RS60432B1

RS60432B1 - Upotreba glp-1 peptida sa dugim dejstvom

Info

Publication number: RS60432B1
Application number: RS20200684A
Authority: RS
Inventors: Christine Bjørn Jensen; Mads Frederik Rasmussen; Milan Zdravkovic; Peter Kristensen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 2012-07-01
Filing date: 2013-06-21
Publication date: 2020-07-31
Also published as: AU2020202573B2; EP3689365A1; MX2014014946A; HRP20200889T1; EP4406593A3; PL3689365T3; EP2866825A1; MX2020010693A; DK2866825T3; JP6059802B2; AU2020202573A1; EP3689365C0; US20150190474A1; AU2013286177A1; ES2796839T3; JP2015522573A; HUE072859T2; MX2019008148A; AU2013286177B2; PL2866825T3

Description

KRATAK OPIS

Predmetni pronalazak odnosi se na kompoziciju koja sadrži semaglutid GLP-1 agonista i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa za upotrebu u prevenciji ili lečenju gojaznosti, pri čemu data upotreba obuhvata davanje datog GLP-1 agonista u količini od najmanje 0,7 mg nedeljno; i data kompozicija (i) sadrži izotonično sredstvo, (ii) je u obliku vodene formulacije koja sadrži najmanje 80% t/t vode ili (iii) je u obliku vodene formulacije sa pH između 3 i 10. Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Slika 1 prikazuje promenu HbA1c nakon supkutane primene placeba, semaglutida ili liraglutida kod ljudskih ispitanika. *p <0,05 u odnosu na placebo; **p <0,001 u odnosu na placebo (na osnovu prilagođenih srednjih vrednosti). Polazne vrednosti su samo za informaciju: podaci su prilagođeni modelu za polazne vrednosti HbA1c. Podaci su srednje vrednosti LS prilagođene modelu, FAS LOCF. Procene su iz ANOVA modela sa tretmanom, zemljom i prethodnim tretmanom kao fiksnim efektima i polaznim HbA1c kao kovarijablom.

Slika 2 prikazuje srednju promenu HbA1c od polaznog u odnosu na vreme; podaci su srednje vrednosti (1.96SE), FAS LOCF. Tretmani su placebo (A); semaglutid 0,1 mg (B, isprekidana linija), 0,2 mg (C), 0,4 mg (D), 0,8 mg (E), 0,8 mg T (F, isprekidana linija), 1,6 mg T (G); liraglutid 1,2 mg (H), 1,8 mg (I).

Slika 3 prikazuje subjekte koji dostižu AACE ili ADA kriterijume za kontrolu glikemije. Broj pacijenata koji dostižu kriterijume po tretmanu naveden je u svakom stubiću. Tretmani su placebo (A); semaglutid 0,1 mg (B), 0,2 mg (C), 0,4 mg (D), 0,8 mg (E), 0,8 mg T (F), 1,6 mg T (G); liraglutid 1,2 mg (H), 1,8 mg (I). *p <0,05 u odnosu na placebo; **p <0,001 u odnosu na placebo; ***p <0,0001 u odnosu na placebo (na osnovu prilagođenih srednjih vrednosti). Podaci su FAS LOCF. Procene su iz modela logističke regresije tretmana, zemlje i prethodnog tretmana kao fiksnih efekata i polaznog HbA1c kao kovarijable. ADA, Američko udruženje za dijabetes; AACE, Američko udruženje kliničkih endokrinologa.

Slika 4 prikazuje promenu srednje telesne težine u odnosu na vreme; podaci su srednja vrednost (1.96SE), FAS LOCF. Tretmani su placebo (A); semaglutid 0,1 mg (B, isprekidana linija), 0,2 mg (C), 0,4 mg (D), 0,8 mg (E), 0,8 mg T (F, isprekidana linija), 1,6 mg T (G); liraglutid 1,2 mg (H), 1,8 mg (I).

Slika 5 prikazuje promenu telesne težine u odnosu na polaznu vrednost u 12. nedelji. **p <0,001 u odnosu na placebo; ***p <0,0001 u odnosu na placebo (na osnovu prilagođenih srednjih vrednosti). †: Osnovne vrednosti samo kao informacije: podaci su prilagođeni modelu za polaznu telesnu težinu. Podaci su srednje vrednosti LS prilagođene modelu, FAS LOCF. Procene su iz ANOVA modela sa tretmanom, zemljom i prethodnim tretmanom kao fiksnim efektima i polaznom telesnom težinom kao kovarijablom.

SE: Standardna greška. FAS: Set za kompletnu analizu. LOCF: Poslednje posmatranje dalje preneto.

OPIS WO2011/138421 se odnosi na terapije metaboličkih bolesti, uključujući gojaznost, koje uključuju kombinovano davanje agonista GLP-1 receptora (opciono semaglutida) i inhibitora DPP-4. Ovaj pronalazak se odnosi na poboljšanu upotrebu GLP-1 agonista u terapiji. U jednoj realizaciji, pronalazak se odnosi na određene režime doziranja GLP-1 agonista koji obezbeđuju poboljšani efekat kod bolesti ili stanja, kao što su prevencija i/ili lečenje dijabetesa tipa 2 i gojaznosti. U jednoj realizaciji, postupci ovog pronalaska pokazuju iznenađujuće poboljšanu redukciju HbA1c i smanjenje telesne težine. U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist se daje u količini koja obezbeđuje poboljšano a) smanjenje HbA1c ili b) smanjenje telesne težine u poređenju sa davanjem 1,8 mg liraglutida ili manje, kao što je 0,8 mg liraglutida ili manje, dnevno.

U jednoj realizaciji, pronalazak se odnosi na postupak za a) redukciju HbA1c; b) prevenciju ili lečenje dijabetesa tipa 2, hiperglikemije, poremećene tolerancije na glukozu ili dijabetesa koji nije zavisan od insulina; ili c) prevenciju ili lečenje gojaznosti, smanjenje telesne težine i/ili unosa hrane ili izazivanje sitosti; pri čemu dati postupak uključuje davanje GLP-1 agonista subjektu kome je potreban, pri čemu dati GLP-1 agonist i) ima poluživot od najmanje 72 sata, pri čemu je dati poluživot opciono određen Analizom (II); ii) se daje u količini od najmanje 0,7 mg nedeljno, količini ekvivalentnoj najmanje 0,7 mg semaglutida nedeljno; i iii) daje se jednom nedeljno ili ređe.

U jednoj realizaciji, pronalazak se odnosi na GLP-1 agonist za upotrebu u a) redukciji HbA1c; b) prevenciji ili lečenju dijabetesa tipa 2, hiperglikemije, poremećene tolerancije na glukozu ili dijabetesa koji nije zavisan od insulina; ili c) prevenciji ili lečenje gojaznosti, za smanjenje telesne težine i/ili unosa hrane, ili za izazivanje sitosti; pri čemu data upotreba uključuje davanje GLP-1 agonista u količini od najmanje 0,7 mg nedeljno, količini ekvivalentnoj najmanje 0,7 mg semaglutida nedeljno, i pri čemu je dati GLP-1 agonist i/ili njegova primena opciona kako je ovde definisano.

U jednoj realizaciji, pronalazak se odnosi na smešu koja sadrži GLP-1 agonist za upotrebu u a) redukciji HbA1c; b) prevenciji ili lečenju dijabetesa tipa 2, hiperglikemije, poremećene tolerancije na glukozu ili dijabetesa koji nije zavisan od insulina; ili c) prevenciji ili lečenju gojaznosti, za smanjenje telesne težine i/ili unosa hrane, ili za izazivanje sitosti; pri čemu dati GLP-1 agonist i) ima poluživot od najmanje 72 sata, pri čemu je dati poluživot opciono određen Analizom (II); i ii) se daje u količini od najmanje 0,7 mg nedeljno, količini ekvivalentnoj najmanje 0,7 mg semaglutida nedeljno; i pri čemu se data kompozicija daje jednom nedeljno ili ređe i pri čemu je dati GLP-1 agonist i/ili primena opciona kako je ovde definisano.

U jednoj realizaciji, pronalazak se odnosi na postupak za smanjenje HbA1c ili za prevenciju ili lečenje dijabetesa tipa 2, hiperglikemije, poremećene tolerancije na glukozu ili dijabetesa koji nije zavisan od insulina, pri čemu dati postupak sadrži davanje GLP-1 agonista subjektu u potrebi za njim u količini od najmanje 0,7 mg nedeljno, količini ekvivalentnoj najmanje 0,7 mg semaglutida nedeljno. U jednoj realizaciji, postupak je za smanjenje HbA1c. U jednoj realizaciji, postupak je za prevenciju ili lečenje dijabetesa tipa 2. U jednoj realizaciji, postupak je za prevenciju ili lečenje hipoglikemije. U jednoj realizaciji, postupak je za sprečavanje ili lečenje poremećene tolerancije na glukozu. U jednoj realizaciji, postupak je za prevenciju ili lečenje dijabetesa koji nije zavisan od insulina. U jednoj realizaciji, postupak prema pronalasku uključuje odlaganje ili prevenciju napredovanja dijabetesa. U jednoj realizaciji je postignut nivo HbA1c ispod 7%. U jednoj realizaciji, nivo HbA1c se određuje prema postupku definisanom u Ispitivanju kontrole i komplikacija dijabetesa (DCCT). U jednoj realizaciji, nivo HbA1c se određuje prema postupku koji je definisala Međunarodna federacija za kliničku hemiju (IFCC).

U jednoj realizaciji, pronalazak se odnosi na postupak za lečenje ili prevenciju gojaznosti, za smanjenje telesne težine i/ili unosa hrane, ili za izazivanje sitosti, dati postupak koji obuhvata davanje GLP-1 agonista subjektu kome je potreban u količini od najmanje 0,7 mg nedeljno, količini ekvivalentnoj najmanje 0,7 mg semaglutida nedeljno. U jednoj realizaciji, postupak je za prevenciju ili lečenje gojaznosti. U jednoj realizaciji, postupak je za smanjenje telesne težine i/ili unosa hrane. U jednoj realizaciji, postupak je za izazivanje sitosti.

U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist ima poluživot od najmanje 24 sata, kao što je najmanje 48 sati, najmanje 60 sati, ili najmanje 72 sata, ili takav najmanje 84 sata, najmanje 96 sati, ili najmanje 108 sati ili opcionalno najmanje 120 sati, najmanje 132 sata ili najmanje 144 sata, pri čemu je navedeni poluživot opcionalno određen Analizom (II).

U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist se daje dva puta nedeljno ili ređe, jednom nedeljno ili ređe, ili jednom nedeljno ili ređe. U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist se daje jednom svake druge nedelje ili ređe, jednom svake treće nedelje ili ređe, ili jednom mesečno ili ređe.

U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist se daje u količini od najmanje 0,8 mg, najmanje 0,9 mg, ili najmanje 1,0 mg. U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist se daje u količini od najmanje 1,1 mg, najmanje 1,2 mg, ili najmanje 1,3 mg. U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist se daje u količini od najmanje 1,4 mg, najmanje 1,5 mg, ili najmanje 1,6 mg.

U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist se daje u količini nedeljno koja iznosi najmanje 0,8 mg, najmanje 0,9 mg, ili najmanje 1,0 mg semaglutida. U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist se daje u količini nedeljno koja iznosi najmanje 1,1 mg, najmanje 1,2 mg, ili najmanje 1,3 mg semaglutida. U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist se daje u količini nedeljno koja iznosi najmanje 1,4 mg, najmanje 1,5 mg, ili najmanje 1,6 mg semaglutida.

U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist je izabran iz grupe koja se sastoji od eksenatida, albiglutida i dulaglitida.

U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist se daje parenteralno, kao što je potkožna injekcija.

U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist je GLP-1 peptid.

U jednoj realizaciji, GLP-1 peptid je DPPIV zaštićen GLP-1 peptid. U jednoj realizaciji, GLP-1 peptid je DPPIV stabilizovan.

U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist ima EC50na ili ispod 3000 pM, kao što je na ili ispod 500 pM ili na ili ispod 100 pM, opcionalno utvrđeno Analizom (I).

U jednoj realizaciji, pronalazak se odnosi na GLP-1 agonist za upotrebu u smanjenju HbA1c ili za upotrebu u prevenciji ili lečenju dijabetesa tipa 2, hiperglikemije, poremećene tolerancije na glukozu ili dijabetesa koji nije zavisan od insulina, i koja uključuje davanje GLP-1 agonista u količini od najmanje 0,7 mg nedeljno, količini ekvivalentnoj najmanje 0,7 mg semaglutida nedeljno. U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist i/ili njegova primena je kao što je ovde definisano.

U jednoj realizaciji, pronalazak se odnosi na GLP-1 agonist za upotrebu u prevenciji ili lečenju gojaznosti, smanjenju telesne težine i/ili unosa hrane ili za izazivanje sitosti, koja uključuje davanje GLP-1 agonista u količini najmanje 0,7 mg nedeljno, količini ekvivalentnoj najmanje 0,7 mg semaglutida nedeljno. U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist i/ili njegova primena je kao što je ovde definisano.

U jednoj realizaciji, pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži GLP-1 agonist i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa za upotrebu u smanjenju HbA1c ili za prevenciju ili lečenje dijabetesa tipa 2, hiperglikemije, oslabljene tolerancije na glukozu ili dijabetesa koji nije zavisan od insulina, pri čemu se dati GLP-1 agonist daje u količini od najmanje 0,7 mg nedeljno, količini ekvivalentnoj najmanje 0,7 mg semaglutida nedeljno. U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist i/ili njegova primena je kao što je ovde definisano.

U jednoj realizaciji, pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži GLP-1 agonist i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa za upotrebu u prevenciji ili lečenju gojaznosti, smanjenju telesne težine i/ili unosa hrane ili za izazivanje sitosti, pri čemu se dati agonist GLP-1 daje u količini od najmanje 0,7 mg nedeljno, količini ekvivalentnoj najmanje 0,7 mg semaglutida nedeljno. U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist i/ili njegova primena je kao što je ovde definisano.

U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist se daje sa drugim terapeutskim sredstvom.

Davanje sa drugim terapeutskim sredstvom može se sprovesti kao primena GLP-1 agonista i drugog terapeutskog sredstva unutar istog terapeutskog prozora (npr. u roku od dve nedelje, perioda od jedne nedelje, ili u 96-, 72-, ili 48-časovnom periodu, itd.). Tretman sa GLP-1 agonistom prema predmetnom pronalasku može biti kombinovan sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava, npr. izabranim iz antidijabetika, sredstava protiv gojaznosti, sredstava za regulisanje apetita, antihipertenzivnih lekova, sredstava za lečenje i/ili prevenciju komplikacija koje su posledica ili povezane sa dijabetesom i sredstava za lečenje i/ili sprečavanje komplikacija i poremećaja koji su posledica ili su povezani sa gojaznošću; primeri ovih terapeutskih sredstava su: sulfoniluree, tiazolidindioni, biguanidi, meglitinidi, inhibitori glukozidaze, antagonisti glukagona i DPP-IV (dipeptidil peptidaza-IV) inhibitori.

U jednoj realizaciji, kako se ovde koristi, „količina ekvivalentna“ kada se koristi u odnosu na GLP-1 agoniste odnosi se na količine prvog GLP-1 agonista i drugog GLP-1 agonista koji imaju potentnost receptora GLP-1 (tj. EC50) unutar ± 30%, kao što je unutar ± 20% ili unutar ± 10%, svaku od njih opciono utvrđenu Analizom (I) opisanom ovde i koji ima poluživot unutar ± 30%, kao što je unutar ± 20% ili unutar ± 10%, jednih od drugih opciono utvrđen Analizom (II) opisanom ovde.

U nekim realizacijama „efikasna količina“ GLP-1 agonista kao što je ovde korišćeno označava količinu koja je dovoljna za lečenje, ublažavanje ili delimično zaustavljanje kliničkih manifestacija date bolesti ili stanja i njegovih komplikacija. Količina dovoljna da se to i postigne definisana je kao „efikasna količina”. Efikasne količine za svaku od navedenih namena zavisiće od težine bolesti ili povrede, kao i ozbiljnosti i opšteg stanja subjekta. Treba razumeti da se određivanje odgovarajuće doze može postići primenom rutinskih eksperimenata, kreiranjem matrice vrednosti i testiranjem različitih tačaka u matrici, što je sve uobičajeno za lekara ili veterinara.

U nekim realizacijama pojam „tretman“ ili „lečenje“, kako se ovde koristi, označava vođenje i negu pacijenta u svrhu suzbijanja stanja, kao što je bolest ili poremećaj. U nekim realizacijama pojam „tretman” ili „lečenje“ ima za cilj da obuhvati puni spektar tretmana za određeno stanje od kojeg pacijent pati, kao što je primena aktivnog jedinjenja radi ublažavanja simptoma ili komplikacija; da odloži progresiju bolesti, poremećaja ili stanja; da ublaži ili oslobodi od simptoma i komplikacija; i/ili da se izleči ili eliminiše bolest, poremećaj ili stanje, kao i da se spreči stanje. U jednoj realizaciji sprečavanje treba shvatiti kao upravljanje i brigu o pacijentu u svrhu suzbijanja bolesti, stanja ili poremećaja i uključuje davanje aktivnih jedinjenja kako bi se sprečio nastanak simptoma ili komplikacija.

U jednoj realizaciji izraz „hidrofilni spejser", kako se ovde koristi, označava odstojnik koji razdvaja peptid i ostatak koji vezuje albumin sa hemijskom grupom koja sadrži najmanje 5 atoma koji nisu vodonik, pri čemu je 30-50% ili N ili O.

U jednoj realizaciji zraz „analog“, kako se ovde koristi, upućivanjem na polipeptid, podrazumeva modifikovani peptid, pri čemu su jedan ili više amino kiselinskih ostataka peptida supstituisani drugim ostacima amino kiselina i/ili gde je jedan ili više amino kiselinskih ostataka izostavljen iz peptida i/ili gde je jedan ili više amino kiselinskih ostataka dodat peptidu. Takvo dodavanje ili delecija amino kiselinskih ostataka može da bude na N-terminalu peptida i/ili na C-terminalu peptida. Jednostavan sistem koristi se za opisivanje analoga: Na primer, Arg<34>GLP-1 (7-37) Lys označava GLP-1 analog, pri čemu je lizin koji se prirodno nalazi na poziciji 34 zamenjen argininom, a lizinski ostatak je dodat na C-kraju (pozicija 38).

U jednoj realizaciji, izraz „GLP-1 peptid“, kako se ovde koristi, znači GLP-1 (7-37), GLP-1 analog, GLP-1 derivat ili derivat GLP-1 analoga.

U jednoj realizaciji, izraz „eksendin-4 peptid“, kako se ovde koristi, znači eksendin-4 (1-39), analog eksendina-4, derivat ekendina-4 ili derivat analoga eksendina-4.

U jednoj realizaciji izraz „zaštićen protiv DPP-IV“, kako je ovde korišćen, koji se odnosi na polipeptid, označava polipeptid koji je hemijski modifikovan da bi se dato jedinjenje učinilo otpornim na peptidazu plazme dipeptidil aminopeptidaze-4 (DPP-IV). Poznato je da je DPP-IV enzim u plazmi uključen u degradaciju nekoliko peptidnih hormona, npr. GLP-1, Eksendina-4, itd. Stoga, ulažu se značajni napori da se razviju GLP-1 agonisti koji su manje podložni hidrolizi posredovanoj DPP-IV da bi se smanjila brzina degradacije pomoću DPP-IV.

Predmetna prijava se, takođe, odnosi na GLP-1 agonist koji se koristi kao lek. U konkretnim realizacijama, GLP-1 agonist može da se koristi za sledeće medicinske tretmane:

(i) prevencija i/ili lečenje svih oblika dijabetesa, kao što su hiperglikemija, dijabetes tipa 2, oštećena tolerancija na glukozu, dijabetes tipa 1, insulin nezavisan dijabetes, MODI (adultni tip dijabetesa kod mladih osoba), gestacijski dijabetes i/ili za redukciju HbA1c;

(ii) odlaganje ili prevenciju napredovanja dijabetesa, kao što je progresija kod dijabetesa tipa 2, odlaganje napredovanja smanjenja tolerancije glukoze (IGT) na insulin koji zahteva dijabetes tipa 2 i/ili odlaganje napredovanja insulin nezavisnog dijabetesa tipa 2 u insulin zavistan dijabetes tipa 2;

(iii) prevencija i/ili tretman poremećaja u ishrani, kao što je gojaznost, npr. smanjivanjem unosa hrane, smanjivanjem telesne težine, potiskivanjem apetita, indukcijom sitosti; lečenje ili sprečavanje poremećaja ishrane, bulimia nervosa i/ili gojaznosti izazvane davanjem antipsihota ili steroida; smanjenje pokretljivosti želuca; i/ili odlaganje gastričnog pražnjenja.

U drugoj konkretnoj realizaciji, indikacija je (i). U daljoj konkretnoj realizaciji, indikacija je (ii). U još jednoj konkretnoj realizaciji, indikacija je (iii). U jednoj realizaciji indikacija je dijabetes tipa 2 i/ili gojaznost.

U jednoj realizaciji postupak obuhvata prevenciju, lečenje, redukciju i/ili indukciju kod jedne ili više bolesti ili stanja kao što je ovde definisano. U jednoj realizaciji indikacija je (i) i (iii). U jednoj realizaciji indikacija je (ii) i (iii). U jednoj realizaciji postupak obuhvata prevenciju, lečenje, redukciju i/ili indukciju kod jedne ili više bolesti ili stanja odabranih od a) i b), a) i c), b) i c) ili a), b) i c ) kao što je definisano u zahtevu 1.

U jednoj realizaciji pronalazak se odnosi na davanje efikasne količine GLP-1 agonista.

U jednoj ovde korišćenoj realizaciji specifične vrednosti date u odnosu na brojeve ili intervale mogu se shvatiti kao specifična vrednost ili vrednost oko specifične vrednosti.

FUNKCIONALNA SVOJSTVA

U prvom funkcionalnom aspektu, GLP-1 agonisti ovog pronalaska imaju dobru potentnost. Takođe, ili alternativno, u drugom funkcionalnom aspektu, GLP-1 agonisti ovog pronalaska imaju produženi farmakokinetički profil. Takođe, ili alternativno, u trećem funkcionalnom aspektu, GLP-1 agonisti ovog pronalaska su stabilni protiv degradacije gastrointestinalnim enzimima.

Biološka aktivnost (potentnost)

Prema prvom funkcionalnom aspektu, GLP-1 agonisti iz pronalaska su biološki aktivna ili potentna. U posebnoj realizaciji, „potentnost“ i/ili „aktivnost“ se odnose na in vitro potentnost, tj. performanse u funkcionalnom testu GLP-1 receptora, tačnije na sposobnost stimulisanja stvaranja cAMP u ćelijskoj liniji koja izražava klonirani humani GLP-1 receptor.

Stimulisanje stvaranja cAMP u medijumu koji sadrži humani GLP-1 receptor može se poželjno odrediti korišćenjem stabilne transfektovane ćelijske linije kao što je BHK467-12A (tk-ts13) i/ili korišćenjem za određivanje cAMP analize funkcionalnog receptora, npr. zasnovane na nadmetanju između endogeno formiranog cAMP-a i egzogeno dodatog biotinoznačenog cAMP-a, u kome je cAMP za analizu poželjnije zarobljen korišćenjem specifičnog antitela, i/ili gde je još poželjniji test AlphaScreen cAMP test, kao što je onaj opisan u Analizi (I).

U jednoj realizaciji izraz polumaksimalna efektivna koncentracija (EC50) generalno se odnosi na koncentraciju koja indukuje odgovor na pola puta između osnovne linije i maksimuma, pozivanjem na krivu odgovora na dozu. EC50se koristi kao mera jačine jedinjenja i predstavlja koncentraciju gde se uočava 50% njenog maksimalnog efekta.

In vitro potentnost GLP-1 agonista može se odrediti kao što je opisano gore, a određena je EC50predmetnog GLP-1 agonista. Niža EC50, bolja potentnost.

U posebnoj realizaciji, medijum ima sledeću kompoziciju (krajnje koncentracije u ispitivanju): 50 mM TRIS-HCl; 5 mM HEPES; 10 mM MgCl2, 6H2O; 150 mM NaCl; 0,01% Tween; 0,1% BSA ; 0,5 mM IBMX; 1 mM ATP; 1 µM GTP; pH 7.4.

U daljoj posebnoj realizaciji, GLP-1 agonist ima in vitro potenciju koja odgovara EC50na ili ispod 3000pM, kao što je ispod 2000pM, ispod 1000pM ili ispod 500pM, ili kao što je ispod 200 pM ili ispod 100 pM.

U sledećoj posebnoj realizaciji, spojevi GLP-1 agonista su potentni in vivo, koji se mogu odrediti kao što je poznato u stanju tehnike u bilo kom pogodnom životinjskom modelu, kao i u kliničkim ispitivanjima.

Dijabetični db/db miš je jedan primer pogodnog životinjskog modela, a efekat snižavanja glukoze u krvi može se odrediti na takvim miševima in vivo, npr. kao što je opisano u Analizi (III), ili kao što je opisano u Primeru 43 WO09/030738.

Takođe, ili alternativno, uticaj na unos hrane in vivo može se utvrditi u farmakodinamičkim studijama kod svinja, npr. kao što je opisano u Analizi (IV).

Dugotrajnost - poluživot in vivo kod patuljastih svinja

Prema drugom funkcionalnom aspektu, GLP-1 agonisti pronalaska su dugotrajni. U posebnoj realizaciji dugotrajnost se može odrediti kao poluživot (T1⁄2) in vivo kod patuljastih svinja posle i.v. primene. U drugim realizacijama poluživot je najmanje 24 sata, kao što je najmanje 48 sati, najmanje 60 sati, najmanje 72 sata, ili kao što je najmanje 84 sata, najmanje 96 sati ili najmanje 108 sati.

Pogodan test za određivanje poluživota in vivo kod patuljastih svinja nakon i.v.

primene je predstavljen u Analizi (II).

Razgradnja gastrointestinalnim enzimima

Prema trećem funkcionalnom aspektu, GLP-1 agonisti su stabilni ili stabilizovani protiv degradacije jednim ili više gastrointestinalnim enzimom.

Gastrointestinalni enzimi uključuju, bez ograničenja, egzo i endo peptidaze, kao što su pepsin, tripsin, himotripsin, elastaze i karboksipeptidaze. Stabilnost se može testirati na ove gastrointestinalne enzime u obliku prečišćenih enzima ili u obliku ekstrakata iz gastrointestinalnog sistema.

U određenoj realizaciji, GLP-1 agonist ima in vitro poluživot (T1⁄2), u ekstraktu tankih creva pacova, podeljen sa odgovarajućim poluživotom (T1⁄2) GLP-1 (7-37), od najmanje 1, kao što je iznad 1.0, najmanje 1.2, najmanje 2.0, ili kao što je najmanje 3.0, ili najmanje 4.0. Drugim rečima, odnos (SI) se može definisati za svaki GLP-1 agonist, odnosno. kao in vitro poluživot (T1⁄2) dotičnog GLP-1 agonista, u ekstraktu tankih creva pacova, podeljen sa odgovarajućim vremenom poluživota (T1⁄2) GLP-1 (7-37).

Pogodan test za određivanje poluživota in vitro u ekstraktu tankih creva pacova je predstavljen u Analizi (V).

GLP-1 AGONISTI

U jednoj realizaciji, GLP-1 agonisti iz pronalaska imaju GLP-1 aktivnost. U jednoj realizaciji, „GLP-1 agonist“ se odnosi na bilo koje jedinjenje, uključujući peptidna i nepeptidna jedinjenja, koje u potpunosti ili delimično aktivira humani GLP-1 receptor. U jednoj realizaciji, „GLP-1 agonist“ je bilo koji peptidni ili nepeptidni mali molekul koji se vezuje za GLP-1 receptor, poželjno sa konstantom afiniteta (KD) ili potencijom (EC50) ispod 1 µM, npr. g. ispod 100 nM, mereno postupcima poznatim u tehnici (videti npr. WO 98/08871). U jednoj realizaciji su postupci za identifikovanje GLP-1 agonista opisani u WO 93/19175 (Novo Nordisk A/S), a primeri pogodnih GLP-1 agonista koji se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom uključuju one pomenute u WO 2005/027978 (Novo Nordisk A/S). „GLP-1 aktivnost“ odnosi se na sposobnost da se veže za receptor GLP-1 i inicira putanju transdukcije signala koji dovodi do insulinotropnog dejstva ili drugih fizioloških efekata, kao što je poznato u tehnici. Na primer, GLP-1 agonisti ovog pronalaska mogu se testirati na GLP-1 aktivnost upotrebom testa opisanog u Analizi (I) ovde.

I u još jednoj realizaciji, GLP-1 agonist je stabilni GLP-1 agonist. Kao što se ovde koristi, „stabilni GLP-1 agonist“ podrazumeva stabilan GLP-1 agonist koji pokazuje in vivo poluživot eliminacije u plazmi od najmanje 24 sata kod čoveka, opcionalno određen

1

postupkom opisanom u daljem tekstu. Primeri stabilnih GLP-1 agonista mogu se naći u WO2006/097537.

U jednoj realizaciji, postupak za određivanje perioda poluživota jedinjenja iz plazme kod čoveka može da se izvede na sledeći način: Jedinjenje je rastvoreno u izotoničnom puferu, pH 7.4, PBS ili bilo kom drugom pogodnom puferu. Doza se ubrizgava periferno, najbolje u trbušni ili gornji deo bedara. Uzorci krvi za određivanje aktivnog jedinjenja uzimaju se u čestim intervalima i u dovoljnom trajanju da pokriju terminalni deo eliminacije (npr. pre doziranja, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 24 (dan 2), 36 (dan 2), 48 (dan 3), 60 (dan 3), 72 (dan 4) i 84 (dan 4) sati nakon davanja doze). Određivanje koncentracije aktivnog jedinjenja je izvedeno kao što je opisano u Wilken et al., Diabetologia 43 (51), 2000. Izvedeni farmakokinetički parametri izračunavaju se iz podataka o koncentraciji i vremenu za svaki pojedinačni subjekt korišćenjem neparcijalnih metoda, koristeći komercijalno dostupan softver WinNonlin Verzija 2.1 (Pharsight, Cary, NC, SAD). Konstantna brzine terminalne eliminacije procenjuje se log-linearnom regresijom na terminalnom log-linearnom delu krive koncentracija-vreme i koristi se za izračunavanje poluživota eliminacije.

U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist je formulisan tako da ima poluživot u čoveku od najmanje 48 sati. Ovo se može dobiti formulacijama sa produženim oslobađanjem poznatim u stanju tehnike.

U jednoj realizaciji, GLP-1 peptid je semaglutid. WO 06/097537 opisuje semaglutid (Primer 4), mono-acilovani GLP-1 agonist za davanje jednom nedeljno.

U jednoj realizaciji, ovaj pronalazak obuhvata farmaceutski prihvatljive soli GLP-1 agonista. Takve soli uključuju farmaceutski prihvatljive kisele adicione soli, farmaceutski prihvatljive soli metala, amonijum i alkilovane amonijumove soli. Takođe su kao farmaceutski prihvatljive adicione soli kiselina namenjeni hidrati koje su u stanju da formiraju prisutni GLP-1 agonisti.

U jednoj realizaciji, put primene GLP-1 agonista može biti bilo koji put koji efikasno prenosi aktivno jedinjenje do odgovarajućeg ili željenog mesta delovanja, kao što je parenteralno. U jednoj realizaciji, lekovi ili farmaceutske kompozicije koje sadrže GLP-1 agonist, kao što je semaglutid, mogu se davati parenteralno pacijentu kome su potrebni. U jednoj realizaciji parenteralno davanje može biti izvedeno supkutanom, intramuskularnom ili intravenskom injekcijom pomoću šprica, opcionalno šprica u obliku olovke.

Alternativno, parenteralna primena može biti izvedena pomoću infuzione pumpe. Sledeća opcija je kompozicija koja može biti prah ili tečnost za davanje GLP-1 agonista u obliku nazalnog ili pulmonalnog spreja. Kao još dodatna opcija, GLP-1 agonist se, takođe, može primeniti transdermalno, npr. iz flastera, opcionalno iz iontoforetskog flastera, ili transmukozno, npr. bukalno. Gorepomenuti mogući načini davanja GLP-1 agonista ne smatraju se ograničavajućim za obim pronalaska.

U jednoj realizaciji, GLP-1 agonist daje se istovremeno zajedno sa dodatnim terapeutski aktivnim sredstvom koje se koristi u ovde definisanim tretmanima.

Humani Glukagonu-Sličan Peptid-1 je GLP-1(7-37) i ima sekvencu HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFI AWLVKGRG (SEQ ID No 1). GLP-1(7-37) može se takođe označiti i kao „nativni“ GLP-1. U popisu sekvenci, prvom aminokiselinskom ostatku SEQ ID NO: 1 (histidinu) je dodeljen br.1. Međutim, u onome što sledi - prema ustaljenoj praksi u tehnici - ovaj ostatak histidina naziva se br.7, a ostaci amin-okiselina su numerisani prema tome, završavajući sa glicin br.37. Prema tome, uopšteno govoreći, svaka referenca ovde na broj amino kiselinskog ostatka ili broj položaja u sekvenci GLP-1 (7-37) je sekvenca koja počinje sa His na poziciji 7 i završava se sa Gly na poziciji 37. Neograničavajući primer pogodne analogne nomenklature je[Aib<8>,Arg<34>,Lys<37>]GLP-1(7-37), koji označava analog GLP-1 (7-37), u kome je alanin na poziciji 8 supstituisan sa α-aminoizobuternom kiselinom (Aib), lizin na poziciji 34 je supstituisan argininom, a glicin na poziciji 37 je supstituisan lizinom.

Koncentracija GLP-1 agonista u plazmi može se odrediti primenom odgovarajućeg metoda. Na primer može se primeniti LC-MS (tečna hromatografija-masena spektrometrija) ili imunološko određivanje kao što je RIA (radioimunotest), ELISA (ELIZA, enzimska imunoproba), i imunotest LOCI (Luminescence Oxygen Channeling Immunoasssay). Opšti protokoli za odgovarajuće RIA i ELISA testove nađeni su u npr. WO09/030738 na str.116-118. Poželjni test je LOCI (luminescentni kiseonički imunološki test usmeravanja), uglavnom kako je opisano za određivanje insulina od strane Polsena i Džensena u Journal of Biomolecular Screening 2007, vol.12, str.240-247 - ukratko uzorci krvi mogu se prikupiti u željenim intervalima, plazma razdvojiti, odmah zamrznuti i držati na -20°C dok se ne analizira koncentracija u plazmi odgovarajućeg GLP-1 agonista; zrnca donora obložena su streptavidinom, dok su zrnca konceptora konjugovana monoklonskim antitelom koje prepoznaje srednji / C-terminalni epitop peptida; drugo monoklonsko antitelo, specifično za N-kraj, je biotinilirano; tri reaktanata su kombinovana sa analitom i formiraju dvostrani imunokompleks; osvetljavanje kompleksa oslobađa pojedinačne atome kiseonika iz zrnca donora, koji su usmereni u akceptorska zrnca i aktiviraju hemiluminescenciju koja se može meriti u čitaču ploča Envision; količina svetlosti je proporcionalna koncentraciji jedinjenja.

U jednoj realizaciji, izraz „Aib“ kako je ovde upotrebljen, odnosi se na αaminoizobuternu kiselinu.

FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE

Data doza može da sadrži od 5 mg do 100 mg GLP-1 agonista, ili od 5-50 mg ili od 5-20 mg ili od 5-10 mg GLP-1 agonista.

U nekim realizacijama, kompozicija je BYDUREON<®>(formula za otpuštanje eksenatida dugog delovanja u česticama PLGA).

Farmaceutske kompozicije koje sadrže GLP-1 agonist ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, amid ili estar i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens mogu da se pripreme kao što je poznato u tehnici.

U jednoj realizaciji zraz „ekscipijens”, se u širem smislu odnosi na bilo koju komponentu osim aktivnog terapeutskog sastojka/jaka. Ekscipijens može biti inertna supstanca, neaktivna supstanca i/ili medicinski neaktivna supstanca. Formulacija farmaceutski aktivnih sastojaka sa različitim ekscipijensima poznata je u stanju tehnike, vidi npr. Remington: The Science and Practice of Pharmacy (e.g.19<h>edition (1995), i bilo koje kasnije izdanje). Neograničavajući primeri ekscipijenasa su: rastvarači, razblaživači, puferi, konzervansi, agensi za regulisanje toničnosti (npr. izotonična sredstva), helatna sredstva, stabilizatori (npr. inhibitori oksidacije, inhibitori agregacije, surfaktanti i/ili inhibitori proteaze).

Primeri formulacija uključuju tečne formulacije, tj. vodene formulacije koje sadrže vodu. Tečna formulacija može biti rastvor ili suspenzija. Vodena formulacija obično sadrži najmanje 50% t/t vode, ili najmanje 60%, 70%, 80%, ili čak najmanje 90% t/t vode.

Alternativno, farmaceutska kompozicija može biti čvrsta formulacija, npr. osuđena smrzavanjem ili osušena raspršivanjem, koja se može koristiti takva kakva jeste ili gde lekar ili pacijent dodaju rastvarače i/ili razblaživače pre upotrebe.

PH u vodenoj formulaciji može biti bilo koji između pH 3 i pH 10, na primer od oko 7.0 do oko 9.5; ili od oko 3.0 do oko 7.0.

Pored toga, farmaceutska kompozicija može biti formulisana kao što je poznato u tehnici oralnih formulacija insulinotropnih jedinjenja, npr. upotrebom bilo koje ili više formulacija opisanih u WO 2008/145728.

Kompozicija se može primeniti u više doznih oblika, na primer kao rastvor; suspenzija; emulzija; mikroemulzija; višestruke emulzije; pena; melem; pasta; gips; mast; tableta; obložena tableta; žvakaća guma; sredstvo za ispiranje; kapsula kao što su tvrde ili meke želatinske kapsule; supozitorija; rektalna kapsula; kapi; gel; sprej; prah; aerosol; inhalant; kapi za oči; oftalmološka mast; oftalmološko ispiranje; vaginalete; vaginalni prsten; vaginalna mast; rastvor za ubrizgavanje; in situ transformaciono rešenje kao što je in situ geliranje, podešavanje, taloženje i in situ kristalizacija; infuzioni rastvor; ili kao implant.

Kompozicija se dalje može kombinovati u nosaču lekova ili sistemu za isporuku

1

leka, npr. u cilju poboljšanja stabilnosti. bioraspoloživosti i/ili rastvorljivosti. U posebnoj realizaciji, kompozicija se može vezati za takav sistem preko kovalentnih, hidrofobnih i/ili elektrostatičkih interakcija. Svrha takvog jedinjenja može biti, na primer, smanjenje negativnih efekata, postizanje hronoterapije i/ili povećanje usklađenosti pacijenta.

Kompozicije se takođe mogu koristiti u formulacijama kontrolisanih, zadržanih, produženih, retardiranih sistema i/ili sistema za sporo otpuštanje lekova.

Kompozicija se može davati parenteralnom primenom. Parenteralno davanje može se izvesti supkutanom, intramuskularnom, intraperitonealnom ili intravenskom injekcijom pomoću šprica, opcionalno šprica u obliku olovke, ili pomoću infuzione pumpe.

PROCESI PROIZVODNJE

U jednoj realizaciji GLP-1 peptidi se mogu dobiti odgovarajućom derivatizacijom odgovarajućeg peptidnog lanca koji je dobijen tehnologijom rekombinantne DNK ili sintezom peptida (npr., sinteza na čvrstoj fazi Merrifieldovog-tipa) kao što je poznato u tehnici sinteze peptida i hemije peptida.

U jednoj realizaciji dobijanje peptida poput GLP-1(7-37) i analoga GLP-1 je dobro poznato u tehnici. GLP-1 grupa GLP-1 peptida pronalaska (ili njihovi fragmenti) mogu se na primer dobiti klasičnom sintezom peptida, npr.,sinteza peptida na čvrstoj fazi primenom hemijske tehnike t-Boc ili Fmoc ili drugih proverenih tehnika, videti, npr., Greene and Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999, Florencio Zaragoza Dörwald, “Organic Synthesis on solid Phase”, Wiley-VCH Verlag GmbH, 2000, and “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”, Edited by W.C. Chan and P.D. White, Oxford University Press, 2000.

U jednoj realizaciji GLP-1 agonisti se mogu dobiti rekombinantnim metodama, kultivacijom ćelija domaćina koje sadrže DNK sekvencu koja kodira GLP-1 agonist i koja može da eksprimira peptid u pogodnom hranljivom medijumu pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju peptida. Neograničavajući primeri ćelija domaćina koje su pogodne za ekspresiju ovih peptida su: Escherichia coli, Saccharomices cerevisiae, kao i ćelijske linije BHK ili CHO sisara.

U jednoj realizaciji GLP-1 agonisti pronalaska koji uključuju ne-prirodne aminokiseline i/ili kovalentno vezane N-terminalni mono- ili dipeptidni mimetik mogu npr. da budu proizvedeni kao što je opisano u eksperimentalnom delu. Ili videti, na primer, Hodgson et al: "The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids", Chemical Society Reviews, vol.33, no.7 (2004), p.422-430; i WO 2009/083549 A1 naslovljen "Semirecombinant preparation of GLP-1 analogues".

Primer 1: Semaglutid Glp-1 peptida obezbeđuje smanjenje HbA1c i telesne težine Semaglutid je jedinstveni acilovani GLP-1 peptid sa poluživotom od 160 sati. Cilj je bio istražiti odgovor HbA1c na dozu na jednonedeljne doze semaglutida (pet nivoa doze) kod ispitanika sa dijabetesom tipa 2. Takođe su ispitivane bezbednost, podnošljivost i farmakodinamika semaglutida nasuprot placebu i javno obeleženog liraglutida davanog jednom dnevno.

Materijali i postupci

Liraglutid se može pripremiti kao što je opisano u Primeru 37 iz WO98/08871.

Semaglutid se može pripremiti kao što je opisano u Primeru 4 iz WO2006/097537.

Kompozicija davanih GLP-1 agonista može se formulisati kao izotonični vodeni rastvori sa fosfatnim puferom, kao što je natrijum-dihidrogen fosfatni pufer, koji ima pH u opsegu 7.0-9.0, kao što je pH 7.4 ili pH 8.15, na primer koji dalje sadrži eksicipijense propilen glikol i fenol. Kompozicija davanih GLP-1 agonista može biti opisan u WO2003/002136 ili WO2005/049061. Kompozicija placeba može biti identična kompoziciji GLP-1 agonista, ali ne sadrži GLP-1 agonist.

U 12-nedeljnom, nasumičnom, dvostruko slepom, placebo kontrolisanim ispitivanjem, 411 ljudi sa dijabetesom tipa 2 je uključeno (n = 43-50 po grupi). Učesnici (muškarci/žene 65/35%; polazna vrednost HbA1c (srednja vrednost ± SD) 8,1 ± 0,8%; polazna telesna težina 87,5 ± 13,8 kg; dijabetes 2,6 ± 3,1 godina; samo metformin / samo dijeta i vežbanje 80/20%) primali su supkutanu injekciju jedne od pet doza semaglutida (0,1– 1,6 mg) jednom nedeljno, otvoreno obeleženog liraglutida (1,2 mg, 1,8 mg) jednom dnevno ili placeba jednom nedeljno. Dve doze semaglutida su titrirane (T) u nedeljnim povećanjima od 0,4 mg. Primarna krajnja tačka bila je promena u HbA1c u odnosu na polazni. Druge krajnje vrednosti efikasnosti uključuju procenat ispitanika koji dostižu ADA HbA1c cilj (<7%) i promene telesne težine. Promena i procenat u odnosu na cilj analizirani su ANOVA i logističkom regresijom, respektivno. Poređenja između semaglutida i liraglutida nisu ispravljena zbog višestrukosti. Polazne karakteristike ispitanika prikazane su u Tabeli 1.

Tabela 1. Polazne karakteristike subjekata

1

Podaci su srednja vrednost (SD) osim ako drugačije nije navedeno. *: Broj subjekata izloženih stvarnom tretmanu. D&E: Dijeta i vežbanje. FPG: Glukoza u plazmi na prazan stomak. BMI: Indeks telesne mase.

Rezultati

U kompletnom skupu analiza, semaglutid (≥0,2 mg) je smanjivao HbA1c zavisno od doze od polazne vrednosti (Sl.1) i povećao verovatnoću postizanja HbA1c <7% (p <0,05 u odnosu na placebo za doze ≥0,2 mg). Rezultati u vezi sa promenom HbA1c prikazani su na Sl.1. Promena HbA1c na Sl.1 je u odnosu na polaznu vrednost u 12. nedelji. Slika 2 prikazuje promenu HbA1c tokom vremena sa različitim tretmanima. Tretman semaglutidom ≥0,8 mg brojčano je doveo do cilja više pacijenata nego liraglutid 1,8 mg (0,8 mg T 69%, 0,8 mg 73%, 1,6 mg T 81% u odnosu na liraglutid 1,8 mg 57%). Rezultati (vidi npr. Sl.1) pokazuju da je tretman semaglutidom od 0,8 mg, 0,8 mg T ili 1,6 mg T poboljšao smanjenje

1

HbA1c u poređenju sa tretmanom liraglutidom 1,2 mg ili 1,8 mg; dalje, tretman semaglutidom 1,6 mg T bio je statistički superiorniji od tretmana liraglutidom 1,2 mg ili 1,8 mg u odnosu na smanjenje HbA1c (zasnovano na neprilagođenim srednjim vrednostima). Slika 3 prikazuje procenat i broj ispitanika koji dostižu AACE ili ADA kriterijume za kontrolu glikemije sa različitim tretmanima. Rezultati (vidi Sl.3) pokazuju da je tretman semaglutidom od 0,8 mg, 0,8 mg T ili 1,6 mg T poboljšao procenat i broj ispitanika koji su dostigli AACE ili ADA kriterijume za kontrolu glikemije u poređenju sa tretmanom liraglutidom 1,2 mg ili 1,8 mg.

Telesna težina je smanjena zavisno od doze od polazne za do 4,8 kg u odnosu na 1,2 kg placeba (p<0,01 za doze ≥0,8 mg). Slike 4 i 5 prikazuju srednje vrednosti promene telesne težine u odnosu na vreme i telesnu težinu u odnosu na polaznu vrednost u 12. nedelji, respektivno, sa različitim tretmanima. Rezultati (vidi npr. Sliku 5) pokazuju da je tretman semaglutidom 0,8 mg, 0,8 mg T ili 1,6 mg T povećao smanjenje telesne težine u poređenju sa tretmanom liraglutidom 1,2 mg ili 1,8 mg. Pored toga, rezultati (videti npr. Sliku 5) pokazuju da je tretman semaglutidom 0,8 mg T ili 1,6 mg T bio statistički superiorniji u odnosu na tretman liraglutidom 1,8 mg u pogledu smanjenja telesne težine; i da je tretman semaglutidom 0,8 mg, 0,8 mg T ili 1,6 mg T bio statistički superiorniji u odnosu na 1,2 mg liraglutida u odnosu na smanjenje telesne težine (zasnovano na neprilagođenim srednjim vrednostima).

Nije bilo izveštaja o pankreatitisu ili promenama kalcitonina u krvi povezanih sa lečenjem. Udeo ispitanika sa mučninom i povraćanjem povećavao se sa dozom, ali su uglavnom blagi ili umereni i poboljšani titracijom. Povlačenja zbog gastrointestinalnih neželjenih događaja bila su 4,7% -27,7% za semaglutide i 2,2% -10% za liraglutide. Mali broj ispitanika je prijavio blažu hipoglikemiju (semaglutid n = 5, liraglutid n = 3); nema veće hipoglikemije.7 ispitanika je prijavilo reakcije na mestu ubrizgavanja: semaglutid n = 2; liraglutid n = 5. Jedan ispitanik (semaglutid 1,6 mg T) razvio je niska titar neneutralizujuća anti-semaglutidna antitela (nema unakrsne reakcije na nativni GLP-1).

Zaključak

Tokom 12 nedelja, semaglutid je zavisno od doze smanjio HbA1c i telesnu težinu. Uticaj semaglutida 0,4 mg na kontrolu glikemije i telesnu težinu bio je uporediv sa efektom liraglutida 1,2 mg, dok se čini da je semaglutid ≥0,8 mg doveo više ispitanika do cilja i obezbedio bolji gubitak telesne težine od liraglutida 1,8 mg. Nisu utvrđene brige u vezi sa sigurnošću semaglutida. Povećanje doze nije bilo glavni fokus ovog ispitivanja i ona će biti optimizovana u budućim kliničkim ispitivanjima.

1

Farmakološki postupci

Ispitivanje (I): In vitro potentnost

Svrha ovog primera je testiranje aktivnosti ili potentnosti GLP-1 agonista in vitro. Potentnosti GLP-1 agonista mogu se odrediti kao što je opisano u daljem tekstu, tj. kao stimulacija stvaranja cikličnog AMP (cAMP) u medijumu koji sadrži membrane koje eksprimuju humani GLP-1 receptor.

Načelo

Prečišćene plazma membrane iz stabilne transfektovane ćelijske linije, BHK467-12A (tk-ts13), koje eksprimuju humani GLP-1 receptor, stimulišu se GLP-1 agonistom u pitanju, i potentnost proizvodnje cAMP se meri korišćenjem AlphaScreenTM cAMP testnog seta kompanije Perkin Elmer Life Sciences. Osnovni princip AlphaScreen analize je nadmetanje između endogenog cAMP-a i egzogeno dodatog biotin-cAMP-a. Hvatanje cAMP se postiže korišćenjem specifičnog antitela konjugovanog na akceptorska zrnca.

Ćelijska kultura i priprema membrana

Stabilna transfektovana ćelijska linija i visoko ekspresivni klon su izabrani za skrining. Ćelije su rasle na 5% CO2u DMEM, 5% FCS, 1% Pen/Strep (Penicilin/ Streptomicin) i 0,5 mg/ml selekcionog markera G418.

Ćelije pri približnom 80% spajanju se isperu 2 puta sa PBS-om i sakupe se Versenom (vodenim rastvorom tetranatrijumove soli etilendiamintetra sirćetne kiseline), centrifugiraju 5 min pri 1000 rpm i supernatant se odstranjuje. Dodatni koraci su svi napravljeni na ledu. Ćelijski pelet je homogenizovan od strane Ultrathurax-a u trajanju od 20-30s u 10 ml pufera 1 (20 mM Na-HEPES, 10 mM EDTA, pH=7.4), centrifugiran 15 min pri 20.000 rpm i pelet je ponovo suspendovan u 10 ml pufera 2 (20 mM Na-HEPES, 0.1 mM EDTA, pH=7.4). Suspenzija je homogenizovana tokom 20-30s i centrifugirana 15 min pri 20.000 rpm. Suspenzija u puferu 2, homogenizacija i centrifugiranje se ponavljaju jednom, a membrane se ponovo suspendiraju u puferu 2. Određuje se koncentracija proteina i membrane se čuvaju na -80°C do upotrebe.

Ispitivanje je izvedeno na 1/2 površine ploča sa 96 ležišta, ravnog dna (npr. Costar kataloški broj: 3693). Konačna zapremina po ležištu je 50 µl.

Rastvori i reagensi

Primeri rastvora i reagenasa su dati u nastavku.

AlphaScreen cAMP test set kompanije Perkin Elmer Life Sciences (kat. Broj:

6760625M); koja sadrži akceptorska zrnca Anti-cAMP (10 U/µl), zrnca streptavidin donora (10 U/µl) i biotinilirani-cAMP (133 U/µl).

1

AlphaScreen pufer, pH=7,4: 50 mM TRIS-HCl (Sigma, kataloški broj: T3253); 5 mM HEPES (Sigma, kataloški broj: H3375); 10 mM MgCl2, 6H2O (Merck, kataloški broj: 5833); 150 mM NaCl (Sigma, kataloški broj: S9625); 0,01% Tween (Merck, kataloški broj: 822184). Sledeće je dodato u AlphaScreen pufer pre upotrebe (naznačene krajnje koncentracije): BSA (Sigma, cat. no. A7906): 0.1%; IBMX (Sigma, cat. no. I5879): 0.5 mM; ATP (Sigma, cat. no. A7699): 1 mM; GTP (Sigma, cat. no. G8877): 1 µM.

cAMP standard (faktor razblaženja u testu = 5): cAMP rastvor: 5 µL 5 mM cAMP-osnove 495 µL AlphaScreen pufera.

Pogodne serije za razblaživanje u AlphaScreen puferu su pripremljene prema cAMP standardu kao i GLP-1 agonist koji se testira, npr. sledećih osam koncentracija GLP-1 agonista: 10<-7>, 10<-8>, 10<-9>, 10<-10>, 10<-11>, 10<-12>, 10<-13>i 10<-14>M, i serija od, na primer, 10<-6>do 3x10<-11>cAMP.

Membrana/Aceptorska zrnca

Koristiti hGLP-1/ BHK 467-12A membrane; 6 µg/ležištu, što odgovara 0,6 mg/ml (količina membrana koja se koristi u ležištu može varirati)

„Bez membrana”: Akceptorska zrnca (15µg/ml konačnog) u AlphaScreen puferu „6 µg/membranskom ležištu“: membrane Akceptorska zrnca (15 µg/ml konačnog) u AlphaScreen puferu

Dodajte 10 µl „Bez membrana“ u cAMP standard (po ležištu u duplikatima) i pozitivne i negativne kontrole

Dodajte 10 µl „6 µg/membranskom ležištu“ GLP-1 i GLP-1 agonistima (po ležištu u duplikatima/triplikatima)

Pos. Kontrola: 10 µl „bez membrana” 10 µl AlphaScreen pufera

Neg. Kontrola: 10 µl „bez membrana” 10 µl cAMP Stock rastvora (50µM) Pošto su zrnca osetljiva na direktno svetlo, svako rukovanje njima je u mraku (što je moguće mračnije) ili pod zelenim svetlu. Sva razblaživanja se rade na ledu.

Procedura

1. Napraviti AlphaScreen pufer.

2. Otopiti i razblažiti GLP-1 agoniste/cAMP standard u AlphaScreen puferu.

3. Napraviti rastvor donorskih zrnaca i inkubirati ih 30 min. na RT.

4. Dodati cAMP/GLP-1 agoniste na ploču: 10 µl po ležištu.

5. Pripremiti rastvor membrana/rastvor zrnaca akceptora i dodati ga na ploče: 10 µl po ležištu.

6. Dodati donorska zrnca: 30 µl po ležištu.

7. Zamotati ploču u aluminijsku foliju i inkubirati je na mućkalici 3 sata (veoma sporo)

1

na RT.

8. Izračunati na AlphaScreen-u - svaka ploča se inkubira na AlphaScreen-u tokom 3 minuta pre brojanja.

Vrednosti EC50[pM] mogu se izračunati pomoću softvera Graph-Pad Prism (verzija 5). Po želji, varijacija preklopa u odnosu na GLP-1 može se izračunati kao EC50(GLP-1)/ EC50(analog) - 3693.2.

Ispitivanje (II): Poluživot kod patuljastih svinja

Svrha ove studije je utvrditi produženost in vivo GLP-1 agonista nakon i.v. davanja patuljastim svinjama, tj. produženje njihovog vremena delovanja. Ovo je učinjeno u farmakokinetičkoj (PK) studiji, gde je određen terminalni poluživot predmetnog GLP-1 agonista. Terminalni poluživot obično podrazumeva period koji je potreban da bi se prepolovila određena koncentracija u plazmi, izmerena nakon početne faze distribucije.

Muške patuljaste svinje Gottingen se dobijaju od Ellegaard Gottingen patuljastih svinja (Dalmose, Danska), a koriste se približno od 7-14 meseci starosti i težine od oko 16-35 kg u istraživanjima. Patuljaste svinje su smeštene individualno i hranjene su ograničeno jednom ili dva puta dnevno sa SDS ishranom za patuljaste svinje (Special Diets Services, Essex, UK). Posle najmanje 2 nedelje aklimatizacije dva stalna centralna venska katetera su postavljena u venu cava caudalis ili cranialis kod svake životinje. Životinjama je dozvoljen oporavak od 1 nedelje nakon operacije, a zatim se koriste za ponovljene farmakokinetičke studije sa pogodnim periodom ispiranja između doziranja.

Životinje gladuju približno 18 sati pre doziranja i najmanje 4 sata posle doziranja, ali imaju ad neograničen pristup vodi tokom celog perioda.

GLP-1 agonist je rastvoren u 50 mM natrijum-fosfata, 145 mM natrijum hlorida, 0,05% tvina 80, pH 7,4 do koncentracije obično od 20-60 nmol/ml. Intravenozne injekcije (zapremina koja odgovara obično 1-2 nmol/kg, na primer 0,033 ml/kg) jedinjenja se daju kroz jedan kateter, a krv se uzorkuje u unapred određenim vremenskim tačkama do 13 dana posle doziranja (poželjno preko drugog katetera). Uzorci krvi (na primer 0,8 ml) su sakupljeni u EDTA puferu (8mM) i zatim centrifugirani na 4°C i 1942G tokom 10 minuta. Plazma se pipetira u Micronic epruvete na suvom ledu i drži se na -20°C dok se ne analizira koncentracija odgovarajućeg GLP-1 jedinjenja u plazmi pomoću ELISA ili sličnog testa zasnovanog na antitelu ili LC-MS. Pojedinačni profili koncentracije u plazmi analiziraju se neparcijalnim modelom u WinNonlin v.5.0 (Pharsight Inc., Mountain View, CA,SAD), i određuje se dobijeni poluživot (harmonička srednja vrednost).

2

Ispitivanje (III): Dejstvo na glukozu u krvi i telesnu težinu

Svrha studije je da se proveri uticaj GLP-1 agonista na glukozu u krvi (BG) i na telesnu težinu (BW) kod dijabetesa. GLP-1 agonisti mogu se testirati u studiji o odgovoru na dozu u gojaznom, dijabetičnom modelu miša (db/db miševima) kao što je opisano u daljem tekstu.

Pedeset db/db miševa (Taconic, Danska), hranjenih od rođenja uz pomoć ishrane NIH31 (NIH 31M Rodent Diet, komercijalno dostupna od kompanije Taconic Farms, Inc., SAD, pogledajte na www.taconic.com), uključeni su u studiju u starosti od 7-9 nedelja.

Miševima je dostupan slobodan pristup standardnoj hrani (npr. Altromin 1324, Brogaarden, Gentofte, Danska) i vodi iz vodovoda i čuvani su na 24°C. Nakon 1-2 nedelje aklimatizacije, bazalna glukoza u krvi se procenjuje dva puta u dva uzastopna dana (tj. u 9 sati ujutru).8 miševa sa najnižim vrednostima glukoze u krvi mogu da budu isključeni iz eksperimenata. Na osnovu srednjih vrednosti glukoze u krvi, preostala 42 miša mogu biti izabrana za dalje eksperimentisanje i raspoređena u 7 grupa (n = 6) sa odgovarajućim nivoima glukoze u krvi. Miševi se mogu koristiti u eksperimentima u trajanju od 5 dana do 4 puta. Nakon poslednjeg eksperimenta, miševi su eutanazirani.

Sedam grupa može dobiti tretman na sledeći način:

1: Nosač, supkutano

2: GLP-1 agonist, 0,3 nmol/kg, supkutano

3: GLP-1 agonist, 1,0 nmol/kg, supkutano

4: GLP-1 agonist, 3,0 nmol/kg, supkutano

5: GLP-1 agonist, 10 nmol/kg, supkutano

6: GLP-1 agonist, 30 nmol/kg, supkutano

7: GLP-1 agonist, 100 nmol/kg, supkutano

Nosač: 50 mM natrijum-fosfata, 145 mM natrijum-hlorida, 0,05% tvina 80, pH 7.4.

GLP-1 agonist je rastvoren u nosaču, npr. do koncentracija 0,05; 0,17; 0,5; 1,7; 5,0 i 17,0 nmol/ml. Životinjama se dozira supkutano, sa dozom zapremine 6 ml/kg (tj.300 µl po 50 g miša).

Na dan doziranja, glukoza u krvi se procenjuje u času -1⁄2h (8.30 ujutru), posle čega se miševi mere. GLP-1 agonist se dozira u otprilike 9 sati ujutru (vreme 0). Na dan doziranja, procenjuje se glukoza u krvi, npr. u vremenima 1, 2, 4 i 8 sati (10č, 11č, 13č i 17č).

Sledećih dana procenjuje se glukoza u krvi, npr. u vremenu 24, 48, 72 i 96h nakon doziranja (tj. u 9 sati ujutru na dan 2, 3, 4, 5). Svakog dana, miševi se mere nakon uzorkovanja glukoze u krvi.

Miševi se pojedinačno mere digitalno.

Uzorci za merenje glukoze u krvi uzimaju se iz kapilara vrha repa svesnih miševa. Krv, 10 µl, se skuplja u heparinizovane kapilare i prenosi u 500 µl glukozni pufer (EKF sistemski rastvor, Eppendorf, Nemačka). Koncentracija glukoze se meri metodom glukozne oksidaze (analizator glukoze Biosen 5040, EKF Diagnostic, GmbH, Barleben, Nemačka). Uzorci se do analize drže na sobnoj temperaturi do 1č. Ako se analiza mora odložiti, uzorci se čuvaju na 4°C najviše 24 sata.

ED50je doza koja podstiče rast polu-maksimalnog efekta u nmol/kg. Ova vrednost se izračunava na osnovu sposobnosti GLP-1 agonista da smanje telesnu težinu, kao i sposobnosti snižavanja glukoze u krvi, kao što je objašnjeno u daljem tekstu.

ED50za telesnu težinu izračunava se kao doza koja podstiče rast polu-maksimalnog efekta na delta BW 24 sata nakon supkutane primene GLP-1 agonista. Na primer, ako je maksimalno smanjenje telesne težine posle 24 sata 4,0 g, tada bi ED50telesna težina bila ta doza u nmol/kg, što dovodi do porasta smanjenja telesne težine nakon 24 sata od 2,0 g. Ova doza (ED50telesne težine) može se očitati sa krive doza-odgovor.

ED50za glukozu u krvi izračunava se kao doza koja podstiče rast polu-maksimalnog efekta na AUC delta BG 8 sati nakon supkutane primene GLP-1 agonista.

Vrednost ED50može se izračunati samo ako postoji pravi sigmoidni odnos dozaodgovor sa jasnom definicijom maksimalnog odgovora. Prema tome, ako to ne bi bio slučaj, predmetni GLP-1 agonist se ponovo testira u različitom rasponu doza dok se ne dobije sigmoidni odnos doza-odgovor.

Ispitivanje (IV): Efekat na unos hrane

Svrha ovog eksperimenta je istražiti uticaj GLP-1 agonista na unos hrane kod svinja. Ovo se radi u farmakodinamičkoj (PD) studiji kao što je opisano u daljem tekstu, u kojoj se unos hrane meri 1, 2, 3 i 4 dana nakon primene jedne doze GLP-1 agonista, u poređenju sa kontrolnom grupom koja je tretirana nosačem.

Koriste se ženke svinja Landrace Yorkshire Duroc (LID), stare oko 3 meseca, težine otprilike 30-35 kg (n = 3-4 po grupi). Životinje su smeštene u grupi 1-2 nedelje tokom aklimatizacije u objektima za životinje. Tokom eksperimentalnog perioda životinje su smeštene u pojedinačne boksove od ponedeljka ujutro do petka posle podne za merenje pojedinačnog unosa hrane. Životinje se hrane ad libitum hranom za svinje (Svinefoder, Antonio) u svim vremenima, i tokom aklimatizacije i eksperimentalnog perioda. Unos hrane nadgleda na liniji, evidentiranjem težine stočne hrane na svakih 15 minuta. Korišćeni sistem je Mpigwin (Ellegaard Systems, Faaborg, Danska).

GLP-1 agonisti su rastvoreni u fosfatnom puferu (50 mM fosfata, 0,05% tvina 80, pH 8), npr. u koncentracijama od 12, 40, 120, 400 ili 1200 nmol/ml, što odgovara dozi od 0,3; 1; 3; 10 ili 30 nmol /kg. Fosfatni puter je poslužio kao nosač. Životinjama se dozira jedna supkutana doza GLP-1 agonista ili nosača (zapremina doze 0,025 ml/kg) ujutro prvog dana, a unos hrane meri se tokom 4 dana nakon doziranja. Poslednjeg dana svake studije, 4 dana nakon doziranja, uzorak krvi za merenje izloženosti plazme GLP-1 agonistu uzet je iz srca anesteziranih životinja. Životinje se nakon toga eutanaziraju intrakardijalnim predoziranjem pentobarbitonom. Sadržaj GLP-1 u plazmi se analizira pomoću ELISA ili sličnog testa zasnovanog na antitelima.

Unos hrane izračunava se kao srednja vrednost ± SEM 24 sata unosa hrane tokom 4 dana. Statistička poređenja unosa hrane tokom 24 sata u nosaču sa GLP-1 agonist grupom tokom 4 dana vrše se jednosmernim ili dvosmernim ponovljenim ANOVA merenjima, praćenim Bonferroni post-testom.

Ispitivanje (V): Stabilnost protiv razgradnje intestinalnim enzimima

Svrha ovog primera je testiranje stabilnosti protiv razgradnje intestinalnim enzimima. GLP-1 (7-37) se može koristiti u testu kao uporedno jedinjenje. Najjače proteolitičke aktivnosti u crevima su pankreasnog porekla i uključuju tripsin serinske endopeptidaze, himotripsin i elastazu, kao i nekoliko vrsta karboksipeptidaza. Razvijen je test sa ekstraktom tankog creva pacova i korišćen kako je opisano u daljem tekstu.

Ekstrakti iz tankog creva pacova

Tanka creva pacova se pripremaju i ispiraju se sa 8 ml 150 mM NaCl, 20 mM Hepes-a pH 7.4. Rastvori su centrifugirani tokom 15 min pri 4.600 rpm u Heraeus Multifuge 3 S-R centrifugi sa rotorom 75006445. Supernatanti se uklanjaju i filtriraju kroz 0,22 µm Millipore Millex GV PVDF membranu. Filtrati nekoliko životinja su objedinjeni da bi se izjednačile pojedinačne razlike.

Sadržaj proteina u dobijenim ekstraktima je određen Bradford analizom (vidi npr. Analytical Biochemistry (1976), vol.72, p.248-254, i Analytical Biochemistry (1996), vol.236 p. 302-308).

Analiza degradacije

2,5 nmol GLP-1 agonista koji se testira inkubira se sa crevnim ekstraktom u zapremini od 250 µl na 37°C tokom jednog sata. Crevni uzorci se testiraju u prisustvu 20 mM Hepes-a pri pH 7.4. Koncentracija crevnog ekstrakta titrirana je u pilot eksperimentima, tako da je poluživot (t1⁄2) GLP-1 (7-37) bio u opsegu od 10-20 minuta. Ekstrakt tankog creva koristi se u koncentraciji od 1,4 µg/ml. Sve komponente, osim crevnog ekstrakta, mešaju se i zagreju deset minuta na 37°C. Odmah nakon dodavanja crevnog ekstrakta uzima se uzorak

2

od 50 µl i meša se sa istom zapreminom 1% trifluorosirćetne kiseline (TFA). Dalji uzorci su u skladu s tim uzimani nakon 15, 30 i 60 minuta.

Analiza uzorkovanja

UPLC analiza: 10 µl uzoraka se analizira UPLC-om, korišćenjem Waters Acquity sistema sa BEH C181,7 µm 2,1 x 50 mm kolonom i 30 do 65% gradijentom od 0,1 % TFA i 0,07% TFA u acetonitrilu tokom 5 minuta pri brzini protoka od 0,6 ml/min. Nakon oduzimanja polazne vrednosti, određuju se vrhovi integrala netaknutih jedinjenja u HPLC hromatogramu snimljenom na talasnoj dužini od 214 nm.

MALDI-TOF analiza: 1 µl svakog uzorka se prenosi u Bruker/Eppendorf PAC HCCA 384 MALDI cilj. Analiza se vrši pomoću Bruker Autoflex laserske desorpcije pomognute matricom i masenim spektrometrom (MALDI-TOF) jonizacije – vreme leta pomoću unapred definisane metode „PAC_measure“ sa proširenim opsegom detekcije od 500 do 5000 Da i unapred definisanom kalibracijom metoda „PAC_calibrate“.

Analiza podataka: Vrhovi integrala HPLC hromatograma se crtaju prema vremenu. Poluživot odgovarajućeg jedinjenja izračunava se prilagođavanjem podataka korišćenjem softvera SigmaPlot 9.0 i jednačinom za eksponencijalno raspadanje sa 2 parametra. Za svaki testirani GLP-1 agonist, relativni poluživot (relativni T1⁄2) se izračunava kao poluživot (T1⁄2) predmetnog jedinjenja, podeljen poluživotom (T1⁄2) GLP-1 (7-37), određenim na isti način.

2

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Kompozicija koja sadrži semaglutid GLP-1 agonista i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa za upotrebu u prevenciji ili lečenju gojaznosti, naznačena time što data upotreba sadrži davanje navedenog GLP-1 agonista u količini od najmanje 0,7 mg nedeljno; i data kompozicija (i) sadrži izotonično sredstvo, (ii) je u obliku vodene formulacije koja sadrži najmanje 80% t/t vode, ili (iii) je u obliku vodene formulacije sa pH između 3 i 10.

2. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time što se data kompozicija sastoji od semaglutida GLP-1 agonista i jednog ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.

3. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, naznačena time što se GLP-1 agonist daje jednom nedeljno ili ređe.

4. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što se GLP-1 agonist daje jednom nedeljno.

5. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što je GLP-1 agonist u obliku farmaceutski prihvatljive soli.

6. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što se dati GLP-1 agonist daje u količini od najmanje 0,8 mg nedeljno, najmanje 0,9 mg ili najmanje 1,0 mg.

7. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što se dati GLP-1 agonist daje u količini od najmanje 1,1 mg nedeljno, najmanje 1,2 mg ili najmanje 1,3 mg.

8. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što se dati GLP-1 agonist daje u količini od najmanje 1,4 mg nedeljno, najmanje 1,5 mg ili najmanje 1,6 mg.

9. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što se GLP-1 agonist daje parenteralnom primenom, kao što je supkutano (s.c.) ubrizgavanje.

2

10. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što data upotreba smanjuje telesnu težinu.

11. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što je pH date vodene formulacije od 7,0 do 9,5.

12. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što je data kompozicija u obliku rastvora.

13. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što je data kompozicija u obliku vodene formulacije koja sadrži najmanje 80% t/t vode.

14. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što data kompozicija sadrži jedno ili više izabrano iz grupe koja se sastoji iz rastvarača, razblaživača, pufera, konzervanasa, sredstava za regulisanje toničnosti, helatnih sredstava, stabilizatora.

15. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što je data kompozicija izotonično sredstvo.