RS66868B1

RS66868B1 - Kompozicije i postupci za lečenje sindroma oslobađanja citokina

Info

Publication number: RS66868B1
Application number: RS20250559A
Authority: RS
Inventors: Kara Olson; Olga Sineshchekova; Eric Smith; Chia-Yang Lin
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2021-01-28
Filing date: 2022-01-28
Publication date: 2025-06-30
Also published as: US20250302949A1; DK4284512T3; WO2022165171A1; US12274747B2; HRP20250696T1; CN116963774A; LT4284512T; FI4284512T3; PL4284512T3; AU2022214319A9; KR20230157315A; IL304502A; MX2023008949A; EP4284512B1; SI4284512T1; HUE071594T2; ES3030523T3; EP4538292A2; JP2024506831A; EP4538292A3

Description

Opis pronalaska

SRODNA PRIJAVA

[0001] Ova prijava zahteva pravo prvenstva u odnosu na Privremenu SAD patentnu prijavu pod serijskim brojem 63/142,643, podnetu 28. januara 2021. godine.

STANJE TEHNIKE

[0002] Sindrom oslobađanja citokina (CRS) je sistemski inflamatorni odgovor koji može biti izazvan raznim faktorima, uklјučujući određene lekove. Kada se simptomi povezani sa CRS jave manje od šest sati nakon početka terapijske infuzije, oni mogu biti označeni kao reakcija povezana sa infuzijom (IRR).

[0003] Imunoterapije kancera koje aktiviraju T-ćelije, uklјučujući terapije bispecifičnim antitelima, nose posebno visok rizik od CRS (uklјučujući IRR). Kod takvih terapija, CRS može biti izazvan masivnim oslobađanjem IFN-γ od strane aktiviranih T-ćelija ili samih tumorskih ćelija. Izlučeni IFN-γ indukuje aktivaciju drugih imunskih ćelija, uklјučujući makrofage, koji zauzvrat proizvode prekomerne količine drugih citokina, kao što su IL-6, TNF-α i IL-10. Preciznije, IL-6 doprinosi mnogim klјučnim simptomima CRS, uklјučujući vaskularno curenje i aktivaciju kaskade komplementa i koagulacije koja indukuje diseminovanu intravaskularnu koagulaciju. IL-6 verovatno takođe doprinosi kardiomiopatiji, pospešivanjem disfunkcije miokarda (Shimabukaro-Vornhagen i saradnici (2018) Journal for Immunotherapy of Cancer 6:1-14).

[0004] Kontrolisanje toksičnosti imunoterapija kancera, uklјučujući CRS, predstavlјa izazovan klinički problem. Ublažavanje CRS i/ili IRR je klјučno za osiguravanje bezbednosti određenih imunoterapijskih pristupa, uklјučujući terapijsku upotrebu bispecifičnih antitela koja cilјano deluju na T-ćelije. Dok se CRS niskog stepena generalno može lečiti simptomatski sa antihistaminicima, antipireticima i tečnostima, ozbiljan oblik CRS može predstavlјati neželјeni događaj opasan po život koji zahteva brzo i agresivno lečenje. Određeni anti-citokinski tretmani, smanjenje doza date terapije i premedikacija sa steroidima, trenutno se upotrebljavaju za smanjenje incidencije teških oblika CRS. Na primer, tocilizumab, anti-IL-6 antitelo, upotrebljava se kao početni tretman za ozbiljan CRS u pojedinim okolnostima. Ipak, svaki od ovih trenutno dostupnih tretmana takođe može smanjiti terapijsku efikasnost imunoterapije za lečenje kancera. Ostaje stoga potreba za alternativnim strategijama za ublažavanje efekata CRS koji su potencijalno opasni po život, bez istovremenog negativnog uticaja na terapijske koristi imunoterapija kancera.

KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0005] Obim pronalaska je određen priloženim patentnim zahtevima. Bilo koji primeri izvođenja, aspekti ili primeri koji su van obima patentnih zahteva, uklјučeni su samo u svrhu upućivanja. Bilo kakva upućivanja u opisu postupaka lečenja, odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i medikamente predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja humanog (ili životinjskog) tela terapijom. Ovde su obezbeđeni postupci i kompozicije za lečenje i/ili prevenciju sindroma oslobađanja citokina (CRS), uklјučujući lečenje i/ili prevenciju reakcije povezane sa infuzijom (IRR). Kao što je ovde opisano, davanje antagonista CD40 (npr. antitela koja blokiraju CD40) može smanjiti oslobađanje citokina povezanih sa CRS, bez uticaja na aktivaciju T-ćelija i citotoksičnost indukovanu davanjem određenih imunoterapija za kancere (npr. CD3 bispecifičnih antitela, CAR T-ćelija). Stoga, prema određenim aspektima, postupci i kompozicije koji su ovde opisani, sposobni su da ublaže efekte CRS koji su potencijalno opasni po život, bez negativnog uticaja na terapijsku efikasnost imunoterapija za kancer koje aktiviraju T-ćelije, uklјučujući bispecifična antitela.

[0006] Prema pojedinim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci lečenja kancera i inhibiranja CRS (uklјučujući IRR) kod subjekta koji obuhvataju zajedničko davanje subjektu (a) multispecifičnog molekula koji vezuje antigen, koji sadrži prvi domen koji vezuje antigen i specifično se vezuje za CD3, i drugi domen koji vezuje antigen i specifično se vezuje za tumorski antigen; i (b) antagoniste CD40.

[0007] U pojedinim primerima izvođenja, multispecifičan molekul koji vezuje antigen i antagonista CD40 daju se istovremeno ili sekvencijalno. U pojedinim primerima izvođenja, antagonista CD40 se daje pre multispecifičnog molekula koji vezuje antigen.

[0008] U pojedinim primerima izvođenja, antagonista CD40 je antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. U pojedinim primerima izvođenja, antitelo koje je antagonista CD40 ili njegov fragment koji vezuje antigen je himerno, humanizovano, kompozitno, mišje ili humano. U pojedinim primerima izvođenja, antitelo koje je antagonista CD40 ili njegov fragment koji vezuje antigen izabrani su od Fv, Fav, F(ab')2), Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 i fragmenata diatela (od engl. diabody).

[0009] Prema pojedinim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci lečenja kancera i inhibiranja CRS (uklјučujući IRR) kod subjekta, koji obuhvataju zajedničko davanje subjektu (a) multispecifičnog molekula koji vezuje antigen, koji sadrži prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD3, i drugi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje tumorski antigen; i (b) CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40.

[0010] U pojedinim primerima izvođenja, multispecifičan molekul koji vezuje antigen i CAR-T-ćelija se daju istovremeno ili sekvencijalno. U pojedinim primerima izvođenja, CAR-T-ćelija se daje pre multispecifičnog molekula koji vezuje antigen.

[0011] U pojedinim primerima izvođenja, CAR-T-ćelija luči antagonistu CD40. U pojedinim primerima izvođenja, antagonista CD40 je scFv ili Fab. U pojedinim primerima izvođenja, CAR-T-ćelija eksprimira antagonistu CD40 kada je aktivirana.

[0012] Multispecifičan molekul koji vezuje antigen može biti bispecifičan molekul koji vezuje antigen ili trispecifičan molekul koji vezuje antigen. U pojedinim primerima izvođenja, trispecifičan molekul koji vezuje antigen dodatno sadrži treći domen koji vezuje antigen, a koji se specifično vezuje za dodatni T-ćelijski antigen ili dodatni tumorski antigen. U pojedinim primerima izvođenja, treći domen koji vezuje antigen specifično se vezuje za CD28. U pojedinim primerima izvođenja, tumorski antigen je izabran od CD19, CD123, STEAP2, CD20, SSTR2, CD38, STEAP1, 5T4, ENPP3, PSMA, MUC16, GPRC5D i BCMA.

[0013] U pojedinim primerima izvođenja, multispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži multispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. U pojedinim primerima izvođenja, multispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen je himerno, humanizovano, kompozitno, mišje ili humano. U pojedinim primerima izvođenja, multispecifičan molekul koji vezuje antigen je izabran od bispecifičnog CD3xCD19 antitela, bispecifičnog CD3x GPRC5D antitela, bispecifičnog CD3xCD123 antitela, bispecifičnog CD3xSTEAP2 antitela, bispecifičnog CD3xCD20 antitela, bispecifičnog CD3xSSTR 2 antitela, bispecifičnog CD3xCD38 antitela, bispecifičnog CD3xSTEAP1 antitela, bispecifičnog CD3x5T4 antitela, bispecifičnog CD3xENPP3 antitela, bispecifičnog CD3xMUC16 antitela, bispecifičnog CD3xBCMA antitela, bispecifičnog CD3xPSMA antitela i trispecifičnog CD3xCD28xCD38 antitela.

[0014] U pojedinim primerima izvođenja, postupak aktivira T-ćelije i/ili povećava T-ćelijsku citotoksičnost kod subjekta. U pojedinim primerima izvođenja, postupak indukuje smrt kancerskih ćelija kod subjekta. U pojedinim primerima izvođenja, postupak inhibira sindrom oslobađanja citokina. U pojedinim primerima izvođenja, sindrom oslobađanja citokina je inhibiran, što se meri održavanjem nivoa C-reaktivnog proteina (CRP) ispod 7 mg/dL, IFN-γ ispod 75 pg/ml i/ili IL-10 ispod 60 pg/ml.

[0015] Prema pojedinim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci inhibiranja CRS (uklјučujući IRR) prozrokovani multispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, koji sadrži prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD3, i drugi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje tumorski antigen kod subjekta, koji obuhvataju davanje subjektu CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40.

[0016] U pojedinim primerima izvođenja, subjekat je čovek. U pojedinim primerima izvođenja, subjekat je pacijent oboleo od kancera. U pojedinim primerima izvođenja, postupci koji su ovde opisani dalјe obuhvataju identifovanje subjekta koji je podložan sindromu oslobađanja citokina ili kome je potrebno smanjenje oslobađanja citokina pre davanja subjektu antagoniste CD40 ili CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40.

[0017] Prema pojedinim aspektima, ovde su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže: multispecifičan molekul koji vezuje antigen, koji sadrži prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD3, i drugi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje tumorski antigen; i antagonistu CD40. U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane dalje sadrže farmaceutski prihvatlјiv nosač.

[0018] Prema pojedinim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci lečenja kancera i/ili inhibiranja CRS (uklјučujući IRR) kod subjekta, koji obuhvataju davanje subjektu farmaceutske kompozicije koja je ovde opisana. Prema pojedinim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci lečenja kancera i/ili inhibiranja CRS (uklјučujući IRR) kod subjekta, koji obuhvataju: identifikovanje subjekta koji je podložan sindromu oslobađanja citokina ili kome je potrebno smanjenje oslobađanja citokina; i davanje subjektu farmaceutske kompozicije koja je ovde opisana.

[0019] Prema pojedinim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci lečenja kancera i/ili inhibiranja CRS (uklјučujući IRR) kod subjekta, koji obuhvataju: (a) identifikovanje subjekta koji je podložan sindromu oslobađanja citokina ili kome je potrebno smanjenje oslobađanja citokina; i (b) zajedničko davanje subjektu (1) multispecifičnog molekula koji vezuje antigen, koji sadrži prvi domen koji vezuje antigen i specifično se vezuje za CD3, i drugi domen koji vezuje antigen i specifično se vezuje za tumorski antigen; i (2) antagoniste CD40.

[0020] Prema pojedinim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci lečenja kancera i/ili inhibiranja CRS (uklјučujući IRR) kod subjekta, koji obuhvataju: (a) identifikovanje subjekta koji je podložan sindromu oslobađanja citokina ili kome je potrebno smanjenje oslobađanja citokina; i (b) zajedničko davanje subjektu (1) multispecifičnog molekula koji vezuje antigen, koji sadrži prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD3, i drugi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje tumorski antigen; i (2) CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40.

[0021] U pojedinim primerima izvođenja, subjekat podložan CRS i/ili kome je potrebno smanjenje oslobađanja citokina identifikuje se detekcijom jednog ili više biomarkera izabranih iz grupe koju čine groznica, osip, respiratorni simptomi, hipoksija, hipotenzija, kardiovaskularna disfunkcija, neurotoksičnost, hepatična disfunkcija, renalna disfunkcija, koagulacija, toksičnost za organe, opterećenje tumorom, citokini, C-reaktivni protein (CRP), feritin, laktat dehidrogenaza (LDH), aspartat aminotransferaza (AST), azot uree u krvi (BUN), alanin aminotransferaza (ALT), kreatinin (Cr), fibrinogen, protrombinsko vreme (PT), parcijalno tromboplastinsko vreme (PTT), eotaksini i aktivacija endotelnih ćelija.

[0022] U pojedinim primerima izvođenja, citokini su jedan ili više citokina izabranih iz grupe koju čine sTNFR2, IP10, sIL1R2, sTNFR1, MIG, VEGF, sIL1R1, TNFα, IFNα, GCSF, sRAGE, IL1, IL2, IL4, IL5, IL10, IL12, IL13, IL18, IL1R1, IFNγ, IL6, IL8, sIL2Rα, sgp130, sIL6R, MCP1, MIP1α, MIP1β, FLT-3L, fraktalkin i GM-CSF. U pojedinim primerima izvođenja, aktivacija endotelnih ćelija se detektuje merenjem nivoa Ang-2 i/ili fon Vilebrandovog faktora u serumu.

KRATAK OPIS SLIKA

[0023]

SL. 1A-1I pokazuju da je blokiranje CD40 inhibiralo oslobađanje citokina posredovano sa CD123xCD, bez uticaja na aktivaciju T-ćelija u 4-dnevnom testu sa PBMC obogaćenim sa autolognim B-ćelijama.

SL.2A-2E pokazuju da je blokiranje CD40 inhibiralo oslobađanje citokina posredovano sa bispecifičnim CD3 u 4-dnevnom testu sa AML ćelijskom linijom i PBMC bez dodatnih autolognih B-ćelija.

SL. 3A-3G pokazuju da je blokiranje CD40 inhibiralo oslobađanje odabranih citokina posredovano bispecifičnim CD3, bez značajnog uticaja na aktivaciju T-ćelija i ciljano ubijanje u 4-dnevnom testu ubijanja sa ćelijskom linijom iz prostate i PBMC.

SL. 4A i 4B pokazuju da je blokiranje CD40 smanjilo citokine u PBMC koje su bile tretirane sa bispecifičnim CD20xCD3 antitelom (REGN1979).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Opšte napomene

[0024] Ovde su obezbeđeni postupci i kompozicije za lečenje i/ili prevenciju sindroma oslobađanja citokina (CRS), uklјučujući lečenje i/ili prevenciju reakcije povezane sa infuzijom (IRR). Kao što je ovde opisano, davanje antagoniste CD40 (npr. antitela koja blokiraju CD40) mogu smanjiti oslobađanje citokina povezanih sa CRS, bez uticaja na aktivaciju T-ćelija i citotoksičnost indukovanu davanjem određenih imunoterapija za kancer (npr. CD3 bispecifičnih antitela, CAR T-ćelija). Stoga, prema određenim aspektima, ovde opisani postupci i kompozicije su u stanju da ublaže efekte CRS koji su potencijalno opasni po život, bez negativnog uticaja na terapijsku efikasnost imunoterapija kancera koje aktiviraju T-ćelije, uklјučujući bispecifična antitela.

[0025] Shodno navedenom, prema određenim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci lečenja i/ili prevencije CRS i/ili smanjenja simptoma povezanih sa CRS kod subjekta koji se podvrgava imunoterapiji kancera (npr. sa multispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, koji sadrži prvi domen koji vezuje antigen i specifično se vezuje za CD3 i drugi domen koji vezuje antigen i specifično se vezuje za tumorski antigen) davanjem subjektu antagoniste CD40 (npr. antagonističkog antitela koje se vezuje za CD40) i/ili CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40.

[0026] Prema pojedinim aspektima, ovde su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže: multispecifičan molekul koji vezuje antigen, koji sadrži prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD3, i drugi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje tumorski antigen; i antagonistu CD40. U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane dodatno sadrže farmaceutski prihvatlјiv nosač.

[0027] Podrazumeva se da ovaj opis nije ograničen na određene postupke i eksperimentalne uslove koji su ovde opisani, pošto takvi postupci i uslovi mogu varirati. Podrazumeva se takođe da se terminologija koja je ovde upotrebljavana, navedena samo u svrhu opisivanja određenih primera izvođenja i da nije predviđeno da bude ograničavajuća, pošto će obim predmetnog pronalaska biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima.

Definicije

[0028] Iz praktičnih razloga, ovde su prikupljeni određeni temini koji su korišćeni u specifikaciji, primerima i priloženim patentnim zahtevima. Ukoliko nije drugačije definisano, svi ovde upotrebljeni tehnički i naučni termini su sa istim značenjem koje se uobičajeno podrazumeva od strane stručnjaka iz oblasti tehnike kojoj predmetni pronalazak pripada. Kao što se ovde upotrebljava, termin „oko“, kada se upotrebljava u odnosu na određenu navedenu numeričku vrednost, označava da vrednost može varirati u odnosu na navedenu vrednost za ne više od 1%. Na primer, kako se ovde upotrebljava, izraz „oko 100” uklјučuje 99 i 101 i sve vrednosti između (npr.99,1; 99,2; 99,3; 99,4 itd.).

[0029] Jednina se ovde upotrebljavaju radi upućivanja na jedan ili više od jednog gramatičkog pojma (tj. na najmanje jedan). Na primer, „element” označava jedan element ili više od jednog elementa.

[0030] Kao što se ovde upotrebljava, termini „davati” ili „davanje” označavaju obezbeđivanje farmaceutskog agensa ili kompozicije subjektu i uklјučuju, ali nisu ograničeni na, davanje od strane medicinskog stručnjaka i samostalno davanje. Takav agens može sadržavati, na primer, CAR T-ćeliju koja je ovde obezbeđena.

[0031] Kao što se ovde upotrebljava, termin „antitelo” može se odnositi i na intaktno antitelo i na njegov fragment koji vezuje antigen. Intaktna antitela su glikoproteini koji uklјučuju najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca koji su međusobno povezani disulfidnim vezama. Svaki teški lanac uklјučuje varijabilni region teškog lanca (ovde skraćeno kao VH) i konstantni region teškog lanca. Svaki laki lanac uklјučuje varijabilni region lakog lanca (ovde skraćeno kao VL) i konstantni region lakog lanca. VHi VLregioni mogu dalje biti podeljeni na regione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), a koji su ispresecani sa regionima koji su više evolutivno očuvani i označeni kao uokvirujući regioni (FR). Svaki VHi VLse sastoji od tri CDR i četiri FR, raspoređenih od amino-kraja ka karboksi-kraju po sledećem rasporedu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Termin „antitelo” uključuje, na primer, monoklonska antitela, poliklonska antitela, himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela, trispecifična antitela), jednolančana antitela i fragmente antitela koji vezuju antigen.

[0032] Termini „fragment koji vezuje antigen” i „deo koji vezuje antigen” antitela, kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se vezuju za antigen. Neograničavajući primeri fragmenata koji vezuju antigen uklјučuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab')2 fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jednolančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAb fragmente; i (vii) minimalne jedinice prepoznavanja koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji imitiraju hipervarijabilni region antitela (npr. izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) kao što je CDR3 peptid) ili kruti FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi molekuli dobijeni genetičkim inženjeringom, kao što su antitela specifična za domen, antitela sa jednim domenom, antitela sa delecijom uklonjenim domenima, himerna antitela, antitela sa CDR graftom, diatela, triatela, tetratela, minitela, nanotela (npr. monovalentna nanotela, bivalentna nanotela itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIP) i varijabilni IgNAR domeni ajkule, takođe su obuhvaćeni izrazom „fragment koji vezuje antigen“, kako se ovde upotrebljava.

[0033] „Kancer” se u širem smislu odnosi na nekontrolisan, abnormalan rast ćelija samog domaćina, koji dovodi do invazije okolnog tkiva i potencijalno tkiva koja se nalaze distalno u odnosu na početno mesto abnormalnog rasta ćelija kod domaćina. Glavne klase uklјučuju karcinome, što su kanceri epitelnog tkiva (npr. kože, skvamoznih ćelija); sarkome, koji su kanceri vezivnog tkiva (npr. kostiju, hrskavice, masnog tkiva, mišića, krvnih sudova itd.); leukemije, što su kanceri krvotvornog tkiva (npr. tkiva kosne srži); limfomi i mijelomi, što su kanceri imunskih ćelija; i kancere centralnog nervnog sistema, koji uklјučuju kancere iz tkiva mozga i kičmene moždine. „Kancer(i) i” „neoplazma(e)” se ovde upotrebljavaju naizmenično. Kao što se ovde upotrebljava, „kancer” se odnosi na sve tipove kancera ili neoplazmi ili malignih tumora, uklјučujući leukemije, karcinome i sarkome, bilo da su novonastali ili rekurentni. Specifični primeri kancera su: karcinomi, sarkomi, mijelomi, leukemije, limfomi i tumori mešovitog tipa. Neograničavajući primeri kancera su novonastali ili rekurentni kanceri mozga, melanom, kancer bešike, dojke, grlića materice, debelog creva, glave i vrata, bubrega, pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, mezoteliom, kancer jajnika, prostate, sarkom, kancer želuca, materice i meduloblastom. U pojedinim primerima izvođenja, kancer obuhvata solidni tumor. U pojedinim primerima izvođenja, kancer obuhvata metastazu.

[0034] Termin „himerni antigenski receptor” (CAR) odnosi se na molekule koji kombinuju vezujući domen za komponente prisutne na cilјnoj ćeliji, na primer, specifičnost zasnovanu na antitelu za želјeni antigen (npr. tumorski antigen) sa unutarćelijskim domenom koji aktivira T-ćelijski receptor, da bi se generisao himerni protein koji ispoljava specifičnu ćelijsku imunsku aktivnost za određeni ciljni molekul. U principu, CAR se sastoje od vanćelijskog jednolančanog domena koji vezuje antigen (scFv) fuzionisanog sa unutarćelijskim signalnim domenom zeta lanca T-ćelijskog antigenskog receptorskog kompleksa i imaju sposobnost, kada se eksprimiraju u T-ćelijama, da preusmere prepoznavanje antigena na osnovu specifičnosti monoklonskog antitela.

[0035] Kao što se ovde upotrebljava, izraz „zajednička davanje” ili „zajednički dato” odnosi se na bilo koji oblik davanja dva ili više različitih terapijskih agenasa tako da se drugi agens daje dok je prethodno dat terapijski agens još uvek efektivan u organizmu (npr. dva agensa su istovremeno efektivna kod subjekta, što može uklјučivati sinergistične efekte dva agensa). Na primer, različiti terapijski agensi mogu biti davani bilo u istoj formulaciji ili u odvojenim formulacijama, bilo istovremeno ili sekvencijalno. U određenim primerima izvođenja, različiti terapijski agensi mogu biti davani jedan u odnosu na drugog unutar perioda od oko jednog sata, oko 12 sati, oko 24 sata, oko 36 sati, oko 48 sati, oko 72 sata ili oko nedelјu dana. Prema tome, subjekat koji prima takav tretman može imati koristi od kombinovanog dejstva različitih terapijskih agenasa.

[0036] „Kostimulatorni domen” ili „kostimulatorni molekul” odnosi se na srodnog vezujućeg partnera na T-ćeliji koji se specifično vezuje sa kostimulatornim ligandom, čime posreduje u kostimulatornom odgovoru ćelije, kao što je, ali ne ograničavajući se na, proliferacija. Kostimulatorni domen može biti humani kostimulatorni domen. Primeri kostimulatornih molekula uklјučuju CD28, 4-1BB, CD27, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antigen-1 povezan sa funkcijom limfocita (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C i B7-H3.

[0037] „Kostimulatorni ligand” se odnosi na molekul na ćeliji koja prezentuje antigene, koji se specifično vezuje za srodni kostimulatorni molekul na T-ćeliji, čime se obezbeđuje signal koji posreduje u odgovoru T-ćelija, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, aktivaciju proliferacije, diferencijacije i sličnog. Kostimulatorni ligand može uključivati, ali nije ograničen na, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, inducibilni kostimulatorni ligand (ICOS-L), unutarćelijski adhezionni molekul (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor limfotoksina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, agonistu ili antitelo koje se vezuje za Toll ligandni receptor i liganda koji se specifično vezuje za B7-H3.

[0038] „Kostimulatorni signal” se odnosi na signal, koji u kombinaciji sa primarnim signalom, dovodi do proliferacije T-ćelija i/ili povećanja ili smanjenja ekspresije klјučnih molekula.

[0039] Termin „epitop” odnosi se na antigenu determinantu koja interaguje sa specifičnim mestom vezivanja antigena u varijabilnom regionu molekula antitela poznatom kao paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Prema tome, različita antitela se mogu vezivati za različite oblasti na antigenu i mogu imati različite biološke efekte. Epitopi mogu biti konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop nastaje od prostorno neposredno postavljenih aminokiselina iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je onaj koji nastaje od susednih aminokiselinskih ostataka u polipeptidnom lancu. U određenim okolnostima, epitop može uključivati ostatke saharida, fosforil grupe ili sulfonil grupe na antigenu.

[0040] Kao što se ovde upotrebljava, izraz „farmaceutski prihvatlјiv” odnosi se na one agense, jedinjenja, materijale, kompozicije i/ili dozne oblike koji su, u okviru zdrave medicinske procene, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima lјudskih bića i životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijske reakcije ili drugih problema ili komplikacija, srazmerno razumnom odnosu koristi i rizika.

[0041] Kao što se ovde upotrebljava, fraza „farmaceutski prihvatlјiv nosač” označava farmaceutski prihvatlјiv materijal, kompoziciju ili nosač, kao što je tečan ili čvrst agens za ispunjavanje, razblaživač, ekscipijens ili materijal rastvarača za kapsuliranje, koji je uklјučen u prenošenje ili transport agensa iz jednog organa ili dela tela u drugi organ ili deo tela. Svaki nosač mora biti „prihvatlјiv” u kontekstu da je kompatibilan sa ostalim sastojcima formulacije i da nije štetan za pacijenta. Pojedini primeri materijala koji mogu poslužiti kao farmaceutski prihvatlјivi nosači uklјučuju: (1) šećere, kao što su laktoza, glukoza i saharoza; (2) skrobove, kao što su kukuruzni skrob i skrob krompira; (3) celulozu i njene derivate, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i celulozni acetat; (4) praškasti tragakant; (5) slad; (6) želatin; (7) talk; (8) ekscipijense, kao što su puter kakaa i voskovi za supozitorije; (9) ulјa, kao što su ulјe kikirikija, ulјe semenki pamuka, ulјe šafrana, susamovo ulјe, maslinovo ulјe, kukuruzno ulјe i sojino ulјe; (10) glikoli, kao što je propilen glikol; (11) polioli, kao što su glicerin, sorbitol, manitol i polietilen glikol; (12) estri, kao što su etil oleat i etil laurat; (13) agar; (14) puferski agensi, kao što su magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; (15) alginska kiselina; (16) voda oslobođena od pirogena; (17) izotonični fiziološki rastvor; (18) Ringerov rastvor; (19) etil alkohol; (20) rastvori sa puferisanim pH; (21) poliesteri, polikarbonati i/ili polianhidridi; i (22) druge netoksične kompatibilne supstance koje se koriste u farmaceutskim formulacijama.

[0042] Termini „polinukleotid” i „nukleinska kiselina” upotrebljavaju se naizmenično. Oni se odnose na prirodni ili sintetički molekul, ili neku njihovu kombinaciju, koji sadrži jedan nukleotid ili dva ili više nukleotida povezanih preko fosfatne grupe na 3' poziciji jednog nukleotida sa 5' krajem drugog nukleotida. Polimerni oblik nukleotida nije ograničen dužinom i može sadržavati bilo dezoksiribonukleotide ili ribonukleotide, ili njihove analoge. Polinukleotidi mogu imati bilo koju trodimenzionalnu strukturu i mogu obavlјati bilo koju funkciju. Slede neograničavajući primeri polinukleotida: kodirajući ili nekodirajući regioni gena ili fragmenta gena, lokusi (lokus) definisani analizom vezanosti, egzoni, introni, informaciona RNK (iRNK), transportna RNK, ribozomska RNK, ribozimi, cDNK, rekombinantni polinukleotidi, razgranati polinukleotidi, plazmidi, vektori, izolovana DNK bilo koje sekvence, izolovana RNK bilo koje sekvence, probe tipa nukleinskih kiselina i prajmeri. Polinukleotid može sadržavati modifikovane nukleotide, kao što su metilovani nukleotidi i nukleotidni analozi. Ukoliko su prisutne, modifikacije nukleotidne strukture mogu biti izvršene pre ili nakon udruživanja polimera. Polinukleotid dalje može biti modifikovan, kao što je konjugacijom sa komponentom za obeležavanje. U svim sekvencama nukleinskih kiselina koje su ovde obezbeđene, U nukleotidi mogu biti zamenjeni sa T nukleotidima. Polinukleotid nije nužno povezan sa ćelijom u kojoj se nukleinska kiselina nalazi u prirodi, i/ili je operativno povezan sa polinukleotidom sa kojim je povezan u prirodi.

[0043] Kao što se ovde upotrebljava, terapeutik za „prevenciju” stanja odnosi se na jedinjenje koje, kada je dato statističkom uzorku pre početka poremećaja ili stanja, smanjuje pojavu poremećaja ili stanja u tretiranom uzorku u odnosu na netretirani kontrolni uzorak, ili odlaže početak ili smanjuje ozbiljnost jednog ili više simptoma poremećaja ili stanja u odnosu na netretirani kontrolni uzorak.

[0044] Termin „suštinska identičnost” ili „suštinski identičan“, kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, ukazuje da, kada je optimalno poravnata sa odgovarajućim nukleotidnim insercijama ili delecijama sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identičnost nukleotidne sekvence u najmanje oko 95%, a poželјnije najmanje oko 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih baza, izmereno bilo kojim dobro poznatim algoritmom identičnosti sekvenci, kao što su FASTA, BLAST ili Gap, kao što je objašnjeno u nastavku teksta. Molekul nukleinske kiseline koji je suštinski identičan referentnom molekulu nukleinske kiseline može, u određenim slučajevima, kodirati polipeptid koji ima istu ili suštinski sličnu aminokiselinska sekvencu kao polipeptid koga kodira referentni molekul nukleinske kiseline.

[0045] Kada se primenjuje na polipeptide, termin „značajna sličnost” ili „značajno sličan” označava da dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što je upotrebom programa GAP ili BESTFIT, ondnosno upotrebom zadatih težina gapova, dele identičnost sekvenci od najmanje 95%, još poželјnije identičnost sekvenci od najmanje 98% ili 99%. Poželјno je i da se pozicije ostataka koje nisu identične razlikuju po tipu konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. „Konzervativna aminokiselinska supstitucija” je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupu) sa sličnim hemijskim osobinama (npr. naelektrisanjem ili hidrofobnošću). U principu, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće značajno promeniti funkcionalne osobine proteina. U slučajevima kada se dve ili više aminokiselinskih sekvenci razlikuju jedna u odnosu na drugu po konzervativnim supstitucijama, procenat identičnosti sekvenci ili stepen sličnosti može biti podešen naviše, da bi se korigovala konzervativna priroda supstitucije. Načini za izvođenje ovog podešavanja su dobro poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Pogledati, npr. Pirson (1994) Methods Mol. Biol.24: 307-331. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim osobinama uklјučuju (1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; (2) alifatično-hidroksilne bočne lance: serin i treonin; (3) bočne lance koji sadrže amide: asparagin i glutamin; (4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin i triptofan; (5) bazne bočne lance: lizin, arginin i histidin; (6) kisele bočne lance: aspartat i glutamat, i (7) bočne lance koji sadrže sumpor, što su cistein i metionin. Poželјne konzervativne grupe aminokiselinske supstitucije su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 logaritamskoj matrici verovatnoće koja je opisana u Gonnet i saradnici (1992) Science 2561443-1445. „Umereno konzervativna” zamena je bilo koja promena koja ima vrednost u PAM250 logaritamskoj matrici verovatnoće koja nije negativna.

[0046] Termini „specifično se vezuje” ili „specifično vezivanje“, kako se ovde upotrebljavaju, kada se odnosi na polipeptid, odnosi se na reakciju vezivanja koja je odlučujuća za prisustvo proteina ili polipeptida ili receptora u heterogenoj populaciji proteina i drugih bioloških materijala. Prema tome, pod definisanim uslovima (npr. uslovima imunskog testa u slučaju antitela), specifično definisan ligand ili antitelo se „specifično vezuje” za svoju određeni „ciljni molekul” (npr. antitelo se specifično vezuje za endotelni antigen) kada se ne vezuje u značajnoj količini za druge proteine prisutne u uzorku ili za druge proteine sa kojima ligand ili antitelo mogu doći u kontakt u organizmu. U principu, prvi molekul koji se „specifično vezuje” za drugi molekul ima konstantu afiniteta (Ka) veću od oko 10<5>M<-1>(npr.10<6>M<-1>, 10<7>M<-1>, 10<8>M<-1>, 10<9>M<-1>, 10<10>M<-1>, 10<11>M<-1>i 10<12>M<-1>ili više) sa tim drugim molekulom. Na primer, u slučaju sposobnosti CAR specifičnog za PIG je da se veže za peptid prezentovan na MHC (npr. MHC klase I ili MHC klase II); obično, CAR se specifično vezuje za svoj peptid/MHC sa afinitetom od najmanje KD od oko 10⁻⁴ M ili manje, i vezuje se za unapred određeni antigen/partner za vezivanje sa afinitetom (izraženim kroz KD) koji je najmanje 10 puta manji, najmanje 100 puta manji ili najmanje 1000 puta manji od njegovog afiniteta za vezivanje za nespecifičan i nesrodan peptid/MHC kompleks (npr. onaj koji sadrži BSA peptid ili kazeinski peptid).

[0047] Kao što se ovde upotrebljava, termin „subjekt” označava čoveka ili životinju koja je različita od čoveka i izabrana je za lečenje ili terapiju.

[0048] Kao što se ovde upotrebljava, termin „lečenje” odnosi se na kliničku intervenciju osmišlјenu tako da promeni prirodan tok pravca kliničke patologije kod pojedinca koji se leči. Poželјni efekti lečenja uklјučuju smanjenje stope progresije, ublažavanje ili palijaciju patološkog stanja, kao i remisiju ili pobolјšanu prognozu za određenu bolest, poremećaj ili stanje. Pojedinac je uspešno „lečen“, na primer, ukoliko se jedan ili više simptoma povezanih sa određenom bolešću, poremećajem ili stanjem ublaže ili eliminišu.

Sindrom oslobađanja citokina (CRS)

Opšte napomene

[0049] Prema određenim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci i kompozicije za lečenje i/ili prevenciju sindroma oslobađanja citokina (CRS). Simptomi povezani sa CRS mogu uklјučivati reakciju povezanu sa infuzijom (IRR), ukoliko se ista javi manje od šest sati nakon početka terapijske infuzije. Prema tome, u određenim primerima izvođenja, ovde obezbeđeni postupci i kompozicijekoji mogu biti korisni u lečenju i/ili prevenciji CRS i/ili simptoma CRS, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, IRR.

[0050] CRS je toksičnost povezana sa citokinima koja je potencijalno opasna po život, a koja se može javiti kao rezultat imunoterapije kancera, npr. terapija antitelima za kancer (npr. bispecifičnim antitelima) i/ili T-ćelijskim imunoterapijama (npr. CAR T-ćelijama). CRS nastaje usled imunske aktivacije visokog nivoa, kada veliki broj limfocita i/ili mijeloidnih ćelija oslobađa inflamatorne citokine nakon aktivacije. Ozbiljnost CRS i vreme pojave simptoma mogu varirati u zavisnosti od veličine aktivacije imunskih ćelija, vrste date terapije i/ili obima opterećenja tumorom kod subjekta. U slučaju T-ćelijske terapije za kancer, pojava simptoma je obično nakon nekoliko dana do nedelja od davanja T-ćelijske terapije, npr. kada je prisutan pik in vivo ekspanzije T-ćelija. Pogledati, npr. Li i saradnici (2014) Blood.124:188-195.

[0051] Simptomi CRS mogu uklјučivati neurološku toksičnost, diseminovanu intravaskularnu koagulaciju, srčanu disfunkciju, sindrom respiratornog distresa kod odraslih, bubrežnu insuficijenciju i/ili insuficijenciju jetre. Na primer, simptomi CRS mogu uklјučivati groznicu sa ili bez rigora, umor, malaksalost, mijalgije, povraćanje, glavobolјu, mučninu, anoreksiju, artalgije, dijareju, osip, hipoksemiju, tahipneu, hipotenziju, prošireni pulsni pritisak, potencijalno smanjen srčani izlaz (kasni), povećan srčani izlaz (rani), azotemiju, hipofibrinogenemiju sa ili bez krvarenja, povišen D-dimer, hiperbilirubinemiju, transaminitis, konfuziju, delirijum, promene mentalnog statusa, halucinacije, tremor, epileptične napade, izmenjen hod, poteškoće u pronalaženju reči, izrazitu afaziju ili dimetriju.

Utvrđivanje stepena ozbiljnosti CRS

[0052] Prema određenim aspektima, ovde obezbeđeni postupci i kompozicije mogu biti upotrebljeni za lečenje i/ili prevenciju CRS bilo kog stepena ozbiljnosti. U određenim primerima izvođenja, postupci i kompozicije koji su ovde obezbeđeni upotrebljavaju se u lečenju i/ili prevenciji ozbiljnog CRS.

[0053] Lečenje CRS može slediti strategiju praćenja i terapije prilagođenu stepenu i riziku. Razvijeno je i opisano nekoliko sistema za određivanje stepena ozbiljnosti CRS, npr. u Porter i saradnici (2018) J. Hematol Oncol.11:35, Lee i saradnici (2014) Blood 124:188-195, Neelapu i saradnici (2018) Nat. Rev. Clin. Oncol.15:47-62, Neelapu i saradnici (2018) Nat. Rev. Clin. Oncol.15:218, Teachey i saradnici (2016) Cancer Discov. 6:664-679 i objavi SAD patentne prijave br. 2019/0335404. Bilo koji od ovih CRS sistema određivanja ozbiljnosti CRS može biti upotrebljen za procenu, postavljanje dijagnoze, stratifikovanje ili identifikovanje subjekata za postupke koji su ovde obezbeđeni.

[0054] U pojedinim primerima izvođenja, stepen ozbiljnosti CRS može biti određen od 1 do 5 na sledeći način. Stepeni 1-3 su manje ozbiljni oblici CRS. Stepeni 4-5 su ozbiljni oblici CRS. Za CRS 1. stepena, potrebno je samo simptomatsko lečenje (npr. za mučninu, groznicu, umor, mijalgiju, malaksalost, glavobolјu) i simptomi nisu opasni po život. Kod CRS 2. stepena, simptomi zahtevaju umerenu intervenciju i generalno reaguju na umerenu intervenciju. Osobe sa CRS 2. stepena razvijaju hipotenziju koja reaguje bilo na tečnosti ili na jednu nisku dozu vazopresora; ili one razvijaju toksičnost organa 2. stepena ili blage respiratorne simptome koji reaguju na kiseonik niskog protoka (<40% kiseonika). Kod osoba sa CRS 3. stepena, hipotenzija se generalno ne može preokrenuti terapijom tečnostima ili jednom niskom dozom vazopresora. Ovim subjektima je u principu potrebno više od kiseonika niskog protoka i oni imaju toksičnost organa 3. stepena (npr. renalnu ili srčanu disfunkciju ili koagulopatiju) i/ili transaminitis 4. stepena. Osobe sa CRS 3. stepena zahtevaju agresivniju intervenciju, npr. kiseonik od 40% ili više, visoke doze vazopresora i/ili višestruke vazopresore. Osobe sa CRS 4. stepena pate od neposrednih simptoma opasnih po život, uklјučujući toksičnost organa 4. stepena ili potrebu za mehaničkom ventilacijom. Subjekti sa CRS 4. stepena u principu nemaju transaminitis. Kod osoba sa CRS 5. stepena, toksičnost prouzrokuje smrt. Na primer, kriterijumi za procenu ozbiljnosti CRS su opisani u objavi SAD patentne prijave br.2019/0336504.

[0055] U određenim primerima izvođenja, postupci i/kompozicije koji su ovde obezbeđeni leče i/ili sprečavaju CRS 5. stepena. U određenim primerima izvođenja, postupci i/kompozicije koji su ovde obezbeđeni, leče i/ili sprečavaju CRS 4. stepena. U određenim primerima izvođenja, postupci i/kompozicije koji su ovde obezbeđeni, leče i/ili sprečavaju CRS 3. stepena. U određenim primerima izvođenja, postupci i/kompozicije koji su ovde obezbeđeni, leče i/ili sprečavaju CRS 2. stepena. U određenim primerima izvođenja, postupci i/kompozicije koji su ovde obezbeđeni, leče i/ili sprečavaju CRS 1. stepena.

Identifikovanje subjekta koji je sa rizikom da razvije CRS

[0056] U određenim primerima izvođenja, ovde obezbeđeni postupci uklјučuju lečenje subjekta podložnog CRS i/ili kome je potrebno smanjenje oslobađanja citokina. U pojedinim primerima izvođenja, ovde obezbeđeni postupci obuhvataju identifikovanje subjekta podložnog CRS i/ili kome je potrebno smanjenje oslobađanja citokina.

[0057] U pojedinim primerima izvođenja, upotrebljavaju se jedan ili više biomarkera za procenu (npr. postavljanje dijagnoze ili identifikovanje) subjekta podložnog CRS ili kome je potrebno smanjenje oslobađanja citokina. U pojedinim primerima izvođenja, jedan ili više biomarkera su izabrani od groznice, osipa, respiratornih simptoma, hipoksije, hipotenzije, kardiovaskularne disfunkcije, neurotoksičnosti, hepatične disfunkcije, renalne disfunkcije, koagulacije, toksičnosti za organe, opterećenja tumorom, citokina, eotaksina, C-reaktivnog proteina (CRP), feratina, kreatinina i aktivacije endotelnih ćelija itd.

[0058] U određenim primerima izvođenja, citokini za primer uklјučuju, ali nisu ograničeni na, npr. sTNFR2, IP10, sIL1R2, sTNFR1, MIG, VEGF, sIL1R1, TNFα, IFNα, GCSF, sRAGE, IL1, IL2, IL4, IL5, IL10, IL12, IL13, IL18, IL1R1, IFNγ, IL6, IL8, sIL2Rα, sgp130, sIL6R, MCP1, MIP1α, MIP1β, FLT-3L, fraktalin i GM-CSF. U pojedinim primerima izvođenja, jedan ili više (npr. dva ili više, ili tri ili više) citokina, sTNFR2, IP10, sIL1R2, sTNFR1, MIG, VEGF, sIL1R1, TNFα, IFNα, GCSF, sRAGE, IL1, IL2, IL4, IL5, IL10, IL12, IL13, IL18, IL1R1, IFNγ, IL6, IL8, sIL2Rα, sgp130, sIL6R, MCP1, MIP1α, MIP1β, FLT-3L, fraktalkin i GM-CSF, upotrebljavaju se za procenu (npr. postavljanje dijagnoze ili identifikovanje) subjekta podložnog CRS ili kome je potrebno smanjenje oslobađanja citokina.

[0059] Biomarkeri za primer koji se upotrebljavaju za procenu (npr. predviđanje) ozbiljnosti CRS, mogu takođe uklјučivati procene opterećenja bolešću, npr. obim bolesti (npr. kancera) kod subjekta. Na primer, procena opterećenja bolešću može biti izvršena utvrđivanjem nivoa bolesti (npr. kancera) u biološkom uzorku iz subjekta. Na primer, visoko opterećenje bolešću je naznačeno prisustvom najmanje 25% (npr.

25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više) kancerskih ćelija u biološkom uzorku dobijenom iz subjekta (npr. što se utvrđuje na osnovu morfologije u uzorku aspirata ili biopsije, testom sa protokom upotrebom aspirata ili biopsije i/ili sa MRD). U pojedinim primerima izvođenja, visoko opterećenje bolešću je naznačeno prisustvom najmanje 50% kancerskih ćelija u biološkom uzorku dobijenom iz subjekta. Na primer, nisko opterećenje bolešću je naznačeno prisustvom manje od 25% (npr.

24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 15%, 10%, 5% ili manje) kancerskih ćelija u biološkom uzorku dobijenom iz subjekta (npr. utvrđenom morfologijom u okviru aspirata ili biopsije, testom sa protokom upotrebom aspirata ili biopsije i/ili sa MRD). U pojedinim primerima izvođenja, nisko opterećenje bolešću je naznačeno prisustvom manje od 0,1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20% ili 25% kancerskih ćelija u biološkom uzorku dobijenom iz subjekta

[0060] U pojedinim primerima izvođenja, jedan ili više citokina u kombinaciji sa procenom opterećenja bolešću upotrebljava se za procenu (npr. postavljanje dijagnoze ili identifikovanje) subjekta podložnog CRS ili kome je potrebno smanjenje oslobađanja citokina.

[0061] Drugi biomarker za primer koji se upotrebljava za procenu (npr. postavljanje dijagnoze ili identifikovanje) subjekta podložnog CRS ili kome je potrebno smanjenje oslobađanja citokina uklјučuje nivo ili aktivnost C-reaktivnog proteina (CRP). U primerima izvođenja, subjekat sa niskim rizikom od ozbiljnog CRS identifikuje se kao onaj koji ima nivo CRP manji od 7 mg/dL (npr.7, 6,8; 6, 5, 4, 3, 2, 1 mg/dL ili manje). U pojedinim primerima izvođenja, subjekat sa visokim rizikom od ozbiljnog CRS identifikuje se kao osoba sa višim nivoom CRP u uzorku (npr. uzorku krvi) u poređenju sa subjektom sa niskim rizikom od ozbiljnog CRS ili u poređenju sa kontrolnim nivoom ili aktivnošću. U pojedinim primerima izvođenja, veći nivo ili aktivnost je najmanje 2 puta veći (npr. najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 500, 1000 puta ili više veći) u poređenju sa subjektom sa niskim rizikom od ozbiljnog CRS ili u poređenju sa kontrolnim nivoom ili aktivnošću.

[0062] U pojedinim primerima izvođenja, jedan ili više biomarkera koji su ovde opisani, upotrebljavaju se za predviđanje rizika ili ozbiljnosti CRS kod subjekta rano nakon davanja antagoniste CD40 i/ili CD3 multispecifičnog antitela koji su ovde opisani. U pojedinim primerima izvođenja, jedan ili više od ovde opisanih biomarkera upotrebljava se za predviđanje rizika ili ozbiljnosti CRS kod subjekta unutar 2 nedelјe, npr. unutar 1 nedelјe ili manje nakon davanja ovde opisanog antagoniste CD40 i/ili CD3 multispecifičnog antitela. U pojedinim primerima izvođenja, biomarkeri koji su ovde opisani, upotrebljavaju se za predviđanje rizika ili ozbiljnosti CRS kod subjekta unutar 10 dana (npr. 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 dan ili manje nakon davanja ovde opisanog antagoniste CD40 i/ili CD3 multispecifičnog antitela. U pojedinim primerima izvođenja, biomarkeri koji su ovde opisani, upotrebljavaju se za predviđanje rizika ili ozbiljnosti CRS kod subjekta unutar 1-10 dana (npr. unutar 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 ili 1 dan nakon davanja ovde opisanog antagoniste CD40 i/ili CD3 multispecifičnog antitela. U pojedinim primerima izvođenja, biomarkeri koji su ovde opisani, upotrebljavaju se za predviđanje rizika ili ozbiljnosti CRS kod subjekta pre nego što subjekat doživi jedan ili više simptoma CRS 2., 3., 4. ili 5. stepena (npr. pre nego što subjekat doživi jedan ili više simptoma 3., 4. ili 5. stepena, ili CRS 4. ili 5. stepena).

[0063] U pojedinim primerima izvođenja, povišeni ili smanjeni nivoi jednog ili više od citokina koji su ovde opisani, npr. sTNFR2, IP10, sIL1R2, sTNFR1, VEGF, sIL1R1, TNFα, IFNα, GCSF, sRAGE, IL1, IL2, IL4, IL5, IL10, IL12, IL13, IL18, IL1R1, IFNγ, IL6, IL8, sIL2Rα, sgp130, sIL6R, MCP1, MIP1α, MIP1β, FLT-3L, fraktalkina i GM-CSF, u odnosu na kontrolni nivo, ukazuju da je subjekat podložan CRS ili da mu je potrebno smanjenje oslobađanja citokina, ili da je u riziku da razvije ozbiljan CRS. Kontrolni nivo može biti referentni nivo, bazalni nivo, nivo kod zdravog subjekta, nivo kod subjekta koji ima poremećaj ili stanje (npr. kancer) drugačiji od CRS, nivo kod subjekta pre davanja CD3 multispecifičnog antitela i/ili antagoniste CD40 koji su ovde opisani, ili kod subjekat sa određenim stepenom CRS.

[0064] U pojedinim primerima izvođenja, povišenje jednog ili više od citokina koji su ovde opisani (npr. jednog ili više od IFNγ, IL6, IL10, sgp130, IL18, TNFα, IL8, IP10, MCP1, MIG, MIP1β i sIL6R) za najmanje 2 puta (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000 puta ili više) u odnosu na kontrolni nivo (npr. bazalni nivo), ukazuje da je subjekat podložan CRS ili da mu je potrebno smanjenje oslobađanja citokina, ili da je u riziku da razvije ozbiljan CRS.

[0065] U pojedinim primerima izvođenja, smanjenje jednog ili više od citokina koji su ovde opisani (npr. jednog ili više od IL1R1, MIP1α i IL13) za najmanje 10% (npr. najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 99%) u odnosu na referentni nivo, ukazuje da je subjekat podložan CRS ili da mu je potrebno smanjenje oslobađanja citokina, ili da je u riziku da razvije ozbiljan CRS. U pojedinim primerima izvođenja, referentni nivo je vrednost koja ne zavisi od bazalnog nivoa citokina kod subjekta. U pojedinim primerima izvođenja, referentni nivo je bazalna vrednost citokina ili bazalne vrednosti citokina u skladu sa opterećenjem bolešću.

[0066] U pojedinim primerima izvođenja, povišenje jednog ili više od citokina koji su ovde opisani (npr. IFNγ, IL6, IL10, sgp130, IL18, TNFα, IL8, IP10, MCP1, MIG, MIP1β i sIL6R), npr. za najmanje 2 puta (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 500, 1000 puta ili više) u odnosu na kontrolni nivo, npr. kada se nivo meri unutar 1-10 dana (npr. unutar 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 ili 1 dana) nakon davanja ovde opisanog CD3 multispecifičnog antitela, ukazuje da je subjekat podložan CRS ili da mu je potrebno smanjenje oslobađanja citokina, ili da je u riziku da razvije ozbiljan CRS.

[0067] U pojedinim primerima izvođenja, nivo CRP manji od 7 mg/dL (npr.7, 6,8; 6, 5, 4, 3, 2, 1 mg/dL ili manje), npr. kada se nivo meri unutar 1-10 dana (npr. unutar 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 ili 1 dana nakon davanja CD3 multispecifičnog antitela koje je ovde opisano, ukazuje da je subjekat u niskom riziku da razvije ozbiljan CRS.

[0068] U primerima izvođenja, nivo CRP od 6 mg/dL ili više (npr.6, 6,8; 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 mg/dL ili više), npr. kada se nivo meri unutar 1-10 dana (npr. unutar 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 ili 1 dana nakon davanja CD3 multispecifičnog antitela koje je ovde opisano, ukazuje da je subjekat u visokom riziku da razvije ozbiljan CRS.

[0069] Prema određenim aspektima, opis obezbeđuje postupak praćenja CRS (npr. praćenje pacijenta koji ima CRS0, CRS1, CSR2 ili CRS3) ili praćenja razvoja ozbiljnog CRS, što obuhvata procenu jednog ili više biomarkera CRS koji su ovde opisani. Postupak može uklјučivati merenje jednog ili više biomarkera u mnoštvu vremenskih tačaka, npr. u 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više vremenskih tačaka. Prema određenim aspektima, opis obezbeđuje postupak kontrole CRS, koji obuhvata procenu subjekta koji je u riziku da razvije CRS (npr. ozbiljan CRS) i opciono davanje tretmana za CRS, npr. tretmana koji je ovde opisan.

Identifikovanje subjekta koji ima CRS

[0070] U određenim primerima izvođenja, postupci koji su ovde obezbeđeni uklјučuju lečenje subjekta koji ima CRS. U pojedinim primerima izvođenja, u pojedinim primerima izvođenja, ovde obezbeđeni postupci uklјučuju korak utvrđivanja da li subjekat ima CRS (npr. ozbiljan CRS). Postupak uklјučuje sticanje statusa rizika od CRS kod subjekta, npr. kao odgovora na imunoterapiju za kancer, npr. sa CD3 multispecifičnim antitelom, pri čemu navedeni status rizika od CRS uklјučuje merenje jednog ili više od nivoa ili aktivnosti jednog ili više (npr.3, 4, 5, 10, 15, 20, ili više) citokina izabranih od ssTNFR2, IP10, sIL1R2, sTNFR1, MIG, VEGF, sIL1R1, TNFα, IFNα, GCSF, sRAGE, IL1, IL2, IL4, IL5, IL10, IL12, IL13, IL18, IL1R1, IFNγ, IL6, IL8, sIL2Rα, sgp130, sIL6R, MCP1, MIP1α, MIP1β, FLT-3L, fraktalkina i GM-CSF, ili laboratorijske testove (npr. analite) izabrane od C-reaktivnog proteina (CRP), feritina, laktat dehidrogenaze (LDH), aspartat aminotransferaze (AST), azota uree u krvi (BUN), alanin aminotransferaze (ALT), kreatinina (Cr), fibrinogena, protrombinskog vremena (PT), parcijalnog tromboplastinskog vremena (PTT), ili njihove kombinacije, u uzorku (npr. uzorku krvi).

[0071] U pojedinim primerima izvođenja, nivo feritina od najmanje oko 23.500, 25.000, 30.000, 40.000, 50.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 150.000, 200.000 ili 250.000 ng/ml, a opciono do oko 299.000 ili 412.000 ng/ml, ukazuje na CRS (npr. ozbiljan CRS). U pojedinim primerima izvođenja, nivo feritina manji od oko 23.500, 20.000, 18.000, 16.000, 14.000, 12.000, 10.000, 9.000, 8.000, 7.000, 6.000, 5.000, 4.000, 3.000, 2.000 ili 1.000 ng/ml i opciono veći od oko 280 ng/ml, ukazuje da subjekat nema CRS (npr. ozbiljan CRS).

[0072] U pojedinim primerima izvođenja, nivo LDH od najmanje oko 1.700, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 15.000 ili 20.000 U/L, i opciono do oko 24.000 U/L, ukazuje na CRS (npr. ozbiljan CRS). U pojedinim primerima izvođenja, nivo LDH manji od oko 1.700, 1.500, 1.400, 1.300, 1.200, 1.100, 1.000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 ili 200 U/L, i opciono veći od oko 159 U/L, ukazuje da subjekat nema CRS (npr. ozbiljan CRS).

[0073] U pojedinim primerima izvođenja, nivo CRP od najmanje oko 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ili 35 mg/dL, a opciono do oko 38 mg/dL, ukazuje na CRS (ozbiljan CRS). U pojedinim primerima izvođenja, nivo CRP manji od oko 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 mg/dL, a opciono veći od oko 0,7 mg/dL, ukazuje da subjekat nema CRS (npr. ozbiljan CRS).

[0074] U pojedinim primerima izvođenja, nivo ALT od najmanje oko 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 980, 900, 950 ili 1000 U/L, a opciono do 1300 U/L, ukazuje na CRS (npr. ozbiljan CRS). U pojedinim primerima izvođenja, nivo ALT manji od oko 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 ili 30 U/L, i opciono veći od oko 25 U/L, ukazuje da subjekat nema CRS (npr. ozbiljan CRS).

[0075] U pojedinim primerima izvođenja, nivo AST od najmanje oko 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 980, 900, 950, 1000 U/L, i opciono do oko 1500 U/L, ukazuje na CRS (npr. ozbiljan CRS). U pojedinim primerima izvođenja, nivo AST manji od oko 150, 140, 130, 120, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 ili 30 U/L, i opciono veći od oko 15 U/L, ukazuje da subjekat nema CRS (npr. ozbiljan CRS).

[0076] U pojedinim primerima izvođenja, nivo BUN od najmanje oko 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 ili 190 mg/dL, a opciono do oko 210 mg/dL, ukazuje na CRS (npr. ozbiljan CRS). U pojedinim primerima izvođenja, nivo BUN manji od oko 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ili 10 mg/dL, i opciono veći od oko 5 mg/dL, ukazuje da subjekat nema CRS (npr. ozbiljan CRS).

[0077] U pojedinim primerima izvođenja, nivo fibrinogena manji od oko 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 ili 30 mg/dL, i opciono veći od oko 20 mg/dL, ukazuje na CRS (npr. ozbiljan CRS). U pojedinim primerima izvođenja, nivo fibrinogena od najmanje oko 150, 160, 170, 180, 190, 200 ili 210 mg/dL, a opciono do oko 230 mg/dL, ukazuje da subjekat nema CRS (npr. ozbiljan CRS).

[0078] U pojedinim primerima izvođenja, nivo PT od najmanje oko 17, 18, 19, 20, 21 ili 22 sekundi, a opciono do oko 24 sekunde, ukazuje na CRS (npr. ozbiljan CRS). U pojedinim primerima izvođenja, nivo PT manji od oko 17, 16, 15 ili 14 sekundi, a opciono veći od oko 12 sekundi, ukazuje da subjekat nema CRS (npr. ozbiljan CRS).

[0079] U pojedinim primerima izvođenja, nivo PTT od najmanje oko 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60, 65, 70, 75, 80 ili 85 sekundi, a opciono do oko 95 sekundi, ukazuje na CRS (npr. ozbiljan CRS). U pojedinim primerima izvođenja, PTT nivo manji od oko 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28 ili 27 sekundi, i opciono veći od oko 25 sekundi, ukazuje da subjekat nema CRS (npr. ozbiljan CRS).

[0080] U pojedinim primerima izvođenja, pacijent sa ozbiljnim CRS ima IFN-γ >75 pg/ml i IL-10 >60 pg/ml. U pojedinim primerima izvođenja, pacijent sa ozbiljnim CRS ima IFN-γ veći ili jednak 40, 50, 60, 70 ili 75 pg/ml, nivo IL-10 veći ili jednak 30, 40, 50 ili 60 pg/ml, ili bilo koju od njihovih kombinacija.

[0081] Dodatni biomarkeri za procenu da li subjekat ima CRS ili je u riziku da razvije CRS opisani su u objavama SAD patentnih prijava br.2019/0336504 i 2018/0252727.

Terapijska antitela

Opšte napomene

[0082] Prema određenim aspektima, postupci i kompozicije koji su ovde obezbeđeni, odnose se na upotrebu terapijskih antitela (npr. antagonističkih anti-CD40 antitela i/ili bispecifičnih antitela koja vezuju CD3).

[0083] Kao što je prethodno navedeno i kako se ovde upotrebljava, termin „antitelo” obuhvata i kompletne molekule antitela i fragmente kompletnih molekula antitela koji vezuju antigen. Neograničavajući primeri fragmenata koji vezuju antigen uklјučuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab')2 fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jednolančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAb fragmente; i (vii) minimalne jedinice prepoznavanja koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji imitiraju hipervarijabilni region antitela (npr. izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) kao što je CDR3 peptid), ili kruti FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi molekuli dobijeni genetičkim inženjeringom, kao što su antitela specifična za domen, antitela sa jednim domenom, antitela sa delecijom uklonjenim domenom, himerna antitela, antitela sa CDR graftom, diatela, triatela, tetratela, minitela, nanotela (npr. monovalentna nanotela, bivalentna nanotela itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIP) i varijabilni IgNAR domeni ajkule, takođe su obuhvaćeni izrazom „fragment koji vezuje antigen“, kako se on ovde upotrebljava.

[0084] Fragment antitela koji vezuje antigen obično će sadržavati najmanje jedan varijabilni domen. Varijabilni domen može biti bilo koje veličine ili aminokiselinskog sastava i u principu će sadržavati najmanje jedan CDR koji je susedan ili u okviru čitanja sa jednom ili više uokvirujućih sekvenci. U fragmentima koji vezuju antigen, a koji imaju VHdomen povezan sa VLdomenom, VHi VLdomeni mogu biti raspoređeni jedan u odnosu na drugog po bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, varijabilni region može biti dimeran i sadržavati VH-VH, VH-VLili VL-VLdimere. Alternativno, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržavati monomerni VHili VLdomen.

[0085] U određenim primerima izvođenja, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržavati najmanje jedan varijabilni domen kovalentno povezan sa najmanje jednim konstantnim domenom. Neograničavajuće konfiguracije varijabilnih i konstantnih domena za primer koje se mogu naći unutar fragmenta antitela koji vezuje antigen predmetnog pronalaska uklјučuju: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL. U bilo kojoj konfiguraciji varijabilnih i konstantnih domena, uklјučujući bilo koju od prethodno navedenih konfiguracija za primer, varijabilni i konstantni domeni mogu biti bilo direktno povezani jedan sa drugim ili mogu biti povezani putem potpunog ili delimičnog zglobnog ili linkerskog regiona. Zglobni region se može sastojati od najmanje 2 (npr. 5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina koje obrazuju fleksibilnu ili polufleksibilnu vezu između susednih varijabilnih i/ili konstantnih domena u jednom polipeptidnom molekulu. Štaviše, fragment antitela koje vezuje antigen predmetnog pronalaska može sadržavati homodimer ili heterodimer (ili drugi multimer) bilo koje od konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena koje su prethodno navedene, u nekovalentnoj vezi sa jednom drugom i/ili sa jednim ili više monomernih VHili VLdomena (npr. preko disulfidne(ih) veze(a)).

[0086] Kao i kod kompletnih molekula antitela, fragmenti koji vezuju antigen mogu biti monospecifični ili multispecifični (npr. bispecifični). Multispecifični fragment antitela koji vezuje antigen obično će sadržavati najmanje dva različita varijabilna domena, pri čemu je svaki varijabilni domen sposoban da se specifično vezuje za odvojeni antigen ili za različit epitop na istom antigenu. Bilo koji format multispecifičnog antitela, uklјučujući formate bispecifičnih antitela za primer koji su ovde opisani, može biti prilagođen za upotrebu u kontekstu fragmenta antitela koji vezuje antigen predmetnog pronalaska, upotrebom rutinskih tehnika dostupnih u oblasti tehnike. U određenim primerima izvođenja koji su ovde obezbeđeni, najmanje jedan varijabilni domen multispecifičnog antitela je sposoban da se specifično vezuje za CD3.

[0087] U pojedinim primerima izvođenja, antitela koja su ovde obezbeđena mogu funkcionisati putem citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC) ili citotoksičnosti posredovane ćelijama zavisne od antitela (ADCC). „Citotoksičnost zavisna od komplementa” (CDC) odnosi se na lizu ćelija koje eksprimiraju antigen od strane antitela pronalaska u prisustvu komplementa. „Citotoksičnost posredovane ćelijama zavisna od antitela” (ADCC) odnosi se na reakciju posredovanu ćelijama, u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju Fc receptore (FcR) (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili i makrofagi) prepoznaju vezano antitelo na cilјnoj ćeliji i time dovode do lize cilјne ćelije. CDC i ADCC mogu biti mereni upotrebom testova koji su dobro poznati i dostupni u oblasti tehnike. (Pogledati, npr. SAD patente br.5,500,362 i 5,821,337, kao i Clynes i saradnici (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656). Konstantni region antitela je važan za sposobnost antitela da fiksira komplement i posreduje u citotoksičnosti zavisnoj od ćelija. Prema tome, izotip antitela može biti izabran na osnovu toga da li je poželјno da antitelo posreduje u citotoksičnosti.

[0088] U određenim primerima izvođenja koji su ovde obezbeđeni, antagonistička anti-CD40 antitela ili CD3 multispecifična (npr. bispecifična ili trispecifična) antitela koja su ovde obezbeđena su humana antitela. Predviđeno je da termin „humano antitelo“, kako se ovde upotrebljava, uključuje antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana antitela pronalaska mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (npr. mutacije uvedene slučajnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR, a posebno CDR3. Ipak, nije predviđeno da termin „humano antitelo“, kako se ovde upotrebljava, uključuje antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativnih sekvenci drugih vrsta sisara, kao što je miš, koje su u vidu grafta povezane sa humanim uokvirujućim sekvencama.

[0089] Antitela koja su ovde obezbeđena, u pojedinim primerima izvođenja, mogu biti rekombinantna humana antitela. Predviđeno je da termin „rekombinantno humano antitelo“, kako se ovde upotrebljava, uključuje sva humana antitela koja su pripremlјena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na rekombinanat način, kao što su antitela eksprimirana upotrebom rekombinantnog ekpresionog vektora koji je transfekcijom uveden u ćeliju domaćina (detalјnije opisano u nastavku teksta), antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanih antitela (detalјnije opisano u nastavku teksta), antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koji je transgen za humane imunoglobulinske gene (pogledati, npr. Taylor i saradnici (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ili antitela pripremlјena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji uklјučuje obradu humanih imunoglobulinskih genskih sekvenci sa drugim DNK sekvencama. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. U određenim primerima izvođenja, međutim, takva rekombinantna humana antitela se podvrgavaju in vitro mutagenezi (ili, kada se koristi transgena životinja sa humanim Ig sekvencama, in vivo somatskoj mutagenezi), čime su aminokiselinske sekvence VHi VLregiona rekombinantnih antitela zapravo sekvence koje, iako su izvedene iz i srodne sa humanim germinativnim VHi VLsekvencama, mogu biti one koje prirodno ne postoje unutar germinativnog repertoara humanih antitela in vivo.

[0090] Humana antitela mogu postojati u dva oblika koji su povezani sa heterogenošću zglobnog regiona. U jednom obliku, molekul imunoglobulina sadrži stabilan konstrukt četiri lanca od približno 150-160 kDa, u kome se dimeri drže zajedno međulančanom disulfidnom vezom između teških lanaca. U drugom obliku, dimeri nisu povezani međulančanim disulfidnim vezama i obrazuje se molekul od oko 75-80 kDa sastavlјen od kovalentno kuplovanog lakog i teškog lanca (polu-antitelo). Ove oblike je izuzetno teško razdvojiti, čak i nakon afinitetnog prečišćavanja.

[0091] Učestalost pojave drugog oblika u raznim intaktnim IgG izotipovima je posledica, ali nije ograničena na, strukturne razlike povezane sa zglobnim regionom izotipa antitela. Jedna aminokiselinska supstitucija u zglobnom regionu humanog IgG4 zglobnog regiona može značajno smanjiti pojavu drugog oblika (Angal i saradnici (1993) Molecular Immunology 30:105) do nivoa koji se obično uočava upotrebom zglobnog regiona humanog IgG1. Predmetni pronalazak obuhvata antitela koja imaju jednu ili više mutacija u zglobnom, CH2 ili CH3 regionu, a koja može biti poželjna, na primer, u proizvodnji, da bi se pobolјšao prinos želјenog oblika antitela.

[0092] Antitela pronalaska mogu biti izolovana antitela. „Izolovano antitelo“, kako se ovde upotrebljava, označava antitelo koje je identifikovano i razdvojeno i/ili izolovano od najmanje jedne komponente iz njegovog prirodnog okruženja. Na primer, antitelo koje je razdvojeno ili uklonjeno od najmanje jedne komponente organizma, ili iz tkiva ili ćelije u kojoj antitelo prirodno postoji ili se prirodno proizvodi, za potrebe predmetnog pronalaska je „izolovano antitelo”. Izolovano antitelo takođe uklјučuje antitelo in situ, unutar rekombinantne ćelije. Izolovana antitela su antitela koja su bila podvrgavana najmanje jednom koraku prečišćavanja ili izolacije. Prema određenim primerima izvođenja, izolovano antitelo može biti značajno oslobođeno od drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.

[0093] U određenim primerima izvođenja, postupci i kompozicije koje su ovde obezbeđeni uklјučuju antitela sa jednim krakom koja vezuju CD40. Kao što se ovde upotrebljava, „antitelo sa jednim krakom” označava molekul koji vezuje antigen, a koji sadrži jedan težak lanac antitela i jedan laki lanac antitela.

Varijante sekvenci

[0094] U pojedinim primerima izvođenja, antagonistička anti-CD40 antitela i/ili CD3 multispecifična (npr. bispecifična ili trispecifična) antitela koja su ovde opisana, mogu sadržavati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u uokvirujućim i/ili CDR regionima varijabilnih domena teških i lakih lanaca u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama iz kojih su antitela izvedena. Takve mutacije lako mogu biti utvrđene poređenjem aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane sa germinativnim sekvencama dostupnim, na primer, u javnim bazama podataka sekvenci antitela. Predmetni pronalazak uključuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji su izvedeni iz bilo koje od aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane, gde je jedna ili više aminokiselina unutar jednog ili više uokvirujućih i/ili CDR regiona mutirana u odgovarajući(e) ostatak(e) germinativne sekvence iz koje je antitelo izvedeno, ili u odgovarajući(e) ostatak(e) druge humane germinativne sekvence, ili u konzervativnu aminokiselinsku supstituciju odgovarajućeg(ih) germinativnog(ih) ostatka(a) (takve promene sekvence se ovde zajednički označavaju kao „germinativne mutacije“). Prosečno iskusan stručnjak iz oblasti tehnike, polazeći od sekvenci varijabilnih regiona teških i lakih lanaca koji su ovde opisani, može lako proizvesti brojna antitela i fragmente koji vezuju antigen, a koji sadrže jednu ili više pojedinačnih germinativnih mutacija ili njihove kombinacije. U određenim primerima izvođenja, svi ostaci uokvirujućih i/ili CDR unutar VHi/ili VLdomena su povratno mutirani u ostatke koji se nalaze u originalnoj germinativnoj sekvenci iz koje je antitelo izvedeno. U drugim primerima izvođenja, samo određeni ostaci se povratno mutiraju do originalne germinativne sekvence, npr. samo se mutiraju ostaci koji se nalaze unutar prvih 8 aminokiselina FR1 ili unutar poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili su samo mutirani ostaci koji se nalaze unutar CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim primerima izvođenja, jedan ili više ostataka uokvirujućih i/ili CDR su mutirani u odgovarajući ostatak(e) različite germinativne sekvence (tj. germinativnu sekvencu koja je različita od geminativne sekvence iz koje je antitelo prvobitno izvedeno). Štaviše, antitela predmetnog pronalaska mogu sadržavati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija unutar uokvirujućih i/ili CDR regiona, npr. gde su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence, dok su određeni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne sekvence zadržani ili su mutirani u odgovarajući ostatak druge germinativne sekvence. Jednom dobijeni, antitela i fragmenti koji vezuju antigene i sadrže jednu ili više germinativnih mutacija, lako mogu biti ispitani u pogledu jedne ili više želјenih osobina, kao što su pobolјšana specifičnost vezivanja, povećano vezivanje (npr. izmereno titracijom vezivanja ćelija ili FACS vezivanja) ili afinitetom vezivanja (npr. KD), pobolјšana ili pojačane antagonističke ili agonističke biološke osobine (u zavisnosti od slučaja), smanjena imunogenost itd. Antitela i fragmenti koji vezuju antigen dobijeni na ovaj opšti način obuhvaćeni su predmetnim pronalaskom.

[0095] U pojedinim primerima izvođenja, antagonistička anti-CD40 antitela ili CD3 multispecifična (npr. bispecifična ili trispecifična) antitela koja su ovde obezbeđena, obuhvataju varijante bilo koje od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane i koje imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, u određenim primerima izvođenja, antagonistička anti-CD40 antitela ili CD3 multispecifična (npr. bispecifična ili trispecifična) antitela koja su ovde obezbeđena, imaju HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, npr.10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje itd. konzervativnih aminokiselinskih supstitucija u odnosu na bilo koju od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane.

FC varijante

[0096] Prema određenim primerima izvođenja koji su ovde navedeni, obezbeđena su antitela i multispecifični molekuli koji vezuju antigen koji sadrže Fc domen koji sadrži jednu ili više mutacija koje pojačavaju ili smanjuju vezivanje antitela za FcRn receptor, npr. pri kiselom pH, u poređenju sa neutralnim pH. Na primer, predmetni pronalazak uklјučuje antitela koja sadrže mutaciju u CH2 ili CH3 regionu Fc domena, pri čemu mutacija(e) povećava(ju) afinitet Fc domena za FcRn u kiseloj sredini (npr. u endozomu gde je pH opsega od oko 5,5 do oko 6,0). Takve mutacije mogu dovesti do povećanja poluživota antitela u serumu kada je isto dato životinji. Neograničavajući primeri takvih Fc modifikacija uklјučuju, npr. modifikaciju na poziciji 250 (npr. E ili Q); 250 i 428 (npr. L ili F); 252 (npr. L/Y/F/W ili T), 254 (npr. S ili T) i 256 (npr. S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju na poziciji 428 i/ili 433 (npr. H/L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr. H/F ili Y); ili modifikaciju na poziciji 250 i/ili 428; ili modifikaciju na poziciji 307 ili 308 (npr.308F, V308F) i 434. U jednom primeru izvođenja, modifikacija obuhvata modifikaciju tipa 428L (npr. M428L) i 434S (npr. N434S); modifikaciju tipa 428L, 259I (npr. V259I) i 308F (npr. V308F); modifikaciju tipa 433K (npr. H433K) i 434 (npr.434Y); modifikaciju tipa 252, 254 i 256 (npr.252Y, 254T i 256E); modifikaciju tipa 250Q i 428L (npr. T250Q i M428L); i modifikaciju tipa 307 i/ili 308 modifikaciju (npr.308F ili 308P).

[0097] Na primer, predmetni pronalazak uklјučuje CD3 multispecifične molekule koji vezuju antigen (npr. bispecifična anti-CD3/anti-MUC16, anti-BCMA x anti-CD3 ili anti-CD3/anti-CD20 bispecifična antitela), koji sadrže Fc domen koji sadrži jedan ili više parova ili grupa mutacija izabranih iz grupe koja se sastoji od: 250Q i 248L (npr. T250Q i M248L); 252Y, 254T i 256E (npr. M252Y, S254T i T256E); 428L i 434S (npr. M428L i N434S); i 433K i 434F (npr. H433K i N434F). Sve moguće kombinacije prethodno navedenih mutacija Fc domena i drugih mutacija unutar varijabilnih domena antitela koja su ovde opisana, razmatraju se u okviru obima predmetnog pronalaska.

Bioekvivalenti

[0098] Ovde su obezbeđeni molekuli koji vezuju antigen sa aminokiselinskim sekvencama koje se razlikuju od onih navedenih kod molekula za primer koji su ovde opisani, ali koji zadržavaju sposobnost vezivanja za isti antigen ili antigene. Takve varijante molekula mogu sadržavati jednu ili više adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina u poređenju sa matičnom sekvencom, ali ispoljavaju biološku aktivnost koja je suštinski ekvivalentna onoj kod opisanih bispecifičnih molekula koji vezuju antigene.

[0099] Predmetni pronalazak uključuje molekule koji vezuju antigen koji su bioekvivalentni bilo kom od ovde navedenih molekula za primer koji vezuju antigen. Dva proteina, ili antitela, koji vezuju antigen, smatraju se bioekvivalentnima ukoliko su, na primer, farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alternative čija stopa i stepen apsorpcije ne pokazuju značajnu razliku kada se daju u istoj molarnoj dozi pod sličnim eksperimentalnim uslovima, bilo pojedinačno ili u višestrukim dozama. Pojedini proteini koji vezuju antigen smatraće se ekvivalentima ili farmaceutskim alternativama ukoliko su ekvivalentni po obimu apsorpcije, ali ne i po njihovoh stopi apsorpcije, a ipak se mogu smatrati bioekvivalentnima pošto su takve razlike u stopi apsorpcije namerne i odražavaju se u obeležavanju, a zapravo nisu neophodne za postizanje efektivnih koncentracija leka u telu pri, npr. hroničnoj upotrebi, tako da se smatraju bez medicinskog značaja za određeni lekoviti proizvod koji se proučava.

[0100] U jednom primeru izvođenja, dva proteina koji vezuju antigen su bioekvivalentna ukoliko ne postoje klinički smislene razlike u njihovoj bezbednosti, čistoći i potenciji.

[0101] U jednom primeru izvođenja, dva proteina koji vezuju antigen su bioekvivalentna ukoliko pacijent može biti prebačen jednom ili više puta sa referentnog proizvoda na biološki proizvod i obratno, bez očekivanog povećanja rizika od neželјenih efekata, uklјučujući klinički značajnu promenu imunogenosti ili smanjenje efikasnosti, u poređenju sa kontinuiranom terapijom bez takvih prebacivanja.

[0102] U jednom primeru izvođenja, dva proteina koji vezuju antigen su bioekvivalentna ukoliko oba deluju zajedničkim mehanizmom ili mehanizmima delovanja za stanje ili uslove upotrebe, u meri u kojoj su takvi mehanizmi poznati.

[0103] Bioekvivalentnost može biti dokazana in vivo i in vitro postupcima. Mere bioekvivalentnosti uklјučuju, npr. (a) in vivo test na lјudima ili drugim sisarima, u kome se koncentracija antitela ili njegovih metabolita meri u krvi, plazmi, serumu ili drugoj biološkoj tečnosti kao funkcija vremena; (b) in vitro test koji je u korelaciji sa i koji razumno predviđa podatke o bioraspoloživosti kod lјudi in vivo; (c) in vivo test na lјudima ili drugim sisarima u kome se odgovarajući akutni farmakološki efekat antitela (ili njegovog ciljnog molekula) meri kao funkcija vremena; i (d) u dobro kontrolisanom kliničkom ispitivanju koje ustanovljava bezbednost, efikasnost ili bioraspoloživost ili bioekvivalenciju proteina koji vezuje antigen.

[0104] Bioekvivalentne varijante bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za primer koji su ovde navedeni, mogu biti konstruisane, na primer, pravlјenjem raznih supstitucija ostataka ili sekvenci ili delecijom terminalnih ili unutrašnjih ostataka ili sekvenci koje nisu potrebne za biološku aktivnost. Na primer, ostaci cisteina koji nisu neophodni za biološku aktivnost mogu biti uklonjeni delecijama ili zamenjeni sa drugim aminokiselinama, da bi se sprečilo obrazovanje nepotrebnih ili netačnih međumolekulskih disulfidnih mostova nakon renaturacije. U drugim kontekstima, bioekvivalentni proteini koji vezuju antigen mogu uklјučivati varijante bispecifičnih molekula koji vezuju antigen za primer koji su ovde navedeni, a koje sadrže aminokiselinske promene koje modifikuju karakteristike glikozilacije molekula, npr. mutacije koje eliminišu ili uklanjaju glikozilaciju.

Vezivanje antitela

[0105] Kao što se ovde upotrebljava, termin „vezivanje” u kontekstu vezivanja antitela, imunoglobulina, fragmenta koji vezuje antitelo ili proteina koji sadrži Fc bilo za, npr. unapred određeni antigen, kao što je protein ćelijske površine ili njegov fragment, obično se odnosi na interakciju ili asocijaciju između najmanje dva entiteta ili molekulske strukture, kao što je interakcija antitelo-antigen.

[0106] Na primer, afinitet vezivanja obično odgovara KDvrednosti od oko 10<-7>M ili manje, kao što je oko 10<-8>M ili manje, kao što je oko 10<-9>M ili manje kada se ista određuje, na primer, tehnologijom rezonancije površinskog plazmona (SPR) u BIAcore 3000 instrumentu, upotrebom antigena kao liganda i antitela, Ig, fragmenta koji vezuje antitelo ili proteina koji sadrži Fc kao analita (ili antiliganda). Strategije vezivanja zasnovane na ćelijama, kao što su testovi vezivanja sa sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS), takođe se rutinski upotrebljavaju, a FACS podaci su u dobroj korelaciji sa drugim postupcima kao što su kompetitivno vezivanje radioliganda i SPR (Benedict CA, J Immunol Methods.1997, 201(2):223-31; Geuijen CA i saradnic, J Immunol Methods.2005, 302(1-2):68-77).

[0107] Shodno navedenom, antitelo ili protein koji vezuje antigen koji su ovde obezbeđeni, vezuju se za unapred određeni antigen ili molekul (receptor) na površini ćelije koji ima afinitet koji odgovara KDvrednosti koja je najmanje deset puta niža od njegovog afiniteta za vezivanje za nespecifični antigen (npr. BSA, kazein). Prema predmetnom pronalasku, afinitet antitela koji odgovara KDvrednosti koja je jednaka ili manja od deset puta niže vrednosti u odnosu na vezivanje nespecifičnog antigen, može biti smatrati vezivanjem koje se ne može detektovati, međutim, takvo antitelo može biti upareno sa drugim krakom za vezivanje antigena radi proizvodnje bispecifičnog antitela pronalaska.

[0108] Termin „KD” (M) se odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antiteloantigen, ili ravnotežnu konstantu disocijacije antitela ili fragmenta koji vezuje antitelo za antigen. Postoji inverzna veza između KDi afiniteta vezivanja, zbog čega što je manja KDvrednost, to je veći tj. jači, afinitet. Prema tome, termini „veći afinitet” ili „jači afinitet” odnose se na veću sposobnost obrazovanja interakcije i samim tim na manju KDvrednost, i obrnuto, dok se termini „niži afinitet” ili „slabiji afinitet” odnose na manju sposobnost obrazovanja interakcije i stoga na veću KDvrednost. U pojedinim okolnostima, veći afinitet vezivanja (ili KD) određenog molekula (npr. antitela) za svoj interaktivni partnerski molekul (npr. antigen X) u poređenju sa afinitetom vezivanja molekula (npr. antitela) sa drugim interaktivnim partnerskim molekulom (npr. antigenom Y) može biti izražen kao odnos vezivanja utvrđen delјenjem veće KDvrednosti (nižeg ili slabijeg afiniteta) sa manjim KD(većim ili jačim afinitetom), na primer, a time i izražen kao 5 puta ili 10 puta veći afinitet vezivanja, zavisno od slučaja.

[0109] Termin „kd” (sek-1 ili 1/s) odnosi se na konstantu stope disocijacije određene interakcije antiteloantigen ili konstantu stope disocijacije antitela ili fragmenta koji se vezuje za antitelo. Navedena vrednost se takođe označava kao koffvrednost.

[0110] Termin „ka” (M-1 x sek-1 ili 1/M) odnosi se na konstantu stope asocijacije određene interakcije antitelo-antigen ili konstantu stope asocijacije antitela ili fragmenta koji se vezuje za antitelo.

[0111] Termin „KA” (M-1 ili 1/M) odnosi se na ravnotežnu konstantu asocijacije određene interakcije antitelo-antigen, ili ravnotežnu konstantu asocijacije antitela ili fragmenta koji se vezuje za antitelo. Konstanta ravnoteže asocijacije se dobija delјenjem kasa kd.

[0112] Termin „EC50” ili „EC50” odnosi se na polovinu maksimalne efektivne koncentracije, koja uklјučuje koncentraciju antitela koja indukuje odgovor na pola puta između bazalne i maksimalne vrednosti nakon određenog vremena izlaganja. EC50u suštini predstavlјa koncentraciju antitela kod koje se uočava 50% njegovog maksimalnog efekta. U određenim primerima izvođenja, EC50vrednost je jednaka koncentraciji antitela pronalaska koja daje polumaksimalno vezivanje za ćelije koje eksprimiraju CD3 ili antigen povezan sa tumorom (npr. CD123, STEAP2, CD20, PSMA, SSTR2, CD38, STEAP1, 5T4, ENPP3, MUC16 ili BCMA), što se određuje, npr. FACS testom vezivanja. Prema tome, smanjeno ili slabije vezivanje se uočava kao povećan EC5050, ili polovina maksimalne vrednosti efektivne koncentracije.

[0113] U jednom primeru izvođenja, smanjeno vezivanje multispecifičnih antitela za CD3 može biti definisano kao povećana EC50koncentracija antitela koja omogućava vezivanje za polovinu maksimalne količine cilјnih ćelija.

[0114] U drugom primeru izvođenja, EC50vrednost predstavlјa koncentraciju CD3 multispecifičnog antitela pronalaska koja izaziva polovinu od maksimalnog smanjenja broja cilјnih ćelija putem citotoksične aktivnosti T-ćelija. Prema tome, povećana citotoksična aktivnost (npr. ubijanje tumorskih ćelija posredovano T-ćelijama) uočava se sa smanjenim EC50, ili polovinom od maksimalne vrednosti efektivne koncentracije.

Vezivanje zavisno od pH

[0115] U pojedinim primerima izvođenja, predmetni pronalazak uključuje antitela i multispecifične molekule koji vezuju antigen sa karakteristikama vezivanja zavisnim od pH. Na primer, CD3 multispecifično antitelo predmetnog pronalaska može ispoljavati smanjeno vezivanje za CD3 pri kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH. Alternativno, CD3 multispecifična antitela predmetnog pronalaska mogu ispoljavati pojačano vezivanje za CD3 pri kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH. Izraz „kiseli pH” uključuje pH vrednosti manje od oko 6,2, npr. oko 6,0; 5,95; 5,9; 5,85; 5,8; 5,75; 5,7; 5,65; 5,6; 5,55; 5,5; 5,45; 5,4; 5,35; 5,3; 5,25; 5,2; 5,15; 5,1; 5,05; 5,0 ili manje. Kao što se ovde upotrebljava, izraz „neutralan pH” označava pH od oko 7,0 do oko 7,4. Izraz „neutralni pH” uključuje pH vrednosti od oko 7,0; 7,05; 7,1; 7,15; 7,2; 7,25; 7,3; 7,35 i 7,4.

[0116] U određenim slučajevima, „smanjeno vezivanje... pri kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH” izražava se odnosom KDvrednosti vezivanja antitela za njegov antigen pri kiselom pH u odnosu na KDvrednost vezivanja antitela za njegov antigen pri neutralnom pH (ili obrnuto). Na primer, za potrebe predmetnog pronalaska, CD3 multispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen se mogu smatrati onima koji ispoljavaju „smanjeno vezivanje za CD3 pri kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH” ukoliko CD3 multispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen pokazuju odnos kisele/neutralne KDvrednosti od oko 3,0 ili više. U određenim primerima izvođenja, odnos kisele/neutralne KDvrednosti za antitelo ili fragment koji vezuje antigen predmetnog pronalaska može biti oko 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5;, 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10,0; 10,5; 11,0; 11,5; 12,0; 12,5; 13,0; 13,5; 14,0; 14,5; 15,0; 20,0; 25,0; 30,0; 40,0; 50,0; 60,0; 70,0; 100,0 ili više.

[0117] Antitela sa karakteristikama vezivanja zavisnim od pH vrednosti mogu biti dobijena, npr. skriningom populacije antitela u kontekstu smanjenog (ili pojačanog) vezivanje za određeni antigen pri kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH. Dodatno, modifikacije domena koji vezuje antigen na nivou aminokiselina mogu dati antitela sa karakteristikama zavisnim od pH. Na primer, supstitucijom jedne ili više aminokiselina u okviru domena koji vezuje antigen (npr. unutar CDR) sa ostatkom histidina, može biti dobijeno antitelo sa smanjenim vezivanjem antigena pri kiselom pH u odnosu na neutralni pH.

Priprema domena koji vezuju antigen i konstruisanje multispecifičnih molekula

[0118] Domeni koji vezuju antigen specifični za određene antigene mogu biti pripremljeni bilo kojom tehnologijom za generisanje antitela koja je poznata u oblasti tehnike. Jednom dobijeni, dva različita domena koji vezuju antigen, specifična za dva različita antigena (npr. CD3 i humani tumorski antigen (npr. MUC16, BCMA, CD20 itd.)), mogu biti odgovarajuće raspoređeni jedan u odnosu na drugog tako da se proizvede bispecifičan molekul koji vezuje antigen predmetnog pronalaska upotrebom rutinskih postupaka. U određenim primerima izvođenja, jedna ili više pojedinačnih komponenti (npr. teški i laki lanci) multispecifičnih molekula koji vezuju antigen pronalaska izvedeni su iz himernih, humanizovanih ili potpuno humanih antitela. Postupci za pravlјenje takvih antitela su dobro poznati u oblasti tehnike. Na primer, jedan ili više teških i/ili lakih lanaca bispecifičnih molekula koji vezuju antigen predmetnog pronalaska mogu biti pripremljeni upotrebom VELOCIMMUNE<™>tehnologije. Upotrebom VELOCIMMUNE<™>tehnologije (ili bilo koje druge tehnologije za generisanje humanih antitela), najpre se izoluju himerna antitela visokog afiniteta za određeni antigen (npr. CD3 ili humani tumorski antigen (npr. MUC16, BCMA, CD20 itd.)) koja imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Antitela se zatim karakterišu i selektuju na osnovu poželјnih karakteristika, uklјučujući afinitet, selektivnost, epitop itd. Mišji konstantni regioni se dalje zamenjuju želјenim humanim konstantnim regionom da bi se generisali potpuno humani teški i/ili laki lanci koji mogu biti ugrađeni u bispecifične molekule koji vezuju antigen predmetnog pronalaska.

[0119] Genetički modifikovane životinje mogu biti upotrebljene za pravlјenje humanih bispecifičnih molekula koji vezuju antigen. Na primer, može biti upotrebljen genetički modifikovan miš koji nije u stanju da preuredi i eksprimira endogenu varijabilnu sekvencu imunoglobulinskog lakog lanca miša, pri čemu miš eksprimira samo jedan ili dva varijabilna domena humanog lakog lanca kodirana humanim imunoglobulinskim sekvencama koje su operativno povezane sa genom konstantnog regiona mišjeg kapa lanca iz endogenog kapa lokusa miša. Takvi genetički modifikovani miševi mogu biti upotrebljeni za proizvodnju potpuno humanih bispecifičnih molekula koji vezuju antigen i sadrže dva različita teška lanca koji su povezani sa identičnim lakim lancem koji sadrži varijabilni domen izveden iz jednog od dva različita genska segmenta varijabilnih regiona humanih lakih lanaca (pogledati, npr. US 2011/0195454). Potpuno humano se odnosi na antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, ili imunoglobulinski domen, koji sadrže aminokiselinsku sekvencu kodiranu sa DNK izvedenom iz humane sekvence i to celom dužinom svakog polipeptida antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen ili imunoglobulinskog domena. U pojedinim slučajevima, potpuno humana sekvenca je izvedena iz proteina endogenog za čoveka. U drugim slučajevima, potpuno humani protein ili proteinska sekvenca sadrže himernu sekvencu gde je svaka komponentna sekvenca izvedena iz humane sekvence. Iako nije povezano sa bilo kakvom teorijom, himerni proteini ili himerne sekvence su generalno dizajnirane tako da se stvaranje imunogenih epitopa na spojevima komponentnih sekvenci svede na minimum, npr. u poređenju sa bilo kojim regionima ili domenima humanog imunoglobulina divlјeg tipa.

Antagonisti CD40

[0120] Prema određenim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci za lečenje kancera i/ili inhibiranje oslobađanja citokina davanjem subjektu (npr. subjektu kome je to potrebno) antagoniste CD40.

[0121] Termin „antagonista CD40” odnosi se na bilo koji agens koji inhibira ili blokira efekat posredovan sa CD40. To može biti mali molekul, antitelo, antisens oligonukleotid, siRNA, shRNA, sgRNA, peptid itd. U pojedinim primerima izvođenja, antagonista CD40 je antitelo (npr. fragment antitela koji vezuje antigen) koji se vezuje za CD40. „Antagonistički” efekat anti-CD40 antitela označava efekat inhibiranja vezivanja CD40 eksprimiranog na površini ćelija, kao što su B-ćelije, tumorske ćelije ili dendritične ćelije, sa njegovim ligandima ili efekat neutralizacije jednog ili više od uticaja CD40 liganada na ćelije koje eksprimiraju CD40. „Antagonističko antitelo” označava antitelo koje ima takve efekte. Jedan primer uticaja na ćelije koje eksprimiraju CD40 uklјučuje supresiju rasta B-ćelija ili supresiju proizvodnje antitela.

[0122] U pojedinim primerima izvođenja, antagonistilko antitelo na CD40 (npr. fragment antitela koji vezuje antigen) cilјano deluje na receptor CD40 i ometa CD40 signalizaciju, posebno CD40 signalne puteve koji su posredovani interakcijom CD40 sa ligandom CD40 (CD40L). Termini „CD40 antigen“, „CD40 antigen na površini ćelije“, „CD40 receptor” ili „CD40” odnose se na transmembranski glikoprotein koji pripada familiji receptora faktora nekroze tumora (TNF) (pogledati, na primer, SAD pat. br.5,674,492 i 4,708,871; Stamenkovic i saradnici (1989) EMBO 8:1403; Clark (1990) Tissue Antigens 36:33; Barclay i saradnici (1997) The Leucocyte Antigen Facts Book (2. izd.; Academic Press, San Diego)). Identifikovano je najmanje šest izoformi humanog CD40, kodiranih alternativnom obradom varijatni transkripata ovog gena (NM_001250.6 i NP_001241.1; NM_001302753.2 i NP_001289682.1; NM_001322421.2 i NP_001309350.1; NM_001322422.2 i NP_001309351.1; NM_001362758.2 i NP_001349687.1; i NM_152854.4 i NP_690593.1). Za potrebe predmetnog pronalaska, termini „CD40 antigen“, „CD40 antigen na površini ćelije“, „CD40 receptor” ili „CD40” obuhvataju sve izoforme CD40.

[0123] CD40 antigen može biti prikazan na površini raznovrsnih tipova ćelija, kao što je ovde opisano na drugom mestu. Termini „prikazan na površini” i „eksprimiran na površini” odnose se na slučajeve u kojima je celokupan ili deo CD40 antigena izložen spolјašnjosti ćelije. Prikazan ili eksprimiran CD40 antigen može biti potpuno ili delimično glikozilovan.

[0124] Pod „antagonističkom aktivnošću” se podrazumeva da supstanca funkcioniše kao antagonista. Antagonista CD40 sprečava ili smanjuje indukciju bilo kog od odgovora indukovanih vezivanjem CD40 receptora za agonistički ligand, posebno CD40L. Antagonista može smanjiti indukciju bilo kog jednog ili više od odgovora na vezivanje agoniste za 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, poželјno 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, poželјnije 70%, 80%, 85% i najpoželјnije 90%, 95%, 99% ili 100%. Postupci za merenje specifičnosti vezivanja liganda CD40 i antagonističke aktivnosti anti-CD40 terapijskog agensa, na primer, anti-CD40 antitela, poznati su u oblasti tehnike i uklјučuju, ali nisu ograničeni na, standardne testove kompetitivnog vezivanja, testove za praćenje sekrecije imunoglobulina od strane B-ćelija, testove proliferacije B-ćelija, testove proliferacije B ćelija nalik Banchereaum-ovim, testove za proizvodnju antitela sa pomoćnim T-ćelijama, testove kostimulacije proliferacije B-ćelija i testove pozitivne regulacije markera aktivacije B-ćelija. Pogledati, na primer, ovakve testove opisane u WO 00/75348 i SAD pat. br.6,087,329. Pogledati takođe privremene prijave pod naslovom „Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies i Methods for Their Use”, podnete 4. novembra 2003. god., 26. novembra 2003. god., i 27. aprila 2004. god., kao i dodeljene SAD patentne prijave br.60/517,337, 60/525,579 i 60/565,710, tim redom, a dalje i Međunarodnu patentnu prijavu br. PCT/US2004/037152, takođe pod naslovom „Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies i Methods for Their Use”, podnetu 4. novembra 2004. god. i objavljenu kao WO 2005/044854).

[0125] Bilo koji od testova poznatih u oblasti tehnike može biti upotrebljen za određivanje da li anti-CD40 antitelo deluje kao antagonista jednog ili više B-ćelijskih odgovora. U pojedinim primerima izvođenja, anti-CD40 antitelo deluje kao antagonista najmanje jednog B-ćelijskog odgovora izabranog iz grupe koju čine proliferacije B-ćelija, diferencijacije B-ćelija, proizvodnje antitela, međućelijska adhezija, generisanja memorije B-ćelija, izmene izotipa, povećanje ekspresije MHC klase II i CD80/86 na ćelijskoj površini, i sekrecija proinflamatornih citokina kao što su IL-8, IL-12 i TNF. Od posebnog interesa su antagonistička anti-CD40 antitela koja su oslobođena od značajne agonističke aktivnosti u pogledu proliferacije B-ćelija kada su vezana za humani CD40 antigen na površini humane B-ćelije.

[0126] Termin „CD40 ligand” uključuje bilo koji peptid, polipeptid ili protein koji se može vezati za i aktivirati jedan ili više od CD40 signalnih puteva. Prema tome, „CD40 ligandi” uklјučuju, ali nisu ograničeni na, proteine CD40 liganda pune dužine i njihove varijante i fragmente koji zadržavaju dovolјnu aktivnost da obavlјaju funkciju vezivanja za i stimulisanja CD40 signalizacije na ćelijama koje eksprimiraju CD40. Modifikacije nativnog CD40 liganda, na primer, humanog CD40 liganda (CD40L; takođe poznatog kao CD154), uklјučuju, ali nisu ograničene na, supstitucije, delecije, skraćivanja, ekstenzije, fuzione proteine, fragmente, peptidomimetike i slično. U pojedinim primerima izvođenja pronalaska, test za procenu biološke aktivnosti antagonističkog anti-CD40 antitela uklјučuje upotrebu solubilnog CD40L, na primer, solubilnog rekombinantnog humanog CD40L (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, UK) za stimulaciju CD40 signalizacije na ćelijama koje eksprimiraju CD40.

[0127] „CD40 signalizacija posredovana sa CD40L” odnosi se na bilo koju od bioloških aktivnosti koje proizilaze iz interakcije CD40 receptora na površini ćelije sa CD40 ligandom. Primeri CD40 signalizacije su signali koji dovode do proliferacije i preživlјavanja ćelija koje eksprimiraju CD40, kao i stimulacije jednog ili više CD40 signalnih puteva unutar ćelija koje eksprimiraju CD40. Predviđeno je da CD40 „signalni put” ili „put prenosa signala” označava najmanje jednu biohemijsku reakciju ili grupu biohemijskih reakcija koje proizilaze iz interakcije CD40 receptora sa CD40 ligandom, na primer, CD40L, a koje generišu signal koji, kada se prenosi signalnim putem, dovodi do aktivacije jednog ili više nishodnih molekula u signalnoj kaskadi. Putevi prenosa signala uklјučuju brojne molekule prenosa signala koji dovode do transmisije signala sa CD40 receptora na površini ćelije preko plazma membrane ćelije, a kroz jednu ili više serija molekula za prenos signala, kroz citoplazmu ćelije, i u pojedinim primerima izvođenja, u jedro ćelije. Putevi prenosa signala CD40 uklјučuju, na primer, AKT signalni put, koji dovodi do aktivacije AKT, i na kraju aktivacije NF-κB putem NF-κB signalnog puta; i signalne puteve protein kinaze aktivirane mitogenima (MAPK), uklјučujući MEK/ERK signalni put i MEK/p38 signalni put, koji dovode do aktivacije ERK i p38, tim redom. Ravnoteža između aktivacije i blokiranja ovih signalnih puteva favorizuje bilo preživlјavanje ćelija ili apoptozu.

[0128] U pojedinim primerima izvođenja, antagonističko antitelo na CD40 je monoklonsko antitelo. U određenim primerima izvođenja, antagonističko antitelo na CD40 ili njegov fragment koji vezuje antigen je himerno, humanizovano, kompozitno, mišje ili humano. U pojedinim primerima izvođenja, antagonističko antitelo na CD40 ili njegov fragment koji se vezuje za antigen izabrani su od Fv, Fav, F(ab')2), Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 i fragmenata diatela.

[0129] Antagonistička antitela na CD40 koja su ovde obezbeđena uklјučuju, ali nisu ograničena na, npr. iskalimab (takođe poznat kao CFZ533) opisan u Kahaly i saradnici (2019) J. Endocr. Sco.

3:doi.org/10.1210/js.2019-OR19-6, Fisher i saradnici (2017) Arthritis Rheumatol. 69:1784, Farkash i saradnici (2019) Am. J. Transplant. 19:632, i objavi Međunarodne patentne prijave br. WO 2012/075111A1; ravagalimab (takođe poznat kao ABBV-323) opisan u objavi Međunarodne patentne prijave br. WO 2016/196314A1; BI 655064 opisan u Visvannathan i saradnici (2016) Arthritis Rheumatol.

68:1588); bleselumab (takođe poznat kao ASKP1240 ili 341G2) opisan u Anil i saradnici (2018) Biopharm. Drug Dispos. 39:245-255, Harland i saradnici (2017) Am. J. Transplant. 17:159-171 i SAD patentu br.

8,716,451B2; ch5D12 opisan u Kasran i saradnici (2005) Aliment. Pharmacol. Ther. 22:111-122; lucatumumab (takođe poznat kao HCD122 ili CHIR-12.12) opisan u Bensinger i saradnici (2012) British J. Haematology 159:58-66, Byrd i saradnici (2012) Leuk. Lymphoma 53:10.3109/10428194.2012.681655, i objavi Međunarodne patentne prijave br. PCT/US2004/037152; CHIR-5.9 opisan u objavi Međunarodne patentne prijave br. PCT/US2004/037152; 201A3 opisan u Perper i saradnici (2019) J. Immunol.203:58-75; KPL-404 opisan u kliničkom ispitivanju NCT04497662 sponzorisanom od strane Kiniksa Pharmaceuticals, Ltd.; PG102 opisan u Bankert i saradnici (2015) J. Immunol. 194:4319-4327 i objavi Međunarodne patentne prijave br. WO 2001/024823A1; i BIIB063 opisan u Musselli i saradnici (2017) Sažeci godišnjeg sastanka ACR/ARHP, 2017.

[0130] Dodatna antagonistička antitela na CD40 koja su korisna u određenim primerima izvođenja postupaka i kompozicija koje su ovde obezbeđeni, opisana su, na primer, u objavi Međunarodnih patentnih prijava br. WO 02/11763A1, WO 02/28481A9, WO 03/045978A3, WO 03/029296A1, WO 03/028809A1, WO 2005/044854, WO 2006/073443A3, WO 2007/124299A8, WO 2011/123489A3, WO 2016/196,314A1, WO 2017/040566A1, WO 2017/060242A1, WO 2018/217976A1, WO2019/156565A1, WO 2020/144605A1, WO 2020/106620A1 i WO 2020/006347A1, kao i objavama SAD patentnih prijava br. US 2020/0291123A1, US 2017/0158771A1 i US 2008/0057070A1, ili SAD patentnima br. US 9,125,893B2, US 8,669,352B2 i US 9,598,494B2.

[0131] Anti-CD40 antagonistička antitela koja su ovde opisana mogu sadržavati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u uokvirujućim i/ili CDR regionima varijabilnih domena teških i lakih lanaca u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama iz kojih su antitela izvedena. Takve mutacije lako mogu biti utvrđene poređenjem aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane sa germinativnim sekvencama dostupnim, na primer, u javnim bazama podataka za sekvence antitela. Predmetni pronalazak uključuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji su izvedeni iz bilo koje od aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane, pri čemu je jedna ili više aminokiselina unutar jednog ili više od uokvirujućih i/ili CDR regiona mutirana u odgovarajući(e) ostatak(e) germinativne sekvence iz koje je antitelo izvedeno, ili u odgovarajući(e) ostatak(e) druge humane germinativne sekvence, ili u konzervativnu aminokiselinsku supstituciju odgovarajućeg(ih) ostatka(a) germinativne sekvence (takve promene sekvenci se ovde zajednički označavaju kao „germinativne mutacije“). Prosečno iskusan stručnjak iz oblasti tehnike, polazeći od sekvenci varijabilnih regiona teških i lakih lanaca koji su ovde opisane, lako mogu proizvesti brojna antitela i fragmente koji vezuju antigen koji sadrže jednu ili više pojedinačnih germinativnih mutacija ili njihovih kombinacija. U određenim primerima izvođenja, svi ostaci uokvirujućih i/ili CDR unutar VHi/ili VLdomena povratno su mutirani do ostataka koji se nalaze u originalnoj germinativnoj sekvenci iz koje je antitelo izvedeno. U drugim primerima izvođenja, samo određeni ostaci se povratno mutiraju do originalne germinativne sekvence, npr. samo se mutirani ostaci koji se nalaze unutar prvih 8 aminokiselina FR1 ili unutar poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili se samo mutiraju ostaci koji se nalaze unutar CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim primerima izvođenja, jedan ili više ostataka uokvirujućih i/ili CDR su mutirani u odgovarajući(e) ostatak(e) različite germinativne sekvence (tj. germinativnu sekvencu koja je različita od germinativne sekvence iz koje je antitelo prvobitno izvedeno). Štaviše, antitela predmetnog pronalaska mogu sadržavati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija unutar uokvirujućih i/ili CDR regiona, npr. pri čemu su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence, dok su određeni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne sekvence zadržani, ili su mutirani u odgovarajući ostatak različite germinativne sekvence. Jednom dobijeni, antitela i fragmenti koji vezuju antigene, koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija, lako mogu biti ispitani u pogledu jedne ili više želјenih osobina, kao što su pobolјšana specifičnost vezivanja, povećano vezivanje (npr. izmereno titracijom ćelijskog vezivanja ili FACS vezivanjem) ili afinitet vezivanja (npr. KD), pobolјšana ili pojačane antagonističke ili agonističke biološke osobine (u zavisnosti od slučaja), smanjena imunogenost itd. Antitela i fragmenti koji vezuju antigen dobijeni na ovaj opšti način obuhvaćeni su predmetnim pronalaskom.

[0132] Ovde su takođe obezbeđena antagonistička anti-CD40 antitela koja sadrže varijante bilo koje od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane, a koje imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, predmetni pronalazak uklјučuje antagonistička anti-CD40 antitela ili CD3 multispecifična (npr. bispecifična ili trispecifična) antitela koja imaju aminokiselinske sekvence HCVR, LCVR i/ili CDR sa, npr. 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje itd. konzervativnih aminokiselinskih supstitucija u odnosu na bilo koju od aminokiselinskih sekvenci HCVR, LCVR i/ili CDR koje su ovde opisane.

CAR-T-ćelije koje eksprimiraju antagonistu CD40

[0133] Prema određenim aspektima, postupci i kompozicije koji su ovde obezbeđeni odnose se na imunske efektorske ćelije (npr. CAR-T-ćelije) koje su konstruisane tako da eksprimiraju antagonistu CD40 (npr. antagonistu CD40 koji je ovde obezbeđen). U pojedinim primerima izvođenja, CAR-T-ćelija luči antagonistu CD40. U određenim primerima izvođenja, antagonista CD40 je scFv ili Fab. U pojedinim primerima izvođenja, CAR-T-ćelija eksprimira antagonistu CD40 kada je aktivirana. Postupci za generisanje CAR-T-ćelije koja luči antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen opisane su u, npr. Choi i saradnici (2019) Nature Biotechnology 37:1049-1058, koji je u celosti ovde uključen u vidu reference.

[0134] CAR-T-ćelije su T-ćelije koje su konstruisane tako da eksprimiraju polipeptid himernog antigenskog receptora (CAR). CAR su receptori koji sadrže ostatak sa ciljanim delovanjem koji je povezan sa jednim ili sa više signalnih domena i/ili kostimulatornih domena u jednom fuzionom molekulu. U određenim primerima izvođenja, vezujući ostatak CAR sadrži domen koji vezuje antigen jednolančanog antitela (scFv), koji sadrži varijabilne fragmente lakih i teških lanaca monoklonskog antitela koji su spojeni fleksibilnim linkerom. U određenim primerima izvođenja, vezujući deo dalјe sadrži transmembranske i zglobne domene monoklonskog antitela. U određenim primerima izvođenja, vezujući domen i/ili vanćelijski domen CAR koji je ovde naveden, obezbeđuje sposobnost vezivanja CAR za ciljni antigen od interesa (npr. tumorski antigen).

[0135] „Domen za prenos signala” ili „signalni domen” iz CAR, kako se ovde upotrebljava, odgovoran je za unutarćelijsku signalizaciju nakon vezivanja vanćelijskog domena za vezivanje liganda za cilјni molekul, što dovodi do aktivacije imunske ćelije i imunskog odgovora. Drugim rečima, domen za prenos signala je odgovoran za aktivaciju najmanje jedne od normalnih efektornih funkcija imunske ćelije u kojoj se CAR eksprimira. Na primer, efektorska funkcija T-ćelije može biti citolitička aktivnost ili pomoćna aktivnost, uklјučujući lučenje citokina. Prema tome, termin „domen za prenos signala” odnosi se na deo proteina koji prenosi signal efektorne funkcije i usmerava ćeliju da obavlјa specijalizovanu funkciju. Primeri domena za prenos signala za upotrebu u CAR mogu biti citoplazmatske sekvence T-ćelijskog receptora i koreceptora koji deluju zajedno da bi pokrenuli prenos signala nakon angažovanja antigenskog receptora, kao i bilo koji derivat ili varijanta ovih sekvenci i bilo koja sintetička sekvenca koja ima istu funkcionalnu sposobnost. U pojedinim slučajevima, signalni domeni obuhvataju dve različite klase citoplazmatskih signalnih sekvenci, one koje pokreću primarnu aktivaciju zavisnu od antigena i one koje deluju na način nezavisan od antigena, da bi se obezbedio sekundarni ili kostimulatorni signal. Primarne citoplazmatske signalne sekvence mogu sadržavati signalne motive koji su poznati kao imunoreceptorski aktivacioni motivi zasnovani na tirozinu iz ITAM. ITAM su dobro definisani signalni motivi koji se nalaze u unutarcitoplazmatskom repu raznovrsnih receptora koji služe kao mesta vezivanja za tirozin kinaze klase syk/zap70. ITAM za primer uključuju one izvedene iz TCRζ, FcRγ, FcRβ, FcRε, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b i CD66d.

[0136] U pojedinim primerima izvođenja, ćelije se dobijaju iz subjekta koji se leči (tj. autologne su). Međutim, u određenim primerima izvođenja, upotrebljavaju se imunske efektorske ćelijske linije ili donorske efektorske (alogene) ćelije.

[0137] Imunske efektorske ćelije mogu biti dobijene iz brojnih izvora, uklјučujući mononuklearne ćelije periferne krvi, kosnu srž, tkivo limfnih čvorova, krv iz pupčane vrpce, tkivo timusa, tkivo sa mesta infekcije, ascite, pleuralni izliv, tkivo slezine i tumore. Imunske efektorske ćelije mogu biti dobijene iz krvi prikuplјene iz subjekta upotrebom bilo kog broja tehnika koje su poznate stručnjaku, kao što je razdvajanje upotrebom Ficoll<™>reagensa. Na primer, ćelije iz cirkulišuće krvi pojedinca mogu biti dobijene aferezom. U pojedinim primerima izvođenja, imunske efektorske ćelije se izoluju iz limfocita periferne krvi, liziranjem crvenih krvnih zrnaca i deplecijom monocita, na primer, centrifugiranjem kroz gradijent PERCOLL<™>reagensa ili centrifugalnom elutrijacijom u suprotnom smeru. Specifična subpopulacija imunskih efektorskih ćelija može dalјe biti izolovana tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. Na primer, imunske efektorske ćelije mogu biti izolovane upotrebom kombinacije antitela usmerenih na površinske markere jedinstvene za pozitivno selektovane ćelije, npr. inkubacijom sa zrncima konjugovanim sa antitelima tokom vremenskog perioda dovolјnog za pozitivnu selekciju želјenih imunskih efektorskih ćelija. Alternativno, obogaćivanje populacije imunskih efektorskih ćelija može biti postignuto negativnom selekcijom, upotrebom kombinacije antitela usmerenih na površinske markere jedinstvene za negativno selektovane ćelije.

[0138] Predmetni opis obezbeđuje postupke za pravlјenje imunskih efektorskih ćelija koje eksprimiraju CAR i antagonistu CD40 koji je ovde opisan. U jednom primeru izvođenja, postupak obuhvata transfekciju ili transdukciju imunskih efektorskih ćelija izolovanih iz subjekta, kao što je subjekat koji ima PIG i/ili tumorsku ćeliju koja eksprimira kancerski antigen u niskoj gustini, tako da imunske efektorske ćelije eksprimiraju jedan ili više CAR i antagoniste CD40 kao što je ovde opisano. U određenim primerima izvođenja, imunske efektorske ćelije se izoluju iz individue i genetički se modifikuje bez dalje manipulacije in vitro. Takve ćelije zatim mogu biti direktno ponovo date individui. U dalјim primerima izvođenja, imunske efektorske ćelije se najpre aktiviraju i stimulišu da proliferišu in vitro, pre nego što budu genetički modifikovane tako da eksprimiraju CAR i antagonistu CD40. U ovom kontekstu, imunske efektorske ćelije mogu biti kultivisane pre ili nakon genetičke modifikacije (tj. transdukovanja ili transfekcije da bi eksprimirale CAR ili antagonistu CD40 koji je kao što je ovde opisano).

[0139] Pre in vitro manipulacije ili genetičke modifikacije imunskih efektorskih ćelija koje su ovde opisane, izvor ćelija može biti dobijen iz subjekta. Preciznije, imunske efektorske ćelije za upotrebu sa CAR i antagonistima CD40 koji su ovde opisani sadrže T-ćelije. T-ćelije mogu biti dobijene iz brojnih izvora, uklјučujući mononuklearne ćelije periferne krvi, kosnu srž, tkivo limfnih čvorova, krv iz pupčane vrpce, timusno kivo, tkivo sa mesta infekcije, ascite, pleuralni izliv, tkivo slezine i tumore. U određenim primerima izvođenja, T-ćelija može biti dobijena iz jedinice krvi prikupljene iz subjekta upotrebom bilo kog broja tehnika koje su poznate stručnjaku, kao što je razdvajanje upotrebom FICOLL reagensa. U jednom primeru izvođenja, ćelije iz cirkulišuće krvi pojedinca dobijaju se aferezom. Proizvod afereze obično sadrži limfocite, uklјučujući T-ćelije, monocite, granulocite, B-ćelije, druga bela krvna zrnca sa jedrom, crvena krvna zrnca i trombocite. U jednom primeru izvođenja, ćelije prikuplјene aferezom mogu biti isprane da bi se uklonila frakcija plazme i da bi se ćelije postavile u odgovarajući pufer ili medijum za kasniju obradu.

U jednom primeru izvođenja, ćelije se ispiraju sa PBS-om. U alternativnom primeru izvođenja, ispranom rastvoru nedostaje kalcijum, a može nedostajati i magnezijum, ili može nedostajati mnogo od, ukoliko ne i svi, dvovalentni katjoni. Za prosečno iskusne stručnjake iz oblasti tehnike je ipak potrebno napomenuti da korak pranja može biti postignut i postupcima koji su poznati u oblasti tehnike, kao što je upotreba poluautomatske protočne centrifuge. Nakon pranja, ćelije mogu biti resuspedovane u različitim biokompatibilnim puferima ili drugim fiziološkim rastvorima, sa ili bez pufera. U određenim primerima izvođenja, neželјene komponente uzorka dobijenog aferezom mogu biti uklonjene iz ćelije direktnim resuspendovanjem u medijum za kulturu.

[0140] U određenim primerima izvođenja, T-ćelije se izoluju iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) liziranjem crvenih krvnih zrnaca i uklanjanjem monocita, na primer, centrifugiranjem kroz Ficoll-Paque<™>gradijent. Specifična subpopulacija T-ćelija, kao što su CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ i CD45RO+ T-ćelije, može dalјe biti izolovana tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. Na primer, obogaćivanje populacije T-ćelija negativnom selekcijom može biti postignuo kombinacijom antitela usmerenih na površinske markere jedinstvene za negativno selektovane ćelije. Jedan od postupaka za upotrebu u ovom slučaju je sortiranje i/ili selekcija ćelija putem negativne magnetne imunoadhezije ili protočne citometrije koje koriste koktel monoklonskih antitela usmerenih na površinske markere ćelija koji su prisutni na ćelijama koje se negativno selektuju. Na primer, da bi se obogatile CD4+ ćelije negativnom selekcijom, koktel monoklonskih antitela obično uklјučuje antitela na CD14, CD20, CD1b, CD16, HLA-DR i CD8. Protočna citometrija i sortiranje ćelija takođe mogu biti upotrebljene da bi se izolovale ćelijske populacije od interesa.

[0141] PBMC mogu biti direktno upotrebljene za genetičku modifikaciju sa CAR i antagonistima CD40, upotrebom postupaka koji su kao što je ovde opisano. U određenim primerima izvođenja, nakon izolacije PBMC, T limfociti se dalјe izoluju, a u određenim primerima izvođenja, i citotoksični i pomoćni T limfociti mogu biti sortirani na naivne, memorijske i efektorske T-ćelijske subpopulacije, bilo pre ili nakon genetičke modifikacije i/ili ekspanzije. CD8+ ćelije mogu biti dobijene upotrebom standardnih postupaka. U pojedinim primerima izvođenja, CD8+ ćelije se dalјe sortiraju na naivne, centralne memorijske i efektorske ćelije, identifikovanjem antigena na ćelijskoj površini koji su povezani sa svakim od ovih tipova CD8+ ćelija. U primerima izvođenja, memorijske T-ćelije su prisutne i u CD62L+ i u CD62L-podskupovima CD8+ perifernih krvnih limfocita. PBMC se sortiraju na CD62L-CD8+ i CD62L+CD8+ frakcije nakon bojenja sa anti-CD8 i anti-CD62L antitelima. U pojedinim primerima izvođenja, ekspresija fenotipskih markera za centralne memorijske TCM uklјučuje CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 i CD127, kao i negativnost na granzim B. U pojedinim primerima izvođenja, centralne memorijske T-ćelije su CD45RO+, CD62L+, CD8+ T-ćelije. U pojedinim primerima izvođenja, efektorske T-ćelije su negativne za CD62L, CCR7, CD28 i CD127, a pozitivne za granzim B i perforin. U pojedinim primerima izvođenja, naivne CD8+T limfocite karakteriše ekspresija fenotipskih markera naivnih T-ćelija, uklјučujući CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD 127 i CD45RA.

[0142] U određenim primerima izvođenja, CD4+ T-ćelije se dalјe sortiraju u subpopulacije. Na primer, CD4+T pomoćne ćelije mogu biti sortirane na naivne, centralne memorijske i efektorske ćelije, identifikovanjem ćelijskih populacija koje imaju antigene na površini ćelija. CD4+ limfociti mogu biti dobijeni standardnim postupcima. U pojedinim primerima izvođenja, naivni CD4+T limfociti su CD45RO-, CD45RA+, CD62L+CD4+ T-ćelije. U pojedinim primerima izvođenja, centralne memorijske CD4+ ćelije su CD62L pozitivne i CD45RO pozitivne. U pojedinim primerima izvođenja, efektorske CD4+ ćelije su CD62L i CD45RO negativne.

[0143] Imunske efektorske ćelije, kao što su T-ćelije, mogu biti genetički modifikovane nakon izolacije, upotrebom poznatih postupaka, ili se imunske efektorske ćelije mogu aktivirati i ekspandovati (ili diferencirati u slučaju progenitorskih ćelija) in vitro pre nego što budu genetički modifikovane. U drugom primeru izvođenja, imunske efektorske ćelije, kao što su T-ćelije, genetički se modifikuju sa himernim antigenskim receptorima koji su ovde opisani (npr. transdukovanjem sa virusnim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira CAR ili antagonistu CD40), a zatim se aktiviraju i ekspanduju in vitro. Postupci za aktiviranje i ekspandovanje T-ćelija su poznati u oblasti tehnike i opisani su, na primer, u SAD pat. br.6,905,874; 6,867,041; 6,797,514; WO2012079000. U principu, takvi postupci uklјučuju dovođenje PBMC ili izolovanih T-ćelija u kontakt sa stimulatornim agensom i kostimulatornim agensom, kao što su anti-CD3 i anti-CD28 antitela, generalno pričvršćena za zrnca ili neku drugu površinu, u medijumu za kultivaciju sa odgovarajućim citokinima, kao što je IL-2 (npr. rekombinantni humani IL-2). Anti-CD3 i anti-CD28 antitela pričvršćena za isto zrnce mogu poslužiti kao „surogat” ćelija koje prezentuju antigen (APC). U drugim primerima izvođenja, T-ćelije mogu biti aktivirane i stimulisane tako da proliferišu sa ćelijama hranilicama i odgovarajućim antitelima i citokinima, upotrebom postupaka kao što su oni opisani u SAD pat. br.6,040,177; 5,827,642 i WO2012129514.

[0144] U pojedinim primerima izvođenja, imunske efektorske ćelije obuhvataju bilo koji leukocit uklјučen u odbranu tela od infektivnih bolesti i stranih materijala. Na primer, imunske efektorske ćelije mogu obuhvatati limfocite, monocite, makrofage, dendritične ćelije, mastocite, neutrofile, bazofile, eozinofile ili bilo koju od njihovih kombinacija. Na primer, imunske efektorske ćelije mogu sadržavati T limfocite, poželјno citotoksične T limfocite (CTL).

[0145] T pomoćne ćelije (THćelije) pomažu drugim belim krvnim zrncima u imunskim procesima, uklјučujući sazrevanje B-ćelija u plazma ćelije i memorijske B-ćelije, kao i aktivaciju citotoksičnih T-ćelija i makrofaga. Ove ćelije su takođe poznate kao CD4+T-ćelije pošto eksprimiraju CD4 glikoprotein na svojoj površini. Pomoćne T-ćelije se aktiviraju kada im se prezentuju peptidni antigeni od strane MHC molekula klase II, koji se eksprimiraju na površini ćelija koje prezentuju antigen (APC). Jednom aktivirane, one se brzo dele i izlučuju male proteine zvane citokini koji regulišu ili pomažu u aktivnom imunskom odgovoru. Ove ćelije se mogu diferencirati u jedan od nekoliko podtipova, uklјučujući TH1, TH2, TH3, TH17, TH9 ili TFH, koji luče različite citokine da bi se olakšao drugačiji tip imunskog odgovora.

[0146] Citotoksične T-ćelije (Tc ćelije ili CTL) uništavaju ćelije zaražene virusom i tumorske ćelije, a takođe se pretpostavlja da su uklјučene u odbacivanje transplantata. Ove ćelije su poznate i kao CD8+ T-ćelije, pošto eksprimiraju CD8 glikoprotein na svojoj površini. Ove ćelije prepoznaju svoje cilјne molekule vezivanjem za antigen povezan sa MHC molekulima klase I koji je prisutan na površini svih ćelija sa jedrom. Putem IL-10, adenozina i drugih molekula koje luče regulatorne T-ćelije, CD8+ ćelije mogu biti inaktivirane do anergičnog stanja, što sprečava autoimunske bolesti.

[0147] Memorijske T-ćelije su podskup T-ćelija specifičnih za antigen koje dugo perzistiraju nakon što se infekcija razreši. One se brzo šire u velike brojeve efektorskih T-ćelija nakon ponovnog izlaganja svom srodnom antigenu, čime imunskom sistemu obezbeđuju „pamćenje” protiv prošlih infekcija. Memorijske ćelije mogu biti bilo CD4<+>ili CD8<+.>Memorijske T-ćelije obično eksprimiraju protein CD45RO na ćelijskoj površini.

[0148] Regulatorne T-ćelije (Tregćelije), ranije poznate kao supresorske T-ćelije, klјučne su za održavanje imunske tolerancije. Nјihova glavna uloga je da isklјuče imunitet posredovan T-ćelijama pred kraj imunske reakcije i da suzbiju autoreaktivne T-ćelije koje su izbegle proces negativne selekcije u timusu. Opisane su dve glavne klase CD4<+>Tregćelija - Tregćelije koje se javljaju u prirodi i adaptivne Tregćelije.

[0149] T-ćelije prirodne ubice (NKT) (ne treba ih mešati sa ćelijama prirodnim ubicama (NK)) povezuju adaptivni imunski sistem sa urođenim imunskim sistemom. Za razliku od konvencionalnih T-ćelija koje prepoznaju peptidne antigene prezentovane od strane molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC), NKT ćelije prepoznaju glikolipidni antigen koga prezentuje molekul pod nazivom CD1d.

[0150] U pojedinim primerima izvođenja, T-ćelije obuhvataju mešavinu CD4+ ćelija. U drugim primerima izvođenja, T-ćelije su obogaćene za jedan ili više podskupova na osnovu ekspresije na površini ćelija. Na primer, u pojedinim slučajevima, T-ćelije obuhvataju citotoksične CD8+ T limfocite.

[0151] Ćelije prirodne ubice (NK) su veliki CD56<+>CD3<->granularni limfociti koji mogu ubijati virusno inficirane i transformisane ćelije, a koje čine kritičan podskup ćelija urođenog imunskog sistema (Godfrey J i saradnici, Leuk Lymphoma 201253:1666-1676). Za razliku od citotoksičnih CD8<+>T limfocita, NK ćelije pokreću citotoksičnost protiv tumorskih ćelija bez potrebe za prethodnom senzibilizacijom i mogu iskoreniti ćelije koje su negativne na MHC-I (Narni-Mancinelli E i saradnici, Int Immunol 201123:427-431). NK ćelije su bezbednije efektorske ćelije, pošto mogu izbeći potencijalno smrtonosne komplikacije citokinske oluje (Morgan RA i saradnici, Mol Ter 2010 18:843-851), sindrom lize tumora (Porter DL i saradnici, N Engl J Med 2011365:725-733) i efekte usmerene van ciljnog molekula ili van tumora.

CD3 multispecifični molekuli koji vezuju antigen

[0152] U određenim primerima izvođenja, postupci i kompozicije koji su ovde obezbeđeni, odnose se na molekule koji vezuju CD3 antigen (tj. molekule koji vezuju antigen i sadrže najmanje jedan domen koji vezuje antigen koji se vezuje za CD3). U određenim primerima izvođenja, ovde obezbeđeni CD3 multispecifični molekuli koji vezuju antigen dalјe sadrže domen koji vezuje antigen koji se vezuje za kancerski antigen (tj. antigen eksprimiran na kancerskoj ćeliji). U određenim primerima izvođenja, ovde obezbeđeni CD3 multispecifični molekuli koji vezuju antigen dalјe sadrže domen koji vezuje antigen koji se vezuje za kostimulatorni receptor (npr. CD28).

[0153] Kao što se ovde upotrebljava, izraz „multispecifičan molekul koji vezuje antigen” odnosi se na protein, polipeptid ili molekulski kompleks koji sadrži najmanje prvi domen koji vezuje antigen i drugi domen koji vezuje antigen. U pojedinim primerima izvođenja, svaki domen koji vezuje antigen unutar multispecifičnog molekula koji vezuje antigen može sadržavati najmanje jedan CDR koji se samostalno, ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih CDR i/ili FR, specifično vezuje za određeni antigen. U kontekstu predmetnog pronalaska, prvi domen koji vezuje antigen specifično vezuje prvi antigen (npr. CD3), dok drugi domen koji vezuje antigen specifično vezuje drugi, jasno različit antigen (npr. tumorski antigen).

[0154] U pojedinim primerima izvođenja, CD3 multispecifičan molekul koji vezuje antigen je CD3 multispecifično antitelo. CD3 multispecifična antitela koja su ovde obezbeđena mogu biti, na primer, bispecifična ili trispecifična. Multispecifična antitela mogu biti specifična za različite epitope jednog cilјnog polipeptida ili mogu sadržavati domene koji vezuju antigen koji su specifični za više od jednog cilјnog polipeptida. Pogledati, npr. Tutt i saradnici, 1991, J. Immunol.147:60-69; Kufer i saradnici, 2004, Trends Biotechnol.22:238-244. Bispecifična CD3 antitela koja su ovde obezbeđena mogu biti povezana sa drugim funkcionalnim molekulom ili koeksprimirana sa njim, npr. sa drugim peptidom ili proteinom. Na primer, antitelo ili njegov fragment mogu biti funkcionalno povezani (npr. hemijskim kuplovanjem, genetičkom fuzijom, nekovalentnim povezivanjem ili na drugi način) sa jednim ili više drugih molekulskih entiteta, kao što su drugo antitelo ili fragment antitela, da bi se proizvelo bispecifično ili multispecifično antitelo sa drugom ili dodatnom specifičnošću vezivanja.

[0155] Termin „CD3“, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na antigen koji se eksprimira na T-ćelijama kao deo multimolekulskog T-ćelijskog receptora (TCR), a koji se sastoji od homodimera ili heterodimera obrazovanog iz udruživanja dva od četiri receptorska lanca: CD3-epsilon, CD3-delta, CD3-zeta i CD3-gama. Humani CD3-epsilon sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je kao što je navedeno u SEQ ID NO: 116 iz objave SAD patentne prijave br. US 2020/0024356A1; humani CD3-delta sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je kao što je navedeno u SEQ ID NO:117 iz objave SAD patentne prijave br. US 2020/0024356A1; humani CD3-zeta sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je kao što je navedeno u SEQ ID NO:118 iz objave SAD patentne prijave br. US 2020/0024356A1; i CD3-gama sadrži sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je kao što je navedeno u SEQ ID NO:119 iz objave SAD patentne prijave br. US 2020/0024356A1. Predviđeno je da se sva upućivanja na proteine, polipeptide i proteinske fragmente u ovoj specifikaciji odnose na humanu verziju odgovarajućeg proteina, polipeptida ili proteinskog fragmenta, osim ukoliko nije eksplicitno naznačeno da potiče iz vrste koja je različita od čoveka. Prema tome, izraz „CD3” označava humani CD3, osim ukoliko nije naznačeno da potiče iz vrste koja je različita od čoveka, npr. da je „mišji CD3“, „majmunski CD3” itd.

[0156] Kao što se ovde upotrebljava, „antitelo koje vezuje CD3” ili „anti-CD3 antitelo” uključuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji specifično prepoznaju jednu subjedinicu CD3 (npr. epsilon, delta, gama ili zeta), kao i antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen koji specifično prepoznaju dimerni kompleks od dve CD3 subjedinice (npr. gama/epsilon, delta/epsilon i zeta/zeta CD3 dimere). Antitela i fragmenti koji vezuju antigen predmetnog pronalaska mogu vezivati solubilan CD3 i/ili CD3 eksprimiran na površini ćelije. Solubilan CD3 uklјučuje prirodne CD3 proteine, kao i rekombinantne varijante CD3 proteina kao što su, npr. monomerni i dimerni CD3 konstrukti, kojima nedostaje transmembranski domen ili nisu na drugi način povezani sa ćelijskom membranom.

[0157] Kao što se ovde upotrebljava, izraz „CD3 eksprimiran na površini ćelije” označava jedan ili više CD3 proteina koji se eksprimira/eksprimiraju na površini ćelije in vitro ili in vivo, tako da je najmanje deo CD3 proteina izložen vanćelijskoj strani ćelijske membrane i dostupan delu antitela koji vezuje antigen. CD3 eksprimiran na površini ćelije uklјučuje CD3 proteine sadržane unutar konteksta funkcionalnog T-ćelijskog receptora u membrani ćelije. CD3 eksprimiran na površini ćelije uklјučuje CD3 protein eksprimiran kao deo homodimera ili heterodimera na površini ćelije. (npr. gama/epsilon, delta/epsilon i zeta/zeta CD3 dimere). CD3 eksprimiran na površini ćelije takođe uklјučuje CD3 lanac (npr. CD3-epsilon, CD3-delta ili CD3-gama) koji se eksprimira samostalno, bez drugih tipova CD3 lanaca, na površini ćelije. CD3 eksprimiran na površini ćelije može sadržavati ili se sastojati od CD3 proteina eksprimiranog na površini ćelije koja normalno eksprimira CD3 protein. Alternativno, CD3 eksprimiran na površini ćelije može sadržavati ili se sastojati od CD3 proteina eksprimiranog na površini ćelije koja normalno ne eksprimira humani CD3 na svojoj površini, ali je veštački modifikovana genetičkim inžinjeringom tako da eksprimira CD3 na svojoj površini.

[0158] U pojedinim primerima izvođenja, predmetni pronalazak uključuje bispecifična antitela gde jedan krak imunoglobulina vezuje CD3, a drugi krak imunoglobulina je specifičan za kancerski antigen (ovde takođe označen kao tumorski antigen ili „TAA“). U pojedinim primerima izvođenja, predmetni pronalazak uključuje trispecifična antitela gde prvi krak imunoglobulina vezuje CD3, drugi krak imunoglobulina je specifičan za tumorski antigen, a treći krak imunoglobulina vezuje dodatni T-ćelijski antigen (npr. CD28) ili dodatni tumorski antigen.

[0159] U pojedinim primerima izvođenja, krak koji vezuje CD3 može sadržavati bilo koju od HCVR/LCVR ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su kao što je opisano u WO 2014/047231 ili WO 2017/053856. U određenim primerima izvođenja, krak koji vezuje CD3 vezuje se za humani CD3 i indukuje aktivaciju humanih T-ćelija. U određenim primerima izvođenja, krak koji vezuje CD3 vezuje se slabo za humani CD3 i indukuje aktivaciju humanih T-ćelija. U drugim primerima izvođenja, krak koji vezuje CD3 vezuje se slabo za humani CD3 i indukuje ubijanje ćelija koje eksprimiraju antigen povezan sa tumorom u kontekstu bispecifičnog ili multispecifičnog antitela. U drugim primerima izvođenja, krak koji vezuje CD3 vezuje se slabo ili se udružuje sa humanim i CD3 cinomolgus majmuna (majmunskim), ali interakciju vezivanja ipak nije moguće detektovana in vitro testovima koji su poznati u oblasti tehnike.

[0160] U određenim primerima izvođenja, multispecifična antitela ili fragmenti koji vezuju antigen za upotrebu u predmetnom pronalasku sadrže krak koji vezuje antigen, a koji se vezuje za CD28, ICOS, HVEM, CD27, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, SLAM, CD2, 2B4, CD226, TIM1 ili TIM2, da bi indukovala aktivacija T-ćelija.

[0161] U određenim primerima izvođenja, CD3 multispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži domen koji vezuje antigen specifičan za kancerski antigen. U određenim primerima izvođenja, kancerski antigen je izabran od AIM-2, ALDH1A1, alfa-aktinina-4, alfa-fetoproteina („AFP“), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), BCMA, BCR-ABL fuzionog proteina b3a2, beta-katenina, BING-4, CA-125, CALCA, karcinoembrionskog antigena CASP-5, CASP-8, CD20, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciklina D1, ciklina-A1, dek-kan fuzionog proteina, DKK1, EFTUD2, faktora elongacije tipa 2, ENAH (hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, epitelnog tumorskog antigena („ETA“), fuzionog proteina ETV6-AML1, EZH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipikana-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, HAUS3, Hepsina, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, intestinalne karboksi esteraze, K-ras, Kalikreina 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 takođe poznatog kao CCDC110, LAGE-1, LDLR-fukoziltransferazaAS fuzionog proteina, Lengzina, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, maličnog enzima, mamaglobina-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloa, Midkina, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, MUC16, mucina, MUM-1, MUM-2, MUM-3, miozina, miozina klase I, N-sirovog, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, P polipeptida, p53, PAP, PAX5, PBF, pml-RARalfa fuzionog proteina, polimorfnog epitelnog mucina ("PEM"), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NYMEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernina 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, STEAP2, survivina, SYT-SSX1 ili -SSX2 fuzionog proteina, TAG-1, TAG-2, telomeraze, TGFbetaRII, TPBG, TRAG-3, triozefosfat izomeraze, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirozinaze, tirozinaze ("TYR"), VEGF, WT1 i XAGE-1b/GAGED2a.

[0162] U pojedinim primerima izvođenja, kancerski antigen uklјučuje ADAM 17, BCMA, CA-IX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CDH3, CEA, EphA2, EpCAM, ERBB2, ENPP3, EGFR, EGFR-vIII, FLT3, FOLR1, GD-2, glipikan-3, gpA33, GPNMB, GPRC5D, HER2, HER3, LMP1, LMP2A, MUC16, mezotelin, PSMA, PSCA, RON, ROR1, ROR2, STEAP1, STEAP2, SSTR2, SSTR5, 5T4 i Trop-2. U pojedinim primerima izvođenja, tumorski antigen može biti CD19, CD123, STEAP2, CD20, SSTR2, CD38, STEAP1, 5T4, ENPP3, PSMA, MUC16, GPRC5D ili BCMA.

[0163] U pojedinim primerima izvođenja, tumorski antigen može biti CD19, CD123, STEAP2, CD20, SSTR2, CD38, STEAP1, 5T4, ENPP3, PSMA, MUC16, GPRC5D ili BCMA.

[0164] U pojedinim primerima izvođenja, kancerski antigen je CD20, MUC16, BCMA, PSMA ili STEAP2.

[0165] CD20 je neglikozilovani fosfoprotein koji se eksprimira na ćelijskim membranama zrelih B-ćelija. CD20 se smatra antigenom povezanim sa B-ćelijskim tumorima pošto ga eksprimira više od 95% B-ćelijskin ne-Hočkinovih limfoma (NHL) i drugih B-ćelijskih maligniteta, ali koji je odsutan na prekursorskim B-ćelijama, dendritičnim ćelijama i plazma ćelijama. Humani CD20 protein ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 5 iz objave SAD patentne prijave br. US 2020/0129617.

[0166] MUC16 se odnosi na mucin 16. MUC16 je visoko glikozilovani integralni membranski glikoprotein sa jednim transmembranskim domenom koji je visoko eksprimiran u kanceru jajnika. Aminokiselinska sekvenca humanog MUC16 je navedena u SEQ ID NO: 1899 iz objave SAD patentne prijave br. US 2018/0118848A1.

[0167] BCMA se odnosi na antigen sazrevanja B-ćelija. BCMA (takođe poznat kao TNFRSF17 i CD269) protein je na površini ćelije koji se eksprimira na malignim plazma ćelijama i ima centralnu ulogu u regulisanju sazrevanja i diferencijacije B-ćelija u plazma ćelije koje proizvode imunoglobuline. Aminokiselinska sekvenca humanog BCMA je prikazana u SEQ ID NO: 115 iz objave SAD patentne prijave br. US 2020/0024356. Takođe se može naći u GenBank bazi podataka pod pristupnim brojem NP_001183.2.

[0168] PSMA se odnosi na membranski antigen specifičan za prostatu, koji je takođe poznat kao folat hidrolaza 1 (FOLH1). PSMA je integralni, neskraćeni membranski glikoprotein koji je visoko eksprimiran u epitelnim ćelijama prostate i predstavlјa marker ćelijske površine za kancer prostate. Aminokiselinska sekvenca humanog PSMA je navedena u SEQ ID NO: 7 iz objave SAD patentne prijave br. US 2020/0129617.

[0169] STEAP2 se odnosi na šesto-transmembranski epitelni antigen prostate 2. STEAP2 je integralni protein koji se proteže šest puta kroz transmembranski sloj i visoko je eksprimiran u ćelijama epitela prostate, koji stoga predstavlјa marker na površini ćelija za kancer prostate. STEAP2 je protein od 490 aminokiselina kodiran STEAP2 genom koji se kod lјudi nalazi u hromozomskom regionu 7q21. Aminokiselinska sekvenca humanog STEAP2 je navedena u SEQ ID NO: 9 iz objave SAD patentne prijave br. US 2020/0129617.

[0170] U pojedinim primerima izvođenja, CD3 multispecifično antitelo može biti bispecifično CD3xCD19 antitelo, bispecifično CD3x GPRC5D antitelo, bispecifično CD3xCD123 antitelo, bispecifično CD3xSTEAP2 antitelo, bispecifično CD3xCD20 antitelo, bispecifično CD3xSSTR 2 antitelo, bispecifično CD3xCD38 antitelo, bispecifično CD3xSTEAP1 antitelo, bispecifično CD3x5T4 antitelo, bispecifično CD3xENPP3 antitelo, bispecifično CD3xMUC16 antitelo, bispecifično CD3xBCMA antitelo, bispecifično CD3xPSMA antitelo ili trispecifično CD3xCD28xCD38 antitelo.

[0171] U pojedinim primerima izvođenja, predmetni pronalazak uklјučuje antitela koja imaju HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinske sekvence antitela koja su ovde navedena, anti-CD3 antitela opisanih u WO 2014/047231 ili WO 2017/053856, bispecifičnih anti-CD20 x anti-CD3 antitela opisanih u WO 2014/047231, bispecifičnih anti-PSMA x anti-CD3 antitela opisanih u WO 2017/023761, bispecifičnih anti-MUC16 x anti-CD3 antitela opisanih u WO 2018/067331, bispecifičnih anti-STEAP2 x anti-CD3 antitela opisanih u WO 2018/058001 ili bispecifičnih anti-BCMA x anti-CD3 antitela opisanih u WO 2020/018820.

[0172] U određenim primerima izvođenja, multispecifičan molekul koji vezuje antigen je multispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. Svaki domen koji vezuje antigen multispecifičnog antitela sadrži varijabilni domen teškog lanca (HCVR) i varijabilni domen lakog lanca (LCVR). U kontekstu bispecifičnog molekula koji vezuje antigen i sadrži prvi i drugi domen koji vezuje antigen (npr. bispecifično je antitelo), CDR prvog domena koji vezuje antigen mogu biti označeni prefiksom „A1“, a CDR drugog domena koji vezuje antigen mogu biti označeni prefiksom „A2“. Prema tome, CDR prvog domena koji vezuje antigen mogu ovde biti označeni kao A1-HCDR1, A1-HCDR2 i A1-HCDR3; a CDR drugog domena koji vezuje antigen mogu ovde biti označeni kao A2-HCDR1, A2-HCDR2 i A2-HCDR3. U kontekstu trispecifičnog molekula koji vezuje antigen, a koji sadrži prvi, drugi i treći domen koji vezuje antigen (npr. trispecifično je antitelo), CDR prvog domena koji vezuje antigen mogu biti označeni prefiksom „A1“, CDR drugog domena koji vezuje antigen mogu biti označeni prefiksom „A2“, a CDR trećeg domena koji vezuje antigen mogu biti označeni prefiksom „A3“. Prema tome, CDR prvog domena koji vezuje antigen mogu ovde biti označeni kao A1-HCDR1, A1-HCDR2 i A1-HCDR3; CDR drugog domena koji vezuje antigen mogu ovde biti označeni kao A2-HCDR1, A2-HCDR2 i A2-HCDR3; i CDR trećeg domena koji vezuje antigen mogu ovde biti označeni kao A3-HCDR1, A3-HCDR2 i A3-HCDR3.

[0173] Bispecifični molekuli koji vezuju antigen koji su prethodno ili ovde razmatrani, mogu biti bispecifična antitela. U pojedinim primerima izvođenja, bispecifično antitelo sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG. U pojedinim primerima izvođenja, konstantni region teškog lanca humanog IgG je IgG1 izotipa. U pojedinim primerima izvođenja, konstantni region teškog lanca humanog IgG je IgG4 izotipa. U raznim primerima izvođenja, bispecifično antitelo sadrži himerni zglob koji smanjuje vezivanje za Fcy receptor u odnosu na zglobni region divlјeg tipa istog izotipa.

[0174] Prvi domen koji vezuje antigen i drugi domen koji vezuje antigen mogu biti direktno ili indirektno povezani jedan sa drugim da bi se obrazovao bispecifičan molekul koji vezuje antigen predmetnog pronalaska. Alternativno, prvi domen koji vezuje antigen i drugi domen koji vezuje antigen mogu biti povezani sa zasebnim multimerizirajućim domenom. Povezivanje jednog multimerizirajućeg domena sa drugim multimerizirajućim domenom olakšava povezivanje između dva domena koja vezuju antigen, čime se obrazuje bispecifičan molekul koji vezuje antigen. Kao što se ovde upotrebljava, „multimerizirajući domen” je bilo koji makromolekul, protein, polipeptid, peptid ili aminokiselina koji imaju sposobnost da se poveže sa drugim multimerizirajućim domenom iste ili slične strukture ili konstitucije. Na primer, multimerizirajući domen može biti polipeptid koji sadrži imunoglobulinski CH3 domen. Neograničavajući primer multimerizirajuće komponente je Fc deo imunoglobulina (koji sadrži CH2-CH3 domen), npr. Fc domen IgG izabranog od izotipova IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, kao i bilo koji alotip unutar svake od izotipskih grupa.

[0175] Bispecifični molekuli koji vezuju antigen predmetnog pronalaska obično će sadržavati dva multimerizirajuća domena, npr. dva Fc domena od kojih je svaki pojedinačno deo odvojenog teškog lanca antitela. Prvi i drugi multimerizujući domeni mogu biti istog IgG izotipa kao što su, npr. IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4. Alternativno, prvi i drugi multimerizujući domen mogu biti različitih IgG izotipova kao što su, npr. IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4 itd.

[0176] U određenim primerima izvođenja, multimerizujući domen je Fc fragment ili aminokiselinska sekvenca dužine od 1 do oko 200 aminokiselina koji sadrže najmanje jedan cisteinski ostatak. U drugim primerima izvođenja, multimerizujući domen je cisteinski ostatak ili kratki peptid koji sadrži cistein. Ostali multimerizujući domeni uklјučuju peptide ili polipeptide koji sadrže ili se sastoje od leucinskog rajsfešlusa, motiva heliks-petlјa ili motiva spiralne zavojnice.

[0177] Bilo koji format bispecifičnog antitela ili tehnologija mogu biti upotrebljeni za pravlјenje bispecifičnih molekula koji vezuju antigen predmetnog pronalaska. Na primer, antitelo ili njegov fragment koji ima prvu specifičnost vezivanja antigena može biti funkcionalno povezan (npr. hemijskim kupolovanjem, genetičkom fuzijom, nekovalentnim udruživanjem ili na drugi način) sa jednim ili više drugih molekulskih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela koji ima drugu specifičnost vezivanja antigena, da bi se proizveo bispecifičan molekul koji vezuje antigen. Specifični primeri bispecifičnih formata koji mogu biti upotrebljeni u kontekstu predmetnog pronalaska uklјučuju, bez ograničenja, npr. bispecifične formate zasnovane na scFv ili diatelima, IgG-scFv fuzije, dvostruke varijabilne domene (DVD)-Ig, kvadrom, strukture tipa „dugme-u-rupicu”, zajedničke lake lance (npr. zajedničke lake lance sa strukturama tipa „dugme-u-rupicu” itd.), CrossMab, CrossFab, (SEED)tela, leucinske rajsfešluse, Duotela, IgG1/IgG2, dvostruko delujuće Fab (DAF)-IgG i Mab<2>bispecifičan format (pogledati, npr. Klein i saradnici, 2012, mAbs 4:6, 1-11, i reference navedene u članku radi revijskog pregleda prethodno navedenih formata).

[0178] U kontekstu bispecifičnih molekula koji vezuju antigen koji su ovde obezbeđeni, multimerizujući domeni, npr. Fc domeni, mogu sadržavati jednu ili više aminokiselinskih promena (npr. insercija, delecija ili supstitucija) u poređenju sa prirodno prisutnom verzijom Fc domena divljeg tipa. Na primer, pronalazak uklјučuje bispecifične molekule koji vezuju antigen, koji sadrže jednu ili više modifikacija u Fc domenu koje rezultuju modifikovanim Fc domenom i koji time ima modifikovanu interakciju vezivanja (npr. pojačanu ili smanjenu) između Fc i FcRn. U jednom primeru izvođenja, bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži modifikaciju u CH2 ili CH3 regionu, pri čemu modifikacija povećava afinitet Fc domena za FcRn u kiseloj sredini (npr. u endozomu gde je pH opsega od oko 5,5 do oko 6,0). Neograničavajući primeri takvih Fc modifikacija uklјučuju, npr. modifikaciju na poziciji 250 (npr. E ili Q); 250 i 428 (npr. L ili F); 252 (npr. L/Y/F/W ili T), 254 (npr. S ili T) i 256 (npr. S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju na poziciji 428 i/ili 433 (npr. L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr. H/F ili Y); ili modifikaciju na poziciji 250 i/ili 428; ili modifikaciju na poziciji 307 ili 308 (npr.308F, V308F) i 434. U jednom primeru izvođenja, modifikacija obuhvata modifikaciju 428L (npr. M428L) i 434S (npr. N434S); modifikaciju 428L, 259I (npr. V259I) i 308F (npr. V308F); modifikaciju 433K (npr. H433K) i 434 (npr. 434Y); modifikaciju 252, 254 i 256 (npr. 252Y, 254T i 256E); modifikaciju 250Q i 428L (npr. T250Q i M428L); i modifikaciju 307 i/ili 308 (npr.308F ili 308P).

[0179] U određenim primerima izvođenja, ovde su obezbeđeni bispecifični molekuli koji vezuju antigen, koji sadrže prvi CH3 domen i drugi Ig CH3 domen, pri čemu se prvi i drugi Ig CH3 domeni razlikuju jedan u odnosu na drugog za najmanje jednu aminokiselinu, i pri čemu najmanje jedna razlika u aminokiselini smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za Protein A u poređenju sa bispecifičnim antitelom u kome takva razliku u aminokiselini nedostaje. U jednom primeru izvođenja, prvi Ig CH3 domen vezuje Protein A, a drugi Ig CH3 domen sadrži mutaciju koja smanjuje ili ukida vezivanje Proteina A, kao što je H95R modifikacija (po IMGT numeraciji egzona; H435R po EU numeraciji). Drugi CH3 može dalјe sadržavati modifikaciju Y96F (po IMGT; Y436F po EU). Pogledati, na primer, SAD patent br. 8,586,713. Dalјe modifikacije koje se mogu naći u drugom CH3 uklјučuju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M i V82I (po IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M i V422I po EU) u slučaju IgG1 antitela; N44S, K52N i V82I (IMGT; N384S, K392N i V422I po EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q i V82I (po IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q i V422I po EU) u slučaju IgG4 antitela.

[0180] U određenim primerima izvođenja, Fc domen može biti himerni, dobijen kombinovanjem Fc sekvenci izvedenih iz više od jednog imunoglobulinskog izotipa. Na primer, himerni Fc domen može sadržavati deo ili celokupnu CH2 sekvencu izvedenu iz CH2 regiona humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4, kao i deo ili celokupnu CH3 sekvencu izvedenu iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4. Himerni Fc domen takođe može sadržavati himerni zglobni region. Na primer, himerni zglobni region može sadržavati sekvencu „gornjeg zglobnog regiona“, izvedenu iz zglobnog regiona humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4, u kombinaciji sa sekvencom „donjeg zglobnog regiona“, izvedenog iz zglobnog regiona humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4. Poseban primer himernog Fc domena koji može biti uklјučen u bilo koji od molekula koji vezuju antigen koji je ovde naveden obuhvata, od N- do C-kraja: [CH1 IgG4] - [gornji zglobni region IgG4] - [donji zglobni region IgG2] - [CH2 IgG4] - [CH3 IgG4]. Drugi primer himernog Fc domena koji može biti uklјučen u bilo koji od molekula koji vezuju antigen koji je ovde naveden obuhvata, od N- do C-kraja: [CH1 IgG1] - [gornji zglobni region IgG1] - [donji zglobni region IgG2] - [CH2 IgG4] - [CH3 IgG1]. Ovi i drugi primeri himernih Fc domena koji mogu biti uklјučeni u bilo koji od molekula koji vezuju antigen predmetnog pronalaska opisani su u SAD patentu br. 2014/0243504, objavljenom 28. avgusta 2014. god. Himerni Fc domeni koji imaju ove opšte strukturne aranžmane, i njihove varijante, mogu imati izmenjeno vezivanje za Fc receptor, što zauzvrat utiče na efektorsku funkciju Fc.

[0181] Multispecifična (npr. bispecifična ili trispecifična) antitela za CD3 koja su ovde opisana mogu sadržavati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u uokvirujućim i/ili CDR regionima varijabilnih domena teških i lakih lanaca, u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama iz kojih su antitela izvedena. Takve mutacije lako mogu biti utvrđene poređenjem aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane sa germinativnim sekvencama dostupnim, na primer, u javnim bazama podataka za sekvence antitela. Predmetni pronalazak uključuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji su izvedeni iz bilo koje od aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane, pri čemu je jedna ili više aminokiselina unutar jednog ili više od uokvirujućih i/ili CDR regiona mutirana u odgovarajući(e) ostatak(e) germinativne sekvence iz koje je antitelo izvedeno, ili u odgovarajući(e) ostatak(e) druge humane germinativne sekvence, ili u konzervativnu aminokiselinsku supstituciju odgovarajućeg(ih) germinativnih ostatka(a) (takve promene sekvence se ovde zajednički označavaju kao „germinativne mutacije“). Prosečno iskusan stručnjak iz oblasti tehnike, polazeći od sekvenci varijabilnog regiona teških i lakih lanaca koji su ovde opisani, lako može proizvesti brojna antitela i fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže jednu ili više pojedinačnih germinativnih mutacija ili njihovih kombinacija. U određenim primerima izvođenja, svi ostaci uokvirujućih i/ili CDR unutar VHi/ili VLdomena povratno su mutirani do ostataka koji se nalaze u originalnoj germinativnoj sekvenci iz koje je antitelo izvedeno. U drugim primerima izvođenja, samo određeni ostaci su povratno mutirani do originalne germinativne sekvence, npr. samo su mutirani ostaci koji se nalaze unutar prvih 8 aminokiselina FR1 ili unutar poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili su samo mutirani ostaci koji se nalaze unutar CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim primerima izvođenja, jedan ili više ostataka uokvirujućih i/ili CDR su mutirani u odgovarajući ostatak(e) različite germinativne sekvence (tj. germinativne sekvence koja se razlikuje od germinativne sekvence iz koje je antitelo prvobitno izvedeno). Štaviše, antitela predmetnog pronalaska mogu sadržavati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija unutar uokvirujućih i/ili CDR regiona, npr. pri čemu su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence, dok su određeni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne sekvence zadržani ili su mutirani u odgovarajući ostatak različite germinativne sekvence. Jednom dobijeni, antitela i fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija, lako mogu biti ispitani u pogledu jedne ili više od želјenih osobina, kao što su pobolјšana specifičnost vezivanja, povećano vezivanje (npr. mereno titracijom vezivanja ćelija ili FACS vezivanjem) ili afinitet vezivanja (npr. KD), pobolјšane ili pojačane antagonističke ili agonističke biološke osobine (u zavisnosti od slučaja), smanjena imunskogenost itd. Antitela i fragmenti koji vezuju antigen dobijeni na ovaj opšti način obuhvaćeni su predmetnim pronalaskom.

[0182] Ovde su takođe obezbeđena CD3 multispecifična (npr. bispecifična ili trispecifična) antitela koja sadrže varijante bilo koje od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane, a koje sadrže jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, predmetni pronalazak uklјučuje antagonistička anti-CD40 antitela ili CD3 multispecifična (npr. bispecifična ili trispecifična) antitela koja imaju HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, npr. 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje itd. konzervativnih aminokiselinskih supstitucija u odnosu na bilo koju od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane.

CD3xMUC16 antitela za primer

[0183] U pojedinim primerima izvođenja, postupci i kompozicije koje su ovde obezbeđeni uklјučuju bispecifična antitela gde jedan krak imunoglobulina vezuje humani CD3, a drugi krak imunoglobulina je specifičan za humani MUC16. Termin „MUC16“, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na humani MUC16 protein, osim ukoliko nije naznačeno da potiče iz vrste koja je različita od čoveka (npr. „mišji MUC16“, „majmunski MUC16“ itd.). Humani MUC16 protein ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1899 iz objave SAD patentne prijave br. US 2018/0118848A1. Takvi molekuli ovde mogu biti označeni kao, npr. „anti-CD3/anti-MUC16” ili „anti-CD3xMUC16” ili „CD3xMUC16” bispecifični molekuli, ili drugom sličnom terminologijom (npr. anti-MUC16/anti-CD3). Takvi bispecifični molekuli koji vezuju antigen konstruisani su sa prvim krakom koji vezuje antigen i vezuje MUC16, i drugim krakom koji vezuje antigen i vezuje CD3. Krak koji vezuje MUC16 može sadržavati bilo koju od HCVR/LCVR ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su kao što je ovde navedeno u Tabeli 1. Krak koji vezuje CD3 može sadržavati bilo koju od HCVR/LCVR ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su kao što je ovde navedeno u Tabelama 2-6. Sekvence u Tabelama 1-6 su opisane u objavi SAD patentne prijave br. US 2020/0118848A1. SEQ ID NO. u Tabelama 1-6 odnose se na sekvence iz objave SAD patentne prijave br. US 2018/0118848A1.

[0184] Tabela 1 prikazuje identifikatore aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona teških i lakih lanaca, kao i CDR, za odabrana anti-MUC16 antitela pronalaska.

Tabela 1: Identifikatori aminokiselinskih sekvenci

[0185] Tabela 2 prikazuje identifikatore aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona teških i lakih lanaca, kao i CDR, za odabrana anti-CD3 antitela pronalaska. Postupci za pravlјenje anti-CD3 antitela koja su ovde opisana takođe se mogu naći u objavi SAD patenta br.2014/0088295.

Tabela 2: Identifikatori aminokiselinskih sekvenci

[0186] Tabele 3 i 4 prikazuju identifikatore aminokiselinskih sekvenci za varijabilne regione teških lanaca (Tabela 3) i varijabilne regione lakih lanaca (Tabela 4), kao i njihove odgovarajuće CDR, za dodatne anti-CD3 HCVR i LCVR korisne u anti-MUC16 × anti-CD3 bispecifičnim antitelima pronalaska.

Tabela 3 (Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teških lanaca)

Tabela 4 (Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona lakih lanaca)

[0187] Tabela 5 prikazuje identifikatore aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona teških lanaca i CDR za anti-CD3 antitela pronalaska konstruisana genetičkim inženjeringom. Identifikatori aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona lakih lanaca i CDR su takođe identifikovani ispod, u Tabeli 6.

Tabela 5: Identifikatori aminokiselinskih sekvenci teških lanaca

Tabela 6: Identifikatori aminokiselinskih sekvenci lakih lanaca

[0188] U određenim izvođenjima za primer, prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje humani CD3 sadrži regione koji određuju komplementarnost teških lanaca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) iz varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) izabranog iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1730, 1762, 1778, 1786 i 1866, kao i regione koji određuju komplementarnost lakih lanaca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) iz varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26.

[0189] U određenim izvođenjima za primer, prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje humani CD3 sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teških lanaca (A1-HCDR1, A1-HCDR2 i A1-HCDR3) i tri regiona koji određuju komplementarnost lakih lanaca (A1-LCDR1, A1-LCDR2 i A1-LCDR3), pri čemu A1-HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1732, 1764, 1780, 1788 i 1868; A1-HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1734, 1766, 1782, 1790 i 1870; A1-HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1736, 1768, 1784, 1792 i 1872; A1-LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28; A1-LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30; i A1-LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32.

[0190] U određenim izvođenjima za primer, prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje humani CD3 sadrži CDR teških i lakih lanaca iz para HCVR/LCVR aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO: 1730/26, 1762/26, 1778/26, 1786/26 i 1866/26.

[0191] U određenim izvođenjima za primer, prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje humani CD3 sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teških lanaca (A1-HCDR1, A1-HCDR2 i A1-HCDR3) i tri regiona koji određuju komplementarnost lakih lanaca (A1-LCDR1, A1-LCDR2 i A1-LCDR3), i drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani MUC16 sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teških lanaca (A2-HCDR1, A2-HCDR2 i A2-HCDR3) i tri regiona koji određuju komplementarnost lakih lanaca (A2-LCDR1, A2-LCDR2 i A2-LCDR3); pri čemu A1-HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1732, 1764, 1780, 1788 i 1868; A1-HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1734, 1766, 1782, 1790 i 1870; A1-HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1736, 1768, 1784, 1792 i 1872; A1-LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28; A1-LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30; i A1-LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32; i pri čemu A2-HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; A2-HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; A2-HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; A2-LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28; A2-LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30; i A2-LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32.

[0192] Dodatna bispecifična anti-MUC16 × anti-CD3 antitela su opisana u, npr. WO 2018/067331.

CD3xBCMA antitela za primer

[0193] U pojedinim primerima izvođenja, postupci i kompozicije koje su ovde obezbeđeni uklјučuju bispecifična antitela u kojima jedan krak imunoglobulina vezuje humani CD3, a drugi krak imunoglobulina je specifičan za humani BCMA. Termin „BCMA“, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na humani BCMA protein, osim ukoliko nije naznačeno da potiče iz vrste koja je različita od čoveka (npr. „mišji BCMA“, „majmunski BCMA” itd.). Humani BCMA protein ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 115 iz objave SAD patentne prijave br. US 2020/0024356A1. Takvi molekuli ovde mogu biti označeni kao, npr. „anti-BCMA × anti-CD3” ili „anti-CD3/anti-BCMA“, ili „anti-CD3xBCMA” ili „CD3xBCMA” bispecifični molekuli, ili drugom sličnom terminologijom (npr. anti-BCMA/anti-CD3). Krak koji vezuje BCMA može sadržavati bilo koju od HCVR/LCVR ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde navedene u Tabeli 7. Krak koji vezuje CD3 može sadržavati bilo koju od HCVR/LCVR ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde navedene u Tabeli 8, ili anti-CD3 antitela opisana u WO 2014/047231 ili WO 2017/053856. Sekvence u Tabelama 7 i 8 su opisane u objavi SAD patentne prijave br. US 2020/0024356A1. SEQ ID NO. u Tabelama 7 i 8 odnose se na sekvence iz objave SAD patentne prijave br. US 2020/0024356A1.

[0194] Tabela 7 prikazuje identifikatore aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona i CDR teških i lakih lanaca za odabrana anti-BCMA antitela pronalaska.

Tabela 7: Identifikatori aminokiselinskih sekvenci

[0195] Tabela 8 prikazuje identifikatore aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona i CDR teških i lakih lanaca za odabrana anti-CD3 antitela. Druga anti-CD3 antitela za upotrebu u pripremi bispecifičnih antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se naći u, npr. WO 2014/047231.

Tabela 8: Identifikatori aminokiselinskih sekvenci

[0196] U određenim izvođenjima za primer, izolovani anti-BCMA × anti-CD3 bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži prvi domen koji vezuje antigen i sadrži: (a) tri regiona koji određuju komplementarnost teških lanaca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) sadržane unutar varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66; i (b) tri regiona koji određuju komplementarnost lakih lanaca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) sadržane unutar varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:82. U pojedinim primerima izvođenja, izolovani bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži HCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:68, HCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:70 i HCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:72. U pojedinim slučajevima, izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži LCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:84, LCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:86 i LCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:88. U pojedinim slučajevima, prvi domen koji vezuje antigen sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66 i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82. Prethodno navedene SEQ ID NO. se odnose na sekvence iz objave SAD patentne prijave br. US 2020/0024356A1.

[0197] U određenim izvođenjima za primer, izolovan anti-BCMA × anti-CD3 bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži drugi domen koji vezuje antigen i koji sadrži: (a) tri regiona koji određuju komplementarnost teških lanaca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) sadržane unutar varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90 ili SEQ ID NO: 98; i (b) tri regiona koji određuju komplementarnost lakih lanaca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) sadržane unutar varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82. U pojedinim slučajevima, drugi domen koji vezuje antigen sadrži: (a) HCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 92 ili SEQ ID NO: 100; (b) HCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 94 ili SEQ ID NO: 102; i (c) HCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 96 ili SEQ ID NO: 104. U pojedinim primerima izvođenja, drugi domen koji vezuje antigen sadrži LCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:84, LCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:86 i LCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:88. U pojedinim slučajevima, drugi domen koji vezuje antigen sadrži: (a) HCDR1, HCDR2, HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 92, 94, 96; i LCDR1,LCDR2,LCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88; ili (b) HCDR1, HCDR2, HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 100, 102, 104; i LCDR1, LCDR2, LCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88. U pojedinim slučajevima, drugi domen koji vezuje antigen sadrži: (a) HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82; ili (b) HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 98, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82. Prethodno navedene SEQ ID NO. se odnose na sekvence iz objave SAD patentne prijave br. US 2020/0024356A1.

[0198] U određenim izvođenjima za primer, izolovani anti-BCMA × anti-CD3 bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži: (a) prvi domen koji vezuje antigen i sadrži HCDR1,HCDR2,HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 68, 70, 72, i LCDR1,LCDR2,LCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88; i (b) drugi domen koji vezuje antigen i sadrži HCDR1,HCDR2,HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 92, 94, 96, i LCDR1,LCDR2,LCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88. U pojedinim slučajevima, izolovan bispecifičan molekul za vezivanje antigena sarži: (a) prvi domen koji vezuje antigen i sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82; i (b) drugi domen koji vezuje antigen i sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82.

[0199] U određenim izvođenjima za primer, izolovan anti-BCMA × anti-CD3 bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži: (a) prvi domen koji vezuje antigen i sadrži HCDR1,HCDR2,HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 68, 70, 72, i LCDR1,LCDR2,LCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88; i (b) drugi domen koji vezuje antigen i sadrži HCDR1,HCDR2,HCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 100, 102, 104 i LCDR1,LCDR2,LCDR3 domene, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 84, 86, 88. U pojedinim primerima izvođenja, izolovan bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži: (a) prvi domen koji vezuje antigen i sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66 i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82; i (b) drugi domen koji vezuje antigen i sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 98 i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82. Prethodno navedene SEQ ID NO. se odnose na sekvence iz objave SAD patentne prijave br. US 2020/0024356A1.

[0200] U određenim izvođenjima za primer, izolovan anti-BCMA × anti-CD3 bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži: (a) prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje humani BCMA, koji sadrži CDR iz HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 122 i 124, i CDR iz LCVR koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 82, 123 i 125; i (b) drugi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje humani CD3. U pojedinim slučajevima, prvi domen koji vezuje antigen sadrži CDR iz para HCVR/LCVR aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 122/123, 124/125, 2/82, 18/82, 34/82, 50/82, 66/82, 122/82 i 124/82. U pojedinim slučajevima, prvi domen koji vezuje antigen sadrži domene HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, tim redom, izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 4-6-8-12-14-16, 20-22-24-28-30-32, 36-38-40-44-46-48, 52-54-56-60-62-64, 68-70-72-76-78-80, 4-6-8-84-86-88, 20-22-24-84-86-88, 36-38-40-84-86-88, 52-54-56-84-86-88 i 68-70-72-84-86-88. U pojedinim slučajevima, prvi domen koji vezuje antigen sadrži par HCVR/LCVR aminokiselinskih sekvenci izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 122/123, 124/125, 2/82, 18/82, 34/82, 50/82, 66/82, 122/82 i 124/82. U pojedinim slučajevima, drugi domen koji vezuje antigen sadrži CDR par HCVR/LCVR aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 90/82 i 98/82. Prethodno navedene SEQ ID NO. se odnose na sekvence iz objave SAD patentne prijave br. US 2020/0024356A1.

[0201] U određenim izvođenjima za primer, izolovan anti-BCMA × anti-CD3 bispecifičan molekul koji vezuje antigen u kompeticiji je vezivanja za BCMA ili se vezuje za isti epitop na BCMA kao referentno antitelo, pri čemu referentno antitelo sadrži prvi domen koji vezuje antigen i sadrži HCVR/LCVR par koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 66/82 i drugi domen koji vezuje antigen i sadrži HCVR/LCVR par koji sadrži aminokiselinske sekvence bilo SEQ ID NO: 90/82 ili SEQ ID NO: 98/82. Prethodno navedene SEQ ID NO. se odnose na sekvence iz objave SAD patentne prijave br. US 2020/0024356A1.

[0202] U određenim izvođenjima za primer, izolovan anti-BCMA × anti-CD3 bispecifičan molekul koji vezuje antigen u konkurenciji je vezivanja za humani CD3 ili se vezuje za isti epitop na humanom CD3 kao referentno antitelo, pri čemu referentno antitelo sadrži prvi domen koji vezuje antigen i sadrži HCVR/LCVR par koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 66/82 i drugi domen koji vezuje antigen i sadrži HCVR/LCVR par koji sadrži aminokiselinske sekvence bilo SEQ ID NO: 90/82 ili SEQ ID NO: 98/82. Prethodno navedene SEQ ID NO. se odnose na sekvence iz objave SAD patentne prijave br. US 2020/0024356A1.

[0203] Dodatna bispecifična anti-BCMA × anti-CD3 antitela su opisana u, npr. WO 2020/018820.

CD3xCD20 antitela

[0204] U pojedinim primerima izvođenja, ovde su obezbeđena bispecifična antitela gde jedan krak imunoglobulina vezuje humani CD3, a drugi krak imunoglobulina je specifičan za humani CD20. Termin „CD20“, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na humani CD20 protein, ukoliko nije specifično naznačeno da potiče iz vrste koja je različita od čoveka (npr. „mišji CD20“, „majmunski CD20” itd.). Humani CD20 protein ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:1369 iz SAD patenta br. US 9,657,102B2. Takvi molekuli ovde mogu označeni kao, npr. „anti-CD3/anti-CD20” ili „anti-CD3×CD20” ili „CD3×CD20” bispecifični molekuli ili drugom sličnom terminologijom.

[0205] U određenim primerima izvođenja, prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD3 sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1250, 1266, 1282, 1298, 1314 i 1329 ili njena suštinski slična sekvenca koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%. Sve sekvence opisane u ovom odelјku za domene koji vezuju antigen i specifično vezuju CD3 ili CD20 i odgovarajući SEQ ID NO. su iz SAD patenta br. US 9,657,102B2.

[0206] U određenim primerima izvođenja, prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD3 sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1258, 1274, 1290, 1306, 1322 i 1333, ili njena suštinski slična sekvenca koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%.

[0207] U određenim primerima izvođenja, prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD3 sadrži par HCVR i LCVR (HCVR/LCVR) aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1250/1258, 1266/1274, 1282/1290, 1298/1306, 1314/1322 i 1329/1333.

[0208] U određenim primerima izvođenja, prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD3 sadrži domen teškog lanca CDR1 (HCDR1) koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1252, 1268, 1284, 1300, 1316 i 1330, ili njena suštinski slična sekvenca koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; domen teškog lanca CDR2 (HCDR2) koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1254, 1270, 1286, 1302, 1318 i 1331, ili njena suštinski slična sekvenca koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; domen teškog lanca CDR3 (HCDR3) koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1256, 1272, 1288, 1304, 1320 i 1332, ili njena suštinski slična sekvenca koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; domen lakog lanca CDR1 (LCDR1) koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1260, 1276, 1292, 1308, 1324 i 1334, ili njena suštinski slična sekvenca koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; domen lakog lanca CDR2 (LCDR2) koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1262, 1278, 1294, 1310, 1326 i 1335, ili njena suštinski slična sekvenca koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%, i domen lakog lanca CDR3 (LCDR3) koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1264, 1280, 1296, 1312, 1328 i 1336, ili njena suštinski slična sekvenca koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%.

[0209] U određenim primerima izvođenja, prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD3 sadrži domene HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, tim redom, koji imaju aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO: 1252-1254-1256-1260-1262-1264; 1268-1270-1272-1276-1278-1280; 1284-1286-1288-1292-1294-1296; 1300-1302-1304-1308-1310-1312; 1316-1318-1320-1324-1326-1328; i 1330-1331 -1332-1334-1335-1336.

[0210] U određenim primerima izvođenja, drugi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD20 sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 1242, ili je njena suštinski slična sekvenca koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%.

[0211] U određenim primerima izvođenja, drugi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD20 sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1258, 1274, 1290, 1306, 1322 i 1333, ili njena suštinski slična sekvenca koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%.

[0212] U određenim primerima izvođenja, drugi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD20 sadrži par HCVR i LCVR (HCVR/LCVR) aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1242/1258, 1242/1274, 1242/1290, 1242/1306, 1242/1322 i 1242/1333.

[0213] U određenim primerima izvođenja, drugi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD20 sadrži domen teškog lanca CDR1 (HCDR1) koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 1244, ili je njena suštinski slična sekvenca koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; domen teškog lanca CDR2 (HCDR2) koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 1246, ili je njena suštinski slična sekvenca koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; domen teškog lanca CDR3 (HCDR3) koji ima aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 1248, ili je njena suštinski slična sekvenca koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; domen lakog lanca CDR1 (LCDR1) koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1260, 1276, 1292, 1308, 1324 i 1334, ili njena suštinski slična sekvenca koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; domen lakog lanca CDR2 (LCDR2) koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1262, 1278, 1294, 1310, 1326 i 1335, ili njena suštinski slična sekvenca koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; i domen lakog lanca CDR3 (LCDR3) koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1264, 1280, 1296, 1312, 1328 i 1336, ili njena suštinski slična sekvenca koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%.

[0214] U određenim primerima izvođenja, drugi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD20 sadrži domene HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, tim redom, koji imaju aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO: SEQ ID NOs: 1244-1246-1248-1260-1262-1264; 1244-1246-1248-1276-1278-1280; 1244-1246-1248-1292-1294-1296; 1244-1246-1248-1308-1310-1312; 1244-1246-1248-1324-1326-1328; i 1244-1246-1248-1334-1335-1336.

[0215] Dodatna bispecifična anti-CD20/anti-CD3 antitela su opisana u npr. SAD patentu br.9,657,102.

Druga CD3 multispecifična antitela za primer

[0216] Dodatna CD3 multispecifična antitela za primer koja mogu biti upotrebljena u kompozicijama i postupcima predmetnog pronalaska uklјučuju, ali nisu ograničena na, npr. bispecifična CD3xCD123 antitela opisana u SAD patentu br.10,787,521B2, objavama SAD patentnih prijava br.2018/0222987A1 i US 2019/024165 7A1, kao i objavama Međunarodnih patentnih prijava br. WO 2016/036937A1, WO 2017/210443A1, WO 2019/050521A1, WO 2019/210147A1, WO 2019/232528A1 i WO 2020/092404A1; bispecifična CD3xSTEAP2 antitela opisana u objavama Međunarodnih patentnih prijava br. WO 2018/058001A1; bispecifična CD3xCD20 antitela opisana u WO 2014/047231A1, WO 2015/143079A1, WO 2016/081490A1, WO 2017/112775A1, WO 2017/210485A1, WO 2018/114748A1, WO 2018/093821A8, WO 2018/223004A1, WO 2018/188612A1, WO 2019/155008A1, WO 2019/228406A1, WO 2020/088608A1, WO 2020/156405A1 i objavama SAD patentnih prijava br. US 2020/0199231A1 i US 2020/0172627A1; bispecifična CD3xSSTR 2 antitela opisana u objavi Međunarodne patentne prijave br. WO 2018/005706A1; bispecifična CD3xCD38 antitela opisana u Međunarodnim prijavama br. WO 2015/149077A1 i WO 2020/018556A1 i objavama SAD patentnih prijava br. US 2018/0305465A1 i US 2020/0102403A1; bispecifična CD3xSTEAP1 antitela opisana u Olivier Nolan-Stevaux (2020) u vidu apstrakta u Zborniku radova Godišnjeg sastanka Američkog udruženja za istraživanje kancera 2020; bispecifična CD3x5T4 antitela opisana u objavi Međunarodne patentne prijave br. WO 2013/041687A1, objavama SAD patentnih prijava br. US 2017/0342160A1, US 20200277397A1; bispecifična CD3xENPP3 antitela koja su kao što je opisano u objavi Međunarodne patentne prijave br. WO 2020/180726A1; bispecifična CD3xMUC16 antitela opisana u objavama Međunarodnih patentnih prijava br. WO 2018/067331A9 i WO 2019/246356A1; bispecifična CD3xBCMA antitela opisana u objavama Međunarodnih patentnih prijava br. WO 2013/072406A1, WO 2014/140248A1, WO 2016/166629A1, WO 2017/031104A1, WO 2017/134134A1, WO 2017/095267A1, WO 2019/220369A3, WO 2019/075359A1, WO 2019/226761A1, WO 2020/025596A1, WO 2020/191346A1, WO 2020018820A1, objavama SAD patentnih prijava br. US 2013/0273055A1, US 2019/0263920A1; bispecifična CD3xCD19 antitela opisana u objavama Međunarodnih patentnih prijava br. WO 2012/055961A1, WO 2016/048938A1,WO 2017/087603A1, WO 2017/096368A1, WO 2018/188612A1, WO 2019/237081A1, WO 2020/048525A1, WO 2020/135335A1, objavama SAD patentnih prijava br. US 2016/0326249A1, US 2020/0283523A1, US 2019/0284279A1, SAD patentu br. US 9,315,567B2, US 7,575,923B2, US 7,635,472B2; bispecifična CD3xGPRC5D antitela opisana u objavama Međunarodnih patentnih prijava br. WO 2018/017786A3, WO 2019/220369A3; bispecifična CD3xPSMA antitela opisana u objavama SAD patentnih prijava br. US 2017/0320947A1; trispecifična CD3xCD28xCD38 antitela opisana u objavi SAD patentne prijave br. US 2020/0140552A1; ili druga CD3 multispecifična antitela opisana u objavama Međunarodnih patentnih prijava br. WO 2016/086189A2, WO 2020/088608A1, WO2019191120A1 i WO 2016/105450A3.

[0217] U pojedinim primerima izvođenja, prethodno navedeni multispecifični (npr. bispecifični ili trispecifični) molekuli koji vezuju antigen i specifično vezuju CD3 i tumorski antigen mogu sadržavati anti-CD3 molekul koji vezuje antigen i koji se vezuje za CD3 sa slabim afinitetom vezivanja, odnosno ispoljava KDveću od oko 40 nM, izmerenu upotrebom in vitro testa afinitetnog vezivanja. Prethodno navedeni bispecifični molekuli koji vezuju antigen mogu sadržavati molekul koji vezuje anti-CD3 antigen, odnosno vezuje se za CD3 i pokazuje EC50 veći od oko 100 nM, izmeren FACS titracionim testom. Prethodno navedeni bispecifični molekuli koji vezuju antigen mogu sadržavati molekul koji vezuje anti-CD3 antigen, a koji ne ispoljava merlјivo ili uočlјivo vezivanje za CD3, mereno in vitro testom afinitetnog vezivanja ili FACS titracionim testom, ali i da zadržava sposobnost da aktiviraju humane PBMC ćelije i/ili indukuju citotoksičnu aktivnost na ćelijskim linijama koje eksprimiraju tumorski antigen.

Terapijska formulacija i davanje

[0218] Prema pojedinim aspektima, ovde su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže antagonistu CD40 (npr. antagonističko antitelo na CD40 ili njegov fragment koji vezuje antigen) i koje su kao što je ovde opisano. Prema pojedinim aspektima, ovde su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže CD3 multispecifičan molekul koji vezuje antigen i koje su kao što je ovde opisano. Prema pojedinim aspektima, ovde su obezbeđene farmaceutske kompozicije u kojima je CD3 multispecifičan molekul koji vezuje antigen i koji je ovde opisan koformulisan sa antagonistom CD40 (npr. antagonističkim antitelom na CD40 ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen) kao što je ovde opisano na drugom mestu.

[0219] Farmaceutske kompozicije koje su ovde obezbeđene, mogu biti formulisane sa odgovarajućim nosačima, ekscipijensima i drugim agensima koji obezbeđuju pobolјšani prenos, isporuku, toleranciju i slično. Mnoštvo odgovarajućih formulacija može se pronaći u formularu poznatom svim farmaceutskim hemičarima: Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije uklјučuju, na primer, praškove, paste, masti, želee, voskove, ulјa, lipide, vezikule koje sadrže lipide (katjonske ili anjonske) (kao što je LIPOFECTIN<™>, Life Technologies, Karlsbad, Kalifornija), DNK konjugate, anhidrovane apsorpcione paste, emulzije tipa ulјe-u-vodi i voda-u-ulјu, emulzije u ugljanom vosku (polietilen glikolima različitih molekulskih težina), polučvrste gelove i polučvrste smeše koje sadrže ugljani vosak. Pogledati takođe Powell i saradnici, „Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[0220] Doza molekula koji vezuje antigen koja se daje pacijentu može varirati u zavisnosti od starosti i veličine pacijenta, cilјne bolesti, stanja, načina davanja i sličnog.

[0221] Poznati su razni sistemi za isporuku koji mogu biti upotrebljeni za davanje farmaceutske kompozicije koja je ovde obezbeđena, npr. inkapsuliranjem u lipozome, mikročestice, mikrokapsule, putem rekombinantnih ćelija sposobnih da eksprimiraju mutirane viruse, endocitoze posredovana receptorima (pogledati, npr. Wu i saradnici, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Postupci uvođenja uklјučuju, ali nisu ograničene na, intradermalni, intramuskularni, intraperitonealni, intravenski, subkutani, intranazalni, epiduralni i oralni način primene. Kompozicija može biti davana bilo kojim pogodnim putem, na primer infuzijom ili bolusnom injekcijom, apsorpcijom kroz epitelne ili mukokutane membrane (npr. oralnu sluzokožu, rektalnu i crevnu sluzokožu itd.) i može biti primenjena zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Davanje može biti sistemsko ili lokalno.

[0222] U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija koji je ovde obezbeđena može biti davana subkutano ili intravenski, standardnom iglom i špricem. Dodatno, u pogledu subkutanog davanja, uređaj za isporuku tipa olovke lako može imati primenu u isporuci farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska. Takav uređaj za isporuku tipa olovke može biti za višekratnu ili jednokratnu upotrebu. Uređaj za višekratnu isporuku tipa olovke generalno koristi patronu koja se može zameniti, a koja sadrži farmaceutsku kompoziciju. Kada se celokupna farmaceutska kompozicija unutar patrone primeni i patrona isprazni, prazna patrona lako može biti odbačena i zamenjena sa novom patronom koja sadrži farmaceutsku kompoziciju. Uređaj za isporuku tipa olovke zatim može biti ponovo upotrebljen. Kod uređaja za isporuku tipa olovke za jednokratnu upotrebu, ne postoji patrona koja se može zameniti. Umesto toga, uređaj za isporuku tipa olovke za jednokratnu upotrebu dolazi prethodno napunjen farmaceutskom kompozicijom koja se nalazi u rezervoaru unutar uređaja. Kada se rezervoar isprazni od farmaceutske kompozicije, ceo uređaj se odbacuje.

[0223] Brojni uređaji za isporuku tipa olovke za višekratnu upotrebu i autoinjektori imaju primenu u subkutanoj isporuci farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska. Primeri uklјučuju, ali nisu ograničeni na, AUTOPEN<™>(Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ pen (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Švajcarska), HUMALOG MIX 75/25™ pen, HUMALOG™ pen, HUMALIN 70/30™ pen (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II i III (Novo Nordisk, Kopenhagen, Danska), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Kopenhagen, Danska), BD™ pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ i OPTICLIK™ (sanofaventis, Frankfurt, Nemačka), da imenujemo samo nekoliko. Primeri uređaja za isporuku tipa olovke za jednokratnu upotrebu koji imaju primenu u subkutanoj isporuci farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska uklјučuju, ali nisu ograničeni na, SOLOSTAR™ pen (sanof-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) i KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICK™ autoinjektor (Amgen,ThousandOaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Študgard, Nemačka), EPIPEN (Dey, L.P.) i HUMIRA™ pen (Abbott Labs, Abbott Park IL), da imenujemo samo nekoliko.

[0224] U određenim situacijama, farmaceutska kompozicija može biti isporučena putem sistema za kontrolisano oslobađanje. U jednom primeru izvođenja, može biti upotrebljeni pumpa (pogledati, Langer, iznad; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). U drugom primeru izvođenja, mogu biti upotrebljeni polimerni materijali; pogledati, Medical Applications of Controlled Release, Langer i Wise (ur.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. U još jednom primeru izvođenja, sistem kontrolisanog oslobađanja može biti postavljen u neposrednu blizinu ciljnog mesta kompozije, čime je potreban samo deo sistemske doze (pogledati, npr. Gudson, 1984, u Medical Applications of Controlled Release, navedeno iznad, tom 2, str.115-138). Drugi sistemi za kontrolisano oslobađanje razmatraju se u reviskom pregledu autora Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

[0225] Preparati koji se mogu injecirati mogu uključivati dozne oblike za intravenske, subkutane, intrakutane i intramuskularne injekcije, infuzije tipa kap po kap itd. Ovi preparati koji se mogu injecirati mogu biti pripremani postupcima koji su javno poznati. Na primer, injekcioni preparati mogu biti pripremani, npr. rastvaranjem, resuspendovanjem ili emulgovanjem antitela ili njihovih soli koje su prethodno opisane, u sterilnom vodenom medijumu ili ulјanom medijumu koji se konvencionalno upotrebljava za injekcije. Kao vodeni medijumi za injekcije, postoje, na primer, fiziološki rastvor, izotoničan rastvor koji sadrži glukozu i drugi pomoćni agensi itd., koji mogu biti upotrebljeni u kombinaciji sa odgovarajućim agensima za solubilizaciju kao što su alkohol (npr. etanol), polialkohol (npr. propilen glikol, polietilen glikol), nejonski surfaktant [npr. polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilenski (50 mol) adukt hidrogenizovanog ricinusovog ulјa)] itd. Kao ulјani medijum koriste se, npr. susamovo ulјe, sojino ulјe itd., koja mogu biti upotrebljena u kombinaciji sa agensom za solubilizaciju kao što je benzil benzoat, benzil alkohol itd. Tako pripremlјenom injekcijom poželjno se ispunjava odgovarajuća ampula.

[0226] Prednost može predstavljati da se prethodno opisane farmaceutske kompozicije za oralnu ili parenteralnu upotrebu pripremaju u jediničnim doznim oblicima, podešenim tako da doza aktivnih sastojaka bude odgovarajuća. Takvi dozni oblici u jediničnoj dozi uključuju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije itd.

[0227] Prema pojedinim aspektima, ovde su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže CAR-T-ćeliju koja eksprimira antagonistu CD40 (npr. antagonističko antitelo na CD40 ili njegov antigen vezujući fragment) kao što je ovde opisano.

[0228] U određenim primerima izvođenja, populacije CAR-T-ćelija koje eksprimiraju antagonistu CD40 mogu biti davane bilo samostalno ili u vidu farmaceutske kompozicije u kombinaciji sa farmaceutski ili fiziološki prihvatlјivim nosačima, razblaživačima, ekscipijensima i/ili sa drugim komponentama ili ćelijskim populacijama. Takve kompozicije mogu sadržavati pufere kao što su neutralno puferisan fiziološki rastvor, fiziološki rastvor puferisan fosfatima i slični; uglјene hidrate kao što su glukoza, manoza, saharoza ili dekstran, manitol; proteine; polipeptide ili aminokiseline kao što je glicin; antioksidanse; helatorne agense kao što su EDTA ili glutation; adjuvanse (npr. aluminijum hidroksid); i konzervanse. Kompozicije koje su ovde opisane mogu biti formulisane za intravensko davanje.

[0229] Davanje CAR-T-ćelija koje eksprimiraju antagonistu CD40 može biti urađeno na bilo koji pogodan način, uklјučujući injeciranje, transfuziju ili implantaciju. Kompozicije koje su ovde opisane mogu biti davane pacijentu subkutano, intradermalno, intratumorski, intranodalno, intramedularno, intramuskularno, intravenskim (i.v.) injeciranjem ili intraperitonealno. U pojedinim primerima izvođenja, opisane kompozicije se daju pacijentu intradermalnim ili subkutanim injeciranjem. U pojedinim primerima izvođenja, opisane kompozicije se daju i.v. injeciranjem. Kompozicije takođe mogu biti injecirane direktno u tumor ili limfni čvor.

Postupci za lečenje kancera i/ili inhibiranje sindroma oslobađanja citokina

[0230] Prema pojedinim aspektima, predmetni pronalazak uključuje postupke za lečenje kancera i inhibiranje sindroma oslobađanja citokina (CRS) kod subjekta. U pojedinim primerima izvođenja, postupci mogu obuhvatiti zajedničko (npr. istovremeno ili sekvencijalno) davanje (1) antagoniste CD40 ili CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40; i (2) multispecifičnog (npr. bispecifičnog ili trispecifičnog) molekula koji vezuje antigen, koji sadrži najmanje prvi domen koji vezuje antigen na CD3 i drugi domen koji vezuje antigen tipa tumorskog antigena, subjektu kome je to potrebno.

[0231] U pojedinim primerima izvođenja, postupci mogu obuhvatiti davanje farmaceutske kompozicije koji sadrži (1) antagonistu CD40 ili CAR-T-ćeliju koja eksprimira antagonistu CD40; i (2) multispecifičan (npr. bispecifičan ili trispecifičan) molekul koji vezuje antigen i sadrži najmanje prvi domen koji vezuje antigen na CD3, i drugi domen koji vezuje antigen tipa tumorskog antigena, subjektu kome je to potrebno. Terapijska kompozicija može sadržavati bilo koje od antagonističkih antitela na CD40 i CD3 multispecifičnih molekula koji vezuju antigen, koji su kao što je ovde opisano, i farmaceutski prihvatlјiv nosač ili razblaživač.

[0232] Prema pojedinim aspektima, predmetni pronalazak uključuje postupke za inhibiranje sindroma oslobađanja citokina (CSR), ili smanjenje oslobađanja citokina prouzrokovanog multispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, a koji sadrži prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD3, i drugi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje tumorski antigen kod subjekta. Postupci prema ovom aspektu pronalaska obuhvataju davanje antagoniste CD40 ili CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40 subjektu kome je to potrebno.

[0233] Prema pojedinim aspektima, prethodno opisani postupci dodatno obuhvataju postavljanje dijagnoze ili identifikovanje subjekata koji su podložni sindromu oslobađanja citokina ili kojima je potrebno smanjenje oslobađanja citokina.

[0234] Kako se ovde upotrebljavaju, termini „lečiti“, „lečenje” ili slično, označavaju ublažavanje simptoma ili eliminisanje uzroka simptoma, bilo privremeno ili trajno. Na primer, „lečenje kancera” može označavati odlaganje ili inhibiranje rasta tumora, smanjenje broja tumorskih ćelija ili opterećenja tumorom, pospešivanje regresije tumora, izazivanje smanjenja, nekroze i/ili nestanka tumora, prevenciju ponovne pojave tumora i/ili povećanje trajanja preživlјavanja subjekta.

[0235] Kao što se ovde upotrebljava, izraz „subjekat kome je to potrebno” označava čoveka ili sisara koji je različit od čoveka, a koji ispoljava jedan ili više simptoma ili indikacija kancera i/ili CRS, i/ili kome je postavljena dijagnoza kancera i/ili CRS, i kome je potrebno lečenje istih. U mnogim primerima izvođenja, termin „subjekat” može biti upotrebljavan naizmenično sa terminom „pacijent“.

[0236] U pojedinim primerima izvođenja, kanceri koji mogu biti lečeni postupcima i kompozicijama koje su ovde obezbeđeni uklјučuju, ali ne ograničavajući se na, kancer grlića materice, anusa, vagine, vulve, penisa, baze jezika, grklјana, krajnika, bešike, krvi, kostiju, kosne srži, mozga, dojke, debelog creva, jednjaka, gastrointestinalnog trakta, desni, glave, bubrega, jetre, pluća, nazofarinksa, vrata, jajnika, prostate, kože, nemelanomske kancere kože (NMSK), karcinom skvamoznih ćelija kože (SCC), želuca, testisa, jezika ili materice. Dodatno, kancer može biti specifično sledećeg histološkog tipa, iako nije ograničeno na navedene: neoplazma, maligna; karcinom; karcinom, nediferenciran; karcinom gigantskih i vretenastih ćelija; sitnoćelijski karcinom; papilarni karcinom; karcinom skvamoznih ćelija; limfoepitelni karcinom; karcinom bazalnih ćelija; karcinom pilomatriksa; karcinom prelaznih ćelija; papilarni karcinom prelaznih ćelija; adenokarcinom; gastrinom, maligni; holangiokarcinom; hepatocelularni karcinom; kombinovani hepatocelularni karcinom i holangiokarcinom; trabekularni adenokarcinom; adenoidni cistični karcinom; adenokarcinom u adenomatoznom polipu; adenokarcinom, familijarna polipoza koli; solidni karcinom; karcinoidni tumor, maligni; branhiolo-alveolarni adenokarcinom; papilarni adenokarcinom; hromofobni karcinom; acidofilni karcinom; oksifilni adenokarcinom; bazofilni karcinom; svetloćelijski adenokarcinom; karcinom granularnih ćelija; folikularni adenokarcinom; papilarni i folikularni adenokarcinom; neinkapsulirajući sklerozirajući karcinom; karcinom kore nadbubrežne žlezde; endometrioidni karcinom; karcinom kožnog dodatka; apokrini adenokarcinom; adenokarcinom lojnih ćelija; ceruminozni adenokarcinom; mukoepidermoidni karcinom; cistadenokarcinom; papilarni cistadenokarcinom; papilarni serozni cistadenokarcinom; mucinozni cistadenokarcinom; mucinozni adenokarcinom; karcinom ćelija pečatnog prstena; infiltrirajući karcinom duktusa; medularni karcinom; lobularni karcinom; inflamatorni karcinom; Padžetova bolest dojke; acinarno-ćelijski karcinom; adenoskvamozni karcinom; adenokarcinom sa skvamoznom metaplazijom; maligni timom; maligni tumor strome jajnika; maligni tekom; maligni tumor granuloznih ćelija; i maligni roblastom; karcinom sertolijevih ćelija; maligni tumor Lajdigovih ćelija; maligni tumor lipidnih ćelija; maligni paragangliom; maligni ekstramamilarni paragangliom; feohromocitom; glomangiosarkom; maligni melanom; amelanotični melanom; površinsko širenje melanoma; maligni melanom u džinovskom pigmentisanom nevusu; melanom epitelioidnih ćelija; maligni plavi nevus; sarkom; fibrosarkom; maligni fibrozni histiocitom; miksosarkom; liposarkom; lejkomiosarkom; rabdomiosarkom; embrionalni rabdomiosarkom; alveolarni rabdomiosarkom; stromalni sarkom; maligni mešoviti tumor; Milerov mešoviti tumor; nefroblastom; hepatoblastom; karcinosarkom; maligni mezenhimom; maligni Brenerov tumor; maligni filoidni tumor; sinovijalni sarkom; maligni mezoteliom; disgerminom; embrionalni karcinom; maligni teratom; maligni struma ovarija; horiokarcinom; maligni mezonefrom; hemangiosarkom; maligni hemangioendoteliom; Kapošijev sarkom; maligni hemangiopericitom; limfangiosarkom; osteosarkom; jukstakortikalni osteosarkom; hondrosarkom; maligni hondroblastom; mezenhimalni hondrosarkom; gigantski ćelijski tumor kostiju; Juingov sarkom; maligni odontogeni tumor; ameloblastični odontosarkom; maligni ameloblastom; ameloblasni fibrosarkom; maligni pinealom; hordom; maligni gliom; ependimom; astrocitom; protoplazmatski astrocitom; fibrilarni astrocitom; astroblastom; glioblastom; oligodendrogliom; oligodendroblastom; primitivni neuroektodermalni; cerebelarni sarkom; ganglioneuroblastom; neuroblastom; retinoblastom; olfaktorni neurogeni tumor; maligni meningiom; neurofibrosarkom; maligni neurilemom; maligni tumor granularnih ćelija; maligni limfom; Hočkinova bolest; Hočkinov limfom; paragranulom; sitnoćelijski mifocitni maligni limfom; difuzni maligni krupnoćelijski limfom; folikularni maligni limfom; mikozis fungoides; drugi specifični ne-Hočkinovi limfomi; maligna histiocitoza; multipli mijelom; sarkom mastocita; imunoproliferativna bolest tankog creva; leukemija; limfoidna leukemija; leukemija plazma ćelija; eritroleukemija; leukemija limfosarkomskih ćelija; mijeloidna leukemija; bazofilna leukemija; eozinofilna leukemija; monocitna leukemija; leukemija mastocita; megakarioblasna leukemija; mijeloidni sarkom; i leukemija vlaknastih ćelija.

[0237] U pojedinim primerima izvođenja, kanceri koji mogu biti lečeni postupcima i kompozicijama koji su ovde obezbeđeni eksprimiraju tumorski antigen na koga ciljano deluju CD3 multispecifični molekuli koji vezuju antigen (npr. tumor je sa ekspresijom tumorskog antigena na ≥20% tumorskih ćelija, što je utvrđeno protočnom citometrijom). Preciznije, kompozicije i postupci predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za lečenje, prevenciju i/ili ublažavanje bilo koje bolesti ili poremećaja koja je povezana ili posredovana, npr. ekspresijom ili aktivnošću CD20, PSMA, MUC16, STEAP2 ili BCMA ili proliferacijom CD20+, PSMA, MUC16+, STEAP2+ ili BCMA+ ćelija. Mehanizam delovanja kojim se postižu terapijski postupci pronalaska uklјučuje ubijanje ćelija koje eksprimiraju takve antigene u prisustvu efektorskih ćelija, na primer, sa CDC, apoptozom, ADCC, fagocitozom ili kombinacijom dva ili više od ovih mehanizama.

[0238] U pojedinim primerima izvođenja, CD3 multispecifičan molekul koji vezuje antigen koji se upotrebljava u predmetnim kompozicijama ili postupcima bispecifično je anti-CD3 × anti-PSMA antitelo. Kompozicije ili postupci su korisni za lečenje kancera koji eksprimira PSMA, uklјučujući kancer prostate, kancer bubrega, kancer bešike, kolorektalni karcinom i kancer želuca. U pojedinim primerima izvođenja, kancer je kancer prostate (npr. kancer prostate rezistentan na kastraciju).

[0239] U pojedinim primerima izvođenja, CD3 multispecifičan molekul koji vezuje antigen koji se upotrebljava u predmetnim kompozicijama ili postupcima bispecifično je anti-CD3 × anti-MUC16 antitelo. Kompozicije ili postupci su korisni za lečenje kancera koji eksprimira MUC16, uklјučujući kancer jajnika, kancer dojke, kancer pankreasa, nesitnoćelijski kancer pluća, intrahepatični tip holangiokarcinoma koji obrazuje velike mase, adenokarcinom grlića materice i adenokarcinom želudačnog trakta. U pojedinim primerima izvođenja, kancer je kancer jajnika.

[0240] U pojedinim primerima izvođenja, CD3 multispecifičan molekul koji vezuje antigen koji se upotrebljava u predmetnim kompozicijama ili postupcima bispecifično je anti-CD3 × anti-STEAP2 antitelo. Kompozicije ili postupci su korisni za lečenje kancera koji eksprimira STEAP2, uklјučujući kancer prostate, kancer bešike, kancer grlića materice, kancer pluća, kancer debelog creva, kancer bubrega, kancer dojke, kancer pankreasa, kancer želuca, kancer materice i kancer jajnika. U pojedinim primerima izvođenja, kancer je kancer prostate (npr. kancer prostate rezistentan na kastraciju).

[0241] U pojedinim primerima izvođenja, CD3 multispecifičan molekul koji vezuje antigen koji se upotrebljava u predmetnim kompozicijama ili postupcima bispecifično je anti-CD3 × anti-BCMA antitelo. Kompozicije ili postupci su korisni za lečenje kancera koji eksprimira BCMA, uklјučujući multipli mijelom ili druge B-ćelijske ili karcinome plazma ćelija, kao što su Valdenstromova makroglobulinemija, Burkitov limfom i difuzni B-krupnoćelijski limfom, ne-Hočkinov limfom, hronična limfocitna leukemija, folikularni limfom, limfom mantl ćelija, limfom marginalne zone, limfoplazmocitni limfom i Hočkinov limfom. U pojedinim primerima izvođenja, kancer je multipli mijelom.

[0242] U pojedinim primerima izvođenja, CD3 multispecifičan molekul koji vezuje antigen koji se upotrebljava u predmetnim kompozicijama ili postupcima bispecifično je anti-CD3 × anti-CD20 antitelo. Kompozicije ili postupci su korisni za lečenje kancera koji eksprimira CD20, uklјučujući ne-Hočkinov limfom, Hočkinov limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju, akutnu limfoblasnu leukemiju, sitnoćelijski limfocitni limfom, difuzni B-krupnoćelijski limfom, folikularni limfom, limfom mantl ćelija, limfom marginalne zone, Valdenstromovu makroglobulinemiju, primarni medijastinalni B-ćelijski limfom, limfoblasni limfom ili Burkitov limfom. U pojedinim primerima izvođenja, kancer je folikularni limfom. U pojedinim primerima izvođenja, kancer je difuzni B-krupnoćelijski limfom (DLBCL).

[0243] U pojedinim primerima izvođenja, postupci predmetnog pronalaska se upotrebljavaju kod subjekta (npr. pacijenta obolelog od kancera) sa jednim ili više simptoma ili indikacija sindroma oslobađanja citokina koji su ovde opisani, a kome je postavljena dijagnoza sindroma oslobađanja citokina i/ili kod koga se sumnja na sindrom oslobađanja citokina ili kome je potrebno smanjenje oslobađanja citokina.

[0244] U određenim primerima izvođenja, postupci predmetnog pronalaska se upotrebljavaju kod subjekta koji je bio lečen određenim lekovima za kancer (npr. imunoterapijom za kancer, CAR-T-ćelijskom terapijom ili CD3 multispecifičnim molekulima koji vezuju antigen, kao što su oni koji su ovde opisani).

[0245] U pojedinim primerima izvođenja, za bilo koji od postupaka koji su ovde opisani, subjekat koji se leči, ili subjekat koji se procenjuje, subjekat je koga je potrebno lečiti ili koji je bio lečen imunoterapijom za kancer, npr. CD3 multispecifičnim molekulom koji vezuju antigen koji je kao što je ovde opisano.

[0246] U pojedinim primerima izvođenja, subjekat je u riziku (npr. sa visokim rizikom) da razvije CRS (npr. ozbiljan CRS). U primerima izvođenja, subjekat je u niskom riziku (npr. nije u riziku) da razvije CRS (npr. ozbiljan CRS). U pojedinim primerima izvođenja, subjekat ima CRS stepena 0, CRS 1. stepena, CRS 2. stepena ili CRS 3. stepena. U pojedinim primerima izvođenja, rizik kod subjekata da razvije CRS (npr. ozbiljan CRS) utvrđuje se upotrebom postupaka procene ili predviđanja koji su ovde opisani.

[0247] U pojedinim primerima izvođenja, postupci koji su ovde obezbeđeni leče, odlažu ili inhibiraju rast tumora ili indukuju smrt tumorskih ćelija. U određenim primerima izvođenja, postupci koji su ovde obezbeđeni pospešuju regresiju tumora. U određenim primerima izvođenja, postupci koji su ovde obezbeđeni smanjuju opterećenje tumorskim ćelijama ili smanjuju opterećenje tumorom. U određenim primerima izvođenja, postupci koji su ovde obezbeđeni sprečavaju ponovnu pojavu tumora.

[0248] U pojedinim primerima izvođenja, postupci koji su ovde obezbeđeni sprečavaju, inhibiraju, ublažavaju ili leče CRS, npr. ublažavanjem najmanje jednog simptoma ili indikacije povezane sa CRS, smanjenjem ozbiljnosti CRS ili smanjenjem oslobađanja citokina itd. U pojedinim primerima izvođenja, postupci koji su ovde obezbeđeni sprečavaju, inhibiraju, ublažavaju ili leče CRS bez negativnog uticaja na terapijske koristi ovde opisanog CD3 multispecifičnog molekula koji vezuje antigen.

[0249] U određenim primerima izvođenja, postupci predmetnog pronalaska obuhvataju davanje subjektu kome je to potrebno terapijski efektivne količine antagoniste CD40 ili CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40 u kombinaciji sa terapijski efektivnom količinom CD3 multispecifičnog molekula koji vezuje antigen, pri čemu davanje antagoniste CD40 ili CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40 dovodi do inhibiranja CRS. (npr. inhibira ili smanjuje najmanje jedan simptom, indikaciju ili biomarker CRS koji su ovde opisani). U određenim primerima izvođenja, CRS je inhibiran za najmanje oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70% ili oko 80% u poređenju sa subjektom kome je davan CD3 multispecifičan molekul koji vezuju antigen kao monoterapija.

[0250] U određenim primerima izvođenja, davanje antagoniste CD40 ili CAR-T-ćelije koje eksprimira antagonistu CD40 smanjuje oslobađanje citokina. U određenim primerima izvođenja, nivoi citokina (npr. TNFα, IL4, IL6, IL10, IL2, IFN-γ, IL-17A, IL13 ili CD40L) inhibirani su za najmanje oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70% ili oko 80% u poređenju sa subjektom kome je davan CD3 multispecifičan molekul koji vezuju antigen kao monoterapija.

[0251] U određenim primerima izvođenja, davanje antagoniste CD40 ili CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40 u kombinaciji sa CD3 multispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, ne smanjuje značajno antitumorske efekte (npr. inhibira ili odlaže rast tumora, indukuju regresiju tumora, sprečava ponovnu pojavu tumora i/ili povećava trajanje preživlјavanja itd.) u poređenju sa subjektom kome je davan CD3 multispecifičan molekul koji vezuju antigen kao monoterapija. Na primer, davanje antagoniste CD40 ili CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40 u kombinaciji sa CD3 multispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, može smanjiti antitumorske efekte za manje od oko 40%, manje od oko 30%, manje od oko 20%, manje od oko 15%, manje od oko 10%, manje od oko 5%, manje od oko 1%, manje od oko 0,5% ili manje od oko 0,1% u poređenju sa subjektom kome je davan CD3 multispecifičan molekul koji vezuju antigen kao monoterapija. U određenim primerima izvođenja, davanje antagoniste CD40 ili CAR-Tćelije koja eksprimira antagonistu CD40 ne utiče na antitumorsku efikasnost CD3 multispecifičnog molekula koji vezuje antigen.

[0252] U određenim primerima izvođenja, davanje antagoniste CD40 ili CAR-T-ćelije koje eksprimira antagonistu CD40 u kombinaciji sa CD3 multispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, ne smanjuje značajno aktivaciju, ekspanziju i/ili citotoksičnost T-ćelija (npr. CD8+ T-ćelija) u poređenju sa subjektom kome je davan CD3 multispecifičan molekul koji vezuju antigen kao monoterapija. Na primer, davanje antagoniste CD40 ili CAR-T-ćelije koje eksprimira antagonistu CD40 u kombinaciji sa CD3 multispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, može smanjiti T-ćelijsku (npr. aktivacija, ekspanzija i/ili citotoksičnost CD8+ T-ćelija) za manje od oko 40%, oko 30%, oko 20%, oko 15%, oko 10%, oko 5%, oko 1%, oko 0,5% ili oko 0,1%, u poređenju sa subjektom kome je primenjen molekul koji vezuje multispecifični antigen CD3 kao monoterapija. U određenim primerima izvođenja, davanje antagonista CD40 ili CAR-T-ćelija koje eksprimiraju antagonist CD40 ne utiče na aktivaciju, ekspanziju i/ili citotoksičnost T-ćelija (npr. CD8+ T-ćelija) indukovanu CD3 multispecifičnim molekulom koji vezuje antigen.

[0253] U određenim primerima izvođenja, opisani antagonista CD40, CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40 i/ili CD3 multispecifičan molekul koji vezuje antigen daju se pacijentu zajedno sa (npr. pre, istovremeno ili nakon) bilo kog broja relevantnih modaliteta lečenja, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na dodatne tretmane kancera ili CRS.

[0254] Tretmani CRS za primer uklјučuju, npr. inhibitora IL-6 ili inhibitore IL-6 receptora (IL-6R) (npr. tocilizumab ili siltuksimab), anti-IFN-γ terapiju, anti-sIL2Ra terapiju, lekove za snižavanje groznice kao što su acetaminofen, blokatori sgp130, vazoaktivni medikamenti, kortikosteroidi, imunskosupresivni agensi i mehanička ventilacija. Vazoaktivni medikamenti za primer uklјučuju, ali nisu ograničeni na, angiotenzin-11, endotelin-1, alfa adrenergičke agoniste, rostanoide, inhibitore fosfodiesteraze, antagoniste endotelina, inotrope (npr. adrenalin, dobutamin, izoprenalin, efedrin), vazopresore (npr. noradrenalin, vazopresin, metaraminol, vazopresin, metilensko plavo), inodilatatori (npr. milrinon, levosimendan) i dopamin. Vazopresori za primer uklјučuju, ali nisu ograničeni na norepinefrin, dopamin, fenilefrin, epinefrin i vazopresin. Kortikosteroidi za primer uklјučuju, ali nisu ograničeni na deksametazon, hidrokortizon i metilprednizolon. Imunskosupresivni agensi za primer uklјučuju, ali nisu ograničeni na, inhibitora TNFα ili inhibitora IL-1. Pomoćne terapije za primer za CRS su opisane u Međunarodnoj prijavi WO2014011984.

[0255] Dodatna(e) terapijski aktivna(e) komponenta(e) mogu biti davane neposredno pre, istovremeno sa ili ubrzo nakon davanja molekula koji vezuje antigen predmetnog pronalaska; (za potrebe predmetnog opisa, takvi režimi davanja se smatraju davanjem molekula koji vezuje antigen „u kombinaciji sa” dodatnom terapijski aktivnom komponentom).

[0256] Kombinovano davanje, kao što je prethodno opisano, može biti istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno. Za istovremenu primenu, agensi mogu biti davani kao jedna kompozicija ili kao razvojene kompozicije, prema potrebi.

Režimi davanja

[0257] U određenim primerima izvođenja, ovde su obezbeđeni postupci koji obuhvataju davanje subjektu antagoniste CD40 (npr. antagonističkog antitela na CD40) ili CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40, sa učestalošću doziranja od oko četiri puta nedelјno, dva puta nedelјno, jednom nedelјno, jednom na svake dve nedelјe, jednom na svake tri nedelјe, jednom na svake četiri nedelјe, jednom na svakih pet nedelјa, jednom na svakih šest nedelјa, jednom na svakih osam nedelјa, jednom na svakih dvanaest nedelјa ili ređe, sve dok se ne postigne terapijski odgovor.

[0258] U određenim primerima izvođenja, ovde su obezbeđeni postupci koji obuhvataju davanje subjektu CD3 multispecifičnog molekula koji vezuje antigen sa učestalošću doziranja od oko četiri puta nedelјno, dva puta nedelјno, jednom nedelјno, jednom na svake dve nedelјe, jednom na svake tri nedelјe, jednom na svake četiri nedelјe, jednom na svakih pet nedelјa, jednom na svakih šest nedelјa, jednom na svakih osam nedelјa, jednom na svakih dvanaest nedelјa ili ređe, sve dok se ne postigne terapijski odgovor.

[0259] U određenim primerima izvođenja, postupci uklјučuju davanje antagoniste CD40 (npr. antagonističkog antitela na CD40) ili CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40, u kombinaciji sa CD3 multispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, sa učestalosti doziranja od oko četiri puta nedelјno, dva puta nedelјno, jednom nedelјno, jednom na svake dve nedelјe, jednom na svake tri nedelјe, jednom na svake četiri nedelјe, jednom na svakih pet nedelјa, jednom na svakih šest nedelјa, jednom na svakih osam nedelјa, jednom na svakih dvanaest nedelјa ili ređe, sve dok se postigne terapijski odgovor.

[0260] Prema određenim primerima izvođenja, višestruke doze antagoniste CD40 (npr. antagonističkog antitela na CD40) ili CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40, u kombinaciji sa CD3 multispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, mogu biti davane subjektu tokom definisanog vremenskog perioda. Postupci prema ovom aspektu pronalaska mogu obuhvatati sekvencijalno davanje višestrukih doza antagoniste CD40 subjektu (npr. antagonističkog antitela na CD40) ili CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40, u kombinaciji sa CD3 multispecifičnim molekulom koji vezuje antigen. Kao što se ovde upotrebljava, „sekvencijalno davanje” označava da se svaka doza molekula koji vezuje antigen daje subjektu u različitom trenutku u vremenu, npr. različitim danima koji su razdvojeni unapred određenim intervalom (npr. satima, danima, nedeljama ili mesecima). Predmetni pronalazak uključuje postupke koje obuhvataju sekvencijalno davanje pacijentu jedne početne doze antagoniste CD40 (npr. antagonističkog antitela na CD40) ili CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40, nakon čega sledi jedna ili više sekundarnih doza antagoniste CD40 (npr. antagonističkog antitela na CD40) ili CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40, a opciono nakon čega sledi jedna ili više tercijarnih doza antagoniste CD40 (npr. antagonističkog antitela na CD40) ili CAR-T-ćelije koja eksprimira antagonistu CD40. U određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak dalјe obuhvata sekvencijalno davanje pacijentu jedne početne doze sa CD3 multispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, nakon čega sledi jedna ili više sekundarnih doza CD3 multispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, a opciono jedna ili više tercijarnih doza CD3 multispecifičnim molekulom koji vezuje antigen.

[0261] Termini „početna doza“, „sekundarne doze” i „tercijarne doze” odnose se na vremenski redosled davanja molekula koji vezuje antigen pronalaska. Prema tome, „početna doza” je doza koja se daje na početku režima lečenja (takođe se naziva „osnovna doza“); „sekundarne doze” su doze koje se daju nakon početne doze; a „tercijarne doze” su doze koje se daju nakon sekundarnih doza. Početna, sekundarne i tercijarne doze mogu sadržavati istu količinu terapijskih agenasa koji su ovde opisani, ali u principu se mogu razlikovati jedna u odnosu na drugu u pogledu učestalosti davanja. U određenim primerima izvođenja, međutim, količina molekula koji vezuje antigen sadržana u početnim, sekundarnim i/ili tercijarnim dozama varira jedna u odnosu na drugu (npr. podešava se naviše ili naniže po potrebi) tokom trajanja lečenja. U određenim primerima izvođenja, dve ili više (npr.2, 3, 4, ili 5) doza se daje na početku režima lečenja kao „udarne doze“, nakon čega slede naknadne doze koje se daju na bazi manje učestalosti (npr. „doze održavanja“).

[0262] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska za primer, svaka sekundarna i/ili tercijarna doza se daje od 1 do 26 (npr.1, 11⁄2, 2, 21⁄2, 3, 31⁄2, 4, 41⁄2, 5, 51⁄2, 6, 61⁄2, 7, 71⁄2, 8, 81⁄2, 9, 91⁄2, 10, 101⁄2, 11, 111⁄2, 12, 121⁄2, 13, 131⁄2, 14, 141⁄2, 15, 151⁄2, 16, 161⁄2, 17, 171⁄2, 18, 181⁄2, 19, 191⁄2, 20, 201⁄2, 21, 211⁄2, 22, 221⁄2, 23, 231⁄2, 24, 241⁄2, 25, 251⁄2, 26, 261⁄2 ili više) nedelјa nakon neposredno prethodne doze. Fraza „neposredno prethodna doza“, kako se ovde upotrebljava, označava, u nizu višestrukih davanja, dozu terapijskih agenasa koji su ovde opisani, a koja se daje pacijentu pre davanja sledeće doze u nizu, bez međudoza.

[0263] Postupci prema ovom aspektu pronalaska mogu obuhvatiti davanje pacijentu bilo kog broja sekundarnih i/ili tercijarnih doza terapijskih agenasa koji su ovde opisani. Na primer, u određenim primerima izvođenja, pacijentu se daje samo jedna sekundarna doza. U drugim primerima izvođenja, pacijentu se daju dve ili više (npr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) sekundarnih doza. Slično navedenom, u određenim primerima izvođenja, pacijentu se daje samo jedna tercijarna doza. U drugim primerima izvođenja, pacijentu se daju dve ili više (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) tercijarnih doza.

[0264] U primerima izvođenja koja uklјučuju višestruke sekundarne doze, svaka sekundarna doza može biti data sa istom učestalošću kao i ostale sekundarne doze. Na primer, svaka sekundarna doza može biti data pacijentu 1 do 2 nedelјe nakon neposredno prethodne doze. Slično tome, u primerima izvođenja koja uklјučuju višestruke tercijarne doze, svaka tercijarna doza može biti davana sa istom učestalošću kao i ostale tercijarne doze. Na primer, svaka tercijarna doza može biti davana pacijentu 2 do 4 nedelјe nakon neposredno prethodne doze. Alternativno, učestalost kojom se sekundarne i/ili tercijarne doze daju pacijentu može varirati tokom trajanja režima lečenja. Učestalost davanja takođe može prilagođena tokom trajanja lečenja od strane ordinirajućeg lekara, u zavisnosti od potreba pojedinačnog pacijenta nakon kliničkog pregleda.

Primeri

Primer 1: Blokiranje CD40 inhibiralo je oslobađanje citokina posredovano sa CD123xCD3 bez uticaja na aktivaciju T-ćelija u 4-dnevnom testu sa PBMC obogaćenim autolognim B-ćelijama

Eksperimentalna postavka:

[0265] Efekat blokiranja CD40 na oslobađanje citokina procenjivan je u testu sa humanim PBMC koje su bile obogaćene autolognim B-ćelijama i AML ćelijskom linijom MOLM13. B-ćelije su izolovane iz humanih PBMC upotrebom EasySep kompleta za izolaciju humanih B-ćelija (StemCells kat. br.17954), nakon čega su ćelije obeležene sa CFSE i zasejavane u kompletnom medijumu (RPMI dopunjen sa 10% FBSm 100 U/mL penicilina, 100µg/ml streptomicina, 292 µg/ml L-glutamina) sa autolognim PBMC i MOLM13 ćelijama u odnosu (5:10:1). CD123xCD3(G) ili jednokraka CD3 kontrola dodavani su u bunariće kao 10-struke titracije polazeći od 1µg/ml. Anti-CD40 antitelo (IgG1 mutant, REGN3794) korišćeno je u konstantnoj koncentraciji od 5µg/ml. Ćelije su inkubirane 4 dana na 37°C u kompletnom medijumu. Citokini i aktivacija T-ćelija su procenjivani 4 dana nakon postavlјanja eksperimenta. Citokini su mereni u supernatantima, upotrebom LegendPlex panela za humane B-ćelije (Biolegend, kat. br.740527). Za procenu aktivacije T-ćelija, ćelije su bojene direktno konjugovanim antitelima na CD2, CD25 i bojom za žive/mrtve ćelije. Aktivacija T-ćelija je prikazana kao procenat živih CD2+ ćelija koje eksprimiraju CD25.

Rezultati:

[0266] Blokiranje CD40 sa anti-CD40 antitelom inhibiralo je oslobađanje citokina posredovano bispecifičnim CD 123xCD3 antitelom u 4-dnevnom in vitro testu sa CD123+ tumorskim ćelijama, humanim PBMC i obogaćenjem sa B-ćelijama bez značajnog uticaja na aktivaciju T-ćelija (SL.1A-1I).

Primer 2: Blokiranje CD40 inhibiralo je oslobađanje citokina posredovano bispecifičnim CD3 bez značajnog uticaja na aktivaciju T-ćelija u 4-dnevnom testu sa AML ćelijskom linijom i PBMC bez dodatnih autolognih B-ćelija

Eksperimentalna postavka:

[0267] Efekat blokiranja CD40 na oslobađanje citokina procenjivan je u testu sa humanim PBMC i AML ćelijskom linijom THP-1. Humani PBMC su obeležavani sa CFSE, a THP-1 ćelije su obeležavane Violet bojom za ćelije. Obeležene PBMC i THP-1 ćelije su zasejavane u kompletan medijum u odnosu (10:1). CD123xCD3(G) ili jednokraka CD3 kontrola dodavani su u bunariće kao 10-struke titracije polazeći od 1µg/ml. Anti-CD40 antitelo (IgG1 mutant, REGN3794) korišćeno je u konstantnoj koncentraciji od 5µg/ml. Ćelije su inkubirane 4 dana na 37°C u kompletnom medijumu. Citokini i aktivacija T-ćelija su procenjivani 4 dana nakon postavlјanja eksperimenta. Citokini su mereni u supernatantima, upotrebom LegendPlex panela za humane B-ćelije (Biolegend, kat. br. 740527). Za procenu aktivacije T-ćelija, ćelije su bojene direktno konjugovanim antitelima na CD2, CD4, CD8, CD16, CD25 i bojom za žive/mrtve ćelije. Aktivacija T-ćelija je prikazana kao procenat živih CD2+CD16-CD8+ ćelija koje eksprimiraju CD25.

Rezultati:

[0268] Blokiranje CD40 sa anti-CD40 antitelom inhibiralo je oslobađanje citokina posredovano bispecifičnim CD3 u 4-dnevnom in vitro testu sa CD123+ tumorskim ćelijama i humanim PBMC (bez dodatnih B-ćelija), bez značajnog uticaja na aktivaciju T-ćelija (SL. 2A-2E). U principu, jače oslobađanje citokina i značajnije blokiranje ovog oslobađanja nakon primene anti-CD40 antitela, uočeni su u testovima koji su uključivali obogaćenje sa B-ćelijama (SL.1A-1H) u poređenju sa onima bez obogaćenja (SL.2A-2E).

Primer 3: Blokiranje CD40 inhibiralo je oslobađanje odabranih citokina posredovano bispecifičnim CD3, bez značajnog uticaja na aktivaciju T-ćelija i ubijanje cilјanih ćelija u 4-dnevnom testu testu ubijanja sa ćelijskom linijom iz prostate i PBMC

Eksperimentalna postavka:

[0269] Efekat blokiranja CD40 na oslobađanje citokina procenjivan je u testu ubijanja sa humanim PBMC i 22Rv1 ćelijskom linijom iz prostate. Humane PBMC su obeležavane sa CFSE, a 22Rv1 ćelije su obeležavane Violet bojom za ćelije. Obeležene PBMC i 22Rv1 ćelije su zasejavane u kompletnom medijumu u odnosu (20:1). Steap2xCD3(G) ili jednokrakai CD3 kontrola dodavani su u bunariće kao 10-struke titracije polazeći od 1µg/ml. Anti-CD40 antitelo (IgG1 mutant, REGN3794) korišćeno je u konstantnoj koncentraciji od 5µg/ml. Ćelije su inkubirane 4 dana na 37°C u kompletnom medijumu. Na kraju kultivisanja, oslobađanje citokina, preživele cilјne ćelije i aktivacija T-ćelija su analizirani protočnom citometrijom. Citokini su mereni u supernatantima upotrebom LegendPlex panela za humane B-ćelije (Biolegend, kat. br. 740527). Za procenu aktivacije T-ćelija i ubijanja cilјnih ćelija, ćelije su isprane i obojene sa direktno konjugovanim antitelima na CD2, CD4, CD8, CD16, CD25 i bojom za žive/mrtve ćelije. Aktivacija T-ćelija je prikazana kao procenat živih CD2+CD16-CD8+ ćelija koje eksprimiraju CD25. Za procenu preživlјavanja 22Rv1, ćelije su gejtovane u odnosu na žive populacije obeležene lјubičastom bojom. Prikazan je procenat žive populacije normalizovan u odnosu na netretirani uzorak.

Rezultati:

[0270] Blokiranje CD40 sa anti-CD40 antitelom inhibiralo je oslobađanje citokina posredovano bispecifičnim CD3 u 4-dnevnom in vitro testu ubijanja sa STEAP2+ tumorskim ćelijama i humanim PBMC, bez značajnog uticaja na aktivaciju i citotoksičnost T-ćelija (SL. 3A-3G). Obim inhibiranja posredovan sa anti-CD40 varirao je u zavisnosti od citokina (SL.3C-3G).

Primer 4: Blokiranje CD40 smanjilo je citokine u PBMC tretiranim bispecifičnim CD20xCD3 (REGN1979)

Eksperimentalna postavka:

[0271] Efekat blokiranja CD40 na oslobađanje citokina procenjivan je u testu ubijanja sa humanim PBMC i NHL ćelijskom linijom Ramos. Ramos ćelije su obeležavane sa CFSE i pomešane sa humanim PBMC u kompletnom medijumu u odnosu (1:10). CD20xCD3 (REGN1979) ili jednokraka CD3 kontrola dodavani su u bunariće kao 10-struke titracije polazeći od 1µg/ml. Anti-CD40 antitelo (IgG1 mutant, REGN3794) korišćeno je u konstantnoj koncentraciji od 5µg/ml. Ćelije su inkubirane 4 dana na 37°C u kompletnom medijumu. Na kraju kultivisanja, oslobađanje citokina, preživele cilјne ćelije i aktivacija T-ćelija su analizirani protočnom citometrijom. Citokini su mereni u supernatantima upotrebom LegendPlex panela za humane B-ćelije (Biolegend, kat. br.740527). Za procenu aktivacije T-ćelija i ubijanja cilјnih ćelija, ćelije su isprane i obojene sa direktno konjugovanim antitelima na CD2, CD4, CD8, CD16, CD25 i bojom za žive/mrtve ćelije. Aktivacija T-ćelija je prikazana kao procenat živih CD2+CD16-CD8+ ćelija koje eksprimiraju CD25. Za procenu preživlјavanja Ramos ćelija, apsolutan broj živih Ramos ćelija po bunariću izračunavan je upotrebom CountBright smole.

Rezultati:

[0272] Blokiranje CD40 sa anti-CD40 antitelom inhibiralo je oslobađanje citokina posredovano sa bispecifičnim CD20xCD3 u 4-dnevnom in vitro testu ubijanja sa CD20+ tumorskim ćelijama i humanim PBMC, bez negativnog uticaja na citotoksičnost (SL. 4A-4B). Kombinacija CD20xCD3 (REGN1979) anti-CD40 antitela smanjila je aktivaciju T-ćelija (~35% ispod CD20xCD3 (REGN1979) samostalno) kod 1 od 2 ispitivana donora (SL.4A).

Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

Zastupaju,

Claims

Patentni zahtevi

1. Antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu u postupku lečenja kancera i inhibiranja sindroma oslobađanja citokina kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata zajedničko davanje subjektu:

(a) bispecifičnog molekula koji vezuje antigen, koji sadrži prvi domen koji vezuje antigen i specifično se vezuje za CD3, i drugi domen koji vezuje antigen i specifično se vezuje za tumorski antigen, opciono pri čemu bispecifičan molekul koji vezuje antigen obuhvata bispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen; i

(b) antagonističkog anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen.

2. Antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je tumorski antigen izabran od CD19, CD123, STEAP2, CD20, SSTR2, CD38, STEAP1, 5T4, ENPP3, PSMA, MUC16, GPRC5D i BCMA.

3. Antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu je bispecifičan molekul koji vezuje antigen izabran od bispecifičnog CD3xCD19 antitela, bispecifičnog CD3x GPRC5D antitela, bispecifičnog CD3xCD123 antitela, bispecifičnog CD3xSTEAP2 antitela, bispecifičnog CD3xCD20 antitela, bispecifičnog CD3xSSTR 2 antitela, bispecifičnog CD3xCD38 antitela, bispecifičnog CD3xSTEAP1 antitela, bispecifičnog CD3x5T4 antitela, bispecifičnog CD3xENPP3 antitela, bispecifičnog CD3xMUC16 antitela, bispecifičnog CD3xBCMA antitela i bispecifičnog CD3xPSMA antitela.

4. Antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu u inhibiranju sindroma oslobađanja citokina prozrokovanog bispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, koji sadrži prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD3, i drugi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje tumorski antigen kod subjekta, opciono pri čemu bispecifičan molekul koji vezuje antigen obuhvata bispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.

5. Antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je tumorski antigen izabran od CD19, CD123, STEAP2, CD20, SSTR2, CD38, STEAP1, 5T4, ENPP3, PSMA, MUC16, GPRC5D i BCMA.

6. Antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema patentnom zahtevu 4 ili 5, pri čemu je bispecifičan molekul koji vezuje antigen izabran od bispecifičnog CD3xCD19 antitela, bispecifičnog CD3x GPRC5D antitela, bispecifičnog CD3xCD123 antitela, bispecifičnog CD3xSTEAP2 antitela, bispecifičnog CD3xCD20 antitela, bispecifičnog CD3xSSTR 2 antitela, bispecifičnog CD3xCD38 antitela, bispecifičnog CD3xSTEAP1 antitela, bispecifičnog CD3x5T4 antitela, bispecifičnog CD3xENPP3 antitela, bispecifičnog CD3xMUC16 antitela, bispecifičnog CD3xBCMA antitela i bispecifičnog CD3xPSMA antitela.

7. Antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 4-6, pri čemu postupak dalјe obuhvata identifikovanje subjekta koji je podložan sindromu oslobađanja citokina, ili kome je potrebno smanjenje oslobađanja citokina, pre davanja subjektu antagonističkog anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen.

8. Farmaceutska kompozicija koji sadrži:

(a) bispecifičan molekul koji vezuje antigen, koji sadrži prvi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje CD3 i drugi domen koji vezuje antigen i specifično vezuje tumorski antigen, opciono pri čemu bispecifičan molekul koji vezuje antigen obuhvata bispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen; i

(b) antagonističko anti-CD40 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.

9. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je tumorski antigen izabran od CD19, CD123, STEAP2, CD20, SSTR2, CD38, STEAP1, 5T4, ENPP3, PSMA, MUC16, GPRC5D i BCMA.

10. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 8 ili 9, gde je bispecifičan molekul koji vezuje antigen izabran od bispecifičnog CD3xCD19 antitela, bispecifičnog CD3x GPRC5D antitela, bispecifičnog CD3xCD123 antitela, bispecifičnog CD3xSTEAP2 antitela, bispecifičnog CD3xCD20 antitela, bispecifičnog CD3xSSTR 2 antitela, bispecifičnog CD3xCD38 antitela, bispecifičnog CD3xSTEAP1 antitela, bispecifičnog CD3x5T4 antitela, bispecifičnog CD3xENPP3 antitela, bispecifičnog CD3xMUC16 antitela, bispecifičnog CD3xBCMA antitela i bispecifičnog CD3xPSMA antitela.

11. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 8-10, koja dalje sadrži farmaceutski prihvatlјiv nosač.

12. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 8-11, za upotrebu u postupku lečenja kancera i inhibiranja sindroma oslobađanja citokina kod subjekta.

13. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, pri čemu postupak obuhvata:

(a) identifikovanje subjekta koji je podložan sindromu oslobađanja citokina ili kome je potrebno smanjenje oslobađanja citokina; i

(b) davanje subjektu farmaceutske kompozicije.

14. Antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, pri čemu se subjekat podložan sindromu oslobađanja citokina, ili kome je potrebno smanjenje oslobađanja citokina, identifikuje detektovanjem jednog ili više biomarkera izabranih iz grupe koju čine groznica, osip, respiratorni simptomi, hipoksija, hipotenzija, kardiovaskularna disfunkcija, neurotoksičnost, hepatična disfunkcija, renalna disfunkcija, koagulacija, toksičnost za organe, opterećenje tumorom, citokini, C-reaktivan protein (CRP), feritin, laktat dehidrogenaza (LDH), aspartat aminotransferaza (AST), azot uree u krvi (BUN), alanin aminotransferaza (ALT), kreatinin (Cr), fibrinogen, protrombinsko vreme (PT), parcijalno tromboplastinsko vreme (PTT), eotaksini i aktivacija endotelnih ćelija.

15. Antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu prema patentnom zahtevu 14 ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, pri čemu

(a) citokini su jedan ili više citokina izabranih iz grupe koju čine sTNFR2, IP10, sIL1R2, sTNFR1, MIG, VEGF, sIL1R1, TNFα, IFNα, GCSF, sRAGE, IL1, IL2, IL4, IL5, IL10, IL12, IL13, IL18, IL1R1, IFNγ, IL6, IL8, sIL2Rα, sgp130, sIL6R, MCP1, MIP1α, MIP1β, FLT-3L, fraktalkin i GM-CSF; i/ili

(b) aktivacija endotelnih ćelija se detektuje merenjem nivoa Ang-2 i/ili fon Vilebrandovog faktora u serumu.