ES3048358T3 - Compounds and methods for modulating gfap - Google Patents

Compounds and methods for modulating gfap

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ES3048358T3 ES20846055T ES20846055T ES3048358T3 ES 3048358 T3 ES3048358 T3 ES 3048358T3 ES 20846055 T ES20846055 T ES 20846055T ES 20846055 T ES20846055 T ES 20846055T ES 3048358 T3 ES3048358 T3 ES 3048358T3
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nucleosides
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Berit Powers
Huynh-Hoa Bui
Susan Freier
Frank Rigo
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Ionis Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Se proporcionan compuestos, métodos y composiciones farmacéuticas para reducir la cantidad o actividad del ARN de GFAP en una célula o sujeto, y en ciertos casos, para reducir la cantidad de GFAP en una célula o sujeto. Dichos compuestos, métodos y composiciones farmacéuticas son útiles para mejorar al menos un síntoma o característica distintiva de una leucodistrofia. Dichos síntomas y características distintivas incluyen retraso motor, retraso cognitivo, deterioro paroxístico, convulsiones, vómitos, dificultad para tragar, marcha atáxica, mioclonía palatina, disfunción autonómica y presencia de inclusiones intraastrocíticas llamadas fibras de Rosenthal. Dichas leucodistrofias incluyen la enfermedad de Alexander. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Compuestos y métodos para modular GFAP
[0003] Listado de secuencias
[0004] La presente solicitud se presenta junto con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado BIOL0353UWOSEQ_ST25.txt, creado el 17 de julio de 2020, que tiene un tamaño de 592 KB.
[0005] Campo
[0006] Se describen en el presente documento compuestos, métodos y composiciones farmacéuticas para reducir la cantidad o actividad del ARN GFAP en una célula o sujeto y, en ciertos casos, reducir la cantidad de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en una célula o sujeto. Dichos compuestos, métodos y composiciones farmacéuticas son útiles para mejorar al menos un síntoma o característica distintiva de una leucodistrofia. Estos síntomas y características incluyen retrasos motores, retrasos cognitivos, deterioro paroxístico, convulsiones, vómitos, dificultades para tragar, marcha atáxica, mioclono palatino, disfunción autonómica e inclusiones intraastrocíticas llamadas fibras de Rosenthal. Entre estas leucodistrofias se encuentra la enfermedad de Alexander.
[0007] Antecedentes
[0008] La enfermedad de Alexander (AxD) es un trastorno del desarrollo poco común que afecta a aproximadamente 1/1.000.000 de nacidos vivos y está causada por varias mutaciones autosómicas dominantes diferentes en el gen que codifica la proteína ácida fibrilar glial, GFAP. La AxD es una leucodistrofia típicamente mortal con formas de aparición temprana (<4 años, tipo I) o de aparición tardía (>4 años, tipo II) (Prust et al., (2011) GFAP mutations, age at onset, and clinical subtypes in Alexander disease. Neurol 77: 1287-1294). Los síntomas incluyen retrasos motores y cognitivos, deterioro paroxístico, convulsiones, encefalopatía, macrocefalia e inclusiones intraastrocíticas llamadas fibras de Rosenthal.
[0009] No existen terapias específicas para la AxD; los tratamientos actuales se limitan a tratamientos de apoyo para los síntomas individuales (por ejemplo, antiepilépticos para prevenir convulsiones; Messing, et. al., "Strategies for treatment in Alexander Disease", Neurotherapeutics: The Journal of the Am. Soc. For Expt. NeuroTher., 2016).
[0010] Actualmente existe una falta de opciones aceptables para el tratamiento de leucodistrofias como la AxD. Por tanto, un objetivo del presente documento es proporcionar compuestos, métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de dichas enfermedades.
[0011] TRACY L. HAGEMANN ET AL., describe la supresión antisentido de la proteína ácida fibrilar glial como tratamiento para la enfermedad de Alexander.
[0012] Resumen de la invención
[0013] La presente invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
[0014] En particular, la presente invención proporciona un oligonucleótido modificado de acuerdo con la siguiente estructura química:
[0015]
[0017] (SEQ ID NO: 20), o una sal de la misma.
[0018] La presente invención también proporciona un oligonudeótido modificado de acuerdo con la siguiente estructura química:
[0019]
[0021] La presente invención también proporciona un compuesto oligomérico que comprende un oligonucleótido modificado según la siguiente notación química:<m>C<es>A<eo>G<eo>T<eo>A<eo>T<eo>T<ds>A<dsm>C<dsm>C<ds>T<dsm>C<ds>T<ds>A<dsm>C<ds>T<ds>A<eo>G<es>T<esmCe>(SEQ ID NO: 20), en donde:
[0023] A = una nucleobase de adenina,
[0024] mC = una nucleobase de 5-metil citosina,
[0025] G = una nucleobase de guanina,
[0026] T = una nucleobase de timina,
[0027] e = una fracción de azúcar ribosilo 2 '-p-D-OCH2CH2OCH3,
[0028] d = una fracción de azúcar 2'-p-D-desoxirribosilo,
[0029] s = un enlace internucleósido fosforotioato, y
[0030] o = un enlace internucleósido fosfodiéster.
[0032] La presente invención también proporciona una población de oligonucleótidos modificados de la invención, en donde todos los enlaces internucleósidos de fosforotioato del oligonucleótido modificado son estereoaleatorios.
[0034] La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido modificado de la invención, el compuesto oligomérico de la invención o la población de oligonucleótidos modificados de la invención y un diluyente farmacéuticamente aceptable.
[0036] La presente invención también proporciona un oligonucleótido modificado de la invención, un compuesto oligomérico de la invención, una población de oligonucleótidos modificados de la invención o una composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con GFAP, opcionalmente en donde la enfermedad asociada con GFAP es una enfermedad neurodegenerativa.
[0037] En el presente documento se describen compuestos, métodos y composiciones farmacéuticas para reducir la cantidad o actividad del ARN GFAP y, en ciertas formas de realización, reducir la expresión de la proteína ácida fibrilar glial en una célula o sujeto. En ciertas formas de realización, el sujeto tiene una leucodistrofia. En ciertas formas de realización, el sujeto tiene enfermedad de Alexander (AxD). Los compuestos útiles para reducir la cantidad o actividad del ARN GFAP pueden ser compuestos oligoméricos. Los compuestos útiles para reducir la cantidad o actividad del ARN GFAP pueden ser oligonucleótidos modificados. Los compuestos útiles para disminuir la expresión de la proteína ácida fibrilar glial pueden ser compuestos oligoméricos. Los compuestos útiles para disminuir la expresión de la proteína ácida fibrilar glial pueden ser oligonucleótidos modificados.
[0038] También se proporcionan composiciones farmacéuticas para su uso en métodos para mejorar al menos un síntoma o sello distintivo de una leucodistrofia. En ciertas formas de realización, la leucodistrofia es la enfermedad de Alexander. En ciertas formas de realización, el síntoma o sello distintivo incluye retrasos motores, retrasos cognitivos, deterioro paroxístico, convulsiones, vómitos, dificultades para tragar, marcha atáxica, mioclono palatino, disfunción autonómica y presencia de inclusiones intraastrocíticas llamadas fibras de Rosenthal.
[0039] Descripción detallada de la invención
[0040] Se debe entender que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada que sigue son sólo ejemplares y explicativas. Aquí, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se utiliza en este documento, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo", así como otras formas, como "incluye" e "incluido", no es limitativo. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos y componentes que comprenden una unidad como elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
[0041] Los títulos de las secciones utilizados en este documento son sólo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes del tema descrito.
[0042] Definiciones
[0043] A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en conexión con, y los procedimientos y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritos en este documento son aquellos bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica.
[0044] A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
[0045] DEFINICIONES
[0046] Como se usa en este documento, "2'-desoxinucleósido" significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar 2'-H(H) desoxifuranosilo. En ciertas formas de realización, un 2'-desoxinucleósido es un 2'-p-D-desoxinucleósido y comprende una fracción de azúcar 2'-p-D-desoxirribosilo, que tiene la configuración p-D ribosilo como se encuentra en los ácidos desoxirribonucleicos (ADN) naturales. En ciertas formas de realización, un 2'-desoxinucleósido puede comprender una nucleobase modificada o puede comprender una nucleobase de ARN (uracilo).
[0047] Como se utiliza en este documento, "2'-MOE" o "fracción de azúcar 2'-MOE" significa un grupo 2'-OCH2CH2OCH3 en lugar del grupo 2'-OH de una fracción de azúcar furanosilo. Una "fracción de azúcar 2'-MOE" significa una fracción de azúcar con un grupo 2 -OCH2CH2OCH3 en lugar del grupo 2'-OH de una fracción de azúcar furanosilo. A menos que se indique lo contrario, una fracción de azúcar 2'-MOE está en la configuración p-D-ribosilo. "MOE" significa O-metoxietilo.
[0048] Como se utiliza en este documento, "nucleósido 2'-MOE" significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar 2'-MOE.
[0049] Como se utiliza en este documento, "2'-OMe" o "resto de azúcar 2'-O-metilo" significa un grupo 2 -OCH3 en lugar del grupo 2'-OH de una fracción de azúcar furanosilo. Una "fracción de azúcar 2'-O-metilo" o "fracción de azúcar 2'-OMe" significa una fracción de azúcar con un grupo 2 -OCH3 en lugar del grupo 2'-OH de una fracción de azúcar furanosilo. A menos que se indique lo contrario, una fracción de azúcar 2'-OMe está en la configuración p-D-ribosilo.
[0050] Como se utiliza en este documento, "nucleósido 2'-OMe" significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar 2'-OMe.
[0051] Como se utiliza en este documento, "nucleósido sustituido en 2'" significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar sustituida en 2'. Como se utiliza en este documento, "2'-sustituido" en referencia a una fracción de azúcar significa una fracción de azúcar que comprende al menos un grupo sustituyente 2' distinto de H u OH.
[0052] Como se utiliza en este documento, "5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
[0053] Como se utiliza en este documento, "administrar" significa proporcionar un agente farmacéutico a un sujeto.
[0055] Como se utiliza en este documento, "actividad antisentido" significa cualquier cambio detectable y/o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico objetivo. En ciertas formas de realización, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico o proteína objetivo codificado por dicho ácido nucleico objetivo en comparación con los niveles de ácido nucleico objetivo o los niveles de proteína objetivo en ausencia del compuesto antisentido.
[0057] Como se utiliza en este documento, "compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico capaz de lograr al menos una actividad antisentido.
[0059] Como se utiliza en este documento, "mejorar" en referencia a un tratamiento significa una mejora en al menos un síntoma o característica distintiva en relación con el mismo síntoma o característica distintiva en ausencia del tratamiento. En ciertas formas de realización, la mejoría es la reducción de la gravedad o frecuencia de un síntoma o la aparición retardada o la desaceleración de la progresión de la gravedad o frecuencia de un síntoma. En ciertas formas de realización, el síntoma o sello distintivo son retrasos motores, retrasos cognitivos, deterioro paroxístico, convulsiones, vómitos, dificultades para tragar, marcha atáxica, mioclono palatino, disfunción autonómica y presencia de inclusiones intraastrocíticas llamadas fibras de Rosenthal.
[0061] Como se utiliza en este documento, "nucleósido bicíclico" o "BNA" significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar bicíclica.
[0063] Como se utiliza en este documento, "azúcar bicíclico" o "fracción de azúcar bicíclico" significa una fracción de azúcar modificado que comprende dos anillos, en donde el segundo anillo se forma a través de un puente que conecta dos de los átomos en el primer anillo formando así una estructura bicíclica. En ciertas formas de realización, el primer anillo de la fracción de azúcar bicíclica es una fracción furanosilo. En ciertas formas de realización, la fracción de azúcar furanosilo es una fracción ribosilo. En ciertas formas de realización, la fracción de azúcar bicíclica no comprende una fracción furanosilo.
[0065] Como se utiliza en este documento, "líquido cefalorraquídeo" o "LCR" significa el líquido que llena el espacio alrededor del cerebro y la médula espinal. "Líquido cefalorraquídeo artificial" o "LCRa" significa un líquido preparado o fabricado que tiene ciertas propiedades del líquido cefalorraquídeo.
[0067] Como se utiliza en este documento, "fracción escindible" significa un enlace o grupo de átomos que se escinde en condiciones fisiológicas, por ejemplo, dentro de una célula, un animal o un ser humano.
[0069] Como se utiliza en este documento, "complementario" en referencia a un oligonucleótido significa que al menos el 70 % de las nucleobases del oligonucleótido o una o más porciones del mismo y las nucleobases de otro ácido nucleico o una o más porciones del mismo son capaces de formar enlaces de hidrógeno entre sí cuando la secuencia de nucleobases del oligonucleótido y el otro ácido nucleico están alineadas en direcciones opuestas. Como se utiliza en este documento, "nucleobases complementarias" significa nucleobases que son capaces de formar enlaces de hidrógeno entre sí. Los pares de nucleobases complementarios incluyen adenina (A) y timina (T), adenina (A) y uracilo (U), citosina (C) y guanina (G), 5-metil citosina (<m>C) y guanina (G). Los oligonucleótidos complementarios y/o ácidos nucleicos diana no necesitan tener complementariedad de nucleobases en cada nucleósido. Más bien, se toleran algunos desajustes. Como se utiliza en este documento, "totalmente complementario" o "100 % complementario" en referencia a un oligonucleótido, o una porción del mismo, significa que el oligonucleótido, o una porción del mismo, es complementario a otro oligonucleótido o ácido nucleico diana en cada nucleobase del más corto de los dos oligonucleótidos, o en cada nucleósido si los oligonucleótidos tienen la misma longitud.
[0071] Como se utiliza en este documento, "grupo conjugado" significa un grupo de átomos que está unido directa o indirectamente a un oligonucleótido. Los grupos conjugados incluyen una fracción conjugada y un enlazador conjugado que une la fracción conjugada al oligonucleótido.
[0073] Como se utiliza en este documento, "enlazador conjugado" significa un enlace simple o un grupo de átomos que comprende al menos un enlace que conecta una fracción conjugada a un oligonucleótido.
[0075] Como se utiliza en este documento, "fracción conjugada" significa un grupo de átomos que está unido a un oligonucleótido a través de un enlazador conjugado.
[0077] Como se utiliza en este documento, "contiguo" en el contexto de un oligonucleótido se refiere a nucleósidos, nucleobases, fracciones de azúcar o enlaces internucleósidos que son inmediatamente adyacentes entre sí. Por ejemplo, "nucleobases contiguas" significa nucleobases que están inmediatamente adyacentes entre sí en una secuencia.
[0079] [0039] Como se utiliza en este documento, "etilo restringido" o "cEt" o "fracción de azúcar modificado con cEt" significa un puente de 4' a 2' en lugar del grupo 2'OH de una fracción de azúcar ribosilo, en donde el puente tiene la fórmula de 4'-CH(CH<3>)-O-2', y en donde el grupo metilo del puente está en la configuración S. Una "fracción de azúcar cEt" es una fracción de azúcar bicíclica con un puente 4' a 2' en lugar del grupo 2'OH de una fracción de azúcar ribosilo, donde el puente tiene la fórmula 4'-CH(CH<3>)-O-2', y donde el grupo metilo del puente está en la configuración S.
[0081] Como se utiliza en este documento, "nucleósido cEt" significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar cEt.
[0083] Como se utiliza en este documento, "población quiralmente enriquecida" significa una pluralidad de moléculas de fórmula molecular idéntica, en donde el número o porcentaje de moléculas dentro de la población que contienen una configuración estereoquímica particular en un centro quiral particular es mayor que el número o porcentaje de moléculas que se espera que contengan la misma configuración estereoquímica particular en el mismo centro quiral particular dentro de la población si el centro quiral particular fuera estereoaleatorio. Las poblaciones de moléculas enriquecidas quiralmente que tienen múltiples centros quirales dentro de cada molécula pueden contener uno o más centros quirales estereoaleatorios. En ciertas formas de realización, las moléculas son oligonucleótidos modificados. En ciertas formas de realización, las moléculas son compuestos que comprenden oligonucleótidos modificados.
[0085] Como se utiliza en este documento, "controlado quiralmente" en referencia a un enlace internucleósido significa que la quiralidad en ese enlace está enriquecida para una configuración estereoquímica particular.
[0087] Como se utiliza en este documento, "región desoxi" significa una región de 5 a 12 nucleótidos contiguos, en donde al menos el 70 % de los nucleósidos son 2'-p-D-desoxinucleósidos. En ciertas formas de realización, cada nucleósido se selecciona entre un 2'-p-D-desoxinucleósido, un nucleósido bicíclico y un nucleósido 2'-sustituido. En ciertas formas de realización, una región desoxirribonucleica favorece la actividad de la ARNasa H. En ciertas formas de realización, una región desoxi es el espacio o región interna de un gapmer.
[0089] Como se utiliza en este documento, "gapmer" significa un oligonucleótido modificado que comprende una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que apoyan la escisión de la ARNasa H posicionados entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede denominarse "hueco" y las externas, "alas". La región interna es una región desoxigenada. Las posiciones de la región interna o gap se refieren al orden de los nucleósidos de la región interna y se cuentan a partir del extremo 5' de la región interna. A menos que se indique lo contrario, "gapmer" se refiere a un motivo de azúcar. A menos que se indique lo contrario, la fracción de azúcar de cada nucleósido del espacio es un 2'-p-D-desoxinucleósido. En ciertas formas de realización, el espacio comprende un nucleósido 2'-sustituido en la posición 1, 2, 3, 4 o 5 del espacio, y el fracción de los nucleósidos del espacio son 2'-p-D-desoxinucleósidos. Como se utiliza en este documento, el término "gapmer MOE" indica un gapmer que tiene un espacio que comprende 2'-p-D-desoxinucleósidos y alas que comprenden nucleósidos 2'-MOE. Como se utiliza en este documento, el término "gapmer de ala mixta" indica un gapmer que tiene alas que comprenden nucleósidos modificados que comprenden al menos dos modificaciones de azúcar diferentes. A menos que se indique lo contrario, un gapmer puede comprender uno o más enlaces internucleósidos modificados y/o nucleobases modificadas y dichas modificaciones no necesariamente siguen el patrón gapmer de las modificaciones de azúcar.
[0091] Como se utiliza en este documento, "región de punto caliente" es un rango de nucleobases en un ácido nucleico objetivo que es susceptible de reducción mediada por compuestos oligoméricos de la cantidad o actividad del ácido nucleico objetivo.
[0093] Como se utiliza en este documento, "hibridación" significa el emparejamiento o apareamiento de oligonucleótidos y/o ácidos nucleicos complementarios. Si bien no se limita a un mecanismo en particular, el mecanismo de hibridación más común implica enlaces de hidrógeno, que pueden ser enlaces de hidrógeno Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertidos, entre nucleobases complementarias.
[0095] Como se utiliza en este documento, "enlace internucleósido" significa el enlace covalente entre nucleósidos contiguos en un oligonucleótido. Como se utiliza en este documento, "enlace internucleósido modificado" significa cualquier enlace internucleósido distinto de un enlace internucleósido fosfodiéster. El "enlace internucleósido fosforotioato o "enlace internucleósido PS" es un enlace internucleósido modificado en el que uno de los átomos de oxígeno no puente de un enlace internucleósido fosfodiéster se reemplaza por un átomo de azufre.
[0097] Como se utiliza en este documento, "leucodistrofia" significa un trastorno debido a anomalías en la vaina de mielina de las neuronas.
[0099] Como se utiliza en este documento, "nucleósido enlazador" significa un nucleósido que enlaza, ya sea directa o indirectamente, un oligonucleótido a una fracción conjugada. Los nucleósidos enlazadores se encuentran dentro del enlazador conjugado de un compuesto oligomérico. Los nucleósidos enlazadores no se consideran parte de la porción oligonucleotídica de un compuesto oligomérico incluso si son contiguos al oligonucleótido.
[0101] Como se utiliza en este documento, "fracción de azúcar modificado no bicíclico" significa una fracción de azúcar modificado que comprende una modificación, tal como un sustituyente, que no forma un puente entre dos átomos del azúcar para formar un segundo anillo.
[0102] Como se utiliza en este documento, "desajuste" o "no complementario" significa una nucleobase de un primer oligonucleótido que no es complementaria con la nucleobase correspondiente de un segundo oligonucleótido o ácido nucleico diana cuando el primer y el segundo oligonucleótido están alineados.
[0104] Como se utiliza en este documento, "motivo" significa el patrón de fracciones de azúcar, nucleobases y/o enlaces internucleósidos no modificados y/o modificados, en un oligonucleótido.
[0106] Como se utiliza en este documento, "nucleobase" significa una nucleobase no modificada o una nucleobase modificada. Como se utiliza en este documento, una "nucleobase no modificada" es adenina (A), timina (T), citosina (C), uracilo (U) o guanina (G). Como se utiliza en este documento, una "nucleobase modificada" es un grupo de átomos distintos de A, T, C, U o G no modificados capaces de aparearse con al menos una nucleobase no modificada. Una "5-metilcitosina" es una nucleobase modificada. Una base universal es una nucleobase modificada que puede aparearse con cualquiera de las cinco nucleobases no modificadas. Como se utiliza en este documento, "secuencia de nucleobases" significa el orden de nucleobases contiguas en un ácido nucleico o oligonucleótido diana independientemente de cualquier modificación del enlace entre azúcares o nucleósidos.
[0108] Como se utiliza en este documento, "nucleósido" significa un compuesto, o un fragmento de un compuesto, que comprende una nucleobase y una fracción de azúcar. La nucleobase y la fracción de azúcar están, cada una de ellas, independientemente, modificadas o no modificadas. Como se utiliza en este documento, "nucleósido modificado" significa un nucleósido que comprende una nucleobase modificada y/o una fracción de azúcar modificada. Los nucleósidos modificados incluyen nucleósidos abásicos, que carecen de una nucleobase. Los "nucleósidos enlazados" son nucleósidos que están conectados en una secuencia contigua (es decir, no se presentan nucleósidos adicionales entre los que están enlazados).
[0110] Como se utiliza en este documento, "compuesto oligomérico" significa un oligonucleótido y opcionalmente una o más características adicionales, tales como un grupo conjugado o un grupo terminal. Un compuesto oligomérico puede estar emparejado con un segundo compuesto oligomérico que sea complementario al primer compuesto oligomérico o puede no estar emparejado. Un "compuesto oligomérico monocatenario" es un compuesto oligomérico desapareado. El término "dúplex oligomérico" significa un dúplex formado por dos compuestos oligoméricos que tienen secuencias de nucleobases complementarias. Cada compuesto oligomérico de un dúplex oligomérico puede denominarse "compuesto oligomérico dúplex".
[0112] En el presente documento, "oligonucleótido" se refiere a una cadena de nucleósidos unidos mediante enlaces internucleósidos, donde cada nucleósido y enlace internucleósido puede estar modificado o no. A menos que se indique lo contrario, los oligonucleótidos constan de entre 8 y 50 nucleósidos unidos. Como se utiliza en este documento, "oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido en el que al menos un enlace nucleósido o internucleósido está modificado. Como se utiliza en este documento, "oligonucleótido no modificado" significa un oligonucleótido que no comprende ninguna modificación de nucleósido o modificación internucleósido.
[0114] Como se utiliza en este documento, "vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable" significa cualquier sustancia adecuada para su uso en la administración a un sujeto. Algunos de estos vehículos permiten formular composiciones farmacéuticas como, por ejemplo, comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, pastillas y pastillas para la ingestión oral por un sujeto. En ciertas formas de realización, un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable es agua estéril, solución salina estéril, solución tampón estéril o líquido cefalorraquídeo artificial estéril.
[0116] Como se utiliza en este documento, "sales farmacéuticamente aceptables" significa sales de compuestos fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables conservan la actividad biológica deseada del compuesto original y no le imparten efectos toxicológicos no deseados.
[0118] Como se utiliza en este documento, "composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un sujeto. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender un compuesto oligomérico y una solución acuosa estéril. En ciertas formas de realización, una composición farmacéutica muestra actividad en el ensayo de captación libre en ciertas líneas celulares.
[0120] Como se utiliza en este documento, "profármaco" significa un agente terapéutico en una forma fuera del cuerpo que se convierte en una forma diferente dentro de un sujeto o células del mismo. Normalmente, la conversión de un profármaco dentro del sujeto se ve facilitada por la acción de una enzima (por ejemplo, una enzima endógena o viral) o de sustancias químicas presentes en las células o tejidos y/o por las condiciones fisiológicas.
[0122] Como se utiliza en este documento, "reducir la cantidad o actividad" se refiere a una reducción o bloqueo de la expresión o actividad transcripcional en relación con la expresión o actividad transcripcional en una muestra no tratada o de control y no indica necesariamente una eliminación total de la expresión o actividad transcripcional.
[0123] Como se utiliza en este documento, "ARN" significa una transcripción de ARN e incluye pre-ARNm y ARNm maduro a menos que se especifique lo contrario.
[0125] Como se utiliza en este documento, "compuesto de ARNi" significa un compuesto antisentido que actúa, al menos en parte, a través de RISC o Ago2 para modular un ácido nucleico objetivo y/o una proteína codificada por un ácido nucleico objetivo. Los compuestos de ARNi incluyen, entre otros, ARNi bicatenario, ARN monocatenario (ssARN) y microARN, incluidos los imitadores de microARN. En ciertas formas de realización, un compuesto de ARNi modula la cantidad, actividad y/o empalme de un ácido nucleico objetivo. El término compuesto de ARNi excluye los compuestos antisentido que actúan a través de la ARNasa H.
[0127] Como se utiliza en este documento, "autocomplementario" en referencia a un oligonucleótido significa un oligonucleótido que se hibrida al menos parcialmente consigo mismo.
[0129] Como se utiliza en este documento, "ensayoin vitroestándar" significa el ensayo descrito en el Ejemplo 1 y variaciones razonables del mismo.
[0131] Como se utiliza en este documento, "ensayoin vivoestándar" significa el ensayo descrito en el Ejemplo 7 y variaciones razonables.
[0133] Como se utiliza en este documento, "centro quiral estereoaleatorio" en el contexto de una población de moléculas de fórmula molecular idéntica significa un centro quiral que tiene una configuración estereoquímica aleatoria. Por ejemplo, en una población de moléculas que comprenden un centro quiral estereoaleatorio, el número de moléculas que tienen la configuración (S) del centro quiral estereoaleatorio puede ser, pero no necesariamente, el mismo que el número de moléculas que tienen la configuración(R)del centro quiral estereoaleatorio. La configuración estereoquímica de un centro quiral se considera aleatoria cuando es el resultado de un método sintético que no está diseñado para controlar la configuración estereoquímica. En ciertas formas de realización, un centro quiral estereoaleatorio es un enlace internucleósido de fosforotioato estereoaleatorio.
[0135] Como se utiliza en este documento, "sujeto" significa un animal humano o no humano.
[0137] Como se utiliza en este documento, "fracción de azúcar" significa una fracción de azúcar no modificada o una fracción de azúcar modificada. Como se utiliza en este documento, "fracción de azúcar no modificada" significa una fracción de 2'-OH(H) p-D-ribosilo, como la que se encuentra en el ARN (una "fracción de azúcar de ARN no modificada"), o una fracción de azúcar 2'-H(H) p-D-desoxirribosilo, como la que se encuentra en el ADN (una "fracción de azúcar de ADN no modificada"). Las fracciones de azúcar no modificadas tienen un hidrógeno en cada una de las posiciones 1', 3' y 4', un oxígeno en la posición 3' y dos hidrógenos en la posición 5'. Como se utiliza en este documento, "fracción de azúcar modificada" o "azúcar modificado" significa una fracción de azúcar furanosilo modificada o un sustituto del azúcar.
[0139] Como se utiliza en este documento, "sustituto de azúcar" significa una fracción de azúcar modificada que tiene una fracción distinta a la furanosilo que puede unir una nucleobase a otro grupo, tal como un enlace internucleósido, un grupo conjugado o un grupo terminal en un oligonucleótido. Los nucleósidos modificados que comprenden sustitutos de azúcar se pueden incorporar en una o más posiciones dentro de un oligonucleótido y dichos oligonucleótidos son capaces de hibridar con compuestos oligoméricos complementarios o ácidos nucleicos diana.
[0141] Como se utiliza en este documento, "síntoma o característica distintiva" significa cualquier característica física o resultado de una prueba que indique la existencia o el alcance de una enfermedad o trastorno. En ciertas formas de realización, un síntoma es evidente para un sujeto o para un profesional médico que examina o prueba a dicho sujeto. En ciertas formas de realización, un sello distintivo es evidente en pruebas de diagnóstico invasivas, incluidas, entre otras, pruebas post mortem. En ciertas formas de realización, un sello distintivo es evidente en una exploración por resonancia magnética del cerebro.
[0143] Como se utiliza en este documento, "ácido nucleico diana" y "ARN diana" significan un ácido nucleico al que un compuesto antisentido está diseñado para afectar.
[0145] Como se utiliza en este documento, "región objetivo" significa una fracción de un ácido nucleico objetivo al que un compuesto oligomérico está diseñado para hibridar.
[0147] Como se utiliza en este documento, "grupo terminal" significa un grupo químico o un grupo de átomos que está unido covalentemente a un extremo de un oligonucleótido.
[0149] Como se utiliza en este documento, "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un sujeto. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz mejora un síntoma o característica de una enfermedad.
[0151] I. Ciertos oligonucleótidos
[0152] Se describen en el presente documento compuestos oligoméricos que comprenden oligonucleótidos, que consisten en nucleósidos unidos. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos no modificados (ARN o ADN) o pueden ser oligonucleótidos modificados. Los oligonucleótidos modificados comprenden al menos una modificación con respecto al ARN o ADN no modificado. Es decir, los oligonucleótidos modificados comprenden al menos un nucleósido modificado (que comprende una fracción de azúcar modificada y/o una nucleobase modificada) y/o al menos un enlace internucleósido modificado.
[0154] A. Ciertos nucleósidos modificados
[0156] Los nucleósidos modificados comprenden una fracción de azúcar modificada o una nucleobase modificada o tanto una fracción de azúcar modificada como una nucleobase modificada.
[0158] 1. Ciertas fracciones de azúcar
[0160] Las fracciones de azúcar modificadas pueden ser fracciones de azúcar modificadas no bicíclicas. Las fracciones de azúcar modificadas pueden ser fracciones de azúcar bicíclicas o tricíclicas. Las fracciones de azúcar modificadas pueden ser sustitutos del azúcar. Dichos sustitutos de azúcar pueden comprender una o más sustituciones correspondientes a las de otros tipos de fracciones de azúcar modificadas.
[0162] Las fracciones de azúcar modificadas pueden ser fracciones de azúcar modificadas no bicíclicas que comprenden un anillo de furanosilo con uno o más grupos sustituyentes, ninguno de los cuales une dos átomos del anillo de furanosilo para formar una estructura bicíclica. Dichos sustituyentes no puenteables pueden estar en cualquier posición del furanosilo, incluidos, entre otros, los sustituyentes en las posiciones 2', 4' y/o 5'. Uno o más sustituyentes no puente de fracciones de azúcar modificadas no bicíclicas pueden estar ramificados. Los ejemplos de grupos sustituyentes 2' adecuados para fracciones de azúcar modificadas no bicíclicas incluyen, entre otros: 2'-F, 2 -OCH<3>("OMe" u "O-metil") y 2'-O(CH<2>)<2>OCH<3>("MOE" u "O-metoxietilo"). Los grupos sustituyentes 2' pueden seleccionarse entre: halo, alilo, amino, azido, SH, CN,<o>C<n>, CF<3>, OCF<3>, O-alcoxi C<1>-C<10>, O-alcoxi C<1>-C<10>sustituido, O-alquilo C<1>-C<10>, O-alquilo C<1>-C<10>sustituido, S-alquilo, N(R<m>)-alquilo, O-alquenilo, S-alquenilo, N(R<m>)-alquenilo, O alquinilo, S-alquinilo, N(R<m>)-alquinilo, O-alquilenil-O-alquilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo, O-aralquilo, O(CH<2>)<2>Sc H<3>, O(CH<2>)<2>ON(R<m>)(R<n>) o OCH<2>C(=O)-N(R<m>)(R<n>), donde cada R<m>y R<n>es, independientemente, H, un grupo protector de amino, o alquilo C<1>-C<10>sustituido o no sustituido, y los grupos sustituyentes 2' descritos en Cook et al., US 6.531.584; Cook et al., US 5.859.221; y Cook et al., US 6.005.087. Los grupos sustituyentes 2' pueden sustituirse además con uno o más grupos sustituyentes seleccionados independientemente entre: hidroxilo, amino, alcoxi, carboxi, bencilo, fenilo, nitro (NO<2>), tiol, tioalcoxi, tioalquilo, halógeno, alquilo, arilo, alquenilo y alquinilo. Los ejemplos de grupos sustituyentes 4' adecuados para fracciones de azúcar modificadas no bicíclicas incluyen, entre otros, alcoxi (por ejemplo, metoxi), alquilo y aquellos descritos en Manoharan et al., WO 2015/106128. Los ejemplos de grupos sustituyentes 5' adecuados para fracciones de azúcar modificadas no bicíclicas incluyen, entre otros: 5'-metilo (R o S), 5'-vinilo y 5'-metoxi. Las fracciones de azúcar modificadas no bicíclicas pueden comprender más de un sustituyente de azúcar no puente, por ejemplo, fracciones de azúcar 2'-F-5'-metilo y las fracciones de azúcar modificadas y nucleósidos modificados descritos en Migawa et al., WO 2008/101157 y Rajeev et al., US2013/0203836.
[0164] Un nucleósido modificado no bicíclico sustituido en 2' puede comprender una fracción de azúcar que comprende un grupo sustituyente 2' no puente seleccionado entre: F, NH<2>, N<3>, OCF<3>, OCH<3>, O(CH<2>)<3>NH<2>, CH<2>CH=CH<2>, OCH<2>CH=CH<2>, OCH<2>CH<2>OCH<3>, O(CH<2>)<2>SCH<3>, O(CH<2>)<2>ON(R<m>)(R<n>), O(CH<2>)<2>O(CH<2>)<2>N(CH<3>)<2>y acetamida N-sustituida (OCH<2>C(=O)-N(R<m>)(R<n>)), donde cada R<m>y R<n>es, independientemente, H, un grupo protector de amino o alquilo C<1>-C<10>sustituido o no sustituido.
[0166] Un nucleósido modificado no bicíclico sustituido en 2' puede comprender una fracción de azúcar que comprende un grupo sustituyente 2' no puente seleccionado entre: F, OCF<3>, OCH<3>, OCH<2>CH<2>OCH<3>, O(CH<2>)<2>SCH<3>, O(CH<2>)<2>O<n>(<c>H<3>)<2>, O(CH<2>)<2>O(CH<2>)<2>N(CH<3>)<2>y OCH<2>C(=O)-N(H)CH<3>("n m a ").
[0168] Un nucleósido modificado no bicíclico sustituido en 2' puede comprender una fracción de azúcar que comprende un grupo sustituyente 2' no puente seleccionado entre: F, OCH<3>y OCH<2>CH<2>OCH<3>.
[0170] Las fracciones de azúcar furanosilo modificadas y los nucleósidos que incorporan dichas fracciones de azúcar furanosilo modificadas pueden definirse con más detalle mediante la configuración isomérica. Por ejemplo, una fracción de azúcar 2'-desoxifuranosilo puede estar en siete configuraciones isoméricas distintas de la configuración p-D-desoxirribosina 1 presente en la naturaleza. Tales fracciones de azúcar modificadas se describen, por ejemplo, en el documento WO 2019/157531. Una fracción de azúcar modificada en 2' tiene un estereocentro adicional en la posición 2' con respecto a una fracción de azúcar 2'-desoxifuranosilada; por lo tanto, dichas fracciones de azúcar tienen un total de dieciséis configuraciones isoméricas posibles. Las fracciones de azúcar modificadas en 2' descritas en este documento están en la configuración isomérica p-D-ribosilo a menos que se especifique lo contrario.
[0172] [0084]Ciertas fracciones de azúcar modificadas comprenden un sustituyente que une dos átomos del anillo furanosilo para formar un segundo anillo, lo que da como resultado una fracción de azúcar bicíclica. La fracción de azúcar bicíclica puede comprender un puente entre los átomos del anillo de furanosa 4' y 2'. Los ejemplos de dichos sustituyentes de azúcar puente de 4' a 2' incluyen, entre otros: 4'-CH<2>-2', 4'-(CH<2>)<2>-2', 4'-(CH<2>)<a>-2', 4'-CH<2>-O-2' ("LNA"), 4'-CH<2>-S-2', 4'-(CH<2>)<2>-O-2' ("ENA"), 4'-CH(CH<3>)-O-2' (denominado "etilo restringido" o "cEt"), 4'-CH<2>-O-CH<2>-2', 4'-CH<2>-N(R)-2', 4'-CH(CH<2>OCH<3>)-O-2' ("MOE restringido" o "cMOE") y análogos de los mismos (véase, por ejemplo, Seth et al., US 7.399.845, Bhat et al., US 7.569.686, Swayze et al., US 7.741.457, y Swayze et al., US 8.022.193), 4'-C(CH<3>)(CH<3>)-O-2' y análogos de los mismos (véase, por ejemplo, Seth et al., US 8.278.283), 4'-CH<2>-N(OCH<3>)-2' y análogos de los mismos (véase, por ejemplo, Prakash et al., US 8.278.425), 4'-CH<2>-ON(CH<3>)-2' (véase, por ejemplo, Allerson et al., US 7.696.345 y Allerson et al., US 8.124.745), 4'-CH<2>-C(H)(CH<3>)-2' (véase, por ejemplo, Zhou, et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134), 4'-CH<2>-C(=CH<2>)-2' y análogos de los mismos (véase, por ejemplo, Seth et al., US 8.278.426), 4'-C(RaRi,)-N(R)-O-2', 4'-C(RaRi,)-ON(R)-2', 4'-CH<2>-ON(R)-2' y 4'-CH<2>-N(R)-O-2', donde cada R, R<a>y R<b>es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C<1>-C<12>(véase, por ejemplo, Imanishi et al., US 7.427.672).
[0174] Dichos puentes 4' a 2' pueden comprender independientemente de 1 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente entre: - [C(R<a>)(R<b>)]<n>-, -[C(R<a>)(R<b>)]<n>O-, -C(R<a>)=C(R<b>)-, -C(R<a>)=N-, -C(=NR<a>)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R<a>)<2>-, -S(=O)<x>-, y -N(R<a>)-; donde:
[0176] x es 0, 1, o 2;
[0177] n es 1, 2, 3, o 4;
[0178] cada R<a>y R<b>es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C<1>-C<12>, alquilo C<1>-C<12>sustituido, alquenilo C<2>-C<12>, alquenilo C<2>-C<12>sustituido, alquinilo C<2>-C<12>, alquinilo C<2>-C<12>sustituido, arilo C<5>-C<20>, arilo C<5>-C<20>sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C<5>-C<7>, radical alicíclico C<5>-C<7>sustituido, halógeno, OJ<1>, NJ<1>J<2>, SJ<1>, N<3>, COOJ<1>, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)<2>-J<1>), o sulfoxilo (S(=O)-J<1>); y
[0179] cada J<1>y J<2>es, independientemente, H, alquilo C<1>-C<12>, alquilo C<1>-C<12>sustituido, alquenilo C<2>-C<12>, alquenilo C<2>-C<12>sustituido, alquinilo C<2>-C<12>, alquinilo C<2>-C<12>sustituido, arilo C<5>-C<20>, arilo C<5>-C<20>sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C<1>-C<12>, aminoalquilo C<1>-C<12>sustituido o un grupo protector.
[0181] Se conocen en la técnica fracciones de azúcar bicíclicas adicionales, véase, por ejemplo: Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443, Albaek et al., J. Org. Chem, 2006, 71, 7731-7740, Singh et al. Chem. Commun, 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219- 2222; Singh et al. J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 8362­ 8379; Wengel et al., US 7.053.207; Imanishi et al., US 6.268.490; Imanishi et al. US 6.770.748; Imanishi et al., US RE44,779; Wengel et al. US 6.794.499; Wengel et al., US 6.670.461; Wengel et al., US 7.034.133; Wengel et al., US 8.080.644; Wengel et al., US 8.034.909; Wengel et al., US 8.153.365; Wengel et al., US 7.572.582; Ramasamy et al., US 6.525.191; Torsten et al., WO 2004/106356; Wengel et al., WO 1999/014226; Seth et al., WO 2007/134181; Seth et al. US 7.547.684; Seth et al., US 7.666.854; Seth et al., US 8.088.746; Seth et al., US 7.750.131; Seth et al., US 8.030.467; Seth et al., US 8.268.980; Seth et al., US 8.546.556; Seth et al., US 8.530.640; Migawa et al., US 9.012.421; Seth et al., US 8.501.805; y Publicaciones de patentes de EE. UU. núms. Allerson et al., US 2008/0039618 y Migawa et al., US 2015/0191727.
[0183] Las fracciones de azúcar bicíclicas y los nucleósidos que incorporan dichas fracciones de azúcar bicíclicas pueden definirse además mediante la configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido LNA (descrito en este documento) puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D.
[0186]
[0188] Puente LNA (configuración p-D) = 4'-CH<2>-O-2' Puente a-L-LNA (configuración a-L) = 4'-CH<2>-O-2'
[0189] Se han incorporado nucleósidos bicíclicos a-L-metilenoxi (4'-CH<2>-O-2') o a-L-LNA en oligonucleótidos que mostraron actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21,6365-6372). Aquí, las descripciones generales de los nucleósidos bicíclicos incluyen ambas configuraciones isoméricas. Cuando se identifican las posiciones de nucleósidos bicíclicos específicos (por ejemplo, LNA o cEt) en las formas de realización ejemplificadas en este documento, están en la configuración p-D, a menos que se especifique lo contrario.
[0191] Las fracciones de azúcar modificadas pueden comprender uno o más sustituyentes de azúcar no puente y uno o más sustituyentes de azúcar puente (por ejemplo, azúcares sustituidos en 5' y con puente en 4'-2').
[0193] [0089]Las fracciones de azúcar modificadas pueden ser sustitutos del azúcar. El átomo de oxígeno de la fracción de azúcar puede reemplazarse, por ejemplo, por un átomo de azufre, carbono o nitrógeno. Dichas fracciones de azúcar modificadas también pueden comprender sustituyentes puente y/o no puente como se describe en este documento. Por ejemplo, ciertos sustitutos del azúcar comprenden un átomo de azufre 4' y una sustitución en la posición 2' (véase, por ejemplo, Bhat et al., US 7.875.733 y Bhat et al., US 7.939.677) y/o la posición 5'.
[0195] Los sustitutos del azúcar pueden comprender anillos que tengan otros 5 átomos. Por ejemplo, un sustituto del azúcar comprende un tetrahidropirano ("THP") de seis miembros. Dichos tetrahidropiranos pueden modificarse o sustituirse adicionalmente. Los nucleósidos que comprenden dichos tetrahidropiranos modificados incluyen, entre otros, ácido nucleico de hexitol ("HNA"), ácido nucleico de anitol ("ANA") y ácido nucleico de manitol ("MNA") (véase, por ejemplo, Leumann, CJ. Bioorg. y Med. Chem. 2002, 10, 841-854), fluoro HNA:
[0198]
[0201] ("F-HNA", véase, por ejemplo, Swayze et al. US 8.088.904; Swayze et al. US 8.440.803; Swayze et al. US 8.796.437; y Swayze et al., US 9.005.906; F-HNA también puede denominarse F-THP o 3'-fluorotetrahidropirano), y nucleósidos que comprenden compuestos THP modificados adicionales que tienen la fórmula:
[0204]
[0207] en donde, independientemente, para cada uno de los nucleósidos THP modificados:
[0209] Bx es una fracción de nucleobase;
[0210] T<3>y T<4>son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleósido que une el nucleósido THP modificado al fracción de un oligonucleótido o uno de T<3>y T<4>es un grupo de enlace internucleósido que une el nucleósido THP modificado al fracción de un oligonucleótido y el otro de T<3>y T<4>es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo 5' o 3'-terminal;
[0211] q-<i>, q<2>, q<3>, q<4>, q<5>, q6 y q<7>son cada uno, independientemente, H, alquilo C<1>-C<6>, alquilo C<1>-C<6>sustituido, alquenilo C<2>-C<6>, alquenilo C<2>-C<6>sustituido, alquinilo C<2>-C<6>o alquinilo C<2>-C<6>sustituido; y
[0212] cada uno de R<1>y R<2>se selecciona independientemente de entre: hidrógeno, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ<1>J<2>, SJ<1>, N<3>, OC(=X)J<1>, O C (=X)N JJ , NJ<3>C(=X)NJJ<2>y CN, donde X es O, S o NJ<1>, y cada J<1>, J<2>y J<3>es, independientemente, H, alquilo C<1>-C<6>.
[0214] Se describen nucleósidos THP modificados en los que q<1>, q<2>, q<3>, q<4>, q<5>, q6 y q<7>son cada uno H. Al menos uno de q<1>, q<2>, q<3>, q<4>, q<5>, q6y q<7>puede ser distinto de H. Al menos uno de q<1>, q<2>, q<3>, q<4>, q<5>, q6 y q<7>puede ser metilo. Se describen nucleósidos THP modificados en los que uno de R<1>y R<2>es F. R<1>es F y R<2>puede ser H. R<1>puede ser metoxi y R<2>puede ser H. R<1>puede ser metoxietoxi y R<2>puede ser H.
[0216] Los sustitutos del azúcar pueden comprender anillos que tengan más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se ha informado sobre nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar morfolino y su uso en oligonucleótidos (véase, por ejemplo, Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510 y Summerton et al., Us 5.698.685; Summerton et al. US 5.166.315; Summerton et al. US 5.185.444; y Summerton et al., US 5.034.506). Tal como se utiliza aquí, el término "morfolino" significa un sustituto del azúcar que tiene la siguiente estructura:
[0219]
[0222] Los morfolinos pueden modificarse, por ejemplo, añadiendo o alterando varios grupos sustituyentes de la estructura de morfolino anterior. Estos sustitutos de azúcar se denominan en el presente documento «morfolinos modificados».
[0223] Los sustitutos de azúcar pueden comprender grupos acíclicos. Los ejemplos de nucleósidos y oligonucleótidos que comprenden dichos sustitutos de azúcar acíclicos incluyen, entre otros: ácido nucleico peptídico ("PNA"), ácido nucleico butílico acíclico (véase, por ejemplo, Kumar et al., Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 5853-5865), y nucleósidos y oligonucleótidos descritos en Manoharan et al., WO2011/133876.
[0225] En la técnica se conocen muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcar y azúcar bicíclicos y tricíclicos que pueden usarse en nucleósidos modificados.
[0227] 2. Ciertas nucleobases modificadas
[0229] En la invención, los oligonucleótidos modificados comprenden uno o más nucleósidos que comprenden una nucleobase no modificada, como se define en las reivindicaciones. En la invención, los oligonucleótidos modificados comprenden uno o más nucleósidos que comprenden una nucleobase modificada, como se define en las reivindicaciones. Los oligonucleótidos modificados pueden comprender uno o más nucleósidos que no comprenden una nucleobase, denominados nucleósidos abásicos.
[0231] Las nucleobases modificadas pueden seleccionarse entre: pirimidinas sustituidas en 5, 6-azapirimidinas, pirimidinas sustituidas con alquilo o alquinilo, purinas sustituidas con alquilo y purinas sustituidas en N-2, N-6 y O-6. En ciertas formas de realización, las nucleobases modificadas se seleccionan de: 2-aminopropiladenina, 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-N-metilguanina, 6-N-metiladenina, 2-propiladenina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-propinil (-CEC-CH<3>) uracilo, 5-propinilcitosina, 6-azouracilo, 6-azocitosina, 6-azotimina, 5-ribosiluracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo, 8-aza y otras purinas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo, 5-halouracilo y 5-halocitosina, 7-metilguanina, 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 7-desazaguanina, 7-desazaadenina, 3-desazaguanina, 3-desazaadenina, 6-N-3-benzoiladenina, 2-N-isobutirilguanina, 4-N-benzoilcitosina, 4-N-benzoiluracilo, 5-metil 4-N-benzoilcitosina, 5-metil 4-N-benzoiluracilo, bases universales, bases hidrófobas, bases promiscuas, bases de tamaño expandido y bases fluoradas. Otras nucleobases modificadas incluyen pirimidinas tricíclicas, como 1,3-diazafenoxazina-2-ona, 1,3-diazafenotiazina-2-ona y 9-(2-aminoetoxi)-1,3-diazafenoxazina-2-ona (abrazadera G). Las nucleobases modificadas también pueden incluir aquellas en las que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo 7-deazaadenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Otras nucleobases incluyen las descritas en Merigan et al., US 3.687.808, los divulgados en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, JI, Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30,613; Sanghvi, YS, Capítulo 15, Antisense Research and Applications, Crooke, ST. y Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993, 273-288; y los descritos en los Capítulos 6 y 15, Antisense Drug Technology, Crooke ST, Ed., CRC Press, 2008, 163-166 y 442-443.
[0233] Las publicaciones que enseñan la preparación de algunas de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente, así como otras nucleobases modificadas, incluyen, sin limitación, Manoharan et al., US2003/0158403; Manoharan et al., US2003/0175906; Dinh et al., US 4.845.205; Spielvogel et al., US 5.130.302; Rogers et al. US 5.134.066; Bischofberger et al., US 5.175.273; Urdea et al., US 5.367.066; Benner et al., US 5.432.272; Matteucci et al., US 5.434.257; Gmeiner et al., US 5.457.187; Cook et al. US 5.459.255; Froehler et al., US 5.484.908; Matteucci et al., US 5.502.177; Hawkins et al., US 5.525.711; Haralambidis et al., US 5.552.540; Cook et al. US 5.587.469; Froehler et al., US 5.594.121; Switzer et al., US 5.596.091; Cook et al., US 5.614.617; Froehler et al., US 5.645.985; Cook et al., US 5.681.941; Cook et al., US 5.811.534; Cook et al., US 5.750.692; Cook et al., US 5.948.903; Cook et al., US 5.587.470; Cook et al., US 5.457.191; Matteucci et al., US 5.763.588; Froehler et al., US 5.830.653; Cook et al., US 5.808.027; Cook et al., 6.166.199; y Matteucci et al., US 6.005.096.
[0235] 3. Ciertos enlaces internucleósidos modificados
[0237] Los nucleósidos de oligonucleótidos modificados pueden unirse entre sí mediante cualquier enlace internucleósido. Las dos clases principales de grupos de enlace internucleósidos se definen por la presencia o ausencia de un átomo de fósforo. Los enlaces internucleósidos que contienen fósforo representativos incluyen, entre otros, fosfodiésteres, que contienen un enlace fosfodiéster ("P(O<2>)=O") (también denominados enlaces no modificados o de origen natural), fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidatos, fosforotioatos ("P(O<2>)=S") y fosforoditioatos ("HS-P=S"). Los grupos de enlace internucleósidos que no contienen fósforo representativos incluyen, entre otros, metilenmetilimino (-CH<2>-N(CH<3>)-O-CH<2>-), tiodiéster, tionocarbamato (-O-C(=O)(NH)-S-); siloxano (-O-SiH<2>-O); y N,N'-dimetilhidrazina (-CH<2>-N(CH<3>)-N(CH<3>)-). Los enlaces internucleósidos modificados, en comparación con los enlaces internucleósidos fosfodiéster que se producen naturalmente, se pueden utilizar para alterar, típicamente aumentar, la resistencia a las nucleasas del oligonucleótido. Los enlaces internucleósidos que tienen un átomo quiral se pueden preparar como una mezcla racémica o como enantiómeros separados. Los métodos de preparación de enlaces internucleósidos que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos por los expertos en la materia.
[0239] [0099]Los enlaces internucleósidos representativos que tienen un centro quiral incluyen, entre otros, alquilfosfonatos y fosforotioatos. Los oligonucleótidos modificados que comprenden enlaces internucleósidos que tienen un centro quiral se pueden preparar como poblaciones de oligonucleótidos modificados que comprenden enlaces internucleósidos estereoaleatorios, o como poblaciones de oligonucleótidos modificados que comprenden enlaces internucleósidos fosforotioato en configuraciones estereoquímicas particulares. En ciertas formas de realización, las poblaciones de oligonucleótidos modificados comprenden enlaces internudeósidos de fosforotioato, en donde todos los enlaces internudeósidos de fosforotioato son estereoaleatorios. Estos oligonucleótidos modificados se pueden generar utilizando métodos sintéticos que dan como resultado una selección aleatoria de la configuración estereoquímica de cada enlace internucleósido de fosforotioato. Sin embargo, como bien entienden los expertos en la materia, cada fosforotioato individual de cada molécula de oligonucleótido individual tiene una estereoconfiguración definida. En ciertas formas de realización, las poblaciones de oligonucleótidos modificados se enriquecen con oligonucleótidos modificados que comprenden uno o más enlaces internudeósidos de fosforotioato particulares en una configuración estereoquímica particular seleccionada independientemente. En ciertas formas de realización, la configuración particular del enlace internucleósido de fosforotioato particular está presente en al menos el 65 % de las moléculas de la población. En ciertas formas de realización, la configuración particular del enlace internucleósido de fosforotioato particular está presente en al menos el 70 % de las moléculas de la población. En ciertas formas de realización, la configuración particular del enlace internucleósido de fosforotioato particular está presente en al menos el 80 % de las moléculas de la población. En ciertas formas de realización, la configuración particular del enlace internucleósido de fosforotioato particular está presente en al menos el 90 % de las moléculas de la población. En ciertas formas de realización, la configuración particular del enlace internucleósido de fosforotioato particular está presente en al menos el 99 % de las moléculas de la población. Estas poblaciones quiralmente enriquecidas de oligonucleótidos modificados se pueden generar utilizando métodos sintéticos conocidos en la técnica, por ejemplo, los métodos descritos en Oka et al., JACS 125, 8307 (2003), Wan et al. Nuc. Acid. Res. 42, 13456 (2014) y WO 2017/015555. En ciertas formas de realización, una población de oligonucleótidos modificados se enriquece con oligonucleótidos modificados que tienen al menos un fosforotioato indicado en la configuración (Sp). En ciertas formas de realización, una población de oligonucleótidos modificados se enriquece con oligonucleótidos modificados que tienen al menos un fosforotioato en la configuración (Rp). En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados que comprenden fosforotioatos (Rp) y/o (Sp) comprenden una o más de las siguientes fórmulas, respectivamente, donde "B" indica una nucleobase:
[0242]
[0244] A menos que se indique lo contrario, los enlaces internudeósidos quirales de los oligonucleótidos modificados descritos en este documento pueden ser estereoaleatorios o estar en una configuración estereoquímica particular.
[0246] Los enlaces internudeósidos neutros incluyen, sin limitación, fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (3'-CH2-N(CHa)-O-5'), amida-3 (3'-CH2-C(=O)-N(H)-5'), amida-4 (3'-CH2-N(H)-C(=O)-5'), formacetal (3'-O-CH2-O-5'), metoxipropilo (MOP) y tioformacetal (3-S-CH2-O-5'). Otros enlaces internudeósidos neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden siloxano (dialquilsiloxano), éster carboxilato, carboxamida, sulfuro, éster sulfonato y amidas (véase, por ejemplo: Modificaciones de carbohidratos en la investigación antisentido; YS Sanghvi y PD Cook, Eds., ACS Symposium Series 580; Capítulos 3 y 4, 40-65). Otros enlaces internudeósidos neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden componentes mixtos de N, O, S y CH2.
[0248] B. Ciertos motivos
[0250] En la invención, los oligonucleótidos modificados comprenden uno o más nucleósidos modificados que comprenden una fracción de azúcar modificada, como se define en las reivindicaciones. En la invención, los oligonucleótidos modificados comprenden uno o más nucleósidos modificados que comprenden una nucleobase modificada, como se define en las reivindicaciones. En la invención, los oligonucleótidos modificados comprenden uno o más enlaces internucleósidos modificados, como se define en las reivindicaciones. Las fracciones de azúcar, nucleobases y/o enlaces internucleósidos modificados, no modificados y modificados de forma diferente de un oligonucleótido modificado definen un patrón o motivo. Los patrones de fracciones de azúcar, nucleobases y enlaces internucleósidos pueden ser independientes entre sí. Por lo tanto, un oligonucleótido modificado puede describirse por su motivo de azúcar, motivo de nucleobase y/o motivo de enlace internucleósido (como se utiliza en este documento, motivo de nucleobase describe las modificaciones de las nucleobases independientemente de la secuencia de nucleobases).
[0252] 1. Ciertos motivos de azúcar
[0254] [0102]En la invención, los oligonucleótidos comprenden uno o más tipos de azúcar modificado y/o porción de azúcar no modificada dispuestos a lo largo del oligonucleótido o porción del mismo en un patrón definido o motivo de azúcar, como se define en las reivindicaciones. Dichos motivos de azúcar pueden incluir, entre otros, cualquiera de las modificaciones de azúcar analizadas en este documento.
[0256] Los oligonucleótidos modificados pueden presentar un motivo gapmer, definido por dos regiones externas o "alas" y una región central o interna o "hueco". Las tres regiones de un motivo gapmer (el ala 5', el hueco y el ala 3') forman una secuencia contigua de nucleósidos en la que al menos algunas de las fracciones de azúcar de los nucleósidos de cada una de las alas difieren de al menos algunas de las fracciones de azúcar de los nucleósidos del hueco. Específicamente, al menos las fracciones de azúcar de los nucleósidos de cada ala que están más cerca del espacio (el nucleósido más 3' del ala 5' y el nucleósido más 5' del ala 3') difieren de la fracción de azúcar de los nucleósidos vecinos del espacio, definiendo así el límite entre las alas y el espacio (es decir, la unión ala/espacio). Las fracciones de azúcar dentro del espacio pueden ser las mismas entre sí. El espacio puede incluir uno o más nucleósidos que tienen una fracción de azúcar que difiere de la fracción de azúcar de uno o más otros nucleósidos del espacio. Los motivos de azúcar de las dos alas pueden ser iguales entre sí (gapmer simétrico). El motivo de azúcar del ala 5' puede diferir del motivo de azúcar del ala 3' (gapmer asimétrico).
[0258] Las alas de un gapmer pueden comprender de 1 a 6 nucleósidos. Cada nucleósido de cada ala de un gapmer puede comprender una fracción de azúcar modificada. Al menos un nucleósido de cada ala de un gapmer puede comprender una fracción de azúcar modificada. Al menos dos nucleósidos de cada ala de un gapmer pueden comprender una fracción de azúcar modificada. Al menos tres nucleósidos de cada ala de un gapmer pueden comprender una fracción de azúcar modificada. Al menos cuatro nucleósidos de cada ala de un gapmer pueden comprender una fracción de azúcar modificada. Al menos cinco nucleósidos de cada ala de un gapmer pueden comprender una fracción de azúcar modificada.
[0260] El espacio de un gapmer puede contener entre 7 y 12 nucleósidos. Cada nucleósido del espacio de un gapmer puede comprender una fracción de azúcar 2-desoxirribosina 1. Cada nucleósido del espacio de un gapmer puede comprender una fracción de azúcar 2'-p-D-desoxirribosina. Al menos un nucleósido del espacio de un gapmer puede comprender una fracción de azúcar modificada. Al menos un nucleósido del espacio de un gapmer puede comprender una fracción de azúcar 2'-OMe.
[0262] El gapmer puede ser un desoxigapmer. Los nucleósidos en el lado de espacio de cada ala/unión de espacio pueden comprender fracciones de azúcar 2'-desoxirribosilo y los nucleósidos en los lados de las alas de cada ala/unión de espacio pueden comprender fracciones de azúcar modificadas. Cada nucleósido del espacio puede comprender una fracción de azúcar 2-desoxirribosilo. Cada nucleósido de cada ala de un gapmer puede comprender una fracción de azúcar modificada. Un nucleósido del espacio puede comprender una fracción de azúcar modificada y cada nucleósido restante del espacio puede comprender una fracción de azúcar 2-desoxirribosilo.
[0264] Los oligonucleótidos modificados pueden comprender o consistir en una porción que tenga un motivo de azúcar completamente modificado. Cada nucleósido de la porción completamente modificada del oligonucleótido modificado puede comprender una fracción de azúcar modificada. Cada nucleósido del oligonucleótido modificado completo puede comprender una fracción de azúcar modificada. Los oligonucleótidos modificados pueden comprender o consistir en una porción que tiene un motivo de azúcar completamente modificado, en donde cada nucleósido dentro de la porción completamente modificada puede comprender la misma porción de azúcar modificada, denominada en este documento como un motivo de azúcar modificado uniformemente. Un oligonucleótido completamente modificado puede ser un oligonucleótido modificado uniformemente. Cada nucleósido de un oligonucleótido modificado uniformemente puede comprender la misma modificación 2'.
[0266] Aquí, las longitudes (número de nucleósidos) de las tres regiones de un gapmer se pueden proporcionar utilizando la notación [número de nucleósidos en el ala 5'] - [número de nucleósidos en el espacio] - [número de nucleósidos en el ala 3']. Por lo tanto, un gapmer 5-10-5 consta de 5 nucleósidos enlazados en cada ala y 10 nucleósidos enlazados en el espacio. Cuando dicha nomenclatura es seguida por una modificación específica, esa modificación es la modificación en cada fracción de azúcar de cada ala y los nucleósidos del espacio comprenden una fracción de azúcar 2'-p-D-desoxirribosil. Por lo tanto, un gapmer 5-10-5 MOE consta de 5 nucleósidos 2'-MOE enlazados en el ala 5', 102'-p-D-desoxinucleósidos enlazados en el espacio y 5 nucleósidos 2'-MOE enlazados en el ala 3'. Un gapmer cEt 3-10-3 consta de 3 nucleósidos cEt enlazados en el ala 5', 10 desoxinucleósidos 2'-p-D- enlazados en el espacio y 3 nucleósidos cEt enlazados en el ala 3'. Un gapmer 5-8-5 consta de 5 nucleósidos enlazados que comprenden una fracción de azúcar modificada en el ala 5', 8 desoxinucleósidos 2' enlazados en el espacio y 5 nucleósidos enlazados que comprenden una fracción de azúcar modificada en el ala 3'. Un gapmer de ala mixta tiene al menos dos azúcares modificados diferentes en el ala 5' y/o 3'. Un gapmer de ala mixta 5-8-5 o 5-8-4 tiene al menos dos fracciones de azúcar modificadas diferentes en el ala 5' y/o 3'.
[0268] Los oligonucleótidos modificados pueden ser gapmers de 5-10-5 MOE. Los oligonucleótidos modificados pueden ser gapmers de 4-10-6 MOE. Los oligonucleótidos modificados pueden ser gapmers de 6-10-4 MOE. Los oligonucleótidos modificados pueden ser gapmers 5-8-5 MOE. Los oligonucleótidos modificados son gapmers MOE X-Y-Z, donde X y Z pueden seleccionarse independientemente entre 1, 2, 3, 4, 5 o 6 e Y es 7, 8, 9, 10 u 11.
[0269] Los oligonucleótidos modificados pueden tener el siguiente motivo de azúcar (5' a 3'): meeemddddddddddmmmmm, donde 'd' representa una fracción de azúcar 2'-desoxirribosilo, 'e' representa una fracción de azúcar 2'-MOE y 'm' representa una fracción de azúcar 2'-OMe.
[0271] 2. Ciertos motivos de nucleobases
[0273] En la invención, los oligonucleótidos comprenden nucleobases modificadas y/o no modificadas dispuestas a lo largo del oligonucleótido o porción del mismo en un patrón o motivo definido, como se define en las reivindicaciones. Cada nucleobase puede ser modificada. Ninguna de las nucleobases puede modificarse. Cada purina o cada pirimidina puede modificarse. Cada adenina puede ser modificada. Cada guanina puede ser modificada. Cada timina puede ser modificada. Cada uracilo puede ser modificado. Cada citosina puede ser modificada. Algunas o todas las nucleobases de citosina en un oligonucleótido modificado pueden ser 5-metilcitosinas. Todas las nucleobases de citosina pueden ser 5-metil citosinas y todas las demás nucleobases del oligonucleótido modificado pueden ser nucleobases no modificadas.
[0275] Los oligonucleótidos modificados pueden comprender un bloque de nucleobases modificadas. El bloqueo puede estar en el extremo 3' del oligonucleótido. El bloque puede estar a 3 nucleósidos del extremo 3' del oligonucleótido. El bloqueo puede estar en el extremo 5' del oligonucleótido. El bloque puede estar a 3 nucleósidos del extremo 5' del oligonucleótido.
[0277] Los oligonucleótidos que tienen un motivo gapmer pueden comprender un nucleósido que comprende una nucleobase modificada. Un nucleósido que comprende una nucleobase modificada puede estar en el espacio central de un oligonucleótido que tiene un motivo gapmer. La fracción de azúcar del nucleósido puede ser una fracción de azúcar 2'-desoxirribosilo. La nucleobase modificada puede seleccionarse entre: una 2-tiopirimidina y una 5-propinepirimidina.
[0279] 3. Ciertos motivos de enlace internucleósido
[0281] En la invención, los oligonucleótidos comprenden enlaces internucleósidos modificados y/o no modificados dispuestos a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón o motivo definido, como se define en las reivindicaciones. Cada grupo de enlace internucleósido puede ser un enlace internucleósido fosfodiéster (P=O). Cada grupo de enlace internucleósido de un oligonucleótido modificado puede ser un enlace internucleósido fosforotioato (P=S). Cada enlace internucleósido de un oligonucleótido modificado puede seleccionarse independientemente entre un enlace internucleósido fosforotioato y un enlace internucleósido fosfodiéster. Cada enlace internucleósido de fosforotioato puede seleccionarse independientemente entre un fosforotioato estereoaleatorio, un fosforotioato (Sp) y un fosforotioato (Rp). El motivo de azúcar de un oligonucleótido modificado puede ser un gapmer y los enlaces internucleósidos dentro del espacio pueden estar todos modificados. Algunos o todos los enlaces internucleósidos en las alas pueden ser enlaces internucleósidos fosfodiéster no modificados. Los enlaces internucleósidos terminales pueden modificarse. El motivo de azúcar de un oligonucleótido modificado puede ser un gapmer, y el motivo de enlace internucleósido puede comprender al menos un enlace internucleósido fosfodiéster en al menos un ala, en donde el al menos un enlace internucleósido fosfodiéster no es un enlace internucleósido terminal, y los enlaces internucleósidos restantes son enlaces internucleósidos fosforotioato. Todos los enlaces internucleósidos de fosforotioato pueden ser estereoaleatorios. Todos los enlaces internucleósidos de fosforotioato en las alas pueden ser fosforotioatos (Sp), y el espacio puede comprender al menos un motivo Sp, Sp, Rp. En ciertas formas de realización, las poblaciones de oligonucleótidos modificados pueden enriquecerse con oligonucleótidos modificados que comprenden dichos motivos de enlace internucleósido.
[0283] Los oligonucleótidos modificados pueden tener un motivo de enlace internucleósido de sooosssssssssssooss, donde cada "s" representa un enlace internucleósido fosforotioato y cada "o" representa un enlace internucleósido fosfodiéster. Los oligonucleótidos modificados pueden tener un motivo de enlace internucleósido de (5' a 3'): sooooossssssssssoss, donde cada "s" representa un enlace internucleósido fosforotioato y cada "o" representa un enlace internucleósido fosfodiéster. Los oligonucleótidos modificados pueden tener un motivo de enlace internucleósido de (5' a 3'): soooossssssssssooss, donde cada "s" representa un enlace internucleósido fosforotioato y cada "o" representa un enlace internucleósido fosfodiéster. Los oligonucleótidos modificados pueden tener un motivo de enlace internucleósido de (5' a 3'):sooosssssssssooss, donde cada "s" representa un enlace internucleósido fosforotioato y cada "o" representa un enlace internucleósido fosfodiéster. Los oligonucleótidos modificados pueden tener un motivo de enlace internucleósido de (5' a 3'): sooossssssssssoooss, donde cada "s" representa un enlace internucleósido fosforotioato y cada "o" representa un enlace internucleósido fosfodiéster. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados tienen un motivo de enlace internucleósido de (5' a 3'): sooosssssssssssssss, donde cada "s" representa un enlace internucleósido fosforotioato y cada "o" representa un enlace internucleósido fosfodiéster.
[0285] C. Ciertas longitudes
[0287] [0116]Es posible aumentar o disminuir la longitud de un oligonucleótido sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992) se probó una serie de oligonucleótidos de 13 a 25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad de inducir la escisión de un ácido nucleico objetivo en un modelo de inyección de ovocito. Los oligonucleótidos de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases desparejadas cerca de los extremos de los oligonucleótidos fueron capaces de dirigir la escisión específica del ácido nucleico objetivo, aunque en menor medida que los oligonucleótidos que no contenían desparejos. De manera similar, se logró la escisión específica del objetivo utilizando 13 oligonucleótidos de nucleobase, incluidos aquellos con 1 o 3 desajustes.
[0289] Los oligonucleótidos (incluidos los oligonucleótidos modificados) pueden tener diversos rangos de longitud. Los oligonucleótidos pueden consistir en nucleósidos unidos de X a Y, donde X representa la menor cantidad de nucleósidos en el rango e Y representa la mayor cantidad de nucleósidos en el rango. X e Y pueden seleccionarse independientemente entre 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50; siempre que X<Y. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden constar de 12 a 13, 12 a 14, 12 a 15, 12 a 16, 12 a 17, 12 a 18, 12 a 19, 12 a 20, 12 a 21, 12 a 22, 12 a 23, 12 a 24, 12 a 25, 12 a 26, 12 a 27, 12 a 28, 12 a 29, 12 a 30, 13 a 14, 13 a 15, 13 a 16, 13 a 17, 13 a 18, 13 a 19, 13 a 20, 13 a 21, 13 a 22, 13 a 23, 13 a 24, 13 a 25, 13 a 26, 13 a 27, 13 a 28, 13 a 29, 13 a 30, 14 a 15, 14 a 16, 14 a 17, 14 a 18, 14 a 19, 14 a 20, 14 a 21, 14 a 22, 14 a 23, 14 a 24, 14 a 25, 14 a 26, 14 a 27, 14 a 28, 14 a 29, 14 a 30, 15 a 16, 15 a 17, 15 a 18, 15 a 19, 15 a 20, 15 a 21, 15 a 22, 15 al 23, 15 al 24, 15 a 25, 15 a 26, 15 a 27, 15 a 28, 15 a 29, 15 a 30, 16 a 17, 16 a 18, 16 a 19, 16 a 20, 16 a 21, 16 a 22, 16 a 23, 16 a 24, 16 a 25, 16 a 26, 16 a 27, 16 a 28, 16 a 29, 16 a 30, 17 a 18, 17 a 19, 17 a 20, 17 a 21, 17 a 22, 17 a 23, 17 a 24, 17 a 25, 17 a 26, 17 al 27, 17 a 28, 17 a 29, 17 a 30, 18 a 19, 18 a 20, 18 a 21, 18 a 22, 18 a 23, 18 a 24, 18 a 25, 18 a 26, 18 a 27, 18 a 28, 18 a 29, 18 a 30, 19 a 20, 19 a 21, 19 a 22, 19 a 23, 19 a 24, 19 a 25, 19 a 26, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 29, 19 a 30, 20 a 21, 20 a 22, 20 a 23, 20 a 24, 20 a 25, 20 a 26, 20 a 27, 20 a 28, 20 a 29, 20 a 30, 21 a 22, 21 a 23, 21 a 24, 21 a 25, 21 a 26, 21 a 27, 21 a 28, 21 a 29, 21 a 30, 22 a 23, 22 a 24, 22 a 25, 22 a 26, 22 a 27, 22 a 28, 22 a 29, 22 a 30, 23 a 24, 23 a 25, 23 a 26, 23 a 27, 23 a 28, 23 a 29, 23 a 30, 24 a 25, 24 a 26, 24 a 27, 24 a 28, 24 a 29, 24 a 30, 25 a 26, 25 a 27, 25 a 28, 25 a 29, 25 a 30, 26 a 27, 26 a 28, 26 a 29, 26 a 30, 27 a 28, 27 a 29, 27 a 30, 28 a 29, 28 a 30 o 29 a 30 nucleósidos enlazados.
[0291] D. Ciertos oligonucleótidos modificados
[0293] En la invención, las modificaciones anteriores (azúcar, nucleobase, enlace internucleósido) se incorporan en un oligonucleótido modificado, como se define en las reivindicaciones. Los oligonucleótidos modificados pueden caracterizarse por sus motivos de modificación y longitudes generales. Estos parámetros pueden ser independientes unos de otros. Por lo tanto, a menos que se indique lo contrario, cada enlace internucleósido de un oligonucleótido que tiene un motivo de azúcar gapmer puede estar modificado o no modificado y puede o no seguir el patrón de modificación gapmer de las modificaciones de azúcar. Por ejemplo, los enlaces internucleósidos dentro de las regiones del ala de un gapmer de azúcar pueden ser iguales o diferentes entre sí y pueden ser iguales o diferentes de los enlaces internucleósidos de la región de espacio del motivo de azúcar. Asimismo, dichos oligonucleótidos gapmer de azúcar pueden comprender una o más nucleobases modificadas independientemente del patrón gapmer de las modificaciones de azúcar. A menos que se indique lo contrario, todas las modificaciones son independientes de la secuencia de nucleobases.
[0295] E. Ciertas poblaciones de oligonucleótidos modificados
[0297] Las poblaciones de oligonucleótidos modificados en las que todos los oligonucleótidos modificados de la población tienen la misma fórmula molecular pueden ser poblaciones estereoaleatorias o poblaciones enriquecidas quiralmente. Todos los centros quirales de todos los oligonucleótidos modificados son estereoaleatorios en una población estereoaleatoria. En una población enriquecida quiralmente, al menos un centro quiral particular no es estereoaleatorio en los oligonucleótidos modificados de la población. Los oligonucleótidos modificados de una población quiralmente enriquecida pueden estar enriquecidos con fracciones de azúcar p-D ribosilo, y todos los enlaces internucleósidos de fosforotioato pueden ser estereoaleatorios. Los oligonucleótidos modificados de una población quiralmente enriquecida pueden enriquecerse tanto en fracciones de azúcar ribosilo p-D como en al menos un enlace internucleósido fosforotioato particular en una configuración estereoquímica particular.
[0299] F. Secuencia de nucleobases
[0301] Los oligonucleótidos (oligonucleótidos no modificados o modificados) pueden describirse con más detalle mediante su secuencia de nucleobases. Los oligonucleótidos pueden tener una secuencia de nucleobases que sea complementaria a un segundo oligonucleótido o a un ácido nucleico de referencia identificado, como un ácido nucleico objetivo. Una porción de un oligonucleótido puede tener una secuencia de nucleobases que sea complementaria a un segundo oligonucleótido o a un ácido nucleico de referencia identificado, como un ácido nucleico objetivo. La secuencia de nucleobases de una porción o de toda la longitud de un oligonucleótido puede ser al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100% complementaria al segundo oligonucleótido o ácido nucleico, tal como un ácido nucleico objetivo.
[0303] II. Ciertos compuestos oligoméricos
[0305] [0121]Se proporcionan en el presente documento compuestos oligoméricos, que consisten en un oligonucleótido (modificado) y opcionalmente uno o más grupos conjugados y/o grupos terminales, como se define en las reivindicaciones. Los grupos conjugados constan de una o más fracciones conjugadas y un enlazador conjugado que une la fracción conjugada al oligonucleótido. Los grupos conjugados pueden unirse a uno o ambos extremos de un oligonucleótido y/o en cualquier posición interna. En ciertas formas de realización, los grupos conjugados están unidos a la posición 2' de un nucleósido de un oligonucleótido modificado. En ciertas formas de realización, los grupos conjugados que están unidos a uno o ambos extremos de un oligonucleótido son grupos terminales. En ciertas de estas formas de realización, los grupos conjugados o grupos terminales están unidos en el extremo 3' y/o 5' de los oligonucleótidos. En ciertas formas de realización de este tipo, los grupos conjugados (o grupos terminales) están unidos en el extremo 3' de los oligonucleótidos. En ciertas formas de realización, los grupos conjugados se unen cerca del extremo 3' de los oligonucleótidos. En ciertas formas de realización, los grupos conjugados (o grupos terminales) están unidos en el extremo 5' de los oligonucleótidos. En ciertas formas de realización, los grupos conjugados están unidos cerca del extremo 5' de los oligonucleótidos.
[0307] Los ejemplos de grupos terminales incluyen, entre otros, grupos conjugados, grupos de protección, fracciones de fosfato, grupos protectores, nucleósidos abásicos, nucleósidos modificados o no modificados y dos o más nucleósidos que están modificados o no modificados independientemente.
[0309] A. Ciertos grupos conjugados
[0311] En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos están unidos covalentemente a uno o más grupos conjugados. En ciertas formas de realización, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del oligonucleótido unido, incluidas, entre otras, la farmacodinámica, la farmacocinética, la estabilidad, la unión, la absorción, la distribución tisular, la distribución celular, la captación celular, la carga y el aclaramiento. En ciertas formas de realización, los grupos conjugados imparten una nueva propiedad al oligonucleótido unido, por ejemplo, fluoróforos o grupos informadores que permiten la detección del oligonucleótido. Se han descrito previamente ciertos grupos conjugados y fracciones conjugadas, por ejemplo: fracción de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1993, 3, 2765­ 2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo, dodecan-diol o residuos undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; et al. Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o una fracción de palmitilo de ácido adamantano acético (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), una fracción de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol Exp. Ther., 1996, 277, 923-937), un grupo tocoferol (Nishina et al., Molecular Therapy Nucleic Acids, 2015, 4, e220; y Nishina et al., Molecular Therapy, 2008, 16, 734-740), o un grupo GalNAc (por ejemplo, WO2014/179620).
[0313] En ciertas formas de realización, los grupos conjugados pueden seleccionarse de cualquiera de un alquilo C22, alquilo C20, alquilo C16, alquilo C10, alquilo C21, alquilo C19, alquilo C18, alquilo C15, alquilo C14, alquilo C13, alquilo C12, alquilo C11, alquilo C9, alquilo C8, alquilo C7, alquilo C6, alquilo C5, alquenilo C22, alquenilo C20, alquenilo C16 , alquenilo C10, alquenilo C21, alquenilo C19, alquenilo C18, alquenilo C15, alquenilo C14, alquenilo C13, alquenilo C12, alquenilo C11, alquenilo C9, alquenilo C8, alquenilo C7, alquenilo C6 o alquenilo C5.
[0315] En ciertas formas de realización, los grupos conjugados pueden seleccionarse entre cualquiera de alquilo C22, alquilo C20, alquilo C16, alquilo C10, alquilo C21, alquilo C19, alquilo C18, alquilo C15, alquilo C14, alquilo C13, alquilo C12, alquilo C11, alquilo C9, alquilo C8, alquilo C7, alquilo C6 y alquilo C5, donde la cadena de alquilo tiene uno o más enlaces insaturados.
[0317] 1. Fracciones conjugadas
[0319] Las fracciones conjugadas incluyen, sin limitación, intercaladores, moléculas informadoras, poliaminas, poliamidas, péptidos, carbohidratos, restos vitamínicos, polietilenglicoles, tioéteres, poliéteres, colesteroles, tiocolesteroles, fracciones de ácido cólico, folato, lípidos, grupos lipofílicos, fosfolípidos, biotina, fenazina, fenantridina, antraquinona, adamantano, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas, fluoróforos y colorantes.
[0321] En ciertas formas de realización, una fracción conjugada comprende una sustancia farmacológica activa, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fen-bufeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triyodobenzoico, fingolimod, ácido flufenámico, ácido folínico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometicina, un barbitúrico, una cefalosporina, una sulfamida, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.
[0323] 2. Enlaces conjugados
[0325] Las fracciones conjugadas se unen a los oligonucleótidos a través de enlaces conjugados. En ciertos compuestos oligoméricos, el enlace conjugado es un enlace químico simple (es decir, la fracción conjugada está unida directamente a un oligonucleótido a través de un enlace simple). En ciertas formas de realización, el enlazador conjugado comprende una estructura de cadena, tal como una cadena de hidrocarbilo, o un oligómero de unidades repetidas tales como etilenglicol, nucleósidos o unidades de aminoácidos.
[0326] En ciertas formas de realización, un enlazador conjugado comprende uno o más grupos seleccionados entre alquilo, amino, oxo, amida, disulfuro, polietilenglicol, éter, tioéter e hidroxilamino. En ciertas de dichas formas de realización, el enlazador conjugado comprende grupos seleccionados entre grupos alquilo, amino, oxo, amida y éter. En ciertas formas de realización, el enlazador conjugado comprende grupos seleccionados entre grupos alquilo y amida. En ciertas formas de realización, el enlazador conjugado comprende grupos seleccionados entre grupos alquilo y éter. En ciertas formas de realización, el enlazador conjugado comprende al menos una fracción de fósforo. En ciertas formas de realización, el enlazador conjugado comprende al menos un grupo fosfato. En ciertas formas de realización, el enlazador conjugado incluye al menos un grupo de enlace neutro.
[0328] En ciertas formas de realización, los enlazadores conjugados, incluidos los enlazadores conjugados descritos anteriormente, son fracciones de enlace bifuncionales, por ejemplo, aquellas conocidas en la técnica por ser útiles para unir grupos conjugados a compuestos parentales, tales como los oligonucleótidos descritos en este documento. En general, una fracción de enlace bifuncional comprende al menos dos grupos funcionales. Se selecciona uno de los grupos funcionales para unirse a un sitio particular en un compuesto original y el otro se selecciona para unirse a un grupo conjugado. Los ejemplos de grupos funcionales utilizados en una fracción de enlace bifuncional incluyen, entre otros, electrófilos para reaccionar con grupos nucleófilos y nucleófilos para reaccionar con grupos electrófilos. En ciertas formas de realización, las fracciones de enlace bifuncionales comprenden uno o más grupos seleccionados entre amino, hidroxi, ácido carboxílico, tiol, alquilo, alquenilo y alquinilo.
[0330] Los ejemplos de enlaces conjugados incluyen, entre otros, pirrolidina, ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (ADO), 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) y ácido 6-aminohexanoico (AHEX o AHA). Otros enlaces conjugados incluyen, entre otros, alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C10 sustituido o no sustituido o alquinilo C2-C10 sustituido o no sustituido, en donde una lista no limitante de grupos sustituyentes preferidos incluye hidroxilo, amino, alcoxi, carboxi, bencilo, fenilo, nitro, tiol, tioalcoxi, halógeno, alquilo, arilo, alquenilo y alquinilo.
[0332] En ciertas formas de realización, los enlazadores conjugados comprenden de 1 a 10 nucleósidos enlazadores. En ciertas formas de realización, los enlazadores conjugados comprenden de 2 a 5 nucleósidos enlazadores. En ciertas formas de realización, los enlazadores conjugados comprenden exactamente 3 nucleósidos-enlazadores. En ciertas formas de realización, los enlazadores conjugados comprenden el motivo TCA. En ciertas formas de realización, dichos nucleósidos enlazadores son nucleósidos modificados. En ciertas formas de realización, dichos nucleósidos enlazadores comprenden una fracción de azúcar modificada. En ciertas formas de realización, los nucleósidos enlazadores no están modificados. En ciertas formas de realización, los nucleósidos enlazadores comprenden una base heterocíclica opcionalmente protegida seleccionada entre una purina, purina sustituida, pirimidina o pirimidina sustituida. En ciertas formas de realización, una fracción escindible es un nucleósido seleccionado entre uracilo, timina, citosina, 4-N-benzoilcitosina, 5-metilcitosina, 4-N-benzoil-5-metilcitosina, adenina, 6-N-benzoiladenina, guanina y 2-N isobutililguanina. Generalmente es deseable que los nucleósidos enlazadores se separen del compuesto oligomérico después de que llega al tejido objetivo. En consecuencia, los nucleósidos enlazadores suelen estar unidos entre sí y al resto del compuesto oligomérico a través de enlaces escindibles. En ciertas formas de realización, dichos enlaces escindibles son enlaces fosfodiéster.
[0334] En este documento, los nucleósidos enlazadores no se consideran parte del oligonucleótido. Por consiguiente, en formas de realización en las que un compuesto oligomérico comprende un oligonucleótido que consiste en un número o rango específico de nucleósidos enlazados y/o un porcentaje específico de complementariedad con un ácido nucleico de referencia y el compuesto oligomérico también comprende un grupo conjugado que comprende un enlazador conjugado que comprende nucleósidos enlazadores, esos nucleósidos enlazadores no se cuentan para la longitud del oligonucleótido y no se utilizan para determinar el porcentaje de complementariedad del oligonucleótido para el ácido nucleico de referencia. Por ejemplo, un compuesto oligomérico puede comprender (1) un oligonucleótido modificado que consiste en 8-30 nucleósidos y (2) un grupo conjugado que comprende 1-10 nucleósidos enlazadores que son contiguos a los nucleósidos del oligonucleótido modificado. El número total de nucleósidos unidos contiguos en dicho compuesto oligomérico es más de 30. Alternativamente, un compuesto oligomérico puede comprender un oligonucleótido modificado que consta de 8-30 nucleósidos y ningún grupo conjugado. El número total de nucleósidos unidos contiguos en dicho compuesto oligomérico no es más de 30. A menos que se indique lo contrario, los enlaces conjugados no comprenden más de 10 nucleósidos de enlace. En ciertas formas de realización, los enlazadores conjugados no comprenden más de 5 nucleósidos enlazadores. En ciertas formas de realización, los enlazadores conjugados no comprenden más de 3 nucleósidos enlazadores. En ciertas formas de realización, los enlazadores conjugados no comprenden más de 2 nucleósidos enlazadores. En ciertas formas de realización, los enlazadores conjugados no comprenden más de 1 enlazador-nucleósido.
[0336] [0134]En ciertas formas de realización, es deseable que un grupo conjugado se escinda del oligonucleótido. Por ejemplo, en determinadas circunstancias los compuestos oligoméricos que comprenden una porción conjugada particular son mejor absorbidos por un tipo particular de célula, pero una vez absorbido el compuesto oligomérico, es deseable que el grupo conjugado se escinda para liberar el oligonucleótido no conjugado o original. Por tanto, ciertos enlaces conjugados pueden comprender una o más fracciones escindibles. En ciertas formas de realización, una fracción escindible es un enlace escindible. En ciertas formas de realización, una fracción escindible es un grupo de átomos que comprende al menos un enlace escindible. En ciertas formas de realización, una fracción escindible comprende un grupo de átomos que tienen uno, dos, tres, cuatro o más de cuatro enlaces escindibles. En ciertas formas de realización, una fracción escindible se escinde selectivamente dentro de una célula o un compartimento subcelular, como un lisosoma. En ciertas formas de realización, una fracción escindible se escinde selectivamente mediante enzimas endógenas, como nucleasas.
[0338] En ciertas formas de realización, un enlace escindible se selecciona entre: una amida, un éster, un éter, uno o ambos ésteres de un fosfodiéster, un éster de fosfato, un carbamato o un disulfuro. En ciertas formas de realización, un enlace escindible es uno o ambos ésteres de un fosfodiéster. En ciertas formas de realización, una fracción escindible comprende un fosfato o fosfodiéster. En ciertas formas de realización, la fracción escindible es un enlace internucleósido de fosfato o fosfodiéster entre un oligonucleótido y una fracción conjugada o un grupo conjugado.
[0340] En ciertas formas de realización, una fracción escindible comprende o consiste en uno o más nucleósidos enlazadores. En ciertas de dichas formas de realización, los uno o más nucleósidos enlazadores están unidos entre sí y/o al resto del compuesto oligomérico a través de enlaces escindibles. En ciertas formas de realización, dichos enlaces escindibles son enlaces fosfodiéster no modificados. En ciertas formas de realización, una fracción escindible es un desoxinucleósido 2' que está unido al nucleósido 3' o 5'-terminal de un oligonucleótido mediante un enlace internucleósido de fosfodiéster y unido covalentemente al resto del enlazador conjugado o fracción conjugada mediante un enlace internucleósido de fosfato o fosforotioato. En ciertas de dichas formas de realización, la fracción escindible es 2'-desoxiadenosina.
[0342] 3.Fracciones dirigidas a células
[0344] En ciertas formas de realización, un grupo conjugado comprende una fracción dirigido a células. En ciertas formas de realización, un grupo conjugado tiene la fórmula general:
[0346] (Ligando—anclaje)n -(grupo ramificador) (fracción de enlace)j—(fracción de)k
[0348]
______ y enlace escindible
[0349]
[0351] Fracción orientada Enlace de conjugado
[0352] a células
[0354] donde n es de 1 a aproximadamente 3, m es 0 cuando n es 1, m es 1 cuando n es 2 o mayor, j es 1 o 0, y k es 1 o 0.
[0356] En ciertas formas de realización, n es 1, j es 1 y k es 0. En ciertas formas de realización, n es 1, j es 0 y k es 1. En ciertas formas de realización, n es 1, j es 1 y k es 1. En ciertas formas de realización, n es 2, j es 1 y k es 0. En ciertas formas de realización, n es 2, j es 0 y k es 1. En ciertas formas de realización, n es 2, j es 1 y k es 1. En ciertas formas de realización, n es 3, j es 1 y k es 0. En ciertas formas de realización, n es 3, j es 0 y k es 1. En ciertas formas de realización, n es 3, j es 1 y k es 1.
[0358] En ciertas formas de realización, los grupos conjugados comprenden fracciones dirigidas a células que tienen al menos un ligando anclado. En ciertas formas de realización, las fracciones dirigidas a las células comprenden dos ligandos unidos covalentemente a un grupo de ramificación. En ciertas formas de realización, las fracciones dirigidas a las células comprenden tres ligandos unidos covalentemente a un grupo de ramificación.
[0360] B. Ciertos grupos terminales
[0362] En ciertas formas de realización, los compuestos oligoméricos comprenden uno o más grupos terminales. En ciertas de dichas formas de realización, los compuestos oligoméricos comprenden un 5'-fosfato estabilizado. Los 5'-fosfatos estabilizados incluyen, entre otros, los 5'-fosfonatos, incluidos, entre otros, los 5'-vinilfosfonatos. En ciertas formas de realización, los grupos terminales comprenden uno o más nucleósidos abásicos y/o nucleósidos invertidos. En ciertas formas de realización, los grupos terminales comprenden uno o más nucleósidos unidos en 2'. En ciertas de dichas formas de realización, el nucleósido unido en 2' es un nucleósido abásico.
[0364] MI. Dúplex oligoméricos
[0366] Los compuestos oligoméricos descritos en este documento pueden comprender un oligonucleótido, que tiene una secuencia de nucleobases complementaria a la de un ácido nucleico objetivo. En ciertas formas de realización, un compuesto oligomérico se empareja con un segundo compuesto oligomérico para formar un dúplex oligomérico. Dichos dúplex oligoméricos comprenden un primer compuesto oligomérico que tiene una porción complementaria a un ácido nucleico objetivo y un segundo compuesto oligomérico que tiene una porción complementaria al primer compuesto oligomérico. En ciertas formas de realización, el primer compuesto oligomérico de un dúplex oligomérico comprende o consiste en (1) un oligonucleótido modificado o no modificado y opcionalmente un grupo conjugado y (2) un segundo oligonucleótido modificado o no modificado y opcionalmente un grupo conjugado. Cualquiera o ambos compuestos oligoméricos de un dúplex oligomérico pueden comprender un grupo conjugado. Los oligonucleótidos de cada compuesto oligomérico de un dúplex oligomérico pueden incluir nucleósidos salientes no complementarios.
[0367] IV. Actividad antisentido
[0369] Los compuestos oligoméricos y los dúplex oligoméricos pueden ser capaces de hibridarse con un ácido nucleico objetivo, dando como resultado al menos una actividad antisentido; dichos compuestos oligoméricos y dúplex oligoméricos son compuestos antisentido. En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido tienen actividad antisentido cuando reducen la cantidad o actividad de un ácido nucleico objetivo en un 25 % o más en el ensayo celular estándar. En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido afectan selectivamente a uno o más ácidos nucleicos objetivo. Dichos compuestos antisentido comprenden una secuencia de nucleobases que se hibrida con uno o más ácidos nucleicos objetivo, lo que resulta en una o más actividades antisentido deseadas y no se hibrida con uno o más ácidos nucleicos no objetivo o no se hibrida con uno o más ácidos nucleicos no objetivo de tal manera que resulte en una actividad antisentido no deseada significativa.
[0371] En ciertas actividades antisentido, la hibridación de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo da como resultado el reclutamiento de una proteína que escinde el ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, ciertos compuestos antisentido dan lugar a una escisión del ácido nucleico objetivo mediada por la ARNasa H. La ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. El ADN en dicho dúplex ARN:ADN no necesita ser ADN no modificado. Se describen aquí compuestos antisentido que son suficientemente "similares al ADN" para provocar la actividad de la ARNasa H. Se puede tolerar uno o más nucleósidos no similares al ADN en el espacio de un gapmer.
[0373] En ciertas actividades antisentido, un compuesto antisentido o una fracción de un compuesto antisentido se carga en un complejo de silenciamiento inducido por a Rn (RISC), lo que finalmente da como resultado la escisión del ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, ciertos compuestos antisentido dan lugar a la escisión del ácido nucleico diana por Argonaute. Los compuestos antisentido que se cargan en RISC son compuestos de ARNi. Los compuestos de a Rní pueden ser de doble cadena (RNApi) o de cadena simple (ssARN).
[0375] En ciertas formas de realización, la hibridación de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo no da como resultado el reclutamiento de una proteína que escinde ese ácido nucleico objetivo. En ciertas formas de realización, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico objetivo da como resultado la alteración del empalme del ácido nucleico objetivo. En ciertas formas de realización, la hibridación de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo da como resultado la inhibición de una interacción de unión entre el ácido nucleico objetivo y una proteína u otro ácido nucleico. En ciertas formas de realización, la hibridación de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo da como resultado la alteración de la traducción del ácido nucleico objetivo.
[0377] Las actividades antisentido pueden observarse directa o indirectamente. En ciertas formas de realización, la observación o detección de una actividad antisentido implica la observación o detección de un cambio en una cantidad de un ácido nucleico o proteína objetivo codificado por dicho ácido nucleico objetivo, un cambio en la proporción de variantes de empalme de un ácido nucleico o proteína y/o un cambio fenotípico en una célula o sujeto.
[0379] V. Ciertos ácidos nucleicos objetivo
[0381] Los compuestos oligoméricos pueden comprender o consistir en un oligonucleótido que comprende una porción que es complementaria a un ácido nucleico objetivo. En ciertas formas de realización, el ácido nucleico objetivo es una molécula de ARN endógena. En ciertas formas de realización, el ácido nucleico objetivo codifica una proteína. En ciertas de dichas formas de realización, el ácido nucleico objetivo se selecciona entre: un ARNm maduro y un pre-ARNm, incluidas regiones intrónicas, exónicas y no traducidas. En ciertas formas de realización, el ácido nucleico objetivo es un ARNm maduro. En ciertas formas de realización, el ácido nucleico objetivo es un pre-ARNm. La región objetivo puede estar completamente dentro de un intrón. La región objetivo puede abarcar una unión intrón/exón. La región objetivo puede estar al menos en un 50 % dentro de un intrón.
[0383] A.Complementariedad/desajustes con el ácido nucleico objetivo
[0385] Es posible introducir bases desparejadas sin eliminar la actividad. Por ejemplo, Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, marzo de 2001) demostró la capacidad de un oligonucleótido con 100 % de complementariedad con el ARNm bcl-2 y con 3 desajustes con el ARNm bcl-xL para reducir la expresión de bcl-2 y bcl-xLin vitroein vivo.Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoralin vivo.Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. (16:3341-3358, 1988) probaron una serie de oligonucleótidos en tándem de 14 nucleobases y oligonucleótidos de 28 y 42 nucleobases compuestos por la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos en tándem, respectivamente, para determinar su capacidad de detener la traducción de DHFR humana en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos de 14 nucleobases por sí solo fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos de 28 o 42 nucleobases.
[0387] [0149]Los oligonucleótidos pueden ser complementarios al ácido nucleico objetivo en toda la longitud del oligonucleótido. Los oligonucleótidos pueden ser 99 %, 95 %, 90 %, 85 % u 80 % complementarios al ácido nucleico objetivo. Los oligonucleótidos pueden ser al menos un 80 % complementarios al ácido nucleico objetivo a lo largo de toda la longitud del oligonucleótido y comprender una porción que es 100%o totalmente complementaria a un ácido nucleico objetivo. La porción de complementariedad completa puede tener una longitud de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 nucleobases.
[0389] Los oligonucleótidos pueden comprender una o más nucleobases desparejadas en relación con el ácido nucleico objetivo. La actividad antisentido contra el objetivo puede verse reducida por dicho desajuste, pero la actividad contra un no objetivo se reduce en una mayor cantidad. De esta forma se puede mejorar la selectividad del oligonucleótido. El desajuste puede ubicarse específicamente dentro de un oligonucleótido que tenga un motivo gapmer. El desajuste puede estar en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 desde el extremo 5' de la región de separación. El desajuste puede estar en la posición 1, 2, 3, 4, 5 o 6 desde el extremo 5' de la región del ala 5' o la región del ala 3'.
[0391] B. GFAP
[0393] En la invención, los compuestos oligoméricos comprenden o consisten en un oligonucleótido que es complementario a un ácido nucleico diana, como se define en las reivindicaciones, en donde el ácido nucleico diana es un ácido nucleico GFAP. El ácido nucleico GFAP puede tener la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1 (Número de acceso GENBANK). NM_002055.4), SEQ ID NO: 2 (Número de acceso GENBANK). NC_000017.11 truncado desde los nucleótidos 44903001 a 44919000), o SEQ ID NO: 3 (Número de acceso GENBANK). NM_001131019.2).
[0395] En ciertas formas de realización, poner en contacto una célula con un compuesto oligomérico complementario a cualquiera de las SEQ ID NO: 1-3 reduce la cantidad de ARN GFAP y, en ciertas formas de realización, reduce la cantidad de proteína GFAP. En la invención, el compuesto oligomérico consiste en un oligonucleótido modificado, tal como se define en las reivindicaciones. En ciertas formas de realización, poner en contacto una célula con un compuesto oligomérico, como se define en las reivindicaciones, complementario a cualquiera de las SEQ ID NO: 1-3 reduce la cantidad de ARN GFAP en una célula y, en ciertas formas de realización, reduce la cantidad de proteína GFAP en una célula. En ciertas formas de realización, la célula estáin vitro.En ciertas formas de realización, la célula está en un sujeto. En ciertas formas de realización, el compuesto oligomérico consiste en un oligonucleótido modificado. En ciertas formas de realización, poner en contacto una célula en un sujeto con un compuesto oligomérico, como se define en las reivindicaciones, complementario a cualquiera de las s Eq ID NO: 1-3 mejora uno o más síntomas o características distintivas de una leucodistrofia. En ciertas formas de realización, la leucodistrofia es AxD. En ciertas formas de realización, el síntoma o sello distintivo se selecciona entre retrasos motores, retrasos cognitivos, deterioro paroxístico, convulsiones, vómitos, dificultades para tragar, marcha atáxica, mioclono palatino, disfunción autonómica y presencia de inclusiones intraastrocíticas llamadas fibras de Rosenthal.
[0397] En ciertas formas de realización, un compuesto oligomérico, como se define en las reivindicaciones, complementario a cualquiera de las SEQ ID NO: 1-3 es capaz de reducir la cantidad detectable de ARN GFAPin vitroen al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % cuando se administra de acuerdo con el ensayo celular estándar. En ciertas formas de realización, un compuesto oligomérico, como se define en las reivindicaciones, complementario a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2915 o SEQ ID NO: 2916 es capaz de disminuir la cantidad de GFAPin vitroen al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % cuando se administra de acuerdo con el ensayoin vitroestándar. En ciertas formas de realización, un compuesto oligomérico, como se define en las reivindicaciones, complementario a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 es capaz de reducir la cantidad detectable de ARN GFAP en el LCR de un sujeto en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 %. En ciertas formas de realización, un compuesto oligomérico, como se define en las reivindicaciones, complementario a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 es capaz de disminuir la cantidad detectable de GFAP en el LCR de un sujeto en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 %.
[0399] C. Ciertos ácidos nucleicos diana en ciertos tejidos
[0401] En ciertas formas de realización, los compuestos oligoméricos comprenden o consisten en un oligonucleótido que comprende una porción que es complementaria a un ácido nucleico diana, como se define en las reivindicaciones, en donde el ácido nucleico diana se expresa en un tejido farmacológicamente relevante. En ciertas formas de realización, los tejidos farmacológicamente relevantes son las células y tejidos que comprenden el sistema nervioso central (SNC). Estos tejidos incluyen el cerebro y la médula espinal. En ciertas formas de realización, los tejidos farmacológicamente relevantes incluyen tractos de materia blanca a través del cerebro y la médula espinal; dichos tejidos incluyen el cuerpo calloso, la corteza, el cerebelo, el hipocampo, el tronco encefálico, el cuerpo estriado y la médula espinal. En ciertas formas de realización, los tejidos farmacológicamente relevantes incluyen la corteza, el cerebelo, el hipocampo, el tronco encefálico y la médula espinal. En ciertas formas de realización, las células farmacológicamente relevantes son oligodendrocitos y células progenitoras de oligodendrocitos 3. En ciertas formas de realización, las células farmacológicamente relevantes son células de Schwann o progenitores de células de Schwann.
[0403] VI. Ciertas composiciones farmacéuticas
[0404] Se proporcionan aquí composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más compuestos oligoméricos, tal como se define en las reivindicaciones. En ciertas formas de realización, uno o más compuestos oligoméricos consisten cada uno en un oligonucleótido modificado. En ciertas formas de realización, la composición farmacéutica comprende un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas formas de realización, una composición farmacéutica comprende o consiste en una solución salina estéril y uno o más compuestos oligoméricos. En ciertas formas de realización, la solución salina estéril es solución salina de grado farmacéutico. En ciertas formas de realización, una composición farmacéutica comprende o consiste en uno o más compuestos oligoméricos y agua estéril. En ciertas formas de realización, el agua esterilizada es agua de calidad farmacéutica. En ciertas formas de realización, una composición farmacéutica comprende o consiste en uno o más compuestos oligoméricos y solución salina tamponada con fosfato (PBS). En ciertas formas de realización, el PBS estéril es PBS de grado farmacéutico. En ciertas formas de realización, una composición farmacéutica comprende o consiste en uno o más compuestos oligoméricos y líquido cefalorraquídeo artificial ("LCR artificial" o "LCRa"). En ciertas formas de realización, el líquido cefalorraquídeo artificial es de grado farmacéutico.
[0406] En ciertas formas de realización, una composición farmacéutica comprende un oligonucleótido modificado y líquido cefalorraquídeo artificial. En ciertas formas de realización, una composición farmacéutica consiste en un oligonucleótido modificado y líquido cefalorraquídeo artificial. En ciertas formas de realización, una composición farmacéutica consiste esencialmente en un oligonucleótido modificado y líquido cefalorraquídeo artificial. En ciertas formas de realización, el líquido cefalorraquídeo artificial es de grado farmacéutico.
[0408] En ciertas formas de realización, las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más compuestos oligoméricos y uno o más excipientes. En ciertas formas de realización, los excipientes se seleccionan entre agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilasa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa y polivinilpirrolidona.
[0410] En ciertas formas de realización, los compuestos oligoméricos pueden mezclarse con sustancias activas y/o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de una serie de criterios, entre los que se incluyen, entre otros, la vía de administración, la extensión de la enfermedad o la dosis a administrar.
[0412] En ciertas formas de realización, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto oligomérico abarcan cualquier sal farmacéuticamente aceptable del compuesto oligomérico, ésteres del compuesto oligomérico o sales de dichos ésteres. En ciertas formas de realización, las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos oligoméricos que comprenden uno o más oligonucleótidos, tras la administración a un sujeto, incluido un ser humano, son capaces de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. En consecuencia, por ejemplo, la divulgación también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos oligoméricos, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio. En ciertas formas de realización, los productos comprenden uno o más grupos conjugados unidos a un oligonucleótido, en donde el grupo conjugado es escindido por nucleasas endógenas dentro del cuerpo.
[0414] Las fracciones lipídicas se han utilizado en terapias con ácidos nucleicos para su uso en una variedad de métodos. En ciertos usos de estos métodos, el ácido nucleico, tal como un compuesto oligomérico, se introduce en liposomas o lipoplejos preformados hechos de mezclas de lípidos catiónicos y lípidos neutros. En ciertos usos de los métodos, se forman complejos de ADN con lípidos mono- o poli-catiónicos sin la presencia de un lípido neutro. En ciertas formas de realización, se selecciona una fracción lipídica para aumentar la distribución de un agente farmacéutico a una célula o tejido en particular. En ciertas formas de realización, se selecciona una fracción lipídica para aumentar la distribución de un agente farmacéutico al tejido graso. En ciertas formas de realización, se selecciona una fracción lipídica para aumentar la distribución de un agente farmacéutico al tejido muscular.
[0416] En ciertas formas de realización, las composiciones farmacéuticas comprenden un sistema de administración. Los ejemplos de sistemas de administración incluyen, entre otros, liposomas y emulsiones. Ciertos sistemas de administración son útiles para preparar ciertas composiciones farmacéuticas, incluidas aquellas que comprenden compuestos hidrófobos. En ciertas formas de realización, se utilizan ciertos disolventes orgánicos como el dimetilsulfóxido.
[0418] En ciertas formas de realización, las composiciones farmacéuticas comprenden una o más moléculas de administración específicas de tejido diseñadas para administrar uno o más agentes farmacéuticos que comprenden un compuesto oligomérico descrito en este documento a tejidos o tipos de células específicos. Por ejemplo, en ciertas formas de realización, las composiciones farmacéuticas incluyen liposomas recubiertos con un anticuerpo específico de tejido.
[0420] [0163]En ciertas formas de realización, las composiciones farmacéuticas comprenden un sistema de codisolvente. Algunos de dichos sistemas codisolventes comprenden, por ejemplo, alcohol bencílico, un tensioactivo no polar, un polímero orgánico miscible en agua y una fase acuosa. En ciertas formas de realización, dichos sistemas codisolventes se utilizan para compuestos hidrófobos. Un ejemplo no limitativo de dicho sistema codisolvente es el sistema codisolvente VPD, que es una solución de etanol absoluto que comprende 3 % p/v de alcohol bencílico, 8 % p/v del surfactante no polar Polysorbate 80™ y 65 % p/v de polietilenglicol 300. Las proporciones de dichos sistemas codisolventes pueden variarse considerablemente sin alterar significativamente sus características de solubilidad y toxicidad. Además, la identidad de los componentes codisolventes puede variar: por ejemplo, se pueden utilizar otros surfactantes en lugar de Polisorbato 80™; se puede variar el tamaño de la fracción de polietilenglicol; otros polímeros biocompatibles pueden reemplazar al polietilenglicol, por ejemplo, polivinilpirrolidona; y otros azúcares o polisacáridos pueden sustituir a la dextrosa.
[0422] En ciertas formas de realización, se preparan composiciones farmacéuticas para administración oral. En ciertas formas de realización, se preparan composiciones farmacéuticas para administración bucal. En ciertas formas de realización, se prepara una composición farmacéutica para administración mediante inyección (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intratecal (IT), intracerebroventricular (ICV), intraneural, perineural, etc.). En algunas de dichas formas de realización, una composición farmacéutica comprende un vehículo y está formulada en una solución acuosa, como agua o tampones fisiológicamente compatibles como la solución de Hanks, la solución de Ringer o un tampón salino fisiológico. En ciertas formas de realización, se incluyen otros ingredientes (por ejemplo, ingredientes que ayudan en la solubilidad o sirven como conservantes). En ciertas formas de realización, las suspensiones inyectables se preparan utilizando vehículos líquidos, agentes de suspensión y similares apropiados. Ciertas composiciones farmacéuticas inyectables se presentan en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis. Ciertas composiciones farmacéuticas para inyección son suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Ciertos disolventes adecuados para su uso en composiciones farmacéuticas para inyección incluyen, pero no se limitan a, disolventes lipofílicos y aceites grasos, tales como aceite de sésamo, ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, y liposomas.
[0424] En determinadas condiciones, ciertos compuestos descritos en este documento actúan como ácidos. Aunque dichos compuestos pueden dibujarse o describirse en forma protonada (ácido libre) o ionizada y en asociación con un catión (sal), las soluciones acuosas de dichos compuestos existen en equilibrio entre dichas formas. Por ejemplo, un enlace fosfato de un oligonucleótido en solución acuosa existe en equilibrio entre formas de ácido libre, anión y sal. A menos que se indique lo contrario, los compuestos descritos en este documento incluyen todas esas formas. Además, ciertos oligonucleótidos tienen varios enlaces de este tipo, cada uno de los cuales está en equilibrio. Por tanto, los oligonucleótidos en solución existen en un conjunto de formas en múltiples posiciones, todas en equilibrio. El término "oligonucleótido" pretende incluir todas esas formas. Las estructuras dibujadas representan necesariamente una única forma. No obstante, a menos que se indique lo contrario, dichos dibujos también pretenden incluir las formas correspondientes. En este documento, una estructura que representa el ácido libre de un compuesto seguida del término "o sal del mismo" incluye expresamente todas aquellas formas que pueden estar total o parcialmente protonadas/desprotonadas/inasociadas con un catión. En ciertos casos, se identifica uno o más cationes específicos.
[0426] En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados o compuestos oligoméricos están en solución acuosa con sodio. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados o compuestos oligoméricos están en solución acuosa con potasio. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados o compuestos oligoméricos están en PBS. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados o compuestos oligoméricos están en agua. En ciertas formas de realización de este tipo, el pH de la solución se ajusta con NaOH y/o HCl para lograr el pH deseado.
[0428] En este artículo se describen ciertas dosis específicas. Una dosis puede tener la forma de una unidad de dosificación. Para mayor claridad, una dosis (o unidad de dosis) de un oligonucleótido modificado o un compuesto oligomérico en miligramos indica la masa de la forma de ácido libre del oligonucleótido modificado o del compuesto oligomérico. Como se describió anteriormente, en solución acuosa, el ácido libre está en equilibrio con las formas aniónicas y salinas. Sin embargo, a los efectos del cálculo de la dosis, se supone que el oligonucleótido modificado o el compuesto oligomérico existe como un ácido libre, anhidro y libre de solventes y acetato de sodio. Por ejemplo, cuando un oligonucleótido modificado o un compuesto oligomérico está en una solución que comprende sodio (por ejemplo, solución salina), el oligonucleótido modificado o el compuesto oligomérico puede estar parcial o totalmente desprotonado y en asociación con iones Na+. Sin embargo, la masa de los protones se cuenta para el peso de la dosis, y la masa de los iones Na+ no se cuenta para el peso de la dosis. Así, por ejemplo, una dosis, o unidad de dosificación, de 10 mg del Compuesto N.° 1362458, equivale al número de moléculas completamente protonadas que pesan 10 mg. Esto equivaldría a 10,47 mg de Compuesto N.° anhidro, sodiado, libre de disolventes y acetato de sodio. 1362458. Cuando un compuesto oligomérico comprende un grupo conjugado, la masa del grupo conjugado se incluye en el cálculo de la dosis de dicho compuesto oligomérico. Si el grupo conjugado también tiene un ácido, también se supone que el grupo conjugado está completamente protonado a efectos de calcular la dosis.
[0430] VII. Ciertas composiciones
[0432] 1. Compuesto N.° 1166998
[0434] [0168]En ciertas formas de realización, el Compuesto N.° 1166998 se caracteriza como un gapmer 6-10-4 MOE que tiene una secuencia (de 5' a 3') de CAGTATTACCTCTACTAGTC (SEQ ID NO: 20), en donde cada uno de los nucleósidos 1-6 y 17-20 (de 5' a 3') son nucleósidos 2'-p-D-MOE y cada uno de los nucleósidos 7-16 son 2'-p-D-desoxinucleósidos, en donde los enlaces internucleósidos entre los nucleósidos 2 a 3, 3 a 4, 4 a 5, 5 a 6, 6 a 7 y 17 a 18 son enlaces internucleósidos fosfodiéster y los enlaces intemucleósidos entre los nucleósidos 1 a 2, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 16 a 17, 18 a 19 y 19 a 20 son enlaces intemucleósidos de fosforotioato, y en donde cada citosina es una citosina 5-metilo.
[0435] En ciertas formas de realización, el Compuesto N.° 1166998 se representa mediante la siguiente notación química:<m>C<es>A<eo>G<eo>T<eo>A<eo>T<eo>T<ds>A<dsm>C<dsm>C<ds>T<dsm>C<ds>T<ds>A<dsm>C<ds>T<ds>A<eo>G<es>T<esmCe>(SEQ ID NO: 20), en donde:
[0436] A = una nucleobase de adenina,
[0437] <m>C = una nucleobase de 5-metil citosina,
[0438] G = una nucleobase de guanina,
[0439] T = una nucleobase de timina,
[0440] e = una fracción de azúcar 2'-p-D-MOE,
[0441] d = una fracción de azúcar 2'-p-D-desoxirribosilo,
[0442] s = un enlace internucleósido de fosforotioato y
[0443] o = un enlace internucleósido de fosfodiéster.
[0444] En ciertas formas de realización, el Compuesto N.° 1166998 está representado por la siguiente estructura química:
[0447]
[0449] Estructura 1. Compuesto N.° 1166998
[0450] En ciertas formas de realización, la sal de sodio del Compuesto N.° 1166998 está representado por la siguiente estructura química:
[0452]
[0454] 2. Compuesto N.° 1166985
[0455] Compuesto N.° 1166985 puede caracterizarse como un gapmer MOE 6-10-4 que tiene una secuencia (de 5' a 3') de CACATTCACTAATATTTAAC (SEQ ID NO: 21), donde cada uno de los nucleósidos 1-6 y 17-20 (de 5' a 3') son nucleósidos 2'-p-D-MOE y cada uno de los nucleósidos 7-16 son 2'-p-D-desoxinucleósidos, donde los enlaces internucleósidos entre los nucleósidos 2 a 3, 3 a 4, 4 a 5, 5 a 6, 6 a 7 y 17 a 18 son enlaces internucleósidos fosfodiéster y los enlaces internucleósidos entre los nucleósidos 1 a 2, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 16 a 17, 18 a 19 y 19 a 20 son enlaces internucleósidos de fosforotioato, y en donde cada citosina es una citosina 5-metilo.
[0456] Compuesto N.° 1166985 puede representarse mediante la siguiente notación química: mCesAeomCeoAeoTeoTeomCdsAdsmCdsTdsAdsAdsTdsAdsTdsTdsTeoAes,AesmCe (SEQ ID NO: 21), en donde:
[0457] A = una nucleobase de adenina,
[0458] mC = una nucleobase de 5-metil citosina,
[0459] G = una nucleobase de guanina,
[0460] T = una nucleobase de timina,
[0461] e = una fracción de azúcar 2'-p-D-MOE,
[0462] d = una fracción de azúcar 2'-p-D-desoxirribosilo,
[0463] s = un enlace internucleósido de fosforotioato y
[0464] o = un enlace internucleósido de fosfodiéster.
[0465] El Compuesto N.° 1166985 puede estar representado por la siguiente estructura química:
[0468]
[0471] (SEQ ID NO: 21).
[0472] Estructura 3. Compuesto N.° 1166985
[0473] La sal de sodio del Compuesto N.° 1166985 puede estar representado por la siguiente estructura química:
[0475] (SEQ ID NO: 21).
[0476] Estructura 4. La sal de sodio del Compuesto N.° 1166985
[0477] 3. Compuesto N.° 1166954
[0478] El Compuesto N.° 1166954 puede caracterizarse como un gapmer MOE 5-10-5 que tiene una secuencia (de 5' a 3') de CCAGTGTCTTCACTTTGCTC (SEQ ID NO: 825), donde cada uno de los nucleósidos 1-5 y 16-20 (de 5' a 3') son nucleósidos 2'-p-D-MOE y cada uno de los nucleósidos 6-15 son 2'-p-D-desoxinucleósidos, donde los enlaces internucleósidos entre los nucleósidos 2 a 3, 3 a 4, 4 a 5, 5 a 6, 16 a 17 y 17 a 18 son enlaces internucleósidos fosfodiéster y los enlaces internucleósidos entre los nucleósidos 1 a 2, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 18 a 19 y 19 a 20 son enlaces internucleósidos de fosforotioato, y en donde cada citosina es una citosina 5-metilo.
[0479] El Compuesto N.° 1166954 puede representarse mediante la siguiente notación química:<m>C<esm>C<eo>A<eo>G<eo>T<eo>G<ds>T<dsm>C<ds>T<ds>T<dsm>C<ds>A<dsm>C<ds>T<ds>T<ds>T<eo>G<eom>C<es>T<esmCe>(SEQ ID NO: 825), en donde:
[0480] A = una nucleobase de adenina,
[0481] <m>C = una nucleobase de 5-metil citosina,
[0482] G = una nucleobase de guanina,
[0483] T = una nucleobase de timina,
[0484] e = una fracción de azúcar 2'-p-D-MOE,
[0485] d = una fracción de azúcar 2'-p-D-desoxirribosilo,
[0486] s = un enlace internucleósido de fosforotioato y
[0487] o = un enlace intemucleósido de fosfodiéster.
[0488] El Compuesto N.° 1166954 puede estar representado por la siguiente estructura química:
[0491]
[0493] (SEQ ID NO: 825)
[0494] Estructura 5: Compuesto N.° 1166954
[0495] La sal de sodio del Compuesto N.° 1166954 puede estar representado por la siguiente estructura química:
[0497] Estructura 6: La sal de sodio del Compuesto N.° 1166954
[0498] 4. Compuesto N.° 1072813
[0499] El Compuesto N.° 1072813 puede caracterizarse como un gapmer MOE 5-10-5 que tiene una secuencia (de 5' a 3') de GCAACAGTTTCCATAACAAC (SEQ ID NO: 1499), en donde cada uno de los nucleósidos 1-5 y 16-20 (de 5' a 3') son nucleósidos 2'-p-D-MOE y cada uno de los nucleósidos 6-15 son 2'-p-D-desoxinucleósidos, en donde los enlaces internucleósidos entre los nucleósidos 2 a 3, 3 a 4, 4 a 5, 16 a 17 y 17 a 18 son enlaces internucleósidos fosfodiéster y los enlaces internucleósidos entre los nucleósidos 1 a 2, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 18 a 19 y 19 a 20 son enlaces internucleósidos de fosforotioato, y en donde cada citosina es una citosina 5-metilo.
[0500] El Compuesto N.° 1072813 puede representarse mediante la siguiente notación química: GesmCeoAeoAeomCesAdsGdsTdsTdsTdsmCdsmCdsAdsTdsAdsAeomCeoAesAesmCe (SEQ ID NO: 1499), en donde:
[0501] A = una nucleobase de adenina,
[0502] mC = una nucleobase de 5-metil citosina,
[0503] G = una nucleobase de guanina,
[0504] T = una nucleobase de timina,
[0505] e = una fracción de azúcar 2'-p-D-MOE,
[0506] d = una fracción de azúcar 2'-p-D-desoxirribosilo,
[0507] s = un enlace internucleósido de fosforotioato y
[0508] o = un enlace internucleósido de fosfodiéster.
[0509] El Compuesto N.° 1072813 puede estar representado por la siguiente estructura química:
[0510]
[0511] Estructura 7: Compuesto N.° 1072813
[0512] La sal de sodio del Compuesto N.° 1072813 puede representarse mediante la siguiente estructura química:
[0513] Estructura 8: La sal de sodio del Compuesto N.° 1072813
[0514] 5. Compuesto N.° 1199983
[0515] El Compuesto N.° 1199983 puede caracterizarse como un gapmer MOE 5-10-5 que tiene una secuencia (de 5' a 3') de TGGTCCTAAATATTCTAGTC (SEQ ID NO: 2170), donde cada uno de los nucleósidos 1-5 y 16-20 (de 5' a 3') son nucleósidos 2'-p-D-MOE y cada uno de los nucleósidos 6-15 son 2'-p-D-desoxinucleósidos, donde los enlaces internucleósidos entre los nucleósidos 2 a 3, 3 a 4, 4 a 5, 5 a 6, 16 a 17 y 17 a 18 son enlaces internucleósidos fosfodiéster y los enlaces internucleósidos entre los nucleósidos 1 a 2, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 18 a 19 y 19 a 20 son enlaces internucleósidos de fosforotioato, y en donde cada citosina es una citosina 5-metilo.
[0516] El Compuesto N.° 1199983 puede representarse mediante la siguiente notación química: TesGeoGeoTeomCeomCdsTdsAdsAdsAdsTdsAdsTdsTdsmCdsTeoAeoGesTesmCe (SEQ ID NO: 2170), en donde:
[0517] A = una nucleobase de adenina,
[0518] mC = una nucleobase de 5-metil citosina,
[0519] G = una nucleobase de guanina,
[0520] T = una nucleobase de timina,
[0521] e = una fracción de azúcar 2'-p-D-MOE,
[0522] d = una fracción de azúcar 2'-p-D-desoxirribosilo,
[0523] s = un enlace internucleósido de fosforotioato y
[0524] o = un enlace internucleósido de fosfodiéster.
[0525] El Compuesto N.° 1199983 puede estar representado por la siguiente estructura química:
[0526]
[0528] (SEQ ID NO: 2170).
[0529] Estructura 9: Compuesto N.° 1199983
[0530] La sal de sodio del Compuesto N.° 1199983 puede representarse mediante la siguiente estructura química:
[0532] Estructura 10: La sal de sodio del Compuesto N.° 1199983
[0533] 6. Compuesto N.° 1166721
[0534] El Compuesto N.° 1166721 puede caracterizarse como un gapmer MOE 5-8-5 que tiene una secuencia (de 5' a 3') de TGGTCCTAAATATTCTAGTC (SEQ ID NO: 2818), donde cada uno de los nucleósidos 1-5 y 14-18 (de 5' a 3') son nucleósidos 2'-p-D-MOE y cada uno de los nucleósidos 6-15 son 2'-p-D-desoxinucleósidos, donde los enlaces internucleósidos entre los nucleósidos 2 a 3, 3 a 4, 4 a 5, 14 a 15 y 15 a 16 son enlaces internucleósidos fosfodiéster y los enlaces internucleósidos entre los nucleósidos 1 a 2, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 16 a17 y 17 a 18 son enlaces internucleósidos de fosforotioato, y en donde cada citosina es una citosina 5-metilo.
[0535] El Compuesto N.° 1166721 puede representarse mediante la siguiente notación química: T<es>G<eo>G<eom>C<eo>A<es>G<ds>T<ds>A<ds>T<ds>T<ds>A<dsm>C<dsm>C<ds>T<eom>C<eo>T<es>A<esm>C<e>
[0536] (SEQ ID NO: 2818), en donde:
[0537] A = una nucleobase de adenina,
[0538] <m>C = una nucleobase de 5-metil citosina,
[0539] G = una nucleobase de guanina,
[0540] T = una nucleobase de timina,
[0541] e = una fracción de azúcar 2'-p-D-MOE,
[0542] d = una fracción de azúcar 2'-p-D-desoxirribosilo,
[0543] s = un enlace internucleósido de fosforotioato y
[0544] o = un enlace internucleósido de fosfodiéster.
[0545] El Compuesto N.° 1166721 puede estar representado por la siguiente estructura química:
[0548]
[0550] (SEQ ID NO: 2818).
[0551] Estructura 11: Compuesto N.° 1166721
[0552] La sal de sodio del Compuesto N.° 1166721 puede representarse mediante la siguiente estructura química:
[0553]
[0555] (SEQ ID NO: 2818)
[0556] Estructura 12: La sal de sodio del Compuesto N.° 1166721
[0557] VIH. Ciertas regiones de puntos calientes
[0558] Las nucleobases en los rangos especificados a continuación comprenden una región de punto caliente del ácido nucleico GFAP. Los oligonucleótidos modificados que son complementarios a una región de punto caliente del ácido nucleico GFAP pueden lograr una reducción promedio de más del 50 % del ARN GFAPin vitroen el ensayo celular estándar. Los oligonucleótidos modificados que son complementarios a una región de punto caliente del ácido nucleico GFAP pueden lograr una reducción promedio del 75 % o más del ARN GFAPin vivoen el ensayoin vivoestándar.
[0559] 1. Nucleobases 9324-9348 de SEQ ID NO: 2
[0560] Las nucleobases 9324-9348 de SEQ ID NO: 2 comprenden una región de punto caliente. Los oligonucleótidos modificados pueden ser complementarios a una fracción de las nucleobases 9324-9348 de SEQ ID NO: 2. En ciertas formas de realización, los oligonucleótidos modificados tienen una longitud de 20 nucleobases. Los oligonucleótidos modificados pueden tener una longitud de 18 nucleobases. Los oligonucleótidos modificados pueden ser gapmers. Los gapmers pueden ser gapmers MOE. Los enlaces internucleósidos de los oligonucleótidos modificados pueden ser enlaces internucleósidos fosforotioato y enlaces internucleósidos fosfodiéster. Los enlaces internucleósidos fosfodiéster ("o") y fosforotioato ("s") pueden estar dispuestos en orden de 5' a 3': Los nucleótidos modificados pueden tener un motivo de enlace internucleósido de sooosssssssssssooss, sooooossssssssssoss, soooossssssssssooss, sooossssssssssooss, o sooosssssssssssoooss, donde cada "s" representa un enlace internucleósido fosforotioato y cada "o" representa un enlace internucleósido fosfodiéster.
[0561] Las secuencias de nucleobases de las SEQ ID Nos: 21, 1177, 2321, 2398, 2808-2809, 2840-2842 y 2853-2854 son complementarias a una fracción de las nucleobases 9324-9348 de la SEQ ID NO: 2.
[0562] La secuencia de nucleobases de los compuestos N.°: 1048181-1048182, 1104071-1104072, 1166746-1166748, 1166803-1166808, 1166894-1166899, 1166985-1166990, 1174016 y 1174018 son complementarias a una fracción de las nucleobases 9324-9348 de la SEQ ID NO: 2.
[0563] Los oligonucleótidos modificados complementarios a una fracción de las nucleobases 9324-9348 de SEQ ID NO: 2 pueden lograr al menos un 7 % de reducción del ARN GFAPin vitroen el ensayo celular estándar. Los oligonucleótidos modificados complementarios a una fracción de las nucleobases 9324-9348 de<s>E<q>ID NO: 2 pueden lograr una reducción promedio del 42 % del ARN GFAPin vitroen el ensayo celular estándar. Los oligonucleótidos modificados complementarios a una fracción de las nucleobases 9324-9348 de SEQ ID NO: 2 pueden lograr una reducción promedio del 81 % del ARN GFAPin vivoen el ensayoin vivoestándar.
[0564] 2. Nucleobases 9459-9480 de SEQ ID NO: 2
[0565] Las nucleobases 9459-9480 de SEQ ID NO: 2 comprenden una región de punto caliente. Los oligonucleótidos modificados pueden ser complementarios a una fracción de las nucleobases 9459-9480 de SEQ ID NO: 2. Los oligonucleótidos modificados pueden tener una longitud de 20 nucleobases. Los oligonucleótidos modificados pueden tener una longitud de 18 nucleobases. Los oligonucleótidos modificados pueden ser gapmers. Los gapmers pueden ser gapmers MOE. Los enlaces internucleósidos de los oligonucleótidos modificados pueden ser enlaces internucleósidos fosforotioato y enlaces internucleósidos fosfodiéster. Los enlaces internucleósidos fosfodiéster ("o") y fosforotioato ("s") pueden estar dispuestos en orden de 5' a 3': Los nucleótidos modificados pueden tener un motivo de enlace internucleósido de sooosssssssssssooss o soooosssssssssssooss, donde cada "s" representa un enlace internucleósido fosforotioato y cada "o" representa un enlace internucleósido fosfodiéster.
[0566] Las secuencias de nucleobases de las SEQ ID Nos: 555, 2093, 2170 y 2813 son complementarias a una fracción de las nucleobases 9459-9480 de la SEQ ID NO: 2.
[0567] La secuencia de nucleobases de los compuestos N.°: 1048190, 1104116-1104117 y 1199982-1199984 son complementarias a una fracción de las nucleobases 9459-9480 de la SEQ ID NO: 2.
[0568] Los oligonucleótidos modificados complementarios a una fracción de las nucleobases 9459-9480 de SEQ ID NO: 2 pueden lograr una reducción de al menos el 26 % del ARN GFAPin vitroen el ensayo celular estándar. Los oligonucleótidos modificados complementarios a una fracción de las nucleobases 9459-9480 de SEQ ID NO: 2 pueden lograr una reducción promedio del 42 % del ARN GFAPin vitroen el ensayo celular estándar. Los oligonucleótidos modificados complementarios a una fracción de las nucleobases 9459-9480 de SEQ ID NO: 2 pueden lograr una reducción promedio del 91 % del ARN GFAPin vivoen el ensayoin vivoestándar.
[0569] 3. Nucleobases 9530-9580 de SEQ ID NO: 2
[0570] Las nucleobases 9530-9580 de SEQ ID NO: 2 comprenden una región de punto caliente. Los oligonucleótidos modificados pueden ser complementarios a una fracción de las nucleobases 9530-9580 de SEQ ID NO: 2. Los oligonucleótidos modificados pueden tener una longitud de 20 nucleobases. Los oligonucleótidos modificados pueden tener una longitud de 18 nucleobases. Los oligonucleótidos modificados pueden ser gapmers. Los gapmers pueden ser gapmers MOE. Los enlaces internucleósidos de los oligonucleótidos modificados pueden ser enlaces internucleósidos fosforotioato y enlaces internucleósidos fosfodiéster. Los enlaces internucleósidos fosfodiéster ("o") y fosforotioato ("s") pueden estar dispuestos en orden de 5' a 3': Los nucleótidos modificados pueden tener un motivo de enlace internucleósido de sooosssssssssssooss, sooooossssssssssoss, soooossssssssssooss, sooossssssssssooss, o sooosssssssssssoooss, donde cada "s" representa un enlace internucleósido fosforotioato y cada "o" representa un enlace internucleósido fosfodiéster.
[0571] Las secuencias de nucleobases de los SEQ ID Nos.: 20, 88, 166, 1331, 1408, 1485, 1637, 1713, 1714, 1789, 1790, 1637, 1638, 1865, 1866, 1941, 2018, 2095, 2172, 2249, 2326, 2403, 2480, 2557, 2633, 2709, 2785, 2816-2818, 2859, 2861 y 2886-2887 son complementarias a una fracción de las nucleobases 9530-9580 del SEQ ID NO: 2.
[0572] La secuencia de nucleobases de los compuestos N.°: 1048200-1048201, 1073062-1073064, 1104142-1104161, 1166719-1166721, 1166816-1166823, 1166826, 1166907-1166920, 1166998-1167011, 1174024, 1174026 y 1174029­ 1174030 son complementarias a una fracción de las nucleobases 9530-9580 de la SEQ ID NO: 2.
[0573] Los oligonucleótidos modificados complementarios a una fracción de las nucleobases 9530-9580 de SEQ ID NO: 2 pueden lograr al menos un 27 % de reducción del ARN GFAPin vitroen el ensayo celular estándar. Los oligonucleótidos modificados complementarios a una fracción de las nucleobases 9530-9580 de<s>E<q>ID NO: 2 pueden lograr una reducción promedio del 52 % del ARN GFAPin vitroen el ensayo celular estándar. Los oligonucleótidos modificados complementarios a una fracción de las nucleobases 9530-9580 de SEQ ID NO: 2 pueden lograr una reducción promedio del 82 % del ARN GFAPin vivoen el ensayoin vivoestándar.
[0574] 4. Nucleobases 12006-12038 de SEQ ID NO: 2
[0575] Las nucleobases 12006-12038 de SEQ ID NO: 2 comprenden una región de punto caliente. Los oligonucleótidos modificados pueden ser complementarios a una fracción de las nucleobases 12006-12038 de SEQ ID NO: 2. Los oligonucleótidos modificados pueden tener una longitud de 20 nucleobases. Los oligonucleótidos modificados pueden tener una longitud de 18 nucleobases. Los oligonucleótidos modificados pueden ser gapmers. Los gapmers pueden ser gapmers MOE. Los enlaces internucleósidos de los oligonucleótidos modificados pueden ser enlaces internucleósidos fosforotioato y enlaces internucleósidos fosfodiéster. Los enlaces internucleósidos fosfodiéster ("o") y fosforotioato ("s") pueden estar dispuestos en orden de 5' a 3': Los nucleótidos modificados pueden tener un motivo de enlace internucleósido de sooosssssssssssooss, donde cada "s" representa un enlace internucleósido fosforotioato y cada "o" representa un enlace internucleósido fosfodiéster.
[0577] Las secuencias de nucleobases de las SEQ ID Nos.: 815, 893, 971, 1049, 1269, 1270, 1346, 1423, 1499, 1500, 1660, 1736, 2655 y 2731 son complementarias a una fracción de las nucleobases 12006-12038 de la SEQ ID NO: 2.
[0579] La secuencia de nucleobases de los compuestos N.°: 1047362-1047365, 1072813-1072818 y 1103276-1103279 son complementarias a una fracción de las nucleobases 12006-12038 de la SEQ ID NO: 2.
[0581] Los oligonucleótidos modificados complementarios a una fracción de las nucleobases 12006-12038 de SEQ ID NO: 2 pueden lograr una reducción de al menos el 29 % del ARN GFAPin vitroen el ensayo celular estándar. Los oligonucleótidos modificados complementarios a una fracción de las nucleobases 12006-12038 de SEQ ID NO: 2 pueden lograr una reducción promedio del 52 % del ARN 3GFAPin vitroen el ensayo celular estándar. Los oligonucleótidos modificados complementarios a una fracción de las nucleobases 12006-12038 de SEQ ID NO: 2 pueden lograr una reducción promedio del 82 % del ARN GFAPin vivoen el ensayoin vivoestándar.
[0583] 5. Nucleobases 13038-13058 de SEQ ID NO: 2
[0585] Las nucleobases 13038-13058 de SEQ ID NO: 2 comprenden una región de punto caliente. Los oligonucleótidos modificados pueden ser complementarios a una fracción de las nucleobases 13038-13058 de SEQ ID NO: 2. Los oligonucleótidos modificados pueden tener una longitud de 20 nucleobases. Los oligonucleótidos modificados pueden tener una longitud de 18 nucleobases. Los oligonucleótidos modificados pueden ser gapmers. Los gapmers pueden ser gapmers MOE. Los enlaces internucleósidos de los oligonucleótidos modificados pueden ser enlaces internucleósidos fosforotioato y enlaces internucleósidos fosfodiéster. Los enlaces internucleósidos fosfodiéster ("o") y fosforotioato ("s") pueden estar dispuestos en orden de 5' a 3': Los nucleótidos modificados pueden tener un motivo de enlace internucleósido de sooosssssssssssooss, sooooossssssssssoss o soooossssssssssooss, donde cada "s" representa un enlace internucleósido fosforotioato y cada "o" representa un enlace internucleósido fosfodiéster.
[0587] Las secuencias de nucleobases de las SEQ ID Nos.: 825 y 1973 son complementarias a una fracción de las nucleobases 13038-13058 de la SEQ ID NO: 2.
[0589] La secuencia de nucleobases de los compuestos N.° 1047522, 1166954 y 1167046 son complementarias a una fracción de las nucleobases 13038-13058 de la s Eq ID NO 2.
[0591] Los oligonucleótidos modificados complementarios a una fracción de las nucleobases 13038-13058 de SEQ ID NO: 2 pueden lograr una reducción de al menos el 27 % del ARN GFAPin vitroen el ensayo celular estándar. Los oligonucleótidos modificados complementarios a una fracción de las nucleobases 13038-13058 de SEQ ID NO: 2 pueden lograr una reducción promedio del 41 % del ARN GFAPin vitroen el ensayo celular estándar. Los oligonucleótidos modificados complementarios a una fracción de las nucleobases 13038-13058 de SEQ ID NO: 2 pueden lograr una reducción promedio del 84 % del ARN GFAPin vivoen el ensayoin vivoestándar.
[0593] 6. Regiones de puntos calientes adicionales
[0595] Los rangos descritos en la siguiente tabla comprenden regiones de puntos calientes. Cada región de punto caliente comienza con la nucleobase de SEQ ID NO: 2 identificada en la columna "Sitio de inicio SEQ ID NO: 2" y termina con la nucleobase de SEQ ID NO: 2 identificada en la columna "Sitio de parada SEQ ID NO: 2". Los oligonucleótidos modificados pueden ser complementarios dentro de cualquiera de las regiones de puntos calientes 1 a 14, como se define en la siguiente tabla. Los oligonucleótidos modificados pueden tener una longitud de 18 nucleobases. Los oligonucleótidos modificados pueden tener una longitud de 20 nucleobases. Los oligonucleótidos modificados pueden ser gapmers. Los oligonucleótidos modificados pueden ser gapmers MOE 5-8-5, 5-10-3, 4-10-6, 6-10-4 o 5-10-5.
[0597] La secuencia de nucleobases de los compuestos enumerados en la columna "Compuesto N.° en rango" en la tabla a continuación son complementarias a SEQ ID NO: 2 dentro de la región de punto de acceso especificada. La secuencia de nucleobases de los oligonucleótidos enumerados en la columna "SEQ ID NO: en rango" en la tabla a continuación son complementarias a la secuencia objetivo, SEQ ID NO: 2, dentro de la región de punto de acceso especificada.
[0599] [0215]Los oligonucleótidos modificados complementarios a las nucleobases dentro de la región del punto caliente pueden alcanzar al menos "Red % Min.in vitro"(reducción porcentual mínima, en relación con las células de control no tratadas) de ARN GFAPin vitroen el ensayo celular estándar, como se indica en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos modificados complementarios a las nucleobases dentro de la región del punto caliente pueden alcanzar un promedio de "Red % Prom.in vitro"(reducción porcentual promedio, en relación con las células de control no tratadas) de ARN GFAPin vitroen el ensayo celular estándar, como se indica en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos modificados complementarios a 3 nucleobases dentro de la región del punto caliente pueden alcanzar un máximo de "Red % Máxin vitro"(reducción máxima porcentual, en relación con las células de control no tratadas) de ARN GFAPin vitroen el ensayo celular estándar, como se indica en la tabla a continuación. Los oligonucleótidos modificados complementarios a las nucleobases dentro de la región del punto caliente pueden alcanzar un promedio de "Red % Prom.in vivo"(reducción porcentual promedio, en relación con los animales tratados con PBS) de ARN GFAPin vivoen el ensayoin vivoestándar, como se indica en la tabla a continuación.
[0600] Tabla 1
[0601] Puntos calientes GFAP
[0604]
[0605]
[0608] Divulgación no limitante
[0610] Si bien ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en este documento se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas formas de realización, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos descritos en este documento y no pretenden limitar los mismos.
[0612] Aunque la lista de secuencias que acompaña a esta presentación identifica cada secuencia como "ARN" o "ADN", según sea necesario, en realidad esas secuencias pueden modificarse con cualquier combinación de modificaciones químicas. Cualquier persona experta en la materia apreciará fácilmente que la designación como "ARN" o "ADN" para describir oligonucleótidos modificados es, en ciertos casos, arbitraria. Por ejemplo, un oligonucleótido que comprende un nucleósido que comprende una fracción de azúcar 2'-OH y una base de timina podría describirse como un ADN que tiene una fracción de azúcar modificada (2'-OH en lugar de un 2'-H de ADN) o como un ARN que tiene una base modificada (timina (uracilo metilado) en lugar de un uracilo de ARN). En consecuencia, las secuencias de ácidos nucleicos divulgadas en este documento, incluidas, entre otras, las del listado de secuencias, pretenden abarcar ácidos nucleicos que contengan cualquier combinación de ARN y/o ADN natural o modificado, incluidos, entre otros, dichos ácidos nucleicos que tengan nucleobases modificadas. A modo de ejemplo adicional y sin limitación, un compuesto oligomérico que tiene la secuencia de nucleobases "ATCGATCG" abarca cualquier compuesto oligomérico que tenga dicha secuencia de nucleobases, ya sea modificada o no modificada, incluidos, entre otros, los compuestos que comprenden bases de ARN, como los que tienen la secuencia "AUCGAUCG" y los que tienen algunas bases de ADN y algunas bases de ARN como "AUCGATCG" y compuestos oligoméricos que tienen otras nucleobases modificadas, como "ATmCGAUCG", donde mC indica una base de citosina que comprende un grupo metilo en la posición 5.
[0614] [0218]Ciertos compuestos descritos en este documento (por ejemplo, oligonucleótidos modificados) tienen uno o más centros asimétricos y, por lo tanto, dan lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras configuraciones estereoisómeras que pueden definirse, en términos de estereoquímica absoluta, como(R)o (S), como un a o un p tal como para los anómeros de azúcar, o como (D) o (L), como para los aminoácidos, etc. Los compuestos descritos en este documento que se dibujan o describen como que tienen ciertas configuraciones estereoisómeras incluyen solo los compuestos indicados. Los compuestos descritos en este documento que se dibujan o describen con una estereoquímica no definida incluyen todos esos isómeros posibles, incluidas sus formas estereoaleatorias y ópticamente puras, a menos que se especifique lo contrario. Asimismo, también se incluyen todos los isómeros cis y trans y las formas tautoméricas de los compuestos aquí mencionados, a menos que se indique lo contrario. Los compuestos oligoméricos descritos en este documento incluyen mezclas quiralmente puras o enriquecidas, así como mezclas racémicas. Por ejemplo, los compuestos oligoméricos que tienen una pluralidad de enlaces internucleósidos de fosforotioato incluyen compuestos en los que la quiralidad de los enlaces internucleósidos de fosforotioato está controlada o es aleatoria. A menos que se indique lo contrario, los compuestos descritos en este documento incluyen formas de sal correspondientes.
[0616] Los compuestos descritos en este documento incluyen variaciones en las que uno o más átomos se reemplazan con un isótopo no radiactivo o un isótopo radiactivo del elemento indicado. Por ejemplo, los compuestos aquí que comprenden átomos de hidrógeno abarcan todas las posibles sustituciones de deuterio para cada uno de los átomos de hidrógeno 1H. Las sustituciones isotópicas abarcadas por los compuestos aquí descritos incluyen, entre otras: 2H o 3H en lugar de 1H, 13C o 14C en lugar de 12C, 15N en lugar de 14N, 17O o 18O en lugar de 16O y 33S, 34S, 35S o 36S En ciertas formas de realización, las sustituciones isotópicas no radiactivas pueden impartir nuevas propiedades al compuesto oligomérico que son beneficiosas para su uso como herramienta terapéutica o de investigación. En ciertas formas de realización, las sustituciones isotópicas radiactivas pueden hacer que el compuesto sea adecuado para fines de investigación o diagnóstico, tales como la obtención de imágenes.
[0618] EJEMPLOS
[0620] Los siguientes ejemplos ilustran ciertas formas de realización de la presente divulgación y no son limitantes.
[0621] Además, cuando se divulgan formas de realización específicas, los inventores han contemplado la aplicación genérica de esas formas de realización específicas.
[0623] Ejemplo 1: Efecto de oligonucleótidos modificados con gapmer de 5-10-5 MOE sobre el ARN GFAP humano in vitro, dosis única
[0625] Se diseñaron oligonucleótidos modificados complementarios al ácido nucleico GFAP humano y se probaron sus efectos de dosis única sobre el ARN GFAPin vitro.Los oligonucleótidos modificados se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares.
[0627] Los oligonucleótidos modificados en las tablas siguientes son gapmers MOE 5-10-5 con enlaces internucleósidos PO/<p>S mixtos. Los gapmers tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento central consta de diez desoxinucleósidos 2'-p-D y los segmentos del ala 5' y 3' constan cada uno de cinco nucleósidos modificados 2'-MOE. El motivo de azúcar para los gapmers es (de 5' a 3'): eeeeeddddddddddeeeee; donde 'd' representa una fracción de azúcar 2'-p-D-desoxirribosil, y 'e' representa una fracción de azúcar 2'-MOE. El motivo de enlace internucleósido para los gapmers es (de 5' a 3'): sooosssssssssssooss; donde cada 'o' representa un enlace internucleósido fosfodiéster y cada 's' representa un enlace internucleósido fosforotioato. Cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
[0629] "Sitio de inicio" indica el nucleósido 5' más al cual el oligonucleótido modificado es complementario en la secuencia de ácido nucleico objetivo. "Sitio de parada" indica el nucleósido 3' más al cual el oligonucleótido modificado es complementario en la secuencia de ácido nucleico objetivo. Cada oligonucleótido modificado que aparece en las tablas siguientes es 100 % complementario a SEQ ID NO: 1 (N.° de acceso de GENBANK NM_002055.4) o SEQ ID NO: 2 (Número de acceso GEn Ba NK NC_000017.ll truncado desde los nucleótidos 44903001 a 44919000). 'N/A' indica que el oligonucleótido modificado no es 100 % complementario a esa secuencia de ácido nucleico objetivo particular.
[0631] Las células U25l cultivadas se trataron con oligonucleótido modificado a una concentración de 4000 nM utilizando captación libre a una densidad de 10000 células por pocillo. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 48 horas, se aisló el ARN total de las células y se midieron los niveles de ARN GFAP mediante RTPCR cuantitativo en tiempo real. Los niveles de ARN GFAP se midieron mediante el conjunto de sondas de cebador GFAP humano RTS37485 (secuencia directa CTGGAGGTTGAGAGGGACA, designada en este documento como SEQ ID NO: 11; secuencia inversa GCTTCATCTGCTTCCTGTCT, designada en este documento como SEQ ID NO: 12; secuencia de sonda CTGGAGCTTCTGCCTCACAGTGG, designada en este documento como SEQ ID NO: 13). Los niveles de ARN de GFAP se normalizaron según el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. La reducción de ARN GFAP se presenta en las tablas siguientes como porcentaje de la cantidad de ARN GFAP en relación con las células de control no tratadas.
[0632] Cada tabla representa los resultados de una placa de ensayo individual. Los valores marcados con un asterisco (*) indican que el oligonucleótido modificado es complementario a la región del amplicón del conjunto de sondas cebadoras. Se pueden utilizar ensayos adicionales para medir la potencia y la eficacia de los oligonucleótidos modificados complementarios a la región del amplicón.
[0633] Tabla 2
[0634] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos PO/PS mixtos en células U251
[0635]
[0636]
[0637]
[0639] Tabla 3
[0640] Reducción de GFAP ARN por gapmers 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos PO/PS mixtos en células U251
[0641]
[0642]
[0643]
[0645] Tabla 4
[0646] Reducción de GFAP ARN por gapmers 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos PO/PS mixtos en células U251
[0647]
[0648]
[0649]
[0651] Tabla 5
[0652] Reducción de GFAP ARN por gapmers 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos PO/PS mixtos en células U251
[0653]
[0654]
[0655]
[0657] Tabla 6
[0658] Reducción de GFAP ARN por gapmers 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos PO/PS mixtos en células U251
[0659]
[0660]
[0661]
[0663] Tabla 7
[0664] Reducción de GFAP ARN por gapmers 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos PO/PS mixtos en células U251
[0665]
[0666]
[0667] Tabla 8
[0668] Reducción de GFAP ARN por gapmers 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos PO/PS mixtos en células U251
[0669]
[0670]
[0671] Tabla 9
[0672] Reducción de GFAP ARN por gapmers 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos PO/PS mixtos en células U251
[0673]
[0674]
[0675] Tabla 10
[0676] Reducción de GFAP ARN por gapmers 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos PO/PS mixtos en células U251
[0677]
[0678]
[0679] Tabla 11
[0680] Reducción de GFAP ARN por gapmers 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos PO/PS mixtos en células U251
[0681]
[0682]
[0683] Tabla 12
[0684] Reducción de GFAP ARN por gapmers 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos PO/PS mixtos en células U251
[0685]
[0686]
[0687] Tabla 13
[0688] Reducción de GFAP ARN por gapmers 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos PO/PS mixtos en células U251
[0689]
[0690]
[0691] Tabla 14
[0692] Reducción de GFAP ARN por gapmers 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos PO/PS mixtos en células U251
[0693]
[0694]
[0695] Tabla 15
[0696] Reducción de GFAP ARN por gapmers 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos PO/PS mixtos en células U251
[0697]
[0698]
[0699] Tabla 16
[0700] Reducción de GFAP ARN por gapmers 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos PO/PS mixtos en células U251
[0701]
[0702]
[0703] Tabla 17
[0704] Reducción de GFAP ARN por gapmers 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos PO/PS mixtos en células U251
[0705]
[0706]
[0708] Ejemplo 2: Efecto de oligonucleótidos modificados con gapmer de 5-10-5 MOE sobre el ARN GFAP humano in vitro, dosis única
[0709] Se diseñaron oligonucleótidos modificados complementarios al ácido nucleico GFAP humano y se evaluaron sus efectos de dosis única sobre el ARN GFAP in vitro. Los oligonucleótidos modificados se probaron en una serie de experimentos con 5 condiciones de cultivo similares.
[0711] Los oligonucleótidos modificados que se muestran en las tablas a continuación son gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces internucleósidos mixtos PO/PS. Los gapmers tienen una longitud de 20 nucleósidos; el segmento de agujero central está compuesto por diez desoxinucleósidos 2'-p-D y los segmentos laterales 5' y 3' están compuestos cada uno por cinco nucleósidos modificados 2'-p-D-MOE. El motivo de azúcar para los gapmers es (de 5' a 3'): eeeeeddddddddddeeeee; Donde «d» representa una fracción de azúcar 2'-p-D-desoxirribosilo y «e» representa una fracción de azúcar 2'-p-D-MOE. El motivo de enlace internucleósido para los gapmer es (de 5' a 3'): sooossssssssssssooss; donde cada «o» representa un enlace internucleósido fosfodiéster y cada «s» representa un enlace internucleósido fosforotioato. Cada residuo de citosina es una 5-metilcitosina.
[0713] El «sitio de inicio» indica el nucleósido más 5' al que el oligonucleótido modificado es complementario en la secuencia de ácido nucleico diana. El «sitio de parada» indica el nucleósido más 3' al que el oligonucleótido modificado es complementario en la secuencia de ácido nucleico diana. Cada oligonucleótido modificado que aparece en las tablas a continuación es 100 % complementario a las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 (N.° de acceso de GENBANK: NM_001131019.2). «NIA» indica que el oligonucleótido modificado no es 100 % complementario a esa secuencia génica en particular.
[0715] Se trataron células U25l cultivadas con oligonucleótido modificado a una concentración de 4000 nM, utilizando captación libre a una densidad de 10.000 células por pocillo. Tras un período de tratamiento de aproximadamente 48 horas, se aisló el ARN total de las células y se midieron los niveles de ARN de GFAP mediante RTPCR cuantitativo en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebador de GFAP humano RTS37485, descrito en el Ejemplo 1 anterior, para medir los niveles de ARN. Los niveles de ARN de GFAP se normalizaron al contenido total de ARN, medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en las tablas a continuación como porcentaje de los niveles de ARN GFAP en relación con las células control sin tratar. Los valores marcados con un asterisco (*) indican que el oligonucleótido modificado es complementario a la región amplicónica del conjunto de sondas cebadoras. Se pueden utilizar ensayos adicionales para medir la potencia y la eficacia de los oligonucleótidos modificados complementarios a la región amplicónica.
[0717] Tabla 18
[0719] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces internucleósidos mixtos PO/PS en células U251
[0722]
[0723]
[0724]
[0726] Tabla 19
[0727] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0728]
[0729]
[0730]
[0732] Tabla 20
[0733] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0734]
[0735]
[0736]
[0738] Tabla 21
[0739] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0740]
[0741]
[0742]
[0744] Tabla 22
[0745] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0746]
[0747]
[0748]
[0750] Tabla 23
[0751] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0752]
[0753]
[0754] Tabla 24
[0755] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0756]
[0757]
[0758] Tabla 25
[0759] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0760]
[0761]
[0762] Tabla 26
[0763] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0764]
[0765]
[0766] Tabla 27
[0767] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0768]
[0769]
[0770] Tabla 28
[0771] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0772]
[0773]
[0774] Tabla 29
[0775] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0776]
[0777]
[0778] Tabla 30
[0779] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0780]
[0781]
[0782] Tabla 31
[0783] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0784]
[0785]
[0786] Tabla 32
[0787] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0788]
[0789]
[0790] Tabla 33
[0791] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0792]
[0793]
[0794] Tabla 34
[0795] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0796]
[0797]
[0798] Tabla 35
[0799] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0800]
[0801]
[0802] Tabla 36
[0803] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0804]
[0805]
[0806] Tabla 37
[0807] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0808]
[0809]
[0810] Tabla 38
[0812] Reducción del ARN GFAP por gapmers de 5-10-5 MOE con enlaces intemudeósidos mixtos PO/PS en células U251
[0815]
[0818] Ejemplo 3: Efecto de oligonucleótidos modificados sobre el ARN GFAP humano in vitro, dosis múltiples
[0819] Se analizaron oligonucleótidos modificados seleccionados de los ejemplos anteriores a diversas dosis en células U25l. Células U25l cultivadas, a una densidad de 10.000 células por pocillo, se trataron mediante captación libre con diversas concentraciones de oligonucleótido modificado, como se especifica en las tablas siguientes. Tras un período de tratamiento de aproximadamente 48 horas, se aisló el ARN total de las células y se midieron los niveles de ARN GFAP mediante RTPCR cuantitativo en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebador GFAP humano RTS37485 para medir los niveles de ARN, como se describió anteriormente. Los niveles de ARN GFAP se ajustaron según el contenido total de ARN, medido con RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de ARN GFAP, en relación con las células control sin tratar (% control). Siempre que fue posible, la concentración inhibitoria máxima semiterminal (CI<50>) de cada oligonucleótido modificado se calculó mediante una regresión lineal en un gráfico logarítmico/lineal de los datos en Excel. En algunos casos, no se pudo calcular la CI<50>de forma fiable y el punto de datos se marcó como "NC". Los oligonucleótidos modificados marcados con un asterisco (*) indican que son complementarios a la región amplicónica del conjunto de sondas de cebadores. Se pueden utilizar ensayos adicionales para medir la potencia y la eficacia de los oligonucleótidos modificados complementarios a la región amplicónica.
[0820] Tabla 39
[0821] Porcentaje dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en comparación con el control no tratado en células U251 mediante oligonucleótidos modificados
[0823]
[0824] Tabla 40
[0825] Porcentaje dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en comparación con el control no tratado en células U251 mediante oligonucleótidos modificados
[0827]
[0828] Tabla 41
[0830] Porcentaje dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en comparación con el control no tratado en células U251 mediante oligonucleótidos modificados
[0833]
[0836] Tabla 42
[0838] Porcentaje dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en comparación con el control no tratado en células U251 mediante oligonucleótidos modificados
[0841]
[0842]
[0845] Tabla 43
[0846] Porcentaje dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en comparación con el control no tratado en células U251 mediante oligonucleótidos modificados
[0849]
[0851] Tabla 44
[0852] Porcentaje dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en comparación con el control no tratado en células U251 mediante oligonucleótidos modificados
[0855]
[0856]
[0859] Tabla 45
[0861] Porcentaje dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en comparación con el control no tratado en células U251 mediante oligonucleótidos modificados
[0864]
[0867] Tabla 46
[0869] Porcentaje dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en comparación con el control no tratado en células U251 mediante oligonucleótidos modificados
[0870]
[0872] Tabla 47
[0873] Porcentaje dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en comparación con el control no tratado en células U25l mediante oligonucleótidos modificados
[0875]
[0876] Tabla 48
[0877] Porcentaje dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en comparación con el control no tratado en células U251 mediante oligonucleótidos modificados
[0879]
[0880] Tabla 49
[0881] Porcentaje dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en comparación con el control no tratado en células U251 mediante oligonucleótidos modificados
[0884]
[0887] Tabla 50
[0888] Porcentaje dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en comparación con el control no tratado en células U251 mediante oligonucleótidos modificados
[0891]
[0892]
[0894] Tabla 51
[0895] Porcentaje dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en comparación con el control no tratado en células U251 mediante oligonucleótidos modificados
[0898]
[0901] Tabla 52
[0902] Porcentaje dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en comparación con el control no tratado en células U251 mediante oligonucleótidos modificados
[0905]
[0906]
[0908] Ejemplo 4: Tolerabilidad de oligonucleótidos modificados complementarios a GFAP humana en ratones de tipo silvestre, estudio de 3 horas
[0909] Los oligonucleótidos modificados descritos anteriormente se probaron en ratones hembra C57/BI6 de tipo silvestre para evaluar la tolerabilidad de los oligonucleótidos. Cada ratón hembra C57/BI6 de tipo silvestre recibió una dosis única ICV de 700 |jg del oligonucleótido modificado que se enumera en la tabla a continuación. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 ratones. Un grupo de 4 ratones recibió PBS como control negativo para cada experimento (identificado en tablas separadas a continuación). A las 3 horas posteriores a la inyección, los ratones se evaluaron según siete criterios diferentes. Los criterios son: (1) el ratón estaba brillante, alerta y receptivo; (2) el ratón estaba de pie o encorvado sin estímulos; (3) el ratón mostró algún movimiento sin estímulos; (4) el ratón demostró movimiento hacia adelante después de ser levantado; (5) el ratón mostró algún movimiento después de ser levantado; (6) el ratón respondió al pellizco de la cola; (7) Respiración regular. Para cada uno de los 7 criterios, se asignó a cada ratón una subpuntuación de 0 si cumplía los criterios y de 1 si no los cumplía (puntuación de la batería de observación funcional o FOB). Tras evaluar los 7 criterios, se sumaron las puntuaciones de cada ratón y se promediaron dentro de cada grupo de tratamiento. Los resultados se presentan en las tablas a continuación.
[0910] Tabla 53
[0911] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a una dosis de 700 jg
[0914]
[0915]
[0917] Tabla 54
[0918] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a una dosis de 700 |jg
[0920]
[0921] Tabla 55
[0922] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a una dosis de 700 |jg
[0924]
[0925] Tabla 56
[0926] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a una dosis de 700 |jg
[0928]
[0929] Tabla 57
[0930] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a una dosis de 700 |jg
[0932]
[0933] Tabla 58
[0934] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a una dosis de 700 |jg
[0937]
[0940] Ejemplo 5: Diseño de oligonucleótidos modificados con gapmer MOE con enlaces internucleósidos mixtos PO/PS, complementarios a un ácido nucleico GFAP humano.
[0941] Se diseñaron oligonucleótidos modificados, complementarios al ácido nucleico GFAP humano. Los oligonucleótidos modificados que se muestran en la tabla a continuación son gapmers de 6-10-4 MOE. Los gapmers tienen una longitud de 20 nucleósidos y presentan un segmento central gap compuesto por diez 2'-p-D-desoxinucleósidos, un segmento de ala 5' compuesto por seis nucleósidos 2'-p-D-MOE y un segmento de ala 3' compuesto por cuatro nucleósidos 2'-p-D-MOE. El motivo de azúcar de los gapmers es (de 5' a 3'): eeeeeeddddddddddeeee; donde «d» representa una fracción de azúcar 2'-p-D-desoxirribosina y «e» representa una fracción de azúcar 2'-p-D-MOE. Los gapmer tienen un motivo de enlace internucleósido de (de 5' a 3'): sooooossssssssssoss; donde cada «s» representa un enlace internucleósido fosforotioato y cada «o» representa un enlace internucleósido fosfodiéster. Cada nucleósido de citosina es una citosina 5-metil.
[0942] Tabla 59
[0943] Gapmers 6-10-4 MOE con enlaces intemucleósidos PO/PS mixtos complementarios al compuesto GFAP humano
[0944]
[0945]
[0948] Los oligonucleótidos modificados de la tabla a continuación son gapmer de 5-10-5 MOE con enlaces intemucleósidos mixtos PO/PS. Los gapmer tienen una longitud de 20 nucleósidos; el segmento central está compuesto por 2'-p-D-desoxinucleósidos, y los segmentos laterales 5' y 3' están compuestos por cinco nucleósidos modificados 2'-p-D-MOE. El motivo de azúcar para los gapmer es (de 5' a 3'): eeeeeddddddddddeeeee; donde 'd' representa una fracción de azúcar 2'-p-D-desoxirribosil, y 'e' representa una fracción de azúcar 2'-p-D-MOE. Los gapmers tienen un motivo de enlace internucleósido de (de 5' a 3'): soooosssssssssssooss; donde cada "s" representa un enlace internucleósido fosforotioato y cada "o" representa un enlace internucleósido fosfodiéster. Cada nucleósido de citosina es una 5-metilcitosina.
[0950] Tabla 60
[0952] Gapmers con MOE 5-10-5 con enlaces internucleósidos mixtos de PO/PS complementarios a la GFAP humana.
[0955]
[0956]
[0959] Los oligonucleótidos modificados de la tabla a continuación son gápmeros de 4-10-6 MOE. Los gápmeros tienen una longitud de 20 nucleósidos y presentan un segmento central de enlace que consiste a menudo en 2'-p-D-desoxinucleósidos, un segmento de ala 5' que consiste en cuatro nucleósidos 2'-p-D-MOE y un segmento de ala 3' que consiste en seis nucleósidos 2'-p-D-MOE. El motivo de azúcar de los gápmeros es (de 5' a 3'): eeeeddddddddddeeeeee; donde 'd' representa una fracción de azúcar 2-p-D-desoxirribosilo y 'e' representa una fracción de azúcar 2'-p-D-MOE. Los gápmeros tienen un motivo de enlace internucleósido de (de 5' a 3'): sooosssssssssssoooss; donde "s" representa un enlace internucleósido fosforotioato y "o" representa un enlace internucleósido fosfodiéster. Cada nucleósido de citosina es una 5-metilcitosina.
[0960] Tabla 61
[0961] -10-6 Gapmer de MOE con enlaces internucleósidos mixtos PO/PS complementarios a la GFAP humana
[0962]
[0963]
[0966] Los oligonucleótidos modificados en la tabla a continuación son gapmers 5-8-5 MOE. Los gapmers tienen 20 nucleósidos de longitud y tienen un segmento central que consiste en ocho 2'-p-D-desoxinucleósidos, un segmento de ala 5' que consiste en cinco nucleósidos 2'-p-D-MOE, y un segmento de ala 3' que consiste en cinco nucleósidos 2'-p-D-MOE. El motivo de azúcar de los gapmers es (de 5' a 3'): eeeeeddddddddeeeee; donde 'd' representa una fracción de azúcar 2'-p-D-desoxirribosina, y 'e' representa una fracción de azúcar 2'-p-D-MOE. Los gapmer tienen un motivo de enlace internucleósido de (de 5' a 3'): sooossssssssssooss; Donde cada "s" representa un enlace internucleósido fosforotioato y cada "o" representa un enlace internucleósido fosfodiéster. Cada nucleobase de citosina es una 5-metilcitosina.
[0967] Tabla 62
[0968] Gapmer de MOE 5-8-5 con enlaces internucleósidos mixtos PO/PS complementarios a la GFAP humana.
[0971]
[0972]
[0975] Ejemplo 6: Tolerabilidad de oligonucleótidos modificados complementarios a GFAP humano en ratones de tipo salvaje, estudio de 3 horas
[0977] Los oligonucleótidos modificados descritos anteriormente se probaron en ratones C57IB16 hembra de tipo salvaje para evaluar la tolerabilidad de los oligonucleótidos. Los ratones hembra C57/BI6 de tipo salvaje recibieron cada uno una dosis ICV única de 700 |jg del oligonucleótido modificado que figura en la siguiente tabla. Cada grupo de tratamiento consistió en 4 ratones. Un grupo de 4 ratones recibió PBS como control negativo para cada experimento (identificado en tablas separadas a continuación). Tres horas después de la inyección, los ratones fueron evaluados según siete criterios diferentes. Los criterios son (1) el ratón estaba brillante, alerta y receptivo; (2) el ratón estaba de pie o encorvado sin estímulos; (3) el ratón mostró cualquier movimiento sin estímulos; (4) el ratón demostró 5 movimientos hacia adelante después de ser levantado; (5) el ratón demostró cualquier movimiento después de ser levantado; (6) el ratón respondió al pellizco de la cola; (7) respiración regular. Para cada uno de los 7 criterios, a un ratón se le asignó una subpuntuación de 0 si cumplía los criterios y 1 si no los cumplía (puntuación de la batería de observación funcional o FOB). Después de evaluar los 7 criterios, se sumaron las puntuaciones de cada ratón y se promediaron dentro de cada grupo de tratamiento. Los resultados se presentan en las tablas siguientes.
[0978] Tabla 63
[0979] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a dosis de 700 |jg
[0981]
[0982] Tabla 64
[0983] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a dosis de 700 |jg
[0985]
[0986] Tabla 65
[0987] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a dosis de 700 |jg
[0989]
[0990] Tabla 66
[0991] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a dosis de 700 |jg
[0993]
[0994] Tabla 67
[0995] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a dosis de 700 |jg
[0997]
[0999] Tabla 68
[1000] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a dosis de 700 jg
[1003]
[1004] Tabla 69
[1005] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a dosis de 700 |jg
[1007]
[1009] Tabla 70
[1010] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a dosis de 700 jg
[1012]
[1013] Tabla 71
[1014] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a dosis de 700 |jg
[1016]
[1018] Tabla 72
[1019] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a dosis de 700 jg
[1021]
[1022] Tabla 73
[1023] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a dosis de 700 |jg
[1026]
[1028] Tabla 74
[1029] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a dosis de 700 jg
[1032]
[1033] Tabla 75
[1034] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a dosis de 700 |jg
[1037]
[1040] Tabla 76
[1041] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a dosis de 700 jg
[1044]
[1047] Tabla 77
[1048] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a dosis de 700 jg
[1051]
[1053] Tabla 78
[1054] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a dosis de 700 jg
[1057]
[1058] Tabla 79
[1060] Puntuaciones de tolerabilidad en ratones a dosis de 700 |jg
[1063]
[1066] Ejemplo 7: Actividad de oligonucleótidos modificados complementarios a GFAP humana en ratones transgénicos
[1067] Los oligonucleótidos modificados descritos anteriormente se probaron en un modelo de ratón transgénico GFAP humano. Los ratones transgénicos (línea 73.7) se describieron previamente en Messing A., et al.,Fatal encephalopathy with astrocyte inclusions in GFAP transgenic mice,Am J Pathos. 1998, 152(2):391-398.
[1069] Tratamiento
[1071] Los ratones transgénicos GFAP se dividieron en grupos de 3-4 ratones cada uno. Cada ratón recibió un único bolo ICV de 300 jg de oligonucleótido modificado. Un grupo de 3-4 ratones recibió PBS como control negativo.
[1073] Análisis de ARN
[1075] Una semana después del tratamiento, se sacrificaron los ratones y se extrajo ARN del tejido cerebral cortical y/o de la médula espinal para el análisis RTPCR para medir la cantidad de ARN de GFAP utilizando el conjunto de sondas cebadoras RTS38621 ((secuencia directa AGTTGCAGTCCTTGACCTG, designada en este documento como SEQ ID NO: 14; secuencia inversa CAGCGCCTCCTGATAACTG, designada en este documento como SEQ ID NO: 15; secuencia de sonda ACGAGTCCCTGGAGAGGCAGATG, designada en este documento como SEQ ID NO: 16), que es un conjunto de sondas cebadoras específicas para humanos que reconoce todas las isoformas de GFAP. Los resultados se presentan como porcentaje de ARN GFAP humano en relación con el control PBS, normalizado a la peptidilprolil isomerasa A de ratón (PPIA), también conocida como ciclofilina A. La PPIA de ratón se amplificó utilizando el conjunto de sondas cebadoras m_cyclo24 (secuencia directa TCGCCGCTTGCTGCA, designada en este documento como SEQ ID NO: 17; secuencia inversa ATCGGCCGTGATGTCGA, designada en este documento como SEQ ID NO: 18; secuencia de sonda CCATGGTCAACCCCACCGTGTTC, designada en este documento como SEQ ID NO: 19). En algunos casos, el valor de RTPCR no está definido para una muestra determinada y se etiqueta como ND (No definido).
[1077] Como se muestra en la siguiente tabla, el tratamiento con oligonucleótidos modificados resultó en una reducción del a Rn GFAP en comparación con el control PBS.
[1078] Tabla 80
[1079] Reducción del ARN GFAP humano en ratones transgénicos
[1080]
[1081] Tabla 81
[1082] Reducción del ARN GFAP humano en ratones transgénicos
[1083]
[1084] Tabla 82
[1085] Reducción del ARN GFAP humano en ratones transgénicos
[1086]
[1087] Tabla 83
[1088] Reducción del ARN GFAP humano en ratones transgénicos
[1091]
[1093] Tabla 84
[1094] Reducción del ARN GFAP humano en ratones transgénicos
[1097]
[1098] Tabla 85
[1099] Reducción del ARN GFAP humano en ratones transgénicos
[1100]
[1101] Tabla 86
[1102]
[1103] Tabla 87
[1104] Reducción del ARN GFAP humano en ratones transgénicos
[1106]
[1108] Tabla 88
[1109] Reducción del ARN GFAP humano en ratones transgénicos
[1111]
[1112] Tabla 89
[1113] Reducción del ARN GFAP humano en ratones transgénicos
[1114] Tabla 90
[1115] Reducción del ARN GFAP humano en ratones transgénicos
[1116]
[1117] Tabla 91
[1118] Reducción del ARN GFAP humano en ratones transgénicos
[1119]
[1120] Tabla 92
[1121] Reducción del ARN GFAP humano en ratones transgénicos
[1122]
[1123] Tabla 93
[1124] Reducción del ARN GFAP humano en ratones transgénicos
[1125]
[1126] Tabla 94
[1127] Reducción del ARN GFAP humano en ratones transgénicos
[1130]
[1132] Tabla 95
[1133] Reducción del ARN GFAP humano en ratones transgénicos
[1136]
[1138] Ejemplo 8: Tolerabilidad de oligonucleótidos modificados complementarios a GFAP humana en ratas, dosis de 3 mg
[1139] Los oligonucleótidos modificados descritos anteriormente se probaron en ratas para evaluar la tolerabilidad de los oligonucleótidos. Cada rata Sprague Dawley recibió una dosis intratecal (IT) única de 3 mg del oligonucleótido que se indica en la siguiente tabla. Cada grupo de tratamiento consistió en 2-4 ratas. Un grupo de 2 a 4 ratas recibió PBS como control negativo. Tres horas después de la inyección, se evaluó el movimiento en siete partes diferentes del cuerpo de cada rata. Las 7 partes del cuerpo son (1) la cola de la rata; (2) la postura posterior de la rata; (3) las extremidades traseras de la rata; (4) las patas traseras de la rata; (5) las patas delanteras de la rata; (6) la postura anterior de la rata; (7) la cabeza de la rata. Para cada una de las 7 partes diferentes del cuerpo, a cada rata se le asignó una subpuntuación de 0 si la parte del cuerpo se movía o 1 si la parte del cuerpo estaba paralizada (puntuación de la batería de observación funcional o FOB). Después de evaluar cada una de las 7 partes del cuerpo, se sumaron los puntajes secundarios de cada rata y luego se promediaron para cada grupo. Por ejemplo, si la cola, la cabeza y todas las demás partes del cuerpo evaluadas de una rata se movieran 3 horas después de la dosis IT de 3 mg, obtendría una puntuación total de 0. Si otra rata no movía la cola 3 horas después de la dosis IT de 3 mg, pero todas las demás partes del cuerpo evaluadas se movían, recibiría una puntuación de 1. Los resultados se presentan como puntuación media para cada grupo de tratamiento.
[1140] Tabla 96
[1141] Puntuaciones de tolerabilidad en ratas a dosis de 3 mg
[1144]
[1147] Tabla 97
[1148] Puntuaciones de tolerabilidad en ratas a dosis de 3 mg
[1151]
[1154] Tabla 98
[1155] Puntuaciones de tolerabilidad en ratas a dosis de 3 mg
[1158]
[1159] Tabla 99
[1160] Puntuaciones de tolerabilidad en ratas a dosis de 3 mg
[1163]
[1166] Tabla 100
[1167] Puntuaciones de tolerabilidad en ratas a dosis de 3 mg
[1170]
[1171] Tabla 101
[1172] Puntuaciones de tolerabilidad en ratas a dosis de 3 mg
[1175]
[1178] Tabla 102
[1179] Puntuaciones de tolerabilidad en ratas a dosis de 3 mg
[1182]
[1183] Tabla 103
[1184] Puntuaciones de tolerabilidad en ratas a dosis de 3 mg
[1187]
[1189] Tabla 104
[1190] Puntuaciones de tolerabilidad en ratas a dosis de 3 mg
[1193]
[1194] Tabla 105
[1195] Puntuaciones de tolerabilidad en ratas a dosis de 3 mg
[1198]
[1201] Tabla 106
[1202] Puntuaciones de tolerabilidad en ratas a dosis de 3 mg
[1205]
[1207] Tabla 107
[1208] Puntuaciones de tolerabilidad en ratas a dosis de 3 mg
[1211]
[1213] Ejemplo 9: Potencia de oligonucleótidos modificados complementarios a GFAP humano en ratones transgénicos [0241] Los oligonucleótidos modificados descritos anteriormente se probaron en un modelo de ratón transgénico GFAP humano. Los ratones transgénicos (línea 73.7) se describieron previamente en Messing A., et al., Fatal encephalopathy with astrocyte inclusions in GFAP transgenic mice, Am J Pathos. 1998, 152(2):391-398.
[1214] Tratamiento
[1215] Los ratones transgénicos GFAP se dividieron en grupos de 4 ratones cada uno. Cada ratón recibió un único bolo ICV de oligonucleótido modificado en las dosis indicadas en las tablas siguientes. Un grupo de 4 a 8 ratones recibió PBS como control negativo.
[1216] Análisis de ARN
[1217] Dos semanas después del tratamiento, se sacrificaron los ratones y se extrajo ARN de la corteza, la médula espinal y el tronco encefálico para el análisis RTPCR de la expresión de ARN de GFAP utilizando el conjunto de sondas cebadoras RTS38621, descrito en el Ejemplo 6 anterior. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARN, en relación con el control PBS, normalizado a PPIA de ratón. La dosis efectiva máxima media (DE50) de cada oligonucleótido modificado se calculó utilizando el software GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, San Diego, CA). Los valores de DE50se calcularon a partir de la dosis y los niveles de ARNm de GFAP de cada animal usando la ecuación personalizada Motulsky: Agonista vs respuesta - Pendiente variable (cuatro parámetros) Y = Inferior (Superior-Inferior)/(1+(10AlogCE50/X)AHillSlope), con las siguientes restricciones: bottom > valor más bajo en el conjunto de datos para comparar entre ASO (3, 5 y 3 para corteza, médula espinal y tronco encefálico, respectivamente), superior = 100, HillSlope < -1 y > -2.
[1219] Como se muestra en la siguiente tabla, el tratamiento con oligonucleótidos modificados resultó en una reducción dependiente de la dosis del ARN GFAP en comparación con el control PBS.
[1221] Tabla 108
[1223] Reducción del ARN GFAP humano (todas las isoformas) en ratones transgénicos
[1226]
[1227] Tabla 109
[1228] Reducción de ARN humano GFAP (todas las isotermas) en ratones transgénicos
[1230]
[1233] Tabla 110
[1234] Reducción de ARN humano GFAP (todas las isoformas) en ratones transgénicos
[1237]
[1238]
[1240] Tabla 111
[1241]
[1242] Tabla 112
[1244] Reducción de ARN humano GFAP (todas las isotermas) en ratones transgénicos
[1247]
[1250] Ejemplo 10: Efecto de oligonucleótidos modificados sobre el ARN GFAP humano in vitro, dosis múltiples
[1251] Los oligonucleótidos modificados seleccionados de los ejemplos anteriores se probaron en varias dosis en células U25l. Las células U25l cultivadas a una densidad de 30.000 células por pocillo se trataron con electroporación con diversas concentraciones de oligonucleótido modificado como se especifica en las tablas siguientes. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN total de las células y se midieron los niveles de ARN GFAP mediante RTPCR cuantitativo en tiempo real. Los conjuntos de sondas de cebador GFAP humano RTS38621 (descritos aquí arriba), RTS38624 (secuencia directa AACc GgATCACCATTCCC, designada aquí como SEQ ID NO:2892; secuencia inversa CCTTGTGATTTTCCCCGTCT, designada aquí como SEQ ID NO: 1064; secuencia de sonda TGCTTTTGCCCCCTCGAATCTG, designada aquí como SEQ ID NO: 2894), y RTS38622 (secuencia directa AACCGGATCACCATTCCC, designada aquí como SEQ ID NO: 2892; secuencia inversa GTCTTCACCACGA TGTTCCTC, designada aquí como SEQ ID NO: 2896; secuencia de sonda CACCAAGTCTGTGTCAGAAGGCCA, designada aquí como SEQ ID NO: 2897) se usaron para medir los niveles de ARN. Los niveles de ARN de GFAP se normalizaron a GAPDH total, según lo medido por el conjunto de sondas de cebador humano RTS104 (secuencia directa GAAGGTGAAGGTCGGAGTC, designada en este documento como SEQ ID NO: 2898; secuencia inversa GAAGATGGTGATGGGATTTC, designada en este documento como SEQ ID NO: 2899; secuencia de sonda CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC, designada en este documento como SEQ ID NO: 2900). Los resultados se presentan como porcentaje de ARN GFAP, en relación con las células de control no tratadas (% UTC). La concentración inhibitoria máxima media (CI50) de cada oligonucleótido modificado se calculó utilizando una regresión lineal en un gráfico logarítmico/lineal de los datos en Excel.
[1253] Tabla 113
[1255] Reducción dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en células U251 por oligonucleótidos modificados
[1258]
[1259] Tabla 114
[1260] Reducción dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en células U251 por oligonucleótidos modificados
[1263]
[1266] Tabla 115
[1267] Reducción dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en células U251 por oligonucleótidos modificados
[1270]
[1272] Tabla 116
[1273] Reducción dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en células U251 mediante oligonucleótidos modificados
[1276]
[1279] Tabla 117
[1280] Reducción dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en células U251 mediante oligonucleótidos modificados
[1283]
[1284] Tabla 118
[1285] Reducción dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en células U251 mediante oligonucleótidos modificados
[1288]
[1290] Ejemplo 11: Efecto de oligonucleótidos modificados sobre el ARN GFAP humano in vitro, dosis múltiples [0246] Los oligonucleótidos modificados seleccionados de los ejemplos anteriores se probaron en varias dosis en células U25l. Las células U25l cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se trataron utilizando captación libre con diversas concentraciones de oligonucleótido modificado como se especifica en las tablas siguientes. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 48 horas, se aisló el ARN total de las células y se midieron los niveles de ARN GFAP mediante RTPCR cuantitativo en tiempo real. Se utilizaron los conjuntos de sondas de cebador GFAP humanas RTS37485 (descritos aquí arriba) para medir los niveles de ARN. Los niveles de ARN GFAP se normalizaron al GAPDH total, medido mediante el conjunto de sondas de cebador humano RTS104 (descrito aquí arriba). Los resultados se presentan como porcentaje de ARN GFAP, en relación con las células de control no tratadas (% UTC). La concentración inhibitoria máxima media (CI50) de cada oligonucleótido modificado se calculó utilizando una regresión lineal en un gráfico logarítmico/lineal de los datos en Excel.
[1291] Tabla 113
[1292] Reducción dependiente de la dosis de ARN GFAP humano en células U251 por oligonucleótidos modificados
[1295]

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES
1. Un oligonucleótido modificado de acuerdo con la siguiente estructura química:
(SEQ ID NO: 20),
o una sal del mismo.
2. Un oligonucleótido modificado de acuerdo con la siguiente estructura química:
3. El oligonucleótido modificado de la reivindicación 1, que es la sal de sodio o la sal de potasio de la estructura química.
4. Un compuesto oligomérico que comprende un oligonucleótido modificado de acuerdo con la siguiente notación química: mCesAeoGeoTeoAeoTeoTdsAdsmCdsmCdsTdsmCdsTdsAdsmCdsTdsAeoGesTesmCe (SEQ ID NO: 20), en donde:
A = una nucleobase de adenina,
mC = una nucleobase de 5-metil citosina,
G = una nucleobase de guanina,
T = una nucleobase de timina,
e = una fracción de azúcar ribosilo 2 '-p-D-OCH2 CH2 OCH3 ,
d = una fracción de azúcar 2'-p-D-desoxirribosilo,
s = un enlace internucleósido fosforotioato, y
o = un enlace internucleósido fosfodiéster.
5. El compuesto oligomérico de la reivindicación 4, que comprende el oligonucleótido modificado unido covalentemente a un grupo conjugado.
6. Una población de oligonucleótidos modificados de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde todos los enlaces internucleósidos de fosforotioato del oligonucleótido modificado son estereoaleatorios.
7. Una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-3,el compuesto oligomérico de cualquiera de las reivindicaciones 4-5, o la población de oligonucleótidos modificados de la reivindicación 6, y un diluyente farmacéuticamente aceptable.
8. La composición farmacéutica según la reivindicación 7, en la que el diluyente farmacéuticamente aceptable es líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) o solución salina tamponada con fosfato (PBS).
9. La composición farmacéutica según la reivindicación 8, en la que la composición farmacéutica consiste en el oligonucleótido modificado, el compuesto oligomérico o la población de oligonucleótidos modificados y LCRa.
10. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, en la que la composición farmacéutica consiste en el oligonucleótido modificado, el compuesto oligomérico o la población de oligonucleótidos modificados y PBS.
11. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, en la que la composición farmacéutica consiste esencialmente en el oligonucleótido modificado, el compuesto oligomérico o la población de oligonucleótidos modificados y LCRa.
12. Un oligonucleótido modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un compuesto oligomérico de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, una población de oligonucleótidos modificados de la reivindicación 6 o una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con GFAP, opcionalmente en donde la enfermedad asociada con GFAP es una enfermedad neurodegenerativa.
13. El oligonucleótido modificado, compuesto oligomérico, población de oligonucleótidos modificados o composición farmacéutica para uso según la reivindicación 12, en donde la enfermedad asociada con GFAP es la enfermedad de Alexander.
14. El oligonucleótido modificado, compuesto oligomérico, población de oligonucleótidos modificados o composición farmacéutica para uso según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en donde el oligonucleótido modificado, compuesto oligomérico, población de oligonucleótidos modificados o composición farmacéutica se administra al sistema nervioso central y/o sistémicamente.
15. El oligonucleótido modificado, compuesto oligomérico, población de oligonucleótidos modificados o composición farmacéutica para uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde el oligonucleótido, compuesto oligomérico, población de oligonucleótidos modificados o composición farmacéutica se administra por vía intratecal.
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