ES3036736T3

ES3036736T3 - Treatment of autonomic disorders with botulinum toxin

Info

Publication number: ES3036736T3
Application number: ES18825698T
Authority: ES
Inventors: Johannes Krupp; Jacquie Maignel-Ludol; Bernadette Pignol
Original assignee: Ipsen Biopharm Ltd
Current assignee: Ipsen Biopharm Ltd
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2025-09-23
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: MA51279A; AU2018392818A1; FI3727429T3; JP2021504301A; WO2019122166A1; BR112020005186A2; PT3727429T; EP4591933A3; EP3727429B1; JP2022191409A; JP7659676B2; TWI810228B; JP7445725B2; JP2024059821A; KR20200100625A; US20250101397A1; CN111491659A; AU2025202320A1; AU2018392818B2; CA3083069A1

Abstract

La presente invención se refiere al tratamiento de trastornos autonómicos con una neurotoxina clostridial que comprende un dominio Hcc de una BoNT/B, BoNT/D, BoNT/DC, BoNT/F o BoNT/G, en donde la dosis de la neurotoxina clostridial que se va a administrar al paciente es equivalente o menor que la dosis de BoNT/A que se usaría para tratar el mismo trastorno autonómico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento de trastornos autonómicos con toxina botulínica

[0001] La presente invención se refiere al tratamiento de trastornos autonómicos con neurotoxinas, según se reivindica.

[0002] Las bacterias del género Clostridia producen toxinas proteicas altamente potentes y específicas, que pueden envenenar las neuronas y otras células a las que se administran. Ejemplos de estas toxinas clostridiales incluyen las neurotoxinas producidas por C.tetani(TeNT) y porC. botulinum(BoNT) serotipos A-G, así como las producidas porC.baratii y C.butyricum.

[0003] Las neurotoxinas clostridiales causan parálisis muscular al inhibir la transmisión colinérgica en el sistema nervioso periférico, en particular en la unión neuromuscular, y por lo tanto pueden ser letales. En la naturaleza, las neurotoxinas clostridiales se sintetizan como un polipéptido monocatenario que se modifica postraduccionalmente mediante un evento de escisión proteolítica para formar dos cadenas polipeptídicas unidas por un enlace disulfuro. La escisión se produce en un sitio de escisión específico, a menudo denominado como sitio de activación, que está ubicado entre los residuos de cisteína que forman el enlace disulfuro intercatenario. Esta forma bicatenaria constituye la forma activa de la toxina. Las dos cadenas se denominan cadena pesada (cadena H), con una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y cadena ligera (cadena L), con una masa molecular de aproximadamente 50 kDa. La cadena H comprende un componente de translocación N-terminal (dominio H<n>) y un componente de reconocimiento C-terminal (dominio Hc). El sitio de escisión se encuentra entre la cadena L y el dominio Hn.

[0004] El modo de acción de las neurotoxinas clostridiales se basa en cinco etapas distintas: (1) unión del dominio Hc a la membrana celular de su neurona diana, seguido de (2) internalización de la toxina unida en la célula a través de un endosoma, (3) translocación de la cadena L por el dominio Hn a través de la membrana endosómica y hacia el citosol, (4) escisión proteolítica de las proteínas de transporte intracelular conocidas como proteínas SNARE por la cadena L que proporciona una función de proteasa no citotóxica, y (5) inhibición de la secreción celular de la célula diana.

[0005] En esta cascada de eventos, las proteínas SNARE (Receptor de la proteína de unión al factor sensible a la N-etilmaleimida soluble) son esenciales para la fusión de vesículas intracelulares y, por lo tanto, para la secreción de moléculas mediante el transporte vesicular desde una célula. Ejemplos de proteínas SNARE presentes en neuronas incluyen, entre otras, SNAP-25, VAMP o sintaxina. La función de proteasa no citotóxica de la cadena L es, por otro lado, una actividad endopeptidasa dependiente de zinc, que exhibe una alta especificidad de sustrato para las proteínas SNARE. Por consiguiente, una vez administrada a una célula neuronal diana, la proteasa no citotóxica de las neurotoxinas clostridiales, al escindir su sustrato, la proteína SNARE, inhibe la liberación de neurotransmisores, lo que consecuentemente conduce a una neuroparálisis.

[0006] Gracias a sus propiedades únicas, las neurotoxinas clostridiales, tales como la toxina botulínica, se han empleado con éxito en una amplia gama de aplicaciones terapéuticas, en particular para trastornos motores y autonómicos, para restaurar, por ejemplo, la actividad de las terminaciones nerviosas hiperactivas a niveles normales. Hasta la fecha, se han descrito al menos siete serotipos de BoNT antigénicamente distintos, a saber: BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G (Rossetto, O. et al., "Botulinum neurotoxins: genetic, structural and mechanistic insights”. Nature Reviews Microbiology 12.8 (2014): 535-549). A pesar de esta diversidad, BoNT/A sigue siendo el serotipo de elección en la terapia, con tres preparaciones comerciales comúnmente disponibles (Botox®, Dysport® y Xeomin®), mientras que solo un producto BoNT/B está disponible en el mercado (Neurobloc®/Myobloc®). Hasta el día de hoy, estos productos BoNT/A y BoNT/B, que son toxinas purificadas de cepas clostridiales, son los únicos dos serotipos de BoNT que están actualmente aprobados por las agencias reguladoras para su uso en humanos para aplicaciones que van, entre otras, desde espasticidad, disfunción de la vejiga o hiperhidrosis (para BoNT/A) (ver por ejemplo https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/112, https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/870, https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/2162) hasta distonía cervical (para BoNT/B) (ver por ejemplo, https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/20568).

[0007] Sin embargo, una limitación actual observada en sus usos terapéuticos es la generación de anticuerpos neutralizantes en los pacientes, lo que hace ineficaz el tratamiento futuro. Si bien pocos han reportado problemas de antigenicidad con Neurobloc®/MyoBloc®, hasta ahora dichas respuestas de anticuerpos se han reportado principalmente con productos de BoNT/A, que siguen siendo la toxina botulínica de elección. Se ha identificado que estas respuestas inmunológicas están directamente correlacionadas con las dosis de toxina (Lange, O., et al., Neutralizing antibodies and secondary therapy failure after treatment with botulinum toxin type A: mucha do about nothing? Clin Neuropharmacol, 2009, 32, 213-218). Los efectos adversos también pueden resultar de la difusión de toxinas a otras regiones del cuerpo y la posibilidad de difusión de toxinas está directamente relacionada con las dosis inyectadas.

[0008] Debido a que tanto la generación de anticuerpos neutralizantes como la difusión de toxinas están directamente relacionadas con las dosis inyectadas, existe una necesidad en la técnica de tratar a los pacientes con productos, tales como serotipos alternativos de BoNT, que sean capaces de lograr el mismo nivel de efecto terapéutico con dosis más bajas.

[0009] Un desafío a este respecto es la diferencia enel modus operandide los diversos serotipos de BoNT, que parecen traducirse en una diferencia en la eficacia terapéutica para el mismo trastorno.

[0010] De hecho, para ejercer actividad clínica, la toxina botulínica debe penetrar en el extremo terminal neuronal de su célula diana. Para ello, las BoNT se dirigen a las neuronas y entran en ellas uniéndose a sus receptores específicos a través de sus dominios de unión a receptores (BoNT-Hc), que están bien definidos en la literatura (Schiavo, G., Matteoli, M. y Montecucco, C. Neurotoxins affecting neuroexocytosis, Physiol Rev, 2000, 80, 717-766). La unión al receptor generalmente dicta la eficacia y especificidad de los BoNT para reconocer neuronas. Las BoNT/B, D-C y G comparten dos proteínas vesiculares sinápticas homólogas, la sinaptotagmina I y II (Syt I/II), como sus receptores, mientras que las BoNT/A, E, D y F utilizan otra proteína vesicular sináptica, la SV2. En este sentido, cabe destacar que la afinidad de unión de los serotipos de BoNT por sus receptores proteicos también puede variar entre especies: por ejemplo, las BoNT/B, /-DC y /G muestran una afinidad mucho mayor por Sytll que por Sytl en las terminales nerviosas motoras de roedores, mientras que, en seres humanos, estas tienen una mayor afinidad por Sytl que por Sytll; esta diferencia se debe a un cambio único de aminoácidos entre las secuencias de Sytll de roedores y seres humanos. Como resultado de este cambio de aminoácido, la Sytll humana es significativamente menos eficiente en la mediación de la entrada de BoNT/B, /D-C y /G, en comparación con la Sytll de ratón. Esto también significa que, en seres humanos, el receptor de alta afinidad para BoNT/B, /D-C y /G parece estar restringido al receptor menor Sytl, al menos en las motoneuronas. Todos estos hallazgos podrían explicar las observaciones clínicas de que una dosis mucho mayor de BoNT/B que de BoNT/A (que se une a un receptor diferente) parece ser necesaria para lograr los mismos niveles de efectos terapéuticos en pacientes con distonía cervical (Brashear A. et al., Safety and efficacy of NeuroBloc (botulinum toxin type B) in type A resistant cervical dystonia, Neurology 53, 1431-1438; Pappert, E.J. y Germanson, T. Botulinum toxin type B vs. type A in toxin-naive patients with cervical dystonia: Randomized, doubleblind, noninferiority trial, 2008 Mov Disord 23, 510-517). En particular, para su uso en la unión neuromuscular, se ha sugerido una relación de conversión entre BOTOX®y MyoBloc™de 1:40 (Dressler et al., Botulinum toxin type B for treatment of axillar hyperdrosis, 2002, J. Neurol. 249, 1729-1732; Comella et al., 2005).

[0012] Además de los receptores proteicos, todos los serotipos de BoNT requieren gangliósidos correceptores lipídicos, que son abundantes en las superficies neuronales y pueden diferir entre serotipos, y escinden diferentes sustratos de la proteína SNARE, lo que puede afectar aún más su eficacia terapéutica dependiendo del tipo de célula diana. De hecho, las proteasas de cadena L de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G escinden VAMP, mientras que las proteasas de cadena L de BoNT/A y BoNT/E escinden SNAP25, y la proteasa de cadena L de BoNT/C escinde tanto SNAP25 como sintaxina. Aunque los usos terapéuticos iniciales de las neurotoxinas botulínicas se basaban en la inhibición de la liberación de acetilcolina en la unión neuromuscular de los músculos esqueléticos para tratar afecciones neuromusculares, tales como distonías y espasticidad, más tarde se descubrió que estas neurotoxinas también eran efectivas en las glándulas y los músculos lisos al inhibir la liberación de acetilcolina en las terminales nerviosas autónomas y, por lo tanto, podían usarse para tratar una variedad de trastornos autonómicos, tales como la hiperhidrosis, la sialorrea o la vejiga hiperactiva.

[0012] La dosis recomendada de Botox® (también conocido como onabotulinumtoxina A) para el tratamiento de la hiperhidrosis es de 50 unidades por axila (https://www.medicines.orq.uk/emc/medicine/112), que es una dosis de aproximadamente 0,365 ng de la toxina BoNT/A de 150 kD. Neurobloc®/Myobloc® (también conocido como rimabotulinumtoxina B) no está aprobado para el tratamiento de la hiperhidrosis; sin embargo, se han descrito en la literatura dosis que oscilan entre 2000 y 4000 unidades, es decir, dosis que oscilan entre 4 y 40 ng de la toxina BoNT/A de 150 kD. Sin embargo, estas dosis elevadas no están exentas de efectos secundarios, tanto a nivel regional como sistémico, tales como sequedad bucal, disfagia, acidez estomacal, etc (Dressler D. y Eleopra R., Clinical use of non-A botulinum toxins: botulinum toxin type B., Neurotoxicity research 9.2-3 (2006): 121-125; Tintner R. et al., Autonomic function after botulinum toxin type A or B: a double-blind, randomized trial., Neurology 65.5 (2005): 765-767; Birklein F. et al. Botulinum toxin type B blocks sudomotor function effectively: a 6 month follow-up., Journal of investigative dermatology 121.6 (2003): 1312-1316). Sin embargo, no se ha investigado si se podría alcanzar eficacia terapéutica para los trastornos autonómicos con dosis más bajas de toxina.

[0013] El documento WO 2017/191315 describe neurotoxinas quiméricas con propiedades mejoradas y su uso en terapia.

[0014] El documento WO 2016/154534 describe un polipéptido de neurotoxina botulínica (BoNT) con un dominio de unión al receptor modificado (Hc) que tiene una o más mutaciones de aminoácidos que modifican la unión de la BoNT al receptor.

[0015] El documento WO 2016/156113 describe neurotoxinas clostridiales recombinantes que han sido modificadas para mejorar su activación.

[0016] Benson et al. (J Biol Chem. 30 de septiembre de 2011; 286(39):34015-22) describe estrategias únicas de reconocimiento de gangliósidos para neurotoxinas clostridiales.

[0017] La presente invención tiene como objetivo proporcionar un tratamiento mejorado de los trastornos autonómicos, que evite los problemas clínicos que se observan actualmente en los pacientes, tales como la producción de anticuerpos neutralizantes contra la toxina, así como los efectos secundarios regionales y/o sistémicos.

[0018] La presente invención proporciona una neurotoxina clostridial para su uso en el tratamiento de un trastorno autonómico en un paciente humano, en donde la neurotoxina clostridial comprende un dominio H<cc>de una BoNT/B, BoNT/F, BoNT/D, BoNT/DC o BoNT/G, y en donde se administra al paciente una dosis que varía de 0,00025 ng a 3 ng de dicha neurotoxina clostridial.

[0019] La dosis de la neurotoxina clostridial que se va a administrar al paciente puede ser equivalente o inferior a la dosis de BoNT/A para el tratamiento de dicho trastorno autonómico.

[0020] La dosis de dicha neurotoxina clostridial que se va a administrar al paciente puede ser de 1,1 a 100 veces, preferiblemente de 1,3 a 90 veces, menor que la dosis de BoNT/A para el tratamiento de dicho trastorno autonómico.

[0021] La presente invención proporciona una neurotoxina clostridial para su uso en el tratamiento de un trastorno autonómico en un paciente humano, en donde dicha neurotoxina clostridial comprende un dominio Hcc de una BoNT/B, BoNT/D, BoNT/DC, BoNT/F o BoNT/G, y en donde se va a administrar a dicho paciente una dosis que varía de 0,00025 ng a 3 ng de dicha neurotoxina clostridial.

[0022] La presente invención se basa en primer lugar en el hallazgo inesperado de los inventores de que BoNT/B es al menos tan potente como BoNT/A en el tejido muscular liso humano.

[0023] Este hallazgo es inesperado, ya que, como se mencionó anteriormente, se requieren dosis mucho más altas de BoNT/B (Neurobloc®/Myobloc®) para el tratamiento de trastornos del músculo esquelético en comparación con BoNT/A (por ejemplo, Botox®). Es probable, basándose en esta observación clínica, que hasta la fecha solo se hayan probado y reportado en la literatura dosis más altas de BoNT/B (Neurobloc®/Myobloc®) que de BoNT/A (por ejemplo, Botox®) para el tratamiento de, por ejemplo, la hiperhidrosis que afecta a los músculos lisos.

[0024] Se plantea la hipótesis de que esta diferencia en la potencia de BoNT/B en estos dos tejidos se debe al hecho de que los trastornos del músculo liso y esquelético realmente no dependen de las mismas vías nerviosas. Las contracciones del músculo liso son impulsadas de hecho por el sistema nervioso autónomo, mientras que las contracciones del músculo esquelético son impulsadas por el sistema nervioso somático. La distonía cervical y muchos otros trastornos tratados con neurotoxinas botulínicas, tales como la espasticidad, se deben a contracciones excesivas del músculo esquelético, mientras que otros trastornos, tales como la vejiga hiperactiva (OAB,overactive bladder)o la hiperactividad neurogénica del detrusor (NDO,neurogenic detrusor overactivity),son causados por contracciones excesivas del músculo liso.

[0025] El sistema nervioso somático (SNSo o sistema nervioso voluntario) es la parte del sistema nervioso periférico asociada con el control voluntario de los movimientos corporales por parte del músculo esquelético. El SNSo consiste en nervios aferentes y nervios eferentes. Los nervios aferentes del SNSo se encargan de transmitir las sensaciones del cuerpo al sistema nervioso central (SNC) y los nervios eferentes del SNSo se encargan de enviar las órdenes del SNC al cuerpo, estimulando la contracción muscular; incluyen todas las neuronas no sensoriales conectadas con los músculos esqueléticos y la piel.

[0026] El sistema nervioso autónomo (SNA) es otro componente del sistema nervioso periférico y también consiste en nervios aferentes y nervios eferentes. El SNA se compone de dos ramas: el sistema nervioso simpático (SNS) y el sistema nervioso parasimpático (SNP). El SNS controla las respuestas más activas, tales como el aumento de la frecuencia cardíaca y la presión arterial. Además del músculo liso, el SNA también controla secreciones, tales como el sudor, la saliva y las lágrimas.

[0027] Los músculos lisos se encuentran en el sistema urinario (por ejemplo, vejiga, uréteres), en el sistema digestivo (por ejemplo, paredes del estómago, tracto gastrointestinal, intestinos, esfínter de Oddi, esfínter anal, tráquea, conducto biliar), en el sistema reproductor (por ejemplo, próstata, útero), en el tracto respiratorio, en el sistema vascular (por ejemplo, paredes de los vasos sanguíneos, aorta, arterias, arteriolas, venas) y en el iris del ojo. Las contracciones del músculo liso son responsables para un amplio número de funciones corporales, tales como la liberación de orina de la vejiga, el transporte de alimentos a través del tracto digestivo, la regulación del flujo de aire en los pulmones, la regulación de la presión arterial en arterias y venas, y la reducción del tamaño de la pupila.

[0028] Las terminaciones nerviosas sinápticas de las neuronas colinérgicas que irrigan las glándulas sudoríparas ecrinas, glándulas salivales y glándulas lagrimales pueden ser diana con neurotoxinas botulínicas. Los trastornos neurogénicos asociados con hiperactividad sudomotora o secretomotora incluyen hiperhidrosis, en particular hiperhidrosis focal en palmas, axilas o pies, sudoración gustativa (síndrome de Frey), aumento del lagrimeo al comer (síndrome de lágrimas de cocodrilo), hipersalivación (sialorrea, babeo), etc.

[0029] Sin querer limitarnos a la teoría, se plantea la hipótesis de que la diferencia en potencia observada entre BoNT/A y BoNT/B en el sistema somático frente al sistema autónomo está relacionada con el hecho de que BoNT/A y BoNT/B difieren con respecto a su receptor de proteína (SV2 y Syt I/II respectivamente), y/o a su SNARE diana (SNAP25 y VAMP, respectivamente).

[0030] Basándose en esta suposición, se ha planteado además la hipótesis de que otros serotipos de BoNT que también usan Syt I/II como receptor de proteína y/o escinden VAMP, tales como BoNT/D, BoNT/DC, BoNT/F o BoNT/G, mostrarán una potencia similar a la de BoNT/B, si no una potencia mejor, hacia los músculos lisos/el sistema autónomo, al menos en seres humanos.

[0031] La dosis de la neurotoxina clostridial que se va a administrar al paciente puede ser equivalente o menor que la dosis de BoNT/A para el tratamiento de dicho trastorno autonómico.

[0032] En una realización, el trastorno autonómico que se va a tratar con la neurotoxina clostridial de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en trastornos del músculo liso, trastornos hipersecretores, trastornos respiratorios, trastornos inflamatorios con un componente autonómico, trastornos neuroendocrinos y otros trastornos autonómicos directamente asociados con un trastorno neurológico central.

[0033] Los ejemplos de dichos trastornos autonómicos incluyen, sin limitación:

- trastornos del músculo liso, que son causados en particular por contracciones musculares excesivas, anormales y/o prolongadas (trastornos espásticos), que incluyen, por ejemplo:

o trastornos urinarios, tales como hiperactividad neurogénica del detrusor (NDO), vejiga hiperactiva (OAB), en particular OAB idiopática (iOAB), espasmos de vejiga, disinergia detrusor-esfínter (DSD), incontinencia urinaria, retención urinaria, nicturia, incontinencia de urgencia, frecuencia urinaria; trastornos gastrointestinales, tales como disfunción del esfínter de Oddi, espasmos esofágicos, espasmos intestinales, acalasia, gastroparesia, colitis espástica, fisuras anales, estreñimiento, diarrea ocasional, disfagia, disfagia orofaríngea, trastornos de la deglución;

° trastornos vasculares y cardiovasculares, tales como enfermedad de Raynaud, trombosis anastomótica, fibrilación auricular después de cirugía cardíaca, hipotensión ortostática, trastorno de la presión arterial;

° trastornos de la próstata, tales como hiperplasia prostática benigna (BPH), prostatitis, prostodinia, agrandamiento prostático; y

o trastornos sexuales: disfunción eréctil, priapismo, insuficiencia eyaculatoria, vaginismo;

- trastornos hipersecretores, tales como hiperhidrosis (axilar, palmar, plantar, sudoración difusa, síndrome de Frey, etc.), hipersalivación (babeo, sialorrea), sudoración gustativa, lagrimeo excesivo, síndrome de lágrimas de cocodrilo, secreción excesiva de moco, bromhidrosis, secreción de ácido estomacal, acné;

- trastornos respiratorios que tienen un componente hipersecretor y/o muscular, tales como rinorrea, rinitis crónica, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), hiperreactividad bronquial, estridor, jadeos inspiratorios involuntarios, episodios de apnea;

- trastornos inflamatorios que tienen un componente autonómico, tales como otitis media, picor, prurito, síndrome inflamatorio intestinal;

- trastornos neuroendocrinos: diabetes, hiperinsulinismo, hiperglucagonismo, trastornos pancreáticos, trastornos tiroideos, hipocalcemia, hipertiroidismo, trastornos metabólicos, lipólisis excesiva; y

- otros trastornos autonómicos directamente asociados con trastornos neurológicos centrales, tales como las características parkinsonianas y cerebelosas/piramidales.

[0034] En una realización preferida, el trastorno autonómico a tratar según la presente invención es un trastorno del músculo liso seleccionado del grupo que consiste en trastornos urinarios, trastornos gastrointestinales, trastornos vasculares y cardiovasculares, trastornos de la próstata y trastornos sexuales.

[0035] El término "neurotoxina clostridial", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier polipéptido que penetra en una neurona e inhibe la liberación de neurotransmisores. Este proceso abarca la unión de la neurotoxina a un receptor de baja o alta afinidad, la internalización de la neurotoxina, la translocación de la parte endopeptidasa de la neurotoxina al citoplasma y la modificación enzimática del sustrato de la neurotoxina. Más específicamente, el término "neurotoxina" abarca cualquier polipéptido producido por bacteriasClostridium(neurotoxinas clostridiales) que penetra en una neurona e inhibe la liberación de neurotransmisores, y a dichos polipéptidos producidos mediante tecnologías recombinantes o técnicas químicas. Esta forma bicatenaria constituye la forma activa de la toxina. Las dos cadenas se denominan cadena pesada (cadena H), con una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y cadena ligera (cadena L), con una masa molecular de aproximadamente 50 kDa. Preferiblemente, la neurotoxina clostridial es una neurotoxina botulínica (BoNT).

[0036] Los serotipos A a G de BoNT se pueden distinguir según su inactivación por antisueros neutralizantes específicos, correlacionándose dicha clasificación por serotipo con el porcentaje de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos. Las proteínas BoNT de un serotipo determinado se dividen a su vez en diferentes subtipos según el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos.

[0037] Se proporciona un ejemplo de la secuencia de aminoácidos de una neurotoxina BoNT/A como SEQ ID NO: 1 (número de acceso de UniProt A5HZZ9). Se proporciona un ejemplo de la secuencia de aminoácidos de una neurotoxina BoNT/B como SEQ ID NO: 2 (número de acceso de UniProt B1INP5). Se proporciona un ejemplo de la secuencia de aminoácidos de una neurotoxina BoNT/C como SEQ ID NO: 3 (número de acceso de UniProt P18640). Se proporciona un ejemplo de la secuencia de aminoácidos de una neurotoxina BoNT/D como SEQ ID NO: 4 (número de acceso de UniProt P19321). Se proporciona un ejemplo de la secuencia de aminoácidos de una neurotoxina BoNT/E como SEQ ID NO: 5 (número de acceso WP_003372387). Se proporciona un ejemplo de la secuencia de aminoácidos de una neurotoxina BoNT/F como SEQ ID NO: 6 (número de acceso de UniProt Q57236) o como SEQ ID NO: 11 (número de acceso de UniProt/UniParc UP10001DE3DAC). Se proporciona un ejemplo de la secuencia de aminoácidos de una neurotoxina BoNT/G como SEQ ID NO: 7 (número de acceso WP_039635782). Se proporciona un ejemplo de la secuencia de aminoácidos de una neurotoxina BoNT/DC como SEQ ID NO: 8 (número de acceso BAM65681).

[0038] El término "dominio Hc", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una región funcionalmente distinta de la cadena pesada de la neurotoxina, con un peso molecular aproximadamente 50 kDa, que permite la unión de la neurotoxina a un receptor ubicado en la superficie de la célula diana. El dominio H<c>consiste en dos subdominios estructuralmente distintos: el "subdominio Hcn" (parte N-terminal del dominio Hc) y el "subdominio Hcc" (parte C-terminal del dominio H<c>, también denominado dominio H<cc>), cada uno con un peso molecular de aproximadamente 25 kDa. El dominio Hcc puede unirse a un receptor proteico de neurotoxina clostridial.

[0039] El término "dominio LHn", tal como se utiliza en este documento, se refiere a una región de neurotoxina distinta del dominio Hc, y que consiste en un dominio de endopeptidasa ("L" o "cadena ligera") y un dominio responsable de la translocación de la endopeptidasa al citoplasma (dominio Hn de la cadena pesada). Un dominio de endopeptidasa ("L" o "cadena ligera") es capaz de escindir una proteína SNARE.

[0040] Los dominios L, Hn, Hcn y Hcc de ejemplo se muestran en la tabla 1.

BoNT Número de acceso SEQ ID NO: L HnHcnHccBoNT/A1 A5HZZ9 1 1-448 449-872 873-1094 1095-1296 BoNT/B1 B1INP5 2 1-441 442-859 860-1081 1082-1291 BoNT/C1 P18640 3 1 -449 450-867 868-1095 1096-1291 BoNT/D P19321 4 1 -442 443-863 864-1082 1083-1276 BoNT/E1 WP_003372387 5 1 -423 424-846 847-1069 1070 - 1252 BoNT/F1 Q57236 6 1 -439 440-865 866-1087 1088-1278 BoNT/F7 UPI0001DE3DAC 11 1 -508 509-862 863-1076 1077-1268 BoNT/G WP_039635782 7 1 -446 447-864 865-1089 1090-1297 BoNT/DC BAM65681 8 1-442 443-863 864-1091 1092-1285

[0041] Las secuencias de referencia identificadas anteriormente deben considerarse una guía, ya que pueden presentarse ligeras variaciones según los subserotipos. A modo de ejemplo, US 2007/0166332 cita secuencias clostridiales ligeramente diferentes.

[0042] El término "bucle de activación" se refiere a un dominio polipeptídico que comprende un sitio de escisión proteolítica. Los bucles de activación de neurotoxinas se han descrito en la técnica, tal como en el documento WO2016156113.

[0043] En una realización de la invención, el dominio H<cc>de la neurotoxina clostridial consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

- residuos de aminoácidos 1082 a 1291 de SEQ ID NO: 2, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1083 a 1276 de SEQ ID NO: 4, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1088 a 1278 de SEQ ID NO: 6, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1077 a 1268 de SEQ ID NO: 11, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma, - residuos de aminoácidos 1090 a 1297 de SEQ ID NO: 7, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma, y

- residuos de aminoácidos 1092 a 1285 de SEQ ID NO: 8, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0044] Tal como se utiliza a lo largo de la memoria descriptiva, el término "porcentaje de identidad de secuencia" entre dos o más secuencias de aminoácidos se refiere a una función del número de aminoácidos idénticos en posiciones idénticas compartidas por las secuencias de aminoácidos alineadas. Por lo tanto, el%de identidad, tal como se utiliza en este documento, puede calcularse como el número de aminoácidos idénticos en cada posición de una alineación dividido por el número total de aminoácidos en la secuencia alineada, multiplicado por 100. Los cálculos del % de identidad de secuencia también pueden tener en cuenta el número de espacios y la longitud de cada espacio que debe introducirse para optimizar la alineación de dos o más secuencias. Las comparaciones de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos o más secuencias pueden llevarse a cabo utilizando algoritmos matemáticos específicos, en particular un algoritmo matemático de alineación global (tal como el descrito por Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48(3), 443-453, 1972), lo que resultará familiar para una persona experta.

[0045] En una realización preferida, el dominio H<cc>consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

- residuos de aminoácidos 1088 a 1278 de SEQ ID NO: 6, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma, y

- residuos de aminoácidos 1077 a 1268 de SEQ ID NO: 11, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0046] En una realización preferida, el dominio HCC consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 1082 a 1291 de SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0047] En una realización preferida, el dominio HCC consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 1088 a 1278 de SEQ ID NO: 6, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0048] En una realización preferida, el dominio HCC consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 1077 a 1268 de SEQ ID NO: 11, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0049] En una realización, la neurotoxina clostridial consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11.

[0050] En una realización preferida, la neurotoxina clostridial consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11.

[0051] En una realización preferida, la neurotoxina clostridial consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

[0052] En una realización preferida, la neurotoxina clostridial consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 6.

[0053] En una realización preferida, la neurotoxina clostridial consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 11.

[0054] En una realización más preferida, la neurotoxina clostridial es una neurotoxina BoNT/B. Preferiblemente, la neurotoxina clostridial BoNT/B consiste o comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2.

[0055] En una realización más preferida, la neurotoxina clostridial es una neurotoxina BoNT/F. Preferiblemente, la neurotoxina clostridial BoNT/F consiste o comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6 o con la SEQ ID NO: 11.

[0056] En una realización, la neurotoxina clostridial es una neurotoxina quimérica.

[0057] El término "neurotoxina quimérica", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una neurotoxina que comprende uno o más dominios procedentes de una primera neurotoxina y uno o más dominios procedentes de una segunda neurotoxina. Por ejemplo, una neurotoxina quimérica puede comprender un dominio LHn procedente de un primer serotipo o subtipo de neurotoxina y un dominio Hc procedente de un segundo serotipo o subtipo de neurotoxina. Otro ejemplo de neurotoxina quimérica es una neurotoxina que comprende un dominio<l>H<n>H<cn>procedente de un primer serotipo o subtipo de neurotoxina y un dominio H<cc>procedente de un segundo serotipo o subtipo de neurotoxina. Otro ejemplo de neurotoxina quimérica es una neurotoxina que comprende un dominio LH<n>de un primer serotipo o subtipo de neurotoxina y un bucle de activación de un segundo serotipo o subtipo de neurotoxina. Se proporcionan ejemplos de neurotoxinas quiméricas en los documentos WO2017191315 y WO2016156113.

[0058] En una realización, la neurotoxina clostridial es una neurotoxina quimérica que comprende un dominio Hc de una BoNT/B y un dominio LHn de una BoNT/A, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G o BoNT/D-C.

[0059] En una realización de una neurotoxina quimérica según la presente invención, el dominio Hc consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

- residuos de aminoácidos 860 a 1291 de SEQ ID NO: 2, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 864 a 1276 de SEQ ID NO: 4, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 866 a 1278 de SEQ ID NO: 6, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 863 a 1268 de SEQ ID NO: 11, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 865 a 1297 de SEQ ID NO: 7, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma, y

- residuos de aminoácidos 864 a 1285 de SEQ ID NO: 8, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

y el dominio LHn consiste o comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: - residuos de aminoácidos 1 a 872 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1 a 859 de SEQ ID NO: 2, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1 a 867 de SEQ ID NO: 3, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1 a 863 de SEQ ID NO: 4, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1 a 846 de SEQ ID NO: 5, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1 a 865 de SEQ ID NO: 6, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1 a 862 de SEQ ID NO: 11, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1 a 864 de SEQ ID NO: 7, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma, y

- residuos de aminoácidos 1 a 863 de SEQ ID NO: 8, o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0060] En una realización preferida, el dominio Hc consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 860 a 1291 de SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma, y el dominio LHn consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

- residuos de aminoácidos 1 a 872 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1 a 863 de SEQ ID NO: 8, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0061] En una realización más preferida, la neurotoxina clostridial es una neurotoxina quimérica que comprende un dominio Hc de una BoNT/B y un dominio LHn de una BoNT/A.

[0062] En una realización más preferida, el dominio Hc consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 860 a 1291 de SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 %, preferiblemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma, y el dominio LH<n>comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 1 a 872 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 %, preferiblemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0063] En una realización, la neurotoxina clostridial es una neurotoxina quimérica que comprende un dominio Hcc de una BoNT/B y un dominio LHnHcn de una BoNT/A, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G o BoNT/D-C.

[0064] En una realización de una neurotoxina quimérica según la presente invención, el dominio Hcc consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

- residuos de aminoácidos 1092 a 1285 de SEQ ID NO: 8, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

y el dominio LH<n>H<cn>consiste o comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: - residuos de aminoácidos 1 a 1094 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1 a 1081 de SEQ ID NO: 2, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1 a 1095 de SEQ ID NO: 3, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1 a 1082 de SEQ ID NO: 4, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1 a 1069 de SEQ ID NO: 5, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1 a 1087 de SEQ ID NO: 6, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1 a 1076 de SEQ ID NO: 11, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1 a 1089 de SEQ ID NO: 7, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma, y

- residuos de aminoácidos 1 a 1091 de SEQ ID NO: 8, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0065] En una realización preferida, el dominio Hcc consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 1082 a 1291 de SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 %, preferiblemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma, y el dominio LHnHcn consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

- residuos de aminoácidos 1 a 1094 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1 a 1076 de SEQ ID NO: 11, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95%o 99%de identidad de secuencia con la misma,

- residuos de aminoácidos 1 a 1091 de SEQ ID NO: 8, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0066] En una realización, la neurotoxina clostridial es una neurotoxina quimérica que comprende un dominio LHn de un primer subtipo de BoNT/F y un bucle de activación de un segundo subtipo de BoNT/F, donde dicho segundo subtipo de BoNT/F difiere de dicho primer subtipo de BoNT/F. Dichos subtipos de BoNT/F y neurotoxinas quiméricas de BoNT/F se han descrito en la técnica, tal como en el documento WO2016156113.

[0067] En una realización preferida, dicho dominio LHn es un dominio LHn del subtipo BoNT/F7 y/o dicho bucle de activación es un bucle de activación del subtipo BoNT/F1.

[0068] En una realización preferida, dicho bucle de activación comprende (o consiste en) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14.

[0069] En una realización preferida, la neurotoxina quimérica comprende (o consiste en) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 %, preferiblemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0070] La neurotoxina clostridial puede ser una neurotoxina modificada o un derivado de la misma, incluyendo, pero sin imitación, los descritos a continuación. Una neurotoxina modificada o un derivado puede contener uno o más aminoácidos que se han modificado en comparación con la forma nativa de la neurotoxina. Ejemplos de dicha modificación, también conocida como mutación, incluyen, sin limitación, la sustitución, adición o deleción de un residuo de aminoácido. En el contexto de la presente invención, una neurotoxina clostridial modificada puede, por ejemplo, tener una o más secuencias de aminoácidos modificadas en uno o más dominios con respecto a la secuencia de aminoácidos de la neurotoxina clostridial nativa. Los términos nativo, sin modificar, natural, de origen natural o de tipo salvaje se pueden usar indistintamente en el presente documento.

[0071] Dichas modificaciones pueden afectar aspectos funcionales de la neurotoxina, por ejemplo, la actividad biológica o persistencia. Sin embargo, en el contexto de la presente invención, se considera que una neurotoxina modificada es funcional. En otras palabras, la neurotoxina modificada de la presente invención conserva la función o funciones de una neurotoxina, seleccionadas entre la capacidad de unirse a un receptor de neurotoxina de baja o alta afinidad en una célula diana, la capacidad de translocar la parte endopeptidasa de la neurotoxina (cadena ligera) al citoplasma celular y la capacidad de escindir una proteína SNARE.

[0072] Una neurotoxina modificada, según la presente invención, puede tener una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (tal como en el dominio Hc), donde dicha cadena pesada modificada se une a las células nerviosas diana con mayor o menor afinidad que la neurotoxina nativa. Dichas modificaciones en el dominio H<c>pueden incluir modificaciones de los residuos de aminoácidos en el sitio de unión al gangliósido del dominio H<cc>que pueden alterar la unión al gangliósido de la célula nerviosa diana, y/o modificaciones de los residuos de aminoácidos en el sitio de unión al receptor proteico del dominio Hcc, que pueden alterar la unión al receptor proteico de la célula nerviosa diana. Se describen ejemplos de dichas neurotoxinas modificadas en los documentos WO2006027207 y WO2006114308.

[0073] En una realización de una neurotoxina clostridial modificada según la presente invención, el dominio H<cc>de una BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F o BoNT/G se modifica en comparación con el dominio H<cc>natural de dichos serotipos de BoNT.

[0074] En una realización preferida, el dominio Hcc de una neurotoxina BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F o BoNT/G comprende al menos una mutación de residuo de aminoácido que aumenta la afinidad de unión de dicho dominio Hcc por la Syt II humana en comparación con el dominio Hcc de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G o BoNT/D-C natural. Los inventores han descubierto de hecho que dicha mutación de un residuo de aminoácido puede aumentar la potencia de la neurotoxina hacia el músculo liso humano.

[0075] En una realización más preferida, el dominio H<cc>de una neurotoxina BoNT/B comprende al menos una mutación de un residuo de aminoácido que aumenta la afinidad de unión de dicho dominio Hcc por la Syt II humana en comparación con el dominio H<cc>de BoNT/B natural. Además, preferiblemente, dicha al menos una mutación de residuo de aminoácido aumenta la afinidad de unión de dicho dominio H<cc>por la Syt II humana en al menos un 50 % en comparación con el dominio Hcc de BoNT/B natural.

[0076] Dichas mutaciones adecuadas de residuos de aminoácidos en el dominio Hcc de BoNT/B se han descrito en la técnica en los documentos WO2013180799 y WO2016154534.

[0077] En particular, dicha al menos una mutación de residuo de aminoácido adecuada para aumentar la afinidad de unión del dominio H<cc>de BoNT/B por Syt II humana en al menos un 50%en comparación con el dominio H<cc>de BoNT/B natural es una sustitución, adición o deleción de residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: 1118M, 1183M, 1191M, 11911, 1191Q, 1191T, 1199Y, 1199F, 1199L, 1201V, 1191C, 1191V, 1191L, 1191Y, 1199W, 1199E, 1199H, 1178Y, 1178Q, 1178A, 1178S, 1183C, 1183P y cualquier combinación de los mismos. Preferiblemente, dicha al menos una mutación de residuo de aminoácido en el dominio H<cc>de BoNT/B consiste en dos sustituciones, adiciones o deleciones de residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: 1191M y 1199L, 1191M y 1199Y, 1191M y 1199F, 1191Q y 1199L, 1191Q y 1199Y, 1191Q y 1199F, 1191M y 1199W, 1191M y 1178Q, 1191C y 1199W, 1191C y 1199Y, 1191C y 1178Q, 1191Q y 1199W, 1191V y 1199W, 1191V y 1199Y, o 1191V y 1178Q. Aún preferiblemente, dicha al menos una mutación de residuo de aminoácido en el dominio H<cc>de BoNT/B consiste en tres sustituciones, adiciones o deleciones de residuos de aminoácidos: 1191M, 1199W y 1178Q. Más preferiblemente, dicha al menos una mutación de residuo de aminoácido en el dominio Hcc de BoNT/B consiste en dos sustituciones, adiciones o deleciones de residuos aminoácidos: 1191M y 1199Y.

[0078] En una realización más preferida, dicha al menos una mutación de residuo de aminoácido adecuada para aumentar la afinidad de unión del dominio Hcc de BoN/B por Syt II humana en al menos un 50 % en comparación con el dominio H<cc>de BoNT/B natural es una sustitución de residuo de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: V1118M, Y1183M, E1191M, E1191I, E1191Q, E1191T, S1199Y, S1199F, S1199L, S1201V, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P y cualquier combinación de las mismas. Preferiblemente, dicha al menos una mutación de residuo de aminoácido en el dominio Hcc de BoNT/B consiste en dos sustituciones de residuos de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: E1191M y S1199L, E1191M y S1199Y, E1191M y S1199F, E1191Q y S1199L, E1191Q y S1199Y, E1191Q y S1199F, E1191M y S1199W, E1191M y W1178Q, E1191C y S1199W, E1191C y S1199Y, E1191C y W1178Q, E1191Q y S1199W, E1191V y S1199W, E1191V y S1199Y, o E1191V y W1178Q. Aún preferiblemente, dicha al menos una mutación de residuo de aminoácido en el dominio Hcc de BoNt /B consiste en las tres sustituciones de residuos de aminoácidos: E1191M, S1199W y W1178Q. Más preferiblemente, dicha al menos una mutación de residuo de aminoácido en el dominio Hcc de BoNT/B consiste en las dos sustituciones de residuos de aminoácidos: E1191M y S1199Y.

[0079] En una realización preferida, el dominio H<cc>de BoNT/B que se va a modificar corresponde a los residuos de aminoácidos 1082 a 1291 de SEQ ID NO: 2 (dominio H<cc>de BoNT/B natural), o a una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 %, preferiblemente al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0080] En una realización más preferida, la neurotoxina clostridial modificada de la presente invención comprende (o consiste en) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 %, preferiblemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0081] En una realización preferida, el dominio H<cc>de una neurotoxina BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F o BoNT/G comprende al menos una mutación de residuo de aminoácido que aumenta la afinidad de unión de dicho dominio Hcc por uno o más gangliósidos en comparación con el dominio Hcc de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/D-C, BoNT/F o BoNT/GH natural.

[0082] En una realización más preferida, dicho dominio H<cc>de una BoNT/F comprende al menos una mutación de residuo de aminoácido que aumenta la afinidad de unión de dicho dominio Hcc por uno o más gangliósidos en comparación con el dominio Hcc de BoNT/F natural.

[0083] En una realización preferida, dichos gangliósidos se seleccionan entre GD1a y/o GM1a.

[0084] Las mutaciones de residuos de aminoácidos adecuadas para aumentar la afinidad de unión de un dominio H<cc>de BoNT/F por gangliósidos, tales como GD1a y/o GM1a, en comparación con un dominio Hcc de BoNT/F natural, incluyen, pero sin limitación, la mutación de aminoácido 1241K, tal como una sustitución, adición o deleción de aminoácidos. Más preferiblemente, dicha al menos una mutación de residuo de aminoácido que aumenta la afinidad de unión de dicho dominio Hcc de BoNT/F en comparación con un dominio Hcc de BoNT/F natural es la sustitución de aminoácido H1241K.

[0085] En una realización preferida, el dominio H<cc>de BoNT/F a modificar corresponde a los residuos de aminoácidos 1088 a 1278 de SEQ ID N<o>: 6 o a los residuos de aminoácidos 1077 a 1268 de SEQ ID NO: 11 (dominios H<cc>de BoNT/F naturales), o a una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 %, preferiblemente al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0086] En una realización preferida, la neurotoxina clostridial quimérica de la presente invención comprende (o consiste en) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 %, preferiblemente al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0087] En una realización, la neurotoxina clostridial de la presente invención puede ser quimérica y modificada, tal como se describió anteriormente. Por ejemplo, en una realización preferida, la neurotoxina clostridial comprende (o consiste en) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10, o una secuencia de aminoácidos con al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la misma.

[0088] La neurotoxina clostridial de la presente invención puede producirse mediante tecnologías recombinantes. Por lo tanto, en una realización, la neurotoxina clostridial de la invención es una neurotoxina clostridial recombinante.

[0089] En una realización, la neurotoxina clostridial se asocia con proteínas complejantes de BoNT, también conocidas como proteínas asociadas a neurotoxinas (NAP) no tóxicas. En otras palabras , la neurotoxina clostridial se administra al paciente humano en asociación o en combinación con proteínas complejantes de BoNT. Por lo tanto, en una realización, la neurotoxina clostridial se compleja con una o más proteínas complejantes de BoNT.

[0090] En otra realización, la neurotoxina clostridial está libre de (o no está asociada ni combinada con) proteínas complejantes de BoNT. En otras palabras, la neurotoxina clostridial se administra al paciente humano sin estar asociada ni combinada con proteínas complejantes de BoNT.

[0091] Preferiblemente, la neurotoxina clostridial (por ejemplo, para su uso como se describe en el presente documento) forma parte de una composición farmacéutica junto con al menos un portador farmacéuticamente aceptable. Por "portador farmacéuticamente aceptable" se entiende en el presente documento cualquier componente que es compatible con los demás ingredientes de la composición farmacéutica, en particular con la neurotoxina clostridial, y que no sea perjudicial para el paciente. El portador farmacéuticamente aceptable puede seleccionarse en función de la vía de administración deseada, de acuerdo con las prácticas farmacéuticas estándar, e incluye, sin limitación, excipientes, diluyentes, adyuvantes, propelentes y sales.

[0092] Por consiguiente, la presente invención se refiere además a una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento de un trastorno autonómico en un paciente humano, donde dicha composición comprende la neurotoxina clostridial de la invención y al menos un portador farmacéuticamente aceptable, y la dosis de la neurotoxina clostridial que se administrará al paciente es la descrita anteriormente. También se incluyen los usos y procedimientos correspondientes para el tratamiento de un trastorno autonómico que comprenden la administración de una composición farmacéutica de la invención a un paciente humano.

[0093] La neurotoxina clostridial de la presente invención puede formularse para administración oral, parenteral (es decir, inyección), infusión continua, inhalación o tópica. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para inyección pueden presentarse en forma de soluciones, suspensiones o emulsiones, o polvos secos que se disuelven o suspenden en un vehículo adecuado antes de su uso.

[0094] En el caso de una neurotoxina que debe administrar localmente, la neurotoxina puede formularse como una crema (por ejemplo, para aplicación tópica) o para inyección subdérmica.

[0095] Los medios de administración local pueden incluir un aerosol u otro tipo de pulverizador (por ejemplo, un nebulizador). En este sentido, una formulación en aerosol de una neurotoxina permite su administración a los pulmones y/u otras vías nasales y/o bronquiales o respiratorias.

[0096] Las neurotoxinas clostridiales de la presente invención también pueden administrarse a un paciente mediante inyección intratecal o epidural en la columna vertebral a nivel del segmento espinal involucrado en la inervación de un órgano afectado.

[0097] En una realización, la neurotoxina clostridial o composición farmacéutica es para administración intramuscular, intradérmica o subcutánea.

[0098] En una realización, la neurotoxina clostridial o composición farmacéutica es para administración tópica, por ejemplo mediante instilación.

[0099] Una vía de administración preferida es mediante inyección intramuscular.

[0100] Sin embargo, también es posible administrar la neurotoxina clostridial a un músculo sin usar ninguna inyección. Por ejemplo, para tratar trastornos urinarios, la neurotoxina clostridial puede administrarse a la vejiga mediante la infusión en la vejiga del paciente con una formulación líquida o semisólida de la neurotoxina clostridial; depositando una formulación en gel que contiene la neurotoxina clostridial en el lugar apropiado de la vejiga del paciente; rociando una formulación en aerosol que contiene la neurotoxina clostridial en el lugar apropiado de la vejiga del paciente; o aplicando tópicamente una formulación sólida (por ejemplo, liofilizada), semisólida o líquida de toxina botulínica que se coloca o se extiende sobre las paredes externas de un balón que continuación se infla en la vejiga para que esté en contacto con la pared de dicha vejiga, tal como se describe enWO2005053733.

[0101] Tal como se indicó anteriormente, la dosis de la neurotoxina clostridial que es adecuada para lograr el efecto terapéutico deseado en un paciente humano que sufre un trastorno autonómico, o, en otras palabras, la dosis terapéutica de dicha neurotoxina clostridial, es equivalente o menor que la dosis de BoNT/A para el tratamiento del mismo trastorno autonómico.

[0102] Preferiblemente, dicha BoNT/A para el tratamiento del mismo trastorno autonómico es una BoNT/A purificada. Tal como se utiliza en el presente documento, el término “BoNT/A purificada” se refiere a una neurotoxina botulínica tipo A purificada a partir de una cepa clostridial que la produce de forma natural (cepa clostridial de origen natural). La BoNT/A purificada puede estar asociada a proteínas complejantes o sin las mismas. Entre los ejemplos de BoNT/A purificadas disponibles comercialmente se incluyen Botox®, Dysport® y Xeomin®.

[0103] En una realización, la dosis de la neurotoxina clostridial que debe administrarse para tratar un trastorno autonómico en un paciente humano (dosis terapéutica) es de aproximadamente 1,1 veces a aproximadamente 100 veces, preferiblemente de aproximadamente 1,3 veces a aproximadamente 90 veces, menor que la dosis de BoNT/A para el tratamiento de dicho trastorno autonómico.

[0104] En una realización preferida, cuando la neurotoxina clostridial comprende un dominio Hcc de una BoNT/B, la dosis terapéutica de dicha neurotoxina clostridial es de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 20 veces, preferiblemente de aproximadamente 1,3 a aproximadamente 19,8 veces, menor que la dosis de BoNT/A para el tratamiento del mismo trastorno autonómico. Por ejemplo, cuando la neurotoxina clostridial de la invención es una neurotoxina BoNT/B natural, tal como la neurotoxina con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, la dosis terapéutica de dicha neurotoxina clostridial es de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 1,5 veces, preferiblemente de aproximadamente 1,3 veces, menor que la dosis de BoNT/A para el tratamiento del mismo trastorno autonómico. Como ejemplo adicional, cuando la neurotoxina clostridial de la invención es una neurotoxina BoNT/B modificada que tiene mayor afinidad de unión al receptor SytII humano (en comparación con la BoNT/B natural), tal como la neurotoxina con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9, la dosis terapéutica de dicha neurotoxina clostridial es de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 veces, preferiblemente aproximadamente 19,8 veces, menor que la dosis de BoNT/A para el tratamiento del mismo trastorno autonómico. Además, como otro ejemplo, cuando la neurotoxina clostridial de la presente invención es una neurotoxina BoNT/B quimérica modificada que tiene mayor afinidad de unión al receptor SytII humano, tal como la neurotoxina con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10, la dosis terapéutica de dicha neurotoxina clostridial es de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 veces, preferiblemente aproximadamente 3,5 veces, menor que la dosis de BoNT/A para el tratamiento del mismo trastorno autonómico.

[0105] En una realización preferida, cuando la neurotoxina clostridial comprende un dominio H<cc>de una BoNT/F, la dosis terapéutica de dicha neurotoxina clostridial es de aproximadamente 60 a aproximadamente 100 veces, preferiblemente de aproximadamente 61,2 a aproximadamente 90 veces, menor que la dosis de BoNT/A para el tratamiento del mismo trastorno autonómico. Por ejemplo, cuando la neurotoxina clostridial de la presente invención es una neurotoxina BoNT/F natural, tal como la neurotoxina con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 11, la dosis terapéutica de dicha neurotoxina clostridial es de aproximadamente 60 a aproximadamente 65 veces, preferiblemente aproximadamente 61,2 veces, menor que la dosis de BoNT/A para el tratamiento del mismo trastorno autonómico. Como ejemplo adicional, cuando la neurotoxina clostridial de la presente invención es una neurotoxina BoNT/F modificada con mayor afinidad de unión por uno o más gangliósidos (en comparación con la BoNT/F natural), tal como la neurotoxina con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12, la dosis terapéutica de dicha neurotoxina clostridial es de aproximadamente 60 a aproximadamente 65 veces, preferiblemente aproximadamente 61,2 veces, menor que la dosis de BoNT/A para el tratamiento del mismo trastorno autonómico. Además, como otro ejemplo, cuando la neurotoxina clostridial de la presente invención es una neurotoxina BoNT/F quimérica, tal como la neurotoxina con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, la dosis terapéutica de dicha neurotoxina clostridial es de aproximadamente 85 a aproximadamente 100 veces, preferiblemente aproximadamente 90 veces, menor que la dosis de BoNT/A para el tratamiento del mismo trastorno autonómico.

[0106] Tal como se indicó anteriormente, las dosis de BoNT/A para el tratamiento de trastornos autonómicos son bien conocidas en la técnica (https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/112).

[0107] Las dosis de neurotoxina clostridial se miden en el presente documento preferiblemente en nanogramos.

[0108] Las dosis de neurotoxina clostridial, según la presente invención, se entienden como dosis de neurotoxina clostridial bicatenaria activa, es decir, sin incluir la cantidad de proteínas complejantes a las que la neurotoxina puede estar asociada. En otras palabras, se refiere a las dosis de neurotoxina clostridial bicatenaria activa, independientemente de si dicha neurotoxina se administra al paciente asociada o no a proteínas complejantes. Como es bien sabido por el profesional experto, una neurotoxina clostridial bicatenaria activa es capaz de unirse a un receptor neuronal, translocar la cadena ligera al citoplasma y escindir una proteína SNARE, mientras que las proteínas complejantes no muestran dicha actividad biológica (es decir, no son “activas”). En el caso de las neurotoxinas botulínicas, el tamaño total de la bicadena activa es generalmente de apoximadamente 150 kD.

[0109] De hecho, como bien sabe el profesional experto, la potencia de una neurotoxina clostridial está relacionada con la cantidad (por ejemplo, nanogramos) de neurotoxina necesaria para alcanzar una unidad de LD50 (dosis letal 50); definiéndose una unidad de LD50 como la mediana de la dosis intraperitoneal letal (medida en ratones). Sin embargo, las preparaciones farmacéuticas de BoNT actualmente en el mercado contienen diferentes cantidades de neurotoxina de 150 kD, pero también de unidades de LD50. Además, en estas preparaciones, la neurotoxina puede estar asociada (es decir, combinada con) o no proteínas asociadas a neurotoxinas (NAP) no tóxicas, también conocidas como proteínas complejantes. Para facilitar la conversión:

- 100 unidades de Botox® (también conocido como OnabotulinumtoxinA) contienen aproximadamente 0,73 ng de BoNT/A de 150 kD, así como proteínas complejantes;

- 100 unidades de Dysport® (también conocido como AbobotulinumtoxinA) contienen aproximadamente 0,65 ng de BoNT/A de 150 kD, así como proteínas complejantes;

- 100 unidades de Xeomin® (también conocido como IncobotulinumtoxinA) contienen aproximadamente 0,44 ng de BoNT/A de 150 kD, sin proteínas complejantes;

- 100 unidades de Neurobloc/Myobloc® (también conocido como RimabotulinumtoxinB) contienen de aproximadamente 0,2 ng a aproximadamente 1 ng de BoNT/B de 150 kD, así como proteínas complejantes.

[0110] La cantidad de neurotoxina clostridial puede ser medida por el profesional experto de acuerdo con los procedimientos utilizados convencionalmente en la técnica para cuantificar proteínas, preferiblemente, a niveles de nanogramos, incluyendo, entre otros, espectroscopia de masas, tal como espectroscopia de masas de dilución isotópica (Muñoz et al., Quantification of protein calibrants by amino acid analysis using isotope dilution mass spectrometry, Anal. Biochem. 2011, 408, 124-131), o ensayo fluorimétrico (Poras et al., Detection and Quantification of Botulinum Neurotoxin Type A by a Novel Rapid In Vitro Fluorimetric Assay, Appl Environ Microbiol. Julio de 2009; 75(13): 4382-4390).

[0111] Cuando se proporciona un intervalo de valores en el presente documento, se entenderá que, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, cada valor intermedio, con una décima de unidad, entre los límites superior e inferior de dicho intervalo también se describe específicamente. Cualquier intervalo menor entre cualquier valor indicado o valor intermedio en un intervalo indicado y cualquier otro valor indicado o valor intermedio en dicho intervalo indicado se incluye en esta descripción. Se entenderá además que cualquier intervalo de valores numéricos indicado en el presente documento con la expresión "de a a b" significa el intervalo de valores numéricos que se extiende de a a b (es decir, incluyendo los extremos estrictos a y b).

[0112] Además, el término "aproximadamente" se entenderá en el presente documento como más o menos (±) 5 %, preferiblemente ± 4 %, ± 3 %, ± 2 %, ± 1 %, ± 0,5 %, ± 0,1 %, del valor numérico del número con el que se está utilizando.

[0113] La dosis de la neurotoxina clostridial de la invención que se va a administrar para tratar un trastorno autonómico en un paciente humano (es decir, dosis terapéutica) varía de 0,00025 ng a 3 ng.

[0114] En una realización preferida, la dosis terapéutica de la neurotoxina clostridial varía de aproximadamente 0,0003 ng a aproximadamente 2 ng, preferiblemente de aproximadamente 0,0004 ng a aproximadamente 1,5 ng, de aproximadamente 0,0005 ng a aproximadamente 1 ng, aún preferiblemente de aproximadamente 0,0006 ng a aproximadamente 0,5 ng de dicha neurotoxina clostridial.

[0115] En una realización preferida, la neurotoxina clostridial comprende un dominio Hcc de BoNT/B o un dominio H<cc>de BoNT/F, y se debe administrar al paciente humano en cualquiera de las dosis descritas en este documento de dicha neurotoxina clostridial, para su uso en el tratamiento de un trastorno autonómico, tal como se describió anteriormente.

[0116] En una realización más preferida, la neurotoxina clostridial comprende un dominio H<cc>de BoNT/B o un dominio H<cc>de BoNT/F, y se debe administrar al paciente humano en cualquiera de las dosis descritas en este documento de dicha neurotoxina clostridial para su uso en el tratamiento de un trastorno del músculo liso, tal como se describió anteriormente. Más preferiblemente, dicho trastorno del músculo liso se selecciona del grupo que consiste en trastornos urinarios, trastornos gastrointestinales, trastornos vasculares y cardiovasculares, trastornos prostáticos y trastornos sexuales.

[0117] Por ejemplo, la dosis terapéutica de la neurotoxina clostridial que comprende un dominio H<cc>de BoNT/B varía preferiblemente de aproximadamente 0,001 ng a aproximadamente 2 ng.

[0118] Sin embargo, por ejemplo, la dosis terapéutica de la neurotoxina clostridial que comprende un dominio H<cc>de BoNT/B varía preferiblemente de aproximadamente 0,0003 ng a aproximadamente 0,05 ng.

[0119] Sin embargo, se entenderá que el intervalo de dosis requerido depende de la naturaleza precisa de la neurotoxina clostridial, el trastorno autonómico, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la edad del paciente, la naturaleza, extensión o gravedad de la afección del paciente, las contraindicaciones, si las hubiera, y el criterio del médico tratante. Las variaciones en estos niveles de dosificación pueden ajustarse mediante rutinas empíricas estándar para su optimización.

[0120] Como referencia, a continuación se proporcionan ejemplos de dosis adecuadas de BoNT/A natural (tales como la neurotoxina que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1), para tratar algunos trastornos autonómicos específicos:

- NDO (hiperactividad neurogénica del detrusor): 1,46 ng de BoNT/A natural en el músculo detrusor;

- OAB (vejiga hiperactiva): 0,73 ng de BoNT/A natural en el músculo detrusor;

- hiperhidrosis de las axilas: 0,365 ng de BoNT/A natural en cada axila;

- sialorrea en pacientes adultos, en particular en pacientes con enfermedad de Parkinson: 0,146 ng de BoNT/A natural por glándula submandibular y/o parótida;

- sialorrea en pacientes pediátricos con parálisis cerebral: 0,073 ng de BoNT/A natural por glándula submandibular y/o parótida.

[0121] Ejemplos de intervalos de dosis adecuados de BoNT/B natural (tales como la neurotoxina que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2), para tratar los trastornos mencionados anteriormente de acuerdo con la invención, son:

- NDO (hiperactividad neurogénica del detrusor): de 0,5 ng a 2 ng de BoNT/B natural en el músculo detrusor;

- OAB (vejiga hiperactiva): de 0,25 ng a 1 ng de BoNT/B natural en el músculo detrusor;

- hiperhidrosis de las axilas: de 0,125 ng a 0,5 ng de BoNT/B natural en cada axila;

- sialorrea en pacientes adultos, en particular en pacientes con enfermedad de Parkinson: de 0,05 ng a 0,2 ng de BoNT/B natural por glándula submandibular y/o parótida;

- sialorrea en pacientes pediátricos con parálisis cerebral: de 0,025 ng a 0,1 ng de BoNT/B natural por glándula submandibular y/o parótida.

[0122] Ejemplos de intervalos de dosis adecuados de BoNT/B modificada que tiene una afinidad de unión aumentada por el receptor SytII humano (tal como la neurotoxina que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9), para tratar los trastornos mencionados anteriormente de acuerdo con la invención, son:

- NDO (hiperactividad neurogénica del detrusor): de 0,025 ng a 0,2 ng de BoNT/B modificada en el músculo detrusor; - OAB (vejiga hiperactiva): de 0,0125 ng a 0,1 ng de BoNT/B modificada en el músculo detrusor;

- hiperhidrosis de las axilas: de 0,0075 ng a 0,05 ng de BoNT/B modificada en cada axila;

- sialorrea en pacientes adultos, en particular en pacientes con enfermedad de Parkinson: de 0,0025 ng a 0,02 ng de BoNT/B modificada por glándula submandibular y/o parótida;

- sialorrea en pacientes pediátricos con parálisis cerebral: de 0,001 ng a 0,01 ng de BoNT/B modificada por glándula submandibular y/o parótida.

[0123] Ejemplos de intervalos de dosis adecuados de BoNT/B modificada quimérica que tiene una afinidad de unión aumentada por el receptor SytII humano (tal como la neurotoxina que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10), para tratar los trastornos mencionados anteriormente de acuerdo con la invención, son:

- NDO (hiperactividad neurogénica del detrusor): de 0,2 ng a 1 ng de BoNT/B modificada quimérica en el músculo detrusor;

- OAB (vejiga hiperactiva): de 0,1 ng a 0,5 ng de BoNT/B modificada quimérica en el músculo detrusor;

- hiperhidrosis de las axilas: de 0,05 ng a 0,2 ng de BoNT/B modificada quimérica en cada axila;

- sialorrea en pacientes adultos, en particular en pacientes con enfermedad de Parkinson: de 0,02 ng a 0,1 ng de BoNT/B modificada quimérica por glándula submandibular y/o parótida;

- sialorrea en pacientes pediátricos con parálisis cerebral: de 0,01 ng a 0,05 ng de BoNT/B modificada quimérica por glándula submandibular y/o parótida.

[0124] Ejemplos de intervalos de dosis adecuados de BoNT/F natural (tal como la neurotoxina que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 11), para tratar los trastornos mencionados anteriormente de acuerdo con la invención, son:

- NDO (hiperactividad neurogénica del detrusor): de 0,01 ng a 0,05 ng de BoNT/F natural en el músculo detrusor; - OAB (vejiga hiperactiva): de 0,005 ng a 0,025 ng de BoNT/F natural en el músculo detrusor;

- hiperhidrosis de las axilas: de 0,0025 ng a 0,01 ng de BoNT/F natural en cada axila;

- sialorrea en pacientes adultos, en particular en pacientes con enfermedad de Parkinson: de 0,001 ng a 0,005 ng de BoNT/F natural por glándula submandibular y/o parótida;

- sialorrea en pacientes pediátricos con parálisis cerebral: de 0,0005 ng a 0,0025 ng de BoNT/F natural por glándula submandibular y/o parótida.

[0125] Ejemplos de intervalos de dosis adecuados de BoNT/F modificada que tiene una afinidad de unión aumentada por uno o más gangliósidos (tal como la neurotoxina que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12), para tratar los trastornos mencionados anteriormente de acuerdo con la invención, son:

- NDO (hiperactividad neurogénica del detrusor): de 0,01 ng a 0,05 ng de BoNT/F modificada en el músculo detrusor; - OAB (vejiga hiperactiva): de 0,005 ng a 0,025 ng de BoNT/F modificada en el músculo detrusor;

- hiperhidrosis de las axilas: de 0,0025 ng a 0,01 ng de BoNT/F modificada en cada axila;

- sialorrea en pacientes adultos, en particular en pacientes con enfermedad de Parkinson: de 0,001 ng a 0,005 ng de BoNT/F modificada por glándula submandibular y/o parótida;

- sialorrea en pacientes pediátricos con parálisis cerebral: de 0,0005 ng a 0,0025 ng de BoNT/F modificada por glándula submandibular y/o parótida.

[0126] Ejemplos de intervalos de dosis adecuados de BoNT/F quimérica (tal como la neurotoxina que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13), para tratar los trastornos mencionados anteriormente de acuerdo con la invención, son:

- NDO (hiperactividad neurogénica del detrusor): de 0,007 ng a 0,03 ng de BoNT/F quimérica en el músculo detrusor; - OAB (vejiga hiperactiva): de 0,003 ng a 0,0015 ng de BoNT/F quimérica en el músculo detrusor;

- hiperhidrosis de las axilas: de 0,001 ng a 0,007 ng de BoNT/F quimérica en cada axila;

- sialorrea en pacientes adultos, en particular en pacientes con enfermedad de Parkinson: de 0,0007 ng a 0,003 ng de BoNT/F quimérica por glándula submandibular y/o parótida;

- sialorrea en pacientes pediátricos con parálisis cerebral: de 0,0003 ng a 0,0015 ng de BoNT/F quimérica por glándula submandibular y/o parótida.

[0127] Esta divulgación no se limita a los procedimientos y materiales de ejemplo descritos en este documento, y cualquier procedimiento o material similar o equivalente a los descritos en este documento puede utilizarse en la práctica o el ensayo de las realizaciones de esta divulgación. Salvo indicación contraria, cualquier secuencia de aminoácidos se escribe de izquierda a derecha en orientación amino a carboxilo, respectivamente.

[0128] Cabe señalar además que, tal como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una neurotoxina clostridial" incluye una pluralidad de dichos agentes candidatos, y la referencia a "la neurotoxina clostridial" incluye la referencia a una o más neurotoxinas clostridiales y sus equivalentes conocidos por los expertos en la materia, y así sucesivamente.

[0129] La presente invención se describirá ahora, sólo a modo de ejemplo, con referencia a las siguientes Figuras y Ejemplos.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0130]

Figura 1- Respuestas contráctiles de la tira de vejiga a las contracciones inducidas por EFS después de 3 estimulaciones aplicadas en un intervalo de 1 minuto seguidas de 3 minutos de descanso.

Figura 2A- Tiempo para la inhibición del 50% (T50) de la contracción máxima de EFS en términos de amplitud a 1, 3, 5 o 10 nM de nBoNT/A, nBoNT/B, rBoNT/BMY y rBoNT/ABMY.

Figura 2B- Tiempo para la inhibición del 50% (T50) de la contracción máxima de EFS en términos de amplitud a 0, 1, 1 o 10 nM de nBoNT/F, mrBoNT/F y mrBoNT/F7-1.

Figura 3 -Curvas de respuesta a la concentración de nBoNT/A, nBoNT/B, rBoNT/BMY, rBoNT/ABMY, nBoNT/F y mrBoNT/F7-1. Se representó el tiempo de inhibición del 50 % (T50) frente a la concentración de proteína de toxina botulínica, y se ajustaron funciones logarítmicas produciendo excelentes valores deR2.

SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS

[0131]

• SEQ ID NO: 1 - BoNT/A1, número de acceso A5HZZ9, secuencia de aminoácidos

HPFVNKQ FN YK DP VNGV D IA Y I KI P NA GQMQ PVKA F K IH N K IWVI PERDT FTNPE E GD LNPE PEA KQVPV 3YYDSTYLSTDNEKDNY LKGVTK L FE R I Y S T DL GRML LT S IVR G IPFW G G G TIDTE L K V I DTK CTNVIQPDG SYR5E E LW LV11 GPSA D 7 TQFECK5FGHEVLN T ,T RNGYG5TQ Y IR F5PD FTFG PEES LEV D7 N P L LG AG KFAT D PA VT L AHE L i H AG HRL YGI A I N FN RVFKVNT NA Y Y L14 SGL E V 3 E1 EELRT FGGHDAKFI DS LQENEFRL Y Y Y N K FK D IASTLH K AK SI VGT TASLQYMKWVFKEKYL LSE DT SGK F3V D KLKF DK L Y KMLT E I YT E DN FVK FFKVLNRKT Y L N F D K A V F K IN IV PKV N Y T IY DG F N LRHTNL AANFNGQNT E INNMNFTKL KN FT G L FE FYK L LCVRG11T 5KTK SL DKGYNKALND L C I KVNHW DLFFSPSE DNFTND LNKGEE I T 3 D T H IE A A E E H IS L D L IQQYY LT FNEDIIE P E N IS IE N L SSD 11G Q LELM PN IE RFPNGKEnf ELDKYTHFHY LRAQE FEH G KSR IALTN SVH EAL LN PSRVYTF F S S DY VK K VNK ATE A AM FL GWVEQLVYDFTDET SEVSTTDKI A D IT 111 P Y IGPALNIG NM LYKD D F V G A L IF S G A V ILLE F IP E I A IP V L G T FALVSY I ANKVLTVQTIDHALSKRNEKW DEVYKYI V T NWLAKVNTQI D L IRKKMKEALEM QAEATKA I IN YQYNQYTBEEKNHIN F N IDDLS3K LNE S I HKA M IN IN K F LN Q C S V SY LMN £M 1 PY GVKRLEDFDAS LK D A LLK Y1YDNRGTL1 GQVDRLK DKVNNT L S T D IP F Q lS K YVDNQR1 L STFTEY I KH U N T SILN1RYES1NH L I DLSRYA S K IN IG 3 K V N F D F ID

<k h>Q 1 Q1FMLES S K IEV IL K N A IV Y N S<m y e n f>£<t>S<fv>:K<y f n>S I S<l n n e y t i i>H C<m e h h>3 GwK V S LN Y G E IIW T LQ D T Q E IK Q R W F K Y S Q M IN IS D Y IN R W IF V T IT N W R L N N S K IY IH G R LID C K P ISM LG N IH ASNN IM FKLDG CR D TH RYIW IKYFN LFD KELNEKEIKD LYD NQ SH SG ILKDFW G D YL QY DKPYYMLNL Y D PNKYVDVNNVGI RGYMYLKGPRGSVMT T N I YLNS £ L. Y RGTK F 11 KKYASGNK DN I VRNN DRV Y I N VW KN KE Y RL AT NASQAGVE K 1 LS ALE IP DVGN L £Q V W M K S KN DQGI TNKC KMN LQDNNGND IG F I G FHQ FMHI AKLVASNWYNR Q IE R S S RTLGCSWEFI PVD DGWG ER PL

• SEQ ID NO: 2 - BoNT/B1, número de acceso B1INP5, secuencia de aminoácidos

MP VT IN N FNYN D P I DNNNIIMM E PP FARGT G R Y Y K A F K IT DRIW 11PERY T FGYKP E D FNKS SG I FMRDVCE Y YDP D YLN TN D KK N IFLQ T H IK L F N R IK S K P L G E K L L E M IIN G IP YLGDÍRRVPLEE FN T N IA S V T VNKLISNPG EVERKKG I FAN L11FG PGPVLNEUE T I D I GIQNH FA SRE GFGGIMQMKF C PEYVSVFHMVQENKGASIFNRRGY FS DPALI LMHE L I H VLHG LYG IKVDDL P I VPN EKK FFMQ S T D AIQ AEEL Y T FGGQDE S 11T P S T D K £ I Y D K VLQ N FR G IVD R LN KV LV C IS DFNI N I N IY K H K F K DKYK FVEDS E GKY S I DVE S FDKLY K S LM F G F T E T N IA E N Y K IK T RASY FS DS L F PVKIK N L L DNE IYTIEEG FNISDKDM EKEYRG Q N KA IN K Q A Y E E IS K E H L AV YK1 QMCK SV KA P G IC ID V D N E D L? F IA D K N S F S D D LS K N E R IE Y N T Q S N Y IE N D F P IN E L IL D T D L IS K IE L P S E N T E SLTDFNVDVPVYEKQPAIKK3FTDEHTIFQYLYSQTFFLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKW EAELF AGfíVKQIVNDFVIEMí KSNTMDKIADISLIVPYIGLA1NVGNET AK GNFENAFEI AGAS I LLE F I PE LLI PW GAFLLE S YIDNECNK11 KTI DM ALTKRMEKtfS DM YGLI VAQWLS TVWT Q F7T1 KEGMYKALNYQAQALE E l i KYR YNI Y SEKEKSNIN I DFNDINSKLNEGIMQAIDNIMH F INGCSV S YLMKKMIPLAVEKLLDFDNT LKKNL LMYIDENKLY LIGSAEY EKS KVNKY LKTIMF F DLSI YT N DTI L I EMFNKYHSEI LN H II LNLRYKDNNLI DL SG YGAKVE VYDGVE LMDKNQFKL T 3 SAÍISKIR VTQNQN11FNSVF L DFEVS FMIRIPKYKNDGIQHYIHHEY T11NCMKNNSGWKI SIRG NR11 WTL IDINGKTKSVTFE YNI RE DI SE Y INRVffFFVT I THM1,™ AKIY I NGKLE 3NT DI KDIREVIAHGEI IFKL DGDI DRTQFIWMKYF 31 FN TE 1 SQ S NIEE RYKIQ S Y 3 EY LK DFWGN PIMY NKE YYM ET1AGN KN3 Y l KLKKDS PVGE3 LTR3KYNQNSKYINYRDLYIGEK F 11 RRKSN3Q 3 IN D DIVKKEDYIYLD F FHLNQEWRVYT YKYFKKEEE KL F L A P IS DSDZFYNTIQIKEY DEQPTYSCQLLFKKDZESTDEI GLIGIHRFYEGGIVFEEYKDY FCISKWYLKEVKRKPYNLK.LGCNWQFIPKDEGWTE

SEQ ID NO: 3 - BoNT/C1, número de acceso P18640, secuencia de aminoácidos

M PFVWKQ FN Y K DP VNGV D IA Y I KI PNA GQMQ PVKA F K IH N K IW JIPERDTFTHPEEGDLNPPPEA KQVPV 3YYDSTYLSTDNEKDNY LKGVTK L FE R IY S T DL GRML LT S IV R G IP FW G G 5TID TE L K V I DTN C I NV IQF DGSYR5E E L N L V 11 G PSA D IT Q FECK5FGHEVLNT ,T RNGYG5TQ Y IR F 5 P DF T FG FE ES LEV D7 N P L LG AG KFAT D PA VT L AHE L i H AG HRL YGI A I N FN RVFKVNT NA Y Y EYl SGL E V S E1 EELRT FG G HDAKFIDS LQENEFRL YYYNKFKDIASTLNIKAKSI VGT T ASLQ YMKNVETÍEK YL LSE DTSGK F3V D KLKF DK L Y KMLT E IY T E DN FVK FFKVLNRKT Y L N F D K A V F K IN IV PKV N Y T IY DG F N LRNTNL A ANITNGQNT E INNMNFTKL KN FT G L FE F YK L LC VRG11T 5KTK SL DKG YNK ALND L C I KVNNWDLFFSPSE DNFTND LN K G EE IT 3 D T H IEA A E E H IS L D L IQQYY LT FNFDira P E N IS IE N L SSD 11G Q LELM PN IE RFPHGKEGf ELDKYTHFHY LRAQE FEH G KSR IALTN SVH EAL LN PSRVYTF FSSDYVKKVNKATEAAMFL GWVEQLVYDFTDET SEVSTTDKI A D IT 111 P Y IGPALNIG NM LYKD D FVG A L IF S G A V I LLE F I PE I A I FVLGT FALVS Y IA N K V L T V Q T I DHAJ<j>SKRNE KWDE V Y K Y I VT NWLftKVNTQI D L IRKKMKEALEM QAEATKA I IN YQYNQYTBEEKNHIN F N IDDLS3K LNE S I HKA M IN IN K F LN Q C S V SYLMNSM1 PYGVKRLEDFDASLKDALLK Y1 Y DNRGTL1 GQ VDRLKDKVNNTL S T D I P F Q lS K Y VDNQR1L STFTEY I KH U N T SILH1RYES1NH L I DLSRYA S K IN IG 3 K V N F D F ID

k h Q 1 Q1FMLES S K IEV IL K N A IV T O S m y e n f St S fv: i r i f K y f n S I S l n n e y t i i N Cm e h h 3 GwK V S LN Y G E IIW T LQ D T Q E IK Q R W F K Y S Q M IN IS D Y IN R W IF V T IT N W R L N N S K IY IH G R LID C K P ISM LG N IH ASNN IM FKLDG CR D TH RYIW IKYFN LFD KELNEKEIKD LYD NQ SH SG ILKDFW G D YL QY DKPYYMLNL Y D FNKYVDVNNVGI RGYMYLKGFRGSVMT T N I YLNS £ L Y RGTK F 11 KKYASGNK DN I VRNN DRV Y IN V W K N K E Y RL AT NASQAGVE K 1 LS ALE IP DVGN LSQ‘W VM K SKN DQGITNKC KMNLQDNNGND IG F I G FHQ FMHIA K L V A S NWYN R Q IE R S S RTLGCSWEFI PVD DGWG ER P I

SEQ ID NO: 4 - BoNT/D, número de acceso P19321, secuencia de aminoácidos

M TW FVKD FN YSD PVN D N D lLYLR IPQ N KLITTPVKA F M IT Q N IW V IPERFSSDTNPSLSKPPRPT SK YQ S YY PPS YLSTD EQ K D TFLKG IIKLFKR IW E R D IG KK LIW YLW G S FFM G D SS TPED TFD FT RH TTN I AVE K FENGS WKVT M 11T P S V L IF G PL PN1 L DY TAS L T LQGQ Q SN P S FEG FG T L S I L KV A PE FLLTFS D VTSN Q S SaVLG KSIFC M D PVIALM H ELTH SLH Q LYG IH IPSD KR IR PQ VSEG FFSQ DGPNVQFEE LY TFG G LDVE11PQ IERSQ LREKA1G HYKDIñ K K L N H IN K T IF SSWT SNI C KYKKI ESEKYNFDK DNTGN F W N I DKFNS L Y S DLTNVM5 E W Y S SQ YN VKNRT HY F3 RHY L FV F AN I L D D N I YTIRDG FNLTNKG FNIEW S GQNIE RNPALQKLSS E S W D L F T K V C rJ íL T KNSRDDSTCIKVKN NRL PYVADKDSI S Q E IF E N K IIT DE TNVQNY S DKFS L DE 51 L D G Q VFIN P E IVDFL L PNVNMEFL NIiPGE E IV F Y D D IT K YVDYUffS Y YY LE SQKL SN N VENIT LT T SVEE ftLG YS N K I YT F L P S IA E K V N KG VO AG EFLN W AN EW ED FTTH IM KKDTLD KISDVSVIIPY IG PALNIG N SALR JG N FNQ AFATA G VAFLLE GFPE F T IP A L G V F T F YS 31QERE K 11 K T IE WCLEQRVKRWK DS YQWMVSNW LS R I TTQ FU HINYQMY D3 L SYG AD A IK A K I DL EYKKY S G S DKENIK SQ VE N LKN 5 L DVKIS EAMNNIN K F IR E GSVT YL FKN M LFKVID ELNK FDLRTKTE L I N I ID S H N 11LVGEVDRLKAKVNE S F E N T H P F N IF 5YTN N SLLKD TITJEYFH SIT íD SK lLSLQ N KKN ALVD T SGYNAEVRVGDNVQLNTIY T N D F K L SSS GDK11V N IN N N I L YS A I YEN 33 V S F W IK IS K D LT N S H N E Y T I1NSIEQ NS G Í5K1C IR NG NIE W IL GDVNRKYKS L I FDYSE S1SHT GYTNKW FFVTITNNIMG YM KL Y IN G E LK Q S Q K IEDLDEVKL DKT tV F G ID E N ID E N Q M LK IR D F N IF S K E LS M E D IN IV Y E G Q ILR N V IK D Y W G H P LK F D T E Y Y IIN D N

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SEQ ID NO: 5 - BoNT/E1, número de acceso WP 003372387, secuencia de aminoácidos

MPKIH SFNYN DPVW D R T IL Y IK P GGCQEFYKSF N IMKNI W II P E RNVI G TTP Q□ FH P PT S LKMG D S S Y YDPN YLQS D EEKD ÍR FLKIVTKIFN R IN N NLSG G ILLEELSKANPYLG N D NTPDN Q FH IG D A3 A V E IK F S N G S Q D I1 L P N V IIM G AEPDLFETNSSNISLRNNYM PSNHG FG SIAIVTFSPEYSFRFN D N S M H E F lQ D P A LTLM H E LlH S LH G LY G A R G lTTK Y T lTQ K Q N P LIT tJ IR G TN IE E FLTFG G TD L N I I TS AQ SN D IYTN LLAD YK EI ASKLS KVÍJVSKPL LN P YKDVFE AK Y GLDKDASGI YS V N I NKFN DIF K K L Y S F TE FD L AT K FQVKCRQ T Y IG Q YKY F K LS N LLN D S IY N ISE GYNINNLKVNFRGQNAN L N P R I IT P I T G R G 1 V K K IIR FC KN IVSVKGI RK S IC I EINNG E L FFVASEN5 YN D D N IN TP K E ID D TV T 'SNNNYEN DL DQVI LN FN SE 5 A PC L S DE KLNL T I QU DA Y I P K Y DSNGTS P I EQ H DVN ELNVF FYLDAQ KVPEG ENNVNLTSSIDTA LLE Q P K IY T FFS SEFINNVMK PVQAALFVSW IQQVLVDFT T E ANQ KSTVDKI AD T S I W F Y I G LALNI GNE AQKGNFKD ALE LLG AGI LLE FE PE L L I PT IL V F T I KSFLGSS D NKNKVIK A INN ALKERDEKWKEV YS F I VS WWMTKINTQFNKRKE QMYQ ALQNQVNAI R T 11 E SKYW S Y T LEE KN E LTN KY D I KQI ENE LNQ KVSIAMNN I DRFLTE S S I SY LM K LIN E V K I N KLR E Y D E H V K TY LLH Y IIQ H G S ILG E S Q Q E LN S M V TD TLN N S IP FK LS S Y TD D K IL IS Y FN K FFK R I KSS SVLNMRYKN DK YVDTS G YD SNINING DVYKYPTNKNQ FG IYNDK1SEVN I SQ!N<d y i i y d n>KYKNET5ISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYT11NCMRDNNSGWKVSLNHHEIIWTLQDNAGINQKLAF NY GNAHG15 D YINKWIFVT: T MDRLGD SK LYINGHL130 K31LN LGNIHVSDH= L FKIVKC3 YTR Y IG IR YFNIFDKELDETEIQT LYEHEPHTNILKDFWGNY LLYDKEYYLLNVLKFNNFIDRRKDST

L31NHIR 5 T IL LANRLY S GIKVKIQRVNNS S TNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTN K EKT IR IS E S GWR ETíQVWMNSVGNNC TMNFKNNNGNNIG L LG FK ADT W AS TWYY THMRDHTNS NGC FWNFISE E HGWQE KSEQ ID NO: 6 - BoNT/F1, número de acceso Q57236, secuencia de aminoácidos

M PFVNKQ FNYK D P V N G V D IA Y IK IP N A GQMQ PVKA F K IH N K IW JIPEFDTFTNPEEG DLNPPPEA KQVPV S Y Y D S T Y L ST DNE K DN Y LKGVTK L FE R IY S T DL GRMLLT 51VRG TPFW GGSTIDTE L K V I DTNCINVIQ FDG SYRS E E L N L V IIG F S A D IIQ FECK5FGHE V LN LT RN G YG 5TQ YIRF SPDF T FG FE E 5LEVD7 N PLLGAGKFATDPAVT LAHE L IH A G H R L Y G IA lN PN RVFKVNTNAYY EMSGLEVSF E E L RT FGGH D AK F ID S L QENE FR LY YYNK FK E IA S T LNKAK S IV G T T A S LQY MKNVETÍEK Y L L S E DT 3 GK F5 VDKL K F DK L Y KMLT E I YT E DN FVK FFKVLNRKT Y L N F D K A V F K IN IV P K VN YTIY DG F NLRNTNLAANFNGQNT EINNM NFTRLKN FTGL FEFYR LLCVRG 11T SKTKSLDKG YNKALNDLCI K V N N W D LFFSP SED N FTN D LM K G EE IT3D TN IEA AEE N ISLBLIQ Q Y YLTFM FD N E PE N IS IE N L S S D IIG Q LE LM P N IE R FPN GKK YE L DK YT MFH Y LR AQ E FE H GK S R I A L TN SVNE AL LH PS RVYT F F S S DYVR KVNKATEAAM FL GWVEQLVYD FT DET SEV S T T D K IA D IT 111 P Y IG PALNIG NM LYK D D FVGA L IF S G A V IL L E F I PE IA IP V L G T F AL VS Y IA N KVLT VQ 71 DN A L SKRHE K WDE V Y K Y IV T N W IA K V N T Q ID L IR K K M K E A LE N Q A E A T K A IIN YQYNQYTB EE KN N IN FM ID D LS 3K LN E S IH K A M IN IN K F lN Q C S V S Y LMN 1 PY <3 VK r LE DFDAS LKD ALLK Y1 Y DNRGTL1CQVDRLK DKVNNTL S T D IP FQ LS K Y V D N Q R ILS T F T E Y IK N T IN T S IL N L R Y E S N H L ID L S R Y A S K IN IG S K V N F D P ID KN Q IQ LFN LES S K IE V IL K N A IV YNSM YE N FST 3 F W IR IP K Y FN SISLN N EYTIIN C M EN N 3G W K V S LN Y G E 11W TLQ D T Q E IK Q R W FK Y S Q M IN IS D Y IN R W IFV T IT N N R LN N S K I Y IN G R IiID Q K P IS N L G N I H A S N N IM FKLD G C R D THR YIW IKY FN LFDKELNEKE IK D L Y DNQS N S G IL K DFWGDYL Q YDKPYYM LNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVM TTHIYLNSSLYRGTKFIIKKYASG NK DNIVRNN DRV Y IN W V KN R EY RL AT NASQAGVE K 1 LS ALE IP DVGN L SQ V W M K S KN DQGITNRC KMN LQ DNNGN D IG F IG FHQ FMM IAKLVAS MWYH RQ Z E R S S RT LGCS WE F IP V D DGWG ER F L SEQ ID NO: 7 - BoNT/G, número de acceso WP 039635782, secuencia de aminoácidos

M FVNIKNFNYN D P IN N D D IIM M E P FN D P G P G T Y Y K A F K IID R ItfIV F E R F T Y G F Q F D Q FNASTGV F3K D V Y E Y Y DP T Y LKT □ AE KDK FL K T M IK LFN R IN 3K PS GQ R L L DM IV □ A I P Y LGH A$T F P D K F A A N V A H V S IN K K IIQ P G A E DQIRGLMTN L11FG PGPVL SDNFT DSMIMNGHS P IS E G FGARMMIRF CFSCLNVFNNVQENKDT SIFSRRAYFADPALT1M HE L IH V L H G 1 Y G IK IS N IP IT F N T K E FFMQH 3 DPVQAE EL Y T FGGH DP S V 13 F S T DMNIY NKALQHFQ D I AN R LN IV S S A Q G S G ID IS LY K Q IY K N KY D FVED PN G KYSVD KD KFD KLYKALM FG FTETN LAG EYG IKTR YSYFSEYLFPIKTEKLLDN TI YTQNEGFNIASKNLKTEFNG QNKAVNKEAYEE1SLEHLVIYRIAM CKPVM YK1TTGKSEQCIIVNM E DL F F IANK DS F S K D L A K A E T IAYNTQ U U T IE N N F S IDQLI L DNDLSS G IDLPNENTEPFTN FDD ID IP V Y I KQ S A LK K IF V D G DS L FEY LH AQT F P S N IEN LQ LTN 5 LN DAL RNNNKVY T F F 3 TN LVE K ANT W G ASLFVN W VKG VI DDF^SESTQKSTT DKV5DVS T T T PY T GPALNVGNF.T AKENFKNAFEI G G AAILM EF IF E L IV F IV G FFTLE SYVGNKGH11M TI SUALKK R DQKWTDMYG L IVSQ W LSTVUT

q f y t ik e k m y h a l w n q s q a : e k i i e d q y n f y s e e d k m w i u i d f h d : d f k l n q s i n l a i n i ; i d d f i N Q C S ISYLMNRMTPLAVKKLKDFDDNLKR DLL E Y I DTWELY LLD EVN I L K SKVNRHL K DSIF F D L S L Y T K E T IL IQ V F K N Y IS N 13 SU A I LS L SYRG G R L IDSS G YGATMNVG 3 B V IF N D I GNGQ FK LWU SENSHI TAHQSK F W Y DSMFDNFSI NFWVRT PKYMUN DI QTYLQNE Y T 113 C I KND SGW KVSIK G N R I IW T LID V N A K S K S IF FEY S IK D N IS D Y IU X W F S IT IT U DRL CN AD I Y ING SLKKS E K ILU L D

R lN SSM D ID FKLlN C TD TTKFVM IK D FK lFG R E LN ATE VSS IiY IfflQ SS TIÍTLK D FW G N PLR YD TQ Y Y L i HQGMQHIY IK Y F S K A SMC-E T A PRT M FU H A A I U YQN L Y L G L R F IIK K AS NSRW1UUDKIVRE G DYI Y LN I D N IS LES Y RVYVLVU SKEI Q TQL F L A P IN D DPTFY D V LQ I KKY Y EKTT YN C Q ILC EK D TKT F G L FGI G K F'VK D Y GY VWDT Y DHY FCISQWY LRRI S E U I NK L R LGCWWQFI ?'VDEGWT E • SEQ ID NO: 8 - BoNT/DC, número de acceso BAM65681, secuencia de aminoácidos MTWFVKDFNYSDPVNDND1 LY LR IP Q N K LITTP V K A FM ITQ N IW V IP E R FS S D TN P S LS K P P R P T SK YQ S YY D P SYLSTD EQ KD TFLKG IIK LFKR IN ER D IG K KLIN YLW G S PFM G D SSTP ED TFD FT RH TTN I AVE KFENGSWKVTN11 T P S V L I FGPL PNI L DYTAS L TLQGQÜ SNPS FEG FG T L S I U ÍV A PEFLLTFSD VTSN Q SSAVLG KSIFC M D PVIALM H ELTHSLH Q LYG IU IPSD KRJR PQ VSEG FFSQ DGPNVQFEE LY TFG G LD V E 11P Q IE R S Q LR E K A 1G H Y K D IA K R 1U H IN K T IP S S W IS N ID K Y K K I FSEKY NF DK DN TGH F V V N IDKFNS L Y S DLTNVMS E W Y S SQYNVTÍNRTH YFSRH YL P V F A N ILD D H IY T IR D G F N LT N K G F H IE U S GQNIE RNPALQKLSS E S W D L F T K V C U íL T KNSRDDSTCIKVKN KR L PYVADKDSIS Q E I F E N K IIT DE TNVQWY S DKFS L DE 51 L D G Q VFIN P E IVDFL L PNVUMEPL NIiPGE E IV F Y D D IT K YVDYLN S Y YY LE SQKL SN N VENIT LT T S V E E M<j>G YSNRI YT F L PS IiA E K V NKGVQAG LFLN WANEW E D FT TU IM KK DT L D K IS D V S V IIP Y 1 G PALMIGNS ALRGN FNQAFATA G V A F LLE G FF E FT IP A LG V F T F Y S S IQ E R E K IIK T IE N C LE Q R V K R W K D 5YQWMVSNWLS R I TT Q FM H IN YQ M YD SLSYQ AD AIKAKIDLEYKKYS GSDKENIK3QVENLKHS L DVKIS E AMNNIN K F IR E C S VT Y L FKMML P K V ID ELNK FDLRTK T E L IU L ID S H N IIL V G E V D R L K A K V H E SFE N TM PFN IF SYTN N S LLKD TIW E YFH SIU D SK ILS LQ U K KN ALVD T SGYNAEVRVGDNVQLNTIYTNDFKL SSS GDK11VM LM tni IL Y S A IY E N S 3 V S F W IK IS K D L T N S H N E Y T IIN S IE Q N S GW KLCIRW GNIEW IL QDVNRKYKS L I FDYSE S1SHT GYTNKWFFVTI TN NIM G YM KLYIU G ELKQ SQ KIED LDEVKL DKT t V F G ID E K I DEMQMLWl R D FH IFS K E L SU SDI N I VY EG Q I LRNVIXDYW GNPIiKFDTE Y Y 11 WDN Y I D R Y IAPE SNVLVLVQYPDRSKLY T GN p I T I K SVS DKMPY SR ILW G DN 11LHMLYM SRKYM II R DT DTI YATQGGECSQNCVYALKLQSHLGNY GIG I ES I KNI VSKNKYC S Q IF 33 FRENTML L A D IY KPWR ES FKNAYT PVAVTNYE T K L L S T S S FWKFI3RDPGWVE

• SEQ ID NO: 9 - BqNT/Bmy. secuencia de aminoácidos

M PVTIH N FN YKD P ID H H H IIM M EP P FARGTGRYYKAFKIT D R IW IIP E R 49 Y T PGY K PE D FU KS S G I FtJR DVCEYYD PDY LNT N D KKNIFLQ T M IK L FN R I 99 KSK PL G E K L L E M IIN G IP Y L G DRRVP LE E F N T N IA S VTVN E L I 5WPGEVE 149 R K K G lFA N L11F G FGPVLNEHETIDIG IQNHFASREGFGGIMQM KPCPEY 199 V 5 V FNNVQE NKGASIFNRRGY F 5 D PALILM HE L IH V LHGL Y G IK V DD L P I?.49 VPHEKKFET1QSTDAIÜAEEL Y T ETGGQ D FS11TPS T DKSIYOK VJjQN F R G l 299 V D R L N K V L V C IS D P N IN IN IY KW KFKDKYKFVEDSEGKYSIDVES FDKLY 149 KS LM FG F TE TNIAEW Y K IK T R A S Y FSDS-LFPVKI KNL_, DD E l Y T IE E G FN 399 1 S DK DMEKE YRGQ NKAlNKQ AYEYISKEKLAVY K i QM CKSVKAPGICIDV 449 DNE DL FF IAD KN S FS DDLSKNERIEYNTQ SNYIEHD F P IN E L IL D T D L IS 499 K IE L PS ENT E 3 LT C FN V DV PV Y E K Q P A IK K IF T D E N T IF Q Y L Y 3QT F F L □ 549 IR D IS L T SS FDDAL L FSKKVYS F FSM D YIK T A N K W E AC-L FAGWVKQIVN 599 D F V IE A tJK S N T M D K IA D IS L IV P Y IG L ALNVGNE T AKGN FE NA FE IA G AS 649 IL L E F IP E L L IP W G A f l l e s y i d n k n k i IK T ID N A LTKRKEKWSDMYGL 699 IV AQ W L3TVN TQ FYTIK EG M YK ALN Y Q AQ ALE EIIKYR Y H IYSE KE KSH I 749 N ID FN D IN SK LNE G IN G A ID N IN N FINGC SVS Y LMKKMI PL A V E K LL D F D 799 NT LKKNL LN Y ID E N K L Y L IG S AE YEK SKVN KYLK T IK F F D L S IY T N D T IL 849 IEM FN K Y M S E IL N H I1 LNLRYKDNHLIDLSGYGAKVEVY DGVELNDKNQF 899 KL T SS AN S K IR V T QNQN11FNSVFLDF3 V$ FW IRIPKYKN D G 1Q NYIN N E 949 Y T IIN C M K N M S G W K IS IR G N R II.W TL ID IM G K T K S V F F E Y W IR E D IS E Y I 999 NRW FFVTITH N LN N AKI Y1 N G K LE S N T D IK D IR E V IA U G E 11 FKLD G D ID 1 D49 RTQ FIWMKY F51FN TE LS Q S N IE E R Y K IQ S Y 5E Y LK DFWGNF LMYNKEYY 1099 METI AG NKN5 Y I KL KK DS P V G E ILT RS K YNQN S K Y IN YR DL Y IG E K F11RR 1149 KSNSQ SIM DDIVRKEDYIYLDFFNLNQ EW RVYTYKYFKKEEM KLFLAPIY 1199 DS D E F Y N T IQ IK E Y DEQPT YS CQLLFKKDEEST D E IG L IG IH R FY E S G IV 124 9 FEEYKDY FCISKWYLKEVKKKFYNLK1GCNWQFIPKDEGWT E 1291

SEQ ID NO: 10 - BqNT/ABmy. secuencia de aminoácidos

MPFVNKQ FM YKD PVN G VDIAYIK IPNAG Q M Q PVKAFK1 H N KIW VIPER D 49 T FTNPEE GDLNPP PEAKQVPVSYY DSTYLSTDNE KDHYLKGVT K L F E R IY 99 S T DLGRMLLT S IV R G IP F H G G S T ID T E L KV ID TKTC IN VIQ P DGS YRSEEL 149 N L V IIG P S A D riQ F E C K S FGHEVLNLTRHGYGSTQYIRFS P DFT FG FEES 199 L EVDT NP LLGAGK F AT DPAVTLAHEL IHAGH REY G l AITJPWRVFKVN TN A 249 YYEM3GLEVS FEELRTFGGH DAKFIDSLQ EHE FR LY YYM KFK D IASTLH K 299 AKSIV G TTASLQ YMKMVFKEKYL LSEDTSGK FSVDK LKFDK LYKML T E IY 349 T E DNFVKFFKVLNRKTY LN F DK A V F K IN IV P K V N Y T IY D G FNLR2ÍTNLAA 399 NFMGQWT EIHMMNFT K1KNFTG LFE F YKL LCVRG 11TSKTKSL DKG'YNKA 449 L H D L C IKVMHWD L F FS P EEDNFTKDLNKGEEI T S D T N IE A A E E N ISL D L I 499

QQy y l t f n f d n e p e n i s i e h l s Sd i i g q l e l m p h ie r f f n g k k y e l d k y t 549

M FH Y LRAQE FE HGKS F .l A I T JJ S VN E A L L M P £R VY T F F SS DY VKKVWKAT E 599

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K K E E M K LFLA P IY D SD EFYW TIQ IK EY D E Q PTY S0Q LLFKKD E E3TD E IG 1249

L 1 G IH RFYE S GI VFE: E YK D Y F C 15 KWYLKEVKRK P YNLK LGC NWQ F IP K D 1299

EGWTE 190 4

SEQ ID NO: 11 - BoNT/F7, secuencia de aminoácidos

M PVNI NW FNYN D F IN N T T I L YMKMPYYE DSNKY Y KA FE IM DNVW 11 PE RN11GKK PS DF Y P P I S L D S G S SAYYEPNYLTTDAEK DRF L K T V IK L FH RINSW PAGQVLL E EIK N G K P YL GMDHTAVNE FCANN R S TS V E IK E S K G TTD S M LLN LV ILG P G FN ILE C S TF PVRI FP N N IA Y D F SEKGFGSIQLMS FSTEY E YA FN DX T D I F IA DP A l S I AH E l IH V LN G LY GAKGVTN KK V 1 E V DQGALMAAEKD1 K 1EE F 1 T FGG QDLN11 TUS THQKIY DN LLS H Y TA IA S R LS Q V N IH N SALNTT YYKNFFQWKYGL DQDSNGNYTVNI SKFNAIYKKIFSFTECD LAQ KFQ VKNR SNYLFH FKPFR LLD LLD D NIYSISEG FM IG SER VN N N G Q N IN LNS R IVG P IP DN G L VE RFVGL C K S IVSKKGT KN S LCIK V N N R D L FFVA S E S S Y H ENGI NS PKE I DDTTITW N M YKKN LDEVILD YN SD AI PMLSSRLLNTTAQND5YVPKYDSNGTSE I KEYTVDKLNV FFYLYAQ KAPEG ESAIS1T SSVNTA L L DASKVYT FFSS D F IN T V N K PV Q A A L F IS H IQ Q V IN D F T T E A T Q K S T ID K IA D IS LW P Y V G L A L N IG N E V Q K G N F K E A IE LL G A G ILL E F V P E L L IF T 1 L V F T IK S F I NS DDSKNK11 K A IN N AL F. ERE LKWKE VY S WI VSNW LTRIN TQ FNKRKE QMYQ AL QNQVDG IK K 11 EYKYNWYT L DE KM RLKAEYNI Y S I KE E LNKKVSLAMQNIDRF LT E S S I SYLM KLI N E A K IN K L S E Y DKRVNQYLLNY I L EN S5 T L G T55 VQE LNN LV5HT LNN S IP FE L SE Y

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SEQ ID NO: 12 - BoNT/F1 (H1241K), secuencia de aminoácidos.

M PFVWKQFNY X D P V N G V D IA Y IK I PNAGQMQ FVK AFK IH W K IW V IP E R D T FTHPE E GD LNPE PEA KQVPV 3YYDSTYLSTDNEKDNY LKGVTK L FE R I Y S T DL GRML LT S IVR G IPFW G G G TIDTE L K V I DTK C I NV IQ F DGSYR5E E L N L V 11 GPS A D IT Q FECK5FGHEVLNT ,T RNGYG5TQ YIRFSPD FTFG PEES LEV D I N P L LG AG KFAT D PA VT L AHE L i H AG HRL YGI A I N FN RVFKVNT NA Y Y LM SGL E V 3 E1 EELRT FGGHDAKFI DS LQENBFRL YYYNKFKDIASTLRIKAKSI VGT T ASLQ YMKWVETÍEK YL LSE DT 5 GK F3V D KLKF DK1 YKMLT E I YT E DN FVK FFKVLNRKT Y L N F D K A V F K IN IV PKV N Y T IY DG F N LRHTNL AANFNGQNT E INNMNFTKL KN FT G L FE FYK L LCVRG11T 5KTK SL DKGYNKALND L C I KVNHW DLFFSPSE DNFTND LNKGEE I T 3 D T H IE A A E E H IS L D L IQQYY LT FNEDIIE P E N IS IE N L SSD 11G Q LELM PN IE RFPNGKKYELDKYTMFHY LRAQE FEH G KSR IALTN SVN EAL LN PSRVYTF F S S DY VR K VNK ATE A AM FL GWVEQLVYDFTDET SEVSTTDKI A D IT 111 PY I GPALNIG NM LYKD D F V G ñ lIF S G A V ILLE F IP E I A IP V L G T FALVSY I A H K V LT V Q T ID H A I<j>SKRNEKWDEVYKYI V T NWLftKVNTQI D L IRKKMKEALEMQAEA T K A I IN YQYNQYTBEEKNHIN F N IDDLS3K LME S I HKA M IN IN K FLNQCS V SY LMN SM1 PY GVKRLE DFDAS LKD ALLK Y1YDN RGT L 1 GQ V DRLK DKVNNT L S T D IP F Q lS K YVDNQR1 L STFTEYI KN U N I S ILN1RYES1NH L I DL3R YA S K IN IG 3 K V N F D F ID<kh>Q<1 Q1FMLES S K IEV IL K N A I VYNSm y e n f St S fv: i r i f K y f n S I S l n n e y t i i H Cm ehh3 GwK>V S LN Y G E IIW T LQ D T Q E IK Q R W F K Y S Q M IN IS D Y IN R W IF V T IT N W R LN N S K IY IH G R D ID C K P IS M LG N IH ASNN IM FKLDG CR D TH RYIW IKTFN LFD KELN EKEIKDLYD N Q SH SG ILKD FW G D YL QYDKPYYM LNLYDFNKYVDVNNVGIRGYM YLKGFRGSVM TTW IYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNK DN I VRNN DRV Y I N VW KN KE Y RL AT NASQAGVE K 1 LS ALE IP DVGN L £Q V W M K S KN DQGI TNKC KMN LQ DNNGND IG F I G FHQ FMHI AK LVASNWYH R Q IE R S S RTLGCSWEFI PVD DGWG ER PL

SEQ ID NO: 13 - BoNT/F7-1, secuencia de aminoácidosMPVTJTNUFNYUDPIHHTTILYMKMPYYEDSNKYYKAFEIMDNVWII PERNTIGKKPSDFYFPIS L DSGS SAYY DPNYLTTDAEKDRFLKTVIKLFNRINSNPAGQVLLEEIXNGK PYLGNDHTAVNE FCA NNRST SVEIKE SKGT T DSMLLNLVILG PGPNIEECST F PVRIF PNNI AY D PS EKGFGS1QLM5FS T E Y EYA FN DNTDLFIA DPAISLAHELIHVLHG LY GAKGVT NK KVIEVDQGALMAAEKDIKIEEFI TFGGQDLNIITHSTNQKIY DNLL SNYTAIA3R1SQVHINN3A1NTTYYKN FFQWKYGL DQD3NGN YTVNISKFNAIYKKLFS FTECDLAQKPQVKNRSNYLFH FKPFKLLDL L D D N IY SIS EG FNIGSLR VNNNGQNINLN3RIVGPIP DNGLVE RFVGLCKSVT FRKGTKAP PRL CIKVNNRDLFFVAS E 3 SYN ENG TNSPKEIDDTTIT NNNYKK N L DE V I LDYNSDAIPHLSSRIiLNTTAQNDSYVPKYDSNGTSE I KEY TVTKLNVFFYLYAQKAPEGESAI3LTSSVNTA1LDA3KVYTFFS S DFINTVNXPVQAAL F I SW IQ Q V IN D FTTE A TQ K S TI O K I A D IS L W P Y VG LA LN I GNE VQKGNETÍ E f t lE L L G A G IL LE FVPE

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L M K L IN E A K IN K L SE YDKRVNQYLLNYI LEN SSTL GT SS VQE LNNLV3NT LNH SI P FE LS E YTND

K I L IS Y F N R F Y K R IID S 5 IL N M K Y E N N R F IDSSGYGSNIS IN G D 1Y IY S TN R R Q FG IY S S R LS E V

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• SEQ ID NO: 14 - bucle de activación, secuencia de aminoácidos

KSVIPRKGTKAPPRL

EJEMPLOS

[0132] Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar realizaciones particulares de la invención, y no limitan de ninguna manera el alcance de la invención definida en las reivindicaciones.

Ejemplo 1-Estudio de muestras de tejido de vejiga humana

[0133] Brevemente, se obtuvieron muestras de tejido de vejiga humana de pacientes sometidos a cistectomía por cáncer de vejiga sin disfunción vesical conocida según su historial médico, asegurándose que la recogida y uso de cualquier tejido u otras muestras se llevó a cabo de conformidad con todas las leyes, regulaciones y códigos de práctica pertinentes, incluido el haber obtenido el consentimiento informado de los pacientes por escrito (mencionando las obligaciones de privacidad de datos), así como el historial médico del paciente.

[0134] Tras la intervención quirúrgica, las muestras se transportaron inmediatamente del quirófano a las instalaciones del patólogo, donde se seleccionó un fragmento normal de la cúpula vesical, es decir, sin tejido tumoral macroscópico, para los experimentos. Inmediatamente después de la extracción, las muestras de tejido se almacenaron a 4 °C en tampón Krebs-HEPES (con la siguiente composición en mM: NaCl 118,0; KCl 4,7; MgSO<4>1,2; KH<2>PO<4>1,2; CaCh 2,5; NaHCO<3>4,2;; glucosa 11,1; HEPES 20,8; pH 7,4) que contenía penicilina (100 UI/ml) y estreptomicina (0,1 mg/ml) para su óptima conservación hasta su uso (en un plazo máximo de 24 horas) y se transportaron a las instalaciones de investigación.

[0135] Para preparar las tiras, se extrajo cuidadosamente el urotelio y se extirparon ocho secciones de detrusor (4 x 2 x 2 mm) de la vejiga de cada donante para cada experimento. El tejido vesical restante se pesó, se dividió en dos criotubos y se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido, y se almacenó a -80 °C para su posterior análisis.

[0136] Se realizaron experimentosex vivoutilizando un montaje colocado bajo una campana de laboratorio (Captair Chem Filtair XL1346A) compuesto por cámaras de órganos llenas de tampón Krebs-HEPES mantenido a 37 °C y burbujeado continuamente con 95 % de O<2>y 5 % de CO<2>para mantener un pH de 7,4. Las tiras de vejiga se suspendieron en cámaras de órganos de 5 ml y se conectaron a transductores de fuerza para el registro de tensión isométrica(Pioden Controls Ltd, Reino Unido).Se aplicó una tensión inicial de 1 g. Después de la amplificación, los cambios de tensión se digitalizaron a través de un Mac Lab TM/8 utilizando el software Chart TM 5(AD Instruments L td ).Después de lavados exhaustivos, las tiras se contrajeron mediante estimulación de campo eléctrico (EFS) a través de dos electrodos de platino situados a cada lado de las tiras y conectados a un estimulador (Bionic System Nozay, Francia).

[0137] La tensión se ajustó durante un período de equilibrio de 60 min para alcanzar una tensión de reposo de 1 g, tiempo durante el cual la solución tampón se renovó cada 15 minutos.

[0138] Tras el período de equilibrado, las tiras de músculo liso del detrusor se cebaron añadiendo secuencialmente al baño de órganos KCl (100 mM, 10 min) y a continuación carbacol (3.10-6 M, 10 min), con etapas de lavado entre cada adición de compuesto. A continuación, se inyectó una cantidad de gelatina al 0,5 % en el baño de órganos antes de aplicar las series de EFS.

[0139] Se realizaron series de EFS (20 Hz, duración de pulso de 1 ms, duración de la serie de 5 s, 300 mA) de forma continua en grupos de 3 estimulaciones, aplicadas con un intervalo de 1 min y seguidas de un periodo de descanso de 3 min (condiciones de estimulación basadas en nuestra experiencia con tejido vesical humano y seleccionadas para obtener contracciones robustas y estables en tiras de vejiga humana). Las estimulaciones se continuaron hasta obtener respuestas estables (una respuesta se consideró estable cuando el porcentaje de variación de la amplitud de las contracciones de EFS, calculado para los últimos tres grupos de contracción de EFS durante el periodo de estabilización, fue > 90 % o < 110 %).

[0140] Se incubaron tiras individuales con vehículo (Krebs con 0,5 % de gelatina), 0,1, 1, 3, 5 o 10 nM de neurotoxina botulínica y las estimulaciones de EFS se continuaron durante 3 horas. Al finalizar el experimento, se contrajeron las tiras vesicales mediante activación directa del receptor muscarínico añadiendo carbacol (3,10-6 M, 10 min) al baño de órganos. La comparación de las contracciones de las tiras inducidas por carbacol antes y después de la incubación con neurotoxina botulínica sirve como prueba de viabilidad de las tiras durante el experimento.

T l 2^ r l r i m r ii v i2 2 m n

[0141] Se probaron ocho neurotoxinas botulínicas no complejadas:

- nBoNT/A, una neurotoxina botulínica natural tipo A obtenida de List Biological Laboratories, Inc. (SEQ ID NO: 1); - nBoNT/B, una neurotoxina botulínica natural tipo B obtenida de List Biological Laboratories, Inc. (SEQ ID NO: 2); - rBoNT/BMY, una neurotoxina botulínica recombinante tipo B que comprende dos mutaciones en el dominio H<c>, E1191M y S1199Y (SEQ ID NO: 9);

- rBoNT/ABMY, una neurotoxina botulínica quimérica recombinante (dominio LHn de BoNT/A y dominio Hc de BoNT/B) que comprende dos mutaciones en el dominio Hc, E1191M y S1199Y (SEQ ID NO: 10);

- nBoNT/F, una neurotoxina botulínica natural subtipo F1 obtenida de Metabiologics Inc. (SEQ ID NO: 6);

- mrBoNT/F, una neurotoxina botulínica recombinante subtipo F1 que comprende una mutación de un solo punto en el dominio Hcc, H1241K (SEQ ID NO: 12);

- mrBoNT/F7-1, una neurotoxina botulínica quimérica recombinante subtipo F7, en la que el bucle de activación nativo de BoNT/F7 ha sido reemplazado por el bucle de activación de BoNT/F1 (SEQ ID NO: 13).

[0142] La incubación de neurotoxinas botulínicas en el baño de órganos se realizó añadiendo 0,75 pl, 7,5 pl, 22,5 pl, 37,5 pl o 75 pl de las soluciones madre de toxina botulínica (a 666 nM) a 5 ml de tampón Krebs-HEPES con gelatina al 0,5 % para obtener 0,1, 1, 3, 5 o 10 nM, respectivamente, como concentración final en el baño de órganos.

[0143] Las respuestas contráctiles a los agentes farmacológicos se cuantificaron en términos de la tensión media desarrollada. La tensión media desarrollada (mg, correspondiente a la media del punto de datos en un trazado seleccionado) se midió durante un período de 1 minuto antes y al final de la respuesta estabilizada de cada tira tras la adición de KCl o carbacol.

[0144] Las respuestas contráctiles a las contracciones inducidas por EFS se cuantificaron de la siguiente manera. En resumen, se aplicaron tres estimulaciones con un intervalo de 1 minuto, seguidas de un descanso de 3 minutos, tal como se muestra en la figura 1.

[0145] Cada respuesta inducida por EFS se analizó durante el intervalo de tiempo entre dos estimulaciones consecutivas, es decir, 60 segundos. Este análisis se realizó en las dos últimas respuestas de cada grupo de estimulación durante 3 horas.

[0146] Para cada grupo de estimulación, se promediaron los valores obtenidos en las dos últimas respuestas (pico 2 y 3).

[0147] Para cuantificar las respuestas inducidas por EFS, se calculó la amplitud de la contracción inducida por EFS (mg) como la diferencia entre la tensión desarrollada antes de la estimulación y la tensión máxima desarrollada durante la respuesta a EFS, es decir, la diferencia entre los puntos de datos más grandes (Max) y más pequeños (Min) en la selección.

[0148] Estos valores de amplitud se expresaron como un porcentaje del valor correspondiente a la contracción máxima de EFS medida durante la última serie de estimulación durante el período de estabilización antes de la adición de neurotoxinas botulínicas.

[0149] Los efectos inhibidores de las neurotoxinas botulínicas se evaluaron determinando los valores de tiempo de parálisis 50 (T50) (min), es decir, el tiempo necesario para inhibir el 50 % de la respuesta máxima. Estos valores se calcularon utilizando el modelo de pendiente variable GraphPad Prism 6.05 (Y = Inferior (Superior-Inferior)/(1 10A((LogIC50-X)*HillSlope)). También se denomina curva logística dosis-respuesta de cuatro parámetros.

[0150] Los resultados se presentan en la tabla 3 y en la figura 2.

Tabla 3 - Efectos inhibitorios de neurotoxinas botulínicas en la contracción de tejido de vejiga humano evaluados mediante T50 min a artir de la inhibición de am litud de contracción

Prueba de Kruskal-Wallis: *, **, *** = p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001 frente a nBoNT/A.

Prueba de Kruskal-Wallis: $, $$, $$$ = p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001 frente a nBoNT/B.

nBoNT/A, nBoNT/B, rBoNT/BMY, rBoNT/ABMY, nBoNT/F, mrBoNT/F y mrBoNT/F7-1 mostraron una inhibición dependiente de concentración de la respuesta contráctil inducida por EFS por lo que respecta a la amplitud. nBoNT/A y nBoNT/B indujeron efectos inhibitorios comparables en contracciones inducidas por EFS de tiras de vejiga humana a la misma concentración. Adicionalmente, a todas las dosis, rBoNT/BMY, rBoNT/ABMY, nBoNT/F, mrBoNT/F y mrBoNT/F7-1 indujeron una reducción superior de contracciones provocadas por EFS de tiras de vejiga humana en comparación con cualquiera de los dos de nBoNT/A y/o nBoNT/B. Todas las BoNT/Fs analizadas, así como rBoNT/BMY y rBoNT/ABMY parecían necesitar una concentración inferior para alcanzar la misma reducción de contracciones que nBoNT/A o nBoNT/B. Entre todas las BoNTs analizadas, mrBoNT/F7-1 era la única que inducía la mayor reducción de contracciones.

[0151] Basándose en las observaciones anteriores, se cuantificó la potencia de las toxinas botulínicas probadas en el tejido de la vejiga humana de acuerdo con el procedimiento descrito por Weisemann et al. (Generation and Characterization of Six Recombinant Botulinum Neurotoxins as Reference Material to Serve in an International Proficiency Test, Toxins, 2015, 7(12): 5035-5054; doi:10.3390/toxins7124861), en particular al representar T50 frente a la concentración de proteína de toxina botulínica, y se ajustaron funciones logarítmicas produciendo excelentes valores R2, tal como se muestra en la tabla 4 a continuación y la figura 3.

Tabla 4 - Potencia normalizada de neurotoxinas botulínicas

[0152] Los resultados muestran que la potencia de BoNT/F fue la más alta en el tejido vesical humano, seguida de BoNT/B y finalmente de BoNT/A. En particular, nBoNT/B fue aproximadamente 1,5 veces más potente que nBoNT/A; mrBoNT/B, aproximadamente 20 veces más potente que nBoNT/A y aproximadamente 15 veces más potente que nBoNT/B; mrBoNT/AB, aproximadamente 4 veces más potente que nBoNT/A y aproximadamente 3 veces más potente que nBoNT/B; nBoNT/F, aproximadamente 60 veces más potente que nBoNT/A y aproximadamente 50 veces más potente que nBoNT/B; y mrBoNT/F7-1, aproximadamente 90 veces más potente que nBoNT/A y aproximadamente 70 veces más potente que nBoNT/B. Además, mrBoNT/F exhibió los mismos valores de T50 a 1 nM y 10 nM que nBoNT/F: se puede deducir razonablemente que mrBoNT/F es tan potente como nBoNT/F.

[0153] Por consiguiente, basándose en los sorprendentes datos aquí descritos, las neurotoxinas BoNT/B y BoNT/F, así como las neurotoxinas clostridiales que muestran propiedades similares de unión, captación, translocación y/o escisión de SNARE, tales como BoNT/D, BoNT/D-C o BoNT/G, pueden usarse para tratar trastornos del sistema autónomo en seres humanos, tales como trastornos del músculo liso, en particular trastornos urinarios (NOD, OAB, etc.), a una dosis menor o equivalente a la de BoNT/A utilizada para tratar dichos trastornos. Los valores de potencia relativa identificados en la tabla 4 permiten determinar la cantidad terapéutica de neurotoxina clostridial BoNT/B, BoNT/F, BoNT/D, BoNT/D-C o BoNT/G que se debe administrar a dichos sujetos, basándose en las dosis conocidas que pueden tratar el mismo trastorno autonómico con BoNT/A.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Neurotoxina clostridial para su uso en el tratamiento de un trastorno autonómico en un paciente humano, en la que la neurotoxina clostridial comprende un dominio Hcc de una BoNT/B, BoNT/F, BoNT/D, BoNT/D-C o BoNT/G, y en la que se administra al paciente una dosis que varía de 0,00025 ng a 3 ng de dicha neurotoxina clostridial.

2. Neurotoxina clostridial para su uso, según la reivindicación 1, en la que dicho trastorno autonómico se selecciona entre trastornos del músculo liso, trastornos hipersecretores, trastornos respiratorios, trastornos inflamatorios con un componente autonómico, trastornos neuroendocrinos y otros trastornos autonómicos directamente asociados con un trastorno neurológico central.

3. Neurotoxina clostridial para su uso, según la reivindicación 1 o 2, en la que dicho dominio Hcc es un dominio Hcc de BoNT/B o un dominio H<cc>de BoNT/F.

4. Neurotoxina clostridial para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho dominio Hcc de BoNT/B comprende al menos una mutación de un residuo de aminoácido que aumenta su afinidad de unión por el receptor Syt II humano en al menos un 50 % en comparación con el dominio H<cc>de BoNT/B natural, en la que dicha al menos una mutación de residuo de aminoácido se selecciona del grupo que consiste en 1118M, 1183M, 1191M, 1191I, 1191Q, 1191T, 1199Y, 1199F, 1199L, 1201V, 1191C, 1191V, 1191L, 1191Y, 1199W, 1199E, 1199H, 1178Y, 1178Q, 1178A, 1178S, 1183C. 1183P y cualquier combinación de las mismas.

5. Neurotoxina clostridial para su uso, según la reivindicación 4, en la que dicha al menos una mutación de residuo de aminoácido consiste en las dos mutaciones de aminoácidos 1191M y 1199Y.

6. Neurotoxina clostridial para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho dominio H<cc>de BoNT/F comprende al menos una mutación de residuo de aminoácido que aumenta su afinidad de unión por uno o más gangliósidos en comparación con el dominio Hcc de BoNT/F natural, en la que dicha mutación de residuo de aminoácido es 1241K.

7. Neurotoxina clostridial para su uso, según la reivindicación 6, en la que dichos gangliósidos se seleccionan entre GD1a y/o GM1a.

8. Neurotoxina clostridial para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha neurotoxina clostridial es una neurotoxina BoNT/B.

9. Neurotoxina clostridial para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 6 o 7, en la que dicha neurotoxina clostridial es una neurotoxina BoNT/F.

10. Neurotoxina clostridial para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha neurotoxina clostridial es una neurotoxina quimérica.

11. Neurotoxina clostridial para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha neurotoxina clostridial es una neurotoxina quimérica que comprende un dominio He de BoNT/B y un dominio LH<n>de BoNT/A.

12. Neurotoxina clostridial para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 6 o 7, en la que dicha neurotoxina clostridial es una neurotoxina quimérica que comprende un dominio LHn de un primer subtipo de BoNT/F y un bucle de activación de un segundo subtipo de BoNT/F, y en la que dicho segundo subtipo de BoNT/F difiere de dicho primer subtipo de BoNT/F, preferiblemente en la que dicho dominio LH<n>es un dominio<l>H<n>de BoNT/F7 y/o dicho bucle de activación es un bucle de activación de BoNT/F1.

13. Neurotoxina clostridial para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la neurotoxina clostridial comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NOs: 2-13 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con las mismas, preferiblemente al menos un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia con las mismas.

14. Neurotoxina clostridial para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la neurotoxina clostridial comprende:

a. una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 o una secuencia de aminoácidos con al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma, preferiblemente al menos un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia con la misma; o b. una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos con al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma, preferiblemente al menos un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia con la misma; o c. una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12 o una secuencia de aminoácidos con al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma, preferiblemente al menos un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia con la misma; o d. una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos con al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma, preferiblemente al menos un 90 % o un 95 % de identidad de secuencia con la misma; o e. una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la misma, preferiblemente al menos un 90% o 95% de identidad de secuencia con la misma.