ES3040945T3 - Materials and methods for treatment of duchenne muscular dystrophy - Google Patents

Materials and methods for treatment of duchenne muscular dystrophy

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ES3040945T3 ES23191483T ES23191483T ES3040945T3 ES 3040945 T3 ES3040945 T3 ES 3040945T3 ES 23191483 T ES23191483 T ES 23191483T ES 23191483 T ES23191483 T ES 23191483T ES 3040945 T3 ES3040945 T3 ES 3040945T3
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Chad Cowan
Ante Lundberg
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Vertex Pharmaceuticals Inc
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Abstract

La presente solicitud proporciona materiales y métodos para el tratamiento de un paciente con distrofia muscular de Duchenne (DMD) tanto ex vivo como in vivo. Además, proporciona materiales y métodos para la edición del gen de la distrofina en una célula mediante edición genómica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Materiales y métodos para el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne
Campo técnico
La presente solicitud proporciona materiales y métodos para tratar a un paciente con distrofia muscular de Duchenne (DMD), tantoex vivocomoin vivo.Además, la presente solicitud proporciona materiales y métodos para editar un gen de la distrofina en una célula mediante edición genómica.
Solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud provisional de los EE. UU. N.° 62/247.484, presentada el 28 de octubre de 2015, y de la solicitud provisional de los EE.UU. N.° 62/324.064, presentada el 18 de abril de 2016.
Listado de secuencias
Esta solicitud contiene un Listado de secuencias en formato legible por ordenador (nombre de archivo: 160101PCT sequence listing _ST25: 286.928.896 bytes - Archivo de texto ASCII; creado el 28 de octubre de 2016).
Antecedentes
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es un trastorno neuromuscular recesivo grave ligado al cromosoma X que afecta aproximadamente a 1 de cada 4.000 varones nacidos vivos. Los pacientes suelen ser diagnosticados a los 4 años y quedan confinados a una silla de ruedas a los 10. La mayoría de los pacientes no viven más allá de los 25 años debido a una insuficiencia cardíaca y/o respiratoria. Los tratamientos existentes son paliativos en el mejor de los casos. El tratamiento más habitual de la DMD son los esteroides, que se usan para frenar la pérdida de fuerza muscular. Sin embargo, debido a que la mayoría de los pacientes con DMD comienzan a recibir esteroides a una edad temprana, el tratamiento retrasa la pubertad y contribuye adicionalmente a la disminución de la calidad de vida del paciente.
La DMD está provocada por mutaciones en el gen de la distrofina (Cromosoma X: 31.117.228-33.344.609 (Consorcio de referencia del genoma - GRCh38/hg38)). Con una región genómica de más de 2,2 megabases de longitud, el gen de la distrofina es el segundo gen humano más grande. El gen de la distrofina contiene 79 exones que son procesados en un ARNm de 11,000 pares de bases que es traducido en una proteína de 427 kDa. Funcionalmente, la distrofina actúa como un enlazador entre los filamentos de actina y la matriz extracelular dentro de las fibras musculares. El extremo N de la distrofina es un dominio de unión a actina, mientras que el extremo C interactúa con un armazón transmembrana que ancla la fibra muscular a la matriz extracelular. Tras la contracción del músculo, la distrofina proporciona soporte estructural que permite al tejido muscular resistir la fuerza mecánica. La DMD está provocada por una amplia diversidad de mutaciones dentro del gen de la distrofina que dan como resultado codones de parada prematuros y, por lo tanto, una proteína distrofina truncada. Las proteínas distrofina truncadas no contienen el extremo C y, por lo tanto, no pueden proporcionar el soporte estructural necesario para resistir el esfuerzo de la contracción muscular. Como resultado, las fibras musculares se separan, lo que conduce al desgaste muscular.
La distrofia muscular de Becker (DMB) es una forma menos grave de distrofia muscular en comparación con la DMD. Mientras que la DMB también está provocada por mutaciones en el gen de la distrofina, las mutaciones de la DMB mantienen el marco de lectura de la distrofina. Las proteínas distrofina de la DMB contienen deleciones internas, pero también conservan porciones de los extremos N y C. Por lo tanto, la proteína distrofina de la DMB es más corta que la proteína de tipo silvestre, pero puede seguir actuando como enlazador entre los filamentos de actina y la matriz extracelular. De hecho, dependiendo del tamaño de la deleción interna, los pacientes con DMB pueden presentar sólo síntomas leves. Como resultado, la mayoría de los esfuerzos de investigación se han centrado en convertir el fenotipo de DMD grave en un fenotipo de DMB menos grave.
La ingeniería genómica se refiere a las estrategias y técnicas para la modificación específica dirigida de la información genética (genoma) de los organismos vivos. La ingeniería genómica es un campo de investigación muy activo por la amplia gama de aplicaciones posibles, particularmente en áreas de la salud humana; la corrección de un gen portador de una mutación perjudicial, por ejemplo, para explorar la función de un gen. Las primeras tecnologías desarrolladas para insertar un gen en una célula viva, tales como la transgénesis, con frecuencia estaban limitadas por la naturaleza aleatoria de la inserción de la nueva secuencia en el genoma. Por lo general, el nuevo gen se colocó a ciegas y puede haber inactivado o alterado el funcionamiento de otros genes, o incluso haber provocado efectos no deseados graves. Además, estas tecnologías generalmente no ofrecían ningún grado de reproducibilidad, ya que no había garantías de que la nueva secuencia se insertara en el mismo lugar en dos células diferentes. Estrategias de ingeniería genómica más recientes, tales como ZFN, TALEN, HE y MegaTAL, permiten modificar una área específica del ADN, aumentando de este modo la precisión de la corrección o inserción en comparación con las primeras tecnologías, y ofreciendo cierto grado de reproducibilidad. A pesar de esto, estas estrategias recientes de ingeniería genómica tienen limitaciones.
Múltiples estudios sugieren que la ingeniería genómica sería una estrategia atractiva para tratar la DMD. Uno de los primeros enfoques implicó la ingeniería de un gen mini-distrofina que es de menos de 4 kb y puede empaquetarse en un vector de virus adenoasociado (AAV, por sus siglas en inglés). Esta es una terapia génica de reemplazo que se ha sometido a ensayo experimentalmente en ratones (Wang, B., J. Li y X. Xiao,Proc Natl Acad Sci U S A,2000. 97 (25): págs. 13714-9) (Watchko, J.,et al., Hum Gene Ther,2002. 13 (12): págs. 1451 60) y modelos en perros (Wang, Z.,et al., Mol Ther,2012. 20 (8): págs. 1501-7), y un ensayo clínico de fase I sugirió que existen problemas asociados a una respuesta inmunitaria a los epítopos sintéticos no propios (Mendell, J.R.,et al., N Engl J Med,2010. 363 (15): págs. 1429-37).
Más recientemente, se usó la omisión de exones mediado por oligonucleótidos para restablecer el marco de lectura en las células de pacientes con DMD. En esta estrategia, los oligonucleótidos cortos bloquean las señales de corte y empalme que se encuentran en el pre-ARNm y facilitan la omisión de un exón único. La omisión de un exón único permite a la maquinaria transcripcional eludir el codón de parada prematuro y producir una proteína con los extremos N y C intactos. Ensayos clínicos de fase I/II han mostrado que inyecciones semanales de oligonucleótidos anti-sentido inducen omisión de exones y fibras positivas de distrofina (Cirak, S.,et al., Lancet,2011. 378 (9791): págs. 595-605). Sin embargo, la principal limitación de este tipo de tratamiento es que requiere dosis repetidas a lo largo de la vida del paciente porque el fármaco se dirige al pre-ARNm y no al locus genómico. Los ensayos clínicos de fase M/IM en curso evalúan el suministro de oligonucleótidos de omisión de exones mediante AAV para una expresión sostenida, así como el suministro de múltiples oligonucleótidos antisentido para facilitar las estrategias de omisión de múltiples exones.
A pesar de los esfuerzos de los investigadores y profesionales médicos de todo el mundo que han tratado de abordar la DMD, y a pesar de la promesa de los enfoques de ingeniería genómica, sigue existiendo una necesidad crítica de desarrollar tratamientos seguros y eficaces para la DMD, que se encuentra entre los trastornos genéticos más prevalentes y debilitantes.
Compendio
La invención es como se define en las reivindicaciones. Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un ARN guía (ARNg) para su uso en el tratamiento de un paciente con Distrofia muscular de Duchenne, en donde el ARNg comprende una secuencia espaciadora que comprende una versión de ARN de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1410445. En un segundo aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico para su uso en el tratamiento de un paciente con Distrofia muscular de Duchenne, en donde el ácido nucleico codifica el ARNg según el primer aspecto. En un tercer aspecto, la invención proporciona una composición de ácido nucleico para su uso en el tratamiento de un paciente con Distrofia muscular de Duchenne, en donde la composición de ácido nucleico comprende el ácido nucleico del segundo aspecto y un segundo ácido nucleico que codifica una endonucleasa Cas9, opcionalmente en donde la endonucleasa Cas9 comprende una señal de localización nuclear, y opcionalmente en donde la endonucleasa Cas9 es una endonucleasa Cas9 deStreptococcus pyogenes.La presente divulgación presenta un enfoque para abordar la base genética de la DMD. Mediante el uso de herramientas de ingeniería genómica para crear cambios permanentes en el genoma que pueden restablecer el marco de lectura de la distrofina y restablecer la actividad de la proteína distrofina con tan sólo un tratamiento, la terapia resultante puede corregir el defecto genético subyacente que provoca la enfermedad.
En la presente memoria se describen métodos celularesex vivoein vivopara crear cambios permanentes en el genoma mediante deleción, inserción o reemplazo (deleción e inserción) de uno o más exones o sitios aceptores o donantes de corte y empalme intrónicos aberrantes en el gen de la distrofina mediante edición genómica y el restablecimiento del marco de lectura de la distrofina y el restablecimiento de la actividad de la proteína distrofina, que pueden usarse para tratar la Distrofia muscular de Duchenne (DMD). En la presente memoria también se describen componentes, kits y composiciones para realizar dichos métodos. Además, se proporcionan células producidas mediante dichos métodos.
En la presente memoria se describe un método para editar un gen de la distrofina en una célula humana mediante edición genómica, el método que comprende la etapa de introducir en la célula humana una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) para efectuar una o más roturas monocatenarias (SSB, por sus siglas en inglés) o roturas bicatenarias (DSB, por sus siglas en inglés) dentro o cerca del gen de la distrofina que da como resultado una deleción, inserción o reemplazo permanente de uno o más exones o sitios aceptores o donantes de corte y empalme intrónicos aberrantes dentro o cerca del gen de la distrofina y da como resultado el restablecimiento del marco de lectura de la distrofina y el restablecimiento de la actividad de la proteína distrofina. La célula humana puede ser una célula muscular o una célula precursora muscular.
En la presente memoria también se describe un métodoex vivopara tratar a un paciente (p. ej., un ser humano) con Distrofia muscular de Duchenne (DMD), comprendiendo el método las etapas de: i) crear una célula madre pluripotente inducida (iPSC, por sus siglas en inglés) específica para el paciente con DMD; ii) edición dentro o
cerca de un gen de la distrofina de la iPSC; iii) diferenciación de la iPSC editada genómicamente en una célula progenitora muscular Pax7+; y iv) implantar la célula progenitora muscular Pax7+ en el paciente.
La etapa de crear una célula madre pluripotente inducida (iPSC) específica del paciente puede comprender: a)
aislar una célula somática del paciente; y b) introducir un conjunto de genes asociados a la pluripotencia en la
célula somática para inducir a la célula somática a convertirse en una célula madre pluripotente. La célula
somática puede ser un fibroblasto. El conjunto de genes asociados a la pluripotencia es uno o más de los genes seleccionados del grupo que consiste en OCT4, SOX2, KLF4, Lin28, NAn Og y cMYC.
La etapa de edición dentro o cerca de un gen de la distrofina de la iPSC puede comprender introducir en la
iPSC de una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) para efectuar una o más roturas monocatenarias (SSB) o roturas bicatenarias (DSB) dentro o cerca del gen de la distrofina que da como
resultado una deleción, inserción o reemplazo permanente de uno o más exones o sitios aceptores o donantes
de corte y empalme intrónicos aberrantes dentro o cerca del gen de la distrofina y da como resultado el restablecimiento del marco de lectura de la distrofina y el restablecimiento de la actividad de la proteína distrofina.
La etapa de diferenciar la iPSC editada genómicamente en una célula progenitora muscular Pax7+ puede comprender poner en contacto la iPSC editada genómicamente con formulaciones de medios específicas, incluyendo fármacos de molécula pequeña; sobreexpresión transgénica; o retirada de suero.
La etapa de implantar la célula progenitora muscular Pax7+ en el paciente puede comprender implantar la
célula progenitora muscular Pax7+ en el paciente mediante inyección local en el músculo deseado.
En la presente memoria también se describe un métodoin vivopara tratar a un paciente (p. ej., un ser humano)
con Distrofia muscular de Duchenne (DMD), comprendiendo el método la etapa de editar un gen de la distrofina
en una célula del paciente. La célula puede ser una célula muscular o una célula precursora muscular.
La etapa de editar una distrofina en una célula del paciente puede comprender introducir en la célula del paciente una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) para efectuar una o más roturas monocatenarias (SSB) o roturas bicatenarias (DSB) dentro o cerca del gen de la distrofina que da como
resultado una deleción, inserción o reemplazo permanente de uno o más exones o sitios aceptores o donantes
de corte y empalme intrónicos aberrantes dentro o cerca del gen de la distrofina y da como resultado el restablecimiento del marco de lectura de la distrofina y el restablecimiento de la actividad de la proteína distrofina.
La una o más endonucleasas de ADN pueden ser una endonucleasa Cas1, Cas1 B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5,
Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (también conocida como Csn1 y Csx12), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2,
Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2,
Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 o Cpf1; un homólogo
de las mismas, un recombinante de la molécula de origen natural de las mismas, una versión con codones optimizados de las mismas, una versión modificada de las mismas y combinaciones de cualquiera de los anteriores.
El método puede comprender introducir en la célula uno o más polinucleótidos que codifican la una o más endonucleasas de ADN. El método puede comprender introducir en la célula uno o más ácidos ribonucleicos
(ARN) que codifican la una o más endonucleasas de ADN. El uno o más polinucleótidos o el uno o más ARN
pueden ser uno o más polinucleótidos modificados o uno o más ARN modificados. La una o más endonucleasas
de ADN pueden ser una o más proteínas o polipéptidos.
El método puede comprender además introducir en la célula uno o más ácidos ribonucleicos guía (ARNg). El
uno o más ARNg son ARN guía de molécula única (ARNgu). El uno o más ARNg o uno o más ARNgu son uno
o más ARNg modificados o uno o más ARNgu modificados. La una o más endonucleasas de ADN pueden precomplejarse con uno o más ARNg o uno o más ARNgu.
El método puede comprender además introducir en la célula un molde donante de polinucleótidos que comprende al menos una porción del gen de la distrofina de tipo silvestre o ADNc. La al menos una porción del
gen de la distrofina de tipo silvestre o ADNc puede incluir al menos una parte del exón 1, exón 2, exón 3, exón
4, exón 5, exón 6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10, exón 11, exón 12, exón 13, exón 14, exón 15, exón 16,
exón 17, exón 18, exón 19, exón 20, exón 21, exón 22, exón 23, exón 24, exón 25, exón 26, exón 27, exón 28, exón 29, exón 30, exón 31, exón 32, exón 33, exón 34, exón 35, exón 36, exón 37, exón 38, exón 39, exón 40, exón 41, exón 42, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 47, exón 48, exón 49, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53, exón 54, exón 55, exón 56, exón 57, exón 58, exón 59, exón 60, exón 61, exón 62, exón 63, exón 64, exón 65, exón 66, exón 67, exón 68, exón 69, exón 70, exón 71, exón 72, exón 73, exón 74, exón 75, exón 76, exón 77, exón 78, exón 79, regiones intrónicas, regiones intrónicas sintéticas, fragmentos, combinaciones de
los mismos o el gen de la distrofina entero o ADNc. La al menos una porción del gen de la distrofina de tipo
silvestre o ADNc puede incluir el exón 1, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón 6, exón 7, exón 8, exón 9, exón
10, exón 11, exón 12, exón 13, exón 14, exón 15, exón 16, exón 17, exón 18, exón 19, exón 20, exón 21, exón
22, exón 23, exón 24, exón 25, exón 26, exón 27, exón 28, exón 29, exón 30, exón 31, exón 32, exón 33, ex 34, exón 35, exón 36, exón 37, exón 38, exón 39, exón 40, exón 41, exón 42, exón 43, exón 44, exón 45, ex 46, exón 47, exón 48, exón 49, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53, exón 54, exón 55, exón 56, exón 57, ex 58, exón 59, exón 60, exón 61, exón 62, exón 63, exón 64, exón 65, exón 66, exón 67, exón 68, exón 69, ex 70, exón 71, exón 72, exón 73, exón 74, exón 75, exón 76, exón 77, exón 78, exón 79, regiones intrónicas,
regiones intrónicas sintéticas, fragmentos, combinaciones de los mismos o el gen de la distrofina entero o
ADNc. El molde donante puede ser un polinucleótido monocatenario o bicatenario.
El método puede comprender además introducir en la célula uno o más ácidos ribonucleicos guía (ARNg). La
una o más endonucleasas de ADN pueden ser una o más endonucleasas Cas9 o Cpf1 que efectúan un par de
roturas monocatenarias (SSB) o roturas bicatenarias (DSB), la primera rotura SSB o DSB en un locus 5' y la
segunda rotura SSB o DSB en un locus 3', que da como resultado una deleción permanente o reemplazo de
uno o más exones o sitios aceptores o donantes de corte y empalme intrónicos aberrantes entre el locus 5' y
el locus 3' dentro o cerca del gen de la distrofina y da como resultado el restablecimiento del marco de lectura
de la distrofina y el restablecimiento de la actividad de la proteína distrofina. Un ARNg puede crear un par de
SSB o DSB. Un ARNg puede comprender una secuencia espaciadora complementaria al locus 5', al locus 3' o
a un segmento entre el locus 5' y el locus 3'. Un primer ARNg puede comprender una secuencia espaciadora
que sea complementaria a un segmento del locus 5' y el segundo ARNg puede comprender una secuencia espaciadora que sea complementaria a un segmento del locus 3'.
El uno o más ARNg puede ser uno o más ARN guía de molécula única (ARNgu). El uno o más ARNg o el uno
o más ARNgu pueden ser uno o más ARNg modificados o uno o más ARNgu modificados. La una o más endonucleasas de ADN pueden precomplejarse con el uno o más ARNg o el uno o más ARNgu.
Puede haber una deleción del ADN cromosómico entre el locus 5' y el locus 3'.
La deleción puede ser de un exón único. La deleción del exón único puede ser una deleción del exón 2, exón
8, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52 o exón 53. El locus 5' puede ser proximal a
un límite 5' de un exón único seleccionado del grupo que consiste en el exón 2, exón 8, exón 43, exón 44, exón
45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52 y exón 53. El locus 3' puede ser proximal a un límite 3' de un exón
único seleccionado del grupo que consiste en el exón 2, exón 8, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 50,
exón 51, exón 52 y exón 53. El locus 5' puede ser proximal a un límite 5' y el locus 3' puede ser proximal al
límite 3' de un exón único seleccionado del grupo que consiste en el exón 2, exón 8, exón 43, exón 44, exón
45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52 y exón 53. La zona proximal al límite del exón puede incluir los donantes
y aceptores de corte y empalme circundantes del intrón vecino.
La deleción puede ser de múltiples exones. La deleción de múltiples exones puede ser una deleción de los
exones 45-53 o los exones 45-55. El locus 5' puede ser proximal a un límite 5' de múltiples exones seleccionados del grupo que consiste en los exones 45-53 y los exones 45-55. El locus 3' puede ser proximal
a un límite 3' de múltiples exones seleccionados del grupo que consiste en los exones 45-53 y los exones 45
55. El locus 5' puede ser proximal a un límite 5' y un locus 3' puede ser proximal al límite 3' de múltiples exones seleccionados del grupo que consiste en los exones 45-53 y los exones 45-55. La zona proximal al límite del
exón puede incluir los donantes y aceptores de corte y empalme circundantes del intrón vecino.
Puede producirse un reemplazo del ADN cromosómico entre el locus 5' y el locus 3'. El reemplazo puede ser
un reemplazo de exón único. El reemplazo del exón único puede ser un reemplazo del exón 2, exón 8, exón
43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53 o exón 70. El locus 5' puede ser proximal
a un límite 5' de un exón único seleccionado del grupo que consiste en el exón 2, exón 8, exón 43, exón 44,
exón 45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53 o exón 70. El locus 3' puede ser proximal a un límite 3'
de un exón único seleccionado del grupo que consiste en el exón 2, exón 8, exón 43, exón 44, exón 45, exón
46, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53 o exón 70. El locus 5' puede ser proximal a un límite 5' y un locus 3'
puede ser proximal al límite 3' de un exón único seleccionado del grupo que consiste en el exón 2, exón 8, exón
43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53 o exón 70. La zona proximal al límite del
exón puede incluir los donantes y aceptores de corte y empalme circundantes del intrón vecino o exón vecino.
El reemplazo puede ser de múltiples exones. El reemplazo de múltiples exones puede ser un reemplazo de los
exones 45-53 o los exones 45-55. El locus 5' puede ser proximal a un límite 5' de múltiples exones seleccionados del grupo que consiste en los exones 45-53 o los exones 45-55. El locus 3' puede ser proximal
a un límite 3' de múltiples exones seleccionados del grupo que consiste en los exones 45-53 o los exones 45
55. El locus 5' puede ser proximal a un límite 5' y un locus 3' puede ser proximal al límite 3' de múltiples exones seleccionados del grupo que consiste en los exones 45-53 o los exones 45-55. La zona proximal al límite del
exón puede incluir los donantes y aceptores de corte y empalme circundantes del intrón vecino o exón vecino.
El método puede comprender además introducir en la célula un molde donante de polinucleótidos que comprende al menos una porción del gen de la distrofina de tipo silvestre o ADNc y el reemplazo es por reparación dirigida por homología (HDR, por sus siglas en inglés).
La al menos una porción del gen de la distrofina de tipo silvestre o ADNc puede incluir al menos una parte del
exón 1, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón 6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10, exón 11, exón 12, exón 13,
exón 14, exón 15, exón 16, exón 17, exón 18, exón 19, exón 20, exón 21, exón 22, exón 23, exón 24, exón 2 exón 26, exón 27, exón 28, exón 29, exón 30, exón 31, exón 32, exón 33, exón 34, exón 35, exón 36, exón 3 exón 38, exón 39, exón 40, exón 41, exón 42, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 47, exón 48, exón 4 exón 50, exón 51, exón 52, exón 53, exón 54, exón 55, exón 56, exón 57, exón 58, exón 59, exón 60, exón 6 exón 62, exón 63, exón 64, exón 65, exón 66, exón 67, exón 68, exón 69, exón 70, exón 71, exón 72, exón 7 exón 74, exón 75, exón 76, exón 77, exón 78, exón 79, regiones intrónicas, regiones intrónicas sintéticas, fragmentos, combinaciones de los mismos o el gen de la distrofina entero o ADNc. La al menos una porción
del gen de la distrofina de tipo silvestre o ADNc puede incluir el exón 1, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón
6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10, exón 11, exón 12, exón 13, exón 14, exón 15, exón 16, exón 17, exón 18,
exón 19, exón 20, exón 21, exón 22, exón 23, exón 24, exón 25, exón 26, exón 27, exón 28, exón 29, exón 3 exón 31, exón 32, exón 33, exón 34, exón 35, exón 36, exón 37, exón 38, exón 39, exón 40, exón 41, exón 4 exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 47, exón 48, exón 49, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53, exón 5 exón 55, exón 56, exón 57, exón 58, exón 59, exón 60, exón 61, exón 62, exón 63, exón 64, exón 65, exón 6 exón 67, exón 68, exón 69, exón 70, exón 71, exón 72, exón 73, exón 74, exón 75, exón 76, exón 77, exón 7 exón 79, regiones intrónicas, regiones intrónicas sintéticas, fragmentos, combinaciones de los mismos o el gen
de la distrofina entero o ADNc.
El método puede comprender además introducir en la célula un ácido ribonucleico guía (ARNg) y un molde
donante de polinucleótidos que comprende al menos una porción del gen de la distrofina de tipo silvestre. La
una o más endonucleasas de ADN pueden ser una o más endonucleasas Cas9 o Cpf1 que efectúan una ruptura monocatenaria (SSB) o bicatenaria (DSB) en un locus dentro o cerca del gen de la distrofina que facilita la
inserción de una nueva secuencia del molde donante de polinucleótidos en el ADN cromosómico en el locus
que da como resultado la inserción permanente o corrección de uno o más exones o sitios aceptores o donantes
de corte y empalme intrónicos aberrantes dentro o cerca del gen de la distrofina y da como resultado el restablecimiento del marco de lectura de la distrofina y el restablecimiento de la actividad de la proteína distrofina. El ARNg puede incluir una secuencia espaciadora que es complementaria a un segmento del locus.
El método puede comprender además introducir en la célula uno o más ácidos ribonucleicos guía (ARNg) y un
molde donante de polinucleótidos que comprende al menos una porción del gen de la distrofina de tipo silvestre.
La una o más endonucleasas de ADN pueden ser una o más endonucleasas Cas9 o Cpf1 que efectúan un par
de roturas monocatenarias (SSB) o roturas bicatenarias (DSB), la primera en un locus 5' y la segunda en un
locus 3', dentro o cerca del gen de la distrofina que facilita la inserción de una nueva secuencia del molde
donante de polinucleótidos en el ADN cromosómico entre el locus 5' y el locus 3' que da como resultado una
inserción permanente o corrección de uno o más exones o sitios aceptores o donantes de corte y empalme
intrónicos aberrantes entre el locus 5' y el locus 3' dentro o cerca del gen de la distrofina y da como resultado
el restablecimiento del marco de lectura de la distrofina y el restablecimiento de la actividad de la proteína distrofina.
Un ARNg puede crear un par de SSB o DSB. Un ARNg puede comprender una secuencia espaciadora complementaria al locus 5', al locus 3' o a un segmento entre el locus 5' y el locus 3'. Un primer ARNg puede comprender una secuencia espaciadora que sea complementaria a un segmento del locus 5' y el segundo
ARNg puede comprender una secuencia espaciadora que sea complementaria a un segmento del locus 3'.
El uno o más ARNg puede ser uno o más ARN guía de molécula única (ARNgu). El uno o más ARNg o el uno
o más ARNgu pueden ser uno o más ARNg modificados o uno o más ARNgu modificados. La una o más endonucleasas de ADN pueden precomplejarse con el uno o más ARNg o el uno o más ARNgu.
Puede haber una inserción entre el locus 5' y el locus 3'.
La inserción puede ser una inserción de un exón único. La inserción de un exón único puede ser una inserción
del exón 2, exón 8, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53 o exón 70. El
locus 5' o el locus 3' pueden ser proximales a un límite de un exón único seleccionado del grupo que consiste
en el exón 2, exón 8, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53 y exón 70. La
zona proximal al límite del exón puede incluir los donantes y aceptores de corte y empalme circundantes del
intrón vecino o exón vecino.
La inserción puede ser una inserción de múltiples exones. La inserción de múltiples exones puede ser una
inserción de los exones 45-53 o los exones 45-55. El locus 5' o el locus 3' pueden ser proximales a un límite
de múltiples exones seleccionados del grupo que consiste en los exones 45-53 o los exones 45-55. La zona
proximal al límite del exón puede incluir los donantes y aceptores de corte y empalme circundantes del intrón
vecino.
La al menos una porción del gen de la distrofina de tipo silvestre o ADNc puede incluir al menos una parte del
exón 1, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón 6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10, exón 11, exón 12, exón 13,
exón 14, exón 15, exón 16, exón 17, exón 18, exón 19, exón 20, exón 21, exón 22, exón 23, exón 24, exón 2 exón 26, exón 27, exón 28, exón 29, exón 30, exón 31, exón 32, exón 33, exón 34, exón 35, exón 36, exón 3 exón 38, exón 39, exón 40, exón 41, exón 42, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 47, exón 48, exón 4 exón 50, exón 51, exón 52, exón 53, exón 54, exón 55, exón 56, exón 57, exón 58, exón 59, exón 60, exón 6 exón 62, exón 63, exón 64, exón 65, exón 66, exón 67, exón 68, exón 69, exón 70, exón 71, exón 72, exón 7 exón 74, exón 75, exón 76, exón 77, exón 78, exón 79, regiones intrónicas, regiones intrónicas sintéticas, fragmentos, combinaciones de los mismos o el gen de la distrofina entero o ADNc. La al menos una porción
del gen de la distrofina de tipo silvestre o ADNc puede incluir el exón 1, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón
6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10, exón 11, exón 12, exón 13, exón 14, exón 15, exón 16, exón 17, exón 18,
exón 19, exón 20, exón 21, exón 22, exón 23, exón 24, exón 25, exón 26, exón 27, exón 28, exón 29, exón 3 exón 31, exón 32, exón 33, exón 34, exón 35, exón 36, exón 37, exón 38, exón 39, exón 40, exón 41, exón 4 exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 47, exón 48, exón 49, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53, exón 5 exón 55, exón 56, exón 57, exón 58, exón 59, exón 60, exón 61, exón 62, exón 63, exón 64, exón 65, exón 6 exón 67, exón 68, exón 69, exón 70, exón 71, exón 72, exón 73, exón 74, exón 75, exón 76, exón 77, exón 7 exón 79, regiones intrónicas, regiones intrónicas sintéticas, fragmentos, combinaciones de los mismos o el gen
de la distrofina entero o ADNc.
La inserción o corrección puede realizarse mediante reparación dirigida por homología (HDR).
El molde donante puede ser un polinucleótido monocatenario o bicatenario.
El ARNm de Cas9 o Cpf1, el ARNg y el molde donante pueden formularse cada uno en nanopartículas lipídicas separadas o pueden coformularse todos en una nanopartícula lipídica.
El ARNm de Cas9 o Cpf1 puede formularse en una nanopartícula lipídica y tanto el ARNg como el molde
donante pueden suministrarse a la célula mediante un vector de virus adenoasociado (AAV).
El ARNm de Cas9 o Cpf1 puede formularse en una nanopartícula lipídica y el ARNg puede suministrarse a la
célula mediante electroporación y el molde donante puede suministrarse a la célula mediante un vector de virus adenoasociado (AAV).
El gen de la distrofina puede ubicarse en el Cromosoma X: 31.117.228-33.344.609 (Consorcio de Referencia
del Genoma - GRCh38/hg38).
En la presente memoria también se describe uno o más ácidos ribonucleicos guía (ARNg) para editar un gen
de la distrofina en una célula de un paciente con DMD. El uno o más ARNg y/o ARNgu pueden comprender
una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de ácido nucleico en las
SEQ ID NO: 1 - 1.410.472 del listado de secuencias. El uno o más ARNg puede ser uno o más ARN guía de
molécula única (ARNgu). El uno o más ARNg o el uno o más ARNgu pueden ser uno o más ARNg modificados
o uno o más ARNgu modificados.
En la presente memoria se describen células que se han modificado mediante los métodos anteriores para
suprimir permanentemente o corregir uno o más exones o sitios aceptores o donantes de corte y empalme
intrónicos aberrantes dentro del gen de la distrofina y restablecer el marco de lectura de la distrofina y restablecer la actividad de la proteína distrofina. Además, en la presente memoria se describen métodos para
mejorar la DMD mediante la administración de células que se han modificado mediante los métodos anteriores
a un paciente con DMD.
Se entiende que las invenciones descritas en esta memoria descriptiva no se limitan a los ejemplos resumidos
en este Compendio. En la presente memoria se describen y ejemplifican otros aspectos diversos.
Breve descripción de los dibujos
Diversos aspectos de los materiales y métodos para el tratamiento de la DMD divulgados y descritos en esta
memoria descriptiva pueden entenderse mejor haciendo referencia a las figuras adjuntas, en las que:
La Figura 1A es un plásmido (CTx-1) que comprende un gen de codones optimizados para la endonucleasa
Cas9 de S.pyogenes.El plásmido CTx-1 también incluye una secuencia armazón de ARNg, que incluye
una secuencia espaciadora de 20 pb de las secuencias enumeradas en las SEQ ID NO: 1 - 467.030 del
Listado de secuencias o una secuencia espaciadora de 19 pb de las secuencias enumeradas en las SEQ
ID NO: 1.410.430 - 1.410.472 del Listado de Secuencias;
La Figura 1B es un plásmido (CTx-2) que comprende un gen de codones optimizados diferente para la endonucleasa Cas9 de S.pyogenes.El plásmido CTx-2 también incluye una secuencia armazón de ARNg, que incluye una secuencia espaciadora de 20 pb de las secuencias enumeradas en las SEQ ID NO: 1 -467.030 del Listado de secuencias o una secuencia espaciadora de 19 pb de las secuencias enumeradas en las SEQ ID NO: 1.410.430 - 1.410.472 del Listado de Secuencias;
La Figura 1C es un plásmido (CTx-3) que comprende otro gen de codones optimizados diferente más para la endonucleasa Cas9 de S.pyogenes.El plásmido CTx-3 también incluye una secuencia armazón de ARNg, que incluye una secuencia espaciadora de 20 pb de las secuencias enumeradas en las SEQ ID NO: 1 - 467.030 del Listado de secuencias o una secuencia espaciadora de 19 pb de las secuencias enumeradas en las SEQ ID NO: 1.410.430 - 1.410.472 del Listado de Secuencias; y
La Figura 2A es una representación del sistema de CRISPR/Cas de tipo II.
La Figura 2B es una representación del sistema de CRISPR/Cas de tipo II.
La Figura 3A describe la eficiencia de corte de los ARNg de S.pyogenesen HEK293T dirigidos a los Exones 45, 51 y 53 del gen de la distrofina.
La Figura 3B describe la eficiencia de corte de los ARNg de S.pyogenesen HEK293T dirigidos a los 55 y 70 del gen de la distrofina.
La Figura 4A describe la eficiencia de corte de los ARNg de S.pyogenesen HEK293T dirigidos al aceptor de corte y empalme de los Exones 43, 44, 45, 46, 50, 51,52, 53 y 55 del gen de la distrofina.
La Figura 4B describe la eficiencia de corte de ARNg deN. meningitides, S. thermophilesy S.aureusen HEK293T dirigidos al aceptor de corte y empalme de los Exones 43, 44, 45, 46, 50, 51,52, 53 y 55 del gen de la distrofina.
La Figura 4C describe la eficiencia de corte de los ARNg de Cpf1 en HEK293T dirigidos a los aceptores de corte y empalme de los Exones 43, 44, 45, 46, 50, 51,52, 53 y 55 del gen de la distrofina.
Las Figuras 5A-B describen las eficiencias de corte y las eficiencias de inactivación del aceptor de corte y empalme de los ARNg de S.pyogenesen HEK293T dirigidos a los Exones 51,45, 53, 44, 46, 52, 50, 43 y 55 del gen de la distrofina.
La Figura 6 describe las eficiencias de corte y las eficiencias de inactivación del aceptor de corte y empalme de ARNg deN. meningitides(NM), S.thermophiles(ST) y S.aureus(SA) en HEK293T dirigidos a los Exones 51,45, 53, 44, 46, 52, 50, 43 y 55 del gen de la distrofina.
La Figura 7A describe la eficiencia de corte de ARNg de S.pyogenesen células HEK293T donde los ARNg se dirigen a las regiones que rodean el Exón 52 del gen de la distrofina.
La Figura 7B describe la eficiencia de corte de ARNg de S.pyogenesen células HEK293T donde los ARNg se dirigen a las regiones que rodean los Exones 44, 45 y 54 del gen de la distrofina.
La Figura 8A describe la eficiencia de corte de ARNg de S.pyogenesen iPSC donde los ARNg se dirigen a las regiones que rodean el Exón 52 del gen de la distrofina.
La Figura 8B describe la eficiencia de corte de ARNg de S.pyogenesen iPSC donde los ARNg se dirigen a las regiones que rodean los Exones 44, 45 y 54 del gen de la distrofina.
La Figura 9 describe la comparación de la eficiencia de corte de ARNg de S.pyogenesen células HEK293T e iPSC donde los ARNg se dirigen a las regiones que rodean los Exones 44, 45, 52 y 54 del gen de la distrofina.
La Figura 10A, la Figura 10B y la Figura 10C describen el análisis clonal de eventos de deleción clonal. La Figura 11A y la Figura 11B describen la secuenciación sanger de clones de A52.
Las Figuras 12A-E describen las eficiencias de corte de ARNg seleccionados a través de un cribado de ARNg transcritos in vitro (IVT, por sus siglas en inglés).
La Figura 13A describe la reparación dirigida por homología (HDR) entre el Exón 45-55 del gen de la distrofina.
La Figura 13B representa la confirmación por PCR de HDR en el locus del Exón 45-55 del gen de la distrofina.
La Figura 14A representa un ensayo de PCR de tres cebadores.
La Figura 14B representa los resultados del ensayo de PCR de tres cebadores.
La Figura 14C describe datos generados a partir del ensayo de PCR de tres cebadores.
La Figura 15 describe 5 clones que tienen la deleción A45-55 deseada.
Las Figuras 16A-B describen los resultados de la tinción SSEA-4 y de la tinción TRA-160 de los 5 clones que tienen la deleción A45-55 deseada.
La Figura 17 representa la expresión de una proteína distrofina suprimida internamente para los 5 clones editados.
La Figura 18 representa la tinción de la cadena pesada de miosina del clon 56 diferenciado.
Las Figuras 19A-19VV describen los resultados de un cribado lentivírico a gran escala.
Breve descripción del listado de secuencias
Las SEQ ID NO: 1 - 467.030 son una lista de secuencias espaciadoras de 20 pb de ARNg para el direccionamiento al gen de la distrofina con una endonucleasa Cas9 de S.pyogenes.
Las SEQ ID NO: 467.031 - 528.196 son una lista de secuencias espaciadoras de 20 pb de ARNg para el direccionamiento al gen de la distrofina con una endonucleasa Cas9 de S.aureus.
Las SEQ ID NO: 528.197 - 553.198 son una lista de secuencias espaciadoras de 24 pb de ARNg para el direccionamiento al gen de la distrofina con una endonucleasa Cas9 de S.thermophilus.
Las SEQ ID NO: 553.199 - 563.911 son una lista de secuencias espaciadoras de 24 pb de ARNg para el direccionamiento al gen de la distrofina con una endonucleasa Cas9 deT. denticola.
Las SEQ ID NO: 563.912 - 627.854 son una lista de secuencias espaciadoras de 24 pb de ARNg para el direccionamiento al gen de la distrofina con una endonucleasa Cas9 deN. meningitides.
Las SEQ ID NO: 627.855 - 1.410.399 son una lista de secuencias espaciadoras de 20-24 pb de ARNg para el direccionamiento al gen de la distrofina con una endonucleasa Cpf1 de unAcidominoccoccus, unaLachnospiraceaey unaFranciscella Novicida.
Las SEQ ID NO: 1.410.400 - 1.410.402 son una lista de secuencias espaciadoras de 24 pb de ARNg para el direccionamiento al gen de la distrofina con una endonucleasa Cas9 deN. meningitides.
Las SEQ ID NO: 1.410.403 - 1.410.429 son una lista de secuencias espaciadoras de 23 pb de ARNg para el direccionamiento al gen de la distrofina con una endonucleasa Cpf1 de un Acidominoccoccus, una Lachnospiraceae y una Franciscella Novicida.
Las SEQ ID NO: 1.410.430 - 1.410.472 son una lista de secuencias espaciadoras de 19 pb de ARNg para el direccionamiento al gen de la distrofina con una endonucleasa Cas9 de S.pyogenes.
Descripción detallada
Distrofia muscular de Duchenne (DMD)
La DMD está provocada por mutaciones en el gen de la distrofina (Cromosoma X: 31.117.228-33.344.609 (Consorcio de referencia del genoma - GRCh38/hg38)). Con una región genómica de más de 2,2 megabases de longitud, el gen de la distrofina es el segundo gen humano más grande. El gen de la distrofina contiene 79 exones que son procesados en un ARNm de 11,000 pares de bases que es traducido en una proteína de 427 kDa. Funcionalmente, la distrofina actúa como un enlazador entre los filamentos de actina y la matriz extracelular dentro de las fibras musculares. El extremo N de la distrofina es un dominio de unión a actina, mientras que el extremo C interactúa con un armazón transmembrana que ancla la fibra muscular a la matriz extracelular. Tras la contracción del músculo, la distrofina proporciona soporte estructural que permite al tejido muscular resistir la fuerza mecánica. La DMD está provocada por una amplia diversidad de mutaciones dentro del gen de la distrofina que dan como resultado codones de parada prematuros y, por lo tanto, una proteína distrofina truncada. Las proteínas distrofina truncadas no contienen el extremo C y, por lo tanto, no pueden proporcionar el soporte estructural necesario para resistir el esfuerzo de la contracción muscular. Como resultado, las fibras musculares se separan, lo que conduce al desgaste muscular.
Enfoque terapéutico
En la presente memoria se describen métodos celulares,ex vivoein vivopara usar herramientas de ingeniería genómica para crear cambios permanentes en el genoma que pueden restablecer el marco de lectura de la distrofina y restablecer la actividad de la proteína distrofina. Estos métodos usan endonucleasas, tales como nucleasas de CRISPR/Cas9, para suprimir definitivamente (eliminar), insertar o reemplazar (suprimir e insertar) exones (es decir, mutaciones en las secuencias codificantes y/o de corte y empalme) en el locus genómico del gen de la distrofina. De esta forma, la presente invención imita el producto producido por omisión de exones y/o restablece el marco de lectura con un único tratamiento (en lugar de suministrar oligonucleótidos de omisión de exones durante toda la vida del paciente). Se han realizado estudios preclínicos con respecto a la expresión del extremo C de la distrofina haciendo cambios dirigidos al genoma usando nucleasas basadas en Dedos de cinc, TALE y CRISPR/Cas9. En un ejemplo, se suprimió una gran región genómica que se prevé que trate a más del 60 % de los pacientes con DMD.
En la presente memoria se describen métodos para tratar a un paciente con DMD. Un ejemplo de dicho método es una terapia basada en célulasex vivo.Por ejemplo, se crea una estirpe celular de iPS específica para pacientes con DMD. Después, el ADN cromosómico de estas células iPS se corrige usando los materiales y métodos descritos en la presente memoria. A continuación, las iPSC corregidas se diferencian en células progenitoras musculares Pax7+. Por último, las células progenitoras se implantan en el paciente. Este enfoqueex vivotiene muchas ventajas.
Una ventaja de un enfoque de terapia celularex vivoes la capacidad de realizar un análisis exhaustivo de la terapia antes de su administración. Todas las terapias basadas en nucleasas tienen cierto nivel de efectos inespecíficos. Realizar la corrección génicaex vivopermite caracterizar totalmente la población celular corregida antes de la implantación. Los aspectos de la presente divulgación incluyen la secuenciación de todo el genoma de las células corregidas para garantizar que los cortes inespecíficos, si es que hay alguno, estén en ubicaciones genómicas asociadas a un riesgo mínimo para el paciente. Además, las poblaciones clonales de células pueden aislarse antes de la implantación.
Otra ventaja de la terapia celularex vivoestá relacionada con la corrección genética en iPSC en comparación con otras fuentes celulares primarias. Las iPSC son prolíficas, facilitando la obtención del gran número de células que se necesitarán para una terapia basada en células. Además, las iPSC son un tipo celular ideal para realizar aislamientos clonales. Esto permite realizar un cribado para la corrección genómica correcta, sin arriesgarse a una disminución de la viabilidad. En cambio, otros posibles tipos celulares, tales como los mioblastos primarios, son viables sólo durante unos pocos pases y son difíciles de expandir clonalmente. Además, los mioblastos de DMD específicos del paciente serán poco saludables debido a la falta de proteína distrofina. Por otro lado, las iPSC derivadas de pacientes con DMD no mostrarán un fenotipo enfermo, ya que no expresan distrofina en este estado de diferenciación. Por lo tanto, la manipulación de las iPSC de DMD será mucho más fácil y acortará el tiempo necesario para realizar la corrección genética deseada.
Una ventaja adicional de la terapia celularex vivoestá relacionada con la implantación de precursores de Pax7+ miogénicos frente a mioblastos. Las células Pax7+ se aceptan como células satélite miogénicas. Los precursores de Pax7+ son células mononucleadas que se sitúan en la periferia de las fibras musculares multinucleadas. En respuesta a una lesión, los precursores se dividen y se fusionan con las fibras existentes. En cambio, los mioblastos se fusionan directamente con la fibra muscular tras la implantación y tienen una capacidad proliferativa mínimain vivo.Por lo tanto, los mioblastos no pueden contribuir a la cicatrización tras lesiones repetidas, mientras que los precursores de Pax7+ pueden actuar como depósito y ayudar a curar el músculo durante toda la vida del paciente.
Otro ejemplo de dicho método es una terapia basadain vivo.En este método, el ADN cromosómico de las células del paciente se corrige usando los materiales y métodos descritos en la presente memoria.
La ventaja de la terapia génicain vivoes la facilidad de producción y administración terapéuticas. El mismo cóctel terapéutico tendrá el potencial de llegar a un subconjunto de la población del paciente con DMD (n > 1). En cambio, la terapia celularex vivopropuesta requiere desarrollar una terapia personalizada para cada paciente (n = 1). El desarrollo de terapias celularesex vivorequiere tiempo, que determinados pacientes con DMD avanzada pueden no tener.
En la presente memoria también se describe un método celular para editar el gen de la distrofina en una célula humana mediante edición genómica. Por ejemplo, se aísla una célula de un paciente o animal. Después, el ADN cromosómico de la célula se corrige usando los materiales y métodos descritos en la presente memoria.
Además de las mutaciones en las secuencias codificantes y de corte y empalme, puede haber varios tipos de sitios genómicos diana.
La regulación de la transcripción y la traducción implica varias clases diferentes de sitios que interactúan con proteínas o nucleótidos celulares. Con frecuencia, los sitios de unión al ADN de los factores de transcripción u otras proteínas pueden ser diana de mutación o deleción para estudiar la función del sitio, aunque también pueden ser diana para cambiar la expresión génica. Los sitios pueden añadirse a través de unión de extremos no homólogos (NHEJ) o edición genómica directa mediante reparación dirigida por homología (HDR). El mayor uso de la secuenciación genómica, la expresión de ARN y los estudios de todo el genoma sobre la unión de factores de transcripción han aumentado la capacidad para identificar cómo los sitios conducen a la regulación génica temporal o del desarrollo. Estos sistemas de control pueden ser directos o pueden implicar una amplia regulación cooperativa que puede requerir la integración de actividades de múltiples potenciadores. Los factores de transcripción normalmente se unen a secuencias de ADN degeneradas de 6-12 pb de longitud. El bajo nivel de especificidad que proporcionan los sitios individuales sugiere que en la unión y el resultado funcional intervienen interacciones y reglas complejas. Los sitios de unión con menos degeneración pueden proporcionar medios de regulación más sencillos. Pueden diseñarse factores de transcripción artificiales para especificar secuencias más largas que tengan menos secuencias similares en el genoma y menor potencial de escisión inespecífica. Cualquiera de estos tipos de sitios de unión puede mutarse, suprimirse o incluso crearse para permitir cambios en la regulación o expresión génica (Canver, M.C.et al., Nature(2015)).
Otra clase de regiones reguladoras de genes que presentan estas características son los sitios de unión a microARN (miARN). Los miARN son ARN no codificantes que desempeñan funciones clave en la regulación postranscripcional de los genes. Los miARN pueden regular la expresión del 30 % de todos los genes de mamíferos que codifican proteínas. Se descubrió el silenciamiento génico específico y potente mediante ARN bicatenario (ARNi), más ARN no codificante pequeño adicional (Canver, M.C.et al., Nature(2015)). La mayor clase de ARN no codificantes importantes para el silenciamiento génico son los miARN. En mamíferos, los miARN se transcriben primero como transcritos de ARN largos, que pueden ser unidades transcripcionales separadas, parte de intrones de proteínas u otros transcritos. Los transcritos largos se denominan miARN primarios (miARN-pri) que incluyen estructuras de horquilla imperfectamente emparejadas por bases. Estos miARN-pri pueden escindirse en uno o más miARN precursores más cortos (pre-miARN) mediante Microprocesador, un complejo proteico en el núcleo, que implica Drosha.
Los pre-miARN son pequeños bucles de tallo de ~70 nucleótidos de longitud con un saliente 3' de 2 nucleótidos que se exportan, en los dúplex miARN:miARN* maduros de 19-25 nucleótidos. La cadena de miARN con menor estabilidad de emparejamiento de bases (la cadena guía) puede cargarse en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, por sus siglas en inglés). El cordón guía pasajero (marcado con *), puede ser funcional, pero por lo general se degrada. El miARN maduro une el RISC a motivos de secuencia parcialmente complementarios en ARNm diana que se encuentran principalmente en las regiones 3' no traducidas (UTR, por sus siglas en inglés), e induce el silenciamiento génico postranscripcional (Bartel, D.P.Cell136, 215-233 (2009); Saj, A. y Lai, E.C.Curr Opin Genet Dev21,504-510 (2011)).
Los miARN pueden ser importantes en el desarrollo, la diferenciación, el control del ciclo y el crecimiento celulares, y en prácticamente todas las vías biológicas de los mamíferos y otros organismos pluricelulares. Los miARN también pueden estar implicados en el control del ciclo celular, la apoptosis y la diferenciación de células madre, la hematopoyesis, la hipoxia, el desarrollo muscular, la neurogénesis, la secreción de insulina, el metabolismo del colesterol, el envejecimiento, la replicación vírica y las respuestas inmunitarias.
Un único miARN puede dirigirse a cientos de transcritos de ARNm diferentes, mientras que un transcrito individual puede ser la diana de muchos miARN diferentes. En la última versión de miRBase (v.21) se han anotado más de 28645 microARN. Algunos miARN pueden estar codificados por múltiples locus, algunos de las cuales pueden expresarse a partir de grupos de cotranscritos en tándem. Estas características permiten la existencia de redes reguladoras complejas con múltiples vías y controles de retroalimentación. Los miARN pueden ser partes integrantes de estos circuitos de retroalimentación y regulación y pueden ayudar a regular la expresión génica manteniendo la producción de proteínas dentro de unos límites (Herranz, H. y Cohen, S.M.Genes Dev24, 1339-1344 (2010); Posadas, D.M. y Carthew, R.W.Curr Opin Genet Dev27, 1-6 (2014)).
Los miARN también pueden ser importantes en un gran número de enfermedades humanas que se asocian a una expresión anormal de miARN. Esta asociación subraya la importancia de la vía reguladora de los miARN. Estudios recientes de deleción de miARN han vinculado los miARN con la regulación de las respuestas inmunitarias (Stern-Ginossar, N.et al., Science317, 376-381 (2007)).
Los miARN también están estrechamente relacionados con el cáncer y pueden desempeñar una función en distintos tipos de cáncer. Se ha descubierto que los miARN están regulados negativamente en varios tumores. Los miARN pueden ser importantes en la regulación de vías clave relacionadas con el cáncer, tales como el control del ciclo celular y la respuesta al daño del ADN, por lo que pueden usarse en el diagnóstico y pueden ser dianas clínicas. Los microARN pueden regular delicadamente el equilibrio de la angiogénesis, de manera que los experimentos en los que se agotan todos los microARN suprimen la angiogénesis tumoral (Chen, S.et al., Genes D ev28, 1054-1067 (2014)).
Como se ha demostrado para los genes codificantes de proteínas, los genes de miARN también pueden estar sujetos a los cambios epigenéticos que se producen con el cáncer. Muchos locus de miARN pueden estar asociados a islas de CpG, lo que aumenta sus posibilidades de regulación por metilación de ADN (Weber, B., Stresemann, C., Brueckner, B. y Lyko, F.Cell Cycle6, 1001-1005 (2007)). La mayoría de los estudios han utilizado el tratamiento con fármacos remodeladores de la cromatina para revelar miARN silenciados epigenéticamente.
Además de su papel en el silenciamiento del ARN, los miARN también pueden activar la traducción (Posadas, D.M. y Carthew, R.W.Curr Opin Genet Dev27, 1-6 (2014)). La inactivación de estos sitios puede provocar una disminución de la expresión del gen diana, mientras que la introducción de estos sitios puede aumentar la expresión.
La forma más eficaz de inactivar un miARN es mutando la secuencia semilla (bases 2-8 del microARN), lo que puede ser importante para la especificidad de unión. La escisión en esta región, seguida de una reparación errónea mediante NHEJ puede anular eficazmente la función del miARN al bloquear la unión a los sitios diana. El miARN también podría inhibirse mediante el direccionamiento específico de la región de bucle especial adyacente a la secuencia palindrómica. También puede usarse Cas9 catalíticamente inactiva para inhibir la expresión de ARNhc (Zhao, Y.et al., Sci Rep4, 3943 (2014)). Además de dirigirse al miARN, los sitios de unión también pueden seleccionarse y mutarse para evitar el silenciamiento por miARN.
Células humanas
Para mejorar la DMD, como se describe e ilustra en la presente memoria, las principales dianas de la edición génica son células humanas. Por ejemplo, en los métodosex vivo,las células humanas pueden ser células somáticas, que después de haber sido modificadas usando las técnicas descritas, pueden dar lugar a células progenitoras musculares Pax7+. Por ejemplo, en los métodosin vivo,las células humanas pueden ser células musculares o células precursoras de músculo.
Mediante la edición génica en células autólogas derivadas y, por lo tanto, totalmente compatibles con el paciente que las necesita, es posible generar células que puedan reintroducirse con seguridad en el paciente, y dar lugar eficazmente a una población de células que puedan ser eficaces para mejorar una o más afecciones clínicas asociadas a la enfermedad del paciente.
Las células progenitoras (también denominadas células madre en la presente memoria) son capaces tanto de proliferar como de dar lugar a más células progenitoras, éstas, a su vez, tienen la capacidad de generar un gran número de células madre que, a su vez, pueden dar lugar a células hijas diferenciadas o diferenciables. Las propias células hijas pueden ser inducidas a proliferar y producir descendencia que posteriormente se diferencia en uno o más tipos celulares maduros, conservando al mismo tiempo una o más células con potencial de desarrollo parental. La expresión "célula madre" se refiere entonces, a una célula con capacidad o potencial, en circunstancias particulares, para diferenciarse a un fenotipo más especializado o diferenciado, y que conserva la capacidad, en determinadas circunstancias, de proliferar sin diferenciarse sustancialmente. En un aspecto, el término progenitor o célula madre se refiere a una célula madre generalizada cuyos descendientes (descendencia) se especializan, con frecuencia en direcciones diferentes, por diferenciación, p. ej., adquiriendo caracteres totalmente individuales, como ocurre en la diversificación progresiva de células y tejidos embrionarios. La diferenciación celular es un proceso complejo que normalmente se produce a través de muchas divisiones celulares. Una célula diferenciada puede derivar de una célula multipotente que a su vez deriva de una célula multipotente, y así sucesivamente. Aunque cada una de estas células multipotentes puede considerarse una célula madre, la gama de tipos celulares que cada una puede originar puede variar considerablemente. Algunas células diferenciadas también tienen la capacidad de dar lugar a células de mayor potencial de desarrollo. Dicha capacidad puede ser natural o inducirse artificialmente tras el tratamiento con diversos factores. En muchos casos biológicos, las células madre pueden ser también "multipotentes" porque pueden producir descendencia de más de un tipo celular distinto, pero esto no es necesario para las "características de célula madre".
La autorrenovación puede ser otro aspecto importante de las células madre. En teoría, la autorrenovación puede producirse por dos mecanismos principales. Las células madre pueden dividirse asimétricamente, con una hija que conserva el estado de célula madre y la otra hija que expresa alguna otra función y fenotipo específicos distintos. Como alternativa, algunas de las células madre de una población pueden dividirse simétricamente en dos células madre, manteniendo de este modo algunas células madre en el conjunto de la población, mientras que otras células de la población sólo dan lugar a descendencia diferenciada. Generalmente, las "células progenitoras" tienen un fenotipo celular más primitivo (es decir, se encuentran en una etapa más temprana de una vía de desarrollo o progresión que una célula totalmente diferenciada). Con frecuencia, las células progenitoras también tienen un potencial proliferativo importante o muy elevado. Las células progenitoras pueden dar lugar a múltiples tipos celulares diferenciados o a un único tipo celular diferenciado, dependiendo de la vía de desarrollo y del entorno en el que las células se desarrollan y se diferencian.
En el contexto de la ontogenia celular, el adjetivo "diferenciado", o "diferenciado^1, es un término relativo. Una "célula diferenciada" es una célula que ha avanzado más en la vía del desarrollo que la célula con la que se compara. Por lo tanto, las células madre pueden diferenciarse en células precursoras de linaje restringido (tales como una célula progenitora de miocitos), que, a su vez, pueden diferenciarse en otros tipos de células precursoras en etapas posteriores de la vía (tales como un precursor de miocitos) y, posteriormente, en una célula diferenciada en fase final, tal como un miocito, que desempeña una función característica en un determinado tipo de tejido, y que puede conservar o no la capacidad de seguir proliferando.
Células madre pluripotentes inducidas
En algunos ejemplos, las células humanas modificadas genéticamente descritas en la presente memoria pueden ser células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Una ventaja de usar iPSC es que las células pueden derivar del mismo sujeto al que se van a administrar las células progenitoras. Es decir, puede obtenerse una célula somática de un sujeto, reprogramarla a una célula madre pluripotente inducida y después rediferenciarla en una célula progenitora que ha de administrarse al sujeto (p. ej., células autólogas). Debido a que los precursores derivan esencialmente de una fuente autóloga, el riesgo de rechazo del injerto o de respuesta alérgica puede reducirse en comparación con el uso de células de otro sujeto o grupo de sujetos. Además, el uso de iPSC elimina la necesidad de células obtenidas de una fuente embrionaria. Por lo tanto, en un aspecto, las células madre utilizadas en los métodos divulgados no son células madre embrionarias.
Aunque la diferenciación generalmente es irreversible en contextos fisiológicos, recientemente se han desarrollado varios métodos para reprogramar células somáticas a iPSC. Los métodos de ejemplo son conocidos por los expertos en la técnica y se describen brevemente en el presente documento a continuación.
El término "reprogramación" se refiere a un proceso que altera o invierte el estado de diferenciación de una célula diferenciada (por ejemplo, una célula somática). Dicho de otro modo, la reprogramación se refiere a un proceso de retroceso de la diferenciación de una célula a un tipo celular más indiferenciado o más primitivo. Debe tenerse en cuenta que la colocación de muchas células primarias en cultivo puede conducir a cierta pérdida de características totalmente diferenciadas. Por lo tanto, el simple cultivo de dichas células incluidas en la expresión células diferenciadas no convierte a estas células en células no diferenciadas (p. ej., células indiferenciadas) ni en células pluripotentes. La transición de una célula diferenciada a pluripotencia requiere un estímulo de reprogramación más allá de los estímulos que conducen a la pérdida parcial del carácter diferenciado en cultivo. Las células reprogramadas también tienen la característica de la capacidad de pase prolongado sin pérdida de potencial de crecimiento, con respecto a los precursores de células primarias, que generalmente sólo tienen capacidad para un número limitado de divisiones en cultivo.
La célula que ha de reprogramarse puede estar parcial o terminalmente diferenciada antes de la reprogramación. La reprogramación abarca la reversión completa del estado de diferenciación de una célula diferenciada (p. ej., una célula somática) a un estado pluripotente o multipotente. La reprogramación puede abarcar la reversión completa o parcial del estado de diferenciación de una célula diferenciada (p. ej., una célula somática) a una célula indiferenciada (p. ej., una célula similar a embrionaria). La reprogramación puede dar como resultado la expresión de genes particulares por las células, cuya expresión contribuye adicionalmente a la reprogramación. En determinados ejemplos descritos en la presente memoria, la reprogramación de una célula diferenciada (p. ej., una célula somática) puede provocar que la célula diferenciada asuma un estado indiferenciado (p. ej., es una célula indiferenciada). Las células resultantes se denominan "células reprogramadas", o "células madre pluripotentes inducidas (iPSC o células iPS)".
La reprogramación puede implicar una alteración, p. ej., la reversión, de al menos algunos de los patrones hereditarios de modificación de ácidos nucleicos (p. ej., metilación), condensación de la cromatina, cambios epigenéticos, impronta genómica, etc., que se producen durante la diferenciación celular. La reprogramación es distinta del simple mantenimiento del estado indiferenciado existente de una célula que ya es pluripotente o del mantenimiento del estado menos que totalmente diferenciado existente de una célula que ya es una célula multipotente (p. ej., una célula madre miogénica). La reprogramación también es distinta de la promoción de la autorrenovación o proliferación de células que ya son pluripotentes o multipotentes, aunque las composiciones y métodos descritos en la presente memoria también pueden ser útiles para dichos fines, en algunos ejemplos.
Se conocen muchos métodos en la técnica para generar células madre pluripotentes a partir de células somáticas. Cualquier método de este tipo que reprograme una célula somática al fenotipo pluripotente sería apropiado para su uso en los métodos descritos en la presente memoria.
Se han descrito metodologías de reprogramación para generar células pluripotentes usando combinaciones definidas de factores de transcripción. Las células somáticas de ratón pueden convertirse en células similares a las células ES (células madre embrionarias por sus siglas en inglés) con un mayor potencial de desarrollo mediante la transducción directa de Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc; véase, p. ej., Takahashi y Yamanaka,Cell126(4): 663-76 (2006). Las iPSC se parecen a las células ES, ya que restablecen el circuito transcripcional asociado a la pluripotencia y gran parte del paisaje epigenético. Además, las iPSC de ratón satisfacen todos los ensayos convencionales de pluripotencia: específicamente, diferenciaciónin vitroen tipos celulares de las tres capas germinales, formación de teratomas, contribución a quimeras, transmisión por estirpe germinal [véase, p. ej., Maherali y Hochedlinger,Cell Stem Cell.3(6):595-605 (2008)] y complementación tetraploide.
Las iPSC humanas pueden obtenerse usando métodos de transducción similares, y el trio de factores de transcripción, OCT4, SOX2 y NANOG, se ha establecido como el conjunto central de factores de transcripción que rigen la pluripotencia; véase, p. ej., Budniatzky y Gepstein,Stem Cells Transí Med.3(4):448-57 (2014); Barrettet al., Stem Cells Trans Med3:1-6 sctm.2014-0121 (2014); Focosiet al., Blood Cáncer Journal4: e211 (2014); y las referencias citadas en los mismos. La producción de iPSC puede lograrse mediante la introducción de secuencias de ácido nucleico que codifican genes asociados a células madre en una célula somática adulta, usando históricamente vectores víricos.
Las iPSC pueden generarse o derivarse de células somáticas diferenciadas terminalmente, así como de células madre adultas o células madre somáticas. Es decir, una célula progenitora no pluripotente puede convertirse en pluripotente o multipotente mediante reprogramación. En dichos casos, puede que no sea necesario incluir tantos factores de reprogramación como se requieren para reprogramar una célula diferenciada terminalmente. Adicionalmente, la reprogramación puede inducirse mediante la introducción no vírica de factores de reprogramación, p. ej., mediante la introducción de las propias proteínas, o mediante la introducción de ácidos nucleicos que codifican los factores de reprogramación, o mediante la introducción de ARN mensajeros que tras la traducción producen los factores de reprogramación (véanse, p. ej., Warrenet al., Cell Stem Cell,7(5):618-30 (2010). La reprogramación puede conducirse introduciendo una combinación de ácidos nucleicos que codifican genes asociados a células madre, incluyendo, por ejemplo, Oct-4 (también conocido como Oct-3/4 o Pouf51), Soxl, Sox2, Sox3, Sox 15, Sox 18, NANOG, Klfl, Klf2, Klf4, Klf5, NR5A2, c-Myc, 1-Myc, n-Myc, Rem2,Terty LIN28. La reprogramación usando los métodos y composiciones descritos en la presente memoria puede comprender además la introducción de uno o más de Oct-3/4, un miembro de la familia Sox, un miembro de la familia Klf y un miembro de la familia Myc a una célula somática. Los métodos y composiciones descritos en la presente memoria pueden comprender además introducir uno o más de cada uno de Oct-4, Sox2, Nanog, c-MYC y Klf4 para la reprogramación. Como indicó anteriormente, el método exacto utilizado para la reprogramación no es necesariamente crítico para los métodos y composiciones descritos en la presente memoria. Sin embargo, cuando las células diferenciadas a partir de las células reprogramadas han de usarse, p. ej., en terapia humana, en un aspecto, la reprogramación no se efectúa mediante un método que altere el genoma. Por lo tanto, en dichos ejemplos, la reprogramación puede conseguirse, p. ej., sin el uso de vectores víricos o plasmídicos.
La eficiencia de la reprogramación (es decir, el número de células reprogramadas) derivada de una población de células de partida puede potenciarse mediante la adición de diversos agentes, p. ej., moléculas pequeñas, como muestran Shiet al., Cell-Stem Cell2:525-528 (2008); Huangfuet al., Nature Biotechnology26(7):795-797 (2008) y Marsonet al., Cell-Stem Cell3: 132-135 (2008). Por lo tanto, puede usarse un agente o combinación de agentes que potencian la eficiencia o la tasa de producción de células madre pluripotentes inducidas en la producción de iPSC específicas de pacientes o específicas de enfermedades. Algunos ejemplos no limitantes de agentes que potencian la eficiencia de la reprogramación incluyen Wnt soluble, medios acondicionados con Wnt, BIX-01294 (una histona metiltransferasa G9a), PD0325901 (un inhibidor de MEK), inhibidores de ADN metiltransferasa, inhibidores de histona desacetilasa (HDAC), ácido valproico, 5'-azacitidina, dexametasona, suberoilanilida, ácido hidroxámico (SAHA), vitamina C y tricostatina (TSA), entre otros.
Otros ejemplos no limitantes de agentes potenciadores de la reprogramación incluyen: Ácido suberoilanilida hidroxámico (SAHA (p. ej., MK0683, vorinostat) y otros ácidos hidroxámicos), BML-210, Depudecina (p. ej., (-)-Depudecina), Toxina HC, Nullscript (4-(1,3-Dioxo-1H,3H-benzo[de]isoquinolin-2-i)-N-hidroxibutanamida), Fenilbutirato (p. ej., fenilbutirato de sodio) y ácido valproico ((VP A) y otros ácidos grasos de cadena corta), Scriptaid, Suramina de sodio, T ricostatina A (TSA), Compuesto 8 de APHA, Apicidina, Butirato de sodio, butirato de pivoiloximetilo (Pivanex, AN-9), T rapoxina B, Clamidocina, Depsipéptido (también conocido como FR901228 o FK228), benzamidas (p. ej., Cl-994 (p. ej., N-acetil dinalina) y MS-27-275), MGCD0103, NVP-LAQ-824, CBHA (ácido m-carboxicinamínico ácido bishidroxámico), JNJ16241199, Tubacina, A-161906, proxamida, oxamflatina, 3-Cl-UCHA (p. ej., ácido hidroxámico 6-(3-clorofenilureido)caproico), AOE (ácido 2-amino-8-oxo-9, 10-epoxidecanoico), CHAP31 y CHAP 50. Otros agentes potenciadores de la reprogramación incluyen, por ejemplo, formas dominantes negativas de las HDAC (p. ej., formas catalíticamente inactivas), inhibidores de ARNip de las HDAC, y anticuerpos que se unen específicamente a las HDAC. Dichos inhibidores están disponibles, p. ej., en BIOMOL International, Fukasawa, Merck Biosciences, Novartis, Gloucester Pharmaceuticals, Titan Pharmaceuticals, MethylGene y Sigma Aldrich.
Para confirmar la inducción de células madre pluripotentes para su uso con los métodos descritos en la presente memoria, los clones aislados pueden someterse a ensayos de expresión de un marcador de células madre. Dicha expresión en una célula derivada de una célula somática identifica a las células como células madre pluripotentes inducidas. Los marcadores de células madre pueden seleccionarse del grupo no limitante que incluye SSEA3, SSEA4, CD9, Nanog, Fbxl5, Ecatl, Esgl, Eras, Gdf3, Fgf4, Cripto, Daxl, Zpf296, Slc2a3, Rexl, Utfl y Natl. En un caso, por ejemplo, una célula que expresa Oct4 o Nanog se identifica como pluripotente. Los métodos para detectar la expresión de dichos marcadores pueden incluir, por ejemplo, RT-PCR y métodos inmunitarios que detectan la presencia de los polipéptidos codificados, tales como transferencias Western o análisis por citometría de flujo. La detección puede implicar, no sólo RT-PCR, sino que también puede incluir la detección de marcadores proteínicos. Los marcadores intracelulares pueden identificarse mejor mediante RT-PCR o métodos de detección de proteínas tales como inmunocitoquímica, mientras que los marcadores de la superficie celular se identifican fácilmente, p. ej., mediante inmunocitoquímica.
El carácter de células madre pluripotentes de las células aisladas puede confirmarse mediante ensayos que evalúen la capacidad de las iPSC para diferenciarse en células de cada una de las tres capas germinales. Como ejemplo, puede usarse la formación de teratomas en ratones desnudos para evaluar el carácter pluripotente de los clones aislados. Las células pueden introducirse en ratones desnudos y puede realizarse histología y/o inmunohistoquímica de un tumor surgido de las células. Crecimiento de un tumor compuesto por células de las tres capas germinales, por ejemplo, indica además que las células son células madre pluripotentes.
Creación de iPSC específicas de pacientes con DMD
Una etapa de los métodosex vivode la presente divulgación puede implicar crear una célula iPS específica del paciente con DMD, células iPS específicas de pacientes con DMD o una estirpe celular de iPS específica de pacientes con DMD. Existen muchos métodos establecidos en la técnica para crear células iPS específicas de pacientes, como se describe en Takahashi y Yamanaka 2006; Takahashi, Tanabeet al.2007. Además, la diferenciación de células pluripotentes hacia el linaje muscular puede lograrse mediante la tecnología desarrollada por Anagenesis Biotechnologies, como se describe en la Solicitud de patente internacional con los números de publicación WO2013/030243 y WO2012/101114. Por ejemplo, la etapa de creación puede comprender: a) aislar una célula somática, tal como una célula cutánea o un fibroblasto del paciente; y b) introducir un conjunto de genes asociados a la pluripotencia en la célula somática para inducir a la célula a convertirse en una célula madre pluripotente. El conjunto de genes asociados a la pluripotencia puede ser uno o más de los genes seleccionados del grupo que consiste en OCT4, SOX2, KLF4, Lin28, NANOG y cMYC.
Edición genómica
La edición genómica se refiere generalmente al proceso de modificación de la secuencia de nucleótidos de un genoma, preferiblemente de forma precisa o predeterminada. Los ejemplos de métodos de edición genómica descritos en la presente memoria incluyen métodos de uso de nucleasas dirigidas al sitio para cortar ácido desoxirribonucleico (ADN) en ubicaciones diana precisas en el genoma, creando de este modo roturas monocatenarias o bicatenarias de ADN en ubicaciones particulares del genoma. Dichas roturas pueden repararse, y de hecho se reparan, mediante procesos celulares endógenos y naturales, tales como la reparación dirigida por homología (HDR) y la unión de extremos no homólogos (NHEJ), como se revisó recientemente en Coxet al., Nature Medicine21(2), 121-31 (2015). La NHEJ une directamente los extremos de ADN resultantes de una rotura bicatenaria, en ocasiones con pérdida o adición de secuencia de nucleótidos, que pueden alterar o potenciar la expresión génica. La HDR utiliza una secuencia homóloga, o secuencia donante, como molde para insertar una secuencia de ADN definida en el punto de rotura. La secuencia homóloga puede estar en el genoma endógeno, tal como una cromátida hermana. Como alternativa, el donante puede ser un ácido nucleico exógeno, tal como un plásmido, un oligonucleótido monocatenario, un oligonucleótido bicatenario, un oligonucleótido dúplex o un virus, que tiene regiones de alta homología con el locus escindido por nucleasa, pero que también pueden contener secuencias adicionales o cambios en la secuencia, incluyendo deleciones que pueden incorporarse al locus diana escindido. Un tercer mecanismo de reparación puede ser la unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ, por sus sigla en inglés), también denominada "NHEJ alternativa", en la que el resultado genético es similar a NHEJ en el sentido de que pueden producirse pequeñas deleciones e inserciones en el sitio de escisión. La MMEJ puede hacer uso de secuencias homólogas de unos pocos pares de bases que flanquean el lugar de rotura del ADN para impulsar un resultado de reparación de la unión de extremos de ADN más favorecido, e informes recientes han dilucidado adicionalmente el mecanismo molecular de este proceso; véase, p. ej., Cho y Greenberg,Nature518, 174-76 (2015); Kentet al., Nature Structural and Molecular Biology, Adv. Onlinedoi:10.1038/nsmb.2961(2015); Mateos-Gómezet al., Nature518, 254-57 (2015); Ceccaldiet al., Nature528, 258-62 (2015). En algunos casos, puede ser posible predecir los resultados probables de la reparación basándose en el análisis de posibles microhomologías en el lugar de la rotura del ADN.
Cada uno de estos mecanismos de edición genómica puede usarse para crear las alteraciones genómicas deseadas. Una etapa en el proceso de edición genómica puede ser crear una o dos roturas en el ADN, estas últimas como roturas bicatenarias o como dos roturas monocatenarias, en el locus diana lo más cerca posible del lugar de la mutación prevista. Esto puede lograrse mediante el uso de polipéptidos dirigidos al sitio, como se describe e ilustra en la presente memoria.
Los polipéptidos dirigidos al sitio, tales como una endonucleasa de ADN, pueden introducir roturas bicatenarias o monocatenarias en los ácidos nucleicos, p. ej., ADN genómico. La rotura bicatenaria puede estimular las vías endógenas de reparación del ADN de una célula (p. ej., la reparación dependiente de homología o la unión de extremos no homólogos o la unión de extremos no homólogos alternativa (A-NHEJ) o la unión de extremos mediada por microhomología). La NHEJ puede reparar el ácido nucleico diana escindido sin necesidad de un molde homólogo. En ocasiones, esto puede dar lugar a pequeñas deleciones o inserciones (indels) en el ácido nucleico diana en el lugar de la escisión, y puede provocar la interrupción o alteración de la expresión génica. La HDR puede producirse cuando un molde de reparación homólogo, o donante, está disponible. El molde donante homólogo puede comprender secuencias que pueden ser homólogas a secuencias que flanquean el sitio de escisión del ácido nucleico diana. La cromátida hermana puede ser utilizada por la célula como molde de reparación. Sin embargo, para los fines de edición genómica, el molde de reparación puede suministrarse como un ácido nucleico exógeno, tal como un plásmido, dúplex de oligonucleótidos, oligonucleótido monocatenario, oligonucleótido bicatenario o ácido nucleico vírico. Con moldes donantes exógenos, puede introducirse una secuencia de ácido nucleico adicional (tal como un transgén) o una modificación (tal como un cambio o una deleción de una única o múltiples bases) entre las regiones flanqueantes de homología, de manera que la secuencia de ácido nucleico adicional o alterada también se incorpore en el locus diana. La MMEJ puede dar lugar a un resultado genético similar a la NHEJ, en el sentido de que pueden producirse pequeñas deleciones e inserciones en el lugar de escisión. La MMEJ puede hacer uso de secuencias homólogas de unos pocos pares de bases que flanquean el sitio de escisión para impulsar un resultado de reparación de ADN de unión de extremos favorecido. En algunos casos, puede ser posible predecir los resultados probables de la reparación basándose en el análisis de microhomologías potenciales en las regiones diana de nucleasas.
Por lo tanto, en algunos casos, puede usarse recombinación homóloga para insertar una secuencia polinucleotídica exógena en el sitio de escisión del ácido nucleico diana. Una secuencia exógena de polinucleótidos se denomina en la presente memoria polinucleótido donante (o donante o secuencia donante o molde donante de polinucleótidos). El polinucleótido donante, una porción del polinucleótido donante, una copia del polinucleótido donante, o una porción de una copia del polinucleótido donante puede insertarse en el sitio de escisión de ácido nucleico diana. El polinucleótido donante puede ser una secuencia polinucleotídica exógena, es decir, una secuencia que no se encuentra de forma natural en el sitio de escisión de ácido nucleico diana.
Las modificaciones del ADN diana debidas a NHEJ y/o HDR pueden conducir a, por ejemplo, mutaciones, deleciones, alteraciones, integraciones, corrección génica, reemplazo génico, marcaje génico, inserción transgénica, deleción de nucleótidos, disrupción génica, translocaciones y/o mutación génica. Los procesos de deleción de ADN genómico y de integración de ácido nucleico no nativo en ADN genómico son ejemplos de edición genómica.
Sistema de endonucleasas de CRISPR
Puede encontrarse un locus genómico de CRISPR (Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas, por sus siglas en inglés) en los genomas de muchos procariotas (p. ej., bacterias y arqueas). En procariotas, el locus de CRISPR codifica productos que actúan como una especie de sistema inmunitario para ayudar a defender a los procariotas contra invasores extraños, tales como virus y fagos. Existen tres fases en la función del locus de CRISPR: la integración de nuevas secuencias en el locus de CRISPR, la expresión de ARN de CRISPR (ARNcr) y el silenciamiento del ácido nucleico invasor extraño. Se han identificado cinco tipos de sistemas de CRISPR (p. ej., Tipo I, Tipo II, Tipo III, Tipo U y Tipo V).
Un locus de CRISPR incluye una serie de secuencias cortas repetitivas denominadas "repeticiones". Cuando se expresan, las repeticiones pueden formar estructuras secundarias (p. ej., horquillas) y/o comprender secuencias monocatenarias no estructuradas. Las repeticiones por lo general se producen en grupos y con frecuencia divergen entre especies. Las repeticiones se intercalan regularmente con secuencias intermedias únicas denominadas "espaciadores", dando como resultado una arquitectura de locus de repeticiónespaciador-repetición. Los espaciadores son idénticos o tienen una gran homología con secuencias invasoras extrañas conocidas. Una unidad de espaciador-repetición codifica un ARNcrispr (ARNcr), que se transforma en una forma madura de la unidad espaciador-repetición. Un ARNcr comprende una secuencia "semilla" o espaciadora que está implicada en la orientación de un ácido nucleico diana (en la forma de origen natural en procariotas, la secuencia espaciadora se dirige al ácido nucleico invasor extraño). En el extremo 5' o 3' del ARNcr se ubica una secuencia espaciadora.
Un locus de CRISPR también comprende secuencias polinucleotídicas que codifican genes asociados a CRISPR (Cas). Los genes Cas codifican endonucleasas implicadas en la biogénesis y las fases de interferencia de la función del ARNcr en procariotas. Algunos genes Cas comprenden estructuras secundarias y/o terciarias homologas.
Sistemas de CRISPR de Tipo II
La biogénesis de ARNcr en un sistema de CRISPR de Tipo II en la naturaleza requiere un ARN de CRISPR transactivador (ARNtracr). El ARNtracr puede ser modificado por la RNasaIII endógena, y después se hibrida con una repetición de ARNcr en la matriz de pre-ARNcr. La RNasaIII endógena puede ser reclutada para escindir el pre-ARNcr. Los ARNcr escindidos pueden someterse a un recorte por exorribonucleasas para producir la forma madura de ARNcr (p. ej., recorte 5'). El ARNtracr puede permanecer hibridado con el ARNcr, y el ARNtracr y el ARNcr se asocian a un polipéptido dirigido al sitio (p. ej., Cas9). El ARNcr del complejo ARNcr-ARNtra-Cas9 puede guiar el complejo a un ácido nucleico diana con el que el ARNcr pueda hibridarse. La hibridación del ARNcr con el ácido nucleico diana puede activar Cas9 para la escisión del ácido nucleico diana. El ácido nucleico diana en un sistema de CRISPR de Tipo II se denomina motivo adyacente al protoespaciador (PAM, por sus siglas en inglés). En la naturaleza, el PAM es esencial para facilitar la unión de un polipéptido dirigido al sitio (p. ej., Cas9) al ácido nucleico diana. Los sistemas de Tipo II (también denominados Nmeni o CASS4) se subdividen a su vez en Tipo II-A (CASS4) y II-B (CASS4a). Jineket al., Science,337(6096):816-821 (2012) demostraron que el sistema de CRISPR/Cas9 es útil para la edición genómica programable por ARN, y la publicación de solicitud de patente internacional número WO2013/176772 proporciona numerosos ejemplos y aplicaciones del sistema de endonucleasas de CRISPR/Cas para la edición génica específica de sitio.
Sistemas de CRISPR de Tipo V
Los sistemas de CRISPR de Tipo V presentan varias diferencias importantes con respecto a los de Tipo II. Por ejemplo, Cpf1 es una endonucleasa única guiada por ARN que, a diferencia de los sistemas de Tipo II, carece de ARNtracr. De hecho, las matrices de CRISPR asociados a Cpf1 pueden ser procesadas en ARNcr maduros sin la necesidad de un ARNtracr transactivador adicional. La matriz de CRISPR de Tipo V puede procesarse en ARNcr cortos maduros de 42-44 nucleótidos de longitud, cada ARNcr maduro comienza con 19 nucleótidos de repetición directa seguidos de 23-25 nucleótidos de secuencia espaciadora. En cambio, los ARNcr maduros en sistemas de Tipo II pueden comenzar con 20-24 nucleótidos de secuencia espaciadora seguidos de aproximadamente 22 nucleótidos de repetición directa. Además, Cpf1 puede utilizar un motivo adyacente al protoespaciador rico en T, de manera que los complejos Cpf1-ARNcr escinden eficazmente el ADN diana precedido por un PAM corto rico en T, que contrasta con el PAM rico en G que sigue al ADN diana para los sistemas de Tipo II. Por lo tanto, los sistemas de Tipo V se escinden en un punto distante del PAM, mientras que los sistemas de Tipo II se escinden en un punto adyacente al PAM. Además, a diferencia de los sistemas de Tipo II, Cpf1 escinde el ADN a través de una rotura bicatenaria de ADN escalonada con un saliente 5' de 4 o 5 nucleótidos. Los sistemas de Tipo II se escinden mediante una rotura bicatenaria roma. Similar a los sistemas de Tipo II, Compf1 contiene un dominio endonucleasa similar a RuvC, pero carece de un segundo dominio endonucleasa HNH, lo que contrasta con los sistemas de Tipo II.
Genes/polipéptidos Cas y motivos adyacentes al protoespaciador
Los polipéptidos CRISPR/Cas de ejemplo incluyen los polipéptidos Cas9 de la Fig. 1 de Fonfaraet al., Nucleic Acids Research,42: 2577-2590 (2014). El sistema de nomenclatura de los genes de CRISPR/Cas se ha modificado en gran medida desde que se descubrieron los genes Cas. La Fig. 5 de Fonfara, citado anteriormente, proporciona secuencias de PAM para los polipéptidos Cas9 de diversas especies.
Polipéptidos dirigidos al sitio
Un polipéptido dirigido al sitio es una nucleasa utilizada en la edición genómica para escindir ADN. El polipéptido dirigido al sitio puede administrarse a una célula o a un paciente como: uno o más polipéptidos, o uno o más ARNm que codifican el polipéptido.
En el contexto de un sistema de CRISPR/Cas o CRISPR/Cpf1, el polipéptido dirigido al sitio puede unirse a un ARN guía que, a su vez, especifica el sitio del ADN diana al que se dirige el polipéptido. En los sistemas de CRISPR/Cas o CRISPR/Cpf1 divulgados en el presente documento, el polipéptido dirigido al sitio puede ser una endonucleasa, tal como una endonucleasa de ADN.
Un polipéptido dirigido al sitio puede comprender una pluralidad de dominios de escisión de ácido nucleico (es decir, nucleasa). Dos o más dominios de escisión de ácido nucleico pueden unirse mediante un enlazador. Por ejemplo, el enlazador puede comprender un enlazador flexible. Los enlazadores pueden comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40 o más aminoácidos de longitud.
Las enzimas Cas9 de tipo natural comprenden dos dominios nucleasa, un dominio nucleasa HNH y un dominio RuvC. En la presente memoria, el término "Cas9" se refiere tanto a las Cas9 naturales como a las recombinantes. Las enzimas Cas9 contempladas en la presente memoria pueden comprender un dominio nucleasa HNH o similar a HNH, y/o un dominio nucleasa RuvC o similar a RuvC.
Los dominios HNH o similares a HNH comprenden un pliegue similar al de McrA. Los dominios HNH o similares a HNH comprenden dos cadenas p antiparalelas y una hélice a. Los dominios HNH o similares a HNH comprenden un sitio de unión a metal (p. ej., un sitio de unión a cationes divalentes). Los dominios HNH o similares a HNH pueden escindir una cadena de un ácido nucleico diana (p. ej., la cadena complementaria de la cadena diana del ARNcr).
Los dominios RuvC o similares a RuvC comprenden un pliegue RNasaH o similar a RNasaH. Los dominios RuvC/RNasaH están implicados en un conjunto diverso de funciones basadas en ácidos nucleicos que incluyen la actuación tanto sobre el ARN como sobre el ADN. El dominio RNasaH comprende 5 cadenas p rodeadas por una pluralidad de hélices a. Los dominios RuvC/RNasaH o similares a RuvC/RNasaH comprenden un sitio de unión a metal (p. ej., un sitio de unión a cationes divalentes). Los dominios RuvC/RNasaH o similares a RuvC/RNasaH pueden escindir una cadena de un ácido nucleico diana (p. ej., la cadena no complementaria de un ADN diana bicatenario).
Los polipéptidos dirigidos al sitio pueden introducir roturas bicatenarias o roturas monocatenarias en ácidos nucleicos, p. ej., ADN genómico. La rotura bicatenaria puede estimular las vías endógenas de reparación del ADN de una célula (p. ej., la reparación dependiente de homología (HDR) o la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la unión de extremos no homólogos alternativa (A-NHEJ) o la unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ)). La NHEJ puede reparar el ácido nucleico diana escindido sin necesidad de un molde homólogo. En ocasiones, esto puede dar lugar a pequeñas deleciones o inserciones (indels) en el ácido nucleico diana en el lugar de la escisión, y puede provocar la interrupción o alteración de la expresión génica. La HDR puede producirse cuando un molde de reparación homólogo, o donante, está disponible. El molde donante homólogo puede comprender secuencias que son homólogas a las secuencias que flanquean el sitio de escisión del ácido nucleico diana. La cromátida hermana puede ser utilizada por la célula como molde de reparación. Sin embargo, para los fines de edición genómica, el molde de reparación puede suministrarse como un ácido nucleico exógeno, tal como un plásmido, dúplex de oligonucleótidos, oligonucleótido monocatenario o ácido nucleico vírico. Con moldes donantes exógenos, puede introducirse una secuencia de ácido nucleico adicional (tal como un transgén) o una modificación (tal como un cambio o una deleción de una única o múltiples bases) entre las regiones flanqueantes de homología, de manera que la secuencia de ácido nucleico adicional o alterada también se incorpore en el locus diana. La MMEJ puede dar lugar a un resultado genético similar a la NHEJ, en el sentido de que pueden producirse pequeñas deleciones e inserciones en el lugar de escisión. La MMEJ puede hacer uso de secuencias homólogas de unos pocos pares de bases que flanquean el sitio de escisión para impulsar un resultado de reparación de ADN de unión de extremos favorecido. En algunos casos, puede ser posible predecir los resultados probables de la reparación basándose en el análisis de microhomologías potenciales en las regiones diana de nucleasas.
Por lo tanto, en algunos casos, se usa recombinación homóloga para insertar una secuencia polinucleotídica exógena en el sitio de escisión del ácido nucleico diana. Una secuencia exógena de polinucleótidos se denomina en la presente memoria polinucleótido donante (o donante o secuencia donante). El polinucleótido donante, una porción del polinucleótido donante, una copia del polinucleótido donante, o una porción de una copia del polinucleótido donante puede insertarse en el sitio de escisión de ácido nucleico diana. El polinucleótido donante puede ser una secuencia polinucleotídica exógena, es decir, una secuencia que no se encuentra de forma natural en el sitio de escisión de ácido nucleico diana.
Las modificaciones del ADN diana debidas a NHEJ y/o HDR pueden conducir a, por ejemplo, mutaciones, deleciones, alteraciones, integraciones, corrección génica, reemplazo génico, marcaje génico, inserción transgénica, deleción de nucleótidos, disrupción génica, translocaciones y/o mutación génica. Los procesos de deleción de ADN genómico y de integración de ácido nucleico no nativo en ADN genómico son ejemplos de edición genómica.
El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un polipéptido dirigido al sitio de ejemplo de tipo silvestre [p. ej., Cas9 de S.pyogenes,SEQ ID NO 8 del documento US2014/0068797 o Sapranauskaset al., Nucleic Acids Res,39 (21): 9275-9282 (2011)], y diversos otros polipéptidos dirigidos al sitio).
El polipéptido dirigido al sitio comprende al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100 % de identidad con un polipéptido dirigido al sitio de tipo silvestre (p. ej., Cas9 de S.pyogenes,citado anteriormente) en 10 aminoácidos contiguos. El polipéptido dirigido al sitio puede comprender como máximo: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100 % de identidad con un polipéptido dirigido al sitio de tipo silvestre (p. ej., Cas9 de S.pyogenes,citado anteriormente) en 10 aminoácidos contiguos. El polipéptido dirigido al sitio puede comprender al menos: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100 % de identidad con un polipéptido dirigido al sitio de tipo silvestre (p. ej., Cas9 de S.pyogenes,citado anteriormente) en más de 10 aminoácidos contiguos en un dominio nucleasa HNH del polipéptido dirigido al sitio. El polipéptido dirigido al sitio puede comprender como máximo: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100 % de identidad con un polipéptido dirigido al sitio de tipo silvestre (p. ej., Cas9 de S.pyogenes,citado anteriormente) en más de 10 aminoácidos contiguos en un dominio nucleasa HNH del polipéptido dirigido al sitio. El polipéptido dirigido al sitio puede comprender al menos: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100 % de identidad con un polipéptido dirigido al sitio de tipo silvestre (p. ej., Cas9 de S.pyogenes,citado anteriormente) en más de 10 aminoácidos contiguos en un dominio nucleasa RuvC del polipéptido dirigido al sitio. El polipéptido dirigido al sitio comprende como máximo: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100 % de identidad con un polipéptido dirigido al sitio de tipo silvestre (p. ej., Cas9 de S.pyogenes,citado anteriormente) en más de 10 aminoácidos contiguos en un dominio nucleasa RuvC del polipéptido dirigido al sitio.
El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una forma modificada de un polipéptido dirigido al sitio de ejemplo de tipo silvestre. La forma modificada del polipéptido dirigido al sitio de ejemplo de tipo silvestre puede comprender una mutación que reduce la actividad de escisión de ácido nucleico del polipéptido dirigido al sitio. La forma modificada del polipéptido de tipo silvestre de ejemplo dirigido al sitio puede tener menos del 90 %, menos del 80 %, menos del 70 %, menos del 60 %, menos del 50 %, menos del 40 %, menos del 30 %, menos del 20 %, menos del 10 %, menos del 5 % o menos del 1 % de la actividad de escisión de ácido nucleico del polipéptido dirigido al sitio de ejemplo de tipo silvestre (p. ej., Cas9 de S.pyogenes,citado anteriormente). La forma modificada del polipéptido dirigido al sitio puede no tener una actividad sustancial de escisión de ácido nucleico. Cuando un polipéptido dirigido al sitio es una forma modificada que no tiene una actividad de escisión de ácido nucleico sustancial, se denomina en la presente memoria "enzimáticamente inactivo".
La forma modificada del polipéptido dirigido al sitio puede comprender una mutación de manera que pueda inducir una rotura monocatenaria (SSB) en un ácido nucleico diana (p. ej., cortando sólo una de las cadenas principales de azúcar-fosfato de un ácido nucleico diana bicatenario). La mutación puede dar como resultado menos del 90 %, menos del 80 %, menos del 70 %, menos del 60 %, menos del 50 %, menos del 40 %, menos del 30 %, menos del 20 %, menos del 10 %, menos del 5 % o menos del 1 % de la actividad de escisión de ácido nucleico en uno o más de la pluralidad de dominios de escisión de ácido nucleico del polipéptido dirigido al sitio de tipo silvestre (p. ej., Cas9 de S.pyogenes,citado anteriormente). La mutación puede dar como resultado que uno o más de la pluralidad de dominios de escisión de ácido nucleico conserven la capacidad de escindir la cadena complementaria del ácido nucleico diana, pero reduciendo su capacidad de escindir la cadena no complementaria del ácido nucleico diana. La mutación puede dar como resultado que uno o más de la pluralidad de dominios de escisión de ácido nucleico conserven la capacidad de escindir la cadena no complementaria del ácido nucleico diana, pero reduciendo su capacidad de escindir la cadena complementaria del ácido nucleico diana. Por ejemplo, se mutan restos en el polipéptido Cas9 de ejemplo de tipo silvestre de S.pyogenes,tales como Asp10, His840, Asn854 y Asn856, para inactivar uno o más de la pluralidad de dominios de escisión de ácido nucleico (p. ej., dominios nucleasa). Los restos que han de mutarse pueden corresponder a restos Asp10, His840, Asn854 y Asn856 en el polipéptido Cas9 de ejemplo de tipo silvestre de S.pyogenes(p. ej., según se determine por alineación de secuencia y/o estructural). Los ejemplos no limitantes de mutaciones incluyen D10A, H840A, N854A o N856A. Un experto en la técnica reconocerá que pueden ser adecuadas mutaciones distintas de las sustituciones de alanina.
Una mutación D10A puede combinarse con una o más de las mutaciones H840A, N854A o N856A para producir un polipéptido dirigido al sitio que carece sustancialmente de actividad de escisión de ADN. Una mutación H840A puede combinarse con una o más de las mutaciones D10A, N854A o N856A para producir un polipéptido dirigido al sitio que carece sustancialmente de actividad de escisión de ADN. Una mutación N854A puede combinarse con una o más de las mutaciones H840A, D10A o N856A para producir un polipéptido dirigido al sitio que carece sustancialmente de actividad de escisión de ADN. Una mutación N856A puede combinarse con una o más de las mutaciones H840A, N854A o D10A para producir un polipéptido dirigido al sitio que carece sustancialmente de actividad de escisión de ADN. Los polipéptidos dirigidos al sitio que comprenden un dominio nucleasa sustancialmente inactivo se denominan "nicasas".
Pueden usarse variantes de nicasa de endonucleasas guiadas por ARN, por ejemplo, Cas9, para aumentar la especificidad de la edición genómica mediada por CRISPR. La Cas9 de tipo silvestre normalmente está guiada por un ARN guía único diseñado para hibridarse con una secuencia específica de ~20 nucleótidos en la secuencia diana (tal como un locus genómico endógeno). Sin embargo, pueden tolerarse varios emparejamientos erróneos entre el ARN guía y el locus diana, reduciendo eficazmente la longitud de homología requerida en el sitio diana a, por ejemplo, tan sólo 13 nt de homología, dando como resultado de este modo un elevado potencial de unión y escisión de ácido nucleico bicatenario por parte del complejo CRISPR/Cas9 en otras partes del genoma diana, también conocida como escisión inespecífica. Debido a que las variantes de nicasa de Cas9 sólo cortan una cadena cada una, para crear una rotura bicatenaria es necesario que un par de nicasas se unan en estrecha proximidad y en cadenas opuestas del ácido nucleico diana, creando de este modo un par de mellas, lo que equivale a una rotura bicatenaria. Para ello es necesario que dos ARN guía distintos, uno para cada nicasa, se unan en estrecha proximidad y en cadenas opuestas del ácido nucleico diana. Este requisito duplica esencialmente la longitud mínima de homología necesaria para que se produzca la rotura bicatenaria, reduciendo de este modo la probabilidad de que se produzca un evento de escisión bicatenaria en otra parte del genoma, donde es poco probable que los dos sitios de ARN guía, si existen, estén lo suficientemente cerca el uno del otro como para permitir que se forme la rotura bicatenaria. Como se describe en la técnica, las nicasas también pueden usarse para promover la HDR frente a la NHEJ. La HDR puede usarse para introducir cambios seleccionados en sitios diana del genoma mediante el uso de secuencias donantes específicas que medien eficazmente los cambios deseados. Pueden encontrarse descripciones de diversos sistemas de CRISPR/Cas para su uso en edición génica, p. ej., en la publicación de solicitud internacional de patente número WO2013/176772, y enNature Biotechnology32, 347-355 (2014), y referencias citadas en los mismos.
Las mutaciones contempladas pueden incluir sustituciones, adiciones y deleciones, o cualquier combinación de las mismas. La mutación convierte el aminoácido mutado en alanina. La mutación convierte el aminoácido mutado en otro aminoácido (p. ej., glicina, serina, treonina, cisteína, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptófano, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina, histidina, lisina o arginina). La mutación convierte el aminoácido mutado en un aminoácido natural (p. ej., selenometionina). La mutación convierte el aminoácido mutado en miméticos de aminoácidos (p. ej., fosfomiméticos). La mutación puede ser conservadora. Por ejemplo, la mutación puede convertir el aminoácido mutado en aminoácidos que se parecen en tamaño, forma, carga, la polaridad, conformación y/o rotámeros de los aminoácidos mutados (p. ej., mutación cisteína/serina, mutación lisina/asparagina, mutación histidina/fenilalanina). La mutación puede provocar un desplazamiento del marco de lectura y/o la creación de un codón de parada prematuro. Las mutaciones pueden provocar cambios en regiones reguladoras de genes o locus que afectan a la expresión de uno o más genes.
El polipéptido dirigido al sitio (p. ej., polipéptido dirigido al sitio variante, mutado, enzimáticamente inactivo y/o condicionalmente enzimáticamente inactivo) puede dirigirse al ácido nucleico. El polipéptido dirigido al sitio (p. ej., endorribonucleasa variante, mutada, enzimáticamente inactiva y/o condicionalmente enzimáticamente inactiva) puede dirigirse al ADN. El polipéptido dirigido al sitio (p. ej., endorribonucleasa variante, mutada, enzimáticamente inactiva y/o condicionalmente enzimáticamente inactiva) puede dirigirse al ARN.
El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una o más secuencias no nativas (p. ej., el polipéptido dirigido al sitio es una proteína de fusión).
El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprenda al menos un 15 % de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (p. ej., S.pyogenes),un dominio de unión a ácido nucleico y dos dominios de escisión de ácido nucleico (es decir, un dominio HNH y un dominio RuvC).
El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprenda al menos un 15 % de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (p. ej., S.pyogenes),y dos dominios de escisión de ácido nucleico (es decir,un dominio HNH y un dominio RuvC).
El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprenda al menos un 15 % de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (p. ej., S.pyogenes),y dos dominios de escisión de ácido nucleico, en donde uno o ambos dominios de escisión de ácido nucleico comprenden al menos un 50 % de identidad de aminoácidos con un dominio nucleasa de Cas9 de una bacteria (p. ej., S.pyogenes).
El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprenda al menos un 15 % de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (p. ej., S.pyogenes),dos dominios de escisión de ácido nucleico (es decir, un dominio HNH y un dominio RuvC), y secuencia no nativa (por ejemplo, una señal de localización nuclear) o un enlazador que une el polipéptido dirigido al sitio a una secuencia no nativa.
El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprenda al menos un 15 % de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (p. ej., S.pyogenes),dos dominios de escisión de ácido nucleico (es decir,un dominio HNH y un dominio RuvC), en donde el polipéptido dirigido al sitio comprende una mutación en uno o ambos dominios de escisión de ácido nucleico que reduce la actividad de escisión de los dominios nucleasa en al menos un 50 %.
El polipéptido dirigido al sitio puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprenda al menos un 15 % de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (p. ej., S.pyogenes),y dos dominios de escisión de ácido nucleico (es decir,un dominio HNH y un dominio RuvC), en donde uno de los dominios nucleasa comprende una mutación del ácido aspártico 10, y/o en donde uno de los dominios nucleasa puede comprender una mutación de la histidina 840, y en donde la mutación reduce la actividad de escisión del dominio o dominios nucleasa en al menos un 50 %.
El uno o más polipéptidos dirigidos al sitio, p. ej., endonucleasas de ADN, puede comprender dos nicasas que conjuntamente efectúen una rotura bicatenaria en un locus específico en el genoma, o cuatro nicasas que conjuntamente efectúen o provoquen dos roturas bicatenarias en locus específicos en el genoma. Como alternativa, un polipéptido dirigido al sitio, p. ej., endonucleasa de ADN, puede producir o provocar una rotura bicatenaria en un locus específico en el genoma.
Ácido nucleico dirigido al genoma
La presente divulgación proporciona un ácido nucleico dirigido al genoma que puede dirigir las actividades de un polipéptido asociado (p. ej., un polipéptido dirigido al sitio) a una secuencia diana específica dentro de un ácido nucleico diana. El ácido nucleico dirigido al genoma puede ser un ARN. Un ARN dirigido al genoma se denomina en la presente memoria "ARN guía" o "ARNg". Un ARN guía puede comprender al menos una secuencia espaciadora que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana de interés, y una secuencia de repeticiones de CRISPR. En los sistemas de Tipo II, el ARNg también comprende un segundo ARN denominado secuencia de ARNtracr. En el ARN guía (ARNg) de Tipo II, la secuencia de repeticiones de CRISPR y la secuencia de ARNtracr se hibridan entre sí para formar un dúplex. En el ARN guía (ARNg) de Tipo V, el ARNcr forma un dúplex. En ambos sistemas, el dúplex puede unirse a un polipéptido dirigido al sitio, de manera que el ARN guía y el polipéptido dirigido al sitio formen un complejo. El ácido nucleico dirigido al genoma puede proporcionar especificidad de diana al complejo en virtud de su asociación con el polipéptido dirigido al sitio. Por lo tanto, el ácido nucleico dirigido al genoma puede dirigir la actividad del polipéptido dirigido al sitio.
Los ARN guía de ejemplo incluyen las secuencias espaciadoras del Listado de Secuencias, mostradas con la ubicación genómica de su secuencia diana, que está dentro o cerca del gen de la distrofina, y el sitio de corte de Cas9 asociado, en donde la ubicación genómica se basa en el ensamblaje del genoma humano GRCh38/hg38.
Cada ARN guía puede diseñarse para incluir una secuencia espaciadora complementaria a su secuencia genómica diana, que está dentro o cerca del gen de la distrofina. Por ejemplo, cada una de las secuencias espaciadoras en el Listado de Secuencias puede introducirse en un ARN guía monocatenario (ARNgu) (p. ej., una quimera de ARN) o en un ARNcr (junto con un ARNtracr correspondiente). Véase Jineket al., Science,337, 816-821 (2012) y Deltchevaet al., Nature,471,602-607 (2011).
El ácido nucleico dirigido al genoma puede ser un ARN guía de doble molécula. El ácido nucleico dirigido al genoma puede ser un ARN guía de molécula única.
Un ARN guía de doble molécula puede comprender dos cadenas de ARN. La primera cadena comprende, en la dirección 5' a 3', una secuencia opcional de extensión espaciadora, una secuencia espaciadora y una secuencia de repeticiones de CRISPR mínima. La segunda cadena puede comprender una secuencia de ARNtracr mínima (complementaria a la secuencia de repeticiones de CRISPR mínima), una secuencia de ARNtracr 3' y una secuencia opcional de extensión de ARNtracr.
Un ARN guía de molécula única (ARNgu) en un sistema de Tipo II puede comprender, en la dirección de 5' a 3', una secuencia opcional de extensión espaciadora, una secuencia espaciadora, una secuencia de repeticiones de CRISPR mínima, un enlazador guía de una sola molécula, una secuencia de ARNtracr mínima, una secuencia de ARNtracr 3' y una secuencia opcional de extensión de ARNtracr. La extensión de ARNtracr opcional puede comprender elementos que aporten funcionalidad adicional (p. ej., estabilidad) al ARN guía. El enlazador guía de una sola molécula puede enlazar la repetición de CRISPR mínima y la secuencia de ARNtracr mínima para formar una estructura de horquilla. La extensión de ARNtracr opcional puede comprender una o más horquillas.
Un ARN guía de molécula única (ARNgu) en un sistema de Tipo V puede comprender, en la dirección de 5' a 3', una secuencia de repeticiones de CRISPR mínima y una secuencia espaciadora.
A modo de ilustración, los ARN guía utilizados en el sistema de CRISPR/Cas/Cpf1, u otros ARN más pequeños, pueden sintetizarse fácilmente por medios químicos, como se ilustra a continuación y se describe en la técnica. Aunque los procedimientos sintéticos químicos están en continua expansión, la purificación de dichos ARN mediante procedimientos tales como la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, que evita el uso de geles tales como PAGE) tiende a volverse más difícil a medida que la longitud de los polinucleótidos aumenta significativamente más allá de un centenar de nucleótidos. Un enfoque utilizado para generar ARN de mayor longitud consiste en producir dos o más moléculas que se ligan entre sí. ARN mucho más largos, tales como aquellos que codifican una endonucleasa Cas9 de Cpf1, se generan más fácilmente por vía enzimática. Pueden introducirse diversos tipos de modificaciones de ARN durante o después de la síntesis química y/o la generación enzimática de ARN, p. ej., modificaciones que potencian la estabilidad, reducen la probabilidad o el grado de respuesta inmunitaria innata, y/o potencian otros atributos, como se describe en la técnica.
Secuencia de extensión espaciadora
En algunos ejemplos de ácidos nucleicos dirigidos al genoma, una secuencia de extensión espaciadora puede modificar la actividad, proporcionar estabilidad y/o proporcionar una ubicación para las modificaciones de un ácido nucleico dirigido al genoma. Una secuencia de extensión espaciadora puede modificar la actividad o especificidad dentro o fuera de la diana. En algunos ejemplos, puede proporcionarse una secuencia de extensión espaciadora. La secuencia de extensión espaciadora puede tener una longitud de más de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 o 7000 o más nucleótidos. La secuencia de extensión espaciadora puede tener una longitud de menos de 1,5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000 o más nucleótidos. La secuencia de extensión espaciadora puede tener menos de 10 nucleótidos de longitud. La secuencia de extensión espaciadora puede tener entre 10-30 nucleótidos de longitud. La secuencia de extensión espaciadora puede tener entre 30-70 nucleótidos de longitud.
La secuencia de extensión espaciadora puede comprender otro resto (p. ej., una secuencia de control de estabilidad, una secuencia de unión a endorribonucleasa, una ribozima). El resto puede disminuir o aumentar la estabilidad de un ácido nucleico diana. El resto puede ser un segmento terminador transcripcional (es decir, una secuencia de terminación de la transcripción). El resto puede actuar en una célula eucariota. El resto puede actuar en una célula procariota. El resto puede actuar tanto en células eucariotas como procariotas. Los ejemplos no limitantes de moléculas adecuadas incluyen: una caperuza 5' (p. ej., una caperuza de 7-metilguanilato (m7 G)), una secuencia de ribointerruptor (p. ej., para permitir la estabilidad regulada y/o la accesibilidad regulada por proteínas y complejos proteicos), una secuencia que forma un dúplex de ARNbc (es decir, una horquilla), una secuencia que dirige el ARN a una ubicación subcelular (p. ej., núcleo, mitocondrias, cloroplastos y similares), una modificación o secuencia que permita el rastreo (p. ej., conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con un resto que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.) y/o una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (p. ej., proteínas que actúan sobre el ADN, incluyendo los activadores transcripcionales, represores transcripcionales, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histonas desacetilasas y similares).
Secuencia espaciadora
La secuencia espaciadora se hibrida con una secuencia en un ácido nucleico diana de interés. El espaciador de un ácido nucleico dirigido al genoma puede interactuar con un ácido nucleico diana de una manera específica de secuencia mediante hibridación (es decir, emparejamiento de bases). La secuencia de nucleótidos del espaciador puede variar dependiendo de la secuencia del ácido nucleico diana de interés.
En la presente memoria, en un sistema de CRISPR/Cas, la secuencia espaciadora puede diseñarse para hibridarse con un ácido nucleico diana situado a 5' de un PAM de la enzima Cas9 utilizada en el sistema. El espaciador puede coincidir perfectamente con la secuencia diana o puede tener emparejamientos erróneos. Cada enzima Cas9 tiene una secuencia de PAM particular que reconoce en un ADN diana. Por ejemplo, S.pyogenesreconoce en un ácido nucleico diana un PAM que comprende la secuencia 5'-NRG-3', donde R comprende A o G, donde N es cualquier nucleótido y N está inmediatamente en 3' de la secuencia de ácido nucleico diana a la que se dirige la secuencia espaciadora.
La secuencia de ácido nucleico diana puede comprender 20 nucleótidos. El ácido nucleico diana puede comprender menos de 20 nucleótidos. El ácido nucleico diana puede comprender más de 20 nucleótidos. El ácido nucleico diana puede comprender al menos: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 o más nucleótidos. En algunos ejemplos, el ácido nucleico diana comprende como máximo: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30 o más nucleótidos. La secuencia de ácido nucleico diana puede comprender 20 bases inmediatamente en 5' del primer nucleótido del PAM. Por ejemplo, en una secuencia que comprende 5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-31 (SEQ ID NO: 1.410.473) el ácido nucleico diana puede comprender la secuencia que corresponde a Ns, donde N es cualquier nucleótido, y la secuencia NRG subrayada es el PAM deS. pyogenes.
La secuencia espaciadora que se hibrida con el ácido nucleico diana puede tener una longitud de al menos aproximadamente 6 nucleótidos (nt). La secuencia espaciadora puede tener al menos aproximadamente 6 nt, al menos aproximadamente 10 nt, al menos aproximadamente 15 nt, al menos aproximadamente 18 nt, al menos aproximadamente 19 nt, al menos aproximadamente 20 nt, al menos aproximadamente 25 nt, al menos aproximadamente 30 nt, al menos aproximadamente 35 nt o al menos aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 19 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 19 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 50 nt o de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 60 nt. En algunos ejemplos, la secuencia espaciadora puede comprender 20 nucleótidos. La secuencia espaciadora puede comprender 19 nucleótidos.
En algunos ejemplos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia espaciadora y el ácido nucleico diana es de al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o el 100 %. En algunos ejemplos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia espaciadora y el ácido nucleico diana es como máximo de aproximadamente el 30 %, como máximo aproximadamente el 40 %, como máximo aproximadamente el 50 %, como máximo aproximadamente el 60 %, como máximo aproximadamente el 65 %, como máximo aproximadamente el 70 %, como máximo aproximadamente el 75 %, como máximo aproximadamente el 80 %, como máximo aproximadamente el 85 %, como máximo aproximadamente el 90 %, como máximo aproximadamente el 95 %, como máximo aproximadamente el 97 %, como máximo aproximadamente el 98 %, como máximo aproximadamente el 99 % o el 100 %. En algunos ejemplos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia espaciadora y el ácido nucleico diana es del 100 % en los seis nucleótidos contiguos más en 5' de la secuencia diana de la cadena complementaria del ácido nucleico diana. El porcentaje de complementariedad entre la secuencia espaciadora y el ácido nucleico diana puede ser de al menos el 60 % sobre aproximadamente 20 nucleótidos contiguos. La longitud de la secuencia espaciadora y el ácido nucleico diana puede diferir entre 1 y 6 nucleótidos, lo que puede considerarse como una protuberancia o protuberancias.
La secuencia espaciadora puede diseñarse o elegirse usando un programa informático. El programa informático puede usar variables, tales como la temperatura de fusión predicha, la formación de la estructura secundaria, la temperatura de hibridación predicha, la identidad de secuencia, el contexto genómico, la accesibilidad de la cromatina, el % de GC, la frecuencia de aparición genómica (p. ej., de secuencias que son idénticas o son similares pero varían en uno o más puntos como resultado de un emparejamiento erróneo, inserción o deleción), el estado de metilación, la presencia de SNP y similares.
Secuencia de repeticiones de CRISPR mínima
Una secuencia de repeticiones de CRISPR mínima es una secuencia con al menos aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de repeticiones de CRISPR de referencia (p. ej., ARNcr de S.pyogenes).
Una secuencia de repeticiones de CRISPR mínima puede comprender nucleótidos que pueden hibridarse con una secuencia de ARNtracr mínima en una célula. La secuencia de repeticiones de CRISPR mínima y una secuencia de ARNtracr mínima pueden formar un dúplex, es decir, una estructura bicatenaria con bases apareadas. Juntas, la secuencia de repeticiones de CRISPR mínima y la secuencia de ARNtracr mínima pueden unirse al polipéptido dirigido al sitio. Al menos una parte de la secuencia de repeticiones de CRISPR mínima puede hibridarse con la secuencia de ARNtracr mínima. Al menos una parte de la secuencia de repeticiones de CRISPR mínima puede comprender al menos aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o un 100 % de complementariedad a la secuencia de ARNtracr mínima. Al menos una parte de la secuencia de repeticiones de CRISPR mínima puede comprender como máximo aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o un 100 % de complementariedad a la secuencia de ARNtracr mínima.
La secuencia de repeticiones de CRISPR mínima puede tener una longitud de aproximadamente 7 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. Por ejemplo, la longitud de la secuencia de repeticiones de CRISPR mínima es de aproximadamente 7 nucleótidos (nt) a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 100 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 30 nt o de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 25 nt. En algunos ejemplos, la secuencia de repeticiones de CRISPR mínima tiene aproximadamente 9 nucleótidos de longitud. La secuencia de repeticiones de CRISPR mínima puede tener aproximadamente 12 nucleótidos de longitud.
La secuencia de repeticiones de CRISPR mínima puede ser al menos aproximadamente un 60 % idéntica a una secuencia de repeticiones de CRISPR mínima de referencia (p. ej., ARNcr de tipo silvestre de S.pyogenes)en un tramo de al menos 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, la secuencia de repeticiones de CRISPR mínima es al menos aproximadamente un 65 % idéntica, al menos aproximadamente un 70 % idéntica, al menos aproximadamente un 75 % idéntica, al menos aproximadamente un 80 % idéntica, al menos aproximadamente un 85 % idéntica, al menos aproximadamente un 90 % idéntica, al menos aproximadamente un 95 % idéntica, al menos aproximadamente un 98 % idéntica, al menos aproximadamente un 99 % idéntica o un 100 % idéntica a una secuencia de repeticiones de CRISPR mínima de referencia en un tramo de al menos 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos.
Secuencia de ARNtracr mínima
Una secuencia de ARNtracr mínima puede ser una secuencia con al menos aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de ARNtracr de referencia (p. ej., ARNtracr de tipo silvestre de S.pyogenes).
Una secuencia de ARNtracr mínima puede comprender nucleótidos que se hibridan con una secuencia de repeticiones de CRISPR mínima en una célula. Una secuencia de ARNtracr mínima y una secuencia de repeticiones de CRISPR mínima forman un dúplex, es decir, una estructura bicatenaria con bases apareadas. Juntas, la secuencia de ARNtracr mínima y la repetición de CRISPR mínima se unen a un polipéptido dirigido al sitio. Al menos una parte de la secuencia de ARNtracr mínima puede hibridarse con la secuencia de repeticiones de CRISPR mínima. La secuencia de ARNtracr mínima puede ser de al menos aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o un 100 % complementaria a la secuencia de repeticiones de CRISPR mínima.
La secuencia de ARNtracr mínima puede tener una longitud de aproximadamente 7 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. Por ejemplo, la secuencia de ARNtracr mínima puede ser de aproximadamente 7 nucleótidos (nt) a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 100 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 30 nt o de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 25 nt de longitud. La secuencia de ARNtracr mínima puede tener aproximadamente 9 nucleótidos de longitud. La secuencia de ARNtracr mínima puede ser de aproximadamente 12 nucleótidos. El ARNtracr mínimo puede consistir en ARNtracr nt 23-48 descrito en Jineket al.,citado anteriormente.
La secuencia de ARNtracr mínima puede ser al menos aproximadamente un 60 % idéntica a una secuencia de ARNtracr mínima de referencia (p. ej., tipo silvestre, ARNtracr de S.pyogenes)en un tramo de al menos 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, la secuencia de ARNtracr mínima puede ser al menos aproximadamente un 65 % idéntica, aproximadamente un 70 % idéntica, aproximadamente un 75 % idéntica, aproximadamente un 80 % idéntica, aproximadamente un 85 % idéntica, aproximadamente un 90 % idéntica, aproximadamente un 95 % idéntica, aproximadamente un 98 % idéntica, aproximadamente un 99 % idéntica o un 100 % idéntica a una secuencia de ARNtracr mínima de referencia en un tramo de al menos 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos.
El dúplex entre el ARN de CRISPR mínimo y el ARNtracr mínimo puede comprender una doble hélice. El dúplex entre el ARN de CRISPR mínimo y el ARNtracr mínimo puede comprender al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos. El dúplex entre el ARN de CRISPR mínimo y el ARNtracr mínimo puede comprender como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos.
El dúplex puede contener un emparejamiento erróneo (es decir, las dos cadenas del dúplex no son 100 % complementarias). El dúplex puede comprender al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 o emparejamientos erróneos. El dúplex puede comprender como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 o emparejamientos erróneos. El dúplex puede contener no más de 2 emparejamientos erróneos.
Protuberancias
En algunos casos, puede haber una "protuberancia" en el dúplex entre el ARN de CRISPR mínimo y el ARNtracr mínimo. Una protuberancia es una región de nucleótidos no apareados dentro del dúplex. Una protuberancia puede contribuir a la unión del dúplex al polipéptido dirigido al sitio. La protuberancia puede comprender, en un lado del dúplex, un 5'-XXXY-3' no apareado donde X es cualquier purina e Y comprende un nucleótido que puede formar un par de bamboleo con un nucleótido de la cadena opuesta, y una región nucleotídica no apareada en el otro lado del dúplex. El número de nucleótidos no apareados en los dos lados del dúplex puede ser diferente.
En un ejemplo, la protuberancia puede comprender una purina no apareada (p. ej., adenina) en la cadena de repeticiones de CRISPR mínima de la protuberancia. En algunos ejemplos, la protuberancia puede comprender un 5'-AAGY-3' no apareado de la cadena de secuencia de ARNtracr mínima de la protuberancia, donde Y comprende un nucleótido que puede formar un apareamiento de bamboleo con un nucleótido en la cadena de repeticiones de CRISPR mínima.
Una protuberancia en el lado de repeticiones de CRISPR mínimas del dúplex puede comprender al menos 1, 2, 3, 4 o 5 o más nucleótidos no apareados. Una protuberancia en el lado de repeticiones de CRISPR mínimas del dúplex puede comprender como máximo 1,2, 3, 4 o 5 o más nucleótidos no apareados. Una protuberancia en el lado de repeticiones de CRISPR mínimas del dúplex puede comprender 1 nucleótido no apareado.
Una protuberancia en el lado de la secuencia de ARNtracr mínima del dúplex puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 o más nucleótidos no apareados. Una protuberancia en el lado de la secuencia de ARNtracr mínima del dúplex puede comprender como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 o más nucleótidos no apareados. Una protuberancia en un segundo lado del dúplex (p. ej., el lado de la secuencia de ARNtracr mínima del dúplex) puede comprender 4 nucleótidos no apareados.
Una protuberancia puede comprender al menos un apareamiento de bamboleo. En algunos ejemplos, una protuberancia comprende como máximo un apareamiento de bamboleo. En algunos ejemplos, una protuberancia puede comprender al menos un nucleótido de purina. Una protuberancia puede comprender al menos 3 nucleótidos de purina. Una secuencia de protuberancia puede comprender al menos 5 nucleótidos de purina. Una secuencia de protuberancia puede comprender al menos un nucleótido de guanina. Una secuencia de protuberancia puede comprender al menos un nucleótido de adenina.
Horquillas
En diversos ejemplos, una o más horquillas pueden estar ubicadas en 3' al ARNtracr mínimo en la secuencia de ARNtracr 3'.
La horquilla puede comenzar al menos aproximadamente a 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, o 20 o más nucleótidos en 3' del último nucleótido apareado en el dúplex de repeticiones de CRISPR mínimas y secuencia de ARNtracr mínima. La horquilla puede comenzar como máximo aproximadamente a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos en 3' del último nucleótido apareado en el dúplex de repeticiones de CRISPR mínimas y secuencia de ARNtracr mínima.
La horquilla puede incluir al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 o más nucleótidos consecutivos. La horquilla puede comprender como máximo aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o más nucleótidos consecutivos.
La horquilla puede comprender un dinucleótido CC (es decir, dos nucleótidos de citosina consecutivos).
La horquilla puede comprender nucleótidos duplexados (p. ej., nucleótidos en una horquilla, hibridados entre sí). Por ejemplo, una horquilla puede comprender un dinucleótido CC que se hibrida con un dinucleótido GG en un dúplex de horquilla de la secuencia de ARNtracr 3'.
Una o más de las horquillas pueden interactuar con las regiones que interactúan con el ARN guía de un polipéptido dirigido al sitio.
En algunos ejemplos, hay dos o más horquillas, y en otros ejemplos hay tres o más horquillas.
Secuencia de ARNtracr 3'
Una secuencia de ARNtracr 3' puede comprender una secuencia con al menos aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de ARNtracr de referencia (p. ej., un ARNtracr de S.pyogenes).
La secuencia de ARNtracr 3' puede tener una longitud de aproximadamente 6 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. Por ejemplo, la secuencia de ARNtracr 3' puede tener una longitud de aproximadamente 6 nucleótidos (nt) a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 100 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 30 nt o de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 25 nt. La secuencia de ARNtracr 3' puede tener una longitud de aproximadamente 14 nucleótidos.
La secuencia de ARNtratcr 3' puede ser al menos un 60 % idéntica a una secuencia de ARNtratcr 3' de referencia (p. ej., la secuencia de ARNtratcr 3' de tipo silvestre de S.pyogenes)en un tramo de al menos 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, la secuencia de ARNtracr 3' puede ser al menos aproximadamente un 60 % idéntica, aproximadamente un 65 % idéntica, aproximadamente un 70 % idéntica, aproximadamente un 75 % idéntica, aproximadamente un 80 % idéntica, aproximadamente un 85 % idéntica, aproximadamente un 90 % idéntica, aproximadamente un 95 % idéntica, aproximadamente un 98 % idéntica, aproximadamente un 99 % idéntica o un 100 % idéntica, a una secuencia de ARNtracr 3' de referencia (p. ej., la secuencia de ARNtracr 3' de tipo silvestre de S.pyogenes)en un tramo de al menos 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos.
La secuencia de ARNtracr 3' puede comprender más de una región duplexada (p. ej., horquilla, región hibridada). La secuencia de ARNtracr 3' puede comprender dos regiones dúplex.
La secuencia de ARNtracr 3' puede comprender una estructura de bucle de tallo. La estructura de bucle de tallo en el ARNtracr 3' puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 o más nucleótidos. La estructura de bucle de tallo en el ARNtracr 3' puede comprender como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos. La estructura de bucle de tallo puede comprender un resto funcional. Por ejemplo, la estructura de bucle de tallo puede comprender un aptámero, una ribozima, una horquilla de interacción con proteínas, una matriz de CRISPR, un intrón o un exón. La estructura de bucle de tallo puede comprender al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 o más restos funcionales. La estructura de bucle de tallo puede comprender como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 o más restos funcionales.
La horquilla en la secuencia de ARNtracr 3' puede comprender un dominio P. En algunos ejemplos, el dominio P puede comprender una región bicatenaria en la horquilla.
Secuencia de extensión de ARNtracr
Puede proporcionarse una secuencia de extensión de ARNtracr tanto si el ARNtracr está en el contexto de guías de molécula única como de guías de molécula doble. La secuencia de extensión de ARNtracr puede tener una longitud de aproximadamente 1 nucleótido a aproximadamente 400 nucleótidos. La secuencia de extensión de ARNtracr puede tener una longitud de más de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380 o 400 nucleótidos. La secuencia de extensión de ARNtracr puede tener una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 5000 nucleótidos o más. La secuencia de extensión de ARNtracr puede tener una longitud de más de 1000 nucleótidos. La secuencia de extensión de ARNtracr puede tener una longitud de menos de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400 o más nucleótidos. La secuencia de extensión de ARNtracr puede tener una longitud de menos de 1000 nucleótidos. La secuencia de extensión de ARNtracr puede comprender menos de 10 nucleótidos de longitud. La secuencia de extensión de ARNtracr puede tener entre 10-30 nucleótidos de longitud. La secuencia de extensión de ARNtracr puede tener entre 30-70 nucleótidos de longitud.
La secuencia de extensión de ARNtracr puede comprender un resto funcional (p. ej., una secuencia de control de estabilidad, ribozima, secuencia de unión a endorribonucleasa). El resto funcional puede comprender un segmento terminador de la transcripción (es decir, una secuencia de terminación de la transcripción). El resto funcional puede tener una longitud total de aproximadamente 10 nucleótidos (nt) a aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 30 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 40 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 50 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 60 nt a aproximadamente 70 nt, de aproximadamente 70 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 80 nt a aproximadamente 90 nt o de aproximadamente 90 nt a aproximadamente 100 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 30 nt o de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 25 nt. El resto funcional puede actuar en una célula eucariota. El resto funcional puede actuar en una célula procariota. El resto funcional puede actuar tanto en células eucariotas como procariotas.
Los ejemplos no limitantes de restos funcionales de extensión de ARNtracr adecuados incluyen una cola poliadenilada 3', una secuencia de ribointerruptor (p. ej., para permitir la estabilidad regulada y/o la accesibilidad regulada por proteínas y complejos proteicos), una secuencia que forma un dúplex de ARNbc (es decir, una horquilla), una secuencia que dirige el ARN a una ubicación subcelular (p. ej., núcleo, mitocondrias, cloroplastos y similares), una modificación o secuencia que permita el rastreo (p. ej., conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con un resto que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.) y/o una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (p. ej., proteínas que actúan sobre el ADN, incluyendo los activadores transcripcionales, represores transcripcionales, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histonas desacetilasas y similares). La secuencia de extensión de ARNtracr puede comprender un sitio de unión de cebador o un índice molecular (p. ej., una secuencia de código de barras). La secuencia de extensión de ARNtracr puede comprender uno o más marcadores de afinidad.
Secuencia enlazadora guía de molécula única
La secuencia enlazadora de un ácido nucleico guía de molécula única puede tener una longitud de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. En Jineket al.,citado anteriormente, por ejemplo, se usó un "tetrabucle" simple de 4 nucleótidos (-GAAA-),Science,337(6096):816-821 (2012). Un enlazador ilustrativo tiene una longitud de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 90 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 70 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 10 nt. Por ejemplo, el enlazador puede tener una longitud de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 5 nt, de aproximadamente 5 nt a aproximadamente 10 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 25 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 30 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 35 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 40 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 50 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 60 nt a aproximadamente 70 nt, de aproximadamente 70 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 80 nt a aproximadamente 90 nt o de aproximadamente 90 nt a aproximadamente 100 nt. El enlazador de un ácido nucleico guía de molécula única puede tener entre 4 y 40 nucleótidos. El enlazador puede tener al menos aproximadamente 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500 o 7000 nucleótidos o más. El enlazador puede tener como máximo aproximadamente 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500 o 7000 nucleótidos o más.
Los enlazadores pueden comprenden cualquiera de una diversidad de secuencias, aunque en algunos ejemplos el enlazador no comprenderá secuencias que tengan regiones extensas de homología con otras porciones del ARN guía, lo que podría provocar uniones intramoleculares que podrían interferir con otras regiones funcionales de la guía. En Jineket al.,citado anteriormente, se usó una secuencia simple de 4 nucleótidos -GAAA-,Science,337(6096):816-821 (2012), pero análogamente pueden usarse otras secuencias numerosas, incluyendo secuencias más largas.
La secuencia enlazadora puede incluir un resto funcional. Por ejemplo, la secuencia enlazadora puede una o más características, incluyendo un aptámero, una ribozima, una horquilla de interacción con proteínas, un sitio de unión de proteínas, una matriz de CRISPR, un intrón o un exón. La secuencia enlazadora puede comprender al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 o más restos funcionales. En algunos ejemplos, la secuencia enlazadora puede comprender como máximo aproximadamente 1,2, 3, 4 o 5 o más restos funcionales.
Estrategias de ingeniería genómica para corregir células por deleción (escisión), inserción o reemplazo (deleción e inserción) de uno o más exones o s itios aceptores o donantes de corte y empalme intrónicos aberrantes
Una etapa de los métodosex vivode la presente divulgación implica editar/corregir las células iPS específicas del paciente con DMD usando ingeniería genómica. Análogamente, una etapa de los métodosin vivode la presente divulgación implica editar/corregir las células musculares en un paciente con DMD usando ingeniería genómica. De manera similar, una etapa en los métodos celulares de la presente divulgación implica editar/corregir el gen de la distrofina en una célula humana por ingeniería genómica.
Los pacientes con DMD muestran una amplia gama de mutaciones en el gen de la distrofina. Por lo tanto, generalmente los distintos pacientes requerirán diferentes estrategias de corrección. En los métodos de la presente divulgación puede usarse cualquier endonucleasa de CRISPR, teniendo cada endonucleasa de CRISPR su propio PAM asociado, que puede ser o no específico de enfermedad. Por ejemplo, se han identificado secuencias espaciadoras de ARNg para el direccionamiento al gen de la distrofina con una endonucleasa CRISPR/Cas9 de S.pyogenesen las SEQ ID NO: 1 - 467.030 y 1.410.430 - 1.410.472 del Listado de Secuencias. Se han identificado secuencias espaciadoras de ARNg para el direccionamiento al gen de la distrofina con una endonucleasa CRISPR/Cas9 de S.aureusen las SEQ ID NO: 467.031 - 528.196 del Listado de Secuencias. Se han identificado secuencias espaciadoras de ARNg para el direccionamiento al gen de la distrofina con una endonucleasa CRISPR/Cas9 de S.thermophilusen las SEQ ID NO: 528.197 - 553.198 del Listado de Secuencias. Se han identificado secuencias espaciadoras de ARNg para el direccionamiento al gen de la distrofina con una endonucleasa CRISPR/Cas9 deT. denticolaen las S<e>Q ID NO: 553.199 - 563.911 del Listado de Secuencias. Se han identificado secuencias espaciadoras de ARNg para el direccionamiento al gen de la distrofina con una endonucleasa CRISPR/Cas9 deN. meningitidesen las SEQ ID NO: 563.912 -627.854 y 1.410.400 - 1.410.402 del Listado de Secuencias. Se han identificado secuencias espaciadoras de ARNg para el direccionamiento al gen de la distrofina con una endonucleasa CRISPR/Cpf1 deAcidominoccoccus, Lachnospiraceae y Franciscella Novicidaen las SEQ ID NO: 627.855 - 1.410.399 y 1.410.403 - 1.410.429 del Listado de secuencias.
Una estrategia de ingeniería genómica implica la deleción de exones. La deleción dirigida de exones específicos puede ser una estrategia atractiva para tratar a un gran subconjunto de pacientes con un único cóctel terapéutico. Se prevé que las deleciones de exón único pueden tratar hasta el 13 % de los pacientes, mientras que una deleción de múltiples exones puede tratar hasta el 62 % de los pacientes restableciendo el marco de lectura de la distrofina. Aunque las deleciones de múltiples exones pueden alcanzar a un mayor número de pacientes, para deleciones más grandes, la eficiencia de la deleción disminuye considerablemente al aumentar el tamaño. Por lo tanto, las deleciones preferidas pueden tener un tamaño de 400 a 350.000 pares de bases (pb). Por ejemplo, las deleciones pueden variar entre 400-1.000; 1.000-5.000; 5.000-10.000, 10.000 25.000; 25.000-50.000, 50.000-100.000; 100.000-200.000; o 200.000-350.000 pares de bases de tamaño.
Como se estableció anteriormente, el gen de la DMD contiene 79 exones. Uno cualquiera o más de los 79 exones, o sitios aceptores o donantes de corte y empalmes intrónicos aberrantes, pueden suprimirse para restablecer el marco de lectura de la distrofina. Los métodos proporcionan pares de ARNg que pueden usarse para suprimir los exones 2, 8, 43, 44, 45, 46, 50, 51, 52, 53, 70, 45-53 o 45-55, ya que éstas son las regiones que se predice que alcancen el mayor subconjunto de pacientes (véanse las Tablas 1 y 2; Los porcentajes proporcionados en la Tabla 2 son el promedio de los datos publicados).
Pueden repararse diferentes regiones del gen de la DMD mediante deleción y/o HDR. Pueden usarse determinadas combinaciones de ARNg que cortan dentro de la región genómica de interés para corregir mutaciones en el exón diana. Las coordenadas se basan en el ensamblaje genómico GRch38/hg38 (Tabla 1).
Tabla 1
Tabla 2
Los métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 2 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 2 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 2.
Los métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 8 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 8 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 8.
Los métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 43 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 43 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 43.
Los métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 44 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 44 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 44.
Los métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 45 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 45 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 45.
Los métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 46 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 46 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 46.
Los métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 50 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 50 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 50.
Los métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 51 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 51 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 51.
Los métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 52 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 52 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 52.
Los métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 53 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 53 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 53.
Los métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 70 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 70 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 70.
Los métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen los exones 45-53 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 45 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 53.
Los métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen los exones 45-55 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 45 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 55.
Otra estrategia de ingeniería genómica implica la inserción o el reemplazo de uno o más exones o de sitios aceptores o donantes de corte y empalme intrónicos aberrantes por reparación dirigida por homología (HDR), que también se conoce como recombinación homóloga (HR). La reparación dirigida por homología es una estrategia para tratar a los pacientes que tienen codones de parada prematuros debido a pequeñas inserciones/deleciones o mutaciones puntuales. En lugar de hacer una gran deleción genómica que convertirá un fenotipo de DMD en un fenotipo de DMB, esta estrategia restablecerá todo el marco de lectura y revertirá por completo la patología. Esta estrategia requerirá un enfoque más personalizado basado en la ubicación de la parada prematura del paciente. La mayoría de los exones de la distrofina son pequeños (< 300pb). Esto es ventajoso, ya que las eficiencias de HDR están inversamente relacionadas con el tamaño de la molécula donante. Además, se espera que los moldes donantes puedan encajar en moléculas de virus adenoasociado (AAV) de tamaño limitado, que han demostrado ser un medio eficaz para el suministro de moldes donantes.
La reparación directa por homología es un mecanismo celular de reparación de roturas bicatenaria (DSB). La forma más común es la recombinación homóloga. Existen vías adicionales para HDR, incluyendo hibridación monocatenaria y HDR alternativa. Las herramientas de ingeniería genómica permiten a los investigadores manipular las vías de recombinación homóloga celular para crear modificaciones específicas del genoma. Se ha descubierto que las células pueden reparar una rotura bicatenaria usando una molécula donante sintética proporcionada en trans. Por lo tanto, introduciendo una rotura bicatenaria cerca de una mutación específica y proporcionando un donante adecuado, pueden realizarse cambios dirigidos en el genoma. La escisión específica aumenta la tasa de HDR más de 1.000 veces por encima de la tasa de 1 de cada 106 células que reciben un donante homólogo solo. La tasa de reparación dirigida por homología (HDR) en un nucleótido particular es una función de la distancia al sitio de corte, por lo que es importante elegir los sitios diana solapados o más cercanos. La edición génica ofrece la ventaja sobre la adición de genes, ya que la correcciónin situno afecta al resto del genoma.
Los donantes suministrados para la edición mediante HDR varían notablemente, pero pueden contener la secuencia prevista con brazos de homología flanqueantes pequeños o grandes para permitir la hibridación con el ADN genómico. Las regiones de homología que flanquean los cambios genéticos introducidos pueden ser de 30 pb o menos, o tan grandes como un casete de varias kilobases que puede contener promotores, ADNc, etc. Se han utilizado donantes de oligonucleótidos tanto monocatenarios como bicatenarios. El tamaño de estos oligonucleótidos puede variar de menos de 100 nt a más de 200 nt, aunque también puede generarse y usarse ADNmc más largo. Pueden usarse donantes bicatenariarios, incluyendo amplicones, plásmidos y minicírculos de PCR. En general, se ha descubierto que un vector AAV puede ser un medio muy eficaz para suministrar un molde donante, aunque los límites de empaquetamiento para donantes individuales es < 5 kb. La transcripción activa del donante multiplicó por tres la HDR, lo que indica que la inclusión del promotor puede aumentar la conversión. Por el contrario, la metilación de CpG del donante disminuyó la expresión génica y la HDR.
Además de las endonucleasas de tipo silvestre, tales como Cas9, existen variantes de nicasas que pueden tener uno u otro dominio nucleasa inactivado, dando como resultado el corte de una sola cadena de ADN. La HDR puede dirigirse a partir de nicasas Cas individuales o usando pares de nicasas que flanqueen la zona diana. Los donantes pueden ser monocatenarios, mellados o ADNbc.
El ADN donante puede suministrarse con la nucleasa o independientemente mediante una diversidad de métodos diferentes, por ejemplo mediante transfección, nanopartículas, microinyección o transducción vírica. Se ha propuesto una serie de opciones de unión para aumentar la disponibilidad de los donantes para HDR. Los ejemplos incluyen fijar el donante a la nucleasa, fijándose a proteínas de unión de ADN que se unen en las proximidades o fijándose a proteínas que están implicadas en la unión o reparación de los extremos de ADN.
La elección de la vía de reparación puede guiarse por una serie de condiciones de cultivo, tales como aquellas que influyen en el ciclo celular, o mediante el direccionamiento de la reparación de ADN y las proteínas asociadas. Por ejemplo, para aumentar la HDR, pueden suprimirse moléculas clave de NHEJ, tales como KU70, KU80 o ADN ligasa IV.
Sin un donante presente, los extremos de una rotura de ADN o los extremos de diferentes roturas pueden unirse usando las diversas vías de reparación no homóloga en las que los extremos de ADN se unen con poco o ningún apareamiento de bases en la unión. Además de la NHEJ canónica, existen mecanismos de reparación similares, tales como alt-NHEJ. Si hay dos roturas, el segmento intermedio puede suprimirse o invertirse. Las vías de reparación de NHEJ pueden conducir a inserciones, deleciones o mutaciones en las articulaciones.
Se usó NHEJ para insertar un casete de expresión génica inducible de 15 kb en un locus definido en estirpes celulares humanas después de la escisión por nucleasas. Maresca, M., Lin, V.G., Guo, N. y Yang, Y.Oblígate ligation-gated recombínatíon (ObLiGaRe): custom-desígned nuclease-medíated targeted íntegratíon through nonhomologous endjoining. Genome Res23, 539-546 (2013).
Además de la edición genómica por NHEJ o HDR, se han realizado inserciones génicas en sitios específicos que usan tanto la vía de NHEJ como HR. Un enfoque de combinación puede ser aplicable en determinados contextos, posiblemente incluyendo los bordes de intrón/exón. La NHEJ puede resultar eficaz para la ligadura en el intrón, mientras que la HDR sin errores puede ser más adecuada en la región codificante.
Como se estableció anteriormente, el gen de la DMD contiene 79 exones. Cualquiera o más de los 79 exones pueden repararse con el fin de corregir una mutación y restablecer el marco de lectura de la distrofina. Algunos métodos proporcionan un ARNg o un par de ARNg que pueden usarse para facilitar la incorporación de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para insertar o reemplazar una secuencia en el exón 70, ya que los datos muestran que el exón 70 puede ser propenso a la mayoría de los codones de parada prematuros en el gen de la distrofina (Tuffery-Giraud, S.,et al., Hum Mutat,2009. 30 (6): págs. 934-45) (Flanigan, K.M.,et al., Hum Mutat,2009. 30 (12): págs. 1657-66). Para que el método sea aplicable al mayor número de pacientes, el método implica un molde donante que puede insertar o reemplazar todo el exón 70. Como alternativa, los métodos proporcionan un ARNg o un par de ARNg que pueden usarse para facilitar la incorporación de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para insertar o reemplazar una secuencia en el exón 2, exón 8, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53 o exón 70. Véase la Tabla 1.
con el fin de garantizar que el pre-ARNm se procesa adecuadamente después de la HDR, es importante mantener intactas las señales de corte y empalme circundantes. Los donantes y aceptores de corte y empalme pueden estar generalmente a menos de 100 pares de bases del intrón vecino. Por lo tanto, en algunos ejemplos, los métodos pueden proporcionar todos los ARNg que cortan aproximadamente /- 0-3100 pb con respecto a las uniones intrónicas del exón.
Algunos métodos proporcionan pares de ARNg que realizan una deleción cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 2 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 2 lo que facilita la incorporación de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 2.
Como alternativa, algunos métodos proporcionan un ARNg del párrafo anterior para realizar un corte bicatenario que facilita la inserción de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 2.
Algunos ejemplos de los métodos proporcionan pares de ARNg que realizan una deleción cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 8 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 8 lo que facilita la incorporación de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 8.
Como alternativa, algunos métodos proporcionan un ARNg del párrafo anterior para realizar un corte bicatenario que facilita la inserción de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 8.
Algunos métodos proporcionan pares de ARNg que realizan una deleción cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 43 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 43 lo que facilita la incorporación de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 43.
Como alternativa, algunos métodos proporcionan un ARNg del párrafo anterior para realizar un corte bicatenario que facilita la inserción de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 43.
Algunos métodos proporcionan pares de ARNg que realizan una deleción cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 44 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 44 lo que facilita la incorporación de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 44.
Como alternativa, algunos métodos proporcionan un ARNg del párrafo anterior para realizar un corte bicatenario que facilita la inserción de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 44.
Algunos métodos proporcionan pares de ARNg que realizan una deleción cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 45 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 45 lo que facilita la incorporación de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 45.
Como alternativa, algunos métodos proporcionan un ARNg del párrafo anterior para realizar un corte bicatenario que facilita la inserción de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 45.
Algunos métodos proporcionan pares de ARNg que realizan una deleción cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 46 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 46 lo que facilita la incorporación de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 46.
Como alternativa, algunos métodos proporcionan un ARNg del párrafo anterior para realizar un corte bicatenario que facilita la inserción de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 46.
Algunos métodos proporcionan pares de ARNg que realizan una deleción cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 50 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 50 lo que facilita la incorporación de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 50.
Como alternativa, algunos métodos proporcionan un ARNg del párrafo anterior para realizar un corte bicatenario que facilita la inserción de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 50.
Algunos métodos proporcionan pares de ARNg que realizan una deleción cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 51 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 51 lo que facilita la incorporación de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 51.
Como alternativa, algunos métodos proporcionan un ARNg del párrafo anterior para realizar un corte bicatenario que facilita la inserción de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 51.
Algunos métodos proporcionan pares de ARNg que realizan una deleción cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 52 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 52 lo que facilita la incorporación de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 52.
Como alternativa, algunos métodos proporcionan un ARNg del párrafo anterior para realizar un corte bicatenario que facilita la inserción de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 52.
Algunos métodos proporcionan pares de ARNg que realizan una deleción cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 53 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 53 lo que facilita la incorporación de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 53.
Como alternativa, algunos métodos proporcionan un ARNg del párrafo anterior para realizar un corte bicatenario que facilita la inserción de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 53.
Algunos métodos proporcionan pares de ARNg que realizan una deleción cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 70 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 70 lo que facilita la incorporación de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 70.
Como alternativa, algunos métodos proporcionan un ARNg del párrafo anterior para realizar un corte bicatenario que facilita la inserción de una nueva secuencia a partir de un molde donante de polinucleótidos para reemplazar una secuencia en el exón 70.
Además de los reemplazos de exón único mediante reparación dirigida por homología, también se describen métodos para realizar una inserción parcial de ADNc de puntos críticos mutacionales encontrados en el gen de la DMD. Por ejemplo, un tratamiento que repara los exones 45-55 puede tratar hasta el 62 % de los pacientes. En lugar de suprimir o sustituir los exones 45-55 como se describe en la presente memoria, otra opción de tratamiento reemplaza toda la región genómica de los exones 45-55, que, incluyendo los intrones, abarca > 350.000 pb, con un ADNc que contiene sólo la región codificante de los exones 45-55, que abarca aproximadamente 1800 pb. El reemplazo podría efectuarse usando un enfoque de reparación dirigido por homología. Excluyendo las regiones intergénicas, el ADNc para los exones 45-55 puede acomodarse más fácilmente (que toda la región genómica) junto con los brazos de homología en cualquier vector donante descrito en la sección de esta solicitud titulada Componentes del sistema codificante de ácidos nucleicos. En este enfoque, pueden suministrarse dos ARNg y Cas9 o Cpf1 que eliminan la región genómica del exón 45-55 junto con una construcción donante para reemplazar la región suprimida por la inserción de ADNc deseada.
El enfoque de inserción de ADNc puede usarse para reemplazar cualquier serie de exones.
La secuencia de inserción de ADNc puede optimizarse para que contenga secuencias intrónicas sintéticas. Pueden añadirse intrones sintéticos más pequeños que los intrones de origen natural entre los exones en la construcción donante para garantizar la expresión y el procesamiento adecuados del locus de DMD.
Las modificaciones ilustrativas dentro del gen de la distrofina incluyen deleciones, inserciones o reemplazos dentro o próximas a los locus de la distrofina referidos anteriormente, tal como dentro de la región de menos de 3 kb, menos de 2 kb, menos de 1 kb, menos de 0,5 kb en dirección 5' o en dirección 3' del exón específico. Dadas las variaciones relativamente amplias de mutaciones en el gen de la distrofina, se apreciará que numerosas variaciones de las deleciones, inserciones o reemplazos mencionados anteriormente (incluyendo, sin limitación, deleciones mayores o menores), se esperaría que diera como resultado el restablecimiento del marco de lectura de la distrofina y el restablecimiento de la actividad de la proteína distrofina.
Dichas variantes pueden incluir deleciones, inserciones o reemplazos que sean más grandes en dirección 5' y/o 3' que el exón específico en cuestión, o más pequeños en cualquier dirección. Por consiguiente, por "cercano" o "proximal" con respecto a deleciones, inserciones o reemplazos específicos de exones, se pretende que el locus de SSB o DSB asociado a un límite deseado de deleción, inserción o reemplazo (también denominado en la presente memoria criterio de valoración) pueda estar dentro de una región que esté a menos de aproximadamente 3 kb del locus de referencia señalado. El locus de SSB o DSB puede ser más proximal y encontrarse a menos de 2 kb, a menos de 1 kb, a menos de 0,5 k o a menos de 0,1 kb. En el caso de deleciones pequeñas, el criterio de valoración deseado puede estar en el locus de referencia o "adyacente" al mismo, por el que se pretende que el criterio de valoración pueda estar a menos de 100 pb, a menos de 50 pb, a menos de 25 pb o a menos de aproximadamente 10 pb a 5 pb del locus de referencia.
Una ventaja para los pacientes con DMD de replicar o imitar el producto producido por la omisión de exones y/o restablecer el marco de lectura es que ya se sabe que es seguro y se asocia a la mejora de la DMD. Puede esperarse que otros ejemplos que comprendan deleciones/inserciones/reemplazos más grandes o más pequeños proporcionen el mismo beneficio, siempre que el marco de lectura de la distrofina se restablezca. Por lo tanto, cabe esperar que muchas variaciones de las deleciones, inserciones y reemplazos descritos e ilustrados en la presente memoria puedan ser eficaces para mejorar la DMD.
Selección de secuencias diana
Los desplazamientos en la ubicación del límite 5' y/o del límite 3' con respecto a locus de referencia particulares pueden usarse para facilitar o potenciar aplicaciones particulares de edición génica, que dependen en parte del sistema de endonucleasas seleccionado para la edición, como se describe e ilustra adicionalmente en la presente memoria.
En un primer ejemplo no limitante de dicha selección de secuencia diana, muchos sistemas de endonucleasas tienen reglas o criterios que pueden guiar la selección inicial de posibles sitios diana para la escisión, tales como el requisito de un motivo de secuencia PAM en una posición particular adyacente a los sitios de escisión de ADN en el caso de las endonucleasas de Tipo II o de Tipo V de CRISPR.
En otro ejemplo no limitante de selección u optimización de secuencias diana, la frecuencia de actividad "inespecífica" para una combinación particular de secuencia diana y endonucleasa de edición génica (es decir, la frecuencia de DSB que se producen en sitios distintos de la secuencia diana seleccionada) puede evaluarse con respecto a la frecuencia de actividad en la diana. En algunos casos, las células que se han editado correctamente en el locus deseado pueden tener una ventaja selectiva con respecto a otras células. Los ejemplos ilustrativos, pero no limitantes, de una ventaja selectiva incluyen la adquisición de atributos tales como tasas potenciadas de replicación, persistencia, resistencia a determinadas condiciones, tasas potenciadas de éxito en el injerto o persistenciain vivodespués de la introducción en un paciente, y otros atributos asociados al mantenimiento o aumento del número o viabilidad de dichas células. En otros casos, las células que se han editado correctamente en el locus deseado pueden seleccionarse positivamente mediante uno o más métodos de cribado utilizados para identificar, clasificar o seleccionar de otro modo células que se han editado correctamente. Tanto los métodos de ventaja selectiva como los de selección dirigida pueden aprovechar el fenotipo asociado a la corrección. En algunos casos, las células pueden editarse dos o más veces con el fin de crear una segunda modificación que cree un nuevo fenotipo que se use para seleccionar o purificar la población prevista de células. Esta segunda modificación podría crearse añadiendo un segundo ARNg para un marcador seleccionable o cribable. En algunos casos, las células pueden editarse correctamente en el locus deseado usando un fragmento de ADN que contenga el ADNc y también un marcador seleccionable.
Si es aplicable alguna ventaja selectiva o ha de aplicarse alguna selección dirigida en un caso particular, la selección de secuencia diana también puede guiarse por la consideración de frecuencias fuera de la diana con el fin de potenciar la eficacia de la aplicación y/o reducir el potencial de alteraciones no deseadas en sitios distintos de la diana deseada. Como se describe adicionalmente y se ilustra en la presente memoria y en la técnica, la aparición de actividad fuera de diana puede verse influida por una serie de factores, incluyendo las similitudes y disimilitudes entre el sitio diana y diversos sitios fuera de diana, así como la endonucleasa particular utilizada. Hay herramientas bioinformáticas disponibles que ayudan a la predicción de la actividad fuera de la diana y, con frecuencia, dichas herramientas también pueden usarse para identificar los sitios más probables de actividad fuera de la diana, que después pueden evaluarse en entornos experimentales para valorar las frecuencias relativas de la actividad fuera de la diana y en la diana, permitiendo de este modo la selección de secuencias que tengan mayores actividades relativas en la diana. En la presente memoria se proporcionan ejemplos ilustrativos de dichas técnicas, y otras se conocen en la técnica.
Otro aspecto de la selección de secuencias diana está relacionado con eventos de recombinación homóloga. Las secuencias que comparten regiones de homología pueden servir como puntos focales para eventos de recombinación homóloga que dan como resultado la deleción de secuencias intermedias. Dichos eventos de recombinación se producen durante el curso normal de replicación de cromosomas y otras secuencias de ADN, y también en otros momentos en los que se están sintetizando secuencias de a Dn , tal como en el caso de reparaciones de roturas bicatenarias (DSB), que se producen de forma regular durante el ciclo normal de replicación celular, pero que también pueden verse potenciadas por la aparición de diversos eventos (tales como la luz UV y otros inductores de la rotura de ADN) o la presencia de determinados agentes (tales como diversos inductores químicos). Muchos de estos inductores provocan DSB de forma indiscriminada en el genoma, y pueden inducirse y repararse DSB regularmente en células normales. Durante la reparación, la secuencia original puede reconstruirse con total fidelidad, sin embargo, en algunos casos, se introducen pequeñas inserciones o deleciones (denominadas "indels") en el sitio de DSB.
Las DSB también pueden inducirse específicamente en ubicaciones particulares, como en el caso de los sistemas de endonucleasas descritos en la presente memoria, que pueden usarse para provocar eventos de modificación génica dirigidos o preferidos en ubicaciones cromosómicas seleccionadas. La tendencia de las secuencias homólogas a ser objeto de recombinación en el contexto de la reparación del ADN (así como de la replicación) puede aprovecharse en diversas circunstancias, y es la base de una de las aplicaciones de los sistemas de edición génica, tales como CRISPR, en los que se usa reparación dirigida por homología para insertar una secuencia de interés, proporcionada por el uso de un polinucleótido "donante", en una ubicación cromosómica deseada.
También pueden usarse regiones de homología entre secuencias particulares, que pueden ser regiones pequeñas de "microhomología" que pueden comprender tan sólo diez pares de bases o menos, para provocar las deleciones deseadas. Por ejemplo, puede introducirse una única DSB en un sitio que presente microhomología con una secuencia cercana. Durante el curso normal de reparación de dicha DSB, un resultado que se produce con alta frecuencia es la deleción de la secuencia intermedia como resultado de la recombinación facilitada por la DSB y el proceso de reparación celular simultáneo.
En algunas circunstancias, sin embargo, la selección de secuencias diana dentro de regiones de homología también puede dar lugar a deleciones mucho más grandes, incluyendo fusiones de genes (cuando las deleciones están en regiones codificantes), lo que puede o no ser deseable dadas las circunstancias particulares.
Los ejemplos proporcionados en la presente memoria ilustran además la selección de diversas regiones diana para la creación de DSB diseñadas para inducir alteraciones, deleciones o reemplazos que dan como resultado el restablecimiento del marco de lectura de la distrofina, así como la selección de secuencias diana específicas dentro de dichas regiones que se diseñan para minimizar los eventos fuera de diana con respecto a los eventos en la diana.
Modificaciones de ácidos nucleicos
En algunos casos, los polinucleótidos introducidos en las células pueden incluir una o más modificaciones que pueden usarse, individualmente o en combinación, por ejemplo, para potenciar la actividad, estabilidad o especificidad, alterar el suministro, reducir las respuestas inmunitarias innatas en las células hospedadoras, o para otras potenciaciones, como se describe adicionalmente en la presente memoria y se conoce en la técnica.
En determinados ejemplos, los polinucleótidos modificados pueden usarse en el sistema de CRISPR/Cas9/Cpf1, en cuyo caso pueden modificarse los ARN guía (ya sean guías de molécula única o guías de molécula doble) y/o un ADN o un ARN que codifiquen una endonucleasa Cas o Cpf1 introducida en una célula, como se describe y se ilustra a continuación. Dichos polinucleótidos modificados pueden usarse en el sistema de CRISPR/Cas9/Cpf1 para editar uno o más locus genómicos.
Usando el sistema de CRISPR/Cas9/Cpf1 con fines ilustrativos no limitantes de dichos usos, pueden usarse modificaciones de ARN guía para potenciar la formación o la estabilidad del complejo de edición genómica de CRISPR/Cas9/Cpf1 que comprende ARN guía, que pueden ser guías de molécula única o de molécula doble, y una endonucleasa Cas o Cpf1. Las modificaciones de los ARN guía también pueden usarse, o como alternativa, para potenciar el inicio, la estabilidad o la cinética de las interacciones entre el complejo de edición genómica con la secuencia diana en el genoma, que pueden usarse, por ejemplo, para potenciar la actividad en la diana. Las modificaciones de los ARN guía también pueden usarse, o como alternativa, para potenciar la especificidad, p. ej., las tasas relativas de edición genómica en el sitio en la diana en comparación con los efectos en otros lugares (fuera de la diana).
Las modificaciones también pueden usarse, o como alternativa, para aumentar la estabilidad de un ARN guía, p. ej., aumentar su resistencia a la degradación por ribonucleasas (RNasas) presentes en una célula, aumentando de este modo su semivida en la célula. Las modificaciones que potencian la semivida del ARN guía pueden ser especialmente útiles en aspectos en los que se introduce una endonucleasa Cas o Cpf1 en la célula que ha de editarse a través de un ARN que necesita ser traducido con el fin de generar la endonucleasa, porque el aumento de la semivida de los ARN guía introducidos al mismo tiempo que el ARN que codifica la endonucleasa puede usarse para aumentar el tiempo durante el cual los ARN guía y la endonucleasa Cas o Cpf1 codificada coexisten en la célula.
Las modificaciones también pueden usarse, o como alternativa, para disminuir la probabilidad o el grado en que los ARN introducidos en las células desencadenan respuestas inmunitarias innatas. Dichas respuestas, que se han caracterizado bien en el contexto del ARN de interferencia (ARNi), incluyendo los ARN de interferencia pequeños (ARNip), como se describe a continuación y en la técnica, tienden a asociarse a una semivida reducida del ARN y/o a la provocación de citocinas u otros factores asociados a respuestas inmunitarias.
También pueden realizarse uno o más tipos de modificaciones en los ARN que codifican una endonucleasa y que se introducen en una célula, incluyendo, sin limitación, modificaciones que potencian la estabilidad del ARN (por ejemplo, aumentando su degradación por las ARNasas presentes en la célula), modificaciones que potencian la traducción del producto resultante (es decir, la endonucleasa) y/o modificaciones que disminuyen la probabilidad o el grado en que los ARN introducidos en las células provocan respuestas inmunitarias innatas.
Análogamente pueden usarse combinaciones de modificaciones, tales como las anteriores y otras. En el caso de CRISPR/Cas9/Cpf1, por ejemplo, pueden realizarse uno o más tipos de modificaciones en los ARN guía (incluyendo los ejemplificados anteriormente) y/o pueden realizarse uno o más tipos de modificaciones en los ARN que codifican la endonucleasa Cas (incluyendo los ejemplificados anteriormente).
A modo de ilustración, los ARN guía utilizados en el sistema de CRISPR/Cas9/Cpf1, u otros ARN más pequeños, pueden sintetizarse fácilmente por medios químicos, lo que permite incorporar fácilmente una serie de modificaciones, como se ilustra a continuación y se describe en la técnica. Aunque los procedimientos sintéticos químicos están en continua expansión, la purificación de dichos ARN mediante procedimientos tales como la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, que evita el uso de geles tales como PAGE) tiende a volverse más difícil a medida que la longitud de los polinucleótidos aumenta significativamente más allá de un centenar de nucleótidos. Un enfoque que puede usarse para generar ARN modificados químicamente de mayor longitud consiste en producir dos o más moléculas que se ligan entre sí. ARN mucho más largos, tales como aquellos que codifican una endonucleasa Cas9, se generan más fácilmente por vía enzimática. Mientras que hay disponibles menos tipos de modificaciones para su uso en ARN producidos enzimáticamente, todavía hay modificaciones que pueden usarse para, p. ej., potenciar la estabilidad, reducir la probabilidad o el grado de respuesta inmunitaria innata, y/o potenciar otros atributos, como se describe adicionalmente a continuación y en la técnica; y regularmente se desarrollan nuevos tipos de modificaciones.
A modo de ilustración de diversos tipos de modificaciones, especialmente aquellas utilizadas frecuentemente con ARN más pequeños sintetizados químicamente, las modificaciones pueden comprender uno o más nucleótidos modificados en la posición 2' del azúcar, en algunos aspectos un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, 2'-O-alquil-O-alquilo o 2'-fluoro. En algunos aspectos, las modificaciones del ARN pueden comprender modificaciones con 2'-fluoro, 2'-amino o 2' O-metilo en la ribosa de las pirimidinas, restos abásicos o una base invertida en el extremo 3' del ARN. Dichas modificaciones pueden incorporarse rutinariamente en los oligonucleótidos y se ha demostrado que estos oligonucleótidos tienen una Tm más alta (es decir, mayor afinidad de unión a la diana) que los 2'-desoxioligonucleótidos contra una diana dada.
Se ha demostrado que varias modificaciones de nucleótidos y nucleósidos hacen que el oligonucleótido en el que se incorporan sea más resistente a la digestión por nucleasas que el oligonucleótido nativo; estos oligonucleótidos modificados sobreviven intactos durante más tiempo que los oligonucleótidos sin modificar. Los ejemplos específicos de oligonucleótidos modificados incluyen aquellos que comprenden cadenas principales modificadas, por ejemplo, fosforotioatos, fosfotriésteres, fosfonatos de metilo, uniones interazúcar de alquilo o cicloalquilo de cadena corta o uniones interazúcar heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Algunos oligonucleótidos son oligonucleótidos con cadena principal de fosforotioato y aquellos con cadenas principales de heteroátomo, particularmente cadenas principales de CH2-NH-O-CH2, CH,~N(CH3)~O~CH2 (conocido como cadena principal de metileno(metilimino) o MMI), CH2O--N (CH3)-CH2, CH2 -N (CH3)-N (CH3)-CH2 y O-N (CH3)- CH2 -CH2, en donde la cadena principal de fosfodiéster nativa se representa como O-P--O-CH); cadenas principales de amida [véase De Mesmaekeretal., Ace. Chem. Res.,28:366-374 (1995)]; estructuras de cadena principal de morfolino (véase Summerton y Weller, Pat. de los EE. UU. N.° 5.034.506); cadena principal de ácido nucleico peptídico (PNA) (en donde la cadena principal de fosfodiéster del oligonucleótido se reemplaza por una cadena principal de poliamida, los nucleótidos se unen directa o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la cadena principal de poliamida, véase Nielsenet al., Science1991,254, 1497). Los enlaces que contienen fósforo incluyen, pero no se limitan a, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo y otros alquilos que comprenden fosfonatos de 3'alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que comprenden 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen uniones 3'-5' normales, análogos unidos 2'-5' de éstos, y aquellos que tienen polaridad invertida en donde los pares adyacentes de unidades nucleosídicas están unidos de 3'-5' a 5'-3' o de 2'-5' a 5'-2'; véanse las Patentes de los EE. UU. N.23.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; y 5.625.050.
Se describen compuestos oligoméricos basados en morfolino en Braasch y David Corey,Biochemistry,41 (14): 4503-4510 (2002);Genesis,Volumen 30, Número 3, (2001); Heasman,Dev. Biol.,243: 209-214 (2002); Naseviciuset al., Nat. Genet,26:216-220 (2000); Lacerraet al., Proc. Natl. Acad. Sci.,97: 9591-9596 (2000); y la Patente de los EE. UU. N.° 5.034.506, expedida el 23 de julio de 1991.
Se describen miméticos de oligonucleótidos de ácido nucleico de ciclohexenilo en Wanget al., J. Am. Chem. Soc,122: 8595-8602 (2000).
Las cadenas principales de oligonucleótidos modificados que no incluyen un átomo de fósforo tienen cadenas principales formadas por enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, uniones internucleosídicas mixtas de heteroátomos y alquilo o cicloalquilo, o uno o más uniones internucleosídicas heteroatómicas o heterocíclicas de cadena corta. Éstos comprenden aquellos que tienen enlaces de morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metilen formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otras que tienen partes componentes mixtas de N, O, S y CH2; véase las Patentes de los EE. UU. N.25.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439.
También pueden incluirse uno o más restos de azúcar sustituidos, p. ej., uno de los siguientes en la posición 2': OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)n NH2 u O(CH2)n CH3, donde n es de 1 a aproximadamente 10; alquilo inferior C1 a C10, alcoxialcoxi, alquilo inferior sustituido, alcarilo o aralquilo; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; SOCH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un grupo de escisión de ARN; un grupo indicador; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido; o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En algunos aspectos, una modificación incluye 2'-metoxietoxi (2'-0-CH2CH2Oc H3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietil)) (Martin et al.,Helv. Chim. Acta,1995, 78, 486). Otras modificaciones incluyen 2'-metoxi (2'-O-CH3), 2'-propoxi (2'-OCH2 CH2CH3) y 2'-fluoro (2'-F). También pueden realizarse modificaciones similares en otras posiciones del oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido terminal 3' y la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar, tales como ciclobutilos en lugar del grupo pentofuranosilo.
En algunos ejemplos, tanto un azúcar como un enlace internucleosídico, es decir, la cadena principal, de las unidades de nucleótidos pueden reemplazarse por grupos novedosos. Las unidades base pueden mantenerse para la hibridación con un compuesto diana de ácido nucleico apropiado. Uno de dichos compuestos oligoméricos, un mimético de oligonucleótido que ha demostrado tener excelentes propiedades de hibridación, se denomina ácido nucleico peptídico (PNA, por sus siglas en inglés). En compuestos de PNA, la cadena principal de azúcar de un oligonucleótido puede reemplazarse por una cadena principal que contenga amida, por ejemplo, una cadena principal de aminoetilglicina. Las nucleobases pueden retenerse y unirse directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la cadena principal. Las Patentes de los Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de compuestos de PNA comprenden, pero no se limitan a, las Patentes de los EE. UU. N.° 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262. Para más información sobre los compuestos de PNA, véase Nielsenet al., Science,254: 1497-1500 (1991).
Los ARN guía también pueden incluir, adicionalmente, o como alternativa, modificaciones o sustituciones de nucleobases (con frecuencia denominadas en la técnica simplemente "bases"). Como se usan en la presente memoria, las nucleobases "sin modificar" o "naturales" incluyen adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases que sólo se encuentran de forma infrecuente o transitoria en los ácidos nucleicos naturales, p. ej., hipoxantina, 6-metiladenina, 5-Me pirimidinas, en particular 5-metilcitosina (también denominada 5-metil-2' desoxicitosina y con frecuencia denominada en la técnica 5-Me-C), 5-hidroximetilcitosina (HMC), HMC glicosilada y HMC gentobiosilada, así como nucleobases sintéticas, p. ej., 2-aminoadenina, 2-(metilamino)adenina, 2-(imidazolilalquil)adenina, 2-(aminoalquilamino)adenina u otras alquiladeninas heterosustituidas, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-bromouracilo, 5-hidroximetiluracilo, 8-azaguanina, 7-desazaguanina, N6 (6-aminohexil)adenina y 2,6-diaminopurina. Kornberg, A.,DNA Replication,W. H. Freeman y Co., San Francisco, págs. 75-77 (1980); Gebeyehuet al., Nucl. Acids Res.15:4513 (1997). Una base "universal" conocida en la técnica, p. ej., inosina, también puede incluirse. Se ha demostrado que las sustituciones 5-Me-C aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6 1,2 °C. (Sanghvi, Y. S., en Crooke, S. T. y Lebleu, B., eds.,Antisense Research and Applications,CRC Press, Boca Ratón, 1993, págs. 276-278) y son aspectos de las sustituciones de bases.
Las nucleobases modificadas pueden comprender otras nucleobases sintéticas y naturales, tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6-metilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudo-uracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilquanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina, y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina.
Adicionalmente, las nucleobases pueden ser aquellas descritas en la Patente de los EE. UU. N.° 3.687.808, aquellas descritas en"The Concise Encyclopedia of Polymer Science AndEngineering", páginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellos descritas por Englischet al., Angewandle Chemie, International Edition’,1991, 30, página 613, y aquellas descritas por Sanghvi, Y. S., Capítulo 15,Antisense Research and Applications’,páginas 289-302, Crooke, S.T. y Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Algunas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos de la invención. Éstas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y N-2, N-6 y 0-6 purinas sustituidas, que comprenden 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds,"Antisense Research and Applications",CRC Press, Boca Ratón, 1993, págs. 276-278) y son aspectos de las sustituciones de bases, incluso más particularmente cuando se combinan con modificaciones del azúcar de 2'-O-metoxietilo. Las nucleobases modificadas se describen en la Patente de loa EE. UU. N.23.687.808, así como 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.596.091; 5.614.617; 5.681.941; 5.750.692; 5.763.588; 5.830.653; 6.005.096; y la Publicación de solicitud de patente de los EE. UU. 2003/0158403.
Por lo tanto, el término "modificado" se refiere a un azúcar no natural, fosfato o base que se incorpora en un ARN guía, una endonucleasa o tanto un ARN guía como una endonucleasa. No es necesario que todas las posiciones de un oligonucleótido dado estén modificadas uniformemente y, de hecho, puede incorporarse más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente en un único oligonucleótido, o incluso en un único nucleósido dentro de un oligonucleótido.
Los ARN guía y/o ARNm (o ADN) que codifican una endonucleasa pueden unirse químicamente a uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, distribución celular o captación celular del oligonucleótido. Dichos restos comprenden, pero no se limitan a, elementos lipídicos tales como un resto de colesterol [Letsingeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86: 6553-6556 (1989)]; ácido colico [Manoharanet al., Bioorg. Med. Chem. Let.,4: 1053-1060 (1994)]; un tioéter, p. ej., hexil-S-tritiltiol [Manoharanet al., Ann. N. Y. Acad. Sci.,660: 306 309 (1992) y Manoharanet al., Bioorg. Med. Chem. Let.,3: 2765-2770 (1993)]; un tiocolesterol [Oberhauseret al., Nucl. Acids Res.,20: 533-538 (1992)]; una cadena alifática, p. ej., restos dodecandiol o undecilo [Kabanovet al., FEBS Lett.,259: 327-330 (1990) y Svinarchuket al., Biochimie,75: 49- 54 (1993)]; un fosfolípido, p. ej., di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio [Manoharanet al., Tetrahedron Lett.,36: 3651-3654 (1995) y Sheaet al., Nucl. Acids Res.,18: 3777-3783 (1990)]; una poliamina o una cadena de polietilenglicol [Mancharanet al., Nucleosides & Nucleotides,14: 969-973 (1995)]; ácido adamantano acético [Manoharanet al., Tetrahedron Lett.,36: 3651-3654 (1995)]; un resto palmitilo [(Mishraet al., Biochim. Biophys. Acta,1264: 229-237 (1995)]; o un resto octadecilamina o hexilamino-carbonil-t oxicolesterol [Crookeet al., J. Pharmacol. Exp. Ther.,277: 923-937 (1996)]. Véanse también las Patentes de los EE. UU. N.24.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717 5.580.731; 5.580.731 5.591.584 5.109.124 5.118.802 5.138.045 5.414.077 5.486.603; 5.512.439 5.578.718; 5.608.046 4.587.044 4.605.735 4.667.025 4.762.779 4.789.737 4.824.941; 4.835.263 4.876.335; 4.904.582 4.958.013 5.082.830 5.112.963 5.214.136 5.082.830 5.112.963; 5.214.136 5.245.022; 5.254.469 5.258.506 5.262.536 5.272.250 5.292.873 5.317.098 5.371.241, 5.391.723 5.416.203, 5.451.463 5.510.475 5.512.667 5.514.785 5.565.552 5.567.810 5.574.142, 5.585.481 5.587.371, 5.595.726, 5.597.696, 5.599.923, 5.599.928 y 5.688.941.
Pueden usarse azúcares y otros restos para dirigir proteínas y complejos que comprendan nucleótidos, tales como polisomas y liposomas catiónicos, a sitios particulares. Por ejemplo, la transferencia dirigida a células hepáticas puede estar mediada por receptores de asialoglicoproteína (ASGPR); véase, p. ej., Hu,et al., Protein Pept Lett.21 (10):1025-30 (2014). Pueden usarse otros sistemas conocidos en la técnica y regularmente desarrollados para dirigir biomoléculas de uso en el presente caso y/o complejos de las mismas a células diana particulares de interés.
Estos conjugados o restos de direccionamiento pueden incluir grupos conjugados unidos covalentemente a grupos funcionales, tales como grupos hidroxilos primarios o secundarios. Los grupos conjugados divulgados en el presente documento incluyen intercaladores, moléculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, poliéteres, grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas de los oligómeros y grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas de los oligómeros. Los grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Los grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas, en el contexto de la presente divulgación, incluyen grupos que mejoren la captación, potencian la resistencia a la degradación y/o refuerzan la hibridación específica de secuencia con el ácido nucleico diana. Los grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas, en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la captación, distribución, metabolismo o excreción de los compuestos de la presente invención. Se describen grupos conjugados representativos en la Solicitud de patente internacional N.° PCT/US92/09196, presentada el 23 de octubre de 1992, y la Patente de los EE.<u>U. N.° 6.287.860. Los restos de conjugado incluyen, pero no se limitan a, restos lipídicos tales como resto de colesterol, ácido cólico, un tioéter, p. ej., hexil-5-tritiltiol, a tiocolesterol, una cadena alifática, p. ej., dodecandiol o restos undecilo, un fosfolípido, p. ej., di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o ácido adamantano acético, un resto de palmitilo o un resto de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxi-colesterol. Véase, p. ej., las Pat. de los EE. UU. N.° 4.828.979; 4.948.882 5.218.105 5.525.465 5.541.313 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717. 5.580.731; 5.580.731 5.591.584 5.109.124 5.118.802 5.138.045 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046 4.587.044 4.605.735 4.667.025 4.762.779 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582 4.958.013 5.082.830 5.112.963 5.214.136 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469 5.258.506 5.262.536 5.272.250 5.292.873 5.317.098; 5.371.241. 5.391.723; 5.416.203, 5.451.463 5.510.475 5.512.667 5.514.785 5.565.552 5.567.810, 5.574.142, 5.585.481, 5.587.371, 5.595.726 5.597.696 5.599.923, 5.599.928 y 5.688.941.
Los polinucleótidos más largos que son menos susceptibles de síntesis química y que normalmente se producen mediante síntesis enzimática también pueden modificarse por diversos medios. Dichas modificaciones pueden incluir, por ejemplo, la introducción de determinados análogos de nucleótidos, la incorporación de secuencias particulares u otros restos en los extremos 5' o 3' de las moléculas, y otras modificaciones. A modo de ilustración, el ARNm que codifica Cas9 tiene una longitud aproximada de 4 kb y puede sintetizarse mediante transcripciónin vitro.Pueden aplicarse modificaciones del ARNm para, p. ej., aumentar su traducción o estabilidad (por ejemplo, aumentando su resistencia a la degradación con una célula), o para reducir la tendencia del ARN para provocar una respuesta inmunitaria innata que con frecuencia se observa en las células después de la introducción de ARN exógenos, particularmente ARN más largos, tales como Cas9 codificante.
Se han descrito en la técnica numerosas modificaciones de este tipo, tales como colas de poliA, análogos de la caperuza 5' (p. ej., el Análogo de caperuza anti-inverso (ARCA) o m7G(5')ppp(5')G (mCAP)), regiones no traducidas (UTR) 5' o 3' modificadas, uso de bases modificadas (tales como Pseudo-UTP, 2-Tio-UTP, 5-Metilcitidina-5'-trifosfato (5-Metil-CTP) o N6-Metil-ATP), o tratamiento con fosfatasa para eliminar los fosfatos terminales 5'. Se conocen en la técnica éstas y otras modificaciones, y periódicamente se desarrollan nuevas modificaciones de los ARN.
Existen numerosos proveedores comerciales de ARN modificados, incluyendo, por ejemplo, TriLink Biotech, AxoLabs, Bio-Synthesis Inc., Dharmacon y muchos otros. Como se describe por TriLink, por ejemplo, puede usarse 5-metil-CTP para conferir características deseables, tales como una mayor estabilidad de las nucleasas, un aumento de la traducción o reducción de la interacción de receptores inmunitarios innatos con ARN transcritoin vitro.5-Metilcitidina-5'-trifosfato (5-metil-CTP), N6-Metil-ATP, así como Pseudo-UTP y 2-Tio-UTP, también han demostrado reducir la estimulación inmunitaria innata en cultivo ein vivo,potenciando al mismo tiempo la traducción, como se ilustra en las publicaciones de Kormannet al.y Warrenet al.a las que se hace referencia a continuación.
Se ha demostrado que puede usarse ARNm modificado químicamente suministradoin vivopara conseguir efectos terapéuticos mejorados; véase, p. ej., Kormannet al., Nature Biotechnology29, 154-157 (2011). Pueden usarse dichas modificaciones, por ejemplo, para aumentar la estabilidad de la molécula de ARN y/o reducir su inmunogenicidad. Usando modificaciones químicas tales como Pseudo-U, N6-Metil-A, 2-Tio-U y 5-Metill-C, se descubrió que la sustitución de sólo una cuarta parte de los restos uridina y citidina por 2-Tio-U y 5-Metil-C, respectivamente, daba como resultado una disminución significativa del reconocimiento del ARNm mediado por el receptor de tipo Toll (TLR) en ratones. Reduciendo la activación del sistema inmunitario innato, estas modificaciones pueden usarse para aumentar eficazmente la estabilidad y longevidad del ARNmin vivo;véase, p. ej., Kormannet al.,citado anteriormente.
También se ha demostrado que la administración repetida de ARN mensajeros sintéticos que incorporan modificaciones diseñadas para eludir las respuestas antivíricas innatas puede reprogramar células humanas diferenciadas a pluripotencia. Véase, p. ej., Warren,et al., Cell Stem Cell,7(5):618-30 (2010). Estos ARNm modificados que actúan como proteínas de reprogramación primaria pueden ser un medio eficiente para reprogramar múltiples tipos de células humanas. Dichas células se denominan células madre de pluripotencia inducida (iPSC) y se descubrió que podría usarse ARN sintetizado enzimáticamente que incorpora 5-Metil-CTP, Pseudo-UTP y un Análogo de Caperuza Anti-inversa (ARCA) para evadir eficazmente la respuesta antivírica de la célula; véase, p. ej., Warrenet al.,citado anteriormente.
Otras modificaciones de polinucleótidos descritas en la técnica incluyen, por ejemplo, el uso de colas de poliA, la adición de análogos de la caperuza 5' (tales como m7G(5')ppp(5')G (mCAP)), las modificaciones de las regiones no traducidas (UTR) 5' o 3', o el tratamiento con fosfatasa para eliminar los fosfatos terminales 5' - y periódicamente se desarrollan nuevos enfoques.
Se han desarrollado varias composiciones y técnicas aplicables a la generación de ARN modificados para su uso en la presente memoria con respecto a la modificación del ARN de interferencia (ARNi), incluyendo ARN de interferencia pequeños (ARNip). Los ARNip plantean retos particularesin vivoporque sus efectos sobre el silenciamiento génico a través de interferencia de ARNm son generalmente transitorios, que pueden requerir la administración repetida. Además, los ARNip son ARN bicatenarios (ARNbc) y las células de los mamíferos tienen respuestas inmunitarias que han evolucionado para detectar y neutralizar ARNbc, que con frecuencia es un subproducto de infección vírica. Por lo tanto, existen enzimas de mamíferos tales como PKR (cinasa sensible a ARNbc) y, potencialmente, el gen I inducible por ácido retinoico (RIG-I), que pueden mediar en las respuestas celulares a ARNbc, así como receptores de tipo Toll (tales como TLR3, TLR7 y TLR8) que pueden desencadenar la inducción de citocinas en respuesta a dichas moléculas; véase, p. ej., las revisiones de Angartet al., Pharmaceuticals(Basilea) 6(4): 440-468 (2013); Kanastyet al., Molecular Therapy20(3): 513-524 (2012); Burnettet al., Biotechnol J.6(9):1130-46 (2011); Judge y MacLachlan,Hum Gene Ther19(2):111-24 (2008); y las referencias citadas en los mismos.
Se ha desarrollado y aplicado una gran diversidad de modificaciones para potenciar la estabilidad del ARN, reducir las respuestas inmunitarias innatas y/o conseguir otros beneficios que pueden ser útiles con respecto a la introducción de polinucleótidos en células humanas, como se describe en la presente memoria; véase, p. ej., las revisiones de Whitehead KAet al., Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering,2: 77-96 (2011); Gaglione y Messere,Mini Rev Med Chem,10(7):578-95 (2010); Chernolovskayaet al., Curr Opin Mol Ther.,12(2):158-67 (2010); Deleaveyet al., Curr Protoc Nucleic Acid ChemCapítulo 16:Unidad 16.3 (2009); Behlke,Oligonucleotides18(4):305-19 (2008); Fuciniet al., Nucleic Acid Ther22(3): 205-210 (2012); Bremsenet al., Front Genet3:154 (2012).
Como indicó anteriormente, existen varios proveedores comerciales de ARN modificados, muchos de los cuales se han especializado en modificaciones diseñadas para mejorar la eficacia de los ARNip. Se ofrece una diversidad de enfoques basados en diversos hallazgos publicados en la literatura. Por ejemplo, Dharmacon señala que el reemplazo de un oxígeno no puente por azufre (fosforotioato, PS) se ha utilizado ampliamente para mejorar la resistencia a nucleasas de ARNip, como publica Kole,Nature Reviews Drug Discovery11:125-140 (2012). Se ha publicado que las modificaciones de la posición 2' de la ribosa mejoran la resistencia a nucleasas del enlace fosfato internucleotídico aumentando al mismo tiempo la estabilidad del dúplex (Tm), que también ha demostrado proporcionar protección frente a la activación inmunitaria. Una combinación de modificaciones moderadas de la cadena principal de PS con pequeñas sustituciones 2' bien toleradas (2'-O-metil, 2'-Fluoro, 2'-Hidro) se han asociado a ARNip altamente estables para aplicacionesin vivo,según publicaron Soutscheket al. Nature432:173-178 (2004); y se ha demostrado que las modificaciones con 2'-O-metilo son eficaces para mejorar la estabilidad, según publicó Volkov,Oligonucleotides19:191 -202 (2009). Con respecto a la disminución de la inducción de respuestas inmunitarias innatas, se ha publicado que modificar secuencias específicas con 2'-O-metilo, 2'-Fluoro, 2'-Hidro reduce la interacción TLR7/TLR8 al mismo tiempo que en general se conserva la actividad silenciadora; véase, p. ej., Judgeet al., Mol. Ther.13:494-505 (2006); y Cekaiteet al., J. Mol. Biol.365:90-108 (2007). También se ha demostrado que modificaciones adicionales, tales como 2-tiouracilo, pseudouracilo, 5-metilcitosina, 5-metiluracilo y N6-metiladenosina minimizan los efectos inmunitarios mediados por TLR3, TLR7 y TLR8; véase, p. ej., Kariko, K.et al., Immunity23:165-175 (2005).
Como también se conocen en la técnica y están disponibles en el mercado, pueden aplicarse varios conjugados a los polinucleótidos, tales como ARN, para su uso en la presente memoria que pueden potenciar su suministro y/o captación por las células, incluyendo, por ejemplo, colesterol, tocoferol y ácido fólico, lípidos, péptidos, polímeros, enlazadores y aptámeros; véase, p. ej., la revisión de Winkler,Ther. Deliv.4:791-809 (2013), y referencias citadas en la misma.
Optimización de codones
Un polinucleótido que codifica un polipéptido dirigido al sitio puede ser optimizarse en sus codones según métodos convencionales en la técnica para la expresión en la célula que contiene el ADN diana de interés. Por ejemplo, si el ácido nucleico diana previsto está en una célula humana, se contempla el uso de un polinucleótido humano con codones optimizado que codifica Cas9 para producir el polipéptido de Cas9.
Complejos de un ácido nucleico dirigido al genoma y un polipéptido dirigido al sitio
Un ácido nucleico dirigido al genoma interactúa con un polipéptido dirigido al sitio (p. ej., una nucleasa guiada por ácido nucleico tal como Cas9), formando de este modo un complejo. El ácido nucleico dirigido al genoma guía al polipéptido dirigido al sitio a un ácido nucleico diana.
RNP
El polipéptido dirigido al sitio y el ácido nucleico dirigido al genoma pueden administrarse cada uno por separado a una célula o a un paciente. Por otro lado, el polipéptido dirigido al sitio puede precomplejarse con uno o más ARN guía, o uno o más ARNcr junto con un ARNtracr. Después, el material precomplejado puede administrarse a una célula o a un paciente. Este material precomplejado se conoce como partícula de ribonucleoproteína (RNP).
Componentes del sistema que codifican ácidos nucleicos
La presente divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ácido nucleico dirigido al genoma de la divulgación, un polipéptido dirigido al sitio de la divulgación, y/o cualquier ácido nucleico o molécula proteinácea necesaria para realizar los aspectos de los métodos de la divulgación.
El ácido nucleico que codifica un ácido nucleico dirigido al genoma de la divulgación, un polipéptido dirigido al sitio de la divulgación, y/o cualquier ácido nucleico o molécula proteinácea necesarios para realizar los aspectos de los métodos de la divulgación pueden comprender un vector (p. ej., un vector de expresión recombinante).
El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde pueden ligarse segmentos adicionales de ácido nucleico al genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamíferos episómicos). Otros vectores (p. ej. vectores de mamíferos no episómicos) se integran en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora y, por lo tanto, se replican junto con el genoma del hospedador.
En algunos ejemplos, los vectores pueden ser capaces de dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en la presente memoria "vectores de expresión recombinante", o más simplemente "vectores de expresión", que cumplen funciones equivalentes.
La expresión "unido operativamente" significa que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a una o más secuencias reguladoras de manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos. La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir, por ejemplo, promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (p. ej., señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Goeddel;Gene Expression Technology: Methods in Enzymology185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedadoras, y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en determinadas células hospedadoras (p. ej., secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula diana, el nivel de expresión deseado, etc.
Los vectores de expresión contemplados incluyen, pero no se limitan a, vectores víricos basados en el virus vaccinia, poliovirus, adenovirus, virus adeno-asociado, SV40, virus del herpes simple, virus de la inmunodeficiencia humana, retrovirus (p. ej., virus de la leucemia murina, virus de la necrosis del bazo y vectores derivados de retrovirus tales como el virus del sarcoma de Rous, virus del Sarcoma Harvey, virus de la leucosis aviar, un lentivirus, virus de la inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus del tumor mamario) y otros vectores recombinantes. Otros vectores contemplados para células diana eucariotas incluyen, pero no se limitan a, los vectores pXT1, pSG5, pSVK3, pBPV, pMSG y pSVLSV40 (Pharmacia). Vectores adicionales contemplados para células diana eucariotas incluyen, pero no se limitan a, los vectores pCTx-1, pCTx-2 y pCTx-3, que se describen en las Figuras 1A a 1C. Pueden usarse otros vectores siempre que sean compatibles con la célula hospedadora.
En algunos ejemplos, un vector puede comprender uno o más elementos de control de la transcripción y/o de la traducción. dependiendo del sistema hospedador/vector utilizado, puede usarse cualquiera de una serie de elementos adecuados de control de la transcripción y la traducción, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. en el vector de expresión. El vector puede ser un vector autoinactivable que inactive las secuencias víricas o los componentes de la maquinaria CRISPR u otros elementos.
Los ejemplos no limitantes de promotores eucarióticos adecuados (es decir, promotores funcionales en una célula eucariota) incluyen los del citomegalovirus (CMV) temprano inmediato, timidina cinasa del virus del herpes simple (HSV), SV40 temprano y tardío, repeticiones terminales largas (LTR) de retrovirus, promotor humano del factor de elongación-1 (EF1), una construcción híbrida que comprende el potenciador del citomegalovirus (CMV) fusionado al promotor de la beta-actina de pollo (CAG), promotor del virus de las células madre murinas (MSCV), promotor del locus fosfoglicerato cinasa-1 (PGK) y metalotioneína-I de ratón.
Para expresar ARN pequeños, incluyendo los ARN guía utilizados con respecto a la endonucleasa Cas, pueden ser ventajosos diversos promotores, tales como los promotores de la ARN polimerasa III, incluyendo, por ejemplo, U6 y H1. Las descripciones y los parámetros para mejorar el uso de dichos promotores son conocidos en la técnica, y regularmente se describen información y enfoques adicionales; véase, p. ej., Ma, H.et al., Molecular Therapy - Nucleic Acids3, e161 (2014) doi:10.1038/mtna.2014.12.
El vector de expresión también puede contener un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector de expresión también puede comprender secuencias apropiadas para amplificar la expresión. El vector de expresión también puede incluir secuencias de nucleótidos que codifican marcadores no nativos (p. ej., marcador de histidina, marcador de hemaglutinina, proteína verde fluorescente, etc.) que se fusionan con el polipéptido dirigido al sitio, dando lugar así a una proteína de fusión.
Un promotor puede ser un promotor inducible (p. ej., un promotor de choque térmico, promotor regulado por tetraciclina, promotor regulado por esteroides, promotor regulado por metales, promotor regulado por el receptor de estrógenos, etc.). El promotor puede ser un promotor constitutivo (p. ej., promotor CMV, promotor UBC). En algunos casos, el promotor puede ser un promotor restringido espacial y/o temporalmente (p. ej., un promotor específico de tejido, un promotor específico del tipo de célula, etc.).
El ácido nucleico que codifica un ácido nucleico dirigido al genoma de la divulgación y/o un polipéptido dirigido al sitio puede empaquetarse en o sobre la superficie de vehículos de suministro para su suministro a células. Los vehículos de suministro contemplados incluyen, pero no se limitan a, nanoesferas, liposomas, puntos cuánticos, nanopartículas, partículas de polietilenglicol, hidrogeles y micelas. Se puede utilizar una gran diversidad de restos de direccionamiento para potenciar la interacción preferente de dichos vehículos con los tipos o ubicaciones celulares deseados.
La introducción de los complejos, polipéptidos y ácidos nucleicos de la divulgación en células puede producirse por infección vírica o por bacteriófago, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, lipofección, electroporación, nucleofección, precipitación de fosfato cálcico, transfección mediada por polietilenimina (PEI), transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas, tecnología de cañón de partículas, precipitación de fosfato cálcico, microinyección directa, suministro de ácidos nucleicos mediada por nanopartículas y similares.
Suministro
Los polinucleótidos de ARN guía (ARN o ADN) y/o polinucleótidos de endonucleasa(s) (ARN o ADN) pueden suministrarse mediante vehículos de suministro víricos o no víricos conocidos en la técnica. Como alternativa, el polipéptido o polipéptidos de endonucleasa pueden suministrarse mediante vehículos de suministro no víricos conocidos en la técnica, tales como electroporación o nanopartículas lipídicas. En otros aspectos alternativos, la endonucleasa de ADN puede suministrarse como uno o más polipéptidos, ya sea sola o precomplejada con uno o más ARN guía, o uno o más ARNcr junto con un ARNtracr.
Los polinucleótidos pueden suministrarse mediante vehículos de suministro no víricos, incluyendo, pero sin limitación, nanopartículas, liposomas, ribonucleoproteínas, péptidos con carga positiva, conjugados de ARN de molécula pequeña, quimeras aptámero-ARN y complejos ARN-proteína de fusión. Algunos vehículos de suministro no víricos de ejemplo se describen en Peer y Lieberman,Gene Therapy,18: 1127-1133 (2011) (que se centra en vehículos de suministro no víricos para ARNip que también son útiles para la suministro de otros polinucleótidos).
Los polinucleótidos, tales como ARN guía, ARNgu y ARNm que codifican una endonucleasa, pueden suministrarse a una célula o a un paciente mediante una nanopartícula lipídica (LNP).
Por LNP se entiende cualquier partícula con un diámetro inferior a 1000 nm, 500 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm o 25 nm. Como alternativa, el tamaño de una nanopartícula puede oscilar entre 1 1000 nm, 1-500 nm, 1-250 nm, 25-200 nm, 25-100 nm, 35-75 nm o 25-60 nm.
Las LNP pueden fabricarse a partir de lípidos catiónicos, aniónicos o neutros. Los lípidos neutros, tales como el fosfolípido fusogénico DOPE o el componente de membrana colesterol, pueden incluirse en las LNP como "lípidos ayudantes" para potenciar la actividad de transfección y la estabilidad de las nanopartículas. Entre las limitaciones de los lípidos catiónicos se encuentran su baja eficacia debido a su escasa estabilidad y su rápida eliminación, así como la generación de respuestas inflamatorias o antiinflamatorias.
Las LNP también pueden estar compuestas por lípidos hidrófobos, lípidos hidrófilos o lípidos tanto hidrófobos como hidrófilos.
Cualquier lípido o combinación de lípidos conocidos en la técnica puede usarse para producir una LNP. Son ejemplos de lípidos utilizados para producir LNP: DOTMA, DOSPA, DOTAP, DMRIE, DC-colesterol, DOTAP-colesterol, GAP-DMORIE-DPyPE, y GL67A-DOPE-DMPE-polietilenglicol (PEG). Son ejemplos de lípidos catiónicos: 98N12-5, C12-200, DLin-KC2-DMA (KC2), DLin-MC3-DMA (MC3), XTC, MD1 y 7C1. Son ejemplos de lípidos neutros: D<p>SC, DPPC, POPC, DOPE y SM. Son ejemplos de lípidos modificados con P<e>G: PEG-DMG, PEG-CerC14 y PEG-CerC20.
Los lípidos pueden combinarse en cualquier relación molar para producir una LNP. Además, el polinucleótido o polinucleótidos pueden combinarse con el lípido o lípidos en un amplio intervalo de relaciones molares para producir una LNP.
Como se estableció anteriormente, el polipéptido dirigido al sitio y el ácido nucleico dirigido al genoma pueden administrarse cada uno por separado a una célula o a un paciente. Por otro lado, el polipéptido dirigido al sitio puede precomplejarse con uno o más ARN guía, o uno o más ARNcr junto con un ARNtracr. Después, el material precomplejado puede administrarse a una célula o a un paciente. Este material precomplejado se conoce como partícula de ribonucleoproteína (RNP).
El ARN es capaz de formar interacciones específicas con el ARN o el ADN. Esta propiedad se aprovecha en muchos procesos biológicos, también conlleva el riesgo de interacciones promiscuas en un entorno celular rico en ácidos nucleicos. Una solución a este problema es la formación de partículas ribonucleoproteicas (RNP), en las que el ARN se precompleja con una endonucleasa. Otra ventaja de la RNP es la protección del ARN frente a la degradación.
La endonucleasa en la RNP puede estar modificada o sin modificar. Análogamente, el ARNg, ARNcr, ARNtracr o ARNgu puede estar modificado o sin modificar. Se conocen en la técnica y pueden usarse numerosas modificaciones.
La endonucleasa y el ARNgu pueden combinarse en una relación molar 1:1. Como alternativa, la endonucleasa, el ARNcr y el ARNtracr pueden combinarse generalmente en una relación molar de 1:1:1. Sin embargo, se puede usar un amplio intervalo de relaciones molares para producir una RNP.
Puede usarse un vector recombinante de virus adenoasociado (AAV) para el suministro. Son convencionales en el arte técnicas de producción de partículas de rAAV, en las que se empaquetará un genoma de AAV que incluye el polinucleótido que se desea suministrar, genes rep y cap, y las funciones del virus ayudante que se proporcionan a una célula. La producción de rAAV suele requerir que los siguientes componentes estén presentes en una única célula (denominada en la presente memoria célula empaquetadora): un genoma de rAAV, genes rep y cap de AAV separados (es decir, no en) del genoma de rAAV, y funciones del virus ayudante. Los genes rep y cap dl AAV pueden ser de cualquier serotipo de AAV del que pueda derivar un virus recombinante, y pueden ser de un serotipo de AAV distinto de los ITR del genoma de rAAV, incluyendo, pero sin limitación, serotipos de AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 y AAV rh.74. La producción de rAAV pseudotipados se describe en, por ejemplo, la solicitud internacional de patente número de publicación WO 01/83692. Véase la Tabla 3.
Tabla 3
Un método para generar una célula de empaquetamiento implica crear una estirpe celular que exprese de forma estable todos los componentes necesarios para la producción de partículas de AAV. Por ejemplo, un plásmido (o múltiples plásmidos) que comprende un genoma rAAV que carece de los genes de AAV rep y cap, genes rep y cap de AAV separados del genoma de rAAV, y un marcador seleccionable, tal como un gen de resistencia a la neomicina, se integran en el genoma de una célula. Los genomas de AAV se han introducido en plásmidos bacterianos mediante procedimientos tales como cola de GC (Samulskiet al.,1982,Proc. Natl. Acad. S6. USA,79:2077-2081), adición de enlazadores sintéticos que contienen sitios de escisión de endonucleasas de restricción (Laughlinet al.,1983,Gene,23:65-73) o por vía directa, ligadura de extremo romo (Senapathy y Carter, 1984,J. Biol. Chem.,259:4661-4666). A continuación, la estirpe celular de empaquetado puede infectarse con un virus auxiliar, tal como el adenovirus. Las ventajas de este método son que las células son seleccionables y adecuadas para la producción a gran escala de rAAV. Otros ejemplos de métodos adecuados emplean adenovirus o baculovirus, en lugar de plásmidos, para introducir genomas de rAAV y/o genes rep y cap en células de empaquetamiento.
Los principios generales de la producción de rAAV se revisan en, por ejemplo, Carter, 1992,Current Opinions in Biotechnology,1533-539; y Muzyczka, 1992,Curr. Topics in Microbial. and Immunol.,158:97-129). Se describen varios enfoques en Ratschinet al., Mol. Cell. Biol.4:2072 (1984); Hermonatet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81:6466 (1984); Tratschinet al., Mo1. Cell. Biol.5:3251 (1985); McLaughlinet al., J. Viro/., 62:1963 (1988); y Lebkowskiet al.,1988Mol. Cell. Biol.,7:349 (1988). Samulskiet al.(1989,J. Virol,63:3822-3828); Patente de los Estados Unidos N.° 5.173.414; documento WO 95/13365 y la correspondiente Patente de los EE. UU. N.25.658.776; documento WO 95/13392; documento WO 96/17947; documento PCT/US98/18600; documento WO 97/09441 (PCT/US96/14423); documento WO 97/08298 (PCT/US96/13872); documento WO 97/21825 (PCT/US96/20777); documento WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); documento WO 99/11764; Perrinet al.(1995)Vaccine13:1244-1250; Paulet al.(1993)Human Gene Therapy4:609-615; Clarket al.(1996)Gene Therapy3:1124-1132; Patente de los e E. UU. N.° 5.786.211; Patente de los Estados Unidos N.° 5.871.982; y Patente de los EE. UU. N.26.258.595.
Los serotipos de los vectores de AAV pueden adaptarse a los tipos de células diana. Por ejemplo, los siguientes tipos celulares de ejemplo pueden transducirse, entre otros, por los serotipos de AAV indicados. Véase la Tabla 4.
Tabla 4
Células modificadas genéticamente
La expresión "célula modificada genéticamente" se refiere a una célula que comprende al menos una modificación genética introducida mediante edición genómica (p. ej., usando el sistema de CRISPR/Cas). En algunos ejemplosex vivode la presente memoria, la célula modificada genéticamente puede ser una célula progenitora modificada genéticamente. En algunos ejemplosin vivode la presente memoria, la célula modificada genéticamente puede ser una célula muscular modificada genéticamente o una célula precursora muscular modificada genéticamente. En la presente memoria se contempla una célula modificada genéticamente que comprende un ácido nucleico exógeno dirigido al genoma y/o un ácido nucleico exógeno que codifica un ácido nucleico dirigido al genoma.
La expresión "población tratada de control" describe una población de células que ha sido tratada con medios idénticos, inducción vírica, secuencias de ácido nucleico, temperatura, confluencia, tamaño del matraz, pH, etc., con la excepción de la adición de los componentes de edición genómica. Cualquier método conocido en la técnica puede ser usado para medir el restablecimiento del marco de lectura de la distrofina, por ejemplo, análisis por transferencia Western de la proteína distrofina o cuantificando el ARNm de la distrofina.
La expresión "célula aislada" se refiere a una célula que ha sido extraída de un organismo en el que se encontraba originalmente, o a un descendiente de dicha célula. Opcionalmente, la célula puede cultivarsein vitro,p. ej., en condiciones definidas o en presencia de otras células. Opcionalmente, la célula puede introducirse posteriormente en un segundo organismo o reintroducirse en el organismo del que se aisló (o la célula de la que desciende).
La expresión "población aislada" con respecto a una población aislada de células se refiere a una población de células que ha sido retirada y separada de una población mixta o heterogénea de células. En algunos casos, la población aislada puede ser una población sustancialmente pura de células, en comparación con la población heterogénea de la que se aislaron o enriquecieron las células. En algunos casos, la población aislada puede ser una población aislada de células progenitoras humanas, p. ej., una población sustancialmente pura de células progenitoras humanas, en comparación con una población heterogénea de células que comprende células progenitoras humanas y células de las que derivaron las células progenitoras humanas.
La expresión "sustancialmente potenciada", con respecto a una población celular particular, se refiere a una población de células en la que la presencia de un tipo particular de célula aumenta con respecto a los niveles preexistentes o de referencia, al menos 2 veces, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 20, al menos 50, al menos 100, al menos 400, al menos 1000, al menos 5000, al menos 20000, al menos 100.000 veces o más dependiendo, p. ej., sobre los niveles deseados de dichas células para mejorar la DMD.
La expresión "sustancialmente enriquecido" con respecto a una población celular particular, se refiere a una población de células de al menos aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 % o más con respecto a las células que componen una población celular total.
La expresión "sustancialmente pura" con respecto a una población celular particular, se refiere a una población de células de al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 % de pureza, con respecto a las células que componen una población celular total. Es decir, las expresiones "sustancialmente puro" o "esencialmente purificado", con respecto a una población de células progenitoras, se refiere a una población de células que contiene menos de aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 9 %, aproximadamente el 8 %, aproximadamente el 7 %, aproximadamente el 6 %, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 4 %, aproximadamente el 3 %, aproximadamente el 2 %, aproximadamente el 1 % o menos del 1 %, de células que no son células progenitoras como se definen en los términos de la presente memoria.
Diferenciación de iPSC corregidas en células progenitoras musculares Pax7+
Otra etapa de los métodosex vivode la presente divulgación implica diferenciar las iPSC corregidas en células progenitoras musculares Pax7+. La etapa de diferenciación puede realizarse según cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la etapa de diferenciación puede comprender el contacto de las iPSC editadas genómicamente con formulaciones de medios específicas, incluyendo los fármacos de molécula pequeña, para diferenciarla en una célula progenitora muscular Pax7+, como se muestra en Chal, Oginumaet al.2015. Como alternativa, las iPSC, los precursores miogénicos y las células de otros linajes pueden diferenciarse en músculo usando cualquiera de los métodos establecidos que implican la sobreexpresión de transgenes, la retirada de suero y/o los fármacos de molécula pequeña, como se muestra en los métodos de Tapscott, Daviset al.1988, Langen, Scholset al.2003, Fujita, Endoet al.2010, Xu, Tabebordbaret al.2013, Shoji, Woltjenet al.2015.
Implantación de células progenitoras musculares Pax7+ en pacientes
Otra etapa de los métodosex vivodescritos en la presente memoria implica implantar las células progenitoras musculares Pax7+ en pacientes. Esta etapa de implantación puede realizarse usando cualquier método de implantación conocido en la técnica. Por ejemplo, las células modificadas genéticamente pueden inyectarse directamente en el músculo del paciente.
Portadores farmacéuticamente aceptables
Los métodosex vivode administración de células progenitoras a un sujeto contemplados en la presente memoria implican el uso de composiciones terapéuticas que comprenden células progenitoras.
Las composiciones terapéuticas pueden contener un portador fisiológicamente tolerable junto con la composición celular, y opcionalmente al menos un agente bioactivo adicional como se describe en la presente memoria, disuelto o disperso en él como principio activo. En algunos casos, la composición terapéutica no es sustancialmente inmunogénica cuando se administra a un mamífero o paciente humano con fines terapéuticos, a menos que así se desee.
En general, las células progenitoras descritas en la presente memoria pueden administrarse en forma de suspensión con un portador farmacéuticamente aceptable. Un experto en la técnica puede reconocer que un portador farmacéuticamente aceptable para su uso en una composición celular no puede incluir tampones, compuestos, agentes de crioconservación, conservantes u otros agentes en cantidades que interfieran sustancialmente con la viabilidad de las células que se van a suministrar al sujeto. Una formulación que comprende células puede incluir, p. ej., tampones osmóticos que permitan mantener la integridad de la membrana celular y, opcionalmente, nutrientes para mantener la viabilidad celular o potenciar el injerto tras su administración. Dichas formulaciones y suspensiones son conocidas por los expertos en la técnica y/o pueden adaptarse para su uso con las células progenitoras, como se describe en la presente memoria, mediante experimentación rutinaria.
Una composición celular también puede emulsionarse o presentarse como una composición liposómica, siempre que el procedimiento de emulsificación no afecte negativamente a la viabilidad celular. Las células y cualquier otro principio activo pueden mezclarse con excipientes farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo, y en cantidades adecuadas para su uso en los métodos terapéuticos descritos en la presente memoria.
Los agentes adicionales incluidos en una composición celular pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables de los componentes de la misma. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivar de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o hierro, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares.
Los portadores fisiológicamente tolerables son bien conocidos en la técnica. Los portadores líquidos de ejemplo son soluciones acuosas estériles que no contienen materiales además de los principios activos y el agua, o contienen un tampón como el fosfato de sodio a un valor de pH fisiológico, suero fisiológico o ambos, tales como solución salina tamponada con fosfato. Es más, los portadores acuosos pueden contener más de una sal tampón, así como sales tales como cloruros de sodio y potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos. Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas además y excluyendo el agua. Un ejemplo de dichas fases líquidas adicionales es glicerina, aceites vegetales, tales como el aceite de semilla de algodón, y emulsiones de agua y aceite. La cantidad de un compuesto activo utilizado en las composiciones celulares que es eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección particular puede depender de la naturaleza del trastorno o afección, y puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales.
Administración y eficacia
Los términos "administrar", "introducir" y "trasplantar" se usan indistintamente en el contexto de la colocación de células, p. ej., células progenitoras, en un sujeto, mediante un método o vía que dé como resultado la localización, al menos parcial, de las células introducidas en un lugar deseado, tal como un sitio de lesión o reparación, de manera que se produzca(n) el(los) efecto(s) deseado(s). Las células, p. ej., células progenitoras o su descendencia diferenciada, pueden administrarse por cualquier vía adecuada que permita su suministro en el lugar deseado del sujeto, donde al menos una porción de las células implantadas o de sus componentes permanezcan viables. El período de viabilidad de las células tras su administración a un sujeto puede ser tan breve como unas horas, p. ej., veinticuatro horas, a unos pocos días, hasta varios años o incluso toda la vida del paciente, es decir, injerto a largo plazo. Por ejemplo, en algunos aspectos descritos en la presente memoria, una cantidad eficaz de células progenitoras miogénicas se administra por vía de administración sistémica, tal como la vía intraperitoneal o intravenosa.
Los términos "individuo", "sujeto", "hospedador" y "paciente" se usan indistintamente en la presente memoria y se refieren a cualquier sujeto para el que se desea un diagnóstico, tratamiento o terapia. En algunos aspectos, el sujeto es un mamífero. En algunos aspectos, el sujeto es un ser humano.
Cuando se administran profilácticamente, las células progenitoras descritas en la presente memoria pueden administrarse a un sujeto antes de que aparezca cualquier síntoma de DMD, p. ej., antes del desarrollo del desgaste muscular. Por consiguiente, la administración profiláctica de una población de células progenitoras musculares puede servir para prevenir la DMD.
Cuando se suministran terapéuticamente, las células progenitoras musculares pueden proporcionarse en el momento (o después) de la aparición de un síntoma o indicio de DMD, p. ej., al inicio del desgaste muscular.
La población de células progenitoras musculares que se administra según los métodos descritos en la presente memoria puede comprender células progenitoras musculares alogénicas obtenidas de uno o más donantes. "Alogénico" se refiere a una célula progenitora muscular o a muestras biológicas que comprenden células progenitoras musculares obtenidas de uno o más donantes diferentes de la misma especie, donde los genes de uno o más locus no son idénticos. Por ejemplo, una población de células progenitoras musculares que se administra a un sujeto puede derivar de uno o más sujetos donantes no emparentados, o de uno o más hermanos no idénticos. En algunos casos, pueden usarse poblaciones de células progenitoras musculares singénicas, tales como las obtenidas de animales genéticamente idénticos o de gemelos idénticos. Las células progenitoras musculares pueden ser células autólogas; es decir, las células progenitoras musculares se obtienen o aíslan de un sujeto y se administran al mismo sujeto, es decir, el donante y el receptor son el mismo.
La expresión "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de una población de células progenitoras o su descendencia necesaria para prevenir o aliviar al menos uno o más signos o síntomas de DMD, y se refiere a una cantidad suficiente de una composición para proporcionar el efecto deseado, p. ej., para tratar a un sujeto con DMD. Por lo tanto, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de células progenitoras o una composición que comprende células progenitoras que es suficiente para promover un efecto particular cuando se administra a un sujeto típico, como el que padece o corre el riesgo de padecer DMD. Una cantidad eficaz también incluiría una cantidad suficiente para prevenir o retrasar el desarrollo de un síntoma de la enfermedad, alterar el curso de un síntoma de la enfermedad (por ejemplo, pero sin limitación, ralentizar la progresión de un síntoma de la enfermedad), o revertir un síntoma de la enfermedad. Se entiende que para un caso determinado, una "cantidad eficaz" apropiada puede ser determinada por un experto en la técnica mediante experimentación rutinaria.
Para su uso en los diversos aspectos descritos en la presente memoria, una cantidad eficaz de células progenitoras comprende al menos 102 células progenitoras, al menos 5 X 102 células progenitoras, al menos 103 células progenitoras, al menos 5 X 103 células progenitoras, al menos 104 células progenitoras, al menos 5 X 104 células progenitoras, al menos 105 células progenitoras, al menos 2 X 105 células progenitoras, al menos 3 X 105 células progenitoras, al menos 4 X 105 células progenitoras, al menos 5 X 105 células progenitoras, al menos 6 X 105 células progenitoras, al menos 7 X 105 células progenitoras, al menos 8 X 105 células progenitoras, al menos 9 X 105 células progenitoras, al menos 1 X 106 células progenitoras, al menos 2 X 106 células progenitoras, al menos 3 X 106 células progenitoras, al menos 4 X 106 células progenitoras, al menos 5 X 106 células progenitoras, al menos 6 X 106 células progenitoras, al menos 7 X 106 células progenitoras, al menos 8 X 106 células progenitoras, al menos 9 X 106 células progenitoras o múltiplos de las mismas. Las células progenitoras pueden derivar de uno o más donantes, o pueden obtenerse de una fuente autóloga. En algunos ejemplos descritos en la presente memoria, las células progenitoras pueden expandirse en cultivo antes de su administración a un sujeto que las necesite.
Aumentos modestos e incrementales en los niveles de distrofina funcional expresada en células de pacientes que tienen DMD pueden ser beneficiosos para mejorar uno o más síntomas de la enfermedad, para aumentar la supervivencia a largo plazo, y/o para reducir los efectos secundarios asociados a otros tratamientos. Tras la administración de dichas células a pacientes humanos, la presencia de precursores musculares que están produciendo niveles aumentados de distrofina funcional es beneficiosa. En algunos casos, el tratamiento eficaz de un sujeto da lugar al menos aproximadamente al 3 %, 5 % o 7 % de distrofina funcional con respecto a la distrofina total en el sujeto tratado. En algunos ejemplos, la distrofina funcional será al menos aproximadamente el 10 % de la distrofina total. En algunos ejemplos, la distrofina funcional será al menos aproximadamente el 20 % al 30 % de la distrofina total. De manera similar, la introducción de incluso subpoblaciones relativamente limitadas de células que tienen niveles significativamente elevados de distrofina funcional puede ser beneficiosa en varios pacientes porque en algunas situaciones las células normalizadas tendrán una ventaja selectiva con respecto a las células enfermas. Sin embargo, incluso niveles modestos de precursores musculares con niveles elevados de distrofina funcional pueden ser beneficiosos para mejorar uno o más aspectos de DMD en pacientes. En algunos ejemplos, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 % o más de los precursores musculares en pacientes a quienes dichas células se les administran están produciendo niveles aumentados de distrofina funcional.
"Administrado" se refiere al suministro de una composición de células progenitoras a un sujeto mediante un método o vía que da lugar a la localización, al menos parcial, de la composición celular en un lugar deseado. Una composición celular puede administrarse por cualquier vía apropiada que dé como resultado un tratamiento eficaz en el sujeto, es decir, la administración tiene como resultado el suministro en un lugar deseado del sujeto en el que se suministró al menos una porción de la composición, es decir, se suministran al menos 1 x 104 células al sitio deseado durante un período de tiempo. Los modos de administración incluyen inyección, infusión, instilación o ingestión. "Inyección" incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracerebroespinal e intraesternal. En algunos ejemplos, la vía es intravenosa. Para el suministro de células, puede administrarse mediante inyección o infusión.
Las células se administran por vía sistémica. Las expresiones "administración sistémica" "administrado por vía sistémica", "administración periférica" y "administrada por vía periférica" se refieren a la administración de una población de células progenitoras de forma distinta a la directa en un sitio, tejido u órgano diana, de manera que entra, en cambio, en el sistema circulatorio del sujeto y, por lo tanto, está sujeto al metabolismo y otros procesos similares.
La eficacia de un tratamiento que comprende una composición para el tratamiento de la DMD puede ser determinada por el clínico experto. Sin embargo, un tratamiento se considera "tratamiento eficaz", si alguno o todos los signos o síntomas de, por poner solo un ejemplo, los niveles de distrofina funcional se alteran en una manera beneficiosa (p. ej., aumentados por al menos el 10 %), u otros síntomas clínicamente aceptados o marcadores de enfermedad se mejoran o aminoran. La eficacia también puede medirse por el hecho de que un individuo no empeore, evaluado mediante hospitalización o necesidad de intervenciones médicas (p. ej., reducción de la atrofia muscular o detención o, al menos, ralentización de la progresión de la enfermedad). Los métodos de medición de estos indicadores son conocidos por los expertos en la técnica y/o se describen en la presente memoria. El tratamiento incluye cualquier tratamiento de una enfermedad en un individuo o un animal (algunos ejemplos no limitantes incluyen un ser humano, o un mamífero) e incluye: (1) inhibir la enfermedad, p. ej., detener o ralentizar la progresión de los síntomas; o (2) aliviar la enfermedad, p. ej., provocar la regresión de los síntomas; y (3) prevenir o reducir la probabilidad del desarrollo de síntomas.
El tratamiento según la presente divulgación puede mejorar uno o más síntomas asociados a DMD aumentando la cantidad de distrofina funcional en el individuo. Los signos tempranos típicamente asociados a la DMD, incluyen por ejemplo, retraso en la marcha, agrandamiento del músculo de la pantorrilla (debido al tejido cicatricial) y caídas frecuentes. A medida que avanza la enfermedad, los niños quedan postrados en una silla de ruedas debido al desgaste muscular y al dolor. La enfermedad se vuelve potencialmente mortal debido a complicaciones cardíacas y/o respiratorias.
Kits
La presente divulgación proporciona kits para realizar los métodos descritos en la presente memoria. Un kit puede incluir uno o más ácidos nucleicos dirigidos al genoma, un polinucleótido que codifica un ácido nucleico dirigido al genoma, un polipéptido dirigido al sitio, un polinucleótido que codifica un polipéptido dirigido al sitio, y/o cualquier ácido nucleico o molécula proteinácea necesaria para realizar los aspectos de los métodos descritos en la presente memoria, o cualquier combinación de los mismos.
Un kit puede comprender: (1) un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ácido nucleico dirigido al genoma, y (2) el polipéptido dirigido al sitio o un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido dirigido al sitio, y (3) un reactivo para la reconstitución y/o dilución del vector o vectores y/o polipéptido.
Un kit puede comprender: (1) un vector que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un ácido nucleico dirigido al genoma, y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido dirigido al sitio y (2) un reactivo para la reconstitución y/o dilución del vector.
En algunos kits, el kit puede comprender un ácido nucleico guía de una sola molécula dirigido al genoma. En cualquiera de los kits anteriores, el kit puede comprender un ácido nucleico de doble molécula dirigido al genoma. En cualquiera de los kits, el kit puede comprender dos o más guías de molécula doble o guías de molécula única. Los kits pueden comprender un vector que codifica el ácido nucleico diana.
En cualquiera de los kits, el kit puede comprender además un polinucleótido que se insertará para efectuar la modificación genética deseada.
Los componentes de un kit pueden estar en envases separados o combinados en un único envase.
Cualquier kit puede comprender además uno o más reactivos adicionales, donde dichos reactivos adicionales se seleccionan de un tampón, un tampón para introducir un polipéptido o polinucleótido en una célula, un tampón de lavado, un reactivo de control, un vector de control, un polinucleótido de ARN de control, un reactivo para la producciónin vitrodel polipéptido a partir de ADN, adaptadores para secuenciación y similares. Un tampón puede ser un tampón de estabilización, un tampón reconstituyente, un tampón de dilución o similares. Un kit también puede incluir uno o más componentes que pueden usarse para facilitar o potenciar la unión a la diana o la escisión del ADN por la endonucleasa, o mejorar la especificidad del direccionamiento.
Además de los componentes mencionados, un kit puede comprender además instrucciones para usar los componentes del kit para practicar los métodos. Las instrucciones para practicar los métodos pueden registrarse en un medio de grabación adecuado. Por ejemplo, las instrucciones pueden imprimirse en un sustrato, tal como papel o plástico, etc. Las instrucciones pueden estar presentes en los kits como prospecto, en el etiquetado del envase del kit o componentes del mismo (es decir, asociado al envase o subenvase), etc. Las instrucciones pueden estar presentes como un archivo de datos de almacenamiento electrónico presente en un medio de almacenamiento legible por ordenador adecuado, por ejemplo, CD-ROM, disquete, unidad flash, etc. En algunos casos, las instrucciones reales no están presentes en el kit, sino que pueden proporcionarse medios para obtener las instrucciones de una fuente remota (p. ej., a través de Internet). Un ejemplo de este caso es un kit que incluye una dirección web en la que se pueden ver las instrucciones y/o desde la que se pueden descargar. Como en las instrucciones, este medio para obtener las instrucciones puede registrarse en un sustrato adecuado.
Guía de formulación de ARN
Los ARN guía de la presente divulgación pueden formularse con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como portadores, disolventes, estabilizantes, adyuvantes, diluyentes, etc., según el modo de administración particular y la forma farmacéutica. Las composiciones de ARN guía pueden formularse para alcanzar un pH fisiológicamente compatible, y oscilar entre un pH de aproximadamente 3 y un pH de aproximadamente 11, de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 7, dependiendo de la formulación y la vía de administración. En algunos casos, el pH puede ajustarse a un intervalo de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 8. En algunos casos, las composiciones pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un compuesto como se describe en la presente memoria, junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Opcionalmente, las composiciones pueden comprender una combinación de los compuestos descritos en la presente memoria, o pueden incluir un segundo principio activo útil en el tratamiento o la prevención del crecimiento bacteriano (por ejemplo y sin limitación, agentes antibacterianos o antimicrobianos), o pueden incluir una combinación de reactivos de la presente divulgación.
Los excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, moléculas portadoras que incluyen macromoléculas grandes de metabolización lenta, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácido poliglicólico, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas víricas inactivas. Otros excipientes de ejemplo pueden incluir antioxidantes (por ejemplo y sin limitación, ácido ascórbico), agentes quelantes (por ejemplo y sin limitación, EDTA), hidratos de carbono (por ejemplo y sin limitación, dextrina, hidroxialquilcelulosa e hidroxialquilmetilcelulosa), ácido esteárico, líquidos (por ejemplo y sin limitación, aceites, agua, solución salina, glicerol y etanol), agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y similares.
Otros posibles enfoques terapéuticos
La edición génica puede realizarse mediante nucleasas diseñadas para dirigirse a secuencias específicas. Hasta la fecha existen cuatro tipos principales de nucleasas: meganucleasas y sus derivados, nucleasas de dedos de cinc (ZFN), nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN) y sistemas de nucleasas CRISPR-Cas9. Las plataformas de nucleasas varían en dificultad de diseño, densidad de diana y modo de acción, sobre todo porque la especificidad de las ZFN y las TALEN se basa en las interacciones proteína-ADN, mientras que las interacciones ARN-ADN guían principalmente a Cas9. La escisión de Cas9 también requiere un motivo adyacente, el PAM, que difiere entre los diferentes sistemas de CRISPR. Cas9 deStreptococcus pyogenesse escinde usando un PAM de NGG, CRISPR deNeisseria meningitidispuede escindirse en sitios con PAM incluyendo NNNNGATT, NNNNN<g>T<t>T y NNNNGCTT. Otros ortólogos de Cas9 se dirigen al protoespaciador adyacente a PAM alternativos.
Pueden usarse endonucleasas CRISPR, tales como Cas9, en los métodos de la presente divulgación. Sin embargo, las enseñanzas descritas en la presente memoria, tales como los sitios diana terapéuticos, podrían aplicarse a otras formas de endonucleasas, tales como ZFN, TALEN, HE o MegaTAL, o usando combinaciones de nucleasas. Sin embargo, con el fin de aplicar las enseñanzas de la presente divulgación a dichas endonucleasas, se necesitaría, entre otras cosas, diseñar proteínas dirigidas a los sitios diana específicos.
Se pueden fusionar dominios de unión adicionales a la proteína Cas9 para aumentar su especificidad. Los sitios diana de estas construcciones se mapearían con el sitio especificado del ARNg identificado, pero requeriría motivos de unión adicionales, tales como para un dominio de dedos de cinc. En el caso de Mega-TAL, una meganucleasa puede fusionarse con un dominio de unión al ADN TALE. El dominio meganucleasa puede aumentar la especificidad y proporcionar la escisión. De manera similar, Cas9 inactivada o muerta (dCas9) puede fusionarse con un dominio de escisión y requiere el sitio diana de ARNgu/Cas9 y el sitio de unión adyacente para el dominio de unión a ADN fusionado. Esto requeriría probablemente cierta ingeniería proteínica de dCas9, además de la inactivación catalítica, para disminuir la unión sin el sitio de unión adicional
Nucleasas de dedos de cinc
Las nucleasas de dedo de cinc (ZFN) son proteínas modulares compuestas por un dominio de unión a ADN de dedos de cinc unido al dominio catalítico de la endonucleasa de tipo II Fokl. Debido a que FokI actúa sólo como un dímero, se debe diseñar un par de ZFN para que se unan a secuencias de "semisitio" diana afines en cadenas de ADN opuestas y con un espaciado preciso entre ellas para permitir que se forme el dímero FokI catalíticamente activo. Tras la dimerización del dominio FokI, que a su vez no tiene especificidad de secuencia en sí, se genera una rotura bicatenaria de ADN entre los semisitios de ZFN como la etapa inicial de la edición genómica.
El dominio de unión a ADN de cada ZFN suele estar compuesto por 3-6 dedos de cinc de la arquitectura Cys2-His2 abundante, reconociendo cada dedo principalmente un triplete de nucleótidos en una cadena de la secuencia de ADN diana, aunque la interacción entre cadenas con un cuarto nucleótido también puede ser importante. La alteración de los aminoácidos de un dedo en posiciones que establecen contactos clave con el ADN altera la especificidad de secuencia de un dedo determinado. Por lo tanto, una proteína de cuatro dedos de cinc reconocerá selectivamente una secuencia diana de 12 pb, donde la secuencia diana es un compuesto de las preferencias de triplete aportadas por cada dedo, aunque la preferencia de tripletes puede verse influida en mayor o menor medida por los dedos vecinos. Un aspecto importante de los ZFN es que pueden reorientarse fácilmente a casi cualquier dirección genómica simplemente modificando dedos individuales, aunque para hacerlo bien se requiere una experiencia considerable. En la mayoría de las aplicaciones de los ZFN, se usan proteínas de 4-6 dedos, que reconocen 12-18 pb respectivamente. Por lo tanto, un par de ZFN reconocerá normalmente una secuencia diana combinada de 24-36 pb, sin incluir el típico espaciador de 5-7 pb entre los semisitios. Los sitios de unión pueden separarse adicionalmente con espaciadores más grandes, incluyendo 15-17 pb. Es probable que una secuencia diana de esta longitud sea única en el genoma humano, suponiendo que las secuencias repetitivas o los genes homólogos se excluyan durante el proceso de diseño. No obstante, las interacciones proteína-ADN de la ZFN no son absolutamente específicas, por lo que se producen uniones y escisiones fuera de la diana, bien como heterodímero entre los dos ZFN, bien como homodímero de uno u otro de los ZFN. Esta última posibilidad se ha eliminado eficazmente mediante la ingeniería de la interfaz de dimerización del dominio FokI para crear variantes "más" y "menos", también conocidas como variantes heterodímeras obligadas, que sólo pueden dimerizarse entre sí, y no consigo mismas. Forzar el heterodímero obligatorio impide la formación del homodímero. Esto ha potenciado enormemente la especificidad de los ZFN, así como cualquier otra nucleasa que adopte estas variantes de Fokl.
Se han descrito diversos sistemas basados en ZFN, se publican periódicamente modificaciones de los mismos y numerosas referencias describen las reglas y parámetros que se usan para guiar el diseño de los ZFN; véase, p. ej., Segalet al., Proc Natl Acad Sci USA96(6):2758-63 (1999); Dreier Bet al., J Mol Biol.303(4):489-502 (2000); Liu Qet al., J Biol Chem.277(6):3850-6 (2002); Dreieret al., J Biol Chem280(42):35588-97 (2005); y Dreieret al., J Biol Chem.276(31):29466-78 (2001).
Nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN)
Las TALEN representan otro formato de nucleasas modulares por el que, como con los ZFN, un dominio de unión a ADN diseñado se une al dominio de la nucleasa Fokl, y un par de TALEN operan en tándem para lograr la escisión selectiva del ADN. La principal diferencia con respecto a las ZFN es la naturaleza del dominio de unión al ADN y las propiedades de reconocimiento de la secuencia de ADN diana asociada. El dominio de unión a ADN de TALEN deriva de las proteínas TALE, que se describieron originalmente en el patógeno bacteriano vegetalXanthomonas sp.Las TALE están formadas por matrices en tándem de 33-35 repeticiones de aminoácidos, cada repetición reconoce un único par de bases en la secuencia de ADN diana, que suele tener hasta 20 pb de longitud, proporcionando una longitud total de la secuencia diana de hasta 40 pb. La especificidad nucleotídica de cada repetición viene determinada por el diresiduo variable de repetición (RVD), que incluye sólo dos aminoácidos en las posiciones 12 y 13. Las bases guanina, adenina, citosina y timina son reconocidas predominantemente por los cuatro RVD: Asn-Asn, Asn-lle, His-Asp y Asn-Gly, respectivamente. Esto constituye un código de reconocimiento mucho más sencillo que el de los dedos de cinc y, por lo tanto, representa una ventaja sobre estos últimos para el diseño de nucleasas. No obstante, como con los ZFN, las interacciones proteína-ADN de las TALEN no son absolutas en su especificidad, y las TALEN también se han beneficiado del uso de variantes heterodímeras obligadas del dominio Fokl para reducir la actividad fuera de la diana.
Se han creado variantes adicionales del dominio Fokl que están desactivadas en su función catalítica. Si una mitad de un par TALEN o ZFN contiene un dominio Fokl inactivo, entonces sólo se producirá la escisión de una sola cadena de ADN monocatenario (mellado) en el sitio diana, en lugar de una DSB. El resultado es comparable al uso de mutantes "nicasa" de CRISPR/Cas9/Cpf1 en los que se ha desactivado uno de los dominios de escisión de Cas9. Las mellas de ADN pueden usarse para impulsar la edición genómica mediante HDR, pero con menor eficiencia que con una DSB. La principal ventaja es que las mellas fuera de la diana se reparan con rapidez y precisión, a diferencia de la DSB, que es propensa a la reparación errónea mediada por NHEJ.
Se han descrito diversos sistemas basados en TALEN y periódicamente se publican modificaciones de los mismos; véase,p. ej.,Boch,Science326(5959):1509-12 (2009); Maket al., Science335(6069):716-9 (2012); y Moscouet al., Science326(5959):1501 (2009). El uso de TALEN basado en la plataforma "Golden Gate", o esquema de clonación, ha sido descrito por múltiples grupos; véase,p. ej.,Cermaket al., Nucleic Acids Res.
39(12):e82 (2011); Liet al., Nucleic Acids Res.39(14):6315-25(2011); Weberet al., PLoS One.6(2):e16765 (2011); Wanget al., J Genet Genomics41 (6):339-47, Epub 17 de mayo de 2014 (2014); y Cermak Tet al., Methods Mol Biol.1239:133-59 (2015).
Endonucleasashoming
Las endonucleasashoming(de integración dirigida, HE, por sus siglas en inglés) son endonucleasas específicas de secuencia que tienen secuencias de reconocimiento largas (14-44 pares de bases) y escinden el ADN con gran especificidad, con frecuencia en sitios únicos del genoma. Se conocen al menos seis familias de HE clasificadas por su estructura, incluyendo LAGLIDADG (SEQ ID NO. 1.410.474), GIY-YIG, Caja His-Cis, H-N-H, PD-(D/E)xK y Vsr-like que derivan de una amplia gama de hospedadores, incluyendo eucariotas, protistas, bacterias, arqueas, cianobacterias y fagos. Al igual que con las ZFN y las TALEN, las HE pueden usarse para crear una DSB en un locus diana como etapa inicial en la edición genómica. Además, algunos HE naturales y artificiales cortan una sola cadena de ADN, actuando de este modo como nicasas específicas de sitio. La amplia secuencia diana de las HE y la especificidad que ofrecen las han convertido en candidatos atractivos para crear DSB específicas de sitio.
Se han descrito diversos sistemas basados en HE y periódicamente se publican modificaciones de los mismos; véase, p. ej., las revisiones de Steentoftet al., Glycobiology24(8):663-80 (2014); Belfort y Bonocora,Methods Mol Biol.1123:1-26 (2014); Hafez y Hausner,Genome55(8):553-69 (2012); y las referencias citadas en los mismos.
MegaTAL / Tev-mTALEN / MegaTev
Como ejemplos adicionales de nucleasas híbridas, la plataforma MegaTAL y la plataforma Tev-mTALEN usan una fusión de dominios TALE de unión al ADN y HE catalíticamente activas, aprovechando tanto la unión al ADN sintonizable como la especificidad de TALE, así como la especificidad de la secuencia de escisión de la HE; véase, p. ej., Boisselet al., NAR42: 2591-2601 (2014); Kleinstiveret al.,G34:1155-65 (2014); y Boissel y Scharenberg,Methods Mol. Biol.1239: 171-96 (2015).
En otra variación, la arquitectura MegaTev consiste en la fusión de una meganucleasa (Mega) con el dominio nucleasa derivado de la endonucleasa homóloga GIY-YIG I-Tevl (Tev). Los dos sitios activos están situados a ~30 pb de distancia en un sustrato de ADN y generan dos DSB con extremos cohesivos no compatibles; véase, p. ej., Wolfset al., NAR42, 8816-29 (2014). Se prevé que otras combinaciones de enfoques basados en nucleasas existentes evolucionarán y serán útiles para lograr las modificaciones genómicas específicas descritas en la presente memoria.
dCas9-Fokl o dCpf1-Fok1 y otras nucleasas
La combinación de las propiedades estructurales y funcionales de las plataformas de nucleasas descritas anteriormente ofrece un enfoque adicional para la edición genómica que puede superar potencialmente algunas de las deficiencias inherentes. Como ejemplo, el sistema de edición genómica CRISPR suele usar una única endonucleasa Cas9 para crear una DSB. La especificidad de la orientación viene determinada por una secuencia de 20 o 24 nucleótidos en el ARN guía que se empareja con el ADN diana mediante el emparejamiento de bases de Watson-Crick (más 2 bases adicionales en la secuencia de PAM NAG o NGG adyacente en el caso de Cas9 de S.pyogenes).Dicha secuencia es lo suficientemente larga como para ser única en el genoma humano, sin embargo, la especificidad de la interacción ARN/ADN no es absoluta, con una promiscuidad significativa en ocasiones tolerada, particularmente en la mitad 5' de la secuencia diana, reduciendo de este modo el número de bases que determinan la especificidad. Una solución ha sido desactivar por completo la función catalítica de Cas9 o Cpf1, conservando únicamente la función de unión a ADN guiada por ARN, y fusionar en su lugar un dominio FokI a la Cas9 desactivada; véase, p. ej., Tsaiet al., Nature Biotech32: 569-76 (2014); y Guilingeret al., Nature Biotech.32: 577-82 (2014). Debido a que FokI debe dimerizarse para ser catalíticamente activo, se necesitan dos ARN guía para unir dos fusiones de FokI en estrecha proximidad para formar el dímero y escindir el ADN. De este modo, se duplica el número de bases en los sitios diana combinados, aumentando de este modo el rigor del direccionamiento por parte de los sistemas basados en CRISPR.
Como otro ejemplo, la fusión del dominio de unión a ADN TALE con una HE catalíticamente activo, tal como I-Tevl, aprovecha tanto la unión al ADN sintonizable como la especificidad de TALE, así como la especificidad de secuencia de escisión de I-Tevl, con la esperanza de reducir aún más la escisión fuera de la diana.
Métodos y composiciones
En un primer método, el Método 1, la presente divulgación proporciona un método para editar un gen de la distrofina en una célula humana mediante edición genómica, comprendiendo el método la etapa de: introducir en la célula humana una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) para efectuar una o más roturas monocatenarias (SSB, por sus siglas en inglés) o roturas bicatenarias (DSB, por sus siglas en inglés) dentro o cerca del gen de la distrofina que da como resultado una deleción, inserción o reemplazo permanente de uno o más exones o sitios aceptores o donantes de corte y empalme intrónicos aberrantes dentro o cerca del gen de la distrofina y da como resultado el restablecimiento del marco de lectura de la distrofina y el restablecimiento de la actividad de la proteína distrofina.
En otro método, el Método 2, la presente divulgación proporciona un método para editar un gen de la distrofina en una célula humana mediante edición genómica, como se indica en el Método 1, en donde la célula humana es una célula muscular o una célula precursora muscular.
En otro método, el Método 3, la presente divulgación proporciona un métodoex vivopara tratar a un paciente con Distrofia muscular de Duchenne (DMD), comprendiendo el método las etapas de: i) crear una célula madre pluripotente inducida (iPSC, por sus siglas en inglés) específica para el paciente con DMD; ii) edición dentro o cerca de un gen de la distrofina de la iPSC; iii) diferenciación de la iPSC editada genómicamente en una célula progenitora muscular Pax7+; y iv) implantar la célula progenitora muscular Pax7+ en el paciente.
En otro método, el Método 4, la presente divulgación proporciona un métodoex vivopara tratar a un paciente con DMD, como se indica en el Método 3, en donde la etapa de creación comprende: a) aislar una célula somática del paciente; y b) introducir un conjunto de genes asociados a la pluripotencia en la célula somática para inducir a la célula somática a convertirse en una célula madre pluripotente.
En otro método, el Método 5, la presente divulgación proporciona un métodoex vivopara tratar a un paciente con DMD, como se indica en el Método 4, en donde la célula somática es un fibroblasto.
En otro método, el Método 6, la presente divulgación proporciona un métodoex vivopara tratar a un paciente con DMD, como se proporciona en los Métodos 4 y 5, en donde el conjunto de genes asociados a la pluripotencia es uno o más de los genes seleccionados del grupo que consiste en OCT4, SOX2, KLF4, Lin28, NANOG y cMYC.
En otro método, el Método 7, la presente divulgación proporciona un métodoex vivopara tratar a un paciente con DMD, como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 3-6, en donde la etapa de edición comprende introducir en la iPSC una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) para efectuar una o más roturas monocatenarias (SSB) o roturas bicatenarias (DSB) dentro o cerca del gen de la distrofina que da como resultado una deleción, inserción o reemplazo permanente de uno o más exones o sitios aceptores o donantes de corte y empalme intrónicos aberrantes dentro o cerca del gen de la distrofina y da como resultado el restablecimiento del marco de lectura de la distrofina y el restablecimiento de la actividad de la proteína distrofina.
En otro método, el Método 8, la presente divulgación proporciona un métodoex vivopara tratar a un paciente con DMD, como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 3-7, en donde la etapa de diferenciación comprende uno o más de los siguientes para diferenciar la iPSC editada genómicamente en una célula progenitora muscular Pax7+: poner en contacto las iPSC editadas genómicamente con formulaciones de medios específicas, incluyendo fármacos de molécula pequeña; sobreexpresión transgénica; o retirada de suero.
En otro método, el Método 9, la presente divulgación proporciona un métodoex vivopara tratar a un paciente con DMD, como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 3-8, en donde la etapa de implantación comprende implantar la célula progenitora muscular Pax7+ en el paciente mediante inyección local en el músculo deseado.
En otro método, el Método 10, la presente divulgación proporciona un métodoin vivopara tratar a un paciente con DMD, comprendiendo el método la etapa de editar un gen de la distrofina en una célula del paciente.
En otro método, el Método 11, la presente divulgación proporciona un métodoin vivopara tratar a un paciente con DMD, como se indica en el Método 10, en donde la etapa de edición comprende introducir en la célula del paciente una o más endonucleasas de ácido desoxirribonucleico (ADN) para efectuar una o más roturas monocatenarias (SSB) o roturas bicatenarias (DSB) dentro o cerca del gen de la distrofina que da como resultado una deleción, inserción o reemplazo permanente de uno o más exones o sitios aceptores o donantes de corte y empalme intrónicos aberrantes dentro o cerca del gen de la distrofina y da como resultado el restablecimiento del marco de lectura de la distrofina y el restablecimiento de la actividad de la proteína distrofina.
En otro método, el Método 12, la presente divulgación proporciona un métodoin vivopara tratar a un paciente con DMD, como se indica en el Método 11, en donde la célula es una célula muscular o célula precursora muscular.
En otro método, el Método 13, la presente divulgación proporciona un métodoin vivopara tratar a un paciente con DMD, como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 1, 7 y 11, en donde la una o más endonucleasas de ADN es una Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (también conocida como Csn1 y Csx12), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 o Cpf1; un homólogo de las mismas, una recombinación de la molécula de origen natural de las mismas, una versión con codones optimizados de las mismas, una versión modificada de las mismas y combinaciones de las mismas.
En otro método, el Método 14, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en el Método 13, en donde el método comprende introducir en la célula uno o más polinucleótidos que codifican la una o más endonucleasas de ADN.
En otro método, el Método 15, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en el Método 13, en donde el método comprende introducir en la célula uno o más ácidos ribonucleicos (ARN) que codifican la una o más endonucleasas de ADN.
En otro método, el Método 16, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en los Métodos 14 y 15, en donde el uno o más polinucleótidos o uno o más ARN son uno o más polinucleótidos modificados o uno o más ARN modificados.
En otro método, el Método 17, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en el Método 13, en donde la una o más endonucleasas de ADN son una o más proteínas o polipéptidos.
En otro método, el Método 18, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 1-17, en donde el método comprende además introducir en la célula uno o más ácidos ribonucleicos guía (ARNg).
En o tro m é todo , e l M é tod o 19, la p re se n te d ivu lg a c ió n p ro p o rc io n a un m é tod o co m o se p ro p o rc io n a en el Método 18, en donde el uno o más ARNg son ARN guía de molécula única (ARNgu).
En otro método, el Método 20, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en los Métodos 18 y 19, en donde el uno o más ARNg o uno o más ARNgu son uno o más ARNg modificados o uno o más ARNgu modificados.
En otro método, el Método 21, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 18-20, en donde la una o más endonucleasas de ADN se precomplejan con uno o más ARNg o uno o más ARNgu.
En otro método, el Método 22, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 1-21, en donde el método comprende además introducir en la célula un molde donante de polinucleótidos que comprende al menos una porción del gen de la distrofina de tipo silvestre o ADNc.
En otro método, el Método 23, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en el Método 22, en donde la al menos una porción del gen o ADNc de la distrofina de tipo silvestre incluye al menos una parte del exón 1, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón 6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10, exón 11, exón
12, exón 13, exón 14, exón 15, exón 16, exón 17, exón 18, exón 19, exón 20, exón 21, exón 22, exón 23, exón 24, exón 25, exón 26, exón 27, exón 28, exón 29, exón 30, exón 31, exón 32, exón 33, exón 34, exón 35, exón 36, exón 37, exón 38, exón 39, exón 40, exón 41, exón 42, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 47, exón 48, exón 49, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53, exón 54, exón 55, exón 56, exón 57, exón 58, exón 59, exón 60, exón 61, exón 62, exón 63, exón 64, exón 65, exón 66, exón 67, exón 68, exón 69, exón 70, exón 71, exón 72, exón 73, exón 74, exón 75, exón 76, exón 77, exón 78, exón 79, regiones intrónicas, regiones intrónicas sintéticas, fragmentos, combinaciones de los mismos o el gen de la distrofina entero o ADNc.
En otro método, el Método 24, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en el Método 22, en donde la al menos una porción del gen de la distrofina de tipo silvestre o ADNc incluye el exón
1, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón 6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10, exón 11, exón 12, exón 13, exón
14, exón 15, exón 16, exón 17, exón 18, exón 19, exón 20, exón 21, exón 22, exón 23, exón 24, exón 25, exón 26, exón 27, exón 28, exón 29, exón 30, exón 31, exón 32, exón 33, exón 34, exón 35, exón 36, exón 37, exón 38, exón 39, exón 40, exón 41, exón 42, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 47, exón 48, exón 49, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53, exón 54, exón 55, exón 56, exón 57, exón 58, exón 59, exón 60, exón 61, exón 62, exón 63, exón 64, exón 65, exón 66, exón 67, exón 68, exón 69, exón 70, exón 71, exón 72, exón 73, exón 74, exón 75, exón 76, exón 77, exón 78, exón 79, regiones intrónicas, regiones intrónicas sintéticas, fragmentos, combinaciones de los mismos o el gen de la distrofina entero o ADNc.
En otro método, el Método 25, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 22-24, en donde el molde donante es un polinucleótido monocatenario o bicatenario.
En otro método, el Método 26, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 1,7 y 11, en donde el método comprende además introducir en la célula uno o más ácidos ribonucleicos guía (ARNg), y en donde la una o más endonucleasas de ADN es una o más endonucleasas Cas9 o Cpf1 que efectúan un par de roturas monocatenarias (SSB) o roturas bicatenarias (DSB), la primera rotura SSB o DSB en un locus 5' y la segunda rotura SSB o DSB en un locus 3', que da como resultado una deleción permanente o reemplazo de uno o más exones o sitios aceptores o donantes de corte y empalme intrónicos aberrantes entre el locus 5' y el locus 3' dentro o cerca del gen de la distrofina y da como resultado el restablecimiento del marco de lectura de la distrofina y el restablecimiento de la actividad de la proteína distrofina.
En otro método, el Método 27, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en el Método 26, en donde un ARNg crea un par de SSB o DSB.
En otro método, el Método 28, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en el Método 26, en donde un ARNg comprende una secuencia espaciadora complementaria al locus 5', al locus 3' o a un segmento entre el locus 5' y el locus 3'.
En otro método, el Método 29, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en el Método 26, en donde el método comprende un primer ARNg y un segundo ARNg, en donde el primer ARNg comprende una secuencia espaciadora que es complementaria a un segmento del locus 5' y el segundo ARNg comprende una secuencia espaciadora que es complementaria a un segmento del locus 3'.
En otro método, el Método 30, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en los Métodos 26-29, en donde el uno o más ARNg son uno o más ARN guía de molécula única (ARNgu).
En o tro m é todo , el M é tod o 31, la p re se n te d ivu lg a c ió n p ro p o rc io n a un m é todo co m o se p ro p o rc io n a en los Métodos 26-30, en donde el uno o más ARNg o uno o más ARNgu son uno o más ARNg modificados o uno o más ARNgu modificados.
En otro método, el Método 32, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 26-31, en donde la una o más endonucleasas de ADN se precomplejan con uno o más ARNg o uno o más ARNgu.
En otro método, el Método 33, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 26-32, en donde existe una deleción del ADN cromosómico entre el locus 5' y el locus 3'.
En otro método, el Método 34, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 26-33, en donde la deleción es una deleción de exón único.
En otro método, el Método 35, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en el Método 34, en donde la deleción del exón único es una deleción del exón 2, exón 8, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52 o exón 53.
En otro método, el Método 36, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en los Métodos 34 o 35, en donde el locus 5' es proximal a un límite 5' de un exón único seleccionado del grupo que consiste en el exón 2, exón 8, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52 y exón 53. En otro método, el Método 37, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 34-36, en donde el locus 3' es proximal a un límite 3' de un exón único seleccionado del grupo que consiste en el exón 2, exón 8, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52 y exón 53.
En otro método, el Método 38, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 34-37, en donde el locus 5' es proximal a un límite 5' y el locus 3' es proximal al límite 3' de un exón único seleccionado del grupo que consiste en el exón 2, exón 8, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52 y exón 53.
En otro método, el Método 39, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 36-38, en donde proximal al límite del exón incluye los donantes y aceptores de corte y empalme circundantes del intrón vecino.
En otro método, el Método 40, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 26-33, en donde la deleción es una deleción de múltiples exones.
En otro método, el Método 41, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en el Método 40, en donde la deleción de múltiples exones es una deleción de los exones 45-53 o los exones 45-55. En otro método, el Método 42, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 40-41, en donde el locus 5' es proximal a un límite 5' de múltiples exones seleccionados del grupo que consiste en los exones 45-53 y los exones 45-55.
En otro método, el Método 43, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 40-42, en donde el locus 3' es proximal a un límite 3' de múltiples exones seleccionados del grupo que consiste en los exones 45-53 y los exones 45-55.
En otro método, el Método 44, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 40-43, en donde el locus 5' es proximal a un límite 5' y un locus 3' es proximal al límite 3' de múltiples exones seleccionados del grupo que consiste en los exones 45-53 y los exones 45-55. En otro método, el Método 45, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 42-44, en donde proximal al límite del exón incluye los donantes y aceptores de corte y empalme circundantes del intrón vecino.
En otro método, el Método 46, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 26-32, en donde se produce un reemplazo del ADN cromosómico entre el locus 5' y el locus 3'.
En otro método, el Método 47, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 26-32 y 46, en donde el reemplazo es un reemplazo de exón único.
En o tro m é todo , e l M é tod o 48, la p re se n te d ivu lg a c ió n p ro p o rc io n a un m é tod o co m o se p ro p o rc io n a en uno cualquiera de los Métodos 26-32 y 46-47, en donde el reemplazo del exón único es un reemplazo del exón 2, exón 8, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53 o exón 70.
En otro método, el Método 49, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 47-48, en donde el locus 5' es proximal a un límite 5' de un exón único seleccionado del grupo que consiste en el exón 2, exón 8, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53 o exón 70.
En otro método, el Método 50, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 47-49, en donde el locus 3' es proximal a un límite 3' de un exón único seleccionado del grupo que consiste en el exón 2, exón 8, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53 o exón 70.
En otro método, el Método 51, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 47-50, en donde el locus 5' es proximal a un límite 5' y un locus 3' es proximal al límite 3' de un exón único seleccionado del grupo que consiste en el exón 2, exón 8, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53 o exón 70.
En otro método, el Método 52, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 49-51, en donde proximal al límite del exón incluye los donantes y aceptores de corte y empalme circundantes del intrón vecino o del exón vecino.
En otro método, el Método 53, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 26-32 o 46, en donde el reemplazo es un reemplazo de múltiples exones.
En otro método, el Método 54, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera del Método 53, en donde el reemplazo de múltiples exones es un reemplazo de los exones 45-53 o los exones 45-55.
En otro método, el Método 55, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 53-54, en donde el locus 5' es proximal a un límite 5' de múltiples exones seleccionados del grupo que consiste en los exones 45-53 y los exones 45-55.
En otro método, el Método 56, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 53-55, en donde el locus 3' es proximal a un límite 3' de múltiples exones seleccionados del grupo que consiste en los exones 45-53 y los exones 45-55.
En otro método, el Método 57, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 53-56, en donde el locus 5' es proximal a un límite 5' y un locus 3' es proximal al límite 3' de múltiples exones seleccionados del grupo que consiste en los exones 45-53 y los exones 45-55.
En otro método, el Método 58, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 55-57, en donde proximal al límite del exón incluye los donantes y aceptores de corte y empalme circundantes del intrón vecino.
En otro método, el Método 59, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 46-58, en donde el método comprende además introducir en la célula un molde donante de polinucleótidos que comprende al menos una porción del gen de la distrofina de tipo silvestre o ADNc y el reemplazo es por reparación dirigida por homología (HDR).
En otro método, el Método 60, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera del Método 59, en donde la al menos una porción del gen o ADNc de la distrofina de tipo silvestre incluye al menos una parte del exón 1, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón 6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10, exón 11, exón 12, exón 13, exón 14, exón 15, exón 16, exón 17, exón 18, exón 19, exón 20, exón 21, exón 22, exón 23, exón 24, exón 25, exón 26, exón 27, exón 28, exón 29, exón 30, exón 31, exón 32, exón 33, exón 34, exón 35, exón 36, exón 37, exón 38, exón 39, exón 40, exón 41, exón 42, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 47, exón 48, exón 49, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53, exón 54, exón 55, exón 56, exón 57, exón 58, exón 59, exón 60, exón 61, exón 62, exón 63, exón 64, exón 65, exón 66, exón 67, exón 68, exón 69, exón 70, exón 71, exón 72, exón 73, exón 74, exón 75, exón 76, exón 77, exón 78, exón 79, regiones intrónicas, regiones intrónicas sintéticas, fragmentos, combinaciones de los mismos o el gen de la distrofina entero o ADNc.
En otro método, el Método 61, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera del Método 59, en donde la al menos una porción del gen de la distrofina de tipo silvestre o ADNc incluye el exón 1, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón 6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10, exón 11, exón 12, exón 13, exón 14, exón 15, exón 16, exón 17, exón 18, exón 19, exón 20, exón 21, exón 22, exón 23, exón 24, exón 25, exón 26, exón 27, exón 28, exón 29, exón 30, exón 31, exón 32, exón 33, exón 34, exón 35, exón 36, exón 37, exón 38, exón 39, exón 40, exón 41, exón 42, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 47, exón 48, exón 49, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53, exón 54, exón 55, exón 56, exón 57, exón 58, exón 59, exón 60, exón 61, exón 62, exón 63, exón 64, exón 65, exón 66, exón 67, exón 68, exón 69, exón 70, exón 71, exón 72, exón 73, exón 74, exón 75, exón 76, exón 77, exón 78, exón 79, regiones intrónicas, regiones intrónicas sintéticas, fragmentos, combinaciones de los mismos o el gen de la distrofina entero o ADNc.
En otro método, el Método 62, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 1,7 u 11, en donde el método comprende además introducir en la célula un ácido ribonucleico guía (ARNg) y un molde donante de polinucleótidos que comprende al menos una porción del gen de la distrofina de tipo silvestre, y en donde la una o más endonucleasas de ADN pueden ser una o más endonucleasas Cas9 o Cpf1 que efectúan una ruptura monocatenaria (SSB) o bicatenaria (DSB) en un locus dentro o cerca del gen de la distrofina que facilita la inserción de una nueva secuencia del molde donante de polinucleótidos en el ADN cromosómico en el locus que da como resultado la inserción permanente o corrección de uno o más exones o sitios aceptores o donantes de corte y empalme intrónicos aberrantes dentro o cerca del gen de la distrofina y da como resultado el restablecimiento del marco de lectura de la distrofina y el restablecimiento de la actividad de la proteína distrofina, y en donde el ARNg comprende una secuencia espaciadora que es complementaria a un segmento del locus.
En otro método, el Método 63, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 1, 7 u 11, en donde el método comprende además introducir en la célula uno o más ácidos ribonucleicos guía (ARNg) y un molde donante de polinucleótidos que comprende al menos una porción del gen de la distrofina de tipo silvestre, y en donde la una o más endonucleasas de ADN es una o más endonucleasas Cas9 o Cpf1 que efectúan un par de roturas monocatenarias (SSB) o roturas bicatenarias (DSB), la primera en un locus 5' y la segunda en un locus 3', dentro o cerca del gen de la distrofina que facilita la inserción de una nueva secuencia del molde donante de polinucleótidos en el ADN cromosómico entre el locus 5' y el locus 3' que da como resultado una inserción permanente o corrección de uno o más exones o sitios aceptores o donantes de corte y empalme intrónicos aberrantes entre el locus 5' y el locus 3' dentro o cerca del gen de la distrofina y da como resultado el restablecimiento del marco de lectura de la distrofina y el restablecimiento de la actividad de la proteína distrofina.
En otro método, el Método 64, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en el Método 63, en donde un ARNg crea un par de SSB o D<s>B.
En otro método, el Método 65, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en el Método 63, en donde un ARNg comprende una secuencia espaciadora complementaria al locus 5', el locus 3', o un segmento entre el locus 5' y el locus 3'.
En otro método, el Método 66, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en el Método 63, en donde el método comprende un primer ARNg y un segundo ARNg, en donde el primer ARNg comprende una secuencia espaciadora que es complementaria a un segmento del locus 5' y el segundo ARNg comprende una secuencia espaciadora que es complementaria a un segmento del locus 3'.
En otro método, el Método 67, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en los Métodos 62 o 63, en donde el uno o más ARNg son uno o más ARN guía de molécula única (ARNgu).
En otro método, el Método 68, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en los Métodos 62-63 o 67, en donde el uno o más ARNg o uno o más ARNgu son uno o más ARNg modificados o uno o más ARNgu modificados.
En otro método, el Método 69, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 62-63 o 67-68, en donde la una o más endonucleasas de ADN se precomplejan con uno o más ARNg o uno o más ARNgu.
En otro método, el Método 70, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 62-69, en donde la inserción es una inserción de exón único
En otro método, el Método 71, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en el Método 70, en donde la inserción de exón único es una inserción del exón 2, exón 8, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53 o exón 70.
En otro método, el Método 72, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 70-71, en donde el locus, el locus 5' o el locus 3' es proximal a un límite de un exón único seleccionado del grupo que consiste en el exón 2, exón 8, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53 y exón 70.
En otro método, el Método 73, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en el Método 72, en donde proximal al límite del exón incluye los donantes y aceptores de corte y empalme circundantes del intrón vecino o del exón vecino.
En otro método, el Método 74, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 62-69, en donde la inserción es una inserción de múltiples exones.
En otro método, el Método 75, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en el Método 74, en donde la inserción de múltiples exones es una inserción de los exones 45-53 o los exones 45 55.
En otro método, el Método 76, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 74-75, en donde el locus, el locus 5' o el locus 3' es proximal a un límite de múltiples exones seleccionados del grupo que consiste en los exones 45-53 o los exones 45-55.
En otro método, el Método 77, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en el Método 76, en donde proximal al límite del exón incluye los donantes y aceptores de corte y empalme circundantes del intrón vecino.
En otro método, el Método 78, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 62 o 63, en donde la al menos una porción del gen o ADNc de la distrofina de tipo silvestre incluye al menos una parte del exón 1, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón 6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10, exón 11, exón 12, exón 13, exón 14, exón 15, exón 16, exón 17, exón 18, exón 19, exón 20, exón 21, exón 22, exón 23, exón 24, exón 25, exón 26, exón 27, exón 28, exón 29, exón 30, exón 31, exón 32, exón 33, exón 34, exón 35, exón 36, exón 37, exón 38, exón 39, exón 40, exón 41, exón 42, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 47, exón 48, exón 49, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53, exón 54, exón 55, exón 56, exón 57, exón 58, exón 59, exón 60, exón 61, exón 62, exón 63, exón 64, exón 65, exón 66, exón 67, exón 68, exón 69, exón 70, exón 71, exón 72, exón 73, exón 74, exón 75, exón 76, exón 77, exón 78, exón 79, regiones intrónicas, regiones intrónicas sintéticas, fragmentos, combinaciones de los mismos o el gen de la distrofina entero o ADNc.
En otro método, el Método 79, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 62 o 63, en donde la al menos una porción del gen de la distrofina de tipo silvestre o ADNc incluye el exón 1, exón 2, exón 3, exón 4, exón 5, exón 6, exón 7, exón 8, exón 9, exón 10, exón 11, exón 12, exón 13, exón 14, exón 15, exón 16, exón 17, exón 18, exón 19, exón 20, exón 21, exón 22, exón 23, exón 24, exón 25, exón 26, exón 27, exón 28, exón 29, exón 30, exón 31, exón 32, exón 33, exón 34, exón 35, exón 36, exón 37, exón 38, exón 39, exón 40, exón 41, exón 42, exón 43, exón 44, exón 45, exón 46, exón 47, exón 48, exón 49, exón 50, exón 51, exón 52, exón 53, exón 54, exón 55, exón 56, exón 57, exón 58, exón 59, exón 60, exón 61, exón 62, exón 63, exón 64, exón 65, exón 66, exón 67, exón 68, exón 69, exón 70, exón 71, exón 72, exón 73, exón 74, exón 75, exón 76, exón 77, exón 78, exón 79, regiones intrónicas, regiones intrónicas sintéticas, fragmentos, combinaciones de los mismos o el gen de la distrofina entero o ADNc.
En otro método, el Método 80, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 62-79, en donde la inserción es mediante reparación dirigida por homología (HDR).
En otro método, el Método 81, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 62-80, en donde el molde donante es un polinucleótido monocatenario o bicatenario.
En otro método, el Método 82, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 26-81, en donde el ARNm de Cas9 o Cpf1, el ARNg y el molde donante se formulan cada uno en nanopartículas lipídicas separadas o pueden coformularse todos en una nanopartícula lipídica.
En otro método, el Método 83, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 26-81, en donde el ARNm de Cas9 o Cpf1 es formula en una nanopartícula lipídica y tanto el ARNg como el molde donante se suministran a la célula mediante un vector de virus adenoasociado (AAV).
En otro método, el Método 84, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 26-81, en donde el ARNm de Cas9 o Cpf1 se formular en una nanopartícula lipídica y el ARNg se suministra a la célula mediante electroporación y el molde donante se suministra a la célula mediante un vector de virus adenoasociado (AAV).
En otro método, el Método 85, la presente divulgación proporciona un método como se proporciona en uno cualquiera de los Métodos 1-84, en donde el gen de la distrofina se ubica en el Cromosoma X: 31.117.228 33.344.609 (Consorcio de Referencia del Genoma - GRCh38/hg38).
En una primera composición, la Composición 1, la presente divulgación proporciona uno o más ácidos ribonucleicos guía (ARNg) para editar un gen de la distrofina en una célula de un paciente con Distrofia muscular de Duchenne (DMD), el uno o más ARNg que comprenden una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de ácido nucleico en las SEQ ID NO: 1 - 1.410.472 del listado de secuencias.
En otra composición, la Composición 2, la presente divulgación proporciona el uno o más ARNg de la Composición 1, en donde el uno o más ARNg son uno o más ARN guía de molécula única (ARNgu).
En otra composición, la Composición 3, la presente divulgación proporciona el uno o más ARNg o ARNgu de las Composiciones 1 o 2, en donde el uno o más ARNg o uno o más ARNgu son uno o más ARNg modificados o uno o más ARNgu modificados.
Definiciones
La expresión "que comprende" o "comprende" se usa en referencia a las composiciones, métodos y respectivos componentes de los mismos, que son esenciales, pero abiertas a la inclusión de elementos no especificados, esenciales o no.
La expresión "que consiste esencialmente en" se refiere a los elementos necesarios para un aspecto dado. La expresión permite la presencia de elementos adicionales que no afecten materialmente a la una o más características básicas y novedosas o funcionales de ese aspecto.
La expresión "que consiste en" se refiere a las composiciones, métodos y respectivos componentes de los mismos como se describen en la presente memoria, que son exclusivos de cualquier elemento no citado en esa descripción del aspecto.
Las formas en singular "un", "una", y "el/la" incluyen las referencia en plural, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.
Cualquier intervalo numérico citado en esta memoria descriptiva describe todos los subintervalos de la misma precisión numérica (es decir, que tienen el mismo número de dígitos especificados) subsumidos dentro del intervalo citado. Por ejemplo, un intervalo citado de "1,0 a 10,0" describe todos los subintervalos entre (e incluyendo) el valor mínimo citado de 1,0 y el valor máximo citado de 10,0, tal como, por ejemplo, "de 2,4 a 7,6," aunque el intervalo de "2,4 a 7,6" no se mencione expresamente en el texto de la memoria descriptiva. Por consiguiente, el Solicitante se reserva el derecho de modificar esta memoria descriptiva, incluyendo las reivindicaciones, para citar expresamente cualquier subintervalo de la misma precisión numérica subsumido dentro de los intervalos expresamente citados en esta memoria descriptiva. Todos estos intervalos se describen de forma inherente en esta memoria descriptiva, de manera que la modificación para citar expresamente cualquiera de estos subintervalos cumplirá con la descripción escrita, la suficiencia de la descripción y los requisitos de materia añadida, incluyendo los requisitos establecidos a tenor de 35 U.S.C. § 112(a) y en el Artículo 123(2) de CPE. Además, a menos que se especifique expresamente o que el contexto exija otra cosa, todos los parámetros numéricos descritos en esta memoria descriptiva (como los que expresan valores, intervalos, cantidades, porcentajes y similares) pueden leerse como si estuvieran precedidos por la palabra "aproximadamente", aunque la palabra "aproximadamente" no aparezca expresamente delante de un número. Adicionalmente, los parámetros numéricos descritos en esta memoria descriptiva deben interpretarse a la luz del número de dígitos significativos indicados, la precisión numérica y mediante la aplicación de técnicas ordinarias de redondeo. También se entiende que los parámetros numéricos descritos en esta memoria descriptiva poseerán necesariamente la variabilidad inherente característica de las técnicas de medición subyacentes utilizadas para determinar el valor numérico del parámetro.
Ejemplos
La invención se entenderá más totalmente por referencia a los siguientes ejemplos, que proporcionan aspectos ilustrativos no limitantes de la invención.
Los ejemplos describen el uso del sistema de CRISPR como técnica ilustrativa de edición genómica para crear deleciones, inserciones o reemplazos genómicos terapéuticos definidos, denominadas colectivamente "modificaciones genómicas" en la presente memoria, en el gen de la distrofina (gen de la DMD) que conducen a la deleción permanente o la corrección de exones problemáticos del locus genómico que restablecen el marco de lectura de la distrofina y restablecen la actividad de la proteína distrofina.
Se seleccionaron ARNg individuales que abarcaban diferentes regiones del gen de la DMD y se sometió a ensayo su eficiencia de corte (Tabla 5). Los ARNg se dirigieron a exones, intrones y los aceptores de corte y empalme de múltiples áreas de interés en el gen de la DMD. La convención de nomenclatura para todos los ARNg analizados en el Ejemplo es: # (correspondiente al ARNg) - NN (proteína Cas: SP- S.pyogenes,SA- S.
aureus,NM-N. meningitides,ST- S.thermophiles,TD-T. denticola,Cpf1) - NN## (SA- Aceptor de corte y empalme, E- Exón, I- Intrón).
Tabla 5
Todos los ARNg sometidos a ensayo pueden usarse para un enfoque de edición basado en HDR/corrección. Pueden usarse ARNg únicos dirigidos a los aceptores de corte y empalme para inducir la omisión de exones y restablecer el marco de lectura del gen de la DMD. Pueden usarse pares seleccionados de ARNg para realizar deleciones en el gen de la DMD que restauren el marco de lectura. Pueden usarse pares seleccionados de ARNg para realizar deleciones que simulen las mutaciones de los pacientes y pueden usarse para generar líneas mutantes de DMD modelo.
Se evaluaron diversos ortólogos de Cas para el corte. Se suministraron SP, NM, ST, SA y ARNg de Cpf1 como ARN, se expresaron a partir del promotor U6 en plásmidos, o se expresaron a partir del promotor U6 en lentivirus. La proteína Cas correspondiente se insertó en la estirpe celular de interés y se expresó de forma constitutiva, se suministró como ARNm o se suministró como proteína. La actividad de los ARNg en todos los formatos mencionados anteriormente se evaluó mediante análisis TIDE o secuenciación de última generación en células HEK293T, células K562 o células madre pluripotentes inducidas (iPSC).
En general, se determinó que la mayoría de los ARNg sometidos a ensayo inducían el corte. Sin embargo, la cantidad de corte dependía en gran medida de la proteína Cas sometida a ensayo. Se descubrió que, generalmente, los ARNg de Cas9 de SP inducen los niveles más altos de corte, mientras que los ARNg de Cas9 de SA inducen el segundo nivel más alto de corte. Generalmente, es beneficioso seleccionar ARNg para su aplicación terapéutica que tengan la mayor eficiencia de corte posible. Sin embargo, para una terapia basada en iPSC, la eficiencia de corte no es tan importante. Las iPSC son altamente proliferativas y facilitan el aislamiento de una población clonal de células con la edición deseada, incluso cuando la eficiencia de la edición es inferior al 10 %.
La introducción de las modificaciones terapéuticas definidas descritas anteriormente representa una estrategia terapéutica novedosa para la mejora potencial de la DMD, como se describe e ilustra adicionalmente en la presente memoria.
Ejemplo 1 - Sitios diana de CRISPR/SPCas9 para el gen de la distrofina
Se exploraron regiones del gen de la distrofina para determinar sitios diana. Cada área se exploró para determinar un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) con la secuencia NRG. Se identificaron secuencias espaciadoras de 20 pb de ARNg correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NO: 1 - 467.030. Se identificaron secuencias espaciadoras de 19 pb de ARNg correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NO: 1.410.430 - 1.410.472 del listado de secuencias.
Ejemplo 2 - Sitios diana de CRISPR/SACas9 para el gen de la distrofina
Se exploraron regiones del gen de la distrofina para determinar sitios diana. Cada área se exploró para determinar un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) con la secuencia NNGRRT. Se identificaron secuencias espaciadoras de 20 pb de ARNg correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NO: 467.031 - 528.196 del listado de secuencias.
Ejemplo 3 - Sitios diana de CRISPR/STCas9 para el gen de la distrofina
Se exploraron regiones del gen de la distrofina para determinar sitios diana. Cada área se exploró para determinar un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) con la secuencia NNAGAAW. Se identificaron secuencias espaciadoras de 24 pb de ARNg correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NO: 528.197 - 553.198 del listado de secuencias.
Ejemplo 4 - Sitios diana de CRISPR/TDCas9 para el gen de la distrofina
Se exploraron regiones del gen de la distrofina para determinar sitios diana. Cada área se exploró para determinar un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) con la secuencia NAAAAC. Se identificaron secuencias espaciadoras de 24 pb de ARNg correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NO: 553.199 - 563.911 del listado de secuencias.
Ejemplo 5 - Sitios diana de CRISPR/NMCas9 para el gen de la distrofina
Se exploraron regiones del gen de la distrofina para determinar sitios diana. Cada área se exploró para determinar un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) con la secuencia NNNNGHTT. Se identificaron secuencias espaciadoras de 24 pb de ARNg correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NO: 563.912 - 627.854 y 1.410.400 - 1.410.402 del listado de secuencias.
Ejemplo 6 - Sitios diana de CRISPR/Cpf1 para el gen de la distrofina
Se exploraron regiones del gen de la distrofina para determinar sitios diana. Cada área se exploró para determinar un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) con la secuencia YTN. Se identificaron secuencias espaciadoras de 20-24 pb de ARNg correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NO: 627.855 -1.410.399 y 1.410.403 - 1.410.429 del Listado de secuencias.
Ejemplo 7 - Estrategias ilustrativas de edición genómica dirigidas al exón 2
Varios métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 2 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 2 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 2.
Ejemplo 8 - Estrategias ilustrativas de edición genómica dirigidas al exón 8
Varios métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 8 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 8 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 8.
Ejemplo 9 - Estrategias ilustrativas de edición genómica dirigidas al exón 43
Varios métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 43 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 43 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 43.
Ejemplo 10 - Estrategias ilustrativas de edición genómica dirigidas al exón 44
Varios métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 44 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 44 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 44.
Ejemplo 11 - Estrategias ilustrativas de edición genómica dirigidas al exón 45
Varios métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 45 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 45 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 45.
Ejemplo 12 - Estrategias ilustrativas de edición genómica dirigidas al exón 46
Varios métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 46 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 46 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 46.
Ejemplo 13 - Estrategias ilustrativas de edición genómica dirigidas al exón 50
Varios métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 50 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 50 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 50.
Ejemplo 14 - Estrategias ilustrativas de edición genómica dirigidas al exón 51
Varios métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 51 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 51 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 51.
Ejemplo 15 - Estrategias ilustrativas de edición genómica dirigidas al exón 52
Varios métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 52 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 52 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 52.
Ejemplo 16 - Estrategias ilustrativas de edición genómica dirigidas al exón 53
Varios métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 53 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 53 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 53.
Ejemplo 17 - Estrategias ilustrativas de edición genómica dirigidas al exón 70
Varios métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen el exón 70 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 70 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 70.
Ejemplo 18 - Estrategias ilustrativas de edición genómica dirigidas a los exones 45-53
Varios métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen los exones 45-53 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 45 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 53.
Ejemplo 19 - Estrategias ilustrativas de edición genómica dirigidas a los exones 45-55
Varios métodos proporcionan pares de ARNg que suprimen los exones 45-55 cortando el gen dos veces, cortando un ARNg en el extremo 5' del exón 45 y cortando el otro ARNg en el extremo 3' del exón 55.
Ejemplo 20 - Análisis bioinformático de las cadenas guía
Las guías candidatas se examinaron y se seleccionaron en un proceso de múltiples etapas que incluía tanto la unión teórica como la actividad evaluada experimentalmente. A modo de ilustración, las guías candidatas que tienen secuencias que coinciden con un determinado sitio en la diana, tal como un sitio dentro o cerca del gen de la distrofina, con PAM adyacentes pueden evaluarse para determinar su potencial para escindirse en sitios fuera de la diana que tengan secuencias similares, usando una o más de las diversas herramientas bioinformáticas disponibles para evaluar la unión fuera de la diana, como se describe e ilustra con más detalle a continuación, para evaluar la probabilidad de efectos en posiciones cromosómicas distintas de las previstas. Los candidatos con un potencial relativamente bajo de actividad fuera de la diana pueden evaluarse experimentalmente para medir su actividad en la diana y, a continuación, las actividades fuera de la diana en varios sitios. Las guías preferidas tienen una actividad sobre la diana suficientemente alta para lograr los niveles deseados de edición génica en el locus seleccionado, y una actividad fuera de la diana relativamente baja para reducir la probabilidad de alteraciones en otros locus cromosómicos. La relación entre la actividad en la diana y fuera de la diana con frecuencia se denomina "especificidad" de una guía.
Para el cribado inicial de las actividades fuera de la diana previstas, existen varias herramientas bioinformáticas conocidas y a disposición del público que pueden usarse para predecir los sitios más probables fuera de la diana; y puesto que la unión a los sitios diana en el sistema de nucleasas CRISPR/Cas9 es impulsada por el emparejamiento de bases Watson-Crick entre secuencias complementarias, el grado de disimilitud (y, por lo tanto, la reducción del potencial de unión fuera de la diana) está esencialmente relacionado con las diferencias de secuencia primaria: emparejamientos erróneos y protuberancias, es decir, bases que se cambian por una base no complementaria, e inserciones o deleciones de bases en el sitio potencial fuera de la diana con respecto al sitio diana. Una herramienta bioinformática de ejemplo llamada COSMID (Sitios fuera de la diana de CRISPR con emparejamientos erróneos, inserciones y deleciones, por sus siglas en inglés) (disponible en la web en crispr.bme.gatech.edu) recopila dichas similitudes. Otras herramientas bioinformáticas incluyen, pero no se limitan a, GUIDO, autoCOSMID y CCtop.
Se usó la bioinformática para minimizar la escisión fuera de la diana con el fin de reducir los efectos perjudiciales de las mutaciones y los reordenamientos cromosómicos. Los estudios sobre los sistemas de CRISPR/Cas9 sugirieron la posibilidad de una elevada actividad fuera de la diana debido a la hibridación inespecífica de la cadena guía con secuencias de ADN con emparejamientos erróneos de pares de bases y/o protuberancias, especialmente en posiciones distales de la región PAM. Por lo tanto, es importante contar con una herramienta bioinformática que pueda identificar posibles sitios fuera de la diana que tengan inserciones y/o deleciones entre la cadena guía de ARN y las secuencias genómicas, además de los emparejamientos erróneos de pares de bases. La herramienta basada en bioinformática, COSMID (Sitios fuera de la diana de CRISPR con emparejamientos erróneos, inserciones y deleciones) para buscar en los genomas posibles sitios fuera de la diana de CRISPR (disponible en la web en crispr.bme.gatech.edu). COSMID genera listas clasificadas de los posibles sitios fuera de la diana basándose en el número y la ubicación de emparejamientos erróneos, permitiendo una elección más informada de los sitios diana, y evitando el uso de sitios con mayor probabilidad de escisión fuera de la diana.
Se emplearon procedimientos bioinformáticos adicionales que ponderan la actividad estimada dentro y fuera de la diana de los sitios de direccionamiento de ARNg en una región. Otras características que pueden usarse para predecir la actividad incluyen información sobre el tipo de célula en cuestión, la accesibilidad del ADN, el estado de la cromatina, los sitios de unión de factores de transcripción, los datos de unión de factores de transcripción y otros datos de CHIP-seq. Se ponderan factores adicionales que predicen la eficiencia de edición, tales como las posiciones relativas y las direcciones de los pares de ARNg, las características locales de la secuencia y las microhomologías.
Ejemplo 21 - Ensayos de actividad en la diana de las guías preferidas en células
A continuación, se someterá a ensayo la actividad de los ARNg que presenten la menor actividad fuera de la diana en células epiteliales derivadas de un riñón embrionario humano, HEK 293T, mediante transfección transitoria y se evaluó la frecuencia de indel usando TIDE o secuenciación de última generación. TIDE es una herramienta web para evaluar rápidamente la edición genómica por CRISPR-Cas9 de un locus diana determinada por un ARN guía (ARNg o ARNgu). Basándose en los datos cuantitativos de rastreo de secuencias de dos reacciones convencionales de secuenciación capilar, el software TIDE cuantifica la eficacia de la edición e identifica los tipos predominantes de inserciones y deleciones (indels) en el ADN de un conjunto de células diana. Véase Brinkmanet al., Nucí. Acids Res.(2014) para una explicación detallada y ejemplos. La secuenciación de última generación (NGS, por sus siglas en inglés), también conocida como secuenciación de alto rendimiento, es la expresión genérica utilizada para describir una serie de tecnologías modernas de secuenciación diferentes incluyendo: secuenciación Illumina (Solexa), secuenciación Roche 454, torrente de iones: secuenciación protón/PGM y secuenciación SOLiD. Estas tecnologías recientes permiten secuenciar el ADN y el ARN de forma mucho más rápida y barata que la secuenciación Sanger utilizada anteriormente, por lo que han revolucionado el estudio de la genómica y la biología molecular. Las HEK 293T son un buen sistema modelo para la corrección génica en iPSC porque se sabe que ambos tipos celulares tienen estructuras de cromatina laxa.
La cromatina se organiza enrollándose en estructuras discretas llamadas nucleosomas. Este enrollamiento influye en la accesibilidad del material genómico a la maquinaria transcripcional. Las regiones del genoma que están abiertas se denominan eucromatina, mientras que las regiones de enrollamiento apretado se denominan heterocromatina. Es un paradigma bien aceptado que las células madre tienen una conformación de cromatina generalmente laxa y a medida que las células se diferencian en tipos celulares más especializados, determinadas regiones del genoma se cierran formando heterocromatina (Sims, R. J. y D. Reinberg (2009)."Stem ceíís: Escaping fates with open states". Nature460(7257): 802-803).
Ejemplo 22 - Ensayos en estirpes celulares modelo relevantes
Una vez evaluados individualmente todos los ARN guía e identificados los ARNg eficaces, todas las permutaciones de pares de ARNg se someterán a ensayo en estirpes celulares modelo relevantes para su capacidad de modificar la secuencia de ADN del gen de la distrofina que se predeciría para restablecer el marco de lectura de la distrofina. Se generaron estirpes celulares de mioblastos e iPSC con modificaciones similares o idénticas a las encontradas en las muestras de pacientes. Las células se tratan con las diferentes combinaciones individuales y por pares de ARNg y un molde de ADN donante, en su caso. Después, las muestras pueden evaluarse para el restablecimiento de la expresión de distrofina usando uno o más métodos biológicos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, un ensayo inmunoenzimático (ELISA) que reconoce específicamente el extremo C de la proteína distrofina (nótese que las proteínas truncadas no contienen un extremo C intacto). Los pares de ARNg que restablecen la expresión de la distrofina pueden entonces evaluarse más a fondo mediante una técnica biológica adicional, tal como transferencia Western para confirmar la expresión del tamaño apropiado de la proteína distrofina.
Ejemplo 23 - Ensayos de diferentes enfoques para la edición génica de HDR
Después de someter a ensayo la actividad de los ARNg tanto en la diana como fuera de la diana, se someterán a ensayo estrategias de corrección de exones e inserción para la edición génica de dHDR.
Para el enfoque de corrección de exones, el molde de ADN donante se proporcionará como un oligonucleótido monocatenario corto, un oligonucleótido bicatenario corto (secuencia de PAM intacta/secuencia de PAM mutada), una molécula larga de ADN monocatenario (secuencia de PAM intacta/secuencia de PAM mutada) o una molécula larga de ADN bicatenario (secuencia de PAM intacta/secuencia de PAM mutada). Además, el molde de ADN del donante será suministrado por AAV.
Para el enfoque de inserción de ADN, un ADN monocatenario o bicatenario que tiene brazos homólogos al locus Xp21.2 puede incluir 40 nt o más de un primer exón diana (el primer exón codificante) del gen de la distrofina, la secuencia de ADN codificante completa (CDS) del gen de la distrofina y 3'UTR del gen de la distrofina, y al menos 40 nt del siguiente intrón. El ADN monocatenario o bicatenario que tiene brazos homólogos al locus Xp21.2 puede incluir 80 nt o más de un primer exón diana (el primer exón codificante) del gen de la distrofina, la secuencia de ADN codificante completa (CDS) del gen de la distrofina y 3'UTR del gen de la distrofina, y al menos 80 nt del siguiente intrón. El ADN monocatenario o bicatenario que tiene brazos homólogos al locus Xp21.2 puede incluir 100 nt o más de un primer exón diana (el primer exón codificante) del gen de la distrofina, la secuencia de ADN codificante completa (CDS) del gen de la distrofina y 3'UTR del gen de la distrofina, y al menos 100 nt del siguiente intrón. El ADN monocatenario o bicatenario que tiene brazos homólogos al locus Xp21.2 puede incluir 150 nt o más del primer exón diana (el primer exón codificante) del gen de la distrofina, la secuencia de ADN codificante completa (CDS) del gen de la distrofina y 3'UTR del gen de la distrofina, y al menos 150 nt del siguiente intrón. El ADN monocatenario o bicatenario que tiene brazos homólogos al locus Xp21.2 puede incluir 300 nt o más del primer exón diana (el primer exón codificante) del gen de la distrofina, la secuencia de ADN codificante completa (CDS) del gen de la distrofina y 3'UTR del gen de la distrofina, y al menos 300 nt del siguiente intrón. El ADN monocatenario o bicatenario que tiene brazos homólogos al locus Xp21.2 puede incluir 400 nt o más del primer exón diana (el primer exón codificante) del gen de la distrofina, la CDS completa del gen de la distrofina y 3'UTR del gen de la distrofina, y al menos 400 nt del siguiente intrón. Como alternativa, el molde de ADN será suministrado por AAV.
Para el enfoque de inserción de ADNc, un ADNc monocatenario o bicatenario puede incluir 40 nt o más de un exón único diana del gen de la distrofina. El ADNc monocatenario o bicatenario puede incluir 80 nt o más de un exón único diana del gen de la distrofina. El ADNc monocatenario o bicatenario puede incluir 100 nt o más de un exón único diana del gen de la distrofina. El ADNc monocatenario o bicatenario puede incluir 150 nt o más de un exón único diana del gen de la distrofina. El ADNc monocatenario o bicatenario puede incluir 300 nt o más de un exón único diana del gen de la distrofina. El ADNc monocatenario o bicatenario puede incluir 400 nt o más de un exón único diana del gen de la distrofina. Como alternativa, el molde de ADN será suministrado por AAV.
Para el enfoque de inserción de ADNc, un ADNc monocatenario o bicatenario puede incluir 40 nt o más de una diana de exones múltiples del gen de la distrofina. El ADNc monocatenario o bicatenario puede incluir 80 nt o más de una diana de exones múltiples del gen de la distrofina. El ADNc monocatenario o bicatenario puede incluir 100 nt o más de una diana de exones múltiples del gen de la distrofina. El ADNc monocatenario o bicatenario puede incluir 150 nt o más de una diana de exones múltiples del gen de la distrofina. El ADNc monocatenario o bicatenario puede incluir 300 nt o más de una diana de exones múltiples del gen de la distrofina. El ADNc monocatenario o bicatenario puede incluir 400 nt o más de una diana de exones múltiples del gen de la distrofina. Como alternativa, el molde de ADN será suministrado por AAV.
Ejemplo 24 - Reevaluación de las combinaciones donantes de CRISPR-Cas9/ADN líderes
Después de someter a ensayo las distintas estrategias de edición génica de HDR, las combinaciones donantes de CRISPR-Cas9/ADN líderes se volverán a evaluar en células terapéuticamente relevantes para determinar la eficiencia de la deleción, la recombinación y la especificidad fuera de la diana. El ARNm de Cas9 o el RNP se formularán en nanopartículas lipídicas para su suministro, los ARNgu se formularán en nanopartículas o se suministrarán como AAV, y el ADN donante se formulará en nanopartículas o se suministrará como AAV.
Ejemplo 25 - Ensayoin vivoen modelo animal relevante
Una vez reevaluadas las combinaciones donantes de CRISPR-Cas9/ADN, las formulaciones líderes se someterán a ensayoin vivoen un modelo de ratón terapéuticamente relevante.
El cultivo en células humanas permite realizar ensayos directos en la diana humana y en el genoma humano de fondo, como se describió anteriormente.
Las evaluaciones preclínicas de eficacia y seguridad pueden observarse mediante el injerto de células humanas o de ratón modificadas en un modelo de ratón terapéuticamente relevante. Las células modificadas pueden observarse en los meses posteriores al injerto.
Ejemplo 26 - Eficiencia de corte de ARNg de S.pyogenesdirigidos a los Exones 45, 51,53, 55 y 70 del gen de la DMD
Se sometieron a ensayo ARNg de S.pyogenes(SP) dirigidos a los Exones 45, 51, 53, 55 y 70 del gen de la DMD (Figuras 3A - 3B). Cada uno de los Exones 45, 51,53, 55 y 70 puede editarse usando un enfoque basado en HDR/corrección.
Los ARNg de SP se clonaron en plásmidos que coexpresaban la proteína Cas de SP. Los plásmidos se transfectaron en células HEK293T usando lipofectamina 2000. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección, se aisló el ADN genómico y la eficiencia del corte se evaluó usando el análisis TIDE. Los datos se recopilaron a partir de un experimento que contenía 3-4 réplicas (N = 3 a 4). Los datos se representaron como media y EEM.
Los datos de las Figuras 3A-3B indican que la mayoría de los ARNg cortan con eficiencias superiores al 50 % en células HEK293T.
Ejemplo 27 - Eficiencia de corte de los ARNg dirigidos al aceptor de corte y empalme de los Exones 43, 44, 45, 46, 50, 51,52, 53 y 55 en el gen de la DMD
Una opción viable para tratar la DMD es inducir la omisión de exones para restablecer el marco de lectura del gen de la DMD. Para inducir la omisión de exones, el enfoque de edición génica debe eliminar la secuencia de AG justo en dirección 5' del exón que es reconocida por la maquinaria de corte y empalme endógena. Cuando un único ARNg induce una rotura bicatenaria, la célula reparará la rotura. Una fracción del tiempo, la maquinaria de reparación endógena cometerá un error e insertará o eliminará bases adyacentes al sitio de corte. Es probable que los ARNg que mutan la secuencia de AG induzcan la omisión de exones en este sitio, ya que la maquinaria de corte y empalme ya no podrá reconocer este sitio como aceptor de corte y empalme y saltará al siguiente aceptor de corte y empalme del exón vecino.
S.pyogenes(SP), S.aureus(SA), S.thermophiles(ST),N. Meningitidis(NM) y ARNg de Cpf1 se diseñaron y se sometieron a ensayo para el direccionamiento al aceptor de corte y empalme de los Exones 43, 44, 45, 46, 50, 51,52, 53 y 55 en el gen de la DMD (Figuras 4A, 4B y 4C).
Se diseñaron ARNg de SP para dirigirse al aceptor de corte y empalme de nueve exones del gen de la DMD. Los ARNg se encargaron como ARNg de ARN dividido a Integrated DNA Technologies (IDT). Los ARNg divididos se hibridaron con el ARNtrac siguiendo las instrucciones del fabricante. Después, los ARNg divididos hibridados se transfectaron en células HEK293T que expresaban de forma estable la proteína Cas9 de SP mediante RNAiMax. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección, se aisló el ADN genómico y la eficiencia del corte se evaluó usando el análisis TIDE (Figura 4A). Los datos se recopilaron entre dos experimentos independientes que contenían 3 réplicas cada uno (N = 2 a 6). Los datos se representaron como media y EEM.
Se diseñaron ARNg de NM, ST y SA para dirigirse al aceptor de corte y empalme de nueve exones. Los ARNg se clonaron en plásmidos que coexpresan la proteína Cas de interés junto con el ARNg correspondiente. Los plásmidos se transfectaron en células HEK293T usando lipofectamina 2000. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección, se aisló el ADN genómico y la eficiencia del corte se evaluó usando el análisis TIDE (Figura 4B). Los datos se recopilaron entre 2-4 experimentos independientes que contenían 3 réplicas cada uno (N = 6 a 12). Los datos se representaron como media y EEM.
Se diseñaron ARNg de Cpf1 para dirigirse al aceptor de corte y empalme de nueve exones del gen de la DMD. Los ARNg se clonaron en plásmidos que expresaban el ARNg. Se cotransfectaron HEK293T con el plásmido de gRNA de interés y un segundo plásmido que expresaba Cpf1 usando lipofectamina 2000. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección, se aisló el ADN genómico y la eficiencia del corte se evaluó usando el análisis TIDE (Figura 4C). Los datos se recopilaron entre dos experimentos independientes que contenían 3 réplicas cada uno (N = 3 a 6). Los datos se representaron como media y EEM.
Ejemplo 28 - Eficiencias de corte y eficiencias de inactivación de aceptores de corte y empalme de ARNg dirigidos a los Exones 43, 44, 45, 46, 50, 51,52, 53 y 55 en el gen de la DMD
Muchos de los ARNg dirigidos al aceptor de corte y empalme cortan eficazmente en el sitio de corte y empalme deseado. Para evaluar si el ARNg inactivaba eficazmente la secuencia de AG deseada, los amplicones de PCR alrededor del sitio de corte se sometieron a secuenciación de última generación. Se cuantificó el porcentaje de lecturas indel en las que se eliminó el sitio aceptor de corte y empalme (Figuras 5A-B y Figura 6). Se identificaron varios ARNg prometedores, incluyendo, pero sin limitación: 8-SA-SA55, 3-SP-SA45, 31-SP-SA50 y 40-SP-SA55 que eliminan el sitio aceptor de corte y empalme en una gran proporción de las lecturas.
Se diseñaron ARNg de S.pyogenesdirigidos al aceptor de corte y empalme de nueve exones del gen de la DMD. Los ARNg se encargaron como ARNg de ARN divididos a IDT. Los ARNg divididos se hibridaron con el ARNtrac siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ARNg divididos hibridados se transfectaron en células HEK293T que expresaban de forma estable la proteína Cas9 de S.pyogenesmediante RNAiMax. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección, se aisló el ADN genómico y los amplicones de PCR de 100 250 pb que rodeaban los aceptores de corte y empalme deseados se sometieron a secuenciación de última generación. Los datos se recopilaron entre dos experimentos independientes conteniendo cada uno 3 réplicas (N = 6). Los promedios se presentaron como promedios poblacionales (Figuras 5A-B).
Se diseñaron ARNg deN. meningitides(NM), S.thermophiles(ST) y S.aureus(SA) para dirigirse el aceptor de corte y empalme de nueve exones. Los ARNg se clonaron en plásmidos que coexpresan la proteína Cas de interés junto con el ARNg correspondiente. Los plásmidos se transfectaron en células HEK293T usando lipofectamina 2000. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección, se aisló el ADN genómico y los amplicones de PCR de 100-250 pb que rodeaban los aceptores de corte y empalme deseados se sometieron a secuenciación de última generación. Los datos se recopilaron entre dos experimentos independientes conteniendo cada uno 3 réplicas (N = 6). Los promedios se presentaron como promedios poblacionales (Figura 6).
Ejemplo 29 - Eficiencia de corte de los ARNg dirigidos a las regiones que rodean los Exones 44, 45, 52 y 54 del gen de la DMD
Para evaluar eficazmente los enfoques de edición, es importante acceder a estirpes celulares de pacientes para realizar ensayosin vitro.Sin embargo, el material del paciente puede ser de difícil acceso y puede haber una gran variación entre las muestras de un paciente a otro. Por lo tanto, era importante crear estirpes celulares mutantes de DMD que imitaran las mutaciones comunes de los pacientes. Esto permite al investigador someter a ensayo la eficacia de una estrategia de reparación en el mismo fondo para garantizar que las variaciones en la eficiencia de la edición no sean específicas de paciente. Para abordarlo, se diseñó una diversidad de ARNg que pueden emparejarse para crear deleciones comunes encontradas en pacientes con DMD (A52, A44, A45 y A54). Las estirpes celulares resultantes pueden corregirse usando un enfoque de HDR o de omisión de exones. Es importante tener en cuenta, que estos ARNg pueden usarse tanto para la creación de la línea modelo como para una corrección basada en HDR de las mutaciones de interés.
La región (100 pb - 1 kb en dirección 5' y en dirección 3' del exón de interés) se examinó usando el software de diseño de ARNg. Se seleccionaron los 6 mejores ARNg dependiendo del menor número de efectos fuera de diana previstos a cada lado del exón de interés (como los Exones 44, 45, 52 y 54 del gen de la DMD). Los ARNg se evaluaron en primer lugar en HEK293T para la eficiencia de corte (Figuras 7A-7B) y se confirmaron para la eficiencia de corte en iPSC (Figuras 8A - 8B).
Se seleccionaron ARNg individuales de S.pyogenesalrededor de los exones 44, 45, 52 y 54. Los ARNg se encargaron como ARNg divididos a IDT. Los ARNg divididos se hibridaron con la secuencia indicadora siguiendo las instrucciones del fabricante.
Los ARNg hibridados se transfectaron en células HEK293T que expresaban de forma estable la proteína Cas9 de SP usando RNAiMax. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección, se aisló el ADN genómico y la eficiencia del corte se evaluó usando el análisis TIDE (Figuras 7A-7B). Los datos se recopilaron a partir de un experimento con 3 réplicas cada uno (N = 1 a 3). Los datos se representaron como media y EEM.
Posteriormente, los ARNg hibridados se complejaron con la proteína Cas9 para formar un complejo ribonucleoproteico (RNP, por sus siglas en inglés). Los RNP se transfectaron en iPSC (DiPS 1016SevA) usando RNAiMax. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección, se aisló el ADN genómico y la eficiencia del corte se evaluó usando el análisis TIDE (Figura 8A-8B). Los datos se recopilaron a partir de un experimento con 3 réplicas (N = 1 a 3). Los datos se representaron como media y EEM.
Se seleccionaron ARNg individuales de S.pyogenesalrededor de los exones 44, 45, 52 y 54. Los ARNg se encargaron como ARNg divididos a IDT. Los ARNg divididos se hibridaron con la secuencia indicadora siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ARNg se transfectaron en células HEK293T que expresaban de forma estable la proteína Cas9 de SP usando RNAiMax. Los mismos ARNg se complejaron con la proteína Cas9 para formar un complejo ribonucleoproteico (RNP, por sus siglas en inglés). Los RNP se transfectaron en iPSC (DiPS 1016SevA) usando RNAiMax. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección, se aisló el ADN genómico y se evaluó el corte usando el análisis TIDE. Los datos se recopilaron de múltiples experimentos. Sólo se representaron los valores promedio.
Hubo una alta correlación entre la eficiencia de edición en células HEK293T y iPSC con un coeficiente de correlación de Pearson de 0,51 en general. En este sentido, el cribado en células HEK293T se consideró un buen sustituto de la estirpe celular terapéutica de interés: las iPSC (Figura 9).
Ejemplo 30 - Análisis clonal de eventos de deleción clonal
Se identificaron ARNg con eficiencias de corte superiores al 20 % en iPSC en cada intrón de interés excepto en el intrón 55. Se seleccionaron los ARNg individuales con las mejores eficiencias de corte para realizar las deleciones deseadas.
Se usaron dos pares de ARNg para crear estirpes celulares clonales A52 (1-SP-I52 2-SP-I53 y 2-SP-I52 2-SP-I53). De un total de 261 clones cribados, 57 tenían la deleción deseada, como se comprobó mediante análisis por PCR (Figuras 10A, 10C).
Para confirmar la presencia de la deleción A52 esperada, se recogió ADN genómico de cada clon de interés. Se diseñaron cebadores de PCR flanqueando la deleción. Puesto que la deleción era pequeña (< 900 pb), se pudo usar un único par de cebadores para detectar la deleción. Esto daría como resultado una banda de deleción más pequeña (~ 500 pb) o una banda de tipo silvestre (WT, por sus siglas en inglés) (~ 1000 pb). En la Figura 10A se muestra un gel representativo del producto de deleción (del) o de tipo silvestre (WT).
La deleción incluso se confirmó en siete clones sometiendo el producto de PCR de deleción a secuenciación Sanger (7/7 clones tenían el evento de deleción predicho con pequeñas inserciones y deleciones (Figuras 11A-B). Las bandas de deleción de siete clones (PCR generadas en la Figura 8A) se prepararon en gel y se sometieron a secuenciación Sanger. Se secuenciaron dos clones creados usando los ARNg 1-SP-I52 y 2-SP-I53 y se alinearon con el producto de deleción previsto (suponiendo que Cas9 de S.pyogenescorta 3BP del extremo 3' del ARNg (Figura 11A). Se secuenciaron cinco clones creados usando los ARNg 2-SP-I52 y 2-SP-I53 y se alinearon con el producto de deleción previsto (suponiendo que Cas9 de S.pyogenescorta 3BP del extremo 3' del ARNg (Figura 11B).
De manera similar, se usaron dos pares de ARNg para crear estirpes celulares clónales A44 (2-SP-I44 3-SP-I45 y 2-SP-I44 4-SP-I45). De un total de 256 clones cribados, 16 tenían la deleción deseada, como se comprobó mediante análisis por PCR (Figuras 10B, 10C).
Para confirmar la presencia de la deleción A44 esperada, se recogió ADN genómico de cada clon de interés. Puesto que los ARNg A44 producen una deleción mayor en comparación con los ARNg A52, se diseñaron dos pares de cebadores de PCR para detectar una banda de deleción o una banda de WT. La banda esperada de la deleción era de ~400 pb y la banda esperada de WT era de ~500 pb. Un gel representativo de la deleción (del), el producto de tipo silvestre (WT+) y una muestra negativa amplificada con los cebadores de tipo silvestre (WT-) se muestra en la Figura 10B.
Ejemplo 31 - Cribado lentivírico
Para identificar un amplio espectro de pares de ARNg capaces de inducir la omisión del Exón51, se realizó un cribado lentivírico a gran escala. La secuencia genómica de Intrón 51 e Intrón 52 se sometió a análisis usando un programa informático de diseño de ARNg. La lista resultante de ARNg se redujo a aproximadamente 3000 ARNg izquierdos y 3000 derechos adyacentes al aceptor de corte y empalme del Exón 51. La lista se redujo basándose en la unicidad de la secuencia (sólo se cribaron los ARNg que no tenían una correspondencia perfecta en otra parte del genoma) y de los valores fuera de la diana predichos mínimos. Un ARNg izquierdo emparejado con un ARNg derecho debería inducir la omisión del Exón 51. Los 6000 ARNg se clonaron en un vector lentivírico que expresaba cada gRNA de interés a partir del promotor U6 y confiere resistencia a la puromicina. Se transdujeron células K562 con el virus a una MOI 2 y se seleccionaron con puromicina para obtener una población de células que expresaron un ARNg de interés. Después, estas células se nucleofectaron con ARNm de Cas9 para inducir un período transitorio de corte. Después de 7 días, las células se precipitaron y se extrajo el ADN genómico. El ADN genómico se enriqueció para la región de interés alrededor del Exón 51 usando captura híbrida. El ADN enriquecido se sometió a secuenciación de última generación (Figuras 19A - 19VV).
Ejemplo 32 - Cribado de ARNg transcritoin vitro(IVT)
Para identificar un amplio espectro de pares de ARNg capaces de inducir la omisión del Exón 45, se realizó un cribado de ARNg transcritoin vitro(IVT). La secuencia genómica de Intrón 45 e Intrón 46 se sometió a análisis usando un programa informático de diseño de ARNg. La lista resultante de ARNg se redujo a aproximadamente 100 ARNg izquierdos y aproximadamente 100 ARNg derechos basándose en la unicidad de la secuencia (sólo se cribaron los ARNg que no tenían una correspondencia perfecta en otra parte del genoma) y de los valores fuera de la diana predichos mínimos. Este conjunto de ARNg se transcribióin vitroy se transfectó usando el mensajero Max en células HEK293T que expresaban Cas9 de forma estable. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección, se aisló el ADN genómico y la eficiencia del corte se evaluó usando el análisis TIDE. (Figuras 12A-E). Se descubrió que aproximadamente el 18 % de los ARNg sometidos a ensayo inducían eficiencias de corte superiores al 50 %.
Ejemplo 33 - Inactivación de ADNc parcial entre los Exones 45-55 del gen de la DMD
Otro enfoque para corregir el gen de la DMD es una inactivación de ADNc parcial. Como prueba de principio, se realizó un estudio para reemplazar la región Exón 45-55 del gen de la DMD (que podría tratar hasta el 62 % de los pacientes con DMD). El ADNc del Exón 45-55 es de 3,2 kb. Para el corte se usaron dos ARNg sintetizados en fase sólida [uno en el Exón 45 (SEQ ID NO. 1410449) y un segundo en el Exón 55 (SEQ ID NO 114738)] de Trilink. Los dos ARNg de trilink se complejaron con la proteína Cas9 y se nucleofectaron en iPSC junto con un plásmido donante. El plásmido donante se diseñó con un casete de 3,2 kb (el mismo tamaño que la inactivación de ADNc deseado) que expresaba GFP constitutivamente con brazos de homología de 1 kb a cada lado para inducir la integración en el sitio del Exón 45 a 55. Las células se rastrearon durante 23 días. Todas las condiciones experimentales se nucleofectaron con alta eficiencia (más del 60 %); sin embargo, sólo la expresión de GFP de las células que recibieron el donante y el ARNg se estabilizó con el tiempo, lo que indica que la HDR se produjo en aproximadamente el 16 % de las células (Figura 13A). Se aisló el ADN genómico de estas muestras y se sometió a ensayo para la integración específica de sitio de la construcción donante. Las muestras se amplificaron con cebadores específicos del alelo de WT o del alelo de inactivación deseado. Como cabía esperar, pudieron detectarse tanto el alelo de WT como el de inactivación (Figura 13B).
Ejemplo 34 - Proteína distrofina internamente suprimida pero funcional
Como prueba de concepto, se demostró que se puede editar en iPSC, aislar una población clonal de células editadas y diferenciar esas células en el linaje miogénico para producir una proteína distrofina funcional, aunque con una deleción interna.
Un método atractivo para corregir el gen de la DMD es crear una deleción A45-55. Esta deleción mantiene el marco de lectura de DMD y puede restablecer la expresión de distrofina en aproximadamente el 62 % de pacientes con DMD. Para crear la deleción A45-55 deseada, se clonaron dos ARNg de SP publicados (CR6: SEQ ID NO: 1.410.475 y CR36: SEQ ID NO: 91033) en plásmidos que también expresan proteína fluorescente naranja (OFP) T2A de Cas9 de SP.
Estos dos plásmidos se transfectaron conjuntamente en iPSC usando el reactivo de transfección Mirus LT1. Dos días después, las células que expresaban Cas9, como indicaba la expresión de OFP, se aislaron usando clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Las células se sembraron a baja densidad y se dejaron crecer durante 7-10 días hasta que aparecieron clones unicelulares en las placas. Los clones se recogieron manualmente al microscopio y se transfirieron a placas de 96 pocillos. Una vez que las células alcanzaron la confluencia, se hicieron pases 1:2 de las muestras y se aisló ADN genómico de las células restantes.
Para identificar clones con la deleción deseada, se diseñó un ensayo de PCR de tres cebadores (Figuras 14A y 14B). El ensayo permite la detección de una banda de tipo silvestre (WT) y una banda de deleción en la misma reacción de PCR. Usando este ensayo, se identificaron 26/100 clones que tenían el evento de edición (Figura 14C).
Para validar adicionalmente que los clones tenían la deleción A45-55 deseada, se enviaron 5 clones para secuenciación Sanger. Se confirmó que los cinco tenían el evento de deleción deseado. Un clon tenía una inserción y otro una deleción de un solo par de bases. Los otros tres clones contenían eventos de deleción perfectos (Figura 15).
Los cinco clones que se secuenciaron, también se sometieron a cariotipado y se encontraron cariotípicamente normales. Además, todos los clones mantuvieron la pluripotencia y se tiñeron en más del 99 % de positivo tanto para SSEA-4 como para TRA-160 (Figuras 16A-B).
Después, cuatro de los clones se diferenciaron en mitotubos siguiendo el protocolo publicado por Chalet al.
[Chalet al.(2015)Differentiation of Pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne Muscular Dystrophy. Nature Biotechnology]para inducir la expresión de distrofina. Se recogieron muestras para transferencia Western e inmunohistoquímica. Los cinco clones editados indujeron la expresión de una proteína distrofina suprimida internamente (Figura 17). Los tamaños se compararon con la proteína aislada de células HEK293T transfectadas con plásmidos de ADNc de control que expresan la proteína distrofina WT o la proteína distrofina A45-55. Las células diferenciadas produjeron miotubos fenotípicamente, como demostró la tinción de la cadena pesada de miosina. En la Figura 18 se muestra una imagen representativa del Clon 56 diferenciado.
Nota sobre los aspectos ilustrativos
Aunque la presente divulgación proporciona descripciones de diversos aspectos específicos con el fin de ilustrar diversos aspectos de la presente invención y/o sus aplicaciones potenciales, se entiende que a los expertos en la técnica se les ocurrirán variaciones y modificaciones. Por consiguiente, la invención o invenciones descritas en la presente memoria deben entenderse al menos tan amplias como se reivindican, y no tan estrechamente definidas por aspectos ilustrativos particulares proporcionados en la presente memoria.
Cualquier patente, publicación u otro material de divulgación identificado en la presente memoria se incorpora por referencia a esta memoria descriptiva en su totalidad a menos que se indique lo contrario, pero sólo en la medida en que el material incorporado no entre en conflicto con las descripciones, definiciones, declaraciones u otro material de divulgación existente expresamente expuesto en esta memoria descriptiva. Como tal, y en la medida necesaria, la divulgación expresa como se expone en esta memoria descriptiva sustituye a cualquier material contradictorio incorporado por referencia. Cualquier material o porción del mismo, que se dice incorporado por referencia en esta memoria descriptiva, pero que entra en conflicto con las definiciones, declaraciones u otro material de divulgación existente expuesto en la presente memoria, sólo se incorpora en la medida en que no surja ningún conflicto entre ese material incorporado y el material de divulgación existente. Los solicitantes se reservan el derecho de modificar esta memoria descriptiva para citar expresamente cualquier materia objeto o porción de la misma, incorporada por referencia en la presente memoria. Las referencias a los métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía o métodos de diagnósticoin vivoen los ejemplos descritos en la presente memoria han de interpretarse como referencias a compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en dichos métodos.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un ARN guía (ARNg) para su uso en el tratamiento de un paciente con Distrofia muscular de Duchenne, en donde el ARNg comprende una secuencia espaciadora que comprende una versión de ARN de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1410445.
2. El ARNg para su uso según la reivindicación 1, donde la secuencia espaciadora comprende de 19 nucleótidos a 25 nucleótidos.
3. El ARNg para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde la secuencia espaciadora consiste en la versión de ARN de la SEQ ID NO: 1410445.
4. El ARNg para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el ARNg es un ARNg de molécula única (ARNgu) y/o el ARNg es un ARNg modificado.
5. El ARNg para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además una secuencia de extensión espaciadora opcional, una secuencia de repeticiones de CRISPR mínima, una secuencia de ARNtracr mínima, una secuencia de ARNtracr 3' y una secuencia opcional de extensión de ARNtracr.
6. El ARNg para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se precompleja con una endonucleasa Cas9, opcionalmente en donde la endonucleasa Cas9 comprende una señal de localización nuclear.
7. Un ácido nucleico para su uso en el tratamiento de un paciente con Distrofia muscular de Duchenne, en donde el ácido nucleico codifica el ARNg según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
8. Una composición de ácido nucleico para su uso en el tratamiento de un paciente con Distrofia muscular de Duchenne, en donde la composición de ácido nucleico comprende el ácido nucleico de la reivindicación 7 y un segundo ácido nucleico que codifica una endonucleasa Cas9, opcionalmente en donde la endonucleasa Cas9 comprende una señal de localización nuclear, y opcionalmente en donde la endonucleasa Cas9 es una endonucleasa Cas9 deStreptococcus pyogenes.
9. El ácido nucleico o composición de ácido nucleico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, que se suministra a la célula mediante un vector vírico.
10. El ácido nucleico o composición de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 9, en donde el vector vírico es un vector de virus adenoasociado (AAV), opcionalmente, el vector de AAV es un vector de AAV9.
11. El ARNg para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el ácido nucleico para su uso según la reivindicación 7, o la composición de ácido nucleico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde tratar al paciente con Distrofia Muscular Duchenne comprende editar un gen de la distrofina en una célula del paciente.
12. El ARNg, ácido nucleico o composición de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 11, en donde la célula es una célula muscular o una célula precursora muscular.
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