ES3048960T3 - Therapeutics for glycogen storage disease type iii - Google Patents

Abstract

Esta invención proporciona una gama de moléculas polinucleotídicas y oligoméricas traducibles para expresar una amilo-alfa-1, 6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa (AGL) humana, o un fragmento de la misma con actividad AGL. Las moléculas polinucleotídicas y oligoméricas son expresables para proporcionar la AGL humana o un fragmento de la misma con actividad AGL. Las moléculas pueden utilizarse como agentes activos para expresar un polipéptido o proteína activo en células o sujetos. Los agentes pueden utilizarse en métodos para mejorar, prevenir, retrasar la aparición o tratar una enfermedad o afección asociada con una actividad reducida de la amilo-alfa-1, 6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa (AGL) en un sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Agentes terapéuticos para la enfermedad del almacenamiento de glucógeno tipo III

[0005] Esta invención se refiere a los campos de la biología molecular y la genética, así como a productos biofarmacéuticos y agentes terapéuticos generados a partir de moléculas traducibles. Más concretamente, esta invención se refiere a estructuras y composiciones para moléculas que tienen la capacidad de traducirse en polipéptidos o proteínas activos, para su usoin vivoy como agentes terapéuticos.

[0007] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0009] La enfermedad del almacenamiento de glucógeno tipo III (también conocida como GSD o enfermedad de Cori) es un error congénito del metabolismo del glucógeno poco común (incidencia de 1:100.000) provocado por la deficiencia de una enzima desramificante del glucógeno conocida como amilo-alfa-1,6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa (AGL). Este trastorno metabólico autosómico recesivo se caracteriza por una implicación variable del hígado, el músculo cardíaco y el músculo esquelético.

[0011] Existen cuatro subtipos de GSD III, basados en las diferencias en la expresión tisular de la enzima deficiente, AGL. La GSD IIIa representa aproximadamente el 85 % de todos los subtipos de GSD III y se presenta con implicación hepática y muscular, resultante de la deficiencia enzimática tanto en el hígado como en el músculo. La GSDIIIb representa aproximadamente el 15 % y generalmente se presenta solo con implicación hepática, debido a la deficiencia enzimática únicamente en el hígado. Por otro lado, la GSDIIIc y la GSDIIId son ambas extremadamente frecuentes; se cree que la GSDIIIc resulta de una deficiencia de la actividad desramificante de la glucosidasa y se cree que la GSDIIId resulta de una deficiencia de la actividad desramificante de la transferasa.

[0013] En la infancia y la niñez temprana, la implicación hepática se presenta como hipoglucemia cetósica, hepatomegalia, hiperlipidemia y elevación de las transaminasas hepáticas. En la adolescencia y la edad adulta, la hepatopatía se vuelve menos prominente. La miocardiopatía hipertrófica se desarrolla en la mayoría de las personas con GSD IIIa, habitualmente durante la infancia. Su importancia clínica varía desde asintomática en la mayoría de los casos hasta disfunción cardíaca grave, insuficiencia cardíaca congestiva y, en raras ocasiones, muerte súbita. La miopatía esquelética que se manifiesta como debilidad no suele ser evidente en la infancia, sino que progresa lentamente y, por lo general, se vuelve prominente en la edad adulta.

[0015] De acuerdo con los órganos afectados, con frecuencia están presentes en el suero de pacientes con GSD III actividades potenciadas de alanina transaminasa (ALT, por sus siglas en inglés), aspartato transaminasa (AST, , por sus siglas en inglés), fosfatasa alcalina (ALP, , por sus siglas en inglés) y/o creatina fosfoquinasa (CPK, por sus siglas en inglés).

[0016] Como se señaló arriba, la GSD III se debe a una deficiencia de AGL. Esta deficiencia generalmente se atribuye a mutaciones hereditarias del gen AGL, que resultan en la abolición parcial o total de la actividad enzimática de AGL en un sujeto con GSD III. Se han realizado análisis moleculares de la proteína AGL en pacientes con GSD III en varias poblaciones étnicas, y se han descrito más de 100 mutaciones diferentes de AGL.VéaseGoldstein et al., 2010, Genet. Med. 12: 424-430.Véase tambiénSentner et al., 2013, JIMD Rep. 7: 19-26.

[0018] Actualmente no existe un tratamiento eficaz de GSD III. Se han realizado intentos para controlar la hipoglucemia con comidas frecuentes con alto contenido en hidratos de carbono, a menudo con el uso de alimentaciones por goteo gástrico nocturno o complementos de almidón de maíz. Por otro lado, los pacientes con miopatía han sido tratados con dietas ricas en proteínas durante el día e infusiones enterales durante la noche. Se ha documentado una mejoría transitoria de los síntomas en unos pocos pacientes, pero no existen datos a largo plazo que demuestren que la dieta rica en proteínas prevenga o trate la miopatía progresiva.VéaseChen YT, Burchell A, Glycogen storage disease. En: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, ValleD.The metabolic and molecular basis of inherited disease. Nueva York: McGraw Hill, 1995: 935-65. La miopatía y/o miocardiopatía progresiva es una causa importante de morbilidad en adultos, y se ha informado de casos de pacientes con cirrosis hepática progresiva y carcinoma hepático. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de un tratamiento que aborde la causa subyacente de esta enfermedad,es decir,la deficiencia de la actividad de la enzima AGL.

[0019] El documento WO2014/130722 describe secuencias que codifican proteínas de fusión de restos internalizantes de AGL humanas de tipo salvaje.

[0021] Hasta la fecha, no se ha explorado el reemplazo enzimático en enfermedades en las que la enzima defectuosa está presente en el citosol tal como AGL en GSD III, presumiblemente debido a la falta de un mecanismo de captación celular eficiente y específico que entregue la enzima exógena a través de la membrana plasmática hasta el citoplasma.

[0023] La presente invención aborda las necesidades arriba mencionadas al proporcionar moléculas, estructuras y composiciones que tienen la capacidad de ser traducidas en el citoplasma para proporcionar AGL activa, que puede mejorar, prevenir o tratar una enfermedad o afección asociada con la AGL tal como GSD III.

[0025] SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0026] La invención se define por el juego de reivindicaciones adjunto. Cualquier referencia a ‘aspectos’ o a ‘la divulgación’ se refiere a materia objeto no reivindicada explícitamente y no define el alcance de la invención, que se define en las reivindicaciones.

[0028] Esta divulgación proporciona composiciones que comprenden moléculas nuevas que tienen la capacidad de ser traducidas, las cuales pueden utilizarse para proporcionar uno o más polipéptidos y proteínas activos, o fragmentos de los mismos. La divulgación proporciona, además, métodos para utilizar estas composiciones que comprenden moléculas nuevas para la prevención o el tratamiento de diversos trastornos. Más específicamente, aspectos de esta divulgación proporcionan composiciones que comprenden moléculas traducibles para proporcionar amilo-alfa-1,6-glucosidasa, 4-alfaglucanotransferasa (AGL) activa, y métodos para utilizar las composiciones para el tratamiento de la GSD III.

[0030] Las moléculas traducibles de esta divulgación pueden tener actividad citoplasmática funcional para producir polipéptidos o proteínas AGL. Los péptidos y proteínas pueden ser activos para modalidades terapéuticas.

[0032] Las moléculas traducibles de esta divulgación pueden tener una semivida prolongada, particularmente en el citoplasma de una célula. Estas moléculas traducibles pueden expresarse para proporcionar un producto que es activo para mejorar, prevenir o tratar una enfermedad o afección asociada con una deficiencia de AGL.

[0034] Esta divulgación proporciona una gama de estructuras para moléculas traducibles destinadas a producir polipéptidos o proteínas AGL. En algunos aspectos, las moléculas traducibles pueden tener una capacidad incrementada para ser traducidas y/o una semivida más larga que la de un ARNm nativo.

[0035] Las moléculas traducibles de esta divulgación pueden utilizarse en medicamentos y para métodos y composiciones para la producción y administración de polipéptidos y proteínas activos. Las moléculas traducibles de esta divulgación pueden utilizarse para proporcionar polipéptidos o proteínasin vitro, ex vivooin vivo.

[0037] Esta divulgación proporciona una gama de nuevos polinucleótidos para expresar una amilo-alfa-1,6-glucosidasa, 4-alfaglucanotransferasa (AGL) humana o un fragmento de la misma que tiene actividad de AGL. Los polinucleótidos pueden incluir nucleótidos naturales y nucleótidos modificados químicamente. Los polinucleótidos pueden expresarse para proporcionar una AGL humana o un fragmento de la misma con actividad de AGL.

[0039] En aspectos adicionales, la divulgación proporciona una gama de nuevos oligómeros traducibles que comprenden uno o más monómeros de ácido nucleico desbloqueado (UNA, por sus siglas en inglés) para expresar una amilo-alfa-1,6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa (AGL) humana, o un fragmento de la misma con actividad de AGL. Un oligómero traducible puede contener uno o más monómeros de UNA, junto con nucleótidos naturales y nucleótidos modificados químicamente. Un oligómero traducible que comprende uno o más monómeros de UNA puede expresarse para proporcionar la amilo-alfa-1,6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa (AGL) humana, o un fragmento de la misma con actividad de AGL.

[0041] En determinados aspectos, las moléculas traducibles de esta divulgación pueden proporcionar una expresión de alta eficacia de un polipéptido o una proteína, o un fragmento del mismo. La expresión puede serin vitro, ex vivoo invivo.

[0042] En algunos aspectos, una molécula de esta divulgación puede tener una semivida citoplasmática más larga que la de un ARNm nativo, maduro que codifica el mismo polipéptido o proteína. Las moléculas y composiciones pueden proporcionar una actividad celular funcional incrementada con respecto a un ARNm nativo maduro.

[0044] En aspectos adicionales, una molécula traducible de esta divulgación puede proporcionar una actividad incrementada como agente farmacológico que proporciona un producto peptídico o proteico, en comparación con un ARNm nativo maduro. Una molécula traducible de esta divulgación puede reducir el nivel de dosis necesaria para una terapia eficaz.

[0046] Las realizaciones de esta divulgación incluyen lo siguiente.

[0048] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0050] La FIG. 1 muestra los resultados de expresarin vitroamilo-alfa-1, 6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa humana (AGL, NM_000028). La FIG. 1 muestra la expresión relativa de AGL en células AML12 y C2C12 normalizadas con respecto a la molécula de referencia 534. El eje vertical refleja el factor de aumento con respecto a la referencia,p. e j,siendo 10 un aumento de 10 veces con respecto a la referencia. Las moléculas, incluida la molécula de referencia, comprenden un UTR 5' del virus del grabado del tabaco (TEV, por sus siglas en inglés) y un UTR 3' de beta-globina de Xenopus (XBG, por sus siglas en inglés). Las moléculas se protegieron durante la transcripción y se sintetizaron con N1-metilpseudouridina, de modo que el 100 % de las uridinas fueron reemplazadas por N1-metilpseudouridina. Las moléculas traducibles que codifican AGL se transfectaron en dos líneas celulares (AML12, C2C12). Las células se lisaron y se recogieron 6 h después de la transfección. Se realizó una transferencia Western cuantitativa para detectar AGL utilizando un anticuerpo específico para AGL (ab133720, conejo).

[0051] La FIG. 2 muestra los resultados de expresarin vitroamilo-alfa-1, 6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa humana (AGL, NM_000028). La FIG. 2 muestra la expresión relativa de AGL en células AML12 y C2C12 normalizadas respecto a la molécula de referencia 534. El eje vertical refleja el factor de aumento con respecto a la referencia;p. e j,siendo 10 un aumento de 10 veces con respecto a la referencia. Las moléculas, incluida la molécula de referencia, comprenden un UTR 5' del virus del grabado del tabaco (TEV) y un UTR 3' de betaglobina de Xenopus (XBG). Las moléculas se protegieron durante la transcripción y se sintetizaron con N1-metilpseudouridina, de modo que el 100 % de las uridinas fueron reemplazadas por N1-metilpseudouridina. Las moléculas traducibles que codifican AGL se transfectaron en dos líneas celulares (AML12, C2C12). Las células se lisaron y se recogieron 24 h después de la transfección. Se realizó una transferencia Western cuantitativa para detectar AGL utilizando un anticuerpo específico para AGL (ab133720, conejo).

[0053] La FIG. 3 muestra los resultados de expresarin vivoamilo-alfa-1, 6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa humana (AGL, NM_000028). La FIG. 3 muestra la expresión relativa de AGL en ratones WT para las moléculas traducibles 528 y 534 (referencia) en los momentos de 24 h y 48 h. Las moléculas comprenden una UTR 5' del virus del grabado del tabaco (TEV) y una UTR 3' de beta-globina de Xenopus (XBG). Las moléculas se protegieron durante la transcripción y se sintetizaron con N1-metilpseudouridina, de modo que el 100 % de las uridinas fueron reemplazadas por N1-metilpseudouridina. Las moléculas traducibles que codifican AGL se prepararon en una formulación de nanopartículas lipídicas y se inyectaron por vía intravenosa en ratones WT a una dosis de 10 mg/kg. Los hígados de los ratones se recogieron a las 24 h y 48 h, y se realizó una transferencia Western cuantitativa para detectar AGL utilizando un anticuerpo específico para AGL (ab133720, conejo).

[0055] La FIG. 4 muestra los resultados de expresar amilo-alfa-1, 6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa (AGL, NM_000028) humanain vivo.La FIG. 4 muestra la expresión hepática relativa de AGL en ratones WT (siglas inglesas de tipo salvaje) post-dosis de moléculas traducibles 525, 527, 528, 529 y 546, en comparación con el valor de referencia de PBS (100). Las moléculas traducibles sintetizadas 525, 527, 528, 529 y 546, que codifican AGL, se prepararon en una formulación de nanopartículas lipídicas y se inyectaron por vía IP en ratones WT. La dosis inyectada fue de 10 mpk y los hígados se recogieron a las 6 h para su posterior análisis. Se realizó una transferencia Western cuantitativa para detectar AGL utilizando un anticuerpo específico para AGL (ab133720, conejo).

[0057] La FIG. 5 muestra el resultado de expresar AGL humana a partir de tres moléculas traducibles: 546, 1783 y 1784. Se transfectaron hepatocitos primarios humanos con ARNm con codones optimizados y se midió la expresión de la proteína AGL mediante In-Cell Western™ a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la transfección. La expresión de las secuencias de ARNm se comparó con la de un control sin tratamiento ("unt").

[0059] La FIG. 6 muestra la expresión de AGL humana a partir de diversas moléculas de ARNm formuladas con nanopartículas lipídicas en ratones C57BL/6 de tipo salvaje. La concentración proteica (ng/mg) de AGL humana exógena expresada a partir de las moléculas de ARNm en homogenizados de muestras de biopsia hepática se determinó mediante un ensayo de monitorización de reacciones múltiples. Las moléculas traducibles mostradas en el gráfico como 546.1,736.1,738.1,737.1,731.1 y 1783.1 son las mismas que 546, 736, 738, 737, 731 y 1783, respectivamente, como se describe en el Ejemplo 2. Por otro lado, la molécula traducible 546.7 tiene la misma secuencia de nucleobases que 546, que se describe en el Ejemplo 2, pero se sintetizó con 5-metoxiuridina en lugar de uridina en lugar de N1-metilpseudouridina, que se utilizó para sintetizar la molécula 546 traducible.

[0060] La FIG. 7 muestra la expresión de AGL de ratón endógena en ratones C57BL/6 de tipo salvaje tratados con diversas moléculas de ARNm formuladas con nanopartículas lipídicas. La concentración proteica (ng/mg) de AGL de ratón endógena expresada en homogenizados de muestras de biopsia hepática se determinó mediante un ensayo de monitorización de reacciones múltiples. Las moléculas traducibles mostradas en el gráfico como 546.1, 736.1,738.1,737.1,731.1 y 1783.1 son las mismas que 546, 736, 738, 737, 731 y 1783, respectivamente, como se describe en el Ejemplo 2. Por otro lado, la molécula 546.7 traducible tiene la misma secuencia de nucleobases que 546, que se describe en el Ejemplo 2, pero se sintetizó con 5-metoxiuridina en lugar de uridina en lugar de N1-metilpseudouridina, que se utilizó para sintetizar la molécula 546 traducible.

[0062] La FIG. 8 muestra la histopatología de un hígado de un ratón deficiente en AGL tratado con vehículo ("VEH"). Se observó una vacuolización de marcada a severa de los hepatocitos y un aumento de moderado a marcado de la acumulación de glucógeno en los hepatocitos tratados con vehículo.

[0064] La FIG. 9 muestra la histopatología de un hígado de un ratón deficiente en AGL tratado con la molécula 546 traducible formulada con nanopartículas lipídicas ATX2. Solo se observó vacuolización de leve a moderada de los hepatocitos y solo aumentos de leves a moderados en la acumulación de glucógeno en los hepatocitos tratados con la molécula 546 traducible formulada con nanopartículas lipídicas ATX2.

[0066] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0067] Esta divulgación proporciona una gama de nuevos agentes y composiciones para aplicaciones terapéuticas. Las moléculas y las composiciones de esta divulgación pueden utilizarse para mejorar, prevenir o tratar la GSD III y/o una enfermedad asociada a la presencia o función reducida de la amilo-alfa-1, 6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa (AGL) en un sujeto.

[0068] En algunos aspectos, la divulgación abarca moléculas de polinucleótidos sintéticos, purificados y traducibles para expresar una amilo-alfa-1,6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa humana. Las moléculas pueden contener nucleótidos naturales y modificados químicamente y pueden codificar la amilo-alfa-1,6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa (AGL) humana, o un fragmento de ésta con actividad de AGL.

[0070] En determinados aspectos, esta divulgación incluye moléculas de oligómeros sintéticos, purificados y traducibles que comprenden uno o más monómeros de UNA para expresar una amilo-alfa-1,6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa (AGL) humana, o un fragmento de la misma con actividad de AGL. Un oligómero traducible puede contener uno o más monómeros de UNA, así como nucleótidos naturales y modificados químicamente. Un oligómero traducible que comprende uno o más monómeros de UNA puede expresarse para proporcionar la amilo-alfa-1,6-glucosidasa, 4-alfaglucanotransferasa (AGL) humana, o un fragmento de la misma con actividad de AGL.

[0072] Tal como se utiliza en esta memoria, el término "traducible" puede utilizarse indistintamente con el término "expresable" y se refiere a la capacidad de un polinucleótido, o una porción del mismo, de ser convertido en un polipéptido por una célula huésped. Como se entiende en la técnica, la traducción es el proceso mediante el cual los ribosomas en el citoplasma de una célula crean polipéptidos. En la traducción, el ARN mensajero (ARNm) es decodificado por los ARNt en un complejo ribosomal para producir una cadena de aminoácidos específica, o polipéptido. Además, el término "traducible", cuando se utiliza en esta memoria descriptiva en referencia a un oligómero, significa que al menos una parte del oligómero,p. e j,la región codificante de una secuencia de oligómero (también conocida como secuencia codificante o CDS), es capaz de convertirse en una proteína o un fragmento de la misma.

[0074] Tal como se utiliza en esta memoria, el término "monómero" se refiere a una sola unidad,p. ej.,un solo ácido nucleico, que puede unirse a otra molécula del mismo tipo o de uno diferente para formar un oligómero. En algunos aspectos, un monómero puede ser un ácido nucleico desbloqueado,es decir,un monómero UNA.

[0076] Por otro lado, el término "oligómero" puede utilizarse indistintamente con "polinucleótido" y se refiere a una molécula que comprende al menos dos monómeros e incluye oligonucleótidos tales como ADN y ARN. En el caso de oligómeros que contienen monómeros de ARN y/o monómeros de ácido nucleico desbloqueado (UNA), los oligómeros de la presente divulgación pueden contener secuencias adicionales a la secuencia codificante (CDS, por sus siglas en inglés). Estas secuencias adicionales pueden ser secuencias no traducidas,es decir,secuencias que la célula huésped no convierte en proteína. Estas secuencias no traducidas pueden incluir un casquete 5', una región no traducida 5' (UTR 5'), una región no traducida 3' (UTR 3') y una región de cola,p. e j,una región de cola de poliA. Como se describe con más detalle en esta memoria, cualquiera de estas secuencias no traducidas puede contener uno o más monómeros de UNA - estos monómeros de UNA no son capaces de ser traducidos por la maquinaria de una célula huésped. En el contexto de la presente divulgación, un "oligómero traducible", una "molécula traducible", un "polinucleótido traducible" o un "compuesto traducible" se refiere a una secuencia que comprende una región,p. ej.,la región codificante de un ARN(p. ej.,la secuencia codificante de AGL humana o una versión optimizada para codones de la misma), que es capaz de convertirse en una proteína o un fragmento de la misma,p. ej.,la proteína AGL humana o un fragmento de la misma.

[0078] Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "optimizada para codones" significa una secuencia codificante natural (o una variante diseñada a propósito de una natural) que se ha rediseñado seleccionando diferentes codones sin alterar la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada, lo que aumenta los niveles de expresión proteica (Gustafsson et al., Codon bias and heterologous protein expression. 2004, Trends Biotechnol 22: 346-53). Se ha demostrado que variables tales como un alto índice de adaptación para codones (CAI, por sus siglas en inglés), el método LowU, las estructuras secundarias del ARNm, las secuencias cis-reguladoras, el contenido de GC y muchas otras variables similares se correlacionan de alguna manera con los niveles de expresión de proteínas (Villalobos et al., Gene Designer: a synthetic biology tool for constructing artificial DNA segments. 2006, BMC Bioinformatics 7:285). El método de alto CAI (índice de adaptación para codones) selecciona el codón sinónimo utilizado con mayor frecuencia para una secuencia codificante de proteínas completa. El codón utilizado con mayor frecuencia para cada uno de los aminoácidos se deduce de 74218 genes codificantes de proteínas del genoma humano. El método LowU fija únicamente como objetivo los codones que contienen U y que pueden reemplazarse por un codón sinónimo con menos restos U. Si existen unas pocas opciones para el reemplazo, se seleccionará el codón más frecuente. El método LowU no modifica los codones restantes de la secuencia. Este método puede utilizarse junto con los ARNm descritos para diseñar secuencias codificantes que se sintetizarán con 5-metoxiuridina.

[0080] Como apreciará el experto en la técnica equipado con la presente divulgación, las moléculas traducibles de la presente divulgación pueden utilizarse para mejorar, prevenir o tratar cualquier enfermedad o trastorno asociado con una actividad reducida (p.e j.,resultante de una concentración, presencia o función reducidas) de la amilo-alfa-1,6-glucosidasa, 4-alfaglucanotransferasa (AGL) en un sujeto. En algunos aspectos, las moléculas traducibles de esta divulgación pueden utilizarse en métodos para mejorar, prevenir o tratar una o más de las siguientes enfermedades: GSD IIIa, GSD IIIb, GSDIIIc y GSDIIId (a las que se alude en esta memoria, colectiva o individualmente, como "GSD III" o "enfermedad del almacenamiento de glucógeno tipo III"). La enfermedad o el trastorno a tratar en esta memoria (p.ej.,GSD IIIa, GSD IIIb, GSDIIIc o GSDIIId ) puede estar asociada con niveles bajos de azúcar en sangre (hipoglucemia), agrandamiento del hígado (hepatomegalia), cantidades excesivas de grasa en la sangre (hiperlipidemia), niveles elevados de enzimas hepáticas en sangre, enfermedad hepática crónica (cirrosis), insuficiencia hepática, crecimiento lento, baja estatura, tumores benignos (adenomas), miocardiopatía hipertrófica, disfunción cardíaca, insuficiencia cardíaca congestiva, miopatía esquelética y/o tono muscular deficiente (hipotonía). En algunos aspectos, las moléculas traducibles de la presente divulgación pueden utilizarse para mejorar, prevenir o tratar alguno o todos estos síntomas mencionados anteriormente.

[0082] Como entiende el experto en la técnica, a la GSD III puede aludirse con diversos nombres alternativos en la técnica, incluyendo, pero no limitados a deficiencia de AGL, enfermedad Cori, enfermedad de Cori, deficiencia de desramificador, enfermedad de Forbes, deficiencia de desramificador de glucógeno, GSD3 o dextrinosis límite (debido a las estructuras similares a la dextrina límite en el citosol). Por consiguiente, la GSD III puede utilizarse indistintamente con cualquiera de estos nombres alternativos en la memoria descriptiva, los ejemplos, los dibujos y las reivindicaciones.

[0084] Una molécula traducible de la divulgación, que codifica un resto funcional de AGL, puede administrarse al hígado, en particular a los hepatocitos, de un paciente que lo necesite(p. e j,un paciente con GSD III), y puede elevar los niveles activos de AGL del paciente. La molécula traducible puede utilizarse para prevenir, tratar, mejorar o revertir cualquier síntoma de GSD III en el paciente.

[0086] En aspectos adicionales, una molécula traducible de esta divulgación también puede utilizarse para reducir la dependencia de un paciente con GSD III a una dieta específica para controlar la enfermedad. Por ejemplo, una molécula traducible de esta divulgación puede utilizarse para reducir la dependencia de un paciente con GSD III a comidas frecuentes ricas en hidratos de carbono y/o dietas anormalmente altas en proteínas.

[0088] Esta divulgación abarca, además, procedimientos para la preparación de una molécula traducible para la expresión de una amilo-alfa-1,6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa (AGL) humana. Los procedimientos incluyen transcribirin vitroun molde de ADN de AGL en presencia de nucleósidos trifosfato naturales y modificados químicamente para formar una mezcla de productos, y purificar la mezcla de productos para aislar la molécula traducible. Una molécula traducible también puede prepararse mediante métodos conocidos en la técnica.

[0090] Las moléculas de esta divulgación pueden ser moléculas traducibles que contienen monómeros de ARN y/o UNA. Estas moléculas traducibles pueden tener una semivida prolongada, particularmente en el citoplasma. Las moléculas traducibles de larga duración pueden utilizarse para mejorar, prevenir o tratar enfermedades o trastornos asociados con una actividad reducida(p. ej.,como resultado de una concentración, presencia o función reducidas) de la amilo-alfa-1,6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa (AGL) en un sujeto.

[0092] Las propiedades de las moléculas traducibles de esta divulgación surgen de acuerdo con su estructura molecular, y la estructura de la molécula en su conjunto puede proporcionar beneficios significativos basados en esas propiedades. Realizaciones de esta divulgación pueden proporcionar moléculas traducibles con una o más propiedades que, ventajosamente, proporcionan una concentración o actividad proteica incrementada. Las moléculas y composiciones de esta divulgación pueden proporcionar formulaciones que comprenden agentes terapéuticos para mejorar, prevenir o tratar cualquier enfermedad o trastorno asociado con una actividad reducida (p.ej.,resultante de una concentración, presencia o función reducidas) de la amilo-alfa-1,6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa (AGL) en un sujeto.

[0094] Esta divulgación proporciona una gama de moléculas traducibles que son sorprendentemente traducibles para proporcionar polipéptidos o proteínas activos,in vitro, ex vivoein vivo.

[0096] Una molécula traducible de esta divulgación se puede expresar para proporcionar uno o más polipéptidos o proteínas activos, o fragmentos de los mismos.

[0097] Las estructuras y composiciones traducibles pueden tener actividad de traducción y semivida citoplasmática incrementadas. En estos aspectos, las estructuras y composiciones traducibles pueden proporcionar una semivida funcional incrementada en el citoplasma de células de mamíferos, en comparación con un ARNm nativo.

[0099] Tal como se utiliza en esta memoria, el término "semivida" es el tiempo requerido para que una cantidad tal como una concentración o actividad de ácido nucleico o proteína caiga a la mitad de su valor medido al comienzo de un período de tiempo.

[0101] En esta memoria se proporciona una gama de estructuras para moléculas traducibles de esta divulgación, incluyendo oligómeros que contienen uno o más monómeros de UNA. Un oligómero que contiene uno o más monómeros de UNA puede incorporar grupos enlazadores especializados. Los grupos enlazadores pueden estar fijados en una cadena en la molécula traducible. Cada uno de los grupos enlazadores también puede estar unido a una nucleobase.

[0103] En algunos aspectos, un grupo enlazador puede ser un monómero. Los monómeros pueden fijarse para formar una molécula en cadena. En una molécula en cadena de esta divulgación, un monómero del grupo enlazador puede fijarse en cualquier punto de la cadena.

[0104] En determinados aspectos, los monómeros del grupo enlazador se pueden fijar en una molécula de la cadena de esta divulgación de modo que los monómeros del grupo enlazador residan cerca de los extremos de la cadena, o en cualquier posición de la cadena.

[0105] En aspectos adicionales, los grupos enlazadores de una molécula de la cadena pueden estar fijados a una nucleobase. La presencia de nucleobases en la molécula de la cadena puede proporcionar una secuencia de nucleobases en la molécula de la cadena.

[0106] En determinados aspectos, esta divulgación proporciona moléculas de oligómeros traducibles que tienen estructuras de cadena que incorporan nuevas combinaciones de monómeros del grupo enlazador, junto con determinados nucleótidos naturales, o nucleótidos no naturales, o nucleótidos modificados, o nucleótidos modificados químicamente.

[0107] Las moléculas de oligómero de esta divulgación pueden presentar una secuencia de nucleobases y pueden diseñarse para expresar un polipéptido o proteína,in vitro, ex vivooin vivo.El polipéptido o la proteína expresado puede tener diversas formas de actividad, incluyendo la actividad correspondiente a una proteína expresada a partir de un ARNm natural, nativo o salvaje, o la actividad correspondiente a una proteína negativa o dominante negativa.

[0108] En algunos aspectos, esta divulgación puede proporcionar moléculas de oligómeros activos y traducibles que tienen una secuencia de bases que es idéntica a al menos un fragmento de una molécula de ácido nucleico nativa de una célula. En algunos aspectos, la célula puede ser una célula eucariótica, una célula de mamífero o una célula humana.

[0109] La divulgación proporciona estructuras, métodos y composiciones para agentes oligoméricos traducibles que incorporan los monómeros del grupo enlazador. Las moléculas de oligómeros de esta divulgación pueden utilizarse como agentes activos en formulaciones para agentes terapéuticos.

[0110] Esta divulgación proporciona una gama de moléculas traducibles que son útiles para proporcionar efectos terapéuticos debido a su capacidad de expresarse como polipéptido o proteína en una célula de un sujeto.

[0111] En determinados aspectos, una molécula traducible puede estructurarse como un oligómero compuesto de monómeros. Las estructuras oligoméricas de esta divulgación pueden contener uno o más monómeros del grupo enlazador, junto con determinados nucleótidos.

[0112] En determinados aspectos, una molécula traducible puede contener una secuencia de nucleobases, y puede diseñarse para expresar un péptido o una proteína de cualquier isoforma, en parte por tener suficiente homología con una secuencia de polinucleótido nativa.

[0113] En algunos aspectos, una molécula traducible puede tener una longitud de aproximadamente 200 a aproximadamente 12.000 monómeros, o más. En determinados aspectos, una molécula traducible puede tener una longitud de aproximadamente 1.000aaproximadamente 9.000 monómeros, una longitud de 3.000 a 7.000 monómeros o una longitud de 4.000 a 6.000 monómeros. En un aspecto ejemplar, la molécula traducible tiene una longitud de 4.500 a 5.500 monómeros. En un aspecto ejemplar adicional, la molécula traducible tiene una longitud de aproximadamente 5.000 monómeros.

[0114] En algunos aspectos, una molécula traducible puede contener de 1 a aproximadamente 800 monómeros de UNA. En determinados aspectos, una molécula traducible puede contener de 1 a 600 monómeros de UNA o 1 a 100 monómeros de UNA o 1 a 12 monómeros de UNA.

[0115] En algunos aspectos, una molécula traducible puede contener de 1 a aproximadamente 800 monómeros de ácido nucleico bloqueado (LNA, por sus siglas en inglés). En determinados aspectos, una molécula traducible puede contener de 1 a 600 monómeros de LNA o 1 a 100 monómeros de LNA o 1 a 12 monómeros de LNA.

[0116] Una molécula traducible de esta divulgación puede comprender un casquete 5', una región no traducida 5' de monómeros, una región codificante de monómeros, una región no traducida 3' de monómeros y una región de cola de monómeros. Una molécula traducible de esta divulgación puede comprender una región 3' no traducida de monómeros que contienen uno o más monómeros de UNA.

[0117] Una molécula traducible de esta divulgación puede comprender una región de cola de monómeros que contienen uno o más monómeros de UNA.

[0118] Una molécula traducible de esta divulgación puede comprender regiones de secuencias o estructuras que pueden actuar para la traducción en una célula, o que tienen la funcionalidad de regiones de un ARNm que incluyen, por ejemplo, un casquete 5', una región no traducida 5', una región codificante, una región no traducida 3' y una cola de poliA.

[0119] La divulgación contempla, además, métodos para administrar uno o más vectores que comprenden una o más moléculas traducibles a una célula. En aspectos adicionales, la divulgación también contempla administrar una o más moléculas traducibles a una célula.

[0121] En algunos aspectos, una o más moléculas traducibles pueden administrarse a una célula,in vitro, ex vivooin vivo.Se pueden utilizar métodos de transferencia viral y no viral, conocidos en la técnica, para introducir moléculas traducibles en células de mamífero. Las moléculas traducibles pueden administrarse con un vehículo farmacéuticamente aceptable o, por ejemplo, con nanopartículas o liposomas.

[0123] En algunos aspectos, las estructuras y composiciones traducibles de esta divulgación pueden reducir la cantidad y la frecuencia de transfecciones requeridas para la manipulación del destino celular en cultivo en comparación con la utilización de composiciones nativas.

[0125] En aspectos adicionales, esta divulgación proporciona una actividad incrementada para las moléculas traducibles como agente activo, en comparación con la utilización de un ARNm nativo.

[0127] En algunos aspectos, esta divulgación puede proporcionar moléculas traducibles que pueden reducir la respuesta inmunitaria innata celular, en comparación con la inducida por un ácido nucleico, polipéptido o proteína nativos.

[0129] Esta divulgación puede proporcionar moléculas sintéticas traducibles que son refractarias a la desadenilación en comparación con las moléculas nativas.

[0131] En determinados aspectos, esta divulgación puede proporcionar moléculas sintéticas traducibles con actividad específica incrementada y una semivida funcional más larga en comparación con las moléculas nativas. Las moléculas sintéticas traducibles de esta divulgación pueden proporcionar niveles de expresión incrementados de proteínas ectópicas. Al expresar una molécula traducible utilizando un vector, la administración celular puede ser a niveles incrementados y se pueden restringir las respuestas inmunitarias innatas citotóxicas, de modo que se puedan alcanzar mayores niveles de expresión de proteínas ectópicas. Las moléculas traducibles de esta divulgación pueden tener actividad específica incrementada y una semivida funcional más larga que los ARNm nativos.

[0133] En determinados aspectos, una molécula traducible puede tener un cierto número de mutaciones con respecto a un ARNm nativo.

[0135] En aspectos adicionales, esta divulgación puede proporcionar moléculas traducibles que tienen restos de administración y fijación de objetivo escindibles fijados en un extremo 3' y/o un extremo 5'.

[0137] En general, la actividad específica de una molécula sintética traducible administrada por transfección puede considerarse como el número de moléculas de proteína expresadas por transcripción administrada por unidad de tiempo.

[0139] Tal como se utiliza en esta memoria, la eficiencia de traducción se refiere a una medida de la producción de una proteína o un polipéptido mediante la traducción de una molécula traduciblein vitrooin vivo.

[0141] Esta divulgación proporciona una gama de moléculas de oligómeros traducibles, que pueden contener uno o más monómeros UNA, y un cierto número de monómeros de ácido nucleico, en donde la molécula traducible puede expresarse para proporcionar un polipéptido o una proteína.

[0143] En algunos aspectos, esta divulgación incluye una gama de moléculas de oligómeros traducibles, que pueden contener uno o más monómeros de UNA en una o más regiones no traducidas, y un cierto número de monómeros de ácido nucleico, en donde la molécula traducible puede expresarse para proporcionar un polipéptido o proteína.

[0144] En algunos aspectos, esta divulgación incluye una gama de moléculas traducibles, que contienen uno o más monómeros de UNA en una región de la cola, y un cierto número de monómeros de ácido nucleico, en donde la molécula traducible puede expresarse para proporcionar un polipéptido o una proteína.

[0146] En algunos aspectos, una molécula traducible puede contener un casquete 5' modificado.

[0148] En aspectos adicionales, una molécula traducible puede contener una región 5' no traducida de monómeros que potencia la traducción.

[0150] En aspectos adicionales, una molécula traducible puede contener una región 3' no traducida de monómeros que potencia la traducción.

[0152] En aspectos adicionales, una molécula traducible puede contener uno o más monómeros de UNA en una región 3' no traducida de monómeros.

[0154] En aspectos adicionales, una molécula traducible puede contener uno o más monómeros de UNA en una región de la cola de monómeros.

[0155] En aspectos adicionales, una molécula traducible puede contener uno o más monómeros de UNA en una cola de poliA.

[0156] En algunos aspectos, una molécula traducible puede contener uno o más monómeros de LNA en una región 3' no traducida de monómeros o en una región de la cola de monómeros,p. ej,en una cola de poliA.

[0158] En otro aspecto, una molécula traducible de esta divulgación puede exhibir una eficiencia de traducción al menos 2 veces, 3 veces, 5 veces o 10 veces mayorin vivoen comparación con un ARNm nativo que codifica el mismo producto de traducción.

[0160] En un aspecto adicional, una molécula traducible puede producir un nivel de polipéptido o proteína al menos 2 veces, 3 veces, 5 veces o 10 veces mayorin vivoen comparación con un ARNm nativo que codifica el mismo polipéptido o proteína.

[0161] En determinados aspectos, una molécula traducible puede proporcionar niveles incrementados de un polipéptido o una proteínain vivoen comparación con un ARNm nativo que codifica el mismo polipéptido o proteína. Por ejemplo, el nivel de un polipéptido o proteína puede aumentarse en un 10 %o20 % o 30 % o 40 % o 50 %, o más.

[0163] En aspectos adicionales, esta divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad o afección en un sujeto administrando al sujeto una composición que contiene una molécula traducible de la divulgación.

[0165] Una molécula traducible de esta divulgación puede utilizarse para mejorar, prevenir o tratar una enfermedad o un trastorno,p. ej.,una enfermedad o un trastorno asociado con una actividad reducida (p.ej., resultante de una concentración, presencia y/o función reducida) de amilo-alfa-1, 6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa (AGL) en un sujeto. En estos aspectos, una composición que comprende una molécula traducible de esta divulgación puede administrarse para regular, modular o aumentar la concentración o la eficacia de la enzima AGL en un sujeto. En algunos aspectos, la enzima puede ser una enzima natural no modificada para la cual el paciente tiene una cantidad anormal(p. ej.,un paciente con una versión mutada de AGL que elimina parcial o totalmente la actividad de AGL). En algunos aspectos, la enzima puede ser una enzima AGL natural no modificada que puede utilizarse para tratar a un paciente que alberga una versión mutada de AGL. En aspectos ejemplares, una molécula traducible de esta divulgación puede utilizarse para mejorar, prevenir o tratar GSD III.

[0167] En algunos aspectos, una molécula traducible puede administrarse a células o sujetos, y puede traducirse para aumentar los niveles de AGL en la célula o sujeto.

[0169] Tal como se utiliza en esta memoria, el término "sujeto" se refiere a un ser humano o a cualquier animal no humano(p. ej.,ratón, rata, conejo, perro, gato, ganado vacuno, cerdo, oveja, caballo o primate). Un ser humano incluye las formas prenatales y posnatales. En muchos aspectos, un sujeto es un ser humano. Un sujeto puede ser un paciente, lo que se refiere a un ser humano que acude a un profesional médico para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad. El término "sujeto" se utiliza en esta memoria indistintamente con "individuo" o "paciente". Un sujeto puede padecer o ser susceptible a una enfermedad o trastorno, pero puede o no presentar síntomas de la enfermedad o trastorno.

[0171] En un aspecto ejemplar, un sujeto de la presente divulgación es un sujeto con actividad reducida (p.ej.,como resultado de una concentración, presencia y/o función reducidas) de amilo-alfa-1,6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa (AGL). En un aspecto ejemplar adicional, el sujeto es un ser humano.

[0173] En algunos aspectos, la administración de una composición que comprende una molécula traducible de la divulgación puede resultar en niveles incremerntados de proteína AGL hepática en un sujeto tratado. En algunos aspectos, la administración de una composición que comprende una molécula traducible de la divulgación resulta en un aumento de aproximadamente el 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % en los niveles de proteína AGL hepática con respecto al nivel de referencia de proteína AGL en el sujeto antes del tratamiento. En un aspecto ejemplar, la administración de una composición que comprende una molécula traducible de la divulgación resulta en un aumento de los niveles de AGL hepática con respecto al nivel de referencia de AGL hepática en el sujeto antes del tratamiento. En algunos aspectos, el aumento de los niveles de AGL hepática puede ser de al menos aproximadamente el 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 100 %, 200 % o más.

[0175] En algunos aspectos, la proteína AGL, que se expresa a partir de una molécula traducible de la divulgación, es detectable en el hígado, suero, plasma, riñón, corazón, músculo, cerebro, líquido cefalorraquídeo o ganglios linfáticos. En aspectos ejemplares, la proteína AGL se expresa en las células hepáticas,p. ej,los hepatocitos de un sujeto tratado.

[0177] En algunos aspectos, administrar una composición que comprende una molécula traducible de la divulgación da como resultado la expresión de un nivel de proteína AGL humana natural, no mutada(es decir,AGL normal o de tipo salvaje en contraposición a AGL anormal o mutada) en o por encima de aproximadamente 10 ng/mg, aproximadamente 20 ng/mg, aproximadamente 50 ng/mg, aproximadamente 100 ng/mg, aproximadamente 150 ng/mg, aproximadamente 200 ng/mg, aproximadamente 250 ng/mg, aproximadamente 300 ng/mg, aproximadamente 350 ng/mg, aproximadamente 400 ng/mg, aproximadamente 450 ng/mg, aproximadamente 500 ng/mg, aproximadamente 600 ng/mg, aproximadamente 700 ng/mg, aproximadamente 800 ng/mg, aproximadamente 900 ng/mg, aproximadamente 1000 ng/mg, aproximadamente 1200 ng/mg o aproximadamente 1500 ng/mg de la proteína total en el hígado de un sujeto tratado.

[0179] Tal como se utiliza en esta memoria, el término "aproximadamente" o “alrededor de”, aplicado a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En determinados aspectos, el término "aproximadamente" o “alrededor de” se refiere a un intervalo de valores que se encuentra dentro del 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos, en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia establecido, a menos que se indique lo contrario o sea evidente del contexto (excepto en los casos en los un número de este tipo supere el 100 % de un valor posible).

[0181] En algunos aspectos, la expresión de la proteína AGL humana natural, no mutada, se detecta 6, 12, 18, 24, 30, 36, 48, 60 y/o 72 horas después de la administración de una composición que comprende una molécula traducible de la divulgación. En algunos aspectos, la expresión de la proteína AGL humana natural, no mutada, es detectable 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días y/o 7 días después de la administración de una composición que comprende una molécula traducible de la divulgación. En algunos aspectos, la expresión de la proteína AGL humana natural, no mutada, es detectable 1 semana, 2 semanas, 3 semanas y/o 4 semanas después de la administración. En algunos aspectos, la expresión de la proteína AGL humana natural, no mutada, es detectable tras la administración de una composición que comprende una molécula traducible de la divulgación. En algunos aspectos, la expresión de la proteína AGL humana natural, no mutada es detectable en el hígado,p. ej.,hepatocitos, después de la administración de una composición que comprende una molécula traducible de la divulgación.

[0183] Moldes Variantes para Producir Moléculas Traducibles

[0185] En diversos aspectos descritos en esta memoria, el oligómero traducible puede comprender un ARNm que codifica AGL, en donde el ARNm que codifica AGL está optimizado para codones. En algunos aspectos, la AGL es AGL humana (es decir, hAGL). En algunos aspectos, la AGL humana comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En algunos aspectos, la AGL humana consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0187] En algunos aspectos, se puede utilizar un molde de ADN variante para producir una molécula traducible capaz de codificar AGL. Un molde de ADN variante de esta divulgación puede exhibir ventajas en procesos para producir una molécula traducible y en la eficiencia de la molécula traducible. La variación del molde puede utilizarse para potenciar la incorporación de nucleótidos o monómeros modificados en una molécula traducible de esta divulgación. En determinados aspectos, la variación del molde puede utilizarse para potenciar las características estructurales de la molécula traducible. Las características estructurales potenciadas de la molécula traducible pueden proporcionar propiedades inesperadamente ventajosas, incluyendo la eficiencia de la traducción para proporcionar un producto polipeptídico o proteico.

[0189] En algunos aspectos de esta divulgación, la variación del molde puede incluir la reducción de la presencia o frecuencia de aparición de determinados nucleótidos en la cadena del molde. Reducir la presencia de un nucleótido determinado puede alterar las estructuras y los procedimientos de esta divulgación para proporcionar formas no nativas, que logran propiedades sorprendentemente mejoradas de un producto de ARN traducible que codifica AGL.

[0191] Aspectos de esta divulgación pueden requerir un molde de ADN variante en los procedimientos para producir una molécula traducible. Una molécula de ADN puede tener una cadena de nucleótidos no codificante como molde que puede transcribirse para proporcionar una molécula traducible diana que codifica AGL.

[0193] Una molécula traducible diana puede ser cualquier ARN, ya sea nativo o modificado, sintético o derivado de una fuente natural.

[0195] En algunos aspectos, se puede utilizar un molde de ADN variante para el cual un marco de lectura abierto de la cadena del molde se transforma en una forma alternativa, al tiempo que se conserva la asignación de codones.

[0196] En determinados aspectos, se puede utilizar un molde de ADN para el cual se utilizan nucleótidos alternativos basados en la optimización para codones alternativos y/o la degeneración de secuencia.

[0198] En aspectos adicionales, un molde de ADN puede tener determinados nucleótidos reemplazados por nucleótidos alternativos, al tiempo que se conserva la asignación de codones.

[0200] Realizaciones de esta divulgación utilizan ventajosamente codones alternativos en un molde de ADN de esta divulgación a utilizar en procedimientos para producir una molécula traducible que codifica AGL. Las variaciones que se pueden lograr en un molde de ADN de esta divulgación pueden ser mucho mayores que para células y organismos, que pueden requerir codones preferidos en muchos procedimientos. En esta divulgación, se puede utilizar una amplia gama de codones y posiciones alternativos en un molde de ADN para transcribir una molécula traducible.

[0202] En aspectos adicionales de la divulgación, la variación del molde puede incluir reducir la presencia o frecuencia de aparición de determinados nucleótidos en la cadena del molde. Por ejemplo, la presencia de un nucleótido en un molde puede reducirse a un nivel por debajo del 25 % de los nucleótidos en el molde. En ejemplos adicionales, la presencia de un nucleótido en un molde puede reducirse a un nivel inferior al 20 % de los nucleótidos en el molde. En algunos ejemplos, la presencia de un nucleótido en un molde puede reducirse a un nivel inferior al 16 % de los nucleótidos en el molde. En determinados ejemplos, la presencia de un nucleótido en un molde puede reducirse a un nivel inferior al 12 % de los nucleótidos en el molde.

[0204] AGL humana

[0206] El gen AGL humano codifica una proteína de 1532 aminoácidos con una masa molecular de aproximadamente 174,8 kDa. La AGL es una enzima multifuncional que actúa como 1,4-alfa-D-glucano:1,4-alfa-D-glucano-4-alfa-D-glicosiltransferasa y amilo-1,6-glucosidasa en la degradación del glucógeno. Como se señaló arriba, la deficiencia genética de la actividad normal de la AGL provoca la enfermedad del almacenamiento de glucógeno III.

[0208] La secuencia codificante de consenso AGL humana tiene una secuencia de ARN de 4.599 nucleobases, mostrada en SEQ ID NO: 1.

[0210] La secuencia codificante de consenso AGL humana, que se encuentra en el número de acceso de NCBI NP_000019.2, se traduce en SEQ ID NO: 2.

[0212] En algunos aspectos, se puede producir una molécula traducible y utilizarla para expresar la amilo-alfa-1, 6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa humana (hAGL) con una eficiencia de traducción ventajosamente mayor, en comparación con un ARNm nativo de hAGL. La molécula traducible que expresa hAGL puede exhibir una actividad adecuada para su uso en métodos para mejorar, prevenir o tratar enfermedades. En algunos aspectos, la molécula traducible puede comprender uno o más monómeros de UNA.

[0214] En algunos aspectos, una molécula traducible puede incluir un casquete 5', una UTR 5', una secuencia de iniciación de la traducción,p. ej.,una secuencia Kozak, una CDS de AGL humana, una UTR 3' y/o una región de la cola. En un aspecto ejemplar, una molécula traducible puede incluir un casquete 5' (m7GpppGm), una UTR 5' del virus del grabado del tabaco (TEV), una secuencia Kozak, una CDS de AGL humana, una UTR 3' de beta-globina de Xenopus y una región de la cola. En aspectos ejemplares adicionales, la CDS de AGL humana puede comprender una secuencia optimizada para codones de SEQ ID NOs: 7-32 o SEQ ID NOs: 41-45, que se describe con más detalle más adelante. En cualquiera de estos y otros aspectos descritos en esta memoria, la molécula traducible puede comprender uno o más monómeros de UNA. En cualquiera de estos y otros aspectos descritos en esta memoria, la molécula traducible puede comprender uno o más monómeros de LNA.

[0216] La eficacia de traducción de la molécula puede aumentarse en comparación con un ARNm nativo de AGL. En particular, después de 48 horas, la eficacia de traducción de la molécula puede ser más del doble en comparación con la del ARNm nativo de AGL.

[0218] En algunos aspectos, una secuencia de ARNm adecuada para la presente divulgación comprende una secuencia de ARNm que codifica la proteína AGL humana. La secuencia de la proteína AGL humana natural se muestra en SEQ ID NO: 2.

[0220] En algunos aspectos, una secuencia de ARNm adecuada puede ser una secuencia de ARNm que codifica un homólogo o una variante de la proteína AGL humana. Tal como se utiliza en esta memoria, un homólogo o una variante de la proteína AGL humana puede ser una proteína AGL humana modificada que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos en comparación con una proteína AGL humana salvaje o que se produce de forma natural, conservando al mismo tiempo una actividad proteica AGL sustancial. En algunos aspectos, un ARNm adecuado para la presente divulgación codifica una proteína sustancialmente idéntica a la proteína AGL humana. En algunos aspectos, un ARNm adecuado para la presente divulgación codifica una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a SEQ ID NO: 2. En algunos aspectos, un ARNm adecuado para la presente divulgación codifica un fragmento o una porción de la proteína AGL humana.

[0222] En algunos aspectos, un ARNm adecuado para la presente divulgación codifica un fragmento o una parte de la proteína AGL humana, en donde el fragmento o la parte de la proteína aún mantiene una actividad de AGL similar a la de la proteína de tipo salvaje.

[0224] En algunos aspectos, un ARNm adecuado para la presente divulgación comprende una secuencia que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a SEQ ID NOs: 7-32 o SEQ ID NOs: 41-45.

[0226] En algunos aspectos, una molécula oligomérica traducible de la presente divulgación comprende una secuencia codificante que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a SEQ ID NOs: 7-32 o SEQ ID NOs: 41-45. En algunos aspectos, una molécula oligomérica traducible que comprende una secuencia codificante que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a SEQ ID NOs: 7-32 o SEQ ID NOs: 41-45 comprende, además, una o más secuencias seleccionadas de un casquete 5', una UTR 5', una secuencia de iniciación de la traducción, una UTR 3' y una región de la cola.

[0227] En algunos aspectos, una molécula oligomérica traducible de la presente divulgación comprende una secuencia codificante que es 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia codificante de AGL humana salvaje a lo largo de la longitud completa de la secuencia codificante de AGL humana de SEQ ID NO: 1, y expresa una proteína AGL humana funcional. En un aspecto ejemplar, una molécula oligomérica traducible de la presente divulgación comprende una secuencia codificante que es menos del 80 % idéntica a la secuencia codificante de AGL humana salvaje en toda la secuencia codificante de AGL humana de SEQ ID NO: 1, y expresa una proteína AGL humana funcional. En otro aspecto ejemplar, una molécula oligomérica traducible de la presente divulgación comprende una secuencia codificante que es menos del 80 % idéntica a la secuencia codificante de AGL humana de tipo salvaje a lo largo de la longitud completa de la secuencia codificante de AGL humana de SEQ ID NO: 1, y expresa una proteína AGL humana funcional, en donde la secuencia codificante es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 7-32 o SEQ ID NOs: 41 -45. En aún otro aspecto ejemplar, una molécula oligomérica traducible de la presente divulgación comprende una secuencia codificante que es menos del 80 % idéntica a la secuencia codificante de AGL humana de tipo salvaje a lo largo de la longitud completa de la secuencia codificante de AGL humana de SEQ ID NO: 1, y expresa una proteína AGL humana funcional, en donde la secuencia codificante es al menos 95 % idéntica a una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 7-32 o SEQ ID NOs: 41 -45. En aún otro aspecto ejemplar, una molécula oligomérica traducible de la presente divulgación comprende una secuencia codificante que es menos del 80 % idéntica a la secuencia codificante de AGL humana de tipo salvaje a lo largo de la longitud completa de la secuencia codificante de AGL humana de SEQ ID NO: 1, y expresa una proteína AGL humana funcional, en donde la secuencia codificante es al menos un 95 % idéntica a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 45. Por consiguiente, en algunos aspectos, la presente solicitud proporciona un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia de nucleobases con una identidad que es menos del 80 % idéntica a la secuencia codificante de AGL humana de tipo salvaje a lo largo de la longitud completa de la secuencia codificante de AGL humana de SEQ ID NO: 1, y donde la secuencia codificante de AGL humana es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98%, 99% o más idéntico a una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 7-32 o SEQ ID NOs: 41-45. En un aspecto ejemplar, la presente solicitud proporciona un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia de nucleobases que es menos del 80 % idéntica a la secuencia codificante de AGL humana de tipo salvaje en la secuencia codificante de AGL humana de longitud completa de SEQ ID NO: 1, y en donde la secuencia codificante de AGL humana es al menos un 95 % idéntica a una secuencia seleccionada de S<e>Q ID NO: 19, SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 45. En un aspecto específico, la presente solicitud proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleobases que es menos del 80 % idéntica a la secuencia codificante de AGL humana de tipo salvaje en la secuencia codificante de AGL humana de longitud completa de SEQ ID NO: 1, y en donde la secuencia codificante de AGL humana es al menos un 95 % idéntica a SEQ ID NO: 19. En otro aspecto específico, la presente solicitud proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleobases que es menos del 80 % idéntica a la secuencia codificante de AGL humana de tipo salvaje en la secuencia codificante de AGL humana de longitud completa de SEQ ID NO: 1, y en donde la secuencia codificante de AGL humana es al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 31. En otro aspecto específico, la presente solicitud proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleobases con una identidad que es menos del 80 % a la secuencia codificante de AGL humana de tipo salvaje a lo largo de la longitud completa de la secuencia codificante de AGL humana de SEQ ID NO: 1, y en donde la secuencia codificante de AGL humana es al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 45.

[0229] En algunos aspectos, una molécula oligomérica traducible de la divulgación codifica una proteína de fusión que comprende una proteína AGL completa, un fragmento o una porción de una proteína AGL condensada a otra secuencia(p. ej.,una fusión N o C-terminal). En algunos aspectos, la secuencia N- o C-terminal es una secuencia señal o una secuencia de fijación de objetivo celular.

[0231] Monómeros y Oligómeros de UNA

[0233] En algunos aspectos, los monómeros del grupo enlazador pueden ser nucleomonómeros desbloqueados (monómeros UNA), que son pequeñas moléculas orgánicas basadas en una estructura de propano-1,2,3-tri-il-trisoxi como se muestra a continuación.

[0236]

[0239] en donde R1 y R2 son H, y R1 y R2 pueden ser enlaces fosfodiéster, Base puede ser una nucleobase y R3 es un grupo funcional que se describe más adelante.

[0240] En otra vista, los átomos principales del monómero UNA se pueden dibujar en notación IUPAC de la siguiente manera:

[0243]

[0245] en que la dirección del progreso de la cadena de oligómero es desde el extremo 1 al extremo 3 del residuo de propano. Ejemplos de una nucleobase incluyen uracilo, timina, citosina, 5-metilcitosina, adenina, guanina, inosina y análogos de nucleobase naturales y no naturales.

[0246] Ejemplos de una nucleobase incluyen pseudouracilo, 1-metilpseudouracilo (mW),es decir,N1-metilpseudouracilo y 5-metoxiuracilo.

[0247] En general, un monómero de UNA, que no es un nucleótido, puede ser un monómero de enlazador interno en un oligómero. Un monómero de UNA interno en un oligómero está flanqueado por otros monómeros a ambos lados.

[0248] Un monómero de UNA puede participar en el apareamiento de bases cuando el oligómero forma un complejo o dúplex, por ejemplo, y existen otros monómeros con nucleobases en el complejo o dúplex.

[0249] A continuación se muestran ejemplos de monómero de UNA como monómeros internos flanqueados tanto en la posición propano-1-ilo como en la posición propano-3-ilo, en que R3 es -OH.

[0252]

[0253]

[0256] Un monómero de UNA puede ser un monómero terminal de un oligómero, en que el monómero de UNA está fijado a un solo monómero en la posición propano-1-ilo o en la posición propano-3-ilo. Dado que los monómeros de UNA son estructuras orgánicas flexibles, a diferencia de los nucleótidos, el monómero de UNA terminal puede ser un terminador flexible para el oligómero.

[0258] A continuación se muestran ejemplos de un monómero de UNA como monómero terminal fijado en la posición propano-3-ilo.

[0261]

[0264] Dado que un monómero de UNA puede ser una molécula flexible, un monómero de UNA como monómero terminal puede adoptar conformaciones muy diversas. A continuación se muestra un ejemplo de una conformación de monómero de UNA con energía minimizada como monómero terminal unido a la posición propano-3-ilo.

[0265]

[0267] Formas terminales de UNA-A: el enlace discontinuo muestra la fijación propano-3-ilo.

[0268] Entre otras cosas, la estructura del monómero de UNA permite que se fije a nucleótidos que se producen de forma natural. Un oligómero de UNA puede ser una cadena compuesta de monómeros de UNA, así como diversos nucleótidos que pueden basarse en nucleósidos que se producen de forma natural.

[0269] En algunos aspectos, el grupo funcional R3 de un monómero de UNA puede ser -OR4, -SR4, -NR4<2>, -NH(C=O)R4, morfolino, morfolin-1-ilo, piperazin-1-ilo o 4-alcanoil-piperazin-1-ilo, en donde R4 es el mismo o diferente para cada aparición, y puede ser H, alquilo, un colesterol, una molécula de lípido, una poliamina, un aminoácido o un polipéptido.

[0270] Las moléculas de UNA son moléculas orgánicas. Las moléculas de UNA no son monómeros de ácidos nucleicos ni nucleótidos, ni nucleósidos naturales ni nucleósidos naturales modificados.

[0271] Un oligómero de UNA de esta divulgación es una molécula de cadena sintética.

[0272] En algunos aspectos, como se muestra arriba, un monómero de UNA puede ser UNA-A (designado Á), UNA-U (designado Ü), UNA-C (designado C) y UNA-G (designado G).

[0273] Designaciones que se pueden utilizar en esta memoria incluyen mA, mG, mC y mU, que se refieren a los ribonucleótidos modificados con 2'-O-metilo.

[0274] Designaciones que se pueden utilizar en esta memoria incluyen dT, que se refiere a un nucleótido 2'-desoxi T.

[0275] Tal como se utiliza en esta memoria, en el contexto de secuencias de oligómeros, el símbolo N puede representar cualquier monómero de nucleótido natural o cualquier monómero de nucleótido modificado.

[0276] Tal como se utiliza en esta memoria, en el contexto de secuencias de oligómeros, el símbolo Q representa un monómero de nucleótido no natural, modificado o modificado químicamente.

[0277] Tal como se utiliza en esta memoria, en el contexto de secuencias de oligómeros, el símbolo X puede utilizarse para representar un monómero de UNA.

[0278] Nucleótidos Modificados y Modificados Químicamente

[0279] En los ejemplos de nucleótidos modificados o modificados químicamente en esta memoria, un sustituyente alquilo, cicloalquilo o fenilo puede no estar sustituido o puede estar sustituido, además, con uno o más sustituyentes alquilo, halo, haloalquilo, amino o nitro.

[0280] Ejemplos de monómeros de ácidos nucleicos incluyen nucleótidos no naturales, modificados y modificados químicamente, incluyendo cualquiera de los nucleótidos de este tipo conocidos en la técnica.

[0281] Ejemplos de nucleótidos modificados o químicamente modificados incluyen 5-hidroxicitidinas, 5-alquilcitidinas, 5-hidroxialquilcitidinas, 5-carboxicitidinas, 5-formilcitidinas, 5-alcoxicitidinas, 5-alquinilcitidinas, 5-halocitidinas, 2-tiocitidinas, N4- alquilcitidinas, N4- aminocitidinas, N4-acetilcitidinas y N4,N4-dialquilcitidinas.

[0282] Ejemplos de nucleótidos modificados o modificados químicamente incluyen 5-hidroxicitidina, 5-metilcitidina, 5-hidroximetilcitidina, 5-carboxicitidina, 5-formilcitidina, 5-metoxicitidina, 5-propinilcitidina, 5-bromocitidina, 5-yodocitidina, 2-tiocitidina; N4-metilcitidina, N4-aminocitidina, N4-acetilcitidina y N4,N4-dimetilcitidina.

[0283] Ejemplos de nucleótidos modificados o modificados químicamente incluyen 5-hidroxiuridinas, 5-alquiluridinas, 5-hidroxialquiluridinas, 5-carboxiuridinas, 5-carboxialquilesteruridinas, 5-formiluridinas, 5-alcoxiuridinas, 5-alquiniluridinas, 5-halouridinas, 2-tiouridinas y 6-alquiluridinas.

[0284] Ejemplos de nucleótidos modificados o modificados químicamente incluyen 5-hidroxiuridina, 5-metiluridina, 5-hidroximetiluridina, 5-carboxiuridina, 5-carboximetilesteruridina, 5-formiluridina, 5-metoxiuridina, 5-propiniluridina, 5-bromouridina, 5-fluorouridina, 5-yodouridina, 2-tiouridina y 6-metiluridina.

[0286] Ejemplos de nucleótidos modificados o modificados químicamente incluyen 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina, 5-metilaminometil-2-tiouridina, 5-carbamoilmetiluridina, 5-carbamoilmetil-2'-O-metiluridina, 1 -metil-3-(3-amino-3-carboxipropil) pseudouridina, 5-metilaminometil-2-selenouridina, 5-carboximetiluridina, 5-metildihidrouridina, 5-taurinometiluridina, 5- taurinometil-2-tiouridina, 5-(isopentenilaminometil)uridina, 2'-O-metilpseudouridina, 2-tio-2'O-metiluridina y 3,2'-O-dimetiluridina.

[0287] Ejemplos de nucleótidos modificados o modificados químicamente incluyen N6-metiladenosina, 2-aminoadenosina, 3-metiladenosina, 8-azaadenosina, 7-deazaadenosina, 8-oxoadenosina, 8-bromoadenosina, 2-metiltio-N6-metiladenosina , N6-isopenteniladenosina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina, 2-metiltio-N6-(cishidroxiisopentenil )adenosina, N6-glicinilcarbamoiladenosina, N6-treonilcarbamoil-adenosina, N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina, 2-metiltio- N6-treonilcarbamoil-adenosina, N6,N6-dimetiladenosina, N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina, 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenosina, N6-acetil-adenosina, 7-metil-adenina, 2-metiltio-adenina, 2-metoxi-adenina, alfa-tio-adenosina, 2'-O-metil-adenosina, N6-2'-O-dimetil-adenosina, N6,N6,2'- O-trimetil-adenosina, 1,2'-O-dimetiladenosina, 2'-O-ribosiladenosina, 2-amino-N6-metil-purina, 1-tio-adenosina, 2'-F-ara-adenosina, 2'-F-adenosina, 2'-OH-ara-adenosina y N6-(19-amino-pentaoxanonadecil)-adenosina.

[0289] Ejemplos de nucleótidos modificados o modificados químicamente incluyen N1-alquilguanosinas, N2-alquilguanosinas, tienoguanosinas, 7-deazaguanosinas, 8-oxoguanosinas, 8-bromoguanosinas, O6-alquilguanosinas, xantosinas, inosinas y N1-alquilinosinas.

[0291] Ejemplos de nucleótidos modificados o modificados químicamente incluyen N1-metilguanosina, N2-metilguanosina, tienoguanosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoguanosina, 8-bromoguanosina, O6-metilguanosina, xantosina, inosina y N1-metilinosina.

[0293] Ejemplos de nucleótidos modificados o modificados químicamente incluyen pseudouridinas. Ejemplos de pseudouridinas incluyen N1-alquilpseudouridinas, N1-cicloalquilpseudouridinas, N1-hidroxipseudouridinas, N1-hidroxialquilpseudouridinas, N1-fenilpseudouridinas, N1-fenilalquilpseudouridinas, N1-aminoalquilpseudouridinas, N1-alquilpseudouridinas, N6-alquilpseudouridinas, N6-alcoxipseudouridinas, N6-hidroxipseudouridinas, N6-hidroxialquilpseudouridinas, N6-morfolinopseudouridinas, N6-fenilpseudouridinas y N6-halopseudouridinas. Ejemplos de pseudouridinas se incluyen N1-alquil-N6- alquilpseudouridinas, N1-alquil-N6-alcoxipseudouridinas, N1-alquil-N6-hidroxipseudouridinas, N1 -alquil-N6-hidroxialquilpseudouridinas, N1-alquil-N6-morfolinopseudouridinas, N1-alquil-N6-fenilpseudouridinas y N1-alquil-N6-halopseudouridinas. En estos ejemplos, los sustituyentes alquilo, cicloalquilo y fenilo pueden estar sin sustituir o sustituidos con sustituyentes alquilo, halo, haloalquilo, amino o nitro.

[0295] Ejemplos de pseudouridinas incluyen N1-metilpseudouridina, N1-etilpseudouridina, N1-propilpseudouridina, N1--ciclopropilpseudouridina, N1-fenilpseudouridina, N1-aminometilpseudouridina, N3-metilpseudouridina, N1-hidroxipseudouridina y N1-hidroximetilpseudouridina.

[0297] Ejemplos de monómeros de ácidos nucleicos incluyen nucleótidos modificados y modificados químicamente, incluyendo cualquiera de nucleótidos de este tipo conocidos en la técnica.

[0299] Ejemplos de monómeros de nucleótidos modificados y modificados químicamente incluyen cualquiera de nucleótidos de este tipo conocidos en la técnica, por ejemplo, ribonucleótidos de 2'-O-metilo, nucleótidos de 2'-O-metilpurina, ribonucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro, nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoropirimidina, ribonucleótidos de 2'-desoxi, nucleótidos de 2'-desoxipurina, nucleótidos de base universal, 5-C-metilnucleótidos y residuos monoméricos desoxibásicos invertidos.

[0300] Ejemplos de monómeros de nucleótidos modificados y modificados químicamente incluyen nucleótidos estabilizados en el extremo 3', nucleótidos de glicerilo 3', nucleótidos abásicos invertidos 3' y timidina invertida 3'.

[0302] Ejemplos de monómeros de nucleótidos modificados y modificados químicamente incluyen los nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA), nucleótidos 2'-O,4'-C-metileno-(D- ribofuranosil o), nucleótidos 2'-metoxietoxi (MOE), nucleótidos 2'-metil-tio-etilo, 2'-desoxi-2'-fluoro y nucleótidos 2'-O-metilo. En un aspecto ejemplar, el monómero modificado es un nucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA).

[0304] Ejemplos de monómeros de nucleótidos modificados y modificados químicamente incluyen ADNs modificados con 2'-O-metoxietilo (cMOE) y 2'-O-etilo (cEt) restringidos en 2',4'.

[0306] Ejemplos de monómeros de nucleótidos modificados y modificados químicamente incluyen nucleótidos de 2'-amino, nucleótidos de 2'-O-amino, nucleótidos de 2'-C-alilo y nucleótidos de 2'-O-alilo.

[0308] Ejemplos de monómeros de nucleótidos modificados y modificados químicamente incluyen nucleótidos de N6-metiladenosina.

[0309] Ejemplos de monómeros de nucleótidos modificados y modificados químicamente incluyen monómeros de nucleótidos con bases modificadas 5-(3-amino)propiluridina, 5-(2-mercapto)etiluridina, 5-bromouridina; 8-bromoguanosina o 7-deazaadenosina.

[0310] Ejemplos de monómeros de nucleótidos modificados y modificados químicamente incluyen nucleótidos sustituidos con 2'-O-aminopropilo.

[0311] Ejemplos de monómeros de nucleótidos modificados y modificados químicamente incluyen reemplazar el grupo 2'-OH de un nucleótido por un 2'-R, un 2'-OR, un 2'-halógeno, un 2'-SR o un 2'-amino, en que R puede ser H, alquilo, alquenilo o alquinilo.

[0312] Algunos ejemplos de nucleótidos modificados se dan en Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag, 1984.

[0313] Ejemplos de modificaciones de bases arriba descritas se pueden combinar con modificaciones adicionales de la estructura de nucleósidos o nucleótidos, incluyendo modificaciones de azúcares y modificaciones de enlace.

[0314] Se pueden encontrar en la naturaleza determinados monómeros de nucleótidos modificados o modificados químicamente.

[0315] Moléculas Traducibles que Contienen Uno o Más Monómeros de UNA

[0316] Aspectos de la divulgación proporcionan estructuras y composiciones para moléculas traducibles que son compuestos oligoméricos que contienen uno o más monómeros de UNA. Los oligómeros traducibles pueden ser agentes activos para composiciones farmacéuticas. En algunos aspectos, los oligómeros traducibles codifican AGL humana o una variante de la misma.

[0317] Una molécula oligomérica traducible de esta divulgación puede contener uno o más monómeros de UNA. Moléculas oligoméricas de esta divulgación se pueden utilizar como agentes activos en formulaciones para suministrar agentes terapéuticos peptídicos y proteicos. En algunos aspectos, los oligómeros traducibles codifican<a>G<l>humana o una variante de la misma.

[0318] En algunos aspectos, esta divulgación proporciona compuestos oligoméricos traducibles que tienen una estructura que incorpora nuevas combinaciones de monómeros de U<n a>con determinados nucleótidos naturales, nucleótidos no naturales, nucleótidos modificados o nucleótidos modificados químicamente.

[0319] Compuestos oligoméricos traducibles de esta divulgación pueden tener una longitud de aproximadamente 200 a aproximadamente 12.000 bases. Compuestos oligoméricos traducibles de esta divulgación pueden tener una longitud de aproximadamente 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 o aproximadamente 9000 bases. En algunos aspectos, compuestos oligoméricos traducibles de esta divulgación pueden tener una longitud de aproximadamente 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400 o aproximadamente 5500 bases. En un aspecto ejemplar, el compuesto oligomérico traducible de la divulgación tiene una longitud de aproximadamente 5000 bases.

[0320] En aspectos adicionales, el compuesto oligomérico traducible de esta divulgación, que comprende uno o más monómeros de UNA, pueden ser moléculas farmacológicamente activas. Una molécula oligomérica traducible puede utilizarse como ingrediente farmacéutico activo para generar un agente activo peptídico o proteicoin vitro, in vivooex vivo.En un aspecto ejemplar, el compuesto oligomérico traducible de esta divulgación codifica AGL humana o una variante de la misma. Una molécula oligomérica traducible de esta divulgación puede tener la estructura de la Fórmula I:

[0323]

Fórmula I

[0324] en donde L1 es un enlace, n es de 200 a 12.000, y para cada aparición L2 es un grupo enlazador de UNA que tiene la fórmula -C1-C2-C3-, en donde R está fijado a C2 y tiene la fórmula -OCH(CH<2>R3)R5, en que R3 es -OR4, -SR4, -NR4<2>, -NH(C=O)R4, morfolino, morfolin-1-ilo, piperazin-1-ilo, o 4-alcanoil-piperazin-1 -ilo, en donde R4 es el mismo o diferente para cada aparición y es H, alquilo, un colesterol, una molécula lipídica, una poliamina, un aminoácido, o un polipéptido, y en que R5 es una nucleobase, o L2 (R) es un azúcar tal como una ribosa, y R es una nucleobase, o L2 es un azúcar modificado, tal como una ribosa modificada, y R es una nucleobase. En determinados aspectos, una nucleobase puede ser una nucleobase modificada. L1 puede ser un enlace fosfodiéster.

[0325] La secuencia de bases de una molécula oligomérica traducible puede ser cualquier secuencia de nucleobases.

[0326] En algunos aspectos, una molécula oligomérica traducible de esta divulgación puede tener cualquier número de enlaces intermonoméricos de fosforotioato en cualquier ubicación intermonómera.

[0327] En algunos aspectos, uno cualquiera o más de los enlaces intermonoméricos de una molécula oligomérica traducible pueden ser un fosfodiéster, un fosforotioato incluyendo ditioatos, un fosforotioato quiral y otras formas químicamente modificadas.

[0328] Cuando una molécula oligomérica traducible termina en un monómero de UNA, la posición terminal tiene un extremo 1, o la posición terminal tiene un extremo 3, de acuerdo con la numeración posicional arriba mostrada..

[0329] Traducción Potenciada

[0330] Una molécula traducible de esta divulgación puede incorporar una región que potencia la eficacia de la traducción de la molécula.

[0331] En general, las regiones potenciadoras de la traducción tal como se conocen en la técnica se pueden incorporar en la estructura de una molécula traducible para aumentar los rendimientos de péptidos o proteínas.

[0332] Una molécula traducible que contiene una región potenciadora de la traducción puede proporcionar una producción incrementada de péptidos o proteínas.

[0333] En algunos aspectos, una región potenciadora de la traducción puede comprender, o estar ubicada en una región no traducida 5' o 3' de una molécula traducible.

[0334] Ejemplos de regiones potenciadoras de la traducción incluyen regiones potenciadoras que se producen de forma natural de u Tr 5' de TEV y beta-globina UTR 3’ de Xenopus.

[0335] Estructuras y Secuencias Moleculares

[0336] Una molécula traducible puede diseñarse para expresar un péptido o una proteína diana. En algunos aspectos, el péptido o la proteína diana puede estar asociado con una afección o enfermedad en un sujeto.

[0337] En algunos aspectos, la secuencia de bases de una molécula traducible puede incluir una parte que es idéntica a al menos una parte o dominio efectivo de una secuencia de bases de un ARNm, en que una porción efectiva es suficiente para impartir una actividad terapéutica a un producto de traducción de la molécula traducible.

[0338] En algunos aspectos, esta divulgación proporciona moléculas traducibles activas que tienen una secuencia de bases idéntica a al menos un fragmento de una molécula de ácido nucleico nativa de una célula.

[0339] En determinados aspectos, la secuencia de bases de una molécula traducible puede incluir una parte que es idéntica a la secuencia de bases de un ARNm, excepto por una o más mutaciones de bases. El número de mutaciones de la molécula traducible no debe exceder una cantidad que produzca un producto de traducción de la molécula traducible con una actividad sustancialmente menor que la del ARNm.

[0340] Las moléculas de UNA oligoméricas traducibles de esta divulgación pueden mostrar una secuencia de nucleobases y pueden diseñarse para expresar un péptido o una proteína in vitro, ex vivo o in vivo. El péptido o la proteína expresados pueden tener actividad en diversas formas, incluyendo la actividad correspondiente a la proteína expresada a partir de un ARNm nativo o natural.

[0341] En algunos aspectos, una molécula traducible de esta divulgación puede tener una longitud de cadena de aproximadamente 400 a 15.000 monómeros, en que cualquier monómero que no sea un monómero de UNA puede ser un monómero N o Q.

[0342] Estructura de la tapa molecular

[0343] Una molécula traducible de esta divulgación puede tener un extremo 5’ protegido con diversos grupos y sus análogos como se conoce en la técnica. En un aspecto ejemplar, el casquete 5' puede ser un casquete m7GpppGm. En aspectos adicionales, el casquete 5' puede seleccionarse de m7GpppA, m7GpppC; análogos del casquete no metilados (p. ej,GpppG); análogo de casquete dimetilado(p. ej.,m2,7GpppG), un análogo de casquete trimetilado(p. ej.,m2,2,7GpppG), análogos de casquetes simétricos dimetilados (p. ej., m7Gpppm7G) o análogos de casquetes antirreverso(p. ej.,ARCA; m7, 2'OmeGpppG, m72'dGpppG, m7,3'OmeGpppG, m7,3'dGpppG y sus derivados de tetrafosfato)(véase, p. ej.,Jemielity, J. et al., RNA 9: 1108-1122 (2003). En otros aspectos, el casquete 5' puede ser un casquete ARCA (3'-OMe-m7G(5 ')pppG). El casquete 5' puede ser una mCAP (m7G(5 ')ppp(5')G, N7-Metil-Guanosina-5'-Trifosfato-5'-Guanosina). El casquete 5' puede ser resistente a la hidrólisis.

[0344] Algunos ejemplos de estructuras de casquete 5' se dan en los documentos WO2015/051169A2, WO/2015/061491 y las patentes de EE.UU. N°s 8.093.367 y 8.304.529.

[0346] Región de cola

[0348] En algunos aspectos, el oligómero traducible que codifica AGL comprende una región de cola que puede servir para proteger al ARNm frente a la degradación por exonucleasas. En algunos aspectos, la región de cola puede ser una cola de poliA..

[0350] Colas de poliA se pueden añadir mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica,p. ej.,utilizando la polimerasa de poliA para añadir colas al ARN sintético o transcritoin vitro.Otros métodos incluyen el uso de un vector de transcripción para codificar colas de poliA o el uso de una ligasa(p. ej.,mediante ligadura de férula con una ARN ligasa T4 y/o una ADN ligasa T4), en donde poliA se puede ligar al extremo 3' de un ARN sentido. En algunos aspectos, se utiliza una combinación de cualquiera de los métodos anteriores.

[0352] En algunos aspectos, un oligómero traducible comprende una estructura de cola de poliA 3'. En algunos aspectos, la longitud de la cola de poliA puede ser de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200 o 300 nucleótidos. En algunos aspectos, una cola de poliA 3' contiene aproximadamente 5 a 300 nucleótidos de adenosina(p. ej.,aproximadamente 30 a 250 nucleótidos de adenosina, aproximadamente 60 a 220 nucleótidos de adenosina, aproximadamente 80 a 200 nucleótidos de adenosina, aproximadamente 90 a aproximadamente 150 nucleótidos de adenosina o aproximadamente 100 a aproximadamente 120 nucleótidos de adenosina). En un aspecto ejemplar, la cola de poliA 3' tiene una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos. En otro aspecto ejemplar, la cola de poliA 3' tiene una longitud de aproximadamente 115 nucleótidos. En otro aspecto ejemplar, la cola de poliA 3' tiene una longitud de aproximadamente 250 nucleótidos.

[0354] En algunos aspectos, la cola de poliA 3' comprende uno o más monómeros de UNA. En algunos aspectos, la cola de poliA 3' contiene 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 o más monómeros de UNA. En un aspecto ejemplar, la cola de poliA 3' contiene 2 monómeros de UNA. En un aspecto ejemplar adicional, la cola de poliA 3' contiene 2 monómeros de UNA que se encuentran consecutivamente,es decir,contiguos entre sí en la cola de poliA 3'.

[0356] En un aspecto ejemplar, la cola de poliA 3' comprende o consiste en una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 6. En otro aspecto ejemplar, la cola de poliA 3' comprende o consiste en una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 38. En aún otro aspecto ejemplar, la cola de poliA 3' comprende o consiste en una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 39.

[0358] En algunos aspectos, el oligómero traducible comprende una estructura de cola de poliC 3'. En algunos aspectos, la longitud de la cola de poliC puede ser de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200 o 300 nucleótidos. En algunos aspectos, una cola de poliC 3' contiene aproximadamente 5 a 300 nucleótidos de citosina (p.ej.,aproximadamente 30 a 250 nucleótidos de citosina, aproximadamente 60 a 220 nucleótidos de citosina, aproximadamente 80 a aproximadamente 200 nucleótidos de citosina, aproximadamente 90 a 150 nucleótidos de citosina o aproximadamente 100 a aproximadamente 120 nucleótidos de citosina). En un aspecto ejemplar, la cola de poliC 3' tiene una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos. En otro aspecto ejemplar, la cola de poliC 3' tiene una longitud de aproximadamente 115 nucleótidos. La cola de poliC puede añadirse a la cola de poliA o puede sustituir la cola de poliA. La cola de poliC puede añadirse al extremo 5' o al extremo 3' de la cola de poliA.

[0360] En algunos aspectos, la longitud de la cola de poli A y/o poli C se ajusta para controlar la estabilidad de una molécula oligomérica traducible modificada de la divulgación y, por lo tanto, la transcripción de la proteína. Por ejemplo, dado que la longitud de la cola de poli A puede influir en la semivida de una molécula traducible, la longitud de la cola de poli A puede ajustarse para modificar el nivel de resistencia del ARNm a las nucleasas y, por lo tanto, controlar la evolución temporal de la expresión de polinucleótidos y/o la producción de polipéptidos en una célula diana.

[0362] Regiones No Traducidas (UTR) 5 ’ y 3 ’

[0364] En algunos aspectos, el oligómero traducible que codifica AGL puede comprender una región 5’ no traducida y/o una región 3’ no traducida. Como se entiende en la técnica, la UTR 5’ y/o 3’ puede afectar a la estabilidad del ARNm o a la eficacia de la traducción de un ARNm. En un aspecto ejemplar, el oligómero traducible comprende una UTR 5' y una UTR 3'.

[0366] En algunos aspectos, el oligómero traducible puede comprender una UTR 5' con al menos aproximadamente 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400 o 500 nucleótidos. En algunos aspectos, una UTR 5' contiene aproximadamente 50 a 300 nucleótidos (p.ej.,aproximadamente 75 a 250 nucleótidos, aproximadamente 100 a 200 nucleótidos, aproximadamente 120 a 150 nucleótidos o aproximadamente 135 nucleótidos). En un aspecto ejemplar, la UTR 5' tiene una longitud de aproximadamente 135 nucleótidos.

[0368] En algunos aspectos, la UTR 5' se deriva de una molécula de ARNm relativamente estable (p.ej.,histona, tubulina, globina, GAPDH, actina o enzimas del ciclo del ácido cítrico) para aumentar la estabilidad del oligómero traducible. En otros aspectos, una secuencia de la UTR 5' puede incluir una secuencia parcial de un gen inmediato-temprano 1 (IE1) del CMV. Se pueden encontrar ejemplos de secuencias de la UTR 5' en la patente de EE.UU. N° 9.149.506. En algunos aspectos, la UTR 5' comprende una secuencia seleccionada de las UTR 5' de IL-6 humana, alanina aminotransferasa 1, apolipoproteína E humana, cadena alfa del fibrinógeno humano, transtiretina humana, haptoglobina humana, alfa-1-antiquimotripsina humana, antitrombina humana, alfa-1-antitripsina humana, albúmina humana, beta-globina humana, complemento C3 humano, complemento C5 humano, SynK, AT1G58420, beta-globina de ratón, albúmina de ratón y un virus del grabado del tabaco, o fragmentos de cualquiera de los anteriores. En un aspecto ejemplar, la UTR 5' se deriva de un virus del grabado del tabaco (VET). En un aspecto ejemplar adicional, la UTR 5’ comprende o consiste en una secuencia recogida en SEQ ID NO: 3. En aún otro aspecto ejemplar, la UTR 5' es un fragmento de una secuencia recogida en SEQ ID NO: 3, tal como un fragmento de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 o 125 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 3.

[0370] En algunos aspectos, la molécula oligomérica traducible comprende un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES, por sus siglas en inglés). Como se entiende en la técnica, un IRES es un elemento de ARN que permite el inicio de la traducción de una manera independiente del extremo. En aspectos ejemplares, el IRES se encuentra en la UTR 5'. En otros aspectos, el IRES puede estar fuera de la UTR 5'.

[0371] En algunos aspectos, el oligómero traducible puede comprender una UTR 3' con al menos aproximadamente 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400 o 500 nucleótidos. En algunos aspectos, una UTR 3' contiene aproximadamente 50 a 300 nucleótidos (p.ej.,aproximadamente 75 a 250 nucleótidos, aproximadamente 100 a 200 nucleótidos, aproximadamente 140 a 175 nucleótidos o aproximadamente 160 nucleótidos). En un aspecto ejemplar, la UTR 3' tiene una longitud de aproximadamente 160 nucleótidos.

[0373] En algunos aspectos, la UTR 3' comprende uno o más monómeros de UNA. En algunos aspectos, la UTR 3' contiene 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 o más monómeros de UNA.

[0375] Se pueden encontrar ejemplos de secuencias UTR 3’ en la patente de EE.UU. N° 9.149.506. En algunos aspectos, la UTR 3’ comprende una secuencia seleccionada de las UTRs 3’ de alanina aminotransferasa 1, apolipoproteína E humana, cadena alfa del fibrinógeno humano, haptoglobina humana, antitrombina humana, alfa-globina humana, beta-globina humana, complemento C3 humano, factor de crecimiento humano, hepcidina humana, MALAT-1, beta-globina de ratón, albúmina de ratón y beta-globina de Xenopus, o fragmentos de cualquiera de los anteriores. En un aspecto ejemplar, la UTR 3’ se deriva de la beta-globina de Xenopus. En otro aspecto ejemplar, la UTR 3’ se deriva de la beta-globina de Xenopus y contiene uno o más monómeros de UNA. En un aspecto ejemplar adicional, la UTR 3' comprende o consiste en una secuencia recogida en SEQ ID NOs: 5 y 33-37. En aún otro aspecto ejemplar, la UTR 3' es un fragmento de una secuencia recogida en SEQ ID NOs: 5 y 33-37 tal como un fragmento de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 o 150 nucleótidos contiguos de SEQ ID NOs: 5 y 33-37.

[0377] En determinados aspectos ejemplares, el oligómero traducible que codifica AGL comprende una secuencia UTR 5’ de SEQ ID NO: 3 y una secuencia UTR 3’ seleccionada de SEQ Id NOs: 5 y 33-37. En algunos aspectos, el oligómero traducible que codifica AGL comprende, además, una cola de poliA mostrada en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 39. En algunos aspectos, la secuencia de ARNm que codifica AGL comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 7-32 o SEQ ID NO: 41-45.

[0379] Codón de Terminación Triple

[0381] En algunos aspectos, el oligómero traducible que codifica AGL puede comprender una secuencia inmediatamente aguas abajo del CDS que crea un triple codón de terminación. El triple codón de terminación puede incorporarse para potenciar la eficacia de la traducción. En algunos aspectos, el oligómero traducible puede comprender la secuencia AUAAGUGAA (SEQ ID NO: 40) inmediatamente aguas abajo de un CDS de PAH descrito en esta memoria, como se ejemplifica en SEQ ID NOs: 7-32 o SEQ ID NOs: 41 -45.

[0383] Sitios de Inicio de la Traducción

[0385] En algunos aspectos, el oligómero traducible que codifica AGL puede comprender un sitio de inicio de la traducción. Secuencias de este tipo son conocidas en la técnica e incluyen la secuencia de Kozak. Véase, por ejemplo, Kozak, Marilyn (1988) Mol. and Cell Biol., 8:2737-2744; Kozak, Marilyn (1991) J. Biol. Chem., 266:19867-19870 ; Kozak, Marilyn (1990) Proc Natl. Acad. Sci. USA, 87:8301-8305 ; y Kozak, Marilyn (1989) J. Cell Biol., 108:229-241; y las referencias citadas en ellas. Según se entiende en la técnica, una secuencia Kozak es una secuencia consenso corta centrada alrededor del sitio de inicio de la traducción de los ARNm eucarióticos, que permite un inicio eficaz de la traducción del ARNm. La maquinaria de traducción ribosómica reconoce el codón de inicio AUG en el contexto de la secuencia Kozak.

[0386] En algunos aspectos, el sitio de inicio de la traducción,p. ej.,una secuencia Kozak, se inserta aguas arriba de la secuencia codificante de AGL. En algunos aspectos, el sitio de inicio de la traducción se inserta aguas abajo de una UTR 5'. En determinados aspectos ejemplares, el sitio de inicio de la traducción se inserta aguas arriba de la secuencia codificante de AGL y aguas abajo de una UTR 5'.

[0388] Como se entiende en la técnica, la longitud de la secuencia Kozak puede variar. Generalmente, aumentar la longitud de la secuencia conductora mejora la traducción.

[0389] En algunos aspectos, el oligómero traducible que codifica AGL comprende una secuencia Kozak que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 4. En determinados aspectos ejemplares, el oligómero traducible que codifica AGL comprende una secuencia Kozak que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 4, en donde la secuencia Kozak está inmediatamente aguas abajo de una UTR 5’ e inmediatamente aguas arriba de la secuencia codificante de AGL.

[0391] Métodos de Síntesis

[0393] En diversos aspectos, esta divulgación proporciona métodos para la síntesis de moléculas mensajeras traducibles.

[0394] Moléculas traducibles de esta divulgación se pueden sintetizar y aislar utilizando métodos descritos en esta memoria, así como cualquier técnica pertinente conocida en la técnica.

[0396] Algunos métodos para preparar ácidos nucleicos se dan, por ejemplo, en Merino, Chemical Synthesis of Nucleoside Analogues, (2013); Gait, Oligonucleotide synthesis: a Practical approach (1984); Herdewijn, Oligonucleotide Synthesis, Methods in Molecular Biology, Vol. 288 (2005).

[0398] En algunos aspectos, se puede producir una molécula traducible mediante una reacción de transcripciónin vitro(IVT, por sus siglas en inglés). Una mezcla de nucleósidos trifosfato (NTP) se puede polimerizar utilizando reactivos T7, por ejemplo, para producir ARN a partir de un molde de ADN. El molde de ADN se puede degradar con DNasa libre de ARNasa y el ARN se puede separar en columna.

[0400] En algunos aspectos, se puede utilizar una ligasa para enlazar un oligómero sintético al extremo 3' de una molécula de ARN o a un transcrito de ARN para formar una molécula traducible. El oligómero sintético que está ligado al extremo 3' puede proporcionar la funcionalidad de una cola de poliA y, ventajosamente, puede proporcionar resistencia a su eliminación por parte de 3'-exorribonucleasas. La molécula traducible del producto ligado puede tener una actividad específica incrementada y puede proporcionar mayores niveles de expresión de proteínas ectópicas.

[0402] En determinados aspectos, el producto ligado de las moléculas traducibles de esta divulgación puede elaborarse con un transcrito de ARN que tiene especificidad nativa. El producto ligado puede ser una molécula sintética que conserva la estructura del transcrito de ARN en el extremo 5' para garantizar la compatibilidad con la especificidad nativa.

[0404] En aspectos adicionales, el producto ligado de las moléculas traducibles de esta divulgación puede obtenerse con un transcrito de ARN exógeno o ARN no natural. El producto ligado puede ser una molécula sintética que conserva la estructura del ARN.

[0406] Sin querer estar ligado por la teoría, la vía de degradación del ARNm canónico en las células incluye los pasos: (i) la cola de poliA se corta gradualmente hasta un trozo por parte de exonucleasas 3', cerrando la interacción de bucle necesaria para una traducción eficaz y dejando el casquete abierto para el ataque; (ii) los complejos de desprotección eliminan el casquete 5'; (iii) el residuo desprotegido e incompetente para la traducción del transcrito se degrada por la actividad de las exonucleasas 5' y 3'.

[0408] Realizaciones de esta divulgación implican nuevas estructuras traducibles que pueden tener una actividad de la traducción incrementada con respecto a un transcrito nativo. Entre otras cosas, las moléculas traducibles de esta memoria pueden impedir que las exonucleasas recorten la cola de poliA durante el proceso de desadenilación.

[0410] Realizaciones de esta divulgación proporcionan estructuras, composiciones y métodos para moléculas traducibles. Realizaciones de esta divulgación pueden proporcionar moléculas traducibles que contienen uno más monómeros de UNA y que tienen una semivida funcional prolongada.

[0412] Se ha descubierto que la ligadura de un oligómero sintético al extremo 3' de un transcrito de ARNm se puede lograr, sorprendentemente, con una alta conversión del transcrito de ARNm al producto de ligadura.

[0414] Tal como se utiliza en esta memoria, las expresiones cola de poliA y oligómero de poliA se refieren a un oligómero de monómeros, en donde los monómeros pueden incluir nucleótidos basados en adenina, monómeros de UNA, nucleótidos que se producen de forma natural, nucleótidos modificados o análogos de nucleótidos.

[0416] Oligómeros para la ligadura al extremo 3’ de un ARN pueden tener una longitud de 2 a 120 monómeros, o una longitud de 4 a 120 monómeros, o una longitud de 5 a 120 monómeros, o más largos: En un aspecto ejemplar, el oligómero para la ligadura tiene una longitud de aproximadamente 30 monómeros.

[0418] Formulaciones Basadas en Lípidos

[0420] Formulaciones basadas en lípidos se han reconocido de manera creciente como uno de los sistemas de administración de ARN más prometedores debido a su biocompatibilidad y a su facilidad de producción a gran escala. Los lípidos catiónicos se han estudiado ampliamente como materiales sintéticos para la administración de ARN. Tras su mezcladura, los ácidos nucleicos se condensan mediante lípidos catiónicos para formar complejos de lípido/ácido nucleico conocidos como lipoplexos. Estos complejos lipídicos son capaces de proteger al material genético de la acción de las nucleasas y lo administran a las células mediante la interacción con la membrana celular cargada negativamente. Los lipoplexos pueden prepararse mezclando directamente lípidos cargados positivamente a pH fisiológico con ácidos nucleicos cargados negativamente.

[0421] Los liposomas convencionales consisten en una bicapa lipídica que puede estar compuesta de lípidos catiónicos, aniónicos o neutros (fosfo)lípidos y colesterol, que encierra un núcleo acuoso. Tanto la bicapa lipídica como el espacio acuoso pueden incorporar compuestos hidrófobos o hidrófilos, respectivamente. Las características y el comportamiento de los liposomas in vivo pueden modificarse mediante la adición de un recubrimiento polimérico hidrófilo, p. ej., polietilenglicol (PEG), a la superficie del liposoma para conferir estabilización estérica. Además, los liposomas pueden utilizarse para la fijación específica del objetivo mediante la unión de ligandos (p. ej., anticuerpos, péptidos e hidratos de carbono) a su superficie o al extremo terminal de las cadenas de PEG unidas (Front Pharmacol. 1 de diciembre de 2015;6:286).

[0422] Los liposomas son sistemas de administración coloidales basados en lípidos y basados en tensioactivos, compuestos de una bicapa fosfolipídica que rodea un compartimiento acuoso. Pueden presentarse como vesículas esféricas y su tamaño varía de 20 nm a unas pocas micras. Los liposomas catiónicos basados en lípidos son capaces de formar complejos con ácidos nucleicos cargados negativamente mediante interacciones electrostáticas, lo que resulta en complejos que ofrecen biocompatibilidad, baja toxicidad y la posibilidad de producción a gran escala requerida para aplicaciones clínicas in vivo. Los liposomas pueden fusionarse con la membrana plasmática para su captación; una vez dentro de la célula, se procesan mediante la vía endocítica y el material genético se libera del endosoma/soporte al citoplasma. Los liposomas han sido considerados durante mucho tiempo como vehículos de administración de fármacos debido a su biocompatibilidad superior, dado que los liposomas son básicamente análogos de las membranas biológicas y pueden prepararse a partir de fosfolípidos tanto naturales como sintéticos (Int J Nanomedicine. 2014; 9: 1833-1843).

[0423] Los liposomas catiónicos han sido tradicionalmente los sistemas de administración no viral más comúnmente utilizados para oligonucleótidos, incluyendo ADN plasmídico, oligos antisentido y ARNi/ARNhp de horquilla pequeña. Los lípidos catiónicos tales como DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano) y DOTMA (metilsulfato de N-[1 -(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio) pueden formar complejos o lipoplexos con ácidos nucleicos cargados negativamente para formar nanopartículas por interacción electrostática, lo que proporciona una alta eficacia de transfección in vitro. Además, se desarrollaron nanoliposomas neutros basados en lípidos para la administración de ARN tales como, p. ej., los nanoliposomas neutros basados en 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DOPC). (Adv Drug Deliv Rev. febrero de 2014; 66: 110-116).

[0424] De acuerdo con algunos aspectos, los polinucleótidos expresables y las construcciones de ARNm heterólogas descritos en esta memoria están formulados con lípidos. La formulación lipídica se selecciona preferiblemente, pero no se limita a liposomas, lipoplexos, copolímeros tales como PLGA, y nanopartículas lipídicas. En un aspecto preferido, una nanopartícula lipídica (LNP) comprende:

[0425] (a) un ácido nucleico,

[0426] (b) un lípido catiónico,

[0427] (c) un agente reductor de la agregación (tal como un lípido de polietilenglicol (PEG) o un lípido modificado con PEG), (d) opcionalmente un lípido no catiónico (tal como un lípido neutro), y

[0428] (e) opcionalmente, un esterol.

[0429] En un aspecto, la formulación de nanopartículas lipídicas consiste en (i) al menos un lípido catiónico; (ii) un lípido neutro; (iii) un esterol, p. ej., colesterol; y (iv) un PEG-lípido, en una relación molar de aproximadamente 20-60 % de lípido catiónico: 5-25 % de lípido neutro: 25-55 % de esterol; 0,5-15 % de PEG-lípido.

[0430] Formulaciones Lipídicas que Contienen Tiocarbamato y Carbamato

[0431] Algunos ejemplos de lípidos y composiciones lipídicas para la administración de una molécula activa de esta divulgación se dan en los documentos WO/2015/074085 y USSN 15/387.067. En determinados aspectos, el lípido es un compuesto de la siguiente fórmula:

[0432]

[0435] en donde

[0437] Ri y R<2>consisten ambos en un alquilo lineal que consiste en 1 a 14 carbonos, o un alquenilo o alquinilo que consiste en 2 a 14 carbonos;

[0438] L<1>y L<2>consisten ambos en un alquileno o alquenileno lineal que consiste en 5 a 18 carbonos, o forma un heterociclo con N;

[0439] X es S;

[0440] L<3>consiste en un enlace o un alquileno lineal que consiste en 1 a 6 carbonos, o forma un heterociclo con N; R<3>consiste en un alquileno lineal o ramificado que consiste en 1 a 6 carbonos; y

[0441] R<4>y R<5>son iguales o diferentes, cada uno de ellos consiste en un hidrógeno o un alquilo lineal o ramificado que consiste en 1 a 6 carbonos;

[0442] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0444] La formulación lipídica puede contener uno o más lípidos catiónicos ionizables seleccionados de entre los siguientes:

[0447]

[0448]

[0449]

[0450]

[0453] Lípidos Catiónicos

[0455] La nanopartícula lipídica incluye preferiblemente un lípido catiónico adecuado para formar una nanopartícula lipídica. Preferiblemente, el lípido catiónico porta una carga neta positiva a un pH aproximadamente fisiológico.

[0457] El lípido catiónico puede ser, por ejemplo, cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de 1,2-dioleoiltrimetilamoniopropano (DOTAP) (también conocido como cloruro de N-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio y sal de cloruro de 1,2-dioleiloxi-3-trimetilaminopropano), cloruro de N-(1-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxi)propilamina (D<o>D<m>A), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2-di-Y-linoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (Y-DLenDMA), 1,2-dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-dilinoleiloxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-dilinoleiloxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-dilinoleil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-linoleil-2-linoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloruro de 1,2-dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.CI), sal de cloruro de 1,2-dilinoleil-3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.CI), 1,2-dilinoleiloxi-3-(N-metilpiperazino)propano (DLin-MPZ) o 3-(N,N- dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-dioleilamino)-1,2-propanodio (<d>O<a>P), 1,2-dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DM A), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin -K-DMA) o análogos de los mismos. (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d][l,3]dioxol-5-amina, (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il4-(dimetilamino)butanoato (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2-hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazanodiil)didodecan-2-ol (C12-200), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C2-DMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA), 4-(dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo (DLin-M-C3-DMA), 3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-iloxi)-N,N-dimetilpropan-1-amina (éter<m>C3), 4-((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-iloxi)-N,N-dimetilbutan-1-amina (éter MC4) o cualquier combinación de los anteriores. Otros lípidos catiónicos incluyen, pero no se limitan a bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), 3P-(N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil)colesterol (DC-Choi), trifluoroacetato de N-(1 -(2,3-dioleiloxi)propil)-N-2-(esperminacarboxamido)etil)-N,N-dimetilamonio (DOSPA), dioctadecilamidoglicil carboxispermina (DOGS), 1,2-dileoil-sn-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dioleoil-3-dimetilamoniopropano (DODAP), bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE) y 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (XTC). Adicionalmente, se pueden utilizar preparaciones comerciales de lípidos catiónicos tales como, p. ej., LIPOFECTIN (incluyendo DOTMA y DOPE, disponible de GIBCO/BRL) y Lipofectamina (que comprende DOSPA y<d>O<p>E, disponible de GIBCO/BRL).

[0459] Otros lípidos catiónicos adecuados se describen en las Publicaciones Internacionales N°s WO 09/086558, WO 09/127060, WO 10/048536, WO 10/054406, WO 10/088537, WO 10/129709 y WO 2011/153493; Publicaciones de Patentes de EE.UU. N°s 2011/0256175, 2012/0128760 y 2012/0027803; Patente de EE.UU. N28.158.601; y Love et al., PNAS, 107(5), 1864-69, 2010. Otros aminolípidos adecuados incluyen los que tiene grupos de ácidos grasos alternativos y otros grupos dialquilamino, incluyendo aquellos en los que los sustituyentes alquilo son diferentes (p. ej., N-etil-N-metilamino- y N-propil-N- etilamino-). En general, los aminolípidos con cadenas acilo menos saturadas se dimensionan con mayor facilidad, en particular cuando los complejos deben dimensionarse por debajo de aproximadamente 0,3 micras con fines para la esterilización por filtración. Se pueden utilizar aminolípidos que contengan ácidos grasos insaturados con longitudes de cadena carbonada en el intervalo de C14 a C22. También se pueden utilizar otros armazones para separar el grupo amino y el ácido graso o la porción de alquilo graso del aminolípido.

[0461] En un aspecto preferido adicional, la LNP comprende el lípido catiónico con la fórmula (III) de acuerdo con la solicitud de patente PCT/EP2017/064066 (que corresponde a la fórmula (III) del documento WO 2018/078053 A1, que reivindica prioridad de PCT/EP2017/064066).

[0463] En determinados aspectos, los aminolípidos o lípidos catiónicos de la divulgación tienen al menos un grupo protonable o desprotonable, de modo que el lípido está cargado positivamente a un pH igual o inferior al pH fisiológico (p. ej., pH 7,4) y es neutro a un segundo pH, preferiblemente igual o superior al pH fisiológico.Naturalmente, se entiende que la adición o eliminación de protones en función del pH es un proceso de equilibrio, y que la referencia a un lípido cargado o neutro se refiere a la naturaleza de la especie predominante y no requiere que todo el lípido esté presente en la forma cargada o neutra. Los lípidos que tienen más de un grupo protonable o desprotonable, o que son de iones híbridos, no se excluyen de su uso en la presente divulgación. En determinados aspectos, los lípidos protonables tienen un pKa del grupo protonable en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 11, p. ej., un pKa de aproximadamente 5 a aproximadamente 7.

[0465] El lípido catiónico puede comprender de aproximadamente 20 % en moles a aproximadamente 70 o 75 % en moles, o de aproximadamente 45 % en moles a aproximadamente 65 % en moles, o aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 % en moles, o aproximadamente 70 % en moles del lípido total presente en la partícula. En otro aspecto, las nanopartículas lipídicas incluyen de aproximadamente 25 % a aproximadamente 75 % en moles de lípido catiónico, p. ej., de aproximadamente 20 a aproximadamente 70 %, de aproximadamente 35 % a aproximadamente 65 %, de aproximadamente 45 % a aproximadamente 65 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 57,5 %, aproximadamente 57,1 %, aproximadamente 50 % o aproximadamente 40 % en moles (basado en el 100 % de moles totales de lípido en la nanopartícula lipídica). En un aspecto, la relación de lípido catiónico a ácido nucleico es de aproximadamente 3 a aproximadamente 15, tal como de aproximadamente 5 a aproximadamente 13 o de aproximadamente 7 a aproximadamente 11.

[0467] Composiciones farmacéuticas

[0469] En algunos aspectos, esta divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto traducible y un soporte farmacéuticamente aceptable.

[0471] Una composición farmacéutica puede administrarse local o sistémicamente. En algunos aspectos, una composición farmacéutica puede administrarse por cualquier modalidad de administración. En determinados aspectos, la administración puede realizarse por cualquier vía, incluyendo la intravenosa, subcutánea, pulmonar, intramuscular, intraperitoneal, dérmica, oral, inhalatoria o nasal.

[0472] Realizaciones de esta divulgación incluyen composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto traducible en una formulación lipídica.

[0474] En algunos aspectos, una composición farmacéutica puede comprender uno o más lípidos seleccionados de lípidos catiónicos, lípidos aniónicos, esteroles, lípidos pegilados y cualquier combinación de los anteriores. En algunos aspectos, la composición farmacéutica que contiene un compuesto traducible comprende un lípido catiónico, un fosfolípido, colesterol y un lípido pegilado.

[0476] En determinados aspectos, una composición farmacéutica puede estar sustancialmente libre de liposomas.

[0478] En aspectos adicionales, una composición farmacéutica puede incluir nanopartículas.

[0480] Algunos ejemplos de lípidos y composiciones lipídicas para la administración de una molécula activa de esta divulgación se dan en el documento WO/2015/074085. En determinados aspectos, el lípido es un lípido catiónico. En algunos aspectos, el lípido catiónico comprende un compuesto de fórmulaII:

[0481]

[0484] en donde Ri y R<2>son iguales o diferentes, cada uno un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal o ramificado, Li y L<2>son iguales o diferentes, cada uno un alquilo lineal con al menos cinco átomos de carbono, o forman un heterociclo con el N, X<1>es un enlace o es --CO--O--, con lo que se forma L<2>- CO--O— R<2>; X<2>es S u O, L<3>es un enlace o un alquilo inferior, R<3>es alquilo inferior, R<4>y R<5>son iguales o diferentes, cada uno un alquilo inferior. Lo que también se describe en esta memoria es el compuesto de fórmula II, en el que L<3>está ausente, R<1>y R<2>consiste cada uno en al menos siete átomos de carbono, R<3>es etileno o n-propileno, R<4>y R<5>son metilo o etilo y L<1>y L<2>consiste cada uno en un alquilo lineal que tiene al menos cinco átomos de carbono. Lo que también se describe en esta memoria es el compuesto de fórmula II, en el que L<3>está ausente, R<1>y R<2>consisten cada uno en al menos siete átomos de carbono, R<3>es etileno o n-propileno, R<4>y R<5>son metilo o etilo, y L<1>y L<2>consiste cada uno en un alquilo lineal que tiene al menos cinco átomos de carbono. Lo que también se describe en esta memoria es el compuesto de fórmula II, en el que L<3>está ausente, R<1>y R<2>consiste cada uno en un alquenilo de al menos nueve átomos de carbono, R<3>es etileno o n-propileno, R<4>y R<5>son metilo o etilo, y L<1>y L<2>consiste cada uno en un alquilo lineal que tiene al menos cinco átomos de carbono. Lo que también se describe en esta memoria es el compuesto de fórmula II, en el que L<3>es metileno, R<1>y R<2>consiste cada uno en al menos siete átomos de carbono, R<3>es etileno o npropileno, R<4>y R<5>son cada uno metilo o etilo y L<1>y L<2>consiste cada uno en un alquilo lineal que tiene al menos cinco átomos de carbono. Lo que también se describe en esta memoria es el compuesto de fórmula II, en el que L<3>es metileno, R<1>y R<2>consiste cada uno en al menos nueve átomos de carbono, R<3>es etileno o n-propileno, R<4>y R<5>son cada uno metilo, L<1>y L<2>consiste cada uno en un alquilo lineal que tiene al menos siete átomos de carbono. Lo que también se describe en esta memoria es el compuesto de fórmula II, en el que L<3>es metileno, R<1>consiste en un alquenilo que tiene al menos nueve átomos de carbono y R<2>consiste en un alquenilo que tiene al menos siete átomos de carbono, R<3>es n-propileno, R<4>y R<5>son cada uno metilo, L<1>y L<2>consiste cada uno en un alquilo lineal que tiene al menos siete átomos de carbono. Lo que también se describe en esta memoria es el compuesto de fórmula II, en el que L<3>es metileno, R<1>y R<2>consiste cada uno en un alquenilo que tiene al menos nueve átomos de carbono, R<3>es etileno, R<4>y R<5>son cada uno metilo, L<1>y L<2>consiste cada uno en un alquilo lineal que tiene al menos siete átomos de carbono.

[0486] En aspectos ejemplares, el lípido catiónico comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en ATX-001, ATX-002, ATX-003, ATX-004, ATX-005, ATX-006, ATX-007, ATX-008, ATX-009, ATX-010, ATX-011, ATX-012, ATX-013, ATX-014, ATX-015, ATX-016, ATX-017, ATX-018, ATX-019, ATX-020, ATX-021, ATX-022, ATX-023, ATX-024, ATX-025, ATX-026, ATX-027, ATX-028, ATX-029, ATX-030, ATX-031, ATX-032, ATX-081, ATX-095 y ATX-126, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

[0488] En determinados aspectos ejemplares, el lípido catiónico comprende ATX-002, ATX-081, ATX-095 o ATX-126.

[0490] En algunos aspectos, el lípido catiónico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo puede presentarse en una composición lipídica que comprende una nanopartícula o una bicapa de moléculas lipídicas. La bicapa lipídica comprende preferiblemente, además, un lípido neutro o un polímero. La composición lipídica comprende preferiblemente un medio líquido. La composición encapsula preferiblemente, además, un compuesto traducible de la presente divulgación. La composición lipídica comprende preferiblemente, además, un compuesto traducible de la presente divulgación y un lípido neutro o un polímero. La composición lipídica encapsula preferiblemente el compuesto traducible.

[0492] En aspectos adicionales, el lípido catiónico comprende un compuesto de fórmula III:

[0495]

[0496] en donde R<i>y R<2>son iguales o diferentes, cada uno un alquilo lineal o ramificado que consiste en 1 a 9 carbonos, un alquenilo o alquinilo que consiste en 2 a 11 carbonos, o colesterilo, L<1>y L<2>son iguales o diferentes, cada uno un alquileno

[0497] 0 alquenileno lineal que consiste en 5 a 18 carbonos, X<1>es CO--O--, con lo que se forma -L<2>-CO--O— R<2>, X<2>es S u O, X<3>es --CO--O--, con lo que se forma -L<1>-CO-O— R<1>, L<3>es un enlace, R<3>es un alquileno lineal o ramificado que consiste en

[0498] 1 a 6 carbonos, y R<4>y R<5>son iguales o diferentes, cada uno hidrógeno o un alquilo lineal o ramificado de 1 a 6 carbonos;

[0499] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En un aspecto, X<2>es S. En otro aspecto, R<3>se selecciona de etileno, n-propileno o isobutileno. En aún otro aspecto, R<4>y R<5>son, por separado, metilo, etilo o isopropilo. En aún otro aspecto,

[0500] L<1>y L<2>son iguales. En aún otro aspecto, L<1>y L<2>difieren. En aún otro aspecto, L<1>o L<2>consiste en un alquileno lineal que tiene siete carbonos. En aún otro aspecto, L<1>o L<2>consiste en un alquileno lineal que tiene nueve carbonos. En aún otro aspecto, R<1>y R<2>son iguales. En aún otro aspecto, R<1>y R<2>difieren. En aún otro aspecto, R<1>y R<2>consiste cada uno en un alquenilo. En aún otro aspecto, R<1>y R<2>consisten cada uno en un alquilo. En aún otro aspecto, el alquenilo consiste en un doble enlace único. En aún otro aspecto, R<1>o R<2>consiste en nueve carbonos. En aún otro aspecto, R<1>o R<2>consiste en once carbonos. En aún otro aspecto, R<1>o R<2>consiste en siete carbonos. En aún otro aspecto, L<3>es un enlace, R<3>es etileno, X<2>es S, y R<4>y R<5>son cada uno metilo. En aún otro aspecto, L<3>es un enlace, R<3>es n-propileno son cada uno metilo. En aún otro aspecto, L<3>es un enlace, R<3>es etileno, X<2>es S y R<4>y R<5>son cada uno etilo.

[0502] Como apreciará el experto en la técnica, los compuestos de fórmulasIIyIIIforman sales que también se incluyen en el alcance de esta divulgación. La referencia a un compuesto de fórmulasIIyIIIen esta memoria incluye sales del mismo, salvo indicación contraria. El término "sal(es)", tal como se emplea en esta memoria, designa sales de carácter ácido formadas con ácidos inorgánicos y/u orgánicos, así como a sales de carácter básico formadas con bases inorgánicas y/u orgánicas. Además, cuando un compuesto de fórmula II o III contiene tanto un resto de carácter básico tal como, pero no limitado a una piridina o un imidazol, como un resto de carácter ácido tal como, pero no limitado a un ácido carboxílico, se pueden formar iones híbridos ("sales internas"), que se incluyen en el término "sal(es)" tal como se utiliza en esta memoria.

[0503] Las sales pueden ser farmacéuticamente aceptables (es decir, no tóxicas y fisiológicamente aceptables), aunque también son útiles otras sales. Sales de los compuestos de la fórmulaIIoIIIse pueden formar, por ejemplo, haciendo reaccionar un compuesto de fórmulaIIoIIIcon una cantidad de ácido o base, tal como una cantidad equivalente, en un medio tal como uno en el que la sal precipita o en un medio acuoso seguido de liofilización.

[0505] Sales por adición de ácidos ejemplares incluyen acetatos, adipatos, alginatos, ascorbatos, aspartatos, benzoatos, bencenosulfonatos, bisulfatos, boratos, butiratos, citratos, alcanforatos, alcanforsulfonatos, ciclopentanopropionatos, digluconatos, dodecilsulfatos, etanosulfonatos, fumaratos, glucoheptanoatos, glicerofosfatos, hemisulfatos, heptanoatos, hexanoatos, hidrocloruros, hidrobromuros, hidroyoduros, 2-hidroxietanosulfonatos, lactatos, maleatos, metanosulfonatos,

[0506] 2-naftalenosulfonatos, nicotinatos, nitratos, oxalatos, pectinatos, persulfatos, 3-fenilpropionatos, fosfatos, picratos, pivalatos, propionatos, salicilatos, succinatos, sulfatos, sulfonatos (tales como los mencionados en esta memoria), tartratos, tiocianatos, toluenosulfonatos (también conocidos como tosilatos), undecanoatos y similares. Adicionalmente, los ácidos que generalmente se consideran adecuados para la formación de sales farmacéuticamente útiles a partir de compuestos farmacéuticos de carácter básico se comentan, por ejemplo, por S. Berge et al., J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66(1)1-19; P. Gould, International J. Pharmaceutics (1986) 33 201-217; Anderson et al., The Practice of Medicinal Chemistry (1996), Academic Press, Nueva York; y en The Orange Book (Food & Drug Administration, Washington, D.C., en su sitio web).

[0508] Sales de carácter básico ejemplares incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos, tales como sales de sodio, litio y potasio, sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de calcio y magnesio, sales con bases orgánicas (por ejemplo, aminas orgánicas) tales como benzatinas, diciclohexilaminas, hidrabaminas (formadas con N,N-bis(deshidroabietil)etilendiamina), N-metil-D-glucaminas , N-metil-D- glucamidas , t-butilaminas y sales con aminoácidos tales como arginina, lisina y similares. Grupos de carácter básico que contienen nitrógeno pueden cuaternizarse con agentes tales como haluros de alquilo inferior (p. ej., cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo), sulfatos de dialquilo (p. ej., sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo y diamilo), haluros de cadena larga (p. ej., cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo), haluros de arilalquilo (p. ej., bromuros de bencilo y fenetilo), y otros.

[0510] Todas las sales de carácter ácido o básico se consideran farmacéuticamente aceptables dentro del alcance de la presente divulgación, y se consideran equivalentes a las formas libres de los compuestos correspondientes a efectos de la misma.

[0511] Compuestos de fórmulaIIoIIIpueden existir en forma no solvatada y solvatada, incluyendo formas hidratadas. En general, las formas solvatadas, con disolventes farmacéuticamente aceptables tales como agua, etanol y similares, son equivalentes a las formas no solvatadas a efectos de esta divulgación. Compuestos de fórmulaIIoIIIy sales y solvatos de los mismos pueden existir en su forma tautomérica (por ejemplo, como una amida o un iminoéter). Todas estas formas tautoméricas se contemplan en esta memoria como parte de la presente divulgación.

[0512] Los compuestos lipídicos catiónicos descritos en esta memoria pueden combinarse con un compuesto traducible de la divulgación para formar micropartículas, nanopartículas, liposomas o micelas. El compuesto traducible de la divulgación a ser suministrado a las partículas, los liposomas o las micelas puede estar en forma de un gas, líquido o sólido. El compuesto lipídico catiónico y el compuesto traducible pueden combinarse con otros compuestos lipídicos catiónicos, polímeros (sintéticos o naturales), tensioactivos, colesterol, hidratos de carbono, proteínas, lípidos, etc. para formar las partículas.

[0513] Estas partículas pueden combinarse opcionalmente con un excipiente farmacéutico para formar una composición farmacéutica.

[0514] En determinados aspectos, los compuestos lipídicos catiónicos son relativamente no citotóxicos. Pueden ser biocompatibles y biodegradables. El lípido catiónico puede tener un pKa en el intervalo de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,5, más preferiblemente entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 7,0. Puede diseñarse para que tenga un pKa deseado entre aproximadamente 3,0 y aproximadamente 9,0, o entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0.

[0516] Una composición que contiene un compuesto lipídico catiónico puede ser 3-70 % de compuesto lipídico catiónico, 0-60 % de colesterol, 0-30 % de fosfolípido y 1-10 % de polietilenglicol (PEG). Preferiblemente, la composición es 30-40 % de compuesto lipídico catiónico, 40-50 % de colesterol y 10-20 % de PEG. En otros aspectos preferidos, la composición es 50-75 % de compuesto lipídico catiónico, 20-40 % de colesterol y 5-10 % de fosfolípido y 1-10 % de PEG. La composición puede contener 60-70 % de compuesto lipídico catiónico, 25-35 % de colesterol y 5-10 % de PEG. La composición puede contener hasta 90 % de compuesto lipídico catiónico y 2 a 15 % de lípido auxiliar. La formulación puede ser una formulación de partículas lipídicas, por ejemplo, que contenga 8-30 % de compuesto, 5-30 % de lípido auxiliar y 0-20 % de colesterol; 4- 25 % de lípido catiónico, 4-25 % de lípido auxiliar, 2 a 25 % de colesterol, 10 a 35 % de colesterol-PEG y 5 % de colesterol-amina; o 2-30 % de lípido catiónico, 2-30 % de lípido auxiliar, 1 a 15 % de colesterol, 2 a 35 % de colesterol-PEG y 1-20 % de colesterol-amina; o hasta 90 % de lípido catiónico y 2-10 % de lípidos auxiliares, o incluso 100 % de lípido catiónico.

[0518] En algunos aspectos, el o los lípidos a base de colesterol se seleccionan de colesterol, colesterol PEGilado y DC-Chol (N,N-dimetil-N- etilcarboxamidocolesterol ) y 1,4-bis(3-N-oleilaminopropil)piperazina. En un aspecto ejemplar, el lípido a base de colesterol es colesterol.

[0520] En algunos aspectos, el uno o más lípidos pegilados,es decir,lípidos modificados con PEG. En algunos aspectos, el uno o más lípidos modificados con PEG comprenden una cadena de poli(etilenglicol) de hasta 5 kDa de longitud fijada covalentemente a un lípido con una o más cadenas alquílicas de C<6>-C<20>de longitud. En algunos aspectos, un lípido modificado con PEG es una ceramida derivatizada, tal como N-octanoil-esfingosina-1- [succinil(metoxipolietilenglicol)-2000]. En algunos aspectos, un lípido modificado con PEG o PEGilado es colesterol PEGilado o dimiristoilglicerol (DMG)-PEG-2K. En un aspecto ejemplar, el lípido modificado con PEG es colesterol PEGilado.

[0522] En aspectos adicionales, una composición farmacéutica puede contener un compuesto oligomérico dentro de un vector viral o bacteriano.

[0524] Una composición farmacéutica de esta divulgación puede incluir soportes, diluyentes o excipientes conocidos en la técnica. Se describen ejemplos de composiciones y métodos farmacéuticos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ed. 1985) y Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición (2005).

[0526] Ejemplos de excipientes para una composición farmacéutica incluyen antioxidantes, agentes de suspensión, agentes dispersantes, conservantes, agentes tampón, agentes de tonicidad y tensioactivos.

[0527] Una dosis efectiva de un agente o formulación farmacéutica de esta divulgación puede ser una cantidad que sea suficiente para provocar la traducción de una molécula traducible en una célula.

[0529] Una dosis terapéuticamente efectiva puede ser una cantidad de un agente o formulación que sea suficiente para provocar un efecto terapéutico. Una dosis terapéuticamente efectiva se puede administrar en una o más administraciones separadas y por diferentes vías. Como se apreciará en la técnica, una dosis terapéuticamente eficaz o una cantidad terapéuticamente eficaz se determina en gran medida en base a la cantidad total del agente terapéutico contenido en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para lograr un beneficio significativo para el sujeto(p. ej.,tratar, modular, curar, prevenir o mejorar la GSD III). Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser una cantidad suficiente para lograr un efecto terapéutico y/o profiláctico deseado. Generalmente, la cantidad de un agente terapéutico(p. ej.,un oligómero traducible que codifica<a>GL) administrada a un sujeto que lo necesite dependerá de las características del sujeto. Características de este tipo incluyen la condición, la gravedad de la enfermedad, el estado general de salud, la edad, el sexo y el peso corporal del sujeto. Un experto ordinario en la técnica será capaz de determinar fácilmente las dosis apropiadas en función de estos y otros factores relacionados. Además, se pueden emplear opcionalmente ensayos objetivos y subjetivos para identificar los intervalos de dosificación óptimos.

[0531] Los métodos proporcionados en esta memoria contemplan administraciones únicas así como múltiples de una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto traducible(p. ej,un oligómero traducible que codifica AGL) descrito en esta memoria. Las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto traducible que codifica AGL se pueden administrar a intervalos regulares, dependiendo de la naturaleza, gravedad y extensión de la afección del sujeto(p. ej.,la gravedad del estado de enfermedad de GSD III de un sujeto y los síntomas asociados de GSD III, y/o los niveles de actividad de AGL del sujeto). En algunos aspectos, una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto traducible (p.ej,un oligómero traducible que codifica AGL) de la presente divulgación se puede administrar periódicamente a intervalos regulares (p. ej., una vez al año, una vez cada seis meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada tres meses, una vez cada dos meses, una vez al mes), quincenalmente, semanalmente, diariamente, dos veces al día, tres veces al día, cuatro veces al día, cinco veces al día, seis veces al día o de forma continua.

[0532] En algunos aspectos, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se formulan de modo que sean adecuadas para la liberación prolongada del compuesto traducible que codifica AGL contenido en ellas. Composiciones de liberación prolongada de este tipo pueden administrarse convenientemente a un sujeto a intervalos de dosificación prolongados. Por ejemplo, en un aspecto, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se administran a un sujeto dos veces al día, diariamente o en días alternos. En algunos aspectos, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se administran a un sujeto dos veces por semana, una vez por semana, cada 10 días, cada dos semanas, cada 28 días, cada mes, cada seis semanas, cada ocho semanas, cada dos meses, cada tres meses, cada cuatro meses, cada seis meses, cada nueve meses o una vez al año. También se contemplan en esta memoria composiciones farmacéuticas que son formuladas para la administración de depósito(p. ej,por vía subcutánea, intramuscular) para administrar o liberar un compuesto traducible que codifica AGL a lo largo de periodos prolongados. Preferiblemente, los medios de liberación prolongada empleados se combinan con modificaciones realizadas al compuesto traducible que codifica AGL para potenciar la estabilidad.

[0534] En algunos aspectos, una dosis terapéuticamente eficaz, tras la administración, puede dar como resultado niveles séricos o plasmáticos de AGL de 1 -1000 pg /ml o 1-1000 ng/ml o 1 -1000 pg/ml, o más.

[0535] En algunos aspectos, la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una molécula traducible de la divulgación puede resultar en un aumento de los niveles de proteína AGL hepática en un sujeto tratado. En algunos aspectos, la administración de una composición que comprende una molécula traducible de la presente divulgación resulta en un aumento del 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % en los niveles de proteína AGL hepática con respecto al nivel de referencia de proteína AGL en el sujeto antes del tratamiento. En determinados aspectos, la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una molécula traducible de la divulgación resultará en un aumento de los niveles de AGL hepática con respecto a los niveles de referencia de AGL hepática en el sujeto antes del tratamiento. En algunos aspectos, el aumento de los niveles de AGL en el hígado en relación con los niveles de referencia de AGL en el hígado será de al menos el 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 100 %, 200 % o más.

[0537] En algunos aspectos, una dosis terapéuticamente eficaz, cuando se administra regularmente, da como resultado una expresión incrementada de AGL en el hígado en comparación con los niveles de referencia antes del tratamiento. En algunos aspectos, la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una molécula traducible de la divulgación da como resultado la expresión de un nivel de proteína AGL de o superior a aproximadamente 10 ng/mg, aproximadamente 20 ng/mg, aproximadamente 50 ng/mg, aproximadamente 100 ng/mg, aproximadamente 150 ng/mg, aproximadamente 200 ng/mg, aproximadamente 250 ng/mg, aproximadamente 300 ng/mg, aproximadamente 350 ng/mg, aproximadamente 400 ng/mg, aproximadamente 450 ng/mg, aproximadamente 500 ng/mg, aproximadamente 600 ng/mg, aproximadamente 700 ng/mg, aproximadamente 800 ng/mg, aproximadamente 900 ng/mg, aproximadamente 1000 ng/mg, aproximadamente 1200 ng/mg o aproximadamente 1500 ng/mg de la proteína total en el hígado de un sujeto tratado.

[0539] En algunos aspectos, administrar una dosis terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un oligómero traducible que codifica AGL dará como resultado niveles reducidos de uno o más marcadores seleccionados de alanina transaminasa (ALT), aspartato transaminasa (AST), fosfatasa alcalina (ALP), creatina fosfoquinasa (CPK), glucógeno y dextrina límite(es decir,un hidrato de carbono de bajo peso molecular producido por la hidrólisis de glucógeno).

[0541] En algunos aspectos, una dosis terapéuticamente eficaz, cuando se administra regularmente, da como resultado una reducción de los niveles de ALT, AST, ALP y/o CPK en una muestra biológica. En algunos aspectos, administrar una dosis terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una molécula traducible de esta divulgación da como resultado una reducción de los niveles de ALT, AST, ALP y/o CPK en una muestra biológica(p. ej.,una muestra de plasma o suero) en al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 % en comparación con los niveles de referencia de ALT, AST, ALP y/o CPK antes del tratamiento. En algunos aspectos, la muestra biológica se selecciona de plasma, suero, sangre entera, orina o líquido cefalorraquídeo.

[0542] En determinados aspectos ejemplares, una dosis terapéuticamente eficaz, cuando se administra regularmente, da como resultado una reducción de los niveles de ALT,p. ej.,medidos en unidades de actividad de ALT/litro (U/l), en una muestra de suero o plasma. En algunos aspectos, administrar una dosis terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una molécula traducible de esta divulgación da como resultado una reducción de los niveles de ALT en una muestra biológica(p. e j,una muestra de plasma o suero) en al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 % en comparación con los niveles de referencia de ALT antes del tratamiento. En un aspecto ejemplar, la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una molécula traducible de esta divulgación resulta en una reducción de los niveles de ALT en una muestra biológica(p. e j,una muestra de plasma o suero) de al menos aproximadamente un 50 % en comparación con los niveles de referencia de ALT antes del tratamiento. En un aspecto ejemplar adicional, los niveles de ALT se miden tras el ayuno,p. ej.,tras 6, 8, 10, 12, 18 o 24 horas de ayuno.

[0544] En otros aspectos ejemplares, una dosis terapéuticamente eficaz, cuando se administra regularmente, da como resultado una reducción de los niveles de AST,p. ej.,medidos en unidades de actividad de AST/litro (U/l), en una muestra de suero o plasma. En algunos aspectos, administrar una dosis terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una molécula traducible de esta divulgación da como resultado una reducción de los niveles de AST en una muestra biológica(p. ej.,una muestra de plasma o suero) en al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 % en comparación con los niveles de referencia de AST antes del tratamiento. En un aspecto ejemplar, la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una molécula traducible de la divulgación da como resultado una reducción de los niveles de AST en una muestra biológica(p. ej.,una muestra de plasma o suero) de al menos aproximadamente un 50 % en comparación con los niveles de referencia de AST antes del tratamiento. En un aspecto ejemplar adicional, los niveles de AST se miden tras el ayuno,p. e j,tras 6, 8, 10, 12, 18 o 24 horas de ayuno.

[0546] Las mediciones de los niveles de ALT, AST, ALP y/o CPK se pueden realizar utilizando cualquier método conocido en la técnica,p. e j,utilizando un analizador de química clínica Fuji Dri -Chem FDC 3500 como se describe en Liu et al., 2014, Mol Genet and Metabolism 111: 467-76.

[0548] En otros aspectos ejemplares, una dosis terapéuticamente eficaz, administrada regularmente, da como resultado una reducción de los niveles de glucógeno en una muestra biológica. En algunos aspectos, la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una molécula traducible de esta divulgación produce una reducción de la acumulación de glucógeno en una muestra biológica(p. ej.,una muestra de hígado) en al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 %, en comparación con los niveles de referencia de glucógeno antes del tratamiento. En algunos aspectos, la muestra biológica es una parte de un órgano seleccionado de hígado, corazón, diafragma, cuádriceps y gastrocnemio. En un aspecto ejemplar, la muestra biológica es una sección de hígado,p. ej,una sección de hepatocitos.

[0549] En otros aspectos ejemplares, una dosis terapéuticamente eficaz, cuando se administra regularmente, da como resultado una reducción de los niveles límite de dextrina en una muestra biológica. En algunos aspectos, la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una molécula traducible de esta divulgación resulta en una reducción de la acumulación límite de dextrina en una muestra biológica(p. e j,una muestra de hígado) en al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 %, en comparación con los niveles de referencia de dextrina límite antes del tratamiento. En algunos aspectos, la muestra biológica es una parte de un órgano seleccionado de hígado, corazón, diafragma, cuádriceps y gastrocnemio. En un aspecto ejemplar, la muestra biológica es una sección de hígado,p. ej.,una sección de hepatocitos. En un aspecto ejemplar adicional, una dosis terapéuticamente eficaz, cuando se administra regularmente, da como resultado una reducción de al menos el 50 %, 60 %, 70 % u 80 % de los niveles límite de dextrina en una muestra de hígado, en comparación con los niveles de referencia de dextrina límite antes del tratamiento.

[0551] En aspectos adicionales, una dosis terapéuticamente eficaz, cuando se administra regularmente, retrasa la aparición de la fibrosis hepática en un sujeto tratado. En algunos aspectos, una dosis terapéuticamente eficaz, cuando se administra regularmente, ralentiza el desarrollo de fibrosis hepática o reduce la cantidad de fibrosis hepática en un sujeto que padece GSD III.

[0553] Una dosis terapéuticamente eficaz de un agente activo(p. ej.,un oligómero traducible que codifica AGL)in vivopuede ser de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal. Por ejemplo, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser de aproximadamente 0,001-0,01 mg/kg de peso corporal o 0,01-0,1 mg/kg o 0,1-1 mg/kg o 1-10 mg/kg o 10­ 100 mg/kg. En algunos aspectos, un oligómero traducible que codifica AGL se proporciona en una dosis que varía de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, p.ej.,de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 4,5 mg/kg o de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 mg/kg. Una dosis terapéuticamente eficaz de un agente activo(p. ej.,un oligómero traducible que codifica AGL)in vivopuede ser una dosis de al menos aproximadamente 0,001 mg/kg de peso corporal, o al menos aproximadamente 0,01 mg/kg o al menos aproximadamente 0,1 mg/kg o al menos aproximadamente 1 mg/kg o al menos aproximadamente 2 mg/kg o al menos aproximadamente 3 mg/kg o al menos aproximadamente 4 mg/kg o al menos aproximadamente 5 mg/kg, al menos aproximadamente 10 mg/kg, al menos aproximadamente 20 mg/kg, al menos aproximadamente 50 mg/kg, o más. En algunos aspectos, se proporciona un oligómero traducible que codifica AGL en una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 1,5 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 2,5 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 3,5 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg o aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 75 o 100 mg/kg.

[0554] Las secuencias de nucleobases mostradas en esta memoria son de izquierda a derecha, de 5' a 3', a menos que se indique lo contrario.

[0555] Transfecciones

[0556] En algunos experimentos, se transfectaron moléculas mensajeras traducibles en células Hepa1-6 o AML12 en placas de 96 pocillos. Se utilizó el reactivo de transfección MessengerMAX (Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante para todas las transfecciones. Otras líneas celulares adecuadas incluyen las células HEK293 y Hep3B.

[0557] Un ejemplo de protocolo de transfección in vitro fue el siguiente:

[0558] Placa de hepatocitos Hepa1-6: 5000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos al menos 8 horas antes de la transfección.

[0559] Reemplazar 90 pL de medio DMEM que contiene FBS al 10 % y aminoácidos no esenciales añadiendo 90 pL en cada uno de los pocillos de la placa de 96 pocillos inmediatamente antes de comenzar el experimento de transfección.

[0560] Preparar el complejo de moléculas traducibles del reactivo de transfección MessengerMAX (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0561] Transferir 10 pL del complejo a un pocillo que contenga las células en la placa de 96 pocillos.

[0562] Recoger el medio después de los momentos deseados y añadir 100 pL de medio reciente a cada uno de los pocillos. El medio se mantendrá a -80 °C hasta que se realice un ensayo ELISA para AGL utilizando el protocolo estándar del fabricante.

[0563] Un ejemplo de un protocolo de transfecciónin vivofue el siguiente:

[0564] La molécula traducible se formula con nanopartículas.

[0565] Inyectar la molécula traducible formulada en nanopartículas (1 mg/kg) a ratones BL57BL/c (de 4-6 semanas de edad) mediante inyección i.v. estándar en la vena lateral de la cola.

[0566] Recoger aproximadamente 50 pL de sangre en un tubo de microcentrífuga recubierto con heparina en un momento adecuado después de la inyección.

[0567] Centrifugar a 3.000 X g durante 10 minutos a 4 °C.

[0568] Transferir el sobrenadante (plasma) a un tubo de microcentrífuga nuevo. El plasma se mantendrá a -80 °C hasta que se realice un ensayo ELISA para AGL utilizando el protocolo estándar del fabricante.

[0569] Formulaciones de Nanopartículas

[0570] Se pueden preparar nanopartículas lipídicas que contienen ARNm, utilizando volúmenes adecuados de lípidos en un tampón de etanol/acuoso que contiene el ARNm. Para ello, se puede utilizar un dispositivo microfluídico Nanossemblr, seguido de un procesamiento posterior. Por ejemplo, para preparar nanopartículas, se puede disolver una cantidad deseada de ARNm fijado como objetivo en un tampón de ácido cítrico 5 mM (pH 3,5). Los lípidos se pueden disolver en la relación molar adecuada en etanol. La relación en porcentaje molar de los lípidos constituyentes puede ser, por ejemplo, 50 % de lípido ionizable, 7 % de DSPC (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina; Avanti Polar Lipids), 40 % de colesterol (Avanti Polar Lipids) y 3 % de DMG-PEG (1,2-dimiristoil-sn-glicerol, metoxipolietilenglicol, cadena de PEG con peso molecular de 2000; NOF America Corporation). A continuación, las soluciones de lípidos y ARNm se pueden combinar en el dispositivo microfluídico (Precision NanoSystems) a un caudal de 1:3 ( etanol: fase acuosa). El caudal combinado total puede ser de 12 mL/min. Las nanopartículas lipídicas se pueden formar y posteriormente purificar mediante diálisis durante la noche utilizando un tampón fosfato en un dispositivo de diálisis (Float-a-lyzer, Spectrum Labs), seguido de concentración utilizando filtros centrífugos Amicon Ultra-15 (Merck Millipore). El tamaño de las partículas se puede determinar mediante dispersión dinámica de luz (ZEN3600, Malvern Instruments). Se puede calcular una eficiencia de ''encapsulación'' determinando el contenido de ARNm no encapsulado medido por la fluorescencia tras la adición de RiboGreen (Molecular Probes) a la suspensión de LNP (Fi); luego, el valor se comparó con el contenido total de ARNm que se obtiene tras la lisis de las LNP con Triton X-100 al 1 % (Ft), en que el porcentaje de "encapsulación" = (Ft - Fi)/Ft x 100. La encapsulación puede referirse a la inclusión del ARNm en la nanopartícula, independientemente de su forma.

[0572] Western en Célula

[0574] Se utilizaron placas de colágeno de 96 pocillos para sembrar las células a la densidad adecuada en medio de cultivo DMEM/FBS. En la confluencia óptima, las células se transfectaron con los ARNm fijados como objetivo, diluidos en la mezcla de reactivos de transfección (MessengerMax y Opti-MEM). Las células se colocaron en una incubadora de CO<2>y se dejaron crecer. En el momento deseado, se retiró el medio y las células se fijaron en PFA reciente al 4 % durante 20 min. Posteriormente, se retiró el fijador y las células se permeabilizaron en TBST durante 5 minutos varias veces. Una vez completados los lavados de permeabilización, las células se incubaron con el tampón de bloqueo durante 45 min. A continuación, se añadió el anticuerpo primario y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, las células se lavaron varias veces en TBST y, posteriormente, se incubaron durante 1 h con el anticuerpo secundario diluido en tampón de bloqueo y con la tinción CellTag 700. Finalmente, las células se lavaron varias veces en TBST, seguido de un último lavado en TBS. Luego, se tomaron imágenes de la placa utilizando el sistema de detección Licor y los datos se normalizaron según el número total de células marcadas por CellTag 700.

[0576] Generación de Productos de PCR de Cola

[0578] ADN plasmídico (10 ng) que contiene cada una de las construcciones de expresión de ARNm se puede utilizar para generar los productos de PCR de la cola de poli A 120 en una reacción de PCR de 50 pl con la mezcla de PCR KAPA HiFi 2X (KR0370), según las instrucciones del fabricante. El producto se puede entonces analizar en un gel al 2 % de Thermo Fisher Scientific y cuantificar aproximadamente en base a la intensidad de la escala de bajo peso molecular (Thermo Fisher Scientific, 10068-013). Se limpia con el kit de purificación de PCR de Qiagen y se resuspende en 50 pl de agua.

[0580] Transcripción in vitro (IVT) para Síntesis

[0582] El siguiente protocolo corresponde a una reacción IVT de 200 pl utilizando reactivos de ARN polimerasa NEB HiScribe T7, que debería producir aproximadamente 1 mg de ARN. Se preparó una mezcla de NTP 2,5X según se requirió descongelando y mezclando las soluciones madre de NTP 100 mM (nucleótidos de ATP, GTP, CTP y UTP, o sus equivalentes modificados químicamente) y agrupándolas. Para la reacción IVT, se utilizaron aproximadamente 2-4 pg del molde para una reacción de 200 pl. El tampón de reacción IVT 10X, la mezcla de dNTP 2,5X, el molde de ADN y la ARN polimerasa T7 se mezclaron bien mediante pipeteo y se incubaron a 37 °C durante 4 horas. Para degradar el molde de ADN, la reacción IVT se diluye con 700 pl de agua exenta de nucleasas y, a continuación, se añade tampón de DNasa I 10X y 20 pl de DNasa I exenta RNasa a la mezcla de IVT, incubándose a 37 °C durante 15 minutos. La reacción diluida (a 1 ml) y tratada con DNasa se purifica mediante columnas Qiagen RNeasy Maxi, según las instrucciones del fabricante, con una elución final en agua exenta de RNasa. El ARN purificado se cuantifica mediante absorbancia UV, en que la A260/A280 debe estar entre 1,8-2,2, dependiendo del tampón de resuspensión utilizado.

[0584] Recubrimiento Enzimático del ARN IVT

[0586] Para el recubrimiento enzimático, se puede utilizar una versión 50X ampliada de reacción de recubrimiento en un solo paso y de metilación en 2'O de NEB, que es adecuada para tratar hasta 1 mg de transcritos de IVT. Se recomienda una reacción de 10 pg de ARN en 20 pl, partiendo del supuesto de que la longitud del transcrito sea de tan solo 100 nt. Sin embargo, se acepta un mayor volumen de sustrato a reacción para transcritos, que generalmente pueden tener una longitud mayor (aproximadamente 300-600 nt). Antes de iniciar la reacción de recubrimiento, el ARN se desnaturaliza a 65 °C durante 5 minutos y, a continuación, se enfría rápidamente para eliminar cualquier conformación secundaria. Para la reacción de recubrimiento total de 1 ml, se utiliza 1 mg de ARN desnaturalizado en 700 pl de agua exenta de nucleasa junto con 100 pl (10X) de tampón de recubrimiento, 50 pl (10 mM) de GTP, 50 pl (4 mM) de SAM, 50 pl de (10 U/pl) de enzima de recubrimiento de Vaccinia y 50 pl de ARNm cap 2'-O-metiltransferasa a (50 U/pl) se combinan y se incuban a 37 °C durante 1 hora. El ARNm recubierto resultante se eluye utilizando agua exenta de RNasa, se vuelve a purificar en una columna RNeasy y se cuantifica por nanogoteo. El ARNm también se visualiza en el gel ejecutando 500 ng del producto purificado por pista en un gel desnaturalizante después de la desnaturalización y snapchill para eliminar las estructuras secundarias.

[0587] EJEMPLOS

[0589] Ejemplo 1: Molécula de referencia traducible 534.

[0591] En este ejemplo, se preparó una molécula de referencia traducible 534 y se utilizó para expresar amilo-alfa-1,6-glucosidas, 4-alfa-glucanotransfersa (AGL) WT humana. La molécula traducible comprendía un casquete 5’ (7mGpppG), una UTR 5' de TEV, una secuencia Kozak, un CDS de AGL WT (SEQ ID NO: 1), una UTR 3' de beta-globina de Xenopus y una región de cola de poli(A) que consiste en 114 As (esdecir,"región de cola de poli(A) 114"). La molécula traducible de referencia comprendía, además, la secuencia de SEQ ID NO: 40 inmediatamente aguas abajo del CDS de AGL. Esta molécula traducible de referencia se sintetizó con N1-metilpseudouridina en lugar de uridina.

[0593] Detalles de la estructura de esta molécula traducible de referencia son los siguientes: UTR 5’ del Virus del grabado del tabaco (TEV) de SEQ ID NO: 3, una secuencia Kozak de SEQ ID NO: 4, una UTR 3’ de beta-globina de Xenopus (XBG) de SEQ ID NO: 5 y una cola de poli(A) 114 de SEQ ID NO: 6.

[0595] Las moléculas traducibles de los ejemplos que figuran más adelante se pueden sintetizar con el casquete 5' m7GpppGm. Las moléculas traducibles en los ejemplos que figuran más adelante pueden contener una UTR 5' (p.ej.,una UTR 5' de TEV (SEQ ID NO: 3)), una secuencia de inicio de la traducción(p. ej.,una secuencia Kozak de SEQ ID NO: 4), una secuencia de SEQ ID NO: 40, una UTR 3'(p. ej.,una UTR 3' de beta-globina de Xenopus (SEQ ID NO: 5)) y una cola de poli(A)(p. ej.,una cola de poliA de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 39).

[0597] Ejemplo 2: Moléculas traducibles que codifican AGL.

[0598] En este ejemplo, se prepararon moléculas traducibles 522-533, 546, 730-740 y 1783-1784 y se utilizaron para expresar la amilo-alfa-1,6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa (AGL) humana, con una eficacia de traducción ventajosamente incrementada. Estas moléculas traducibles, que expresan la amilo-alfa-1,6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa (AGL) humana, exhibieron una actividad adecuada para uso en métodos de mejora o tratamiento de la GSD III. Estas moléculas traducibles comprendían un casquete 5' (7mGpppG), una UTR 5' de TEV, una secuencia Kozak, un CDS de AGL y una UTR 3' de beta-globina de Xenopus. Las moléculas traducibles 522-533, 546 y 1783-1784 comprenden, además, una región de cola de poli(A) 114. La molécula traducible 730 comprende, además, una región de cola de poli(A) 100, mientras que las moléculas traducibles 731 -740 comprenden, además, una región de cola de poli(A) 110. Las moléculas traducibles 522-533, 546, 730-740 y 1783-1784 comprenden, además, la secuencia de SEQ ID NO: 40 inmediatamente aguas abajo del CDS de AGL. Se desarrollaron dos moléculas traducibles adicionales - 2258 y 2259 - que son idénticas a 546 y 1783, respectivamente, excepto que contienen una región de cola de poli(A) 100 en lugar de una región de cola de poli(A) 114. La secuencia codificante de 1783 y 2259 puede modificarse opcionalmente para contener 12 diferencias de nucleótidos, como se refleja en SEQ ID NO: 45. Las moléculas traducibles descritas en este ejemplo se sintetizaron con N1-metilpseudouridina en lugar de uridina.

[0600] El CDS de AGL en cada una de las moléculas traducibles está compuesto por las siguientes secuencias:

[0603]

[0606] Las moléculas traducibles de este ejemplo se tradujeron en células AML12 y C2C12 para producir AGL humana.

[0608] Ejemplo 3: Potenciador de la traducción basado en la UTR 3’ de beta-globina de Xenopus.

[0609] En este ejemplo, se muestran las estructuras de secuencias de la UTR 3’ para uso en potenciar la eficacia de la traducción de una molécula traducible.

[0611] Las secuencias de bases mostradas en SEQ ID NOs: 33-37 corresponden a la parte de la molécula traducible que podría corresponder funcionalmente a la UTR 3’ de beta-globina de Xenopus. La molécula traducible completa comprende un casquete 5' (m7GpppGm), una UTR 5’ y una región codificante (CDS) aguas arriba de la secuencia que figura más adelante, y una cola de poliA aguas abajo de la secuencia que figura más adelante, cada una de las cuales corresponde a la estructura de un ARNm humano nativo. Como se muestra arriba, se puede utilizar opcionalmente una secuencia Kozak. Por lo tanto, una molécula traducible que incorpore el fragmento que figura más adelante puede tener una eficacia potenciada de la traducción. La secuencia del gen de la beta-globina de Xenopus se muestra con el n° de acceso NM_001096347.1.

[0613] Ejemplo 4: Expresión de AGL en Hepatocitos Primarios Humanos

[0615] En este ejemplo, se transfectaron hepatocitos primarios humanos con las moléculas de ARNm optimizadas para codones 546, 1783 y 1784. La expresión de la proteína AGL se midió mediante In-Cell Western™ a las 6, 24, 48 y 72 horas después de la transfección. La expresión de las secuencias de ARNm en comparación con un control sin tratar (“unt”) se muestra en la FIG. 5.

[0617] Ejemplo 5: Análisis in vivo de la Expresión de la Proteína AGL en Ratones de Tipo Salvaje

[0619] En este ejemplo, a ratones C57BL/6 de tipo salvaje se les inyectó ARNm de AGL humana formulado con nanopartículas lipídicas. Los ratones se sacrificaron 6 horas después de la inyección. Se tomaron biopsias hepáticas de los ratones y se analizó la expresión de la proteína AGL humana y murina en homogenizados hepáticos. La FIG. 6 muestra la expresión ectópica de la proteína AGL humana en diversas moléculas de ARNm. La FIG. 7 muestra los niveles de proteína AGL de ratón, lo que indica niveles similares de expresión endógena de la proteína AGL de ratón en los ratones tratados. La molécula traducible 546.7, como se muestra en las FIGs. 6 y 7, tiene una secuencia de nucleobases idéntica a la de la molécula traducible 546, pero se sintetizó con 5-metoxiuridina en lugar de uridina en lugar de N1-metilpseudouridina.

[0620] Ejemplo 6: El Tratamiento con ARNm Reduce la Acumulación de Glucógeno en Ratones GSD3

[0622] En este ejemplo, ratones inactivados con AGL se trataron con vehículo o molécula traducible 546 formulada con nanopartículas lipídicas ATX2. Los hígados de ratones inactivados tratados con vehículo ("VEH") mostraron una vacuolización de hepatocitos de marcada a severa y aumentos de moderados a marcados en la acumulación de glucógeno en los hepatocitos (FIG. 8). Por el contrario, los hígados de ratones inactivados tratados con la molécula traducible 546 formulada con nanopartículas lipídicas ATX2 tenían solo vacuolización de hepatocitos de leve a moderada y aumentos de leves a moderados en la acumulación de glucógeno en los hepatocitos (FIG. 9). En base a los resultados histopatológicos mostrados en este ejemplo, parece existir una reducción en la gravedad de la vacuolización hepatocelular y la acumulación de glucógeno en los hígados de ratones inactivados tratados con ARNm, en comparación con los ratones KO tratados con vehículo.

[0624] Ejemplo 7: Moléculas Traducibles Adicionales que Expresan AGL

[0626] Cuatro moléculas traducibles adicionales - 1970, 1987, SD1 y SD2 - se diseñaron con secuencias codificantes de AGL humana optimizadas para codones, modificadas adicionalmente, mostradas en SEQ ID NO: 41, 42, 43 y 44, respectivamente. Las moléculas traducibles 1970, 1987, SD1 y SD2 comprenden, además, un casq uete 5' (7mGpppG), una UTR 5' de TEV, una secuencia Kozak, una secuencia de SEQ ID NO: 40 inmediatamente aguas abajo de la secuencia codificante, una UTR 3' de beta-globina de Xenopus y una región de cola de poli(A)(p. ej.,una región de cola de poli(A) 100, 110 o 114). Estas moléculas traducibles pueden sintetizarse opcionalmente con N1-metilpseudouridina o 5-metoxiuridina en lugar de uridina.

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleobases que codifica una amilo-alfa-1, 6-glucosidasa, 4-alfaglucanotransferasa humana (hAGL) de SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de nucleobases que codifica hAGL es al menos 99 % idéntica a una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 7-32 y SEQ ID NOs: 41-45, y en donde el producto de traducción del polinucleótido es una AGL humana activa que tiene actividad AGL.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleobases que codifica hAGL es al menos 99 % idéntica a SEQ ID NO: 41.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que todos los residuos de uridina están reemplazados por residuos de N1-metilpseudouridina.

4. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el polinucleótido comprende un casquete 5'.

5. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el polinucleótido comprende una región no traducida 5' (UTR 5’).

6. El polinucleótido de la reivindicación 5, en el que la UTR 5’ se deriva de un virus del grabado del tabaco (TEV).

7. El polinucleótido de la reivindicación 5, en el que la UTR 5’ comprende SEQ ID NO: 3.

8. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el polinucleótido comprende una región no traducida 3' (UTR 3’).

9. El polinucleótido de la reivindicación 8, en el que la UTR 3' se deriva de una globina beta de Xenopus.

10. El polinucleótido de la reivindicación 8, en el que al UTR 3' comprende SEQ ID NO: 5.

11. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, en donde el polinucleótido comprende una cola de poliA 3'.

12. El polinucleótido de la reivindicación 11, en el que la cola de poliA 3' tiene una longitud de 60 a 220 nucleótidos de adenosina.

13. El polinucleótido de la reivindicación 12, en el que la cola de poliA 3' tiene una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos.

14. Una composición que comprende uno o más polinucleótidos de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y un soporte farmacéuticamente aceptable.

15. La composición de la reivindicación 14, en la que el soporte comprende un reactivo de transfección, una nanopartícula o un liposoma.

16. La composición de la reivindicación 15, en la que el soporte es una nanopartícula.

17. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en la que la composición comprende un lípido catiónico seleccionado de ATX-002, ATX-081, ATX-095 y ATX-126.

18. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 14-17 para uso en mejorar, prevenir, retrasar la aparición o tratar una enfermedad o trastorno asociado con una actividad reducida de la amilo-alfa-1, 6-glucosidasa, 4-alfaglucanotransferasa (hAGL) en un sujeto que lo necesite.

19. La composición para uso de la reivindicación 18, en la que la enfermedad es la enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo III.