ES3041720T3 - Use of long-acting glp-1 peptides - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al uso de péptidos GLP-1 de acción prolongada en ciertos regímenes de dosificación para el tratamiento de la diabetes tipo 2, la obesidad, etc. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCION

Uso de péptidos de GLP-1 de acción prolongada

La presente invención se refiere a usos mejorados de péptidos de GLP-1 en terapia.

Resumen de la invención

La invención se refiere al agonista de GLP-1 semaglutida en una composición farmacéutica para su uso en la prevención o tratamiento de la diabetes tipo 2, en donde dicho agonista de GLP-1 se administra una vez a la semana en una cantidad de 1,0 mg, y en donde dicho agonista de GLP-1 se administra mediante administración parenteral.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el cambio en HbA1c después de la administración subcutánea de placebo, semaglutida o liraglutida a sujetos humanos. *p<0,05 frente al placebo; **p<0,001 frente al placebo (basado en medias ajustadas). Los valores iniciales son solo para información: los datos se ajustan al modelo para la HbA1c inicial. Los datos son medias LS ajustadas por modelo, FAS LOCF. Las estimaciones son de un modelo ANOVA con tratamiento, país y tratamiento previo como efectos fijos y HbA1c inicial como covariable.

La Figura 2 muestra el cambio medio en HbA1c desde el inicio frente al tiempo; los datos son la media (1,96SE), FAS LOCF. Los tratamientos son placebo (A); semaglutida 0,1 mg (B, línea discontinua), 0,2 mg (C), 0,4 mg (D), 0,8 mg (E), 0,8 mg T (F, línea discontinua), 1,6 mg T (G); liraglutida 1,2 mg (H), 1,8 mg (I).

La Figura 3 muestra sujetos que alcanzan los criterios de AACE o ADA para el control glucémico. El número de pacientes que alcanzan los criterios por tratamiento se indica en cada barra. Los tratamientos son placebo (A); semaglutida 0,1 mg (B), 0,2 mg (C), 0,4 mg (D), 0,8 mg (E), 0,8 mg T (F), 1,6 mg T (G); liraglutida 1,2 mg (H), 1,8 mg (I). *p<0,05 frente al placebo; **p<0,001 frente al placebo; ***p<0,0001 frente al placebo (basado en las medias ajustadas). Los datos son FAS LOCF. Las estimaciones son de un tratamiento de modelo de regresión logística, país y tratamiento previo como efectos fijos y HbA1c inicial como covariable. ADA, Asociación Americana de Diabetes; AACE, Asociación Americana de Endocrinólogos Clínicos.

La Figura 4 muestra el cambio medio del peso corporal frente al tiempo; los datos son la media (1,96SE), FAS LOCF. Los tratamientos son placebo (A); semaglutida 0,1 mg (B, línea discontinua), 0,2 mg (C), 0,4 mg (D), 0,8 mg (E), 0,8 mg T (F, línea discontinua), 1,6 mg T (G); liraglutida 1,2 mg (H), 1,8 mg (I).

La Figura 5 muestra el cambio del peso corporal desde el inicio en la semana 12. **p<0,001 frente al placebo; ***p<0,0001 frente al placebo (basado en las medias ajustadas. f: Valores iniciales solo para información: los datos se ajustan al modelo para el peso inicial. Los datos son medias LS ajustadas por modelo, FAS LOCF. Las estimaciones son de un modelo ANOVA con tratamiento, país y tratamiento previo como efectos fijos y peso inicial como covariable.

SE: Error estándar. FAS: Conjunto de análisis completo. LOCF: Última observación realizada.

Características

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

La presente invención se refiere a un uso mejorado de agonistas de GLP-1 en terapia. En una modalidad, la invención se refiere a ciertos regímenes de dosificación de agonistas de GLP-1 que proporcionan un efecto mejorado en enfermedades o afecciones, tales como la prevención y/o el tratamiento de la diabetes tipo 2 y la obesidad. En una modalidad, los métodos de la presente invención proporcionan una reducción mejorada de HbA1c y una reducción del peso corporal, que se mostró sorprendentemente. En una modalidad, el agonista de GLP-1 se administra en una cantidad que proporciona una a) reducción mejorada en HbA1c o b) reducción en el peso corporal en comparación con la administración de 1,8 mg de liraglutida o menos, tal como 0,8 mg de liraglutida o menos, por día.

En una modalidad, la invención se refiere a un método para la reducción de HbA1c o para la prevención o el tratamiento de la diabetes tipo 2, hiperglucemia, tolerancia a la glucosa alterada o diabetes no dependiente de insulina, dicho método comprende la administración de un agonista de GLP-1 a un sujeto que lo necesita en una cantidad de al menos 0,7 mg por semana. En una modalidad, el método es para la reducción de HbA1c. En una modalidad, el método es para la prevención o el tratamiento de la diabetes tipo 2. En una modalidad, el método es para la prevención o el tratamiento de la hiperglucemia. En la presente descripción se describe un método para la prevención o el tratamiento de la tolerancia a la glucosa alterada. En la presente descripción se describe un método para la prevención o el tratamiento de la diabetes no dependiente de insulina. En la presente descripción se describe un método que comprende retrasar o prevenir la progresión de la enfermedad diabética. En una modalidad se logra un nivel de HbA1c por debajo del 7 %. En una modalidad, el nivel de HbA1c se determina de acuerdo con el método definido por el ensayo de control y complicaciones de la diabetes (DCCT). En una modalidad, el nivel de HbA1c se determina de acuerdo con el método definido por la Federación Internacional de Química Clínica (IFCC).

En una modalidad, el agonista de GLP-1 se administra en una cantidad por semana de 1,0 mg.

El agonista de GLP-1 es semaglutida.

El agonista de GLP-1 se administra mediante administración parenteral, tal como inyección subcutánea.

En la presente descripción se describe un agonista de GLP-1 para su uso en la reducción de HbA1c o para su uso en la prevención o tratamiento de la diabetes tipo 2, hiperglucemia, tolerancia a la glucosa alterada o diabetes no dependiente de insulina que comprende administrar un agonista de GLP-1 en una cantidad de al menos 0,7 mg por semana. En una modalidad, el agonista de GLP-1 y/o la administración es como se define en la presente descripción.

En una modalidad, la invención se refiere a una composición que comprende un agonista de GLP-1 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables para su uso en la reducción de HbA1c o para la prevención o el tratamiento de la diabetes tipo 2, hiperglucemia, intolerancia a la glucosa o diabetes no dependiente de insulina, en donde dicho agonista de GLP-1 se administra en una cantidad de al menos 0,7 mg por semana. En una modalidad, el agonista de GLP-1 y/o la administración es como se define en la presente descripción.

En una modalidad, el agonista de GLP-1 se administra con otro agente terapéutico. La administración con otro agente terapéutico puede llevarse a cabo como la administración del agonista de GLP-1 y el otro agente terapéutico dentro de la misma ventana terapéutica (por ejemplo, dentro de un período de dos semanas, un período de una semana, o en un período de 96, 72 o 48 horas, etc.). El tratamiento con un agonista de GLP-1 de acuerdo con la presente invención puede combinarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, seleccionados de agentes antidiabéticos, agentes antiobesidad, agentes reguladores del apetito, agentes antihipertensivos, agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones resultantes de o asociadas con la diabetes y agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones y trastornos resultantes de o asociados con la obesidad; ejemplos de estos agentes terapéuticos son: sulfonilureas, tiazolidinedionas, biguanidas, meglitinidas, inhibidores de la glucosidasa, antagonistas del glucagón e inhibidores de DPP-IV (dipeptidil peptidasa-IV).

En una modalidad, una "cantidad eficaz" de un agonista de GLP-1 como se usa en la presente descripción significa una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente las manifestaciones clínicas de una enfermedad o estado dado y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "cantidad eficaz". Las cantidades eficaces para cada propósito dependerán de la gravedad de la enfermedad o lesión, así como también del peso y el estado general del sujeto. Se debe entender que la determinación de una dosis apropiada puede lograrse mediante el uso de la experimentación de rutina, mediante la construcción de una matriz de valores y la prueba de diferentes puntos en la matriz, lo que está dentro de las habilidades ordinarias de un médico o veterinario capacitado.

En una modalidad, el término “tratamiento” o “tratar” como se usa en la presente descripción significa la gestión y el cuidado de un paciente con el propósito de combatir una afección, tal como una enfermedad o un trastorno. En una modalidad, el término "tratamiento" o "tratar" pretende incluir el espectro completo de tratamientos para una afección dada de la que el paciente padece, tal como la administración del compuesto activo para aliviar los síntomas o complicaciones; para retrasar la progresión de la enfermedad, trastorno o afección; para aliviar o aliviar los síntomas y complicaciones; y/o, para curar o eliminar la enfermedad, trastorno o afección, así como también para prevenir la afección. En una modalidad, la prevención debe entenderse como la gestión y el cuidado de un paciente con el propósito de combatir la enfermedad, afección o trastorno e incluye la administración de los compuestos activos para prevenir la aparición de los síntomas o complicaciones.

En una modalidad, el término "espaciador hidrófilo" como se usa en la presente descripción significa un espaciador que separa un péptido y un residuo de unión a albúmina con un resto químico que comprende al menos 5 átomos no de hidrógeno donde 30-50 % de estos son N u O.

En una modalidad, el término “análogo” como se usa en la presente descripción con referencia a un polipéptido significa un péptido modificado en donde uno o más residuos de aminoácidos del péptido se han sustituido por otros residuos de aminoácidos y/o en donde uno o más residuos de aminoácidos se han eliminado del péptido y o en donde uno o más residuos de aminoácidos se han añadido al péptido. Tal adición o eliminación de residuos de aminoácidos puede tener lugar en el N-terminal del péptido y/o en el C-terminal del péptido. Se usa un sistema simple para describir los análogos: Por ejemplo, Arg34GLP-1 (7-37) Lys designa un análogo de GLP-1 en donde la lisina de origen natural en la posición 34 se ha sustituido con arginina y se ha añadido un residuo de lisina al C-terminal (posición 38).

En una modalidad, el término "péptido de GLP-1" como se usa en la presente descripción significa GLP-1 (7 37), un análogo de GLP-1, un derivado de GLP-1 o un derivado de un análogo de GLP-1.

En una modalidad, el término “protegido contra DPP-IV” como se usa en la presente descripción con referencia a un polipéptido significa un polipéptido que se ha modificado químicamente para que dicho compuesto sea resistente a la plasma peptidasa dipeptidil aminopeptidasa-4 (DPP-IV). Se conoce que la enzima DPP-IV en plasma está implicada en la degradación de varias hormonas peptídicas, por ejemplo, GLP-1, exendina-4, etc. Por lo tanto, se está haciendo un esfuerzo considerable para desarrollar agonistas de GLP-1 menos susceptibles al hidrólisis mediada por DPP-IV para reducir la velocidad de degradación por DPP-IV.

La presente invención también se refiere a un agonista de GLP-1 de la invención, para su uso como un medicamento. En la presente descripción, el agonista de GLP-1 puede usarse para los siguientes tratamientos médicos:

(i) prevención y/o tratamiento de todas las formas de diabetes, tales como hiperglucemia, diabetes tipo 2, tolerancia a la glucosa alterada, diabetes tipo 1, diabetes no dependiente de insulina, MODY (diabetes de aparición en la madurez de los jóvenes), diabetes gestacional y/o para la reducción de HbA1C;

(ii) retardar o prevenir la progresión de la enfermedad diabética, tal como la progresión en la diabetes tipo 2, retardar la progresión de la tolerancia alterada a la glucosa (IGT) a diabetes tipo 2 que requiere insulina, y/o retardar la progresión de la diabetes tipo 2 que no requiere insulina a diabetes tipo 2 que requiere insulina;

(iii) prevención y/o tratamiento de trastornos alimentarios, tales como obesidad, por ejemplo, mediante la disminución de la ingestión de alimentos, reducción del peso corporal, supresión del apetito, inducción de la saciedad; tratamiento o prevención del trastorno por atracón, la bulimia nerviosa y/o la obesidad inducida por la administración de un antipsicótico o un esteroide; disminución de la motilidad gástrica; y/o retrasar el vaciamiento gástrico.

En otra modalidad particular, la indicación es (i). En una modalidad particular adicional la indicación es (ii). En una modalidad aún más particular, la indicación es (iii). En una modalidad, la indicación es diabetes tipo 2 y/u obesidad.

En una modalidad, el método comprende la prevención, el tratamiento, la reducción y/o la inducción en una o más enfermedades o afecciones definidas en la presente descripción. En una modalidad, la indicación es (i) y (iii). En una modalidad, la indicación es (ii) y (iii).

En una modalidad, la invención se refiere a la administración de una cantidad eficaz de un agonista de GLP-1.

En una modalidad como se usa en la presente descripción, los valores específicos dados en relación con números o intervalos pueden entenderse como el valor específico o como aproximadamente el valor específico.

Propiedades funcionales

En un primer aspecto funcional, los agonistas de GLP-1 de la invención tienen una buena potencia. Además, o alternativamente, en un segundo aspecto funcional, los agonistas de GLP-1 de la invención tienen un perfil farmacocinético prolongado. Además, o alternativamente, en un tercer aspecto funcional, los agonistas de GLP-1 de la invención son estables frente a la degradación por las enzimas gastrointestinales.

Actividad biológica (potencia)

De acuerdo con el primer aspecto funcional, los agonistas de GLP-1 de la invención son biológicamente activos, o potentes. En una modalidad particular, “potencia” y/o “actividad” se refiere a la potencia in vitro, es decir, el rendimiento en un ensayo funcional del receptor de GLP-1, más en particular a la capacidad de estimular la formación de AMPc en una línea celular que expresa el receptor de GLP-1 humano clonado.

La estimulación de la formación de AMPc en un medio que contiene el receptor de GLP-1 humano puede determinarse preferentemente mediante el uso de una línea celular transfectada estable tal como BHK467-12A (tk-ts13), y/o mediante el uso para la determinación de AMPc un ensayo de receptor funcional, por ejemplo, basado en la competencia entre el AMPc formado endógenamente y el AMPc marcado con biotina añadido exógenamente, en el que el AMPc se captura con mayor preferencia mediante el uso de un anticuerpo específico, y/o en donde un ensayo aún más preferido es el ensayo de AMPc AlphaScreen, tal como el descrito en el ensayo (I).

En una modalidad, el término concentración efectiva semimáxima (EC<50>) generalmente se refiere a la concentración que induce una respuesta a la mitad entre el valor inicial y el máximo, por referencia a la curva de respuesta a la dosis. La EC<50>se usa como una medida de la potencia de un compuesto y representa la concentración en donde se observa el 50 % de su efecto máximo.

La potencia in vitro de los agonistas de GLP-1 de la invención puede determinarse como se describió anteriormente, y la EC<50>del agonista de GLP-1 en cuestión determinado. A menor EC<50>, mejor la potencia.

En una modalidad particular, el medio tiene la siguiente composición (concentraciones finales en el ensayo): TRIS-HCl 50 mM; HEPES 5 mM; MgCl 10 mM<2>, 6H<2>O; NaCl 150 mM; Tween 0,01 %; BSA al 0,1 %; IBMX 0,5 mM; ATP 1 mM; GTP 1<|j>M; pH 7,4.

En una modalidad particular adicional, el agonista de GLP-1 de la invención tiene una potencia in vitro correspondiente a una EC<50>a o por debajo de 3000 pM, tal como por debajo de 2000 pM, por debajo de 1000 pM o por debajo de 500 pM, o tal como por debajo de 200 pM o por debajo de 100 pM.

En otra modalidad particular, el agonista de GLP-1 de la invención es potente in vivo, lo que puede determinarse como se conoce en la técnica en cualquier modelo animal adecuado, así como también en ensayos clínicos.

El ratón db/db diabético es un ejemplo de un modelo animal adecuado, y el efecto reductor de la glucosa en sangre puede determinarse en tales ratones in vivo, por ejemplo, como se describe en el ensayo (III), o como se describe en el ejemplo 43 del documento núm. WO09/030738.

Además, o alternativamente, el efecto sobre la ingestión de alimentos in vivo puede determinarse en estudios farmacodinámicos en cerdos, por ejemplo, como se describe en el ensayo (IV).

Prolongación - vida media in vivo en minicerdos

De acuerdo con el segundo aspecto funcional, los agonistas de GLP-1 de la invención son prolongados. En una modalidad particular la prolongación puede determinarse como el tiempo de vida media (T<y>) in vivo en minicerdos después de la administración i.v. En modalidades adicionales, la semivida es al menos 24 horas, tal como al menos 48 horas, al menos 60 horas, al menos 72 horas, o tal como al menos 84 horas, al menos 96 horas, o al menos 108 horas.

Un ensayo adecuado para determinar la semivida in vivo en minicerdos después de la administración i.v. se describe en el ensayo (II).

Degradación mediante enzimas gastrointestinales

De acuerdo con el tercer aspecto funcional, los agonistas de GLP-1 de la invención son estables, o estabilizados, frente a la degradación por una o más enzimas gastrointestinales.

Las enzimas gastrointestinales incluyen, sin limitación, exo y endo peptidasas, tales como pepsina, tripsina, quimotripsina, elastasas y carboxipeptidasas.

La estabilidad puede probarse contra estas enzimas gastrointestinales en la forma de enzimas purificadas, o en la forma de extractos del sistema gastrointestinal.

En una modalidad particular, el agonista de GLP-1 de la invención tiene una semivida in vitro (T<y>), en un extracto de intestinos delgados de rata, dividido por la semivida correspondiente (T<y>) de GLP-1(7-37), de al menos 1, tal como por encima de 1,0, al menos 1,2, al menos 2,0, o tal como al menos 3,0, o al menos 4,0. En otras palabras, puede definirse una relación (SI) para cada agonista de GLP-1, es decir, como la semivida in vitro (T<y>) del agonista de GLP-1 en cuestión, en un extracto de intestinos delgados de rata, dividido por la semivida correspondiente (T<y>) de GLP-1(7-37).

Un ensayo adecuado para determinar la semivida in vitro en un extracto de intestinos delgados de rata se describe en el ensayo (V).

Agonistas de GLP-1

En una modalidad, los agonistas de GLP-1 de la invención tienen actividad GLP-1. En una modalidad, “un agonista de GLP-1” se entiende que se refiere a cualquier compuesto, incluidos péptidos y compuestos no peptídicos, que activan total o parcialmente el receptor de GLP-1 humano. En una modalidad, el "agonista de GLP-1" es cualquier péptido o molécula pequeña no peptídica que se une a un receptor de GLP-1, preferentemente con una constante de afinidad (K<d>) o una potencia (EC<50>) de menos de 1<|j>M, por ejemplo, menos de 100 nM medida por métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, el documento núm. WO 98/08871). En una modalidad, los métodos para identificar agonistas de GLP-1 se describen en el documento núm. WO 93/19175 (Novo Nordisk A/S) y ejemplos de agonistas de GLP-1 adecuados que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen los mencionados en el documento núm. WO 2005/027978 (Novo Nordisk A/S), cuyas enseñanzas se incorporan en la presente descripción como referencia. La “actividad de GLP-1” se refiere a la capacidad de unirse al receptor de GLP-1 e iniciar una vía de transducción de señales que da como resultado una acción insulinotrópica u otros efectos fisiológicos como se conoce en la técnica. Por ejemplo, los agonistas de GLP-1 de la invención pueden evaluarse para determinar la actividad de GLP-1 mediante el uso del ensayo descrito en el ensayo (I) en la presente descripción.

En aún otra modalidad, el agonista de GLP-1 es un agonista de GLP-1 estable. Como se usa en la presente, un “agonista estable de GLP-1” significa un agonista de GLP-1 que presenta una semivida de eliminación plasmática in vivo de al menos 24 horas en el ser humano, determinada opcionalmente mediante el método descrito más abajo. Los ejemplos de agonistas de GLP-1 estables pueden encontrarse en el documento WO2006/097537.

En una modalidad, el método para la determinación de la semivida de eliminación plasmática de un compuesto en el ser humano puede llevarse a cabo de la siguiente manera: El compuesto se disuelve en un tampón isotónico, pH 7,4, PBS o cualquier otro tampón adecuado. La dosis se inyecta periféricamente, preferentemente en el abdomen o el muslo superior. Las muestras de sangre para la determinación del compuesto activo se toman a intervalos frecuentes, y durante un tiempo suficiente para cubrir la parte de eliminación terminal (por ejemplo, antes de la dosis, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 24 (día 2), 36 (día 2), 48 (día 3), 60 (día 3), 72 (día 4) y 84 (día 4) horas después de la dosis). La determinación de la concentración del compuesto activo se realiza como se describe en Wilken y otros, Diabetologia 43 (51), 2000. Los parámetros farmacocinéticos derivados se calculan a partir de los datos de concentración-tiempo para cada sujeto individual mediante el uso de métodos no compartimentales, mediante el uso del software comercialmente disponible WinNonlin Versión 2.1 (Pharsight, Cary, NC, Estados Unidos). La constante de velocidad de eliminación terminal se estima mediante regresión logarítmica en la parte logarítmica terminal de la curva de concentración-tiempo, y se usa para calcular la semivida de eliminación.

En una modalidad, el agonista de GLP-1 se formula para que tenga una semivida en el ser humano de al menos 48 horas. Esto puede obtenerse mediante formulaciones de liberación sostenida conocidas en la técnica.

En una modalidad, el agonista de GLP-1 es un péptido de GLP-1. El péptido GLP-1 es semaglutida. El documento WO 06/097537 describe semaglutida (Ejemplo 4), un agonista de GLP-1 monoacilado para la administración una vez a la semana.

En una modalidad, la presente invención abarca sales farmacéuticamente aceptables de los agonistas de GLP-1. Tales sales incluyen sales de adición ácida farmacéuticamente aceptables, sales metálicas farmacéuticamente aceptables, sales de amonio y amonio alquilado. También se pretende que los hidratos que los agonistas de GLP-1 actuales son capaces de formar como sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables.

En una modalidad, los medicamentos o composiciones farmacéuticas que comprenden el agonista de GLP-1 semaglutida pueden administrarse por vía parenteral a un paciente que lo necesite. En una modalidad, la administración parenteral puede realizarse mediante inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa tipo pluma.

Alternativamente, la administración parenteral puede realizarse por medio de una bomba de infusión. Una opción adicional es una composición que puede ser un polvo o un líquido para la administración de un agonista de GLP-1 en forma de aerosol nasal o pulmonar. Como una opción aún más, el agonista de GLP-1 también puede administrarse por vía transdérmica, por ejemplo, a partir de un parche, opcionalmente un parche iontoforético, o transmucoso, por ejemplo, bucalmente. Las posibles vías mencionadas anteriormente para administrar agonistas de GLP-1 no se consideran limitantes del alcance de la invención.

En una modalidad, el agonista de GLP-1 se coadministra junto con un agente terapéuticamente activo adicional usado en los tratamientos definidos en la presente descripción.

En una modalidad, el péptido GLP-1 comprende [Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37).

El péptido similar al glucagón-1 humano es GLP-1(7-37) y tiene la secuencia HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFI AWLVKGRG (SEQ ID NO: 1). GLP-1(7-37) también puede designarse como GLP-1 "nativo". En el listado de secuencias, al primer residuo de aminoácido de la SEQ ID NO: 1 (histidina) se le asigna el núm. 1. Sin embargo, en lo siguiente, de acuerdo con la práctica establecida en la técnica, este residuo de histidina se refiere como núm. 7, y los residuos de aminoácido subsecuentes se enumeran en consecuencia, terminando con la glicina núm. 37. Por lo tanto, generalmente, cualquier referencia en la presente descripción a un número del residuo de aminoácido o a un número de la posición de la secuencia de GLP-1(7-37) es a la secuencia que comienza con His en la posición 7 y termina con Gly en la posición 37. Un ejemplo no limitativo de una nomenclatura analógica adecuada es [Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37), que designa un análogo de GLP-1(7-37), en el que la alanina en la posición 8 se ha sustituido con<a>ácido -aminoisobutírico (Aib), la lisina en la posición 34 se ha sustituido con arginina, y la glicina en la posición 37 se ha sustituido con lisina.

La concentración en plasma de los agonistas de GLP-1 de la invención puede determinarse mediante el uso de cualquier método adecuado. Por ejemplo, puede usarse la LC-MS (Espectroscopía de Masas acoplada a Cromatografía Líquida), o inmunoensayos tales como el RIA (Radio Inmuno Ensayo), el ELISA (Ensayo Inmuno Sorbente ligado a Enzimas) y el LOCI (Inmunoensayo de Luminiscencia de Canalización de Oxígeno). Los protocolos generales para los ensayos RIA y ELISA adecuados se encuentran en, por ejemplo, el documento WO09/030738 en las páginas 116-118. Un ensayo preferido es el LOCI (inmunoensayo de canalización de oxígeno luminiscente), generalmente como se describe para la determinación de insulina por Poulsen y Jensen en Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, p. 240-247 - brevemente las muestras de sangre pueden recogerse a intervalos deseados, el plasma se separa, se congela inmediatamente y se mantiene a -20 °C hasta que se analiza la concentración plasmática del agonista de GLP-1 respectivo; las perlas donantes están recubiertas con estreptavidina, mientras que las perlas aceptoras se conjugan con un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo medio/C-terminal del péptido; otro anticuerpo monoclonal, específico para el extremo N-terminal, se biotinila; los tres reactivos se combinan con el analito y forman un inmunocomplejo de dos sitios; la iluminación del complejo libera átomos de oxígeno singlete de las perlas donantes, que se canalizan en las perlas aceptoras y desencadenan quimioluminiscencia que puede medirse en un lector de placas Envision; la cantidad de luz es proporcional a la concentración del compuesto.

En una modalidad, el término “Aib” como se usa en la presente se refiere al ácido a-aminoisobutírico.

Composiciones farmacéuticas

Una dosis administrada puede contener de 5 mg - 100 mg del agonista de GLP-1, o de 5-50 mg, o de 5-20 mg, o de 5-10 mg del agonista de GLP-1.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden un agonista de GLP-1 de la invención o una sal, amida o éster farmacéuticamente aceptable de este, y un excipiente farmacéuticamente aceptable pueden prepararse como se conoce en la técnica.

En una modalidad, el término "excipiente" se refiere en sentido amplio a cualquier componente distinto del(de los) ingrediente(s) terapéutico(s) activo(s). El excipiente puede ser una sustancia inerte, una sustancia inactiva, y/o una sustancia no activa medicinalmente. En la técnica se conoce la formulación de ingredientes activos farmacéuticamente con diversos excipientes, véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por ejemplo, 19na edición (1995) y cualquiera de las ediciones posteriores). Los ejemplos no limitantes de excipientes son: solventes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes reguladores de la tonicidad (por ejemplo, agentes isotónicos), agentes quelantes, estabilizadores (por ejemplo, inhibidores de la oxidación, inhibidores de la agregación, surfactantes y/o inhibidores de proteasas).

Los ejemplos de formulaciones incluyen formulaciones líquidas, es decir, formulaciones acuosas que comprenden agua. Una formulación líquida puede ser una solución, o una suspensión. Una formulación acuosa típicamente comprende al menos 50 % p/p de agua, o al menos 60 %, 70 %, 80 %, o incluso al menos 90 % p/p de agua.

Alternativamente una composición farmacéutica puede ser una formulación sólida, por ejemplo, una composición liofilizada o secada por pulverización, que puede usarse tal cual, a la que el médico o el paciente añaden solventes y/o diluyentes antes de su uso.

El pH en una formulación acuosa puede ser cualquiera entre pH 3 y pH 10, por ejemplo, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 9,5; o de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 7,0.

Una composición puede combinarse adicionalmente en un portador o sistema de suministro de fármacos, por ejemplo, para mejorar la estabilidad, biodisponibilidad y/o solubilidad. En una modalidad particular, una composición puede unirse a tal sistema a través de interacciones covalentes, hidrófobas y/o electrostáticas. El propósito de tal composición puede ser, por ejemplo, disminuir los efectos adversos, lograr la cronoterapia y/o aumentar la satisfacción del paciente.

Una composición también puede usarse en la formulación de sistemas de suministro de fármacos de liberación controlada, sostenida, prolongada, retardada y/o lenta.

La composición se administra mediante administración parenteral. La administración parenteral puede realizarse mediante inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa tipo pluma o por medio de una bomba de infusión.

Procesos de producción

En una modalidad los péptidos GLP-1 pueden producirse mediante derivatización apropiada de una cadena principal peptídica apropiada que se produjo mediante tecnología de ADN recombinante o mediante síntesis peptídica (por ejemplo, síntesis en fase sólida de tipo Merrifield) como se conoce en la técnica de síntesis de péptidos y química de péptidos.

En una modalidad la producción de péptidos similares a GLP-1(7-37) y análogos de GLP-1 se conoce bien en la técnica. La porción GLP-1 del péptido GLP-1 de la invención (o los fragmentos de este) puede producirse, por ejemplo, mediante síntesis peptídica clásica, por ejemplo, síntesis peptídica en fase sólida mediante el uso de química t-Boc o Fmoc u otras técnicas bien establecidas, ver, por ejemplo, Greene y Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999, Florencio Zaragoza Dorwald, “Organic Synthesis on solid Phase”, Wiley-VCH Verlag GmbH, 2000, y “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”, editado por W.C. Chan y P.D. White, Oxford University Press, 2000.

En una modalidad, los agonistas de GLP-1 pueden producirse mediante métodos recombinantes, es decir, mediante el cultivo de una célula huésped que contiene una secuencia de ADN que codifica el agonista de GLP-1 y capaz de expresar el péptido en un medio de nutrientes adecuado en condiciones que permiten la expresión del péptido. Los ejemplos no limitantes de células hospedadoras adecuadas para la expresión de estos péptidos son: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, así como también líneas celulares de mamíferos BHK o CHO.

En una modalidad, los agonistas de GLP-1 de la invención que incluyen aminoácidos no naturales y/o un mimético de mono o dipeptídico N-terminal unido covalentemente pueden, por ejemplo, producirse como se describe en la parte experimental. O ver, por ejemplo, Hodgson y otros: "The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids", Chemical Society Reviews, vol. 33, núm. 7 (2004), páginas 422-430; y el documento WO 2009/083549 A1 titulado "Semi-recombinant preparation of GLP-1 analogues".

Ejemplos

Abreviaturas

Las siguientes abreviaturas se usan en lo siguiente, en orden alfabético:

ADA: Asociación Americana de Diabetes

Ejemplo 1: El péptido de Glp-1 semaglutida proporciona HbA1c y peso corporal reducidos

La semaglutida es un péptido de GLP-1 acilado único con una semivida de 160 horas. El objetivo fue investigar la respuesta a la dosis de HbA1c de dosis semanales únicas de semaglutida (cinco niveles de dosis) en sujetos con diabetes tipo 2. También se investigaron la seguridad, la tolerabilidad y la farmacodinámica de semaglutida frente a placebo y liraglutida de una vez al día en abierto.

Materiales y métodos

La liraglutida puede prepararse como se describe en el Ejemplo 37 del documento WO98/08871. La semaglutida puede prepararse como se describe en el Ejemplo 4 del documento WO2006/097537. La composición de los agonistas de GLP-1 administrados puede formularse como soluciones acuosas isotónicas con un tampón de fosfato, tal como un tampón de dihidrógeno fosfato de sodio, que tiene un pH en el intervalo de 7,0-9,0, tal como pH 7,4 o pH 8,15, por ejemplo, que comprende además los excipientes propilenglicol y fenol. La composición de los agonistas de GLP-1 administrados puede ser como se describe en los documentos núms. WO2003/002136 o WO2005/049061. La composición de placebo puede ser idéntica a la composición de los agonistas de GLP-1, pero no contiene un agonista de GLP-1.

En un ensayo de 12 semanas, aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo, se expuso a 411 sujetos humanos (n=43-50 por grupo) con diabetes tipo 2. Los participantes (hombre/mujer 65/35 %; HbA1c inicial (media±SD) 8,1±0,8 %; peso corporal inicial 87,5±13,8 kg; duración de la diabetes 2,6±3,1 años; solo metformina/dieta y ejercicio solo 80/20 %) recibieron una inyección subcutánea de una de cinco dosis de semaglutida (0,1 —1,6 mg) una vez a la semana, liraglutida de etiqueta abierta (1,2 mg, 1,8 mg) una vez al día, o placebo una vez a la semana. Dos de las dosis de semaglutida se titularon (T) en incrementos semanales de 0,4 mg. El criterio de valoración primario fue el cambio en HbA1c desde el inicio. Los criterios de valoración de eficacia secundarios incluyeron la proporción de sujetos que alcanzaron el objetivo de HbA1c de ADA (<7 %) y el cambio en el peso corporal. El cambio y el porcentaje al objetivo se analizaron mediante ANOVA y regresión logística, respectivamente. Las comparaciones entre semaglutida y liraglutida no se corrigieron para la multiplicidad. Las características iniciales de los sujetos se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Características iniciales de los sujetos

Los datos son media (SD) a menos que se indique de cualquier otra manera. *: Número de sujetos expuestos al tratamiento real. DyE: Dieta y ejercicio. FPG: Glucosa plasmática en ayunas. IMC: Índice de masa corporal.

Resultados

En el conjunto de análisis completo, la semaglutida (>0,2 mg) redujo en dependencia de la dosis HbA1c desde el inicio (Figura 1) y aumentó la probabilidad de lograr HbA1c <7 % (p<0,05 frente al placebo para dosis >0,2 mg). Los resultados con respecto al cambio en HbA1c se muestran en la Figura 1. El cambio en HbA1c en la figura 1 es desde el inicio en la semana 12. La Figura 2 muestra el cambio en HbA1c a lo largo del tiempo con los diferentes tratamientos. El tratamiento con semaglutida >0,8 mg llevó numéricamente a más pacientes al objetivo que el liraglutida 1,8 mg (0,8 mg T 69 %, 0,8 mg 73 %, 1,6 mg T 81 % frente a liraglutida 1,8 mg 57 %). Los resultados (ver, por ejemplo, Figura 1) muestran que el tratamiento con semaglutida 0,8 mg, 0,8 mg T o 1,6 mg T mejoró la reducción de HbA1c en comparación con el tratamiento con liraglutida 1,2 mg o 1,8 mg; además, el tratamiento con semaglutida 1,6 mg T fue estadísticamente superior al tratamiento con liraglutida 1.2 mg o 1,8 mg con respecto a la reducción de HbA1c (basado en las medias no ajustadas). La Figura 3 muestra el porcentaje y el número de sujetos que alcanzaron los criterios de AACE o ADA para el control glucémico con los diferentes tratamientos. Los resultados (ver Figura 3) muestran que el tratamiento con semaglutida 0,8 mg, 0,8 mg T o 1,6 mg T mejoró el porcentaje y el número de sujetos que alcanzaron los criterios de AACE o ADA para el control glucémico en comparación con el tratamiento con liraglutida 1,2 mg o 1,8 mg.

El peso corporal se redujo de forma dependiente de la dosis desde el inicio hasta en 4,8 kg frente al placebo de 1.2 kg (p<0,01 para dosis >0,8 mg). Las Figuras 4 y 5 muestran el cambio medio del peso corporal frente al tiempo y el cambio del peso corporal desde el inicio en la semana 12, respectivamente, con los diferentes tratamientos. Los resultados (ver, por ejemplo, la Figura 5) muestran que el tratamiento con semaglutida 0,8 mg, 0,8 mg T o 1,6 mg T aumentó la reducción del peso corporal en comparación con el tratamiento con liraglutida 1,2 mg o 1,8 mg. Además, los resultados (ver por ejemplo, Figura 5) muestran que el tratamiento con semaglutida 0,8 mg T o 1,6 mg T fue estadísticamente superior al tratamiento con liraglutida 1,8 mg con respecto a la reducción del peso corporal; y que el tratamiento con semaglutida 0,8 mg, 0,8 mg T o 1,6 mg T fue estadísticamente superior a liraglutida 1,2 mg con respecto a la reducción del peso corporal (basado en las medias no ajustadas).

No hubo informes de pancreatitis ni cambios relacionados con el tratamiento en la calcitonina en sangre. La proporción de sujetos con náuseas y vómitos aumentó con la dosis, pero generalmente fueron leves o moderados y mejoraron con la titulación. Los retiros debido a eventos adversos gastrointestinales fueron del 4,7 %-27,7 % para semaglutida y del 2,2 %-10 % para liraglutida. Pocos sujetos informaron hipoglucemia leve (semaglutida n=5, liraglutida n=3); no hubo hipoglucemia grave. Las reacciones en el lugar de inyección se informaron en 7 sujetos: semaglutida n=2; liraglutida n=5. Un sujeto (semaglutida 1,6 mg T) desarrolló anticuerpos anti-semaglutida no neutralizantes de título bajo (sin reacción cruzada con GLP-1 nativo).

Conclusión

Durante más de 12 semanas, la semaglutida redujo en dependencia de la dosis HbA1c y el peso corporal. El efecto de semaglutida de 0,4 mg sobre el control glucémico y el peso corporal fue comparable al de liraglutida de 1,2 mg, mientras que semaglutida >0,8 mg pareció llevar a más sujetos al objetivo la meta y proporcionó una mejor pérdida de peso que liraglutida de 1,8 mg. No se identificaron preocupaciones de seguridad de semaglutida. El aumento escalonado de la dosis no fue un enfoque principal de este ensayo y se optimizará en futuros ensayos clínicos.

Métodos farmacológicos

Ensayo (I): Potencia in vitro

El propósito de este ejemplo es probar la actividad, o potencia, de los agonistas de GLP-1 in vitro. Las potencias de los agonistas de GLP-1 pueden determinarse como se describe más abajo, es decir, como la estimulación de la formación de AMP cíclico (AMPc) en un medio que contiene membranas que expresan el receptor de GLP-1 humano.

Principio

Las membranas plasmáticas purificadas de una línea celular transfectada estable, BHK467-12A (tk-ts13), que expresa el receptor de GLP-1 humano se estimulan con el agonista de GLP-1 en cuestión, y la potencia de producción de AMPc se mide mediante el uso del kit de ensayo de AMPc AlphaScreenTM de Perkin Elmer Life Sciences. El principio básico del ensayo The AlphaScreen es una competencia entre el AMPc endógeno y el AMPc-biotina añadido exógenamente. La captura de AMPc se alcanza mediante el uso de un anticuerpo específico conjugado a perlas aceptoras.

Cultivo celular y preparación de las membranas

Se seleccionan una línea celular transfectada estable y un clon de alta expresión para la selección. Las células se cultivan en 5 % de CO2 en DMEM, FCS al 5 %, Pen/Estrep al 1 % (penicilina/estreptomicina) y 0,5 mg/ml del marcador de selección G418.

Las células a aproximadamente 80 % de confluencia se lavan 2X con PBS y se cosechan con Versene (solución acuosa de la sal de tetrasodio del ácido etilendiaminotetraacético), se centrifugan 5 min a 1000 rpm y se retira el sobrenadante. Las etapas adicionales se realizan todas en hielo. El sedimento celular se homogeneiza con el Ultrathurax durante 20-30 s en 10 ml de tampón 1 (Na-HEPES 20 mM, EDTA 10 mM, pH=7,4), se centrifuga 15 min a 20000 rpm y el sedimento se resuspende en 10 ml de tampón 2 (Na-HEPES 20 mM, EDTA 0,1 mM, pH=7,4). La suspensión se homogeneiza durante 20-30 s y se centrifuga 15 min a 20 000 rpm. La suspensión en el tampón 2, la homogeneización y la centrifugación se repiten una vez y las membranas se resuspenden en el tampón 2. La concentración de proteína se determina y las membranas se almacenan a -80 °C hasta su uso.

El ensayo se realiza en placas de 96 pocilios de ^ de área, fondo plano (por ejemplo, Costar núm. cat.: 3693). El volumen final por pocillo es de 50 μl.

Soluciones y reactivos

Más abajo se dan soluciones y reactivos ilustrativos.

Kit de ensayo de AMPc AlphaScreen de Perkin Elmer Life Sciences (núm. de cat: 6760625M); que contiene perlas aceptoras de anti-AMPc (10 U/μl), perlas donantes de estreptavidina (10 U/μl) y AMPc biotinilado (133 U/μl).

Tampón AlphaScreen, pH=7,4: TRIS-HCl 50 mM (Sigma, núm. cat: T3253); HEPES 5 mM (Sigma, núm. cat: H3375); MgCh 10 mM, 6H<2>O (Merck, núm. de cat.: 5833); NaCl 150 mM (Sigma, núm. de cat.: S9625); Tween al 0,01 % (Merck, núm. de cat.: 822184). Lo siguiente se añadió al tampón de AlphaScreen antes de su uso (concentraciones finales indicadas): BSA (Sigma, núm. de cat. A7906): 0,1 %; IBMX (Sigma, núm. de cat. I5879): 0,5 mM; ATP (Sigma, núm. de cat. A7699): 1 mM; GTP (Sigma, núm. de cat. G8877): 1 pM.

AMPc estándar (factor de dilución en el ensayo = 5): solución de AMPc: 5 |jl de una solución madre de AMPc 5 mM 495 μl de tampón AlphaScreen.

Se preparan series de dilución adecuadas en tampón de AlphaScreen del estándar de AMPc, así como también el agonista de GLP-1 a probar, por ejemplo, las siguientes ocho concentraciones del agonista de GLP-1: 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13 y 10-14M, y una serie de, por ejemplo, 10-6 a 3x10-11 de AMPc.

Membrana/Perlas aceptoras

Usar membranas hGLP-1/ BHK 467-12A; 6 μg/pocillo correspondiente a 0,6 mg/ml (la cantidad de membranas usadas por pocillo puede variar)

“Sin membranas”: Perlas aceptoras (15 μg/ml final) en tampón de AlphaScreen

“Membranas de 6 μg/pocillo”: membranas perlas aceptoras (15 μg/ml final) en tampón de AlphaScreen

Añadir 10 μl de “sin membranas” al estándar de AMPc (por pocillo en duplicados) y los controles positivo y negativo

Añadir 10 μl de “6 μg/pocillo de membranas” a GLP-1 y agonistas de GLP-1 (por pocillo en duplicados/triplicados)

Control Pos. Control: 10 μl de “sin membranas” 10 μl de tampón de AlphaScreen

Control Neg. Control: 10 |jl de “sin membranas” 10 |jl de solución madre de AMPc (50<|j>M)

Como las perlas son sensibles a la luz directa, cualquier manipulación se realiza en la oscuridad (tan oscura como sea posible), o en luz verde. Todas las diluciones se realizan en hielo.

Procedimiento

1. Preparar el tampón de AlphaScreen.

2. Disolver y diluir los agonistas de GLP-1/estándar de AMPc en tampón de AlphaScreen.

3. Preparar la solución de perlas donantes e incubar 30 min a RT.

4. Añadir los agonistas de AMPc/GLP-1 a la placa: 10 jil por pocillo.

5. Preparar solución de membrana/perlas aceptoras y añadirla a las placas: 10 jil por pocillo.

6. Añadir las perlas donantes: 30 j l por pocillo.

7. Envolver la placa en papel de aluminio e incubar en el agitador durante 3 horas (muy lentamente) a RT.

8. Contar en AlphaScreen - cada placa se pre incuba en el AlphaScreen durante 3 minutos antes del conteo.

Los valores de EC<50>[pM] pueden calcularse mediante el uso del software Graph-Pad Prism (versión 5). Si se desea, la variación en veces en relación con GLP-1 puede calcularse como EC<50>(GLP-1)/ EC<50>(análogo) -3693,2.

Ensayo (II): Semivida en minicerdos

El propósito de este estudio es determinar la prolongación in vivo de los agonistas de GLP-1 después de la administración i.v. a minicerdos, es decir, la prolongación de su tiempo de acción. Esto se realiza en un estudio farmacocinético (PK), donde se determina la semivida terminal del agonista de GLP-1 en cuestión. Por vida media terminal se entiende generalmente el período de tiempo que se tarda en reducir a la mitad una determinada concentración plasmática, medida después de la fase de distribución inicial.

En los estudios se usan minicerdos Gottingen machos obtenidos de minicerdos Gottingen Ellegaard (Dalmosa, Dinamarca) de aproximadamente 7-14 meses de edad y que pesan de aproximadamente 16-35 kg. Los minicerdos se alojan individualmente y se alimentan de manera restringida una o dos veces al día con la dieta de minicerdos SDS (Special Diets Services, Essex, Reino Unido). Después de al menos 2 semanas de aclimatación se implantaron dos catéteres venosos centrales permanentes en la vena cava caudalis o craneal en cada animal. Los animales se dejan en recuperación durante 1 semana después de la cirugía y después se usan para estudios farmacocinéticos repetidos con un período de lavado adecuado entre las administraciones.

Los animales se someten a ayuno durante aproximadamente 18 h antes de la administración de la dosis y durante al menos 4 h después de la administración de la dosis, pero tienen acceso ad libitum al agua durante todo el período.

El agonista de GLP-1 se disuelve en fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, tween 80 al 0,05 %, pH 7,4 a una concentración de generalmente de 20-60 nmol/ml. Las inyecciones intravenosas (el volumen correspondiente a 1-2 nmol/kg, por ejemplo 0,033 ml/kg) de los compuestos se administran a través de un catéter, y se toma una muestra de sangre en puntos de tiempo predefinidos hasta 13 días después de la dosificación (preferentemente a través del otro catéter). Las muestras de sangre (por ejemplo 0,8 ml) se recogen en tampón de EDTA (8 mM) y después se centrifugan a 4 °C y 1942G durante 10 minutos. El plasma se pipetea en tubos Micronic en hielo seco y se mantiene a -20 °C hasta que se analiza la concentración de plasma del compuesto de GLP-1 respectivo mediante el uso de ELISA o un ensayo basado en anticuerpos similar o LC-MS. Los perfiles de concentración plasmática- tiempo individuales se analizan mediante un modelo no compartimental en WinNonlin v. 5.0 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, Estados Unidos), y se determinan las semividas terminales resultantes (media armónica).

Ensayo (III): Efecto sobre la glucosa en sangre y el peso corporal

El propósito del estudio es verificar el efecto de los agonistas de GLP-1 sobre la glucosa en sangre (BG) y el peso corporal (BW) en un entorno diabético. Los agonistas de GLP-1 pueden evaluarse en un estudio de dosisrespuesta en un modelo de ratón obeso y diabético (ratones db/db) como se describe a continuación.

Cincuenta ratones db/db (Taconic, Dinamarca), alimentados desde el nacimiento con la dieta NIH31 (dieta NIH 31M para roedores, disponible comercialmente en Taconic Farms, Inc., Estados Unidos, ver www.taconic.com), se inscriben para el estudio a la edad de 7-9 semanas. Los ratones tienen acceso libre a alimento estándar (por ejemplo, Altromin 1324, Brogaarden, Gentofte, Dinamarca) y agua del grifo y se mantienen a 24 °C. Después de 1-2 semanas de aclimatación, la glucosa en sangre basal se evalúa dos veces en dos días consecutivos (es decir, a las 9 a.m.). Los 8 ratones con los valores de glucosa en sangre más bajos pueden excluirse de los experimentos. En base a los valores medios de glucosa en sangre, los 42 ratones restantes pueden seleccionarse para más experimentos y asignarse a 7 grupos (n=6) con niveles de glucosa en sangre coincidentes. Los ratones pueden usarse en experimentos con una duración de 5 días hasta 4 veces. Después del último experimento, los ratones se sacrifican.

Los siete grupos pueden recibir tratamiento de la siguiente manera:

1: Vehículo, subcutáneo

2: Agonista de GLP-1, 0,3 nmol/kg, subcutáneo

3: Agonista de GLP-1, 1,0 nmol/kg, subcutáneo

4: Agonista de GLP-1, 3,0 nmol/kg, subcutáneo

5: Agonista de GLP-1, 10 nmol/kg, subcutáneo

6: Agonista de GLP-1, 30 nmol/kg, subcutáneo

7: Agonista de GLP-1, 100 nmol/kg, subcutáneo

Vehículo: fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 145 mM, tween 80 al 0,05 %, pH 7,4.

El agonista de GLP-1 se disuelve en el vehículo, por ejemplo, a concentraciones de 0,05, 0,17, 0,5, 1,7, 5,0 y 17,0 nmol/ml. Los animales se administran por vía subcutánea con un volumen de dosis de 6 ml/kg (es decir, 300 |jl por ratón de 50 g).

El día de la administración, la glucosa en sangre se evalúa a las ^ h (8,30 am), donde después se pesan los ratones. El agonista de GLP-1 se administra aproximadamente a las 9 a.m. (hora 0). El día de la administración, se evalúa la glucosa en sangre, por ejemplo, a las horas 1, 2, 4 y 8 (10 am, 11 am, 1 pm y 5 pm).

En los días siguientes, se evalúa la glucemia, por ejemplo, a las 24, 48, 72 y 96 horas después de la administración (es decir, a las 9 a.m. del día 2, 3, 4, 5). Cada día, los ratones se pesan después del muestreo de glucosa en sangre.

Los ratones se pesan individualmente en una balanza digital.

Las muestras para la medición de la glucosa en sangre se obtienen del lecho capilar de la punta de la cola de ratones conscientes. Se recoge sangre, 10 jl, en capilares heparinizados y se transfiere a 500 |jl de tampón de glucosa (solución del sistema EKF, Eppendorf, Alemania). La concentración de glucosa se mide mediante el uso del método de glucosa oxidasa (analizador de glucosa Biosen 5040, EKF Diagnostic, GmbH, Barleben, Alemania). Las muestras se mantienen a temperatura ambiente durante hasta 1 hora hasta el análisis. Si el análisis tiene que posponerse, las muestras se mantienen a 4 °C durante un máximo de 24 horas.

La ED<50>es la dosis que da lugar al efecto semimáximo en nmol/kg. Este valor se calcula sobre la base de la capacidad de los agonistas de GLP-1 para reducir el peso corporal, así como también la capacidad de reducir la glucosa en sangre, como se explica más abajo.

ED<50>para el peso corporal se calcula como la dosis que da lugar a un efecto semimáximo sobre el delta BW 24 horas después de la administración subcutánea del agonista de GLP-1. Por ejemplo, si la disminución máxima del peso corporal después de 24 horas es 4,0 g, entonces la ED<50>del peso corporal es la dosis en nmol/kg que da lugar a una disminución del peso corporal después de 24 horas de 2,0 g. Esta dosis (ED<50>del peso corporal) puede leerse a partir de la curva de respuesta a la dosis.

ED<50>para la glucosa en sangre se calcula como la dosis que da lugar al efecto semimáximo en AUC delta BG 8 horas después de la administración subcutánea del agonista de GLP-1.

El valor de la ED<50>sólo puede calcularse si existe una relación sigmoidal de respuesta a la dosis apropiada con una clara definición de la respuesta máxima. Por lo tanto, si este no fuera el caso, el agonista de GLP-1 en cuestión se vuelve a probar en un intervalo diferente de dosis hasta que se obtiene la relación de dosisrespuesta sigmoidea.

Ensayo (IV): Efecto sobre la ingestión de alimentos

El propósito de este experimento es investigar el efecto de los agonistas de GLP-1 sobre la ingestión de alimentos en cerdos. Esto se realiza en un estudio farmacodinámico (PD) como se describe más abajo, en el que la ingestión de alimentos se mide 1, 2, 3 y 4 días después de la administración de una dosis única del agonista de GLP-1, en comparación con un grupo de control tratado con vehículo.

Se usan cerdos Duroc de Landrace Yorkshire hembra (LYD), de aproximadamente 3 meses de edad, que pesan aproximadamente 30-35 kg (n=3-4 por grupo). Los animales se alojaron en un grupo por 1-2 semanas durante la aclimatación a las instalaciones de los animales. Durante el período experimental, los animales se colocaron en corrales individuales desde el lunes por la mañana hasta el viernes por la tarde para la medición de la ingestión de alimentos individual. Los animales se alimentaron ad libitum con forraje de cerdo (Svinefoder, Antonio) en todos los momentos tanto durante el período de aclimatación y el experimental. La ingestión de alimentos se monitoreó en línea al registrar el peso del forraje cada 15 minutos. El sistema usado es Mpigwin (Ellegaard Systems, Faaborg, Dinamarca).

Los agonistas de GLP-1 se disuelven en un tampón de fosfato (fosfato 50 mM, tween 80 al 0,05 %, pH 8), por ejemplo, a concentraciones de 12, 40, 120, 400 o 1200 nmol/ml correspondientes a dosis de 0,3, 1, 3, 10 o 30 nmol/kg. El tampón de fosfato sirvió como vehículo. Los animales reciben una dosis subcutánea única del agonista de GLP-1 o vehículo (volumen de dosis 0,025 ml/kg) en la mañana del día 1, y la ingestión de alimentos se mide durante 4 días después de la dosificación. El último día de cada estudio, 4 días después de la administración, se toma una muestra de sangre para la medición de la exposición plasmática del agonista de GLP-1 del corazón en animales anestesiados. Los animales se sacrifican después con una sobredosis intracardíaca de pentobarbital. El contenido plasmático del agonista de GLP-1 se analiza mediante el uso de ELISA o un ensayo basado en anticuerpos similar.

La ingestión de alimentos se calcula como media ± SEM de la ingestión de alimentos a las 24 h en los 4 días. Las comparaciones estadísticas de la ingestión de alimentos en 24 horas en el vehículo frente al grupo de agonista de GLP-1 en los 4 días se realizan mediante el uso de medidas repetidas de ANOVA unidireccional o bidireccional, seguido de la prueba postest de Bonferroni.

Ensayo (V): Estabilidad frente a la degradación por enzimas intestinales

El propósito de este ejemplo es probar la estabilidad contra la degradación por las enzimas intestinales. GLP-1(7-37) puede usarse en el ensayo como un compuesto comparativo. Las actividades proteolíticas más fuertes en el intestino son de origen pancreático e incluyen las endopeptidasas de serina tripsina, quimotripsina y elastasa, así como también varios tipos de carboxipeptidasas. Se desarrolló un ensayo con extracto de intestino delgado de ratas y se usó como se describió a continuación.

Extractos a partir de intestino delgado de rata

Los intestinos delgados se preparan a partir de ratas y se enjuagan con 8 ml de NaCI 150 mM, Hepes 20 mM pH 7,4. Las soluciones se centrifugan durante 15 min a 4600 rpm en una centrífuga Heraeus Multifuge 3 S-R con un rotor 75006445. Los sobrenadantes se eliminan y se filtran a través de una membrana Millipore Millex GV PVDF de 0,22 |jm. Los filtrados de varios animales se combinan para promediar las diferencias individuales.

El contenido de proteínas de los extractos obtenidos se determina mediante el ensayo de Bradford (ver, por ejemplo, Analytical Biochemistry (1976), vol. 72, p. 248-254, y Analytical Biochemistry (1996), vol. 236 p. 302 308).

Ensayo de degradación

Se incuban 2,5 nmol de los agonistas de GLP-1 a probar con el extracto intestinal en un volumen de 250 |jl a 37 °C durante un período de una hora. Las muestras intestinales se analizan en presencia de Hepes 20 mM a pH 7,4. La concentración del extracto intestinal se titula en experimentos piloto de manera que la semivida (ty) de GLP-1(7-37) esté en el intervalo de 10-20 minutos. El extracto de intestino delgado se usa a una concentración de 1,4 jg/ml. Todos los componentes excepto el extracto intestinal se mezclan y se precalientan durante diez minutos a 37 °C. Inmediatamente después de la adición del extracto intestinal se toma una muestra de 50 j l y se mezcla con el mismo volumen de ácido trifluoroacético (TFA) al 1 %. Se toman muestras adicionales en consecuencia después de 15, 30 y 60 minutos.

Análisis de las muestras

Análisis de UPLC: 10 j l de las muestras se analizan por UPLC mediante el uso de un sistema Waters Acquity con una columna BEH C181,7 jm 2,1 x 50 mm y un gradiente de 30 a 65 % de TFA al 0,1 % y TFA al 0,07 % en acetonitrilo durante 5 minutos a un régimen de flujo de 0,6 ml/min. Después de la sustracción del valor inicial, se determinan los integrales de los picos de los compuestos intactos en el cromatograma de HPLC registrados a una longitud de onda de 214 nm.

Análisis MALDI-TOF: Se transfiere 1 j l de cada muestra a un objetivo MALDI Bruker/Eppendorf PAC HCCA 384. El análisis se realiza con un espectrómetro de masas de desorción y ionización por láser asistida por matriz (MALDI-TOF) Bruker Autoflex mediante el uso del método predefinido “PAC_measure” con un intervalo de detección extendido de 500 a 5000 Da y el método de calibración predefinido “PAC_calibrate”.

Análisis de datos: Los integrales de picos de los cromatogramas de HPLC se representan gráficamente contra el tiempo. La semivida del compuesto respectivo se calcula mediante el ajuste de los datos mediante el uso del software SigmaPlot 9.0 y una ecuación para un decaimiento exponencial de 2 parámetros. Para cada agonista de GLP-1 probado, la semivida relativa (T<y>) se calcula como la semivida (T<y>) del compuesto en cuestión, dividido por la semivida (T<y>) de GLP-1(7-37), determinada de la misma manera.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un agonista de GLP-1 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables para su uso en la prevención o tratamiento de la diabetes tipo 2, en donde dicho agonista de GLP-1 es semaglutida, en donde dicho agonista de GLP-1 se administra una vez a la semana en una cantidad de 1,0 mg y en donde dicho agonista de GLP-1 se administra mediante administración parenteral.

2. El agonista de GLP-1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho agonista de GLP-1 se administra mediante inyección subcutánea (s.c.).

3. El agonista de GLP-1 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho agonista de GLP-1 tiene forma de una sal farmacéuticamente aceptable.

4. El agonista de GLP-1 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha composición consiste en dicho agonista de GLP-1 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

5. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el pH de dicha composición es aproximadamente 7,0.