ES2901402T3 - Uso médico relacionado con la extensión telomérica - Google Patents

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ES2901402T3
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John Ramunas
Eduard Yakubov
Helen M Blau
John Cooke
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Leland Stanford Junior University
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Abstract

Un compuesto que comprende un ácido ribonucleico sintético que comprende al menos un nucleósido modificado y que codifica una transcriptasa inversa de telomerasa para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de (a) una enfermedad que implica telómeros cortos seccionados de entre el grupo que consiste en síndrome metabólico, diabetes, úlceras diabéticas, enfermedad cardíaca, cáncer, demencia vascular, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, degeneración macular relacionada con la edad, inmunosenescencia, insuficiencia de médula ósea, úlceras gastrointestinales, cirrosis, hernia, infección, infección crónica, deterioro cognitivo leve o grave, movilidad alterada, osteoporosis, osteoartritis, artritis reumatoide, ansiedad relacionada con la edad, trastornos del equilibrio, acúfenos, parálisis de Bell, cataratas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, abrasión corneal, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad de las arterias periféricas, conjuntivitis, chalazión, deshidratación, depresión, enfisema, enfermedad ocular, retraso del crecimiento, gripe, trastorno de ansiedad generalizada, glaucoma, pérdida de la audición, pérdida del sentido del gusto, pérdida del apetito, dislocación de la cadera, pérdida de la memoria, enfermedad de Parkinson, estenosis espinal, incontinencia urinaria y fractura vertebral; o (b) una enfermedad relacionada con la edad en un sujeto animal que padece o está en riesgo de padecer una enfermedad relacionada con la edad, donde la enfermedad relacionada con la edad implica telómeros cortos; donde la transcriptasa inversa de la telomerasa se expresa de forma transitoria en una célula; y donde al menos un telómero se extiende dentro de la célula; y donde el al menos un nucleósido modificado comprendido en el ácido ribonucleico sintético confiere inmunogenicidad reducida al ácido ribonucleico sintético.

Description

DESCRIPCIÓN
Uso médico relacionado con la extensión telomérica
Antecedentes de la invención
Los telómeros comprenden secuencias de ADN repetitivas en los extremos de los cromosomas lineales que, cuando son lo suficientemente largas,
permiten que cada extremo del cromosoma forme un bucle que protege los extremos para que no actúen como rupturas de ADN monocatenario o bicatenario. Artandi & DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18. Los telómeros se acortan con el tiempo, debido en parte al daño oxidativo y la replicación incompleta del ADN, lo que por último conduce a telómeros críticamente cortos incapaces de formar el bucle protector, la exposición de los extremos del cromosoma, las fusiones cromosoma-cromosoma, las respuestas al daño del ADN y
la senescencia, apoptosis o malignidad. O'Sullivan and Karlseder (2010) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11:171-181; Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707; Artandi and DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18.
El complejo enzimático telomerasa extiende telómeros y comprende dos componentes esenciales: la telomerasa transcriptasa inversa (TERT), y un componente de ARN conocido como componente de ARN telomerasa (TERC). Otros componentes del complejo de telomerasa incluyen las proteínas TCAB1, Diskerina, Gar1, Nhp2, Nop10 y RHAU. Brouilette et al. (2003) Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 23:842-846. La TERT es un componente limitante del complejo de telomerasa y, por lo tanto, los tratamientos que aumentan la TERT pueden aumentar la actividad de la telomerasa. La actividad de la telomerasa se mide normalmente usando el ensayo de protocolo de amplificación de repetición telomérica (TRAP), que cuantifica la capacidad de un lisado celular u otra muestra para extender una secuencia de ADN similar a un telómero sintético.
Como sería de esperar debido a la importancia del mantenimiento de la longitud de los telómeros en la prevención de la senescencia celular y la apoptosis y la disfunción celular resultante, las mutaciones genéticas de TERT y TERC están relacionadas con enfermedades hereditarias fatales de mantenimiento inadecuado de los telómeros, incluidas las formas de fibrosis pulmonar idiopática, disqueratosis congénita y anemia aplásica. Los efectos de la senescencia celular prematura y la apoptosis debido a telómeros cortos en estas enfermedades son devastadores en sí mismos, y pueden verse agravados por un mayor riesgo de cáncer. Artandi and DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18; Alter et al. (2009) Blood 113:6549-6557. Además de abundantes datos correlativos que vinculan telómeros cortos con el cáncer (Wentzensen et al. (2011) Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 20: 1238-1250), la anemia aplásica proporciona algunas de las primeras pruebas directas de que los telómeros críticamente cortos y la inestabilidad cromosómica resultante predisponen a las células a la transformación maligna en humanos (Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707). Hay evidencia de que los telómeros cortos marcan la diferencia entre la distrofia muscular mortal y no mortal (Sacco et al. (2010) Cell 143:1059-1071), y esa extensión de telómero evita la senescencia de células endoteliales (Matsushita et al. (2001) Circ. Res. 89:793-798), que se asocia con aterosclerosis, hipertensión y enfermedad cardíaca (Perez-Rivero et al. (2006) Circulation 114:309-317). Además de estar implicado en estas y otras enfermedades, los telómeros cortos también limitan la amplificación celular para tratamientos celulares y aplicaciones en bioingeniería. Mohsin et al. (2012) Journal of the American College of Cardiology doi:10.1016/j.jacc.2012.04.0474.
Un activador de la telomerasa derivado de productos naturales, TA-65®, se ha vendido comercialmente como un nutracéutico por T.A. Sciences, Inc. Harley et al. (2011) Rejuvenation Research 14:45-56. Este compuesto supuestamente activa el gen hTERT endógeno, lo que activa la expresión de la telomerasa natural. Sin embargo, no está claro cómo este tratamiento supera la regulación normal de la actividad de la telomerasa natural.
Las células humanas con poca o ninguna actividad de telomerasa se han transfectado con vectores que codifican TERT humana (hTERT). Véase, p. ej., Bodnar et al. (1998) Science 279:349-352. Se encontró que las células transfectadas expresan telomerasa, muestran telómeros alargados, se dividen vigorosamente y muestran una senescencia reducida en comparación con las células que carecen de telomerasa, pero la modificación genómica resultante de este tratamiento aumenta el riesgo y limita la utilidad de la estrategia.
Una capacidad limitada para replicarse es una de las características definitorias de la mayoría de las células normales. Un punto final de este procedimiento replicativo limitado es la senescencia, un estado detenido donde la célula sigue siendo viable pero ya no se divide. Las células senescentes a menudo se caracterizan por un patrón alterado de expresión génica, morfología alterada y capacidad reducida o abrogada para realizar sus funciones normales.
El acortamiento de los telómeros juega un papel directo en la senescencia celular en los tejidos animales durante el envejecimiento. Además, hay evidencia acumulada que implica telómeros cortos en una variedad de enfermedades, incluidas las descritas anteriormente. La perspectiva de prevenir la enfermedad por extensión telomérica motiva la necesidad de tratamientos seguros y eficaces para extender los telómeros en las células animales in vivo y/o in vitro. Además, existe la necesidad de extender de forma segura y rápida los telómeros en las células para su uso en tratamiento celular, ingeniería celular y tisular, y medicina regenerativa.
Al mismo tiempo, sin embargo, existe un peligro en la activación constitutiva de la actividad de la telomerasa. De hecho, para las aplicaciones de tratamiento celular, evitar el riesgo de inmortalización celular es de suma importancia. Con este fin, la actividad telomerasa transitoria, en lugar de constitutiva, puede ser ventajosa para la seguridad, especialmente si la actividad telomerasa elevada no solo es breve, sino que extiende los telómeros lo suficientemente rápido como para que no sea necesario repetir el tratamiento de forma continua. Los procedimientos actuales para extender los telómeros incluyen la administración viral de TERT bajo un promotor inducible, la administración de TERT usando vectores basados en adenovirus y virus adenoasociados, y activadores de moléculas pequeñas de la telomerasa. Se recoge el uso de una administración de genes TER basada en vectores víricos adenoasociados (AAV, del inglés adeno-associated viral) en Bernardes de Jesus B, et al.,
EMBO Mol Med. 2012 Aug;4(8):691-704; and Boccardi V & Herbig U., EMBO Mol Med. 2012 Aug;4(8):685-7. Estos procedimientos corren el riesgo de mutagénesis insercional, elevación continua de la actividad de la telomerasa o ambos.
Por lo tanto, existe una fuerte motivación para desarrollar un tratamiento que extienda de forma segura los telómeros para impedir, retrasar, mejorar o tratar potencialmente estas y otras afecciones y enfermedades, para hacer lo mismo para la disminución gradual de la función y forma física y la función mental que acompaña el envejecimiento cronológico, y para habilitar los tratamientos celulares y la medicina regenerativa. Dicha tratamiento sería de gran utilidad en el rejuvenecimiento de todos los animales, incluidos los humanos, las mascotas, el ganado, los animales de zoológico y los animales de especies en peligro de extinción.
Resumen de la invención
La presente descripción aborda estos y otros problemas al proporcionar una alternativa que ofrece los beneficios de un aumento altamente transitorio en la actividad de la telomerasa, combinado con una rápida extensión telomérica de modo que el tratamiento no necesite ser continuo o incluso frecuente, y sin riesgo de mutagénesis de inserción genómica.
La presente invención se define por las reivindicaciones. Por lo general se describen en la presente composiciones, procedimientos y kits para la extensión telomérica mediante la traducción transitoria de la actividad de la telomerasa exógena en una célula. La invención se refiere en una realización a un compuesto que comprende un ácido ribonucleico sintético que comprende al menos un nucleósido modificado y que codifica una transcriptasa inversa de telomerasa para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de (a) una enfermedad que implica telómeros cortos seleccionados de entre el grupo que consiste en síndrome metabólico, diabetes, úlceras diabéticas, enfermedad cardíaca, cáncer, demencia vascular, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, degeneración macular relacionada con la edad, inmunodeficiencia, insuficiencia de médula ósea, úlceras gastrointestinales, cirrosis, hernia, infección, infección crónica, deterioro cognitivo leve o grave, movilidad alterada, osteoporosis, osteoartritis, artritis reumatoide, ansiedad relacionada con la edad, trastornos del equilibrio, acúfenos, parálisis de Bell, cataratas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, abrasión corneal, enfermedad arterial coronaria, enfermedad arterial periférica, conjuntivitis, chalazión, deshidratación, depresión, enfisema, enfermedad ocular, falta de crecimiento, gripe, trastorno de ansiedad generalizada, glaucoma, pérdida de audición, pérdida del sentido del gusto, pérdida del apetito, dislocación de cadera, pérdida de memoria, enfermedad de Parkinson, estenosis espinal, incontinencia urinaria y fractura vertebral; o (b) una enfermedad relacionada con la edad en un sujeto animal que padece o está en riesgo de padecer una enfermedad relacionada con la edad, donde la enfermedad relacionada con la edad implica telómeros cortos; donde la transcriptasa inversa de la telomerasa se expresa de forma transitoria en una célula; y donde al menos un telómero se extiende dentro de la célula; y donde el al menos un nucleósido modificado comprendido en el ácido ribonucleico sintético confiere inmunogenicidad reducida al ácido ribonucleico sintético.
También se describen en esta invención compuestos para la extensión telomérica que comprenden: un ácido ribonucleico sintético que comprende al menos un nucleósido modificado y que codifica una transcriptasa inversa de la telomerasa; donde los telómeros se extienden dentro de una célula tratada con el compuesto.
En algunos casos, la transcriptasa inversa de la telomerasa es una transcriptasa inversa de los mamíferos, las aves, los reptiles o los peces o una variante que retiene la actividad catalítica de la telomerasa y, en casos específicos, es una transcriptasa inversa de la telomerasa humana.
En algunas realizaciones, el ácido ribonucleico comprende una caperuza 5', una región no traducida 5', una región no traducida 3' y una cola de poli-A. La caperuza 5' puede ser no inmunogénica y la caperuza 5' puede haberse tratado con fosfatasa.
En realizaciones preferidas de la invención, la cola de poli-A aumenta la estabilidad del ácido ribonucleico.
En otras realizaciones preferidas de la invención, la región no traducida 5' o la región no traducida 3' comprenden una secuencia de un ARNm estable o un ARNm que se traduce de manera eficiente, o ambas comprenden una secuencia de un ARNm estable o un ARNm que se traduce de manera eficiente.
En aun otras realizaciones preferidas de la invención, la caperuza 5', la región no traducida 5' o la región no traducida 3' estabilizan el ácido ribonucleico o aumentan la tasa de traducción del ácido ribonucleico. En otros casos, la caperuza 5', la región no traducida 5' o la región no traducida 3' modulan la inmunogenicidad del ácido ribonucleico.
En algunos casos, el ácido ribonucleico es un ácido ribonucleico sintético purificado.
En casos preferidos, el ácido ribonucleico sintético se purifica para eliminar componentes inmunogénicos.
En determinados casos específicos, el ácido ribonucleico codifica para una transcriptasa inversa de telomerasa humana, gato, perro, ratón, caballo, vaca, oveja, cerdo, elefante africano, pollo, rata, pez cebra, medaka japonés o chimpancé, o un polipéptido con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la transcriptasa inversa de telomerasa.
La descripción también proporciona composiciones que comprenden un compuesto de la descripción y un componente de ARN de telomerasa, que, en algunos casos, es un componente de ARN de telomerasa de mamíferos, aves, reptiles o peces. En casos más específicos, el componente de a Rn de telomerasa es un componente de ARN de telomerasa humana. En algunas realizaciones, el compuesto comprende en una composición la composición que comprende además un vehículo de administración, donde el vehículo de administración no es un vehículo de administración vírico. En algunos casos, el vehículo de administración es un exosoma, una nanopartícula lipídica, una nanopartícula polimérica, una partícula de lipoproteína natural o artificial, un lípido catiónico, una proteína, un complejo de proteína y ácido nucleico, un liposoma, un virosoma o un polímero. En casos específicos, el vehículo de administración es un lípido catiónico.
En determinados casos, el vehículo de administración no es inmunogénico. En otros casos, el vehículo de administración es parcialmente inmunogénico. En casos particulares, en algunas circunstancias, puede ser deseable que el vehículo retenga algo de inmunogenicidad.
Según otro aspecto de la descripción, se proporcionan procedimientos para extender telómeros, que comprenden la etapa de administrar cualquiera de los compuestos o composiciones descritos a una célula animal, donde al menos un telómero se extiende dentro de la célula.
En algunos casos de procedimiento, la célula tiene al menos un telómero acortado antes de la etapa de administración. En algunas realizaciones, la célula es de o está en un sujeto que padece o está en riesgo de padecer una enfermedad relacionada con la edad, una afección relacionada con la edad o una disminución relacionada con la edad en su función o apariencia.
En algunas realizaciones, la célula es de o está en un sujeto que padece o está en riesgo de padecer cáncer, enfermedad cardíaca, accidente cerebrovascular, diabetes, úlceras diabéticas, enfermedad de Alzheimer, osteoporosis, una disminución en la capacidad o apariencia física, trauma físico o estrés físico crónico, trauma psicológico o estrés psicológico crónico, función inmunitaria reducida, inmunodeficiencia o degeneración macular. En algunos casos, la célula es una célula somática de linaje endodérmico, mesodérmico o ectodérmico, o una línea germinal o célula embrionaria.
En algunos casos, la célula es una célula madre pluripotente inducida o una célula utilizada para producir una célula madre pluripotente inducida.
En algunos casos, la célula es una célula transdiferenciada o una célula utilizada para producir una célula transdiferenciada.
En algunos casos, la célula es una célula aislada, y la etapa de administración no dura más de 48 horas. En otros casos, la célula es una célula aislada, y la etapa de administración dura al menos 2 horas.
En algunos casos, la célula es una célula aislada, y la etapa de administración se realiza no más de cuatro veces. En otros casos, la célula es una célula aislada, y la etapa de administración se realiza al menos dos veces.
En algunos casos, la célula es una célula aislada y el procedimiento comprende además la etapa de medición de la actividad de la telomerasa en la célula. En casos específicos, la etapa de administración aumenta la actividad de la telomerasa en la célula y, en casos aún más específicos, la actividad de la telomerasa aumenta de forma transitoria en al menos un 5 %. En otros casos específicos, la vida media del aumento de la actividad de la telomerasa no es superior a 48 horas.
En algunos casos, el procedimiento comprende además la etapa de medir la longitud del telómero en la célula. En casos específicos, la longitud media de los telómeros se incrementa en al menos 0,1 kb.
En algunos casos, la célula es una célula aislada y el procedimiento comprende además la etapa de medir la capacidad de duplicación de la población en la célula. En casos específicos, la capacidad de duplicación de la población aumenta, en algunos casos al menos en una población.
En casos preferidos, la célula es de o está en un sujeto mamífero, y en incluso casos más preferidos, la célula es de o está en un sujeto humano.
En algunos casos, la célula es una célula aislada, y en otros casos, la célula no es una célula aislada. En algunos casos, la etapa de administración comprende electroporación. En algunos casos, el al menos un telómero se extiende de forma transitoria dentro de la célula.
Según aun otro aspecto de la descripción, se proporcionan kits para extender telómeros en una célula animal, los kits comprenden cualquiera de los compuestos o composiciones anteriores e instrucciones para usar el compuesto o composición para extender telómeros.
En algunos casos, los kits comprenden además materiales de envase. En algunos casos específicos, los materiales de envase son herméticos. En algunos casos específicos, los materiales de envase comprenden un recipiente de lámina metálica.
En algunos casos, los kits comprenden además un desecante, un medio de cultivo o un inhibidor de RNasa.
En algunos casos, la composición es estéril. En algunos casos, el kit comprende un compuesto de la descripción, instrucciones para usar la composición para extender telómeros y un componente de ARN de telomerasa, un vehículo de administración o tanto un componente de ARN de telomerasa como un vehículo de administración.
En aun otro aspecto, la descripción proporciona procedimientos de tratamiento, que comprenden administrar un compuesto o composición de la descripción a un sujeto animal que necesita, o que puede beneficiarse de, la extensión telomérica. El sujeto animal padece o corre el riesgo de padecer una enfermedad o afección resultante de telómeros acortados.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. La transfección de células MRC-5 con un ácido ribonucleico modificado (ARNmod) que codifica TERT, pero no TERT catalíticamente inactiva (CI TERT), aumenta transitoriamente la actividad de la telomerasa. (a) Esquema de la construcción de ARNmod y estrategia utilizada en estos estudios. La construcción de ARNmod codifica TERT humana y tiene UTR 5' y 3' que confieren estabilidad, tal como a partir de ARNm de p-globina. CI TERT tiene una mutación de un único pb. (b) La transfección de ARNmod de TERt o CI TERT da como resultado niveles aumentados de ARNmod de TERT exógena en células tratadas, pero no controles no tratados, por encima de los niveles de ARN de TERT endógena. (c) Los niveles de proteína reconocidos por el anticuerpo anti-TERT son significativamente mayores en células MRC-524 horas después de la transfección con ARNmod que codifica TERT o CI TERT (p < 0,03 o 0,01, respectivamente) que en células no tratadas o solo vehículo. (d) El tratamiento con ARNmod que codifica TERT, pero no CI TERT, provoca un aumento transitorio en la actividad de la telomerasa en células MrC-5.
Figura 2. Uso de exosomas como vehículo de administración para agentes terapéuticos de ácido ribonucleico. Figura 3. Ilustración gráfica del uso de múltiples tratamientos rápidos y transitorios de telomerasa en la extensión telomérica en una célula.
Figura 4. El tratamiento con ARNmod de TERT extiende rápidamente los telómeros en las células MRC-5. (a) Programa de tratamiento y ensayo utilizado en estos estudios. Los tratamientos duraron 5 horas. (b) Imagen de TRF Southern blot (recuadro) y su cuantificación donde la señal quimioluminiscente se normalizó para tener en cuenta el número de sondas por unidad de longitud de telómero, y la intensidad promedio de cada fila de píxeles en cada carril de gel se mostró en un gráfico a continuación con respecto a la longitud del telómero (n = 3 réplicas biológicas para cada tratamiento). (c) Los promedios de las distribuciones de longitud de los telómeros en la figura 4b, que revelan que los telómeros en las células tratadas con ARNmod de TERT son significativamente (p < 0,014) más largos que en los controles no tratados o tratados solo con vehículo. d) La proporción de telómeros más largos que un umbral arbitrario (4,2 kb) es mayor en las células tratadas con ARNmod de TERT que en los controles no tratados y tratados solo con vehículo. (e) Micrografía de fluorescencia representativa de la propagación en metafase de los fibroblastos MRC-5 utilizados en la hibridación cuantitativa in situ (Q-FISH) para comparar las longitudes de los telómeros, mostrando la sonda del telómero (ligera, punteada) y el ADN (sombreado suave). (f) Cuantificación de las mediciones Q-FISH de la longitud del telómero en las células tratadas y de control (n = 15 células para cada una de las dos réplicas biológicas para cada tratamiento), mostrando una rápida extensión telomérica en las células tratadas. (Tener en cuenta que TRF mide la longitud del ADN telomérico y subtelomérico, mientras que Q-FISH mide solo el ADN telomérico, lo que explica las diferencias entre los resultados de Q- FISH y TRF). (g) (i) Curva estándar que relaciona las duplicaciones acumulativas de la población de células MRC-5 después de la recepción del proveedor con la longitud del telómero medida utilizando Q-FISH para cuantificar la fluorescencia total promedio de la sonda del telómero por célula, que es linealmente proporcional a la longitud del telómero. (g) (ii) Cuantificación de la longitud promedio de los telómeros por célula en células MRC-5 tratadas tres veces con ARNmod de TERT en intervalos de 48 horas, tal como se midió usando Q-FISH.
Figura 5. El tratamiento breve con ARNmod de TERT aumenta la capacidad de replicación de, pero no inmortaliza, las células MRC-5 de una manera dependiente de la dosis. (a) Curvas de crecimiento de células tratadas con ARNmod de TERT una, dos o tres veces, o tres veces seguidas por un tratamiento adicional 8 semanas después del primer tratamiento. Los controles comprenden o bien ningún tratamiento, o el tratamiento solo con vehículo o CI TERT cuatro veces. (n = 3 para cada tratamiento). (b) Curvas de crecimiento de células tratadas con ARNmod de TERT y ARN de TERC en una relación molar 1:5 (n = 3). (c) El tratamiento una, dos o tres veces con ARNmod de TERT confiere capacidad de replicación adicional a las células MRC-5 más allá de la de las células no tratadas, de una manera dependiente de la dosis. El aumento incremental de la capacidad proliferativa conferido por el segundo y el tercer tratamiento, administrado a las 48 horas después del primer tratamiento, no es tan grande como el aumento de la capacidad proliferativa conferido por el primer tratamiento; sin embargo, un cuarto tratamiento adicional varias semanas después de los primeros tres tratamientos confiere tanta capacidad proliferativa adicional como el primer tratamiento, lo que indica que el momento de los tratamientos es importante para optimizar la cantidad de capacidad proliferativa conferida por el tratamiento. El tratamiento tres veces con ARNmod DE TERT y ARNmod de TERC juntos en una relación molar 1:5 confiere mayor capacidad proliferativa que el tratamiento tres veces con ARNmod DE TERT solo. El tratamiento con solamente vehículo o ARNmod de Ci TER no confiere capacidad de replicación adicional. (n = 3).
Figura 6. Alta eficiencia de transfección de células MRC-5 tratadas con ARNmod que codifican GFP nuclear (nGFP). (a) Porcentaje de células con fluorescencia más de dos DE por encima de la media de las células no tratadas (n = 10000). (b) Fluorescencia media (n = 10000). (c) Micrografía de fluorescencia de nGFP en células MRC-5 transfectadas, contratinción con DAPI. Figura 7. Dosis-respuesta de la actividad de la telomerasa.
Figura 8. EL tratamiento con ARNmod de TERT retrasa la hinchazón celular en las células MRC-5. (a) Las células MRC-5 en los pasajes tempranos (izquierda) son varias veces más pequeñas que las células en los pasajes posteriores (derecha), como se muestra en las micrografías normales de células PD 2 y PD 53 no tratadas como se ve en un hemocitómetro. (b) Las células MRC-5 de paso temprano (PD 2) y medio (PD 35) muestran poca hinchazón, definida como que tiene un diámetro mayor que 25 micras según se mide visualmente en un hemocitómetro (donde un cuadrado pequeño tiene 50 micras de diámetro), mientras que una fracción significativamente mayor de las células de paso tardío (PD 53) se hinchan. Por el contrario, las células PD 53 que habían sido tratadas con ARNmod de TERT, pero no las tratadas con ARNmod de CI TERT, en PD 40 muestran poca hinchazón.
Figura 9. Curva de crecimiento de las células endoteliales dérmicas microvasculares humanas (HMDEC).
Figura 10. Efecto del tratamiento con ARNmod de TERT en el número de células en HMDEC. CO: tratamiento de control; hTERT-CI: hTERT catalíticamente inactivo; hTERT-WT: hTERT sin mutaciones.
Figura 11. Efecto del tratamiento con ARNmod de TERT sobre el crecimiento de HMDEC. UT: sin tratar; CO: tratamiento de control; CI: hTERT catalíticamente inactivo; WT: hTERT sin mutaciones.
Figura 12. Efecto del tratamiento con ARNmod de TERT sobre la senescencia en HMDEC. NT: sin tratar; hTERT-CI: hTERT catalíticamente inactivo; hTERT-WT: hTERT sin mutaciones.
Figura 13. Aumentos en la actividad de la proteína TERT y la telomerasa después de la administración de ARNm de TERT modificado. (A) Esquema de ARNm modificado que comprende la secuencia codificante de la forma funcional de longitud completa de TERT o una forma catalíticamente inactiva (CI) de TERT, flanqueada por regiones no traducidas (UTR) de HBB y una cola de poli-A de 151 nt, sintetizada usando nucleótidos modificados pseudouridina y 5-metilcitidina. (B) La eficiencia de transfección de mioblastos (n = 2.000) tratados con ARNm modificado de 0,8 mg/ml que codifica GFP medido por citometría de flujo 24 h después de la transfección excedió el 95 % (gráficas adicionales en la figura 16A). (C) Los niveles totales de proteína TERT se midieron mediante inmunoelectrotransferencia cuantitativa (panel C, izquierda; figura 17). Cuantificación de los niveles de proteínaTERT 24 horas después de la transfección con 1 mg/ml de ARNm de TERT o CI TERT (n = 3). La cuantificación de la proteína TERT en respuesta a varias dosis de ARNm se midió a nivel de célula única mediante citometría de flujo (n = 10.000) (panel C, derecha). *p < 0,05, **p < 0,01 en comparación con las células no tratadas. Las barras de error representan s.e.m. (D) Detección de la actividad de la telomerasa en fibroblastos y mioblastos transfectados con 1 mg/ml de ARNm de TERT modificado, medido utilizando el protocolo de amplificación de repetición de telómeros (TRAP). La flecha indica los controles internos para la eficiencia de la PCR.
Figura 14. Aumentos en la longitud del telómero y la capacidad proliferativa después de la administración de ARNm de TERT modificado (ARNmod). (A) Las longitudes teloméricas medias en fibroblastos no tratados disminuyeron con el tiempo en el cultivo según lo medido por MMqPCR y por SpectraCell (coeficiente de correlación 0,97, p < 0,001). El experimento se repitió dos veces con cuatro réplicas técnicas cada una. (B) Longitudes teloméricas medias en fibroblastos transfectados con 1 mg/mll de ARNmod de TERT, ARNm de CI TERT, o vehículo solo, una, dos o tres veces en sucesión en intervalos de 48 h. El experimento se repitió dos veces con cuatro réplicas técnicas cada una. **p < 0,01, ***p < 0,001 en comparación con las células tratadas solo con vehículo. (C) Longitudes teloméricas medias en mioblastos tratados como en (B). El experimento se repitió dos veces con cuatro réplicas técnicas cada una. ***p < 0,001 en comparación con las células tratadas solo con vehículo. (D) Curvas de crecimiento de fibroblastos tratadas como en (B), con flechas verdes que indican los tiempos de tratamiento. Las curvas de crecimiento se repitieron dos veces con cada población cultivada por triplicado. La capacidad de replicación aumentó de una manera dependiente de la dosis (panel derecho). *p < 0,05, **p < 0,01 en comparación con las células tratadas solo con vehículo. (E) Capacidad de proliferación de mioblastos, tratadas como en (B) (flechas verdes). Las curvas de crecimiento se repitieron dos veces, con cada población cultivada por triplicado. Todos los datos se presentan como medios 6 s.e.m.
Figura 15. Reducción transitoria de marcadores asociados a la senescencia después de la administración de ARNm de TERT modificado. (A) Cuantificación de fibroblastos que expresan p-gal después de la transfección modificada de ARNm de TERT tres veces en sucesión en intervalos de 48 h (flechas verdes). Las células de control, que comprenden poblaciones no tratadas, tratadas con ARNm de CI TERC y solamente con vehículo, dejaron de expandirse en PD 53, y la población tratada con ARNmod de TERC dejó de expandirse en PD 80. Cada experimento se llevó a cabo dos veces con >50 células por muestra calificadas manualmente. Las imágenes representativas muestran fibroblastos tratados con ARNm de TERC teñidos con p-gal en PD 53 (parte superior) y PD 80 (parte inferior). La longitud de la escala es de 200 micras.
(B) Cuantificación de la expresión de p-gal en mioblastos tratadas como en (A). Los controles son como en (A). Las poblaciones tratadas con control y ARNmod de TERT dejaron DE expandirse en PD 8 y PD 11, respectivamente. Cada experimento se llevó a cabo dos veces, con >50 células por muestra puntuadas manualmente. Las imágenes representativas muestran mioblastos en PD 2 (superior) y mioblastos tratados con ARNmod de TERC en PD 11 (inferior). (C) Cuantificación de células agrandadas asociadas con senescencia replicativa en fibroblastos transfectados tres veces con ARNm de TERT modificado. Las mesetas de población son como en (A). Los controles son solo para vehículos y están tratados con ARNm de CI TERT. Cada experimento se llevó a cabo dos veces, con >50 células por muestra puntuadas manualmente. Las imágenes representativas muestran fibroblastos no tratados en PD 2 (parte superior) y PD 53 (parte inferior). Todos los datos se presentan como medios 6 s.e.m. La longitud de la escala es de 200 micras.
Figura 16. Transfección de alta eficiencia de ARNm modificado en mioblastos humanos. (A,B) Cuantificación de mioblastos fluorescentes de GFP (n = 2000) transfectados con 0,1-0,8 mg/ml de ARNm modificado que codifica GFP medido por citometría de flujo 24 h después del inicio del tratamiento. (C) Fluorescencia media de mioblastos transfectados con ARNm de GFP modificado en respuesta a dosis en aumento. (D) Cuantificación de ARNmod de TERT exógena en fibroblastos 24 h después de la transfección con 1 mg/ml de ARNmod de CI TERT o TERT, tal como se midió usando RT-qPCR. La relación entre TER y CI TER se calculó utilizando el procedimiento Pfaffl con RPL37A y GAPDH como genes de referencia (n = 3). (E) Cuantificación de ARNmod de TERT endógeno en fibroblastos 24 h después de la transfección con 1 mg/ml de ARNmod de CI TERT o TERT, medido usando qPCR, calculado como en (D). Todos los datos se presentan como medios 6 s.e.m.
Figura 17. Expresión de TERT después de la administración de ARNm modificado. La expresión de proteína TERT en fibroblastos recogidos 24 h después del inicio del tratamiento con ARNm de TERT de 1 mg/ml se midió mediante inmunoelectrotransferencia infrarroja multiplexada. La dilución en serie de la proteína total se utilizó para generar una curva estándar para comparar las cantidades relativas de proteína TERT con los controles. La especificidad del anticuerpo TERT utilizado en esta invención se ha evaluado ampliamente (Wu, 2006).
Figura 18. Gel TRAP que muestra un aumento de la actividad de la telomerasa en células mononucleares electroporadas con ARNmod de TERT en un ajuste de 200 V, 25 uF, 1000 Ohm, en una cubeta de 1 mm con 10 ul de suspensión celular y ARNmod de TERT. El carril de muestra tratado térmicamente contiene un artefacto de dímero de cebador del procedimiento como lo indica la banda fuerte en el cuarto peldaño de la escalera.
Figura 19. Imágenes de microscopio de células mononucleares fluorescentes después de la electroporación con ARNmod que codifica GFP. Figura 20. La electroporación de ARNmod de GFP en leucocitos humanos (células mononucleares) resulta en una alta eficiencia de transfección.
Figura 21. Imagen de gel del ensayo TRAP que muestra un aumento de la actividad de la telomerasa en fibroblastos electroporados con dosis crecientes de ARNmod de TERT.
Figura 22. Micrografías fluorescentes que muestran que los linfocitos T CD8+ se activaron con CD3/CD28 y se electroporaron con ARNmod de GFP expresan la actividad de GFP. Los puntos oscuros son microesferas recubiertas con CD3/CD28.
Figura 23. La electroporación de queratinocitos humanos con ARNmod de TERT da como resultado la expresión de la actividad de la telomerasa.
Figura 24. Expresión de un ARNmod de luciferasa después de la administración in vivo a un roedor.
Descripción detallada de la invención
Los telómeros son secuencias de ADN en los extremos de los cromosomas que protegen los extremos de los cromosomas, pero que se acortan con el tiempo. Los telómeros críticamente cortos pueden hacer que las células dejen de funcionar correctamente o mueran. Los telómeros críticamente cortos también pueden conducir a fusiones cromosómicas que a su vez pueden conducir a cáncer. Incluso en ausencia de una enfermedad específica diagnosticada, los telómeros cortos están implicados en la disminución gradual de la función de la mente y el cuerpo y en la aparición del envejecimiento.
Al mismo tiempo, sin embargo, el acortamiento de telómeros puede desempeñar un papel protector contra el cáncer, por ejemplo, en la situación donde una célula adquiere una mutación que hace que prolifere más rápido que las células normales. En esa situación, el acortamiento de los telómeros evita que la célula prolifere indefinidamente y provoque cáncer. Por lo tanto, no es necesariamente beneficioso extender los telómeros continuamente.
En mamíferos, los telómeros comprenden repeticiones en tándem de la secuencia TTAGGG, y en otros animales tales como aves, reptiles y peces, la secuencia repetida varía. En todos estos tipos de animales, los telómeros son de doble hebra para muchas kilobases (kb). Las longitudes medias de los telómeros difieren entre las especies como se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1: Lon itud media de los telómeros en los fibroblastos adultos de distintas especies
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En los seres humanos, los telómeros comienzan antes del nacimiento con longitudes de 15-20 kb, y al nacer con longitudes de 12-15 kb. Los telómeros se acortan rápidamente durante la infancia, y a continuación en un promedio de 0-100 pb por año en la edad adulta, una tasa que varía en función del tipo de célula, la exposición al estrés psicológico u oxidativo, y otros factores.
Los telómeros forman parte del complejo telómero, que protege los extremos de los cromosomas. El complejo telómero también comprende un conjunto de proteínas denominadas colectivamente Shelterin. Las proteínas del complejo telómero incluyen POT1, TPP1, ATM, DAT, TRF1, TRF2, Rap1, Rif1, TIN2, NBS, MRE17 y RAD50 y sus homólogos en distintas especies de mamíferos. Podlevsky and Chen (2012) Mutat. Res. 730:3-11. En muchas especies el telómero termina en un voladizo 3' de cadena simple que se inserta en la región de cadena doble, en asociación con proteínas del complejo telómero, de manera que forman un bucle dentro del complejo telómero.
Los telómeros se acortan con el tiempo debido al daño oxidativo y al intercambio de cromátidas hermanas, y también debido al problema de replicación final, donde los extremos de los cromosomas no se duplican completamente durante la mitosis. Cuando los telómeros se vuelven críticamente cortos, el complejo telómero ya no es capaz de proteger los extremos del cromosoma, y los extremos del cromosoma se vuelven «sin caperuza». Destapar los extremos del cromosoma puede resultar en fusiones cromosoma-cromosoma, lo que a su vez puede resultar en cáncer. O'Sullivan and Karlseder (2010) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11:171-181; Calado etal. (2012) Leukemia 26:700-707; Artandi and DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18. El destapado también puede dar como resultado que los extremos del cromosoma se reconozcan como ADN dañado, por lo que se activan las respuestas de daño del ADN y se desencadena la apoptosis o senescencia celular. La senescencia es un estado detenido donde la célula permanece viable pero ya no se divide, y las células senescentes normalmente dejan de realizar sus funciones normales, de presenescencia, útiles de manera adecuada o en absoluto. Por lo tanto, el acortamiento de los telómeros conduce a la disfunción del tejido, la pérdida de la capacidad física y la apariencia juvenil, la pérdida de la capacidad mental y la enfermedad en parte debido a la acumulación de células senescentes, y en parte debido a la pérdida de células por apoptosis. De hecho, las personas mayores con telómeros cortos tienen aproximadamente entre un 200 y un 750 % más de probabilidades de desarrollar infarto de miocardio (200 %) (von Zglinicki et al. (2000) Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology 80:1739-1747), demencia vascular (200 %) (Testa et al. (2011) Diabetic Medicine 28:1388-1394, diabetes con complicaciones (400 %) (Blackburn et al. (2010) Cancer Prevention Research 3:394-402, cáncer (Stern and Bryan (2008) Cytogenetic and Genome Research 122:243-254), ictus, enfermedad de Alzheimer, infección (750 %), fibrosis pulmonar idiopática y otras enfermedades. Es probable que las personas con telómeros cortos en un tejido también tengan telómeros cortos en la mayoría de sus otros tejidos, y por lo tanto los telómeros cortos se correlacionen con un mayor riesgo de muchas enfermedades en un individuo. Takubo et al. (2010) Geriatr Gerontol Int. 10 Suppl 1:S197-206; doi: 10.1111/j.1447-0594.2010.00605.x. Los telómeros cortos también limitan la capacidad de replicación celular que a su vez limita los tratamientos celulares y los tratamientos regenerativos. Por el contrario, el aumento de la longitud de los telómeros en ratones con telómeros cortos mediante el uso de procedimientos de ingeniería genética basados en virus rejuvenece a los ratones mediante varios parámetros, que incluyen el grosor y la elasticidad de la piel, la función hepática y el sentido del olfato. Jaskelioff (2011) Nature 469:102-107.
Dado que la telomerasa extiende los telómeros, una estrategia útil para extender los telómeros es aumentar el nivel de actividad de la telomerasa en las células. Se ha recogido que muchos agentes y afecciones aumentan la actividad de la telomerasa en las células, incluidos los agentes y afecciones enumerados en la Tabla 2.
T l 2: E m l n f i n m n n l ivi l l m r
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Sin embargo, los ejemplos de tratamiento de la Tabla 2 no están exentos de efectos no deseados. Por ejemplo, el tratamiento con factores de crecimiento, hormonas o citocinas puede provocar efectos secundarios, puede activar múltiples vías de señalización, puede provocar replicación celular no deseada, puede desencadenar una respuesta inmunitaria y, en general, no son específicos. Los tratamientos genéticos que utilizan plásmidos o virus conllevan un riesgo de modificación genómica por mutagénesis de inserción y un riesgo de cáncer. La transfección con ARN no modificado provoca una fuerte respuesta inmunitaria y no se ha demostrado que extienda los telómeros. Los tratamientos físicos pueden dañar el ADN genómico. Se ha descubierto que el tratamiento con moléculas pequeñas de plantas solo extiende los telómeros en algunos sujetos y células, solo extiende los telómeros muy lentamente y requiere administración crónica, por lo tanto, corre el riesgo de cáncer.
Se ha propuesto que la expresión en células de secuencias de ácido nucleico que codifican hTERT y TERC, y el uso de estos componentes en sí mismos, son útiles en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de enfermedades humanas (ver, p. ej., las patentes estadounidenses n.° 5.583.016 y 6.166.178), pero no se ha demostrado la extensión telomérica de una manera que sea rápida y transitoria, y por lo tanto potencialmente segura por las razones descritas anteriormente. SAbe-Larssen et al. (2002) J. Immunol. Los procedimientos 259:191-203 registraron la transfección de células dendríticas con ARNm que codifica hTERT, y que dichas células adquirieron actividad de telomerasa, pero la transfección utilizó ARNm estándar y dio como resultado una respuesta fuerte de linfocito T citotóxico (CTL) de hTERT en lugar de una extensión telomérica.
Además, todos los tratamientos de moléculas pequeñas existentes son en gran medida ineficaces y lentos (Harley et al. (2011) Rejuvenation Research 14:45-56), principalmente porque actúan a través del componente catalítico de la telomerasa, TERT, que está fuertemente regulado postraduccionalmente, limitando los efectos de los tratamientos existentes a un pequeño subconjunto de células, y excluyendo células en interfase o G0 tales como muchas células madre y progenitoras. Cifuentes-Rojas and Shippen (2012) Mutat. Res. 730:20-27; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003; Cong et al. (2002) Microbiology and Molecular Biology Reviews 66:407-425. Esta regulación está mediada en parte por las interacciones entre los componentes del complejo telomerasa, el complejo telómero y otras moléculas. Por ejemplo, la TER se fosforila o desfosforila en múltiples sitios por múltiples cinasas y fosfatasas, y en algunos sitios, la fosforilación produce un aumento de la actividad de la telomerasa (por ejemplo, fosforilación por Akt), mientras que en otros sitios la fosforilación reduce la actividad de la telomerasa (por ejemplo, fosforilación por Src1 o cAbl). Además, la TERT se ubiquitina o desubiquitina en lugares específicos. TERT también interactúa con otras proteínas en lugares específicos en TERT, y estas interacciones pueden inactivar TERT (por ejemplo, interacciones con Pinx1 o cAbl), o transportar TERT lejos de los cromosomas (por ejemplo, interacciones con CRM1 y Pinx1), lo que impide o retrasa la extensión telomérica. Además, algunas proteínas se unen a los telómeros o al complejo telómero, de manera que bloquean la TERT (por ejemplo, POT1), impiden la extensión telomérica. Además, algunas proteínas ayudan indirectamente a la extensión telomérica, por ejemplo, helicasas y UPF1. Debido a los mecanismos reguladores, la actividad de la telomerasa alcanza su punto máximo durante la fase S del ciclo celular y, por lo tanto, las células que se dividen rápidamente pueden tender a beneficiarse más de los tratamientos que aumentan la actividad de la telomerasa. Sin embargo, a menudo es deseable mantener las células en un estado de división lenta o no división; por ejemplo, las células madre o progenitoras son a menudo de división lenta, y por lo tanto pueden pasar la mayor parte de su tiempo en interfase o G0. Por lo tanto, los tratamientos existentes son lentos e ineficaces en la mayoría de los tipos de células en general, y en todos los tipos de células durante la interfase y G0. Los tratamientos lentos son menos seguros, porque requieren tratamiento durante más tiempo. Dado que el acortamiento de los telómeros proporciona un mecanismo de seguridad protector contra la proliferación celular de escurrimiento, tal como en el cáncer, un tratamiento que extiende los telómeros rápidamente es por lo general más seguro, porque puede administrarse durante períodos cortos de tiempo y con poca frecuencia, lo que permite que el mecanismo de seguridad de acortamiento de los telómeros normal permanezca vigente durante gran parte del tiempo. Por lo tanto, se necesita un procedimiento capaz de superar transitoriamente la regulación de la telomerasa para extender rápidamente los telómeros durante un breve tratamiento.
TERT regula cientos de genes, incluidos los enumerados en la Tabla 3.
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En muchos casos, la modulación de los genes o vías de la Tabla 3 no es deseable porque hacerlo puede provocar cambios no deseados en las células. Por ejemplo, la TERT activa reguladores epigenéticos, que pueden cambiar el fenotipo celular o interferir con los esfuerzos para reprogramar o transdiferenciar células con fines terapéuticos. La TERT activa los potenciadores del crecimiento, pero a menudo no se desea la proliferación, por ejemplo, a menudo las células madre con el potencial más regenerativo son las que se dividen lentamente. La TERT modula los reguladores del destino y la diferenciación celular, lo que puede perjudicar los esfuerzos para diferenciar las células en tipos celulares específicos. La TERT también activa protoncogenes, lo que podría conducir a cáncer. Por lo tanto, es deseable reducir la cantidad de tiempo durante el cual los niveles de TERT se elevan artificialmente, incluyendo cualquier tratamiento que extienda los telómeros usando TERT. Por lo tanto, se necesita un tratamiento que extienda los telómeros solo aumentando transitoriamente los niveles de actividad de la telomerasa.
En algunos tipos de células, se ha demostrado que la TERT afecta a la expresión de otros genes (Young et. al (2003) J. Biol. Chem. 278:19904-19908; Perrault et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 335:925-936), y esto puede no ser deseable en algunos casos. Por lo tanto, se necesita un tratamiento que reduzca la cantidad de tiempo durante el cual se aumentan los niveles de TERT.
Compuestos
La presente descripción aborda estos problemas al proporcionar, en un aspecto, compuestos novedosos para la expresión transitoria de telomerasa exógena en una célula. Los compuestos comprenden un ácido ribonucleico sintético que comprende al menos un nucleósido modificado y que codifica una transcriptasa inversa de telomerasa (TERT), donde los telómeros se extienden dentro de una célula tratada con el compuesto.
Ácidos ribonucleicos sintéticos
Los ácidos ribonucleicos utilizados en la expresión transitoria de TER según diversos aspectos de la presente descripción comprenden un ácido ribonucleico que codifica para una proteína TER. Los ácidos ribonucleicos normalmente comprenden además secuencias que afectan a la expresión y/o estabilidad del ácido ribonucleico en la célula. Por ejemplo, como se muestra en la figura 1a, los ácidos ribonucleicos pueden contener una caperuza 5' y una región no traducida (UTR) al lado 5' y/o 3' de la secuencia codificante. Los ácidos ribonucleicos pueden contener además una cola 3', tal como una cola de poli-A. La cola de poli-A puede, por ejemplo, aumentar la estabilidad del ácido ribonucleico. En algunas realizaciones, la cola de poli-A es de al menos 75 nucleótidos, 100 nucleótidos, 125 nucleótidos o 150 nucleótidos.
En algunos casos, la caperuza 5' del ácido ribonucleico es una caperuza no inmunogénico. En algunas realizaciones, la caperuza 5' puede aumentar la traducción del ácido ribonucleico. En algunos casos, la caperuza 5' se puede tratar con fosfatasa para modular la inmunogenicidad innata del ácido ribonucleico. En algunos casos, la caperuza 5' es un análogo de caperuza antirreverso («ARCA»), tal como un análogo de estructura de caperuza de ARN 3'-O-Mem7G(5')ppp(5')G.
Como es bien sabido en la materia, las características anteriores, u otras, pueden aumentar la traducción de la proteína TERT codificada por el ácido ribonucleico, pueden mejorar la estabilidad del ácido ribonucleico en sí, o pueden hacer ambas. En algunos casos, la 5' UTR y/o la 3' UTR son de un gen que tiene un ARNm muy estable y/o un ARNm que se traduce rápidamente, por ejemplo, a-globina o p-globina, c-fos o virus de grabado de tabaco. En algunos casos, la 5' UTR y la 3' UTR son de genes diferentes, o son de especies distintas a la especie a la que se administran las composiciones. Las UTR también pueden ser ensamblajes de partes de UTR de los ARNm de distintos genes, donde las partes se seleccionan para lograr una cierta combinación de estabilidad y eficiencia de traducción.
Los ácidos ribonucleicos de la descripción son preferentemente ARN modificados por nucleósidos («ARNmod»). La mayoría de las moléculas de ARN maduras en células eucariotas contienen nucleósidos que son versiones modificadas de los nucleósidos de ARN no modificados canónicos, adenina, citidina, guanosina y uridina. Esas modificaciones pueden evitar que el ARN sea reconocido como un ARN extraño. Kariko et al. (2005) Immunity 23:165-175. Los usos de ARN sintéticos modificados en un procedimiento in vitro para reprogramar células se describen en WO 2011/130624. Las moléculas de ARN sintético hechas usando ciertos nucleósidos son mucho menos inmunogénicas que el ARN no modificado. La inmunogenicidad se puede reducir aún más mediante la purificación del ARNmod sintético, por ejemplo, mediante el uso de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los nucleósidos modificados se pueden, por ejemplo, elegir entre los nucleósidos que se muestran en la Tabla 4. Los nucleósidos son, en algunos casos, pseudouridina, 2-tiouridina o 5-metilcitidina. En algunas circunstancias, puede ser deseable que el ARN modificado retenga algo de inmunogenicidad.
T a l 4: N l i m ifi n n r n n l ARN ri ta
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Sin pretender estar limitado por la teoría, la presencia de nucleósidos modificados permite al ARNmod evitar la activación de una respuesta inmunitaria mediada por varios receptores, incluidos los receptores tipo Toll y RIG-1. El ARNmod no inmunogénico se ha utilizado como agente terapéutico en ratones mediante administración tópica. Kormann et al. (2011) Nature Biotechnology 29:154-157. El descubrimiento de ARNm modificado por nucleótidos facilita la administración de proteínas terapéuticas codificadas por ARN, o mutantes de estas, a las células, y la expresión de esas proteínas en las células.
Por consiguiente, en algunos casos, los ácidos ribonucleicos de las composiciones descritas comprenden una pseudouridina, una 2-tiouridina, una 5-metilcitidina o un nucleósido de la Tabla 4. Los ácidos ribonucleicos pueden comprender más de uno de los nucleósidos anteriores o una combinación de los nucleósidos anteriores. Los ácidos ribonucleicos pueden comprender pseudouridina y 5-metilcitidina.
En algunos casos distintos a la invención reivindicada, se puede desear una respuesta inmunitaria al ARNmodificado y el ARN se puede modificar para inducir un nivel óptimo de inmunidad innata. Es posible que no se desee una respuesta inmunitaria al ARNmod, y el ARN puede modificarse para reducir dicha reacción. El ARN se puede modificar para cualquier situación.
Los ácidos ribonucleicos de la presente invención son ácidos ribonucleicos sintéticos. El término «sintético», como se usa en esta invención, significa que los ácidos ribonucleicos se preparan en algunos casos usando las herramientas de biología molecular bajo la dirección de un ser humano, por ejemplo, como se describe a continuación. Los ácidos ribonucleicos sintéticos pueden, por ejemplo, prepararse mediante síntesis in vitro usando extractos celulares o enzimas purificadas y plantillas de ácido nucleico. En algunos casos, los ácidos ribonucleicos sintéticos se pueden preparar mediante síntesis química, ya sea parcial o completamente. De manera alternativa o adicional, los ácidos ribonucleicos sintéticos se pueden preparar en algunos casos mediante expresión modificada en una célula, seguida de interrupción de la célula y al menos purificación parcial del ácido ribonucleico. Un ácido ribonucleico sintético no es, sin embargo, un ácido ribonucleico de origen natural, ya que se expresa en una célula no modificada sin extracción o purificación.
Los ácidos ribonucleicos de la presente descripción se pueden preparar usando una variedad de técnicas estándar, como lo entendería un experto en la materia. En algunos casos, los ácidos ribonucleicos se pueden preparar mediante síntesis in vitro, como se describe, por ejemplo, en las publicaciones de solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0286852 y 2011/0143397. En algunos casos, los ácidos ribonucleicos se pueden preparar mediante síntesis química. En algunos casos, los ácidos ribonucleicos se pueden preparar mediante una combinación de síntesis in vitro y síntesis química. Tal como se describió anteriormente, el término «sintético» deberá entenderse que incluye ácidos ribonucleicos que se preparan ya sea por síntesis química, por síntesis in vitro, por expresión in vivo y al menos purificación parcial, o por una combinación de tales, u otros procedimientos químicos o biológicos moleculares. Los ácidos ribonucleicos de la presente descripción pueden, en algunos casos, purificarse. Como se señaló anteriormente, la purificación puede reducir la inmunogenicidad de los ácidos ribonucleicos y puede ser ventajosa en algunas circunstancias. Véase también la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2011/0143397. En casos preferidos, los ácidos ribonucleicos se purifican por HPLC o por captura y elución de afinidad.
La estructura proteica de TERT incluye al menos tres dominios distintos: una extensión larga en el extremo amino (la extensión del extremo N, NTE) que contiene dominios conservados y una región enlazadora no estructurada; un dominio de transcriptasa inversa catalítica en el centro de la secuencia primaria que incluye siete motivos de RT conservados; y una extensión corta en el extremo carboxilo (la extensión del extremo C, CTE). Autexier and Lue (2006) Annu Rev Biochem. 75:493-517. En algunos casos, el ácido ribonucleico de la presente descripción codifica para un TERT de longitud completa. En algunos casos, el ácido ribonucleico codifica para un dominio de transcriptasa inversa catalítica de TERT. En algunos casos, el ácido ribonucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de TERT.
La TERT codificada por los ácidos ribonucleicos de la presente descripción puede ser una TERT de mamífero, ave, reptil o pez. La TERT puede ser una TERT de mamífero, tal como TERT humana. Meyerson et al. (1997) Cell 90:785-795; Nakamura et al. (1997) Science 277:955-959; Wick et al. (1999) Gene 232:97-106. La secuencia de aminoácidos de dos isoformas TERT humanas están disponibles como secuencias de referencia NCBI: NP_937983.2 y NP_001180305.1. Otras secuencias de aminoácidos de ejemplo no taxativas codificadas de manera útil por los ácidos ribonucleicos de las composiciones de la presente incluyen TERT de gato (secuencia de referencia de NCBI: XP_003981636.1), perro (secuencia de referencia NCBI: Np_001026800.1), ratón (secuencia de referencia NCBI: NP_033380.1), vaca (secuencia de referencia NCBI: NP_001039707.1), oveja (secuencia de referencia NCBI: XP_004017220.1), cerdo (secuencia de referencia NCBI: NP_001231229.1), elefante africano (secuencia de referencia NCBI: XP_003408191.1), pollo (secuencia de referencia NCBI: NP_001026178.1), rata (secuencia de referencia NCBI: NP_445875.1), pez cebra (secuencia de referencia NCBI: NP_001077335.1); medaka japonés (secuencia de referencia NCBI: Np_001098286.1); y chimpancé (secuencias de referencia de NCBI: XP_003950543.1 y XP_003950544.1).
Deberá entenderse que los ácidos ribonucleicos de la presente descripción pueden codificar variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos enumeradas anteriormente, en particular variantes que retienen la actividad catalítica de la telomerasa, que incluyen variantes truncadas. En algunos casos, los ácidos ribonucleicos de las composiciones de la presente codifican una de las secuencias de aminoácidos enumeradas anteriormente o una secuencia con al menos un 95 % de identidad de secuencia con esa secuencia. En algunos casos, los ácidos nucleicos de las composiciones de la presente codifican una de las secuencias de aminoácidos enumeradas anteriormente o una secuencia con al menos un 98 %, 99 %, 99,9 % o incluso mayor identidad de secuencia con esa secuencia.
También deberá entenderse que los ácidos ribonucleicos de la presente pueden corresponder a las secuencias génicas naturales que codifican para las proteínas TERT mencionadas anteriormente o pueden corresponder a variantes que son posibles debido a la redundancia del código genético, como lo entendería un experto en la materia. En algunos casos, la selección de codones se puede optimizar para optimizar la expresión de proteínas utilizando algoritmos y procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Fath et al. (2011) PLoS ONE 6:3.
Composiciones
En otro aspecto, la presente descripción proporciona composiciones para la extensión telomérica en una célula, donde las composiciones comprenden un compuesto de la descripción, tal como se describió anteriormente, y un componente adicional. En algunos casos, las composiciones comprenden además un componente de ARN de telomerasa (TERC). (Véase también la Tabla 6 a continuación). En algunas realizaciones, las composiciones comprenden además un vehículo de administración.
Vehículos de administración
Como se acaba de señalar, las composiciones de la presente descripción pueden comprender además un vehículo de administración para el ácido ribonucleico. El vehículo de administración puede, en algunos casos, facilitar el direccionamiento y la absorción del ácido ribonucleico de la composición a la célula diana. En particular, las composiciones de la presente descripción pueden comprender cualquier vehículo de administración de genes conocido en el campo, por ejemplo, nanopartículas, liposomas, partículas balísticas de pistola de genes, virus, lípidos catiónicos, productos comerciales, tales como Lipofectamine® RNAiMax u otros vehículos. El vehículo de administración puede ser un exosoma, una nanopartícula lipídica, una nanopartícula polimérica, una partícula de lipoproteína natural o artificial, un lípido catiónico, una proteína, un complejo de proteína-ácido nucleico, un liposoma, un virosoma o un polímero. El vehículo de administración puede ser una formulación de lípidos catiónicos. No se prefiere la administración viral, que explícitamente no aceptada la invención reivindicada, ya que puede conducir a mutagénesis de inserción.
El vehículo de administración puede ser un exosoma, una nanopartícula lipídica o una nanopartícula polimérica. En casos altamente preferidos, el vehículo de administración es un exosoma. Los exosomas son vesículas de bicapa lipídica de origen natural de 40-100 nm de diámetro. Los exosomas contienen un conjunto de proteínas específicas, incluyendo las proteínas de membrana Lamp-1 y Lamp-2, que son en particular abundantes. Lakhal and Wood (2011) BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology 33:737-741. En 2007, se descubrió que los exosomas eran portadores naturales de ARN y proteína, incluidos más de 1.300 tipos de ARNm y 121 tipos de microARN no codificante. Los exosomas también pueden transmitir ARNm entre especies: la exposición de células humanas a exosomas de ratón que transportan ARNm de ratón da como resultado la traducción en las células humanas del ARNm de ratón.
Como vehículos de administración de ARN, proteína o ADN, los exosomas tienen una serie de ventajas sobre los vehículos alternativos. Específicamente, los exosomas se pueden generar a partir de las propias células de un paciente, haciéndolas no inmunogénicas; por lo tanto, no son atacadas por anticuerpos, complemento, factores de coagulación u opsoninas. Además, los exosomas se pueden cargar con ácidos nucleicos por electroporación, y son vehículos de origen natural que transportan ARNm y proteína entre células humanas. Los exosomas protegen su carga de ARN y proteínas durante el transporte, y la carga se entrega directamente en el citosol. Pueden extravasarse del torrente sanguíneo a los tejidos extravasculares, incluso cruzando la barrera hematoencefálica, y pueden ser la diana. Además, los exosomas evitan acumularse en órganos no dirigidos, tales como, por ejemplo, el hígado. Por lo tanto, los exosomas se pueden utilizar como «liposomas» derivados de células para administrar ARNm de terapéutico u otra carga en el tratamiento de la enfermedad. Mizrak et al. (2013) Molecular Therapy 21:101-108; doi:10.1038/mt.2012.161. En la figura 2 se muestra una ilustración gráfica de un exosoma que administra un ARNm a una célula. Véase también van den Boorn et al. (2011) Nature Biotechnology 29:325-326.
Se cree que la mayoría de los tipos de células son capaces de generar exosomas, y los exosomas se encuentran en la mayoría de los fluidos biológicos, incluidos sangre, saliva, orina, líquido cefalorraquídeo, leche materna y líquido amniótico. Los exosomas son producidos por la mayoría de los tipos celulares, en distinta abundancia. Los exosomas abundantes, desprovistos de activadores de linfocitos T, pueden derivar de células dendríticas inmaduras, que están presentes en la sangre humana. O'Doherty et al. (1994) Immunology 82:487-493. Los exosomas también se pueden producir artificialmente, por ejemplo, mediante la combinación de proteínas exosómicas recombinantes con lípidos y fosfolípidos, tales como los que se encuentran en las membranas exosómicas. De manera alternativa, los exosomas se pueden construir mediante autoensamblaje in vitro de liposomas con un subconjunto de proteínas de superficie exosómica.
El potencial de administración de fármacos de los exosomas se demostró por primera vez en 2011. Alvarez-Erviti et al. (2011) Nature Biotechnology 29:341-345. Específicamente, los exosomas se recolectaron de células dendríticas modificadas genéticamente para expresar una proteína de fusión Lamp2B fusionada a un ligando dirigido a 28 a.a. de glicoproteína del virus de la rabia (RVG), a continuación se electroporó ARNip en los exosomas y se inyectaron los exosomas en ratones inmunocompatibles con los ratones de los que obtuvieron las células dendríticas. Por lo tanto, los exosomas eran autólogos y no generaron una respuesta inmunitaria, según lo medido por los niveles de IL-6, IP-10, TNF-a e IFN-a. Además, las dosis repetidas durante un mes provocaron respuestas similares, lo que demuestra que tampoco hubo respuesta inmunitaria adaptativa.
Como se describió anteriormente, los exosomas pueden ser autólogos y, por lo tanto, tener baja inmunogenicidad. Dado que el ARNmod también tiene baja inmunogenicidad, se prefiere en particular la combinación de ARNmod como el ácido ribonucleico y un exosoma como el vehículo de administración en las composiciones de la presente descripción. En estos casos, la descripción proporciona, por lo tanto, una nueva forma de administrar ARNm o ARNmod a células o tejidos, utilizando exosomas. Dicha administración proporciona un procedimiento útil para aumentar temporalmente el nivel de cualquier proteína en una célula in vivo usando ARN administrado en exosomas mediante inyección intravenosa o tópica, y en particular en la administración de un ARN que codifica TERT. Por consiguiente, los vehículos de suministro de las composiciones de la presente pueden ser no inmunogénicos. En algunas circunstancias, sin embargo, puede ser deseable que el vehículo retenga algo de inmunogenicidad.
Componentes adicionales
Las composiciones descritas en esta invención pueden comprender además componentes adicionales que mejoran la administración de la composición a la célula diana, mejoran la extensión telomérica dentro de la célula o ambos. Por ejemplo, las composiciones pueden comprender además uno o más de los compuestos y condiciones de la Tabla 2. Tal como lo entendería un experto en la materia, las combinaciones de ingredientes activos a menudo muestran efectos sinérgicos sobre una actividad deseada, tal como, por ejemplo, la expresión transitoria de la actividad de la telomerasa exógena en una célula, y se entiende que dichas combinaciones se encuentran dentro del alcance de la descripción. Los ejemplos adicionales de proteínas que se pueden incluir dentro de las composiciones de la presente descripción se enumeran en la Tabla 5. Deberá entenderse que las composiciones podrían incluir las propias proteínas, o secuencias de ácido nucleico, preferentemente ARN o ARNmod, que codifican estas proteínas, o proteínas con alta identidad de secuencia que retienen la actividad de la proteína enumerada.
T l : Pr ín mini r f rm il n m in i n n TERT
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Otros ejemplos de agentes que pueden incluirse de forma útil dentro de las composiciones de la presente descripción se enumeran en la tabla 6.
T l : r n mini r f rm il n m in i n n TERT
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Dado que la TERT es más activa durante determinadas fases del ciclo celular, las composiciones de la presente descripción también pueden incluir opcionalmente uno o más activadores transitorios de la proliferación celular, con el fin de mejorar la eficacia del tratamiento con TERT. Dichos agentes pueden incluir, por ejemplo, un agente de iARN que reduce transitoriamente las cantidades de inhibidores del ciclo celular tales como Rb o P19/Arf en la célula. Otros activadores transitorios de la proliferación celular pueden incluirse útilmente en las composiciones de la presente, como lo entendería un experto en la materia.
Procedimientos de extensión telomérica y procedimientos de tratamiento
En otro aspecto, la presente descripción proporciona procedimientos para extender telómeros, que comprenden la etapa de administrar cualquiera de los compuestos o composiciones descritos anteriormente a una célula con telómeros acortados, donde los telómeros se extienden dentro de la célula. La presente descripción también proporciona procedimientos de tratamiento, que comprenden la etapa de administrar cualquiera de los compuestos o composiciones descritos anteriormente a un sujeto animal que necesita, o que puede beneficiarse de, la extensión telomérica.
Los compuestos o composiciones se pueden administrar a una célula, donde la célula es una célula aislada o es parte de un cultivo celular, un cultivo de tejido aislado, un órgano aislado o similares (es decir, la administración es in vitro). Los compuestos o composiciones se pueden administrar sin aislar la célula o células, el tejido o el órgano del sujeto (es decir, la administración es in vivo). El compuesto o composición se puede administrar a todas, o casi todas, las células en el cuerpo del sujeto. El compuesto o composición se puede administrar a una célula o tejido específico en el cuerpo del sujeto.
El sujeto puede ser un mamífero, un pájaro, un pez o un reptil. El sujeto puede ser un mamífero y puede ser un ser humano. En otros casos, el sujeto puede ser un animal doméstico, un animal de zoológico, un animal de ganado o un animal de especie en peligro de extinción. Los ejemplos de especies de la presente se enumeran en la Tabla 7.
T l 7: E i nim l i .
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Para aplicaciones in vitro, los compuestos o composiciones se pueden administrar usando cualquier técnica adecuada, como lo entenderían los expertos en los campos de biología celular, cultivo celular, cultivo tisular, cultivo de órganos o similares. Para aplicaciones in vivo, los compuestos o composiciones se administran útilmente mediante inyección, aplicación tópica, inhalación o cualquier otra técnica de administración adecuada, tal como entenderían los expertos en la técnica médica o similares.
Tal como se describió anteriormente, las células tratadas de manera útil según los procedimientos de la descripción incluyen células, ya sea en un sujeto (para administración in vivo) o de un sujeto (para administración in vitro), que pueden beneficiarse de la extensión telomérica. Dado que los telómeros cortos afectan a casi todos los tipos de células en la mayoría de los animales, la extensión telomérica puede beneficiar a la mayoría de los animales. Un tratamiento de extensión telomérica que es transitorio y breve tiene el potencial de ser seguro, como se describió anteriormente. Por lo tanto, la extensión telomérica usando un tratamiento transitorio como se describe en esta invención puede ser útil en todos o la mayoría de los individuos ya sea como una medida preventiva, por ejemplo, para prevenir o retrasar la aparición de las muchas enfermedades y afecciones donde los telómeros cortos están implicados, o como un tratamiento para esas enfermedades y afecciones. El tratamiento puede beneficiar a sujetos en riesgo de enfermedades o afecciones relacionadas con la edad, o que ya están sufriendo de dichas enfermedades, y también puede beneficiar a sujetos que han experimentado, están experimentando o están en riesgo de experimentar trauma físico o estrés físico crónico tal como ejercicio duro o trabajo manual, o trauma psicológico o estrés psicológico crónico, ya que todas estas afecciones provocan acortamiento de telómeros; el estrés físico o trauma requiere división celular para reparar el daño resultante, lo que acorta los telómeros, y estas afecciones también pueden provocar estrés oxidativo, que también acorta los telómeros. Dichas enfermedades y afecciones incluyen, por ejemplo, síndrome metabólico, diabetes, úlceras diabéticas, enfermedad cardíaca, muchas formas de cáncer, demencia vascular, Alzheimer, apoplejía, degeneración macular relacionada con la edad, inmunosenescencia, insuficiencia de médula ósea, úlceras gastrointestinales, cirrosis, hernia, infección tal como neumonía secundaria a la función inmunitaria alterada, infección crónica, deterioro cognitivo leve o grave, movilidad alterada, osteoporosis, osteoartritis, artritis reumatoide, ansiedad relacionada con la edad, trastornos del equilibrio, acúfenos, parálisis de Bell, cataratas, EPOC, abrasión corneal, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad de las arterias periféricas, conjuntivitis, chalazión, deshidratación, depresión, enfisema, diversas enfermedades oculares, retraso del crecimiento, gripe, trastorno de ansiedad generalizada, glaucoma, pérdida de audición, pérdida del sentido del gusto, pérdida del apetito, dislocación de cadera, pérdida de memoria, enfermedad de Parkinson, estenosis espinal, incontinencia urinaria, fractura vertebral y otras.
Las células tratadas de manera útil según los procedimientos de la presente también pueden incluir células en o desde un sujeto que padece una enfermedad o afección relacionada con la edad o que está en riesgo de padecer dicha enfermedad o afección. Dichas enfermedades y afecciones relacionadas con la edad pueden incluir enfermedades genéticas donde los genes que codifican componentes del complejo de telomerasa o complejo telómero están mutados, lo que conduce a telómeros cortos. Dichas enfermedades incluyen, por ejemplo, formas de fibrosis pulmonar idiopática, disqueratosis congénita y anemia aplásica.
Por lo tanto, en el caso de enfermedades genéticas, las composiciones pueden incluir además ácidos nucleicos adicionales, tales como las versiones funcionales normales de las secuencias codificantes de los genes que se ven afectados por dichas enfermedades, por ejemplo, DKC1, TINF2, NOP10, NHP2, TERC u otros genes. Los ejemplos de dichos genes se enumeran en la Tabla 8. Véase también Armanios (2009) Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 10: 45-61.
Tabla 8: Genes relacionados con enfermedades relacionadas con la edad.
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Además, el tratamiento puede beneficiar a sujetos que padecen, o están en riesgo de padecer, otros tipos de enfermedades genéticas en las cuales los telómeros cortos pueden desempeñar un papel, tal como, por ejemplo, distrofia muscular. En tales enfermedades, la necesidad de replicación celular para abordar el problema provocado por la mutación genética acorta los telómeros más rápidamente de lo normal, lo que resulta en un acortamiento de telómeros más rápido de lo normal, que a su vez agota la capacidad de replicación de las células, lo que conduce a disfunción tisular, síntomas exacerbados o adicionales, discapacidad y, a menudo, muerte. Además, varios tipos de cáncer pueden prevenirse o retrasarse mediante el tratamiento con compuestos de la descripción y, de hecho, se cree que las fusiones cromosoma-cromosoma provocadas por telómeros críticamente cortos son una causa de cáncer. Los telómeros también se pueden alargar selectivamente en células sanas en un individuo, sin alargar los telómeros en células cancerosas, lo que puede permitir que se usen los compuestos, composiciones y procedimientos instantáneos, por ejemplo, para alargar los telómeros del sistema inmunitario para aumentar su capacidad de combatir un cáncer. Además, las células del sistema inmunitario se pueden recoger de un individuo para el tratamiento usando la descripción ex vivo seguida de reintroducción en el individuo.
Las células tratadas según los procedimientos de la presente pueden ser de sujetos donde aún no se manifieste ningún estado de enfermedad pero donde el sujeto esté en riesgo de una afección o enfermedad que involucre telómeros cortos, o donde las células contengan telómeros acortados. La enfermedad relacionada con la edad puede ser simplemente la vejez. Los tratamientos descritos en esta invención también se pueden usar como ayuda cosmética, para prevenir, retrasar o mejorar el deterioro relacionado con la edad en la apariencia de la piel, el cabello, la estructura ósea, la postura, la claridad ocular u otros rasgos que disminuyen con el envejecimiento. Por ejemplo, los tratamientos pueden usarse para ayudar a mantener la elasticidad, el grosor, la suavidad y la apariencia de la piel, ya que la extensión telomérica mejora estos parámetros. En casos de trauma físico tal como una fractura ósea o una lesión o quemadura por aplastamiento o corte de tejido, la descripción se puede usar para aumentar las longitudes de los telómeros en células que participan en la cicatrización del trauma, para aumentar su capacidad de replicación. En los casos de estrés físico crónico, que provoca el acortamiento de los telómeros, el tratamiento con la descripción puede alargar los telómeros en las células afectadas aumentando su capacidad de replicación y capacidad para reparar el daño tisular. Dado que el acortamiento de los telómeros se acumula durante generaciones, por ejemplo, en humanos con haploinsuficiencia de componentes de la telomerasa como hTR o hTERT, Armanios (2009) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 10:45-61, los tratamientos de la presente descripción se pueden aplicar a células de línea germinal tales como óvulos, esperma o sus precursores, o a óvulos o embriones fertilizados, por ejemplo, durante procedimientos de fertilización in vitro. Los tratamientos también pueden ser útiles para ayudar a otros tratamientos de distintas enfermedades o afecciones, por ejemplo, la transdiferenciación de células in vivo. Los procedimientos de tratamiento también pueden ser útiles antes o durante la cirugía o quimioterapia, o radioterapia, para aumentar la capacidad de las células de replicarse para reparar el daño resultante de estos procedimientos.
Los procedimientos también pueden ser útiles para tratar células in vitro para diversas aplicaciones, que incluyen tratamiento celular autólogo o heterólogo, bioingeniería, ingeniería tisular, crecimiento de órganos artificiales, generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y diferenciación, desdiferenciación o transdiferenciación celular. En estas aplicaciones, se puede requerir que las células se dividan muchas veces, lo que puede conducir a la pérdida de la longitud del telómero, que se puede contrarrestar mediante la descripción antes, durante o después de la aplicación.
Además, varios tipos de cáncer se pueden considerar enfermedades relacionadas con la edad, en particular cuando las células cancerosas contienen telómeros cortos. En algunos casos, las células tratadas según los procedimientos de la presente son de sujetos donde aún no se manifiesta ningún estado de enfermedad pero donde las células contienen telómeros acortados. La enfermedad relacionada con la edad puede ser simplemente la forma y función alterada normalmente asociada con la edad cronológica en humanos.
Los compuestos o composiciones administrados útilmente por las células de la presente descripción según los procedimientos de la presente incluyen células de cualquier tejido o tipo celular que puede sufrir los efectos de telómeros acortados o que de alguna manera se pueden beneficiar del alargamiento de los telómeros de la célula. Las células pueden incluir células somáticas o células germinales, así como células madre y otras células progenitoras y/o células indiferenciadas. Las células pueden incluir células tumorales y células no tumorales.
Los ejemplos de composiciones o compuestos administrados de forma útil según los procedimientos de la presente incluyen células que se derivan principalmente del endodermo, células que se derivan principalmente del ectodermo y células que se derivan principalmente del mesodermo. Las células derivadas principalmente del endodermo incluyen, por ejemplo, células epiteliales secretoras de exocrina y células secretoras de hormonas. Las células derivadas principalmente del ectodermo incluyen, por ejemplo, células del sistema integumentario (p. ej., células epiteliales queratinizantes y células epiteliales de barrera estratificadas húmedas) y el sistema nervioso (p. ej., células transductoras sensoriales, células neuronales autónomas, células de soporte de órganos sensoriales y neuronas periféricas, neuronas del sistema nervioso central y células gliales y células del cristalino). Las células derivadas principalmente del mesodermo incluyen, por ejemplo, células de metabolismo y almacenamiento, células de función de barrera (por ejemplo, células del pulmón, intestino, glándulas exocrinas y tracto urogenital), células de matriz extracelular, células contráctiles, células sanguíneas y del sistema inmunitario, células germinales, células de Sertoli y células intersticiales. Por consiguiente, en algunos casos de los procedimientos de la presente, la célula a la que se administra la composición es una célula somática de linaje endodérmico, mesodérmico o ectodérmico. En algunos casos, la célula es una célula de línea germinal o una célula embrionaria.
Ejemplos específicos de células a las que se puede administrar un compuesto o composición según los presentes procedimientos incluyen, p. ej., células mucosas de glándulas salivales, células serosas de glándulas salivales, células de glándulas de von Ebner en lengua, células de glándulas mamarias, células de glándulas lagrimales, células de glándulas ceruminosas en oído, células oscuras de las glándulas sudoríparas ecrinas, células claras de las glándulas sudoríparas ecrinas, células de las glándulas sudoríparas apocrinas, glándulas de Moll en el párpado, células de las glándulas sebáceas, células de la glándula de Bowman en la nariz, células de la glándula de Brunner en el duodeno, células de las vesículas seminales, células de la glándula prostática, células de la glándula bulbouretral, células de la glándula de Bartholin, glándula de las células de Littre, células del endometrio del útero, células caliciformes aisladas de los tractos respiratorio y digestivo, células mucosas del revestimiento del estómago, células cimógenas de la glándula gástrica, células oxínticas de la glándula gástrica, células acinares pancreáticas, células de Paneth del intestino delgado, neumocitos del pulmón tipo II, células claras del pulmón, células de la pituitaria anterior (p. ej., somatotropas, lactotropas, tirotropas, gonadotropas y corticotropas), células de la pituitaria intermedia (p. ej., las que secretan la hormona estimulante de los melanocitos), células neurosecretoras magnocelulares (p. ej., las que secretan oxitocina o vasopresina), células del tracto intestinal y respiratorio (p. ej., las que secretan serotonina, endorfina, somatostatina, gastrina, secretina, colecistoquinina, insulina, glucagón o bombesina), células de la glándula tiroidea (p. ej., células epiteliales tiroideas y células parafoliculares), células de la glándula paratiroidea (p. ej., células principales paratiroideas y células oxifílicas), células de la glándula suprarrenal (p. ej., células cromafines y células secretoras de hormonas esteroideas tales como mineralcorticoides y glucocorticoides), células de Leydig de los testículos, células de la teca interna del folículo ovárico, células del cuerpo lúteo del folículo ovárico roto, células de luteína de la granulosa, células de luteína de la teca, células yuxtaglomerulares, células de la mácula densa del riñón, células peripolares del riñón, células mesangiales del riñón, queratinocitos epidérmicos, células basales epidérmicas, queratinocitos de las uñas de los dedos de las manos y los pies, células basales del lecho ungueal, células del tallo piloso medular, células del tallo piloso cortical, células del tallo piloso cuticular, células de la vaina de la raíz pilosa cuticular, células de la vaina de la raíz pilosa de la capa de Huxley, células de la vaina de la raíz pilosa de la capa de Henle, células de la vaina de la raíz pilosa externa, células de la matriz pilosa, células epiteliales superficiales del epitelio escamoso estratificado de la córnea, lengua, cavidad bucal, esófago, canal anal, uretra distal y vagina, células basales del epitelio de la córnea, lengua, cavidad bucal, esófago, canal anal, uretra distal y vagina, células del epitelio urinario (p. ej., que recubren la vejiga urinaria y los conductos urinarios), células ciliadas internas auditivas del órgano de Corti, células ciliadas externas auditivas del órgano de Corti, células basales del epitelio olfatorio, neuronas sensoriales primarias sensibles al frío, neuronas sensoriales primarias sensibles al calor, células de Merkel de la epidermis, neuronas receptoras olfativas, neuronas sensoriales primarias sensibles al dolor, células fotorreceptoras de la retina en el ojo (p. ej., células bastón fotorreceptoras, células cónicas fotorreceptoras sensibles al azul, células cónicas fotorreceptoras sensibles al verde y células cónicas fotorreceptoras sensibles al rojo), neuronas sensoriales primarias propioceptivas, neuronas sensoriales primarias sensibles al tacto, células del cuerpo carotídeo tipo I y II, células ciliadas de tipo I y II del aparato vestibular del oído, células de las papilas gustativas de tipo I, células neurales colinérgicas, células neurales adrenérgicas, células neurales peptidérgicas, células de los pilares internos y externos del órgano de Corti, células de la falange interna y externa del órgano de Corti, células fronterizas del órgano de Corti, células de Hensen del órgano de Corti, células de soporte del aparato vestibular, células de soporte de las papilas gustativas, células de soporte del epitelio olfatorio, células de Schwann, células gliales satélite, células gliales entéricas, astrocitos, células neuronales, oligodendrocitos, neuronas fusiformes, células epiteliales del cristalino anterior, células de fibra del cristalino que contienen cristalino, hepatocitos, adipocitos (p. ej., glóbulos blancos y adipocitos pardos), lipocitos hepáticos, células parietales del riñón, podocitos del glomérulo del riñón, células del borde en cepillo del túbulo proximal del riñón, células del segmento delgado del asa de Henle, células del túbulo distal del riñón, células del conducto colector del riñón, neumocitos tipo I, células del conducto pancreático, células del conducto no estriado (p. ej., células principales y células intercaladas), células de los conductos (de la vesícula seminal, glándula prostática, etc.), células del borde en cepillo intestinal (con microvellosidades), células del conducto estriado de las glándulas exocrinas, células epiteliales de la vesícula biliar, células del conducto eferente no ciliadas, células principales del epidídimo, células basales del epidídimo, células epiteliales de ameloblastos, células epiteliales de la porción semilunar del aparato vestibular del oído, células epiteliales interdentales del órgano de Corti, fibroblastos de tejido conjuntivo laxo, fibroblastos corneales (queratocitos corneales), fibroblastos del tendón, fibroblastos del tejido reticular de la médula ósea, otros fibroblastos no epiteliales, pericitos, células del núcleo pulposo del disco intervertebral, cementoblastos/cementocitos, odontoblastos/odontocitos, condrocitos del cartílago hialino, condrocitos del fibrocartílago, condrocitos del cartílago elástico, osteoblastos/osteocitos, células osteoprogenitoras, hialocitos del cuerpo vítreo del ojo, células estrelladas del espacio perilinfático del oído, células estrelladas hepáticas (células de Ito), células estrelladas pancreáticas, células del músculo esquelético (p. ej., células rojas del músculo esquelético (lento) y células blancas del músculo esquelético (rápido), células intermedias del músculo esquelético, células de la bolsa nuclear del huso muscular, células de la cadena nuclear del huso muscular, células satélite, células del músculo cardíaco (p. ej., células del músculo cardíaco normal, células del músculo cardíaco nodal y células fibrosas de Purkinje, células musculares lisas (varios tipos), células mioepiteliales del iris, células mioepiteliales de las glándulas exocrinas, eritrocitos, megacariocitos, monocitos, macrófagos del tejido conectivo (varios tipos), células de Langerhans epidérmicas, osteoclastos, células dendríticas, células microgliales, granulocitos neutrófilos, granulocitos eosinófilos, granulocitos basófilos, células de hibridoma, mastocitos, células T auxiliares, células T supresoras, células T citotóxicas, células T asesinas naturales, células B, células asesinas naturales, reticulocitos, células madre y progenitores comprometidos para la sangre y el sistema inmunitario (varios tipos), ovogonias/ovocitos, espermátidas, espermatocitos, células de espermatogonio, espermatozoides, células de Sertoli, células del folículo ovárico, células epiteliales del timo y células renales intersticiales.
Las células a las que se administra un compuesto o composición según los procedimientos también descritos pueden ser células madre o progenitoras, ya que estas células dan lugar a otras células del cuerpo. Las células tratadas pueden ser células en las que los telómeros se acorten más rápidamente que en otros tipos de células, por ejemplo, células endoteliales, fibroblastos, queratinocitos, células del sistema inmunitario, incluidas células tiroideas y paratiroideas y leucocitos y sus progenitores, células del intestino, hígado, células de la membrana mucosa, p. ej., en el esófago y el colon, y las células de las encías y la pulpa dental.
Por consiguiente, en algunos casos, las células son células de fibroblastos, queratinocitos, células endoteliales, células epiteliales o células sanguíneas.
La etapa de administración se puede realizar una o más veces en función de la cantidad de extensión de telómero deseada. En algunos casos de los procedimientos descritos, la célula es una célula aislada, y la etapa de administración no dura más de 96 horas, no más de 72 horas, no más de 48 horas, no más de 36 horas, no más de 24 horas, no más de 18 horas, no más de 12 horas, no más de 8 horas, no más de 4 horas o incluso tiempos más cortos. En algunos casos, la etapa de administración dura al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas, al menos 18 horas, al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas, o incluso tiempos más largos. En casos preferidos, la etapa de administración no dura más de 48 horas, no más de 96 horas o no más de 1 semana. En otros casos preferidos, la etapa de administración dura al menos 2 horas. Deberá entenderse que, en el caso de que la administración sea por transfección, el tiempo de administración incluye el tiempo que tarda la célula en recuperarse del procedimiento de transfección.
En algunos casos de los procedimientos descritos, la célula es una célula aislada, y la etapa de administración se realiza no más de 6 veces, no más de 5 veces, no más de 4 veces, no más de 3 veces, no más de 2 veces, o incluso no más de 1 vez. En algunos casos, la etapa de administración se realiza no menos de 2 veces, no menos de 3 veces, no menos de 4 veces, no menos de 5 veces, no menos de 6 veces o incluso con mayor frecuencia.
En algunos casos, la etapa de administración se realiza una o varias veces durante un período relativamente breve para volver a extender los telómeros, y a continuación no se realiza durante un período prolongado hasta que los telómeros necesitan extenderse nuevamente. Este ciclo puede repetirse indefinidamente. Dicho programa de tratamiento permite que los telómeros se vuelvan a extender periódicamente, con intervalos entre los pasos de administración durante los cuales los telómeros se acortan. Los procedimientos de tratamiento periódico se pueden realizar ya sea mediante administración in vivo o mediante administración in vitro, según se desee. En algunos casos, la etapa de administración en dicha serie se realiza no más de 6 veces, no más de 5 veces, no más de 4 veces, no más de 3 veces, no más de 2 veces, o incluso no más de 1 vez. En algunos casos, la etapa de administración se realiza no menos de 2 veces, no menos de 3 veces, no menos de 4 veces, no menos de 5 veces, no menos de 6 veces o incluso con mayor frecuencia. Al variar la cantidad de veces que se lleva a cabo la etapa de administración, y la dosis de los compuestos utilizados en nuestras composiciones de la descripción, se puede controlar la cantidad de extensión telomérica lograda.
En algunos casos, los procedimientos de la presente descripción incluyen además la etapa de cultivar la célula en un sustrato específico, preferentemente un sustrato elástico. Se sabe que dichos sustratos evitan cambios no deseados en la célula que normalmente se producirían en otros sustratos debido a la elasticidad no fisiológica de dichos sustratos. Véase la publicación internacional PCT n.° WO2012/009682. Los sustratos elásticos pueden promover adicionalmente la supervivencia celular.
La administración de los compuestos o composiciones de la presente descripción da como resultado la expresión transitoria de una actividad telomerasa en la célula. El aumento de la actividad se mide fácilmente mediante distintos ensayos, tales como, por ejemplo, el kit de detección de telomerasa Trapeze® RT (Millipore), que proporciona un ensayo in vitro sensible en tiempo real usando detección fluorimétrica y cuantificación de la actividad de la telomerasa, aunque también son posibles otras técnicas de medición. En algunos casos, la actividad de la telomerasa aumenta en al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 50 %, o incluso más. En los casos preferidos, la actividad de la telomerasa aumenta en al menos un 5 %.
Como se señaló anteriormente, una de las ventajas de las técnicas de la presente es que la expresión de la actividad de la telomerasa es transitoria en las células tratadas. En particular, dicha expresión transitoria está en contraste con técnicas anteriores donde un gen de transcriptasa inversa de telomerasa se inserta en la secuencia genómica de la célula o modifica de otro modo de forma permanente la composición genética de la célula diana y da como resultado la actividad constitutiva de la secuencia de ácido nucleico.
La figura 3 ilustra gráficamente algunas de las ventajas de los compuestos, composiciones y procedimientos descritos en esta invención. En particular, la velocidad de extensión telomérica que se hace posible con estos compuestos, composiciones y procedimientos permite el mantenimiento del telómero mediante la administración muy infrecuente de ARNmod de TERT. La actividad expresada de la telomerasa extiende rápidamente los telómeros en un breve período, antes de ser volteada, lo que permite que el mecanismo contra el cáncer protector del acortamiento de telómeros funcione la mayor parte del tiempo. Entre tratamientos, la actividad normal de la telomerasa y el acortamiento de los telómeros está presente, y por lo tanto el mecanismo de seguridad contra el cáncer del acortamiento de telómeros para prevenir la proliferación fuera de control permanece intacto, mientras que el riesgo de enfermedad relacionada con los telómeros cortos sigue siendo bajo. Por el contrario, el mejor tratamiento de moléculas pequeñas existente para extender los telómeros requiere la administración crónica, y por lo tanto presenta un riesgo crónico de cáncer, e incluso entonces tiene un efecto pequeño e inconsistente en la longitud del telómero, sin ningún efecto detectable en la longitud del telómero en absoluto en aproximadamente la mitad de los pacientes.
Por consiguiente, en algunos casos de los procedimientos descritos, la expresión de la actividad de la transcriptasa inversa de la telomerasa, es decir, la semivida de la actividad de la telomerasa, no dura más de 48 horas, no más de 36 horas, no más de 24 horas, no más de 18 horas, no más de 12 horas, no más de 8 horas, no más de 4 horas, o incluso tiempos más cortos. En algunos casos, la expresión de la actividad de la transcriptasa inversa de la telomerasa dura al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas, al menos 18 horas, al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas, o incluso tiempos más largos. En casos preferidos, la expresión de la actividad de la transcriptasa inversa de la telomerasa no dura más de 48 horas. En otros casos, la expresión de la actividad de la transcriptasa inversa de la telomerasa dura al menos 2 horas.
En algunos casos de los procedimientos instantáneos, la expresión transitoria es independiente del ciclo celular.
Como se señaló anteriormente, la expresión transitoria de la transcriptasa inversa de la telomerasa da como resultado la extensión de los telómeros acortados en las células tratadas. La longitud del telómero se puede medir fácilmente usando técnicas tales como análisis de longitud de fragmento de restricción terminal (TRF), qPCR, MMqPCR y Q-FISH, como lo entendería un experto en la materia. Véase, e.g, Kimura et al. (2010) Nat Protoc. 5:1596-607; doi: 10.1038/nprot.2010.124. En algunos casos, los procedimientos de la presente aumentan la longitud del telómero en células tratadas en al menos 0,1 kb, al menos 0,2 kb, al menos 0,3 kb, al menos 0,4 kb, al menos 0,5 kb, al menos 1 kb, al menos 2 kb, al menos 3 kb, al menos 4 kb, al menos 5 kb o incluso más.
Una de las ventajas de los compuestos, composiciones y procedimientos de la presente es la rapidez de extensión telomérica lograda por estas técnicas. Las técnicas permiten que los tratamientos sean breves y, por lo tanto, seguros porque el mecanismo de acortamiento telomérico de protección normal permanece intacto la mayor parte del tiempo. El tratamiento con los compuestos y composiciones descritos en esta invención da como resultado la administración de decenas o cientos de copias de ARNmod de TERT por célula, tal como se midió mediante RT-qPCR absoluta, que es sustancialmente mayor que la cantidad promedio de copias de ARNm de TERT endógena que se encuentran incluso en células con alta actividad telomerasa. Normalmente, dichas células tienen menos de una copia de ARNm de TERT por célula (Yi et al. (2001) Nucl. Acids Res. 29:4818-4825). Por lo tanto, los tratamientos introducen transitoriamente una gran cantidad de copias de ARNmod que codifican TERT a una célula, lo que resulta en una rápida extensión telomérica. Sin pretender limitarse a la teoría, la gran cantidad de copias de ARNmod que codifican TERT puede abrumar transitoriamente los mecanismos reguladores inhibitorios que normalmente impiden que TERT, y otros procedimientos de extensión telomérica, extiendan los telómeros tan rápidamente como los compuestos, composiciones y procedimientos descritos en esta invención.
La expresión transitoria de la transcriptasa inversa de la telomerasa también resulta en un aumento de la capacidad de replicación en las células tratadas. El aumento de la capacidad de replicación se monitoriza fácilmente en células que se acercan a la senescencia de replicación mediante la medición de duplicaciones de población adicionales en dichas células. Las células senescentes no se estimulan para dividirse por el paso en cultivo o tratamiento con suero. Las células senescentes se caracterizan además a menudo por la expresión de la actividad p-galactosidasa dependiente del pH, la expresión de los inhibidores del ciclo celular p53 y p19, y otros patrones alterados de expresión génica, y un tamaño celular agrandado. En ausencia de tratamiento con los compuestos y composiciones de la presente descripción, las células de fibroblastos pulmonares humanos normalmente se duplican 50-60 veces. Con un conjunto de uno a tres tratamientos que duran sólo unos pocos días en total, sin embargo, estas células logran 16-28 duplicaciones de población adicionales. Si se trata de nuevo varias semanas después, la capacidad proliferativa adicional se confiere de nuevo. Este procedimiento de tratamientos intermitentes para reextender periódicamente los telómeros se puede aplicar más veces, con el intervalo entre tratamientos en función de factores tales como la tasa de acortamiento del telómero, la tasa de divisiones celulares y la cantidad de extensión telomérica proporcionada por el tratamiento. Del mismo modo, las células endoteliales dérmicas microvasculares humanas de un individuo envejecido, en ausencia de tratamiento con las composiciones de esta invención, pueden lograr solo 1-2 duplicaciones de población, mientras que las células tratadas pueden lograr 3, 4 o incluso más duplicaciones de población.
Por consiguiente, en algunos casos, los procedimientos de tratamiento también descritos aumentan la cantidad de duplicaciones de población en al menos una, dos, cuatro o incluso más duplicaciones de población. En algunos casos, los procedimientos de tratamiento aumentan la cantidad de duplicaciones de población en al menos 5, 10, 15, 20 o incluso más duplicaciones de población.
En algunos de los casos del presente procedimiento, los compuestos o composiciones de la descripción se administran a la célula animal mediante electroporación. En casos específicos, se administra un compuesto de la descripción a la célula animal mediante electroporación en ausencia de un vehículo de administración. En otros casos específicos, un compuesto de la descripción y un componente de ARN de telomerasa se administran a la célula animal mediante electroporación.
Kits
En otro aspecto, la presente descripción proporciona kits listos para usar para su uso en la extensión telomérica en una célula de mamífero. Los kits comprenden cualquiera de los compuestos o composiciones descritos anteriormente, junto con instrucciones para su uso. En algunos casos, los kits comprenden además materiales de envase. En los casos preferidos, los materiales del envase son herméticos. En estos casos, los materiales del envase pueden llenarse opcionalmente con un gas inerte, tal como, por ejemplo, nitrógeno, argón o similares. En algunos casos, los materiales del envase comprenden un recipiente de lámina metálica, tal como, por ejemplo, una bolsa de aluminio sellada o similar. Dichos materiales del envase son bien conocidos por los expertos en la materia.
En algunos casos, el kit puede comprender además un desecante, un medio de cultivo, un inhibidor de RNasa u otros componentes similares. En algunos casos, el kit puede comprender además una combinación de más de uno de estos componentes adicionales. En algunos casos de kit, la composición del kit es estéril.
Una vez descrita la presente invención en detalle, la misma se entenderá más claramente por referencia a los Ejemplos siguientes, que se incluyen aquí sólo con fines ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Extensión telomérica altamente eficiente en células humanas utilizando ARNm modificado que codifica telomerasa
Las enfermedades de mantenimiento inadecuado de la longitud telomérica y la necesidad de aumentar la capacidad de replicación celular para tratamientos celulares y aplicaciones de bioingeniería motivan el desarrollo de procedimientos seguros para la extensión telomérica. Blackburn et al. (2010) Cancer Prev Res (Phila) 3:394-402; Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707; Alter et al. (2009) Blood 113:6549-6557; Mohsin et al. (2012) Journal of the American College of Cardiology doi:10.1016/j.jacc.2012.04.047. La administración de ARNm para aumentar transitoriamente la cantidad de proteína codificada por el ARNm para aplicaciones terapéuticas se facilita mediante la incorporación de nucleósidos modificados que reducen la inmunogenicidad y aumentan la estabilidad. Kariko et al.
(2005) Immunity 23:165-175; Kariko et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:e142; doi: 10.1093/nar/gkr695.
Para ser terapéuticamente útil, un tratamiento de extensión telomérica debe ser idealmente no inmunogénico; específico; capaz de iniciarse antes de que los telómeros se acorten a las longitudes críticamente cortas que provocan inestabilidad cromosómica y mayor riesgo de cáncer (Wentzensen et al. (2011) Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev.
20:1238-1250; Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707; Artandi and DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18); transitorio e intermitente, para permitir que el mecanismo de acortamiento telomérico contra el cáncer normal funcione casi continuamente; eficaz incluso en células de división lenta, tales como algunas poblaciones de células madre y progenitoras; administrable in vitro e in vivo usando vehículos no inmunogénicos; y, finito, que solo permita divisiones celulares adicionales suficientes para mejorar o prevenir potencialmente enfermedades de mantenimiento de telómeros inadecuados, o para permitir una amplificación suficiente de células para tratamientos celulares o aplicaciones de bioingeniería. Los tratamientos existentes, incluidos los que utilizan moléculas pequeñas, no cumplen todos estos criterios. Harley et al. (2011) Rejuvenation Res. 14:45-56. La administración viral de TERT, aunque posiblemente inducible, corre el riesgo de mutagénesis de inserción y, por lo tanto, presenta serias preocupaciones de seguridad. Los tratamientos que implican la sobreexpresión continua de telomerasa son potencialmente inseguros, porque en una célula con una mutación oncogénica, ya sea debido a telómeros críticamente cortos y la inestabilidad cromosómica resultante (O'Sullivan and Karlseder (2010) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11:171-181) u otra causa, la expresión de telomerasa constitutiva, ya sea debido a una segunda mutación o un fármaco, puede apoyar la malignidad al permitir la proliferación ilimitada. Artandi and DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18; Ding etal. (2012) Cell 148:896-907.
Los criterios para la extensión telomérica seguros se cumplen mediante una estrategia basada en ARN, facilitada por el reciente descubrimiento de que ciertos nucleósidos de origen natural que se encuentran en el ARN aumentan la estabilidad y reducen la inmunogenicidad del ARN exógeno cuando se administra a las células. Kariko et al. (2005) Immunity 23:165-175. Los ejemplos de dichos nucleósidos se enumeran en la Tabla 4. Sin pretender limitarse a la teoría, estas versiones modificadas de nucleósidos canónicos pueden permitir que los receptores tipo Toll del sistema inmunitario innato distingan el ARNmod endógeno del a Rn extraño que no contiene estos nucleótidos. La administración de ARNmod sintético suficientemente purificado que contiene estos nucleósidos no canónicos a las células da como resultado una mayor estabilidad del ARNmod y una elevación transitoria de la proteína codificada por el ARNmod con respuesta inmunitaria reducida o abrogada. Kariko et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:e142; doi: 10.1093/nar/gkr695. Por lo tanto, la administración de ARNmod exógeno presenta oportunidades sin precedentes para aplicaciones que requieren producción transitoria de proteínas. Por ejemplo, el ARNmod biomimético se ha transfectado en fibroblastos, de manera que los reprograma en células madre pluripotentes. Yakubov et al. (2010) Biochem. Biophys. Res. Commun. 394:189-193. También se ha inyectado ARNmod biomimético en ratones para rescatar un modelo de deficiencia de proteína tensioactiva pulmonar y para elevar los niveles de eritropoyetina y hematocrito. Kormann et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29:154-157. Tal como se describió anteriormente, los nucleósidos utilizados en los ARNmod utilizados en la presente se eligieron no solo para aumentar la estabilidad, sino también para reducir o anular la inmunogenicidad y para aumentar la eficiencia de traducción del ARN. La transfección de células dendríticas usando un ARNm no modificado que codifica hTERT, mientras que resulta en un aumento en la actividad de la telomerasa dentro de las células también provocó una fuerte respuesta de linfocitos T citotóxicos específicos de hTERT. Saeboe-Larssen et al. (2002) Journal of Immunological Methods 259: 191-203. Por lo tanto, no es probable que las estrategias que utilizan ARN no modificados sean eficaces para extender los telómeros en las células.
Por lo tanto, la administración de ARNmod que codifica TERT a las células se puede utilizar para aumentar transitoriamente los niveles de proteína TERT y la actividad de la telomerasa lo suficiente como para extender los telómeros y aumentar la capacidad de replicación en una cantidad finita. Los niveles aumentados de actividad de la telomerasa ocurren lo suficientemente rápido como para permitir un tratamiento de extensión telomérica que sea breve e infrecuente (véase la figura 1a y la figura 3).
Para demostrar la estrategia, se sintetizó ARNmod de TERT utilizando proporciones de nucleósidos canónicos y no canónicos que confieren estabilidad, traducción eficiente e inmunogenicidad reducida o abrogada. Yakubov et al. (2010) Biochem. Biophys. Res. Commun. 394:189-193; Kariko et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:e142; doi: 10.1093/nar/gkr695. El ARNmod sintético contiene las UTR 5' y 3' del ARNm de beta globina, que tiene una vida media relativamente larga. Para mejorar aún más la estabilidad, el ARNmod tiene una cola larga de poli-A de 151 nucleótidos. Para maximizar la fidelidad de la plantilla larga de ADN de TERT utilizada en la reacción de transcripción in vitro para generar ARN, las plantillas de ADN se generaron utilizando una estrategia basada en plásmido en lugar de PCR.
Para distinguir la extensión de telómero de buena fe de la selección de células con telómeros largos de una población inicial heterogénea, se sintetizó un ARNmod de control que codifica una forma catalíticamente inactiva de TERT (CI TERT) con la mutación de residuo único D712A, donde una de la tríada de aspartatos que coordinan metales en el sitio catalítico del dominio de transcriptasa inversa se sustituye con alanina, abrogando la actividad catalítica de CI TERT pero dejándola estructuralmente intacta hasta el punto de poder unirse al ADN de plantilla, y tan estable como TERT en lisado de reticulocitos. Wyatt (2009) "Structure-Function Analysis of the Human Telomerase Reverse Transcriptase" University of Calgary, Ph.D. Thesis (http://dspace.ucalgary.ca/bitstream/1880/47511/1/2009_Wyatt_PhD.pdf).
Los fibroblastos pulmonares fetales humanos MRC-5 se eligieron como células de prueba en este ejemplo porque estas y otras cepas de fibroblastos humanos han servido durante décadas como caballos de batalla en el campo de los telómeros y, por lo tanto, hay datos abundantes para registrar el diseño y análisis experimental. Las células MRC-5 también tienen actividad telomerasa endógena relativamente baja y presentan acortamiento de telómeros y senescencia final. Dado que el estrés oxidativo aumenta la tasa de acortamiento de telómeros en células MRC-5 (von Zglinicki et al. (2000) Free Radic. Biol. Med. 28:64-74), y hace que TERT se localice en el citoplasma donde no puede extender los telómeros (Ahmed et al. (2008) J. Cell. Sci. 121:1046-1053), las células se cultivaron en 5 % en lugar de oxígeno ambiente. Para aumentar aún más la probabilidad de éxito, las células también se cultivaron en medio optimizado para la producción de proteínas en células MRC-5 (Wu et al. (2005) Cytotechnology 49:95-107).
La eficiencia de la extensión telomérica basada en ARNmod está sujeta a varios factores, incluida la eficiencia de transfección, traducción y plegamiento en telomerasa funcional, y la capacidad de escapar al menos transitoriamente de los mecanismos extensos de regulación postraduccional que inhiben la TERT y la telomerasa en muchos tipos de células, incluidas las células MRC-5. Si bien las eficiencias de transfección con especies de ARNmod más pequeñas tales como nGFP (0,8 kb) en células MRC-5 son normalmente superiores al 90 % incluso con bajas concentraciones de ARNmod (figura 6), el marco de lectura abierto de TERT es relativamente grande (3399 pb) y la construcción de TERT de ARNmod incluye UTR y una cola de poli-A, lo que hace que la construcción sea aún más grande (3751 pb). Como se muestra en la figura 1b, sin embargo, tanto TERT como CI TERT se transfectaron eficientemente en células MRC-5 por lípido catiónico (medido por RT-PCR de ARNm recogido al final del tratamiento de células MRC-5 tratadas con 1 ug/ml de ARNmod de TERT durante 5 horas). Además, la administración de ARNmod de TERT o CI TERT dio como resultado aumentos equivalentes y significativos (p < 0,03 y < 0,01, respectivamente) en la cantidad de proteína reconocida por el anticuerpo anti-TERT, con un tamaño de aproximadamente 122 kDa, cercano al tamaño estimado de TERT de 127 kDa (figura 1c). Wick et al. (1999) Gene 232:97-106. Los niveles de proteína se midieron mediante inmunoelectrotransferencia de fluorescencia infrarroja cuantitativa. Los niveles de proteína TERT no difieren significativamente entre las células tratadas con TERT y las células tratadas con CI TERT (n=3).
Para formar la telomerasa funcional, TERT debe doblarse adecuadamente y formar un complejo con al menos TERC. La telomerasa también está fuertemente regulada postraduccionalmente, incluso por localización citoplasmática y fosforilación inhibitoria. Cifu- entes-Rojas and Shippen (2012) Mutat. Res. 730:20-27; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. De hecho, no todas las células que expresan TERT son capaces de mantener telómeros. Counter et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:14723-14728. La administración de ARNmod de TERT aumentó la actividad de la telomerasa de una manera dependiente de la dosis hasta un máximo a una concentración de aproximadamente 0,6 ug/ml (véase la figura 7), y se utilizó una concentración de 1 ug/ml para experimentos posteriores. Los niveles de actividad de la telomerasa aumentaron rápidamente, pero volvieron a los niveles iniciales en aproximadamente 48 horas, y ARNmod de CI TERT no provocó ningún cambio en la actividad telomerasa (figura Id). La actividad de la telomerasa se midió mediante el ensayo TRAPeze® RT basado en qPCR (n=3).
Dado que la regulación postraduccional de TERT está mediada en parte por el secuestro citoplasmático de una manera dependiente del ciclo celular, también se investigó la localización subcelular de TERT en células tratadas y no tratadas. Cifuentes-Rojas et al. (2011) Mutat. Res. doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. Según los resultados de Western blot, la inmunocitoquímica mostró una proteína abundante, aunque posiblemente inhibida, reconocida por el anticuerpo TERT en células MRC-5 no tratadas, lo que dificulta la distinción endógena de TERT exógena (datos no mostrados).
Se utilizaron células dentro de aproximadamente 10 duplicaciones de población (PD) del inicio de la senescencia replicativa para medir el efecto del tratamiento con ARNmod de TERT sobre la longitud del telómero y la capacidad de replicación. La decisión de utilizar dichas células se basó en al menos dos factores. En primer lugar, las células en esta etapa tienen telómeros relativamente cortos, y dado que la telomerasa se extiende preferentemente a los telómeros cortos, incluso en las células MRC-5, el tratamiento de las células en esta etapa debería dar como resultado un efecto mayor y más fácil de medir. Britt-Compton et al. (2009) FEBS Lett. 583:3076-3080. En segundo lugar, al tratar las células en esta etapa, se reduce la cantidad de tiempo necesario para determinar si el tratamiento aumentó la capacidad de replicación. En las presentes condiciones, la senescencia replicativa comienza aproximadamente 50 PD después de la recepción de las células MRC-5 del proveedor (ver procedimientos para más detalles) y, por lo tanto, se decidió tratar las células a aproximadamente 40 PD. Las células MRC-5 en esta etapa tienen longitudes promedio de telómeros de aproximadamente 5-7 kb, en función del historial de cultivo y PD en la recepción de los proveedores. Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893; MacKenzie et al. (2000) Exp. Cell Res. 259:336-350.
Se tuvieron en cuenta varias consideraciones al diseñar el programa de tratamiento (figura 4a). Las tasas de extensión telomérica obtenidas mediante el uso de la transducción viral de TERT en células MRC-5 varían pero están en el orden de aproximadamente 0,2 kb por división. MacKenzie et al. (2000) Exp. Cell Res. 259:336-350. Las tasas de acortamiento de telómeros en células MRC-5 varían con las condiciones y prácticas de cultivo (Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893; von Zglinicki et al. (2000) Free Radic. Biol. Med. 28:64-74), pero son aproximadamente 0,1 kb por PD en oxígeno ambiente (Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893). Las células se cultivaron en oxígeno al 5 %, a medida que los telómeros de células MRC-5 se acortan más lentamente en condiciones menos oxidativas. von Zglinicki y col. (2000) Free Radic. Biol. Med. 28:64-74. Se descubrió que el tiempo de PD en las células PD 40 MRC-5 era de aproximadamente 33 horas. Dados estos datos, se podría esperar que se necesitaran múltiples tratamientos para detectar la extensión telomérica dentro de la resolución de los procedimientos elegidos de medición de la longitud de los telómeros, análisis de fragmentos de restricción de telómeros (TRF) e hibridación cuantitativa de fluorescencia in situ (Q-FISH). El intervalo entre tratamientos se eligió para ser de 48 horas ya que se encontró que los niveles de actividad de la telomerasa volvieron a los niveles basales en este momento después de un solo tratamiento.
Tal como se muestra en las figuras 3(b)-(d), el tratamiento de células MRC-5 con ARNmod de hTERT produce un aumento significativo en la longitud del telómero en estas células en comparación con las células que no se tratan o se tratan únicamente con el vehículo de administración. Las micrografías de fluorescencia de las células MRC-5 en metafase después del tratamiento muestran la ubicación de una sonda de telómeros en los cromosomas en estas células (figura 4(e)).
El efecto del tratamiento en la longitud del telómero también se midió por hibridación cuantitativa de fluorescencia in situ (Q-FISH) (figura 4(f)), porque esta técnica proporciona una resolución relativamente alta (0,3 kb) y porque la fluorescencia de las sondas de telómeros Q-FISH es directamente proporcional a la longitud del telómero. Lansdorp et al. (1996) Hum. Mol. Genet. 5:685-691; Martens et al. (1998) Nat. Genet. 18:76-80. Debido a que la capacidad de replicación es el parámetro funcional de mayor interés en aumentar como resultado de la extensión telomérica, se construyó una curva estándar que relaciona el número de duplicación de población de células MRC-5 con la longitud del telómero medida usando Q-FISH (figura 4(g)(i)). Después de tres tratamientos de PD 40 MRC-5 con ARNm de TERT en intervalos de 48 horas, la longitud total promedio del telómero por célula aumentó en 56 /- 5 % (n = 15 células para cada una de dos réplicas biológicas para cada tratamiento; las barras de error representan s.e.m.). Las longitudes de los telómeros en las células PD 40 tratadas fueron similares a las de las células PD 3 no tratadas (figura 4(g)(ii)) (línea punteada superior) y, por lo tanto, el tratamiento extendió los telómeros en la cantidad donde el telómero se acorta en estas células sobre 37 PD. En este número de PD en condiciones de cultivo estándar, los telómeros MRC-5 se acortan en más de >1 kb. Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893. Según esto, el aumento observado en la longitud del telómero del 56 % corresponde a un aumento en la longitud media del telómero de aproximadamente 0,6-2,5 kb, basado en el hecho de que las células PD 40 MRC-5 tienen longitudes medias del telómero de aproximadamente 5-7 kb según lo medido usando TRF (Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893; MacKenzie et al. (2000) Exp. Cell Res. 259: 336-350), que sobreestima la longitud del telómero en aproximadamente 2,5-4 kb, y por lo tanto las longitudes promedio reales de los telómeros en células PD 40 MRC-5 están en el intervalo de 1-4,5 kb. Aubert et al. (2012) Mutat. Res. 730:59-67. Dado que el tratamiento duró un total de 144 horas, y el tiempo de duplicación de la población de las células fue de aproximadamente 33 h durante este tiempo, las células se sometieron a aproximadamente 4-5 PD. Por lo tanto, la tasa de extensión telomérica fue de aproximadamente 0,1-0,6 kb por PD, cuyo intervalo superior se aproxima a las tasas máximas jamás registradas después de la transducción viral de ADN que codifica TERT, y cuyo intervalo inferior es comparable a las tasas normales observadas usando la administración viral. Como se esperaba, las células no tratadas tienen longitudes teloméricas equivalentes a las células PD 40 durante la generación de la curva estándar (línea punteada inferior en la figura 4(g)).
A continuación, se examinó el efecto del tratamiento con ARNm de TERT sobre la capacidad de replicación celular. Como se esperaba, las células no tratadas y tratadas solo con vehículo sufrieron senescencia dentro del intervalo normal de 50-60 PD (figura 5a). En contraste sorprendente, las células tratadas con ARNm de TERT continuaron proliferando más allá de la PD donde las poblaciones de control alcanzaron la senescencia replicativa de una manera dependiente de la dosis, con cada tratamiento adicional que confiere significativamente más Pd adicional.
Tres tratamientos con ARNm de TERT resultaron en un aumento en la capacidad de replicación de 28 /- 1,5 PD. Este resultado es consistente con una estimación de que los telómeros se extendieron en >1 kb, a medida que los telómeros MRC-5 se acortan en aproximadamente 0,1 kb por PD (Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893) en oxígeno ambiente (20 %), y las células tratadas se cultivaron en oxígeno al 5 %, donde los telómeros se acortan más lentamente. El aumento observado en la capacidad de replicación de las células tratadas de 28 PD es equivalente a la pérdida de la capacidad de replicación que se produce en los fibroblastos normales durante más de una década de envejecimiento humano normal. Takubo et al. (2010) Geriatr Gerontol Int. 10 Suppl 1:S197-206; doi: 10.1111/j.1447-0594.2010.00605.x.; Allsopp, R. C. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10114-10118.
Es importante destacar que para aplicaciones terapéuticas, todas las células tratadas estudiadas hasta la fecha al final sufrían senescencia, y de hecho lo hacían en menos PD que las células no tratadas con longitudes de telómeros equivalentes, como se podría esperar, ya que las células tratadas se han sometido a docenas de PD adicionales, en comparación con las células no tratadas con telómeros de longitud similar, para acumular daño de ADN no telomérico u otro daño que podría afectar a las tasas de acortamiento telomérico o apoyar de otro modo la inducción de senescencia replicativa.
A medida que las células MRC-5 se acercaban e ingresaban en la senescencia replicativa, tendían a hincharse varias veces el diámetro de los pasajes tempranos (figura 8a). Al igual que con la senescencia replicativa, esta transición se retrasó en células tratadas con ARNmod de TERT, pero no en células que recibieron ARNmod de CI TERT o vehículo solo (figura 8b).
Según el hallazgo de que ARNmod de CI TERT no provocó ningún aumento en la actividad de la telomerasa (figura Id), el tratamiento con ARNmod de CI TERT no cambió la distribución de la longitud de los telómeros con respecto a las células no tratadas, y tampoco ARNmod de CI TERT aumentó la capacidad de replicación, a pesar de provocar un aumento en el nivel de proteína de TERT equivalente al provocado por ARNmod de TERT (figura 1c). Dado que la única diferencia entre TERT y CI TERT es una sustitución de residuo único que anula la capacidad de CI TERT para transferir nucleótidos a telómeros, estos resultados respaldan firmemente la hipótesis de que el aumento en la longitud del telómero y la capacidad de replicación observada en células tratadas con ARNmod de TERT se debe a la extensión telomérica de buena fe en al menos algunas de las células tratadas, en lugar de la selección de una subpoblación preexistente de células con telómeros más largos.
Los resultados de este ejemplo muestran que la administración de ARNmod de TERC a células humanas eleva de forma transitoria la actividad de la telomerasa, extiende rápidamente los telómeros y aumenta la capacidad de replicación en una cantidad finita y, por lo tanto, potencialmente segura. El ARNmod biomimético purificado también es hipoinmunogénico. Kariko et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:e142; doi: 10.1093/nar/gkr695. Por lo tanto, la administración de ARNmod cumple con varios criterios importantes para un tratamiento de extensión telomérica terapéuticos, y también tiene una promesa con respecto a otros criterios que incluyen especificidad, administración dirigida y capacidad para superar la regulación postraduccional. Con respecto a la especificidad, la sobreexpresión de TERT también puede afectar a otros genes tales como Wnt (Park et al. (2009) Nature 460:66-72), pero dichos efectos pueden evitarse mediante la administración de ARNmod que codifica un TERT mutado en sitios de unión de factores que median dichos efectos no específicos. Con respecto a la administración, el reciente descubrimiento de que en humanos el ARNmod se transporta en exosomas entre células a través de la sangre y otros fluidos corporales permite la administración de ARNmod basado en exosomas para la extensión telomérica y otras aplicaciones. Lakhal and Wood (2011) Bioessays 33:737-741. Los exosomas se han utilizado con éxito para administrar ARNmod biomimético a las células in vitro (datos no mostrados). Con respecto a la regulación postraduccional, se puede evitar la regulación postraduccional inhibitoria independiente y dependiente del ciclo celular de TERT mediante la administración de ARNmod que codifica TERT mutado en uno o más sitios conocidos que median esas actividades, tales como la secuencia de exportación nuclear, o mediante la administración conjunta de ARNmod que codifica otros miembros de la telomerasa o complejos de telómeros. Estas estrategias permiten la extensión telomérica incluso en células que se dividen lentamente o no, lo que hace que el tratamiento con ARNmod de TERT sea apropiado para poblaciones de células madre y progenitoras en reposo o que se dividan lentamente. La extensión telomérica basada en ARNmod encuentra así un uso inmediato para aumentar la capacidad de replicación de las células para la investigación y, además, para tratamientos celulares, aplicaciones de bioingeniería y tratamientos in vivo que aborden enfermedades y condiciones de mantenimiento inadecuado de los telómeros.
En resumen, el ARNmod que codifica la transcriptasa inversa (TERT) de la telomerasa humana se administró a los fibroblastos pulmonares humanos MRC-5 tres veces durante 96 horas. Los telómeros en las células tratadas se extendieron en >1 kb, una cantidad por la cual los telómeros de fibroblastos se acortan durante más de una década de envejecimiento en humanos en promedio. Takubo et al. (2010) Geriatr Gerontol Int. 10 Suppl 1:S197-206; doi: 10.1111/j.1447-0594.2010.00605.x. La actividad de la telomerasa volvió a los niveles previos al tratamiento en 48 horas y el inicio de la senescencia replicativa en las células tratadas se retrasó en aproximadamente 30 duplicaciones de la población, de una manera dependiente de la dosis. Por lo tanto, la administración de ARN telomerasa que contiene nucleósidos modificados a las células permite la rápida e hipoinmunogénica o no inmunogénica y el ARN es una estrategia útil para la extensión telomérica para distintas aplicaciones.
PROCEDIMIENTOS
Generación y síntesis de plantillas de ARNmod. El marco de lectura abierto (ORF) de TERT humana sin mutaciones (WT) utilizado para generar las plantillas de ADN para la síntesis de ARNmod es idéntico a la secuencia de referencia de la variante 1 del transcripto de TERT humana NCBI NM_198253.2, y se generó mediante la realización de la modificación G516D al ORF del plásmido pBABE-neo-hTERT (plásmido Addgene 1774). El residuo 516 está en el motivo QFP de la extensión N-terminal de TERT, un motivo asociado con la multimerización y la unión al ARN de TERT. El mutante de TERT catalíticamente inactivo (CI TERT) se generó a partir de la secuencia WT TERT mediante la introducción de la mutación D712A. Los ORF de WT y CI TERT se insertaron en el MCS de un plásmido de partida que contiene el promotor T7, la UTR 5' de beta globina humana (hBB), el MCS, la UTR 3' de hBB, una secuencia de poli-A de 151 pb y un sitio de restricción para la linealización con enzima de clase IIs después de la secuencia de poli-A. El plásmido intermedio resultante se secuenció en al menos cuadruplicado para garantizar la fidelidad, se linealizó y se transcribió a ARN con caperuza usando la ARN polimerasa del kit MEGAscript T7 (Ambion, Austin, Texas) y una mezcla de nucleótidos personalizada de nucleótidos canónicos y no canónicos (TriLink BioTechnologies) donde las concentraciones de nucleótidos finales por 40 ul de reacción IVT fueron 7,5 mM para cada uno de entre adenosina-5'-trifosfato (ATP), 5-metilcitidina-5'-trifosfato (m5C) y pseudouridina-5'-trifosfato (V), 1,5 mM para guanosina-5'-trifosfato (GTP) y 6 mM para el análogo de caperuza (ARCA, NEB), o una relación molar de ATP:m5C:T:GTP:ARCA de 1:1:1:0.2:08. Para disminuir aún más la inmunogenicidad potencial del ARNm relacionado con la fracción que contiene 5'-3P (~20 % del total), los productos IVT se trataron con fosfatasa (fosfatasa antártica, NEB). El tamaño y la integridad de los productos de ARNmod se verificaron usando electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante.
Células y cultivo celular. Se recibieron fibroblastos pulmonares fetales humanos MRC-5 (ATCC CCL-171) de ATCC en el pasaje 14, el número de pasaje actual de su inventario de distribución. Dado que ATCC no indica el número de PD, los valores de PD citados en esta invención se refieren al número de PD después de la recepción de células de ATCC, definidas aquí como PD 0. Para acortar sus telómeros en preparación para experimentos de extensión telomérica, las células se cultivaron usando pautas de ATCC en DMEM con 10 % de FBS, en oxígeno ambiente y 5 % de CO2. El tratamiento de extensión telomérica comenzó aproximadamente a las PD 40 después de recibir células de ATCC. Al menos 48 horas antes del inicio del tratamiento con ARNmod, las células se transfirieron a 5 % de oxígeno y medio DMEM que contenía 20 % de FBS y penicilina-estreptomicina. Las células se trataron al menos 24 horas después de la colocación en placas y 24 horas antes de la tripsinización.
Transfección de ARNmod. Las células se transfectaron con ARNmod de TERT 0,4 nM y ARN de TERC 2,0 nM a menos que se especifique lo contrario, utilizando ARNiMax de lipofectamina (Invitrogen), un lípido catiónico, en medio sérico reducido Opti-MEM (Invitrogen) durante 4-5 horas, después de lo cual se devolvieron al medio normal.
Medición de la actividad telomerasa. 24 horas después del inicio del período de transfección, las células se lavaron con PBS, se tripsinizaron, se sedimentaron a 500 g durante 5 min y se lavaron con PBS, se repelieron y a continuación se lisaron siguiendo las instrucciones en el kit TRAPeze RT (Millipore). Las etapas de transcripción inversa y qPCR se llevaron a cabo en un Roche LightCycler 480 II y un Abi 7900 HT. La actividad de la telomerasa de las muestras siempre se comparó con el estándar de referencia proporcionado con el kit, ya que descubrimos que el aumento de veces era propenso a ser altamente variable, probablemente debido a la baja actividad de la telomerasa en las células MRC-5.
Inmunocitoquímica. 24 horas después del inicio del período de transfección, las células se lavaron con PBS, se fijaron en paraformaldehído al 2 % durante 20 minutos, se lavaron tres veces con PBS, se bloquearon en PBS que contenía BSA al 7,5 % y Triton X-100 al 0,1 % durante 1 hora, se lavaron tres veces, se incubaron durante la noche a 4 °C en un balancín en anticuerpo anti-TRT (ABCAM 32020 a 1:50 o Rockland 600-401-252S a 1:500) en PBS con BSA al 5 %, se lavaron tres veces, se incubaron durante una hora en anticuerpo secundario, se lavaron dos veces y a continuación dos veces más en un agitador durante 3 minutos cada vez, a continuación se incubaron en DAPI 0,1 ug/ml durante 3 minutos y se lavaron cuatro veces en PBS.
Citometría de flujo. Las células tratadas con 0,5-1,5 ug/ml de ARNmod de TERT y los controles se tripsinizaron 22 h después del inicio de la transfección, se lavaron, se fijaron en paraformaldehído al 2 %, se permeabilizaron en BSA al 7,5 % con Triton X-100 al 0,1 % durante 20 min, se lavaron tres veces en PBS, se bloquearon en BSA al 7,4 % durante 1 h, se incubaron en anticuerpo anti-TRT (ABCAM 32020 a 1:50) en PBS con BSA al 5 %, se lavaron tres veces, se incubaron en anticuerpo secundario (1:200) en PBS, a continuación se lavaron tres veces y se resuspendieron en amortiguador FACS y se analizaron en un citómetro de flujo Accuri C6 (Becton Dickinson). La intensidad de fluorescencia media se calculó como la fluorescencia media de todas las células en las muestras tratadas y de control. Los datos se analizaron utilizando el software CFlow Plus.
El ARN total de RT-PCR se recolectó usando el mini kit RNeasy (Qiagen) y se convirtió en ADNc usando el kit de ARN a ADNc de alta capacidad (Invitrogen). El ADNc se amplificó usando PCR con los siguientes cebadores:
hTERT-F: 5'-GCCCTCAGACTTCAAGACCA (SEQ ID NO:1)
3'-hBB-R: 5'-AGGCAGAATCCAGATGCTCA (SEQ ID NO:2)
GAPDH-F: 5'-GTGGACCTGACCTGCCGTCT (SEQ ID NO:3)
GAPDH-R: 5'-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT (SEQ ID NO:4)
Western blot. La proteína se cosechó lavando las células una vez con PBS y a continuación lisando las células en amortiguador RIPA. La proteína se ejecutó en NuPAGE Novex Tris-Acetate Gels, se transfirió a la membrana PVDF durante 2 h a 35 V, a continuación se hibridó a tubulina anti-alfa (Sigma a 1:10.000) y anticuerpo anti-TERT (ABCAM 32020 a 1:1000 o Rockland 600-401-252S a 1:500) y anti-noche a 4 °C. La detección secundaria se realizó utilizando anticuerpos infrarrojos (680 nm y 800 nm) (LI-COR) y el generador de imágenes Odyssey (LI-COR). Las imágenes se analizaron usando ImageJ.
Q-FISH. Las células se incubaron en 0,1 ug/ml de colcemida durante 4 horas antes de la fijación y preparación de los esparcimientos de metafase siguiendo el procedimiento de Lansdorp y col. A continuación se tiñeron 41 portaobjetos usando el kit Telomere PNA FISH/kit FITC (Dako, Dinamarca), sustituyendo la sonda telomérica marcada con AlexaFluor 555 (BioSynthesis, EUA) por la sonda del kit. Cada célula se capturó en imágenes en un microscopio DeltaVision (Applied Precision, Inc., Washington) usando software SoftWoRx usando un objetivo de aceite 60X o 100X a intervalos de 0,2 micrones en un intervalo de 3 micrones usando una etapa motorizada, y se utilizó software personalizado para identificar la imagen donde cada punto de telómero estaba enfocado e integrar su intensidad en esa imagen de enfoque. La variación temporal en la intensidad de iluminación se compensó con el uso del fotosensor DeltaVision, que registró la intensidad de iluminación de cada imagen, y la variación en la intensidad espacial y el error de lectura y corriente oscura del CCD se compensó mediante la adquisición de imágenes de campo plano e imágenes de campo oscuro, respectivamente. Al menos 15 células en metafase contribuyeron a cada repetición y cada muestra se midió en al menos duplicado durante al menos dos experimentos separados.
Curvas de crecimiento. Las células se cosecharon y se contaron con un hemocitómetro, ya que un contador automatizado no pudo contar con precisión las células cuando la población se volvió heterogénea con respecto al diámetro a medida que la población entró en senescencia replicativa. Las imágenes se adquirieron para permitir la medición de los diámetros de las células. La PD se calculó como el log2 de la relación de números de células al final e inicio de cada período de cultivo entre pasajes.
Estadísticas. El análisis estadístico se realizó utilizando Microsoft Excel. Las barras de error representan la media de 6 s.e.m. Las longitudes de los telómeros se compararon usando pruebas T con P < 0,05 (dos colas) consideradas estadísticamente significativas.
Ejemplo 2. Efectos del tratamiento con ARNmod TERT sobre las células endoteliales humanas
Los efectos del tratamiento con ARNmod de TERT no se limitan a las células de fibroblastos. Como se muestra en la figura 9, las células endoteliales dérmicas microvasculares humanas («HMDEC») muestran curvas de duplicación normales, con inicio temprano de senescencia en aproximadamente el pasaje #12 y con células completamente senescentes en el pasaje #17. Como se muestra en la figura 10, el tratamiento de estas células en el pasaje #18 con ARNmod de hTERT sin mutaciones (barra derecha en cada serie) da como resultado la reversión de la senescencia, mientras que el tratamiento de control (barra izquierda en cada serie), o el tratamiento con ARNmod de hTERT mutante (barra media en cada serie), no tuvo efecto sobre la senescencia celular.
La figura 11 demuestra los efectos de varios tratamientos sobre el crecimiento de HMDEC. Específicamente, las células tratadas tres veces con ARNmT sin mutaciones (WT) entre el pasaje #10 y el pasaje #11 continuaron creciendo, mientras que las células no tratadas (UT), las células tratadas solo con portador (CO) y las células tratadas con un TERT catalíticamente inactivo (CI) dejaron de duplicarse.
La figura 12 muestra los resultados de la tinción con p-galactosidasa (bGAL) de HMDEC en el pasaje #14 después del tratamiento con ARNmod CI y WT. Esta tinción mide la actividad de la p-galactosidasa a pH 6, que es una propiedad de las células senescentes que no se encuentra en las células presenescentes, inactivas o inmortales. Véase Dimri et al. (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 92:9363-7.
PROCEDIMIENTOS
La curva de duplicación de población acumulada de HMDEC se construyó utilizando un formato de placa de 12 pocilios. Aproximadamente 105 de las HMDEC se recultivaron en placas en cada punto de tiempo por triplicado y el recuento de células se realizó el día 4 después del recultivo en placa anterior. Como se muestra en la figura 9, el pasaje #12 se determinó como el punto de inicio temprano de la senescencia de HMDEC.
Como se muestra en la figura 10, aproximadamente 105 HMDEC se transfectaron dos veces cada dos días con 0,75 mg de ARNmod codificantes de hTERT-CI, y -WT en presencia del control de solo portador (CO, RNiMAX). El recuento de células se realizó en los Pasajes #19, 20 y 21 cada vez en el día 5 después del recultivo.
Para el experimento que se muestra en la figura 11, en el intervalo entre el pasaje #10 y #11 (y, como se señaló anteriormente, el pasaje #12 corresponde al inicio temprano de la senescencia de HMDEC), se cultivaron aproximadamente 5 x 105 HMDEC por matraz de 75 cm3 en medio EBM-2 soportado con suplemento EGM-2 MV (ambos de Lonza, Walkersville, MD, EE: UU., n.° de catálogo CC-3156 y CC-4176, respectivamente). Las células microvasculares se transfectaron tres veces cada dos días con 5 mg de ARNmod codificante de hTERT-WT (WT) y hTERT-CI (CI) en presencia de matraces de control sin tratar (UT) y portadores solo (CO, RNAiMAX). En cada punto de tiempo, se colocaron en placas 5 x 105 células y, a partir del pasaje #11 se realizó un recuento celular mediante hemocitómetro en 5 días después de la colocación. Para cada punto de tiempo, cada condición experimental se realizó por triplicado.
Para los experimentos mostrados en la figura 12, aproximadamente 105 de cada NT, hTERT-CI y hTERT-WT HMDEC del pasaje #14 se trataron como se describe en la figura 10. Las células a continuación se sometieron a análisis de células senescentes en base a una tinción histoquímica para la actividad de p-galactosidasa a pH 6 usando un kit de tinción histoquímica de células senescentes (Sigma, n.° de catálogo CS0030). El lado izquierdo de la diapositiva muestra imágenes representativas de células (NT) no tratadas y células tratadas con ARNmod de hTERT-CI (CI) o hTERT-WT (WT). Todas las imágenes se obtuvieron en condiciones idénticas de adquisición de imágenes. Cada condición experimental se realizó por triplicado, y el porcentaje de células positivas para la actividad de p-galactosidasa (como se representa en el gráfico) para cada condición se calculó como un promedio de células positivas en tres zonas capturadas aleatoriamente.
Ejemplo 3. Caracterización adicional de los efectos del tratamiento con ARNmod de TERT en células humanas
En este ejemplo, el ARNm se transfectó a través de un lípido catiónico en fibroblastos y mioblastos humanos primarios (figura 13A), células que se sabe que tienen una capacidad proliferativa limitada. Webster and Blau (1990) Somat Cell Mol Genet. 16:557-565; Hayflick and Moorhead (1961) Exp Cell Res. 25:585-621; Yakubov et al. (2010) Biochem Biophys Res Commun. 394:189-193. La eficiencia de transfección se determinó usando cuantificación unicelular citométrica de flujo de fluorescencia después de la administración de ARNm de GFP, que mostró que la mayoría de las células (>90 %) se transfectaron incluso a concentraciones relativamente bajas de ARNm modificado (0,1 mg/ml) (figura 13B y figura 16A-C). El tratamiento de células con concentraciones iguales de ARNm de TERT exógena o ARNm que codifica una forma catalíticamente inactiva (CI) de TERT dio como resultado la internalización de cantidades similares de ARNm (figura 16D), tal como se midió mediante RT-qPCR 24 h después del primer tratamiento. CI TERT tiene una mutación de sustitución en una de las tríadas de aspartatos que coordinan metales en el sitio catalítico del dominio de transcriptasa inversa de TERT. Como resultado, CI TERT no puede agregar nucleótidos a los telómeros, sin embargo, permanece estructuralmente intacta, capaz de unirse al ADN de plantilla y exhibe estabilidad comparable a TERT sin mutaciones en lisados de reticulocitos. Wyatt (2009) Structure-Function Analysis of the Human Telomerase Reverse Transcriptase. Ni el tratamiento con ARNm de TERT ni CI CERTE afectaron a los niveles de ARNm de TERT endógeno con respecto a las células no tratadas, tal como se midió mediante RT-qPCR (figura 16E). La transfección con 1 mg/ml de ARNm de TERT o CI de TERT dio como resultado aumentos equivalentes del 50 % (p < 0,05 y < 0,01, respectivamente) en la cantidad de proteína de TERT en fibroblastos (figura 13C, panel izquierdo). Wick et al. (1999) Gene. 232:97-106; Ahmed et al. (2008) J Cell Sci. 121:1046-1053. La presencia de proteína de TERT endógena en células con poca actividad telomerasa endógena es consistente con la abundancia relativa de variantes de empalme inactivas de TERT en muchos tipos de células y la regulación inhibitoria postraduccional extensa de la actividad de TERT como se informó previamente por otros. Yi et al. (2001) Nucleic Acids Res. 29:4818-4825; Cifuentes-Rojas and Shippen (2011) Mutat Res. [published online ahead of print: October 18, 2011]; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. El tratamiento con cantidades crecientes de ARNm de TERT dio como resultado un aumento dependiente de la dosis de la expresión de la proteína de TERT tal como se midió en ensayos unicelulares mediante citometría de flujo (figura 13C, panel derecho).
La actividad telomerasa aumenta transitoriamente. Para evaluar si la administración de ARNm de TERT modificado dio como resultado la generación de proteína de TERT funcional, la actividad telomerasa se cuantificó usando un ensayo TRAP a base de gel. La actividad telomerasa se detectó en fibroblastos y mioblastos en todas las dosis de
ARNm de TERT evaluadas (0,25, 0,5, 1,0 y 2,0 mg/ml), y no se detectó en células no tratadas o células tratadas con
ARNm modificado o solo vehículo que codifica CI TERT, incluso en la dosis más alta de 2,0 mg/ml (figura 13D). Aunque
TERT requiere que TERC forme un complejo telomerasa funcional, la administración de TERT sola fue suficiente para aumentar la actividad de la telomerasa, según los hallazgos previos de que TERT es a menudo limitante, ya que el número de copias de ARN de TERC es alto en muchos tipos de células que carecen de actividad telomerasa, incluidos
los fibroblastos. Yi et al. (2001) Nucleic Acids Res.29:4818-4825. Un curso temporal reveló que la actividad telomerasa alcanzó su punto máximo a las 24 horas y volvió a los niveles basales dentro de las 48 horas posteriores a una única transfección. Este marco de tiempo es consistente con las semividas previamente registradas de ARNm de TERT humana (2-4 h), ARNm de p-globina humana (17-18 h: nuestro ARNm de TERT exógena está flanqueado por pglobina 5' y 3' UTR) y la actividad de la telomerasa en células expuestas a un inhibidor de la síntesis de proteínas (dependiente del tipo celular, pero normalmente >24 h). Kabnick and Housman (1988) Mol Cell Biol. 8:3244-3250; Holt et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA. 94:10687-10692; Xu et al. (1999) Br J Cancer. 80:1156-1161.
Alargamiento de telómeros. Las longitudes de los telómeros en los fibroblastos sin tratar disminuyeron con el tiempo
(3 meses) como se esperaba (62) (figura 14A) y se cuantificaron usando dos procedimientos distintos. Se utilizó el procedimiento qPCR multiplexado monocromático (MMqPCR) para evaluar la longitud, y las mediciones se validaron
de forma independiente con un procedimiento qPCR realizado por SpectraCell Laboratories, Inc. (coeficiente de correlación 0,97, p < 0,001). Administración de ARNm de TERT tres veces en sucesión en intervalos de 48 horas a fibroblastos o mioblastos comenzando con la duplicación de la población (PD) 25 y 6, respectivamente, telómeros extendidos en 0,960,1 kb (2263 %) y 0,760,1 kb (1262 %), respectivamente (figura 14B, C). El tratamiento solo
con vehículo o ARNm de CI TERT no tuvo un efecto significativo en la longitud de los telómero con respecto a las
células sin tratar. La tasa media de extensión telomérica en fibroblastos fue de 135615 pb/PD.
Aumentos dependientes del tipo celular en la capacidad proliferativa. Para evaluar el efecto de la administración de
ARNm de TERT modificado y la consiguiente extensión telomérica sobre la capacidad proliferativa celular, se transfectaron fibroblastos humanos una, dos o tres veces en sucesión. Los tratamientos se administraron en intervalos
de 48 horas. Los fibroblastos sin tratar, tratados solo con vehículo y tratados con ARNm de TERT CI mostraron una meseta equivalente en el número de células después de aproximadamente 50-60 PD, mientras que las células tratadas
tres veces con ARNm de TERT continuaron proliferando para una PD adicional finita 2861,5 con un aumento general en el número de células de 2,7 x 108 más allá de las células sin tratar (figura 14D, panel izquierdo). El efecto fue dependiente de la dosis con cada tratamiento adicional que confería PD adicional (figura 14D, panel derecho). El aumento incremental de la capacidad proliferativa fue mayor con el primer tratamiento que con el segundo o tercer tratamiento. Los mioblastos humanos tratados tres veces consecutivas cada 48 horas ganaron 3,4 6 0,4 PD, equivalente a un aumento de 10 veces en el número de células en comparación con los controles no tratados o tratados
con vehículo (figura 14E). Tales diferencias en la PD entre mioblastos y fibroblastos no son inesperadas, ya que estudios previos encontraron efectos limitados similares de la sobreexpresión de TERT a unos pocas PD y mostraron
que esta limitación se debió a una detención del crecimiento mediada por p16 en mioblastos humanos, en contraste
con los fibroblastos. Bodnar et al. (1998) Science. 279:349-352; Zhu et al. (2007) Aging Cell. 6:515-523. Tanto en fibroblastos como en mioblastos, el ARNm solo del vehículo o del CI TERT no tuvo ningún efecto sobre la capacidad proliferativa en comparación con los controles sin tratar. Estos datos muestran que la administración de ARNm de
TERT modificado es un procedimiento eficaz para aumentar la PD en cultivo. Es importante destacar que todas las
células tratadas estudiadas mostraron un aumento significativo en el número de células, pero finalmente alcanzaron
una meseta en sus curvas de crecimiento, lo que demuestra la ausencia de inmortalización.
Reducción transitoria de los marcadores de senescencia. A medida que las poblaciones de fibroblastos dejaron de
crecer, mostraron marcadores de senescencia que incluyen tinción de p-galactosidasa asociada a senescencia (p-gal) y tamaño agrandado (figura 15A-C). Cristofalo and Kritchevsky (1969) Med Exp Int J Exp Med. 19:313-320; Dimri et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA. 92:9363-9367; Cristofalo et al. (2004) Mech Ageing Dev. 125:827-848; Lawless et al. (2010) Exp Gerontol. 45:772-778. Estos cambios se redujeron de forma transitoria en los fibroblastos tratados con
ARNm de TERT en relación con las células sin tratar y las células que recibieron ARNm de CI TERT o vehículo solo.
Según los hallazgos de otros, no todas las células en las poblaciones que habían entrado en una meseta de crecimiento expresaron p-galactosidasa a niveles detectables. Lawless et al. (2010) Exp Gerontol. 45:772-778; Binet et al. (2009) Cancer Res. 69:9183-9191. Sin embargo, los fibroblastos y mioblastos transfectados con ARNm de TERT expresaron p-galactosidasa en el mismo grado que las células de control de cada tipo después de que las dos poblaciones alcanzasen una meseta de crecimiento. Estos datos demuestran que las células tratadas con ARNm de
TERT cesan final y previsiblemente la división y expresan marcadores de senescencia y, por lo tanto, es poco probable
que se transformen.
Este ejemplo demuestra que la administración transitoria de ARNm de TERT que comprende nucleótidos modificados
extiende los telómeros humanos y aumenta la capacidad proliferativa celular sin inmortalizar las células. La tasa de extensión telomérica en fibroblastos observada en esta invención de 135 6 15 pb/PD es comparable a las tasas registradas usando procedimientos virales, de 94 a >150 pb/PD (22, 69). Telómeros extendidos de ARNm de TERT modificado en fibroblastos en pocos días en 0,960,1 kb. Se ha informado que las longitudes de los telómeros de los fibroblastos se acortan a lo largo de la vida humana en aproximadamente 1-2 kb de media. Allsopp et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA. 89:10114-10118. Por lo tanto, el ARNm de TERT modificado es eficaz, pero transitorio y no se integra, superando las principales limitaciones de la administración de ARNm de TERT viral expresado de forma constitutiva.
Las células humanas de mayor interés a menudo son limitadas en número, incluidas las células madre para su uso en experimentación o medicina regenerativa. Este problema está siendo abordado actualmente por varios procedimientos, incluidos la transferencia nuclear somática, procedimientos virales para la administración de genes y el uso de condiciones de cultivo que disminuyen la tasa de acortamiento de los telómeros. Le et al. (2013) Cell Stem Cell. [published online ahead of print: November 19, 2013]; doi:10.1016/j.stem.2013.11.005; Zimmermann and Martens (2008) Cell Tissue Res. 331:79-90; Mohsin et al. (2013) Circ Res. 113:1169-1179. El tratamiento de ARNm de TERT modificado descrito en esta invención proporciona un complemento ventajoso o una alternativa a estos procedimientos que es breve, extiende rápidamente los telómeros y no arriesga la mutagénesis de inserción. La brevedad del tratamiento con ARNm de TERT es en particular atractiva porque puede evitar la pérdida del fenotipo de células madre que puede ocurrir con el tiempo en el cultivo (Gilbert et al. (2010) Science. 329:1078-1081) y acortar la etapa posterior a la reprogramación de la generación de iPSC durante la cual se extienden los telómeros (Wang et al. (2012) Cell Res.
22:757-768). Dicho procedimiento de extensión telomérica tiene el potencial de aumentar la utilidad de distintos tipos celulares para modelar enfermedades, detectar fármacos mejoradores y usar en tratamientos celulares.
Se observó un espectro de efectos sobre la capacidad proliferativa para los tipos de células analizados, según estudios previos que demostraron distintos efectos de la sobreexpresión de TERT en la capacidad proliferativa de mioblastos y fibroblastos. Bodnar et al. (1998) Science. 279:349-352; Zhu et al. (2007) Aging Cell. 6:515-523. Además, la cantidad de extensión telomérica no se correlacionó con la capacidad proliferativa. Por lo tanto, el contexto celular determina la eficacia de la expresión de TERT en la capacidad proliferativa y una comprensión de los factores que median este efecto es de interés para superar esta limitación. Los factores que se han implicado en la limitación de la capacidad proliferativa de los mioblastos tras la sobreexpresión de TERT viral incluyen la detención del crecimiento mediada por p16, el tipo y la cepa celular y las condiciones de cultivo. Zhu et al. (2007) Aging Cell. 6:515-523. De manera más general, el efecto puede estar mediado por el daño no telomérico del ADN, la edad y la integridad mitocondrial. Sahin et al. (2011) Nature. 470:359-365; Mourkioti et al. (2013) Nat Cell Biol. 15:895-904; L6pez-Otfn etal. (2013) Cell.
153:1194-1217. La ausencia de un aumento en la longitud del telómero o la capacidad proliferativa celular en las células transfectadas con ARNm de CI TERT es consistente con el tratamiento que actúa a través del sitio catalítico de TERT mediante el cual se agregan nucleótidos directamente a los telómeros. Las poblaciones de células tratadas con ARNm de TERT aumentaron en número exponencialmente durante un período de tiempo y a continuación finalmente dejaron de expandirse y mostraron marcadores de senescencia en un grado similar al de las poblaciones no tratadas, según la ausencia de inmortalización.
La naturaleza transitoria no integradora del ARNm modificado y el aumento finito en la capacidad proliferativa observados aquí lo hacen más seguro que los vectores virales o de ADN utilizados actualmente. Además, el procedimiento extiende rápidamente los telómeros para que el tratamiento pueda ser breve, después de lo cual el mecanismo protector de acortamiento de telómeros permanece intacto. Este procedimiento se puede utilizar ex vivo para tratar tipos de células que median ciertas afecciones y enfermedades, tales como células madre hematopoyéticas o progenitores en casos de inmunosenescencia o insuficiencia de médula ósea. Además, se puede administrar ARNm modificado a determinados tejidos in vivo. Kormann et al. (2011) Nat Biotechnol. 29:154-157. En resumen, el procedimiento rápido y seguro para la extensión rápida de los telómeros descritos en la presente conduce a la senescencia retardada y al aumento de la capacidad proliferativa celular sin inmortalizar las células humanas.
PROCEDIMIENTOS
Generación y síntesis de plantillas de ARNm. Para generar ARNm modificado que codifica GFP, TERT y CI TERT, sus marcos de lectura abiertos (ORF) respectivos se insertaron en el MCS de un plásmido de partida que contiene el promotor T7, la UTR 5' de b-globina humana (HBB), el MCS, la UTR 3' de HBB, una secuencia de poli-A de 151 pb y un sitio de restricción para la linealización con una enzima de clase II que sigue la secuencia de poli-A. Los plásmidos intermedios resultantes se secuenciaron, linealizaron y transcribieron usando el amortiguador y ARN polimerasa del kit MEGAscript T7 (Ambion, Austin, Texas, EE. UU.), y una mezcla personalizada de nucleótidos canónicos y no canónicos (TriLink BioTechnologies, San Diego, CA, e E. UU.) donde las concentraciones de nucleótidos finales por reacción IVT de 40 ml fueron 7,5 mM para cada uno de entre adenosina-5'-trifosfato (ATP), 5-metilcitidina-5'-trifosfato (m5C) y pseudouridina-5'-trifosfato (V), 1,5 mM para guanosina-5'-trifosfato (GTP) y 6 mM para el análogo con caperuza (ARCA) (New England Biolabs, Ipswitch, MA, EE. UU.), o una relación molar de ATP:m5C:'I':GTP:ARCA de 1:1:1:0.2:08. Para disminuir aún más la inmunogenicidad potencial del ARNm relacionado con la fracción que contiene 5'- 3P, los productos IVT se trataron con fosfatasa antártica (New England Biolabs). El tamaño y la integridad de los productos de ARNm se verificaron usando electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante. El ORF de TERT humana sin mutaciones utilizado para generar las plantillas de ADN para la síntesis de ARNm es idéntico al variante 1 del transcripto de TERT humana NCBI (secuencia de referencia NM_198253.2). El ORF se generó a partir del plásmido pBABE-neo-hTERT (Counter et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA. 95:14723-14728) (plásmido 1774, Addgene, Cambridge, MA, EE. UU.). El plásmido pBABE-neo-hTERT tenía una mutación no silenciosa en el residuo 516 en el motivo QFP de TERT, un motivo asociado con la multimerización y la interacción de TERT con el ARN de TERC, y por lo tanto, para evitar la posibilidad de artefactos debido a esta mutación, hicimos la secuencia idéntica a la secuencia de referencia de NCBI al corregir la mutación con el cambio G516D. El mutante CI TERT se generó a partir de la secuencia de TERT mediante la introducción de la mutación D712A.
Tratamiento y cultivo celular. Los fibroblastos MRC5 de pulmón fetal primario humano se obtuvieron a partir de ATCC (Manassas, Va , EE. UU.) en el paso 14. ATCC no indica el número de PD, por lo tanto, nuestros valores de PD citados en esta invención se refieren al número de PD después de la recepción de células de ATCC. Las células MRC5 se cultivaron en DMEM con FBS al 20 % y penicilina-estreptomicina. Los mioblastos de músculo esquelético primario humano de 30 años (Lonza, Allendale, NJ, EE. UU.) se cultivaron en medios SkGM-2 (Lonza) según las instrucciones del proveedor. Los duplicados de población se calcularon como el logaritmo en base 2 de la relación entre las células recogidas y las células colocadas en placas en el paso anterior, y se consideraron cero si se recogieron menos células que las colocadas en placas. Las células se transfectaron con ARNm de TERT modificado usando ARNiMax de lipofectamina (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.) preparado en medio sérico reducido OptiMEM (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.) y se agregaron a las células en una relación 1:5 v:v con sus medios normales para lograr las concentraciones finales indicadas en esta invención.
Medición de la actividad telomerasa. Veinticuatro horas después del inicio del período de transfección, las células se recogieron y se lisaron en tampón CHAP. El ensayo TRAP se realizó utilizando una versión modificada del kit TRAPeze (EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.), donde se añadieron los cebadores y la polimerasa después, en lugar de antes, de la etapa durante la cual se extiende el sustrato de telómero artificial. El programa de PCR fue 94 °C 30 s / 59 °C 30 s / 72 °C 45 s durante 30 ciclos, y los productos se ejecutaron en un gel de poliacrilamida al 15 % en tinción de TBE 0,5X con tinción en gel de ácido nucleico SYBR Gold (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.). El curso temporal de la actividad de la telomerasa se realizó utilizando el kit TRAPeze RT (EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.).
Western blot. La proteína se cosechó lavando las células una vez con PBS y a continuación lisando las células en amortiguador RIPA (Cell Signaling Technology, Danvers MA, EE. UU.). La proteína se ejecutó en NuPAGE Novex Tris-Acetate Gels (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.), se transfirió a la membrana PVDF durante 2 h a 35 V, a continuación se hibridó a tubulina anti-a (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) a 1:10.000 y anticuerpo anti-TERT (ABCAM, Cambridge, MA, EE. UU., 32020 a 1:1000; o Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, Ee . UU., 600­ 401-252S a 1:500) y se incubó durante la noche a 4 °C. La detección se realizó utilizando anticuerpos infrarrojos (680 nm y 800 nm) (LI-COR, Lincoln, NE, EE. UU.) y el generador de imágenes Odyssey (LI- COR). La intensidad total de cada banda se cuantificó usando ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EE. UU.). La intensidad de cada banda de TERT se normalizó por su banda de tubulina a correspondiente.
Citometría de flujo. Las células se recogieron 24 h después de la transfección con las dosis indicadas (figura 16A-C) de ARNm de TERT y se tiñeron con anticuerpo anti-TERT (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, EE. UU.; 600-401-252S) a 1:500.
Medición de la longitud de los telómeros por SpectraCell Laboratories, Inc. El ADN genómico se extrajo usando fenol cloroformo y se cuantificó usando el Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Assay Kit (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.). El análisis de la longitud de los telómeros se realizó en SpectraCell Laboratories Inc. (Houston, TX, EE. UU.) utilizando un ensayo
qPCR de alto rendimiento autorizado CLIA, esencialmente como se describe por Cawthon et al. Cawthon (2002) Nucleic Acids Res. 30(10):e47; Cawthon (2009) Nucleic Acids Res. 37(3):e21. El ensayo determina una longitud de telómero relativa midiendo el factor por el cual la muestra difiere de una muestra de ADN de referencia en su relación entre número de copia repetida de telómero y número de copia del gen individual (36B4). Se cree que esta relación (relación T/S) es proporcional a la longitud media del telómero. Todas las muestras se ejecutaron al menos por duplicado con al menos un control negativo y dos controles positivos de dos longitudes de telómero conocidas distintas (alta y baja) y se observó una varianza promedio de hasta un 8 %. Los resultados se registraron como una puntuación de telómeros equivalente a la longitud media de los telómeros en kb.
Medición de la longitud de los telómeros mediante MMqPCR. La longitud del telómero se midió usando una versión modificada del protocolo MMqPCR desarrollado por Cawthon (Cawthon (2009) Nucleic Acids Res. 37(3):e21) con los cambios siguientes: Se agregaron ciclos de preamplificación de PCR adicionales para hacer que el producto de telómero se amplificara antes, ampliando la brecha entre las señales de los genes de telómero y de copia única; se determinó experimentalmente que una mezcla de dos polimerasas Taq daba como resultado mejores eficiencias de reacción de PCR que cada una por sí sola; la reducción de la concentración de SYBR Green de 0,75X a 0,5X dio como resultado una señal más temprana. El ADN genómico se recogió de células usando el kit PureGene (Qiagen Germantown, MD, EE. UU.) con digestión de RNasa, se cuantificó usando un NanoDrop 2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), y se usaron 10-40 ng por reacción de qPCR de 15 ml realizada por cuadruplicado usando un sistema de PCR LightCycler 480 (Roche, Basilea, Suiza). Se incluyó una dilución en serie de ADN de referencia que abarca cinco puntos de 100 ng/ml a 1,23 ng/ml en cada ensayo para generar una curva estándar necesaria para la cuantificación de ADN de muestra. Las concentraciones finales de reactivos en cada reacción de PCR de 15 ml fueron: 20 mM de Tris-HCl pH 8,4, 50 mM de KCl, 3 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTP cada uno, 1 mM de DTT, 1 M de betaína (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE. UU.), 0,5X de SYBR Green I (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.), 0,1875U de Platinum Taq (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. Uu .), 0,0625X de Titanium Taq (Clontech) y 900 nM de cada cebador (secuencias de cebador telg, telc, hbgu y hbgd especificadas en Cawthon (2009) Nucleic Acids Res.
37(3):e21. El programa de ciclado térmico fue: 2 minutos a 95 °C; seguido de 6 ciclos de 15 s a 95 °C, 15 s a 49 °C; seguido de 40 ciclos de 15 s a 95 °C, 10 s a 62 °C, 15 s a 72 °C con adquisición de señal, 15 s a 84 °C y 10 s a 88 °C con adquisición de señal. Se utilizó el software Roche LightCycler 480 para generar curvas estándar y calcular las concentraciones de ADN de los genes de copia única y teloméricos para cada muestra. Se calcularon las relaciones T/S para cada réplica de muestra, y el resultado se promedió para producir la relación T/S de muestra que se calibró utilizando muestras de réplica cegadas de células de referencia enviadas a SpectraCell como se describió anteriormente. Los valores relativos obtenidos de forma independiente de las relaciones T/S medidos usando MMqPCR y por SpectraCell para las mismas muestras fueron altamente consistentes (coeficiente de correlación = 0,97, p < 0,001).
qPCR de transcripción inversa. Los cebadores se diseñaron usando Primer3 (Untergasser et al. (2012) Nucleic Acids Res. 40:e115) y se enumeran en la Tabla 9, excepto donde se indique lo contrario. Veinticuatro horas después del inicio del tratamiento, las células se lavaron tres veces con PBS antes de la recogida en Buffer RLT (Qiagen, Germantown, MD, EE. UU.). El ARN se convirtió en ADNc usando mezcla maestra de ARN a ADNc de alta capacidad (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.). El ARNm de TERT endógeno se amplificó usando un cebador directo en el marco de lectura abierto de TERT y un cebador inverso en la UTR 3' de ARNm de TERT endógeno. Se amplificó el ARNm de TERT exógena usando un cebador directo en el marco de lectura abierto de ARNm de TERT y un cebador inverso en la UTR 3' de HBB presente en nuestro ARNm de CI TERT y TERT exógena, pero no en ARNm de TERT endógena. Los niveles relativos se calcularon utilizando el procedimiento Pfaffl. Los genes de referencia fueron RPL37A (usando cebadores especificados en Greber et al. (2011) EMBO J. 30: 4874-4884) y GAPDH, ninguno de los cuales presentó un cambio significativo en el valor de Ct en las células de control o tratadas.
Tabla 9: Secuencias de cebadores.
Diana Cebador hacia delante (5'-3') Cebador hacia atrás (5'-3') Longitud del ___________________________________________________________________________ producto (pb) TERT hTERT (NM_198253.2) 3'UTR of HBB 162
exógena GTCACCTACGTGCCACTCCT (SEQ ID AGCAAGAAAGCGAGCCAAT (SEQ
NO:5) ID NO: 6)
TERT hTERT (NM_198253.2) 3' UTR of hTERT (NM_198253.2) 74
endógena GCCCTCAGACTTCAAGACCA (SEQ ID GCTGCTGGTGTCTGCTCTC (SEQ
NO:7) ID NO: 8)
GAPDH CAATGACCCCTTCATTGACC (SEQ ID TTGATTTTGGAGGGATCTCG (SEQ 159
NO:9) ID
NO:10)
Tinción de p-galactosidasa asociada a la senescencia y puntuación del tamaño celular. La tinción de p-gal se realizó utilizando el kit de tinción de p-galactosidasa de senescencia (Cell Signaling Technology, Danvers MA, EE. UU.). Al menos 50 células por población se puntuaron por duplicado. El diámetro celular se calificó manualmente después de la tripsinización en una cuadrícula hemocitométrica. Cristofalo and Kritchevsky (1969) Med Exp Int J Exp Med. 19:313320.
Estadísticas. Las pruebas T de Student y los cálculos del coeficiente de correlación de Pearson se realizaron utilizando Microsoft Excel. Las barras de error representan la media de 6 s.e.m.
Ejemplo 4. Administración de ARNmod de TERT a las células por electroporación
Los compuestos de ARNmod de TERT de la descripción también se pueden administrar a las células mediante electroporación, tal como se ilustra en las figuras 18-20, utilizando parámetros de electroporación, que incluyen la concentración de ARNmod de TERT, la forma de onda de voltaje y la geometría del electrodo adecuadas para lograr una eficiencia y viabilidad de transfección óptimas en un tipo de célula dado. La figura 21 muestra la dependencia de la actividad telomerasa de la dosis de ARNmod de TERT administrada por electroporación.
Ejemplo 5. Administración de un ARNmod a células sanguíneas humanas
Los linfocitos T CD8+ se transfectaron con ARNmod de la manera siguiente. La capa esponjosa de sangre humana completa se centrifugó en medio de gradiente de densidad Lymphoprep (Axis-Shield) para obtener células mononucleares que se lavaron dos veces y a continuación se agotaron de leucocitos no CD8+ usando el kit Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells (Life Technologies). Las células CD8+ se estimularon usando Dynabeads Human T-Activator CD3.CD28 (Life Technologies) y se cultivaron durante 4 días usando medios de cultivo de células T OpTimizer complementados con 30.000 U/ml de IL-2. A continuación se transfectaron los linfocitos T con ARNmod que codifica GFP nuclear y TERT a una concentración de 50 mg/ml en un volumen de 20 ml de solución de Nucleofector P3 que contiene el Suplemento 1. Las células se analizaron para determinar la fluorescencia y viabilidad 24 horas después de la transfección. Los resultados de la transfección se muestran en la figura 22. La fluorescencia brillante demuestra un alto número de copias, con una eficiencia de transfección superior al 90 % con alta viabilidad.
Ejemplo 6. Expresión de telomerasa en queratinocitos humanos usando un ARNmod de telomerasa
Como se muestra en la figura 23, la electroporación de queratinocitos humanos con ARNmod de TERC da como resultado la expresión de la actividad telomerasa en las células. Los queratinocitos primarios humanos (Lonza) se suspendieron a una densidad de 3x107 células/ml en medio OptiMEM (Life Technologies) que contenía 50 mg/ml de ARNmod codificante de TERT catalíticamente inactivo (CI) o TERT sin mutaciones. Se colocaron 10 ml de la suspensión celular en una cubeta de separación de 1 mm y se electroporaron usando un pulsador de genes (BioRad) usando 200 V, 1000 Ohmios y 25 microfaradios. Las células se devolvieron inmediatamente al medio KGM-2 (Lonza) y se incubaron durante 24 horas antes de recogerlas para medir la actividad de la telomerasa usando el ensayo TRAPeze a base de gel (Millipore). Cada reacción TRAp de 25 ml se realizó usando 1 mg de proteína total, con muestras duplicadas calentadas a 85 °C durante 10 minutos para inactivar la telomerasa. Las muestras de CI TERT de solo electroporación sin tratar sirvieron como controles negativos, y las células 293T y TSR8 sirvieron como controles positivos.
Ejemplo 7. Expresión de una proteína codificada por ARNmod mediante administración in vivo
El ARNmod administrado in vivo puede dar como resultado la expresión de una proteína funcional codificada por el ARNmod. Kormann et al. (2012) Nature Biotechnology 29:154-157; Kariko et al. (2012) Molecular Therapy 20:948-93. Esto se ha confirmado aquí mediante la formación de complejos de 2 mg de ARNmod que codifica luciferasa con un vehículo de lípidos catiónicos (TransIT) y la inyección intravenosa en 50 ml de OptiMEM (Life Technologies) en una cola de roedor. El bazo se recolectó y trató con luciferina y se analizó para determinar la actividad de la luciferasa mediante el uso de un generador de imágenes de bioluminiscencia IVIS (Perkin-Elmer). Como se muestra en la figura 24, la actividad luciferasa se detectó en el sitio de inyección y en el bazo (flechas).

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que comprende un ácido ribonucleico sintético que comprende al menos un nucleósido modificado y que codifica una transcriptasa inversa de telomerasa para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de
(a) una enfermedad que implica telómeros cortos seccionados de entre el grupo que consiste en síndrome metabólico, diabetes, úlceras diabéticas, enfermedad cardíaca, cáncer, demencia vascular, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, degeneración macular relacionada con la edad, inmunosenescencia, insuficiencia de médula ósea, úlceras gastrointestinales, cirrosis, hernia, infección, infección crónica, deterioro cognitivo leve o grave, movilidad alterada, osteoporosis, osteoartritis, artritis reumatoide, ansiedad relacionada con la edad, trastornos del equilibrio, acúfenos, parálisis de Bell, cataratas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, abrasión corneal, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad de las arterias periféricas, conjuntivitis, chalazión, deshidratación, depresión, enfisema, enfermedad ocular, retraso del crecimiento, gripe, trastorno de ansiedad generalizada, glaucoma, pérdida de la audición, pérdida del sentido del gusto, pérdida del apetito, dislocación de la cadera, pérdida de la memoria, enfermedad de Parkinson, estenosis espinal, incontinencia urinaria y fractura vertebral; o
(b) una enfermedad relacionada con la edad en un sujeto animal que padece o está en riesgo de padecer una enfermedad relacionada con la edad, donde la enfermedad relacionada con la edad implica telómeros cortos; donde la transcriptasa inversa de la telomerasa se expresa de forma transitoria en una célula; y
donde al menos un telómero se extiende dentro de la célula; y
donde el al menos un nucleósido modificado comprendido en el ácido ribonucleico sintético confiere inmunogenicidad reducida al ácido ribonucleico sintético.
2. El compuesto de la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 1, donde el ácido ribonucleico comprende una caperuza 5', una región no traducida 5', una región no traducida 3' y una cola de poli-A; y
(a) la cola de poli-A aumenta la estabilidad del ácido ribonucleico, opcionalmente, donde la cola de poli-A es al menos 75 nucleótidos, 100 nucleótidos, 125 nucleótidos, 150 nucleótidos; o
(b) la región no traducida 5' o la región no traducida 3' comprenden una secuencia de un ARNm estable o un ARNm que se traduce de manera eficiente; o
(c) la región no traducida 5' y la región no traducida 3' comprenden una secuencia de un ARNm estable o un ARNm que se traduce de manera eficiente; o
(d) la caperuza 5', la región no traducida 5' o la región no traducida 3' estabiliza el ácido ribonucleico o aumenta la velocidad de traducción del ácido ribonucleico.
3. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde el compuesto está comprendido en una composición, donde la composición comprende además un vehículo de administración; y donde el vehículo de administración no es un vehículo de administración viral.
4. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la enfermedad relacionada con la edad comprende infarto de miocardio, demencia vascular, diabetes con complicaciones, cáncer, accidente cerebrovascular, enfermedad de Alzheimer o infección.
5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la enfermedad relacionada con la edad comprende una forma de fibrosis pulmonar idiopática, disqueratosis congénita o anemia aplásica.
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