ES3030523T3

ES3030523T3 - Compositions and methods for treating cytokine release syndrome

Info

Publication number: ES3030523T3
Application number: ES22704236T
Authority: ES
Inventors: Kara Olson; Olga Sineshchekova; Eric Smith; Chia-Yang Lin
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2021-01-28
Filing date: 2022-01-28
Publication date: 2025-06-30
Anticipated expiration: 2042-01-28
Also published as: US20250302949A1; DK4284512T3; WO2022165171A1; US12274747B2; HRP20250696T1; CN116963774A; LT4284512T; FI4284512T3; PL4284512T3; AU2022214319A9; KR20230157315A; IL304502A; MX2023008949A; RS66868B1; EP4284512B1; SI4284512T1; HUE071594T2; EP4538292A2; JP2024506831A; EP4538292A3

Abstract

La presente invención proporciona composiciones y métodos para el tratamiento del cáncer y la inhibición del síndrome de liberación de citocinas (SLC). Los métodos de la presente invención comprenden la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de CD40 o de una célula CAR-T que exprese un antagonista de CD40, en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de unión a antígeno multiespecífica CD3. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para tratar el síndrome de liberación de citocinas

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el derecho de prioridad de la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° de serie 63/142.643, presentada el 28 de enero de 2021.

Antecedentes

El síndrome de liberación de citocinas (SLC) es una respuesta inflamatoria sistémica que puede desencadenarse por una diversidad de factores, incluyendo determinados fármacos. Cuando los síntomas asociados al SLC se producen menos de seis horas después del inicio de una infusión terapéutica pueden denominarse reacción relacionada con la infusión (RRI).

Las inmunoterapias contra el cáncer activadoras de linfocitos T, incluidas las terapias con anticuerpos biespecíficos, conllevan un riesgo particularmente elevado de SLC (incluida la RRI). En tales terapias, el SLC puede desencadenarse por una liberación masiva de IFN-y por los linfocitos T activados o por las propias células tumorales. El IFN-y secretado induce la activación de otras células inmunitarias, incluyendo macrófagos, que a su vez producen cantidades excesivas de otras citocinas, tales como IL-6, TNF-a e IL-10. En particular, la IL-6 contribuye a muchos de los síntomas clave del SLC, incluyendo la fuga vascular y la activación de la cascada del complemento y de la coagulación que induce la coagulación intravascular diseminada. Es probable que la IL-6 también contribuya a la miocardiopatía al promover la disfunción miocárdica (Shimabukaro-Vornhagen et al. (2018) Journal for Immunotherapy of Cancer 6:1-14).

El control de las toxicidades de la inmunoterapia del cáncer, incluyendo el SLC, es un problema clínico difícil. Mitigar el SLC y/o la RRI es fundamental para garantizar la seguridad de determinados abordajes de inmunoterapia, incluyendo el uso terapéutico de anticuerpos biespecíficos dirigidos contra linfocitos T. Mientras que el SLC de bajo grado puede tratarse generalmente de forma sintomática con antihistamínicos, antipiréticos y líquidos, el SLC grave puede representar un acontecimiento adverso potencialmente mortal que requiere un tratamiento rápido y agresivo. Ciertos tratamientos anticitocinas, la reducción de la dosis de la terapia administrada y la premedicación con esteroides se utilizan actualmente para reducir la incidencia del SLC grave. Por ejemplo, tocilizumab, un anticuerpo anti-IL-6, se utiliza como tratamiento inicial del SLC grave en algunas circunstancias. Sin embargo, cada uno de estos tratamientos actualmente disponibles también puede reducir la eficacia terapéutica de la inmunoterapia para el tratamiento del cáncer. Por lo tanto, sigue siendo necesario encontrar estrategias alternativas para mitigar los efectos potencialmente mortales del SLC sin que ello repercuta negativamente en los beneficios terapéuticos de las inmunoterapias contra el cáncer.

Sumario

El alcance de la invención se determina por las reivindicaciones adjuntas. Cualquiera de las realizaciones, aspectos o ejemplos que quedan fuera del alcance de las reivindicaciones se incluyen únicamente a título de referencia. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia. Se proporcionan en el presente documento métodos y composiciones para el tratamiento y/o prevención del síndrome de liberación de citocinas (SLC), incluyendo el tratamiento y/o la prevención de las reacciones relacionadas con la infusión (RRI). Como se divulga en el presente documento, la administración de antagonistas de CD40 (p. ej., anticuerpos bloqueantes de CD40) puede reducir la liberación de citocinas asociadas al SLC sin afectar a la activación de linfocitos T y la citotoxicidad inducida por la administración de ciertas inmunoterapias contra el cáncer (p. ej., anticuerpos anti-CD3 biespecíficos, linfocitos T-CAR). Por lo tanto, en determinados aspectos, los métodos y composiciones del presente documento son capaces de mitigar los efectos potencialmente mortales del SLC sin afectar negativamente a la eficacia terapéutica de las inmunoterapias contra el cáncer activadoras de linfocitos T, incluidos los anticuerpos biespecíficos.

En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan métodos para tratar el cáncer e inhibir el SLC (incluida la RRI) en un sujeto, que comprende administrar conjuntamente al sujeto (a) una molécula de unión a antígeno multiespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno tumoral; y (b) un antagonista de CD40.

En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno multiespecífica y el antagonista de CD40 se administran al mismo tiempo o secuencialmente. En algunas realizaciones, el antagonista de CD40 se administra antes que la molécula de unión a antígeno multiespecífica.

En algunas realizaciones, el antagonista de CD40 es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista de CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo es quimérico, humanizado, compuesto, murino o humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista de CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona de Fv, Fav, F(ab')2), Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, y fragmentos de diacuerpos.

En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan métodos para tratar el cáncer e inhibir el SLC (incluida la RRI) en un sujeto, que comprende administrar conjuntamente al sujeto (a) una molécula de unión a antígeno multiespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno tumoral; y (b) un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40.

En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno multiespecífica y el linfocito T-CAR se administran al mismo tiempo o secuencialmente. En algunas realizaciones, el linfocito T-CAR se administra antes que la molécula de unión a antígeno multiespecífica.

En algunas realizaciones, el linfocito T-CAR secreta el antagonista de CD40. En algunas realizaciones, el antagonista de CD40 es un scFv o Fab. En algunas realizaciones, el linfocito T-CAR expresa el antagonista de CD40 cuando se activa.

La molécula de unión a antígeno multiespecífica puede ser una molécula de unión a antígeno biespecífica o una molécula de unión a antígeno triespecífica. En algunas realizaciones, en donde la molécula de unión a antígeno triespecífica comprende además un tercer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno de linfocitos T adicional o a un antígeno tumoral adicional. En algunas realizaciones, el tercer dominio de unión a antígeno se une específicamente a CD28. En algunas realizaciones, el antígeno tumoral se selecciona de CD19, CD123, STEAP2, CD20, SSTR2, CD38, STEAP1, 5T4, ENPP3, PSMA, MUC16, GPRC5D y BCMA.

En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno multiespecífica comprende un anticuerpo multiespecífico o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico o el fragmento de unión a antígeno del mismo es quimérico, humanizado, compuesto, murino o humano. En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno multiespecífica se selecciona de un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD19, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xGPRC5D, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD123, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xSTEAP2, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD20, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xSSTR2, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD38, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xSTEAP1, un anticuerpo biespecífico anti-CD3x5T4, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xENPP3, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xMUC16, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xBCMA, un anticuerpo biespecífico anti CD3xPSMA, y un anticuerpo triespecífico CD3xCD28xCD38.

En algunas realizaciones, el método activa los linfocitos T y/o aumenta la citotoxicidad de los linfocitos T en el sujeto. En algunas realizaciones, el método induce la muerte de las células cancerosas en el sujeto. En algunas realizaciones, el método inhibe el síndrome de liberación de citocinas. En algunas realizaciones, se inhibe el síndrome de liberación de citocinas, tal como se mide manteniendo la concentración de proteína C reactiva (PCR) por debajo de 7 mg/dl, IFN-Y inferior a 75 pg/ml y/o IL-10 inferior a 60 pg/ml.

En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan métodos para inhibir el SLC (incluida la RRI) mediante una molécula de unión a antígeno multiespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno tumoral en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un linfocito T-CAr que exprese un antagonista de CD40.

En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un paciente con cáncer. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento comprenden además la identificación de un sujeto susceptible de padecer el síndrome de liberación de citocinas o con necesidad de reducción de la liberación de citocinas antes de administrar al sujeto un antagonista de CD40 o un linfocito T-CAR que exprese un antagonista de CD40.

En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden: una molécula de unión a antígeno multiespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a antígeno tumoral; y un antagonista de CD40. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden un portador farmacéuticamente aceptable.

En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan métodos para tratar el cáncer y/o inhibir el SLC (incluida la RRI) en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica descrita en el presente documento. En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan métodos para tratar el cáncer y/o inhibir el SLC (incluida la RRI) en un sujeto que comprende: identificar a un sujeto que es susceptible de padecer el síndrome de liberación de citocinas o que necesita reducir la liberación de citocinas; y administrar al sujeto una composición farmacéutica descrita en el presente documento.

En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan métodos para tratar el cáncer y/o inhibir el SLC (incluida la RRI) en un sujeto que comprende: (a) identificar a un sujeto que es susceptible de padecer el síndrome de liberación de citocinas o que necesita reducir la liberación de citocinas; y (b) administrar conjuntamente al sujeto (1) una molécula de unión a antígeno multiespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno tumoral; y (2) un antagonista de CD40.

En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan métodos para tratar el cáncer y/o inhibir el SLC (incluida la RRI) en un sujeto que comprende: (a) identificar a un sujeto que es susceptible de padecer el síndrome de liberación de citocinas o que necesita reducir la liberación de citocinas; y (b) administrar conjuntamente al sujeto (1) una molécula de unión a antígeno multiespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno tumoral; y (2) un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40.

En algunas realizaciones, el sujeto susceptible de padecer SLC y/o que necesita reducir la liberación de citocinas se identifica mediante la detección de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en fiebre, erupción cutánea, síntomas respiratorios, hipoxia, hipotensión, disfunción cardiovascular, neurotoxicidad, disfunción hepática, insuficiencia renal, coagulación, toxicidad orgánica, carga tumoral, citocinas, proteína C reactiva (PCR), ferritina, lactato deshidrogenasa (LDH), aspartato aminotransferasa (AST), nitrógeno de urea en sangre (NUS), alanina aminotransferasa (ALT), creatinina (Cr), fibrinógeno, tiempo de protrombina (TP), tiempo de tromboplastina parcial (TTP), eotaxinas y activación de las células endoteliales.

En algunas realizaciones, las citocinas son una o más citocinas seleccionadas del grupo que consiste en sTNFR2, IP10, sIL1R2, sTNFRI, MIG, VEGF, sIL1R1, TNFa, IFNa, GCSF, sRAGE, IL1, IL2, IL4, IL5, IL10, IL12, IL13, IL18, IL1R1, IFNy, IL6, IL8, sIL2Ra, sgp130, sIL6R, MCP1, MIP1a, MIP1p, FLT-3L, fractalquina y GM-CSF. En algunas realizaciones, la activación de las células endoteliales se detecta midiendo la concentración sérica de Ang-2 y/o del factor von Willebrand.

Breve descripción de los dibujos

LasFiguras 1A-1Imuestran que el bloqueo de CD40 inhibió la liberación de citocinas mediada por CD123xCD3 sin afectar a la activación de linfocitos T en un ensayo de 4 días con CMSP enriquecidas con linfocitos B autólogos. LasFiguras 2A-2Emuestran que el bloqueo de CD40 inhibió la liberación de citocinas mediada por un anti-CD3 biespecífico en un ensayo de 4 días con línea celular de LMA y CMSP sin linfocitos B autólogos adicionales. LasFiguras 3A-3Gmuestran que el bloqueo de CD40 inhibió la liberación de citocinas seleccionadas mediada por un anti-CD3 biespecífico sin afectar significativamente a la activación de linfocitos T y a la destrucción de dianas en ensayos de destrucción de 4 días con línea celular prostática y CMSP.

LasFiguras 4Ay4Bmuestran que el bloqueo de CD40 redujo las citocinas en CMSP tratadas con biespecífico anti-CD20xCD3 (REGN1979).

Descripción detallada

Generalidades

Se proporcionan en el presente documento métodos y composiciones para el tratamiento y/o prevención del síndrome de liberación de citocinas (SLC), incluyendo el tratamiento y/o la prevención de las reacciones relacionadas con la infusión (RRI). Como se divulga en el presente documento, la administración de antagonistas de CD40 (p. ej., anticuerpos bloqueantes de CD40) puede reducir la liberación de citocinas asociadas al SLC sin afectar a la activación de linfocitos T y la citotoxicidad inducida por la administración de ciertas inmunoterapias contra el cáncer (p. ej., anticuerpos anti-CD3 biespecíficos, linfocitos T-CAR). Por lo tanto, en determinados aspectos, los métodos y composiciones del presente documento son capaces de mitigar los efectos potencialmente mortales del SLC sin afectar negativamente a la eficacia terapéutica de las inmunoterapias contra el cáncer activadoras de linfocitos T, incluidos los anticuerpos biespecíficos.

Por consiguiente, en determinados aspectos, en el presente documento se proporcionan métodos para tratar y/o prevenir el SLC y/o reducir los síntomas asociados al SLC en un sujeto que se somete a una inmunoterapia contra el cáncer (p. ej., con una molécula de unión a antígeno multiespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno tumoral) administrando al sujeto un antagonista de CD40 (p. ej., un anticuerpo antagonista que se une a CD40) y/o un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40.

Debe entenderse que la presente divulgación no se limita a métodos ni condiciones experimentales particulares descritos, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.

Definiciones

Por comodidad de uso, determinados términos empleados en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas se recogen aquí. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se utiliza en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, como se utiliza en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101, y todos los valores intermedios (p. ej., 99,1,99,2, 99,3, 99,4, etc.).

En el presente documento, los artículos "un" y "uno(a)" se usan para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Como se utiliza en el presente documento, el término "administrar" o "administración" significa proporcionar un agente o composición farmacéutica a un sujeto, e incluye, pero sin limitación, administrado por un profesional médico y administrado por él mismo. Tal agente puede contener, por ejemplo, un linfocitos T-CAR proporcionado en el presente documento.

Como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" puede referirse tanto a un anticuerpo intacto como a un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos intactos son glucoproteínas que incluyen al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por puentes disulfuro. Cada cadena pesada incluye una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como V<h>) y una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera incluye una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como V<l>) y una región constante de cadena ligera. Las regiones V<h>y V<l>pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada V<h>y V<l>está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. El término "anticuerpo" incluye, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos, anticuerpos triespecíficos), anticuerpos de cadena simple y fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno.

Las expresiones "fragmento de unión a antígeno" y "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, como se utiliza en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse a un antígeno. Los ejemplos no limitativos de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimas que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (p. ej., una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos con dominio eliminado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (p. ej., nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se utiliza en el presente documento.

"Cáncer" se refiere en sentido amplio a un crecimiento descontrolado y anormal de las células propias de un hospedador que conduce a la invasión del tejido circundante y potencialmente de tejido distal al sitio inicial de crecimiento celular anormal en el hospedador. Las clases principales incluyen los carcinomas, que son cánceres del tejido epitelial (p. ej., piel, células escamosas); los sarcomas, que son cánceres del tejido conjuntivo (p. ej., hueso, cartílago, grasa, músculo, vasos sanguíneos, etc.); las leucemias, que son cánceres del tejido formador de sangre (p. ej., tejido de la médula ósea); los linfomas y mielomas, que son cánceres de células inmunitarias; y los cánceres del sistema nervioso central, que incluyen los cánceres del tejido cerebral y medular. "Cáncer" o "cánceres" y "neoplasia" o "neoplasias" se usan en el presente documento indistintamente. Como se utiliza en el presente documento, "cáncer" se refiere a todos los tipos de cáncer o neoplasia o tumores malignos, incluyendo las leucemias, carcinomas y sarcomas, ya sean nuevos o recurrentes. Son ejemplos específicos de cánceres: carcinomas, sarcomas, mielomas, leucemias, linfomas y tumores de tipo mixto. Son ejemplos no limitantes de cánceres los cánceres nuevos o recurrentes del cerebro, melanoma, vejiga, mama, cuello uterino, colon, de cabeza y cuello, riñón, pulmón, pulmón no microcítico, mesotelioma, ovarios, próstata, sarcoma, estómago, útero y meduloblastoma. En algunas realizaciones, el cáncer comprende un tumor sólido. En algunas realizaciones, el cáncer comprende una metástasis.

La expresión "receptor de antígeno quimérico" (CAR) se refiere a moléculas que combinan un dominio de unión contra un componente presente en la célula diana, por ejemplo, una especificidad basada en anticuerpos para un antígeno deseado (p. ej., un antígeno tumoral) con un dominio intracelular activador del receptor de linfocitos T para generar una proteína quimérica que presenta una actividad inmunitaria celular específica anti-diana. Generalmente, los CAR consisten en un dominio extracelular de unión a antígeno monocatenario (scFv) fusionado al dominio de señalización intracelular de la cadena zeta del complejo receptor de antígeno de linfocitos T, y tienen la capacidad, cuando se expresan en linfocitos T, de redirigir el reconocimiento de antígenos basándose en la especificidad del anticuerpo monoclonal.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "administración conjunta" o "administrado conjuntamente" se refiere a cualquier forma de administración de dos o más agentes terapéuticos diferentes, de manera que el segundo agente se administra mientras que el agente terapéutico administrado previamente es aún eficaz en el cuerpo (p. ej., los dos agentes son eficaces de manera simultánea en el paciente, lo que puede incluir efectos sinérgicos de los dos agentes). Por ejemplo, los diferentes agentes terapéuticos se pueden administrar bien en la misma formulación o en formulaciones distintas, de forma concomitante o secuencial. En determinadas realizaciones, los diferentes agentes terapéuticos pueden administrarse dentro de aproximadamente una hora, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas o aproximadamente en semanas alternas. Por lo tanto, un sujeto que recibe tal tratamiento se puede beneficiar de un efecto combinado de diferentes agentes terapéuticos.

Un "dominio coestimulador" o una "molécula coestimuladora" se refiere a la molécula asociada de unión afín en un linfocito T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando de este modo en una respuesta coestimuladora por la célula, tal como, aunque no de forma limitativa, la proliferación. El dominio coestimulador puede ser un dominio coestimulador humano. Algunos ejemplos de moléculas coestimuladoras incluyen, CD28, 4-1BB, CD27, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C y B7-H3.

Un "ligando coestimulador" se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígeno que se une específicamente a una molécula coestimuladora afín en un linfocito T, proporcionando de este modo una señal que media en la respuesta de los linfocitos T, incluyendo, aunque no de forma limitativa, activación de proliferación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, pero sin limitación, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (CA<m>), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une con el receptor de ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3.

Una "señal coestimuladora" se refiere a una señal, que, junto con una señal primaria, conduce a la proliferación de linfocitos T y/o a la regulación por aumento o por disminución de moléculas clave.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como un parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, distintos anticuerpos pueden unirse a distintas áreas de un antígeno y pueden tener distintos efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce mediante aminoácidos yuxtapuestos espacialmente de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En una determinada circunstancia, un epítopo puede incluir restos de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos agentes, compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del ámbito del buen criterio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" significa un material, una composición o un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un material de relleno líquido o sólido, diluyente, excipiente o disolvente material de encapsulación, implicados en llevar o transportar el agente de un órgano, o parte del organismo, a otro órgano o parte del organismo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no ser perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como transportadores farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras de supositorio; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua apirógena; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones de pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y (22) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.

Las expresiones "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan indistintamente. Se refieren a moléculas naturales o sintéticas, o combinaciones de las mismas, que comprenden un solo nucleótido o dos o más nucleótidos unidos por un grupo fosfato en la posición 3' de un nucleótido al extremo 5' de otro nucleótido. La forma polimérica de los nucleótidos no está limitada por la longitud y puede comprender desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento de gen, loci (locus) definidos a partir del análisis de uniones, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si están presentes, pueden transmitirse modificaciones a la estructura de los nucleótidos antes o después del ensamblaje del polímero. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente, tal como mediante conjugación con un componente de marcaje. En todas las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en el presente documento, los nucleótidos U son intercambiables con los nucleótidos T. Los polinucleótidos no están necesariamente asociados con la célula en la que el ácido nucleico se encuentra en la naturaleza y/o tampoco están operativamente unidos a un polinucleótido al que está unido en la naturaleza.

Como se utiliza en el presente documento, un agente terapéutico que "impide" una afección se refiere a un compuesto que, cuando se administra a una muestra estadística antes de la aparición del trastorno o afección, reduce la aparición del trastorno o afección en la muestra tratada respecto a la muestra de control sin tratar, o retrasa o reduce la gravedad de uno o más síntomas del trastorno o afección respecto a la muestra de control sin tratar.

La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea de forma óptima con inserciones o deleciones de nucleótidos adecuadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente un 95 % y, más preferentemente, en al menos aproximadamente un 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases nucleotídicas, según se mide mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tales como FASTA, BLAST o Gap, como se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene una identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en determinados casos, codificar un polipéptido que tenga la misma secuencia de aminoácidos o una sustancialmente similar que el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.

Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos un 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es aquella en la que un resto de aminoácido se sustituye por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (p. ej., carga o hidrofobia). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, p. ej., Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Los grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos son: valina-leucinaisoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un remplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256 1443-1445. Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

Las expresiones "unión específica" o "que se une específicamente", como se utiliza en el presente documento, cuando se refiere a un polipéptido se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína o polipéptido o receptor en una población heterogénea de proteínas y otros biológicos. Por lo tanto, en las condiciones designadas (p. ej., condiciones de inmunoensayo en el caso de un anticuerpo), un ligando o anticuerpo especificado se "une específicamente" a su "diana" particular (p. ej., un anticuerpo se une específicamente a un antígeno endotelial) cuando éste no se une en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra o a otras proteínas con las que el ligando o anticuerpo pueda entrar en contacto en un organismo. Generalmente, una primera molécula que "se une específicamente" a una segunda molécula tiene una constante de afinidad (Ka) superior a aproximadamente 105 M-1 (p. ej., 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, y 1012 M-1 o más) con esa segunda molécula. Por ejemplo, en el caso de la capacidad de un CAR específico de PIG que se une a un péptido presentado en un MHC (p. ej., MHC de clase I o MHC de clase II); habitualmente, un CAR se une específicamente a su péptido/MHC con una afinidad de al menos una KD de aproximadamente 10-4 M o menos, y se une a antígeno/molécula asociada de unión predeterminado con una afinidad (expresada por KD) que es al menos 10 veces menor, al menos 100 veces menos o al menos 1000 veces menos que su afinidad de unión a un complejo péptido/MHC no específico y no relacionado (p. ej., uno que comprende un péptido BSA o un péptido caseína).

Como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.

Como se utiliza en el presente documento, el término "tratamiento" se refiere a una intervención clínica diseñada para alterar el curso natural del individuo que se está tratando durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen disminuir la tasa de progresión, mejorar o paliar el estado patológico, y remisión o mejorar el pronóstico de una enfermedad, trastorno o afección en particular. Un individuo es "tratado" con éxito, por ejemplo, si uno o más síntomas asociados a una enfermedad, trastorno o afección en particular se mitigan o eliminan.

Síndrome de liberación de citocinas (SLC)

Generalidades

En determinados aspectos, se proporcionan en el presente documento métodos y composiciones para tratar y/o prevenir el síndrome de liberación de citocinas (SLC). Los síntomas asociados al SLC pueden incluir la reacción relacionada con la infusión (RRI) si se producen menos de seis horas después del inicio de una infusión terapéutica. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, los métodos y composiciones del presente documento pueden ser útiles para tratar y/o prevenir el SLC y/o los síntomas del SLC, incluyendo, aunque no de forma limitativa, la RRI.

El SLC es una toxicidad potencialmente mortal asociada a las citocinas que puede producirse como resultado de la inmunoterapia contra el cáncer, p. ej., terapias con anticuerpos contra el cáncer (p. ej., anticuerpos biespecíficos) y/o inmunoterapias con linfocitos T (p. ej., linfocitos T-CAR). El SLC es el resultado de una activación inmunitaria de alto nivel cuando un gran número de linfocitos y/o células mieloides liberan citocinas inflamatorias al activarse. La gravedad del SLC y el momento de aparición de los síntomas pueden variar en función de la magnitud de la activación de las células inmunitarias, el tipo de terapia administrada y/o la extensión de la carga tumoral en un sujeto. En el caso de la terapia con linfocitos T para el cáncer, los síntomas normalmente aparecen días o semanas después de la administración de la terapia con linfocitos T, p. ej., cuando se produce el pico de expansión de linfocitos T in vivo. Véase, p. ej., Lee et al. (2014) Blood. 124:188-195.

Los síntomas del SLC pueden incluir toxicidad neurológica, coagulación intravascular diseminada, disfunción cardíaca, síndrome de dificultad respiratoria aguda, insuficiencia renal y/o hepática. Por ejemplo, los síntomas del SLC pueden incluir fiebre con o sin rigidez, cansancio, malestar general, mialgias, vómitos, cefalea, náuseas, anorexia, artralgias, diarrea, erupción cutánea, hipoxemia, taquipnea, hipotensión, aumento de la presión del pulso, disminución potencial del gasto cardíaco (tardía), aumento del gasto cardíaco (precoz), azoemia, hipofibrinogenemia con o sin hemorragia, dímero D elevado, hiperbilirrubinemia, transaminitis, confusión, delirios, cambios del estado mental, alucinaciones, temblor, convulsiones, alteración de la marcha, dificultad para encontrar palabras, afasia franca o dismetria.

Clasificación del SLC

En determinados aspectos, los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento pueden utilizarse para tratar y/o impedir el SLC de cualquier grado de gravedad. En determinadas realizaciones, los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento se utilizan en el tratamiento y/o prevención del SLC grave.

El tratamiento del SLC puede seguir una estrategia de seguimiento y terapia adaptada al grado y al riesgo. Se han desarrollado y divulgado varios sistemas de clasificación del SLC en, p. ej., Porter et al. (2018) J. Hematol Oncol.

11:35, Lee et al. (2014) Blood 124:188-195, Neelapu et al. (2018) Nat. Rev. Clin. Oncol. 15:47-62, Neelapu et al. (2018) Nat. Rev. Clin. Oncol. 15:218, Teachey et al. (2016) Cancer Discov. 6:664-679 y en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2019/0335404. Cualquiera de estos sistemas de clasificación del SLC puede usarse para evaluar, diagnosticar, estratificar o identificar sujetos para los métodos proporcionados en el presente documento.

En algunas realizaciones, la gravedad del SLC puede graduarse del 1 al 5 de la siguiente manera. Los grados 1-3 son SLC menos graves. Los grados 4-5 son SLC graves. Para el grado 1 de SLC, solo es necesario un tratamiento sintomático (por ej., náuseas, fiebre, fatiga, mialgias, malestar, cefalea) y los síntomas no son potencialmente mortales. Para el grado 2 de SLC, los síntomas requieren una intervención moderada y, por lo general, responden a una intervención moderada. Los sujetos que tienen SLC de grado 2 desarrollan hipotensión que responde a líquidos o a una dosis baja de vasopresor; o desarrollan toxicidad orgánica de grado 2 o síntomas respiratorios leves que responden a oxígeno de bajo flujo (<40 % de oxígeno). En los sujetos con SLC de grado 3, en general, la hipotensión no puede revertirse con fluidoterapia o una dosis baja de vasopresor. Estos sujetos requieren generalmente más oxígeno que a bajo flujo y tienen toxicidad orgánica de grado 3 (p, ej., disfunción renal o cardíaca o coagulopatía) y/o transaminitis de grado 4. Los sujetos con SLC de grado 3 requieren una intervención más agresiva, p. ej., oxígeno del 40 % o superior, vasopresor(es) a dosis altas y/o vasopresores múltiples. Los sujetos con SLC de grado 4 sufren síntomas que ponen en peligro su vida de forma inmediata, incluyendo toxicidad orgánica de grado 4 o necesidad de ventilación mecánica. Los sujetos con SLC de grado 4 no suelen tener transaminitis. En los sujetos con SLC de grado 5, la toxicidad causa la muerte. Por ejemplo, los criterios para clasificar el SLC se divulgan en la publicación solicitud de patente de EE. UU. n.° 2019/0336504.

En determinadas realizaciones, los métodos y/o composiciones proporcionados en el presente documento tratan y/o impiden el SLC de grado 5. En determinadas realizaciones, los métodos y/o composiciones proporcionados en el presente documento tratan y/o impiden el SLC de grado 4. En determinadas realizaciones, los métodos y/o composiciones proporcionados en el presente documento tratan y/o impiden el SLC de grado 3. En determinadas realizaciones, los métodos y/o composiciones proporcionados en el presente documento tratan y/o impiden el SLC de grado 2. En determinadas realizaciones, los métodos y/o composiciones proporcionados en el presente documento tratan y/o impiden el SLC de grado 1.

Identificación de un sujeto con riesgo de SLC

En determinadas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento incluyen el tratamiento de un sujeto susceptible de padecer SLC y/o que necesite reducir la liberación de citocinas. En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento comprenden identificar un sujeto susceptible de padecer SLC y/o que necesita reducir la liberación de citocinas.

En algunas realizaciones, se utilizan uno o más biomarcadores para evaluar (p. ej., diagnosticar o identificar) a un sujeto susceptible de padecer SLC o que necesita reducir la liberación de citocinas. En algunas realizaciones, el uno o más biomarcadores se seleccionan de fiebre, erupción cutánea, síntomas respiratorios, hipoxia, hipotensión, disfunción cardiovascular, neurotoxicidad, disfunción hepática, insuficiencia renal, coagulación, toxicidad orgánica, carga tumoral, citocinas, eotaxinas, proteína C reactiva (CRP), ferratina, creatinina y la activación de las células endoteliales, etc.

En determinadas realizaciones, las citocinas ilustrativas incluyen, pero sin limitación, p. ej., sTNFR2, IP10, sIL1R2, sTNFRI, MIG, VEGF, sIL1R1, TNFa, IFNa, GCSF, sRAGE, IL1, IL2, IL4, IL5, IL10, IL12, IL13, IL18, IL1R1, IFN<y>, IL6, IL8, sIL2Ra, sgp130, sIL6R, MCP1, MIP1a, MIP1p, FLT-3L, fractalquina y GM-CSF. En algunas realizaciones, una o más (p. ej., dos o más, o tres o más) de las citocinas, sTNFR2, I10,<si>L1R2, sTNFR1, MIG, VEGF, sIL1R1, TNFa, IFNa, GCSF, sRAGE, IL1, IL2, IL4, IL5, IL10, IL12, IL13, IL18, IL1R1, IFNy, IL6, IL8, sIL2Ra, sgp130, sIL6R, MCP1, MIP1a, MIP1p, FLT-3L, fractalquina y GM-CSF, se utilizan para evaluar (p. ej., diagnosticar o identificar) a un sujeto susceptible de padecer SLC o que necesita reducir la liberación de citocinas.

Los biomarcadores ilustrativos utilizados para evaluar (p. ej., predecir) la gravedad del SLC también pueden incluir evaluaciones de la carga de la enfermedad, p. ej., la extensión de la enfermedad (p. ej., cáncer) en un sujeto. Por ejemplo, puede realizarse una evaluación de la carga de enfermedad determinando el grado de enfermedad (p. ej., cáncer) en una muestra biológica de un sujeto. Por ejemplo, una carga de morbilidad elevada se indica por la presencia de al menos un 25 % (p. ej., 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o superior) de células cancerosas en una muestra biológica obtenida de un sujeto (p. ej., determinada por morfología en un aspirado o biopsia, un ensayo de flujo en un aspirado o biopsia, y/o por MRD). En algunas realizaciones, una carga de enfermedad elevada se indica por la presencia de al menos un 50 % de células cancerosas en una muestra biológica obtenida de un sujeto. Por ejemplo, una carga de enfermedad baja se indica por la presencia de menos del 25 % (p. ej., 24 %, 23 %, 22 %, 21 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % o menos) de células cancerosas en una muestra biológica obtenida de un sujeto (p. ej., determinada por morfología en un aspirado o biopsia, un ensayo de flujo en un aspirado o biopsia, y/o por MRD). En algunas realizaciones, una carga de enfermedad baja se indica por la presencia de menos del 0,1 %, 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 % o 25 % de células cancerosas en una muestra biológica obtenida de un sujeto.

En algunas realizaciones, una o más citocinas junto con una evaluación de la carga de la enfermedad se usa para evaluar (p. ej., diagnosticar o identificar) a un sujeto susceptible de padecer SLC o que necesita una reducción de la liberación de citocinas.

Otro biomarcador ilustrativo utilizado para evaluar (p. ej., diagnosticar o identificar) a un sujeto susceptible de padecer SLC o que necesita reducir la liberación de citocinas incluye la concentración o la actividad de la proteína C reactiva (PCR). En realizaciones, un sujeto con bajo riesgo de SLC grave es aquel que tiene una concentración de PCR inferior a 7 mg/dl (p. ej., 7, 6,8, 6, 5, 4, 3, 2, 1 mg/dl o menos). En algunas realizaciones, un sujeto con alto riesgo de SLC grave es aquel que tiene una concentración más elevada de PCR en una muestra (p. ej., una muestra de sangre) en comparación con un sujeto con bajo riesgo de SLC grave o en comparación con una concentración o actividad de control. En algunas realizaciones, la concentración o actividad más elevada es al menos 2 veces mayor (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 500, 1000 veces o más) en comparación con un sujeto con bajo riesgo de SLC grave o en comparación con una concentración o actividad de control.

En algunas realizaciones, uno o más biomarcadores descritos en el presente documento se usan para predecir el riesgo o la gravedad del SLC en un sujeto poco después de la administración con el antagonista de CD40 y/o el anticuerpo multiespecífico anti-CD3 descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, uno o más biomarcadores descritos en el presente documento se utilizan para predecir el riesgo o la gravedad del SLC en un sujeto en un plazo de 2 semanas, p. ej., dentro de 1 semana o menos tras la administración con el antagonista de<c>D40 y/o el anticuerpo multiespecífico anti-CD3 descritos en el presente documento. En realizaciones, los biomarcadores descritos en el presente documento se utilizan para predecir el riesgo o la gravedad del SLC en un sujeto dentro de 10 días (p. ej., 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 día o menos después de la administración con el antagonista de CD40 y/o el anticuerpo multiespecífico anti-CD3 descritos en el presente documento. En realizaciones, los biomarcadores descritos en el presente documento se usan para predecir el riesgo o la gravedad del SLC en un sujeto dentro de 1-10 días (p. ej., dentro de 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, o 1 día después de la administración con el antagonista de CD40 y/o el anticuerpo multiespecífico anti-CD3 descritos en el presente documento. En realizaciones, los biomarcadores descritos en el presente documento se utilizan para predecir el riesgo o la gravedad del SLC en un sujeto antes de que el sujeto experimente uno o más síntomas de SLC de grado 2, 3, 4 o 5 (p. ej., antes de que el sujeto experimente uno o más síntomas de SLC de grado 3, 4 o 5 o SLC de grado 4 o 5).

En algunas realizaciones, concentraciones elevadas o reducidas de una o más de las citocinas descritas en el presente documento, p. ej., sTNFR2, IP10, sIL1R2, sTNFR1, VEGF, sIL1R1, TNFa, IFNa, GCSF, sRAGE, IL1, IL2, IL4, IL5, IL10, IL12, IL13, IL18, IL1R1, IFNy, IL6, IL8, sIL2Ra, sgp130, sIL6R, MCP1, MIP1a, MIP1p, FLT-3L, fractalquina y GM-CSF, respecto a una concentración de control, indica que el sujeto es susceptible de padecer SLC o que necesita reducir la liberación de citocinas, o que corre el riesgo de desarrollar SLC grave. La concentración de control puede ser una concentración de referencia, una concentración basal, una concentración de un sujeto sano, una concentración de un sujeto que tiene un trastorno o afección (p. ej., cáncer) distinto del SLC, una concentración de un sujeto antes de la administración del anticuerpo multiespecífico anti-CD3 y/o del antagonista de CD40 descritos en el presente documento, o de un sujeto con un grado específico de SLC.

En algunas realizaciones, una elevación de una o más de las citocinas descritas en el presente documento (p. ej., uno o más de IFN<y>, IL6, IL10, sgp130, IL18, TNFa, IL8, IP10, MCP1, MIG, MIP1p y sIL6R) al menos 2 veces (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000 veces o más) respecto a una concentración de control (p. ej., una concentración de referencia), indica que el sujeto es susceptible de padecer SLC o que necesita reducir la liberación de citocinas, o que corre el riesgo de desarrollar SLC grave.

En algunas realizaciones, una reducción de una o más de las citocinas descritas en el presente documento (p. ej., una o más de IL1R1, MIP1a, e IL13) en al menos un 10 % (p. ej., al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 %) respecto a una concentración de referencia, indica que el sujeto es susceptible de padecer SLC o que necesita reducir la liberación de citocinas, o que corre el riesgo de desarrollar SLC grave. En algunas realizaciones, la concentración de referencia es un valor que no depende del concentración basal de la citocina en el sujeto. En algunas realizaciones, la concentración de referencia es el valor basal de la citocina o los valores basales de la citocina según la carga de la enfermedad.

En algunas realizaciones, una elevación de una o más de las citocinas descritas en el presente documento (p. ej., IFNy, IL6, IL10, sgp130, IL18, TNFa, IL8, IP10, MCP1, MIG, MIP1p, y sIL6R), p. ej., al menos 2 veces (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000 veces o más) respecto a una concentración de control, p. ej., cuando se mide dentro de 1-10 días (p. ej., dentro de 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, o 1 día) después de la administración con un anticuerpo multiespecífico anti-CD3 descrito en el presente documento, indica que el sujeto es susceptible de padecer SLC o que necesita reducir la liberación de citocinas, o que corre el riesgo de desarrollar SLC grave.

En algunas realizaciones, una concentración de PCR inferior a 7 mg/dl (p. ej., 7, 6,8, 6, 5, 4, 3, 2, 1 mg/dl o menos), p. ej., cuando se mide dentro de 1-10 días (p. ej., dentro de 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, o 1 día después de la administración con un anticuerpo multiespecífico anti-CD3 descrito en el presente documento, indica que el sujeto tiene un riesgo bajo de desarrollar SLC grave.

En realizaciones, una concentración de PCR igual o superior a 6 mg/dl (p. ej., 6, 6,8, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 mg/dl o superior), p. ej., cuando se mide dentro de 1-10 días (p. ej., dentro de 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, o 1 día después de la administración con un anticuerpo multiespecífico anti-CD3 descrito en el presente documento, indica que el sujeto tiene un alto riesgo de desarrollar SLC grave.

En determinados aspectos, la divulgación proporciona un método de control del SLC (p. ej., control de un paciente que tiene SLC0, SLC1, SLC2 o SLC3) o control del desarrollo de SLC grave, que comprende la evaluación de uno o más biomarcadores de SLC. El método puede incluir medir el uno o más biomarcadores en una pluralidad de puntos temporales, p. ej., en los puntos temporales 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más. En determinados aspectos, la divulgación proporciona un método para controlar el SLC, que comprende evaluar a un sujeto en riesgo de desarrollar SLC (p. ej., SLC grave), y opcionalmente administrar un tratamiento para el SLC, p. ej., un tratamiento descrito en el presente documento.

Identificación de un sujeto que tiene SLC

En determinadas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento incluyen el tratamiento de un sujeto que tiene SLC. En algunas realizaciones, en algunas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento incluyen una etapa para determinar si un sujeto tiene SLC (p. ej., SLC grave). El método incluye adquirir un estado de riesgo de s Lc , p. ej., en respuesta a una inmunoterapia contra el cáncer, p. ej., un anticuerpo multiespecífico anti-CD3, para el sujeto, en donde dicho estado de riesgo de SLC incluye una medición de uno o más de la concentración o actividad de una o más (p. ej., 3, 4, 5, 10, 15, 20, o más) citocinas elegidas de sTNFR2, IP10, sIL1R2, sTNFRI, MIG, VEGF, sIL1R1, TNFa, IFNa, GCSF, sRAGE, IL1, IL2, IL4, IL5, IL10, IL12, IL13, IL18, IL1R1, IFNy, IL6, IL8, sIL2Ra, sgp130, sIL6R, MCP1, MIP1a, MIP1p, FLT-3L, fractalquina y GM-CSF, o pruebas de laboratorio (p. ej., analitos) elegidas de proteína C reactiva (PCR), ferritina, lactato deshidrogenasa (LDH), aspartato aminotransferasa (AST), nitrógeno de urea en sangre (NUS), alanina aminotransferasa (ALT), creatinina (Cr), fibrinógeno, tiempo de protrombina (TP), tiempo de tromboplastina parcial (TTP), o una combinación de los mismos, en una muestra (p. ej., una muestra de sangre).

En algunas realizaciones, una concentración de ferritina de al menos aproximadamente 23.500, 25.000, 30.000, 40.000, 50.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 150.000, 200.000 o 250.000 ng/ml, y opcionalmente hasta aproximadamente 299.000 o 412.000 ng/ml, es indicativa de SLC (p. ej., SLC grave). En algunas realizaciones, una concentración de ferritina inferior a aproximadamente 23.500, 20.000, 18.000, 16.000, 14.000, 12.000, 10.000, 9.000, 8.000, 7.000, 6.0005.000, 4.000, 3.000, 2.000 o 1000 ng/ml y opcionalmente superior a aproximadamente 280 ng/ml, es indicativa de que el sujeto no tiene SLC (p. ej., SLC grave).

En algunas realizaciones, una concentración de LDH de al menos aproximadamente 1.700, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 15.000 o 20.000 U/l y opcionalmente hasta aproximadamente 24.000 U/l, es indicativa de SLC (p. ej., SLC grave). En algunas realizaciones, una concentración de LDH inferior a aproximadamente 1700, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 o 200 U/l, y opcionalmente superior a aproximadamente 159 U/l, es indicativa de que el sujeto no tiene SLC (p. ej., SLC grave).

En algunas realizaciones, una concentración de PCR de al menos aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 mg/dl, y opcionalmente hasta aproximadamente 38 mg/dl, es indicativa de SLC (SLC grave). En algunas realizaciones, una concentración de PCR inferior a aproximadamente 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mg/dl, y opcionalmente superior a aproximadamente 0,7 mg/dl, es indicativa de que el sujeto no tiene SLC (p. ej., SLC grave).

En algunas realizaciones, una concentración de ALT de al menos aproximadamente 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 980, 900, 950, o 1000 U/l, y opcionalmente hasta 1300 U/l, es indicativa de SLC (p. ej., SLC grave). En algunas realizaciones, una concentración de ALT inferior a aproximadamente 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 o 30 U/l, y opcionalmente superior a aproximadamente 25 U/l, es indicativa de que el sujeto no tiene SLC (p. ej., SLC grave).

En algunas realizaciones, una concentración de AST de al menos aproximadamente 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 980, 900, 950, 1000 U/l, y opcionalmente hasta aproximadamente 1500 U/l, es indicativa de SLC (p. ej., SLC grave). En algunas realizaciones, una concentración de AST inferior a aproximadamente 150, 140, 130, 120, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 o 30 U/l, y opcionalmente superior a aproximadamente 15 U/l, es indicativa de que el sujeto no tiene SLC (p. ej., SLC grave).

En algunas realizaciones, una concentración de NUS de al menos aproximadamente 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 o 190 mg/dl, y opcionalmente hasta aproximadamente 210 mg/dl, es indicativa de SLC (p. ej., SLC grave). En algunas realizaciones, una concentración de BUN inferior a aproximadamente 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 mg/dl, y opcionalmente superior a aproximadamente 5 mg/dl, es indicativa de que el sujeto no tiene SLC (p. ej., SLC grave).

En algunas realizaciones, una concentración de fibrinógeno inferior a aproximadamente 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 o 30 mg/dl, y opcionalmente superior a aproximadamente 20 mg/dl, es indicativa de SLC (p. ej., SLC grave). En algunas realizaciones, una concentración de fibrinógeno de al menos aproximadamente 150, 160, 170, 180, 190, 200 o 210 mg/dl y opcionalmente hasta aproximadamente 230 mg/dl, es indicativa de que el sujeto no tiene SLC (p. ej., SLC grave).

En algunas realizaciones, un nivel de TP de al menos aproximadamente 17, 18, 19, 20, 21 o 22 s y opcionalmente hasta aproximadamente 24 s, es indicativo de SLC (p. ej., SLC grave). En algunas realizaciones, un nivel de TP inferior a aproximadamente 17, 16, 15 o 14 s y, opcionalmente, superior a aproximadamente 12 s, es indicativo de que el sujeto no tiene SLC (p. ej., SLC grave).

En algunas realizaciones, un nivel de TTP de al menos aproximadamente 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60, 65, 70, 75, 80 u 85 s y opcionalmente hasta aproximadamente 95 s, es indicativo de SLC (p. ej., SLC grave). En algunas realizaciones, un nivel de TTP inferior a aproximadamente 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28 o 27 s y opcionalmente superior a aproximadamente 25 s, es indicativo de que el sujeto no tiene SLC (p. ej., SLC grave).

En algunas realizaciones, un paciente con SLC grave tiene un IFN-y >75 pg/ml y una IL-10 >60 pg/ml. En algunas realizaciones, un paciente con SLC grave tiene un IFN-<y>mayor o igual a 40, 50, 60, 70 o 75 pg/ml, una concentración de IL-10 superior o igual a 30, 40, 50 o 60 pg/ml, o cualquier combinación de los mismos.

Los biomarcadores adicionales para evaluar si un sujeto tiene SLC o corre el riesgo de padecer SLC se divulgan en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. números 2019/0336504 y 2018/0252727.

Anticuerpos terapéuticos

Generalidades

En determinados aspectos, los métodos y composiciones del presente documento se refieren al uso de anticuerpos terapéuticos (p. ej., anticuerpos antagonistas anti-CD40 y/o anticuerpos biespecíficos de unión a CD3).

Como se ha expuesto anteriormente, como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" abarca tanto las moléculas de anticuerpo completas como los fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Los ejemplos no limitativos de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimas que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (p. ej., una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-C<d>R3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos con dominio eliminado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (p. ej., nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se utiliza en el presente documento.

Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que está adyacente a o en fase con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio V<h>asociado con un dominio V<l>, los dominios V<h>y V<l>pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros V<h>-V<h>, V<h>-V<l>o V<l>-V<l>. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio V<h>o V<l>monomérico.

En determinadas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Configuraciones no limitantes, ilustrativas, de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen: (i) V<h>-C<h>1; (ii) V<h>-C<h>2; (iii) V<h>-C<h>3; (iv) V<h>-C<h>1-C<h>2; (v) V<h>-C<h>1-C<h>2-C<h>3; (vi) V<h>-C<h>2-C<h>3; (vii) V<h>-C<l>; (viii) V<l>-C<h>1; (ix) V<l>-C<h>2; (x) V<l>-C<h>3; (xi) V<l>-C<h>1-C<h>2; (xii) V<l>-C<h>1-C<h>2-C<h>3; (xiii) V<l>-C<h>2-C<h>3; y (xiv) V<l>-C<l>. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, que incluye cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (p. ej., 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que producen una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Por otro lado, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios V<h>o V<l>monoméricos (p. ej., mediante enlace o enlaces disulfuro).

Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (p. ej., biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno diferente o a un epítopo distinto en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico ilustrativos que se divulgan en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención utilizando técnicas rutinarias disponibles en la técnica. En ciertas realizaciones proporcionadas en el presente documento, al menos un dominio variable de un anticuerpo multiespecífico es capaz de unirse específicamente a CD3.

En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden actuar mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). "Citotoxicidad dependiente del complemento" (CDC) se refiere a lisis de células que expresan antígeno por un anticuerpo de la invención en presencia del complemento. "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" (ADCC) se refiere a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan receptores de Fc (FcR) (p. ej., linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y de ese modo da lugar a la lisis de la célula diana. La CDC y la CCDA pueden medirse usando ensayos que se conocen bien y están disponibles en la técnica. (Véase,p. ej.,las patentes de Ee . UU. números 5.500.362 y 5.821.337 y en Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656). La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo de fijar el complemento y mediar la citotoxicidad dependiente de células. Por lo tanto, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse basándose en si se desea que el anticuerpo medie la citotoxicidad.

En ciertas realizaciones proporcionadas en el presente documento, los anticuerpos antagonistas anti-CD40 o anticuerpos multiespecíficos (p. ej., biespecíficos o triespecíficos) anti-CD3 proporcionados en el presente documento son anticuerpos humanos. La expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria y de sitio específicoin vitroo mediante mutación somáticain vivo),por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias de CDR procedentes de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se hayan injertado en secuencias marco humanas.

Los anticuerpos proporcionados en el presente documento, en algunas realizaciones, pueden ser anticuerpos humanos recombinantes. La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se utiliza en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresados, crean o aíslan mediante medios recombinantes, tales como los anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos recombinantes (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesisin vitro(o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somáticain vivo)y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones V<h>y V<l>de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de y están relacionadas con secuencias V<h>y V<l>de la línea germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanosin vivo.

Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que están asociadas a la heterogeneidad de bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción de cuatro cadenas estable de aproximadamente 150-160 kDa en donde los dímeros se mantienen juntos mediante un enlace disulfuro intercatenario de la cadena pesada. En una segunda forma, los dímeros no están unidos a través de enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta por una cadena ligera y pesada acopladas covalentemente (semianticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de la purificación por afinidad.

La frecuencia de aparición de la segunda forma en diferentes isotipos de IgG inalterada se debe, aunque no de forma limitativa, a diferencias estructurales asociadas al isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una sustitución de un único aminoácido en la región bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) hasta las concentraciones normalmente observadas usando una bisagra de IgG1 humana. La presente invención abarca anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra, la región C<h>2 o C<h>3, que puede ser deseable, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.

Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos aislados. Un "anticuerpo aislado", como se utiliza en el presente documento, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o eliminado de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en donde el anticuerpo existe de forma natural o se produce de forma natural, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpoin situdentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han sometido a al menos una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con determinadas realizaciones, un anticuerpo aislado puede carecer sustancialmente de otro material celular y/o agentes químicos.

En determinadas realizaciones, los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento incluyen anticuerpos de un brazo que se unen a CD40. Como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo de un brazo" significa una molécula de unión a antígeno que comprende una única cadena pesada de anticuerpo y una única cadena ligera de anticuerpo.

Variantes de secuencia

En algunas realizaciones, los anticuerpos antagonistas anti-CD40 y/o anticuerpos multiespecíficos (p. ej., biespecíficos o triespecíficos) anti-CD3 divulgados en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que proceden los anticuerpos. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles, por ejemplo, en bases de datos públicas de secuencias de anticuerpos. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que proceden de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que procede el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en conjunto en el presente documento "mutaciones de la línea germinal"). Un experto en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera desveladas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. En determinadas realizaciones, todos los restos de la región marco y/o CDR dentro de los dominios Vhy/o Vlretromutan a los restos encontrados en la secuencia de la línea germinal original de la que se obtuvo el anticuerpo. En otras realizaciones, únicamente determinados restos se retromutan a la secuencia de la línea germinal original, p. ej., únicamente los restos mutados encontrados dentro de los 8 primeros aminoácidos de FR1 o dentro de los 8 últimos aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otras realizaciones, uno o más del resto o los restos de la región marco y/o de la CDR están mutados al resto o los restos correspondientes de una secuencia de la línea germinal diferente (es decir, una secuencia de la línea germinal diferente que es diferente de la secuencia de la línea germinal de la que derivó originariamente el anticuerpo). Asimismo, los anticuerpos de la presente invención pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, p. ej., en donde determinados restos individuales mutan al resto correspondiente de una secuencia de la línea germinal particular, mientras que otros restos determinados, que difieren de los de la secuencia de la línea germinal original, se mantienen o mutan al resto correspondiente de una secuencia de línea germinal distinta. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden probarse fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, aumento de la unión (p. ej., medido por valoración de unión celular o unión FACS) o afinidad de unión (p. ej., K<d>), propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), inmunogenicidad reducida, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general están abarcados en la presente invención.

En algunas realizaciones, los anticuerpos antagonista anti-CD40 o anticuerpos multiespecíficos (p. ej., biespecíficos o triespecíficos) anti-CD3 proporcionados en el presente documento comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, en ciertas realizaciones los anticuerpos antagonista anti-CD40 o multiespecíficos (p. ej., biespecíficos o triespecíficos) anti-CD3 proporcionados en el presente documento tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, p. ej., 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservativas de aminoácidos respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR divulgadas en el presente documento.

Variantes Fc

De acuerdo con ciertas realizaciones proporcionadas en el presente documento, se proporcionan anticuerpos y moléculas de unión a antígeno biespecíficos que comprenden un dominio Fc que comprende una o más mutaciones que potencian o disminuyen la unión del anticuerpo al receptor FcRn, p. ej., a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos que comprenden una mutación en la región C<h>2 o C<h>3 del dominio Fc, en donde la mutación o mutaciones aumentan la afinidad del dominio Fc por FcRn en un entorno ácido (p. ej., en un endosoma en donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Dichas mutaciones pueden dar como resultado un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se administra a un animal. Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, p. ej., una modificación en la posición 250 (p. ej., E o Q); 250 y 428 (p. ej., L o F); 252 (p. ej., L/Y/F/W o T), 254 (p. ej., S o T) y 256 (p. ej., S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (p. ej., H/L/R/S/P/Q o K) y/o 434 (p. ej., H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (p. ej., 308F, V308F) y 434. En una realización, la modificación comprende una modificación en 428L (p. ej., M428L) y 434S (p. ej., N434S); una modificación en 428L, 259I (p. ej., V259I), y 308F (p. ej., V308F); una modificación en 433K (p. ej., H433K) y una en 434 (p. ej., 434Y); una modificación en 252, 254, y 256 (p. ej., 252Y, 254T y 256E); una modificación en 250Q y 428L (p. ej.,T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (p. ej., 308F o 308P).

Por ejemplo, la presente invención incluye moléculas multiespecíficas de unión al antígeno CD3 (p. ej., anticuerpos biespecíficos anti-CD3/anti-MUC16, anti-BCMA x anti-CD3, o anticuerpos biespecíficos anti-CD3/anti-CD20), que comprenden un dominio Fc que comprende uno o más pares o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (p. ej., T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (p. ej., M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (p. ej., M428L y N434S); y 433K y 434F (p. ej., H433K y N434F). Todas las posibles combinaciones de las mutaciones del dominio Fc anteriores y otras mutaciones dentro de los dominios variables de los anticuerpos divulgados en el presente documento, se contemplan dentro del alcance de la presente invención.

Bioequivalentes

En el presente documento se proporcionan moléculas de unión a antígeno que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de las moléculas ilustrativas divulgadas en el presente documento pero que retienen la capacidad de unirse al mismo antígeno o antígenos. Dichas moléculas variantes pueden comprender una o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia original, pero presentan actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas descritas.

La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno que son bioequivalentes a cualquiera de las moléculas de unión a antígeno ilustrativas expuestas en el presente documento. Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, ya sea en una única dosis o en múltiples dosis. Algunas proteínas de unión a antígeno se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción, pero no en su velocidad de absorción y, sin embargo, pueden considerarse bioequivalentes porque tales diferencias en la velocidad de absorción son intencionales y se reflejan en el marcaje, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, p. ej., el uso crónico, y se consideran médicamente irrelevantes para el fármaco estudiado en concreto.

En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente significativas en su seguridad, pureza y potencia.

En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.

En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan mediante un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la condición o condiciones de uso, en la medida en que se conozcan dichos mecanismos.

La bioequivalencia puede demostrarse por métodosin vivoein vitro.Las mediciones de bioequivalencia incluyen, p. ej., (a) un ensayoin vivoen seres humanos u otros mamíferos, en donde se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) un ensayoin vitroque se haya correlacionado con y es razonablemente predictivo de datos de biodisponibilidadin vivoen seres humanos; (c) un ensayoin vivoen seres humanos u otros mamíferos en que se mide el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) como una función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia, biodisponibilidad o bioequivalencia de una proteína de unión a antígeno.

Las variantes bioequivalentes de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas ilustrativas expuestas en el presente documento pueden construirse mediante, por ejemplo, la generación de diferentes sustituciones de restos o secuencias o la deleción de secuencias o restos terminales o internos no necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden delecionarse restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o remplazarse por otros aminoácidos, para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, las proteínas de unión a antígeno bioequivalentes pueden incluir variantes de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas ilustrativas expuestas en el presente documento que comprenden cambios de aminoácidos que modifican las características de glucosilación de las moléculas, p. ej., mutaciones que eliminan o retiran la glucosilación.

Unión de anticuerpos

Como se utiliza en el presente documento, el término "unión" en el contexto de la unión de un anticuerpo, inmunoglobulina, fragmento de unión al anticuerpo o proteína que contiene Fc a cualquiera, p. ej., un antígeno predeterminado, tal como una proteína de la superficie celular o un fragmento de la misma, se refiere normalmente a una interacción o asociación entre un mínimo de dos entidades o estructuras moleculares, tal como una interacción de anticuerpo y antígeno.

Por ejemplo, la afinidad de unión corresponde normalmente a un valor Kd de aproximadamente 10-7 M o menor, tal como de aproximadamente 10-8 M o menor, tal como de aproximadamente 10-9 M o menor cuando se determina, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR,Surface Plasmon Resonance)en un instrumento BIAcore 3000 que utiliza el antígeno como ligando y el anticuerpo, Ig, fragmento de unión a anticuerpo o proteína que contiene Fc como analito (o antiligando). Las estrategias de unión basadas en células, tales como los ensayos de unión por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS,Fluorescent-Activated Cell Sorting),también se utilizan de forma habitual, y los datos de FACS se correlacionan bien con los de otros métodos, tales como la unión por competición de radioligandos y la SPR (Benedict, CA, J Immunol Methods. 1997, 201(2):223-31; Geuijen, CA, et al. J Immunol Methods. 2005, 302(1-2):68-77).

Por consiguiente, el anticuerpo o la proteína de unión a antígeno proporcionado en el presente documento se une a antígeno predeterminado o molécula de la superficie celular (receptor) que tiene una afinidad correspondiente a un valor de K<d>que es al menos diez veces inferior a su afinidad por unirse a un antígeno no específico (p. ej., BSA, caseína). De acuerdo con la presente invención, la afinidad de un anticuerpo correspondiente a un valor de Kd que es igual a o inferior a diez veces menor que un antígeno no específico puede considerarse unión no detectable, sin embargo, dicho anticuerpo puede emparejarse con un segundo brazo de unión a antígeno para la producción de un anticuerpo biespecífico de la invención.

El término "K<d>"(M) se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción de anticuerpo y antígeno particular, o la constante de equilibrio de disociación de un anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo que se une a un antígeno. Existe una relación inversa entre K<d>y la afinidad de unión, por lo tanto cuanto menor es el valor de K<d>, más alta, es decir, más fuerte, será la afinidad. Por lo tanto, las expresiones "mayor afinidad" o "afinidad más fuerte" se refieren a una mayor capacidad para formar una interacción y, por lo tanto, un valor de Kd más pequeño y, por el contrario, las expresiones "menor afinidad" o "afinidad más débil" se refieren a una menor capacidad para formar una interacción y, por lo tanto, un valor de Kd más alto. En algunas circunstancias, una mayor afinidad de unión (o Kd) de una molécula particular (p. ej., anticuerpo) a su molécula asociada interactiva (p. ej., antígeno X) en comparación con la afinidad de unión de la molécula (p. ej., anticuerpo) a otra molécula asociada interactiva (p. ej., antígeno Y) puede expresarse como una relación de unión determinada mediante la división del valor de Kd más elevado (afinidad menor, o más débil) entre el valor de Kd más bajo (afinidad mayor, o más fuerte), por ejemplo, expresada como afinidad de unión 5 veces o 10 veces superior, según pueda ser el caso.

El término "kd"(s-1 o 1/s) se refiere a la constante de velocidad de disociación de una interacción de anticuerpo y antígeno particular o la constante de velocidad de disociación de un anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo. Dicho valor también se conoce como el valor koff.

El término "ka" (M-1 x s-1 o 1/M) se refiere a la constante de velocidad de asociación de una interacción de anticuerpo y antígeno particular, o la constante de velocidad de asociación de un anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo.

El término "K<a>"(M-1 o 1/M) se refiere a la constante de equilibrio de asociación de una interacción de anticuerpo y antígeno particular o la constante de equilibrio de asociación de un anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo. La constante de equilibrio de asociación se obtiene dividiendo la ka entre la kd.

El término "CE50" o "CE<50>" se refiere a la concentración eficaz semimáxima, que incluye la concentración de un anticuerpo que induce una respuesta a medio camino entre el valor inicial y el máximo después de un tiempo de exposición específico. La CE<50>representa esencialmente la concentración de un anticuerpo donde se observa el 50 % de su efecto máximo. En determinadas realizaciones, el valor de CE<50>es igual a la concentración de un anticuerpo de la invención que proporciona una unión semimáxima a las células que expresan CD3 o antígeno asociado a tumores (p. ej., CD123, STEAP2, CD20, PSMA, SSTR2, CD38, STEAP1, 5T4, ENPP3, MUC16 o BCMA), como se determina, por ejemplo, mediante un ensayo de unión FACS. Por lo tanto, se observa una unión reducida o más débil con un aumento de la CE<50>, o valor de concentración eficaz semimáxima.

En una realización, la unión disminuida de los anticuerpos multiespecíficos anti-CD3 puede definirse como un aumento de la concentración de anticuerpos CE<50>que permite la unión a la cantidad semimáxima de células diana.

En otra realización, el valor de CE<50>representa la concentración de un anticuerpo multiespecífico anti-CD3 de la invención que provoca el agotamiento semimáximo de las células diana mediante la actividad citotóxica de los linfocitos T. Por lo tanto, se observa un aumento de la actividad citotóxica (p. ej., destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T) con una disminución de la CE<50>, o el valor de concentración eficaz semimáxima.

Unión dependiente de pH

En algunas realizaciones, la presente invención incluye anticuerpos y moléculas multiespecíficas de unión a antígeno con características de unión dependientes del pH. Por ejemplo, un anticuerpo multiespecífico anti-CD3 de la presente invención puede presentar una unión reducida a CD3 a pH ácido en comparación con pH neutro. Como alternativa, los anticuerpos multiespecíficos anti-CD3 de la invención pueden presentar una unión mejorada a CD3 a pH ácido en comparación con pH neutro. La expresión "pH ácido" incluye valores de pH inferiores a aproximadamente 6,2, p. ej., aproximadamente 6,0, 5,95, 5,9, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1, 5,05, 5.0 o inferior. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "pH neutro" significa un pH de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 7,4. La expresión "pH neutro" incluye valores de pH de aproximadamente 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 y 7,4.

En determinados casos, "unión reducida... a pH ácido en comparación con un pH neutro" se expresa en términos de una relación del valor de K<d>del anticuerpo que se une a su antígeno a pH ácido respecto al valor de K<d>del anticuerpo que se une a su antígeno a pH neutro (o viceversa). Por ejemplo, un anticuerpo multiespecífico anti-CD3,o fragmento de unión a antígeno del mismo puede considerarse que presenta "unión reducida a CD3 a pH ácido en comparación con pH neutro" para los fines de la presente invención si el anticuerpo multiespecífico anti-CD3 o fragmento de unión a antígeno del mismo presenta una relación de K<d>ácido/neutro de aproximadamente 3,0 o superior. En determinadas realizaciones ilustrativas, la relación de K<d>ácido/neutro para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención puede ser aproximadamente 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 20,0. 25,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 100,0 o superior.

Los anticuerpos con características de unión dependientes del pH pueden obtenerse, p. ej., rastreando una población de anticuerpos para la unión reducida (o potenciada) a un antígeno particular a pH ácido en comparación con pH neutro. Adicionalmente, las modificaciones del dominio de unión a antígeno a la concentración de aminoácidos pueden producir anticuerpos con características dependientes del pH. Por ejemplo, mediante la sustitución de uno o más aminoácidos de un dominio de unión a antígeno (p. ej., dentro de una CDR) con un resto de histidina, puede obtenerse un anticuerpo con unión a antígeno reducida a pH ácido respecto a pH neutro.

Preparación de dominios de unión a antígeno y construcción de moléculas biespecíficas

Los dominios de unión a antígeno específicos para antígenos particulares pueden prepararse mediante cualquier tecnología generadora de anticuerpos conocida en la técnica. Una vez obtenidos, dos dominios de unión a antígeno diferentes, específicos de dos antígenos diferentes (p. ej., CD3 y un antígeno tumoral humano (p. ej., MUC16, BCMA, CD20, etc.)), se pueden disponer de manera adecuada entre sí para producir una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente invención utilizando métodos de rutina. En determinadas realizaciones, uno o más de los componentes individuales (p. ej., cadenas pesadas y ligeras) de las moléculas de unión a antígeno multiespecíficas de la invención se derivan de anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos. Los métodos para fabricar tales anticuerpos se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, una o más de las cadenas pesadas y/o ligeras de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención pueden prepararse usando la tecnología VELOCIMMUNE™. Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ (o cualquier otra tecnología de generación de anticuerpos humanos), se aíslan inicialmente anticuerpos quiméricos de alta afinidad frente a un antígeno particular (p. ej., CD3 o antígeno tumoral humano (p. ej., MUC16, BCMA, CD20, etc.) que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Los anticuerpos se caracterizan y se seleccionan para las características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se reemplazan con una región constante humana deseada para generar cadenas pesadas y/o ligeras completamente humanas que pueden incorporarse en las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención.

Los animales genéticamente modificados pueden usarse para producir moléculas de unión a antígeno biespecíficas humanas. Por ejemplo, puede usarse un ratón modificado genéticamente que es incapaz de reorganizar y expresar una secuencia variable de cadena ligera de inmunoglobulina endógena de ratón, en donde el ratón expresa solo uno o dos dominios variables de cadena ligera humana codificados por secuencias de inmunoglobulina humana unidas operativamente al gen constante<k>de ratón en el locus<k>de ratón endógeno. Tales ratones modificados genéticamente pueden usarse para producir moléculas de unión a antígeno biespecíficas completamente humanas que comprenden dos cadenas pesadas diferentes que se asocian a una cadena ligera idéntica que comprende un dominio variable procedente de uno de dos segmentos génicos de región variable de cadena ligera humana diferentes. (Véase, p. ej., el documento US 2011/0195454). Completamente humano se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno o dominio de inmunoglobulina del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN derivado de una secuencia humana en toda la longitud de cada polipéptido del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o dominio de inmunoglobulina del mismo. En algunos casos, la secuencia completamente humana deriva de una proteína endógena a un ser humano. En otros casos, la proteína o secuencia de proteína completamente humana comprende una secuencia quimérica en donde cada secuencia constituyente deriva de una secuencia humana. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, las proteínas o secuencias quiméricas generalmente están diseñadas para minimizar la creación de epítopos inmunogénicos en las uniones de las secuencias constituyentes, p. ej., en comparación con cualquier región o dominio de inmunoglobulina humana de tipo silvestre.

Antagonistas de CD40

En determinados aspectos, en el presente documento se proporcionan métodos para tratar el cáncer y/o inhibir la liberación de citocinas mediante la administración a un sujeto (p. ej., un sujeto que lo necesite) de un antagonista de CD40.

La expresión "antagonista de CD40" se refiere a cualquier agente que inhiba o bloquee un efecto mediado por CD40. Puede ser una molécula pequeña, un anticuerpo, un oligonucleótido antisentido, un ARNip, un ARNhc, un ARNgu, un péptido, etc. En algunas realizaciones, el antagonista de CD40 es un anticuerpo (p. ej., un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno) que se une a CD40. Por efecto "antagonista" del anticuerpo anti-CD40 se entiende el efecto de inhibir la unión del CD40 expresado en la superficie de células tales como los linfocitos B, células tumorales, o células dendríticas con sus ligandos o el efecto de neutralizar uno o más de las influencias de los ligandos de CD40 en las células que expresan CD40. Por "anticuerpo antagonista" se entiende un anticuerpo que tiene tales efectos. Un ejemplo de las influencias sobre las células que expresan CD40 incluye la supresión del crecimiento de linfocitos B o la supresión de la producción de anticuerpos.

En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista de CD40 (p. ej., un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno) se dirige al receptor CD40 e interfiere con la señalización de c D40, en particular las vías de señalización de CD40 que están mediadas por la interacción de CD40 con el ligando de CD40 (CD40L). La expresión "antígeno CD40", "antígeno de superficie celular CD40", "receptor de CD40", o "CD40" se refiere a una glicoproteína transmembrana que pertenece a la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) (véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. números 5.674.492 y 4.708.871; Stamenkovic et al. (1989) EMO 8:1403; Clark (1990) Tissue Antigens 36:33; Barclay et al. (1997) The Leucocyte Antigen Facts Book (2d ed.; Academic Press, San Diego)). Se han identificado al menos seis isoformas de CD40 humano, codificadas por variantes de transcripción de corte y empalme alternativo de este gen, (NM_001250.6 y NP_001241.1; NM_001302753.2 y NP_001289682.1; NM_001322421.2 y NP_001309350.1; NM_001322422.2 y NP_001309351.1; NM_001362758.2 y NP_001349687.1; y NM_152854.4 y NP_690593.1). Para los fines de la presente invención, la expresión "antígeno CD40", "antígeno de superficie celular CD40", "receptor de CD40", o "CD40" engloba todas las isoformas de CD40.

El antígeno CD40 puede presentarse en la superficie de diversos tipos de células, como se describe en cualquier otra parte del presente documento. Las expresiones "presentado en la superficie" y "expresado en la superficie" se refieren a casos en los que todo o parte del antígeno CD40 está expuesto al exterior de la célula. El antígeno CD40 presentado o expresado puede estar total o parcialmente glicosilado.

Por "actividad antagonista" está previsto que la sustancia funcione como un antagonista. Un antagonista de CD40 impide o reduce la inducción de cualquiera de las respuestas inducidas por la unión del receptor CD40 a un ligando agonista, concretamente CD40L. El antagonista puede reducir la inducción de cualquiera de una o más de las respuestas a la unión del agonista en un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, preferentemente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, más preferentemente 70 %, 80 %, 85 %, y lo más preferentemente 90 %, 95 %, 99 % o 100 %. Los métodos para medir la especificidad de unión del ligando CD40 y la actividad antagonista de un agente terapéutico anti-CD40, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD40, son conocidos en la técnica, e incluyen, pero sin limitación, ensayos estándar de unión competitiva, ensayos para controlar la secreción de inmunoglobulinas por los linfocitos B, ensayos de proliferación de linfocitos B, ensayos de proliferación de linfocitos B de tipo Banchereau, ensayos de linfocitos T cooperadores para la producción de anticuerpos, ensayos de coestimulación de la proliferación de linfocitos B y ensayos de regulación al alza de marcadores de activación de linfocitos B. Véase, por ejemplo, tales ensayos divulgados en los documentos WO 00/75348 y patente de EE. UU. n.° 6.087.329. Véanse también, solicitudes provisionales tituladas "Anticuerpos monoclonales antagonistas anti-CD40 y métodos para usarlos", presentadas el 4 de noviembre de 2003, 26 de noviembre de 2003, y 27 de abril de 2004, y las solicitudes de patente de EE. UU. n.° 60/517.337, 60/525.579 y 60/565.710, respectivamente y la solicitud de patente internacional n.° PCT/US2004/037152, titulada también "Anticuerpos monoclonales antagonistas anti-CD40 y métodos para usarlos", presentada el 4 de noviembre de 2004, y publicada como WO 2005/044854).

Cualquiera de los ensayos conocidos en la técnica puede usarse para determinar si un anticuerpo anti-CD40 actúa como antagonista de una o más respuestas de linfocitos B. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD40 actúa como antagonista de al menos una respuesta de linfocitos B seleccionada del grupo que consiste en la proliferación de linfocitos B, diferenciación de linfocitos B, producción de anticuerpos, adhesión intercelular, generación de memoria de linfocitos B, cambio de isotipo, regulación al alza de la expresión en la superficie celular de MHC Clase II y CD80/86, y secreción de citocinas proinflamatorias tales como IL-8, IL-12 y TNF. De particular interés son los anticuerpos anti-CD40 antagonistas libres de actividad agonista significativa con respecto a la proliferación de linfocitos B cuando se unen al antígeno CD40 humano en la superficie de un linfocito B humano.

El término "ligando CD40" incluye cualquier péptido, polipéptido o proteína que pueda unirse a una o más vías de señalización CD40 y activarlas. Por lo tanto, "ligandos de CD40" incluye, pero sin limitación, proteínas ligando de CD40 de longitud completa y variantes y fragmentos de las mismas que conservan actividad suficiente para llevar a cabo la función de unirse a la señalización de CD40 y estimularla en células que expresan CD40. Las modificaciones de un ligando de CD40 nativo, por ejemplo, ligando de CD40 humano (CD40L; también conocido como CD154), incluyen, pero sin limitación, sustituciones, deleciones, truncamientos, extensiones, proteínas de fusión, fragmentos, peptidomiméticos y similares. En algunas realizaciones de la invención, un ensayo para evaluar la actividad biológica de un anticuerpo anti-CD40 antagonista incluye el uso de CD40L soluble, por ejemplo, CD40L humano recombinante soluble (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, Reino Unido) para estimular la señalización CD40 en las células que expresan CD40.

"Señalización de CD40 mediada por CD40L" se refiere a cualquiera de las actividades biológicas que resultan de la interacción del receptor CD40 de la superficie celular con un ligando de CD40. Ejemplos de señalización de CD40 son las señales que conducen a la proliferación y supervivencia de las células que expresan CD40, y la estimulación de una o más vías de señalización de CD40 dentro de las células que expresan CD40. Por "vía de señalización" o "vía de transducción de señales" de CD40 se entiende al menos una reacción bioquímica o un grupo de reacciones bioquímicas, que resulta de la interacción del receptor CD40 con un ligando de CD40, por ejemplo, CD40L, y que genera una señal que, cuando se transmite por la vía de señalización, conduce a la activación de una o más moléculas de la cascada de señalización. Las vías de transducción de señales implican una serie de moléculas de transducción de señales que conducen a la transmisión de una señal desde el receptor CD40 de la superficie celular a través de la membrana plasmática de una célula, y a través de una o más en una serie de moléculas de transducción de señales, a través del citoplasma de la célula y, en algunos casos, hasta el núcleo de la célula. Las vías de transducción de señales de CD40 incluyen, por ejemplo, la vía de señalización AKT, que conduce a la activación de AKT y, en última instancia, a la activación de NF-kB a través de la vía de señalización NF-kB; y las vías de señalización de la proteína cinasa activada por mitógenos (MAPK), incluida la vía de señalización MEK/ERK y la vía de señalización MEK/p38, que conducen a la activación de ERK y p38, respectivamente. El equilibrio entre la activación y el bloqueo de estas vías de señalización favorece la supervivencia celular o la apoptosis.

En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista de CD40 es un anticuerpo monoclonal. En determinadas realizaciones, el anticuerpo antagonista de CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo es quimérico, humanizado, compuesto, murino o humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo antagonista de CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona de Fv, Fav, F(ab')2), Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, y fragmentos de diacuerpos.

Los anticuerpos antagonistas de CD40 proporcionados en el presente documento incluyen, pero sin limitación, p. ej., iscalimab (también conocido como CFZ533) divulgado en Kahaly et al. (2019) J. Endocr. Sco.

3:doi.org/10.1210/js.2019-OR19-6, Fisher et al. (2017) Arthritis Rheumatol. 69:1784, Farkash et al. (2019) Am. J. Transplant. 19:632, y la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2012/075111A1; ravagalimab (también conocido como ABBV-323) divulgado en la publicación de solicitud internacional de patente n.° WO 2016/196314A1; BI 655064 divulgado en Visvannathan et al. (2016) Arthritis Rheumatol. 68:1588); bleselumab (también conocido como ASKP1240 o 341G2) divulgado en Anil et al. (2018) Biopharm. Drug Dispos. 39:245-255, Harland et al. (2017) Am. J. Transplant. 17:159-171, y en la patente de EE. UU. n.° 8.716.451B2; ch5D12 divulgado en Kasran et al. (2005) Aliment. Pharmacol. Ther. 22:111-122; lucatumumab (también conocido como HCD122 o CHIR-12.12) divulgado en Bensinger et al. (2012) British J. Haematology 159:58-66, Byrd et al. (2012) Leuk. Lymphoma 53:10.3109/10428194.2012.681655 y en la solicitud de patente internacional n.° PCT/US2004/037152; CHlR-5.9 divulgado en la solicitud de patente internacional n.° PCT/S2004/037152; 201A3 divulgado en Perper et al. (2019) J. Immunol. 203:58-75; KPL-404 divulgado en el ensayo clínico NCT04497662 patrocinado por Kiniksa Pharmaceuticals, Ltd.; PG102 divulgado en Bankert et al. (2015) J. Immunol. 194:4319-4327 y en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2001/024823A1; y BIIB063 divulgado en Musselliet al.(2017) 2017 ACR/ARHP Annual Meeting Abstracts.

Anticuerpos antagonistas de CD40 adicionales útiles en ciertas realizaciones de los métodos y composiciones del presente documento se divulgan en, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional números WO 02/11763A1, WO 02/28481A9, WO 03/045978A3, WO 03/029296A1, WO 03/028809A1, WO 2005/044854, WO 2006/073443A3, WO 2007/124299A8, WO 2011/123489A3, WO 2016/196,314A1, WO 2017/040566A1, WO 2017/060242A1, WO 2018/217976A1, WO2019/156565A1, WO 2020/144605A1, WO 2020/106620A1 y WO 2020/006347A1, publicación de solicitud de patente de EE. UU. números US 2020/0291123A1, US 2017/0158771A1 y US 2008/0057070A1 o patentes de EE. UU. n.° US 9.125.893B2, US 8.669.352B2 y US 9.598.494B2.

Los anticuerpos antagonistas anti-CD40 divulgados en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que proceden los anticuerpos. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles, por ejemplo, en bases de datos públicas de secuencias de anticuerpos. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que proceden de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que procede el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en conjunto en el presente documento "mutaciones de la línea germinal"). Un experto en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera desveladas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. En determinadas realizaciones, todos los restos de la región marco y/o CDR dentro de los dominios Vhy/o Vlretromutan a los restos encontrados en la secuencia de la línea germinal original de la que se obtuvo el anticuerpo. En otras realizaciones, únicamente determinados restos se retromutan a la secuencia de la línea germinal original, p. ej., únicamente los restos mutados encontrados dentro de los 8 primeros aminoácidos de FR1 o dentro de los 8 últimos aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otras realizaciones, uno o más del resto o los restos de la región marco y/o de la CDR están mutados al resto o los restos correspondientes de una secuencia de la línea germinal diferente (es decir, una secuencia de la línea germinal diferente que es diferente de la secuencia de la línea germinal de la que derivó originariamente el anticuerpo). Asimismo, los anticuerpos de la presente invención pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, p. ej., en donde determinados restos individuales mutan al resto correspondiente de una secuencia de la línea germinal particular, mientras que otros restos determinados, que difieren de los de la secuencia de la línea germinal original, se mantienen o mutan al resto correspondiente de una secuencia de línea germinal distinta. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden probarse fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, aumento de la unión (p. ej., medido por valoración de unión celular o unión FACS) o afinidad de unión (p. ej., K<d>), propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), inmunogenicidad reducida, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general están abarcados en la presente invención.

En el presente documento se proporcionan también anticuerpos antagonistas anti-CD40 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos antagonistas anti-CD40 o anticuerpos multiespecíficos (p. ej., biespecíficos o triespecíficos) anti-CD3 que tienen HCVR, LCVR y/o CDR con, p. ej., 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservativas de aminoácidos respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR divulgadas en el presente documento.

Linfocitos T-CAR que expresan el antagonista de CD40

En determinados aspectos, los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento se refieren a células inmunoefectoras (p. ej., linfocitos T-CAR) que están modificadas genéticamente para expresar un antagonista de CD40 (p. ej., un antagonista de CD40 proporcionado en el presente documento). En algunas realizaciones, el linfocito T-CAR secreta el antagonista de CD40. En determinadas realizaciones, el antagonista de CD40 es un scFv o Fab. En algunas realizaciones, el linfocito T-CAR expresa el antagonista de CD40 cuando se activa. Los métodos para generar linfocitos T-CAR que secretan un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo se divulgan en, p. ej., Choi et al. (2019) Nature Biotechnology 37:1049-1058, que se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad.

Los linfocitos T-CAR son linfocitos T modificados genéticamente para expresar un polipéptido de receptor quimérico para el antígeno (CAR). Los CAR son receptores que comprenden una fracción diana de direccionamiento asociada a uno o más dominios de señalización y/o dominios coestimuladores en una única molécula de fusión. En determinadas realizaciones, la fracción de unión de un CAR comprende un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo monocatenario (scFv), que comprende los fragmentos variables de la cadena ligera y pesada de un anticuerpo monoclonal unidos mediante un enlazador flexible. En determinadas realizaciones, la fracción de unión comprende además los dominios transmembrana y bisagra de un anticuerpo monoclonal. En determinadas realizaciones, el dominio de unión y/o el dominio extracelular de un CAR proporcionado en el presente documento proporciona al CAR la capacidad de unirse a antígeno diana de interés (p. ej., un antígeno tumoral).

Un "dominio de transducción de señales" o "dominio de señalización" de un CAR, como se utiliza en el presente documento, es responsable de la señalización intracelular después de la unión de un dominio de unión a ligando extracelular con la diana, lo que da como resultado la activación de la célula inmunitaria y de la respuesta inmunitaria. Dicho de otro modo, el dominio de transducción de señales es responsable de la activación o inactivación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se expresa el CAR. Por ejemplo, la función efectora de un linfocito T puede ser una actividad citolítica o actividad cooperadora incluyendo la secreción de citocinas. Por lo tanto, la expresión "dominio de transducción de señales" se refiere a la parte de una proteína que transduce la señal efectora a señal funcional y dirige la célula para realizar una función especializada. Los ejemplos de dominios de transducción de señales para su uso en un CAR pueden ser las secuencias citoplasmáticas del receptor y correceptores de linfocitos T que actúan en sintonía para iniciar la transducción de la señal después de la interacción con el receptor antigénico, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional. En algunos casos, los dominios de señalización comprenden dos clases distintas de secuencias de señalización citoplasmáticas, las que inician la activación primaria dependiente de antígeno y las que actúan de una manera dependiente de antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora. Las secuencias de señalización citoplasmática primaria pueden comprender motivos de señalización que se conocen como motivos de activación inmunorreceptores basados en tirosina o ITAM. Los ITAM son motivos de señalización bien definidos hallados en la cola intracitoplasmática de una diversidad de receptores que actúan como sitios de unión para tirosina cinasas de clase syk/zap70. Como ITAM ilustrativos se incluyen los que proceden de TCRZ, F<c>R<y>, FcRp, FcR£, CD3<y>, CD35, CD3£,<c>D5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d.

En algunas realizaciones, las células se obtienen del sujeto a tratar (es decir, son autólogas). Sin embargo, en determinadas realizaciones, se usan líneas de células inmunoefectoras o células efectoras de donantes (alogénicas).

Las células inmunoefectoras se pueden obtener de varias fuentes, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglio linfático, sangre del cordón umbilical, tejido de timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. Las células inmunoefectoras pueden obtenerse de la sangre recogida de un sujeto utilizando cualquiera de las técnicas conocidas por el experto, tal como la separación de Ficoll™. Por ejemplo, las células de la sangre circulante de un individuo pueden obtenerse mediante aféresis. En algunas realizaciones, las células inmunoefectoras se aíslan de los linfocitos de la sangre periférica lisando los glóbulos rojos y eliminando los monocitos, por ejemplo, por centrifugación mediante un gradiente PERCOLL™ o por elutriación centrífuga a contracorriente. Una subpoblación específica de células inmunoefectoras puede aislarse adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, las células inmunoefectoras pueden aislarse utilizando una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie exclusivos de las células seleccionadas positivamente, p. ej., mediante incubación con perlas conjugadas con anticuerpos durante un periodo de tiempo suficiente para la selección positiva de las células inmunoefectoras deseadas. Como alternativa, el enriquecimiento de la población de células inmunoefectoras puede lograrse mediante selección negativa utilizando una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie exclusivos de las células seleccionadas negativamente.

La presente divulgación proporciona métodos para fabricar las células inmunoefectoras que expresan los CAR y los antagonistas de CD40 descritos en el presente documento. En una realización, el método comprende transfectar o transducir células inmunoefectoras aisladas de un sujeto, tal como un sujeto que tiene una célula tumoral que expresa PIG y/o antígeno de cáncer de baja densidad, de tal manera que las células inmunoefectoras expresen uno o más CAR y antagonista de CD40 como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, las células inmunoefectoras se aíslan de un individuo y se modifican genéticamente sin manipulación adicionalin vitro.Después, dichas células se pueden volver a administrar directamente al individuo. En realizaciones adicionales, las células inmunoefectoras se activan y estimulan primero para que proliferenin vitroantes de modificarse genéticamente para expresar un CAR y un antagonista de CD40. En este sentido, las células inmunoefectoras pueden cultivarse antes o después de ser modificadas genéticamente (es decir, transducidas o transfectadas para expresar un CAR o un antagonista de CD40 como se describe en el presente documento).

Antes de la manipulación o modificación genéticain vitrode las células inmunoefectoras descritas en el presente documento, la fuente de células puede obtenerse de un sujeto. En particular, las células inmunoefectoras para su uso con los CAR y los antagonistas de CD40 descritos en el presente documento comprenden linfocitos T. Los linfocitos T se pueden obtener de varias fuentes, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En determinadas realizaciones, los linfocitos T se pueden obtener de una unidad de sangre recogida de un sujeto utilizando cualquier serie de técnicas conocidas por el experto en la materia, tal como separación por FICOLL. En una realización, las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen mediante aféresis. El producto de aféresis normalmente contiene linfocitos, incluyendo linfocitos T, monocitos, granulocitos, linfocitos B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En una realización, las células recogidas por aféresis se pueden lavar para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio adecuado para el posterior procesamiento. En una realización, las células se lavan con PBS. En una realización alternativa, la solución lavada carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos, si no todos, cationes divalentes. Como apreciarán los expertos en la materia, una etapa de lavado se puede realizar mediante métodos conocidos por los expertos en la materia, tal como usando una centrífuga de flujo semiautomática. Después del lavado, las células pueden resuspenderse en una variedad de tampones biocompatibles u otra solución salina con o sin tampón. En determinadas realizaciones, los componentes no deseados de la muestra de aféresis pueden eliminarse en el medio de cultivo resuspendido directamente de las células.

En determinadas realizaciones, los linfocitos T se aíslan de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) causando la lisis de glóbulos rojos y el empobrecimiento de monocitos, por ejemplo, por centrifugación mediante un gradiente Ficoll-Paque™. Una subpoblación específica de linfocitos T, tal como linfocitos T CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y CD45RO+ T, puede aislarse adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, el enriquecimiento de una población de linfocitos T mediante selección negativa se puede lograr con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie exclusivos de las células seleccionadas negativamente. Un método para usar en el presente documento es la clasificación y/o selección de células mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de la superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para el enriquecimiento de linfocitos CD4+ por selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales normalmente incluye anticuerpos contra CD14, Cd 20, CD1 b, CD16, HLA-DR y CD8. La citometría de flujo y la clasificación celular también pueden usarse para aislar poblaciones celulares de interés.

Las CMSP pueden utilizarse directamente para la modificación genética con los CAR y los antagonistas de CD40 utilizando los métodos descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, después del aislamiento de las CMSP, los linfocitos T también se aíslan y, en determinadas realizaciones, tanto los linfocitos T citotóxicos como los linfocitos T cooperadores pueden clasificarse en subpoblaciones de linfocitos T indiferenciados, de memoria y efectores antes o después de la modificación y/o expansión genética. Los linfocitos CD8+ pueden obtenerse mediante métodos estándar. En algunas realizaciones, los linfocitos CD8+ también se clasifican en linfocitos indiferenciados, de memoria central y efectores mediante la identificación de antígenos de superficie celular que están asociados a cada uno de estos tipos de linfocitos CD8+. En realizaciones, los linfocitos T de memoria están presentes en los subconjuntos CD62L+ y CD62L- de linfocitos CD8+ de sangre periférica. Las CMSP se clasifican en fracciones CD62L-CD8+ y CD62L+CD8+ después de la tinción con anticuerpos anti-CD8 y anti-CD62L. En algunas realizaciones, la expresión de marcadores fenotípicos de TCM de memoria central incluye CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 y CD127 y son negativos para la granzima B. En algunas realizaciones, los linfocitos T de memoria central son linfocitos T CD45RO+, CD62L+ y CD8+. En algunas realizaciones, los linfocitos T efectores son negativas para CD62L, CCR7, CD28 y CD127, y positivos para la granzima B y la perforina. En algunas realizaciones, los linfocitos T CD8+ indiferenciados se caracterizan por la expresión de marcadores fenotípicos de linfocitos T indiferenciados, incluyendo CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD 127 y CD45RA.

En determinadas realizaciones, los linfocitos T CD4+ también se clasifican en subpoblaciones. Por ejemplo, los linfocitos T CD4+ cooperadores pueden clasificarse en linfocitos indiferenciados, de memoria central y efectores mediante la identificación de poblaciones celulares que tienen antígenos de superficie celular. Los linfocitos CD4+ se pueden obtener mediante métodos convencionales. En algunas realizaciones, los linfocitos T CD4+ indiferenciados son linfocitos T CD45RO-, CD45RA+, CD62L+CD4+. En algunas realizaciones, los linfocitos CD4+ de memoria central son positivos para CD62L y positivos para CD45RO. En algunas realizaciones, los linfocitos CD4+ efectores son negativos para CD62L y CD45RO.

Las células inmunoefectoras, tales como los linfocitos T, pueden modificarse genéticamente después de su aislamiento mediante métodos conocidos, o las células inmunoefectoras pueden activarse y expandirse (o diferenciarse en el caso de que sean progenitoras)in vitroantes de modificarse genéticamente. En otra realización, las células inmunoefectoras, tales como los linfocitos T, se modifican genéticamente con los receptores quiméricos para el antígeno descritos en el presente documento (p. ej., transducidos con un vector vírico que comprende un ácido nucleico que codifica un CAR o un antagonista de CD40) y a continuación se activan y expandenin vitro.En la técnica se conocen métodos para activar y expandir linfocitos T y se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. números 6.905.874; 6.867.041; 6.797.514 y en el documento WO2012079000. Generalmente, dichos métodos incluyen poner en contacto CMSP o linfocitos T aislados con un agente estimulador y un agente coestimulador, tales como anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, generalmente unidos a una perla u otra superficie, en un medio de cultivo con citocinas apropiadas, tales como la IL-2 (p. ej., IL-2 humana recombinante). Los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos a la misma perla sirven como célula presentadora de antígeno (CPA) "sustituta". En otras realizaciones, los linfocitos T pueden activarse y estimularse para que proliferen con células alimentadoras y anticuerpos y citocinas apropiados usando métodos tales como los descritos en las patentes de EE. UU. números 6.040.177; 5.827.642; y en el documento WO2012129514.

En algunas realizaciones, las células inmunoefectoras comprenden cualquier leucocito implicado en la defensa del cuerpo contra enfermedades infecciosas y materiales extraños. Por ejemplo, las células inmunoefectoras pueden comprender linfocitos, monocitos, macrófagos, células dendríticas, mastocitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, las células inmunoefectoras pueden comprender linfocitos T, preferentemente linfocitos T citotóxicos (LTC).

Los linfocitos T cooperadores (linfocitos T<h>) ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunológicos, incluyendo la maduración de linfocitos B en células plasmáticas y linfocitos B de memoria y la activación de linfocitos T citotóxicos y macrófagos. Estas células también se conocen como linfocitos T CD4+ porque expresan la glucoproteína CD4 en su superficie. Los linfocitos T colaboradores se activan cuando las moléculas del MHC de clase II les presentan antígenos peptídicos, que se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígeno (CPA). Una vez activadas, se dividen rápidamente y secretan pequeñas proteínas llamadas citocinas que regulan o ayudan en la respuesta inmunitaria activa. Estas células pueden diferenciarse en uno de varios subtipos, incluyendo T<h>1, T<h>2, T<h>3, T<h>17, T<h>9 o T<fh>, que secretan diferentes citocinas para facilitar un tipo diferente de respuesta inmunitaria.

Los linfocitos T citotóxicos (linfocitos Tc o LTC) destruyen las células infectadas por virus y las células tumorales, y también están implicados en el rechazo de trasplantes. Estas células también se conocen como linfocitos T CD8+ dado que expresan la glucoproteína CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus dianas al unirse a antígeno asociado con moléculas de MHC de clase I, que están presentes en la superficie de todas las células nucleadas. A través de IL-10, la adenosina y otras moléculas secretadas por los linfocitos T reguladores, los linfocitos CD8+ pueden inactivarse a un estado anérgico, que previene enfermedades autoinmunitarias.

Los linfocitos T de memoria son un subconjunto de linfocitos T específicos de antígeno que persisten a largo plazo después de que se resuelve una infección. Se expanden rápidamente hasta formar un gran número de linfocitos T efectores tras la reexposición a su antígeno afín, proporcionando de esta manera al sistema inmunitario "memoria" contra infecciones pasadas. Los linfocitos de memoria pueden ser CD4+ o CD8+. Los linfocitos T de memoria típicamente expresan la proteína de la superficie celular CD45RO.

Los linfocitos T reguladores (linfocitos Treg), anteriormente conocidos como linfocitos T supresores, son cruciales para el mantenimiento de la tolerancia inmunitaria. Su función principal es detener la inmunidad mediada por linfocitos T hacia el final de una reacción inmunitaria y suprimir linfocitos T autorreactivos que escaparon al proceso de selección negativa en el timo. Se han descrito dos clases principales de linfocitos Treg CD4+, los linfocitos Treg naturales y los linfocitos Treg adaptativos.

Los linfocitos T citolíticos naturales (NKT) (no confundir con los linfocitos citolíticos naturales (NK)) sirven de puente entre el sistema inmunitario adaptativo y el innato. A diferencia de los linfocitos T convencionales, que reconocen antígenos peptídicos presentados por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), Los linfocitos NKT reconocen el antígeno glicolípido presentado por una molécula denominada CD1d.

En algunas realizaciones, los linfocitos T comprenden una mezcla de linfocitos CD4+. En otras realizaciones, los linfocitos T están enriquecidos para uno o más subconjuntos basados en la expresión de la superficie celular. Por ejemplo, en algunos casos, los linfocitos T comprenden linfocitos T CD8+ citotóxicos.

Los linfocitos citolíticos naturales (NK) son linfocitos CD56+CD3- granulares que pueden eliminar células infectadas por virus y transformadas, y constituyen un subconjunto celular crítico del sistema inmunitario innato (Godfrey J, et al. Leuk Lymphoma 2012 53:1666-1676). A diferencia de los linfocitos T citotóxicos CD8+, Los linfocitos citolíticos naturales lanzan citotoxicidad contra las células tumorales sin necesidad de sensibilización previa, y pueden erradicar las células MHC-I negativas (Narni-Mancinelli E, et al. Int Immunol 2011 23:427-431). Los linfocitos citolíticos naturales son células efectoras más seguras, ya que pueden evitar las complicaciones potencialmente letales de las tormentas de citocinas (Morgan RA, et al. Mol Ther 2010 18:843-851), síndrome de lisis tumoral (Porter DL, et al. N Engl J Med 2011 365:725-733), y los efectos en la diana, y efectos extratumorales.

Moléculas de unión a antígeno CD3 multiespecíficas

En determinadas realizaciones, los métodos y composiciones del presente documento se refieren a moléculas de unión al antígeno CD3 (es decir, moléculas de unión a antígeno que comprenden al menos un dominio de unión a antígeno que se une a CD3). En determinadas realizaciones, las moléculas multiespecíficas de unión al antígeno CD3 proporcionadas en el presente documento comprenden además un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno de cáncer (es decir, un antígeno expresado en una célula cancerosa). En determinadas realizaciones, las moléculas multiespecíficas de unión al antígeno CD3 proporcionadas en el presente documento comprenden además un dominio de unión a antígeno que se une a un receptor coestimulador (p. ej., CD28).

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula de unión a antígeno multiespecífica" se refiere a una proteína, un polipéptido o un complejo molecular que comprende al menos un primer dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, cada dominio de unión a antígeno dentro de la molécula de unión a antígeno multiespecífica comprende al menos una CDR que sola, o junto con una o más CDR y/o FR adicionales, se une específicamente a un antígeno particular. En el contexto de la presente invención, el primer dominio de unión a antígeno se une específicamente a un primer antígeno (p. ej., CD3), y el segundo dominio de unión a antígeno se une específicamente a un segundo antígeno distinto (p. ej., un antígeno tumoral).

En algunas realizaciones, la molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 es un anticuerpo multiespecífico anti-CD3. Los anticuerpos multiespecíficos anti-CD3 proporcionados en el presente documento pueden ser, por ejemplo, bi-específicos o tri-específicos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, p. ej., Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos anti-CD3 biespecíficos proporcionados en el presente documento pueden unirse o coexpresarse con otra molécula funcional, p. ej., otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse funcionalmente (p. ej., mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión o especificidad de unión adicional.

El término "CD3", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un antígeno que se expresa en linfocitos T como parte del receptor multimolecular de linfocitos T (TCR) y que consiste en un homodímero o heterodímero formado a partir de la asociación de dos de las cuatro cadenas receptoras: CD3-épsilon, CD3-delta, CD3-zeta y CD3-gamma. La CD3-épsilon humana comprende la secuencia de aminoácidos según se establece en la SEQ ID NO: 116 de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0024356A1; la CD3-delta humana comprende la secuencia de aminoácidos según se establece en la SEQ ID NO: 117 de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0024356A1; la CD3-zeta humana comprende la secuencia de aminoácidos según se establece en la SEQ ID NO: 118 de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0024356A1; y la CD3-gamma comprende la secuencia de aminoácidos según se establece en la SEQ ID NO: 119 de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0024356A1.Todas las referencias a proteínas, polipéptidos y fragmentos de proteína en el presente documento pretenden referirse a la versión humana de la proteína, polipéptido o fragmento de proteína respectiva a menos que se especifique explícitamente como de una especie no humana. Por lo tanto, la expresión "CD3" significa CD3 humano a menos que se especifique que proviene de una especie no humana, p. ej., "CD3 de ratón", "CD3 de mono", etc.

Como se utiliza en el presente documento, "un anticuerpo que se une a CD3" o un "anticuerpo anti-CD3" incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen específicamente una subunidad<c>D3 única (p. ej., épsilon, delta, gamma o zeta), así como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen específicamente un complejo dimérico de dos subunidades CD3 (p. ej., dímeros de CD3 gamma/épsilon, delta/épsilon y zeta/zeta). Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente invención pueden unirse a CD3 soluble y/o CD3 expresado en la superficie celular. CD3 soluble incluye proteínas CD3 naturales, así como variantes de proteínas CD3 recombinantes tales como, p. ej., construcciones CD3 monoméricas y diméricas, que carecen de un dominio transmembrana o que están de otra manera no asociadas con una membrana celular.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "CD3 expresado en la superficie celular" significa una o más proteínas CD3 que se expresan en la superficie de una célulain vitrooin vivo,de modo que al menos una parte de una proteína<c>D3 está expuesta al lado extracelular de la membrana celular y es accesible a una parte de unión a antígeno de un anticuerpo. "CD3 expresado en la superficie celular" incluye proteínas CD3 contenidas dentro del contexto de un receptor de linfocitos T funcional en la membrana de una célula. CD3 expresado en la superficie celular incluye la proteína CD3 expresada como parte de un homodímero o heterodímero en la superficie de una célula (p. ej., dímeros de CD3 gamma/épsilon, delta/épsilon y zeta/zeta). CD3 expresado en la superficie celular también incluye una cadena de CD3 (p.ej., CD3-épsilon, CD3-delta o CD3-gamma) que se expresa por sí misma, sin otros tipos de cadenas de CD3, en la superficie de una célula. Un CD3 expresado en la superficie celular puede comprender o consistir en una proteína CD3 expresada en la superficie de una célula que normalmente expresa la proteína CD3. Como alternativa, CD3 expresado en la superficie celular puede comprender o consistir en una proteína CD3 expresada en la superficie de una célula que normalmente no expresa c D3 humano en su superficie pero que se ha manipulado de manera artificial para expresar CD3 en su superficie.

En algunas realizaciones, la presente invención incluye anticuerpos biespecíficos en donde un brazo de una inmunoglobulina se une a CD3, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para un antígeno de cáncer (también se denomina en el presente documento antígeno tumoral o "TAA"). En algunas realizaciones, la presente invención incluye anticuerpos triespecíficos en donde un primer brazo de una inmunoglobulina se une a CD3, un segundo brazo de la inmunoglobulina es específico para un antígeno tumoral, y un tercer brazo de la inmunoglobulina se une a un antígeno adicional de linfocitos T (p. ej., CD28) o a un antígeno tumoral adicional.

En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD3 puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR divulgadas en los documentos WO 2014/047231 o WO 2017/053856. En determinadas realizaciones, el brazo de unión a CD3 se une a CD3 humano e induce la activación de linfocitos T humanos. En determinadas realizaciones, el brazo de unión a CD3 se une de forma débil al CD3 humano e induce la activación de linfocitos T humanos. En otras realizaciones, el brazo de unión a CD3 se une de forma débil a CD3 humano e induce la destrucción de células que expresan antígenos asociados a tumores en el contexto de un anticuerpo biespecífico o multiespecífico. En otras realizaciones, el brazo de unión a CD3 se une o se asocia de forma débil con CD3 humano y de macaco cangrejero (mono), sin embargo, la interacción de unión no es detectable mediante ensayosin vitroconocidos en la materia.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos o fragmentos de unión a antígeno para usar en la presente invención comprenden un brazo de unión a antígeno que se une a CD28, ICOS, HVEM, CD27, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, SLAM, CD2, 2B4, CD226, TIM1 o TIM2 para inducir la activación de los linfocitos T.

En determinadas realizaciones, la molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 comprende un dominio de unión a antígeno específico para un antígeno de cáncer. En determinadas realizaciones, el cáncer se selecciona de AIM-2, ALDH1A1, alfa-actinina-4, alfa-fetoproteína ("AFP"), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), BCMA, proteína de fusión BCR-ABL (b3a2), beta-catenina, BING-4,<c>A-125, CALCA, antígeno carcinoembrionario ("CEA"), CASP-5, CASP-8, CD20, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciclina D1, Ciclina-A1, proteína de fusión dek-can, DKK1, EFTUD2, Factor 2 de elongación, ENAH (hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, antígeno tumoral epitelial ("ETA"), proteína de fusión de ETV6-AML1, EZH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipicano-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, HAUS3, Hepsin, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralpha2, Carboxil esterasa intestinal, K-ras, Calicreína 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 también conocido como CCDC110, LAGE-1, Proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, Lengsina, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, enzima málica, mammaglobina-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloe, Midquina, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, MUC16, mucina, MUM-1, MUM-2, MUM-3, miosina, Miosina clase I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, polipéptido P, p53, PAP, PAX5, PBF, proteína de fusión pml-RARalfa, mucina epitelial polimórfica ("PEM"), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernina 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, STEAP2, survivina, proteína de fusión SYT-SSX1 o -SSX2, TAG-1, TAG-2, Telomerasa, TGF-betaRII, TPBG, TRAG3, Triosafosfato isomerasa, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirosinasa, tirosinasa ("TYR"), VEGF, WT1 y XAGE-1b/GAGED2a.

En algunas realizaciones, el antígeno de cáncer incluye ADAM 17, BCMA, CA-IX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CDH3, CEA, EphA2, EpCAM, ERBB2, ENPP3, EGFR, EGFR-vIII, FLT3, FOLR1, GD-2, glipicano-3, gpA33, GPNMB, GPRC5D, HER2, HER3, LMP1, LMP2A, MUC16, Mesotelina, PSMA, PSCA, RON, ROR1, ROR2, STEAP1, STEAP2, SSTR2, SSTR5, 5T4 y Trop-2. En algunas realizaciones, el antígeno tumoral puede ser CD19, CD123, STEAP2, CD20, SSTR2, CD38, STEAP<1>, 5T4, ENPP3, PSMA, MUC16, GPRC5D o BCMA.

En algunas realizaciones, el antígeno tumoral puede ser CD19, CD123, STEAP2, CD20, SSTR2, CD38, STEAP1, 5T4, ENPP3, PSMA, MUC16, GPRC5D o BCMA.

En algunas realizaciones, el antígeno del cáncer es CD20, MUC16, BCMA, PSMA o STEAP2.

CD20 es una fosfoproteína no glucosilada expresada en las membranas celulares de linfocitos B maduros. CD20 se considera un antígeno asociado a tumores de linfocitos B porque se expresa en más del 95 % de los linfomas no Hodgkinianos (NHL) de linfocitos B y otras neoplasias malignas de linfocitos B, pero está ausente en los linfocitos B precursores, células dendríticas y células plasmáticas. La proteína CD20 humana tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0129617.

MUC16 hace referencia a la mucina 16. MUC16 es una glucoproteína de membrana integral muy glucosilada de un solo dominio transmembrana que se expresa a una concentración alto en el cáncer de ovario. La secuencia de aminoácidos de MUC16 humana se expone en la SEQ ID NO: 1899 de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2018/0118848A1.

BCMA se refiere al antígeno de maduración de linfocitos B. El BCMA (también conocido como TNFRSF17 y CD269) es una proteína de la superficie celular expresada en células plasmáticas neoplásicas y desempeña un papel fundamental en la regulación de la maduración de los linfocitos B y en la diferenciación en células plasmáticas productoras de inmunoglobulina. La secuencia de aminoácidos de BCMA humano se muestra en la SEQ ID NO: 115 de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0024356. También se puede encontrar en el número de registro de GenBank NP_001183.2.

PSMA se refiere a antígeno prostático específico de membrana, también conocido como folato hidrolasa 1 (FOLH1). PSMA es una glucoproteína integral de membrana no desprendida que se expresa en gran medida en las células epiteliales de la próstata y es un marcador de la superficie celular para el cáncer de próstata. La secuencia de aminoácidos de PSMA humano se expone en la SEQ ID NO: 7 de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0129617.

STEAP2 se refiere a antígeno epitelial de próstata 2 de seis transmembrana. STEAP2 es una proteína integral que abarca seis transmembrana que se expresa en gran medida en las células epiteliales de la próstata y es un marcador de la superficie celular para el cáncer de próstata. STEAP2 es una proteína de 490 aminoácidos codificada por el gen STEAP2 ubicado en la región cromosómica 7q21 en seres humanos. La secuencia de aminoácidos de STEAP2 humano se expone en la SEQ ID NO: 9 de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0129617.

En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico anti-CD3 puede ser un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD19, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xGPRC5D, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD123, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xSTEAP2, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD20, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xSSTR2, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD38, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xSTEAP1, un anticuerpo biespecífico anti-CD3x5T4, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xENPP3, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xMUC16, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xBCMA, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xPSMA o un anticuerpo triespecífico anti-CD3xCD28xCD38.

En algunas realizaciones, la presente invención incluye anticuerpos que tienen las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR de los anticuerpos expuestos en el presente documento, los anticuerpos anti-CD3 divulgados en el documento WO 2014/047231 o en el documento<w>O 2017/053856, los anticuerpos biespecíficos anti-CD20 x anti-CD3 divulgados en el documento WO 2014/047231, los anticuerpos biespecíficos anti-PSMA x anti-CD3 divulgados en el documento WO 2017/023761, los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16 x anti-CD3 divulgados en el documento WO 2018/067331, los anticuerpos biespecíficos anti-STEAP2 x anti-CD3 divulgados en el documento WO 2018/058001, o los anticuerpos biespecíficos anti-BCMA x anti-CD3 divulgados en el documento WO 2020/018820.

En determinadas realizaciones, la molécula de unión a antígeno multiespecífica es un anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo. Cada dominio de unión a antígeno de un anticuerpo multiespecífico comprende un dominio variable de cadena pesada (HCVR) y un dominio variable de cadena ligera (LCVR). En el contexto de una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un primer y un segundo dominio de unión a antígeno (p. ej., un anticuerpo biespecífico), las CDR del primer dominio de unión a antígeno pueden designarse con el prefijo "A1" y las CDR del segundo dominio de unión a antígeno pueden designarse con el prefijo "A2". Por lo tanto, en el presente documento las CDR del primer dominio de unión a antígeno pueden denominarse A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3; y las CDR del segundo dominio de unión a antígeno en el presente documento pueden denominarse A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-HCDR3. En el contexto de una molécula de unión a antígeno triespecífica que comprende un primer, un segundo, y un tercer dominio de unión a antígeno (p. ej., un anticuerpo triespecífico), las CDR del primer dominio de unión a antígeno pueden designarse con el prefijo "A1", las CDR del segundo dominio de unión a antígeno pueden designarse con el prefijo "A2" y las CDR del tercer dominio de unión a antígeno pueden designarse con el prefijo "A3". Por lo tanto, en el presente documento las CDR del primer dominio de unión a antígeno pueden denominarse A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3; las CDR del segundo dominio de unión a antígeno en el presente documento pueden denominarse A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-HCDR3; y las CDR del tercer dominio de unión a antígeno en el presente documento pueden denominarse A3-HCDR1, A3-HCDR2 y A3-HCDR3.

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas analizadas anteriormente o en el presente documento pueden ser anticuerpos biespecíficos. En algunos casos, el anticuerpo biespecífico comprende una región constante de cadena pesada de IgG humana. En algunos casos, la región constante de cadena pesada de IgG humana es el isotipo IgG1. En algunos casos, la región constante de cadena pesada de IgG humana es el isotipo IgG4. En diversas realizaciones, el anticuerpo biespecífico comprende una bisagra quimérica que reduce la unión al receptor Fcy respecto a una bisagra de tipo silvestre del mismo isotipo.

El primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar conectados directa o indirectamente entre sí para formar una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente invención. Como alternativa, el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar unidos a un dominio de multimerización separado. La asociación de un dominio de multimerización con otro dominio de multimerización facilita la asociación entre los dos dominios de unión a antígeno, formando de este modo una molécula de unión a antígeno biespecífica. Como se utiliza en el presente documento, un "dominio de multimerización" es cualquier macromolécula, proteína, polipéptido, péptido o aminoácido que tiene la capacidad de asociarse con un segundo dominio de multimerización de la misma estructura o constitución o similar. Por ejemplo, un dominio de multimerización puede ser un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina C<h>3. Un ejemplo no limitante de un componente de multimerización es una porción Fc de una inmunoglobulina (que comprende un dominio C<h>2-C<h>3), por ejemplo, un dominio Fc de una IgG seleccionada de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4, así como cualquier alotipo dentro de cada grupo de isotipo.

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención comprenderán normalmente dos dominios de multimerización, p. ej., dos dominios Fc que son cada uno de manera individual parte de una cadena pesada de anticuerpo separada. El primer y el segundo dominio de multimerización pueden ser del mismo isotipo de IgG tal como, p. ej., IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4. Como alternativa, el primer y segundo dominios de multimerización pueden ser de diferentes isotipos de IgG tales como, p. ej., IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, etc.

En determinadas realizaciones, el dominio de multimerización es un fragmento Fc o una secuencia de aminoácidos de 1 a aproximadamente 200 aminoácidos de longitud que contiene al menos un resto de cisteína. En otras realizaciones, el dominio de multimerización es un resto de cisteína o un péptido corto que contiene cisteína. Otros dominios de multimerización incluyen péptidos o polipéptidos que comprenden o consisten en una cremallera de leucina, un motivo de bucle de hélice o un motivo de hélice superenrollada.

Puede usarse cualquier formato o tecnología de anticuerpo biespecífico para preparar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene una primera especificidad de unión a antígeno puede unirse funcionalmente (p. ej., mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene una segunda especificidad de unión a antígeno para producir una molécula de unión a antígeno biespecífica. Otros formatos biespecíficos ilustrativos específicos que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen, sin limitación, p. ej., formatos biespecíficos basados en scFv o de diacuerpo, fusiones IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-Ig, cuadroma, botón en ojal, cadena ligera común (p. ej., cadena ligera común con "botón en ojal", etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, Duocuerpo, IgG1/IgG2, Fab de acción doble (DAF)-IgG y formatos biespecíficos de Mab2 (véase, p. ej., Klein et al.

2012, mAbs 4:6, 1-11, y las referencias citadas en el mismo, para una revisión de los formatos anteriores).

En el contexto de las moléculas de unión a antígenos biespecíficas proporcionadas en el presente documento, los dominios de multimerización, p. ej., dominios Fc, pueden comprender uno o más cambios de aminoácidos (p. ej., inserciones, deleciones o sustituciones) en comparación con la versión natural de tipo silvestre del dominio Fc. Por ejemplo, la invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden una o más modificaciones en el dominio Fc produciendo un dominio Fc modificado que tiene una interacción de unión modificada (p. ej., mejorada o disminuida) entre Fc y FcRn. En una realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende una modificación en una región C<h>2 o C<h>3, en donde la modificación aumenta la afinidad del dominio Fc a FcRn en un entorno ácido (p. ej., en un endosoma donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, p. ej., una modificación en la posición 250 (p. ej., E o Q); 250 y 428 (p. ej., L o F); 252 (p. ej., L/Y/F/W o T), 254 (p. ej., S o T) y 256 (p. ej., S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (p. ej., L/R/S/P/Q o K) y/o 434 (p. ej., H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (p. ej., 308F, V308F) y 434. En una realización, la modificación comprende una modificación en 428L (p. ej., M428L) y 434S (p. ej., N434S); una modificación en 428L, 259I (p. ej., V259i), y 308F (p. ej., V308F); una modificación en 433k (p. ej., H433K) y una en 434 (p. ej., 434Y); una modificación en 252, 254, y 256 (p. ej., 252Y, 254T y 256E); una modificación en 250Q y 428L (p. ej.,T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (p. ej., 308F o 308P).

En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio C<h>3 y un segundo dominio C<h>3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio C<h>3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio C<h>3 de Ig está unido a la proteína A y el segundo dominio C<h>3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a la proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo C<h>3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 8.586.713. Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo C<h>3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG4.

En determinadas realizaciones, el dominio Fc puede ser quimérico, que combina secuencias de Fc procedentes de más de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, un dominio Fc quimérico puede comprender parte o la totalidad de una secuencia de C<h>2 derivada de una región C<h>2 de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana y parte o la totalidad de una secuencia de C<h>3 derivada de una IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. Un dominio Fc quimérico también puede contener una región bisagra quimérica. Por ejemplo, una bisagra quimérica puede comprender una secuencia de "bisagra superior", derivada de una región bisagra de IgG1 humana, una IgG2 humana o una IgG4 humana, junto con una secuencia de "bisagra inferior", derivada de una región bisagra de IgG1 humana, una IgG2 humana o una IgG4 humana. Un ejemplo particular de un dominio Fc quimérico que se puede incluir en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno establecidas en el presente documento comprende, desde el extremo N al extremo C: [C<h>1 de IgG4] - [Bisagra superior de IgG4] - [Bisagra inferior de IgG2] - [C<h>2 de IgG4] - [C<h>3 de IgG4]. Otro ejemplo de un dominio Fc quimérico que se puede incluir en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno establecidas en el presente documento comprende, desde el extremo N al extremo C: [C<h>1 de IgG1] - [Bisagra superior de IgG1] - [Bisagra inferior de IgG2] - [C<h>2 de IgG4] - [C<h>3 de IgG1]. Estos y otros ejemplos de dominios Fc quiméricos que pueden incluirse en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno de la presente invención se describen en la publicación de EE. UU. 2014/0243504, publicada el 28 de agosto de 2014. Los dominios Fc quiméricos que tienen estas disposiciones estructurales generales y variantes de los mismos, pueden tener alterada la unión al receptor de Fc, que a su vez afecta la función efectora de Fc.

Los anticuerpos multiespecíficos (p. ej., biespecíficos o triespecíficos) anti-CD3 divulgados en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que proceden los anticuerpos. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles, por ejemplo, en bases de datos públicas de secuencias de anticuerpos. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que proceden de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que procede el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en conjunto en el presente documento "mutaciones de la línea germinal"). Un experto en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera desveladas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. En determinadas realizaciones, todos los restos de la región marco y/o CDR dentro de los dominios Vhy/o Vlretromutan a los restos encontrados en la secuencia de la línea germinal original de la que se obtuvo el anticuerpo. En otras realizaciones, únicamente determinados restos se retromutan a la secuencia de la línea germinal original, p. ej., únicamente los restos mutados encontrados dentro de los 8 primeros aminoácidos de FR1 o dentro de los 8 últimos aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otras realizaciones, uno o más del resto o los restos de la región marco y/o de la CDR están mutados al resto o los restos correspondientes de una secuencia de la línea germinal diferente (es decir, una secuencia de la línea germinal diferente que es diferente de la secuencia de la línea germinal de la que derivó originariamente el anticuerpo). Asimismo, los anticuerpos de la presente invención pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, p. ej., en donde determinados restos individuales mutan al resto correspondiente de una secuencia de la línea germinal particular, mientras que otros restos determinados, que difieren de los de la secuencia de la línea germinal original, se mantienen o mutan al resto correspondiente de una secuencia de línea germinal distinta. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden probarse fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, aumento de la unión (p. ej., medido por valoración de unión celular o unión FACS) o afinidad de unión (p. ej., K<d>), propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), inmunogenicidad reducida, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general están abarcados en la presente invención.

También se proporcionan en el presente documento anticuerpos multiespecíficos (p. ej., biespecíficos o triespecíficos) anti-CD3 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos antagonistas anti-CD40 o anticuerpos multiespecíficos (es decir, biespecíficos o triespecíficos) anti-CD3 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, p. ej., 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservativas de aminoácidos respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR divulgadas en el presente documento.

Ejemplos de anticuerpos anti-CD3xMUC16

En algunas realizaciones, los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento incluyen anticuerpos biespecíficos en donde un brazo de una inmunoglobulina se une a CD3 humano, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico de la MUC16 humana. El término "MUC16", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la proteína MUC16 humana, a menos que se especifique que proviene de una especie no humana (p. ej., "MUC16 de ratón", "MUC16 de mono", etc.). La proteína humana Mu c 16 tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1899 de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2018/0118848A1. En el presente documento dichas moléculas pueden denominarse, p. ej., moléculas biespecíficas "anti-CD3/anti-MUC16", o "anti-CD3xMUC16" o "CD3xMUC16", u otra terminología similar (p. ej., anti-MUC16/anti-CD3). Dichas moléculas de unión a antígeno biespecíficas se construyen con un primer brazo de unión a antígeno que se une a MUC16 y un segundo brazo de unión a antígeno que se une a CD3. El brazo de unión a MUC16 puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR como se establece en la Tabla 1 en el presente documento. El brazo de unión a CD3 puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR como se establece en las Tablas 2-6 del presente documento. Las secuencias de las Tablas 1-6 se divulgaron en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0118848A1. Las SEQ ID NO de las Tablas 1-6 hacen referencia a las secuencias de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2018/0118848A1.

La Tabla 1 muestra los identificadores de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y ligera y las CDR de los anticuerpos anti-MUC16 seleccionados de la invención.

continuación

La Tabla 2 muestra los identificadores de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y ligera y las CDR de los anticuerpos anti-CD3 seleccionados de la invención. Los métodos para producir los anticuerpos anti-CD3 divulgados en el presente documento también se pueden encontrar en la publicación de EE. UU.

2014/0088295.

Tabla 2: Identificadores de la secuencia de aminoácidos

continuación

Las Tablas 3 y 4 establecen los identificadores de la secuencia de aminoácidos para regiones variables de cadena pesada (Tabla 3) y regiones variables de cadena ligera (Tabla 4) y sus correspondientes CDR, de HCVR y LCVR anti-CD3 adicionales útiles en los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16 * anti-CD3 de la invención.

Tabla 4 secuencias de aminoácidos de la re ión variable de la cadena li era)

continuación

La Tabla 5 muestra los identificadores de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y las CDR de los anticuerpos anti-CD3 modificados genéticamente de la invención. Los identificadores de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera y las CDR también se identifican a continuación en la Tabla 6.

T l : I n ifi r l n i min i l n

T a

En determinadas realizaciones ilustrativas, el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) de una región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1730, 1762, 1778, 1786 y 1866, y regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) de una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.

En determinadas realizaciones ilustrativas, el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A1-LCDR1, A1-LCDR2 y A1-LCDR3), en donde A1-HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1732, 1764, 1780, 1788 y 1868; A1-HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1734, 1766, 1782, 1790 y 1870; A1-HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1736, 1768, 1784, 1792 y 1872; A1-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; A1-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; y A1-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

En determinadas realizaciones ilustrativas, el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende las CDR de cadena pesada y ligera de un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1730/26, 1762/26, 1778/26, 1786/26 y 1866/26.

En determinadas realizaciones ilustrativas, el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A1-LCDR1, A1-LCDR2 y A1-LCDR3), y el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a MUC16 humana comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A2-LCDR1, A2-LCDR2 y A2-LCDR3); en donde A1-HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1732, 1764, 1780, 1788 y 1868; A1-HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID N<o>: 1734, 1766, 1782, 1790 y 1870; A1-HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1736, 1768, 1784, 1792 y 1872; A1-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; A1-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; y A1-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; y en donde A2-HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; A2-HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; A2-HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; A2-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; A2-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; y A2-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

Otros anticuerpos biespecíficos adicionales anti-MUC16 * anti-CD3 se divulgan en, p. ej., el documento WO 2018/067331.

Ejemplos de anticuerpos anti-CD3xBCMA

En algunas realizaciones, los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento incluyen anticuerpos biespecíficos en donde un brazo de una inmunoglobulina se une a CD3 humano, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico de BCMA humano. El término "BCMA", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la proteína BCMA humana a menos que se especifique que proviene de una especie no humana (p. ej., "BCMA de ratón", "BCMA de mono", etc.). La proteína BCMA humana tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 115 de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0024356A1. En el presente documento dichas moléculas pueden denominarse, p. ej., "anti-BCMA * anti-CD3" o "anti-CD3/anti-BCMA", o "anti-CD3xBCMA" o "CD3xBCMA", u otra terminología similar (p. ej., anti-BCMA/anti-CD3). El brazo de unión a BCMA puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR como se establece en la Tabla 7 en el presente documento. El brazo de unión a CD3 puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR como se establece en la Tabla 8 del presente documento, o los anticuerpos anti-CD3 divulgados en el documento WO 2014/047231 o en el documento WO 2017/053856. Las secuencias de las Tablas 7 y 8 se divulgaron en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0024356A1. Las SEQ ID NO de las Tablas 7 y 8 hacen referencia a las secuencias de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0024356A1.

La Tabla 7 expone los identificadores de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera y las CDR de los anticuerpos anti-BCMA seleccionados de la invención.

Tabla 7: Identificadores de la secuencia de aminoácidos

La Tabla 8 muestra los identificadores de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera y las CDR de los anticuerpos anti-CD3 seleccionados. Otros anticuerpos anti-CD3 para su uso en la preparación de anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la presente invención se pueden encontrar en, p. ej., el documento WO 2014/047231.

Tabla 8: Identificadores de la secuencia de aminoácidos

En determinadas realizaciones ilustrativas, la molécula de unión a antígeno biespecífica anti-BCMA * anti-CD3 aislada comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende: (a) tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66; y (b) tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 82. En algunos casos, la molécula de unión a antígeno biespecífica aislada comprende una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 68, una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70 y una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 72. En algunos casos, la molécula de unión a antígeno biespecífica aislada comprende una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 84, una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 86 y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 88. En algunos casos, el primer dominio de unión a antígeno comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66 y una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 82. Las anteriores SEQ ID NO hacen referencia a las secuencias de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0024356A1.

En determinadas realizaciones ilustrativas, la molécula de unión a antígeno biespecífica anti-BCMA * anti-CD3 aislada comprende un segundo dominio de unión a antígeno que comprende: (a) tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 o SEQ ID NO: 98; y (b) tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 82. En algunos casos, el segundo dominio de unión a antígeno comprende: (a) una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 92 o la SEQ ID NO: 100; (b) una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 94 o la SEQ ID NO: 102; y (c) una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 96 o la SEQ ID NO: 104. En algunos casos, el segundo dominio de unión a antígeno comprende una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 84, una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 86 y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 88. En algunos casos, el segundo dominio de unión a antígeno comprende: (a) los dominios HCDR1, HCDR2, HCDR3, respectivamente, que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 92, 94, 96; y los dominios LCDR1, LCDR2, LCDR3, respectivamente, que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 84, 86, 88; o (b) los dominios HCDR1, HCDR2, HCDR3, respectivamente, que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 100, 102, 104; y los dominios LCDR1, LCDR<2>, LCDR3, respectivamente, que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 84, 86, 88. En algunos casos, el segundo dominio de unión a antígeno comprende: (a) una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90 y una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 82; o (b) una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 98 y una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 82. Las anteriores SEQ ID NO hacen referencia a las secuencias de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0024356A1.

En determinadas realizaciones ilustrativas, la molécula de unión a antígeno biespecífica anti-BCMA * anti-CD3 aislada comprende: (a) un primer dominio de unión a antígeno que comprende los dominios HCDR1, HCDR2, HCDR3, respectivamente, que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 68, 70, 72, y los dominios LCDR1, LCDR2, LCDR3, respectivamente, que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 84, 86, 88; y (b) un segundo dominio de unión a antígeno que comprende los dominios HCDR1, HCDR2, HCDR3, respectivamente, que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 92, 94, 96, y los dominios LCDR1, LCDR2, LCDR3, respectivamente, que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 84, 86, 88. En algunos casos, la molécula de unión a antígeno biespecífica aislada comprende: (a) un primer dominio de unión a antígeno que comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66, y una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 82; y (b) un segundo dominio de unión a antígeno que comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 90, y una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 82.

En determinadas realizaciones ilustrativas, la molécula de unión a antígeno biespecífica anti-BCMA * anti-CD3 aislada comprende: (a) un primer dominio de unión a antígeno que comprende los dominios HCDR1, HCDR2, HCDR3, respectivamente, que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 68, 70, 72, y los dominios LCDR1, LCDR2, LCDR3, respectivamente, que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 84, 86, 88; y (b) un segundo dominio de unión a antígeno que comprende los dominios HCDR1, HCDR2, HCDR3, respectivamente, que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 100, 102, 104, y los dominios LCDR1, LCDR2, LCDR3, respectivamente, que comprenden las secuencias de aminoácidos de las<s>E<q>ID NO: 84, 86, 88. En algunos casos, la molécula de unión a antígeno biespecífica aislada comprende: (a) un primer dominio de unión a antígeno que comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66, y una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 82; y (b) un segundo dominio de unión a antígeno que comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 98, y una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 82. Las anteriores SEQ ID NO hacen referencia a las secuencias de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0024356A1.

En determinadas realizaciones ilustrativas, la molécula de unión a antígeno biespecífica anti-BCMA * anti-CD3 aislada comprende: (a) un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a BCMA humano, y comprende las CDR de una HCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, l22, y 124, y las CDR de una LCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 82, 123, y 125; y (b) un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano. En algunos casos, el primer dominio de unión a antígeno comprende las CDR de un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 122/123, 124/125, 2/82, 18/82, 34/82, 50/82, 66/82, 122/82 y 124/82. En algunos casos, el primer dominio de unión a antígeno comprende los dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4-6-8 12-14-16, 20-22-24-28-30-32, 36-38-40-44-46-48, 52-54-56-60-62-64, 68-70-72-76-78-80, 4-6-8-84-86-88, 20-22-24 84-86-88, 36-38-40-84-86-88, 52-54-56-84-86-88 y 68-70-72-84-86-88. En algunos casos, el primer dominio de unión a antígeno comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 122/123, 124/125, 2/82, 18/82, 34/82, 50/82, 66/82, 122/82 y 124/82. En algunos casos, el segundo dominio de unión a antígeno comprende las CDR de un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 90/82 y 98/82. Las anteriores SEQ ID NO hacen referencia a las secuencias de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0024356A1.

En determinadas realizaciones ilustrativas, la molécula de unión a antígeno biespecífica anti-BCMA * anti-CD3 aislada compite por la unión a BCMA, o se une al mismo epítopo en BCMA que un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende un par HCVR/LCVR que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 66/82 y un segundo dominio de unión a antígeno que comprende un par HCVR/LCVR que comprende las secuencias de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 90/82 o SEQ ID NO: 98/82. Las anteriores SEQ ID NO hacen referencia a las secuencias de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0024356A1.

En determinadas realizaciones ilustrativas, la molécula de unión a antígeno biespecífica anti-BCMA * anti-CD3 aislada compite por la unión a CD3 humano, o se une al mismo epítopo en CD3 humano que un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo de referencia comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende un par HCVR/LCVR que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 66/82 y un segundo dominio de unión a antígeno que comprende un par HCVR/LCVR que comprende las secuencias de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 90/82 o SEQ ID<n>O: 98/82. Las anteriores SEQ ID NO hacen referencia a las secuencias de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0024356A1.

Otros anticuerpos biespecíficos anti-BCMA * anti-CD3 se divulgan en, p. ej., el documento WO 2020/018820.

Anticuerpos anti-CD3xCD20

En algunas realizaciones, en el presente documento se proporcionan anticuerpos biespecíficos en donde un brazo de una inmunoglobulina se une a CD3 humano, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico de CD20 humano. El término "CD20", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la proteína CD20 humana, a menos que se especifique que proviene de una especie no humana (p. ej., "CD20 de ratón", "CD20 de mono", etc.). La proteína c D20 humana tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1369 de la patente de EE. UU. n.° US 9.657.102B2. En el presente documento dichas moléculas pueden denominarse, p. ej., moléculas biespecíficas "anti-CD3/anti-CD20", o moléculas biespecíficas "anti-CD3*CD20" o "CD3*CD20", u otra terminología similar.

En determinadas realizaciones, el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1250, 1266, 1282, 1298, 1314 y 1329 o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tengan al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia. Todas las secuencias divulgadas en esta sección para dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a CD3 o CD20 y las correspondientes SEQ ID NO proceden de la patente de EE. UU. n.° US 9.657.102B2.

En determinadas realizaciones, el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1258, 1274, 1290, 1306, 1322 y 1333, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.

En determinadas realizaciones, el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1250/1258, 1266/1274, 1282/1290, 1298/1306, 1314/1322, y 1329/1333.

En determinadas realizaciones, el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende una CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1252, 1268, 1284, 1300, 1316 y 1330, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1254, 1270, 1286, 1302, 1318 y 1331, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1256, 1272, 1288, 1304, 1320 y 1332, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1260, 1276, 1292, 1308, 1324 y 1334, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1262, 1278, 1294, 1310, 1326 y 1335, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia, y un dominio CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1264, 1280, 1296, 1312, 1328 y 1336, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.

En determinadas realizaciones, el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende los dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, que tienen las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1252-1254-1256-1260-1262-1264; 1268-1270 1272-1276-1278-1280; 1284-1286-1288-1292-1294-1296; 1300-1302-1304-1308-1310-1312; 1316-1318-1320-1324 1326-1328; y 1330-1331 -1332-1334-1335-1336.

En determinadas realizaciones, el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1242, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.

En determinadas realizaciones, el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1258, 1274, 1290, 1306, 1322 y 1333, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.

En determinadas realizaciones, el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1242/1258, 1242/1274, 1242/1290, 1242/1306, 1242/1322 y 1242/1333.

En determinadas realizaciones, el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende un dominio CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1244, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1246, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1248, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1260, 1276, 1292, 1308, 1324 y 1334, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98%o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1262, 1278, 1294, 1310, 1326 y 1335, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1264, 1280, 1296, 1312, 1328 y 1336, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.

En determinadas realizaciones, el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende los dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, que tienen las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1244-1246-1248-1260-1262-1264; 1244-1246-1248-1276-1278-1280; 1244-1246-1248-1292-1294-1296; 1244-1246-1248-1308-1310-1312; 1244-1246 1248-1324-1326-1328; y 1244-1246-1248-1334-1335-1336.

Se divulgan adicionalmente anticuerpos biespecíficos anti-CD20/anti-CD3 en p. ej., la patente de EE. UU. n.° 9.657.102.

Ejemplos de otros anticuerpos multiespecíficos anti-CD3

Otros ejemplos de anticuerpos multiespecíficos anti-CD3 que pueden usarse en las composiciones y métodos de la presente invención incluyen, aunque no de forma limitativa, p. ej., anticuerpos biespecíficos anti-CD3xCD123 divulgados en la patente de EE. u U. n.° 10.787.521B2, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. números 2018/0222987A1 y US 2019/0241657A1, y la publicación de solicitud internacional números WO 2016/036937A1, WO 2017/210443A1, WO 2019/050521A1, WO 2019/210147A1, WO 2019/232528A1 yWO 2020/092404A1; anticuerpos biespecíficos anti-CD3xSTEAP2 divulgados en la publicación de solicitud internacional números WO 2018/058001A1; anticuerpos biespecíficos anti-CD3xCD20 divulgados en los documentos WO 2014/047231A1, WO 2015/143079A1, WO 2016/081490A1, WO 2017/112775A1, WO 2017/210485A1, WO 2018/114748A1, WO 2018/093821A8, WO 2018/223004A1, WO 2018/188612A1, WO 2019/155008A1, WO 2019/228406A1, WO 2020/088608A1, WO 2020/156405A1 y en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. números US 2020/0199231A1 y US 2020/0172627A1; anticuerpos biespecíficos anti-CD3xSSTR 2 divulgados en la publicación de solicitud internacional n.° WO 2018/005706A1; anticuerpos biespecíficos anti-CD3xCD38 divulgados en la solicitud internacional números WO 2015/149077A1 y WO 2020/018556A1, y en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. números US 2018/0305465A1 yS 2020/0102403A1; anticuerpos biespecíficos anti-CD3xSTEAP1 divulgados en Olivier Nolan-Stevaux (2020) Abstract at Proceedings of the Annual Meeting of the American Association for Cancer Research 2020; anticuerpos biespecíficos anti-CD3x5T4 divulgados en la publicación de solicitud internacional n.° WO 2013/041687A1, publicación de solicitud de patente de EE. UU. números US 2017/0342160A1, US 20200277397A1; anticuerpos biespecíficos anti-CD3xENPp3 descritos en la publicación de solicitud internacional n.° WO 2020/180726A1; anticuerpos biespecíficos anti-CD3xMUC16 divulgados en publicación de solicitud internacional números WO 2018/067331A9 y WO 2019/246356A1; anticuerpos biespecíficos anti-CD3xBCMA divulgados en la publicación de solicitud internacional números WO 2013/072406A1, WO 2014/140248A1, WO 2016/166629A1, WO 2017/031104A1, WO 2017/134134A1, WO 2017/095267A1, WO 2019/220369A3, WO 2019/075359A1, WO 2019/226761A1, WO 2020/025596A1, WO 2020/191346A1, WO 2020018820A1, publicación de solicitud de patente de EE. UU. números US 2013/0273055A1, US 2019/0263920A1; anticuerpos biespecíficos anti-CD3xCD19 divulgados en la publicación de solicitud internacional números WO 2012/055961A1, WO 2016/048938A1,WO 2017/087603A1, WO 2017/096368A1, WO 2018/188612A1, WO 2019/237081A1, WO 2020/048525A1, WO 2020/135335A1, publicación de solicitud de patente de EE. UU. números US 2016/0326249A1, US 2020/0283523A1, US 2019/0284279A1, patente de EE. UU. n.° US 9.315.567B2, US 7.575.923B2, US 7.635.472B2; anticuerpos biespecíficos anti-CD3xGPRC5D divulgados en la publicación de solicitud internacional números WO 2018/017786A3, WO 2019/220369A3; anticuerpos biespecíficos anti-CD3xPSMA divulgados en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2017/0320947A1; anticuerpos triespecíficos anti-CD3xCD28xCD38 divulgados en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2020/0140552A1; u otros anticuerpos multiespecíficos anti-CD3 divulgados en la publicación de solicitud internacional números WO 2016/086189A2, WO 2020/088608A1, WO2019191120A1 y WO 2016/105450A3.

En algunas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno multiespecíficas (p. ej., biespecíficas o triespecíficas) mencionadas anteriormente que se unen específicamente a CD3 y a un antígeno tumoral pueden comprender una molécula de unión a antígeno anti-CD3 que se une a CD3 con una afinidad de unión débil, tal como la que presenta una Kd superior a aproximadamente 40 nM, medida mediante un ensayo de unión por afinidadin vitro.Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas mencionadas anteriormente pueden comprender una molécula de unión a antígeno anti-CD3 que se une a CD3 y muestra una CE<50>superior a aproximadamente 100 nM, medida mediante un análisis de valoración FACS. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas mencionadas anteriormente pueden comprender una molécula de unión a antígeno anti-CD3 que no muestra una unión medible u observable a CD3, medida mediante un análisis de unión por afinidad o un análisis de valoración FACSin vitro, que aún conserva la capacidad de activar células CMSP humanas y/o inducir actividad citotóxica en líneas celulares que expresan antígenos tumorales.

Formulación terapéutica y administración

En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un antagonista de CD40 (p. ej., un anticuerpo antagonista de CD40, o un fragmento de unión a antígeno del mismo) como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas en las que una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 descrita en el presente documento se coformula con un antagonista de CD40 (p. ej., un anticuerpo antagonista de CD40, o un fragmento de unión a antígeno del mismo) como se describe en cualquier otro sitio del presente documento.

Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento pueden formularse con portadores adecuados, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan una mejor transferencia, administración, tolerancia y similares. Una multitud de formulaciones adecuadas puede encontrarse en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa . Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

La dosis de la molécula de unión a antígeno administrada a un paciente puede variar según la edad y la talla del paciente, la enfermedad diana, las afecciones, la vía de administración y similares.

Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento, p. ej., encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, p. ej., Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en embolada, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (p. ej., mucosa oral, rectal y mucosa intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

En algunas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento puede administrarse por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Además, con respecto a la administración subcutánea, un dispositivo inyector de pluma tiene fácilmente aplicaciones en la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo inyector de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo inyector de pluma reutilizable utiliza generalmente un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y sustituirse por un nuevo cartucho que contenga la composición farmacéutica. El dispositivo inyector de pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo inyector de pluma desechable, no hay cartucho sustituible. Más bien, el dispositivo inyector de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, se desecha todo el dispositivo.

Numerosos dispositivos inyectores de pluma y autoinyectores reutilizables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, y o Pt ICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Ejemplos de dispositivos inyectores de pluma desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), la FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y la KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), la PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), la EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar solo algunos.

En determinadas situaciones, la composición farmacéutica se puede administrar en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer, citado anteriormente; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos; véase, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Ratón, Florida. Incluso en otra realización, un sistema de liberación controlada puede colocarse en proximidad a la diana de la composición, por lo tanto, requiriendo solo una fracción de la dosis sistémica (véase, p. ej., Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Release, citado anteriormente, vol. 2, págs. 115-138). Otros sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse mediante métodos conocidos por el público en general. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, p. ej., disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o en un medio oleaginoso usado convencionalmente para inyecciones. Como el medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que puede usarse junto con un agente solubilizante adecuado tal como un alcohol (p. ej., etanol), un polialcohol (p. ej., propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [p. ej., polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso, se emplean, p. ej., aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse junto con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se carga preferentemente en una ampolla apropiada.

Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para su uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc.

En algunos aspectos, se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40 (p. ej., un anticuerpo antagonista de CD40, o un fragmento de unión a antígeno del mismo) como se describe en el presente documento.

En determinadas realizaciones, las poblaciones de linfocitos T-CAR que expresan el antagonista de CD40 pueden administrarse solas o como una composición farmacéutica junto con portadores, diluyentes y excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables y/o con otros componentes o poblaciones celulares. Tales composiciones pueden comprender tampones tales como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato y similares; hidratos de carbono, tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos, tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (p. ej., hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones divulgadas en el presente documento pueden formularse para administración intravenosa.

La administración del linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40 puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, incluyendo por inyección, transfusión o implantación. Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un paciente por vía subcutánea, intradérmica, intratumoral, intraganglionar, intramedular, intramuscular, por inyección intravenosa (i.v.) o intraperitoneal. En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas se administran a un paciente mediante inyección intradérmica o subcutánea. En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas se administran mediante inyección i.v. Las composiciones también pueden inyectarse directamente en un tumor o en un ganglio linfático.

Métodos para tratar cánceres y/o inhibir el síndrome de liberación de citocinas

En algunos aspectos, la presente invención incluye métodos para tratar el cáncer e inhibir el síndrome de liberación de citocinas (SLC) en un sujeto. En algunas realizaciones, los métodos pueden comprender la administración conjunta (p. ej., de forma concomitante o secuencial) de (1) un antagonista de CD40 o un linfocito T-CAR que exprese un antagonista de CD40; y (2) una molécula de unión a antígeno multiespecífica (p. ej., biespecífica o triespecífica) que comprende al menos un primer dominio de unión a antígeno contra CD3 y un segundo dominio de unión a antígeno contra un antígeno tumoral a un sujeto que lo necesite.

En algunas realizaciones, los métodos pueden comprender administrar una composición farmacéutica que comprende (1) un antagonista de CD40 o un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40; y (2) una molécula de unión a antígeno multiespecífica (p. ej., biespecífica o triespecífica) que comprende al menos un primer dominio de unión a antígeno contra CD3 y un segundo dominio de unión a antígeno contra un antígeno tumoral a un sujeto que lo necesite. La composición terapéutica puede comprender cualquiera de los anticuerpos antagonistas de CD40 y moléculas multiespecíficas de unión al antígeno c D3 como se ha descrito en el presente documento y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En algunos aspectos, la presente invención incluye métodos para inhibir el síndrome de liberación de citocinas (SLC), o reducir la liberación de citocinas causada por una molécula de unión a antígeno multiespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno tumoral en un sujeto. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención comprenden administrar un antagonista de CD40 o un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40 a un sujeto que lo necesite.

En algunos aspectos, los métodos descritos además comprenden diagnosticar o identificar sujetos susceptibles de padecer el síndrome de liberación de citocinas o que necesitan una reducción de la liberación de citocinas.

Como se utiliza en el presente documento, los términos "tratar", "tratamiento", o similares, significan aliviar los síntomas o eliminar la causa de los síntomas de forma temporal o permanente. Por ejemplo, "tratar el cáncer" puede significar retrasar o inhibir el crecimiento del tumor, reducir la carga de células tumorales o la carga tumoral, promover la regresión tumoral, provocar la reducción del tumor, necrosis y/o desaparición, prevenir la recidiva de tumores y/o aumentar la duración de la supervivencia del sujeto.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "un sujeto que lo necesite" significa un mamífero humano o no humano que presenta uno o más síntomas o indicios de cáncer y/o SLC, y/o al que se le ha diagnosticado cáncer y/o SLC, y que necesita tratamiento para el mismo. En muchas realizaciones, el término "sujeto" puede utilizarse indistintamente con el término "paciente".

En algunas realizaciones, los cánceres que pueden tratarse con los métodos y composiciones del presente documento incluyen, pero sin limitación, cáncer de cuello uterino, ano, vagina, vulva, pene, base de la lengua, laringe, amígdala, vejiga, sangre, hueso, médula ósea, cerebro, mama, colon, esófago, gastrointestinal, encías, cabeza, riñón, hígado, pulmón, nasofaringe, cuello, ovarios, próstata, piel, cáncer de piel no melanoma (CPNM), carcinoma de células escamosas cutáneo (SCC), estómago, testículos, lengua o útero. Además, el cáncer puede ser específicamente del siguiente tipo histológico, aunque no se limita a estos: neoplasia, maligno; carcinoma; carcinoma, indiferenciado; carcinoma de células gigantes y fusiformes; carcinoma microcítico; carcinoma papilar; carcinoma de células escamosas; carcinoma linfoepitelial; carcinoma de células basales; carcinoma pilomatricial; carcinoma de células transicionales; carcinoma papilar de células transicionales; adenocarcinoma; gastrinoma, maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular y colangiocarcinoma combinados; adenocarcinoma trabecular; carcinoma adenoideo quístico; adenocarcinoma en pólipo adenomatoso; adenocarcinoma, poliposis familiar del colon; carcinoma sólido; tumor carcinoide, maligno; adenocarcinoma bronquioloalveolar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromófobo; carcinoma acidófilo; adenocarcinoma oxifílico; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de células claras; carcinoma de células granulares; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma papilar y folicular; carcinoma esclerosante no encapsulante; carcinoma cortical suprarrenal; carcinoma endometrioide; carcinoma de anejos cutáneos; adenocarcinoma apocrino; adenocarcinoma sebáceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide; cistadenocarcinoma; cistadenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma papilar seroso; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de células en forma de anillo de sello; carcinoma ductal infiltrante; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatorio; enfermedad de Paget mamaria; carcinoma de células acinares; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma con metaplasia escamosa; timoma maligno; tumor estromal ovárico maligno; tecoma maligno; tumor maligno de células de la granulosa; y roblastoma maligno; carcinoma de células de Sertoli; tumor maligno de células de Leydig; tumor maligno de células lipídicas; paraganglioma maligno; paraganglioma maligno extramamario; feocromocitoma; glomangiosarcoma; melanoma maligno; melanoma amelánico; melanoma de diseminación superficial; melanoma maligno en nevo pigmentado gigante; melanoma de células epitelioides; nevus azul maligno; sarcoma; fibrosarcoma; histiocitoma fibroso maligno; mixosarcoma; liposarcoma; liomiosarcoma; rabdomiosarcoma; rabdomiosarcoma embrionario; rabdomiosarcoma alveolar; sarcoma estromal; tumor mixto maligno; tumor mixto mulleriano; nefroblastoma; hepatoblastoma; carcinosarcoma; mesenquimoma maligno; tumor de Brenner maligno; tumor filoides maligno; sarcoma sinovial; mesotelioma maligno; disgerminoma; carcinoma embrionario; teratoma maligno; estruma ovárico maligno; coriocarcinoma; mesonefroma maligno; hemangiosarcoma; hemangioendotelioma maligno; sarcoma de Kaposi; hemangiopericitoma maligno; linfangiosarcoma; osteosarcoma; osteosarcoma yuxtacortical; condrosarcoma; condroblastoma maligno; condrosarcoma mesenquimatoso; tumor óseo de células gigantes; sarcoma de Ewing; tumor odontogénico maligno; odontosarcoma ameloblástico; ameloblastoma maligno; fibrosarcoma ameloblástico; pinealoma maligno; cordoma; glioma maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma protoplásmico; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; neuroectodérmico primitivo; sarcoma cerebeloso; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; tumor neurogénico olfativo; meningioma maligno; neurofibrosarcoma; neurilemmoma maligno; tumor maligno de células granulares; linfoma maligno; enfermedad de Hodgkin; linfoma de Hodgkin; paragranuloma; linfoma linfocítico de células pequeñas; linfoma maligno difuso de células grandes; linfoma folicular maligno; micosis fungoide; otros linfomas no hodgkinianos especificados; histiocitosis maligna; mieloma múltiple; sarcoma de mastocitos; enfermedad inmunoproliferativa del intestino delgado; leucemia; leucemia linfoide; leucemia de células plasmáticas; eritroleucemia; leucemia de células de linfosarcoma; leucemia mieloide; leucemia basófila; leucemia eosinófila; leucemia monocítica; leucemia de mastocitos; leucemia megacarioblástica; sarcoma mieloide; y tricoleucemia.

En algunas realizaciones, los cánceres que pueden tratarse mediante los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento expresan el antígeno tumoral al que se dirigen las moléculas multiespecíficas de unión al antígeno CD3 (p. ej., un tumor con una expresión del antígeno tumoral determinada por citometría de flujo en >20 % de las células tumorales). En particular, las composiciones y métodos de la presente invención pueden usarse para el tratamiento, prevención y/o la mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado con o mediado por, p. ej., la expresión o actividad de CD20, PSMA, MUC16, STEAP2 o BCMA o la proliferación de CD20+, PSMA, MUC16+, STEAP2+ o células BCMA+. El mecanismo de acción mediante el cual se logran los métodos terapéuticos de la invención incluye la destrucción de las células que expresan dichos antígenos en presencia de células efectoras, por ejemplo, mediante CDC, apoptosis, ADCC, fagocitosis, o por una combinación de dos o más de estos mecanismos.

En algunas realizaciones, la molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 utilizada en las presentes composiciones o métodos es un anticuerpo biespecífico anti-CD3 * anti-PSMA. Las composiciones o métodos son útiles para tratar un cáncer que exprese PSMA, incluido el cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal y cáncer gástrico. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de próstata (p. ej., cáncer de próstata resistente a la castración).

En algunas realizaciones, la molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 usada en las presentes composiciones o métodos es un anticuerpo biespecífico anti-CD3 * anti-MUC16. Las composiciones o métodos son útiles para tratar un cáncer que expresa MUC16, incluido el cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón no microcítico, colangiocarcinoma intrahepático de tipo formador de masa, adenocarcinoma del cuello uterino y adenocarcinoma del tubo gástrico. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de ovario.

En algunas realizaciones, la molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 usada en las presentes composiciones o métodos es un anticuerpo biespecífico anti-CD3 * anti-STEAP2. Las composiciones o métodos son útiles para tratar un cáncer que exprese STEAP2, incluido el cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer cervicouterino, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, cáncer uterino y cáncer de ovario. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de próstata (p. ej., cáncer de próstata resistente a la castración).

En algunas realizaciones, la molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 utilizada en las presentes composiciones o métodos es un anticuerpo biespecífico anti-CD3 * anti-BCMA. Las composiciones o métodos son útiles para tratar un cáncer que exprese BCMA, incluido el mieloma múltiple u otros cánceres de linfocitos B o de células plasmáticas, tales como la macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de Burkitt y linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma no hodgkiniano, leucemia linfocítica crónica, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de la zona marginal, linfoma linfoplasmocítico y linfoma de Hodgkin. En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma múltiple.

En algunas realizaciones, la molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 usada en las presentes composiciones o métodos es un anticuerpo biespecífico anti-CD3 * anti-CD20. Las composiciones o métodos son útiles para tratar un cáncer que exprese CD20, incluido el linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma linfocítico pequeño, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de la zona marginal, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma mediastínico primario de linfocitos B, linfoma linfoblástico o linfoma de Burkitt. En algunas realizaciones, el cáncer es linfoma folicular. En algunas realizaciones, el cáncer es el linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL).

En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención se usan en un sujeto (p. ej., un paciente con cáncer) con uno o más síntomas o indicaciones del síndrome de liberación de citocinas actualmente descrito, que haya sido diagnosticado de síndrome de liberación de citocinas, y/o que sea susceptible de padecerlo o que necesite una reducción de la liberación de citocinas.

En determinadas realizaciones, los métodos de la presente invención se usan en un sujeto que ha sido tratado con ciertos medicamentos contra el cáncer (p. ej., inmunoterapia contra el cáncer, terapia con linfocitos T-CAR o moléculas multiespecíficas de unión al antígeno CD3, tal como se describen en el presente documento).

En algunas realizaciones, para cualquiera de los métodos divulgados en el presente documento, el sujeto tratado o el sujeto evaluado, es un sujeto que va a ser tratado o que ha sido tratado con una inmunoterapia contra el cáncer, p. ej., una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, el sujeto tiene riesgo (p. ej., un alto riesgo) de desarrollar SLC (p. ej., SLC grave). En realizaciones, el sujeto tiene un riesgo bajo (p. ej., no tiene riesgo) de desarrollar SLC (p. ej., SLC grave). En algunas realizaciones, el sujeto tiene SLC grado 0, SLC grado 1, SLC grado 2 o SLC grado 3. En algunas realizaciones, el riesgo de un sujeto de desarrollar SLC (p. ej., SLC grave) se determina utilizando una evaluación o métodos de predicción descritos en el presente documento.

En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento tratan, retrasan o inhiben el crecimiento de un tumor, o inducen la muerte de las células tumorales. En determinadas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento favorecen la regresión tumoral. En determinadas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento reducen la carga de células tumorales o reducen la carga tumoral. En determinadas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento impiden la recurrencia del tumor.

En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento impiden, inhiben, alivian o tratan el SLC, p. ej., aliviando al menos un síntoma o indicación asociados al SLC, reduciendo la gravedad del SLC, o reduciendo la liberación de citocinas, etc. En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento impiden, inhiben, alivian o tratan el SLC sin afectar negativamente a los beneficios terapéuticos de la molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 descrita en el presente documento.

En determinadas realizaciones, los métodos de la presente invención comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de CD40 o un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40 junto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula multiespecífica de unión al CD3, en donde la administración de un antagonista de CD40 o un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40 conduce a la inhibición del SLC (p. ej., inhibe o reduce al menos un síntoma, indicación, o biomarcador de SLC divulgado en el presente documento). En determinadas realizaciones, el SLC se inhibe en al menos aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 % o un 80 % en comparación con un sujeto al que se administra una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 como monoterapia.

En determinadas realizaciones, la administración de un antagonista de CD40 o de un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40 reduce la liberación de citocinas. En determinadas realizaciones, las concentraciones de citocinas (p. ej., TNFa, IL4, IL6, IL10, IL2, IFN-<y>, IL-17A, IL13, o CD40L) se inhiben en al menos aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 % o un 80 % en comparación con un sujeto al que se administra una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 como monoterapia.

En determinadas realizaciones, la administración de un antagonista de CD40 o un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40 junto con una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 no reduce significativamente los efectos antitumorales (p. ej., inhibir o retrasar el crecimiento tumoral, inducir la regresión tumoral, impedir la recurrencia del tumor y/o aumentar la duración de la supervivencia, etc.) en comparación con un sujeto al que se le administra una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 como monoterapia. Por ejemplo, la administración de un antagonista de CD40 o un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40 junto con una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 puede reducir los efectos antitumorales en menos de aproximadamente un 40 %, menos de aproximadamente un 30 %, menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 15 %, menos de aproximadamente un 10 %, menos de aproximadamente un 5 %, menos de aproximadamente un 1 %, menos de aproximadamente un 0,5 %, o menos de aproximadamente un 0,1 % en comparación con un sujeto al que se administra una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 como monoterapia. En determinadas realizaciones, la administración de un antagonista de CD40 o de un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40 no afecta a la eficacia antitumoral de la molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3.

En determinadas realizaciones, la administración de un antagonista de CD40 o un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40 junto con una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 no reduce significativamente la activación de los linfocitos T (p. ej., linfocitos T CD8+), la expansión y/o la citotoxicidad en comparación con un sujeto al que se administra una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 como monoterapia. Por ejemplo, la administración de un antagonista de CD40 o un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40 junto con una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 puede reducir la activación de los linfocitos T (p. ej., linfocitos T CD8+), y/o la citotoxicidad en menos de aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 15 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 1 %, aproximadamente un 0,5 % o aproximadamente un 0,1 %, en comparación con un sujeto al que se administra una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 como monoterapia. En determinadas realizaciones, la administración de un antagonista de CD40 o de un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40 no afecta a la activación de los linfocitos T (p. ej., linfocitos T CD8+), y/o la citotoxicidad inducida por la molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3.

En determinadas realizaciones, el antagonista de CD40 divulgado, el linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40 y/o una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 se administran a un paciente junto con (p. ej., antes, simultáneamente o después de) cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo, aunque no de forma limitativa, tratamientos adicionales contra el cáncer o el SLC.

Entre los tratamientos del SLC ilustrativos se incluyen, p. ej., el inhibidor de la IL-6 o los inhibidores del receptor de la IL-6 (IL-6R) (p. ej., tocilizumab o siltuximab), terapia anti-IFN-y, terapia anti-sIL2Ra, medicamentos antifebriles tales como el paracetamol, bloqueadores de sgp130, medicamentos vasoactivos, corticoesteroides, agentes inmunosupresores y ventilación mecánica. Algunos ejemplos de medicamentos vasoactivos incluyen, aunque no de forma limitativa, la angiotensina-11, endotelina-1, agonistas adrenérgicos alfa, rostanoides, inhibidores de fosfodiesterasa, antagonistas de la endotelina, inótropos (p. ej., adrenalina, dobutamina, isoprenalina, efedrina), vasopresores (p. ej., noradrenalina, vasopresina, metaraminol, vasopresina, azul de metileno), inodilatadores (p. ej., milrinona, levosimendan) y dopamina. Los vasopresores ilustrativos incluyen, pero sin limitación, norepinefrina, dopamina, fenilefrina, epinefrina y vasopresina. Los corticoesteroides ilustrativos incluyen, pero sin limitación, dexametasona, hidrocortisona y metilprednisolona. Agentes inmunosupresores ilustrativos incluyen, pero sin limitación, un inhibidor del TNFa o un inhibidor de la IL-1. En la solicitud internacional WO2014011984 se describen terapias ilustrativas similares para el SLC.

El componente o componentes terapéuticamente activos adicionales pueden administrarse justo antes de, de manera simultánea o poco después de la administración de una molécula de unión a antígeno de la presente invención; (para los fines de la presente divulgación, en dichos regímenes de administración se considera la administración de una molécula de unión a antígeno "junto con" un componente terapéuticamente activo adicional).

La administración combinada, como se ha descrito anteriormente, puede ser simultánea, por separado o secuencial. Para la administración simultánea, los agentes pueden administrarse como una composición o como composiciones separadas, según sea adecuado.

Pautas de administración

En determinadas realizaciones, en el presente documento se proporcionan métodos que comprenden administrar a un sujeto un antagonista de CD40 (p. ej., un anticuerpo antagonista de CD40) o un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40 con una frecuencia de dosificación de aproximadamente cuatro veces por semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada ocho semanas, una vez cada doce semanas o con menos frecuencia siempre que se logre una respuesta terapéutica.

En determinadas realizaciones, en el presente documento se proporcionan métodos que comprenden administrar a un sujeto una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 con una frecuencia de dosificación de aproximadamente cuatro veces por semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada ocho semanas, una vez cada doce semanas o con menos frecuencia siempre que se logre una respuesta terapéutica.

En determinadas realizaciones, los métodos implican la administración de un antagonista de CD40 (p. ej., un anticuerpo antagonista de CD40) o un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40 junto con una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 a una frecuencia de dosificación de aproximadamente cuatro veces por semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada ocho semanas, una vez cada doce semanas o con menos frecuencia siempre que se logre una respuesta terapéutica.

De acuerdo con determinadas realizaciones, pueden administrarse a un sujeto dosis múltiples de un antagonista de CD40 (p. ej., un anticuerpo antagonista de CD40) o un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40 junto con una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3 a lo largo de un tiempo definido. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención pueden comprender administrar secuencialmente a un sujeto dosis múltiples de un antagonista de CD40 (p. ej., un anticuerpo antagonista de CD40) o un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40 junto con una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3. Como se utiliza en el presente documento, "administrar de manera secuencial" significa que cada dosis de una molécula de unión a antígeno se administra al sujeto en un momento diferente, p. ej., en diferentes días separados por un intervalo predeterminado (p. ej., horas, días, semanas o meses). La presente invención incluye métodos que comprenden administrar secuencialmente al paciente una dosis inicial única de un antagonista de CD40 (por ej., un anticuerpo antagonista de CD40) o un linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40, seguido de una o más dosis secundarias del antagonista de CD40 (p. ej., un anticuerpo antagonista de CD40) o del linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40, y opcionalmente seguido de una o más dosis terciarias del antagonista de CD40 (p. ej., un anticuerpo antagonista de CD40) o del linfocito T-CAR que expresa un antagonista de CD40. En determinadas realizaciones, la presente invención comprende además la administración secuencial al paciente de una dosis inicial única de una molécula multiespecífica de unión al antígeno CD3, seguido de una o más dosis secundarias de la molécula de unión a antígeno multiespecífica anti-CD3, y opcionalmente seguido de una o más dosis terciarias de la molécula de unión a antígeno multiespecífica anti-CD3.

Las expresiones "dosis inicial", "dosis secundarias", y "dosis terciarias", se refieren a la secuencia temporal de administración de la molécula de unión a antígeno de la invención. Por lo tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio de la pauta de tratamiento (también denominada "dosis de referencia"); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis inicial, secundarias y terciarias pueden contener todas la misma cantidad de los agentes terapéuticos descritos en el presente documento, pero generalmente pueden diferir entre sí en términos de frecuencia de administración. En determinadas realizaciones, sin embargo, la cantidad de una molécula de unión a antígeno contenida en las dosis inicial, secundarias y/o terciarias varían entre sí (p. ej., se ajustan al alza o a la baja según corresponda) durante el curso del tratamiento. En determinadas realizaciones, se administran dos o más (p. ej., 2, 3, 4 o 5) dosis se administran al comienzo del régimen de tratamiento como "dosis de carga" seguidas de dosis posteriores que se administran con menos frecuencia (p. ej., "dosis de mantenimiento").

En una realización ilustrativa de la presente invención, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra de 1 a 26 (p. ej., 1, 1 / , 2, 2 / , 3, 31/ 2, 4, 41/ 2, 5, 51/ 2, 6, 61/ 2, 7, 71/ 2, 8, 81/ 2, 9, 91/ 2, 10, 101/ 2, 11, 11 /, 12, 121/ 2, 13, 131/ 2, 14, 141/ 2, 15, 151/ 2, 16, 16 /, 17, 17 /, 18, 18 /, 19, 19 /, 20, 20 /, 21, 21 /, 22, 22 /, 23, 23 /, 24, 24 /, 25, 25 /, 26, 26 / o más) semanas después de la dosis inmediatamente anterior. La expresión "la dosis inmediatamente anterior", como se utiliza en el presente documento, significa, en una secuencia de administraciones múltiples, la dosis de los agentes terapéuticos descritos en el presente documento que se administra a un paciente antes de la administración de la siguiente dosis inmediata en la secuencia sin dosis intermedias.

Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención pueden comprender administrar a un paciente cualquier cantidad de dosis secundarias y/o terciarias de los agentes terapéuticos descritos en el presente documento. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, al paciente se le administra únicamente una sola dosis secundaria. En otras realizaciones, se administran dos o más (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis secundarias al paciente. Análogamente, en determinadas realizaciones, al paciente se le administra únicamente una sola dosis terciaria. En otras realizaciones, se administran dos o más (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias al paciente.

En realizaciones que implican múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria puede administrarse al paciente de 1 a 2 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. De forma similar, en realizaciones que implican múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria puede administrarse al paciente de 2 a 4 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. Como alternativa, la frecuencia a la que se administran las dosis secundarias y/o terciarias a un paciente puede variar en el transcurso del régimen de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ajustarla un médico en el transcurso del tratamiento, dependiendo de las necesidades del paciente individual, después de la exploración clínica.

Ejemplos

Ejemplo 1: El bloqueo de CD40 inhibió la liberación de citocinas mediada por anti-CD123xCD3 sin afectar a la activación de linfocitos T en un ensayo de 4 días con CMSP enriquecidas con linfocitos B autólogosConfiguración experimental:

El efecto del bloqueo de CD40 sobre la liberación de citocinas se evaluó en el ensayo con CMSP humanas enriquecidas con linfocitos B autólogos y la línea celular de LMA MOLM13. Los linfocitos B se aislaron de CMSP humanas utilizando el kit EasySep de aislamiento de linfocitos B humanos (StemCells n.° cat.17954), se marcaron con CFSE y se colocaron en medio completo (RPMI suplementado con FBSm 10 % 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, 292 pg/ml de L-glutamina) con CMSP autólogas y células MOLM13 en la proporción (5:10:1). Se añadieron al pocillo CD123xCD3(G) o el control CD3 de un brazo en titulaciones de 10 veces a partir de 1 pg/ml. Se utilizó el anticuerpo anti-CD40 (IgG1 mutante, REGN3794) a una concentración constante de 5 pg/ml. Las células se incubaron 4 días a 37 °C en medios completos. Las citocinas y las activaciones de linfocitos T se evaluaron 4 días después de la implementación. Se midieron las citocinas en los sobrenadantes utilizando el panel de linfocitos B humanos LegendPlex (Catálogo Biolegend n.° 740527). Para evaluar la activación de los linfocitos T, éstos se tiñeron con anticuerpos directamente conjugados con CD2, CD25 y tinción de células vivas/muertas. La activación de linfocitos T se expresa como el porcentaje de linfocitos CD2+ vivos que expresan CD25.

Resultados:

El bloqueo de CD40 con un anticuerpo anti-CD40 inhibió la liberación de citocinas mediada por el anticuerpo biespecífico anti CD123xCD3 en un ensayoin vitrode 4 días con células tumorales CD123+, CMSP humanas y linfocitos B enriquecidos sin afectar significativamente a la activación de linfocitos T (Figuras 1A-1I).

Ejemplo 2: El bloqueo de CD40 inhibió la liberación de citocinas mediada por anti-CD3 biespecífico sin afectar significativamente a la activación de linfocitos T en un ensayo de 4 días con línea celular de LMA y CMSP sin linfocitos B autólogos adicionales

Configuración experimental:

El efecto del bloqueo de CD40 sobre la liberación de citocinas se evaluó en el ensayo con CMSP humanas y la línea celular THP-1 de LMA. Las CMSP humanas se marcaron con CFSE y las células THP-1 se marcaron con Violet Cell Trace. Las CMSP marcadas y las células THP-1 se sembraron en medio completo en la proporción (10:1). Se añadieron al pocillo CD123xCD3(G) o el control CD3 de un brazo en titulaciones de 10 veces a partir de 1 pg/ml. Se utilizó el anticuerpo anti-CD40 (IgG1 mutante, REGN3794) a una concentración constante de 5 pg/ml. Las células se incubaron 4 días a 37 °C en medios completos. Las citocinas y las activaciones de linfocitos T se evaluaron 4 días después de la implementación. Se midieron las citocinas en los sobrenadantes utilizando el panel de linfocitos B humanos LegendPlex (Catálogo Biolegend n.° 740527). Para evaluar la activación de los linfocitos T, éstos se tiñeron con anticuerpos directamente conjugados con CD2, CD4, CD8, CD16, CD25 y tinción de células vivas/muertas. La activación de linfocitos T se expresa como el porcentaje de células vivas CD2+CD16-CD8+ que expresan CD25.Resultados:

El bloqueo de CD40 con anticuerpos anti-CD40 inhibió la liberación de citocinas mediada por anti-CD3 biespecífico en ensayosin vitrode 4 días con células tumorales CD123+ y CMSP humanas (sin linfocitos B adicionales) sin afectar significativamente a la activación de linfocitos T (Figuras 2A-2E). En general, se observó una mayor liberación de citocinas y un bloqueo más significativo de esta liberación por el anticuerpo anti-CD40 en los ensayos que incluían linfocitos B enriquecidos (Figuras 1A-1H) en comparación con los que no incluían (Figuras 2A-2E).

Ejemplo 3: El bloqueo de CD40 inhibió la liberación de citocinas seleccionadas mediada por anti-CD3 biespecífico sin afectar significativamente a la activación de linfocitos T ni a la destrucción de dianas en ensayos de destrucción de 4 días con línea celular de próstata y CMSP

Configuración experimental:

El efecto del bloqueo de CD40 sobre la liberación de citocinas se evaluó en el ensayo de destrucción con CMSP humanas y la línea celular de próstata 22Rv1. Las CMSP humanas se marcaron con CFSE y las células 22Rv1 se marcaron con Violet Cell Trace. Las CMSP marcadas y las células 22Rv1 se sembraron en medio completo en la proporción (20:1). Se añadieron al pocillo Steap2xCD3(G) o el control CD3 de un brazo en titulaciones de 10 veces a partir de 1 pg/ml. Se utilizó el anticuerpo anti-CD40 (IgG1 mutante, REGN3794) a una concentración constante de 5 pg/ml. Las células se incubaron 4 días a 37 °C en medios completos. Al final del cultivo, se analizó la liberación de citocinas, las células diana supervivientes y la activación de los linfocitos T mediante citometría de flujo. Se midieron las citocinas en los sobrenadantes utilizando el panel de linfocitos B humanos LegendPlex (Catálogo Biolegend n.° 740527). Para evaluar la activación de los linfocitos T y la destrucción de las células diana, se lavaron las células y se tiñeron con anticuerpos directamente conjugados con CD2, CD4, CD8, CD16, CD25 y tinción de células vivas/muertas. La activación de linfocitos T se expresa como el porcentaje de células vivas CD2+CD16-CD8+ que expresan CD25. Para la evaluación de la supervivencia de 22Rv1, las células se dividieron en poblaciones vivas marcadas con violeta. Se indica el porcentaje de población viva normalizado con respecto a la muestra no tratada.

Resultados:

El bloqueo de CD40 con anticuerpos anti-CD40 inhibió la liberación de citocinas mediada por anti-CD3 biespecífico en ensayos de destrucción in vitro de 4 días con células tumorales STEAP2+ y CMSP humanas sin afectar significativamente a la activación y citotoxicidad de los linfocitos T (Figuras 3A-3G). El alcance de la inhibición mediada por anti-CD40 varió en función de las citocinas (Figuras 3C-3G).

Ejemplo 4: El bloqueo de CD40 redujo las citocinas en CMSP tratadas con anti-CD20xCD3 biespecífico (REGN1979)

Configuración experimental:

El efecto del bloqueo de CD40 sobre la liberación de citocinas se evaluó en el ensayo de destrucción con CMSP humanas y la línea celular Ramos de LNH. Las células Ramos se marcaron con CFSE y se mezclaron con CMSP humanas en medio completo en la proporción (1:10). Se añadieron CD20xCD3 (REGN1979) o el control CD3 de un brazo al pocillo en titulaciones de 10 veces a partir de 10 pg/ml. Se utilizó el anticuerpo anti-CD40 (IgG1 mutante, REGN3794) a una concentración constante de 5 pg/ml. Las células se incubaron 4 días a 37 °C en medios completos. Al final del cultivo, se analizó la liberación de citocinas, las células diana supervivientes y la activación de los linfocitos T mediante citometría de flujo. Se midieron las citocinas en los sobrenadantes utilizando el panel de linfocitos B humanos LegendPlex (Catálogo Biolegend n.° 740527). Para evaluar la activación de los linfocitos T y la destrucción de las células diana, se lavaron las células y se tiñeron con anticuerpos directamente conjugados con CD2, CD4, CD8, CD16, CD25 y tinción de células vivas/muertas. La activación de linfocitos T se expresa como el porcentaje de células vivas CD2+CD16-CD8+ que expresan CD25. Para evaluar la supervivencia de Ramos, se calculó el número absoluto de células Ramos vivas por pocillo utilizando perlas CountBright.

Resultados:

El bloqueo de CD40 con un anticuerpo anti-CD40 inhibió la liberación de citocinas mediada por el anti-CD20xCD3 biespecífico en un ensayo de destrucciónin vitrode 4 días con células tumorales CD20+ y CMSP humanas sin afectar negativamente a la citotoxicidad (Figuras 4A-4B). La combinación de CD20xCD3 (REGN1979) anticuerpo anti-CD40 redujo la activación de linfocitos T (~35 % por debajo de CD20xCD3 (REGN1979) solo) en 1 de 2 donantes analizados (FIG 4A).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo para usar en un método para tratar el cáncer e inhibir el síndrome de liberación de citocinas en un sujeto, comprendiendo el método administrar conjuntamente al sujeto:

(a) una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno tumoral, opcionalmente, en donde la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión a antígeno del mismo; y

(b) el anticuerpo antagonista anti-CD40, o fragmento de unión a antígeno del mismo.

2. El anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo para usar de la reivindicación 1, en donde el antígeno tumoral se selecciona de CD19, CD123, STEAP2, CD20, SSTR2, CD38, STEAP1, 5T4, ENPP3, PSMA, MUC16, GPRC5D y BCMA.

3. El anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo para usar de la reivindicación 1 o 2, en donde la molécula de unión a antígeno biespecífica se selecciona de un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD19, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xGPRC5D, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD123, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xSTEAP2, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD20, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xSSTR2, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD38, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xSTEAP1, un anticuerpo biespecífico anti-CD3x5T4, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xENPP3, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xMUC16, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xBCMA y un anticuerpo biespecífico anti-CD3xPSMA.

4. Un anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo para usar en la inhibición del síndrome de liberación de citocinas causado por una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno tumoral en un sujeto, opcionalmente, en donde la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

5. El anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo para usar de la reivindicación 4, en donde el antígeno tumoral se selecciona de CD19, CD123, STEAP2, CD20, SSTR2, CD38, STEAP1, 5T4, ENPP3, PSMA, MUC16, GPRC5D y BCMA.

6. El anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo para usar de la reivindicación 4 o 5, en donde la molécula de unión a antígeno biespecífica se selecciona de un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD19, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xGPRC5D, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD123, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xSTEAP2, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD20, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xSSTR2, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD38, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xSTEAP1, un anticuerpo biespecífico anti-CD3x5T4, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xENPP3, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xMUC16, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xBCMA y un anticuerpo biespecífico anti-CD3xPSMA.

7. El anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo para usar de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde el método comprende además identificar a un sujeto susceptible de padecer el síndrome de liberación de citocinas o que necesita reducir la liberación de citocinas antes de administrar al sujeto el anticuerpo antagonista anti-CD40 o el fragmento de unión a antígeno del mismo.

8. Una composición farmacéutica que comprende:

(b) un anticuerpo antagonista anti-CD40, o fragmento de unión a antígeno del mismo.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, en donde el antígeno tumoral se selecciona de CD19, CD123, STEAP2, CD20, SSTR2, CD38, STEAP1, 5T4, ENPP3, PSMA, MUC16, GPRC5D y BCMA.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 8 o 9, en donde la molécula de unión a antígeno biespecífica se selecciona de un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD19, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xGPRC5D, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD123, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xSTEAP2, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD20, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xSSTR2, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD38, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xSTEAP1, un anticuerpo biespecífico anti-CD3x5T4, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xENPP3, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xMUC16, un anticuerpo biespecífico anti-CD3xBCMA y un anticuerpo biespecífico anti-CD3xPSMA.

11. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.

12. Una composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 8-11 para usar en un método para tratar el cáncer e inhibir el síndrome de liberación de citocinas en un sujeto.

13. La composición farmacéutica para usar de la reivindicación 12, en donde el método comprende:

(a) identificar a un sujeto que es susceptible de padecer el síndrome de liberación de citocinas o que necesita reducir la liberación de citocinas; y

(b) administrar al sujeto la composición farmacéutica.

14. El anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo para usar de la reivindicación 7 o la composición farmacéutica para usar de la reivindicación 13, en donde el sujeto susceptible de padecer el síndrome de liberación de citocinas o que necesita reducir la liberación de citocinas se identifica mediante la detección de uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en fiebre, erupción cutánea, síntomas respiratorios, hipoxia, hipotensión, disfunción cardiovascular, neurotoxicidad, disfunción hepática, insuficiencia renal, coagulación, toxicidad orgánica, carga tumoral, citocinas, proteína C reactiva (PCR), ferritina, lactato deshidrogenasa (LDH), aspartato aminotransferasa (AST), nitrógeno de urea en sangre (NUS), alanina aminotransferasa (ALT), creatinina (Cr), fibrinógeno, tiempo de protrombina (TP), tiempo de tromboplastina parcial (TTP), eotaxinas y activación de las células endoteliales.

15. El anticuerpo antagonista anti-CD40 o fragmento de unión a antígeno del mismo para usar de la reivindicación 14 o la composición farmacéutica para usar de la reivindicación 14, en donde

(a) las citocinas son una o más citocinas seleccionadas del grupo que consiste en sTNFR2, IP10, sIL1R2, sTNFR1, MIG, VEGF, sIL1R1, TNFa, IFNa, GCSF, sRAGE, IL1, IL2, IL4, IL5, IL10, IL12, IL13, IL18, IL1R1, IFN<y>, IL6, IL8, sIL2Ra, sgp130, sIL6R, MCP1, MIP1a, MIP1p, FLT-3L, fractalquina y GM-CSF; y/o

(b) la activación de las células endoteliales se detecta midiendo la concentración sérica de Ang-2 y/o del factor von Willebrand.