ES3036459T3

ES3036459T3 - Methods for plant transformation

Info

Publication number: ES3036459T3
Application number: ES19713627T
Authority: ES
Inventors: Ajith Anand; William James Gordon-Kamm; George J Hoerster; Keith S Lowe; Kevin E Mcbride
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 2018-03-12
Filing date: 2019-03-11
Publication date: 2025-09-19
Anticipated expiration: 2039-03-11
Also published as: US20220251587A1; US20210062203A1; US20250290083A1; KR20200128129A; WO2019177978A1; CA3092071A1; BR112020018646A2; AU2019234474B2; EP4549576A3; EP3765622A1; US20210010012A1; CN111868247A; EP3765605A4; US11332752B2; CN111886337B; EP3765605A1; BR112020018644A2; CN111886337A; CN111868247B; US12344851B2

Abstract

Los métodos descritos en este documento utilizan un gen morfogénico o un gen represor para proporcionar una planta transgénica que contiene una sola copia de un evento transgénico en donde el gen morfogénico o el gen represor no se integra en el genoma de la planta y la planta no contiene una estructura vectorial (plásmido). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para la transformación de plantas

CAMPO DE LA DIVULGACIÓN

La presente divulgación se refiere, en general, al campo de la biología molecular de plantas, incluyendo la manipulación genética de plantas. Más específicamente, la presente divulgación pertenece a métodos rápidos y de alta eficiencia para producir una planta transformada.

REFERENCIA A UN LISTADO DE SECUENCIAS ENVIADO COMO ARCHIVO DE TEXTO A TRAVÉS DE EFS-WEB

La copia oficial del listado de secuencias se presenta electrónicamente mediante la página web de EFS como un listado de secuencias en formato ASCII con un archivo denominado 20190309_7486WOPCT_SeqList.TXT, creado el 9 de marzo de 2019, y que tiene un tamaño de 803.180 bitios y se presenta simultáneamente con la memoria descriptiva. El listado de secuencias contenido en este documento con formato ASCII forma parte de la memoria descriptiva.

ANTECEDENTES

El uso de protocolos convencionales de transformación y regeneración es largo e ineficaz, e influye negativamente en los plazos de desarrollo de productos transgénicos, dado que habitualmente hay una "ventana de desarrollo prioritario" limitada estacionalmente para tomar decisiones con respecto a las construcciones genéticas para priorizar para uso en trabajo de campo a mayor escala basándose en los resultados obtenidos durante la investigación inicial. Los métodos convencionales disponibles de transformación y regeneración tienen múltiples inconvenientes que limitan la velocidad y eficacia con que pueden producirse y cribarse las plantas transgénicas. Por ejemplo, muchos métodos convencionales de transformación y regeneración requieren el uso de altos niveles de auxina o citoquinina y requieren etapas que implican formación de callo embriogénico u organogénesis, que da lugar a procedimientos que tardan muchas semanas antes de producir plantas para el crecimiento en un entorno de invernadero después de la transformación. Sigue existiendo la necesidad de métodos de transformación que produzcan frecuencias de transformación significativamente más altas y eventos de calidad significativamente mayores (eventos que contienen una copia de un casete de expresión de genes de rasgo sin estructura principal del vector (plásmido)) en múltiples líneas endogámicas utilizando diversos tipos de tejidos iniciales, incluyendo líneas endogámicas transformadas que representan una gama de diversidades genéticas y que tienen una utilidad comercial significativa.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un método para producir una planta transgénica que tiene una copia de un casete de expresión de un gen de rasgo que comprende:

(a) poner en contacto una célula vegetal:

(i) simultáneamente con un ADN-T que contiene un casete de expresión de un gen de rasgo en una primera cepa bacteriana y un ADN-T que contiene un casete de expresión de un gen morfogenético en una segunda cepa bacteriana; o

(ii) con una cepa bacteriana que contiene un plásmido que comprende un casete de expresión de genes de rasgo dentro del ADN-T y un casete de expresión de genes morfogenéticos fuera del ADN-T;

(b) seleccionar una célula vegetal que contenga el casete de expresión del gen de rasgo y ningún casete de expresión del gen morfogenético; y

(c) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal.

La invención proporciona, además, un método para producir una planta transgénica que tiene una copia de un casete de expresión de un gen de rasgo, que comprende:

simultáneamente poner en contacto una célula vegetal con un ADN-T que contiene un casete de expresión de un gen de rasgo en una primera cepa bacteriana y un ADN-T que contiene un casete de expresión de un gen morfogenético en una segunda cepa bacteriana;

en donde el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende:

(i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido homeobox WUS/WOX; o

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido Babyboom (BBM) o un polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2); o

(Ni) una combinación de (i) y (ii);

en donde el casete de expresión del gen de rasgo comprende:

un gen de rasgo seleccionado del grupo de un gen que confiere resistencia a plagas, un gen que confiere resistencia a herbicidas, un gen que confiere tolerancia al estrés, un gen que confiere resistencia a la sequía, un gen que confiere eficiencia en el uso del nitrógeno (NUE), un gen que confiere resistencia a enfermedades y un gen que confiere una capacidad para alterar una vía metabólica;

seleccionar una célula vegetal que contenga el casete de expresión del gen de rasgo y ningún casete de expresión del gen morfogenético; y

regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal.

La invención también proporciona un método para producir una planta transgénica que tiene una copia de un casete de expresión de un gen de rasgo, que comprende:

(I) poner en contacto una célula vegetal con una cepa bacteriana que contiene un plásmido que comprende un casete de expresión de genes de rasgo dentro del ADN-T y un casete de expresión de genes morfogenéticos fuera del ADN-T;

en donde el casete de expresión génica morfogénica comprende:

(iii) una combinación de (i) y (ii);

en donde el casete de expresión del gen de rasgo comprende:

regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal; o

(II) poner en contacto una célula vegetal con una cepa bacteriana que comprende un primer ADN-T que contiene un casete de expresión de un gen de rasgo y un segundo ADN-T que contiene un casete de expresión de un gen morfogenético;

en donde un primer plásmido comprende el primer ADN-T y un segundo plásmido diferente comprende el segundo ADN-T;

en donde el primer plásmido comprende un primer origen de replicación y el segundo plásmido comprende un segundo origen de replicación diferente;

en donde el primer y segundo orígenes de replicación se seleccionan del grupo que consiste en: BBR1 ORI (SEQ ID NO: 134), PSA ORI (SEQ ID NO: 135), PSA PADRE ORI (SEQ ID NO: 136), PVS1 ORI (SEQ ID NO: 137), repABC ORI (SEQ ID NO: 138), RK2 ORI (SEQ ID NO: 139), RK2 PADRE ORI (SEQ ID NO: 140) y RSF 1010 ORI (SEQ ID NO: 141);

en donde el casete de expresión génica morfogénica comprende:

(Ni) una combinación de (i) y (ii);

en donde el casete de expresión del gen de rasgo comprende:

seleccionar una célula vegetal que contenga el casete de expresión del gen de rasgo y ningún casete de expresión del gen morfogénico; y

regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal.

Aspectos adicionales y realizaciones preferidas se definen en las reivindicaciones dependientes. Cualquier aspecto, realización y ejemplo de la presente divulgación que no se encuentre bajo el alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona simplemente para fines ilustrativos.

SUMARIO DE ENSEÑANZAS TÉCNICAS

La presente divulgación comprende métodos y composiciones para producir eventos transgénicos que contienen una copia de un gen de rasgo. En un aspecto adicional, en esta memoria se describe una semilla de la planta producir a partir de los métodos descritos en esta memoria.

En un aspecto, se describe un método para producir una planta transgénica que tiene una copia de un casete de expresión de genes de rasgos que comprende: poner en contacto una célula vegetal con un ADN-T que contiene un casete de expresión de genes de rasgos y un ADN-T que contiene un casete de expresión de genes morfogenéticos; seleccionar una célula vegetal que contiene el casete de expresión de genes de rasgos y no un casete de expresión de genes morfogenéticos; y regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal. En un aspecto adicional, la puesta en contacto comprende poner en contacto simultáneamente una célula vegetal con un ADN-T que contiene un casete de expresión de genes de rasgos en una primera cepa bacteriana y un ADN-T que contiene un casete de expresión de genes morfogenéticos en una segunda cepa bacteriana. En aún un aspecto adicional, la puesta en contacto comprende poner en contacto una célula vegetal con una cepa bacteriana que comprende un plásmido que comprende un casete de expresión de genes de rasgo dentro del ADN-T y un casete de expresión de genes morfogenéticos fuera del ADN-T. En aún otro aspecto, la puesta en contacto comprende poner en contacto una célula vegetal con el ADN-T que contiene un casete de expresión de un gen de rasgo y el ADN-T que contiene un casete de expresión de un gen morfogenético en una segunda cepa bacteriana. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido homeobox WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido Babyboom (BBM) o un polipéptido de la Proteína de Desarrollo del Óvulo 2 (ODP2); o (iii) una combinación de (i) y (ii). En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX se selecciona de WUS1, WUS2, w Us 3, WOX2A, WOX4, WOX5 y WOX9. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos codifica el polipéptido Babyboom (BBM) o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2). En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido Babyboom (BBM) se selecciona de BBM2, BMN2 y BMN3 o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2) es ODP2. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX y el polipéptido Babyboom (BBM) o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2). En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX se selecciona de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 y WOX9, y el polipéptido Babyboom (BBM) se selecciona de BBM2, BMN2 y BMN3, o el polipéptido de la proteína de desarrollo del óvulo 2 (ODP2) es ODP2. En un aspecto adicional, el casete de expresión del gen de rasgo comprende: un gen de rasgo seleccionado del grupo de un gen que confiere resistencia a plagas, un gen que confiere resistencia a herbicidas, un gen que confiere tolerancia al estrés, un gen que confiere resistencia a la sequía, un gen que confiere eficiencia en el uso del nitrógeno (NUE), un gen que confiere resistencia a enfermedades y un gen que confiere capacidad para alterar una vía metabólica. En un aspecto adicional, la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana son la misma cepa bacteriana. En un aspecto adicional, la misma cepa bacteriana es una Rhizobiales seleccionada del grupo deAgrobacteriadesarmada, una bacteriaOchrobactrumy una bacteriaRhizobiaceae.En un aspecto adicional, laAgrobacteriadesarmada se selecciona del grupo de Ag L-1, EHA105, GV3101, LBA4404 y LBA4404 THY-. En un aspecto adicional, la bacteriaOchrobactrumse selecciona de la Tabla 2 En un aspecto adicional, la bacteriaRhizobiaceaese selecciona de la Tabla 3. En aún un aspecto adicional, la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana son cepas bacterianas diferentes. En un aspecto adicional, las diferentes cepas bacterianas se seleccionan de: (i) unaAgrobacteriadesarmada y una bacteriaOchrobactrum;(ii) unaAgrobacteriadesarmada y una bacteriaRhizobiaceae;y (iii) una bacteriaRhizobiaceaey una bacteriaOchrobactrum.En un aspecto adicional, laAgrobacteriadesarmada se selecciona del grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 y LBA4404 THY-. En un aspecto adicional, la bacteriaOchrobactrumse selecciona de la Tabla 2 En un aspecto adicional, la bacteriaRhizobiaceaese selecciona de la Tabla 3. En un aspecto adicional, la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana están presentes en una relación 50:50. En un aspecto adicional, la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana están presentes en una relación 75:25. En un aspecto adicional, la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana están presentes en una relación 90:10. En un aspecto adicional, la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana están presentes en una relación 95:5. En un aspecto adicional, la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana están presentes en una relación 99:1. En un aspecto adicionales, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende, además, un promotor seleccionado de la Tabla 4 o la Tabla 5. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor HBSTART3 enlazado operativamente a un gen WUS. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS y un promotor de ubiquitina enlazado operativamente a un gen LEC1. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS y un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen LEC1. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS condensado a una fusión del gen LEC1 del péptido viral T2A. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende, además, una secuencia potenciadora viral o vegetal. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS condensado a una fusión del gen BBM del péptido viral T2A. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS condensado a una fusión del gen RepA del péptido viral T2A. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS y un promotor PLTP enlazado operativamente a una fusión de PKLamiRNA. En un aspecto adicional, se describe una semilla de una planta que contiene el casete de expresión del gen de rasgo.

En un aspecto, se describe en esta memoria un método para producir una planta transgénica que tiene una copia de un casete de expresión de un gen de rasgo y una copia de un casete de expresión de un marcador seleccionable, que comprende: poner en contacto una célula vegetal con una cepa bacteriana que contiene un plásmido que comprende un ADN-T que tiene un borde derecho y un borde izquierdo que flanquean un casete de expresión de un gen de rasgo y un casete de expresión de un marcador seleccionable, y fuera del ADN-T un casete de expresión de un gen represor, en donde el casete de expresión de un marcador seleccionable comprende un promotor que es reprimido por un polipéptido represor expresado por un gen represor; seleccionar una célula vegetal que contiene el casete de expresión de un gen de rasgo y el casete de expresión de un marcador seleccionable y ningún casete de expresión de un gen represor; y regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal. En un aspecto adicional, el casete de expresión del gen represor comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el represor de tetraciclina (TETR), un represor de etametsulfurón (ESR), un represor de clorsulfurón (CSR) y una fusión represor-dCAS9 con un ARN guía dirigido al promotor en el ADN-T. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos codifica el represor de tetraciclina (TETR) que reprime el promotor enlazado operativamente al marcador seleccionable en el ADN-T. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos codifica el represor de etametsulfurón (ESR) que reprime el promotor enlazado operativamente al marcador seleccionable en el ADN-T. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos codifica el represor de clorsulfurón (CSR) que reprime el promotor enlazado operativamente al marcador seleccionable en el ADN-T. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos codifica la fusión represor-dCAS9 que tiene un ARN guía que reprime al promotor, enlazado operativamente al marcador seleccionable en el ADN-T. En un aspecto adicional, el casete de expresión del gen de rasgo comprende: un gen de rasgo seleccionado del grupo de un gen que confiere resistencia a plagas, un gen que confiere resistencia a herbicidas, un gen que confiere tolerancia al estrés, un gen que confiere resistencia a la sequía, un gen que confiere eficiencia en el uso del nitrógeno (NUE), un gen que confiere resistencia a enfermedades y un gen que confiere capacidad para alterar una vía metabólica. En un aspecto adicional, la cepa bacteriana es una Rhizobiales seleccionada del grupo deAgrobacteriadesarmada, una bacteriaOchrobactrumy una bacteriaRhizobiaceae.En un aspecto adicional, la Agrobacteria desarmada se selecciona del grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 y LBA4404 THY-. En un aspecto adicional, la bacteriaOchrobactrumse selecciona de la Tabla 2 En un aspecto adicional, la bacteriaRhizobiaceaese selecciona de la Tabla 3. En un aspecto adicional, se describe una semilla de una planta que contiene el casete de expresión del gen de rasgo.

En un aspecto, se describe en esta memoria un método para producir una planta transgénica que tiene una copia de un casete de expresión de un gen de rasgo que comprende: poner en contacto simultáneamente una célula vegetal con un ADN-T que contiene un casete de expresión de un gen de rasgo en una primera cepa bacteriana y un ADN-T que contiene un casete de expresión de un gen morfogenético en una segunda cepa bacteriana; en donde el casete de expresión de un gen morfogenético comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido homeobox WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido Babyboom (BBM) o un polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2); o (iii) una combinación de (i) y (ii); en donde el casete de expresión de un gen de rasgo comprende: un gen de rasgo seleccionado del grupo de un gen que confiere resistencia a plagas, un gen que confiere resistencia a herbicidas, un gen que confiere tolerancia al estrés, un gen que confiere resistencia a la sequía, un gen que confiere eficiencia en el uso del nitrógeno (NUE), un gen que confiere resistencia a enfermedades y un gen que confiere la capacidad de alterar una vía metabólica; seleccionar una célula vegetal que contiene el casete de expresión del gen de rasgo y ningún casete de expresión del gen morfogenético; y regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX se selecciona de<w>U<s>1 , WUS2,<w>U<s>3, WOX2A, WOX4, WOX5 y WOX9. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos codifica el polipéptido Babyboom (BBM) o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2). En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido Babyboom (BBM) se selecciona de BBM2, BMN2 y BMN3 o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2) es ODP2. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX y el polipéptido Babyboom (BBM) o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2). En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX se selecciona de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 y WOX9, y el polipéptido Babyboom (BBM) se selecciona de BBM2, BMN2 y BMN3, o el polipéptido de la proteína de desarrollo del óvulo 2 (ODP2) es ODP2. En un aspecto adicional, la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana son la misma cepa bacteriana. En un aspecto adicional, la misma cepa bacteriana es una Rhizobiales seleccionada del grupo deAgrobacteriadesarmada, una bacteriaOchrobactrumy una bacteriaRhizobiaceae.En un aspecto adicional, la Agrobacteria desarmada se selecciona del grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 y LBA4404 THY-. En un aspecto adicional, la bacteriaOchrobactrumse selecciona de la Tabla 2 En un aspecto adicional, la bacteriaRhizobiaceaese selecciona de la Tabla 3. En un aspecto adicional, la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana son cepas bacterianas diferentes. En un aspecto adicional, las diferentes cepas bacterianas se seleccionan de: (i) unaAgrobacteriadesarmada y una bacteriaOchrobactrum;(ii) unaAgrobacteriadesarmada y una bacteriaRhizobiaceae;y (iii) una bacteriaRhizobiaceaey una bacteriaOchrobactrum.En un aspecto adicional, la Agrobacteria desarmada se selecciona del grupo de Ag L-1 , EHA105, GV3101, LBA4404 y LBA4404 THY-. En un aspecto adicional, la bacteriaOchrobactrumse selecciona de la Tabla 2 En un aspecto adicional, la bacteriaRhizobiaceaese selecciona de la Tabla 3. En un aspecto adicional, la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana están presentes en una relación 50:50. En un aspecto adicional, la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana están presentes en una relación 75:25. En un aspecto adicional, la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana están presentes en una relación 90:10. En un aspecto adicional, la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana están presentes en una relación 95:5. En un aspecto adicional, la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana están presentes en una relación 99:1. En un aspecto adicionales, el casete de expresión génica morfogénica comprende, además, un promotor seleccionado de la Tabla 4 o la Tabla 5. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor HBSTART3 enlazado operativamente a un gen WUS. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS y un promotor de ubiquitina enlazado operativamente a un gen LEC1. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS y un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen LEC1. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS condensado a una fusión del gen LEC1 del péptido viral T2A. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende, además, una secuencia potenciadora viral o vegetal. En un aspecto adicional, el casete de expresión génica morfogénica comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS condensado a una fusión del gen BBM del péptido viral T2A. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS condensado a una fusión del gen RepA del péptido viral T2A. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS y un promotor PLTP enlazado operativamente a una fusión de PKLamiRNA. En un aspecto adicional, se describe una semilla de una planta que contiene el casete de expresión del gen de rasgo.

En un aspecto, se describe en esta memoria un método para producir una planta transgénica que tiene una copia de un casete de expresión de un gen de rasgo que comprende: poner en contacto una célula vegetal con una cepa bacteriana que contiene un plásmido que comprende un casete de expresión de un gen de rasgo dentro del ADN-T y un casete de expresión de un gen morfogenético fuera del ADN-T; en donde el casete de expresión de un gen morfogenético comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido homeobox WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido Babyboom (BBM) o un polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2); o (iii) una combinación de (i) y (ii); en donde el casete de expresión de un gen de rasgo comprende: un gen de rasgo seleccionado del grupo de un gen que confiere resistencia a plagas, un gen que confiere resistencia a herbicidas, un gen que confiere tolerancia al estrés, un gen que confiere resistencia a la sequía, un gen que confiere eficiencia en el uso del nitrógeno (NUE), un gen que confiere resistencia a enfermedades y un gen que confiere la capacidad de alterar una vía metabólica; seleccionar una célula vegetal que contiene el casete de expresión del gen de rasgo y ningún casete de expresión del gen morfogénico; y regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX se selecciona de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 y WOX9. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos codifica el polipéptido Babyboom (BBM) o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2). En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido Babyboom (BBM) se selecciona de BBM2, BMN2 y BMN3 o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2) es ODP2. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX y el polipéptido Babyboom (BBM) o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2). En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX se selecciona de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 y WOX9, y el polipéptido Babyboom (BBM) se selecciona de BBM2, BMN2 y BMN3, o el polipéptido de la proteína de desarrollo del óvulo 2 (ODP2) es ODP2. En un aspecto adicional, la cepa bacteriana es una Rhizobiales seleccionada del grupo de unaAgrobacteriadesarmada, una bacteriaOchrobactrumy una bacteriaRhizobiaceae.En un aspecto adicional, la Agrobacteria desarmada se selecciona del grupo de Ag L-1, EHA105, GV3101, LBA4404 y LBA4404 THY-. En un aspecto adicional, la bacteriaOchrobactrumse selecciona de la Tabla 2 En un aspecto adicional, la bacteriaRhizobiaceaese selecciona de la Tabla 3. En un aspecto adicionales, el casete de expresión génica morfogénica comprende, además, un promotor seleccionado de la Tabla 4 o la Tabla 5. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor HBSTART3 enlazado operativamente a un gen WUS. En un aspecto adicional, el casete de expresión génica morfogénica comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS y un promotor de ubiquitina enlazado operativamente a un gen LEC1. En un aspecto adicional, el casete de expresión génica morfogénica comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS y un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen LEC1. En un aspecto adicional, el casete de expresión génica morfogénica comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS condensado a una fusión del gen LEC1 del péptido viral T2A. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende, además, una secuencia potenciadora viral o vegetal. En un aspecto adicional, el casete de expresión génica morfogénica comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS condensado a una fusión del gen BBM del péptido viral T2A. En un aspecto adicional, el casete de expresión génica morfogénica comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS condensado a una fusión del gen RepA del péptido viral T2A. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS y un promotor PLTP enlazado operativamente a una fusión de PKLamiRNA. En un aspecto adicional, se describe una semilla de una planta que contiene el casete de expresión del gen de rasgo.

En un aspecto, se describe en esta memoria un método para producir una planta transgénica que tiene una copia de un casete de expresión de un gen de rasgo que comprende: poner en contacto una célula vegetal con una cepa bacteriana que comprende un ADN-T que contiene un casete de expresión de un gen de rasgo y un ADN-T que contiene un casete de expresión de un gen morfogenético; en donde el casete de expresión de un gen morfogenético comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido homeobox WUS/WOX; o (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido Babyboom (BBM) o un polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2); o (iii) una combinación de (i) y (ii); en donde el casete de expresión de un gen de rasgo comprende: un gen de rasgo seleccionado del grupo de un gen que confiere resistencia a plagas, un gen que confiere resistencia a herbicidas, un gen que confiere tolerancia al estrés, un gen que confiere resistencia a la sequía, un gen que confiere eficiencia en el uso del nitrógeno (NUE), un gen que confiere resistencia a enfermedades y un gen que confiere la capacidad de alterar una vía metabólica; seleccionar una célula vegetal que contiene el casete de expresión del gen de rasgo y ningún casete de expresión del gen morfogénico; y regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX se selecciona de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 y WOX9. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos codifica el polipéptido Babyboom (BBM) o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2). En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido Babyboom (BBM) se selecciona de BBM2, BMN2 y BMN3 o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2) es ODP2. En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX y el polipéptido Babyboom (BBM) o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2). En un aspecto adicional, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX se selecciona de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 y WOX9, y el polipéptido Babyboom (BBM) se selecciona de BBM2, BMN2 y BMN3, o el polipéptido de la proteína de desarrollo del óvulo 2 (ODP2) es ODP2. En un aspecto adicional, la una cepa bacteriana es una Rhizobiales seleccionada del grupo de unaAgrobacteriadesarmada, una bacteriaOchrobactrumy una bacteriaRhizobiaceae.En un aspecto adicional, la Agrobacteria desarmada se selecciona del grupo de Ag L-1, EHA105, GV3101, LBA4404 y LBA4404 THY-. En un aspecto adicional, la bacteriaOchrobactrumse selecciona de la Tabla 2 En un aspecto adicional, la bacteriaRhizobiaceaese selecciona de la Tabla 3. En un aspecto adicionales, el casete de expresión génica morfogénica comprende, además, un promotor seleccionado de la Tabla 4 o la Tabla 5. En un aspecto adicional, el casete de expresión génica morfogénica comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS. En un aspecto adicional, el casete de expresión génica morfogénica comprende un promotor HBSTART3 enlazado operativamente a un gen WUS. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS y un promotor de ubiquitina enlazado operativamente a un gen LEC1. En un aspecto adicional, el casete de expresión génica morfogénica comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS y un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen LEC1. En un aspecto adicional, el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS condensado a una fusión del gen LEC1 del péptido viral T2A. En un aspecto adicional, el casete de expresión génica morfogénica comprende, además, una secuencia potenciadora viral o vegetal. En un aspecto adicional, el casete de expresión génica morfogénica comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS condensado a una fusión del gen BBM del péptido viral T2A. En un aspecto adicional, el casete de expresión génica morfogénica comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS condensado a una fusión del gen RepA del péptido viral T2A. En un aspecto adicional, el casete de expresión génica morfogénica comprende un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS y un promotor PLTP enlazado operativamente a una fusión de PKLamiRNA. En un aspecto adicional, se describe una semilla de una planta que contiene el casete de expresión del gen de rasgo.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS

La FIG. 1 muestra la eficiencia de la formación de embriones somáticos de los plásmidos PHP81718 (tratamiento WUS) y PHP80728 (tratamiento TAG-RFP) como se describe con más detalle en el Ejemplo 11.

DESCRIPCION DETALLADA

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualesquiera aspectos, realizaciones y ejemplos de la presente divulgación que no se encuentren bajo el alcance de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención y se proporcionan simplemente para fines ilustrativos.

Las divulgaciones en esta memoria se describirán más completamente en adelante en esta memoria con referencia a las figuras adjuntas en las que se muestran algunos, pero no todos los posibles aspectos.

La terminología utilizada en esta memoria es con el fin de describir únicamente aspectos particulares, y no pretende ser limitativa. Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la expresión "que comprende" puede incluir el aspecto de "que consiste en". Salvo que se definan de otro modo, toda las expresiones y términos técnicos y científicos utilizados en en esta memoria tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto en la materia a la que pertenecen los métodos descritos. En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones posteriores, se hará referencia a varios términos que se definirán en este documento.

La presente divulgación comprende métodos para producir una planta transgénica utilizando un gen morfogenético. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "gen morfogenético" se refiere a un gen que, al expresarse ectópicamente, estimula la formación de una estructura somática que puede producir una planta. Más precisamente, la expresión ectópica del gen morfogenético estimula la formación de novo de un embrión somático o una estructura organogénica, como el meristemo de un brote, que puede producir una planta. Esta formación de novo estimulada se produce en la célula en la que se expresa el gen morfogenético o en una célula vecina. Un gen morfogenético puede ser un factor de transcripción que regula la expresión de otros genes, o un gen que influye en los niveles hormonales en el tejido vegetal, ambos factores pueden estimular cambios morfogénicos. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "factor morfogénico" se refiere a un gen morfogenético y/o a la proteína expresada por un gen morfogenético.

Un gen morfogenético está implicado en el metabolismo de la planta, el desarrollo de órganos, el desarrollo de células madre, la estimulación del crecimiento celular, la organogénesis, la iniciación de la embriogénesis somática, la maduración acelerada del embrión somático, la iniciación y/o el desarrollo del meristemo apical, la iniciación y/o el desarrollo del meristemo del brote, o una combinación de los mismos, tales como los genes WUS/WOX (WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 o WOX9) véanse las patentes de EE.UU. 7.348.468 y 7.256.322 y las publicaciones de solicitudes de patente de EE.UU. números 2017/0121722 y 2007/0271628; Laux et al. (1996) Development 122:87-96; y Mayer et al. (1998) Cell 95:805-815; van der Graaff et al., 2009, Genome Biology 10:248; Dolzblasz et al., 2016, Mol. Plant 19:1028-39. Se espera que la modulación de WUS/WOX module el fenotipo de la planta y/o del tejido vegetal, incluyendo el metabolismo de la planta, el desarrollo de órganos, el desarrollo de células madre, la estimulación del crecimiento celular, la organogénesis, la iniciación de la embriogénesis somática, la maduración acelerada de embriones somáticos, la iniciación y/o el desarrollo del meristemo apical, la iniciación y/o el desarrollo del meristemo del brote, o una combinación de los mismos. La expresión de WUS en Arabidopsis puede inducir la formación de células madre en tejidos vegetativos, que pueden diferenciarse en embriones somáticos (Zuo, et al. (2002) Plant J 30:349-359). También sería de interés a este respecto un gen MYB118 (véase la patente de EE.UU. 7.148.402), un gen MYB115 (véase Wang et al. (2008) Cell Research 224-235), un gen BABYBOOM (BBM; véase Boutilier et al. (2002) Plant Cell 14: 1737-1749), o un gen CLAVATA (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 7.179.963).

Las secuencias de polinucleótidos morfogénicos y las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos homeobox WUS/WOX son útiles en los métodos descritos. La proteína Wuschel, denominada en adelante en esta memoria WUS, desempeña un papel clave en el inicio y mantenimiento del meristemo apical, que contiene una combinación de células madre pluripotentes (Endrizzi, et al., (1996) Plant Journal 10:967-979; Laux, et al., (1996) Development 122:87-96; y Mayer, et al., (1998) Cell 95:805-815). Las plantas de Arabidopsis mutantes para el gen WUS contienen células madre que se especifican de forma incorrecta y que parecen experimentar diferenciación. WUS codifica una proteína de homeodominio novedosa que supuestamente funciona como regulador transcripcional (Mayer, et al., (1998) Cell 95:805-815). Se cree que la población de células madre de meristemos de los brotes de Arabidopsis se mantienen mediante un bucle regulador entre los genes CLAVATA (CLV) que fomentan el inicio orgánico y el gen WUS que es necesaria para la identidad de las células madre, reprimiendo WUS mediante los genes CLV a nivel de transcrito, y siendo suficiente la expresión de WUS para inducir la identidad celular del meristemo y la expresión del marcador de células madre CLV3 (Brand, et al., (2000) Science 289:617-619; Schoof, et al., (2000) Cell 100:635-644). Se ha demostrado que la expresión constitutiva de WUS en Arabidopsis da lugar a proliferación de brotes accidentales a partir de las hojas (en la planta) (Laux, T., Talk Presented at the XVI International Botanical Congress Meeting, 1-7 de agosto de 1999, St. Louis, Mo.).

En un aspecto, el polipéptido homeobox WUS/WOX útil en los métodos de la divulgación es un polipéptido WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5, WOX5A o WOX9 (véanse las patentes de EE.UU. 7.348.468 y 7.256.322 y las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. números 2017/0121722 y 2007/0271628, y van der Graaff et al., 2009, Genome Biology 10:248). El polipéptido homeobox WUS/WOX útil en los métodos de la divulgación puede obtenerse o derivarse de cualquiera de las plantas descritas en esta memoria. En la Tabla 1 que figura a continuación se enumeran otros genes WUS/WOX útiles en los métodos de la divulgación.

Tabla 1.

Otros genes morfogenéticos útiles en la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, LEC1 (Patente de EE.UU. 6.825.397, Lotan et al., 1998, Cell 93:1195-1205), LEC2 (Stone et al., 2008, PNAS 105:3151-3156; Belide et al., 2013, Plant Cell Tiss. Organ Cult 113:543-553), KN1/STM (Sinha et al., 1993. Genes Dev 7:787-795), el gen IPT de Agrobacterium (Ebinuma y Komamine, 2001, In vitro Cell. Dev Biol - Plant 37:103-113), MONOpTe ROS-DELTA (Ckurshumova et al., 2014, New Phytol. 204:556-566), el gen AV-6b de Agrobacterium (Wabiko y Minemura 1996, Plant Physiol. 112:939-951), la combinación de los genes IAA-h e IAA-m de Agrobacterium (Endo et al., 2002, Plant Cell Rep., 20:923-928), el gen SERK de Arabidopsis (Hecht et al., 2001, Plant Physiol. 127:803-816), el gen AGL15 de Agrobacterium (Harding et al., 2003, Plant Physiol. 133:653-663), el gen FUSCA (Castle y Meinke, Plant Cell 6:25-41) y el gen PICKLE (Ogas et al., 1999, PNAS 96:13839-13844).

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "casete de expresión" significa un componente distinto del ADN vectorial que consiste en secuencias codificantes y no codificantes que incluyen secuencias reguladoras 5' y 3' que controlan la expresión en una célula transformada/transfectada.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "secuencia codificante" significa la porción de la secuencia de ADN delimitada por un codón de inicio y uno de parada que codifica los aminoácidos de una proteína.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "secuencia no codificante" se refiere a las porciones de una secuencia de ADN que se transcriben para producir un ARN mensajero, pero que no codifican los aminoácidos de una proteína tales como las regiones 5' no traducidas, los intrones y las regiones 3' no traducidas. Secuencia no codificante también puede referirse a moléculas de ARN, tales como microARNs, ARN interferente o ARN en horquilla, que, al expresarse, pueden inhibir la expresión de regulación negativa de un gen endógeno u otro transgén.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "secuencia reguladora" significa un segmento de una molécula de ácido nucleico que es capaz de aumentar o disminuir la expresión de un gen. Secuencias reguladoras incluyen promotores, terminadores, elementos potenciadores, elementos silenciadores, 5' UTR y 3' UTR (región no traducida).

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "Agro1" significa unaAgrobacteriumque alberga un plásmido con un ADN-T que contiene un casete de expresión de "gen de rasgo".

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "Agro2" significa unaAgrobacteriumque alberga un plásmido con un ADN-T que contiene un casete de expresión de "gen morfogenético", que expresa genes tales como, pero no limitados a BBM y/o WUS2.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "casete de transferencia" significa un ADN-T que comprende un casete de expresión o casetes de expresión flanqueados por el borde derecho y el borde izquierdo.

Tal como se utiliza en esta memoria, ADN-T significa una porción de un plásmido Ti que se inserta en el genoma de una célula vegetal huésped.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "marcador seleccionable" significa un transgén que, cuando se expresa en una célula transformada/transfectada, confiere resistencia a agentes selectivos tales como antibióticos, herbicidas y otros compuestos tóxicos para una célula no transformada/no transfectada.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "EAR" significa un motivo de represión anfifílica asociado al factor de unión del elemento sensible al etileno con una secuencia consenso general de LLxLxL, DNLxxP, LxLxPP, R/KLFGV o TLLLFR, que actúa como señales de represión transcripcional dentro de los factores de transcripción. La adición de un elemento represor de tipo EAR a una proteína de unión al ADN, tal como un factor de transcripción, dCAS9 o LEXA (como ejemplos), confiere la función de represión transcripcional a la proteína de fusión (Kagale, S. y Rozwadowski, K. 2010. Plant Signaling and Behavior 5:691-694).

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "factor de transcripción" se refiere a una proteína que controla la tasa de transcripción de genes específicos mediante su unión a la secuencia de ADN del promotor y la regulación positiva o la regulación negativa de la expresión. Ejemplos de factores de transcripción, que también son genes morfogenéticos, incluyen miembros de la familia AP2/EREBP (incluyendo las subfamilias BBM (ODP2), plethora y aintegumenta), las proteínas de unión a la caja CAAT, tales como LEC1 y HAP3, y miembros de las familias MYB, bHLH, NAC, MADS, bZIP y WRKY.

Las secuencias de polinucleótidos morfogénicos y las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de la proteína de desarrollo del óvulo 2 (ODP2) y polipéptidos relacionados, p. ej., las proteínas de la familia de proteínas Babyboom (BBM), son útiles en los métodos de la divulgación. En un aspecto, un polipéptido que comprende dos dominios de unión AP2-ADN es un polipéptido ODP2, BBM2, BMN2 o BMN3 (véase la publicación de solicitud de patente de EE.UU. número 2017/0121722). Polipéptidos ODP2, útiles en los métodos de la divulgación, contiene dos dominios APETALA2 (AP2) predichos y son miembros de la familia de proteínas AP2 (PFAM acceso PF00847). La familia AP2 de supuestos factores de transcripción ha demostrado regular una amplia gama de procesos de desarrollo, y los miembros de la familia se caracterizan por la presencia de un dominio de unión a ADN AP2. Se prevé que este núcleo conservado formará una alfa hélice anfipática que se une a ADN. El dominio AP2 se identificó por primera vez en APETALA2, una proteína de Arabidopsis que regula la identidad del meristemo, la especificación del órgano floral, el desarrollo de la cubierta de la semilla y la expresión del gen homeótico floral. El dominio AP2 ahora se ha descubierto en una diversidad de proteínas.

Polipéptidos ODP2 útiles en los métodos de la divulgación comparten homología con varios polipéptidos dentro de la familia AP2, p. ej., véase la FIG. 1 del documento US8420893 proporciona un alineamiento de los polipéptidos ODP2 de maíz y arroz con otras ocho proteínas que tienen dos dominios AP2. También se proporciona una secuencia consenso de todas las proteínas que aparecen en el alineamiento del documento US 8420893 en la FIG. 1 del mismo. El polipéptido que comprende los dos dominios de unión AP2-ADN, útiles en los métodos de la divulgación, puede obtenerse o derivarse de cualquiera de las plantas descritas en esta memoria. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2, útiles en los métodos de la divulgación, es un polipéptido ODP2. En un aspecto, el polipéptido que comprende los dos dominios de unión a ADN-AP2, útiles en los métodos de la divulgación, es un polipéptido BBM2. El polipéptido ODP2 y el polipéptido BBM2, útiles en los métodos de la divulgación, pueden obtenerse o derivarse de cualquiera de las plantas descritas en esta memoria.

Un gen morfogenético puede incorporarse de forma estable al genoma de una planta o expresarse transitoriamente. En un aspecto, la expresión del gen morfogenético está controlada. La expresión controlada puede ser una expresión pulsada del gen morfogenético durante un período de tiempo determinado. Alternativamente, el gen morfogenético puede expresarse sólo en algunas células transformadas y no se expresa en otras. El control de la expresión del gen morfogenético puede conseguirse mediante una diversidad de métodos como se describe en esta memoria más adelante. Los genes morfogenéticos útiles en los métodos de la divulgación pueden obtenerse o derivarse de cualquier especie vegetal descrita en esta memoria.

El término "planta" se refiere a plantas completas, órganos vegetales (p. ej., hojas, tallos, raíces, etc.), tejidos vegetales, células vegetales, partes de la planta, semillas, propágulos, embriones y progenie de las mismas. Las células vegetales pueden ser diferenciadas o indiferenciadas (p. ej., callo, callo indiferenciado, embriones inmaduros y maduros, embrión cigótico inmaduro, cotiledón inmaduro, eje embrionario, células de cultivo en suspensión, protoplastos, hoja, células foliares, células radiculares, células del floema y polen). Las células vegetales incluyen, sin limitación, células de semillas, cultivos en suspensión, explantes, embriones inmaduros, embriones, embriones cigóticos, embriones somáticos, callo embriogénico, meristemo, meristemos somáticos, callo organogénico, protoplastos, embriones derivados de semillas derivadas de mazorcas maduras, bases de hojas, hojas de plantas maduras, puntas de hojas, influorescencias inmaduras, borla, mazorca inmadura, sedas, cotiledones, cotiledones inmaduros, ejes embrionarios, regiones meristemáticas, tejido calloso, células de hojas, células de tallos, células de raíces, células de brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas. Las partes de plantas incluyen tejidos diferenciados e indiferenciados incluyendo, pero sin limitarse a raíces, tallos, brotes, hojas, polen, semillas, tejido tumoral y diversas formas de células en cultivo (p. ej., células individuales, protoplastos, embriones y tejido de callo). El tejido vegetal puede estar en una planta o en un órgano de la planta, tejido o cultivo celular. Grano pretende significar la semilla madura producida por productores comerciales para fines distintos de cultivar o reproducir las especies. También se describen en esta memoria la progenie, variantes y mutantes de las plantas regeneradas, siempre que esta progenie, variantes y mutantes comprendan los polinucleótidos introducidos.

La presente divulgación puede utilizarse para la transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero no limitado a monocotiledóneas y dicotiledóneas. Monocotiledóneas incluyen, pero no se limitan a cebada, maíz, mijo (p. ej., mijo perla (Pennisetum glaucum)), mijo común (Panicum miliaceum), mijo cola de zorra (Setaria italica), mijo de dedo (Eleusine coracana), teff (Eragrostis tef), avena, arroz, centeno, Setaria sp., sorgo, triticale o trigo, o cultivos de hojas y tallos, incluyendo, pero no limitado a bambú, pasto barrón, pasto de pradera, juncos, raigrás, caña de azúcar; pastos de césped, pastos ornamentales y otros pastos tales como el pasto varilla y el césped. Alternativamente, las plantas dicotiledóneas utilizadas en la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a col rizada, coliflor, brócoli, mostaza, repollo, guisante, trébol, alfalfa, haba, tomate, cacahuete, yuca, soja, canola, alfalfa, girasol, cártamo, tabaco, Arabidopsis o algodón.

Ejemplos de especies de plantas de interés incluyen, pero no se limitan a maíz (Zea maíz), Brassica sp. (p. ej., B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuente de aceite de semilla, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (p. ej., mijo perla (Pennisetum glaucum), mijo común (Panicum miliaceum), mijo cola de zorra (Setaria italica), mijo africano (Eleusine coracana), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuete (Arachis hipogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), yuca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), piña tropical (Ananas comosus), cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guava), mango (Mangifera indica), olivo (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendro (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, hortalizas, plantas ornamentales y coníferas.

Las plantas superiores, p. ej., clases de angiospermas y gimnospermas, pueden utilizarse en la presente divulgación. Plantas de especies adecuadas, útiles en la presente divulgación, pueden proceder de las familias Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae y Vitaceae. Plantas de miembros del género Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis y Zea se pueden utilizar en los métodos de la divulgación.

En los métodos de la divulgación se pueden utilizar plantas importantes o de interés para la agricultura, la horticultura, la producción de biomasa (para la producción de moléculas de combustible líquido y otras sustancias químicas) y/o la silvicultura. Ejemplos no limitantes incluyen, por ejemplo, Panicum virgatum (pasto varilla), Miscanthus giganteus (miscanto) y Saccharum spp. (caña de azúcar, caña energética), Populus balsamifera (álamo), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), Helianthus annuus (girasol), Medicago sativa (alfalfa), Beta vulgaris (remolacha azucarera), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Erianthus spp., Andropogon gerardii (hierba de tallo azul grande), Pennisetum purpureum (hierba de elefante), Phalaris arundinacea (alpiste), Cynodon dactylon (bermuda), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (pasto de pradera), Arundo donax (caña gigante), Secale cereale (centeno), Salix spp. (sauce), Eucalyptus spp. (eucalipto, incluyendo E. grandis (y sus híbridos, conocidos como "urograndis"), E. globulus, E. camaldulensis, E. tereticornis, E. viminalis, E. nitens, E. saligna y E. urophylla), Triticosecale spp. (triticum - trigo X centeno), teff (Eragrostis tef), bambú, Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatropha), Ricinus communis (ricino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (lino), Manihot esculenta (yuca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca sativa (lechuga), Phaseolus vulgaris (habas verdes), Phaseolus limensis (habas lima), Lathyrus spp. (guisantes), Musa paradisiaca (plátano), Solanum tuberosum (patata), Brassica spp. (B. napus (canola), B. rapa, B. juncea), Brassica oleracea (brócoli, coliflor, coles de Bruselas), Camellia sinensis (té), Fragaria ananassa (fresa), Theobroma cacao (cacao), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (piña tropical), Capsicum annum (pimiento picante y dulce), Arachis hypogaea (cacahuetes), Ipomoea batatus (batata), Cocos nucífera (coco), Citrus spp. (cítricos), Persea americana (aguacate), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guava), mango (Mangifera indica), olivo (Olea europaea), Carica papaya (papaya), Anacardium occidentale (anacardo), Macadamia integrifolia (árbol de macadamia), Prunus amygdalus (almendra), Cucumis melo (melón almizclero), Cucumis sativus (pepino), Cucumis cantalupensis (melón), Cucurbita maxima (calabaza), Cucurbita moschata (calabaza), Spinacea oleracea (espinaca), Citrullus lanatus (sandía), Abelmoschus esculentus (okra), Solanum melongena (berenjena), Cyamopsis tetragonoloba (habas guar), Ceratonia siliqua (algarroba), Trigonella foenum-graecum (fenogreco), Vigna radiata (habas mung), Vigna unguiculata (caupí), Vicia faba (haba), Cicer arietinum (garbanzo), Lens culinaris (lenteja), Papaver somniferum (amapola), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis sativa, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Colchicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guayule), Hevea spp. (caucho), Mentha spicata (menta), Mentha piperita (menta piperita), Bixa orellana (achiote), Alstroemeria spp., Rose spp. (rosa), Rhododendron spp. (azalea), Macrophylla hydrangea (hortensia), Hibiscus rosasanensis (hibisco), Tulip spp. (tulipanes), Narcissus spp. (narcisos), petunia híbrida (petunias), Dianthus caryophyllus (clavel), Euphorbia pulcherrima (poinsetia), crisantemo, Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (altramuz), Uniola paniculata (avena), bentgrass (Agrostis spp.), Populus tremuloides (álamo temblón), Pinus spp. (pino), Abies spp. (abeto), Acer spp. (arce), Hordeum vulgare (cebada), Poa pratensis (pasto azul), Lolium spp. (raigrás), Phleum pratense (fleo) y coníferas.

Las coníferas que pueden emplearse en la presente divulgación e incluyen, por ejemplo, pinos tales como pino taeda (Pinus taeda), pino del incienso (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino murrayana (Pinus contorta) y pino de Monterrey (Pinus radiata); abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii); cicuta del este o canadiense (Tsuga canadensis); cicuta occidental (Tsuga heterophylla); cicuta montañosa (Tsuga mertensiana); alerce o pino alerce (Larix occidentalis); pícea blanca (Picea glauca); secuoya (Sequoia sempervirens); abetos verdaderos tales como abeto plateado (Abies amabilis) y abeto balsámico (Abies balsamea); y cedros tales como cedro rojo occidental (Thuja plicata) y falso ciprés de Nootka (Chamaecyparis nootkatensis).

Céspedes se pueden utilizar en la presente divulgación e incluyen, pero no se limitan a: pasto azul de invierno (Poa annua); margallo (Lolium multiflorum); pasto azul de Canadá (Poa compressa); festuca reptante (Festuca rubra); yerba fina (Agrostis tenuis); césped inclinado progresivo (Agrostis palustris); pasto de trigo del desierto (Agropyron desertorum); triguillo ruso del norte (Agropyron cristatum); festuca dura (Festuca longifolia); pasto azul de Kentucky (Poa pratensis); pasto ovillo (Dactylis glomerata); ballica (Lolium perenne); festuca roja (Festuca rubra); pasto quila (Agrostis alba); gamilla (Poa trivialis); cañuela de oveja (Festuca ovina); bromo suave (Bromus inermis); festuca alta (Festuca arundinacea); fleo (Phleum pratense); césped inclinado terciopelo (Agrostis canina); hierba alcalina llorona (Puccinellia distans); pasto de trigo occidental (Agropyron smithii); pasto de San Agustín (Stenotaphrum secundatum); zoisia (Zoysia spp.); pasto bahía (Paspalum notatum); pasto alfombra (Axonopus affinis); prado chino (Eremochloa ophiuroides); pasto africano (Pennisetum clandesinum); grama de río (Paspalum vaginatum); grama azul (Bouteloua gracilis); hierba búfalo (Buchloe dactyloids); pasto banderita (Bouteloua curtipendula).

En aspectos específicos, las plantas transformadas mediante los métodos de la presente divulgación son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, cártamo, cacahuete, arroz, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.). Plantas de interés particular incluyen plantas de cereales que proporcionan semillas de interés, plantas de semillas oleaginosas y plantas leguminosas. Semillas de interés incluyen semillas de cereales, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Plantas de semillas oleaginosas incluyen algodón, soja, cártamo, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, etc. Plantas leguminosas incluyen, pero no se limitan a habas y guisantes. Las judías incluyen, aunque sin limitación, guar, algarrobo, fenugreco, soja, judías de jardín, caupí, soja verde, judía blanca, haba, lentejas y garbanzos.

La presente divulgación también incluye plantas obtenidas por cualquiera de los métodos descritos en esta memoria. La presente divulgación también incluye semillas de una planta obtenida por cualquiera de los métodos descritos en esta memoria. Una planta transgénica se define como una planta fértil madura que contiene un transgén.

En los métodos descritos, pueden utilizarse diversos explantes derivados de plantas, incluyendo embriones inmaduros, embriones cigóticos de 1-5 mm, embriones de 3-5 mm y embriones derivados de semilla derivada de espiga madura, bases foliares, hojas de plantas maduras, puntas de hojas, inflorescencias inmaduras, panícula, espiga inmadura y sedas. En un aspecto, los explantes utilizados en los métodos descritos pueden derivarse de semilla derivada de espiga madura, bases foliares, hojas de plantas maduras, puntas de hojas, inflorescencias inmaduras, panícula, espiga inmadura y sedas. El explante utilizado en los métodos descritos se puede derivar de cualquiera de las plantas descritas en esta memoria.

La divulgación abarca composiciones de ácidos nucleicos aislados o sustancialmente purificados. Una molécula de ácido nucleico o proteína "aislada" o "purificada", o una porción biológicamente activa de la misma, está sustancialmente libre de otros materiales o componentes celulares que normalmente acompañan o interactúan con la molécula de ácido nucleico o proteína tal como se encuentra en su entorno natural, o está sustancialmente libre de medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. Un ácido nucleico "aislado" está sustancialmente libre de secuencias (incluyendo secuencias codificantes de proteínas) que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversos aspectos, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que deriva el ácido nucleico. Una proteína que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente un 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando una proteína útil en los métodos de la divulgación o porción biológicamente activa de la misma se produce de forma recombinante, de forma óptima el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % (en peso seco) de precursores químicos o productos químicos que no son la proteína de interés. Secuencias útiles en los métodos de la divulgación se pueden aislar de la región no traducida 5' que flanquea sus sitios de iniciación de la transcripción respectivos. La presente divulgación abarca composiciones de ácidos nucleicos o proteínas aisladas o sustancialmente purificadas, útiles en los métodos de la divulgación.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "fragmento" se refiere a una porción de la secuencia de ácido nucleico. Fragmentos de secuencia útiles en los métodos de la divulgación conservan la actividad biológica de la secuencia de ácido nucleico. Alternativamente, fragmentos de una secuencia de nucleótidos que son útiles como sondas de hibridación pueden no retener necesariamente la actividad biológica. Fragmentos de una secuencia de nucleótidos descrita en esta memoria pueden variar desde al menos aproximadamente 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150, 1175, 1200, 1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375, 1400, 1425, 1450, 1475, 1500, 1525, 1550, 1575, 1600, 1625, 1650, 1675, 1700, 1725, 1750, 1775, 1800, 1825, 1850, 1875, 1900, 1925, 1950, 1975, 2000, 2025, 2050, 2075, 2100, 2125, 2150, 2175, 2200, 2225, 2250, 2275, 2300, 2325, 2350, 2375, 2400, 2425, 2450, 2475, 2500, 2525, 2550, 2575, 2600, 2625, 2650, 2675, 2700, 2725, 2750, 2775, 2800, 2825, 2850, 2875, 2900, 2925, 2950, 2975, 3000, 3025, 3050, 3075, 3100, 3125, 3150, 3175, 3200, 3225, 3250, 3275, 3300, 3325, 3350, 3375, 3400, 3425, 3450, 3475, 3500, 3525, 3550, 3575, 3600, 3625, 3650, 3675, 3700, 3725, 3750, 3775, 3800, 3825, 3850, 3875, 3900, 3925, 3950, 3975, 4000, 4025, 4050, 4075, 4100, 4125, 4150, 4175, 4200, 4225, 4250, 4275, 4300, 4325, 4350, 4375, 4400, 4425, 4450, 4475, 4500, 4525, 4550, 4575, 4600, 4625, 4650, 4675, 4700, 4725, 4750, 4775, 4800, 4825, 4850, 4875, 4900, 4925, 4950, 4975, 5000, 5025, 5050, 5075, 5100, 5125, 5150, 5175, 5200, 5225, 5250, 5275, 5300, 5325, 5350, 5375, 5400, 5425, 5450, 5475, 5500, 5525, 5550, 5575, 5600, 5625, 5650, 5675, 5700, 5725, 5750, 5775, 5800, 5825, 5850, 5875, 5900, 5925, 5950, 5975, 6000, 6025, 6050, 6075, 6100, 6125, 6150, 6175, 6200, o 6225 nucleótidos, y hasta la longitud completa de la secuencia en cuestión. Se puede preparar una porción biológicamente activa de una secuencia de nucleótidos aislando una porción de la secuencia y evaluando el actividad de la porción.

También quedan abarcados fragmentos y variantes de secuencias de nucleótidos y las proteínas codificadas por ellas, útiles en los métodos de la presente divulgación. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "fragmento" se refiere a una porción de una secuencia de nucleótidos y, por lo tanto, a la proteína codificada por ella, o a una porción de una secuencia de aminoácidos. Fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden codificar fragmentos de la proteína que retienen la actividad biológica de la proteína nativa. Como alternativa, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos útiles como sondas de hibridación en general no codifican fragmentos proteínicos que conservan actividad biológica. Por tanto, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar de al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos y hasta la secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica las proteínas útiles en los métodos de la divulgación.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "variantes" significa secuencias que tienen una similitud sustancial con una secuencia descrita en esta memoria. Una variante comprende una deleción y/o adición de uno o más nucleótidos o péptidos en uno o más sitios internos dentro del polinucleótido o polipéptido nativo, o la sustitución de uno o más nucleótidos o péptidos en uno o más sitios en el polinucleótido o polipéptido nativo. Tal como se utiliza en esta memoria, una secuencia de nucleótidos o péptidos "nativa" comprende una secuencia de nucleótidos o péptidos que se produce de forma natural, respectivamente. Para secuencias de nucleótidos, se pueden identificar variantes que se producen de forma natural, con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas tales como, por ejemplo, con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como se expone brevemente más adelante. Una variante biológicamente activa de una proteína útil en los métodos de la divulgación puede diferir de esa proteína nativa en tan poco como 1-15 residuos de aminoácidos, tal poco como tan poco como 1-10, tal como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2 o incluso 1 residuo de aminoácido.

Secuencias de nucleótidos variantes incluyen también secuencias de nucleótidos sintéticamente derivadas, tales como las generadas, por ejemplo, utilizando mutagénesis dirigida al sitio. Generalmente, variantes de una secuencia de nucleótidos descrita en esta memoria tendrán al menos 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, a 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con esa secuencia de nucleótidos, según se determina por programas de alineamiento de secuencias descritos en otras partes de esta memoria utilizando parámetros predeterminados. También quedan abarcadas variantes biológicamente activas de una secuencia de nucleótidos descrita en esta memoria. La actividad biológica puede medirse utilizando técnicas tales como el análisis de transferencia Northern, mediciones de la actividad del reportero obtenidas de fusiones transcripcionales. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), en lo que sigue "Sambrook". Alternativamente, se pueden medir los niveles de un gen reportero, tal como la proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés) o la proteína amarilla fluorescente (YFP, por sus siglas en inglés), producidos bajo el control de un promotor operativamente enlazado a un fragmento o variante de nucleótido. Véase, por ejemplo, Matz et al. (1999) Nature Biotechnology 17:969-973; Patente de EE.UU. Número 6.072.050; Nagai, et al., (2002) Nature Biotechnology 20(1):87-90. Secuencias de nucleótidos de variante también abarcan secuencias derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico, tal como barajado de ADN. Con un procedimiento de este tipo se pueden manipular una o más secuencias de nucleótidos diferentes para crear una nueva secuencia de nucleótidos. De esta manera, se generan colecciones de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprenden regiones de secuencia que tienen identidad de secuencia sustancial y pueden recombinarse de forma homóloga in vitro o in vivo. Se conocen en la técnica estrategias para un barajado de ADN de este tipo. Véase, por ejemplo, Stemmer, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer, (1994) Nature 370:389 391; Crameri, et al., (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol.

272:336-347; Zhang, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288-291; y Patentes de EE.UU. Números 5.605.793 y 5.837.458.

Los métodos para mutagénesis y alteraciones de la secuencia de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kunkel, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel, et al., (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; Patente de EE.UU. Número 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y las referencias citadas en la misma. Pueden encontrarse directrices con respecto a las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan a la actividad biológica de la proteína de interés se pueden encontrar en el modelo de Dayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.). Las sustituciones conservativas, tales como intercambio de un aminoácido con otro que tenga propiedades similares, pueden ser óptimas.

Las secuencias de nucleótidos de la divulgación se pueden utilizar para aislar secuencias correspondientes de otros organismos, particularmente otras plantas, más particularmente otras monocotiledóneas o dicotiledóneas. De este modo, se pueden utilizar métodos tales como PCR e hibridación para identificar secuencias de este tipo, basándose en su homología de secuencia con las secuencias recogidas en esta memoria. Las secuencias aisladas basándose en su identidad de secuencia con las secuencias enteras expuestas en el presente documento o con fragmentos de los mismos están englobadas por la presente divulgación.

En una estrategia de PCR, pueden diseñarse cebadores de oligonucleótidos para uso en reacciones de PCR para amplificar secuencias de ADN correspondientes a partir del ADNc o ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos de diseño de cebadores de PCR y clonación por PCR se conocen, en general, en la técnica y se describen en Sambrook, supra. Véanse, por lo tanto, Innis, et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Métodos de PCR conocidos incluyen, pero no se limitan a, métodos que utilizan cebadores emparejados, cebadores anidados, cebadores específicos individuales, cebadores degenerados, cebadores específicos para genes, cebadores específicos para vectores y cebadores parcialmente desapareados.

En las técnicas de hibridación, toda o parte de una secuencia de nucleótidos conocida se utiliza como una sonda que se hibrida selectivamente con otras secuencias de nucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN o fragmentos de ADNc genómicos clonados (es decir, genotecas o colecciones de ADNc) de un organismo elegido. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómicos, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos y se pueden marcar con un grupo detectable, tal como 32P o cualquier otro marcador detectable. Por lo tanto, por ejemplo, pueden fabricarse sondas para hibridación marcando oligonucleótidos sintéticos basándose en las secuencias de la divulgación. Métodos de preparación de sondas para la hibridación y para la construcción de genotecas se conocen, en general, en la técnica y se describen en Sambrook, supra.

Por ejemplo, se puede utilizar una secuencia completa descrita en esta memoria, o una o más porciones de la misma, como una sonda capaz de hibridarse específicamente con las secuencias correspondientes y ARN mensajeros. Para lograr una hibridación específica en una diversidad de condiciones, sondas de este tipo incluyen secuencias que son únicas entre secuencias y, en general, tienen al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud o al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Sondas de este tipo pueden utilizarse para amplificar las correspondientes secuencias de una planta elegida por PCR. Esta técnica puede utilizarse para aislar secuencias codificantes adicionales de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Técnicas de hibridación incluyen el cribado por hibridación de colecciones de ADN sembradas en placas (o placas o colonias, véase, por ejemplo, Sambrook, supra).

La hibridación de dichas secuencias puede realizarse en condiciones rigurosas. Las expresiones "condiciones rigurosas" o "condiciones de hibridación rigurosas" pretenden significar condiciones en las que una sonda se hibridará con su secuencia diana hasta un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (p. ej., al menos 2 veces sobre el fondo). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Controlando la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, pueden identificarse secuencias diana que sean un 100 % complementarias a la sonda (sondeo homólogo). Como alternativa, las condiciones de rigurosidad pueden ajustarse para permitir cierto emparejamiento incorrecto en las secuencias, de manera que se detecten menores grados de similitud (sondeo heterólogo). En general, una sonda es de menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, óptimamente de menos de 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración salina sea menor que aproximadamente 1,5 M de iones Na, típicamente de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración de iones Na (u otras sales) a pH 7,0 hasta 8,3 y la temperatura sea de al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (p. ej., de 10 a 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (p. ej., de más de 50 nucleótidos). También pueden conseguirse condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Condiciones ejemplares de baja rigurosidad incluyen hibridación con una solución tampón de 30 a 35 % de formamida, NaCl 1 M, SDS (dodecil sulfato sódico) al 1 % a 37 °C, y un lavado en SSC de 1 vez a 2 veces (SSC 20 veces = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) a 50 hasta 55 °C. Condiciones ejemplares de rigurosidad moderada incluyen hibridación en 40 a 45 % de formamida, NaCl 1,0 M, SDS al 1 % a 37 °C, y un lavado de 0,5 veces a 1 vez en SSC a 55 hasta 60 °C. Condiciones ejemplares de rigurosidad elevada incluyen hibridación en un 50 % de formamida, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C, y un lavado final en SSC 0,1 veces a 60 hasta 65 °C durante al menos 30 minutos. La duración de la hibridación en general es de menos de aproximadamente 24 horas, habitualmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas. La duración del tiempo de lavado será al menos una longitud de tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio.

La especificidad es típicamente la función de los lavados posteriores a la hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos ADN-ADN, el punto de fusión térmico (Tm) puede aproximarse a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl, (1984) Anal. Plant 138:267284: Tm = 81,5 °C 16,6 (log M) 0,41 (% GC) 0,61 (% form) - 500/L; en que M es la molaridad de los cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (en condiciones de fuerza iónica y pH definidas) a la que un 50 % de una secuencia diana complementaria hibrida con una sonda perfectamente emparejada. La Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de emparejamiento incorrecto; por lo tanto, la Tm, las condiciones de hibridación y/o las de lavado pueden ajustarse para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con 90 % de identidad, la Tm puede disminuirse 10 °C. En general, se seleccionan condiciones rigurosas que sean aproximadamente 5 °C inferiores a la Tm para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, condiciones muy rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3 o 4 °C inferiores a la Tm; condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 °C inferiores a la Tm; las condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20 °C inferiores a la Tm. Usando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, los expertos en la materia entenderán que se describen de forma inherente las variaciones en la rigurosidad de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado deseado de emparejamiento incorrecto produce una Tm de menos de 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC de modo que pueda usarse una temperatura mayor. Se encuentran una amplia guía sobre la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel, et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York). Véase también, Sambrook supra. Por lo tanto, las secuencias aisladas que tienen actividad y que se hibridan en condiciones estrictas con las secuencias descritas en esta memoria o con fragmentos de las mismas, quedan abarcadas por la presente divulgación.

En general, las secuencias que tienen actividad y que se hibridan con las secuencias descritas en esta memoria serán al menos 40 % a 50 % homólogas, aproximadamente 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % a 98 % homólogas o más con las secuencias descritas. Es decir, la similitud de secuencias de las secuencias puede variar, compartiendo al menos aproximadamente el 40 % al 50 %, aproximadamente el 60 % al 70 %, y aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % a 98 % de similitud de secuencia.

Las siguientes expresiones y términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia" y (e) "identidad sustancial". Tal como se utiliza en esta memoria, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de un ADNc o de una secuencia génica de longitud completa, o el ADNc o la secuencia génica de longitud completa.

Tal como se utiliza en esta memoria, "ventana de comparación" se refiere a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótidos, en donde la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineamiento óptimo de las dos secuencias. En general, la ventana de comparación es de al menos 20 nucleótidos contiguos de longitud y, opcionalmente, puede ser de 30, 40, 50, 100 o más larga. Los expertos en la técnica comprenderán que para evitar una similitud elevada con una secuencia de referencia debido a la inclusión de huecos en la secuencia de polinucleótidos, se introduce típicamente una penalización por hueco y se sustrae del número de coincidencias. Métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Por lo tanto, la determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias cualesquiera puede conseguirse utilizando un algoritmo matemático. Ejemplos no limitantes algoritmos matemáticos de este tipo son el algoritmo de Myers y Miller, (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de Smith, et al., (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de Needleman y Wunsch, (1970) J. Mol. Biol.

48: 443- 453; el algoritmo de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U<s a>872:264, modificado como en Karlin y Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.

Implementaciones informáticas de estos algoritmos matemáticos pueden utilizarse para comparar secuencias y determinar la identidad de secuencia. Implementaciones de este tipo incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics, Mountain View, Calif.); el programa ALIGN (Version 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el GCG Wisconsin Genetics Software Package®, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Calif., EE.UU.). Los alineamientos que utilizan estos programas pueden realizarse utilizando los parámetros predeterminados. El programa CLUSTAL está bien descrito por Higgins, et al., (1988) Gene 73:237-244; Higgins, et al., (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet, et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang, et al., (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson, et al., (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Al comparar secuencias de aminoácidos, con el programa ALIGN se puede utilizar una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Los programas BLAST de Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul, (1990) supra. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa BLASTN, con una puntuación = 100 y una longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la divulgación. Pueden realizarse búsquedas de proteínas de BLAST con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una proteína o polipéptido de la divulgación. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul, et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, puede utilizarse PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas. Véase, Altschul, et al., (1997) supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST o PSI-BLAST, se pueden utilizar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (p. ej., BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Véase el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica en la World Wide Web: ncbi.nlm.nih.gov. El alineamiento también puede realizarse manualmente por inspección.

Salvo que se indique de otro modo, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en esta memoria se refieren al valor obtenido utilizando GAP Versión 10 utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando un peso GAP de 50 y un peso de longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando un peso GAP de 8 y un peso de longitud de 2, y la matriz de puntuación BLOSUM62; o cualquier programa equivalente de los mismos. Tal como se utiliza en esta memoria, "programa equivalente" es cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualesquiera en cuestión, genera un alineamiento que tiene emparejamientos idénticos de nucleótidos o residuos de aminoácidos y un porcentaje de identidad de secuencia idéntico en comparación con el alineamiento correspondiente generado por GAP Versión 10.

El programa GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch, supra para encontrar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de huecos. GAP considera todos los posibles alineamientos y posiciones de huecos, y crea el alineamiento con el mayor número de bases coincidentes y el menor número de huecos. Permite aplicar una penalización por creación de huecos y una penalización por extensión de huecos en unidades de bases coincidentes. GAP debe obtener un beneficio del número de coincidencias de la penalización por creación de huecos por cada hueco insertado. Si se elige una penalización por extensión de huecos mayor que cero, GAP debe, además, obtener un beneficio por cada hueco insertado equivalente a la longitud del hueco multiplicada por la penalización por extensión de huecos. Los valores predeterminados de penalización por creación de huecos y de penalización por extensión de huecos en la Versión 10 del GCG Wisconsin Genetics Software Package® para secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente.

Para secuencias de nucleótidos, la penalización de creación de hueco predeterminada es 50, mientras que la penalización de extensión de hueco predeterminada es 3. Las penalizaciones de creación de huecos y extensión de huecos se pueden expresar como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consiste en 0 a 200. Por lo tanto, por ejemplo, las penalizaciones de creación de huecos y extensión de huecos pueden ser 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o mayores.

GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineamientos. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene una calidad superior. GAP muestra cuatro figuras de mérito para los alineamientos: Calidad, Razón, Identidad y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada con el fin de alinear las secuencias. Razón es la Calidad dividida por el número de bases en el segmento más corto. El Porcentaje de Identidad es el porcentaje de símbolos que realmente coinciden. El Porcentaje de Similitud es el porcentaje de símbolos que son similares. Los símbolos que están frente a los huecos se ignoran. Una similitud se puntúa cuando el valor de la matriz de puntuación para un par de símbolos es mayor que o igual a 0,50, el umbral de similitud. La matriz de puntuación utilizada en la Versión 10 del GCG Wisconsin Genetics Software Package® es BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).

Tal como se utiliza en esta memoria, "identidad de secuencia" o "identidad", en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una correspondencia máxima sobre una ventaja de comparación especificada. Cuando se utiliza el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticas a menudo difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas, en donde los residuos de aminoácidos están sustituidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (p. ej., carga o hidrofobia) y, por lo tanto, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia se puede ajustar al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren en dichas sustituciones conservativas tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los expertos en la técnica. Típicamente, esto implica puntuar una sustitución conservativa como un emparejamiento erróneo parcial en lugar de completo, aumentando de ese modo el porcentaje de identidad de secuencia. Por tanto, por ejemplo, en los casos en los que un aminoácido idéntico se le da una puntuación de uno y a una sustitución no conservativa se le da una puntuación de cero, a una sustitución conservativa se le da una puntuación entre cero y uno. La puntuación de sustituciones conservativas se calcula, p. ej., como se implementa en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif.).

Tal como se utiliza en esta memoria, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias alineadas de forma óptima sobre una ventana de comparación, en donde la parte de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base del ácido nucleico o el residuo aminoacídico idéntico en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia con al menos un 70 % de identidad de secuencia, óptimamente al menos un 80 %, más óptimamente al menos un 90 % y, lo más óptimamente, al menos un 95 %, en comparación con una secuencia de referencia utilizando un programa de alineamiento utilizando parámetros estándar. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores pueden ajustarse adecuadamente para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos considerando la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos y la posición del marco de lectura. Para estos fines, la identidad sustancial de secuencias de aminoácidos significa normalmente una identidad de secuencia de al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % y al menos un 95 %.

Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es si dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones rigurosas. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C inferiores a la Tm para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, las condiciones rigurosas abarcan temperaturas en el intervalo de aproximadamente 1 °C a aproximadamente 20 °C inferiores a la Tm, dependiendo del grado de rigurosidad deseado, como se califica en esta memoria. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones rigurosas siguen siendo sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto puede ocurrir, p. ej., cuando se crea una copia de un ácido nucleico utilizando la máxima degeneración de codones permitida por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es cuando el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico presenta reactividad cruzada inmunológica con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico.

Se pretende que "variantes" signifique secuencias sustancialmente similares. Para los polinucleótidos, las variantes conservativas incluyen las secuencias que, a causa de la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los genes morfogenéticos y/o genes/polinucleótidos de interés descritos en esta memoria. Los polinucleótidos variantes también incluyen polinucleótidos derivados sintéticamente tales como los generados, por ejemplo, utilizando mutagénesis dirigida, pero que aún codifican una proteína de un gen morfogenético y/o gen/polinucleótido de interés descrito en esta memoria. Generalmente, las variantes de un gen morfogenético y/o gen/polinucleótido de interés particular descrito en esta memoria tendrán al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con ese gen morfogenético y/o gen/polinucleótido de interés particular, según se determina por los programas de alineamiento de secuencias y los parámetros descritos en otra parte de esta memoria.

Se pretende que una proteína "variante" signifique una proteína derivada de la proteína nativa mediante la deleción o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios internos en la proteína nativa y/o la sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Las proteínas variantes abarcadas por la presente divulgación son biológicamente activas, es decir, continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, el polipéptido tiene actividad génica morfogénica y/o génica/polinucleotídica de interés. Variantes de este tipo pueden ser el resultado de, por ejemplo, polimorfismo genético o manipulación humana. Variantes biológicamente activas de un gen morfogenético nativo y/o gen/polinucleótido de la proteína de interés descritas en esta memoria tendrán al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa, según lo determinado por los programas de alineamiento de secuencias y los parámetros descritos en otras partes de esta memoria. Una variante biológicamente activa de una proteína de la divulgación puede diferir de esa proteína en tan poco como 1-15 residuos aminoacídicos, tal poco como 1-10, tal como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2 o incluso 1 residuo aminoacídico.

Las secuencias y genes descritos en esta memoria, así como variantes y fragmentos de los mismos, son útiles para la ingeniería genética de plantas, p. ej., para producir una planta transformada o transgénica para expresar un fenotipo de interés. Como se usa en esta memoria, las expresiones "planta transformada" y "planta transgénica" se refieren a una planta que comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. En general, el polinucleótido heterólogo está establemente integrado dentro del genoma de una planta transgénica o transformada de forma que el polinucleótido pase a generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo se puede integrar en el genoma solo o como parte de una construcción de ADN recombinante. Se debe entender que, tal como se utiliza en esta memoria, el término "transgénico" incluye cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte de planta o planta, cuyo genotipo ha sido alterado por la presencia de ácido nucleico heterólogo, que incluye los transgénicos inicialmente así alterados, así como los creados por cruces sexuales o propagación asexual del transgénico inicial.

Un "evento" transgénico se produce por la transformación de células vegetales con una construcción de ADN heteróloga, que incluye un casete de expresión de ácido nucleico que comprende un gen de interés, la regeneración de una población de plantas resultantes de la inserción del gen transferido en el genoma de la planta y la selección de una planta caracterizada por la inserción en una localización de genoma particular. Un evento se caracteriza fenotípicamente por la expresión del gen de interés. Al nivel genético, un evento es parte de la constitución genética de una planta. El término "evento" también se refiere a la progenie producida por un cruce sexual entre el transformante y otra planta en donde la progenie incluyen el ADN heterólogo.

Los protocolos de transformación, así como los protocolos de introducción de secuencias de nucleótidos en plantas, pueden variar dependiendo del tipo de planta o la célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, elegida para la transformación. Métodos adecuados para introducir secuencias de nucleótidos en células vegetales y su posterior inserción en el genoma vegetal incluyen la microinyección (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporation (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, transformación mediada por Agrobacterium (Townsend et al., Pat. de EE.UU. N° 5.563.055; Zhao et al., Pat. de EE.UU. N° 5.981.840), transferencia directa de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722) y aceleración de partículas balísticas (véase, por ejemplo, Sanford et al., Pat. de EE.UU. N° 4.945.050; Tomes et al., Pat. de EE.UU. N° 5.879.918; Tomes et al., Pat. de EE.UU. N° 5.886,244; Bidney et al., Pat. de EE.UU. N2 5.932.782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlin) (maíz); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926); y Lec1 transformation (documento WO 00/28058). Véase también Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen (1991) In Vitro Cell Dev Biol. 27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Tomes, Pat. de EE.UU. N° 5.240.855; Buising et al., Pat. de EE.UU. N°s 5.322.783 y 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol.

91:440-444 (maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311:763-764; Bowen et al., Pat. de EE.UU. N° 5.736.369 (cereales); Bytebier et al. (1987) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, Nueva York), pp. 197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por bigotes); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255; Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz a través de Agrobacterium tumefaciens); y número de publicación de solicitud de patente de EE.UU. 2017/0121722 (transformación rápida de plantas).

Los métodos descritos en esta memoria se basan en el uso de la transferencia génica mediada por bacterias y/o mediada por biolística para producir células vegetales regenerables con una secuencia de nucleótidos de interés incorporada. Cepas bacterianas útiles en los métodos de la divulgación incluyen, pero no se limitan aAgrobacteriadesarmada, una bacteriaOchrobactrumo una bacteriaRhizobiaceae.

Agrobacteriadesarmadas, útiles en los presentes métodos incluyen, pero no se limitan a, AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 y LBA4404 THY-.

Cepas bacterianas deOchrobactrumútiles en los presentes métodos incluyen, pero no se limitan a las enumeradas en la Tabla 2.

Tabla 2.

Cepas bacterianas deRhizobiaceaeútiles en los presentes métodos incluyen, pero no se limitan a las enumeradas en la Tabla 3 (véase también el documento US 9.365.859).

Tabla 3.

El polinucleótido de la divulgación se puede introducir en plantas poniendo en contacto las plantas con un virus o ácidos nucleicos víricos. En general, métodos de este tipo implican incorporar una construcción de nucleótido de la divulgación dentro de una molécula de ADN o ARN vírico. Los métodos de introducción de polinucleótidos en plantas y que expresan una proteína codificada en ellas, que implican ADN vírico o moléculas de ARN, se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Números 5.889.191,5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931 y Porta, et al., (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221.

Los métodos de la divulgación implican introducir un polipéptido o polinucleótido en una planta. "Introducir", tal como se utiliza en esta memoria, significa presentar a la planta el polinucleótido o polipéptido de tal forma que la secuencia obtenga acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la divulgación no dependen de un método particular de introducir una secuencia en una planta, sólo que el polinucleótido o los polipéptidos ganan acceso al interior de al menos una célula de la planta. Métodos para introducir un polinucleótido o polipéptidos en plantas son conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus.

Una "transformación estable" es una transformación en la que una construcción de nucleótido o un casete de expresión introducido en una planta se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredada por la progenie de la misma. "Transformación transitoria" significa que se introduce un polinucleótido o un casete de expresión en la planta y no se integra en el genoma de la planta o se introduce un polipéptido en una planta.

Genes reporteros o genes marcadores seleccionables también pueden incluirse en los casetes de expresión descritos en esta memoria y utilizarse en los métodos de la divulgación. Ejemplos de genes reporteros adecuados conocidos en la técnica se pueden encontrar, por ejemplo, en Jefferson, et al., (1991) en Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin, et al., (Kluwer Academic Publishers), pp. 1-33; DeWet, et al., (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725-737; Goff, et al., (1990) EMBO J. 9:2517-2522; Kain, et al., (1995) Bio Techniques 19:650-655 y Chiu, et al., (1996) Current Biology 6:325-330.

Un marcador de selección comprende un segmentos de ADN que permite identificar o seleccionar una o frente a una molécula o una célula que la contiene, a menudo en condiciones particulares. Estos marcadores pueden codificar una actividad, tal como, pero no limitada a producción de ARN, péptido o proteína, o pueden proporcionar un sitio de unión para ARN, péptidos, proteínas y compuestos o composiciones inorgánicos y orgánicos. Ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a segmentos de ADN que comprenden sitios de enzimas de restricción; segmentos de ADN que codifican productos que proporcionan resistencia contra compuestos de lo contrario tóxicos (p. ej., antibióticos, tales como espectinomicina, ampicilina, kanamicina, tetraciclina, Basta, neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT)); segmentos de ADN que codifican productos que, de lo contrario, están ausentes en la célula destinataria (p. ej., genes de ARNt, marcadores auxotróficos); segmentos de ADN que codifican productos que pueden identificarse fácilmente (p. ej., marcadores fenotípicos tales como p-galactosidasa, GUS; proteínas fluorescentes tales como proteína fluorescente verde (GFP), cian (CFP), amarilla (YFP), roja (RFP), y proteínas de la superficie celular); la generación de nuevos sitios de cebador para PCR (p. ej., la yuxtaposición de dos secuencias de ADN que no estaban yuxtapuestas previamente), la inclusión de secuencias de ADN que no actúan sobre o actúan mediante una endonucleasa de restricción u otra enzima modificadora de ADN, producto químico, etc.; y la inclusión de secuencias de ADN requeridas para una modificación específica (p. ej., metilación) que permite su identificación.

Los genes marcadores seleccionables para la selección de células o tejidos transformados pueden incluir genes que confieren resistencia a antibióticos o resistencia a herbicidas. Ejemplos de genes marcadores seleccionables adecuados incluyen, pero no se limitan a genes que codifican resistencia a cloranfenicol (Herrera Estrella, et al., (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella, et al., (1983) Nature 303:209-213; Meijer, et al., (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820); higromicina (Waldron, et al., (1985) Plant Mol. Biol. 5:103-108 y Zhijian, et al., (1995) Plant Science 108:219-227); estreptomicina (Jones, et al., (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard, et al., (1996) Transgenic Res.5:131-137); bleomicina (Hille, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-36); bromoxinilo (Stalker, et al., (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw, et al., (1986) Science 233:478-481 y las solicitudes de patente de EE.UU. Números de serie 10/004.357 y 10/427.692); fosfinotricina (DeBlock, et al., (1987) EMBO J. 6:2513-2518).

Marcadores seleccionables que confieren resistencia a compuestos herbicidas incluyen genes que codifican resistencia y/o tolerancia a compuestos herbicidas, tales como glifosato, sulfonilureas, glufosinato de amonio, bromoxinil, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Véase. en general, Yarranton, (1992) Curr. Opin. Biotech. 3;506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) en The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillen y Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591 -1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724.

Determinados marcadores seleccionables útiles en los presentes métodos incluyen, pero no se limitan a, el gen HRA de maíz (Lee et al., 1988, EMBO J 7:1241-1248) que confiere resistencia a sulfonilureas e imidazolinonas, el gen GAT que confiere resistencia a glifosato (Castle et al., 2004, Science 304:1151-1154), genes que confieren resistencia a espectinomicina tal como el gen aadA (Svab et al., 1990, Plant Mol Biol. 14:197-205) y el gen bar que confiere resistencia a glufosinato amonio (Whiteet al.,1990, Nucl. Acids Res. 25:1062), y PAT (o moPAT para el maíz, véase Rasco-Gaunt et al., 2003, Plant Cell Rep.21:569-76) y el gen PMI, que permite el crecimiento en un medio con manosa (Negrotto et al., 2000, Plant Cell Rep. 22:684-690), son muy útiles para la selección rápida durante el breve periodo que abarca la embriogénesis somática y la maduración embrionaria del método. Sin embargo, dependiendo del marcador de selección usado y el cultivo, endogámico o variedad que se esté transformando, puede variar el porcentaje de escapes de tipo silvestre. En maíz y sorgo, el gen HRA es eficaz en reducir la frecuencia de escapes de tipo salvaje.

Otros genes que podrían tener utilidad en la recuperación de eventos transgénicos incluirían, pero no se limitan a ejemplos tales como GUS (beta-glucuronidasa; Jefferson, (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387), GFP (proteína de fluorescencia verde; Chalfie, et al., (1994) Science 263:802), luciferasa (Riggs, et al., (1987) Nucleic Acids Res.

15(19):8115 y Luehrsen, et al., (1992) Methods Enzymol. 216:397-414), diversas proteínas fluorescentes con un espectro de óptimos de emisión alternativos que abarcan rojo lejano, rojo, naranja, amarillo, verde cian y azul (Shaner et al., 2005, Nature Methods 2:905-909) y los genes del maíz que codifican la producción de antocianina (Ludwig, et y al., (1990) Science 247:449).

La lista anterior de marcadores seleccionables no se entiende como limitante. Puede utilizarse cualquier marcador de selección en los métodos de la divulgación.

En un aspecto, los métodos de la divulgación proporcionan métodos de transformación que permiten una selección de crecimiento positivo. Un experto en la técnica puede apreciar que los métodos convencionales de transformación de plantas han dependido predominantemente de esquemas de selección negativa como se describe arriba, en que se utiliza un antibiótico o herbicida (un agente selectivo negativo) para inhibir o destruir células o tejidos no transformados, y las células o tejidos transgénicos siguen creciendo debido a la expresión de un gen de resistencia. En contraste, los métodos de la presente divulgación pueden utilizarse sin aplicación de un agente selectivo negativo. Por lo tanto, aunque las células de tipo salvaje pueden crecer sin impedimentos, en comparación, las células afectadas por la expresión controlada de un gen morfogenético pueden identificarse fácilmente debido a su tasa de crecimiento acelerada en relación con el tejido salvaje circundante. Además de simplemente observar un crecimiento más rápido, los métodos de la divulgación proporcionan células transgénicas que exhiben una morfogénesis más rápida en comparación con las células no transformadas. Por consiguiente, un crecimiento diferencial y desarrollo morfogenético de este tipo pueden utilizarse para distinguir fácilmente estructuras de plantas transgénicas del tejido no transformado circundante, un proceso que se denomina en esta memoria "selección de crecimiento positiva".

En esta memoria se describen métodos para producir plantas transgénicas con mayor eficiencia y velocidad, que proporcionan frecuencias de transformación significativamente mayores y eventos de mayor calidad (eventos que contienen una copia de un casete de expresión génica de rasgo sin estructura principal del vector (plásmido)) en múltiples líneas endogámicas utilizando una diversidad de tipos de tejido de partida, incluyendo líneas endogámicas transformadas que representan una gama de diversidades genéticas y tienen una utilidad comercial significativa. Los métodos descritos pueden comprender, además, polinucleótidos que proporcionan rasgos y características mejorados.

Tal como se utiliza en esta memoria, "rasgo" se refiere a una característica fisiológica, morfológica, bioquímica o física de una planta o material vegetal particular o célula. En algunos casos, esta característica es visible a simple vista, tal como tamaño de la semilla o la planta, o puede medirse por técnicas bioquímicas, tal como detectando el contenido de proteínas, almidón o aceite de la semilla u hojas, o por observación de un proceso metabólico o fisiológico, p. ej., midiendo la captación de dióxido de carbono, o por la observación del nivel de expresión de un gen o genes, p. ej., empleando análisis Northern, RT-PCR, ensayos de expresión génica en micromatriz o sistemas de expresión de genes reporteros, o por observaciones agrícolas tales como tolerancia a las agresiones, producción o tolerancia a patógenos.

Rasgos agronómicamente importantes tales como contenido de aceite, almidón y proteínas pueden alterarse genéticamente además de utilizando métodos de mejora vegetal tradicionales. Las modificaciones incluyen aumentar el contenido de ácido oleico, aceites saturados e insaturados, aumentar los niveles de lisina y azufre, proporcionar aminoácidos esenciales y también la modificación del almidón. Se describen modificaciones de la proteína hordotionina en las Pat. de EE.UU. N°s 5.703.049, 5.885.801,5.885.802 y 5.990.389. Otro ejemplo es la proteína de semilla rica en lisina y/o azufre codificada por la albúmina 2S de soja descrita en la Pat. de EE.UU. N° 5.850.016, y el inhibidor de quimotripsina de cebada, descrito en Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106.

Pueden prepararse derivados de las secuencias codificantes por mutagénesis dirigida al sitio para aumentar el nivel de aminoácidos preseleccionados en el polipéptido codificado. Por ejemplo, podrían utilizarse las proteínas vegetales ricas en metionina tales como de semillas de girasol (Lilley et al. (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs, ed. Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign, Ill.), pág. 497-502); maíz (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71:359); y arroz (Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123). Otros genes agronómicamente importantes codifican látex, Floury 2, factores de crecimiento, factores de almacenamiento en semillas y factores de transcripción.

Muchos rasgos agronómicos pueden afectar a la "producción" incluyendo, sin limitación, la altura de la planta, el número de vainas, la posición de las vainas en la planta, el número de internudos, la incidencia de desintegración de la vaina, el tamaño del grano, la eficacia de nodulación y fijación de nitrógeno, la eficacia de asimilación de nutrientes, la resistencia a agresión biótica y abiótica, la asimilación de carbono, la arquitectura de la planta, la resistencia a encamado, el porcentaje de germinación de las semillas, el vigor de las plántulas y rasgos juveniles. Otros rasgos que pueden afectar a la producción incluyen eficacia de germinación (incluyendo germinación en condiciones de agresión), tasa de crecimiento (incluyendo tasa de crecimiento en condiciones de agresión), número de espigas, número de semillas por espiga, tamaño de la semilla, composición de la semilla (almidón, aceite, proteínas) y características del llenado de la semilla. También es de interés la generación de plantas transgénicas que demuestran propiedades fenotípicas deseables que puedan conferir o no un aumento en la producción global de la planta. Propiedades de este tipo incluyen potenciación de la morfología de la planta, la fisiología de la planta o componentes mejorados de la semilla madura recogida de la planta transgénica.

La "producción incrementada" de una planta transgénica de la presente divulgación puede evidenciarse y medirse de varias maneras, incluyendo comprobación del peso, número de semillas por planta, peso de las semillas, número de semillas por área unitaria (es decir, semillas o peso de las semillas, por acre (4050 m2), fanegas por acre (4050 m2), toneladas por acre (4050 m2), kilogramos por hectárea. Por ejemplo, la producción de maíz puede medirse como la producción de granos de maíz con cáscara por unidad de área de producción, p. ej., en fanegas por acre (4050 m2) o toneladas métricas por hectárea, a menudo presentada en una base ajustada a la humedad, p. ej., a un 15,5 % de humedad. La producción incrementada puede ser el resultado de la utilización mejorada de compuestos bioquímicos clave, tales como nitrógeno, fósforo y carbohidratos, o de la tolerancia mejorada a las agresiones ambientales, tales como frío, calor, sequía, salinidad y ataque por plagas o patógenos. También puede utilizarse ADN recombinante potenciador de rasgos para proporcionar plantas transgénicas que tienen crecimiento y desarrollo mejorado y, finalmente, producción incrementada, como resultado de la expresión modificada de reguladores del crecimiento de la planta o la modificación del ciclo celular o las rutas de fotosíntesis.

Un "rasgo potenciado", tal como se utiliza al describir los aspectos de la presente divulgación, incluye eficacia del uso de agua o tolerancia a las sequías mejorada o potenciada, tolerancia a agresión osmótica, tolerancia a agresión por alta salinidad, tolerancia a agresión térmica, tolerancia potenciada al frío, incluyendo tolerancia a germinación en frío, producción aumentada, eficacia del uso de nitrógeno potenciada, crecimiento y desarrollo temprano de la planta, crecimiento y desarrollo de la planta tardío, contenido potenciado de proteínas en la planta y producción potenciada de aceite en las semillas.

Puede utilizarse cualquier polinucleótido de interés o gen de rasgo en los métodos de la divulgación. Diversos cambios en el fenotipo, impartidos por un gen de interés o un gen de rasgo, incluyen los que modifican la composición de ácidos grasos en una planta, alteran el contenido de aminoácidos, almidón o carbohidratos, alteran el mecanismo de defensa de una planta frente a patógenos, alteran el tamaño del grano y alteran la carga de sacarosa. El gen de interés o gen de rasgo también puede estar implicado en la regulación del flujo entrante de nutrientes, y en la regulación de la expresión de genes de fitato, particularmente para reducir los niveles de fitato en la semilla. Estos resultados pueden conseguirse proporcionando la expresión de productos heterólogos o la expresión incrementada de productos endógenos en las plantas. Como alternativa, los resultados pueden conseguirse proporcionando una reducción de la expresión de uno o más productos endógenos, particularmente enzimas o cofactores en la planta. Estos cambios provocan un cambio en el fenotipo de la planta transformada.

Tal como se utiliza en esta memoria, "gen de rasgo" significa un gen de interés que se ha de integrar en el genoma de la planta para producir una planta transgénica T0 fértil. Marcadores seleccionables tales como la acetolactato sintasa de alta resistencia (HRA, por sus siglas en inglés) y marcadores visuales tales como los genes de proteínas fluorescentes se utilizan en esta memoria a modo de ejemplo. Un gen de rasgo puede ser cualquier gen (o combinación de genes) que confiera un fenotipo agronómico, fisiológico, bioquímico o físico de valor añadido.

Genes de interés/de rasgo son un reflejo de los mercados comerciales y los intereses de los implicados en el desarrollo del cultivo. Los cultivos y mercados de interés cambian, y según se abren las naciones en desarrollo a los mercados mundiales, surgirán también nuevos cultivos y tecnologías. Además, a medida que aumenta la comprensión de los rasgos y características agronómicas tales como la producción y heterosis, la elección de genes y rasgos para su transformación cambiará en consecuencia. Categorías generales de secuencias de nucleótidos o genes de interés o genes de rasgo útiles en los métodos de la divulgación incluyen, por ejemplo, los genes implicados en la información, tales como los dedos de zinc, los implicados en la comunicación, tales como quinasas, y los implicados en el mantenimiento, tales como las proteínas de choque térmico. Categorías más específicas de transgenes, por ejemplo, incluyen genes que codifican rasgos importantes para la agronomía, la resistencia a insectos, la resistencia a enfermedades, la resistencia a herbicidas, la esterilidad, la resistencia al estrés ambiental (tolerancia alterada al frío, la sal, la sequía, etc.), las características del grano y los productos comerciales.

Secuencias codificantes heterólogas, polinucleótidos heterólogos y polinucleótidos de interés expresados por una secuencia de promotor transformada mediante los métodos descritos en esta memoria pueden utilizarse para modificar el fenotipo de una planta. Diversos cambios en el fenotipo son de interés, que incluyen modificar la expresión de un gen en una planta, alterar el mecanismo de defensa contra los patógenos o insectos de una plata, aumentar la tolerancia de una planta a herbicidas, alterar el desarrollo de la planta para responder al estrés medioambiental, modular la respuesta de la planta a las sales, la temperatura (calor y frío) y la sequía. Estos resultados se pueden lograr por la expresión de una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés que comprende un producto génico apropiado. En aspectos específicos, la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés es una secuencia de planta endógena cuyo nivel de expresión es elevado en la planta o parte de la planta. Los resultados se pueden lograr proporcionando la expresión alterada de uno o más productos de genes endógenos, particularmente hormonas, receptores, moléculas de señalización, enzimas, transportadores o cofactores, o afectando la captación en nutrientes de la planta. Estos cambios provocan un cambio en el fenotipo de la planta transformada. Todavía otras categorías de transgenes incluyen genes para inducir la expresión de productos exógenos, tales como enzimas, cofactores y hormonas de plantas y otros eucariotas, así como organismos procariotas.

Se reconoce que cualquier gen de interés, polinucleótido de interés, gen de rasgo o múltiples genes/polinucleótidos/rasgos de interés pueden enlazarse operativamente a un promotor o promotores y expresarse en una planta transformada por los métodos descritos en esta memoria, por ejemplo, genes de rasgos de resistencia a insectos que pueden apilarse con uno o más genes de rasgos de entrada adicionales (p. ej., resistencia a herbicidas, resistencia a hongos, resistencia a virus, tolerancia al estrés, resistencia a enfermedades, esterilidad masculina y fuerza del tallo) o genes de rasgos de salida (p. ej., rendimiento incrementado, almidones modificados, perfil de aceite mejorado, aminoácidos equilibrados, alto contenido de lisina o metionina, digestibilidad incrementada, calidad de fibra mejorada y resistencia a la sequía).

Un promotor puede enlazarse operativamente a genes de rasgos agronómicos importantes para su expresión en plantas transformadas mediante los métodos descritos en esta memoria que afectan a la calidad del grano, tales como los niveles (aumento del contenido de ácido oleico) y los tipos de aceites, saturados e insaturados, la calidad y cantidad de aminoácidos esenciales, niveles incrementados de lisina y azufre, niveles de celulosa y contenido de almidón y proteína. Un promotor puede enlazarse operativamente a genes de rasgos que proporcionan modificaciones de la proteína hordotionina para su expresión en plantas transformadas mediante los métodos descritos en esta memoria, que se describen en las patentes de EE.UU. Números 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802 y 5.703.049. Otro ejemplo de un gen de rasgo al que se puede enlazar operativamente un promotor para su expresión en plantas transformadas mediante los métodos descritos en esta memoria es una proteína de semilla rica en lisina y/o azufre codificada por la albúmina 2S de soja descrita en la patente de EE.UU. Número 5.850.016, y el inhibidor de quimotripsina de la cebada, Williamson, et al., (1987) Eur. J. Biochem 165:99-106.

Un promotor puede enlazarse operativamente a genes de rasgos de resistencia a insectos que codifican resistencia a plagas que tienen un impacto negativo en el rendimiento, tales como el gusano de la raíz, el gusano cortador y el barrenador europeo del maíz, para su expresión en plantas transformadas mediante los métodos descritos en esta memoria. Genes de este tipo incluyen, por ejemplo, genes de proteína tóxica de Bacillus thuringiensis, patentes de EE.UU. Números 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881 y Geiser et al., (1986) Gene 48:109. Los genes de rasgos que codifican rasgos de resistencia a enfermedades que pueden enlazarse operativamente a un promotor para su expresión en plantas transformadas mediante los métodos descritos en esta memoria incluyen, por ejemplo, genes de desintoxicación, como los que desintoxican fumonisina (patente de EE.UU. número 5.792.931); genes de avirulencia (avr) y resistencia a enfermedades (R) (Jones, et al., (1994) Science 266:789; Martin, et al., (1993) Science 262:1432; y Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089).

Genes de rasgos de resistencia a herbicidas que pueden enlazarse operativamente a un promotor para la expresión en plantas transformadas por los métodos descritos en esta memoria incluyen genes que codifican la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la acetolactato sintasa (ALS), en particular los herbicidas de tipo sulfonilurea (p. ej., el gen de la acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a una resistencia de este tipo, en particular las mutaciones S4 y/o Hra), genes que codifican la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la glutamina sintasa, tales como fosfinotricina o basta (p. ej., el gen bar), genes que codifican la resistencia al glifosato (p. ej., el gen EPSPS y el gen GAT; véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. Número 2004/0082770, documentos WO 03/092360 y W<o>05/012515) u otros genes de este tipo conocidos en la técnica. El gen bar codifica resistencia al herbicida basta, el gen nptII codifica resistencia a los antibióticos kanamicina y geneticina y los mutantes del gen ALS codifican resistencia al herbicida clorsulfurón, todos los cuales pueden enlazarse operativamente a un promotor para su expresión en plantas transformadas mediante los métodos descritos en esta memoria.

La resistencia al glifosato es impartida por genes mutantes de la 5-enolpiruvil-3-fosfiquimato sintasa (EPSPS) y aroA, que pueden enlazarse operativamente a un promotor para su expresión en plantas transformadas mediante los métodos descritos en esta memoria. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Número 4.940.835 expedida a Shah, et al., que describe la secuencia de nucleótidos de una forma de EPSPS que puede conferir resistencia a glifosato. La patente de EE.UU. Número 5.627.061 expedida a Barry et al. también describe genes que codifican enzimas EPSPS que pueden enlazarse operativamente a un promotor para su expresión en plantas transformadas mediante los métodos descritos en esta memoria. Véanse, por tanto, las patentes de EE.UU. Números 6.248.876 B1; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; Re. 36,449; RE 37,287 E y 5,491,288 y las publicaciones internacionales WO 97/04103; WO 97/04114; WO 00/66746; WO 01/66704; WO 00/66747 y WO 00/66748. La resistencia al glifosato también se imparte a las plantas que expresan un gen que puede enlazarse operativamente a un promotor para su expresión en plantas transformadas mediante los métodos descritos en esta memoria y que codifica una enzima glifosato oxido-reductasa, como se describe con más detalle en las patentes de EE.UU. Números 5.776.760 y 5.463.175. La resistencia al glifosato también puede impartirse a las plantas mediante la sobre-expresión de genes que pueden enlazarse operativamente a un promotor para su expresión en plantas transformadas mediante los métodos descritos en esta memoria que codifican la glifosato N-acetiltransferasa. Véanse, por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. Número de publicación 2004/0082770, documentos WO 03/092360 y WO 05/012515.

Los genes de esterilidad enlazados operativamente a un promotor para su expresión en plantas transformadas mediante los métodos descritos en esta memoria también pueden codificarse en una construcción de ADN y proporcionar una alternativa al despanojamiento físico. Ejemplos de genes utilizados de estas maneras incluyen genes con preferencia de tejido masculino y genes con fenotipos de esterilidad masculina tales como QM, descrito en la patente de EE.UU. Número 5.583.210. Otros genes que pueden enlazarse operativamente a un promotor para su expresión en plantas transformadas mediante los métodos descritos en esta memoria incluyen quinasas y los que codifican compuestos tóxicos para el desarrollo gametofítico, tanto masculino como femenino.

Los rasgos comerciales también pueden ser codificados por un gen o genes operativamente enlazados a un promotor para su expresión en plantas transformadas mediante los métodos descritos en esta memoria, lo que podría, por ejemplo, aumentar el almidón para la producción de etanol o proporcionar la expresión de proteínas. Otro uso comercial importante de las plantas transformadas es la producción de polímeros y productos bioplásticos, tal como se describe en la patente de EE.UU. Número 5.602.321. Genes tales como p-cetotiolasa, PHBase (polihidroxibutirato sintasa) y acetoacetil-CoA reductasa, que facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHAs), pueden estar operativamente enlazados a un promotor para su expresión en plantas transformadas mediante los métodos descritos en esta memoria (véase Schubert et al., (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847).

Ejemplos de otros genes de rasgos aplicables y su fenotipo asociado que pueden enlazarse operativamente a un promotor para su expresión en plantas transformadas por los métodos descritos en esta memoria incluyen genes que codifican proteínas de la cubierta viral y/o ARN, u otros genes virales o vegetales que confieren resistencia viral; genes que confieren resistencia fúngica; genes que fomentan mejoras en el rendimiento; y genes que proporcionan resistencia al estrés, tales como el frío, la deshidratación resultante de la sequía, el calor y la salinidad, o metales tóxicos o elementos traza.

A modo de ilustración, sin intención de ser limitante, la siguiente es una lista de otros ejemplos de los tipos de genes de rasgos que pueden enlazarse operativamente a un promotor para su expresión en plantas transformadas por los métodos descritos en esta memoria.

1. Genes de Rasgos Que Confieren Resistencia A Insectos O Enfermedad Y Que Codifican:

(A) Genes de resistencia a enfermedades de las plantas. Las defensas de las plantas son frecuentemente activadas por la interacción específica entre el producto de un gen de resistencia (R) a enfermedad en la planta y el producto de un gen de avirulencia (Avr) correspondiente en el patógeno. Una variedad de planta puede transformarse con un gen de resistencia clonado para manipular genéticamente plantas que son resistentes a cepas de patógenos específicas. Véanse, por ejemplo, Jones, et al., (1994) Science 266:789 (clonación del gen de tomate Cf-9 para la resistencia a Cladosporium fulvum); Martin, et al., (1993) Science 262:1432 (gen Pto de tomate para la resistencia a Pseudomonas syringae pv. tomato codifica una proteína quinasa); Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089 (gen RSP2 de Arabidopsis para resistencia a Pseudomonas syringae); McDowell y Woffenden, (2003) Trends Biotechnol. 21 (4):178-83 y Toyoda, et al., (2002) Transgenic Res. 11 (6):567-82. Una planta resistente a una enfermedad es una que es más resistente a un patógeno en comparación con la planta de tipo salvaje.

(B) Una proteína de Bacillus thuringiensis, un derivado de la misma o un polipéptido sintético modelado en la misma. Véanse, por ejemplo, Geiser, et al., (1986) Gene 48:109, que describen la clonación y la secuencia de nucleótidos de un gen de delta-endotoxina de Bt. Además, pueden adquirirse moléculas de ADN que codifican genes de delta-endotoxina en la American Type Culture Collection (Rockville, MD), por ejemplo, con los Números de Acceso ATCC 40098, 67136, 31995 y 31998. Otros ejemplos de transgenes de Bacillus thuringiensis que están manipulados genéticamente se dan en las siguientes patentes y solicitudes de patente: Patentes de EE.UU.

Números 5.188.960; 5.689.052; 5.880.275; WO 91/14778; WO 99/31248; WO 01/12731; WO 99/24581; WO 97/40162 y Solicitudes de EE.UU. Números de Serie 10/032.717; 10/414.637 y 10/606.320.

(C) Una hormona o feromona específica de insectos, tal como un ecdisteroide y hormona juvenil, una variante de las mismas, un mimético basado en ellas, o un antagonista o agonista de las mismas. Véase, por ejemplo, la divulgación por Hammock, et al., (1990) Nature 344:458, de la expresión en baculovirus de esterasa de hormona juvenil clonada, un inactivador de la hormona juvenil.

(D) Un péptido específico de insectos que, tras la expresión, altera la fisiología de la plaga afectada. Por ejemplo, véanse las divulgaciones de Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269:9 (la clonación de expresión produce a Dn que codifica el receptor de la hormona diurética de insectos); Pratt, et al., (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm.

163:1243 (se identifica una alostatina en Diploptera puntata); Chattopadhyay, et al., (2004) Critical Reviews in Microbiology 30(1):33-54; Zjawiony, (2004) J Nat Prod 67(2):300-310; Carlini y Grossi-de-Sa, (2002) Toxicon 40(11 ):1515-1539; Ussuf, et al., (2001) Curr Sci. 80(7):847-853 y Vasconcelos y Oliveira, (2004) Toxicon 44(4):385-403. Véase también la patente de EE.UU. Número 5.266.317 expedida a Tomalski, et al., que describe genes que codifican toxinas específicas de insectos.

(E) Una enzima responsable de una hiperacumulación de un monterpeno, un sesquiterpeno, un esteroide, ácido hidroxámico, un derivado fenilpropanoide u otra molécula no proteína con actividad insecticida.

(F) Una enzima implicada en la modificación, que incluye la modificación postraduccional, de una molécula biológicamente activa; por ejemplo, una enzima glicolítica, una enzima proteolítica, un enzima lipolítica, una nucleasa, una ciclasa, una transaminasa, una esterasa, una hidrolasa, una fosfatasa, una quinasa, una fosforilasa, una polimerasa, una elastasa, una quitinasa y una glucanasa, tanto natural como sintética. Véase la solicitud PCT Número WO 93/02197 a nombre de Scott, et al., que describe la secuencia de nucleótidos de un gen callasa. Moléculas de ADN que contienen secuencias codificantes de quitinasa se pueden obtener, por ejemplo, de la ATCC con los Números de Acceso 39637 y 67152. Véase también Kramer, et al., (1993) Insect Biochem. Molec. Biol.

23:691, que enseñan la secuencia de nucleótidos de un ADNc que codifica la quitina del anquilostoma del tabaco, y Kawalleck et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:673, que proporciona la secuencia de nucleótidos del gen ubi4-2 poliubiquitina de perejil, solicitudes de patente de EE.UU. Números de Serie 10/389.432, 10/692.367 y la patente de EE.UU. Número 6.563.020.

(G) Una molécula que estimula la transducción de señales. Por ejemplo, véase la divulgación por Botella, et al., (1994) Plant Molec. Biol. 24:757, de secuencias de nucleótidos de clones de ADNc de calmodulina de judía mungo, y Griess, et al., (1994) Plant Physiol. 104:1467, quienes proporcionan la secuencia de nucleótidos de un clon de ADNc de calmodulina de maíz.

(H) Un péptido de momento hidrófobo. Véase la solicitud PCT Número WO 95/16776 y la patente de EE.UU. Número 5.580.852 (divulgación de derivados peptídicos de taquiplesina que inhiben los patógenos fúngicos de las plantas) y la solicitud PCT Número WO 95/18855 y la patente de EE.UU. Número 5.607.914) (enseña péptidos antimicrobianos sintéticos que confieren resistencia a enfermedades).

(I) Una permeasa de membrana, un formador de canales o un bloqueante de canales. Por ejemplo, véase la divulgación por Jaynes, et al., (1993) Plant Sci. 89:43, de expresión heteróloga de un análogo del péptido lítico cecropina-beta para hacer que las plantas de tabaco transgénicas sean resistentes a Pseudomonas solanacearum.

(J) Una proteína invasiva viral o una toxina compleja derivada de la misma. Por ejemplo, la acumulación de proteínas de la cubierta vírica en células vegetales transformadas confiere resistencia a infección vírica y/o desarrollo de enfermedad provocada por el virus del que deriva el gen de la proteína de la cubierta, así como por virus relacionados. Véase Beachy, et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451. Se ha conferido resistencia mediada por proteínas de la cubierta a plantas transformadas contra el virus del mosaico de la alfalfa, el virus del mosaico del pepino, el virus del veteado del tabaco, el virus X de la patata, el virus Y de la patata, el virus del grabado del tabaco, el virus del traqueteo del tabaco y el virus del mosaico del tabaco. Id.

(K) Un anticuerpo específico de insecto o una inmunotoxina derivada de los mismos. Por lo tanto, un anticuerpo dirigido hacia una función metabólica crítica en el intestino del insecto inactivaría una enzima afectada, matando el insecto. Véase Taylor, et al., Resumen N.2497, SEVENTH INT'L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS (Edimburgo, Escocia, 1994) (inactivación enzimática en el tabaco transgénico por producción de fragmentos de anticuerpos monocatenarios).

(L) Un anticuerpo específico de virus. Véase, por ejemplo, Tavladoraki, et al., (1993) Nature 366:469, que muestra que las plantas transgénicas que expresan genes de anticuerpo recombinante se protegen del ataque por virus.

(M) Una proteína que detiene el desarrollo producido en la naturaleza por un patógeno o un parásito. Por lo tanto, las endo alfa-1,4-D-poligalacturonasas fúngicas facilitan la colonización fúngica y la liberación de nutrientes de la planta solubilizando la homo-alfa-1,4-D-galacturonasa de la pared de las células de la planta. Véase, Lamb, et al., (1992) Bio/Technology 10:1436. La clonación y la caracterización de un gen que codifica una proteína inhibidora de la endopoligalacturonas de judía se describe por Toubart, et al., (1992) Plant J. 2:367.

(N) Una proteína que detiene el desarrollo producido en la naturaleza por una planta. Por ejemplo, Logemann, et al., (1992) Bio/Technology 10:305, han demostrado que plantas transgénicas que expresan el gen inactivante del ribosoma de cebada tienen una resistencia incrementada a la enfermedad fúngica.

(O) Genes implicados en la respuesta a resistencia adquirida sistémica (SAR) y/o los genes relacionados con la patogénesis. Briggs, (1995) Current Biology 5(2): 128-131, Pieterse y Van Loon, (2004) Curr. Opin. Plant Bio.

7(4):456-64 y Somssich, (2003) Cell 113(7):815-6.

(P) Genes antifúngicos (Cornelissen y Melchers, (1993) Pl. Physiol. 101:709-712 y Parijs, et al., (1991) Plant 183:258-264 y Bushnell, et al., (1998) Can. J. of Plant Path. 20(2): 137-149. Véase también la solicitud de patente de EE.UU. Número 09/950.933.

(Q) Genes de desintoxicación, tales como para fumonisina, beauvericina, moniliformina y zearalenona y sus derivados estructuralmente relacionados. Por ejemplo, véase, la patente de EE.UU. Número 5.792,931.

(R) Inhibidores de la cistatina y cisteína proteinasa. Véase la solicitud de EE.UU. número de serie 10/947.979.

(S) Genes defensina. Véanse el documento de patente WO03/000863 y la solicitud de EE.UU. de Número de Serie 10/178.213.

(T) Genes que confieren resistencia a nematodos. Véanse el documento de patente WO 03/033651 y Urwin, et. al., (1998) Plant 204:472-479, Williamson (1999) Curr Opin Plant Bio. 2(4):327-31.

(U) Genes tales como rcg1 que confieren resistencia a la pudrición del tallo por antracnosis, que es provocada por el hongo Colletotrichum graminiola. Véanse Jung, et al., Generation-means analysis and quantitative trait locus mapping of Anthracnose Stalk Rot genes in Maize, Theor. Appl. Genet. (1994) 89:413-418, así como la solicitud de patente provisional de EE.UU. Número 60/675.664.

2. Genes de Rasgos Que Confieren Resistencia A Un Herbicida, Por Ejemplo:

(A) Un herbicida que inhibe el punto de crecimiento o meristemo, tal como una imidazolinona o una sulfonilurea. Genes ejemplares en esta categoría codifican la enzima ALS y AHAS mutante como se describe, por ejemplo, por Lee, et al., (1988) EMBO J. 7:1241 y Miki, et al., (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449, respectivamente. Véanse también las patentes de EE.UU. Números 5.605.011; 5.013.659; 5.141.870; 5.767.361; 5.731.180; 5.304.732; 4.761.373; 5.331.107; 5.928.937 y 5.378.824 y la publicación internacional WO 96/33270.

(B) Glifosato (resistencia impartida por los genes 5-enolpiruvil-3-fosfikimato sintasa (EPSP) mutante y aroA, respectivamente) y otros compuestos de fosfono, tales como glufosinato (genes de fosfinotricina acetil transferasa (PAT) y fosfinotricina acetil transferasa de Streptomyces hygroscopicus (bar)) y ácidos piridinoxi o fenoxi propriónicos y ciclohexonas (genes que codifican un inhibidor de ACCasa). Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Número 4.940.835 expedida a Shah, et al., que describe la secuencia de nucleótidos de una forma de EPSPS que puede conferir resistencia a glifosato. La patente de EE.UU. Número 5.627.061 expedida a Barry et al. también describe genes que codifican enzimas EPSPS. Véanse, por tanto, las patentes de EE.UU. Números 6.566.587; 6.338.961; 6.248.876 B1; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; Re. 36.449; RE 37.287 E y 5.491.288 y las publicaciones internacionales EP1173580; WO 01/66704; EP1173581 y EP1173582. La resistencia al glifosato también es impartida a plantas que expresan un gen que codifica una enzima oxido-reductasa de glifosato, como se describe más completamente en las patentes de EE.UU. Números 5.776.760 y 5.463.175. Además, puede impartirse resistencia al glifosato a plantas mediante la sobre expresión de genes que codifican la glifosato N-acetiltransferasa. Véanse, por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. Número de publicación 2004/0082770, documentos WO 03/092360 y Wo 05/012515. Una molécula de ADN que codifica un gen aroA mutante puede obtenerse con el Número de Acceso a la ATCC 39256, y la secuencia de nucleótidos del gen mutante se describe en la patente de Estados Unidos Número 4.769.061 expedida a Comai. La solicitud de patente EP Número 0333033 expedida a Kumada, et al., y la patente de EE.UU. Número 4.975.374 expedida a Goodman et al. describe secuencias de nucleótidos de genes glutamina sintetasa que confieren resistencia a herbicidas, tales como L-fosfinotricina. La secuencia de nucleótidos de un gen fosfinotricin-acetiltransferasa se proporciona en las patentes EP Números 0242 246 y 0242 236 expedidas a Leemans et al., De Greef, et al., (1989) Bio/Technology 7 :61 que describen la producción de plantas transgénicas que expresan genes bar quiméricos que codifican la actividad de fosfinotricina acetil transferasa. Véanse también, las patentes de EE.UU. Números 5.969.213; 5.489.520; 5.550.318; 5.874.265; 5.919.675; 5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 6.177.616 B1 y 5.879.903. Genes a modo de ejemplo que confieren resistencia a ácidos fenoxipropriónicos y cicloshexonas, tales como setoxidim y haloxifop, son los genes Acc1 -S1, Acc1 -S2 y Acc1 -S3 descritos por Marshall, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435.

(C) Un herbicida que inhibe la fotosíntesis, tal como una triazina (genes psbA y gs+) y un benzonitrilo (gen nitrilasa). Przibilla, et al., (1991) Plant Cell 3:169, describen la transformación de Chlamydomonas con plásmidos que codifican genes psbA mutantes. Las secuencias de nucleótidos para genes nitrilasa se describen en la patente de EE.UU. Número 4.810.648 expedida a Stalker, y las moléculas de ADN que contienen estos genes están disponibles bajo los Números de Acceso ATCC 53435, 67441 y 67442. La clonación y la expresión de ADN que codifica una glutatión S-transferasa se describen por Hayes, et al., (1992) Biochem. J. 285:173.

(D) Acetohidroxiácido sintasa, que se ha encontrado que hace que las plantas que expresan esta enzima sean resistentes a múltiples tipos de herbicidas, se ha introducido en una variedad de plantas (véase, por ejemplo, Hattori, et al., (1995) Mol Gen Genet 246:419). Otros genes que confieren resistencia a herbicidas incluyen: un gen que codifica una proteína quimérica de citocromo de rata P4507A1 y NADPH de levadura-citocromo P450 oxidorreductasa (Shiota, et al., (1994) Plant Physiol. 106(1 ):17-23), genes para glutatión reductasa y superóxido dismutasa (Aono, et al., (1995) Plant Cell Physiol 36:1687 y genes para diversas fosfotransferasas (Datta, et al., (1992) Plant Mol Biol 20:619).

(E) La protoporfirinógeno oxidasa (protox) es necesaria para la producción de clorofila, que es necesaria para la supervivencia de toda la planta. La enzima protox sirve de diana para una variedad de compuestos herbicidas. Estos herbicidas también inhiben el crecimiento de todas las especies diferentes de plantas presentes, causando su destrucción total. El desarrollo de plantas que contienen actividad de protox alterada que son resistentes a estos herbicidas se describe en las patentes de EE. UU. número 6.288.306 B1; 6.282.837 B1 y 5.767.373; y la publicación internacional número WO 01/12825.

3. Transgenes Que Confieren O Contribuyen A Una Característica De Grano Alterada, Tales Como:

(A) Ácidos grasos alterados, por ejemplo, por

(1) Regulación negativa de la estearoil-ACP desaturasa para aumentar el contenido de ácido esteárico de la planta. Véase Knultzon, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2624 y el documento WO99/64579 (Genes for Desaturases to Alter Lipid Profiles in Corn),

(2) Elevación del ácido oleico por la modificación del gen FAD-2 y/o disminución del ácido linolénico por la modificación del gen FAD-3 (véanse las patentes de EE.UU. Números 6.063.947; 6.323.392; 6.372.965 y el documento WO 93/11245),

(3) Alteración del contenido de ácido linolénico o linoleico conjugado, tal como en el documento WO 01/12800,

(4) Alteración de LEC1, AGP, Dek1, Superal1, mi1ps, diversos genes lpa, tales como lpa1, lpa3, hpt o hggt. Por ejemplo, véanse los documentos W<o>02/42424, WO 98/22604, WO 03/011015, la patente de EE.UU. Número 6.423.886, la patente de EE.UU. Número 6.197.561, la patente de EE.UU. Número 6.825.397, las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. Números 2003/0079247, 2003/0204870, WO02/057439, WO03/011015 y Rivera-Madrid, et. al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:5620-5624.

(B) Contenido de fósforo alterado, por ejemplo, por la

(1) Introducción de un gen que codifica fitasa se potenciaría la degradación de fitato, que añade más fosfato libre a la planta transformada. Por ejemplo, véase, Van Hartingsveldt, et al., (1993) Gene 127:87, para una divulgación de la secuencia de nucleótidos de un gen de fitasa de Aspergillus niger.

(2) Regulación positiva de un gen que reduce el contenido de fitato. En maíz, esto se podría llevar a cabo, por ejemplo, clonando y luego re-introduciendo el ADN asociado a uno o más de los alelos, tales como los alelos LPA, identificados en mutantes de maíz caracterizados por bajos niveles de ácido fítico, tales como en Raboy, et al., (1990) Maydica 35:383 y/o alterando la actividad de inositol quinasa como en el documento WO 02/059324, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. Número 2003/0009011, documento WO 03/027243, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. Número 2003/0079247, documento W<o>99/05298, la patente de EE.UU. Número 6.197.561, la patente de EE.UU. Número 6.291.224, la patente de EE. UU. Número 6.391.348, el documento WO2002/059324, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. Número 2003/0079247, los documentos WO98/45448, WO99/55882, WO01/04147.

(C) La alteración de hidratos de carbono se efectuó, por ejemplo, alterando un gen para una enzima que afecta el patrón de ramificación del almidón o un gen que altera la tiorredoxina, tal como NTR y/o TRX (véase la patente de EE.UU. Número 6.531.648) y/o una inactivación de gamma zaína o mutante tal como cs27 o TUSC27 o en27 (véase la patente de EE.UU. Número 6.858.778 y las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. Números 2005/0160488 y 2005/0204418). Véanse Shiroza, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:810 (secuencia de nucleótidos del gen de fructosiltransferasa de Streptococcus mutans), Steinmetz et al., (1985) Mol. Gen. Genet. 200:220 (secuencia de nucleótidos del gen levansucrasa de Bacillus subtilis), Pen, et al., (1992) Bio/Technology 10:292 (producción de plantas transgénicas que expresan alfa-amilasa de Bacillus licheniformis), Elliot, et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:515 (secuencias de nucleótidos de genes de invertasa de tomate), S0gaard, et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:22480 (mutagénesis dirigida al sitio del gen alfa-amilasa de cebada) y Fisher, et al., (1993) Plant Physiol. 102:1045 (enzima II de ramificación de almidón de endosperma de maíz), documento WO 99/10498 (digestibilidad mejorada y/o extracción de almidón mediante la modificación de UDP-D-xilosa 4-epimerasa, frágil 1 y 2, Ref1, HCHL, C4H), patente de EE.UU. Número 6.232.529 (método de producción de semillas de alto contenido en aceite por modificación de niveles de almidón (AGP)). Los genes de modificación de ácido graso arriba mencionados también se pueden utilizar para afectar el contenido de almidón y/o la composición a través de la interrelación de las vías de almidón y de aceite.

(D) Alteración del contenido o la composición de antioxidantes, tal como la alteración de tocoferol o tocotrienoles. Por ejemplo, véase la patente de EE. UU. número 6.787.683, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. número 2004/0034886 y el documento de patente WO 00/68393 que implican la manipulación de niveles de antioxidante mediante la alteración de una fitil prenil transferasa (ppt), el documento de patente WO 03/082899 mediante la alteración de una homogentisato geranil transferasa (hggt).

(E) Alteración de aminoácidos esenciales en semillas. Por ejemplo, véanse la patente de EE.UU. Número 6.127.600 (método de aumento de la acumulación de aminoácidos esenciales en semillas), la patente de EE.UU. Número 6.080.913 (métodos binarios de aumento de la acumulación de aminoácidos esenciales en semillas), la patente de EE.UU. Número 5.990.389 (alta lisina), los documentos WO99/40209 (alteración de las composiciones de aminoácido en semillas), WO99/29882 (métodos de alteración del contenido en aminoácidos de las proteínas), la patente de EE.UU. Número 5.850.016 (alteración de las composiciones de aminoácidos en semillas), documento WO98/20133 (proteínas con niveles potenciados de aminoácidos esenciales), patente de EE.UU. Número 5.885.802 (alto contenido en metionina), patente de EE.UU. Número 5.885.801 (alto contenido en treonina), patente de EE.UU. Número 6.664.445 (enzimas biosintéticas de aminoácidos de plantas), patente de EE.UU. Número 6.459.019 (alto contenido en lisina y treonina), patente de EE.UU. Número 6.441.274 (subunidad beta de la triptófano sintasa de planta), patente de EE.UU. Número 6.346.403 (enzimas metabólicas de metionina), patente de EE.UU. Número 5.939.599 (alto contenido en azufre), patente de EE.UU. Número 5.912,414 (alto contenido en metionina), documento WO98/56935 (enzimas biosintéticas de aminoácidos de plantas), documento WO98/45458 (proteína de semilla manipulada genéticamente que tiene mayor porcentaje de aminoácidos esenciales), documento WO98/42831 (alto contenido en lisina), patente de EE.UU. Número 5.633.436 (aumento del contenido de aminoácidos de azufre), patente de EE.UU. Número 5.559.223 (proteínas de almacenamiento sintético con estructura definida que contienen niveles programables de aminoácidos esenciales para mejorar el valor nutritivo de las plantas), documentos WO96/01905 (alto contenido en treonina), WO95/15392 (alto contenido en lisina), publicación de solicitud de patente de EE.UU. Número 2003/0163838, publicación de solicitud de patente de EE.UU. número 2003/0150014, publicación de solicitud de patente de EE.UU. Número 2004/0068767, patente de EE.UU. Número 6.803.498, documentos WO01/79516 y WO00/09706 (Ces A: celulosa sintasa), patente de EE.UU. Número 6.194.638 (hemicelulosa), patente de e E.UU. Número 6.399.859 y publicación de solicitud de patente de EE.UU. número 2004/0025203 (UDPGdH), patente de EE.UU. Número 6.194.638 (RGP).

Se pueden incluir genes adicionales en los casetes de expresión útiles en los métodos descritos en esta memoria. Ejemplos no limitantes incluyen:

A. Genes que crean un sitio para la integración de ADN específica del sitio.

Esto incluye la introducción de sitios de FRT que pueden utilizarse en el sistema FLP/FRT y/o sitios Lox que pueden utilizarse en el sistema Cre/Loxp. Por ejemplo, véase Lyznik, et al., (2003) Plant Cell Rep 21:925-932 y el documento WO 99/25821. Otros sistemas que se pueden utilizar incluyen la recombinase Gin de fago Mu (Maeser, et al., 1991; Vicki Chandler, The Maize Handbook cap. 118 (Springer-Verlag 1994), la recombinasa Pin de E. coli (Enomoto, et al., 1983) y el sistema R/RS del plásmido pSR1 (Araki, et al., 1992).

B. Genes que afectan la resistencia al estrés abiótico (que incluyen, pero no se limitan a florecimiento, desarrollo de espigas y semillas, potenciamiento de la eficiencia de utilización de nitrógeno, alteración de la sensibilidad al nitrógeno, resistencia o tolerancia a la sequía, resistencia o tolerancia al frío y resistencia o tolerancia a la sal) y elevado rendimiento bajo estrés. Por ejemplo, véase el documento WO 00/73475, en que la eficiencia de uso del agua se altera mediante la alteración de malato; la patente de EE.UU. Número 5.892.009, la patente de EE.UU. Número 5.965.705, la patente de EE.UU. Número 5.929.305, la patente de EE.UU. Número 5.891.859, la patente de EE.UU. Número 6.417.428, la patente de EE.UU. Número 6.664.446, la patente de EE.UU. Número 6.706.866, la patente de EE.UU. Número 6.717.034, los documentos WO2000060089, WO2001026459, WO2001035725, WO2001034726, WO2001035727, WO2001036444, WO2001036597, WO2001036598, WO2002015675, WO2002017430, WO2002077185, WO2002079403, WO2003013227, WO2003013228, WO2003014327, WO2004031349, WO2004076638, WO9809521 y WO9938977 que describen genes, que incluye genes CBF y factores de transcripción eficaces en mitigar los efectos negativos de la congelación, la alta salinidad y la sequía en plantas, así como que confieren otros efectos positivos sobre el fenotipo de las plantas; la publicación de solicitud de patente de EE.UU. Número 2004/0148654 y el documento WO01/36596 en que se altera el ácido abscísico en las plantas, dando como resultado una mejora en el fenotipo de la planta, tal como un elevado rendimiento y/o una elevada tolerancia al estrés abiótico; documentos WO2000/006341, WO04/090143, la solicitud de patente de EE.UU. Número de serie 10/817483 y la patente de EE.UU. Número 6.992.237, en que la expresión de citoquinina se modifica dando como resultado plantas con elevada tolerancia al estrés, tal como tolerancia a la sequía y/o rendimiento incrementado. Véanse también los documentos WO0202776, WO2003052063, JP2002281975, la patente de EE.UU. Número 6.084.153, documento WO0164898, la patente de EE.UU. Número 6.177.275 y la patente de EE.UU. Número 6.107.547 (potenciamiento de la utilización de nitrógeno y alteración de la sensibilidad al nitrógeno). Para la alteración de etileno, véase la publicación de solicitud de patente de EE.UU. Número 2004/0128719, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. Número 2003/0166197 y el documento WO200032761. Para factores de transcripción o reguladores de la transcripción de plantas de estrés abiótico, véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. número 2004/0098764 o la publicación de solicitud de patente de EE. UU. número 2004/0078852.

C. Otros genes y factores de transcripción que afectan el crecimiento de las plantas y los rasgos agronómicos, tales como el rendimiento, la floración, el crecimiento de la planta y/o la estructura de la planta, se pueden introducir o introgresar en las plantas, véanse, p. ej., los documentos WO97/49811 (LHY), WO98/56918 (ESD4), WO97/10339 y la patente de EE.UU. Número 6.573.430 (TFL), la patente de EE.UU. Número 6.713.663 (FT), los documentos WO96/14414 (CON), WO96/38560, WO01/21822 (VRN1), WO00/44918 (VRN2), WO99/49064 (GI), WO00/46358 (FRI), WO97/29123, la patente de EE.UU. Número 6.794.560, la patente de EE.UU. Número 6.307.126 (GAI), el documento WO99/09174 (D8 y Rht) y los documentos WO2004076638 y WO2004031349 (factores de transcripción).

Tal como se utiliza en esta memoria, "orientación antisentido" incluye la referencia a una secuencia polinucleotídica que está enlazada operativamente a un promotor en una orientación en que se transcribe la cadena antisentido. La cadena antisentido es suficientemente complementaria a un producto de transcripción endógeno, de modo que la traducción del producto de transcripción endógeno a menudo se inhibe. "Enlazado operativamente" se refiere a la asociación de dos o más fragmentos de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico, de modo que la función de uno se ve afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está enlazado operativamente con una secuencia codificante cuando es capaz de afectar a la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes pueden enlazarse operativamente a secuencias reguladoras en orientación de sentido o de antisentido.

Una secuencia de nucleótidos heteróloga enlazada operativamente a un promotor y sus fragmentos o variantes biológicamente activos relacionados, útiles en los métodos descritos en esta memoria, puede ser una secuencia antisentido para un gen fijado como objetivo. La terminología "secuencia de nucleótidos de ADN antisentido" pretende significar una secuencia con orientación inversa a la orientación normal 5'-a-3' de esa secuencia de nucleótidos. Al administrarse en una célula vegetal, la expresión de la secuencia de ADN antisentido impide la expresión normal de la secuencia de nucleótidos de ADN del gen fijado como objetivo. La secuencia de nucleótidos antisentido codifica una transcripción de ARN que es complementario y capaz de hibridarse con el ARN mensajero (ARNm) endógeno producido por la transcripción de la secuencia de nucleótidos de ADN del gen fijado como objetivo. En este caso, se inhibe la producción de la proteína nativa codificada por el gen fijado como objetivo para lograr una respuesta fenotípica deseada. Se pueden realizar modificaciones de las secuencias antisentido siempre que hibriden con el ARNm correspondiente e interfieran con su expresión. De esta manera, se pueden utilizar construcciones antisentido con una identidad de secuencia del 70 %, 80 %, 85 % con las secuencias antisentido correspondientes. Además, se pueden utilizar porciones de los nucleótidos antisentido para interrumpir la expresión del gen diana. Generalmente, se pueden utilizar secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos o 200 nucleótidos o mayores. Por lo tanto, un promotor puede enlazarse operativamente a secuencias de ADN antisentido para reducir o inhibir la expresión de una proteína nativa en la planta cuando se transforma mediante los métodos descritos en esta memoria.

"ARNi" se refiere a una serie de técnicas relacionadas para reducir la expresión de genes (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Número 6.506.559). Se cree que técnicas más antiguas, conocidas con otros nombres, se basan en el mismo mecanismo, pero reciben nombres diferentes en la bibliografía. Estas incluyen "inhibición antisentido", la producción de transcripciones de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína diana y la "co-supresión" o "supresión sentido", que se refieren a la producción de transcripciones sentido de ARN capaces de suprimir la expresión de genes extraños o endógenos idénticos o sustancialmente similares (patente de EE.UU. Número 5.231.020). Técnicas de este tipo se basan en el uso de construcciones que dan como resultado la acumulación de ARN de doble cadena con una cadena complementaria al gen diana a silenciar.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "promotor" o la expresión "región de iniciación transcripcional" significan una región reguladora del ADN que comprende habitualmente una caja TATA o una secuencia de ADN capaz de dirigir a la ARN polimerasa II para que inicie la síntesis de ARN en el sitio de inicio de la transcripción apropiado para una secuencia codificante específica. Un promotor puede comprender, además, otras secuencias de reconocimiento, generalmente situadas aguas arriba o en 5' respecto a la caja TATA o a la secuencia de ADN capaz de dirigir a la ARN polimerasa II para que inicie la síntesis de ARN, denominadas elementos promotores aguas arriba, que influyen en la tasa de inicio de la transcripción.

La región de inicio transcripcional, el promotor, puede ser natural u homólogo o exógeno o heterólogo al huésped, o podría ser la secuencia natural o una secuencia sintética. Por exógeno se pretende que la región de inicio transcripcional no se encuentre en el huésped de tipo salvaje en que se introduce la región de inicio transcripcional. Puede utilizarse un promotor nativo o heterólogo con respecto a la secuencia codificante de interés.

El casete transcripcional (expresión) incluirá, en la dirección 5'-3' de transcripción, una región de inicio de la transcripción y la traducción, una secuencia de ADN de interés/gen de rasgo y una región de terminación de la transcripción y la traducción funcional en plantas. La región de terminación puede ser nativa con la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN de interés, o se puede derivar de otra fuente. Están disponibles regiones de terminación convenientes del gen inhibidor de la proteinasa de la patata (PinII) o secuencias del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de la nopalina sintasa, la octopina sintasa y la opalina sintasa. Véase también, Guerineau et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas et al. 1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.

Los casetes de expresión pueden contener adicionalmente secuencias conductoras 5' en la construcción del casete de expresión. Secuencias coinductoras de este tipo pueden actuar potenciando la traducción. Los conductores de la traducción son conocidos en la técnica e incluyen: conductores de picornavirus, por ejemplo, conductor de EMCV (región no codificante 5' del virus de la encefalomiocarditis) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R., y Moss, B. (1989) PNAS USA, 86: 6126-6130); conductores de potyvirus, por ejemplo, conductor de TEV (virus del grabado del tabaco) (Allison et al. (1986); conductor de MDM<v>(virus del mosaico enano del maíz); Virology, 154: 9-20), y proteína de unión de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana (BiP), (Macejak, D. G., y P. Sarnow (1991) Nature, 353: 90-94); conductor no traducido de la proteína de la cubierta MARNA del virus del mosaico de la alfalfa (ARN 4 de AMV), (Jobling, S. A., y Gehrke, L., (1987) Nature, 325: 622-625; líder del virus del mosaico del tabaco (TMV), (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of Rn A, páginas 237-256, Gallie et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15: 3257 3273; conductor del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lornmel, S. A. et al. (1991) Virology, 81: 382 385). Véase también, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology, 84: 965-968; y secuencias no traducidas 5' del maíz endógenas. También se pueden utilizar otros métodos conocidos para potenciar la traducción y para potenciar la estabilidad del ARNm, por ejemplo, intrones, tales como el intrón de la ubiquitina del maíz (Christensen y Quail, (1996) Transgenic Res. 5:213-218; Christensen, et al., (1992) Plant Molecular Biology 18:675-689) o el intrón AdhI de maíz (Kyozuka, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 228:40-48; Kyozuka, et al., (1990) Maydica 35:353-357).

Los casetes de expresión pueden contener uno o más de un gen o secuencia de ácido nucleico a transferir y expresar en la planta transformada. Por tanto, cada secuencia de ácido nucleico se unirá de forma funcional a secuencias reguladoras 5' y 3'. Como alternativa, pueden proporcionarse múltiples casetes de expresión.

En la preparación de los casetes de expresión útiles en los métodos de la divulgación, los diversos fragmentos de ADN pueden manipularse para proporcionar las secuencias de ADN en la orientación apropiada y, según sea apropiado, en el marco de lectura apropiado. Para este fin, se pueden emplear adaptadores o enlazadores para unir los fragmentos de ADN, u otras manipulaciones pueden estar implicadas para proporcionar sitios de restricción convenientes, retirada de ADN superfluo o retirada de sitios de restricción. Para este fin, se puede implicar a la mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, restricción, reasociación, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones.

Los genes morfogenéticos y/o genes de rasgos/polinucleótidos de interés introducidos en un explante mediante los métodos descritos pueden enlazarse operativamente a un promotor adecuado. Un "promotor vegetal" es un promotor capaz de iniciar la transcripción en células vegetales sea su origen o no de una célula vegetal. Promotores vegetales ejemplares incluyen, pero no se limitan a los que se obtienen de plantas, virus de plantas y bacterias que comprenden genes expresados en células vegetales tales como de Agrobacterium o Rhizobium. Ejemplos de promotores bajo el control del desarrollo incluyen promotores que inician la transcripción preferentemente en determinados tejidos, tales como hojas, raíces o semillas. Promotores de este tipo se denominan "con preferencia de tejido". Los promotores que inician la transcripción solamente en determinados tejidos se denominan "específicos de tejido". Un promotor específico de "tipo de célula" dirige principalmente la expresión en determinados tipos de células en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares en raíces u hojas. Promotores específicos de tejido, con preferencia de tejido, específicos de tipo celular e inducibles constituyen la clase de promotores "no constitutivos".

Un promotor "inducible" o "reprimible" puede ser un promotor que está bajo control ambiental o exógeno. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar a la transcripción por promotores inducibles incluyen condiciones anaerobias, o determinados productos químicos, o la presencia de luz. Como alternativa, el control exógeno de un promotor inducible o reprimible puede lograrse proporcionando un producto químico adecuado u otro agente que, mediante interacción con polipéptidos diana, provoca la inducción o represión del promotor. Los promotores inducibles incluyen promotores inducibles por calor, promotores sensibles al estradiol y promotores inducibles por sustancias químicas. Los promotores inducibles por patógenos incluyen los de proteínas relacionadas con patogénesis (proteínas PR), que se inducen después de infección por un patógeno; por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanasa, quitinasa, etc. Véase, por ejemplo, Redolfi, et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol.

89: 245-254; Uknes et al. (1992) The Plant Cell 4: 645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4: 111-116. Promotores inducibles útiles en los presentes métodos incluyen los promotores GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A y XVE.

Un promotor químicamente inducible puede ser reprimido por el represor de tetraciclina (TETR), el represor de etametsulfurón (ESR) o el represor de clorsulfurón (CSR), y la desrepresión ocurre tras la adición de ligandos relacionados con la tetraciclina o sulfonilurea. El represor puede ser TETR y el ligando relacionado con tetraciclina es doxiciclina o anhidrotetraciclina. (Gatz, C., Frohberg, C. y Wendenburg, R. (1992) Stringent repression and homogeneous de-repression by tetracycline of a modified CaMV 35S promoter in intact transgenic tobacco plants, Plant J. 2, 397-404). Alternativamente, el represor puede ser ESR y el ligando de sulfonilurea es etametsulfurón, clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, nicosulfurón, primisulfurón, tribenurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, foramsulfurón, yodosulfurón, prosulfurón, tifensulfurón, rimsulfurón, mesosulfurón o halosulfurón (documento US20110287936). Si el represor es CSR, el ligando de CSR es clorsulfurón. Véase, la patente de EE.UU. N28.580.556.

Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de circunstancias. Promotores útiles en la presente divulgación incluyen los descritos en el documento WO2017/112006 y en la solicitud provisional de EE.UU. 62/562.663. Promotores constitutivos para uso en la expresión de genes en plantas son conocidos en la técnica. Promotores de este tipo incluyen, perro no se limitan a el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Depicker et al. (1982) Mol. Appl. Genet. 1 : 561-573; Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812), promotor de la ubiquitina (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689), promotores de genes tales como la ribulosa bisfosfato carboxilasa (De Almeida et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 218: 78-98), actina (McElroy et al. (1990) Plant J. 2: 163-171), histona y DnaJ (Baszczynski et al. (1997) Maydica 42: 189-201). En diversos aspectos, promotores constitutivos útiles en los métodos de la divulgación incluyen promotores UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT 1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1.2 KB), IN2-2, NOS, la versión -135 de 35S y ZM-ADF PRO (ALT2).

Promotores útiles en la presente divulgación, enumerados en la Tabla 4 que figura a continuación, incluyen los descritos en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. Número 2017/0121722 y la Patente de EE.UU. Número 8.710.206.

Tabla 4.

En la Tabla 5 que figura a continuación se enumeran promotores adicionales útiles en los métodos de la divulgación.

Tabla 5.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "elemento regulador" también se refiere a una secuencia de ADN, habitualmente, aunque no siempre, aguas arriba (5') de la secuencia codificante de un gen estructural, que incluye secuencias que controlan la expresión de la región codificante al proporcionar el reconocimiento de la ARN polimerasa y/u otros factores necesarios para el inicio de la transcripción en un sitio específico. Un ejemplo de un elemento regulador que proporciona el reconocimiento de la ARN polimerasa u otros factores transcripcionales para asegurar la iniciación en un sitio específico es un elemento promotor. Un elemento promotor comprende un elemento promotor central, responsable del inicio de la transcripción, así como otros elementos reguladores que modifican la expresión génica. Debe entenderse que las secuencias de nucleótidos, situadas dentro de los intrones o en el extremo 3' de la secuencia de la región codificante, también pueden contribuir a la regulación de la expresión de una región codificante de interés. Ejemplos de intrones adecuados incluyen, pero no se limitan a, intrón IVS6 del maíz, o el intrón de actina del maíz. Un elemento regulador también puede incluir los elementos localizados aguas abajo (3') con respecto al sitio de iniciación de la transcripción, o dentro de regiones transcritas, o ambos. En el contexto de los métodos de la divulgación, un elemento regulador postranscripcional puede incluir elementos que se activan tras el inicio de la transcripción, por ejemplo, potenciadores de la traducción y la transcripción, represores de la traducción y la transcripción, y determinantes de estabilidad del ARNm.

Una "secuencia de nucleótidos heteróloga", "polinucleótido heterólogo de interés", "polinucleótido heterólogo" o "gen de rasgo heterólogo", según se utiliza en la divulgación, es una secuencia que no se encuentra de forma natural con un promotor ni está operativamente enlazada a un promotor. Si bien esta secuencia de nucleótidos o gen de rasgo es heterólogo respecto a la secuencia del promotor, puede ser homóloga o nativa o heteróloga o ajena al huésped vegetal. Asimismo, la secuencia del promotor puede ser homóloga o nativa o heteróloga o ajena al huésped vegetal y/o al polinucleótido de interés.

Las construcciones de ADN/casetes de expresión útiles en los métodos de la divulgación también pueden incluir potenciadores adicionales, ya sean potenciadores de la traducción o de la transcripción, según sea necesario. Estas regiones potenciadoras son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden incluir el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. El codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante para asegurar la traducción de toda la secuencia. Las señales de control de la traducción y los codones de iniciación pueden tener diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. Las regiones de inicio de la traducción pueden proporcionarse de la fuente de la región de inicio de la transcripción o del gen estructural. La secuencia también se puede derivar del elemento regulador seleccionado para expresar el gen y puede modificarse específicamente para aumentar la traducción del ARNm. Se reconoce que para aumentar los niveles de transcripción, se pueden utilizar potenciadores en combinación con regiones promotoras. Se reconoce que para aumentar los niveles de transcripción, se pueden utilizar potenciadores en combinación con regiones promotoras. Los potenciadores son secuencias de nucleótidos que actúan para aumentar la expresión de una región promotora. Los potenciadores son conocidos en la técnica e incluyen la región potenciadora SV40 y el elemento potenciador 35S. También se sabe que algunos potenciadores alteran los patrones normales de expresión del promotor, por ejemplo, provocando que un promotor se exprese constitutivamente cuando, sin el potenciador, éste se expresa sólo en un tejido específico o en unos pocos tejidos específicos. En la Tabla 6 que figura a continuación se describen potenciadores útiles en los métodos de la divulgación.

Tabla 6.

En general, un "promotor débil" significa un promotor que impulsa la expresión de una secuencia codificante a un bajo nivel. Un "bajo nivel" de expresión pretende significar la expresión a niveles de aproximadamente 1/10.000 transcripciones a aproximadamente 1/100.000 transcripciones a aproximadamente 1/500.000 transcripciones. En cambio, un promotor fuerte impulsa la expresión de una secuencia codificante a un alto nivel, o a aproximadamente 1/10 transcripciones a aproximadamente 1/100 transcripciones a aproximadamente 1/ 1.000 transcripciones.

Se reconoce que las secuencias útiles en los métodos de la divulgación pueden utilizarse con sus secuencias codificantes nativas, resultando con ello un cambio en el fenotipo de la planta transformada. Los genes morfogenéticos y los genes de interés descritos en esta memoria, así como variantes y fragmentos de los mismos, son útiles en los métodos de la divulgación para la manipulación genética de cualquier planta. La expresión "enlazado operativamente" significa que la transcripción o traducción de una secuencia de nucleótidos heteróloga se realiza bajo la influencia de una secuencia promotora.

En un aspecto de la divulgación, los casetes de expresión comprenden una región de inicio de la transcripción, o variantes o fragmentos de la misma, operativamente enlazados a un gen morfogenético y/o a una secuencia de nucleótidos heteróloga. Casetes de expresión de este tipo se pueden proporcionar con una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia de nucleótidos esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. El casete de expresión puede contener adicionalmente genes marcadores seleccionables, así como regiones de terminación en 3'.

El casete de expresión puede incluir, en la dirección 5'-3' de transcripción, una región de inicio de la transcripción (es decir, un promotor o variante o fragmento del mismo), una región de inicio de la traducción, un gen morfogénico y/o una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, una región de terminación de la traducción y, opcionalmente, una región de terminación de la transcripción funcional en el organismo huésped. Las regiones reguladoras (es decir, promotores, regiones reguladoras de la transcripción y regiones de terminación de la traducción), el gen morfogenético y/o el polinucleótido de interés, útiles en los métodos de la divulgación, pueden ser nativos/análogos de la célula huésped o entre sí. Alternativamente, las regiones reguladoras, el gen morfogenético y/o el polinucleótido de interés pueden ser heterólogos a la célula huésped o entre sí. Como se usa en el presente documento, "heterólogo" en referencia a una secuencia es una secuencia que se origina a partir de una especie extraña o, si es de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma nativa en composición y/o locus genómico por intervención humana intencionada. Por ejemplo, un promotor operativamente enlazado a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente de la especie de la que derivó el polinucleótido o, si es de la misma especie/análoga, uno o ambos se modifican sustancialmente de su forma original y/o locus genómico o el promotor no es el promotor nativo para el polinucleótido operativamente enlazado.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con el gen morfogenético operativamente enlazado y/o puede ser nativa con la secuencia de ADN operativamente enlazada de interés, puede ser nativa con la planta huésped, o puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga al promotor, el gen morfogenético y/o la secuencia de ADN que se expresa, la planta huésped, o cualquier combinación de los mismos). Están disponibles regiones de terminación convenientes del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Véase también Guerineau, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot, (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon, et al., (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe, et al., (1990) Gene 91:151-158; Ballas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi, et al., (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

El casete de expresión que comprende un promotor enlazado operativamente a un gen morfogenético y/u opcionalmente enlazado operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga, un polinucleótido heterólogo de interés, un nucleótido de polinucleótido heterólogo, una secuencia de interés o un gen de rasgo, puede utilizarse para transformar cualquier planta. Alternativamente, un polinucleótido heterólogo de interés, un nucleótido de polinucleótido heterólogo, una secuencia de interés o un gen de rasgo enlazado operativamente a un promotor puede estar en un casete de expresión separado, situado fuera del ADN de transferencia (ADN-T). De este modo, se pueden obtener plantas genéticamente modificadas, células vegetales, tejido vegetal, semilla y raíz. El casete de expresión que comprende las secuencias de la presente divulgación también puede contener al menos una secuencia de nucleótidos adicional para un gen, una secuencia de nucleótidos heteróloga, un polinucleótido heterólogo de interés o un polinucleótido heterólogo que se co-transformará en el organismo. Alternativamente, se pueden proporcionar secuencia(s) adicional(es) en otro casete de expresión.

Cuando corresponda, las secuencias de nucleótidos/genes de rasgos cuya expresión se controlará mediante una secuencia promotora y cualquier secuencia de nucleótidos adicional pueden optimizarse para aumentar su expresión en la planta transformada. Es decir, estas secuencias de nucleótidos se pueden sintetizar usando codones preferidos por las plantas para expresión mejorada. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri, (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para una discusión del uso de codones preferidos por el huésped. Están disponibles en la técnica métodos de síntesis de genes preferidos de planta. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Números 5.380.831 y 5.436.391 y Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.

Se conocen modificaciones de secuencia adicionales para potenciar la expresión génica en un huésped celular. Estas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación falsas, señales de sitios de corte y empalme de exones-intrones, repeticiones de tipo transposón y otras de dichas secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresión génica. El contenido de G-C de una secuencia de nucleótidos heteróloga se puede ajustar a niveles promedio para un huésped celular dado, como se calcula como referencia con genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando sea posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm de horquilla secundaria predichas.

Tal como se utiliza en esta memoria, "vector" se refiere a una molécula de ADN, como un plásmido, un cósmido o un fago bacteriano, para introducir una construcción de nucleótidos, por ejemplo, un casete de expresión, en una célula huésped. Los vectores de clonación contienen típicamente uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción donde se pueden insertar secuencias de ADN foráneas de forma determinable sin pérdida de la función biológica esencial del vector, así como un gen marcador que es adecuado para la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores incluyen típicamente genes que proporcionan resistencia a la tetraciclina, resistencia a la higromicina o resistencia a la ampicilina.

Las células que se han transformado pueden hacerse crecer en plantas de acuerdo con maneras convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick, et al., (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Entonces se pueden cultivar estas plantas, y o polinizarse con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y la descendencia resultante que tiene expresión de la característica fenotípica deseada identificada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene de forma estable y se hereda y después pueden recogerse las semillas para garantizar que se ha conseguido la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, se describe en esta memoria una semilla transformada (también denominada "semilla transgénica") que tiene una construcción de nucleótidos útil en los métodos de la divulgación, por ejemplo, un casete de expresión útil en los métodos de la divulgación, incorporado de forma estable en su genoma.

Hay una variedad de métodos para la regeneración de plantas a partir de tejido de planta. El método de regeneración particular dependerá del tejido de planta de partida y de la especie de planta particular a regenerar. La regeneración, el desarrollo y el cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplastos de plantas o a partir de diversos explantes transformados se conoce bien en la técnica (Weissbach y Weissbach, (1988) en: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.). Este proceso de regeneración y crecimiento incluye típicamente las etapas de selección de células transformadas, cultivo de las células individualizadas a través de las fases usuales de desarrollo embrionario a través del estadio de plántula enraizada. Los embriones transgénicos y las semillas se regeneran similarmente. Los brotes enraizados transgénicos resultantes se plantan a partir de aquí en un medio de crecimiento de plantas apropiado, tal como tierra. Preferentemente, las plantas regeneradas se autopolinizan proporcionando plantas transgénicas homocigóticas. De otro modo, el polen obtenido de la planta regenerada se cruza con plantas crecidas a partir de líneas agronómicamente importantes. En cambio, el polen de plantas de estas líneas importantes se usa para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica, producida mediante los métodos de la divulgación que contiene un polinucleótido deseado de interés se cultiva utilizando métodos bien conocidos por un experto en la técnica.

Se conocen en la técnica métodos para la inserción fijada como objetivo de un polinucleótido en una ubicación específica en el genoma de la planta. La inserción del polinucleótido en una ubicación genómica deseada se consigue utilizando un sistema de recombinación específico de sitio. Véanse, por ejemplo, los documentos de patente WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 y WO99/25853. En resumen, un polinucleótido de interés, flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos, puede estar contenido en un casete de transferencia de ADN-T. El casete de transferencia de ADN-T se introduce en una planta que ha incorporado de forma estable en su genoma un sitio diana que está flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos que corresponden a los sitios del casete de transferencia. Se proporciona una recombinasa apropiada y el casete de transferencia se integra en el sitio diana. El polinucleótido de interés se integra de ese modo en una posición cromosómica específica en el genoma de la planta.

Los métodos descritos pueden utilizarse para introducir en explantes polinucleótidos útiles para fijar como objetivo un sitio específico para su modificación en el genoma de una planta derivada del explante. Modificaciones específicas para el sitio que pueden introducirse con los métodos y las composiciones descritas incluyen las producidas utilizando cualquier método para introducir una modificación específica del sitio incluyendo, pero no limitadas a mediante el uso de oligonucleótidos de reparación génica (p. ej., publicación de EE.UU. 2013/0019349), o mediante el uso de tecnologías de rotura de doble cadena tales como TALENs, meganucleasas, nucleasas de dedos de cinc y CRISPR-Cas. Por ejemplo, los métodos descritos pueden utilizarse para introducir un sistema de CRISPR-Cas en una célula vegetal o planta, con fines de modificación genómica de una secuencia diana en el genoma de una planta o célula vegetal, para seleccionar plantas, para eliminar una base o una secuencia, para edición génica y para insertar un polinucleótido de interés en el genoma de una planta o célula vegetal. Por lo tanto, los métodos descritos pueden utilizarse conjuntamente con un sistema de CRISPR-Cas para proporcionar un sistema eficaz para modificar o alterar sitios diana y nucleótidos de interés dentro del genoma de una planta, célula vegetal o semilla. El gen de la endonucleasa Cas es una endonucleasa Cas9 optimizada para plantas, en el que la endonucleasa Cas9 optimizada para plantas es capaz de unirse a y crear una rotura de doble cadena en una secuencia diana genómica del genoma de la planta.

La endonucleasa Cas es guiada mediante el nucleótido guía para reconocer e introducir opcionalmente una rotura de doble cadena en un sitio diana específico en el genoma de una célula. El sistema de CRISPR-Cas proporciona un sistema eficaz para modificar sitios diana dentro del genoma de una planta, célula vegetal o semilla. Se describen, además, métodos que emplean un sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas para proporcionar un sistema eficaz para modificar sitios diana dentro del genoma de una célula y para editar una secuencia de nucleótidos en el genoma de una célula. Una vez identificado el sitio diana genómico, puede emplearse una diversidad de métodos para modificar adicionalmente los sitios diana, de modo que contienen una diversidad de polinucleótidos de interés. Lo métodos descritos pueden utilizarse para introducir un sistema de CRISPR-Cas para editar una secuencia de nucleótidos en el genoma de una célula. La secuencia de nucleótidos a editar (la secuencia de nucleótidos de interés) puede ubicarse dentro o fuera de un sitio diana que es reconocido por una endonucleasa Cas.

Los loci de CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas intercaladas de forma regular) (también conocidos como SPIDR-repeticiones directas intercaladas SPacer) constituyen una familia de loci de ADN recientemente descritos. Los loci de CRISPR consisten en repeticiones de ADN cortas y muy conservadas (típicamente de 24 a 40 pb, repetidas de 1 a 140 veces - también denominadas repeticiones CRISPR) que son parcialmente palindrómicas. Las secuencias repetidas (habitualmente específicas para una especie) están intercaladas por secuencias variables de longitud constante (típicamente de 20 a 58 dependiendo del locus CRISPR (documento WO2007/025097, publicado el 1 de marzo de 2007).

Los loci de CRISPR se reconocieron en primer lugar en E. coli (Ishino et al. (1987) J. Bacterial. 169:5429-5433; Nakata et al. (1989) J. Bacterial. 171:3553-3556). Se han identificado repeticiones de secuencia cortas intercaladas similares en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (Groenen et al. (1993) Mol. Microbiol. 10:1057-1065; Hoe et al. (1999) Emerg. Infect. Dis. 5:254-263; Masepohl et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30; Mojica et al. (1995) Mol. Microbiol. 17:85-93). Los locus de CRISPR difieren de otras SSR en la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones espaciadas de forma regular cortas (SRSR) (Janssenet al.(2002) OM iCs J. Integ. Biol. 6:23-33; Mojicaet al.(2000) Mol. Microbiol.

36:244-246). Las repeticiones son elementos cortos que aparecen en grupos, que siempre están espaciados de forma regular por secuencias variables de longitud constante (Mojicaet al.(2000) Mol. Microbiol. 36:244-246).

El gen Cas incluye un gen que está generalmente acoplado, asociado o cerca de, o en las cercanías de locus de CRISPR flanqueantes. Las expresiones "gen Cas" y "gen (Cas) asociado a CRISPR" se usan indistintamente en este documento. Se presenta una revisión extensa de la familia de la proteína Cas en Haftet al.(2005) Computational Biology, PLoS Comput Biol 1 (6): e60. doi:10.1371 / journal.pcbi.0010060.

Además de las cuatro familias de genes descritas inicialmente, se han descrito 41 familias de genes (Cas) asociadas a CRISPR adicionales en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. Número 2015/0059010. Esta referencia muestra que los sistemas de CRISPR pertenecen a clases diferentes, con diferentes patrones de repetición, conjuntos de genes e intervalos de especie. El número de genes Cas en un locus CRISPR dado puede variar entre especies. La endonucleasa Cas se refiere a una proteína Cas codificada por un gen Cas, en la que la proteína Cas puede introducir una rotura de doble cadena en una secuencia diana de ADN. La endonucleasa Cas es guiada mediante el polinucleótido guía para reconocer e introducir opcionalmente una rotura de doble cadena en un sitio diana específico en el genoma de una célula. Como se usa en este documento, la expresión "sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas" incluye un complejo de una endonucleasa Cas y un polinucleótido guía que puede introducir una rotura bicatenaria en una secuencia diana de ADN. La endonucleasa Cas desenrolla el ADN de doble cadena en cercana proximidad al sitio diana genómico y escinde ambas cadenas de ADN tras el reconocimiento de una secuencia diana mediante un nucleótido guía, pero solamente si el motivo adyacente de protoespaciador (PAM) correcto está orientado aproximadamente en el extremo 3' de la secuencia diana (véase la FIG. 2A y la FIG. 2B de la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. Número 2015/0059010.

En un aspecto, el gen de la endonucleasa Cas es una endonucleasa Cas9, tal como, pero no limitado a genes Cas9 enumerados en SEQ ID NOs: 462, 474, 489, 494, 499, 505 y 518 del documento WO2007/025097, publicado el 1 de marzo de 2007. En otro aspecto, el gen de la endonucleasa Cas es endonucleasa Cas9 optimizada para plantas, maíz o soja, tal como, pero no limitado a las mostradas en la FIG. 1A de la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. Número 2015/0059010.

En otro aspecto, el gen de la endonucleasa Cas está unido de forma funcional a una señal de dirección nuclear de SV40 en dirección 5' de la región de codones de Cas y una señal de localización nuclear VirD2 bipartita (Tinland et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7442-6) en dirección 3' de la región de codones de Cas.

En un aspecto, el gen de la endonucleasa Cas es un gen de la endonucleasa Cas9 de SEQ ID NO: 1, 124, 212, 213, 214, 215, 216, 193 o nucleótidos 2037-6329 de SEQ ID NO: 5, o cualquier fragmento funcional o variante del mismo, de la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. Número 2015/0059010.

En relación con la endonucleasa Cas, las expresiones "fragmento funcional", "fragmento que es funcionalmente equivalente" y "fragmento funcionalmente equivalente" se utilizan indistintamente en esta memoria. Estas expresiones se refieren a una parte o subsecuencia de la secuencia de la endonucleasa Cas en la que se retiene la capacidad de crear una rotura de doble cadena.

En relación con la endonucleasa Cas, las expresiones "variante funcional", "variante que es funcionalmente equivalente" y "variante funcionalmente equivalente" se utilizan indistintamente en esta memoria. Estas expresiones se refieren a una variante de la endonucleasa Cas en que se retiene la capacidad de crear una rotura de doble cadena. Los fragmentos y variantes pueden obtenerse mediante métodos tales como mutagénesis dirigida al sitio y construcción sintética.

En un aspecto, el gen de la endonucleasa Cas es un gen Cas9 de Streptococcus pyogenes optimizado en codones para plantas que reconocen cualquier secuencia genómica de la forma N(12-30)NGG que, en principio, puede ser fijada como objetivo.

Las endonucleasas son enzimas que escinden el enlace fosfodiéster dentro de una cadena polinucleotídica, e incluyen endonucleasas de restricción que escinden ADN en sitios específicos sin dañar las bases. Las endonucleasas de restricción incluyen endonucleasas de Tipo I, Tipo II, Tipo III y Tipo IV que, además, incluyen subtipos. En los sistemas de Tipo I y Tipo III, están contenidas tanto la actividad metilasa como la actividad de restricción en un solo complejo. Las endonucleasas también incluyen meganucleasas, también conocidas como endonucleasas de asentamiento (HEasas), que como las endonucleasas de restricción, se unen y cortan en un sitio de reconocimiento específico, sin embargo, los sitios de reconocimiento para las meganucleasas son típicamente más largos, de aproximadamente 18 pb o más (solicitud de patente PCT/US 12/30061 presentada el 22 de marzo de 2012). Las meganucleasas se han clasificado en cuatro familias basadas en los motivos de secuencia conservados, las familias son las familias de las cajas LAGLIDADG, GIY-YIG, H-N-H e His-Cys. Estos motivos participan en la coordinación de iones metálicos e hidrólisis de enlaces fosfodiéster. Las meganucleasas son destacables por sus sitios de reconocimiento largos, y por tolerar algunos polimorfismos de secuencia en sus sustratos de ADN. La convención de nomenclatura para las meganucleasas es similar a la convención para otras endonucleasas de restricción. Las meganucleasas también se caracterizan por el prefijo F-, I- o PI- para enzimas codificadas por ORF independientes, intrones e inteínas, respectivamente. Una etapa en el proceso de reconocimiento implica la escisión polinucleotídica en o cerca del sitio de reconocimiento. Esta actividad de escisión puede usarse para producir una rotura de doble cadena. Para revisiones de recombinasas específicas de sitio y sus sitios de reconocimiento, véase, Sauer (1994) Curr Op Biotechnol 5:521-7; y Sadowski (1993) FASEB 7:760-7. En algunos ejemplos, la recombinasa es de las familias integrasa o resolvasa. Las nucleasas efectoras TAL son una clase nueva de nucleasas específicas para la secuencia que pueden utilizarse para generar roturas de doble cadena en secuencias diana específicas en el genoma de una planta u otro organismo. (Miller, et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143-148). Las nucleasas con dedos de zinc (ZFN) son agentes que inducen roturas de doble cadena manipuladas genéticamente que comprenden un dominio de unión al ADN de tipo dedos de zinc y un dominio de un agente inductor de rotura de doble cadena. La especificidad por el sitio de reconocimiento la confiere el dominio de dedos de zinc, que típicamente comprende dos, tres o cuatro dedos de zinc, por ejemplo, que tiene una estructura C2H2, sin embargo, se conocen otras estructuras de dedos de zinc y se han manipulado genéticamente. Los dominios de dedos de zinc son susceptibles al diseño de polipéptidos que se unen específicamente a una secuencia de reconocimiento polinucleotídica seleccionada. Las ZFN incluyen un dominio de dedos de zinc de unión a ADN manipulado genéticamente unido a un dominio de endonucleasa no específico, por ejemplo, dominio de nucleasa de una endonucleasa de tipo Ms tal como Fokl. Pueden fusionarse funcionalidades adicionales al dominio de unión de dedos de zinc, incluyendo dominios activadores transcripcionales, dominios represores de la transcripción y metilasas. En algunos ejemplos, se requiere dimerización del dominio nucleasa para la actividad de escisión. Cada uno de los dedos de zinc reconoce tres pares de bases consecutivas en el ADN diana. Por ejemplo, un dominio de 3 dedos reconocía una secuencia de 9 nucleótidos contiguos, con un requisito de dimerización de la nucleasa, se usan dos conjuntos de tripletes de dedos de zinc para unirse a una secuencia de reconocimiento de 18 nucleótidos.

Un "Dead-CAS9" (dCAS9), como se utiliza en esta memoria, se utiliza para suministrar un dominio represor transcripcional. El dCAS9 ha sido mutado, por lo que ya no puede cortar ADN. El dCAS0 aún puede unirse al ser guiado a una secuencia por el ARNg y también puede fusionarse a elementos represores (véase Gilbert et al., Cell, 18 de julio de 2013; 154(2): 442-451; Kiani et al., Nature Methods, noviembre de 2015, vol. 12, N° 11: 1051-1054). El dCAS9 fusionado al elemento represor, como se describe en esta memoria, se abrevia como dCAS9~REP, en que el elemento represor (REP) puede ser cualquiera de los motivos represores conocidos que se han caracterizado en plantas (véase Kagale y Rozxadowski, Plant Signaling & Behavior, 20010, 5:6, 691-694 para una revisión). Un ARN guía (ARNg) expresado se une a la proteína dCAS9~REP y fija como objetivo la unión de la proteína de fusión dCAS9-REP a una secuencia de nucleótidos predeterminada específica dentro de un promotor (un promotor dentro del ADN-T). Por ejemplo, si se expresa más allá del borde utilizando un casete ZM-UBI PRO::dCAS9~REP::PINII TERM junto con un casete U6-POL PRO::gRNA::U6 TERM, y el ARNg está diseñado para guiar la proteína dCAS9-REP a unirse al promotor SB-UBI en el casete de expresión SB-UBI PRO::moPAT::PINII TERM dentro del ADN-T, cualquier evento que haya integrado la secuencia más allá del borde sería sensible al bialafos. Los eventos transgénicos que integran sólo el ADN-T expresarían moPAT y serían resistentes al bialafos. La ventaja de utilizar una proteína dCAS9 fusionada a un represor (a diferencia de un TETR o un ESR) reside en la capacidad de fijar como objetivo estos represores a cualquier promotor dentro del ADN-T. TETR y ESR están restringidos a secuencias de unión a operadores cognados. Alternativamente, se puede utilizar una nucleasa de dedos de zinc sintética fusionada a un dominio represor en lugar del ARNg y dCAS9~REP (Urritia et al., 2003, Genome Biol. 4:231), como se describió arriba.

Las bacterias y arqueobacterias han desarrollado defensas inmunitarias adaptativas denominadas sistemas asociados a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas intercaladas de forma regular (CRISPR)/CRISPR (Cas) que utilizan ARN corto para dirigir la degradación de ácidos nucleicos exógenos (documento WO2007/025097, publicado el 1 de marzo de 2007). El sistema de CRISPR/Cas de tipo II de bacterias emplea un ARNcr y ARNcrtra para guiar la endonucleasa Cas a su diana de ADN. El ARNcr (ARN de CRISPR) contiene la región complementaria a una cadena de la diana de ADN de doble cadena y forma pares de bases con el ARNcrtra (ARN de CRISPR de activación entrans)que forma un ARN de doble cadena que dirige la endonucleasa Cas para escindir la diana de ADN.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "nucleótido guía" se refiere a una fusión sintética de dos moléculas de ARN, un ARNcr (ARN de CRISPR) que comprende un dominio de fijación de objetivo variable y un ARNcrtra. En un aspecto, el nucleótido guía comprende un dominio de fijación de objetivo variable de secuencias de 12 a 30 nucleótidos y un fragmento de ARN que puede interactuar con una endonucleasa Cas.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "polinucleótido guía", se refiere a una secuencia polinucleotídica que puede formar un complejo con una endonucleasa Cas y posibilita que la endonucleasa Cas reconozca y opcionalmente escinda un sitio diana de ADN. El polinucleótido guía puede ser una molécula sencilla o una molécula doble. La secuencia de polinucleótido guía puede ser una secuencia de ARN, una secuencia de ADN o una combinación de éstas (una secuencia de combinación de ARN-ADN). Opcionalmente, el polinucleótido guía puede comprender al menos una modificación de nucleótido, enlace o unión fosfodiéster tal como, pero no limitada a ácido nucleico bloqueado (LNA), 5-metil dC, 2,6-diaminopurina, 2'-fluoro A, 2'-fluoro U, 2'-O-metil ARN, enlace fosforotioato, enlace a una molécula de colesterol, enlace a una molécula de polietilenglicol, enlace a una molécula espaciadora 18 (cadena de hexaetilenglicol) o enlace covalente 5' a 3' que provoca circularización. Un polinucleótido guía que únicamente comprende ácidos ribonucleicos también se denomina "nucleótido guía".

El polinucleótido guía puede ser una molécula doble (también denominada polinucleótido guía de doble cadena) que comprende un primer dominio de secuencia de nucleótidos (denominado dominio de dirección variable o dominio VT) que es complementario a una secuencia de nucleótidos en un ADN diana y un segundo dominio de secuencia de nucleótidos (denominado dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas o dominio CER) que interactúa con un polipéptido de endonucleasa Cas. El dominio CER del polinucleótido guía de molécula doble comprende dos moléculas diferentes que hibridan a lo largo de una región de complementariedad. Las dos moléculas separadas pueden ser secuencias de ARN, de ADN y/o de combinación de ARN-ADN. En un aspecto, la primera molécula del polinucleótido guía de doble cadena que comprende un dominio VT enlazado a un dominio CER se denomina "ADNcr" (cuando está compuesto de un tramo contiguo de nucleótidos de ADN) o "ARNcr" (cuando está compuesto de un tramo contiguo de nucleótidos de ARN) o "ADN-ARNcr" (cuando está compuesto de una combinación de nucleótidos de ADN y ARN). El nucleótidocr puede comprender un fragmento del ARNc que existe de forma natural en bacterias y arqueobacterias. En un aspecto, el tamaño del fragmento del ARNc que existe de forma natural en bacterias y arqueobacterias que está presente en un nucleótidocr descrito en esta memoria puede variar de, aunque no se limita a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos.

En un aspecto, la segunda molécula del polinucleótido guía de doble cadena que comprende un dominio CER se denomina "ARNcrtra" (cuando está compuesto de un tramo contiguo de nucleótidos de ARN) o "ADNcrtra" (cuando está compuesto de un tramo contiguo de nucleótidos de ADN) o "ADN-ARNcrtra" (cuando está compuesto de una combinación de nucleótidos de ADN y ARN). En un aspecto, el ARN que guía el complejo de endonucleasa Cas9 de ARN es un ARN de doble cadena que comprende un ARNcr-ARNcrtra de doble cadena.

El polinucleótido guía también puede ser una molécula sencilla que comprende un primer dominio de secuencia de nucleótidos (denominado dominio de dirección variable o dominio VT) que es complementario a una secuencia de nucleótidos en un ADN diana y un segundo dominio de nucleótidos (denominado dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas o dominio CER) que interactúa con un polipéptido de endonucleasa Cas. Por "dominio" se entiende un tramo contiguo de nucleótidos que puede ser de secuencia de ARN, ADN y/o combinación de ARN-ADN. El dominio VT y/o el dominio CER de un polinucleótido guía sencillo puede comprender una secuencia de ARN, una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN. En un aspecto, el polinucleótido guía sencillo comprende un nucleótidocr (que comprende un dominio VT enlazado a un dominio CER) enlazado a un nucleótidocrtra (que comprende un dominio CER), en el que el enlace es una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de ARN, una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN. El polinucleótido guía sencillo compuesto de secuencias del nucleótidocr y el nucleótidocrtra puede denominarse "nucleótido guía sencillo" (cuando está compuesto de un tramo contiguo de nucleótidos de ARN) o "ADN guía sencillo" (cuando está compuesto de un tramo contiguo de nucleótidos de ADN) o "nucleótido-ADN guía sencillo" (cuando está compuesto de una combinación de nucleótidos de ARN y ADN). En un aspecto de la divulgación, el nucleótido guía sencillo comprende un ARNc o fragmento de ARNc y un ARNcrtra o fragmento de ARNcrtra del sistema de CRISPR/Cas de tipo II que puede formar un complejo con una endonucleasa Cas de tipo II, en donde el complejo de nucleótido guía y endonucleasa Cas puede dirigir la endonucleasa Cas a un sitio diana genómico de la planta, posibilitando que la endonucleasa Cas introduzca una rotura de doble cadena en el sitio diana genómico. Un aspecto de utilizar un polinucleótido guía sencillo frente a un polinucleótido guía de doble cadena es que tiene que prepararse solamente un casete de expresión para expresar el polinucleótido guía sencillo.

La expresión "dominio de dirección variable" o "dominio VT" se utiliza indistintamente en esta memoria e incluye una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una cadena (secuencia de nucleótidos) de un sitio diana de ADN de doble cadena. El % de complementariedad entre el primer dominio de secuencia de nucleótidos (dominio VT) y la secuencia diana puede ser al menos un 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 63%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. El dominio diana variable puede ser de al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. En un aspecto, el dominio de dirección variable comprende un tramo contiguo de 12 a 30 nucleótidos. El dominio de dirección variable puede estar compuesto de una secuencia de ADN, una secuencia de ARN, una secuencia de ADN modificada, una secuencia de ARN modificada o cualquier combinación de las mismas.

La expresión "dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas" o "dominio CER" de un polinucleótido guía se usa indistintamente en este documento e incluye una secuencia de nucleótidos (tal como un segundo dominio de secuencia de nucleótidos de un polinucleótido guía), que interactúa con un polipéptido de endonucleasa Cas. El dominio CER puede estar compuesto de una secuencia de ADN, una secuencia de ARN, una secuencia de ADN modificada, una secuencia de ARN modificada (véanse, por ejemplo, las modificaciones descritas en este documento), o cualquier combinación de las mismas.

La secuencia de nucleótidos que conecta el nucleótidocr y el nucleótidocrtra de un polinucleótido guía sencillo puede comprenden una secuencia de ARN, una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN. En un aspecto, la secuencia de nucleótidos que conecta el nucleótidocr y el nucleótidocrtra de un polinucleótido guía sencillo puede ser de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 nucleótidos de longitud. En otro aspecto, la secuencia de nucleótidos que conecta el nucleótidocr y el nucleótidocrtra de un polinucleótido guía sencillo puede comprender una secuencia de tetrabucle tal como, pero no limitada a una secuencia de tetrabucle GAAA.

La modificación de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido guía, el dominio VT y/o el dominio CER puede seleccionarse de, pero no se limita a el grupo que consiste en un casquete 5', una cola poliadenilada 3', una secuencia de ribointerruptor, una secuencia de control de la estabilidad, una secuencia que forma un ARNbc duplex, una modificación o secuencia que fija como objetivo el polinucleótido guía a una localización subcelular, una modificación o secuencia que proporciona rastreo, una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas, un ácido nucleico bloqueado (LNA), un nucleótido 5-metil dC, un nucleótido 2,6-diaminopurina, un nucleótido 2'-fluoro A, un nucleótido 2'-fluoro U; un nucleótido de 2'-O-metil ARN, un enlace fosforotioato, un enlace a una molécula de colesterol, un enlace a una molécula de polietilenglicol, un enlace a una molécula espaciadora 18, un enlace covalente 5' a 3' o cualquier combinación de las mismas. Estas modificaciones pueden resultar en al menos un rasgo característico beneficioso adicional, en donde el rasgo característico beneficioso adicional se selecciona del grupo de una estabilidad modificada o regulada, una fijación de objetivo subcelular, un rastreo, un marcador fluorescente, un sitio de unión para una proteína o complejo proteínico, afinidad de unión modificada a secuencia diana complementaria, resistencia modificada a degradación celular y permeabilidad celular aumentada.

En un aspecto, el nucleótido guía y la endonucleasa Cas pueden formar un complejo que posibilita que la endonucleasa Cas introduzca una rotura de doble cadena en un sitio diana de ADN.

En un aspecto, el dominio diana variable es de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud.

En un aspecto de la divulgación, el nucleótido guía comprende un ARNc (o fragmento de ARNc) y un ARNcrtra (o fragmento de ARNcrtra) del sistema de CRISPR/Cas de tipo II que puede formar un complejo con una nucleasa Cas de tipo II, en el que el complejo de nucleótido guía y endonucleasa Cas puede dirigir la endonucleasa Cas a un sitio diana genómico de la planta, posibilitando que la endonucleasa Cas introduzca una rotura de doble cadena en el sitio diana genómico. El nucleótido guía puede introducirse en una planta o célula vegetal directamente usando cualquier método conocido en la técnica tal como, aunque sin limitación, bombardeo de partículas o aplicaciones tópicas.

En un aspecto, el nucleótido guía puede introducirse indirectamente introduciendo una molécula de ADN recombinante que comprenden la secuencia de ADN guía correspondiente unida de forma funcional a un promotor específico de plantas que puede transcribir el nucleótido guía en la célula vegetal. La expresión "ADN guía correspondiente" incluye una molécula de ADN que es idéntica a la molécula de ARN, pero tiene una "T" sustituida en el lugar de cada "U" de la molécula de ARN.

En un aspecto, el nucleótido guía se introduce mediante bombardeo de partículas o utilizando los métodos descritos para la transformación con Agrobacterium de una construcción de ADN recombinante que comprende el ADN guía correspondiente enlazado operativamente a un promotor de polimerasa III U6 de plantas.

En un aspecto, el ARN que guía el complejo de endonucleasa Cas9 de ARN es un ARN de doble cadena que comprende un ARNcr-ARNcrtra de doble cadena. Una ventaja de utilizar un nucleótido guía frente a un ARNcr-ARNcrtra de doble cadena es que tiene que prepararse solamente un casete de expresión para expresar el nucleótido guía fusionado.

La expresiones "sitio diana", "secuencia diana", "ADN diana", "locus diana", "sitio diana genómico", "secuencia diana genómica" y "locus diana genómico" se utilizan indistintamente en este documento y se refieren a una secuencia polinucleotídica en el genoma (que incluye ADN de cloroplastos y mitocondrial) de una célula vegetal en que se induce una rotura de doble cadena en el genoma de la célula vegetal por una endonucleasa Cas. El sitio diana puede ser un sitio endógeno en el genoma de la planta o, como alternativa, el sitio diana puede ser heterólogo a la planta y, de ese modo, no existir de forma natural en el genoma, o el sitio diana puede encontrarse en una localización genómica heteróloga en comparación con donde existe de forma natural.

Tal como se utilizan en esta memoria, las expresiones "secuencia diana endógena" y "secuencia diana natural" se utilizan indistintamente en esta memoria para referirse a una secuencia diana que es endógena o natural al genoma de una planta y está en la posición endógena o nativa de esa secuencia diana en el genoma de la planta. En un aspecto, el sitio diana puede ser similar a un sitio de reconocimiento de ADN o sitio diana que se reconoce específicamente y/o se une por un agente que induce rotura de doble cadena tal como una endonucleasa LIG3-4 (Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. 2009-0133152) o una meganucleasa MS26++ (Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. Número 2014/0020131).

Un "sitio diana artificial" o "secuencia diana artificial" se utilizan indistintamente en esta memoria y se refieren a una secuencia diana que ha sido introducida en el genoma de una planta. Una secuencia diana artificial puede ser idéntica en secuencia a una secuencia diana endógena o natural en el genoma de una planta, pero puede estar localizada en una posición diferente (es decir, una posición no endógena o no nativa) en el genoma de una planta.

Un "sitio diana alterado", "secuencia diana alterada", "sitio diana modificado" y "secuencia diana modificada" se utilizan indistintamente en esta memoria y se refieren a una secuencia diana como se describe en esta memoria que comprende al menos una alteración en comparación con una secuencia diana no alterada. "Alteraciones" de este tipo incluyen, por ejemplo: (i) sustitución de al menos un nucleótido, (ii) una deleción de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido o (iv) cualquier combinación de (i) - (iii).

En un aspecto, los métodos descritos pueden utilizarse para introducir en plantas polinucleótidos útiles para supresión génica de un gen diana en una planta. La reducción de la actividad de genes específicos (también conocido como silenciamiento génico o supresión génica) es deseable para varios aspectos de manipulación genética en plantas. Los expertos en la materia conocen bien muchas técnicas para silenciamiento génico incluyendo, aunque sin limitación, tecnología de antisentido (véase, por ejemplo, Sheehy et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8805-8809; y patentes de EE.UU. N°s 5.107.065; 5.453.566; y 5.759.829); co-supresión (p. ej., Taylor (1997) Plant Cell 9:1245; Jorgensen (1990) Trends Biotech. 8(12):340-344; Flavell (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.<u>S<a>91:3490-3496; Finnegan et al. (1994) Bio/Technology 12: 883-888; y Neuhuber et al. (1994) Mol. Gen. Genet. 244:230-241); interferencia de ARN (Napoli et al. (1990) Plant Cell 2:279-289; patente de EE.UU. N° 5.034.323; Sharp (1999) Genes Dev. 13:139-141; Zamore et al. (2000) Cell 101:25-33; Javier (2003) Nature 425:257-263; y Montgomery et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:15502-15507), silenciamiento génico inducido por virus (Burton, et al. (2000) Plant Cell 12:691-705; y Baulcombe (1999) Curr. Op. Plant Bio. 2:109-113); ribozimas específicas de ARN diana (Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591); estructuras de horquilla (Smith et al. (2000) Nature 407:319-320; documentos WO 99/53050; WO 02/00904; y WO 98/53083); ribozimas (Steinecke et al. (1992) EMBO J. 11:1525; patente de EE.UU. N° 4.987.071; y Perriman et al. (1993) Antisense Res. Dev.

3:253); modificación fijada como objetivo mediada por oligonucleótidos (p. ej., documentos WO 03/076574 y WO 99/25853); moléculas fijadas como objetivo a dedos de Zn (p. ej., documentos WO 01/52620; WO 03/048345; y WO 00/42219); microARN artificiales (documento US8106180; Schwab et al. (2006) Plant Cell 18:1121-1133); y otros métodos o combinaciones de los métodos anteriores conocidos por los expertos en la materia.

En un aspecto, los métodos descritos pueden utilizarse para introducir en plantas polinucleótidos útiles para la integración fijada como objetivo de secuencias de nucleótidos en una planta. Por ejemplo, los métodos descritos pueden utilizarse para introducir casetes de expresión de ADN-T que comprenden secuencias de nucleótidos de interés flanqueadas por sitios de recombinación no idénticos, que se utilizan para transformar una planta que comprende un sitio diana. En un aspecto, el sitio diana contiene al menos un conjunto de sitios de recombinación no idénticos correspondientes a aquellos en el casete de expresión de ADN-T. El intercambio de las secuencias de nucleótidos flanqueadas por los sitios de recombinación se logra mediante una recombinasa. Por tanto, los métodos descritos pueden utilizarse para la introducción de casetes de expresión de ADN-T para la integración fijada como objetivo de secuencias de nucleótidos, en los que los casetes de expresión de ADN-T que están flanqueados por sitios de recombinación no idénticos se reconocen por una recombinasa que reconoce e implementa la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos. Por consiguiente, los métodos descritos pueden utilizarse para mejorar la eficacia y velocidad de desarrollo de plantas que contienen sitios de recombinación no idénticos.

Por lo tanto, los métodos descritos pueden comprender, además, métodos para la integración direccional, fijada como objetivo de nucleótidos exógenos en una planta transformada. En un aspecto, los métodos divulgados usan sitios de recombinación novedosos en un sistema de dirección génica que facilita la dirección direccional de genes deseados y secuencias de nucleótidos en sitios de recombinación correspondientes previamente introducidos en el genoma de la planta diana.

En un aspecto, se introduce una secuencia de nucleótidos flanqueada por dos sitios de recombinación no idénticos en una o más células de un explante derivado del genoma del organismo diana que establece un sitio diana para la inserción de secuencias de nucleótidos de interés. Una vez establecida una planta estable o tejido cultivado, se introduce una segunda construcción, o secuencia de nucleótidos de interés, flanqueada por sitios de recombinación correspondientes como los que flanquean el sitio diana, en la planta o tejidos transformados de forma estable en presencia de una proteína recombinasa. Este proceso resulta en el intercambio de las secuencias de nucleótidos entre los sitios de recombinación no idénticos del sitio diana y el casete de expresión de ADN-T.

Se reconoce que la planta transformada preparada de esta manera puede comprender múltiples sitios diana; es decir, conjuntos de sitios de recombinación no idénticos. De esta manera, están disponibles múltiples manipulaciones del sitio diana en la planta transformada. Por sitio diana en la planta transformada se pretende una secuencia de ADN que se ha insertado en el genoma de la planta transformada y comprende sitios de recombinación no idénticos.

Ejemplos de sitios de recombinación para su uso en el método divulgado son conocidos en la técnica e incluyen sitios FRT (véase, por ejemplo, Schlake y Bode (1994) Biochemistry 33: 12746-12751; Huang et al. (1991) Nucleic Acids Research 19: 443-448; Paul D. Sadowski (1995) En Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology vol. 51, pp. 53-91; Michael M. Cox (1989) En Mobile DNA, Berg y Howe (eds) American Society of Microbiology, Washington D. C., pp. 116-670; Dixon et al. (1995) 18: 449-458; Umlauf y Cox (1988) The EMBO Journal 7: 1845 1852; Buchholz et al. (1996) Nucleic Acids Research 24: 3118-3119; Kilby et al. (1993) Trends Genet. 9: 413-421: Rossant y Geagy (1995) Nat. Med. 1: 592-594; Albert et al. (1995) The Plant J. 7: 649-659: Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 353-361; Odell et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 223: 369-378; y Dale y Ow (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10558-105620); Lox (Albert et al. (1995) Plant J. 7: 649-659; Qui et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1706-1710; Stuurman et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 901-913; Odell et al. (1990) Mol. Gen. Gevet.

223: 369-378; Dale et al. (1990) Gene 91: 79-85; y Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 353-361.) El plásmido de dos micras, encontrado en la mayoría de cepas de origen natural de Saccharomyces cerevisiae, codifica una recombinasa específica del sitio que fomenta una inversión del ADN entre dos repeticiones invertidas. Esta inversión desempeña una función central en la amplificación del número de copias del plásmido.

La proteína, denominada proteína FLP, cataliza acontecimientos de recombinación específica de sitio. El sitio de recombinación mínimo (FRT) se ha definido y contiene dos repeticiones invertidas de 13 pares de bases (pb) que rodean un espaciador asimétrico de 8 pb. La proteína FLP escinde el sitio en las uniones de las repeticiones y el espaciador y se une covalentemente al ADN mediante un 3'fosfato. Las recombinasas específicas de sitio como FLP escinden y vuelven a ligar el ADN en secuencias diana específicas, provocando una recombinación definida de manera precisa entre dos sitios idénticos. Para funcionar, el sistema necesita los sitios de recombinación y la recombinasa. No se necesitan factores auxiliares. Por tanto, el sistema completo puede insertarse y funcionar en células vegetales. El sistema de recombinación específico de sitio de FLP\FRT de levadura ha demostrado funcionar en plantas. Hasta la fecha, el sistema se ha utilizado para la escisión de ADN indeseado. Véase, Lyznik et at. (1993) Nucleic Acid Res. 21: 969-975. En contraste, la presente divulgación utiliza FRT no idénticas para el intercambio, fijación de objetivo, disposición, inserción y control de la expresión de secuencias de nucleótidos en el genoma de la planta.

En un aspecto, se necesita un organismo transformado de interés, tal como un explante de una planta, que contiene un sitio diana integrado en su genoma. El sitio diana se caracteriza por estar flanqueado por sitios de recombinación no idénticos. Se requiere adicionalmente un casete de fijación de objetivo que contenga una secuencia de nucleótidos flanqueada por correspondientes sitios de recombinación no idénticos como aquellos sitios contenidos en el sitio diana del organismo transformado. Se requiere una recombinasa que reconozca los sitios de recombinación no idénticos y catalice la recombinación específica del sitio.

Se reconoce que la recombinasa puede proporcionarse mediante cualquier medio conocido en la técnica. Es decir, puede proporcionarse en el organismo o célula vegetal transformando el organismo con un casete de expresión que pueda expresar la recombinasa en el organismo, por expresión transitoria o proporcionando ARN mensajero (ARNm) para la recombinasa o la proteína recombinasa.

Por "sitios de recombinación no idénticos" se pretende que los sitios de recombinación flanqueantes no sean idénticos en secuencia y no recombinarán o la recombinación entre los sitios será mínima. Es decir, un sitio de recombinación flanqueante puede ser un sitio FRT en que el segundo sitio de recombinación puede ser un sitio FRT mutado. Los sitios de recombinación no idénticos utilizados en los métodos de la divulgación evitan o suprimen enormemente la recombinación entre los dos sitios de recombinación flanqueantes y la escisión de la secuencia de nucleótidos contenida en los mismos. Por consiguiente, se reconoce que puede utilizarse cualquier sitio de recombinación no idéntico adecuado en la divulgación, incluyendo sitios FRT y FRT mutantes, sitios FRT y lox, sitios lox y lox mutantes, así como otros sitios de recombinación conocidos en la técnica.

Por sitio de recombinación no idéntico adecuado supone que en presencia de recombinasa activa, la escisión de secuencias entre dos sitios de recombinación no idénticos se produce, si acaso, con una eficacia considerablemente menor que el intercambio mediado por recombinación que dirige la disposición de las secuencias de nucleótidos en el genoma de la planta. Por tanto, sitios no idénticos adecuados para su uso en la divulgación incluyen aquellos sitios en que la eficacia de recombinación entre los sitios es baja; por ejemplo, en que la eficacia es de menos de aproximadamente un 30 a aproximadamente un 50 %, preferiblemente menos de aproximadamente un 10 a aproximadamente un 30 %, más preferiblemente menos de aproximadamente un 5 a aproximadamente 10 %.

Como se indica anteriormente, los sitios de recombinación en el casete de fijación de objetivo corresponden a los del sitio diana de la planta transformada. Es decir, si el sitio diana de la planta transformada contiene sitios de recombinación no idénticos flanqueantes de FRT y FRT mutante, el casete de fijación de objetivo contendrá los mismos sitios de recombinación no idénticos de<f>R<t>y FRT mutante.

Además, se reconoce que la recombinasa, que se utiliza en los métodos descritos dependerá de los sitios de recombinación en el sitio diana de la planta transformada y el casete de fijación de objetivo. Es decir, si se utilizan sitios FRT, se necesitará la recombinasa FLP. De la misma manera, cuando se utilizan sitios lox, se requiere la recombinasa Cre. Si los sitios de recombinación no idénticos comprenden tanto un sitio FRT como uno lox, tanto la recombinasa FLP como la Cre serán necesarias en la célula vegetal.

La recombinasa FLP es una proteína que cataliza una reacción específica del sitio que está implicada en la amplificación del número de copias del plásmido de dos micras de S. cerevisiae durante la replicación del ADN. La proteína FLP se ha clonado y expresado. Véase, por ejemplo, Cox (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80: 4223 4227. La recombinasa FLP para uso en la divulgación puede ser la derivada del género Saccharomyces. Puede ser preferible sintetizar la recombinasa usando codones preferidos de plantas para su expresión óptima en una planta de interés. Véase, por ejemplo, la solicitud de EE.UU. N° de serie 08/972.258 presentada el 18 de noviembre de 1997, titulada "Novel Nucleic Acid Sequence Encoding FLP Recombinase".

La recombinasa Cre del bacteriófago cataliza la recombinación específica de sitio entre dos sitios lox. La recombinasa Cre es conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, Guo et al. (1997) Nature 389: 40-46; Abremski et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 1509-1514; Chen et al. (1996) Somat. Cell Mol. Genet. 22: 477-488; y Shaikh et al. (1977) J. Biol. Chem. 272: 5695-5702. Una secuencia Cre de este tipo también puede sintetizarse utilizando codones preferidos de plantas.

Cuando sea apropiado, las secuencias de nucleótidos a insertar en el genoma de la planta pueden optimizarse para expresión aumentada en la planta transformada. Cuando se usan genes de mamífero, levadura o bacterianos en la divulgación, pueden sintetizarse usando codones preferidos de plantas para expresión mejorada. Se reconoce que para la expresión en monocotiledóneas, también pueden sintetizarse genes de dicotiledóneas utilizando codones preferidos de monocotiledóneas. Hay métodos disponibles en la técnica para sintetizar genes preferidos de plantas. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5.380.831, 5.436.391 y Murrayet al.(1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498. Los codones preferidos de plantas pueden determinarse a partir de los codones utilizados más frecuentemente en las proteínas expresadas en la planta de interés. Se reconoce que pueden construirse secuencias preferidas de monocotiledóneas o dicotiledóneas, así como secuencias preferidas de plantas para especies de plantas particulares. Véanse, por ejemplo, los documentos EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; Perlaket al.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 3324-3328; y Murrayet al.(1989) Nucleic Acids Research, 17: 477-498. Patente de Estados Unidos n.° 5.380.831; y patente de Estados Unidos n.° 5.436.391. Se reconoce además que la totalidad o cualquier parte de la secuencia génica puede optimizarse o ser sintética. Es decir, también pueden usarse secuencias completamente optimizadas o parcialmente optimizadas.

Se conocen modificaciones de secuencia adicionales que potencian la expresión génica en un hospedador celular y pueden usarse en la divulgación. Éstas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación putativas, señales de sitio de corte y empalme de exones e intrones, repeticiones de tipo transposón y otras secuencias bien caracterizadas de este tipo, que pueden ser perjudiciales para la expresión génica. El contenido de G-C de la secuencia puede ajustarse a niveles promedio para un huésped celular dado, calculado por referencia a genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar las estructuras de ARN secundarias en forma de horquilla previstas.

La presente divulgación también abarca sitios diana de recombinación de FLP (FRT) novedosos. El FRT se ha identificado como una secuencia mínima que comprende dos repeticiones de 13 pares de bases, separadas por un espaciador de 8 bases, de la siguiente manera: 5'-GAAGTTCCTATTC [TCT<a>G<a>AA] GTATAGGAACTTC3' en el que los nucleótidos dentro de los corchetes indican la región espaciadora. Los nucleótidos en la región espaciadora pueden remplazarse con una combinación de nucleótidos, siempre que las dos repeticiones de 13 bases estén separadas por ocho nucleótidos. Parece que la secuencia de nucleótidos real del espaciador no es crucial; sin embargo, para la práctica de la divulgación, algunas sustituciones de nucleótidos en la región espaciadora pueden funcionar mejor que otras. El espaciador de ocho pares de bases está implicado en el emparejamiento de ADN-ADN durante el intercambio de hebras. La asimetría de la región determina la dirección de alineación del sitio en el acontecimiento de recombinación, que posteriormente dará lugar a inversión o escisión. Como se indica anteriormente, la mayor parte del espaciador puede mutarse sin pérdida de función. Véase, por ejemplo, Schlake y Bode (1994) Biochemistry 33: 12746-12751.

Pueden usarse sitios mutantes FRT novedosos en la práctica de los métodos descritos. Dichos sitios mutantes pueden construirse por mutagénesis basada en PCR. Aunque sitios FRT mutantes son conocidos (véanse SEQ ID NO: 2, 3, 4 y 5 del documento WO/1999/025821), se reconoce que pueden utilizarse otros sitios FRT mutantes en la práctica de la divulgación. La presente divulgación no es el uso de un sitio FRT o de recombinación particular, sino que en su lugar pueden utilizarse sitios de recombinación o sitios FRT no idénticos para inserción y expresión fijadas como objetivo de secuencias de nucleótidos en un genoma de la planta. Por lo tanto, pueden construirse otros sitios FRT mutantes y utilizarse basándose en la presente divulgación.

Como se comentó anteriormente, poner un ADN genómico que contiene un sitio diana con sitios de recombinación no idénticos junto con un vector que contiene un casete de expresión de ADN-T con correspondientes sitios de recombinación no idénticos, en presencia de la recombinasa, resulta en la recombinación. La secuencia de nucleótidos del casete de expresión de ADN-T localizado entre los sitios de recombinación flanqueantes se intercambia con la secuencia de nucleótidos del sitio diana localizado entre los sitios de recombinación flanqueantes. De esta manera, las secuencias de nucleótidos de interés pueden incorporarse de forma precisa en el genoma del hospedador.

Se reconoce que pueden ponerse en práctica muchas variaciones de la divulgación. Por ejemplo, pueden construirse sitios diana que tienen múltiples sitios de recombinación no idénticos. Por tanto, pueden apilarse u ordenarse múltiples genes o secuencias de nucleótidos en localizaciones precisas en el genoma vegetal. Asimismo, una vez que se ha establecido un sitio diana dentro del genoma, pueden introducirse sitios de recombinación adicionales incorporando dichos sitios dentro de la secuencia de nucleótidos del casete de expresión de ADN-T y la transferencia de los sitios a la secuencia diana. Por tanto, una vez se ha establecido un sitio diana, es posible añadir posteriormente sitios, o alterar sitios a través de recombinación.

Otra variación incluye proporcionar un promotor o región de inicio de la transcripción unida de forma funcional con el sitio diana en un organismo. Preferiblemente, el promotor estará 5' al primer sitio de recombinación. Al transformar el organismo con un casete de expresión de ADN-T que comprende una región codificante, se producirá la expresión de la región codificante tras la integración del casete de expresión de ADN-T en el sitio diana. Este aspecto proporciona un método para seleccionar células transformadas, particularmente células vegetales, proporcionando una secuencia marcadora de selección como secuencia codificante.

Otras ventajas del presente sistema incluyen la capacidad de reducir la complejidad de la integración de transgenes o ADN transferido en un organismo utilizando casetes de expresión de ADN-T como se comentan anteriormente y seleccionando organismos con patrones de integración simples. De la misma manera, pueden identificarse sitios preferidos dentro del genoma comparando varios acontecimientos de transformación. Un sitio preferido dentro del genoma incluye uno que no altera la expresión de las secuencias esenciales y proporciona expresión adecuada de la secuencia transgénica.

Los métodos descritos también proporcionan medios para combinar múltiples casetes en una localización dentro del genoma. Pueden añadirse o eliminarse sitios de recombinación en sitios diana dentro del genoma.

Puede utilizarse cualquier medio conocido en la técnica para poner los tres componentes del sistema juntos en la divulgación. Por ejemplo, una planta puede transformarse de forma estable para que albergue el sitio diana en su genoma. La recombinasa puede expresarse o proporcionarse de forma transitoria. Como alternativa, puede integrarse de forma estable una secuencia de nucleótidos que pueda expresar la recombinasa en el genoma de la planta. En presencia del sitio diana correspondiente y la recombinasa, el casete de expresión de ADN-T, flanqueado por sitios de recombinación no idénticos correspondientes, se inserta en el genoma de la planta transformada.

Como alternativa, los componentes del sistema pueden ponerse juntos cruzando sexualmente plantas transformadas. En este aspecto, una planta transformada, progenitora uno, que contiene un sitio diana integrado en su genoma, puede cruzarse sexualmente con una segunda planta, progenitora dos, que ha sido transformada genéticamente con un casete de expresión de ADN-T que contiene sitios de recombinación no idénticos flanqueantes, que corresponden a los de la planta uno. O la planta uno o la planta dos contiene dentro de su genoma una secuencia de nucleótidos que expresa recombinasa. La recombinasa puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o inducible. De esta manera, puede controlarse la expresión de la recombinasa y la posterior actividad en los sitios de recombinación.

Los métodos descritos son útiles para fijar como objetivo la integración de secuencias de nucleótidos transferidas a un sitio cromosómico específico. La secuencia de nucleótidos puede codificar cualquier secuencia de nucleótidos de interés. Genes de interés particulares incluyen los que proporcionan un rasgo característico funcional fácilmente analizable a la célula y/u organismo huésped, tal como genes marcadores, así como otros genes que alteran el fenotipo de las células receptoras. Por lo tanto, los genes que logran el crecimiento de la planta, la altura, la susceptibilidad a enfermedades, insectos y el valor nutritivo pueden utilizarse en la divulgación. La secuencia de nucleótidos también puede codificar una secuencia ‘antisentido’ para inactivar o modificar la expresión génica.

Se reconoce que las secuencias de nucleótidos se utilizarán en una unidad de presión funcional o un casete de expresión de ADN-T. Por unidad de expresión funcional o casete de expresión de ADN-T se pretende la secuencia de nucleótidos de interés con un promotor funcional y, en la mayoría de los casos, una región de terminación. Hay diversas maneras de conseguir la unidad de expresión funcional dentro de la práctica de la divulgación. En un aspecto de la divulgación, el ácido nucleico de interés se transfiere o inserta en el genoma como una unidad de expresión funcional.

Alternativamente, la secuencia de nucleótidos puede insertarse en un sitio dentro del genoma que está 3' a una región promotora. En este último caso, la inserción de la secuencia codificante 3' a la región promotora es tal que se consigue una unidad de expresión funcional tras la integración. El casete de expresión de ADN-T comprenderá una región de inicio de la transcripción, o promotor, enlazado operativamente al ácido nucleico que codifica el péptido de interés. Un casete de expresión de este tipo está provisto de una pluralidad de sitios de restricción para la inserción del gen o genes de interés para que esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

PARTE EXPERIMENTAL

Ejemplo 1: Plásmidos

Véase la Tabla 7 para una descripción de los plásmidos que comprenden los componentes referenciados en los Ejemplos. Los ID de plásmido seguidos de un "+" comprenden ADN-T que contiene los componentes indicados y componentes adicionales ubicados más allá del Borde Izquierdo (LB) del ADN-T. Como es habitual en la experiencia en la técnica, los componentes adicionales pueden ubicarse alternativamente más allá del Borde Derecho (RB) del ADN-T.

Tabla 7.

Ejemplo 2: Medio de cultivo

Véanse las Tablas 8, 9 y 10 para obtener una descripción de las formaciones de medios para la transformación, selección y regeneración a las que se hace referencia en los Ejemplos.

Tabla 8.

Tabla 9.

La composición de los diversos medios utilizados en la transformación, el cultivo de tejidos y la regeneración de soja se describe en la Tabla 10. En esta tabla, el medio M1 se utiliza para el inicio de cultivos en suspensión, si éste es el material de partida para la transformación. Los medios M2 y M3 representan medios de co-cultivo típicos útiles para la transformación de Agrobacterium de toda la gama de explantes arriba enumerados. El medio M4 es útil para la selección (con el agente selectivo adecuado), M5 se utiliza para la maduración de embriones somáticos y el medio M6 se utiliza para la germinación para producir plántulas T0.

Tabla 10.

Ejemplo 3: Bombardeo de Partículas

Se utiliza la cepa endogámica Pioneer PH184C (documento US8445763) que contiene en el cromosoma 1 un sitio diana de Integración Específica del Sitio pre-integrado (sitio diana de Chrom-1) compuesto por UBI PRO:FRT1 :NPTN::PINM TERM FRT87. Antes del bombardeo, se aíslan 10-12 embriones inmaduros DAP (siglas inglesas de días después de la polinización) de espigas de la cepa endogámica Pioneer PH184C y se colocan en medio de cultivo 605J más sacarosa al 16 % durante tres horas para plasmolisar las células escutelares.

Típicamente se utilizan cuatro plásmidos para cada bombardeo de partículas:

1) un plásmido donante (100 ng/gl) que contiene un casete donante flanqueado por FRT para el intercambio de casetes mediado por recombinasa, por ejemplo, un plásmido que contiene FRT1:PMI:: PINII TERM UBI1ZM PRO::DS-RED2::PINII TERM FRT87 (PHP0004);

2) un plásmido (2,5 ng/gl) que contiene el casete de expresión UBI1ZM PRO::FLPm::PINII TERM (PHP5096);

3) un plásmido (10 ng/gl) que contiene el casete de expresión ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM FMV & PCSV POTENCIADORES (PHP89030); y

4) un plásmido (5 ng/gl) que contiene el casete de expresión ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM (PHP89179).

Para fijar el ADN a partículas de oro de 0,6 gm, los cuatro plásmidos se mezclan añadiendo 10 gl de cada plásmido juntos en un tubo de microcentrífuga de baja unión (Sorenson Bioscience 39640T) para un total de 40 gl. A esta suspensión, se añaden 50 gl de partículas de oro de 0,6 gm (30 gg/gl) y 1,0 gl de Transit 20/20 (N° Cat MIR5404, Mirus Bio LLC), y la suspensión se coloca en un agitador giratorio durante 10 minutos. La suspensión se centrifuga a 10.000 RPM (~9400 x g) y se descarta el sobrenadante. Las partículas de oro se resuspenden en 120 gl de etanol al 100 %, se sonican brevemente a baja potencia y se pipetean 10 gl en cada disco portador. A continuación, los discos portadores se secan al aire para eliminar todo el etanol restante. El bombardeo de partículas se realiza utilizando un Biolistics PDF-1000, a 28 pulgadas (71 cm) de mercurio, utilizando un disco de ruptura de 200 PSI. Tras el bombardeo de partículas, los embriones inmaduros se seleccionan en medio 605J modificado para contener 12,5 g/l de manosa y 5 g/l de maltosa y nada de sacarosa. Tras 10-12 semanas de selección, las plántulas se regeneran y se analizan utilizando qPCR. Se espera que la administración conjunta de PLTP::ODP2 (PHP89030) y PLTP::WUS2 (PHP89179) junto con los componentes SSI (ADN del donante (PHP0004) UBI::FLP (PHP5096)) produzca altas frecuencias de integración específica del sitio del fragmento del donante en el sitio diana de Chrom-1 (es decir, a tasas de 4-7 % en relación con el número de embriones inmaduros bombardeados).

Ejemplo 4: Transformación mediada por Agrobacterium de maíz

A. Preparación de Placa Maestra de Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens que alberga un vector donante binario se sembró en estrías a partir de una parte alícuota congelada a - 80 °C en medio 12R sólido y se cultivó a 28 °C en la oscuridad durante 2-3 días para generar una placa maestra.

B. Crecimiento de Agrobacterium en medio sólido.

Se cogió una sola colonia o múltiples colonias de Agrobacterium de la placa maestra y se sembró en estrías en una segunda placa que contenía medio 810K y se incubó a 28 °C en la oscuridad durante la noche.

Se añadió medio de infección de Agrobacterium (700A; 5 ml) y 3'-5'-dimetoxi-4'-hidroxiacetofenona 100 mM (acetosiringona; 5 pL) a un tubo cónico de 14 mL en una campana. Se suspendieron aproximadamente 3 inóculos completos de Agrobacterium de la segunda placa en el tubo y el tubo se mezcló entonces con agitadora vorticial para generar una suspensión uniforme. La suspensión (1 ml) se transfirió a un tubo de espectrofotómetro y se ajustó la densidad óptica (550 nm) de la suspensión a una lectura de aproximadamente 0,35-1,0. La concentración de Agrobacterium fue de aproximadamente 0,5 a 2,0 x 109 ufc/mL. La suspensión final de Agrobacterium se dividió en partes alícuotas en tubos de microcentrifugadora de 2 mL, que contenían cada uno aproximadamente 1 mL de la suspensión. Las suspensiones se utilizaron entonces lo antes posible.

C. Crecimiento de Agrobacterium en medio líquido.

Alternativamente, Agrobacterium puede prepararse para transformación por crecimiento en medio líquido. Un día antes de la infección, se preparó un matraz de 125 ml con 30 ml de medio 557A (10,5 g/l de fosfato de potasio dibásico, 4,5 g/l de fosfato de potasio monobásico anhidro, 1 g/l de sulfato de amonio, 0,5 g/l de citrato de sodio deshidrato, 10 g/l de sacarosa, sulfato de magnesio 1 mM) y 30 pl de espectinomicina (50 mg/ml) y 30 pl de acetosiringona (20 mg/ml). Se suspendió medio inóculo de Agrobacterium de una segunda placa en los matraces y se colocó en un agitador orbital establecida a 200 rpm y se incubó a 28 °C durante una noche. El cultivo de Agrobacterium se centrifugó a 5000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se retiró y se añadió el medio de infección de Agrobacterium (700A) con solución de acetosiringona. Las bacterias se resuspendieron por mezcla en agitadora vorticial y la densidad óptica (550 nm) de la suspensión de Agrobacterium a una lectura de aproximadamente 0,35 a 2,0.

D. Transformación de Maíz.

Se esterilizaron superficialmente mazorcas de un cultivar de maíz (Zea mays L.) durante 15-20 min en lejía al 20 % (v/v) (hipoclorito de sodio al 5,25 %) más 1 gota de Tween 20 seguido de 3 lavados en agua estéril. Los embriones inmaduros (lEs) se aislaron de las mazorcas y se colocaron en 2 ml del medio de infección de Agrobacterium (700A) con solución de acetosiringona. El tamaño óptimo de los embriones varía basándose en el endogámico, pero para transformación con WUS2 y ODP2 podría usarse una intervalo de tamaños amplio de tamaños de embriones inmaduros. El medio de infección de Agrobacterium (810K) se trasvasó y se añadió 1 ml de suspensión de Agrobacterium a los embriones y el tubo se mezcló con agitadora vorticial durante 5-10 s. El tubo de microcentrífuga se dejó reposar durante 5 min en la campana. La suspensión de Agrobacterium y embriones se vertió en medio de co-cultivo 7101 (o 562V) (véase la Tabla 8). Cualquier embrión que quedara en el tubo se transfirió a la placa utilizando una espátula estéril. La suspensión de Agrobacterium se trasvasó y los embriones se colocaron con el eje hacia abajo en el medio. La placa se incubó en oscuridad a 21 °C durante 1-3 días de co cultivo.

Los embriones se transfirieron a medio de reposo (medio 605T) sin selección. Tres a 7 días más tarde, los embriones se transfirieron a medio de maduración (medio 289Q) complementado con un agente selectivo.

Ejemplo 5: Mezclas de A grobacteria para la Recuperación de Eventos Transgénicos de Maíz que Contienen Únicamente el Casete de Expresión de Rasgos ADN-T

Los siguientes experimentos demostraron que la administración de un plásmido que contenía WUS2 junto con el plásmido que contenía un casete de expresión de rasgos mejoró la recuperación de plantas transgénicas T0 que contenían sólo el ADN-T del rasgo y ninguna estructura principal de vector (plásmido).

Se transformaron embriones inmaduros de maíz HC69 endogámico de tallo no rígido con la cepa LBA4404 THY-de Agrobacterium (véase la Patente de EE.UU. 8.334.429) (Agro1) que contenía PHP86491, un ADN-T con dos casetes de expresión "Trait" (ZS-GREEN y ZM-HRA) (Tabla 7). Esta cepa de Agrobacterium (Agro1) se utilizó sola (tratamiento de control) para infectar los embriones inmaduros o como parte de una mezcla con otra cepa de Agrobacterium (Agro2) que contenía un casete de expresión WUS (PHP87598, PHP88156, PHP88157 o PHP88158, véase la Tabla 7). Para los tratamientos (Trts) 1 -4, las dos Agrobacteria se mezclaron en una relación de 95% del plásmido PHP86491 (Agro1) con el rasgo y 5% del plásmido WUS (Agro2) (PHP87598, PHP88156, PHP88157 o PHP88158, véase la Tabla 7). Como se muestra en la Tabla 11 que figura más adelante, cuando sólo se utilizó la Agrobacterium que contenía el plásmido (Agrol) con ADN-T del rasgo (PHP86491) para la transformación, la frecuencia de recuperación de plantas T0 con una sola copia del ADN-T y sin estructura principal del plásmido (secuencia fuera de los límites del ADN-T) fue baja (Trt C = 1,8 %). Sin embargo, cuando una segunda Agrobacterium (Agro2) que contenía un ADN-T con un casete de expresión WUS (PHP87598, PHP88156, PHP88157 o PHP88158, véase la Tabla 7) se mezcló en un título bajo con Agro1, la recuperación de plantas T0 transgénicas que contenían solo una copia del ADN-T del rasgo (PHP86491 - ZS-GREEN ZM-HRA) sin integración del ADN-T que contenía WUS (PHP87598, PHP88156, PHP88157 o PHP88158, véase la Tabla 7) o la estructura principal del plásmido se observó en frecuencias sustancialmente mejoradas (6,4 % a 16,2 % para Trts 1-4 en la Tabla 11). Para Trt1 en el que el ADN-T en Agro2, PHP87598, contenía tres elementos potenciadores virales (ENH) 5' al promotor ZM-PLTP que impulsa la expresión de WUS junto con un promotor de choque térmico que impulsa la expresión de CRE, un casete de expresión de antocianina expresado de forma constitutiva (NOS PRO::CRC::SB-GKAF TERM) y sitios loxP que flanqueaban los tres casetes de expresión, la frecuencia de integración de una única copia del ADN-T del rasgo y ninguna estructura principal del plásmido fue del 6,5 %. Para PHP88156, PHP88157 y PHP88158, que contenían un casete de expresión WUS con un promotor 3xENH:PLTP (con o sin un elemento potenciador derivado del maíz (EME) ubicado cerca de la caja TATA del promotor PLTP (por triplicado (3xEME en PHP88156), como una sola copia (EME en PHP88157) o sin EME (EME- en PHP88158)) que impulsaba WUS y el casete de expresión de antocianina expresado constitutivamente, la frecuencia de plantas T0 que contenían sólo una copia única del ADN-T del rasgo y ninguna estructura principal del plásmido fue de 6,4 (PHP88156), 16,2 (PHP88157) y 12,1 % (PHP88158). Los escapes (plantas t 0 no transgénicas regeneradas) fueron del 4 % cuando Agro2 contenía PHP88157 y 1 % cuando Agro2 contenía PHP88158. El 3X ENH afectó al casete de expresión NOS PRO::CRC::SB-GKAF t Er M y si el ADN-T que contenía el ENH y NOS PRO::CRC::SB-GKAF TERM el casete de expresión se integró, los embriones adquirieron un color rojo intenso y no produjeron plántulas. Los tratamientos 2-4 (Tabla 11) demostraron que la mezcla de una segunda Agrobacterium con un casete de expresión WUS a bajo título (5% en comparación con Agro1 con el ADN-T de rasgos) proporcionó una alternativa eficaz para potenciar la recuperación de plantas T0 que contenían sólo una copia única del ADN-T del rasgo y sin estructura principal del plásmido, sin necesidad de continuar el proceso de transformación con la escisión del casete de expresión WUS.

Tabla 11.

Se transformaron embriones inmaduros de maíz consanguíneo de tallo rígido PH1V69, descrito en la patente de EE.UU. 8.907.160, con la cepa LBA4404 THY- de Agrobacterium (Agro1) que contenía PHP86491 (Tabla 7). Esta cepa de Agrobacterium (Agro1) se utilizó sola (tratamiento de control) para infectar los embriones inmaduros o como parte de una mezcla con otra cepa de Agrobacterium (Agro2) que contenía un casete de expresión WUS (PHP87598 o PHP88156 o PHP88157 o PHP88157) (95 % de Agro1 5 % de Agro2).

En el tratamiento de control (Agro1 solo), no se recuperaron escapes (plantas T0 no transgénicas regeneradas) ni se recuperaron plantas T0 que contuvieran sólo una copia única del ADN-T del rasgo y ninguna estructura principal del plásmido. Por el contrario, cuando se mezcló una segunda cepa de Agrobacterium (Agro2) que contenía PHP87598 (Tabla 7) con Agro1 y la mezcla se utilizó para la transformación, tampoco se recuperaron escapes y la frecuencia de plantas T0 que contenían sólo una copia única del ADN-T del rasgo y ninguna estructura principal del plásmido fue del 16,5 %. Cuando se sustituyó PHP87078 (Tabla 7) en lugar de PHP87598 en Agro2, no se observaron escapes en las plantas T0 regeneradas y la frecuencia de plantas T0 que contenían sólo una copia única del ADN-T del rasgo y ninguna estructura principal del plásmido fue del 7,1 %. Estas frecuencias representaron una mejora importante en la capacidad para utilizar casetes de expresión de genes morfogenéticos (p. ej., 3xENH:PLTP::WUS2) sin la integración del casete de expresión que contiene WUS para recuperar plantas T0 de alta calidad (copia única para rasgos sin secuencias extrañas integradas (sin estructura principal del plásmido ni ninguna secuencia de ADN-T de Agro2).

Se transformaron embriones inmaduros de maíz consanguíneo de tallo rígido PH1V69 con el plásmido PHP86491 de la cepa LBA4404 THY- de Agrobacterium (Tabla 7). Esta Agrobacterium (Agro1) se utilizó como parte de una mezcla con otro plásmido PHP87598 que contenía Agrobacterium (Agro2) (Tabla 7), el cual contenía un casete de expresión WUS. Se analizaron dos relaciones diferentes de Agro1 :Agro2: 50:50 o 90:10. Al utilizar la mezcla 50:50 para la transformación, no se observaron escapes en las plantas T0 resultantes, y una frecuencia de plantas T0 que contenían sólo una copia única del ADN-T del rasgo sin estructura principal del plásmido fue del 8,2 %. Al utilizar la mezcla 90:10 para la transformación, no se observaron escapes en las plantas T0 resultantes, y una frecuencia de plantas T0 que contenían sólo una copia única del ADN-T del rasgo y ninguna estructura principal del plásmido fue del 26 %. Este resultado demostró que la concentración relativa de Agro1 y Agro2 en la mezcla de transformación impactó en la frecuencia de plantas T0 que contenían sólo una copia única del ADN-T del rasgo y ninguna estructura principal del plásmido.

Se cosecharon embriones inmaduros de cuatro variedades endogámicas de maíz tropical y se transformaron con uno de dos casetes de expresión "Rasgo" utilizando PHP81561 (ZS-YELLOW NPTII) o PHP86491 (ZS-GREEN y ZM-HRA). Para las cuatro variedades endogámicas, PH2KD1, PH44MH, PH4bAh y PH28SV, la tasa de transformación con selección por G-418 o imazapir (para los genes NPTII o HRA, respectivamente) fue prácticamente del 0 %. Sin embargo, cuando se añadió un segundo Agrobacterium que contenía (PHP88158, véase la Tabla 7) a un título de 10 % en relación con Agro1 que contenía el rasgo (que contenía PHP81561, véase la Tabla 7) y se utilizó la selección G-418 durante toda la maduración y germinación del embrión somático, la frecuencia de plantas T0 recuperadas con sólo una sola copia del ADN-T y sin estructura principal del vector (plásmido) fue 30 % para PH2KD1, 38 % para PH44MH, 43 % para PH4BAH y 3,2 % para PH28SV, en relación con el número de embriones iniciales. Cuando se añadió una segunda Agrobacterium que contenía PHP88158 a un título de 10 % en relación con Agro1 que contenía ZS-GREEN y ZM-HRA (que contenía PHP86491) y 0,1 mg/l de selección de imazapir durante toda la maduración y germinación del embrión somático, la frecuencia de plantas T0 recuperadas con sólo una sola copia del ADN-T y sin estructura principal del vector (plásmido) fue 15 % para PH2KD1, 18 % para PH44MH, 9,6 % para PH4BAH y 0 % para PH28SV, en relación con el número de embriones iniciales. Estos resultados demostraron que el uso de un casete que expresa WUS dentro del ADN-T de Agro2 y la mezcla de Agro2 al 10 % con respecto al Agro1 que contiene el rasgo (90 %) dio como resultado un método eficaz para integrar el ADN-T del rasgo, lo que resultó en plantas T0 recuperadas que contenían sólo una única copia del ADN-T y ninguna estructura principal del vector (plásmido) en frecuencias extremadamente eficaces.

Ejemplo 6: Uso de un casete de expresión de WUS2 fuera de los límites del ADN-T que contiene rasgos para estimular la transformación y selección de plantas de maíz T0 de copia única que no contenían casete de expresión de WUS2 integrado en el ADN cromosómico

Para estos experimentos, se testó un conjunto de tres diseños de plásmidos. Los tres plásmidos contenían el mismo ADN-T (RB LOXP SI-UBI3 PRO::ZS-VERDE1::PINII TERM SB-ALS PRO::ZM-HRA::SB-PEPC1 TERM LB), pero diferían en los casetes de expresión WUS2 o WUS2/ODP2 más allá del borde izquierdo. Específicamente, PHP86295 contenía dos casetes de expresión inmediatamente fuera del borde izquierdo, ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM (véase la Tabla 7), PHP86296 contenía un solo casete de expresión inmediatamente fuera del borde izquierdo, ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM, y PHP86297 contenía un solo casete de expresión inmediatamente fuera del borde izquierdo, ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2~T2A~ZM-ODP2::OS-T28 TERM. Para PH1V69 consanguíneo de tallo rígido de Pioneer, después de la transformación mediada por Agrobacterium con estos ADN-T respectivos, y la selección en 0,05 a 0,1 mg/l de imazapir durante la maduración y regeneración del embrión somático, las plantas T0 se analizaron mediante qPCR. Según el análisis de qPCR, el uso de PHP86295 resultó en que el 10,2 % de las plantas T0 recuperadas presentaban una sola copia de los genes de rasgos dentro del ADN-T, mientras que carecían de WUS y/u ODP2 integrados, sin contaminación de la estructura principal del plásmido, estos valores fueron 12,2 % y 12,3 % para PHP86296 y PHP86297, respectivamente. Estos resultados demostraron que la colocación de los casetes de expresión de WUS2 y/u ODP2 fuera del borde izquierdo del ADN-T proporcionó la estimulación necesaria para la transformación sin la integración concomitante de estos casetes de expresión de genes morfogenéticos. Este resultado demostró, además, que WUS y/u ODP2 podían expresarse transitoriamente tras la administración "fuera del borde" para estimular la transformación del maíz. Por el contrario, el uso de estos mismos vectores en HC69 endogámico no resultó en una mayor recuperación de eventos de ADN-T de rasgos de copia única sin estructura principal de vector (plásmido), esto probablemente se deba a la propensión de este endogámico a producir eventos de integración de múltiples copias con un alto grado de lectura en el borde.

Ejemplo 7: El uso de múltiples bordes izquierdos entre el ADN-T y los casetes de expresión de genes morfogenéticos aumenta la frecuencia de eventos de integración del ADN-T de rasgos de copia única

Las variedades endogámicas de maíz varían en muchas características morfológicas y fisiológicas. Una manifestación de esta variabilidad es la susceptibilidad del escutelo embrionario inmaduro de diferentes variedades endogámicas a la administración e integración del ADN-T durante la infección y el co-cultivo con Agrobacterium. Por ejemplo, cuando se utiliza la cepa LBA4404 THY- de Agrobacterium para transformar la variedad endogámica de Pioneer HC69, una alta frecuencia de plantas transgénicas T0 recuperadas contienen múltiples copias del ADN-T y han sido sometidas a lectura continua en el borde izquierdo (LB) del ADN-T, lo que resulta en la integración de la estructura principal del vector (plásmido). La introducción de múltiples bordes izquierdos mitigará esta tendencia. A modo de ejemplo, se introducen múltiples bordes izquierdos en PHP86296 entre el ADN-T que contiene rasgo y el casete de expresión WUS2 flanqueante, lo que resulta en la siguiente configuración: RB LOXP SI-UBI3 PRO::ZS-VERDE1::PINII TERM SB-ALS PRO::ZM-HRA::SB-PEPC1 TERM LB LB LB ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM. Al utilizar LBA4404, que contiene el ADN-T con múltiples LB anterior y el casete de expresión WUS2 flanqueante, para transformar HC69, se espera que una frecuencia sustancialmente mayor de las plantas T0 recuperadas sea de copia única para el ADN-T sin casete de expresión WUS2 integrado y sin estructura principal del plásmido.

Ejemplo 8: La mutagénesis de la secuencia del borde izquierdo aumenta la frecuencia de recuperación de eventos transgénicos

Las variedades endogámicas de maíz varían en muchas características morfológicas y fisiológicas. Una manifestación de esta variabilidad es la susceptibilidad del escutelo embrionario inmaduro de diferentes variedades endogámicas a la administración e integración del ADN-T durante la infección y el co-cultivo con Agrobacterium. Por ejemplo, cuando se utiliza la cepa LBA4404 THY- de Agrobacterium para transformar la variedad endogámica PH28SV de Pioneer, muy pocas células del escutelo reciben una secuencia flanqueante de LB, tal como el casete de expresión WUS2 flanqueante, y por lo tanto no se estimulan para formar rápidamente nuevos embriones somáticos. Mediante la mutagénesis selectiva de la secuencia LB, se puede modificar su eficacia para permitir una mayor frecuencia de lectura directa de LB. Al utilizarse para la transformación, se espera una mayor frecuencia de embriones somáticos de rápida formación y la producción de plantas T0 resultantes con un gen de rasgo de una sola copia sin estructura de vector (plásmido).

El co-cultivo de variedades deAgrobacteriummás resistentes a la infección podría dificultar la administración transfronteriza para la expresión de genes morfogenéticos. Se prevé que el uso de cepas deAgrobacteriummás agresivas, tales como AGL1, EHA101, EHA105 o cualquier cepa que posea el plásmido Ti supervirulento pTiBo54, podría abordar esta posible deficiencia. Además, el uso de un vector binario con un mayor número de copias podría utilizarse para administrar un mayor número de moléculas de ADN-T por célula, amplificando así la lectura transfronteriza y la posterior expresión de genes morfogenéticos.

Ejemplo 9: Mezclas de Plásmidos para la Recuperación de Eventos Transgénicos de Maíz que Contienen Únicamente el ADN-T de Rasgos

Semillas de canola se esterilizan superficialmente y se germinan en medio MS a la mitad de su concentración para producir plantas estériles de una semana de edad. Los hipocótilos se colocan en 10 ml de medio 20A (Tabla 9) y se cortan en segmentos de 2 mm. La cepa LBA4404 THY- de Agrobacterium se suspende en medio 20A y se ajusta a 0,6 de DO550 y se añaden 10-200 pl de esta suspensión a cada una de las placas que contiene los hipocótilos.

Los segmentos de hipocótilo se transforman con la cepa LBA4404 THY-(Agro1) de Agrobacterium que contiene PHP88193, un ADN-T con dos casetes de expresión "Rasgo" (SPCN y ZS-YELLOW 1 N1) (Tabla 7). Esta cepa de Agrobacterium (Agro1) se utilizó sola (tratamiento de control) para infectar los segmentos de hipocótilo, o como parte de una mezcla con otra Agrobacterium (Agro2) que contiene PHP90094 (SEQ ID NO: 116), un casete de expresión HA-WUS (Tabla 7). La mezcla contiene 95 % de Agro1 y 5 % de Agro2. Tras el co-cultivo con Agrobacterium en medio 20A (Tabla 9) con baja luminosidad y 21 °C, los segmentos de hipocótilo se transfieren a una progresión de medios de selección, comenzando con medio 70A (Tabla 9) durante dos semanas, medio 70B (Tabla 9) durante dos semanas adicionales y luego a medio 70C (Tabla 9) durante dos semanas. Para una germinación y enraizamiento continuos, los brotes pequeños se transfieren a un medio sólido que consiste en sales MS a la mitad de su concentración, 10 g/l de sacarosa, 0,5 mg/l de IBA y 5 g/l de agar TC ajustado a pH 5,7. Una vez formadas las raíces adecuadas, las plántulas se transfieren al suelo del invernadero.

En el tratamiento de control con Agro1 solo, se espera que no se recuperen escapes (plantas T0 no transgénicas regeneradas) debido a la selección rigurosa de espectinomicina, la frecuencia de recuperación de plantas T0 transgénicas será baja (es decir, <1,5 %), el período de tiempo desde la infección por Agrobacterium hasta la recuperación de plántulas T0 tardará típicamente entre 3-4 meses, y la frecuencia de plantas T0 que contienen sólo una copia única del ADN-T de rasgos y ninguna estructura principal del vector (plásmido) será baja. Por el contrario, cuando una segunda Agrobacterium (Agro2) que contiene PHP90094 se mezcla con Agro1 y la mezcla se utiliza para la transformación, se espera que i) no se recuperen escapes, ii) aumente la frecuencia de recuperación de plantas T0 transgénicas, iii) se reduzca sustancialmente el período de tiempo desde la infección por Agrobacterium hasta la recuperación de las plantas T0, y iv) aumente sustancialmente la frecuencia de plantas T0 que contienen sólo una copia única del ADN-T de rasgos sin estructura de vector (plásmido).

Ejemplo 10: Uso de un casete de expresión de WUS2 fuera de los límites del ADN-T que contiene rasgos para estimular la transformación y selección de plantas de maíz T0 de copia única que no contenían casete de expresión de WUS2

La transformación se realiza utilizando una sola cepa de Agrobacterium que contiene un único ADN-T, con los casetes de expresión "Rasgos" dentro de los bordes derecho e izquierdo del ADN-T, y un casete de expresión WUS justo fuera del borde izquierdo. Por ejemplo, se puede utilizar un plásmido (PHP0001, véase la Tabla 7) que contiene un casete de expresión PRO::WUS 35S potenciado con la siguiente configuración: RB AT-UBQ10 PRO::CTP::SPCN::UBQ14 TERM GM-UBQ PRO::ZS-YELLOW N1::NOS TERM LB FMV ENH:PSCV ENH:MMV ENH:CAMV35S PRO::HA-WUS::OS-T28 TERM.

Para el tratamiento de control, PHP88193, en el que el ADN-T contiene los casetes de expresión SPCN y ZS-AMARILLO N1 sin casete de expresión WUS, se espera que no se recuperen escapes (plantas T0 no transgénicas regeneradas) debido a la selección rigurosa de espectinomicina, la frecuencia de recuperación de plantas T0 transgénicas será baja (es decir, <1,5 %), el período de tiempo desde la infección por Agrobacterium hasta la recuperación de plántulas T0 tardará generalmente entre 3-4 meses, y la frecuencia de plantas T0 que contienen solo una copia única del ADN-T del rasgo y ninguna estructura principal del vector (plásmido) será baja. Por el contrario, cuando el casete de expresión PRO::WUS 35S potenciado descrito anteriormente se añade al plásmido inmediatamente fuera del LB del ADN-T, después de la transformación mediada por Agrobacterium se espera que i) no se recuperen escapes, ii) aumente la frecuencia de recuperación de plantas T0 transgénicas, iii) se reduzca sustancialmente el período de tiempo desde la infección por Agrobacterium hasta la recuperación de las plantas T0, y iv) aumente sustancialmente la frecuencia de plantas T0 que contienen sólo una copia única del ADN-T rasgos sin WUS integrado o estructura principal de vector (plásmido).

Ejemplo 11: El casete de expresión WUS ubicado 3' hacia el borde izquierdo mejora la recuperación de eventos de soja transgénica que contienen los componentes dentro del ADN-T

Para este experimento, se construyó un vector binario que contenía el origen de replicación PVS1 y un único ADN-T. Se construyó un vector control (PHP80728) con dos casetes de expresión dentro de los bordes derecho e izquierdo del ADN-T. El primer casete de expresión consistió en el promotor UBQ de soja, que impulsa la expresión de TAG-RFP, seguido del terminador UBQ3 de Arabidopsis. El segundo casete de expresión consistió en el promotor SAMS de soja, que impulsa la expresión de un gen ALS resistente a herbicidas (HRA) de soja, y el terminador ALS de soja.

Se construyó un segundo vector (PHP81718) que contenía el mismo gen ALS resistente a herbicidas y casetes de expresión TAG-RFP idénticos situados dentro del ADN-T, y adicionalmente contenía un casete de expresión más allá del borde izquierdo: GM-EF1A PRO::AT-WUS::UBQ14 TERM. Estos dos plásmidos se introdujeron en la cepa AGL1 de Agrobacterium para su comparación.

Tras la transformación de cotiledones inmaduros de soja variedad 93Y21 de Pioneer con el plásmido de ADN-T de control (PHP80728) o con el plásmido de ADN-T WUS más allá del borde izquierdo (PHP81718), los cotiledones se cultivaron durante dos semanas y se transfirieron a medio de maduración M5 complementado con 10 pg/l de clorsulfurón, herbicida selectivo, antes de enviar las plántulas T0 al invernadero. Se tomaron muestras de las plantas T0 y se analizó mediante PCR en cuanto a la presencia de los casetes de expresión ALS, TAG-RFP y WUS.

El plásmido WUS más allá del borde izquierdo de ADN-T (PHP81718) mejoró considerablemente la eficiencia de la embriogénesis somática (véase la FIG. 1), aumentando la eficiencia de la formación de embriones desde un valor mediano inferior al 5 % en el control TA<g>-RFP (PHP80728) a más del 25 % en el tratamiento con WUS (PHP81718). Esto se tradujo directamente en una frecuencia incrementada de embriones somáticos maduros transgénicos capaces de germinar para formar plantas transgénicas T0.

La transformación utilizando el vector de control TAG-RFP (PHP80728) no produjo plantas T0. En comparación, el tratamiento con WUS (PHP81718) produjo algunas plantas T0. Se analizaron seis plantas T0 mediante qPCR y cuatro plantas T0 contenían los casetes de expresión ALS y TAG-RFP, pero carecían de WUS integrado y no presentaban contaminación de la estructura principal del plásmido. Este resultado demostró que WUS podía expresarse transitoriamente tras la administración "transfronteriza" junto con el ADN-T integrado en niveles suficientemente altos como para estimular la formación de embriones somáticos, sin integrarse en el genoma. Esto proporcionó un método eficiente para utilizar WUS en la producción rápida de eventos de soja transgénica (portadores de los rasgos ALS y TAG-RFP) sin tener que extirpar el casete de expresión de WUS, ya que éste sólo se expresaba transitoriamente y nunca se integraba.

Ejemplo 12: Uso de un casete de expresión WUS2 y un casete de expresión RepA del virus del enanismo del trigo fuera de los bordes del ADN-T que contiene rasgos para estimular la transformación y selección de plantas de maíz T0 de copia única que no contenían casetes de expresión WUS2 o RepA

Para estos experimentos, se comparan dos plásmidos. El primero contiene un ADN-T que comprende los siguientes componentes; RB LOXP SI-UBI3 PRO::ZS-VERDET1 ::PINII TERM SB-ALS PRO::ZM-HRA::SB-PEPC1 TERM LB con un casete de expresión adicional inmediatamente más allá del borde izquierdo; ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2:: IN2-1 TERM (Véase PHP86296 en la Tabla 7). El segundo plásmido contiene un A<d>N-T que comprende los siguientes componentes; RB LOXP SI-u Bi PRO::ZS-VERDE1::PINII TERM SB-ALS PRO::ZM-HRA::SB-PEPC1 TERM LB con dos casetes de expresión adicionales inmediatamente más allá del borde izquierdo; ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2:: IN2-1 TERM ZM-PLTP PRO::WDV-RepA::OS-T28 TERM (Véase PHP0002 en la Tabla 7) (WDV-RepA es virus del enanismo del trigo RepA véase la patente de EE.Uu . N° 6.284.947). Para el PH1V69 consanguíneo de tallo rígido de Pioneer, después de la transformación mediada por Agrobacterium con estos ADN-T respectivos, y la selección en 0,05 a 0,1 mg/l de imazapir durante la maduración y regeneración del embrión somático, las plantas T0 se analizaron mediante qPCR. Al utilizar PHP86296, se espera que la frecuencia de recuperación de plantas T0 (en relación con el número de embriones inmaduros iniciales) con una sola copia de los genes de rasgo dentro del ADN-T sin vector (plásmido) sea de aproximadamente el 10 %. Al utilizar PHP0002 en Agrobacterium, se espera que las frecuencias de transformación sean mayores que en el control (PHP86296), que el crecimiento de embriones somáticos transgénicos se acelere y que la frecuencia de recuperación de plantas T0 con una sola copia de los genes de rasgos dentro del ADN-T, que carecen de WUS y RepA integrados y sin estructura principal de vector (plásmido), aumente en relación con el tratamiento control (PHP86296). Se espera que la colocación de los casetes de expresión de WUS2 y RepA fuera del borde izquierdo del ADN-T proporcionará una estimulación necesaria para la transformación sin la integración concomitante de estos casetes de expresión de genes morfogenéticos.

Alternativamente, se espera que un ADN-T que contiene un casete de expresión único fuera del LB que comprende RB SI-UBI PRO::ZS-GREEN::PINII TERM SB-ALS PRO::ZM-HRA::SB-PEPC1 TERM LB ZM-PLTP PRO::WUS2~T2A~WDV-RepA::IN2-1 TERM (PHP0005) sea igualmente eficaz con frecuencias de transformación más altas que el control, con un crecimiento acelerado de embriones somáticos transgénicos y con una frecuencia incrementada de recuperación de plantas T0 que son una sola copia de los genes de rasgos dentro del ADN-T mientras que carecen de WUS y RepA integrados y ninguna estructura principal de vector (plásmido) en relación con el tratamiento de control.

Ejemplo 13: Uso tanto de un casete de expresión WUS2 como de un casete de expresión amiRNA que fijan el objetivo de la transcripción PICKLE (PKL) del maíz fuera de los bordes del ADN-T que contiene rasgos para estimular la transformación y selección de plantas de maíz T0 de copia única que no contenían casetes de expresión WUS2 o RepA

Para estos experimentos, se comparan dos plásmidos. El primero, PHP86296, contiene un ADN-T que comprende los siguientes componentes; RB LOXP SI-UBI3 PRO::Z<s>-VERDE1 ::PINII TERM SB-ALS PRO::ZM-HRA::SB-PEPC1 TERM LB con un casete de expresión adicional inmediatamente más allá del borde izquierdo; ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM.

El segundo plásmido contiene un PHP86296 modificado con un casete de expresión adicional, ZM-PLTP PRO::PKLamiRNA::OS-T28 TERM, fuera del borde izquierdo (PHP0003 en la Tabla 7). El componente PKLamiRNA es un micro-ARN artificial que fija como objetivo una secuencia corta en la transcripción PICKLE (PKL) del maíz, lo cual desestabiliza la transcripción PKL, provocando degradación. Para el PH1V5T consanguíneo de tallo rígido de Pioneer, después de la transformación mediada por Agrobacterium con estos ADN-T respectivos, y la selección en 0,05 a 0,1 mg/l de imazapir durante la maduración y regeneración del embrión somático, las plantas T0 se analizaron mediante qPCR. Se espera que el uso de PHP86296 dará como resultado la recuperación de plantas T0 que son de copia única de los genes de rasgos dentro del ADN-T, y carecerán de WUS y PKLamiRNA integrados y sin estructura principal del plásmido, con una frecuencia de aproximadamente el 1 % (en relación con el número de embriones inmaduros iniciales). Al utilizar PHP0003 en Agrobacterium, se espera que las frecuencias de transformación sean mayores que para PHP86296, el crecimiento de embriones somáticos transgénicos se acelerará y la frecuencia de recuperación de plantas T0 con una copia única de los genes de rasgos dentro del ADN-T, careciendo al mismo tiempo de WUS y RepA integrados y sin estructura principal de plásmido, aumente en relación con el tratamiento con PHP86296.

Cuando se utiliza Agrobacterium, que contiene estos dos plásmidos, para transformar tejido foliar de maíz a partir de PH1V5T endogámico, seguido de selección con 0,05 a 0,1 mg/l de imazapir durante la maduración y regeneración del embrión somático, las plantas T0 se analizan mediante qPCR. Se espera que el uso de PHP86296 permita la recuperación del callo transgénico y que, tras dos o tres semanas, se formen embriones somáticos con una frecuencia de aproximadamente el 1 % (en relación con el número de embriones inmaduros iniciales). Al utilizar PHP0003 en Agrobacterium, se espera que las frecuencias de transformación sean mayores que para PHP86296, los embriones somáticos se formarán rápidamente directamente a partir de las células de las hojas (sin una etapa de callo intermedia) y la frecuencia de recuperación de plantas T0 que son una copia única de los genes de rasgos dentro del ADN-T al tiempo que carecen de WUS y PKLamiRNA integrados y ninguna estructura principal de vector (plásmido) aumentará en relación con el tratamiento con PHP86296.

Ejemplo 14: Uso de un represor de tetraciclina expresado de manera constitutiva fuera de los bordes del ADN-T que contiene rasgos junto con un promotor reprimible que impulsa la expresión de moPAT~DsRED dentro del ADN-T para fomentar la recuperación de eventos resistentes a bialafos de copia única que no contienen el casete de expresión del represor inmediatamente más allá del LB.

Para estos experimentos, el plásmido PHP38042 (Véase la Tabla 7) contiene un ADN-T que comprende los siguientes componentes; RB CAMV35S PRO:3xTET-OP:ADH1 INTRÓN1 ::MO-PAT~DS-RED EXPRÉS::PINII TERM LB UBI1ZM PRO::TET REPRESOR::PINII TERM.

Para el PH1V5T consanguíneo de tallo rígido de Pioneer, después de la transformación mediada por Agrobacterium con este ADN-T, y la selección en 3,0 mg/l de bialafos durante la maduración y regeneración del embrión somático, las plantas T0 se analizan mediante qPCR. Se espera que el uso de PHP38042 dará como resultado la recuperación de plantas T0 que son de copia única de los genes de rasgos dentro del ADN-T, y carecerán de REPRESOR TET sin estructura principal del plásmido, con una frecuencia de aproximadamente 3-5 % en relación con el número de embriones inmaduros iniciales), y plantas T0 que carecen del REPRESOR TET integrado serán tolerantes a herbicidas y expresarán DS-RED.

Ejemplo 15: Uso de un casete de expresión WUS2 y un casete de expresión de fusión dCAS~Represor (REP) expresado constitutivamente fuera de los bordes del ADN-T que contiene el gen de rasgos para estimular la transformación y selección de plantas de maíz T0 de copia única que no contienen casetes de expresión WUS2 o RepA

Para estos experimentos, se comparan dos plásmidos. El primero contiene un ADN-T que comprende los siguientes componentes: RB SI-UBI3 PRO::ZS-GREEN1::PINII TERM SB-ALS PRO::ZM-HRA::SB-PEPC1 TERM LB (el plásmido control) El segundo plásmido contiene los mismos componentes dentro del ADN-T (RB SI-UBI3 PRO::ZS-GREEN1 ::PINII TERM SB-ALS PRO::ZM-HRA::SB-PEPC1 TERM LB) más tres casetes de expresión adicionales inmediatamente más allá del borde izquierdo: i) un casete de expresión que contiene ZM-U6 PRO::gRNA::ZM-U6 TERM; ii) casete de expresión ZM-UBI PRO::dCAS9~REP::PINII TERM; y Ni) un casete de expresión PLTP PRO::ZM-w Us 2:: IN2-1 TERM (el plásmido de prueba). El ARNg del primer casete de expresión se diseñó para fijar como objetivo el dCAS9~REP a la secuencia SB-ALS PRO, que silencia transcripcionalmente la expresión de HRA y hace que la célula sea sensible al imazapir.

Para el HC69 consanguíneo de tallo rígido de Pioneer, después de la transformación mediada por Agrobacterium con la cepa LBA4404 THY- de Agrobacterium que contiene el plásmido control, durante la maduración y regeneración del embrión somático, se analizaron las plantas T0 mediante qPCR. Al utilizar el plásmido control en Agrobacterium, se espera que la frecuencia de recuperación de plantas T0 (en relación con el número de embriones inmaduros infectados con Agrobacterium) con una copia única de los genes de rasgos dentro del ADN-T sin la estructura principal de vector (plásmido) será de aproximadamente el 5 %. Al utilizar el plásmido de prueba en Agrobacterium, se espera que las frecuencias de transformación sean mayores que en el control, el crecimiento de embriones somáticos transgénicos se acelerará y la frecuencia de recuperación de plantas T0 con una copia única de los genes de rasgos dentro del ADN-T, careciendo de WUS y dCAS9~REP integrados y sin estructura principal del vector (plásmido), aumentará en comparación con el tratamiento control. Se espera que la colocación de los casetes de expresión de dCAS9~REP y WUS2 fuera del borde izquierdo del ADN-T proporcionará una estimulación mejorada para la transformación sin la integración concomitante de estos casetes de expresión de genes morfogenéticos.

Alternativamente, se puede utilizar una nucleasa de dedos de zinc sintética fusionada a un dominio represor en lugar del ARNg y dCAS9~REP (Urritia et al., 2003, Genome Biol. 4:231) en el ejemplo anterior.

Ejemplo 16: Transformación de Algodón

Semillas de algodón deshilachado(Gossypium hirsutum)cv. Coker 310 y 312 se esterilizaron superficialmente utilizandoercial al 40 % (v/v; 80 ml de lejía y 120 ml de agua) y 1 gota de Triton X-100 durante 30 min y se enjuagaron con agua estéril tres veces con intervalos de 2 minutos. Tras el tratamiento con lejía, las semillas se enjuagaron con etanol al 95 % durante 1 minuto y se volvieron a enjuagar 3 veces con agua estéril. A continuación, las semillas se colocaron en una toalla de papel estéril para secar las semillas.

Se germinaron veinte semillas esterilizadas en superficie en 'Cotton Seed Medium' (CSM; (GH3210)) que contenía 1/2 concentración de sales MS (2,2 g/L), 1/2 concentración de vitaminas B5, 0,9 g/L de cloruro de magnesio hexahidrato, 15 g/L de glucosa, 3,6 g/L de Phytagel (Sigma)) con un pH ajustado a 5,8, a 28 °C, con 5 semillas por bandeja fitata, y se incubaron en oscuridad durante aproximadamente 7-9 días.

Después de aproximadamente 3 días, las cubiertas de las semillas se abrieron y emergieron las radículas. Las cubiertas de las semillas se retiraron utilizando pinzas estériles, presionando suavemente la punta redondeada (chalazas) de todas las semillas en la superficie del medio para exponer los cotiledones plegados, y las radículas se insertaron en el medio. Las bandejas fitata se incubaron nuevamente a 28 °C para completar la germinación. Después de 8 días, se cortaron los hipocótilos y los explantes de cotiledones de las plántulas utilizando tijeras. Los explantes de hipocótilos y cotiledones se colocaron en una placa de Petri estéril y, utilizando una hoja de bisturí, se cortaron en segmentos de 0,9 cm (para los hipocótilos) y de 0,5 cm2 (para los cotiledones). Luego, los segmentos se colocaron en una placa Petri estéril de 100 x 25 mm (anchura x profundidad) con 35 ml de medio de co-cultivo líquido (sales MS, vitaminas B5, 30 g/L de glucosa, 0,9 g/L de cloruro de magnesio hexahidrato, 1,9 g/L de nitrato de potasio, 0,1 g/L de mio-inositol, pH 5,8) en preparación para el tratamiento conAgrobacterium.

En este experimento, el plásmido PHP89484 contenía el ADN-T con los siguientes componentes: RB AT-UBQ10 PRO::CTP::SPCN::UBQ14 TERM GM-UBQ PRO::DS-RED2::UBQ3 TERM LB CAMV35S PRO::HAWUS::OS-T28 TERM FMC ENH::PCSV ENH::MMV ENH. El plásmido de control (PHP88193), en el que no estaba presente un casete de expresión de WUS, contenía un ADN-T con los siguientes componentes: RB AT-UBQ10 PRO::CTP::SPCN::UBQ14 TERM GM-UBQ PRO::ZS-YELLOW1 N1 ::NOS TERM LB.

La cepa LBA4404 deAgrobacterium,que contenía PHP89484, se preparó en medio mínimo 810K más 100 qg/ml de espectinomicina y 200 qM de acetosiringona. El cultivo deAgrobacteriumse cultivó en una incubadora con agitación a 28 °C y 280 rpm durante la noche hasta alcanzar una DO a 600 nm de 0,6-0,8. Las células bacterianas se sedimentaron mediante centrifugación a 4000 rpm durante 15 min y se resuspendieron en medio 700A hasta alcanzar una DO600 final de 0,6. Se añadieron cuarenta ml de la solución deAgrobacteriuma cada una de las placas de Petri que contenían los segmentos cortados y se incubó durante 30 minutos con agitación intermitente.

Tras la infección, se colocaron aproximadamente 50 segmentos de hipocótilo o 50 explantes de cotiledón en placas de Petri con medio de co-cultivo sólido 710I y se cubrieron con papel de filtro estéril. El co-cultivo se llevó a cabo durante cuatro días a 28 °C con baja luminosidad (5 qE) y un fotoperiodo de 16 h. Posteriormente, los explantes se transfirieron directamente a la superficie de un medio de inducción de callos (CIM) (sales MS, vitaminas B5, 30 g/L de glucosa, 0,9 g/L de cloruro de magnesio hexahidrato, 1,9 g/L de nitrato de potasio, 0,1 g/L de mio-inositol, 0,1 mg/L de kinetina, 0,1 mg/L (0,45 qM) de 2,4-D, 500 mg/L de carbenicilina, 3,6 g/L de Phytagel (pH 5,8)) sin agente de selección. Después de 14 días los explantes fueron transferidos a CIM con 60 mg/l de espectinomicina.

Tras 7 días de tratamiento con Agro, se observó una expresión transitoria de RFP con un estereomicroscopio de epifluorescencia. Se observaron focos de DS-RED con fuerte expresión en explantes de cotiledón e hipocótilo en toda la superficie de corte. Se observó la expresión de DS-RED en callos estables, que mostraron estructuras multicelulares que expresaban DS-RED después de 3 semanas. En comparación, al utilizar un ADN-T de control (en PHP88193) en la misma cepa y bajo las mismas condiciones experimentales, la administración de ADN-T fue similar en base a la fluorescencia, pero tres semanas después del tratamiento con Agro, no se observó crecimiento de estructuras multicelulares.

Ejemplo 17: El uso de potenciadores virales con LTP2 PRO de cebada para impulsar la expresión de WUS2 mejora adicionalmente la recuperación de eventos transgénicos de copia única solo para el ADN-T "Rasgo".

La cepa LBA4404 THY- deAgrobacterium,que contiene el plásmido de virulencia PHP71539 (SEQ ID NO: 132), se utilizó en todos los tratamientos. PHP86491 (SEQ ID NO: 110), que contiene un ADN-T con los casetes de expresión "Rasgo" (RB SB-UBI PRO::ZS-GREEN1 ::OS-UBI TERM SB-ALS PRO::ZM-HRA::PINII TERM LB) se utilizó también en todos los tratamientos. Como control negativo, el Tratamiento 1 (Trt. N° 1), se utilizó una sola cepa deAgrobacterium(Agro1) que contenía únicamente PHP86491. Como control positivo, el Tratamiento 2 (Trt. n.° 2), una segunda cepa deAgrobacterium(Agro2) que contenía PHP88158 (SEQ ID NO: 109) (RB FMV ENH:PSCV ENH:MMV ENH:ZM-PLTP PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM NOS PRO::CRC::SB-GKAF TERM LB) se mezcló con Agro1. Las dos suspensiones deAgrobacteriase ajustaron a 0,7 DO550 y luego se mezclaron en una relación de 90 % de Agro1 y 10 % de Agro2. En un tercer tratamiento, el Tratamiento 3 (Trt. N° 3), PHP93161 (SEQ ID NO: 130) (RB LOXP FMV ENH:PCSV ENH:MMV ENH::LTP2 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM NOS PRO::CRC::SB-GKAF TERM LB) se utilizó para reemplazar PHP88158 en Agro2, y la relación de Agro1/Agro2 se mantuvo igual tanto en Trt. N° 2 como en Trt. N° 3 (90 %/10 %).

En Trt. N° 1, trescientos cincuenta y ocho (358) embriones inmaduros de HC69 endogámicos se infectaron con la mezcla deAgrobacteriumy se produjeron noventa y una (91) plantas transgénicas T0 (25 % de frecuencia de transformación), de las cuales el 11 % eran de copia única para los rasgos (en relación con el número inicial de embriones). En Trt. N° 2, tanto la frecuencia de transformación como la frecuencia de copia única mejoraron en comparación con el Trt. N° 1 (del 25 % al 31 % y del 11 % al 16 %, respectivamente). La mejora en el valor final de "% de copia única para Rasgos" fue la medida definitiva del éxito en términos de entrega de plantas transgénicas fértiles de alta calidad al invernadero. Este valor se vio afectado por los resultados de un cierto número de etapas individuales durante el proceso, incluyendo la frecuencia de transformación inicial (producción de una célula transgénica), la frecuencia de regeneración (producción de una planta a partir de la célula transgénica) y, finalmente, el análisis molecular. El análisis molecular confirmó que las plantas transgénicas i) eran eventos de integración independientes, ii) contenían una sola copia del ADN-T deseado y sus casetes de expresión de rasgos compuestos, iii) no contenían ADN-T con el casete de expresión de genes morfogenéticos y iv) no contenían secuencias de la estructura principal del plásmido deAgrobacterium.Cada uno de estos resultados (frecuencia de transformación, frecuencia de regeneración y frecuencia de control de calidad molecular) contribuyó a la atrición a lo largo del proceso y se resume mediante las frecuencias de "% de copias únicas para rasgos", como se muestra en la Tabla 12. Debido a la importancia de este resultado final - la frecuencia de producción de plantas T0 fértiles de alta calidad - una mejora del 11 % en Trt. N° 1 al 16 % en Trt. N° 2 representó una mejora importante y sustancial en la eficiencia de transformación global de esta valiosa cepa endogámica de Pioneer.

Como se describió arriba, en PHP93161 (SEQ ID NO: 130), el promotor utilizado para expresar el gen ZM-WUS2 se cambió del promotor ZM-PLTP en el Trt. N° 2 al promotor<l>T<p>2 (Kalla et al., 1994, The Plant J. 6:849-860) en el Trt. N° 3. Ambos promotores vegetales en Trt. N° 2 y en Trt. N° 3 fueron precedidos por tres elementos potenciadores del promotor de tres virus separados, a saber, el virus del mosaico de la escrofularia, el virus de la estría clorótica del cacahuete y el virus del mosaico de Mirabilis (las tres secuencias de elementos potenciadores, en este orden, se abrevian como "3xENH" en la Tabla 12). Cuando se utilizó el promotor LTP2 en el Trt. N° 3, las frecuencias de transformación y de "% de copia única para rasgos" aumentaron con respecto al Trt. N° 2 (del 31 % al 45 % y del 16 % al 24 %, respectivamente). Esto demostró la utilidad de diferentes promotores en esta estrategia. Además, reforzó la conclusión alcanzada al comparar Trt N° 1 con Trt. N° 2; al mezclar unaAgrobacterium(que contiene casetes de expresión de rasgos en el ADN-T) con otraAgrobacterium(que contiene el casete de expresión de genes morfogenéticos en el ADN-T), la frecuencia general de producción de plantas T0 fértiles de alta calidad (eventos independientes basados en la caracterización por PCR) aumentó en comparación con el uso de una solaAgrobacteriumque contiene el ADN-T y solo rasgos.

Tabla 12.

La Tabla 12 muestra las eficiencias de transformación cuando no estaba presente Agro2 (casete de expresión de genes morfogenéticos), como en el caso de Trt. N° 1, o con Agro2 que contenía un casete de expresión de genes WUS2 con dos promotores diferentes (Trt. N° 2 y Trt. N° 3). La frecuencia de transformación se calculó en base al número de plantas T0 transgénicas (T nx) recuperadas en relación con el número inicial de embriones inmaduros. El análisis de copias individuales para los genes de rasgo (ZS-GREEN1 Y HRA) y para el gen morfogenético (WUS2) se determinó utilizando PCR cuantitativa para determinar la presencia de genes y el número de copias. Plantas T0 que contenían solo una copia única de los genes de rasgo sin el gen WUS2 se utilizaron para calcular los valores de "% de copias individuales para rasgos" en relación con el número inicial de embriones inmaduros.

Ejemplo 18: El uso de una mezcla de una Agrobacterium que contiene rasgos y una Agrobacterium que contiene genes morfogenéticos mejoró la transformación del eje del embrión de girasol

La cepa LBA4404 THY- deAgrobacteriumse utilizó para la transformación de girasol (variedad F1503LG deHelianthus annuus).Semillas de girasol maduras y secas se esterilizaron en una solución de lejía (10-15 % v/v en agua con una gota de detergente Tween) durante quince (15) minutos y luego se enjuagaron tres (3) veces en agua estéril. Las semillas se remojaron durante la noche. Los embriones se retiraron de las cáscaras ablandadas. Una vez aislados los embriones, se realizaron incisiones en la base de los cotiledones para facilitar el aislamiento del embrión, exponiendo de ese modo los primordios de las hojas que recubren el meristemo apical. La punta radical se dejó unida al embrión. Después del aislamiento, los ejes embrionarios (EA) se transfirieron a placas de Petri para la infección. DosAgrobacteria(conteniendo cada una un plásmido de ADN-T diferente) se suspendieron en un medio de infección líquido. La primeraAgrobacteriumalbergaba el plásmido PHP92349 (SEQ ID NO: 131) con un ADN-T que contenía casetes de expresión "Rasgo" para los genes SPCN (resistencia a espectinomicina) y DS-RED2 (fluorescencia), específicamente que contenía<r>B LOXP GM-QBU P<r>O::CTP:SP<c>N::UBQ14 TE<r>M GM-EF1A2 PRO::DS-R<e>D2::UBQ3 TERM LOXP LB. La segundaAgrobacteriumalbergaba PHP90094 con un ADN-T que contenía un casete de expresión de genes morfogenéticos para HA-WUS, específicamente que contenía RB CAMV35S PRO::HA-WUS::OS-T28 TERM FMV ENHANCER:PCSV ENHANCER:MMV ENHANCER LB. Cada una de las cepas deAgrobacteriumse suspendió en medio 20A y la concentración de las suspensiones bacterianas se ajustó a 0,5 DO550. Las suspensiones deAgrobacteriumse mezclaron en una relación 1:1 y se añadieron cinco (5) ml de la suspensión a los EA para cubrir los explantes. A continuación, los EA se sometieron a vacío con agitación suave durante veinte (20) minutos. Los EA se retiraron de laAgrobacteriumy se insertaron con el extremo radicular hacia abajo en un medio 272AC (sales MS estándar y niveles de vitaminas (Murashige y Skoog, 1962, Physiol. Plant 15:473-497), 0,1 g/l de mio-inositol, 50 mg/l de timidina, 100 uM de acetosiringona, 0,1 mg/l de BAP, 40 g/l de sacarosa, 6 g/l de Bacto Agar, pH 5,6), dejando la cúpula apical por encima del medio 272AC y se colocaron bajo luz tenue a 21 °C durante tres días de co-cultivo. Después del co cultivo, los EA se transfirieron a un medio de selección de espectinomicina 272AB (sales MS estándar y niveles de vitaminas (Murashige y Skoog, 1962, Physiol. Plant 15:473-497), 0,1 g/l de mio-inositol, 10 mg/l de meropenum, 0,1 mg/l de meta-topolina, 30 mg/l de dihidrocloruro de espectinomicina, 0,1 ug/l, 40 g/l de sacarosa, 6 g/l de Bacto Agar, pH 5,6) bajo plena luz a 28 °C.

Se permitió el crecimiento de los EA, con recortes periódicos de las hojas blanqueadas. Aproximadamente tres semanas después de la exposición a la espectinomicina, se observaron sectores verdes u hojas verdes completas. Este tejido verde también expresó DS-RED, lo que confirmó la integración del ADN-T de PHP92349. Para el enraizamiento, los eventos transgénicos se transfirieron a un material de enraizamiento Bio-Dome Sponge (Park Seed Co., 3507 Cokesbury Road, Hodges, SC). Tras la transferencia al material de enraizamiento Bio-Dome Sponge, las raíces se formaron en un plazo de una a tres semanas y las plantas se trasplantaron al invernadero o a cámaras de crecimiento.

En el experimento control, cuando se utilizó un único plásmido PHP92349 deAgrobacteriumque contenía "Rasgo", se recuperaron únicamente tres (3) plantas transgénicas T0 de ochocientos veintitrés (823) EAinfectados con Agrobacterium, lo que resultó en una frecuencia de transformación del 0,4 %. Al utilizar la mezcla 1:1 deAgrobacteriumquecontenía PHP92349 (casete de expresión "Rasgo") yAgrobacteriumque contenía PHP90094 (un casete de expresión del gen morfogenético (WUS)), se recuperaron seis plantas transgénicas T0 de trescientos setenta (370) EAinfectados con Agrobacterium,lo que resultó una frecuencia de transformación del 1,6 %. Adicionalmente, ninguna de las plantas transgénicas T0 que contenía "Rasgo" contenía el casete de expresión del gen morfogenético (WUS). Esto demostró que el uso de una mezcla de dosAgrobacteriapara conferir la ventaja de la estimulación morfogénica sin la integración del casete de expresión de genes morfogenéticos mejoró la eficiencia de la transformación en el girasol.

Ejemplo 19: Co-entrega de dos plásmidos de ADN-T de una cepa bacteriana

Una alternativa a la administración de casete(s) de expresión de genes de rasgo y casete(s) de expresión de genes morfogenéticos utilizando una mezcla de dosAgrobacteria(cada una conteniendo uno de los dos plásmidos), es utilizar una solaAgrobacteriumque contenga dos ADN-T diferentes. Esto se logra construyendo un solo plásmido que contenga dos ADN-T o utilizando dos plásmidos separados con uno que contenga un casete(s) de expresión de genes de rasgo de ADN-T y el otro plásmido que contenga un casete de expresión de genes morfogenéticos de ADN-T. Las variedades endogámicas de maíz varían en muchas características morfológicas y fisiológicas. Una manifestación de esta variabilidad es la susceptibilidad del escutelo embrionario inmaduro de diferentes variedades endogámicas a la administración e integración del ADN-T durante la infección y el co-cultivo conAgrobacterium. Por ejemplo, cuando se utilizan mezclas de plásmidos en dos cepas bacterianas para transformar la cepa endogámica HC69 de tallo no rígido, muchas células reciben sólo uno de los plásmidos y, por lo tanto, no se estimulan para formar rápidamente nuevos embriones somáticos ni para producir eventos transgénicos con un rasgo. En lugar de utilizar diferentes relaciones de Agro1 :Agro2 para la administración de las mezclas de plásmidos, la administración de mezclas de plásmidos de la misma célula bacteriana puede resultar en una mayor frecuencia de células que reciben ambos ADN-T y permitir una mayor frecuencia de producción de eventos transgénicos. Cuando se utiliza para la transformación, se espera que se produzca una mayor frecuencia de embriones somáticos de rápida formación y plantas T0 resultantes que contengan un casete de expresión de genes de rasgo de una sola copia ADN-T, sin ADN vector (plásmido) y sin integración del ADN-T del casete de expresión de genes morfogenéticos.

Ejemplo 20: Uso de plásmidos de ADN-T con diferentes orígenes de replicación para modular el número de copias del plásmido

Para estos experimentos, se administran dos ADN-T diferentes en relaciones variables (entre sí) desde una sola célula bacteriana al albergar estos ADN-T dos plásmidos con diferentes orígenes de replicación (ORI). Los diferentes ORI varían en el número de plásmidos mantenidos con una célula bacteriana. Los diferentes ORI se pueden utilizar para titular el número de copias del plásmido para lograr diferentes relaciones de los plásmidos en la misma célula bacteriana En este experimento se diseña un plásmido que tiene uno o más ORI seleccionados de los siguientes ORI: BBR1 ORI; PSA ORI; PSA PARDE ORI; PVS1 ORI; repABC ORI; RK2 ORI; RK2+PARDE ORI; o RSF1010 ORI (Publicación de Patente de EE.UU. 20180216123 y documento WO2017078836) que residen dentro de la misma célula bacteriana. Dentro de estos diversos ORI, se determinó previamente que pVS1 confiere un número alto de copias de plásmido (~20 copias/célula) y repABC confiere un número bajo de copias (~1-2 copias/célula) enAgrobacterium(Zhi et al., 2015, Plant Cell Rep. 34:745-754).

Tabla 13.

Para validar este concepto, se construye un primer plásmido con un ORI que resulta en un alto número de copias (pVS1) y un ADN-T que contiene casetes de expresión de genes de rasgos, tales como ZS-GREEN y HRA. Se construye un segundo plásmido con un ORI que resulta en un bajo número de copias (repABC) y un ADN-T que contiene un casete de expresión de genes morfogenéticos (WUS2). Ambos plásmidos se introducen en una solaAgrobacterium.Cuando los plásmidos que residen en la misma célula bacteriana se injertan simultáneamente en la misma célula vegetal, la relación relativa de ADN-T injertados reflejará la proporción estable de estos plásmidos en laAgrobacterium.

De esta manera, se produce un efecto similar cuando se compara con el método de mezclar dosAgrobacteriadiferentes que contienen un casete de expresión de genes de rasgo de ADN-T o un casete de expresión de genes morfogenéticos de ADN-T (es decir, en una mezcla 90 %/10 % de Agro1 y Agro2). Similar al método de mezcla deAgrobacterium, la administración de mezclas de plásmidos de la misma cepa bacteriana puede resultar en una mayor frecuencia de células que reciben ambos ADN-T y permitir una mayor frecuencia de transformación. Cuando se utiliza para la transformación, se espera que se produzca una mayor frecuencia de embriones somáticos de rápida formación y plantas T0 resultantes que contengan un casete de expresión de genes de rasgo de una copia única ADN-T, sin ADN vector (plásmido) y sin integración del ADN-T del casete de expresión de genes morfogenéticos.

Ejemplo 21. Uso de un casete de expresión de genes represores fuera del ADN-T para reprimir la expresión de un marcador seleccionable dentro del ADN-T

Se utiliza la cepa LBA4404 THY- deAgrobacteriumque alberga un ADN-T plasmídico que contiene un marcador seleccionable reprimible/desreprimible, además de un casete de genes de expresión represor cognado fuera del ADN-T. Por ejemplo, el plásmido deAgrobacteriumcontiene el siguiente ADN-T: RB CAMV35S PRO:TOP3::NPTII::PINII TERM LB, en que TOP3 indica que el promotor CAMV35S tiene tres secuencias de unión al represor de tetraciclina (secuencias operadoras) que rodean la caja TATA y se solapan al sitio de inicio de la transcripción, y UBI1ZM PRO::TETR::PINII situado fuera del borde izquierdo. Además de los casetes de expresión descritos en la configuración anterior, se puede añadir un casete de expresión de genes de rasgo (utilizando el rasgo ejemplar ZS-GREEN1) dentro del ADN-T y un casete de expresión de genes morfogenéticos (utilizando WUS2) fuera del ADN-T, lo que da como resultado el siguiente plásmido deAgrobacterium:RB SB-UBI PRO::ZS-GREEN1 ::OS-UBI TERM CAMV35S PRO:TOP3::NPTII::PINII TERM LB UBI1ZM PRO::TETR::PINII PLTP::WUS2::In2-1 TERM (abreviado RB ZS-GREEN REPRESIBLE NPTII LB TETR WUS2).

Esta segunda configuración (RB ZS-GREEN REPRESIBLE NPTII LB TETR WUS2) se introduce mediante infección conAgrobacteriumen embriones inmaduros de maíz de HC69 endogámico. En la mayoría de los eventos transgénicos recuperados, se espera que sólo se integre el ADN-T (que contiene el casete de expresión del gen de rasgo y el casete de expresión del gen marcador seleccionable), mientras que los casetes de expresión de los genes TETR y WUS2 no se integran, lo que resulta en una expresión transitoria de los genes TETR y WUS2. Por lo tanto, la formación de embriones somáticos estimulada por WUS2 aumenta la frecuencia de transformación, mientras que la expresión transitoria de TETR resulta en una represión temporal de la expresión de NPTII. Después de una semana en cultivo después de la infección, las células transgénicas se transfieren a un medio de cultivo que contiene 150 mg/l de G418. Se espera que la formación de embriones somáticos que contienen el ADN-T integrado (con el casete de expresión del gen de rasgo y el casete de expresión del gen marcador seleccionable) se seleccionen fácilmente y se produzcan altas frecuencias de plantas transgénicas fértiles.

Ejemplo 22. Uso de un casete de expresión dCAS9:Represor-Fusion fuera del ADN-T para reprimir la expresión de un marcador seleccionable dentro del ADN-T

Se utiliza la cepa LBA4404 THY- deAgrobacteriumque alberga un ADN-T plasmídico que contiene un promotor constitutivo que impulsa la expresión de un marcador seleccionable, además de un casete de expresión represor represor dCAS9 fuera del ADN-T. Por ejemplo, el plásmido deAgrobacteriumcontiene el siguiente ADN-T: RB UBI1ZM PRO::NPTII::PINII TERM LB y UBI1ZM PRO::dCAS:EAR::PINII situado fuera del borde izquierdo, en que EAR indica una secuencia que codifica un péptido represor condensado en marco a dCAS9. Además de los casetes de expresión descritos en la configuración anterior, se puede añadir un casete de expresión de genes de rasgo (utilizando el rasgo ejemplar ZS-GREEN1) dentro del ADN-T y un casete de expresión de genes morfogénicos (utilizando WUS2) fuera del ADN-T, lo que da como resultado el siguiente plásmido deAgrobacterium:RB SB-UBI PRO::ZS-GREEN1 ::OS-UBI TERM CAMV35S PRO:TOP3::NPTII::PINII TERM LB UBI1ZM PRO::dCAS9:EAR::PINII zmu6 pro::gRNA::ZMU6 TERM PLTP::WUS2::In2-1 TERM (abreviado RB ZS-GREEN REPRESIBLE NPTII LB dCAS9:EAR gRNA WUS2).

La segunda configuración (RB ZS-GREEN REPRESIBLE NPTII LB dCAS9: EAR gRNA WUS2) se introduce mediante infección conAgrobacteriumen embriones inmaduros de maíz de HC69 endogámico. En la mayoría de los eventos transgénicos recuperados, se espera que sólo se integre el ADN-T (que contiene el casete de expresión del gen de rasgo y el casete de expresión del gen marcador seleccionable), mientras que los casetes de expresión de los genes dCAS9:EAR y WUS2 no se integran, lo que resulta en una expresión transitoria de los genes dCAS9:EAR y WUS2. Por lo tanto, la formación de embriones somáticos estimulada por WUS2 aumenta la frecuencia de transformación, mientras que la expresión transitoria de dCAS9:EAR resulta en una represión temporal de la expresión de NPTII. Después de una semana en cultivo después de la infección, las células transgénicas se pueden transferir a un medio de cultivo que contiene 150 mg/l de G418. Se espera que la formación de embriones somáticos que contienen el ADN-T integrado (con el casete de expresión del gen de rasgo y el casete de expresión del gen marcador seleccionable) se seleccionen fácilmente y se produzcan altas frecuencias de plantas transgénicas fértiles.

Como se usa en este documento, las formas singulares "uno", "una", y "el", "la" incluyen referentes plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, una referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y una referencia a "la proteína" incluye referencias a una o más proteínas y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, y así sucesivamente. Todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece esta divulgación salvo que se indique claramente lo contrario.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una planta transgénica que tiene una copia de un casete de expresión de un gen de rasgo que comprende:

(a) poner en contacto una célula vegetal:

(i) simultáneamente con un ADN-T que contiene un casete de expresión de un gen de rasgo en una primera cepa bacteriana y un ADN-T que contiene un casete de expresión de un gen morfogénico en una segunda cepa bacteriana; o

(ii) con una cepa bacteriana que contiene un plásmido que comprende un casete de expresión de genes de rasgo dentro del ADN-T y un casete de expresión de genes morfogénicos fuera del ADN-T;

(b) seleccionar una célula vegetal que contenga el casete de expresión del gen de rasgo y ningún casete de expresión del gen morfogénico; y

(c) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido homeobox WUS/WOX; o

(iii) una combinación de (i) y (ii).

3. El método de la reivindicación 2, en el que:

(A) la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX:

Preferiblemente, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX se selecciona de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 y WOX9;

(B) la secuencia de nucleótidos codifica el polipéptido Babyboom (BBM) o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2);

preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido Babyboom (BBM) se selecciona de BBM2, BMN2 y BMN3 o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2) es ODP2;

(C) la secuencia de nucleótidos codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX y el polipéptido Babyboom (BBM) o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2);

preferiblemente, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX se selecciona de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 y WOX9, y el polipéptido Babyboom (BBM) se selecciona de BBM2, BMN2 y BMN3, o el polipéptido de la proteína de desarrollo del óvulo 2 (ODP2) es ODP2; o (D) el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende, además, un promotor seleccionado de la Tabla 4 o la Tabla 5;

preferiblemente, en donde el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende:

(a) un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS;

(b) un promotor HBSTART3 enlazado operativamente a un gen WUS;

(c) un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS y un promotor de ubiquitina enlazado operativamente a un gen LEC1;

(d) un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS y un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen LEC1;

(e) un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS condensado a una fusión del gen LEC1 del péptido viral T2A;

(f) una secuencia potenciadora viral o vegetal;

(g) un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS condensado a una fusión del gen BBM del péptido viral T2A;

(h) un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS condensado a una fusión del gen RepA del péptido viral T2A; o

(i) un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS y un promotor PLTP enlazado operativamente a una fusión PKLamiRNA.

4. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que el casete de expresión de genes de rasgos comprende: un gen de rasgo seleccionado del grupo de un gen que confiere resistencia a plagas, un gen que confiere resistencia a herbicidas, un gen que confiere tolerancia al estrés, un gen que confiere resistencia a la sequía, un gen que confiere eficiencia en el uso del nitrógeno (NUE), un gen que confiere resistencia a enfermedades y un gen que confiere una capacidad para alterar una vía metabólica.

5. El método de la reivindicación 1, que comprende poner en contacto simultáneamente una célula vegetal con un ADN-T que contiene el casete de expresión de un gen de rasgo en una primera cepa bacteriana y un ADN-T que contiene el casete de expresión de un gen morfogenético en una segunda cepa bacteriana, en donde:

(A) la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana son la misma cepa bacteriana; preferiblemente, en donde la misma cepa bacteriana es una Rhizobiales seleccionada del grupo deAgrobacteriadesarmada, una bacteriaOchrobactrumy una bacteriaRhizobiaceae;

más preferiblemente en el que:

(a) laAgrobacteriadesarmada se selecciona del grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 y LBA4404 THY-; (b) la bacteriaOchrobactrumse selecciona de la Tabla 2; o

(c) en donde la bacteriaRhizobiaceaese selecciona de la Tabla 3; o

(B) la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana son cepas bacterianas diferentes; preferiblemente, en donde las diferentes cepas bacterianas se seleccionan de:

(a) unaAgrobacteriadesarmada y una bacteriaOchrobactrum;

(b) unaAgrobacteriadesarmada y una bacteriaRhizobiaceae;y

(c) una bacteriaRhizobiaceaey una bacteriaOchrobactrum;

más preferiblemente en el que:

(i) laAgrobacteriadesarmada se selecciona del grupo de AGL-1, EHA105, GV3101, LBA4404 y LBA4404 THY-; (ii) la bacteriaOchrobactrumse selecciona de la Tabla 2; o

(iii) la bacteriaRhizobiaceaese selecciona de la Tabla 3;

y/o en donde la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana están presentes en:

(a) una relación 50:50;

(b) una relación 75:25;

(c) una relación 90:10;

(d) una relación 95:5; o

(e) una relación 99:1.

6. Un método para producir una planta transgénica que tiene una copia de un casete de expresión de un gen de rasgo que comprende:

en donde el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende:

(iii) una combinación de (i) y (ii);

en donde el casete de expresión del gen de rasgo comprende:

regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal.

7. El método de la reivindicación 6, en el que:

(I) la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX;

(II) la secuencia de nucleótidos codifica el polipéptido Babyboom (BBM) o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2);

preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido Babyboom (BBM) se selecciona de BBM2, BMN2 y BMN3 o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2) es OD<p>2;

(III) la secuencia de nucleótidos codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX y el polipéptido Babyboom (BBM) o el polipéptido de la proteína de desarrollo de óvulos 2 (ODP2);

preferiblemente, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX se selecciona de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 y WOX9, y el polipéptido Babyboom (BBM) se selecciona de BBM2, Bm N2 y BMN3, o el polipéptido de la proteína de desarrollo del óvulo 2 (o Dp2) es ODp2; (IV) la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana son la misma cepa bacteriana o cepas bacterianas diferentes;

preferiblemente en el que:

(A) la misma cepa bacteriana es una Rhizobiales seleccionada del grupo de unaAgrobacteriadesarmada, una bacteriaOchrobactrumy una bacteriaRhizobiaceae;

más preferiblemente en el que:

(c) la bacteriaRhizobiaceaese selecciona de la Tabla 3; o

(B) las diferentes cepas bacterianas se seleccionan de:

(a) unaAgrobacteriadesarmada y una bacteriaOchrobactrum;

(b) unaAgrobacteriadesarmada y una bacteriaRhizobiaceae;y

(c) una bacteriaRhizobiaceaey una bacteriaOchrobactrum;

más preferiblemente en el que:

(iii) la bacteriaRhizobiaceaese selecciona de la Tabla 3; o

(C) la primera cepa bacteriana y la segunda cepa bacteriana están presentes en:

(a) una relación 50:50;

(b) una relación 75:25;

(c) una relación 90:10;

(d) una relación 95:5; o

(e) una relación 99:1; o

(V) el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende, además, un promotor seleccionado de la Tabla 4 o la Tabla 5;

(a) un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS;

(b) un promotor HBSTART3 enlazado operativamente a un gen WUS;

(f) una secuencia potenciadora viral o vegetal;

8. Un método para producir una planta transgénica que tiene una copia de un casete de expresión de un gen de rasgo que comprende:

en donde el casete de expresión génica morfogénica comprende:

(iii) una combinación de (i) y (ii);

en donde el casete de expresión del gen de rasgo comprende:

regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal; o

en donde el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende:

(iii) una combinación de (i) y (ii);

en donde el casete de expresión del gen de rasgo comprende:

regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal.

9. El método de la reivindicación 8, en el que:

(A) la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX:

preferiblemente, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido homeobox WUS/WOX se selecciona de WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 y WOX9, y el polipéptido Babyboom (BBM) se selecciona de BBM2, BMN2 y BMN3, o el polipéptido de la proteína de desarrollo del óvulo 2 (ODP2) es ODP2; (D) la misma cepa bacteriana es una Rhizobiales seleccionada del grupo de unaAgrobacteriadesarmada, una bacteriaOchrobactrumy una bacteriaRhizobiaceae;

preferiblemente en el que:

(c) la bacteriaRhizobiaceaese selecciona de la Tabla 3; o

(E) en donde el casete de expresión de genes morfogenéticos comprende, además, un promotor seleccionado de la Tabla 4 o la Tabla 5;

(a) un promotor PLTP enlazado operativamente a un gen WUS;

(b) un promotor HBSTART3 enlazado operativamente a un gen WUS;

(f) una secuencia potenciadora viral o vegetal;