RS67358B1 - Gen otpornosti na rizomaniju - Google Patents

Description

[0001] Opis

[0003] OBLAST PRONALASKA

[0005] Predmetni pronalazak se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji je u stanju da posreduje u otpornosti protiv patogena, naročito protiv virusa nekrotičnog žutila nerava repe („Beet Necrotic Yellow Vein Virus”, BNYVV) u biljci, naročito roda Beta, u kojoj se polipeptid eksprimira, kao što je detaljnije pojašnjeno u nastavku. Pronalazak se dalje odnosi na transgenu biljnu ćeliju, transgenu biljku, BNYVV-rezistentnu biljku ili njene delove, ili seme biljke, koja sadrži molekul nukleinske kiseline, u kojem se otpornost izaziva unošenjem jedne ili više mutacija. Postupci za proizvodnju BNYVV-rezistentne biljke, za identifikaciju BNYVV-rezistentne biljke roda Beta, i za kontrolu zaraze biljaka roda Beta virusom BNYVV su takođe obuhvaćeni predmetnim pronalaskom.

[0007] POZADINA PRONALASKA

[0009] Bradatost korena (rizomanija) je ekonomski najznačajnija bolest šećerne repe u svetu, koja može izazvati gubitke prinosa od 50% i više. Ovu bolest, koja se naziva i „bradatost korena”, izaziva virus nekrotičnog žutila nerava repe (BNYVV), a prenosi je zemljišna protozoa Polymyxa betae. BNYVV infekcija se ispoljava pojačanom proliferacijom tankih korenova i bočnih korenova i formiranjem znatno umanjenog tela korena sa smanjenim sadržajem šećera. Inficirane biljke pokazuju smanjeno usvajanje vode i time su osetljivije na sušni stres. Kada se infekcija proširi na celu biljku, dolazi do žućenja nerava lista, do nekrotičnih lezija i žutih pega na listovima. Pošto kurativno suzbijanje bolesti, kao i kod drugih virusnih bolesti, nije moguće, šteta se može sprečiti samo gajenjem otpornih sorti. Razvoj genotipova sa genetičkom otpornošću na rizomaniju je time odlučujući za oplemenjivanje šećerne repe.

[0010] Prvi programi oplemenjivanja za otpornost na rizomaniju započeli su već 1981. godine u Italiji, kada je prepoznato da u komercijalnim germplazmama postoji zadovoljavajuća genetička varijabilnost za otpornost na rizomaniju. Selektovane su biljke i genotipovi koji su pokazivali ublažene simptome bolesti i približno normalnu težinu korena i sadržaj šećera.

[0011] Pritom je uspešno identifikovan multigenski izvor otpornosti pod nazivom „Alba type” iz ukrštanja sa Beta vulgaris L. subsp. maritima (L.).

[0012] Godine 1982. razvijen je još jedan tip otpornosti koji je pokazivao poboljšanu zaštitu od rizomanije. On se pojavio dve godine kasnije u sorti Rizor i klasifikovan je kao monogenska, dominantna otpornost. Dalja monogenska, dominantna otpornost pronađena je 1983. godine tokom sortnih ogleda u Kaliforniji u oplemenjivačkoj kompaniji „Holly Sugar Company”, a već tri godine kasnije takođe je uvedena u Evropu (Lewellen et al. 1987). Ova otpornost, poznata kao RZ-1 (označavana i kao „Holly”), razvila se u najčešće korišćeni izvor i brzo je zamenila Rizor. Nekoliko godina kasnije, pronađen je novi izvor otpornosti na rizomaniju u Beta maritima akcesiji WB42 iz Danske. Ona je pokazivala mapirani položaj na hromozomu III različit od RZ-1 i, pored toga, obezbedila povišen nivo otpornosti u poređenju sa RZ-1. Ovaj novi glavni gen označen je kao RZ-2. U međuvremenu, dalje je poznat i RZ-3 iz Beta maritima akcesije WB41, kod kojeg se verovatno radi o alelskoj varijanti gena RZ-2.

[0013] Do danas je RZ-3 jedini gen otpornosti na rizomaniju čija je funkcionalna osnova, tj. genetička struktura, razjašnjena (videti nemačku patentnu prijavu DE 102013 010 026 A2), čime je korišćenje gena u oplemenjivanju moglo biti značajno poboljšano. Stoga postoji stalna želja da se već poznati, kao i novi izvori otpornosti, genetički bolje opišu, kako bi se time unapredio razvoj molekularnih markera. Time bi se elitne linije šećerne repe mogle dalje optimizovati eliminacijom „linkage drag-a”, ali bi se mogli identifikovati i novi izvori otpornosti.

[0014] Za održivo oplemenjivanje protiv rizomanije, koje treba da se suprotstavi opasnosti od BNYVV izolata koji probijaju otpornost, neophodno je stalno identifikovati nove gene otpornosti i integrisati ih u genske fondove gajenih biljaka kao što je šećerna repa. Ovaj zadatak se prema pronalasku rešava pomoću primera izvođenja naznačenih u patentnim zahtevima i u opisu.

[0016] SAŽETAK PRONALASKA

[0018] [0007] Predmetni pronalazak se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji je u stanju da posreduje u otpornosti na patogen, naročito na virus nekrotičnog žutila nerava repe (BNYVV) u biljci, naročito roda Beta, u kojoj se eksprimira polipeptid koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline. Pronalazak se dalje odnosi na transgenu biljnu ćeliju, transgenu biljku, BNYVV-rezistentnu biljku ili njene delove, ili seme biljke, koja sadrži molekul nukleinske kiseline, u kojem se u otpornosti posreduje uvođenjem jedne ili više mutacija. Postupci za proizvodnju BNYVV-rezistentne biljke, za identifikaciju BNYVV-rezistentne biljke roda Beta, i za kontrolu zaraze biljaka roda Beta virusom BNYVV su takođe obuhvaćeni predmetnim pronalaskom.

[0019] Predmetni pronalazak je definisan karakteristikama nezavisnih patentnih zahteva.

[0020] Prema prvom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji je u stanju da posreduje u otpornosti na patogen u biljci u kojoj se polipeptid eksprimira, naznačen time, što molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu koja je izabrana iz

[0022] (a) nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80 % identična sa SEQ ID NO: 2, pri čemu molekul nukleinske kiseline poseduje jednu ili više mutacija koje dovode do toga da polipeptid, koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline, na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 307, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od lizina (K), i/ili na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 437, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od glutamina (Q); i

[0023] (b) nukleotidne sekvence koja hibridizuje sa sekvencom komplementarnom sa SEQ ID NO: 1 pod stringentnim uslovima, pri čemu nukleotidna sekvenca na onim mestima koja odgovaraju mestima u referentnoj nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1 poseduje jednu ili više sledećih nukleotidnih supstitucija: C umesto A na poziciji 919; G umesto A na poziciji 1310; A umesto G na poziciji 1697; A umesto C na poziciji 2191; i/ili T umesto C na poziciji 2491;

[0025] pri čemu je poželjno da patogen bude virus nekrotičnog žutila nerava repe (BNYVV), a biljka da bude biljka roda Beta, poželjno šećerna repa (Beta vulgaris L.).

[0026] Pomenuti molekul nukleinske kiseline može biti naznačen time, što kodirani polipeptid dalje (i) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 566, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od arginina (R), i/ili (ii) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 731, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od glutamina (Q), i/ili (iii) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 831, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od prolina (P).

[0027] Pomenuti molekul nukleinske kiseline može biti naznačen time, što kodirani polipeptid (i) poseduje glutamin (Q) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 307, i/ili (ii) poseduje arginin (R) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 437, i/ili (iii) poseduje histidin (H) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 566, i/ili (iv) poseduje lizin (K) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 731, i/ili (v) poseduje serin (S) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 831.

[0028] Pomenuti molekul nukleinske kiseline može biti naznačen time, što molekul nukleinske kiseline na onim mestima koja odgovaraju mestima u referentnoj nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1 poseduje jednu ili više sledećih nukleotidnih supstitucija:

[0030] (a) C umesto A na poziciji 919;

[0031] (b) G umesto A na poziciji 1310;

[0032] (c) A umesto G na poziciji 1697;

[0033] (d) A umesto C na poziciji 2191; i/ili

[0034] (e) T umesto C na poziciji 2491.

[0036] Pomenuti molekul nukleinske kiseline može biti naznačen time, što molekul nukleinske kiseline kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 4 i/ili sadrži kodirajuću DNK sekvencu prema SEQ ID NO: 3.

[0037] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na vektor koji sadrži gorenavedeni molekul nukleinske kiseline.

[0038] Prema trećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na transgenu biljnu ćeliju, poželjno od biljke roda Beta, koja sadrži gorenavedeni molekul nukleinske kiseline kao transgen, opciono pod kontrolom heterolognog promotera, ili gorenavedeni vektor.

[0039] Prema četvrtom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na transgenu biljku, poželjno roda Beta, ili njen deo, koja sadrži biljnu ćeliju.

[0040] [0017] Prema petom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na BNYVV-rezistentnu biljku vrste Beta vulgaris ili njen deo, u kojoj je pomenuti molekul nukleinske kiseline endogeno prisutan, ili u kojoj su jedna ili više mutacija, kako je gore definisano, unete u endogeni molekul nukleinske kiseline sa nukleotidnom sekvencom koja sadrži sekvencu prema SEQ ID NO: 1 ili koja hibridizuje sa sekvencom komplementarnom sa SEQ ID NO: 1 pod stringentnim uslovima, pri čemu biljka ili njen deo ne pripada podvrsti Beta vulgaris subsp. maritima.

[0041] Gorenavedena biljka je hibridna biljka ili duplo haploidna biljka, i/ili su molekul nukleinske kiseline ili jedna ili više mutacija heterozigotne ili homozigotne.

[0042] Prema šestom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na seme gorenavedene biljke, pri čemu seme transgeno ili endogeno sadrži jedan ili više prethodno navedenih molekula nukleinske kiseline ili vektora.

[0043] Prema sedmom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju BNYVV-rezistentne biljke, koji obuhvata sledeće korake:

[0044] (a) mutagenizaciju u biljnim ćelijama i naknadnu regeneraciju biljaka iz mutagenizovanih biljnih ćelija, ili izazivanje mutacija u biljkama, i

[0045] (b) identifikaciju biljke iz (a) koja u endogenom molekulu nukleinske kiseline poseduje jednu ili više mutacija.

[0046] Prema osmom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za identifikaciju biljke roda Beta koja je rezistentna na patogen BNYVV, naznačen time, što postupak obuhvata sledeći korak:

[0048] (i) dokazivanje prisustva pomenutog molekula nukleinske kiseline, pri čemu polipeptid kodiran njime poseduje (i) glutamin (Q) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 307, ili (ii) arginin (R) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 437, i/ili

[0049] ekspresije molekula nukleinske kiseline, pri čemu molekul nukleinske kiseline na onim mestima koja odgovaraju mestima u referentnoj nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1 poseduje sledeće nukleotidne supstitucije: (a) C umesto A na poziciji 919, ili (b) G umesto A na poziciji 1310; u biljci, odnosno uzorku iz nje; i/ili

[0050] (ii) dokazivanje prisustva pomenutog molekula nukleinske kiseline, pri čemu polipeptid kodiran njime poseduje (i) glutamin (Q) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 307, i (ii) arginin (R) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 437, i/ili

[0051] ekspresije pomenutog molekula nukleinske kiseline, pri čemu molekul nukleinske kiseline na onim mestima koja odgovaraju mestima u referentnoj nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1 poseduje sledeće nukleotidne supstitucije: (a) C umesto A na poziciji 919, i (b) G umesto A na poziciji 1310; u biljci, odnosno uzorku iz nje, i po potrebi (iii) selekciju BNYVV-rezistentne biljke.

[0053] Prema devetom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na populaciju biljaka koja sadrži gorenavedene biljke ili biljke koje su identifikovane i po potrebi selektovane pomoću gorenavedenog postupka.

[0054] Prema desetom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za kontrolu zaraze patogenom, virusom nekrotičnog žutila nerava repe (BNYVV) u poljoprivrednom ili hortikulturnom gajenju biljaka roda Beta, koji obuhvata

[0055] I) identifikaciju i selekciju biljaka roda Beta pomoću gorenavedenog postupka i II) gajenje biljaka iz I) ili njihovog potomstva.

[0057] Najpre će u nastavku biti detaljnije pojašnjeni neki od pojmova korišćenih u ovoj prijavi: pojam „otprilike” u vezi sa navođenjem dužine nukleotidne sekvence znači odstupanje od /-10.000 baznih parova, /- 5000 baznih parova ili /- 1000 baznih parova, poželjno od /- 200 baznih parova ili /- 100 baznih parova i naročito poželjno od /- 50 baznih parova.

[0058] „Biljka roda Beta” pripada porodici štireva (Amaranthaceae). U ove biljke se ubrajaju biljke vrsta Beta macrocarpa, Beta vulgaris, Beta lomatogona, Beta macrorhiza, Beta corolliflora, Beta trigyna i Beta nana. Biljka vrste Beta vulgaris je naročito biljka podvrste Beta vulgaris subsp. vulgaris. Ovde se ubrajaju na primer Beta vulgaris subsp. vulgaris var. altissima (šećerna repa u užem smislu), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. vulgaris (blitva), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. conditiva (cvekla), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. crassa/alba (stočna repa).

[0059] [0026] Pod „hibridizovanjem” ili „hibridizacijom” podrazumeva se proces u kojem se jednolančani molekul nukleinske kiseline vezuje za pretežno komplementaran lanac nukleinske kiseline, tj. sa njim formira bazne parove. Standardni postupci za hibridizaciju su, na primer, opisani u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. Poželjno se pod time podrazumeva da najmanje 60 %, dalje poželjno najmanje 65 %, 70 %, 75 %, 80 % ili 85 %, naročito poželjno 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ili 99 % baza molekula nukleinske kiseline formira bazne parove sa pretežno komplementarnim lancem nukleinske kiseline. Mogućnost takvog vezivanja zavisi od stringentnosti uslova hibridizacije. Pojam „stringentnost” odnosi se na uslove hibridizacije. Visoka stringentnost je data onda kada je sparivanje baza otežano, a niska stringentnost kada je sparivanje baza olakšano. Stringentnost uslova hibridizacije zavisi, na primer, od koncentracije soli, odnosno jonske jačine i temperature. Generalno, stringentnost se može povećati povišenjem temperature i/ili sniženjem sadržaja soli. Pod „stringentnim uslovima hibridizacije” treba podrazumevati takve uslove pod kojima se hibridizacija odvija preovlađujuće samo između homolognih molekula nukleinske kiseline. Pojam „uslovi hibridizacije” se pritom ne odnosi samo na uslove koji vladaju tokom samog vezivanja nukleinskih kiselina, već i na uslove koji vladaju tokom koraka ispiranja koji slede. Stringentni uslovi hibridizacije su, na primer, uslovi pod kojima preovlađujuće hibridizuju samo takvi molekuli nukleinske kiseline koji poseduju najmanje 70 %, poželjno najmanje 75 %, najmanje 80 %, najmanje 85 %, najmanje 90 % ili najmanje 95 % identitet sekvence. Stringentni uslovi hibridizacije su, na primer: hibridizovanje u 4 x SSC na 65 °C i naknadno ispiranje više puta u 0,1 x SSC na 65 °C ukupno oko 1 sat. Ovde upotrebljen pojam „stringentni uslovi hibridizacije” može takođe značiti: hibridizovanje na 68 °C u 0,25 M natrijum-fosfata, pH 7,2, 7 % SDS, 1 mM EDTA i 1 % BSA tokom 16 sati i naknadno ispiranje dva puta sa 2 x SSC i 0,1 % SDS na 68 °C. Poželjno se hibridizacija odvija pod stringentnim uslovima.

[0060] „Komplementarna” nukleotidna sekvenca znači da, u odnosu na nukleinsku kiselinu u obliku dvolančane DNK, drugi lanac DNK, komplementaran prvom lancu DNK, u skladu sa pravilima sparivanja baza, poseduje nukleotide koji korespondiraju sa bazama prvog lanca.

[0061] Pod „izolovanim molekulom nukleinske kiseline” podrazumeva se molekul nukleinske kiseline izdvojen iz svoje prirodne, odnosno prvobitne okoline. Pojam obuhvata i sintetički proizveden molekul nukleinske kiseline. Pod „izolovanim polipeptidom” podrazumeva se polipeptid izdvojen iz svoje prirodne, odnosno prvobitne okoline. Pojam obuhvata i sintetički proizveden polipeptid.

[0062] [0029] „Molekularni marker” je nukleinska kiselina koja je polimorfna u biljnoj populaciji i koristi se kao referentna ili orijentaciona tačka. Marker za prepoznavanje događaja rekombinacije treba da bude pogodan da prati razlike ili polimorfizme unutar biljne populacije. Time je takav marker u stanju da detektuje i razlikuje različita alelska stanja (alele). Pojam „molekularni marker” se takođe odnosi na nukleotidne sekvence koje su komplementarne ili bar pretežno komplementarne ili homologne genomskim sekvencama, na primer, nukleinske kiseline koje se koriste kao sonde ili prajmeri. Kod markera se ove razlike nalaze na nivou DNK i predstavljaju, na primer, razlike u polinukleotidnim sekvencama kao što su, na primer, SSR-ovi (simple sequence repeats), RFLP-ovi (restriction fragment length polymorphisms), FLP-ovi (fragment length polymorphisms) ili SNP-ovi (single nucleotide polymorphisms). Markeri mogu biti izvedeni iz genomskih ili eksprimiranih nukleinskih kiselina kao što su, na primer, splajsovana RNK, cDNK ili EST-ovi, i mogu se takođe odnositi na nukleinske kiseline koje se koriste kao sonde ili parovi prajmera i kao takve su pogodne da amplifikuju fragment sekvence upotrebom postupaka baziranih na PCR-u. Markeri koji opisuju genetičke polimorfizme (između delova jedne populacije) mogu se dokazati upotrebom dobro utvrđenih postupaka iz stanja tehnike (An Introduction to Genetic Analysis.7th Edition, Griffiths, Miller, Suzuki et al., 2000). Tu spadaju npr. sekvenciranje DNK, amplifikacija specifična za sekvencu bazirana na PCR-u, dokazivanje RFLP-ova, dokazivanje polinukleotidnih polimorfizama pomoću alelspecifične hibridizacije (ASH), detekcija amplifikovanih varijabilnih sekvenci biljnog genoma, detekcija 3SR (self-sustained sequence replication), detekcija SSR-ova, SNP-ova, RFLP-ova ili AFLP-ova (amplified fragment length polymorphisms). Dalje su poznati i postupci za detekciju EST-ova (expressed sequence tags) i SSR markera izvedenih iz EST sekvenci i RAPD (randomly amplified polymorphie DNA). Zavisno od konteksta, pojam marker u opisu takođe može da znači specifičnu poziciju na hromozomu u genomu jedne vrste, gde specifičan marker (npr. SNP) može biti pronađen.

[0063] „Promotor” je netranslatirana regulatorna DNK sekvenca, tipično uzvodno od kodirajućeg regiona, koja uključuje mesto vezivanja za RNK polimerazu i inicira transkripciju DNK. Promotor, pored toga, sadrži i druge elemente, koji funkcionišu kao regulatori genske ekspresije (npr. cis-regulatorni elementi). „Jezgro-promotor ili minimalni promotor” je promoter koji poseduje barem osnovne elemente koji su potrebni za inicijaciju transkripcije (npr. TATA kutiju i/ili inicijator).

[0064] „Patogen” označava organizam koji u interakcijama sa biljkom dovodi do simptoma bolesti na jednom ili više organa kod biljke. U ove patogene ubrajaju se, na primer, životinjski, gljivični, bakterijski ili virusni organizmi ili oomicete.

[0065] Pod „infekcijom patogenom” treba podrazumevati najraniji trenutak u kojem patogen stupa u interakciju sa biljnim tkivom domaćina. Na primer, u slučaju virusnog patogena BNYVV, ovaj se prenosi protozoom Polymyxa betae. Polymyxa formira spore koje u zemlji mogu preživeti više decenija. U ovim sporama preživljava i virus. Kada ove trajne spore proklijaju u pokretne zoospore, virus preko njih može dospeti u ćelije biljnog tkiva domaćina i tamo stupiti u interakciju sa domaćinom (Esser (2000) Kryptogamen 1: Cyanobakterien Algen Pilze Flechten Praktikum und Lehrbuch. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 3. izdanje).

[0066] [0033] Biljni „organi” označavaju, na primer, listove, osovinu izdanka, stablo, korenove, hipokotil, vegetativne pupoljke, meristeme, embrione, antere, ovule, semena ili plodove. „Biljni delovi” odnosno „deo(delovi) biljke” uključuju, ali nisu ograničeni na, osovinu izdanka, odnosno stabljiku, listove, cvetove, cvasti, korenove, plodove i semena, kao i polen. Pojam „biljni delovi” odnosno „deo(delovi) biljke” dalje označava skup više organa, npr. cvet ili seme, ili deo organa, npr. poprečni presek kroz osovinu izdanka. Biljna „tkiva” su, na primer, kalusno tkivo, tkivo za skladištenje, meristemska tkiva, tkivo lista, tkivo izdanka, tkivo korena, biljno tumorsko tkivo ili reproduktivno tkivo, kao i tvorno tkivo, osnovno tkivo (takozvani parenhim), provodno tkivo, potporno tkivo i pokrovno tkivo (takozvana epidermis). Tkivo, međutim, nije ograničeno ovim nabrajanjem. Pod biljnim „ćelijama” podrazumevaju se, na primer, izolovane ćelije sa ćelijskim zidom ili njihovi agregati ili protoplasti.

[0067] U vezi sa predmetnim pronalaskom, pojam „regulatorna sekvenca” se odnosi na nukleotidnu sekvencu koja utiče na specifičnost i/ili jačinu ekspresije, na primer, time što regulatorna sekvenca posreduje u određenoj tkivnoj specifičnosti. Takva regulatorna sekvenca može biti lokalizovana uzvodno od tačke inicijacije transkripcije minimalnog promotora, ali i nizvodno od nje, kao, na primer, u transkribovanoj, ali netranslatiranoj vodećoj sekvenci ili unutar introna.

[0068] Pojam „otpornost” treba shvatiti široko i on pokriva opseg zaštite, od usporenja do potpune inhibicije razvoja bolesti. Primer patogena od značaja je virus nekrotičnog žutila nerava repe (BNYVV). Poželjno, rezistentna biljna ćelija prema pronalasku ili rezistentna biljka prema pronalasku postiže otpornost na BNYVV. Otpornost na patogen izjednačava se sa otpornošću na bolest koju taj patogen izaziva, na primer, otpornost na BNYVV je takođe otpornost na bradatost korena (rizomaniju).

[0069] „Transgena biljka” se odnosi na biljku u čiji je genom integrisan najmanje jedan polinukleotid. Pritom se može raditi o heterolognom polinukleotidu. Poželjno je polinukleotid stabilno integrisan, što znači da integrisani polinukleotid ostaje stabilno očuvan u biljci, da se eksprimira i da takođe može stabilno da se prenese na potomstvo. Stabilno unošenje polinukleotida u genom jedne biljke uključuje i integraciju u genom biljke iz prethodne roditeljske generacije, pri čemu polinukleotid može stabilno dalje da se nasleđuje. Pojam „heterologan” znači da uneseni polinukleotid, na primer, potiče od ćelije ili organizma sa drugačijom genetičkom pozadinom iste vrste ili druge vrste, ili je homologan prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji domaćinu, ali je onda lokalizovan u različitoj genetičkoj okolini i tako se razlikuje od eventualno prirodno prisutnog korespondirajućeg polinukleotida. Heterologni polinukleotid može biti prisutan dodatno uz odgovarajući endogeni gen.

[0070] Izvedbe i primeri izvođenja predmetnog pronalaska biće opisani na primeru u vezi sa priloženim sekvencama i slikama.

[0071] Sl. 1: (A) Genomska DNK sekvenca alela wb-s osetljivog na bradatost korena (WB) gena otpornosti wb (SEQ ID NO: 1) iz ss-genotipa, koji je identifikovan kao NBS-LRR (gen NB-ARC domena) pomoću finog mapiranja. Analiza potomstva 4 najbliže rekombinantne biljke (2 direktne rekombinante levo i dve direktne rekombinante desno oko gena) suzila je NBS-LRR gen precizno na jedan gen. Prikazana sekvenca sadrži kodirajući region predviđene proteinske sekvence (B, SEQ ID NO: 2) proteina otpornosti WB-s. (C) Genomska DNK sekvenca WB-rezistentnog alela wb-R gena otpornosti wb (SEQ ID NO: 3) koja sadrži kodirajući region predviđene proteinske sekvence. Dijagnostički polimorfizmi koji dovode do zamena aminokiselina istaknuti su podvlačenjem i masnim slovima. (D) Aminokiselinska sekvenca proteina kodiranog genomskom DNK sekvencom WB-rezistentnog alela wb-R gena otpornosti wb (SEQ ID NO: 3). Dijagnostički polimorfizmi istaknuti su podvlačenjem i masnim slovima. Eksperimenti u okviru predmetnog pronalaska, između ostalog analize sekvenci WB-rezistentnih genotipova naspram preovlađujućih osetljivih genotipova, i aminokiselinske sekvence sadržane u genomskoj bazi podataka, pokazali su da, u genomskoj DNK sekvenci WB-rezistentnih wb-R alela, korelirajući NBS-LRR gen sa okvirom čitanja prikazanim u SEQ ID NO: 3 poseduje jednu ili više zamena aminokiselina, pa se uočena otpornost može pripisati mutacijama u ovom genu. Na osnovu dosadašnje analize rekombinanti, naročito jedna od dve zamene aminokiselina, K307Q i/ili Q437R, može se smatrati uzročnom za otpornost.

[0073] DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0075] Predmetni pronalazak se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji je u stanju da posreduje u otpornosti na patogen, naročito na virus nekrotičnog žutila nerava repe (BNYVV) u biljci, naročito roda Beta, u kojoj se eksprimira polipeptid koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline. Predmetni pronalazak se zasniva na genetičkom finom mapiranju, identifikaciji, izolaciji i karakterizaciji gena koji originalno potiče od donora Beta vulgaris subsp. maritima, čije je prisustvo u biljci, naročito u šećernoj repi, u korelaciji sa, odnosno uzrok je, otpornosti dotične biljke na bradatost korena (WB), i čija se nukleotidna i kodirana aminokiselinska sekvenca odlikuju najmanje jednom zamenom nukleotida, odnosno aminokiseline u odnosu na nukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu identifikovanog NBS-LRR gena prikazanu na Slikama 1A i B.

[0076] Prema prvom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji je u stanju da posreduje u otpornosti na patogen u biljci u kojoj se polipeptid eksprimira, naznačen time, što molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu koja je izabrana iz

[0078] (a) nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80 % identična sa SEQ ID NO: 2, pri čemu molekul nukleinske kiseline poseduje jednu ili više mutacija koje dovode do toga da polipeptid, koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline, na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 307, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od lizina (K), i/ili na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 437, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od glutamina (Q); i

[0079] (b) nukleotidne sekvence koja hibridizuje sa sekvencom komplementarnom sa SEQ ID NO: 1 pod stringentnim uslovima, pri čemu nukleotidna sekvenca na onim mestima koja odgovaraju mestima u referentnoj nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1 poseduje jednu ili više sledećih nukleotidnih supstitucija: C umesto A na poziciji 919; G umesto A na poziciji 1310; A umesto G na poziciji 1697; A umesto C na poziciji 2191; i/ili T umesto C na poziciji 2491;

[0081] pri čemu je poželjno da patogen bude virus nekrotičnog žutila nerava repe (BNYVV), a biljka da bude biljka roda Beta, poželjno šećerna repa (Beta vulgaris L.).

[0082] Kod molekula nukleinske kiseline može se raditi o izolovanom molekulu nukleinske kiseline. Poželjno se radi o DNK, a naročito poželjno o cDNK, odnosno kodirajućoj DNK. Poželjno, polipeptid koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline prema pronalasku posreduje u otpornosti na virusni patogen „Beet Necrotic Yellow Vein Virus” (BNYVV), koji izaziva biljnu bolest bradatost korena (rizomaniju) i prenosi se putem zemljišne protozoe Polymyxa betae. Dalje, polipeptid koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline prema pronalasku posreduje, naročito u biljci roda Beta, u otpornosti na ovaj patogen. Poželjno se kod biljke radi o biljci vrste Beta vulgaris, naročito poželjno o biljci podvrste Beta vulgaris subsp. vulgaris; ovde se ubrajaju, na primer, gajene vrste šećerna repa, cvekla, stočna repa, lisnata blitva i rebrasta blitva.

[0083] [0041] U primeru izvođenja predmetnog pronalaska, molekul nukleinske kiseline prema pronalasku sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80 % identična sa SEQ ID NO: 2, pri čemu molekul nukleinske kiseline poseduje jednu ili više mutacija koje dovode do toga da polipeptid, koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline, na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 307, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od lizina (K), i/ili na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 437, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od glutamina (Q). Jedna od dve ili obe pomenute mutacije u aminokiselinskoj sekvenci verovatno su identifikovane kao uzročne za otpornost na rizomaniju.

[0084] Kao što je pojašnjeno u primerima i u legendi slike, kod identifikovanog gena radi se o genu/proteinu otpornosti tipa NBS-LRR, koji se karakteriše određenim strukturnim motivima. Opšta struktura takvih proteina otpornosti u biljkama je već dobro istražena (Martin et al., Annual Review Plant Biology 54 (2003), 23-61). Međutim, princip strukturnog oblikovanja, naročito takozvanog LRR domena, koji se smatra potencijalnim domenom prepoznavanja za uglavnom nepoznate patogene efektore, nije predvidiv i generalno je funkcionalna osnova gena otpornosti, tj. genetička struktura, u velikoj meri nepoznata. Shodno tome, identifikacija gena, odnosno proteina koji posreduje u BNYVV-otpornosti je samo na osnovu poznatih strukturnih motiva nemoguća. Dalje, često su sekvencni regioni oko ovih gena otpornosti repetitivni, što razvoj dijagnostičkih markera, kao i asembliranje sekvenci, čini naročito teškim.

[0085] Identifikovani protein otpornosti pripada tipu NBS-LRR i poseduje najmanje jedan domen bogat leucinom (LRR) koji odgovara pozicijama aminokiselina 558 do 594 iz SEQ ID NO: 4, poželjno pozicijama aminokiselina 542 do 594 iz SEQ ID NO: 4, pozicijama aminokiselina 604 do 634 iz SEQ ID NO: 4, poželjno pozicijama aminokiselina 582 do 634 iz SEQ ID NO: 4, pozicijama aminokiselina 760 do 790 iz SEQ ID NO: 4 ili pozicijama aminokiselina 838 do 869 iz SEQ ID NO: 4, i/ili najmanje jedan domen AAA ATPaze koji odgovara pozicijama aminokiselina 177 do 289 iz SEQ ID NO: 4 ili pozicijama aminokiselina 156 do 263 iz SEQ ID NO: 4. Kod identifikovanog domena ATPaze radi se najverovatnije o NB-ARC domenu, kojem pripada centralna funkcija vezivanja nukleotida. Ne vezujući se za određenu teoriju, ovaj funkcionalni domen ATPaze verovatno reguliše aktivnost proteina otpornosti.

[0086] U daljem primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline prema pronalasku sadrži nukleotidnu sekvencu koja hibridizuje sa sekvencom komplementarnom sa SEQ ID NO: 1 pod stringentnim uslovima, pri čemu je na pozicijama 919-921 i/ili 1309-1311 zamenjen jedan ili više nukleotida, što dovodi do zamene aminokiseline.

[0087] Ove zamene aminokiselina, odnosno zamene nukleotida mogu se sprovesti upotrebom konvencionalnih postupaka koji su poznati u stanju tehnike, na primer, mesto-usmerenom mutagenezom, mutagenezom posredovanom PCR-om, transpozonskom mutagenezom, TILLING-om, genomskim inženjeringom, na primer, pomoću meganukleaza, nukleaza cinkovog prsta, TALENS i CRISPR/Cas., itd. Dalje, u nukleotidnu sekvencu mogu se dodatno uvesti, bilo pojedinačno ili u kombinacijama, dalje supstitucije, delecije, insercije, adicije i/ili svaka druga izmena, koje nukleotidnu sekvencu zapravo menjaju, ali ispunjavaju istu funkciju kao polazna sekvenca, ovde nukleotidna sekvenca prema pronalasku koja kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom prema pronalasku, koji posreduje u otpornosti na bradatost korena (rizomaniju). Stoga, pronalazak u daljem primeru izvođenja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji predstavlja derivat polipeptida koji je kodiran nukleotidnom sekvencom prema pronalasku ili koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema pronalasku. Derivat polipeptida predstavlja izvedenu aminokiselinsku sekvencu koja poseduje najmanje jednu supstituciju, deleciju, inserciju ili adiciju jedne ili više aminokiselina, pri čemu funkcionalnost kodiranog polipeptida/proteina ostaje očuvana.

[0088] Kod supstitucije jedne aminokiseline drugom aminokiselinom sa istim ili ekvivalentnim ili sličnim hemijsko-fizičkim svojstvima reč je o „konzervativnoj zameni” ili „semikonzervativnoj zameni”. Primeri fizičko-hemijskih svojstava jedne aminokiseline su, na primer, hidrofobnost ili naelektrisanje. Stručnjaku je poznato koja supstitucija aminokiseline predstavlja konzervativnu ili semikonzervativnu zamenu. Opšte stručno znanje, pored toga, omogućava da stručnjak može prepoznati, identifikovati i dokazati koje su delecije i adicije aminokiselina neškodljive za funkcionalnost proteina otpornosti i na kojim pozicijama su one moguće. Stručnjaku je poznato da u slučaju predmetnog NBS-LRR proteina kod modifikacija aminokiselinske sekvence (supstitucije, delecije, insercije ili adicije jedne ili više aminokiselina) naročito funkcionalnost goredefinisanih konzervisanih domena mora ostati očuvana i da su stoga u ovim domenima prethodno navedene modifikacije samo ograničeno moguće.

[0089] Time pronalazak obuhvata funkcionalni fragment nukleotidne sekvence prema pronalasku. Pojam „fragment” pritom obuhvata gene sa nukleotidnom sekvencom dovoljno sličnom gorenavedenoj nukleotidnoj sekvenci. Pojam „dovoljno sličan” označava prvu nukleotidnu sekvencu ili aminokiselinsku sekvencu koja ima dovoljan ili minimalan broj identičnih ili ekvivalentnih nukleotida, odnosno aminokiselinskih ostataka u odnosu na drugi nukleotid, odnosno drugu aminokiselinsku sekvencu.

[0090] U pogledu aminokiselinske sekvence, ona i nakon izmene pomoću gorenavedenog postupka poseduje zajednički strukturni domen i/ili poseduje zajedničku funkcionalnu aktivnost. Aminokiselinske sekvence koje poseduju identitet od najmanje 80 %, najmanje 85 %, najmanje 90 %, najmanje 91 %, najmanje 92 %, najmanje 93 %, najmanje 94 %, najmanje 95 %, najmanje 96 %, najmanje 97 %, najmanje 98 %, najmanje 99 %, ili 100 % sa nukleotidnom sekvencom, odnosno aminokiselinskom sekvencom, prema pronalasku, ovde se definišu kao dovoljno slične. Poželjno, takve nukleotidne sekvence koje kodiraju derivat, odnosno izvedenu aminokiselinsku sekvencu, mogu se proizvesti bilo direktno ili indirektno (na primer, putem koraka amplifikacije ili replikacije) iz polazne nukleotidne sekvence koja po celoj dužini ili bar delimično odgovara nukleotidnoj sekvenci prema pronalasku.

[0091] Shodno tome, predmetni pronalazak obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je u stanju da pod stringentnim uslovima hibridizuje sa nukleotidnom sekvencom koja je komplementarna sa nukleotidnom sekvencom prema pronalasku, odnosno sa nukleotidnom sekvencom koja kodira aminokiselinsku sekvencu prema pronalasku.

[0092] U daljem primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline prema pronalasku sadrži nukleotidnu sekvencu, pri čemu molekul nukleinske kiseline poseduje jednu ili više mutacija koje dovode do toga da polipeptid, koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline, na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 307, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od lizina (K), i/ili na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 437, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od glutamina (Q), i (i) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 566, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od arginina (R), i/ili (ii) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 731, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od glutamina (Q), i/ili (iii) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 831, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od prolina (P). Prve dve zamene su, kao što je prethodno pomenuto, identifikovane kao odgovorne za otpornost. Iako je uloga poslednje tri zamene u posredovanju u otpornosti još uvek nejasna, one su dijagnostičke i stoga se mogu povoljno koristiti u postupcima dokazivanja i/ili selekcije.

[0093] [0051] U daljem primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline prema pronalasku sadrži nukleotidnu sekvencu, pri čemu kodirani polipeptid poseduje glutamin (Q) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 307, i/ili poseduje arginin (R) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 437, i/ili poseduje histidin (H) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 566, i/ili poseduje lizin (K) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 731, i/ili poseduje serin (S) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 831. Ove zamene aminokiselina poželjno nastaju supstitucijom jednog ili više nukleotida u molekulu nukleinske kiseline iz SEQ ID NO: 1, pri čemu se poželjno jedan nukleotid supstituiše drugim. Shodno tome, molekul nukleinske kiseline prema pronalasku je naznačen time, što molekul nukleinske kiseline na onim mestima koja odgovaraju mestima u referentnoj nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1 poseduje jednu ili više sledećih nukleotidnih supstitucija: C umesto A na poziciji 919; G umesto A na poziciji 1310; A umesto G na poziciji 1697; A umesto C na poziciji 2191; i/ili T umesto C na poziciji 2491. U poželjnom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline prema pronalasku je naznačen time, što kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 4 i/ili sadrži kodirajuću DNK sekvencu prema SEQ ID NO: 3; videti takođe Sliku 1 i legendu slike uz nju, kao i primere.

[0094] Dalje, predmetna prijava otkriva rekombinantni DNK molekul koji sadrži sekvence pomenutog molekula nukleinske kiseline. Poželjno, rekombinantni DNK molekul dalje poseduje regulatornu sekvencu, odnosno povezan je/operativno spojen sa njom, poželjno sa promotorskom sekvencom i/ili drugim sekvencama kontrolnih elemenata transkripcije ili translacije, pri čemu je regulatorna sekvenca, koja kontroliše ekspresiju gena koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema pronalasku, naznačena time, što je regulatorna sekvenca u stanju da posreduje u ekspresiji ili da moduliše ekspresiju heterologne DNK sekvence usled infekcije patogenom. Poželjno, heterologna DNK sekvenca je nukleotidna sekvenca koja kodira komponentu biljne odbrane od patogena (npr.: geni otpornosti (R geni) ili geni koji kodiraju enzime uključene u prenos signala, kao što su kinaze ili fosfataze, kao i G protein) ili koja kodira patogeni efektor (tzv. geni avirulencije (avr)).

[0095] [0053] Predmetni pronalazak dalje otkriva i polipeptid koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline prema pronalasku i funkcionalni i/ili imunološki aktivni fragment istog, kao i antitelo koje se specifično vezuje za polipeptid ili za njegov fragment. Naročito poželjno, polipeptid poseduje aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 4. Rekombinantna proizvodnja proteina, polipeptida i fragmenata je poznata stručnjaku i opisana je, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001 ili Wingfield, P. T.2008. Production of Recombinant Proteins. Current Protocols in Protein Science. 52:5.0:5.0.1‐5.0.4. Poliklonska ili monoklonska antitela na protein predmetnog pronalaska mogu biti proizvedena od strane stručnjaka prema poznatim postupcima, kao što su oni opisani u E. Harlow et al., urednici Antibodies: A Laboratory Manual (1988). Proizvodnja monoklonskih antitela, kao i Fab-fragmenata i F(ab')<2>-fragmenata, koji su takođe korisni kod postupaka detekcije proteina, može se sprovesti pomoću različitih uobičajenih postupaka, kao što su oni opisani u Goding, Mononoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 98‐118, New York: Academic Press (1983). Antitelo se zatim može koristiti za skrining biblioteka ekspresione cDNK da bi se identifikovali identični, homologni ili heterologni geni pomoću imunološkog skrininga (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 ili Ausubel et al., 1994, „Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley & Sons). Naročito se predmetni pronalazak odnosi na antitela koja selektivno prepoznaju polipeptid kodiran wb-R alelom prema pronalasku i u suštini ne prepoznaju polipeptid kodiran osetljivim wb-s alelom, tj. prepoznaju ga najmanje za faktor 2, poželjno za faktor 5, a još poželjnije za faktor 10, ili više, slabije nego polipeptid kodiran wb-R alelom prema pronalasku.

[0096] [0054] Dalji predmet pronalaska su vektori koji sadrže molekul nukleinske kiseline prema pronalasku, odnosno rekombinantni DNK molekul. Kod vektora se može raditi o plazmidu, kozmidu, fagu ili ekspresionom vektoru, transformacionom vektoru, šatl-vektoru ili vektoru za kloniranje; on može biti dvolančani ili jednolančani, linearan ili cirkularan ili može transformisati prokariotskog ili eukariotskog domaćina bilo integracijom u njegov genom ili ekstrahromozomski. Poželjno je molekul nukleinske kiseline prema pronalasku ili DNK molekul u ekspresionom vektoru operativno spojen sa jednom ili više regulatornih sekvenci koje omogućavaju transkripciju i ,opciono, ekspresiju u prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji domaćinu; videti, na primer, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. Poželjno su ove regulatorne sekvence promotori ili terminatori, naročito startno mesto inicijacije transkripcije, mesto vezivanja ribozoma, signal za procesiranje RNK, mesto terminacije transkripcije i/ili signal poliadenilacije. Na primer, pri tome molekul nukleinske kiseline stoji pod kontrolom pogodnog promotora i/ili terminatora. Pogodni promotori mogu biti promotori koji se konstitutivno indukuju (npr.: 35S-promoter iz „Cauliflower mosaic virus” (Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812), naročito su pogodni takvi promotori koji su patogen-inducibilni (npr.: PR1-promotor iz peršuna (Rushton et al., EMBO J.15 (1996), 5690-5700). Naročito pogodni patogen-inducibilni promotori su sintetički, odnosno himerni promotori koji se ne javljaju u prirodi, sastavljeni su od više elemenata i uključuju minimalni promotor, i uzvodno od minimalnog promotora poseduju najmanje jedan cis-regulatorni element koji služi kao mesto vezivanja za specijalne transkripcione faktore. Himerni promotori se koncipiraju prema željenim zahtevima i indukuju se ili reprimiraju pomoću različitih faktora. Primeri takvih promotora nalaze se u WO 00/29592, WO 2007/147395 i WO 2013/091612. Pogodan terminator je, na primer, nos-terminator (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 561-573). Vektori obično dodatno sadrže indikatorske/reporterske gene ili gene otpornosti za dokazivanje prenosa željenog vektora, odnosno DNK molekula/molekula nukleinske kiseline, i za selekciju jedinki koje ih sadrže, pošto je direktno dokazivanje putem ekspresije gena obično prilično teško. Pošto molekul nukleinske kiseline prema pronalasku ovde sam kodira polipeptid koji sa prethodno pomenutim mutacijama predstavlja protein koji daje otpornost na rizomaniju, nije esencijalno za ekspresiju u biljnim ćelijama obezbediti još jedan gen otpornosti, ali se on poželjno obezbeđuje da bi se omogućila brza selekcija.

[0097] Primeri indikatorskih/reporterskih gena su, na primer, gen luciferaze i gen koji kodira zeleni fluorescentni protein (GFP). Oni dalje omogućavaju i ispitivanja aktivnosti i/ili regulacije promotora gena. Primeri gena otpornosti, specifično za transformacije biljaka, su gen neomicin-fosfotransferaze, gen higromicin-fosfotransferaze ili gen koji kodira fosfinotricinacetiltransferazu. Ovo, međutim, ne isključuje druge indikatorske/reporterske gene ili gene otpornosti poznate stručnjaku. U poželjnom primeru izvođenja, vektor je biljni vektor.

[0098] Nadalje, predmetna prijava otkriva ćelije domaćine koje sadrže vektore prema pronalasku, rekombinantne DNK molekule i/ili molekule nukleinske kiseline. Ćelija domaćin u smislu pronalaska može biti prokariotska (npr. bakterijska) ili eukariotska ćelija (npr. biljna ćelija ili ćelija kvasca). Poželjno, ćelija domaćin je agrobakterija kao što je Agrobacterium tumefaciens ili Agrobacterium rhizogenes ili biljna ćelija.

[0099] Stručnjaku su poznati kako brojni postupci, poput konjugacije ili elektroporacije, pomoću kojih može da unese molekul nukleinske kiseline prema pronalasku, rekombinantni DNK molekul i/ili vektor predmetnog pronalaska u agrobakteriju, tako i postupci poput različitih postupaka transformacije (biolitička transformacija, transformacija posredovana agrobakterijom), pomoću kojih može da unese molekul nukleinske kiseline prema pronalasku, DNK molekul i/ili vektor predmetnog pronalaska u biljnu ćeliju (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001).

[0100] [0058] Dalje poželjno, predmetni pronalazak se odnosi na transgenu biljnu ćeliju koja sadrži molekul nukleinske kiseline ili DNK molekul prema pronalasku kao transgen ili vektor predmetnog pronalaska. Takva transgena biljna ćelija je, na primer, biljna ćelija koja je transformisana, poželjno stabilno, molekulom nukleinske kiseline prema pronalasku, DNK molekulom ili vektorom predmetnog pronalaska. U poželjnoj izvedbi transgene biljne ćelije, molekul nukleinske kiseline je operativno spojen sa jednom ili više regulatornih sekvenci koje omogućavaju transkripciju i, opciono, ekspresiju u biljnoj ćeliji. Celokupni konstrukt od molekula nukleinske kiseline prema pronalasku i regulatorne sekvence/regulatornih sekvenci tada predstavlja transgen. Takve regulatorne sekvence su, na primer, promotor, pojačivač ili terminator. Stručnjaku su poznati brojni funkcionalni promotori, pojačivači i terminatori primenljivi u biljkama.

[0101] Poželjno, transgena biljna ćelija predmetnog pronalaska, naročito ćelija biljke roda Beta, pokazuje u odnosu na patogen, naročito BNYVV, višu otpornost od korespondirajuće netransformisane biljne ćelije (biljna ćelija bez transgena). Nivo otpornosti, na primer, na BNYVV može se u biljkama roda Beta kvalitativno utvrditi određivanjem bonitetnih ocena (skale bonitetnih ocena za biljke roda Beta su poznate iz stanja tehnike, na primer, za šećernu repu; videti Mechelke (1997) Probleme in der Rizomaniaresistenzzüchtung, Vorträge für Pflanzenzüchtung, Resistenzzüchtung bei Zuckerrüben, Gesellschaft für Pflanzenzüchtung e.V., 113-123). Viša otpornost se pokazuje poboljšanjem otpornosti za najmanje jednu bonitetnu ocenu, za najmanje dve bonitetne ocene, za najmanje tri ili više bonitetnih ocena. Dalje, predmetna prijava otkriva i postupak za proizvodnju transgene biljne ćelije predmetnog pronalaska, koji obuhvata korak unošenja molekula nukleinske kiseline prema pronalasku, DNK molekula ili vektora predmetnog pronalaska u biljnu ćeliju. Na primer, unošenje može da se izvrši transformisanjem, poželjno stabilnim transformisanjem. Pogodne tehnike za unošenje kao što su biolitička transformacija, transformacija posredovana agrobakterijom ili elektroporacija su poznate stručnjaku (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001).

[0102] [0060] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na transgenu biljku i njene delove, koji sadrže prethodno opisanu transgenu biljnu ćeliju. Deo pri tome može biti ćelija, tkivo, organ ili skup više ćelija, tkiva ili organa. Skup više organa je npr. cvet ili seme. U posebnoj izvedbi, pronalazak se odnosi na seme transgene biljke, pri čemu seme sadrži molekul nukleinske kiseline prema pronalasku kao transgen. Poželjno, transgena biljka predmetnog pronalaska, naročito biljka roda Beta, pokazuje u odnosu na patogen, naročito BNYVV, višu otpornost od korespondirajuće netransformisane biljke (biljka bez transgena). Nivo otpornosti, na primer, na BNYVV može se u biljkama roda Beta kvalitativno utvrditi određivanjem bonitetnih ocena (skale bonitetnih ocena za biljke roda Beta su poznate iz stanja tehnike, na primer, za šećernu repu; Mechelke (1997) Probleme in der Rizomaniaresistenzzüchtung, Vorträge für Pflanzenzüchtung, Resistenzzüchtung bei Zuckerrüben, Gesellschaft für Pflanzenzüchtung e.V., 113-123). Viša otpornost pokazuje se poboljšanjem otpornosti za najmanje jednu bonitetnu ocenu, za najmanje dve bonitetne ocene, za najmanje tri ili više bonitetnih ocena. Dalje, pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju transgene biljke, koji obuhvata korak unošenja molekula nukleinske kiseline prema pronalasku ili vektora predmetnog pronalaska u biljnu ćeliju i, opciono, korak selekcije transgene biljne ćelije. Dalje, takav postupak za proizvodnju transgene biljke je naznačen naknadnim korakom koji uključuje regeneraciju transgene biljke iz transgene biljne ćelije proizvedene u prvom koraku. Postupci za regeneraciju su poznati stručnjaku iz stanja tehnike.

[0103] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi i na postupak za posredovanje u otpornosti ili povećanje otpornosti na patogen, naročito BNYVV, u biljci, poželjno biljci roda Beta, koji obuhvata korak transformisanja biljne ćelije molekulom nukleinske kiseline prema pronalasku ili vektorom predmetnog pronalaska. Alternativno, kao što je prethodno opisano, iz genotipa osetljivog na WB može se proizvesti WB-rezistentan genotip pomoću nasumičnog ili ciljanog mutagenizovanja postojećeg endogenog wb-s gena.

[0104] Na primer, wb gen se može modifikovati mutacijom gena pomoću TALE nukleaza (TALEN-i) ili nukleaza cinkovog prsta (ZFN-ovi), kao i CRISPR/Cas sistema, koji su, između ostalog, na primer opisani u WO 2014/144155 A1 (Engineering plant genomes using CRISPR/Cas systems) i u Osakabe & Osakabe, Plant Cell Physiol, 56 (2015), 389‐400. Ovo se može postići i upotrebom postupka označenog kao TILLING (Targeted Induced Local Lesions in Genomes), pri čemu se, kao što je, primera radi, opisano u nemačkoj patentnoj prijavi DE 10 2013 101 617, izazivaju tačkaste mutacije u genu divljeg tipa i naknadno selektuju biljke koje poseduju pogodnu mutaciju, tj. mutaciju koja posreduje u otpornosti, kao npr. ječam otporan na virus žutog mozaika; videti DE 102013 101617 na stranama 4, 8 i 12 u paragrafima [0014], [0026] i [0038]. TILLING postupak je takođe detaljno opisan u publikaciji Henikoff et al. (Henikoff et al., Plant Physiol. 135, 2004, 630‐636).

[0105] Poželjno, ovaj postupak dovodi do poboljšanja otpornosti za najmanje jednu bonitetnu ocenu, naročito poželjno do poboljšanja otpornosti za najmanje dve, tri ili više bonitetnih ocena. Skale bonitetnih ocena za biljke roda Beta su poznate iz stanja tehnike, na primer, za šećernu repu Mechelke (1997). Nakon mutagenizovanja biljnih ćelija i naknadnog regenerisanja biljaka iz mutagenizovanih biljnih ćelija ili mutagenizovanja biljaka, mogu se, zatim, identifikovati one biljke koje u endogenom molekulu nukleinske kiseline, poželjno sa nukleotidnom sekvencom koja pod stringentnim uslovima hibridizuje sa sekvencom komplementarnom sa SEQ ID NO: 1, poseduju jednu ili više mutacija, kako je prethodno definisano.

[0106] [0064] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na BNYVV-rezistentnu biljku roda Beta ili njen deo, u kojoj je molekul nukleinske kiseline prema pronalasku endogeno prisutan, ili u kojoj su jedna ili više prethodno definisanih mutacija unete u endogeni molekul nukleinske kiseline koji inače korelira sa genotipom osetljivim na WB, pri čemu biljka ili njen deo ne pripadaju vrsti Beta vulgaris subsp. maritima. U primeru izvođenja, kod biljke prema pronalasku radi se o hibridnoj biljci ili duplo haploidnoj biljci. U daljem primeru izvođenja biljke prema pronalasku, molekul nukleinske kiseline ili jedna ili više mutacija, kako je prethodno definisano, nalaze se u heterozigotnom ili homozigotnom obliku. U slučaju, na primer, hibridne biljke, molekul nukleinske kiseline ili jedna ili više mutacija mogu se nalaziti i u hemizigotnom obliku.

[0107] Nadalje, prijava otkriva da biljka dodatno transgeno ili endogeno sadrži drugi molekul nukleinske kiseline na drugoj ili daljoj poziciji u genomu, koji kodira polipeptid koji je u stanju da posreduje u otpornosti na BNYVV u biljci u kojoj se polipeptid eksprimira usled transkripcije drugog molekula nukleinske kiseline. Druga ili dalja pozicija u genomu može značiti da je drugi molekul nukleotida lokalizovan izvan hromozomskog intervala hromozoma III od s3e4516s05 do s3e5918s01. Na primer, ukoliko već nije prisutan u polaznom genotipu, RZ-3 gen opisan u međunarodnoj prijavi WO 2014/202044 A1 može se pomoću ukrštanja ili transformacije uneti u wb-R biljku predmetne biljke. U predmetnoj prijavi se stoga otkrivaju wb-R/RZ-3-R biljke koje su poželjno homozigotne za jedan i naročito poželjno za oba gena otpornosti. U ovom kontekstu se podrazumeva da se, na osnovu obezbeđivanja informacije o sekvenci za wb-R gen u predmetnoj prijavi i npr. informacije o sekvenci opisane u pomenutoj WO 2014/202044 A1 za RZ-3 gen, takve dvostruko otporne biljke mogu po prvi put dobiti isključivo na osnovu ukrštanja i selekcije potpomognute markerima, tako da nisu potrebni nikakvi genetičko-inženjerski postupci.

[0108] Shodno tome, predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak za identifikaciju biljke roda Beta koja je otporna na patogen BNYVV, naznačen time, što postupak obuhvata sledeći korak:

[0110] (i) dokazivanje prisustva pomenutog molekula nukleinske kiseline, pri čemu polipeptid kodiran njime poseduje (i) glutamin (Q) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 307, ili (ii) arginin (R) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 437, i/ili

[0111] ekspresije pomenutog molekula nukleinske kiseline, pri čemu molekul nukleinske kiseline na onim mestima koja odgovaraju mestima u referentnoj nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1 poseduje sledeće nukleotidne supstitucije: (a) C umesto A na poziciji 919, ili (b) G umesto A na poziciji 1310; u biljci, odnosno uzorku iz nje; i/ili

[0112] (ii) dokazivanje prisustva pomenutog molekula nukleinske kiseline, pri čemu polipeptid kodiran njime poseduje (i) glutamin (Q) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 307, i (ii) arginin (R) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 437, i/ili

[0113] ekspresije pomenutog molekula nukleinske kiseline, pri čemu molekul nukleinske kiseline na onim mestima koja odgovaraju mestima u referentnoj nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1 poseduje sledeće nukleotidne supstitucije: (a) C umesto A na poziciji 919, i (b) G umesto A na poziciji 1310; u biljci, odnosno uzorku iz nje, i po potrebi (iii) selekciju BNYVV-rezistentne biljke.

[0115] Kako predmetna prijava otkriva, postupak povoljno može obuhvatiti dokazivanje najmanje jednog polimorfizma koji dovodi do zamene aminokiseline u odnosu na aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 1B (SEQ ID NO: 2), poželjno na jednom od mesta istaknutih u aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj na Slici 1D (SEQ ID NO: 4) (videti takođe legendu slike za Sliku 1) sa polimorfizmima istaknutim na Slici 1C (SEQ ID NO: 3) upotrebom molekularnih markera koji prepoznaju polimorfizme, naročito dijagnostičke polimorfizme. Poželjno, ovo dokazivanje se odvija upotrebom najmanje jednog molekularnog markera po polimorfizmu, naročito po dijagnostičkom polimorfizmu. Stručnjaku je poznato koje tehnike markera treba primeniti za dokazivanje odgovarajućeg polimorfizma i kako se konstruišu molekularni markeri za to. Dalje, predmetna prijava otkriva molekularne markere koji opisuju, odnosno detektuju polimorfizam prema Slici 1C ili D, kao i upotrebu molekularnog markera za detekciju polimorfizma prema Slici 1C i/ili D.

[0116] Dalje, prethodno navedeni postupci identifikacije predstavljaju i postupke za selekciju biljke koja poseduje otpornost na BNYVV. Postupak za selekciju obuhvata završni korak selekcije otporne biljke.

[0117] Dalje, susedni segmenti genomske DNK sekvence uzvodno od wb-R gena (kao SEQ ID NO: 3) i susedni segmenti genomske DNK sekvence nizvodno od wb-R gena, koji su lokalizovani u neposrednoj okolini, poželjno na hromozomu III i stoga tesno povezani sa wb-R genom, mogu se koristiti kao DNK regioni za razvoj dijagnostičkih markera za wb-R.

[0118] Stoga se predmetni pronalazak odnosi na postupak za selekciju biljke koja poseduje otpornost na BNYVV.

[0119] [0071] Kao što je u predmetnoj prijavi otkriveno, postupak za selekciju može obuhvatiti upotrebu molekularnog markera na DNK sekvenci prema SEQ ID NO: 3 i/ili na DNK sekvenci koja je lokalizovana u neposrednoj okolini, poželjno na hromozomu III. Poželjno, markeri lokalizovani u neposrednoj okolini, prema markerima s3e4516s05 i s3e5918s01 opisanim u primerima, nalaze se u opsegu od 0,11 cM, što odgovara fizičkoj dužini od oko 100.000 bp od wb-R gena i pokazuju uporedivu dijagnostičku vrednost (DW) kao (a) s3e4516s05_cyt / DW=0,89; levo flankirajući i (b) s3e5918s01 ade / DW=0,91; desno flankirajući. Postupak opisan u predmetnoj prijavi obično dalje obuhvata završni korak selekcije otporne biljke. Stručnjaku je poznato kako da na osnovu otkrivenih informacija o sekvencama razvije i upotrebi markere.

[0120] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi i na biljku, povoljno naročito BNYVV-rezistentnu biljku ili njen deo, koja je identifikovana i po potrebi selektovana pomoću postupka poput prethodno opisanog.

[0121] Predmetni pronalazak se naročito odnosi na populaciju biljaka koja sadrži biljke koje se mogu dobiti prema jednom od prethodno opisanih postupaka prema pronalasku i koje su poželjno otporne na bradatost korena (rizomaniju), odnosno na BNYVV zarazu, i odlikuju se prisustvom molekula nukleinske kiseline prema pronalasku. Poželjno, populacija poseduje najmanje 10, poželjno 50, poželjnije 100, naročito poželjno 500 i, naročito u poljoprivrednom gajenju, poželjno najmanje 1000 biljaka. Poželjno, udeo biljaka u populaciji koje ne nose molekul nukleinske kiseline prema pronalasku i/ili su podložne bradatosti korena iznosi ispod 25 %, poželjno ispod 20 %, poželjnije ispod 15 %, još poželjnije 10 %, a naročito poželjno ispod 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % ili 0,5 %, ako su uopšte prisutne.

[0122] Kao što je otkriveno u predmetnoj prijavi, dalje se mogu postići sledeće prednosti za oplemenjivanje i razvoj novih otpornih linija biljaka roda Beta: informacije o sekvencama, kao i identifikovani polimorfizmi, koji omogućavaju razlikovanje između rezistentnih wb-R i podložnih wb-s alela otkrivenog gena, čine mogućim razvoj markera direktno u genu, što, naročito u pogledu razvoja optimizovanih elitnih linija bez „linkage drag-a”, predstavlja značajno olakšanje za oplemenjivača biljaka. Osim toga, poznavanje sekvencne strukture može se koristiti za identifikaciju daljih novih gena otpornosti, naročito protiv rizomanije, koji su, na primer, delimično homologni ili ortologni.

[0123] Ovde otkrivena upotreba rezistentnog genskog alela u cis-genetičkim ili transgenetičkim pristupima otvara mogućnost razvoja novih rezistentnih sorti roda Beta koje poseduju višu otpornost na osnovu efekta doze ili kod kojih se slaganjem (stacking-om) otkrivenog gena sa drugim genima otpornosti, naročito sa RZ-3 genom, može izbeći probijanje otpornosti i optimizovati ispoljavanje otpornosti. Dalje, moguće su modifikacije gena pomoću TILLING-a ili ciljanog genomskog inženjeringa za razvoj novih alela otpornosti.

[0124] Kao što je otkriveno u predmetnoj prijavi, identifikovani rezistentni wb-R genski alel može se u biljci koristiti u genetičkom ili molekularnom slaganju (stack-u) sa drugim genetičkim elementima koji mogu posredovati u agronomski povoljnim osobinama. Time se ekonomska vrednost gajenih biljaka može značajno povećati, tako što se, na primer, povećava prinos ili se osvajaju nove površine za gajenje biljke koje prethodno, između ostalog zbog biotičkih faktora poput jakog pritiska patogena ili abiotičkih faktora poput suše, nisu bile dostupne za gajenje ove biljke. Naročito se predmetni pronalazak odnosi na upotrebu identifikovanog rezistentnog wb-R genskog alela u postupcima za kontrolu zaraze patogenom, virusom nekrotičnog žutila nerava repe (BNYVV), u poljoprivrednom ili hortikulturnom gajenju biljaka roda Beta, na primer, obuhvatajući identifikaciju i selekciju biljaka roda Beta pomoću jednog od prethodno opisanih postupaka i gajenje tako odabranih biljaka ili njihovog potomstva.

[0125] Agronomski povoljna osobina je, na primer, tolerancija na herbicid kao što je glifosat, glufosinat ili ALS inhibitori. Stručnjaku su iz stanja tehnike poznati brojni drugi herbicidi i njihova primenljivost. On se može osloniti na stanje tehnike da bi stekao znanje o tome koji genetički elementi i na koji način treba da se koriste da bi se odgovarajuća tolerancija implementirala u biljke. Dalji primer agronomski povoljne osobine je dodatna otpornost na patogene, pri čemu patogeni mogu biti, na primer, insekti, virusi, nematode, bakterije ili gljive. Kombinacijom različitih otpornosti/tolerancija na patogene može se, na primer, postići široka odbrana od patogena za biljku, pošto genetički elementi međusobno mogu ispoljavati dopunska dejstva. U ovu svrhu, stručnjaku su kao genetički elementi poznati, na primer, brojni geni otpornosti. Dalji primer agronomski povoljne osobine je tolerancija na hladnoću ili mraz. Biljke koje poseduju ovu osobinu mogle bi se sejati ranije u godini ili bi mogle duže, na primer, i tokom perioda mraza, ostati na polju, što bi, na primer, moglo dovesti do povećanih prinosa. I ovde se stručnjak može osloniti na stanje tehnike da bi pronašao pogodne genetičke elemente. Dalji primeri agronomski povoljnih osobina su efikasnost korišćenja vode, efikasnost korišćenja azota, kao i prinos. Genetički elementi koji se mogu upotrebiti da bi posredovali u takvim osobinama mogli bi se naći u stanju tehnike.

[0126] [0078] Stručnjaku su dalje poznate brojne modifikacije za odbranu od patogena. Pored često opisivanih familija R gena, mogli bi se povoljno upotrebiti Avr/R pristup, komplementacija Avr gena (WO 2013/127379), autoaktivacija R gena (WO 2006/128444), HIGS (host induced gene silencing) pristup (npr. WO2013/050024) ili VIGS (virus induced gene silencing) pristup. Naročito bi autoaktivacija R gena mogla biti od značaja za predmetni pronalazak. U ovu svrhu treba napraviti nukleinsku kiselinu koja kodira autoaktivirani protein otpornosti za stvaranje otpornosti na patogene kod biljaka. Ova nukleinska kiselina tada poseduje samo ograničeni deo NBS-LRR gena otpornosti, kao što je wb-R gen, koji se proteže od 5’ kraja kodirajućeg regiona NBS-LRR gena otpornosti nizvodno do početka NBS domena NBS-LRR gena otpornosti, pri čemu NBS-LRR gen otpornosti nije TIR-NBS-LRR gen otpornosti.

[0127] Dalje, predmetna prijava otkriva i upotrebu rezistentnog wb-R genskog alela, identifikovanog pomoću prethodno opisanog postupka, za kombinaciju sa prethodno navedenom modifikacijom ili sa prethodno opisanim genetičkim elementom koji može posredovati u jednoj ili više agronomski povoljnih osobina u biljci.

[0128] Dalje, predmetna prijava otkriva, pored biljke prema pronalasku, i seme ili potomstvo, ili organe, biljne delove, tkiva ili ćelije istih, u proizvodnji proizvoda uobičajeno izrađenih od obnovljivih sirovina, kao što su prehrambeni proizvodi i stočna hrana, poželjno šećer ili sirup (melasa), pri čemu se melasa koristi i za industrijske primene, na primer, u dobijanju alkohola ili kao hranljivi medijum za proizvodnju biotehnoloških proizvoda, u proizvodnji materijala ili supstanci za hemijsku industriju, npr. finih hemikalija, lekova odnosno njihovih prekursora, dijagnostika, kozmetike, bioetanola ili biogasa. Primer upotrebe šećerne repe kao biogenog materijala u biogasnim postrojenjima opisan je u prijavi DE 102012 022 178 A1, videti npr. paragraf 10.

[0129] Sledeći primeri pojašnjavaju pronalazak. Ukoliko nije drugačije navedeno, korišćeni su standardni molekularno-biološki postupci, videti na primer (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001), Fritsch et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989; Mayer et al., Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, eds., Academic Press, London, 1987) i Weir et al., Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, Blackwell, eds., 1986).

[0131] PRIMERI

[0133] Primer 1: Identifikacija gena (WB1) koji posreduje u otpornosti na rizomaniju (bradatost korena, WB) i njemu pripadajućih osetljivih alela

[0135] [0082] U populaciji šećerne repe (Beta vulgaris L.) sa introgresijom iz akcesije Beta vulgaris subsp. maritima, mogao se u ovoj introgresiji dokazati gen, odnosno genomski segment koji posreduje u otpornosti na bradatost korena (rizomaniju) pomoću markera sa dobrom dijagnostičkom vrednošću (DW), (a) s3e4516s05_cyt / DW=0,89; levo flankirajući i (b) s3e5918s01_ade / DW=0,91; desno flankirajući. Oba markera, međutim, nisu potpuno dijagnostička zbog pojavljivanja nul-alela u različitim pedigreima. Genomski region između s3e4516s05 i s3e5918s01 obuhvata genetičku dužinu od 0,11 cM, što odgovara fizičkoj dužini od oko 100.000 bp. Ovaj sekvencni region je visoko repetitivan i pokazuje jaku strukturnu varijaciju u različitim genotipovima; stoga je veoma teško razviti dalje dijagnostičke markere. Zbog nepoznavanja genetičke strukture genomskog segmenta koji posreduje u otpornosti na rizomaniju, dodatno je samo ograničeno moguće dalje redukovati potencijalni „negativni linkage drag” oko uzročnog gena.

[0136] Prvi eksperimenti za bliže sužavanje relevantnog genomskog segmenta i po potrebi pronalaženje gena koji posreduje u uočenoj otpornosti, odnosno genskog lokusa odgovornog za osobinu osetljivosti biljaka na rizomaniju, nisu uspeli, između ostalog, zato što je ciljni region veoma repetitivan i pokazuje jaku strukturnu varijaciju (nul-alele) u mnogim genotipovima, a dalji markeri sa visokom dijagnostičkom vrednošću nisu stajali na raspolaganju. Osim toga, analiza ekspresije kandidatnih gena u ciljnom regionu isprva nije pružio dokaz, tj. specifičan odgovor na infekciju rizomanijom. Konačno, i fenotipizacija biljaka se pokazala teškom, pošto ispoljavanje otpornosti iz nepoznatih razloga nije uvek bilo jednoznačno, tako da se isprva sumnjalo i na prisustvo multigenske otpornosti i/ili epigenetskih efekata, koji su tek povećanjem broja ispitivanih biljaka sa 90-180 potomaka i intenzivnim statističkim postupcima (t-test, analiza snage) mogli biti isključeni.

[0137] [0084] U daljim sprovedenim eksperimentima i analizama moglo se, zatim, pomoću kloniranja baziranog na mapiranju („Map Based Cloning”), koje je obuhvatalo, između ostalog, korake genetičkog finog mapiranja, fizičkog mapiranja, analize sekvence celog genoma (WHG), formiranja veoma velike segregirajuće populacije od preko 2000 F2 potomaka, skrininga rekombinanti, razvoja markera u ciljnom regionu, uporednog sekvenciranja BAC u rezistentnim (RR) i osetljivim/podložnim (ss) genotipovima, bioinformatičkih analiza, predviđanja proteina i poređenja proteina, utvrditi da je jedan NB-ARC (NBS-LRR) gen odgovoran za uočenu otpornost na rizomaniju. Ovaj NBS-LRR gen je identifikovan intenzivnim finim mapiranjem, pri čemu se zbog kompleksnosti sekvence asembliranje RR-sekvenci i ss-sekvenci nije dobilo bez problema, već se tek analizom potomstva 4 najbliže rekombinantne biljke (2 direktne rekombinante levo i dve direktne rekombinante desno oko gena) NBS-LRR gen mogao precizno identifikovati. Sekvenca NBS-LRR gena rezistentnog genotipa prikazana je u SEQ ID NO: 3, a njemu pripadajući gen, odnosno genotip, nazvan je „wb-R” za „Wurzelbärtigkeit-Resistenz” (otpornost na bradatost korena). U NBS-LRR genu je pronađeno ukupno 17 „nesinonimskih”jednonukleotidnih polimorfizama (SNP-ova) (polimorfizmi koji dovode do zamene aminokiseline u proteinu). Na osnovu podataka o sekvencama koji se sastoje od osetljivih i rezistentnih genotipova pokazalo se da je 5 od tih zamena aminokiselina potpuno dijagnostičko:

[0139] K307Q, „C” umesto „A” u genomskoj sekvenci na poziciji 919 u rezistentnom genotipu, što zamenjuje kodirani lizin (K) na poziciji 307 osetljivog gena glutaminom (Q),

[0140] Q437R, „G” umesto „A” u genomskoj sekvenci na poziciji 1310 u rezistentnom genotipu, što zamenjuje kodirani glutamin (Q) na poziciji 437 osetljivog gena argininom (R),

[0141] R566H, „A” umesto „G” u genomskoj sekvenci na poziciji 1697 u rezistentnom genotipu, što zamenjuje kodirani arginin (R) na poziciji 566 osetljivog gena histidinom (H),

[0142] Q731K, „A” umesto „C” u genomskoj sekvenci na poziciji 2191 u rezistentnom genotipu, što zamenjuje kodirani glutamin (Q) na poziciji 731 osetljivog gena lizinom (K), i

[0143] P831S, „T” umesto „C” u genomskoj sekvenci na poziciji 2491 u rezistentnom genotipu, što zamenjuje kodirani prolin (P) na poziciji 831 osetljivog gena serinom (S); videti Sliku 1. Na osnovu tačaka rekombinacije, jedna od dve ili obe zamene aminokiselina, K307Q ili Q437R, mogu se smatrati uzročnim za posredovanje u otpornosti. Odgovarajuće sekvence gena, odnosno genotipovi koji koreliraju sa fenotipom osetljivim na bradatost korena nazivaju se - takođe „wb-s” za „Wurzelbärtigkeit-sensitiv” (osetljiv na bradatost korena).

[0145] Primer 2: Validacija wb-R gena pomoću RNAi pristupa

[0147] [0085] Pored verifikacije gena korišćenjem bliskih rekombinanta opisanih gore, efekat otpornosti gena može se demonstrirati korišćenjem RNK interferencije kao dodatnog sredstva dokazivanja; videti, na primer, verifikaciju RZ-3 gena opisanu u Primerima međunarodne prijave WO 2014/202044 A1 ili verifikaciju vil gena opisanu u Primerima međunarodne prijave WO 2011/032537 A1. U tu svrhu, rezistentni standardni genotip šećerne repe se transformiše DNK konstrukcijom koja kodira dvolančanu RNK u obliku ukosnica. Ova dsRNK je sposobna da izazove posttranskripciono utišavanje gena, što bi smanjilo ili eliminisalo aktivnost rezistentnog alela wb-R gena, čineći tako prethodno rezistentni genotip šećerne repe osetljivim na bolest bradatost korene (rizomaniju).

[0148] Za pripremu odgovarajućeg DNK konstrukta odabira se definisani ciljni sekvencni region rezistentnog wb-R genskog alela dužine od, na primer, 400-500 baznih parova, poželjno iz regiona kodirajuće sekvence koji su specifični za rezistentni wb-R genski alel, amplifikuje se pomoću PCR-a i klonira kako u sens tako i u antisens smeru u vektor pZFN, koji je pogodan za sintezu hairpin-struktura (videti Sl. 6 međunarodne prijave WO 2014/202044 A1). Ovaj vektor poseduje dvostruki CaMV 35S promotor, višestruko mesto kloniranja, intron iz gena AtAAP6, koji u Arabidopsis thaliana kodira permeazu aminokiselina, dalje višestruko mesto kloniranja, kao i nos-terminator. Transformacija šećerne repe pripremljenim vektorom vrši se prema protokolu Lindsey & Gallois, J. Exp. Bot.41 (1990), 529‐536, uz upotrebu antibiotika kanamicina kao selekcionog markera. Nakon više koraka selekcije, uspešna transformacija se proverava na transgenim izdancima pomoću PCR-a dokazivanjem prisustva nptII gena, AAP6 introna i obe granične t-DNK sekvence (LB/RB) i odsustva vir. Pozitivni izdanci se in vitro klonski umnožavaju na po 30 izdanaka, puštaju korenje i prebacuju se u zemlju u stakleniku. Oko 2 nedelje kasnije, transgene biljke šećerne repe pikiraju se u zemlju kontaminiranu rizomanijom, u kojoj se gaje 8 do 10 nedelja. Kao kontrola koriste se, pod istim uslovima, netransformisane biljke iste rezistentne genetičke standardne transformacione pozadine. Za dokazivanje ispoljavanja rizomanije, korenovi biljaka šećerne repe se vade iz zemlje i pomoću ELISA testa kvantifikuje se zaraza BNYVV, pri čemu niska ELISA vrednost ukazuje na otpornost, a visoka vrednost na osetljivost (Mechelke 1997, gore; Clark & Adams, J. Gen. Virol.

[0149] 34 (1977), 475‐483). ELISA vrednost transformisane šećerne repe je, očekivano, sa srednjom vrednošću od 3-4 značajno viša od ELISA vrednosti i dalje rezistentne kontrole sa srednjom vrednošću od 1-2 i uporediva je sa osetljivim standardom. Nakon toga se rezultatima ELISA testa može pokazati da specifičnim utišavanjem gena (Gene Silencing) rezistentnog wb-R alela u transformacionoj pozadini, prethodno rezistentna biljka postaje osetljiva na BNYVV. Shodno tome, wb-R gen predmetnog pronalaska može se jednoznačno verifikovati kao gen otpornosti.

[0150] [0087] Validacija funkcije gena se dalje može sprovesti komplementacijom biljke osetljive na WB, naročito šećerne repe, wb-R genom prema pronalasku, na primer, time što se u osetljivi genotip transformiše biljni ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline sa nukleotidnom sekvencom iz SEQ ID NO: 3, odnosno ekvivalentnom nukleotidnom sekvencom koja kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 4, od kojih je svaka pod kontrolom konstitutivnog promotora. Za transformaciju se načelno može koristiti prethodno opisani pZFN vektor i pomenute tehnike, ili takođe one koje su prethodno opisane u opštem opisu.

Claims (15)

1. Patentni zahtevi

1. Molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji je u stanju da posreduje u otpornosti na patogen u biljci u kojoj se polipeptid eksprimira, naznačen time, što molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu koja je izabrana iz

(a) nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80 % identična sa SEQ ID NO: 2,

pri čemu molekul nukleinske kiseline poseduje jednu ili više mutacija koje dovode do toga da polipeptid, koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline, na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 307, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od lizina (K), i/ili na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 437, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od glutamina (Q); i

(b) nukleotidne sekvence koja hibridizuje sa sekvencom komplementarnom sa SEQ ID NO: 1 pod stringentnim uslovima, pri čemu nukleotidna sekvenca na onim mestima koja odgovaraju mestima u referentnoj nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1 poseduje jednu ili više sledećih nukleotidnih supstitucija: C umesto A na poziciji 919; G umesto A na poziciji 1310; A umesto G na poziciji 1697; A umesto C na poziciji 2191; i/ili T umesto C na poziciji 2491;

pri čemu je poželjno da patogen bude virus nekrotičnog žutila nerava repe (BNYVV), a biljka da bude biljka roda Beta, poželjno šećerna repa (Beta vulgaris L.).

2. Molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što kodirani polipeptid dalje (i) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 566, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od arginina (R), i/ili (ii) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 731, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od glutamina (Q), i/ili (iii) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 831, poseduje aminokiselinu koja se razlikuje od prolina (P).

3. Molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što kodirani polipeptid (i) poseduje glutamin (Q) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj

sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 307, i/ili (ii) poseduje arginin (R) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 437, i/ili (iii) poseduje histidin (H) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 566, i/ili (iv) poseduje lizin (K) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 731, i/ili (v) poseduje serin (S) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 831.

4. Molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 3, naznačen time, što molekul nukleinske kiseline na onim mestima koja odgovaraju mestima u referentnoj nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1 poseduje jednu ili više sledećih nukleotidnih supstitucija:

(a) C umesto A na poziciji 919;

(b) G umesto A na poziciji 1310;

(c) A umesto G na poziciji 1697;

(d) A umesto C na poziciji 2191; i/ili

(e) T umesto C na poziciji 2491.

5. Molekul nukleinske kiseline prema jednom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time, što molekul nukleinske kiseline kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 4 i/ili sadrži kodirajuću DNK sekvencu prema SEQ ID NO: 3.

6. Vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema jednom od patentnih zahteva 1 do 5.

7. Transgena biljna ćelija, poželjno od biljke roda Beta, koja sadrži molekul nukleinske kiseline prema jednom od patentnih zahteva 1 do 5 kao transgen, opciono pod kontrolom heterolognog promotera, ili vektor prema patentnom zahtevu 6.

8. Transgena biljka, poželjno roda Beta, ili njen deo, koja sadrži biljnu ćeliju prema patentnom zahtevu 7.

9. BNYVV-rezistentna biljka vrste Beta vulgaris ili njen deo, u kojoj je molekul nukleinske kiseline prema jednom od patentnih zahteva 1 do 5 endogeno prisutan, ili u kojoj su jedna ili više mutacija, definisanih u jednom od patentnih zahteva 1 do 4, unete u endogeni

molekul nukleinske kiseline sa nukleotidnom sekvencom koja sadrži sekvencu prema SEQ ID NO: 1 ili koja hibridizuje sa sekvencom komplementarnom sa SEQ ID NO: 1 pod stringentnim uslovima, pri čemu biljka ili njen deo ne pripada podvrsti Beta vulgaris subsp. maritima.

10. Biljka prema patentnom zahtevu 8 ili 9, naznačena time, što je biljka hibridna biljka ili duplo haploidna biljka i/ili što se molekul nukleinske kiseline ili jedna ili više mutacija nalaze u heterozigotnom ili homozigotnom obliku.

11. Seme biljke prema jednom od patentnih zahteva 8 do 10, pri čemu seme transgeno ili endogeno sadrži jedan ili više prethodno navedenih molekula nukleinske kiseline ili vektora.

12. Postupak za proizvodnju BNYVV-rezistentne biljke, koji obuhvata sledeće korake:

(a) mutagenizovanje biljnih ćelija i naknadno regenerisanje biljaka iz mutagenizovanih biljnih ćelija ili mutagenizovanje biljaka, i

(b) identifikovanje biljke iz (a) koja u endogenom molekulu nukleinske kiseline poseduje jednu ili više mutacija definisanih u jednom od patentnih zahteva 1 do 5.

13. Postupak za identifikaciju biljke roda Beta koja je rezistentna na patogen BNYVV, naznačen time, što postupak obuhvata sledeći korak:

(i) dokazivanje prisustva molekula nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 3, pri čemu polipeptid kodiran njime poseduje (i) glutamin (Q) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 307, ili (ii) poseduje arginin (R) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 437, i/ili ekspresije molekula nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 4, pri čemu molekul nukleinske kiseline na onim mestima koja odgovaraju mestima u referentnoj nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1 poseduje sledeće nukleotidne supstitucije: (a) C umesto A na poziciji 919, ili (b) G umesto A na poziciji 1310; u biljci, odnosno uzorku iz nje; i/ili

(ii) dokazivanje prisustva molekula nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 3, pri čemu polipeptid kodiran njime poseduje (i) glutamin (Q) na onoj poziciji koja u

referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 307, i (ii) poseduje arginin (R) na onoj poziciji koja u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2 odgovara poziciji 437, i/ili ekspresije molekula nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 4, pri čemu molekul nukleinske kiseline na onim mestima koja odgovaraju mestima u referentnoj nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 1 poseduje sledeće nukleotidne supstitucije: (a) C umesto A na poziciji 919, i (b) G umesto A na poziciji 1310; u biljci, odnosno uzorku iz nje, i po potrebi

(iii) selekciju BNYVV-rezistentne biljke.

14. Populacija biljaka koja sadrži biljke prema jednom od patentnih zahteva 9 ili 10 ili biljke koje su identifikovane i po potrebi selektovane pomoću postupka prema patentnom zahtevu 13.

15. Postupak za kontrolu zaraze patogenom virusom nekrotičnog žutila nerava repe (BNYVV) u poljoprivrednom ili hortikulturnom gajenju biljaka roda Beta, koji obuhvata

I) identifikaciju i selekciju biljaka roda Beta pomoću postupka prema patentnom zahtevu 13 i

II) gajenje biljaka iz I) ili njihovog potomstva.