RS62824B1 - Medicinska upotreba koja se odnosi na produžetak telomera - Google Patents

Description

Opis

Stanje tehnike

[0001] Telomeri obuhvataju ponavljajuće sekvence DNK na krajevima linearnih hromozoma koje, kada su dovoljno dugačke, omogućavaju svakom kraju hromozoma da formira petlju koja štiti krajeve od delovanja kao dvolančane ili jednolančane DNK prekida. Artandi & DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18. Telomere se vremenom skraćuju, delom zbog oksidacije oštećenje i nepotpuna replikacija DNK, što na kraju dovodi do kritično kratkih telomera nesposobnih da formiraju zaštitnu petlju, izlaganja krajeva hromozoma, fuzije hromozoma i hromozoma, odgovora na oštećenje DNK i ćelijskih starenja, apoptoza ili maligniteta. O’Salivan i Karlseder (2010) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11:171-181; Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707; Artandi i DePinho (2010) Karcinogeneza 31:9-18.

[0002] Enzimska supstanca telomeraza proširuje telomere i sadrži dva bitna jedinjanja: reverznu transkriptazu telomeraze (TERT) i RNK jedinjenje poznato kao telomerazno RNK jedinjenje (TERC). Ostala jedinjenja supstance telomeraze uključuju proteine TCAB1, Diskerin, Gar1, Nhp2, Nop10 i RHAU. Brouilette i dr. (2003)

Arterioskleroza, tromboza i vaskularna biologija 23:842-846. TERT je ograničavajuće jedinjenje supstance telomeraze, i stoga tretmani koji povećavaju TERT mogu povećati aktivnost telomeraze. Aktivnost telomeraze se obično meri korišćenjem testa protokola telomernog ponavljanja amplifikacije (TRAP), koji kvantifikuje sposobnost ćelijskog lizata ili drugog uzorka da produži sintetičku sekvencu DNK nalik telomeru.

[0003] Kao što bi se očekivalo zbog važnosti održavanja dužine telomera u sprečavanju ćelijske senescencije i apoptoze i rezultirajuće ćelijske disfunkcije, genetske mutacije TERT i TERC su povezane sa fatalnim naslednim bolestima neadekvatnog održavanja telomera, uključujući oblike idiopatske plućne fibroze, kongenita diskeratoze i aplastična anemija. Efekti preranog ćelijskog starenja i apoptoze zbog kratkih telomera u ovim bolestima su sami po sebi razorni, a mogu biti pojačani povećanim rizikom od raka. Artandi i DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18; Alter et al. (2009) Blood 113:6549-6557. Pored obilja korelativnih podataka povezivanje kratkih telomera do raka (Ventzensen et al. (2011) Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 20:1238-1250), aplastična anemija pruža neke od prvih direktnih dokaza da kritično kratki telomeri i rezultirajuća hromozomska nestabilnost predisponiraju ćelije na malignu transformaciju kod ljudi (Calado i drugi (2012) Leukemia 26:700-707). Postoje dokazi da kratki telomeri prave razliku između fatalne i nefatalne mišićne distrofije (Sacco et al. (2010) Cell 143:1059-1071), i da produžetak telomera sprečava starenje endotelnih ćelija (Matsushita et al. (2001) Circ. Res. 89: 793-798), koji je povezan sa aterosklerozom, hipertenzijom i srčanim oboljenjima (Perez-Rivero et al. (2006) Circulation 114:309-317). Pored toga što su umešani u ove i druge bolesti, kratki telomeri takođe ograničavaju amplifikaciju ćelija za ćelijske terapije i primene bioinženjeringa. Mohsin et al. (2012) Journal of the American College of Cardiologi doi:10.1016/j.jacc.2012.04.0474.

[0004] Aktivator telomeraze dobijen iz prirodnog proizvoda, TA-65®, komercijalno je prodao T.A. Sciences, Inc. Harlei et al. (2011) Istraživanje podmlađivanja 14:45-56. Ovo jedinjenje navodno uključuje endogeni hTERT gen, aktivirajući tako ekspresiju prirodne telomeraze. Međutim, nije jasno kako ovaj tretman prevazilazi normalnu regulaciju aktivnosti prirodne telomeraze.

[0005] LJudske ćelije sa malo ili bez aktivnosti telomeraze su transfektovane vektorima koji kodiraju humani TERT (hTERT). Videti, npr., Bodnar et al. (1998) Science 279:349-352. Utvrđeno je da transfektovane ćelije eksprimiraju telomerazu, da prikazuju izdužene telomere, da se energično dele i da pokazuju smanjeno starenje u poređenju sa ćelijama kojima nedostaje telomeraza, ali genomska modifikacija koja je rezultat ovog tretmana povećava rizik i ograničava korisnost pristupa.

[0006] Ograničeni kapacitet replikacije je jedna od definišnih karakteristika većine normalnih ćelija. Krajnja tačka ovoga ograničeni replikacioni proces je starenje, zaustavljeno stanje u kome ćelija ostaje održiva, ali se više ne deli. Stareće ćelije se često karakterišu izmenjenim obrascem ekspresije gena, izmenjenom morfologijom i smanjenom ili poništenom sposobnošću da obavljaju svoje normalne funkcije.

[0007] Skraćivanje telomera igra direktnu ulogu u ćelijskom starenju u životinjskim tkivima tokom starenja. Štaviše, gomilaju se dokazi koji impliciraju kratke telomere u raznim bolestima, uključujući one opisane gore. Izgledi za prevenciju bolesti produženjem telomera motivišu potrebu za bezbednim i efikasnim tretmanima za proširenje telomera u životinjskim ćelijama in vivo i/ili in vitro. Dalje, postoji potreba za bezbednim i brzim proširenjem telomera u ćelijama za upotrebu u ćelijskoj terapiji, ćelijskom i tkivnom inženjeringu i regenerativnoj medicini.

[0008] Međutim, u isto vreme postoji opasnost u konstitutivnoj aktivaciji aktivnosti telomeraze. Zaista, za primenu u ćelijskoj terapiji, izbegavanje rizika od ovekovečenja ćelije je od najveće važnosti. U tom cilju, prolazna, a ne konstitutivna, aktivnost telomeraze može biti korisna za bezbednost, posebno ako je povišena aktivnost telomeraze ne samo kratko, već dovoljno brzo proširuje telomere da tretman ne treba stalno ponavljati. Trenutne metode proširenja telomera uključuju virusnu isporuku TERT-a pod inducibilnim promoterom, isporuku TERT-a korišćenjem vektora zasnovanih na adenovirusu i virusu povezanom sa adeno, i malim molekulskim aktivatorima telomeraze. Upotreba adeno-asociranog virusa (AAV) zasnovanog na vektoru TERT gena je prijavljena u Bernardes de Jesus B, et al., EMBO Mol Med. 2012. avgust;4(8):691-704; i Boccardi V & Herbig U., EMBO Mol Med. 2012. avgust;4(8):685-7. Ove metode rizikuju ili insercionu mutagenezu, kontinuirano povećanje aktivnosti telomeraze ili oboje.

[0009] Dakle, postoji jaka motivacija da se razvije terapija koja bezbedno proširuje telomere da bi potencijalno sprečila, odložila, poboljšala ili lečila ova i druga stanja i bolesti, da bi se isto uradilo za postepeni pad fizičke forme i funkcije i mentalne funkcije koja prati hronološko starenje i da omogući ćelijske terapije i regenerativnu medicinu. Takva terapija bi bila od velike koristi u podmlađivanju svih životinja, uključujući ljude, kućne ljubimce, stoku, životinje u zoološkim vrtovima i životinje ugroženih vrsta.

Suština pronalska

[0010] Ovo otkriće se bavi ovim i drugim problemima tako što pruža alternativu koja nudi prednosti veoma prolaznog povećanja aktivnosti telomeraze, u kombinaciji sa brzim produžavanjem telomera, tako da tretman ne mora da bude kontinuiran ili čak čest, i bez rizika od genomske insercione mutageneze.

[0011] Ovaj pronalazak je definisan zahtevima. Ovde su generalno opisane supstance , metode i jedinjenja za produženje telomera prolaznim prevođenjem aktivnosti egzogene telomeraze u ćeliji. Pronalazak se u jednom aspektu odnosi na jedinjenje koje sadrži sintetičku ribonukleinsku kiselinu koja sadrži najmanje jedan modifikovani nukleozid i kodira reverznu transkriptazu telomeraze za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije (a) bolesti koja uključuje kratke telomere izabrane iz grupe koju čine metaboličkog sindroma, dijabetesa, dijabetičkih čireva, bolesti srca, raka, vaskularne demencije, Alchajmerove bolesti, moždanog udara, starosne makularne degeneracije, imuno-nesence, zatajenje koštane srži, gastrointestinalni čirevi, ciroza, hernija, infekcija, hronična infekcija, blago ili ozbiljno kognitivno oštećenje, poremećena pokretljivost, osteoporoza, osteoartritis, reumatoidni artritis, anksioznost u vezi sa uzrastom, poremećaji ravnoteže, tinitus, Bellova bolest opstruktivna bolest pluća, abrazija rožnjače, bolest koronarne arterije, bolest perifernih arterija, konjuktivitis, halazion, dehidracija, depresija, emfizem, bolest oka, neuspeh u razvoju, grip, generalizovani anksiozni poremećaj, glaukom, gubitak sluha, gubitak osećaja ukusa, gubitak apetita, iščašenja kuka, gubitak pamćenja, Parkinsonova bolest, spinalna stenoza, urinarna inkontinencija i frakture pršljenova; ili (b) bolest povezana sa uzrastom kod životinje koja pati ili je u opasnosti od bolesti povezane sa uzrastom, pri čemu bolest povezana sa uzrastom uključuje kratke telomere; pri čemu se reverzna transkriptaza telomeraze eksprimira prolazno u ćeliji; i pri čemu je najmanje jedan telomer produžen unutar ćelije; i pri čemu je najmanje jedan modifikovani nukleozid sadržan u sintetičkoj ribonukleinskoj kiselini daje smanjenu imunogenost sintetičkoj ribonukleinskoj kiselini.

[0012] Ovde su takođe otkrivena jedinjenja za produženje telomera koja sadrže: sintetičku ribonukleinsku kiselinu koja sadrži najmanje jedan modifikovani nukleozid i kodira reverznu transkriptazu telomeraze; pri čemu su telomeri prošireni unutar ćelije tretirane ovim jedinjenjem.

[0013] U nekim izvođenjima, reverzna transkriptaza telomeraze je reverzna transkriptaza telomeraze sisara, ptica, reptila ili ribe ili varijanta koja zadržava katalitičku aktivnost telomeraze, a u specifičnim izvođenjima je reverzna transkriptaza telomeraze čoveka.

[0014] U nekim izvođenjima, ribonukleinska kiselina sadrži 5’ kap, 5’ netranslatirani region, 3’ netranslatirani region i poli-A rep. Kapa od 5' može biti neimunogena, a 5' kapa je možda tretirana fosfatazom.

[0015] U poželjnim izvođenjima, poli-A rep povećava stabilnost ribonukleinske kiseline.

[0016] U drugim poželjnim izvođenjima, 5' netranslatirani region ili 3' netranslatirani region sadrže sekvencu iz stabilne iRNK ili mRNK koja je efikasno translatirana, ili oba sadrže sekvencu iz stabilne iRNK ili mRNK koja je efikasno translatirana.

[0017] U još nekim poželjnim izvođenjima, 5’ kap, 5’ netranslatirani region ili 3’ netranslatirani region se stabilizuju ribonukleinske kiseline ili povećava brzinu translacije ribonukleinske kiseline. U drugim izvođenjima, 5' kapa, 5' netranslatirana regija ili 3' netranslatirana regija modulira imunogenost ribonukleinske kiseline.

[0018] U nekim izvođenjima, ribonukleinska kiselina je prečišćena sintetička ribonukleinska kiselina.

[0019] U poželjnim izvođenjima, sintetička ribonukleinska kiselina se prečišćava da bi se uklonile imunogene komponente-[0020] U određenim specifičnim izvođenjima ribonukleinska kiselina kodira čoveka, mačku, psa, miša, konja, kravu, ovcu, svinju, afričkog slona, pile, pacova, zebru, japansku prepelicu ili reverznu transkriptazu telomeraze, ili polipeptid sa najmanje 95% identičnosti sekvence sa reverznom transkriptazom telomeraze.

[0021] Pronalazak takođe obezbeđuje supstance koje sadrže jedinjenje iz ovog otkrića i komponentu RNK telomeraze, koja je, u nekim izvođenjim, RNK komponenta telomeraze sisara, ptica, reptila ili riba. U specifičnijim izvođenjima, komponenta RNK telomeraze je komponenta RNK telomeraze čoveka. U nekim izvođenjima, jedinjenje je sdržano u supstanci koja dalje sadrži pomoćno farmaceutsko sredstvo za isporuku pacijentu, pri čemu nosač za isporuku nije nosač za oslobađanje virusa.

[0022] U nekim izvođenjima, nosač za isporuku je egzosom, lipidna nanočestica, polimerna nanočestica, prirodna ili veštačka čestica lipoproteina, katjonski lipid, protein, kompleks proteinnukleinska kiselina, lipozom, virosom ili polimer. U specifičnim izvođenjima, nosač za isporuku je katjonski lipid.

[0023] U određenim izvođenjima, nosač za isporuku nije imunogen. U drugim izvođenjima, nosač za isporuku je delimično imunogen. U posebnim izvođenjima, pod nekim okolnostima, može biti poželjno da nosač zadrži određenu imunogenost.

[0024] Prema drugom aspektu pronalaska, obezbeđuju se metode proširenja telomera, koje obuhvataju korak davanja bilo kog od otkrivenih jedinjenja ili supstanci na životinjsku ćeliju, pri čemu je najmanje jedan telomer produžen unutar ćelije.

[0025] U nekim slučajevima izvođenjima, ćelija ima najmanje jednu skraćenu telomeru pre koraka primene.

[0026] U nekim izvođenjima, ćelija je od ili u subjektu koji pati od ili je pod rizikom od bolesti povezane sa uzrastom, stanja vezanog za uzrast, ili opadanja funkcije ili izgleda u vezi sa uzrastom.

[0027] U nekim izvođenjima, ćelija je od ili u subjektu koji pati od raka, srčanih bolesti, moždanog udara, dijabetesa, dijabetičkih čireva, Alchajmerove bolesti, osteoporoze, opadanja fizičke sposobnosti ili izgleda, fizičke traume ili hroničnog fizičkog stresa, psihološke traume ili hroničnog psihološkog stresa, smanjene imunološke funkcije, imunonescencije ili makularne degeneracije.

[0028] U nekim izvođenjima, ćelija je somatska ćelija endodermalne, mezodermalne ili ektodermalne linije, ili zametna linija ili embrionalna ćelija.

[0029] U nekim izvođenjima, ćelija je indukovana pluripotentna matična ćelija ili ćelija koja se koristi za proizvodnju indukovanog pluripotentnog matične ćelije.

[0030] U nekim izvođenjima, ćelija je transdiferencirana ćelija ili ćelija koja se koristi za proizvodnju transdiferencirane ćelije.

[0031] U nekim izvođenjima, ćelija je izolovana ćelija, a korak primene ne traje duže od 48 sati. U drugim izvođenjima, ćelija je izolovana ćelija, a korak primene traje najmanje 2 sata.

[0032] U nekim izvođenjima, ćelija je izolovana ćelija, a korak davanja se izvodi najviše četiri puta. I u drugim izvođenjima, ćelija je izolovana ćelija, a korak primene se izvodi najmanje dva puta.

[0033] U nekim izvođenjima, ćelija je izolovana ćelija, a postupak dalje obuhvata korak merenja aktivnosti telomeraze u ćeliji. U specifičnim izvođenjima, korak primene povećava aktivnost telomeraze u ćeliji, a u još specifičnijim izvođenjima aktivnost telomeraze se prolazno povećava za najmanje 5%. U drugim specifičnim izvođenjima, poluvreme povećane aktivnosti telomeraze nije duže od 48 sati.

[0034] U nekim izvođenjima, metoda dalje obuhvata korak merenja dužine telomera u ćeliji. U specifičnim izvođenjima, prosečna dužina telomera se povećava za najmanje 0,1 kb.

[0035] U nekim izvođenjima, ćelija je izolovana ćelija, a postupak dalje obuhvata korak merenja kapaciteta udvostručavanja populacije u ćeliji. U određenim izvođenjima, kapacitet udvostručavanja populacije se povećava, u nekim izvođenjim najmanje jedna populacija se udvostručila.

[0036] U poželjnim izvođenjima, ćelija je od ili u subjektu sisara, a u još poželjnijim izvođenjima, ćelija je od čoveka ili u čoveku.

[0037] U nekim izvođenjima, ćelija je izolovana ćelija, a u drugim izvođenjima, ćelija nije izolovana ćelija. U nekim izvođenjima, korak primene obuhvata elektroporaciju. U nekim izvođenjima, najmanje jedan telomer je prolazno produžena ćelija.

[0038] Prema još jednom aspektu pronalaska, obezbeđene su supstance za proširenje telomera u životinjskoj ćeliji, pri čemu supstance sadrže bilo koje od gornjih jedinjenja ili sastava i uputstva za korišćenje jedinjenja ili sastava za produženje telomera.

[0039] U nekim izvođenjima, supstance dalje sadrže materijale za pakovanje. U nekim specifičnim izvođenjima, materijali za pakovanje su nepropusni za vazduh. U nekim specifičnim izvođenjima, materijali za pakovanje sadrže rezervoar (posude) od metalne folije.

[0040] U nekim izvođenjima, supstance dalje sadrže sredstvo za sušenje, medijum za kulturu ili inhibitor RNKaze.

[0041] U nekim izvođenjima, supstanca je sterilna. U nekim izvođenjima, supstanca sadrži jedinjenje iz ovog otkrića, uputstva za korišćenje supstnce za produženje telomera i RNK jedinjenje telomeraze, sredstvo za isporuku ili i jedinjenje RNK telomeraze i sredstvo za isporuku.

[0042] U još jednom izvođenju, pronalazak pruža metode lečenja, koje obuhvataju davanje jedinjenja ili sastav otkrića za životinju kojoj je potrebno produženje telomera ili koji može imati koristi od produženja telomera. Subjekat životinje pati od ili je u opasnosti od bolesti ili stanja koje je rezultat skraćenih telomera.

Kratak opis crteža

[0043]

Slika 1. Transfekcija MRC-5 ćelija sa modifikovanom ribonukleinskom kiselinom (modRNA) koja kodira TERT, ali ne i katalitički neaktivnom TERT (CI TERT), prolazno povećava aktivnost telomeraze. (a) Šema modRNA konstrukcije i pristupa koji se koristi u ovim studijama. ModRNA konstrukcija kodira ljudski TERT i ima 5’ i 3’ UTR-e koji se prenose stabilnost, kao što je iz mRNK β-globina. CI TERT ima jednu bp mutaciju. (b) Transfekcija TERT ili CI TERT modRNA dovodi do povećanja nivoa egzogene TERT modRNA u tretiranim ćelijama, ali ne i u netretiranim ćelijama, iznad nivoa endogene TERT RNK. (c) Nivoi proteina koji prepoznaju anti-TERT antitelo su značajno viši u MRC-5 ćelijama 24 sata nakon transfekcije sa modRNA koja kodira TERT ili CI TERT (P<0,03 ili 0,01, respektivno) nego u netretiranim ćelijama ili ćelijama samo sa nosačem. (d) Tretman modRNA koja kodira TERT, ali ne i CI TERT, uzrokuje prolazno povećanje aktivnosti telomeraze u ćelijama MRC-5.

Slika 2. Upotreba egzozoma kao nosača za terapiju ribonukleinskom kiselinom.

Slika 3. Grafička ilustracija upotrebe višestrukih brzih i prolaznih tretmana telomerazom u produžetku telomera u ćeliji.

Slika 4. Tretman sa TERT modRNA brzo proširuje telomere u MRC-5 ćelijama. (a) Raspored tretmana i testova koji se koriste u ovim studijama. Tretmani su trajali 5 sati. (b) Slika TRF Southern blota (inset) i njegova kvantifikacija u kojoj je hemoluminiscentni signal normalizovan da bi se uračunao broj sondi po jedinici dužine telomera, a prosečan intenzitet svakog reda piksela u svakoj gel traci je zatim ucrtan relativno do dužine telomera (n=3 biološka ponavljanja za svaki tretman). (c) Proseci distribucije dužine telomera na slici 4b, otkrivajući da su telomeri u ćelijama tretiranim TERT modRNA značajno (P<0,014) duže nego u netretiranim kontrolama ili kontrolama koje su tretirane samo nosačem. (d) Udeo telomera duži od proizvoljnog praga (4,2 kb) veći je u ćelijama tretiranim sa TERT modRNA nego u netretiranim i kontrolama koje su tretirane samo nosačem. (e) Reprezentativni fluorescentni mikrograf širenja met-afaze MRC-5 fibroblasta koji se koristi u kvantitativnoj hibridizaciji (K-FISH) za upoređivanje dužine telomera, pokazujući sondu telomera (svetlo, punktat) i DNK (glatko senčenje). (f) Kvantifikacija K-FISH merenja dužine telomera u tretiranim i kontrolnim ćelijama (n=15 ćelija za svaku od dve biološke replike za svaki tretman), pokazujući brzo proširenje telomera u tretiranim ćelijama. (Imajte na umu da TRF meri dužinu i telomerne i subtelomerne DNK, dok K-FISH meri samo telomernu DNK, objašnjavajući tako razlike između K-FISH i TRF rezultata.) (g) (i) Standardna kriva koja se odnosi na kumulativnu populaciju udvostručavanja MRC-5 ćelija nakon prijema od dobavljača do dužine telomera mereno korišćenjem K-FISH da bi se kvantifikovala prosečna ukupna fluorescencija sonde telomera po ćeliji, koja je linearno proporcionalna dužini telomera. (g) (ii) Kvantifikacija prosečne dužine telomera po ćeliji u MRC-5 ćelijama tretiranim tri puta sa TERT modRNA u intervalima od 48 sati, mereno korišćenjem K-FISH.

Slika 5. Kratak tretman sa TERT modRNA povećava replikativni kapacitet, ali ne ovekovečuje ćelije MRC-5 na način koji zavisi od doze. (a) Krive rasta ćelija tretiranih TERT modRNA jednom, dvaput ili tri puta ili tri puta nakon čega sledi dodatni tretman 8 nedelja nakon prvog tretmana. Kontrole obuhvataju ili bez tretmana, ili tretman samo sa vehikulom ili CI TERT četiri puta. (n=3 za svaki tretman). (b) Krive rasta ćelija tretiranih TERT modRNA i TERC RNK u molarnom odnosu 1:5 (n=3). (c) Tretman jednom, dva ili tri puta sa TERT modRNA daje dodatni replikativni kapacitet ćelijama MRC-5, osim onih u netretiranim ćelijama, na način koji zavisi od doze. Inkrementalno povećanje proliferativnog kapaciteta dobijeno drugim i trećim tretmanom, primenjenim 48 sati nakon prvog tretmana, nije tako veliko kao povećanje proliferativnog kapaciteta koje je dato prvim tretmanom; međutim, dodatni četvrti tretman nekoliko nedelja nakon prva tri tretmana daje isto toliko dodatnog proliferativnog kapaciteta kao i prvi tretman, što ukazuje da je tajming tretmana važan za optimizaciju količine proliferativnog kapaciteta koju daje tretman. Tretman tri puta sa TERT modRNA i TERC modRNA zajedno u molarnom odnosu 1:5 daje veći proliferativni kapacitet nego tretman tri puta samo sa TERT modRNA. Tretman samo sa nosačem ili CI TERT modRNA ne daje dodatni replikativni kapacitet. (n=3).

Slika 6. Visoka efikasnost transfekcije MRC-5 ćelija tretiranih modRNA koja kodira nuklearni GFP (nGFP). (a) Procenat ćelija sa fluorescencijom više od dva SD iznad srednje vrednosti netretiranih ćelija (n=10000). (b) Srednja fluorescencija (n=10000). (c) Fluorescentna mikrografija nGFP-a u transfektovanim MRC-5 ćelijama, obojena sa DAPI.

Slika 7. Doza-odgovor aktivnosti telomeraze.

Slika 8. Tretman TERT modRNA odlaže oticanje ćelija u MRC-5 ćelijama. (a) MRC-5 ćelije u ranim pasusima (levo) imaju nekoliko puta manju površinu od ćelija u kasnijim pasusima (desno), kao što je prikazano na tipičnim mikrografijama PD 2 i PD 53 netretiranih ćelija koje se vide na hemocitometru. (b) MRC-5 ćelije ranog (PD 2) i srednjeg (PD 35) prolaza pokazuju malo otoka, definisano kao da imaju prečnik veći od 25 mikrona, izmereno vizuelno na hemocitometru (gde je jedan mali kvadrat prečnika 50 mikrona), dok značajno veći deo ćelija kasnog prolaza (PD 53) je otečen. Nasuprot tome, ćelije PD 53 koje su tretirane TERT modRNA, ali ne i one tretirane CI TERT modRNA, na PD 40 pokazuju malo otoka.

Slika 9. Kriva rasta za ljudske mikrovaskularne dermalne endotelne ćelije (HMDEC).

Slika 10. Efekat tretmana TERT modRNA na broj ćelija u HMDEC. CO: kontrolni tretman; hTERT-CI: cat-alitički neaktivan hTERT; hTERT-VT: divlji tip hTERT.

Slika 11. Efekat tretmana TERT modRNA na rast HMDEC. UT: nelečeno; CO: kontrolni tretman; CI: katalitički neaktivan hTERT; VT: divlji tip hTERT.

Slika 12. Efekat tretmana TERT modRNA na starenje u HMDEC. NT: nelečeno; hTERT-CI: katalitički- inactive hTERT; hTERT-VT: divlji tip hTERT.

Slika 13. Povećanja aktivnosti TERT proteina i telomeraze nakon modifikovane isporuke TERT mRNA. (A) Šema modifikovane mRNA koja sadrži kodirajuću sekvencu funkcionalnog oblika pune dužine TERT-a ili katalitički neaktivnog (CI) oblika TERT-a, okruženog neprevedenim regionima (UTR) HBB-a i sintetizovanim repom od 151 nt poli-A korišćenjem modifikovanih nukleotida pseudouridina i 5-metilcitidina. (B) Efikasnost transfekcije mioblasta (n=2.000) tretiran sa 0,8 mg/ml modifikovanom mRNA koja kodira GFP mereno protočnom citometrijom 24 h posle transfekcije premašio je 95% (dodatni grafikoni na Slici 16A). (C) Ukupni nivoi TERT proteina mereni su kvantitativnim Vestern blot-om (panel C, levo; Slika 17). Kvantifikacija nivoa TERT proteina 24 sata nakon transfekcije sa 1 mg/ml TERT ili CI TERT mRNA (n=3). Kvantifikacija TERT proteina kao odgovor na različite doze mRNK merena je na nivou jedne ćelije protočnom citometrijom (n=10,000) (panel C, desno). *P<0,05, **P<0,01 u poređenju sa netretiranim ćelijama. Trake grešaka predstavljaju s.e.m. (D) Detekcija aktivnosti telomeraze u fibroblastima i mioblastima transfektovanim sa 1 mg/ml modifikovane TERT mRNA, mereno korišćenjem protokola za ponovljeno amplifikaciju telomera (TRAP). Strelica pokazuje interne kontrole za efikasnost PCR-a.

Slika 14. Povećanje dužine telomera i proliferativnog kapaciteta nakon isporuke modifikovane TERT mRNA (modRNA). (A) Prosečne dužine telomera u netretiranim fibroblastima su se smanjivale tokom vremena u kulturi mereno pomoću MMkPCR i SpectraCell-a (koeficijent korelacije 0,97, P<0,001). Eksperiment je ponovljen dva puta sa po četiri tehničke replike. (B) Srednje dužine telomera u fibroblastima transfektovanim sa 1 mg/ml TERT modRNA, CI TERT mRNA ili samo nosačem, jednom, dva ili tri puta uzastopno u intervalima od 48 sati. Eksperiment je ponovljen dva puta sa četiri tehnička replicira svaki. **P<0,01, ***P<0,001 u poređenju sa ćelijama tretiranim samo nosačem. (C) Srednje dužine telomera u mioblastima tretiran kao u (B). Eksperiment je ponovljen dva puta sa po četiri tehničke replike. ***P<0,001 u poređenju sa ćelijama tretiranim samo nosačem. (D) Krive rasta fibroblasta tretiranih kao u (B), sa zelenim strelicama koje pokazuju vremena tretmana. Krive rasta su ponovljene dva puta sa svakom populacijom kultivisanom u tri primerka. Kapacitet replikacije je povećan na način koji zavisi od doze (desni panel). *P<0,05, **P<0,01 u poređenju sa ćelijama koje su tretirane samo nosačem. (E) Kapacitet proliferacije mioblasta, tretiran kao u (B) (zelene strelice). Krive rasta su ponovljene dva puta, sa svakom populacijom kultivisan u tri primerka. Svi podaci su predstavljeni kao sredstva 6 s.e.m.

Slika 15. Prolazna redukcija markera povezanih sa starenjem nakon modifikovane isporuke TERT mRNA. (A) Kvantifikacija fibroblasta koji eksprimiraju β-gal nakon modifikovane TERT mRNA transfekcije tri puta uzastopno u intervalima od 48 sati (zelene strelice). Kontrolne ćelije, koje se sastoje od netretiranih, samo nosača i populacije tretirane CI TERT mRNA, prestale su da se šire na PD 53, a populacija tretirana TERT modRNA prestala je da se širi na PD 80. Svaki eksperiment je sproveden dva puta sa >50 ćelija po uzorku koji je ručno ocenjen. Reprezentativne slike pokazuju fibroblaste tretirane TERT modRNA sa β-galom na PD 53 (gore) i PD 80 (dole). Dužina skale je 200 mikrona.(B) Kvantifikacija ekspresije β-gal u mioblastima tretiranim kao u (A). Kontrole su kao u (A). Kontrolne i populacije tretirane TERT modRNA prestale su da se šire na PD 8 i PD 11, respektivno. Svaki eksperiment je sproveden dva puta, sa >50 ćelija po uzorku koji je ručno ocenjen. Reprezentativne slike pokazuju mioblaste na PD 2 (gore) i TERT mioblasti tretirani modRNA na PD 11 (dole). (C) Kvantifikacija uvećanih ćelija povezanih sa replikativnim se-nescencijom u fibroblastima transfektovanim tri puta sa modifikovanom TERT mRNA. Populacioni platoi su kao u (A). Kontrole su samo nosači i tretirane CI TERT mRNA. Svaki eksperiment je sproveden dva puta, sa >50 ćelija po uzorku koji je ručno ocenjen. Reprezentativne slike pokazuju netretirane fibroblaste na PD 2 (gore) i PD 53 (dole). Svi podaci su predstavljeni kao sredstva 6 s.e.m. Dužina skale je 200 mikrona.

Slika 16. Visokoefikasna transfekcija modifikovane mRNK u ljudske mioblaste. (A,B) Kvantifikacija GFP fluorescentnih mioblasta (n=2000) transfektovanih sa 0,1-0,8 mg/ml modifikovane mRNA koja kodira GFP, mereno protočnom citometrijom 24 h nakon početka tretmana. (C) Srednja fluorescencija modifikovanih mioblasta transficiranih GFP mRNA kao odgovor na povećanje doze. (D) Kvantifikacija egzogene TERT modRNA u fibroblastima 24 sata nakon transfekcije sa 1 mg/ml TERT ili CI TERT modRNA, mereno korišćenjem RT-kPCR. Izračunat je odnos TERT prema CI TERT koristeći Pfaffl metod sa RPL37A i GAPDH kao referentnim genima (n=3). (E) Kvantifikacija endogene TERT modRNA u fibroblastima 24 h nakon transfekcije sa 1 mg/ml TERT ili CI TERT modRNA, mereno korišćenjem kPCR, izračunato kao u (D). Svi podaci su predstavljeni kao sredstva 6 s.e.m.

Slika 17. Ekspresija TERT nakon isporuke modifikovane mRNA. Ekspresija TERT proteina u fibroblastima sakupljenim 24 sata nakon početka tretmana sa 1 mg/ml TERT modRNA merena je multipleksiranim infracrvenim Vestern blotom. Serijsko razblaživanje ukupnog proteina je korišćeno da se generiše standardna kriva za poređenje relativnih količina TERT proteina sa kontrolama. Specifičnost TERT antitela korišćenog ovde je opširno testirana (Vu, 2006).

1

Slika 18. TRAP gel koji pokazuje povećanu aktivnost telomeraze u mononuklearnim ćelijama elektroporisanim sa TERT modRNA na postavci od 200 V, 25 uF, 1000 Ohm, u kiveti od 1 mm sa 10 ul ćelijske suspenzije i TERT modRNA. Termički obrađena traka za uzorke sadrži artefakt dimera prajmera metode kao što je jako naznačeno trakom na četvrtom stepenu skale.

Slika 19. Mikroskopske slike mononuklearnih ćelija koje fluoresciraju nakon elektroporacije sa modRNA koja kodira GFP.

Slika 20. Elektroporacija GFP modRNA u ljudske leukocite (mononuklearne ćelije) rezultira visokom efikasnošću transfekcije.

Slika 21. Slika gela iz TRAP testa koji pokazuje povećanje aktivnosti telomeraze u fibroblastima elektroporisanim sa povećanje doze TERT modRNA.

Slika 22. Fluorescentne mikrografije koje pokazuju da CD8+ T-ćelije aktivirane sa CD3/CD28 i elektroporisane sa GFP modRNA izražavaju GFP aktivnost. Tamne tačke su tačke obložene CD3/CD28.

Slika 23. Elektroporacija ljudskih keratinocita sa TERT modRNA rezultira ekspresijom aktivnosti telomeraze.

Slika 24. Ekspresija modRNK luciferaze nakon in vivo isporuke glodaru.

Detaljan opis pronalaska

[0044] Telomeri su DNK sekvence na krajevima hromozoma koje štite krajeve hromozoma, ali se skraćuju tokom vremena. Kritično kratki telomeri mogu dovesti do toga da ćelije prestanu da funkcionišu ispravno ili da umru. Kritično kratki telomeri takođe mogu dovesti do fuzije hromozoma što može dovesti do raka. Čak i u odsustvu specifične dijagnostikovane bolesti, kratki telomeri su umešani u postepeno opadanje funkcije uma i tela i u pojavu starenja.

[0045] U isto vreme, međutim, skraćivanje telomera može da igra zaštitnu ulogu protiv raka, na primer u situaciji kada ćelija dobije mutaciju koja uzrokuje da se profiliše brže od normalnih ćelija. U toj situaciji, skraćivanje telomera sprečava neograničeno razmnožavanje ćelije i izazivanje raka. Stoga nije nužno korisno stalno produžavati telomere.

[0046] Kod sisara, telomeri sadrže tandem ponavljanja sekvence TTAGGG, a kod drugih životinja kao npr.ptica, gmizavaca i riba, ponovljeni niz varira. Kod svih ovih vrsta životinja, telomeri su dvostruki.

Tabela 1 Prosečna dužina telomera kod odraslih fibroblasta različitih vrsta

Vrsta Proseecna duzina telomera (kb)

Krava 18

Ovca 18

Svinja 15

Konj 14

Pas 15

Panda 25

Tigar 50

Kucni mis 40

Sonorski jelen mis 9

Norveski pacov 40

Pacov 16

Evropski beli zec 50

Crnorepi zec 25

Pauk majmun 7

Veverica 9

Rezus majmun 16

Orangutag 10

Bonobo 10

Covek 9

Indijski slon 15

Africki slon 14

Macka 11

[0047] Kod ljudi, telomeri počinju pre rođenja sa dužinom od 15-20 kb, a na rođenju sa dužinom od 12-15 kb.Telomere se brzo skraćuju tokom detinjstva, a zatim za oko 0-100 bp godišnje u proseku u odraslom dobu, stopa koja varira u zavisnosti od tipa ćelije, izloženosti psihološkom ili oksidativnom stresu i drugih faktora.

[0048] Telomere su deo supstance telomera, koji štiti krajeve hromozoma. Supstanca telomera takođe sadrži skup proteina koji se zajednički nazivaju Shelterin. Proteini supstance telomera uključuju POT1, TPP1, ATM DAT, TRF1, TRF2, Rap1, Rif1, TIN2, NBS, MRE17 i RAD50 i njihovi homolozi u različitim vrstama sisara. Podlevski i Čen (2012) Mutat. Res. 730:3-11. Kod mnogih vrsta telomer se završava jednolančanim 3’ prepustom koji se umeće u dvolančani region, zajedno sa proteinima supstance telomera, formirajući petlju unutar supstance telomera.

[0049] Telomere se skraćuju tokom vremena, zbog oksidativnog oštećenja i razmene sestrinskih hromatida, kao i zbog problema krajnje replikacije, u kojoj krajevi hromozoma nisu potpuno duplirani tokom mitoze. Kada telomeri postanu kritično kratki, supstanca telomera više nije u stanju da zaštiti krajeve hromozoma, a krajevi hromozoma postaju „otkriveni“. Otpuštanje krajeva hromozoma može dovesti do fuzije hromozoma i hromozoma, što zauzvrat može dovesti do raka. O’Salivan i Karlseder (2010) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11:171-181; Calado etal. (2012) Leukemia 26:700-707; Artandi i DePinho (2010) Karcinogeneza 31:9-18. Otpuštanje takođe može dovesti do toga da se krajevi hromozoma prepoznaju kao oštećena DNK, aktivirajući odgovore na oštećenje DNK i aktivirajući ćelijsku apoptozu ili starenje. Starenje je zaustavljeno stanje u kome ćelija ostaje održiva, ali se više ne deli, a stare ćelije obično prestaju da obavljaju svoje normalne, korisne funkcije pre starenja na odgovarajući način ili uopšte. Tako skraćivanje telomera dovodi do disfunkcije tkiva, gubitka fizičke sposobnosti i mladalačkog izgleda, gubitka mentalnih sposobnosti i bolesti delom zbog akumulacije stare ćelije, a delom zbog gubitka ćelija apoptozom. Zaista, stariji ljudi sa kratkim telomerima imaju otprilike 200-750% veće šanse da dobiju infarkt miokarda (200%) (von Zglinicki et al. (2000) Laboratori Investigation; Journal of Technical Methods and Pathologi 80:1739-1747), vaskularni demencija (200%) (Testa et al. (2011) Diabetic Medicine 28:1388-1394, dijabetes sa komplikacijama (400%) (Blackburn et al. (2010) Cancer Prevention Research 3:394-402, rak (Stern i Brian) (2008) Citogenetic and Genome Research 122:243-254), moždani udar, Alchajmerova bolest, infekcija (750%), idiopatska plućna fibroza i druge bolesti LJudi sa kratkim telomerima u jednom tkivu verovatno imaju i kratke telomere u većini njihova druga tkiva, a samim tim i kratki telomeri koreliraju sa povećanim rizikom od mnogih bolesti kod jedne osobe Takubo i sar.(2010) Geriatr Gerontol Int. 10 Suppl 1:S197-206;doi: 10.1111/j.1447-0594.2010.00605. k. Kratki telomeri takođe ograničavaju replikacioni kapacitet ćelije, što zauzvrat ograničava ćelijske terapije i regenerativne terapije. Nasuprot tome, povećanje dužine telomera kod miševa sa kratkim telomerima korišćenjem metoda genetskog inženjeringa zasnovanog na virusima podmlađuje miševe po nekoliko parametara, uključujući debljinu i elastičnost kože, funkciju jetre i osećaj mirisa. Jaskelioff (2011) Nature 469:102-107.

[0050] Pošto telomeraza proširuje telomere, koristan pristup proširenju telomera je povećanje nivoa aktivnosti telomeraze u ćelijama. Prijavljeno je da mnogi agensi i uslovi povećavaju aktivnost telomeraze u ćelijama, uključujući agense i uslove navedene u tabeli 2.

1

Tabela 2: Primeri agenasa i stanja koji povećavaju aktivnost telomerase

[0051] Primeri tretmana iz Tabele 2, međutim, nisu bez neželjenih efekata. Na primer, tretman faktorima rasta, hormonima ili citokinima može izazvati neželjene efekte, može aktivirati više signalnih puteva, može izazvati neželjena ćelijska replikacija, mogu izazvati imuni odgovor i generalno su nespecifični. Genetski tretmani korišćenjem plazmida ili virusa nose rizik od genomske modifikacije insercionom mutagenezom i rizik od raka. Transfekcija nemodifikovanom RNK izaziva jak imuni odgovor i nije pokazano da produžava telomere. Fizički tretmani mogu oštetiti genomsku DNK. Utvrđeno je da tretman malim molekulima iz biljaka samo produžava telomere kod nekih subjekata i ćelija, samo veoma sporo proširuje telomere i zahteva hroničnu isporuku, što dovodi do rizika od raka.

[0052] Predloženo je da ekspresija sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju hTERT i TERC u ćelijama, i upotreba samih ovih jedinjenja, budu korisni u dijagnozi, prognozi i lečenju ljudskih bolesti (videti, npr., US patent br. 5,583,016 i 6,166,178), ali produženje telomera na način koji je i brz i prolazan, a samim tim i potencijalno bezbedan iz gore opisanih razloga, nije dokazano. Sӕbe-Larssen i dr. (2002) J. Immunol. Metode 259:191-203 izvestile su o transfekciji dendritskih ćelija sa mRNA koja kodira hTERT, i da su takve ćelije stekle aktivnost telomeraze, ali je transfekcija koristila standardnu iRNK i rezultirala je snažnim

hTERT citotoksičnim T limfocitnim (CTL) odgovorom pre nego proširenjem telomera .

[0053] Štaviše, svi postojeći tretmani sa malim molekulima su uglavnom neefikasni i spori (Harlei et al. (2011) Rejuvenation Research 14:45-56), prvenstveno zato što deluju preko katalitičke komponente telomeraze, TERT, koja je regulisana jakim post-translaciono, ograničavajućim efektima postojećih tretmana na mali podskup ćelija i isključujući ćelije u interfazi ili G0, kao što su mnoge matične i progenitorne ćelije. Cifuentes-Rohas i Shippen (2012) Mutat. Res. 730:20-27; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003; Cong et al. (2002) Pregledi mikrobiologije i molekularne biologije 66:407-425. Ova regulacija je delimično posredovana

interakcijama između jedinjenja supstanci telomeraze, supstanci telomera i drugih molekula. Na primer, ERT je fosforilisan ili defosforilisan na više mesta pomoću višestrukih kinaza i fosfataza, a na nekim mestima, fosforilacija dovodi do povećane aktivnosti telomeraze (na primer fosforilacija pomoću Akt), dok na drugim mestima fosforilacija smanjuje aktivnost telomeraze (npr. fosforilacija pomoću Src1 ili cAbl). Takođe, TERT je ubikvitiniran ili deubikvitiniran na određenim mestima. TERT takođe stupa u interakciju sa drugim proteinima na određenim mestima na TERT, i ove interakcije mogu da inaktiviraju TERT (na primer interakcije sa Pink1 ili cAbl) ili transportuju TERT dalje od hromozoma (na primer, interakcije sa CRM1 i Pink1), sprečavajući ili usporavajući produžetak telomera. Dalje, neki proteini se vezuju za telomere ili supstancu telomera, blokirajući TERT (na primer POT1), sprečavajući produženje telomera. Dalje, neki proteini indirektno pomažu produženju telomera, na primer helikaze i UPF1. Zbog regulatornih mehanizama, aktivnost telomeraze dostiže vrhunac tokom S faze ćelijskog ciklusa, pa stoga ćelije koje se brzo dele mogu imati više koristi od tretmana koji povećavaju aktivnost telomeraze. Međutim, često je poželjno držati ćelije u stanju koje se sporo ili ne dele; na primer, matične ili progenitorne ćelije se često sporo dele i stoga većinu svog vremena mogu provesti u interfazi ili G0. Dakle, postojeći tretmani su spori i neefikasni u većini tipova ćelija uopšte, I u svim tipovima ćelija tokom interfaze i G0. Tretmani koji su spori su manje bezbedni, jer zahtevaju duže lečenje. Pošto skraćivanje telomera obezbeđuje zaštitni mehanizam protiv proliferacije ćelija koje beže, kao što je kod raka, tretman koji brzo proširuje telomere je generalno bezbedniji, jer se može primenjivati u kratkim vremenskim periodima i retko, čime se omogućavaju normalne telomere. skraćivanje sigurnosnog mehanizma da ostane na snazi veći deo vremena. Zbog toga je potreban metod koji je u stanju da privremeno prevaziđe regulaciju telomeraze kako bi se brzo proširili telomeri tokom kratkog tretmana.

[0054] TERT reguliše stotine gena uključujući i one navedene u Tabeli 3.

Tabela 3: Primeri gena i puteva regulisanih TERT-om

1

Regulisani

Tip Primeri

Epigenetsko stanje DNA 5-methylcytosine transferase I (Young et al. (2003) The Journal of Biological Chemistry modulatori 278:19904-19908)

Proto-onkogeni Hepatocyte growth factor receptor (MET), AKT-2, CRK (Perrault et al. (2005) Biochemical and Biophysical Research Communications 335:925-936)

Diferencijacija, ćelijska Sox-13 (Perrault et al. (2005) Biochemical and Biophysical Research Communications 335: sudbina 925-936), Wnt (Park et al. (2009) Nature 460:66-72)

Glycolisis Phosphofructokinase (Bagheri et al. (2006) Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 103:11306-11311), aldolase C (Bagheri et al. (2006) Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 103:11306-11311)

Proliferacija Activating transcription factor-3, Xbox protein-1, FGF, EGFR (Smith et al. (2003) Nature Cell pojačivači Biology 5:474-479), Insulin-like growth factor 2 (Perrault et al. (2005) Biochemical and Biophysical Research Communications 335:925-936), Wnt (Park et al. (2009) Nature 460:

66-72), tp53bpl (Perrault et al. (2005) Biochemical and Biophysical Research Communications 335:925-936), epiregulin (Lindvall et al. (2003) Cancer Research 63:1743-1747)

[0055] U mnogim slučajevima, modulacija gena ili puteva iz Tabele 3 je nepoželjna jer to može izazvati neželjene promene u ćelijama. Na primer, TERT aktivira epigenetske regulatore, koji mogu promeniti fenotip ćelije ili ometati napore da se reprogramiraju ili transdiferenciraju ćelije u terapeutske svrhe. TERT aktivira pojačivače rasta, ali često proliferacija nije poželjna, na primer često su matične ćelije sa najvećim regenerativnim potencijalom one koje se dele sporo. TERT modulira regulatore ćelijske sudbine i diferencijacije, što može umanjiti napore da se ćelije diferenciraju u specifične tipove ćelija. TERT takođe aktivira protoonkogene, što može dovesti do raka. Stoga je poželjno minimizirati količinu vremena tokom kojeg su nivoi TERT veštački povišeni, uključujući bilo koji tretman koji produžava telomere korišćenjem TERT-a. Stoga je potreban tretman koji produžava telomere samo prolaznim povećanjem nivoa aktivnosti telomeraze.

[0056] U nekim tipovima ćelija pokazalo se da TERT utiče na ekspresiju drugih gena (Ioung et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:19904-19908; Perrault et al. (2005) Biochem. Biophis. Res. Commun.

335:925-936), a to u nekim slučajevima možda nije poželjno. Dakle, potreban je tretman koji minimizira vreme tokom kojeg se nivoi TERT povećavaju.

Jedinjenja

[0057] Ovaj pronalazak se bavi ovim problemima tako što u jednom aspektu obezbeđuje nova jedinjenja za prolaznu ekspresiju egzogene telomeraze u ćeliji. Jedinjenja sadrže sintetičku ribonukleinsku kiselinu koja sadrži najmanje jedan modifikovani nukleozid i kodira reverznu transkriptazu telomeraze (TERT), pri čemu su telomeri prošireni unutar ćelije tretirane ovim jedinjenjem.

1

Sintetičke ribonukleinske kiseline

[0058] Ribonukleinske kiseline koje se koriste u prolaznoj ekspresiji TERT prema različitim aspektima ovog otkrića sadrže ribonukleinsku kiselinu koja kodira za TERT protein. Ribonukleinske kiseline tipično dalje sadrže sekvence koje utiču na ekspresiju i/ili stabilnost ribonukleinske kiseline u ćeliji. Na primer, kao što je prikazano na slici 1a, ribonukleinske kiseline mogu sadržati 5' kapu i netranslatirani region (UTR) na 5' i/ili 3' stranu kodirajuće sekvence. Ribonukleinske kiseline mogu dalje da sadrže 3' rep, kao što je poli-A rep. Poli-A rep može, na primer, povećati stabilnost ribonukleinske kiseline. U nekim realizacijama, poli-A rep ima najmanje 75 nukleotida, 100 nukleotida, 125 nukleotida ili 150 nukleotida.

[0059] U nekim slučajevima, 5' kap ribonukleinske kiseline je neimunogena kapa. U nekim realizacijama, 5' kap može povećati translaciju ribonukleinske kiseline. U nekim slučajevima, 5' kap se može tretirati fosfatazom kako bi se modulirala urođena imunogenost ribonukleinske kiseline. U nekim slučajevima, 5’ kap je analog protiv reverzne kapice („ARCA“), kao što je analog strukture 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNK kapice.

[0060] Kao što je dobro poznato u tehnici, gore navedene karakteristike, ili druge, mogu povećati translaciju TERT proteina kodiranog ribonukleinskom kiselinom, mogu poboljšati stabilnost same ribonukleinske kiseline, ili mogu učiniti oboje. U nekim slučajevima, 5' UTR i/ili 3' UTR su od gena koji ima veoma stabilnu iRNK i/ili iRNK koja se brzo prevodi, na primer, α-globin ili β-globin, c-fos, ili virus jetkanja duvana. U nekim slučajevima, 5’ UTR i 3’ UTR su iz različitih gena, ili su iz različitih vrsta od vrsta u koje se kompozicije isporučuju. UTR mogu takođe mogu biti sklopovi delova UTR-a iz mRNK različitih gena, gde se delovi biraju da bi se postigla određena kombinacija stabilnosti i efikasnosti translacije.

[0061] Ribonukleinske kiseline prema pronalasku su poželjno nukleozid-modifikovane RNK ("modRNA"). Većina zrelih RNK molekula u eukariotskim ćelijama sadrži nukleozide koji su modifikovane verzije kanonskih nemodifikovanih RNK nukleozida, adenina, citidina, gvanozina i uridina. Te modifikacije mogu sprečiti da se RNK prepozna kao strana RNK. Kariko i dr. (2005) Immuniti 23:165-175. Upotreba sintetičkih, modifikovanih RNK u in vitro metodi za reprogramiranje ćelija opisana je u VO 2011/130624. Sintetički molekuli RNK napravljeni korišćenjem određenih nukleozida su mnogo manje imunogeni od nemodifikovane RNK. Imunogenost se može još više smanjiti prečišćavanjem sintetičke modRNK, na primer korišćenjem tečne hromatografije visokih performansi (HPLC). Modifikovani nukleozidi mogu se, na primer, izabrati između nukleozida prikazanih u Tabeli 4. Nukleozidi su, u nekim slučajevima, pseudouridin, 2-tiouridin ili 5-metilcitidin. Pod nekim okolnostima, može biti poželjno da modifikovana RNK zadrži određenu imunogenost.

1

Tabela 4: Modifikovani nukleozidi pronađeni u eukariotskoj RNK

(nastavak)

1

[0062] Bez namere da budemo vezani teorijom, prisustvo modifikovanih nukleozida omogućava modRNA da izbegne aktivaciju imunog odgovora posredovanog različitim receptorima, uključujući Toll-like receptore i RIG-1. Neimunogena modRNA je korišćena kao terapeutski agens kod miševa putem lokalne primene. Kormann i dr. (2011) Biotehnologija prirode 29:154-157. Otkriće mRNK modifikovane nukleotidom olakšava isporuku terapeutskih proteina kodiranih RNK, ili njihovih mutanata, u ćelije i ekspresiju tih proteina u ćelijama.

1

[0063] Shodno tome, u nekim izvođenjima, ribonukleinske kiseline otkrivenih jedinjenja sadrže pseudouridin, 2-tiuridin, 5-metilcitidin ili nukleozid iz Tabele 4. Ribonukleinske kiseline mogu sadržati više od jednog od gore navedenih nukleozida ili kombinacija gore navedenih nukleozida. Ribonukleinske kiseline mogu da sadrže pseudouridin i 5-metilcitidin.

[0064] U nekim slučajevima koji su različiti od zahtevanog pronalaska, imuni odgovor na modRNA može biti poželjan, a RNK se može modifikovati da izazove optimalan nivo urođenog imuniteta. Imuni odgovor na modRNA možda neće biti poželjan, a RNK se može modifikovati da bi se takva reakcija svela na minimum. RNK se može modifikovati za bilo koju situaciju.

[0065] Ribonukleinske kiseline ovog pronalaska su sintetičke ribonukleinske kiseline. Termin "sintetički", kako se ovde koristi, znači da se ribonukleinske kiseline u nekim slučajevima pripremaju korišćenjem alata molekularne biologije pod vođstvom čoveka, na primer kako je opisano u nastavku. Sintetičke ribonukleinske kiseline mogu se, na primer, pripremiti in vitro sintezom korišćenjem ćelijskih ekstrakata ili prečišćenih enzima i šablona nukleinskih kiselina. Sintetičke ribonukleinske kiseline mogu se u nekim slučajevima dobiti hemijskom sintezom, delimično ili u potpunosti. Alternativno, ili kao dodatak, sintetičke ribonukleinske kiseline mogu u nekim slučajevima biti pripremljene konstruisanom ekspresijom u ćeliji, nakon čega sledi razbijanje ćelije i bar delimično prečišćavanje ribonukleinske kiseline. Sintetička ribonukleinska kiselina, međutim, nije ribonukleinska kiselina koja se javlja u prirodi, jer se ekspresuje u nemodifikovanoj ćeliji bez ekstrakcije ili prečišćavanja.

[0066] Ribonukleinske kiseline prema ovom pronalasku mogu biti pripremljene korišćenjem različitih standardnih tehnika, kao što će razumeti stručnjak u ovoj oblasti. U nekim slučajevima, ribonukleinske kiseline mogu biti pripremljene in vitro sintezom, kao što je opisano, na primer, u US Patent Application Publication Nos. 2009/0286852 i 2011/0143397. U nekim slučajevima, ribonukleinske kiseline se mogu pripremiti hemijskom sintezom. U nekim slučajevima, ribonukleinske kiseline se mogu pripremiti kombinacijom in vitro sinteze i hemijske sinteze. Kao što je gore opisano, termin "sintetički" treba razumeti da uključuje ribonukleinske kiseline koje se pripremaju bilo hemijskom sintezom, in vitro sintezom, ekspresijom in vivo i barem delimičnim prečišćavanjem, ili kombinacijom takvih ili drugih hemijskih ili molekularne biološke metode.

[0067] Ribonukleinske kiseline ovog pronalaska mogu, u nekim slučajevima, biti prečišćene. Kao što je gore navedeno, prečišćavanje može smanjiti imunogenost ribonukleinskih kiselina i može biti korisno u nekim okolnostima. Vidi takođe publikaciju američke patentne prijave br.2011/0143397. U poželjnim slučajevima, ribonukleinske kiseline se prečišćavaju pomoću HPLC ili afinitetnim hvatanjem i eluiranjem.

[0068] Proteinska struktura TERT uključuje najmanje tri različita domena: dugačku ekstenziju na amino-terminusu (N-terminalnu ekstenziju, NTE) koja sadrži očuvane domene i nestrukturirani linker region; katalitički domen reverzne transkriptaze u sredini primarne sekvence koji uključuje sedam konzerviranih RT motiva; i kratko proširenje na karboksilnom kraju (C-terminalno proširenje, CTE).

2

Autekier and Lue (2006) Annu Rev Biochem. 75:493-517. U nekim slučajevima, ribonukleinska kiselina iz trenutnog pronalaska kodira za TERT pune dužine. U nekim slučajevima, ribonukleinska kiselina kodira domen katalitičke reverzne transkriptaze TERT-a. U nekim slučajevima, ribonukleinska kiselina kodira polipeptid koji ima TERT aktivnost.

[0069] TERT kodiran ribonukleinskim kiselinama iz ovog pronalaska može biti TERT sisara, ptica, reptila ili riba. TERT može biti TERT sisara, kao što je ljudski TERT. Meierson et al. (1997) Cell 90:785-795; Nakamura i dr. (1997) Science 277:955-959; Vick et al. (1999) Gene 232:97-106. Aminokiselinska sekvenca dve ljudske TERT izoforme dostupna je kao NCBI referentne sekvence: NP_937983.2 i NP_001180305.1. Druge neograničavajući primeri sekvenci amino kiselina koje su korisno kodirane ribonukleinskim kiselinama trenutnih kompozicija uključuju TERT od mačke (NCBI referentna sekvenca: KSP_003981636.1), psa (NCBI referentna sekvenca: NP_001026800.1), miša (NCBI Referentna sekvenca NCBI 8NP_03 .1), krava (NCBI referentna sekvenca: NP_001039707.1), ovca NCBI referentna sekvenca: KSP_004017220.1), svinja (NCBI referentna sekvenca: NP_001231229.1), afrički slon (NCBI Referentna sekvenca: KSP_003408191.1), pileta (NCBI referentna sekvenca: NP_001026178.1), pacova (NCBI referentna sekvenca: NP_445875.1), zebra (NCBI referentna sekvenca: NP_0010177335); Japanska medaka (NCBI referentni niz: NP_001098286.1); i šimpanza (NCBI referentne sekvence: KSP_003950543.1 i KSP_003950544.1).

[0070] Trebalo bi razumeti da ribonukleinske kiseline ovog pronalaska mogu kodirati varijante bilo koje od gore navedenih sekvenci amino kiselina, posebno varijante koje zadržavaju katalitičku aktivnost telomeraze, uključujući skraćene varijante. U nekim izvođenjima, ribonukleinske kiseline trenutnih supstanci kodiraju za jednu od gore navedenih sekvenci aminokiselina ili sekvencu sa najmanje 95% identičnosti sekvence sa tom sekvencom. U nekim slučajevima, nukleinske kiseline trenutnih supstanci kodiraju za jednu od gore navedenih sekvenci aminokiselina ili sekvencu sa najmanje 98%, 99%, 99,9%, ili čak većom identičnom sekvencom sa tom sekvencom.

[0071] Takođe treba razumeti da trenutne ribonukleinske kiseline mogu odgovarati nativnim genskim sekvencama koje kodiraju za gore navedene TERT proteine ili mogu odgovarati varijantama koje su omogućene zbog redundancije genetskog koda, kao što bi razumeo stručnjak u ovoj oblasti. U nekim izvođenjima, selekcija kodona može biti optimizovana za optimizaciju ekspresije proteina korišćenjem algoritama i metoda poznatih prosečnom stručnjaku. Fath i dr. (2011) PLOS ONE 6:3.

Supstance

[0072] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje supstance za produženje telomera u ćeliji, supstance koje sadrže jedinjenje iz ovog otkrića, kao što je gore opisano, i dalju komponentu. U nekimizvođenjima, supstance dalje sadrže RNK komponentu telomeraze (TERC). (Pogledajte takođe Tabelu 6 ispod.) U nekim izvođenjima, supstance dalje sadrže pomoćno farmaceutsko sredstvo za isporuku .

Sredstva za isporuku

[0073] Kao što je upravo napomenuto, supstance ovog pronalaska mogu dalje da sadrže farmaceutsko sredstvo za isporuku ribo-nukleinske kiseline. Sredstvoza isporuku može, u nekim slučajevima, olakšati ciljanje i unos ribonukleinske kiseline supstanci u ciljnu ćeliju. Posebno, supstance ovog pronalaska mogu sadržati bilo koje sredstvo za isporuku gena poznato u ovoj oblasti, na primer nanočestice, lipozome, balističke čestice genskog oružja, viruse, katjonske lipide, komercijalne proizvode, kao što je Lipofectamine® RNAiMak, ili druga sredstva. Sredstvoza isporuku može biti egzosom, lipidna nanočestica, polimerna nanočestica, prirodna ili veštačka lipoproteinska čestica, katjonski lipid, protein, kompleks protein-nukleinska kiselina, lipozom, virosom ili polimer. Sredstvo za isporuku može biti formulacija katjonskih lipida. Isporuka virusa, koja eksplicitno nije obuhvaćena pronalaskom za koji se traži patent, nije poželjna, jer može dovesti do insercione mutageneze.

[0074] Sredstvo za isporuku može biti egzosom, lipidna nanočestica ili polimerna nanočestica. U veoma poželjnim slučajevima, vozilo za isporuku je egzosom. Egzozomi su prirodne dvoslojne vezikule lipida prečnika 40-100 nm. Egzozomi sadrže skup specifičnih proteina, uključujući membranski protein Lamp-1 i Lamp-2, kojih ima posebno u izobilju. Lakhal i Vood (2011) BioEssais: Nevs and Revievs in Molecular, Cellular and Developmental Biologi 33:737-741. Godine 2007. otkriveno je da su egzosomi prirodni nosioci RNK i proteina, uključujući preko 1.300 tipova mRNK i 121 tip nekodirajuće mikroRNK. Egzozomi takođe mogu da prenose mRNK između vrsta: izlaganje ljudskih ćelija egzozomima miša koji nose mRNK miša dovodi do translacije u ljudskim ćelijama mišje mRNK.

[0075] Kao sredstva za isporuku RNK, proteina ili DNK, egzozomi imaju brojne prednosti u odnosu na alternativna sredstva. Konkretno, egzozomi se mogu generisati iz sopstvenih ćelija pacijenta, što ih čini neimunogenim - stoga ih ne napadaju antitela, komplementi, faktori koagulacije ili opsonini. Pored toga, egzozomi se mogu napuniti nukleinskim kiselinama elektroporacijom, i oni su prirodni prenosioci koji prenose mRNA i protein između ljudskih ćelija. Egzozomi štite svoj RNK i proteinski teret tokom isporuke, a sredstvo se isporučuje direktno u citosol. Oni mogu ekstravazirati iz krvotoka u ekstravaskularna tkiva, čak i preći krvno-moždanu barijeru, i mogu biti ciljani. Štaviše, egzosomi izbegavaju da se akumuliraju u neciljanim organima, kao što je, na primer, jetra. Egzozomi se stoga mogu koristiti kao "lipozomi" iz ćelija za isporuku terapeutske mRNK ili drugog tereta u lečenju bolesti. Mizrak i dr. (2013) Molekularna terapija 21:101-108; doi:10.1038/mt.2012.161. Grafička ilustracija egzozoma koji isporučuje mRNA u ćeliju prikazana je na slici 2. Videti takođe van den Boorn et al. (2011) Biotehnologija prirode 29:325-326.

[0076] Veruje se da je većina tipova ćelija sposobna da generiše egzozome, a egzozomi se nalaze u većini bioloških tečnosti uključujući krv, pljuvačku, urin, cerebrospinalnu tečnost, majčino mleko i amnionsku tečnost. Egzozome proizvodi većina tipovi ćelija, u različitom obilju. Obilni egzosomi, lišeni aktivatora T-ćelija, mogu biti izvedeni iz nezrelih dendritskih ćelija, koje su prisutne u ljudskoj krvi. O’Doherti i dr. (1994) Imunologi 82:487-493. Egzozomi se takođe mogu proizvesti veštački, na primer kombinovanjem rekombinantnih egzosomalnih proteina sa lipidima i fosfolipidima, kakvi se nalaze u egzozomalnim membranama. Alternativno, egzozomi se mogu konstruisati in vitro samosastavljanjem lipozoma sa podskupom egzozomalnih površinskih proteina.

[0077] Potencijal egzozoma za isporuku leka je prvi put prikazan 2011. Alvarez-Erviti et al. (2011) Priroda Biotechnologi 29:341-345. Konkretno, egzosomi su sakupljeni iz dendritskih ćelija dizajniranih da eksprimiraju Lamp2B fuzioni protein fuzionisan sa 28 a.a. ciljajući ligand iz glikoproteina virusa besnila (RVG), zatim elektroporisao siRNA u egzozome i ubrizgao egzozome u miševe koji su imunokompatibilni sa miševima od kojih su dobili dendritske ćelije. Egzozomi su stoga bili autologni i nisu generisali imuni odgovor, kao što je mereno nivoima IL-6, IP-10, TNF-α i IFN-α. Dalje, ponovljene doze tokom jednog meseca izazvale su slične odgovore, pokazujući da nije bilo ni adaptivnog imunološkog odgovora.

[0078] Kao što je gore opisano, egzozomi mogu biti autologni i stoga imaju nisku imunogenost. Pošto modRNA takođe ima nisku imunogenost, kombinacija modRNA kao ribonukleinske kiseline i egzozoma kao nosača u kompozicijama ovog pronalaska je posebno poželjna. U ovim slučajevima, otkrivanje stoga pruža novi način isporuke mRNK ili modRNK ćelijama ili tkivima, korišćenjem egzozoma. Takva isporuka pruža koristan metod za privremeno povećanje nivoa bilo kog proteina u ćeliji in vivo koristeći RNK koja se isporučuje u egzozomima intravenskom ili lokalnom injekcijom, a posebno u isporuci RNK koja kodira TERT. Shodno tome, sredstva za isporuku trenutnih supstanci mogu biti neimunogeni. U nekim okolnostima, međutim, može biti poželjno da sredstvo za isporuku zadrži određenu imunogenost.

Dodatna jedinjenja

[0079] Supstance koje su ovde otkrivene mogu dalje da sadrže dodatna jedinjenja koja ili poboljšavaju isporuku supstance u ciljnu ćeliju, povećavaju proširenje telomeraunuta rćelije, ili oboje. Na primer, supstance mogu dalje sadržati jedno ili više jedinjenja I uslovi iz tabele 2. Kao što će razumeti stručnjak u ovoj oblasti, kombinacije aktivnih sastojaka često pokazuju sinergističke efekte na željenu aktivnost, kao što je, na primer, prolazna ekspresija aktivnosti egzogenetelomeraze u ćeliji, a za takve kombinacije se podrazumeva da spadaju u obim otkrivanja. Dodatni primeri proteina koji mogu biti uključeni u kompozicije trenutnog otkrića su navedeni u tabeli 5. Trebalo bi razumeti da kompozicije mogu uključivati ili same proteine, ili sekvence nukleinskih kiselina, poželjno RNK ili modRNA, koje kodiraju ove proteine, ili proteini sa visokim identitetom sekvence koji zadržavaju aktivnost navedenog proteina.

2

Tabela 5: Korisno isporučeni proteini u kombinacijisa TERT-om

[0080] Drugiprimerijedinjenja koji mogubitikorisnouključeni u supstancutrenutnogotkrićasunavedeni u Tabeli 6.

Tabela 6: Drugajedinjenja koji sukorisna u kombinacijisa TERT-om

Okadaik kiselina Inhibira PP2A. PP2A Povećana aktivnost telomeraze zbog Wojtyla et al. (2011)

defosforilira AKT i ili TERT fosforilacije . Molecular Biology Reports TERT Pas (Canis lupus familiaris) 38:3339-3349 TERT, aktivira ga.

TERRA ili TERRA inhibira telomerazu Antisense TERRA, ili ARRET, Cifuentes-Rojas and anti -sense vezuje se za TERC, za koji je treba povećati telomerazu Shippen (2012) Mutat. Res. TERRA komplementarni. aktivnost vezivanjem za TERRA, 730:20-27; doi:

(ARRET) sprečavajući ga da se veže za TERC. 10.1016/j.mrfmmm.

2011.10.003

TERC RNA RNA komponenta telomeraze, Povećajte aktivnost

bitan za njegovu funkciju, može biti telomeraze .

drugi po redu ograničavajući faktor

nakon TERT-a u većini ćelija.

[0081] Pošto je TERT najaktivniji tokomo dređenih faza ćelijskog ciklusa, supstance ovog pronalaska mogu takođe opciono da sadrže jedan ili više prolaznih aktivatora ćelijske proliferacije, kako bi se poboljšala efikasnost TERT tretmana. Takva jedinjenja mogu uključivati, na primer, RNAi jedinjenje koje prolazno smanjuje količine inhibitora ćelijskog ciklusa kao štosu Rb ili P19/Arf u ćeliji. Drugi prolazni aktivatori ćelijske proliferacije mogu biti korisno uključeni u trenutne supstance, kao što će razumeti stručnjak u ovojoblasti.

Metode proširenja telomera i metode lečenja

[0082] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje metode proširenja telomera, koje obuhvataju korak promene bilo kog od gore opisanih jedinjenja ili supstanci u ćeliju sa skraćenim telomerima, pri čemu su telomeri prošireni unutar ćelije. Sadašnje otkriće takođe pruža metode lečenja, koje obuhvataju korak davanja bilo kog od gore opisanih jedinjenja ili supstanci na životinju kojoj je potrebno produženje telomera ili koji moze imati koristi od produženja telomera.

[0083] Jedinjenja ili supstance mogu da se daju u ćeliju, pri čemu je ćelija izolovana ćelija ili je deo ćelijske kulture, izolovane culture tkiva, izolovanog organa ilis lično (tj. primena je in vitro) .

[0084] Jedinjenja ili supstance se mogu davati bez izolovanja ćelije ili ćelija, tkiva ili organa od subjekta (tj. primena je in vivo). Jedinjenje ili supstanca se mogu isporučiti svim ili skoro svim ćelijama u telu subjekta. Jedinjenje ili supstanca se mogu isporučiti u određenu ćeliju ili tkivo u telu subjekta.

[0085] Subjekt moze biti sisar, ptica, riba ili gmizavac. Subjekt moze biti sisar, a moze biti I čovek. U drugim slučajevima, predmet moze biti kućni ljubimac, životinja u zoološkom vrtu, stoka ili životinja ugrožene vrste. Primeri predmetnih vrsta su navedeni u tabeli 7.

2

Tabela 7: Predmetne životinjske vrste.

Ovca (Ovis aries)

Domaca svinja (Sus scrofa domesticus) Domaca koza (Capra aegagrus hircus) Goveda (Bos primigenius taurus)

Zebu (Bos primigenius indicus)

Macka (Felis catus)

Kokoska (Gallus gallus domesticus) Zamorac (Cavia porcellus)

Magarac (Equus africanus asinus)

Domaca patka (Anas platyrhynchos domesticus) Vodeni bivol (Bubalus bubalis)

Konj (Equus ferus caballus)

Pripitomljeni leptir (Bombyx mori)

Domaci golub (Columba livia domestica) Domaca guska (Anser anser domesticus) Lama (Lama glama)

Alpaka (Vicugna pacos)

Pripitomljena curka (Numida meleagris) Tvor (Mustela putorius furo)

Prstenatsi golub (Streptopelia risoria)

Bali goveda (Bos javanicus domestica) Gajal (Bos frontalis)

Pripitomljana curka (Meleagris gallopavo) Zlatna ribica (Carassius auratus auratus) Domaci zec (Oryclolagus cuniculus) Domaci kanarinac (Serinus canaria domestica) Karabao (Bubalus bubalis carabenesis) Sijamske borbene ribe (Betta splendens)

Koi (Cyprinus carpio haematopterus) Domaca srebrna lisica (Vulpes vulpes)

2 Pripitomljeni jez (Atelerix albiventris)

Vrabac (Lonchura striata domestica)

Jak (Bos grunniens)

Pacovi i laboratorijski pacovi

Pripitomljena kamila dromedara (Camelus dromedarius)

Pripitomljena baktrijska kamila (Camelus bactrianus)

Gupi (riba) (Poecilia reticulata some strains)

MIs

[0086] Za in vitro primene, jedinjenja ili supstance se mogu primeniti korišćenjem bilo koje pogodne tehnike, kako bi razumeli stručnjaci izoblastićelijskebiologije, ćelijskekulture, kulturetkiva, kulture organa ilislično. Za in vivo aplikacije, jedinjenja ili supstance se korisno daju injekcijom, lokalnom primenom, inhalacijom, ili bilo kojom drugom pogodnom tehnikom davanja, kako bi razumeli stručnjaci u medicinskoj oblasti ili slično.

[0087] Kao što je gore opisano, ćelije koje su korisno tretirane u skladu sa metodama pronalaska uključuju ćelije, bilo u subjektu (za in vivo primenu) ili od subjekta (za in vitro primenu), koji mogu imati koristi od produženja telomera. Pošto kratki telomeri utiču na skoro sve tipove ćelija kod većine životinja, produženje telomera moze koristiti većini životinja. Tretman produženja telomera koji je prolazan I kratak ima potencijal da bude bezbedan, kao što je gore opisano. Proširenje telomera korišćenjem prolaznog tretmana kako je ovde otkriveno moze stoga biti od koristi kod svih ili kod većine pojedinaca ili kao preventivne mere, na primer za sprečavanje ili odlaganje pojave mnogih bolesti I stanja u Kojima su kratki telomeri umešani, ili kao tretman za te bolesti I stanja. Lečenje moze biti od koristi osobama sa rizikom od starosti srodne bolesti ili stanja, ili koji već boluju od takvih bolesti, a takođe mogu biti od koristi subjektima koji su iskusili, doživljavaju ili su u opasnosti da dožive fizičku trauma ili hronični fizički stress kao što su teške vežbe ili fizički rad, ili psihološke trauma ili hronični psihološki stres, jer svi ovi uslovi izazivaju skraćivanje telomera; fizički stresili trauma zahtevaju podelu ćelija kako bi se popravilo nastalo oštećenje skraćivanje telomera, a ovi uslovi takođe mogu izazvati oksidativni stres, koji takođe skraćuje telomere. Takve bolesti I stanja uključuju, na primer, metabolički sindrom, dijabetes, dijabetičke čireve, bolesti srca, mnoge oblike raka, vaskularnu demenciju, Alchajmerovu bolest, moždani udar, starosnu degeneraciju makule, imunosenscenciju, otkazivanje koštane srži, gastrointestinalne čireve, cirozu, herniju, infekcije, kao što je pneumonija koja je posledica oslabljenog imunološkog sistema, hronična infekcija, blago ili ozbiljno kognitivno oštećenje, poremećena pokretljivost, osteoporoza, osteoartritis, reumatoidniartritis, anksioznost vezana za uzrast, poremećaji ravnoteže, tinitus, Bellovaparaliza, katarakta, COPD bolestarterija, bolest periferniharterija, konjuktivitis, halazion, dehidracija, depresija,

2

emfizem, razne očne bolesti, neuspeh u razvoju, grip, generalizovani anksiozni poremećaj, glaukom, gubitaksluha, gubitak osećaja ukusa, gubitak apetita, iščašenje kuka, gubitak pamćenj, Parkinsonovu bolest, spinalnastenoza, urinarna inkontinencija, fraktura pršljenova i dr.

[0088] Ćelije koje su korisno tretirane u skladu sa ovim metodama mogu takođe uključiti ćelije u ili od subjekta koji pati od bolesti ili stanja povezanih sa uzrastom ili koji je u opasnosti da pati od takve bolesti ili stanja. Takva vezana za uzrast bolesti i stanja mogu uključivati genetske bolesti u kojima su geni koji kodiraju komponente kompleksa telomerase ili kompleksa telomeramutirani, što dovodi do kratkih telomera. Takve bolesti uključuju, na primer, oblike idiopatske plućne fibroze, kongenitadiskeratoze I plastične anemije.

[0089] U slucaju genetskih bolesti, supstance stoga mogu dalje uključivati dodatne nukleinske kiseline, kao što su kao normalne, funkcionalne verzije kodirajućih sekvenci gena koji su zahvaćeni takvim bolestima, na primer DKC1, TINF2, NOP10, NHP2, TERC ili drugi geni. Primeri takvih gena su navedeni u tabeli 8. Videti takođe Armanios (2009) Ann. Rev. Genomics Hum. Genet.10: 45-61.

Tabela 8: Geni povezani sa bolestima vezanim za uzrast.

[0090] Pored toga, tretman moze imati koristi od subjekata koji pate od, ili su izloženi riziku od drugih vrsta genetskih bolesti u kojima kratki telomeri mogu igrati ulogu, kao što je, na primer, mišićna distrofija. Kod takvih bolesti, potreba za replikacijom ćelije da bi se rešio problem izazvan genetskom mutacijom skraćuje telomere brže nego što je normalno, što dovodi do bržeg skraćivanja telomera nego što je normalno, što za uzvrat iscrpljuje replikativni kapacitet ćelija, što dovodi do disfunkcije tkiva, pogoršanja ili dodatnih simptoma, invaliditeta, a često I smrti. Pored toga, različite vrste carcinoma mogu biti sprečene ili odložene tretmanom jedinjenjima iz ovog otkrića, I zaista se veruje da su fuzije hromozoma I hromozoma izazvane kritično kratkim telomerima uzrok raka. Telomere se takođe mogu selektivno produžavati u zdravim ćelijama kod pojedinca, dok ne produžava telomere u ćelijama raka, što moze dozvoliti da se trenutna jedinjenja, kompozicije I metode koriste, na primer, da produže telomere imunog sistema kako bi se povećala njegova sposobnost da se boriprotiv raka. Dalje, ćelije imunog Sistema mogu biti sakupljene od pojedinca za lečenje korišćenjem otkrića ex vivo nakon čega sledi ponovno uvođenje u pojedinca.

2

[0091] Ćelije tretirane prema ovim metodama mogu biti od subjekata kod kojih se još uvek ne manifestuje nijedno bolesno stanje, ali kod kojih je subjekt u riziku za stanje ili bolest koja uključuje kratke telomere, ili gde ćelije sadrže skraćene telomere. Bolest povezana sa godinama moze biti jednostavno starost. Ovde otkriveni tretmani se takođe mogu koristiti kao kozmetička pomoć, za sprečavanje, odlaganje ili ublažavanje pogoršanja izgleda kože, kose, structure kostiju, držanja, bistrine očiju ili drugih osobina koje opadaju starenjem ili u vezi sa starenjem. Na primer, tretmani se mogu koristiti za održavanje elastičnosti kože, debljine, glatkoće I izgleda, pošto produžetak telomera poboljšava ove parametre. U slučajevima fizičke trauma kao što je prelom kosti ili nagnječenje tkiva ili posekotina ili opekotina, otkrivanje se moze koristiti za povećanje dužine telomera u ćelijama koje učestvuju u lečenju traume, kako bi se poveća o njihov replikativni kapacitet. U slučajevima hroničnog fizičkog stresa, koji uzrokuje skraćivanje telomera, tretman sa otkrivanjem može da produži telomere u pogođenim ćelijama povećavaju njihovr eplikativni kapaciteti sposobnost da poprave oštećenje tkiva. Od skraćivanja telomera akumulira tokom generacija, na primer kod ljudi sa haploin suficijencijom komponenti telomera ze kao što su hTRili hTERT, Armanios (2009) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 10:45-61, tretmani iz ovog otkrića mogu se primeniti na linije ćelije kao što su jaja, sperma ili njihovi prekursori, ili na oplođena jajašca ili embrione, na primer tokom in vitro postupaka oplodnje. Tretmani takođe mogu biti korisni za pomoć drugim tretmanima različitih bolesti ili stanja, na primer, transdiferencija ćelija in vivo. Metodel takođe mogu biti korisne pre ili tokom operacije ili hemoterapije, ili radioterapije, kako bi se povećala sposobnost ćelija da se repliciraju kako bi popravila oštećenja koja su rezultat ovih procedura.

[0092] Metode takođe mogu biti korisne za lečenje ćelija in vitro za različite primene, uključujući autologne ili heterologna ćelijska terapija, bioinženjering, tkivni inženjering, rast veštačkih organa, stvaranje indukovanog pluripotenta matične ćelije (iPSC) i ćelijska diferencijacija, dediferencijacija ili transdiferencijacija. U ovim aplikacijama ćelije mogu moraju da se dele mnogo puta, što može dovesti do gubitka dužine telomera, što se može sprečiti otkrivanjem pre, tokom ili posle aplikacije.

[0093] Pored toga, različiti tipovi karcinoma se mogu smatrati bolestima povezanim sa uzrastom, posebno kada su kancerozni ćelije sadrže kratke telomere. U nekim slučajevima, ćelije tretirane prema trenutnim metodama su od subjekata gde još uvek se ne manifestuje nijedno bolesno stanje, ali gde ćelije sadrže skraćene telomere. Bolest povezana sa godinama može biti jednostavno izmenjeni oblik i funkcija tipično povezana sa starim hronološkim uzrastom kod ljudi.

[0094] Ćelije koje su korisno dale jedinjenja ili kompozicije iz ovog otkrića u skladu sa trenutnim metode uključuju ćelije iz bilo kog tkiva ili tipa ćelije koje mogu da trpe efekte skraćenih telomera ili koje mogu u bilo kom imaju koristi od produženja telomera ćelije. Ćelije mogu uključivati somatske ćelije ili zametne ćelije, kao i matične ćelije i druge progenitorne ćelije i/ili nediferencirane ćelije. Ćelije mogu uključivati tumorske ćelije i ne-tumorske ćelije.

[0095] Primeri jedinjenja ili kompozicija koje se koriste ćelijama u skladu sa trenutnim metodama uključuju ćelije koje potiču prvenstveno iz endoderma, ćelije koje potiču prvenstveno iz ektoderma i

2

ćelije koje su izvedene prvenstveno iz mezoderma. Ćelije izvedene prvenstveno iz endoderme uključuju, na primer, egzokrini sekretorni epitel ćelije i ćelije koje luče hormone. Ćelije izvedene prvenstveno iz ektoderme obuhvataju, na primer, ćelije integumenta sistem (npr. keratinizirajuće epitelne ćelije i epitelne ćelije vlažne slojevite barijere) i nervni sistem (npr. ćelije senzorne transduktore, autonomne neuronske ćelije, ćelije čula i periferne neurone koje podržavaju ćelije, centralni nervni system sistemske neurone i glijalne ćelije i ćelije sočiva). Ćelije izvedene prvenstveno iz mezoderma uključuju, na primer, metabolizam i ćelije za skladištenje, ćelije sa barijernom funkcijom (npr. ćelije pluća, creva, egzokrinih žlezda i urogenitalnog trakta), ekstracelularne ćelije matriksa, kontraktilne ćelije, ćelije krvi i imunog sistema, zametne ćelije, ćelije medicinskih sestara i intersticijske ćelije. Shodno tome, u nekim slučajevima trenutnih metoda, ćelija kojoj je dat preparat je somatska ćelija endoderma, mezodermalna ili ektodermalna linija. U nekim slučajevima ćelija je ćelija zametne linije ili embrionalna ćelija.

[0096] Specifični primeri ćelija kojima se može primeniti jedinjenje ili kompozicija u skladu sa trenutnim metode uključuju, na primer, ćelije sluzokože pljuvačne žlezde, serozne ćelije pljuvačne žlezde, ćelije von Ebnerove žlezde u jeziku, ćelije mlečne žlezde, ćelije suzne žlezde, ćelije ceruminozne žlezde u uhu, ekkrine znojne žlezde tamne ćelije, ekkrini znoj čiste ćelije žlezde, ćelije apokrine znojne žlezde, Moll ćelije u kapku, ćelije lojne žlezde, ćelije Boumanove žlezde u nosu, ćelije Brunnerove žlezde u dvanaestopalačnom crevu, ćelije semenskih vezikula, ćelije prostate, ćelije bulburetralne žlezde, Bartolinove ćelije žlezde, Littre ćelije, ćelije endometrijuma materice, izolovane peharaste ćelije respiratornih i digestivnih organa trakti, ćelije sluzokože želuca, zimogene ćelije želudačne žlezde, oksintične ćelije želudačne žlezde, acinarne ćelije pankreasa, Panet ćelije tankog creva, pneumociti tipa II pluća, klara ćelije pluća, ćelije prednje hipofize (npr. somatotropi, laktotropi, tirotropi, gonadotropi i kortikotropi), srednje ćelije hipofize (npr. melanocit-stimulišući hormon), .magnoćelijske neurosekretorne ćelije (npr. one koje luče oksitocin ili vazopresin), ćelije creva i respiratornog trakta (npr. one koje luče serotonin, endorfin, somatostatin, gastrin, sekretin, holecistokinin, insulin, glukagon ili bombesin), ćelije štitne žlezde (npr. epitelne ćelije štitne žlezde i parafolikularne ćelije), ćelije paratiroidne žlezde (npr. glavne ćelije paratiroidne žlezde i ćelije oksifila), ćelije nadbubrežne žlezde (npr. hromafinske ćelije.

[0097] Ćelije kojima je dato jedinjenje ili kompozicija prema takođe otkrivenim metodama mogu biti matične ili progenitorne ćelije, pošto ove ćelije daju početak drugim ćelijama tela. Tretirane ćelije mogu biti ćelije u kojima su telomere skraćuju brže nego kod drugih tipova ćelija, na primer endotelne ćelije, fibroblasti, keratinociti, ćelije imunog sistema sistem uključujući ćelije štitaste i paratiroidne žlezde i leukocite i njihove progenitore, ćelije creva, jetre, sluzokože ćelije membrane, npr. u jednjaku i debelom crevu i ćelijama desni i zubne pulpe.

[0098] Shodno tome, u nekim slučajevima, ćelije su ćelije fibroblasta, keratinociti, endotelne ćelije, epitelne ćelije ili krvna zrnca.

[0099] Korak davanja se može izvesti jednom ili više puta u zavisnosti od količine produženja telomera željeni. U nekim slučajevima otkrivenih metoda, ćelija je izolovana ćelija i korak davanja više ne traje od 96 sati, ne duže od 72 sata, ne duže od 48 sati, ne duže od 36 sati, ne duže od 24 sata, ne duže od 18 sati, ne duže od 12 sati, ne duže od 8 sati, ne duže od 4 sata ili čak kraće. U nekim slučajevima, korak primene traje najmanje 2 sata, najmanje 4 sata, najmanje 8 sati, najmanje 12 sati, najmanje ne više od 1 puta. U nekim slučajevima, korak davanja se izvodi najmanje 2 puta, ne manje od 3 puta, ne manje od 4 puta, ne manje od 5 puta, ne manje od 6 puta, pa čak i češće.

[0101] U nekim slučajevima, korak davanja se izvodi jednom ili nekoliko puta tokom relativno kratkog perioda da bi se ponovo produžio telomere, a zatim se ne izvodi duže vreme dok telomere ne treba ponovo produžiti. Ovaj ciklus može se ponavljati u nedogled. Takav raspored tretmana omogućava da se telomeri periodično ponovo produžavaju, sa intervalima između koraka administracije tokom kojih se telomeri skraćuju. Mogu se sprovoditi i periodične metode lečenja primenom in vivo ili primenom in vitro, po želji. U nekim slučajevima, administrativni korak u takvoj seriji izvodi se ne više od 6 puta, ne više od 5 puta, ne više od 4 puta, ne više od 3 puta, ne više od 2 puta puta, ili čak ne više od 1 puta. U nekim slučajevima, korak davanja se izvodi najmanje 2 puta, ne manje od 3 puta, ne manje od 4 puta, ne manje od 5 puta, ne manje od 6 puta, pa čak i češće. Variranjem broj puta koji se izvodi korak administriranja i doza jedinjenja u našim kompozicijama iz pronalaska kada se koristi, postignuta količina produženja telomera može se kontrolisati.

[0102] U nekim slučajevima, metode sadašnjeg otkrića dalje uključuju korak kultivisanja ćelije na specifičnom podloga, poželjno elastična podloga. Poznato je da takvi supstrati sprečavaju neželjene promene u ćeliji koje bi normalno se javljaju na drugim supstratima zbog nefiziološke elastičnosti tih supstrata. Vidi PCT Int. Publikacija br. VO2012/009682. Elastični supstrati mogu dodatno unaprediti opstanak ćelija.

[0103] Primena jedinjenja ili kompozicija trenutnog otkrića dovodi do prolazne ekspresije aktivnosti telomeraze u ćeliji. Povećana aktivnost se lako meri različitim testovima, kao što je npr. Trapeze® RT komplet za detekciju telomeraze (Millipore), koji obezbeđuje osetljivu in vitro analizu u realnom vremenu korišćenjem fluorimetrije detekciju i kvantifikaciju aktivnosti telomeraze, iako su moguće i druge tehnike merenja. U nekim slučajevima, aktivnost telomeraze je povećana za najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 50%, ili još više. U poželjnim slučajevima, aktivnost telomeraze je povećana za najmanje 5%.

[0104] Kao što je ranije navedeno, jedna od prednosti trenutnih tehnika je da ekspresija aktivnosti telomerase je prolazan u tretiranim ćelijama. Konkretno, takav prolazni izraz je u suprotnosti sa prethodnim tehnikama gde je a gen za reverznu transkriptazu telomeraze se ubacuje u genomski niz ćelije ili na drugi način trajno modifikuje genetski sastav ciljane ćelije i rezultira konstitutivnom aktivnošću sekvence nukleinske kiseline.

[0105] Slika 3 grafički ilustruje neke od prednosti otkrivenih jedinjenja, kompozicija i metoda ovde. Konkretno, brzina proširenja telomera je omogućena ovim jedinjenjima, kompozicijama i metodama

1

omogućava održavanje telomera veoma retkim isporukom TERT modRNA. Izražena aktivnost telomeraze brzo produžava telomere u kratkom periodu, pre nego što se preokrenu, omogućavajući tako zaštitni mehanizam protiv raka. Skraćivanje telomera da bi funkcionisalo većinu vremena. Između tretmana, normalna aktivnost telomeraze i skraćivanje telomera je prisutan, a samim tim i sigurnosni mehanizam protiv raka skraćivanja telomera kako bi se sprečilo nekontrolisano širenje ostaje netaknut, dok rizik od bolesti povezanih sa kratkim telomerom ostaje nizak. Nasuprot tome, najbolji postojeći mali molekul tretman za produženje telomera zahteva hroničnu isporuku, i stoga predstavlja hronični rizik od raka, pa čak i tada ima mali, nedosledan efekat na dužinu telomera, bez uočljivog efekta na dužinu telomera kod otprilike polovine pacijenata. 18 sati, najmanje 24 sata, najmanje 36 sati, najmanje 48 sati, ili čak i duže. U poželjnim slučajevima, administriranje korak ne traje duže od 48 sati, ne duže od 96 sati ili ne duže od 1 nedelje. U drugim poželjnim slučajevima, korak primene traje najmanje 2 sata. Trebalo bi razumeti da, u slučaju kada je primena transfekcijom, vreme za davanje uključuje vreme za oporavak ćelije od metode transfekcije.

[0100] U nekim slučajevima otkrivenih metoda, ćelija je izolovana ćelija i korak davanja se izvodi ne više od 6 puta, ne više od 5 puta, ne više od 4 puta, ne više od 3 puta, ne više od 2 puta, ili čak [0106] Shodno tome, u nekim slučajevima otkrivenih metoda, ekspresija reverzne transkriptaze telomerase aktivnost, odnosno poluvreme aktivnosti telomeraze, traje ne duže od 48 sati, ne duže od 36 sati, ne duže od 24 sata, ne duže od 18 sati, ne duže od 12 sati, ne duže od 8 sati, ne duže od 4 sata, ili čak kraća vremena. U nekim slučajevima, ekspresija aktivnosti reverzne transkriptaze telomeraze traje najmanje 2 sata 4 sata, najmanje 8 sati, najmanje 12 sati, najmanje 18 sati, najmanje 24 sata, najmanje 36 sati, najmanje 48 sati, ili čak i duža vremena. U poželjnim slučajevima, ekspresija aktivnosti reverzne transkriptaze telomeraze ne traje duže od 48 sati. U drugim slučajevima, ekspresija aktivnosti reverzne transkriptaze telomeraze traje najmanje 2 sata.

[0107] U nekim slučajevima trenutnih metoda, prolazna ekspresija je nezavisna od ćelijskog ciklusa.

[0108] Kao što je gore navedeno, prolazna ekspresija reverzne transkriptaze telomeraze rezultira produženjem skraćenog telomera u tretiranim ćelijama. Dužina telomera se može lako izmeriti korišćenjem tehnika kao što je terminalna restrikcija analiza dužine fragmenata (TRF), kPCR, MMkPCR i K-FISH, kako bi razumeo neko ko je obično vešt u umetnost. Videti, npr., Kimura et al. (2010) Nat Protoc. 5:1596-607; doi: 10.1038/nprot.2010.124. U nekim slučajevima, instant metode povećavaju dužinu telomera u tretiranim ćelijama za najmanje 0,1 kb, najmanje 0,2 kb, najmanje 0,3 kb, najmanje 0,4 kb, na najmanje 0,5 kb, najmanje 1 kb, najmanje 2 kb, najmanje 3 kb, najmanje 4 kb, najmanje 5 kb, ili čak i više.

[0109] Jedna od prednosti trenutnih jedinjenja, kompozicija i metoda je brzina proširenja telomere postignute ovim tehnikama. Tehnike omogućavaju da tretmani budu kratki i na taj način bezbedni jer su normalni zaštitni mehanizam skraćivanja telomera ostaje netaknut većinu vremena. Tretman jedinjenjima I kompozicije koje su ovde otkrivene rezultiraju isporukom desetina ili stotina kopija TERT modRNA po ćeliji kako je izmereno apsolutnim RT-kPCR, što je znatno više od prosečnog

2

broja kopija endogene TERT mRNA nalaze čak i u ćelijama sa visokom aktivnošću telomeraze. Obično takve ćelije imaju manje od jedne kopije TERT mRNA po ćeliji (Ii et al. (2001) Nucl. Acids Res. 29:4818-4825). Tako tretmani prolazno uvode veliki broj kopija modRNA koja kodira TERT u ćeliju što rezultira brzim produžavanjem telomera. Bez namere da budem vezan teorijom, veliki broj kopija modRNA koja kodira TERT može privremeno nadvladati inhibitorne regulatorne mehanizme jedinjenja, kompozicije i metode koje su ovde otkrivene.

[0110] Prolazna ekspresija reverzne transkriptaze telomeraze takođe dovodi do povećanog kapaciteta replikacije u tretiranim ćelijama. Povećani replikativni kapacitet se lako prati u ćelijama koje se približavaju replikativnom starenju merenjem dodatnih udvostručavanja populacije u takvim ćelijama. Stareće ćelije nisu stimulisane da se podele prolazom kulture ili tretmana serumom. Stare ćelije se dalje često karakterišu ekspresijom pH-zavisnih β-aktivnost galaktozidaze, ekspresija inhibitora ćelijskog ciklusa p53 i p19, i drugi izmenjeni obrasci ekspresije gena, i povećana veličina ćelije. Odsutan tretman sa jedinjenjima i kompozicijama prema ovom pronalasku, ljudska pluća ćelije fibroblasta se obično udvostručuju 50-60 puta. Međutim, sa jednim setom od jednog do tri tretmana koji ukupno traju samo nekoliko dana, ove ćelije postižu dodatnih 16-28 udvostručenja populacije. Ako se ponovo leči nekoliko nedelja kasnije, dodatna proliferacija kapacitet se ponovo dodeljuje. Može se primeniti ovaj proces povremenih tretmana za periodično produženje telomera dodatna vremena, sa intervalom između tretmana koji zavisi od faktora kao što je brzina skraćivanja elomera, stopa deobe ćelija i količina produženja telomera obezbeđena tretmanom. Isto tako, ljudska mikrovaskularna dermalne endotelne ćelije starije osobe, bez tretmana sa trenutnim kompozicijama, mogu postići samo 1-2 udvostručavanja populacije, dok tretirane ćelije mogu postići 3, 4 ili čak više udvostručenja populacije.

[0111] Shodno tome, u nekim slučajevima, takođe otkrivene metode lečenja povećavaju broj udvostručenja populacije za najmanje jedno, dva, četiri ili čak više udvostručenja stanovništva. U nekim slučajevima, metode lečenja povećavaju broj udvostručenja stanovništva za najmanje 5, 10, 15, 20 ili čak i više udvostručenja stanovništva.

[0112] U nekim od slučajeva trenutnog metoda, jedinjenja ili kompozicije iz otkrića se daju u životinjska ćelija elektroporacijom. U specifičnim slučajevima, jedinjenje prema pronalasku se daje životinjskoj ćeliji od strane elektroporacija u odsustvu dostavnog vozila. U drugim specifičnim slučajevima, jedinjenje prema pronalasku i telomeraza RNK komponenta se daje u životinjsku ćeliju elektroporacijom.

Kompleti

[0113] U drugom aspektu, trenutno otkriće obezbeđuje komplete spremne za upotrebu za upotrebu u proširenju telomera kod sisara ćelija. Kompleti sadrže bilo koje od gore opisanih jedinjenja ili kompozicija, zajedno sa uputstvima za njihovu upotrebu. U nekim slučajevima, kompleti dodatno sadrže materijale za pakovanje. U poželjnim slučajevima, materijali za pakovanje su nepropusna za vazduh. U ovim slučajevima, materijali za pakovanje mogu opciono biti punjeni inertnim gasom, kao što je, na primer, azot, argon, ili slično. U nekim slučajevima, materijali za pakovanje sadrže kontejner od metalne folije, kao što je, na primer, zapečaćena aluminijumska torbica ili slično. Takvi materijali za pakovanje su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti.

[0114] U nekim slučajevima, komplet može dalje da sadrži sredstvo za sušenje, medijum za kulturu, inhibitor RNKaze ili druge slične komponente. U nekim slučajevima, komplet može dalje da sadrži kombinaciju više od jedne od ovih dodatnih komponenti. U nekim slučajevima kompleta, sastav kompleta je sterilan.

[0115] Pošto je sada opisani pronalazak detaljno, isti će biti jasnije shvaćen referencom na sledeće primere, koji su ovde uključeni samo u svrhu ilustracije i nemaju nameru da budu ograničavajući.

PRIMERI

Primer 1. Visoko efikasno produženje telomera u ljudskim ćelijama korišćenjem modifikovane iRNK koja kodira telomerazu

[0116] Bolesti neadekvatnog održavanja dužine telomera i potrebe za povećanim kapacitetom replikacije ćelija za ćelijske terapije i aplikacije bioinženjeringa motivišu razvoj bezbednih metoda za produženje telomera. Blackburn et al. (2010) Cancer Prev Res (Phila) 3:394-402; Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707; Alter et al. (2009) Blood 113:6549-6557; Mohsin et al. (2012) Journal of the American College of Cardiologi doi:10.1016/j.jacc.2012.04.047. Isporuka iRNK za prolazno povećanje količine proteina kodiranog mRNK za terapeutske primene je olakšano ugradnjom modifikovanih nukleozida smanjuju imunogenost i povećavaju stabilnost. Kariko i dr. (2005) Immuniti 23:165-175; Kariko i dr. (2011) Nukleinske kiseline Res.39:e142; doi: 10.1093/nar/gkr695.

[0117] Da bi bio terapeutski koristan, tretman produženjem telomera bi idealno trebalo da bude neimunogeni; specifičan; sposoban da se pokrene pre nego što se telomeri skrate na kritično kratke dužine koje izazivaju hromozomsku nestabilnost I povećan rizik od raka (Ventzensen et al. (2011) Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 20:1238-1250; Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707; Artandi i DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18); prolazno i povremeno, da bi se omogućilo normalan mehanizam za skraćivanje telomera protiv raka da funkcioniše skoro neprekidno; efikasan čak iu ćelijama koje se sporo dele kao što su neke populacije progenitornih i matičnih ćelija; koje se mogu isporučiti in vitro i in vivo korišćenjem neimunogenih nosača; i, konačno, omogućavajući samo dovoljno dodatnih deoba ćelija da bi se potencijalno poboljšale ili sprečile bolesti neadekvatne održavanje telomera, ili da se omogući dovoljno pojačanje ćelija za ćelijske terapije ili bioinženjerske primene. Postojeći tretmani, uključujući tretmane koji koriste male molekule, ne ispunjavaju sve ove kriterijume. Harlei et al. (2011) Rejuvenation Res. 14:45-56. Virusna isporuka TERT-a, iako je moguće inducibilna, rizikuje insercionu mutagenezu i na taj nacin predstavlja ozbiljnu zabrinutost za

4

bezbednost. Tretmani koji uključuju kontinuiranu prekomernu ekspresiju telomeraze su potencijalno nebezbedni, jer u ćeliji sa onkogenom mutacijom, bilo zbog kritično kratkih telomera i rezultirajuće hromozomske nestabilnosti (O’Sullivan i Karlseder (2010) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11:171-181) ili drugi uzrok, konstitutivna ekspresija telomeraze, bilo zbog druge mutacije ili leka, može podržati malignitet omogućavajući neograničenu proliferaciju. Artandi i DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18; Ding etal. (2012) Cell 148:896-907.

[0118] Kriterijumi za bezbedno produženje telomera su ispunjeni pristupom zasnovanim na RNK, olakšanim nedavnim otkrićem da određeni prirodni nukleozidi koji se nalaze u RNK povećavaju stabilnost i smanjuju imunogenost egzogenih RNK kada se isporučuje u ćelije. Kariko i dr. (2005) Immuniti 23:165-175. Primeri takvih nukleozida su navedene u tabeli 4. Bez namere da budemo vezani teorijom, ove modifikovane verzije kanonskih nukleozida mogu dozvolite Toll-like receptore urođenog imunog sistema za razlikovanje endogene modRNA od strane RNK koja ne sadrži ovi nukleotidi. Isporuka dovoljno prečišćene sintetičke modRNA koja sadrži ove nekanonske nukleozide u ćelije rezultira povećanom stabilnošću modRNA i prolaznim porastom proteina kodiranog modRNA sa smanjenim ili poništen imuni odgovor. Kariko i dr. (2011) Nukleinske kiseline Res. 39:e142; doi: 10.1093/nar/gkr695. Dakle, isporuka egzogene modRNA predstavlja mogućnosti bez presedana za aplikacije koje zahtevaju prolaznu proizvodnju proteina.

Na primer, biomimetička modRNA je transfektovana u fibroblaste, reprogramirajući ih na pluripotentno stablo ćelije. Iakubov etal. (2010) Biochem. Biophis. Res. Commun. 394:189-193. Biomimetička modRNA je takođe ubrizgana kod miševa kako bi se spasio model nedostatka proteina plućnog surfaktanta i da bi se povisio eritropoetin i hematokrit nivoa. Kormann i dr. (2011) Nat. Biotechnol. 29:154-157. Kao što je gore opisano, nukleozidi koji se koriste u modRNA koji se ovde koriste izabrani su ne samo da povećaju stabilnost, već i da smanje ili ukinu imunogenost i da povećaju translaciona efikasnost RNK. Transfekcija dendritskih ćelija korišćenjem nemodifikovane mRNA koja kodira hTERT, dok što je rezultiralo povećanjem aktivnosti telomeraze unutar ćelija, takođe je izazvalo jak hTERT-specifičan citotoksični T limfocit odgovor. Saeboe-Larssen i dr. (2002) Journal of Immunological Methods 259: 191-203. Pristupi koji koriste neizmenjeni stoga nije verovatno da će RNK biti efikasne u proširenju telomera u ćelijama.

[0119] Prema tome, isporuka modRNA koja kodira TERT ćelijama može se koristiti za prolazno povećanje nivoa TERT proteina i aktivnost telomeraze dovoljna da produži telomere i poveća replikativni kapacitet za konačan iznos. Povećano nivoi aktivnosti telomeraze se javljaju dovoljno brzo da omoguće tretman produženja telomera koji je kratak i retko (vidi sliku 1a i sliku 3).

[0120] Da bi se demonstrirao pristup, TERT modRNA je sintetizovana korišćenjem odnosa kanonskih i nekanonskih nukleozidi koji daju stabilnost, efikasno prevođenje i smanjenu ili poništenu imunogenost. Iakubov i dr. (2010) Biochem. Biophis. Res. Commun. 394:189-193; Kariko i dr. (2011) Nukleinske kiseline Res. 39:e142; doi: 10.1093/nar/gkr695. Sintetička modRNA sadrži 5’ i 3’ UTR beta globin iRNK, koja ima relativno dugi poluživot. Da bi se dodatno poboljšala stabilnost, modRNA ima dugačak poli-A rep od 151 nukleotida. Da biste maksimizirali vernost dugog TERT DNK šablona koji se koristi u reakciji in vitro transkripcije za generisanje RNK, DNK šabloni su bili generisan korišćenjem pristupa zasnovanog na plazmidu, a ne na PCR.

[0121] Da se razlikuje verodostojno produženje telomera od selekcije ćelija sa dugim telomerima od heterogenog početna populacija, sintetizovana je kontrolna modRNA koja kodira katalitički neaktivan oblik TERT (CI TERT) sa mutacijom jednog ostatka D712A, u kojoj je jedan od trijade aspartata koji koordinira metal na katalitičkom mestu domena reverzne transkriptaze je supstituisan sa alaninom, poništavajući katalitičku aktivnost CI TERT, ali ostavljajući on je strukturno netaknut do te mere da može da veže šablon DNK, i stabilan kao TERT u lizatu retikulocita. Viatt (2009) „Structure-Function Analisis of the Human Telomerase Reverse Transcriptase” Univerzitet u Kalgariju, Ph.D. Teza (http://dspace.ucalgari.ca/bitstream/1880/47511/1/2009_Viatt_PhD.pdf).

[0122] MRC-5 humani fetalni fibroblasti pluća izabrani su kao test ćelije u ovom primeru jer su ovi i drugi ljudski sojevi fibroblasta su decenijama služili kao radni konji u polju telomera i stoga postoji obilje podataka za informisanje eksperimentalni dizajn i analiza. MRC-5 ćelije takođe imaju relativno nisku aktivnost endogene telomeraze i pokazuju skraćivanje telomera i eventualno starenje. Pošto oksidativni stres povećava brzinu skraćivanja telomera u MRC-u 5 ćelija (von Zglinicki et al. (2000) Free Radic. Biol. Med. 28:64-74), i uzrokuje da se TERT lokalizuje u citoplazmi gde ne može da produži telomere (Ahmed et al. (2008) J. Cell. Sci.121:1046-1053), ćelije su kultivisane u 5% umesto ambijentalni kiseonik. Da bi se dodatno povećala verovatnoća uspeha, ćelije su takođe uzgajane u medijumu optimizovanom za protein proizvodnja u MRC-5 ćelijama (Vu et al. (2005) Citotechnologi 49:95-107).

[0122] MRC-5 humani fetalni plućni fibroblasti su izabrani kao test ćelije u ovom primeru zato što su ovi i drugi sojevi humanih fibroblasta decenijama služili kao zamorci u polju telomera i stoga postoji obilje podataka za informisanje eksperimentalnog dizajna i analize. MRC-5 ćelije takođe imaju relativno nisku aktivnost endogene telomeraze i pokazuju skraćivanje telomera i eventualno starenje. Pošto oksidativni stres povećava brzinu skraćivanja telomera u MRC-5 ćelijama (von Zglinicki et al. (2000) Free Radic. Biol. Med. 28:64-74) i uzrokuje da se TERT lokalizuje u citoplazmi gde ne može da produži telomere (Ahmed et al. (2008) J. Cell. Sci. 121:1046-1053), ćelije su kultivisane u 5% kiseonika umesto u ambijentalnom kiseoniku. Da bi se dodatno povećala verovatnoća uspeha, ćelije su takođe uzgajane u medijumu optimizovanom za proizvodnju proteina u MRC-5 ćelijama (Vu et al. (2005) Citotechnologi 49:95-107).

[0123] Efikasnost produžetka telomera zasnovanog na modRNA je podložna nekoliko faktora, uključujući efikasnost transfekcije, translacija i savijanje u funkcionalnu telomerazu, i sposobnost da se barem privremeno izbegne opsežni mehanizmi post-translacione regulacije koja inhibira TERT i telomerazu u mnogim tipovima ćelija uključujući MRC-5 ćelije. Dok efikasnost transfekcije sa manjim vrstama modRNA kao što je nGFP (0,8 kb) u MRC-5 ćelijama je obično preko 90% čak i sa niskim koncentracijama modRNA (slika 6), otvoreni okvir TERT je relativno velik (3399 bp), a modRNA TERT konstrukcija uključuje UTR i poli-A rep, čineći tako konstrukt još većim (3751 bp). Kao što je prikazano na slici 1b, međutim, i TERT i CI TERT su efikasno transfektovani u MRC-5 ćelije pomoću katjonskog lipida (kako je izmereno pomoću RT-PCR mRNA sakupljene na kraju tretmana iz ćelija MRC-5 tretiranih sa 1 ug/ml TERT modRNA tokom 5 sati). Dalje, isporuka TERT ili CI TERT modRNA je rezultirala ekvivalentnim i značajnim (P<0,03 i <0,01, respektivno) povećanjem količine proteina prepoznatog anti-TERT antitelom, veličine približno 122 kDa, blizu procenjena veličina TERT-a od 127 kDa (Slika 1c). Vick et al. (1999) Gene 232:97-106. Izmereni su nivoi proteina kvantitativnom infracrvenom fluorescencijom Vestern blot. Nivoi TERT proteina se ne razlikuju značajno između tretiranih ćelija sa TERT i ćelije tretirane sa CI TERT (n=3).

[0124] Da bi se formirala funkcionalna telomeraza, TERT se mora pravilno sklopiti i formirati kompleks sa najmanje TERC. Telomeraza je takođe snažno regulisana posttranslaciono, uključujući citoplazmatsku lokalizaciju i inhibitornu fosforilaciju. Cifu-entes-Rojas i Shippen (2012) Mutat. Res.

730:20-27; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. Zaista, nisu sve ćelije koje eksprimiraju TERT sposobne da održavaju telomere. Counter et al. (1998) Proc. Natl. Akad. Sci. U.S.A.95:14723-14728. Isporuka TERT modRNA povećala je aktivnost telomeraze na način zavisan od doze do maksimuma pri koncentraciji od približno 0,6 ug/ml (vidi sliku 7), a koncentracija od 1 ug/ml je korišćena za naredne eksperimente. Nivoi aktivnosti Tel-omeraze su se brzo povećali, ali su se vratili na početne nivoe u roku od približno 48 sati, a CI TERT modRNA nije izazvala promenu aktivnosti telomeraze (slika Id). Aktivnost telomeraze je merena pomoću TRAPeze® RT testa zasnovanog na kPCR (n=3).

[0125] Pošto je posttranslaciona regulacija TERT delimično posredovana citoplazmatskom sekvestracijom na način koji zavisi od ćelijskog ciklusa, subćelijska lokalizacija TERT-a u tretiranim i netretiranim ćelijama je takođe ispitana. Cifuentes-Rojas i dr. (2011) Mutat. Res. doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. U skladu sa rezultatima Vestern blot-a, imuno-citohemija je pokazala obilje, iako možda inhibirano, proteina koje prepoznaje TERT antitelo u netretiranim MRC-5 ćelijama, što otežava razlikovanje endogenog od egzogenog TERT (podaci nisu prikazani).

[0126] Ćelije unutar približno 10 udvostručavanja populacije (PD) od početka replikacijskog starenja su korišćene za merenje efekta tretmana TERT modRNA na dužinu telomera i replikativni kapacitet. Odluka o upotrebi takvih ćelija bila je zasnovana na najmanje dva faktora. Prvo, ćelije u ovoj fazi imaju relativno kratke telomere, a pošto telomeraza prvenstveno proširuje kratke telomere, uključujući i ćelije MRC-5, tretman ćelija u ovoj fazi bi trebalo da rezultira većim, lakše merljivim efektom. Britt-Compton i dr. (2009) FEBS Lett. 583:3076-3080. Drugo, tretiranjem ćelija u ovoj fazi, smanjuje se vreme potrebno da se utvrdi da li je tretman povećao replikacioni kapacitet. U trenutnim uslovima, replikativno starenje počinje približno 50 PD nakon prijema ćelija MRC-5 od dobavljača (pogledajte metode za detalje), i stoga je odlučeno da se ćelije tretiraju na približno PD 40. MRC-5 ćelije u ovoj fazi imaju prosečnu vrednost. dužine telomera od približno 5-7 kb, u zavisnosti od istorije kulture i PD po prijemu od dobavljača. Sitte et al. (1998) Slobodni Radić. Biol. Med. 24:885-893; MacKenzie et al. (2000) Ekp. Cell Res.259:336-350.

[0127] Nekoliko razmatranja je uzeto u obzir pri dizajniranju šeme tretmana (Slika 4a). Stope produženja telomera dobijene korišćenjem virusne transdukcije TERT u MRC-5 ćelije variraju, ali su reda oko 0,2 kb po podeli. MacKenzie et al. (2000) Ekp. Cell Res. 259:336-350. Stope skraćivanja telomera u MRC-5 ćelijama variraju u zavisnosti od uslova kulture i prakse (Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893; von Zglinicki et al. (2000) Free Radic. Biol. Med 28:64-74), ali su približno 0,1 kb po PD u kiseoniku okoline (Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893). Ćelije su kultivisane u 5% kiseonika, pošto se telomeri ćelija MRC-5 skraćuju sporije pod manje oksidativnim uslovima. von Zglinicki i dr. (2000) Slobodni Radic. Biol. Med. 28:64-74. Utvrđeno je da je PD vreme u ćelijama PD 40 MRC-5 približno 33 sata. Imajući u vidu ove podatke, moglo bi se očekivati da će biti potrebno više tretmana kako bi se otkrilo produženje telomera u okviru rezolucije odabranih metoda merenja dužine telomera, analize restrikcionog fragmenta telomera (TRF) i kvantitativne fluorescencije in situ hibridizacije (K-FISH) . Interval između tretmana je odabran da bude 48 sati pošto je otkriveno da su se nivoi aktivnosti telomeraze vratili na početne nivoe do tog vremena nakon jednog tretmana.

[0128] Kao što je prikazano na slikama 3(b)-(d), tretman MRC-5 ćelija sa hTERT modRNA dovodi do značajnog povećanja dužine telomera u ovim ćelijama u poređenju sa ćelijama koje su ili netretirane ili tretirane samo sredstvom za isporuku. Fluorescentne mikrografije metafaznih MRC-5 ćelija nakon tretmana pokazuju lokaciju telomerne sonde na hromozomima u ovim ćelijama (Slika 4(e)).

[0129] Efekat tretmana na dužinu telomera je takođe meren kvantitativnom fluorescencijom in situ hibridizacijom (K-FISH) (Slika 4(f)), jer ova tehnika obezbeđuje relativno visoku rezoluciju (0,3 kb) i zato što fluorescencija K-FISH telomernih sondi je direktno proporcionalna dužini telomera. Lansdorp et al. (1996) Hum. Mol. Genet. 5:685-691; Martens et al. (1998) Nat. Genet. 18:76-80. Pošto je replikativni kapacitet funkcionalni parametar od najvećeg interesa za povećanje kao rezultat proširenja telomera, konstruisana je standardna kriva koja povezuje broj udvostručavanja populacije MRC-5 ćelija sa dužinom telomera mereno korišćenjem K-FISH (slika 4(g)(i). )). Nakon tri tretmana PD 40 MRC-5 sa TERT mRNA u intervalima od 48 sati, prosečna ukupna dužina telomera po ćeliji se povećala za 56+/-5% (n=15 ćelija za svaku od dve biološke replike za svaki tretman; trake greške predstavljaju s.e.m.. Dužina telomera u tretiranim ćelijama PD 40 bila je slična onoj u netretiranim ćelijama PD 3 (slika 4(g)(ii)) (gornja isprekidana linija), pa je tretman produžio telomere za iznos za koji se telomer skraćuje u ovim ćelijama preko 37. PD. U ovom broju PD pod standardnim uslovima kulture, telomeri MRC-5 se skraćuju za preko >1 kb. Sitte et al. (1998) Slobodni Radić. Biol. Med.

24:885-893. U skladu sa ovim, uočeno povećanje dužine telomera od 56% odgovara povećanju prosečne dužine telomera od približno 0,6-2,5 kb, na osnovu činjenice da ćelije PD 40 MRC-5 imaju prosečnu dužinu telomera od približno 5-7 kb kao mereno korišćenjem TRF (Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893; MacKenzie et al. al. (2000) Ekp. Cell Res. 259:336-350), koji precenjuje dužinu telomera za približno 2,5-4 kb, pa su stvarne prosečne dužine telomera u PD 40 MRC-5 ćelijama u opsegu od 1-4,5 kb. Aubert et al. (2012) Mutat. Res. 730:59-67. Pošto je tretman trajao ukupno 144 sata, a vreme udvostručenja populacije ćelija bilo je približno 33 h. tokom ovog vremena, ćelije su bile podvrgnute približno 4-5 PD. Dakle, stopa produženja telomera bila je približno 0,1-0,6 kb po PD, čiji se gornji opseg približava maksimalnim stopama ikada prijavljenim nakon virusne transdukcije DNK koja kodira TERT, a čiji je donji opseg uporediv sa tipičnim stopama primećenim korišćenjem virusne isporuke . Kao što se i očekivalo, netretirane ćelije imaju dužine telomera ekvivalentne PD 40 ćelijama tokom generisanja standardne krive (donja isprekidana linija na slici 4(g)).

[0130] Zatim je ispitan efekat tretmana TERT mRNA na replikacioni kapacitet ćelije. Kao što se i očekivalo, netretirane ćelije i ćelije koje su tretirane samo nosačem starile su u normalnom opsegu od 50-60 PD (Slika 5a). U upečatljivom kontrastu, ćelije tretirane TERT mRNA nastavile su da se razmnožavaju izvan PD pri čemu su kontrolne populacije dostigle replikativno starenje na način zavisan od doze, pri čemu je svaki dodatni tretman davao znatno više dodatne PD.

[0131] Tri tretmana sa TERT mRNK rezultirala su povećanjem replikativnog kapaciteta od 28+/-1,5 PD. Ovaj rezultat je u skladu sa procenom da su telomeri produženi za > 1 kb, pošto se telomeri MRC-5 skraćuju za približno 0,1 kb po PD (Sitte et al. (1998) Free Radic. Biol. Med. 24:885-893) u ambijentalnog (20%) kiseonika, a tretirane ćelije su kultivisane u 5% kiseonika, u kome se telomeri sporije skraćuju. Uočeno povećanje replikativnog kapaciteta tretiranih ćelija od 28 PD je ekvivalentno gubitku replikativnog kapaciteta koji se javlja u normalnim fibroblastima tokom više od jedne decenije normalnog ljudskog starenja. Takubo i dr. (2010) Geriatr Gerontol Int.10 Suppl 1:S197-206; doi: 10.1111/j.1447-0594.2010.00605.k.; Allsopp, R.C. et al. (1992) Proc. Natl. Akad. Sci. U.S.A.

89:10114-10118.

[0132] Važno za terapeutske primene, sve do sada proučavane tretirane ćelije su na kraju stare, i zaista stare u manjem broju PD nego u netretiranim ćelijama sa ekvivalentnom dužinom telomera, kao što bi se moglo očekivati pošto su tretirane ćelije prošle desetine dodatnih PD, u poređenju sa netretiranim ćelijama sa telomerima slične dužine, u kojima se akumuliraju oštećenja netelomerne DNK ili druga oštećenja koja mogu uticati na stope skraćivanja telomera ili na drugi način podržavati indukciju replikacijskog starenja.

[0133] Kako su se ćelije MRC-5 približavale i ulazile u replikativno starenje, one su imale tendenciju da nabubre do nekoliko puta većeg od prečnika ranih prolaza (Slika 8a). Kao i kod replikativnog starenja, ova tranzicija je odložena u ćelijama tretiranim sa TERT modRNA, ali ne i u ćelijama koje su primale CI TERT modRNA ili samo sredstvo isporuke (slika 8b).

[0134] U skladu sa nalazom da CI TERT modRNA nije izazvala povećanje aktivnosti telomeraze (slika Id), tretman CI TERT modRNA nije promenio distribuciju dužine telomera u odnosu na netretirane ćelije, niti je CI TERT modRNA povećao kapacitet replikacije, uprkos tome što je uzrokovao povećanje nivoa TERT proteina ekvivalentno onom izazvanom TERT modRNA (Slika 1c). Pošto je jedina razlika između TERT i CI TERT zamena sa jednim ostatkom koja poništava sposobnost CI TERT da prenese nukleotide u telomere, ovi rezultati snažno podržavaju hipotezu da je povećanje dužine telomera i replikativnog kapaciteta primećeno u ćelijama tretiranim sa TERT modRNA je zbog verodostojnog produženja telomera u bar nekim tretiranim ćelijama, a ne selekcije već postojeće subpopulacije ćelija sa dužim telomerima.

[0135] Rezultati ovog primera pokazuju da isporuka TERT modRNA u ljudske ćelije prolazno podiže aktivnost telomeraze, brzo proširuje telomere i povećava replikativni kapacitet za konačnu, a time i potencijalno bezbednu količinu. Prečišćena biomimetička modRNA je takođe hipoimunogena. Kariko i dr. (2011) Nukleinske kiseline Res. 39:e142; doi: 10.1093/nar/gkr695. Stoga isporuka modRNA ispunjava nekoliko važnih kriterijuma za terapijski tretman produženja telomera, a takođe ima obećanje u pogledu drugih kriterijuma uključujući specifičnost, ciljanu isporuku i sposobnost da se prevaziđe posttranslaciona regulacija. Što se tiče specifičnosti, prekomerna ekspresija TERT takođe može uticati na druge gene kao što je Vnt (Park et al. (2009) Nature 460:66-72), ali takvi efekti se mogu izbeći isporukom modRNA koja kodira TERT mutiran na mestima vezivanja faktora koji posreduju u bilo kom takvom nespecifičnom efektu. Što se tiče isporuke, nedavno otkriće da se modRNA kod ljudi isporučuje u egzozomima između ćelija preko krvi i drugih telesnih tečnosti omogućava isporuku modRNA zasnovanu na egzozomima za produžavanje telomera i druge primene. Lakhal i Vud (2011) Bioeseji 33:737-741. Egzo-somi su uspešno korišćeni za isporuku biomimetičke modRNK ćelijama in vitro (podaci nisu prikazani). Što se tiče posttranslacione regulacije, zavisna od ćelijskog ciklusa i nezavisna inhibitorna posttranslaciona regulacija TERT-a može se izbeći isporukom modRNA koja kodira TERT mutiranu na jednom ili više poznatih mesta koja posreduju u tim aktivnostima, kao što je sekvenca nuklearnog izvoza, ili koisporuku modRNA koja kodira druge delove jedinjenja telomeraze ili telomera. Ovi pristupi omogućavaju produžavanje telomera čak i u ćelijama koje se sporo ili ne dele, čineći tretman TERT modRNA prikladnim za populaciju matičnih i progenitornih ćelija u mirovanju ili sporo dele. Proširenje telomera zasnovano na modRNA stoga nalazi neposrednu primenu u povećanju replikativnog kapaciteta ćelija za istraživanje, i dodatno za ćelijske terapije, aplikacije bioinženjeringa i in vivo tretmane koji se bave bolestima i uslovima neadekvatnog održavanja tel-omera.

[0136] Ukratko, modRNA koja kodira reverznu transkriptazu humane telomeraze (TERT) je isporučena u MRC-5 humane plućne fibroblaste tri puta tokom 96 sati. Telomere u tretiranim ćelijama su produžene za >1 kb, količinu za koju se telomeri fibroblasta skraćuju tokom više od jedne decenije starenja kod ljudi u proseku. Takubo i dr. (2010) Geriatr Gerontol Int. 10 Suppl 1:S197-206; doi: 10.1111/j.1447-0594.2010.00605.k. Aktivnost telomeraze vraćena na pre-tretman- nivoa u roku od 48 sati i početak replikativnog starenja u tretiranim ćelijama je odložen za približno 30 udvostručavanja populacije, na način koji zavisi od doze. Stoga isporuka RNK telomeraze koja sadrži modifikovane nukleozide u ćelije omogućava brzu i hipoimunogenu ili neimunogenu, a RNK je koristan pristup produženju telomera za različite primene.

4

METODE

[0137] Generisanje i sinteza modRNA šablona. Divlji tip (VT) ljudski TERT otvoreni obrazac za čitanje (ORF) koji se koristi za generisanje DNK šablona za sintezu modRNA identičan je NCBI humanom TERT transkriptu, varijanta 1 referenca sekvenca NM_198253.2, i generisana je modifikacijom G516D na ORF plazmida pBABE-neo-hTERT (Addgene plazmid 1774). Ostatak 516 je u KFP motivu N-terminalnog produžetka TERT-a, motivu koji je povezan sa multimerizacijom i RNK vezivanjem TERT-a. Katalitički neaktivni TERT (CI TERT) mutant je generisan iz VT TERT sekvence uvođenjem mutacije D712A. VT i CI, TERT ORF su ubačeni u MCS početnog plazmida koji sadrži T7 promoter, 5’ UTR humanog beta globina (hBB), MCS, 3’ UTR hBB,poli-A sekvenca od 151 bp i restrikciono mesto za linearizaciju sa enzimom klase IIs koji prati poli-A sekvencu. Dobijeni intermedijarni plazmid je sekvencioniran u najmanje četiri puta da bi se osigurala vernost, linearizovan i transkribovan na zatvorenu RNK koristeći RNK polimerazu iz MEGAscript T7 kompleta (Ambion, Austin, Teksas) i prilagođenu mešavinu nukleotida kanonskih i nekanonskih nukleotida ( TriLink BioTechnologies) u kojoj su konačne koncentracije nukleotida po 40 ul IVT reakcije bile 7,5 mM za svaki od adenozin-5'-trifosfata (ATP), 5-metilcitidin-5'-trifosfata (m5C) i pseudouridin-5'-trifosfata Ψ), 1,5 mM za gvanozin-5'-trifosfat (GTP) i 6 mM za analog kapice (ARCA, NEB), ili molarni odnos ATP:m5C:Ψ:GTP:ARCA od 1:1:1: 0,2:0,8. Da bi se dodatno smanjila potencijalna imunogenost mRNK u vezi sa frakcijom koja nosi 5’-3P (∼20% ukupnog broja), IVT proizvodi su tretirani fosfatazom (Antarktička fosfataza, NEB). Veličina i integritet modRNA proizvoda je verifikovan korišćenjem elektroforeze denaturišućeg agaroznog gela.

[0138] Ćelije i ćelijska kultura. MRC-5 humani fetalni plućni fibroblasti (ATCC CCL-171) su primljeni od ATCC na pasusu 14, trenutnom broju prolaza njihovog inventara distribucije. Pošto ATCC ne ukazuje na PD broj, ovde citirane vrednosti PD odnose se na broj PD nakon prijema ćelija od ATCC-a, koji je ovde definisan kao PD 0. Da bi se skratili njihovi telomeri u pripremi za eksperimente proširenja telomera, ćelije su kultivisane korišćenjem ATCC smernica u DMEM sa 10% FBS, u ambijentalnom kiseoniku i 5% CO2. Tretman proširenja telomera počeo je otprilike nakon 40. PD prijema ćelija od ATCC. Najmanje 48 sati pre početka tretmana modRNA ćelije su prebačene u 5% kiseonik i DMEM medijum koji sadrži 20% FBS i penicilin-streptomicin. Ćelije su tretirane najmanje 24 sata nakon postavljanja i 24 sata pre tripsinizacije.

[0139] modRNA transfekcija. Ćelije su transfektovane sa 0,4 nM TERT modRNA i 2,0 nM TERC RNK osim ako nije drugačije naznačeno, korišćenjem Lipofectamine RNAiMak (Invitrogen), katjonskog lipida, u Opti-MEM redukovanom serumskom medijumu (Invitrogen) tokom 4-5 sati, nakon čega su vraćene u normalnu sredinu.

[0140] Merenje aktivnosti telomeraze. 24 sata nakon početka perioda transfekcije, ćelije su isprane PBS, tripsinizovane, peletirane na 500 g tokom 5 minuta. i isprano sa PBS, repelirano, a zatim lizirano prateći uputstva u TRAPeze RT kompletu (Millipore). Koraci reverzne transkripcije i kPCR su sprovedeni u Roche LightCicler 480 II i ABI 7900 HT. Aktivnost telomeraze uzoraka je uvek upoređivana sa referentnim standardom koji se isporučuje sa kompletom, jer smo otkrili da je povećanje preklopa bilo sklono da bude veoma varijabilno, verovatno zbog niske aktivnosti telomeraze u MRC-5 ćelijama.

[0141] Imunocitohemija. 24 sata nakon početka perioda transfekcije, ćelije su isprane sa PBS, fiksirane u 2% paraformaldehidu 20 minuta, isprane tri puta sa PBS, blokirane u PBS koji sadrži 7,5% BSA i 0,1% Triton Ks-1001 sat, ispran tri puta, inkubiran preko noći na 4oC na klackalici u anti-TERT antitelu (ABCAM 32020 u 1:50 ili Rockland 600-401-252S u 1:500) u PBS sa 5% BSA, ispran tri puta, inkubirano jedan sat u sekundarnom antitelu, isprano dva puta, a zatim još dva puta na šejkeru po 3 minuta svaki put, zatim inkubirano u 0,1 ug/ml DAPI tokom 3 minuta, i isprano četiri puta u PBS.

[0142] Protočna citometrija. Ćelije tretirane sa 0,5-1,5 ug/ml TERT modRNA i kontrole su tripsinizovane 22 h. nakon početka transfekcije, ispran, fiksiran u 2% paraformaldehidu, permeabilizovan u 7,5% BSA sa 0,1% Triton Ks-100 tokom 20 min., ispran tri puta u PBS, blokiran u 7,4% BSA tokom 1 h, inkubiran u anti-TERT antitelo (ABCAM 32020 u 1:50) u PBS sa 5% BSA, isprano tri puta, inkubirano u sekundarnom antitelu (1:200) u PBS, zatim isprano tri puta i resuspendovano u FACS puferu i analizirano na Accuri C6 Flov Citometer ( Bekton Dikinson). Srednji intenzitet fluorescencije izračunat je kao prosečna fluorescencija svih ćelija u tretiranim i kontrolnim uzorcima. Podaci su analizirani korišćenjem softvera CFlov Plus.

[0143] RT-PCR Ukupna RNK je sakupljena korišćenjem RNeasi Mini kita (Kiagen) i konvertovana u cDNK korišćenjem jedinjenja RNA-to-cDNK visokog kapaciteta (Invitrogen). cDNK je amplifikovan korišćenjem PCR sa sledećim prajmerima:

hTERT-F: 5’-GCCCTCAGACTTCAAGACCA (SEK ID NO:1)

3’-hBB-R: 5’-AGGCAGAATCCAGATGCTCA (SEQ ID NO:2)

GAPDH-F: 5’-GTGGACCTGACCTGCCGTCT (SEQ ID NO:3)

GAPDH-R: 5’-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT (SEQ ID NO:4)

[0144] Western blot. Protein je sakupljen ispiranjem ćelija jednom sa PBS, a zatim liziranjem ćelija u RIPA puferu. Protein je stavljen na NuPAGE Novek tris-acetat gel, prebačen na PVDF membranu tokom 2 h. na 35 V, zatim hibridizovan sa anti-alfa tubulinom (Sigma na 1:10,000) i anti-TERT antitelom (ABCAM 32020 na 1:1000 ili Rockland 600-401-252S na 1:500) i anti-preko noći na 4°C . Sekundarna detekcija je izvršena korišćenjem infracrvenih (680 nm i 800 nm) antitela (LI-COR) i Odissei imidžera (LI-COR). Slike su analizirane korišćenjem ImageJ.

[0145] K-FISH. Ćelije su inkubirane u 0,1 ug/ml kolcemida 4 sata pre fiksacije i pripreme metafaze namazi prema proceduri Lansdorpa et al.41 Slajdovi su zatim obojeni pomoću Telomere PNA FISH Kit/FITC kit (Dako, Danska), zamenjujući sondu za telomere obeleženu AlekaFluor 555 (BioSinthesis, SAD) za kit sondu. Svaki ćelija je snimljena na DeltaVision (Applied Precision, Inc., Vašington) mikroskopu koristeći SoftVoRk softver koristeći ili 60Ks ili 100Ks uljni objektiv u intervalima od 0,2 mikrona u opsegu od 3 mikrona koristeći motorizovani stepen, i prilagođeni korišćen je softver za identifikaciju slike na kojoj je svako telomerno mesto bilo u fokusu i integrisanje njenog intenziteta u taj infokus slika. Vremenske varijacije u intenzitetu osvetljenja kompenzovane su korišćenjem fotosenzora DeltaVision koji snimio intenzitet osvetljenja svake slike, varijaciju u prostornom intenzitetu i tamnu struju CCD i grešku čitanja kompenzovano je dobijanjem slika ravnog polja i slika tamnog polja, respektivno. Najmanje 15 metafaznih ćelija doprineo svakoj replikaciji i svaki uzorak je meren u najmanje duplikatu tokom najmanje dva odvojena eksperimenta.

[0146] Krive rasta. Ćelije su sakupljene i prebrojane na hemocitometru jer automatizovani brojač nije mogao

da se tačno prebroje ćelije kada populacija postane heterogena u odnosu na prečnik kao populacija ušao u replikativno starenje. Slike su dobijene da bi se omogućilo merenje prečnika ćelija. PD su izračunati kao log2 odnosa broja ćelija na kraju i početku svakog perioda kulture između pasaža.

[0147] Statistika. Statistička analiza je izvršena korišćenjem Microsoft Ekcel-a. Trake greške predstavljaju srednju vrednost 6 s.e.m. Dužine telomera su upoređene korišćenjem T-testova sa P < 0,05 (dvostrano) koje se smatra statistički značajnim.

Primer 2. Efekti tretmana TERT modRNA na ljudske endotelne ćelije

[0148] Efekti tretmana TERT modRNA nisu ograničeni na ćelije fibroblasta. Kao što je prikazano na slici 9, ljudske mikro- vaskularne dermalne endotelne ćelije ("HMDEC") pokazuju tipične krive udvostručavanja, sa ranim početkom starenja na približno prolazu #12 i sa ćelijama koje su potpuno stare na prolazu #17. Kao što je prikazano na slici 10, tretman ovih ćelija na prolazu #18 sa divljim tipom hTERT modRNA (desna traka u svakoj seriji) dovodi do preokreta starenja, dok kontrolni tretman (leva traka u svakoj seriji) ili tretman sa mutantnim hTERT modRNA (srednja traka u svakoj seriji), nije imala uticaja na ćelijsko starenje.

[0149] Slika 11 pokazuje efekte različitih tretmana na rast HMDEC. Konkretno, ćelije tretirane tri puta sa divljim tipom TERT modRNA (VT) između prolaza #10 i prolaza #11 su nastavile da rastu, dok su netretirane ćelije (UT), ćelije tretirane samo nosačem (CO) i ćelije tretirane katalitičkineaktivan TERT (CI) je prestao da se udvostručuje.

[0150] Slika 12 prikazuje rezultate β-galaktozidaze (bGAL) bojenja HMDEC na prolazu #14 nakon tretmana sa VT i CI modRNA. Ovo bojenje meri aktivnost β-galaktozidaze na pH 6, što je svojstvo starih ćelija koje se ne nalazi u presenescentnim, mirnim ili besmrtnim ćelijama. Vidi Dimri et al. (1995) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 92:9363-7.

4

METODE

[0151] HMDECs kumulativna kriva udvostručavanja populacije je napravljena korišćenjem formata ploče sa 12 utora. Približno 105 HMDEC-a je u svakoj vremenskoj tački zamenjeno u tri primerka, a brojanje ćelija je obavljeno 4. dana nakon prethodnog ponovnog postavljanja. Kao što je prikazano na slici 9, pasus #12 je određen kao rana početna tačka starenja HMDEC.

[0152] Kao što je prikazano na Slici 10, približno 105 HMDEC-a je transfektovano dva puta svakog drugog dana sa 0,75 mg modRNA koje kodiraju hTERT-CI i -VT u prisustvu kontrole samo nosioca (CO, RNiMAKS). Brojanje ćelija je obavljeno na pasusima #19, 20 i 21 svaki put 5. dana nakon ponovnog postavljanja.

[0153] Za eksperiment prikazan na slici 11, u intervalu između pasusa #10 i #11 (i, kao što je gore navedeno, pasus #12 odgovara ranom početku HMDEC starenja), približno 5 x 10<5>HMDECs po boci od 75 cm<3>kultivisani su na medijumu EBM-2 podržanom sa EGM-2 MV dodatkom (oba iz Lonze, Valkersville, MD USA, kataloški br. CC-3156 i CC-4176, respektivno). Mikrovaskularne ćelije su transfektovane tri puta svakog drugog dana sa 5 mg modRNA koje kodiraju hTERT-VT (VT) i hTERT-CI (CI) u prisustvu netretiranih (UT) i samo nosača (CO, RNAiMAKS) kontrolnih boca. U svakoj vremenskoj tački, 5 x 10<5>ćelija je postavljeno na ploče i, počevši od pasusa #11, brojanje ćelija putem hemocitometra je urađeno 5 dana nakon ponovnog postavljanja. Za svaku vremensku tačku, svaki eksperimentalni uslov je izveden u tri primerka.

[0154] Za eksperimente prikazane na Slici 12, približno 10<5>od svakog NT, hTERT-CI i hTERT-VT HMDEC pasaža #14 je tretirano kao što je opisano na Slici 10. Ćelije su zatim podvrgnute analizi starenja ćelija na osnovu histohemijske analize obojene za aktivnost β-galaktozidaze na pH 6 korišćenjem kompleta za histohemijsko bojenje Senescence Cells (Sigma, kataloški br. CS0030). Leva strana slajda prikazuje reprezentativne slike netretiranih (NT) ćelija i ćelija tretiranih hTERT-CI (CI) ili hTERT-VT (VT) modRNA. Sve slike su dobijene pod identičnim uslovima snimanja. Svako eksperimentalno stanje je izvedeno u tri primerka, a procenat ćelija pozitivnih na aktivnost βgalaktozidaze (kao što je prikazano na grafikonu) za svako stanje je izračunat kao prosek pozitivnih ćelija u tri nasumično uhvaćene oblasti.

Primer 3. Dalja karakterizacija efekata tretmana TERT modRNA na ljudske ćelije

[0155] U ovom primeru, mRNA je transfektovana preko katjonskog lipida u primarne humane fibroblaste i mioblaste (Slika 13A), ćelije za koje je poznato da imaju ograničen proliferativni kapacitet. Vebster i Blau (1990) Somat Cell Mol Genet.16:557-565; Haiflick and Moorhead (1961) Ekp Cell Res. 25:585-621; Iakubov i dr. (2010) Biochem Biophis Res Commun. 394:189-193. Efikasnost transfekcije je određena korišćenjem protočne citometrijske kvantitacije fluorescencije jedne ćelije nakon isporuke GFP mRNA, što je pokazalo da je većina ćelija (>90%) transfektovana čak i pri relativno niskim koncentracijama modifikovane iRNK (0,1 mg/ml) (Slika 13B i Slika 16AC). Tretman ćelija sa jednakim koncentracijama egzogene TERT mRNK ili mRNK koja kodira katalitički neaktivan (CI) oblik TERT-a rezultirao je internalizacijom sličnih količina mRNK (Slika 16D), kao što je mereno RT-kPCR 24 h nakon prvog tretmana. CI TERT ima supstitucionu mutaciju na jednoj od trijade aspartata koji koordiniraju metal na katalitičkom mestu domena reverzne transkriptaze TERT. Kao rezultat toga, CI TERT ne može da dodaje nukleotide u telomere, ali ostaje strukturno netaknut, sposoban da veže šablon DNK i pokazuje stabilnost uporedivu sa divljim tipom TERT u lizatima retikulocita. Viatt (2009) Strukturno-funkcionalna analiza reverzne transkriptaze ljudske telomeraze. Ni tretman TERT ni CI TERT mRNA nije uticao na nivoe endogena TERT mRNA u odnosu na netretirane ćelije mereno RT-kPCR (Slika 16E). Transfekcija sa 1 mg/ml TERT ili CI TERT mRNA dovela je do ekvivalentnih 50% povećanja (P<0,05 i <0,01, respektivno) količine TERT proteina u fibroblastima (Slika 13C, levi panel). Vick et al. (1999) Gene.232:97-106; Ahmed i dr. (2008) J Cell Sci. 121:1046-1053. Prisustvo endogenog TERT proteina u ćelijama sa malom aktivnošću endogene telomeraze je u skladu sa relativnim obiljem neaktivnih varijanti spajanja TERT-a u mnogim tipovima ćelija i ekstenzivnim post-trans-trans-lacionalna inhibitorna regulacija aktivnosti TERT-a kao što su drugi ranije izvestili. Ii et al. (2001) Nukleinske kiseline Res. 29:4818-4825; Cifuentes-Rohas i Shippen (2011) Mutat Res. [objavljeno onlajn pre štampanja: 18. oktobar 2011]; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. Tretman sa sve većim količinama TERT mRNA je rezultirao zavisnošću od doze povećanjem ekspresije TERT proteina mereno u jednoćelijskim testovima protočnom citometrijom (Slika 13C, desni panel).

[0156] Aktivnost telomeraze je prolazno povećana. Da bi se testiralo da li je modifikovana isporuka TERT mRNA rezultirala stvaranjem funkcionalnog TERT proteina, aktivnost telomeraze je kvantifikovana korišćenjem TRAP testa zasnovanog na gelu. Aktivnost telomeraze je otkrivena u fibroblastima i mioblastima pri svim testiranim dozama TERT mRNA (0,25, 0,5, 1,0 i 2,0 mg/ml), i nije otkrivena u netretiranim ćelijama ili ćelijama tretiranim samo sredstvom za isporuku ili modifikovanom mRNA koja kodira CI TERT, čak i pri najvišoj dozi od 2,0 mg/ml (slika 13D). Iako TERT zahteva TERC da formira funkcionalni kompleks telomeraze, samo isporuka TERT-a je bila dovoljna da poveća aktivnost telomeraze, u skladu sa prethodnim nalazima da je TERT često ograničavajući jer je broj kopija TERC RNK visok u mnogim tipovima ćelija kojima nedostaje aktivnost telomeraze, uključujući fibroblaste. Ii et al. (2001) Nukleinske kiseline Res. 29:4818-4825. Vremenski tok je otkrio da je aktivnost telomeraze dostigla vrhunac nakon 24 sata i da se vratila na početne nivoe u roku od 48 sati nakon jedne transfekcije. Ovaj vremenski okvir je u skladu sa ranije prijavljenim ljudske TERT mRNK (2-4 h), humane β-globinske mRNK (17-18 h: naša egzogena TERT mRNA je okružena β-globinom 5' i 3' UTR) i aktivnost telomeraze u ćelijama izloženim inhibitoru sinteze proteina (zavisno od tipa ćelije, ali tipično >24 h). Kabnick i Housman (1988) Mol Cell Biol. 8:3244-3250; Holt et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA. 94:10687-10692; Ksu et al. (1999) Br J Cancer.80:1156-1161.

[0157] Produženje telomera. Dužina telomera u netretiranim fibroblastima opadala je tokom vremena

4

(3 meseca) kako se očekivalo (62) (Slika 14A) i kvantifikovana je korišćenjem dve različite metode. Monohromna multipleks kPCR metoda (MMkPCR) je korišćena za procenu dužine, a merenja su nezavisno potvrđena kPCR metodom koju je sprovela SpectraCell Laboratories, Inc. (koeficijent korelacije 0,97, P<0,001). Isporuka TERT mRNA tri puta uzastopno u intervalima od 48 sati fibroblastima ili mioblastima počevši od udvostručavanja populacije (PD) 25 i 6, respektivno, produžili su telomere za 0,960,1 kb (226 3%) i 0,76 0,1 kb ( 126 2%), respektivno (slika 14B,C). Tretman samo sa sredstvom za isporuku ili CI TERT mRNA nije imao značajan uticaj na dužinu telomera u odnosu na netretirane ćelije. Prosečna stopa produženja telomera u fibroblastima bila je 135 615 bp/PD.

[0158] Povećanje proliferativnog kapaciteta zavisno od tipa ćelije. Da bi se testirao efekat modifikovane isporuke TERT mRNA i posledičnog produženja telomera na proliferativni kapacitet ćelije, humani fibroblasti su transfektovani jednom, dva ili tri puta uzastopno. Tretmani su davani u intervalima od 48 sati. Netretirani fibroblasti tretirani samo sredstvom za isporuku i CI TERT mRNA tretirani fibroblasti su pokazali ekvivalentan plato u broju ćelija nakon približno 50-60 PD, dok su ćelije tretirana tri puta sa TERT mRNA nastavila je da se razmnožava za konačnih dodatnih 2861,5 PD sa ukupnim povećanjem broja ćelija od 2,7k108 iznad netretiranih ćelija (Slika 14D, levi panel). Efekat je zavisio od doze sa svakim dodatnim tretmanom koji je davao dodatni PD (Slika 14D, desni panel). Inkrementalno povećanje proliferativnog kapaciteta bilo je veće sa prvim tretmanom nego sa drugim ili trećim tretmanima. LJudski mioblasti tretirani tri puta uzastopno svakih 48 sati dobili su 3,4 6 0,4 PD, što je ekvivalentno 10-strukom povećanju broja ćelija u poređenju sa netretiranim kontrolama ili kontrolama tretiranim sredstvom za isporuku (Slika 14E). Takve razlike u PD između mioblasta i fibroblasta nisu neočekivane, jer su prethodne studije otkrile slične ograničene efekte prekomerne ekspresije TERT na nekoliko PD i pokazale da je ovo ograničenje posledica zaustavljanja rasta kod mioblasta posredovanog p16 u ljudskim mioblastima, za razliku od fibroblasta. Bodnar i dr. (1998) Nauka. 279:349-352; Zhu et al. (2007) Aging Cell. 6:515-523. I kod fibroblasta i kod mioblasta, samo nosač ili CI TERT mRNA nisu imali uticaja na proliferativni kapacitet u poređenju sa netretiranim kontrolama. Ovi podaci pokazuju da je isporuka modifikovane TERT mRNA efikasan metod za povećanje PD u kulturi. Važno je da su sve proučavane tretirane ćelije pokazale značajno povećanje broja ćelija, ali su na kraju dostigle nivo u svojim krivuljama rasta, pokazujući odsustvo starenja.

[0159] Prolazno smanjenje markera starenja. Kako su populacije fibroblasta prestale da rastu, izlagale su se markerima starenja uključujući bojenje β-galaktozidazom (β-gal) povezano sa starenjem i uvećanu veličinu (Slika 15A-C). Cristofalo i Kritchevski (1969) Med Ekp Int J Ekp Med.19:313-320; Dimri i dr. (1995) Proc Natl Acad Sci USA. 92:9363-9367; Kristofalo i dr. (2004) Mech Aging Dev.

125:827-848; Lavless i dr. (2010) Ekp Gerontol. 45:772-778. Ove promene su prolazno smanjene u fibroblastima tretiranim TERT mRNA u odnosu na netretirane ćelije i ćelije koje su primale CI TERT mRNA ili samo nosač. U skladu sa nalazima drugih, nisu sve ćelije u populaciji koja je ušla u nivo

4

rasta eksprimirala β-galaktozidazu na nivoima koji se mogu detektovati. Lavless i dr. (2010) Ekp Gerontol. 45:772-778; Binet i dr. (2009) Cancer Res. 69:9183-9191. Međutim, fibroblasti i mioblasti transfektovani TERT mRNA su eksprimirali β-galaktozidazu u istom stepenu kao i kontrolne ćelije svakog tipa nakon što su dve populacije dostigle plato rasta. Ovi podaci pokazuju da ćelije tretirane sa TERT mRNA na kraju i predvidljivo prestaju da se dele i eksprimiraju markere starenja, i stoga je malo verovatno da će biti transformisane.

[0160] Ovaj primer pokazuje da prolazna isporuka TERT mRNK koja sadrži modifikovane nukleotide proširuje ljudske telomere i povećava proliferativni kapacitet ćelije bez ovekovečavanja ćelija. Stopa ekstenzije telomera u fibroblastima koja je ovde primećena od 135 6 15 bp/PD je uporediva sa stopama prijavljenim korišćenjem virusnih metoda, od 94 do >150 bp/PD (22, 69). Modifikovana TERT mRNA je produžila telomere u fibroblastima za nekoliko dana za 0,960,1 kb. Prijavljeno je da se dužine telomera fibroblasta skraćuju tokom ljudskog života u proseku za oko 1-2 kb. Allsopp et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA. 89:10114-10118. Dakle, modifikovana TERT mRNA je efikasna, ali prolazna i neintegrišuća, prevazilazeći glavna ograničenja konstitutivno eksprimirane virusne TERT mRNK isporuke.

[0161] Ljudske ćelije od najvećeg interesa su često ograničene u broju, uključujući matične ćelije za upotrebu u eksperimentisanju ili regenerativnoj medicini. Ovaj problem se trenutno rešava različitim metodama uključujući somatski nuklearni transfer, virusne metode za isporuku gena i korišćenje uslova kulture koji smanjuju brzinu skraćivanja telomera. Le et al. (2013) Cell Stem Cell.

[objavljeno onlajn pre štampanja: 19. novembra 2013]; doi:10.1016/j.stem.2013.11.005; Zimmermann i Martens (2008) Cell Tissue Res. 331:79-90; Mohsin et al. (2013) Circ Res. 113:1169-1179. Ovde opisani modifikovani tretman TERT mRNA pruža povoljan dodatak ili alternativu ovim metodama koji je kratak, brzo proširuje telomere i ne rizikuje insercionu mutagenezu. Kratkoća tretmana TERT mRNA je posebno privlačna po tome što može sprečiti gubitak fenotipa matičnih ćelija koji se može pojaviti tokom vremena u kulturi (Gilbert et al. (2010) Science. 329:1078-1081) i skratiti fazu nakon reprogramiranja iPSC generacije tokom koje se telomeri šire (Vang et al. (2012) Cell Res. 22:757-768). Takav metod proširenja telomera ima potencijal da poveća korisnost različitih tipova ćelija za modeliranje bolesti, skrining za meliorativne lekove i upotrebu u ćelijskoj terapiji.

[0162] Uočen je spektar efekata na proliferativni kapacitet za testirane tipove ćelija, u skladu sa prethodnim studijama koje su pokazale različite efekte prekomerne ekspresije TERT na proliferativni kapacitet mioblasta i fibroblasta. Bodnar i dr. (1998) Nauka. 279:349-352; Zhu et al. (2007) Aging Cell. 6:515-523. Štaviše, količina produženja telomera nije bila u korelaciji sa proliferativnim kapacitetom. Dakle, ćelijski kontekst određuje efikasnost ekspresije TERT na proliferativni kapacitet i razumevanje faktora koji posreduju u ovom efektu je od interesa za prevazilaženje ovog ograničenja. Faktori koji su uključeni u ograničavanje proliferativnog kapaciteta mioblasta nakon prekomerne ekspresije TERT virusa uključuju zaustavljanje rasta posredovano p16, tip i soj ćelije i uslove kulture. Zhu et al. (2007) Aging Cell. 6:515-523. Uopštenije, efekat može biti posredovan netelomernim

4

oštećenjem DNK, uzrastom i integritetom mitohondrija. Sahin i dr. (2011) Priroda. 470:359-365; Mourkioti i dr. (2013) Nat Cell Biol. 15:895-904; Lopez-Otin i dr. (2013) Cell. 153:1194-1217. Odsustvo povećanja dužine telomera ili proliferativnog kapaciteta ćelije u ćelijama transfektovanim sa CI TERT mRNA je u skladu sa tretmanom koji deluje preko katalitičkog mesta TERT pomoću kojeg se nukleotidi dodaju direktno telomerima. Populacije ćelija koje su tretirane TERT mRNA su se eksponencijalno povećavale u određenom vremenskom periodu, a zatim su na kraju prestale da se šire i pokazale markere starenja u sličnom stepenu kao netretirane populacije, u skladu sa odsustvom imortalizacije.

[0163] Prolazna neintegrišuća priroda modifikovane mRNK i konačno povećanje proliferativnog kapaciteta uočeno ovde čine je bezbednijom od trenutno korišćenih virusnih ili DNK vektora. Dalje, metoda brzo proširuje telomere tako da tretman može biti kratak, nakon čega zaštitni mehanizam skraćivanja telomera ostaje netaknut. Ova metoda se može koristiti ex vivo za lečenje tipova ćelija koje posreduju u određenim stanjima i bolestima, kao što su hematopoetske matične ćelije ili progenitori u slučajevima imunosenscencije ili otkazivanja koštane srži. Pored toga, modifikovana mRNA može biti isporučena u određena tkiva in vivo. Kormann i dr. (2011) Nat Biotechnol. 29:154-157. Ukratko, brza i sigurna metoda za brzo proširenje telomera opisano ovde dovodi do odloženog starenja i povećanog proliferativnog kapaciteta ćelija

bez ovekovečavanja ljudskih ćelija.

METODE

[0164] Generisanje i sinteza šablona mRNA. Da bi se generisala modifikovana mRNA koja kodira GFP, TERT i CI TERT, njihovi odgovarajući otvoreni okviri čitanja (ORF) su ubačeni u MCS početnog plazmida koji sadrži T7 promoter, 5' UTR humanog b-globina (HBB), MCS , 3' UTR HBB, poli-A sekvenca od 151 bp i restrikciono mesto za linearizaciju sa enzimom klase II koji prati poli-A sekvencu. Dobijeni srednji plazmidi su sekvencionirani, linearizovani i transkribovani korišćenjem pufera i RNK polimeraze iz MEGAscript T7 kompleta (Ambion, Austin, Teksas, SAD) i prilagođene mešavine kanonskih i nekanonskih nukleotida (TriLink BioTechnologies, San Diego, CA, SAD) u kojoj su konačne koncentracije nukleotida po 40 ml IVT reakcije bile 7,5 mM za svaki od adenozin-5'-trifosfata (ATP), 5-metilcitidin-5'-trifosfata (m5C) i pseudouridin-5'-trifosfata (Ψ), 1,5 mM za gvanozin-5'-trifosfat (GTP) i 6 mM za analog kapice (ARCA) (Nev England Biolabs, Ipsvitch, MA, SAD), ili molarni odnos ATP:m5C:Ψ :GTP:ARCA od 1:1:1:0,2:0,8. Da bi se dodatno smanjila potencijalna imunogenost mRNK u vezi sa frakcijom koja nosi 5'-3P, IVT proizvodi su tretirani antarktičkom fosfatazom (Nev England Biolabs). Veličina i integritet mRNA proizvoda su verifikovani korišćenjem elektroforeze denaturišućeg agaroznog gela. LJudski TERT ORF divljeg tipa koji se koristi za generisanje DNK šablona za sintezu mRNA je identičan varijanti 1 transkripta 1 NCBI humanog TERT (referentna sekvenca NM_198253.2). ORF je generisan iz pBABE-neo-

4

hTERT plazmida (Counter et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA. 95:14723-14728) (plazmid 1774, Addgene, Cambridge, MA, USA). Plazmid pBABE-neo- hTERT imao je mutaciju na ostatku 516 u KFP motivu TERT, motivu povezanom sa multimerizacijom i TERT interakcijom sa TERC RNK, i na taj način da bismo izbegli mogućnost artefakata usled ove mutacije, napravili smo sekvencu identičnu NCBI referentnoj sekvenci ispravljanjem mutacije promenom G516D. CI TERT mutant je generisan iz TERT sekvence uvođenjem mutacije D712A.

[0165] Ćelijska kultura i tretman. LJudski primarni fetalni MRC5 fibroblasti pluća dobijeni su od ATCC (Manassas, VA, SAD) na pasusu 14. ATCC ne ukazuje na PD broj, tako da se naše PD vrednosti koje su ovde citirane odnose na broj PD nakon prijema ćelija iz ATCC. MRC5 ćelije su kultivisane u DMEM sa 20% FBS i penicilin-streptomicinom. LJudski 30-godišnji primarni mioblasti skeletnih mišića (Lonza, Allendale, NJ, SAD) kultivisani su u SkGM-2 medijumu (Lonza) prema uputstvima Udvostručavanja populacije su izračunata kao baza 2 log odnosa između sakupljenih ćelija i ćelija postavljenih na prethodno mesto, i smatralo se da je nula ako je sakupljeno manje ćelija nego što je postavljeno na pločice. Ćelije su transfektovane modifikovanom TERT mRNA korišćenjem Lipofectamine RNAiMak (Life Technol-ogies, Grand Island, NI, USA) pripremljene u OptiMEM Reduced Serum Mediji (Life Technologies, Grand Island, NI, USA) i dodate ćelijama u razmeri 1:5 v:v odnos sa njihovim normalnim medijumima da bi se postigle konačne koncentracije navedene ovde.

[0166] Merenje aktivnosti telomeraze. Dvadeset četiri sata nakon početka perioda transfekcije, ćelije su sakupljene i lizirane u CHAPS puferu. TRAP test je izveden korišćenjem modifikovane verzije TRAPeze kompleta (EMD Millipore, Billerica, MA, SAD), u koji su prajmeri i polimeraza dodani nakon, a ne pre, koraka tokom kojeg se produžava veštački telomerni supstrat. PCR program je bio 94°C 30s/59°C 30s/72°C 45s tokom 30 ciklusa, a proizvodi su korišćeni na 15% poliakrilamidnom gelu u 0,5Ks TBE obojenom SIBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (Life Technologies, Grand Ostrvo, NJujork, SAD). Vremenski tok aktivnosti telomeraze je izveden korišćenjem TRAPeze RT kita (EMD Millipore, Billerica, MA, SAD).

[0167] Vestern blot. Protein je sakupljen ispiranjem ćelija jednom sa PBS, a zatim liziranjem ćelija u RIPA puferu (Cell Signaling Technologi, Danvers MA, SAD). Protein je stavljen na NuPAGE Novek tris-acetat gel (Life Technologies, Grand Island, NI, USA), prebačen na PVDF membranu tokom 2 h na 35V, zatim hibridizovan u anti-a tubulin (Sigma, St. Louis, MO, SAD) u 1:10,000 i anti-TERT antitelo (ABCAM, Cambridge, MA, SAD, 32020 u 1:1000; ili Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, SAD, 600-401-252S u 1:500) i inkubirano preko noći na 4° C. Detekcija je izvršena korišćenjem infracrvenih (680 nm i 800 nm) antitela (LI-COR, Linkoln, NE, SAD) i Odissei imagera (LI-COR). Ukupni intenzitet svake trake je kvantifikovan korišćenjem ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA). Intenzitet svake TERT trake je normalizovan odgovarajućim α tubulinskom trakom.

[0168] Protočna citometrija. Ćelije su sakupljene 24 h nakon transfekcije sa naznačenim dozama (Slika 16A-C) TERT mRNA i obojene anti-TERT antitelom (Rockland Immunochemicals,

4

Gilbertsville, PA, SAD; 600-401-252S) u 1:500.

[0169] Merenje dužine telomera od strane SpectraCell Laboratories, Inc. Genomska DNK je ekstrahovana korišćenjem fenol hloroforma i kvantifikovana korišćenjem Kuant-iT™ PicoGreen® dsDNK kompleta za analizu (Life Technologies, Grand Island, NI, USA). Analiza dužine telomera je izvršena u SpectraCell Laboratories Inc. (Hjuston, Teksas, SAD) korišćenjem CLIA odobren, kPCR test velike propusnosti, u suštini kao što su opisali Cavthon et al. Cavthon (2002) Nucleic Acids Res.

30(10):e47; Cavthon (2009) Nukleinske kiseline Res. 37(3):e21. Test određuje relativnu dužinu telomera merenjem faktora po kome se uzorak razlikuje od referentnog DNK uzorka u odnosu broja kopija ponavljanja telomera i broja kopija pojedinačnog gena (36B4). Smatra se da je ovaj odnos (T/S odnos) proporcionalan prosečnoj dužini telomera. Svi uzorci su rađeni u najmanje duplikatu sa najmanje jednom negativnom kontrolom i dve pozitivne kontrole dve različite poznate dužine telomera (visoke i niske) i primećeno je prosečno variranje do 8%. Rezultati su prijavljeni kao rezultat telomera koji je ekvivalentan prosečnoj dužini telomera u kb.

[0170] Merenje dužine telomera pomoću MMkPCR. Dužina telomera je merena korišćenjem modifikovane verzije MMkPCR protokol koji je razvio Cavthon (Cavthon (2009) Nucleic Acids Res.

37(3):e21) sa sledećim izmenama: Dodati su dodatni ciklusi pre-amplifikacije PCR-a kako bi se telomerni proizvod ranije pojačao, proširujući jaz između telomera i genskih signala jedne kopije; eksperimentalno je utvrđeno da mešavina dve Tak polimeraze daje bolju efikasnost PCR reakcije nego svaka za sebe; smanjenje koncentracije SIBR Green sa 0,75Ks na 0,5Ks rezultiralo je ranijim signalom. Genomska DNK je sakupljena iz ćelija korišćenjem kompleta PureGene (Kiagen Germantovn, MD, SAD) sa varenjem RNase, kvantifikovanim pomoću NanoDrop 2000 (ThermoFisher Scientific, Valtham, MA, SAD) i 10-40 ng je korišćeno na 15 ml kPCR reakcije izvedene u četiri primerka korišćenjem LightCicler 480 PCR sistema (Roche, Bazel, Švajcarska). Serijsko razblaživanje referentne DNK koje obuhvata pet tačaka od 100 ng/ml do 1,23 ng/ml je uključeno u svaki test da bi se stvorila standardna kriva potrebna za kvantifikaciju DNK uzorka. Konačne koncentracije reagensa u svakoj PCR reakciji od 15 ml bile su: 20 mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0,2 mM svaki dNTP, 1 mM DTT, 1 M betain (Affimetrik, USA Santa Clara, CA ), 0,5Ks SIBR Green I (Life Technologies, Grand Island, NI, SAD), 0,1875U Platinum Tak (Life Technologies, Grand Island, NI, SAD), 0,0625Ks Titanium Tak (Clontech) i 900 nM svaki prajmer (telg, telc, hbgu i hbgd sekvence prajmera navedene u Cavthon (2009) Res. Nucleic Acids. 37(3):e21 Program termičkog ciklusa je bio: 2 minuta na 95°C; praćeno 6 ciklusa od 15s na 95°C, 15s na 49°C; praćeno 40 ciklusa od 15s na 95°C, 10s na 62°C, 15s na 72°C sa akvizicijom signala, 15s na 84°C i 10s na 88°C sa akvizicijom signala. Softver Roche LightCicler 480 je korišćen za generisanje standardnih krivih i izračunavanje koncentracije DNK telomera i gena sa jednom kopijom za svaki uzorak. Odnosi T/S su izračunati za svaku repliku uzorka, a rezultat je uprosečen da bi se dobio odnos T/S uzorka koji je kalibrisan korišćenjem slepih replika uzoraka referentnih ćelija poslatih u SpectraCell kao što je gore opisano. Nezavisno dobijene relativne vrednosti T/S odnosa merene korišćenjem MMkPCR i SpectraCell-om za iste uzorke bile su veoma konzistentne (koeficijent korelacije = 0,97, P<0,001).

[0171] Reverzna transkripcija kPCR. Prajmeri su dizajnirani korišćenjem Primer3 (Untergasser et al. (2012) Nucleic Acids Res. 40:e115) i navedeni su u tabeli 9 osim tamo gde je drugačije naznačeno. Dvadeset četiri sata nakon početka tretmana, ćelije su isprane tri puta sa PBS pre sakupljanja u puferu RLT (Kiagen, Germantovn, MD, SAD). RNK je pretvorena u cDNK korišćenjem Master Miksa RNA-to-cDNK velikog kapaciteta (Life Technologies, Grand Island, NI, USA). Endogena TERT mRNA je amplifikovana korišćenjem prednjeg prajmera u otvorenom okviru TERT i reverznog prajmera u 3' UTR endogene TERT mRNA. Egzogena TERT mRNA je amplifikovana korišćenjem prednjeg prajmera u otvorenom okviru TERT mRNA i obrnutog prajmera u 3' UTR HBB prisutnog u našoj egzogenoj TERT i CI TERT mRNA, ali ne u endogenoj TERT mRNA. Relativni nivoi su izračunati korišćenjem Pfafflove metode. Referentni geni su bili RPL37A (koristeći prajmere navedene u Greber et al. (2011) EMBO J. 30:4874-4884) i GAPDH, od kojih nijedan nije pokazao značajnu promenu u vrednosti Ct u kontrolnim ili tretiranim ćelijama.

Tabela 9: Primer sekvenci

[0172] Bojenje β-galaktozidazom povezano sa starenjem i bodovanjem veličine ćelije. β-gal bojenje je izvedeno korišćenjem kompleta za bojenje Senescence β-galaktozidaze (Cell Signaling Technologi, Danvers MA, SAD). Najmanje 50 ćelija po populaciji je ocenjeno u duplikatu. Prečnik ćelije je meren ručno nakon tripsinizacije na mreži hemocitometra. Cristofalo i Kritchevski (1969) Med Ekp Int J Ekp Med.19:313-320.

[0173] Statistika. Studentovi T-testovi i proračuni Pirsonovog koeficijenta korelacije izvršeni su korišćenjem Microsoft Excel-a. Trake greške predstavljaju srednju vrednost 6 s.e.m.

Primer 4. Dostavljanje TERT modRNA u ćelije elektroporacijom

[0174] Jedinjenja TERT modRNA iz pronalaska takođe mogu biti isporučena u ćelije elektroporacijom, kao što je ilustrovano na slikama 18-20, koristeći parametre elektroporacije, uključujući koncentraciju TERT modRNA, oblik talasa napona i geometriju elektrode koja je odgovarajuća za postizanje optimalne transfekcije. efikasnost i održivost u datom tipu ćelije. Slika 21 prikazuje zavisnost aktivnosti telomeraze od doze TERT modRNK isporučene elektroporacijom.

1

Primer 5. Isporuka modRNA u ljudske krvne ćelije

[0175] CD8+ T-ćelije su transfektovane sa modRNA na sledeći način. Penasti sloj iz cele ljudske krvi centrifugiran je na medijumu sa gradijentom gustine Limphoprep (Akis-Shield) da bi se dobile mononuklearne ćelije koje su dva puta isprane, a zatim osiromašeni ne-CD8+ leukocitima korišćenjem kompleta Dinabeads Untouched Human CD8 T Cell Kit (Life Technologies). CD8+ ćelije su stimulisane korišćenjem Dinabeads Human T-Activator CD3.CD28 (Life Technologies) i kultivisane su 4 dana korišćenjem OpTimizer T-Cell medijuma sa dodatkom 30,000 U/ml IL-2. T-ćelije su zatim transfektovane sa modRNA koja kodira nuklearni GFP i TERT u koncentraciji od 50 mg/ml u zapremini od 20 ml rastvora Nucleofector P3 koji sadrži dodatak 1. Ćelije su ispitane na fluorescenciju i vitalnost 24 sata nakon transfekcije. Rezultati transfekcije su prikazani na slici 22. Jarka fluorescencija pokazuje veliki broj kopija, sa efikasnošću transfekcije preko 90% sa visokom održivošću.

Primer 6. Ekspresija telomeraze u humanim keratinocitima korišćenjem modRNA telomeraze

[0176] Kao što je prikazano na Slici 23, elektroporacija humanih keratinocita sa TERT modRNA rezultira ekspresijom aktivnosti telomeraze u ćelijama. LJudski primarni keratinociti (Lonza) su suspendovani pri gustini od 3k107 ćelija/ml u OptiMEM medijumu (Life Technologies) koji sadrži 50 mg/ml modRNA koja kodira ili katalitički neaktivan (CI) TERT ili divlji tip TERT. 10 ml ćelijske suspenzije je stavljeno u kivetu sa razmakom od 1 mm i elektroporisano korišćenjem Gene Pulser-a (BioRad) korišćenjem 200 V, 1000 Ohma i 25 mikrofarada. Ćelije su odmah vraćene u medijum KGM-2 (Lonza) i inkubirane 24 sata pre nego što su sakupljene za merenje aktivnosti telomeraze korišćenjem TRAPeze testa na bazi gela (Millipore). Svaka TRAP reakcija od 25 ml je izvedena korišćenjem 1 mg ukupnog proteina, sa duplim uzorcima zagrejanim na 85°C tokom 10 minuta da bi se inaktivirala telomeraza. Netretirani uzorci samo elektroporacijom i CI TERT uzorci su služili kao negativne kontrole, a 293T ćelije i TSR8 su služile kao pozitivne kontrole.

Primer 7. Ekspresija modRNA-kodiranog proteina isporukom in vivo

[0177] modRNA isporučena in vivo može dovesti do ekspresije funkcionalnog proteina kodiranog modRNA. Kormann i dr. (2012) Nature Biotechnologi 29:154-157; Kariko i dr. (2012) Molekularna terapija 20:948-93. Ovo je ovde potvrđeno kompleksiranjem 2 mg modRNA koja kodira luciferazu sa katjonskim lipidnim nosačem (TransIT) i intravenskim ubrizgavanjem u 50 ml OptiMEM-a (Life Technologies) u rep glodara. Slezina je sakupljena i tretirana luciferinom i ispitana na aktivnost luciferaze korišćenjem IVIS bioluminiscentnog snimača (Perkin-Elmer). Kao što je prikazano na slici 24, aktivnost luci-feraze je otkrivena na mestu injekcije iu slezini (strelice).

2

4

Claims (5)

Patentni zahtevi

1.Jedinjenje koje obuhvata sintetičku ribonukleinsku kiselinu obuhvata najmanje jedan modifikovan nukleozid i kodiranje za reverznu transkripciju telomeraze za upotrebu u postupku lečenja ili sprečavanja

a) bolesti koja obuhvata kratke telomere izabrane iz grupe koja obuhvata metabolički sindrom, dijabetes, dijabetesne čireve, bolest srca, kancer, vaskularnu demenciju, Alchajmerovu bolest, moždani udar, degeneraciju makule povezanu sa starošću, starenje sistema imuniteta, propadanje koštane srži, gastrointestinalne čireve, cirozu, bruh, infekciju, hroničnu infekciju, blago ili ozbiljno kognitivno oštećenje, poteškoće sa kretanjem, osteoporozu, osteoartritis, reumatoidni artritis, anksioznost povezanu sa starošću, poremećaje ravnoteže, tinitus, Belovu paralizu, katarakte, hroničnu opstruktivnu bolest pluća, abraziju rožnjače, bolest srčane arterije, bolest periferne arterije, konjuktivitis, halacion, dehidracije, depresiju, emfizem, bolest oka, sporo napredovanje, grip, opšti anksiozni poremećaj, glaukom, gubitak sluha, gubitak čula ukusa, gubitak apetita, iščašenje kuka, gubitak memorije, Parkinsonovu bolest, stenozu kičme, urinarnu inkontinencije, i prelom pršljena; ili

b) bolesti povezane sa starošću kod životinje koja je subjekat koji boluje ili je pod rizikom da boluje od neke bolesti povezane sa starošću, pri čemu ta bolest povezana sa starošću obuhvata kratke telomere;

pri čemu je reverzna transkripcija telomeraze izražena prolazno u nekoj ćeliji; i pri čemu je najmanje jedan telomer produžen unutar te ćelije; i

pri čemu najmanje jedan modifikovan nukleozid sadržan u sintetičkoj ribonukleinskoj kiselini daje smanjenu imunogenost za tu sintetičku ribonukleinsku kiselinu.

2.Jedinjenje iz patentnog zahteva 1 za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu ta ribonukleinska kiselina obuhvata 5’ kap, 5’ netranslatirani region, 3’ netranslatirani region, i poli-A rep; i

a) taj poli-A rep povećava stabilnost te ribonukleinske kiseline, opciono, pri čemu taj poli-A rep jeste najmanje 75 nukleotida, 100 nukleotida, 125 nukleotida, 150 nukleotida; ili

b) taj 5’ netranslatirani region ili 3’ netranslatirani region obuhvata sekvencu iz stabilne mRNK ili neke mRNK koja je efikasno translatirana; ili

c) taj 5’ netranslatirani region i 3’ netranslatirani region oba obuhvataju sekvencu iz stabilne mRNK ili neke mRNK koja je efikasno translatirana; ili

d) ta 5’ kap, taj 5’ netranslatirani region, ili taj 3’ netranslatirani region stabilizuje tu ribonukleinsku kiselinu ili povećava brzinu translacije te ribonukleinske kiseline.

3.Jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 2 za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2, pri čemu je to jedinjenje sadržano u supstanci, ta supstanca još obuhvata pomoćno farmaceutsko sredstvo za isporuku pacijentu; i

pri čemu to pomoćno farmaceutsko sredstvo za isporuku pacijentu nije virusno pomoćno farmaceutsko sredstvo za isporuku pacijentu.

4.Jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3 za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu ta bolest povezana sa starošću obuhvata infarkt miokarda, vaskularnu demenciju, dijabetes sa komplikacijama, kancer, moždani udar, Alchajmerovu bolest, ili infekciju.

5.Jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3 za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu ta bolest povezana sa starošću obuhvata oblik idiopatske plućne fibroze, diskeratoze kongenita, ili aplastične anemije.