ES3038408T3 - Formulations with reduced degradation of polysorbate - Google Patents

Abstract

La invención proporciona métodos para elaborar dichas formulaciones y métodos para su uso. Además, proporciona métodos para reducir la degradación del polisorbato, métodos para reducir la cantidad de partículas visibles y subvisibles en una formulación acuosa, y métodos para desagregar los productos de degradación del polisorbato, que comprenden la adición de una ciclodextrina a una fórmula que comprende polisorbato y un polipéptido. La invención también proporciona formulaciones acuosas que comprenden un polipéptido, un polisorbato y una ciclodextrina con una degradación reducida del polisorbato. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones con degradación reducida de polisorbato

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. n.° 62/272.965 presentada el 30 de diciembre de 2015.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de una ciclodextrina para reducir la degradación del polisorbato en una formulación acuosa.

Antecedentes de la invención

Las formulaciones farmacéuticas comúnmente contienen polisorbatos 20 y 80 (PS20 y PS80), tensioactivos no iónicos compuestos por un grupo de cabeza de polioxietileno hidrófilo y una cola de ácido graso hidrófobo. La adición de tensioactivos a las formulaciones protege a las proteínas de la desnaturalización y agregación inducidas por la superficie (Geisen,Diabetologia27:212-218 (1984); Wang,Int. J. Pharm.289:1-30 (2005)). La agregación de proteínas se puede producir durante el procesamiento de la sustancia farmacéutica (DS) y el medicamento (DP), el almacenamiento a largo plazo, el envío y durante la administración (Cromwellet al., AApS J.8:E572-E579 (2006)). Se ha demostrado que la adición de un tensioactivo (por ejemplo, PS20) puede minimizar las interacciones interfaciales que pueden sobrecargar las proteínas durante la filtración (Maaet al., J. Pharm. Sci.87:808-812 (1998); Maaet al., Biotechnol. Bioeng.50:319-328 (1996)), agitación (Liuet al., J. Pharm. Sci.102:2460-2470 (2013) ), congelación-descongelación (Kreilgaardet al., J. Pharm. Sci.87:1597-1603 (1998); Hillgrenet al., Int. J. Pharm.237:57-69 (2002)), liofilización (Carpenter,Protein Sci.13:54-54 (2004); Carpenteret al., Pharm. Res.

14:969-975 (1997)), reconstitución (Webbet al., J. Pharm. Sci.91:543-558 (2002)), administración (Kumruet al., J. Pharm. Sci.101:3636-3650 (2012)) y almacenamiento.

Para garantizar la estabilización de los ingredientes farmacéuticos activos (API) durante el procesamiento, el almacenamiento a largo plazo y durante la administración, es importante evitar la degradación del polisorbato. Sin embargo, PS20 es susceptible a la degradación por medio de vías hidrolíticas y oxidativas (Kumru,et al., J. Pharm. Sci.101:3636-3650 (2012); Mahleret al., Abstr Pap Am Chem S.239: (2010)).

La degradación oxidativa de los polisorbatos se ha caracterizado bien y se ha estudiado ampliamente (Kerwin,J. Pharm. Sci.97:2924-2935 (2008); Kishoreet al., J. Pharm. Sci.100:721-731 (2011)). La oxidación se produce típicamente en el contexto de dos mecanismos (1) la autooxidación del grupo de óxido de etileno y (2) la oxidación por radicales en el sitio de insaturación (Kishoreet al., J. Pharm. Sci.100:721-731 (2011)). Aunque se ha observado degradación oxidativa de polisorbatos, se ha demostrado que la oxidación de PS20 se puede mitigar en formulaciones de proteínas mediante la coformulación con antioxidantes (por ejemplo, metionina). También se han desarrollado formulaciones que contienen triptófano para evitar la oxidación de residuos aminoacídicos (documentos US2014/0322203; US2014/0314). Las vías de degradación oxidativa e hidrolítica del polisorbato se pueden distinguir por perfiles únicos de productos de degradación. La degradación hidrolítica del polisorbato produce predominantemente ácidos grasos y la degradación oxidativa del polisorbato produce productos de degradación más diversos que incluyen peróxidos, aldehídos, ácidos, cetonas, n-alcanos, ésteres de ácidos grasos y otros productos de degradación (Ravuriet al., Pharm. Res.28:1194-1210 (2011)).

Los modelos de agresión para la degradación oxidativa del polisorbato usando 2,2'-azobisisobutiramidinio (AAPH) que degradan PS20 se han descrito previamente (Borisovet al.,J. Pharm. Sci. 104:1005-1018 (2015)). Usando enfoques similares, se pueden usar modelos de agresión representativos para desarrollar formulaciones que reduzcan la degradación oxidativa del polisorbato en condiciones relevantes.

Los modelos de agresión para la hidrólisis usando esterasas purificadas (por ejemplo, esterasa de hígado porcino, etc.) y lipasas (por ejemplo, tweenasa, etc.) se han descrito previamente (Labrenz,J. Pharm. Sci.103L2268-2277 (2014) ). Usando enfoques similares, se pueden usar modelos de agresión representativos para desarrollar formulaciones que reduzcan la degradación catalítica del polisorbato en condiciones relevantes.

Recientemente, ha habido informes de degradación enzimática del polisorbato en formulaciones de anticuerpos monoclonales (mAb). Por ejemplo, Labrenz atribuyó la degradación del polisorbato 80 (PS80) observada en formulaciones de mAb derivadas de CHO a un mecanismo enzimático específico en lugar de un mecanismo de hidrólisis biológica general basado en el perfil de degradación de PS20 (Labrenzet al., J. Pharm. Sci.103:2268-2277 (2014)). La secuenciación del genoma de células CHO ha identificado diversas proteínas de la célula huésped (HCP) (por ejemplo, lipasas) que pueden degradar el polisorbato (S. Hammondet al., Biotech. Bioeng.109:1353-1356 (2012)). Posteriormente, Leeet al.han demostrado que reducir la expresión de HCP específicas redujo sustancialmente la hidrólisis de PS80 con respecto a las muestras de control. Estos hallazgos recientes establecen que las lipasas asociadas con la fabricación de productos biológicos se expresan en procedimientos anteriores. Los procedimientos de purificación posteriores (por ejemplo, proteína A) pueden eliminar las HCP; sin embargo, se ha demostrado que algunas HCP se pueden purificar conjuntamente con moléculas API que tienen propiedades similares y, por tanto, se retienen en cantidades mínimas en la sustancia farmacéutica y el medicamento (K. Lee,et al.,A Chinese Hamster Ovary Cell Host Cell Protein That Impacts PS-80 Degradation. AccBio Conference (2015)). Supuestamente, las lipasas con alta actividad pueden dar como resultado una degradación significativa del polisorbato incluso a niveles indetectables. Existen numerosos esfuerzos en curso por identificar y eliminar las lipasas de los fármacos proteínicos mediante genomanipulación de células con expresión reducida de lipasa y por medio de etapas de procesamiento posteriores (por ejemplo, cromatografía). Sin embargo, la degradación enzimática de PS20 y PS80 sigue siendo un desafío significativo en el desarrollo biofarmacéutico y no se ha informado de esfuerzos significativos por identificar formulaciones óptimas para reducir la degradación hidrolítica o catalítica de PS20.

La degradación del polisorbato tiene numerosas consecuencias que pueden afectar a la estabilidad y la vida útil de las formulaciones de fármacos proteínicos. Los degradantes del polisorbato incluyen ácidos grasos poco solubles que pueden dar como resultado la formación de partículas visibles y subvisibles en la solución. La pérdida de PS20 también puede reducir los efectos protectores de PS20 para formulaciones de proteínas. Además, un estudio de adición demostró que algunos de los degradantes relacionados con PS20 pueden afectar a la estabilidad de los fármacos proteínicos; sin embargo, no se observó ningún impacto en condiciones farmacéuticamente relevantes (Kishoreet al., Pharm. Res.28:1194-1210 (2011)).

Lo que se necesita es un procedimiento de reducción de la degradación del polisorbato de modo que los efectos protectores del polisorbato en las formulaciones (por ejemplo, polipéptidos) se mantengan a lo largo del tiempo. Esto dará como resultado formulaciones de polipéptidos más estables durante el procesamiento, el almacenamiento a largo plazo y durante la administración, lo que a su vez alargará el tiempo de vida útil de las formulaciones de polipéptidos y reducirá los desechos provocados por formulaciones degradadas y caducadas.

El documento WO 2010/057107 divulga una formulación farmacéutica para su administración subcutánea de un anticuerpo, que comprende ciclodextrina para inhibir la agregación y floculación del anticuerpo.

Sumario

La invención proporciona el uso de una ciclodextrina para reducir la degradación del polisorbato en una formulación acuosa que comprende un polisorbato y una ciclodextrina,

en el que la proporción p/p resultante de ciclodextrina con respecto a polisorbato es mayor de aproximadamente 37,5:1 y en el que la formulación comprende de aproximadamente un 0,01 % (p/v) a un 0,4 % (p/v) de polisorbato, y en el que la ciclodextrina se selecciona de HP-a-CD, HP-p-CD y SBE-p-CD.

En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80.

En algunos modos de realización, la concentración de polisorbato en la formulación está en el intervalo de aproximadamente un 0,01 % a un 0,1 %. En algunos modos de realización, la concentración de polisorbato en la formulación es de aproximadamente un 0,02 %. En algunos modos de realización, la concentración de ciclodextrina en la formulación está en el intervalo de aproximadamente un 0,5-30 %. En algunos modos de realización, la concentración de ciclodextrina en la formulación es de aproximadamente un 15 %.

En algunos modos de realización de los aspectos y modos de realización anteriores, la degradación del polisorbato se reduce en aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o aproximadamente un 99 %. En algunos modos de realización, se forman menos de aproximadamente 1000, aproximadamente 750, aproximadamente 500, aproximadamente 250, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 50 o aproximadamente 25 partículas de polisorbato mayores de aproximadamente 2 micrómetros de diámetro/ml.

En algunos modos de realización de los aspectos y modos de realización anteriores, la formulación comprende un polipéptido. En algunos modos de realización, el polipéptido es un anticuerpo. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico o un fragmento de anticuerpo. En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la formulación es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml.

En algunos modos de realización de los aspectos y modos de realización anteriores, la formulación es estable a aproximadamente 2 °C hasta aproximadamente 8 °C durante al menos aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses o al menos aproximadamente 24 meses. En algunos modos de realización, la formulación es estable a aproximadamente 1 °C hasta aproximadamente 10 °C durante al menos aproximadamente cuarenta y ocho meses. En algunos modos de realización, la formulación es estable a aproximadamente 2 °C hasta aproximadamente 8 °C durante al menos aproximadamente cuarenta y ocho meses.

En algunos modos de realización, la formulación tiene un pH de aproximadamente 4,5 a 7,0. En algunos modos de realización, la formulación tiene un pH de aproximadamente 4,5 a 6,0. En algunos modos de realización, la formulación tiene un pH de aproximadamente 6,0.

En algunos modos de realización de los aspectos y modos de realización anteriores, la formulación comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizante, un tampón, un tensioactivo y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la formulación es una formulación farmacéutica adecuada para su administración a un sujeto. En algunos modos de realización, la formulación es una formulación farmacéutica adecuada para su administración intravenosa, subcutánea, intramuscular o intravítrea a un sujeto.

Breve descripción de los dibujos

LaFIG. 1muestra el porcentaje relativo promedio (n = 3) de PS20 determinado por RP-ELSD para muestras oxidadas con AAPH 5 mM a 40 °C durante 24 horas que contiene nada de excipiente (control), sacarosa al 15 % (p/v) y HP-p-CD al 15 % (p/v).

LaFIG. 2muestra el porcentaje relativo promedio (n = 3) de PS20 determinado por RP-ELSD para muestras digeridas usando enzimas lipasa B deCandida antárctica(negro), lipoproteína lipasa (gris) y esterasa hepática de conejo (blanco) en muestras sin proteínas que contienen tanto PS20 al 0,02 % (p/v) como HP-p-CD al 0 y al 15 % (p/v).

LasFIGS.3A-3Dmuestran los recuentos de partículas promedio (n = 3) >2 |jm (FIG. 3A), >5 |jm (FIG. 3B), >10 |jm (FIG. 3C) y >25 jim (FIG. 3D) por mililitro determinados por HIAC para muestras digeridas usando enzimas lipasa B deCandida antarctica(negro), lipoproteína lipasa (gris) y esterasa de hígado de conejo (blanco) en muestras sin proteínas que contienen PS20 al 0,02 % (p/v) con HP-p-CD al 0 y al 15 % (p/v).

LaFIG. 4muestra el porcentaje relativo promedio (n = 3) de PS80 determinado por RP-ELSD para muestras sin proteínas que contienen PS80 al 0,02 % (p/v) digeridas usando 15 jig/ml de PPL durante 5 horas a temperatura ambiente que contiene HP-p-CD al 0 y al 15 % (p/v).

LasFIGS. 5A-5Fmuestran los recuentos de partículas subvisibles promedio (n = 3) (FIG. 5A) >1,4 |jm, (FIG. 5B) >2 jm , (FIG. 5C) >5 jm , (FIG. 5D) >10 jm , (FIG. 5E) >15 jm y (FIG. 5F) >25 jm por mililitro para muestras digeridas con 15 jg/m l de PPL durante 5 horas a temperatura ambiente en muestras sin proteínas que contienen PS80 al 0,02 % (p/v) y HP-p-CD al 0 y al 15 % (p/v).

LaFIG. 6muestra el porcentaje relativo promedio (n = 3) de PS20 determinado por RP-ELSD para muestras digeridas con 15 jg/m l de enzima PPL a temperatura ambiente en muestras sin proteínas que contienen un 15 % (p/v) de sacarosa (círculos), HP-a-CD (rombos) y HP-p-CD (triángulos) en función del tiempo.

LaFIG. 7muestra el porcentaje relativo promedio (n = 3) de PS20 determinado por RP-ELSD para muestras digeridas usando 15 jg/m l de enzima PPL durante 4,5 horas a temperatura ambiente en muestras sin proteínas que contienen PS20 al 0,02 % (p/v) sin excipiente (control), sacarosa al 15 % (p/v), metionina al 1 % (p/v), PEG 1500 al 15 % (p/v), PVP al 15 % (p/v), HP-a-CD al 15 % (p/v), HP-p-CD al 15 % (p/v), SBE-p-CD al 15 % (p/v) y HP-y-CD al 15 % (p/v).

LasFIGS.8A-8Dmuestran los recuentos de partículas promedio (n = 3) >2 jm (FIG. 8A), >5 jm (FIG. 8B), >10 jm (FIG. 8C) y >25 jm (FIG. 8D) por mililitro determinados por HIAC para muestras digeridas usando 15 jg/m l de enzima PPL durante 4,5 horas a temperatura ambiente en muestras sin proteínas que contienen PS20 al 0,02 % (p/v) sin excipiente (control), sacarosa al 15 % (p/v), metionina al 1 % (p/v), PEG 1500 al 15 % (p/v), PVP al 15 % (p/v), HP-a-CD al 15 % (p/v), HP-p-CD al 15 % (p/v), SBE-p-CD al 15 % (p/v) y HP-y-CD al 15 % (p/v).

LaFIG. 9muestra el porcentaje relativo promedio (n = 3) de PS20 determinado por RP-ELSD para muestras digeridas usando lipasa B deCandida antarcticaen muestras sin proteínas que contienen PS20 al 0,02 (p/v) sin excipiente (control), SBE-p-CD al 15 % (p/v), HP-a-CD al 15 % (p/v), HP-p-CD al 15 % (p/v), HP-y-CD al 15 % (p/v) y sacarosa al 15 % (p/v).

LasFIGS. 10A y 10Bmuestran los recuentos de partículas promedio (n = 3) (FIG. 10A) >2 jm y (FIG. 10B) >5 jm por mililitro determinados por HIAC para muestras después de la adición de diversos excipientes (HP-a-CD, HP-p-CD, HP-<y>-CD, SBE-p-CD, PVP, PEG 1500, sacarosa y metionina) para evaluar la resolubilización de partículas existentes producidas como resultado de la degradación enzimática de PS-20.

LasFIGS. 11A y 11Bmuestran un vial que contiene partículas relacionadas con PS20 generadas por digestión enzimática usando 15 |jg/ml de enzima PPL durante 4,5 horas a temperatura ambiente (FIG. 11 A) antes y (FIG.

11B) después de añadir HP-p-CD al 15,0 % (p/v). Después de la adición de HP-p-CD al 15 % (p/v), no hay partículas visibles.

LasFIGS. 12A-12Fmuestran los recuentos de partículas subvisibles promedio (n = 3) (FIG. 12A) >1,4 |jm, (FIG.

12B) >2 jm , (FIG. 12C) >5 jm , (FIG. 12D) >10 jm , (FIG. 12E) >15 jm y (FIG. 12F) >25 jm determinados por HIAC por mililitro en muestras sin proteínas que contienen PS20 al 0,02 % (p/v) almacenadas durante 27 meses a 5 °C.

LaFIG. 13muestra el porcentaje relativo promedio (n = 3) de PS20 determinado por RP-ELSD para muestras digeridas usando 15 jg/m l de enzima PPL durante 4,5 horas a temperatura ambiente en muestras sin proteínas que contienen PS20 al 0,02 % (p/v) y diferentes cantidades de HP-p-CD. Los datos se ajustan usando un modelo sigmoide.

LasFIGS. 14A-14Dmuestran el porcentaje relativo promedio (n = 3) de PS20 determinado por RP-ELSD para muestras que contienen (FIG. 14A) un 0,005 %, (FIG. 14B) un 0,02 %, (FIG. 14C) un 0,1 % y (FIG. 14D) un 0,4 % de PS20 digeridas usando 15 jg/m l de enzima PPL durante 4,5 horas a temperatura ambiente en muestras sin proteínas que contienen nada de excipiente (control), un 0, un 0,5, un 5 y un 15 % (p/v) de HP-p-CD.

La gráfica de barras del panel de visualización de lasFIGS. 15A-15Cmuestra los recuentos de partículas promedio (n = 3) (FIG. 15A) >2 jm , (FIG. 15B) >5 jm , (FIG. 15C) >10 jm por mililitro determinados por HiAC para muestras digeridas con 15 jg/m l de enzima PPL durante 4,5 horas a temperatura ambiente en muestras sin proteínas que contienen PS20 al 0,02 % y HP-p-CD al 0, 0,1, 0,5, 5 y 15 % (p/v).

LaFIG. 16muestra el porcentaje relativo promedio (n = 3) de PS20 determinado por RP-ELSD para muestras digeridas usando 15 jg/m l de enzima PPL durante 4,5 horas a temperatura ambiente en muestras sin proteínas que contienen diferentes proporciones molares de HP-p-CD con respecto a PS20. Los datos se ajustan usando un modelo sigmoide.

LasFIGS. 17A-17Dmuestran el porcentaje relativo de PS20 determinado por RP-ELSD para muestras (FIG. 17A) de control, (FIG. 17B) de anticuerpo monoclonal (mAb), (FIG. 17C) de anticuerpo biespecífico (BsAb) y (FIG. 17D) de anticuerpo Fab sencillo (sFAb) digeridas usando 15 jg/m l de enzima PPL durante 4,5 horas a temperatura ambiente que contienen HP-p-CD al 0, 5 y 15 % (p/v).

Descripción detallada

La invención en el presente documento se refiere al uso de una ciclodextrina para reducir la degradación del polisorbato en una formulación acuosa que comprende un polisorbato y una ciclodextrina, en el que la proporción p/p resultante de ciclodextrina con respecto a polisorbato es mayor de aproximadamente 37,5:1 y en el que la formulación comprende de aproximadamente un 0,01 % (p/v) a un 0,4 % (p/v) de polisorbato, y en el que la ciclodextrina se selecciona de HP-a-CD, HP-p-CD y SBE-p-CD.

I. Definiciones.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica del ingrediente activo sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación. Dichas formulaciones son estériles.

Una formulación "estéril" es aséptica o está libre o esencialmente libre de todos los microorganismos vivos y sus esporas.

Una formulación "estable" es una en la que la proteína en la misma conserva esencialmente su estabilidad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica tras el almacenamiento. Preferentemente, la formulación conserva esencialmente su estabilidad física y química, así como su actividad biológica tras el almacenamiento. Una formulación estable también puede conservar su nivel de polisorbato tras el almacenamiento. El periodo de almacenamiento se selecciona, en general, en base al periodo de validez previsto de la formulación. Diversas técnicas analíticas para medir la estabilidad de las proteínas están disponibles en la técnica y se revisan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) y Jones,Adv. Drug Delivery Rev.10: 29-90 (1993), por ejemplo. La estabilidad se puede medir a una cantidad seleccionada de exposición a la luz y/o temperatura durante un periodo de tiempo seleccionado. La estabilidad se puede evaluar cualitativa y/o cuantitativamente en una variedad de formas diferentes, incluyendo la evaluación de la formación de agregados (por ejemplo, usando cromatografía de exclusión por tamaño, midiendo la turbidez y/o por inspección visual); evaluación de la formulación de ROS (por ejemplo, usando un ensayo de agresión con luz o un ensayo de agresión con diclorhidrato de 2,2'-azobis(2-amidinopropano) (AAPH)); oxidación de residuos aminoacídicos específicos de la proteína (por ejemplo, un residuo de Trp y/o un residuo de Met de un anticuerpo monoclonal); evaluando la heterogeneidad de cargas usando cromatografía de intercambio catiónico, enfoque isoeléctrico capilar de imagen (icIEF) o electroforesis de zona capilar; análisis de secuencia aminoterminal o carboxiterminal; análisis espectrométrico de masas; análisis SDS-PAGE para comparar el anticuerpo reducido y el intacto; análisis por cartografía peptídica (por ejemplo, tripsínico o LYS-C); evaluando la actividad biológica o función de unión a la diana de la proteína (por ejemplo, función de unión a antígeno de un anticuerpo); etc. La inestabilidad puede implicar uno cualquiera o más de: agregación, desamidación (por ejemplo, desamidación de Asn), oxidación (por ejemplo, oxidación de Met y/u oxidación de Trp), isomerización (por ejemplo, isomerización de Asp), recorte/hidrólisis/fragmentación (por ejemplo, fragmentación de región de bisagra), formación de succinimida, cisteína(s) desemparejada(s), extensión N terminal, procesamiento C terminal, diferencias de glucosilación, etc.

Una proteína "conserva su estabilidad física" en una formulación farmacéutica si no muestra signos o muestra muy pocos signos de agregación, precipitación y/o desnaturalización tras el examen visual del color y/o la claridad, o como se mide por dispersión de luz UV o por cromatografía de exclusión por tamaño.

Una proteína "conserva su estabilidad química" en una formulación farmacéutica, si la estabilidad química en un momento dado es de modo que se considera que la proteína todavía conserva su actividad biológica como se define a continuación. La estabilidad química se puede valorar detectando y cuantificando formas químicamente alteradas de la proteína. La alteración química puede implicar la oxidación de proteínas que se puede evaluar usando cartografía de péptidos trípticos, cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) de fase inversa y cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (CL/<e>M), por ejemplo. Otros tipos de alteración química incluyen la alteración de cargas de la proteína que se puede evaluar por cromatografía de intercambio iónico o icIEF, por ejemplo.

Una proteína "conserva su actividad biológica" en una formulación farmacéutica, si la actividad biológica de la proteína en un momento dado está dentro de aproximadamente un 10 % (dentro de los errores del ensayo) de la actividad biológica presentada en el momento en que se preparó la formulación farmacéutica, como se determina, por ejemplo, en un ensayo de unión a antígeno para un anticuerpo monoclonal.

Como se usa en el presente documento, "actividad biológica" de una proteína se refiere a la capacidad de la proteína de unirse a su diana, por ejemplo, la capacidad de un anticuerpo monoclonal de unirse a un antígeno. Puede incluir además una respuesta biológica que se puede medirin vitrooin vivo.Dicha actividad puede ser antagonista o agonista.

Una proteína que es "susceptible a la oxidación" es una que comprende uno o más residuo(s) que se ha descubierto que son propensos a la oxidación tales como, pero sin limitarse a, metionina (Met), cisteína (Cys), histidina (His), triptófano (Trp) y tirosina (Tyr). Por ejemplo, un aminoácido triptófano en la porción Fab de un anticuerpo monoclonal o un aminoácido metionina en la porción Fc de un anticuerpo monoclonal puede ser susceptible de oxidación.

Por "isotónico" se quiere decir que la formulación de interés tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas tendrán en general una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. La isotonicidad se puede medir usando un osmómetro de tipo presión de vapor o congelación de hielo, por ejemplo.

Como se usa en el presente documento, "tampón" se refiere a una solución tamponada que resiste los cambios en el pH por la acción de sus componentes conjugados ácido-base. El tampón de la presente invención preferentemente tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 8,0. Por ejemplo, el acetato de histidina es un ejemplo de un tampón que controlará el pH en este intervalo.

Un "conservante" es un compuesto que se puede incluir opcionalmente en la formulación para reducir esencialmente la acción bacteriana en la misma, facilitando por tanto la producción de una formulación de múltiples usos, por ejemplo. Los ejemplos de conservantes potenciales incluyen cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en los que los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, alcohol butílico y bencílico, alquilparabenos tales como metil o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol. En un modo de realización, el conservante en el presente documento es alcohol bencílico.

Como se usa en el presente documento, un "tensioactivo" se refiere a un agente activo en superficie, preferentemente un tensioactivo no iónico. Los ejemplos de tensioactivos en el presente documento incluyen polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20 y polisorbato 80); poloxámero (por ejemplo, poloxámero 188); Tritón; dodecilsulfato de sodio (SDS); lauril sulfato de sodio; octil-glucósido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil- o estearilsulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- o cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-betaína (por ejemplo, lauroamidopropilo); miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil-taurato de sodio o metil oleil-taurato de disodio; y la serie MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); polietilglicol, polipropilglicol y copolímeros de etilen- y propilenglicol (por ejemplo, Pluronics, PF68, etc.); etc.

Los excipientes o vehículos "farmacéuticamente aceptables" como se usan en el presente documento incluyen vehículos, estabilizantes, tampones, ácidos, bases, glúcidos, conservantes, tensioactivos, agentes de tonicidad y similares farmacéuticamente aceptables, que son bien conocidos en la técnica(Remington: The Science and Practice of Pharmacy,22.a ed., Pharmaceutical Press, 2012). Los ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen tampones, tales como fosfato, citrato, acetato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico, L-triptófano y metionina; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona (PVP); aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; complejos metálicos tales como complejos de Zn-proteína; agentes quelantes, tales como EDTA; alditoles, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos, tales como polisorbato, poloxámero, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS™. Los excipientes o vehículos "farmacéuticamente aceptables" son los que se pueden administrar razonablemente a un sujeto para proporcionar una dosis eficaz del ingrediente activo empleado y que no son tóxicos para el sujeto que se expone a los mismos en las dosificaciones y concentraciones empleadas.

El término "polisorbato" (también abreviado como PS), como se usa en el presente documento, se refiere a sorbitán PEGilado esterificado con ácidos grasos e incluye polisorbato 20 (monolaurato de sorbitán polioxietilenado (20)), polisorbato 40 (monopalmitato de sorbitán polioxietilenado (20)), polisorbato 60 (monoestearato de sorbitán polioxietilenado (20)) y polisorbato 80 (monooleato de sorbitán polioxietilenado (20)).

El término "ciclodextrina" se refiere a una familia de compuestos que comprenden moléculas de glucosa unidas en una estructura similar a un anillo con unidades de d-glucopiranosa unidas con enlaces alfa-(1,4) glicosídicos. Ciclodextrinas ejemplares incluyen 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina (HP-p-CD o HP-beta-ciclodextrina), 2-hidroxipropil-a-ciclodextrina (HP-a-CD o HP-alfa-ciclodextrina), 2-hidroxipropil-Y-ciclodextrina (HP-<y>-CD o HP-gamma-ciclodextrina), p-ciclodextrina (p-CD o beta-ciclodextrina), éter sulfobutílico de p-ciclodextrina (SBE-p-CD o SBE-beta-ciclodextrina), a-ciclodextrina (a-CD o alfa-ciclodextrina) y Y-ciclodextrina (<y>-CD o gammaciclodextrina). Los sinónimos de ciclodextrina incluyen Cavitron, oligosacárido cíclico, cicloamulosa y cicloglucano.

El término "agente de tonicidad" se refiere a un agente que se usa para ajustar o mantener la concentración relativa de las soluciones. Los agentes de tonicidad preferentes incluyen alditoles polihídricos, preferentemente alditoles trihídricos o superiores, tales como glicerol, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol.

El término "estabilizante" se refiere a agentes que estabilizan biomoléculas cargadas grandes, tales como proteínas y anticuerpos. Los agentes de tonicidad también pueden servir como estabilizantes, cuando se usan con biomoléculas cargadas grandes.

"Degradación reducida del polisorbato" se refiere a condiciones donde, después de un periodo de tiempo, permanece más polisorbato en una muestra en comparación con un control en condiciones de almacenamiento similares. Por ejemplo, una muestra que tiene un 95 % de polisorbato restante después de un periodo de tiempo muestra degradación reducida del polisorbato en comparación con una muestra de control que tiene un 50 % de polisorbato restante después del mismo periodo de tiempo.

El término "desagregar", como se usa en el presente documento, se refiere a la reducción de partículas visibles y/o subvisibles provocadas por la degradación del polisorbato. Por ejemplo, un agente es eficaz para desagregar los productos de degradación del polisorbato si las cantidades de partículas visibles y/o subvisibles se reducen cuando se añade a una solución que contiene polisorbato.

El término "solubilizar" se refiere a disolver un sólido en un líquido. Por ejemplo, un agente es eficaz para solubilizar un compuesto si el compuesto se disuelve más fácilmente en presencia de ese agente.

El término "proporción p/p" se refiere a la cantidad de un soluto por masa dividida por la cantidad de otro soluto por masa. Por ejemplo, una solución que contiene 100 mg de ciclodextrina y 1 mg de polisorbato tiene una proporción p/p de ciclodextrina con respecto a polisorbato de 100:1. De acuerdo con un modo de realización, la proporción p/p de ciclodextrina con respecto a polisorbato es mayor de aproximadamente 37,5:1.

Una "formulación acuosa” se refiere a una formulación líquida a base de agua adecuada para su administración. La formulación puede contener un agente terapéutico, tal como un anticuerpo o moléculas pequeñas y es preferentemente estéril. Las formulaciones acuosas también pueden contener tampones, estabilizantes, agentes de tonicidad y excipientes.

La proteína que se formula es preferente y esencialmente pura y de forma deseable esencialmente homogénea (por ejemplo, libre de proteínas contaminantes, etc.). Proteína "esencialmente pura" quiere decir una composición que comprende al menos aproximadamente un 90 % en peso de la proteína (por ejemplo, anticuerpo monoclonal), en base al peso total de la composición, preferentemente al menos aproximadamente un 95 % en peso. Proteína "esencialmente homogénea" quiere decir una composición que comprende al menos aproximadamente un 99 % en peso de la proteína (por ejemplo, anticuerpo monoclonal), en base al peso total de la composición.

Los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido" se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y se puede interrumpir por restos no aminoacídicos. Los términos también engloban un polímero de aminoácidos que se ha modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcado. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, proteínas que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los ejemplos de proteínas englobadas dentro de la definición en el presente documento incluyen proteínas de mamífero, tales como, por ejemplo, renina; una hormona del crecimiento, incluyendo hormona del crecimiento humana y hormona del crecimiento bovina; factor liberador de la hormona del crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; leptina; factores de coagulación tales como factor VIIIC, factor IX, tromboplastina tisular y factor de von Willebrand; factores anticoagulación, tales como proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como urocinasa u orina humana o activador tisular del plasminógeno (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; un receptor del factor de necrosis tumoral tal como el receptor de muerte 5 y CD120; ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL); antígeno de maduración de linfocitos B (BCMA); estimulador de linfocitos B (BLyS); un ligando inductor de proliferación (APRIL); encefalinasa; RANTES (regulada por activación normalmente expresada y secretada por linfocitos T); proteína inflamatoria de macrófagos (MIP-1-alfa) humana; una seroalbúmina tal como seroalbúmina humana; hormona antimülleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas (PD-ECGF); una proteína de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular (por ejemplo, VEGF-A,<v>E<g>F-B, VEGF-C, V<e>GF-D y P1GF); una proteína de la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (por ejemplo, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D y dímeros de los mismos); familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), tal como aFGF, bFGF, FGF4 y FGF9; factor de crecimiento epidérmico (EGF); receptores de hormonas o factores de crecimiento tales como (un) receptor(es) de VEGF (por ejemplo, VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3), receptor(es) del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (por ejemplo, receptor ErbB1, ErbB2, ErbB3 y ErbB4), receptor(es) del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (por ejemplo, PDGFR-a y PDGFR-p), y receptor(es) del factor de crecimiento de fibroblastos; ligandos TIE (angiopoyetinas, ANGPT1, ANGPT2); receptor de angiopoyetina tal como TIE1 y TIE2; proteína A o D; factores reumatoideos; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso, tal como NGF-b; factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-pi, TGF-P2, TGF-p3, TGF-p4 o TGF-p5; factor de crecimiento insulínico I y II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento insulínico (IGFBP); proteínas CD, tales como CD3, CD4, CD8, CD19 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); una quimiocina tal como CXL12 y CXCR4; un interferón tal como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; una citocina, tal como interleucinas (IL), por ejemplo, de IL-1 a IL-10; midcina; superóxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteínas de membrana de superficie; factor de aceleración del decaimiento; antígeno vírico, tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura del sida; proteínas de transporte; receptores de migración dirigida; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; efrinas; Bv8; ligando 4 de tipo Delta (DLL4); Del-1; BMP9; BMP10; folistatina; factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/factor de dispersión (SF); Alk1; Robo4; ESM1; Perlecan; dominio de tipo EGF, múltiple 7 (EGFL7); CTGF y miembros de su familia; trombospondinas, tales como trombospondina 1 y trombospondina 2; colágenos, tales como colágeno IV y colágeno XVIII; neuropilinas, tales como NRP1 y NRP2; pleiotrofina (PTN); progranulina; proliferina; proteínas Notch, tales como Notchl y Notch4; semaforinas tales como Sema3A, Sema3C y Sema3F; antígeno asociado a tumor, tal como CA125 (antígeno de cáncer de ovario); inmunoadhesinas; y fragmentos y/o variantes de cualquiera de las proteínas enumeradas anteriormente, así como anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpo, que se unen a una o más proteínas, incluyendo, por ejemplo, cualquiera de las proteínas enumeradas anteriormente.

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, siempre que presenten la actividad biológica deseada.

Una proteína "aislada" (por ejemplo, un anticuerpo aislado) es una que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían en los usos en la investigación, en el diagnóstico o terapéuticos para la proteína, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. La proteína aislada incluye la proteínain situdentro de células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural de la proteína no está presente. Habitualmente, sin embargo, la proteína aislada se preparará por al menos una etapa de purificación.

Los "anticuerpos naturales" son normalmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se enlaza a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, aunque el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de isotipos de inmunoglobulina diferentes. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V<h>) seguido de una serie de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V<l>) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos aminoacídicos particulares forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada.

El término "dominio constante" se refiere a la porción de una molécula de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos más conservada en relación con la otra porción de la inmunoglobulina, el dominio variable, que contiene el sitio de unión a antígeno. El dominio constante contiene los dominios CH1, CH2 y CH3 (conjuntamente, CH) de la cadena pesada y el dominio CHL (o CL) de la cadena ligera.

La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios aminoterminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada se puede denominar "VH". El dominio variable de la cadena ligera se puede denominar "VL". Estos dominios son, en general, las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión a antígeno.

El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente en todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables (HVR) o en los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada. En algunos modos de realización, las HVR son regiones determinantes de la complementariedad (CDR).

Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se llaman regiones estructurales (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina beta, conectadas por tres HVR, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de lámina beta. Las HVR en cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las HVR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,quinta edición, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de mamífero se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa ("<k>") y lambda ("A"), basados en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

El término "isotipo" o "subclase" de IgG, como se usa en el presente documento, significa cualquiera de las subclases de inmunoglobulinas definidas por las características químicas y antigénicas de sus regiones constantes. Dependiendo de las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) se pueden asignar a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 5, £,<y>y M, respectivamente. Las estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas y se describen, en general en, por ejemplo, Abbaset al., Cellular and Mol. Immunology,4.a ed., W.B. Saunders, Co. (2000). Un anticuerpo puede formar parte de una molécula de fusión más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo con otra u otras proteínas o péptidos.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no a fragmentos de anticuerpo como se define a continuación. Los términos se refieren, en particular, a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una región Fc.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la región de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')<2>y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, en el que su nombre refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')<2>que tiene dos sitios de combinación con antígeno y todavía puede reticular el antígeno. El fragmento Fab contiene los dominios variables de la cadena pesada y ligera y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxílico del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para un Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes porta(n) un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')<2>se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También son conocidos otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

"Fv" es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de unión a antígeno completo. En un modo de realización, una especie de Fv bicatenario consiste en un dímero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la ligera en asociación estrecha no covalente. En una especie de Fv monocatenario (scFv) se pueden enlazar de forma covalente un dominio variable de la cadena pesada y uno de la ligera por un conector peptídico flexible, de modo que las cadenas ligera y pesada se puedan asociar en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie de Fv bicatenario. Es en esta configuración en la que las tres HVR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Conjuntamente, las seis HVR confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenarios" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En general, el polipéptido scFv<comprende además un conector polipeptídico entre los dominios>V<h y>V<l>,<lo que posibilita que el scFv forme la>estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de scFv, véase, por ejemplo, Pluckthün, enThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269 315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo los fragmentos un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Usando un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno.

Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 1993/01161; Hudsonet al., Nat. Med.9:129-134 (2003); y Hollingeretal.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudsonet al., Nat. Med.9:129-134 (2003).

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones naturales, que pueden estar presentes en cantidades menores. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que no es una mezcla de anticuerpos diferenciados. En determinados modos de realización, dicho anticuerpo monoclonal típicamente incluye un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a una diana, en los que la secuencia polipeptídica de unión a diana se obtuvo por un procedimiento que incluye la selección de una única secuencia polipeptídica de unión a diana de una pluralidad de secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, el procedimiento de selección puede ser la selección de un único clon de una pluralidad de clones, tal como un grupo de clones de hibridoma, clones de fago o clones de ADN recombinante. Se debe entender que una secuencia de unión a diana seleccionada se puede alterar adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a diana, para mejorar su producción en el cultivo celular, para reducir su inmunogenicidadin vivo,para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión a diana alterada también es un anticuerpo monoclonal de la presente invención. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas en tanto que típicamente no están contaminadas por otras inmunoglobulinas.

El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, el procedimiento de hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256:495-97 (1975); Hongoet al., Hybridoma14 (3): 253-260 (1995), Harlowet al., Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed.

1988); Hammerlinget al.,en:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomaspp. 563-681 Elsevier, N.Y. (1981)), procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.816.567), tecnología de expresión en fagos (véase, por ejemplo, Clacksonet al., Nature,352: 624-628 (1991); Markset al., J. Mol. Biol.

222: 581-597 (1992); Sidhuet al., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Leeet al., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Leeet al., J. Immunol. Methods284(1-2): 119-132 (2004); y tecnologías para producir anticuerpos humanos o humanizados en animales que tienen partes o la totalidad de los locus de inmunoglobulina humana o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (véanse, por ejemplo, los documentos WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovitset al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:2551 (1993); Jakobovitset al., Nature362: 255-258 (1993); Bruggemannet al., Year in Immunol.7:33 (1993); patentes de EE. UU. n.° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016; Markset al.,Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberget al., Nature368: 856-859 (1994); Morrison,Nature368: 812-813 (1994); Fishwildet al., Nature Biotechnol.14: 845-851 (1996); Neuberger,Nature Biotechnol.14: 826 (1996) y Lonberg y Huszar,Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995)).

Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico a u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrisonet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos PRIMATIZED® en los que la región de unión a antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido, por ejemplo, por la inmunización de macacos con el antígeno de interés.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En un modo de realización, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en el que los residuos de una HVR del receptor se remplazan por residuos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En algunos casos, se reemplazan residuos de FR de la inmunoglobulina humana por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentren ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se pueden preparar para refinar además el rendimiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente comprenderá también al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véanse, por ejemplo, Joneset al., Nature321:522-525 (1986); Riechmannet al., Nature332:323-329 (1988); y Presta,Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992). Véanse también, por ejemplo, Vaswani y Hamilton,Ann. Allergy, Asthma & Immunol.1:105-115 (1998); Harris,Biochem. Soc. Transactions23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross,Curr. Op. Biotech.5:428-433 (1994); y patentes de EE. UU. n.° 6.982.321 y 7.087.409.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha preparado usando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos como se divulga en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo colecciones de presentación en fagos. Hoogenboom y Winter,J. Mol. Biol.,227:381 (1991); Markset al., J. Mol. Biol.,222:581 (1991). También están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos los procedimientos descritos en Coleet al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerneret al., J. Immunol.,147(1):86-95 (1991). Véase también van Dijk y van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol.,5:368-74 (2001). Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta a la exposición antigénica, pero cuyos locus endógenos se han desactivado, por ejemplo, xenorratones inmunizados (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 6.075.181 y 6.150.584 con respecto a la tecnología XENOMOUSE™). Véase también, por ejemplo, Liet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,103:3557-3562 (2006) con respecto a los anticuerpos humanos generados por medio de una tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos.

El término "región hipervariable", "HVR" o "HV", cuando se usa en el presente documento, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son de secuencia hipervariable y/o forman bucles estructuralmente definidos. En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). En anticuerpos naturales, H3 y L3 presentan la mayor diversidad de las seis HVR, y se cree que H3 en particular desempeña un papel único al conferir una especificidad precisa a los anticuerpos. Véanse, por ejemplo, Xuet al., Immunity13:37-45 (2000); Johnson y Wu, enMethods in Molecular Biology248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003). De hecho, los anticuerpos de camélido naturales que consisten en una cadena pesada solo son funcionales y estables en ausencia de la cadena ligera. Véanse, por ejemplo, Hamers-Castermanet al., Nature363:446-448 (1993); Sheriffet al.,Nature Struct. Biol.(1996).

Una serie de delimitaciones de HVR están en uso y se engloban en el presente documento. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las usadas más comúnmente (Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia se refiere, en cambio, a la localización de los bucles estructurales (Chothia y LeskJ. Mol. Biol.196:901-917 (1987)). Las HVR de AbM representan un término medio entre las HVR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y se usan por el programa informático de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las HVR de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada una de estas HVR se indican a continuación.

Bucle Kabat AbM Chothia Contacto

L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (numeración de Kabat)

H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (numeración de Chothia)

H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

Las HVR pueden comprender "HVR extendidas" como sigue: 24-36 o 24-34 (L1), 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 o 89 96 (L3) en el VL y 26-35 (H1), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102, o 95-102 (H3) en el VH. Los residuos del dominio variable se enumeran de acuerdo con Kabatet al., supra,para cada una de estas definiciones.

Los residuos de la "región estructural" o "FR" son los residuos del dominio variable distintos de los residuos de HVR, como se define en el presente documento.

El término "numeración de residuos de dominio variable como en Kabat" o "numeración de posiciones aminoacídicas como en Kabat", y variaciones del mismo, se refiere al sistema de numeración usado para dominios variables de la cadena pesada o dominios variables de la cadena ligera de la recopilación de anticuerpos en Kabatet al., supra.Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento de, o inserción en, una F<r>o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir una única inserción aminoacídica (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc., de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de FR de la cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos se puede determinar para un anticuerpo dado por alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada según Kabat "estándar".

El sistema de numeración de Kabat se usa, en general, cuando se hace referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente los residuos 1-107 de la cadena ligera y los residuos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabatet al., Sequences of Immunological Interest.5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). El "sistema de numeración EU" o "índice EU" se usa, en general, cuando se hace referencia a un residuo en una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, el índice EU que se informa en Kabatet al., supra).El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo IgG1 humano EU.

La expresión "anticuerpos lineales" se refiere a los anticuerpos descritos en Zapataet al. (Protein Eng,8(10):1057-1062 (1995)). En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fc en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, conjuntamente con polipéptidos de la cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

Se producen preferentemente anticuerpos policlonales en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (s.c.) o intraperitoneales (i.p.) del antígeno pertinente y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno pertinente (especialmente cuando se usan péptidos sintéticos) a una proteína que sea inmunógena en la especie que se va a inmunizar. Por ejemplo, el antígeno se puede conjugar con hemocianina de lapa californiana (KLH), seroalbúmina, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja, usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl<2>o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.

El término "anticuerpo multiespecífico" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente un anticuerpo que comprende un dominio de unión a antígeno que tiene especificidad poliepitópica (es decir, se puede unir específicamente a dos o más epítopos diferentes en una molécula biológica o se puede unir específicamente a epítopos en dos o más moléculas biológicas diferentes). En algunos modos de realización, un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo multiespecífico (tal como un anticuerpo biespecífico) comprende dos unidades VH/VL, en el que una primera unidad VH/VL se une específicamente a un primer epítopo y una segunda unidad VH/VL se une específicamente a un segundo epítopo, en el que cada unidad VH/<v>L comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL). Dichos anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de longitud completa, anticuerpos que tienen dos o más dominios VL y VH, fragmentos de anticuerpo tales como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos y triacuerpos biespecíficos, fragmentos de anticuerpo que se han enlazado covalente o no covalentemente. Una unidad VH/V<l>que comprende además al menos una porción de una región constante de cadena pesada y/o al menos una porción de una región constante de cadena ligera también se puede denominar "hemímero" o "semianticuerpo". En algunos modos de realización, un semianticuerpo comprende al menos una porción de una única región variable de cadena pesada y al menos una porción de una única región variable de cadena ligera. En algunos modos de realización de este tipo, un anticuerpo biespecífico que comprende dos semianticuerpos y se une a dos antígenos comprende un primer semianticuerpo que se une al primer antígeno o primer epítopo pero no al segundo antígeno o segundo epítopo y un segundo semianticuerpo que se une al segundo antígeno o segundo epítopo y no al primer antígeno o primer epítopo. De acuerdo con algunos modos de realización, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo IgG que se une a cada antígeno o epítopo con una afinidad de 5 M a 0,001 pM, de 3 M a 0,001 pM, de 1 M a 0,001 pM, de 0,5 M a 0,001 pM o de 0,1 M a 0,001 pM. En algunos modos de realización, un hemímero comprende una porción suficiente de una región variable de cadena pesada para permitir que se formen enlaces disulfuro intramoleculares con un segundo hemímero. En algunos modos de realización, un hemímero comprende una mutación de botón o una mutación de ojal, por ejemplo, para permitir la heterodimerización con un segundo hemímero o semianticuerpo que comprende una mutación de ojal o una mutación de botón complementaria. Las mutaciones de botón y las mutaciones de ojal se analizan más adelante.

Un "anticuerpo biespecífico" es un anticuerpo multiespecífico que comprende un dominio de unión a antígeno que se puede unir específicamente a dos epítopos diferentes en una molécula biológica o se puede unir específicamente a epítopos en dos moléculas biológicas diferentes. Un anticuerpo biespecífico también se puede denominar en el presente documento como que tiene "doble especificidad" o como "doblemente específico". A menos que se indique de otro modo, el orden en que se enumeran los antígenos unidos por un anticuerpo biespecífico en un nombre de anticuerpo biespecífico es arbitrario. En algunos modos de realización, un anticuerpo biespecífico comprende dos semianticuerpos, en los que cada semianticuerpo comprende una única región variable de cadena pesada y, opcionalmente, al menos una porción de una región constante de cadena pesada, y una única región variable de cadena ligera y, opcionalmente, al menos una porción de una región constante de cadena ligera. En determinados modos de realización, un anticuerpo biespecífico comprende dos semianticuerpos, en los que cada semianticuerpo comprende una única región variable de cadena pesada y una única región variable de cadena ligera y no comprende más de una única región variable de cadena pesada y no comprende más de una única región variable de la cadena ligera. En algunos modos de realización, un anticuerpo biespecífico comprende dos semianticuerpos, en los que cada semianticuerpo comprende una única región variable de cadena pesada y una única región variable de cadena ligera, y en los que el primer semianticuerpo se une a un primer antígeno y no a un segundo antígeno y el segundo semianticuerpo se une al segundo antígeno y no al primer antígeno.

El término tecnología "botón en ojal" o "KnH" como se usa en el presente documento se refiere a la tecnología que dirige el emparejamiento entre síin vitrooin vivode dos polipéptidos introduciendo una protuberancia (botón) en un polipéptido y una cavidad (ojal) en el otro polipéptido en una interfase en la que interactúan. Por ejemplo, se han introducido KnH en las interfases de unión de Fc:Fc, interfases CL:CH1 o interfases VH/VL de anticuerpos (véanse, por ejemplo, los documentos US 2011/0287009, US2007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431 y Zhuet al.,1997,Protein Science6:781-788). En algunos modos de realización, los KnH impulsan el emparejamiento entre sí de dos cadenas pesadas diferentes durante la fabricación de anticuerpos multiespecíficos. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos que tienen KnH en sus regiones Fc pueden comprender además dominios variables únicos enlazados a cada región Fc, o comprender además dominios variables de la cadena pesada diferentes que se emparejen con dominios variables de la cadena ligera similares o diferentes. También se puede usar la tecnología KnH para emparejar entre sí dos dominios extracelulares de receptores diferentes o cualquier otra secuencia polipeptídica que comprenda secuencias de reconocimiento de diana diferentes (por ejemplo, que incluyan aficuerpos, pepticuerpos y otras fusiones de Fc).

El término "mutación de botón", como se usa en el presente documento, se refiere a una mutación que introduce una protuberancia (botón) en un polipéptido en una interfase en la que el polipéptido interactúa con otro polipéptido. En algunos modos de realización, el otro polipéptido tiene una mutación de ojal (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.731.168, US 5.807.706, US 5.821.333, US 7.695.936, US 8.216.805).

El término "mutación de ojal", como se usa en el presente documento, se refiere a una mutación que introduce una cavidad (ojal) en un polipéptido en una interfase en la que el polipéptido interactúa con otro polipéptido. En algunos modos de realización, el otro polipéptido tiene una mutación de botón (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.731.168, US 5.807.706, US 5.821.333, US 7.695.936, US 8.216.805).

El término "aproximadamente", como se usa en el presente documento, se refiere a un intervalo de error aceptable para el valor respectivo, como se determina por un experto en la técnica, que dependerá en parte de la manera en que se mida o determine el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "aproximadamente" puede querer decir dentro de 1 o más de 1 desviaciones estándar, según la práctica en la técnica. Una referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye y describe modos de realización que se refieren a ese valor o parámetroper se.Por ejemplo, una descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

Como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen las referencias plurales a menos que el contenido lo indique claramente de otro modo. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un compuesto" incluye opcionalmente una combinación de dos o más de dichos compuestos, y similares.

II. Formulaciones y preparación

La invención en el presente documento se refiere al uso de una ciclodextrina para reducir la degradación del polisorbato en una formulación acuosa que comprende un polisorbato y una ciclodextrina, en el que la proporción p/p resultante de ciclodextrina con respecto a polisorbato es mayor de aproximadamente 37,5:1 y en el que la formulación comprende de aproximadamente un 0,01 % (p/v) a un 0,4 % (p/v) de polisorbato, y en el que la ciclodextrina se selecciona de HP-a-CD, HP-p-CD y SBE-p-CD.

En algunos modos de realización, la formulación comprende además un polipéptido.

También se divulga, pero no forma parte de la invención reivindicada, una formulación acuosa que comprende un polisorbato y una ciclodextrina, en la que menos de un 1 % del polisorbato se ha degradado después de almacenamiento a aproximadamente 1 °C hasta aproximadamente 10 °C durante de al menos aproximadamente seis meses hasta al menos aproximadamente 48 meses, en la que la proporción p/p de ciclodextrina con respecto a polisorbato en la formulación es al menos aproximadamente 37,5:1.

En algunos modos de realización, la formulación es estable a aproximadamente 2 °C hasta aproximadamente 8 °C durante al menos aproximadamente seis meses hasta al menos aproximadamente 48 meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses o al menos aproximadamente 48 meses.

En algunos modos de realización, la degradación del polisorbato se reduce en aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o aproximadamente un 99 %. En otros modos de realización, se forman menos de aproximadamente 1000, aproximadamente 750, aproximadamente 500, aproximadamente 250, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 50 o aproximadamente 25 partículas de polisorbato mayores de aproximadamente dos micrómetros de diámetro por ml. En algunos modos de realización, la formulación comprende además un polipéptido. En algunos modos de realización, la concentración de proteína es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml. En algunos modos de realización, la concentración de proteína es mayor de aproximadamente 250 mg/ml. En algunos modos de realización, la formulación tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,0 o de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,0, o de aproximadamente 6,0. En algunos modos de realización, la formulación comprende además uno o más de un estabilizante, un tampón, un tensioactivo y un agente de tonicidad. En otros modos de realización, la formulación es adecuada para su administración intravenosa, subcutánea, intramuscular o intravítrea a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico o un fragmento de anticuerpo. En algunos modos de realización, la formulación comprende además una molécula pequeña, un ácido nucleico, un lípido y/o un carbohidrato.

Las proteínas y anticuerpos en la formulación se pueden preparar usando procedimientos conocidos en la técnica. En el presente documento se proporcionan procedimientos ejemplares no limitantes para preparar un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo y anticuerpos multiespecíficos). El anticuerpo en la formulación acuosa se prepara usando técnicas disponibles en la técnica para generar anticuerpos, de los que se describen procedimientos ejemplares con más detalle en las siguientes secciones. Un experto en la técnica puede adaptar los procedimientos del presente documento para la preparación de formulaciones que comprenden otras proteínas, tales como inhibidores basados en péptidos. Véase Sam Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,4.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012);Current Protocols in Molecular Biology,F.M. Ausubel,et al.eds. (2003); Short Protocols in Molecular Biology, Ausubelet al.,eds., J. Wiley and Sons (2002); Horswillet al., Current Protocols in Protein Science,(2006);Antibodies, A Laboratory Manual,Harlow y Lane, eds. (1988); R.I. Freshney,Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Application,6.a ed., J. Wiley and Sons (2010) para técnicas y procedimientos en general bien entendidos y comúnmente empleados para la producción de proteínas terapéuticas.

A. Preparación del anticuerpo

El anticuerpo en las formulaciones acuosas proporcionadas en el presente documento se dirige contra un antígeno de interés. Preferentemente, el antígeno es un polipéptido biológicamente importante y la administración del anticuerpo a un mamífero que padece un trastorno puede dar como resultado un beneficio terapéutico en dicho mamífero. Sin embargo, también se contemplan anticuerpos dirigidos frente a antígenos distintos de polipéptido.

Si el antígeno es un polipéptido, puede ser una molécula transmembranaria (por ejemplo, receptor) o ligando, tal como un factor de crecimiento. Los antígenos ejemplares incluyen moléculas tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); CD20; ox-LDL; ox-ApoB100; renina; una hormona del crecimiento, incluyendo hormona del crecimiento humana y hormona del crecimiento bovina; factor liberador de la hormona del crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación, tales como factor VIIIC, factor IX, tromboplastina tisular y factor de von Willebrand; factores anticoagulación, tales como proteína C; péptido natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como urocinasa u orina humana o activador tisular del plasminógeno (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulada por activación normalmente expresada y secretada por linfocitos T); proteína inflamatoria de macrófagos (MIP-1-alfa) humana; una seroalbúmina, tal como seroalbúmina humana; hormona antimülleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropinas de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoideos; un factor neurotrófico, tal como el factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento nervioso, tal como NGF-P; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos, tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento y transformación (TGF), tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-P1, TGF-P2, TGF-P3, TGF-P4 o TGF-P5; factor de crecimiento insulínico I y II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento insulínico; proteínas CD, tales como CD3, CD4, CD8, CD19 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón, tal como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, de IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteínas de membrana de superficie; factor de aceleración del decaimiento; antígeno vírico, tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura del sida; proteínas de transporte; receptores de migración dirigida; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas, tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor, tal como el receptor HER2, HER3 o HER4; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente.

(i) Preparación de antígeno

Se pueden usar antígenos solubles o fragmentos de los mismos, opcionalmente conjugados a otras moléculas, como inmunógenos para generar anticuerpos. Para moléculas transmembranarias, tales como receptores, se pueden usar fragmentos de estos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) como inmunógeno. De forma alternativa, se pueden usar células que expresen la molécula transmembranaria como inmunógeno. Dichas células se pueden derivar de una fuente natural (por ejemplo, líneas de células de cáncer) o pueden ser células que se hayan transformado por técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembranaria. Otros antígenos y formas de los mismos útiles para preparar anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica.

(ii) Determinados procedimientos basados en anticuerpos

Se producen preferentemente anticuerpos policlonales en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (s.c.) o intraperitoneales (i.p.) del antígeno pertinente y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno pertinente con una proteína que sea inmunógena en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja, usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil-sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCh o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunógenos o derivados combinando, por ejemplo, 100 |jg o 5 |jg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes más tarde, se administra a los animales una dosis de refuerzo con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días más tarde, se extrae sangre de los animales y el suero se somete a ensayo para determinar el valor de anticuerpos. Se administra una dosis de refuerzo a los animales hasta la meseta del valor. Preferentemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. También se pueden preparar conjugados en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteínas. También se usan adecuadamente agentes de agregación, tales como alumbre, para potenciar la respuesta inmunitaria.

Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden preparar usando el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohleret al., Nature,256:495 (1975), y descrito además, por ejemplo, en Hongoet al., Hybridoma,14 (3): 253-260 (1995), Harlowet al., Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988); Hammerlinget al.,en:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), y Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268 (2006) con respecto a hibridomas humanos-humanos. Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.189.826 con respecto a la producción de anticuerpos IgM naturales humanos monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma. La tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) se describe en Vollmers y Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91 (2005).

Para diversas otras técnicas de hibridoma, véanse, por ejemplo, los documentos US 2006/258841; US 2006/183887 (anticuerpos completamente humanos), US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229; y patentes de EE. UU. n.° 7.078.492 y 7.153.507. Un protocolo ejemplar para producir anticuerpos monoclonales usando el procedimiento de hibridoma se describe como sigue. En un modo de realización, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, se inmuniza para obtener linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se unen específicamente a la proteína usada para la inmunización. Los anticuerpos se generan en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (s.c.) o intraperitoneales (i.p.) de un polipéptido de la invención o un fragmento del mismo, y un adyuvante, tal como el monofosforil lípido A (MPL)/dicrinomicolato de trehalosa (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont.). Se puede preparar un polipéptido de la invención (por ejemplo, antígeno) o un fragmento del mismo usando procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como procedimientos recombinantes, de los que algunos se describen adicionalmente en el presente documento. El suero de animales inmunizados se somete a ensayo para determinar anticuerpos anti-antígeno, y se administran opcionalmente inmunizaciones de refuerzo. Se aíslan los linfocitos de animales que producen anticuerpos anti-antígeno. De forma alternativa, los linfocitos se pueden inmunizarin vitro.

A continuación, se fusionan los linfocitos con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Véase, por ejemplo, Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,pp. 59-103 Academic Press, (1986). Se pueden usar células de mieloma que se fusionan eficazmente, soportan una producción de alto nivel estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Las células de mieloma ejemplares incluyen, pero no se limitan a, líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif., EE. UU., y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, Md., EE. UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma murino-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor,J. Immunol.,133:3001 (1984); Brodeuret al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York (1987).

Se siembran las células de hibridoma así preparadas y se cultivan en un medio de cultivo adecuado, por ejemplo, un medio que contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), evitando dichas sustancias el crecimiento de células carentes de HGPRT. Preferentemente, se usan procedimientos de cultivo celular de hibridoma sin suero para reducir el uso de suero derivado de animal, tal como suero fetal bovino, como se describe, por ejemplo, en Evenet al., Trends in Biotechnology,24(3), 105-108 (2006).

Los oligopéptidos como herramientas para mejorar la productividad de cultivos celulares de hibridoma se describen en Franek,Trends in Monoclonal Antibody Research,111-122 (2005). Específicamente, se enriquecen los medios de cultivo estándar con determinados aminoácidos (alanina, serina, asparagina, prolina) o con fracciones de hidrolizado de proteínas, y se puede suprimir significativamente la apoptosis por oligopéptidos sintéticos, constituidos por de tres a seis residuos aminoacídicos. Los péptidos están presentes en concentraciones milimolares o mayores.

El medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma se puede analizar para determinar la producción de anticuerpos monoclonales que se unen a un anticuerpo de la invención. La especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se puede determinar por inmunoprecipitación o por un ensayo de uniónin vitro,tal como radioinmunoanálisis (RIA) o enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA). La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, por análisis de Scatchard. Véase, por ejemplo, Munsonet al., Anal. Biochem.,107:220 (1980).

Después de que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución limitante y cultivar por procedimientos estándar. Véase, por ejemplo, Goding,supra.Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, se pueden cultivarin vivocélulas de hibridoma como tumores ascíticos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Un procedimiento para el aislamiento de proteínas de células de hibridoma se describe en el documento US 2005/176122 y la patente de EE. UU. n.° 6.919.436. El procedimiento incluye el uso de sales mínimas, tales como sales liotrópicas, en el procedimiento de unión y preferentemente también el uso de pequeñas cantidades de disolventes orgánicos en el procedimiento de elución.

(iii) Determinados procedimientos de cribado de colecciones

Los anticuerpos de la invención se pueden preparar mediante el uso de colecciones combinatorias para cribar para determinar anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, son conocidos en la técnica una variedad de procedimientos para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para detectar los anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se describen, en general, en Hoogenboomet al.,enMethods in Molecular Biology178:1-37, O'Brienet al.,ed., Human Press, Totowa, N.J., (2001). Por ejemplo, un procedimiento de generación de anticuerpos de interés es a través del uso de una colección de anticuerpos en fagos como se describe en Leeet al., J. Mol. Biol.340(5):1073-93 (2004).

En principio, los clones de anticuerpos sintéticos se seleccionan cribando colecciones de fagos que contienen fagos que presentan diversos fragmentos de la región variable (Fv) del anticuerpo fusionada a la proteína de la cubierta del fago. Dichas colecciones de fagos se analizan por cromatografía de afinidad frente al antígeno deseado. Los clones que expresan fragmentos Fv que se pueden unir al antígeno deseado se adsorben en el antígeno y, por tanto, se separan de los clones de no unión en la colección. A continuación, los clones de unión se eluyen del antígeno, y se pueden enriquecer además por ciclos adicionales de adsorción/elución de antígeno. Cualquiera de los anticuerpos de la invención se puede obtener diseñando un procedimiento de cribado de antígenos adecuado para seleccionar el clon de fago de interés seguido de la construcción de un clon de anticuerpo de longitud completa usando las secuencias de Fv del clon de fago de interés y secuencias de la región constante (Fc) adecuadas descritas en Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,quinta edición, publicación NIH 1-3:91-3242, Bethesda Md. (1991).

En determinados modos de realización, el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo se forma a partir de dos regiones variables (V) de aproximadamente 110 aminoácidos, cada una de las cadenas ligera (VL) y pesada (VH), presentando ambas tres bucles hipervariables (HVR) o regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Los dominios variables se pueden presentar funcionalmente en fagos, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) en los que VH y VL están unidos covalentemente a través de un péptido flexible corto, o bien como fragmentos Fab en los que están fusionados cada uno a un dominio constante e interaccionan no covalentemente, como se describe en Winteret al., Ann. Rev. Immunol.,12:433-455 (1994). Como se usa en el presente documento, los clones de fago que codifican scFv y los clones de fago que codifican Fab se denominan conjuntamente "clones de fago de Fv" o "clones de Fv".

Los repertorios de genes de VH y VL se pueden clonar por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y recombinar aleatoriamente en colecciones de fagos que, a continuación, se pueden consultar para determinar los clones de unión a antígeno como se describe en Winteret al., Ann. Rev. Immunol.,12: 433-455 (1994). Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio sin exposición previa para proporcionar una única fuente de anticuerpos humanos para una amplia gama de antígenos no propios y también propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffithset al., EMBO J,12: 725-734 (1993). Finalmente, también se pueden preparar sintéticamente colecciones sin exposición previa clonando los segmentos génicos V no reordenados a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 altamente variables y conseguir el reordenamientoin vitro,como se describe por Hoogenboom y Winter,J. Mol. Biol.,227: 381-388 (1992).

En determinados modos de realización, el fago filamentoso se usa para presentar fragmentos de anticuerpo por fusión a la proteína de la cubierta menor pIII. Los fragmentos de anticuerpo se pueden presentar como fragmentos Fv monocatenarios, en los que los dominios VH y VL están conectados en la misma cadena polipeptídica por un espaciador polipeptídico flexible, por ejemplo, como se describe por Markset al., J. Mol. Biol.,222: 581-597 (1991), o como fragmentos Fab, en los que una cadena se fusiona a pIII y la otra se secreta en el periplasma de la célula huésped bacteriana, donde el ensamblaje de una estructura de Fab-proteína de la cubierta se presenta en la superficie del fago desplazando algunas de las proteínas de la cubierta naturales, por ejemplo, como se describe en Hoogenboomet al., Nucl. Acids Res.,19: 4133-4137 (1991).

En general, los ácidos nucleicos que codifican fragmentos de genes de anticuerpos se obtienen de células inmunitarias obtenidas de seres humanos o animales. Si se desea una colección sesgada en favor de clones antiantígeno, se inmuniza al sujeto con antígeno para generar una respuesta de anticuerpos, y se recuperan las células del bazo y/o linfocitos B en circulación u otros linfocitos de sangre periférica (LSP) para la construcción de colecciones. En un modo de realización se obtiene una colección de fragmentos de genes de anticuerpos humanos sesgada en favor de los clones anti-antígeno generando una respuesta de anticuerpos anti-antígeno en ratones transgénicos que portan una micromatriz genética de inmunoglobulina humana funcional (y que carecen de un sistema de producción de anticuerpos endógenos funcionales), de modo que la inmunización con antígeno dé lugar a linfocitos B que producen anticuerpos humanos frente al antígeno. La generación de ratones transgénicos que producen anticuerpos humanos se describe a continuación.

Se puede obtener un enriquecimiento adicional en cuanto a las poblaciones celulares reactivas anti-antígeno usando un procedimiento de cribado adecuado para aislar linfocitos B que expresan un anticuerpo unido a membrana específico de antígeno, por ejemplo, por separación celular usando cromatografía de afinidad por antígeno o adsorción de células sobre antígeno marcado con fluorocromo seguida de separación celular activada por flujo (FACS).

De forma alternativa, el uso de células del bazo y/o linfocitos B u otros LSP de un donante no inmunizado proporciona una mejor representación del posible repertorio de anticuerpos, y también permite la construcción de una colección de anticuerpos usando cualquier especie animal (humana o no humana) en la que el antígeno no es antigénico. Para colecciones que incorporan una construcción génica de anticuerpoin vitro,se obtienen células madre del sujeto para proporcionar ácidos nucleicos que codifiquen segmentos de genes de anticuerpo no reordenados. Las células inmunitarias de interés se pueden obtener a partir de una variedad de especies animales, tales como las especies humana, de ratón, de rata, lagomorfa, lupina, canina, felina, porcina, bovina, equina y aviar, etc.

Los segmentos de genes variables de anticuerpos que codifican ácidos nucleicos (incluyendo los segmentos de VH y VL) se recuperan de las células de interés y se amplifican. En el caso de las colecciones de genes VH y VL reordenados, se puede obtener el ADN deseado aislando ADN genómico o ARNm de linfocitos, seguido de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores que coinciden con los extremos 5' y 3' de genes VH y VL reordenados como se describe en Orlandiet al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),86: 3833-3837 (1989), preparando de este modo diversos repertorios de genes V para su expresión. Los genes V se pueden amplificar a partir de ADNc y ADN genómico, con los cebadores inversos en el extremo 5' del exón que codifica el dominio V maduro y los cebadores directos basadosdentro del segmento J como se describe en Orlandiet al.(1989) y en Wardet al., Nature,341: 544-546 (1989). Sin embargo, para amplificar a partir de ADNc, los cebadores inversos también se pueden basar en el exón líder como se describe en Joneset al., Biotechnol.,9: 88-89 (1991), y los cebadores directos dentro de la región constante como se describe en Sastry et al.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. UU.),86: 5728-5732 (1989). Para maximizar la complementariedad, se puede incorporar redundancia en los cebadores como se describe en Orlandiet al.(1989) o Sastryet al.(1989). En determinados modos de realización, la diversidad de las colecciones se maximiza usando cebadores de PCR dirigidos a cada familia de genes V para amplificar todas las disposiciones de VH y VL disponibles presentes en la muestra de ácido nucleico de células inmunitarias, por ejemplo, como se describe en el procedimiento de Markset al., J. Mol. Biol.,222: 581-597 (1991) o como se describe en el procedimiento de Orumet al., Nucleic Acids Res.,21: 4491-4498 (1993). Para la clonación del ADN amplificado en vectores de expresión, se pueden introducir sitios de restricción infrecuentes dentro del cebador de PCR como una marca en un extremo como se describe en Orlandiet al.(1989), o por amplificación por PCR adicional con un cebador marcado como se describe en Clacksonet al., Nature,352: 624-628 (1991).

Los repertorios de genes V reordenados sintéticamente se pueden derivarin vitrode segmentos de genes V. La mayoría de los segmentos de genes VH humanos se han clonado y secuenciado (informado en Tomlinsonet al., J. Mol. Biol.,227: 776-798 (1992)), y cartografiado (informado en Matsudaet al., Nature Genet.,3: 88-94 (1993); estos segmentos clonados (incluyendo todas las conformaciones principales de los bucles H1 y H2) se pueden usar para generar diversos repertorios de genes VH con cebadores de PCR que codifican bucles H3 de secuencia y longitud diversas como se describe en Hoogenboom y Winter,J. Mol. Biol.,227: 381-388 (1992). También se pueden preparar repertorios de VH con toda la diversidad de secuencia enfocada en un bucle H3 largo de una única longitud como se describe en Barbaset al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89: 4457-4461 (1992). Los segmentos Vk y VX humanos se han clonado y secuenciado (informado en Williams y Winter,Eur. J. Immunol.,23: 1456-1461 (1993)) y se pueden usar para preparar repertorios de cadena ligera sintéticos. Los repertorios de genes V sintéticos, basados en una gama de plegamientos de VH y VL, y longitudes de L3 y H3, codificarán anticuerpos de considerable diversidad estructural. Después de la amplificación de los ADN que codifican genes V, se pueden reordenarin vitrosegmentos de genes V de la estirpe germinal de acuerdo con los procedimientos de Hoogenboom y Winter,J. Mol. Biol.,227: 381-388 (1992).

Los repertorios de fragmentos de anticuerpo se pueden construir combinando los repertorios de genes VH y VL conjuntamente de varias formas. Cada repertorio se puede crear en vectores diferentes y los vectores se pueden recombinarin vitro,por ejemplo, como se describe en Hogrefeet al., Gene,128: 119-126 (1993), oin vivopor infección combinatoria, por ejemplo, el sistema loxP descrito en Waterhouseet al., Nucl. Acids Res.,21: 2265 2266 (1993). El enfoque de recombinaciónin vivoaprovecha la naturaleza bicatenaria de fragmentos Fab para superar el límite del tamaño de la colección impuesto por la eficacia de transformación deE. coli.Los repertorios de VH y VL sin exposición previa se clonan por separado, uno en un fagómido y el otro en un vector de fago. A continuación, se combinan las dos colecciones por infección por fagos de bacterias que contienen fagómidos, de modo que cada célula contenga una combinación diferente y el tamaño de la colección esté limitado solo por el número de células presentes (aproximadamente 1012 clones). Ambos vectores contienen señales de recombinaciónin vivode modo que los genes VH y VL se recombinen en un único replicón y se empaqueten conjuntamente en viriones de fago. Estas inmensas colecciones proporcionan grandes cantidades de diversos anticuerpos con buena afinidad (Kd-1 de aproximadamente 10-8 M).

De forma alternativa, los repertorios se pueden clonar secuencialmente en el mismo vector, por ejemplo, como se describe en Barbaset al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88: 7978-7982 (1991), o ensamblar conjuntamente por PCR y a continuación clonar, por ejemplo, como se describe en Clacksonet al., Nature,352: 624-628 (1991). También se puede usar ensamblaje por p Cr para unir los ADN de VH y VL con ADN que codifica un espaciador peptídico flexible para formar repertorios de Fv monocatenarios (scFv). Aún en otra técnica, se usa "ensamblaje por PCR en célula" para combinar genes de VH y VL en linfocitos por PCR y, a continuación, clonar repertorios de genes unidos como se describe en Embletonet al., Nucl. Acids Res.,20: 3831-3837 (1992).

Los anticuerpos producidos por las colecciones sin exposición previa (naturales o bien sintéticas) pueden ser de afinidad moderada (Kd-1 de aproximadamente 106 a 107 M-1), pero la maduración de la afinidad también se puede imitarin vitroconstruyendo y reseleccionando a partir de colecciones secundarias como se describe en Winteret al.(1994),supra.Por ejemplo, la mutación se puede introducir al azarin vitrousando polimerasa propensa a errores (informada en Leunget al., Technique1:11-15 (1989)) en el procedimiento de Hawkinset al., J. Mol. Biol.,226: 889-896 (1992) o en el procedimiento de Gramet al., Proc. Natl. Acad. Sci USA,89: 3576-3580 (1992). Adicionalmente, la maduración de la afinidad se puede realizar mutando aleatoriamente una o más CDR, por ejemplo, usando PCR con cebadores que portan secuencias aleatorias que abarcan la CDR de interés, en clones de Fv individuales seleccionados y cribando para determinar clones de mayor afinidad. El documento WO 9607754 (publicado el 14 de marzo de 1996) describió un procedimiento para inducir mutagénesis en una región determinante de la complementariedad de una cadena ligera de inmunoglobulina para crear una colección de genes de la cadena ligera. Otro enfoque eficaz es recombinar los dominios VH o VL seleccionados por presentación en fagos con repertorios de variantes de dominios V naturales obtenidas a partir de donantes no inmunizados y cribar para determinar la mayor afinidad en varias tandas de rebarajado de cadenas como se describe en Markset al., Biotechnol.,10: 779-783 (1992). Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo con afinidades de aproximadamente 10-9 M o menos.

El cribado de las colecciones se puede lograr por diversas técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, el antígeno se puede usar para recubrir los pocillos de las placas de adsorción, expresar en células huésped fijadas a placas de adsorción o usar en la separación celular, o conjugar con biotina para la captura con microesferas recubiertas con estreptavidina, o usar en cualquier otro procedimiento para explorar colecciones de presentación en fagos.

Las muestras de las colecciones en fagos se ponen en contacto con el antígeno inmovilizado en condiciones adecuadas para la unión de al menos una porción de las partículas de fago con el adsorbente. Normalmente, las condiciones, que incluyen pH, fuerza iónica, temperatura y similares, se seleccionan para imitar condiciones fisiológicas. Los fagos unidos a la fase sólida se lavan y a continuación se eluyen con ácido, por ejemplo, como se describe en Barbaset al., Proc. Natl. Acad. Sci USA,88: 7978-7982 (1991), o con álcali, por ejemplo, como se describe en Markset al., J. Mol. Biol.,222: 581-597 (1991), o por competencia antigénica, por ejemplo, en un procedimiento similar al procedimiento de competencia antigénica de Clacksonet al., Nature,352: 624-628 (1991). Los fagos se pueden enriquecer 20-1000 veces en una única tanda de selección. Además, se pueden cultivar los fagos enriquecidos en cultivos bacterianos y someterse a tandas de selección adicionales.

La eficacia de la selección depende de muchos factores, incluyendo la cinética de disociación durante el lavado, y si múltiples fragmentos de anticuerpo en un único fago pueden interactuar simultáneamente con el antígeno. Los anticuerpos con cinética de disociación rápida (y afinidades de unión débiles) se pueden conservar por el uso de lavados cortos, presentación en fagos multivalente y alta densidad de recubrimiento de antígeno en fase sólida. La alta densidad no solo estabiliza el fago a través de interacciones multivalentes, sino que favorece que el fago que se ha disociado se vuelva a unir. La selección de anticuerpos con cinética de disociación lenta (y buenas afinidades de unión) se puede promover por el uso de lavados largos y presentación en fagos monovalente como se describe en Basset al., Proteins,8: 309-314 (1990) y en el documento WO 92/09690, y una baja densidad de recubrimiento de antígeno como se describe en Markset al., Biotechnol.,10: 779-783 (1992).

Es posible seleccionar entre anticuerpos en fagos de diferentes afinidades, incluso con afinidades que difieran ligeramente, por el antígeno. Sin embargo, es probable que la mutación aleatoria de un anticuerpo seleccionado (por ejemplo, como se realiza en algunas técnicas de maduración de la afinidad) dé lugar a muchos mutantes, uniéndose la mayor parte al antígeno, y unos pocos con mayor afinidad. Con antígeno limitante, el fago de alta afinidad infrecuente podría quedar fuera. Para conservar todos los mutantes de mayor afinidad, los fagos se pueden incubar con un exceso de antígeno biotinilado, pero con el antígeno biotinilado a una concentración de molaridad menor que la constante de afinidad molar diana por el antígeno. A continuación, los fagos de alta afinidad de unión se pueden capturar por microesferas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina. Dicha “captura en equilibrio” permite que se seleccionen los anticuerpos de acuerdo con sus afinidades de unión, con una sensibilidad que permita el aislamiento de clones mutantes con una afinidad tan solo dos veces más alta a partir de un gran exceso de fagos con afinidad más baja. Las condiciones usadas en el lavado de fagos unidos a una fase sólida también se pueden manipular para discriminar en base a la cinética de disociación.

Los clones anti-antígeno se pueden seleccionar en base a la actividad. En determinados modos de realización, la invención proporciona anticuerpos anti-antígeno que se unen a células vivas que expresan naturalmente el antígeno o se unen al antígeno flotante libre o al antígeno unido a otras estructuras celulares. Los clones Fv correspondientes a dichos anticuerpos anti-antígeno se pueden seleccionar (1) aislando clones anti-antígeno a partir de una colección de fagos como se describe anteriormente, y opcionalmente, amplificando la población aislada de clones de fago cultivando la población en un huésped bacteriano adecuado; (2) seleccionando el antígeno y una segunda proteína frente a la que se desea actividad de bloqueo y de no bloqueo, respectivamente; (3) adsorbiendo los clones de fago anti-antígeno sobre el antígeno inmovilizado; (4) usando un exceso de la segunda proteína para eluir cualquier clon no deseado que reconozca determinantes de unión a antígeno que se solapan o se comparten con los determinantes de unión de la segunda proteína; y (5) eluyendo los clones que permanecen adsorbidos después de la etapa (4). Opcionalmente, los clones con las propiedades de bloqueo/no bloqueo deseadas se pueden enriquecer además repitiendo una o más veces los procedimientos de selección descritos en el presente documento.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales derivados de hibridoma o los clones Fv de presentación en fagos de la invención se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando cebadores oligonucleotídicos diseñados para amplificar específicamente las regiones codificantes de la cadena pesada y ligera de interés a partir de un molde de ADN de fago o hibridoma). Una vez aislado, el ADN se puede disponer en vectores de expresión que, a continuación, se transfectan en células huésped tales como células deE. coli,células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma, que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales deseados en las células huésped recombinantes. Los artículos de revisión sobre expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerraet al., Curr. Opinión in Immunol.,5: 256 (1993) y Pluckthun,Immunol. Revs,130: 151 (1992).

El ADN que codifica los clones Fv de la invención se puede combinar con secuencias de ADN conocidas que codifican regiones constantes de la cadena pesada y/o la cadena ligera (por ejemplo, las secuencias de<a>D<n>apropiadas se pueden obtener de Kabatet al., supra)para formar clones que codifiquen la cadena pesada y/o ligera de longitud parcial o completa. Se apreciará que se pueden usar regiones constantes de cualquier isotipo para este propósito, incluyendo las regiones constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y que dichas regiones constantes se pueden obtener a partir de cualquier especie humana o animal. Un clon de Fv derivado del ADN del dominio variable de una especie animal (tal como humana) y, a continuación, fusionado a ADN de la región constante de otra especie animal para formar (una) secuencia(s) codificante(s) para la cadena pesada y/o la cadena ligera de longitud completa "híbrida" se incluye en la definición de anticuerpo "quimérico" e "híbrido" como se usa en el presente documento. En determinados modos de realización, un clon Fv derivado de ADN variable humano se fusiona a ADN de la región constante humana para formar (una) secuencia(s) codificante(s) para las cadenas pesada y/o ligera humanas de longitud parcial o completa.

El ADN que codifica el anticuerpo antiantígeno derivado de un hibridoma de la invención también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de la cadena pesada y ligera humanas en el lugar de las secuencias murinas homólogas derivadas del clon de hibridoma (por ejemplo, como en el procedimiento de Morrisonet al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 81: 6851-6855 (1984)). El a Dn que codifica un anticuerpo o fragmento derivado de un clon de hibridoma o Fv puede modificarse además uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no es de inmunoglobulina. De esta manera, se preparan anticuerpos “quiméricos” o “híbridos” que tienen la especificidad de unión del clon Fv o anticuerpos derivados de clones de hibridoma de la invención.

(iv) Anticuerpos humanizados y humanos

Son conocidos en la técnica diversos procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoacídicos introducidos en el mismo desde una fuente que no es humana. Estos residuos aminoacídicos no humanos se denominan a menudo residuos "importados", que típicamente se toman de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Joneset al., Nature,321:522-525 (1986); Riechmannet al., Nature,332:323-327 (1988); Verhoeyenet al., Science,239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano por las CDR o secuencias de CDR de roedor. En consecuencia, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE. UU. n.° 4.816.567) en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen con residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se van a usar en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el llamado procedimiento de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda la colección de secuencias conocidas de dominio variable humano. A continuación, se acepta la secuencia humana que es la más cercana a la del roedor como la región estructural (FR) humana para el anticuerpo humanizado (Simset al., J. Immunol.,151:2296 (1993); Chothiaet al., J. Mol. Biol.,196:901 (1987)). Otro procedimiento usa una región estructural particular derivada de la secuencia consenso de la totalidad de los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de las cadenas ligera o pesada. Se puede usar la misma región estructural para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carteret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:4285 (1992) ; Prestaet al., J. Immunol.151:2623 (1993)).

Es importante además que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un modo de realización del procedimiento, los anticuerpos humanizados se preparan por un procedimiento de análisis de las secuencias originales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina están disponibles comúnmente y son consabidos por los expertos en la técnica. Están disponibles programas informáticos que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antígeno. De esta manera, se pueden seleccionar y combinar residuos de FR de las secuencias receptoras y de importación de modo que se logre la característica de anticuerpo deseada, tal como afinidad incrementada por el/los antígeno(s) diana. En general, los residuos de la región hipervariable están directamente y lo más sustancialmente implicados en la influencia en la unión a antígeno.

Los anticuerpos humanos de la invención se pueden construir combinando (una) secuencia(s) del dominio variable de clones de Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de seres humanos con (una) secuencia(s) del dominio constante humanas conocidas como se describe anteriormente. De forma alternativa, se pueden preparar anticuerpos monoclonales humanos de la invención mediante el procedimiento de hibridoma. Las líneas celulares mieloma humano y heteromieloma murino-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos se han descrito, por ejemplo, por Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeuret al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987); y Boerneret al., J. Immunol.,147: 86 (1991).

Es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que, tras la inmunización, pueden producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión a la cadena pesada de anticuerpo (J<h>) en ratones mutantes quiméricos y de estirpe germinal da como resultado una inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la micromatriz genética de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana en dichos ratones mutantes de la estirpe germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición a antígeno. Véanse, por ejemplo, Jakobovitset al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:2551 (1993); Jakobovitset al., Nature,362:255-258 (1993); Bruggermannet al., Year in Immuno.,7:33 (1993) ; y Duchosalet al., Nature355:258 (1992).

También se puede usar el barajado de genes para derivar anticuerpos humanos a partir de anticuerpos no humanos, por ejemplo, de roedor, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo no humano de partida. De acuerdo con este procedimiento, que también se llama "sellado de epítopo", la región variable de la cadena pesada o bien ligera de un fragmento de anticuerpo no humano obtenido por técnicas de presentación en fagos como se describe en el presente documento se reemplaza por un repertorio de genes de dominio V humanos, creando una población de quimeras de scFv o Fab de cadena humana/cadena no humana. La selección con antígeno da como resultado el aislamiento de un scFv o Fab quimérico de cadena humana/cadena no humana, en el que la cadena humana restablece el sitio de unión a antígeno destruido tras la retirada de la cadena no humana correspondiente en el clon de presentación en fagos principal, es decir, el epítopo regula (sella) la elección del ligando de cadena humana. Cuando se repite el proceso para reemplazar la cadena no humana restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase la publicación PCT WO 93/06213 publicada el 1 de abril de 1993). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos no humanos por injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen residuos de F<r>o CDR de origen no humano.

(v) Fragmentos de anticuerpo

Se pueden generar fragmentos de anticuerpo por medios tradicionales, tales como digestión enzimática, o por técnicas recombinantes. En determinadas circunstancias, existen ventajas del uso de fragmentos de anticuerpo, en lugar de anticuerpos completos. El tamaño más pequeño de los fragmentos permite un aclaramiento rápido y puede dar lugar a un acceso mejorado a tumores sólidos. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudsonet al. Nat. Med.9:129-134 (2003).

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véanse, por ejemplo, Morimotoet al., Journalof Biochemicaland BiophysicalMethods24:107-117 (1992); y Brennanet al., Science229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir ahora directamente por células huésped recombinantes. Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv se pueden expresar todos en y secretar deE. coli,permitiendo, por tanto, la fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Se pueden aislar fragmentos de anticuerpo de las colecciones de fagos de anticuerpos analizadas anteriormente. Como alternativa, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente deE. coliy acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')<2>(Carteret al., Bio/Technology10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, se pueden aislar directamente fragmentos F(ab')<2>del cultivo de células huésped recombinantes. Los fragmentos Fab y F(ab')<2>con semividain vivoincrementada que comprenden residuos de epítopo de unión a receptor de rescate se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el profesional experto. En determinados modos de realización, un anticuerpo es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Véanse el documento WO 93/16185; las patentes de EE. UU. n.° 5.571.894 y 5.587.458. Fv y scFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que carecen de regiones constantes; por tanto, pueden ser adecuados para una unión inespecífica reducida durante su usoin vivo.Se pueden construir proteínas de fusión de scFv para proporcionar la fusión de una proteína efectora en el extremo amínico o bien carboxílico de un scFv. VéaseAntibody Engineering,ed. Borrebaeck,supra.El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.641.870, por ejemplo. Dichos anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

(vi) Anticuerpos multiespecíficos

Los anticuerpos multiespecíficos tienen especificidades de unión por al menos dos epítopos diferentes, donde los epítopos son normalmente de diferentes antígenos. Si bien dichas moléculas normalmente solo se unirán a dos epítopos diferentes (es decir, anticuerpos biespecíficos, BsAb), los anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespecíficos se engloban en esta expresión cuando se usan en el presente documento. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')<2>).

Son conocidos en la técnica procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millsteinet al., Nature305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las que solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que normalmente se realiza por etapas de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa, y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares se divulgan en el documento WO 93/08829, y en Trauneckeret al., EMBOJ., 10:3655-3659 (1991).

De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es, preferentemente, con un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Es típico que la primera región constante de la cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión a la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en los modos de realización cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no son de especial importancia.

En un modo de realización de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma de separación fácil. Este enfoque se divulga en el documento WO 94/04690. Para más detalles de la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Sureshet al., Methods in Enzymology,121:210 (1986).

De acuerdo con otro enfoque descrito en el documento WO96/27011, se puede genomanipular la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. Una interfase comprende al menos una parte del dominio C<h>3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero frente a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Por ejemplo, se han propuesto dichos anticuerpos para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (patente de EE. UU. n.° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Se pueden preparar anticuerpos heteroconjugados usando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica y se divulgan en la patente de EE. UU. n.° 4.676.980, junto con una serie de técnicas de reticulación.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando un enlace químico. Brennanet al., Science,229: 8 l (1985) describen un procedimiento en el que los anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')<2>. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente que forma complejos con ditiol arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinos y evitar la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten a continuación en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte a continuación en Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Los recientes avances han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH deE. coli,que se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalabyet al., J. Exp. Med.,175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')<2>de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó por separado deE. coliy se sometió a acoplamiento químico dirigidoin vitropara formar el anticuerpo biespecífico.

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelnyet al., J. Immunol.,148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos con cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y, a continuación, se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollingeret al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (V<h>) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (V<l>) por un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, se obliga a que los dominios Vh y Vi de un fragmento se emparejen con los dominios V i y Vh complementarios de otro fragmento, formando de este modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico por el uso de dímeros de Fv monocatenario (sFv). Véase Gruberet al., J. Immunol.152:5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tuftet al., J. Immunol.147: 60 (1991).

(vii) Anticuerpos de dominio único

En algunos modos de realización, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo de dominio único. Un anticuerpo de dominio único es una cadena polipeptídica única que comprende todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, Mass.; véase, por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 6.248.516). En un modo de realización, un anticuerpo de dominio único consiste en todo o una parte del dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo.

(viii) Variantes de anticuerpo

En algunos modos de realización, se contempla(n) una modificación/modificaciones en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo introduciendo cambios apropiados en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede preparar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Las alteraciones de aminoácidos se pueden introducir en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo objeto en el momento en el que se prepara la secuencia.

(ix) Derivados de anticuerpo

Los anticuerpos de la invención se pueden modificar además para que contengan restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. En determinados modos de realización, los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo son polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)/polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros fijados al anticuerpo puede variar y, si se fija más de un polímero, pueden ser las mismas o moléculas diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar en base a consideraciones incluyendo, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, ya sea si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.

(x) Vectores, células huésped, procedimientos recombinantes

Los anticuerpos también se pueden producir usando procedimientos recombinantes. Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-antígeno, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo se aísla y se inserta en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se puedan unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. Los componentes del vector en general incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia finalizadora de la transcripción.

(a) Componente de secuencia señal

Un anticuerpo de la invención se puede producir de forma recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterógeno, que es preferentemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia señal heterógena seleccionada preferentemente es una que se reconoce y se procesa (por ejemplo, se escinde por una peptidasa señal) por la célula huésped. Para las células huésped procariotas que no reconocen y procesan una secuencia señal de anticuerpo natural, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de las secuencias líder de fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxina II termoestable. Para la secreción en levadura, la secuencia señal natural se puede sustituir, por ejemplo, por la secuencia líder de invertasa de levadura, secuencia líder de factor a (incluyendo las secuencias líder de factor a deSaccharomycesyKluyveromyces)o la secuencia líder de la fosfatasa ácida, la secuencia líder de la glucoamilasa deC. albicanso la secuencia señal descrita en el documento WO 90/13646. En la expresión de células de mamífero, están disponibles secuencias señal de mamífero así como secuencias líder secretoras víricas, por ejemplo, la señal gD del herpes simple.

(b) Origen de replicación

Tanto los vectores de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que posibilita que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. En general, en vectores de clonación esta secuencia es una que posibilita que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Dichas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias gramnegativas, el origen del plásmido 2|j es adecuado para levaduras, y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. En general, el componente de origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamífero (el origen de SV40 se puede usar típicamente solo porque contiene el promotor temprano).

(c) Selección de componente génico

Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Típicamente, los genes de selección codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan carencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa de bacilos.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Las células que se transforman con éxito con un gen heterógeno producen una proteína que confiere resistencia a fármaco y, por tanto, sobreviven a la pauta de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son los que permiten la identificación de células competentes para aceptar el ácido nucleico que codifica el anticuerpo, tales como DHFR, glutamina sintetasa (GS), timidina cinasa, metalotioneína-I y -II, preferentemente genes de metalotioneína de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, se identifican células transformadas con el gen DHFR cultivando los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. En estas condiciones, se amplifica el gen DHFR junto con cualquier otro ácido nucleico cotransformado. Se puede usar una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) carente de actividad de DHFR endógena (por ejemplo, ATCC CRL-9096).

De forma alternativa, las células transformadas con el gen GS se identifican cultivando los transformantes en un medio de cultivo que contiene L-metionina sulfoximina (Msx), un inhibidor de GS. En estas condiciones, se amplifica el gen GS junto con cualquier otro ácido nucleico cotransformado. El sistema de selección/amplificación de G<s>se puede usar en combinación con el sistema de selección/amplificación de DHFR descrito anteriormente.

De forma alternativa, se pueden seleccionar células huésped (en particular huéspedes naturales que contienen DHFR endógena) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de interés, gen DHFR natural y otro marcador seleccionable tal como aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH) por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo, canamicina, neomicina o G418. Véase la patente de EE. UU. n.° 4.965.199.

Un gen de selección adecuado para su uso en levaduras es el gentrplpresente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcombet al., Nature,282:39 (1979)). El gentrplproporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC n.° 44076 o PEP4-1. Jones,Genetics,85:12 (1977). La presencia de la lesión detrplen el genoma de célula huésped de levadura proporciona a continuación un entorno eficaz para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano. De forma similar, las cepas de levadura carentes deLeu2(ATCC 20.622 o 38.626) se complementan con plásmidos conocidos que portan el genLeu2.

Además, se pueden usar vectores derivados del plásmido circular de 1,6 |jm pKD1 para la transformación de levadurasKluyveromyces.De forma alternativa, se ha informado de un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina bovina recombinante paraK. lactis.Van den Berg,Bio/Technology,8:135 (1990). También se han divulgado vectores de expresión de múltiples

humana recombinante madura por cepas industriales deKluyveromyces.Fleeret al., Bio/Technology,9:968-975 (1991).

(d) Componente de promotor

Los vectores de expresión y clonación contienen, en general, un promotor que se reconoce por el organismo huésped y se une de forma funcional al ácido nucleico que codifica un anticuerpo. Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen el promotor dephoA,los sistemas promotores de p-lactamasa y lactosa, el promotor de fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) enlazada de forma funcional al ADN que codifica un anticuerpo.

Las secuencias promotoras son conocidas para los eucariotas. Prácticamente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases en dirección 5' del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases en dirección 5' del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas está la secuencia AATAAA qUe pUede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan de forma adecuada en vectores de expresión eucariotas.

Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de levaduras se describen además en el documento EP 73.657. Los potenciadores de levadura también se usan de forma ventajosa con promotores de levadura.

La transcripción del anticuerpo a partir de vectores en células huésped de mamífero se puede controlar, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B, virus de simio 40 (SV40), o de promotores de mamífero heterógenos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación vírico de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de HindIII E. Un sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos usando el virus del papiloma bovino como vector se divulga en la patente de EE. UU. n.° 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.601.978. Véase también Reyeset al., Nature297:598-601 (1982) sobre la expresión del ADNc de interferón p humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. De forma alternativa, se puede usar la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous como promotor.

(e) Componente de elemento potenciador

La transcripción de un ADN que codifica un anticuerpo de la presente invención por eucariotas superiores se incrementa a menudo mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Muchas secuencias potenciadoras son conocidas ahora a partir de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv,Nature297:17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador se puede empalmar en el vector en una posición 5' o 3' para la secuencia codificante de anticuerpo, pero se localiza preferentemente en un sitio 5' del promotor.

(f) Componente finalizador de la transcripción

Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (células de levadura, hongo, insecto, vegetal, animal, humana o nucleadas de otros organismos multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles a partir de regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente, 3' de ADN o ADNc de eucariotas o virus. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica el anticuerpo. Un componente finalizador de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véase el documento WO94/11026 y el vector de expresión divulgado en el mismo.

(g) Selección y transformación de células huésped

Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en el presente documento son las células procariotas, de levadura o eucariotas superiores descritas anteriormente. Las procariotas adecuadas para este propósito incluyen eubacterias, tales como organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, enterobacteriáceas tales comoEscherichia,por ejemplo,E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella,por ejemplo,Salmonella typhimurium, Serratia,por ejemplo,Serratia marcescansyShigella,así como bacilos tales comoB. subtilisyB. licheniformis(por ejemplo,B. licheniformis41P divulgado en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), seudomonas tales comoP. aeruginosayStreptomyces.Un huésped de clonación deE. colipreferente esE. coli294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas tales comoE. coliB,E. coliX1776 (ATCC 31.537) yE. co liW3110 (ATCC 27.325) son adecuadas. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes.

Los anticuerpos de longitud completa, proteínas de fusión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo se pueden producir en bacterias, en particular cuando no se necesitan la glucosilación y la función efectora de Fc, tal como cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) que por sí mismo muestra eficacia en la destrucción de células tumorales. Los anticuerpos de longitud completa tienen mayor semivida en circulación. La producción enE. colies más rápida y más rentable. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.648.237 (Carteret al.),<la patente de EE.>U<u>.<n.° 5.789.199 (Joly et al.), la patente de EE. UU. n.° 5.840.523 (Simmons et al.), que>describen la región de inicio de la traducción (TIR) y las secuencias señal para optimizar la expresión y la secreción. Véase también Charlton,Methods in Molecular Biology,vol. 248, B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., pp. 245-254 (2003), que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo enE. coli.Después de la expresión, el anticuerpo se puede aislar de la pasta celular deE. colien una fracción soluble y se puede purificar a través de, por ejemplo, una columna de proteína A o G dependiendo del isotipo. La purificación final se puede llevar a cabo de forma similar al procedimiento para purificar el anticuerpo expresado, por ejemplo, en células CHO.

Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores codificantes de anticuerpos.Saccharomyces cerevisiae,o levadura común de cerveza, es el usado más habitualmente entre los microorganismos huéspedes eucariotas inferiores. Sin embargo, varios otros géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en el presente documento, tales comoSchizosaccharomyces pombe;huéspedes deKluyveromycestales como, por<ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii>(<a>T<c>C<24.178), K. waltii>(ATCC 56.500),K. drosophilarum(ATCC 36.906),K. thermotoleransyK. marxianus; Yarrowia(documento EP 402.226);Pichia pastoris(documento EP 183.070);Candida; Trichoderma reesia(documento EP 244.234);Neurospora crassa; Schwanniomycestales comoSchwanniomyces occidentalis;y hongos filamentosos tales como, por ejemplo,Neurospora, Penicillium, Tolypocladium,y huéspedes deAspergillustales comoA. nidulansyA. niger.Para una revisión que analiza el uso de levaduras y hongos filamentosos para la producción de proteínas terapéuticas, véase, por ejemplo, Gerngross,Nat. Biotech.22:1409-1414 (2004).

Se pueden seleccionar determinadas cepas de hongos y levaduras en las que las vías de glucosilación se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véase, por ejemplo, Liet al., Nat. Biotech.24:210-215 (2006) (que describe la humanización de la vía de glucosilación enPichia pastoris);y Gemgrosset al., supra.

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también se derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovíricas y las correspondientes células huésped de insecto permisivas de huéspedes tales comoSpodoptera frugiperda(oruga),Aedes aegypti(mosquito),Aedes albopictus(mosquito),Drosophila melanogaster(mosca de la fruta) yBombyx mori.Están públicamente disponibles una variedad de cepas víricas para transfección, por ejemplo, la variante L-1 de NPV deAutographa californicay la cepa Bm-5 de NPV deBombyx mori,y dichos virus se pueden usar como el virus del presente documento de acuerdo con la invención, en particular para la transfección de células deSpodoptera frugiperda.

Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, lenteja de agua(Leninaceae),alfalfa(M. truncatula)y tabaco también se pueden utilizar como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

Las células de vertebrado se pueden usar como huéspedes, y la propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento habitual. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Grahamet al., J. Gen Virol.36:59 (1977)); células de riñón de hámster neonato (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather,Biol. Reprod.23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065);<tumor mamario de ratón (MMT 060562,>A<t>CC<CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44->68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR-(Urlaubet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA77:4216 (1980)); y líneas de células de mieloma, tales como NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu,Methods in Molecular Biology,248:255-268 (2003).

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o de clonación descritos anteriormente para la producción de anticuerpos y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

(h) Cultivo de células huésped

Las células huésped usadas para producir un anticuerpo de la presente invención se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente tales como Ham F10 (Sigma), medio esencial mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio Eagle modificado de Dulbecco ((D<m>EM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Hamet al., Meth. Enz.58:44 (1979), Barneset al., Anal. Biochem.102:255 (1980), las patentes de EE. UU. n.° 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; documentos WO 90/03430; WO 87/00195; o patente de EE. UU. Re. 30.985 se pueden usar como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede complementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro complemento necesario también se puede incluir en concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para su expresión, y serán evidentes para el experto en la técnica.

(xi) Purificación de anticuerpo

Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir intracelularmente, en el espacio periplásmico, o se puede secretar directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, los restos de partículas, células huésped o bien fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Carteret al., Bio/Technology10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico deE. coli.En resumen, se descongela pasta celular en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los restos celulares se pueden retirar por centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión, en general, se concentran en primer lugar usando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes accidentales.

La composición de anticuerpo preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía con hidroxilapatita, cromatografía de interacción hidrófoba, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad una de las etapas de purificación típicamente preferentes. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. Se puede usar proteína A para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas y1, y2 o y4 humanas (Lindmarket al., J. Immunol. Meth.62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para<y>3 humana (Gusset al., EMBO J.

5:15671575 (1986)). La matriz a la que se fija el ligando de afinidad es muy a menudo agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio C<h>3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina-SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna con poli(ácido aspártico)), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar.

En general, diversas metodologías para preparar anticuerpos para su uso en investigación, pruebas y clínica están bien establecidas en la técnica, consecuente con las metodologías descritas anteriormente y/o como se considere apropiado por un experto en la técnica para un anticuerpo de interés particular.

B. Selección de anticuerpos biológicamente activos

Los anticuerpos producidos como se describe anteriormente se pueden someter a uno o más ensayos de "actividad biológica" para seleccionar un anticuerpo con propiedades beneficiosas desde una perspectiva terapéutica. El anticuerpo se puede cribar por su capacidad de unirse al antígeno frente al que se generó. Por ejemplo, para un anticuerpo anti-DR5 (por ejemplo, drozitumab), las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo se pueden evaluar en un ensayo que detecta la capacidad de unirse a un receptor de muerte 5 (DR5).

En otro modo de realización, la afinidad del anticuerpo se puede determinar por unión por saturación; ELISA; y/o ensayos de competencia (por ejemplo, RIA), por ejemplo.

Además, el anticuerpo se puede someter a otros ensayos de actividad biológica, por ejemplo, para evaluar su eficacia como agente terapéutico. Dichos ensayos son conocidos en la técnica y dependen del antígeno diana y del uso previsto para el anticuerpo.

Para detectar anticuerpos que se unen a un epítopo particular en el antígeno de interés, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como el descrito enAntibodies, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, ed Harlow y David Lane (1988). De forma alternativa, se puede realizar una cartografía de epítopos, por ejemplo, como se describe en Champeet al., J. Biol. Chem.270:1388-1394 (1995), para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés.

C. Preparación de las formulaciones

En el presente documento se proporcionan formulaciones que comprenden un polisorbato y una ciclodextrina que tienen una degradación del polisorbato reducida. En algunos modos de realización, la ciclodextrina es 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina (HP-p-CD). En algunos modos de realización, la ciclodextrina es 2-hidroxipropil-aciclodextrina (HP-a-CD).

En algunos modos de realización, la ciclodextrina es éter sulfobutílico de p-ciclodextrina (SBE-p-CD).

En algunos modos de realización, la formulación comprende además un polipéptido.

En determinados modos de realización, el polisorbato está en el intervalo de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 0,3 %, de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 0,2 %, de aproximadamente un 0,01% a aproximadamente un 0,1 %. En algunos modos de realización, la formulación comprende aproximadamente un 0,01 %, aproximadamente un 0,02 %, aproximadamente un 0,03 %, aproximadamente un 0,04 %, aproximadamente un 0,05 %, aproximadamente un 0,06 %, aproximadamente un 0,07 %, aproximadamente un 0,08 %, aproximadamente un 0,09 %, aproximadamente un 0,1 % o aproximadamente un 0,4 % de polisorbato. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 40. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 60. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 80.

En algunos modos de realización, la polivinilpirrolidona es una clase de moléculas poliméricas hechas a partir del monómero N-vinilpirrolidona. En algunos modos de realización, la polivinilpirrolidona (PVP) es povidona (PVP<soluble). En algunos modos de realización, la PVP es povidona K12>(P<m aproximado: 2,5 kDa). En algunos modos>de realización, la PVP es povidona K15 (PM aproximado: 8 kDa). En algunos modos de realización, la PVP es povidona K17 (PM aproximado: 10 kDa). En algunos modos de realización, la PVP es povidona K25 (PM aproximado: 30 kDa). En algunos modos de realización, la PVP es povidona K30 (PM aproximado: 50 kDa). En algunos modos de realización, la PVP es povidona K60 (PM aproximado: 400 kDa). En algunos modos de realización, la PVP es povidona K90 (PM aproximado: 1000 kDa). En algunos modos de realización, la PVP es povidona K120 (3000 kDa). En algunos modos de realización, la PVP es crospovidona (PVP insoluble). En algunos modos de realización, la PVP es copovidona.

En algunos modos de realización, la ciclodextrina está en el intervalo de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 30 %. En algunos modos de realización, la ciclodextrina está en el intervalo de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 25 %, o de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 20 %, o de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 15 %. En otros modos de realización, la ciclodextrina está a una concentración de aproximadamente un 0,5 %, aproximadamente un 1 %, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 15 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 % o aproximadamente un 30 %. En algunos modos de realización, la PVP está en el intervalo de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 30 %.

La proporción p/p de ciclodextrina con respecto a polisorbato en la formulación es mayor de aproximadamente 37,5:1. En algunos modos de realización, la proporción p/p de ciclodextrina con respecto a polisorbato en la formulación es mayor de aproximadamente 50:1, mayor de aproximadamente 100:1, mayor de aproximadamente 150:1, mayor de aproximadamente 250:1, mayor de aproximadamente 750:1, mayor de aproximadamente 1000:1 o mayor de aproximadamente 3000:1. En algunos modos de realización, la proporción p/p de ciclodextrina con respecto a polisorbato no está entre 67:1 y 1000:1. En algunos modos de realización, la proporción p/p de PVP con respecto a polisorbato en la formulación es mayor de aproximadamente 37,5:1.

En algunos modos de realización, la formulación acuosa comprende un polipéptido a una concentración en el intervalo de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml o cualquier intervalo entre estos valores. En algunos modos de realización, el polipéptido está a una concentración mayor de aproximadamente 250 mg/ml. En algunos modos de realización, el polipéptido está a una concentración en el intervalo de uno cualquiera de aproximadamente 10 mg/ml a 250 mg/ml, de 50 mg/ml a 250 mg/ml, de 100 mg/ml a 250 mg/ml, de 150 mg/ml a 250 mg/ml, de 200 mg/ml a 250 mg/ml, de 10 mg/ml a 200 mg/ml, de 50 mg/ml a 200 mg/ml, de 100 mg/ml a 200 mg/ml, de 150 mg/ml a 200 mg/ml, de 10 mg/ml a 150 mg/ml, de 50 mg/ml a 150 mg/ml, de 100 mg/ml a 150 mg/ml, de 10 mg/ml a 100 mg/ml, de 50 mg/ml a 100 mg/ml, de 10 mg/ml a 50 mg/ml o cualquier intervalo entre estos intervalos.

En algunos modos de realización, la formulación acuosa comprende un anticuerpo. En algunos modos de realización, el anticuerpo se dirige contra (VEGF); CD20; ox-LDL; ox-ApoB100; renina; una hormona del crecimiento, incluyendo hormona del crecimiento humana y hormona del crecimiento bovina; factor liberador de la hormona del crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación, tales como factor VIIIC, factor IX, tromboplastina tisular y factor de von Willebrand; factores anticoagulación, tales como proteína C; péptido natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como urocinasa u orina humana o activador tisular del plasminógeno (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulada por activación normalmente expresada y secretada por linfocitos T); proteína inflamatoria de macrófagos (MIP-1-alfa) humana; una seroalbúmina, tal como seroalbúmina humana; hormona antimülleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropinas de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoideos; un factor neurotrófico, tal como el factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento nervioso, tal como NGF-p; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos, tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento y transformación (TGF), tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4 o TGF-p5; factor de crecimiento insulínico I y II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento insulínico; proteínas CD, tales como CD3, CD4, CD8, CD19 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón, tal como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, de IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteínas de membrana de superficie; factor de aceleración del decaimiento; antígeno vírico, tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura del sida; proteínas de transporte; receptores de migración dirigida; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas, tales como CD11a, CD11b, CD18c, CD18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor, tal como el receptor HER2, HER3 o HER4; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente. En algunos modos de realización, el anticuerpo no es un anticuerpo anti-CD20. En algunos modos de realización, la formulación no comprende un anticuerpo anti-CD20 y polisorbato al 0,2 % (por ejemplo, polisorbato 80). En algunos modos de realización, la formulación no comprende HP-<y>ciclodextrina al 10 % y polisorbato 20 al 0,03 %. En algunos modos de realización, la formulación no comprende un anticuerpo anti-CD20, HP-y ciclodextrina al 10 % y polisorbato 20 al 0,03 %.

En algunos modos de realización, la formulación acuosa comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizante, un tampón y un agente de tonicidad. Una formulación acuosa de la invención se puede preparar en una solución de pH tamponado. El tampón de la presente invención tiene un pH en el intervalo de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente 9,0. En determinados modos de realización, el pH está en el intervalo de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente 7,0, en el intervalo de aproximadamente pH 4.5 a aproximadamente 6,5, en el intervalo de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente 6,0, en el intervalo de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente 5,5, en el intervalo de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente 5,0, en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente 7,0, en el intervalo de aproximadamente pH 5.5 a aproximadamente 7,0, en el intervalo de aproximadamente pH 5,7 a aproximadamente 6,8, en el intervalo de aproximadamente pH 5,8 a aproximadamente 6,5, en el intervalo de aproximadamente pH 5,9 a aproximadamente 6,5, en el intervalo de aproximadamente pH 6,0 a aproximadamente 6,5 o en el intervalo de aproximadamente pH 6,2 a aproximadamente 6,5. En determinados modos de realización, la formulación líquida tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 5,2, en el intervalo de aproximadamente 5,0 a 6,0 o en el intervalo de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 5,8. En determinados modos de realización de la invención, la formulación líquida tiene un pH de 6,2 o aproximadamente 6,2. En determinados modos de realización de la invención, la formulación líquida tiene un pH de 6,0 o aproximadamente 6,0.

Los ejemplos de tampones que controlarán el pH dentro de este intervalo incluyen ácidos orgánicos e inorgánicos y sales de los mismos. Por ejemplo, acetato (por ejemplo, acetato de histidina, acetato de arginina, acetato de sodio), succinato (por ejemplo, succinato de histidina, succinato de arginina, succinato de sodio), gluconato, fosfato, fumarato, oxalato, lactato, citrato y combinaciones de los mismos.

La concentración de tampón puede ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 600 mM, dependiendo, por ejemplo, del tampón y la isotonicidad deseada de la formulación.

Opcionalmente, se pueden añadir tensioactivos adicionales a la formulación acuosa. Los tensioactivos ejemplares incluyen tensioactivos no iónicos tales como poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188, etc.). La cantidad de tensioactivo añadido es de modo que reduce la agregación del anticuerpo formulado y/o minimiza la formación de partículas en la formulación y/o reduce la adsorción. Por ejemplo, el tensioactivo puede estar presente en la formulación en una cantidad de aproximadamente un 0,001 % a aproximadamente un 0,5 %, de aproximadamente un 0,005 % a aproximadamente un 0,2 %, de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 0,1 % o de aproximadamente un 0,02% aaproximadamente un 0,06 %, o de aproximadamente un 0,03% aaproximadamente un 0,05 %. En determinados modos de realización, el tensioactivo está presente en la formulación en una cantidad de un 0,04 % o de aproximadamente un 0,04 %. En determinados modos de realización, el tensioactivo está presente en la formulación en una cantidad de un 0,02 % o de aproximadamente un 0,02 %. En un modo de realización, la formulación no comprende un tensioactivo.

Los agentes de tonicidad, a veces conocidos como "estabilizantes" están presentes para ajustar o mantener la tonicidad del líquido en una composición. Cuando se usan con biomoléculas grandes cargadas, tales como proteínas y anticuerpos, a menudo se denominan "estabilizantes" debido a que pueden interactuar con los grupos cargados de las cadenas laterales de los aminoácidos, disminuyendo de este modo la posibilidad de que se produzcan interacciones inter e intramoleculares. Los agentes de tonicidad pueden estar presentes en cualquier cantidad entre un 0,1 % y un 25 % en peso, o más preferentemente entre un 1 % y un 5 % en peso, teniendo en cuenta las cantidades relativas de los demás ingredientes. Los agentes de tonicidad preferentes incluyen alditoles polihídricos, preferentemente alditoles trihídricos o superiores, tales como glicerol, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol.

En algunos modos de realización, la formulación es para su administraciónin vivo.En algunos modos de realización, la formulación es estéril. La formulación se puede hacer estéril por filtración a través de membranas de filtración estériles. Las formulaciones terapéuticas en el presente documento se disponen, en general, en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. La vía de administración es de acuerdo con los procedimientos conocidos y aceptados, tales como por inyección intravenosa rápida o infusión única o múltiple durante un periodo de tiempo prolongado de una manera adecuada, por ejemplo, inyección o infusión por vía subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intrarterial, intralesional o intrarticular, administración tópica, inhalación o por medios de liberación mantenida o de liberación prolongada.

Las formulaciones acuosas proporcionadas por la invención comprenden un polipéptido, un polisorbato y una ciclodextrina y muestran estabilidad potenciada del polisorbato después de un periodo de almacenamiento. En un modo de realización, la estabilidad del polisorbato se expresa como un porcentaje relativo del polisorbato restante en una formulación después de un periodo de almacenamiento. Por ejemplo, si una formulación que contiene polisorbato al 0,1 % inicialmente y contiene polisorbato al 0,09 % después de un periodo de almacenamiento, se ha degradado un 10 % del polisorbato. En otro modo de realización, la cantidad de polisorbato en una solución se determina mediante cromatografía de líquidos de ultrarrendimiento de fase inversa usando detección de dispersión de luz por evaporación (RP-ELSD) (Kim, J y Qiu, J. 2014,Analytica Chimica Acta806:144-151). En algunos modos de realización, la concentración de polisorbato en una muestra se determina comparando los resultados de la muestra con una curva de calibración generada usando diferentes concentraciones de polisorbato.

En algunos modos de realización, se ha degradado menos de un 5 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 1 °C hasta 10 °C durante aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses. En algunos modos de realización, se ha degradado menos de un 5 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 2 °C hasta 8 °C durante aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses. En algunos modos de realización, se ha degradado menos de un 5 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 4 °C hasta 6 °C durante aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses.

En algunos modos de realización, se ha degradado menos de un 1 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 1 °C hasta 10 °C durante aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses. En algunos modos de realización, se ha degradado menos de un 1 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 2 °C hasta 8 °C durante aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses. En algunos modos de realización, se ha degradado menos de un 1 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 4 °C hasta 6 °C durante aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses.

En algunos modos de realización, se ha degradado menos de un 0,1%del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 1 °C hasta 10 °C durante aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses. En algunos modos de realización, se ha degradado menos de un 0,1 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 2 °C hasta 8 °C durante aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses. En algunos modos de realización, se ha degradado menos de un 0,1 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 4 °C hasta 6 °C durante aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses.

En algunos modos de realización, se ha degradado menos de un 5 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 22 °C hasta aproximadamente 28 °C durante al menos aproximadamente un mes, al menos aproximadamente dos meses, al menos aproximadamente tres meses, al menos aproximadamente cuatro meses, al menos aproximadamente cinco meses, al menos aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente siete meses, al menos aproximadamente ocho meses, al menos aproximadamente nueve meses, al menos aproximadamente diez meses, al menos aproximadamente once meses o al menos aproximadamente doce meses. En algunos modos de realización, se ha degradado menos de un 1 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 22 °C hasta aproximadamente 28 °C durante al menos aproximadamente un mes, al menos aproximadamente dos meses, al menos aproximadamente tres meses, al menos aproximadamente cuatro meses, al menos aproximadamente cinco meses, al menos aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente siete meses, al menos aproximadamente ocho meses, al menos aproximadamente nueve meses, al menos aproximadamente diez meses, al menos aproximadamente once meses o al menos aproximadamente doce meses. En algunos modos de realización, se ha degradado menos de un 0,1 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 22 °C hasta aproximadamente 28 °C durante al menos aproximadamente un mes, al menos aproximadamente dos meses, al menos aproximadamente tres meses, al menos aproximadamente cuatro meses, al menos aproximadamente cinco meses, al menos aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente siete meses, al menos aproximadamente ocho meses, al menos aproximadamente nueve meses, al menos aproximadamente diez meses, al menos aproximadamente once meses o al menos aproximadamente doce meses.

En algunos modos de realización, se ha degradado menos de un 5 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente -15 °C hasta aproximadamente -25 °C durante al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses, al menos aproximadamente 48 meses, al menos aproximadamente 54 meses, al menos aproximadamente 60 meses, al menos aproximadamente 66 meses o al menos aproximadamente 72 meses. En algunos modos de realización, se ha degradado menos de un 1 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente -15 °C hasta aproximadamente -25 °C durante al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses, al menos aproximadamente 48 meses, al menos aproximadamente 54 meses, al menos aproximadamente 60 meses, al menos aproximadamente 66 meses o al menos aproximadamente 72 meses. En algunos modos de realización, se ha degradado menos de un 0,1 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente -15 °C hasta aproximadamente -25 °C durante al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses, o al menos aproximadamente 48 meses, al menos aproximadamente 54 meses, al menos aproximadamente 60 meses, al menos aproximadamente 66 meses o al menos aproximadamente 72 meses.

En algunos modos de realización, la formulación se almacena a aproximadamente -8 °C hasta aproximadamente -80 °C. En algunos modos de realización, la formulación se almacena a aproximadamente -20 °C, -40 °C, -70 °C o -80 °C.

Las formulaciones proporcionadas por la invención en el presente documento son eficaces para reducir los productos de degradación del polisorbato tales como partículas visibles y subvisibles. En un modo de realización, las partículas visibles se observan colocando la muestra en un vial de vidrio y girando la muestra en presencia de una luz de efecto Tyndall. En un modo de realización, las partículas subvisibles se analizan usando un contador de partículas de alta precisión (HIAC). En algunos modos de realización, se puede usar un contador de partículas HIAC 9703 equipado con un detector HRDL-150 y una jeringa de 1 ml. En algunos modos de realización, el rendimiento del instrumento se puede verificar con calibradores de microesferas de poliestireno de 2 |jm rastreables por NIST a 3000 recuentos/ml antes de cada sesión de medición. En algunos modos de realización, el instrumento HIAC se puede configurar para un caudal de 10 ml/min, un volumen neto de 0,1 ml y un volumen de muestra de 0,4 ml. En modos de realización particulares, las muestras se pueden analizar usando 4 ciclos de aspiraciones de 0,4 ml, descartando el primer ciclo de cada muestra para evitar errores de medición debidos al arrastre de la muestra. Se pueden usar tamaños de filtro de 2, 5, 10, 15 y 25 |jm para el análisis.

En algunos modos de realización, la formulación tiene menos de aproximadamente 10.000, aproximadamente 5000, aproximadamente 1000, aproximadamente 500, aproximadamente 250, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 50 o aproximadamente 25 partículas mayores de 1,4 jm de diámetro por ml. En algunos modos de realización, la formulación tiene menos de aproximadamente 10.000, aproximadamente 5000, aproximadamente 1000, aproximadamente 500, aproximadamente 250, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 50 o aproximadamente 25 partículas mayores de 2 jm de diámetro por ml. En algunos modos de realización, la formulación tiene menos de aproximadamente 1250, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 50, aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 o aproximadamente 1 partícula mayor de 5 jm de diámetro por ml. En algunos modos de realización, la formulación tiene menos de aproximadamente 250, aproximadamente 150, aproximadamente<1 0 0>, aproximadamente 50, aproximadamente 25, aproximadamente<2 0>, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 o aproximadamente 1 partícula de 10 jm de diámetro por ml. En algunos modos de realización, la formulación tiene menos de aproximadamente 250, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 50, aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 o aproximadamente 1 partícula mayor de 15 jm de diámetro por ml. En algunos modos de realización, la formulación tiene menos de aproximadamente 250, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 50, aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 o aproximadamente 1 partícula mayor de 25 jm de diámetro por ml.

MI. Administración de formulaciones

La formulación acuosa se administra a un mamífero que necesita tratamiento con la proteína (por ejemplo, un anticuerpo), preferentemente un ser humano, de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como administración intravenosa como una inyección intravenosa rápida o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracefalorraquídea, subcutánea, intravítrea, intrarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. En un modo de realización, la formulación acuosa se administra al mamífero por administración intravenosa. Para dichos propósitos, la formulación se puede inyectar usando una jeringuilla o por medio de una vía i.v., por ejemplo. En un modo de realización, la formulación líquida se administra al mamífero por administración subcutánea.

La dosificación apropiada ("cantidad terapéuticamente eficaz") de la proteína dependerá, por ejemplo, de la afección que se va a tratar, la gravedad y evolución de la afección, si la proteína se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, el tratamiento previo, la anamnesis del paciente y reacción a la proteína, el tipo de proteína usada y el criterio del médico especialista. La proteína se administra de forma adecuada al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos y se puede administrar al paciente en cualquier momento desde el diagnóstico en adelante. La proteína se puede administrar como el único tratamiento o junto con otros fármacos o tratamientos útiles en el tratamiento de la afección en cuestión. Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como profiláctico o a medidas preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, así como aquellos en los que se ha de prevenir el trastorno. Como se usa en el presente documento, un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento, incluyendo, pero sin limitarse a, trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluyendo las afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión.

En un sentido farmacológico, en el contexto de la invención, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una proteína (por ejemplo, un anticuerpo) se refiere a una cantidad eficaz en la prevención o el tratamiento de un trastorno para cuyo tratamiento el anticuerpo es eficaz. Como una proposición general, la cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína administrada estará en el intervalo de aproximadamente<0 , 1>a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal del paciente ya sea por una o más administraciones, siendo el intervalo típico de proteína usado de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 20 mg/kg, preferentemente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 15 mg/kg, administrados diariamente, por ejemplo. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. Por ejemplo, una proteína se puede administrar a una dosis de aproximadamente 100 o 400 mg cada 1, 2, 3 o 4 semanas o se administra una dosis de aproximadamente 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 15,0 o 20,0 mg/kg cada 1, 2, 3 o 4 semanas. La dosis se puede administrar como una dosis única o como dosis múltiples (por ejemplo, 2 o 3 dosis), tal como infusiones. El curso de este tratamiento se supervisa fácilmente por técnicas convencionales.

IV. Reducción de la degradación del polisorbato

En el presente documento se proporciona el uso de una ciclodextrina para reducir la degradación del polisorbato en una formulación acuosa que comprende un polisorbato y una ciclodextrina, en el que la proporción p/p resultante de ciclodextrina con respecto a polisorbato es mayor de aproximadamente 37,5:1 y en el que la formulación comprende de aproximadamente un 0,01 % (p/v) a un 0,4 % (p/v) de polisorbato, y en el que la ciclodextrina se selecciona de HP-a-CD, HP-p-CD y SBE-p-CD.

En algunos modos de realización, la formulación comprende además un polipéptido, un ácido nucleico, un lípido y/o un carbohidrato.

En determinados modos de realización, el polisorbato está en el intervalo de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 0,3 %, de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 0,2 %, o de aproximadamente un 0,01% a aproximadamente un 0,1 %. En algunos modos de realización, la formulación comprende aproximadamente un 0,01 %, aproximadamente un 0,02 %, aproximadamente un 0,03 %, aproximadamente un 0,04 %, aproximadamente un 0,05 %, aproximadamente un 0,06 %, aproximadamente un 0,07 %, aproximadamente un 0,08 %, aproximadamente un 0,09 %, aproximadamente un 0,1 % o aproximadamente un 0,4 % de polisorbato. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 40. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 60. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 80.

En algunos modos de realización, la ciclodextrina se añade a una concentración de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 30 %. En algunos modos de realización, la ciclodextrina está en el intervalo de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 25 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 20 % o de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 15 %. En otros modos de realización, la ciclodextrina se añade a una concentración de aproximadamente un 0,5 %, aproximadamente un 1 %, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 15 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 % o aproximadamente un 30 %. En algunos modos de realización, la PVP se añade a una concentración de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 30 %.

En algunos modos de realización, la formulación no comprende HP-y ciclodextrina al 10 % y polisorbato 20 al 0,03 %. En algunos modos de realización, la formulación no comprende un anticuerpo anti-CD20, HP-y ciclodextrina al 10 % y polisorbato 20 al 0,03 %.

La proporción p/p resultante de ciclodextrina con respecto a polisorbato en la formulación es mayor de aproximadamente 37,5:1. En algunos modos de realización, la proporción p/p resultante de ciclodextrina con respecto a polisorbato en la formulación es mayor de aproximadamente 50:1, mayor de aproximadamente 100:1, mayor de aproximadamente 150:1, mayor de aproximadamente 250:1, mayor de aproximadamente 750 a 1, mayor de aproximadamente 1000:1 o mayor de aproximadamente 3000:1. En algunos modos de realización, la proporción p/p resultante de ciclodextrina con respecto a polisorbato en la formulación no está entre 67:1 y<1 0 0 0>:<1>. En algunos modos de realización, la proporción p/p resultante de PVP con respecto a polisorbato en la formulación es mayor de aproximadamente 37,5:1. En algunos modos de realización, la proporción p/p resultante de PVP con respecto a polisorbato en la formulación es 250:1.

En algunos modos de realización, la ciclodextrina es 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina (HP-p-CD). En algunos modos de realización, la ciclodextrina es 2-hidroxipropil-a-ciclodextrina (HP-a-CD). En algunos modos de realización, la ciclodextrina es éter sulfobutílico de p-ciclodextrina (SBE-p-CD).

En algunos modos de realización, la formulación acuosa comprende un polipéptido a una concentración en el intervalo de 10 mg/ml a 250 mg/ml. En algunos modos de realización, el polipéptido está a una concentración por encima de 250 mg/ml. En algunos modos de realización, el polipéptido está a una concentración en el intervalo de 30 mg/ml a 150 mg/ml, de 50 mg/ml a 150 mg/ml o de 100 a 150 mg/ml.

En algunos modos de realización, la formulación acuosa comprende un anticuerpo. En algunos modos de realización, el anticuerpo se dirige contra (VEGF); CD20; ox-LDL; ox-ApoB100; renina; una hormona del crecimiento, incluyendo hormona del crecimiento humana y hormona del crecimiento bovina; factor liberador de la hormona del crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; alfa-<1>-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación, tales como factor VIIIC, factor IX, tromboplastina tisular y factor de von Willebrand; factores anticoagulación, tales como proteína C; péptido natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como urocinasa u orina humana o activador tisular del plasminógeno (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulada por activación normalmente expresada y secretada por linfocitos T); proteína inflamatoria de macrófagos (MIP-1-alfa) humana; una seroalbúmina, tal como seroalbúmina humana; hormona antimülleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropinas de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoideos; un factor neurotrófico, tal como el factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 o<- 6>(NT-3, NT4, NT-5 o NT-<6>) o un factor de crecimiento nervioso, tal como NGF-p; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos, tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento y transformación (TGF), tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4 o TGF-p5; factor de crecimiento insulínico I y II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento insulínico; proteínas CD, tales como CD3, CD4, CD<8>, CD19 y CD20; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón, tal como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, de IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteínas de membrana de superficie; factor de aceleración del decaimiento; antígeno vírico, tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura del sida; proteínas de transporte; receptores de migración dirigida; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas, tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor, tal como el receptor HER2, HER3 o HER4; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente. En algunos modos de realización, el anticuerpo no es un anticuerpo anti-CD20.

En algunos modos de realización, se incluye uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizante, un tampón, un tensioactivo y un agente de tonicidad en la formulación acuosa. El procedimiento de la invención se puede llevar a cabo preparado en una solución de pH tamponado. El tampón de la presente invención tiene un pH en el intervalo de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente 9,0. En determinados modos de realización, el pH está en el intervalo de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente 7,0, en el intervalo de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente<6>,<6>, en el intervalo de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente 6,0, en el intervalo de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente 5,5, en el intervalo de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente 5,0, en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente 7,0, en el intervalo de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente 7,0, en el intervalo de aproximadamente pH 5,7 a aproximadamente<6>,<8>, en el intervalo de aproximadamente pH 5,8 a aproximadamente 6,5, en el intervalo de aproximadamente pH 5,9 a aproximadamente 6,5, en el intervalo de aproximadamente pH 6,0 a aproximadamente 6,5 o en el intervalo de aproximadamente pH 6,2 a aproximadamente 6,5. En determinados modos de realización, la formulación líquida tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 5,2, en el intervalo de aproximadamente 5,0 a 6,0 o en el intervalo de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 5,8. En determinados modos de realización de la invención, la formulación líquida tiene un pH de 6,2 o aproximadamente 6,2. En determinados modos de realización de la invención, la formulación líquida tiene un pH de 6,0 o aproximadamente 6,0.

Los ejemplos de tampones que controlarán el pH dentro de este intervalo incluyen ácidos orgánicos e inorgánicos y sales de los mismos. Por ejemplo, acetato (por ejemplo, acetato de histidina, acetato de arginina, acetato de sodio), succinato (por ejemplo, succinato de histidina, succinato de arginina, succinato de sodio), gluconato, fosfato, fumarato, oxalato, lactato, citrato y combinaciones de los mismos. La concentración de tampón puede ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 600 mM, dependiendo, por ejemplo, del tampón y la isotonicidad deseada de la formulación.

Opcionalmente, se pueden añadir tensioactivos adicionales a la formulación acuosa. Los tensioactivos ejemplares incluyen tensioactivos no iónicos tales como poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188, etc.). La cantidad de tensioactivo añadido es de modo que reduce la agregación del anticuerpo formulado y/o minimiza la formación de partículas en la formulación y/o reduce la adsorción. Por ejemplo, el tensioactivo puede estar presente en la formulación en una cantidad de aproximadamente un 0,001 % a aproximadamente un 0,5 %, de aproximadamente un 0,005 % a aproximadamente un 0,2 %, de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 0,1 %, de aproximadamente un 0,02 % a aproximadamente un 0,06 % o de aproximadamente un 0,03 % a aproximadamente un 0,05 %. En determinados modos de realización, el tensioactivo está presente en la formulación en una cantidad de un 0,04 % o de aproximadamente un 0,04 %. En determinados modos de realización, el tensioactivo está presente en la formulación en una cantidad de un 0,02 % o de aproximadamente un 0,02 %. En un modo de realización, la formulación no comprende un tensioactivo.

El uso de la invención puede implicar el uso de agentes de tonicidad, a veces conocidos como "estabilizantes", para ajustar o mantener la tonicidad de la formulación acuosa. Cuando se usan con biomoléculas grandes cargadas, tales como proteínas y anticuerpos, a menudo se denominan "estabilizantes" debido a que pueden interactuar con los grupos cargados de las cadenas laterales de los aminoácidos, disminuyendo de este modo la posibilidad de que se produzcan interacciones inter e intramoleculares. Los agentes de tonicidad pueden estar presentes en cualquier cantidad entre un 0,1 % y un 25 % en peso, o más preferentemente entre un 1 % y un 5 % en peso, teniendo en cuenta las cantidades relativas de los demás ingredientes. Los agentes de tonicidad preferentes incluyen alditoles polihídricos, preferentemente alditoles trihídricos o superiores, tales como glicerol, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol.

En algunos modos de realización, el uso de la invención da como resultado degradación de menos de un 5 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 1 °C hasta 10 °C durante aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente<12>meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses. En algunos modos de realización, se ha degradado menos de un 5 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 2 °C hasta<8>°C durante al menos aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses. En algunos modos de realización, el uso de la invención da como resultado degradación de menos de un 5 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 4 °C hasta<6>°C durante aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente<12>meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses.

En algunos modos de realización, el uso de la invención da como resultado degradación de menos de un 1 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 1 °C hasta 10 °C durante aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente<12>meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses. En algunos modos de realización, el uso de la invención da como resultado degradación de menos de un<1>% del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 2 °C hasta<8>°C durante aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses. En algunos modos de realización, el uso de la invención da como resultado degradación de menos de un<1>% del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 4 °C hasta<6>°C durante aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses.

En algunos modos de realización, el uso de la invención da como resultado degradación de menos de un 0,1 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 1 °C hasta 10 °C durante aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente<12>meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses. En algunos modos de realización, el uso de la invención da como resultado degradación de menos de un<0 , 1>% del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 2 °C hasta<8>°C durante aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses. En algunos modos de realización, el uso de la invención da como resultado degradación de menos de un<0 , 1>% del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 4 °C hasta<6>°C durante aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses o al menos aproximadamente 48 meses.

En algunos modos de realización, el uso de la invención da como resultado degradación de menos de un 5 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 22 °C hasta aproximadamente 28 °C durante al menos aproximadamente un mes, al menos aproximadamente dos meses, al menos aproximadamente tres meses, al menos aproximadamente cuatro meses, al menos aproximadamente cinco meses, al menos aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente siete meses, al menos aproximadamente ocho meses, al menos aproximadamente nueve meses, al menos aproximadamente diez meses, al menos aproximadamente once meses o al menos aproximadamente doce meses. En algunos modos de realización, el uso de la invención da como resultado degradación de menos de un<1>% del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 22 °C hasta aproximadamente 28 °C durante al menos aproximadamente un mes, al menos aproximadamente dos meses, al menos aproximadamente tres meses, al menos aproximadamente cuatro meses, al menos aproximadamente cinco meses, al menos aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente siete meses, al menos aproximadamente ocho meses, al menos aproximadamente nueve meses, al menos aproximadamente diez meses, al menos aproximadamente once meses o al menos aproximadamente doce meses. En algunos modos de realización, el uso de la invención da como resultado degradación de menos de un 0,1 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente 22 °C hasta aproximadamente 28 °C durante al menos aproximadamente un mes, al menos aproximadamente dos meses, al menos aproximadamente tres meses, al menos aproximadamente cuatro meses, al menos aproximadamente cinco meses, al menos aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente siete meses, al menos aproximadamente ocho meses, al menos aproximadamente nueve meses, al menos aproximadamente diez meses, al menos aproximadamente once meses o al menos aproximadamente doce meses.

En algunos modos de realización, se ha degradado menos de un 5 % del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente -15 °C hasta aproximadamente -25 °C durante al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses, al menos aproximadamente 48 meses, al menos aproximadamente 54 meses, al menos aproximadamente 60 meses, al menos aproximadamente<6 6>meses o al menos aproximadamente 72 meses. En algunos modos de realización, el uso de la invención da como resultado degradación de menos de un<1>% del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente -15 °C hasta aproximadamente -25 °C durante al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses, al menos aproximadamente 48 meses, al menos aproximadamente 54 meses, al menos aproximadamente 60 meses, al menos aproximadamente<6 6>meses o al menos aproximadamente 72 meses. En algunos modos de realización, el uso de la invención da como resultado degradación de menos de un<0 , 1>% del polisorbato después de almacenar la formulación a aproximadamente -15 °C hasta aproximadamente -25 °C durante al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, al menos aproximadamente 30 meses, al menos aproximadamente 36 meses, al menos aproximadamente 42 meses, o al menos aproximadamente 48 meses, al menos aproximadamente 54 meses, al menos aproximadamente 60 meses, al menos aproximadamente<6 6>meses o al menos aproximadamente 72 meses.

El uso proporcionado por la invención es eficaz para reducir el número de partículas subvisibles y visibles. En algunos modos de realización, se forman menos de aproximadamente 10.000, aproximadamente 5000, aproximadamente 1000, aproximadamente 500, aproximadamente 250, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 50 o aproximadamente 25 partículas mayores de 1,4 |jm (micrómetros) de diámetro por ml. En algunos modos de realización, la formulación tiene menos de aproximadamente 10.000, aproximadamente 5000, aproximadamente 1000, aproximadamente 500, aproximadamente 250, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 50 o aproximadamente 25 partículas mayores de 2 jm de diámetro por ml. En algunos modos de realización, se forman menos de aproximadamente 1250, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 50, aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 o aproximadamente 1 partícula mayor de 5 jm de diámetro por ml. En algunos modos de realización, se forman menos de aproximadamente 250, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 50, aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 o aproximadamente 1 partícula de 10 jm de diámetro por ml. En algunos modos de realización, se forman menos de aproximadamente 250, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 50, aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 o aproximadamente 1 partícula mayor de 15 jm de diámetro por ml. En algunos modos de realización, se forman menos de aproximadamente 250, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 50, aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, aproximadamente 2 o aproximadamente 1 partícula mayor de 25 jm de diámetro por ml.

V. Artículos de fabricación

También se divulga un artículo de fabricación que comprende un recipiente que contiene la formulación líquida y opcionalmente proporciona instrucciones para su uso. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales y jeringuillas. El recipiente se puede formar a partir de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. Un recipiente ejemplar es un vial de vidrio de un único uso de 3-20 ml. De forma alternativa, para una formulación multidosis, el recipiente puede ser un vial de vidrio de 3-100 ml. El recipiente contiene la formulación y la etiqueta sobre, o asociada con, el recipiente puede indicar instrucciones de uso. El artículo de fabricación puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas y prospectos del envase con instrucciones para su uso.

VI. Kits

También se divulgan kits para reducir la degradación del polisorbato.

En algunos modos de realización, se proporciona un kit que comprende cualquiera de las formulaciones proporcionadas en el presente documento. En un modo de realización, dichos kits comprenden un recipiente de una formulación acuosa de péptido o anticuerpo terapéutico y una solución de una ciclodextrina que se puede añadir a la formulación acuosa, en la proporción de ciclodextrina con respecto a polisorbato es mayor de 37,5:1.

La memoria descriptiva se considera que es suficiente para permitir que un experto en la técnica ponga en práctica la invención.

EJEMPLOS

La invención se entenderá más completamente por referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención. Se entiende que los ejemplos y modos de realización descritos en el presente documento son solo para propósitos ilustrativos.

Materiales y procedimientos

Materiales

Hidroxipropil-p-ciclodextrina (HP-p-CD) como se obtuvo de Ashland Inc. (Ashland, Kentucky) como Cavitron W7 HP5 Pharma. La éter sulfobutílico-p-ciclodextrina (SBE-p-CD) se obtuvo de Ligand Pharmaceuticals (La Jolla, California) como Captisol. La hidroxipropil-alfa-ciclodextrina (HP-a-CD), la hidroxipropil-Y-ciclodextrina (HP-y-CD), el polietilenglicol (PEG 1500) y la metionina se obtuvieron de Sigma Aldrich (St. Louis, Misuri). La polivinilpirrolidona (PVP) se obtuvo como KollidonPovidone K-157 de Spectrum Chemical (Gardena, California). El polisorbato 20 (PS20) se obtuvo de Croda Inc. (New Castle, Delaware). Lipasa pancreática porcina (PPL), la lipoproteína lipasa deBurkholderiasp. (LPL), la lipasa B deCandida antárctica(CALB), la esterasa de hígado de conejo (RLE) y el diclorhidrato de 2,2'-azobis(2-metilpropionamidina) (AAPH) se obtuvieron de Sigma Aldrich Inc. (St. Louis, Misuri).

Determinación de recuentos de partículas subvisibles por HIAC

Las partículas subvisibles se midieron usando un contador de partículas HIAC 9703 equipado con un detector HRDL-150 y una jeringa de 1 ml. El rendimiento del instrumento se verificó con calibradores de microesferas de poliestireno de 2 |jm rastreables por NIST a 3000 recuentos/ml antes de cada sesión de medición. El instrumento HIAC se configuró para un caudal de 10 ml/min, un volumen neto de 0,1 ml y un volumen de muestra de 0,4 ml. Las muestras se analizaron usando 4 ciclos de aspiraciones de 0,4 ml, descartando el primer ciclo de cada muestra para evitar errores de medición debidos al arrastre de la muestra. Los resultados se informaron como los valores promedio para los tamaños de filtro de análisis de 1,4, 2, 5, 10, 15 y 25, 50 jm .

Determinación de la concentración de polisorbato

La concentración de polisorbato se determinó usando cromatografía de líquidos de ultrarrendimiento de fase inversa usando detección de dispersión de luz por evaporación (RP-ELSD). Las muestras se analizaron usando un sistema de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) de la serie Agilent 1100 equipado con una columna de cartucho Waters Oasis MAX (20 x 2,1 mm, tamaño de partícula de 30 jm ). Se configuró el sistema de HPLC con una válvula de conmutación que dirigía el flujo pasante de la columna a los residuos o a un detector de dispersión de luz por evaporación Varian 380-LC ajustado a 100 °C. Las fases móviles consistían en ácido fórmico al 2 % en agua (bomba A) y ácido fórmico al 2 % en isopropanol (bomba B). El gradiente de la bomba fue isocrático al 10 % de la bomba B durante el equilibrado, lineal al 20 % de la bomba B durante 1 minuto, isocrático al 20 % de la bomba B durante 2,4 minutos, lineal al 100 % de la bomba B durante 0,1 minutos, isocrático al 100 % de la bomba B durante 1,1 minutos, lineal al 10 % de la bomba B durante 0,1 minutos y, finalmente, isocrático al 10 % de la bomba B durante 1,9 minutos. La válvula de conmutación dirigió el flujo pasante de la columna a los residuos al comienzo de cada inyección, y a continuación dirigió el flujo al detector después de 2,4 minutos hasta el final del gradiente. Para cuantificar la concentración de PS20, se generó una curva de calibración inyectando 20 j l de soluciones que contenían entre un 0 % p/v y un 0,4 % p/v de PS20. Para los excipientes que afectaron al tiempo de migración de PS20 a través de la columna, se incluyeron en el análisis soluciones de curva de calibración de PS20 que contenían el excipiente pertinente para facilitar una cuantificación precisa.

Imágenes de partículas visibles por Seidenader

Se inspeccionaron los viales para detectar partículas visibles usando una unidad de inspección visual Seidenader V90-T (Markt Schwaben, Alemania) con el carro de viales inclinado a 60 grados. La inspección de partículas visibles de las muestras se realizó colocando los viales de vidrio en el soporte y girando en presencia de una luz de efecto Tyndall dirigida a través del fondo del vial. En primer lugar, se realizó prerrotación (es decir, rotación rápida) para agitar los líquidos, suspender y hacer circular las partículas. Después de la rotación y la iluminación, las partículas están en movimiento y la luz provoca reflejos de las partículas que las hacen visibles (es decir, el efecto Tyndall). A continuación, se observaron las partículas visibles usando una lente de aumento. Se obtuvieron vídeos y fotografías de partículas visibles usando un dispositivo Galaxy de Samsung (Seúl, Corea del Sur).

Determinación de la turbidez

La turbidez se determinó usando espectroscopia UV. Se midió la absorbancia UV de cada muestra registrando la absorbancia a 279 nm y 320 nm en una cubeta de cuarzo con un camino óptico de 1 cm en un espectrofotómetro Agilent 8453 usando el programa informático Chemstation (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).

Determinación de la concentración de proteína

Se midió la concentración de proteína mediante la absorbancia UV de cada muestra registrando la absorbancia promedio entre 340 nm y<3 6 0>nm en una cubeta de cuarzo con una trayectoria óptica de 1 cm en un espectrofotómetro Agilent 8453 usando el programa informático Chemstation (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). La determinación de la concentración por UV se calculó usando las absortividades determinadas experimentalmente para cada proteína. Se estableció el blanco de las mediciones frente a los tampones apropiados.

Ejemplo 1: Degradación oxidativa del polisorbato

La capacidad de las ciclodextrinas de inhibir la degradación oxidativa de PS20 se evaluó usando 2,2'-azobisisobutiramidinio (AAPH), que se ha demostrado previamente que degrada PS20 (Borisovet al.,J. Pharm. Sci. 104:1005-1018 (2015)). Para evaluar la capacidad de las ciclodextrinas de inhibir la oxidación de PS20, se compararon muestras que contenían HP-p-CD al 15 % (p/v) o sacarosa al 15 % (p/v) con muestras de control (sin ningún excipiente adicional). La degradación del polisorbato 20 se determinó por RP-ELSD para muestras oxidadas con AAPH 5 mM a 40 °C durante 24 horas que contiene nada de excipiente (control), sacarosa al 15 % (p/v) y HP-p-CD al 15 % (p/v).

Como se muestra en la FIG. 1, los datos demuestran que tanto HP-p-CD como la sacarosa disminuyen la cantidad de degradación de PS20. Después de la incubación con AAPH, se observó una disminución de 17,9 en el porcentaje relativo de degradación de PS20 en la muestra de control. Por el contrario, se observaron disminuciones más pequeñas de 9,8 y 3,6 en el porcentaje de degradación de PS20 para muestras que contenían sacarosa al 15 % (p/v) y HP-p-CD, respectivamente.

Ejemplo 2: Efectos inhibidores de HP-p-CD sobre la degradación enzimática del polisorbato 20

Se midió el efecto de HP-p-CD al 15 % sobre la degradación enzimática de PS20. Se digirieron muestras de PS20 al 0,02 % en tampón de pH 5,5 que contenía nada de excipiente adicional, sacarosa al 15 % o HP-p-CD al 15 % con cada una de las enzimas lipasa pancreática porcina (PPL), lipoproteína lipasa (LPL), lipasa deCandida antárctica(CALB) y esterasa de hígado de conejo (RLE) a temperatura ambiente. Las muestras de PPL se digirieron con 15 |jg/ml de enzima durante 4,5 horas. Las muestras de LPL se digirieron con 70 |jg/ml de enzima durante 5 horas. Las muestras de CALB se digirieron con 0,1 mg/ml de enzima inmovilizada durante 1 hora. Las muestras de RLE se digirieron con 15 jg/m l de enzima durante 5 horas. Todas las digestiones se realizaron a temperatura ambiente.

La digestión de PPL se detuvo mediante inactivación por calor en un baño de agua a 85 °C durante 30 minutos. La digestión de LPL y RLE no se pudo detener por inactivación por calor, por lo que las muestras se analizaron inmediatamente para determinar el contenido de PS20. La digestión de CALb se detuvo filtrando las microesferas de enzima inmovilizadas. Para permitir la formación de partículas, las muestras de CALB se pusieron a 5 °C durante la noche. Las muestras de RLE y LPL se congelaron a -20 °C durante la noche para impedir la actividad enzimática y a continuación se descongelaron en hielo inmediatamente antes del análisis de las partículas.

Como se describe anteriormente, todas las muestras se analizaron para determinar el contenido de PS20 mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (serie Agilent 1100) con un detector de dispersión de luz por evaporación en línea (serie Varian 380-LC). La inspección de partículas visibles se realizó en un instrumento de inspección visual Seidenader. El análisis de partículas subvisibles se realizó en un contador de partículas HIAC 9703.

Las muestras tratadas con CALB, RLE y LPL mostraron reducciones de un 59,2 % - 68,3 % en PS20 (FIG. 2). Por el contrario, las muestras que contenían HP-p-CD al 15 % mostraron una inhibición significativa de la degradación de PS20. Específicamente, para estas muestras, la concentración de PS20 se redujo en un 14,3 % - 37,4 % (FIG.

<2>y tabla<1>).

Tabla 1: degradación enzimática del polisorbato 20 por CALB, LPL y RLE

Adicionalmente, los datos de HIAC demuestran que HP-p-CD al 15 % (p/v) reduce la formación de partículas subvisibles (SVP). Después de la degradación enzimática con múltiples enzimas (CALB, LPL y RLE), se observaron menos SVP/ml para todas las clasificaciones de tamaño de partícula (partículas >2, >5, >10 y >25 micrómetros) cuando se incluyó HP-p-CD al 15 % (p/v) en la muestra. Se obtuvieron resultados similares para LPL y RLE; sin embargo, las cantidades muy pequeñas de partículas >10 y >>25 micrómetros impiden la interpretación de mediciones de recuento de partículas >10 y >25 micrómetros (FIGS. 3A-3D).

Estos hallazgos demuestran que HP-p-CD, un complejo de ciclodextrina representativo, puede inhibir la degradación enzimática de PS20 por múltiples enzimas. Sin quedar vinculado a teoría alguna, esto puede sugerir que el mecanismo principal de protección de PS20 por las moléculas de ciclodextrina implica una interacción directa entre la ciclodextrina y las moléculas de polisorbato.

Ejemplo 3: Efectos inhibidores de HP-p-CD sobre la degradación enzimática del polisorbato 80

Se midió el efecto de HP-p-CD al 15 % (p/v) sobre la degradación enzimática de PS80. Se digirieron muestras de PS80 al 0,02 % (p/v) en tampón a pH 5,5 que contenía HP-p-CD al 0 % y al 15 % (p/v) con 15 |jg/ml de lipasa pancreática porcina (PPL) durante 5 horas a temperatura ambiente. La digestión de PPL se detuvo mediante inactivación por calor en un baño de agua a 85 °C durante 30 minutos.

Después de la digestión de PPL, RP-ELSD demuestra una disminución de aproximadamente 19 en el porcentaje relativo en PS80 (FIG. 4). Por el contrario, se observó una disminución de aproximadamente un 4 % de degradación de PS80 en muestras que contenían HP-p-CD al 15 % (p/v).

Adicionalmente, los datos de HIAC demuestran que HP-p-CD al 15 % (p/v) reduce la cantidad promedio (n = 3) de partículas subvisibles (SVP). Después de la degradación enzimática con PPL, se observaron menos SVP/ml para todas las clasificaciones de tamaño de partícula (partículas >1,4, >2, >5, >10 y >25 micrómetros) cuando se incluyó HP-p-CD al 15 % (p/v) en la muestra (FIGS. 5A-5F).

Estos hallazgos demuestran que HP-p-CD, un complejo de ciclodextrina representativo, puede inhibir la degradación enzimática de PS80. Estos resultados sugieren que la capacidad de las ciclodextrinas de reducir la degradación del polisorbato, reducir la formación de partículas y solubilizar las partículas existentes es en general aplicable a la clase de moléculas de polisorbato (por ejemplo, PS20, PS40, PS60, PS80, etc.). Sin quedar vinculado a teoría alguna, esto puede sugerir que el mecanismo principal de protección de los polisorbatos por las moléculas de ciclodextrina implica una interacción directa entre la ciclodextrina y las subunidades de la estructura química conservada (por ejemplo, ácidos grasos) que todas las moléculas de polisorbato comprenden.

Ejemplo 4: Cinética de la degradación enzimática del polisorbato 20

Para evaluar la cinética de la degradación enzimática de PS20, las muestras se digirieron con 15 jg/m l de PPL a temperatura ambiente en muestras sin proteínas que contenían PS20 al 0,02 % (p/v) y sacarosa al 15 %, HP-p-CD al 15 % o HP-a-CD al 15 %, se digirieron usando PPL incubado durante 180 horas a aproximadamente 25 °C. Como se describe anteriormente, todas las muestras se analizaron para determinar el contenido de PS20 mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (serie Agilent 1100) con un detector de dispersión de luz por evaporación en línea (serie Varian 380-LC). El análisis de partículas subvisibles se realizó en un contador de partículas HIAC 9703.

La curva de sacarosa al 15 % en la FIG.<6>muestra que la degradación de PS20 se puede describir por un descenso exponencial de una fase. La semivida es de 32,91 horas con una fase de meseta del 44 % (FIG.<6>). Estas cinéticas de degradación respaldan el uso de un modelo de digestión de 4,5 horas usando PPL a 25 °C durante 4,5 horas para estudios posteriores.

Ejemplo 5: Efectos inhibidores de la ciclodextrina y otros excipientes sobre la degradación enzimática del polisorbato

Se sometieron a prueba varios excipientes para determinar su capacidad para proteger PS20 contra la hidrólisis enzimática, incluyendo HP-a-CD, HP-p-CD, HP-y-CD, SBE-p-CD, PVP, PEG 1500, sacarosa y metionina. Se prepararon soluciones de cada excipiente en tampón de pH 5,5 que contenían una concentración final de PS20 al 0,02 % después de la adición de enzima. La concentración de HP-a-CD, HP-p-CD, HP-y-CD y SBE-p-CD en las soluciones de excipiente fue 106 mM. La muestra de metionina contenía 10 mg/ml de metionina debido a las limitaciones de solubilidad. Los excipientes restantes (PVP, PEG 1500, sacarosa) se añadieron al 15 % p/v para que coincidiera con el % p/v de HP-p-CD. Las muestras se digirieron con 15 jg/m l de enzima PPL durante 4,5 horas a temperatura ambiente, seguido de 30 minutos de inactivación por calor a 85 °C. Se analizó la concentración de PS20 en cada muestra usando cromatografía de líquidos de alto rendimiento con un detector de dispersión de luz por evaporación en línea. A continuación, las muestras se pusieron a 5 °C durante la noche para permitir la formación de partículas y se analizaron para detectar partículas visibles y subvisibles como se describe previamente.

Los resultados de RP-ELSD demuestran que la clase de excipiente es importante para determinar el grado de degradación enzimática de PS20 (FIG. 7). Después de la digestión enzimática, la muestra de control (es decir, sin excipiente) tuvo una disminución de un 58 por ciento en la degradación de PS20. Se observó una disminución equivalente de un 58 por ciento de PS20 para las muestras que contenían sacarosa al 15 % (p/v). Estos hallazgos demuestran que la sacarosa, un disacárido acíclico (es decir, sacarosa) no tiene efecto inhibidor sobre la degradación enzimática de PS20. Los efectos inhibidores de la ciclodextrina no se pueden atribuir únicamente a los efectos de dilución de masa, porque los resultados demuestran que las masas equivalentes de otros excipientes (por ejemplo, sacarosa) no mitigan la degradación catalítica del polisorbato.

De forma similar, las muestras que contenían metionina no tuvieron efecto inhibidor sobre la degradación enzimática de PS20 o la formación de SVP (FIGS. 7 y<8>A-<8>D). Supuestamente, la metionina evitaría la degradación oxidativa de PS20, pero no evitaría la degradación enzimática de PS20. Sin quedar vinculado a teoría alguna, el mecanismo de degradación de PS20 reproducido en este experimento es probablemente hidrolítico e independiente de la degradación oxidativa de PS20.

Los resultados demuestran que el PEG tiene un efecto inhibidor pequeño sobre la degradación de PS20 con respecto a la muestra de control. Se observó una disminución de un 51%de PS20 para las muestras que contenían PEG 1500 al 5 % (p/v).

Las moléculas de ciclodextrina evaluadas (HP-a-CD, HP-p-CD y SBE-p-CD) todas ellas tuvieron efectos inhibidores significativos sobre la degradación enzimática de PS20 y la formación de SVP (FIGS. 7 y<8>A-<8>D). De forma interesante, el número de subunidades glucídicas puede ser importante al determinar el grado de inhibición por la ciclodextrina. Por ejemplo, se observaron disminuciones de un 1 % y un 7 % de PS20 para HP-a-CD y HP-p-CD, respectivamente.

Se realizaron otros estudios para evaluar la importancia de HP-a-CD, HP-p-CD y HP-<y>-CD para entender mejor la importancia del tamaño del anillo de ciclodextrina. Los datos mostrados en la FIG. 9 indican que no se observó degradación significativa de PS20 para las muestras que contenían HP-a-CD y HP-p-CD; por el contrario, se observó ~82 % en la degradación de PS20 en muestras que contenían HP-y-CD al 15 %. De forma similar, se observaron disminuciones significativas en la concentración de PS20 en las muestras de control (es decir, nada de excipiente y sacarosa al 15 %) (FIG. 9). Estos hallazgos demuestran que las ciclodextrinas más pequeñas HP-a-CD (diámetro de cavidad: 4,7-5,2 A; volumen de cavidad: 174 A3) y HP-p-CD (diámetro de cavidad: 6,0-6,5 A; volumen de cavidad: 262 A3) son inhibidores más eficaces de la degradación del polisorbato 20 que HP-y-CD (diámetro de cavidad: 7,5-8,3 A; volumen de cavidad: 472 A3).

Las dimensiones y el volumen de la cavidad para cada ciclodextrina pueden determinar su eficacia como inhibidores moleculares de la degradación enzimática de PS20, en lugar de las propiedades fisicoquímicas de cada ciclodextrina. Sin quedar vinculado a teoría alguna, este hallazgo sugiere que el mecanismo de protección puede implicar una formación de complejos entre el huésped y el visitante entre las ciclodextrinas y el sitio reactivo de polisorbato<2 0>.

Ejemplo 6: Solubilización de partículas visibles y subvisibles relacionadas con la degradación enzimática del polisorbato 20 por ciclodextrinas y otros excipientes

Se sometieron a prueba varios excipientes para determinar su capacidad de solubilizar partículas producidas como resultado de la degradación enzimática de PS20. Se prepararon por triplicado soluciones de HP-a-CD, HP-p-CD, HP-<y>-CD, SBE-p-CD, PVP, PEG 1500, sacarosa y metionina concentradas en tampón de pH 5,5. Se prepararon partículas de degradación enzimática de PS20. Se degradaron enzimáticamente tres soluciones de PS20 al 0,05 % en tampón de pH 5,5 con 37,5 |jg/ml de PPL durante 4,5 horas a temperatura ambiente, seguido de 30 minutos de inactivación por calor a 85 °C. Las soluciones de PS20 degradadas se pusieron a 5 °C para permitir la cristalización de las partículas.

Después de la formación de partículas en las soluciones de PS20 degradadas, la preparación de la muestra restante se realizó en una cámara fría a 5 °C para evitar que las partículas derivadas de PS20 se disolvieran. Cada solución de PS20 degradada se dividió en 11 alícuotas y se añadió excipiente concentrado a cada una de las alícuotas. La concentración final de excipiente en cada muestra fue como sigue: sacarosa al 5 %, 10 mg/ml de metionina, PVP al 5 %, PEG 1500 al 5 %, HP-p-CD al 15 %, HP-p-CD al 5 %, HP-p-CD al 0,5 %, HP-a-CD 35,5 mM, HP-y-CD 35,5 mM y SBE-p-CD 35,5 mM. Después de la adición de cada excipiente, las muestras se dejaron a 5 °C durante la noche. Al día siguiente, se inspeccionan los viales en busca de partículas visibles con un instrumento de inspección visual Seidenader. Los recuentos de partículas subvisibles se midieron usando un contador de partículas HIAC 9703.

Los resultados demuestran que las ciclodextrinas (HP-a-CD, HP-p-CD y HP-y-CD) pudieron reducir significativamente la cantidad de SVP con respecto al control y otras muestras de excipientes (FIGS. 10A y 10B). Estos resultados establecen que, además de evitar la degradación enzimática del polisorbato, las ciclodextrinas también pueden solubilizar los productos de degradación de PS20 que resultan de la digestión enzimática del polisorbato<2 0>.

Adicionalmente, se tomaron fotografías inmediatamente antes y después de la adición de HP-p-CD al 15 % (p/v). Las fotografías representan la solubilización de partículas visibles relacionadas con PS20 antes (FIG. 11A) y después de la adición de HP-p-CD al 15%(p/v) (FIG. 11B). La solubilización inmediata de las partículas visibles representadas en las fotografías proporciona pruebas convincentes de que las ciclodextrinas pueden incrementar la solubilidad de las partículas visibles y subvisibles asociadas con la degradación de PS20.

Ejemplo 7: Solubilización de partículas visibles y subvisibles relacionadas con la degradación oxidativa del polisorbato 20 por ciclodextrinas

Se sometieron a prueba diferentes concentraciones de HP-p-CD para determinar su capacidad de solubilizar partículas producidas como resultado de la degradación oxidativa de PS20. Se prepararon por triplicado soluciones de HP-p-CD concentradas en tampón de pH 5,5. Las muestras sin proteínas que contenían PS20 al 0,02 % (p/v) se almacenaron durante 27 meses a 5 °C, dando como resultado la degradación oxidativa de PS20 y la formación de partículas visibles y subvisibles relacionadas con los productos de degradación de PS20. Cada solución de PS20 degradada se dividió en 3 alícuotas y se añadió excipiente concentrado a cada una de las alícuotas. La concentración final de excipiente en cada muestra fue como sigue: HP-p-CD al 0 % (p/v) (control), HP-p-CD al 5 % (p/v) y HP-p-CD al 15 % (p/v). Después del ajuste de la concentración de HP-p-CD, las muestras se dejaron a 5 °C durante la noche. Al día siguiente, los recuentos de partículas subvisibles se midieron usando un contador de partículas HIAC 9703.

Se sometió a prueba el efecto de la concentración de HP-p-CD al 0 %, 5 % y 15 % (p/v) sobre la resolubilización de SVP. Los resultados demuestran que hay una reducción significativa en SVP en muestras que contienen HP-p-CD con respecto a la muestra de control (HP-p-CD al 0 %). Como se muestra en las FIGS. 12A-12F, HP-p-CD al 15 % resolubiliza eficazmente partículas mayores de o iguales a 1,4 micrómetros, mientras que HP-p-CD al 5 % resolubiliza eficazmente partículas mayores de o iguales a<2>micrómetros.

Estos resultados establecen que, además de evitar la degradación enzimática del polisorbato y solubilizar los productos de degradación de PS20 que resultan de la digestión enzimática del polisorbato 20, las ciclodextrinas también pueden solubilizar los productos de degradación de PS20 que resultan de la digestión oxidativa del polisorbato<2 0>.

Ejemplo 8: Los efectos de la concentración de HP-p-CD y la proporción de HP-p-CD:PS20 sobre la degradación de PS20

Para determinar el efecto de la concentración de HP-p-CD sobre la degradación de PS20, se digirieron muestras que contenían PS20 al 0,001,0,01, 0,1, 1, 5 o 15 % usando 15 |jg/ml de PPL durante 4,5 horas. Como se muestra en la FIG. 13, el incremento de la cantidad de HP-p-CD reduce la degradación de PS20.

Se evaluó el efecto de la concentración de HP-p-CD a diferentes concentraciones de PS20 sobre la degradación enzimática de PS20 para identificar concentraciones óptimas para la inhibición de la degradación enzimática de PS20. Para evaluar la dependencia de la degradación de PS20 de la concentración de HP-p-CD, se determinó el contenido de PS20 usando RP-ELSD para muestras por triplicado que contenían diferentes concentraciones de HP-p-CD a diversas concentraciones de PS20. Se digirieron muestras que contenían PS20 al 0,005 % (FIG. 14A), 0,02 % (FIG. 14B), 0,1 % (FIG. 14C) y 0,4 % (FIG. 14D) usando 15 jg/m l de enzima PPL durante 4,5 horas a temperatura ambiente en muestras sin proteínas que contenían nada de excipiente (control), HP-p-CD al 0, 0,5, 5 y 15 % (p/v). Se añadió PPL a cada una de las soluciones de tratamiento en una proporción de 75 mg de PPL por mg de PS20, con un volumen equivalente de tampón añadido a las soluciones de control para determinar el efecto de la proporción de HP-p-CD con respecto a polisorbato sobre la degradación enzimática. La digestión se detuvo mediante inactivación por calor en un baño de agua a 85 °C durante 30 minutos. Cada muestra se analizó para determinar la concentración de PS20 usando cromatografía de líquidos de alto rendimiento con un detector de dispersión de luz por evaporación en línea como se describe anteriormente. A continuación, las muestras se pusieron a 5 °C durante la noche para permitir la formación de partículas y se colocaron en hielo durante el análisis para detectar partículas visibles y subvisibles como se describe anteriormente.

Tabla 2: proporción de HP-p-CD con respecto a PS20

La cantidad de ciclodextrina necesaria para la inhibición completa de la degradación enzimática de PS20 depende de la concentración de PS20 (FIGS. 13 y 14A-D). A una concentración más baja de PS20 (por ejemplo, PS20 al 0,005%(FIG. 14A)), solo se requiere HP-p-CD al 0,5%para inhibir completamente la degradación de PS20, mientras que se requiere HP-p-CD al 15 % para las muestras que contienen PS20 al 0,1 % (FIG. 14C). De forma similar, la formación de partículas subvisibles mayores de 2, 5 o 10 |jm de diámetro depende de la proporción de ciclodextrina con respecto a polisorbato. Las muestras que contenían PS20 al 0,02 % requerían HP-p-CD al 0,5 % para inhibir parcialmente la formación de partículas subvisibles y HP-p-CD al 15 % para inhibir completamente la formación de partículas subvisibles (FIGS. 15A-15C).

Estos resultados se pueden interpretar en el contexto de la proporción de HP-p-CD con respecto a PS20 (p/p) (FIG. 16 y tabla 2). Los datos de PS20 demuestran que se requiere suficiente HP-p-CD:Ps20 (>37,5 p/p) para inhibir la degradación enzimática de PS20 (tabla 2). Los resultados sugieren que la proporción de HP-p-CD con respecto a PS20 es importante para determinar la degradación de PS20 en amplios intervalos de concentración para PS20 y HP-p-CD.

Los resultados también aclaran un posible mecanismo de inhibición de la degradación de PS20 por HP-p-CD. En este caso, la cantidad de degradación de PS20 varía de forma sigmoidea a medida que la concentración de inhibidor (es decir, HP-p-CD) aumenta a una concentración fija de sustrato (es decir, PS20) (FIG. 13). Por tanto, sin quedar vinculado a teoría alguna, el incremento de la concentración de ciclodextrina puede reducir eficazmente la concentración de sustrato libre en la solución, lo que disminuye la velocidad de degradación de PS20. De forma alternativa, es posible que la velocidad de degradación de PS20 se inhiba por el complejo de sustrato-inhibidor.

Ejemplo 9: Degradación del polisorbato en condiciones de almacenamiento de anticuerpos

Se evaluó el impacto de diversas clases de moléculas proteínicas (por ejemplo, anticuerpo monoclonal (mAb), anticuerpo de Fab único (sFAb) y anticuerpo biespecífico (BsAb)) sobre la capacidad de las ciclodextrinas de disminuir la degradación enzimática de PS20. Las muestras de sustancias farmacéuticas mAb, sFAb y BsAb se proporcionaron en sus formulaciones naturales. Las muestras se dializaron y acondicionaron en la formulación objetivo de acetato de histidina 20 mM a pH 5,5 con PS20 al 0,02 % hasta una concentración final de proteína de 20 mg/ml. La muestra de control se preparó para que contuviera acetato de histidina 20 mM, pH 5,5, PS20 al 0,02 %. Cada una de las muestras de mAb, sFAb, BsAb y control se subdividió en alícuotas y se ajustó usando tampón de acondicionamiento para que contuviera diferentes cantidades (0 %, 5 % y 15 %) de HPpCD. Las muestras se digirieron con 15 jg/ml de enzima PPL durante 4,5 horas a temperatura ambiente, seguido de 30 minutos de inactivación por calor a 85 °C. Cada muestra se analizó para determinar la concentración de PS20 usando cromatografía de líquidos de alto rendimiento con un detector de dispersión de luz por evaporación en línea. A continuación, las muestras se pusieron a 5 °C durante la noche para permitir la formación de partículas y se analizaron para detectar partículas visibles y subvisibles como se describe anteriormente.

Los resultados demuestran que cada muestra que contiene HPpCD al 0 % tiene una cantidad diferente de degradación de PS20. Los resultados muestran que las muestras de HPpCD al 0 % que contienen proteína (FIGS.

17B-D) tienen mayores cantidades de degradación de PS20 con respecto a la muestra de control (FIG. 17A). Debido a que las proteínas se expresan en células de ovario de hámster chino (CHO) oE. coli,las muestras de proteína pueden contener otras impurezas (es decir, lipasas, etc.) que contribuyen a la cantidad total de degradación de PS20.

Aunque se observó que las muestras que contenían proteína de HPpCD al 0 % tenían mayores cantidades de degradación de PS20, los resultados demuestran que hay cantidades comparables de degradación de PS20 observadas en muestras que contenían HPpCD al 5 % y 15 %. Estos resultados demuestran que HPpCD es igual de eficaz para mitigar la degradación catalítica de PS20 para todos los formatos moleculares evaluados, aunque pueden tener diferentes cantidades de impurezas que degradan catalíticamente PS20 (FIGS. 17A-D). Esto establece que la presencia de moléculas proteínicas y sus perfiles de impurezas naturales no afectan significativamente a la proporción de ciclodextrina con respecto a proteína que es necesaria para mitigar la degradación de PS20. Sin quedar vinculado a teoría alguna, este hallazgo sugiere que el mecanismo de inhibición catalítica implica que las moléculas de ciclodextrina interactúen directamente con PS20, y no con la enzima que está degradando el polisorbato. De lo contrario, las muestras que contienen proteínas, que contienen enzimas adicionales que degradan el polisorbato requerirían más HPpCD para mitigar la degradación de PS20 en comparación con el control. Por tanto, la proporción de ciclodextrina con respecto a PS20 descrita en el presente documento debe ser ampliamente aplicable a una amplia gama de formulaciones que contienen diferentes moléculas proteínicas y perfiles de impurezas.

Conclusión

Los estudios realizados muestran la capacidad de las ciclodextrinas de inhibir la degradación enzimática y oxidativa de los polisorbatos (PS20 y PS80). Los resultados demuestran que la PVP y las ciclodextrinas (es decir, HP-a-CD, HP-p-CD, HP-y-CD, SBE-p-CD) pudieron evitar la degradación enzimática de PS20. Otros experimentos demuestran que HP-p-CD protege el polisorbato en presencia de múltiples enzimas (es decir, CALB, RLE, LPL y PLL). Sin quedar vinculado a teoría alguna, el mecanismo inhibidor puede implicar una interacción entre el inhibidor (es decir, la ciclodextrina) y el sustrato (es decir, el polisorbato). La formación del complejo de inclusión puede reducir la concentración de sustrato libre y el complejo de inclusión también puede inhibir estéricamente de forma directa la interacción con el sitio activo y el sustrato. Adicionalmente, los estudios de concentración establecen que hay un intervalo óptimo de proporción de HP-p-CD con respecto a PS20 (>37,5 p/p) que es necesario para proporcionar inhibición completa de la degradación enzimática de PS20.

Además de evitar la degradación enzimática de PS20, los resultados demuestran que las ciclodextrinas pueden reducir eficazmente la cantidad de partículas subvisibles y visibles. De esta manera, las ciclodextrinas disgregan y disuelven las partículas subvisibles y visibles en solución. Además de evitar eficazmente la formación de partículas, los resultados demuestran que las ciclodextrinas también pueden solubilizar eficazmente las partículas existentes relacionadas con la degradación del polisorbato. Supuestamente, las ciclodextrinas también incrementan la solubilidad de los ácidos grasos libres que son productos de la degradación del polisorbato.

Los hallazgos de este estudio tienen amplias implicaciones prácticas. Los resultados proporcionan pruebas exhaustivas de que se pueden usar formulaciones que contienen ciclodextrinas para evitar la degradación enzimática del polisorbato. Adicionalmente, las ciclodextrinas se pueden usar para solubilizar los ácidos grasos libres asociados con la degradación del polisorbato, tanto por degradación oxidativa como enzimática. Por tanto, las ciclodextrinas también pueden ser útiles como diluyentes o tampones de reconstitución para medicamentos para disolver productos de degradación y partículas asociadas con la degradación del polisorbato.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. El uso de una ciclodextrina para reducir la degradación del polisorbato en una formulación acuosa que comprende un polisorbato y una ciclodextrina, en el que la proporción p/p resultante de ciclodextrina con respecto a polisorbato es mayor de aproximadamente 37,5:1 y en el que la formulación comprende de aproximadamente un 0,01 % (p/v) a un 0,4 % (p/v) de polisorbato, y en el que la ciclodextrina se selecciona de HP-a-CD, HP-p-CD y SBE-p-CD.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80.

3. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la concentración de ciclodextrina en la formulación está en el intervalo de aproximadamente un 0,5 % a un 30 % (p/v).

4. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la concentración de ciclodextrina en la formulación es de aproximadamente un 15 % (p/v).

5. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la degradación del polisorbato se reduce en aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o aproximadamente un 99 %.

<6>. El uso de la reivindicación 1, en el que se forman menos de aproximadamente 1000, aproximadamente 750, aproximadamente 500, aproximadamente 250, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 50 o aproximadamente 25 partículas de polisorbato mayores de aproximadamente 2 micrómetros de diámetro/ml.

7. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la formulación es estable a aproximadamente 2 °C hasta aproximadamente<8>°C durante al menos aproximadamente seis meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses o al menos aproximadamente 24 meses.

<8>. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la formulación es estable a aproximadamente 1 °C hasta 10 °C durante al menos aproximadamente cuarenta y ocho meses.

9. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la formulación es estable a aproximadamente 2 °C hasta<8>°C durante al menos aproximadamente cuarenta y ocho meses.

10. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la formulación comprende además un polipéptido.

11. El uso de la reivindicación 10, en el que el polipéptido es un anticuerpo.

12. El uso de la reivindicación 11, en el que el anticuerpo es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico o un fragmento de anticuerpo.

13. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que la concentración de polipéptido en la formulación es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml.

14. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que la formulación tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,0.

15. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que la formulación es una formulación farmacéutica adecuada para su administración a un sujeto.

16. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el que la formulación es una formulación farmacéutica adecuada para su administración intravenosa, subcutánea, intramuscular o intravítrea a un sujeto.