ES3047667T3 - Methods relating to telomere extension - Google Patents

Methods relating to telomere extension

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ES3047667T3
ES3047667T3 ES21200777T ES21200777T ES3047667T3 ES 3047667 T3 ES3047667 T3 ES 3047667T3 ES 21200777 T ES21200777 T ES 21200777T ES 21200777 T ES21200777 T ES 21200777T ES 3047667 T3 ES3047667 T3 ES 3047667T3
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ES
Spain
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cell
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telomere
mrna
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ES21200777T
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John Ramunas
Eduard Yakubov
Helen M Blau
John Cooke
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Leland Stanford Junior University
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Abstract

La invención se refiere a un método para extender telómeros in vitro o ex vivo, que comprende la etapa de: administrar un compuesto que comprende un ácido ribonucleico sintético que comprende al menos un nucleósido modificado y que codifica una transcriptasa inversa de la telomerasa a una célula animal in vitro o ex vivo; en donde la transcriptasa inversa de la telomerasa se expresa transitoriamente en la célula; en donde al menos un telómero se extiende dentro de la célula; y en donde el al menos un nucleósido modificado comprendido en el ácido ribonucleico sintético confiere inmunogenicidad reducida al ácido ribonucleico sintético. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0003] Métodos relacionados con la extensión de los telómeros
[0005] Antecedentes de la invención
[0007] Los telómeros comprenden secuencias de ADN repetitivas en los extremos de los cromosomas lineales que, cuando son lo suficientemente largas, permiten que cada extremo del cromosoma forme un bucle que protege los extremos de actuar como roturas de ADN de doble cadena o de una sola cadena. Artandi y DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18. Los telómeros se acortan con el tiempo, debido en parte al daño oxidativo y la replicación incompleta del ADN, lo que eventualmente lleva a telómeros críticamente cortos que son incapaces de formar el bucle protector, a la exposición de los extremos del cromosoma, a fusiones cromosoma-cromosoma, a respuestas al daño del ADN y a senescencia, apoptosis o malignidad celulares. O'Sullivan y Karlseder (2010) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11:171-181; Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707; Artandi y DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18.
[0009] El complejo enzimático telomerasa extiende los telómeros y comprende dos componentes esenciales: la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) y un componente de ARN conocido como componente ARN de la telomerasa (TERC). Entre otros componentes del complejo de la telomerasa se incluyen las proteínas TCAB1, dyskerina, Gar1, Nhp2, Nop10 y RHAU. Brouilette et al. (2003) Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 23:842-846. La TERT es un componente limitante del complejo de la telomerasa, y de esta manera, los tratamientos que incrementan la TERT pueden incrementar la actividad de la telomerasa. La actividad de la telomerasa se mide típicamente utilizando el ensayo de protocolo de amplificación de repeticiones teloméricas (TRAP), que cuantifica la capacidad de un lisado celular u otra muestra para extender una secuencia de ADN sintética similar a un telómero.
[0011] Como cabría esperar debido a la importancia del mantenimiento de la longitud de los telómeros para prevenir la senescencia y apoptosis celular y la consecuente disfunción celular, las mutaciones genéticas de TERT y TERC están vinculadas a enfermedades hereditarias fatales de mantenimiento inadecuado de los telómeros, incluyendo formas de fibrosis pulmonar idiopática, disqueratosis congénita y anemia aplásica. Los efectos de la senescencia celular prematura y la apoptosis debido a telómeros cortos en estas enfermedades son devastadores por sí mismos y pueden verse agravados por un mayor riesgo de cáncer. Artandi y DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18; Alter et al. (2009) Blood 113:6549-6557. Además de abundantes datos correlativos que vinculan los telómeros cortos con el cáncer (Wentzensen et al. (2011) Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 20:1238-1250), la anemia aplásica proporciona algunas de las primeras pruebas directas de que los telómeros críticamente cortos y la resultante inestabilidad cromosómica predisponen a las células a la transformación maligna en seres humanos (Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707). Existe evidencia de que los telómeros cortos marcan la diferencia entre la distrofia muscular fatal y no fatal (Sacco et al. (2010) Cell 143:1059-1071), y que la extensión de los telómeros evita la senescencia de las células endoteliales (Matsushita et al. (2001) Circ. Res. 89:793-798), que está asociada a aterosclerosis, hipertensión y enfermedades cardíacas (Pérez-Rivero et al. (2006) Circulation 114:309-317). Además de estar implicados en estas y otras enfermedades, los telómeros cortos asimismo limitan la amplificación celular para terapias celulares y aplicaciones de bioingeniería. Mohsin et al. (2012) Journal of the American College of Cardiology doi:10.1016/j.jacc.2012.04.0474.
[0013] Un activador de la telomerasa derivado de un producto natural, TA-65®, ha sido comercializado como nutracéutico por T.A. Sciences, Inc. Harley et al. (2011) Rejuvenation Research 14:45-56. Se afirma que este compuesto activa el gen de hTERT endógeno, estimulando de esta manera la expresión de la telomerasa nativa. No está claro, sin embargo, cómo este tratamiento supera la regulación normal de la actividad de la telomerasa nativa.
[0015] Las células humanas con poca o ninguna actividad de telomerasa han sido transfectadas con vectores codificantes de TERT humana (hTERT). Ver, por ejemplo, Bodnar et al. (1998) Science 279:349-352. Se ha observado que las células transfectadas expresan telomerasa, muestran telómeros extendidos, se dividen vigorosamente y muestran una senescencia reducida en comparación con células que carecen de telomerasa, pero la modificación genómica resultante de este tratamiento incrementa el riesgo y limita la utilidad del enfoque.
[0017] Una capacidad limitada para replicarse es una de las características definitorias de la mayoría de las células normales. Un punto final de este proceso replicativo limitado es la senescencia, un estado de detención en el que la célula sigue siendo viable pero ya no se divide. Las células senescentes con frecuencia se caracterizan por un patrón alterado de expresión génica, morfología alterada y una capacidad reducida o anulada para realizar sus funciones normales.
[0019] El acortamiento de los telómeros desempeña un papel directo en la senescencia celular en los tejidos animales durante el envejecimiento. Además, existe evidencia creciente que implica a los telómeros cortos en una variedad de enfermedades, incluyendo las indicadas anteriormente. La posibilidad de prevenir enfermedades mediante la extensión de los telómeros ha generado la necesidad de tratamientos seguros y eficaces para extender los telómeros en células animalesin vivoy/oin vitro.Además, es necesario extender los telómeros de manera segura y rápida en las células para la utilización en terapias celulares, ingeniería de tejidos y células, y en medicina regenerativa.
[0020] Sin embargo, al mismo tiempo existe el peligro de la activación constitutiva de la actividad de la telomerasa. De hecho, para las aplicaciones de terapia celular, evitar el riesgo de inmortalización celular es de suma importancia. Con este fin, la actividad de la telomerasa transitoria, no la constitutiva, puede resultar ventajosa para la seguridad, especialmente si la actividad elevada de la telomerasa no únicamente es breve, sino que extiende los telómeros lo suficientemente rápido como para que el tratamiento no deba repetirse continuamente. Entre los presentes métodos para extender los telómeros se incluyen la administración mediante virus de TERT bajo un promotor inducible, la administración de TERT utilizando vectores basados en adenovirus y virus adenoasociados, y los activadores de telomerasa de molécula pequeña. Se ha informado de la utilización de administración de genes de TERT basada en un vector vírico adenoasociado (AAV) en Bernardes de Jesus B et al. (EMBO Mol Med 2012 Aug 4(8):691-704) y Boccardi V y Herbig U (EMBO Mol Med 2012 Aug 4(8):685-7). Estos métodos presentan el riesgo de mutagénesis por inserción, una elevación continua de la actividad de la telomerasa, o ambos.
[0021] Por lo tanto, existe una fuerte motivación para desarrollar una terapia que extienda los telómeros de manera segura para potencialmente prevenir, retrasar, mejorar o tratar estas y otras afecciones y enfermedades, hacer lo mismo con el deterioro gradual de la forma física, y las funciones corporal y mental que acompaña al envejecimiento cronológico, y posibilitar terapias celulares y medicina regenerativa. Tal terapia sería de gran utilidad en el rejuvenecimiento de todos los animales, incluidos los seres humanos, los animales de compañía, el ganado, los animales de zoológico y los animales de especies en peligro de extinción.
[0022] Sumario de la Invención
[0023] La presente divulgación aborda estos y otros problemas mediante la provisión de una alternativa que ofrece los beneficios de un incremento altamente transitorio de la actividad de la telomerasa, combinado con una rápida extensión de los telómeros, de modo que el tratamiento no necesita ser continuo, ni siquiera frecuente, y que no presenta ningún riesgo de mutagénesis por inserción genómica. La invención está definida por el alcance según las reivindicaciones adjuntas. En general, se describen en la presente memoria composiciones, métodos y kits para la extensión de telómeros mediante la traducción transitoria de la actividad de telomerasa exógena en una célula.
[0024] Son divulgados, aunque no se reivindican, unos compuestos para la extensión de telómeros que comprenden: un ácido ribonucleico sintético que comprende por lo menos un nucleósido modificado y codifica una transcriptasa inversa de telomerasa; en los que los telómeros se extienden dentro de una célula tratada con el compuesto.
[0025] En algunas formas de realización, la transcriptasa inversa de telomerasa es una transcriptasa inversa de telomerasa de mamífero, ave, reptil o pez, o una variante que conserva la actividad catalítica de la telomerasa, y en formas de realización específicas es una transcriptasa inversa de telomerasa humana.
[0026] En algunas formas de realización, el ácido ribonucleico comprende una caperuza 5', una región no traducida 5', una región no traducida 3' y una cola poli-A. La caperuza 5' puede ser no inmunogénica y la caperuza 5' puede haber sido tratada con fosfatasa.
[0027] En las formas de realización preferidas, la cola poli-A incrementa la estabilidad del ácido ribonucleico.
[0028] En otras formas de realización preferidas, la región no traducida 5' o la región no traducida 3' comprenden una secuencia de un ARNm estable o un ARNm que se traduce eficientemente, o ambas comprenden una secuencia de un ARNm estable o un ARNm que se traduce eficientemente.
[0029] En otras formas de realización preferidas, la caperuza 5', la región no traducida 5' o la región no traducida 3' estabiliza el ácido ribonucleico, incrementa la tasa de traducción del ácido ribonucleico o modula la inmunogenicidad del ácido ribonucleico.
[0030] El nucleósido o nucleósidos modificados modulan la inmunogenicidad del ácido ribonucleico.
[0031] En algunas formas de realización, el ácido ribonucleico es un ácido ribonucleico sintético purificado.
[0032] En las formas de realización preferidas, el ácido ribonucleico sintético se purifica para eliminar componentes inmunogénicos.
[0033] En determinadas formas de realización específicas, el ácido ribonucleico codifica la transcriptasa inversa de telomerasa de ser humano, gato, perro, ratón, caballo, vaca, oveja, cerdo, elefante africano, pollo, rata, pez cebra, medaka japonés o chimpancé, o un polipéptido con por lo menos 95 % de identidad de secuencia respecto a la transcriptasa inversa de telomerasa.
[0034] Son divulgadas, aunque no se reivindican, unas composiciones que comprenden un compuesto divulgado en la presente memoria y un componente ARN de telomerasa, que, en algunas formas de realización, es un componente ARN de telomerasa de mamífero, ave, reptil o pez. En unas formas de realización más específicas, el componente ARN de telomerasa es un componente ARN de telomerasa humana. En algunas formas de realización, los compuestos y composiciones comprenden, además, un vehículo de administración.
[0035] En algunas formas de realización, el vehículo de administración es un exosoma, una nanopartícula lipídica, una nanopartícula polimérica, una partícula de lipoproteína natural o artificial, un lípido catiónico, una proteína, un complejo de proteína-ácido nucleico, un liposoma, un virosoma o un polímero. En unas formas de realización específicas, el vehículo de administración es un lípido catiónico.
[0036] En las formas de realización preferidas, el vehículo de administración es no inmunogénico. En otras formas de realización preferidas, el vehículo de administración es parcialmente inmunogénico. En particular, bajo determinadas circunstancias, puede resultar deseable que el vehículo conserve cierto grado de inmunogenicidad. Se proporcionan métodosin vitrooex vivopara extender los telómeros según las reivindicaciones, en los que los métodos comprenden la etapa de administrar cualquiera de los compuestos o composiciones divulgados en una célula animal, en los que se extiende por lo menos un telómero dentro de la célula.
[0037] En algunos métodos de realización, la célula presenta por lo menos un telómero acortado antes de la etapa de administración.
[0038] En algunas formas de realización, la célula procede de un sujeto o se encuentra en un sujeto que sufre o está en riesgo de una enfermedad relacionada con la edad, una afección relacionada con la edad, o un deterioro relacionado con la edad de función o la apariencia.
[0039] En algunas formas de realización, la célula procede de un sujeto o se encuentra en un sujeto que sufre o está en riesgo de cáncer, enfermedades cardíacas, accidente cerebrovascular, diabetes, úlceras diabéticas, enfermedad de Alzheimer, osteoporosis, un deterioro de la capacidad física o apariencia, traumatismo físico o estrés físico crónico, trauma psicológico o estrés psicológico crónico, función inmunitaria reducida, inmunosenescencia o degeneración macular.
[0040] En algunas formas de realización, la célula es una célula somática de linaje endodérmico, mesodérmico o ectodérmico, o una célula de línea germinal o embrionaria.
[0041] En algunas formas de realización, la célula es una célula madre pluripotente inducida o una célula utilizada para producir una célula madre pluripotente inducida.
[0042] En algunas formas de realización, la célula es una célula transdiferenciada o una célula utilizada para producir una célula transdiferenciada.
[0043] En algunas formas de realización, la célula es una célula aislada, y la etapa de administración tiene una duración no superior a 48 horas. En otras formas de realización, la célula es una célula aislada, y la etapa de administración tiene una duración mínima de dos horas.
[0044] En algunas formas de realización, la célula es una célula aislada, y la etapa de administración se lleva a cabo no más de cuatro veces. En otras formas de realización, la célula es una célula aislada, y la etapa de administración se lleva a cabo por lo menos dos veces.
[0045] En algunas formas de realización, la célula es una célula aislada, y el método comprende, además, la etapa de medir la actividad de la telomerasa en la célula. En formas de realización específicas, la etapa de administración incrementa la actividad de la telomerasa en la célula, y en formas de realización todavía más específicas, la actividad de la telomerasa se incrementa transitoriamente en por lo menos 5 %. En otras formas de realización específicas, la semivida de la actividad incrementada de la telomerasa no es superior a 48 horas.
[0046] En algunas formas de realización, el método comprende, además, la etapa de medir la longitud de los telómeros en la célula. En formas de realización específicas, la longitud media de los telómeros se incrementa en por lo menos 0,1 kb.
[0047] En algunas formas de realización, la célula es una célula aislada, y el método comprende, además, la etapa de medir la capacidad de duplicación de población en la célula. En formas de realización específicas, la capacidad de duplicación de la población se incrementa, en algunos casos por lo menos en una duplicación de población. En las formas de realización preferidas, la célula procede de un sujeto mamífero o se encuentra en un sujeto mamífero, y en formas de realización todavía más preferidas, la célula procede de un sujeto humano o se encuentra en un sujeto humano.
[0049] En algunas formas de realización, la célula es una célula aislada, y en otras formas de realización, la célula no es una célula aislada. En algunas formas de realización, la etapa de administración comprende la electroporación. En algunas formas de realización, el telómero o telómeros se extienden transitoriamente dentro de la célula.
[0051] Son divulgados, aunque no se reivindican, kits para extender los telómeros en una célula animal, en los que los kits comprenden cualquiera de los compuestos o composiciones mencionados anteriormente e instrucciones para utilizar el compuesto o la composición para extender los telómeros.
[0053] En algunas formas de realización, los kits comprenden, además, materiales de envasado. En algunas formas de realización específicas, los materiales de envasado son herméticos. En algunas formas de realización específicas, los materiales de envasado comprenden un recipiente de lámina de aluminio.
[0055] En algunas formas de realización, los kits comprenden, además, un desecante, un medio de cultivo o un inhibidor de ARNasa.
[0057] En algunas formas de realización, la composición es estéril. En algunas formas de realización, el kit comprende un compuesto, instrucciones de utilización de la composición para extender los telómeros, y un componente ARN telomerasa, un vehículo de administración, o tanto un componente ARN de telomerasa como un vehículo de administración.
[0059] Son divulgados, aunque no se reivindican, unos métodos de tratamiento, que comprenden la administración de un compuesto o composición a un sujeto animal que necesita, o que podría beneficiarse de la extensión de los telómeros. En algunas formas de realización, el sujeto animal sufre o está en riesgo de una enfermedad o afección resultante de telómeros acortados.
[0061] Breve descripción de los dibujos
[0063] Figura 1. La transfección de células MRC-5 con un ácido ribonucleico modificado (ARNmod) codificante de TERT, pero no TERT catalíticamente inactiva (CI TERT), incrementa transitoriamente la actividad de la telomerasa. (a) Esquema del constructo de ARNmod y enfoque utilizado en estos estudios. El constructo de ARNmod codifica TERT humana y presenta UTR 5' y 3' que confieren estabilidad, tales como procedentes de ARNm de p-globina. La CI TERT presenta una mutación de un solo pb. (b) La transfección de ARN mod de TERT o CI TERT resulta en un incremento de los niveles de ARNmod de TERT exógeno en las células tratadas, pero no en los controles no tratados, por encima de los niveles de ARN de TERT endógeno. (c) Los niveles de proteína reconocidos por el anticuerpo anti-TERT son significativamente más altos en las células MRC-5 veinticuatro horas después de la transfección con ARNmod codificante de TERT o CI TERT (P<0.03 y 0.01, respectivamente) que en las células no tratadas o que en las células con solo vehículo. (d) El tratamiento con ARNmod codificante de TERT, pero no CI TERT, provoca un incremento transitorio en la actividad de la telomerasa en las células MRC-5.
[0065] Figura 2. Utilización de exosomas como vehículo de administración para terapias con ácido ribonucleico.
[0066] Figura 3. Ilustración gráfica de la utilización de múltiples tratamientos transitorios y rápidos de telomerasa en la extensión de los telómeros en una célula.
[0068] Figura 4. El tratamiento con ARNmod de TERT extiende rápidamente los telómeros en las células MRC-5. (a) Programa de tratamiento y ensayo utilizado en estos estudios. Los tratamientos tuvieron una duración de cinco horas. (b) Imagen de transferencia Southern de TRF (recuadro) y cuantificación de la misma en la que la señal quimioluminiscente se normalizó para considerar el número de sondas por unidad de longitud de telómero, y a continuación se representó gráficamente la intensidad media de cada fila de píxeles en cada carril del gel frente a la longitud del telómero (n=3 réplicas biológicas para cada tratamiento). (c) Medias de las distribuciones de longitud de los telómeros en la figura 4b, que revelan que los telómeros en las células tratadas con ARNmod de TERT son significativamente (P<0.014) más largos que en los controles no tratados o tratados con solo vehículo. (d) La proporción de telómeros más largos que un umbral arbitrario (4,2 kb) es mayor en las células tratadas con ARNmod de TERT que en los controles no tratados y tratados con solo vehículo. (e) Micrografía de fluorescencia representativa de la extensión metafásica de fibroblastos MRC-5 utilizada en la hibridaciónin situcuantitativa (Q-FISH) para comparar longitudes de telómeros, que muestra la sonda de telómeros (clara, punteada) y el ADN (sombreado uniforme). (f) Cuantificación de mediciones Q-FISH de la longitud de los telómeros en células tratadas y de control (n=15 células para cada una de dos réplicas biológicas para cada tratamiento), que muestra una rápida extensión de los telómeros en las células tratadas. (Cabe destacar que TRF mide la longitud tanto del ADN telomérico como del subtelomérico, mientras que Q-FISH mide solo el ADN telomérico, lo que explica las diferencias entre los resultados de Q-FISH y TRF). (g) (i) Curva patrón que relaciona las duplicaciones poblacionales acumuladas de las células MRC-5 tras la recepción del proveedor con la longitud de los telómeros medida mediante Q-FISH para cuantificar la fluorescencia total media de la sonda de telómero por célula, que es linealmente proporcional a la longitud de los telómeros. (g) (ii) Cuantificación de la longitud media de los telómeros por célula en células MRC-5 tratadas tres veces con ARNmod de TERT a intervalos de 48 horas, medida utilizando Q-FISH.
[0070] Figura 5. El tratamiento breve con ARNmod de TERT incrementa la capacidad replicativa, pero no inmortaliza, las células MRC-5 de manera dependiente de la dosis. (a) Curvas de crecimiento de células tratadas con ARNmod de TERT una vez, dos veces o tres veces, o tres veces seguidas de un tratamiento adicional ocho semanas después del primer tratamiento. Los controles comprenden ausencia de tratamiento, o tratamiento con solo vehículo o CI TERT cuatro veces. (n=3 para cada tratamiento). (b) Curvas de crecimiento de células tratadas con ARNmod de TERT y ARN de TERC en una proporción molar de 1:5 (n=3). (c) El tratamiento una, dos o tres veces con ARNmod de TERT confiere capacidad replicativa adicional a las células MRC-5 más allá de la de las células no tratadas, de manera dependiente de la dosis. El incremento progresivo de la capacidad proliferativa conferido por los segundo y tercer tratamientos, administrados 48 horas después del primer tratamiento, no es tan grande como el incremento de la capacidad proliferativa conferido por el primer tratamiento; sin embargo, un cuarto tratamiento adicional varias semanas después de los primeros tres tratamientos confiere tanta capacidad proliferativa adicional como lo hizo el primer tratamiento, lo que indica que el momento de los tratamientos es importante para optimizar el nivel de capacidad proliferativa conferido por el tratamiento. El tratamiento tres veces con ARNmod de TERT y ARNmod de TERC juntos en una proporción molar 1:5 confiere una mayor capacidad proliferativa que el tratamiento tres veces solo con ARNmod de TERT. El tratamiento con solo vehículo o con ARNmod de CI TERT no confiere capacidad replicativa adicional (n=3).
[0072] Figura 6. Alta eficacia de transfección de células MRC-5 tratadas con ARNmod que codifica GFP nuclear (GFPn). (a) Porcentaje de células con fluorescencia más de dos desviaciones estándar (DE) por encima de la media de las células no tratadas (n=10000). (b) Fluorescencia media (n=10000). (c) Micrografía de fluorescencia de GFPn en células MRC-5 transfectadas, contrateñidas con DAPI.
[0074] Figura 7. Dosis-respuesta de la actividad de la telomerasa.
[0076] Figura 8. El tratamiento con ARNmod de TERT retrasa la hinchazón celular en células MRC-5. (a) Las células MRC-5 en los primeros pases (izquierda) presentan una superficie varias veces menor que las células en pases posteriores (derecha), tal como se muestra en micrografías típicas de células no tratadas en duplicación poblacional (DP) 2 y DP 53 vistas en un hemocitómetro. (b) Las células MRC-5 en pases tempranos (DP 2) y medios (DP 35) muestran poca hinchazón, definida como un diámetro mayor de 25 micras, medido visualmente en un hemocitómetro (en el que un cuadrado pequeño mide 50 micras de anchura), mientras que una fracción significativamente mayor de células en pases tardíos (DP 53) están hinchadas. En cambio, las células DP 53 que habían sido tratadas con ARNmod de TERT, pero no aquellas tratadas con ARNmod de CI TERT, en DP 40 muestran poca hinchazón.
[0078] Figura 9. Curva de crecimiento para células endoteliales dérmicas microvasculares humanas (HMDEC).
[0079] Figura 10. Efecto del tratamiento con ARNmod de TERT sobre el número de células HMDEC. CO: tratamiento de control; hTERT-CI: hTERT catalíticamente inactivo; hTERT-WT: hTERT de tipo salvaje.
[0081] Figura 11. Efecto del tratamiento con ARNmod de TERT sobre el crecimiento de las HMDEC. NT: no tratado; CO: tratamiento de control; CI: hTERT catalíticamente inactivo; WT: hTERT de tipo salvaje.
[0083] Figura 12. Efecto del tratamiento con ARNmod de TERT sobre la senescencia en las HMDEC. NT: no tratado; hTERT-CI: hTERT catalíticamente inactivo; hTERT-WT: hTERT de tipo salvaje.
[0085] Figura 13. Incrementos en la proteína deTERTy de la actividad de la telomerasa tras la administración de ARNm deTERTmodificado. (A) Esquema de ARNm modificado que comprende la secuencia codificante de la forma funcional completa deTERTo una forma catalíticamente inactiva (CI) deTERT,flanqueada por regiones no traducidas (UTR) deHBBy una cola poli-A de 151 nt, sintetizada utilizando los nucleótidos modificados pseudouridina y 5-metilcitosina. (B) La eficacia de transfección de los mioblastos (n=2,000) tratados con 0.8 |jg/ml de ARNm modificado codificante de GFP, medida mediante citometría de flujo 24 h después de la transfección, superó el 95 % (gráficos adicionales en la figura 16A). (C) Los niveles de proteína deTERTtotal se midieron mediante transferencia Western cuantitativa (panel C, izquierda; figura 17). Cuantificación de los niveles de proteína deTERT24 horas después de la transfección con 1 jg/m l de ARNm deTERToCI TERT(n=3). Se cuantificó la proteína deTERTen respuesta a diversas dosis de ARNm a nivel de células individuales mediante citometría de flujo (n=10,000) (panel C, derecha). *P<0.05, **P<0.01 en comparación con células no tratadas. Las barras de error representan el error estándar de la media (e.e.m.). (D) Detección de la actividad de la telomerasa en fibroblastos y mioblastos transfectados con 1 jg/m l de ARNm modificado deTERT,medida utilizando el protocolo de amplificación de repeticiones de telómeros (TRAP). La flecha indica controles internos para la eficacia de la PCR.
[0086] Figura 14. Incrementos de la longitud de los telómeros y la capacidad proliferativa tras la administración de ARNm modificado deTERT(ARNmod). (A) Las longitudes medias de los telómeros en fibroblastos no tratados se redujeron durante el tiempo en cultivo, según mediciones mediante MMqPCR y SpectraCell (coeficiente de correlación: 0.97, P<0.001). El experimento se repitió dos veces con cuatro réplicas técnicas cada vez. (B) Longitudes medias de los telómeros en fibroblastos transfectados con 1 pg/ml de ARNmodde TERT,ARNm deTERT,o solo vehículo, una, dos o tres veces sucesivas a intervalos de 48 horas. El experimento se repitió dos veces con cuatro réplicas técnicas cada vez. **P<0.01, ***P<0.001 comparado con células tratadas con solo vehículo. (C) Longitudes medias de los telómeros en mioblastos tratados tal como en (B). El experimento se repitió dos veces con cuatro réplicas técnicas cada vez. ***P<0.001 en comparación con las células tratadas con solo vehículo. (D) Curvas de crecimiento de fibroblastos tratados tal como en (B), en las que las flechas verdes indican los tiempos de tratamiento. Las curvas de crecimiento se repitieron dos veces con cada población cultivada por triplicado. La capacidad replicativa se incrementó de manera dependiente de la dosis (panel derecho). *P<0.05, **P<0.01 en comparación con las células tratadas con solo vehículo. (E) Capacidad de proliferación de los mioblastos, tratados tal como en (B) (flechas verdes). Las curvas de crecimiento se repitieron dos veces, con cada población cultivada por triplicado. Todos los datos se presentan como medias ± e.e.m.
[0088] Figura 15. Reducción transitoria de los marcadores asociados a la senescencia tras la administración de ARNm modificado deTERT.(A) Cuantificación de fibroblastos que expresan p-gal después de la transfección de ARNm modificado deTERTtres veces sucesivas a intervalos de 48 h (flechas verdes). Las células de control, que comprenden poblaciones no tratadas, solo con vehículo y tratadas con ARNm deTERT,dejaron de expandirse en DP 53, y la población tratada con ARNmod deTERTdejó de expandirse en DP 80. Cada experimento se llevó a cabo dos veces con >50 células por muestra evaluadas manualmente. Imágenes representativas muestran fibroblastos tratados con ARNmod deTERTtratados con p-gal en DP 53 (parte superior) y DP 80 (parte inferior). La longitud de la barra de escala es de 200 micras. (B) Cuantificación de la expresión de p-gal en mioblastos tratados tal como en (A). Los controles son tal como en (A). Las poblaciones de control y tratadas con ARNmod deTERTdejaron de expandirse en DP 8 y DP 11, respectivamente. Cada experimento se llevó a cabo dos veces, con >50 células por muestra evaluadas manualmente. Las imágenes representativas muestran mioblastos en DP 2 (parte superior) y mioblastos tratados con ARNmod deTERTen DP 11 (parte inferior). (C) Cuantificación de células agrandadas asociadas con la senescencia replicativa en fibroblastos transfectados tres veces con ARNm modificado deTERT.Las mesetas de población son tal como en (A). Los controles son vehículo solo y tratamiento con ARNm deCI TERT.Cada experimento se llevó a cabo dos veces, con >50 células por muestra evaluadas manualmente. Las imágenes representativas muestran fibroblastos no tratados en DP 2 (parte superior) y DP 53 (parte inferior). Todos los datos se presentan como medias ± e.e.m. La longitud de la barra de escala es de 200 micras.
[0090] Figura 16. Transfección de alta eficacia de ARNm modificado en mioblastos humanos. (A,B) Cuantificación de mioblastos fluorescentes marcados con GFP (n=2000) transfectados con 0.1 a 0.8 pg/ml de ARNm modificado codificante de GFP, medido mediante citometría de flujo 24 horas después del inicio del tratamiento. (C) Fluorescencia media de mioblastos transfectados con ARNm modificado de GFP en respuesta a dosis crecientes. (D) Cuantificación de ARNmod exógeno deTERTen fibroblastos 24 horas después de la transfección con 1 pg/ml de ARNmod deTERToCI TERT,mediante RT-qPCR. La proporción deTERTaCI TERTse calculó utilizando el método de Pfaffl con RPL37A y GAPDH como genes de referencia (n=3). (E) Cuantificación de ARNmod endógeno deTERTen fibroblastos 24 horas después de la transfección con 1 pg/ml de ARNmod deTERToCI TERT,utilizando qPCR, calculada tal como en (D). Todos los datos se presentan como medias ± e.e.m.
[0092] Figura 17. Expresión deTERTdespués de la administración de ARNm modificado. La expresión de la proteína deTERTen fibroblastos recogidos 24 horas después del inicio del tratamiento con 1 pg/ml de ARNmod deTERTse midió mediante transferencia Western infrarrojo multiplexado. La dilución en serie de la proteína total se utilizó para generar una curva patrón para comparar las cantidades relativas de la proteína deTERTcon los controles. La especificidad del anticuerpo deTERTutilizado en la presente memoria ha sido ampliamente sometida a ensayo (Wu, 2006).
[0094] Figura 18. Gel TRAP que muestra un incremento de la actividad de la telomerasa en células mononucleares electroporadas con ARNmod de TERT a un ajuste de 200 V, 25 pF, 1.000 Ohm, en una cubeta de 1 mm con 10 pl de suspensión celular y ARNmod de TERT. El carril de muestra tratada con calor contiene un artefacto de dímero de cebador del método, tal como indica la banda intensa en el cuarto peldaño de la escalera.
[0095] Figura 19. Imágenes de microscopía de células mononucleares fluorescentes después de la electroporación con ARNmod codificante de GFP.
[0097] Figura 20. La electroporación de ARNmod de GFP en leucocitos humanos (células mononucleares) resulta en una alta eficacia de transfección.
[0098] Figura 21. Imagen de gel del ensayo TRAP que muestra un incremento de la actividad de la telomerasa en fibroblastos electroporados con dosis crecientes de ARNmod de TERT.
[0100] Figura 22. Micrografías fluorescentes que muestran que las células T CD8+ activadas con CD3/CD28 y electroporadas con ARNmod de GFP expresan actividad de GFP. Los puntos oscuros son perlas recubiertas con CD3/CD28.
[0102] Figura 23. La electroporación de queratinocitos humanos con ARNmod de TERT resulta en la expresión de actividad de telomerasa.
[0104] Figura 24. Expresión de un ARNmod de luciferasa después de la administraciónin vivoa un roedor.
[0106] Descripción detallada de la invención
[0108] Los telómeros son secuencias de ADN en los extremos de los cromosomas que protegen los extremos de los cromosomas, pero que se acortan con el tiempo. Los telómeros críticamente cortos pueden provocar que las células dejen de funcionar correctamente o mueran. Los telómeros críticamente cortos asimismo pueden llevar a fusiones de cromosomas que a su vez pueden conducir a cáncer. Incluso en ausencia de una enfermedad diagnosticada específica, los telómeros cortos están implicados en el deterioro gradual de la función psicológica y corporal y en la aparición del envejecimiento.
[0110] Al mismo tiempo, sin embargo, el acortamiento de los telómeros puede desempeñar un papel protector frente al cáncer, por ejemplo, en la situación en la que una célula adquiere una mutación que causa que prolifere más rápidamente que las células normales. En esa situación, el acortamiento de los telómeros impide que la célula prolifere indefinidamente y cause cáncer. Por lo tanto, no es necesariamente beneficioso extender los telómeros continuamente.
[0112] En los mamíferos, los telómeros comprenden repeticiones en tándem de la secuencia TTAGGG, y en otros animales, tales como aves, reptiles y peces, la secuencia repetida varía. En todos estos tipos de animales, los telómeros son de doble cadena a lo largo de muchas kilobases (kb). Las longitudes medias de los telómeros difieren entre especies, tal como se muestra en la tabla 1.
[0114] Tabla 1: longitud media de los telómeros en fibroblastos adultos de diferentes especies
[0117]
[0120] En los seres humanos, los telómeros antes del nacimiento presentan longitudes de 15 a 20 kb, y al nacer, de 12 a 15 kb. Los telómeros se acortan rápidamente durante la infancia, y posteriormente, de media, entre 0 y 100 pb por año en la adultez, una tasa que varía dependiendo del tipo de célula, la exposición a estrés psicológico u oxidativo, y otros factores.
[0122] Los telómeros son parte del complejo telomérico, que protege los extremos de los cromosomas. El complejo telomérico comprende, además, un conjunto de proteínas denominadas en conjuntoshelterina.Entre los complejos de proteínas teloméricas se incluyen POT1, TPP1, ATM, DAT, TRF1, TRF2, Rap1, Rif1, TIN2, NBS, Mr E17 y RAD50 y sus homólogos en diferentes especies de mamíferos. Podlevsky y Chen (2012) Mutat. Res. 730:3-11. En muchas especies, el telómero termina en un extremo 3' protuberante de cadena sencilla que se inserta en la región de doble cadena, en asociación con proteínas del complejo telomérico, formando un bucle dentro del complejo telomérico.
[0124] Los telómeros se acortan con el tiempo, debido al daño oxidativo y al intercambio de cromátidas hermanas, y asimismo debido al problema de la replicación de los extremos, en el que los extremos de los cromosomas no se duplican completamente durante la mitosis. Cuando los telómeros se vuelven críticamente cortos, el complejo telomérico ya no es capaz de proteger los extremos de los cromosomas, y los extremos de los cromosomas quedan “sin caperuza”. La falta de caperuza de los extremos de los cromosomas puede resultar en fusiones cromosomacromosoma, lo que a su vez puede resultar en cáncer. O'Sullivan y Karlseder (2010) Nat. Rev. Mol. Cell Biol.
[0125] 11:171-181; Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707; Artandi y DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18. La falta de caperuza asimismo puede resultar en que los extremos de los cromosomas sean reconocidos como ADN dañado, activando respuestas al daño del ADN e induciendo apoptosis o senescencia celular. La senescencia es un estado de detención en el que la célula se mantiene viable pero ya no se divide, y las células senescentes normalmente dejan de realizar sus funciones normales, presenescentes y útiles de manera adecuada o en absoluto. De esta manera, el acortamiento de los telómeros conduce a la disfunción tisular, pérdida de capacidad física y apariencia juvenil, pérdida de capacidad mental y enfermedades, en parte debido a la acumulación de células senescentes y en parte debido a la pérdida de células por apoptosis. De hecho, las personas mayores con telómeros cortos presentan aproximadamente 200 % a 750 % más de probabilidades de desarrollar infarto de miocardio (200 %) (von Zglinicki et al. (2000) Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology 80:1739-1747), demencia vascular (200 %) (Testa et al. (2011) Diabetic Medicine 28:1388-1394, diabetes con complicaciones (400 %) (Blackburn et al. (2010) Cancer Prevention Research 3:394-402, cáncer (Stern y Bryan (2008) Cytogenetic and Genome Research 122:243-254), accidente cerebrovascular, enfermedad de Alzheimer, infección (750 %), fibrosis pulmonar idiopática, y otras enfermedades. Las personas con telómeros cortos en un tejido probablemente asimismo presenten telómeros cortos en la mayoría de sus otros tejidos, y por lo tanto, los telómeros cortos correlacionan con un mayor riesgo de muchas enfermedades en un individuo. Takubo et al. (2010) Geriatr Gerontol Int. 10 Suppl 1:S197-206; doi: 10.1111/j.1447-0594.2010.00605.x. Los telómeros cortos asimismo limitan la capacidad replicativa celular, lo que a su vez limita las terapias celulares y las terapias regenerativas. A la inversa, el incremento de la longitud de los telómeros en ratones con telómeros cortos utilizando métodos de ingeniería genética basados en virus rejuvenece a los ratones de acuerdo con varios parámetros, incluyendo el grosor y la elasticidad de la piel, la función hepática y el sentido del olfato. Jaskelioff (2011) Nature 469:102-107.
[0127] Dado que la telomerasa extiende los telómeros, un enfoque útil para extender los telómeros es incrementar el nivel de actividad de la telomerasa en las células. Se ha informado de que muchos agentes y condiciones incrementan la actividad de la telomerasa en las células, incluyendo los agentes y condiciones enumerados en la tabla 2.
[0128] Tabla 2: ejemplos de agentes y condiciones que incrementan la actividad de la telomerasa
[0131]
[0132] Sin embargo, los ejemplos de tratamiento de la tabla 2 no están exentos de efectos no deseados. Por ejemplo, el tratamiento con factores de crecimiento, hormonas o citocinas puede causar efectos secundarios, puede activar múltiples rutas de señalización, puede provocar replicación celular no deseada, puede inducir una respuesta inmunitaria y son generalmente no específicos. Los tratamientos genéticos que utilizan plásmidos o virus conllevan un riesgo de modificación genómica por mutagénesis insercional y un riesgo de cáncer. La transfección con ARN no modificado provoca una fuerte respuesta inmunitaria y no se ha demostrado que extienda los telómeros. Los tratamientos físicos pueden dañar el ADN genómico. Se ha encontrado que el tratamiento con moléculas pequeñas de origen vegetal solo extiende los telómeros en algunos sujetos y células, solo extiende los telómeros muy lentamente y requiere una administración crónica, lo que incrementa el riesgo de cáncer.
[0134] La expresión en células de secuencias de ácidos nucleicos que codifican hTERT y TERC, y la utilización de estos componentes mismos, se ha propuesto que resulta útil en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de enfermedades humanas (ver,por ejemplo,las patentes US n° 5.583.016 y n° 6.166.178), pero no se ha demostrado que se produzca la extensión de los telómeros de manera rápida y transitoria, por lo tanto potencialmente segura, por las razones descritas anteriormente. Sabe-Larssen et al. (2002) J. Immunol. Methods 259:191-203 han informado sobre la transfección de células dendríticas con ARNm codificante de hTERT, y que tales células adquieren actividad de telomerasa, pero la transfección utiliza ARNm estándar y resulta en una fuerte respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) contra hTERT en lugar de una extensión de los telómeros.
[0136] Además, todos los tratamientos actuales con moléculas pequeñas resultan en gran medida ineficaces y lentos (Harley et al. (2011) Rejuvenation Research 14:45-56), principalmente porque actúan a través del componente catalítico de la telomerasa, TERT, que está fuertemente regulado postraduccionalmente, limitando los efectos de los tratamientos actuales a un pequeño subconjunto de células y excluyendo las células en interfase o G0, tales como muchas células madre y progenitoras. Cifuentes-Rojas y Shippen (2012) Mutat. Res. 730:20-27; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003; Cong et al. (2002) Microbiology and Molecular Biology Reviews 66:407-425. Esta regulación está mediada en parte por interacciones entre componentes del complejo telomérico, el complejo telomérico y otras moléculas. Por ejemplo, TERT es fosforilado o desfosforilado en múltiples sitios por múltiples cinasas y fosfatasas, y en algunos sitios, la fosforilación resulta en un incremento de la actividad de la telomerasa (por ejemplo, la fosforilación por Akt), mientras que en otros sitios la fosforilación reduce la actividad de la telomerasa (por ejemplo, la fosforilación por Src1 o cAbl). Además, TERT es ubiquitinada o desubiquitinada en sitios específicos. La TERT asimismo interactúa con otras proteínas en sitios específicos de TERT, y estas interacciones pueden inactivar TERT (por ejemplo, interacciones con Pinx1 o cAbl), o transportar TERT lejos de los cromosomas (por ejemplo, interacciones con CRM1 y Pinx1), bloqueando o ralentizando la extensión de los telómeros. Además, algunas proteínas se unen a los telómeros o al complejo telomérico, bloqueando la TERT (por ejemplo, POT1), impidiendo la extensión del telómero. Además, algunas proteínas ayudan a la extensión de los telómeros de forma indirecta, por ejemplo, helicasas y UPF1. Debido a los mecanismos regulatorios, la actividad de la telomerasa alcanza su punto máximo durante la etapa S del ciclo celular, y de esta manera, las células que se dividen rápidamente pueden beneficiarse más de los tratamientos que incrementan la actividad de la telomerasa. Sin embargo, con frecuencia resulta deseable mantener las células en un estado de división lenta o no proliferativo; por ejemplo, las células madre o progenitoras frecuentemente son de división lenta y, de esta manera, pueden pasar la mayor parte del tiempo en interfase o G0. Por lo tanto, los tratamientos actuales son lentos e ineficaces en la mayoría de los tipos de células en general, y en todos los tipos de células durante la interfase y G0. Los tratamientos que son lentos son menos seguros, debido a que requieren tratamiento durante más tiempo. Dado que el acortamiento de los telómeros proporciona un mecanismo de seguridad protector contra la proliferación celular descontrolada, tal como en el cáncer, un tratamiento que extiende los telómeros rápidamente es generalmente más seguro, porque puede administrarse en períodos cortos de tiempo y de poca frecuencia, permitiendo de esta manera que el mecanismo de seguridad normal de acortamiento de telómeros se mantenga activo durante la mayor parte del tiempo. Por lo tanto, se necesita un método capaz de superar transitoriamente la regulación de la telomerasa para extender rápidamente los telómeros durante un tratamiento breve.
[0138] TERT regula cientos de genes, incluyendo los enumerados en la tabla 3.
[0140] Tabla 3: ejemplos de genes y rutas reguladas por TERT
[0142]
[0143]
[0146] En muchos casos, modular los genes o rutas de la tabla 3 no es deseable porque hacerlo podría provocar cambios no deseados en las células. Por ejemplo, TERT activa reguladores epigenéticos, que pueden cambiar el fenotipo celular o interferir con los esfuerzos para reprogramar o transdiferenciar células con fines terapéuticos. La TER<t>activa potenciadores del crecimiento, pero a menudo no se desea la proliferación, por ejemplo, frecuentemente las células madre con el mayor potencial regenerativo son aquellas que se dividen lentamente. La TERT modula los reguladores del destino y la diferenciación celular, lo que puede obstaculizar los esfuerzos para diferenciar las células en tipos celulares específicos. La TERT asimismo activa protooncogenes, lo que podría conducir al cáncer. De esta manera, resulta deseable minimizar la cantidad de tiempo durante el que los niveles de TERT se elevan artificialmente, incluyendo cualquier tratamiento que extienda los telómeros utilizando TERT. Por lo tanto, se necesita un tratamiento que extienda los telómeros mediante un incremento únicamente transitorio de los niveles de actividad de la telomerasa.
[0148] En algunos tipos de células, se ha demostrado que TERT afecta a la expresión de otros genes (Young et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:19904-19908; Perrault et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 335:925-936), y ello podría no ser deseable en algunos casos. De esta manera, se necesita un tratamiento que minimice la cantidad de tiempo durante el que se incrementan los niveles de TERT.
[0150] Compuestos
[0152] La presente divulgación aborda estos problemas mediante la provisión en un aspecto de nuevos compuestos para la expresión transitoria de telomerasa exógena en una célula. Los compuestos comprenden un ácido ribonucleico sintético que comprende por lo menos un nucleósido modificado y que codifica una transcriptasa inversa de telomerasa (TERT), en los que los telómeros se extienden dentro de una célula tratada con el compuesto.
[0154] Ácidos ribonucleicos sintéticos
[0156] Los ácidos ribonucleicos utilizados en la expresión transitoria de TERT según diversos aspectos de la presente divulgación comprenden un ácido ribonucleico codificante de una proteína TERT. Los ácidos ribonucleicos normalmente comprenden, además, secuencias que afectan a la expresión y/o estabilidad del ácido ribonucleico en la célula. Por ejemplo, tal como se representa en la figura 1a, los ácidos ribonucleicos pueden contener una caperuza 5' y una región no traducida (UTR) en el lado 5' y/o 3' de la secuencia codificante. Los ácidos ribonucleicos pueden contener, además, una cola 3', tal como una cola poli-A. La cola poli-A puede incrementar, por ejemplo, la estabilidad del ácido ribonucleico. En algunas formas de realización, la cola poli-A presenta por lo menos 75 nucleótidos, 100 nucleótidos, 125 nucleótidos, 150 nucleótidos, o es incluso más larga.
[0158] En algunas formas de realización, la caperuza 5' del ácido ribonucleico es una caperuza no inmunogénica. En algunas formas de realización, la caperuza 5' puede incrementar la traducción del ácido ribonucleico. En algunas formas de realización, la caperuza 5' puede ser tratada con fosfatasa para modular la inmunogenicidad innata del ácido ribonucleico. En algunas formas de realización, la caperuza 5' es un análogo anticaperuza inversa ("ARCA"), como un análogo 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G de estructura de ARN de caperuza.
[0160] Tal como es bien conocido en la materia, las características mencionadas anteriormente, u otras, pueden incrementar la traducción de la proteína TERT codificada por el ácido ribonucleico, pueden mejorar la estabilidad del ácido ribonucleico mismo, o pueden hacer ambas cosas. En algunas formas de realización, el 5' UTR y/o el 3' UTR son de un gen que presenta un ARNm muy estable y/o un ARNm que se traduce rápidamente, por ejemplo, a-globina o p-globina, c-fos, o el virus del mosaico del tabaco. En algunas formas de realización, el 5' UTR y el 3' UTR son de genes diferentes o son de especies diferentes a la especie en la que se están administrando las composiciones. Las UTR asimismo pueden ser ensamblajes de partes de UTR procedentes de los ARNm de diferentes genes, en donde se seleccionan las partes para conseguir una determinada combinación de estabilidad y eficacia de traducción.
[0162] Los ácidos ribonucleicos divulgados en la presente memoria son ARN modificados con nucleósidos ("ARNmod"). La mayoría de las moléculas de ARN maduras en las células eucarióticas contienen nucleósidos que son versiones modificadas de los nucleósidos de ARN canónicos no modificados, adenina, citidina, guanosina y uridina. Esas modificaciones pueden evitar que el ARN sea reconocido como un ARN foráneo. Karikó et al. (2005) Immunity 23:165-175. Se describen las utilizaciones de ARN sintéticos y modificados en un métodoin vitropara la reprogramación de células en el documento n° WO2011/130624. Las moléculas de ARN sintético producidas con determinados nucleósidos son mucho menos inmunogénicas que el ARN no modificado. La inmunogenicidad se puede reducir adicionalmente mediante purificación del ARNmod sintético, por ejemplo, mediante la utilización de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Los nucleósidos modificados pueden seleccionarse, por ejemplo, de entre los nucleósidos mostrados en la tabla 4. Los nucleósidos son, en algunas formas de realización, pseudouridina, 2-tiouridina o 5-metilcitidina. En algunas circunstancias, puede resultar deseable que el ARN modificado conserve cierta inmunogenicidad.
[0164] Tabla 4: nucleósidos modificados que se observan en el ARN eucariótico
[0167]
[0168]
[0171] Sin respaldo teórico, la presencia de los nucleósidos modificados permite que el ARNmod evite la activación de una respuesta inmunitaria mediada por diversos receptores, incluyendo los receptores tipo Toll y RIG-1. Se ha utilizado ARNmod no inmunogénico como agente terapéutico en ratones mediante administración tópica. Kormann et al. (2011) Nature Biotechnology 29:154-157. La identificación del ARNm modificado por nucleótidos facilita la administración de proteínas terapéuticas codificadas por ARN, o mutantes de las mismas, en las células, y la expresión de esas proteínas en las células.
[0173] De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en algunas formas de realización, los ácidos ribonucleicos de las presentes composiciones comprenden una pseudouridina, una 2-tiouridina, una 5-metilcitidina o un nucleósido de la tabla 4. En algunas formas de realización, los ácidos ribonucleicos comprenden más de uno de los nucleósidos anteriormente indicados o una combinación de los nucleósidos anteriormente indicados. En formas de realización altamente preferidas, los ácidos ribonucleicos comprenden pseudouridina y 5-metilcitidina.
[0175] En algunas formas de realización, puede desearse una respuesta inmunitaria a ARNmod, y el ARN puede ser modificado para inducir un nivel óptimo de inmunidad innata. En otras formas de realización, puede que no se desee una respuesta inmunitaria al ARNmod, y el ARN puede modificarse con el fin de minimizar tal reacción. El ARN se puede modificar para cualquier situación.
[0177] Los ácidos ribonucleicos divulgados en la presente memoria son ácidos ribonucleicos sintéticos. El término «sintético», tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a que los ácidos ribonucleicos en algunas formas de realización se preparan utilizando las herramientas de la biología molecular bajo la dirección de un ser humano, por ejemplo, tal como se describe posteriormente. Los ácidos ribonucleicos sintéticos pueden prepararse, por ejemplo, mediante la síntesisin vitroutilizando extractos celulares o enzimas purificados y moldes de ácidos nucleicos. Los ácidos ribonucleicos sintéticos pueden, en algunas formas de realización, prepararse mediante síntesis química, ya sea de forma parcial o completa. Alternativa o adicionalmente, en algunas formas de realización los ácidos ribonucleicos sintéticos pueden prepararse mediante expresión diseñada en una célula, seguida de la disrupción de la célula y la purificación por lo menos parcial del ácido ribonucleico. Sin embargo, un ácido ribonucleico sintético no es un ácido ribonucleico natural, ya que se expresa en una célula no modificada sin extracción o purificación.
[0179] Los ácidos ribonucleicos se pueden preparar utilizando una variedad de técnicas estándares, tal como resulta evidente para el experto ordinario en la materia. En algunas formas de realización, los ácidos ribonucleicos pueden prepararse mediante síntesisin vitro, tal como se describe, por ejemplo, en las solicitudes publicadas de patentes US n° 2009/0286852 y n° 2011/0143397. En algunas formas de realización, los ácidos ribonucleicos pueden prepararse mediante síntesis química. En algunas formas de realización, los ácidos ribonucleicos pueden prepararse mediante una combinación de síntesisin vitroy síntesis química. Tal como se ha descrito anteriormente, el término «sintético» debe entenderse que incluye ácidos ribonucleicos que se preparan ya sea por síntesis química, mediante síntesisin vitro,mediante expresiónin vivoy purificación por lo menos parcial, o mediante una combinación de dichos métodos, o de otros métodos químicos o de biología molecular.
[0180] Los ácidos ribonucleicos pueden, en algunas formas de realización, ser purificados. Tal como se ha señalado anteriormente, la purificación puede reducir la inmunogenicidad de los ácidos ribonucleicos y puede resultar ventajosa en algunas circunstancias. Ver asimismo la solicitud publicada de patente US n° 2011/0143397. En las formas de realización preferidas, los ácidos ribonucleicos se purifican mediante HPLC o mediante captura y elución por afinidad.
[0182] La estructura proteica de TERT incluye por lo menos tres dominios distintos: una extensión larga en el extremo aminoterminal (la extensión N-terminal, ENT) que contiene dominios conservados y una región de enlace no estructurada; un dominio catalítico de transcriptasa inversa en el medio de la secuencia primaria que incluye siete motivos RT conservados, y una extensión corta en el extremo carboxiterminal (la extensión C-terminal, ECT). Autexier y Lue (2006) Annu Rev Biochem. 75:493-517. En algunas formas de realización, el ácido ribonucleico codifica una TERT de longitud completa. En algunas formas de realización, el ácido ribonucleico codifica un dominio catalítico de transcriptasa inversa de TERT. En algunas formas de realización, el ácido ribonucleico codifica un polipéptido con actividad TERT.
[0184] La TERT codificada por los ácidos ribonucleicos de la presente divulgación es preferentemente una TERT de mamífero, ave, reptil o pez. Más preferentemente, la TERT es una TERT de mamífero, tal como la TERT humana. Meyerson et al. (1997) Cell 90:785-795; Nakamura et al. (1997) Science 277:955-959; Wick et al. (1999) Gene 232:97-106. La secuencia de aminoácidos de dos isoformas de TERT humana está disponible como secuencias de referencia del NCBI: NP_937983.2 y NP_001180305.1. Entre otras secuencias de aminoácidos de ejemplo no limitativas que resultan útiles y están codificadas por los ácidos ribonucleicos de las presentes composiciones se incluyen TERT de gato (secuencia de referencia del NCBI: XP_003981636.1), perro (secuencias de referencia del NCBl: NP_001026800.1), ratón (secuencias de referencia del NCBI: NP_033380.1), vaca (secuencia de referencia del NCBI: NP_001039707.1), secuencia de referencia del NCBI de oveja Xp_004017220.1), cerdo (secuencia de referencia del NCBI: NP_001231229.1), elefante africano (secuencia de referencia del NCBI: XP_003408191.1), pollo (secuencia de referencia del NCBI: NP_001026178.1), rata (secuencia de referencia del NCBI: NP_445875.1), pez cebra (secuencia de referencia del NCBI: NP_001077335.1); medaka japonés (secuencia de referencia del NCBI: NP_001098286.1); y chimpancé (secuencias de referencia del NCBI: XP_003950543.1 y XP_003950544.1).
[0186] Se debe entender que los ácidos ribonucleicos pueden codificar variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos enumeradas anteriormente, en particular variantes que conservan la actividad catalítica de la telomerasa, incluyendo las variantes truncadas. En algunas formas de realización, los ácidos ribonucleicos de las presentes composiciones codifican una de las secuencias de aminoácidos enumeradas anteriormente o una secuencia con por lo menos 95 % de identidad de secuencia respecto a esa secuencia. En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos de las presentes composiciones codifican una de las secuencias de aminoácidos enumeradas anteriormente o una secuencia con una identidad de secuencia de por lo menos 98 %, 99 %, 99,9 % o incluso mayor respecto a esa secuencia.
[0188] Asimismo debe entenderse que los presentes ácidos ribonucleicos pueden corresponder a las secuencias de genes nativos que codifican las proteínas TERT mencionadas anteriormente o pueden corresponder a variantes que son posibles debido a la redundancia del código genético, tal como lo entenderá el experto ordinario en la materia. En algunas formas de realización, la selección de codones puede ser optimizada para optimizar la expresión de proteínas utilizando algoritmos y métodos conocidos por el experto ordinario en la materia. Fath et al. (2011) PLoS ONE 6:3.
[0190] Composiciones
[0192] Son divulgadas, aunque no se reivindican, composiciones para la extensión de telómeros en una célula, en las que las composiciones comprenden un compuesto tal como se ha descrito anteriormente, y un componente adicional. En algunas formas de realización, las composiciones comprenden, además, un componente ARN de telomerasa (TERC). (Ver asimismo la tabla 6, a continuación.) En algunas formas de realización, las composiciones comprenden, además, un vehículo de administración.
[0194] Vehículos de administración
[0196] Tal como se acaba de señalar, las composiciones de la presente divulgación pueden comprender, además, un vehículo de administración para el ácido ribonucleico. En algunos casos, el vehículo de administración puede facilitar el direccionamiento e incorporación del ácido ribonucleico de la composición en la célula diana. En particular, las composiciones de la presente divulgación pueden comprender cualquier vehículo de administración de genes conocido en el campo, por ejemplo, nanopartículas, liposomas, partículas balísticas de pistola génica, virus, lípidos catiónicos, productos comerciales, tales como Lipofectamine® RNAiMax, u otros vehículos. En algunas formas de realización, el vehículo de administración es un exosoma, una nanopartícula lipídica, una nanopartícula polimérica, una partícula de lipoproteína natural o artificial, un lípido catiónico, una proteína, un complejo de proteína-ácido nucleico, un liposoma, un virosoma o un polímero. En algunas formas de realización preferidas, el vehículo de administración es una formulación de lípidos catiónicos. Sin embargo, la administración vírica generalmente no resulta preferida ya que puede conducir a la mutagénesis por inserción.
[0198] En algunas formas de realización preferidas, el vehículo de administración es un exosoma, una nanopartícula lipídica o una nanopartícula polimérica. En formas de realización altamente preferidas, el vehículo de administración es un exosoma. Los exosomas son vesículas de bicapa lipídica que ocurren de forma natural y presentan un diámetro de 40 a 100 nm. Los exosomas contienen un conjunto de proteínas específicas, incluyendo las proteínas de membrana Lamp-1 y Lamp-2, que son particularmente abundantes. Lakhal y Wood (2011) BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology 33:737-741. En 2007, se identificaron los exosomas, que son portadores naturales de ARN y proteínas, incluyendo más de 1.300 tipos de ARNm y 121 tipos de microARN no codificante. Los exosomas asimismo pueden transmitir ARNm entre especies: la exposición de células humanas a exosomas de ratón portadores de ARNm de ratón resulta en la traducción en las células humanas del ARNm de ratón.
[0200] Como vehículos de administración para ARN, proteínas o ADN, los exosomas presentan una serie de ventajas sobre los vehículos alternativos. Específicamente, los exosomas pueden generarse a partir de las propias células del paciente, haciéndolos no inmunogénicos; por lo tanto, no son atacados por anticuerpos, complemento, factores de coagulación u opsoninas. Además, los exosomas pueden cargarse con ácidos nucleicos mediante electroporación, y son vehículos de origen natural que son portadores de ARNm y proteínas entre las células humanas. Los exosomas protegen su carga de ARN y proteínas durante el transporte, y la carga se administra directamente en el citosol. Pueden extravasarse del torrente sanguíneo a los tejidos extravasculares, cruzando incluso la barrera hematoencefálica, y pueden ser dianas. Además, los exosomas evitan la acumulación en órganos que no son diana, tales como, por ejemplo, el hígado. Por lo tanto, los exosomas pueden utilizarse como «liposomas» derivados de células para la administración de ARNm terapéutico u otra carga en el tratamiento de enfermedades. Mizrak et al. (2013) Molecular Therapy 21:101-108; doi:10.1038/mt.2012.161. Una ilustración gráfica de un exosoma que administra un ARNm a una célula se representa en la figura 2. Ver asimismo van den Boorn et al. (2011) Nature Biotechnology 29:325-326.
[0202] Se cree que la mayoría de los tipos de células son capaces de generar exosomas, y los exosomas se encuentran en la mayoría de los líquidos biológicos, incluyendo la sangre, la saliva, la orina, el líquido cefalorraquídeo, la leche materna y el líquido amniótico. Los exosomas son producidos por la mayoría de los tipos de células, en diferentes abundancias. Se pueden obtener abundantes exosomas, carentes de activadores de células T, a partir de células dendríticas inmaduras, las cuales están presentes en la sangre humana. O'Doherty et al. (1994) Immunology 82:487-493. Los exosomas asimismo pueden producirse artificialmente, por ejemplo, mediante combinación de proteínas exosómicas recombinantes con lípidos y fosfolípidos, tal como los que se encuentran en las membranas exosómicas. Alternativamente, los exosomas pueden construirse mediante autoensamblajein vitrode liposomas con un subconjunto de proteínas de superficie exosómica.
[0204] El potencial de administración de fármacos de los exosomas se demostró por primera vez en 2011. Alvarez-Erviti et al. (2011) Nature Biotechnology 29:341-345. Específicamente, se recogieron exosomas de células dendríticas diseñadas para expresar una proteína de fusión Lamp2B fusionada con un ligando de direccionamiento de 28 aminoácidos de la glucoproteína del virus de la rabia (RVG), después se electroporó ARN de interferencia pequeño (ARNip) en los exosomas y se inyectaron los exosomas en ratones inmunocompatibles con los ratones de los que se obtuvieron las células dendríticas. De esta manera, los exosomas eran autólogos y no generaban una respuesta inmunitaria, según las mediciones de los niveles de IL-6, IP-10, TNF-a e IFN-a. Además, las dosis repetidas durante un mes provocaron respuestas similares, demostrando que tampoco se producía una respuesta inmunitaria adaptativa.
[0206] Tal como se ha descrito anteriormente, los exosomas pueden ser autólogos y, por lo tanto, presentan baja inmunogenicidad. Dado que el ARNm modificado asimismo presenta una baja inmunogenicidad, la combinación de ARNmod como el ácido ribonucleico y un exosoma como vehículo de administración en las composiciones de la presente divulgación resulta particularmente preferida. En estas formas de realización, de esta manera, la exposición proporciona una nueva forma de administrar ARNm o ARNmod en células o tejidos utilizando exosomas. Dicha administración proporciona un método útil para incrementar temporalmente el nivel de cualquier proteína en una célulain vivoutilizando ARN administrando en exosomas mediante inyección intravenosa o tópica, y particularmente en la administración de un ARN codificante de TERT. En consecuencia, en las formas de realización preferidas, los vehículos de administración de las presentes composiciones no son inmunogénicos. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias, puede ser deseable que el vehículo conserve cierta inmunogenicidad.
[0207] Componentes adicionales
[0209] Las composiciones divulgadas en la presente memoria pueden comprender, además, componentes adicionales que mejoren la administración de la composición en la célula diana, mejoren la extensión de los telómeros dentro de la célula, o ambos. Por ejemplo, las composiciones pueden comprender, además, uno o más de los compuestos y condiciones de la tabla 2. Tal como apreciará un experto ordinario en la materia, las combinaciones de principios activos frecuentemente muestran efectos sinérgicos en una actividad deseada, tal como, por ejemplo, la expresión transitoria de actividad de telomerasa exógena en una célula. Son ejemplos adicionales de proteínas que pueden incluirse en las composiciones de la presente divulgación los enumerados en la tabla 5. Debe entenderse que las composiciones podrían incluir las propias proteínas, o secuencias de ácidos nucleicos, preferentemente ARN o ARNmod, que codifican estas proteínas, o proteínas con alta identidad de secuencia que conservan la actividad de la proteína enumerada.
[0211] Tabla 5: proteínas administradas de manera útil en combinación con TERT
[0213]
[0216] Otros ejemplos de agentes que pueden incluirse útilmente dentro de las composiciones de la presente divulgación se enumeran en la tabla 6.
[0218] Tabla 6: otros agentes administrados útilmente en combinación con TERT
[0221]
[0222]
[0224] Dado que TERT es más activo durante determinadas etapas del ciclo celular, las composiciones de la presente divulgación asimismo pueden incluir opcionalmente uno o más activadores transitorios de la proliferación celular, con el fin de mejorar la eficacia del tratamiento con TERT. Dichos agentes pueden incluir, por ejemplo, un agente de ARNi que reduce transitoriamente las cantidades de inhibidores del ciclo celular, tales como Rb o P19/Arf en la célula. Otros activadores transitorios de la proliferación celular pueden incluirse útilmente en las presentes composiciones, tal como lo entendería el experto ordinario en la materia.
[0225] Métodos de extensión de los telómeros y métodos de tratamiento
[0226] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para extender los telómeros según las reivindicaciones adjuntas que comprenden la etapa de administrar cualquiera de los compuestos o composiciones descritos anteriormente en una célula con telómeros acortados, en los que los telómeros se extienden dentro de la célula. Se dan a conocer, aunque no se reivindican, métodos de tratamiento que comprenden la etapa de administrar cualquiera de los compuestos o composiciones descritos anteriormente en un sujeto animal que lo necesita o que puede beneficiarse de la extensión de los telómeros.
[0227] En las formas de realización preferidas, los compuestos o composiciones se administran en una célula, en los que la célula es una célula aislada o forma parte de un cultivo celular, un cultivo de tejido aislado, un órgano aislado, o similar (es decir, la administración esin vitro).
[0228] En otras formas de realización preferidas, que son divulgadas, aunque no se reivindican, los compuestos o composiciones se administran sin aislar la célula o células, el tejido o el órgano del sujeto (es decir, la administración esin vivo).En algunas de dichas formas de realización, el compuesto o la composición se administra en todas, o casi todas, las células del cuerpo del sujeto. En algunas formas de realización, el compuesto o la composición se administración en una célula o tejido específico en el cuerpo del sujeto.
[0229] En algunas formas de realización, el sujeto es un mamífero, ave, pez o reptil. En las formas de realización preferidas, el sujeto es un mamífero y más preferentemente, un ser humano. En otras formas de realización preferidas, el sujeto es un animal de compañía, un animal de zoológico, un animal de ganado o un animal de una especie en peligro de extinción. Se enumeran ejemplos de especies preferidas en la tabla 7.
[0230] Tabla 7: especies de animal sujeto.
[0233]
[0234]
[0237] Para aplicacionesin vitro,los compuestos o composiciones pueden administrarse utilizando cualquier técnica adecuada, tal como entenderá el experto en los campos de la biología celular, el cultivo celular, el cultivo de tejidos, el cultivo de órganos, o similares. Para aplicacionesin vivo,los compuestos o composiciones se administran de manera útil mediante inyección, aplicación tópica, inhalación o cualquier otra técnica de administración adecuada, tal como entenderá el experto ordinario en materia médica o similares.
[0239] Tal como se ha descrito anteriormente, entre las células tratadas de manera útil según los métodos de la exposición se incluyen células, ya sea en un sujeto (para la administraciónin vivo)o procedentes de un sujeto (para la administraciónin vitro),que pueden beneficiarse de la extensión de los telómeros. Dado que los telómeros cortos afectan a prácticamente todos los tipos de células en la mayoría de los animales, la extensión de los telómeros puede beneficiar a la mayoría de los animales. Un tratamiento de extensión de los telómeros que sea transitorio y breve tiene el potencial de ser seguro, tal como se ha descrito anteriormente. La extensión de los telómeros mediante un tratamiento transitorio tal como se divulga en la presente memoria puede resultar útil en todos o la mayoría de los individuos, ya sea como medida preventiva, por ejemplo, para prevenir o retrasar la aparición de muchas enfermedades y afecciones en las que están implicados los telómeros cortos, o como un tratamiento para esas enfermedades y afecciones. El tratamiento puede beneficiar a los sujetos en riesgo de enfermedades o afecciones relacionadas con la edad, o que ya están sufriendo tales enfermedades, y asimismo puede beneficiar a los sujetos que han experimentado, están experimentando o están en riesgo de experimentar traumatismo físico o estrés físico crónico, tal como ejercicio intenso o trabajo manual, o trauma psicológico o estrés psicológico crónico, ya que todas estas afecciones causan el acortamiento de los telómeros; el estrés o traumatismo físico requiere división celular para reparar el daño resultante, acortando de esta manera los telómeros, y estas afecciones asimismo pueden causar estrés oxidativo, que asimismo acorta los telómeros. Entre dichas enfermedades y afecciones se incluyen, por ejemplo, síndrome metabólico, diabetes, úlceras diabéticas, enfermedades cardíacas, muchas formas de cáncer, demencia vascular, Alzheimer, accidente cerebrovascular, degeneración macular relacionada con la edad, inmunosenescencia, insuficiencia medular, úlceras gastrointestinales, cirrosis, hernia, infecciones, tales como la neumonía secundaria a una función inmune deteriorada, infección crónica, deterioro cognitivo leve o grave, movilidad reducida, osteoporosis, osteoartritis, artritis reumatoide, ansiedad relacionada con la edad, trastornos del equilibrio, tinnitus, parálisis de Bell, cataratas, EPOC, abrasión corneal, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad de las arterias periféricas, conjuntivitis, chalazión, deshidratación, depresión, enfisema, diversas enfermedades oculares, retraso del crecimiento, gripe, trastorno de ansiedad generalizada, glaucoma, pérdida de audición, pérdida del sentido del gusto, pérdida de apetito, dislocación de cadera, pérdida de memoria, enfermedad de Parkinson, estenosis espinal, incontinencia urinaria, fractura vertebral, y otros.
[0241] Las células tratadas de manera útil según los presentes métodos pueden incluir, además, células en un sujeto o procedentes de un sujeto que sufre de una enfermedad o afección relacionada con la edad o que está en riesgo de sufrir dicha enfermedad o afección. Dichas enfermedades y afecciones relacionadas con la edad pueden incluir enfermedades genéticas en las que los genes que codifican componentes del complejo de telomerasa o del complejo telomérico están mutados, lo que de esta manera lleva a telómeros cortos. Entre dichas enfermedades se incluyen, por ejemplo, formas de fibrosis pulmonar idiopática, disqueratosis congénita y anemia aplásica.
[0242] En el caso de enfermedades genéticas, las composiciones pueden incluir adicionalmente, por lo tanto, ácidos nucleicos adicionales, tales como las versiones normales y funcionales de las secuencias codificantes de los genes afectados por dichas enfermedades, por ejemplo DKC1, TINF2, NOP10, NHP2, TERC, u otros genes. Se enumeran ejemplos de tales genes en la tabla 8. Ver asimismo Armanios (2009) Ann. Rev. Genomics Hum. Genet.
[0243] 10: 45-61.
[0244] Tabla 8: genes relacionados con enfermedades relacionadas con la edad.
[0247]
[0250] Además, el tratamiento puede beneficiar a sujetos que padecen, o están en riesgo de padecer, otros tipos de enfermedades genéticas en las que los telómeros cortos pueden desempeñar un papel, tal como, por ejemplo, la distrofia muscular. En tales enfermedades, la necesidad de replicación celular para abordar el problema causado por la mutación genética acorta los telómeros más rápidamente de lo normal, lo que resulta en un acortamiento de telómeros más rápido de lo normal, lo que a su vez agota la capacidad replicativa de las células, conduciendo a la disfunción del tejido, síntomas exacerbados o adicionales, discapacidad y, frecuentemente, la muerte. Además, pueden prevenirse o retrasarse diversos tipos de cáncer mediante el tratamiento con compuestos divulgados en la presente memoria, y de hecho se cree que las fusiones cromosoma-cromosoma causadas por telómeros críticamente cortos son una causa de cáncer. Los telómeros asimismo pueden alargarse selectivamente en células sanas de un individuo, sin alargar los telómeros en las células cancerosas, lo que puede permitir que los presentes compuestos, composiciones y métodos se utilicen, por ejemplo, para alargar los telómeros del sistema inmunitario a fin de incrementar su capacidad de combatir un cáncer. Además, las células del sistema inmunitario pueden ser extraídas de un individuo para el tratamiento utilizando la invenciónex vivoseguido de la reintroducción en el individuo.
[0252] En algunas formas de realización, las células tratadas según los presentes métodos proceden de sujetos en los que todavía no se ha manifestado ningún estado de enfermedad, pero en los que el sujeto está en riesgo de una afección o enfermedad que involucra telómeros cortos, o en los que las células contienen telómeros acortados. En algunas formas de realización, la enfermedad relacionada con la edad es simplemente la vejez. Los presentes tratamientos asimismo pueden utilizarse como un auxiliar cosmético, para prevenir, retrasar o mejorar el deterioro relacionado con la edad en la apariencia de la piel, el cabello, la estructura ósea, la postura, la claridad de los ojos u otras características que se deterioran con el envejecimiento. Por ejemplo, los tratamientos pueden utilizarse para ayudar a mantener la elasticidad, el grosor, la tersura y la apariencia de la piel, ya que la extensión de los telómeros mejora estos parámetros. En casos de traumatismo físico, tales como una fractura ósea o una lesión por aplastamiento o corte de tejido o una quemadura, la exposición puede utilizarse para incrementar la longitud de los telómeros en las células que participan en la curación del trauma, para incrementar su capacidad replicativa. En casos de estrés físico crónico, que causa el acortamiento de los telómeros, el tratamiento con la divulgación puede alargar los telómeros en las células afectadas, incrementando su capacidad replicativa y su capacidad para reparar el daño tisular. Dado que el acortamiento de los telómeros se acumula a lo largo de las generaciones, por ejemplo, en seres humanos con haploinsuficiencia de componentes de la telomerasa, tales como hTR o hTERT, Armanios (2009) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 10:45-61, los tratamientos de la presente divulgación pueden aplicarse a células de la línea germinal, tales como óvulos, espermatozoides o sus precursores, o en óvulos fertilizados o embriones, por ejemplo, durante procedimientos de fertilizaciónin vitro.Los tratamientos asimismo pueden resultar útiles para ayudar en otros tratamientos de diversas enfermedades o afecciones, por ejemplo, la transdiferenciación de célulasin vivo.Los métodos de tratamiento asimismo pueden resultar útiles antes o durante la cirugía, la quimioterapia o la radioterapia, para incrementar la capacidad de las células de replicarse y reparar el daño resultante de estos procedimientos.
[0254] Los métodos asimismo pueden resultar útiles para tratar célulasin vitropara diversas aplicaciones, incluyendo terapia celular autóloga o heteróloga, bioingeniería, ingeniería de tejidos, crecimiento de órganos artificiales, generación de células madre pluripotentes inducidas (CMPi), y diferenciación celular, desdiferenciación o transdiferenciación. En estas aplicaciones, es posible que se requiera que las células se dividan muchas veces, lo que puede llevar a la pérdida de longitud de los telómeros, lo que puede contrarrestarse con la exposición antes, durante o después de la aplicación.
[0256] Además, diversos tipos de cáncer pueden considerarse enfermedades relacionadas con la edad, particularmente cuando las células cancerosas contienen telómeros cortos. En algunos casos, las células tratadas según los presentes métodos proceden de sujetos en los que todavía no se ha manifestado ningún estado de enfermedad, pero en los que las células contienen telómeros acortados. En algunas formas de realización, la enfermedad relacionada con la edad es simplemente la forma y función alteradas típicamente asociadas a la vejez cronológica en el ser humano.
[0258] Las células en las que se administran de manera útil compuestos o composiciones de la presente divulgación según los presentes métodos incluyen células de cualquier tejido o tipo celular que puedan sufrir los efectos de telómeros acortados o que de alguna manera puedan beneficiarse del alargamiento de los telómeros de la célula. Entre las células se pueden incluir células somáticas o células germinales, así como células madre y otras células progenitoras y/o células no diferenciadas. Las células pueden incluir células tumorales y células no tumorales.
[0259] Entre los ejemplos de células en las que se administran compuestos o composiciones de manera útil según los presentes métodos se incluyen células derivadas principalmente del endodermo, células derivadas principalmente del ectodermo y células derivadas principalmente del mesodermo. Entre las células derivadas principalmente del endodermo se incluyen, por ejemplo, células epiteliales secretoras exocrinas y células secretoras de hormonas. Entre las células derivadas principalmente del ectodermo se incluyen, por ejemplo, células del sistema tegumentario (por ejemplo, células epiteliales queratinizantes y células epiteliales de barrera húmeda estratificada) y del sistema nervioso (por ejemplo, células transductoras sensoriales, células neuronales autonómicas, células de órganos sensoriales y de soporte de las neuronas periféricas, neuronas del sistema nervioso central y células gliales, y células del cristalino). Entre las células derivadas principalmente del mesodermo se incluyen, por ejemplo, células de metabolismo y almacenamiento, células de función de barrera (por ejemplo, células pulmonares, intestinales, glándulas exocrinas y tracto urogenital), células de la matriz extracelular, células contráctiles, células sanguíneas y del sistema inmunitario, células germinales, células nodrizas y células intersticiales. En consecuencia, en algunas formas de realización de los presentes métodos, la célula en la que se administra la composición es una célula somática de linaje endodérmico, mesodérmico o ectodérmico. En algunas formas de realización, la célula es una célula de línea germinal o una célula embrionaria.
[0261] Entre los ejemplos específicos de células en las que se puede administrar un compuesto o una composición según los métodos descritos se incluyen, por ejemplo: células mucosas de las glándulas salivales, células serosas de las glándulas salivales, células de las glándulas de von Ebner en la lengua, células de las glándulas mamarias, células de las glándulas lagrimales, células de las glándulas ceruminosas del oído, células oscuras de las glándulas sudoríparas ecrinas, células claras de las glándulas sudoríparas ecrinas, células de las glándulas sudoríparas apocrinas, células de la glándula de Moll en el párpado, células de las glándulas sebáceas, células de las glándulas de Bowman en la nariz, células de las glándulas de Brunner en el duodeno, células de la vesícula seminal, células de la glándula prostática, células de la glándula bulbouretral, células de la glándula de Bartolino, células de la glándula de Littre, células del endometrio uterino, células caliciformes aisladas del tracto respiratorio y digestivo, células mucosas del revestimiento gástrico, células zimógenas de la glándula gástrica, células oxínticas de la glándula gástrica, células acinares pancreáticas, células de Paneth del intestino delgado, neumocitos tipo II del pulmón, células de Clara del pulmón, células de la hipófisis anterior (por ejemplo, somatotropas, lactotropas, tirotropas, gonadotropas y corticotropas), células de la hipófisis intermedia (por ejemplo, las que secretan hormona estimulante de melanocitos), células neurosecretoras magnocelulares (por ejemplo, las que secretan oxitocina o vasopresina), células del tracto gastrointestinal y respiratorio (por ejemplo, las que secretan serotonina, endorfina, somatostatina, gastrina, secretina, colecistoquinina, insulina, glucagón o bombesina), células de la glándula tiroides (por ejemplo, células epiteliales tiroideas y células parafoliculares), células de la glándula paratiroides (por ejemplo, células principales paratiroideas y células oxífilas), células de la glándula suprarrenal (por ejemplo, células cromafines y células que secretan hormonas esteroideas, tales como mineralocorticoides y glucocorticoides), células de Leydig de los testículos, células de la teca interna del folículo ovárico, células del cuerpo lúteo del folículo ovárico roto, células luteínicas de la granulosa, células luteínicas de la teca, células yuxtaglomerulares, células de la mácula densa del riñón, células peripolares del riñón, células mesangiales del riñón, queratinocitos epidérmicos, células basales epidérmicas, queratinocitos de las uñas de manos y pies, células basales del lecho ungueal, células medulares del tallo piloso, células corticales del tallo piloso, células cuticulares del tallo piloso, células cuticulares de la vaina radicular del pelo, células de la vaina radicular del pelo de la capa de Huxley, células de la vaina radicular del pelo de la capa de Henle, células externas de la vaina radicular del pelo, células de la matriz del cabello, células epiteliales superficiales del epitelio escamoso estratificado de la córnea, lengua, cavidad oral, esófago, canal anal, uretra distal y vagina, células basales del epitelio de la córnea, lengua, cavidad oral, esófago, canal anal, uretra distal y vagina, células del epitelio urinario (por ejemplo, que recubren la vejiga urinaria y los conductos urinarios), células ciliadas internas del órgano de Corti, células ciliadas externas del órgano de Corti, células basales del epitelio olfatorio, neuronas sensoriales primarias sensibles al frío, neuronas sensoriales primarias sensibles al calor, células de Merkel de la epidermis, neuronas receptoras olfatorias, neuronas sensoriales primarias sensibles al dolor, células fotorreceptoras de la retina del ojo (por ejemplo, bastones fotorreceptores, conos sensibles al azul, conos sensibles al verde y conos sensibles al rojo), neuronas sensoriales primarias propioceptivas, neuronas sensoriales primarias sensibles al tacto, células tipo I y II del cuerpo carotídeo, células tipo I del gusto, células ciliadas tipo I y I<i>del aparato vestibular del oído, células neuronales colinérgicas, células neuronales adrenérgicas, células neuronales peptidérgicas, células pilar internas y externas del órgano de Corti, células falángicas internas y externas del órgano de Corti, células de borde del órgano de Corti, células de Hensen del órgano de Corti, células de soporte del aparato vestibular, células de soporte de las papilas gustativas, células de soporte del epitelio olfatorio, células de Schwann, células gliales satélite, células gliales entéricas, astrocitos, neuronas, oligodendrocitos, neuronas fusiformes, células epiteliales anteriores del cristalino, células de fibras del cristalino que contienen cristalinas, hepatocitos, adipocitos (por ejemplo, células de grasa blanca y células de grasa parda), lipocitos hepáticos, células parietales del riñón, podocitos del glomérulo renal, células del borde en cepillo del túbulo proximal renal, células del segmento delgado del asa de Henle, células del túbulo distal renal, células del conducto colector renal, neumocitos tipo I, células del conducto pancreático, células de conductos no estriados (por ejemplo, células principales e intercaladas), células de los conductos (de la vesícula seminal, glándula prostática, etc.), células del borde en cepillo intestinal (con microvellosidades), células de los conductos estriados de glándulas exocrinas, células epiteliales de la vesícula biliar, células no ciliadas del conducto eferente, células principales del epidídimo, células basales del epidídimo, células epiteliales ameloblásticas, células epiteliales delplanum semilunatumdel aparato vestibular del oído, células epiteliales interdentales del órgano de Corti, fibroblastos del tejido conectivo laxo, fibroblastos corneales (queratocitos corneales), fibroblastos de tendones, fibroblastos del tejido reticular de la médula ósea, otros fibroblastos no epiteliales, pericitos, células del núcleo pulposo del disco intervertebral, cementoblastos/cementocitos, odontoblastos/odontocitos, condrocitos del cartílago hialino, condrocitos del fibrocartílago, condrocitos del cartílago elástico, osteoblastos/osteocitos, células osteoprogenitoras, hialocitos del cuerpo vítreo del ojo, células estrelladas del espacio perilinfático del oído, células estrelladas hepáticas (células de Ito), células estrelladas pancreáticas, células musculares esqueléticas (por ejemplo, fibras musculares rojas (lentas) y blancas (rápidas)), células musculares esqueléticas intermedias, células en bolsa nuclear del huso muscular, células en cadena nuclear del huso muscular, células satélite musculares, células musculares cardíacas (por ejemplo, células musculares cardíacas ordinarias, células nodales y células de las fibras de Purkinje), células musculares lisas (de diversos tipos), células mioepiteliales del iris, células mioepiteliales de glándulas exocrinas, eritrocitos, megacariocitos, monocitos, macrófagos del tejido conectivo (de diversos tipos), células de Langerhans epidérmicas, osteoclastos, células dendríticas, microglía, granulocitos neutrófilos, granulocitos eosinófilos, granulocitos basófilos, células híbridas (hibridomas), mastocitos, linfocitos T ayudantes, linfocitos T supresores, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T citolíticos naturales, linfocitos B, células citolíticas naturales, reticulocitos, células madre y progenitores comprometidos para el sistema sanguíneo e inmunitario (de diversos tipos), oogonias/ovocitos, espermátidas, espermatocitos, espermatogonias, espermatozoides, células nodrizas, células del folículo ovárico, células de Sertoli, células epiteliales del timo y células intersticiales de riñón.
[0263] En una forma de realización preferida, las células a las que se administra un compuesto o composición según los presentes métodos son células madre o progenitoras, ya que estas células dan lugar a otras células del cuerpo. En otra forma de realización preferida, las células tratadas son células en las que los telómeros se acortan más rápidamente que en otros tipos de células, por ejemplo, células endoteliales, fibroblastos, queratinocitos, células del sistema inmunitario, incluyendo células tiroideas y paratiroideas y leucocitos y sus progenitores, células de los intestinos, hígado, células de la membrana mucosa, por ejemplo, en el esófago y colon, y células de las encías y pulpa dental.
[0265] De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en algunas formas de realización, las células son células fibroblásticas, queratinocitos, células endoteliales, células epiteliales o células sanguíneas.
[0267] La etapa de administración puede llevarse a cabo una o más veces dependiendo del nivel de extensión de los telómeros deseado. En algunas formas de realización de los presentes métodos, la célula es una célula aislada, y la etapa de administración tiene una duración no superior a 96 horas, no superior a 72 horas, no superior a 48 horas, no superior a 36 horas, no superior a 24 horas, no superior a 18 horas, no superior a 12 horas, no superior a 8 horas, no superior a 4 horas, o incluso tiempos más cortos. En algunas formas de realización, la etapa de administración tiene una duración de por lo menos 2 horas, por lo menos 4 horas, por lo menos 8 horas, por lo menos 12 horas, por lo menos 18 horas, por lo menos 24 horas, por lo menos 36 horas, por lo menos 48 horas, o incluso tiempos más prolongados. En las formas de realización preferidas, la etapa de administración tiene una duración no superior a 48 horas, no superior a 96 horas, o no superior a 1 semana. En otras formas de realización preferidas, la etapa de administración tiene una duración de por lo menos 2 horas. Debe entenderse que, en el caso de que la administración sea por transfección, el tiempo de administración incluye el tiempo para que la célula se recupere del método de transfección.
[0269] En algunas formas de realización de los presentes métodos, la célula es una célula aislada, y la etapa de administración se lleva a cabo no más de seis veces, no más de cinco veces, no más de cuatro veces, no más de tres veces, no más de dos veces, o incluso no más de una vez. En algunas formas de realización, la etapa de administración se lleva a cabo no menos de dos veces, no menos de tres veces, no menos de cuatro veces, no menos de cinco veces, no menos de seis veces, o incluso más frecuentemente.
[0271] En algunas formas de realización, la etapa de administración se lleva a cabo una o pocas veces durante un período relativamente breve para volver a extender los telómeros, y después no se lleva a cabo durante un período prolongado hasta que los telómeros necesiten ser extendidos nuevamente. Este ciclo puede repetirse indefinidamente. Dicho programa de tratamiento permite que los telómeros se vuelvan a extender periódicamente, a intervalos entre las etapas de administración durante las que se acortan los telómeros. Los métodos de tratamiento periódico pueden llevarse a cabo mediante la administraciónin vivoo mediante la administraciónin vitro,según se desee. En algunas formas de realización, la etapa de administración en dicha serie se lleva a cabo no más de seis veces, no más de cinco veces, no más de cuatro veces, no más de tres veces, no más de dos veces, o incluso no más de una vez. En algunas formas de realización, la etapa de administración se lleva a cabo no menos de dos veces, no menos de tres veces, no menos de cuatro veces, no menos de cinco veces, no menos de seis veces, o incluso más frecuentemente. Mediante la variación del número de veces en que se lleva a cabo la etapa de administración y la dosis de los compuestos o composiciones utilizados, se puede controlar el nivel de extensión de los telómeros que se consigue.
[0273] En algunas formas de realización, los métodos de la presente divulgación incluyen, además, la etapa de cultivar la célula en un sustrato específico, preferentemente un sustrato elástico. Es conocido que dichos sustratos evitan cambios no deseados en la célula que normalmente ocurrirían en otros sustratos debido a la elasticidad no fisiológica de esos sustratos. Ver la publicación de patente internacional PCT n° WO2012/009682. Los sustratos elásticos pueden además promover la supervivencia celular.
[0275] La administración de los compuestos o composiciones de la presente divulgación da como resultado la expresión transitoria de una actividad de telomerasa en la célula. La actividad incrementada se mide fácilmente mediante diversos ensayos, tales como, por ejemplo, el kit de detección de telomerasa Trapeze® RT (Millipore), que proporciona un ensayoin vitrosensible y en tiempo real utilizando detección fluorimétrica y cuantificación de la actividad de la telomerasa, aunque asimismo son posibles otras técnicas de medición. En algunas formas de realización, la actividad de la telomerasa se incrementa en por lo menos 5 %, por lo menos 10 %, por lo menos 20 %, por lo menos 30 %, por lo menos 50 %, o incluso más. En las formas de realización preferidas, la actividad de la telomerasa se incrementa en por lo menos 5 %.
[0277] Tal como se ha señalado anteriormente, una de las ventajas de las presentes técnicas es que la expresión de la actividad de la telomerasa es transitoria en las células tratadas. En particular, dicha expresión transitoria contrasta con técnicas anteriores en las que un gen de transcriptasa inversa de telomerasa se inserta en la secuencia genómica de la célula o, de otro modo, modifica permanentemente la composición genética de la célula diana y resulta en la actividad constitutiva de la secuencia de ácido nucleico.
[0279] La figura 3 ilustra gráficamente algunas de las ventajas de los compuestos, composiciones y métodos divulgados en la presente memoria. En particular, la velocidad de extensión de los telómeros que es posible con estos compuestos, composiciones y métodos permite el mantenimiento de los telómeros mediante la administración muy infrecuente de ARNmod de TERT. La actividad de telomerasa expresada extiende rápidamente los telómeros en un breve período, antes de ser eliminada, permitiendo de esta manera que el mecanismo protector anticancerígeno de acortamiento de telómeros funcione la mayor parte del tiempo. Entre los tratamientos, está presente la actividad normal de la telomerasa y el acortamiento de los telómeros, y por lo tanto, el mecanismo de seguridad anticanceroso del acortamiento de los telómeros para prevenir la proliferación descontrolada se mantiene intacto, mientras que el riesgo de enfermedades relacionadas con telómeros cortos se mantiene bajo. Por el contrario, el mejor tratamiento existente de molécula pequeña para extender los telómeros requiere una administración crónica, y por lo tanto presenta un riesgo crónico de cáncer, e incluso en este caso presenta un efecto pequeño e inconsistente sobre la longitud de los telómeros, sin ningún efecto detectable sobre la longitud de los telómeros en aproximadamente la mitad de los pacientes.
[0281] De acuerdo con lo anterior, en algunas formas de realización de los presentes métodos, la expresión de la actividad de transcriptasa inversa de la telomerasa, es decir, la semivida de la actividad de la telomerasa, tiene una duración no superior a 48 horas, no superior a 36 horas, no superior a 24 horas, no superior a 18 horas, no superior a 12 horas, no superior a ocho horas, no superior a cuatro horas, o incluso tiempos más cortos. En algunas formas de realización, la expresión de la actividad de la transcriptasa inversa de la telomerasa dura por lo menos dos horas, por lo menos cuatro horas, por lo menos ocho horas, por lo menos 12 horas, por lo menos 18 horas, por lo menos 24 horas, por lo menos 36 horas, por lo menos 48 horas, o incluso más tiempo. En las formas de realización preferidas, la expresión de la actividad de la transcriptasa inversa de la telomerasa tiene una duración no superior a 48 horas. En otras formas de realización preferidas, la expresión de la actividad de la transcriptasa inversa de la telomerasa tiene una duración de por lo menos dos horas.
[0283] En algunas formas de realización de los presentes métodos, la expresión transitoria es independiente del ciclo celular.
[0285] Tal como se ha señalado anteriormente, la expresión transitoria de la transcriptasa inversa de la telomerasa resulta en la extensión de telómeros acortados en células tratadas. La longitud de los telómeros se puede medir fácilmente utilizando técnicas tales como el análisis de las longitudes de los fragmentos de restricción terminal (TRF), qPCR, MMqPCR y Q-FISH, tal como entenderá el experto ordinario en la materia. Ver,por ejemplo,Kimura et al. (2010) Nat Protoc. 5:1596-607; doi: 10.1038/nprot.2010.124. En algunas formas de realización, los presentes métodos incrementan la longitud de los telómeros en las células tratadas en por lo menos 0,1 kb, por lo menos 0,2 kb, por lo menos 0,3 kb, por lo menos 0,4 kb, por lo menos 0,5 kb, por lo menos 1 kb, por lo menos 2 kb, por lo menos 3 kb, por lo menos 4 kb, por lo menos 5 kb, o incluso más.
[0287] Una de las ventajas de los presentes compuestos, composiciones y métodos es la rapidez de la extensión de los telómeros conseguida mediante estas técnicas. Las técnicas permiten que los tratamientos sean breves y, de esta manera, seguros porque el mecanismo normal de acortamiento de los telómeros protectores se mantiene intacto la mayor parte del tiempo. El tratamiento con los compuestos y composiciones divulgados en la presente memoria resulta en la administración de decenas o cientos de copias de ARNmod de TERT en cada célula, según lo medido mediante RT-qPCR absoluto, que es sustancialmente más que el número medio de copias de ARNm de TERT endógeno que se encuentran incluso en células con alta actividad de telomerasa. Normalmente, tales células presentan menos de una copia de ARNm de TERT en cada célula (Yi et al. (2001) Nucl. Acids Res. 29:4818-4825). De esta manera, los tratamientos introducen transitoriamente un gran número de copias de ARNmod que codifican TERT en una célula, lo que resulta en una rápida extensión de los telómeros. Sin respaldo teórico, el gran número de copias de ARNmod que codifican TERT puede superar transitoriamente los mecanismos reguladores inhibitorios que normalmente evitan que TERT, y otros métodos de extensión de los telómeros, extiendan los telómeros tan rápidamente como los compuestos, composiciones y métodos divulgados en la presente memoria.
[0288] La expresión transitoria de la transcriptasa inversa de la telomerasa asimismo resulta en una mayor capacidad replicativa en las células tratadas. Se lleva a cabo fácilmente el seguimiento de la capacidad replicativa incrementada en las células que se acercan a la senescencia replicativa mediante la medición de las duplicaciones poblacionales adicionales de dichas células. Las células senescentes no son estimuladas a dividirse mediante el pase en cultivo o el tratamiento con suero. Las células senescentes frecuentemente se caracterizan adicionalmente por la expresión de la actividad de p-galactosidasa dependiente del pH, la expresión de los inhibidores del ciclo celular p53 y p19, y otros patrones alterados de expresión génica, así como un tamaño celular incrementado. En ausencia de tratamiento con los compuestos y composiciones de la presente divulgación, las células fibroblásticas pulmonares humanas habitualmente se duplican de 50 a 60 veces. Con un conjunto de uno a tres tratamientos de una duración de apenas unos pocos días en total, sin embargo, estas células consiguen entre 16 y 28 duplicaciones poblacionales adicionales. Si se aplica el tratamiento de nuevo varias semanas después, se confiere nuevamente capacidad proliferativa adicional. Este proceso de tratamientos intermitentes para volver a extender periódicamente los telómeros puede aplicarse veces adicionales, con el intervalo entre tratamientos dependiente de factores tales como la tasa de acortamiento de los telómeros, la tasa de divisiones celulares y el nivel de extensión de los telómeros proporcionada por el tratamiento. De manera similar, las células endoteliales dérmicas microvasculares humanas de un individuo envejecido, sin tratamiento con las presentes composiciones, pueden conseguir solo 1 o 2 duplicaciones poblacionales, mientras que las células tratadas pueden conseguir tres, cuatro o incluso más duplicaciones poblacionales.
[0290] De acuerdo con lo anterior, en algunas formas de realización, los presentes métodos de tratamiento incrementan el número de duplicaciones poblacionales en por lo menos una, dos, cuatro o incluso más duplicaciones poblacionales. En algunas formas de realización, los métodos de tratamiento incrementan el número de duplicaciones poblaciones en por lo menos 5, 10, 15, 20, o incluso más duplicaciones poblacionales.
[0292] En algunas de las formas de realización del presente método, los compuestos o composiciones se administran a la célula animal mediante electroporación. En formas de realización específicas, se administra un compuesto en la célula animal mediante electroporación en ausencia de un vehículo de administración. En otras formas de realización específicas, se administran un compuesto y un componente de ARN telomerasa a la célula animal mediante electroporación.
[0294] Kits
[0296] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona kits listos para utilizar para la utilización en la extensión de telómeros en una célula de mamífero. Los kits comprenden cualquiera de los compuestos o composiciones indicados anteriormente, junto con instrucciones para la utilización de los mismos. En algunas formas de realización, los kits comprenden además materiales de envasado. En las formas de realización preferidas, los materiales de envasado son herméticos. En estas formas de realización, los materiales de envasado pueden opcionalmente llenarse con un gas inerte, tal como, por ejemplo, nitrógeno, argón o similar. En algunas formas de realización, los materiales de envasado comprenden un recipiente de lámina de aluminio, tal como, por ejemplo, una bolsa de aluminio sellada o similar. Tales materiales de envasado son bien conocidos por el experto ordinario en la materia.
[0298] En algunas formas de realización, el kit puede comprender además un desecante, un medio de cultivo, un inhibidor de ARNasa u otros componentes similares. En algunas formas de realización, el kit puede comprender, además, una combinación de más de uno de dichos componentes adicionales. En algunas formas de realización de kit, la composición del kit es estéril.
[0300] Una vez se ha descrito la presente invención en detalle, se entenderá más claramente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen en la presente memoria únicamente a título ilustrativo y no limitativo.
[0301] Ejemplos
[0303] Ejemplo 1. Extensión de telómeros altamente eficaz en células humanas utilizando ARNm modificado codificante de telomerasa
[0305] Las enfermedades por mantenimiento inadecuado de la longitud de los telómeros y la necesidad de una capacidad replicativa celular incrementada para terapias celulares y aplicaciones de bioingeniería han motivado el desarrollo de métodos seguros para la extensión de los telómeros. Blackburn et al. (2010) Cancer Prev Res (Phila) 3:394-402; Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707; Alter et al. (2009) Blood 113:6549-6557; Mohsin et al. (2012) Journal of the American College of Cardiology doi:10.1016/j.jacc.2012.04.047. La administración de ARNm para incrementar transitoriamente la cantidad de proteína codificada por el ARNm para aplicaciones terapéuticas se facilita mediante la incorporación de nucleósidos modificados que reducen la inmunogenicidad e incrementan la estabilidad. Karikó et al. (2005) Immunity 23:165-175; Karikó et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:e142; doi: 10.1093/nar/gkr695.
[0307] Para resultar terapéuticamente útil, un tratamiento de extensión de telómeros debería ser idealmente no inmunogénico; específico; capaz de iniciarse antes de que los telómeros se acorten a longitudes críticamente cortas que causan inestabilidad cromosómica y un riesgo de cáncer incrementado (Wentzensen et al. (2011) Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 20:1238-1250; Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707; Artandi y DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18); transitorio e intermitente, para permitir que el mecanismo normal de acortamiento de telómeros anticanceroso funcione casi continuamente; efectivo incluso en células de división lenta, tal como algunas poblaciones de progenitores y células madre; administrablein vitroein vivoutilizando vehículos no inmunogénicos; y finito, al permitir solo suficientes divisiones celulares adicionales para potencialmente mejorar o prevenir enfermedades de mantenimiento inadecuado de telómeros, o para permitir una suficiente amplificación de las células para terapias celulares o aplicaciones de bioingeniería. Los tratamientos actuales, incluyendo los tratamientos de molécula pequeña, no cumplen con la totalidad de dichos criterios. Harley et al. (2011) Rejuvenation Res. 14:45-56. La administración vírica de TERT, aunque posiblemente inducible, conlleva el riesgo de mutagénesis por inserción y, de esta manera, platea graves preocupaciones de seguridad. Los tratamientos que implican la sobreexpresión continua de la telomerasa son potencialmente inseguros, debido a que en una célula con una mutación oncogénica, ya sea debido a telómeros críticamente cortos y la consiguiente inestabilidad cromosómica (O'Sullivan y Karlseder (2010) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11:171-181) u otra causa, la expresión constitutiva de la telomerasa, ya sea debido a una segunda mutación o a un fármaco, puede apoyar la malignidad al permitir una proliferación ilimitada. Artandi and DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18; Ding et al. (2012) Cell 148:896-907.
[0309] Los criterios para la extensión segura de los telómeros se cumplen mediante un enfoque basado en ARN, facilitado por la identificación reciente de que determinados nucleósidos que se encuentran de forma natural en el ARN incrementan la estabilidad y reducen la inmunogenicidad del ARN exógeno cuando se introduce en las células. Karikó et al. (2005) Immunity 23:165-175. Se enumeran ejemplos de dichos nucleósidos en la tabla 4. Sin respaldo teórico, dichas versiones modificadas de nucleósidos canónicos pueden permitir que los receptores de tipo Toll del sistema inmunitario innato distingan el ARNmod endógeno del ARN foráneo que no contiene estos nucleótidos. La administración de ARNmod sintético suficientemente purificado que contiene estos nucleósidos no canónicos en las células resulta en una estabilidad incrementada del ARNmod y una elevación transitoria de la proteína codificada por el ARNmod con una respuesta inmunitaria reducida o anulada. Karikó et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:e142; doi: 10.1093/nar/gkr695. De esta manera, la administración de ARNmod exógeno presenta oportunidades sin precedentes para aplicaciones que requieren la producción transitoria de proteínas. Por ejemplo, el ARNmod biomimético ha sido transfectado en fibroblastos, reprogramándolos de esta manera en células madre pluripotentes. Yakubov et al. (2010) Biochem. Biophys. Res. Commun. 394:189-193. El ARNmod biomimético asimismo ha sido inyectado en ratones para rescatar un modelo de deficiencia de proteína tensioactiva pulmonar y para elevar los niveles de eritropoyetina y el hematocrito. Kormann et al. (2011) Nat. Biotecnol. 29:154-157. Tal como se ha indicado anteriormente, los nucleósidos utilizados en los ARNmod utilizados en la presente memoria fueron seleccionados no solo para incrementar la estabilidad, sino asimismo para reducir o eliminar la inmunogenicidad e incrementar la eficacia de traducción del ARN. La transfección de células dendríticas utilizando un ARNm no modificado codificante de hTERT, aunque resulta en un incremento de la actividad de la telomerasa dentro de las células, asimismo indujo una fuerte respuesta de linfocitos T citotóxicos específicos de hTERT. Saeboe-Larssen et al. (2002) Journal of Immunological Methods 259: 191-203. Por lo tanto, es poco probable que los enfoques que utilizan ARN no modificados resulten eficaces para extender los telómeros en las células.
[0311] De esta manera, la administración de ARNmod codificante de TERT en las células puede utilizarse para incrementar transitoriamente los niveles de proteína TERT y la actividad de la telomerasa lo suficiente como para extender los telómeros e incrementar la capacidad replicativa en una cantidad finita. Los niveles incrementados de actividad de la telomerasa ocurren lo suficientemente rápido como para permitir un tratamiento de extensión de los telómeros que sea breve e infrecuente (ver la figura 1a y la figura 3).
[0313] Para demostrar el enfoque, se sintetizó ARNmod de TERT utilizando proporciones de nucleósidos canónicos y no canónicos que confieren estabilidad, traducción eficaz y una inmunogenicidad reducida o anulada. Yakubov et al. (2010) Biochem. Biophys. Res. Commun. 394:189-193; Karikó et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:e142; doi: 10.1093/nar/gkr695. El ARNmod sintético contiene las UTR 5' y 3' del ARNm de la beta globina, que presenta una semivida relativamente larga. Para mejorar adicionalmente la estabilidad, el ARNmod presenta una cola poli-A larga de 151 nucleótidos. Para maximizar la fidelidad del molde de ADN largo de TERT utilizado en la reacción de transcripciónin vitropara generar ARN, los ARN de molde se generaron utilizando un enfoque basado en plásmidos en lugar de uno basado en PCR.
[0315] Para distinguir la extensión genuina de los telómeros de la selección de células con telómeros largos a partir de una población inicial heterogénea, se sintetizó un ARNmod de control que codifica una forma catalíticamente inactiva de TERT (CI TERT) con la mutación de un solo residuo D712A, en el que uno de la tríada de aspartatos que coordinan metales en el sitio catalítico del dominio de la transcriptasa inversa es sustituido por alanina, anulando la actividad catalítica de CI TERT pero dejándola estructuralmente intacta hasta el punto de poder unirse al ADN de molde, y tan estable como TERT en lisado de reticulocitos. Wyatt (2009) "Structure-Function Analysis of the Human Telomerase Reverse Transcriptase" University of Calgary, Ph.D. Tesis (http://dspace.ucalgary.ca/bitstream/1880/47511/1/2009_Wyatt_PhD.pdf).
[0317] Se seleccionaron fibroblastos pulmonares fetales humanos MRC-5 como células de ensayo en el presente ejemplo porque estas y otras cepas de fibroblastos humanos han servido durante décadas como caballos de batalla en el campo de los telómeros, y por lo tanto existen abundantes datos para informar el diseño experimental y el análisis. Las células MRC-5 además presentan una actividad telomerasa endógena relativamente baja, y muestran un acortamiento de los telómeros y finalmente, senescencia. Dado que el estrés oxidativo incrementa la tasa de acortamiento de los telómeros en las células MRC-5 (von Zglinicki et al. (2000) Free Radic. Biol. Med. 28:64-74), y hace que TERT se localice en el citoplasma, en donde no puede extender los telómeros (Ahmed et al. (2008) J. Cell. Sci. 121:1046-1053), las células se cultivaron en un 5 % de oxígeno en lugar de en oxígeno ambiental. Para incrementar adicionalmente la probabilidad de éxito, las células asimismo se cultivaron en un medio optimizado para la producción de proteínas en células MRC-5 (Wu et al. (2005) Cytotechnology 49:95-107).
[0319] La eficacia de la extensión de telómeros basada en ARNmod está sujeta a varios factores, incluyendo la eficacia de la transfección, traducción y plegado en telomerasa funcional, y la capacidad de escapar por lo menos transitoriamente de los extensos mecanismos de regulación postraduccional que inhiben TERT y la telomerasa en muchos tipos de células, incluyendo las células MRC-5. Aunque las eficacias de transfección con especies de ARNmod más pequeñas, tales como GFPn (0.8 kb) en células MRC-5, son típicamente superiores al 90 %, incluso con bajas concentraciones de ARNmod (figura 6), el marco de lectura abierto de TERT es relativamente grande (3.399 pb), y el constructo de ARNmod de TERT incluye UTR y una cola de poli-A, lo que hace que el constructo sea todavía más grande (3.751 pb). Tal como se representa en la figura 1b, sin embargo, tanto TERT como CI TERT fueron transfectados eficientemente en células MRC-5 mediante lípidos catiónicos (según medición mediante RT-PCR del ARNm recogido al final del tratamiento de células MRC-5 tratadas con 1 pg/ml de ARNmod de TERT durante 5 horas). Además, la administración de ARNmod de TERT o CI TERT dio como resultado incrementos equivalentes y significativos (P<0.03 y <0.01, respectivamente) de la cantidad de proteínas reconocida por el anticuerpo anti-TERT, con un tamaño de aproximadamente 122 kDa, cercano al tamaño estimado de TERT de 127 kDa (figura 1c). Wick et al. (1999) Gene 232:97-106. Los niveles de proteína se midieron mediante transferencia Western cuantitativa de fluorescencia de infrarrojos. Los niveles de proteína TERT no difieren significativamente entre las células tratadas con TERT y las células tratadas con CI TERT (n=3).
[0321] Para formar telomerasa funcional, TERT debe plegarse correctamente y formar un complejo con por lo menos TERC. La telomerasa asimismo está fuertemente regulada postraduccionalmente, incluyendo por localización citoplasmática y fosforilación inhibitoria. Cifuentes-Rojas y Shippen (2012) Mutat. Res. 730:20-27; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. De hecho, no todas las células que expresan TERT son capaces de mantener los telómeros. Counter et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:14723-14728. La administración de ARNmod de TERT incrementó la actividad de la telomerasa de manera dependiente de la dosis hasta un máximo a una concentración de aproximadamente 0,6 pg/ml (ver la figura 7), y se utilizó una concentración de 1 pg/ml para experimentos posteriores. Los niveles de actividad de la telomerasa se incrementaron rápidamente pero volvieron a los niveles basales en aproximadamente 48 horas, y el ARNmod de CI TERT no causó ningún cambio en la actividad de la telomerasa (figura 1d). La actividad de la telomerasa se midió mediante el ensayo RT TRAPeze® basado en qPCR (n=3).
[0323] Debido a que la regulación postraduccional de TERT está mediada en parte por el secuestro citoplasmático de manera dependiente del ciclo celular, asimismo se investigó la localización subcelular de TERT en células tratadas y no tratadas. Cifuentes-Rojas et al. (2011) Mutat. Res. doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. En concordancia con los resultados de la transferencia Western, la inmunocitoquímica mostró una abundante, aunque posiblemente inhibida, proteína reconocida por el anticuerpo TERT en las células MRC-5 no tratadas, lo que dificulta distinguir el TERT endógeno del exógeno (datos no mostrados).
[0325] Se utilizaron células a aproximadamente 10 duplicaciones de población (PD) del inicio de la senescencia replicativa para medir el efecto del tratamiento con ARNmod de TERT sobre la longitud de los telómeros y la capacidad replicativa. La decisión de utilizar dichas células se basó en por lo menos dos factores. Primero, las células en esta etapa presentan telómeros relativamente cortos, y debido a que la telomerasa extiende preferentemente los telómeros cortos, incluyendo las células MRC-5, el tratamiento de las células en esta etapa debería resultar en un efecto más grande y más fácilmente medible. Britt-Compton et al. (2009) FEBS Lett. 583:3076-3080. En segundo lugar, mediante el tratamiento de las células en esta etapa, se reduce la cantidad de tiempo necesario para determinar si el tratamiento ha incrementado la capacidad replicativa. Bajo las presentes condiciones, la senescencia replicativa comienza aproximadamente 50 DP después de recibir las células MRC-5 del proveedor (ver Métodos para más información), por lo que se decidió tratar las células aproximadamente en la DP 40. Las células MRC-5 en esta etapa presentan longitudes medias de telómeros de aproximadamente 5 a 7 kb, dependiendo de la historia de cultivo y de la DP al recibirlas de los proveedores. Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893; MacKenzie et al. (2000) Exp. Cell Res. 259:336-350.
[0327] Se tuvieron en cuenta varias consideraciones al diseñar el calendario de tratamiento (figura 4a). Las tasas de extensión de los telómeros obtenidas mediante la transducción vírica de TERT en células MRC-5 varían, pero son del orden de aproximadamente 0,2 kb por división. MacKenzie et al. (2000) Exp. Cell Res. 259:336-350. Las tasas de acortamiento de los telómeros en las células MRC-5 varían según las condiciones y prácticas de cultivo (Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893; von Zglinicki et al. (2000) Free Radic. Biol. Med. 28:64-74), pero son aproximadamente de 0,1 kb por DP en condiciones ambiente de oxígeno (Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893). Las células fueron cultivadas con 5 % de oxígeno, ya que los telómeros de las células MRC-5 se acortan más lentamente bajo condiciones menos oxidativas. von Zglinicki et al. (2000) Free Radic. Biol. Med.
[0328] 28:64-74. El tiempo de DP en las células MRC-5 DP 40 se encontró que era de aproximadamente 33 horas. Dado estos datos, se podría esperar que se requirieran múltiples tratamientos para detectar la extensión de los telómeros dentro de la resolución de los métodos seleccionados de medición de la longitud de los telómeros, el análisis de fragmentos de restricción de telómeros (TRF) y la hibridación fluorescentein situcuantitativa (Q-FISH). Se optó por un intervalo entre tratamientos de 48 horas, ya que se encontró que los niveles de actividad de la telomerasa volvían a los niveles basales para este momento después de un solo tratamiento.
[0330] Tal como se muestra en las figuras 3(b)-(d), el tratamiento de las células MRC-5 con ARNmod de hTERT resulta en un incremento significativo de la longitud de los telómeros en estas células en comparación con las células sin tratar o tratadas con solo el vehículo de administración. Las micrografías de fluorescencia de células MRC-5 en metafase tras el tratamiento muestran la localización de una sonda de telómero en los cromosomas de estas células (figura 4(e)).
[0332] El efecto del tratamiento sobre la longitud de los telómeros asimismo se midió mediante hibridaciónin situpor fluorescencia cuantitativa (Q-FISH) (figura 4(f)), debido a que esta técnica proporciona una resolución relativamente alta (0,3 kb) y a que la fluorescencia de las sondas teloméricas de Q-FISH es directamente proporcional a la longitud de los telómeros. Lansdorp et al. (1996) Hum. Mol. Genet. 5:685-691; Martens et al. (1998) Nat. Genet. 18:76-80. Debido a que la capacidad replicativa es el parámetro funcional que interesa más incrementar como resultado de la extensión de los telómeros, se construyó una curva patrón que relaciona el número de duplicación poblacional de las células MRC-5 con la longitud de los telómeros, medida mediante Q-FISH (figura 4(g)(i)). Después de tres tratamientos de las MRC-5 de DP 40 con ARNm de TERT a intervalos de 48 horas, la longitud media total de los telómeros por célula se había incrementado en 56+/-5 % (n=15 células para cada una de las dos réplicas biológicas para cada tratamiento; las barras de error representan el e.e.m.). Las longitudes de los telómeros en las células DP 40 tratadas fueron similares a las de las células DP 3 no tratadas (figura 4(g)(ii)) (línea discontinua superior), y por lo tanto el tratamiento extendió los telómeros en la cantidad que los telómeros se acortan en estas células a lo largo de 37 DP. En este número de DP bajo condiciones estándares de cultivo, los telómeros de MRC-5 se acortan en más de >1 kb. Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893. En concordancia con ello, el incremento observado en la longitud de los telómeros del 56 % corresponde a un incremento en la longitud media de los telómeros de aproximadamente 0,6-2,5 kb, basado en el hecho de que las células MRC-5 de DP 40 presentan longitudes medias de telómeros de aproximadamente 5 a 7 kb, medidas mediante TRF (Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893; MacKenzie et al. (2000) Exp. Cell Res.
[0333] 259:336-350), lo que sobrestima la longitud de los telómeros en aproximadamente 2,5 a 4 kb, y por lo tanto, las longitudes medias reales de los telómeros en las células MRC-5 de DP 40 están comprendidas en el intervalo de 1 a 4,5 kb. Aubert et al. (2012) Mutat. Res. 730:59-67. Debido a que el tratamiento tuvo una duración total de 144 horas, y el tiempo de duplicación poblacional de las células fue de aproximadamente 33 horas durante este tiempo, las células experimentaron aproximadamente 4 a 5 DP. De esta manera, la tasa de extensión de los telómeros era de aproximadamente 0,1 a 0,6 kb por cada DP, cuyo intervalo superior se acerca a las tasas máximas jamás notificadas tras la transducción vírica de ADN codificante de TERT, y cuyo rango inferior es comparable a las tasas típicas observadas utilizando la administración vírica. Tal como se esperaba, las células no tratadas presentaban longitudes de telómeros equivalentes a las células DP 40 durante la generación de la curva patrón (línea discontinua inferior en la figura 4(g)).
[0335] A continuación, se examinó el efecto del tratamiento con ARNm de TERT sobre la capacidad replicativa celular. Tal como se esperaba, las células no tratadas y tratadas solo con vehículo envejecieron dentro del intervalo normal de 50 a 60 DP (figura 5a). En marcado contraste, las células tratadas con ARNm de TERT continuaron proliferando más allá de las DP en las que las poblaciones de control habían alcanzado la senescencia replicativa de manera dependiente de la dosis, con cada tratamiento adicional confiriendo significativamente más DP adicionales.
[0336] Tres tratamientos con ARNm de TERT resultaron en un incremento de la capacidad replicativa de 28+/-1,5 DP. Este resultado es coherente con una estimación de que los telómeros se extienden en >1 kb, ya que los telómeros de MRC-5 se acortaron aproximadamente en 0,1 kb por cada DP (Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893) en oxígeno ambiente (20%), y las células tratadas se cultivaron en 5% de oxígeno, en el cual los telómeros se acortan más lentamente. El incremento observado en la capacidad replicativa de las células tratadas de 28 DP es equivalente a la pérdida de capacidad replicativa que ocurre en los fibroblastos normales durante más de una década de envejecimiento humano normal. Takubo et al. (2010) Geriatr Gerontol Int. 10 Suppl 1:5197-206; doi: 10.1111/j.1447-0594.2010.00605.x.; Allsopp, R. C. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10114-10118.
[0337] Es importante para las aplicaciones terapéuticas que todas las células tratadas estudiadas hasta la fecha finalmente entraron en senescencia, y de hecho lo hicieron en un número menor de DP que las células no tratadas y con longitudes de telómero equivalentes, tal como cabría esperar, ya que las células tratadas han pasado por docenas de DP adicionales, en comparación con las células no tratadas con telómeros de longitud similar, en las que se puede acumular daño en el ADN no telomérico u otro daño que podría afectar las tasas de acortamiento de los telómeros o de otro modo apoyar la inducción de la senescencia replicativa.
[0339] A medida que las células MRC-5 se acercaban y entraban en senescencia replicativa, tendían a hincharse hasta varias veces el diámetro de los pases tempranos (figura 8a). Al igual que con la senescencia replicativa, esta transición se retrasó en las células tratadas con ARNmod de TERT, pero no en las células que recibieron ARNmod de CI TERT o solo vehículo (figura 8b).
[0341] En concordancia con el hallazgo de que el ARNmod de CI TERT NO causó un incremento en la actividad de la telomerasa (figura 1d), el tratamiento con ARNmod de CI TERT no cambió la distribución de la longitud de los telómeros en comparación con las células no tratadas, y tampoco incrementó la capacidad replicativa, a pesar de causar un incremento en el nivel de proteína TERT equivalente al causado por ARNmod de TERT (figura 1c). Dado que la única diferencia entre TERT y CI TERT es una sustitución de un solo residuo que anula la capacidad de CI TERT para transferir nucleótidos a los telómeros, estos resultados apoyan firmemente la hipótesis de que el incremento en la longitud de los telómeros y la capacidad replicativa observada en las células tratadas con ARNmod de TERT se debe a una extensión auténtica de los telómeros en por lo menos algunas de las células tratadas, en lugar de una selección de una subpoblación preexistente de células con telómeros más largos.
[0342] Los resultados del presente ejemplo muestran que la administración de ARNmod de TERT a células humanas eleva transitoriamente la actividad de la telomerasa, extiende rápidamente los telómeros e incrementa la capacidad replicativa en una cantidad finita y, por lo tanto, potencialmente segura. El ARNmod biomimético purificado asimismo es hipoinmunogénico. Karikó et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:e142; doi: 10.1093/nar/gkr695. De este modo, la administración de ARNmod cumple con varios criterios importantes para un tratamiento terapéutico de extensión de los telómeros, y asimismo presenta potencial en relación con otros criterios, incluyendo especificidad, administración dirigida, y capacidad para superar la regulación postraduccional. En cuanto a la especificidad, la sobreexpresión de TERT asimismo puede afectar a otros genes, tales como Wnt (Park et al. (2009) Nature 460:66-72), pero tales efectos pueden evitarse administrando ARNmod que codifica un TERT mutado en sitios de unión de factores que actúa de mediador en dichos efectos no específicos. Con respecto a la administración, la identificación reciente de que en seres humanos el ARNm modificado se transporta en exosomas entre las células a través de la sangre y otros líquidos corporales permite la administración de ARNm modificado basado en exosomas para la extensión de los telómeros y otras aplicaciones. Lakhal and Wood (2011) Bioessays 33:737-741. Los exosomas se han utilizado con éxito para administrar ARNm modificado biomimético a las célulasin vitro(datos no representados). Con respecto a la regulación postraduccional, la regulación postraduccional inhibitoria dependiente e independiente del ciclo celular de TERT puede evitarse administrando ARNmod codificante de TERT mutado en uno o más sitios conocidos que median en esas actividades, tales como la secuencia de exportación nuclear, o administrando conjuntamente ARNmod que codifica otros elementos de los complejos de telomerasa o teloméricos. Estos enfoques permiten la extensión de los telómeros incluso en células que se dividen lentamente o no se dividen, haciendo que el tratamiento con ARNmod de TERT resulte apropiado para poblaciones de células madre y progenitoras quiescentes o de división lenta. La extensión de telómeros basada en ARNmod encuentra de esta manera un uso inmediato en el incremento de la capacidad replicativa de las células para la investigación, y además para terapias celulares, aplicaciones de bioingeniería y tratamientosin vivoque tratan enfermedades y afecciones de mantenimiento inadecuado de los telómeros.
[0344] En resumen, se administró ARNmod codificante de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (TERT) en fibroblastos pulmonares humanos MRC-5 tres veces durante 96 horas. Los telómeros en las células tratadas se extendieron en >1 kb, una cantidad por la que los telómeros de los fibroblastos se acortan a lo largo de más de una década de envejecimiento en el ser humano de media. Takubo et al. (2010) Geriatr. Gerontol. Int. 10 Suppl 1:5197-206; doi: 10.1111/j.1447-0594.2010.00605.x. La actividad de la telomerasa volvió a los niveles previos al tratamiento en 48 horas y el inicio de la senescencia replicativa en las células tratadas se retrasó aproximadamente en 30 duplicaciones poblacionales, de manera dependiente de la dosis. De esta manera, la administración de ARN de telomerasa que contiene nucleósidos modificados en las células permite una rápida e hipoimunogénica o no inmunogénica, y el ARN es un enfoque útil para la extensión de los telómeros para diversas aplicaciones.
[0346] Métodos
[0348] Generación y síntesis de molde de ARNmod.El marco de lectura abierto (ORF) del TERT humano de tipo salvaje (WT) utilizado para generar los ADN de molde para la síntesis de ARNmod es idéntico a la secuencia de referencia del transcrito variante 1 de TERT humano de NCBI NM_198253.2, y se generó mediante introducción de la modificación G516D en el ORF del plásmido pBABE-neo-hTERT (plásmido Addgene 1774). El residuo 516 se encuentra en el motivo QFP de la extensión N-terminal de TERT, un motivo asociado a la multimerización y unión del ARN de TERT. El mutante TERT catalíticamente inactivo (CI TERT) se generó a partir de la secuencia TERT WT mediante la introducción de la mutación D712A. Los ORF de TERT WT y CI fueron insertados en el MCS de un plásmido inicial que contenía el promotor T7, el UTR 5' de la beta globina humana (hBB), el MCS, el UTR 3' de hBB, una secuencia poli-A de 151 pb y un sitio de restricción para la linealización con el enzima de clase IIs después de la secuencia de poli-A. El plásmido intermedio resultante se secuenció por lo menos por cuadruplicado para garantizar la fidelidad, se linealizó y se transcribió a ARN con extremos protegidos, utilizando la ARN polimerasa del kit MEGAscript T7 (Ambion, Austin, Texas) y una mezcla de nucleótidos personalizada de nucleótidos canónicos y no canónicos (TriLink BioTechnologies) en la que las concentraciones finales de nucleótidos por reacción IVT de 40 pl eran 7,5 mM para cada uno de adenosina-5'-trifosfato (ATP), 5-metilcitidina-5'-trifosfato (m5C) y pseudouridina-5'-trifosfato (^), 1,5 mM para guanosina-5'-trifosfato (GTP) y 6 mM para el análogo de la caperuza (ARCA, NEB), o una proporción molar de ATP:m5C:l+l:GTP:ARCA de 1:1:1:0,2:0.8. Para reducir adicionalmente la potencial inmunogenicidad del ARNm relacionada con la fracción portadora de 5'-3P (~20 % del total), los productos IVT fueron tratados con fosfatasa (fosfatasa antártica, NEB). Se verificó el tamaño y la integridad de los productos de ARNmod utilizando electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante.
[0350] Células y cultivo celular.Se obtuvieron de la ATCC, fibroblastos pulmonares fetales humanos MRC-5 (ATCC n° CCL-171) de pase 14, el número de pase actual de su inventario de distribución. Dado que la ATCC no indica el número de DP, los valores de DP citados en la presente memoria se refieren al número de DP después de la recepción de las células de ATCC, definido en la presente memoria como DP 0. Para acortar sus telómeros en preparación para los experimentos de extensión de telómeros, las células se cultivaron utilizando las pautas de ATCC en DMEM con FBS al 10 %, en oxígeno ambiental y 5 % de CO2. El tratamiento de extensión de los telómeros se inició aproximadamente en la DP 40 después de recibir las células de la ATCC. Por lo menos 48 horas antes del inicio del tratamiento con ARNmod, las células fueron transferidas a un ambiente con 5 % de oxígeno y medio DMEM que contenía BS al 20 % y penicilina-estreptomicina. Las células se trataron por lo menos 24 horas después de la siembra y 24 horas antes de la tripsinización.
[0352] Transfección de ARNmod.Las células se transfectaron con ARNmod de TERT 0,4 nM y ARN de TERC 2,0 nM, a menos que se especifique otra cosa, utilizando Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen), un lípido catiónico, en medio Opti-MEM con suero reducido (Invitrogen) durante 4 a 5 horas, seguido de la devolución al medio normal.
[0354] Medición de la actividad de la telomerasa.Veinticuatro horas después del inicio del período de transfección, las células se lavaron con PBS, se tripsinizaron, se centrifugaron a 500 g durante 5 minutos y se lavaron con PBS, se volvieron a centrifugar y después se lisaron siguiendo las instrucciones del kit TRAPeze R<t>(Millipore). Las etapas de transcripción inversa y qPCR se llevaron a cabo en un Roche LightCycler 480 II y un ABI 7900 HT. La actividad de la telomerasa en las muestras siempre se comparó con el patrón de referencia proporcionado con el kit, ya que los presentes inventores descubrieron que el incremento en pliegues era propenso a ser altamente variable, probablemente debido a la baja actividad de la telomerasa en las células MRC-5.
[0356] Inmunocitoquímica.Veinticuatro horas después del inicio del período de transfección, las células se lavaron con PBS, se fijaron en paraformaldehído al 2 % durante 20 minutos, se lavaron tres veces con PBS, se bloquearon en PBS que contenía BSA al 7,5 % y Triton X-100 al 0,1 % durante 1 hora, se lavaron tres veces, se incubaron durante la noche a 4 °C en un agitador de balanceo en anticuerpo anti-TERT (ABCAM 32020 a 1:50 o Rockland 600-401-252S a 1:500) en PBS con BSA al 5 %, se lavaron tres veces, se incubaron durante una hora en anticuerpo secundario, se lavaron dos veces y a continuación dos veces más en un agitador durante 3 minutos cada vez; a continuación se incubaron en 0,1 pg/ml de DAPI durante 3 minutos, y se lavaron cuatro veces en PBS.
[0358] Citometría de flujo.Se tripsinizaron células tratadas con 0,5 a 1,5 pg/ml de ARNmod de TERT y controles 22 horas después del inicio de la transfección, se lavaron, se fijaron en paraformaldehído al 2 %, se permeabilizaron en BSA al 7,5 % con Triton X-100 al 0,1 % durante 20 min, se lavaron tres veces en PBS, se bloquearon en BSA al 7,4 % durante 1 hora, se incubaron en anticuerpo anti-TERT (ABCAM 32020 a 1:50) en PBS con BSA al 5 %, se lavaron tres veces, se incubaron en anticuerpo secundario (1:200) en PBS, después se lavaron tres veces y se resuspendieron en tampón FACS y se analizaron en un citómetro de flujo Accuri C6 (Becton Dickinson). La intensidad media de fluorescencia se calculó como la fluorescencia media de todas las células en muestras tratadas y de control. Los datos se analizaron utilizando el software CFlow Plus.
[0360] RT-PCR:se obtuvo ARN total utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen) y se convirtió a ADNc utilizando el kit de ARN a ADNc de alta capacidad (Invitrogen). El ADNc se amplificó mediante PCR con los siguientes cebadores: hTERT-F: 5'-GCCCTCAGACTTCAAGACCA (SEC ID NO:1)
[0361] 3'-hBB-R: 5'-AGGCAGAATCCAGATGCTCA (SEC ID NO:2)
[0362] GAPDH-F: 5'-GTGGACCTGACCTGCCGTCT (SEC ID NO:3)
[0363] GAPDH-R: 5'-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT (SEC ID NO:4)
[0365] Transferencia Western.La proteína se obtuvo mediante lavado de las células una vez con PBS, seguido del lisado de las células en un tampón RIPA. La proteína se separó en geles NuPAGE Novex Tris-acetato, se transfirió a una membrana de PVDF durante 2 h a 35 V, después se hibridó con antitubulina alfa (Sigma a 1:10,000) y anticuerpo anti-TERT (ABCAM 32020 a 1:1000 o Rockland 600-401-252S a 1:500) durante toda la noche a 4 °C. La detección secundaria se llevó a cabo utilizando anticuerpos infrarrojos (680 nm y 800 nm) (LI-COR) y el equipo de obtención de imágenes Odyssey (LI-COR). Las imágenes fueron analizadas utilizando ImageJ.
[0367] Q-FISH.Las células se incubaron en 0,1 pg/ml de colcemid durante 4 horas antes de la fijación y preparación de extensiones de metafase siguiendo el procedimiento de Lansdorpet al.41. A continuación, se tiñeron las diapositivas utilizando el kit Telomere<p>N<a>FISH Kit/FITC (Dako, Dinamarca), sustituyendo la sonda telomérica etiquetada con AlexaFluor 555 (BioSynthesis, USA) por la sonda del kit. Se fotografió cada célula en un microscopio DeltaVision (Applied Precision, Inc., Washington) utilizando el software SoftWoRx con un objetivo de inmersión en aceite de 60X o 100X a intervalos de 0,2 micras en un rango de 3 micras utilizando una platina motorizada, y se utilizó un software personalizado para identificar la imagen en la que cada punto telomérico estaba enfocado y para integrar su intensidad en esa imagen enfocada. La variación temporal en la intensidad de la iluminación se compensó utilizando el fotosensor DeltaVision, que registró la intensidad de la iluminación de cada imagen, y la variación en la intensidad espacial y la corriente oscura del CCD y el error de lectura se compensó mediante la adquisición de imágenes de campo plano e imágenes de campo oscuro, respectivamente. Por lo menos 15 células en metafase contribuyeron a cada réplica y cada muestra se midió por lo menos por duplicado en por lo menos dos experimentos separados.
[0369] Curvas de crecimiento.Las células se recogieron y contaron en un hemocitómetro, ya que un contador automatizado no podía contar con precisión las células al volverse heterogénea la población con respecto al diámetro al entrar en senescencia replicativa. Se adquirieron imágenes para permitir la medición de los diámetros de las células. Las DP se calcularon como el log2 del cociente entre el número de células al final y al inicio de cada período de cultivo entre pases.
[0371] Estadísticas.Se llevó a cabo un análisis estadístico utilizando Microsoft Excel. Las barras de error representan la media ± e.e.m. Se compararon las longitudes de los telómeros utilizando pruebas T con P<0.05 (bilateral) considerado como estadísticamente significativo.
[0373] Ejemplo 2. Efectos del tratamiento con ARNmod de TERT en células endoteliales humanas
[0375] Los efectos del tratamiento con ARNmod de TERT no se limitaron a las células fibroblásticas. Tal como se representa en la figura 9, las células endoteliales dérmicas microvasculares humanas (HMDEC) muestran curvas de duplicación típicas, con un inicio temprano de la senescencia aproximadamente en el pase n° 12 y con las células completamente senescentes en el pase n° 17. Tal como se representa en la figura 10, el tratamiento de estas células en el pase n° 18 con ARNmod de hTERT de tipo salvaje (barra derecha en cada serie) resulta en la reversión de la senescencia, mientras que el tratamiento de control (barra izquierda en cada serie), o el tratamiento con ARNmod de hTERT mutante (barra del medio en cada serie), no presentó ningún efecto sobre la senescencia celular.
[0377] La figura 11 representa los efectos de diversos tratamientos sobre el crecimiento de las células HMDEC. Específicamente, las células tratadas tres veces con ARNmod de TERT de tipo salvaje (WT) entre el pase n° 10 y el pase n° 11 continuaron creciendo, mientras que las células no tratadas (NT), las células tratadas solo con el portador (CO) y las células tratadas con un TERT catalíticamente inactivo (CI) dejaron de duplicarse.
[0379] La figura 12 representa los resultados de la tinción de p-galactosidasa (bGAL) de HMDEC en el pase n° 14 tras el tratamiento con ARNmod WT y CI. Esta tinción mide la actividad de p-galactosidasa a pH 6, que es una propiedad de las células senescentes que no se observa en las células presenescentes, quiescentes o inmortales. Ver Dimri et al. (1995) Proc. Nat l Acad. Sci. USA 92:9363-7.
[0381] Métodos
[0383] La curva acumulativa de duplicación poblacional de las HMDEC se construyó utilizando un formato de placa de 12 pocillos. Se sembraron aproximadamente 105 células HMDEC en triplicados en cada punto temporal y el recuento de células se realizó el día 4 después de la siembra previa. Tal como se representa en la figura 9, el pase n° 12 se determinó como el punto de inicio temprano de la senescencia de las HMDEC.
[0385] Tal como se representa en la figura 10, se transfectaron aproximadamente 105 HMDEC dos veces cada dos días con 0,75 mg de ARNmod codificante de hTERT-CI, y -WT en presencia de control de solo portador (CO, RNiMAX). El recuento de células se llevó a cabo en los pases n° 19, 20 y 21 cada vez en el día 5 después de la resiembra.
[0386] Para el experimento representado en la figura 11, en el intervalo entre los pases n° 10 y n° 11 (y, tal como se señaló anteriormente, el pase n° 12 corresponde al inicio temprano de la senescencia de las HMDEC), se cultivaron aproximadamente 5*105 células HMDEC por matraz de 75 cm3 en medio EBM-2 complementado con suplemento EGM-2 MV (ambos de Lonza, Walkersville, MD, EE. UU., números de catálogo). CC-3156 y C<c>-4176, respectivamente). Las células microvasculares fueron transfectadas tres veces cada dos días con 5 |jg de ARNmod que codificaban para hTERT-WT (WT) y hTERT-CI (CI) en presencia de matraces de control no tratados (NT) y de solo transportador (CO, RNAiMAX). En cada punto temporal, se sembraron 5x105 células y, a partir del pase n° 11, se llevó a cabo un recuento celular mediante hemocitómetro cinco días después de la resiembra. Para cada punto temporal, cada condición experimental se llevó a cabo por triplicado.
[0388] Para los experimentos representados en la figura 12, aproximadamente 105 de cada uno de HMDEC NT, hTERT-CI y hTERT-WT del pase n° 14 fueron tratados tal como se describe en la figura 10. A continuación, las células se sometieron a un análisis de células senescentes basado en una tinción histoquímica para la actividad de pgalactosidasa a pH 6 utilizando un kit de tinción histoquímica para células senescentes (Sigma, n° de catálogo CS0030). El lado izquierdo de la diapositiva muestra imágenes representativas de células no tratadas (NT) y células tratadas con ARNmod de hTERT-CI (CI) o hTERT-WT (WT). Todas las imágenes se obtuvieron bajo las mismas condiciones de adquisición de imágenes. Cada condición experimental se llevó a cabo por triplicado, y el porcentaje de células positivas para la actividad de p-galactosidasa (tal como se representa en el gráfico) para cada condición se calculó como una media de las células positivas en tres zonas capturadas al azar.
[0390] Ejemplo 3. Caracterización adicional de los efectos del tratamiento con ARNmod de TERT en células humanas
[0392] En el presente ejemplo, el ARNm fue transfectado mediante un lípido catiónico en fibroblastos humanos primarios y mioblastos (figura 13A), células conocidas por poseer una capacidad proliferativa limitada. Webster y Blau (1990) Somat Cell Mol Genet. 16:557-565; Hayflick y Moorhead (1961) Exp Cell Res. 25:585-621; Yakubov et al. (2010) Biochem Biophys Res Commun. 394:189-193. La eficacia de transfección se determinó mediante cuantificación de la fluorescencia de células individuales por citometría de flujo tras la administración de ARNm de GFP, que mostró que la mayoría de las células (>90 %) habían sido transfectadas incluso a concentraciones relativamente bajas de ARNm modificado (0,1 jg/m l) (figura 13B y figura 16A-C). El tratamiento de las células con concentraciones iguales de ARNm exógeno deTERTo ARNm codificante de una forma catalíticamente inactiva (CI) deTERTresultó en la internalización de cantidades similares de ARNm (figura 16D), según mediciones mediante RT-qPCR 24 horas después del primer tratamiento. CI TERT presenta una mutación de sustitución en uno de la tríada de aspartatos coordinantes de metal en el sitio catalítico del dominio de transcriptasa inversa deTERT.Como resultado,CI TERTno puede añadir nucleótidos a los telómeros, pero se mantiene estructuralmente intacto, capaz de unirse al ADN molde, y muestra una estabilidad comparable aTERTde tipo salvaje en lisados de reticulocitos. Wyatt (2009) Structure-Function Analysis of the Human Telomerase Reverse Transcriptase. Ni el tratamiento con ARNm deTERTni deCI TERTafectó a los niveles de ARNm endógeno deTERTen comparación con las células no tratadas, según las mediciones de RT-qPCR (figura 16E). La transfección con 1 jg/m l de ARNm deTERToCI TERTresultó en incrementos equivalentes del 50 % (P<0.05 y <0.01, respectivamente) en la cantidad de proteínaTERTen fibroblastos (figura 13C, panel izquierdo). Wick et al. (1999) Gene. 232:97-106; Ahmed et al. (2008) J Cell Sci.
[0393] 121:1046-1053. La presencia de la proteínaTERTendógena en células con poca actividad de telomerasa endógena es consistente con la abundancia relativa de variantes de procesamiento inactivas deTERTen muchos tipos de células y la extensa regulación inhibitoria postraduccional de la actividad deTERTcomo ha sido informada anteriormente por otros. Yi et al. (2001) Nucleic Acids Res. 29:4818-4825; Cifuentes-Rojas y Shippen (2011) Mutat Res. [publicado en línea antes de la impresión: 18 de octubre de 2011]; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. El tratamiento con cantidades crecientes de ARNmde TERTresultó en un incremento dependiente de la dosis de la expresión de la proteínaTERTmedida en ensayos de células individuales mediante citometría de flujo (figura 13C, panel derecho).
[0395] La actividad de la telomerasa se incrementó transitoriamente.Con el fin de someter a ensayo si la administración de ARNm deTERTmodificado resultaba en la generación de proteínaTERTfuncional, se cuantificó la actividad de la telomerasa utilizando un ensayo TRAP basado en gel. Se detectó actividad de la telomerasa en fibroblastos y mioblastos en todas las dosis de ARNmde TERTsometidas a ensayo (0,25, 0,5, 1,0 y 2,0 jg/ml), y no se detectó en células no tratadas o células tratadas solo con vehículo o ARNm modificado codificante deCI TERT,incluso a la dosis más alta, de 2,0 jg/m l (figura 13D). AunqueTERTrequiere deTERCpara formar un complejo telomérico funcional, la administración deTERTpor sí sola resultó suficiente para incrementar la actividad de la telomerasa, en concordancia con hallazgos previos que indican queTERTcon frecuencia es el factor limitante, ya que el número de copias de ARN deTERCes alto en muchos tipos celulares que carecen de actividad de telomerasa, incluyendo los fibroblastos. Yi et al. (2001) Nucleic Acids Res. 29:4818-4825. Un curso temporal reveló que la actividad de la telomerasa alcanzó su máximo a las 24 horas y volvió a los niveles basales dentro de las 48 horas después de una única transfección. Este marco temporal es coherente con las semividas de las que se informa previamente del ARNm humano deTERT(2-4 h), del ARNm de la p-globina humana (17-18 h: el ARNm exógeno deTERTde los presentes inventores está flanqueado por las UTR 5' y 3' de la p-globina), y de la actividad de la telomerasa en células expuestas a un inhibidor de la síntesis de proteínas (dependiente del tipo de célula, pero normalmente >24 h). Kabnick y Housman (1988) Mol Cell Biol. 8:3244-3250; Holt et al. (1997) Proc Natl Acad Sci U S A. 94:10687-10692; Xu et al. (1999) Br J Cancer. 80:1156-1161.
[0397] Alargamiento de los telómeros.Las longitudes de los telómeros en los fibroblastos no tratados se redujeron con el tiempo (3 meses) tal como se esperaba (62) (figura 14A) y se cuantificaron utilizando dos métodos diferentes. El método de qPCR multiplex monocromático (MMqPCR) se utilizó para evaluar la longitud, y las mediciones se validaron independientemente con un método de qPCR llevado a cabo por SpectraCell Laboratories, Inc. (coeficiente de correlación de 0.97, P<0.001). La administración de ARNmde TERttres veces consecutivas a intervalos de 48 horas en fibroblastos o mioblastos comenzando en la duplicación poblacional (DP) 25 y 6, respectivamente, extendió los telómeros en 0.9±0,1 kb (22±3 %) y 0,7±0,1 kb (12±2 %), respectivamente (figura 14B, C). El tratamiento con solo vehículo o con ARNm de CI TERT no presentó ningún un efecto significativo sobre la longitud de los telómeros en comparación con las células no tratadas. La tasa media de extensión de los telómeros en fibroblastos fue de 135±15 pb/DP.
[0399] Incrementos de la capacidad proliferativa dependientes del tipo de célula.Para someter a ensayo el efecto de la administración de ARNm modificado deTERTy la consecuente extensión de los telómeros sobre la capacidad proliferativa celular, se transfectaron fibroblastos humanos una, dos o tres veces en sucesión. Los tratamientos se administraron a intervalos de 48 horas. Los fibroblastos no tratados, tratados con solo vehículo y tratados con ARNm deCI TERTmostraron un estancamiento equivalente en el número celular después de aproximadamente 50 a 60 DP, mientras que las células tratadas tres veces con ARNm deTERTcontinuaron proliferando durante 28±1,5 DP adicionales, con un incremento total en el número de células de 2,7*108 adicional al de las células no tratadas (figura 14D, panel izquierdo). El efecto fue dependiente de la dosis, y cada tratamiento adicional confería una DP adicional (figura 14D, panel derecho). El incremento progresivo de la capacidad proliferativa fue mayor con el primer tratamiento que con el segundo o tercer tratamientos. Los mioblastos humanos tratados tres veces consecutivas cada 48 horas ganaron 3,4±0,4 DP, lo que equivale a un incremento de 10 veces en el número de células en comparación con los controles no tratados o los tratados con vehículo (figura 14E). Tales diferencias en DP entre mioblastos y fibroblastos no son inesperadas, ya que estudios previos han encontrado efectos limitados similares de la sobreexpresión deTERTa unas pocas DP y han mostrado que esta limitación se debe a una detención del crecimiento mediado por p16 en mioblastos humanos, en contraste con los fibroblastos. Bodnar et al. (1998) Science. 279:349-352; Zhu et al. (2007) Aging Cell. 6:515-523. Tanto en fibroblastos como en mioblastos, ni el vehículo solo ni el ARNm deTERTpresentaron ningún efecto sobre la capacidad proliferativa en comparación con los controles no tratados. Estos datos muestran que la administración de ARNm deTERTmodificado es un método eficaz para incrementar las DP en cultivo. Es importante destacar que todas las células tratadas estudiadas mostraron un incremento significativo en el número de células, pero finalmente alcanzaron una meseta en sus curvas de crecimiento, demostrando la ausencia de inmortalización.
[0401] Reducción transitoria de los marcadores de senescencia.A medida que las poblaciones de fibroblastos dejaron de crecer, mostraron marcadores de senescencia, incluyendo la tinción de p-galactosidasa asociada a senescencia (p-gal) y un tamaño agrandado (figura 15A-C). Cristofalo y Kritchevsky (1969) Med Exp Int J Exp Med. 19:313-320; Dimri et al. (1995) Proc Natl Acad Sci U S A. 92:9363-9367; Cristofalo et al. (2004) Mech Ageing Dev. 125:827-848; Lawless et al. (2010) Exp Gerontol. 45:772-778. Estos cambios se redujeron transitoriamente en los fibroblastos tratados con ARNm deTERTen comparación con células no tratadas y células que recibieron ARNm deCI TERTo solo vehículo. De acuerdo con los hallazgos de otros, no todas las células en las poblaciones que habían entrado en una meseta de crecimiento expresaron p-galactosidasa a niveles detectables. Lawless et al. (2010) Exp Gerontol. 45:772-778; Binet et al. (2009) Cancer Res. 69:9183-9191. Sin embargo, los fibroblastos y mioblastos transfectados con ARNm deTERTexpresaron p-galactosidasa al mismo nivel que las células de control de cada tipo después de que ambas poblaciones alcanzaran una meseta de crecimiento. Estos datos demuestran que las células tratadas con ARNm deTERTeventualmente y de manera predecible dejaron de dividirse y expresaron marcadores de senescencia, y por lo tanto es poco probable que se transformen.
[0403] El presente ejemplo demuestra que la administración transitoria de ARNm deTERTque comprende nucleótidos modificados extiende los telómeros humanos e incrementa la capacidad proliferativa celular sin inmortalizar las células. La tasa de extensión de los telómeros en fibroblastos observada en la presente memoria, de 135±15 pb/DP es comparable a las tasas publicadas utilizando métodos víricos, de 94 a >150 pb/DP (22, 69). El ARNm modificado deTERtextendió los telómeros en fibroblastos en unos pocos días en 0.9±0,1 kb. Se ha informado de que las longitudes de los telómeros de los fibroblastos se acortan a lo largo de la vida humana en aproximadamente 1 a 2 kb de media. Allsopp et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A. 89:10114-10118. De esta manera, el ARNm modificado deTERTresulta eficaz, aunque transitoriamente y sin integrarse, superando las principales limitaciones de la administración de ARNm deTERTexpresado constitutivamente.
[0405] Las células humanas de mayor interés frecuentemente presentan limitaciones de número, incluyendo las células madre para la utilización en experimentación o medicina regenerativa. Este problema se está abordando actualmente mediante diversos métodos, incluyendo la transferencia nuclear somática, los métodos víricos para la administración de genes y la utilización de condiciones de cultivo que reduzcan la tasa de acortamiento de los telómeros. Le et al. (2013) Cell Stem Cell. [publicado en línea previamente a la impresión: 19 de noviembre de 2013]; doi:10.1016/j.stem.2013.11.005; Zimmermann y Martens (2008) Cell Tissue Res. 331:79-90; Mohsin et al. (2013) Circ Res. 113:1169-1179. El tratamiento de ARNm modificado deTERTdescrito en la presente memoria proporciona un complemento o una alternativa ventajosa a estos métodos que es corto, extiende los telómeros rápidamente y no presenta riesgo de mutagénesis por inserción. La cortedad del tratamiento con ARNm deTERTresulta especialmente atractiva, ya que puede evitar la pérdida del fenotipo de células madre que puede ocurrir con el tiempo en cultivo (Gilbert et al. (2010) Science. 329:1078-1081) y acortar la etapa posterior a la reprogramación de la generación de CMPi durante la cual se extienden los telómeros (Wang et al. (2012) Cell Res.
[0406] 22:757-768). Este método de extensión de los telómeros presenta el potencial de incrementar la utilidad de diversos tipos celulares para modelar enfermedades, buscar medicamentos mitigadores y utilizarse en terapias celulares.
[0407] Se ha observado un espectro de efectos sobre la capacidad proliferativa para los tipos celulares sometidos a ensayo, en concordancia con estudios previos que muestran diferentes efectos de la sobreexpresión deTERTsobre la capacidad proliferativa de mioblastos y fibroblastos. Bodnar et al. (1998) Science. 279:349-352; Zhu et al. (2007) Aging Cell. 6:515-523. Además, el nivel de extensión de los telómeros no ha correlacionado con la capacidad proliferativa. De esta manera, el contexto celular determina la eficacia de la expresión deTERTsobre la capacidad proliferativa y es de interés comprender los factores que median en este efecto para superar esta limitación. Entre los factores que se han implicado en la limitación de la capacidad proliferativa de los mioblastos tras la sobreexpresión vírica deTERTse incluyen la detención del crecimiento mediado por p16, el tipo y la cepa celular, y las condiciones de cultivo. Zhu et al. (2007) Aging Cell. 6:515-523. Más generalmente, el efecto puede estar mediado por el daño en el ADN no telomérico, la edad y la integridad mitocondrial. Sahin et al. (2011) Nature.
[0408] 470:359-365; Mourkioti et al. (2013) Nat Cell Biol. 15:895-904; López-Otín et al. (2013) Cell. 153:1194-1217. La ausencia de un incremento en la longitud de los telómeros o en la capacidad proliferativa celular en las células transfectadas con ARNm deCI TERTes consistente con el tratamiento que actúa a través del sitio catalítico deTERTpor el que los nucleótidos son añadidos directamente a los telómeros. Las poblaciones de células tratadas con ARNm deTERTse incrementaron en número exponencialmente durante un período de tiempo, seguido eventualmente de un cese de la expansión y la exposición de marcadores de senescencia en un grado similar a las poblaciones no tratadas, lo que concuerda con la ausencia de inmortalización.
[0410] La naturaleza transitoria y de no integración del ARNm modificado y el incremento finito en la capacidad proliferativa observada en la presente memoria lo hacen más seguro que los vectores víricos o de ADN utilizados actualmente. Además, el método extiende los telómeros rápidamente de manera que el tratamiento puede ser corto, y después del cual se mantiene intacto el mecanismo protector de acortamiento de los telómeros. Este método se puede utilizarex vivopara tratar tipos celulares que median en determinadas afecciones y enfermedades, tales como las células madre hematopoyéticas o progenitoras en casos de inmunosenescencia o insuficiencia medular. Además, el ARNm modificado puede administrarse en determinados tejidosin vivo.Kormann et al. (2011) Nat Biotechnol. 29:154-157. En resumen, el método rápido y seguro de rápida extensión de los telómeros que se describe en la presente memoria conduce a un retraso en la senescencia y a un incremento de la capacidad proliferativa celular sin inmortalizar las células humanas.
[0412] Métodos
[0414] Generación y síntesis de ARNm molde.Para generar ARNm modificado codificante de GFP,TERT,yCI TERT,se insertaron sus respectivos marcos de lectura abiertos (ORF) en el sitio de clonación múltiple (MCS) de un plásmido inicial que contenía el promotor T7, la UTR 5' de la beta-globina humana (HBB), el MCS, la UTR 3' deHBB,una secuencia poli-A de 151 pb, y un sitio de restricción para la linealización con un enzima de clase II siguiendo la secuencia poli-A. Los plásmidos intermedios resultantes fueron secuenciados, linealizados y transcritos utilizando el tampón y la ARN polimerasa del kit MEGAscript T7 (Ambion, Austin, Texas, EE. UU.), y una mezcla personalizada de nucleótidos canónicos y no canónicos (TriLink BioTechnologies, San Diego, CA, EE. UU.) en la que las concentraciones finales de nucleótidos por reacción de transcripciónin vitro(IVT) de 40 pl fueron 7,5 mM para cada uno de adenosín-5'-trifosfato (ATP), 5-metilcitidín-5'-trifosfato (m5C), y pseudouridín-5'-trifosfato (^), 1,5 mM para la guanosín-5'-trifosfato (GTP), y 6 mM para el análogo de caperuza (ARCA) (New England Biolabs, Ipswitch, MA, EE. UU.), o una proporción molar de ATP:m5C:^:GTP:ARCA de 1:1:1:0,2:0.8. Para reducir adicionalmente la posible inmunogenicidad del ARNm relacionada con la fracción portadora de 5'-3P, los productos de la IVT fueron tratados con fosfatasa antártica (New England Biolabs). Se verificó el tamaño y la integridad de los productos de ARNm mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante. El ORF deTERThumano de tipo salvaje utilizado para generar los ADN de molde para la síntesis de ARNm era idéntico a la variante de transcripción 1 deTERthumano del NCBI (secuencia de referencia n° NM_198253.2). El ORF se generó a partir del plásmido pBABE-neo-hTERT (Counter et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A. 95:14723-14728) (plásmido 1774, Addgene, Cambridge, MA, EE. UU.). El plásmido pBABE-neo-hTERT presentaba una mutación no silenciosa en el residuo 516 en el motivo QFP deTERT,un motivo asociado a la multimerización e interacción deTERTcon el ARN deTERC,y de esta manera, para evitar la posibilidad de artefactos debido a esta mutación, los presentes inventores hicieron que la secuencia fuese idéntica a la secuencia de referencia del NCBI mediante la corrección de la mutación con el cambio G516D. El mutanteCI TERTfue generado a partir de la secuencia deTERTmediante la introducción de la mutación D712A.
[0415] Cultivo celular y tratamiento.Los fibroblastos pulmonares fetales humanos primarios MRC5 se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA, EE. UU.) en el pase 14. ATCc no indica el número de DP, por lo tanto, los valores de DP de los presentes inventores citados en la presente memoria se refieren al número de DP después de recibir las células de la ATCC. Las células MRC5 se cultivaron en DMEM con FBS al 20 % y penicilina-estreptomicina. Se cultivaron mioblastos primarios de músculo esquelético de persona de 30 años (Lonza, Allendale, NJ, EE. UU.) en medio SkGM-2 (Lonza) siguiendo las instrucciones del proveedor. Las duplicaciones poblacionales se calcularon como el logaritmo en base 2 del cociente entre las células recogidas y las células sembradas en el pase anterior, y se consideraron cero si se recogían menos células que el número sembrado. Las células fueron transfectadas con ARNm modificado deTERTutilizando Lipofectamine RNAiMax (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.) preparado en medio OptiMEM de suero reducido (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.) y añadido a las células en una proporción de 1:5 v:v con su medio normal para alcanzar las concentraciones finales indicadas en la presente memoria.
[0417] Medición de la actividad de la telomerasa.Veinticuatro horas después del inicio del período de transfección, se recogieron las células y se lisaron en tampón CHAPS. El ensayo TRAP se llevó a cabo utilizando una versión modificada del kit TRAPeze (EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.), en la que los cebadores y la polimerasa se añadieron después, en lugar de antes, de la etapa durante la que se extiende el sustrato artificial de telómero. El programa de PCR fue 94 °C 30 s/59 °C 30 s/72 °C 45 s durante 30 ciclos, y los productos se separaron en un gel de poliacrilamida al 15 % en 0,5X TBE teñido con tinción de ácidos nucleicos en geles SYBR Gold (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.). El curso temporal de la actividad de telomerasa se realizó utilizando el kit TRAPeze RT (EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.).
[0419] Transferencia Western.La proteína se recogió mediante lavado de las células una vez con PBS, seguido del lisado de las células en un tampón RIPA (Cell Signaling Technology, Danvers MA, EE. UU.). La proteína se separó en geles NuPAGE Novex Tris-Acetate (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.), se transfirió a una membrana de PVDF durante 2 h a 35 V, después se hibridó con anti-tubulina a (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) a 1:10,000 y anticuerpo anti-TERT (ABCAM, Cambridge, MA, EE. UU., 32020 a 1:1000; o Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, EE. UU., 600-401-252S a 1:500) y se incubó durante la noche a 4 °C. La detección se llevó a cabo utilizando anticuerpos infrarrojos (680 nm y 800 nm) (LI-COR, Lincoln, NE, USA) y el equipo de obtención de imágenes Odyssey (LI-COR). La intensidad total de cada banda se cuantificó utilizando ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EE. UU.). La intensidad de cada banda deTERTse normalizó respecto a su correspondiente banda de tubulina a.
[0421] Citometría de flujo.Las células se recogieron 24 h después de la transfección con las dosis indicadas (figura 16A-C) de ARNm deTERTy se tiñeron con el anticuerpo anti-TERT (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, EE. UU.; 600-401-252S) a 1:500.
[0423] Medición de la longitud de los telómeros por SpectraCell Laboratories, Inc.Se extrajo ADN genómico usando fenolcloroformo y se cuantificó utilizando el kit de ensayo Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.). El análisis de la longitud de los telómeros se llevó a cabo en SpectraCell Laboratories Inc. (Houston, TX, EE.UU.) utilizando un ensayo de qPCR de alto rendimiento aprobado según CLIA, esencialmente tal como ha sido descrito por Cawthon et al. Cawthon (2002) Nucleic Acids Res. 30(10):e47; Cawthon (2009) Nucleic Acids Res. 37(3):e21. El ensayo determina la longitud relativa de los telómeros mediante la medición del factor por el que la muestra difiere de una muestra de ADN de referencia respecto a su proporción entre el número de copias de repeticiones teloméricas y el número de copias de un gen único (36B4). Se cree que esta proporción (proporción T/S) es proporcional a la longitud media de los telómeros. Todas las muestras se separaron por lo menos por duplicado con por lo menos un control negativo y dos controles positivos de dos longitudes de telómeros conocidas diferentes (alta y baja) y se observó una variación media de hasta el 8 %. Se informó de los resultados como una puntuación telomérica equivalente a la longitud media de los telómeros en kb.
[0425] Medición de la longitud de los telómeros mediante MMqPCR.La longitud de los telómeros se midió utilizando una versión modificada del protocolo MMqPCR desarrollado por Cawthon (Cawthon (2009) Nucleic Acids Res.
[0426] 37(3):e21) con los siguientes cambios: Se añadieron ciclos adicionales de preamplificación por PCR para que el producto telomérico se amplificara antes, ampliando la brecha entre las señales teloméricas y las señales del gen de copia única; se determinó experimentalmente que una mezcla de dos Taq polimerasas resultaba en mejores eficacias de reacción de PCR que cada una por separado; reducir la concentración de verde SYBR de 0,75X a 0,5X resultó en una señal más temprana. El ADN genómico se extrajo de las células utilizando el kit PureGene (Qiagen Germantown, MD, EE. UU.) con digestión de ARNasa, se cuantificó utilizando un NanoDrop 2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y se utilizaron 10 a 40 ng por cada reacción de qPCR de 15 pl realizada por cuadruplicado utilizando un sistema de PCR LightCycler 480 (Roche, Basilea, Suiza). Se incluyó una dilución en serie de ADN de referencia que abarcaba cinco puntos, desde 100 ng/pl hasta 1,23 ng/pl, en cada ensayo a fin de generar una curva patrón necesaria para la cuantificación del ADN de la muestra. Las concentraciones finales de los reactivos en cada reacción de PCR de 15 pl fueron: Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl23 mM, 0,2 mM de cada dNTP, DTT 1 mM, betaína 1M (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE. UU.), 0,5X verde SYBR I (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.), 0,1875 U de Platinum Taq (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.), 0.0625X de Titanium Taq (Clontech), y 900 nM de cada cebador (secuencias de cebador telg, tele, hbgu, y hbgd especificadas en Cawthon (2009) Nucleic Acids Res. 37(3):e21. El programa de ciclado térmico fue el siguiente: 2 minutos a 95 °C; seguido de 6 ciclos de 15 s a 95 °C, 15 s a 49 °C; seguido de 40 ciclos de 15 s a 95 °C, 10 s a 62 °C, 15 s a 72 °C con adquisición de señal, 15 s a 84 °C, y 10 s a 88 °C con adquisición de señal. El software Roche LightCycler 480 se utilizó para generar curvas patrón y para calcular las concentraciones de ADN de telómeros y genes de copia única para cada muestra. Se calcularon las proporciones T/S para cada réplica de muestra, y se calculó la media del resultado para obtener la proporción T/S de la muestra, que se calibró utilizando muestras replicadas con enmascaramiento de células de referencia enviadas a SpectraCell, tal como se ha indicado anteriormente. Los valores relativos de T/S obtenidos de forma independiente, medidos mediante MMqPCR y mediante SpectraCell para las mismas muestras, fueron altamente consistentes (coeficiente de correlación=0.97, P<0.001).
[0428] qPCR con transcripción inversa .Se diseñaron cebadores utilizando Primer3 (Untergasser et al. (2012) Nucleic Acids Res. 40:e115) y se enumeran en la tabla 9, excepto donde se indique lo contrario. Veinticuatro horas después del inicio del tratamiento, las células se lavaron tres veces con PBS antes de recogerlas en tampón RLT (Qiagen, Germantown, MD, EE. UU.). El ARN se convirtió en ADNc utilizando la mezcla maestra High Capacity RNA-tocDNA (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.). El ARNm endógeno deTERTse amplificó utilizando un cebador directo en el marco de lectura abierto deTERTy un cebador inverso en la UTR 3' del ARNm endógeno deTERT.Se amplificó el ARNmTERTexógeno utilizando un cebador directo en el marco de lectura abierta del ARNm deTERTy un cebador inverso en la UTR 3' deHBBpresente en el ARNm deTERTyCI TERTexógenos de los presentes inventores, pero no en el ARNm deTERTendógeno. Se calcularon los niveles relativos utilizando el método de Pfaffl. Los genes de referencia fueron RPL37A (utilizando cebadores especificados en Greber et al. (2011) EMBO J. 30:4874-4884) y GAPDH, ninguno de los cuales mostró un cambio significativo en el valor de Ct en células de control o tratadas.
[0430] Tabla 9: secuencias de cebadores.
[0432] Diana Cebador directo (5-3) Cebador inverso (5-3) Longitud del producto (pb)TERT hTERT (NM 198253.2) 3' UTR de HBB 162 exógeno GTCACCTACGTGCCACTCCT AGCAAGAAAGCGAGCCAAT
[0435]
[0438] Tinción de p-galactosidasa asociada a la senescencia y puntuaciones de tamaño celular.La tinción de p-gal se llevó a cabo utilizando el kit de tinción de p-galactosidasa de senescencia (Cell Signaling Technology, Danvers MA, EE. UU.). Se puntuaron como mínimo 50 células por población por duplicado. Se midió el diámetro celular manualmente después de la tripsinización en una rejilla de hemocitómetro. Cristofalo y Kritchevsky (1969) Med Exp Int J Exp Med. 19:313-320.
[0440] Estadísticas.Se realizaron pruebas T de Student y cálculos del coeficiente de correlación de Pearson utilizando Microsoft Excel. Las barras de error representan la media ± e.e.m.
[0442] Ejemplo 4. Administración de ARNmod de TERT a células mediante electroporación
[0444] Los compuestos ARNmod de TERT asimismo pueden ser administrados en las células mediante electroporación, tal como se ilustra en las figuras 18 a 20, utilizando parámetros de electroporación, incluyendo la concentración de ARNmod de TERT, la forma de la onda de tensión y la geometría del electrodo apropiados para conseguir una eficacia de transfección y viabilidad óptimas en un tipo celular dado. La figura 21 representa la dependencia de la actividad de la telomerasa de la dosis de ARNmod de TERT administrada mediante electroporación.
[0446] Ejemplo 5. Administración de un ARNmod en células sanguíneas humanas
[0448] Se transfectaron células T CD8+ con ARNmod de la siguiente manera. La capa leucocitaria de sangre humana entera centrifugada en medio de gradiente de densidad Lymphoprep (Axis-Shield) para obtener células mononucleares que se lavaron dos veces y de la que se eliminaron a continuación los leucocitos no CD8+ utilizando el kit de células T CD8 humanas Dynabeads Untouched (Life Technologies). Se estimularon las células CD8+ utilizando activador de células T humanas Dynabeads CD3.CD28 (Life Technologies) y se cultivaron durante cuatro días utilizando el medio OpTimizer T-Cell suplementado con 30.000 U/ml de IL-2. A continuación, las células T fueron transfectadas con ARNmod que codificaba GFP nuclear y TERT a una concentración de 50 pg/ml en un volumen de 20 pl de solución Nucleofector P3 que contenía suplemento 1. Las células se analizaron para detectar la fluorescencia y la viabilidad 24 horas después de la transfección. Los resultados de la transfección se muestran en la figura 22. La fluorescencia brillante muestra un alto número de copia, con una eficacia de transfección superior al 90%y alta viabilidad.
[0450] Ejemplo 6. Expresión de la telomerasa en queratinocitos humanos utilizando un ARNmod de telomerasa
[0451] Tal como se representa en la figura 23, la electroporación de queratinocitos humanos con ARNmod de TERT resulta en la expresión de actividad de la telomerasa en las células. Los queratinocitos primarios humanos (Lonza) se suspendieron a una densidad de 3x107 células/ml en medio OptiMEM (Life Technologies) que contenía 50 pg/ml de ARNmod codificante de TERT inactivo catalíticamente (CI) o TERT de tipo salvaje. Se introdujeron 10 pl de la suspensión celular en una cubeta de 1 mm de paso y se electroporaron utilizando un aparato Gene Pulser (BioRad) a 200 V, 1.000 Ohms y 25 microfaradios. Las células se devolvieron inmediatamente al medio KGM-2 (Lonza) y se incubaron durante 24 horas antes de ser recogidas para medir la actividad de la telomerasa utilizando el ensayo TRAPeze en gel (Millipore). Cada reacción TRAP de 25 pl se llevó a cabo utilizando 1 pg de proteína total, con muestras duplicadas calentadas a 85 °C durante 10 minutos para inactivar la telomerasa. Las muestras no tratadas, las muestras solo electroporadas y las muestras de CI TERT sirvieron como controles negativos, y las células 293T y TSR8 sirvieron como controles positivos.
[0453] Ejemplo 6. Expresión de una proteína codificada por ARNmod mediante administración in vivo
[0455] El ARNmod administradoin vivopuede resultar en la expresión de una proteína funcional codificada por ARNmod. Kormann et al. (2012) Nature Biotechnology 29:154-157; Kariko et al. (2012) Molecular Therapy 20:948-93. Lo anterior ha sido confirmado en la presente memoria mediante la formación de complejo de 2 pg de ARNmod que codifica luciferasa con un vehículo lipídico catiónico (TransIT) y la inyección por vía intravenosa en 50 pl de OptiMEM (Life Technologies) en la cola de un roedor. Se extrajo el bazo y se trató con luciferina y analizó para la actividad de luciferasa utilizando un equipo de obtención de imágenes de bioluminiscencia IVIS (Perkin-Elmer). Tal como se representa en la figura 24, se detectó actividad de luciferasa en el sitio de inyección y en el bazo (flechas).
[0456] Aunque se han proporcionado ejemplos específicos, la descripción anterior es ilustrativa y no limitativa. Cualquiera de las características de las formas de realización descritas anteriormente se puede combinar de cualquier manera con una o más características de cualesquiera otras formas de realización. Además, muchas variaciones resultarán evidentes para el experto en la materia a partir de la lectura de la memoria descriptiva. Por lo tanto, el alcance de la invención debe determinarse en referencia a las reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES
1. Método de extensión de los telómerosin vitroo exvivo,que comprende la etapa de:
administrar un compuesto que comprende un ácido ribonucleico sintético que comprende por lo menos un nucleósido modificado y que codifica una transcriptasa inversa de telomerasa a una célula animalin vitrooex vivo;
en el que la transcriptasa inversa de telomerasa se expresa transitoriamente en la célula;
en el que se extiende por lo menos un telómero dentro de la célula; y
en el que por lo menos un nucleósido modificado comprendido en el ácido ribonucleico sintético confiere una inmunogenicidad reducida al ácido ribonucleico sintético.
2. Método según la reivindicación 1, en el que el ácido ribonucleico comprende una caperuza 5', una región no traducida 5', una región no traducida 3' y una cola poli-A; y
(a) la cola poli-A incrementa la estabilidad del ácido ribonucleico, opcionalmente, en el que la cola poli-A es de por lo menos 75 nucleótidos, 100 nucleótidos, 125 nucleótidos o 150 nucleótidos; o
(b) la región no traducida 5' o la región no traducida 3' comprende una secuencia de un ARNm estable o un ARNm que es traducido eficazmente; o
(c) la región no traducida 5' y la región no traducida 3' comprenden ambas una secuencia de un ARNm estable o un ARNm que es traducido eficazmente; o
(d) la caperuza 5', la región no traducida 5' o la región no traducida 3' estabiliza el ácido ribonucleico o incrementa la tasa de traducción del ácido ribonucleico.
3. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que el compuesto está comprendido en una composición, comprendiendo además la composición un vehículo de administración, y en el que el vehículo de administración no es un vehículo de administración vírico.
4. Método según la reivindicación 1, 2 o 3, en el que la célula ha sido recolectada de un animal que sufre o en riesgo de traumatismo físico o estrés físico crónico.
5. Método según la reivindicación 4, en el que el animal sufre o está en riesgo de quemadura.
6. Método según la reivindicación 4, en el que el animal sufre o está en riesgo de fractura ósea.
7. Método según la reivindicación 4, en el que el animal sufre o está en riesgo de lesión por corte o aplastamiento de tejido.
8. Compuesto según la reivindicación 1,2 o 3, en el que la célula es una célula fibroblástica, un queratinocito, una célula endotelial, una célula epitelial o una célula sanguínea.
9. Método según la reivindicación 1, 2 o 3, en el que la célula ha sido recolectada de un animal que sufre o en riesgo de trauma psicológico o estrés psicológico crónico.
10. Método según la reivindicación 1, 2 o 3, en el que el animal es un ser humano.
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