ES3051716T3 - Humanized anti-pacap antibodies and uses thereof - Google Patents

Humanized anti-pacap antibodies and uses thereof

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ES3051716T3
ES3051716T3 ES17783258T ES17783258T ES3051716T3 ES 3051716 T3 ES3051716 T3 ES 3051716T3 ES 17783258 T ES17783258 T ES 17783258T ES 17783258 T ES17783258 T ES 17783258T ES 3051716 T3 ES3051716 T3 ES 3051716T3
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ES
Spain
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seq
pacap
antibody
sequence
antibodies
Prior art date
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ES17783258T
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English (en)
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Maria-Cristina Loomis
Leon Garcia-Martinez
Benjamin Dutzar
Daniel Allison
Katherine Hendrix
Ethan Ojala
Pei Fan
Jeffrey Smith
John Latham
Charlie Karasek
Jenny Mulligan
Michelle Scalley-Kim
Erica Stewart
Vanessa Lisbeth Rubin
Jens J Billgren
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H Lundbeck AS
Original Assignee
H Lundbeck AS
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Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno con especificidad de unión por PACAP. Los anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno comprenden las secuencias de los polipéptidos VH, VL y CDR descritos en este documento, y los polinucleótidos que los codifican. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento se unen y/o compiten por la unión con el mismo epítopo lineal o conformacional en PACAP humano que un anticuerpo anti-PACAP. La invención contempla conjugados de anticuerpos anti-PACAP y sus fragmentos de unión conjugados con una o más fracciones funcionales o detectables. También se contemplan métodos para la elaboración de dichos anticuerpos anti-PACAP y sus fragmentos de unión a antígeno. Otras realizaciones de la invención contemplan el uso de anticuerpos anti-PACAP y sus fragmentos de unión para el diagnóstico, la evaluación y el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con PACAP, así como afecciones en las que el antagonismo de las actividades relacionadas con PACAP, como la vasodilatación, la fotofobia, la degranulación de mastocitos y/o la activación neuronal, resultaría terapéuticamente beneficioso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0003] Anticuerpos anti-PACAP humanizados y sus usos
[0005] CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0007] Esta invención se refiere en general a anticuerpos, preferiblemente anticuerpos humanizados, y a composiciones que contienen dichos anticuerpos, en las que dichos anticuerpos se unen específicamente al polipéptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria ("PACAP"), y a usos terapéuticos para los anticuerpos y composiciones de los mismos.
[0009] Antecedentes
[0011] El polipéptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria ("PACAP") es un miembro de la familia de la secretina/péptido intestinal vasoactivo ("VIP")/hormona liberadora de la hormona del crecimiento ("GHRH"). PACAP es un péptido vasodilatador multifuncional que existe en dos formas activas a-amidadas, una con 38 aminoácidos (PACAP38; SEQ ID NO: 1241) y la otra con 27 aminoácidos (PACAP27; SEQ ID NO: 1242). Ambos péptidos tienen los mismos 27 aminoácidos N-terminales y se sintetizan a partir de la misma proteína precursora, preproPACAP (véase Moody et al., Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes., 18(1 ):61-67, 2011). PACAP38 es la forma activa más prevalente y representa hasta el 90% de las formas de PACAP en los tejidos de mamíferos (véase Kaiser y Russo, Neuropeptides, 47:451-461,2013). La secuencia de PACAP38 es idéntica en todos los mamíferos, y difiere de los ortólogos aviares y anfibios en sólo un aminoácido (véase Vaudry et al., Pharmacol. Rev., 52:269-324, 2000). La familia de secretina/VIP/GHRH incluye el péptido mamífero histidina metioninamida ("PHM"), la secretina, el glucagón, el péptido similar al glucagón 1 ("GLP1"), el péptido similar al glucagón 2 ("GLP2"), el polipéptido insulinotrófico dependiente de glucosa ("GIP"), y el factor liberador de la hormona del crecimiento ("GRF"). PACAP27 tiene un 68% de identidad de secuencia con VIP a nivel de aminoácidos (véase Vaudry et al., 2000).
[0013] PACAP se distribuye ampliamente en el cerebro y los órganos periféricos, por ejemplo el sistema endocrino, las gónadas, las neuronas simpáticas, el sistema respiratorio, el tracto gastrointestinal, el sistema cardiovascular y los tractos urogenitales (véase Schytz et al., Neurotherapeutics, 7:191-196, 2010). En particular, PACAP se expresa en todo el sistema nervioso, incluida una presencia en el sistema trigéminovascular, los ganglios trigéminos, la médula espinal, el hipotálamo, y la pituitaria. PACAP tiene funciones en el neurodesarrollo, la neuroprotección, la neuromodulación, la inflamación neurogénica ,y la nocicepción con múltiples acciones (véase Kaiser y Russo, 2013).
[0015] En consonancia con su amplia distribución, PACAP ejerce efectos pleiotrópicos que incluyen modulación de la liberación de neurotransmisores, vasodilatación, broncodilatación y activación de la motilidad intestinal, aumento de la secreción de insulina e histamina, así como estimulación de la proliferación y/o diferenciación celular. PACAP ha demostrado que actúa como una hormona, una neurohormona, un neurotransmisor, y un factor trófico en varios tejidos (Vaudry et al., Pharmacological Rev., 52(2):269-324, 2000).
[0017] Los efectos biológicos de PACAP están mediados por tres receptores acoplados a proteína G diferentes: PAC1-R, receptor del péptido intestinal vasoactivo tipo 1 ("VPAC1-R"), y receptor del péptido intestinal vasoactivo tipo 2 ("VPAC2-R"). Estos receptores se expresan en diversos tejidos. PAC1-R es particularmente abundante en el sistema nervioso (por ejemplo, bulbo olfatorio, tálamo, hipotálamo, cerebelo, y asta dorsal espinal), la pituitaria y las glándulas suprarrenales. Por el contrario, VPAC1-R y VPAC2-R se expresan principalmente en el pulmón, el hígado y los testículos, aunque también se han detectado en otros tejidos. Se ha detectado la expresión de VPAC1-R en el sistema nervioso (por ejemplo, corteza cerebral e hipocampo), células musculares lisas de pulmón, hígado, intestino, megacariocitos y plaquetas. VPAC1-R se asocia con la proteína de membrana asociada al receptor ("RAMP", específicamente, R<a>MP2) (véase Christopoulos et al., J. Biol. Chem., 278:3293-3297, 2002). El perfil de expresión de VPAC2-R incluye el sistema nervioso (por ejemplo, tálamo, hipocampo, tronco encefálico, y ganglios de la raíz dorsal ("DRG")), el sistema cardiovascular, el sistema gastrointestinal, el páncreas y el sistema reproductivo (véase Usdin et al., Endocrin., 135:2662-2680, 1994; Sheward et al., Neurosci., 67:409-418, 1995).
[0018] PAC1-R es selectivo para PACAP38 y PACAP27. En particular, PAC1-R se une a PACAP con una afinidad 100­ 1000 veces mayor que VIP, es decir, K<d>~0,5 nM para PACAP27/PACAP38 frente a K<d>~500 nM para VIP. Por el contrario, VPAC1-R y VPAC2-R tienen afinidades iguales por PACAP y VIP (K<d>~1 nM) (véase Schytz et al., 2010). Se ha desarrollado un anticuerpo que se une a PAC1-R (véase la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20160251432).
[0020] Tras la activación, todos estos receptores son capaces de provocar la producción de monofosfato de adenosina cíclico ("AMPc"), y/o la activación de la fosfolipasa C ("PLC"), y/o la modulación de la fosfolipasa D ("PLD"). En particular, PAC1-R está acoplado a vías de transducción de señales duales que actúan a través de cAMP y Ca<2>, mientras que VPAC1-R y VPAC2-R están acoplados principalmente a la adenilil ciclasa. PAC1-R está acoplado a la proteína Gs, que activa la adenilil ciclasa para formar AMPc, que a su vez activa la proteína cinasa A. PAC1-R también se acopla a Gq, y por lo tanto activa PLC, que produce fosfato de inositol, que aumenta la liberación de calcio citosólico de las reservas de calcio intracelulares. Existe cierta evidencia de que PAC1-R tiene un papel en la activación de PLD (véase McCulloch et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 921:175-185, 2000). Otra ruta de señalización de PACAP produce la elevación de los niveles intracelulares de sodio a través de la activación de canales catiónicos no selectivos (véase Roy et al., American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, 304(12):R1070-R1084, 2013).
[0022] Se plantea la hipótesis de que el PACAP desempeña un papel en una multitud de enfermedades y trastornos, incluidos, pero sin limitarse a, la migraña, la cefalea, y el dolor, aunque tal papel de PACAP no se ha demostrado clínicamente. Se cree que las migrañas tienen un componente neurovascular. Las migrañas afectan aproximadamente al 10% de la población adulta en los EE. UU., y generalmente están acompañadas de cefaleas intensas. Aproximadamente 20-30% de los pacientes que sufren migraña experimentan aura, que comprende fenómenos neurológicos focales que preceden y/o acompañan al evento. Varias observaciones han sugerido que PACAP desempeña un papel en la migraña: (1) los niveles plasmáticos de PACAP se elevan durante los ataques de migraña (ictal), en comparación con los niveles interictales, en seres humanos (véase Tuka et al., Cephalalgia, 33(13):1085-1095, 2013); (2) una infusión de PACAP38 desencadenó cefaleas en sujetos sanos y cefaleas seguidas de ataques similares a la migraña en pacientes con migraña (véanse Schytz et al., Brain, 132:16-25, 2009; y Amin et al., Brain, 137:779-794, 2014, respectivamente); (3) la vasodilatación inducida por PACAP puede desempeñar un papel en la inflamación neurogénica (véase Kaiser y Russo, Neuropeptides, 47:451-461, 2013); y (4) las migrañas inducidas por PACAP se asocian con fotofobia, fonofobia, náuseas, y responden a los triptanos (véase Amin et al., Brain, 32:140-149, 2012). También se ha demostrado que PACAP induce vasodilatación, fotofobia, así como desgranulación de mastocitos y activación neuronal (véanse Markovics et al., Neurobiology of Disease, 45:633-644, 2012; Baun et al., Cephalalgia, 32(4):337-345, 2012; Chan et al., Pharmacology & Therapeutics, 129:332-351, 2011).
[0024] Un tratamiento eficaz para las migrañas es la administración de triptanos, que son una familia de fármacos a base de triptamina, entre los que se encuentran el sumatriptán y el rizatriptán. Los miembros de esta familia tienen afinidad por múltiples receptores de serotonina, incluidos 5-HT1B, 5-HT1D, y 5-HT1F. Los miembros de esta familia de fármacos contraen selectivamente los vasos cerebrales, pero también causan efectos vasoconstrictores en los vasos coronarios (véase Durham, New Eng. J. Med., 350 (11):1073-75, 2004). Existe un riesgo teórico de espasmo coronario en pacientes con enfermedad cardíaca establecida tras la administración, y en raras ocasiones pueden ocurrir eventos cardíacos después de tomar triptanos. Por tanto, están contraindicados para algunos pacientes con enfermedad vascular coronaria.
[0026] De manera similar, el dolor a menudo puede abordarse mediante la administración de ciertos narcóticos o fármacos antiinflamatorios no esteroideos ("AINE"). Sin embargo, la administración de estos tratamientos a menudo tiene consecuencias negativas. Los AINE tienen el potencial de causar insuficiencia renal, hemorragia intestinal, y disfunción hepática. Los narcóticos tienen el potencial de causar náuseas, vómitos, deterioro del funcionamiento mental, y adicción. Por lo tanto, es deseable identificar tratamientos alternativos para el dolor con el fin de evitar algunas de estas consecuencias negativas.
[0028] PACAP también puede estar involucrada en otras enfermedades y trastornos además de la migraña, la cefalea, y el dolor. Por ejemplo, PACAP puede correlacionarse o incluso desempeñar un papel causal en los trastornos de ansiedad (documento WO 2012/106407), trombocitopenia (documento WO 2004/062684), y enfermedades inflamatorias de la piel (documento WO 2010/007175). Los polimorfismos de PACAP y PAC1-R están asociados con el síndrome de estrés postraumático ("TEPT") en mujeres, el trastorno depresivo mayor y el trastorno de ansiedad generalizada, lo que sugiere un papel de PACAP en estas afecciones. Además, en apoyo del papel de PACAP en la trombocitopenia, los pacientes con trisomía 18 tienen un exceso de PACAP y presentan una maduración defectuosa de los megacariocitos (véase Schytz et al., 2010; y Moody et al., Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes., 18(1 ):61-67, 2011).
[0030] Además, PACAP y otros neuropéptidos, tal como el péptido relacionado con el gen de la calcitonina ("CGRP"), la sustancia P, la neuroquinina A, la bradicinina y la endotelina-1, se expresan en el tracto urinario inferior ("LUT") (véase Arms y Vizzard, Handbook Exp. Pharmacol., 202:395-423, 2011), y según se informa, puede desempeñar un papel en la disfunción del tracto urinario inferior y en los trastornos del tracto urinario, tal como la infección del tracto urinario ("ITU"), micción anormal, urgencia urinaria, nicturia, incontinencia urinaria, vejiga hiperactiva, y el dolor asociado con dichas afecciones.
[0032] También se ha sugerido que PACAP y los receptores de PACAP modulan el dolor inflamatorio y neuropático, y se los ha implicado tanto en la pronocicepción como en la antinocicepción (véase Davis-Taber et al., J. Pain, 9(5):449-56, 2008). También se ha informado que PACAP es necesaria para la desensibilización espinal y la inducción de dolor neuropático (véase Mabuchi et al., J. Neurosci., 24(33):7283-91, 2004). Además, se informa que el comportamiento de abstinencia de morfina se modifica en ratones deficientes en el receptor de PACAP, lo que sugiere aún más el papel de PACAP en la respuesta ansiolítica a la abstinencia de morfina (véase Martin et al., Mol. Brain Res., 110(1):109-18, 2003).
[0033] BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN
[0035] Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento o diagnóstico in vivo se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o para diagnóstico in vivo.
[0037] En un aspecto, la presente invención se refiere en general a anticuerpos anti-PACAP, preferiblemente anticuerpos anti-PACAP humanizados, que antagonizan, inhiben, neutralizan o bloquean al menos un efecto biológico asociado con PACAP humano. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-PACAP inhiben o neutralizan al menos un efecto biológico provocado por PACAP, que incluye PACAP27 y/o PACAP38, como se analizamás adelante.En otras realizaciones, los anticuerpos anti-PACAP neutralizan o inhiben la activación por PACAP de al menos uno de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; neutralizan o inhiben la activación por PACAP de cada uno de PAC1-R, VPAC1-R y VPAC2- R; y/o neutralizan o inhiben la activación por PACAP de PAC1-R; y/o inhiben la unión de PACAP a la superficie celular, por ejemplo a través de un glicosaminoglicano ("GAG"). En otras realizaciones, los anticuerpos anti-PACAP pueden inhibir la unión de PACAP a al menos uno de los siguientes: PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; pueden inhibir la unión de PACAP a cada uno de los siguientes: PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; o pueden inhibir la unión de PACAP a PAC1-R. En otras realizaciones, los anticuerpos anti-PACAP inhiben la producción de AMPc inducida por PACAP. En otras realizaciones más, los anticuerpos anti-PACAP, solos o en combinación, cuando se administran a un sujeto, por ejemplo un ser humano, reducen la vasodilatación, la fotofobia, la desgranulación de mastocitos, y/o la activación neuronal inducidas por PACAP. En realizaciones relacionadas, los anticuerpos anti-PACAP humanizados son adecuados para tratar a un sujeto humano que tiene una afección aguda, episódica o crónica asociada con mayor vasodilatación, fotofobia, desgranulación de mastocitos, y/o activación neuronal.
[0039] En una realización preferida, los anticuerpos anti-PACAP no interactúan sustancialmente con (se unen a) VIP. La presente invención también abarca el uso terapéutico (como monoterapia o terapia combinada) y el uso diagnóstico de dichos anticuerpos anti-PACAP.
[0041] Más particularmente, los anticuerpos anti-PACAP según la invención pueden incluir anticuerpos humanizados. Además, los anticuerpos anti-PACAP según la invención pueden carecer sustancial o totalmente de N-glicosilación y/u O-glicosilación. En una realización, los anticuerpos anti-PACAP comprenden un dominio constante humano, por ejemplo el del anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 o uno de los mismos. En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender una región Fc que se ha modificado para alterar (mejorar o perjudicar) al menos una de las siguientes funciones efectoras: vida media, proteólisis, o glicosilación. Por ejemplo, la región Fc puede contener una o más mutaciones que alteran o eliminan la N- y/u O-glicosilación.
[0043] En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PACAP se unen a PACAP con una K<d>menor o igual a 5x10<' 5>M, 10<' 5>M, 5x1°<-6>M, 10<-6>M, 5x1°<-7>M, 10<‘ 7>M, 5x10<‘ 8>M, 10<‘ 8>M, 5x10<‘ 9>M, 10<‘ 9>M, 5x10<‘ 1 °>M, 10<‘ 1 °>M, 5x10<-11>M, 1°<-11>M, 5x10<‘ 12>M, 1°<’ 12>M, 5x1°<’ 13>M, o 10<‘ 13>M, por ejemplo, según lo determinado por ELISA, interferometría de biocapa ("BLI"), ensayo de exclusión cinética (KlNEXA<®>, Sapidyne Instruments, Boise, ID), o SPR, por ejemplo, a 25° o 37 °C. Preferiblemente, los anticuerpos anti-PACAP humanizados se unen a PACAP con una K<d>menor o igual a 5x1° 1<°>m , 1°<- 1 °>m , 5x1°<’ 11>M, 1°<’ 11>M, 5x1°<’ 12>M, o 10<‘ 12>M. Preferiblemente, los anticuerpos anti-PACAP humanizados se unen a PACAP con una K<d>que es menor que alrededor de 10° nM, menor que alrededor de 4° nM, menor que alrededor de 1 nM, menor que alrededor de 1°° pM, menor que alrededor de 5° pM, o menor que alrededor de 25 pM. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP se unen a PACAP con una K<d>que está entre alrededor de 1° pM y alrededor de 1°° pM. En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP humanizados se unen a PACAP con una constante de disociación (koff) menor o igual a 5x1°<’ 4>s<-1>, 1°<-4>s<-1>, 5x1°<’ 5>s<-1>, o 1°<’ 5>s<-1>.
[0045] En aún otra realización, los anticuerpos anti-PACAP se unirán específicamente a los epítopos lineales o conformacionales y/o competirán por la unión al o a los mismos epítopos lineales o conformacionales en PACAP humano que un anticuerpo anti-PACAP seleccionado del grupo que consiste en Ab1°.H, Ab1°.H2, Ab1°.H3 y Ab1°.H5 (las secuencias de aminoácidos específicas de las regiones variables y constantes de estos anticuerpos anti-PACAP, y los ácidos nucleicos que codifican dichas regiones variables y constantes, y los epítopos unidos de ese modo según lo determinado usando métodos de barrido de alanina se describenmása abajo).En particular, la invención abarca anticuerpos anti-PACAP que se unen específicamente al o a los mismos epítopos lineales o conformacionales en PACAP humano que un anticuerpo anti-PACAP seleccionado del grupo que consiste en Ab1°.H, Ab1°.H2, Ab1°.H3 y Ab1°.H5. Como se describemás abajo,en realizaciones ejemplares, el o los epítopos se determinan utilizando una estrategia de mutación de barrido de alanina.
[0047] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos anti-PACAP, preferiblemente anticuerpos anti-PACAP humanizados, que comprenden al menos 2 regiones determinantes de la complementariedad ("CDR"), o al menos 3 CDR, o al menos 4 CDR, o al menos 5 CDR, o las seis CDR de un anticuerpo anti-PACAP seleccionado del grupo que consiste en Ab1°.H, Ab1°.H2, Ab1°.H3 y Ab1°.H5. En los casos en que no estén presentes las 6 CDR, preferiblemente están presentes al menos la CDR3 de V<h>y la CDR3 de V<l>. En realizaciones ejemplares, los anticuerpos comprenden la cadena pesada variable ("VH") y/o la cadena ligera variable ("VL") de uno de Ab1°.H, Ab1°.H2, Ab1°.H3 y Ab1°.H5.
[0048] En una realización específica, los anticuerpos anti-PACAP según la invención son preferiblemente anticuerpos anti-PACAP humanizados, y comprenden (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 964; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 966; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 968; y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 984; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 986; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 988. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 962, y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 982. En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 962, y/o (b) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 982. Más específicamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 961, y/o (b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 981.
[0050] En una realización específica, los anticuerpos anti-PACAP según la invención son preferiblemente anticuerpos anti-PACAP humanizados, y comprenden (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de c DR1 que consiste en SEQ ID NO: 1284; una secuencia de<c>DR2 que consiste en SEQ ID NO: 1286; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1288; y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1304; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 1306; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1308. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1282, y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1302. En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1282, y/o (b) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1302. Más específicamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1281, y/o (b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1301.
[0052] En una realización específica, los anticuerpos anti-PACAP según la invención son preferiblemente anticuerpos anti-PACAP humanizados, y comprenden (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1324; una secuencia de<c>DR2 que consiste en SEQ ID NO: 1326; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1328; y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1344; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 1346; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1348. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1322, y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1342. En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1322, y/o (b) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1342. Más específicamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1321, y/o (b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1341.
[0054] En una realización específica, los anticuerpos anti-PACAP según la invención son preferiblemente anticuerpos anti-PACAP humanizados, y comprenden (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de<c>DR1 que consiste en SEQ ID NO: 1404; una secuencia de c DR2 que consiste en SEQ ID NO: 1406; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1408; y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1424; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 1426; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1428. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1402, y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1422. En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1402, y/o (b) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1422. Más específicamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1401, y/o (b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1421.
[0056] Además, en algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PACAP y la unión al antígeno pueden comprender variantes de secuencia de cualquiera de los anticuerpos descritos que se modifican mediante mutagénesis, por ejemplo maduración de la afinidad para alterar una o más propiedades tales como afinidad de unión o inmunogenicidad.
[0058] En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP están unidos directa o indirectamente a otro resto, tal como una etiqueta detectable o un agente terapéutico.
[0059] En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP inhiben o neutralizan al menos un efecto biológico provocado por PACAP; neutralizan o inhiben la activación por PACAP de al menos uno de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; neutralizan o inhiben la activación por PACAP de cada uno de PAC1-R, VPAC1-R y VPAC2-R; neutralizan o inhiben la activación por PACAP de PAC1-R; son capaces de inhibir la unión de PACA<p>a al menos uno de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; son capaces de inhibir la unión de PACAP a cada uno de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; son capaces de inhibir la unión de PACAP a PAC1-R; y/o inhiben la unión de PACAP a la superficie celular, por ejemplo a través de un GAG; inhiben la producción de AMPc inducida por PACAP; y/o cuando se administra a un sujeto reduce la vasodilatación inducida por PACAP, la fotofobia, la desgranulación de mastocitos y/o la activación neuronal.
[0061] En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP humanos o humanizados son adecuados para tratar a un sujeto humano que tiene una afección aguda, episódica o crónica asociada con mayor vasodilatación, fotofobia, desgranulación de mastocitos, y/o activación neuronal.
[0063] En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP no interactúan sustancialmente con (es decir, no se unen a) VIP Preferiblemente, los anticuerpos anti-PACAP tienen una afinidad más fuerte por PACAP en comparación con VIP, es decir, aunque existe cierta reactividad cruzada, los anticuerpos se unen preferentemente a PACAP en comparación con VIP. Por ejemplo, la afinidad de dichos anticuerpos por PACAP es al menos 10 veces, 30 veces, 100 veces, 300 veces, 1000 veces, 3000 veces, 10000 veces, 30000 veces, 100000 veces, 300000 veces, 1000000 veces, 3000000 veces, 10000000 veces, 30000000 veces, o más fuerte que la afinidad de dichos anticuerpos por VIP (por ejemplo, la K<d>de dicho anticuerpo o para la unión a PACAP humano es 10 veces, 30 veces, 100 veces, 300 veces, 1000 veces, 3000 veces, 10000 veces, 30000 veces, 100000 veces, 300000 veces, 1000000 veces, 3000000 veces, 10000000 veces o 30000000 veces menor que la K<d>para la unión a VIP).
[0065] En una realización, los anticuerpos anti-PACAP están unidos a al menos un resto efector, por ejemplo que comprende un enlazador químico. En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP están unidos a un o más restos detectables, por ejemplo que comprenden un colorante fluorescente, enzima, sustrato, material bioluminiscente, material radiactivo, resto quimioluminiscente, o mezclas de los mismos.
[0067] En una realización, los anticuerpos anti-PACAP están unidos a uno o más restos funcionales.
[0069] La invención también contempla anticuerpos, por ejemplo anticuerpos antiidiotípicos, producidos contra anticuerpos anti-PACAP como se describió anteriormente. Además, la invención proporciona un método para utilizar el anticuerpo antiidiotípico para monitorizar los nivelesin vivode dichos anticuerpos anti-PACAP en un sujeto, o para neutralizar dicho anticuerpo anti-PACAP en un sujeto al que se le administra dicho anticuerpo anti-PACAP del mismo.
[0071] Además, la presente invención abarca una composición adecuada para uso terapéutico, profiláctico o de diagnóstico que comprende una cantidad terapéuticamente, profilácticamente o diagnósticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-PACAP como se describe en este documento. En particular, en el presente documento se proporcionan composiciones y formas de dosificación que contienen los anticuerpos anti-PACAP en cuestión o que se unen para uso en el tratamiento o prevención de la migraña u otras indicaciones de cefalea. También se proporcionan en este documento formas de dosificación que contienen los anticuerpos anti-PACAP en cuestión o que se unen para uso en el tratamiento o prevención de la fotofobia. La composición puede ser adecuada para administración subcutánea, administración intramuscular, y/o administración intravenosa. La composición puede liofilizarse. En algunas realizaciones, la composición comprende además un diluyente, vehículo, solubilizante, emulsionante, conservante o mezcla de los mismos farmacéuticamente aceptable.
[0073] Además, en algunas realizaciones, la composición comprende además otro agente activo, por ejemplo un quimioterapéutico, un analgésico, un antiinflamatorio, un inmunosupresor, una citocina, un antiproliferativo, y un antiemético. Preferiblemente, el otro agente terapéutico es un analgésico, por ejemplo un AINE, un analgésico opioide, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo o anticuerpo anti-factor de crecimiento nervioso ("NGF") humano; o un anticuerpo o anticuerpo anti-CGRP humano o anti-receptor de CGRP humano); o un biológico no anticuerpo, tal como un polipéptido o conjugado de NGF o CGRP; o BOTOX® (toxina botulínica). Los AINE adecuados para uso en combinación con los anticuerpos anti-PACAP en cuestión incluyen, pero no se limitan a, un inhibidor de la ciclooxigenasa 1 y/o ciclooxigenasa 2; derivados del ácido propiónico, incluidos ibuprofeno, naproxeno, naprosina, diclofenaco y ketoprofeno; derivados del ácido acético, incluidos tolmetina y sulindaco; derivados del ácido fenámico, incluidos ácido mefenámico y ácido meclofenámico; derivados del ácido bifenilcarboxílico, incluidos diflunisal y flufenisal; y oxicams, incluidos piroxim, sudoxicam e isoxicam. Los analgésicos opioides adecuados para uso en combinación con los anticuerpos anti-PACAP en cuestión incluyen, por ejemplo, codeína, dihidrocodeína, morfina o un derivado de morfina o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, diacetilmorfina, hidrocodona, hidromorfona, levorfanol, oximorfona, alfentanilo, buprenorfina, butorfanol, fentanilo, sufentanilo, meperidina, metadona, nalbufina, propoxifeno, y pentazocina, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. La administración combinada del analgésico opioide y el anticuerpo anti-PACAP puede aumentar el efecto analgésico provocado de ese modo.
[0074] La presente invención contempla además una secuencia o secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican un anticuerpo anti-PACAP descrito en este documento, así como un vector o vectores que contienen estas secuencias o secuencias de ácidos nucleicos aisladas.
[0076] Además, la invención proporciona una célula hospedadora que comprende estas secuencias de ácidos nucleicos aislados o el vector expuesto anteriormente. La célula hospedadora puede ser una célula hospedadora eucariota de mamífero, seleccionada del grupo que consiste en células de riñón de hámster bebé ("BHK"); células de ovario de hámster chino ("CHO"); células de Sertoli de ratón (células "TM4"); células de riñón de mono verde africano (células "VERO-76"); células de carcinoma cervical humano ("HELA"); células de riñón canino ("MDCK"); células de hígado de rata búfalo ("BRL"); células de pulmón humano; células de hígado humano ("Hep G2"); células de tumor mamario de ratón ("MMT"); células TRI; células MRC 5; y células FS4. Preferiblemente, la célula hospedadora mamífera es una célula CHO. Más preferiblemente, la célula hospedadora mamífera es una célula CHO K1. La célula hospedadora puede ser una célula procariota, es decir, una célula bacteriana, o una célula eucariota, incluida una célula de mamífero, de hongo, de levadura, de ave o de insecto. En una realización, la célula hospedadora es un hongo filamentoso o es una célula de levadura. Preferiblemente, la especie de levadura es del géneroPichia.Lo más preferiblemente, la especie dePichiase selecciona dePichia pastoris, Pichia metanolica,yHansenula polymorpha (Pichia angusta).
[0078] La invención proporciona además un método para expresar anticuerpos anti-PACAP, típicamente anticuerpos humanizados, comprendiendo el método cultivar la célula hospedadora descrita en este documento en condiciones que proporcionen la expresión de dicho anticuerpo en la misma. La célula hospedadora puede ser un cultivo celular, tal como una célula de ovario de hámster chino ("CHO") o un cultivo de levadura poliploide que expresa y segrega de manera estable en el medio de cultivo al menos 10-25 mg/litro de dicho anticuerpo. La levadura poliploide puede obtenerse mediante un método que comprende: (i) introducir al menos un vector de expresión que contenga uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican dicho anticuerpo unido operativamente a un promotor y una secuencia señal en una célula de levadura haploide; (ii) producir mediante apareamiento o fusión de esferoplastos una levadura poliploide a partir de dicha primera y/o segunda célula de levadura haploide; (iii) seleccionar células de levadura poliploide que expresen de forma estable dicho anticuerpo; y (iv) producir cultivos de levadura poliploide estables a partir de dichas células de levadura poliploide que expresen de forma estable dicho anticuerpo en el medio de cultivo. Preferiblemente, la especie de levadura es del géneroPichia.
[0080] En otras realizaciones, el cultivo de células de mamíferos puede realizarse mediante un método que comprende: (i) introducir al menos un vector de expresión que contiene uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican dicho anticuerpo unido operativamente a un promotor y una secuencia señal en una célula de mamífero; (ii) producir células individuales para cultivar para expresar uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican dicho anticuerpo; (iii) seleccionar una célula de mamífero que exprese de forma estable dicho anticuerpo; y (iv) producir cultivos celulares a partir de dicha célula de mamífero que expresen de forma estable dicho anticuerpo en el medio de cultivo. Preferiblemente, las especies de mamíferos son células CHO.
[0082] La invención se refiere además a los usos terapéuticos y diagnósticos de anticuerpos anti-PACAP, preferiblemente un anticuerpo humanizado.
[0084] En una realización, la invención proporciona un método para bloquear, inhibir o neutralizar uno o más efectos biológicos asociados con PACAP en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PACAP humano o humanizado o quimerizado que antagoniza, inhibe, neutraliza o bloquea al menos un efecto biológico asociado con PACAP humano. En una realización específica, el método emplea un anticuerpo anti-PACAP que se une específicamente al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes, y/o compite por la unión al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes en PACAP humano como un anticuerpo anti-PACAP seleccionado de Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5.
[0086] En otra realización, la invención proporciona un método para bloquear, inhibir o neutralizar uno o más efectos biológicos asociados con PACAP en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PACAP humanizado que antagoniza, inhibe, neutraliza o bloquea al menos un efecto biológico asociado con PACAP humano y que no interactúa sustancialmente con (se une a) VIP, por ejemplo el anticuerpo anti-PACAP tiene una afinidad más fuerte por PACAP en comparación con VIP, es decir, aunque hay cierta reactividad cruzada, los anticuerpos se unen preferentemente a PACAP en comparación con VIP. Por ejemplo, la afinidad de dicho anticuerpo por PACAP es al menos 10 veces, 30 veces, 100 veces, 300 veces, 1000 veces, 3000 veces, 10000 veces, 30000 veces, 100000 veces, 300000 veces, 1000000 veces, 3000000 veces, 10000000 veces, 30000000 veces, o mayor que la afinidad de dicho anticuerpo por VIP (por ejemplo, la K<d>de dicho anticuerpo o para la unión a PACAP humano es 10 veces, 30 veces, 100 veces, 300 veces, 1000 veces, 3000 veces, 10000 veces, 30000 veces, 100000 veces, 300000 veces, 1000000 veces, 3000000 veces, 10000000 veces, 30000000 veces, o menor que la K<d>para la unión a VIP). En una realización específica, el método emplea un anticuerpo anti-PACAP que se une específicamente al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes, y/o compite por la unión al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes en PACAP humano como un anticuerpo anti-PACAP seleccionado de Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5.
[0087] En aún otra realización, la invención proporciona un método para bloquear, inhibir o neutralizar uno o más efectos biológicos asociados con PACAP en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PACAP humanizado que inhibe o neutraliza al menos un efecto biológico provocado por PACAP; neutraliza o inhibe la activación por PACAP de al menos uno de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; neutraliza o inhibe la activación por PACAP de cada uno de PAC1-R, VPAC1-R y VPAC2-R; neutraliza o inhibe la activación por PACAP de PAC1-R; es capaz de inhibir la unión de PACAP a al menos uno de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; es capaz de inhibir la unión de PACAP a cada uno de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; es capaz de inhibir la unión de PACAP a PAC1-R; y/o es capaz de inhibir la unión de PACAP a la superficie celular, por ejemplo a través de GAG; inhibe la producción de AMPc inducida por PACAP; y/o cuando se administra a un sujeto reduce la vasodilatación, la fotofobia, la desgranulación de mastocitos, y/o la activación neuronal inducidas por PACAP. En una realización específica, el método emplea un anticuerpo anti-PACAP que se une específicamente al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes, y/o compite por la unión al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes en PACAP humano como un anticuerpo anti-PACAP seleccionado de Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5.
[0089] En otra realización, la invención proporciona un método para tratar o prevenir la aparición, frecuencia, gravedad o duración de la cefalea o la migraña en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PACAP humanizado que inhibe o neutraliza al menos un efecto biológico provocado por PACAP; neutraliza o inhibe la activación por PACAP de al menos uno de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; neutraliza o inhibe la activación por PACAP de cada uno de PAC1-R, VPAC1-R y VPAC2-R; neutraliza o inhibe la activación por PACAP de PAC1-R; es capaz de inhibir la unión de PACAP a al menos uno de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; es capaz de inhibir la unión de PACAP a cada uno de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; es capaz de inhibir la unión de PACAP a PAC1-R; y/o es capaz de inhibir la unión de PACAP a la superficie celular, por ejemplo a través de GAG; inhibe la producción de AMPc inducida por PACAP; y/o cuando se administra a un sujeto reduce la vasodilatación, la fotofobia, la desgranulación de mastocitos y/o la activación neuronal inducidas por PACAP. En otra realización, la invención proporciona un método para tratar o prevenir en un sujeto humano una afección aguda, episódica o crónica asociada con aumento de vasodilatación, fotofobia, desgranulación de mastocitos, y/o activación neuronal.
[0091] En una realización específica, el método emplea un anticuerpo anti-PACAP que se une específicamente al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes, y/o compite por la unión al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes en PACAP humano como un anticuerpo anti-PACAP seleccionado de Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5. El epítopo se puede identificar utilizando una estrategia de mutación de barrido de alanina, por ejemplo.
[0093] En una realización específica, la cefalea o la migraña tratada y/o prevenida mediante la administración de los anticuerpos anti-PACAP en cuestión se selecciona de migraña con o sin aura, migraña hemipléjica, cefalea en racimos, neuralgia migrañosa, cefalea crónica, y cefalea tensional.
[0095] En otra realización específica, el sujeto tiene un trastorno ocular asociado con fotofobia seleccionado del grupo que consiste en acromatopsia, aniridia, fotofobia causada por un fármaco anticolinérgico, afaquia (ausencia del cristalino del ojo), buftalmos (ángulo anormalmente estrecho entre la córnea y el iris), cataratas, distrofia de conos, anomalías congénitas del ojo, conjuntivitis viral ("ojo rojo"), abrasión corneal, distrofia corneal, úlcera corneal, disrupción del epitelio corneal, ectopia lentis, endoftalmitis, traumatismo ocular causado por enfermedad, lesión, o infección tal como chalazión, epiescleritis, glaucoma, queratocono, o hipoplasia del nervio óptico, hidroftalmos, o iritis por glaucoma congénito, neuritis óptica, síndrome de dispersión pigmentaria, dilatación pupilar (natural o inducida químicamente), desprendimiento de retina, cicatrización de la córnea o esclerótica, y uveítis.
[0097] En otra realización específica, el sujeto tiene una afección neurológica o relacionada con el sistema nervioso asociada con fotofobia seleccionada del grupo que consiste en trastornos del espectro autista, malformación de Chiari, dislexia, encefalitis, incluyendo encefalomielitis miálgica (también conocida como "síndrome de fatiga crónica"), meningitis, hemorragia subaracnoidea, tumor de la fosa craneal posterior, espondilitis anquilosante, albinismo, ariboflavinosis, benzodiazepinas (uso a largo plazo o abstinencia de benzodiazepinas), quimioterapia, chikungunya, cistinosis, síndrome de Ehlers-Danlos, resaca, gripe, mononucleosis infecciosa, deficiencia de magnesio, envenenamiento por mercurio, migraña, rabia, y tirosinemia tipo II (también conocida como "síndrome de Richner-Hanhart").
[0099] En otra realización específica, el sujeto tiene un trastorno asociado con fotofobia seleccionado del grupo que consiste en migraña (con o sin aura), iritis, uveítis, meningitis, depresión, trastorno bipolar, cefalea en racimos o cefalalgia autonómica trigémina ("CAT") o blefaroespasmo, depresión, agorafobia, trastorno de estrés postraumático ("TEPT"), lesión cerebral traumática, y trastorno bipolar.
[0101] En otra realización, la invención proporciona un método para neutralizar la señalización de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R inducida por PACAP, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PACAP que se une específicamente al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes, y/o compite por la unión al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes en PACAP humano como un anticuerpo anti-PACAP seleccionado de Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5.
[0103] En otra realización, la invención proporciona un método para inhibir la producción de AMPc inducida por PACAP, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PACAP que se une específicamente al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes, y/o compite por la unión al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes en PACAP humano como un anticuerpo anti-PACAP seleccionado de Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5.
[0105] En aún otra realización, la invención proporciona un método para inhibir la vasodilatación, la fotofobia, la desgranulación de mastocitos y/o la activación neuronal inducidas por PACAP, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PACAP que se une específicamente al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes, y/o compite por la unión al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes en PACAP humano como un anticuerpo anti-PACAP seleccionado de Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5.
[0107] En aún otra realización, la invención proporciona un método para tratar o prevenir una afección asociada con niveles elevados de PACAP en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PACAP que se une específicamente al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes, y/o compite por la unión al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes en PACAP humano como un anticuerpo anti-PACAP seleccionado de Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5. El epítopo se puede identificar utilizando una estrategia de mutación de barrido de alanina, por ejemplo.
[0108] En una realización, el anticuerpo anti-PACAP empleado en los métodos se une a PACAP27 y/o PACAP38 y bloquea la unión de PACAP27 y/o PACAP38 a PAC1-R, VPAC1-R, y/o VPAC2-R. En otra realización, el anticuerpo anti-PACAP empleado en los métodos se une a PACAP27 y/o PACAP38 y bloquea la unión de PACAP27 y/o PACAP38 a cada uno de PAC1-R, VPAC1-R, y VPAC2-R. Preferiblemente, el anticuerpo anti-PACAP se une a PACAP27 y/o PACAP38 y bloquea la unión de PACAP27 y/o PACAP38 a PAC1-R.
[0110] Más particularmente, los anticuerpos anti-PACAP empleados en los métodos según la invención pueden incluir anticuerpos humanizados. Además, el anticuerpo anti-PACAP empleado por los métodos de acuerdo con la invención puede carecer sustancial o totalmente de N-glicosilación y/u O-glicosilación. En una realización, el anticuerpo anti-PACAP utilizado en los métodos abarcados comprende un dominio constante humano, por ejemplo un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En otra realización, el anticuerpo anti-PACAP comprende una región Fc que se ha modificado para alterar (mejorar o perjudicar) al menos una de las funciones efectoras: vida media, proteólisis, o glicosilación. Por ejemplo, la región Fc puede contener una o más mutaciones que alteran o eliminan la N- y/u O-glicosilación.
[0112] En una realización, los métodos en cuestión emplean un anticuerpo anti-PACAP que se une a PACAP con una Kd menor o igual a 5x10'5 M, 10'5 M, 5x10'6 M, 10'6 M, 5x10'7 M, 10'7 M, 5x10'8 M, 10'8 M, 5x10'9 M, 10'9 M, 5x10'10 M, 10-10 M, 5x10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 M, 10'12 M, 5x10'13 M, o 10'13 M. Preferiblemente, el anticuerpo anti-PACAP humanizado se une a PACAP con una Kd menor o igual a 5x10'10 M, 10'10 M, 5x10'11 M, 10'11 M, 5x10'12 M, o 10'12 M. Más preferiblemente, los métodos emplean un anticuerpo anti-PACAP humanizado que se une a PACAP con una Kd que es menor que alrededor de 100 nM, menor que alrededor de 40 nM, menor que alrededor de 1 nM, menor que alrededor de 100 pM, menor que alrededor de 50 pM, o menor que alrededor de 25 pM. Alternativamente, el anticuerpo anti-PACAP se une a PACAP con una KD que está entre alrededor de 10 pM y alrededor de 100 pM. En otra realización, el anticuerpo anti-PACAP humanizado se une a PACAP con una constante de disociación (koff) menor o igual a 5x10'4 s-1, 10'4 s-1, 5x10'5 s-1, o 10'5 s-1.
[0114] En otra realización, el anticuerpo anti-PACAP utilizado en los métodos en cuestión está unido directa o indirectamente a otro resto, tal como un marcador detectable o un agente terapéutico; está unido a al menos un resto efector, por ejemplo que comprende un enlazador químico; y/o está unido a uno o más restos detectables, por ejemplo que comprende un tinte fluorescente, enzima, sustrato, material bioluminiscente, material radiactivo, resto quimioluminiscente, o mezclas de los mismos; y/o está unido a uno o más restos funcionales.
[0116] En otra realización, el método comprende además administrar por separado o coadministrar otro agente, por ejemplo seleccionado de un quimioterapéutico, un analgésico, un antiinflamatorio, un inmunosupresor, una citocina, un antiproliferativo, y un antiemético. Preferiblemente, el otro agente terapéutico es un analgésico, por ejemplo, un AINE (tales como un inhibidor de la ciclooxigenasa 1 y/o ciclooxigenasa 2; derivados del ácido propiónico, incluidos ibuprofeno, naproxeno, naprosina, diclofenaco y ketoprofeno; derivados del ácido acético, incluidos tolmetina y sulindaco; derivados del ácido fenámico, incluidos ácido mefenámico y ácido meclofenámico; derivados del ácido bifenilcarboxílico, incluidos diflunisal y flufenisal; y oxicams, incluidos piroxim, sudoxicam e isoxicam), un analgésico opioide (tal como morfina o un derivado de morfina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma; codeína, dihidrocodeína, diacetilmorfina, hidrocodona, hidromorfona, levorfanol, oximorfona, alfentanilo, buprenorfina, butorfanol, fentanilo, sufentanilo, meperidina, metadona, nalbufina, propoxifeno y pentazocina o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos), otro anticuerpo (tal como un anticuerpo o anticuerpo anti-NGF o un anticuerpo o anticuerpo anti-CGRP o anti-receptor CGRP ("anti-CGRP-R")), o un producto biológico no anticuerpo, por ejemplo BOTOX®.
[0118] En una realización, la administración combinada del analgésico opioide y el anticuerpo anti-PACAP aumenta el efecto analgésico en comparación con el analgésico opioide o el anticuerpo anti-PACAP administrados solos.
[0119] En otra realización, el sujeto se ha tratado previamente ("un sujeto tratado") y recibió un anticuerpo anti-CGRP o anti-CGRP-R. El sujeto tratado puede ser un paciente con migraña que no respondió adecuadamente al tratamiento con anticuerpos anti-CGRP o anti-CGRP-R ("mal respondedor"). Alternativamente, el sujeto tratado puede haber recibido previamente al menos un anticuerpo anti-CGRP o la administración de un anticuerpo anti-CGRP-R, y ha provocado una respuesta inmune a dicho anticuerpo.
[0121] En otra realización, un anticuerpo anti-PACAP de la invención puede comprender o puede provocar uno de los siguientes efectos: (a) inhibir o neutralizar al menos un efecto biológico provocado por PACAP; (b) neutralizar o inhibir la activación por PACAP de al menos uno del receptor de PAC1 ("PAC1-R"), receptor del péptido intestinal vasoactivo tipo 1 ("VPAC1-R") y/o receptor del péptido intestinal vasoactivo tipo 2 ("VPAC2-R"); (c) neutralizar o inhibir la activación por PACAP de cada uno de PAC1-R, VPAC1-R y VPAC2-R; (d) neutralizar o inhibir la activación por PACAP de PAC1-R; (e) inhibir la unión de PACAP a al menos uno de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; (f) inhibir la unión de PACAP a cada uno de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; (g) inhibir la unión de PACAP a células que expresan PAC1-R; (h) inhibir la unión de PACAP a la superficie celular, por ejemplo a través de un glicosaminoglicano ("GAG"); (i) no inhibir la unión mediada por PACAP de dicho anticuerpo a la superficie celular, por ejemplo a través de un GAG; (j) inhibir la unión mediada por PACAP de dicho anticuerpo a la superficie celular, por ejemplo a través de un GAG (k) inhibir la producción de AMPc inducida por PACAP; y/o (1) cuando se administra a un sujeto, reducir la vasodilatación, la fotofobia, la desgranulación de mastocitos y/o la activación neuronal inducidas por PACAP. En algunas realizaciones, dicho anticuerpo anti-PACAP puede no unirse a la superficie celular en presencia de PACAP38, por ejemplo a través de un GAG. En algunas realizaciones, dicho anticuerpo anti-PACAP puede unirse a la superficie celular en presencia de PACAP38, por ejemplo a través de un GAG. En algunas realizaciones, dicho anticuerpo anti-PACAP puede unirse de manera limitada a la superficie celular en presencia de PACAP38, por ejemplo a través de un GAG.
[0123] En aún otra realización, un anticuerpo anti-PACAP de la invención puede ser adecuado para tratar a un sujeto humano que tiene una afección aguda, episódica o crónica asociada con mayor vasodilatación, fotofobia, desgranulación de mastocitos y/o activación neuronal. La invención abarca un anticuerpo anti-PACAP que puede comprender al menos 2; al menos 3; al menos 4; al menos 5; o las 6 regiones determinantes de la complementariedad ("CDR") de un anticuerpo anti-PACAP que puede comprender Ab21.H, Ab21.H2, Ab21.H3 o Ab21.H4.
[0125] En aún otra realización, un anticuerpo anti-PACAP de la invención puede ser adecuado para tratar a un sujeto humano que tiene una afección aguda, episódica o crónica asociada con mayor vasodilatación, fotofobia, desgranulación de mastocitos y/o activación neuronal. Además, la invención abarca un anticuerpo anti-PACAP que puede comprender al menos 2; al menos 3; al menos 4; al menos 5; o las 6 regiones determinantes de la complementariedad ("CDR") de un anticuerpo anti-PACAP que puede comprender Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3, o , Ab10.H5.
[0127] En una realización específica, los anticuerpos anti-PACAP según la invención son preferiblemente anticuerpos anti-PACAP humanizados, y comprenden (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 964; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 966; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 968; y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 984; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 986; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 988. En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 962, y/o (b) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 982. Más específicamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 961, y/o (b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 981.
[0129] Otra realización de la invención se refiere en general a un anticuerpo anti-PACAP humano humanizado que se une específicamente a un epítopo en PACAP humano, en el que dicho epítopo puede seleccionarse del grupo que consiste en:
[0131] i. al menos uno de los residuos 22, 23, 27, 28 y 31 de un PACAP humano;
[0133] ii. al menos uno de los residuos 12, 20, 23, 24, 26, 27 y 28 de un PACAP humano;
[0135] iii. al menos uno de los residuos 19, 22, 23 y 27 de un PACAP humano;
[0137] iv. al menos dos de los residuos de (i), (ii) o (iii);
[0138] v. al menos tres de los residuos de (i), (ii) o (Ni);
[0139] vi. al menos cuatro de los residuos de (i), (ii) o (iii);
[0140] vii. al menos cinco de los residuos de (i) o (ii);
[0141] viii. al menos seis de los residuos de (ii);
[0142] ix. al menos siete de los residuos de (ii); y
[0143] x. al menos los residuos 23, 27 y 28 de un PACAP humano, y opcionalmente, entre uno y seis de los residuos adicionales de (i) y/o (ii).
[0144] En aún otra realización de la invención, un anticuerpo anti-PACAP humano humanizado puede unirse específicamente a un epítopo en PACAP humano (o una variante de la misma que contiene los residuos de aminoácidos correspondientes que está presente en PACAP38 de tipo salvaje humana) pero no en PACAP27 de tipo salvaje humana. Además, otra realización de la invención se refiere a un anticuerpo anti-PACAP humano humanizado o un anticuerpo que puede unirse específicamente a un epítopo en PACAP humano o una variante de la misma que contiene los residuos de aminoácidos correspondientes, en el que dicho epítopo consiste en los residuos de cualquiera de (i), (ii) o (iii). Además, otra realización de la invención se refiere a un anticuerpo anti-PA CAP humana humanizado que puede unirse específicamente a un epítopo en PACAP humano (o una variante de la misma que contiene los residuos de aminoácidos correspondientes) que está presente en PACAP38 humana de tipo salvaje y en PACAP27 humana de tipo salvaje. Dicho epítopo puede identificarse mediante barrido de alanina, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 12 aquí, o mediante otro método reconocido en la técnica.
[0145] Otra realización de la invención se refiere en general a un anticuerpo anti-PACAP que puede humanizarse. Además, aún otra realización comprende un anticuerpo anti-PACAP que puede carecer sustancial o totalmente de N-glicosilación y/u O-glicosilación.
[0146] Otra realización de la invención abarca un anti-PACAP que puede comprender un dominio constante humano, por ejemplo un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Además, una realización de la invención se refiere a un anticuerpo anti-PACAP que puede comprender una región Fc que se ha modificado para alterar al menos una de las funciones efectoras: vida media, proteólisis, o glicosilación, por ejemplo en el que la región Fc puede contener una o más mutaciones que alteran o eliminan la N- y/u O-glicosilación.
[0147] En aún otra realización de la invención, un anticuerpo anti-PACAP puede unirse a PACAP con una afinidad de unión (K<d>) menor o igual a 5x10'5 M, 10'5 M, 5x10'6 M, 10'6 M, 5x10'7 M, 10'7 M, 5x10'8 M, 10'8 M, 5x10'9 M, 10'9 M, 5x10'1° M, 10'1° M, 5x10'11 M, 10'11 M, 5x10-12 M, 10-12 M, 5x10'13 M, o 10'13 M, por ejemplo según se determina por ELISA, interferometría de biocapa ("BLI"), KINEXA o resonancia de plasmones superficiales a 25° o 37 °C. Además, otra realización de la invención abarca un anticuerpo anti-PACAP que puede unirse a PACAP con una afinidad de unión (Kd) menor o igual a 5x1°'10 M, 10'10 M, 5x1o-11 M, 1°-11 M, 5x1°-12 M, o 1°-12 M. Además, una realización adicional de la invención se refiere a un anticuerpo anti-PACAP que puede unirse a PACAP con una constante de disociación (kd) menor o igual a 5x10-4 s-1, 10-4 s-1, 5x10-5 s-1, o 10-5 s-1.
[0148] Una realización adicional de la invención se refiere a un anticuerpo anti-PACAP que puede estar unido directa o indirectamente a un marcador detectable o agente terapéutico. Además, otra realización de la invención se refiere a un anticuerpo anti-PACAP que puede unirse a PACAP con una K<d>que es menor que alrededor de 100 nM, 40 nM, 50 pM, 25 pM, o está entre alrededor de 1° pM y alrededor de 100 pM. Una realización adicional se refiere a un anticuerpo anti-PACAP que puede tener una afinidad más fuerte por PACAP en comparación con VIP y/o no se une a VIP, por ejemplo en el que la afinidad de dicho anticuerpo por PACAP puede ser al menos 10 veces, 30 veces, 100 veces, 300 veces, 1000 veces, 3000 veces, 10000 veces, 30000 veces, 100000 veces, 300000 veces, 1000000 veces, 3000000 veces, 10000000 veces, 30000000 veces, o más fuerte que la afinidad de dicho anticuerpo por VIP.
[0149] Además, otro aspecto de la invención se refiere generalmente a un anticuerpo anti-PACAP que puede estar unido a al menos un resto efector o funcional y/o a uno o más restos detectables, por ejemplo un colorante fluorescente, enzima, sustrato, material bioluminiscente, material radiactivo, resto quimioluminiscente, o mezcla de los mismos. Aún otra realización de la invención se refiere a un anticuerpo antiidiotípico que puede producirse contra un anticuerpo anti-PACAP que opcionalmente puede neutralizar uno o más efectos biológicos del anticuerpo anti-PACAP al que puede unirse. Además, dicho anticuerpo antiidiotípico puede usarse para monitorizar los nivelesin vivode dicho anticuerpo anti-PACAP en un sujeto, o para neutralizar los efectosin vivode dicho anticuerpo anti-PACAP en un sujeto.
[0150] Otra realización de la invención abarca una composición que puede ser adecuada para uso terapéutico, profiláctico o de diagnóstico, que puede comprender una cantidad terapéutica, profiláctica o diagnósticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-PACAP Dicha composición puede ser adecuada para administración subcutánea; y/o puede ser adecuada para administración intravenosa o intramuscular. Además, en una realización, dicha composición puede liofilizarse, estabilizarse y/o formularse para administración mediante inyección. Además, dicha composición puede comprender además un diluyente, vehículo, solubilizante , emulsionante, conservante o mezcla de los mismos farmacéuticamente aceptable y/u otro agente activo, por ejemplo en la que el otro agente activo puede seleccionarse del grupo que consiste en un quimioterapéutico, un analgésico, un antiinflamatorio, un inmunosupresor, una citocina, un antiproliferativo, un antiemético, y una citotoxina.
[0152] Además, otra realización se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislada o secuencias de ácido nucleico que pueden codificar un anticuerpo anti-PACAP En una realización de la invención, un vector o vectores pueden contener la secuencia o secuencias de ácido nucleico aisladas. Además, otra realización se refiere a una célula hospedadora que puede comprender la secuencia o secuencias de ácido nucleico aisladas y/o el vector o vectores. Dicha célula hospedadora puede ser una célula de mamífero, bacteriana, fúngica, de levadura, aviar, anfibia, vegetal o de insecto, o es una célula CHO. Además, dicha célula hospedadora puede ser un hongo filamentoso o una levadura, por ejemplo seleccionada de los siguientes géneros:Arxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis;yZygosaccharomycespreferiblementePichia ymás preferiblementePichia pastoris, Pichia methanolicaoHansenula polymorpha (Pichia angusta);o dicha célula hospedadora puede ser una célula de mamífero, por ejemplo seleccionada de células de riñón de hámster bebé ("BHK"); células de ovario de hámster chino ("CHO"); células de Sertoli de ratón (células "TM4"); células de riñón de mono verde africano (células "VERO-76"); células de carcinoma cervical humano ("HELA"); células de riñón canino ("MDCK"); células de hígado de rata búfalo ("BRL"); células de pulmón humano; células de hígado humano ("Hep G2"); células de tumor mamario de ratón ("MMT"); células TRI; células MRC 5; y células FS4. Además, dicha célula CHO puede seleccionarse de uno de los siguientes subclones o sublíneas celulares: línea celular DP12 (CHO K1 dhfr-), células NS0, CHO-DXB11 (CHO-DUKX), CHO-pro3, CHO-DG44, CHO 1-15, CHO DP-12, Lec2, M1WT3, Lec8 o pgsA-745.
[0154] Otra realización de la invención se refiere a un método para expresar un anticuerpo anti-PACAP, que puede comprender cultivar dicha célula hospedadora en condiciones que proporcionen la expresión de dicho anticuerpo. Además, dicha célula hospedadora puede ser un cultivo de levadura poliploide o una célula CHO que expresa y segrega de forma estable en el medio de cultivo al menos 10-25 mg/litro de dicho anticuerpo. Además, dicha levadura poliploide, preferiblemente una levaduraPichia, puede obtenerse mediante un método que puede comprender: (i) introducir al menos un vector de expresión que contenga uno o más polinucleótidos heterólogos que codifican dicho anticuerpo unido operativamente a un promotor y una secuencia señal en una célula de levadura haploide; (ii) producir mediante apareamiento o fusión de esferoplastos una levadura poliploide a partir de dicha primera y/o segunda célula de levadura haploide; (iii) seleccionar células de levadura poliploide que expresen de forma estable dicho anticuerpo; y (iv) producir cultivos de levadura poliploide estables a partir de dichas células de levadura poliploide que expresen de forma estable dicho anticuerpo en el medio de cultivo.
[0155] Otro aspecto de la invención se refiere en general a un método para bloquear, inhibir o neutralizar uno o más efectos biológicos asociados con el péptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria ("PACAP") en un sujeto, que puede comprender administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PACAP como se describe en este documento o una composición como se describe en este documento. En otra realización, la invención se refiere en general a un método para bloquear, inhibir o neutralizar uno o más efectos biológicos asociados con el péptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria ("PACAP") en un sujeto, que puede comprender administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PACAP como se analiza en este documento o una composición como se analiza en este documento que puede antagonizar, inhibir, neutralizar o bloquear al menos un efecto biológico asociado con PACAP humano y que no interactúa sustancialmente con (se une a) el péptido intestinal vasoactivo ("VIP").
[0157] Además, otra realización abarca un método para bloquear, inhibir o neutralizar uno o más efectos biológicos asociados con el péptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria ("PACAP") en un sujeto, que puede comprender administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PACAP como se describe en este documento o una composición como se describe en este documento que puede provocar o puede comprender uno o más de los siguientes: (a) inhibir o neutralizar al menos un efecto biológico provocado por PACAP; (b) neutralizar o inhibir la activación por PACAP de al menos uno del receptore de PAC1 ("PAC1-R"), receptor de péptido intestinal vasoactivo tipo 1 ("VPAC1-R") y/o receptor de péptido intestinal vasoactivo tipo 2 ("VPAC2-R"); (c) neutralizar o inhibir la activación por PACAP de cada uno de PAC1-R, VPAC1-R y VPAC2-R; (d) neutralizar o inhibir la activación por PACAP de PAC1-R; (e) es capaz de inhibir la unión de PACAP a al menos uno de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; (f) es capaz de inhibir la unión de PACAP a cada uno de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; (g) es capaz de inhibir la unión de PACAP a células que expresan PAC1-R; (h) es capaz de inhibir la unión de PACAP a la superficie celular, por ejemplo a través de un glicosaminoglicano ("GAG"); (i) no inhibe la unión mediada por PACAP de dicho anticuerpo a la superficie celular, por ejemplo a través de un GAG; (j) inhibir la unión mediada por PACAP de dicho anticuerpo a la superficie celular, por ejemplo a través de un GAG; (k) inhibir la producción de AMPc inducida por PACAP; y/o (l) cuando se administra a un sujeto, reducir la vasodilatación, la fotofobia, la desgranulación de mastocitos y/o la activación neuronal inducidas por PACAP
[0158] Otra realización de la invención se refiere a un método para tratar o prevenir la aparición, frecuencia, gravedad o duración de la cefalea o migraña, por ejemplo en el que la cefalea o migraña puede seleccionarse de migraña con aura, migraña sin aura, migraña hemipléjica, cefalea en racimos, neuralgia migrañosa, cefalea crónica, migraña crónica, cefalea por abuso de medicamentos, y cefalea tensional, en un sujeto, que puede comprender la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad cantidad eficaz de un anticuerpo humanizado anti-Polipéptido Activador de la Adenilato Ciclasa de la Pituitaria ("PACAP") como se describe en este documento o una composición como se describe en este documento que puede provocar o puede comprender uno o más de los siguientes: (a) inhibir o neutralizar al menos un efecto biológico provocado por PACAP; (b) neutralizar o inhibir la activación por PACAP de al menos uno del receptore de PAC1 ("PAC1-R"), receptor de péptido intestinal vasoactivo tipo 1 ("VPAC1-R") y/o receptor de péptido intestinal vasoactivo tipo 2 ("VPAC2-R"); (c) neutralizar o inhibir la activación por PACAP de cada uno de PAC1-R, VPAC1-R y VPAC2-R; (d) neutralizar o inhibir la activación por PACAP de PAC1-R; (e) es capaz de inhibir la unión de PACAP a al menos uno de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; (f) es capaz de inhibir la unión de PACAP a cada uno de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; (g) es capaz de inhibir la unión de PACAP a células que expresan PAC1-R; (h) es capaz de inhibir la unión de PACAP a la superficie celular, por ejemplo a través de un glicosaminoglicano ("GAG"); (i) no inhibe la unión mediada por PACAP de dicho anticuerpo a la superficie celular, por ejemplo a través de un GAG; (j) inhibir la unión mediada por PACAP de dicho anticuerpo a la superficie celular, por ejemplo a través de un GAG; (k) inhibir la producción de AMPc inducida por PACAP; y/o (l) cuando se administra a un sujeto, reducir la vasodilatación, la fotofobia, la desgranulación de mastocitos y/o la activación neuronal inducidas por PACAP.
[0160] Aún otra realización de la invención se refiere a un método para tratar a un sujeto humano que tiene una afección aguda, episódica o crónica asociada con al menos uno de los siguientes: aumento de vasodilatación, fotofobia, desgranulación de mastocitos y activación neuronal o una combinación de cualquiera de los anteriores, que puede comprender administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-polipéptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria ("PACAP") como se analiza en este documento o una composición como se analiza en este documento.
[0162] Una realización adicional se refiere a un método para bloquear, inhibir o neutralizar uno o más efectos biológicos asociados con el péptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria ("PACAP"), que puede comprender administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PACAP que puede unirse específicamente al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes y/o puede competir por la unión al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes en el PACAP humano que un anticuerpo anti-PACAP que comprende Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5, o uno divulgado en este documento o una composición divulgada en este documento.
[0164] Aún otra realización se refiere a un método para neutralizar la señalización del receptor de PAC1 ("PAC1-R"), el receptor del péptido intestinal vasoactivo tipo 1 ("VPAC1-R") y/o el receptor del péptido intestinal vasoactivo tipo 2 ("VPAC2-R") inducida por el péptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria ("PACAP"), que puede comprender administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PACAP que puede unirse específicamente al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes y/o puede competir por la unión al mismo epítopo o o epítopos lineales o conformacionales solapantes en PACAp humano que un anticuerpo anti-PACAP que comprende Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5, o uno divulgado en este documento o una composición divulgada en este documento.
[0166] En otra realización, la invención comprende un método para inhibir la producción de monofosfato de adenosina cíclico ("AMPc") inducida por el péptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria ("PACAP"), que puede comprender administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PACAP que puede unirse específicamente al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes y/o puede competir por la unión al mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes en PACAP humano que un anticuerpo anti-PACAP que comprende Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5, o uno divulgado en este documento o una composición divulgada en este documento.
[0168] Otro aspecto de la invención se refiere en general a un método en el que un anticuerpo anti-PACAP puede ser un anticuerpo humanizado. Otro aspecto de la invención se refiere en general a un método en el que un anticuerpo anti-PACAP puede unirse a PACAP27 y/o PACAP38 y puede bloquear la unión de PACAP27 y/o PACAP38 a PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R. Además, otra realización se refiere a un método en el que un anticuerpo anti-PACAP puede unirse a PACAP27 y/o PACAP38 y puede bloquear la unión de PACAP27 y/o PACAP38 a cada uno de PAC1-R, VPAC1-R y VPAC2-R.
[0170] Otra realización más de la invención se refiere a un método en el que el anticuerpo anti-PACAP puede unirse a PACAP27 y/o PACAP38 y puede bloquear la unión de PACAP27 y/o PACAP38 a las células que expresan PAC1-R. Además, otra realización de la invención se refiere a un método en el que un sujeto puede tener una afección que puede seleccionarse del grupo que consiste en migraña con aura, migraña sin aura, migrañas hemipléjicas, cefaleas en racimos, neuralgia migrañosa, cefaleas crónicas, migraña crónica, cefalea por abuso de medicamentos, cefaleas tensionales, cefaleas generales, sofocos, fotofobia, hemicránea paroxística crónica, cefaleas secundarias debido a un problema estructural subyacente en la cabeza, cefaleas secundarias debido a un problema estructural subyacente en el cuello, neuralgia craneal, cefaleas sinusales, cefalea asociada a sinusitis, cefaleas inducidas por alergias, migrañas inducidas por alergias, neuralgia del trigémino, neuralgia posherpética, dolor de miembro fantasma, fibromialgia, distrofia simpática refleja, dolor, dolor crónico, dolor inflamatorio, dolor por incisión posoperatoria, dolor posquirúrgico, dolor relacionado con traumatismos, dolor lumbar, dolor ocular, dolor de muelas, síndrome de dolor regional complejo, dolor por cáncer, dolor por cáncer óseo primario o metastásico, dolor por fractura, dolor por fractura osteoporótica, dolor por quemaduras, dolor articular por gota, dolor asociado con crisis de células falciformes, dolor asociado con trastornos temporomandibulares, cirrosis, hepatitis, dolor neurogénico, dolor neuropático, dolor nocicéptico, dolor visceral, dolor menstrual, ovarialgia, dolor por osteoartritis, dolor por artritis reumatoide, neuropatía diabética, ciática, dispepsia, síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, ileítis, colitis ulcerosa, cólico renal, dismenorrea, cistitis, cistitis intersticial, menstruación, parto, menopausia, pancreatitis, esquizofrenia, depresión, trastorno de estrés postraumático ("TEPT"), trastornos de ansiedad, diabetes autoinmune, síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, vejiga hiperactiva, hiperreactividad bronquial, asma, accidente cerebrovascular, bronquitis, broncodilatación, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica ("EPOC"), dermatitis inflamatoria, acné vulgar, dermatitis atópica, urticaria, queloides, cicatrices hipertróficas y rosácea, disfunción endotelial, síndrome de Raynaud, cardiopatía coronaria ("ECC"), enfermedad de la arteria coronaria ("EAC"), insuficiencia cardíaca, enfermedad arterial periférica ("EAP"), diabetes, hipertensión pulmonar ("HP"), trastorno del tejido conjuntivo, dermatitis alérgica, psoriasis, prurito, enrojecimiento cutáneo neurogénico, eritema, sarcoidosis, choque, septicemia, síndrome de abstinencia de opiáceos, tolerancia a la morfina, y epilepsia; y/o en el que dicho sujeto puede tener una afección que puede seleccionarse del grupo que consiste en migraña, cefalea y una enfermedad o afección asociada al dolor; y/o en el que dicho cefalea o migraña puede seleccionarse del grupo que consiste en migraña con aura, migraña sin aura, migraña hemipléjica, cefalea en racimos, neuralgia migrañosa, cefalea crónica, migraña crónica, cefalea por abuso de medicamentos, y cefalea tensional. Además, dicho sujeto puede tener un trastorno ocular asociado con fotofobia seleccionado del grupo que consiste en acromatopsia, aniridia, fotofobia causada por un fármaco anticolinérgico, afaquia, buftalmos, cataratas, distrofia de conos, anomalías congénitas del ojo, conjuntivitis viral, abrasión corneal, distrofia corneal, úlcera corneal, disrupción del epitelio corneal, ectopia lentis, endoftalmitis, traumatismo ocular causado por enfermedad, traumatismo ocular causado por lesión, traumatismo ocular causado por infección, chalazión, epiescleritis, glaucoma, queratocono, hipoplasia del nervio óptico, hidroftalmos, iritis por glaucoma congénito, neuritis óptica, síndrome de dispersión pigmentaria, dilatación pupilar, desprendimiento de retina, cicatrización de la córnea, esclerótica y uveítis.
[0172] Además, dicho sujeto puede tener una afección neurológica o relacionada con el sistema nervioso asociada con fotofobia seleccionada del grupo que consiste en trastornos del espectro autista, malformación de Chiari, dislexia, encefalitis, meningitis, hemorragia subaracnoidea, tumor de la fosa craneal posterior, espondilitis anquilosante, albinismo, ariboflavinosis, benzodiazepinas, quimioterapia, chikungunya, cistinosis, síndrome de Ehlers-Danlos, resaca, gripe, mononucleosis infecciosa, deficiencia de magnesio, envenenamiento por mercurio, migraña, rabia, y tirosinemia tipo II; y/o dicho sujeto puede tener un trastorno asociado con fotofobia seleccionado del grupo que consiste en migraña con aura, migraña sin aura, iritis, uveítis, meningitis, depresión, trastorno bipolar, cefalea en racimos o cefalea autonómica trigémina anterior ("TAC") o blefaroespasmo, depresión, agorafobia, y trastorno bipolar.
[0174] En una realización específica, la invención también abarca cualquiera de los métodos divulgados en este documento, en los que los anticuerpos anti-PACAP según la invención son preferiblemente anticuerpos anti-PACAP humanizados, y comprenden (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 964; una secuencia de Cd R2 que consiste en SEQ ID NO: 966; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 968; y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 984; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 986; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 988. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 962, y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 982. En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 962, y/o (b) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 982. Más específicamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 961, y/o (b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 981.
[0176] En otra realización específica, la invención también abarca cualquiera de los métodos divulgados en este documento, en los que los anticuerpos anti-PACAP según la invención, son preferiblemente anticuerpos anti-PACAP humanizados, y comprenden (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1284; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 1286; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1288; y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1304; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 1306; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1308. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1282, y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1302. En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1282, y/o (b) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1302. Más específicamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1281, y/o (b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1301.
[0178] En otra realización específica, la invención también abarca cualquiera de los métodos divulgados en este documento, en los que los anticuerpos anti-PACAP según la invención son preferiblemente anticuerpos anti-PACAP humanizados, y comprenden (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1324; una secuencia de C<d>R2 que consiste en SEQ ID NO: 1326; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1328; y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1344; una secuencia de CDR2 que consiste en<s>E<q>ID NO: 1346; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1348. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1322, y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1342. En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1322, y/o (b) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1342. Más específicamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1321, y/o (b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1341.
[0180] En otra realización específica, la invención también abarca cualquiera de los métodos divulgados en este documento, en los que los anticuerpos anti-PACAP según la invención son preferiblemente anticuerpos anti-PACAP humanizados, y comprenden (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1404; una secuencia de Cd R2 que consiste en SEQ ID NO: 1406; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1408; y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1424; una secuencia de CDR2 que consiste en<s>E<q>ID NO: 1426; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1428. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1402, y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1422. En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1402, y/o (b) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1422. Más específicamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
[0182] En otra realización específica, la invención también abarca cualquiera de los métodos divulgados en este documento, en los que los anticuerpos anti-PACAP según la invención son preferiblemente anticuerpos anti-PACAP humanizados, y comprenden (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 962 y que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 964; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 966; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 968; y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 982 y que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 984; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 986; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 988. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 962, y/o (b) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 982. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 962, y (b) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 982. En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con s Eq ID NO: 961 y que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 964; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 966; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 968; y/o (b) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 981 y que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 984; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 986; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 988. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 961, y/o (b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 981. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 961, y (b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 981.
[0184] En otra realización específica, la invención también abarca cualquiera de los métodos divulgados en este documento, en los que los anticuerpos anti-PACAP según la invención son preferiblemente anticuerpos anti-PACAP humanizados, y comprenden (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1282 y que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1284; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 1286; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1288; y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1302 y que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1304; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 1306; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1308. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de<s>E<q>ID NO: 1282, y/o (b) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1302. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1282, y (b) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1302. En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1281 y que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1284; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 1286; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1288; y/o (b) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1301 y que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1304; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 1306; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1308. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1281, y/o (b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1301. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1281, y (b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1301.
[0186] En otra realización específica, la invención también abarca cualquiera de los métodos divulgados en este documento, en los que los anticuerpos anti-PACAP según la invención son preferiblemente anticuerpos anti-PACAP humanizados, y comprenden (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1322 y que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1324; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 1326; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1328; y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1342 y que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1344; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 1346; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1348. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 1322, y/o (b) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1342. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1322, y (b) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1342. En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1321 y que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1324; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 1326; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1328; y/o (b) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1341 y que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1344; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 1346; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1348. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1321, y/o (b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1341. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1321, y (b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1341.
[0188] En otra realización específica, la invención también abarca cualquiera de los métodos divulgados en este documento, en los que los anticuerpos anti-PACAP según la invención son preferiblemente anticuerpos anti-PACAP humanizados, y comprenden (a) una cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1402 y que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1404; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 1406; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1408; y/o (b) una cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1422 y que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1424; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 1426; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1428. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 1402, y/o (b) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1422. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1402, y (b) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1422. En otra realización, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1401 y que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1404; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 1406; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1408; y/o (b) una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1421 y que comprende una secuencia de CDR1 que consiste en SEQ ID NO: 1424; una secuencia de CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 1426; y una secuencia de CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 1428. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1401, y/o (b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1421. Alternativamente, los anticuerpos anti-PACAP pueden comprender (a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1401, y (b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1421.
[0190] Otra realización de la invención también se refiere en general a un método en el que el anticuerpo anti-PACAP puede carecer sustancial o totalmente de N-glicosilación y/u O-glicosilación. Aún otra realización se refiere a un método en el que el anticuerpo anti-PACAP puede comprender un dominio constante humano, por ejemplo un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
[0192] Además, otra realización de la invención se refiere en general a un método en el que el anticuerpo anti-PACAP puede comprender una región Fc que se ha modificado para alterar al menos una de las funciones efectoras, vida media, proteólisis, o glicosilación, por ejemplo en el que la región Fc puede contener una o más mutaciones que alteran o eliminan la N- y/u O-glicosilación.
[0194] Además, otra realización de la invención se refiere a un método en el que el anticuerpo anti-PACAP puede unirse a PACAP con una afinidad de unión (Kd) menor o igual a 5x10<-5>M, 10<-5>M, 5x10‘6 M, 10‘6 M, 5x10‘7 M, 10‘7 M, 5x10' 8 M, 10-8 M, 5x10-9 M, 10-9 M, 5x10-10 M, 10<-10>M, 5x1o-11 M, 10<-11>M, 5x10<-12>M, 10<-12>M, 5x10-13 M, o 10’13 M. Además, otra realización de la invención se refiere a un método en el que el anticuerpo anti-PACAP puede unirse a PACAP con una afinidad de unión (K<d>) menor o igual a 5x10<-10>M, 10<-10>M, 5x10<-11>M, 10<-11>M, 5x10<-12>M, o 10<-12>M, y/o se une a PACAP con una constante de disociación (kd) menor o igual a 5x10<-4>s-1, 10<-4>s-1, 5x10<-5>s<-1>, o 10<-5>s-1.
[0196] Otro aspecto de la invención abarca un método en el que el anticuerpo anti-PACAP puede unirse directa o indirectamente a un marcador detectable o agente terapéutico. Otro aspecto de la invención abarca un método en el que el anticuerpo anti-PACAP puede unirse a PACAP con una K<d>que es menor que alrededor de 100 nM, menor que alrededor de 40 nM, menor que alrededor de 1 nM, menor que alrededor de 100 pM, menor que alrededor de 50 pM, o menor que alrededor de 25 pM, o una Kd que está entre alrededor de 10 pM y alrededor de 100 pM.
[0197] Otro aspecto de la invención abarca un método en el que el método puede comprender además administrar por separado o coadministrar otro agente, por ejemplo un quimioterapéutico, un analgésico, un antiinflamatorio, un inmunosupresor, una citocina, un antiproliferativo, un antiemético, una citotoxina, un analgésico, por ejemplo en el que el analgésico puede ser un fármaco antiinflamatorio no esteroideo ("AINE"), un analgésico opioide, otro anticuerpo o un biológico no anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo anti-NGF o un anticuerpo anti-péptido relacionado con el gen de la calcitonina ("<c>G<r>P"). Dicho AINE puede ser un inhibidor de la ciclooxigenasa 1 y/o ciclooxigenasa 2, o puede seleccionarse del grupo que consiste en (1) derivados del ácido propiónico, incluidos ibuprofeno, naproxeno, naprosina, diclofenaco, y ketoprofeno; (2) derivados del ácido acético, incluidos tolmetina y sulindaco; (3) derivados del ácido fenámico, incluidos ácido mefenámico y ácido meclofenámico; (4) derivados del ácido bifenilcarboxílico, incluidos diflunisal y flufenisal. y (5) oxicams, incluidos piroxim, sudoxicam e isoxicam, o es un analgésico opioide seleccionado del grupo que consiste en codeína, dihidrocodeína, diacetilmorfina, hidrocodona, hidromorfona, levorfanol, oximorfona, alfentanilo, buprenorfina, butorfanol, fentanilo, sufentanilo, meperidina, metadona, nalbufina, propoxifeno, pentazocina, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, preferiblemente morfina o un derivado de morfina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
[0199] Otro aspecto de la invención abarca un método en el que la administración combinada del analgésico opioide y el anticuerpo anti-PACAP puede aumentar el efecto analgésico en comparación con el analgésico opioide o el anticuerpo anti-PACAP administrados solos. Además, otra realización de la invención se refiere a un método en el que el sujeto puede haber recibido previamente un anticuerpo anti-CGRP y/o es un migrañoso que puede no haber respondido adecuadamente al tratamiento con anticuerpos anti-CGRP y/o puede haber provocado una respuesta inmune a un anticuerpo anti-CGRP administrado previamente.
[0201] BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS VARIAS VISTAS DE LOS DIBUJOS
[0203] Las FIG. 1A-1G proporcionan las secuencias polipeptídicas de la cadena pesada de longitud completa para los anticuerpos Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, y Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, y Ab21.H4 (SEQ ID NOS: 401; 441; 841; 881; 921; 961; 1201; 1281; 1321; 1361; 1401; 1441; 1481; 1521; y 1561, respectivamente) alineados por sus FR, CDR y regiones constantes.
[0205] Las FIG. 2A-2D proporcionan las secuencias polipeptídicas de la cadena ligera de longitud completa para los anticuerpos Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, y Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, y Ab21.H4 (SEQ ID NOS: 421; 461; 861; 901; 941; 981; 1221; 1301; 1341; 1381; 1421; 1461; 1501; 1541; y 1581, respectivamente) alineados por sus FR, CDR y regiones constantes.
[0207] Las FIG. 3A-3S proporcionan las secuencias polinucleotídicas que codifican la cadena pesada de longitud completa para los anticuerpos Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, y Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, y Ab21.H4 (SEQ ID NOS: 411; 451; 851; 891; 931; 971; 1211; 1291; 1331; 1371; 1411; 1451; 1491; 1531; y 1571, respectivamente) alineados por sus FR, CDR y regiones constantes.
[0208] Las FIG. 4A-4J proporcionan las secuencias polinucleotídicas que codifican la cadena ligera de longitud completa Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, y Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, y Ab21.H4 (SEQ ID NOS: 431; 471; 871; 911; 951; 991; 1231; 1311; 1351; 1391; 1431; 1471; 1511; 1551; y 1591, respectivamente) alineados por sus FR, CDR y regiones constantes.
[0210] La FIG. 5 proporciona las coordenadas de la secuencia polipeptídica para ciertas características de la secuencia proteica de cadena pesada del anticuerpo, incluida la región variable y las CDR de la cadena pesada para los anticuerpos Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, y Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, y Ab21.H4.
[0212] La FIG. 6 proporciona las coordenadas de la secuencia polipeptídica para ciertas características de la secuencia proteica de cadena pesada del anticuerpo, incluidas la región constante y las regiones marco FR de la cadena pesada para los anticuerpos Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, y Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, y Ab21.H4.
[0214] La FIG. 7 proporciona las coordenadas de la secuencia polipeptídica para ciertas características de la secuencia proteica de cadena ligera del anticuerpo, incluida la región variable y las CDR de la cadena ligera para los anticuerpos Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, y Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, y Ab21.H4.
[0216] La FIG. 8 proporciona las coordenadas de la secuencia polipeptídica para ciertas características de la secuencia proteica de la cadena ligera del anticuerpo, incluidas la región constante y las regiones marco FR de la cadena ligera para los anticuerpos Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4.
[0218] La FIG. 9 proporciona las coordenadas de la secuencia polinucleotídica para ciertas características de la secuencia de ADN de la cadena pesada del anticuerpo, incluida la región variable y las CDR de la cadena pesada de los anticuerpos Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4.
[0220] La FIG. 10 proporciona las coordenadas de la secuencia polinucleotídica para ciertas características de la secuencia de ADN de la cadena pesada del anticuerpo, incluida la región constante y las FR de la cadena pesada para los anticuerpos Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4.
[0222] La FIG. 11 proporciona las coordenadas de la secuencia polinucleotídica para ciertas características de la secuencia de ADN de la cadena ligera del anticuerpo, incluida la región variable y las CDR de la cadena ligera para los anticuerpos Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4.
[0224] La FIG. 12 proporciona las coordenadas de la secuencia polinucleotídica para ciertas características de la secuencia de ADN de la cadena ligera del anticuerpo, incluida la región constante y las FR de la cadena ligera para los anticuerpos Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4.
[0226] Las FIG. 13A-F proporcionan datos representativos de unión competitiva para Ab10 (FIG. 13A), Ab20 (FIG. 13B), Ab21 (FIG. 13C), Ab1.H (FIG. 13D), Ab22 (FIG. 13E) y Ab23 (FIG. 13F) obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1más abajo.
[0228] Las FIG. 14A-H proporcionan datos representativos que muestran la inhibición mediada por Ab10 (FIG. 14A), mediada por Ab20 (FIG. 14B), mediada por Ab21 (FIG. 14C), mediada por Ab1.H (FIG. 14D), mediada por Ab10.H (FIG. 14E), mediada por Ab21.H (FIG. 14F), mediada por Ab22 (FIG. 14G) y mediada por Ab23 (FIG. 14H) de la unión de PACAP38 a células PC-12 que expresan PAC1-R obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 5más abajo.
[0230] Las FIG. 15A-O proporcionan datos representativos que muestran la unión de Ab10 (FIG. 15A), Ab20 (FIG. 15B), Ab21 (FIG. 15C), Ab1.H (FIG. 15D), Ab10.H (FIG. 15E), Ab21.H (FIG. 15F), Ab22 (FIG. 15G), Ab23 (FIG. 15H), Ab10.H2 (FIG. 15I), Ab10.H3 (FIG. 15J), Ab10.H4 (FIG. 15K), Ab10.H5 (FIG. 15L), Ab21.H2 (FIG. 15M), Ab21.H3 (FIG. 15N) y Ab21.H4 (FIG. 15O) a células PC-12 que expresan PAC1-R en presencia de PACAP38 obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 6más abajo.La línea discontinua en la FIG. 15A representa un control sin PACAP y sin anticuerpos.
[0232] Las FIG. 16A-O proporcionan datos representativos que muestran la inhibición mediada por Ab10 (FIG. 16A), mediada por Ab20 (FIG. 16B), mediada por Ab21 (FIG. 16C), mediada por Ab1.H (FIG. 16D), mediada por Ab10.H (FIG. 16E), mediada por Ab21.H (FIG. 16F), mediada por Ab22 (FIG. 16G), mediada por Ab23 (FIG. 16H), mediada por Ab10.H2 (FIG. 16I), mediada por Ab10.H3 (FIG. 16J), mediada por Ab10.H4 (FIG. 16K), mediada por Ab10.H5 (FIG. 16L), mediada por Ab21.H2 (FIG. 16M), mediada por Ab21.H3 (FIG. 16N), y mediada por Ab21.H4 (FIG. 16O) de la producción de AMPc dirigida por PACAP38 a través de células PC-12 que expresan PAC1-R obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1más abajo.
[0234] Las FIG. 17A-O proporcionan datos representativos que muestran la inhibición mediada por Ab10 (FIG. 17A), mediada por Ab20 (FIG. 17B), mediada por Ab21 (FIG. 17C), mediada por Ab1.H (FIG. 17D), mediada por Ab10.H (FIG. 17E), mediada por Ab21.H (FIG. 17F), mediada por Ab22 (FIG. 17G), mediada por Ab23 (FIG. 17H), mediada por Ab10.H2 (FIG. 17I), mediada por Ab10.H3 (FIG. 17J), mediada por Ab10.H4 (FIG. 17K), mediada por Ab10.H5 (FIG. 17L), mediada por Ab21.H2 (FIG. 17M), mediada por Ab21.H3 (FIG. 17N), y mediada por Ab21.H4 (FIG. 17O) de la producción de AMPc dirigida por PACAP27 a través de células PC-12 que expresan PAC1-R obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1más abajo.
[0236] Las FIG. 18A-L proporcionan datos representativos que muestran la inhibición mediada por Ab10 (FIG. 18A), mediada por Ab20 (F<i>G. 18B), mediada por Ab21 (FIG. 18C), mediada por Ab1.H (FIG. 18D), mediada por Ab10.H (FIG. 18E), mediada por Ab21.H (FIG. 18F), mediada por Ab22 (FIG. 18G), mediada por Ab23 (FIG. 18H), mediada por Ab10.H3 (FIG. 18I), mediada por Ab21.H2 (FIG. 18J), mediada por Ab21.H3 (FIG. 18K) y mediada por Ab21.H4 (FIG. 18L) de la producción de AMPc dirigida por PACAP38 a través de células CHO-K1 que expresan VPAC1-R obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 3más abajo.
[0238] Las FIG. 19A-L proporcionan datos representativos que muestran la inhibición mediada por Ab10 (FIG. 19A), mediada por Ab20 (FiG. 19B), mediada por Ab21 (FIG. 19C), mediada por Ab1.H (FIG. 19D), mediada por Ab10.H (FIG. 19E), mediada por Ab21.H (FIG. 19F), mediada por Ab22 (FIG. 19G), mediada por Ab23 (FIG. 19H), mediada por Ab10.H3 (FIG. 19I), mediada por Ab21.H2 (FIG. 19J), mediada por Ab21.H3 (FIG. 19K) y mediada por Ab21.H4 (FIG. 19L) de la producción de AMPc dirigida por PACAP38 a través de células CHO-K1 que expresan VPAC2-R obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 4más abajo.
[0240] La FIG. 20 proporciona datos representativos que muestran una reducción en la vasodilatación obtenida mediante la administración de Abl.H después de la administración de PACAP38 en un modelo de conejo, con respecto a un control de vehículo, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 7más abajo.
[0242] La FIG. 21 proporciona datos representativos que muestran una reducción en la vasodilatación obtenida mediante la administración de Ab10 después de la administración de PACAP38 en un modelo de conejo, con respecto a un control de anticuerpo de isotipo, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 8más abajo.
[0244] La FIG. 22A proporciona datos de agrupamiento de epítopos para Ab1 marcado y Ab10 no marcado, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 9más abajo.
[0246] La FIG. 22B proporciona datos de agrupamiento de epítopos para Ab1 no marcado y Ab10 marcado, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 9más abajo.
[0248] La FIG. 23 proporciona datos representativos que muestran el efectoin vivode la administración de PACAP y un anticuerpo anti-PACAP Abl.H en un modelo de fotofobia de roedor, modelo que detecta la cantidad de tiempo que los animales tratados (ratones) pasan en la luz por intervalo de 5 minutos en comparación con los animales de control apropiados obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 11más abajo.
[0250] La FIG. 24 proporciona datos representativos que muestran el efectoin vivode la administración de PACAP y el anticuerpo anti-PACAP Ab1.H en un modelo animal de fotofobia en roedor, que detecta la cantidad promedio de tiempo que los animales tratados (ratones) pasan a la luz en comparación con los animales de control apropiados obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 11más abajo.
[0252] La FIG. 25 proporciona datos representativos que muestran el efectoin vivode la administración de PACAP y un anticuerpo anti-PACAP Ab10.H en un modelo de fotofobia de roedor, modelo que detecta la cantidad de tiempo que los animales tratados (ratones) pasan en la luz por intervalo de 5 minutos en comparación con los animales de control apropiados, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 11más abajo.
[0254] La FIG. 26A presenta los resultados de las mediciones de cinética de unión basadas en resonancia de plasmones superficiales para la unión del anticuerpo anti-PACAP Ab10 a los mutantes de barrido de alanina de PACAP 19A, 22A, 23A y 27A, junto con controles que incluyen PACAP de tipo salvaje (huPACAP marcado (1-38)) (control positivo) y tampón de ejecución 1x (control negativo), obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 12más abajo.
[0255] La FIG. 26B presenta los resultados de las mediciones de cinética de unión basadas en resonancia de plasmones superficiales para la unión del anticuerpo anti-PACAP Ab10 a los mutantes de barrido de alanina de PACAP 1A-18A, 20A, 21A, 24V-26A y 28A-38A, junto con controles que incluyen PACAP de tipo salvaje (huPACAP marcado (1-38)) (control positivo) y tampón de ejecución 1x (control negativo), obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 12más abajo.
[0256] La FIG. 27A presenta los resultados de las mediciones de cinética de unión basadas en resonancia de plasmones superficiales para la unión del anticuerpo anti-PACAP Ab20 a los mutantes de barrido de alanina de PACAP 19A, 19A, 22A, 23A, 24V y 27A, junto con controles que incluyen PACAP de tipo salvaje (huPACAP marcado (1-38)) (control positivo) y tampón de ejecución 1x (control negativo), obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 12más abajo.
[0258] La FIG. 27B presenta los resultados de las mediciones de cinética de unión basadas en resonancia de plasmones superficiales para la unión del anticuerpo anti-PACAP Ab20 a los mutantes de barrido de alanina de PACAP 1A-18A, 20A, 21A, 25A, 26A y 28A-38A, junto con controles que incluyen PACAP de tipo salvaje (huPACAP marcado (1-38)) (control positivo) y tampón de ejecución 1x (control negativo), obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 12más abajo.
[0260] La FIG. 28A presenta los resultados de las mediciones de cinética de unión basadas en resonancia de plasmones superficiales para la unión del anticuerpo anti-PACAP Ab21 a los mutantes de barrido de alanina de PACAP 19A, 22A, 23A y 27A, junto con controles que incluyen PACAP de tipo salvaje (huPACAP marcado (1-38)) (control positivo) y tampón de ejecución 1x (control negativo), obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 12más abajo.
[0261] La FIG. 28B presenta los resultados de las mediciones de cinética de unión para la unión del anticuerpo PACAP Ab21 a los mutantes de barrido de alanina de PACAP 1A-18A, 20A, 21A, 24V-26A y 28A-38A, junto con controles que incluyen PACAP de tipo salvaje (huPACAP marcado (1-38)) (control positivo) y tampón de ejecución 1x (control negativo), obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 12más abajo.
[0263] La FIG. 29A presenta los resultados de las mediciones de cinética de unión basadas en resonancia de plasmones superficiales para la unión del anticuerpo anti-PACAP Ab22 a los mutantes de barrido de alanina de PACAP 22A, 23A, 27A, 28A y 31A, junto con controles que incluyen PACAP de tipo salvaje (huPACAP marcado (1-38)) (control positivo) y tampón de ejecución 1x (control negativo), obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 12más abajo.
[0264] La FIG. 29A presenta los resultados de las mediciones de cinética de unión basadas en resonancia de plasmones superficiales para la unión del anticuerpo anti-PACAP Ab22 a los mutantes de barrido de alanina de PACAP 1A-21A, 24V-26A, 29A y 30A, junto con controles que incluyen PACAP de tipo salvaje (huPACAP marcado (1-38)) (control positivo) y tampón de ejecución 1x (control negativo), obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 12más abajo.
[0266] La FIG. 30A presenta los resultados de las mediciones de cinética de unión basadas en resonancia de plasmones superficiales para la unión del anticuerpo anti-PACAP Ab23 a los mutantes de barrido de alanina de PACAP 12A, 20A, 23A, 24V, 26A, 27A y 28A, junto con controles que incluyen PACAP de tipo salvaje (huPACAP marcado (1­ 38)) (control positivo) y tampón de ejecución 1x (control negativo), obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 12más abajo.
[0268] La FIG. 30B presenta los resultados de las mediciones de cinética de unión basadas en resonancia de plasmones superficiales para la unión del anticuerpo anti-PACAP Ab23 a los mutantes de barrido de alanina de PACAP 1A-11A, 13A-19A, 21A, 22A, 25V y 29A-31A, junto con controles que incluyen PACAP de tipo salvaje (huPACAP marcado (1-38)) (control positivo) y tampón de ejecución 1x (control negativo), obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 12más abajo.
[0270] La FIG. 31A presenta un resumen de los efectos de los mutantes de barrido de alanina de PACAP sobre la unión de anticuerpos. En la columna 1 de la FIG. 31A, los residuos de VIP se enumeran en el orden de su disposición espacial a lo largo de la secuencia primaria de VIP desde los residuos de aminoácidos 1-27. En la columna 2 de la FIG. 31A, los residuos de PACAP se enumeran en el orden de su disposición espacial a lo largo de la secuencia primaria de PACAP desde los residuos de aminoácidos 1-27. La columna 3 de la FIG. 31A proporciona el número correspondiente a cada residuo del 1 al 27 tanto para VIP como para PACAP, dispuestos espacialmente a lo largo de sus secuencias primarias. En las columnas 4-8 de la FIG. 31A, se enumeran cada anticuerpo probado durante los estudios de barrido de alanina (tales como Ab10, Ab20, por ejemplo), y los residuos de PACAP que se determinó que contribuyen a la unión de PACAP/anticuerpo (tales como 5A, 6A, por ejemplo).
[0272] La FIG. 31B presenta un resumen de los efectos de los mutantes de barrido de alanina de PACAP sobre la unión de anticuerpos. En la columna 1 de la FIG 31B, se enumera el residuo 28 de VIP. En la columna 2 de la FIG 31B, los residuos de PACAP se enumeran en el orden de su disposición espacial a lo largo de la secuencia primaria de PACAP desde los residuos de aminoácidos 28-38. La columna 3 de la FIG 31B proporciona el número correspondiente al residuo 28 de VIP y cada uno de los residuos 28-38 de PACAP, dispuestos espacialmente a lo largo de sus secuencias primarias. En las columnas 4-8 de la FIG 31B, se enumeran cada anticuerpo probado durante los estudios de barrido de alanina (tales como Ab10, Ab20, por ejemplo), y los residuos de PACa P que se determinó que contribuyen a la unión de PACAP/anticuerpo (tales como 5A, 6A, por ejemplo).
[0274] La FIG. 32 proporciona datos representativos que muestran el efectoin vivode la administración de PACAP y un anticuerpo anti-PACAP Ab10.H3 en un modelo de fotofobia de roedor, modelo que detecta la cantidad de tiempo que los animales tratados (ratones) pasan en la luz por intervalo de 5 minutos en comparación con los animales de control apropiados, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 11más abajo.
[0276] Las FIG. 33A-33B proporcionan datos que resumen los datos presentados en la FIG. 32, de modo que el tiempo total en luz durante todo el período de observación de 30 minutos para cada animal individual en la línea base, el tratamiento 1 y el tratamiento 2 se presentan para los animales en los grupos de anticuerpos de isotipo (FIG. 33A) y los animales en los grupos de Ab10.H3 (FIG. 33B).
[0278] Las FIG. 34A-34B proporcionan datos representativos que muestran el efectoin vivode la administración de un anticuerpo anti-PACAP Ab10.H3, un anticuerpo de isotipo, o un anticuerpo anti-PAC1-R patentado, sobre la lagrimación obtenida siguiendo el protocolo del Ejemplo 13más abajo.Las mediciones se representaron gráficamente para animales individuales en cada grupo en la FIG. 34A, y la medición promedio para los animales en cada grupo se representó gráficamente en la FIG. 34B.
[0280] Las FIG. 35A-35B proporcionan datos representativos que muestran el efectoin vivode la administración de un anticuerpo anti-PACAP Ab10.H3, un anticuerpo de isotipo, o un anticuerpo anti-PAC1-R patentado, sobre el cambio en la temperatura de la nariz obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 13más abajo.Las mediciones se representaron gráficamente para animales individuales en cada grupo en la FIG. 35A, y la medición promedio para los animales en cada grupo se representó gráficamente en la FIG. 35B.
[0282] DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0284] Definiciones
[0286] Se debe entender que esta invención no está limitada a la metodología, protocolos, líneas celulares, especies o géneros animales, y reactivos particulares descritos, ya que los mismos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. Como se utiliza en este documento, las formas singulares "un", "y" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células, y la referencia a "la proteína" incluye la referencia a una o más proteínas y equivalentes de las mismas conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. Todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos normales en la técnica a la que pertenece esta invención, a menos que se indique claramente lo contrario.
[0288] Polipéptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria (PACAP):Como se utiliza en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, PACAP incluye cualquier forma mamífera de PACAP, y en particular abarca las siguientes secuencias de aminoácidos de PACAP27 deHomo sapiensy de PACAP38 deHomo sapiens:
[0290] PACAP38:
[0292] HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK (SEQ ID NO: 1241), en la que la lisina C-terminal está amidada; pero también cualquier mutante, variantes de empalme, isoforma, ortólogo, homólogo, y variantes de esta secuencia.
[0294] PACAP27:
[0296] HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL (SEQ ID NO: 1242), en la que la leucina C-terminal está amidada; pero también cualquier mutante, variantes de empalme, isoforma, ortólogo, homólogo, y variantes de esta secuencia.
[0297] "Fotofobia" se refiere aquí a un síntoma de intolerancia anormal a la percepción visual de la luz, a veces definida además por un miedo anormal o irracional a la luz, o por la presencia de fotosensibilidad física real de los ojos. En la presente invención, la fotofobia incluye en particular la aversión a la luz asociada con la migraña, cefaleas en racimos y otras causas neurológicas de comportamiento aversivo a la luz que pueden desencadenar una migraña o una cefalea en racimos. Los pacientes/sujetos pueden desarrollar fotofobia como resultado de varias afecciones médicas diferentes, relacionadas con el ojo o el sistema nervioso. La fotofobia puede ser causada por una mayor respuesta a la luz que comienza en cualquier etapa en el sistema visual, tal como: (i) demasiada luz entra al ojo, (ii) demasiada luz puede entrar al ojo si está dañado, tal como en el caso de abrasión corneal y daño en la retina, o si una o más pupilas no pueden contraerse normalmente (como se observa en el daño al nervio oculomotor), (iii) sobreestimulación de los fotorreceptores en la retina, (iv) impulsos eléctricos excesivos al nervio óptico, y (v) respuesta excesiva en el sistema nervioso central.
[0299] "Tratamiento o prevención eficaz de la fotofobia", en este documento, se refiere a inhibir el comportamiento aversivo a la luz o fotofobia o a inhibir la aparición del comportamiento aversivo a la luz o fotofobia en un sujeto que lo necesite, por ejemplo un sujeto que tiene un ataque de migraña activo o cefalea en racimos o un sujeto propenso a migraña o cefaleas en racimos, o uno de los otros trastornos asociados con la fotofobia identificados en este documento después de la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PACAP de acuerdo con la invención. El tratamiento puede efectuarse en monoterapia o en asociación con otro agente activo tal como por ejemplo topiramato o dihidroergotamina.
[0301] El término "migraña" se refiere a un trastorno neurológico complejo incapacitante que puede progresar durante cuatro etapas: pródromo, aura, cefalea, y posdromo. La Sociedad Internacional de Cefaleas define la migraña como una cefalea que dura entre 4 y 72 horas y se caracteriza por al menos dos de los siguientes síntomas: localización unilateral, sensación pulsátil, intensidad del dolor de moderada a grave, y agravamiento con el movimiento, tal como caminar. Además, la cefalea debe estar acompañada de al menos uno de los siguientes: náuseas y/o vómitos, fotofobia, o fonofobia. Una migraña también puede ir acompañada de aura, que generalmente precede a la extinción durante la fase de premonición o pródromo, y a menudo da como resultado cambios visuales, por ejemplo un escotoma centelleante que se mueve a través del campo visual. El pródromo también puede estar acompañado de otros síntomas, por ejemplo fatiga, problemas gastrointestinales, y cambios de humor. Una persona que padece migraña a menudo queda incapacitada durante largos períodos de tiempo. El posdromo es la fase final, y ocurre después del ataque, durante la cual el paciente migrañoso puede sentirse agotado o ligeramente eufórico.
[0303] El término "cefalea" se refiere al dolor en cualquier región de la cabeza. Las cefaleas pueden ocurrir en uno o ambos lados de la cabeza, estar aisladas en una ubicación determinada, irradiarse a través de la cabeza desde un punto, o tener una calidad similar a una prensa. Una cefalea puede ser un dolor agudo, una sensación pulsante, o un dolor sordo. Las cefaleas pueden aparecer de forma gradual o repentina, y pueden durar menos de una hora o varios días.
[0305] La expresión "enfermedad o afección asociada al dolor" se refiere a cualquier enfermedad o afección definida, total o parcialmente, por dolor agudo y/o crónico. El dolor se define generalmente como una experiencia sensorial y emocional desagradable asociada con un daño tisular real o potencial, o descrita en términos de dicho daño. El dolor puede clasificarse como neurogénico, neuropático, inflamatorio, o nocicéptico.
[0307] La expresión "analgésico opioide" se refiere aquí a todos los fármacos, naturales o sintéticos, con acciones similares a la morfina. Los analgésicos opioides sintéticos y semisintéticos son derivados de cinco clases químicas de compuestos: fenantrenos, fenilheptilaminas, fenilpiperidinas, morfinanos, y benzomorfanos, todos ellos dentro del alcance del término. Los analgésicos opioides ejemplares incluyen codeína, dihidrocodeína, diacetilmorfina, hidrocodona, hidromorfona, levorfanol, oximorfona, alfentanilo, buprenorfina, butorfanol, fentanilo, sufentanilo, meperidina, metadona, nalbufina, propoxifeno, y pentazocina, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
[0309] El término "AINE" se refiere a un compuesto antiinflamatorio no esteroideo. Los AINE se clasifican en virtud de su capacidad para inhibir la ciclooxigenasa. La ciclooxigenasa 1 y la ciclooxigenasa 2 son dos isoformas principales de la ciclooxigenasa, y la mayoría de los AINE estándar son inhibidores mixtos de las dos isoformas. La mayoría de los AINE estándar caen dentro de una de las siguientes cinco categorías estructurales: (1) derivados del ácido propiónico, tales como ibuprofeno, naproxeno, naprosina, diclofenaco y ketoprofeno; (2) derivados del ácido acético, tales como tolmetina y sulindaco; (3) derivados del ácido fenámico, tales como ácido mefenámico y ácido meclofenámico; (4) derivados del ácido bifenilcarboxílico, tales como diflunisal y flufenisal; y (5) oxicams, tales como piroxim, sudoxicam, e isoxicam. Se ha descrito otra clase de AINE que inhiben selectivamente la ciclooxigenasa 2. Los inhibidores de COX-2 se han descrito, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 5.616.601; 5.604.260; 5.593.994; 5.550.142; 5.536.752; 5.521.213; 5.475.995; 5.639.780; 5.604.253; 5.552.422; 5.510.368; 5.436.265; 5.409.944; y 5.130.311. Ciertos inhibidores ejemplares de la COX-2 incluyen celecoxib (SC-58635), DUP-697, flosulida (Cg P-28238), meloxicam, ácido 6-metoxi-2-naftilacético (6-MNA), rofecoxib, MK-966, nabumetona (profármaco para 6-MNA), nimesulida, NS-398, SC-5766, SC-58215, T-614; o combinaciones de los mismos.
[0311] Como se utiliza en este documento, "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: mejora en cualquier aspecto de las afecciones relacionadas con PACAP, tal como migraña o cefalea. Por ejemplo, en el contexto del tratamiento de la cefalea o la migraña, esto incluye disminuir la gravedad, aliviar la intensidad del dolor y otros síntomas asociados, reducir la frecuencia de recurrencia, aumentar la calidad de vida de quienes sufren cefalea, y disminuir la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar la cefalea. En el caso de la migraña, otros síntomas asociados incluyen, pero no se limitan a, náuseas, vómitos y sensibilidad a la luz, el sonido y/o el movimiento. En el caso de la cefalea en racimos, otros síntomas asociados incluyen, pero no se limitan a, hinchazón debajo o alrededor de los ojos, lágrimas excesivas, ojos rojos, rinorrea o congestión nasal, y rostro enrojecido.
[0313] "Reducir la incidencia" o "profilaxis" o "prevención" significa cualquiera de "reducir la gravedad" de una enfermedad, afección, síntoma o trastorno en particular (los términos enfermedad", afección y trastorno se usan indistintamente en toda la solicitud). La reducción de la gravedad incluye la reducción de los fármacos y/o terapias generalmente utilizados para la afección, por ejemplo reduciendo la necesidad, la cantidad y/o la exposición a los fármacos o terapias. La reducción de la gravedad también incluye la reducción de la duración y/o frecuencia de la afección, síntoma o trastorno particular (incluyendo, por ejemplo, retrasar o aumentar el tiempo hasta el siguiente ataque episódico en un individuo).
[0315] "Mejorar" la cefalea o uno o más síntomas de la cefalea o migraña u otra afección relacionada con PACAP significa una disminución o mejora de uno o más síntomas de la afección, por ejemplo cefalea o migraña en comparación con no administrar un anticuerpo antagonista anti-PACAP "Mejorar" también incluye acortar o reducir la duración de un síntoma.
[0317] Como se utiliza en este documento, "controlar la cefalea" o "controlar la migraña" o "controlar" otra afección relacionada con PACAP se refiere a mantener o reducir la gravedad o duración de uno o más síntomas de la afección, por ejemplo cefalea o migraña, o la frecuencia de los ataques de cefalea o migraña en un individuo (en comparación con el nivel antes del tratamiento). Por ejemplo, la duración o la gravedad de la cefalea, o la frecuencia de los ataques, se reduce en al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en el individuo en comparación con el nivel antes del tratamiento. La reducción en la duración o gravedad de la cefalea, o la frecuencia de los ataques puede durar cualquier período de tiempo, por ejemplo 2 semanas, 4 semanas (1 mes), 8 semanas (2 meses), 16 semanas (3 meses), 4 meses, 5 meses, 6 meses, 9 meses, 12 meses, etc.
[0319] Como se utiliza allí, "retrasar" el desarrollo de una afección relacionada con PACAP, tal como migraña o cefalea, significa diferir, obstaculizar, ralentizar, retardar, estabilizar y/o posponer la progresión de la afección o enfermedad. Este retraso puede tener una duración variable, dependiendo de la historia de la afección o enfermedad y/ o de los individuos tratados. Como es evidente para un experto en la técnica, un retraso suficiente o significativo puede, en efecto, abarcar la prevención, en el sentido de que el individuo no desarrolle cefalea (por ejemplo, migraña). Un método que "retrasa" el desarrollo del síntoma es un método que reduce la probabilidad de desarrollar el síntoma en un período de tiempo determinado y/o reduce la extensión de los síntomas en un período de tiempo determinado, en comparación con no utilizar el método. Estas comparaciones suelen basarse en estudios clínicos que utilizan un número estadísticamente significativo de sujetos.
[0321] "Desarrollo" o "progresión" de una afección relacionada con PACAP, al como migraña o cefalea, significa manifestaciones iniciales y/o progresión posterior del trastorno. El desarrollo de la cefalea o de la migraña se puede detectar y evaluar utilizando técnicas clínicas estándar como se conocen en la técnica. Sin embargo, el desarrollo también se refiere a una progresión, que puede ser indetectable. Para los fines de esta invención, desarrollo o progresión se refiere al curso biológico de los síntomas. "Desarrollo" incluye aparición, recurrencia y comienzo. Como se utiliza en este documento, "comienzo" u "aparición" de una afección tal como cefalea o migraña incluye el comienzo inicial y/o la recurrencia.
[0323] Como se utiliza en este documento, una "dosis eficaz" o "cantidad eficaz" de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para producir resultados beneficiosos o deseados. Para uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados tales como eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad, o retrasar la aparición de la enfermedad, incluidos los síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos tales como reducir la intensidad del dolor, la duración, o la frecuencia del ataque de cefalea, y disminuir uno o más síntomas resultantes de la cefalea (bioquímicos, histológicos y/o conductuales), incluyendo sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad, aumentar la calidad de vida de quienes padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad, mejorar el efecto de otro medicamento, y/o retrasar la progresión de la enfermedad de los pacientes. Una dosis eficaz puede administrarse en una o más administraciones. Para los fines de esta invención, una dosis eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para lograr un tratamiento profiláctico o terapéutico, ya sea directa o indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una dosis eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede o no lograrse en conjunto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por lo tanto, una "dosis eficaz" puede considerarse en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos, y puede considerarse que un solo agente se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o más agentes adicionales, se puede lograr o se logra un resultado deseable.
[0325] Una "célula hospedadora adecuada" o "célula hospedadora" generalmente incluye cualquier célula en la que los anticuerpos anti-PACAP en cuestión se puedan producir de forma recombinante utilizando técnicas y materiales fácilmente disponibles. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PACAP de la presente invención pueden producirse en células hospedadoras modificadas genéticamente de acuerdo con técnicas convencionales. Las células hospedadoras adecuadas son aquellos tipos de células que pueden transformarse o transfectarse con ADN exógeno y cultivarse en cultivo, e incluyen bacterias, células fúngicas (por ejemplo, levadura) y células eucariotas superiores cultivadas (incluidas células cultivadas de organismos multicelulares), particularmente células de mamíferos cultivadas, por ejemplo células de mamíferos humanos o no humanos. En una realización ejemplar, estos anticuerpos pueden expresarse en células CHO. Las técnicas para manipular moléculas de ADN clonadas e introducir ADN exógeno en una variedad de células hospedantes se describen Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., editores, Nueva York, NY: Green and Wiley and Sons (1993).
[0326] En algunas realizaciones ejemplares, los anticuerpos pueden expresarse en levaduras competentes para el apareamiento, por ejemplo cualquier levadura haploide, diploide o tetraploide que pueda cultivarse en cultivo. La levadura útil en los métodos de expresión fermentativa puede existir en forma haploide, diploide, u otra forma poliploide. Las células de una ploidía dada pueden, en condiciones apropiadas, proliferar durante un número indefinido de generaciones en esa forma. Las células diploides también pueden esporular para formar células haploides. El apareamiento secuencial puede dar lugar a cepas tetraploides mediante apareamiento posterior o fusión de cepas diploides. La presente invención contempla el uso de células de levadura haploide, así como de células de levadura diploide u otras células poliploides producidas, por ejemplo, por apareamiento o fusión de esferoplastos. A modo de ejemplo, dichas levaduras pueden incluir miembros de la familiaSaccharomycetaceae,que incluye los génerosArxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis;yZygosaccharomyces.Otros tipos de levadura potencialmente útiles en la invención incluyenYarrowia; Rhodosporidium; Candida; Hansenula; Filobasium; Sporidiobolus; Bullera; LeucosporidiumyFilobasidella.
[0328] En una realización ejemplar preferida de la invención, la levadura competente para el apareamiento utilizada para la expresión de anticuerpos puede comprender un miembro del géneroPichia.En otra realización ejemplar preferida de la invención, la levadura competente para el apareamiento del géneroPichiaes una de las siguientes especies:Pichia pastoris, Pichia methanolica,yHansenula polymorpha (Pichia angusta).En una realización particularmente preferida de la invención, la levadura competente para el apareamiento del géneroPichiaes la especiePichia pastoris.
[0330] Un "marcador seleccionable", en este documento, se refiere a un gen o genes que confieren un fenotipo de crecimiento (característica de crecimiento físico) a una célula que recibe ese gen, por ejemplo a través de un evento de transformación. El marcador seleccionable permite que esa célula sobreviva y crezca en un medio de crecimiento selectivo en condiciones en las que las células que no reciben ese gen marcador seleccionable no pueden crecer. Los genes marcadores seleccionables generalmente se dividen en varios tipos, incluidos los genes marcadores seleccionables positivos, tal como un gen que confiere a una célula resistencia a un antibiótico u otro fármaco, la temperatura cuando se cruzan dos mutantes sensibles a la temperatura ("ts") o se transforma un mutante ts; genes marcadores seleccionables negativos, tal como un gen biosintético que confiere a una célula la capacidad de crecer en un medio sin un nutriente específico que necesitan todas las células que no tienen ese gen biosintético, o un gen biosintético mutagenizado que confiere a una célula la incapacidad de crecer a las células que no tienen el gen de tipo salvaje; y similares. Los marcadores adecuados incluyen, pero no se limitan a: ZEO; G418; LYS3; METI; MET3a; ADE1; ADE3; URA3; y similares.
[0332] Un "vector de expresión", en este documento, se refiere a vectores de ADN que contienen elementos que facilitan la manipulación para la expresión de una proteína extraña dentro de la célula hospedadora diana, por ejemplo una célula bacteriana, de insecto, de levadura, vegetal, de anfibio, de reptil, de ave, o de mamífero, y más típicamente una célula de levadura o de mamífero, por ejemplo, una célula CHO. Convenientemente, la manipulación de secuencias y la producción de ADN para la transformación se realiza primero en un hospedante bacteriano, por ejemploE. coli, y normalmente los vectores incluirán secuencias para facilitar dichas manipulaciones, incluido un origen de replicación bacteriano y un marcador de selección bacteriano apropiado. Los marcadores de selección codifican proteínas necesarias para la supervivencia o el crecimiento de células hospedadoras transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células hospedadoras no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos que no están disponibles en medios complejos. Los vectores y métodos ejemplares para la transformación de levadura se describen, por ejemplo, en Burke, D., Dawson, D., y Stearns, T., Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual, Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000).
[0334] Los vectores de expresión para uso en los métodos de la invención pueden incluir secuencias específicas de levaduras o mamíferos, incluido un marcador auxotrófico o farmacológico seleccionable para identificar cepas hospedadoras transformadas. Además, se puede utilizar un marcador farmacológico para amplificar el número de copias del vector en una célula hospedadora de levadura.
[0336] La secuencia codificante del polipéptido de interés está unida operativamente a secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción que proporcionan la expresión del polipéptido en las células hospedadoras deseadas, por ejemplo células de levadura o de mamíferos. Estos componentes del vector pueden incluir, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. También se pueden incluir secuencias para la secreción del polipéptido, por ejemplo una secuencia señal, y similares. Un origen de replicación, por ejemplo un origen de replicación de levadura, es opcional, ya que los vectores de expresión a menudo están integrados en el genoma de la célula hospedadora. En una realización de la invención, el polipéptido de interés está unido operativamente, o fusionado, a secuencias que proporcionan una secreción optimizada del polipéptido a partir de células diploides de levadura.
[0338] Los ácidos nucleicos están "unidos operativamente" cuando se colocan en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una secuencia señal está operativamente unido al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia. En general, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. La unión se logra mediante ligadura en sitios de restricción convenientes, o alternativamente, a través de PCR/método de recombinación familiar para los expertos en la técnica (GATEWAYR Technology; Invitrogen, Carlsbad California). Si dichos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores oligonucleotídicos sintéticos se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.
[0340] Los promotores son secuencias no traducidas ubicadas en dirección 5' (5') del codón de inicio de un gen estructural (generalmente entre 100 y 1000 pb) que controlan la transcripción y la traducción de secuencias particulares de ácidos nucleicos a las que están operativamente unidos. Estos promotores se dividen en varias clases: promotores inducibles, constitutivos, y reprimibles (que aumentan los niveles de transcripción en respuesta a la ausencia de un represor). Los promotores inducibles pueden iniciar mayores niveles de transcripción del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura.
[0342] El promotor también puede servir como sitio para la recombinación homóloga y la integración del vector de expresión en el mismo sitio en la célula hospedadora, por ejemplo célula de levadura, genoma; alternativamente, se puede utilizar un marcador seleccionable como sitio para la recombinación homóloga. La transformación dePichiase describe en Cregg et al., Mol. Cell. Biol., 5:3376-3385 (1985).
[0344] Los promotores adecuados para uso en diferentes células eucariotas y procariotas son bien conocidos y están disponibles comercialmente.
[0346] Los polipéptidos de interés pueden producirse de forma recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, por ejemplo una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte de la secuencia codificante del polipéptido que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es aquella que se reconoce y procesa a través de una de las rutas estándar disponibles dentro de la célula hospedadora, por ejemplo una célula de mamífero, una célula de insecto o una célula de levadura. Además, estas secuencias de péptidos señal pueden diseñarse para proporcionar una secreción mejorada en los sistemas de expresión. Las señales de secreción de interés también incluyen secuencias señal de mamíferos y de levaduras, que pueden ser heterólogas a la proteína que se segrega, o pueden ser una secuencia nativa de la proteína que se segrega. Las secuencias señal incluyen secuencias prepeptídicas, y en algunos casos, pueden incluir secuencias propeptídicas. En la técnica se conocen muchas de estas secuencias señal, incluidas las secuencias señal que se encuentran en las cadenas de inmunoglobulina, por ejemplo la secuencia de preprotoxina K28, PHA-E, FACE, MCP-1 humana, secuencias señal de seroalbúmina humana, cadena pesada de Ig humana, cadena ligera de Ig humana, y similares. Por ejemplo, véase Hashimoto et. al., Protein Eng., 11(2):75 (1998); y Kobayashi et. al., Therapeutic Apheresis, 2(4):257 (1998).
[0347] La transcripción se puede aumentar insertando una secuencia activadora transcripcional en el vector. Estos activadores son elementos del ADN que actúan en cis, normalmente alrededor de 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores de la transcripción son relativamente independientes de la orientación y la posición, y se han encontrado en 5' y 3' de la unidad de transcripción, dentro de un intrón, así como dentro de la propia secuencia codificante. El potenciador se puede empalmar en el vector de expresión en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante, pero preferiblemente se ubica en un sitio en 5' del promotor.
[0349] Los vectores de expresión utilizados en células hospedadoras eucariotas también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias están comúnmente disponibles desde 3' hasta el codón de terminación de la traducción, en regiones no traducidas de los ADN o ADNc eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como poliadenilados en la porción no traducida del ARNm.
[0351] La construcción de vectores adecuados que contengan uno o más de los componentes enumerados anteriormente emplea técnicas de ligadura estándar o PCR/métodos de recombinación. Los plásmidos o ADN aislados se escinden, se adaptan, y se vuelven a ligar en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos o mediante métodos de recombinación. Para el análisis que confirma las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligadura se utilizan para transformar las células hospedadoras, y los transformantes exitosos se seleccionan por resistencia a antibióticos (por ejemplo, ampicilina o zeocina) cuando corresponde. Los plásmidos de los transformantes se preparan, se analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción, y/o se secuencian.
[0353] Como alternativa a la restricción y ligadura de s, se pueden utilizar métodos de recombinación basados en sitios de unión específicos("att")y enzimas de recombinación para insertar secuencias de ADN en un vector. Estos métodos se describen, por ejemplo, por Landy, Ann. Rev. Biochem., 58:913-949 (1989); y son conocidos por los expertos en la técnica. Estos métodos utilizan la recombinación de ADN intermolecular que está mediada por una mezcla de proteínas de recombinación codificadas por lambda yE. coli.La recombinación ocurre entre los sitiosattde las moléculas de ADN que interactúan. Para una descripción de los sitiosatt,véase Weisberg y Landy, Site-Specific Recombination in Phage Lambda, en Lambda II, págs. 211-250, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (1983). Los segmentos de ADN que flanquean los sitios de recombinación se intercambian, de modo que después de la recombinación, los sitiosattson secuencias híbridas compuestas por secuencias donadas por cada vector parental. La recombinación puede ocurrir entre los ADN de cualquier topología.
[0355] Los sitios deattse pueden introducir en una secuencia de interés ligando la secuencia de interés en un vector apropiado; generando un producto de PCR que contenga sitiosattB mediante el uso de cebadores específicos; generando una biblioteca de ADNc clonada en un vector apropiado que contenga sitios att; y similares.
[0357] Plegamiento, como se utiliza en este documento, se refiere a la estructura tridimensional de polipéptidos y proteínas, en la que las interacciones entre los residuos de aminoácidos actúan para estabilizar la estructura. Si bien las interacciones no covalentes son importantes para determinar la estructura, generalmente las proteínas de interés tendrán enlaces disulfuro covalentes intra y/o intermoleculares formados por dos residuos de cisteína. En el caso de proteínas y polipéptidos naturales o derivados y variantes de los mismos, el plegamiento adecuado es típicamente la disposición que da como resultado una actividad biológica óptima, y se puede monitorizar convenientemente mediante ensayos de actividad, por ejemplo unión de ligando, actividad enzimática, etc.
[0359] En algunos casos, por ejemplo cuando el producto deseado es de origen sintético, los ensayos basados en la actividad biológica serán menos significativos. El plegamiento adecuado de dichas moléculas puede determinarse basándose en propiedades físicas, consideraciones energéticas, estudios de modelos, y similares.
[0361] El hospedante de expresión puede modificarse aún más mediante la introducción de secuencias que codifican una o más enzimas que mejoran el plegamiento y la formación de enlaces disulfuro, es decir, foldasas, chaperoninas, etc. Dichas secuencias pueden expresarse de forma constitutiva o inducible en la célula hospedadora de levadura, utilizando vectores, marcadores, etc. como se conoce en la técnica. Preferiblemente, las secuencias, incluyendo los elementos reguladores de la transcripción suficientes para el patrón de expresión deseado, se integran de forma estable en el genoma de la levadura a través de una metodología dirigida.
[0363] Por ejemplo, la proteína eucariota disulfuro isomerasa ("PDI") no sólo es un catalizador eficiente de la oxidación de la cisteína de la proteína y de la isomerización del enlace disulfuro, sino que también exhibe actividad de chaperona. La coexpresión de PDI puede facilitar la producción de proteínas activas que tienen múltiples enlaces disulfuro. También es de interés la expresión de la proteína de unión a la cadena pesada de inmunoglobulina ("BIP"); ciclofilina; y similares. En una realización de la invención, cada una de las cepas parentales haploides expresa una enzima de plegamiento distinta, por ejemplo una cepa puede expresar BIP y la otra cepa puede expresar PDI o combinaciones de las mismas.
[0365] Las células de mamíferos cultivadas también son hospedantes ejemplares preferidos para la producción de los anticuerpos anti-PACAP descritos. Como se mencionó, las células CHO son particularmente adecuadas para la expresión de anticuerpos. Se conocen muchos procedimientos en la técnica para fabricar anticuerpos monoclonales en células de mamíferos. (Véanse, Galfre, G. y Milstein, C., Methods Enzym., 73:3-46, 1981; Basalp et al., Turk. J. Biol., 24:189-196, 2000; Wurm, F.M., Nat. Biotechnol., 22:1393-1398, 2004; y Li et al., mAbs, 2(5):466-477, 2010). Como se menciona con más detallemás abajo,las líneas celulares hospedadoras comunes empleadas en esquemas de fabricación de anticuerpos monoclonales de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, la línea celular de retinoblasto embrionario humano PER.C6® (Crucell NV, Leiden, Países Bajos), células de mieloma murino NS0 (Medical Research Council, Londres, Reino Unido), línea celular de riñón de mono CV1, línea celular de riñón embrionario humano 293, línea celular de riñón de hámster bebé BHK, línea celular de riñón de mono verde africano VERO, línea celular de carcinoma cervical humano HELA, células de riñón canino MDCK, células de hígado de rata búfalo BRL, células de pulmón humano W138, células de hígado humano HepG2, células de tumor mamario de ratón MMT, células TRI, células MRC5, células Fs4, células de mieloma o linfoma, o células de ovario de hámster chino(Cricetulus griseus)(CHO), y similares. Se conocen en la técnica muchos subclones o sublíneas celulares diferentes de células CHO que son útiles y están optimizadas para la producción de anticuerpos monoclonales recombinantes, tales como la línea celular DP12 (CHO K1 dhfr-), las células NS0 son un subclón de células NS-1 que no segrega Ig ni sintetiza cadenas ligeras y que son resistentes a la azaguanina. Existen otras células de hámster chino y CHO disponibles comercialmente (de ATCC, etc.), incluidas CHO-DXB11 (CHO-DUKX), CHO-pro3, CHO-DG44, CHO 1-15, CHO DP-12, Lec2, M1WT3, Lec8, pgsA-745, y similares, todas ellas modificadas genéticamente para optimizar la línea celular para diversos parámetros. Los anticuerpos monoclonales se fabrican comúnmente utilizando un método de alimentación por lotes mediante el cual las cadenas de anticuerpos monoclonales se expresan en una línea celular de mamíferos y se segregan en el medio de cultivo tisular en un biorreactor. El medio (o alimentación) se suministra continuamente al biorreactor para maximizar la expresión de proteína recombinante. El anticuerpo monoclonal recombinante se purifica entonces a partir del medio recolectado. En algunas circunstancias, se necesitan etapas adicionales para volver a ensamblar los anticuerpos mediante la reducción de enlaces disulfuro, etc. Dichos métodos de producción pueden escalarse hasta 10000 l en un solo lote o más. En la actualidad, es habitual obtener hasta 20 pg/célula/día mediante el uso de dichas líneas celulares y metodologías, lo que proporciona títulos de hasta 10 g/l o más, que equivalen a 15 a 100 kg a partir de biorreactores de 10 kl a 25 kl. (Li et al., 2010). A continuación se proporcionan diversos detalles de esta metodología de producción, incluida la clonación de los polinucleótidos que codifican los anticuerpos en vectores de expresión, la transfección de células con estos vectores de expresión, la selección de células transfectadas, y la expresión y purificación de los anticuerpos monoclonales recombinantes de estas células.
[0367] Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-PACAP en células de mamíferos, los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo generalmente se insertan en un vector replicable para una clonación posterior (amplificación del ADN) o para su expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se puede aislar o sintetizar fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente al ADN que codifica las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación , uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. La selección de promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es una cuestión de diseño rutinario dentro del nivel de habilidad normal en la técnica. Muchos de estos elementos son conocidos en la técnica y están disponibles a través de proveedores comerciales.
[0369] Los anticuerpos de esta invención pueden producirse de forma recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia señal homóloga o heteróloga seleccionada preferiblemente es aquella que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa señal) por la célula hospedadora. En la expresión de células de mamíferos, están disponibles secuencias señal de mamíferos, así como líderes secretores virales, por ejemplo la señal gD del herpes simple.
[0371] Dichos vectores de expresión y vectores de clonación generalmente contendrán una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células hospedadoras seleccionadas. Normalmente, en los vectores de clonación, esta secuencia es la que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del hospedante, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Estas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus, por ejemplo el origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias gra-negativas, el origen del plásmido 2mu es adecuado para la levadura, y diversos orígenes virales (virus de simio 40 ("SV40"), polioma, adenovirus, virus de la estomatitis vesicular ("VSV") o virus del papiloma bovino ("BPV") son útiles para clonar vectores en células de mamíferos. Generalmente, el componente de origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamíferos (el origen SV40 normalmente se puede usar sólo porque contiene el promotor temprano).
[0373] Estos vectores normalmente también contendrán un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos que no están disponibles en medios complejos, por ejemplo el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli.
[0375] Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedadora. La selección de fármacos se utiliza generalmente para seleccionar células de mamíferos cultivadas en las que se ha insertado ADN extraño. Estas células se denominan comúnmente "transfectantes". Las células que se han cultivado en presencia del agente selectivo y son capaces de transmitir el gen de interés a su progenie se denominan "transfectantes estables". Ejemplos de dicha selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico, e higromicina. Un marcador seleccionable ejemplar es un gen que codifica la resistencia al antibiótico neomicina. La selección se lleva a cabo en presencia de un fármaco de tipo neomicina, tal como G-418 o similar. Las células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco, y por lo tanto sobreviven al régimen de selección.
[0377] Los sistemas de selección también se pueden utilizar para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso denominado "amplificación". La amplificación de los transfectantes normalmente se produce cultivando las células en presencia de un nivel bajo del agente selectivo y aumentando después la cantidad de agente selectivo para seleccionar células que produzcan niveles altos de los productos de los genes introducidos. Los marcadores seleccionables adecuados a modo de ejemplo para células de mamíferos son aquellos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico del anticuerpo, tales como la dihidrofolato reductasa ("DHFR"), la timidina cinasa, la metalotioneína-I y -II, preferiblemente los genes de metalotioneína de primates, la adenosina desaminasa, la ornitina descarboxilasa, etc.
[0379] Por ejemplo, un marcador seleccionable amplificable para células de mamíferos es la dihidrofolato reductasa, que confiere resistencia a metotrexato. También se pueden utilizar otros genes de resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a higromicina, resistencia a múltiples fármacos, puromicina acetiltransferasa). Las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato ("MTX"), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula hospedadora apropiada cuando se emplea DHFR de tipo salvaje es la línea celular de ovario de hámster chino ("CHO") deficiente en actividad de DHFR.
[0381] Como alternativa, las células hospedadoras (en particular, los hospedantes de tipo salvaje que contienen DHFR endógena) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican anticuerpos, proteína DHFR de tipo salvaje, y otro marcador seleccionable tal como la aminoglucósido 3'-fosfotransferasa ("APH"), se pueden seleccionar mediante el crecimiento celular en un medio que contenga un agente de selección para el marcador seleccionable, tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo kanamicina, neomicina, o G-418. Véase la patente de EE. UU. n.° 4.965.199.
[0383] Estos vectores pueden comprender una secuencia potenciadora que facilita la transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo. Se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína, e insulina). Un potenciador utilizado con frecuencia es aquel derivado de un virus de célula eucariota. Sus ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los potenciadores de adenovirus (véase también Yaniv, Nature, 297:17-18, 1982, sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas). El potenciador se puede empalmar en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante del anticuerpo, pero preferiblemente se ubica en un sitio en 5' del promotor.
[0385] Los vectores de expresión y clonación generalmente también comprenderán un promotor que es reconocido por el organismo hospedador y está unido operativamente al ácido nucleico del anticuerpo. Las secuencias promotoras son conocidas para eucariotas. Prácticamente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente 25 a 30 bases en dirección 5' del sitio en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia que se encuentra 70 a 80 bases en dirección 5' del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAA<t>, en la que N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan adecuadamente en vectores de expresión eucariotas.
[0387] La transcripción de anticuerpos de vectores en células hospedadoras de mamíferos está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar, el adenovirus (tal como el Adenovirus 2), BPV, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B, y lo más preferible el SV40, de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células hospedadoras.
[0389] Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como una restricción SV40 que también contiene el origen de replicación viral SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como una restricción HindlII E. En la patente de EE. UU. n.° 4.419.446 se describe un sistema para expresar ADN en hospedantes mamíferos utilizando el BPV como vector. Una modificación de este sistema se describe en la patente estadounidense n.° 4.601.978. Véase también Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982) sobre la expresión del ADNc del beta-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de la timidina cinasa del virus del herpes simple. Alternativamente, se puede utilizar como promotor la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous.
[0391] Se pueden utilizar promotores de transcripción fuertes, tales como los promotores de SV40, citomegalovirus o virus del sarcoma mieloproliferativo. Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 4.956.288 y la publicación de patente de EE.UU. n.° 20030103986. Otros promotores adecuados incluyen los de los genes de metalotioneína (patentes de EE. UU. n.° 4.579.821 y 4.601.978) y el promotor tardío principal del adenovirus. Los vectores de expresión para uso en células de mamíferos incluyen pZP-1, pZP-9 y pZMP21, que se han depositado en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA. EE.UU. bajo los números de acceso 98669, 98668 y PTA-5266, respectivamente, y derivados de estos vectores.
[0393] Los vectores de expresión utilizados en células hospedadoras eucariotas (levadura, hongo, insecto, planta, animal, ser humano, o una célula nucleada de otro organismo multicelular) generalmente también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias suelen estar disponibles en las regiones no traducidas 5', y ocasionalmente 3', de los ADN o ADNc eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica el anticuerpo. Un componente útil para la terminación de la transcripción es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véase el documento WO 94/11026 y el vector de expresión allí descrito.
[0394] Las células hospedadoras adecuadas para clonar o expresar los anticuerpos en cuestión incluyen células procariotas, de levadura, o eucariotas superiores descritas anteriormente. Sin embargo, el mayor interés se ha centrado en las células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo se ha convertido en un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas celulares hospedantes de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-1 (ATCC No. CRL 1650); y COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Vi rol., 36:59-72 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATc C CCL 10, ATCC No. CRL 1632; BHK 570, ATCC No. CRL 10314); CHO cells (CHO-K1, ATCC No. CCL 61; CHO-DG44, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77:4216-4220 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 At CC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC Cr L-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Se conocen en la técnica líneas celulares adecuadas adicionales, y están disponibles en depósitos públicos tal como la American Type Culture Collection, Manassas, VA.
[0396] Las células hospedadoras se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de anticuerpos, y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas como se analizamás arriba.
[0398] Las células hospedadoras de mamíferos utilizadas para producir el anticuerpo de esta invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente, tales como Ham's F10 (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO), Medio Mínimo Esencial ("MEM" (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO), medio Roswell Park Memorial Institute-1640 ("RPMI-1640", Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO), y medio de Eagle modificado de Dulbecco ("DMEM" Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO) son adecuados para cultivar las células hospedadoras. Los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz., 58:44 (1979); Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980); patentes de EE.UU. Nros. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; documento WO 90/03430; documento WO 87/00195; o Reexamen de Patente de EE.UU. n.° 30.985, pueden usarse como medios de cultivo para las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios puede complementarse, según sea necesario, con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tal como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tal como el fármaco gentamicina), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos generalmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se pueden incluir otros suplementos necesarios en concentraciones apropiadas que serán conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las utilizadas previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto normalmente capacitado. Se conocen en la técnica métodos de desarrollo y optimización de medios y condiciones de cultivo. (Véase, Gronemeyer et al., Bioengineering, 1 (4):188-212, 2014).
[0400] Una vez optimizadas las condiciones de cultivo y seleccionado un clon de línea celular preferido, estas células se cultivan (ya sean células adherentes o cultivos en suspensión) generalmente en un proceso de alimentación por lotes en un biorreactor (hay muchos modelos disponibles comercialmente) que implica alimentar continuamente el cultivo celular con medio y alimento, optimizados para la línea celular particular escogida y seleccionada para este propósito. (Véase, Butler, M., Appl. Microbiol. Biotechnol., 68:283-291,2005; y Kelley, B., mAb, 1(5):443-452, 2009). También existen sistemas de perfusión en los que se suministran continuamente medios y alimento al cultivo mientras se extrae el mismo volumen de medios del biorreactor. (Wurm, 2004). Existen medios sintéticos, también disponibles comercialmente, para el cultivo de células en lotes alimentados, evitando la posibilidad de contaminación de fuentes externas, tales como con el uso de componentes animales, tal como seroalbúmina bovina, etc. Sin embargo, existen hidrolizados sin componentes animales disponibles comercialmente para ayudar a aumentar la densidad celular, la viabilidad del cultivo y la productividad. (Li et al., 2010). Se han realizado muchos estudios en un esfuerzo por optimizar los medios de cultivo celular, incluida una cuidadosa atención al espacio libre disponible en los frascos rotatorios, los potenciales redox durante las fases de crecimiento y expresión, la presencia de agentes reductores para mantener los enlaces disulfuro durante la producción, etc. (Véase, por ejemplo, Hutterer et al., mAbs, 5(4):608-613, 2013; y Mullan et al., BMC Proceed., 5(Suppl 8):P110, 2011). Se han desarrollado diversas metodologías para abordar la posibilidad de oxidación dañina durante la producción de anticuerpos monoclonales recombinantes. (Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 8.574.869). Las células cultivadas pueden cultivarse alimentándolas con nutrientes de forma continua o como cantidades administradas por separado. A menudo, diversos parámetros del proceso, tales como la concentración celular, el pH, la temperatura, el CO2, dO2, la osmolalidad, la cantidad de metabolitos tales como glucosa, lactato, glutamina y glutamato, y similares, se controlan mediante el uso de sondas durante el crecimiento celular, ya sea en línea mediante conexión directa a analizadores calibrados o fuera de línea mediante la intervención de los operadores. La etapa de cultivo normalmente también implica asegurar que las células que crecen en el cultivo mantengan los genes recombinantes transfectados mediante cualquier medio conocido en la técnica para la selección de células.
[0401] Después de la fermentación, es decir, al alcanzar el máximo crecimiento celular y la expresión de proteína recombinante, la etapa de cultivo normalmente es seguida de una etapa de recolección, mediante la cual las células se separan del medio y se obtiene así un medio de cultivo celular recolectado. (Véase, Liu et al., mAbs, 2(5):480-499, 2010). Por lo general, después del cultivo siguen diversas etapas de purificación que involucran cromatografía en columna y similares, para separar el anticuerpo monoclonal recombinante de los componentes celulares y de los componentes del medio de cultivo celular. Las etapas de purificación exactas necesarias para esta fase de la producción de anticuerpos monoclonales recombinantes dependen del sitio de expresión de las proteínas, es decir, en el citosol de las propias células, o la ruta más comúnmente preferida de proteína excretada en el medio de cultivo celular. Se pueden separar diversos componentes celulares utilizando técnicas conocidas en la técnica, tales como técnicas de centrifugación diferencial, sedimentación celular basada en la gravedad, y/o técnicas de cromatografía de exclusión por tamaño/filtración que pueden incluir microfiltración de flujo tangencial o filtración de profundidad. (Véanse Pollock et al., Biotechnol. Bioeng., 110:206-219, 2013, y Liu et al., 2010). La centrifugación de los componentes celulares se puede lograr a gran escala mediante el uso de centrífugas de discos continuos, seguido de una clarificación mediante filtros de profundidad y de membrana. (Véase Kelley, 2009). Con mayor frecuencia, después de la clarificación, la proteína recombinante se purifica aún más mediante cromatografía de proteína A debido a la alta afinidad de la proteína A por el dominio Fc de los anticuerpos, y normalmente se realiza mediante una etapa de elución por acidificación/pH bajo (normalmente, la etapa de acidificación se combina con una etapa de inactivación del virus como medida de precaución). También se pueden emplear etapas de floculación y/o precipitación utilizando polielectrolitos ácidos o catiónicos, para separar las células animales en cultivos en suspensión de las proteínas solubles. (Liu et al., 2010). Por último, la cromatografía de intercambio aniónico y catiónico, la cromatografía de interacción hidrófoba ("HIC"), la cromatografía de inducción de carga hidrófoba (HCIC), la cromatografía de hidroxiapatita que utiliza hidroxiapatita cerámica (Ca5(PO4)3OH)2, y combinaciones de estas técnicas se utilizan típicamente para pulir la solución del anticuerpo monoclonal recombinante. La formulación final y la concentración del anticuerpo monoclonal deseado pueden lograrse mediante el uso de técnicas de ultracentrifugación. El rendimiento de purificación suele ser 70 a 80%. (Kelley, 2009).
[0403] Las expresiones "proteína deseada" o "anticuerpo deseado" se utilizan indistintamente, y se refieren generalmente a un anticuerpo parental específico para una diana, es decir, PACAP humanizado como se describe en este documento. El término "anticuerpo" pretende incluir cualquier estructura molecular que contenga una cadena polipeptídica con una forma específica que se adapta y reconoce un epítopo, en la que una o más interacciones de unión no covalentes estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epítopo. La molécula de anticuerpo arquetípica es la inmunoglobulina, y todos los tipos de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc., de todas las fuentes, por ejemplo ser humano, roedores, conejos, vacas, ovejas, cerdos, perros, otros mamíferos, pollos, otras aves, etc., se consideran "anticuerpos". Una fuente preferida para producir anticuerpos útiles como material de partida según la invención son los conejos. Entre los ejemplos se incluyen anticuerpos humanizados (véase Streltsov et al., Protein Sci., 14(11):2901-9, 2005; Greenberg et al., Nature, 374(6518):168-73, 1995; Nuttall et al., Mol. Immunol., 38(4):313-26, 2001; Hamers-Casterman et al., Nature, 363(6428):446-8, 1993; Gill et al., Curr. Opin. Biotechnol., (6):653-8, 2006).
[0405] Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse mediante ingeniería genética. En esta técnica, como con otros métodos, las células productoras de anticuerpos se sensibilizan al antígeno o inmunógeno deseado. El ARN mensajero aislado de las células productoras de anticuerpos se utiliza como plantilla para producir ADNc mediante amplificación por PCR. Se produce una biblioteca de vectores, cada uno de los cuales contiene un gen de cadena pesada y un gen de cadena ligera que conserva la especificidad por el antígeno inicial, mediante la inserción de secciones apropiadas del ADNc de inmunoglobulina amplificado en los vectores de expresión. Una biblioteca combinatoria se construye combinando la biblioteca de genes de cadena pesada con la biblioteca de genes de cadena ligera. Esto da como resultado una biblioteca de clones que coexpresan una cadena pesada y ligera (similar al Fab de una molécula de anticuerpo). Los vectores que portan estos genes se cotransfectan en una célula hospedadora. Cuando se induce la síntesis de genes de anticuerpos en el hospedante transfectado, las proteínas de cadena pesada y ligera se autoensamblan para producir anticuerpos activos que pueden detectarse mediante el análisis del antígeno o inmunógeno.
[0407] Las secuencias codificantes de anticuerpos de interés incluyen aquellas codificadas por secuencias nativas, así como ácidos nucleicos que, en virtud de la degeneración del código genético, no son idénticos en secuencia a los ácidos nucleicos descritos y variantes de los mismos. Los polipéptidos variantes pueden incluir sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos ("aa"). Las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservativas o sustituciones para eliminar aminoácidos no esenciales, tal como para alterar un sitio de glicosilación, o para minimizar el plegamiento incorrecto mediante la sustitución o deleción de uno o más residuos de cisteína que no son necesarios para la función. Se pueden diseñar variantes para conservar o mejorar la actividad biológica de una región particular de la proteína (por ejemplo, un dominio funcional, residuos de aminoácidos catalíticos, etc.). Las variantes también incluyen polipéptidos de los descritos en este documento, particularmente biológicamente activos y/o correspondientes a dominios funcionales. Se conocen técnicas para la mutagénesisin vitrode genes clonados. También se incluyen en la invención en cuestión polipéptidos que se han modificado utilizando técnicas de biología molecular habituales para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacerlos más adecuados como agente terapéutico.
[0409] Los anticuerpos humanizados están diseñados para contener incluso más dominios de inmunoglobulina similares a los humanos, e incorporan sólo las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo derivado del animal. Esto se logra examinando cuidadosamente la secuencia de los bucles hipervariables de las regiones variables del anticuerpo monoclonal y ajustándolos a la estructura de las cadenas de anticuerpos humanos. Aunque a primera vista parece complejo, en la práctica el proceso es sencillo. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.187.287.
[0411] Las inmunoglobulinas pueden modificarse postraduccionalmente, por ejemplo para añadir restos efectores tales como enlaces químicos, restos detectables, tales como colorantes fluorescentes, enzimas, toxinas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, restos quimioluminiscentes, y similares, o restos de unión específica, tales como estreptavidina, avidina o biotina, y similares, que pueden utilizarse en los métodos y composiciones de la presente invención. Más adelante se proporcionan ejemplos de moléculas efectoras adicionales.
[0413] Una secuencia polinucleotídica "corresponde" a una secuencia polipeptídica si la traducción de la secuencia polinucleotídica de acuerdo con el código genético produce la secuencia polipeptídica (es decir, la secuencia polinucleotídica "codifica" la secuencia polipeptídica), una secuencia polinucleotídica "corresponde" a otra secuencia polinucleotídica si las dos secuencias codifican la misma secuencia polipeptídica.
[0415] Una región o dominio "heterólogo" de una construcción de ADN es un segmento identificable de ADN dentro de una molécula de ADN más grande que no se encuentra asociado con la molécula más grande en la naturaleza. Por lo tanto, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el ADN que flanquea el gen generalmente no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. Otro ejemplo de una región heteróloga es una construcción en la que la propia secuencia codificante no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un ADNc en el que la secuencia codificante genómica contiene intrones o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes a los del gen nativo). Las variaciones alélicas o los eventos mutacionales que ocurren naturalmente no dan lugar a una región heteróloga de ADN como se define aquí.
[0417] Una "secuencia codificante" es una secuencia de codones en marco que corresponden o codifican una secuencia proteica o peptídica. Dos secuencias codificantes se corresponden entre sí si las secuencias o sus secuencias complementarias codifican las mismas secuencias de aminoácidos. Una secuencia codificante en asociación con secuencias reguladoras apropiadas puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. Una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción generalmente estarán ubicadas en 3' de la secuencia codificante. Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de iniciar la transcripción de una secuencia codificante en dirección 3' (dirección 3'), y típicamente contiene sitios adicionales para la unión de moléculas reguladoras, por ejemplo factores de transcripción, que afectan la transcripción de la secuencia codificante. Una secuencia codificante está "bajo el control" de la secuencia promotora, o "ligada operativamente" al promotor, cuando la ARN polimerasa se une a la secuencia promotora en una célula y transcribe la secuencia codificante en ARNm, que luego a su vez se traduce en la proteína codificada por la secuencia codificante.
[0419] La estructura general de los anticuerpos en los vertebrados ahora se entiende bien. Véase Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190:5 (1971). Los anticuerpos consisten en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas con un peso molecular de alrededor de 23.000 daltons (la "cadena ligera") y dos cadenas pesadas idénticas con un peso molecular de 53.000 a 70.000 (la "cadena pesada"). Las cuatro cadenas están unidas por enlaces disulfuro en una configuración en "Y", en la que las cadenas ligeras encierran las cadenas pesadas comenzando en la boca de la configuración en "Y". La porción de "rama" de la configuración en "Y" se denomina región Fab; la porción de tallo de la configuración en "Y" se denomina región Fc. La orientación de la secuencia de aminoácidos va desde el extremo N-terminal en la parte superior de la configuración en "Y" hasta el extremo C-terminal en la parte inferior de cada cadena. El extremo N-terminal posee la región variable que tiene especificidad para el antígeno que la provocó, y tiene alrededor de 100 aminoácidos de longitud, existiendo ligeras variaciones entre la cadena ligera y la pesada y de un anticuerpo a otro.
[0421] La región variable está unida en cada cadena a una región constante que extiende la longitud restante de la cadena y que, dentro de una clase particular de anticuerpo, no varía con la especificidad del anticuerpo (es decir, el antígeno que lo provoca). Hay cinco clases principales conocidas de regiones constantes que determinan la clase de la molécula de inmunoglobulina (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE correspondientes a las regiones constantes de cadena pesada<y>, |J, a, 5 y £ (gamma, mu, alfa, delta o épsilon)). La región o clase constante determina la función efectora posterior del anticuerpo, incluida la activación del complemento (véase Kabat, E.A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2.a ed., págs. 413-436, Nueva York, NY: Holt, Rinehart, Winston (1976)) y otras respuestas celulares (véase Andrews et al., Clinical Immunology, págs. 1-18, W.B. Sanders, Filadelfia, PA (1980); Kohl et al., Immunology, 48:187 (1983)); mientras que la región variable determina el antígeno con el que reaccionará. Las cadenas ligeras se clasifican como k (kappa) o A (lambda). Cada clase de cadena pesada se puede preparar con cadena ligera kappa o lambda. Las cadenas ligeras y pesadas están unidas covalentemente entre sí, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro covalentes cuando las inmunoglobulinas son generadas por hibridomas o por células B.
[0423] La expresión "región variable" o "VR" se refiere a los dominios dentro de cada par de cadenas ligeras y pesadas en un anticuerpo que están involucrados directamente en la unión del anticuerpo al antígeno. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V<h>) seguido de una serie de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (Vl) en un extremo y un dominio constante en el otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada.
[0425] Las expresiones "región determinante de la complementariedad", " región hipervariable" o "CDR" se refieren a una o más de las regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad ("CDR") que se encuentran en las regiones variables de las cadenas ligeras o pesadas de un anticuerpo (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4.a ed., Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1987)). Estas expresiones incluyen las regiones hipervariables definidas por Kabat et al., (Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, National Institutes of Health (1983)) o los bucles hipervariables en estructuras tridimensionales de anticuerpos (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987). Las CDR de cada cadena se mantienen en estrecha proximidad mediante regiones marco ("FR") y, junto con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno. Dentro de las CDR hay aminoácidos selectos que se han descrito como regiones determinantes de la selectividad ("SDR") que representan los residuos de contacto críticos utilizados por la CDR en la interacción anticuerpo-antígeno. (Véase, Kashmiri et al., Methods, 36(1):25-34, 2005).
[0426] Un "epítopo" o "sitio de unión" es un área o región de un antígeno al que se une específicamente un péptido de unión al antígeno (tal como un anticuerpo). Un epítopo de proteína puede comprender residuos de aminoácidos directamente involucrados en la unión (también llamado componente inmunodominante del epítopo) y otros residuos de aminoácidos, que no están directamente involucrados en la unión, tales como los residuos de aminoácidos que están bloqueados de manera efectiva por el péptido de unión al antígeno específicamente (en otras palabras, el residuo de aminoácido está dentro de la "huella" del péptido de unión al antígeno específicamente). El término epítopo en este documento incluye ambos tipos de sitios de unión de aminoácidos en cualquier región particular de PACAp, es decir, PACAP38 y PACAP27, que se une específicamente a un anticuerpo anti-pACAP PACAP puede comprender varios epítopos diferentes, que pueden incluir, sin limitación, (1) determinantes antigénicos peptídicos lineales, (2) determinantes antigénicos conformacionales que consisten en uno o más aminoácidos no contiguos ubicados cerca uno del otro en una conformación de PACAP madura; y (3) determinantes antigénicos postraduccionales que consisten, ya sea en su totalidad o en parte, en estructuras moleculares unidas covalentemente a una proteína PACAP, tales como grupos de hidratos de carbono. En particular, el término "epítopo" incluye los residuos específicos de una proteína o péptido, por ejemplo PACAP, que están involucrados en la unión de un anticuerpo a dicha proteína o péptido según lo determinado por métodos conocidos y aceptados, tales como técnicas de barrido de alanina. Dichos métodos se ejemplifican en este documento.
[0428] La frase de que un anticuerpo (por ejemplo, primer anticuerpo) se une "sustancialmente" o "al menos parcialmente" al mismo epítopo que otro anticuerpo (por ejemplo, segundo anticuerpo) significa que el sitio de unión del epítopo para el primer anticuerpo comprende al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de los residuos de aminoácidos en el antígeno que constituye el sitio de unión del epítopo del segundo anticuerpo. Además, que un primer anticuerpo se una sustancial o parcialmente al mismo epítopo o a un epítopo solapante que un segundo anticuerpo significa que el primer y el segundo anticuerpo compiten en la unión al antígeno, como se describió anteriormente. Por lo tanto, la expresión "se une sustancialmente al mismo epítopo o determinante que" un anticuerpo monoclonal significa que un anticuerpo "compite" con el anticuerpo.
[0430] La frase "se une al mismo epítopo o determinante solapante que" un anticuerpo de interés significa que un anticuerpo "compite" con dicho anticuerpo de interés por al menos uno (por ejemplo, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5) o todos los residuos en PACAP a los que dicho anticuerpo de interés se une específicamente. La identificación de uno o más anticuerpos que se unen sustancial o esencialmente al mismo epítopo que los anticuerpos monoclonales descritos en este documento se puede determinar fácilmente utilizando un barrido de alanina. Además, cualquiera de la variedad de ensayos de detección inmunológica en los que se puede evaluar la competición de anticuerpos. Varios de estos ensayos se practican de forma rutinaria y son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.660.827, expedida el 26 de agosto de 1997). Se entenderá que la determinación real del epítopo al que se une un anticuerpo descrito en este documento no es de ninguna manera necesaria para identificar un anticuerpo que se une al mismo o sustancialmente al mismo epítopo o epítopo solapante que el anticuerpo monoclonal descrito en este documento.
[0432] Por ejemplo, cuando los anticuerpos de prueba que se van a examinar se obtienen de diferentes animales de origen, o incluso son de un isotipo de Ig diferente, se puede emplear un ensayo de competición simple en el que el anticuerpo de control se mezcla con el anticuerpo de prueba y luego se aplica a una muestra que contiene PACAP. Los protocolos basados en ELISA, radioinmunoensayos, transferencia Western, y el uso del análisis BIACORE® (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA) son adecuados para uso en estos estudios de competición simple.
[0434] En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PACAP de control se premezcla con cantidades variables del anticuerpo de prueba (por ejemplo, en proporciones de alrededor de 1:1, 1:2, 1:10 o alrededor de 1:100) durante un período de tiempo antes de aplicarlo a la muestra de antígeno PACAP38 o PACAP27. En otras realizaciones, el control y las cantidades variables del anticuerpo de prueba pueden simplemente añadirse por separado y mezclarse durante la exposición a la muestra de antígeno PACAP38 o PACAP27. Siempre que los anticuerpos unidos se puedan distinguir de los anticuerpos libres (por ejemplo, mediante técnicas de separación o lavado para eliminar los anticuerpos no unidos), y el anticuerpo de control del anticuerpo de prueba (por ejemplo, mediante anticuerpos secundarios específicos de la especie o del isotipo o mediante el marcaje específico del anticuerpo de control con una etiqueta detectable), se puede determinar si el anticuerpo de prueba reduce la unión del anticuerpo de control a los antígenos PACAP38 o PACAP27, lo que indica que el anticuerpo de prueba reconoce sustancialmente el mismo epítopo que el anticuerpo de control anti-PACAP. La unión del anticuerpo de control (marcado) en presencia de un anticuerpo completamente irrelevante (que no se une a PACAP) puede servir como valor de control alto. El valor de control bajo se puede obtener incubando el anticuerpo de control marcado con el mismo anticuerpo de control pero no marcado, en el que se produciría competición y reduciría la unión del anticuerpo marcado. En un ensayo de prueba, una reducción significativa en la reactividad del anticuerpo marcado en presencia de un anticuerpo de prueba es indicativo de un anticuerpo de prueba que reconoce sustancialmente el mismo epítopo, es decir, aquel que compite con el anticuerpo de control marcado. Por ejemplo, cualquier anticuerpo de prueba que reduzca la unión del anticuerpo de control a PACAP38 o PACAP27 en al menos alrededor de 50%, tal como al menos alrededor de 60%, o más preferiblemente al menos alrededor de 70% (por ejemplo, alrededor de 65-100%), en cualquier proporción de anticuerpo de prueba entre alrededor de 1:1 o 1:10 y alrededor de 1:100, se considera un anticuerpo que se une a sustancialmente el mismo epítopo o determinante o epítopo o determinante solapante que el anticuerpo de control.
[0436] Preferiblemente, dicho anticuerpo de prueba reducirá la unión del anticuerpo de control al antígeno PACAP38 o PACAP27 preferiblemente al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 80%, o al menos alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 95%) de la unión del anticuerpo de control observada en ausencia del anticuerpo de prueba.
[0438] También se puede emplear de forma ventajosa un ensayo de competición simple, en el que se aplica un anticuerpo de prueba en una concentración saturante a una superficie sobre la que está inmovilizado PACAP38 o PACAP27. La superficie en el ensayo de competición simple es preferiblemente un chip BIACORE® (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, Ma ) (u otro medio adecuado para el análisis de resonancia de plasmones de superficiales ("SPR")). Se mide la unión de un anticuerpo de control que une PACAP38 o PACAP27 a la superficie recubierta con PACAP. Esta unión a la superficie que contiene PACAP38 o PACAP27 del anticuerpo de control solo se compara con la unión del anticuerpo de control en presencia de un anticuerpo de prueba. Una reducción significativa en la unión a la superficie que contiene PACAP38 o PACAP27 por el anticuerpo de control en presencia de un anticuerpo de prueba indica que el anticuerpo de prueba reconoce sustancialmente el mismo epítopo que el anticuerpo de control, de modo que el anticuerpo de prueba "compite" con el anticuerpo de control. Cualquier anticuerpo de prueba que reduzca la unión del anticuerpo de control en al menos alrededor de 20% o más, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 70% o más, puede considerarse un anticuerpo que se une sustancialmente al mismo epítopo o determinante que el anticuerpo de control. Preferiblemente, dicho anticuerpo de prueba reducirá la unión del anticuerpo de control a PACAP38 o PACAP27 en al menos alrededor de 50% (por ejemplo, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, o más). Se apreciará que el orden de los anticuerpos de control y de prueba se puede invertir, es decir, el anticuerpo de control se puede unir primero a la superficie y luego el anticuerpo de prueba se pone en contacto con la superficie posteriormente en un ensayo de competición. Preferiblemente, se utiliza el ensayo de unión "estilo sándwich" ejemplificado en el Ejemplo 9más abajo.Como alternativa, el anticuerpo que tiene mayor afinidad por el antígeno PACAP38 o PACAP27 se une primero a la superficie que contiene PACAP38 o PACAP27, ya que se esperará que la disminución en la unión observada para el segundo anticuerpo (asumiendo que los anticuerpos están compitiendo) sea de mayor magnitud. Se proporcionan más ejemplos de dichos ensayos en, por ejemplo, Saunal y Regenmortel, J. Immunol. Methods, 183:33-41 (1995).
[0440] Además, el hecho de que un anticuerpo se une al mismo epítopo o epítopos o a epítopo o epítopos solapantes en PACAP que otro anticuerpo, o al epítopo unido por un anticuerpo de prueba, se puede determinar en particular utilizando un ensayo basado en transferencia Western. En este ensayo se crea una biblioteca de péptidos correspondientes al antígeno unido por el anticuerpo, la proteína PACAP, que comprenden porciones solapantes de la proteína, típicamente de 10-25, 10-20 o 10-15 aminoácidos de longitud. Estos diferentes péptidos de aminoácidos solapantes que abarcan la secuencia de PACAP se sintetizan y se unen covalentemente a una membrana de nitrocelulosa PEPSPOTS™ (JPT Peptide Technologies, Berlín, Alemania). Luego se preparan las transferencias, y se analizan según las recomendaciones del fabricante.
[0441] Básicamente, el ensayo de inmunotransferencia detecta entonces mediante medios fluorométricos qué péptidos de la biblioteca se unen al anticuerpo de prueba, y de ese modo puede identificar qué residuos del antígeno, es decir, PACAP, interactúan con el anticuerpo de prueba. (Véase la patente de EE. UU. n.° 7.935.340).
[0443] Se conocen en la técnica diversas técnicas de cartografiado de epítopos. A modo de ejemplo, la cocristalografía de rayos X del antígeno y el anticuerpo; RMN; SPR (por ejemplo, a 25° o 37 °C); escaneo de oligopéptidos basado en matrices (o "análisis pepscan"); mutagénesis dirigida al sitio (por ejemplo, barrido de alanina); cartografiado de mutagénesis; intercambio de hidrógeno-deuterio; presentación de fagos; y proteólisis limitada, son todas técnicas de cartografiado de epítopos que son bien conocidas en la técnica. (Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols: segunda edición, Methods in Molecular Biology,, editores Mike Schutkowski y Ulrich Reineke, 2nd Ed., Nueva York, NY: Humana Press, 2009; y Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, editor Glenn Morris, 1a ed., Nueva York, NY: Humana Press, 1996).
[0445] La identificación de uno o más anticuerpos que se unen sustancial o esencialmente al mismo epítopo que los anticuerpos monoclonales descritos en este documento, por ejemplo Ab10, Ab10.H, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5, se puede determinar fácilmente utilizando cualquiera de los diversos ensayos de detección inmunológica en los que se puede evaluar la competición de anticuerpos. Varios de estos ensayos se practican de forma rutinaria y son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.660.827). Se entenderá que la determinación del epítopo al que se une un anticuerpo descrito en este documento no es de ninguna manera necesaria para identificar un anticuerpo que se una al mismo o sustancialmente el mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal descrito en este documento.
[0447] Por ejemplo, cuando los anticuerpos de prueba que se van a examinar se obtienen de diferentes animales de origen, o incluso son de un isotipo de Ig diferente, se puede emplear un ensayo de competición simple en el que el anticuerpo de control (uno de Ab10, Ab10.H, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Abl0.H5, por ejemplo) se mezcla con el anticuerpo de prueba y luego se aplica a una muestra que contiene uno o ambos PACAP38 y PACAP27, cada uno de los cuales se sabe que está unido por Ab10, Ab10.H, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5. Los protocolos basados en ELISA, radioinmunoensayos, transferencia Western, y análisis BIACORe® (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA) (como se describe en la sección de Ejemplos aquí) son adecuados para uso en dichos estudios de competición simple.
[0449] En ciertas realizaciones, el método comprende premezclar el anticuerpo de control con cantidades variables del anticuerpo de prueba (por ejemplo, en proporciones de alrededor de 1:1, 1:2, 1:10 o alrededor de 1:100) durante un período de tiempo antes de aplicarlo a la muestra de antígeno PACAP. En otras realizaciones, el control y las cantidades variables del anticuerpo de prueba pueden añadirse por separado y mezclarse durante la exposición a la muestra de antígeno PACAP. Siempre que los anticuerpos unidos se puedan distinguir de los anticuerpos libres (por ejemplo, mediante técnicas de separación o lavado para eliminar los anticuerpos no unidos), y el anticuerpo de control del anticuerpo de prueba (por ejemplo, mediante anticuerpos secundarios específicos de la especie o del isotipo o mediante el marcaje específico del anticuerpo de control con un marcador detectable), el método se puede utilizar para determinar que el anticuerpo de prueba reduce la unión del anticuerpo de control al antígeno PACAP, lo que indica que el anticuerpo de prueba reconoce sustancialmente el mismo epítopo que el anticuerpo de control (por ejemplo, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5). La unión del anticuerpo de control (marcado) en presencia de un anticuerpo completamente irrelevante (que no se une a PACAP) puede servir como valor de control alto. El valor de control bajo se puede obtener incubando el anticuerpo de control marcado con el mismo anticuerpo de control pero no marcado, en el que se produciría competición y reduciría la unión del anticuerpo marcado. En un ensayo de prueba, una reducción significativa en la reactividad del anticuerpo marcado en presencia de un anticuerpo de prueba es indicativo de un anticuerpo de prueba que reconoce sustancialmente el mismo epítopo, es decir, aquel que compite con el anticuerpo de control marcado. Por ejemplo, cualquier anticuerpo de prueba que reduzca la unión de Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5 a los antígenos PACAP38 y PACAP27 en al menos alrededor de 50%, tal como al menos alrededor de 60%, o más preferiblemente al menos alrededor de 70% (por ejemplo, alrededor de 65-100%), en cualquier proporción de control a Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5 entre alrededor de 1:1 o 1:10 y alrededor de 1:100, se considera un anticuerpo que se une sustancialmente al mismo epítopo o determinante que Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5, respectivamente. Preferiblemente, dicho anticuerpo de prueba reducirá la unión de Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5 a al menos uno, preferiblemente cada uno, de los antígenos PACAP38 y PACAP27, preferiblemente al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 80% o al menos alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 95%) de la unión de Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5 observada en ausencia del anticuerpo de prueba. Estos métodos se pueden adaptar para identificar y/o evaluar anticuerpos que compiten con otros anticuerpos de control.
[0451] También se puede emplear de forma ventajosa un ensayo de competición simple, en el que se aplica un anticuerpo de prueba en una concentración saturante a una superficie sobre la que están inmovilizados PACAP38 o PACAP27, o ambos. La superficie en el ensayo de competición simple es preferiblemente de un medio adecuado para OCTET® y/o Pr Ot EON®. Se mide la unión de un anticuerpo de control (por ejemplo, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5) a la superficie recubierta con PACAP. Esta unión a la superficie que contiene PACAP del anticuerpo de control solo se compara con la unión del anticuerpo de control en presencia de un anticuerpo de prueba. Una reducción significativa en la unión a la superficie que contiene PACAP por el anticuerpo de control en presencia de un anticuerpo de prueba indica que el anticuerpo de prueba reconoce sustancialmente el mismo epítopo que el anticuerpo de control, de modo que el anticuerpo de prueba "compite" con el anticuerpo de control. Cualquier anticuerpo de prueba que reduzca la unión del anticuerpo de control (tal como Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5) a los antígenos PACAP38 y PACAP27 en al menos alrededor de 20% o más, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 70%, o más, puede considerarse un anticuerpo que se une sustancialmente al mismo epítopo o determinante que el anticuerpo de control (por ejemplo, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5). Preferiblemente, dicho anticuerpo de prueba reducirá la unión del anticuerpo de control (por ejemplo, Ab10.H, AM0.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5) al antígeno PACAP en al menos alrededor de 50% (por ejemplo, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, o más). Se apreciará que el orden de los anticuerpos de control y de prueba se puede invertir, es decir, el anticuerpo de control se puede unir primero a la superficie y luego el anticuerpo de prueba se pone en contacto con la superficie posteriormente en un ensayo de competición. Preferiblemente, el anticuerpo que tiene mayor afinidad por PACAP38 y PACAP27 se une primero a la superficie que contiene PACAP, ya que se esperará que la disminución en la unión observada para el segundo anticuerpo (asumiendo que los anticuerpos están compitiendo) sea de mayor magnitud. Se proporcionan más ejemplos de dichos ensayos en, por ejemplo, Saunal y Regenmortel, J. Immunol. Methods, 183:33-41 (1989).
[0452] La determinación de si un anticuerpo, su unión a antígeno o un derivado de anticuerpo se une dentro de una de las regiones epitópicas definidas anteriormente se puede llevar a cabo de maneras conocidas por la persona experta en la técnica. En otro ejemplo de dichos métodos de cartografiado/caracterización, una región epitópica para un anticuerpo anti-PACAP puede determinarse mediante una "huella" epitópica usando una modificación química de las aminas/carboxilos expuestos en las proteínas PACAP38 y PACAP27. Un ejemplo específico de dicha técnica de huella es el uso del intercambio de hidrógeno-deuterio detectado por espectrometría de masas ("HXMS"), en el que se produce un intercambio de hidrógeno/deuterio de protones de amida proteica de receptor y ligando, unión, y retrointercambio, en el que los grupos amida de la cadena principal que participan en la unión de la proteína están protegidos del retrointercambio, y por lo tanto permanecerán deuterados. Las regiones relevantes se pueden identificar en este punto mediante proteólisis péptica, separación por cromatografía de líquidos de alto rendimiento de microcalibre rápido, y/o espectrometría de masas con ionización por electropulverización. (Véanse, por ejemplo, Ehring H., Anal. Biochem., 267(2):252-259, 1999; y Engen, J. R. y Smith, D. L., Anal. Chem., 73:256A-265<a>, 2001). Otro ejemplo de una técnica adecuada de identificación de epítopos es el cartografiado de epítopos por resonancia magnética nuclear ("RMN"), en el que típicamente se comparan la posición de las señales en espectros de RMN bidimensionales del antígeno libre y del antígeno complejado con el péptido de unión al antígeno, tal como un anticuerpo. El antígeno generalmente se marca isotópicamente de forma selectiva con 15N, de modo que en el espectro de RMN sólo se ven señales correspondientes al antígeno y ninguna señal del péptido que se une al antígeno. Las señales de antígeno que se originan a partir de los aminoácidos involucrados en la interacción con el péptido que se une al antígeno normalmente cambiarán de posición en los espectros del complejo en comparación con los espectros del antígeno libre, y los aminoácidos involucrados en la unión se pueden identificar de esa manera. (Véanse, por ejemplo, Ernst Schering Res. Found. Workshop, (44):149-67, 2004; Huang et al., J. Mol. Biol., 281 (1 ):61-67, 1998; y Saito y Patterson, Methods, 9(3):516-24, 1996).
[0454] El cartografiado/caracterización de epítopos también se puede realizar utilizando métodos de espectrometría de masas ("MS"). (Véase, por ejemplo, Downard, J. Mass Spectrom., 35(4):493-503, 2000; y Kiselar y Downard, Anal. Chem., 71(9):1792-801, 1999).
[0456] Las técnicas de digestión con proteasas también pueden ser útiles en el contexto del cartografiado e identificación de epítopos. Las regiones/secuencias relevantes para los determinantes antigénicos se pueden determinar mediante digestión con proteasas, por ejemplo utilizando tripsina en una proporción de alrededor de 1:50 con PACAP38 o PACAP27, digestión durante la noche ("o/n") a 37 °C y pH 7-8, seguido de análisis por espectrometría de masas ("MS") para la identificación de péptidos. Los péptidos protegidos de la escisión con tripsina por el anticuerpo anti-PACAP se pueden identificar posteriormente mediante la comparación de muestras sometidas a digestión con tripsina y muestras incubadas con anticuerpo y luego sometidas a digestión por ejemplo con tripsina (revelando así una huella del anticuerpo). Se pueden utilizar otras enzimas como la quimotripsina o la pepsina en métodos de caracterización epitópica similares. Además, la digestión enzimática puede proporcionar un método rápido para analizar si una secuencia determinante antigénica potencial está dentro de una región de PACAP en el contexto de un polipéptido de unión a PACAP. Si el polipéptido no está expuesto en la superficie, lo más probable es que no sea relevante en términos de inmunogenicidad/antigenicidad. (Véase, por ejemplo, Manca, Ann. Ist. Super. Sanita., 27(1):15-9, 1991, para una discusión de técnicas similares).
[0458] La mutagénesis dirigida al sitio es otra técnica útil para la caracterización de un epítopo de unión. Por ejemplo, en la mutagénesis dirigida al sitio de "barrido de alanina" (también conocida como barrido de alanina, mutagénesis de barrido de alanina, mutaciones de barrido de alanina, barrido de alanina combinatorio, o creación de mutaciones puntuales de alanina, por ejemplo), cada residuo dentro de un segmento proteico se reemplaza por un residuo de alanina (u otro residuo tal como valina, en el que la alanina está presente en la secuencia de tipo salvaje) a través de metodologías tales como la síntesis directa de péptidos o proteínas, la mutagénesis dirigida al sitio, el Servicio de Mutagénesis GENEART™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) o la mutagénesis de escopeta, por ejemplo. De este modo, usando esta técnica, se genera una serie de mutantes puntuales únicos de la molécula; el número de mutantes generados es equivalente al número de residuos en la molécula, reemplazándose cada residuo, uno a la vez, por un único residuo de alanina. La alanina se utiliza generalmente para reemplazar residuos nativos (de tipo salvaje) debido a su grupo funcional metilo, químicamente inerte y no voluminoso, que puede imitar las preferencias de estructura secundaria que pueden poseer muchos otros aminoácidos. Posteriormente, los efectos que tiene la sustitución de un residuo nativo por una alanina sobre la afinidad de unión de un mutante de barrido de alanina y su pareja de unión se pueden medir utilizando métodos tales como, pero sin limitarse a, experimentos de unión por<s>P<r>. Si una mutación conduce a una reducción significativa en la afinidad de unión, lo más probable es que el residuo mutado esté involucrado en la unión. Los anticuerpos monoclonales específicos para epítopos estructurales (es decir, anticuerpos que no se unen a la proteína desplegada) se pueden utilizar como control positivo para experimentos de afinidad de unión para verificar que el reemplazo de alanina no influya en la estructura terciaria general de la proteína (ya que los cambios en el plegamiento general de la proteína pueden afectar indirectamente la unión y de ese modo producir un resultado falso positivo). (Véase, por ejemplo, Clackson y Wells, Science, 267:383-386 (1995); Weiss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(16):8950-8954 (2000); y Wells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:1-6 (1996)). En el Ejemplo 12 se utilizan métodos de barrido de alanina para identificar el epítopo o los residuos específicos de PACAP que interactúan específicamente con los anticuerpos anti-PACAP descritos en este documento.
[0460] La microscopía electrónica también se puede utilizar para determinar la "huella" de un epítopo. Por ejemplo, Wang et al., Nature, 355:275-278 (1992) utilizaron la aplicación coordinada de microscopía crioelectrónica, reconstrucción de imágenes tridimensionales y cristalografía de rayos X para determinar la huella física de un Fab en la superficie de la cápside del virus del mosaico del caupí nativo.
[0462] Otras formas de ensayo "sin marcadores" para la evaluación de epítopos incluyen SPR (vendido comercialmente como sistema BIACORE®, GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA) y espectroscopia de interferencia reflectométrica ("RifS"). (Véase, por ejemplo, Fagerstam et al., J. Mol. Recog., 3:208-14, 1990; Nice et al., J. Chromatogr., 646:159-168, 1993; Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed., 37:3308-3311, 1998; Kroger et al., Biosensors and Bioelectronics, 17:937-944, 2002).
[0464] Las expresiones "región marco" o "FR" se refieren a una o más de las regiones marco dentro de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo. (Véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a edición, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, 1987). Estas expresiones incluyen aquellas regiones de secuencia de aminoácidos interpuestas entre las CDR dentro de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo.
[0465] La expresión "región Fc" se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. La "región Fc" puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana generalmente se define para extenderse desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo terminal de la misma. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice EU como en Kabat. (Véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, 1991). La región Fc de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, CH2 y CH3.
[0467] Los términos "receptor Fc" y "FcR" describen un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es aquel que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma), e incluye receptores de las subclases FcyRi, FcyRII y FcyRIII, incluidas variantes alélicas y formas empalmadas alternativamente de estos receptores. Los receptores F<cy>RII incluyen F<cy>RIIA (un "receptor activador") y F<cy>RIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplasmáticos. Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587, 1976; y Kim et al., J. Immunol., 24:249, 1994), y que funciona principalmente para modular y/o extender la vida media de los anticuerpos en circulación. En la medida en que los anticuerpos anti-PACAP descritos estén aglicosilados, como resultado del sistema de expresión y/o secuencia, se espera que los anticuerpos en cuestión se unan a los receptores FcRn, pero no se unan (o se unan mínimamente) a los receptores Fcy.
[0469] Una "región Fc funcional" posee al menos una función efectora de una región Fc de secuencia nativa. Las "funciones efectoras" ejemplares incluyen la unión a C1q; la citotoxicidad dependiente del complemento ("CDC"); la unión al receptor Fc; la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos ("ADCC"); la fagocitosis; la regulación negativa de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, el receptor de células B ("BCR")), etc. Dichas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo), y pueden evaluarse mediante diversos ensayos conocidos en la técnica para evaluar dichas funciones efectoras de anticuerpos.
[0470] Una "región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc que se encuentra en la naturaleza. Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácido, pero conserva al menos una función efectora de la región Fc de secuencia nativa. Preferiblemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácido en comparación con una región Fc de secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido parental, por ejemplo de alrededor de una a alrededor de diez sustituciones de aminoácidos, y preferiblemente de alrededor de una a alrededor de cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido parental. La región Fc variante aquí descrita poseerá preferiblemente al menos alrededor de 80% de identidad de secuencia con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido parental, y más preferiblemente al menos alrededor de 90% de identidad de secuencia con la misma, más preferiblemente al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, o al menos alrededor de 99% de identidad de secuencia con la misma.
[0472] Anticuerpos anti-PACAPy unión que tienen actividad de unión para PACAP
[0474] PACAP es un péptido vasodilatador multifuncional con expresión en todo el sistema nervioso central ("SNC") y periférico. PACAP es un miembro de la familia de secretina/VIP/GRH. PACAP existe en dos formas activas aamidadas, PACAP38 (SEQ ID NO: 1241) y PACAP27 (SEQ ID NO: 1242). En este documento, el término "PACAP" incluye uno o ambos de PACAP38 y PACAP27 a menos que se indique expresamente lo contrario. PACAP está altamente conservado entre especies.
[0476] En los seres humanos, PACAP deriva de una proteína precursora de 176 aminoácidos (preproPACAP), y el gen está ubicado en el cromosoma 18p11, con PACAP38 codificado por el exón 5. (Véase, Vaudry et al., Pharmacol. Rev., 61:283-357, 2009). PreproPACAP contiene una proteína señal de 24 aminoácidos N-terminal, un péptido relacionado con PACAP de 29 aminoácidos, y PACAP en el dominio C-terminal. El precursor es metabolizado por las enzimas convertasas de prohormona en PACAP38 y PACAP27 biológicamente activos.
[0478] VIP (SEQ ID NO: 1243) pertenece a la misma familia de proteínas que PACAP y comparte una alta homología con PACAP, es decir, VIP y PACAP27 tienen 68% de homología de secuencia a nivel de aminoácidos, así como una estructura secundaria general similar, es decir, estructuras alfa-helicoidales largas en el extremo C.
[0480] Las acciones de PACAP están mediadas por tres receptores acoplados a proteína G diferentes: PAC1-R, VPAC1-R y VPAC2-R. VPAC1-R puede asociarse con todas las proteínas de membrana asociadas al receptor ("RAMPs", véase Kaiser y Russo, Neuropeptides 47:451-461,2013). PAC1-R es selectivo para PACAP, mientras que VPAC1-R y VPAC2-R se unen tanto a V iP como a PACAP con alta afinidad. PAC1-R se une a PACAP con una afinidad 100-1000 veces mayor que VIP, es decir, Kd ~0,5 nM para PACAP27/PACAP38 frente a Kd ~500 nM para VIP. Por el contrario, VPAC1-R y VPAC2-R tienen afinidades iguales para PACAP y VIP (K<d>~1 nM). (Véase, Schytz et al., 2010). Los tres receptores se expresan ampliamente tanto en los tejidos periféricos como en el SNC, expresándose PAC1-R predominantemente en el SNC, muy abundantemente en el bulbo olfatorio, el tálamo, el hipotálamo, el giro dentado del hipocampo y en las células granulares del cerebelo. (Véase, Hashimoto et al., J. Comp. Neurol., 371:567-577, 1996; y Shioda et al., Neurosci. Res., 28:345-354, 1997).
[0482] La activación de PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R produce un aumento de la actividad de la adenilato ciclasa y, por tanto, un aumento de la producción de AMPc. Sin embargo, los receptores de PACAP también pueden mediar sus efectos a través de PLC, lo que conduce a un aumento de los niveles de Ca2+ y PLD.
[0484] PACAP tiene una amplio intervalo de efectos biológicos, incluido un papel en el desarrollo neurológico, la neuroprotección, la neuromodulación, la inflamación neurogénica, y la nocicepción. También se informa que PACAP interactúa con los glicosaminoglicanos ("GAG"). Los GAG son polisacáridos largos y no ramificados compuestos por unidades de disacáridos repetidas, tales como heparina, condroitina, queratina y ácido hialurónico. Se ha demostrado que la captación celular de PACAP depende de la expresión de proteínas GAG y de que PACAP se una a GAG sulfatados. En particular, se determinó que la unión de PACAP38 a los GAG era capaz de inducir la captación celular de PACAP38 independiente del receptor. Este estudio demostró además que una transición aleatoria de espiral a hélice a en PACAP38 era esencial para la captación de PACAP38 dependiente de GAG, ya que un PACAP38 mutante que no podía experimentar la transición estructural no era internalizado por líneas celulares que contenían GAG tan eficientemente como la forma de tipo salvaje de PACAP38 (Neree et al., FEBS Lett., 588(24):4590-4596, 2014). En un estudio de seguimiento, se determinó que la capacidad de PACAP para agrupar los GAG, es decir, heparina, estaba directamente relacionada con su capacidad para funcionar como un péptido penetrante celular ("CPP"). Se plantea la hipótesis de que esta actividad es atribuible al motivo de unión a la heparina, o Cardin-Weintraub, que se encuentra en los miembros de la familia de secretina/glucagón/GHRH, tal como PACAP (Neree et al., Int. J. Mol. Sci., 16:27391-27400, 2015). Curiosamente, Neree et al. (2015) presentaron datos que demostraban que PACAP38 era capaz de agrupar los GAG sulfatadosin vitro.Estos datos sugirieron que el efecto de agrupamiento observado es importante para la captación celular de PACAP38 mediada por GAG, ya que otros péptidos, tal como el glucagón, mostraron mayores afinidades de unión para los GAG sulfatados (heparina) pero no son internalizados por las células tan eficientemente como PACAP38. Además, se informa que en estudiosin vitroen los que las células están expuestas a PACAP, aumenta la formación de cartílago, incluida la matriz de cartílago que es rica en proteínas GAG sulfatadas, lo que es coherente con su supuesto papel protector expresado durante diversas respuestas al estrés celular (Juhász et al., PLoS ONE, 9(3):e91541,2014). Utilizando tipos de células que carecen de receptores específicos de PACAP en sus membranas plasmáticas, tales como las células CHO-K1, Doan et al. presentaron datos que demuestran la capacidad de dichas células para participar en la captación celular independiente del receptor de diversas formas de PACAP38 y PACAP27 marcados fluorescentemente (Doan et al., Biochem. Biophys. Acta, 1823:940-949, 2012).
[0486] La presente invención proporciona anticuerpos ejemplares que se unen a PACAP. Se pueden obtener otros anticuerpos que se unen a PACAP, incluidos aquellos que tienen diferentes CDR, y especificidad epitópica, utilizando la divulgación de la presente memoria descriptiva y utilizando métodos que son generalmente conocidos en la técnica. Estos anticuerpos antagonizan los efectos biológicos de PACAPin vivo,y por lo tanto son útiles para tratar o prevenir afecciones relacionadas con PACAP, incluidas, por ejemplo, cefalea, migraña, dolor, fotofobia, sofocos, trastorno de estrés postraumático, y trastornos de ansiedad. En realizaciones preferidas, el anticuerpo según la invención comprende una o más CDR, una cadena Vl y/o una cadena Vh de los anticuerpos anti-PACAP descritos en este documento.
[0488] En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-PACAP según la invención interferirá, bloqueará, reducirá o modulará la interacción entre PACAP y su o sus receptores (por ejemplo, PAC1-R, VPAC1-R y VPAC2-R). En algunos casos, un anticuerpo anti-PACAP según la invención es "neutralizante", es decir, impide totalmente la interacción específica de PACAP con PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R. En algunas realizaciones, el anticuerpo neutraliza PACAP, por ejemplo al permanecer unido a PACAP en una ubicación y/o manera que impide que PACAP se una específicamente a PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R.
[0490] En algunas realizaciones, el anticuerpo según la invención es capaz de inhibir la actividad mediada por PACAP (incluida la unión a células que expresan PAC1R). En algunas realizaciones, los anticuerpos según la invención están humanizados, tales como anticuerpos de conejo humanizados contra PACAP.
[0492] Como se mencionó, los anticuerpos anti-PACAP según la invención tienen una variedad de usos. Por ejemplo, los anticuerpos en cuestión pueden ser útiles en aplicaciones terapéuticas, así como diagnósticamente en ensayos de unión. Los anticuerpos anti-PACAP en cuestión son útiles para la purificación por afinidad de PACAP, en particular PACAP humano o sus ligandos, y en ensayos de detección para identificar otros antagonistas de la actividad de PACAP Algunos de los anticuerpos son útiles para inhibir la unión de PACAP a PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R, o inhibir las actividades mediadas por PACAP y/o los efectos biológicos.
[0494] Como se utiliza en este documento, la expresión "uno o más efectos biológicos asociados con PACAP" se refiere a cualquier efecto biológico mediado, inducido o de otro modo atribuible a PACAP, por ejemplo propiedades de unión, propiedades funcionales, y otras propiedades de importancia biológica. Los efectos biológicos ejemplares no limitativos de PACAP incluyen la unión de PACAP a PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; la activación por PACAP de la señalización mediada por PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R; el aumento mediado por PACAP de la producción de AMPc; el aumento mediado por PACAP de la actividad de PLC; el aumento mediado por PACAP de la actividad de PLD; el aumento mediado por PACAP de los niveles de Ca2+; y la vasodilatación, fotofobia, desgranulación de mastocitos y/o activación neuronal mediadas por PACAP. Los anticuerpos anti-PACAP en cuestión son capaces de inhibir una, una combinación de, o todas estas actividades biológicas de PACAP ejemplares. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PACAP proporcionados en este documento son capaces de inhibir la vasodilatación inducida por PACAP (véanse el Ejemplo 7 y el Ejemplo 8).
[0496] El anticuerpo según la invención se puede utilizar en una variedad de aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PACAP es útil para tratar afecciones asociadas con PACAP, tales como, pero sin limitarse a, migraña (con o sin aura), migrañas hemipléjicas, cefaleas en racimos, neuralgia migrañosa, cefaleas crónicas, cefaleas tensionales, cefaleas generales, sofocos, fotofobia, hemicránea paroxística crónica, cefaleas secundarias debido a un problema estructural subyacente en la cabeza o el cuello, neuralgia craneal, cefaleas sinusales (por ejemplo, cefalea asociada con sinusitis), cefaleas o migrañas inducidas por alergias, dolor, dolor crónico, dolor neuroinflamatorio o inflamatorio, dolor por incisión posoperatoria, dolor posquirúrgico, dolor relacionado con traumatismos, dolor ocular, dolor de muelas, síndrome de dolor regional complejo, dolor por cáncer (por ejemplo, dolor por cáncer óseo primario o metastásico), dolor por fractura, dolor por fractura osteoporótica, dolor resultante de quemaduras, dolor articular por gota, dolor asociado con crisis de células falciformes, dolor asociado con trastornos temporomandibulares, cirrosis, hepatitis, dolor neurogénico, dolor neuropático, dolor nocicéptico, dolor visceral, neuralgia del trigémino, neuralgia posherpética, dolor del miembro fantasma, fibromialgia, dolor menstrual, ovarialgia, distrofia simpática refleja, dolor por osteoartritis o artritis reumatoide, lumbalgia, neuropatía diabética, ciática, dispepsia, síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, ileítis, colitis ulcerosa, cólico renal, dismenorrea, cistitis, cistitis intersticial, menstruación, parto, menopausia, pancreatitis, esquizofrenia, depresión, TEPT, trastornos de ansiedad, diabetes, diabetes autoinmune, disfunción endotelial, isquemia, síndrome de Raynaud, cardiopatía coronaria ("CC"), arteriopatía coronaria ("EAC"), insuficiencia cardíaca, arteriopatía periférica ("EAP"), hipertensión pulmonar ("HP"), trastornos del tejido conjuntivo, accidente cerebrovascular, síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, hiperreactividad bronquial, asma, bronquitis, broncodilatación, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica ("EPOC"), dermatitis inflamatoria, adenocarcinoma en tejido glandular, blastema en tejido embrionario de órganos, carcinoma en tejido epitelial, leucemia en tejidos que forman células sanguíneas, linterna en tejido linfático, mieloma en médula ósea, sarcoma en tejido conjuntivo o de sostén, cáncer suprarrenal, linfoma relacionado con el SIDA, anemia, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer cerebral, cáncer de mama, tumores carcinoides, cáncer de cuello uterino, quimioterapia, cáncer de colon, citopenia, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer hepatobiliar, cáncer de riñón, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, enfermedad de Hodgkin, no Hodgkin, tumores del sistema nervioso, cáncer oral, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer uretral, cáncer de médula ósea, mieloma múltiple, tumores que hacen metástasis en el hueso, tumores que infiltran el nervio y la víscera hueca, tumores cerca de estructuras neurales, acné vulgar, dermatitis atópica, urticaria, queloides, cicatrices hipertróficas y rosácea, dermatitis alérgica, psoriasis, prurito, enrojecimiento cutáneo neurogénico, eritema, pérdida de peso, anorexia, sarcoidosis, choque, septicemia, síndrome de abstinencia de opiáceos, tolerancia a la morfina, epilepsia, trastornos del tracto urinario inferior (LUT) tales como infección del tracto urinario, micción anormal, urgencia urinaria, nicturia, incontinencia urinaria, vejiga hiperactiva, y para prevenir o aliviar el dolor asociado con dichas afecciones del LUT.
[0498] Ejemplos específicos de dolor visceral, es decir, dolor asociado con las vísceras, u órganos internos del cuerpo, incluyen el dolor que afecta órganos tales como, por ejemplo, el corazón, los pulmones, los órganos reproductores, la vejiga, los uréteres, los órganos digestivos, el hígado, el páncreas, el bazo, y los riñones. Las afecciones asociadas incluyen, por ejemplo, pancreatitis, parto, cirugía abdominal asociada con íleo, cistitis, período menstrual, o dismenorrea. De la misma manera, el dolor de riñón, el dolor epigástrico, el dolor pleural, el cólico biliar doloroso y el dolor de apendicitis pueden considerarse dolor visceral. El dolor o la presión subesternal del infarto de miocardio temprano también es visceral. Las enfermedades del estómago, del duodeno o del colon pueden causar dolor visceral. Los trastornos gastrointestinales ("GI") más comunes que causan dolor visceral incluyen el trastorno funcional intestinal ("FBD") y la enfermedad inflamatoria intestinal ("EN"). Estos trastornos gastrointestinales pueden incluir además reflujo gastroesofágico, dispepsia, síndrome del intestino irritable ("EN") y síndrome de dolor abdominal funcional ("FAPS"), y, con respecto a la EII, enfermedad de Crohn, ileítis y colitis ulcerosa.
[0500] Los anticuerpos anti-PACAP en cuestión se pueden usar solos o en asociación con otros agentes activos o fármacos, incluidos otros productos biológicos, para tratar a cualquier sujeto en el que bloquear, inhibir o neutralizar el efectoin vivode PACA<p>o bloquear o inhibir la interacción de PACA<p>y sus receptores, PAC1-R, VPAC1-R y VPAC2-R, sea terapéuticamente deseable.
[0502] En esta sección se identifican anticuerpos anti-PACAP ejemplares según la invención y sus CDR específicas. Para mayor comodidad, cada anticuerpo ejemplificado y las secuencias correspondientes se identifican por separado mediante una nomenclatura específica, es decir, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 y Ab10.H5.
[0504] Los anticuerpos anti-PACAP que comprende la invención tienen afinidad de unión por PACAP, en los que la afinidad de unión comprende anticuerpos anti-PACAP que se unen específicamente a PACAP38 y PACAP27, pero no se unen a VIP, y/o anticuerpos que se unen específicamente a PACAP38, pero no se unen a PACAP27 o VIP, y/o anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo lineal y/o conformacional dentro de PACAP38 y/o PACAP27. Más específicamente, los epítopos de PACAP38 y/o PACAP27 a los que se unen los anticuerpos anti-PACAP antagonistas según la invención incluirán aquellos que se identifican en el Ejemplo 12 o residuos de los mismos (como se determina mediante el uso de barrido de alanina) y/u otros métodos de identificación epitópica.
[0506] Secuencias polipeptídicas de anticuerpos anti-PACAP
[0508] Anticuerpo Ab10.H
[0510] En una realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 961 que consiste en la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 962 ligada a la región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 970.
[0512] En una realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que contienen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se expone a continuación:
[0515] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDLNSYYMTWVRQAPGKGLEWIGFIDAG
[0517] GDAYYASWAKGRFT1SRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARDLDLWGQGTLVTVS
[0519] S (SEQ ID NO: 962).
[0520] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que se unen al mismo epítopo que Ab10.H, y que contienen una secuencia de cadena pesada constante que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 1244, 1245 o 1246, o que comprende la secuencia que se expone a continuación:
[0523] ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
[0525] VLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP
[0526] ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
[0527] REEQ YA STYR W S VLTVLHQDWLNGKE YTCCKVSNK ALP APIETCTTSK AKGQPREPQVY
[0528] TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
[0529] LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 970).
[0531] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que contienen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de s Eq ID NO: 981 que consiste en la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 982 ligada a la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 990.
[0533] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que contienen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se expone a continuación:
[0535] DAQLTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSESVYGNYLAWFQQKPGKAPKFLIYEASKL
[0536] ESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCAGGDISEGVAFGGGTKVEIKR (SEQ ID
[0538] NO: 982).
[0540] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP, que se unen al mismo epítopo que Ab10.H, y que contienen una secuencia de cadena ligera constante que comprende la secuencia que se expone a continuación:
[0542] TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES
[0543] VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID
[0545] NO: 990).
[0547] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que contienen una, dos o tres de las secuencias polipeptídicas de Se Q ID NO: 964; SEQ ID NO: 966; y SEQ ID NO: 968, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 961, o que contienen la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 962, y/o que además contienen una, dos o tres de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 984; SEQ ID NO: 986; y SEQ ID NO: 988, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 981, o que contienen la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 982, o anticuerpos que contengan combinaciones de secuencias idénticas a las mismas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, combinaciones de una o más de las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable ejemplificadas, o las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, o secuencias que son idénticas a las mismas.
[0549] La invención contempla además anticuerpos anti-PACAP que comprenden una, dos, tres o cuatro de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 963; SEQ ID NO: 965; s Eq ID NO: 967; y SEQ ID NO: 969, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 961, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 962, y/o una, dos, tres o cuatro de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 983; SEQ ID NO: 985; SEQ ID NO: 987; y SEQ ID NO: 989, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 981, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 982, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas, o secuencias idénticas a ellas.
[0550] En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, combinaciones de una o más de las FR, CDR, las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas, o secuencias que son idénticas a las mismas.
[0552] En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 961, o SEQ ID NO: 962, o polipéptidos que sean idénticos a las mismas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 981, o SEQ ID NO: 982, o polipéptidos que sean idénticos a las mismas.
[0554] En una realización adicional de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una, dos o tres de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 964; SEQ ID NO: 966; y SEQ ID NO: 968, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 961, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 962, o secuencias idénticas a las mismas.
[0556] En una realización adicional de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una, dos o tres de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 984; SEQ ID NO: 986; y SEQ ID NO: 988, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 981, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 982, o secuencias idénticas a las mismas.
[0558] En una realización adicional de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una, dos, tres o cuatro de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 963; SEQ ID NO: 965; SEQ ID NO: 967; y SEQ ID NO: 969, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 961, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 962, o secuencias idénticas a las mismas.
[0560] En una realización adicional de la invención, los anticuerpos en cuestión que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una, dos, tres o cuatro de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 983; SEQ ID NO: 985; SEQ ID NO: 987; y SEQ ID NO: 989, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 981, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 982, o secuencias idénticas a las mismas.
[0562] La invención también contempla anticuerpos anti-PACAP que incluyen uno o más de los anticuerpos descritos en este documento. En una realización de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes anticuerpos: la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 962; la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 982; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 964; SEQ ID NO: 966; y SEQ ID NO: 968) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 962; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 984; SEQ ID NO: 986; y SEQ ID NO: 988) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 982, o secuencias idénticas a las mismas. En otra realización de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes anticuerpos: la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 962; la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 982; las regiones marco (SEQ ID NO: 963; SEQ ID NO: 965; SEQ ID NO: 967; y SEQ ID NO: 969) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 962; y las regiones marco (SEQ ID NO: 983; SEQ ID NO: 985; SEQ ID NO: 987; y SEQ ID NO: 989) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 982, o secuencias idénticas a las mismas.
[0564] En otra realización de la invención, el anticuerpo anti-PACAP es Ab10.H, que comprende, o alternativamente consiste en, SEQ ID NO: 961 y SEQ ID NO: 981, o SEQ ID NO: 962 y S<e>Q ID NO: 982, o un anticuerpo que comprende las CDR de Ab10.H y que tiene al menos una de las actividades biológicas aquí descritas, o es un anticuerpo anti-PACAP que compite con Ab10.H en la unión a PACAP, preferiblemente aquel que contiene secuencias que son idénticas a las de Ab10.H, o un anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopos o epítopo o epítopos solapantes en PACAP que Ab10.H.
[0566] En una realización adicional de la invención, la unión al antígeno comprende, o alternativamente consiste en, Fab que tiene especificidad de unión para PACAP. Con respecto al anticuerpo Ab10.H, el Fab incluye preferiblemente la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 962 y la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 982, o secuencias idénticas a las mismas. Esta realización de la invención incluye además Fab que contienen adiciones, deleciones, y variantes de SEQ ID NO: 962 y/o SEQ ID NO: 982 que conservan la especificidad de unión para PACAP.
[0568] En una realización de la invención descrita en este documento, Fab puede producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab10.H. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP tales como Ab10.H y Fab se pueden producir a través de la expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levadura haploide o diploide, tal como Pichia haploide o diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Pichia pastoris.
[0570] En una realización adicional, la invención se refiere además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP, incluidas las cadenas pesadas y/o ligeras de Ab10.H, así como variantes y combinaciones de una o más de las FR, CDR, las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas, o secuencias que son idénticas a las mismas.
[0572] Anticuerpo Ab10.H2
[0574] En una realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1281 que consiste en la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 1282 ligada a la región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 1290.
[0576] En una realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que contienen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se expone a continuación:
[0579] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDLNSYYMTWVRQAPGKGLEWIGFIDAG
[0581] GD AY YAS WAKGRFT1SRDN SKNTV YLQMN SLRAEDTA V YFC ARDLDL WGQGTL VT VS
[0583] S (SEQ ID NO: 1282)
[0585] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que se unen al mismo epítopo que Ab10.H2, y que contienen una secuencia de cadena pesada constante que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 1244, 1245 o 1246, o que comprende la secuencia que se expone a continuación:
[0588] ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
[0590] VLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTFTTCPPCPAP
[0591] ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMTSRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVFTNAKTKP
[0592] REEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP1EKTISKAKGQPREPQVY
[0593] TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
[0594] LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 1290).
[0596] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que contienen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1301 que consiste en la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1302 ligada a la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 1310.
[0597] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que contienen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se expone a continuación:
[0599] AVLTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSESVYGNYLAWFQQKPGKAPKFLIYEASKLE
[0600] SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCAGGDISEGVAFGGGTKVEIKR (SEQ ID
[0602] NO: 1302).
[0604] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP, que se unen al mismo epítopo que Ab10.H2, y que contienen una secuencia de cadena ligera constante que comprende la secuencia que se expone a continuación:
[0606] TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES
[0607] VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID
[0609] NO: 1310)
[0611] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que contienen una, dos o tres de las secuencias polipeptídicas de s Eq ID NO: 1284; SEQ ID NO: 1286; y SEQ ID NO: 1288, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1281, o que contienen la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1282, y/o que además contienen una, dos o tres de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1304; SEQ ID NO: 1306; y SEQ ID NO: 1308, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1301, o que contienen la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1302, o anticuerpos que contengan combinaciones de secuencias idénticas a las mismas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, combinaciones de una o más de las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable ejemplificadas, o las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, o secuencias que son idénticas a las mismas.
[0612] La invención contempla además anticuerpos anti-PACAP que comprenden una, dos, tres o cuatro de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1283; SEQ ID NO: 1285; SEQ ID NO: 1287; y SEQ ID NO: 1289, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1281, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1282, y/o una, dos, tres o cuatro de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1303; SEQ ID NO: 1305; SEQ ID NO: 1307; y SEQ ID NO: 1309, que corresponden a las F<r>(regiones constantes) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1301, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1302, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas, o secuencias que sean idénticas a ellas.
[0614] En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, combinaciones de una o más de las FR, CDR, las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas, o secuencias que son idénticas a las mismas.
[0616] En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 1281, o SEQ ID NO: 1282, o polipéptidos que sean idénticos a las mismas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 1301, o SEQ ID NO: 1302, o polipéptidos que sean idénticos a las mismas.
[0618] En una realización adicional de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una, dos o tres de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1284; SEQ ID NO: 1286; y SEQ ID NO: 1288, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1281, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1282, o secuencias idénticas a las mismas.
[0620] En una realización adicional de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una, dos o tres de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1304; SEQ ID NO: 1306; y SEQ ID NO: 1308, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1301, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1302, o secuencias idénticas a las mismas.
[0622] En una realización adicional de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una, dos, tres o cuatro de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1283; SEQ ID NO: 1285; SEQ ID NO: 1287; y SEQ ID NO: 1289, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1281, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1282, o secuencias idénticas a las mismas.
[0624] En una realización adicional de la invención, los anticuerpos en cuestión que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una, dos, tres o cuatro de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1303; SEQ ID NO: 1305; SEQ ID NO: 1307; y SEQ ID NO: 1309, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1301, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1302, o secuencias idénticas a las mismas.
[0626] La invención también contempla anticuerpos anti-PACAP que incluyen uno o más de los anticuerpos descritos en este documento. En una realización de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes anticuerpos: la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1282; la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1302; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 1284; SEQ ID NO: 1286; y SEQ ID NO: 1288) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1282; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ<i>D NO: 1304; SEQ ID NO: 1306; y SEQ ID<n>O: 1308) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1302, o secuencias idénticas a las mismas. En otra realización de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes anticuerpos: la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1282; la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1302; las regiones marco (SEQ ID NO: 1283; SEQ ID NO: 1285; SEQ ID NO: 1287; y SEQ ID NO: 1289) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1282; y las regiones marco (SEQ ID NO: 1303; SEQ ID NO: 1305; SEQ ID NO: 1307; y SEQ ID NO: 1309) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1302, o secuencias idénticas a las mismas.
[0628] En otra realización de la invención, el anticuerpo anti-PACAP es Ab10.H2, que comprende, o alternativamente consiste en, SEQ ID NO: 1281 y SEQ ID NO: 1301, o SEQ ID NO: 1282 y SEQ ID NO: 1302, o un anticuerpo que comprende las CDR de Ab10.H2 y que tiene al menos una de las actividades biológicas aquí descritas, o es un anticuerpo anti-PACAP que compite con Ab10.H2 en la unión a PACAP, preferiblemente aquel que contiene secuencias que son idénticas a las de Ab10.H2, o un anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopos o epítopo o epítopos solapantes en PACAP que Ab10.H2.
[0629] En una realización adicional, la invención se refiere además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP, incluidas las cadenas pesadas y/o ligeras de Ab10.H2, así como variantes y combinaciones de una o más de las FR, CDR, las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas, o secuencias que son idénticas a las mismas.
[0631] Anticuerpo Ab10.H3
[0633] En una realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1321 que consiste en la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 1322 ligada a la región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 1330.
[0635] En una realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que contienen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se expone a continuación:
[0637] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDLNSYYMTWVRQAPGKGLEWIGFIDAG
[0638] GD AY YAS WAKGRFT1SRDN SKN TV YLQMN SLRAEDTA V YFCARDLDLWGQGTL VT VS
[0639] S (SEQ ID NO: 1322).
[0641] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que se unen al mismo epítopo que Ab10.H3, y que contienen una secuencia de cadena pesada constante que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 1244, 1245 o 1246, o que comprende la secuencia que se expone a continuación:
[0643] ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
[0644] VLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 1330).
[0646] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que contienen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1341 que consiste en la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1342 ligada a la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 1350.
[0647] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que contienen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se expone a continuación:
[0649] DTQLTQ SPSTLS A S VGDR VTITCQS SES VYGN YLA WFQQKPGK APKFLI YE A SKLE
[0650] S GVPSRF SGSGS GTEFTLTIS SLQPDDFATYYCAGGDISEGVAFGGGTKVEIKR (SEQ ID
[0651] NO: 1342)
[0653] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP, que se unen al mismo epítopo que Ab10.H3, y que contienen una secuencia de cadena ligera constante que comprende la secuencia que se expone a continuación:
[0654] TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID
[0655] NO: 1350).
[0657] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que contienen una, dos o tres de las secuencias polipeptídicas de<s>E<q>ID NO: 1324; SEQ ID NO: 1326; y SEQ ID NO: 1328, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1321, o que contienen la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1322, y/o que además contienen una, dos o tres de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1344; SEQ ID NO: 1346; y SEQ ID NO: 1348, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1341, o que contienen la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1342, o anticuerpos que contengan combinaciones de secuencias idénticas a las mismas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, combinaciones de una o más de las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable ejemplificadas, o las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, o secuencias que son idénticas a las mismas.
[0659] La invención contempla además anticuerpos anti-PACAP que comprenden una, dos, tres o cuatro de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1323; SEQ ID NO: 1325; SEQ ID NO: 1327; y SEQ ID NO: 1329, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1321, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1322, y/o una, dos, tres o cuatro de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1343; SEQ ID NO: 1345; SEQ ID NO: 1347; y SEQ ID NO: 1349, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1341, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1342, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas, o secuencias que sean idénticas a ellas.
[0661] En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, combinaciones de una o más de las FR, CDR, las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas, o secuencias que son idénticas a las mismas.
[0663] En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 1321, o SEQ ID NO: 1322, o polipéptidos que sean idénticos a las mismas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 1341, o SEQ ID NO: 1342, o polipéptidos que sean idénticos a las mismas.
[0665] En una realización adicional de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una, dos o tres de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1324; SEQ ID NO: 1326; y SEQ ID NO: 1328, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1321, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1322, o secuencias idénticas a las mismas.
[0667] En una realización adicional de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una, dos o tres de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1344; SEQ ID NO: 1346; y SEQ ID NO: 1348, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1341, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1342, o secuencias idénticas a las mismas.
[0669] En una realización adicional de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una, dos, tres o cuatro de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1323; SEQ ID NO: 1325; SEQ ID NO: 1327; y SEQ ID NO: 1329, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1321, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1322, o secuencias idénticas a las mismas.
[0671] En una realización adicional de la invención, los anticuerpos en cuestión que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una, dos, tres o cuatro de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1343; SEQ ID NO: 1345; SEQ ID NO: 1347; y SEQ ID NO: 1349, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1341, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1342, o secuencias idénticas a las mismas.
[0673] La invención también contempla anticuerpos anti-PACAP que incluyen uno o más de los anticuerpos descritos en este documento. En una realización de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes anticuerpos: la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1322; la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1342; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 1324; SEQ ID NO: 1326; y SEQ ID NO: 1328) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1322; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ iD NO: 1344; SEQ ID NO: 1346; y SEQ ID n O: 1348) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1342, o secuencias idénticas a las mismas. En otra realización de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes anticuerpos: la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1322; la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1342; las regiones marco (SEQ ID NO: 1323; SEQ ID NO: 1325; SEQ ID NO: 1327; y SEQ ID NO: 1329) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1322; y las regiones marco (SEQ ID NO: 1343; SEQ ID NO: 1345; SEQ ID NO: 1347; y SEQ ID NO: 1349) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1342, o secuencias idénticas a las mismas.
[0675] En otra realización de la invención, el anticuerpo anti-PACAP es Ab10.H3, que comprende, o alternativamente consiste en, SEQ ID NO: 1321 y SEQ ID NO: 1341, o SEQ ID NO: 1322 y SEQ ID NO: 1342, o un anticuerpo que comprende las CDR de Ab10.H3 y que tiene al menos una de las actividades biológicas aquí descritas, o es un anticuerpo anti-PACAP que compite con Ab10.H3 en la unión a PACAP, preferiblemente aquel que contiene secuencias que son idénticas a las de Ab10.H3, o un anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopos o epítopo o epítopos solapantes en PACAP que Ab10.H3.
[0677] En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP tales como Ab10.H3 se pueden producir a través de la expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levadura haploide o diploide, tal como Pichia haploide o diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Pichia pastoris.
[0679] En una realización adicional, la invención se refiere además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP, incluidas las cadenas pesadas y/o ligeras de Ab10.H3, así como variantes y combinaciones de una o más de las FR, CDR, las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas, o secuencias que son idénticas a las mismas.
[0681] Anticuerpo Ab10.H5
[0683] En una realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1401 que consiste en la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 1402 ligada a la región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 1410.
[0685] En una realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que contienen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se expone a continuación:
[0688] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDLNSYYMTWVRQAPGKGLEWIGFIDAG
[0690] GD AY Y AS WAKGRFT1SRDN SKNT V YLQMN SLRAEDTA V YFC ARDLDL WGQGTL VTV S
[0692] S (SEQ ID NO: 1402)
[0694] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que se unen al mismo epítopo que Ab10.H5, y que contienen una secuencia de cadena pesada constante que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 1244, 1245 o 1246, o que comprende la secuencia que se expone a continuación:
[0696] ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
[0697] VLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP
[0698] ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
[0699] REEQ Y A STYRWS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALP APIEKTISK AKGQPREPQVY
[0700] TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
[0701] LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 1410)
[0703] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que contienen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1421 que consiste en la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1422 ligada a la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 1430.
[0704] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que contienen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se expone a continuación:
[0706] QLTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSESVYGNYLAWFQQKPGKAPKFLIYEASKLES
[0707] GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCAGGDISEGVAFGGGTKVE1KR (SEQ ID
[0709] NO: 1422)
[0711] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP, que se unen al mismo epítopo que Ab10.H5, y que contienen una secuencia de cadena ligera constante que comprende la secuencia que se expone a continuación:
[0712] TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES
[0713] VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID
[0715] NO: 1430).
[0717] En otra realización, la invención incluye anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP que contienen una, dos o tres de las secuencias polipeptídicas de<s>E<q>ID NO: 1404; SEQ ID NO: 1406; y SEQ ID NO: 1408, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1401, o que contienen la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1402, y/o que además contienen una, dos o tres de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1424; SEQ ID NO: 1426; y SEQ ID NO: 1428, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1421, o que contienen la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1422, o anticuerpos que contengan combinaciones de secuencias idénticas a las mismas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, combinaciones de una o más de las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable ejemplificadas, o las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, o secuencias que son idénticas a las mismas.
[0719] La invención contempla además anticuerpos anti-PACAP que comprenden una, dos, tres o cuatro de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1403; SEQ ID NO: 1405; SEQ ID NO: 1407; y SEQ ID NO: 1409, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1401, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1402, y/o una, dos, tres o cuatro de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1423; SEQ ID NO: 1425; SEQ ID NO: 1427; y SEQ ID NO: 1429, que corresponden a las Fr (regiones constantes) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1421, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1422, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas, o secuencias que sean idénticas a ellas.
[0721] En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, combinaciones de una o más de las FR, CDR, las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas, o secuencias que son idénticas a las mismas.
[0723] En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 1401, o SEQ ID NO: 1402, o polipéptidos que sean idénticos a las mismas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 1421, o SEQ ID NO: 1422, o polipéptidos que sean idénticos a las mismas.
[0725] En una realización adicional de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una, dos o tres de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1404; SEQ ID NO: 1406; y SEQ ID NO: 1408, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1401, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1402, o secuencias idénticas a las mismas.
[0727] En una realización adicional de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una, dos o tres de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1424; SEQ ID NO: 1426; y SEQ ID NO: 1428, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1421, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1422, o secuencias idénticas a las mismas.
[0729] En una realización adicional de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una, dos, tres o cuatro de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1403; SEQ ID NO: 1405; SEQ ID NO: 1407; y SEQ ID NO: 1409, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1401, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1402, o secuencias idénticas a las mismas.
[0731] En una realización adicional de la invención, los anticuerpos en cuestión que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una, dos, tres o cuatro de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 1423; SEQ ID NO: 1425; SEQ ID NO: 1427; y SEQ ID NO: 1429, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1421, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1422, o secuencias idénticas a las mismas.
[0733] La invención también contempla anticuerpos anti-PACAP que incluyen uno o más de los anticuerpos descritos en este documento. En una realización de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes anticuerpos: la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1402; la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1422; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO: 1404; SEQ ID NO: 1406; y SEQ ID NO: 1408) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1402; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ<i>D NO: 1424; SEQ ID NO: 1426; y SEQ ID<n>O: 1428) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1422, o secuencias idénticas a las mismas. En otra realización de la invención, los anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes anticuerpos: la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1402; la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1422; las regiones marco (SEQ ID NO: 1403; SEQ ID NO: 1405; SEQ ID NO: 1407; y SEQ ID NO: 1409) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1402; y las regiones marco (SEQ ID NO: 1423; SEQ ID NO: 1425; SEQ ID NO: 1427; y SEQ ID NO: 1429) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1422, o secuencias idénticas a las mismas.
[0735] En otra realización de la invención, el anticuerpo anti-PACAP es Ab10.H5, que comprende, o alternativamente consiste en, SEQ ID NO: 1401 y SEQ ID NO: 1421, o SEQ ID NO: 1402 y SEQ ID NO: 1422, o un anticuerpo que comprende las CDR de Ab10.H5 y que tiene al menos una de las actividades biológicas aquí descritas, o es un anticuerpo anti-PACAP que compite con Ab10.H5 en la unión a PACAP, preferiblemente aquel que contiene secuencias que son idénticas a las de Ab10.H5, o un anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopos o epítopo o epítopos solapantes en PACAP que Ab10.H5.
[0737] En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP tales como Ab10.H5 se pueden producir a través de la expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levadura haploide o diploide, tal como Pichia haploide o diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Pichia pastoris.
[0739] En una realización adicional, la invención se refiere además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP, incluidas las cadenas pesadas y/o ligeras de Ab10.H5, así como variantes y combinaciones de una o más de las FR, CDR, las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas, o secuencias que son idénticas a las mismas.
[0741] En una realización de la invención, los anticuerpos quiméricos o humanizados o los polipéptidos V<h>o V<l>se originan o derivan de uno o más anticuerpos de conejo, por ejemplo un anticuerpo de conejo aislado de una población de células B de conejo clonal.
[0743] En algunos aspectos, la invención proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-PACAP o como se describe en este documento. En algunas realizaciones, la invención proporciona una célula hospedadora que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-PACAP o como se describe en este documento.
[0745] En algunos aspectos, la invención proporciona un anticuerpo aislado que compite por la unión a PACAP con un anticuerpo descrito en este documento.
[0747] En algunos aspectos, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo como se describe en este documento.
[0749] En algunos aspectos, la invención proporciona una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende al menos un anticuerpo como se describe en este documento.
[0751] En algunos aspectos, la invención proporciona un método para tratar o prevenir una afección asociada con niveles elevados de PACAP en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo aislado como se describe en este documento.
[0753] En algunos aspectos, la invención proporciona un método para inhibir la unión de PACAP a PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo como se describe en este documento.
[0755] En algunos aspectos, la invención proporciona un anticuerpo que se une selectivamente a PACAP, en la que el anticuerpo se une a PACAP con una K<d>menor o igual a 5x10-5 M, 10-5 M, 5x10-6 M, 10-6 M, 5x10-7 M, 10-7 M, 5x10-8 M, 10-8 M, 5x10-9 M, 10-9 M, 5x10<-10>M, 10-10 M, 5X10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 M, 10-12 M, 5x10‘13 M, o 10-13 M; preferiblemente, con una Kd menor o igual a 5x10<-10>M, 10-10 M, 5x10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 M, o 10-12 M; más preferiblemente, con una K<d>que es menor que alrededor de 100 pM, menor que alrededor de 50 pM, menor que alrededor de 40 pM, menor que alrededor de 25 pM, menor que alrededor de 1 pM, entre alrededor de 10 pM y alrededor de 100 pM, entre alrededor de 1 pM y alrededor de 100 pM, o entre alrededor de 1 pM y alrededor de 10 pM. Preferiblemente, el anticuerpo anti-PACAP no tiene reactividad cruzada o tiene una reactividad cruzada mínima con VIP.
[0756] Los anticuerpos inventivos pueden modificarse postraduccionalmente para añadir restos efectores tales como enlazadores químicos, restos detectables tales como, por ejemplo, colorantes fluorescentes, enzimas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, y restos quimioluminiscentes, o restos funcionales tales como, por ejemplo, estreptavidina, avidina, biotina, una citotoxina, un agente citotóxico, y materiales radiactivos.
[0758] Los anticuerpos también pueden modificarse químicamente para proporcionar ventajas adicionales, tales como mayor solubilidad, estabilidad y tiempo de circulación (vida mediain vivo)del polipéptido, o menor inmunogenicidad (véase la patente de EE. UU. n.° 4.179.337). Los rstos químicos para la derivatización pueden seleccionarse de polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, y similares. Los anticuerpos pueden modificarse en posiciones aleatorias dentro de la molécula o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula, y pueden incluir una, dos, tres o más restos químicos unidos.
[0760] El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede estar ramificado o no ramificado. Para el polietilenglicol, el peso molecular preferido está entre alrededor de 1 kDa y alrededor de 100 kDa (el término "alrededor de" indica que en preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, otras menos, que el peso molecular indicado) para facilitar su manipulación y fabricación. Se pueden utilizar otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos, si los hay, sobre la actividad biológica, la facilidad de manipulación, el grado o falta de antigenicidad, y otros efectos conocidos del polietilenglicol sobre una proteína terapéutica o análogo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular promedio de alrededor de 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10.000, 10.500, 11.000, 11.500, 12.000, 12.500, 13.000, 13.500, 14.000, 14.500, 15.000, 15.500, 16.000, 16.500, 17.000, 17.500, 18.000, 18.500, 19.000, 19.500, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000, o 100.000 kDa. Los polietilenglicoles ramificados se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 5.643.575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides and Nucleotides, 18:2745-2750 (1999); y Caliceti et al., Bioconjug. Chem., 10:638-646 (1999).
[0762] Hay varios métodos de unión disponibles para los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, el documento EP 0 401 384, que divulga un método de acoplamiento de PEG a G-CSF; y Malik et al., Exp. Hematol., 20:1028-1035 (1992) (informa sobre la pegilación de GM-CSF usando cloruro de tresilo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede unirse covalentemente a través de residuos de aminoácidos mediante un grupo reactivo, tal como un grupo amino o carboxilo libre. Los grupos reactivos son aquellos a los que puede unirse una molécula de polietilenglicol activada. Los residuos de aminoácidos que tienen un grupo amino libre pueden incluir residuos de lisina y los residuos de aminoácidos N-terminales; aquellos que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir residuos de ácido aspártico, residuos de ácido glutámico y el residuo de aminoácido C-terminal. Los grupos sulfhidrilo también pueden usarse como grupo reactivo para unir las moléculas de polietilenglicol. Para fines terapéuticos se prefiere la unión en un grupo amino, tal como la unión en el extremo N o en el grupo lisina.
[0764] Como se sugirió anteriormente, el polietilenglicol puede unirse a las proteínas a través de la unión a cualquiera de varios residuos de aminoácidos. Por ejemplo, el polietilenglicol se puede unir a polipéptidos a través de enlaces covalentes a residuos de lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, o cisteína. Se pueden emplear una o más químicas de reacción para unir polietilenglicol a residuos de aminoácidos específicos (por ejemplo, lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico o cisteína) o a más de un tipo de residuo de aminoácido (por ejemplo, lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína y combinaciones de los mismos).
[0766] Como alternativa, los anticuerpos pueden tener vidas mediasin vivoaumentadas a través de la fusión con albúmina (incluyendo, pero no limitado a, seroalbúmina humana recombinante o variantes de la misma (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.876.969, el dcoumento EP 0413622, y la patente de EE. UU. n.° 5.766.883)), u otras proteínas sanguíneas circulantes tal como transferrina o ferritina. En una realización preferida, los polipéptidos y/o anticuerpos de la presente invención (incluyendo o variantes de los mismos) se fusionan con la forma madura de la seroalbúmina humana (es decir, los aminoácidos 1-585 de la seroalbúmina humana como se muestra en las FIGS. 1 y 2 del documento EP 0322 094). Los polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de la invención también están abarcados por la invención.
[0768] Respecto a las restos detectables, otras enzimas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, peroxidasa de rábano picante, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, y luciferasa. Otros materiales fluorescentes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, rodamina, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, umbeliferona, diclorotriazinilamina, ficoeritrina, y cloruro de dansilo. Otros restos quimioluminiscentes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, luminol. Otros materiales bioluminiscentes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, luciferina y aequorina. Otros materiales radiactivos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, yodo 125 (125I), carbono 14 (14C), azufre 35 (35S), tritio (3H) y fósforo 32 (32P).
[0770] En la técnica se conocen métodos para conjugar un anticuerpo con un resto detectable y similares, tales como por ejemplo los métodos descritos por Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); y Nygren, J., Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982).
[0771] Las realizaciones descritas en este documento incluyen además variantes y equivalentes que son sustancialmente homólogos a los anticuerpos, anticuerpos, diacuerpos, SMIP, cuerpos de camélidos, nanocuerpos, IgNAR, polipéptidos, regiones variables, y las CDR expuestos en este documento. Estos pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustitución conservativa (es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos similares). Por ejemplo, la sustitución conservativa se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro dentro de la misma clase general, por ejemplo un aminoácido ácido por otro aminoácido ácido, un aminoácido básico por otro aminoácido básico, o un aminoácido neutro por otro aminoácido neutro. Lo que se pretende con una sustitución conservativa de aminoácidos es bien conocido en la técnica.
[0773] Los métodos para determinar la homología entre secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos son bien conocidos por aquellos con conocimientos normales en la técnica.
[0775] En otra realización, la invención contempla además los homólogos polipeptídicos citados anteriormente de las uniones al antígeno, regiones variables y CDR aquí expuestas que tienen además actividad anti-PACAP En este documento se exponen ejemplos no limitativos de actividad anti-PACAP, por ejemplo la capacidad de inhibir la unión de PACAP a PAC1-R, VPAC1-R y/o VPAC2-R, lo que da como resultado una producción reducida de AMPc.
[0776] En otra realización, la invención contempla además la generación y el uso de anticuerpos que se unen a cualquiera de las secuencias anteriores, incluidos, pero sin limitarse a, anticuerpos antiidiotípicos. En una realización ejemplar, dicho anticuerpo antiidiotípico podría administrarse a un sujeto que ha recibido un anticuerpo anti-PACAP para modular, reducir o neutralizar el efecto del anticuerpo anti-PACAP Estos anticuerpos también podrían ser útiles para el tratamiento de una enfermedad autoinmune caracterizada por la presencia de anticuerpos anti-PACAP Otro uso ejemplar de dichos anticuerpos, por ejemplo anticuerpos antiidiotípicos, es para la detección de los anticuerpos anti-PACAP de la presente invención, por ejemplo para monitorizar los niveles de los anticuerpos anti-PACAP presentes en la sangre u otros fluidos corporales de un sujeto. Por ejemplo, en una realización, la invención proporciona un método para utilizar el anticuerpo antiidiotípico para monitorizar los nivelesin vivode dicho anticuerpo anti-PACAP en un sujeto, o para neutralizar dicho anticuerpo anti-PACAP en un sujeto al que se le administra dicho anticuerpo anti-PACAP del mismo.
[0778] La presente invención también contempla anticuerpos anti-PACAP que comprenden cualquiera de las secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas descritas en este documento sustituidas por cualquiera de las otras secuencias polinucleotídicas descritas en este documento. Por ejemplo, sin limitación a ello, la presente invención contempla anticuerpos que comprenden la combinación de cualquiera de las secuencias de cadena ligera variable y cadena pesada variable descritas en este documento, y contempla además anticuerpos resultantes de la sustitución de cualquiera de las secuencias de CDR descritas en este documento por cualquiera de las otras secuencias de CDR descritas en este documento.
[0780] Polinucleótidos ejemplares que codifican polipéptidos de anticuerpos anti-PACAP
[0782] La invención se refiere además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP
[0784] Anticuerpo Ab10.H
[0786] En una realización, la invención se refiere además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia polinucleotídica de s Eq ID NO: 971 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 961 y que consiste en la secuencia codificante de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 972 y la secuencia codificante de la región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 980.
[0788] En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 962:
[0790] gaggtgcagcttgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggaatcgac
[0791] ctcaatagctactacatgacctgggtccgtcaggctccagggaaggggctggagtggatcggattcattgatgctggtggtgacgcatacta
[0792] cgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacaccgtgtatcttcaaatgaacagcctgagagctgagga
[0793] cactgctgtgtatttctgtgctagagatcttgacttgtggggccaagggaccctcgtcaccgtctcgagc (SEQ ID NO: 972).
[0795] E n o tra re a liz a c ió n d e la in v e n c ió n , lo s p o lin u c le ó t id o s d e la in v e n c ió n c o m p re n d e n , o a l te rn a t iv a m e n te c o n s is te n en , la s ig u ie n te s e c u e n c ia p o lin u c le o tíd ic a q u e c o d if ic a la s e c u e n c ia p o lip e p tíd ic a d e c a d e n a p e s a d a c o n s ta n te de S E Q ID N O : 970 :
[0796] gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcct ggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctaca gtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaag cccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctg gggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacg tgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagca gtacgccagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaa caaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcc cgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaa tgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaa gagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtct ccgggtaaa (SEQ ID NO: 980)
[0798] En otra realización de la invención, los polinucleótidos comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 991 que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO: 981 y que consiste en la secuencia codificante de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 992 y la secuencia codificante de la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 1000.
[0799] En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 982:
[0800] gacgcccagctgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcagtccagtgagagtgt ttacggtaactacttagcctggtttcagcagaaaccaggaaaagcccctaagttcctgatctatgaagcatccaaactggaatctggagtccc atcaaggttcagcggcagtggatctggaacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttactactgtgcagg cggtgatattagtgaaggtgttgctttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 992).
[0802] En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera constante de SEQ ID NO: 990:
[0803] acggtagcggccccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaata acttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggac agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtca cccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 1000).
[0805] En una realización adicional de la invención, los polinucleótidos que codifican la unión a antígeno con especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 974; SEQ ID NO: 976; y SEQ ID NO: 978, que corresponden a polinucleótidos que codifican las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 961, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 962, y/o una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 994; SEQ ID NO: 996; y SEQ ID NO: 998, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 981, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 982, o combinaciones de estas secuencias polinucleotídicas. En otra realización de la invención, los polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, combinaciones de polinucleótidos que codifican una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
[0806] En una realización adicional de la invención, los polinucleótidos que codifican la unión a antígeno con especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 973; SEQ ID NO: 975; SEQ ID NO: 977; y SEQ ID NO: 979, que corresponden a polinucleótidos que codifican las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 961, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 962, y/o una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 993; SEQ ID NO: 995; SEQ ID NO: 997; y SEQ ID NO: 999, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 981, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 982, o combinaciones de estas secuencias polinucleotídicas. En otra realización de la invención, los polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, combinaciones de una o más de las FR, las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
[0808] La invención también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican la unión al antígeno descritas en este documento. En una realización de la invención, los polinucleótidos que codifican la unión al antígeno que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican uniones al antígeno: el polinucleótido SEQ ID NO: 971 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 961; el polinucleótido SEQ ID NO: 972 que codifica la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 962; el polinucleótido SEQ ID NO: 991 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 981; el polinucleótido SEQ ID NO: 992 que codifica la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 982; polinucleótidos que codifican las CDR (SEQ ID NO: 974; SEQ ID NO: 976; y SEQ ID NO: 978) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 961, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 962; polinucleótidos que codifican las CDR (SEQ ID NO: 994; SEQ ID NO: 996; y SEQ ID NO: 998) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 981, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 982; polinucleótidos que codifican las FR (SEQ ID NO: 973; SEQ ID NO: 975; SEQ ID NO: 977; y SEQ ID NO: 979) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 961, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 962; y polinucleótidos que codifican las FR (SEQ ID NO: 993; SEQ ID NO: 995; SEQ ID NO: 997; y SEQ ID NO: 999) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 981, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 982.
[0810] En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, polinucleótidos que codifican Fab que tienen especificidad de unión para PACAP. Con respecto al anticuerpo Ab10.H, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab10.H de longitud completa comprenden, o alternativamente consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 971 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 961, y el polinucleótido SEQ ID NO: 991 que codifica la secuencia de cadena ligera de s Eq ID NO: 981.
[0812] Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamíferos tales como células CHO, NSO o<h>EK-293, o en sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Pichia pastoris. En una realización de la invención descrita en este documento, Fab se puede producir mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab10.H después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedante adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP, tales como Ab10.H o Fab, se pueden producir a través de la expresión de polinucleótidos Ab10.H en células de mamíferos tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo, levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Pichia pastoris.
[0814] Anticuerpo Ab10.H2
[0816] En una realización, la invención se refiere además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión para PACAP En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 1291 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1281 y que consiste en la secuencia codificante de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 1292 y la secuencia codificante de la región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 1300.
[0818] En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1282:
[0820] gaggtgcagcttgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggaatcgac
[0821] ctcaatagctactacatgacctgggtccgtcaggctccagggaaggggctggagtggatcggattcattgatgctggtggtgacgcatacta
[0822] cgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacaccgtgtatcttcaaatgaacagcctgagagctgagga
[0823] cactgctgtgtatttctgtgctagagatcttgacttgtggggccaagggaccctcgtcaccgtctcgagc (SEQ ID NO: 1292).
[0825] E n o tra re a liz a c ió n d e la in v e n c ió n , lo s p o lin u c le ó t id o s d e la in v e n c ió n c o m p re n d e n , o a lte rn a t iv a m e n te c o n s is te n e n , la s ig u ie n te s e c u e n c ia p o lin u c le o tíd ic a q u e c o d if ic a la s e c u e n c ia p o lip e p tíd ic a d e c a d e n a p e s a d a c o n s ta n te de S E Q ID N O : 1290 :
[0826] gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcct ggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctaca gtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaag cccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctg gggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacg tgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagca gtacgccagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaa caaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcc cgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaa tgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaa gagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtct ccgggtaaa (SEQ ID NO: 1300).
[0828] En otra realización de la invención, los polinucleótidos comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 1311 que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO: 1301 y que consiste en la secuencia codificante de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1312 y la secuencia codificante de la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 1320.
[0830] En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1302:
[0831] gccgtgctgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcagtccagtgagagtgtttac ggtaactacttagcctggtttcagcagaaaccaggaaaagcccctaagttcctgatctatgaagcatccaaactggaatctggagtcccatca aggttcagcggcagtggatctggaacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttactactgtgcaggcggt gatattagtgaaggtgttgctttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 1312).
[0833] En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera constante de SEQ ID NO: 1310:
[0834] acggtagcggccccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaata acttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggac agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtca cccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 1320).
[0836] En una realización adicional de la invención, los polinucleótidos que codifican la unión a antígeno con especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1294; Se Q ID NO: 1296; y SEQ ID NO: 1298, que corresponden a polinucleótidos que codifican las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1281, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1282, y/o una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1314; SEQ ID NO: 1316; y SEQ ID NO: 1318, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1301, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1302, o combinaciones de estas secuencias polinucleotídicas. En otra realización de la invención, los polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, combinaciones de polinucleótidos que codifican una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
[0837] En una realización adicional de la invención, los polinucleótidos que codifican la unión a antígeno con especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1293; SEQ ID NO: 1295; SEQ ID NO: 1297; y SEQ ID NO: 1299, que corresponden a polinucleótidos que codifican las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1281, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1282, y/o una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1313; SEQ ID NO: 1315; SEQ ID NO: 1317; y SEQ ID NO: 1319, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1301, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1302, o combinaciones de estas secuencias polinucleotídicas. En otra realización de la invención, los polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, combinaciones de una o más de las FR, las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
[0838] La invención también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican la unión al antígeno descritas en este documento. En una realización de la invención, los polinucleótidos que codifican la unión al antígeno que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican uniones al antígeno: el polinucleótido SEQ ID NO: 1291 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1281; el polinucleótido SEQ ID NO: 1292 que codifica la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1282; el polinucleótido SEQ ID NO: 1311 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1301; el polinucleótido SEQ ID NO: 1312 que codifica la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1302; polinucleótidos que codifican las CDR (SEQ ID NO: 1294; SEQ ID NO: 1296; y SEQ ID NO: 1298) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1281, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1282; polinucleótidos que codifican las CDR (SEQ ID NO: 1314; SEQ ID NO: 1316; y SEQ ID NO: 1318) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1301, o la secuencia de cadena ligera variable de Se Q ID NO: 1302; polinucleótidos que codifican las FR (SEQ ID NO: 1293; SEQ ID NO: 1295; SEQ ID NO: 1297; y SEQ ID NO: 1299) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1281, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1282; y polinucleótidos que codifican las FR (SEQ ID NO: 1313; SEQ ID NO: 1315; SEQ ID NO: 1317; y SEQ ID NO: 1319) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1301, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1302.
[0840] En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, polinucleótidos que codifican Fab que tienen especificidad de unión para PACAP. Con respecto al anticuerpo Ab10.H2, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab10.H2 de longitud completa comprenden, o alternativamente consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 1291 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1281, y el polinucleótido SEQ ID NO: 1311 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1301.
[0842] Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamíferos tales como células CHO, NSO o<h>EK-293, o en sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Pichia pastoris. En una realización de la invención descrita en este documento, los Fab se pueden producir mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab10.H2 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedante adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP, tales como Ab10.H2 o Fab, se pueden producir a través de la expresión de polinucleótidos Ab10.H2 en células de mamíferos tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo, levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Pichia pastoris.
[0844] Anticuerpo Ab10.H3
[0846] En una realización, la invención se refiere además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerposs que tienen especificidad de unión para PACAP En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 1331 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1321 y que consiste en la secuencia codificante de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 1332 y la secuencia codificante de la región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 1340.
[0848] En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1322:
[0850] gaggtgcagcttgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggaatcgac
[0851] ctcaatagctactacatgacctgggtccgtcaggctccagggaaggggctggagtggatcggattcattgatgctggtggtgacgcatacta
[0852] cgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacaccgtgtatcttcaaatgaacagcctgagagctgagga
[0853] cactgctgtglatttctgtgctagagatcttgacttgtggggccaagggaccctcgtcaccgtctcgagc (SEQ ID NO: 1332),
[0855] E n o tra re a liz a c ió n d e la in v e n c ió n , lo s p o lin u c le ó t id o s d e la in v e n c ió n c o m p re n d e n , o a l te rn a t iv a m e n te c o n s is te n en , la s ig u ie n te s e c u e n c ia p o lin u c le o tíd ic a q u e c o d if ic a la s e c u e n c ia p o lip e p tíd ic a d e c a d e n a p e s a d a c o n s ta n te de S E Q ID N O : 1330 :
[0856] gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcct
[0857] ggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctaca
[0858] gtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaag
[0859] cccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctg
[0860] gggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacg
[0861] tgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagca
[0862] gtacgccagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaa
[0863] caaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcc
[0864] cgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaa
[0865] tgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaa
[0866] gagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtct
[0867] ccgggtaaa (SEQ ID NO: 1340).
[0869] En otra realización de la invención, los polinucleótidos comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 1351 que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO: 1341 y que consiste en la secuencia codificante de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1352 y la secuencia codificante de la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 1360.
[0871] En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1342:
[0873] gacatccagctgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcagtccagtgagagtgt
[0874] ttacggtaactacttagcctggtttcagcagaaaccaggaaaagcccctaagttcctgatctatgaagcatccaaactggaatctggagtccc
[0875] atcaaggttcagcggcagtggatctggaacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttactactgtgcagg
[0876] cggtgatattagtgaaggtgttgctttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 1352).
[0878] En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera constante de SEQ ID NO: 1350:
[0880] acggtagcggccccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaata
[0881] acttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggac
[0882] agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtca
[0883] cccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 1360).
[0885] En una realización adicional de la invención, los polinucleótidos que codifican la unión a antígeno con especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1334; Se Q ID NO: 1336; y SEQ ID NO: 1338, que corresponden a polinucleótidos que codifican las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1321, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1322, y/o una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1354; SEQ ID NO: 1356; y SEQ ID NO: 1358, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1341, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1342, o combinaciones de estas secuencias polinucleotídicas. En otra realización de la invención, los polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, combinaciones de polinucleótidos que codifican una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
[0886] En una realización adicional de la invención, los polinucleótidos que codifican la unión a antígeno con especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1333; SEQ ID NO: 1335; SEQ ID NO: 1337; y SEQ ID NO: 1339, que corresponden a polinucleótidos que codifican las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1321, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1322, y/o una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1353; SEQ ID NO: 1355; SEQ ID NO: 1357; y SEQ ID NO: 1359, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1341, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1342, o combinaciones de estas secuencias polinucleotídicas. En otra realización de la invención, los polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, combinaciones de una o más de las FR, las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
[0887] La invención también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican la unión al antígeno descritas en este documento. En una realización de la invención, los polinucleótidos que codifican la unión al antígeno que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican uniones al antígeno: el polinucleótido SEQ ID NO: 1331 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1321; el polinucleótido SEQ ID NO: 1332 que codifica la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1322; el polinucleótido SEQ ID NO: 1351 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1341; el polinucleótido SEQ ID NO: 1352 que codifica la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1342; polinucleótidos que codifican las CDR (SEQ ID NO: 1334; SEQ ID NO: 1336; y SEQ ID NO: 1338) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1321, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1322; polinucleótidos que codifican las CDR (SEQ ID NO: 1354; SEQ ID NO: 1356; y SEQ ID NO: 1358) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1341, o la secuencia de cadena ligera variable de Se Q ID NO: 1342; polinucleótidos que codifican las FR (SEQ ID NO: 1333; SEQ ID NO: 1335; SEQ ID NO: 1337; y SEQ ID NO: 1339) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1321, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1322; y polinucleótidos que codifican las FR (SEQ ID NO: 1353; SEQ ID NO: 1355; SEQ ID NO: 1357; y SEQ ID NO: 1359) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1341, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1342.
[0889] En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, polinucleótidos que codifican Fab que tienen especificidad de unión para PACAP. Con respecto al anticuerpo Ab10.H3, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab10.H3 de longitud completa comprenden, o alternativamente consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 1331 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1321, y el polinucleótido SEQ ID NO: 1351 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1341.
[0891] Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamíferos tales como células CHO, NSO o<h>EK-293, o en sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Pichia pastoris. En una realización de la invención descrita en este documento, los Fab se pueden producir mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab10.H3 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedante adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP, tales como Ab10.H3 o Fab, se pueden producir a través de la expresión de polinucleótidos Ab10.H3 en células de mamíferos tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo, levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Pichia pastoris.
[0893] Anticuerpo Ab10.H5
[0895] En una realización, la invención se refiere además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerposs que tienen especificidad de unión para PACAP En una realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 1411 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1401 y que consiste en la secuencia codificante de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 1412 y la secuencia codificante de la región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 1420.
[0897] En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1402:
[0899] gaggtgcagcttgtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggaatcgac
[0900] ctcaatagctactacatgacctgggtccgtcaggctccagggaaggggctggagtggatcggattcattgatgctggtggtgacgcatacta
[0901] cgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacaccgtgtatcttcaaatgaacagcctgagagctgagga
[0902] cactgctgtgtatttctgtgctagagatcttgacttgtggggccaagggaccctcgtcaccgtctcgagc (SEQ ID NO: 1412),
[0904] En o tra re a liz a c ió n d e la in v e n c ió n , lo s p o lin u c le ó t id o s d e la in v e n c ió n c o m p re n d e n , o a l te rn a t iv a m e n te c o n s is te n e n , la s ig u ie n te s e c u e n c ia p o lin u c le o tíd ic a q u e c o d if ic a la s e c u e n c ia p o lip e p tíd ic a d e c a d e n a p e s a d a c o n s ta n te de S E Q ID N O : 1410 :
[0905] gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcct ggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctaca gtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaag cccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctg gggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacg tgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagca gtacgccagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaa caaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcc cgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaa tgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaa gagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtct ccgggtaaa (SEQ ID NO: 1420).
[0907] En otra realización de la invención, los polinucleótidos comprenden, o alternativamente consisten en, la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 1431 que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO: 1421 y que consiste en la secuencia codificante de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1432 y la secuencia codificante de la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 1440.
[0908] En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1422:
[0909] cagctgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcagtccagtgagagtgtttacggt aactacttagcctggtttcagcagaaaccaggaaaagcccctaagttcctgatctatgaagcatccaaactggaatctggagtcccatcaag gttcagcggcagtggatctggaacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttactactgtgcaggcggtga tattagtgaaggtgttgctttcggcggaggaaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 1432).
[0911] En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera constante de SEQ ID NO: 1430:
[0912] acggtagcggccccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaata acttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggac agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtca cccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 1440).
[0914] En una realización adicional de la invención, los polinucleótidos que codifican la unión a antígeno con especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1414; S<e>Q ID NO: 1416; y SEQ ID NO: 1418, que corresponden a polinucleótidos que codifican las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1401, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1402, y/o una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1434; SEQ ID NO: 1436; y SEQ ID NO: 1438, que corresponden a las CDR (regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1421, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1422, o combinaciones de estas secuencias polinucleotídicas. En otra realización de la invención, los polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, combinaciones de polinucleótidos que codifican una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas. En una realización adicional de la invención, los polinucleótidos que codifican la unión a antígeno con especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1413; SEQ ID NO: 1415; SEQ ID NO: 1417; y SEQ ID NO: 1419, que corresponden a polinucleótidos que codifican las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1401, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1402, y/o una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1433; SEQ ID NO: 1435; SEQ ID NO: 1437; y SEQ ID NO: 1439, que corresponden a las FR (regiones constantes) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1421, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1422, o combinaciones de estas secuencias polinucleotídicas. En otra realización de la invención, los polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, combinaciones de una o más de las FR, las secuencias de cadena pesada variable y cadena ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y cadena ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
[0915] La invención también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican la unión al antígeno descritas en este documento. En una realización de la invención, los polinucleótidos que codifican la unión al antígeno que tienen especificidad de unión para PACAP comprenden, o alternativamente consisten en, uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican uniones al antígeno: el polinucleótido SEQ ID NO: 1411 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1401; el polinucleótido SEQ ID NO: 1412 que codifica la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1402; el polinucleótido SEQ ID NO: 1431 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1421; el polinucleótido SEQ ID NO: 1432 que codifica la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1422; polinucleótidos que codifican las CDR (SEQ ID NO: 1414; SEQ ID NO: 1416; y SEQ ID NO: 1418) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1401, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1402; polinucleótidos que codifican las CDR (SEQ ID NO: 1434; SEQ ID NO: 1436; y SEQ ID NO: 1438) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1421, o la secuencia de cadena ligera variable de Se Q ID NO: 1422; polinucleótidos que codifican las FR (SEQ ID NO: 1413; SEQ ID NO: 1415; SEQ ID NO: 1417; y SEQ ID NO: 1419) de la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1401, o la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 1402; y polinucleótidos que codifican las FR (SEQ ID NO: 1433; SEQ ID NO: 1435; SEQ ID NO: 1437; y SEQ ID NO: 1439) de la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1421, o la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 1422.
[0917] En otra realización de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o alternativamente consisten en, polinucleótidos que codifican Fab que tienen especificidad de unión para PACAP. Con respecto al anticuerpo Ab10.H5, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab10.H5 de longitud completa comprenden, o alternativamente consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 1411 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 1401, y el polinucleótido SEQ ID NO: 1431 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 1421.
[0919] Otra realización de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamíferos tales como células CHO, NSO o<h>EK-293, o en sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Pichia pastoris. En una realización de la invención descrita en este documento, los Fab se pueden producir mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab10.H5 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedante adecuado. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP, tales como Ab10.H5 o Fab, se pueden producir a través de la expresión de polinucleótidos Ab10.H5 en células de mamíferos tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo, levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Pichia pastoris.
[0921] Detección y aislamiento de células B
[0923] En una realización, la presente invención contempla la preparación y el aislamiento de una población clonal de células B específicas del antígeno que se pueden utilizar para aislar al menos una célula específica del antígeno PACAP, que se puede utilizar para producir un anticuerpo monoclonal contra PACAP, que es específico para un antígeno PACAP deseado, o una secuencia de ácido nucleico correspondiente a dicho anticuerpo. Los métodos para preparar y aislar dicha población clonal de células B específicas del antígeno se enseñan, por ejemplo, en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2007/0269868 de Carvalho-Jensen et al. En los ejemplos también se enseñan aquí métodos para preparar y aislar dicha población clonal de células B específicas del antígeno. Se conocen en la técnica métodos para "enriquecer" una población de células por tamaño o densidad (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.627.052). Estas etapas se pueden utilizar además de enriquecer la población celular mediante especificidad para el antígeno.
[0925] Métodos de humanización de anticuerpos
[0927] En otra realización, la presente invención contempla métodos para humanizar cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos. Los métodos para humanizar cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos que se pueden aplicar a anticuerpos anti-PACAP se enseñan, por ejemplo, en la publicación de patente de Ee . UU. n.° 2009/0022659 de Olson et al., y en la patente de EE. UU. n.° 7.935.340 de Garcia-Martínez et al.
[0929] Métodos para producir anticuerpos y
[0931] En otra realización, la presente invención contempla métodos para producir anticuerpos anti-PACAP y . Los métodos para producir anticuerpos anti-PACAP y segregados a partir de cepas poliploides, preferiblemente diploides o tetraploides de levaduras competentes para el apareamiento se enseñan, por ejemplo, en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2009/0022659 de Olson et al., y en la patente de EE. Uu . n.° 7.935.340 de Garcia-Martínez et al.
[0933] Los expertos en la técnica conocen bien otros métodos para producir anticuerpos. Por ejemplo, los métodos para producir anticuerpos quiméricos son ahora bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.816.567 de Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:8651-55, 1984; Neuberger et al., Nature, 314:268-270, 1985; y Boulianne et al., Nature, 312:643-46, 1984).
[0935] Asimismo, otros métodos para producir anticuerpos humanizados son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.<u>U. n.° 5.530.101, 5.585.089, 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al; las patentes de EE. UU. n.° 5.225.539 y 6.548.640 de Winter; las patentes de EE. UU. n.° 6.054.297, 6.407.213 y 6.639.055 de Carter et al; la patente de EE. UU. n.° 6.632.927 de Adair; Jones, P.T. et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann, L. et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen, M. et al., Science, 239:1534-36 (1988).
[0937] Los polipéptidos de anticuerpos de la invención que tienen especificidad de unión para PACAP también se pueden producir construyendo, utilizando técnicas convencionales bien conocidas por aquellos con conocimientos normales en la técnica, un vector de expresión que contiene un promotor (opcionalmente como un componente de un operón eucariota o procariota) y una secuencia de ADN que codifica una cadena pesada de anticuerpo, en el que la secuencia de ADN que codifica las CDR requeridas para la especificidad para el anticuerpo deriva de una fuente de células no humanas, preferiblemente una fuente de células B de conejo, mientras que la secuencia de ADN que codifica las partes restantes de la cadena del anticuerpo deriva de una fuente de células humanas.
[0938] Se produce un segundo vector de expresión utilizando los mismos medios convencionales bien conocidos por aquellos con conocimientos normales en la técnica, conteniendo dicho vector de expresión un promotor (opcionalmente como un componente de un operón eucariota o procariota) y una secuencia de ADN que codifica una cadena ligera de anticuerpo, en el que la secuencia de ADN que codifica las CDR requeridas para la especificidad para el anticuerpo deriva de una fuente de células no humanas, preferiblemente una fuente de células B de conejo, mientras que la secuencia de ADN que codifica las partes restantes de la cadena del anticuerpo deriva de una fuente de células humanas.
[0940] Los vectores de expresión se transfectan en una célula hospedadora mediante técnicas convencionales bien conocidas por aquellos con conocimientos normales en la técnica para producir una célula hospedadora transfectada, cultivándose dicha célula hospedadora transfectada mediante técnicas convencionales bien conocidas por aquellos con conocimientos normales en la técnica para producir dichos polipéptidos de anticuerpos.
[0941] La célula hospedadora puede cotransfectarse con los dos vectores de expresión descritos anteriormente, el primer vector de expresión que contiene ADN que codifica un promotor (opcionalmente como un componente de un operón eucariota o procariota) y un polipéptido derivado de una cadena ligera, y el segundo vector que contiene ADN que codifica un promotor (opcionalmente como un componente de un operón eucariota o procariota) y un polipéptido derivado de una cadena pesada. Los dos vectores contienen diferentes marcadores seleccionables, pero preferiblemente logran una expresión sustancialmente igual de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, se puede utilizar un único vector que incluya ADN que codifica los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Las secuencias codificantes para las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc, ADN genómico, o ambos.
[0943] Las células hospedadoras utilizadas para expresar los polipéptidos de anticuerpos pueden ser una célula bacteriana tal comoE. coli,o una célula eucariota tal como Ppastoris.En una realización de la invención, se puede utilizar una célula de mamífero de un tipo bien definido para este propósito, tal como una célula de mieloma, una línea de células CHO, una línea de células NSO, o una línea de células HEK293.
[0945] Los métodos generales mediante los cuales se pueden construir los vectores, los métodos de transfección requeridos para producir la célula hospedadora, y los métodos de cultivo requeridos para producir los polipéptidos de anticuerpos a partir de dichas células hospedadoras incluyen todos técnicas convencionales. Aunque preferiblemente la línea celular utilizada para producir el anticuerpo es una línea celular de mamífero, alternativamente se puede utilizar cualquier otra línea celular adecuada, tal como una línea celular bacteriana tal como una cepa bacteriana derivada de E. coli, o una línea celular de levadura.
[0947] De manera similar, una vez producidos, los polipéptidos de anticuerpos pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar en la técnica, tales como, por ejemplo, filtración de flujo cruzado, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba ("HIC"), y similares.
[0948] Los polipéptidos de anticuerpos descritos en este documento también pueden usarse para el diseño y síntesis de miméticos peptídicos o no peptídicos que serían útiles para las mismas aplicaciones terapéuticas que los polipéptidos de anticuerpos de la invención. (Véase, por ejemplo, Saragobi et al., Science, 253:792-795, 1991).
[0949] Ensayos de detección
[0951] Los ensayos de detección descritos aquí están diseñados para identificar anticuerpos anti-PACAP de alta afinidad que pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con PACAP en sujetos que presentan síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con PACAP.
[0953] En algunas realizaciones, el anticuerpo se utiliza como herramienta de diagnóstico. El anticuerpo se puede utilizar para analizar la cantidad de PACAP presente en una muestra y/o sujeto. Como lo apreciará una persona experta en la técnica, dichos anticuerpos no necesitan ser anticuerpos neutralizantes. En algunas realizaciones, el anticuerpo de diagnóstico no es un anticuerpo neutralizante. En algunas realizaciones, el anticuerpo de diagnóstico se une a un epítopo diferente al que se une el anticuerpo neutralizante. En algunas realizaciones, los dos anticuerpos no compiten entre sí.
[0955] En algunas realizaciones, los anticuerpos divulgados en este documento se utilizan o se proporcionan en un kit de ensayo y/o método para la detección de PACAP en tejidos o células de mamífero con el fin de examinar/diagnosticar una enfermedad o trastorno asociado con cambios en los niveles de PACAP El kit comprende un anticuerpo que se une a PACAP y medios para indicar la unión del anticuerpo con PACAP, si está presente, y opcionalmente los niveles de proteína PACAP Se pueden utilizar diversos medios para indicar la presencia de un anticuerpo. Por ejemplo, los fluoróforos, otras sondas moleculares, o enzimas se pueden unir al anticuerpo, y la presencia del anticuerpo se puede observar de diversas maneras. El método para detectar dichos trastornos puede implicar el uso del kit o simplemente el uso de uno de los anticuerpos descritos y la determinación de si el anticuerpo se une a PACAP en una muestra. Como lo apreciará una persona experta en la técnica, niveles altos o elevados de PACAP darán como resultado mayores cantidades del anticuerpo unido a PACAP en la muestra. Por lo tanto, el grado de unión del anticuerpo se puede utilizar para determinar cuánta cantidad de PACAP hay en una muestra. Los sujetos o muestras con una cantidad de PACAP mayor que una cantidad predeterminada (por ejemplo, una cantidad o intervalo que tendría una persona sin un trastorno relacionado con PACAP) pueden caracterizarse como pacientes con un trastorno mediado por PACAP, por ejemplo migraña, cefalea, dolor, u otra afección.
[0957] La presente invención proporciona además un kit para detectar la unión de un anticuerpo anti-PACAP de la invención a PACAP. En particular, el kit puede usarse para detectar la presencia de PACAP específicamente reactivo con un anticuerpo anti-PACAP de la invención o un inmunorreactivo del mismo. El kit también puede incluir un anticuerpo unido a un sustrato, un anticuerpo secundario reactivo con el antígeno, y un reactivo para detectar una reacción del anticuerpo secundario con el antígeno. Un kit de este tipo puede ser un kit de ELISA, y puede comprender el sustrato, anticuerpos primarios y secundarios cuando sea apropiado, y cualquier otro reactivo necesario, tales como restos detectables, sustratos enzimáticos y reactivos de color, por ejemplo como se describe en este documento. El kit de diagnóstico también puede adoptar la forma de un kit de inmunotransferencia. El kit de diagnóstico también puede tener la forma de un kit quimioluminiscente (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). El kit de diagnóstico también puede ser un kit de detección basado en lantánidos (PerkinElmer, San Jose, CA).
[0959] Un médico experto comprendería que una muestra biológica incluye, pero no se limita a, suero, plasma, orina, saliva, moco, líquido pleural, líquido sinovial, y líquido cefalorraquídeo.
[0961] Métodos para mejorar o reducir los síntomas de, o para tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con PACAP
[0963] En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP descritos en este documento son útiles para mejorar o reducir los síntomas de, o para tratar o prevenir, enfermedades y trastornos asociados con PACAP Los anticuerpos anti-PACAP descritos en este documento, así como las combinaciones, también se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz a pacientes que necesitan tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con PACA<p>en forma de una composición farmacéutica como se describe con mayor detalle a continuación.
[0965] En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP descritos en este documento son útiles (ya sea solos o en combinación con otro agente) para mejorar o reducir los síntomas de, o para tratar o prevenir una enfermedad o afección asociada con PACAP
[0967] En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP descritos en este documento, con o sin un segundo agente, son útiles para mejorar o reducir los síntomas de, o para tratar o prevenir, la siguiente lista no limitativa de enfermedades y trastornos: migraña (con o sin aura), migrañas hemipléjicas, cefaleas en racimos, neuralgia migrañosa, cefaleas crónicas, cefaleas tensionales, cefaleas generales, sofocos, fotofobia, hemicránea paroxística crónica, cefaleas secundarias debido a un problema estructural subyacente en la cabeza o el cuello, neuralgia craneal, cefaleas sinusales (por ejemplo, cefalea asociada con sinusitis), cefaleas o migrañas inducidas por alergias, dolor, dolor crónico, dolor neuroinflamatorio o inflamatorio, dolor por incisión posoperatoria, dolor posquirúrgico, dolor relacionado con traumatismos, dolor ocular, dolor de muelas, síndrome de dolor regional complejo, dolor por cáncer (por ejemplo, dolor por cáncer óseo primario o metastásico), dolor por fractura, dolor por fractura osteoporótica, dolor resultante de quemaduras, dolor articular por gota, dolor asociado con crisis de células falciformes, dolor asociado con trastornos temporomandibulares, cirrosis, hepatitis, dolor neurogénico, dolor neuropático, dolor nocicéptico, dolor visceral, neuralgia del trigémino, neuralgia posherpética, dolor del miembro fantasma, fibromialgia, dolor menstrual, ovarialgia, distrofia simpática refleja, dolor por osteoartritis o artritis reumatoide, lumbalgia, neuropatía diabética, ciática, dispepsia, síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, ileítis, colitis ulcerosa, cólico renal, dismenorrea, cistitis, cistitis intersticial, menstruación, parto, menopausia, pancreatitis, esquizofrenia, depresión, trastorno de estrés postraumático, trastornos de ansiedad, diabetes, diabetes autoinmune, disfunción endotelial, isquemia, síndrome de Raynaud, cardiopatía coronaria ("CC"), arteriopatía coronaria ("EAC"), insuficiencia cardíaca, arteriopatía periférica ("EAP"), hipertensión pulmonar ("HP"), trastornos del tejido conjuntivo, accidente cerebrovascular, síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, hiperreactividad bronquial, asma, bronquitis, broncodilatación, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica ("EPOC"), dermatitis inflamatoria, adenocarcinoma en tejido glandular, blastoma en tejido embrionario de órganos, carcinoma en tejido epitelial, leucemia en tejidos que forman células sanguíneas, linfoma en tejido linfático, mieloma en médula ósea, sarcoma en tejido conjuntivo o de sostén, cáncer suprarrenal, linfoma relacionado con el SIDA, anemia, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer cerebral, cáncer de mama, tumores carcinoides, cáncer de cuello uterino, quimioterapia, cáncer de colon, citopenia, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer hepatobiliar, cáncer de riñón, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, enfermedad de Hodgkin, no Hodgkin, tumores del sistema nervioso, cáncer oral, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer uretral, cáncer de médula ósea, mieloma múltiple, tumores que hacen metástasis en el hueso, tumores que infiltran el nervio y la víscera hueca, tumores cerca de estructuras neurales, acné vulgar, dermatitis atópica, urticaria, queloides, cicatrices hipertróficas y rosácea, dermatitis alérgica, psoriasis, prurito, enrojecimiento cutáneo neurogénico, eritema, pérdida de peso, anorexia, sarcoidosis, choque, septicemia, síndrome de abstinencia de opiáceos, tolerancia a la morfina, epilepsia, trastornos del tracto urinario inferior ("LUT") tales como infección del tracto urinario, micción anormal, urgencia urinaria, nicturia, incontinencia urinaria, vejiga hiperactiva, y para prevenir o aliviar el dolor asociado con dichas afecciones del LUT. Preferiblemente, los anticuerpos anti-PACAP y la unión al antígeno descritos en este documento son útiles para mejorar o reducir los síntomas de, tratar o prevenir la migraña, la cefalea y una enfermedad o afección asociada con el dolor.
[0969] En particular, los anticuerpos anti-PACAP y la unión al antígeno también pueden ser útiles para mejorar o reducir los síntomas, tratar o prevenir la fotofobia, que se produce con un cefalea y/o una migraña, así como las que se produce independientemente de un cefalea y/o una migraña.
[0971] Las personas que padecen migraña generalmente desarrollan un dolor que empeora y síntomas de migraña cuando se exponen a la luz, un fenómeno conocido como fotofobia. La fotofobia también es común en trastornos oculares, tales como la iritis y la uveítis, y en trastornos intracraneales, tal como la meningitis. En la ruta visual clásica, la luz activa bastones y conos en la retina, que activan las células ganglionares de la retina que se proyectan a través del nervio óptico hasta el núcleo geniculado lateral, el colículo superior, y luego la corteza visual. Esta ruta incluye datos formadores y no formadores de imágenes. Una nueva ruta (información no formadora de imágenes) permite el mantenimiento de ritmos circadianos normales a través del núcleo supraquiasmático, y está regulada por células ganglionares de la retina intrínsecamente fotosensibles (ipRGC). Estas ipRGC son independientes de los bastones y conos, y contienen melanopsina, un fotopigmento.
[0973] Noseda, R. et al., Nat. Neurosci., 13:239-245 (2010) estudiaron a individuos ciegos que tenían migraña y correlacionaron estos hallazgos con modelos de ratas que implicaban el rastreo de proyecciones de ipRGC a áreas de percepción del dolor desde la duramadre. De los pacientes ciegos con migraña, 6 no tenían percepción de luz debido a un daño severo del nervio óptico o enucleación bilateral. Estos sujetos experimentaron patrones de sueño anormales y respuestas pupilares deficientes a la luz. Sus migrañas no empeoraron con la exposición a la luz. Por el contrario, 14 sujetos ciegos que pudieron detectar la luz a pesar de una percepción mínima de imágenes tenían patrones de sueño normales y un reflejo pupilar normal a la luz. A pesar de la degeneración generalizada de bastones y conos, estos pacientes tuvieron síntomas de migraña que empeoraron con la exposición a la luz durante los ataques de migraña, lo que sugiere que las ipRGC, y no los bastones y conos, son importantes en la fotofobia.
[0974] Estas proyecciones retinianas de áreas cerebrales que no forman imágenes se proyectan a la región dorsocaudal contralateral del tálamo posterior, como lo demuestra el trazado anterógrado en la rata. La entrada de ipRGC a esta área modula las neuronas del dolor sensibles a la duramadre, que también se proyectan a esta región. Las neuronas talámicas, doblemente sensibles al dolor dural y a la entrada de luz, se proyectan ampliamente a múltiples regiones corticales, incluidas la corteza somatosensorial primaria, las cortezas motoras primaria y secundaria, la corteza de asociación parietal, y las cortezas visuales primaria y secundaria. Estas proyecciones corticales pueden ayudar a explicar otros síntomas comunes de la migraña, además de la fotofobia, tales como debilidad motora o incoordinación, alteraciones visuales, y falta de concentración.
[0976] La fotofobia también acompaña a otros trastornos menos frecuentes pero igualmente incapacitantes, tales como la cefalea en racimos y otras cefaleas trigémino-autonómicas y el blefaroespasmo. Los mecanismos subyacentes a la fotofobia involucran al sistema trigémino. La fotofobia en pacientes ciegos sugiere contribuciones de una ruta no visual. Además, las cefalalgias autonómicas trigeminales, un grupo menos común de trastornos de cefalea primaria, se caracterizan por un dolor unilateral mediado por el trigémino frecuentemente asociado con fotofobia ipsilateral.
[0978] Las causas comunes de fotofobia incluyen cefaleas migrañosas, cataratas, o enfermedades oftalmológicas graves tal como uveítis o abrasión corneal. Una lista más extensa de trastornos asociados con la fotofobia incluye causas relacionadas con los ojos tales como acromatopsia, aniridia, afaquia (ausencia del cristalino), buftalmos (ángulo anormalmente estrecho entre la córnea y el iris), cataratas, distrofia de conos, anomalías congénitas del ojo, conjuntivitis viral ("ojo rojo"), abrasión corneal, distrofia corneal, úlcera corneal, alteración del epitelio corneal, tal como la causada por un cuerpo extraño corneal o queratitis, ectopia del cristalino, endoftalmitis, traumatismo ocular causado por enfermedad, lesión o infección tal como chalazión, epiescleritis, glaucoma, queratocono, o hipoplasia del nervio óptico, hidroftalmos, o glaucoma congénito, iritis, neuritis óptica, síndrome de dispersión pigmentaria, dilatación pupilar (natural o químicamente inducida), desprendimiento de retina, cicatrización de la córnea o la esclerótica y uveítis.
[0980] Además, la fotofobia tiene causas relacionadas con el sistema nervioso o neurológicas que incluyen: trastornos del espectro autista, malformación de Chiari, dislexia, encefalitis, incluida la encefalomielitis miálgica también conocida como síndrome de fatiga crónica, meningitis, hemorragia subaracnoidea, tumor de la fosa craneal posterior, así como otras causas tales como espondilitis anquilosante, albinismo, ariboflavinosis, benzodiazepinas (uso a largo plazo o abstinencia de benzodiazepinas), quimioterapia, chikungunya, cistinosis, síndrome de Ehlers-Danlos, resaca, gripe, mononucleosis infecciosa, deficiencia de magnesio, envenenamiento por mercurio, migraña, rabia, y tirosinemia tipo II, también conocida como "síndrome de Richner-Hanhart".
[0982] Además, se sabe que la fotofobia aumenta en la depresión, el trastorno bipolar y la agorafobia.
[0984] Los anticuerpos anti-PACAP y la unión al antígeno descritos en este documento pueden ser eficaces para tratar o prevenir la fotofobia en cualquiera de estas afecciones, preferiblemente, en un sujeto con trastorno de estrés postraumático ("TEPT") o en un sujeto con lesión cerebral traumática.
[0986] Las cefaleas se pueden clasificar según la causa, como se analiza a continuación.
[0988] Cefaleas primarias. Una cefalea primaria es causada por problemas o hiperactividad de las estructuras sensibles al dolor en la cabeza. Por lo general, una cefalea primaria no se considera un síntoma de una enfermedad subyacente. En cambio, la actividad química en el cerebro, los nervios o los vasos sanguíneos de la cabeza fuera del cráneo, o los músculos de la cabeza y el cuello, o alguna combinación de estos factores, pueden desempeñar un papel en las cefaleas primarias. Algunas personas pueden ser portadoras de genes que las hacen más propensas a desarrollar este tipo de cefaleas. Las cefaleas primarias comunes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cefalea en racimos, cefalea tensional (o cefalea de tipo tensional), y cefalea autonómica trigémina ("CTA"), incluida la hemicránea paroxística. Existen otros patrones de cefalea que pueden considerarse tipos de cefalea primaria, por ejemplo cefaleas crónicas diarias, cefaleas por tos, cefaleas por ejercicio, y cefaleas por relaciones sexuales. Estos cefaleas son menos comunes y tienen características distintivas, tal como una duración inusual o dolor asociado con una determinada actividad. Aunque estas cefaleas generalmente se consideran primarias, cada una de ellas podría ser un síntoma de una enfermedad subyacente. Además, algunas cefaleas primarias pueden ser provocadas por factores del estilo de vida, incluidos: alcohol; ciertos alimentos (por ejemplo, carnes procesadas que contienen nitratos); cambios en el sueño o falta de sueño; mala postura; comidas salteadas; y estrés.
[0990] Cefaleas secundarias. Una cefalea secundaria es un síntoma de una enfermedad que puede activar los nervios de la cabeza sensibles al dolor. Existen numerosas afecciones, cuya gravedad puede variar considerablemente, que pueden provocar cefaleas secundarias. Las fuentes ejemplares de cefaleas secundarias incluyen, pero no se limitan a, sinusitis aguda; desgarros arteriales (disecciones carotídeas o vertebrales); trombosis venosa en el cerebro; aneurisma cerebral; malformación arteriovenosa cerebral; intoxicación por monóxido de carbono; malformación de Chiari; conmoción cerebral; deshidratación; problemas dentales; infección de oído (oído medio); encefalitis; arteritis de células gigantes; glaucoma; resacas; influenza (gripe); hematoma intracraneal; medicamentos para tratar otros trastornos; meningitis; glutamato monosódico ("MSG"); uso excesivo de analgésicos; ataques de pánico; síndrome posconmoción cerebral; presión de un casco ajustado, por ejemplo casco o gafas protectoras; pseudotumor cerebral; toxoplasmosis; y neuralgia del trigémino. Los tipos específicos de cefaleas secundarias incluyen, pero no se limitan a, cefaleas por compresión externa (resultado de un casco que genera presión); cefaleas por helado (comúnmente llamadas "congelación cerebral"); cefaleas por rebote (causadas por el uso excesivo de analgésicos); cefaleas sinusales (causadas por inflamación y congestión en las cavidades sinusales); cefaleas espinales (causadas por niveles bajos de líquido cefalorraquídeo, posiblemente resultado de un traumatismo, punción lumbar o anestesia espinal); y cefaleas en trueno (un grupo de trastornos que implican cefaleas repentinas y graves).
[0992] Las enfermedades y trastornos asociados con el dolor, a modo de ejemplo y no limitativos, que se pueden tratar y/o prevenir mediante la administración de los anticuerpos anti-PACAP de la presente invención incluyen el dolor resultante de cualquier afección asociada con dolor neurogénico, neuropático, inflamatorio, o nocicéptico. Preferiblemente, el trastorno asociado al dolor estará asociado con un aumento de PACAP en el sitio del dolor.
[0993] En ciertas realizaciones, el trastorno asociado al dolor que se va a tratar es dolor por cáncer que surge de una neoplasia o de un cáncer seleccionado de uno o más de los siguientes: adenocarcinoma en tejido glandular, blastoma en tejido embrionario de órganos, carcinoma en tejido epitelial, leucemia en tejidos que forman células sanguíneas, linfoma en tejido linfático, mieloma en médula ósea, sarcoma en tejido conjuntivo o de sostén, cáncer suprarrenal, linfoma relacionado con el SIDA, anemia, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer cerebral, cáncer de mama, tumores carcinoides, cáncer de cuello uterino, quimioterapia, cáncer de colon, citopenia, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de cabeza, cáncer de cuello uterino, cáncer hepatobiliar, cáncer de riñón, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, enfermedad de Hodgkin, no Hodgkin, tumores del sistema nervioso, cáncer oral, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer uretral, cáncer de médula ósea, mieloma múltiple, tumores que hacen metástasis en el hueso, tumores que infiltran el nervio y la víscera hueca, tumores cerca de estructuras neurales. Además, preferiblemente, el dolor por cáncer comprende dolor visceral, preferiblemente dolor visceral que surge del cáncer de páncreas y/o metástasis en el abdomen. Además, preferiblemente, el dolor por cáncer comprende dolor somático, preferiblemente dolor somático debido a una o más metástasis en el hueso, dolor posquirúrgico, sarcomas, cáncer del tejido conjuntivo, cáncer de tejido óseo, cáncer de células formadoras de sangre de la médula ósea, mieloma múltiple, leucemia, cáncer óseo primario o secundario.
[0995] En otras realizaciones, la afección asociada al dolor que se va a tratar está asociada con dolor neuropático, e incluye, a modo de ejemplo, neuralgia del trigémino, neuralgia posherpética, dolor del miembro fantasma, fibromialgia y distrofia simpática refleja.
[0997] Otras enfermedades o afecciones ejemplares asociadas con el dolor incluyen, pero no se limitan a, dolor general, dolor crónico, dolor inflamatorio, dolor por incisión posoperatorio, dolor posquirúrgico, dolor relacionado con traumatismos, dolor lumbar, dolor ocular, dolor de muelas, síndrome de dolor regional complejo, dolor por cáncer (por ejemplo, dolor por cáncer óseo primario o metastásico), dolor por fractura, dolor por fractura osteoporótica, dolor resultante de quemaduras, dolor articular por gota, dolor asociado con crisis de células falciformes, dolor asociado con trastornos temporomandibulares, cirrosis, hepatitis, dolor neurogénico, dolor neuropático, dolor nocicéptico, dolor visceral, neuralgia del trigémino, neuralgia posherpética, dolor del miembro fantasma, fibromialgia, dolor menstrual, ovariolgia, distrofia simpática refleja, dolor por osteoartritis o artritis reumatoide, dolor lumbar, neuropatía diabética, ciática, dispepsia, síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, ileítis, colitis ulcerosa, cólico renal, dismenorrea, cistitis, cistitis intersticial, período menstrual, parto, menopausia, pancreatitis, esquizofrenia, depresión, trastorno de estrés postraumático, trastornos de ansiedad, diabetes, diabetes autoinmune, disfunción endotelial, isquemia, síndrome de Raynaud, enfermedad cardíaca coronaria ("CHD"), enfermedad de la arteria coronaria ("CAD"), insuficiencia cardíaca, enfermedad arterial periférica ("EAP"), hipertensión pulmonar ("HP"), trastornos del tejido conjuntivo, accidente cerebrovascular, síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, vejiga hiperactiva, hiperreactividad bronquial, asma, bronquitis, broncodilatación, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva crónica ("EPOC"), dermatitis inflamatoria, acné vulgar, dermatitis atópica, urticaria, queloides, cicatrices hipertróficas y rosácea, dermatitis alérgica, psoriasis, prurito, enrojecimiento cutáneo neurogénico, eritema, sarcoidosis, choque, septicemia, y síndrome de abstinencia de opiáceos.
[0999] Por lo tanto, la presente invención incluye métodos para tratar, prevenir y/o mejorar cualquier enfermedad o trastorno asociado con la actividad de PACAP o la regulación positiva de PACAP (incluida cualquiera de las enfermedades, trastornos y afecciones asociados con el dolor a modo de ejemplo mencionados anteriormente) mediante el uso de los anticuerpos y la unión al antígeno de la invención.
[1001] Además, los anticuerpos anti-PACAP y la unión al antígeno pueden usarse solos o junto con otros agentes activos, por ejemplo opioides y analgésicos no opioides tales como los AINE, para provocar analgesia o potenciar la eficacia de otro analgésico.
[1003] Los anticuerpos en cuestión potencialmente pueden combinarse con cualquier analgésico opioide o AINE u otro analgésico, potencialmente otro anticuerpo u otro producto biológico tal como, por ejemplo, un anticuerpo anti-NGF o anti-CGRP o anti-CGRP-R o un anticuerpo o polipéptido NGF, CGRP o C<g r>P-R o conjugado, con el fin de aumentar o mejorar el manejo del dolor. Esto puede permitir que dichos compuestos analgésicos se administren durante un período más prolongado o en dosis más reducidas, aliviando potencialmente así los efectos secundarios adversos asociados con ellos.
[1005] De particular interés es la coadministración de los anticuerpos anti-PACAP y el anticuerpo con un anticuerpo anti-CGRP (por ejemplo, ALD403) o un anticuerpo o anticuerpo anti-CGRP-R y, además, el uso de los anticuerpos anti-PACAP y el anticuerpo para tratar sujetos que previamente recibieron un anticuerpo o anticuerpo anti-CGRP o anti-CGRP-R. Por ejemplo, el sujeto tratado previamente (que previamente recibió al menos una administración de anticuerpo o anticuerpo anti-CGRP o anti-CGRP-R) puede ser un paciente con migraña que no respondió adecuadamente al tratamiento con anticuerpo anti-CGRP o anti-CGRP-R ("respondedor deficiente") y/o ha provocado una respuesta inmune al anticuerpo o anticuerpo anti-CGRP o anti-CGRP-R.
[1007] Asimismo, la coadministración de los anticuerpos anti-PACAP y la unión al antígeno con BOTOX® (toxina botulínica) también es de particular interés, por ejemplo en el tratamiento de un paciente con migraña. En algunos casos, es posible que la persona que padece migraña no haya respondido adecuadamente a los tratamientos anteriores ("respondedor deficiente") y/o haya provocado una respuesta inmune al tratamiento anterior.
[1009] En algunas realizaciones, se pueden tomar aspirina y/o acetaminofeno junto con el anticuerpo anti-PACAP en cuestión. La aspirina es otro tipo de compuesto antiinflamatorio no esteroideo.
[1011] El sujeto al que se administra la formulación farmacéutica puede ser, por ejemplo, cualquier animal humano o no humano que necesite dicho tratamiento, prevención y/o mejora, o que de otro modo se beneficiaría de la inhibición 0 atenuación de la actividad mediada por PACAP. Por ejemplo, el sujeto puede ser un individuo al que se le ha diagnosticado o se considera que corre el riesgo de padecer cualquiera de las enfermedades o trastornos mencionados anteriormente. La presente invención incluye además el uso de cualquiera de las formulaciones farmacéuticas descritas en este documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención y/o mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado con la actividad de PACAP (incluida cualquiera de las enfermedades, trastornos y afecciones ejemplares mencionados anteriormente).
[1013] A dministración
[1015] En una realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP descritos en este documento, o la unión a PACAP, así como las combinaciones de dichos anticuerpos, se administran a un sujeto a una concentración de entre 0,1 mg/ml y alrededor de uno cualquiera de 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mg/ml, /-10% de error.
[1017] En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP descritos en este documento se administran a un sujeto en una dosis de entre alrededor de 0,01 y 100,0 o 200,0 mg/kg de peso corporal del sujeto receptor. En ciertas realizaciones, dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad relacionada con PACAP, alrededor de 1 |jg/kg a 50 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosis candidata inicial para administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. En otra realización, alrededor de 1 jg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo es una dosis candidata inicial para administración al paciente. Una dosis diaria típica puede oscilar de alrededor de 1 jg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de varios factores, por ejemplo el mamífero particular que se está tratando, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, la programación de la administración, y otros factores conocidos por los médicos. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles.
[1019] Por ejemplo, además de las dosis relativas (mg/kg) analizadas en este documento, los anticuerpos anti-PACAP en cuestión se pueden administrar a un sujeto en una dosis absoluta (mg). Por consiguiente, en una realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP descritos en este documento se administran a un sujeto en una dosis de entre alrededor de 1 microgramo y alrededor de 1000 miligramos, independientemente de la vía de administración.
[1020] En una realización preferida de la invención, los anticuerpos anti-PACAP descritos en este documento, o la unión al antígeno anti-PACAP, así como las combinaciones de dichos anticuerpos, se administran a un sujeto receptor con una frecuencia de una vez cada veintiséis semanas o menos, tal como una vez cada dieciséis semanas o menos, una vez cada ocho semanas o menos, una vez cada cuatro semanas o menos, una vez cada dos semanas o menos, una vez cada semana o menos, o una vez al día o menos.
[1022] Según realizaciones preferidas, el medicamento o la composición farmacéutica que contiene el anticuerpo se administra periféricamente a un sujeto a través de una vía seleccionada de una o más de las siguientes: oralmente, sublingualmente, bucalmente, tópicamente, rectalmente, por inhalación, transdérmicamente, subcutáneamente, intravenosamente, intraarterialmente, o intramuscularmente, mediante administración intracardíaca, intraósea, intradérmicamente, intraperitonealmente, transmucosamente, vaginalmente, intravítreamente, epicutáneamente, intraarticularmente, periarticularmente, o localmente.
[1024] Fab puede administrarse cada dos semanas o menos, cada semana o menos, una vez al día o menos, varias veces al día, y/o cada pocas horas. En una realización de la invención, un paciente recibe Fab de 0,1 mg/kg a 40 mg/kg por día administrado en dosis divididas de 1 a 6 veces al día, o en forma de perfusión continua, eficaz para obtener los resultados deseados.
[1026] Se debe entender que la concentración del anticuerpo o Fab administrado a un paciente determinado puede ser mayor o menor que las concentraciones de administración ejemplares establecidas anteriormente.
[1027] Una persona experta en la técnica podría determinar una dosis eficaz y una frecuencia de administración a través de experimentación de rutina, por ejemplo guiada por la divulgación aquí contenida y las enseñanzas en The Pharmacological Basis of Therapeutics de Goodman & Gilman, Brunton, LL et al. editores, 11.a edición, Nueva York, Nueva York: McGraw-Hill (2006); Howland, R. D. et al., Pharmacology, Volumen 864, Lippincott's illustrated reviews., Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins (2006); and Golan, D. E., Principles of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy, Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins (2007).
[1029] En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP descritos en este documento, o la unión de PACAP, así como las combinaciones de dichos anticuerpos, se administran a un sujeto en una formulación farmacéutica. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano.
[1031] Una "composición farmacéutica" o "medicamento" se refiere a una composición química o biológica adecuada para su administración a un sujeto, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Dichas composiciones pueden formularse específicamente para su administración a través de una o más de varias vías, incluidas, pero sin limitarse a, bucal, epicutánea, epidural, inhalación, intraarterial, intracardial, intracerebroventricular, intradérmica, intramuscular, intranasal, intraocular, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intravenosa, oral, parenteral, rectal a través de un enema o supositorio, subcutánea, subdérmica, sublingual, transdérmica, y transmucosa. Además, la administración puede realizarse mediante inyección, polvo, líquido, gel, gotas, u otros medios de administración.
[1033] En una realización de la invención, los anticuerpos anti-PACAP descritos en este documento, o la unión de PACAP, así como las combinaciones de dichos anticuerpos, pueden administrarse opcionalmente en combinación con uno o más agentes activos. Dichos agentes activos incluyen agentes analgésicos, antihistamínicos, antipiréticos, antiinflamatorios, antibióticos, antivirales, y anticitocinas. Los agentes activos incluyen agonistas, antagonistas, y moduladores de TNF-a, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-a, IFN-y, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, factor de crecimiento de hepatocitos ("HGF"), hepcidina,<n>G<f>, CGRP, incluidos los anticuerpos reactivos contra cualquiera de los anteriores, y los anticuerpos reactivos contra cualquiera de sus receptores. Los agentes activos también incluyen, pero no se limitan a, ácidos 2-arilpropiónicos, aceclofenaco, acemetacina, ácido acetilsalicílico (aspirina), alclofenaco, alminoprofeno, amoxiprina, ampirona, ácidos arilalcanoicos, azapropazona, benorilato/benorilato, benoxaprofeno, bromfenaco, carprofeno, celecoxib, salicilato de colina y magnesio, clofezona, inhibidores de la c OX-2, dexibuprofeno, dexketoprofeno, diclofenaco, diflunisal, droxicam, etenzamida, etodolaco, etoricoxib, faislamina, ácidos fenámicos, fenbufeno, fenoprofeno, ácido flufenámico, flunoxaprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, ibuproxam, indometacina, indoprofeno, kebuzona, ketoprofeno, ketorolaco, lornoxicam, loxoprofeno, lumiracoxib, salicilato de magnesio, ácido meclofenámico, ácido mefenámico, meloxicam, metamizol, salicilato de metilo, mofebutazona, nabumetona, naproxeno, ácidos N-arilantranílicos, NGF, oxametacina, oxaprozina, oxicams, oxifenbutazona, oxitocina, parecoxib, fenazona, fenilbutazona, fenilbutazona, piroxicam, pirprofeno, profens, proglumetacina, derivados de pirazolidina, rofecoxib, salicilato de salicilo, salicilamida, salicilatos, sustancia P, sulfinpirazona, sulindaco, suprofeno, tenoxicam, ácido tiaprofénico, ácido tolfenámico, tolmetina, y valdecoxib. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PACAP seleccionados, o los anticuerpos de unión a PACAP, así como las combinaciones de estos anticuerpos, se pueden administrar opcionalmente en combinación con oxitocina, por ejemplo administrada en una formulación nasal, para administración intranasal.
[1035] Un antihistamínico puede ser cualquier compuesto que se oponga a la acción de la histamina o a su liberación de las células (por ejemplo, los mastocitos). Los antihistamínicos incluyen, pero no se limitan a, acrivastina, astemizol, azatadina, azelastina, betatastina, bromfeniramina, buclizina, cetirizina, análogos de cetirizina, clorfeniramina, clemastina, CS 560, ciproheptadina, desloratadina, dexclorfeniramina, ebastina, epinastina, fexofenadina, HSR 609, hidroxizina, levocabastina, loratadina, metescopolamina, mizolastina, norastemizol, fenindamina, prometazina, pirilamina, terfenadina, y tranilast.
[1037] Los antibióticos incluyen, pero no se limitan a, amikacina, aminoglucósidos, amoxicilina, ampicilina, ansamicinas, arsfenamina, azitromicina, azlocilina, aztreonam, bacitracina, carbacefem, carbapenémicos, carbenicilina, cefaclor, cefadroxilo, cefalexina, cefalotina, cefalotina, cefamandol, cefazolina, cefdinir, cefditoren, cefepima, cefixima, cefoperazona, cefotaxima, cefoxitina, cefpodoxima, cefprozil, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftobiprol, ceftriaxona, cefuroxima, cefalosporinas, cloranfenicol, cilastatina, ciprofloxacino, claritromicina, clindamicina, cloxacilina, colistina, cotrimoxazol, dalfopristina, demeclociclina, dicloxacilina, diritromicina, doripenem, doxiciclina, enoxacina, ertapenem, eritromicina, etambutol, flucloxacilina, fosfomicina, furazolidona, ácido fusídico, gatifloxacino, geldanamicina, gentamicina, glucopéptidos, herbimicina, imipenem, isoniazida, kanamicina, levofloxacino, lincomicina, linezolid, lomefloxacino, loracarbef, macrólidos, mafenida, meropenem, meticilina, metronidazol, mezlocilina, minociclina, monobactámicos, moxifloxacino, mupirocina, nafcilina, neomicina, netilmicina, nitrofurantoína, norfloxacino, ofloxacino, oxacilina, oxitetraciclina, paromomicina, penicilina, penicilinas, piperacilina, platensimicina, polimixina B, polipéptidos, prontosil, pirazinamida, quinolonas, quinupristina, rifampicina, rifampicina, roxitromicina, espectinomicina, estreptomicina, sulfacet amida, sulfametizol, sulfanilamida, sulfasalazina, sulfisoxazol, sulfonamidas, teicoplanina, telitromicina, tetraciclina, tetraciclinas, ticarcilina, tinidazol, tobramicina, trimetoprima, trimetoprima-sulfametoxazol, troleandomicina, trovafloxacina, y vancomicina.
[1038] Los agentes activos también incluyen aldosterona, beclometasona, betametasona, corticosteroides, cortisol, acetato de cortisona, acetato de desoxicorticosterona, dexametasona, acetato de fludrocortisona, glucocorticoides, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, esteroides, y triamcinolona. También se contempla cualquier combinación adecuada de estos agentes activos.
[1040] Un "excipiente farmacéutico" o un "excipiente farmacéuticamente aceptable" es un vehículo, generalmente un líquido, en el que se formula un agente terapéutico activo. En una realización de la invención, el agente terapéutico activo es un anticuerpo humanizado descrito en este documento, o uno o más. El excipiente generalmente no proporciona ninguna actividad farmacológica a la formulación, aunque puede proporcionar estabilidad química y/o biológica y características de liberación. Se pueden encontrar formulaciones ejemplares, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, A. editor, 19.a edición, Filadelfia, PA: Williams and Wilkins (1995).
[1041] Como se utiliza en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, isotónicos, y agentes retardantes de la absorción que sean fisiológicamente compatibles. En una realización, el vehículo es adecuado para la administración parenteral. Alternativamente, el vehículo puede ser adecuado para administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o sublingual. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles, y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Salvo que algún medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas de la invención. También se pueden incorporar a las composiciones compuestos activos suplementarios.
[1043] Las composiciones farmacéuticas normalmente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La invención contempla que la composición farmacéutica esté presente en forma liofilizada. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración del fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), y mezclas adecuadas de los mismos. La invención contempla además la inclusión de un estabilizador en la composición farmacéutica. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos.
[1045] En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol y sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. La absorción de las composiciones inyectables se puede prolongar incluyendo un agente que retrase la absorción, por ejemplo sales de monoestearato y gelatina. Además, el polipéptido alcalino se puede formular en una formulación de liberación prolongada, por ejemplo en una composición que incluye un polímero de liberación lenta. Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán el compuesto contra una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluidos implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico, copolímeros polilácticos y poliglicólicos ("PLG"). Los expertos en la técnica conocen muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones.
[1047] Para cada una de las realizaciones mencionadas, los compuestos pueden administrarse mediante una variedad de formas de dosificación. Se contemplan cualquier forma de dosificación biológicamente aceptable conocida por personas con conocimientos normales en la técnica, y combinaciones de las mismas. Los ejemplos de dichas formas de dosificación incluyen, sin limitación, polvos reconstituibles, elixires, líquidos, soluciones, suspensiones, emulsiones, polvos, gránulos, partículas, micropartículas, gránulos dispersables, sellos, inhalantes, inhalantes en aerosol, parches, inhalantes de partículas, implantes, implantes de depósito, inyectables (incluidos subcutáneos, intramusculares, intravenosos, e intradérmicos), infusiones, y combinaciones de los mismos.
[1049] Ciertas enseñanzas relacionadas con métodos para obtener una población clonal de células B específicas del antígeno se divulgaron en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2013/0316353.
[1051] Ciertas enseñanzas relacionadas con la humanización de anticuerpos monoclonales derivados de conejo y modificaciones de la secuencia preferidas para mantener la afinidad de unión al antígeno se divulgaron en la Publicación Internacional n.° WO 2008/144757, titulada Nuevos métodos de humanización de anticuerpos de conejo y anticuerpos de conejo humanizados, presentada el 21 de mayo de 2008.
[1053] Ciertas enseñanzas relacionadas con la producción de anticuerpos o el uso de levaduras competentes para el apareamiento, y los métodos correspondientes, se divulgaron en la Publicación de Patente de EE. UU. n.° US2006/0270045.
[1055] Ciertas enseñanzas relacionadas con la producción de anticuerpos o enPichia,y métodos preferidos para obtener y purificar anticuerpos, también se divulgan en las Publicaciones de Patentes de EE. Uu . n.° 2014/0288272; 2014/0287952; 2013/0055888; y 2012/0277408.
[1056] Ciertas enseñanzas relacionadas con la producción de anticuerpos o en células CHO, y métodos ejemplares para obtener y purificar anticuerpos, también se divulgan en las Patentes y Publicaciones de EE. UU. n.° 7.932.087; 2009/0285795; 9.090.672; y 2010/0221781.
[1058] Ejemplos
[1060] Ejemplo 1: Preparación de anticuerpos que se unen selectivamente a PACAP
[1062] Mediante el uso de un protocolo de selección de anticuerpos sustancialmente como se describe en este documento, se produjo un panel de anticuerpos específicos para PACAP38 y PACAP27, y un panel de anticuerpos específicos sólo para PACAP38.
[1064] Estrategia de inmunización
[1066] Los conejos se inmunizaron con PACAP38 (American Peptide, Vista, CA) (SEQ ID NO: 1241). Los péptidos se prepararon para la inmunización de la siguiente manera. Un volumen de 0,15 ml de hemocianina de lapa ("KLH") 10 mg/ml disuelta en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco ("DPBS") suplementada con NaCl 1M se combinó con 1,0 ml de péptido 1 mg/ml (disuelto en agua desionizada). Después, se añadió 1,0 ml de carbodiimida 40 mM antes de una incubación de 12 horas a temperatura ambiente con mezclamiento suave. El exceso de carbodiimida y péptido no conjugado se eliminaron mediante diálisis a DPBS antes de la filtración estéril. A continuación, se añadió un péptido no conjugado igual a la masa inicial de KLH antes de la preparación para la inyección en conejos. Alternativamente, se mezclaron masas iguales de KLH estéril y péptido sin química de carbodiimida.
[1068] Las inmunizaciones se realizaron diluyendo 200 |jg de antígeno en 0,5 ml con DPBS, y mezclando con un volumen igual de adyuvante completo de Freund para inyección subcutánea de 1 ml el día 1.
[1070] Se realizaron inyecciones de refuerzo de 100 jg con adyuvante de Freund incompleto en los días 21 y 42.
[1072] Evaluación del título funcional de elección de anticuerpos
[1074] Para identificar anticuerpos que neutralizan la señalización inducida por PACAP38 (SEQ ID NO: 1241) a través de PAC1-R, las soluciones de anticuerpos policlonales se purificaron primero a través de proteína A, y se dializaron en un tampón neutro. Brevemente, las soluciones de anticuerpos se incubaron con PACAP38 (SEQ ID NO: 1241) a 4x la concentración final (100 pM) durante 1 hora. Mientras se incubaban los complejos anticuerpo/antígeno, las células PC-12 que expresaban PAC1-R (Banco de células de la Colección Japonesa de Recursos Biológicos de Investigación) se lavaron y se resuspendieron a 2 x 106 células por ml en medio de cultivo celular. Las células (10 j l) y el complejo antígeno/anticuerpo (40 j l) se transfirieron a una placa de fluorescencia de resuelta en el tiempo (HTRF) homogénea, y se agitaron a temperatura ambiente durante 30 min. Tras la incubación, se añadieron 20 j l de mAb anti-AMPc marcado con criptato de Eu3+ (diluido 1:20) y 20 j l de AMPc marcado con d2 (diluido 1:20) en tampón de lisis, y la placa se incubó durante 1 h con agitación. Después de la incubación, las placas se leyeron (excitación 330 nm, emisión 620/665 nm), y se determinó una relación de señal de 620:665.
[1076] Recolección de tejidos
[1078] Una vez establecidos los títulos aceptables, se sacrificaron los conejos. Se extrajeron el bazo, los ganglios linfáticos y la sangre completa, y se procesaron de la siguiente manera:
[1080] El bazo y los ganglios linfáticos se procesaron en una suspensión de células individuales disociando el tejido y empujándolo a través de una malla de alambre estéril a 70 jm (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) con un émbolo de una jeringa de 20 cc. Las células se recogieron en solución salina tamponada con fosfato (“PBS”). Las células se lavaron entonces dos veces mediante centrifugación. Después del último lavado, se determinó la densidad celular mediante azul tripán. Las células se centrifugaron a 1500 RPM durante 10 minutos; después se descartó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en el volumen apropiado de dimetilsulfóxido al 10% ("DMSO", Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) en suero bovino fetal ("FBS" HYCLONE™, GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA), y se dispensaron a 1 ml/vial. Los viales se almacenaron a -70 °C en una cámara de congelación lenta durante 24 horas, y se almacenaron en nitrógeno líquido.
[1082] Las células mononucleares de sangre periférica ("PBMC") se aislaron mezclando sangre completa con partes iguales de PBS. Se colocaron cuidadosamente 35 ml de la mezcla de sangre completa sobre 8 ml de LYMPHOLYTE® Rabbit (Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontario) en un tubo cónico de 45 ml (Corning, Corning, NY), y se centrifugó durante 30 minutos a 2500 RPM a temperatura ambiente sin frenos. Después de la centrifugación, las capas de PBMC se retiraron cuidadosamente utilizando una pipeta Pasteur de vidrio (VWR International, Radnor, PA), se combinaron, y se colocaron en un vial limpio de 50 ml. Las células se lavaron dos veces con PBS mediante centrifugación a 1500 RPM durante 10 minutos a temperatura ambiente, y la densidad celular se determinó mediante tinción con azul tripán. Después del último lavado, las células se resuspendieron en un volumen apropiado de medio DMSO/FBS al 10%, y se congelaron como se describió anteriormente.
[1084] Selección, enriquecimiento y condiciones de cultivo de células B
[1086] El día de la preparación del cultivo de células B, los viales de PBMC, esplenocitos o ganglios linfáticos se descongelaron para su uso. Los viales se retiraron del tanque de nitrógeno líquido y se colocaron en un baño de agua a 37 °C hasta que se descongelaron. El contenido de los viales se transfirió a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml (Corning, Inc., Corning, NY), y se añadieron lentamente al tubo 10 ml de RPMI modificado. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 2000 RPM, y se descartó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 10 ml de medio fresco. La densidad celular y la viabilidad se determinaron mediante azul tripán.
[1088] Para la selección positiva de células B productoras de anti-PACAP38, se cargó previamente PACAP38 biotinilado (SEQ ID NO: 1241) en las perlas de estreptavidina de la siguiente manera. Se mezclaron 75 |jl de perlas de estreptavidina (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) con PACAP38 biotinilado en el extremo N (concentración final de 10 jg/m l) y 300 j l de PBS suplementado con 0,5% de seroalbúmina bovina libre de biotina ("BSA") y 2 mM de EDTA ("PBF"). Esta mezcla se incubó a 4 °C durante 30 minutos, y el PACAP38 biotinilado no unido (AnaSpec, Fremont, CA) se eliminó utilizando una columna de separación MACS® (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) con un enjuague de 1 ml para eliminar el material no unido. El material unido se extrajo mediante desprendimiento del imán, y se utilizó para resuspender las células desde arriba en 100 j l por 1X107 células. Después, la mezcla se incubó a 4 °C durante 30 minutos, y se lavó una vez con 10 ml de PBF. Después del lavado, las células se resuspendieron en 500 j l de PBF y se reservaron. Una columna MACS® MS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) se enjuagó previamente con 500 j l de PBF en un soporte magnético (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). La suspensión celular se aplicó a la columna a través de un prefiltro, y se recogió la fracción no unida. La columna se lavó con 2,5 ml de tampón PBF. La columna se retiró del soporte magnético y se colocó en un tubo EPPENDORF™ limpio y estéril de 1,5 ml. Se añadió 1 ml de tampón PBF a la parte superior de la columna, y se recolectaron las células seleccionadas positivas. El rendimiento y la viabilidad de la fracción de células positivas se determinaron mediante tinción con azul tripán. La selección positiva produjo un promedio del 1% de la concentración celular inicial.
[1090] Se estableció una célula piloto para proporcionar información sobre los niveles de siembra del cultivo. Las placas se sembraron a 5, 10, 25, 50, 100 o 200 células B enriquecidas/pocillo. Además, cada pocillo contenía 25-50000 células/pocillo de células EL-4.B5 irradiadas (5000 Rads) y un nivel apropiado de sobrenadante de células T de conejo activadas (véase la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 20070269868) (que oscila de 1 a 5% según la preparación) en medio RPMI modificado con alto contenido de glucosa a un volumen final de 250 jl/pocillo. Los cultivos se incubaron durante 5 a 7 días a 37 °C en 4% de CO2.
[1092] Detección de cultivos de células B mediante reconocimiento de antígenos (ELISA)
[1094] Para identificar los pocillos que producen anticuerpos anti-PACAP38, los sobrenadantes de células B se analizaron mediante reconocimiento de antígenos (ELISA). Brevemente, las placas recubiertas con NEUTRAVIDIN™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) se recubrieron con PACAP38 biotinilado, ya sea N-term o C-term (AnaSpec Inc., Fremont, CA) (50 j l por pocillo; 1 jg/ml), diluido en tampón de ELISA (gelatina de piel de pescado al 0,5% en PBS, pH 7,4) durante alrededor de 1 hora a temperatura ambiente, o alternativamente durante toda la noche a 4 °C. Posteriormente, las placas se bloquearon con tampón de ELISA durante una hora a temperatura ambiente y se lavaron con PBS con Tween 20 al 0,05% ("tampón de lavado"). Las muestras de sobrenadante de células B (50 jl) se transfirieron a los pocillos y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después de esta incubación, la placa se lavó con tampón de lavado. Para el desarrollo, se añadió a los pocillos una anti-Fc específico de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante ("Fc-HRP") (dilución 1:5000 en tampón de ELISA), y se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después de una etapa de lavado 3X con solución de lavado, la placa se reveló utilizando sustrato 3,3',5,5'-tetrametilbencidina ("TMB") durante dos minutos a temperatura ambiente, y la reacción se detuvo utilizando HCl 0,5 M. La absorbancia de los pocillos se leyó a 450 nm.
[1096] Para identificar pocillos que producen anticuerpos anti-PACAP38 que no reconocen VIP (SEQ ID NO: 1243), el sobrenadante de los pocillos positivos para la unión de PACAP38 por ELISA se analizó mediante ELISA para determinar su unión a VIP. Brevemente, el VIP biotinilado (AnaSpec Inc., Fremont, CA) se unió a placas recubiertas con NEUTRAVIDIN™ (50 jg por pocillo, 1 jg / j l de cada péptido). Se analizaron muestras de sobrenadante de células B (50 j l) sin dilución previa. El reconocimiento en este ensayo puede indicar reactividad cruzada con un péptido estrechamente relacionado, VIP.
[1098] Identificación de la actividad funcional en sobrenadantes de células B mediante uno o más ensayos
[1099] Para identificar pocillos que producen anticuerpos anti-PACAP38 que bloquean la señalización de PACAP38 a través de PAC1-R, el sobrenadante de pocillos positivos para la unión de PACAP38 por ELISA se analizó en un ensayo HTRF para AMPc (Cisbio US, Bedford, MA). Los sobrenadantes (78 jl) se preincubaron con 2 j l de PACAP38 5 nM (American Peptide Company, Sunnyvale, CA) durante 1 hora a 37 °C. Durante la incubación, las células PC-12 se prepararon como se describe para la evaluación del título. Las células (10 j l) y el complejo antígeno/anticuerpo (40 |jl) se transfirieron a una placa de HTRF, y se agitaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Tras la incubación, se añadieron 20 j l de mAb anti-AMPc marcado con criptato de Eu3+ (diluido 1:20) y 20 j l de AMPc marcado con d2 (diluido 1:20) en tampón de lisis, y la placa se incubó durante 1 hora mientras se agitaba. Tras la incubación, las placas se leyeron (excitación 330 nm, emisión 620/665 nm), y se determinó una relación de señal de 620:665.
[1100] Aislamiento de células B específicas del antígeno
[1101] Se aislaron células B específicas del antígeno (para métodos generales, véase la publicación de propiedad conjunta n.° WO 2014/146074). Las placas que contenían pocillos de interés se retiraron de -70 °C, y las células de cada pocillo se recuperaron utilizando cinco lavados de 200 j l de medio (10% de RPMI completo, 55 jM de pmercaptoetanol ("BME")) por pocillo. Las células recuperadas se peletizaron mediante centrifugación, y el sobrenadante se eliminó cuidadosamente. Despules, las células de cada pocillo se resuspendieron en 100 j l de medio, y se transfirieron a una placa de 96 pocillos. Las células se incubaron durante 90 minutos a 37 °C. Tras la incubación, se peletizaron por centrifugación, se tiñeron con un IgG anti-conejo marcado con isotiocianato de fluoresceína ("marcado con FITC") (concentración final de 6,25 jg/m l) (Creative Diagnostics, Shirley, NY), se lavaron con hasta 2 ml de tampón de separación celular activado por fluorescencia ("tampón FACS") (PBS de Dulbecco con 2% de FBS) y se resuspendieron en 250 j l de tampón de FACS.
[1102] Los pocillos de control de los mismos conjuntos de cultivos que eran similares en composición a los pocillos reunidos de interés se descongelaron y se tiñeron junto con los pocillos diana. Estas muestras se procesaron inicialmente en FACS (BD INFLUX™, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) y se establecieron puertas para IgG, viabilidad y parámetros físicos (dispersión frontal ("FSC")/dispersión lateral ("SSC")) que diferencian las células B de las células EL4 murinas. Una vez establecidas las puertas, se ejecutó la muestra de interés y las células viables, positivas para IgG que eran de una población física consistente (FSC/SSC) se clasificaron individualmente en pocillos de una placa de 96 pocillos precargada con mezcla maestra de RT-PCR. Se clasificaron más de 8 células por pocillo. Las placas clasificadas se retiraron del clasificador y se transfirieron directamente a termocicladores para PCR.
[1103] Amplificación y determinación de secuencias de anticuerpos de células B clasificadas por FACS
[1104] Las secuencias de anticuerpos se recuperaron utilizando un método combinado basado en RT-PCR a partir de una sola célula B clasificada. Se diseñaron cebadores que contenían enzimas de restricción para que se aparearan en regiones conservadas y constantes de los genes de inmunoglobulina diana (pesados y ligeros), tales como secuencias de inmunoglobulina de conejo, y se utilizó una recuperación de PCR anidada de dos etapas para amplificar la secuencia de anticuerpos. Se secuenciaron y analizaron los amplicones de cada pocillo. Se seleccionaron anticuerpos representativos de los grupos de secuencias resultantes para la expresión de proteínas recombinantes. Las regiones variables pesadas y ligeras originales amplificadas a partir de células de conejo se clonaron en vectores de expresión de la región constante de cadena pesada y ligera humana mediante digestión y ligadura con enzimas de restricción y mediante el método de Gibson. Se amplificaron y purificaron vectores que contenían ADN subclonado. Las secuencias de las cadenas pesadas y ligeras subclonadas se verificaron antes de la expresión.
[1105] Producción recombinante de anticuerpos monoclonales con especificidad antigénica y/o propiedades funcionales deseadas
[1106] Para determinar la especificidad del antígeno y las propiedades funcionales de los anticuerpos recuperados de células B específicas, los plásmidos de cadena pesada y ligera se cotransfectaron para generar anticuerpos quiméricos de conejo/humano para realizar pruebas. Brevemente, los plásmidos quiméricos pesados y ligeros se transfectaron transitoriamente en células h EK-293. Las transfecciones se dejaron incubar durante 5 a 7 días, y tras la cosecha, las células se peletizaron mediante centrifugación. Los sobrenadantes se enviaron para purificación a través de proteína A. Los anticuerpos quiméricos purificados resultantes se evaluaron entonces en una variedad de ensayos para confirmar la especificidad y la potencia.
[1107] Utilizando los métodos descritos anteriormente, se identificaron numerosos anticuerpos funcionales (antagonistas) que se unen a PACAP38 y PACAP27, o que se unen sólo a PACAP38, pero que no se unen, o no se unen de manera apreciable, al VIP. Las secuencias de polipéptidos y codificantes ejemplares de anticuerpos anti-PACAP antagonistas ejemplares están contenidas en la lista de secuencias biológicas incluida.
[1108] Los anticuerpos de longitud completa Ab10, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab20, Ab21, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4 utilizados en estos ejemplos se expresaron como polipéptidos de cadena pesada que tienen las secuencias de SEQ ID NOS: 401; 961; 1281; 1321; 1361; 1401; 441; 841; 1201; 881; 921; 1481; 1521; y 1561, respectivamente, y los polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NOS: 421; 981; 1301; 1341; 1381; 1421; 461; 861; 1221; 901; 941; 1501; 1541; y 1581, respectivamente. Los polipéptidos de cadena pesada de los anticuerpos Ab10, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab20, Ab21, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4 se expresaron a partir de los polinucleótidos de SEQ ID NOS: 411; 971; 1291; 1331; 1371; 1411; 451; 851; 1211; 891; 931; 1491; 1531; y 1571, respectivamente. Los polipéptidos de cadena ligera de los anticuerpos Ab10, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab 10.H5, Ab20, Ab21, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4 se expresaron a partir de los polinucleótidos de SEQ ID NOS: 431; 991; 1311; 1351; 1391; 1431; 471; 871; 1231; 911; 951; 1511; 1551; y 1591, respectivamente. Las características adicionales de dichos anticuerpos se identifican mediante SEQ ID NOS en las FIGs.1-12.
[1110] Especificidad de unión a antígeno de anticuerpos mediante ensayo de unión HTRF competitivo
[1112] A continuación se describen con más detalle las propiedades de unión y funcionales de los anticuerpos anti-PACAP38 y anti-PACAP27 ejemplares producidos de acuerdo con la invención.
[1114] Para identificar anticuerpos que se unen preferentemente a PACAP38 (SEQ ID NO: 1241) y PACAP27 (SEQ ID NO: 1242), pero no se unen a VIP (SEQ ID NO: 1243), o para identificar anticuerpos que se unen específicamente a PACAP38, pero no se unen apreciablemente a PACAP27, o no se unen apreciablemente a VIP, etc., se realizó un ensayo de unión HTRF de competición.
[1116] Paralelamente, se incubaron 10 |jl de una serie de diluciones de anticuerpos (concentración final más alta de 100 nM) con 10 j l de PACAP38 biotinilado N-terminal o C-terminal (35 nM final) solo, o en combinación con PACAP27 (350 nM final) o VIP (350 nM final), es decir, 10x PACAP27 o 10x VIP, respectivamente, en una placa HTRF. Se añadieron a cada pocillo 20 j l de donante anti-hu Fc marcado con criptato de Eu3+ y 20 j l de aceptor de estreptavidina marcado con d2, y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La fluorescencia se midió a 620 y 665 nm con un retraso de 300 js .
[1118] Las FIG. 13A-D proporcionan datos de unión representativos de Ab10, Ab20, Ab21 y Ab1.H a PACAP38 y a PACAP27, y la incapacidad del VIP para competir con la unión de PACAP38. La FIG. 13E y la FIG. 13F proporcionan datos de unión representativos de los anticuerpos anti-PACAP Ab22 y Ab23 a PACAP38, y la incapacidad de PACAP27 o VIP para competir con la unión de PACAP38. La falta de efecto del VIP en la unión a PACAP38 indicó su incapacidad para competir con la unión de PACAP38. Estos resultados demostraron que Ab10, Ab20, Ab21 y Ab1.H se unen a PACAP38 y PACAP27, pero no se unen (o no se unen apreciablemente) a VIP. Estos resultados también demostraron que Ab22 y Ab23 se unen a PACAP38, pero no se unen (o no se unen apreciablemente) a PACAP27 o VIP.
[1120] Los valores EC50, es decir, la concentración de un anticuerpo que produce una respuesta a mitad de camino entre el valor inicial y el valor máximo dentro de un período de tiempo específico, se calcularon para cada anticuerpo en función de sus curvas de unión y se muestran en la Tabla 1 a continuación. Los resultados demostraron que Ab10, Ab20, Ab21, Ab22 y Ab23 se unieron y reconocieron al PACAP38 humano con alta afinidad. Una forma humanizada del anticuerpo Ab1 identificada con una "H" añadida, es decir, Ab1.H, también se unió a PACAP38 con alta afinidad.
[1121] TABLA 1
[1124]
[1127] Capacidad de los anticuerpos anti-PACAP para neutralizar la producción de AMPc inducida por PACAP38 y PACAP27
[1129] Se probó la capacidad de los anticuerpos anti-PACAP para neutralizar la señalización PAC1-R inducida por PACAP38 e inducida por PACAP27 en un ensayo basado en células.
[1131] Para Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4 para identificar anticuerpos que neutralizaran la señalización inducida por PACAP38 y PACAP27 a través de PAC1-R, se incubaron soluciones de anticuerpos con PACAP38 a 4x la concentración final (100 pM) durante 1 hora, o con PACAP27 a 4x la concentración final (100 pM para Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22 y Ab23; y 1 nM para Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4) durante 1 hora. Mientras se incubaban los complejos anticuerpo/antígeno, las células PC-12 que expresaban PAC1-R (Banco de células de la Colección Japonesa de Recursos Biológicos de Investigación) se lavaron y se resuspendieron a 2 x 106 células por ml en medio de cultivo celular. Las células (10 |jl) y el complejo antígeno/anticuerpo (40 j l) se transfirieron a una placa de HTRF, y se agitaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Tras la incubación, se añadieron 20 j l de mAb anti-AMPc marcado con criptato de Eu3+ (diluido 1:20) y 20 j l de AMPc marcado con d2 (diluido 1:20) en tampón de lisis, y la placa se incubó durante 1 hora mientras se agitaba. Después de la incubación, las placas se leyeron (excitación 330 nm, emisión 620/665 nm), y se determinó una relación de señal de 620:665. La concentración final de PACAP38 en cada pocillo fue 0,1 nM, y la concentración final de PACAP27 en cada pocillo fue 0,1 nM para Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22 y Ab23; y 1 nM para Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4.
[1133] Las FIGs.16A-O(PACAP38) y 17A-O (PACAP27) muestran curvas de inhibición (para Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4) que son representativas de las curvas de inhibición obtenidas con los anticuerpos probados. Los resultados de inhibición se cuantificaron para cada anticuerpo para obtener un valor IC50, que se resumen en las Tablas 2 y 3 a continuación. Estos resultados demostraron que los anticuerpos anti-PACAP Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4 inhibieron el aumento de AMPc inducido por PACAP38 en células que expresaban PAC1-R (véanse las FIGs. 16A-O). Además, estos resultados demostraron que los anticuerpos anti-PACAP Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4, pero no Ab22 o Ab23, inhibieron el aumento de AMPc inducido por PACAP27 en células que expresaban PAC1-R (véanse las FIGS.17A-O).
[1135] TABLA 2
[1137]
[1140] TABLA 3
[1142]
[1145] Ejemplo 2: Afinidades de unión de los anticuerpos anti-PACAP
[1146] Las afinidades de unión de los anticuerpos monoclonales para PACAP humano se estimaron utilizando SPR en el PROTEON™ XPR36 (Bio-Rad, Hercules, CA). El anticuerpo se inmovilizó en la superficie de chips de acoplamiento de amina general ("GLC" o "GLM") (Bio-Rad, Hercules, CA). Se utilizó una serie de diluciones de PACAP38 humano (SEQ ID NO: 1241) preparado en tampón PBST 1x (fosfato de sodio 4,3 mM, fosfato de potasio 1,4 mM, NaCl 135 mM, KCl 2,7 mM, polisorbato-20 al 0,05%) adquirido de Teknova (n.° de cat. P1192, Teknova, Hollister, CA) y suplementado con 0,25 M de arginina (de J.T. BAKER®), BSA 0,2 mg/ml (Jackson Immuno Research Labs, West Grove, PA), y azida sódica al 0,005% (VWR International, Radnor, PA), con un pH ajustado a 7 para investigar los anticuerpos. El antígeno (que oscila de 1,23 nM a 100 nM) se ejecutó típicamente de manera secuencial con tiempos de asociación de 2-4 minutos y tiempos de disociación de 3-120 minutos agrupados con el software PROTEON™ Manager (v3.1.0.6 (Bio-Rad, Hercules, CA)), y se ajustó utilizando un modelo de unión de Langmuir 1:1. Las superficies se regeneraron entre consultas de analito utilizando ácido fosfórico al 0,85%. Se calculó una única Kd para cada anticuerpo con tiempos de asociación limitados cerca de la velocidad de difusión (1,0 X 106) y tiempos de disociación limitados a 1,5 X 10'5, en los que no se observó ninguna disociación perceptible.
[1148] Se utilizó el mismo procedimiento para determinar las afinidades de unión de los anticuerpos para VIP humano (SEQ ID NO: 1243) y PACAP27 (s Eq ID NO: 1242), aunque las concentraciones de péptidos variaron de 1,23 nM a 1000 nM con tiempos de asociación de 200 segundos y tiempos de disociación de 3 a 120 minutos.
[1150] Las afinidades de anticuerpos medidas para PACAP38 se enumeran en la Tabla 4.
[1152] TABLA 4
[1155]
[1158] En la Tabla 5 se enumeran ejemplos de constantes de afinidad de anticuerpos para VIP.
[1160] TABLA 5
[1163]
[1164]
[1167] En la Tabla 6 se enumeran ejemplos de constantes de afinidad de anticuerpos para PACAP27.
[1169] TABLA 6
[1172]
[1175] Los resultados de afinidad de unión de las Tablas 4 y 6 presentan datos que demuestran que Ab23 se unió débilmente a PACAP27 en comparación con su afinidad de unión por PACAP38. Las Tablas 4 y 6 también presentan datos que demuestran que Ab22 no reconoció específicamente a PACAP27, pero que Ab22 se unió específicamente a PACAP38.
[1177] Ejemplo 3: Inhibición de la señalización inducida por PACAP38 a través de VPAC1-R
[1179] Para identificar anticuerpos que neutralizan la señalización inducida por PACAP38 a través del VPAC1-R humano, se utilizaron células CHO-K1 que expresaban VPAC1-R humano en un ensayo basado en células cAMP HTRF. Las diluciones de anticuerpos se incubaron con PACAP38 a 4x la concentración final (5 nM) durante 1 hora. Mientras los complejos anticuerpo/antígeno se incubaban durante 1 hora, las células CHO-K1 que expresaban VPAC1-R (generadas en Alder Biopharmaceuticals, mediante transfección estable de células CHO-K1 (ATCC, catálogo n.° CCL-61) con ADNc de VPAC1-R humano; el clon 1 seleccionado se utilizó para ensayos basados en célulasin vitro)se separaron con tripsina al 0,25% durante 4 minutos. Las células se lavaron y se resuspendieron a 1x106 células por ml de medio de cultivo. Se mezclaron 20 |jl de mezcla de Ab/antígeno con 20 |jl de células en placas HTRF y se incubaron con agitación durante 30 minutos. Se añadieron 20 j l de mAb anti-cAMP marcado con criptato de Eu3+ (diluido 1:20) y 20 j l de cAMP marcado con d2 (diluido 1:20) en tampón de lisis a cada pocillo, y se incubaron durante 1 hora con agitación. La concentración final de PACAP38 en cada pocillo fue de 5 nM. Después de la incubación, las placas se leyeron (excitación 330 nm, emisión 620/665 nm), y se determinó una relación de señal de 620:665.
[1181] Las FIGs.18A-L son representativas de las curvas de inhibición obtenidas por este método (se muestran resultados para Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H3, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4, respectivamente). Los valores de IC50 calculados para cada anticuerpo, que se muestran a continuación en la Tabla 7, demostraron que Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H3, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4 inhibieron el aumento de AMPc inducido por PACAP38 en células que expresaban VPAC1-R humano.
[1182] TABLA 7
[1183]
[1186] Ejemplo 4: Inhibición de la señalización inducida por PACAP38 a través de VPAC2-R
[1188] Para identificar anticuerpos que neutralizan la señalización inducida por PACAP38 a través del VPAC2-R humano, se utilizaron células CHO-K1 que expresaban VPAC2-R humano en un ensayo basado en células cAMP HTRF. Las diluciones de anticuerpos se incubaron con PACAP38 a 4x la concentración final (1 nM) durante 1 hora. Mientras los complejos anticuerpo/antígeno se incubaban durante 1 hora, las células CHO-K1 que expresaban VPAC2-R (generadas en Alder Biopharmaceuticals, mediante transfección estable de células CHO-K1 (ATCC, catálogo n.° CCL-61) con ADNc de VPAC2-R humano; el clon 8 seleccionado se utilizó para ensayos basados en célulasin vitro)se separaron con tripsina al 0,25% durante 4 minutos. Las células se lavaron y se resuspendieron a 1x106 células por ml de medio de cultivo. Se mezclaron 20 |jl de mezcla de Ab/antígeno con 20 |jl de células en placas HTRF y se incubaron con agitación durante 30 minutos. Se añadieron 20 j l de mAb anti-cAMP marcado con criptato de Eu3+ (diluido 1:20) y 20 j l de cAMP marcado con d2 (diluido 1:20) en tampón de lisis a cada pocillo, y se incubaron durante 1 hora con agitación. La concentración final de PACAP38 en los pocillos fue 1 nM. Tras la incubación, las placas se leyeron (excitación 330 nm, emisión 620/665 nm), y se determinó una relación de señal de 620:665.
[1190] Las FIGS. 19A-L son representativas de las curvas de inhibición obtenidas por este método (se muestran resultados para Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H3, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4, respectivamente). Los valores de IC50 calculados para cada anticuerpo, que se muestran a continuación en la Tabla 8, demostraron que Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H3, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4 inhibieron el aumento de AMPc inducido por PACAP38 en células que expresaban VPAC2-R humano.
[1191] TABLA 8
[1193]
[1194]
[1197] Ejemplo 5: Inhibición de la unión de PACAP38 a células que expresan PAC-1-R
[1199] Para identificar anticuerpos que bloquean la unión de PACAP38 a las células que expresan PAC1-R, se utilizaron células PC-12 adherentes (ATCC, Manassas, VA) que expresan PAC1-R en un ensayo de unión de células que expresan PAC1-R basado en europio. Las soluciones de anticuerpos se incubaron con PACAP38 biotinilado N-terminal a 10x la concentración final (100 nM o 30 nM) durante 1 hora, luego se añadieron a células PC-12 que se sembraron 24 horas antes en placas de 96 pocillos con fondo transparente negro (COSTAR™, Corning Incorporated, Corning, NY), y se incubaron durante 1 hora más a temperatura ambiente. Después de tres lavados, las células se incubaron con 20 |jl de estreptavidina marcada con europio (PerkinElmer, Waltham, MA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces, luego se añadieron 20 j l de solución de mejora DELFIA® (PerkinElmer, Waltham, MA) a cada pocillo, y se incubaron durante 15 minutos con agitación suave. Las placas se leyeron (fluorescencia resuelta en el tiempo ("TRF")) en un lector de placas SPECTRAMAX® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
[1201] Las FIGs.14A-H son representativas de las curvas de inhibición obtenidas por este método (los resultados se muestran para Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22 y Ab23, respectivamente) en las que las células que expresaban PAC1-R eran células PC-12. Los valores de IC50 calculados para cada anticuerpo, que se muestran a continuación en la Tabla 9, demostraron que Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22 y Ab23 inhibieron la unión de PACAP38 a las células PC-12 que expresan PAC1-R.
[1203] TABLA 9
[1205]
[1208] Ejemplo 6: Unión de anticuerpos anti-PACAP mediada por PACAP38 a la superficie celular de células que expresan PAC1-R
[1210] Para identificar anticuerpos anti-PACAP que se unen, a través de PACAP38, a la superficie celular de las células que expresan PAC1-R, se utilizaron células PC-12 adherentes (Banco de células de la Colección Japonesa de Recursos Biológicos de Investigación) que expresaban PAC1-R en un ensayo basado en la unión a la superficie celular. Para realizar el experimento de unión, primero se sembraron células PC-12 que expresaban PAC1-R en placas de fondo sólido blancas de 96 pocillos Corning (Corning, Corning, NY). Las células se sembraron inicialmente a razón de 1x105 células/pocillo en una solución de RPMI completo ("cRPMI": medio RPMI suplementado con 10% de FBS estéril inactivado por calor y 1% de antibiótico/antimicótico estéril) 10% de FBS, y las placas se dejaron incubar durante la noche a 37 °C. El día del ensayo de unión, se diluyeron anticuerpos a una concentración inicial de 15 |jg/ml en una proporción 1:3 en tampón de unión DELFIA® (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, azida al 0,1%, suero de caballo al 2%) (Perkin-Elmer, Waltham, MA) hasta un volumen total de 60 j l en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se preparó PACAP38 para el ensayo de unión diluyéndolo en tampón de unión DELFIA® a una concentración de 200 nM, y luego se añadieron 60 j l del PACAP38 diluido a cada uno de los pocillos que contenían anticuerpos para formar complejos anticuerpo:antígeno. Después de la adición de PACAP38, los complejos anticuerpo:antígeno se incubaron a temperatura ambiente en un agitador durante 1 hora. Por separado, las células PC-12 se prepararon para la adición de complejos de anticuerpo: antígeno lavando las células dos veces con tampón de lavado DELFlA® (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% de azida) (Perkin-Elmer, Waltham, MA). Después de lavar las células dos veces y tras 1 hora de incubación a temperatura ambiente de los complejos anticuerpo:antígeno, se añadieron 50 j l del complejo anticuerpo:antígeno a cada pocillo que contenía células. Después, las mezclas de células y complejos anticuerpo:antígeno se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de esta incubación de 30 minutos, cada mezcla se lavó dos veces con tampón de lavado DELFIA® (Perkin-Elmer, Waltham, MA).
[1212] El reactivo de detección de IgG anti-humana marcado con europio DELFIA® (Cat # 1244-330, Perkin-Elmer, Waltham, MA) se diluyó a una concentración de 300 ng/ml en tampón de unión DELFIA®. Después de la dilución, se añadieron 50 j l del reactivo de detección de IgG anti-humana a cada pocillo que contenía células, y luego se realizó una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente después de esta adición de reactivo de detección de IgG. Después de completar la incubación a temperatura ambiente de 30 minutos, las células se lavaron dos veces con tampón de lavado DELFIA®. A continuación, se añadieron 50 j l de solución de mejora DELFIA® (Cat. n.° 1244-105, Perkin-Elmer, Waltham, MA) a cada pocillo que contenía células para una incubación final a temperatura ambiente de 15 minutos con agitación. Entonces se leyeron las placas (TRF, excitación 330 nm, emisión 620 nm) en un lector de placas SPECTRAMAX® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
[1214] Las FIGS. 15A-O son representativas de las curvas de unión obtenidas por este método (se muestran resultados para Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4, respectivamente) en las que las células que expresaban PAC1-R eran células PC-12. Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4 demostraron una unión limitada a la superficie de las células que expresan PAC1-R en presencia de PACAP38. Ab1.H demostró una fuerte unión a la superficie de las células que expresaban PAC1-R en presencia de PACAP38, mientras que Ab20, Ab21, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4 y Ab10.H5 no parecieron unirse de manera apreciable a la superficie de las células que expresaban PAC1-R utilizando este ensayo. La fuerte unión del anticuerpo Ab1.H y la unión limitada de Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4 a la superficie celular de las células PAC1-R sólo se observó en presencia de PACAP38. Sin intención de limitarse a la teoría, se plantea la hipótesis de que la unión, ya sea fuerte o limitada, de los anticuerpos a la superficie celular estaba mediada por la unión de PACAP38 a los GAG que estaban presentes en la superficie celular, ya que la unión de PACAP38 por los GAG se ha demostrado previamente como un mecanismo independiente del receptor PAC1-R de unión e internalización de PACAP38 por las células PC-12 (véase Doan et al. (2012), Juhász et al. (2014), y Neree et al. (2015)).
[1216] Ejemplo 7: Inhibición de la vasodilatación dérmica inducida por PACAP38 en conejos por el anticuerpo anti-PACAP Ab1.H
[1218] Se ha demostrado que la inyección intradérmica de PACAP38 provoca una vasodilatación localizada en conejos y humanos (Warren et al., J. Cardio. Pharmacol., 29(1): 83-87 (1992); y Seelinger et al., Am. J. Path., 177(5):2563-2575, 2010). Se realizó un estudio de eficaciain vivopara determinar la actividad de Ab1.H para inhibir una vasodilatación dérmica localizada inducida por una inyección intradérmica de PACAP38 en conejos blancos de Nueva Zelanda machos.
[1220] A grupos de 4 conejos se les administró una dosis de 90 mg/kg de Ab1.H o de un vehículo de control negativo (25 mM de histidina, 250 mM de sorbitol, pH 6,0). Las inyecciones se realizaron mediante administración en bolo intravenoso (vena de la oreja) el día 0. Antes de cada exponsición a PACAP38 en conejos, se cortó el pelo de la región escapular de cada animal y se limpió con alcohol al 20% (v/v) en agua. El día 2, los animales se preanestesiaron con hidrocloruro de ketamina y se mantuvieron bajo anestesia profunda con gas isoflurano. Se identificaron cuatro sitios (Región de interés ("ROI")) para la inyección en la espalda de cada animal utilizando un marcador permanente SHARPIE®. La vasodilatación dérmica y la perfusión sanguínea se monitorizaron utilizando el sistema PeriCam PSI NR para imágenes de análisis de contraste de moteado láser ("LASCA") (Perimed, Jarfalla, Suecia), antes (línea de base) y durante 35 minutos después de la exposición intradérmica a PACAP38. La exposición intradérmica a PACAP38 se realizó de la siguiente manera: cada animal recibió administraciones intradérmicas únicas (100 jl/sitio) de vehículo (un sitio o ROI) y PACAP38 a 30 pmoles/sitio (3 sitios o 3 ROI). Las tasas de perfusión sanguínea para cada ROI fueron informadas por el sistema PeriCam PSI NR en unidades de perfusión ("PU") y analizadas utilizando PIMSoft (Ver. 1.5, Perimed, Jarfalla, Suecia).
[1222] Para cada grupo de tratamiento, se calculó el cambio relativo de %PU tras la administración de Ab1.H o control negativo en comparación con el valor inicial para cada ROI (cambio de %PU para cada sitio de desafío PACAP38 - cambio de %PU para el sitio del vehículo). El cambio relativo de %PU en el grupo Abl.H se comparó con el cambio relativo de %PU en el grupo de control negativo realizando una evaluación estadística de la prueba de la t no pareada de dos colas utilizando el software GraphPad Prism (versión 5.0d, GraphPad Software, La Jolla, CA).
[1223] La FIG. 20 demuestra que Ab1.H inhibió la vasodilatación dérmica inducida por PACAP38 en conejos, lo que indica la eficacia del anticuerpo para neutralizar la actividad de PACAP38in vivo.
[1225] Ejemplo 8: Inhibición de la vasodilatación dérmica inducida por PACAP38 en conejos por el anticuerpo anti-PACAP Ab10
[1227] Se ha demostrado que la inyección intradérmica de PACAP38 provoca una vasodilatación localizada en conejos y humanos (Warren et al., 1992; y Seelinger et al., 2010). Se realizó un estudio de eficaciain vivopara determinar la actividad de Ab10 para inhibir una vasodilatación dérmica localizada inducida por una inyección intradérmica de PACAP38 en conejos blancos de Nueva Zelanda machos.
[1229] A grupos de 4 conejos se les administró 72 mg/kg de Ab10 o un control de anticuerpo de isotipo. Las inyecciones se realizaron mediante administración intravenosa en bolo (vena de la oreja) el día 0. Antes de cada exponsición a PACAP38 en conejos, se cortó el pelo de la región escapular de cada animal y se limpió con alcohol al 20% (v/v) en agua. El día 2, los animales se preanestesiaron con hidrocloruro de ketamina y se mantuvieron bajo anestesia profunda con gas isoflurano. Se identificaron cuatro sitios (ROI) para inyección en la espalda de cada animal utilizando un marcador permanente SHARPIE®. La vasodilatación dérmica y la perfusión sanguínea se monitorizaron utilizando el sistema PeriCam PSI NR para imágenes LASCA (Perimed, Jarfalla, Suecia), antes (línea de base) y durante 35 minutos después de la exposición intradérmica a PACAP38. La exposición intradérmica a PACAP38 se realizó de la siguiente manera: cada animal recibió administraciones intradérmicas únicas (100 jl/sitio) de vehículo (un sitio o ROI) y PACAP38 a 30 pmoles/sitio (3 sitios o 3 ROI). Las tasas de perfusión sanguínea para cada ROI fueron informadas por el sistema PeriCam PSI NR en PU y analizadas utilizando PIMSoft (Ver. 1.5 (Perimed, Jarfalla, Suecia)).
[1231] Para cada grupo de tratamiento, se calculó el cambio relativo de %PU tras la administración de Ab10 o control de Ab de isotipo en comparación con el valor inicial para cada ROI (cambio de %PU para cada sitio de desafío PACAP38 - cambio de %PU para el sitio del vehículo). El cambio relativo de %PU en el grupo Ab10 se comparó con el cambio relativo de %PU en el grupo de control de Ab de isotipo realizando una evaluación estadística de la prueba de la t no pareada de dos colas utilizando el software GraphPad Prism (versión 5.0d, GraphPad Software, La Jolla, CA).
[1233] La FIG. 21 demuestra que Ab10 inhibió la vasodilatación dérmica inducida por PACAP38 en conejos, lo que indica la eficacia del anticuerpo para neutralizar la actividad de PACAP38in vivo.
[1235] Ejemplo 9: Agrupación de epítopos de anticuerpos anti-PACAP, Ab1 y Ab10
[1237] Ab1 se biotiniló en una proporción molar de 10:1 con biotina (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) según las pautas del fabricante. Se realizó un experimento de interferometría de biocapa de 5 etapas de la siguiente manera: En la etapa 1, los biosensores de estreptavidina (Pall ForteBio LLC, Menlo Park, CA) se equilibraron durante 50 segundos en un tampón cinético 1x (una dilución 1:10 en DBS de Pall ForteBio LLC, Menlo Park, CA, cat. n.° 18­ 5032). En la etapa 2, una dilución de 2 |jg/ml del anticuerpo biotinilado Ab1 en tampón cinético 1x se inmovilizó durante 500 segundos sobre biosensores de estreptavidina. En la etapa 3, los biosensores funcionalizados con anticuerpos se incubaron en una solución de péptido PACAP no marcado 2 jM (American Peptide Company, Sunnyvale, CA, catálogo n.° 34-0-20) en tampón cinético 1x durante 200 segundos. En la etapa 4, los sensores se colocaron en soluciones de 67 nM de anticuerpo no marcado Ab10 (FIG. 22A) o de anticuerpo no marcado Ab1 como control (FIG. 22B) en tampón cinético 1x durante una etapa de asociación de 1000 segundos. La estabilidad de la unión se controló durante la etapa 5 durante una disociación de 1000 segundos en un tampón cinético 1x. En la FIG. 22A, la captura "estilo sándwich" de Ab10 a través de PACAP capturado por Ab1 indica una unión simultánea y no competitiva de estos dos anticuerpos a PACAP. El experimento de control en la FIG. 22B muestra una captura mínima "estilo sándwich" de Ab1 a través de PACAP capturado por Ab1. El experimento se llevó a cabo en un instrumento ForteBio OCTET® QK (Pall ForteBio LLC, Menlo Park, CA) a 30 °C y 1000 RPM.
[1239] Ejemplo 10: Inhibición de la unión de PACAP27 a PAC1-R humano por anticuerpos anti-PACAP
[1241] Para identificar los anticuerpos que bloquean la unión de PACAP27 a PAC1-R, los anticuerpos a una concentración inicial de 30 nM se diluyeron en un tampón de incubación (50 mM Hepes pH 7,4, 1 mM CaCh, 5 mM MgCh, 0,2% BSA) y se realizaron diluciones seriadas 1:3. Después, las diluciones de anticuerpos (30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 0,3 nM, 0,1 nM, 0,03 nM, 0,01 nM, 0,003 nM y 0,001 nM) se mezclaron y preincubaron a 25 °C durante 30 minutos con 0,1 nM de PACAP27 marcado con 125I en tampón de incubación. El anticuerpo: la mezcla de PACAP27 marcada con 125I se añadió entonces a alícuotas de 0,5 jg de membranas celulares derivadas de células Chem-1 que expresan la isoforma larga de PAC1-R recombinante humano en tampón de incubación. La mezcla se incubó durante 1 hora a 25 °C. Tras la incubación, las muestras se filtraron y se lavaron. Posteriormente, los filtros se contaron para cuantificar el PACAP27 marcado con 125I. Como control experimental, se estimó la unión no específica a las membranas celulares utilizando 0,1 |jM de PACAP27 marcado. Los resultados indicaron que Abl.H, Ab10.H, Ab10.H3 y Ab21.H fueron capaces de bloquear la unión de PACAP27 a PAC1-R, demostrando así la inhibición de la unión ligando-receptor por los anticuerpos probados presentados en la Tabla 10.
[1243] Tabla 10
[1246]
[1249] Ejemplo 11: Efecto del anticuerpo anti-PACAP sobre la aversión a la luz
[1251] Para examinar el efecto de los anticuerpos anti-PACAP sobre la fotofobia, se utilizó un modelo de ratón en el que se administró a los ratones PACAP para desencadenar la fotofobia. La fotofobia se detectó mediante un ensayo de aversión a la luz utilizando una caja de luz-oscuridad como se describe en Kaiser et al., J. Neurosci., 32(44):15439-15449, 2012. A los ratones se les administraron entonces anticuerpos anti-PACAP Abl.H, Ab10.H o Ab10.H3 o un anticuerpo de control no relacionado, y se cuantificó su aversión a la luz. Los resultados se reflejan en las FIGS. 23-25, FIG. 32 y FIG. 33A-33B.
[1253] Ensayo de aversión a la luz
[1255] Como describen Kaiser et al., las cámaras de prueba eran un campo abierto de plexiglás (27 cm de ancho * 27 cm de profundidad * 20,3 cm de alto) que contenía tres conjuntos de 16 haces infrarrojos (dos conjuntos de haces perpendiculares se cruzan a una altura de 1,0 cm para detectar la ubicación y locomoción del ratón, y el tercer haz cruza el ancho de la cámara a una altura de 7,3 cm para detectar la actividad vertical). El campo estaba dividido en dos zonas de igual tamaño por un inserto oscuro, que es una caja de plexiglás de cinco lados, de color negro, con una tapa pero sin piso. El uso de rayos de luz infrarrojos permitió el seguimiento en ambas zonas. Una abertura (5,2 cm * 6,8 cm) en el inserto oscuro permitió el libre movimiento entre zonas. Aunque el inserto oscuro bloqueaba la luz directa, aún podía entrar algo de luz a través de la abertura. Cada cámara de prueba estaba ubicada dentro de un cubículo de atenuación de sonido (56 cm de ancho * 38 cm de profundidad * 36 cm de alto) con un ventilador para ventilación (Med Associates, Inc®, St. Albans, VT). Se utilizó una computadora que utiliza Activity Monitor v6.02 (Med Associated Inc.) para registrar datos de las seis cámaras.
[1257] Para cada cámara se fijó un panel LED al techo del cubículo de atenuación de sonido. El panel LED contiene 36 LED colimados de 1 vatio (luz blanca diurna de 5500 k) (LEDwholesalers.com, Burlingame, CA). Para controlar la intensidad de la luz, cada panel LED se conectó a un controlador LED regulable (LINEARdrive®; eldoLED America Inc., San José, CA), lo que generó un rango potencial de intensidad de luz de 3,0*102 a 2,7*104 lx. Los niveles se atenuaron aún más a 5,5 * 101 lx utilizando papel encerado colocado sobre una bandeja de plexiglás transparente debajo de los LED. La intensidad de la luz se midió con un fotómetro de pantalla dual trazable (Control Company, Friendswood, TX) colocado en el piso de la cámara de pruebas. A 2,7*104 lx, las luces LED generaron algo de calor en la cámara de atenuación de sonido con la zona oscura a ~25 °C y la zona clara a ~27 °C.
[1259] El día del experimento, los ratones se transportaron desde el alojamiento de los animales y se les permitió aclimatarse a la sala de pruebas (~22 °C) durante al menos 30 a 60 minutos con iluminación fluorescente estándar en el techo (~200 lx dentro de la jaula de alojamiento). Las luces de la habitación permanecieron encendidas, a menos que se indique lo contrario. Además, todos los equipos generadores de sonido se encendieron durante la aclimatación y permanecieron encendidos hasta que se completó la prueba. Hubo mínima presencia humana en la sala durante la aclimatación. Las pruebas de comportamiento se realizaron entre las 08:00 CST y las 14:00 CST. Se registraron todas las condiciones físicas anormales (por ejemplo, ausencia de un ojo).
[1261] En el estudio se utilizaron ratones CD1 machos y hembras de diez semanas de edad (raza n.° 022, Charles River, Wilmington, MA, EE. UU.). Se permitió que los ratones se recuperaran del transporte durante una o dos semanas antes de la prueba.
[1263] Aclimatación
[1265] Todos los ratones se aclimataron en la sala de pruebas al menos 30 a 60 minutos antes de ser colocados en la cámara de luz/oscuridad. La intensidad de la luz en la cámara se ajustó inicialmente a 2,7 x 103 lx. Los ratones se probaron durante treinta minutos en la cámara todos los días que estuvieron expuestos a la cámara de luz/oscuridad. El tiempo de referencia en luz para cada ratón se obtuvo exponiendo a los ratones a la cámara de luz/oscuridad dos veces, con un período de descanso de tres días entre las mediciones de referencia (FIGS. 23 y 25, "Valor inicial 1" y "Valor inicial 2", o "Valor inicial", respectivamente, y FIG. 32, "Valor inicial").
[1267] Tratamiento
[1269] En las FIGS. 25 y 32, a los ratones se les administró 0,6 mg/kg de PACAP mediante inyección i.p., y descansaron durante 30 minutos. Después, los ratones se colocaron en la cámara de luz/oscuridad durante 3o minutos (FIGS.
[1270] 25 y 32, "Tratamiento 1"). Después de un período de descanso de tres días que siguió a las mediciones del Valor inicial 1 y el Valor inicial 2 de la FIG. 23 o a las mediciones del Tratamiento 1 de las FIGS. 25 y 32, a los ratones se les administraron 30 mg/kg de anticuerpo anti-PACAP o anticuerpo IgG de control (anticuerpo de control negativo que tiene el mismo marco que los anticuerpos probados y que reconoce digoxigenina) mediante inyección i.p. Los ratones se devolvieron entonces a su jaula para descansar durante un día (24 horas) antes de la prueba. A los ratones se les administró entonces 0,6 mg/kg de PACAP o vehículo mediante inyección i.p., y descansaron durante 30 minutos. Los ratones se colocaron entonces en la cámara de luz/oscuridad durante 30 minutos (FIG.
[1271] 23, "Tratamiento" FIGS. 25 y 32, "Tratamiento 2"). Después de exponer cada ratón a la cámara de luz/oscuridad, la cámara de luz/oscuridad y sus componentes se limpiaron con toallitas germicidas y se secaron. Alrededor de 5 a 7 minutos después de colocar a un ratón en la cámara de luz/oscuridad, al siguiente ratón que se iba a evaluar se le inyectó PACAP o vehículo, como se describió anteriormente. Este intervalo fue aproximadamente el tiempo necesario para limpiar la cámara de luz/oscuridad entre experimentos.
[1273] Mediciones de movilidad
[1275] La movilidad se midió a intervalos de 5 minutos durante el período de prueba de 30 minutos como se describe en Kaiser et al., J. Neurosci., 2012. Brevemente, se midió el número de movimientos verticales, tales como levantarse, distancia ambulatoria (cm, la distancia total recorrida durante el estado de movimiento ambulatorio), transiciones, y descanso (porcentaje de tiempo empleado sin romper nuevos haces), mediante un haz de luz. Todos los parámetros de movilidad se normalizaron al tiempo transcurrido en cada zona para tener en cuenta la diferente cantidad de tiempo transcurrido en esa zona; por lo tanto, el valor bruto de cada parámetro se dividió entre el tiempo transcurrido en esa zona durante el intervalo de 5 minutos. El tiempo pasado en cada cámara se analizó utilizando el software GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA), y se informó como media ± error estándar de la media ("SEM"). La comparación se calculó mediante ANOVA de medidas repetidas de dos vías, con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni para el análisis post-hoc.
[1277] Los ratones se excluyeron según tres criterios: (1) después de las dos primeras exposiciones a la caja, se analizó el tiempo de referencia en luz, y cualquier ratón que pasó /- una desviación estándar del tiempo medio en luz al inicio fue retirado del experimento y no se le administró tratamiento farmacológico, (2) los ratones se excluyeron del análisis si se identificaron como valores atípicos estadísticos (diagrama de caja, 10-90%), y (3) los ratones se excluyeron si se movieron menos del 10% del tiempo (luz y oscuridad combinadas).
[1279] En tres experimentos que compararon la respuesta de ratones a los que se les administró el anticuerpo Ab1.H, Ab10.H o Ab10.H3 con el control de IgG, los resultados indican que los ratones a los que se les administró el anticuerpo anti-PACAP Ab1.H, Ab10.H o Ab10.H3 pasaron más tiempo bajo la luz en comparación con los ratones de control de IgG. La FIG. 23 muestra que los ratones se comportaron de manera normal y similar en ambas mediciones iniciales. Por otra parte, los datos proporcionados en la FIG. 23 muestran que los ratones tratados con el anticuerpo IgG de control y luego PACAP pasaron estadísticamente menos tiempo en la luz (cuadrados) que los ratones a los que se les administró el anticuerpo anti-PACAP Ab1.H y luego PACAP (círculos). (Véase FIG. 23, “Tratamiento”). Los datos proporcionados en la FIG. 25 también muestran que los ratones se comportaron de manera normal y similar en las mediciones iniciales. Por otra parte, los datos proporcionados en la FIG. 25 muestran que los ratones tratados con el anticuerpo IgG de control y luego PACAP pasaron estadísticamente menos tiempo en la luz (triángulos) que los ratones a los que se les administró el anticuerpo anti-PACAP Ab10.H y luego PACAP (triángulos invertidos). (Véase, FIG. 25, “Tratamiento 2”). El tiempo entre cada medición, por ejemplo entre el Valor inicial y el Tratamiento 1 (sólo PACAP), por ejemplo entre el Tratamiento 1 (sólo pAc a P) y el Tratamiento 2 (anticuerpo seguido de PACAP), fue de tres días. Los datos proporcionados en la FIG. 32 también muestran que los ratones se comportaron de manera normal y similar en las mediciones iniciales. Por otra parte, los datos proporcionados en la FIG. 32 muestran que los ratones tratados con el anticuerpo IgG de control y luego PACAP pasaron estadísticamente menos tiempo en la luz (triángulos) que los ratones a los que se les administró el anticuerpo anti-PACAP Ab10.H3 y luego pAc AP (triángulos invertidos). (Véase, FIG. 32, “Tratamiento 2”). El tiempo entre cada medición, por ejemplo Valor inicial y Tratamiento 1 (sólo PACAP), por ejemplo Tratamiento 1 (sólo PACAP) y Tratamiento 2 (anticuerpo seguido de PACAP), fue de tres días. Se proporciona la media ± SEM para cada intervalo de 5 minutos. Los ratones a los que se les administró el vehículo sólo se comportaron como controles normales. Los datos proporcionados en la FIG. 24 muestran que la administración del anticuerpo anti-PACAP Ab1.H o IgG de control y vehículo ("Veh PAC Ab" y "Veh Con Ab", respectivamente) no alteró notablemente el comportamiento del ratón. La FIG. 24 también muestra que el tiempo promedio del ratón en la luz disminuyó cuando se administró PACAP e IgG de control ("PACAP Con Ab"), mientras que los ratones a los que se administró el anticuerpo anti-PACAP Abl.H y PACAP exhibieron un comportamiento normal, no sensible a la luz ("PACAP PAC Ab").
[1281] Las FIG. 33A-33B resume datos que resumen los datos presentados en la FIG. 32, de modo que el tiempo total en luz durante todo el período de observación de 30 minutos para cada animal individual en la línea base, el tratamiento 1 y el tratamiento 2 se presentan para los animales en los grupos de anticuerpos de isotipo (FIG. 33A) y los animales en los grupos de Ab10.H3 (FIG. 33B).
[1283] Ejemplo 12: Cartografiado de epítopos de anticuerpos anti-PACAP
[1285] Para determinar los epítopos contenidos en PACAP a los que se unen los anticuerpos anti-PACAP de la invención, se utilizaron experimentos de barrido de alanina. Para realizar estos experimentos, se sintetizaron péptidos PACAP con una única mutación puntual en cada posición reemplazando el aminoácido nativo por una alanina ("Ala"), y se midieron las consecuencias de una única mutación puntual con respecto a la afinidad de unión de PACAP y un anticuerpo. Dado que un residuo de alanina ya ocupa las posiciones 18, 24 y 25 del PACAP de tipo salvaje, según la convención, estos residuos de Ala se reemplazaron por valina ("Val") para determinar los posibles efectos de la eliminación de la alanina en estas posiciones sobre la unión de los anticuerpos anti-PACAP en cuestión a PACAP. Según la convención habitual, estos mutantes Ala se etiquetaron de acuerdo con la posición en PACAP 1-38 seguida del código de letras del aminoácido sustituido, por ejemplo 10A indica PACAP 1-38 sustituido con alanina en la posición de aminoácido 10. La unión de anticuerpos monoclonales para PACAP humano y cada péptido mutante se detectó utilizando SPR en PROTEON™ XRP36 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Las muestras y los controles de muestra se inmovilizaron en un chip sensor GLC PROTEON™ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) a una sola densidad utilizando acoplamiento de amina estándar. El tampón de ejecución utilizado para la inmovilización fue DPBS modificado (HYCLONE™, GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA), y la inmovilización se realizó a 25 °C. El chip sensor PROTEON™ GLC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) se inicializó y preacondicionó según el protocolo del fabricante (inyecciones bidireccionales de SDS al 0,5%, NaOH 50 mM y HCl 100 mM). El proceso de inmovilización se realizó por etapas para garantizar un anticuerpo único en los puntos del chip PROTEON™ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). La superficie del chip se activó con una mezcla 1:1 de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida/N-hidroxisuccinimida ("EDAC/NHS") y un caudal de 30 |jl/min x 5 minutos. Las muestras de anticuerpos se dializaron previamente o se intercambiaron con HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2, y la concentración de anticuerpos se cuantificó utilizando un espectrofotómetro NANODROP™2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). La inmovilización tuvo como objetivo entre 2.000 y 3.000 unidades de respuesta ("RU"). Se hicieron fluir muestras de anticuerpos (5 jg/m l) en acetato de sodio 10 mM, pH 5,5, a 30 jl/m in x 4 minutos. La desactivación se logró a un caudal de 30 jl/m in durante 5 minutos utilizando etanolamina 0,3 M concomitantemente con la siguiente activación.
[1287] Después de la inmovilización, el tampón de ejecución se cambió a 1x PBST (fosfato de sodio 4,3 mM, fosfato de potasio 1,4 mM, NaCl 135 mM, KCl 2,7 mM, T<w>EEN® 0,05%) con 0,2 M de hidrocloruro de arginina (para reducir la unión no específica), BSA (0,2 mg/ml, como vehículo) y PROCLIN300® (0,005% como conservante, Sigma Aldrich, St. Louis, MO), y se dejó que la superficie del chip se reequilibrara con una inyección de nuevo tampón de ejecución. Se añadieron soluciones madre de péptido PACAP humano (1-38) y péptidos mutantes de alanina/valina (Peso(s) molecular(es): 4,5 kD a una concentración de 1 mg/ml al tampón de ejecución hasta alcanzar concentraciones finales de 0,45 jg/m l (100 nM). Estas mezclas se utilizaron luego para interrogar puntos individuales en la superficie del chip con caudales de 100 jl/m in x 2 minutos, y se dejaron disociar durante 600 segundos. Las superficies del chip se regeneraron entre analitos mediante la adición de ácido fosfórico al 0,85%. Cada uno de los anticuerpos Ab10, Ab20, Ab21, Ab22 y Ab23 se examinaron en las mismas condiciones que se describen aquí.
[1289] Se evaluaron sensorgramas que representan datos de afinidad de la unión del péptido mutante a un panel de anticuerpos utilizando múltiples parámetros. Primero se realizó una inspección visual de cada sensorgrama para evaluar la respuesta máxima aparente ("Rmax") con respecto al péptido PACAP de tipo salvaje (1-38). En segundo lugar, se realizó una inspección visual de la fase de disociación con énfasis en la forma de la curva con respecto al péptido PACAP de tipo salvaje. Se calcularon las tasas de disociación para el péptido PACAP de tipo salvaje y la unión de cada péptido mutante al panel de anticuerpos. Finalmente, como experimento de control para confirmar la integridad de cada variante de péptido (tipo salvaje o mutante), se determinó individualmente la afinidad de unión de cada miembro de la biblioteca de péptidos para cada miembro de un panel de anticuerpos que se sabía que se unían al PACAP de tipo salvaje, para asegurar que cada péptido PACA<p>mutante Ala exhibiera una afinidad de unión que fuera similar a la afinidad de unión del péptido PACAP de tipo salvaje. La evaluación colectiva de todos los parámetros descritos identificó residuos de aminoácidos PACAP importantes para la unión PACAP/anticuerpo.
[1290] Los datos de unión y disociación se muestran en las FIGS. 26A-30B para la unión de los anticuerpos Ab10, Ab20, Ab21, Ab22 y Ab23 a PACAP de tipo salvaje y mutantes de PACAP. El panel superior de cada figura contiene los datos de unión de los residuos en PACAP que parecen ser importantes para la unión de anticuerpos (etiquetados en el extremo derecho del gráfico, por ejemplo, "10A" indica los datos de unión del mutante que contiene alanina en la posición 10 de PACAP). El panel inferior proporciona puntos de datos que representan el grado de unión de los mutantes de alanina PACAP restantes, es decir, los mutantes de alanina PACAP que se unieron al anticuerpo probado similar al PACAP de tipo salvaje. En base a esto, se determinó que el residuo probablemente no sea importante para la unión del anticuerpo. Como control positivo, los paneles superior e inferior de cada figura también revelan los datos de unión obtenidos utilizando PACAP de tipo salvaje (etiquetado como huPACAP(1-38)).
[1291] La FIG. 31A-B resume las posiciones de residuos de PACAP determinadas para contribuir a la afinidad de unión del anticuerpo según los datos obtenidos en estos estudios de barrido de alanina. Las posiciones enumeradas en cada columna identifican los mutantes de barrido de alanina PACAP cuya mutación condujo a una disminución en la afinidad de unión PACAP/anticuerpo. Las posiciones de los residuos se enumeran en la columna 3 de la FIG.
[1292] 31A-B de acuerdo con la disposición espacial de los residuos a lo largo de la secuencia primaria PACAP (desde el residuo de aminoácido 1-38). Se interpretó que las posiciones de residuos de PACAP que más contribuyen a la unión del anticuerpo comprenden conjuntamente los epítopos unidos por cada anticuerpo. Con base en los datos obtenidos en estos estudios de barrido de alanina, se concluyó que los epítopos unidos por cada anticuerpo comprendían los siguientes residuos:
[1294] (i) Ab10: residuos 19, 22, 23 y 27 de PACAP humano.
[1296] (ii) Ab20: residuos 19, 22, 23, 24 y 27 de PACAP humano.
[1298] (iii) Ab21: residuos 19, 22, 23 y 27 de PACAP humano.
[1300] (iv) Ab22: residuos 22, 23, 27, 28 y 31 de PACAP humano.
[1302] (v) Ab23: residuos 12, 20, 23, 24, 26, 27 y 28 de PACAP humano.
[1304] Se observó además, en base a los resultados experimentales del barrido de alanina, que la afinidad de cada uno de los anticuerpos Ab10, Ab20, Ab21, Ab22 y Ab23 por PACAP involucra o depende de los residuos 19, 22, 23 y/o 27 del PACAP humano.
[1306] Además, se observó que la afinidad de cada uno de los anticuerpos Ab22 y Ab23 por PACAP involucra o requiere residuos de aminoácidos específicos que están presentes en el PACAP38 de tipo salvaje humano, pero que no están presentes en el PACAP27 de tipo salvaje humano, por ejemplo los residuos 28 y 31 de PACAP38.
[1308] Con respecto a los resultados del barrido de alanina anteriores, las variantes humanizadas de los anticuerpos anti-PACAP en cuestión deberían interactuar con los residuos idénticos o sustancialmente idénticos de PACAP humano, ya que la humanización no debería afectar de manera apreciable la especificidad de la unión del anticuerpo anti-PACAP humanizado para PACAP humano en comparación con el anticuerpo parental (no humanizado). En particular, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5 y Ab10.H6 deberían interactuar con los mismos residuos en el PACAP humano que Ab10, y Ab21.H, Ab21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4 deberían interactuar con los mismos residuos en el PACAP humano que Ab21.
[1310] Los anticuerpos que se unen a los mismos epítopos o epítopos solapantes en PACAP humano que los anticuerpos en cuestión se pueden producir e identificar utilizando el método descrito en este documento. Es razonable anticipar que los anticuerpos que se unen al mismo epítopo o a uno solapante que cualquiera de los anticuerpos identificados aquí probablemente poseerán una actividad biológica similar en ausencia de una diferencia significativa en la cinética de unión. En particular, dichos anticuerpos deberían antagonizar uno o más de los efectos biológicos provocados por PACAP de manera análoga a los anticuerpos anti-PACAP ejemplificados que se unen a estos epítopos. Además, se prevé que los anticuerpos que se unen a estos mismos epítopos o a epítopos solapantes, o a un subconjunto de residuos de los mismos, imiten las características de unión de los anticuerpos en cuestión. Por ejemplo, se espera que dichos anticuerpos se unan selectivamente a PACAP y no se unan o se unan con mucha menos afinidad (más débil) a VIP u otros péptidos dentro de esta familia de neuropéptidos.
[1311] Ejemplo 13: Efecto de los anticuerpos anti-PACAP sobre la inducción del lagrimeo y el aumento de la temperatura facial tras la administración intranasal de umbelulona
[1313] La estimulación química nociva de la mucosa facial de ratas aumenta el flujo sanguíneo facial e intracraneal, así como la lagrimación, a través de la activación del reflejo trigémino-parasimpático, y por lo tanto puede servir como modelo experimental para disfunciones vasculares en la cefalea en racimos, la neuralgia del trigémino y posiblemente la migraña (Gottselig y Messlinger, Cephalalgia 2004, 24, 206-214; Nassini et al., Brain 2012, 135, 376-390; Khan et al., Cephalalgia 2014, 34(5), 382-391). Para examinar el efecto de los anticuerpos anti-PACAP sobre la lagrimación inducida por irritantes intranasales, se realizó un ensayo de lagrimeoin vivoen un modelo de rata. En dicho ensayo, se desencadenó lagrimeo mediante la administración intranasal de umbelulona (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), un agente químico nocivo. El lagrimeo se determinó por la distancia de humedecimiento en las tiras de prueba de Schirmer, como se describe a continuación, y se midió el efecto de los anticuerpos anti-PACAP o anti-PAC1R sobre dicho lagrimeo. Además, la administración intranasal de umbelulona provocó un aumento de la temperatura de la piel en la nariz de los animales, medida con un termómetro infrarrojo. No se observaron cambios en la temperatura de la almohadilla de la pata después de la administración de Umbelulona.
[1314] También se monitorizó el efecto de los anticuerpos anti-PACAP o anti-PACIR sobre los cambios en la temperatura de la piel de la nariz. Estas mediciones de los efectos de la umbelulona sobre la lagrimeo y la temperatura facial representan, hasta donde saben los solicitantes, el primer modelo que muestra el antagonismo del PACAP liberado endógenamente mediante el uso de un estimulante químico.
[1316] Para el presente ensayo, se utilizaron 60 ratas macho SPRAGUE DAWLEY® (Envigo, Huntingdon, Cambridgeshire, Reino Unido) más 3 ratas adicionales para la aleatorización. Las ratas pesaban entre 250 y 275 gramos al momento de su llegada, y se aclimataron durante al menos 7 días después de su llegada a la sala de pruebas.
[1318] El día -1 del estudio, las ratas se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento según su peso corporal. Después de la asignación de los grupos de tratamiento, las ratas se trataron con el anticuerpo anti-PACAP Ab10.H3, un anticuerpo de control de isotipo coincidente o un anticuerpo anti-PAC1-R patentado administrado por vía intravenosa a 20 mg/kg.
[1320] El día 0 del estudio, se preparó umbelulona fresca diluyendo aceite de umbelulona a 0,2 |jmol/kg en DMSO al 0,5% en agua en un vial de vidrio ámbar. Las tiras de prueba de Schirmer, utilizadas para medir la producción de lágrimas, se modificaron cortando 2 mm de ancho de la tira de prueba de 5 mm de ancho suministrada, lo que dio como resultado una tira de prueba de ~3 mm de ancho ("tiras de prueba de Schirmer modificadas"). Antes de administrar la dosis, a las ratas se les tomó la temperatura de la nariz y del pie derecho con un termómetro infrarrojo TW2 de Thermoworks (American Fork, UT) con una emisividad ajustada a 0,97. El termómetro se mantuvo a unos 2,5 cm de la nariz o la almohadilla de la pata para realizar la lectura. Los animales se anestesiaron con isoflurano inhalado. Después de la anestesia, se administraron por vía intranasal 50 j l de 0,2 jmol de umbelulona o 50 j l de DMSO al 0,5% (control del vehículo) a 2 mm en la fosa nasal derecha durante un período de 5 segundos. 5 minutos después de la dosificación intranasal, se midió nuevamente la temperatura de las ratas utilizando el proceso descrito anteriormente.
[1322] A los 60 minutos de la dosificación intranasal, las ratas se anestesiaron y se les colocó una tira de prueba de Schirmer modificada en el lado medial del párpado inferior derecho durante un período de 5 minutos. Después de 5 minutos, se leyó la tira de prueba para determinar la producción de lágrimas utilizando las marcas de almohadilla preimpresas (subdivisiones en milímetros) en la tira.
[1324] El anticuerpo anti-PACAP Ab10.H3 y un anticuerpo anti-PACIR patentado demostraron una disminución estadísticamente significativa en la producción de lágrimas que resultó de la administración intranasal de umbelulona en comparación con los animales tratados con el anticuerpo de control del mismo isotipo (FIG. 34A-B). Además, los animales tratados con Ab10.H3 y anticuerpo anti-PACIR a los que se les administró umbelulona demostraron una temperatura de la piel en la nariz estadísticamente significativamente menor en comparación con los animales tratados con el anticuerpo de control de isotipo coincidente y a los que se les administró umbelulona (FIG. 35A-B). Estos resultados sugirieron que el anticuerpo anti-PACAP Ab10.H3 o un anticuerpo anti-PACIR patentado podrían disminuir con éxito el reflejo parasimpático trigémino medido por lagrimeo y temperatura nasal tras la administración intranasal de umbelulona.
[1326] Ejemplo 14: Afinidades de unión de los anticuerpos anti-PACAPAb21.H2, Ab21.H3 y Ab21.H4
[1328] Las afinidades de unión de los anticuerpos monoclonales para PACAP humano se estimaron utilizando SPR en el PROTEON™ XPR36 (Bio-Rad, Hercules, CA). El anticuerpo se inmovilizó en la superficie de chips de acoplamiento de amina general ("GLC" o "GLM") (Bio-Rad, Hercules, CA). Se utilizó una serie de diluciones de PACAP38 humano (SEQ ID NO: 1241) preparado en tampón PBST 1x (fosfato de sodio 4,3 mM, fosfato de potasio 1,4 mM, NaCl 135 mM, KCl 2,7 mM, polisorbato-20 al 0,05%) adquirido de Teknova (n.° de cat. P1192, Teknova, Hollister, CA) y suplementado con 0,25 M de arginina (de J.T. BAKER®), BSA 0,2 mg/ml (Jackson Immuno Research Labs, West Grove, PA), y azida sódica al 0,005% (VWR International, Radnor, PA), con un pH ajustado a 6,8-7,45 para investigar los anticuerpos. El antígeno (que oscila de 1,23 nM a 100 nM) se ejecutó típicamente de manera secuencial con tiempos de asociación de 2-4 minutos y tiempos de disociación de 3-120 minutos agrupados con el software PROTEON™ Manager (v3.1.0.6 (Bio-Rad, Hercules, CA)), y se ajustó utilizando un modelo de unión de Langmuir 1:1. Las superficies se regeneraron entre consultas de analito utilizando ácido fosfórico al 0,85%, SDS al 0,5% y NaOH 0,1N. Se calculó una única K<d>para cada anticuerpo con tiempos de asociación limitados cerca de la velocidad de difusión (1,0 X 106) y tiempos de disociación limitados a 1,5 X 10'5, en los que no se observó ninguna disociación perceptible.
[1330] Se utilizó el mismo procedimiento para determinar las afinidades de unión de los anticuerpos para VIP humano (SEQ ID NO: 1243) y PACAP27 (s Eq ID NO: 1242), aunque las concentraciones de péptidos variaron de 1,23 nM a 1000 nM con tiempos de asociación de 240 segundos y tiempos de disociación de 3 a 120 minutos.
[1332] Las afinidades de anticuerpos medidas para PACAP38 se enumeran en la Tabla 11.
[1334] TABLA 11
[1335]
[1337] En la Tabla 12 se en um e ran e je m p lo s de co n s ta n te s de a fin id ad de a n ticu e rp o s para VIP. T A B LA 12
[1339]
[1341] En la Tabla 13 se en um e ran e je m p lo s de co n s ta n te s de a fin id ad de a n ticu e rp o s para P A C AP 27. T A B LA 13
[1343]

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo humanizado antipéptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria ("PACAP"), en el que: (1) el anticuerpo posee (a) una secuencia de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 962, y (b) una secuencia de cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 982;
(2) el anticuerpo posee (a) una secuencia de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 1282, y (b) una secuencia de cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1302;
(3) el anticuerpo posee (a) una secuencia de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 1322, y (b) una secuencia de cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1342;
(4) el anticuerpo posee (a) una secuencia de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 1362, y (b) una secuencia de cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1382; o
(5) el anticuerpo posee (a) una secuencia de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 1402, y (b) una secuencia de cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1422.
2. El anticuerpo anti-PACAP humanizado según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo posee (a) una secuencia de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 962, y (b) una secuencia de cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 982.
3. El anticuerpo anti-PACAP humanizado según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo posee (a) una secuencia de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 1282, y (b) una secuencia de cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1302.
4. El anticuerpo anti-PACAP humanizado según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo posee (a) una secuencia de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 1322, y (b) una secuencia de cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1342.
5. El anticuerpo anti-PACAP humanizado según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo posee (a) una secuencia de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 1362, y (b) una secuencia de cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1382.
6. El anticuerpo anti-PACAP humanizado según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo posee (a) una secuencia de cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 1402, y (b) una secuencia de cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1422.
7. El anticuerpo anti-PACAP humanizado según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo posee (a) una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 961 que consiste en la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 962 ligada a la región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 970, y (b) una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 981 que consiste en la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 982 ligada a la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 990.
8. El anticuerpo anti-PACAP humanizado según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo posee (a) una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1281 que consiste en la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 1282 ligada a la región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 1290, y (b) una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1301 que consiste en la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1302 ligada a la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 1310.
9. El anticuerpo anti-PACAP humanizado según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo posee (a) una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1321 que consiste en la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 1322 ligada a la región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 1330, y (b) una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1341 que consiste en la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1342 ligada a la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 1350.
10. El anticuerpo anti-PACAP humanizado según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo posee (a) una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1361 que consiste en la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 1362 ligada a la región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 1370, y (b) una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1381 que consiste en la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1382 ligada a la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 1390.
11. El anticuerpo anti-PACAP humanizado según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo posee (a) una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1401 que consiste en la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 1402 ligada a la región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 1410, y
(b) una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1421 que consiste en la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1422 ligada a la región constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 1430.
12. El anticuerpo anti-PACAP humanizado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que se expresa o se aísla de Pichia pastoris o una célula de CHO que expresa el anticuerpo anti-PACAP humanizado.
13. Un anticuerpo anti-PACAP humanizado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para uso en el tratamiento o prevención de la migraña o la cefalea.
14. El anticuerpo anti-PACAP humanizado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para el uso según la reivindicación 13, en el que dicha cefalea o migraña se puede seleccionar del grupo que consiste en migraña con aura, migraña sin aura, migraña hemipléjica, cefalea en racimos, neuralgia migrañosa, cefalea crónica, migraña crónica, cefalea por uso excesivo de medicamentos, y cefalea tensional.
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