UA126858C2 - Ген резистентності до ризоманії - Google Patents

Abstract

Винахід стосується молекули нуклеїнової кислоти, що забезпечує стійкість до ризоманії, зокрема до "вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка" (Beet Necrotic Yellow Vein Virus-BNYVV) у рослини, зокрема роду буряк, а також у рослин, що містять аналогічні молекули нуклеїнової кислоти. Також винахід стосується способу виведення резистентних до BNYVV сортів рослин, а також способи ідентифікації та селекції резистентних до BNYVV рослин з використанням маркерів, включаючи спосіб контролю ураження патогеном BNYVV.

Description

А

АРТЕСВАССАТТТСКВГСТАСАТСВОС ТО ІТС СТТСАВЗАТТТІСТТІАСАААСАТТТІБААТСАТТАСТСОВТТІА ЛА

ВАТ ОВАЛУ ТАТА Т ТАТО СВД АСТОЛАСАЛАСТОСАОВаОААОТАТТАААЛСОСССАВУТИТ МИХ

ТЕСТУ КЕ ТО ТАС СОАСАМАВАРТТССААТЛЬОТО ТЕТ, СА СОАТВАСТТТУТТАТЕАРТОСТВАА

ЗАСЕРОЗТТСАТОАТАТАСТЮТТОАРТОСТООААААСТТТСАРТТТІТАСААСАТОТТОТСАТАТТТОВОААТАЄЄНААС

СЕНС ПИКА ВА ТОССЕ РВС ТОСА ВАТ ХК СААСАРТАТАВТААУТОСАКТТАСАСАТОСТТАВСАААВІМАВОС еАПСАЛСАСЬОСААТОТТАТЕТАСОВСОАСТКТТОКТТАТЕ СТА ААСВАТТАСТОИТТААСАСАСАВСТ ТАТ ТТ ВІ

САТОСАСАТААЗСБАЗААСАТТАТСТОСАТеТТАСТОААСАСВІВАТА АС ТСАСКАТИТАШТТО ТТ САТНІАКИХО

ТОСТААВАСАДСАТУТОСТІВОВАТАТІТАТАТТАТТІСТАААТССАССАСААВТТТОАТСАТАХВІУТО ТОМУ ТМ ТІХ тотІтТосовАОоТттТТсАтТОотТОвоОВААААТТАСАсАСТТТВТОТТАТАТОоССАОСсСОВсСтАвТоОТАОТАСВТЕТИТТСТ

АСАвААТАТАЛІО І ТО КТ РСАТОАТСТОТАТАТВІОТААААСТАТАДТТЗА ТТН ТО ТРОСА АСТЕБЛІЧЗАТОТОовВА сТАСсАТУАТТ ММК КІТТІ ЕТ ТТ СТЕ ТТОоСААЛ ІТС ТТО ТАС АТТВААТИСАА,

РУТ ААСААСУГТАСААААІТАТАСПТТАТСАТТРТАвААТТОАТОААСАТОААСАТТССТААООСТОІТААТСАТОВАТ

БОАТТТТОСТСАРТОТАВТАВТТАТОСТАВСІЕТОАСОСТТОТААТО ТАТАР ТАЛА ТТ АААВТОХ

ПАРАХ СТОТТ ІОВА ТТ ВОСТІ ТТТАТ УГТ ТО ОСІ АСАТСАТОААТХАТААТТТТТ

Тв АТІБАСАТАТАТО ВИТ дОсТТАТЕТСААААЗАВМАТАТТТСОСПТОІТТРІТАСАСТОААТААСССТТУКТ ТВ ОСА

ТАСАСТТАААСААСТВКО ТРИ ТТА ТТ УХТТСАТТАВРЕСЦО ТАТІ ЕТАСТАРТТОСААСАВВЗАААВСТТВ ТИВ етТІМІАТИТОВ ВАТ ТКТЕІТЕТОТОСИТОА ВААС ТАОовАСААВ ТТ ВІТ ПЛУГ ТАТА

ЗІВА САТСТУГОСТТТААТЕТТТАСАТЕТ ТО ТВАТСАССАОСТАССААСТТАТААЛАТТАТОВАТТТАТТИВОВО

ТЕТОСТОААЕБТ ВІН ТСАВАСАСАТУЖТТО КО БАЗА КСАВАС ТО ТТРЕОТОВКТІСТТОСТАСАВААС

ССО ЕОСІСАКТТАТОТІВОТТТОГОАТРТОСАРТСАААШСА СТАТОК ТАВАТАСАТТОААААТТЕЕСАТОСТОТВАЦА пьтттоттотТОостТАветеивАААдОсАДОСВОвАВТ ТМ ІТТ УТЕАТТСАСТУТТОСАСАААСТАВТАСТА СТО СА

ВЕТО АСТТОАЖТОСТАСТОСАТАЮТОАТОВС ТО АСТСАТ ТОБ АЛАТТААВОГТАТОСТТО В ТАВТЕТОТОАРОИ

АВС АСАСАЦСАТАТОСТААЛОУКТОСИТАРТУГТИАСТТАССААСТТТОСАТСААТТАСААВГТАСТСАОАТТОААНАМРТКЕ

ВРЕАВРЛУРОТАЗАСТТОСТАААввАСАТТАААСТСТОАСТАВТТРТОТАСАТІТТСАС ТО АСАТТАВВСОХАТТОВХО тетАтСсвсвААСТАТВССААСТІТААСТТОССТТВАВАТАСТТОСТЕТССТЕТОССтТа ТТ, АВМУТАЄСАКТАРТОИ

ПАТРТОСАСОАТОТАВААТ УТА ААТСТАТОТТАПААТТТ ОСТІ УТААТСТТОААВАТОТТА;АВОАтТІМО ОСА

Вк ан кох НАТАТОГАТАВОТСАТАТАРТСАНААОКТОСААТТАБААТОСВКІСЕТЕЕ ВО ТОМАТА

ТАРА БАСАТОСАЛІОТВОТРТОСТОССІТТСААССАСАСАААААТТТОСдААлАВОТОСАлЕТвАТСААОТАЛНЮТІМНЯСВОИ

ЗАС ЕТТТЮТС ТОКАР ТІСАТОПТТО САТ АТІТАТАТІСААВААТТО ТОМАТА СТЕТСИ тост утТтТоОсОТААСТТІТТТІССТОТААОВОАСТТСАТЕТТААСОУТАТ АТАЦІ УТА УТАТУТОЗАСТАТОСАТ

ТЕТ ЕУТОО ТА АЛУТАСААСТ ОСС ТТТИ СТЕ ТТОСААТСАСТААА КОСА АТЕСТАТ А ТЕТ птАтоОСАтТтТАСссВвОоВводатвоссИ ССС тТЗАТІТТАТАвАТАСВвОсСАТтТЕТОСАвшТОСТОГтТОоТОвАТОА АТ ссСтвАвАВСАТАТ ВО ТС ТАТА ТТАТТСАТОСАВСТІТТВОССТВ Сто сАСАСАТТ ОТО АС ТАСОСВОА

ТСААТТОАСТТАТТСАТСАТЕТТТТОААМУТОСАТА ТМ Т АВАТАР ІАСАТРТОвАВТВ ТО ТслЛАТВОААТАТ

САТАААВАСААТРТССТТАТОСТОЗАВАТТОАСТА СОВА ТАТИ ТТГ АТЕСАТТАЄ

В

МЕАРГІОЗСІВЬАІІТОСЬІЕБЕКВОМІЕАСОІУСЕКОАВОСВЬККЕВЕКЕСКАсСУБЬВКОМТТСКМКоНМУСІУ Кс АЕН,

МибБІЧЕ ГАК ТЕЬОЕКІТВУЕтТвоОЗМаВКІСТВЬОСБВІОЕРБІІВСЮКІМУВМЕТКЕСКАСССТХІЕЕУХОСОМЕСЬБОТЕАЛВОВИВИК

ЕМІЇЗМЕЬЕОТІСБВУВІУСМІМХІсМІТІВвОММороКІСЕКЕННВЖУВУЗАКЕРБЬАКІТБЕТЬНАВСЕСЕУНЕОВЕКІ ХІІ, кни БІМОКаІБЕІ ПІТИ УКУПпПиВОЕВЗБКЬнЕЗОСКУБТТЕМВРМУТТУТКАТРЕУНКІКЬМКЕВЕГЛССАТІМВМОНУВВИММІ:

ЗЕКСБУТТЕБІААМАШКИСКОСРТААЦНУВОБНІЕХИЗКВКИПЕКИВНЕТ ОВО ІСВОКУЕКВБЕТЕРАКВЬММВСОТАВНОККОСОЦАХО шдЬЕВНОЕГЕЕКВМІ УСІМ ВОКЕБРОВМТВЬЕсІВОПОВрЕБІЧвБУКОБаНУЗІОЕБЕТУКМАЕЕТВВКАЕВИАЛІКСЕ В,

ЖЕО КЕТЕМЕКТАКНІ ВІСТІ ТІКРАКІКУІЕМОПОВТЕІГІЗЕКТсСІСсСБЕЕЕТЕОККУВеЕСЬНЬОЕТОІСВЬЕЕ

ВиЗВІКХІВХЕСАВСТНІБРВЬРКЕУТМІЕНпОТУТвЬКЕСУКЬЬВБЕКМІКМНІТКЕБНЬОУБІКСІЇВСКРАБІСВЬОСІКТЬЕ

ЗКАХСККУСЧІРБІАВСЕБЬКМЕСОТІСТЕМЬЕМУКЕСАЕАКНАМІСОКЕХІКВОВБЕЕКОВКЕСРІНВСІВМИУБАТІДВИКМОКЕ паТІШУОСспВЕгАМЕТаАРЕСІМ ВІЗ ВОМОСВОПОКОРАБОШЬРЕБЕТІБУВОЮНОВУКУУСІНЕСОКаТТОвЕВВоЕВЬКІСГЇ

МисСіМмечІвОвиМаБІстЕТЬтТІВБОСВВЕЬЕОМІВКнНМиЗівБЕУТМВСОСТЕЗІЕТЕВОБЕОЖІСВЬІТВЕВІВУКЮОВОДІВЕО

ЕЕЖХМЗІІКТІРУМЕІГЕКАМЕРОГЛЕ"

Фіг.і1

ГАЛУЗЬ ЗАСТОСУВАННЯ ВИНАХОДУ

Даний винахід відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, здатний забезпечити стійкість до патогену, зокрема, до «вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка» (Вееї Месгоїїс МеПЙом Меїп Мігиз - ВМУМУ) у рослини, зокрема, роду буряк, в якій експресується цей поліпептид, а також поліпептид, що кодується молекулою нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом. Винахід також відноситься до трансгенної рослини, рослинної клітини, органа рослини, рослинної тканини, частини рослини або насіння рослини, що включають молекулу нуклеїнової кислоти або її частини, а також до резистентної до ВМУМУМ рослини або її частинам, в яких шляхом здійснення однієї або декількох мутацій в ендогенній молекулі нуклеїнової кислоти була викликана ця резистентність. Спосіб створення такої трансгенної рослини або рослинної клітини, а також резистентної до ВМУММ нетрансгенної рослини, також охоплює даний винахід. Крім того, винахід також відноситься до заснованого на маркерах способу ідентифікації та селекції резистентних до ВМУММ рослин, у тому числі й до способу контролю ураження патогеном ВМ'УУМ.

ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Бородатість буряка (ризоманія) є захворюванням цукрових буряків, яке може призвести до найбільш економічно значущим у світі втратам врожаю, що становлять від 5095 і більше. Дане захворювання, що зветься також «бородатість буряка», викликає «вірус некротичного пожовтіння жилок буряка» (Веєї Месгоїіїс МеПом/ Меіїп Міги5 - ВМУММ), воно переноситься найпростішими РоїЇутуха Беїає, які знаходяться в землі. Інфекція ВМУММУМ проявляється в посиленні проліферації тонких і бічних коренів, а також в утворенні значно зменшеного кореневого тіла зі зниженим вмістом цукру. Інфіковані рослини характеризуються зниженим водопоглинанням і тому більш чутливі до посухи. Якщо інфекція поширюється на всю рослину, жилки листя стають жовтими, на листі з'являються некротичні утворення та жовті плями.

Оскільки куративна боротьба з цим захворюванням неможлива, як і у випадку з іншими вірусними захворюваннями, збиток може бути відвернений тільки шляхом вирощування стійких до даної хвороби сортів. Тому розвиток генотипів з генетичною стійкістю до ризоманії має вирішальне значення для вирощування цукрових буряків.

Перші селекційні програми, які спрямовані на одержання стійких до ризоманії рослин,

Зо почалися в Італії ще в 1981 році, коли було встановлено, що комерційна зародкова плазма має задовільну генетичну мінливість для одержання стійкості до ризоманії. Були відібрані рослини та генотипи зі зниженими симптомами захворювання і майже нормальною вагою кореня та вмістом цукру. В результаті схрещування з Веїа миїЇдагіз І. підвиду тагійта (І...) вдалося виявити джерело мультигенної резистентності, назване типом «АїЇра».

В 1982 році був розроблений інший тип резистентності, який показав поліпшений захист від ризоманії. Він був виявлений два роки по тому в сорті Кіог і був класифікований як моногенна, домінуюча резистентність. Ще одна моногенна, домінуюча резистентність була виявлена в 1983 році в ході сортовипробувань у Каліфорнії в селекційній компанії «НоПу Бидаг Сотрапу», яка також була представлена в Європі три роки по тому (І еугеЇІеп еї аї. 1987). Ця резистентність, відома як К2-1 (що також зветься «НоїЇу»), стала найбільше широко використовуваним джерелом і швидко прийшла на зміну Кі2ог. Кілька років по тому в Веїа тагіййта, прирощення

МУВ42 з Данії, було знайдено нове джерело резистентності до ризоманії. В результаті картування воно показало інше положення в хромосомі Ії у порівнянні з К2-1 і забезпечило підвищену резистентність у порівнянні з К2-1. Цей новий основний ген був названий К2-2. Тим часом в Веїа тагййта, прирощення УМВ41, був знайдений і К2-3, у випадку з яким мова, ймовірно, йде про алельний варіант К2-2.

На сьогоднішній день К2-3 є єдиним геном резистентності до ризоманії, функціональний фон якого, тобто генетична структура, був з'ясований (див. німецьку патентну заявку ОЕ 10 2013 010 026 Аг), що дозволило значно поліпшити селекційне використання гена. Таким чином, існує постійне прагнення краще описати генетично як вже відомі, так і нові джерела резистетності, щоб прискорити розробку молекулярних маркерів. Тим самим, елітні лінії цукрового буряка можна було би додатково оптимізувати, не тільки усунувши «зчеплений вантаж» (ГіпКаде Огад), але й виявляючи нові джерела резистентності.

Для стабільної селекції сортів, стійких до ризоманії, яка протидіє ізолятам ВМУМММ, що порушують резистентність, необхідно постійно ідентифікувати нові гени резистентності й інтегрувати їх в генофонд культивованих рослин, таких як цукровий буряк. Це завдання вирішується за допомогою варіантів здійснення винаходу, що зазначені у формулі винаходу та в описі.

РОЗКРИТТЯ ВИНАХОДУ

Даний винахід відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, яка здатна забезпечити стійкість до патогену, зокрема, до «вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка» (Вееєї Месгоїїс

УеїПом Меїп Мігиз - ВМУМУМ) у рослини, зокрема, роду буряк, в якій експресується поліпептид, що кодується даною молекулою нуклеїнової кислоти. Винахід також відноситься до рослини, зокрема, до трансгенної рослини, рослинної клітини, органа рослини, рослинної тканини, частини рослини або насіння рослини, що включають молекулу нуклеїнової кислоти або її частини, а також до резистентної до ВМУУМ рослини або її частинам, в яких шляхом здійснення однієї або декількох мутацій в ендогенній молекулі нуклеїнової кислоти була викликана ця резистентність. Спосіб створення такої трансгенної рослини або рослинної клітини, а також резистентної до ВМУММ нетрансгенної рослини, також охоплює даний винахід. Крім того, винахід також включає заснований на маркерах спосіб ідентифікації та селекції резистентних до

ВМУУМ рослин, у тому числі й спосіб контролю ураження патогеном ВМУУМ.

Тому даний винахід відноситься до варіантів здійснення, що перераховані в наступних пунктах з (1) по (221) і проілюстровані прикладами, та на зображеннях.

ПЇ Молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, здатний забезпечити стійкість до патогену рослини, в якій експресується цей поліпептид, яка відрізняється тим, що вона включає послідовність нуклеотидів, що вибрана з (а) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид з амінокислотною послідовністю за

ЗЕО ІЮ МО: 2 або поліпептид з амінокислотною послідовністю, ідентичною 5ЕО ІЮ МО: 2 щонайменше на 7095, в якому в результаті однієї або декількох мутацій нуклеотидної послідовності відбувається щонайменше одне амінокислотне заміщення, переважно в позиції 307 -- лізин «(К) і/або в позиції 437 -- глутамін (0); (Б) нуклеотидної послідовності, що містить послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 1 або такої, що гібридизується з додатковою послідовністю, з утворенням ЗЕО ІЮО МО: 1 в жорстких умовах, в якій в результаті однієї або декількох мутацій відбувається щонайменше одне нуклеотидне заміщення, що призводить до амінокислотного заміщення, переважно в позиціях 919-921 і/або в позиціях 1309-1311; (с) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який виробляється шляхом заміщення, делеції і/або додавання однієї або декількох амінокислот амінокислотної послідовності, що кодується нуклеотидною послідовністю за п. (а) або (Б), одного поліпептида, що кодується нуклеотидною послідовністю за п. (а) або (Б); або (4) нуклеотидної послідовності, що кодує щонайменше один лейцин-багатий домен (КК) відповідно () амінокислотним позиціям 558-594 послідовності ЗЕО ОО МО: 4, переважно амінокислотним позиціям 542-594 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 4, (ї) амінокислотним позиціям 604-634 послідовності ЗЕО ОО МО: 4, переважно амінокислотним позиціям 582-634 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 4, (її) амінокислотним позиціям 760-790 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 4 або (м) амінокислотним позиціям 838-869 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 4, і або щонайменше один домен ААА АТФаз відповідно (І) амінокислотним позиціям 177-289 послідовності 5ХЕО ІЮ МО: 4 або (ІЇ) амінокислотним позиціям 156-263 послідовності БЕО ІЮО МО: 4, причому переважно, щоб патогеном був вірус некротичного пожовтіння жилок буряка (Вевї

Месгоїїс МеПом/ Меіп Мігив - ВМУУМ), а рослиною - рослина роду буряк, переважно цукровий буряк (Веїа уцідагіз І..). (2) Молекула нуклеїнової кислоти за п. (1), яка відрізняється тим, що кодований поліпептид як альтернатива або додатково включає (ії) в позиції, яка відповідає позиції 566 в контрольній амінокислотній послідовності ФЕО ІЮ МО: 2, амінокислоту, відмінну від аргініну (В), і/або (ії) в позиції, яка відповідає позиції 731 в контрольній амінокислотній послідовності ФЕО ІО МО: 2, амінокислоту, відмінну від глутаміну (0), і/або (ії) в позиції, яка відповідає позиції 831 в контрольній амінокислотній послідовності ФЕО ІО МО: 2, амінокислоту, відмінну від проліну (Р).

ЇЇ Молекула нуклеїнової кислоти за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що кодований поліпептид (ї) включає глутамін (0) в позиції, яка відповідає позиції 307 в контрольній амінокислотній послідовності ФЕО ІЮ МО: 2, і/або (ії) аргінін (В) в позиції, яка відповідає позиції 437 в контрольній амінокислотній послідовності ФЕО ІЮ МО: 2, і/або (іїї) гістидин (Н) в позиції, яка відповідає позиції 566 в контрольній амінокислотній послідовності ФЕО ІО МО: 2, і/або (ім) лізин (К) в позиції, яка відповідає позиції 731 в контрольній амінокислотній послідовності ФЕО ІЮ

МО: 2, і/або (м) серин (5) в позиції, яка відповідає позиції 831 в контрольній амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО: 2.

Молекула нуклеїнової кислоти за п. ІЗ|, яка відрізняється тим, що вона включає в місцях, які відповідають місцям в контрольній амінокислотній послідовності 5ЕО ІО МО: 1, одне або декілька з перерахованих нижче нуклеотидних заміщень: (а) С замість А в позиції 919; (Б) о замість А в позиції 1310; (с) А замість С в позиції 1697; (8) А замість С в позиції 2191; і/або (є) Т замість С в позиції 2491.

І5Ї Молекула нуклеїнової кислоти за будь-яким з пунктів з |1| по (4), яка відрізняється тим, що вона кодує поліпептид з амінокислотною послідовністю згідно з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 4 і/або включає кодуючу послідовність ДНК згідно з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 3.

І6Ї Вектор, що включає молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з пунктів з (1) по (51.

ГИ Клітина-хазяїн, що включає молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з пунктів з (1) по

ІБЇ, або вектор за п. ІбІ.

ЇВ) Поліпептид, що кодується молекулою нуклеїнової кислоти за будь-яким з пунктів з (1) по

ІБЇ, або антитіло, що діє проти цього поліпептида.

ІЗ|Ї Трансгенна клітина рослини, переважно рослини роду буряк, що включає як трансген молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з пунктів з (1) по (5), за необхідності, під контролем гетерологічного промотора, або вектор за п. |б).

МОЇ Трансгенна рослина, переважно рослина роду буряк, або її частина, що включає рослинну клітину за п. (|9І.

МИ Резистентна до ВМУММ рослина роду буряк або її частина, яка ендогенно містить молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з пунктів з (1) по (5), або в якій одна або декілька мутацій, що зазначені в одному з пунктів з (1| по |4Ї, вноситься в ендогенну молекулу нуклеїнової кислоти з нуклеотидною послідовністю, що включає послідовність згідно з БЕО ІЮ

МО: 1 або такою, що гібридизується з додатковою послідовністю, з утворенням 5ЕО ІЮ МО: 1 в жорстких умовах, при цьому рослина або її частина не відноситься до підвиду Веїа мпцдагі5 5иБр5р. татпйіта. 21 Рослина за п. |10Ї або (11), яка відрізняється тим, що вона являє собою гібридну

Зо рослину або диплоїдну рослину. 13) Рослина за будь-яким з пунктів з (10) по (12), що містить молекули нуклеїнової кислоти або одну або декілька гетерозиготних або гомозиготних мутацій. 114) Рослина за будь-яким з пунктів з (101 по (13), що додатково містить в геномі трансгенну або ендогенну другу молекулу нуклеїнової кислоти, переважно в іншій або, відповідно, додатковій позиції в геномі, який кодує поліпептид, здатний забезпечити резистентність до

ВМУУМ в даній рослині, де поліпептид експресується в результаті транскрипції другої молекули нуклеїнової кислоти. 151 Насіння рослини за будь-яким з пунктів з (101 по (14), яке трансгенно або ендогенно містить одну або декілька згаданих вище молекул нуклеїнової кислоти або векторів.

І16Ї Спосіб створення трансгенної рослинної клітини та/або трансгенної рослини, що включає етап введення в рослинну клітину молекули нуклеїнової кислоти за будь-яким з пунктів з ПІ по 5) або вектора за п. |б), і за необхідності регенерації трансгенної рослини з трансгенної рослинної клітини.

І17| Спосіб виведення резистентної до ВМУУМ рослини, що включає наступні етапи (а) мутагенізацію клітин рослин з наступною регенерацією рослин з мутагенізованих рослинних клітин або мутагенізація рослин; за необхідності (Б) ідентифікацію рослини за п. (а), що містить в ендогенній молекулі нуклеїнової кислоти одну або декілька мутацій, зазначених в будь-якому з пунктів з || по (бі. 181 Спосіб ідентифікації рослини роду буряк, яка має резистентність до патогену ВМУММ, що включає () підтвердження наявності та/або експресії молекули нуклеїнової кислоти за будь-яким з пунктів з (1) по 5) в рослині або, відповідно, в її зразку; та/або (ї) підтвердження щонайменше одного маркерного локусу в нуклеотидній послідовності молекули нуклеїнової кислоти за будь-яким з пунктів з (1| по |5)| або в безпосередньому оточенні, переважно в хромосомі ПП; і/або (ії) підтвердження щонайменше двох маркерних локусів у хромосомі І рослини, при цьому щонайменше один маркерний локус знаходиться на ділянці або в її межах, хромосоми від 53е4516505 (5ЕО ІО МО: 5) до молекули нуклеїнової кислоти за будь-яким з пунктів з |1) по (5) і щонайменше один маркерний локус знаходиться на ділянці або в її межах, хромосоми від молекули нуклеїнової кислоти згідно з будь-яким з пунктів з (11 по (5| до 53е5918501 (5ЕО ІЮ МО: б); і за необхідності, (ім) селекцію резистентної до ВМУМУМ рослини.

М9| Спосіб за п. (18), який відрізняється тим, що щонайменше один маркерний локус визначає одну або декілька мутацій, зазначених в пунктах з |1) по (5). (20| Рослина або її частина, що ідентифіковані або за необхідності піддані селекції із застосуванням способу за п. (181 або п. (191. (21| Популяція рослин, що включають рослини за будь-яким з пунктів з (111 по (13) або 201. (22) Спосіб контролю ураження вірусом некротичного пожовтіння жилок буряка (Вееєї Месгоїїс

УеПйом Меїп Мігив - ВМУМУМ) рослин роду буряк у сільському господарстві або садівництві, що включає І) ідентифікацію та селекцію рослин роду буряк способом за п. (18) або п. М9| ї ІІ) вирощування рослин з п. Ї) або їх потомства. (23) Застосування рослинної клітини за п. ІФ), рослини за будь-яким з пунктів з (101) по (14) або 201 або її органів, частин, тканин або клітин, насіння за п. (15) або одержуваних способом за п. 16Ї або (17) або таких, що піддаються селекції за п. (18) або (19) рослини або її органів, частин, тканин, клітин, потомства або насіння у виробництві продуктів харчування, матеріалів, лікарських засобів або, відповідно, на попередніх етапах такого виробництва, в діагностиці, виробництві косметичних засобів, хімічних продуктів тонкого органічного синтезу, цукру, сиропу, біоетанолу або біогазу.

Раніше за все, нижче буде дано більш докладне пояснення до деяких термінів, що використовуються в даній заявці.

Термін «приблизно» в зв'язку із зазначенням довжини нуклеотидної послідовності означає відхилення на --/- 10 000 пар основ, на -/- 5000 пар основ або на -ч/- 1000 пар основ, переважно на яж7- 200 пар основ або на -- /- 100 пар основ і найбільше переважно на /- 50 пар основ. «Рослина роду буряк» відноситься до сімейства амарантових (Атагапіпасеає). До таких рослин відносяться представники видів Веїа тасгосагра, Веїа миЇдагі5, Веїа Іотаюдопа, Веїа тасгогтпіга, Веїа согоїІШога, Веїа ідупа і Вега папа. Рослиною виду Веїа миїЇдагі5, зокрема, є рослина підвиду Веїа миЇдагіз зиб5р. миЇдагіє5. Сюди відносяться, наприклад, Веїа миЇдагі5 зир5р. мицЇдагіх маг. акієбвіта (у вузькому сенсі цукровий буряк), Веїа миїдагіє 55р. миїдагі5 маг. миїдагіб

Зо (мангольд), Веїа мцідагі5 55р. миЇдагів маг. сопайіма (червоний/столовий буряк), Вега миЇдагів в55р. мУцідагі5 маг. сгазза/аІба (буряк кормовий).

Під «гібридизуванням» або «гібридизацією» мається на увазі процес, в якому одноланцюжкова молекула нуклеїнової кислоти приєднується до переважно комплементарного ланцюжку нуклеїнової кислоти, тобто об'єднується з нею в пари основ. Стандартний спосіб гібридизації описаний, наприклад, у книзі Затьгоок еї аї., МоІесшіаг СіІопіпд: А І арогаогу Мапиаї зга Еа. Соїіа Зргіпд Нагброг ІГарогафогу Рге55, Сода Зргіпд Нагброг, МУ, 2001. Під цим переважно слід розуміти, що не менше 6095, переважно не менше 6595, 7095, 7595, 8095 або 8595, найбільше переважно 9095, 9195, 92905, 9395, 9495, 9595, 9690, 9795, 9895 або 9995 основ молекули нуклеїнової кислоти входять в пару основ з ланцюжком нуклеїнової кислоти, в значній мірі комплементарної. Можливість такого збирання залежить від жорсткості умов гібридизації.

Термін «жорсткість» відноситься до умов гібридизації. Дуже жорсткі умови припускають ускладнення об'єднання в пари, не жорсткі умови передбачають спрощення об'єднання в пари.

Жорсткість умов гібридизації залежить, наприклад, від концентрації солей або іонної сили та температури. В цілому, жорсткість може бути посилена за рахунок підвищення температури та/або зниження вмісту солей. Під «жорсткими умовами гібридизації» слід розуміти умови, в яких гібридизація відбувається переважно тільки між гомологічними молекулами нуклеїнової кислоти. При цьому термін «умови гібридизації» відноситься не тільки до умов, що переважають під час фактичного збирання нуклеїнових кислот, але й до умов, що переважають на наступних етапах промивання. Жорсткими умовами гібридизації є, наприклад, умови, в яких гіоридизуються переважно тільки ті молекули нуклеїнової кислоти, ступінь ідентичності послідовності в яких становить не менше 7095, переважно не менше 7595, не менше 8095, не менше 8595, не менше 9095 або не менше 9595. Жорсткими умовами гібридизації, наприклад, є: гібридизація в 4 х 55С при 65 "С з подальшою багаторазовою промивкою в 0,1 х 55С при 657 із загальною тривалістю приблизно 1 година. Використовуваний тут термін «жорсткі умови гібридизації» також може означати наступне: гібридизація при 68 "С в 0,25 М фосфату натрію, з рН 7,2, 795 505, 1 мМ ЕОТА і 195 ВБ5А протягом 16 годин з наступною дворазовою промивкою в 2 х 5560 і 0,195 505 при 68 "С. Переважно, щоб гібридизація відбувалася в жорстких умовах. «Комплементарна» нуклеотидна послідовність у відношенні нуклеїнової кислоти в формі дволанцюжкової ДНК, означає, що другий ланцюг ДНК, комплементарний першому ланцюгу

ДНК, включає за правилами об'єднання в пари нуклеотиди, що відповідні основам першого ланцюга.

Під «ізольованою молекулою нуклеїнової кислоти» мається на увазі молекула нуклеїнової кислоти, що виділена зі свого природного або вихідного оточення. Даний термін також позначає молекулу нуклеїнової кислоти, що одержана синтетичним способом. Під «ізольованим поліпептидом» мається на увазі поліпептид, що виділений зі свого природного або вихідного оточення. Даний термін також позначає поліпептид, що одержаний синтетичним способом. «Молекулярний маркер» -- це нуклеїнова кислота, яка є поліморфною в популяції рослин і використовується як контрольна або орієнтована точка. Маркер для виявлення рекомбінаційної події повинен бути придатний для моніторингу відмінностей або поліморфізму в популяції рослин. Таким чином, такий маркер дозволяє виявляти та розрізняти різні алельні стани (алелі).

Термін «молекулярний маркер» також відноситься до нуклеотидних послідовностей, що є комплементарними або щонайменше в значному ступеню комплементарними або гомологічними геномним послідовностям, наприклад, нуклеїнові кислоти, які використовуються як зонди або праймери. Для маркерів ці відмінності знаходяться на рівні ДНК і являють собою, наприклад, відмінності в полінуклеотидних послідовностях, таких як, наприклад, 595 (5ітріе зедиепсе гереаї5), ВЕ Р5 (гезігісійоп Падтепі Іепдій роїутогрпізт5), ЕГ/Р5 (падтепі Іепдій роїутогрвпізт5) або ЗМР» (зіпдіеє писіеоїіде роїЇутогрпієт»5). Маркери можуть бути одержані з геномних або експресованих нуклеїнових кислот, таких як сплайсована РНК, кКДНК або Е5Т5 (маркерні послідовності, які експресуються), а також можуть відноситися до нуклеїнових кислот, які використовуються як зонди або пар праймерів і як такі здатні посилювати фрагмент послідовності за допомогою методів на основі ПЛР. Маркери, які описують генетичні поліморфізми (між частинами однієї популяції), можуть бути виявлені за допомогою сучасних методів, що добре зарекомендували себе (Ап Іпігодисіп їо Сепеїіс Апаїувзібє. 7 Еайоп, сСтіййн5, Мійег, Зи2иКі еї аі., 2000). До них відносяться, наприклад, секвенування ДНК, ампліфікація окремих послідовностей з використанням ПЛР, підтвердження поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів (КР Р), підтвердження поліморфізму полінуклеотидів за допомогою алель-специфічної гібридизації (А5БН), виявлення ампліфікованих змінних послідовностей геному рослин, виявлення З35К (5еїї-5и5іаіїпей зедцепсе геріїсайоп), виявлення

Зо 5ОК5, ЗМР5, ЕРІГР5 або АРІ Ро (атрійеа їгтадтепі Іепдій роїЇутогрпізптв5). Крім того, також відомі методи виявлення ЕЗТ5 (ехргеззей зедциепсе їадб5) і 55Н-маркерів, що одержані з Е5Т- послідовностей і КАРО (гападотіу атрійеай роїутогрпіс ОМА). Залежно від контексту, термін «маркер» в описі може також означати конкретну позицію в хромосомі геному будь-якого виду, де може бути знайдений специфічний маркер (наприклад, ЗМР). «Промотор» -- це нетрансльована регуляторна послідовність ДНК, що зазвичай розташована вище області кодування, яка містить точку з'єднання для РНК-полімерази та ініціює транскрипцію ДНК. Промотор також містить інші елементи, які виступають в ролі регуляторних генів для експресії генів (наприклад, цис-регуляторні елементи). «Кор-промотор або мінімальний промотор» -- це промотор, що має щонайменше базові елементи, необхідні для ініціювання транскрипції (наприклад, ТАТА-бокс і/або ініціатор). «Патоген» означає організм, який взаємодіє з рослиною та призводить до виникнення симптомів захворювання в одному або декількох органах рослини. До таких патогенів відносяться, наприклад, тварини, грибкові, бактеріальні або вірусні організми або ооміцети.

Під «патогенною інфекцією» слід розуміти найбільш ранній час, коли патоген взаємодіє з тканинами рослини-хазяїна. Наприклад, у випадку з вірусним патогеном ВМУММ перенесення здійснюється найпростішими РоіЇутуха Ббеїає. РоїЇутуха утворює спори, які можуть зберігатися в землі протягом багатьох десятиліть. У цих спорах знаходиться і вірус. Якщо ці спочиваючі спори проростають і стають рухливими зооспорами, крізь них вірус може проникати в клітини тканини рослини-хазяїна та взаємодіяти з хазяїном (Ев55ег (2000) Кгуріодатеп 1: Суапобакіегіеп АІдеп

Ріїге Ріеєспієп Ргакікит шипа Гептиси. Зргіпдег-Мепад, Вепіп, Неїдеї!рего, 3. Ашіаде).

До рослинних «органів» відносяться, наприклад, листя, стебло, стовбур, коріння, гіпокотиль, вегетативні бруньки, меристема, ембріони, пиляки, яйцеклітини, насіння або плоди. «Частини рослин» включають, крім іншого, стебло або, відповідно, стовбур, листя, квіти, суцвіття, коріння, плоди та насіння, а також пилок. Термін «частини рослини» також означає поєднання декількох органів, наприклад, квітка або насіння, або частину органа, наприклад, перетин стебла. До рослинних «тканин» відносяться, наприклад, калусна тканина, накопичувальна тканина, меристематична тканина, листова тканина, тканина пагона, коренева тканина, тканина рослинних пухлин або репродуктивна тканина, а також освітна тканина, паренхімна тканина (так звана паренхіма), провідна тканина, механічна тканина та покривна тканина (так званий бо епідерміс). Дане перерахування не є вичерпаним списком понять, що відносяться до терміну

«тканина». Під рослинними «клітинами» слід розуміти, наприклад, ізольовані клітини з клітинною стінкою або їх агрегатами або протопластами.

В контексті даного винаходу термін «регуляторна послідовність» відноситься до нуклеотидної послідовності, яка впливає на специфічність і/або експресійну силу, наприклад, при передачі конкретної специфічності тканини регуляторною послідовністю. Така регуляторна послідовність може бути розташована не тільки вище точки ініціації транскрипції мінімального промотора, але й нижче її, наприклад, у транскрибованій, але не трансльованій лідерній послідовності або всередині інтрону.

Термін «резистентність» слід розуміти в широкому сенсі, він охоплює діапазон захисту починаючи від затримування та закінчуючи повним блокуванням розвитку захворювання.

Прикладом значущого патогену є вірус некротичного пожовтіння жилок буряка (Веєї Месгоїїс

УеПйом/ Меїпй Мігпиє - 2 ВМУММ). Переважно, щоб резистентна рослинна клітина за даним винаходом або резистентна рослина за даним винаходом мали резистентність до ВМУММ.

Резистентність до патогену еквівалентна резистентності до захворювання, що викликане даними патогеном, наприклад, резистентність до ВМУУМ також є резистентністю до бородатості буряка (ризоманії). «Трансгенна рослина» означає рослину, в геном якої інтегрований хоча б один полінуклеотид. При цьому мова може йти про гетерологічний полінуклеотид. Переважно, щоб полінуклеотид був стабільно інтегрований, що означає, що інтегрований полінуклеотид стабільно зберігається в рослині, експресується та може бути стабільно успадкований потомством. Стабільне впровадження полінуклеотиду в геном рослини також включає інтеграцію в геном рослини попереднього батьківського покоління, завдяки чому полінуклеотид може бути стабільно успадкований наступним потомством. Термін «гетерологічний» означає, що запроваджений полінуклеотид, наприклад, походить з клітини або організму з іншим генетичним фоном того ж виду або іншого виду, або є гомологічним прокаріотичній або еукаріотичній клітині-хазяїну, але локалізований в іншому генетичному середовищі і тому відрізняється від будь-якого природно існуючого відповідного полінуклеотиду. Гетерологічний полінуклеотид може бути присутнім на додаток до відповідного ендогенного гена.

Варіанти та форми здійснення даного винаходу описані на прикладах з посиланням на відповідні послідовності й зображення.

Фіг. 1(А) Геномна послідовність ДНК сприйнятливого до ризоманії (М/В) алеля м/р-5 гена резистентності р (ЗЕО ІО МО: 1) з 55-генотипу, ідентифікованого як МВ5-І КК (ген домену МВ-

АКС) за допомогою тонкого картування. Аналіз потомства 4 найближчих рекомбінантних рослин (2 прямих рекомбінантів зліва та 2 прямих рекомбінантів справа навколо гена) локалізував ген

МВ5-ІКК з точністю до одного гена. Показана послідовність включає кодовану область згаданої раніше білкової послідовності (В, ЗЕО ІЮ МО: 2) білка резистентності УУВ-5. (С) Геномна послідовність ДНК резистентного до ризоманії алеля м/р-К гена резистентності мб (ЗЕО ІЮ МО: 3) з кодованою областю згаданої раніше білкової послідовності. Діагностичний поліморфізм, який призводить до амінокислотного заміщення, підкреслений і виділений напівжирним шрифтом. (0) Амінокислотна послідовність геномної послідовності ДНК резистентного до ризоманії алеля м/р-К, що кодований геном резистентності мо (ЗЕО ІЮ МО: 3) білка.

Діагностичний поліморфізм підкреслений і виділений напівжирним шрифтом. Експерименти в рамках даного винаходу, поміж іншого -- аналіз послідовностей резистивних до ризоманії генотипів у порівнянні з переважаючим сприйнятливим генотипом і амінокислотною послідовністю, яка наявна в геномній базі даних, показали, що в геномній послідовності ДНК резистентних до ризоманії алелів м'б-К корелюючий ген МВ5-Ї КК з показаною в послідовності

ЗЕО ІЮ МО: З рамкою зчитування включає одне або декілька амінокислотних заміщень, так що резистентність, яка спостерігається, пояснюється мутаціями в даному гені. Базуючись на попередньому аналізі рекомбінантів, одне з двох амінокислотних заміщень КЗ3070О і/або 0437, зокрема, може розглядатися як причина виникнення резистентності.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Даний винахід відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, яка здатна забезпечити стійкість до патогену, зокрема, до «вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка» (Вееєї Месгоїїс

УеїПом Меїп Мігиз - ВМУМУМ) у рослини, зокрема, роду буряк, в якій експресується поліпептид, що кодується даною молекулою нуклеїнової кислоти. Даний винахід оснований на генетичному тонкому картуванні, ідентифікації, ізолюванні й описі гена, що походить від донора Веїа миЇдагіб 5ир5р. тагіййта, наявність якого в рослині, зокрема, в цукровому буряку корелює з резистентністю відповідної рослини до ризоманії (М/В) або, відповідно, є причиною такої резистентності, а його нуклеотидна та кодована амінокислотна послідовності відрізняються 60 щонайменше одним нуклеотидним або, відповідно, амінокислотним заміщенням у порівнянні із зображеними на фіг. 1А і В нуклеотидної і амінокислотної послідовностями гена МВ5-І ЕК, що ідентифікований згідно з винаходом, при цьому переважно, щоб нуклеотидні або, відповідно, амінокислотні заміщення становили не більше 5095, переважно не більше 6095, більш переважно не більше 7095, ще більш переважно не більше 8095, і ще більш переважно не більше 9095 і, зокрема, переважно не більше 9595 від всієї нуклеотидної і амінокислотної послідовностей, що зображені на фіг. тА і В. Найбільш переважні варіанти здійснення нуклеотидної і амінокислотної послідовностей молекули нуклеїнової кислоти відповідно з винаходом показані на фіг. 1С і О й описані в прикладах разом із легендою до зображення.

У випадку з молекулою нуклеїнової кислоти мова може йти про ізольовану молекулу нуклеїнової кислоти. Переважно, щоб це була ДНК, найбільше переважно - кКДНК або, відповідно, кодуюча ДНК. Переважно, щоб поліпептид, який кодується молекулою нуклеїнової кислоти відповідно до винаходу, забезпечував резистентність до вірусного патогену «некротичного пожовтіння жилок буряка» (Вееї Месгоїїс МеПйом/ Меїп Мігивє - ВММУММУ), який викликає бородатість буряка (ризоманію) тапередається найпростішими РоїЇутуха Беїає, що знаходяться в землі. Крім того, поліпептид, який згідно з винаходом кодується молекулою нуклеїнової кислоти, забезпечує резистентність до цього патогену, зокрема, рослин роду буряк.

Переважно, щоб рослиною, яка описується, була рослина виду Веїа миїЇдагі5, найбільш переважно -- рослина підвиду Веїа миїЇдагіз зир5р. миїдагіє; до них відносяться, наприклад, культивовані види цукрових буряків, червоних буряків, кормових буряків, листового мангольда тачерешкового мангольда.

В одному з варіантів здійснення даного винаходу описувана молекула нуклеїнової кислоти включає нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид з амінокислотною послідовністю за

ЗБЕО ІЮО МО: 2, при цьому дана молекула нуклеїнової кислоти включає одну або декілька мутацій, які призводять до того, що поліпептид, який кодується цією молекулою нуклеїнової кислоти, в позиції, що відповідає позиції 307 у контрольній послідовності зБЕО ІЮО МО: 2, включає амінокислоту, що відрізняється від лізину (К), і/або в позиції, що відповідає позиції 437 у контрольній послідовності БЕО ІЮО МО: 2, включає амінокислоту, що відрізняється від глутаміну (0). Одна з двох або обидві згадані мутації в амінокислотній послідовності, імовірно, були ідентифіковані як причина резистентності до ризоманії.

Як пояснюється на прикладах і в легенді до зображень, у випадку з ідентифікованим геном згідно з винаходом мова йде про ген/білок резистентності типу МВ5-І КЕ, який характеризується певними структурними мотивами. Загальна структура подібних білків резистентності у рослин уже добре вивчена (Магінп еї аї., Аппиа! Кеміем/ Ріапі Віоіоду 54 (2003), 23-61). Однак принцип формування структури, зокрема, так званого домену І КК, який розглядається як потенційний домен ідентифікації для переважно невідомих патогенних ефекторів, не передбачуваний і в цілому функціональний фон генів резистентності, тобто генетичної структури, в значному ступеню невідомий. Відповідно, ідентифікація гена або, відповідно, білка, що забезпечують резистентність до ВМУМУ, тільки на основі відомих структурних мотивів неможлива. Крім того, області послідовності навколо цих генів резистентності часто повторюються, що особливо ускладнює розробку діагностичних маркерів і збирання послідовностей.

Ідентифікований білок резистентності відноситься до типу МВ5-І КЕ і включає щонайменше один кодований лейцин-багатий домен (ЕК) відповідно до амінокислотних позицій 558-594 послідовності зЕО ІЮ МО: 4, переважно амінокислотними позиціями 542-594 послідовності 5хЕО

ІЮ0 МО: 4, амінокислотними позиціями 604-634 послідовності 5ЕО ІЮ МО: 4, переважно амінокислотними позиціями 582-634 послідовності БЕО ІЮ МО: 4, амінокислотними позиціями 760-790 послідовності 5ЕО ІЮ МО: 4 або амінокислотними позиціями 838-869 послідовності ЗЕО

ІО МО: 4 і/або щонайменше один кодований домен ААА АТФаз відповідно до амінокислотних позицій 177-289 послідовності 5ЕО ІЮ МО: 4 або амінокислотними позиціями 156-263 послідовності зЕО ІЮ МО: 4. У випадку з ідентифікованим доменом ААА АТФаз мова з великою ймовірністю йде про домен МВ-АКС, головною функцією якого є зв'язування нуклеотидів. Не будучи прив'язаним до будь-якої або конкретної теорії, цей функціональний домен АТФаз імовірно регулює активність білка резистентності.

В іншому варіанті здійснення молекула нуклеїнової кислоти за винаходом включає нуклеотидну послідовність 5ЕО І МО: 1, при цьому в позиціях 919-921 і/або 1309-1311 відбувається заміщення одного або декількох нуклеотидів, що призводить до амінокислотного заміщення.

Ці амінокислотні або, відповідно, нуклеотидні заміщення можуть бути виконані з використанням традиційних методів, відомих згідно із сучасним рівнем розвитку технологій, наприклад, локального мутагенезу, спрямованого мутагенезу за допомогою ПЛР, транспозоного 60 мутагенезу, методу ТІ ІМО, геномної інженерії, наприклад, з використанням мегануклеаз,

нуклеаз цинкових пальців, методів ТАГЕМ5 і СКІЗРК/Савз і т.д. Крім того, в нуклеотидній послідовності можуть бути вироблені додаткові заміщення, делеції, інсерції, додавання та/або будь-які інші змінення як окремо, так і в комбінації, які хоч і змінюють нуклеотидну послідовність, але виконують ту ж функцію, що й вихідна послідовність, в даному випадку це - нуклеотидна послідовність згідно з винаходом, що кодує поліпептид з амінокислотною послідовністю згідно з винаходом, яка забезпечує резистентність до бородатості буряка (різоманії). Тому в іншому варіанті здійснення винахід включає нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид, який є похідною поліпептида, кодованого нуклеотидною послідовністю згідно з винаходом, або амінокислотну послідовність згідно з винаходом. Похідна поліпептида являє собою похідну амінокислотну послідовність, що включає щонайменше одне заміщення, одну делецію, одну інсерцію або одне додавання однієї або декількох амінокислот зі збереженням функціональності кодованого поліпептида/білка.

Заміщення однієї амінокислоти іншою амінокислотою з такими ж або еквівалентними або аналогічними хіміко-фізичними властивостями називається «консервативне заміщення» або «напівконсервативне заміщення». Прикладами фізико-хімічних властивостей амінокислот є, наприклад, гідрофобність або заряд. Професіоналу відомо, яке амінокислотне заміщення являє собою консервативне або напівконсервативне заміщення. Крім того, загальні професійні знання дозволяють розпізнати, ідентифікувати та підтвердити, які амінокислотні делеції і додавання не порушують функціональність білка стійкості, а в яких позиціях такі порушення можливі.

Професіонал усвідомлює, що у випадку з даними білком МВ5З-ЇКЕК для модифікації амінокислотної послідовності (заміщення, делецій, інсерцій або додавань однієї або декількох амінокислот), зокрема, функціональність згаданих вище консервативних доменів, повинна бути збережена, і тому в цих доменах можливі лише обмежені змінювання.

Таким чином, винахід включає функціональний фрагмент нуклеотидної послідовності, що описується тут. При цьому термін «фрагмент» охоплює гени з нуклеотидною послідовністю, досить схожою із зазначеною вище послідовністю. Термін «досить схожа» означає першу нуклеотидну послідовність або амінокислотну послідовність, що має достатнє або мінімальне число ідентичних або еквівалентних нуклеотидів або, відповідно, амінокислотних залишків у порівнянні з другою нуклеотидною або, відповідно, амінокислотною послідовністю.

Зо Амінокислотна послідовність має загальний структурний домен і/або загальну функціональну активність навіть після змінювання із застосуванням згаданого вище методу.

Нуклеотидні або амінокислотні послідовності, що ідентичні щонайменше на 7095, щонайменше на 7595, щонайменше на 8095, щонайменше на 8095, щонайменше на 8595, щонайменше на 9096, щонайменше на 9195, щонайменше на 9295, щонайменше на 9395, щонайменше на 94965, щонайменше на 9595, щонайменше на 9695, щонайменше на 9795, щонайменше на 9895, щонайменше на 9995 або на 10095 нуклеотидній або, відповідно, амінокислотній послідовності за даним винаходом, розглядаються тут як досить схожі послідовності. Переважно, щоб достатня схожість у функціональних фрагментах була обгрунтована у випадку, якщо нуклеотидна послідовність або, відповідно, амінокислотна послідовність в цілому має ті ж властивості, що й вищезгадані нуклеотидні або, відповідно амінокислотні послідовності за даним винаходом. Переважно, щоб нуклеотидні послідовності, що кодують похідну або, відповідно, похідну амінокислотну послідовність, могли бути створені безпосередньо або опосередковано (наприклад, шляхом ампліфікації або реплікації) з вихідної нуклеотидної послідовності, яка генерується за всією довжиною або щонайменше частково в нуклеотидній послідовності за даним винаходом.

Відповідно, даний винахід включає нуклеотидну послідовність, здатну гібридизувати в жорстких умовах нуклеотидну послідовність, яка комплементарна нуклеотидній послідовності за даним винаходом або нуклеотидній послідовності, що кодує амінокислотну послідовність за даним винаходом.

В додатковому варіанті здійснення даного винаходу молекула нуклеїнової кислоти, що описується тут, включає нуклеотидну послідовність, яка кодує щонайменше один кодований лейцин-багатий домен (І АВ) відповідно до амінокислотних позицій 558-594 послідовності 5ЕО

ІЮ0 МО: 4, переважно амінокислотними позиціями 542-594 послідовності 5ЕО ІЮО МО: 4, амінокислотними позиціями 604-634 послідовності 5ЕО ІЮО МО: 4, переважно амінокислотними позиціями 582-634 послідовності 5ЕСО 10 МО: 4, амінокислотними позиціями 760-790 послідовності ФЕО ІЮ МО: 4 або амінокислотними позиціями 838-869 послідовності ФЕО ІЮ МО: 4 або щонайменше один домен ААА АТФаз відповідно до амінокислотних позицій 177-289 послідовності ФЕО ІЮ МО: 4 або амінокислотними позиціями 156-263 послідовності ФЕО ІЮ МО: 4. Найбільше переважно, щоб ці домени були присутні в поліпептиді послідовно від М-кінця до

С-кінця в порядку АДА АТФаза - І ВЕ, при цьому між доменами можуть бути присутніми одна або декілька додаткових амінокислот.

В додатковому варіантів здійснення даного винаходу описувана молекула нуклеїнової кислоти включає нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид з амінокислотною послідовністю за БЕО ІЮ МО: 2, при цьому дана молекула нуклеїнової кислоти включає одну або декілька мутацій, які призводять до того, що поліпептид, який кодується цією молекулою нуклеїнової кислоти, в позиції, що відповідає позиції 307 у контрольній послідовності 5ЕО 10

МО: 2, включає амінокислоту, що відрізняється від лізину (К), і/або в позиції, що відповідає позиції 437 у контрольній послідовності зФЕО ІЮ МО: 2, включає амінокислоту, що відрізняється від глутаміну (0), і в позиції, що відповідає позиції 566 в контрольній амінокислотній послідовності ФЕО ІЮ МО: 2, амінокислоту, що відрізняється від аргініну (В), і/або (ії) в позиції, яка відповідає позиції 731 в контрольній амінокислотній послідовності 5ЕСО 10 МО: 2, амінокислоту, що відрізняється від глутаміну (0), і/або (ії) в позиції, яка відповідає позиції 831 в контрольній амінокислотній послідовності ЕС) 10 МО: 2, амінокислоту, що відрізняється від проліну (Р). Перші два заміщення раніше були визначені як відповідальні за резистентність.

Хоча роль останніх трьох заміщень в забезпеченні резистентності залишається неясною, вони носять діагностичний характер і тому можуть бути вигідно використані в методах підтвердження та/або селекції.

В додатковому варіанті здійснення винаходу описувана молекула нуклеїнової кислоти включає нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид з амінокислотною послідовністю згідно з ЗЕО ІЮО МО: 2, при цьому кодований поліпептид включає глутамін (0) в позиції, яка відповідає позиції 307 у контрольній амінокислотній послідовності ЖЕО ІЮ МО: 2, і/або аргінін (К) в позиції, яка відповідає позиції 437 в контрольній амінокислотній послідовності зЗЕО ІЮО МО: 2, мМабо гістидин (Н) в позиції, яка відповідає позиції 566 в контрольній амінокислотній послідовності ЗЕО ІО МО: 2, і/або лізин (К) в позиції, яка відповідає позиції 731 в контрольній амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2, і/або серин (5) в позиції, яка відповідає позиції 831 в контрольній амінокислотній послідовності ЗЕБЕО ІО МО: 2. Дані амінокислотні заміщення переважно відбуваються в результаті заміщення одного або декількох нуклеотидів в молекулі нуклеїнової кислоти послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1, при цьому переважно, щоб один нуклеотид був

Зо заміщений іншим. Відповідно, описувана молекула нуклеїнової кислоти відрізняється тим, що дана молекула нуклеїнової кислоти включає в місцях, які відповідають місцям в контрольній амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1, одне або декілька з перерахованих нижче нуклеотидних заміщень: С замість А в позиції 919; б замість А в позиції 1310; А замість С в позиції 1697; А замість С в позиції 2191; і/або Т замість С в позиції 2491. В переважному варіанті здійснення винаходу описувана молекула нуклеїнової кислоти відрізняється тим, що ця молекула нуклеїнової кислоти кодує поліпептид з амінокислотною послідовністю згідно з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 4 і/або включає кодуючу послідовність ДНК згідно з послідовністю

ЗЕО ІЮО МО: 3; див. також фіг. 1 та її легенду, включаючи приклади.

Далі, даний винахід відноситься до рекомбінантної молекули ДНК, що включає послідовності молекули нуклеїнової кислоти, яка описується тут. Переважно, щоб дана рекомбінантна молекула ДНК додатково включала регуляторну послідовність або, відповідно, була з'єднана з нею асоційовано/оперативно, переважно з промоторною послідовністю та/або іншими послідовностями транскрипційних або трансляційних контрольних елементів, при цьому регуляторна послідовність, що контролює експресію гена, який містить молекулу нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, відрізняється тим, що ця регуляторна послідовність здатна забезпечувати або модулювати експресію гетерологічної послідовності ДНК внаслідок патогенної інфекції. Переважно, щоб гетерологічна послідовність ДНК являла собою нуклеотидну послідовність, що кодує компонент захисту рослин від патогенів (наприклад, гени резистентності (К-гени) або гени, що кодують ферменти, які беруть участь у передачі сигналу, наприклад кінази або фосфатази, а також С-білок) або що кодує патогенний ефектор (так звані авірулентні гени (амг)).

Даний винахід також відноситься до поліпептида, який може бути кодований описуваною молекулою нуклеїнової кислоти та до функціонального та/або імунологічно активного його фрагменту, а також до антитіла, яке специфічно прив'язується до поліпептида або до його фрагменту. Найбільше переважно, щоб поліпептид включав амінокислотну послідовність відповідно до 5ЕО ІЮО МО: 4. Процес одержання рекомбінантних білків, поліпептидів і фрагментів фахівцю відомий і описаний, наприклад, у виданні Затьгоок еї аї., Моїесшаг Сіопіпд:

А І арогаюгу Мапиаї! За Еа. Соїй бргіпд Натог І абогаюгу Ргевз5, Соїд 5ргіпд Наїбог, МУ, 2001 або М/іпдіїє!а, Р. Т. 2008. Ргодисійоп ої Несотріпапі Ргоївіпв. Сцтепі Ргоїосої5 іп Ргоївіп Зсієпсе. 60 52:5.0:5.0.1-5.0.4. Поліклональні або моноклональні антитіла до білка з даного винаходу можуть бути одержані фахівцем відомими методами, як описано в виданні Е. Нагіоуу єї аІ., Негаиздебег

Апііродіев5: А І арогаїогу Мапиаї (1988). Одержання моноклональних антитіл і фрагментів Рар- і

Каь», які також корисні в методах виявлення білків, може бути вироблено різними поширеними методами, як описано у виданні Содіпд, Мопопосіопа! Апііродіев: Ргіпсіріе5 апа Ргасіїсе, 5. 98- 118, Мем Хогк: Асадетіс Ргез55 (1983). Згодом ці антитіла можуть бути використані для скринінгу експресійних бібліотек КкДНК з метою ідентифікації ідентичних, гомологічних або гетерологічних генів шляхом імунологічного скринінгу (затргоок еї а!., МоїІесціаг Сіопіпд: А І аброгаїгу Мапиаї,

Соїа 5ргіпд Нагбог Іарогаїогу Рге55, Соїд бргіпд Натог, МУ, 1989 одег А!йзибеї! еї аї., 1994, «Сигтепі Ргоїосо!5 іп МоїІесшіаг Віоіоду», Уопп Уміеу 5 5оп5). Зокрема, даний винахід відноситься до антитіл, які вибірково розпізнають поліпептид, що кодований алелем м/р-К, і не розпізнають поліпептиди, що кодовані, в основному, сприйнятливим алелем м/р-5, тобто щонайменше в 2 рази, переважно в 5 разів і ще більш переважно в 10 і більше разів менше, ніж поліпептид, що кодований алелем м'р-Е згідно з винаходом.

Ще одним предметом винаходу є вектори, які включають молекулу нуклеїнової кислоти, що описана тут, або, відповідно, рекомбінантну молекулу ДНК. Вектором може бути плазміда, косміда, фаг або вектор експресії, трансформації, човниковий або клонуючий вектор, може бути дво- або одноланцюжковий, лінійний або круговий, може трансформувати прокаріотичний або еукаріотичний носій або шляхом інтеграції в його геном, або екстрахромосомно. Переважно, щоб молекула нуклеїнової кислоти або молекула ДНК згідно з винаходом у векторі експресії була оперативно зв'язана з однією або декількома регуляторними послідовностями, які роблять можливою транскрипцію та -- що не обов'язково -- експресію в прокаріотичній або еукаріотичній клітині-хазяїні; див., наприклад, затбгоокК еї а!І., МоїІесшаг СіІопіпу: А Гарогайогу

Мапциаї Зга Еа. Сода 5ргіпа Натог І абогаїогу Ргез5, Соїд бргіпд Нагбог, МУ, 2001. Переважно, щоб ці регуляторні послідовності були промоторами або термінаторами, зокрема, початковою точкою ініціації транскрипції, точкою з'єднання рибосом, сигналом обробки РНК, ділянкою завершення транскрипції та/або сигналом поліаденілювання. Наприклад, молекула нуклеїнової кислоти знаходиться під контролем відповідного промотора та/або термінатора. Відповідними промоторами можуть бути промотори, що індуковані конститутивно (напр.: промотор 355 з «вірусу мозаїки цвітної капусти»(СаціШомег тозаїс міги5) (Оаеї еї аїЇ., Маїшге 313 (1985), 810--

Зо 812), найбільше підходящими є промотори з можливістю патогенного індукування (напр.: промотор РЕК! з петрушки (КизПіоп еї а, ЕМВО 3. 15 (1996), 5690-5700). Найбільше підходящими патогенно індукованими промоторами є синтетичні або, відповідно, химерні промотори, які в природі не зустрічаються, складаються з множини елементів, містять мінімальний промотор, а також вище мінімального промотора мають щонайменше один цис- регуляторний елемент, який служить місцем з'єднання для спеціальних транскрипційних факторів. Химерні промотори розроблені відповідно до необхідних вимог і індукуються або припиняються різними факторами. Приклади таких промоторів наводяться в УМО 00/29592,

МО 2007/147395 і ММО 2013/091612. Соответствующим терминатором является, например, пов5- терминатор (ОеріскКег еї аї., у). Мої. Аррі. Сепеї. 1 (1982), 561-573). Зазвичай вектори додатково містять індикаторні/репортерні гени або гени резистентності для виявлення перенесення бажаного вектора або, відповідно, молекули ДНК/молекули нуклеїнової кислоти та для селекції індивідів, які їх містять, оскільки пряме виявлення експресії гена є досить важким. Оскільки описувана у винаході молекула нуклеїнової кислоти сама кодує поліпептид, який разом з вищезгаданими мутаціями являє собою білок, що забезпечує резистентність до ризоманії, немає необхідності створювати інший ген резистентності для експресії в рослинних клітинах, але він переважний для швидкої селекції.

Прикладами індикаторних/репортерних генів є ген люциферази та ген, що кодує зелений флуоресцентний білок (СЕР). Вони також дозволяють вивчати активність і/або регуляцію промотора гена. Прикладами генів резистентності, зокрема, для трансформації рослин, є ген неоміцинфосфотрансферази, ген гігроміцинфосфотрансферази або ген, що кодує фосфінотрицин-ацетилтрансферазу. Однак ці приклади не виключають інші відомі фахівцям індикаторні/репортерні гени або гени резистентності. В переважному варіанті здійснення цим вектором є вектор рослини.

За іншим аспектом даний винахід відноситься до клітин-хазяїв, що включають вектори згідно з винаходом, молекули рекомбінантної ДНК і/або молекули нуклеїнової кислоти. Клітиною- хазяїном у сенсі даного винаходу може бути прокаріотична (наприклад, бактеріальна) або еукаріотична клітина (наприклад, рослинна клітина або дріжджова клітина). Переважно, клітиною-хазяїном є агробактерія, наприклад, Адгобрасіегішт іштеїасіеп5 або Адгобасіегійт гпігодепез або рослинна клітина.

Фахівцю відомі як численні методи, наприклад, кон'югація або електропорація, за допомогою яких він може ввести описувану молекулу нуклеїнової кислоти, молекулу рекомбінантної ДНК іМабо вектор з даного винаходу в агробактерію, так і різні методи, наприклад, метод трансформації (біолістична трансформація, агробактеріальна трансформація), за допомогою яких він може ввести описувану молекулу нуклеїнової кислоти, молекулу ДНК і/або вектор згідно з даним винаходом у рослинну клітину (Затрбгоок еї аї., МоїІесшіаг Сіопіп а: А І арогаїогу Мапиаї

Зга Ед. Соїа 5ргіпу Нагбог І арогаїогу Ргезв, Соїд 5рііпуд Нагбог, МУ, 2001).

Крім того, даний винахід відноситься до трансгенної рослинної клітини, яка включає молекулу нуклеїнової кислоти або молекулу ДНК як трансген або вектор за даним винаходом.

Такою трансгенною рослинною клітиною є, наприклад, рослинна клітина, яка трансформується, переважно стабільно, за допомогою описуваної тут молекули нуклеїнової кислоти, молекули

ДНК або вектора за даним винаходом. В переважному варіанті виконання трансгенної рослинної клітини молекула нуклеїнової кислоти оперативно зв'язана з однією або декількома регуляторними послідовностями, які забезпечують можливість транскрипції і, за необхідності, експресії в рослинній клітині. Тоді загальна структура з молекули нуклеїнової кислоти згідно з винаходом і регуляторної послідовності (регуляторних послідовностей) являє собою трансген.

Такими регуляторними послідовностями є, наприклад, промотор, підсилювач або термінатор.

Фахівцю відомі численні функціональні промотори, підсилювачі та термінатори, які можуть бути використані в рослинах.

Переважно, щоб трансгенна рослинна клітина за даним винаходом, зокрема, клітина рослини роду буряк, демонструвала більш високу резистентність до патогену, зокрема, до

ВМУММ в порівнянні з відповідною нетрансформованою рослинною клітиною (рослинною клітиною без трансгена). Рівень резистентності, наприклад, до ВМУММ, може бути якісно визначений в рослинах роду буряк шляхом визначення балів у рамках бонітування (схеми присудження балів бонітування для рослин роду буряк відомі відповідно до сучасного рівня розвитку технологій, наприклад, для цукрових буряків;див. МеспеїЇКе (1997) Ргобіете іп аег

Кіготапіагезізіеп27йспйипо, Могігаде їТйг РпПаплеп2йспіипо, Кезібїеп27йспішпу Бреї 7исКеїтабреп,

Сезеїїзспай їтйг РіПапгеп2йспіипд е.Мм., 113-123). Більш висока резистентність проявляється в поліпшенні резистентності щонайменше на один бал, щонайменше на два бали, щонайменше

Зо на три або більше балів у рамках бонітування. Крім того, даний винахід також відноситься до способу одержання трансгенної рослинної клітини за даним винаходом, що включає етап введення в рослинну клітину молекули нуклеїнової кислоти, молекули ДНК або вектора за даним винаходом. Наприклад, введення може відбуватися через трансформацію, переважно через стабільну трансформацію. Фахівцю відомі відповідні методи введення, наприклад, біолистична трансформація, агробактеріальна трансформація або електропорація (Затьгоок еї аІ,, МоїІєсшаг Сіопіпд: А Іарогаїогу Мапиа! За Еа. Со ріпа Нагбог І абогаюгу Ргезв, Соїй

Зргіпд Наотг, ММ, 2001).

За іншим аспектом даний винахід відноситься до трансгенної рослини та її частин, що включають описану вище трансгенну рослинну клітину. При цьому частиною може бути клітина, тканина, орган або поєднання декількох клітин, тканин або органів. Поєднанням декількох органів є, наприклад, квітка або насіння. В особливому виконанні даний винахід відноситься до насіння трансгенної рослини, при цьому це насіння включає як трансген описувану тут молекулу нуклеїнової кислоти. Переважно, щоб трансгенна рослина за даним винаходом, зокрема, рослина роду буряк, демонструвала більш високу резистентність до патогену, зокрема, до

ВМУМУМ в порівнянні з відповідною нетрансформованою рослиною (рослиною без трансгена).

Рівень резистентності, наприклад, до ВМУММ, може бути якісно визначений в рослинах роду буряк шляхом визначення балів у рамках бонітування (схеми присудження балів бонітування для рослин роду буряк відомі відповідно до сучасного рівня розвитку технологій, наприклад, для цукрових буряків; МеспеїКе (1997) РгоБіете іп дег Кіготапіагевізіеп27йсйипо, Могігаде Тйг

РПапгеп2астипо, Кевзізіеп22йспішпо беї 2исКеїтабреп, сСезеїїзспай гг Рааплеп2йсптипа е.М., 113-- 123). Більш висока резистентність проявляється в поліпшенні резистентності щонайменше на один бал, щонайменше на два бали, щонайменше на три або більше балів у рамках бонітування. Крім того, винахід передбачає спосіб одержання трансгенної рослини, який включає етап введення молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом або вектора за даним винаходом у рослинну клітину і, за необхідності, селекцію трансгенної рослинної клітини.

Крім того, такий спосіб одержання трансгенної рослини відрізняється наступним етапом, що включає регенерацію трансгенної рослини з трансгенної рослинної клітини, яка створена на першому етапі. Методи регенерації відомі фахівцю з сучасного рівня розвитку технологій.

Згідно з іншим аспектом даний винахід також відноситься до способу забезпечення або бо підвищення резистентності до патогену, зокрема, до ВМУММ, рослини, переважно рослини роду буряк, який включає етап трансформації рослинної клітини з молекулою нуклеїнової кислоти за даним винаходом або вектором за даним винаходом. Як альтернатива, як було описано вище, з сприятливого до ризоманії генотипу за допомогою випадкової або спрямованої мутагенізації наявного ендогенного гена м/р-5 може бути одержаний резистентний до ризоманії генотип.

Наприклад, ген мб може бути модифікований шляхом мутації гена за допомогою ТА Е- нуклеаз (ТАГЕМ5) або нуклеаз цинкових пальців (7ЕМ5), а також за допомогою систем

СКІБРЕ/Са5, що описані, серед іншого, на прикладах з УМО 2014/144155 АЇ (Епдіпеегіпд ріапі депоте5 изіпд СКІЗРК/Са5 5узіет5) і у виданні ОзаКаре 5 ОзаКаре, Ріапі Сеї! Рпузіої, 56 (2015), 389-400. Цього результату також можна домогтися за допомогою методу, що зветься

ТІШІМа (Тагдеїей Іпдисес / оса! І евіопо іп Сепотез - пошук індукованих локальних порушень в геномах), при цьому, як описано, наприклад, у німецькій патентній заявці ОЕ 10 2013 101 617, в гені дикого типу викликаються точкові мутації, а потім проводиться селекція рослин, що мають відповідну мутацією, тобто таку, що забезпечує резистентність, як, наприклад, у випадку з ячменем, стійким до вірусної мозаїки; див. ОЕ 10 2013 101 617 на сторінках 4, 8 і 12 в розділах 00141, 100261 і (0038). Метод ТІ ІМО також докладно описаний в публікації Хенікоффа та ін. (Непікої еї а!., Ріапі Рпузіої. 135, 2004, 630-636).

Переважно, щоб цей спосіб призводив до підвищення резистентності щонайменше на один бал, найбільше переважно до підвищення резистентності щонайменше на два, три або більше балів бонітування. Схеми присудження балів бонітування для рослин роду буряк відомі відповідно до сучасного рівня розвитку технологій, наприклад, для цукрових буряків: МеспеїКе (1997). Після мутагенізації рослинних клітин і подальшої регенерації рослин з мутагенізованних рослинних клітин або мутагенізації рослин можна ідентифікувати рослини, які в ендогенній молекулі нуклеїнової кислоти, переважно з нуклеотидною послідовністю, що має або включає послідовність згідно з 5ЕО ІЮ МО: 1, або такою, що гібридизується з комплементарною 5ЕО І

МО: 1 послідовністю в жорстких умовах, мають одну або декілька описаних вище мутацій.

За іншим аспектом даний винахід відноситься до резистентної до ВМУММ рослини роду буряк або до її частини, в якій молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом присутня ендогенно або в якій одна або декілька із зазначених вище мутацій були введені в ендогенну молекулу нуклеїнової кислоти, яка корелює в іншому випадку із сприйнятливим до ризоманії

Зо генотипом, при цьому ця рослина або її частина не відносяться до роду Веїа миїЇдагі5 5,иБ5р. тагійта. В одному з варіантів здійснення винаходу описуваною тут рослиною є гібридна рослина або диплоїдна рослина. В додатковому варіанті здійснення рослини згідно з винаходом молекула нуклеїнової кислоти або одна або декілька описаних вище мутацій є гетерозиготними або гомозиготними. Наприклад, у випадку з гібридною рослиною молекула нуклеїнової кислоти або одна або декілька мутацій можуть також бути гемізиготними.

В іншому варіанті здійснення рослина за даним винаходом додатково має трансгенну або ендогенну другу молекулу нуклеїнової кислоти в інший або додатковій позиції в геномі, що кодує поліпептид, здатний забезпечити резистентність до ВМУММ в даній рослині, де поліпептид експресується в результаті транскрипції другої молекули нуклеїнової кислоти. Інша або додаткова позиція в геномі може означати, що друга молекула нуклеотиду знаходиться за межами ділянки хромосоми Ш від 53е4516505 до 53е5918501. Наприклад, ген К2-3, що описаний у міжнародній заявці УМО 2014/202044 АТ, може бути введений в рослину м/р-К даної рослини шляхом схрещування або трансформації, якщо його ще немає у вихідному генотипі.

Тому в найбільше переважному варіанті здійснення даного винаходу створюються рослини м/р-

В/А2-3-К, які переважно є гомозиготними для одного та, зокрема, переважно для двох генів резистентності. В цьому контексті передбачається, що завдяки наявності інформації про послідовність гена м/р-К в даній заявці та, наприклад, інформації про послідовність гена К2-3, яка описана у вищезгаданому документі УМО 2014/202044 Ат, такі рослини з подвійною резистентністю можуть бути одержані, раніше за все, тільки шляхом схрещування та селекції з використанням маркерних методів, так що не потрібно ніяких процедур генної інженерії.

Відповідно до цього даний винахід також відноситься до способу ідентифікації рослини роду буряк, яка має резистентність до патогену ВМУММ, який відрізняється тим, що даний спосіб включає наступний етап () підтвердження наявності та/або експресії молекули нуклеїнової кислоти, що забезпечує резистентність до ризоманії згідно з винаходом, в рослині або, відповідно, в її зразку; та/або (ї) підтвердження щонайменше одного маркерного локусу в нуклеотидній послідовності молекули нуклеїнової кислоти, що забезпечує резистентність до ризоманії згідно з винаходом, або в безпосередньому оточенні, переважно в хромосомі ПІ; і/або (ії) підтвердження щонайменше двох маркерних локусів у хромосомі І рослини, при цьому бо щонайменше один маркерний локус знаходиться на ділянці (або в її межах) хромосоми від

53е4516505 до молекули нуклеїнової кислоти, що забезпечує резистентність до ризоманії згідно з винаходом, і щонайменше, одного маркерного локусу на ділянці (або в її межах) хромосоми від згаданої молекули нуклеїнової кислоти до 53е5918501; і за необхідності, (ім) селекцію резистентної до ВМУММ рослини, при цьому даний спосіб переважно додатково відрізняється тим, що щонайменше один маркерний локус включає одну або декілька описаних вище мутацій. В додатковому варіанті здійснення спосіб також включає відповідне підтвердження ще одного генотипу резистентності, зокрема, переважно гена К2-3, як описано в УМО 2014/202044 А1.

Перевагою даного способу є підтвердження щонайменше одного поліморфізму, що призводить до амінокислотного заміщення в порівнянні з амінокислотною послідовністю, що показана на фіг. 18 (ЗЕО ІЮ МО: 2), переважно в одному з виділених місць, що зображені на фіг. 10 (5ЕБО ІЮ МО: 4) амінокислотних послідовностей (див. також легенду до фіг. 1) з поліморфізмами, що виділені на фіг. 15 (5ЕБО І МО: 3), за молекулярними маркерами, які розпізнають поліморфізми, зокрема, діагностичні поліморфізми. Переважно, щоб це підтвердження відбувалося з використанням щонайменше одного молекулярного маркера на кожний поліморфізм, зокрема, на кожний діагностичний поліморфізм. Фахівцю відомо, які маркерні методи слід застосовувати для підтвердження відповідного поліморфізму і як конструювати для цих цілей молекулярні маркери. Крім того, даний винахід відноситься до молекулярних маркерів, що описують або, відповідно, виявляють поліморфізм відповідно до фіг. 1С або 0, а також до застосування молекулярного маркера для виявлення поліморфізму відповідно до фіг. 1С і/або 0. Крім цього, вищезазначені методи ідентифікації також являють собою методи селекції рослини, резистентної до ВМУММУ. Цей метод селекції включає заключний етап селекції резистентної рослини.

Додатково ділянки геномної послідовності ДНК, що примикають вище відносно гена м/р-К (як

ЗБЕО ІЮО МО: 3) і нижче відносно гена м/б-К, які локалізовані в безпосередньому оточенні, переважно в хромосомі ПІ, і тому тісно зв'язані з геном м/б-К, можуть бути використані як області

ДНК для розробки діагностичних маркерів для м/б-К. Тому даний винахід також відноситься до методу селекції рослини, резистентної до ВМУММ. Даний метод селекції включає використання молекулярного маркера на послідовності ДНК відповідно до 5ЕО ІЮ МО: З і/або на послідовності

Зо ДНК, яка локалізована в безпосередньому оточенні, переважно в хромосомі Ії. Переважно, щоб локалізовані в безпосередньому оточенні маркери згідно з описаними в прикладах маркерами 53е4516505 і 53е5918501 були розташовані в діапазоні 0,11 СМ, що приблизно відповідає фізичній довжині в 100 000 пар основ гена м/р-К і показує порівняне діагностичне значення (33), як (а) 53е4516505 суї/ ДЗ - 0,89; по лівій стороні та (б) 53е5918501 аде / ДЗ - 0,91; по правій стороні. Метод селекції додатково включає, зазвичай, заключний етап селекції резистентної рослини. Фахівцю відомо, як розробити та використовувати маркери на основі розкритої інформації про послідовності.

Відповідно, даний винахід відноситься також до рослини, переважно, зокрема, до резистентної до ВМУММ рослини або до її частини, яка була ідентифікована описаним вище способом і, за необхідності, піддана селекції. Зокрема, даний винахід відноситься до популяції рослин, що включає рослини, які можуть бути одержані одним з описаних вище способів згідно з винаходом і які переважно стійкі до бородатості буряка (ризоманії) або, відповідно, до ВМУММ, і які відрізняються наявністю молекули нуклеїнової кислоти згідно з винаходом. Переважно, щоб популяція складалася з не менше 10, переважно з 50, переважно з 100, найбільше переважно з 500, а, зокрема, в сільському господарстві -- з не менше ніж 1000 рослин. Переважно, щоб частка рослин в популяції, які не мають молекули нуклеїнової кислоти згідно з винаходом і/або схильні до ризоманії, становила менше 2595, переважно менше 2095, переважно менше 1595, ще більш переважно менше 1095, і, зокрема, менше 5 95, 495, 395, 295, 195 або 0,595, якщо такі взагалі є.

Даний винахід може також забезпечити наступні переваги для вирощування та розробки нових резистентних сімейств рослин роду буряк: інформація про послідовність, а також ідентифіковані поліморфізми, які дозволяють розрізняти резистентні алелі м/р-К і сприйнятливі алелі мр-5 розкритого гена, роблять можливою розробку маркера безпосередньо в гені, що значно спрощує роботу селекціонера, зокрема, в плані розробки оптимізованих елітних ліній без ефекту «зчепленого вантажу» (ГіпКкаде Огад). Крім того, знання структури послідовностей може бути використано для ідентифікації нових генів резистентності, зокрема, до ризоманії, які, наприклад, частково гомологічні або ортологічні.

Розкрите тут застосування алеля гена резистентності в цис- або транс-генетичних підходах відкриває можливість одержання нових стійких сортів роду буряк, які мають більш високу 60 резистентність за рахунок ефекту дози або дозволяють уникнути порушення резистентності шляхом пірамідування розкритого гена з іншими генами стійкості, зокрема, з геном К2-3, й оптимізувати прояв резистентності. Крім того, можливі модифікації гена методом ТІ ІМО або цілеспрямована геномна інженерія для розробки нових алелей резистентності.

Даний винахід також відноситься до застосування ідентифікованого резистентного алеля гена м/б-К в генетичній або молекулярній піраміді разом з іншими генетичними елементами, здатними забезпечити рослині сприятливі з точки зору агрономії характеристики. Це може значно збільшити економічну цінність культивованих рослин, наприклад, за рахунок підвищення врожайності або відкриття нових площ для вирощування рослин, які раніше були недоступні через біотичні фактори, такі як сильний патогенний тиск або через абіотичні фактори, такі як посуха. Зокрема, даний винахід відноситься до застосування ідентифікованого резистентного алеля гена мб-К в методах контролю ураження патогеном вірусу некротичного пожовтіння жилок (Вееї Месгоїіїс ХеПом/ Меїп Міги5 - ВМУМУМ) в сільському господарстві або садівництві при вирощуванні рослин роду буряк, наприклад, в області ідентифікації та селекції рослин роду буряк за допомогою одного з описаних вище методів вирощування відібраних таким чином рослин або їх потомства.

Вигідною з точки зору агрономії властивістю є, наприклад, толерантність до гербіцидів, наприклад, таких як гліфосат, глюфосинат або інгібіторів А! 5. З сучасних технологій фахівцю відомі багато інших гербіцидів і їх застосовність. Він може ознайомитися з сучасними технологіями для отримання знань про те, які генетичні елементи і яким чином необхідно використовувати для забезпечення належної толерантності рослин. Іншим прикладом вигідної з точки зору агрономії властивості є додаткова стійкість до патогенів, при цьому патогенами можуть бути комахи, віруси, нематоди, бактерії або грибки. Поєднання різних рівнів резистентності/толерантності до патогенів може, наприклад, забезпечити широкий патогенний захист рослини, оскільки генетичні елементи можуть надавати взаємодоповнюючий вплив один на одного. Фахівцю відомі, наприклад, багато генів резистентності як генетичні елементи. Ще одним прикладом вигідної з точки зору агрономії властивості є толерантність до знижених температур або до заморозків. Рослини з цією властивістю можуть бути посіяні раніше або можуть залишатися в полі довше, наприклад, навіть у період заморозків, що може призвести, наприклад, до підвищення врожайності. | тут фахівець також може ознайомитися з сучасними технологіями, щоб знайти підходящі генетичні елементи. Іншими прикладами вигідних з точки зору агрономії властивостей є ефективне використання води, азоту, а також врожайність.

Генетичні елементи, які можуть бути використані для одержання таких властивостей, відомі з існуючих технологій.

Фахівцю також відома множина модифікацій для патогенного захисту. Разом із докладно описаними сімействами К-генів можна було б вигідно використовувати підхід Амг/К, комплементацію гена Амг (МО 2013/127379), автоактивацію В-гена (М/О 2006/128444), підхід

НІС5З (пові іпдисей депе 5іІепсіпу) (наприклад, УУО 2013/050024) або підхід МІС5 (міги5 іпдисейа депе зіїепсіпа). Зокрема, значущим для даного винаходу міг би бути метод автоактивації К-гена.

Для цього необхідно створити нуклеїнову кислоту, що кодує автоактивований білок резистентності для одержання стійкості рослин до патогенів. В цьому випадку нуклеїнова кислота має лише обмежену частину гена резистентності МВ5-ЇІ КК, наприклад, гена м/р-К, який продовжується від кінця 5' області кодування гена резистентності МВ5-І ЕК вгору до початку домену МВ5 гена резистентності МВ5-ЇІ КК, при цьому ген резистентності МВ5-І КК не є геном резистентності ТІК-МВ5-І ВВ.

Крім того, винахід також відноситься до застосування резистентного алеля гена м'б-К, що ідентифікований описаним вище способом, для комбінування з однією з описаних вище модифікацій або з описаним вище генетичним елементом, який може забезпечити для рослини одну або декілька вигідних з точки зору агрономії властивостей.

Крім описаної тут рослини даний винахід також відноситься до насіння або до потомства, органів, частин рослин, тканин або клітин цих рослин при одержанні продукції, що зазвичай, виготовляються з відновлюваної сировини, наприклад, продукти харчування та корми для тварин, переважно цукор або сироп (меласа), при цьому меласа також використовується в промисловості, наприклад, при виробництві спиртів або як поживне середовище для одержання біотехнологічних виробів, при виготовленні матеріалів або речовин для хімічної промисловості, наприклад, хімічні продукти тонкого органічного синтезу, медикаменти або, відповідно, їх напівфабрикати, діагностичні засоби, косметика, біоетанол або біогаз. Приклад використання цукрових буряків як біогенної сировини в біогазових установках описаний в заявці ОЕ 10 2012 022 178 АТ, див., наприклад, абзац 10.

Наведені нижче приклади дають пояснення до винаходу, не обмежуючи при цьому предмет бо винаходу. Якщо не зазначено інше, використовувалися стандартні молекулярно-біологічні методи, див., наприклад (Затьгоок еї аї., Моїесціаг Сіопіпуд: А Габрогаїгу Мапиаї! Зга Ега. Соїа

Зргіпуд Наог І арогаїогу Рге55, Соїд брііпа Нагрог, ММ, 2001), Епіївсй еї а!., Соїй бргіпд Нагбог

І арогаїогу Ргезв: 1989; Маує" вії аї., Іттипоспетіса! Меїнодз Іп СеїЇ Апа Моїесшіаг Віоіоду, еав.,

Асадетіс Ргевзв, І опдоп, 1987) і МУєїг еї аі., Напароок ОЇ Ехрегітепіа! Іттипоїоду, Моїштез І-ІМ,

ВіасКмуеї), єд5., 1986).

ПРИКЛАДИ

Приклад 1:Ідентифікація гена (М/В1), що забезпечує резистентність до ризоманії (бородатість буряка, МВ), і відповідних сприйнятливих алелів

В популяції цукрових буряків (Веїа мпїдагів І.) з інтрогресією з приросту Веїа муцідагів зибер. тагіййта за допомогою маркерів з хорошим діагностичним значенням (ДЗ) в цьому прирості вдалося підтвердити ген, що забезпечує резистентність до бородатості буряка (ризоманії) або, відповідно, сегмент генома, (а) 53е4516505 суї / ДЗ - 0,89; по лівій стороні та (б) 53Зе5918501 аде / ДЗ - 0,91; по правій стороні. Однак обидва ці маркери не є в повній мірі діагностичними в зв'язку з виникненням нульових алелів у різних родоводів. Генетична довжина області геному між 53е4516505 і 53е5918501 становить 0,11 СМ, що приблизно відповідає фізичній довжині в 100 000 пар основ. Ця область послідовності є високоповторюваною та демонструє сильні структурні варіації в різних генотипах; тому дуже важко розробити інші діагностичні маркери. Через те, що генетична структура сегмента геному, що забезпечує резистентність до ризоманії, невідома, можна лише в обмеженому ступеню знизити потенційний «негативний зчеплений вантаж» (І іпкаде Огад) навколо причинного гена.

Перші експерименти з більш точної локалізації значущого сегмента геному та, за необхідності, з пошуку гена, що забезпечує резистентність, яка розглядається, або, відповідно, генного локусу, що відповідає за сприйнятливість рослин до ризоманії, завершилися невдачею, серед іншого, через високі показники повторюваності цільової області та сильну структурну варіативність (нульові алелі) в багатьох генотипах і відсутності інших маркерів з високим діагностичним значенням. Крім того, аналіз експресії генів-кандидатів у досліджуваній області спочатку не дав ніяких доказів, тобто специфічної відповіді на інфекцію ризоманії. В підсумку фенотипування рослин також було ускладнено, оскільки прояв резистентності не завжди був однозначним з невідомих причин, так що спочатку передбачалася наявність мультигенної

Зо резистентності та/або епігенетичних ефектів, які можна було виключити тільки шляхом збільшення числа вивчених рослин з 90-180 нащадками та із застосуванням інтенсивних статистичних методів (І-тестування, аналіз потужності).

В ході подальших експериментів і аналізів з використанням «картографічного клонування» (Мар Вазхей Сіопіпду), яке включало етапи тонкого генетичного картування, фізичного картування, аналіз послідовностей УНСО (весь геном), створення дуже великої популяції з більш ніж 2000 нащадків Е2, скринінг рекомбінантів, розробку маркерів у досліджуваній області, порівняльне секвенування ВАС в резистентних (КК) і сприйнятливих (55) генотипах, біоінформаційний аналіз, прогнозування білків і порівняння білків, вдалося встановити, що ген

МвВ-АВС (МВ5-І КК) відповідає за спостережувану резистентність до ризоманії. Цей ген МВ5-

ЇКК був ідентифікований в результаті інтенсивного тонкого картування, при цьому через складність послідовності збирання послідовностей ЕК і 55 виявилося непростим завданням, але тільки завдяки аналізу потомства 4 найближчих рекомбінантних рослин (2 прямих рекомбінанти зліва та 2 прямих рекомбінанти справа від гена) вдалося точно ідентифікувати ген МВ5-Ї АВ.

Послідовність гена МВ5-І КК резистентного генотипу відображена в ЗЕО ІЮО МО: 3, а відповідний ген або генотип був названий «м/б-К» (від поєднання «УМиггеїрапідкей-Кевівїеп/» - резистентність до ризоманії). В гені МВ5-ЇКК були виявлені в цілому 17 «несинонімічних» поліморфізмів одиночних нуклеотидів (ЗМР5) (поліморфізмів, що ведуть до амінокислотного заміщення в білку). Базуючись на даних послідовності, що складається з сприйнятливих і стійких генотипів, 5 амінокислотних заміщень виявилися повністю діагностичними:

КЗ307О, «С» замість «А» в геномній послідовності в позиції 919 в резистентному генотипі, що заміщує кодований лізин (К) в позиції 307 сприйнятливого гена глутаміном (0),

О437В, «С» замість «А» в геномній послідовності в позиції 1310 в резистентному генотипі, що заміщує кодований глутамін (С) в позиції 437 сприйнятливого гена аргініном (К),

В56бН, «А» замість «С» в геномній послідовності в позиції 1697 в резистентному генотипі, що заміщує кодований аргінін (К) в позиції 566 сприйнятливого гена гістидином (Н),

О7З1К, «А» замість «С» в геномній послідовності в позиції 2191 в резистентному генотипі, що заміщує кодований глутамін (С) в позиції 731 сприйнятливого гена лізином (К),

Р8315, «Т» замість «С» в геномній послідовності в позиції 2491 в резистентному генотипі, що заміщує кодований пролін (Р) в позиції 831 сприйнятливого гена серином (5); див. фіг. 1.

Завдяки точкам рекомбінації одне з двох або обидва амінокислотних заміщення КЗ3070) або 0437К можуть розглядатися як причина забезпечення резистентності. Відповідні послідовності генів або генотипів, що корелюють з сприйнятливим до ризоманії фенотипом, були названі «мр- 5» (від поєднання «Ууиг7еїрапідкей зепо5йім» - сприйнятливі до ризоманії).

Приклад 2:Валідація гена м/р-К із застосуванням підходу КМАЇ

На додаток до описаної вище верифікації гена за допомогою вузьких рекомбінантів як ще один доказ можна продемонструвати ефект резистентності гена з використанням інтерференції

РНК; див., наприклад, верифікацію гена К2-3, описану в прикладах (Ехатріе5) міжнародної заявки УМО 2014/202044 Аї1 або верифікацію гена мії, описану в прикладах (Ехатріев5) міжнародної заявки МО 2011/032537 А1. Для цього резистентний стандартний генотип цукрових буряків трансформується за допомогою конструкції ДНК, що кодує дволанцюжкову РНК- шпильку. Ця дволанцюжкова РНК здатна пост-транскрипційно викликати глушіння генів, яке зменшило б або усунуло вплив алеля гена м/р-К, в результаті чого генотип цукрових буряків, що раніше проявляв резистентність, повинний був стати сприйнятливим до бородатості буряка (ризоманії).

Для одержання підходящої конструкції ДНК, переважно з області кодуючої послідовності, вибирають певну область цільової послідовності резистентного алеля гена м/р-К на ділянці довжиною, наприклад, 400-500 пар основ, які є специфічними для резистентного алеля гена м/р-

Е, піддають ампліфікації з використанням ПЛР і клонують як у напрямку сприйнятливості, такі в напрямку несприйнятливості, у вектор раЕМ, який підходить для синтезу структур шпильок (див. фіг. 6 міжнародної заявки УМО 2014/202044 АТ). Цей вектор включає подвійний промотор СаММУ 355, місце множинного клонування, інтрон гена АїААРб, що кодує в Агабідорбзів5 (Паїїапа амінокислотну пермазу, додаткове місце множинного клонування, а також поз5-термінатор.

Трансформація цукрових буряків з використанням готового вектора здійснюється за протоколом

Іпавзеу 4 СзаїПоїв5, У. Ехр. Вої. 41 (1990), 529-536 із застосуванням антибіотика Канаміцина як селективного маркера. Після декількох етапів селекції успішність трансформації трансгенних пагонів перевіряють за допомогою ПЛР шляхом підтвердження присутності гена прі, інтрона

ААРб і обох граничних послідовностей І1-ДНК (18/КВ), а також відсутності міг. Пагони з позитивними результатами розмножують клонуванням іп-міго до, відповідно, 30 пагонів,

Зо вкорінюють і розміщують у грунті в теплиці. Приблизно через 2 тижні рослини трансгенних цукрових буряків пікірують в заражений ризоманією грунт, де їх культивують протягом 8-10 тижнів. Для контролю використовують не трансформовані рослини з таким же фоном резистентної генетичної стандартної трансформації, що культивуються в тих же умовах. Для підтвердження прояву ризоманії корені цукрових буряків збирають і визначають кількість заражених ВМУММ одиниць в ході тесту ЕГІЗА, при цьому низьке значення ЕГІЗА вказує на резистентність, а високе значення - на сприйнятливість (МеспеїКе 1997, див. вище; Сіагк 5

Адатв, У. Сеп. Мігої. 34 (1977), 475-483). Середнє значення ЕГІЗА 3-4 для трансформованих цукрових буряків очікувано значно вище значення ЕЇГІЗБА для як і раніше резистентних контрольних одиниць з середнім значенням 1-2 і порівняно зі стандартом сприйнятливості.

Відповідно до цього за результатами тесту ЕГІБА можна продемонструвати, що специфічне глушіння генів резистентного алеля м/р-К на фоні трансформації робить раніше стійку рослину сприйнятливою до ВМУММ. Відповідно, ген м/р-К згідно з даним винаходом можна однозначно верифікувати як ген резистентності.

Валідація функції гена також може бути здійснена шляхом комплементації чутливої до ризоманії рослини, зокрема, цукрових буряків з геном м/б-К, згідно з винаходом, наприклад, шляхом трансформації вектора експресії рослин, який містить молекулу нуклеїнової кислоти з нуклеотидною послідовністю 5ЕО І МО: З або, відповідно, з еквівалентною нуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид з амінокислотною послідовністю З5ЕО ІО МО: 4 в сприйнятливий генотип, у кожному випадку з контролем конститутивного промотора. Для трансформації, в принципі, можна використовувати описаний вище вектор рАЕМ і згадані технології або ті з них, які були наведені в загальному описі.

Заключення

Створення гена мр-К згідно з винаходом дозволяє домогтися більш ефективного вирощування рослин, стійких до бородатості буряка (ризоманії), або, відповідно розробляти нові резистентні лінії. Ген м/б-К і описані вище варіанти здійснення даного винаходу розкривають інші можливості застосування, наприклад, використання резистентного алеля гена в цис- або транс-генетичних підходах з метою розробки нових резистентних сортів, «пірамідування генів» - підвищення резистентності за рахунок ефекту дози, модифікація гена з використанням методу

ТІШІМО або цілеспрямована геномна інженерія/редагування гена для розробки нових алелів резистентності, а також визначення взаємодій між м/б-К й іншими генами резистентності до ризоманії з метою виведення сортів з оптимальним проявом резистентності.

Claims (16)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Молекула нуклеїнової кислоти, здатна забезпечити стійкість до ВМУМУ, яка кодує поліпептид, здатний забезпечити стійкість до ВМУУМ рослини роду Веїа ушідагі5, в якому експресується цей поліпептид, яка відрізняється тим, що вона включає послідовність нуклеотидів, вибрану з: (а) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид з амінокислотною послідовністю за 5ЕО ІЮ МО: 2 або поліпептид з амінокислотною послідовністю, ідентичною 5ЕО ІЮО МО: 2 щонайменше на 90 90; кодований поліпептид включає (ї) глутамін (0) в позиції, яка відповідає позиції 307 в контрольній амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2, і/або (ії) аргінін (К) в позиції, яка відповідає позиції 437 в контрольній амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО: 2, або (Б) нуклеотидної послідовності, що містить послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 1, або такої, що гібридизується з додатковою послідовністю, з утворенням 5ЕО ІЮ МО: 1 в жорстких умовах, в яких в результаті однієї або декількох мутацій відбувається щонайменше одне нуклеотидне заміщення, що приводить до амінокислотного заміщення, при цьому в позиціях 919-921 в контрольній послідовності нуклеотидів зЗЕО ІЮ МО: 1 і/або в позиціях 1309-1311 в контрольній послідовності нуклеотидів 5ЕО ІО МО: 1 відбулося заміщення одного або декількох нуклеотидів.

2. Молекула нуклеїнової кислоти, здатна забезпечити стійкість до ВМУММ, за п. 1, яка відрізняється тим, що кодований поліпептид додатково включає (ї) в позиції, яка відповідає позиції 566 в контрольній амінокислотній послідовності зЕО ІЮО МО: 2, амінокислоту, відмінну від аргініну (К), і/або (її) в позиції, яка відповідає позиції 731 в контрольній амінокислотній послідовності «ЕО ІЮ МО: 2, амінокислоту, відмінну від глутаміну (0), і/або (іїї) в позиції, яка відповідає позиції 831 в контрольній амінокислотній послідовності зЕО ІЮО МО: 2, амінокислоту, відмінну від проліну (Р).

3. Молекула нуклеїнової кислоти, здатна забезпечити стійкість до ВМУММ, за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що кодований поліпептид (ії) включає гістидин (Н) в позиції, яка відповідає позиції 566 в контрольній амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2, і/або (ім) лізин (К) в позиції, яка відповідає позиції 731 в контрольній амінокислотній послідовності зЕО ІЮО МО: 2, мМабо (м) серин (5) в позиції, яка відповідає позиції 831 в контрольній амінокислотній послідовності ФЕО ІЮ МО: 2.

4. Молекула нуклеїнової кислоти, здатна забезпечити стійкість до ВМУММ, за п. 3, яка відрізняється тим, що вона включає в місцях, які відповідають місцям в контрольній амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1, одне або декілька з перерахованих нижче нуклеотидних заміщень: (а) С замість А в позиції 919; (р) о замість А в позиції 1310; (с) А замість С в позиції 1697; (8) А замість С в позиції 2191; і/або (є) Т замість С в позиції 2491.

5. Молекула нуклеїнової кислоти, здатна забезпечити стійкість до ВМУМУ, за будь-яким з пп. 1- 4, яка відрізняється тим, що вона кодує поліпептид з амінокислотною послідовністю, згідно з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 4, і/або містить кодуючу послідовність ДНК, згідно з послідовністю ЗЕО ПО МО: 3.

6. Вектор, що включає молекулу нуклеїнової кислоти, яка здатна забезпечити стійкість до ВМУУММ, за будь-яким з пп. 1-5.

7. Трансгенна клітина рослини, переважно рослини роду буряк, що включає як трансген молекулу нуклеїнової кислоти, здатну забезпечити стійкість до ВМУМУМ, за будь-яким з пп. 1-5.

8. Трансгенна рослина, переважно рослина роду буряк, або її частина, що включає рослинну клітину за п. 7.

9. Резистентна до ВМУУМ рослина роду буряк або її частина, яка ендогенно містить молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-5, при цьому рослина належить до Веїа мушідагів 55р. уцідагів маг. уцідагіє (мангольд), Веїа уш/дагіє 55р. миїдагів маг. сопайнма (червоний/столовий буряк), Веїа миїдагів 55р. миЇдагів маг. стазза/авІба (кормовий буряк).

10. Резистентна до ВМУУМ рослина роду буряк або її частина, в якій одна або декілька мутацій, зазначених в одному з пп. 1-4, вносяться в ендогенну молекулу нуклеїнової кислоти з нуклеотидною послідовністю, що включає послідовність, згідно з 5ХЕО ІЮ МО: 1, або такою, що гібридизується з додатковою послідовністю, з утворенням 5ЕО ІЮ МО: 1 в жорстких умовах, при бо цьому рослина або її частина не належить до підвиду Веїа ушдагів зиб5р. тапіта.

11. Рослина за пп. 8-10, яка відрізняється тим, що вона являє собою гібридну рослину або диплоїдну рослину та/або містить молекули нуклеїнової кислоти або однієї або декількох гетерозиготних або гомозиготних мутацій.

12. Насіння рослини за будь-яким з пп. 8-11, яке трансгенно або ендогенно містить одну або декілька молекул нуклеїнової кислоти з пп. 1-5 або вектор за п. 6.

13. Спосіб виведення резистентної до ВМУМУМ рослини, що включає наступні етапи: (а) мутагенізацію клітин рослин з наступною регенерацією рослин з мутагенізованих рослинних клітин або мутагенізацію рослин, (Б) ідентифікацію рослини з (а) такою, що містить в ендогенній молекулі нуклеїнової кислоти нуклеотидну послідовність, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО: 1, або такою, що гібридизується з додатковою послідовністю з утворенням 5ЕО ІЮ МО: 1 в жорстких умовах, одну або декілька мутацій, зазначених в п. 1.

14. Спосіб ідентифікації рослини роду буряк, яка має резистентність до патогену ВМУММ, що включає: () підтвердження наявності та/або експресії молекули нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1- 5 в рослині або, відповідно, в її зразку; та/або (і) підтвердження наявності та/або експресії молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, здатний надавати стійкість до патогену, в якому експресується поліпептид, який відрізняється тим, що молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, яка містить лейцин-багатий домен (ЇїЖКК) відповідно до амінокислотних позицій 558-594 послідовності 5600 ІЮ МО: 4, амінокислотних позицій 542-594 послідовності 560 ІЮ МО: 4, ї щонайменше один домен АдА АТФаз відповідно до амінокислотних позицій 177-289 послідовності ЗЕО ІЮО МО: 4 або амінокислотних позицій 156-263 послідовності ЗЕО ІЮО МО: 4, та/або (ії) підтвердження щонайменше одного маркерного локусу в нуклеотидній послідовності молекули нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-5 або в безпосередньому оточенні, в хромосомі Ії, при цьому щонайменше один маркерний локус містить одну або декілька мутацій, зазначених в пп. 1-4, і/або (м) підтвердження щонайменше двох маркерних локусів у хромосомі ІШ рослини, при цьому щонайменше один маркерний локус знаходиться на ділянці, або в її межах, хромосоми від 53е4516505 до молекули нуклеїнової кислоти, згідно з будь-яким з пп. 1-5, і щонайменше один маркерний локус знаходиться на ділянці, або в її межах, хромосоми від молекули нуклеїнової кислоти, згідно з будь-яким з пп. 1-4, до 53е5918501; і, (м) селекцію резистентної до ВМУМУМ рослини.

15. Популяція рослин, що включають рослини за будь-яким з пп. 9-11, або рослин, що ідентифіковані і піддані селекції за способом за п. 14.

16. Спосіб контролю ураження вірусом некротичного пожовтіння жилок буряка (Веєеї Месгоїіс УеПйом Меїп Мігив - ВМУМУМ) рослин роду буряк у сільському господарстві або садівництві, що включає: І) ідентифікацію та селекцію рослин роду буряк за способом за п. 14, їі І) вирощування рослин з І) або їх потомства.

пато сек АКТІВ тТІд ВА ясел ТтТААВТОАТТАЗТОАТ ВАЗІ ТААВТОЬ плати г гад пед вттеттос асвАдсти сво ал Бали шт Тов лєтя встаєте зе пути халата ші свасвдес дя зт ; Опт т ОТО АІВОІЇ ати є даетстивОВлеОст тоААСАДАТТАТЯ о детеКтто вто втватьсьсття палІвоем дово тВ ЕВ тотІАТУЄ ПАХ Тік АВ ТОВВО сАтетнасововстя остова дтТОЗшАВОСЬ АС ТЕТЕдТІМІвОВ Ім стевстетотетя птостстостсв я ВЕ тТдАЛТААУТТИ опти го пет вп тру с сдестттсвнют У З лес ВВ й доб ит я спать спВАОМА ТОВ піс АВаДеРОНУ стул дЛлтит о дввалвнноя Вас хасАвстОстАСТАвААВЕ дл влАВ стався плит, сх хАТААС Зк жовт со Я ді ТТ те тах зо АС ЕТОАИТ я ЛЕ СААВОТІ волі тТтААТА ТЯ ттспоАно тт Іде ЕТ етвастесвя з сяааясюяс іх дО тА о СКЛЕТАВТААСЯ росттвасьАн ше сто БлВНАТОТ ЧІТ АТ діАлт т-е попи ІА АТАСЕТІТО таж ТАСТТІТААТВЗ пиві тт ОСТІ видпотесадтлАтТ щ зОовАСаАВТАТО отоАтотВаЗАто Не пло стАВлАТТИ пттАтТпААТОАВОЇ сететтоете повАвтитМ тиша РАІ ТЕ ет дет я ВОСвсАссАх халат тет т ПЕТ ТЕ, пт СА ТІНИ: інша ттут ааситовоитАт вестнеоте Слоіхиому ПТ ТАТА твгпдІ АВТ ВеНТГЕ я двстототстт ТАТА ТТАТТТ доле втді Авт я ТА САТАНсЯ САС ПАСАСТААТ талі ттвслецв в сапддалттсвтся росте сатенсяті ЕстишАлЛТТЕ тосгАспдсоААдИТ ІАОСКУБЛЕВИ ВТОМИ АС стат А псвскатесвооі вовототос ВІВАТ пвптоАттссАоААТ ІЕЕ шТОД АВ й оотАваАСЬАТЬС полилетвтАтТАТЯ сив оо, ХО Ето АХ ІАЛІАТАНВЕ ОИтТІВваАТВТАТОСТ ЕТО АТОСССВМИЇ кто ссвте 7 пс пАлОптдО Дт о тнсвтоветтвтое ст вв з-за ТІВ. АХ теп ллет с; пдв тов: остова пАТАСАтВоТІТЯ ОА ТО ОСА гАА тота; ВВА АТОІВОТА ЛАТІВ ТО стессвтсся тіж ПАЛ ТО АЦАВАдА заст товста Сх ВАЛЧІТІА Ід тАтТІ ТВА дишло то ди, Ах лОопчтІм ит сл чпАРЕТУ сш ТИ втевтост ПЛОСКІ ОСПТІЧЕ ТЕ БАНІ АТТ я пстеттстосттос тотастьссвтоті ше сет ств це й лин іт ГА щ-іпоОгхх сюда - пил; моля З, пут т АХ Ст тАСАВАвТАТАТМХ вошетовититот лАдсОдтлАВСАТТИС ТВАТлЕове печі лото ттттощоетитит длаттодтодвсА слвАяІствАТо пом титдаАВБАтТІ тост гталтАти чу гаю всодтОАтИМІВО оо тАТоОАТІТААВА ссввттсстот вето тотвтави А ст ТАСТАСТУТАТОТОІ ста ТАТ підт т Ов Угода ТАТАС ст ТО ТАТО ЧиІ атоатодАТОАТИВ, свв лою ТЬМА ЕХ сип А со У селі шватшА: ТІ пп, ва т плит, а кю люту Але пилка спттетяя ВВА В. ЗІЖАТОТІАВО сто ТА лА пссттстттання зі твлитвА тА ло Ал тА дети ААСАДСНСЯТО ВВС ТА ТЕТ УТА ЛІТ тасттвовсвоУтОсАВ ттовль дв то ІІ АТОТЕ ТО ВТАТЕТОССТТТЕТ; асан а етАТОССВСттсІ сама ТАТТТ "ІД ВОДА ВАДСТУ зт НІ ТІ плов из уст пику пихи СВ у ДО САС ТАТО В о свттАСОВтттся отаотосно СЕ ссср рЕ зро дптА АТ пАвАсттАОтІ т ЗАІ АТАЦІ лот ВВ стос птквсва паст вТтоссвстОВт снедою дтаетпт ліву, Із ч: лах с. отиті з хе п ТтАСАВТАЗА твор твори т авсспотьтАвстаАвАтто Атетеетснох тв пп т, є З- али ж. пиву таауюьу п ог Є МУ тн вахта 7 що що вто Е гоАтатсААт пли тЄ саАвсТтТАСАВААТІВО стдоввАВИ тост вити стос пил АСАВА Т пав шТттТттИттс ті тА ТИВНУ ТАСОЯ о етстстяссттое шо САВОМЕТІТТ терергулчдводт о скеститттстсея Бе ротознонте пнсасатстетос авпстововшетит севтестетовсск я тот тлчпаАСТТЧВ Сидів етатов ост тотутостттв; село тиці дттсдннття пови ле Ма и сш їдхт Кл сито тА д пи ТВО АСАТО ТАБ САРВОТЕТОССИЬ противаг свтвотот онов тт: о СТАТОТТРССТІТОТОЯ АВС ТАТТСОСТІвА, ЛАК АМСТАЗТАССАО татів Ел тод вв ВВ витодОстттт вд етннртне ЕТО я пн парта ер вет пепотвтттиньте 4 ся; Ах ет арх 7 вста трав отттох туди авствтетт сег в пл тя р че ва яд Ат дент ліття дстт то ЕС ЕТА АВАТАР АВАТТІМО о ттссетси тт зовтттосьтох ши плода спсаствттесет теттовотьтт А ОАРЕІАСТОСТОТІ ВИС оаАгТА с! пар во с сети й ЕТ ІА БАС доня т кт зи сн тай ту при їжіщ САЖІ БДТТО ДОтТлАТАТТІДОЇ поттоатдАттвгВ зве лвАаввАвІ що ГЕТЕ ТАТА лава ттєвт сонати шиті ТІМ ВАТ СВАТИ я сесвСстосАСНТТІ й тт тт СТАВІ ВІВ васвтеттсвсето тт ОЗЕРА си ЕТІС АВТО петтстинатстто гтадасвттот її вловити ВОАС я тотАвсвсетсс: кокот ост ди п яп МЕШЕЯ льки ще свт АВЛЕАСИТОВИ сотутттвА ТАтех я ТАдСТтстятЕ ПАРТАХ омлет тет затошосеви ОТО анЕ ЛА ААВВАТАТТАВ певне во в то о сттАвссатоссосях

«ль. зон спати; ех -О - ту І ою і Щи й домо ссосвосАсткако МТВТКТТАВАВОВУ ПАТО ААВТТ: пд - ста сек хо сети дю пежта тля вет -ї пеприсичи де ізя то тваватитВ пит ТА втратити ПтовАсаАтствсь питала тІТОсИ сп ОВТ ВИН : тет тАЕтАВЕТАт ААТОотиачТ ТАС А ВТ -даттдоадтІВОЦОт пит листи. светоссяс ТУКА БВІААТИТЬЯ ЕТНО счІдаттАТениТОМи т - т сов 1 пав гь . пак пад нн Щи й стЕтея АОС ТтОслААКТУКО СТАТ ТАТІАВАРІМО степова го САНТА хАТААССЛАТАтТА о свввсвнетосяве пох воосво о стсттостовсстт дАВАТІТТУАВАТАВО СПАВ ТАТ ЗОНУ ВМОИХА ТА ТАТО десни Еваттте овастьхесянст помощи тв татдто авт кто т ВИМИ АСО тот о сватАлетТвт вто зовано по томІд лото тоне тів АТИТ заттогов свт се І ката щі пит я якою их пу пюТд ТЕ ТТ ТІВАТтТдОВДТОМхВ Ост пшЛАТІОАТДОЦТЕ папенстес ій . Й свт аа4 типі Кок пит их гт тд М зате 7 ще Те щи т ПІ е т вд КУ - плудатНу Сх --х вто АСТТСТТЯ А АТЕТОАТ ТВА вслсасвЕдл то т ШОЕ НІ тла о САТССАССЕСАТе атоветто АССТЕТСО ТІСТА, ати стовААТ отоссттатовоттс : откскство: плин САТ щі я ЕМААСТКСКА - що Му відь. пет л ще Кк хи ків ПТО доти песто сАААтІсАстьОВІ пато ТІТКА ЕД тт сттдОодВТАгВО дя состидеттАтво тІДдАТАСАВОТНУЦМО ПЛОВ АТОСТТАСАВТІ Я сасвсватосстн ПІ шк ту кт вип тд тив - питали оз лия то те тТЕТОТО о РОН МАН ОХ тоепоссСА МІ тОопАО орати її пато иа ТТН ВДС АТя сттостеАКТОКЯ вс сАСААЖВМУ АпТтОдДТОСААСлЧШЕТ ен АСОТОСто ТАТІ САТТАСТОТАА пвсадстаттоАтсА о стсрсвкттеввсяя пил дл ІТАСАДЛАВИТТАТИ Спстетевсвтт Я сясвттсвтсаттттс пдв вит тадаттви ТАТА пітпАтдтутиІді всаттсввстта, поОстАвААСТА ттттосваріІ тот сввтвотетвАЗьт г ПАТІВВТИЛІТТТНЯВ пами ТВІТИ АЖТОСАСТОАТТЗАТОЇ стсвстансвсястя ТтІААЖВТТОвОУТ патент сто щі ТтТЕССТтТАТОГООВЬО вАввАсВАТТССТтТА с. тА пити СсАтТАААе Що УСІ твУсУ ПАБ Меси УСІМТВуУх пло БЕе»ТТБЕМАСсНИУ в КОБНКІЕБКАТУТБЕ ЦІ, ес тттЕнт своя пЕВККТвЕнЖТІ, о БЕУТОМЕОТТТЯ стзкИдапЕЕКитВ рості сЕротоМЕ в: дисІУОКБАБОЕ ЕКОвАСОстт свя пгововоя пЕБШЕБУТИКАЦИЗІИУ дав УучитконлАсюо паскстечрт ти омега их МІОМІ. МГУ " - ІтНВВОЖСВта ПТАБАЛІКНЬБЕНВ тові ЗрЕЕгпІ ІДУ я ЕкІТСЕІТНАКО Іто: МЕАКІОВИІАБАТІС тАОЕМАВКІЛКІНК пУШОВУшАКЕОЬЕКІТИЕ оовпоЗЕТЕвНгиВЬ МЕАКО клчІішУКТВАЛОМАВ тІОЕКЕБЕВУМОУВУХАК, емЕОЕРОСятІМНВ. тили тЕБеЕКІГЯТЕ ме УгакІСЕКРЕНВУ о втвтнІкІмкоЕрсся не й щі тя коттав ЗО. ДСУФЬ У вики Вл че оса уттлттско их сіті, ох чула ьо шЕ смерека т о стаенІКЕсІх М умі. км рам о СУБІМПВСТ Анні заМщтутмрчх вежа КУ Тра КЕЕБІЕКЕРАБРБІ МВ У ЕМІІХЕМОЬБВОТІВВМВ МЕЖЕБЖЕЕБЕЖВОТЕ ВРІСЕБЕЗЕКЕБІКВАКЕВ о Етветлсвв ОІВ ТПУКУСОБЕЕВТЕ о вЕрдгІСТІВТЯ птаєкекк Я х тут не МУКУ; - свиті втіх ве в таз А ЕБРІАТЕУАСКСКІ піршавскеррЕеиМКї, ЗОБІ ВТУКМНЕКІВЕ ткт ол о ЕБЕОЕУТІЕРІАТЕ аАМУЇЬніВшскКЕ лиЕСБЕНУСНОВОЕТЕ пЬВЕжтрІЦЕЬЕЕ ЕниМУВ воекскомеБаАвНУт ЗЕПЕЇІНВАДУКОВЕНУС ООЕБЕКІВБЕАРЕТЬХ Емі кнео ЛІСІВ КЕБИАЬ шчУаткокІтниВУ. ; тт М ди ше хз 7 пив ток ові - пе ЕРІВАМ песто тЕКсВОотлоВБимех, паетосовлтя вітенот Ентер кт Ів тЕКОБОЕВЕКТОоТО хЬЕлвРЕатОшТасЬК У стекти Дона тт пІКЛІВТВра чит БоХпПЕВКЕВМО чІЕВАЕБЕЖІКМИВ пттнтветтКи осот ЗВБЕЕББЕІБЕККЕ вп сІКвЕАКЬКХТ МІК РТМОИНтЬ птАСТЯВОКМІКЕ ше готвтввтттехтн пекрамтивитка влашІЕМТЄЛЬАдОАВО еттавот І: : тя т пив "Мтег а МУКУ ек вСОоВвшВкаСЕТевтле МИТ свлЕБЕВИвВЕшВоЄ я о вовІКУТВС БЕВБЕКЕСТМЬВНОБОчГЬВ оМІСПКЕчІКВОЕВЕМЯЕ пттоОаКЕБІвВВЬКІСИ У шатТБІБЕВЕКЕУТ АБаЕлАМмІспКЕ о шЕссввттедте тЕрАЩОтТНІТ, ТІК ІАВАВТАХ пиши т. га оба МВБЕХЬБУКРАШИТЬ ІПЬБМБЕМУКІАВАВ сувСМНнаКУТТені сінеікто ЗОБА ОЕМ І ОМ о РРІКТІВЧУКОМНИХТ пеетгсокесіжвікі о СР тТЕРНСМІ ВЕБЕР ОБЕЕБЕТІ, ПРОБІСВІІІКБВЕДІМ о деІнтІсоЕЕРАНІтІ ОМС ЕсвОоКеЕЕТ о ІІ ЕТ вв ОБІСВІ КАК СЕК БІ ОСТ ЦО ІПССРСІЕТЕРО «ЕЕ фа тавЕнсВмо ВІ ЧЕ ЕІСЕІІШОСЯ їаАВЕВБАВЬТВЕОЕ А СМОтІКНМеЄТсв пОоІВУстАЕКвА тівостовтонотік ммстме их тТІБИСЕаІ. ізжУВьРОМапІЛЬКЕ ММмопОше Вес пити те хУвБІіПптваМЕросБаАй тЕтТІВТУВІЦУКОХ ЕБИМІТКТІВУУВ Бех щ Чет,

Є ВТЕСААССеТЕТОДОТОВСАТАТОСОТТООЕЕТТТІАААТТТОТТАСАВАСАТТТААВТОАТТАТСАТОСАТОВАЄ САССТСАдСТАСТАСАСЕВТТОдтТосдОоВвсоАтУдАСТОВАсААдсТІДсАЗОоВАоСтАВВААВОТССА АСВ ТТ САССТТТОАССТОВСВАСССАСВАВААТТООСАВОДСТО ОВТ УТА ТСТОАСОАСАЕТТТАТСОАТОЮТІВОАСТТО СТРАТА ТАТАСТОСТРОАТСПОСАВАВОТТСАТТОСТРТОАСАЛОАЖСТТОТІАТАВТТОДСАВОДСВА МЕТО ОСАВСАТОСААСАССТОсААСАТАСОТТОАМЗАТАТЬАТАВоТОсСАТттТА всАтосттввсВдвасавассввссАССВТВ ССАБТОТРТАВРЕВОСОСАСЕТТОТЕРЕРТ ТАТО АЖЕТАСТОСТАВСАВАСАВОТТАТТТОСЬДОСАТАСАТАВ ОАСАВСАТТАТСАСОВАТСТТОСТОСАВСВСВСААТАВОСТОВОТАТСТДЕТОТТО В САРОСВОССОТТ ОК ААВВСАВСАЄ ТІШУТОСАТААТАТАСТАТАТСАТТОСВОВАТОСАСсАСАААВТТІАТСОДтАСДОТОоТОСссТОССТОоТОТОоТеСсАвоТитТОов ТОРАСАДБАВТСАСТЬСВТТТТАТОТЕАСАТОСТА САС РТ ІДІ ВААС СТОААВААТАСВЛТЕИТ У ТТРОАССАТОТУТАТАТОЗОТААААСТАТАТТОДТТІТО ТТ ОАТОВОТТАТІООАРТОрІАВОТАСАТОДТІ ОСТ Е ТЕС тОтТтТОТЕТсТОоСсІТоТтОоТтОТТІСААВОТТТТОТОАТСАСВАССІАВТІСАААТОТААСАВСОУТТАСВАААСС ТАСТЕССТАТІАТТТАСААТТОАТОСАВОСАТОАААТТОССВАІТОТААТОДТОсАТААОТТЕВТОТСАТТААТАВТИТА ТОРС ТОАСТТТААТОТТОССАСОСАТАТЕОТОТАССВОТТОСССАААДОТСТААЦОСОТВОИТОТОС САС СА АТ ТЕСТИ АТТТАРТОТ ОТО СТОТААСАВОАТОААТОСсАТОААВРТТТТТАСАТАСАСАСАТАТОТІДОТРТОвОТ вЕтТОАвАсАБсАВАТАТТ ІСТОТ тТттАсАСтТОАвСАдСсСоТОсТттТтВО ств ТТАВАСсАВИТОУВОСТТО ТАТО ТІБТТАФРТІСТОДТОдЖЕАТСАТВРСАВОАААСВАААСТТАСЕВРОАОСТАТОЗАТІТСАСАВОСТЕРТТФТРОВОСТОЗАА САТ ОАСААОЗССТАСААСААВТТО СВУ ТСАЖЕО РЕТРО ОТОЖРУВСсАОВ ВВС ФР ВВА РОВОВлУТРО ТОвТІДССАОСТАССААСТТАСААВАТОСАТСААВТТАТРСССАСТТЕ ТУ СТІААТЕРТЕТИОССВСАБАСАСАТОВІТО ОС ТС АВІЕТ ВОАС ТІВ ВОВКТОВІ ТА САААВССТОСТОАТТТАТОТТТОСТЕВОТАТТСАТСААВС САбСАЖТОСТТАААТАСАТРТОАААВТРМУГТСАТООРСТТАССАСАТТТС ТЕСТІ ТААСТСАААААССААСВСАВАТТОСССА СЕТ РАЖТОВТ ТТ ВОАС АВСТАТАСАСТОССАСР ТАС ЕТСАЗТСАТАСТІАТАТВОДЛЕВМОТВООСАЄ тІВтТтТОсствсАттІВвААСсТАТеТтТСссТАТТТОсАтТОсСАтТотІДсСАСвАСсАТАТІСТАВЕСТТОССТАРВТСАСТсВССААТО ттидтодаттасадотАстодесВттОовІАоВАтОоттатАААсттстТАжАСТтТОстАВАВЕВСаАтТтТАВсАдСОСТАСТААСТИ тотАСАТоТтвСсТОосАСАТТАВвАсСВТТОДОСВаТВСсССАСсССвАУТАТАСОСадОсТОТвАсТТОоСссТтТАдвАСВСТТССТ ТІСТО СтТУВЕТ УТА дАЦУТАТОАТАТОСВІАТТОСАТАСТТОвАААТОТІВАсАаАтТСсТАтстТОостТАсААТЕТТНСТтТА СТтАВТОТТСсАВААТОТТАВСАТИ ОВО ТОАСОСАТОССАТІАТАТсТОАдТДАСсССаТАТАТОВАВВІО КТ АТЕ АОААТОСАОССТТТ ТРОСА АРСОТОАВТАСАСАТОСЕТОТОСОСТТОСТІОССТТАААССАСВОАвААААТТТІВАВНВА СтТОСвВУКААТІВАЛЕТ РОТ ВОДО Т ЕТ ТРОС РТТАСАВОСИСТАТИЕТ АТС ТРУКСАТЕАВІТАТАТО ВАСКО САВСАТОВСТТТСРТСОТТОСІЕЕЕООСААСТТССТЕТССТСАА САТ ТЕС АССТАТОСвАТА ПОРА ОТАТІТОСАСТАТСАТТТРрГЕТОТОАДАсТАСВА СТО ОВСТЕРЕТИСТТІОТтОСААТОАС ТАТО СА ТВО дТОоАТОТССТТАТІДОСТТІОТАТОСЕТТАЖСАСАСААТАСТВІИТОСВАССТОССТОАТИТТАСААТТОВОСАТТУТССАХ СТСТІТТІТОААТОАВРІССТААААТАТАТОАВРОВСТАТААААСТАСТІМТОДАСТОТТССОАО ІРО ХВОАТАТЕ остов стассвоалоМУгтТовоттАТтІдЕсаттТтТтоссІвАСТОов ТАТО ТОовАдСсАССОсТОТОІвОоДЕтІАВОов АТ ПОТОВАТСААСТАТІАТААВВАТААТТОСТТАТВОсАСАТТОВОТАСтАСАТАТИТЕрТССТІОВвсАТТОСвАСТЕВО в МЕАКОББІАБАБІСНЬБЕВЕКЖЬЧСІСЕАСсОУЧОКБОАЕВЕБКЕБЕВКІОККАОСтУБІСВЗЕОптТрЕМкОонЕУСПУТВУЄХЦАЕНІ УБНІУБПАСКТаБЬЕКІВБЕХЕТЕСЕМАЕКІСКБООКБЕНІЇВСВІМУМИТКОВВОСОСУБОБЕУЖСМЕОБИБТЕКОЕАРАНК ЕМІІТМЬТВОТІВЕУЗІССМІСЬСКРТЬВОМІБУОБВІСЕКЕННВУКУВУСАКРЕБІВКІТРЕГТЬНВВОВСЕХБЕБРЕКІНОСТ, ЕНИБУМОКЗІВБІУТІТІШЕЗИМІШЕЛЕВЛЬКЬНнНОвВссЕУБІТТЕМеМУТТУТКАТВУБІЮІМКОВІСІАТІМОВУКВОЕММ ЗЕБШЕМІБЕНІДУАМАОКСКСЬВЕВЗАМУТЬНІЬЗВОКАПрЕЖИМКЬОСВБІСЕБВОККЕЕТЕРАКЕВІММРОВБАВБІЕККОМВАО ШЬЕВНОХУБПЕККБИБУСТШМАВОКВЬРКВМТЛЬЕСІСОПЛІСЕБЕБЬКВОУЕсСЬЕНУСІОВЬЕТІЕМНЕБІВВЕАВЕТАВИТОУКЕ ЧЕВЕСОЗВЕКЕТРИУКТАВЕІЕТІСІСІКРАКЬКХУІЕМСІЗЬЕТЕКОБІБОЕКОТОТООЬЕХВЬКОКІсВЬьВУБЕКЬОНтТВБІРЕКВВЕ ШОВКУ ВТЕБАВОТНІБВІРКЕУТМІНОБОУБАЬВЕСТЕБТЕБРЕМІКМНЬТВІ:ЇНЬБпУТІКСЬВСВРВАНІСВІВСЬКТЬЕ ЕБЕАУМОКЕЧЗОУВІАВСЕМЬКМІССТІСЬМЬЕМУКІОВЕАВРАМІССКРУІКВЬКІЕКОВЕЖВАРСОВІЕМБУБАСЬКРОКШЬКВ ШУМ КЕвАВІТОрЕІМОУВІХМоОМОКОПрКОРЕБОСПРЕБКтТЬНОВосМНаУКУУрУНЕССЕВТТОДЕКБЕВЬВаБКІШІ ММСІЖОМЖУРЬЗиМаОЬСБЕБІТІКОСРЖБКЕМОВЬКНМІЗГОВОБУТІМССРБЕТЬВОББОБУСЯБІІвІВОМУКОоОВТОЇ КЕ ЕЕБММІКТІВУУВІРрЕУКаАМЕВСрЕВ «Вії. 1 (нродовження)