ES3051145T3

ES3051145T3 - Stable protein solution formulation containing high concentration of an anti-vegf antibody

Info

Publication number: ES3051145T3
Application number: ES15798609T
Authority: ES
Inventors: Huixiang Zhang; Charles Boring; Alok Kulshreshtha; Yuhong Zeng; Li Wan; Laman Alani
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2014-11-07
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2025-12-26
Anticipated expiration: 2035-11-06
Also published as: IL251696A0; IL265497B; JP6753848B2; KR102588846B1; EP3215123A1; IL251642B; RU2017119647A3; US20160340420A1; US12049495B2; CL2017001115A1; JP2022141923A; CN107635580A; AU2018278870A1; RU2020114917A; CN120938921A; MY193913A; BR112017008660A2; CL2017001117A1; MY183807A; AU2015342815A1

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos anti-VEGF formulados como composiciones farmacéuticas acuosas de alta concentración, aptas para inyección, preferiblemente intravítrea. Estas composiciones farmacéuticas acuosas son útiles para administrar una alta concentración del principio activo del anticuerpo a un paciente sin altos niveles de agregación de anticuerpos ni una alta concentración de partículas subvisibles. Una composición acuosa de la invención comprende un anticuerpo con una concentración de al menos 50 mg/ml. Una composición farmacéutica acuosa de la invención incluye un azúcar, un agente tampón y un surfactante. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Formulación de solución de proteína estable que contiene una alta concentración de un anticuerpo anti-VEGF

[0003] La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad sobre la solicitud provisional de EE. UU. con n.º de serie 62/088.061, presentada el 5 de diciembre de 2014, y sobre la solicitud provisional de EE. UU. con n.º de serie 62/076.770, presentada el 7 de noviembre de 2014.

[0004] Campo de la invención

[0005] La presente invención se refiere a formulaciones farmacéuticas acuosas de anticuerpos anti-VEGF, a un proceso para la preparación de las mismas y a usos de las formulaciones.

[0006] Antecedentes de la invención

[0007] El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es un conocido regulador de la angiogénesis y la neovascularización, y se ha demostrado que es un mediador clave de la neovascularización asociada a tumores y trastornos intraoculares (Ferraraet al. Endocr.Rev. 18:4-25 (1997)). El ARNm del VEGF se sobreexpresa en muchos tumores humanos, y la concentración de VEGF en los fluidos oculares está altamente correlacionada con la presencia de proliferación activa de vasos sanguíneos en pacientes diabéticos y con otras retinopatías relacionadas con la isquemia (Berkmanet al.,J Clin Invest91:153-159 (1993); Brownet al. Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brownet al. Cancer Res. 53:4727-4735 (1993); Matternet al. Brit. J. Cancer.73:931-934 (1996); y Dvoraket al. Am J. Pathol.146:1029-1039(1995); Aielloet al.N. Engl. J. Med.331:1480-1487 (1994)). Además, se ha demostrado en estudios recientes la presencia de VEGF localizado en membranas neovasculares coroideas en pacientes afectados por DMAE (Lópezet al. Invest.Ophtalmo.Vis. Sci.37:855-868 (1996)). Los anticuerpos neutralizantes anti-VEGF pueden utilizarse para suprimir el crecimiento de diversas líneas celulares tumorales humanas en ratones desnudos y también para inhibir la angiogénesis intraocular en modelos de trastornos isquémicos de la retina (Kimet al. Nature362:841-844 (1993); Warrenet al. J. Clin.Invest95:1789-1797 (1995); Borgstromet al. Cancer Res. 56:4032-4039 (1996); y Melnyket al. Cancer Res.56:921-924 (1996)) (Adamiset al. Arch. Opthalmol.114:66-71 (1996)).

[0008] Varios anticuerpos están aprobados para uso terapéutico en seres humanos y otros mamíferos, incluidos los anticuerpos anti-VEGF. La concentración de los anticuerpos terapéuticos en las formulaciones farmacéuticas líquidas varía mucho en función, por ejemplo, de la vía de administración. A menudo se necesita una formulación de alta concentración de un anticuerpo cuando se desean volúmenes pequeños. Por ejemplo, las formulaciones de alta concentración pueden ser deseables para la inyección intravítrea o la administración subcutánea.

[0009] Sin embargo, las formulaciones con alta concentración de anticuerpos pueden tener un periodo de validez corto, y los anticuerpos formulados pueden perder actividad biológica debido a inestabilidades químicas y físicas durante su conservación. Se sabe que la agregación, la desamidación y la oxidación son las causas más comunes de la degradación de los anticuerpos. En particular, la agregación puede conducir potencialmente a un aumento de la respuesta inmunitaria en los pacientes, lo que plantea problemas de seguridad. Por lo tanto, debe minimizarse o prevenirse.

[0010] La formación de partículas en las formulaciones bioterapéuticas es también un importante problema de calidad, ya que las partículas en el intervalo de tamaño de decenas de micrómetros a submilimétricas y milimétricas pueden generalmente verse a simple vista (véase Das, 2012,AAPS Pharm SciTech, 13:732-746). Las partículas de los preparados oftálmicos terapéuticos pueden causar lesiones oculares. Por lo tanto, existen normas de registro farmacéutico para garantizar que el contenido de partículas subvisibles en las formulaciones oftálmicas esté dentro de ciertos límites. Por ejemplo, la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) ha establecido requisitos para las partículas en las soluciones oftálmicas, de modo que el número máximo de partículas ≥10 µm de diámetro es de 50 por ml, el número máximo de partículas ≥25 µm de diámetro es de 5 por ml, y el número máximo de partículas ≥50 µm de diámetro es de 2 por ml, determinado por el método microscópico de recuento de partículas (véase el capítulo general <789> de la USP).

[0011] Se conocen métodos para producir formulaciones de anticuerpos de alta concentración. Sin embargo, no existe una estrategia universal para superar el impacto impredecible de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo en su tendencia a formar agregados o degradarse en presencia de diversos excipientes farmacéuticos, tampones, etc. Además, preparar una formulación oftálmica con una alta concentración de proteína (como un anticuerpo) que contenga un nivel aceptable de partículas subvisibles es un reto y no es predecible. Además, los documentos US 2006/088523 y US 2013/004484 se refieren a composiciones que comprenden anticuerpos anti-VEGF.

[0012] Es un objeto de la invención proporcionar formulaciones adicionales y mejoradas con alta concentración de anticuerpos anti-VEGF y bajos niveles de agregación de anticuerpos y partículas subvisibles, que sean adecuadas para la administración a un ser humano, en particular a un ojo humano.

[0013] Sumario de la invención

[0014] Por consiguiente, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica acuosa que comprende una alta concentración de anticuerpo anti-VEGF adecuada para inyección oftálmica. En ciertos aspectos, las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención presentan niveles de bajos a indetectables de agregación o degradación del anticuerpo, con muy poca o ninguna pérdida de las actividades biológicas durante la fabricación, preparación, transporte y largos periodos de almacenamiento, siendo la concentración del anticuerpo anti-VEGF de al menos aproximadamente 50 mg/ml, 60 mg/ml, 80 mg/ml, 100 mg/ml, 120 mg/ml, 140 mg/ml, 160 mg/ml, 180 mg/ml o 200 mg/ml.

[0015] La invención proporciona composiciones farmacéuticas acuosas que comprenden un anticuerpo anti-VEGF, un estabilizante, un tampón y un tensioactivo. En ciertos aspectos, una composición farmacéutica acuosa comprende: (i) al menos 50 mg/ml de un anticuerpo anti-VEGF, (ii) sacarosa o trehalosa como estabilizante, (iii) un tampón de citrato o histidina, y (iv) polisorbato 80 como tensioactivo de acuerdo con la reivindicación 1.

[0016] En ciertos aspectos, la composición farmacéutica acuosa comprende aproximadamente un 4,5 %-11 % p/v de sacarosa o un 5 %-10 % de trehalosa, de un 0,006 % a un 0,012 % (p/v) de ácido cítrico, de un 0,2 % a un 0,6 % (p/v) de citrato trisódico dihidratado, y de aproximadamente un 0,01 % a un 0,1 % (p/v) de polisorbato 80, en donde el pH de la formulación es de 6,3 a 7,3.

[0017] Las realizaciones preferidas específicas de la invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción más detallada de ciertas realizaciones preferidas y de las reivindicaciones.

[0018] Breve descripción de los dibujos

[0019] La FIG. 1 muestra un gráfico de los resultados de un ensayo de turbidez para 1008 formulado a diferentes pH. El eje x muestra el tiempo de incubación a 55 °C; mientras que el eje y muestra la densidad óptica controlada a 350 nm. Las FIG. 2A y FIG. 2B muestran un ensayo de turbidez que controla los cambios en la DO<360>para diferentes formulaciones de 1008 incubadas a 55 °C durante 180 min (FIG. 2A). Las curvas de DO<360>obtenidas en 60 min se amplían y se muestran en la (FIG. 2B). Los números de muestra de las figuras 2A y 2B corresponden al número de formulación de la Tabla 13.

[0020] La FIG.3 muestra un ensayo de turbidez con datos recogidos entre cero y 90 minutos para simplificar. El experimento completo duró 180 minutos. Los cambios en la DO<360>se monitorizaron para diferentes formulaciones de 1008 incubadas a 55 °C. Los números de muestra de la figura corresponden a los números de formulación de la tabla 15. La FIG. 4 es un gráfico que muestra los resultados de la SEC para el pico principal en las ocho formulaciones seleccionadas durante la conservación de 6 semanas a 40 °C.

[0021] Descripción detallada de la invención

[0022] La invención proporciona composiciones farmacéuticas acuosas que comprenden una alta concentración de un anticuerpo anti-VEGF. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica acuosa de la invención es estable durante al menos 18 meses a 2-8 °C y es adecuada para la administración ocular, incluida por inyección o infusión. En una realización particular, una composición farmacéutica acuosa de la invención cumple los requisitos del capítulo <789> de la USP relativos a la presencia de materia particulada. Por tanto, en ciertas realizaciones, el número máximo de partículas ≥10 µm de diámetro en una composición farmacéutica acuosa de la invención es de 50 por ml, el número máximo de partículas ≥25 µm de diámetro en una composición farmacéutica acuosa de la invención es de 5 por ml, y el número máximo de partículas ≥50 µm de diámetro en una composición farmacéutica acuosa de la invención es de 2 por ml, determinándose dichos números de partículas por el método de oscurecimiento por luz y/o recuento microscópico de partículas, según los requisitos del capítulo general <789> de la Farmacopea Europea).

[0023] Como se utiliza en el presente documento, una composición farmacéutica "acuosa" es una composición adecuada para uso farmacéutico, en donde el portador acuoso es agua destilada. Una composición adecuada para uso farmacéutico puede ser estéril, homogénea y/o isotónica. Las composiciones farmacéuticas acuosas pueden prepararse directamente en forma acuosa, por ejemplo en jeringa precargada lista para su uso (las "formulaciones líquidas") o como liofilizado para su reconstitución poco antes de su uso. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "composición farmacéutica acuosa" se refiere a la formulación líquida o a la formulación liofilizada reconstituida. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención son adecuadas para la administración oftálmica a un sujeto humano. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención son adecuadas para la administración intravítrea. En otra realización, las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención son adecuadas para la administración por infusión intravítrea.

[0024] La presente invención proporciona formulaciones farmacéuticas novedosas, en particular formulaciones farmacéuticas novedosas en las que el principio activo comprende anticuerpos contra el VEGF humano. En un aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica acuosa con alta concentración de anticuerpos anti-VEGF. Los anticuerpos anti-VEGF preferidos en las formulaciones de la invención se describen en el documento WO 2009/155724,

[0025] El término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir,"porción de unión a antígeno", "polipéptido de unión a antígeno" o "inmuno-ligante") o cadena simple del mismo. Un "anticuerpo" incluye una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porción de unión a antígeno de la misma. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como V<H>) y una región constante de cadena pesada. La región constante de la cadena pesada se compone de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como V<L>) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera se compone de un dominio, CL. Las regiones V<H>y V<L>pueden subdividirse a su vez en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada V<H>y V<L>se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el aminoterminal al carboxiterminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del hospedador, incluidas diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.

[0027] La expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo") se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (p. ej., VEGF). Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede ejercerse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Algunos ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro de la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente formado por los dominios V<L>, V<H>, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')<2>, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd formado por los dominios V<H>y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios V<L>y V<H>de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento de dominio único o dAb (Wardet al., (1989)Nature341:544-546), que consiste en un dominio V<H>; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada o (vii) una combinación de dos o más CDR aisladas que opcionalmente pueden estar unidas mediante un enlazador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V<L>y V<H>, están codificados por genes separados, pueden unirse, mediante métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite formar una única cadena proteica en la que las regiones V<L>y V<H>se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenarios (scFv); véase p. ej., Birdet al. (1988)Science242:423-426; y Hustonet al.(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883). También se pretende que dichos anticuerpos monocatenarios estén abarcados dentro de la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen empleando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y se explora la utilidad de los anticuerpos del mismo modo que para los anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos pueden ser de distinto isotipo, por ejemplo, un anticuerpo IgG (p. ej., un subtipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM.

[0028] En una realización preferida, una composición farmacéutica acuosa de la invención comprende una cadena pesada variable que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera variable que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2.

[0030] VH: SEQ ID NO: 1

[0033]

[0036] En otra realización preferida, el anticuerpo anti-VEGF es un fragmento de anticuerpo Fv monocatenario (scFv) que comprende la secuencia:

[0037]

[0040] Un anticuerpo anti-VEGF en una composición farmacéutica acuosa de la invención puede producirse, por ejemplo, como se describe en el documento WO 2009/155724. Un scFv puede producirse utilizando un vector de expresión, como se describe en dicho documento. Una metionina derivada del codón de inicio en un vector de expresión está presente en la proteína final en los casos en los que no se ha escindido postraduccionalmente (véase la SEQ ID NO: 4 en los ejemplos). En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VEGF en una composición farmacéutica acuosa de la invención comprende la CDR1, la CDR2 y la CDR3 de cadena pesada como se expone en las SEQ ID NO: 5, 6 y 7 respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se exponen en las SEQ ID NO: 8, 9 y 10.

[0042] SEQ ID NO: 5 GFSLTDYYYMT

[0044] SEQ ID NO: 6 FIDPDDDPYYATWAKG

[0046] SEQ ID NO: 7 GDHNSGWGLDI

[0048] SEQ ID NO: 8 QASEIIHSWLA

[0049] SEQ ID NO: 9 LASTLAS

[0051] SEQ ID NO: 10 QNVYLASTNGAN

[0052] En una realización, la concentración de un anticuerpo anti-VEGF en la composición farmacéutica acuosa de la invención es de al menos 50 mg/ml. Preferentemente, la composición farmacéutica acuosa de la invención comprende aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 60 mg/ml, aproximadamente 70 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 90 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 110 mg/ml, aproximadamente 120 mg/ml, aproximadamente 130 mg/ml, aproximadamente 140 mg/ml, aproximadamente 150 mg/ml, aproximadamente 160 mg/ml, aproximadamente 170 mg/ml, aproximadamente 180 mg/ml, aproximadamente 190 mg/ml, aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 210 mg/ml, aproximadamente 220 mg/ml, aproximadamente 230 mg/ml, aproximadamente 240 mg/ml, aproximadamente 250 mg/ml o aproximadamente 300 mg/ml de un anticuerpo anti-VEGF.

[0053] En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica acuosa de la invención comprende entre 60 mg/ml y 120 mg/ml de un anticuerpo anti-VEGF, por ejemplo, un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.

[0054] En una realización, la composición farmacéutica acuosa de la invención comprende 60 mg/ml de un anticuerpo anti-VEGF que comprende la SEQ ID NO: 3.

[0055] En otra realización, la composición farmacéutica acuosa de la invención comprende 120 mg/ml de un anticuerpo anti-VEGF que comprende la SEQ ID NO: 3.

[0056] Las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención incluyen, además del anticuerpo anti-VEGF, otros componentes como uno o más de los siguientes: (i) un estabilizante; (ii) un agente tampón; (iii) un tensioactivo; aminoácido de acuerdo con la reivindicación 1. Además, la inclusión de cada uno de estos componentes adicionales puede dar lugar a composiciones con baja agregación del anticuerpo anti-VEGF. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención incluyen, además del anticuerpo anti-VEGF: (i) un estabilizante; (ii) un agente tampón; y (iii) un tensioactivo.

[0057] Los estabilizantes adecuados para su uso con la invención pueden actuar, por ejemplo, como agentes mejoradores de la viscosidad, agentes espesantes, agentes solubilizantes y/o similares. El estabilizante puede ser iónico o no iónico (p. ej. azúcares). Como azúcares se incluyen, pero sin limitación, monosacáridos, p. ej., fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, p. ej. lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares; polisacáridos, p. ej. rafinosa, melezitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol) y similares. Por ejemplo, el azúcar puede ser sacarosa, trehalosa, rafinosa, maltosa, sorbitol o manitol. El azúcar puede ser un alditol o un aminoazúcar. Se prefieren la sacarosa y la trehalosa. El más preferido es la sacarosa. Como estabilizante iónico pueden incluirse sales como NaCl o componentes de aminoácidos, tales como arginina-HCl.

[0058] Los agentes tampón adecuados para la invención incluyen, pero sin limitación, sales de ácidos orgánicos, tales como sales de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético o ácido ftálico; Tris, clorhidrato de trometamina o tampón fosfato. Además, los componentes de aminoácidos también pueden utilizarse como agentes tampón. Son particularmente útiles las soluciones tampón de citrato o histidina, incluida la solución tampón de histidina 10-20 mM, por ejemplo, del 0,13 % al 0,26 % (p/v) de histidina y del 0,03 %-0,07 % (p/v) de clorhidrato de histidina monohidratado), o de tampón citrato 10-20 mM, por ejemplo, del 0,006 % al 0,012 % (p/v) de ácido cítrico y del 0,2 % al 0,6 % (p/v) de citrato trisódico dihidratado. El ácido cítrico utilizado en una formulación de la invención puede tener cualquier forma de hidratación, por ejemplo anhidra o monohidratada.

[0060] Las composiciones farmacéuticas acuosas incluyen dicho agente tampón o agente de ajuste del pH para proporcionar un control mejorado del pH. En cierta realización, una composición farmacéutica acuosa de la invención tiene un pH entre 5,0 y 8,0, entre 5,0 y 7,0, entre 6,0 y 8,0, o entre 6,0 y 7,0. En una realización, el pH de una composición farmacéutica acuosa de la invención es de aproximadamente 6,3 a aproximadamente 7,3. En una realización específica, una composición farmacéutica acuosa de la invención tiene un pH de aproximadamente 6,8.

[0062] Como se utiliza en el presente documento, el término "tensioactivo" se refiere a sustancias orgánicas con estructuras anfipáticas; es decir, están compuestos por grupos con tendencias de solubilidad opuestas, normalmente una cadena de hidrocarburos soluble en aceite y un grupo iónico soluble en agua. Los tensioactivos pueden clasificarse, en función de la carga del resto tensioactivo, en agentes aniónicos, catiónicos y dispersantes para diversas composiciones farmacéuticas y preparaciones de materiales biológicos.

[0064] Los tensioactivos adecuados para la invención incluyen, entre otros, tensioactivos no iónicos, tensioactivos iónicos y tensioactivos zwitteriónicos. Los tensioactivos típicos para su uso con la invención incluyen, pero sin limitación, ésteres de ácidos grasos de sorbitán (p. ej., monocaprilato de sorbitán, monolaurato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán), trioleato de sorbitán, ésteres de ácidos grasos de glicerina (p. ej., monocaprilato de glicerina, monomiristato de glicerina, monoestearato de glicerina), ésteres de ácido graso de poliglicerina (p. ej., monoestearato de decaglicerilo, diestearato de decaglicerilo, monolinoleato de decaglicerilo), ésteres de ácidos grasos de polioxietileno sorbitán (p. ej., monolaurato de polioxietileno sorbitán, monooleato de polioxietileno sorbitán, monoestearato de polioxietileno sorbitán, monopalmitato de polioxietileno sorbitán, trioleato de polioxietileno sorbitán, triestearato de polioxietileno sorbitán), ésteres de ácidos grasos de polioxietileno sorbitol (p. ej., tetraestearato de polioxietileno sorbitol, tetraoleato de polioxietileno sorbitol), ésteres de ácidos grasos de polioxietileno glicerina (p. ej., monoestearato de polioxietileno glicerilo), ésteres de ácido graso de polietilenglicol (p. ej., diestearato de polietilenglicol), éteres de polioxietilenalquilo (p. ej., lauril éter de polioxietileno), éteres de polioxietilen polioxipropilen alquilo (p. ej., polioxietilen polipropilenglicol, éter propílico de polioxietilen polioxipropileno, éter cetílico de polioxietilen polioxipropileno), éteres alquilfenílicos de polioxietileno (p. ej., éter nonilfenílico de polioxietileno), aceites de ricino hidrogenados con polioxietileno (p. ej., aceite de ricino polioxietilenado, aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno), derivados de cera de abeja con polioxietileno (p. ej., cera de abeja con polioxietilensorbitol), derivados de lanolina con polioxietileno (p. ej., lanolina con polioxietileno) y amidas de ácidos grasos con polioxietileno (p. ej., amida del ácido esteárico con polioxietileno); alquilsulfatos C<10>-C<18>(p. ej., cetíl sulfato sódico, lauril sulfato sódico, oleil sulfato sódico), polioxietilen alquil C<10>-C<18>éter sulfato con una media de 2 a 4 moles de unidades de óxido de etileno añadidas (p. ej., polioxietilen lauril sulfato sódico), y sales de éster de sulfosuccinato de alquilo C<1>-C<18>(p. ej., éster de lauril sulfosuccinato de sodio); y tensioactivos naturales, tales como lecitina, glicerofosfolípidos, esfingofosfolípidos (p. ej., esfingomielina) y ésteres de sacarosa de ácidos grasos C<12>-<18>. Una composición puede incluir uno o más de estos tensioactivos. Los tensioactivos preferidos son ésteres de ácidos grasos de polioxietileno sorbitán, p. ej., polisorbato 20, 40, 60 u 80. Se prefiere particularmente el polisorbato 80.

[0066] Los aminoácidos libres adecuados para su uso con la invención incluyen, pero sin limitación, arginina, lisina, histidina, ornitina, isoleucina, leucina, alanina, glicina, ácido glutámico o ácido aspártico. Se prefiere la inclusión de un aminoácido básico, es decir, arginina, lisina y/o histidina. Si una composición incluye histidina, ésta puede actuar tanto como agente tampón como aminoácido libre, pero cuando se utiliza un tampón de histidina es típico incluir un aminoácido libre que no sea histidina, p. ej., incluir tampón de histidina y lisina. Un aminoácido puede estar presente en su forma D y/o L, pero la forma L es la típica. El aminoácido puede estar presente como cualquier sal adecuada, p. ej., una sal de clorhidrato, tal como arginina-HCl. En una realización preferida, una composición farmacéutica acuosa de la invención no comprende ninguno de dichos aminoácidos libres.

[0068] En una realización preferente, un azúcar está presente en la composición farmacéutica acuosa de la invención, p. ej., tras la reconstitución de un liofilizado en agua, a una concentración de entre el 3 y el 11 % (p/v). En ciertas realizaciones, el azúcar es sacarosa en una concentración de aproximadamente el 4,5 % a aproximadamente el 11 %, o trehalosa en una concentración de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 10 %. Se prefiere una concentración del 6,75 % (p/v) de sacarosa.

[0070] En una realización preferida, un agente tampón está presente en la composición farmacéutica acuosa de la invención, p. ej., tras la reconstitución de un liofilizado en agua, a una concentración de entre 1 y 60 mM, p. ej., 10-40 mM, 15-30 mM, 15-25 mM. En ciertas realizaciones, el agente tampón es citrato o histidina. Se prefiere una concentración de tampón citrato de 15 mM.

[0072] En una realización preferida, un tensioactivo está presente en la composición farmacéutica acuosa de la invención, p. ej., tras la reconstitución de un liofilizado en agua, a una concentración de hasta el 0,2 % (en volumen), p. ej., del 0,01-0,1 %, 0,03-0,08 %, 0,04-0,08 %. Se prefiere una concentración del 0,05 % de polisorbato 80.

[0073] Otros excipientes contemplados, que pueden utilizarse en las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención incluyen, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes antiestáticos, lípidos tales como fosfolípidos o ácidos grasos, esteroides tales como colesterol, excipientes proteicos tales como seroalbúmina (seroalbúmina humana), albúmina humana recombinante, gelatina, caseína, contraiones formadores de sales, tales como sodio y similares. Estos y otros excipientes y/o aditivos farmacéuticos conocidos adecuados para su uso en las formulaciones de la invención son conocidos en la técnica, p. ej., como los enumerados en "The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4.ª edición, Roweet al., Eds., American Pharmaceuticals Association (2003); y Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 21.ª edición, Gennaro, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2005).

[0074] Algunas formulaciones preferidas de la invención se muestran en la tabla 40 de los ejemplos a continuación.

[0075] En ciertas realizaciones, se contempla la liofilización de un anticuerpo anti-VEGF para proporcionar una composición farmacéutica acuosa de la invención para tratar a un paciente.

[0076] Las técnicas de liofilización de anticuerpos son bien conocidas en la técnica, p. ej. véase John F. Carpenter y Michael J. Pikal, 1997 (Pharm. Res.14, 969-975); Xialin (Charlie) Tang y Michael J. Pikal, 2004 (Pharm. Res.21, 191-200).

[0077] Antes de administrar un liofilizado a un paciente, debe reconstituirse con un reconstituyente acuoso. Esta etapa permite que el anticuerpo y otros componentes del liofilizado se redisuelvan para dar lugar a una solución adecuada para la inyección a un paciente.

[0078] El volumen de material acuoso utilizado para la reconstitución determina la concentración del anticuerpo en la composición farmacéutica resultante. La reconstitución con un volumen de reconstituyente menor que el volumen previo a la liofilización proporciona una composición más concentrada que antes de la liofilización. El factor de reconstitución (volumen de la formulación tras la liofilización:volumen de la formulación antes de la liofilización) puede ser de 1:0,5 a 1:6. Resulta útil un factor de reconstitución de 1:3. Como se ha mencionado anteriormente, los liofilizados de la invención pueden reconstituirse para dar composiciones acuosas con una concentración de anticuerpo anti-VEGF de al menos 50 mg/ml (es decir, al menos 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 o 130 mg/ml), y el volumen de reconstituyente se seleccionará en consecuencia. En caso necesario, la formulación reconstituida puede diluirse antes de su administración al paciente para administrar la dosis prevista.

[0079] Los reconstituyentes típicos de los anticuerpos liofilizados incluyen agua estéril o tampón, opcionalmente con un conservante. Si el liofilizado incluye un agente tampón, el reconstituyente puede incluir otro agente tampón (que puede ser igual o diferente del agente tampón del liofilizado) o puede no incluir ningún agente tampón (p. ej., agua para preparaciones inyectables o solución salina fisiológica).

[0080] Las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención que comprenden anticuerpos anti-VEGF pueden utilizarse para tratar diversas enfermedades o trastornos. Las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-VEGF son particularmente útiles para tratar enfermedades oculares neovasculares en un sujeto.

[0081] Una "enfermedad ocular neovascular" que puede tratarse utilizando una composición farmacéutica acuosa de la invención incluye una afección, enfermedad o trastorno asociado con la neovascularización ocular, lo que incluye, pero sin limitación, angiogénesis anormal, neovascularización coroidea (NVC), permeabilidad vascular retiniana, edema retiniano, retinopatía diabética (particularmente retinopatía diabética proliferativa), edema macular diabético, degeneración macular asociada a la edad (DMAE) neovascular (exudativa), incluida NVC asociada a DMAEn (DMAE neovascular), secuelas asociadas a la isquemia retiniana, la oclusión de la vena central de la retina (OVCR) y la neovascularización del segmento posterior. Las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención pueden incluir otros principios activos además del anticuerpo anti-VEGF. Otros agentes farmacológicos pueden incluir, por ejemplo, otros anticuerpos útiles para tratar enfermedades oculares.

[0082] Las composiciones farmacéuticas acuosas de la invención pueden administrarse a un paciente. Como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" o "paciente" se refiere a mamíferos humanos y no humanos, incluidos, entre otros, primates, conejos, cerdos, caballos, perros, gatos, ovejas y vacas. Preferentemente, el sujeto o paciente es un ser humano.

[0083] La administración suele realizarse mediante una jeringa. Por tanto, la invención proporciona un dispositivo de administración (p. ej., una jeringa) que incluye una composición farmacéutica de la invención (p. ej., jeringa precargada). Los pacientes recibirán una cantidad eficaz del anticuerpo anti-VEGF como principio activo principal (es decir,una cantidad que sea suficiente para conseguir o al menos conseguir parcialmente el efecto deseado). Una dosis terapéuticamente eficaz es suficiente si puede producir incluso un cambio incremental en los síntomas o afecciones asociados a la enfermedad. La dosis terapéuticamente eficaz no tiene por qué curar completamente la enfermedad ni eliminar por completo los síntomas. Preferentemente, la dosis terapéuticamente eficaz puede detener, al menos parcialmente, la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya padece la enfermedad. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad del trastorno que se esté tratando y del estado general del propio sistema inmunitario del paciente.

[0085] La cantidad de la dosis puede determinarse fácilmente utilizando técnicas conocidas de ajuste de dosis por un médico normalmente versado en el tratamiento de la enfermedad o afección. La cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-VEGF utilizado en una composición farmacéutica acuosa de la invención se determina, por ejemplo, teniendo en cuenta los volúmenes de dosis deseados y el modo o modos de administración. Típicamente, las composiciones terapéuticamente eficaces se administran en una dosis en el intervalo de 0,001 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml por dosis. Preferentemente, una dosis utilizada en un método de la invención es de aproximadamente 60 mg/ml a aproximadamente 120 mg/ml (es decir, aproximadamente 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 mg/ml). En una realización preferida, la dosis de un anticuerpo anti-VEGF utilizado en un método de la invención es de 60 mg/ml o 120 mg/ml.

[0086] En determinadas realizaciones, la dosis se administra directamente en el ojo del paciente. En una realización, una dosis por ojo es de al menos aproximadamente 0,5 mg hasta aproximadamente 6 mg. Las dosis preferidas por ojo incluyen aproximadamente 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,8 mg, 0,9 mg, 1,0 mg, 1,2 mg, 1,4 mg, 1,6 mg, 1,8 mg, 2,0 mg, 2,5 mg, 3,0 mg, 3,5 mg, 4,0 mg, 4,5 mg, 5,0 mg, 5,5 mg y 6,0 mg. Las dosis pueden administrarse en diversos volúmenes adecuados para la administración oftálmica, tal como 50 µl o 100 µl, por ejemplo, incluidos 3 mg/50 µl o 6 mg/50 µl. También pueden usarse volúmenes más pequeños, incluidos 10 µl o menos, por ejemplo aproximadamente 10 µl o aproximadamente 8,0 µl. En ciertas realizaciones, se administra una dosis de 1,2 mg/10 µl o 1 mg/8,0 µl (p. ej., 1 mg/8,3 µl) a un ojo de un paciente para tratar o mejorar una o más de las enfermedades y trastornos descritos anteriormente. La administración puede realizarse, por ejemplo, mediante inyección intravítrea o infusión.

[0088] La invención también proporciona formulaciones (es decir, composiciones farmacéuticas acuosas) de la invención para su uso como medicamentos, p. ej. para su uso en la administración de un anticuerpo a un paciente, o para su uso en el tratamiento o mejora de una o más de las enfermedades y trastornos descritos anteriormente.

[0090] La invención proporciona además un método para administrar un anticuerpo anti-VEGF a un paciente, que comprende una etapa de administrar al paciente una composición farmacéutica acuosa de la invención.

[0092] En ciertas realizaciones, un método para administrar un anticuerpo anti-VEGF a un paciente de la invención comprende las etapas de: (i) reconstituir un liofilizado de la invención para obtener una formulación acuosa, y (ii) administrar la formulación acuosa al paciente. La etapa (ii) tiene lugar idealmente en las 24 horas posteriores a la etapa (i) (p. ej., en las 12 horas posteriores, en las 6 horas posteriores, en las 3 horas posteriores o en la hora posterior).

[0094] A continuación en el presente documento se describen ciertas realizaciones numeradas de la invención:

[0096] 1. Una composición farmacéutica acuosa, que comprende (i) al menos 50 mg/ml de un anticuerpo anti-VEGF que incluye las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 5, 6 y 7 respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 8, 9 y 10 respectivamente, (ii) sacarosa o trehalosa, (iii) un tampón citrato, y (iv) polisorbato 80 como tensioactivo (realización comparativa).

[0097] 2. La composición farmacéutica acuosa de la realización 1, que comprende del 4,5 % al 11 % (p/v) de sacarosa o del 5 % al 10 % de trehalosa, del 0,006 % al 0,012 % (p/v) de ácido cítrico, del 0,2 % al 0,6 % (p/v) de citrato trisódico dihidratado, y del 0,01 % al 0,1 % (p/v) de polisorbato 80, en donde el pH de la composición es de aproximadamente 6,3 a aproximadamente 7,3.

[0098] 3. La composición farmacéutica acuosa de la realización 2, en donde la concentración de sacarosa es del 6,75 % (p/v), la concentración de ácido cítrico es de aproximadamente el 0,01 % (p/v), la concentración de citrato trisódico dihidratado es de aproximadamente el 0,428 % (p/v), la concentración de polisorbato 80 es de aproximadamente el 0,05 % (p/v), y el pH es de aproximadamente 6,8.

[0099] 4. La composición farmacéutica acuosa de una cualquiera de las realizaciones 1-3, en donde la concentración del anticuerpo anti-VEGF es de al menos 60 mg/ml, al menos 70 mg/ml, al menos 80 mg/ml, al menos 90 mg/ml, al menos 100 mg/ml, al menos 110 mg/ml, al menos 120 mg/ml, al menos 130 mg/ml, al menos 140 mg/ml, o al menos 150 mg/ml.

[0100] 5. La composición farmacéutica acuosa de una cualquiera de las realizaciones 1-4, en donde la concentración del anticuerpo anti-VEGF es de aproximadamente 60 mg/ml, aproximadamente 70 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 90 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 110 mg/ml, aproximadamente 120 mg/ml, aproximadamente 130 mg/ml, aproximadamente 140 mg/ml, o aproximadamente 150 mg/ml.

[0101] 6. La composición farmacéutica acuosa de una cualquiera de las realizaciones 1-5, en donde el anticuerpo anti-VEGF comprende las secuencias de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.

[0102] 7. La composición farmacéutica acuosa de una cualquiera de las realizaciones 1-6, en donde el anticuerpo anti-VEGF comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3.

[0103] 8. La composición farmacéutica acuosa de una cualquiera de las realizaciones 1-7, en donde la concentración del anticuerpo anti-VEGF es de aproximadamente 60 mg/ml o aproximadamente 120 mg/ml.

[0104] 9. Un dispositivo de administración que incluye la composición farmacéutica acuosa de una cualquiera de las realizaciones 1-8.

[0105] 10. El dispositivo de administración de la realización 9, que es una jeringa precargada.

[0106] 11. Una composición para administrar un anticuerpo anti-VEGF a un sujeto, que comprende una etapa de administración al sujeto de una composición farmacéutica acuosa de una cualquiera de las realizaciones 1-8.

[0107] 12. Una composición para el tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular mediado por VEGF, que comprende la administración a un sujeto de una composición farmacéutica acuosa de una cualquiera de las realizaciones 1-8.

[0108] 13. La composición para su uso de acuerdo con la realización 12, en donde dicha enfermedad o trastorno ocular es una enfermedad neovascular ocular.

[0109] 14. Una formulación liofilizada preparada liofilizando la composición farmacéutica acuosa de una cualquiera de las realizaciones 1-8.

[0110] 15. Un método para preparar un liofilizado, que comprende las etapas de: (i) preparar una solución acuosa de un anticuerpo anti-VEGF, sacarosa o trehalosa, tampón citrato o histidina y un tensioactivo; y (ii) liofilizar la solución acuosa.

[0111] 16. El método de la realización 15, en donde el anticuerpo anti-VEGF incluye las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 5, 6 y 7 respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 8, 9 y 10, respectivamente.

[0112] 17. El método de la realización 16, en donde el anticuerpo anti-VEGF comprende las secuencias de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.

[0113] 18. El método de una cualquiera de las realizaciones 16-17, en donde el anticuerpo anti-VEGF comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3.

[0114] 19. Una composición farmacéutica acuosa de una cualquiera de las realizaciones 1-8 para administrar un anticuerpo anti-VEGF a un sujeto, que comprende una etapa de administración de la composición farmacéutica acuosa al sujeto.

[0115] 20. Una composición farmacéutica acuosa de una cualquiera de las realizaciones 1-8 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno ocular mediado por VEGF, que comprende la administración de la composición farmacéutica acuosa a un sujeto.

[0116] 21. El uso de la realización 20, en donde dicha enfermedad o trastorno ocular es una enfermedad neovascular ocular. Como se utiliza en el presente documento, todos los porcentajes son porcentajes en peso, a menos que se indique lo contrario.

[0117] Como se utiliza en el presente documento y a menos que se indique lo contrario, los términos "un" y "una" significan "uno", "al menos uno" o "uno o más". Salvo que el contexto exija lo contrario, los términos en singular utilizados en el presente documento incluirán los plurales y los términos en plural incluirán los singulares.

[0118] Se pretende que la presente memoria descriptiva y los ejemplos se consideren únicamente ilustrativos, indicándose el verdadero alcance y espíritu de la invención mediante las siguientes reivindicaciones y equivalentes de las mismas.Ejemplos

[0119] Los siguientes ejemplos describen los esfuerzos de desarrollo de la formulación diseñados para identificar estrategias y composiciones de estabilización adecuadas para proporcionar soluciones estables y altamente concentradas que comprenden el anticuerpo 1008, permitiendo una formulación IVT con un periodo de validez de al menos 18 meses en condiciones de almacenamiento refrigerado que cumple los requisitos reglamentarios para productos oftálmicos.

[0120] El anticuerpo 1008 es un anticuerpo monocatenario que se une al factor A de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF-A) e inhibe su actividad biológica. La secuencia de aminoácidos de 1008 expresado es:

[0123]

[0126] Se observaron cantidades significativas de partículas subvisibles a una concentración de 60 mg/ml de 1008 cuando se formuló 1008 como solución isotónica en tampón citrato 15 mM con un 0,001 % de polisorbato 20 a pH 6,25. El principal problema de esta formulación inicial eran las partículas, que superaban los límites reglamentarios para las soluciones oftálmicas inyectables (USP <789>), incluso cuando se conservaban a -20 °C.

[0127] Los siguientes ejemplos resumen el desarrollo de la formulación de soluciones intravítreas (IVT) de 60 y 120 mg/ml de 1008 estables durante la conservación a 2-8 °C durante al menos 18 meses. El esfuerzo de desarrollo de la formulación se centró en la inhibición de la formación de partículas subvisibles y en el cumplimiento de los requisitos de contenido, pureza y potencia de la USP.

[0128] Métodos analíticos

[0129] A lo largo de los Ejemplos se utilizaron los métodos que se indican a continuación.

[0130] Método de obtención de imágenes de microflujo (MFI)

[0131] El método de MFI utilizado para la selección de excipientes, el Estudio 1 y el Estudio 2 para los estudios de optimización de 60 mg/ml fue el siguiente:

[0132] Volumen total de muestra utilizado: 0,50 ml

[0133] Volumen de purga: 0,20 ml

[0134] Volumen de análisis: 0,26 ml

[0135] La etapa de optimización de la iluminación se realizó con agua filtrada purificada libre de partículas.

[0136] Método de MFI utilizado para el análisis del Estudio 3 y el Estudio 4 de 120 mg/ml de 1008:

[0137] Volumen total de muestra utilizado: 0,80 ml

[0138] Volumen de purga: 0,23 ml

[0139] Volumen de análisis: 0,48 ml

[0140] La etapa de optimización de la iluminación se realizó con agua filtrada purificada libre de partículas.

[0141] Método de SEC

[0142] La SE-HPLC (cromatografía de exclusión por tamaño molecular) separa las proteínas en función de su tamaño. La separación se conseguía por exclusión diferencial, o inclusión, de las moléculas de la muestra a su paso por la fase estacionaria de partículas porosas. Sistema de cromatografía de líquidos de alta resolución capaz de mantener un caudal de 0,25 ml/minuto y una temperatura de la muestra de 4 °C, equipado con una columna TOSOH SuperSW3000 (Tosoh Bioscience LLC, King of Prussia, PA) y un detector capaz de funcionar simultáneamente a 214 nm y 280 nm. Este método se utilizó para los análisis de pureza.

[0143] Método de IEX-HPLC

[0144] La cromatografía de líquidos de alta resolución de intercambio aniónico (AIEX-HPLC) separa las proteínas según su carga neta. Este procedimiento se realizó mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), capaz de mantener un caudal de 0,8 ml/minuto, con un compartimento de columna a temperatura controlada (ajustada a 25 °C) que contenía una columna de intercambio aniónico fuerte, un automuestreador (ajustado a 4 °C) y un detector UV de longitud de onda variable, capaz de funcionar a 280 nm.

[0145] Método de CGE

[0146] El método de electroforesis capilar en gel se realizó para la determinación de la identidad y la pureza de las proteínas con pesos moleculares entre 10 kDa y 225 kDa mediante electroforesis capilar en gel de SDS. El capilar se llenó dinámicamente con un tampón de gel de SDS al 0,2 %, pH 8, de formulación propia de Beckman Coulter. La separación de la proteína se realizó mediante electroforesis de tamizado molecular. El logaritmo del peso molecular de la proteína era lineal con su movilidad electroforética recíproca. La identidad de una proteína se determinó comparando su migración con un patrón de peso molecular. La pureza se determinó mediante el análisis del porcentaje de área del pico principal y las impurezas. Se utilizó un detector de matriz de fotodiodos (PDA) para analizar la muestra a 220 nm.

[0147] Análisis de la potencia

[0148] Para el análisis de la potencia se utilizó un ELISA de competición. En ELISA de competición, se midió la capacidad de 1008 para competir con VEGFR2/Fc por el VEGF biotinilado. La señal observada estaba inversamente relacionada con la concentración de 1008, ya que cantidades crecientes de 1008 bloqueaban eficazmente la unión del VEGF biotinilado con su receptor, VEGFR2/Fc. Cada muestra se analizó en una placa de microtitulación de 96 pocillos frente a un patrón de referencia de 1008, y se comunicó la potencia relativa de la muestra con respecto a la del patrón de referencia.Ejemplo 1

[0149] Selección de excipientes

[0150] 1008 se formuló en un tampón citrato a pH 6,25. La composición de la formulación se muestra en la Tabla 1.

[0151] Tabla 1

[0154]

[0156] Se observó un número significativo de partículas subvisibles en la formulación anterior. Las partículas superaron los límites de registro farmacéutico según USP <789> para soluciones oftálmicas inyectables incluso durante la conservación a -20 °C.

[0157] Se investigó el efecto de varios excipientes en la formación de partículas subvisibles para desarrollar una solución líquida de 1008 más estable. Las soluciones de proteína a 60 mg/ml que contenían diferentes excipientes se conservaron a 40 °C y se analizaron en busca de partículas de un tamaño de 1-100 µm mediante MFI. Los datos experimentales demostraron que la mayoría de los excipientes probados, incluidos la arginina, el dextrano, el ácido ascórbico, la metionina y el acetato de amonio, no redujeron la formación de partículas. Únicamente en presencia de azúcares no reductores, como la sacarosa y la trehalosa, se redujo significativamente la formación de partículas.

[0158] Se realizó una selección adicional de excipientes. Se evaluó el efecto de los excipientes sobre la estabilidad de 1008 en una solución de 1008 de ~60 mg/ml. Las soluciones de proteína que contenían seroalbúmina humana (HAS) al 0,1 %, poloxámero 407 al 0,1 %, Brij 35 al 0,1 %, glicerina al 3 % y glicina 50 mM se conservaron a 40 °C, y las muestras se analizaron mediante MFI, SEC e IEX tras 8, 21 y 28 días de conservación. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Los resultados experimentales demostraron la inestabilidad de la proteína en presencia de los excipientes analizados.Tabla 2

[0161]

[0162]

[0164] Se investigó la estabilidad de 57 mg/ml de 1008 en tampón fosfato 20 mM a pH 6,25. La formulación que contenía un 9 % de sacarosa y un 0,1 % de PS80 se analizó a los 6, 14 y 27 días de conservación a 40 °C. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

[0165] Tabla 3

[0168]

[0170] Ejemplo 2

[0171] Desarrollo de nuevas formulaciones

[0172] Estudio 1

[0173] Selección de excipientes

[0174] Para la preparación de la muestra se utilizó una solución de proteína de 60 mg/ml de 1008 en tampón citrato 20 mM que contenía polisorbato 20 al 0,001 % y NaCl al 0,73 % a pH 6,25. Para eliminar el tensioactivo de la solución de proteína original, se realizó primero un intercambio tampón con la columna NAP-25 utilizando el vehículo sin polisorbato 20. A continuación, la solución de proteína intercambiada se concentró a aproximadamente 60 mg/ml utilizando un filtro Vivaspin con un MWCO de 10 kDa. Los excipientes HSA, glicina, glicerina, poloxámero 407 y Brij 35 se añadieron individualmente. A continuación, las muestras preparadas se filtraron con jeringa a través de una membrana de PVDF de 0,2 um a un vial de vidrio transparente de 4 ml. Se utilizaron unos 100 µl de muestra para el ensayo inicial, mientras que el resto de las muestras se conservaron a 40 °C. Se extrajo una muestra de un mililitro de cada formulación a los 8, 21 y 28 días de conservación a 40 °C para su análisis mediante MFI, SEC e IEX.

[0175] Selección de componentes de tampón, azúcar y tensioactivo

[0176] A partir de los estudios de selección de excipientes realizados internamente, se eligieron dos tampones (citrato e histidina), azúcares (sacarosa y trehalosa) y tensioactivos (polisorbato 20 y polisorbato 80) para la selección de los componentes de la formulación. Para el estudio se eligió una concentración del tampón de 20 mM, una concentración de azúcar de 264 mM y una concentración de tensioactivo del 0,1 %. Se diseñó un estudio experimental factorial completo como se muestra en la tabla siguiente.

[0177] Tabla 4

[0180]

[0182] El diseño completo utilizado se muestra en la Tabla 5 a continuación:

[0183] Tabla 5

[0186]

[0187]

[0189] Otros parámetros:

[0190] Concentración / pH 50-60 mg/ml de 1008 a pH 6,25

[0191] Intercambio de tampón<Columna NAP25, concentrado con Vivaspin con un MWCO>

[0192] <de 10 kDa>

[0193] Tamaño de la muestra/Pkg<2-2,5 ml en un vial de vidrio transparente de 4 ml con tapón>

[0194] <de rosca>

[0195] Conservación/extracción 40 °C / 0, 1, 2 y 4 semanas

[0196] Ensayos MFI, SEC e IEX

[0197] Para la preparación de la muestra se utilizó una solución de proteína con 60 mg/ml de 1008 en el tampón original que contenía polisorbato 20 al 0,001 %. Se prepararon cuatro tampones de vehículo nuevos con diferentes combinaciones de tampón/azúcar (citrato 20 mM/trehalosa 264 mM, citrato 20 mM/sacarosa 264 mM, histidina 20 mM/trehalosa 264 mM, histidina 20 mM/sacarosa 264 mM). El principio activo (PA) 1008 se extrajo en primer lugar en los tampones de vehículo usando una columna Illustra NAP-25 (GE Healthcare). La columna se equilibró con 25 ml de tampón citrato. A continuación, se cargaron 2 ml del PA 1008 en la columna. Una vez que la solución de PA se movió completamente al interior de la columna, se lavó la columna con 2 ml del mismo tampón utilizado para equilibrar la columna. Los 6 ml de solución eluidos de la columna se recogieron en un concentrador Vivaspin 6 (MWCO de 10 KD, GE Healthcare). A continuación, se concentraron los 6 ml de solución eluida hasta aproximadamente 2 ml utilizando una centrifugadora Beckman GS-15R a 9384 xg y 4 °C. A continuación, se midió la concentración de proteína con un espectrofotómetro NanoDrop 1000 a una DO280. Se añadió polisorbato 20 (PS20) o polisorbato 80 (PS80) en las formulaciones a una concentración final del 0,1 %. A continuación, las formulaciones preparadas se filtraron a través de un filtro de jeringa de PVDF de 0,2 um y se introdujeron en un vial de vidrio transparente de 4 ml. Se utilizaron aproximadamente 100 ul de muestra para el ensayo inicial, mientras que el resto de las muestras se conservaron a 40 °C. Se extrajo una muestra de un mililitro tras una conservación de 1, 2 y 4 semanas a 40 °C para su análisis mediante MFI, SEC e IEX.

[0198] El estudio cualitativo se realizó con el fin de seleccionar los componentes óptimos de azúcar/tensioactivo/tampón para la formulación. En el diseño del estudio se utilizaron dos tampones (citrato e histidina), azúcares (sacarosa y trehalosa) y tensioactivos (polisorbato 20 y polisorbato 80), tal como se ha comentado anteriormente. Se realizó un estudio de estabilidad de cuatro semanas en condiciones de envejecimiento acelerado (40 °C). Las muestras para los estudios de estabilidad se analizaron mediante SEC, IEX y MFI. La Tabla 6 muestra los resultados de los estudios de estabilidad mediante SEC, IEX y punto de fusión (Tm) mediante µDSC.

[0199] Tabla 6

[0201]

[0203] Los resultados de los estudios de estabilidad se analizaron utilizando Minitab (Minitab Inc., State College PA). Dado que la SEC y la IEX mostraron las mismas tendencias, solo se analizaron y notificaron mediante Minitab los resultados de la SEC. Los resultados del SEC demostraron que el tensioactivo era el único factor significativo; los otros factores que parecían influir en la respuesta incluían la selección del tampón y la interacción entre el tampón y el azúcar (en menor medida). Los resultados de la SEC sugirieron que el componente de formulación óptimo era citrato como tampón, polisorbato 80 como tensioactivo y sacarosa como el azúcar.

[0204] Los resultados experimentales de la materia particulada mediante MFI también se analizaron mediante Minitab. Los tres factores evaluados (azúcar, tensioactivo y tampón) parecían ser insignificantes (α = 0,05). Comparando los efectos principales sobre la materia particulada, el citrato era mejor que la histidina; el PS80 era mejor que el PS20; la sacarosa era similar o ligeramente mejor que la trehalosa. Por tanto, para estudios posteriores se seleccionaron el citrato como tampón, el polisorbato 80 como tensioactivo y la sacarosa como el azúcar.

[0205] Estudio 2

[0206] Optimización de las concentraciones de tampón, azúcar y tensioactivo

[0207] Se realizó un estudio factorial completo que contenía tres factores en dos niveles con dos puntos centrales en tampones de citrato e histidina respectivamente, con el fin de determinar la concentración óptima de cada componente seleccionado de la formulación. Los tres factores son el tampón (citrato o histidina), el polisorbato 80 y la sacarosa. Los factores y el espacio de diseño se tabulan en la Tabla 7 y los diseños experimentales detallados se muestran en las Tablas 8 y 9.Tabla 7

[0210]

[0212] Tabla 8

[0215]

[0217] Tabla 9

[0220]

[0221]

[0223] Para preparar la formulación individual, se utilizó una solución de proteína con 60 mg/ml de 1008 en tampón citrato con un 0,001 % de polisorbato 20/0,73 % de NaCl a pH 6,25. En primer lugar se intercambió el tampón de la solución de proteína a un vehículo usando la columna NAP-25. Este vehículo contenía tampón y sacarosa a sus concentraciones objetivo. La solución de proteína intercambiada se concentró hasta una concentración de aproximadamente 60 mg/ml utilizando Vivaspin con un MWCO de 10 kDa.

[0224] A continuación, se añadieron cantidades discontinuas de polisorbato 80 y cloruro de sodio para obtener las composiciones finales de la formulación. La concentración de proteína en cada muestra se verificó con el coeficiente de extinción teórico utilizando la absorbancia medida por UV a 280 nm.

[0225] Las formulaciones preparadas se filtraron a continuación a través de un filtro de jeringa de PVDF de 0,2 µm a un vial de vidrio transparente limpio de 4 ml. Se utilizaron aproximadamente 100 µl de muestra para el análisis inicial mediante SEC e IEX, mientras que se conservaron aproximadamente 2-2,5 ml de muestra a 40 °C. Se extrajeron aproximadamente 600 µl de muestra tras la conservación durante 11, 20 y 27 días a 40 °C para su análisis mediante MFI, SEC e IEX. Basándose en los resultados del Estudio 1, se realizó un estudio factorial completo que contenía tres factores en dos niveles con dos puntos centrales en tampones de citrato e histidina respectivamente, con el fin de determinar la concentración óptima de cada componente seleccionado de la formulación. Las muestras analizadas se conservaron a 40 °C y se extrajeron a las 0, 1,6, 2,9 y 4 semanas para los análisis mediante MFI, SEC e IEX. Los resultados se tabulan en las Tablas 10 y 11.

[0226] Tabla 10

[0228]

[0229]

[0231] Continuación

[0232]

[0234] Tabla 11

[0235]

[0236]

[0238] continuación

[0240]

[0243] Los resultados experimentales se analizaron con Minitab. En los resultados de la SEC en tampón citrato, el tensioactivo fue el principal factor que influyó en la agregación de proteínas, mientras que la sacarosa, la interacción entre la sacarosa y el polisorbato 80 y la concentración del tampón desempeñaron papeles menos significativos. Una mayor concentración de sacarosa y una menor concentración de polisorbato 80 favorecieron la estabilidad de la proteína. La estabilidad de la proteína afectó ligeramente a la agregación y una mayor concentración del tampón citrato promovió una estabilidad ligeramente mejor de la proteína.

[0244] En cuanto a los resultados del MFI en tampón citrato, los factores sacarosa y polisorbato 80, así como la interacción de sacarosa y polisorbato 80, desempeñaron papeles igualmente significativos en la formación de partículas. Una concentración elevada de sacarosa y de polisorbato 80 suprimió significativamente la formación de partículas, mientras que una concentración de tampón en el intervalo de 10-20 mM afectó ligeramente a la formación de partículas, por lo que se prefirió una concentración de tampón más baja.

[0245] Los resultados del análisis Minitab de las soluciones de tampón de histidina mostraron que el tensioactivo, polisorbato 80, era el principal factor que influía en la agregación de proteínas, mientras que la interacción entre la concentración del tampón y el polisorbato 80, así como la sacarosa, desempeñaban papeles menos significativos. Una menor cantidad de polisorbato 80 favoreció la estabilidad de la proteína. La concentración del tampón y la concentración de sacarosa no parecían afectar a la agregación de proteínas.

[0246] En cuanto a los resultados del MFI en el tampón de histidina, el polisorbato 80, la sacarosa y la interacción de la sacarosa y el polisorbato 80 desempeñaron papeles significativos en la formación de partículas. Para suprimir la formación de partículas, se prefirió una concentración alta de sacarosa y baja de polisorbato 80, así como una concentración baja de tampón.

[0247] Optimización del pH

[0248] Se estudiaron los efectos del pH sobre el comportamiento de agregación de 1008 en seis condiciones de pH (5,0, 6,0, 6,25, 6,50, 6,75 y 7,0) en tampón citrato 15 mM que contenía NaCl al 0,1 %, sacarosa al 6,75 % y PS80 al 0,05 %. En primer lugar, se intercambió el principio activo 1008 en los vehículos (sin PS80) de diferente pH usando una columna Illustra NAP-10 (GE Healthcare). La columna se equilibró primero con 15 ml de tampón citrato. A continuación, se cargaron 1 ml del PA 1008 en la columna. Una vez que la solución de PA se movió completamente al interior de la columna, se lavó la columna con 2 ml del mismo tampón citrato utilizado para equilibrar la columna. Se recogieron los 2 ml de la solución eluida de la columna en un concentrador Vivaspin 2 (MWCO de 10 KD, GE Healthcare). A continuación, se concentraron los 2 ml de solución eluida hasta aproximadamente 1 ml utilizando una centrifugadora Beckman GS-15R a 9384 xg y 4 °C. A continuación, se midió la concentración de proteína con un espectrofotómetro NanoDrop 1000. La concentración final de 1008 para este estudio se determinó en aproximadamente 70 mg/ml. Se añadió PS80 a las formulaciones hasta una concentración objetivo final del 0,05 %. El ensayo cinético de turbidez se realizó utilizando un espectrofotómetro PerkinElmer Lambda 35 con un soporte de celda de dos posiciones y un baño de agua para la regulación de la temperatura. En una celda de cuarzo con un volumen submicrométrico Starna (Starna Scientific Ltd., Inglaterra) con un camino óptico de 1 cm, se añadieron 250 µl de la formulación 1008 o del vehículo correspondiente. Las celdas se colocaron en el soporte para celdas que se precalentó a 55 °C. Se controló el cambio de DO350 en la formulación 1008 durante 120 minutos. A continuación, se representaron gráficamente los datos de DO350 obtenidos para formulaciones de pH diferente frente al tiempo para su comparación.

[0249] Utilizando el ensayo cinético basado en la turbidez, se estudiaron los efectos del pH en el comportamiento de agregación de 1008 con las formulaciones a pH 5,0 a 7,0 que contenían aproximadamente 70 mg/ml de 1008. Para el ensayo de turbidez, se asoció un aumento brusco de la DO<350>con los principales eventos de agregación de la proteína. Por tanto, la diferencia en el tiempo de incubación necesario para que aumente la DO<350>de cada formulación podría reflejar la diferente estabilidad física de la proteína en las formulaciones. Como se muestra en la Figura 1, 1008 parecía ser más estable a pH 6,75 en las condiciones de formulación ensayadas, ya que presentaba el tiempo de incubación más largo antes del aumento brusco de la DO<350>. Los experimentos repetidos con resultados similares confirmaron que la formulación analizada alcanzaba su máxima estabilidad a pH 6,75.

[0250] Estudio 3

[0251] Efectos de los excipientes y de las altas concentraciones de principio activo

[0252] Se realizó un estudio medio factorial (Tabla 12) para investigar los efectos de las principales condiciones de formulación, incluidas las concentraciones de proteína (60-120 mg/ml), sacarosa (4,5-9,0 %), tampón citrato (10 a 20 mM) y polisorbato 80 (0,01-0,1 %).

[0253] Tabla 12

[0256]

[0257]

[0259] Para preparar las formulaciones anteriores, se prepararon primero una solución de tampón citrato al 20 % a pH 6,5 y una solución madre de sacarosa al 30 % en una solución de tampón citrato 20 mM a pH 6,5. A continuación, el tampón citrato, la solución madre de sacarosa y el agua para preparaciones inyectables se mezclaron en proporciones adecuadas para generar cinco tampones con PS80, que fueron sacarosa al 4,5 % en citrato 10 mM, sacarosa al 9 % en citrato 10 mM, sacarosa al 4,5 % en citrato 20 mM, sacarosa al 9 % en citrato 20 mM y sacarosa al 6,75 % en citrato 15 mM. Posteriormente, se intercambió el PA 1008 a estos cinco tampones utilizando una columna Illustra NAP-25 (GE Healthcare) seguido de concentración con un concentrador Vivaspin 6 (MWCO de 5 KD, GE Healthcare) a 8000 x a 5 °C. Las concentraciones de proteína en cada muestra se determinaron con un espectrofotómetro NanoDrop 2000 durante la centrifugación. En el caso de las muestras en los cuatro primeros tampones, cuando la concentración de 1008 alcanzó ~70 mg/ml, se retiró parte de la muestra del concentrador y se utilizó para preparar las formulaciones (n.º 1, 3, 5 y 7 en la Tabla 12) con 60 mg/ml de PA añadiendo la cantidad adecuada del tampón correspondiente y añadiendo PS80 al 10 %. El resto de las muestras se concentraron aún más por encima de 130 mg/ml y a continuación se les añadió tampón y PS80 al 10 % para obtener las formulaciones finales (n.º 2, 4, 6 y 8 en la Tabla 12). Las formulaciones n.º 9 y 10 de la Tabla 12 se prepararon concentrando las muestras de 1008 con el tampón intercambiado al n.º 5 hasta aproximadamente 108 mg/ml y mezclándolas a continuación con tampón y PS80 al 10 % para alcanzar las concentraciones finales de la formulación. Se midieron los valores de pH de todas las formulaciones finales y se ajustaron a 6,5.

[0260] Como herramienta analítica para la evaluación, se utilizó un ensayo de turbidez modificado a partir del descrito anteriormente. En este ensayo de turbidez modificado se utilizó un espectrofotómetro UV-Vis Cary 100 de 12 posiciones de celda. Las cubetas utilizadas en este ensayo eran cubetas de cuarzo de 1 mm con tapones. En cada cubeta se añadieron 300 µl de muestra para la prueba. Se controló el cambio de densidad óptica a 360 nm de las formulaciones incubadas a 55 °C.

[0261] Efectos de los excipientes y de las altas concentraciones de principio activo

[0262] Las concentraciones de 1008 medidas y el pH final de todas las formulaciones del Estudio 3 se resumen en la Tabla 13. Las formulaciones con concentraciones bajas, medias y altas de 1008 (Tabla 4.3.1-1) con diferentes concentraciones de sacarosa, PS80 y concentración del tampón se incubaron a 55 °C y se controlaron los cambios en la DO<360>. Como se muestra en la Figura 2, se observó una propensión a la agregación diferente para las formulaciones. Las dos formulaciones que mostraron agregación de manera prácticamente inmediata cuando comenzó la incubación fueron las formulaciones 2 y 6, que contenían la concentración de 1008 relativamente mayor (~120 mg/ml) y menor concentración de sacarosa (4,5 %). Por otra parte, las formulaciones 3 y 7, que contenían una concentración relativamente más baja de 1008 (~60 mg/ml) y una concentración más alta de sacarosa (9 %), se agregaron más lentamente que otras formulaciones. La propensión a la agregación de otras combinaciones de medio de 1008 y concentraciones de sacarosa se situó entre los dos grupos anteriores.

[0263] Tabla 13

[0266]

[0267]

[0269] Utilizando como criterio el tiempo necesario para que la DO<360>de cada formulación alcance 0,25, se compararon los efectos de los distintos factores de formulación. Los resultados sugirieron que la sacarosa tenía el mayor impacto en la agregación de 1008, seguida de la concentración del PA. Los efectos de las concentraciones de sacarosa y PA fueron opuestos, lo que indica que se prefirieron concentraciones más altas de sacarosa y más bajas de PA para mejorar la estabilidad de la formulación. Los otros dos factores, la concentración del tampón y el PS80 mostraron un efecto menor.

[0270] Estudio 4

[0271] Estudio adicional de las concentraciones del principio activo y la sacarosa

[0272] Basándose en los resultados del Estudio 3 anterior, se llevó a cabo el Estudio 4 para investigar más a fondo los efectos de la concentración de proteína (60-120 mg/ml) y la concentración de sacarosa (con un intervalo más estrecho del 6 al 9 %) en tampón citrato 15 mM que contenía PS80 al 0,05 % a pH 6,50. El diseño del estudio se muestra en la tabla siguiente.

[0273] Tabla 14

[0276]

[0278] Para preparar las formulaciones, se cargaron aproximadamente 80 g de principio activo 1008 en un sistema de TFF y, a continuación, se realizó un intercambio de tampón con un tampón citrato 15 mM que contenía sacarosa al 6 % a aproximadamente 5 veces el volumen del principio activo. Tras el intercambio del tampón, el volumen de la solución de proteína se redujo a aproximadamente la mitad del volumen inicial mediante el sistema de TFF. Se recuperaron aproximadamente 44 g de solución concentrada de 1008 y la proteína concentrada se encontraba a aproximadamente 112 mg/ml, medida con el espectrofotómetro NanoDrop 2000. La solución concentrada de 1008 se utilizó a continuación para preparar las formulaciones n.º 1, 3, 5, 7-12 mezclándola con la cantidad adecuada de PS80 al 10 % y tampones citrato 15 mM que contenían un 0, 6 % y/o 40 % de sacarosa para obtener las correspondientes concentraciones finales de PA, sacarosa y PS80 en cada una de estas formulaciones. El resto de la solución de 1008 se concentró de nuevo hasta aproximadamente 132 mg/ml para preparar las formulaciones n.º 2 y 4 de la misma manera. Por último, la formulación n.º 6 se preparó concentrando la solución de 1008 a aproximadamente 171 mg/ml y las concentraciones de proteína, sacarosa y PS80 se ajustaron con PS80 al 10 % y tampones citrato 15 mM que contenían un 0, 6 % y/o 40 % de sacarosa. La concentración final de 1008 en cada formulación se determinó con el espectrofotómetro NanoDrop 2000 y el pH se ajustó a 6,5.

[0279] Las muestras se analizaron mediante el ensayo de turbidez descrito anteriormente. También se conservaron ocho formulaciones seleccionadas (n.º 1-4 y n.º 7-10) en una incubadora de exploración a 40 °C durante 6 semanas y se analizaron mediante métodos de MIF, IEX y SEC en diferentes puntos temporales.

[0280] Se investigaron doce formulaciones, que figuran en la Tabla 15.

[0281] Tabla 15

[0282]

[0285] El ensayo de turbidez a 55 °C se utilizó para supervisar la agregación de las formulaciones. Como se muestra en la Figura 3, las formulaciones mostraron diferentes grados de agregación en las mismas condiciones extremas de temperatura. Las formulaciones con las concentraciones ligeramente mayores de 1008 y bajas de sacarosa (tales como las formulaciones n.º 2 y 6 en la Tabla 15) fueron las que mostraron agregación rápidamente tras la incubación. Las formulaciones con concentraciones relativamente bajas de 1008 y altas de sacarosa (formulaciones n.º 3 y 5 de la Tabla 15) fueron las que mostraron una agregación más lenta que el resto de las formulaciones. Las curvas obtenidas del ensayo de turbidez para las distintas formulaciones se ajustaron a una función sigmoidal. El tiempo de incubación correspondiente a la mitad de una transición se registró como T<m>(tiempo del punto medio de la transición) para cada formulación. Los resultados se muestran en la Tabla 15. Los valores de T<m>frente a las concentraciones de sacarosa y 1008 mostraron los efectos opuestos de las concentraciones de sacarosa y 1008 sobre la agregación de la proteína.

[0287] Además de los estudios mediante el ensayo de turbidez a 55 °C, la estabilidad de ocho formulaciones seleccionadas a 40 °C también se controló mediante MFI, SEC e IEX durante 6 semanas. Las formulaciones y los resultados figuran en las Tablas 16 a 23. En concordancia con el ensayo de turbidez, los resultados del MFI mostraron que las formulaciones con alta concentración de 1008 (~120 mg/ml) formaron más partículas, especialmente partículas mayores de 25 µm, en comparación con las formulaciones con concentraciones más bajas de PA. Los resultados del IMF no mostraron efectos claros de la concentración de sacarosa para las formulaciones con una cantidad similar de 1008 (formulaciones n.º 7 a 10). Como se muestra en la Figura 4, después de 6 semanas de conservación a 40 °C, las dos formulaciones (n.º 2 y 4) con la alta concentración de 1008 presentaron más degradación, que las formulaciones con ~60 mg/ml de 1008 se degradaron menos que todas las demás formulaciones. En cuanto a las formulaciones con ~90 mg/ml de 1008, se observó una degradación ligeramente menor a mayor concentración de sacarosa (formulación n.º 8) que a menor concentración de sacarosa (formulación n.º 7). Los resultados de la IEX mostraron la misma tendencia que los de la SEC.

[0289] Tabla 16

[0292]

[0295] Tabla 17

[0298]

[0299]

[0300] Tabla 18

[0302]

[0304] Tabla 19

[0306]

[0308] Tabla 20

[0310]

[0311] Tabla 21

[0313]

[0315] Tabla 22

[0317]

[0319] Tabla 23

[0321]

[0323] EJEMPLO 3

[0324] Estudios exploratorios de estabilidad

[0325] Formulación de control

[0326] Se realizaron estudios exploratorios de estabilidad de una formulación de una solución con 60 mg/ml de 1008 en citrato 20 mM, PS20 al 0,001 % a pH 6,25 como control. La formulación de control se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 um y se conservó a 40 °C, a temperatura ambiente y en un frigorífico. Las muestras se extrajeron a las 0, 2 y 5 semanas en el caso de las muestras a 40 °C, y a las 26 semanas en el caso de las muestras conservadas a temperatura ambiente y en el frigorífico. Se analizó el pH, la osmolalidad, el contenido mediante la A280, SEC, IEX, CGE y ELISA de muestras seleccionadas de los estudios de estabilidad. Los resultados se muestran en la Tabla 24.

[0327] Tabla 24

[0329]

[0331] Se realizó otro estudio de la formulación de control para la solución de 1008 con 60 mg/ml en citrato 20 mM, PS20 al 0,001 % y NaCl al 0,73 % a pH 6,25. La formulación se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 µm y se conservó a 40 °C. Las muestras se extrajeron al cabo de 1, 2, 3 y 4 semanas para el análisis del IMF. Los resultados se muestran en la Tabla 25.

[0332] Tabla 25

[0335]

[0337] Estudio de estabilidad exploratorio para 60 mg/ml de 1008 con sacarosa al 9 % y polisorbato 80 al 0,5 %

[0338] Se realizó un estudio de estabilidad exploratorio para la formulación con 60 mg/ml de 1008 que contenía sacarosa al 9 % y PS80 al 0,5 %. La formulación se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 µm y se conservó a 40 °C. Las muestras se extrajeron a las 1,6, 2,9 y 4 semanas y se analizaron mediante MFI, SEC e IEX. Los resultados se tabulan en la Tabla 26.

[0339] Tabla 26

[0341]

[0343] Estudio piloto de estabilidad para 60 mg/ml de 1008, sacarosa al 9 %, citrato 20 mM, PS80 al 0,1 % a pH 6,25Se realizó un estudio de estabilidad en condiciones de envejecimiento natural de la solución de 60 mg/ml de 1008 para la formulación que contenía sacarosa al 9 %, citrato 20 mM, PS80 al 0,1 % a pH 6,25 como se muestra en la Tabla 27. Las muestras de los estudios de estabilidad se conservaron a 2-8 °C, 25 °C, 40 °C y en cabina de luz (LC); también se sometieron a tres ciclos de congelación-descongelación (CD). Las muestras se extrajeron de acuerdo con el programa indicado en la Tabla 28 y se analizaron mediante diversos métodos analíticos como pH, osmolalidad, IMF, contenido, SEC, IEX, CGE y potencia.

[0344] Tabla 27

[0347]

[0349] Tabla 28

[0352]

[0354] En la etapa inicial, se inició el estudio de estabilidad en condiciones de envejecimiento natural de la solución de 1008 con 60 mg/ml. La formulación contenía sacarosa al 9 %, citrato 20 mM, PS80 al 0,1 % a pH 6,25, como se muestra en la Tabla 29. Las muestras se conservaron a 2-8 °C, 25 °C, 40 °C y en cabina de luz (LC); también se sometieron a tres ciclos de congelación-descongelación (CD). Las muestras se extrajeron de acuerdo con el calendario indicado en la Tabla 30 y se analizaron mediante diversos métodos analíticos. Los resultados de los estudios de estabilidad se tabulan en las Tablas 31-33.

[0355] Tabla 29

[0358]

[0359] Tabla 30

[0361]

[0363] Tabla 31 Resultados Parte 1/3 del estudio iloto de estabilidad

[0365]

[0367] Tabla 32 Resultados Parte 2/3 del estudio iloto de estabilidad

[0369]

[0370] Tabla 33 Resultados Parte 3/3 del estudio iloto de estabilidad

[0372]

[0374] Estudios de estabilidad exploratorios en tampón citrato: 60 mg/ml de 1008 en citrato 15 mM/sacarosa al 6,75 %/PS80 al 0,05 %/pH 6,75

[0375] Se realizó un estudio de estabilidad exploratorio en tampón citrato para la formulación con 60 mg/ml de 1008 en citrato 15 mM/sacarosa al 6,75 %/PS80 al 0,05 %/pH 6,75. Las muestras para los estudios de estabilidad se conservaron a 5 °C y 25 °C, y además se sometieron a ciclos de congelación-descongelación. Las muestras se extrajeron de acuerdo con el programa indicado en la tabla siguiente y se analizaron para determinar su aspecto, pH, osmolalidad, IMF, contenido, SEC e IEX.

[0376] Tabla 34

[0379]

[0381] De forma similar, se realizó un estudio de estabilidad exploratorio en tampón histidina para la formulación con 60 mg/ml de 1008 en histidina 15 mM/sacarosa al 6,75 %/PS80 al 0,05 %/pH 6,75. Las muestras para los estudios de estabilidad se conservaron a 5 °C y 25 °C. Las muestras también se sometieron a ciclos de congelación-descongelación. Las muestras se extrajeron de acuerdo con el programa indicado en la tabla siguiente y se analizaron para determinar su aspecto, pH, osmolalidad, IMF, contenido, SEC e IEX.

[0382] Tabla 35

[0385]

[0386]

[0388] Los datos experimentales se tabulan en las tablas siguientes.

[0389] Tabla 36 Resultados Parte 1/2 del estudio de estabilidad intermedio a 25 °C

[0391]

[0393] Tabla 37 Resultados Parte 2/2 del estudio de estabilidad intermedio

[0395]

[0396] IEX (% Inicial)

100,0

99,4

99,9 99,5

[0397] Tabla 38 Resultados Parte 1/2 del estudio de estabilidad intermedio a 25 °C

[0399]

[0401] Tabla 39 Resultados Parte 2/2 del estudio de estabilidad intermedio

[0403]

[0405] Los resultados experimentales indicaron que la estabilidad de las formulaciones probadas mejoró significativamente, especialmente en la supresión de la formación de partículas, en comparación con la de la formulación de control a una concentración de proteína de 60 mg/ml.

[0407] La formulación de solución estable identificada contenía citrato 15 mM/sacarosa al 6,75 %/PS80 al 0,0505 % como se muestra en la Tabla 40.

[0409] Tabla 40

[0412]

[0415] La presente invención y sus realizaciones se han descrito en detalle. Se pueden realizar diversas modificaciones, sustituciones y variaciones al material divulgado sin apartarse del espíritu y/o características esenciales de la presente invención. Por consiguiente, un experto en la materia apreciará fácilmente a partir de la divulgación que las modificaciones, sustituciones y/o variaciones posteriores que realicen sustancialmente la misma función o consigan sustancialmente el mismo resultado que las realizaciones descritas en el presente documento pueden utilizarse de acuerdo con dichas realizaciones relacionadas de la presente invención. Por tanto, las siguientes reivindicaciones pretenden abarcar dentro de su ámbito las modificaciones, sustituciones y variaciones de procesos, artículos, composiciones de materia, compuestos, medio, métodos y/o etapas descritos en este documento. Las reivindicaciones no deben entenderse como limitadas al orden o a los elementos descritos, a menos que así se indique. Debe entenderse que pueden introducirse diversos cambios de forma y detalle sin desviarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica oftálmica acuosa, que comprende al menos 50 mg/ml de un anticuerpo anti-VEGF que comprende las secuencias de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, y que comprende de aproximadamente el 4,5 % al 11 % (p/v) de sacarosa o de aproximadamente el 5 % al 10 % (p/v) de trehalosa, del 0,006 % al 0,012 % (p/v) de ácido cítrico, del 0,2 % al 0,6 % (p/v) de citrato trisódico dihidratado, y del 0,01 % al 0,1 % (p/v) de polisorbato 80, en donde el pH de la composición es de aproximadamente 6,3 a aproximadamente 7,3.

2. La composición farmacéutica oftálmica acuosa de la reivindicación 1, en donde el pH de la composición es de aproximadamente 6,8.

3. La composición farmacéutica oftálmica acuosa de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4.

4. La composición farmacéutica oftálmica acuosa de la reivindicación 1, en donde la concentración del anticuerpo anti-VEGF es de aproximadamente 60 mg/ml, la concentración de sacarosa es de aproximadamente el 6,75 % (p/v), la concentración de ácido cítrico es de aproximadamente el 0,01 % (p/v), la concentración de citrato trisódico dihidratado es de aproximadamente el 0,428 % (p/v), y la concentración de polisorbato 80 es de aproximadamente el 0,05 % (p/v).

5. La composición farmacéutica oftálmica acuosa de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo anti-VEGF comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4, y el pH es de aproximadamente 6,8.

6. La composición farmacéutica oftálmica acuosa de la reivindicación 1, en donde la concentración del anticuerpo anti-VEGF es de aproximadamente 120 mg/ml, la concentración de sacarosa es de aproximadamente el 6,8 % (p/v), la concentración de ácido cítrico es de aproximadamente el 0,01 % (p/v), la concentración de citrato trisódico dihidratado es de aproximadamente el 0,428 % (p/v), y la concentración de polisorbato 80 es de aproximadamente el 0,05 % (p/v).

7. La composición farmacéutica oftálmica acuosa de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo anti-VEGF comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4, y el pH es de aproximadamente 6,8.

8. Una jeringa precargada que incluye la composición farmacéutica acuosa de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

9. La composición farmacéutica acuosa de la reivindicación 1-7, para su uso en el tratamiento de una enfermedad ocular.

10. La composición farmacéutica acuosa de la reivindicación 1-7 para uso en el tratamiento de una enfermedad ocular neovascular seleccionada entre angiogénesis anormal, neovascularización coroidea (NVC), permeabilidad vascular retiniana, edema retiniano, retinopatía diabética, edema macular diabético, degeneración macular asociada a la edad (DMAE) neovascular (exudativa), incluida la NVC asociada a la DMAE neovascular, secuelas asociadas a isquemia retiniana, oclusión de la vena central de la retina (OVCR) y neovascularización del segmento posterior.

11. La composición farmacéutica acuosa para el uso de la reivindicación 10, en donde la retinopatía diabética es retinopatía diabética proliferativa.

12. Una formulación liofilizada preparada liofilizando la composición farmacéutica acuosa de la reivindicación 1-7.