TW201903151A - Iii 型糖原貯積病治療劑 - Google Patents

Abstract

本發明提供了多種用於表現人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)或其具有AGL活性之片段的可轉譯聚核苷酸及寡聚物分子。該等聚核苷酸及寡聚物分子可表現以提供人類AGL或其具有AGL活性之片段。該等分子可用作活性劑以便在細胞或個體中表現活性多肽或蛋白質。該等試劑可用於改善、預防個體之與澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)之活性降低相關之疾病或病狀、延遲其發作或對其進行治療的方法中。

Description

III型糖原貯積病治療劑

本發明係關於分子生物學及遺傳學領域，以及由可轉譯分子產生之生物藥劑及治療劑。更特定言之，本發明係關於能夠轉譯成活性多肽或蛋白質之供活體內使用及用作治療劑之分子的方法、結構及組合物。

III型糖原貯積病(亦稱為GSD III或柯里氏病(Cori disease))為一種由缺乏稱為澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)之糖原去分支酶而引起的罕見(發病率1：100,000)先天性糖原代謝障礙。此體染色體隱性代謝病症之特徵在於可變肝臟、心肌及骨骼肌涉入。

基於缺乏酶AGL之組織表現差異，存在四種亞型GSD III。GSD IIIa佔所有GSD III之約85%，且存在肝臟及肌肉涉入，從而在肝臟與肌肉二者中引起酶缺乏。GSDIIIb佔約15%且一般僅存在肝臟涉入，從而僅在肝臟中引起酶缺乏。同時，GSDIIIc與GSDIIId二者均極為罕見，其中咸信GSDIIIc為缺乏葡萄糖苷酶去分支活性之結果，且咸信GSDIIId為缺乏轉移酶去分支活性之結果。

在嬰兒期及幼兒期，肝臟涉入體現為酮性低血糖症、肝腫大、高血脂症及肝臟轉胺酶升高。在青春期及成人期，肝臟疾病不太顯著。患有GSD IIIa者大多數通常在兒童期罹患肥厚型心肌病。其臨床顯著性介於大多數情況下之無症狀至嚴重心臟功能障礙、充血性心臟衰竭及少數情況下之猝死的範圍內。骨骼肌病體現為虛弱，在兒童期通常不明顯，但會緩慢進展，通常在成人中較為顯著。

根據受影響之器官，GSD III患者之血清中往往存在增強之丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)、鹼性磷酸酶(ALP)及/或肌酸磷酸激酶(CPK)活性。

如以上所指出，GSD III係由AGL缺乏所致。此缺乏一般可歸因於遺傳性AGL基因突變，由此引起罹患GSD III之個體的AGL酶活性的部分或全部廢除。已在若干種族群體中對GSD III患者之AGL蛋白進行分子分析，並且已描述超過100種不同的AGL突變。參見Goldstein等人，2010,Genet.Med.12：424-430。亦參見Sentner等人，2013,JIMD Rep.7：19-26。

目前尚無有效的GSD III療法。已試圖利用頻繁高碳水化合物膳食，通常經由使用夜間胃滴注灌食或玉米澱粉補充來控制低血糖症。同時，已利用日間高蛋白膳食加隔夜腸輸注來治療肌病患者。已記載數名患者之暫時性症狀改良，但尚無長期資料顯示高蛋白膳食可預防或治療漸進性肌病。參見Chen YT,Burchell A,Glycogen storage disease.Scriver CR,Beaudet AL,Sly WS,Valle D,The metabolic and molecular basis of inherited disease.New York：McGraw Hill,1995：935-65。漸進性肌病及/或心肌病為成人發病之主要病因，並且已報導諸多患者存在漸進性肝硬化及肝癌。因而，急需可解決此疾病之根本病因，亦即缺乏AGL酶活性的療法。

迄今為止，尚未探索在胞質液中存在缺陷性酶(諸如GSD III中之AGL)之疾病中進行酶置換，此大概係由於缺乏可遞送外源酶越過細胞膜進入細胞質中之有效特異性細胞攝取機制。

本發明藉由提供能夠在細胞質中轉譯從而提供活性AGL，由此可改善、預防或治療與AGL缺乏相關之疾病或病狀(諸如GSD III)的分子、結構及組合物來解決以上提及之需要。

本發明提供了包含能夠轉譯且可用於提供一或多種活性多肽及蛋白質或其片段之新穎分子的組合物。本發明進一步提供了使用此等包含新穎分子之組合物來預防或治療各種病症之方法。更特定言之，本發明之實施例提供了包含可提供活性澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)之可轉譯分子的組合物及使用該等組合物來治療GSD III之方法。

本發明之可轉譯分子可對產生AGL多肽或蛋白具有功能細胞質活性。該等肽及蛋白質可對諸多治療型式具有活性。

本發明之可轉譯分子可具有長半衰期，尤其在細胞之細胞質中。該等可轉譯分子可表現以提供對改善、預防或治療與AGL缺乏相關之疾病或病狀而言具有活性之產物。

本發明提供了用於產生AGL多肽或蛋白之可轉譯分子的多種結構。在一些實施例中，與原生mRNA相比，該等可轉譯分子可具有增強之轉譯能力及/或延長之半衰期。

本發明之可轉譯分子可用於藥物，以及用於產生及遞送活性多肽及蛋白質之方法及組合物。本發明之可轉譯分子可用於在活體外、離體或活體內提供多肽或蛋白質。

本發明之實施例提供了多種用於表現人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)或其具有AGL活性之片段的新穎聚核苷酸。該等聚核苷酸可包括天然核苷酸及經化學修飾之核苷酸。該等聚核苷酸可表現以提供人類AGL或其具有AGL活性之片段。

在其他態樣中，本發明提供了多種用於表現人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)或其具有AGL活性之片段的新穎可轉譯寡聚物，該等可轉譯寡聚物包含一或多個非鎖核酸(UNA)單體。可轉譯寡聚物可含有一或多個UNA單體，以及天然核苷酸及經化學修飾之核苷酸。包含一或多個UNA單 體之可轉譯寡聚物可表現以提供人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)或其具有AGL活性之片段。

在某些態樣中，本發明之可轉譯分子可提供多肽或蛋白質或其片段之高效表現。該表現可為活體外、離體或活體內的。

在一些實施例中，與編碼相同多肽或蛋白質之原生成熟mRNA相比，本發明之分子可具有增加之細胞質半衰期。相對於原生成熟mRNA，本發明之分子及組合物可提供增加之功能細胞活性。

在其他態樣中，與原生成熟mRNA相比，本發明之可轉譯分子作為提供肽或蛋白質產物之藥劑可提供增加之活性。本發明之可轉譯分子可降低有效治療所需之劑量水準。

本發明之實施例包括以下。

圖1顯示使用本發明之可轉譯分子活體外表現人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL，NM_000028)之結果。圖1顯示相對於參考分子534加以標準化之AML12及C2C12細胞中之相對AGL表現。垂直軸體現相對於參考物之倍數增加，例如，10為相對於參考物之10倍增加。該等分子(包括參考分子)包含菸草蝕刻病毒(TEV)5' UTR及爪蟾β-球蛋白(XBG)3' UTR。在轉錄期間對該等分子進行封端並且利用N¹-甲基假尿苷來合成，使得100%尿苷置換為N¹-甲基假尿苷。將編碼AGL之可轉譯分子轉染於兩種細胞株(AML12、C2C12)中。在轉染後6小時溶解細胞並加以收集。藉由使用AGL特異性抗體(ab133720，兔)進行定量西方墨點法來偵測AGL。

圖2顯示使用本發明之可轉譯分子活體外表現人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL，NM_000028)之結果。圖2顯示相對於參考分子534加以標準化之AML12及C2C12細胞中之相對AGL表現。垂直軸體現相 對於參考物之倍數增加，例如，10為相對於參考物之10倍增加。該等分子(包括參考分子)包含菸草蝕刻病毒(TEV)5' UTR及爪蟾β-球蛋白(XBG)3' UTR。在轉錄期間對該等分子進行封端並且利用N¹-甲基假尿苷來合成，使得100%尿苷置換為N¹-甲基假尿苷。將編碼AGL之可轉譯分子轉染於兩種細胞株(AML12、C2C12)中。在轉染後24小時溶解細胞並加以收集。藉由使用AGL特異性抗體(ab133720，兔)進行定量西方墨點法來偵測AGL。

圖3顯示使用本發明之可轉譯分子活體內表現人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL，NM_000028)之結果。圖3顯示對於可轉譯分子528及534(參考物)，在時間點24小時及48小時野生型小鼠中之相對AGL表現。該等分子包含菸草蝕刻病毒(TEV)5' UTR及爪蟾β-球蛋白(XBG)3' UTR。在轉錄期間對該等分子進行封端並且利用N¹-甲基假尿苷來合成，使得100%尿苷置換為N¹-甲基假尿苷。將編碼AGL之可轉譯分子各自製成脂質奈米粒子調配物，並且以10mg/kg經靜脈內注射至野生型小鼠中。在24小時及48小時收集小鼠肝臟，且藉由使用AGL特異性抗體(ab133720，兔)進行定量西方墨點法來偵測AGL。

圖4顯示使用本發明之可轉譯分子活體內表現人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL，NM_000028)之結果。圖4顯示給與可轉譯分子525、527、528、529及546後野生型小鼠中相較於基線PBS(100)之相對AGL肝臟表現。將所合成之編碼AGL之可轉譯分子525、527、528、529及546製成脂質奈米粒子調配物，且經由腹膜內注射至野生型小鼠。所注射之劑量為10mpk，且在6小鼠收集肝臟以供進一步分析。藉由使用AGL特異性抗體(ab133720，兔)進行定量西方墨點法來偵測AGL。

圖5顯示由三種可轉譯分子546、1783及1784表現人類AGL之結果。用經密碼子優化之mRNA轉染人類初級肝細胞，且在轉染後6、24、48及 72小時藉由In-Cell Western^TM來量測AGL蛋白表現。將mRNA序列之表現與未經處理之對照物(「unt」)相比較。

圖6顯示在野生型C57BL/6小鼠中由用脂質奈米粒子調配之各種mRNA分子表現人類AGL。藉由多反應監測分析來測定來自肝臟活組織檢驗樣品之均質物中由mRNA分子表現之外源人類AGL的蛋白質濃度(ng/mg)。該圖中示為546.1、736.1、738.1、737.1、731.1及1783.1之可轉譯分子分別與如實例2中所描述之546、736、738、737、731及1783相同。同時，可轉譯分子546.7與實例2中所描述之546具有相同的核鹼基序列，但係用5-甲氧基尿苷而不是用於合成可轉譯分子546之N¹-甲基假尿苷來替代尿苷而合成。

圖7顯示經用脂質奈米粒子調配之各種mRNA分子處理之野生型C57BL/6小鼠中的內源小鼠AGL表現。藉由多反應監測分析來測定來自肝臟活組織檢驗樣品之均質物中所表現之內源小鼠AGL的蛋白質濃度(ng/mg)。該圖中示為546.1、736.1、738.1、737.1、731.1及1783.1之可轉譯分子分別與如實例2中所描述之546、736、738、737、731及1783相同。同時，可轉譯分子546.7與實例2中所描述之546具有相同的核鹼基序列，但係用5-甲氧基尿苷而不是用於合成可轉譯分子546之N¹-甲基假尿苷來替代尿苷而合成。

圖8顯示來自經媒劑(「VEH」)處理之AGL敲除小鼠的肝臟的組織病理學。在經媒劑處理之肝細胞內觀測到顯著至嚴重肝細胞空泡形成及中度至顯著糖原積聚增加。

圖9顯示來自經用ATX2脂質奈米粒子調配之可轉譯分子546處理之AGL敲除小鼠之肝臟的組織病理學。在經用ATX2脂質奈米粒子調配之可轉譯分子546處理之肝細胞內觀測到僅輕度至中度肝細胞空泡形成及僅輕度至中度糖原積聚增加。

對相關申請案之交叉引用

本申請案主張2017年5月31日申請之美國臨時申請案序號62/513,350之優先權，該案出於所有目的以引用之方式整體併入本文中。

以電子方式提交之正文檔案的描述

與本文一起以電子方式提交之正文檔案的內容係以引用之方式整體併入本文中：序列表之電腦可讀形式複本(檔案名稱：ULPI_041_01WO_SeqList_ST25.txt，記錄日期：2018年5月30日，檔案大小226kb)。

本發明提供了多種新穎試劑及組合物供用於治療應用。本發明之分子及組合物可用於改善、預防或治療個體之GSD III及/或與澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)之存在或功能降低相關之疾病。

在一些實施例中，本發明涵蓋用於表現人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶之合成、經純化之可轉譯聚核苷酸分子。該等分子可含有天然及經化學修飾之核苷酸，且編碼人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)或其具有AGL活性之片段。

在某些實施例中，本發明包括合成、經純化之可轉譯寡聚物分子，該等可轉譯寡聚物分子包含一或多個用於表現人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)或其具有AGL活性之片段的UNA單體。可轉譯寡聚物可含有一或多個UNA單體，以及天然及經化學修飾之核苷酸。包含一或多個UNA單體之可轉譯寡聚物可表現以提供人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)或其具有AGL活性之片段。

如本文中所使用，術語「可轉譯」可與術語「可表現」互換使用，並且係指聚核苷酸或其部分能夠由宿主細胞轉化成多肽。如此項技術中所理解，轉譯為細胞質中之核糖體產生多肽的過程。在轉譯中，信使RNA(mRNA) 被核糖體複合物中之tRNA解碼，從而產生特定胺基酸鏈或多肽。此外，術語「可轉譯」當在本說明書中用於提及寡聚物時意謂該寡聚物之至少一部分，例如寡聚物序列之編碼區(亦稱為編碼序列或CDS)能夠轉化成蛋白質或其片段。

如本文中所使用，術語「單體」係指可與屬於相同或不同類型之另一分子連接以形成寡聚物的單一單位，例如單一核酸。在一些實施例中，單體可為非鎖核酸，亦即，UNA單體。

同時，術語「寡聚物」可與「聚核苷酸」互換使用，並且係指包含至少兩個單體之分子且包括寡核苷酸，諸如DNA及RNA。在寡聚物含有RNA單體及/或非鎖核酸(UNA)單體之情況下，本發明之寡聚物可含有除編碼序列(CDS)以外之序列。此等額外序列可為非轉譯序列，亦即，未被宿主細胞轉化成蛋白質之序列。此等非轉譯序列可包括5'帽、5'非轉譯區(5' UTR)、3'非轉譯區(3' UTR)及尾區，例如polyA尾區。如本文中更詳細描述，此等非轉譯序列中之任一者均可含有一或多個UNA單體，此等UNA單體不能夠被宿主細胞之機構轉譯。在本發明之內容中，「可轉譯寡聚物」、「可轉譯分子」、「可轉譯聚核苷酸」或「可轉譯化合物」係指包含能夠轉化成蛋白質或其片段，例如人類AGL蛋白或其片段之區域，例如RNA之編碼區(例如人類AGL或其經密碼子優化型式之編碼序列)的序列。

如本文中所使用，術語「經密碼子優化」意謂在不改變所編碼之蛋白質胺基酸序列的情況下藉由選擇不同的密碼子，增加蛋白質表現量而重新設計之天然編碼序列(或天然編碼序列之有目的性設計之變異體)(Gustafsson等人，Codon bias and heterologous protein expression.2004,Trends Biotechnol 22：346-53)。諸如高密碼子適應指數(CAI)、LowU方法、mRNA二級結構、順式調控序列、GC含量及許多其他類似變數之變數已顯示在一定程度上與蛋白質表現量相關(Villalobos等人，Gene Designer：a synthetic biology tool for constructing artificial DNA segments.2006,BMC Bioinformatics 7：285)。高CAI(密碼子適應指數)方法針對整個蛋白質編碼序列揀選最常用之同義密碼子。各胺基酸之最常用密碼子係由人類基因組之74218個蛋白質編碼基因推導而來。LowU方法僅靶向可用具有較少U部分之同義密碼子加以置換之含U密碼子。若存在數個置換選擇，則將選擇最常用之密碼子。LowU方法不改變序列中之其餘密碼子。可使用此方法連同所揭示之mRNA來設計欲合成之具有5-甲氧基尿苷之編碼序列。

如熟習本發明之技術人員所瞭解，本發明之可轉譯分子可用於改善、預防或治療個體之與澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)活性降低(例如，由濃度、存在及/或功能降低而引起)相關之任何疾病或病症。在一些實施例中，本發明之可轉譯分子可用於改善、預防或治療GSD IIIa、GSD IIIb、GSDIIIc及GSDIIId(在本文中集體地或個別地稱為「GSD III」或「III型糖原貯積病」)中之一或多種的方法中。本文中欲治療之疾病或病症(例如GSD IIIa、GSD IIIb、GSDIIIc或GSDIIId)可能與低血糖(低血糖症)、肝臟腫大(肝腫大)、血液中脂肪過量(高血脂症)、肝臟酶血液水準升高、慢性肝病(肝硬化)、肝臟衰竭、生長緩慢、身材矮小、良性腫瘤(腺瘤)、肥厚型心肌病、心臟功能障礙、充血性心臟衰竭、骨骼肌病及/或肌張力不良(張力減退)相關。在一些實施例中，本發明之可轉譯分子可用於改善、預防或治療任何或所有此等上述症狀。

如熟習此項技術者所理解，此項技術中可能以許多替代名稱提及GSD III，包括但不限於AGL缺乏症、柯里病、柯里氏病、去分支酶缺乏症、福伯氏病(Forbes disease)、糖原去分支酶缺乏症、GSD3或極限糊精病(由於胞質液中存在極限糊精樣結構)。因此，在本說明書、實例、附圖及申請專利範圍中，GSD III可與此等替代名稱中之任一者互換使用。

編碼功能AGL部分之本發明之可轉譯分子可遞送至有需要之患者(例如，GSD III患者)的肝臟，特定言之，至肝細胞，且可提高該患者之活性AGL 水準。可轉譯分子可用於預防、治療、改善或逆轉該患者之GSD III的任何症狀。

在其他態樣中，本發明之可轉譯分子亦可用於降低GSD III患者對用於控制該疾病之特定飲食的依賴性。舉例而言，本發明之可轉譯分子可用於降低GSD III患者對頻繁高碳水化合物膳食及/或異常高蛋白質飲食之依賴性。

本發明之實施例進一步涵蓋製造用於表現人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)之可轉譯分子的方法。該等方法包括在天然及經化學修飾之核苷三磷酸的存在下在活體外轉錄AGL DNA模板以形成產物混合物，及對該產物混合物進行純化以分離該可轉譯分子。亦可藉由此項技術中已知的方法來製造可轉譯分子。

本發明之分子可為含有RNA及/或UNA單體之可轉譯分子。此等可轉譯分子可具有長半衰期，尤其在細胞質中。長持續時間可轉譯分子可用於改善、預防或治療個體之與澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)之活性降低(例如，由濃度、存在及/或功能降低而引起)相關的疾病或病症。

本發明之可轉譯分子之性質根據其分子結構而出現，且總體上，基於彼等性質，分子之整體結構可提供顯著益處。本發明之實施例可提供具有可有利地提供增強之蛋白質濃度或增加之蛋白質活性的一或多種性質的可轉譯分子。本發明之分子及組合物可提供包含用於改善、預防或治療個體之與澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)之活性降低(例如，由濃度、存在及/或功能降低而引起)相關之任何疾病或病症的治療劑的調配物。

本發明提供多種可轉譯分子，令人驚訝地，該等可轉譯分子可轉譯以便在活體外、離體及活體內提供活性多肽或蛋白質。

本發明之可轉譯分子可表現以提供一或多種活性多肽或蛋白質或其片段。

該等可轉譯結構及組合物可具有增加之轉譯活性或細胞質半衰期。 在此等實施例中，相較於原生mRNA，該等可轉譯結構及組合物可在哺乳動物細胞之細胞質中提供增加之功能半衰期。

如本文中所使用，術語「半衰期」為諸如核酸或蛋白質濃度或活性之量降至其在某一時段開始時所量測之值的一半所需的時間。

本文中提供了本發明之可轉譯分子之結構的範圍，包括含有一或多個UNA單體之寡聚物。含有一或多個UNA單體之寡聚物可併入專用連接基團。連接基團可附接於可轉譯分子中之鏈中。各連接基團亦可附接於核鹼基。

在一些態樣中，連接基團可為單體。單體可附接以形成鏈狀分子。在本發明之鏈狀分子中，連接基團單體可附接於該鏈中之任一點。

在某些態樣中，連接基團單體可附接於本發明之鏈狀分子中，因此該等連接基團單體附接於該鏈之末端附近或該鏈中之任何位置。

在其他態樣中，鏈狀分子之連接基團可各自附接於核鹼基。鏈狀分子中之核鹼基之存在可提供該鏈狀分子中之核鹼基序列。

在某些實施例中，本發明提供具有併入連接基團單體與某些天然核苷酸或非天然核苷酸或經修飾核苷酸或經化學修飾核苷酸之新穎組合的鏈結構的可轉譯寡聚物分子。

本發明之寡聚物分子可呈現核鹼基序列，且可經設計以便在活體外、離體或活體內表現多肽或蛋白質。所表現之多肽或蛋白質可具有呈各種形式之活性，包括對應於由天然、原生或野生型mRNA表現之蛋白質的活性，或者對應於負或顯性負蛋白質之活性。

在一些態樣中，本發明可提供具有與細胞之原生核酸分子之至少一個片段一致之鹼基序列的活性可轉譯寡聚物分子。

在一些實施例中，該細胞可為真核細胞、哺乳動物細胞或人類細胞。

本發明提供了併入連接基團單體之可轉譯寡聚試劑的結構、方法及 組合物。本發明之寡聚分子可用作治療用調配物中之活性劑。

本發明提供了由於其能夠在個體之細胞中表現為多肽或蛋白質而適用於提供治療效應的多種可轉譯分子。

在某些實施例中，可轉譯分子可結構化為由單體構成之寡聚物。本發明之寡聚結構可含有一或多個連接基團單體以及某些核苷酸。

在某些實施例中，可轉譯分子可含有核鹼基序列，且可經設計以表現任何同功異型體之肽或蛋白質，此在某種程度上係由於與原生聚核苷酸序列具有充分同源性。

在一些實施例中，可轉譯分子可具有約200至約12,000個單體之長度或更長。在某些實施例中，可轉譯分子可具有1,000至9,000個單體之長度、3,000至7,000個單體之長度或4,000至6,000個單體之長度。在一例示性實施例中，該可轉譯分子具有4,500至5,500個單體之長度。在另一例示性實施例中，該可轉譯分子具有約5,000個單體之長度。

在一些實施例中，可轉譯分子可含有1至約800個UNA單體。在某些實施例中，可轉譯分子可含有1至600個UNA單體或1至100個UNA單體或1至12個UNA單體。

在一些實施例中，可轉譯分子可含有1至約800個鎖核酸(LNA)單體。在某些實施例中，可轉譯分子可含有1至600個LNA單體或1至100個LNA單體或1至12個LNA單體。

本發明之可轉譯分子可包含5'帽、單體5'非轉譯區、單體編碼區、單體3'非轉譯區及單體尾區。

本發明之可轉譯分子可包含有含一或多個UNA單體之單體3'非轉譯區。

本發明之可轉譯分子可包含有含一或多個UNA單體之單體尾區。

本發明之可轉譯分子可包含具有可操作以便在細胞中進行轉譯或具有mRNA之區域之功能性的序列或結構的區域，包括例如5'帽、5'非轉譯區、編碼區、3'非轉譯區及polyA尾。

本發明進一步設想用於遞送包含一或多個可轉譯分子之一或多種載體至細胞的方法。在其他實施例中，本發明亦設想遞送一或多個可轉譯分子至細胞。

在一些實施例中，可離體將一或多個可轉譯分子活體外、離體或活體內遞送至細胞。如此項技術中已知的病毒及非病毒轉移方法可用於在哺乳動物細胞中引入可轉譯分子。可轉譯分子可與醫藥學上可接受之媒劑一起或例如與奈米粒子或脂質體一起遞送。

在一些實施例中，與利用原生組合物相比，本發明之可轉譯結構及組合物可降低在培養物中進行細胞命運操縱所需之轉染次數及頻率。

在其他態樣中，與利用原生mRNA相比，本發明提供增強之作為活性劑之可轉譯分子之活性。

在一些態樣中，本發明可提供與原生核酸、多肽或蛋白質所誘導之細胞先天免疫反應相比可降低細胞先天免疫反應之可轉譯分子。

本發明可提供與原生分子相比對去腺苷化無感受性之合成可轉譯分子。

在某些實施例中，本發明可提供與原生分子相比具有增加之比活性及更久功能半衰期之合成可轉譯分子。本發明之合成可轉譯分子可提供增加之異位蛋白質表現量。當使用載體表現可轉譯分子時，細胞遞送可處於增高之水準，且細胞毒性先天免疫反應可受到約束，因此可達成較高水準之異位蛋白質表現。本發明之可轉譯分子與原生mRNA相比可具有增加之比活性及更久功能半衰期。

在某些態樣中，相對於原生mRNA，可轉譯分子可具有眾多突變。

在其他實施例中，本發明可提供具有附接於3'端及/或5'端之可裂解遞送及靶向部分的可轉譯分子。

一般而言，藉由轉染遞送之合成可轉譯分子之比活性可視為每單位時間內表現之蛋白質分子數目/遞送之轉錄物。

如本文中所使用，轉譯效率係指由可轉譯分子之活體外或活體內轉譯產生之蛋白質或多肽的量度。

本發明提供多種可轉譯寡聚物分子，該等可轉譯寡聚物分子可含有一或多個UNA單體及眾多核酸單體，其中該可轉譯分子可表現以提供多肽或蛋白質。

在一些實施例中，本發明包括多種可轉譯寡聚物分子，該等可轉譯寡聚物分子可含有處於一或多個非轉譯區中之一或多個UNA單體及眾多核酸單體，其中該可轉譯分子可表現以提供多肽或蛋白質。

在一些實施例中，本發明包括多種可轉譯分子，該等可轉譯分子可含有處於尾區中之一或多個UNA單體及眾多核酸單體，其中該可轉譯分子可表現以提供多肽或蛋白質。

在一些實施例中，可轉譯分子可含有經修飾之5'帽。

在其他實施例中，可轉譯分子可含有單體轉譯增強5'非轉譯區。

在其他實施例中，可轉譯分子可含有單體轉譯增強3'非轉譯區。

在其他實施例中，可轉譯分子可含有處於單體3'非轉譯區中之一或多個UNA單體。

在其他實施例中，可轉譯分子可含有處於單體尾區中之一或多個UNA單體。

在其他實施例中，可轉譯分子可含有處於polyA尾中之一或多個UNA 單體。

在一些實施例中，可轉譯分子可含有處於單體3'非轉譯區中或處於單體尾區中，例如處於polyA尾中之一或多個LNA單體。

在另一態樣中，本發明之可轉譯分子可展現與編碼相同轉譯產物之原生mRNA相比增加至少2倍、3倍、5倍或10倍之活體內轉譯效率。

在另一態樣中，可轉譯分子可產生與編碼相同多肽或蛋白質之原生mRNA相比增加至少2倍、3倍、5倍或10倍之活體內多肽或蛋白質水準。

在某些實施例中，可轉譯分子與編碼相同多肽或蛋白質之原生mRNA相比可在活體內提供增加水準之多肽或蛋白質。舉例而言，多肽或蛋白質之水準可增加10%或20%或30%或40%或50%或更多。

在其他實施例中，本發明提供藉由向該個體投與含有本發明之可轉譯分子的組合物來治療個體之疾病或病狀的方法。

本發明之可轉譯分子可用於改善、預防或治療個體之疾病或病症，例如與澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)之活性降低(例如，由濃度、存在及/或功能降低而引起)相關之疾病或病症。在此等實施例中，可投與包含本發明之可轉譯分子的組合物以調控、調節或增加個體中之AGL酶的濃度或有效性。在一些態樣中，該酶可為患者具有異常量(例如，具有可部分或完全廢除AGL活性之AGL突變型式的患者)之未經修飾之天然酶。在一些態樣中，該酶可為可用於治療攜帶AGL突變型式之患者的未經修飾之天然AGL酶。在例示性實施例中，本發明之可轉譯分子可用於改善、預防或治療GSD III。

在一些實施例中，可將可轉譯分子遞送至細胞或個體，並且進行轉譯以增加細胞或個體中之AGL水準。

如本文中所使用，術語「個體」係指人類或任何非人類動物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、豬、綿羊、馬或靈長類動物)。人類包括出生前 及出生後形式。在許多實施例中，個體為人類。個體可為患者，患者係指接受醫療提供者診斷或治療疾病之患者。術語「個體」在本文中可與「個人」或「患者」互換使用。個體可能罹患或易患疾病或病症，但可能或可能未顯示該疾病或病症之症狀。

在一例示性實施例中，本發明之個體為具有降低活性(例如，由濃度、存在及/或功能降低而引起)之澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)的個體。在另一例示性實施例中，該個體為人類。

在一些實施例中，投與包含本發明之可轉譯分子的組合物可引起所治療個體之肝臟AGL蛋白水準增加。在一些實施例中，投與包含本發明之可轉譯分子的組合物引起肝臟AGL蛋白水準相對於個體在治療前之基線AGL蛋白水準增加約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。在一例示性實施例中，投與包含本發明之可轉譯分子的組合物引起肝臟AGL水準相對於個體在治療前之基線肝臟AGL水準有所增加。在一些實施例中，肝臟AGL水準增加可為至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、100%、200%或更多。

在一些實施例中，在肝臟、血清、血漿、腎臟、心臟、肌肉、腦、腦脊髓液或淋巴結中可偵測到由本發明之可轉譯分子表現之AGL蛋白。在例示性實施例中，AGL蛋白表現於所治療個體之肝臟細胞，例如肝細胞中。

在一些實施例中，投與包含本發明之可轉譯分子的組合物在所治療個體之肝臟中引起等於或高於約10ng/mg、約20ng/mg、約50ng/mg、約100ng/mg、約150ng/mg、約200ng/mg、約250ng/mg、約300ng/mg、約350ng/mg、約400ng/mg、約450ng/mg、約500ng/mg、約600ng/mg、約700ng/mg、約800ng/mg、約900ng/mg、約1000ng/mg、約1200ng/mg或約1500ng/mg總蛋白質之天然非突變人類AGL(亦即，正常或野生型AGL，與異常或突變AGL相反)蛋白 表現量。

如本文中所使用，術語「約」或「大約」在應用於一或多個目標值時係指與所陳述之參考值類似的值。在某些實施例中，除非另外闡述或除非根據上下文顯而易見，否則術語「大約」或「約」係指在所陳述之參考值的任一方向(更大或更小)上處於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小範圍內的值範圍(除非此種數值將超過可能值之100%)。

在一些實施例中，在投與包含本發明之可轉譯分子的組合物之後6、12、18、24、30、36、48、60及/或72小時可偵測到天然非突變人類AGL蛋白之表現。在一些實施例中，在投與包含本發明之可轉譯分子的組合物之後1天、2天、3天、4天、5天、6天及/或7天可偵測到天然非突變人類AGL蛋白之表現。在一些實施例中，在投與之後1週、2週、3週及/或4週可偵測到天然非突變人類AGL蛋白之表現。在一些實施例中，在投與包含本發明之可轉譯分子的組合物之後可偵測到天然非突變人類AGL蛋白之表現。在一些實施例中，在投與包含本發明之可轉譯分子的組合物之後，在肝臟，例如肝細胞中可偵測到天然非突變人類AGL蛋白之表現。

用於製造可轉譯分子之變異模板

在本文中所描述之各種實施例中，可轉譯寡聚物可包含編碼AGL之mRNA，其中該編碼AGL之mRNA經密碼子優化。在一些實施例中，該AGL為人類AGL(亦即，hAGL)。在一些實施例中，該人類AGL包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。在一些實施例中，該人類AGL由SEQ ID NO：2之胺基酸序列組成。

在一些實施例中，可利用變異DNA模板來製造能夠編碼AGL之可轉譯分子。本發明之變異DNA模板可在製造可轉譯分子之方法及可轉譯分子之效率方面展現優勢。可利用模板變異來增強經修飾之核苷酸或單體併入本發明之可轉譯分子中。在某些態樣中，可利用模板變異來增強可轉譯分子之結構特徵。 增強可轉譯分子之結構特徵可提供出乎意料有利之性質，包括提供多肽或蛋白質產物之轉譯效率。

在本發明之一些態樣中，模板變異可包括降低模板鏈中某些核苷酸之出現率或出現頻率。降低某一核苷酸之出現率可改變本發明之結構及方法從而提供非原生形式，此舉令人驚訝地達成了改良編碼AGL之可轉譯RNA產物的性質。

本發明之態樣可能需要變異DNA模板用於製造可轉譯分子之方法中。DNA分子可具有可經轉錄以提供編碼AGL之靶可轉譯分子的非編碼模板核苷酸鏈。

靶可轉譯分子可為任何RNA，無論是原生的或是經修飾的、是合成的或是來源於天然來源。

在一些實施例中，可使用模板鏈之開放閱讀框轉化至替代形式同時保留密碼子分配的變異DNA模板。

在某些實施例中，可使用基於替代密碼子優化及/或序列簡併而使用替代核苷酸之DNA模板。

在其他實施例中，DNA模板可允許某些核苷酸經替代核苷酸置換，同時保留密碼子分配。

有利的是，本發明之實施例在用於產生編碼AGL之可轉譯分子的過程中所使用之本發明之DNA模板中利用了替代密碼子。本發明之DNA模板中可達成之變異在規模上遠大於可能在眾多過程中需要較佳密碼子之細胞及生物體。在本發明中，可使用DNA模板中之眾多替代密碼子及位置來轉錄可轉譯分子。

在本發明之其他態樣中，模板變異可包括模板鏈中某些核苷酸之出現率或出現頻率減少。舉例而言，模板中核苷酸之出現率可降至佔該模板中核 苷酸之25%以下的水準。在其他實例中，模板中核苷酸之出現率可降至佔該模板中核苷酸之20%以下的水準。在一些實例中，模板中核苷酸之出現率可降至佔該模板中核苷酸之16%以下的水準。在某些實例中，模板中核苷酸之出現率可降至佔該模板中核苷酸之12%以下的水準。

人類AGL

人類AGL基因編碼具有1532個胺基酸之蛋白質，該蛋白質之分子質量為約174.8kDa。AGL為多功能酶，其在糖原降解中充當1,4-α-D-葡聚糖：1,4-α-D-葡聚糖-4-α-D-糖基轉移酶及澱粉-1,6-葡萄糖苷酶。如以上所指出，正常AGL活性之遺傳性缺乏導致糖原貯積病III。

一致人類AGL編碼序列具有SEQ ID NO：1中所示之4,599個核鹼基之RNA序列。

一致人類AGL編碼序列(見於NCBI登錄號NP_000019.2)轉譯成SEQ ID NO：2。

在一些實施例中，可產生可轉譯分子並且用於表現人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(hAGL)，與hAGL之原生mRNA相比，有利地增加了轉譯效率。表現hAGL之可轉譯分子可展現適用於改善、預防或治療疾病之方法中的活性。在一些實施例中，可轉譯分子可包含一或多個UNA單體。

在一些實施例中，可轉譯分子可包括5'帽、5' UTR、轉譯起始序列(例如Kozak序列)、人類AGL CDS、3' UTR及/或尾區。在一例示性實施例中，可轉譯分子可包括5'帽(m7GpppGm)、菸草蝕刻病毒(TEV)之5' UTR、Kozak序列、人類AGL CDS、爪蟾β-球蛋白之3' UTR及尾區。在其他例示性實施例中，人類AGL CDS可包含以下更詳細描述之SEQ ID NO：7-32或SEQ ID NO：41-45之經密碼子優化之序列。在本文中所描述之此等及其他實施例中之任一者中，可轉譯分子可包含一或多個UNA單體。在本文中所描述之此等及其他實施例中之任一者 中，可轉譯分子可包含一或多個LNA單體。

該分子之轉譯效率與AGL之原生mRNA相比可能有所增加。特定言之，在48小時之後，該分子之轉譯效率與AGL之原生mRNA相比可能超過兩倍。

在一些實施例中，適用於本發明之mRNA序列包含編碼人類AGL蛋白之mRNA序列。天然存在之人類AGL蛋白之序列示於SEQ ID NO：2中。

在一些實施例中，適合之mRNA序列可為編碼人類AGL之同系物或變異體的mRNA序列。如本文中所使用，人類AGL蛋白之同系物或變異體可為與野生型或天然存在之人類AGL蛋白相比含有一或多個胺基酸取代、缺失及/或插入而保留實質性AGL蛋白活性的經修飾之人類AGL蛋白。在一些實施例中，適用於本發明之mRNA編碼實質上與人類AGL蛋白一致之蛋白質。在一些實施例中，適用於本發明之mRNA編碼與SEQ ID NO：2具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，適用於本發明之mRNA編碼人類AGL蛋白之片段或部分。

在一些實施例中，適用於本發明之mRNA編碼人類AGL蛋白之片段或部分，其中該蛋白質之該片段或部分仍維持與野生型蛋白質類似之AGL活性。

在一些實施例中，適用於本發明之mRNA包含與SEQ ID NO：7-32或SEQ ID NO：41-45具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性之序列。

在一些實施例中，本發明之可轉譯寡聚分子包含與SEQ ID NO：7-32或SEQ ID NO：41-45具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性之編碼序列。在一些實施例中，包含與SEQ ID NO：7-32或SEQ ID NO：41-45具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性之編碼序列的可轉譯寡聚分 子進一步包含選自5'帽、5' UTR、轉譯起始序列、3' UTR及尾區之一或多個序列。

在一些實施例中，本發明之可轉譯寡聚分子包含與野生型人類AGL編碼序列在SEQ ID NO：1之全長人類AGL編碼序列上具有低於80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之編碼序列，並且表現功能人類AGL蛋白。在一例示性實施例中，本發明之可轉譯寡聚分子包含與野生型人類AGL編碼序列在SEQ ID NO：1之全長人類AGL編碼序列上具有低於80%一致性之編碼序列，並且表現功能人類AGL蛋白。在另一例示性實施例中，本發明之可轉譯寡聚分子包含與野生型人類AGL編碼序列在SEQ ID NO：1之全長人類AGL編碼序列上具有低於80%一致性之編碼序列，並且表現功能人類AGL蛋白，其中該編碼序列與選自SEQ ID NO：7-32或SEQ ID NO：41-45之序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性。在另一例示性實施例中，本發明之可轉譯寡聚分子包含與野生型人類AGL編碼序列在SEQ ID NO：1之全長人類AGL編碼序列上具有低於80%一致性之編碼序列，並且表現功能人類AGL蛋白，其中該編碼序列與選自SEQ ID NO：7-32或SEQ ID NO：41-45之序列具有至少95%一致性。在另一例示性實施例中，本發明之可轉譯寡聚分子包含與野生型人類AGL編碼序列在SEQ ID NO：1之全長人類AGL編碼序列上具有低於80%一致性之編碼序列，並且表現功能人類AGL蛋白，其中該編碼序列與選自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：45之序列具有至少95%一致性。因此，在一些實施例中，本申請案提供一種聚核苷酸，其包含與野生型人類AGL編碼序列在SEQ ID NO：1之全長人類AGL編碼序列上具有低於80%一致性之核鹼基序列或由其組成，且其中該人類AGL編碼序列與選自SEQ ID NO：7-32或SEQ ID NO：41-45之序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性。在一例示性實施例中，本申請案提供一種聚核苷酸，其包含與野 生型人類AGL編碼序列在SEQ ID NO：1之全長人類AGL編碼序列上具有低於80%一致性之核鹼基序列或由其組成，且其中該人類AGL編碼序列與選自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：45之序列具有至少95%一致性。在一特定實施例中，本申請案提供一種聚核苷酸，其包含與野生型人類AGL編碼序列在SEQ ID NO：1之全長人類AGL編碼序列上具有低於80%一致性之核鹼基序列，且其中該人類AGL編碼序列與SEQ ID NO：19具有至少95%一致性。在另一特定實施例中，本申請案提供一種聚核苷酸，其包含與野生型人類AGL編碼序列在SEQ ID NO：1之全長人類AGL編碼序列上具有低於80%一致性之核鹼基序列，且其中該人類AGL編碼序列與SEQ ID NO：31具有至少95%一致性。在另一特定實施例中，本申請案提供一種聚核苷酸，其包含與野生型人類AGL編碼序列在SEQ ID NO：1之全長人類AGL編碼序列上具有低於80%一致性之核鹼基序列，且其中該人類AGL編碼序列與SEQ ID NO：45具有至少95%一致性。

在一些實施例中，本發明之可轉譯寡聚分子編碼融合蛋白質，該融合蛋白質包含與另一序列融合(例如，N或C末端融合)之全長、片段或部分AGL蛋白。在一些實施例中，該N或C末端序列為信號序列或細胞靶向序列。

UNA單體及寡聚物

在一些實施例中，連接子基團單體可為非鎖核酸單體(UNA單體)，其為基於如以下所示之丙烷-1,2,3-三基-參氧基結構的小有機分子： 其中R¹及R²為H，且R¹及R²可為磷酸二酯鍵聯，鹼基可為核鹼基，且R³為以下所描述之官能基。

在另一視圖中，該UNA單體主要原子可用IUPAC記法繪出如下： 其中寡聚物鏈之前進方向為自該丙烷殘基之1端至3端。

核鹼基之實例包括尿嘧啶、胸嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、肌苷，以及天然及非天然核鹼基類似物。

核鹼基之實例包括假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶(m1Ψ，亦即，N¹-甲基假尿嘧啶)及5-甲氧基尿嘧啶。

一般而言，UNA單體不為核苷酸，其可為寡聚物中之內部連接子單體。寡聚物中之內部UNA單體在兩側上均側接其他單體。

舉例而言，當寡聚物形成複合物或雙螺旋且存在有核鹼基處於該複合物或雙螺旋中之其他單體時，UNA單體可參與鹼基配對。

呈側接於丙烷-1-基位置與丙烷-3-基位置之內部單體(其中R³為-OH)形式的UNA單體的實例顯示如下。

UNA單體可為寡聚物之末端單體，其中該UNA單體在丙烷-1-基位置或丙烷-3-基位置附接於僅一個單體。因為UNA單體為可撓性有機結構，故不同於核苷酸，末端UNA單體可為寡聚物之可撓性終止子。

作為附接於丙烷-3-基位置之末端單體的UNA單體之實例顯示如下。

因為UNA單體可為可撓性分子，故作為末端單體之UNA單體可呈現廣泛不同的構形。作為附接於丙烷-3-基位置之末端單體的能量最小化UNA單體構形之實例顯示如下。

UNA單體之結構尤其允許其附接於天然存在之核苷酸。

UNA寡聚物可為由UNA單體以及可基於天然存在之核苷的各種核苷酸構成之鏈。

在一些實施例中，UNA單體之官能基R³可為-OR⁴、-SR⁴、-NR⁴ ₂、-NH(C=O)R⁴、嗎啉基、嗎啉-1-基、哌嗪-1-基或4-烷醯基-哌嗪-1-基，其中R⁴在每次出現時相同或不同，並且可為H、烷基、膽固醇、脂質分子、聚胺、胺基酸或多肽。

該等UNA單體為有機分子。UNA單體既非核酸單體或核苷酸，其又非天然存在核苷或經修飾之天然存在核苷。

本發明之UNA寡聚物為合成鏈分子。

在一些實施例中，如以上所示，UNA單體可為UNA-A(命名為Ã)、UNA-U(命名為)、UNA-C(命名為)及UNA-G(命名為)。

本文中可能使用之名稱包括mA、mG、mC及mU，其係指經2'-O-甲基修飾之核糖核苷酸。

本文中可能使用之名稱包括dT，其係指2'-去氧T核苷酸。

如本文中所使用，在寡聚物序列之內容中，符號N可表示任何天然核苷酸單體或任何經修飾之核苷酸單體。

如本文中所使用，在寡聚物序列之內容中，符號Q表示非天然、經修飾或經化學修飾之核苷酸單體。

如本文中所使用，在寡聚物序列之上下文中，可能使用符號X來表示UNA單體。

經修飾及經化學修飾之核苷酸

在本文中之經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例中，烷基、環烷基或苯基取代基可能未經取代，或進一步經一或多個烷基、鹵基、鹵烷基、胺基或硝基取代基取代。

核酸單體之實例包括非天然、經修飾及經化學修飾之核苷酸，包括此項技術中已知的任何此種核苷酸。

經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括5-羥基胞苷、5-烷基胞苷、5-羥基烷基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲醯基胞苷、5-烷氧基胞苷、5-炔基胞苷、5-鹵基胞苷、2-硫基胞苷、N⁴-烷基胞苷、N⁴-胺基胞苷、N⁴-乙醯基胞苷及N⁴,N⁴-二烷基胞苷。

經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括5-羥基胞苷、5-甲基胞苷、5-羥基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲醯基胞苷、5-甲氧基胞苷、5-丙炔基胞苷、 5-溴胞苷、5-碘胞苷、2-硫胞苷、N⁴-甲基胞苷、N⁴-胺基胞苷、N⁴-乙醯基胞苷及N⁴,N⁴-二甲基胞苷。

經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括5-羥基尿苷、5-烷基尿苷、5-羥基烷基尿苷、5-羧基尿苷、5-羧基烷基酯尿苷、5-甲醯基尿苷、5-烷氧基尿苷、5-炔基尿苷、5-鹵基尿苷、2-硫尿苷及6-烷基尿苷。

經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括5-羥基尿苷、5-甲基尿苷、5-羥基甲基尿苷、5-羧基尿苷、5-羧基甲酯尿苷、5-甲醯基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-丙炔基尿苷、5-溴尿苷、5-氟尿苷、5-碘尿苷、2-硫尿苷及6-甲基尿苷。

經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷、5-甲基胺基甲基-2-硫尿苷、5-胺甲醯基甲基尿苷、5-胺甲醯基甲基-2'-O-甲基尿苷、1-甲基-3-(3-胺基-3羧基丙基)假尿苷、5-甲基胺基甲基-2-硒基尿苷、5-羧基甲基尿苷、5-甲基二氫尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫尿苷、5-(異戊烯基胺基甲基)尿苷、2'-O-甲基假尿苷、2-硫-2'O-甲基尿苷及3,2'-O-二甲基尿苷。

經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括N⁶-甲基腺苷、2-胺基腺苷、3-甲基腺苷、8-氮雜腺苷、7-去氮腺苷、8-側氧基腺苷、8-溴腺苷、2-甲硫基-N⁶-甲基腺苷、N⁶-異戊烯基腺苷、2-甲硫基-N⁶-異戊烯基腺苷、N⁶-(順-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N⁶-(順-羥基異戊烯基)腺苷、N⁶-甘胺醯基胺甲醯基腺苷、N6-酥胺醯基胺甲醯基-腺苷、N⁶-甲基-N⁶-酥胺醯基胺甲醯基-腺苷、2-甲硫基-N⁶-酥胺醯基胺甲醯基-腺苷、N⁶,N⁶-二甲基腺苷、N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基腺苷、2-甲硫基-N⁶-羥基正纈胺醯基胺甲醯基-腺苷、N⁶-乙醯基-腺苷、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫基-腺苷、2'-O-甲基-腺苷、N⁶,2'-O-二甲基-腺苷、N⁶,N⁶,2'-O-三甲基-腺苷、1,2'-O-二甲基-腺苷、2'-O-核糖基腺苷、2-胺基-N⁶-甲基-嘌呤、1-硫基-腺苷、2'-F-阿糖-腺苷、2'-F-腺苷、2'-OH-阿糖-腺苷 及N⁶-(19-胺基-五氧雜十九基)-腺苷。

經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括N¹-烷基鳥苷、N²-烷基鳥苷、噻吩并鳥苷、7-去氮鳥苷、8-側氧基鳥苷、8-溴鳥苷、O⁶-烷基鳥苷、黃苷、肌苷及N¹-烷基肌苷。

經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括N¹-甲基鳥苷、N²-甲基鳥苷、噻吩并鳥苷、7-去氮鳥苷、8-側氧基鳥苷、8-溴鳥苷、O⁶-甲基鳥苷、黃苷、肌苷及N¹-甲基肌苷。

經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括假尿苷。假尿苷之實例包括N¹-烷基假尿苷、N¹-環烷基假尿苷、N¹-羥基假尿苷、N¹-羥基烷基假尿苷、N¹-苯基假尿苷、N¹-苯基烷基假尿苷、N¹-胺基烷基假尿苷、N³-烷基假尿苷、N⁶-烷基假尿苷、N⁶-烷氧基假尿苷、N⁶-羥基假尿苷、N⁶-羥基烷基假尿苷、N⁶-嗎啉基假尿苷、N⁶-苯基假尿苷及N⁶-鹵基假尿苷。假尿苷之實例包括N¹-烷基-N⁶-烷基假尿苷、N¹-烷基-N⁶-烷氧基假尿苷、N¹-烷基-N⁶-羥基假尿苷、N¹-烷基-N⁶-羥基烷基假尿苷、N¹-烷基-N⁶-嗎啉基假尿苷、N¹-烷基-N⁶-苯基假尿苷及N¹-烷基-N⁶-鹵基假尿苷。在此等實例中，烷基、環烷基及苯基取代基可能未經取代，或進一步經烷基、鹵基、鹵烷基、胺基或硝基取代基取代。

假尿苷之實例包括N¹-甲基假尿苷、N¹-乙基假尿苷、N¹-丙基假尿苷、N¹-環丙基假尿苷、N¹-苯基假尿苷、N¹-胺基甲基假尿苷、N³-甲基假尿苷、N¹-羥基假尿苷及N¹-羥基甲基假尿苷。

核酸單體之實例包括經修飾及經化學修飾之核苷酸，包括此項技術中已知的任何此種核苷酸。

經修飾及經化學修飾之核苷酸單體的實例包括此項技術中已知的任何此種核苷酸，例如2'-O-甲基核糖核苷酸、2'-O-甲基嘌呤核苷酸、2'-去氧-2'-氟核糖核苷酸、2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸、2'-去氧核糖核苷酸、2'-去氧嘌呤核苷酸、 通用鹼基核苷酸、5-C-甲基-核苷酸及倒位去氧無鹼基單體殘基。

經修飾及經化學修飾之核苷酸單體的實例包括3'-端穩定之核苷酸、3'-甘油核苷酸、3'-倒位無鹼基核苷酸及3'-倒位胸嘧啶。

經修飾及經化學修飾之核苷酸單體的實例包括鎖核酸核苷酸(LNA)、2'-O,4'-C-亞甲基-(D-核呋喃糖基)核苷酸、2'-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸、2'-甲基-硫基-乙基、2'-去氧-2'-氟核苷酸及2'-O-甲基核苷酸。在一例示性實施例中，經修飾之單體為鎖核酸核苷酸(LNA)。

經修飾及經化學修飾之核苷酸單體的實例包括經2',4'-受限2'-O-甲氧基乙基(cMOE)及2'-O-乙基(cEt)修飾之DNA。

經修飾及經化學修飾之核苷酸單體的實例包括2'-胺基核苷酸、2'-O-胺基核苷酸、2'-C-烷基核苷酸及2'-O-烷基核苷酸。

經修飾及經化學修飾之核苷酸單體的實例包括N⁶-甲基腺苷核苷酸。

經修飾及經化學修飾之核苷酸單體的實例包括具有經修飾之鹼基5-(3-胺基)丙基尿苷、5-(2-巰基)乙基尿苷、5-溴尿苷、8-溴鳥苷或7-去氮腺苷的核苷酸單體。

經修飾及經化學修飾之核苷酸單體的實例包括經2'-O-胺基丙基取代之核苷酸。

經修飾及經化學修飾之核苷酸單體的實例包括用2'-R、2'-OR、2'-鹵素、2'-SR或2'-胺基置換核苷酸之2'-OH基團，其中R可為H、烷基、烯基或炔基。

Saenger,Principles of Nucleic Acid Structure,Springer-Verlag,1984中提供了經修飾之核苷酸的一些實例。

以上所描述之鹼基修飾的實例可與額外核苷或核苷酸結構修飾(包括糖修飾及鍵聯修飾)組合。

某些經修飾或經化學修飾之核苷酸單體可見於自然界中。

含有一或多個UNA單體之可轉譯分子

本發明之態樣提供了作為含有一或多個UNA單體之寡聚化合物的可轉譯分子的結構及組合物。該等可轉譯寡聚物可為醫藥組合物之活性劑。在一些實施例中，該等可轉譯寡聚物編碼人類AGL或其變異體。

本發明之寡聚可轉譯分子可含有一或多個UNA單體。本發明之寡聚分子可作為活性劑用於調配物中以便提供肽及蛋白質治療劑。在一些實施例中，該等可轉譯寡聚物編碼人類AGL或其變異體。

在一些實施例中，本發明提供具有併入UNA單體與某些天然核苷酸、非天然核苷酸、經修飾核苷酸或經化學修飾核苷酸之新穎組合的結構的寡聚可轉譯化合物。

本發明之可轉譯寡聚化合物可具有長約200至約12,000個鹼基之長度。本發明之可轉譯寡聚化合物可具有約1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000或約9000個鹼基之長度。在一些實施例中，本發明之可轉譯寡聚化合物可具有約4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400或約5500個鹼基之長度。在一例示性實施例中，本發明之可轉譯寡聚化合物具有約5000個鹼基之長度。

在其他態樣中，本發明之包含一或多個UNA單體之寡聚可轉譯化合物可為藥理學活性分子。可轉譯寡聚分子可用作活性醫藥成分以供在活體外、活體內或離體產生肽或蛋白質活性劑。在一例示性實施例中，本發明之可轉譯寡聚化合物編碼人類AGL或其變異體。

本發明之可轉譯寡聚分子可具有式I之結構： 其中L¹為鍵聯，n為200至12,000，且L²在每次出現時為具有式-C¹-C²-C³-之UNA 連接子基團，其中R附接至C²且具有式-OCH(CH₂R³)R⁵，其中R³為-OR⁴、-SR⁴、-NR⁴ ₂、-NH(C=O)R⁴、嗎啉基、嗎啉-1-基、哌嗪-1-基或4-烷醯基-哌嗪-1-基，其中R⁴在每次出現時相同或不同並且為H、烷基、膽固醇、脂質分子、聚胺、胺基酸或多肽，且其中R⁵為核鹼基，或者L²(R)為糖(諸如核糖)且R為核鹼基，或者L²為經修飾之糖(諸如經修飾之核糖)且R為核鹼基。在某些實施例中，核鹼基可為經修飾之核鹼基。L¹可為磷酸二酯鍵聯。

可轉譯寡聚分子之鹼基序列可為任何核鹼基序列。

在一些態樣中，本發明之可轉譯寡聚分子可在任何單體間位置上具有任何數目之硫代磷酸酯單體間鍵聯。

在一些實施例中，可轉譯寡聚分子之單體間鍵聯中之任何一或多個均可為磷酸二酯、硫代磷酸酯(包括二硫代磷酸酯)、對掌性硫代磷酸酯及其他經化學修飾之形式。

當可轉譯寡聚分子以UNA單體為末端時，根據以上所示之位置編號，該末端位置具有1-端，或該末端位置具有3-端。

增強之轉譯

本發明之可轉譯分子可併入能增強該分子之轉譯效率的區域。

一般而言，可將如此項技術中已知的轉譯增強子區域併入可轉譯分子之結構中以增加肽或蛋白質產率。

含有轉譯增強子區域之可轉譯分子可增加肽或蛋白質之產生。

在一些實施例中，轉譯增強子區域可構成或位於可轉譯分子之5'或3'非轉譯區中。

轉譯增強子區域之實例包括來自TEV 5' UTR及爪蟾β-球蛋白3' UTR之天然存在之增強子區域。

分子結構及序列

可設計可轉譯分子以表現靶肽或蛋白質。在一些實施例中，該靶肽或蛋白質可與個體之病狀或疾病相關。

在一些態樣中，可轉譯分子之鹼基序列可包括與mRNA鹼基序列之至少一個有效部分或結構域一致的部分，其中有效部分足以賦予該可轉譯分子之轉譯產物以治療活性。

在一些態樣中，本發明提供具有與細胞之原生核酸分子之至少一個片段一致之鹼基序列的活性可轉譯分子。

在某些實施例中，可轉譯分子之鹼基序列可包括除一或多個鹼基突變外與mRNA之鹼基序列一致的部分。可轉譯分子之突變數目不應超過將會產生具有實質上低於mRNA之活性的可轉譯分子轉譯產物的量。

本發明之寡聚可轉譯UNA分子可呈現核鹼基序列，且可經設計以便在活體外、離體或活體內表現肽或蛋白質。所表現之肽或蛋白質可具有各種形式之活性，包括對應於由原生或天然mRNA表現之蛋白質的活性。

在一些實施例中，本發明之可轉譯分子可具有約400至15,000個單體之鏈長度，其中除UNA單體外之任何單體均可為N或Q單體。

分子帽結構

可用如此項技術中已知的各種基團及其類似物對本發明之可轉譯分子進行5'端封端。在一例示性實施例中，5'帽可為m7GpppGm帽。在其他實施例中，5'帽可選自m7GpppA、m7GpppC；未甲基化帽類似物(例如，GpppG)；二甲基化帽類似物(例如，m2,7GpppG)、三甲基化帽類似物(例如，m2,2,7GpppG)、二甲基化對稱帽類似物(例如，m7Gpppm7G)或抗反向帽類似物(例如，ARCA；m7,2'OmeGpppG、m72'dGpppG、m7,3'OmeGpppG、m7,3'dGpppG及其四磷酸鹽衍生物)(參見例如Jemielity,J.等人，RNA 9：1108-1122(2003))。在其他實施例中，5'帽可為ARCA帽(3'-OMe-m7G(5')pppG)。5'帽可為mCAP(m7G(5')ppp(5')G，N⁷- 甲基-鳥苷-5'-三磷酸-5'-鳥苷)。5'帽可抵抗水解。

5'帽結構之一些實例提供於WO2015/051169A2、WO/2015/061491及美國專利第8,093,367號及第8,304,529號中。

尾區

在一些實施例中，編碼AGL之可轉譯寡聚物包含尾區，該尾區可用於保護mRNA免受外切核酸酶降解影響。在一些實施例中，該尾區可為polyA尾。

可使用此項技術中已知的多種方法來添加polyA尾，例如使用polyA聚合酶對合成或活體外轉錄之RNA進行加尾。其他方法包括使用轉錄載體來編碼polyA尾或使用連接酶(例如，經由使用T4 RNA連接酶及/或T4 DNA連接酶進行夾板連接)，其中polyA可連接至有義RNA之3'端。在一些實施例中，利用任何以上方法之組合。

在一些實施例中，可轉譯寡聚物包含3' polyA尾結構。在一些實施例中，該polyA尾之長度可為至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200或300個核苷酸。在一些實施例中，3' polyA尾含有約5至300個腺苷核苷酸(例如，約30至250個腺苷核苷酸、約60至220個腺苷核苷酸、約80至200個腺苷核苷酸、約90至約150個腺苷核苷酸或約100至約120個腺苷核苷酸)。在一例示性實施例中，該3' polyA尾之長度為約100個核苷酸。在另一例示性實施例中，該3' polyA尾之長度為約115個核苷酸。在另一例示性實施例中，該3' polyA尾之長度為約250個核苷酸。

在一些實施例中，該3' polyA尾包含一或多個UNA單體。在一些實施例中，該3' polyA尾含有2、3、4、5、10、15、20或更多個UNA單體。在一例示性實施例中，該3' polyA尾含有2個UNA單體。在另一例示性實施例中，該3' polyA尾含有2個連續發現，亦即，彼此鄰接於該3' polyA尾中之UNA單體。

在一例示性實施例中，該3' polyA尾包含SEQ ID NO：6中所示之序列 或由其組成。在另一例示性實施例中，該3' polyA尾包含SEQ ID NO：38中所示之序列或由其組成。在另一例示性實施例中，該3' polyA尾包含SEQ ID NO：39中所示之序列或由其組成。

在一些實施例中，該可轉譯寡聚物包含3'聚C尾結構。在一些實施例中，該聚C尾之長度可為至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200或300個核苷酸。在一些實施例中，3'聚C尾含有約5至300個胞嘧啶核苷酸(例如，約30至250個胞嘧啶核苷酸、約60至220個胞嘧啶核苷酸、約80至200個胞嘧啶核苷酸、約90至約150個胞嘧啶核苷酸或約100至約120個胞嘧啶核苷酸)。在一例示性實施例中，該3'聚C尾之長度為約100個核苷酸。在另一例示性實施例中，該3'聚C尾之長度為約115個核苷酸。該聚C尾可添加至該polyA尾或可取代該polyA尾。該聚C尾可添加至該polyA尾之5'端或該polyA尾之3'端。

在一些實施例中，調節該polyA及/或聚C尾之長度以控制本發明之經修飾可轉譯寡聚分子的穩定性且因而控制蛋白質之轉錄。舉例而言，因為該polyA尾之長度可影響可轉譯分子之半衰期，故可調節該polyA尾之長度以改良mRNA對核酸酶之抗性的水準，且從而控制靶細胞中之聚核苷酸表現及/或多肽產生的時程。

5'及3'非轉譯區(UTR)

在一些實施例中，編碼AGL之可轉譯寡聚物可包含5'非轉譯區及/或3'非轉譯區。如此項技術中應理解，5'及/或3' UTR可能影響mRNA之穩定性或轉譯之效率。在一例示性實施例中，可轉譯寡聚物包含5' UTR及3' UTR。

在一些實施例中，可轉譯寡聚物可包含至少約25、50、75、100、125、150、175、200、300、400或500個核苷酸之5' UTR。在一些實施例中，5' UTR含有約50至300個核苷酸(例如，約75至250個核苷酸、約100至200個核苷酸、約120至150個核苷酸或約135個核苷酸)。在一例示性實施例中，該5' UTR之長度為 約135個核苷酸。

在一些實施例中，5' UTR來源於此項技術中已知的相對穩定之mRNA分子(例如組蛋白、微管蛋白、球蛋白、GAPDH、肌動蛋白或檸檬酸循環酶)，從而可增加可轉譯寡聚物之穩定性。在其他實施例中，5' UTR序列可包括CMV立即早期基因1(IE1)基因之部分序列。5' UTR序列之實例可見於美國專利第9,149,506號中。在一些實施例中，5' UTR包含選自人類IL-6、丙胺酸轉胺酶1、人類載脂蛋白E、人類纖維蛋白原α鏈、人類轉甲狀腺素蛋白、人類肝球蛋白、人類α-1-抗凝乳蛋白酶、人類抗凝血酶、人類α-1-抗胰蛋白酶、人類白蛋白、人類β球蛋白、人類補體C3、人類補體C5、SynK、AT1G58420、小鼠β球蛋白、小鼠白蛋白及菸草蝕刻病毒或上述任一者之片段的5' UTR的序列。在一例示性實施例中，5' UTR來源於菸草蝕刻病毒(TEV)。在另一例示性實施例中，5' UTR包含SEQ ID NO：3中所示之序列或由其組成。在另一例示性實施例中，5' UTR為SEQ ID NO：3中所示之序列的片段，諸如SEQ ID NO：3中至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120或125個連續核苷酸之片段。

在一些實施例中，可轉譯寡聚分子包含內部核糖體進入位點(IRES)。如此項技術中應理解，IRES為允許以非末端依賴性方式進行轉譯起始的RNA元件。在例示性實施例中，IRES處於5' UTR中。在其他實施例中，IRES可處於5' UTR外部。

在一些實施例中，可轉譯寡聚物可包含至少約25、50、75、100、125、150、175、200、300、400或500個核苷酸之3' UTR。在一些實施例中，3' UTR含有約50至300個核苷酸(例如，約75至250個核苷酸、約100至200個核苷酸、約140至175個核苷酸或約160個核苷酸)。在一例示性實施例中，該3' UTR之長度為約160個核苷酸。

在一些實施例中，該3' UTR包含一或多個UNA單體。在一些實施例 中，該3' UTR含有2、3、4、5、10、15、20或更多個UNA單體。

3' UTR序列之實例可見於美國專利第9,149,506號中。在一些實施例中，3' UTR包含選自丙胺酸轉胺酶1、人類載脂蛋白E、人類纖維蛋白原α鏈、人類肝球蛋白、人類抗凝血酶、人類α球蛋白、人類β球蛋白、人類補體C3、人類生長因子、人類鐵調節素、MALAT-1、小鼠β球蛋白、小鼠白蛋白及爪蟾β球蛋白或上述任一者之片段的3' UTR的序列。在一例示性實施例中，3' UTR來源於爪蟾β球蛋白。在另一例示性實施例中，3' UTR來源於爪蟾β球蛋白且含有一或多個UNA單體。在另一例示性實施例中，3' UTR包含SEQ ID NO：5及33-37中所示之序列或由其組成。在另一例示性實施例中，3' UTR為SEQ ID NO：5及33-37中所示之序列的片段，諸如SEQ ID NO：5及33-37中至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150個連續核苷酸之片段。

在某些例示性實施例中，編碼AGL之可轉譯寡聚物包含SEQ ID NO：3之5' UTR序列及選自SEQ ID NO：5及33-37之3' UTR序列。在一些實施例中，編碼AGL之可轉譯寡聚物進一步包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39中所示之polyA尾。在一些實施例中，AGL之mRNA編碼序列包含選自SEQ ID NO：7-32或SEQ ID NO：41-45之序列。

三元終止密碼子

在一些實施例中，編碼AGL之可轉譯寡聚物可包含緊鄰CDS下游之可產生三元終止密碼子之序列。可併入該三元終止密碼子以增強轉譯效率。在一些實施例中，可轉譯寡聚物可包含緊鄰本文中所描述之PAH CDS下游的序列AUAAGUGAA(SEQ ID NO：40)，如SEQ ID NO：7-32或SEQ ID NO：41-45中所例示。

轉譯起始位點

在一些實施例中，編碼AGL之可轉譯寡聚物可包含轉譯起始位點。 此種序列在此項技術中為已知的且包括Kozak序列。參見例如Kozak,Marilyn(1988)Mol.and Cell Biol.,8：2737-2744；Kozak,Marilyn(1991)J.Biol.Chem.,266：19867-19870；Kozak,Marilyn(1990)Proc Natl.Acad.Sci.USA,87：8301-8305；及Kozak,Marilyn(1989)J.Cell Biol.,108：229-241；及其中引用之參考文獻。如此項技術中應理解，Kozak序列為以允許有效起始mRNA轉譯之真核生物mRNA轉譯起始位點為中心的短一致序列。核糖體轉譯機構識別Kozak序列範圍內之AUG起始密碼子。

在一些實施例中，將轉譯起始位點(例如，Kozak序列)插入AGL之編碼序列上游。在一些實施例中，將轉譯起始位點插入5' UTR下游。在某些例示性實施例中，將轉譯起始位點插入AGL之編碼序列上游及5' UTR下游。

如此項技術中所理解，Kozak序列之長度可變化。一般而言，增加前導序列之長度可增強轉譯。

在一些實施例中，編碼AGL之可轉譯寡聚物包含具有SEQ ID NO：4之序列的Kozak序列。在某些例示性實施例中，編碼AGL之可轉譯寡聚物包含具有SEQ ID NO：4之序列的Kozak序列，其中該Kozak序列緊鄰5' UTR下游且緊鄰AGL之編碼序列上游。

合成方法

在各種態樣中，本發明提供了合成可轉譯信使分子之方法。

可使用本文中所揭示之方法以及此項技術中已知的任何相關技術來合成並分離本發明之可轉譯分子。

一些製備核酸之方法提供於例如以下文獻中：Merino,Chemical Synthesis of Nucleoside Analogues,(2013)；Gait,Oligonucleotide synthesis：a practical approach(1984)；Herdewijn,Oligonucleotide Synthesis,Methods in Molecular Biology，第288卷(2005)。

在一些實施例中，可藉由活體外轉錄(IVT)反應來製造可轉譯分子。可使用T7試劑使核苷三磷酸(NTP)混合物聚合，例如，以便由DNA模板產生RNA。可用不含RNA酶之DNA酶使DNA模板降解，並且管柱分離RNA。

在一些實施例中，可使用連接酶將合成寡聚物連接至RNA分子或RNA轉錄物之3'端以形成可轉譯分子。連接至3'端之合成寡聚物可提供polyA尾之功能性，且有利地提供對其被3'-外切核糖核酸酶移除之抗性。可轉譯分子之連接產物可具有增加之比活性且提供增加之異位蛋白質表現量。

在某些實施例中，可用具有原生特異性之RNA轉錄物來製造本發明之可轉譯分子之連接產物。連接產物可為在5'端保留RNA轉錄物之結構以確保與原生特異性之相容性的合成分子。

在其他實施例中，可用外源RNA轉錄物或非天然RNA來製造本發明之可轉譯分子之連接產物。連接產物可為保留RNA之結構的合成分子。

不希望受理論束縛，細胞中之典型mRNA降解途徑包括以下步驟：(i)polyA尾被3'外切核酸酶逐漸切割至根端，從而關閉有效轉譯所需之成環相互作用並且使帽易受攻擊；(ii)使複合物脫帽移除5'帽；(iii)轉錄物之未受保護及轉譯不勝任之殘留物被5'及3'外切核酸酶活性降解。

本發明之實施例涉及相對於原生轉錄物可具有增加之轉譯活性的新可轉譯結構。本文中之可轉譯分子尤其可防止外切核酸酶在去腺苷醯過程中修剪polyA尾。

本發明之實施例提供可轉譯分子之結構、組合物及方法。本發明之實施例可提供含有一或多個UNA單體且具有增加之功能半衰期的可轉譯分子。

已發現合成寡聚物連接至mRNA轉錄物之3'端可令人驚訝地實現較高mRNA轉錄物向連接產物轉化率。

如本文中所使用，術語polyA尾及polyA寡聚物係指單體寡聚物，其 中該等單體可包括基於腺嘌呤之核苷酸、UNA單體、天然存在之核苷酸、經修飾之核苷酸或核苷酸類似物。

用於連接至RNA之3'端的寡聚物可為2至120個單體長，或3至120個單體長，或4至120個單體長，或5至120個單體長，或更長。在一例示性實施例中，用於連接之寡聚物為約30個單體長。

基於脂質之調配物

基於脂質之調配物由於其生物相容性及其易大規模生產性而日益被認為最有前景之RNA遞送系統之一。已廣泛研究陽離子脂質作為合成材料用於遞送RNA。混合在一起之後，藉由陽離子脂質使核酸凝聚，以形成脂質/核酸複合物，稱為脂質複合物。此等脂質複合物能夠保護遺傳物質免受核酸酶作用，且藉由與帶負電之細胞膜相互作用而將其遞送至細胞中。可藉由在生理學pH值下直接混合帶正電之脂質與帶負電之核酸來製備脂質複合物。

習知脂質體係由可由陽離子性、陰離子性或中性(磷酸)脂質及膽固醇構成之圍蔽水性核心之脂質雙層組成。脂質雙層與水性空間二者分別可併入疏水性或親水性化合物。可藉由向脂質體表面添加親水性聚合物塗層，例如聚乙二醇(PEG)以賦予立體穩定來修飾活體內脂質體特徵及特性。此外，脂質體可藉由連接配位體(例如，抗體、肽及碳水化合物)至其表面或至所連接之PEG鏈的末端而用於特異性靶向(Front Pharmacol.2015年12月1日；6：286)。

脂質體為由磷脂雙層圍繞水性區室而構成的基於膠體脂質及基於界面活性劑之遞送系統。其可呈現為球形囊泡，且大小介於20nm至數微米之範圍內。基於陽離子脂質之脂質體能夠經由靜電相互作用與帶負電之核酸複合，從而產生能提供活體內臨床應用所需之生物相容性、低毒性及大規模生產可能性的複合物。可使脂質體與質膜融合以供吸收；一旦在細胞內部後，脂質體便經由胞吞途徑得到處理且遺傳物質隨後自核內體/載體釋放至細胞質中。由於脂質 體之優越生物相容性、鑒於脂質體基本上為生物膜之類似物且可由天然及合成磷脂製備而長期將其視為藥物遞送媒劑(Int J Nanomedicine.2014；9：1833-1843)。

陽離子脂質體照例為用於寡核苷酸，包括質粒DNA、反義寡核苷酸及siRNA/小髮夾RNA-shRNA)之最常用非病毒遞送系統。陽離子脂質，諸如DOTAP、(1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷)及DOTMA(N-[1-(2,3-二油醯基)丙基]-N,N,N-三甲基銨硫酸甲酯)可與帶負電之核酸形成複合物或脂質複合物，以便藉由靜電相互作用形成奈米粒子，從而提供高活體外轉染效率。此外，開發了用於RNA遞送之中性基於脂質之奈米脂質體，例如中性基於1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷脂醯膽鹼(DOPC)之奈米脂質體。(Adv Drug Deliv Rev.2014 Feb；66：110-116.)

根據一些實施例，本文中所描述之可表現聚核苷酸及異源mRNA構築體經脂質調配。脂質調配物較佳選自但不限於脂質體、脂質複合物、共聚物(諸如PLGA)及脂質奈米粒子。在一個較佳實施例中，脂質奈米粒子(LNP)包含：(a)核酸；(b)陽離子脂質；(c)聚集減少劑(諸如聚乙二醇(PEG)脂質或經PEG修飾之脂質)；(d)視情況選用之非陽離子脂質(諸如中性脂質)；及(e)視情況選用之固醇。

在一個實施例中，脂質奈米粒子調配物由以下組成：(i)至少一種陽離子脂質；(ii)中性脂質；(iii)固醇，例如膽固醇；及(iv)PEG-脂質，其中莫耳比為約20%至60%陽離子脂質：5%至25%中性脂質：25%至55%固醇：0.5%至15% PEG-脂質。

含有硫代胺基甲酸酯及胺基甲酸酯之脂質調配物

用於遞送本發明之活性分子的脂質及脂質組合物的一些實例提供於 WO/2015/074085及USSN 15/387,067中，各案以引用之方式整體併入本文中。在某些實施例中，脂質為具有下式之化合物： 其中R₁與R₂均由直鏈烷基(由1至14個碳組成)或者烯基或炔基(由2至14個碳組成)組成；L₁與L₂二者均由直鏈伸烷基或伸烯基(由5至18個碳組成或，或與N形成雜環)組成；X為S；L₃由鍵或直鏈伸烷基(由1至6個碳組成，或與N形成雜環)組成；R₃由直鏈或分支鏈伸烷基(由1至6個碳組成)組成；且R₄與R₅相同或不同，各自由氫或者直鏈或分支鏈烷基(由1至6個碳組成)組成；或其醫藥學上可接受之鹽。

脂質調配物可含有一或多種選自以下之可離子化陽離子脂質：

陽離子脂質

脂質奈米粒子較佳包括適用於形成脂質奈米粒子之陽離子脂質。陽離子脂質在約生理pH值下較佳攜帶淨正電荷。

陽離子脂質可為例如氯化N,N-二油基-N,N-二甲基銨(DODAC)、溴化N,N-二硬脂基-N,N-二甲基銨(DDAB)、氯化1,2-二油醯基三甲基銨丙烷(DOTAP)(亦稱為氯化N-(2,3-二油醯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨及氯化1,2-二油基氧基-3-三甲基胺基丙烷鹽)、氯化N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二亞麻基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻烯基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亞麻烯基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(γ-DLenDMA)、1,2- 二亞麻基胺甲醯基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亞麻基氧基-3-(二甲基胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亞麻基氧基-3-嗎啉基丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞麻基-3-二甲基胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞麻基硫代-3-二甲基胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞麻醯基-2-亞麻基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、氯化1,2-二亞麻基氧基-3-三甲基胺基丙烷鹽(DLin-TMA.CI)、氯化1,2-二亞麻基-3-三甲基胺基丙烷鹽(DLin-TAP.CI)、1,2-二亞麻基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N,N-二亞麻基胺基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基胺基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亞麻基側氧基-3-(2-N,N-二甲基胺基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、2,2-二亞麻基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)或其類似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氫-3aH-環戊二烯并[d][1,3]間二氧雜環戊烯-5-胺、4-(二甲基胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-酯(MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)二十二烷-2-醇(C12-200)、2,2-二亞麻基-4-(2-二甲基胺基乙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C2-DMA)、2,2-二亞麻基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)、4-(二甲基胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-酯(DLin-M-C3-DMA)、3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(MC3醚)、4-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丁-1-胺(MC4醚)或上述任一者之任何組合。其他陽離子脂質包括但不限於溴化N,N-二硬脂基-N,N-二甲基銨(DDAB)、3P-(N-(N',N'-二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基)膽固醇(DC-Choi)、三氟乙酸N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲醯胺)乙基)-N,N-二甲基銨(DOSPA)、二(十八基醯胺基)甘胺醯基羧基精胺(DOGS)、1,2-二油醯基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油醯基-3-二甲基銨丙烷(DODAP)、溴化N-(1,2-二肉豆蔻基氧基 丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥基乙基銨(DMRIE)及2,2-二亞麻基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷(XTC)。另外，可使用陽離子脂質之市售製劑，諸如LIPOFECTIN(包括DOTMA及DOPE，可得自於GIBCO/BRL)及脂質轉染胺(包含DOSPA及DOPE，可得自於GIBCO/BRL)。

其他適合之陽離子脂質揭示於以下文獻中：國際公開案第WO 09/086558號、第WO 09/127060號、第WO 10/048536號、第WO 10/054406號、第WO 10/088537號、第WO 10/129709號及第WO 2011/153493號；美國專利公開案第2011/0256175號、第2012/0128760號及第2012/0027803號；美國專利第8,158,601號；及Love等人，PNAS,107(5),1864-69,2010。其他適合之胺基脂質包括具有替代脂肪酸基團及其他二烷基胺基基團之胺基脂質，包括烷基取代基不同(例如，N-乙基-N-甲基胺基-及N-丙基-N-乙基胺基-)的彼等胺基脂質。一般而言，具有較少飽和醯基鏈之胺基脂質更容易定大小，尤其當複合物之大小出於過濾滅菌之目的而必須在約0.3微米以下時。可使用含有碳鏈長度處於C14至C22之範圍內的不飽和脂肪酸之胺基脂質。亦可使用其他支架來隔開胺基脂質之氨基與脂肪酸或脂肪烷基部分。

在另一較佳實施例中，LNP包含具有根據專利申請案PCT EP2017/064066之式(III)的陽離子脂質。在此情況下，PCT/EP2017/064066之揭示內容亦以引用之方式併入本文中。

在某些實施例中，本發明之胺基或陽離子脂質具有至少一個可質子化或去質子化基團，使得該脂質在等於或低於生理pH值之pH值(例如pH 7.4)下帶正電且在第二pH值下、較佳在等於或高於生理pH值時呈中性。固然，應理解隨pH值變化而添加或移除質子為平衡過程，且提及帶電或中性脂質係指主要物質之特性且不需要所存在之所有脂質均呈帶電或中性形式。本發明中不排除使用具有超過一個可質子化或可去質子化基團或具兩性離子性之脂質。在某些實施 例中，可質子化脂質具有處於約4至約11之範圍內的可質子化基團之pKa，例如約5至約7之pKa。

陽離子脂質可構成粒子中所存在之總脂質的約20mol%至約70mol%或75mol%，或者約45mol%至約65mol%，或者約20mol%、25mol%、30mol%、35mol%、40mol%、45mol%、50mol%、55mol%、60mol%、65mol%或約70mol%。在另一實施例中，脂質奈米粒子包括以莫耳濃度計約25%至約75%之陽離子脂質，例如，以莫耳濃度計約20%至約70%、約35%至約65%、約45%至約65%、約60%、約57.5%、約57.1%、約50%或約40%(以脂質奈米粒子中之脂質的100%總莫耳數計)。在一個實施例中，陽離子脂質與核酸之比率為約3至約15，諸如約5至約13或約7至約11。

醫藥組合物

在一些態樣中，本發明提供含有可轉譯化合物及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。

醫藥組合物能夠進行局部或全身投與。在一些態樣中，醫藥組合物能夠進行任何型式之投與。在某些態樣中，投與可藉由任何途徑，包括經靜脈內、經皮下、經肺、經肌肉內、經腹膜內、經皮膚、經口、吸入或經鼻投與。

本發明之實施例包括呈脂質調配物形式之含有可轉譯化合物之醫藥組合物。

在一些實施例中，醫藥組合物可包含一或多種選自陽離子脂質、陰離子脂質、固醇、聚乙二醇化脂質及上述之任何組合的脂質。在一些實施例中，含有可轉譯化合物之醫藥組合物包含陽離子脂質、磷脂、膽固醇及聚乙二醇化脂質。

在某些實施例中，醫藥組合物可能實質上不含脂質體。

在其他實施例中，醫藥組合物可包括奈米粒子。

用於遞送本發明之活性分子的脂質及脂質組合物的一些實例提供於WO/2015/074085中，該案以引用之方式整體併入本文中。在某些實施例中，該脂質為陽離子脂質。在一些實施例中，該陽離子脂質包含式II化合物： 其中R₁與R₂相同或不同，各自為直鏈或分支鏈烷基、烯基或炔基；L₁與L₂相同或不同，各自為具有至少五個碳原子之直鏈烷基，或與N形成雜環；X₁為鍵，或為--CO--O--，借此形成L₂-CO--O--R₂；X₂為S或O；L₃為鍵或低碳烷基；R₃為低碳烷基；R₄與R₅相同或不同，各自為低碳烷基。本文中亦描述式II化合物，其中L₃不存在，R₁及R₂各自由至少七個碳原子組成，R₃為伸乙基或伸正丙基，R₄及R₅為甲基或乙基，且L₁及L₂各自由具有至少五個碳原子之直鏈烷基組成。本文中亦描述式II化合物，其中L₃不存在，R₁及R₂各自由至少七個碳原子組成，R₃為伸乙基或伸正丙基，R₄及R₅為甲基或乙基，且L₁及L₂各自由具有至少五個碳原子之直鏈烷基組成。本文中亦描述式II化合物，其中L₃不存在，R₁及R₂各自由具有至少九個碳原子之烯基組成，R₃為伸乙基或伸正丙基，R₄及R₅為甲基或乙基，且L₁及L₂各自由具有至少五個碳原子之直鏈烷基組成。本文中亦描述式II化合物，其中L₃為亞甲基，R₁及R₂各自由至少七個碳原子組成，R₃為伸乙基或伸正丙基，R₄及R₅為甲基或乙基，且L₁及L₂各自由具有至少五個碳原子之直鏈烷基組成。本文中亦描述式II化合物，其中L₃為亞甲基，R₁及R₂各自由至少九個碳原子組成， R₃為伸乙基或伸正丙基，R₄及R₅各自為甲基，L₁及L₂各自由具有至少七個碳原子之直鏈烷基組成。本文中亦描述式II化合物，其中L₃為亞甲基，R₁由具有至少九個碳原子之烯基組成且R₂由具有至少七個碳原子之烯基組成，R₃為伸正丙基，R₄及R₅各自為甲基，L₁及L₂各自由具有至少七個碳原子之直鏈烷基組成。本文中亦描述式II化合物，其中L₃為亞甲基，R₁及R₂各自由具有至少九個碳原子之烯基組成，R₃為伸乙基，R₄及R₅各自為甲基，L₁及L₂各自由具有至少七個碳原子之直鏈烷基組成。

在例示性實施例中，陽離子脂質包含選自由以下組成之群的化合物：ATX-001、ATX-002、ATX-003、ATX-004、ATX-005、ATX-006、ATX-007、ATX-008、ATX-009、ATX-010、ATX-011、ATX-012、ATX-013、ATX-014、ATX-015、ATX-016、ATX-017、ATX-018、ATX-019、ATX-020、ATX-021、ATX-022、ATX-023、ATX-024、ATX-025、ATX-026、ATX-027、ATX-028、ATX-029、ATX-030、ATX-031、ATX-032、ATX-081、ATX-095及ATX-126，或其醫藥學上可接受之鹽。

在某些例示性實施例中，陽離子脂質包含ATX-002、ATX-081、ATX-095或ATX-126。

在一些實施例中，陽離子脂質或其醫藥學上可接受之鹽可存在於脂質組合物中，包含脂質分子之奈米粒子或雙層。脂質雙層較佳進一步包含中性脂質或聚合物。該脂質組合物較佳包含液體介質。該組合物較佳進一步囊封本發明之可轉譯化合物。該脂質組合物較佳進一步包含本發明之可轉譯化合物及中性脂質或聚合物。該脂質組合物較佳囊封該可轉譯化合物。

在其他實施例中，該陽離子脂質包含式III化合物： 其中R₁與R₂相同或不同，各自為由1至9個碳組成之直鏈或分支鏈烷基、由2至11個碳組成之烯基或炔基或膽固醇基；L₁與L₂相同或不同，各自為由5至18個碳組成之直鏈伸烷基或伸烯基；X₁為--CO--O--，借此形成-L₂-CO--O--R₂；X₂為S或O；X₃為--CO--O--，借此形成-L₁-CO--O--R₁；L₃為鍵；R₃為由1至6個碳組成之直鏈或分支鏈伸烷基；且R₄與R₅相同或不同，各自為氫或者由1至6個碳組成之直鏈或分支鏈烷基；或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，X₂為S。在另一實施例中，R₃係選自伸乙基、伸正丙基或伸異丁基。在另一實施例中，R₄及R₅分別為甲基、乙基或異丙基。在另一實施例中，L₁與L₂相同。在另一實施例中，L₁與L₂不同。在另一實施例中，L₁或L₂由具有七個碳之直鏈伸烷基組成。在另一實施例中，L₁或L₂由具有九個碳之直鏈伸烷基組成。在另一實施例中，R₁與R₂相同。在另一實施例中，R₁與R₂不同。在另一實施例中，R₁及R₂各自由烯基組成。在另一實施例中，R₁及R₂各自由烷基組成。在另一實施例中，烯基由單一雙鍵組成。在另一實施例中，R₁或R₂由九個碳組成。在另一實施例中，R₁或R₂由十一個碳組成。在另一實施例中，R₁或R₂由七個碳組成。在另一實施例中，L₃為鍵，R₃為乙烯，X₂為S，且R₄及R₅各自為甲基。在另一實施例中，L₃為鍵，R₃為伸正丙基，X₂為S，且R₄及R₅各自為甲基。在另一實施例中，L₃為鍵，R₃為乙烯，X₂為S，且R₄及R₅各自為乙基。

如熟習此項技術者應瞭解，式II及式III化合物形成亦處於本發明之範疇內的鹽。除非另外指示，否則本文中提及式II及式III化合物應理解為包括提及其鹽。如本文中所採用之術語「鹽」表示與無機酸及/或有機酸形成之酸式鹽以及與無機鹼及/或有機鹼形成之鹼式鹽。另外，當式II或式III化合物含有諸如但不限於吡啶或咪唑之鹼性部分及諸如但不限於羧酸之酸性部分時，可能形成兩性離子(「內鹽」)且其包括在如本文中所使用之術語「鹽」內。該等鹽可為醫藥學上可接受(亦即，無毒、生理學上可接受)之鹽，但其他鹽亦適用。舉例而言，可藉由使式II或式III化合物與一定量(諸如等效量)之酸或鹼在諸如可使鹽沈澱之介質的介質中反應或在水性介質中反應繼而凍乾來形成式II或式III化合物之鹽。

例示性例示性酸加成鹽包括乙酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡萄糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、果凍酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、磺酸鹽(諸如本文中所提及之彼等磺酸鹽)、酒石酸鹽、硫代氰酸鹽、甲苯磺酸鹽(亦稱為甲苯磺酸鹽)、十一酸鹽及其類似物。另外，舉例而言，以下文獻論述了一般被視為適於由鹼性醫藥化合物形成醫藥學上適用之鹽的酸：S.Berge等人，J.Pharmaceutical Sciences(1977)66(1)1-19；P.Gould,International J.Pharmaceutics(1986)33 201-217；Anderson等人，The Practice of Medicinal Chemistry(1996),Academic Press,New York；及The Orange Book(Food & Drug Administration,Washington,D.C.，見其網站)。此等揭示內容以引用之方式併入本文中。

例示性鹼式鹽包括銨鹽、鹼金屬鹽(諸如鈉鹽、鋰鹽及鉀鹽)、鹼土金屬鹽(諸如鈣鹽及鎂鹽)、與有機鹼(例如有機胺，諸如苯基青黴素、二環己胺、海巴胺(用N,N-雙(去氫松香基)乙二胺形成)、N-甲基-D-葡萄糖胺、N-甲基-D-葡萄糖醯胺、第三丁胺)之鹽及與胺基酸(諸如精胺酸、離胺酸)之鹽及其類似物。鹼性含氮基團可用諸如低碳烷基鹵化物(例如，甲基、乙基、丙基及丁基氯化物、溴化物及碘化物)、二烷基硫酸酯(例如，二甲基、二乙基、二丁基及二戊基硫酸酯)、長鏈鹵化物(例如，癸基、月桂基、肉豆蔻基及硬脂基氯化物、溴化物及碘化物)、芳烷基鹵化物(例如，苯甲基及苯乙基溴化物)及其他試劑之試劑進行四級胺化。

出於本發明之目的，所有此種酸及鹼鹽均意欲為本發明之範疇內的醫藥學上可接受之鹽，且所有酸及鹼鹽均被視為與相應化合物之游離形式等效。式II或式III化合物可呈非溶劑合物及溶劑合物形式(包括水合形式)存在。一般而言，出於本發明之目的，與醫藥學上可接受之溶劑(諸如水、乙醇及其類似物)之溶劑合物形式與非溶劑合物形式等效。式II或式III化合物及其鹽、溶劑合物可呈其互變異構形式形式(例如，作為醯胺或亞胺醚)存在。本文中預期所有此種互變異構形式均為本發明之一部分。

本文中所描述之陽離子脂質化合物可與本發明之可轉譯化合物組合以形成微粒、奈米粒子、脂質體或微膠粒。欲藉由粒子、脂質體或微膠粒遞送之本發明之可轉譯化合物可呈氣體、液體或固體形式。陽離子脂質化合物及可轉譯化合物可與其他陽離子脂質化合物、聚合物(合成或天然)、界面活性劑、膽固醇、碳水化合物、蛋白質、脂質等組合，以形成粒子。此等粒子隨後可視情況與醫藥賦形劑組合以形成醫藥組合物。

在某些實施例中，陽離子脂質化合物相對無細胞毒性。陽離子脂質化合物可為生物相容且生物可降解的。陽離子脂質可具有處於約5.5至約7.5之範 圍內、更佳介於約6.0與約7.0之間的pKa。其可經設計以具有介於約3.0與約9.0之間或介於約5.0與約8.0之間的所要pKa。

含有陽離子脂質化合物之組合物可為30%至70%陽離子脂質化合物、0至60%膽固醇、0至30%磷脂及1%至10%聚乙二醇(PEG)。該組合物較佳為30%至40%陽離子脂質化合物、40%至50%膽固醇及10%至20% PEG。在其他較佳實施例中，該組合物為50%至75%陽離子脂質化合物、20%至40%膽固醇以及5%至10%磷脂及1%至10% PEG。該組合物可含有60%至70%陽離子脂質化合物、25%至35%膽固醇及5%至10% PEG。該組合物可含有多達90%陽離子脂質化合物及2%至15%輔助脂質。該調配物可為脂質粒子調配物，例如含有8%至30%化合物、5%至30%輔助脂質及0至20%膽固醇；4%至25%陽離子脂質、4%至25%輔助脂質、2%至25%膽固醇、10%至35%膽固醇-PEG及5%膽固醇-胺；或2%至30%陽離子脂質、2%至30%輔助脂質、1%至15%膽固醇、2%至35%膽固醇-PEG及1%至20%膽固醇-胺；或多達90%陽離子脂質及2%至10%輔助脂質，或甚至100%陽離子脂質。

在一些實施例中，一或多種基於膽固醇之脂質係選自膽固醇、PEG化膽固醇及DC-膽固醇(N,N-二甲基-N-乙基甲醯胺基膽固醇)及1,4-雙(3-N-油基胺基-丙基)哌嗪。在一例示性實施例中，基於膽固醇之脂質為膽固醇。

在一些實施例中，一或多種聚乙二醇化脂質，亦即經PEG修飾之脂質。在一些實施例中，一或多種經PEG修飾之脂質包含共價附接於具有C₆-C₂₀長度之烷基鏈的脂質的長度達至5kDa之聚(乙)二醇鏈。在一些實施例中，經PEG修飾之脂質為經衍生化之神經醯胺，諸如N-辛醯基-神經鞘胺醇-1-[丁二醯基(甲氧基聚乙二醇)-2000]。在一些實施例中，經PEG修飾或PEG化之脂質為PEG化膽固醇或二肉豆蔻醯甘油(DMG)-PEG-2K。在一例示性實施例中，經PEG修飾之脂質為PEG化膽固醇。

在其他實施例中，醫藥組合物可含有處於病毒或細菌載體內之寡聚化合物。

本發明之醫藥組合物可包括如此項技術中已知的載劑、稀釋劑或賦形劑。醫藥組合物及方法之實例描述於例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編，1985)及Remington,The Science and Practice of Pharmacy，第21版(2005)中。

用於醫藥組合物之賦形劑之實例包括抗氧化劑、懸浮劑、分散劑、防腐劑、緩衝劑、張力劑及界面活性劑。

本發明之藥劑或醫藥調配物之有效劑量可為足以引起可轉譯分子在細胞中轉譯之量。

治療有效劑量可為藥劑或調配物之足以引起治療效應的量。治療有效劑量可在一或多次單獨投藥中且藉由不同的途徑投與。如此項技術中將瞭解，治療有效劑量或治療有效量主要基於本發明之醫藥組合物中所含有之治療劑的總量而確定。一般而言，治療有效量足以達成對個體有意義之益處(例如，治療、調節、治癒、預防及/或改善GSD III)。舉例而言，治療有效量可為足以實現所要治療及/或預防效應之量。一般而言，投與有需要之個體的治療劑(例如，編碼AGL之可轉譯寡聚物)之量將視個體之特徵而定。該等特徵包括個體之病狀、疾病嚴重程度、一般健康狀況、年齡、性別及體重。一般熟習此項技術者將很容易便能夠視此等及其他相關因素而確定適當劑量。另外，可視情況採用客觀及主觀分析法以確定最佳劑量範圍。

本文提供之方法涵蓋單次以及多次投與治療有效量之本文所描述之可轉譯化合物(例如，編碼AGL之可轉譯寡聚物)。包含編碼AGL之可轉譯化合物的醫藥組合物可以規律間隔投與，視個體病狀之性質、嚴重程度及程度(例如，個體GSD III疾病狀態及GSD III相關症狀之嚴重程度，及/或個體之AGL活性水準) 而定。在一些實施例中，治療有效量之本發明之可轉譯化合物(例如，編碼AGL之可轉譯寡聚物)可以定期間隔(例如，每年一次、每六個月一次、每四個月一次、每三個月一次、每兩個月一次、每個月一次)、兩週一次、每週一次、每天一次、一天兩次、一天三次、一天四次、一天五次、一天六次或持續定期地投與。

在一些實施例中，本發明之醫藥組合物經調配，以使得其適用於延期釋放其中所含有之編碼AGL之可轉譯化合物。此種延續釋放組合物適宜地以延長之給藥間隔投與個體。舉例而言，在一個實施例中，本發明之醫藥組合物係一天兩次、每天一次或每隔一天一次投與個體。在一些實施例中，本發明之醫藥組合物係一週兩次、一週一次、每10天一次、每兩週一次、每28天一次、每月一次、每六週一次、每八週一次、每隔一個月一次、每三個月一次、每四個月一次、每六個月一次、每九個月一次或一年一次投與個體。本文亦涵蓋經調配用於積存投與(例如，皮下、肌肉內)以在延長時段內遞送或釋放編碼AGL之可轉譯化合物的醫藥組合物。較佳將所採用之延期釋放方式與對編碼AGL之可轉譯化合物進行的修飾組合以增強穩定性。

在一些實施例中，在投與後，治療有效劑量可導致AGL之血清或血漿水準為1-1000pg/ml或1-1000ng/ml或1-1000μg/ml或更高。

在一些實施例中，投與治療有效劑量之本發明之包含可轉譯分子之組合物可引起所治療個體之肝臟AGL蛋白水準增加。在一些實施例中，投與本發明之包含可轉譯分子之組合物導致肝臟AGL蛋白水準相對於治療之前個體中之基線AGL蛋白水準增加5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。在某些實施例中，投與治療有效劑量之本發明之包含可轉譯分子的組合物將導致肝臟AGL水準相對於治療之前個體中之基線肝臟AGL水準有所增加。在一些實施例中，肝臟AGL水準相對於基線肝臟AGL水準之增加將為至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、100%、200%或更多。

在一些實施例中，當定期投與時，治療有效劑量導致肝臟中之AGL表現與治療之前的基線水準相比有所增加。在一些實施例中，投與治療有效劑量之本發明之包含可轉譯分子之組合物引起所治療個體之肝臟中的AGL蛋白表現量為或超過約10ng/mg、約20ng/mg、約50ng/mg、約100ng/mg、約150ng/mg、約200ng/mg、約250ng/mg、約300ng/mg、約350ng/mg、約400ng/mg、約450ng/mg、約500ng/mg、約600ng/mg、約700ng/mg、約800ng/mg、約900ng/mg、約1000ng/mg、約1200ng/mg或約1500ng/mg總蛋白質。

在一些實施例中，投與治療有效劑量之包含編碼AGL之可轉譯寡聚物的組合物將導致選自以下之標記中的一或多者之水準降低：丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)、鹼性磷酸酶(ALP)、肌酸磷酸激酶(CPK)、糖原及極限糊精(亦即由糖原水解產生之低分子碳水化合物)。

在一些實施例中，當定期投與時，治療有效劑量引起生物樣品中之ALT、AST、ALP及/或CPK水準降低。在一些實施例中，投與治療有效劑量之本發明之包含可轉譯分子的組合物引起生物樣品(例如，血漿或血清樣品)中之ALT、AST、ALP及/或CPK水準與治療之前的基線ALT、AST、ALP及/或CPK水準相比降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%。在一些實施例中，生物樣品係選自血漿、血清、全血、尿液或腦脊液。

在某些例示性實施例中，當定期投與時，治療有效劑量引起血清或血漿樣品中之ALT水準有所降低，例如，如以ALT活性單位/公升(U/l)所量度。在一些實施例中，投與治療有效劑量之本發明之包含可轉譯分子的組合物引起生物樣品(例如，血漿或血清樣品)中之ALT水準與治療之前的基線ALT水準相比 降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%。在一例示性實施例中，投與治療有效劑量之本發明之包含可轉譯分子的組合物引起生物樣品(例如，血漿或血清樣品)中之ALT水準與治療之前的基線ALT水準相比降低至少約50%。在另一例示性實施例中，ALT水準係在空腹之後，例如在空腹6、8、10、12、18或24小時之後量測。

在其他例示性實施例中，當定期投與時，治療有效劑量引起血清或血漿樣品中之AST水準有所降低，例如，如以AST活性單位/公升(U/l)所量度。在一些實施例中，投與治療有效劑量之本發明之包含可轉譯分子的組合物引起生物樣品(例如，血漿或血清樣品)中之AST水準與治療之前的基線AST水準相比降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%。在一例示性實施例中，投與治療有效劑量之本發明之包含可轉譯分子的組合物引起生物樣品(例如，血漿或血清樣品)中之AST水準與治療之前的基線AST水準相比降低至少約50%。在另一例示性實施例中，AST水準係在空腹之後，例如在空腹6、8、10、12、18或24小時之後量測。

ALT、AST、ALP及/或CPK水準之量測可使用此項技術中已知的任何方法，例如使用Fuji Dri-Chem Clinical Chemistry分析儀FDC 3500，如Liu等人，2014,Mol Genet and Metabolism 111：467-76中所描述來進行。

在其他例示性實施例中，當定期投與時，治療有效劑量引起生物樣品中之糖原水準降低。在一些實施例中，投與治療有效劑量之本發明之包含可轉譯分子的組合物引起生物樣品(例如，肝臟樣品)中之糖原積聚與治療之前的基 線糖原水準相比降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%。在一些實施例中，生物樣品為選自肝臟、心臟、隔膜、四頭肌及腓腸肌之器官的一部分。在一例示性實施例中，生物樣品為肝臟切片，例如肝細胞切片。

在其他例示性實施例中，當定期投與時，治療有效劑量引起生物樣品中之侷限性糊精水準降低。在一些實施例中，投與治療有效劑量之本發明之包含可轉譯分子的組合物引起生物樣品(例如，肝臟樣品)中之極限糊精積聚與治療之前的基線極限糊精水準相比降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%。在一些實施例中，生物樣品為選自肝臟、心臟、隔膜、四頭肌及腓腸肌的器官之一部分。在一例示性實施例中，生物樣品為肝臟切片，例如肝細胞切片。在另一例示性實施例中，當定期投與時，治療有效劑量導致肝臟樣品中之極限糊精水準與治療之前的基線極限糊精水準相比降低至少50%、60%、70%或80%。

在其他實施例中，當定期投與時，治療有效劑量延遲所治療個體之肝臟纖維化之發作。在一些實施例中，當定期投與時，治療有效劑量減緩罹患GSD III之個體的肝臟纖維化之發展或減少肝臟纖維化之量。

活性劑(例如，編碼AGL之可轉譯寡聚物)在活體內之治療有效劑量可為約0.001至約500mg/kg體重之劑量。舉例而言，治療有效劑量可為約0.001-0.01mg/kg體重、或0.01-0.1mg/kg或0.1-1mg/kg或1-10mg/kg或10-100mg/kg。在一些實施例中，編碼AGL之可轉譯寡聚物係以約0.1至約10mg/kg體重，例如約0.5至 約5mg/kg、約1至約4.5mg/kg或約2至約4mg/kg範圍內之劑量提供。

活性劑(例如，編碼AGL之可轉譯寡聚物)在活體內之治療有效劑量可為至少約0.001mg/kg體重、或至少約0.01mg/kg或至少約0.1mg/kg或至少約1mg/kg或至少約2mg/kg或至少約3mg/kg或至少約4mg/kg或至少約5mg/kg、至少約10mg/kg、至少約20mg/kg、至少約50mg/kg或更大之劑量。在一些實施例中，編碼AGL之可轉譯寡聚物係以約0.1mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約1.5mg/kg、約2mg/kg、約2.5mg/kg、約3mg/kg、約3.5mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg或約6、7、8、9、10、15、20、25、50、75或100mg/kg之劑量提供。

除非另外陳述，否則本文所示之核鹼基序列自左至右為5’至3’。

轉染

在一些實驗中，將可轉譯信使分子轉染至96孔盤中之Hepal-6或AML12細胞中。根據製造商說明書將MessengerMAX轉染試劑(Thermo Fisher Scientific)用於全部轉染。其他適合細胞株包括HEK293及Hep3B細胞。

例示性活體外轉染方案如下：在轉染之前至少8小時將肝細胞Hepa1-6細胞以5000個細胞/孔塗佈於96孔盤中。

置換90μL含有10% FBS及非必需胺基酸之DMEM培養基，緊鄰開始轉染實驗之前添加90μL至96孔盤之各孔中。

根據製造商之說明書製備MessengerMAX轉染試劑(Thermo Fisher Scientific)可轉譯分子複合物。

將10μL複合物轉移至96孔盤中含有細胞之孔中。

在所要時間點之後收集培養基且添加100μL新鮮培養基至各孔中。將培養基保持在-80℃下直至使用標準製造商方案對AGL進行ELISA分析。

活體內轉染方案之實例如下： 將可轉譯分子與奈米粒子一起調配。

經由標準靜脈內注射將奈米粒子調配之可轉譯分子(1mg/kg)注射至BL57BL/c小鼠(4-6週齡)之側尾靜脈中。

在注射後之適合時間收集約50μL血液於經肝素塗佈之微離心管中。

在4℃下以3,000×g離心10分鐘。

將上清液(血漿)轉移至新鮮微離心管中。將血漿保持在-80℃下直至使用標準製造商方案對AGL進行ELISA分析。

奈米粒子調配物

可在含有mRNA之乙醇/水性緩衝液中使用適當體積之脂質來製備含有mRNA之脂質奈米粒子。Nanossemblr微流體裝置可用於此目的，隨後進行下游處理。舉例而言，為了製備奈米粒子，可將所要量之靶mRNA溶解至5mM檸檬酸緩衝液(pH 3.5)中。脂質可以充足莫耳比溶解於乙醇中。構成脂質之莫耳百分比比率可為例如50%可離子化脂質、7% DSPC(1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼；Avanti Polar Lipids)、40%膽固醇(Avanti Polar Lipids)及3% DMG-PEG(1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇，PEG鏈分子量：2000；NOF America Corporation)。隨後，可在微流體裝置(Precision NanoSystems)中將脂質與mRNA溶液以1：3之流量比率(乙醇：水性相)合併。總合併流速可為12mL/min。可形成脂質奈米粒子，且隨後藉由以下方式對其進行純化：在透析裝置(Float-a-lyzer,Spectrum Labs)中使用磷酸鹽緩衝液隔夜透析，隨後使用Amicon Ultra-15離心過濾器(Merck Millipore)濃縮。粒度可藉由動態光散射(ZEN3600，Malvern Instruments)來測定。可藉由以下方式計算「囊封」效率：在添加RiboGreen(Molecular Probes)至LNP漿液後測定藉由螢光量測之未囊封mRNA含量(Fi)；隨後，將該值與在藉由1% Triton X-100溶解LNP後獲得的總mRNA含量(Ft)比較，其中「囊封」之百分比=(Ft-Fi)/Ft×100。囊封可指mRNA包括在奈米 粒子中，無關於形式。

In-Cell Western

使用96孔膠原蛋白盤將細胞以適當密度接種於DMEM/FBS培養基中。在最佳匯合下，用稀釋於轉染試劑混合物(MessengerMax及Opti-MEM)中之靶mRNA轉染細胞。將細胞置於CO₂培育器中且使其生長。在所要時間點，移除培養基且將細胞固定於4%新鮮PFA中20分鐘。隨後，移除固定劑且使細胞在TBST中滲透5分鐘若干次。當滲透洗滌完畢時，將細胞與阻斷緩衝液一起培育45分鐘。隨後添加初級抗體且在室溫下培育1小時。隨後，將細胞於TBST中洗滌若干次，且隨後與稀釋於阻斷緩衝液中且含有CellTag 700染色劑之二級抗體一起培育1小時。結束時，將細胞於TBST中洗滌若干次，隨後於TBS中進行最後一次洗滌。隨後，使用Licor偵測系統對盤進行成像，且將資料針對由CellTag 700標記之細胞的總數進行標準化。

生成Tail PCR產物

可使用含有各mRNA表現構築體之質體DNA(10ng)以依據製造商之說明書在含2X KAPA HiFi PCR混合物(KR0370)之50μl PCR反應中生成polyA尾120 PCR產物。隨後可在來自Thermo Fisher Scientific之2%凝膠上檢查產物，且基於低分子量梯級(Thermo Fisher Scientific,10068-013)之強度進行大致定量，並且用Qiagen PCR純化套組加以清潔且再懸浮於50ul水中。

用於合成之活體外轉錄(IVT)

以下方案係用於使用NEB HiScribe T7 RNA聚合酶試劑之200μl IVT反應，該反應將產生約1mg RNA。需要時藉由對個別100mM NTP儲備(ATP、GTP、CTP及UTP核苷酸，或經化學修飾之對應物)進行解凍並且將其彙集在一起來製備2.5X NTP混合物。對於IVT反應，將約2-4μg模板用於200μl反應。藉由吸移將10X IVT反應緩衝液、2.5X dNTP混合物、模板DNA及T7 RNA聚合酶充 分混合並且在37℃下培育4小時。為了使DNA模板降解，依序用700ul不含核酸酶之水及10X DNA酶I緩衝液稀釋IVT反應，且向IVT混合物中添加20ul不含RNA酶之DNA酶I，並且在37℃下培育15分鐘。隨後藉由Qiagen RNeasy Maxi管柱，根據製造商之說明書來純化經稀釋(至1ml)及DNA酶處理之反應物，其中在不含RNA酶之水中進行最終溶析。隨後藉由紫外光吸收率對經純化之RNA進行定量，其中A260/A280應為約1.8至2.2，視所使用之再懸浮緩衝液而定。

IVT RNA之酶促加帽

對於酶促加帽，可使用適於處理達至1mg IVT轉錄物之NEB一步式加帽及2'O-甲基化反應之50X放大型式。基於假定轉錄物長度將短達100nt，推薦10μg RNA用於20μl反應。然而，更高受質：反應物體積對於轉錄物為可接受的，其長度一般可能更長(約300-600nt)。在起始加帽反應之前，在65℃下使RNA變性5分鐘，隨後急冷以脫除任何二級構形。對於總計1ml加帽反應，使用含1mg變性RNA之700μl不含核酸酶之水連同100μl(10X)加帽緩衝液，將50μl(10mM)GTP、50μl(4mM)SAM、50μl(10U/μl)牛痘加帽酶及50μl mRNA帽2'-O-甲基轉移酶(50U/μl)合併，且在37℃下培育1小時。使用不含RNA酶之水來溶析所得經封端之mRNA，在RNeasy管柱上進行再純化，藉由nanodrop進行定量。在變性及急冷以移除二級結構之後，亦藉由在變性凝膠中運作500ng經純化之產物/泳道而在凝膠上檢視mRNA。

實例 實施例1：參考可轉譯分子534.

在此實施例中，製造參考可轉譯分子534且用於表現人類野生型澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)。可轉譯分子包含5'帽(7mGpppG)、TEV之5' UTR、Kozak序列、WT AGL CDS(SEQ ID NO：1)、爪蟾β-球蛋白之3' UTR及由114個A組成之Poly(A)尾區(亦即「Poly(A)114尾區」)。參考可轉譯分子進 一步包含緊鄰AGL CDS下游之SEQ ID NO：40之序列。此參考可轉譯分子用N¹-甲基假尿苷替代尿苷而合成。

此參考可轉譯分子之結構之詳情如下：SEQ ID NO：3之菸草蝕刻病毒(TEV)5' UTR、SEQ ID NO：4之Kozak序列、SEQ ID NO：5之爪蟾β-球蛋白(XBG)3' UTR及SEQ ID NO：6之Poly(A)114尾。

以下實施例中之可轉譯分子可用5'帽作為m7GpppGm帽來合成。以下實施例中之可轉譯分子可含有5'-UTR(例如TEV(SEQ ID NO：3)之5' UTR)、轉譯起始序列(例如SEQ ID NO：4之Kozak序列)、SEQ ID NO：40之序列、3' UTR(例如爪蟾β-球蛋白(SEQ ID NO：5)之3' UTR)及poly(A)尾(例如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39之polyA尾)。

實施例2：編碼AGL之可轉譯分子.

在此實施例中製備可轉譯分子522-533、546、730-740及1783-1784，且用於表現人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)，其有利地增加轉譯效率。此等表現人類澱粉-α-1,6-葡糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)之可轉譯分子展現出適用於改善或治療GSD III之方法中的活性。此等可轉譯分子包含5'帽(7mGpppG)、TEV之5' UTR、Kozak序列、AGL CDS及爪蟾β-球蛋白之3' UTR。可轉譯分子522-533、546及1783-1784進一步包含Poly(A)114尾區。可轉譯分子730進一步包含Poly(A)100尾區，而可轉譯分子731-740進一步包含Poly(A)110尾區。可轉譯分子522-533、546、730-740及1783-1784進一步包含緊鄰AGL CDS下游之SEQ ID NO：40之序列。兩個額外的可轉譯分子，亦即2258及2259，分別與546及1783相同，不同之處在於其含有Poly(A)100尾區而非Poly(A)114尾區。1783及2259之編碼序列可視情況經修飾以含有12個核苷酸差異，如SEQ ID NO：45中所示。此實施例中描述之可轉譯分子係用N¹-甲基假尿苷替代尿苷而合成。

各可轉譯分子中之AGL CDS由以下序列組成：

此實施例之可轉譯分子在AML12及C2C12細胞中轉譯以產生人類AGL。

實施例3：基於爪蟾β-球蛋白3'UTR之轉譯增強子.

此實施例中顯示用於增強可轉譯分子之轉譯效率之3' UTR序列的結構。

SEQ ID NO：33-37中所示之鹼基序列為可轉譯分子之部分，其可在功能上對應於爪蟾β-球蛋白之3'-UTR。完整的可轉譯分子包含以下序列上游的5'帽(m7GpppGm)、5'-UTR及編碼區(CDS)，以及以下序列下游的polyA尾，其各自 對應於天然人類mRNA之結構。如以上所示，可視情況使用Kozak序列。因此，併入以下片段之可轉譯分子可具有增強之轉譯效率。爪蟾β-球蛋白基因序列示於登錄號NM_001096347.1中。

實施例4：人類初代肝細胞中之AGL表現

在此實施例中，用經密碼子優化之mRNA分子546、1783及1784轉染人類初代肝細胞。在轉染後6、24、48及72小時藉由In-Cell Western^TM量測AGL蛋白表現。mRNA序列相較於未處理之對照(「unt」)之表現示於圖5中。

實施例5：野生型小鼠中AGL蛋白表現之活體內分析

在此實施例中，對野生型C57BL/6小鼠注射經脂質奈米粒子調配之人類AGL mRNA。注射後6小時將小鼠處死。自小鼠取得肝活組織檢驗樣品，且分析肝勻漿中之人類及小鼠AGL蛋白表現。圖6顯示來自各種mRNA分子之人類AGL蛋白的異位表現。圖7顯示小鼠AGL蛋白含量，表明小鼠AGL蛋白在經處理之小鼠中的內源表現量相似。如圖6及7所示，可轉譯分子546.7與可轉譯分子546具有相同的鹼基序列，但用5-甲氧基尿苷而非N¹-甲基假尿苷替代尿苷而合成。

實施例6：mRNA處理減輕GSD3小鼠中之糖原積聚

在此實施例中，用媒劑或ATX2脂質奈米粒子調配之可轉譯分子546處理AGL敲除小鼠。用媒劑(「VEH」)處理之基因敲除小鼠的肝臟顯示顯著至嚴重肝細胞空泡形成及中度至顯著肝細胞內糖原積聚增加(圖8)。相比之下，用ATX2脂質奈米粒子調配之可轉譯分子546處理之基因敲除小鼠的肝臟僅具有輕度至中度肝細胞空泡形成及僅輕度至中度肝細胞內糖原積聚增加(圖9)。基於此實施例中顯示之組織病理學結果，與用媒劑處理之KO小鼠相比，用mRNA處理之基因敲除小鼠的肝臟中肝細胞空泡形成及糖原積聚的嚴重程度似乎有所降低。

實施例7：其他表現AGL之可轉譯分子

分別用另外修飾的經密碼子優化之人類AGL編碼序列設計四種額外的可轉譯分子，亦即1970、1987、SD1及SD2，其分別示於SEQ ID NO：41、42、43及44中。可轉譯分子1970、1987、SD1及SD2進一步包含5'帽(7mGpppG)、TEV之5' UTR、Kozak序列、緊鄰編碼序列下游之SEQ ID NO：40之序列、爪蟾β-球蛋白之3' UTR及Poly(A)尾區(例如poly(A)100、110或114尾區)。此等可轉譯分子可視情況用N¹-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷替代尿苷來合成。

本文中明確提及之所有公開案、專利及文獻均出於所有目的以引用之方式併入。

應理解，本發明不限於所描述之特定方法、方案、材料及試劑，因為此等因素可能變化。亦應理解，本文中所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，而不意欲限制本發明之範疇，本發明之範疇將由所附申請專利範圍涵蓋。

必須指出，除非上下文另外明確指出，否則如本文中及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一」及「該」包括複數個參考物。同樣，術語「一」、「一或多」及「至少一」在本文中可互換使用。亦應指出，術語「包含」、「含有」、「包括」及「具有」可互換使用。

在無更詳細描述之情況下，咸信熟習此項技術者可基於以上描述而將本發明利用至其最大程度。因此，以下特定實施例應被視為僅具說明性，且無論如何均不以任何方式限制本發明之其餘部分。

本說明書中所揭示之所有特徵均可以任何組合形式加以組合。本說明書中所揭示之各特徵均可替換為服務於相同、等效或類似目的之替代特徵。

<110> Ultragenyx Pharmaceutical Inc.Tachikawa,Kiyoshi Perez-Garcia,Carlos Gustavo Chivukula,Padmanabh Bhaskaran,Hari Prakash Cobaugh,Christian W.Daugherty,Sean Christopher

<120> 用於III型糖原貯積病之治療劑

<130> ULPI-041/01WO 315613-2474

<150> US 62/513,350

<151> 2017-05-31

<160> 45

<170> PatentIn第3.5版

<210> 1

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 一致人類AGL編碼序列

<400> 1

<210> 2

<211> 1532

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 一致人類AGL胺基酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 129

<212> RNA

<213> 菸草蝕紋病毒

<400> 3

<210> 4

<211> 6

<212> RNA

<213> 未知

<220>

<223> 科劄克序列

<400> 4

<210> 5

<211> 158

<212> RNA

<213> 爪蟾屬

<400> 5

<210> 6

<211> 114

<212> RNA

<213> 未知

<220>

<223> 聚(A)114尾

<400> 6

<210> 7

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 7

<210> 8

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 8

<210> 9

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 9

<210> 10

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 10

<210> 11

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 11

<210> 12

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 12

<210> 13

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 13

<210> 14

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 14

<210> 15

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 15

<210> 16

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 16

<210> 17

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 17

<210> 18

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 18

<210> 19

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 19

<210> 20

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 20

<210> 21

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 21

<210> 22

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 22

<210> 23

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 23

<210> 24

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 24

<210> 25

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 25

<210> 26

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 26

<210> 27

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 27

<210> 28

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 28

<210> 29

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 29

<210> 30

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 30

<210> 31

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 31

<210> 32

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 32

<210> 33

<211> 158

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修飾之爪蟾β-球蛋白3’UTR

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (157)..(157)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<400> 33

<210> 34

<211> 158

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修飾之爪蟾β-球蛋白3’UTR

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (155)..(155)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (156)..(156)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (157)..(157)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<400> 34

<210> 35

<211> 158

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修飾之爪蟾β-球蛋白3’UTR

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (38)..(38)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (44)..(44)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (50)..(50)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(56)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (62)..(62)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (68)..(68)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (74)..(74)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (80)..(80)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (86)..(86)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (92)..(92)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (98)..(98)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (104)..(104)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (110)..(110)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (116)..(116)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (122)..(122)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (128)..(128)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (134)..(134)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (140)..(140)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (146)..(146)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (152)..(152)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (157)..(157)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<400> 35

<210> 36

<211> 158

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修飾之爪蟾β-球蛋白3’UTR

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(27)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(33)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (38)..(39)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (44)..(44)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (45)..(45)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (50)..(51)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(57)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (62)..(62)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (63)..(63)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (68)..(68)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (69)..(69)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (74)..(75)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (80)..(81)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (86)..(86)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (87)..(87)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (92)..(92)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (93)..(93)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (98)..(98)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (99)..(99)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (104)..(105)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (110)..(111)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (116)..(116)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (117)..(117)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (122)..(122)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (123)..(123)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (128)..(128)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (129)..(129)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (134)..(134)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (135)..(135)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (140)..(141)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (146)..(146)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (147)..(147)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (152)..(153)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (157)..(157)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<400> 36

<210> 37

<211> 158

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修飾之爪蟾β-球蛋白3’UTR

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(16)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(22)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(24)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(27)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(33)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(35)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(36)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (37)..(37)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (38)..(39)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (40)..(40)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (41)..(41)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..(43)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (44)..(44)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (45)..(46)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (47)..(47)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (48)..(48)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (49)..(51)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (52)..(52)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (53)..(54)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(55)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(57)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (58)..(58)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (59)..(59)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (60)..(60)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(61)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (62)..(62)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (63)..(63)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (64)..(64)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (65)..(66)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (67)..(67)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (68)..(68)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (69)..(69)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (70)..(70)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (71)..(71)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (72)..(72)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (73)..(73)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (74)..(75)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (76)..(76)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (77)..(77)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (78)..(79)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (80)..(81)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (82)..(82)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (83)..(84)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (85)..(85)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (86)..(86)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (87)..(87)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (88)..(88)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (89)..(90)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (91)..(91)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (92)..(92)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (93)..(96)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (97)..(97)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (98)..(98)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (99)..(100)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)..(101)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (102)..(102)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (103)..(107)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (108)..(111)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (112)..(112)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(113)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (114)..(114)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (115)..(115)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (116)..(116)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (117)..(118)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (119)..(119)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (120)..(121)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (122)..(122)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (123)..(123)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (124)..(124)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (125)..(125)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (126)..(126)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (127)..(127)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (128)..(128)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (129)..(129)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (130)..(130)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (131)..(131)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (132)..(133)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (134)..(134)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (135)..(136)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (137)..(137)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (138)..(142)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (143)..(143)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (144)..(146)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (147)..(147)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-G

<220>

<221> misc_feature

<222> (148)..(149)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (150)..(150)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (151)..(151)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (152)..(153)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<220>

<221> misc_feature

<222> (154)..(154)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (155)..(155)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (156)..(156)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-C

<220>

<221> misc_feature

<222> (157)..(157)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-A

<220>

<221> misc_feature

<222> (158)..(158)

<223> n為非鎖核苷酸單體UNA-U

<400> 37

<210> 38

<211> 100

<212> RNA

<213> 未知

<220>

<223> 聚(A)100尾

<400> 38

<210> 39

<211> 110

<212> RNA

<213> 未知

<220>

<223> 聚(A)110尾

<400> 39

<210> 40

<211> 9

<212> RNA

<213> 未知

<220>

<223> 三元終止密碼子

<400> 40

<210> 41

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 41

<210> 42

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 42

<210> 43

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 43

<210> 44

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 44

<210> 45

<211> 4599

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經密碼子優化之AGL編碼序列

<400> 45

Claims (65)

1. 一種用於表現人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)或其片段之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含天然及經化學修飾之核苷酸，且可表現以提供人類AGL或其具有AGL活性之片段。
2. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸與人類AGL野生型mRNA相比經密碼子優化。
3. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該等經化學修飾之核苷酸係選自5-羥基胞苷、5-甲基胞苷、5-羥基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲醯基胞苷、5-甲氧基胞苷、5-丙炔基胞苷、2-硫基胞苷；5-羥基尿苷、5-甲基尿苷、5,6-二氫-5-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、2'-O-甲基-5-甲基尿苷、2'-氟-2'-去氧尿苷、2'-胺基-2'-去氧尿苷、2'-疊氮基-2'-去氧尿苷、4-硫尿苷、5-羥基甲基尿苷、5-羧基尿苷、5-羧基甲酯尿苷、5-甲醯基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-丙炔基尿苷、5-溴尿苷、5-碘尿苷、5-氟尿苷；假尿苷、2'-O-甲基-假尿苷、N ¹-羥基假尿苷、N ¹-甲基假尿苷、2'-O-甲基-N ¹-甲基假尿苷、N ¹-乙基假尿苷、N ¹-羥基甲基假尿苷及阿糖尿苷(Arauridine)；N ⁶-甲基腺苷、2-胺基腺苷、3-甲基腺苷、7-去氮腺苷、8-側氧基腺苷、肌苷；噻吩并鳥苷、7-去氮鳥苷、8-側氧基鳥苷及6-O-甲基鳥嘌呤。
4. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該等經化學修飾之核苷酸為N ¹-甲基假尿苷。
5. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該等經化學修飾之核苷酸為5-甲氧基尿苷。
6. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該等經化學修飾之核苷酸 為假尿苷與N ¹-甲基假尿苷之組合。
7. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該等經化學修飾之核苷酸為5-甲基胞苷與N ¹-甲基假尿苷之組合。
8. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該等經化學修飾之核苷酸為5-甲氧基尿苷與N ¹-甲基假尿苷之組合。
9. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該等經化學修飾之核苷酸為5-甲氧基尿苷、5-甲基胞苷與N ¹-甲基假尿苷之組合。
10. 如前述申請專利範圍中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸之轉譯效率與人類AGL野生型mRNA相比增加至少50%。
11. 如前述申請專利範圍中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸之轉譯效率與人類AGL野生型mRNA相比增加至少三倍。
12. 如前述申請專利範圍中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含200至12,000個核苷酸。
13. 如前述申請專利範圍中任一項之聚核苷酸，其中經化學修飾之核苷酸構成該等核苷酸之1%至99%。
14. 如前述申請專利範圍中任一項之聚核苷酸，其中經化學修飾之核苷酸構成該等核苷酸之50%至99%。
15. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含5'帽、5'非轉譯區、編碼區、3'非轉譯區及尾區。
16. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含轉譯增強子。
17. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸在哺乳動物細胞中可轉譯以表現人類AGL或其具有AGL活性之片段。
18. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸在個體中可 活體內轉譯以表現人類AGL或其具有AGL活性之片段。
19. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸之轉譯產物為活性人類AGL或其具有AGL活性之片段。
20. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸與人類AGL野生型mRNA相比具有降低之免疫原性。
21. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含選自SEQ ID NO：7-32或SEQ ID NO：41-45之核鹼基序列。
22. 一種用於表現人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)或其片段之可轉譯寡聚物，其中該寡聚物包含天然及經化學修飾之核苷酸、一或多個UNA單體，且可表現以提供該人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)或其具有AGL活性之片段。
23. 如申請專利範圍第22項之寡聚物，其中該寡聚物與人類AGL野生型mRNA相比經密碼子優化。
24. 如申請專利範圍第22項之寡聚物，其中該寡聚物之轉譯效率與人類AGL野生型mRNA相比增加至少50%。
25. 如申請專利範圍第22項之寡聚物，其中該寡聚物之轉譯效率與人類AGL野生型mRNA相比增加至少三倍。
26. 如申請專利範圍第22項之寡聚物，其中該等經化學修飾之核苷酸係選自5-羥基胞苷、5-甲基胞苷、5-羥基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲醯基胞苷、5-甲氧基胞苷、5-丙炔基胞苷、2-硫基胞苷；5-羥基尿苷、5-甲基尿苷、5-羥基甲基尿苷、5-羧基尿苷、5-羧基甲酯尿苷、5-甲醯基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-丙炔基尿苷、5-溴尿苷、5-氟尿苷、5-碘尿苷、5,6-二氫-5-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、2'-O-甲基-5-甲基尿苷、2'-氟-2'- 去氧尿苷、2'-胺基-2'-去氧尿苷、2'-疊氮基-2'-去氧尿苷；假尿苷、2'-O-甲基-假尿苷、N ¹-羥基假尿苷、N ¹-甲基假尿苷、N ¹-羥基甲基假尿苷、2'-O-甲基-N ¹-甲基假尿苷、N ¹-乙基假尿苷、阿糖尿苷；N ⁶-甲基腺苷、2-胺基腺苷、3-甲基腺苷、7-去氮腺苷、8-側氧基腺苷、肌苷；噻吩并鳥苷、7-去氮鳥苷、8-側氧基鳥苷及6-O-甲基鳥嘌呤。
27. 如申請專利範圍第22項至第26項中任一項之寡聚物，其中該等經化學修飾之核苷酸構成該等核苷酸之1%至99%。
28. 如申請專利範圍第22項至第27項中任一項之寡聚物，其中該寡聚物包含5'帽、5'非轉譯區、編碼區、3'非轉譯區及尾區。
29. 如申請專利範圍第22項之寡聚物，其中該寡聚物包含轉譯增強子。
30. 如申請專利範圍第22項之寡聚物，其中該寡聚物在哺乳動物細胞中可轉譯以表現人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)或其具有AGL活性之片段。
31. 如申請專利範圍第22項之寡聚物，其中該寡聚物之轉譯產物為活性人類澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶或其具有AGL活性之片段。
32. 如申請專利範圍第22項之寡聚物，其中該寡聚物與人類AGL野生型mRNA相比具有降低之免疫原性。
33. 如申請專利範圍第22項至第32項中任一項之寡聚物，其中該寡聚物包含選自SEQ ID NO：7-32或SEQ ID NO：41-45之核鹼基序列。
34. 一種聚核苷酸，其包含與選自SEQ ID NO：7-32或SEQ ID NO：41-45之核鹼基序列具有至少90%一致性之核鹼基序列。
35. 如申請專利範圍第34項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含與選自SEQ ID NO：7-32或SEQ ID NO：41-45之核鹼基序列具有至少95%一致性之核鹼基序列。
36. 如申請專利範圍第34項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含與選自SEQ ID NO：7-32或SEQ ID NO：41-45之核鹼基序列具有至少99%一致性之核鹼基序列。
37. 如申請專利範圍第34項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含選自SEQ ID NO：7-32或SEQ ID NO：41-45之核鹼基。
38. 一種組合物，其包含一或多種如申請專利範圍第1項至第21項或第34項至第37項中任一項之聚核苷酸及醫藥學上可接受之載劑。
39. 一種組合物，其包含一或多種如申請專利範圍第22項至第33項中任一項之寡聚物及醫藥學上可接受之載劑。
40. 一種組合物，其包含一或多種如申請專利範圍第1項至第21項或第34項至第37項中任一項之聚核苷酸及一或多種如申請專利範圍第22項至第33項中任一項之寡聚物及醫藥學上可接受之載劑。
41. 如申請專利範圍第38項至第40項中任一項之組合物，其中該載劑包含轉染試劑、奈米粒子或脂質體。
42. 如申請專利範圍第38項至第40項中任一項之組合物，其係用於醫學療法。
43. 如申請專利範圍第38項至第40項中任一項之組合物，其係用於治療人體或動物體。
44. 一種如申請專利範圍第38項至第40項中任一項之組合物之用途，其係用於製備或製造用以改善、預防、延遲發作或治療有需要之個體的與澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)之活性降低相關之疾病或 病症的藥物。
45. 如申請專利範圍第44項之用途，其中該疾病為III型糖原貯積病。
46. 如申請專利範圍第45項之用途，其中該III型糖原貯積病係選自IIIa型糖原貯積病、IIIb型糖原貯積病、IIIc型糖原貯積病及IIId型糖原貯積病。
47. 一種改善、預防、延遲發作或治療有需要之個體的與澱粉-α-1,6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖轉移酶(AGL)之活性降低相關之疾病或病症的方法，該方法包含向該個體投與如申請專利範圍第38項至第40項中任一項之組合物。
48. 如申請專利範圍第47項之方法，其中該疾病為III型糖原貯積病。
49. 如申請專利範圍第48項之方法，其中該III型糖原貯積病係選自IIIa型糖原貯積病、IIIb型糖原貯積病、IIIc型糖原貯積病及IIId型糖原貯積病。
50. 如申請專利範圍第47項至第49項中任一項之方法，其中該投與為經靜脈內、經皮下、經肺、經肌肉內、經腹膜內、經皮膚、經口、經鼻或吸入。
51. 如申請專利範圍第47項至第50項中任一項之方法，其中該投與為每日一次、每週一次、每兩週一次或每個月一次。
52. 如申請專利範圍第47項至第51項中任一項之方法，其中該投與包含0.01至10mg/kg之有效劑量。
53. 如申請專利範圍第47項至第52項中任一項之方法，其中該投與增加該個體之肝臟、血清、血漿、腎臟、心臟、肌肉、腦、腦脊髓液或淋巴結中之AGL表現。
54. 如申請專利範圍第47項之方法，其中在投與之後，該個體之肝 臟中的AGL水準為10至1500ng/mg總肝蛋白。
55. 如申請專利範圍第47項之方法，其中在投與之後，該個體之肝臟中的AGL水準為20至150ng/mg總肝蛋白。
56. 一種用於活體內表現人類AGL之套組，該套組包含0.1至500mg劑量之一或多種如申請專利範圍第1項至第21項或第34項至第37項中任一項之聚核苷酸或者一或多種如申請專利範圍第22項至第33項中任一項之寡聚物及用於投與該劑量之裝置。
57. 如申請專利範圍第56項之套組，其中該裝置為注射針、靜脈內針或吸入裝置。
58. 一種聚核苷酸，其包含與野生型人類AGL編碼序列在SEQ ID NO：1之全長人類AGL編碼序列上具有低於80%一致性之核鹼基序列，且其中該人類AGL編碼序列與選自SEQ ID NO：7-32或SEQ ID NO：41-45之序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性。
59. 一種聚核苷酸，其係由與野生型人類AGL編碼序列在SEQ ID NO：1之全長人類AGL編碼序列上具有低於80%一致性之核鹼基序列組成，且其中該人類AGL編碼序列與選自SEQ ID NO：7-32或SEQ ID NO：41-45之序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性。
60. 一種聚核苷酸，其包含與野生型人類AGL編碼序列在SEQ ID NO：1之全長人類AGL編碼序列上具有低於80%一致性之核鹼基序列，且其中該人類AGL編碼序列與SEQ ID NO：19具有至少95%一致性。
61. 一種聚核苷酸，其包含與野生型人類AGL編碼序列在SEQ ID NO：1之全長人類AGL編碼序列上具有低於80%一致性之核鹼基序列，且 其中該人類AGL編碼序列與SEQ ID NO：31具有至少95%一致性。
62. 一種聚核苷酸，其包含與野生型人類AGL編碼序列在SEQ ID NO：1之全長人類AGL編碼序列上具有低於80%一致性之核鹼基序列，且其中該人類AGL編碼序列與SEQ ID NO：45具有至少95%一致性。
63. 一種聚核苷酸，其包含SEQ ID NO：19之核鹼基序列。
64. 一種聚核苷酸，其包含SEQ ID NO：31之核鹼基序列。
65. 一種聚核苷酸，其包含SEQ ID NO：45之核鹼基序列。