ES3049641T3 - Resistance against rhizomania - Google Patents

Abstract

Se describen moléculas de ácido nucleico que confieren resistencia a la necrosis radicular, en particular al virus de la nervadura amarilla necrótica de la remolacha (BNYVV), en plantas, especialmente del género Beta, así como en plantas que contienen dichas moléculas. Además, se describen métodos para producir plantas resistentes al BNYVV y se proporcionan métodos basados en marcadores para identificar y seleccionar plantas resistentes al BNYVV, así como métodos para controlar la infección por el patógeno BNYVV. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Gen de resistencia contra la rizomanía

[0005] Campo de la invención

[0007] La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido capaz de conferir resistencia frente a un patógeno, en particular frente al “Beet Necrotic Yellow Vein Virus” (BNYVV), en una planta, especialmente del género Beta, en la cual se exprese dicho polipéptido, según se explica más detalladamente a continuación. La invención se refiere además a una célula vegetal transgénica, a una planta transgénica, a una planta resistente al BNYVV o a partes de la misma, o a una semilla de una planta que comprenda la molécula de ácido nucleico, en la cual la resistencia se haya inducido mediante la introducción de una o varias mutaciones. La presente invención comprende, además, procedimientos para la obtención de una planta resistente al BNYVV, para la identificación de una planta resistente al BNYVV del género Beta, y para el control de la infección de plantas del género Beta por el BNYVV.

[0009] Antecedentes de la invención

[0011] La rizomanía es la enfermedad más importante de la remolacha azucarera a nivel mundial desde el punto de vista económico, pudiendo causar pérdidas de rendimiento del 50 % o más. Esta enfermedad es causada por el “Beet Necrotic Yellow Vein Virus” (BNYVV) y transmitida por el protozoo transmitido por el sueloPolymyxa betae.La infección por BNYVV se manifiesta en una proliferación incrementada de las raíces finas y laterales, así como en la formación de una raíz principal muy reducida, con bajo contenido de azúcar. Las plantas infectadas presentan una absorción de agua reducida y, en consecuencia, son más sensibles al estrés por sequía. Cuando la infección se extiende a toda la planta, se produce amarilleamiento de las nervaduras foliares, lesiones necróticas y manchas amarillas en las hojas. Dado que no es posible combatir la enfermedad de manera curativa, como ocurre en otras enfermedades víricas, el daño solo puede evitarse mediante el cultivo de variedades resistentes. El desarrollo de genotipos con resistencia genética a la rizomanía es, por tanto, fundamental para la mejora genética de la remolacha azucarera.

[0013] Los primeros programas de mejora para resistencia a rizomanía comenzaron ya en 1981 en Italia, al constatarse que en los germoplasmas comerciales existía una variabilidad genética suficiente para la resistencia a rizomanía. Se seleccionaron plantas y genotipos que mostraban síntomas atenuados y casi un peso de raíz y contenido de azúcar normales. De este modo se consiguió identificar una fuente de resistencia multigénica denominada “tipo Alba”, procedente de cruzamientos conBeta vulgarisL. subsp.marítima(L.).

[0014] En el año 1982 se desarrolló otro tipo de resistencia que mostró una protección mejorada frente a la rizomanía. Este apareció dos años más tarde en la variedad Rizor y fue clasificado como una resistencia monogénica dominante. Una resistencia monogénica dominante adicional se descubrió en el año 1983 en ensayos varietales realizados en California por la empresa de mejora “Holly Sugar Company”, la cual fue introducida en Europa solo tres años más tarde (Lewellen et al., 1987). Esta resistencia conocida como RZ-1 (también denominada “Holly”) se convirtió en la fuente más utilizada y sustituyó rápidamente a Rizor. Pocos años después se encontró una nueva fuente de resistencia a la rizomanía en la accesión danesa deBeta marítimadenominada WB42, la cual mostraba una posición de mapeo diferente de la de RZ-1 en el cromosoma III y proporcionaba además un nivel de resistencia superior en comparación con RZ-1. Este nuevo gen mayor se denominó RZ-2. Actualmente también se conoce el RZ-3 de la accesiónBeta marítimaWB41, que probablemente constituye una variante alélica de RZ-2.

[0016] Hasta hoy, RZ-3 es el único gen de resistencia a rizomanía cuyo fundamento funcional, es decir, su estructura genética, ha sido dilucidado (véase la solicitud de patente alemana DE 102013 010 026 A2), lo que permitió mejorar notablemente la utilización del gen en programas de mejora. Por tanto, existe un interés continuo en caracterizar genéticamente tanto las fuentes de resistencia ya conocidas como nuevas fuentes, con el fin de impulsar el desarrollo de marcadores moleculares. De esta forma, podrían optimizarse las líneas élite de remolacha azucarera mediante la eliminación del “Linkage Drag”, y además identificarse nuevas fuentes de resistencia.

[0018] Para una mejora sostenible frente a la rizomanía, capaz de contrarrestar la aparición de aislados de BNYVV que rompan la resistencia, es necesario identificar continuamente nuevos genes de resistencia e integrarlos en los acervos génicos de cultivos como la remolacha azucarera. Esta tarea se resuelve, conforme a la invención, mediante las realizaciones definidas en las reivindicaciones y en la descripción que sigue.

[0020] Resumen de la invención

[0021] La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de conferir resistencia frente a un patógeno, en particular frente al “Beet Necrotic Yellow Vein Virus” (BNYVV), en una planta, especialmente del género Beta, en la cual se exprese un polipéptido codificado por dicha molécula de ácido nucleico. La invención se refiere además a una célula vegetal transgénica, a una planta transgénica, a una planta resistente al BNYVV o a partes de la misma, o a una semilla de una planta que contenga dicha molécula de ácido nucleico, en la que la resistencia se obtenga mediante la introducción de una o varias mutaciones. Asimismo, se incluyen procedimientos para la producción de una planta resistente al BNYVV, para la identificación de una planta resistente al BNYVV del género Beta y para el control de la infección de plantas del género Beta por BNYVV.

[0022] La presente invención queda definida por las características de las reivindicaciones independientes.

[0024] De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido capaz de conferir resistencia frente a un patógeno en una planta en la que dicho polipéptido se exprese, caracterizada por que la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre:

[0026] a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos al menos en un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 2, en la que la molécula de ácido nucleico presenta una o varias mutaciones que provocan que el polipéptido codificado por dicha molécula de ácido nucleico presente, en la posición correspondiente a la posición 307 de la secuencia de referencia SEQ ID NO: 2, un aminoácido distinto de lisina (K) y/o, en la posición correspondiente a la posición 437 de la secuencia de referencia SEQ ID NO: 2, presente un aminoácido distinto de glutamina (Q); y

[0028] b) una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones estrictas con la secuencia complementaria a SEQ ID NO: 1, en la cual la secuencia de nucleótidos presenta, en los sitios correspondientes a los sitios de la secuencia nucleotídica de referencia SEQ ID NO: 1, una o más de las siguientes sustituciones de nucleótidos: C en lugar de A en la posición 919; G en lugar de A en la posición 1310; A en lugar de G en la posición 1697; A en lugar de C en la posición 2191; y/o T en lugar de C en la posición 2491,

[0029] preferiblemente siendo el patógeno el Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) y la planta una planta del género Beta, preferiblemente remolacha azucarera(Beta vulgaris L.).

[0031] La mencionada molécula de ácido nucleico puede caracterizarse por que el polipéptido codificado además (i) en la posición correspondiente a la posición 566 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2 presenta un aminoácido distinto de arginina (R), y/o (ii) en la posición correspondiente a la posición 731 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2 presenta un aminoácido distinto de glutamina (Q), y/o (iii) en la posición correspondiente a la posición 831 de la secuencia aminoácidos de referencia SEQ ID NO: 2 presenta un aminoácido distinto de prolina (P).

[0033] La mencionada molécula de ácido nucleico puede caracterizarse por que el polipéptido codificado (i) presenta una glutamina (Q) en la posición correspondiente a la posición 307 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2 y/o (ii) una arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 437 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2 y/o (iii) una histidina (H) en la posición correspondiente a la posición 566 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2 y/o (iv) una lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 731 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2 y/o (v) una serina (S) en la posición correspondiente a la posición 831 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2.

[0035] La molécula de ácido nucleico mencionada puede estar caracterizada por el hecho de que la molécula de ácido nucleico presenta, en las posiciones que corresponden a las posiciones de la secuencia nucleotídica de referencia SEQ ID NO: 1, una o varias de las siguientes sustituciones de nucleótidos:

[0037] a) C en lugar de A en la posición 919;

[0039] b) G en lugar de A en la posición 1310;

[0041] c) A en lugar de G en la posición 1697;

[0043] d) A en lugar de C en la posición 2191; y/o

[0045] e) T en lugar de C en la posición 2491.

[0047] La molécula de ácido nucleico mencionada puede caracterizarse por que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 4 y/o comprende la secuencia de ADN codificante según la SEQ ID NO: 3.

[0048] De acuerdo con un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico antes mencionada.

[0049] Según un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una célula vegetal transgénica, preferentemente de una planta del género Beta, que contenga la molécula de ácido nucleico antes mencionada como transgén, opcionalmente bajo el control de un promotor heterólogo, o el vector indicado anteriormente.

[0050] De acuerdo con un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una planta transgénica, preferentemente del género Beta, o a una parte de la misma, que contenga una célula vegetal.

[0051] Conforme a un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una planta resistente al BNYVV de la especieBeta vulgariso a una parte de ella, en la cual la molécula de ácido nucleico indicada esté presente de forma endógena, o en la que una o varias mutaciones, según se ha definido más arriba, se hayan introducido en una molécula de ácido nucleico endógena con una secuencia de nucleótidos que comprenda la secuencia SEQ ID NO: 1 o que hibrida, bajo condiciones estrictas, con la secuencia complementaria a SEQ ID NO: 1, siendo la planta o la parte de la misma distinta de la subespecieBeta vulgarissubsp.marítima.

[0052] La planta mencionada anteriormente es una planta híbrida o una planta doble haploide y/o la molécula de ácido nucleico o una o varias de las mutaciones están presentes en forma heterocigota o homocigota.

[0053] De acuerdo con un sexto aspecto, la presente invención se refiere a una semilla de la planta mencionada anteriormente, donde la semilla comprende uno o varios de los ácidos nucleicos o vectores antes mencionados, de forma transgénica o endógena.

[0054] Según un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de una planta resistente al BNYVV, que comprende los pasos siguientes:

[0055] a) mutagenizar células vegetales y regenerar posteriormente plantas a partir de las células vegetales mutagenizadas, o bien mutagenizar plantas; e

[0056] b) identificar una planta de (a) que presente en una molécula de ácido nucleico endógena una o varias de las mutaciones.

[0057] De acuerdo con un octavo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la identificación de una planta del género Beta resistente al patógeno BNYVV, caracterizado por que el procedimiento comprende el paso siguiente:

[0058] (i) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico como la mencionada, cuyo polipéptido codificado presenta (i) una glutamina (Q) en la posición correspondiente a la posición 307 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2 o (ii) una arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 437 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, y/o la expresión de la molécula de ácido nucleico en la cual, la molécula de ácido nucleico presenta, en los sitios que corresponden a los de la secuencia nucleotídica de referencia SEQ ID NO: 1, las siguientes sustituciones de nucleótidos: (a) C en lugar de A en la posición 919 o (b) G en lugar de A en la posición 1310, en la planta o en una muestra de la misma; y/o

[0059] (ii) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico como la mencionada, cuyo polipéptido codificado presenta (i) una glutamina (Q) en la posición correspondiente a la posición 307 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2 y (ii) una arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 437 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, y/o

[0060] la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en la cual, la molécula de ácido nucleico, en los sitios que corresponden a los de la secuencia nucleotídica de referencia SEQ ID NO: 1, presenta las siguientes sustituciones de nucleótidos: (a) C en lugar de A en la posición 919 y (b) G en lugar de A en la posición 1310, en la planta o en una muestra de la misma; y, en su caso,

[0061] (iii) seleccionar la planta resistente al BNYVV.

[0062] Según un noveno aspecto, la presente invención se refiere a una población de plantas que comprende las plantas mencionadas anteriormente o aquellas plantas que se hayan identificado y, en su caso, seleccionado mediante el procedimiento anterior.

[0063] De acuerdo con un décimo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para el control de la infección por el patógeno Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) en el cultivo agrícola u hortícola de plantas del género Beta, que comprende:

[0064] I) la identificación y selección de plantas del género Beta mediante el procedimiento descrito anteriormente, y

[0065] II) el cultivo de las plantas obtenidas en I) o de su descendencia.

[0067] A continuación, se explican más detalladamente algunos de los términos utilizados en la presente solicitud: el término “aproximadamente”, en relación con la indicación de una longitud de una secuencia de nucleótidos, significa una desviación de /- 10000 pares de bases, /- 5000 pares de bases o /- 1000 pares de bases, preferiblemente de /- 200 pares de bases o /-100 pares de bases, y particularmente preferida de /- 50 pares de bases.

[0069] Una “planta del género Beta” pertenece a la familia de las amarantáceas (Amaranthaceae). Entre estas plantas se incluyen plantas de las especiesBeta macrocarpa, Beta vulgaris, Beta lomatogona, Beta macrorhiza, Beta corolliflora, Beta trigynayBeta nana.Una planta de la especieBeta vulgarises, en particular, una planta de la subespecieBeta vulgarissubsp.vulgaris.Entre ellas se incluyen, a modo de ejemplo,Beta vulgarissubsp.vulgarisvar.altissima(remolacha azucarera en sentido estricto),Beta vulgarissubsp.vulgarisvar.vulgaris(acelga),Beta vulgarissubsp.vulgarisvar.conditiva(remolacha roja),Beta vulgarissubsp.vulgarisvar.crassa/alba(remolacha forrajera).

[0071] Por “hibridar” o “hibridación” se entiende el proceso mediante el cual una molécula de ácido nucleico monocatenario se une a una hebra de ácido nucleico esencialmente complementaria, es decir, forma pares de bases con ella. Los procedimientos estándar de hibridación se describen, por ejemplo, enSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. Preferiblemente, se entiende por ello que al menos el 60 %, más preferiblemente al menos el 65 %, 70 %, 75 %, 80 % o 85 %, y de manera especialmente preferida el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases de la molécula de ácido nucleico forman pares de bases con la hebra de ácido nucleico esencialmente complementaria. La posibilidad de tal apareamiento depende de la estringencia de las condiciones de hibridación. El término “estringencia” se refiere a las condiciones de hibridación: alta estringencia significa que el apareamiento de bases es más difícil; baja estringencia, que el apareamiento de bases es más fácil. La estringencia de las condiciones de hibridación depende, por ejemplo, de la concentración salina o fuerza iónica y de la temperatura. En general, la estringencia puede aumentarse al elevar la temperatura y/o disminuir la concentración de sales. Por “condiciones de hibridación estringentes” se entienden aquellas condiciones bajo las cuales la hibridación tiene lugar predominantemente solo entre moléculas de ácido nucleico homólogas. El término “condiciones de hibridación” abarca no solo las condiciones durante la unión de los ácidos nucleicos, sino también las condiciones durante los pasos de lavado posteriores. Las condiciones de hibridación estringentes son, por ejemplo, aquellas condiciones en las que hibridan predominantemente solo moléculas de ácido nucleico con al menos 70 %, preferiblemente al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de identidad de secuencia. Unas condiciones de hibridación estringentes son, por ejemplo: hibridación en 4*SSC a 65 °C y, a continuación, lavados múltiples en 0,1*SSC a 65 °C durante aproximadamente 1 hora. El término “condiciones de hibridación estringentes” aquí usado, puede significar también: hibridación a 68 °C en 0,25 M fosfato de sodio, pH 7,2, 7 % SDS, 1 mM e Dt A y 1 % BSA durante 16 h, y, a continuación, dos lavados con 2*SSC y 0,1 % SDS a 68 °C. Preferiblemente, la hibridación se realiza bajo condiciones estringentes.

[0073] La secuencia de nucleótidos “complementaria” significa, con respecto a un ácido nucleico en forma de ADN bicatenario, que la segunda cadena de ADN, complementaria de la primera cadena de ADN, presenta, de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases, los nucleótidos que corresponden a las bases de la primera cadena.

[0075] Por una “molécula de ácido nucleico aislada” se entiende una molécula de ácido nucleico que ha sido separada de su entorno natural u original. El término también abarca una molécula de ácido nucleico obtenida sintéticamente. Por “polipéptido aislado” se entiende un polipéptido separado de su entorno natural u original. Este término comprende igualmente un polipéptido obtenido sintéticamente.

[0076] Un “marcador molecular” es un ácido nucleico que presenta polimorfismo en una población vegetal y que se utiliza como punto de referencia u orientación. Un marcador para detectar un evento de recombinación debe ser adecuado para supervisar diferencias o polimorfismos dentro de una población vegetal. Por tanto, dicho marcador puede detectar y distinguir diferentes estados alélicos (alelos). El término “marcador molecular” se refiere también a secuencias de nucleótidos complementarias o, al menos, esencialmente complementarias u homólogas a secuencias genómicas, por ejemplo, ácidos nucleicos empleados como sondas o primer. En los marcadores, estas diferencias se manifiestan a nivel del ADN y pueden corresponder, por ejemplo, a diferencias en la secuencia polinucleotídica como SSRs(simple sequence repeats),RFLPs(restriction fragment length polymorphisms),FLPs(fragment length polymorphisms)o SNPs(single nucleotide polymorphisms).Los marcadores pueden derivarse de ácidos nucleicos genómicos o expresados, como por ejemplo ARN empalmado, ADNc o ESTs, y también pueden referirse a ácidos nucleicos que se utilizan como sondas o pares de primer, siendo adecuados, en tal caso, para amplificar un fragmento de secuencia mediante procedimientos basados en PCR. Los marcadores que pueden describir polimorfismos genéticos (entre partes de una población) pueden detectarse utilizando métodos bien establecidos en el estado de la técnica(An Introduction to Genetic Analysis,7.a edición, Griffiths, Miller, Suzuki et al., 2000). Entre estos métodos se incluyen, por ejemplo, la secuenciación de ADN, la amplificación específica de secuencias mediante PCR, la detección de RFLPs, la detección de polimorfismos polinucleotídicos mediante hibridación alélica específica (ASH), la detección de secuencias variables amplificadas del genoma vegetal, la detección de 3SR(self-sustained sequence replication),la detección de SSRs, SNPs, RFLPs o AFLPs(amplified fragment length polymorphisms).También son conocidos los métodos de detección de ESTs(expressed sequence tags)y los marcadores SSR derivados de secuencias EST, así como los RAPD(randomly amplified polymorphic DNA).Dependiendo del contexto, el término “marcador” puede referirse en la descripción igualmente a una posición cromosómica específica en el genoma de una especie donde se localiza un marcador concreto (por ejemplo, un SNP).

[0078] Un “promotor” es una secuencia de ADN reguladora no traducida, situada típicamente aguas arriba de una región codificante, que contiene el sitio de unión para la ARN polimerasa e inicia la transcripción del ADN. Un promotor incluye, además, otros elementos que actúan como genes reguladores de la expresión génica (por ejemplo, elementos cis-reguladores). Un “promotor núcleo” o “promotor mínimo” es un promotor que contiene al menos los elementos fundamentales necesarios para la iniciación de la transcripción (por ejemplo, caja TATA y/o iniciador).

[0080] Un “patógeno” designa un organismo que, al interactuar con una planta, provoca síntomas de enfermedad en uno o varios de los órganos de la planta. Entre estos patógenos se incluyen, por ejemplo, organismos animales, fúngicos, bacterianos o víricos, así como oomicetos.

[0082] Por “infección por patógenos” se entiende el momento más temprano en el que un patógeno interactúa con un tejido vegetal hospedador. Por ejemplo, en el caso del patógeno vírico BNYVV, este es transmitido por el protozooPolymyxa betae. Polymyxaforma esporas que pueden sobrevivir en el suelo durante muchas décadas, y en dichas esporas también sobrevive el virus. Cuando estas esporas de resistencia germinan produciendo zoosporas móviles, el virus puede penetrar a través de ellas en las células del tejido vegetal hospedador e interactuar allí con el hospedador (Esser,Kryptogamen 1: Cyanobakterien, Algen, Pilze, Flechten. Praktikum und Lehrbuch,Springer-Verlag, Berlín, Heidelberg, 3a ed., 2000).

[0084] Los “órganos” vegetales incluyen, por ejemplo, hojas, eje caulinar, tallo, raíces, hipocótilo, yemas vegetativas, meristemos, embriones, anteras, óvulos, semillas o frutos. Las “partes vegetales” o “parte(s) de planta” comprenden, aunque sin limitarse a ello, el eje caulinar o el tallo, las hojas, las flores, las inflorescencias, las raíces, los frutos y las semillas, así como el polen. El término “partes vegetales” o “parte(s) de planta” comprende además asociaciones de varios órganos, por ejemplo, una flor o una semilla, o partes de un órgano, por ejemplo, una sección transversal de un eje caulinar. Los “tejidos” vegetales son, por ejemplo, el tejido de callo, el tejido de reserva, los tejidos meristemáticos, el tejido foliar, el tejido del brote, el tejido radicular, los tejidos tumorales de planta o el tejido reproductivo, así como el tejido formador, el tejido fundamental (también denominado parénquima), el tejido conductor, el tejido de sostén y el tejido de protección (la denominada epidermis). No obstante, el concepto de tejido no se limita a esta enumeración. Por “células” vegetales se entienden, por ejemplo, células aisladas con pared celular, agregados de las mismas o protoplastos.

[0086] En el contexto de la presente invención, el término “secuencia reguladora” se refiere a una secuencia de nucleótidos que influye en la especificidad y/o en la intensidad de la expresión, por ejemplo, al conferir la secuencia reguladora una determinada especificidad tisular. Dicha secuencia reguladora puede encontrarse aguas arriba del punto de inicio de la transcripción de un promotor mínimo, pero también aguas abajo del mismo, como, por ejemplo, en una secuencia líder transcrita pero no traducida o dentro de un intrón.

[0087] El término “resistencia” debe entenderse en sentido amplio e incluye todo el espectro de protección, desde un retraso en el desarrollo de la enfermedad hasta su inhibición completa. Un ejemplo de patógeno relevante es el Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV). Preferiblemente, una célula vegetal resistente o una planta resistente según la invención presenta resistencia frente al BNYVV. La resistencia frente a un patógeno equivale a resistencia frente a la enfermedad causada por dicho patógeno; por ejemplo, la resistencia frente al BNYVV equivale a resistencia frente a la rizomanía.

[0089] “Planta transgénica” se refiere a una planta en cuyo genoma se ha integrado al menos un polinucleótido. Este puede ser un polinucleótido heterólogo. Preferiblemente, el polinucleótido está integrado de forma estable, lo que significa que el polinucleótido integrado se mantiene de manera estable en la planta, se expresa y puedes transmitirse de forma estable a la descendencia. La introducción estable de un polinucleótido en el genoma de una planta incluye también la integración en el genoma de una planta de una generación parental previa, siendo que el polinucleótido puede heredarse de forma estable. El término “heterólogo” significa que el polinucleótido introducido proviene, por ejemplo, de una célula o de un organismo con un trasfondo genético diferente, ya sea de la misma especie o de otra especie, o bien que es homólogo a la célula huésped procariota o eucariota, pero se encuentra localizado en un entorno genético diferente, distinguiéndose así de un polinucleótido correspondiente que pueda estar presente de manera natural. Un polinucleótido heterólogo puede estar presente adicionalmente a un gen endógeno correspondiente.

[0091] Las configuraciones y modos de realización de la presente invención se describen a título ejemplificativo con referencia a las secuencias y figuras adjuntas.

[0093] Fig. 1: (A) Secuencia de ADN genómico del alelowb-s,sensible a la formación de rizomanía (WB), del gen de resistenciawb(SEQ ID NO: 1), procedente de un genotipo sensible ss, identificado mediante un mapeo fino como gen NBS-LRR (gen del dominio NBARC). El análisis de la descendencia de las cuatro plantas recombinantes más cercanas (dos recombinantes directas a la izquierda y dos recombinantes directas a la derecha del gen) permitió delimitar con precisión el gen NBS-LRR a un solo gen. La secuencia mostrada comprende la región codificante de la secuencia proteica predicha (B, SEQ ID NO: 2) de la proteína de resistencia WB-s. (C) Secuencia de ADN genómico de un alelo wb-R resistente a WB del gen de resistenciawb(SEQ ID NO: 3), que abarca la región codificante de la secuencia proteica predicha. Los polimorfismos diagnósticos que conducen a sustituciones de aminoácidos se indican subrayados y en negrita. (D) Secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por la secuencia de ADN genómico de un alelo wb-R resistente a WB del gen de resistenciawb(SEQ ID NO: 3). Los polimorfismos diagnósticos se muestran subrayados y en negrita. Los experimentos realizados en el marco de la presente invención, entre otros los análisis de secuencia de genotipos resistentes a WB frente al genotipo sensible predominante, así como las secuencias de aminoácidos contenidas en la base de datos genómica, demostraron que, en la secuencia de ADN genómico de los alelos resistentes wb-R, el gen NBS-LRR correspondiente, con el marco de lectura mostrado en la SEQ ID NO: 3, presenta una o varias sustituciones de aminoácidos, por lo que la resistencia observada se atribuye a mutaciones en dicho gen. Sobre la base del análisis realizado hasta el momento de los recombinantes, puede considerarse en particular que una de las dos sustituciones de aminoácidos, K307Q y/o Q437R, es causal de la resistencia.

[0095] Descripción detallada de la invención

[0097] La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de conferir resistencia frente a un patógeno, en particular frente al “Beet Necrotic Yellow Vein Virus” (BNYVV), en una planta, especialmente del género Beta, en la cual se exprese el polipéptido codificado por dicha molécula de ácido nucleico. La presente invención se basa en la cartografía fina, la identificación, el aislamiento y la caracterización de un gen que se origina en el donanteBeta vulgarissubsp.marítima,cuya presencia en una planta, especialmente en la remolacha azucarera, se correlaciona con la resistencia de dicha planta a la rizomanía (WB) o es causal de ella, y cuya secuencia de nucleótidos y aminoácidos codificada se caracterizan por presentar al menos un reemplazo de nucleótido o de aminoácido con respecto a la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos del gen NBS-LRR identificado, mostrada en las Figuras 1A y 1B.

[0099] Según un primer aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido capaz de conferir resistencia frente a un patógeno en una planta en la cual dicho polipéptido se exprese, caracterizada por que la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre:

[0101] a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos al menos en un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 2, en la que la molécula de ácido nucleico presenta una o varias mutaciones que provocan que el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico presente, en la posición correspondiente a la posición 307 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, un aminoácido distinto de lisina (K) y/o, en la posición correspondiente a la posición 437 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, presente un aminoácido distinto de glutamina (Q); y

[0102] b) una secuencia de nucleótidos que híbrida, bajo condiciones estringentes, con la secuencia complementaria a SEQ ID NO: 1, en la cual la secuencia de nucleótidos presenta, en los sitios que corresponden a los de la secuencia nucleotídica de referencia SEQ ID NO: 1, una o varias de las siguientes sustituciones: C en lugar de A en la posición 919; G en lugar de A en la posición 1310; A en lugar de G en la posición 1697; A en lugar de C en la posición 2191; y/o T en lugar de C en la posición 2491,

[0103] preferiblemente siendo el patógeno el Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) y la planta una planta del género Beta, en particular remolacha azucarera(Beta vulgaris L.).

[0105] La molécula de ácido nucleico puede ser una molécula aislada de ácido nucleico. Preferiblemente se trata de ADN, y de manera especialmente preferida ADNc o ADN codificante. Preferiblemente, el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico según la invención confiere resistencia frente al patógeno vírico “Beet Necrotic Yellow Vein Virus” (BNYVV), causante de la enfermedad vegetal de la rizomanía, que es transmitido por el protozoo transmitido por el sueloPolymyxa betae.Además, el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico según la invención confiere especialmente en una planta del género Beta una resistencia frente a dicho patógeno. Preferiblemente, la planta pertenece a la especieBeta vulgarisy, de manera más preferida, a la subespecieBeta vulgarissubsp.vulgaris,incluyendo, por ejemplo, las variedades cultivadas remolacha azucarera, remolacha roja, remolacha forrajera, acelga de hoja y acelga nervuda.

[0107] En una realización de la presente invención, la molécula de ácido nucleico según la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos al menos en un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 2, en la que la molécula de ácido nucleico presenta una o varias mutaciones que provocan que el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico posea, en la posición correspondiente a la posición 307 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, un aminoácido distinto de lisina (K) y/o, en la posición correspondiente a la posición 437 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, un aminoácido distinto de glutamina (Q). Una o ambas de estas mutaciones en la secuencia de aminoácidos se han identificado presumiblemente como causales de la resistencia a la rizomanía.

[0109] Tal como se explica en los ejemplos y en la leyenda de la figura, el gen identificado corresponde a un gen/proteína de resistencia del tipo NBS-LRR, caracterizado por determinados motivos estructurales. La estructura general de tales proteínas de resistencia en plantas está bien estudiada (Martin et al.,Annual Review of Plant Biology54 (2003), 23-61). Sin embargo, el principio de la configuración estructural, en particular del denominado dominio LRR, el cual se considera un posible dominio de reconocimiento para efectores patógenos en su mayoría desconocidos, no es predecible y, en general, el fundamento funcional de los genes de resistencia, es decir, su estructura genética, se desconoce en gran medida. Por consiguiente, la identificación de un gen o proteína que confiera resistencia al BNYVV es imposible basándose únicamente en los motivos estructurales conocidos. Además, las regiones de secuencia que rodean estos genes de resistencia suelen ser repetitivas, lo que dificulta el desarrollo de marcadores diagnósticos y la ensambladura de secuencias.

[0111] La proteína de resistencia identificada pertenece al tipo NBS-LRR y presenta al menos un dominio rico en leucina (LRR) correspondiente a las posiciones de aminoácidos 558 a 594 de la SEQ ID NO: 4, preferiblemente a las posiciones de aminoácidos 542 a 594 de la SEQ ID NO:4; a las posiciones de aminoácidos 604 a 634 de la SEQ ID NO:4, preferiblemente a las posiciones de aminoácidos 582-634 de la SEQ ID NO:4; a las posiciones de aminoácidos 760 a 790 de la SEQ ID NO:4; o a las posiciones de aminoácidos 838 a 869 de la SEQ ID NO: 4, y/o al menos un dominio AAA-ATPasa correspondiente a las posiciones de aminoácidos 177 a 289 de la SEQ ID NO:4 o a las posiciones de aminoácidos 156 a 263 de la SEQ ID NO: 4. Este dominio ATPasa identificado es muy probablemente el dominio NB-ARC, al cual corresponde una función central de unión a nucleótidos. Sin estar vinculado a una teoría específica, se considera que este dominio funcional de tipo ATPasa regula la actividad de la proteína de resistencia.

[0113] En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico según la invención comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida con la secuencia complementaria a SEQ ID NO: 1 bajo condiciones estringentes, en la que se sustituyen uno o varios nucleótidos en las posiciones 919-921 y/o 1309-1311, lo que produce un reemplazo de aminoácido.

[0114] Estas sustituciones de aminoácidos o sustituciones de nucleótidos pueden introducirse utilizando métodos convencionales conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis mediada por PCR, mutagénesis por transposones, TILLING, ingeniería del genoma, por ejemplo, mediante meganucleasas, nucleasas de dedos de zinc, TALEN o sistemas CRISPR/Cas, entre otros. Asimismo, pueden introducirse adicionalmente en la secuencia de nucleótidos más sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones y/u cualquier otra modificación, individualmente o en combinación, que alteren la secuencia de nucleótidos, pero que mantengan la misma función que la secuencia original; aquí, la secuencia según la invención que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos según la invención que confiere resistencia a la rizomanía. Por lo tanto, la invención abarca, en una forma de realización adicional, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido derivado del polipéptido codificado por la secuencia según la invención o que comprende la secuencia de aminoácidos según la invención. Un derivado del polipéptido constituye una secuencia de aminoácidos derivada que presenta al menos un reemplazo, una deleción, inserción o adición de uno o varios aminoácidos, manteniendo la funcionalidad del polipéptido o proteína codificada.

[0116] El reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido con propiedades fisicoquímicas iguales, equivalentes o similares se denomina “sustitución conservadora” o “sustitución semiconservadora”. Ejemplos de propiedades fisicoquímicas de un aminoácido son, entre otros, la hidrofobicidad o la carga. El experto en la materia conoce qué sustituciones de aminoácidos constituyen reemplazos conservadores o semiconservadores. Asimismo, el conocimiento general del especialista le permite reconocer, identificar y determinar qué deleciones o adiciones de aminoácidos son inocuas para la funcionalidad de la proteína de resistencia y en qué posiciones pueden producirse. El experto sabe que, en el caso de la proteína NBS-LRR presente, en las modificaciones de la secuencia de aminoácidos (sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno o varios aminoácidos), debe conservarse en particular la funcionalidad de los dominios conservados definidos anteriormente, y que, por tanto, en dichos dominios las mencionadas modificaciones solo son posibles de forma limitada.

[0118] La invención incluye, por tanto, un fragmento funcional de la secuencia de nucleótidos según la invención. El término “fragmento” comprende genes con una secuencia de nucleótidos suficientemente similar a la secuencia de nucleótidos mencionada anteriormente. El término “suficientemente similar” significa una primera secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos que presenta un número suficiente o mínimo de nucleótidos o residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes en relación con una segunda secuencia de nucleótidos o una segunda secuencia de aminoácidos.

[0120] Con respecto a la secuencia de aminoácidos, esta presenta, incluso tras una modificación mediante uno de los procedimientos mencionados anteriormente, un dominio estructural común y/o mantiene una actividad funcional común. Las secuencias de aminoácidos que presentan una identidad de al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % con la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos según la invención se consideran suficientemente similares. Preferiblemente, dichas secuencias de nucleótidos que codifican un derivado o una secuencia de aminoácidos derivada pueden obtenerse, directa o indirectamente (por ejemplo, mediante etapas de amplificación o de replicación) a partir de una secuencia de nucleótidos de partida, la cual corresponde en toda su longitud o al menos parcialmente a la secuencia de nucleótidos objeto de la invención.

[0122] En consecuencia, la presente invención abarca una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar, bajo condiciones estringentes, con una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos según la invención o a una secuencia de nucleótidos que codifique la secuencia de aminoácidos según la invención.

[0124] En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico según la invención comprende una secuencia de nucleótidos en la que la molécula de ácido nucleico presenta una o varias mutaciones que provocan que el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico posea, en la posición correspondiente a la posición 307 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, un aminoácido distinto de lisina (K) y/o, en la posición correspondiente a la posición 437 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, presenta un aminoácido distinto de glutamina (Q), y en la posición correspondiente a la posición 566 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, presenta un aminoácido distinto de arginina (R), y/o (ii) en la posición correspondiente a la posición 731 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, presenta un aminoácido distinto de glutamina (Q), y/o (iii) en la posición correspondiente a la posición 831 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, presenta un aminoácido distinto de prolina (P). Los dos primeros reemplazos se identificaron, como se indicó anteriormente, como responsables de la resistencia. Aunque el papel de los tres últimos reemplazos en la mediación de la resistencia aún no está claro, son diagnósticos y, por tanto, pueden emplearse ventajosamente en procedimientos de detección y/o selección.

[0125] En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico según la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que presenta una glutamina (Q) en la posición correspondiente a la posición 307 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2 y/o una arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 437 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, y/o una histidina (H) en la posición correspondiente a la posición 566 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, y/o una lisina (K) en la posición correspondiente a la posición 731 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, y/o una serina (S) en la posición correspondiente a la posición 831 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2. Estos reemplazos de aminoácidos surgen preferentemente por reemplazo de uno o varios nucleótidos en la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1, preferentemente por reemplazo de un nucleótido por otro. En consecuencia, la molécula de ácido nucleico según la invención se caracteriza por que la molécula de ácido nucleico presenta, en los sitios correspondientes a los de la secuencia nucleotídica de referencia SEQ ID NO: 1, una o varias de las siguientes sustituciones de nucleótidos: C en lugar de A en la posición 919; G en lugar de A en la posición 1310; A en lugar de G en la posición 1697; A en lugar de C en la posición 2191; y/o T en lugar de C en la posición 2491. En una forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico según la invención se caracteriza por que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 4 y/o comprende la secuencia de ADN codificante según la SEQ ID NO: 3; véase también la Figura 1 y su leyenda, así como los ejemplos.

[0127] La presente solicitud divulga, además, una molécula de ADN recombinante que comprende las secuencias de la mencionada molécula de ácido nucleico. Preferiblemente, la molécula de ADN recombinante incluye además una secuencia reguladora o está asociada u operativamente unida a ella, preferentemente a una secuencia promotora y/o a otras secuencias de elementos de control de la transcripción o de la traducción, en la que la secuencia reguladora que controla la expresión de un gen que comprende la molécula de ácido nucleico según la invención, se caracteriza por que la secuencia reguladora es capaz de mediar o modular la expresión de una secuencia de ADN heteróloga como consecuencia de una infección por patógenos. Preferiblemente, la secuencia de ADN heteróloga es una secuencia de nucleótidos que codifica un componente de la defensa vegetal frente a patógenos (por ejemplo, genes de resistencia (R-genes) o genes que codifican enzimas implicadas en la transducción de señales como quinasas o fosfatasas, así como proteínas G) o que codifica un efector patógeno (denominado gen de avirulencia (avr)).

[0129] La presente invención divulga además un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico según la invención, y un fragmento funcional y/o inmunológicamente activo del mismo, así como un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido o a dicho fragmento. De manera especialmente preferida, el polipéptido presenta una secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID NO: 4. La producción recombinante de proteínas, polipéptidos y fragmentos es conocida por el experto y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, o en Wingfield, P. T. (2008,).Production o f Recombinant Proteins, Current Protocols in Protein Science,52:5.0:5.0.1-5.0.4. Los anticuerpos policlonales o monoclonales frente a la proteína de la presente invención pueden producirse por el experto mediante métodos conocidos, como los descritos en Harlow et al.,Antibodies: A Laboratory Manual,1988. La producción de anticuerpos monoclonales, así como de fragmentos Fab y F(ab')2, útiles también en métodos de detección de proteínas, puede realizarse mediante diversos procedimientos convencionales como los descritos en Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,Academic Press, 1983). El anticuerpo puede emplearse para el cribado de bibliotecas de cDNA de expresión, con el fin de identificar genes idénticos, homólogos o heterólogos mediante un cribado inmunológico (Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; o Ausubel et al., 1994,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons). En particular, la presente invención se refiere a anticuerpos que reconocen de manera selectiva un polipéptido codificado por el alelowb-Rsegún la invención y que, esencialmente, no reconocen el polipéptido codificado por el alelo sensiblewb-s,es decir, que lo reconocen por un factor al menos 2 menor, preferiblemente por un factor 5 menor, y más preferiblemente por un factor 10 o más menor que el polipéptido codificado por el alelowb-Rde la invención.

[0130] Otro objeto de la invención son los vectores que comprenden la molécula de ácido nucleico o la molécula de ADN recombinante según la invención. El vector puede ser un plásmido, cosmidio, fago o vector de expresión, vector de transformación, vector lanzadera o vector de clonación, pudiendo ser de doble o simple hebra, lineal o circular, o transformar un hospedador procariótico o eucariótico por integración en su genoma o de forma extragénica. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico o la molécula de ADN según la invención está operativamente unida, en un vector de expresión, a una o varias secuencias reguladoras que permiten la transcripción y, opcionalmente, la expresión en una célula hospedadora procariótica o eucariótica; véase Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. Preferiblemente, dichas secuencias reguladoras son promotores o terminadores, en particular un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión al ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de transcripción y/o una señal de poliadenilación. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra bajo el control de un promotor y/o terminador apropiado. Los promotores adecuados pueden ser promotores que se inducen de forma constitutiva (por ejemplo, el promotor 35S del “Cauliflower mosaic virus” (Odell et al.,Nature313 (1985): 810-812)), o, particularmente idóneos son aquellos promotores que son inducibles por patógenos (por ejemplo, el promotor PR1 de perejil (Rushton et al.,EMBO J.15 (1996): 5690-5700)). Los promotores inducibles por patógenos especialmente adecuados son promotores sintéticos o quiméricos, que no se encuentran de forma natural, están constituidos por varios elementos e incluyen un promotor mínimo, así como al menos un elemento cis regulador localizado aguas arriba del promotor mínimo, el cual sirve como sitio de unión para factores de transcripción específicos. Los promotores quiméricos se diseñan de acuerdo con los requisitos deseados y pueden ser inducidos o reprimidos por distintos factores. Ejemplos de tales promotores se describen en WO 00/29592, WO 2007/147395 y WO 2013/091612. Un terminador adecuado es, por ejemplo, el terminadornos(Depicker et al., J. Mol.Appl. Genet. 1 (1982), 561­ 573).Los vectores contienen además habitualmente genes marcadores/reporteros o genes de resistencia, que permiten verificar la transferencia del vector o de la molécula de ADN/molécula de ácido nucleico deseada, así como seleccionar los individuos que la contienen, dado que una detección directa de la expresión del gen suele ser más difícil. Dado que la molécula de ácido nucleico objeto de la invención codifica por sí misma un polipéptido que, con las mutaciones mencionadas anteriormente, constituye la proteína que confiere resistencia a la rizomanía, no es esencial proporcionar un gen de resistencia adicional para su expresión en células vegetales; sin embargo, se prefiere incluirlo con el fin de permitir una selección rápida.

[0132] Ejemplos de genes indicadores o reportadores son el gen de luciferasa y el gen que codifica la proteína verde fluorescente (GFP), que permiten estudiar además la actividad y/o regulación del promotor del gen. Ejemplos de genes de resistencia, en particular para transformaciones vegetales, incluyen el gen de la neomicinafosfotransferasa, el gen de la higromicina-fosfotransferasa o el gen que codifica la fosfinotricinaacetiltransferasa. No obstante, otros genes indicadores o de resistencia conocidos por el experto no se excluyen. En una forma de realización preferida, el vector es un vector vegetal.

[0134] La presente solicitud divulga asimismo células hospedadoras que comprenden los vectores, las moléculas de ADN recombinante y/o las moléculas de ácido nucleico de la invención. Una célula hospedadora en el sentido de la invención puede ser una célula procariótica (por ejemplo, bacteriana) o eucariótica (por ejemplo, una célula vegetal o de levadura). Preferiblemente, la célula hospedadora es un Agrobacterium, tal comoAgrobacterium tumefaciensoAgrobacterium rhizogenes,o una célula vegetal.

[0136] El experto conoce numerosos métodos, como conjugación o electroporación, para introducir la molécula de ácido nucleico según la invención, la molécula ADN recombinante y/o el vector de la presente invención en un Agrobacterium, así como métodos tales como diversos procedimientos de transformación (transformación biolística, transformación mediada por Agrobacterium) para introducir la molécula de ácido nucleico según la invención, la molécula ADN y/o el vector de la presente invención en una célula vegetal (Sambrook et al.,Molecular Cloning: A LaboratoryManual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001).

[0138] De manera más preferida, la presente invención se refiere a una célula vegetal transgénica que contiene la molécula de ácido nucleico según la invención o la molécula ADN recombinante como transgén o el vector de la presente invención. Dicha célula vegetal transgénica es, por ejemplo, una célula vegetal transformada, preferentemente de forma estable, con la molécula de ácido nucleico según la invención, la molécula ADN o el vector de la presente invención. En una realización preferida de la célula vegetal transgénica, la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a una o varias secuencias reguladoras que permiten la transcripción y, opcionalmente, la expresión en la célula vegetal. El conjunto formado por la molécula de ácido nucleico y las secuencias reguladoras constituye el transgén. Tales secuencias reguladoras son, por ejemplo, un promotor, un potenciador o un terminador. El experto conoce numerosos promotores, potenciadores y terminadores funcionales aplicables en plantas.

[0139] Preferiblemente, una célula vegetal transgénica según la presente invención, en particular una célula de una planta del género Beta, muestra una mayor resistencia frente a un patógeno, especialmente frente al BNYVV, en comparación con una célula vegetal correspondiente no transformada (la célula vegatal sin el transgén). El nivel de resistencia, por ejemplo, frente al BNYVV, puede determinarse cualitativamente en plantas del género Beta mediante la asignación de notas de valoración (los esquemas de notas de valoración son conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo, para la remolacha azucarera; véase Mechelke (1997)Probleme in der Rizomaniaresistenzzüchtung, Vortrage für Pflanzenzüchtung, Resistenzzüchtung bei Zuckerrüben,Gesellschaft für Pflanzenzüchtung e.V., 113-123). Una resistencia superior se manifiesta en una mejora de la resistencia de al menos una nota de valoración, de al menos dos notas de valoración, de al menos tres o más notas de valoración. Asimismo, la presente solicitud también revela un procedimiento para la obtención de una célula vegetal transgénica según la presente invención, que comprende un paso de introducción de la molécula de ácido nucleico, molécula de ADN o vector objeto de la invención en una célula vegetal. Por ejemplo, dicha introducción puede realizarse mediante transformación, preferiblemente mediante transformación estable. Las técnicas adecuadas de introducción, tales como la transformación biolística, la transformación mediada por Agrobacterium o la electroporación, son conocidas por el experto (Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001).

[0141] En otro aspecto, la presente invención se refiere a una planta transgénica y a partes de la misma que comprenden una célula vegetal transgénica descrita anteriormente. Una parte puede ser una célula, un tejido, un órgano o una asociación de varias células, tejidos u órganos. Una asociación de varios órganos es, por ejemplo, una flor o una semilla. En una realización particular, la invención se refiere a una semilla de la planta transgénica, en la que la semilla comprende la molécula de ácido nucleico objeto de la invención como transgén. Preferentemente, una planta transgénica de la presente invención, en particular una planta del género Beta, presenta frente a un patógeno, en especial frente a BNYVV, una resistencia superior a la de una planta correspondiente no transformada (planta sin el transgén). El nivel de resistencia, por ejemplo, frente a BNYVV, puede determinarse en plantas del género Beta de forma cualitativa mediante la asignación de notas de valoración (los esquemas de notas de valoración para plantas del género Beta son conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo, para la remolacha azucarera, Mechelke (1997),Probleme in der Rizomaniaresistenzzüchtung,Vortrage für Pflanzenzüchtung,Resistenzzüchtung bei Zuckerrüben,Gesellschaft für Pflanzenzüchtung e.V., pp. 113-123). Una resistencia superior se manifiesta en una mejora de la resistencia de al menos una nota de valoración, de al menos dos notas de valoración, de al menos tres o más notas de valoración. Además, la invención proporciona un procedimiento para la obtención de una planta transgénica, que comprende un paso de introducción de la molécula de ácido nucleico según la invención o del vector objeto de la presente invención en una célula vegetal, y opcionalmente un paso de selección de una célula vegetal transgénica. Asimismo, dicho procedimiento para la obtención de una planta transgénica se caracteriza por un paso posterior que incluye la regeneración de la planta transgénica a partir de la célula vegetal transgénica generada en el primer paso. Los métodos de regeneración son conocidos por el experto a partir del estado de la técnica.

[0143] En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para conferir o aumentar la resistencia frente a un patógeno, especialmente BNYVV, en una planta, preferiblemente del género Beta, que comprende un paso de transformación de una célula vegetal con la molécula de ácido nucleico según la invención o el vector de la presente invención. Alternativamente, puede generarse, como se describió anteriormente, un genotipo resistente a WB a partir de un genotipo sensible a WB mediante mutagénesis aleatoria o dirigida del gen endógeno wb-s existente.

[0145] Por ejemplo, el genwbpuede modificarse mediante mutagénesis génica con nucleasas TALE (TALENs) o nucleasas de dedos de zinc (ZFNs), así como mediante sistemas CRISPR/Cas, descritos, entre otros, en WO 2014/144155 A1(Engineering plant genomes using CRISPR/Cas systems)y en Osakabe & Osakabe,Plant Cell Physiol.56 (2015), 389-400. Esto también puede lograrse utilizando el método conocido como TILLING(Targeted Induced Local Lesions in Genomes),en el que, como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente alemana DE 102013 101 617, se inducen mutaciones puntuales en el gen silvestre y posteriormente se seleccionan las plantas que presentan una mutación adecuada, es decir, una mutación que confiere resistencia, por ejemplo una cebada resistente al virus del mosaico amarillo; véanse en DE 102013 101617, en las páginas 4,8 y 12 los párrafos [0014], [0026] y [0038]. El método TILLING se describe también detalladamente en la publicación de Henikoff et al. (Henikoff et al.,Plant Physiol.135, 2004, 630-636).

[0147] De forma preferida, este procedimiento conduce a una mejora de la resistencia de al menos una nota de valoración, y de forma particularmente preferida, a una mejora de la resistencia de al menos dos, tres o más notas de valoración. Los esquemas de las notas de valoración para plantas del género Beta son conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo, para la remolacha azucarera (Mechelke, 1997). Tras la mutagénesis de las células vegetales y la posterior regeneración de plantas a partir de las células vegetales mutagenizadas, o bien tras la mutagénesis de plantas, pueden identificarse las plantas que, en una molécula de ácido nucleico endógena, preferiblemente en una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones de alta estringencia con la secuencia complementaria de la SEQ ID NO: 1, presentan una o varias mutaciones definidas como se ha indicado anteriormente.

[0148] En otro aspecto, la presente invención se refiere a una planta resistente al BNYVV del género Beta o a una parte de la misma en la cual la molécula de ácido nucleico según la invención está presente de forma endógena, o en la que una o varias de las mutaciones definidas anteriormente se han introducido en una molécula de ácido nucleico endógena correlacionada con un genotipo sensible a la WB, siendo la planta o una parte de la misma distinta de la especieBeta vulgarissubsp.marítima.En una forma de realización, la planta según la invención es una planta híbrida o una planta doble haploide. En otra forma de realización de la planta según la invención, la molécula de ácido nucleico o una o varias mutaciones, como se definió anteriormente, se encuentran en estado heterocigoto o homocigoto. En el caso, por ejemplo, de una planta híbrida, la molécula de ácido nucleico o una o varias de las mutaciones pueden encontrarse también en estado hemicigoto.

[0150] Además, la solicitud revela que la planta puede comprender adicionalmente, de forma transgénica o endógena, una segunda molécula de ácido nucleico en otra posición o en una posición adicional del genoma, que codifica un polipéptido capaz de conferir resistencia frente al BNYVV en la planta en la cual el polipéptido se exprese como resultado de la transcripción de dicha segunda molécula de ácido nucleico. Otra o una posición adicional en el genoma puede significar que la segunda molécula de nucleótidos está localizada fuera del intervalo cromosómico del cromosoma III comprendido entre s3e4516s05 y s3e5918s01. Por ejemplo, si no está ya presente en el genotipo de partida, mediante cruzamiento o transformación puede introducirse en la plantawb-Rde la presente planta el gen RZ-3 descrito en la solicitud internacional WO 2014/202044 A1. En la presente solicitud se divulgan, por tanto, plantas wb-R/RZ-3-R, preferiblemente homocigotas para uno y, de manera especialmente preferida, para ambos genes de resistencia. En este contexto, gracias a la información de secuencia proporcionada para el genwb-Ren la presente solicitud y, por ejemplo, la secuencia descrita en WO 2014/202044 A1 para el genRZ-3,tales plantas con resistencia doble pueden obtenerse por primera vez únicamente mediante cruzamiento y selección basada en marcadores, sin necesidad de procedimientos de ingeniería genética.

[0152] Por consiguiente, la presente invención se refiere asimismo a un procedimiento para la identificación de una planta del género Beta resistente al patógeno BNYVV, caracterizado por que el procedimiento comprende el paso siguiente:

[0154] (i) detectar la presencia de la mencionada molécula de ácido nucleico, cuyo polipéptido codificado presenta (i) una glutamina (Q) en la posición correspondiente a la posición 307 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2 o (ii) una arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 437 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, y/o la expresión de la molécula de ácido nucleico mencionada en la que la molécula de ácido nucleico, en los sitios correspondientes a las posiciones de la secuencia nucleotídica de referencia SEQ ID NO: 1, presenta las siguientes sustituciones: (a) C en lugar de A en la posición 919 o (b) G en lugar de A en la posición 1310, en la planta o en una muestra de la misma; y/o

[0155] (ii) detectar la presencia de la mencionada molécula de ácido nucleico cuyo polipéptido codificado presenta (i) una glutamina (Q) en la posición correspondiente a la posición 307 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2 y (ii) una arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 437 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, y/o la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en la que la molécula de ácido nucleico, en los sitios correspondientes a los de la secuencia nucleotídica de referencia SEQ ID NO: 1, presenta las siguientes sustituciones: (a) C en lugar de A en la posición 919 y (b) G en lugar de A en la posición 1310, en la planta o en una muestra de la misma; y, en su caso, (iii) seleccionar la planta resistente al BNYVV.

[0157] Tal como se revela en la presente solicitud, el procedimiento puede comprender ventajosamente la detección de al menos un polimorfismo que dé lugar a un reemplazo de aminoácido con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1B (SEQ ID NO: 2), preferiblemente en una de las posiciones destacadas en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1D (SEQ ID NO: 4) (véase también la leyenda de la Figura 1), con los polimorfismos resaltados en la Figura 1C (SEQ ID NO: 3), utilizando marcadores moleculares que reconocen dichos polimorfismos, en particular polimorfismos diagnósticos. De forma preferida, dicha detección se lleva a cabo mediante la utilización de al menos un marcador molecular por polimorfismo, y en particular por polimorfismo diagnóstico. El experto conoce las técnicas de marcadores adecuadas para detectar un polimorfismo correspondiente y cómo diseñar marcadores moleculares apropiados. La presente solicitud divulga además marcadores moleculares que describen o detectan un polimorfismo conforme a las Figuras 1C o 1D, así como el uso de un marcador molecular para la detección de un polimorfismo según la Figura 1C y/o D.

[0159] Asimismo, los procedimientos de identificación descritos constituyen procedimientos de selección de una planta que presenta resistencia frente al BNYVV. El procedimiento de selección incluye un paso final de selección de una planta resistente.

[0160] Asimismo, pueden utilizarse como regiones de ADN para el desarrollo de marcadores diagnósticos del gen wb-R los segmentos de secuencia de ADN genómico adyacentes al gen wb-R (como SEQ ID NO: 3) localizados agua arriba y los segmentos de secuencia de ADN genómico adyacentes al gen wb-R localizados aguas abajo, los cuales se encuentran en su entorno inmediato, preferiblemente en el cromosoma III, y por tanto están estrechamente ligados al gen wb-R.

[0162] Por consiguiente, la presente invención se refiere a un procedimiento para la selección de una planta que presente resistencia frente al BNYVV.

[0164] Tal como se describe en la presente solicitud, el procedimiento de selección puede incluir el uso de un marcador molecular en una secuencia de ADN según la SEQ ID NO: 3 y/o en una secuencia de ADN situada en su entorno inmediato, preferiblemente en el cromosoma III. Preferiblemente, los marcadores localizados en el entorno inmediato corresponden a los marcadores descritos en los ejemplos s3e4516s05 y s3e5918s01, situados dentro de un intervalo de 0,11 cM, que equivale a una longitud física de aproximadamente 100.000 pb desde el gen wb-R, y presentan un valor diagnóstico comparable (DW) a (a) s3e4516s05_cyt / DW = 0,89; flanqueante izquierdo y (b) s3e5918s01_ade / DW = 0,91; flanqueante derecho. El procedimiento descrito en la presente solicitud incluye, además, por lo general, un paso final de selección de una planta resistente. El experto sabe cómo desarrollar y aplicar marcadores sobre la base de la información de secuencia divulgada.

[0165] En consecuencia, la presente invención se refiere también a una planta, preferiblemente una planta resistente al BNYVV, o a una parte de la misma, identificada y, en su caso, seleccionada mediante un procedimiento según lo descrito.

[0167] En particular, la presente invención se refiere a una población de plantas que comprende plantas obtenidas mediante cualquiera de los procedimientos según la invención, descritos anteriormente, y que son preferiblemente resistentes a la rizomanía o infección por BNYVV, caracterizándose por la presencia de una molécula de ácido nucleico conforme a la invención. Preferiblemente, la población comprende al menos 10, preferiblemente 50, más preferiblemente 100, especialmente preferible 500 y, en el contexto del cultivo agrícola, particularmente preferible al menos 1.000 plantas. Preferiblemente, la proporción de plantas en la población que no contienen la molécula de ácido nucleico según la invención y/o que son susceptibles a la rizomanía es inferior al 25 %, preferiblemente inferior al 20 %, más preferiblemente inferior al 15 %, aún más preferiblemente inferior al 10 % e, incluso más preferiblemente, inferior al 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o 0,5 %, si las hubiera.

[0168] Tal como se revela en la presente solicitud, pueden obtenerse además los siguientes beneficios para la mejora y el desarrollo de nuevas líneas de plantas resistentes del género Beta: la información de secuencia, así como los polimorfismos identificados, que permiten distinguir entre los alelos resistentes wb-R y los alelos susceptibles wb-s del gen divulgado, hacen posible el desarrollo de marcadores directamente dentro del propio gen, lo cual constituye una notable simplificación para el fitomejorador, especialmente con respecto al desarrollo de líneas élite optimizadas sin “linkage drag”. Además, el conocimiento de la estructura de la secuencia puede utilizarse para la identificación de nuevos genes de resistencia, en particular contra la rizomanía, que sean parcialmente homólogos u ortólogos, por ejemplo.

[0170] El uso del alelo génico resistente aquí divulgado en enfoques cis- o transgénicos, abre la posibilidad de desarrollar nuevas variedades resistentes del género Beta que presenten una resistencia incrementada debida a un efecto de dosis, o en las cuales, mediante el apilamiento del gen divulgado con otros genes de resistencia, en particular con el gen RZ-3, pueda evitarse la ruptura de la resistencia y optimizarse el grado de resistencia. Asimismo, son posibles modificaciones del gen mediante TILLING o ingeniería genómica dirigida, con el fin de desarrollar nuevos alelos de resistencia.

[0172] Tal como se revela en la presente solicitud, el alelo génico resistente wb-R identificado puede utilizarse en un apilamiento genético o molecular junto con otros elementos genéticos que confieran propiedades agronómicamente ventajosas en una planta. De este modo, puede aumentarse significativamente el valor económico de las plantas cultivadas, por ejemplo, incrementando el rendimiento o habilitando nuevas zonas de cultivo para una planta que anteriormente no eran aptas, entre otros motivos, debido a factores bióticos como una fuerte presión de patógenos, o factores abióticos como la sequía. En particular, la presente invención se refiere al uso del alelo génico resistente wb-R identificado en procedimientos de control de la infección por el patógenoBeet Necrotic Yellow Vein Virus(BNYVV) en el cultivo agrícola u hortícola de plantas del género Beta, comprendiendo, por ejemplo, la identificación y selección de plantas del género Beta mediante uno de los procedimientos descritos anteriormente, así como el cultivo de las plantas seleccionadas o de su descendencia.

[0173] Una característica agronómicamente ventajosa es, por ejemplo, una tolerancia a un herbicida como glifosato, glufosinato o inhibidores de la ALS. El experto conoce, a partir del estado de la técnica, numerosos herbicidas adicionales y su aplicabilidad. Puede basarse en el estado de la técnica para determinar qué elementos genéticos deben emplearse y de qué manera para implantar una tolerancia correspondiente en las plantas. Otro ejemplo de característica agronómicamente ventajosa es una resistencia adicional a patógenos, donde los patógenos pueden ser, por ejemplo, insectos, virus, nematodos, bacterias o hongos. La combinación de distintas resistencias o tolerancias a patógenos puede proporcionar, por ejemplo, una defensa más amplia frente a patógenos en una planta, ya que los elementos genéticos pueden ejercer efectos complementarios entre sí. A este respecto, son conocidos para el experto numerosos genes de resistencia que pueden utilizarse como elementos genéticos. Otro ejemplo de característica agronómicamente ventajosa es una tolerancia al frío o a las heladas. Las plantas que presentan esta característica pueden sembrarse antes en el año o permanecer, por ejemplo, más tiempo en el campo, incluso durante periodos de heladas, lo que puede conducir a un aumento del rendimiento. También en este caso, el experto puede recurrir al estado de la técnica para identificar los elementos genéticos adecuados. Otros ejemplos de características agronómicamente ventajosas incluyen la eficiencia en el uso del agua, la eficiencia en el uso del nitrógeno y el rendimiento. Los elementos genéticos que pueden emplearse para conferir dichas características pueden encontrarse en el estado de la técnica.

[0174] Asimismo, el experto conoce numerosas modificaciones para la defensa frente a patógenos. Además de las familias de genes R descritas con frecuencia, pueden emplearse ventajosamente el enfoque Avr/R, la complementación génica Avr (WO 2013/127379), la autoactivación de un gen R (WO 2006/128444), el enfoque HIGS (host-induced gene silencing) (por ejemplo, WO 2013/050024) o el enfoque VIGS (virus-induced gene silencing). En particular, la autoactivación de un gen R puede ser de especial relevancia para la presente invención. Para ello, debe generarse un ácido nucleico que codifique una proteína de resistencia autoactivada, destinada a proporcionar resistencia frente a patógenos en plantas. Este ácido nucleico presenta solo una parte limitada de un gen de resistencia NBS-LRR, como el gen wb-R, que se extiende desde el extremo 5' aguas abajo de la región codificante del gen de resistencia NBS-LRR hasta el inicio del dominio NBS de dicho gen de resistencia NBS-LRR, siendo dicho gen de resistencia NBS-LRR un gen de resistencia distinto de un gen de tipo TIR-NBS-LRR.

[0176] Asimismo, la presente solicitud divulga el uso del alelo génico resistente wb-R, identificado mediante uno de los procedimientos descritos anteriormente, para su combinación con una de las modificaciones mencionadas anteriormente o con un elemento genético descrito anteriormente que pueda conferir una o varias características agronómicamente ventajosas en una planta.

[0178] Además, la presente solicitud divulga, junto con la planta objeto de la invención, semillas o descendencia, así como órganos, partes de planta, tejidos o células derivadas de la misma, en la fabricación de productos obtenidos habitualmente a partir de materias primas renovables, tales como alimentos y piensos, preferentemente azúcar o jarabe (melaza), donde la melaza puede emplearse también en aplicaciones industriales, por ejemplo, para la producción de alcohol o como medio nutritivo para la fabricación de productos biotecnológicos, así como en la producción de materiales o sustancias para la industria química, tales como productos químicos finos, medicamentos o sus precursores, diagnósticos, cosméticos, bioetanol o biogás. Un ejemplo del uso de la remolacha azucarera como materia prima biogénica en plantas de biogás se describe en la solicitud DE 102012022 178 A1, véase, por ejemplo, el párrafo 10.

[0180] Los siguientes ejemplos ilustran la invención. Salvo indicación en contrario, se emplearon métodos estándar de biología molecular, véanse, por ejemplo: Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Fritsch et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Mayer et al.,Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology,eds., Academic Press, Londres, 1987; y Weir et al.,Handbook of Experimental Immunology,Vols. I-IV, Blackwell, eds., 1986.

[0181] Ejemplos

[0183] Ejemplo 1: Identificación de un gen (WB1) que confiere resistencia frente a la rizomanía (WB) y de los alelos sensibles correspondientes

[0184] En una población de remolacha azucarera(Beta vulgarisL.) con una introgresión procedente de una accesión deBeta vulgarissubsp.marítima,se pudo detectar en dicha introgresión un gen o segmento genómico que confiere resistencia a la rizomanía mediante marcadores con buen valor diagnóstico (DW): (a) s3e4516s05_cyt / DW = 0,89, flanqueando por el lado izquierdo, y (b) s3e5918s01_ade / DW = 0,91, flanqueando por el lado derecho. No obstante, ambos marcadores no son completamente diagnósticos debido a la aparición de alelos nulos en diferentes linajes genéticos. La región genómica comprendida entre s3e4516s05 y s3e5918s01 presenta una longitud genética de 0,11 cM, lo que corresponde a una longitud física de aproximadamente 100.000 pb. Esta región de secuencia es altamente repetitiva y muestra una fuerte variación estructural entre distintos genotipos; por ello, resulta muy difícil desarrollar marcadores diagnósticos adicionales. Además, debido al desconocimiento de la estructura genética del segmento genómico que confiere resistencia a la rizomanía, solo es limitadamente posible reducir el “ linkage drag” potencialmente negativo alrededor del gen causal.

[0186] Los primeros experimentos dirigidos a una delimitación más precisa del segmento genómico relevante y, en su caso, a la identificación de un gen que confiriera la resistencia observada o de un locus génico responsable de la sensibilidad a la rizomanía en las plantas, no tuvieron éxito, entre otros motivos porque la región diana es altamente repetitiva y presenta una fuerte variación estructural (alelos nulos) en numerosos genotipos, y además no se disponía de marcadores con un alto valor diagnóstico adicional. Además, el análisis de expresión de los genes candidatos situados en la región diana no proporcionó evidencia alguna, es decir ninguna respuesta específica a la infección por rizomanía. Finalmente, la fenotipificación de las plantas resultó también difícil, ya que el grado de la resistencia no siempre era inequívoca por causas desconocidas, de modo que, inicialmente, se sospechó incluso la presencia de una resistencia multigénica y/o de efectos epigenéticos, los cuales solo pudieron descartarse mediante el incremento del número de plantas analizadas con 90-180 descendientes y mediante análisis estadísticos exhaustivos (prueba t, análisis de potencia).

[0188] En experimentos y análisis adicionales se pudo determinar, mediante clonación basada en mapas que incluye, entre otras, las etapas de cartografía genética fina, cartografía física, análisis de secuenciación del WGS (genoma completo), establecimiento de una población segregante muy amplia de más de 2000 descendientes F2, cribado de recombinantes, desarrollo de marcadores en la región diana, secuenciación comparativa de BAC en genotipos resistentes (RR) y sensibles/susceptibles (ss), análisis bioinformáticos, predicción de proteínas y comparación de las mismas, que un gen NB-ARC (NBS-LRR) es responsable de la resistencia a la rizomanía observada. Este gen NBS-LRR fue identificado mediante una cartografía fina intensiva; sin embargo, debido a la complejidad de la secuencia, la ensambladura de las secuencias RR y ss no pudo completarse directamente, sino solo a través del análisis de la descendencia de las 4 plantas recombinantes más cercanas (dos recombinantes directos a la izquierda y dos recombinantes directos a la derecha alrededor del gen), lo que permitió identificar con precisión el gen NBS-LRR. La secuencia del gen NBS-LRR del genotipo resistente se presenta en la SEQ ID NO: 3, y el gen o genotipo correspondiente se designó “wb-R” para resistencia a la rizomanía. En el gen NBS-LRR se identificaron un total de 17 polimorfismos de nucleótido único “no sinónimos” (SNPs) (polimorfismos que producen un reemplazo de aminoácidos en la proteína). A partir de los datos de secuencia de genotipos sensibles y resistentes, se determinó que cinco reemplazos de aminoácidos son completamente diagnósticos:

[0190] K307Q, “C” en lugar de “A” en la secuencia genómica en la posición 919 del genotipo resistente, lo que sustituye la lisina (K) codificada en la posición 307 del gen susceptible por glutamina (Q),

[0191] Q437R, “G” en lugar de “A” en la secuencia genómica en la posición 1310 del genotipo resistente, lo que sustituye la glutamina (Q) codificada en la posición 437 del gen susceptible por arginina (R), R566H, “A” en lugar de “G” en la secuencia genómica en la posición 1697 del genotipo resistente, lo que sustituye la arginina (R) codificada en la posición 566 del gen susceptible por histidina (H), Q731K, “A” en lugar de “C” en la secuencia genómica en la posición 2191 del genotipo resistente, lo que sustituye la glutamina (Q) codificada en la posición 731 del gen susceptible por lisina (K) y

[0192] P831S, “T” en lugar de “C” en la secuencia genómica en la posición 2491 del genotipo resistente, lo que sustituye la prolina (P) codificada en la posición 831 del gen susceptible por serina (S); véase la Figura 1. En función de los puntos de recombinación, una o ambas sustituciones de aminoácidos K307Q y/o Q437R pueden considerarse causales de la resistencia. Las secuencias génicas o genotipos correspondientes que se correlacionan con el fenotipo sensible a la rizomanía se denominan también “wb-s” por sensibles a la rizomanía.

[0194] Ejemplo 2: Validación del gen wb-R mediante un enfoque de interferencia por ARN (RNAi)

[0195] Además de la verificación del gen descrita anteriormente mediante recombinantes cercanos, la función de resistencia del gen puede demostrarse adicionalmente mediante interferencia por ARN; véase, por ejemplo, la verificación del gen RZ-3 descrita en los ejemplos (Examples) de la solicitud internacional WO 2014/202044 A1 o la verificación del gen vil descrita en los ejemplos (Examples) de la solicitud internacional WO 2011/032537 A1. Para ello, se transforma un genotipo estándar de remolacha azucarera resistente con una construcción de ADN que codifica un ARN de horquilla bicatenario. Este dsRNA es capaz de inducir un silenciamiento génico postranscripcional, lo que reduciría o anularía la función del alelo génico resistente wb-R, haciendo que el genotipo de remolacha azucarera previamente resistente se vuelva sensible a la rizomanía.

[0197] Para la obtención de una construcción de ADN adecuada, se selecciona un fragmento definido de la secuencia diana del alelo génico resistentewb-R,de aproximadamente 400-500 pares de bases de longitud, preferiblemente procedente de una región de la secuencia codificante que sea específica del alelo resistentewb-R,se amplifica mediante PCR y se clona en el vector pZFN tanto en orientación sentido como antisentido, siendo dicho vector adecuado para la síntesis de estructuras tipo horquilla (véase la Figura 6 de la solicitud internacional WO 2014/202044 A1). Dicho vector contiene un promotor doble CaMV 35S, un sitio de clonación múltiple, un intrón del gen AtAAP6 que codifica enArabidopsis thalianapara una permeasa de aminoácidos, otro sitio de clonación múltiple y un terminador nos. La transformación de las remolachas azucareras con el vector así obtenido se realiza de acuerdo con el protocolo de Lindsey & Gallois, J. Exp. Bot. 41 (1990), 529­ 536, empleando el antibiótico canamicina como marcador de selección. Tras varios pasos de selección, la transformación exitosa se confirma en los brotes transgénicos mediante PCR, detectando la presencia del gen nptII, del intrón AAP6 y de las dos secuencias de borde T-DNA (LB/RB), así como la ausencia de vir. Los brotes positivos se multiplican in vitro de forma clonal hasta obtener 30 brotes por cada uno, se enraízan y se trasplantan a tierra en invernadero. Aproximadamente 2 semanas después, las plantas transgénicas de remolacha azucarera se trasfieren a suelo contaminado con rizomanía, donde se cultivan durante 8 a 10 semanas. Como control, se emplean plantas no transformadas del fondo genético resistente estándar de transformación, cultivadas en las mismas condiciones. Para demostrar la expresión del fenotipo de rizomanía, las raíces de las remolachas azucareras se cosechan y se cuantifica la infección por BNYVV mediante ensayo ELISA, en el cual un valor ELISA bajo indica resistencia y un valor alto indica sensibilidad (Mechelke 1997, citado anteriormente; Clark & Adams, J. Gen.Virol.34 (1977), 475-483). El valor ELISA de las remolachas azucareras transformadas es, como era de esperar, significativamente superior, con un valor medio de 3-4, al valor ELISA de las plantas control que permanecen resistentes, cuyo valor medio es de 1-2, y comparable al del estándar sensible. Por consiguiente, los resultados del ensayo ELISA pueden demostrar que, mediante el silenciamiento génico específico del alelo resistente wb-R en el fondo genético de transformación, una planta previamente resistente se vuelve sensible frente a BNYVV. De este modo, el gen wb-R objeto de la presente invención puede verificarse inequívocamente como el gen de resistencia.

[0199] La validación de la función génica puede realizarse además mediante la complementación de una planta sensible a WB, en particular remolacha azucarera, con un gen wb-R según la invención, por ejemplo, transformando un genotipo sensible con un vector de expresión vegetal que contiene una molécula de ácido nucleico con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 3 o una secuencia de nucleótidos equivalente, la cual codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, estando cada una de ellas bajo el control de un promotor constitutivo. Para la transformación, puede recurrirse, en principio, al vector pZFN descrito anteriormente y a las técnicas mencionadas, o bien a aquellas descritas en la parte general de la presente descripción.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

1. Molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido capaz de conferir resistencia frente a un patógeno en una planta en la que dicho polipéptido se exprese, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre:

a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos al menos en un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 2,

en la que la molécula de ácido nucleico presenta una o varias mutaciones que provocan que el polipéptido codificado por dicha molécula de ácido nucleico, en la posición correspondiente a la posición 307 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, un aminoácido distinto de lisina (K) y/o, en la posición correspondiente a la posición 437 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, un aminoácido distinto de glutamina (Q); y

b) una secuencia de nucleótidos que hibrida, bajo condiciones estringentes, con la secuencia complementaria a la SEQ ID NO: 1, en la cual la secuencia de nucleótidos presenta, en los sitios correspondientes a los de la secuencia nucleotídica de referencia SEQ ID NO: 1, una o varias de las siguientes sustituciones de nucleótidos: C en lugar de A en la posición 919; G en lugar de A en la posición 1310; A en lugar de G en la posición 1697; A en lugar de C en la posición 2191; y/o T en lugar de C en la posición 2491;

preferiblemente, en la que el patógeno es elBeet Necrotic Yellow Vein Virus(BNYVV) y la planta una planta del género Beta, preferiblemente remolacha azucarera(Beta vulgarisL.).

2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizada por que el polipéptido codificado presenta además (i) en la posición correspondiente a la posición 566 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, un aminoácido distinto de arginina (R); y/o (ii) en la posición correspondiente a la posición 731 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, presenta un aminoácido distinto de glutamina (Q); y/o (iii) en la posición correspondiente a la posición 831 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, presenta un aminoácido distinto de prolina (P).

3. Molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada por que el polipéptido codificado (i) presenta una glutamina (Q) en la posición que corresponde a la posición 307 en la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, y/o (ii) presenta una arginina (R) en la posición que corresponde a la posición 437 en la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, y/o (iii) presenta una histidina (H) en la posición que corresponde a la posición 566 en la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, y/o (iv) presenta una lisina (K) en la posición que corresponde a la posición 731 en la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, y/o

(v) presenta una serina (S) en la posición que corresponde a la posición 831 en la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2.

4.Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3, caracterizada por que dicha molécula de ácido nucleico presenta, en las posiciones correspondientes a las posiciones de la secuencia nucleotídica de referencia SEQ ID NO: 1, una o varias de las siguientes sustituciones de nucleótidos:

(a) C en lugar de A en la posición 919;

(b) G en lugar de A en la posición 1310;

(c) A en lugar de G en la posición 1697;

(d) A en lugar de C en la posición 2191; y/o

(e) T en lugar de C en la posición 2491.

5. Molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que dicha molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID NO: 4 y/o comprende la secuencia de ADN codificante conforme a la SEQ ID NO: 3.

6. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Célula vegetal transgénica, preferiblemente de una planta del género Beta, que comprende la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 como transgén, opcionalmente bajo el control de un promotor heterólogo, o bien el vector según la reivindicación 6.

8. Planta transgénica, preferiblemente del género Beta, o una parte de la misma, que comprende una célula vegetal según la reivindicación 7.

9. Planta resistente al BNYVV de la especie Beta vulgaris, o una parte de la misma, en la que la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 está presente de forma endógena, o en la que una o varias mutaciones definidas en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 se han introducido en una molécula de ácido nucleico endógena que comprende una secuencia de nucleótidos conforme a la SEQ ID NO: 1, o que hibrida bajo condiciones estringentes con la secuencia complementaria a la SEQ ID NO: 1, caracterizada por que la planta o una parte de la misma no pertenece a la subespecieBeta vulgarissubsp.marítima.

10. Planta según la reivindicación 8 o 9, caracterizada por que la planta es una planta híbrida o una planta doblemente haploide, y/o por que la molécula de ácido nucleico o la o las mutaciones están presentes en estado heterocigoto o homocigoto.

11. Semilla de la planta según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la que la semilla comprende una o varias de las moléculas de ácido nucleico o vectores mencionados anteriormente, de forma transgénica o endógena.

12. Procedimiento para la obtención de una planta resistente al BNYVV, que comprende las siguientes etapas:

(a) mutagenizar células vegetales y, a continuación, regenerar plantas a partir de las células vegetales mutagenizadas o mutagenizar plantas; e

(b) identificar una planta obtenida según (a) que presente, en una molécula de ácido nucleico endógena, una o varias mutaciones definidas en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

13. Procedimiento para la identificación de una planta del género Beta que sea resistente frente al patógeno BNYVV, caracterizado por que el procedimiento comprende el siguiente paso:

(i) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3, cuyo polipéptido codificado (i) presenta una glutamina (Q) en la posición correspondiente a la posición 307 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, o (ii) presenta una arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 437 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, y/o detectar la expresión de la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4, cuya molécula presenta, en las posiciones correspondientes a las posiciones de la secuencia nucleotídica de referencia SEQ ID NO: 1, las siguientes sustituciones de nucleótidos: (a) C en lugar de A en la posición 919, o (b) G en lugar de A en la posición 1310, en la planta o en una muestra de la misma; y/o

(ii) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3, cuyo polipéptido codificado (i) presenta una glutamina (Q) en la posición correspondiente a la posición 307 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, y (ii) presenta una arginina (R) en la posición correspondiente a la posición 437 de la secuencia aminoacídica de referencia SEQ ID NO: 2, y/o la expresión de la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4, cuya molécula presenta, en las posiciones correspondientes a las posiciones de la secuencia nucleotídica de referencia SEQ ID NO: 1, las siguientes sustituciones de nucleótidos: (a) C en lugar de A en la posición 919, y (b) G en lugar de A en la posición 1310, en la planta o en una muestra de la misma; y, en su caso,

(iii) seleccionar la planta resistente al BNYVV.

14. Población de plantas que comprende plantas según una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, o plantas identificadas y, en su caso, seleccionadas mediante un procedimiento según la reivindicación 13.

15. Procedimiento para el control de la infección por el patógeno Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) en el cultivo agrícola u hortícola de plantas del género Beta, que comprende:

I) la identificación y selección de plantas del género Beta mediante un procedimiento según la reivindicación 13; y

II) el cultivo de las plantas obtenidas en I) o de su descendencia.