RS67475B1 - Humanizovana anti-pacap antitela i njihove upotrebe - Google Patents

Humanizovana anti-pacap antitela i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS67475B1
RS67475B1 RS20251190A RSP20251190A RS67475B1 RS 67475 B1 RS67475 B1 RS 67475B1 RS 20251190 A RS20251190 A RS 20251190A RS P20251190 A RSP20251190 A RS P20251190A RS 67475 B1 RS67475 B1 RS 67475B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
pacap
antibody
sequence
heavy chain
Prior art date
Application number
RS20251190A
Other languages
English (en)
Inventor
Maria-Cristina Loomis
Leon F Garcia-Martinez
Benjamin H Dutzar
Daniel S Allison
Katherine Lee Hendrix
Ethan Ojala
Pei Fan
Jeffrey T L Smith
John A Latham
Charlie Karasek
Jenny Mulligan
Michelle Scalley-Kim
Erica Stewart
Vanessa Lisbeth Rubin
Jens J Billgren
Original Assignee
H Lundbeck As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by H Lundbeck As filed Critical H Lundbeck As
Publication of RS67475B1 publication Critical patent/RS67475B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/10—Anti-acne agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Description

[0001] Opis
[0002] OBLAST PRONALASKA
[0003] Ovaj pronalazak se uopšteno odnosi na antitela, poželjno humanizovana antitela i kompozicije koje sadrže takva antitela, pri čemu se ta antitela specifično vezuju za polipeptid koji aktivira adenilat ciklazu hipofize („PACAP“), kao i na terapijske primene tih antitela i njihovih kompozicija.
[0005] Pozadina
[0007] Polipeptid koji aktivira adenilat ciklazu hipofize („PACAP“) pripada porodici sekretina/vazoaktivnog intestinalnog peptida („VIP“)/hormona koji oslobađa hormon rasta („GHRH“). PACAP je multifunkcionalni vazodilatatorni peptid koji postoji u dva α-amidirana aktivna oblika – jednom sa 38 aminokiselina (PACAP38; SEQ ID NO: 1241) i drugom sa 27 aminokiselina (PACAP27; SEQ ID NO: 1242). Obe vrste peptida imaju istih 27 aminokiselina na N-kraju i sintetišu se iz istog prekursorskog proteina, preproPACAP (videti Moody et al., Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes., 18(1):61–67, 2011). PACAP38 je zastupljeniji aktivni oblik, koji čini do 90% PACAP oblika u tkivima sisara (videti Kaiser i Russo, Neuropeptides, 47:451–461, 2013). Sekvenca PACAP38 identična je kod svih sisara i razlikuje se od pticolikih i amfibijskih ortologa samo u jednoj aminokiselini (videti Vaudry et al., Pharmacol. Rev., 52:269–324, 2000). Porodica sekretin/VIP/GHRH uključuje peptid histidin-metioninamid („PHM“) kod sisara, sekretin, glukagon, peptid-1 sličan glukagonu („GLP1“),peptid-2 sličan glukagonu („GLP2“), glukozom zavisni insulinotropni polipeptid („GIP“) i faktor koji oslobađa hormon rasta („GRF“). PACAP27 ima 68% identičnosti sekvence sa VIP na nivou aminokiselina (videti Vaudry et al., 2000).
[0008] PACAP je široko rasprostranjen u mozgu i perifernim organima, na primer u endokrinom sistemu, gonadama, simpatikusnim neuronima, respiratornom sistemu, gastrointestinalnom traktu, kardiovaskularnom sistemu i urogenitalnim putevima (videti Schytz et al., Neurotherapeutics, 7:191– 196, 2010). Posebno, PACAP je eksprimiran u celom nervnom sistemu, uključujući njegovo prisustvo u trigeminovaskularnom sistemu, trigeminalnim ganglijama, kičmenoj moždini, hipotalamusu i hipofizi. PACAP ima uloge u neurorazvoju, neuroprotekciji, neuromodulaciji, neurogenoj inflamaciji i nocicepciji, delujući kroz više mehanizama (videti Kaiser i Russo, 2013).
[0009] [0004] U skladu sa svojom širokom rasprostranjenošću, PACAP ispoljava plejotropne efekte, uključujući modulaciju oslobađanja neurotransmitera, vazodilataciju, bronhodilataciju i aktivaciju crevne pokretljivosti, povećanje lučenja insulina i histamina, kao i stimulaciju proliferacije i/ili diferencijacije ćelija. Pokazano je da PACAP deluje kao hormon, neurohormon, neurotransmiter i trofični faktor u brojnim tkivima (Vaudry et al., Pharmacological Rev., 52(2):269-324, 2000).
[0010] Biološki efekti PACAP-a posreduju se putem tri različita receptora povezana sa G-proteinom: PAC1-R, receptor za vazoaktivni intestinalni peptid tip 1 („VPAC1-R“) i receptor za vazoaktivni intestinalni peptid tip 2 („VPAC2-R“). Ovi receptori su eksprimirani u različitim tkivima. PAC1-R je naročito zastupljen u nervnom sistemu (npr. u olfaktornom bulbusu, talamusu, hipotalamusu, malom mozgu i dorzalnom rogu kičmene moždine), hipofizi i nadbubrežnim žlezdama. Nasuprot tome, VPAC1-R i VPAC2-R su uglavnom eksprimirani u plućima, jetri i testisima, mada su otkriveni i u drugim tkivima. Eksprimiranje VPAC1-R receptora utvrđeno je u nervnom sistemu (npr. u moždanoj kori i hipokampusu), u glatkim mišićnim ćelijama pluća, jetre i creva, kao i u megakariocitima i trombocitima. VPAC1-R se povezuje sa membranskim proteinom povezanim sa receptorom ("RAMP", konkretno,
[0011] RAMP2) (videti, Christopoulos et al., J. Biol. Chem., 278:3293-3297, 2002). Profil eksprimiranja VPAC2-R uključuje nervni sistem (npr. talamus, hipokampus, moždano stablo i dorzalne korenske ganglije („DRG“)), kardiovaskularni sistem, gastrointestinalni sistem, pankreas i reproduktivne
[0012] sisteme (videti, Usdin et al., Endocrin., 135:2662-2680, 1994; Sheward et al., Neurosci., 67:409-418, 1995).
[0013] PAC1-R je selektivan za PACAP38 i PACAP27. Određenije, PAC1-R se vezuje za PACAP sa 100-1000-struko većim afinitetom u odnosu na VIP, tj., K<D>~0.5 nM za PACAP27/PACAP38 nasuprot K<D>~500 nM za VIP. Suprotno tome, VPAC1-R i VPAC2-R imaju iste afinitete za PACAP i VIP (K<D>~1
[0014] nM) (videti, Schytz et al., 2010). Razvijeno je antitelo koje se vezuje za PAC1-R (videti objavu prijave patenta u SAD br.20160251432).
[0015] Po aktivaciji, svi ovi receptori mogu izazvati kasniju proizvodnju cikličnog adenozin monofosfata („cAMP“), i/ili aktivaciju fosfolipaze C
i/ili modulaciju fosfolipaze D („PLD“). Konkretno, PAC1-R je povezan sa dvostrukim signalnim transdukcijskim putevima koji deluju putem cAMP i Ca²⁺, dok su VPAC1-R i VPAC2-R uglavnom povezani sa adenilat ciklazom. PAC1-R je povezan sa Gs proteinom, koji aktivira adenilat ciklazu za formiranje cAMP-a, što zauzvrat aktivira protein kinazu A. PAC1-R se takođe povezuje sa Gq, čime aktivira PLC, koji proizvodi inozitol-fosfat, što povećava oslobađanje kalcijuma u citosolu iz unutarćelijskih rezervi kalcijuma. Postoje određeni dokazi za ulogu PAC1-R u aktivaciji PLD (videti, McCulloch et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 921:175-185, 2000). Drugi PACAP signalizirajući put dovodi do povećanja nivoa unutarćelijskog natrijuma aktivacijom neselektivnih katjonskih kanala (videti, Roy et al., American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, 304(12):R1070-R1084, 2013).
[0016] [0008] Pretpostavlja se da PACAP ima ulogu u brojnim bolestima i poremećajima, uključujući, ali ne ograničavajući se na migrenu, glavobolju i bol, iako takva uloga PACAP još nije klinički dokazana. Smatra se da migrena ima neurovaskularnu komponentu. Migrena pogađa približno 10% odrasle populacije u SAD i obično je praćena intenzivnim glavoboljama. Oko 20–30% osoba koje pate od migrene doživljava auru, koja se sastoji od fokalnih neuroloških fenomena koji prethode i/ili prate napad. Na ulogu PACAP u migreni ukazale su brojne primedbe: (1) nivoi PACAP u plazmi su povišeni tokom migrenoznih napada (tokom samog napada) u poređenju sa interiktalnim nivoima kod ljudi (videti Tuka et al., Cephalalgia, 33(13):1085-1095, 2013); (2) infuzija PACAP38 izazvala je glavobolju kod zdravih ispitanika, dok je kod osoba koje pate od migrene dovela do glavobolje praćene napadima sličnim migreni (videti Schytz et al., Brain, 132:16-25, 2009; i Amin et al., Brain, 137:779-794, 2014, tim redom); (3) vazodilatacija indukovana PACAP-om može da ima ulogu u neureogenskom zapaljenju (videti Kaiser and Russo, Neuropeptides, 47:451-461, 2013); i (4) migrene indukovane PACAP-om su povezane sa fotofobijom, fonofobijom, mučninom, i odgovaraju na triptane (videti Amin et al., Brain, 32:140-149, 2012). Takođe je pokazano da PACAP izaziva vazodilataciju, fotofobiju, kao i degranulaciju mastocita i aktivaciju neurona (videti, Markovics et al., Neurobiology of Disease, 45:633-644, 2012; Baun et al., Cephalalgia, 32(4):337-345, 2012; Chan et al., Pharmacology & Terapijskis, 129:332-351, 2011).
[0017] Jedna efikasna terapije za migrene je primena triptana, koji predstavljaju porodicu lekova zasnovanih na triptaminu, uključujući sumatriptan i rizatriptan. Članovi ove porodice imaju afinitet prema više receptora za serotonin, uključujući 5-HT<1B>, 5-HT<1D>i 5-HT<1F>. Ovi lekovi selektivno sužavaju moždane krvne sudove, ali takođe izazivaju vazokonstriktivne efekte na koronarne krvne sudove (videti, Durham, New Eng. J. Med., 350 (11):1073-75, 2004). Teorijski postoji rizik od koronarnog spazma kod pacijenata sa ustanovljenom srčanom bolešću nakon primene, a u retkim slučajevima se mogu javiti srčani događaji nakon uzimanja triptana. Shodno tome, kontraindikovani su za neke pacijente sa koronarnom vaskularnom bolešću.
[0018] Slično tome, bol se često može ublažiti primenom određenih narkotika ili nesteroidnih antiinflamatornih lekova („NSAIL“). Međutim, primena ovih terapija često ima negativne posledice. NSAIL mogu izazvati otkazivanje bubrega, krvarenje u crevima i disfunkciju jetre. Narkotici mogu izazvati mučninu, povraćanje, oštećenje mentalnih funkcija i zavisnost. Zbog toga je poželjno identifikovati alternativne terapije za bol kako bi se izbegle neke od ovih negativnih posledica.
[0019] [0011] PACAP može biti uključen i u bolesti i poremećaje koji nisu povezani sa migrenom, glavoboljom i bolom. Na primer, PACAP može biti povezan sa ili čak imati ulogu uzročnika u anksioznim poremećajima (WO 2012/106407), trombocitopeniji (WO 2004/062684) i inflamatornim kožnim bolestima (WO 2010/007175). Polimorfizmi PACAP-a i PAC1-R receptora povezani su sa posttraumatskim stresnim sindromom („PTSD“) kod žena, teškim depresivnim poremećajem i generalizovanim anksioznim poremećajem, što ukazuje na ulogu PACAP-a u ovim stanjima. Dalje, podržavajući ulogu PACAP u trombocitopeniji, pacijenti sa trisomijom 18 imaju povišene nivoe PACAP i pokazuju defektno sazrevanje megakariocita (videti, Schytz et al., 2010; i Moody et al., Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes., 18(1):61-67, 2011).
[0020] Takođe, PACAP i drugi neuropeptidi, kao što su peptid povezan sa kalcitoninskim genom („CGRP“), supstanca P, neurokinin A, bradikinin i endotelinin-1, izraženi su u donjim urinarnim putevima („LUT“) (videti Arms i Vizzard, Handbook Exp. Pharmacol., 202:395–423, 2011) i, prema izveštajima, mogu imati ulogu u disfunkciji donjih urinarnih puteva i poremećajima urinarnog trakta, kao što su urinarne infekcije („UTI“), abnormalno pražnjenje bešike, urgentna potreba za mokrenjem, nokturija, urinarna inkontinencija, previše aktivna bešika, kao i bol povezan sa ovim stanjima.
[0021] Takođe je ukazano da PACAP i PACAP receptori moduliraju inflamatorni i neuropatski bol i da su uključeni i u pronocicepciju i u antinocicepciju (videti, Davis-Taber et al., J. Pain, 9(5):449-56, 2008). Za PACAP je takođe prijavljeno da je potreban za spinalnu desenziblizaciju i indukciju neuropatskog bola (videti, Mabuchi et al., J. Neurosci., 24(33):7283-91, 2004). Dodatno, ponašanje usled povlačenja morfina je navodno modifikovano kod miševa koji su bili u deficitu sa PACAP-receptorom što dodatno ukazuje na ulogu PACAP u anksiolitičkom odgovoru tokom apstinencije od morfina (videti, Martin et al., Mol. Brain Res., 110(1):109-18, 2003).
[0023] KRATAK SADRŽAJ OVOG PRONALASKA
[0024] Svako pominjanje postupaka lečenja ili in vivo dijagnostike u opisu odnosi se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska, namenjene za upotrebu u postupku lečenja ljudskog ili životinjskog tela terapijom ili za in vivo dijagnostiku.
[0025] [0015] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se uopšteno odnosi na anti-PACAP antitela, poželjno humanizovana anti-PACAP antitela, koja antagonizuju, inhibiraju, neutrališu, ili blokiraju najmanje jedno biološko dejstvo povezano sa humanim. U određenim načinima ostvarivanja, anti-PACAP antitela inhibiraju ili neutrališu najmanje jedan biološki efekat koji izaziva PACAP, koji uključuje PACAP27 i/ili PACAP38, kako je navedeno dole. U drugim načinima ostvarivanja, anti-PACAP antitela neutrališu ili inhibiraju PACAP aktivaciju najmanje jednog od PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R; neutrališu ili inhibiraju PACAP aktivaciju jednog od PAC1-R, VPAC1-R, iVPAC2-R; i/ili neutrališu ili inhibiraju PACAP aktivaciju PAC1-R; i/ili inhibira PACAP vezivanje za ćelijsku površinu, npr., preko glikozaminoglikana ("GAG"). Opet u drugim načinima ostvarivanja, anti-PACAP antitela su sposobna da inhibiraju vezivanje PACAP-a za najmanje jedan od PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R; su sposobna da inhibiraju vezivanje PACAP za svaki od PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R; ili su sposobna da inhibiraju vezivanje PACAP za PAC1-R. U drugim načinima ostvarivanja, anti-PACAP antitela inhibiraju proizvodnju cAMP ikoju indukuje PACAP. Opet u drugim načinima ostvarivanja, anti-PACAP antitela, sama ili u kombinaciji, kada se daju subjektu, npr., čoveku, smanjuju vazodilataciju koju indukuje PACAP, fotofobiju, degranulaciju mastocita, i/ili neuronsku aktivaciju. U povezanim načinima ostvarivanja, humanizovana anti-PACAP antitela su pogodna za lečenje humanog subjekta sa akutnim, epizodnim ili hroničnim stanjem povezanim sa povećanom vazodilatacijom, fotofobijom, degranulacijom mastocita, i/ili neuronskom aktivacijom.
[0026] U poželjnom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela suštinski ne stupaju u interakciju sa (vezuju se) za VIP. Ovaj pronalazak takođe obuhvata terapijsku upotrebu (u obliku monoterapije ili kombinovane terapije) i dijagnostičku upotrebu takvih anti-PACAP antitela .
[0027] Određenije, anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku mogu da uključuju humanizovana antitela. Pored toga, anti-PACAP antitelima prema ovom pronalasku suštinski ili u celosti nedostaje N-glikozilacija i/ili O-glikozilacija. U jednom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela obuhvataju humani konstantni domen, npr., onaj od IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 antitela ili njegovog derivata. U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju Fc region koji je modifikovan tako da izmeni (pojača ili ošteti) najmanje jedno od funkcije efektora, vreme eliminacije, proteolizu, ili glikozilaciju. Na primer, Fc region može da sadrži jednu ili više mutacija koja menja ili eliminiše N- i/ili O-glikozilaciju.
[0028] U nekim načinima ostvarivanja, anti-PACAP antitela se vezuju za PACAP sa K<D>manjim od ili jednakim 5x10<-5>M, 10<-5>M, 5x10<-6>M, 10<-6>M, 5x10<-7>M, 10<-7>M, 5x10<-8>M, 10<-8>M, 5x10<-9>M, 10<-9>M, 5x10-
[0029] <10>M, 10<-10>M, 5x10<-11>M, 10<-11>M, 5x10<-12>M, 10<-12>M, 5x10<-13>M, ili 10<-13>M, npr., kao što je određeno ELISA-om, interferometrijom na bio-sloju ("BLI"), kinetičkim ekskluzionim testom (KINEXA<®>, Sapidyne Instruments, Boise, ID), ili SPR, npr., na 25° ili 37°C. Poželjno, humanizovana anti-PACAP antitela se vezuju za PACAP sa a K<D>manjim od ili jednakim 5x10<-10>M, 10<-10>M, 5x10<-11>M, 10<-11>M, 5x10<-12>M, ili 10-
[0030] <12>M. Poželjno, humanizovana anti-PACAP antitela se vezuju za PACAP sa K<D>koji je manji od oko 100 nM, manji od oko 40 nM, manji od oko 1 nM, manji od oko 100 pM, manji od oko 50 pM, ili manji od oko 25 pM. Alternativno, anti-PACAP antitela se vezuju za PACAP sa K<D>koji je između oko 10 pM i oko 100 pM. U drugom načinu ostvarivanja, humanizovana anti-PACAP antitela se vezuju za PACAP sa brzinom disocijacije (k<off>) manjom od ili jednakom 5x10<-4>s<-1>, 10<-4>s<-1>, 5x10<-5>s<-1>, ili 10<-5>s<-1>.
[0031] Opet, u drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela konkretno se vezuju za linearni ili konformacioni epitop(e) i/ili ulaze u nadmetanju za vezivanje na isti linearni ili konformacioni epitop(e) na humanom PACAP-u kao antitelo anti-PACAP izabrano iz grupe koja se sastoji od Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5 (specifične sekvence aminokiselina promenljivih i konstantnih regiona ovih anti-PACAP antitela, nukleinske kiseline koje kodiraju te promenljive i konstantne regione, kao i epitopi za koje se vezuju, određeni postupkom alanin skeniranja, otkriveni su u daljem tekstu). Konkretno, pronalazak obuhvata anti-PACAP antitela koja se specifično vežu za isti linearni ili konformacioni epitop(e) na humanom PACAP-u kao antitelo iz grupe Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5. Kao što je otkriveno u daljim primerima načina ostvarivanja, epitopi se određuju korišćenjem strategije mutacija alanin skeniranjem.
[0032] [0020] U nekim načinima ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-PACAP antitela, poželjno humanizovana anti-PACAP antitela, koja obuhvataju najmanje 2 regiona koji određuju komplementarnost („CDR“), ili najmanje 3 CDR, ili najmanje 4 CDR, ili najmanje 5 CDR, ili svih šest CDR anti-PACAP antitela izabranih iz grupe koja se sastoji od Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5. U slučajevima kada nije prisutno svih 6 CDR, poželjno je da budu prisutni najmanje V<H>CDR3 i V<L>CDR3. U primerima načina ostvarivanja, antitela obuhvataju promenljivi teški („VH“) lanac i/ili promenljivi laki („VL“) lanac jednog od antitela Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5.
[0033] U konkretnom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku, su poželjno humanizovana anti-PACAP antitela, i obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 964; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 966; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 968; i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 984; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 986; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 988. Alternativno, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 962, i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 982. U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 962, i/ili (b) varijabilni laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 982. Konkretnije, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 961, i/ili (b) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 981.
[0034] U konkretnom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku, su poželjno humanizovana anti-PACAP antitela, i obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1284; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1286; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1288; i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1304; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1306; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1308. Alternativno, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1282, i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1302. U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1282, i/ili (b) varijabilni laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1302. Konkretnije, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1281, i/ili (b) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1301.
[0035] [0023] U konkretnom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku, su poželjno humanizovana anti-PACAP antitela, i obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1324; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1326; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1328; i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1344; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1346; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1348. Alternativno, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1322, i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1342. U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1322, i/ili (b) varijabilni laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1342. Konkretnije, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1321, i/ili (b) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1341.
[0036] U konkretnom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku, su poželjno humanizovana anti-PACAP antitela, i obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1404; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1406; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1408; i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1424; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1426; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1428. Alternativno, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1402, i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1422. U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1402, i/ili (b) varijabilni laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1422. Konkretnije, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1401, i/ili (b) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1421.
[0037] Takođe, u nekim načinima ostvarivanja anti-PACAP antitela i vezivanje za antigen mogu da obuhvataju varijante sekvenci bilo kog ovde otkrivenog antitela koja su modifikovana mutagenezom, npr. sazrevanjem afiniteta kako bi se izmenilo jedno ili više svojstava kao što je afinitet vezivanja ili imunogenost.
[0038] U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela su direktno ili indirektno pričvršćena za grupu, kao što je detektabilno obeležje ili terapijski agens.
[0039] [0027] U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela inhibiraju ili neutrališu najmanje jedan biološki efekat koji izaziva PACAP, neutrališu ili inhibiraju PACAP aktivaciju najmanje jednog od receptora PAC1-R, VPAC1-R i/ili VPAC2-R, neutrališu ili inhibiraju PACAP aktivaciju svakog od PAC1-R, VPAC1-R i/ili VPAC2-R, neutrališu ili inhibiraju PACAP aktivaciju PAC1-R, sposobna su da inhibiraju vezivanje PACAP-a za najmanje jedan od PAC1-R, VPAC1-R i/ili VPAC2-R, sposobna su da inhibiraju vezivanje PACAP-a za svaki od PAC1-R, VPAC1-R i/ili VPAC2-R, sposobna su da inhibiraju vezivanje PACAP-a za PAC1-R, i/ili inhibiraju vezivanje PACAP-a za ćelijsku površinu, npr. putem GAG-a, inhibiraju proizvodnju cAMP-a koju indukuje PACAP i/ili kada se daju subjektu smanjuju vazodilataciju koju indukuje PACAP, fotofobiju, degranulaciju mastocita i/ili neuronsku aktivaciju.
[0040] U drugom načinu ostvarivanja, ljudska ili humanizovana anti-PACAP antitela su pogodna za lečenje ljudskog subjekta koji ima akutno, epizodno ili hronično stanje povezano sa povećanom vazodilatacijom, fotofobijom, degranulacijom mastocita i/ili neuronskom aktivacijom.
[0041] U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela suštinski ne stupaju u interakciju sa VIP-om (tj. ne vežu se za VIP). Poželjno je da anti-PACAP antitela imaju jači afinitet za PACAP u poređenju sa VIP-om, tj. iako postoji određena unakrsna reaktivnost, antitela se poželjno vezuju za PACAP u odnosu na VIP. Na primer, afinitet ovih antitela za PACAP može biti najmanje 10-, 30-, 100-, 300-, 1000-, 3000-, 10000-, 30000-, 100000-, 300000-, 1000000-, 3000000-, 10000000- ili 30000000- puta veći od afiniteta za VIP (npr. KD antitela za vezivanje za human PACAP je 10-, 30-, 100-, 300-, 1000-, 3000-, 10000-, 30000-, 100000-, 300000-, 1000000-, 3000000-, 10000000- ili 30000000- puta niži nego KD za vezivanje za VIP).
[0042] U jednom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela su pričvršćena za najmanje jednu efektorsku grupu, npr. koja obuhvata hemijski link. U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela su pričvršćena za jednu ili više detektabilnih grupa, npr. koje obuhvataju fluorescentnu boju, enzim, supstrat, bioluminiscentni materijal, radioaktivni materijal, hemiluminiscentnu grupu ili njihove mešavine.
[0043] U jednom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela su pričvršćena za jednu ili više funkcionalnih grupa.
[0044] Ovaj pronalazak takođe obuhvata antitela, npr. anti-idiotipna antitela, proizvedena protiv anti-PACAP antitela kako je prethodno opisano. Dalje, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak korišćenja antiidiotipnog antitela za praćenje in vivo nivoa navedenih anti-PACAP antitela kod subjekta ili za neutralizaciju navedenog anti-PACAP antitela kod subjekta kojem se daje to anti-PACAP antitelo.
[0045] [0033] Štaviše, ovaj pronalazak obuhvata kompoziciju pogodnu za terapijsku, preventivnu ili dijagnostičku upotrebu, koja sadrži terapijski, preventivno ili dijagnostički efektivnu količinu najmanje jednog anti-PACAP antitela kako je ovde opisano. Konkretno, obezbeđene su kompozicije i farmaceutski oblici doziranja koji sadrže navedena anti-PACAP antitela ili vezujuća sredstva za upotrebu u lečenju ili prevenciji migrena ili drugih oblika glavobolje. Takođe su obezbeđeni dozni oblici koji sadrže navedena anti-PACAP antitela ili sredstva za vezivanje za upotrebu u lečenju ili prevenciji fotofobije. Kompozicija može biti pogodna za potkožnu, intramuskularnu i/ili intravensku primenu. Kompozicija može biti liofilizovana. U nekim načinima ostvarivanja, kompozicija dodatno sadrži farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač, rastvarač, emulgator, konzervans ili njihovu mešavinu.
[0046] Pored toga, u nekim načinima ostvarivanja, kompozicija dalje obuhvata neki drugi aktivni agens, npr., hemioterapijsko sredstvo, analgetik, antiinflamatorno sredstvo, imunosupresiv, citokin, antiproliferativno sredstvo i antiemetik. Poželjno, drugi terapijski agens je neki analgetik, npr., NSAIL, opioidni analgetik, neko antitelo (npr., antitelo protiv humanog faktora rasta nerava ("NGF") ili antitelo ; ili anti-humani CGRP ili antitelo protiv humanog CGRP-receptora ili antitelo ); ili neki biološki agens koji nije antitelo, kao što je NGF ili CGRP polipeptid ili konjugat; ili BOTOX<®>(Botulinum toksin). Pogodni NSAIL-ovi za upotrebu u kombinaciji sa predmetnim anti-PACAP antitelima uključuju, ali nisu ograničeni na, inhibitor ciklooksigenaze 1 i/ili ciklooksigenaze 2; derivate propionske kiseline uključujući ibuprofen, naproksen, naprozin, diklofenak i ketoprofen; derivate sirćetne kiseline uključujući tolmetin i sulindak; derivate fenaminske kiseline uključujući mefenaminska kiselina i meklofenaminska kiselina; derivate bifenilkarboksilne kiseline uključujući diflunisal i flufenisal; i oksikame uključujući piroksim, sudoksikam, i izoksikam. Pogodni opioidni analgetici za upotrebu u kombinaciji sa predmetnim anti-PACAP antitelima uključuju, npr., kodein, dihidrokodein, morfin ili derivat morfina ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, diacetilmorfin, hidrokodon, hidromorfon, levorfanol, oksimorfon, alfentanil, buprenorfin, butorfanol, fentanil, sufentanil, meperidin, metadon, nalbufin, propoksifen i pentazocin ili njihove farmaceutski prihvatljive soli. Kombinovano davanje opioidnog analgetika i anti-PACAP antitela može pojačati analgetski efekat koji se time izaziva.
[0047] Ovaj pronalazak dalje razmatra izolovanu sekvencu nukleinske kiseline ili sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju ovde opisano anti-PACAP antitelo, kao i vektor ili vektore koji sadrže ovu izolovanu sekvencu ili sekvence nukleinske kiseline.
[0048] Pored toga, ovaj pronalazak obezbeđuje neku ćeliju domaćina koja obuhvata ovu izolovanu sekvencu ili sekvence nukleinske kiseline ili vektor ili gorepomenuto. Ćelija domaćina može biti eukariotska ćelija domaćina koji je neki sisar, izabrana iz grupe koju čine ćelije bubrega mladunca hrčka ("BHK"); ćelije jajnika kineskog hrčka ("CHO"); sertolijeve ćelije miša ("TM4" ćelije); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna ("VERO-76" ćelije); humane ćelije karcinoma grlića materice ("HELA"); pseće bubrežne ćelije ("MDCK"); bivolje ćelije jetre pacova ("BRL"); humane plućne ćelije; humane ćelije jetre ("Hep G2"); ćelije tumora mlečnih žlezda miša ("MMT"); TRI ćelije; MRC 5 ćelije; i FS4 ćelije. Poželjno, ćelija domaćina sisara je CHO ćelija. Poželjnije, ćelija domaćina sisara je CHO K1 ćelija. Ćelija domaćina može biti prokariotska ćelija, tj., bakterijska ćelija ili neka eukariotska ćelija, uključujući ćeliju sisara, gljivica, kvasaca, ptica ili insekata. U jednom načinu ostvarivanja, ćelija domaćina je filamentozna gljivica ili je ćelija kvasca. Poželjno, vrste kvasaca su roda Pichia. Najpoželjnije, vrste Pichia odabrane su od Pichia pastoris, Pichia methanolica i Hansenula polymorpha (Pichia angusta).
[0049] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje postupak za eksprimiranje anti-PACAP antitela, obično humanizovanih antitela, pri čemu postupak obuhvata kultivisanje ovde opisane ćelije domaćina u uslovima koji obezbeđuju ekspresiju njenog pomenutog antitela. Ćelija domaćina može biti ćelijska kultura, kao što je ćelija jajnika kineskog hrčka ("CHO") ili poliploidna kultura kvasca koja stabilno eksprimira i luči u podlogu za kultivisanje najmanje 10-25 mg/litru njenog pomenutog antitela.
[0050] Poliploidni kvasac može se izvesti postupkom koji obuhvata: (i) uvođenje najmanje jednog ekspresionog vektora koji sadrži jedan ili više heterolognih polinukleotida koji kodiraju pomenuto antitelo radno vezano za promotor i signalnu sekvencu u haploidnu ćeliju kvasca; (ii) proizvodnju parenjem ili fuzijom sferoplasta poliploidnog kvasca iz pomenute prve i/ili druge haploidne ćelije kvasca; (iii) odabir poliploidnih ćelija kvasaca koje stabilno eksprimiraju pomenuto antitelo; i (iv) proizvodnju stabilnih poliploidnih kultura kvasaca iz pomenutih poliploidnih ćelija kvasaca koje stabilno eksprimiraju pomenuto antitelo u podlogu za kultivisanje. Poželjno, vrste kvasaca je roda Pichia.
[0051] U drugim načinima ostvarivanja, ćelijska kultura sisara može se izvesti postupkom koji obuhvata: (i) uvođenje najmanje jednog ekspresionog vektora koji sadrži jedan ili više heterolognih polinukleotida koji kodiraju pomenuto antitelo radno vezano za promotor i signalnu sekvencu u ćeliju sisara; (ii) proizvodnju pojedinačnih ćelija za kultivisanje da bi se eksprimirao jedan ili više heterolognih polinukleotida koji kodiraju pomenuto antitelo; (iii) proizvodnju ćelije sisara koja stabilno eksprimira pomenuto antitelo; i (iv) proizvodnju ćelijskih kultura iz pomenute ćelije sisara koja stabilno eksprimira pomenuto antitelo u podlogu za kultivisanje. Poželjno, vrste sisara su CHO ćelije.
[0052] Ovaj se pronalazak dalje odnosi na terapijske i dijagnostičke upotrebe anti-PACAP antitela, poželjno nekog humanizovanog antitela.
[0053] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za blokiranje, inhibiciju ili neutralizaciju jednog ili više bioloških efekata povezanih sa PACAP kod subjekta, koji obuhvata davanje subjektu efektivne količine humanog ili humanizovanog ili himerizovanog anti-PACAP antitela koje antagonizuje, inhibira, neutrališe ili blokira najmanje jedan biološki efekat povezan sa humanim PACAP. U konkretnom načinu ostvarivanja, postupak koristi anti-PACAP antitelo koje se konkretno vezuje za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) i/ili takmiči u vezivanju za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) na humanom PACAP kao anti-PACAP antitelo izabrano od Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5.
[0054] [0041] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za blokiranje, inhibiciju ili neutralizaciju jednog ili više bioloških efekata povezanih sa PACAP kod subjekta, koji obuhvata davanje subjektu efektivne količine humanizovanog anti-PACAP antitela koje antagonizuje, inhibira, neutrališe, ili blokira najmanje jedan biološki efekat povezan sa humanim PACAP i koji značajno ne reaguje (ne vezuje se) sa VIP, npr., anti-PACAP antitelo ima jači afinitet prema PACAP u odnosu na VIP, tj., iako postoji neka unakrsna reaktivnost, antitela se poželjno vezuju za PACAP u odnosu na VIP. Na primer, afinitet pomenutog antitela prema PACAP je najmanje 10-puta, 30-puta, 100-puta, 300-puta, 1000-puta, 3000-puta, 10000-puta, 30000-puta, 100000-puta, 300000-puta, 1000000-puta, 3000000-puta, 10000000-puta, 30000000-puta, ili više, veći od afiniteta pomenutog antitela prema VIP (npr., K<D>pomenutog antitela ili za vezivanje za humani PACAP je 10-puta, 30-puta, 100-puta, 300-puta, 1000-puta, 3000-puta, 10000-puta, 30000-puta, 100000-puta, 300000-puta, 1000000-puta, 3000000-puta, 10000000-puta, 30000000-puta, ili niže od K<D>za vezivanje za VIP). U konkretnom načinu ostvarivanja, postupak koristi anti-PACAP antitelo koje se konkretno vezuje za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) i/ili takmiči u vezivanju za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) na humanom PACAP kao anti-PACAP antitelo izabrano od Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5.
[0055] Opet u drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za blokiranje, inhibiciju ili neutralizaciju jednog ili više bioloških efekata povezanih sa PACAP kod subjekta, koji obuhvata davanje subjektu efektivne količine humanizovanog anti-PACAP antitela koje inhibira ili neutrališe najmanje jedan biološki efekat koji izaziva PACAP; neutrališe ili inhibira PACAP aktivaciju najmanje jednog od PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R; neutrališe ili inhibira PACAP aktivaciju jednog od PAC1-R, VPAC1-R, i VPAC2-R; neutrališe ili inhibira PACAP aktivaciju PAC1-R; može da inhibira vezivanje PACAP za najmanje jedan od PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R; može da inhibira vezivanje PACAP za svaki od PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R; može da inhibira vezivanje PACAP za PAC1-R; i/ili može da inhibira PACAP vezivanje za ćelijsku površinu, npr., preko GAG; inhibira PACAP-indukovanu cAMP proizvodnju; i/ili, kada se daju subjektu, smanjuje PACAP-indukovanu vazodilataciju, fotofobiju, degranulaciju mastocita, i/ili neuronsku aktivaciju. U konkretnom načinu ostvarivanja, postupak koristi anti-PACAP antitelo koje se konkretno vezuje za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) i/ili takmiči u vezivanju za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) na humanom PACAP kao anti-PACAP antitelo izabrano od Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5.
[0056] [0043] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje ili prevenciju pojave, učestalost, težine ili trajanja glavobolje ili migrene kod subjekta, koji obuhvata davanje subjektu efektivne količine humanizovanog anti-PACAP antitela koje inhibira ili neutrališe najmanje jedan biološki efekat koji izaziva PACAP; neutrališe ili inhibira PACAP aktivaciju najmanje jednog od PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R; neutrališe ili inhibira PACAP aktivaciju jednog od PAC1-R, VPAC1-R, i VPAC2-R; neutrališe ili inhibira PACAP aktivaciju PAC1-R; može da inhibira vezivanje PACAP za najmanje jedan od PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R; može da inhibira vezivanje PACAP za svaki od PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R; može da inhibira vezivanje PACAP za PAC1-R; i/ili može da inhibira PACAP vezivanje za ćelijsku površinu, npr., preko GAG; inhibira PACAP-indukovanu cAMP proizvodnju; i/ili, kada se daju subjektu, smanjuje PACAP-indukovanu vazodilataciju, fotofobiju, degranulaciju mastocita, i/ili neuronsku aktivaciju. U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje ili prevenciju akutno, epizodno ili hronično stanje povezano sa povećanom vazodilatacijom, fotofobijom, degranulacijom mastocita, i/ili neuronskom aktivacijom kod humanog subjekta.
[0057] U konkretnom načinu ostvarivanja, postupak koristi anti-PACAP antitelo koje se konkretno vezuje za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) i/ili takmiči u vezivanju za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) na humanom PACAP kao anti-PACAP antitelo izabrano od Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5. Epitop može se identifikovati korišćenjem strategije mutacije skeniranjem alanina, na primer.
[0058] U konkretnom načinu ostvarivanja, glavobolja ili migrena lečena i/ili prevenirana davanjem anti-PACAP antitela subjekta izabrana je od migrene sa ili bez aure, hemiplegične migrene, klaster glavobolje, migrenozne neuralgije, hronične glavobolje i tenzione glavobolje.
[0059] U drugom konkretnom načinu ostvarivanja, subjekat ima očni poremećaj povezan sa fotofobijom izabran iz grupe koju čine ahromatopsija, aniridija, fotofobija uzrokovana antiholinergičkim lekom, afakija (odsustvo sočiva oka), buftalmos (abnormalno uzak ugao između rožnjače i irisa), katarakte, konusna distrofija, kongenitalne abnormalnosti oka, virusni konjunktivitis ("ružičasto oko"), abrazija rožnjače, distrofija rožnjače, čir na rožnjači, poremećaj epitela rožnjače, ektopija sočiva, endoftalmitis, trauma oka izazvana bolešću, povreda, ili infekcija kao što je halazion, episkleritis, glaukom, keratokonus, ili hipoplazija očnog živca, hidroftalmos, ili kongenitalni glaukom iritis, optički neuritis, sindrom disperzije pigmenta, širenje zenica (prirodno ili hemijski izazvano), odvajanje mrežnjače, ožiljavanje rožnjače ili sklera, i uveitis.
[0060] U drugom konkretnom načinu ostvarivanja, subjekat ima stanje povezano sa nervnim sistemom ili neurološko stanje povezano sa fotofobijom izabrano iz grupe koju čine poremećaji autističnog spektra, Kiarijeva malformacija, disleksija, encefalitis uključujući mijalgični encefalomijelitis (takođe poznat kao "sindrom hroničnog umora"), meningitis, subarahnoidno krvarenje, tumor zadnje kranijalne jame, ankilozni spondilitis, albinizam, ariboflavinozu, benzodiazepine (dugotrajna upotreba ili odvikavanje od benzodiazepina), hemioterapiju, čikungunju, cistinozu, Ehlers-Danlos sindrom, mamurluk, grip, infektivnu mononukleozu, nedostatak magnezijuma, trovanje živom, migrenu, besnilo, i tirozinemiju tipa II (takođe poznata kao "Richner-Hanhart sindrom").
[0061] U drugom konkretnom načinu ostvarivanja, subjekat ima poremećaj povezan sa fotofobijom izabran iz grupe koju čine migrena (sa ili bez aure), iritis, uveitis, meningitis, depresija, bipolarni poremećaj, klaster glavobolja ili anter trigeminalna autonomna cefalalgija ("TAC") ili blefarospazam, depresija, agorafobija, Posttraumatski stresni poremećaj ("PTSD"), traumatska povreda mozga, i bipolarni poremećaj.
[0062] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za neutralizaciju PACAPindukovane PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R signalizaciju, koji obuhvata davanje, subjektu kom je to potrebno, efektivne količine anti-PACAP antitela koje se konkretno vezuje za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) i/ili takmiči u vezivanju za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) na humanom PACAP kao anti-PACAP antitelo izabrano od Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5.
[0063] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za inhibiciju PACAP-indukovane cAMP proizvodnje, koji obuhvata davanje, subjektu kom je to potrebno, efektivne količine anti-PACAP antitela koje se konkretno vezuje za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) i/ili takmiči u vezivanju za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) na humanom PACAP kao anti-PACAP antitelo izabrano od Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5.
[0064] Opet u drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za inhibiciju PACAP-indukovane vazodilatacije, fotofobije, degranulacije mastocita, i/ili neuronske aktivacije, koji obuhvata davanje, subjektu kom je to potrebno, efektivne količine anti-PACAP antitela koje se konkretno vezuje za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) i/ili takmiči u vezivanju za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) na humanom PACAP kao anti-PACAP antitelo izabrano od Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5.
[0065] Opet u drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje ili prevenciju stanja povezanog sa povišenim PACAP nivoima kod subjekta, koji obuhvata davanje, subjektu kom je to potrebno, efektivne količine anti-PACAP antitela koje se konkretno vezuje za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) i/ili takmiči u vezivanju za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) na humanom PACAP kao anti-PACAP antitelo izabrano od Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5. Epitop se može identifikovati korišćenjem strategije mutacije skeniranjem alanina, na primer.
[0066] U jednom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitelo korišćeno u postupcima vezuje se za PACAP27 i/ili PACAP38 i blokira PACAP27 i/ili PACAP38 koji se vezuje za PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R. U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitelo korišćeno u postupcima vezuje se za PACAP27 i/ili PACAP38 i blokira PACAP27 i/ili PACAP38 koji se vezuje za svaki od PAC1-R, VPAC1-R, i VPAC2-R. Poželjno, anti-PACAP antitelo vezuje se za PACAP27 i/ili PACAP38 i blokira PACAP27 i/ili PACAP38 koji se vezuje za PAC1-R.
[0067] [0054] Određenije, anti-PACAP antitela korišćena u postupcima prema ovom pronalasku mogu da uključuju humanizovano antitelo. Pored toga, anti-PACAP antitelo korišćeno u postupcima prema ovom pronalasku može u značajnoj meri ili potpuno da nema N-glikozilaciju i/ili O-glikozilaciju. U jednom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitelo korišćeno u obuhvaćenim postupcima obuhvata humani konstantni domen, npr., IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 antitelo. U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitelo obuhvata Fc region koji je modifikovan tako da izmeni (pojača ili ošteti) najmanje jedno od funkcije efektora, vremena eliminacije, proteolize ili glikozilacije. Na primer, Fc region može da sadrži jednu ili više mutacija koje menjaju ili eliminišu N- i/ili O-glikozilaciju.
[0068] U jednom načinu ostvarivanja, predmetni postupci koriste anti-PACAP antitelo koje se vezuje za PACAP sa K<D>manjim od ili jednakim 5x10<-5>M, 10<-5>M, 5x10<-6>M, 10<-6>M, 5x10<-7>M, 10<-7>M, 5x10<-8>M, 10-
[0069] <8>M, 5x10<-9>M, 10<-9>M, 5x10<-10>M, 10<-10>M, 5x10<-11>M, 10<-11>M, 5x10<-12>M, 10<-12>M, 5x10<-13>M, ili 10<-13>M. Poželjno, humanizovano anti-PACAP antitelo se vezuje za PACAP sa K<D>manjim od ili jednakim 5x10<-10>M, 10<-10>M, 5x10<-11>M, 10<-11>M, 5x10<-12>M, ili 10<-12>M. Poželjnije, postupci koriste humanizovano anti-PACAP antitelo koje se vezuje za PACAP sa K<D>koji je manji od oko 100 nM, manji od oko 40 nM, manji od oko 1 nM, manji od oko 100 pM, manji od oko 50 pM, ili manji od oko 25 pM. Alternativno, anti-PACAP antitelo se vezuje za PACAP sa K<D>koja je između oko 10 pM i oko 100 pM. U drugom načinu ostvarivanja, humanizovano anti-PACAP antitelo se vezuje za PACAP sa brzinom disocijacije (k<off>) manjom od ili jednakoj 5x10<-4>s<-1>, 10<-4>s<-1>, 5x10<-5>s<-1>, ili 10<-5>s<-1>.
[0070] U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitelo korišćeno u predmetnim postupcima je direktno ili posredno vezano za neki drugi deo, kao što je oznaka koja se može detektovati ili terapijski agens; je vezano za najmanje jedan efektorski deo, npr., koji obuhvata hemijski linker; i/ili je vezano za jedan ili više delova koji se mogu detektovati, npr., koji obuhvataju fluorescentna boja, enzim, supstrat, bioluminescentni materijal, radioaktivni materijal, hemiluminescentni deo, ili njihove mešavine; i/ili je vezano za jedan ili više funkcionalnih grupa.
[0071] U drugom načinu ostvarivanja, postupak dalje obuhvata davanje odvojeno ili zajedničko davanje nekog drugog agensa, npr., izabranog od hemioterapijskog sredstva, analgetika, antiinflamatornog sredstva, imunosupresiva, citokina, antiproliferativnog sredstva, i antiemetika. Poželjno, drugi terapijski agens je analgetik, npr., NSAIL (kao što su inhibitor ciklooksigenaze 1 i/ili ciklooksigenaze 2; derivati propionske kiseline uključujući ibuprofen, naproksen, naprozin, diklofenak, i ketoprofen; derivati sirćetne kiseline uključujući tolmetin i sulindak; derivati fenaminske kiseline uključujući mefenaminsku kiselinu i meklofenaminsku kiselinu; derivati bifenilkarboksilne kiseline uključujući diflunisal i flufenisal; i oksikami uključujući piroksim, sudoksikam, i izoksikam), opioidni analgetik (kao što je morfin ili derivat morfina ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; kodein, dihidrokodein, diacetilmorfin, hidrokodon, hidromorfon, levorfanol, oksimorfon, alfentanil, buprenorfin, butorfanol, fentanil, sufentanil, meperidin, metadon, nalbufin, propoksifen i pentazocin ili njihove farmaceutski prihvatljive soli), drugo antitelo (kao što je anti-NGF antitelo ili antitelo ili anti-CGRP ili anti-CGRP receptor ("anti-CGRP-R") antitelo ili antitelo ), ili neki biološki agens koji nije antitelo, npr., BOTOX<®>.
[0072] U jednom načinu ostvarivanja, kombinovano davanje opioidnog analgetika i anti-PACAP antitela povećava analgetski efekat u odnosu ili na opioidni analgetik ili na anti-PACAP antitelo kada su dati sami.
[0073] U drugom načinu ostvarivanja, subjekat je prethodno lečen ("lečen subjekat") i primio je anti-CGRP ili anti-CGRP-R antitelo. Lečeni subjekat može biti čovek s migrenom koji nije na adekvatan način reagovao na lečenje anti-CGRP ili anti-CGRP-R antitelom ("pacijent s lošim odgovorom"). Alternativno, lečeni subjekat može prethodno da primi najmanje jedno anti-CGRP antitelo ili anti-CGRP-R ili davanje antitela, i razvije imunološki odgovor na pomenuto antitelo.
[0074] U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitelo ovog pronalaska može da obuhvata ili može izazvati jedan od sledećih efekata: (a) inhibira ili neutrališe najmanje jedan biološki efekat koji izaziva PACAP; (b) neutrališe ili inhibira PACAP aktivaciju najmanje jednog od PAC1 receptora ("PAC1-R"), vazoaktivni intestinalni peptidni receptor tipa 1 ("VPAC1-R"), i/ili vazoaktivni intestinalni peptidni receptor tipa 2 ("VPAC2-R"); (c) neutrališe ili inhibira PACAP aktivaciju jednog od PAC1-R, VPAC1-R, i VPAC2-R; (d) neutrališe ili inhibira PACAP aktivaciju PAC1-R; (e) inhibira vezivanje PACAP za najmanje jedan od PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R; (f) inhibira vezivanje PACAP za svaki od PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R; (g) inhibira vezivanje PACAP za ćelije koje eksprimiraju PAC1-R; (h) inhibira PACAP vezivanje za ćelijsku površinu, npr., preko glikozaminoglikana ("GAG"); (i) ne inhibira PACAP-posredovano vezivanje takvog antitela za ćelijsku površinu, npr., preko GAG; (j) inhibira PACAP-posredovano vezivanje takvog antitela za ćelijsku površinu, npr., preko GAG (k) inhibira PACAP-indukovanu cAMP proizvodnju; i/ili (1) kada se daju subjektu smanjuju vazodilataciju koju indukuje PACAP, fotofobiju, degranulaciju mastocita i/ili neuronsku aktivaciju. U nekim načinima ostvarivanja, pomenuto anti-PACAP antitelo može da se ne veže za ćelijsku površinu u prisustvu PACAP38, npr., preko GAG. U nekim načinima ostvarivanja, pomenuto anti-PACAP antitelo može se vezati za ćelijsku površinu u prisustvu PACAP38, npr., preko GAG. U nekim načinima ostvarivanja, pomenuto anti-PACAP antitelo može se vezati na ograničeni način za ćelijsku površinu u prisustvu PACAP38, npr., preko GAG.
[0075] Opet u drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitelo ovog pronalaska može biti pogodno za lečenje humanog subjekta sa akutnim, epizodnim ili hroničnim stanjem povezanim sa povećanom vazodilatacijom, fotofobijom, degranulacijom mastocita i/ili neuronskom aktivacijom. Ovaj pronalazak obuhvata anti-PACAP antitelo koje može da obuhvata najmanje 2; najmanje 3; najmanje 4; najmanje 5; ili svih 6 regiona koji određuju komplementarnost ("CDR") anti-PACAP antitela koje može da obuhvata Ab21.H, Ab21.H2, Ab21.H3, ili Ab21.H4.
[0076] Opet u drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitelo ovog pronalaska može biti pogodno za lečenje humanog subjekta sa akutnim, epizodnim ili hroničnim stanjem povezanim sa povećanom vazodilatacijom, fotofobijom, degranulacijom mastocita i/ili neuronskom aktivacijom. Pored toga, ovaj pronalazak obuhvata anti-PACAP antitelo koje može da obuhvata najmanje 2; najmanje 3; najmanje 4; najmanje 5; ili svih 6 regiona koji određuju komplementarnost ("CDR") anti-PACAP antitela koje može da obuhvata Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3, ili , Ab10.H5.
[0077] U konkretnom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku, su poželjno humanizovana anti-PACAP antitela i obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 964; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 966; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 968; i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 984; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 986; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 988. U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 962, i/ili (b) varijabilni laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 982. Konkretnije, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 961, i/ili (b) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 981.
[0078] Neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska generalno se odnosi na humanizovano antitelo protiv humanog PACAP koje se konkretno vezuje za epitop na humanom PACAP, pri čemu pomenuti epitop može se izabrati iz grupe koju čine:
[0079] i. najmanje jedan od ostataka 22, 23, 27, 28, i 31 humanog PACAP;
[0080] ii. najmanje jedan od ostataka 12, 20, 23, 24, 26, 27, i 28 humanog PACAP;
[0081] iii. najmanje jedan od ostataka 19, 22, 23, i 27 humanog PACAP;
[0082] iv. najmanje dva od ostataka iz (i), (ii), ili (iii);
[0083] v. najmanje tri od ostataka iz (i), (ii), ili (iii);
[0084] vi. najmanje četiri od ostataka iz (i), (ii), ili (iii);
[0085] vii. najmanje pet od ostataka iz (i) ili (ii);
[0086] viii. najmanje šest od ostataka iz (ii);
[0087] ix. najmanje sedam od ostataka iz (ii); i
[0088] x. najmanje ostatke 23, 27, i 28, humanog PACAP, i opciono, između jedan i šest dodatnih ostataka iz (i) i/ili (ii).
[0089] [0065] Opet u drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, humanizovano antitelo protiv humanog PACAP može se konkretno vezati za epitop na humanom PACAP (ili ili njegova varijanta koja sadrži odgovarajuće aminokiselinske ostatke koji su prisutni u humanom PACAP38 divljeg tipa) ali ne humani divljeg tipa humani PACAP27. Takođe, neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska odnosi se na humanizovano antitelo protiv humanog PACAP ili antitelo koje se može konkretno vezati za epitop na humanom PACAP ili ili njegova varijanta koja sadrži odgovarajuće aminokiselinske ostatke, pri čemu se pomenuti epitop sastoji od ostataka iz bilo koje od (i), (ii), ili (iii). Takođe, neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska odnosi se na humanizovano antitelo protiv humanog PACAP koje se može konkretno vezati za epitop na humanom PACAP (ili ili njegova varijanta koji sadrži odgovarajuće aminokiselinske ostatke) koji je prisutan kod humanog PACAP38 divljeg tipa i kod humanog divljeg tipa humanog PACAP27. Pomenuti epitop može se identifikovati skeniranjem alanina, npr., kao što je otkriveno u primeru 12 ovde, ili nekim drugim postupkom prepoznatim u stanju tehnike.
[0090] Neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska uopšteno se odnosi na anti-PACAP antitelo koje može biti humanizovano. Pored toga, još neki drugi način ostvarivanja obuhvata anti-PACAP antitelo koje može u značajnoj meri ili potpuno da nema N-glikozilacija i/ili O-glikozilacija.
[0091] Neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska obuhvata anti-PACAP koji može da obuhvata humani konstantni domen, npr., IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 antitelo. Štaviše, neki način ostvarivanja ovog pronalaska odnosi se na anti-PACAP antitelo koje može da obuhvata Fc region koji je modifikovan da bi izmenio najmanje jedno od funkcije efektora, vremena eliminacije, proteolize, ili glikozilacije, npr., pri čemu Fc region može da sadrži jednu ili više mutacija koja menja ili eliminiše N- i/ili O-glikozilaciju.
[0092] Opet u drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitelo može se vezati za PACAP sa afinitetom vezivanja (K<D>) manjim od ili jednakim 5x10<-5>M, 10<-5>M, 5x10<-6>M, 10<-6>M, 5x10<-7>M, 10<-7>M, 5x10<-8>M, 10<-8>M, 5x10<-9>M, 10<-9>M, 5x10<-10>M, 10<-10>M, 5x10<-11>M, 10<-11>M, 5x10<-12>M, 10<-12>M, 5x10<-13>M, ili 10<-13>M, npr., kao što je određeno pomoću ELISA, interferometrijom bio-sloja ("BLI"), KINEXA ili površinskom plazmonskom rezonancom na 25° ili 37°C. Takođe, neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska obuhvata anti-PACAP antitelo koje se može vezati za PACAP sa afinitetom vezivanja (K<D>) manjim od ili jednakim 5x10<-10>M, 10<-10>M, 5x10<-11>M, 10<-11>M, 5x10<-12>M, ili 10<-12>M. Takođe, neki dalji način ostvarivanja ovog pronalaska odnosi se na anti-PACAP antitelo koje se može vezati za PACAP sa brzinom disocijacije (k<d>) manjom od ili jednakom 5x10<-4>s<-1>, 10<-4>s<-1>, 5x10<-5>s<-1>, ili 10<-5>s<-1>.
[0093] Neki dalji način ostvarivanja ovog pronalaska odnosi se na anti-PACAP antitelo koje se može direktno ili posredno vezati za oznaku koja se može detektovati ili terapijski agens. Takođe, neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska odnosi se na anti-PACAP antitelo koje se može vezati za PACAP sa K<D>koji je manji od oko 100 nM, 40 nM, 50 pM, 25pM, ili je između oko 10 pM i oko 100 pM. Neki dalji način ostvarivanja odnosi se na anti-PACAP antitelo koje može imati veći afinitet prema PACAP u odnosu na VIP i/ili se ne vezuje za VIP, npr., pri čemu afinitet pomenutog antitela prema PACAP može biti najmanje 10-puta, 30-puta, 100-puta, 300-puta, 1000-puta, 3000-puta, 10000-puta, 30000-puta, 100000-puta, 300000-puta, 1000000-puta, 3000000-puta, 10000000-puta, 30000000-puta ili više veći od afiniteta pomenutog antitela prema VIP.
[0094] [0070] Takođe, neki drugi aspekt ovog pronalaska uopšteno se odnosi na anti-PACAP antitelo koje se može vezati za najmanje jedan efektor ili funkcionalni deo i/ili jedan ili više delova koji se mogu detektovati, npr., fluorescentna boja, enzim, supstrat, bioluminescentni materijal, radioaktivni materijal, hemiluminescentni deo, ili njihova mešavina. Još neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska odnosi se na anti-idiotipsko antitelo koje se može proizvoditi protiv anti-PACAP antitela koje opciono može da neutrališe jedan ili više bioloških efekata anti-PACAP antitela za koje se može vezati. Takođe, pomenuto anti-idiotipsko antitelo može da se koristi za praćenje in vivo nivoa pomenutog anti-PACAP antitela kod subjekta ili za neutralizaciju in vivo efekata pomenutog anti-PACAP antitela kod subjekta.
[0095] Neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska obuhvata kompoziciju koja može biti pogodna za terapijsku, profilaktičku ili dijagnostičku upotrebu koja može da obuhvata neku terapijski, profilaktički ili dijagnostički efektivnu količinu najmanje jednog anti-PACAP antitela. Pomenuta kompozicija može biti pogodna za subkutano davanje; i/ili može biti pogodna za intravensko ili intramuskularno davanje. Pored toga, u nekim načinima ostvarivanja, pomenuta kompozicija može biti liofilizovana, stabilizovana i/ili formulisana za davanje injekcijom. Takođe, pomenuta kompozicija može dalje da obuhvata neki farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač, rastvarač, emulgator, konzervans, ili njihovu mešavinu i/ili neki drugi aktivni agens, npr., gde se drugi aktivni agens može izabrati iz grupe koju čine hemioterapijsko sredstvo, analgetik, antiinflamatorno sredstvo, imunosupresiv, citokin, antiproliferativno sredstvo, antiemetik i citotoksin.
[0096] Takođe, neki drugi način ostvarivanja odnosi se na izolovanu sekvencu nukleinske kiseline ili sekvence nukleinske kiseline koje mogu da kodiraju anti-PACAP antitelo . U nekom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, vektor ili vektori mogu da sadrže izolovanu sekvencu ili sekvence nukleinske kiseline. Osim toga, neki drugi način ostvarivanja odnosi se na ćeliju domaćina koja može da obuhvata izolovanu sekvencu ili sekvence nukleinske kiseline i/ili vektor ili vektore. Pomenuta ćelija domaćina može biti ćelija sisara, bakterijska ćelija, ćelija gljivica, ćelija kvasca, ćelija ptica, ćelija vodozemaca, biljna ćelija ili ćelija insekata, ili je CHO ćelija. Takođe, pomenuta ćelija domaćina može biti filamentozna gljivica ili kvasac, npr., izabrana od sledećih rodova: Arxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces;
[0097] Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; i Zygosaccharomyces poželjno Pichia, a poželjnije Pichia pastoris, Pichia methanolica ili Hansenula polymorpha (Pichia angusta); ili pomenuta ćelija domaćina može biti ćelija sisara, npr., izabrana od ćelija bubrega mladunca hrčka ("BHK"); ćelija jajnika kineskog hrčka ("CHO"); sertolijevih ćelija miša ("TM4" ćelije); ćelija bubrega afričkog zelenog majmuna ("VERO-76" ćelije); humanih ćelija karcinoma grlića materice ("HELA"); psećih bubrežnih ćelija ("MDCK"); bivoljih ćelija jetre pacova ("BRL"); humanih plućnih ćelija; humanih ćelija jetre ("Hep G2"); ćelija tumora mlečnih žlezda miša ("MMT"); TRI ćelija; MRC 5 ćelija; i FS4 ćelija. Pored toga, pomenuta CHO ćelija može biti izabrana od jednog od sledećih podklonova ili podćelijskih linija: DP12 (CHO K1 dhfr-) ćelijska linija, NS0 ćelije, CHO-DXB11 (CHO-DUKX), CHO-pro3, CHO-DG44, CHO 1-15, CHO DP-12, Lec2, M1WT3, Lec8, ili pgsA-745.
[0098] [0073] Neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska odnosi se na postupak eksprimiranja anti-PACAP antitela, koji može da obuhvata kultivisanje pomenute ćelije domaćina u uslovima koji obezbeđuju ekspresiju pomenutog antitela . Pored toga, pomenuta ćelija domaćina može biti poliploidna kultura kvasca ili CHO ćelija koja stabilno eksprimira i luči najmanje 10-25 mg/litru pomenutog antitela u podlogu za kultivisanje . Takođe, pomenuti poliploidni kvasac, poželjno Pichia kvasac, može se izvesti postupkom koji može da obuhvata: (i) uvođenje najmanje jednog ekspresionog vektora koji sadrži jedan ili više heterolognih polinukleotida koji kodiraju pomenuto antitelo radno vezano za promotor i signalnu sekvencu u haploidnu ćeliju kvasca; (ii) proizvodnju parenjem ili fuzijom sferoplasta poliploidnog kvasca iz pomenute prve i/ili druge haploidne ćelije kvasca; (iii) odabir poliploidnih ćelija kvasaca koje stabilno eksprimiraju pomenuto antitelo; i (iv) proizvodnju stabilnih poliploidnih kultura kvasaca iz pomenutih poliploidnih ćelija kvasaca koje stabilno eksprimiraju pomenuto antitelo u podlogu za kultivisanje.
[0099] Neki drugi aspekt ovog pronalaska uopšteno se odnosi na postupak za blokiranje, inhibiciju ili neutralizaciju jednog ili više bioloških efekata povezanih sa peptidom koji aktivira hipofiznu adenilat ciklazu ("PACAP") kod subjekta, koji može da obuhvata davanje, subjektu kom je to potrebno, efektivne količine anti-PACAP antitela, kao što je otkriveno ovde, ili kompozicije kao što je otkrivena ovde. U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uopšteno se odnosi na postupak za blokiranje, inhibiciju ili neutralizaciju jednog ili više bioloških efekata povezanih sa peptidom koji aktivira hipofiznu adenilat ciklazu ("PACAP") kod subjekta, koji može da obuhvata davanje, subjektu kom je to potrebno, efektivne količine anti-PACAP antitela, kao što je ovde opisano, ili kompozicije, kao što je ovde opisana, koje može da antagonizuje, inhibira, neutrališe ili blokira najmanje jedan biološki efekat povezan sa humanim PACAP i koje značajno ne reaguje (ne vezuje se) sa vazoaktivnim intestinalnim peptidom ("VIP").
[0100] [0075] Takođe, neki drugi način ostvarivanja obuhvata postupak za blokiranje, inhibiciju ili neutralizaciju jednog ili više bioloških efekata povezanih sa peptidom koji aktivira hipofiznu adenilat ciklazu ("PACAP") kod subjekta, koji može da obuhvata davanje, subjektu kom je to potrebno, efektivne količine anti-PACAP antitela, kao što je otkriveno ovde, ili kompozicije, kao što je otkrivena ovde, koja može da izazove ili može da obuhvata jedno ili više od sledećeg: (a) inhibira ili neutrališe najmanje jedan biološki efekat koji izaziva PACAP; (b) neutrališe ili inhibira PACAP aktivaciju najmanje jednog od PAC1 receptora ("PAC1-R"), vazoaktivnog intestinalnog peptidnog receptora tipa 1 ("VPAC1-R"), i/ili vazoaktivnog intestinalnog peptidnog receptora tipa 2 ("VPAC2-R"); (c) neutrališe ili inhibira PACAP aktivaciju jednog od PAC1-R, VPAC1-R, i VPAC2-R; (d) neutrališe ili inhibira PACAP aktivaciju PAC1-R; (e) može da inhibira vezivanje PACAP za najmanje jedan od PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R; (f) može da inhibira vezivanje PACAP za svaki od PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R; (g) može da inhibira vezivanje PACAP za ćelije koje eksprimiraju PAC1-R; (h) može da inhibira PACAP vezivanje za ćelijsku površinu, npr., preko glikozaminoglikana ("GAG"); (i) ne inhibira PACAP-posredovano vezivanje takvog antitela za ćelijsku površinu, npr., preko GAG; (j) inhibira PACAP-posredovano vezivanje takvog antitela za ćelijsku površinu, npr., preko GAG; (k) inhibira PACAP-indukovanu cAMP proizvodnju; i/ili (l), kada se daju subjektu, smanjuje PACAP-indukovanu vazodilataciju, fotofobiju, degranulaciju mastocita i/ili neuronsku aktivaciju.
[0101] Još neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska odnosi se na postupak za lečenje ili prevenciju pojave, učestalosti, težine ili trajanja glavobolje ili migrene, npr. pri čemu se glavobolja ili migrena može izabrati od migrene sa aurom, migrene bez aure, hemiplegične migrene, klaster glavobolje, migrenozne neuralgije, hronične glavobolje, hronične migrene, glavobolje zbog prekomerne upotrebe lekova, i tenzione glavobolje kod subjekta, koji može da obuhvata davanje, subjektu kom je to potrebno, neke efektivne količine humanizovanog antitela protiv polipeptida koji aktivira hipofiznu adenilat ciklazu ("PACAP"), kao što je ovde opisano, ili kompozicije, kao što je ovde opisana, koja može da izazove ili može da obuhvata jedno ili više od sledećeg: (a) inhibira ili neutrališe najmanje jedan biološki efekat koji izaziva PACAP; (b) neutrališe ili inhibira PACAP aktivaciju najmanje jednog od PAC1 receptora ("PAC1-R"), vazoaktivnog intestinalnog peptidnog receptora tipa 1 ("VPAC1-R"), i/ili vazoaktivnog intestinalnog peptidnog receptora tipa 2 ("VPAC2-R"); (c) neutrališe ili inhibira PACAP aktivaciju jednog od PAC1-R, VPAC1-R, i VPAC2-R; (d) neutrališe ili inhibira PACAP aktivaciju PAC1-R; (e) može da inhibira vezivanje PACAP za najmanje jedan od PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R; (f) može da inhibira vezivanje PACAP za svaki od PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R; (g) može da inhibira vezivanje PACAP za ćelije koje eksprimiraju PAC1-R; (h) može da inhibira PACAP vezivanje za ćelijsku površinu, npr., preko glikozaminoglikana ("GAG"); (i) ne inhibira PACAP-posredovano vezivanje takvog antitela za ćelijsku površinu, npr., preko GAG; (j) inhibira PACAP-posredovano vezivanje takvog antitela za ćelijsku površinu, npr., preko GAG; (k) inhibira PACAP-indukovanu cAMP proizvodnju; i/ili (l) kada se daju subjektu smanjuje PACAP-indukovanu vazodilataciju, fotofobiju, degranulaciju mastocitu i/ili neuronsku aktivaciju.
[0102] Još neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska odnosi se na postupak lečenja humanog subjekta sa akutnim, epizodnim ili hroničnim stanjem povezanim sa najmanje jednim od povećane vazodilatacije, fotofobije, degranulacije mastocita i neuronske aktivacije ili kombinaciju bilo kojeg od gorepomenutih koji mogu da obuhvataju davanje, subjektu kom je to potrebno, neke efektivne količine antitela protiv polipeptida koji aktivira hipofiznu adenilat ciklazu ("PACAP"), kao što je ovde opisano, ili kompozicije kao što je ovde opisana.
[0103] Neki dalji način ostvarivanja odnosi se na postupak za blokiranje, inhibiciju ili neutralizaciju jednog ili više bioloških efekata povezanih sa peptidom koji aktivira hipofiznu adenilat ciklazu ("PACAP"), koji može da obuhvata davanje, subjektu kom je to potrebno, efektivne količine anti-PACAP antitela koje se može konkretno vezati za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) i/ili se može takmičiti u vezivanju za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) na humanom PACAP kao anti-PACAP antitelo koje obuhvata Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3, i Ab10.H5, ili neko ovde opisano ili ovde opisanu kompoziciju.
[0104] Još neki drugi način ostvarivanja odnosi se na postupak za neutralizaciju signalizacije PAC1 receptora kojeg indukuje peptid koji aktivira hipofiznu adenilat ciklazu ("PACAP") ("PAC1-R"), vazoaktivnog intestinalnog peptidnog receptora tipa 1 ("VPAC1-R"), i/ili vazoaktivnog intestinalnog peptidnog receptora tipa 2 ("VPAC2-R"), koji može da obuhvata davanje, subjektu kom je to potrebno, efektivne količine anti-PACAP antitela koje se može konkretno vezati za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) i/ili se može takmičiti u vezivanju za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) na humanom PACAP kao anti-PACAP antitelo koje obuhvata Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3, i Ab10.H5, ili neko ovde opisano ili ovde opisanu kompoziciju.
[0105] U nekom daljem načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obuhvata postupak za inhibiciju proizvodnje cikličnog adenozin monofosfata ("cAMP") indukovanu peptidom koji aktivira hipofiznu adenilat ciklazu ("PACAP"), koji može da obuhvata davanje, subjektu kom je to potrebno, efektivne količine anti-PACAP antitela koje se može konkretno vezati za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) i/ili se može takmičiti u vezivanju za isti ili preklapajući linearni ili konformacioni epitop(e) na humanom PACAP kao anti-PACAP antitelo koje obuhvata Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3, i Ab10.H5, ili neko ovde opisano ili ovde opisanu kompoziciju.
[0106] Neki drugi aspekt ovog pronalaska uopšteno se odnosi na postupak, pri čemu anti-PACAP antitelo može biti humanizovano antitelo. Neki drugi aspekt ovog pronalaska generalno se odnosi na postupak, pri čemu se anti-PACAP antitelo može vezati za PACAP27 i/ili PACAP38 i može da blokira PACAP27 i/ili PACAP38 koji se vezuje za PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R. Takođe, neki drugi način ostvarivanja odnosi se na postupak gde se anti-PACAP antitelo može vezati za PACAP27 i/ili PACAP38 i može da blokira PACAP27 i/ili PACAP38 koji se vezuje za svaki od PAC1-R, VPAC1-R, i VPAC2-R.
[0107] [0082] Još neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska odnosi se na postupak, pri čemu se anti-PACAP antitelo može vezati za PACAP27 i/ili PACAP38 i može da blokira PACAP27 i/ili PACAP38 koji se vezuje za ćelije koje eksprimiraju PAC1-R. Takođe, neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska odnosi se na postupak pri čemu subjekat može imati stanje koje se može izabrati iz grupe koju čine migrena sa aurom, migrena bez aure, hemiplegične migrene, klaster glavobolje, migrenozna neuralgija, hronične glavobolje, hronična migrena, glavobolja zbog prekomerne upotrebe lekova, tenzione glavobolje, opšte glavobolje, valunzi, fotofobija, hronična paroksizmalna hemikranija, sekundarne glavobolje zbog osnovnog strukturnog problema u glavi, sekundarne glavobolje zbog osnovnog strukturnog problema u vratu, kranijalna neuralgija, sinusne glavobolje, glavobolja povezana sa sinusitisom, glavobolje izazvane alergijom, migrene izazvane alergijom, trigeminalna neuralgija, postherpetična neuralgija, fantomski bol u ekstremitetima, fibromijalgija, refleksna simpatička distrofija, bol, hronični bol, inflamatorni bol, bol nakon operativnog reza, postoperativni bol, bol povezan sa traumom, bol u donjem delu leđa, bol u očima, zubobolja, kompleksni regionalni bolni sindrom, bol zbog raka, bol zbog primarnog ili metastatskog raka kostiju, bol zbog preloma, bol zbog preloma kod osteoporoze, bol nastao usled opekotina, bol u zglobovima kod gihta, bol povezan sa krizom srpastih ćelija, bol povezan sa temporomandibularnim poremećajima, ciroza, hepatitis, neurogeni bol, neuropatski bol, nociceptivni bol, visceralni bol, menstrualni bolovi, ovarijalgija, bol zbog osteoartritisa, bol zbog reumatoidnog artritisa, dijabetesna neuropatija, išijas, dispepsija, sindrom iritabilnog creva, inflamatorna bolest creva, Kronova bolest, ileitis, ulcerativni kolitis, bubrežne kolike, dismenoreja, cistitis, intersticijalni cistitis, menstrualni period, porođaj, menopauza, pankreatitis, šizofrenija, depresija, posttraumatski stresni poremećaj ("PTSD"), anksiozni poremećaji, autoimuni dijabetes, Sjogrenov sindrom, multipla skleroza, preaktivna bešika, bronhijalna hiperreaktivnost, astma, moždani udar, bronhitis, bronhodilatacija, emfizem, hronična opstruktivna bolest pluća ("COPD"), inflamatorni dermatitis, akne vulgaris, atopijski dermatitis, urtikarija, keloidi, hipertrofični ožiljci i rozacea, endotelna disfunkcija, Rejnoov sindrom, koronarna bolest srca ("CHD"), koronarna arterijska bolest ("CAD"), srčana insuficijencija, periferna arterijska bolest ("PAD"), dijabetes, plućna hipertenzija ("PH"), poremećaj vezivnog tkiva, alergijski dermatitis, psorijaza, pruritus, neurogeno crvenilo kože, eritem, sarkoidoza, šok, sepsa, sindrom apstinencije od opijata, tolerancija na morfin i epilepsija; i/ili pri čemu pomenuti subjekat može imati stanje koje se može izabrati iz grupe koju čine migrena, glavobolja i bolest ili stanje povezano sa bolom; i/ili pri čemu se pomenuta glavobolja ili migrena može izabrati iz grupe koju čine migrena sa aurom, migrena bez aure, hemiplegična migrena, klaster glavobolja, migrenozna neuralgija, hronična glavobolja, hronična migrena, glavobolja zbog prekomerne upotrebe lekova i tenziona glavobolja. Takođe, pomenuti subjekat može imati neki očni poremećaj povezan sa fotofobijom izabran iz grupe koju čine ahromatopsija, aniridija, fotofobija uzrokovana antiholinergičkim lekom, afakija, buftalmos, katarakte, konusna distrofija, kongenitalne abnormalnosti oka, virusni konjunktivitis, abrazija rožnjače, distrofija rožnjače, čir na rožnjači, poremećaj epitela rožnjače, ektopija sočiva, endoftalmitis, trauma oka izazvana bolešću, trauma oka uzrokovana povredom, trauma oka uzrokovana infekcijom, halazion, episkleritis, glaukom, keratokonus, hipoplazija očnog živca, hidroftalmos, kongenitalni glaukom iritis, optički neuritis, sindrom disperzije pigmenta, širenje zenica, odvajanje mrežnjače, ožiljavanje rožnjače, sklera i uveitis.
[0108] [0083] Štaviše, pomenuti subjekat može imati neko stanje povezano sa nervnim sistemom ili neurološko stanje povezano sa fotofobijom izabrano iz grupe koju čine poremećaji autističnog spektra, Kiarijeva malformacija, disleksija, encefalitis, meningitis, subarahnoidno krvarenje, tumor zadnje kranijalne jame, ankilozni spondilitis, albinizam, ariboflavinoza, benzodiazepini, hemioterapija, čikungunja, cistinoza, Ehlers-Danlos sindrom, mamurluk, grip, infektivna mononukleoza, nedostatak magnezijuma, trovanje živom, migrena, besnilo i tirozinemija tipa II; i/ili pomenuti subjekat može imati poremećaj povezan sa fotofobijom izabran iz grupe koju čine migrena sa aurom, migrena bez aure, iritis, uveitis, meningitis, depresija, bipolarni poremećaj, klaster glavobolja ili anter trigeminalna autonomna cefalalgija ("TAC") ili blefarospazam, depresija, agorafobija i bipolarni poremećaj.
[0109] U konkretnom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak takođe obuhvata bilo koji od ovde opisanih postupaka, pri čemu su anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku poželjno humanizovana anti-PACAP antitela, i obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 964; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 966; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 968; i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 984; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 986; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 988. Alternativno, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 962, i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 982. U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 962, i/ili (b) varijabilni laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 982. Konkretnije, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 961, i/ili (b) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 981.
[0110] U drugom konkretnom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak takođe obuhvata bilo koji od ovde opisanih postupaka, pri čemu su anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku poželjno humanizovana anti-PACAP antitela, i obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1284; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1286; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1288; i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1304; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1306; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1308. Alternativno, anti- PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1282, i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1302. U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1282, i/ili (b) varijabilni laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1302. Konkretnije, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1281, i/ili (b) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1301.
[0111] [0086] U drugom konkretnom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak takođe obuhvata bilo koji od ovde opisanih postupaka, pri čemu su anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku poželjno humanizovana anti-PACAP antitela , i obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1324; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1326; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1328; i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1344; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1346; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1348. Alternativno, anti- PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1322, i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1342. U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1322, i/ili (b) varijabilni laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1342. Konkretnije, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1321, i/ili (b) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1341.
[0112] U drugom konkretnom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak takođe obuhvata bilo koji od ovde opisanih postupaka, pri čemu su anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku poželjno humanizovana anti-PACAP antitela , i obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1404; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1406; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1408; i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1424; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1426; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1428. Alternativno, anti- PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1402, i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1422. U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1402, i/ili (b) varijabilni laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1422. Konkretnije, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID
[0113] [0088] U drugom konkretnom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak takođe obuhvata bilo koji od ovde opisanih postupaka, pri čemu su anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku poželjno humanizovana anti-PACAP antitela, i obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 962 i koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 964; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 966; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 968; i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 982 i koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 984; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 986; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 988. Alternativno, anti- PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 962, i/ili (b) varijabilni laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 982. Alternativno, anti- PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 962, i (b) varijabilni laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 982. U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 961 i koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 964; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 966; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 968; i/ili (b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 981 i koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 984; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 986; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 988. Alternativno, anti- PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 961, i/ili (b) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 981. Alternativno, anti- PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 961, i (b) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 981.
[0114] U drugom konkretnom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak takođe obuhvata bilo koji od ovde opisanih postupaka, pri čemu su anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku poželjno humanizovana anti-PACAP antitela, i obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1282 i koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1284; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1286; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1288; i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1302 i koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1304; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1306; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1308. Alternativno, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1282, i/ili (b) varijabilni laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1302. Alternativno, anti- PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1282, i (b) varijabilni laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1302. U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1281 i koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1284; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1286; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1288; i/ili (b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1301 i koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1304; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1306; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1308.
[0115] Alternativno, anti- PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1281, i/ili (b) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1301. Alternativno, anti- PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1281, i (b) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1301.
[0116] [0090] U drugom konkretnom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak takođe obuhvata bilo koji od ovde opisanih postupaka, pri čemu su anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku poželjno humanizovana anti-PACAP antitela, i obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1322 i koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1324; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1326; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1328; i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1342 i koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1344; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1346; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1348. Alternativno, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1322, i/ili (b) varijabilni laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1342. Alternativno, anti- PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1322, i (b) varijabilni laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1342. U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1321 i koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1324; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1326; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1328; i/ili (b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1341 i koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1344; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1346; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1348.
[0117] Alternativno, anti- PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1321, i/ili (b) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1341. Alternativno, anti- PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1321, i (b) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1341.
[0118] [0091] U drugom konkretnom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak takođe obuhvata bilo koji od ovde opisanih postupaka, pri čemu su anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku poželjno humanizovana anti-PACAP antitela, i obuhvataju (a) varijabilni teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1402 i koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1404; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1406; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1408; i/ili (b) varijabilni laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1422 i koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1424; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1426; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1428. Alternativno, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1402, i/ili (b) varijabilni laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1422. Alternativno, anti- PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) varijabilni teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1402, i (b) varijabilni laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1422. U drugom načinu ostvarivanja, anti-PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1401 i koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1404; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1406; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1408; i/ili (b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa identitetom sekvence SEQ ID NO: 1421 i koji obuhvata CDR1 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1424; CDR2 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1426; i CDR3 sekvencu koja se sastoji od SEQ ID NO: 1428.
[0119] Alternativno, anti- PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1401, i/ili (b) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1421. Alternativno, anti- PACAP antitela mogu da obuhvataju (a) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1401, i (b) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 1421.
[0120] Neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska uopšteno se odnosi i na postupak, pri čemu anti-PACAP antitelo može u značajnoj meri ili potpuno da nema N-glikozilaciju i/ili O-glikozilaciju. Još neki drugi način ostvarivanja odnosi se na postupak, pri čemu anti-PACAP antitelo može da obuhvata humani konstantni domen, npr., IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 antitelo.
[0121] Takođe, neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska generalno se odnosi na postupak, pri čemu anti-PACAP antitelo može da obuhvata Fc region koji je modifikovan da bi izmenio najmanje jedno od funkcije efektora, vremena eliminacije, proteolize ili glikozilacije, npr., pri čemu Fc region može da sadrži jednu ili više mutacija koje menjaju ili eliminišu N- i/ili O-glikozilaciju.
[0122] Pored toga, neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska odnosi se na postupak, pri čemu anti-PACAP antitelo može da se vezuje za PACAP sa afinitetom vezivanja (K<D>) manjim od ili jednakim 5x10-
[0123] <5>M, 10<-5>M, 5x10<-6>M, 10<-6>M, 5x10<-7>M, 10<-7>M, 5x10<-8>M, 10<-8>M, 5x10<-9>M, 10<-9>M, 5x10<-10>M, 10<-10>M, 5x10<-11>M, 10<-11>M, 5x10<-12>M, 10<-12>M, 5x10<-13>M, ili 10<-13>M. Takođe, neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska odnosi se na postupak, pri čemu anti-PACAP antitelo može da se vezuje za PACAP sa afinitetom vezivanja (K<D>) manjim od ili jednakim 5x10<-10>M, 10<-10>M, 5x10<-11>M, 10<-11>M, 5x10<-12>M, ili 10-
[0124] <12>M i/ili vezuje za PACAP sa brzinom disocijacije (k<d>) manjom od ili jednakoj 5x10<-4>s<-1>, 10<-4>s<-1>, 5x10<-5>s<-1>, ili 10<-5>s<-1>.
[0125] Neki drugi aspekt ovog pronalaska obuhvata postupak, pri čemu se anti-PACAP antitelo može direktno ili posredno vezati za oznaku koja se može detektovati ili terapijski agens. Neki drugi aspekt ovog pronalaska obuhvata postupak, pri čemu anti-PACAP antitelo može da se vezuje za PACAP sa K<D>koji je manji od oko 100 nM, manji od oko 40 nM, manji od oko 1 nM, manji od oko 100 pM, manji od oko 50 pM, ili manji od oko 25 pM ili K<D>koji je između oko 10 pM i oko 100 pM.
[0126] [0096] Neki drugi aspekt ovog pronalaska obuhvata postupak, pri čemu taj postupak dalje može da obuhvata davanje odvojeno ili zajedničko davanje sa nekim drugim agensom npr., hemioterapijsko sredstvo, analgetik, antiinflamatorno sredstvo, imunosupresiv, citokin, antiproliferativno sredstvo, antiemetik, citotoksin, analgetik, npr., pri čemu analgetik može biti nesteroidni antiinflamatorni lek ("NSAIL"), opioidni analgetik, neko drugo antitelo ili neki biološki agens koji nije antitelo, npr., anti-NGF antitelo ili antitelo protiv peptida povezanog sa genom kalcitonina ("CGRP"). Pomenut NSAIL može biti inhibitor ciklooksigenaze 1 i/ili ciklooksigenaze 2 ili može se izabrati iz grupe koju čine (1) derivati propionske kiseline uključujući ibuprofen, naproksen, naprozin, diklofenak i ketoprofen; (2) derivati sirćetne kiseline uključujući tolmetin i sulindak; (3) derivati fenaminske kiseline uključujući mefenaminsku kiselinu i meklofenaminsku kiselinu; (4) derivati bifenilkarboksilne kiseline uključujući diflunisal i flufenisal; i (5) oksikami uključujući piroksim, sudoksikam i izoksikam ili je neki opioidni analgetik izabran iz grupe koju čine kodein, dihidrokodein, diacetilmorfin, hidrokodon, hidromorfon, levorfanol, oksimorfon, alfentanil, buprenorfin, butorfanol, fentanil, sufentanil, meperidin, metadon, nalbufin, propoksifen, pentazocin, i njihove farmaceutski prihvatljive soli, poželjno morfin ili derivat morfina ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
[0127] Neki drugi aspekt ovog pronalaska obuhvata postupak, pri čemu kombinovano davanje opioidnog analgetika i PACAP antitela može povećati analgetski efekat u odnosu ili na opioidni analgetik ili na PACAP antitelo kada se daju sami. Pored toga, neki dalji način ostvarivanja ovog pronalaska odnosi se na postupak, pri čemu je subjekat prethodno primio anti-CGRP antitelo i/ili predstavlja čoveka s migrenom koji možda nije adekvatno reagovao na lečenje anti-CGRP antitelom i/ili je možda izazvao imuni odgovor na prethodno dato anti-CGRP antitelo .
[0129] KRATAK OPIS NEKOLIKO PRIKAZA IZ NACRTA
[0131]
[0132] FIG.1A-1G obezbeđuju polipeptidne sekvence teškog lanca pune dužine za antitela Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, i Ab21.H4 (SEQ ID NO: 401; 441; 841; 881; 921; 961; 1201; 1281; 1321; 1361; 1401; 1441; 1481; 1521; i 1561, tim redom) poravnate po svojim FR-ovima, i CDR-ovima, i konstantnim regionima.
[0133] FIG.2A-2D obezbeđuju polipeptidne sekvence lakog lanca pune dužine za antitela Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, i Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, i Ab21.H4 (SEQ ID NO: 421; 461; 861; 901; 941; 981; 1221; 1301; 1341; 1381; 1421; 1461; 1501; 1541; i 1581, tim redom) poravnate po svojim FR-ovima, i CDR-ovima, i konstantnim regionima.
[0134] FIG.3A-3S obezbeđuju polinukleotidne sekvence koje kodiraju teški lanac pune dužine za antitela Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, i Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, i Ab21.H4 (SEQ ID NO: 411; 451; 851; 891; 931; 971; 1211; 1291; 1331; 1371; 1411; 1451; 1491; 1531; i 1571, tim redom) poravnate po svojim FR-ovima, i CDR-ovima, i konstantnim regionima.
[0135] FIG.4A-4J obezbeđuju polinukleotidne sekvence koje kodiraju laki lanac pune dužine Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, i Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, i Ab21.H4 (SEQ ID NO: 431; 471; 871; 911; 951; 991; 1231; 1311; 1351; 1391; 1431; 1471; 1511; 1551; i 1591, tim redom) poravnate po svojim FR-ovima, i CDR-ovima, i konstantnim regionima.
[0136] FIG.5 obezbeđuje koordinate polipeptidnih sekvenci za karakteristike proteinske sekvence teškog lanca određenog antitela koje uključuju varijabilni region i CDR-ove teškog lanca za antitela Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, i Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, i Ab21.H4.
[0137] FIG.6 obezbeđuje koordinate polipeptidnih sekvenci za karakteristike proteinske sekvence teškog lanca određenog antitela koje uključuju konstantni region i okvirne regione FR teškog lanca za antitela Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, i Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, i Ab21.H4.
[0138] FIG.7 obezbeđuje koordinate polipeptidnih sekvenci za karakteristike proteinske sekvence lakog lanca određenog antitela koje uključuju varijabilni region i CDR-ove lakog lanca za antitela Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, i Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, i Ab21.H4.
[0139] FIG.8 obezbeđuje koordinate polipeptidnih sekvenci za karakteristike proteinske sekvence lakog lanca određenog antitela koje uključuju konstantni region i okvirne regione FR lakog lanca za antitela Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, i Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, i Ab21.H4.
[0140] FIG.9 obezbeđuje koordinate polinukleotidnih sekvenci za karakteristike DNK sekvence teškog lanca određenog antitela koje uključuju varijabilni region i CDR-ove teškog lanca za antitela Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, i Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, i Ab21.H4.
[0141] FIG.10 obezbeđuje koordinate polinukleotidnih sekvenci za karakteristike DNK sekvence teškog lanca određenog antitela koje uključuju konstantni region i FR-ove teškog lanca za antitela Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, i Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, i Ab21.H4.
[0142] FIG.11 obezbeđuje koordinate polinukleotidnih sekvenci za karakteristike DNK sekvence lakog lanca određenog antitela koje uključuju varijabilni region i CDR-ove lakog lanca za antitela Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, i Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, i Ab21.H4.
[0143] FIG.12 obezbeđuje koordinate polinukleotidnih sekvenci za karakteristike DNK sekvence lakog lanca određenog antitela koje uključuju konstantni region i FR-ove lakog lanca za antitela Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, i Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3, i Ab21.H4.
[0144] FIG.13A-F obezbeđuju reprezentativne podatke o konkurentnom vezivanju za Ab10 (FIG.
[0145] 13A), Ab20 (FIG.13B), Ab21 (FIG.13C), Ab1.H (FIG.13D), Ab22 (FIG.13E), i Ab23 (FIG.
[0146] 13F), dobijene prema protokolu u primeru 1 dole.
[0147] FIG.14A-H obezbeđuju reprezentativne podatke koji prikazuju Ab10-posredovanu (FIG.
[0148] 14A), Ab20-posredovanu (FIG.14B), Ab21-posredovanu (FIG.14C), Ab1.H-posredovanu (FIG.
[0149] 14D), Ab10.H-posredovanu (FIG.14E), Ab21.H-posredovanu (FIG.14F), Ab22-posredovanu (FIG.
[0150] 14G), i Ab23-posredovanu (FIG.14H) inhibiciju PACAP38 vezivanja za PC-12 ćelije koje eksprimiraju PAC1-R, dobijene prema protokolu u primeru 5 dole.
[0151] FIG.15A-O obezbeđuju reprezentativne podatke koji prikazuju Ab10 (FIG.15A), Ab20 (FIG. 15B), Ab21 (FIG.15C), Ab1.H (FIG.15D), Ab10.H (FIG.15E), Ab21.H (FIG.15F), Ab22 (FIG.
[0152] 15G), Ab23 (FIG.15H), Ab10.H2 (FIG.15I), Ab10.H3 (FIG.15J), Ab10.H4 (FIG.
[0153] 15K), Ab10.H5 (FIG.15L), Ab21.H2 (FIG.15M), Ab21.H3 (FIG.15N), i Ab21.H4 (FIG.
[0154] 15O) vezivanje za PC-12 ćelije koje eksprimiraju PAC1-R u prisustvu PACAP38 dobijene prema protokolu u primeru 6 dole. Isprekidana linija na FIG.15A predstavlja kontrolu bez PACAP i bez antitela.
[0155] FIG.16A-O obezbeđuju reprezentativne podatke koji prikazuju Ab10-posredovanu (FIG.
[0156] 16A), Ab20-posredovanu (FIG.16B), Ab21-posredovanu (FIG.16C), Ab1.H-posredovanu (FIG.
[0157] 16D), Ab10.H-posredovanu (FIG.16E), Ab21.H-posredovanu (FIG.16F), Ab22-posredovanu (FIG.
[0158] 16G), Ab23-posredovanu (FIG.16H), Ab10.H2-posredovanu (FIG.16I), Ab10.H3-posredovanu (FIG.16J), Ab10.H4-posredovanu (FIG.16K), Ab10.H5-posredovanu (FIG.
[0159] 16L), Ab21.H2-posredovanu (FIG.16M), Ab21.H3-posredovanu (FIG.16N), i Ab21.H4-posredovanu (FIG.16O) inhibiciju PACAP38-pogonjene cAMP proizvodnje preko PC-12 ćelija koje eksprimiraju PAC1-R, dobijene prema protokolu u primeru 1 dole.
[0160] FIG.17A-O obezbeđuju reprezentativne podatke koji prikazuju Ab10-posredovanu (FIG.
[0161] 17A), Ab20-posredovanu (FIG.17B), Ab21-posredovanu (FIG.17C), Ab1.H-posredovanu (FIG.
[0162] 17D), Ab10.H-posredovanu (FIG.17E), Ab21.H-posredovanu (FIG.17F), Ab22-posredovanu (FIG.
[0163] 17G), Ab23-posredovanu (FIG.17H), Ab10.H2-posredovanu (FIG.17I), Ab10.H3-posredovanu (FIG.17J), Ab10.H4-posredovanu (FIG.17K), Ab10.H5-posredovanu (FIG.
[0164] 17L), Ab21.H2-posredovanu (FIG.17M), Ab21.H3-posredovanu (FIG.17N), i Ab21.H4-posredovanu (FIG.17O) inhibiciju PACAP27-pogonjene cAMP proizvodnje preko PC-12 ćelija koje eksprimiraju PAC1-R, dobijene prema protokolu u primeru 1 dole.
[0165] FIG.18A-L obezbeđuju reprezentativne podatke koji prikazuju Ab10-posredovanu (FIG.
[0166] 18A), Ab20-posredovanu (FIG.18B), Ab21-posredovanu (FIG.18C), Ab1.H-posredovanu (FIG.
[0167] 18D), Ab10.H-posredovanu (FIG.18E), Ab21.H (FIG.18F) Ab22-posredovanu (FIG.18G), Ab23 posredovanu (FIG.18H), Ab10.H3-posredovanu (FIG.18I), Ab21.H2-posredovanu (FIG.
[0168] 18J), Ab21.H3-posredovanu (FIG.18K), i Ab21.H4-posredovanu (FIG.18L) inhibiciju PACAP38-pogonjene cAMP proizvodnje preko CHO-K1 ćelija koje eksprimiraju VPAC1-R, dobijene prema protokolu u primeru 3 dole.
[0169] FIG.19A-L obezbeđuju reprezentativne podatke koji prikazuju Ab10-posredovanu (FIG.
[0170] 19A), Ab20-posredovanu (FIG.19B), Ab21-posredovanu (FIG.19B), Ab1.H-posredovanu (FIG.
[0171] 19D), Ab10.H-posredovanu (FIG.19E), Ab21.H (FIG.19F), Ab22-posredovanu (FIG.19G), Ab23-posredovanu (FIG.19H), Ab10.H3-posredovanu (FIG.19I), Ab21.H2-posredovanu (FIG.
[0172] 19J), Ab21.H3-posredovanu (FIG.19K), i Ab21.H4-posredovanu (FIG.19L) inhibiciju PACAP38-pogonjene cAMP proizvodnje preko CHO-K1 ćelija koje eksprimiraju VPAC2-R, dobijene prema protokolu u primeru 4 dole.
[0173] FIG.20 obezbeđuje reprezentativne podatke koji prikazuju smanjenje vazodilatacije dobijeno davanjem Ab1.H nakon PACAP38 davanja kod zečjeg modela, u odnosu na kontrolu sa vehikulumom, dobijene prema protokolu u primeru 7 dole.
[0174] FIG.21 obezbeđuje reprezentativne podatke koji prikazuju smanjenje vazodilatacije dobijeno davanjem Ab10 nakon PACAP38 davanja kod zečjeg modela, u odnosu na kontrola sa izotipskim antitelom, dobijene prema protokolu u primeru 8 dole.
[0175] FIG.22A obezbeđuje podatke za razvrstavanje epitopa za obeleženo Ab1 i neobeleženo Ab10, dobijene prema protokolu u primeru 9 dole.
[0176] FIG.22B obezbeđuje podatke za razvrstavanje epitopa za neobeleženo Ab1 i obeleženo Ab10, dobijene prema protokolu u primeru 9 dole.
[0177] FIG.23 obezbeđuje reprezentativne podatke koji prikazuju in vivo efekat davanja PACAP i anti-PACAP antitela Ab1.H u modelu fotofobije glodara, koji model detektuje vreme koje tretirane životinje (miševi) provode na svetlu u intervalu od 5 min. poređenjem sa odgovarajućim kontrolnim životinjama, dobijene prema protokolu u primeru 11 dole.
[0178] FIG.24 obezbeđuje reprezentativne podatke koji prikazuju in vivo efekat davanja PACAP i anti-PACAP antitelo Ab1.H u životinjskom modelu glodarske fotofobije, koji detektuje prosečno vreme koje su lečene životinje (miševi) proveli na svetlu poređenjem sa odgovarajućim kontrolnim životinjama dobijene prema protokolu u primeru 11 dole.
[0179] FIG.25 obezbeđuje reprezentativne podatke koji prikazuju in vivo efekat davanja PACAP i anti-PACAP antitela Ab10.H u modelu fotofobije glodara, koji model detektuje vreme koje tretirane životinje (miševi) provode na svetlu u intervalu od 5 min. poređenjem sa odgovarajućim kontrolnim životinjama, dobijene prema protokolu u primeru 11 dole.
[0180] FIG.26A prikazuje rezultate merenja kinetike vezivanja zasnovana na površinskoj plazmonskoj rezonanciji za vezivanje anti-PACAP antitela Ab10 za PACAP mutante skeniranje alanina 19A, 22A, 23A, i 27A, zajedno sa kontrolama koje uključuju PACAP divljeg tipa (obeležen huPACAP (1-38)) (pozitivna kontrola) i 1x pufer za elektroforezu (negativna kontrola), dobijene prema protokolu u primeru 12 dole.
[0181] FIG.26B prikazuje rezultate merenja kinetike vezivanja zasnovana na površinskoj plazmonskoj rezonanciji za vezivanje anti-PACAP antitela Ab10 za PACAP mutante skeniranje alanina 1A-18A, 20A, 21A, 24V-26A, i 28A-38A, zajedno sa kontrolama koje uključuju PACAP divljeg tipa (obeležen huPACAP (1-38)) (pozitivna kontrola) i 1x pufer za elektroforezu (negativna kontrola), dobijene prema protokolu u primeru 12 dole.
[0182] FIG.27A prikazuje rezultate merenja kinetike vezivanja zasnovana na površinskoj plazmonskoj rezonanciji za vezivanje anti-PACAP antitela Ab20 za PACAP mutante skeniranje alanina 19A, 22A, 23A, 24V, i 27A, zajedno sa kontrolama koje uključuju PACAP divljeg tipa (obeležen huPACAP (1-38)) (pozitivna kontrola) i 1x pufer za elektroforezu (negativna kontrola), dobijene prema protokolu u primeru 12 dole.
[0183] FIG.27B prikazuje rezultate merenja kinetike vezivanja zasnovana na površinskoj plazmonskoj rezonanciji za vezivanje anti-PACAP antitela Ab20 za PACAP mutante skeniranje alanina 1A-18A, 20A, 21A, 25A, 26A, i 28A-38A, zajedno sa kontrolama koje uključuju PACAP divljeg tipa (obeležen huPACAP (1-38)) (pozitivna kontrola) i 1x pufer za elektroforezu (negativna kontrola) dobijene prema protokolu u primeru 12 dole.
[0184] FIG.28A prikazuje rezultate merenja kinetike vezivanja zasnovana na površinskoj plazmonskoj rezonanciji za vezivanje anti-PACAP antitela Ab21 za PACAP mutante skeniranje alanina 19A, 22A, 23A, i 27A, zajedno sa kontrolama koje uključuju PACAP divljeg tipa (obeležen huPACAP (1-38)) (pozitivna kontrola) i 1x pufer za elektroforezu (negativna kontrola), dobijene prema protokolu u primeru 12 dole.
[0185] FIG.28B prikazuje rezultate merenja kinetike vezivanja za vezivanje anti-PACAP antitela Ab21 za PACAP mutante skeniranje alanina 1A-18A, 20A, 21A, 24V-26A, i 28A-38A, zajedno sa kontrolama koje uključuju PACAP divljeg tipa (obeležen huPACAP (1-38)) (pozitivna kontrola) i 1x pufer za elektroforezu (negativna kontrola), dobijene prema protokolu u primeru 12 dole.
[0186] FIG.29A prikazuje rezultate merenja kinetike vezivanja zasnovana na površinskoj plazmonskoj rezonanciji za vezivanje anti-PACAP antitela Ab22 za PACAP mutante skeniranje alanina 22A, 23A, 27A, 28A, i 31A, zajedno sa kontrolama koje uključuju PACAP divljeg tipa (obeležen huPACAP (1-38)) (pozitivna kontrola) i 1x pufer za elektroforezu (negativna kontrola), dobijene prema protokolu u primeru 12 dole.
[0187] FIG.29B prikazuje rezultate merenja kinetike vezivanja zasnovana na površinskoj plazmonskoj rezonanciji za vezivanje anti-PACAP antitela Ab22 za PACAP mutante skeniranje alanina 1A-21A, 24V-26A, 29A, i 30A, zajedno sa kontrolama koje uključuju PACAP divljeg tipa (obeležen huPACAP (1-38)) (pozitivna kontrola) i 1x pufer za elektroforezu (negativna kontrola), dobijene prema protokolu u primeru 12 dole.
[0188] FIG.30A prikazuje rezultate merenja kinetike vezivanja zasnovana na površinskoj plazmonskoj rezonanciji za vezivanje anti-PACAP antitela Ab23 za PACAP mutante skeniranje alanina 12A, 20A, 23A, 24V, 26A, 27A, i 28A, zajedno sa kontrolama koje uključuju PACAP divljeg tipa (obeležen huPACAP (1-38)) (pozitivna kontrola) i 1x pufer za elektroforezu (negativna kontrola), dobijene prema protokolu u primeru 12 dole.
[0189] FIG.30B prikazuje rezultate merenja kinetike vezivanja zasnovana na površinskoj plazmonskoj rezonanciji za vezivanje anti-PACAP antitela Ab23 za PACAP mutante skeniranje alanina 1A-11A, 13A-19A, 21A, 22A, 25V, i 29A-31A, zajedno sa kontrolama koje uključuju PACAP divljeg tipa (obeležen huPACAP (1-38)) (pozitivna kontrola) i 1x pufer za elektroforezu (negativna kontrola), dobijene prema protokolu u primeru 12 dole.
[0190] FIG.31A prikazuje sažetak efekata PACAP mutanata skeniranje alanina na vezivanje antitela. U koloni 1 na FIG.31A, VIP ostaci navedeni su redosledom prema njihovom prostornom rasporedu duž VIP primarne sekvence iz aminokiselinskih ostataka 1-27. U koloni 2 na FIG.31A, PACAP ostaci navedeni su redosledom prema njihovom prostornom rasporedu duž PACAP primarne sekvence iz aminokiselinskih ostataka 1-27. Kolona 3 na FIG.31A obezbeđuje broj koji odgovara svakom ostatku od 1-27 i za VIP i za PACAP, kako su prostorno raspoređeni duž njihovih primarnih sekvenci. U kolonama 4-8 na FIG.31A, navedeni su svako antitelo ispitivano tokom ispitivanja skeniranja alanina (kao što je Ab10, Ab20, na primer), i PACAP ostaci određeni da doprinose PACAP/antitelo vezivanju, (kao što je 5A, 6A, na primer).
[0191] FIG.31B prikazuje sažetak efekata PACAP mutanata skeniranje alanina na vezivanje antitela. U koloni 1 na FIG 31B, naveden je VIP ostatak 28. U koloni 2 na FIG 31B, PACAP ostaci navedeni su redosledom prema njihovom prostornom rasporedu duž PACAP primarne sekvence iz aminokiselinskih ostataka 28-38. Kolona 3 na FIG 31B obezbeđuje broj koji odgovara ostatku 28 za VIP i svakom od ostataka 28-38 za PACAP, kako su prostorno raspoređeni duž njihovih primarnih sekvenci. U kolonama 4-8 na FIG 31B, navedeni su svako antitelo ispitivano tokom ispitivanja skeniranja alanina (kao što je Ab10, Ab20, na primer), i PACAP ostaci određeni da doprinose PACAP/antitelo vezivanju, (kao što je 5A, 6A, na primer).
[0192] FIG.32 obezbeđuje reprezentativne podatke koji prikazuju in vivo efekat davanja PACAP i anti-PACAP antitela Ab10.H3 u modelu fotofobije glodara, koji model detektuje vreme koje tretirane životinje (miševi) provode na svetlu u intervalu od 5 min. poređenjem sa odgovarajućim kontrolnim životinjama, dobijene prema protokolu u primeru 11 dole.
[0193] FIG.33A-33B obezbeđuju podatke koji sumiraju podatke prikazane na FIG.32, tako da je ukupno vreme provedeno na svetlu tokom celog perioda posmatranja od 30 minuta za svaku pojedinačnu životinju na osnovnoj liniji, za tretiranje 1 i tretiranje 2 prikazano za životinje u grupama izotipskih antitela (FIG.33A) i životinje u Ab10.H3 grupama (FIG.33B).
[0194] FIG.34A-34B obezbeđuje reprezentativne podatke koji prikazuju in vivo efekat davanja anti-PACAP antitela Ab10.H3, izotipskog antitela ili patentiranog anti-PAC1-R antitela, na lakrimaciju, dobijene prema protokolu u primeru 13 dole. Merenja su prikazana u grafikonu za pojedinačne životinje u svakoj grupi na FIG.34A, i prosečno merenje za životinje u svakoj grupi prikazano je u grafikonu na FIG.34B.
[0195] FIG.35A-35B obezbeđuje reprezentativne podatke koji prikazuju in vivo efekat davanja anti-PACAP antitela Ab10.H3, izotipskog antitela ili patentiranog anti-PAC1-R antitela, na promenu temperature nosa, dobijene prema protokolu u primeru 13 dole. Merenja su prikazana u grafikonu za pojedinačne životinje u svakoj grupi na FIG.35A, i prosečno merenje za životinje u svakoj grupi prikazano je u grafikonu na FIG.35B.
[0197] DETALJAN OPIS
[0199] Definicije
[0201] Podrazumeva se da ovaj pronalazak nije ograničen na opisanu posebnu metodologiju, protokole, ćelijske linije, životinjske vrste ili rodove, i reagense, već mogu varirati. Podrazumeva se i da je ovde korišćena terminologija samo za svrhu opisa određenih načina ostvarivanja, a nije namera da ograniči obim ovog pronalaska, koji je ograničen samo priloženim patentnim zahtevima. Kao što se ovde koriste, oblici jednine "neki", "i", i "taj" uključuju referente množine, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, referenca "ćelija" uključuje množinu tih ćelija dok referenca "protein" uključuje upućivanje na jedan ili više proteina i njegovih ekvivalenata poznatih stručnjacima u ovoj oblasti, i tako dalje. Svi tehnički i naučni pojmovi koji su ovde korišćeni imaju isto značenje kao i obično koje razume prosečan stručnjak u ovoj oblasti kojoj pripada ovaj pronalazak osim ako jasno nije drugačije naznačeno.
[0202] Polipeptid koji aktivira hipofiznu adenilat ciklazu (PACAP): Kao što se ovde koristi, osim ako nije drugačije naznačeno, PACAP uključuje bilo koji oblik PACAP kod sisara, a posebno obuhvata sledeće aminokiselinske sekvence PACAP27 Homo sapiensa i PACAP38 Homo sapiensa:
[0203] PACAP38:
[0205] HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK (SEQ ID NO: 1241), pri čemu je C-terminalni lizin amidovan; ali i bilo koji mutanti, varijante spajanja, izoforme, ortolozi, homolozi i varijante ove sekvence.
[0207] PACAP27:
[0209] HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL (SEQ ID NO: 1242), pri čemu je C-terminalni leucin amidovan; ali i bilo koji mutanti, varijante spajanja, izoforme, ortolozi, homolozi i varijante ove sekvence.
[0210] "Fotofobija" ovde se odnosi na simptom abnormalne intolerancije na vizuelnu percepciju svetlosti, ponekad, pored toga, definisana je abnormalnim ili iracionalanim strahom od svetlosti, ili prisustvom stvarnom fizičkom fotosenzitivnošću očiju. U ovom pronalasku, fotofobija uključuje posebno averziju na svetlost povezanu sa migrenom, klaster glavoboljama i drugim neurološkim uzrocima odbojnog ponašanja prema svetlosti koji mogu izazvati migrenu ili klaster glavobolju. Pacijenti/subjekti mogu razviti fotofobiju kao rezultat nekoliko različitih medicinskih stanja, povezanih s okom ili nervnim sistemom. Fotofobiju može izazvati povećani odgovor na svetlost koji počinje u bilo kojoj fazi u vizuelnom sistemu kao što je: (i) previše svetlosti ulazi u oko, (ii) previše svetlosti može ući u oko ako je ono oštećeno, kao što je sa abrazijom rožnjače i oštećenjem mrežnjače, ili ako zenica(e) ne mogu normalno da se sužavaju (primećuje se kod oštećenja okulomotornog nerva), (iii) prekomerna stimulacija fotoreceptora u mrežnjači, (iv) prekomerni električni impulsi ka optičkom nervu, i (v) prekomerna reakcija centralnog nervnog sistema.
[0211] "Efektivno lečenje ili prevencija fotofobije" ovde se odnosi na inhibiciju odbojnog ponašanja prema svetlosti ili fotofobije ili inhibiciju pojave odbojnog ponašanja prema svetlosti ili fotofobiji kod subjekta kom je to potrebno, npr., subjekat koji ima aktivni napad migrene ili klaster glavobolju ili subjekat sklon migreni ili klaster glavoboljama, ili nekog od drugih poremećaja povezanih sa fotofobijom identifikovanih ovde nakon davanja efektivne količine anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku. Lečenje se može sprovesti kao monoterapija ili u vezi sa nekim drugim aktivnim agensom kao što je topiramat ili dihidroergotamin putem primera.
[0212] [0105] Pojam "migrena" odnosi se na složen i onesposobljavajući neurološki poremećaj koji se može razviti tokom četiri faze: prodrom, aura, glavobolja i postdrom. Migrena je definisana od strane Međunarodnog društva za glavobolju kao glavobolja koja traje 4-72 sata i karakteriše se sa najmanje dva od sledećeg: jednostranom lokalizacijom, pulsirajućim karakterom, umerenim do jakim intenzitetom bola; i pogoršanjem s kretanjem kao što je hodanje. Pored toga, glavobolja mora biti praćena najmanje jednim od sledećeg: mučnina i/ili povraćanje, fotofobija ili fonofobija. Migrena može biti praćena i aurom, što obično prethodi roku tokom faze predosećanja ili prodromalne faze, i često dovodi do vizuelnih promena, npr., scintilacioni skotom koji se kreće preko vidnog polja. Prodrom može biti praćeno i drugim simptomima, npr., zamor, gastrointestinalni problemi i promene raspoloženja. Čovek s migrenom često je nesposoban duže vreme. Postdrom je završna faza i javlja se nakon napada, tokom kojih čovek sa migrenom može osećati iscrpljenost ili blagu euforiju.
[0213] Pojam "glavobolja" odnosi se na bol u bilo kojoj regiji glave. Glavobolje se mogu javiti na jednoj ili na obe strane glave, mogu biti izolovane na određenom mestu, zrače preko glave iz jedne tačke, ili imaju karakteristike stezanja. Glavobolja može biti oštar bol, pulsirajući osećaj ili tup bol. Glavobolje se mogu pojaviti postepeno ili iznenada, i mogu trajati manje od sat vremena ili nekoliko dana.
[0214] Pojam "bolest ili stanje povezano sa bolom" odnosi se na bilo koju bolest ili stanje definisanu, u celini ili delimično, akutnim i/ili hroničnim bolom. Bol se uopšteno definiše kao neprijatan osećaj i emocionalno iskustvo povezano sa stvarnim ili potencijalnim oštećenjem tkiva, ili opisano u smislu takvog oštećenja. Bol se može klasifikovati kao neurogeni, neuropatski, inflamatorni ili nociceptični.
[0215] Pojam "opioidni analgetik" ovde odnosi se na sve lekove, prirodne ili sintetičke, sadejstvima poput morfina. Sintetički i polusintetički opioidni analgetici su derivati pet hemijskih klasa jedinjenja: fenantreni; fenilheptilamini; fenilpiperidini; morfinani; i benzomorfani, od kojih su svi u okviru obima tog pojma. Primeri opioidnih analgetika uključuju kodein, dihidrokodein, diacetilmorfin, hidrokodon, hidromorfon, levorfanol, oksimorfon, alfentanil, buprenorfin, butorfanol, fentanil, sufentanil, meperidin, metadon, nalbufin, propoksifen, i pentazocin, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.
[0216] Pojam "NSAIL" odnosi se na nesteroidno antiinflamatorno jedinjenje. NSAIL se kategorišu na osnovu svoje sposobnosti da inhibiraju ciklooksigenazu. Ciklooksigenaza 1 i ciklooksigenaza 2 su dve glavne izoforme ciklooksigenaze i većina standardnih NSAIL su mešoviti inhibitori ove dve izoforme. Većina standardnih NSAIL spada u jednu od sledećih pet strukturnih kategorija: (1) derivati propionske kiseline, kao što su ibuprofen, naproksen, naprozin, diklofenak, i ketoprofen; (2) derivati sirćetne kiseline, kao što je tolmetin i sulindak; (3) derivati fenaminske kiseline, kao što su mefenaminska kiselina i meklofenaminska kiselina; (4) derivati bifenilkarboksilne kiseline, kao što su diflunisal i flufenisal; i (5) oksikami, kao što su piroksim, sudoksikam i izoksikam. Druga klasa NSAIL opisano je da selektivno inhibira ciklooksigenazu 2. COX-2 inhibitori opisani su, npr., u U.S. Patent br.5,616,601; 5,604,260; 5,593,994; 5,550,142; 5,536,752; 5,521,213; 5,475,995; 5,639,780; 5,604,253; 5,552,422; 5,510,368; 5,436,265; 5,409,944; i 5,130,311. Određeni primeri COX-2 inhibitora uključuju celekoksib (SC-58635), DUP-697, flosulid (CGP-28238), meloksikam, 6-metoksi-2 naftilsirćetna kiselina (6-MNA), rofekoksib, MK-966, nabumeton (prolek za 6-MNA), nimesulid, NS-398, SC-5766, SC-58215, T-614; ili njihove kombinacije.
[0217] Kao što se ovde koristi, "lečenje" je pristup za dobijanje korisnih ili željenih kliničkih rezultata. Za potrebe ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, jedno ili više od sledećeg: poboljšanje bilo kog aspekta stanja povezanih sa PACAP kao što je migrena ili glavobolja. Na primer, u kontekstu lečenja glavobolje ili migrene, ovo uključuje smanjenje težine, ublažavanje intenziteta bola i drugih povezanih simptoma, smanjenje učestalosti ponovne pojave, povećanje kvaliteta života onih koji pate od glavobolje i smanjenje doze drugih lekova potrebnih za lečenje glavobolje. Kod migrene, drugi povezani simptomi uključuju, ali nisu ograničeni na, mučninu, povraćanje i osetljivost na svetlost, zvuk i/ili pokret. Kod klaster glavobolje, drugi povezani simptomi uključuju, ali nisu ograničeni na, otok ispod ili oko očiju, prekomerno suzenje, crvenilo očiju, rinoreju ili začepljenje nosa i crvenilo lica.
[0218] "Smanjenje incidence" ili "profilaksa" ili "prevencija" znači bilo koje smanjenje težine određene bolesti, stanja, simptoma ili poremećaja (pojmovi bolest, stanje i poremećaj se koriste naizmenično u celoj prijavi). Smanjenje težine uključuje smanjenje lekova i/ili terapija koji se generalno koriste za stanje, na primer, smanjenjem potrebe za količinom lekova ili terapija i/ili izloženosti njima. Smanjenje težine takođe uključuje smanjenje trajanja i/ili učestalosti određenog stanja, simptoma ili poremećaja (uključujući, na primer, odlaganje ili povećanje vremena do sledećeg epizodnog napada kod pojedinca).
[0219] "Ublažavanje" glavobolje ili jednog ili više simptoma glavobolje ili migrene ili drugog stanja povezanog sa PACAP znači smanjenje ili poboljšanje jednog ili više simptoma stanja, npr. glavobolje ili migrene u poređenju sa nedavanjem anti-PACAP antagonist antitelo. "Ublažavanje" takođe uključuje skraćivanje ili smanjenje trajanja simptoma.
[0220] Kao što se ovde koristi, "kontrolisanje glavobolje" ili "kontrolisanje migrene" ili "kontrolisanje" nekog drugog stanja povezanog sa PACAP odnosi se na održavanje ili smanjenje težine ili trajanja jednog ili više simptoma stanja, npr., glavobolja ili migrena ili učestalost napada glavobolje ili migrene kod pojedinca (poređenjem sa nivoom pre lečenja). Na primer, trajanje ili težina bola u glavi, ili učestalosti napada, smanjena je za najmanje oko bilo koliko od 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 100%, kod pojedinca u odnosu na nivo pre lečenja. Smanjenje trajanja ili težine bola u glavi, ili učestalosti napada može da traje za bilo koji vremenski period, npr., 2 nedelje, 4 nedelje (1 mesec), 8 nedelje (2 meseci), 16 nedelje (3 meseci), 4 meseci, 5 meseci, 6 meseci, 9 meseci, 12 meseci, itd.
[0221] [0114] Kako se ovde koristi, "odlaganje" razvoja stanja povezanog sa PACAP kao što je migrena ili glavobolja znači odlaganje, sprečavanje, usporavanje, zaustavljanje, stabilizaciju i/ili odlaganje progresije stanja ili bolesti. Ovo odlaganje može biti različitog vremenskog trajanja, u zavisnosti od istorije stanja ili bolesti i/ili pojedinaca koji se leče. Kao što je očigledno stručnjaku u ovoj oblasti, dovoljno ili značajno odlaganje može, u stvari, obuhvatiti prevenciju, u smislu da pojedinac ne razvije glavobolju (npr., migrena). Postupak koji "odlaže" razvoj simptoma je metod koji smanjuje verovatnoću razvoja simptoma u datom vremenskom okviru i/ili smanjuje obim simptoma u datom vremenskom okviru, u poređenju sa nekorišćenjem postupka. Takva poređenja se obično zasnivaju na kliničkim studijama, koristeći statistički značajan broj ispitanika.
[0222] "Razvoj" ili "progresija" stanja povezanog sa PACAP kao što je migrena ili glavobolja predstavlja početne manifestacije i/ili naknadno napredovanje poremećaja. Razvoj glavobolje ili migrene može se detektovati i proceniti korišćenjem standardnih kliničkih tehnika koje su dobro poznate u ovoj oblasti. Međutim, razvoj se takođe odnosi na progresiju koja može biti nedetektabilna. Za potrebe ovog pronalaska, razvoj ili progresija se odnosi na biološki tok simptoma. "Razvoj" uključuje pojavu, recidiv i početak. Kao što se ovde koristi "početak" ili "pojava" stanja kao što su glavobolja ili migrena uključuje početnu pojavu i/ili recidiv.
[0223] Kao što se ovde koristi, "efektivna doza" ili "efektivna količina" leka, jedinjenja ili farmaceutska kompozicija je količina dovoljna da dovede do korisnih ili željenih rezultata. Za profilaktičku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju rezultate kao što je eliminisanje ili smanjenje rizika, ublažavanje težine ili odlaganje pojave bolesti, uključujući biohemijske, histološke i/ili bihejvioralne simptome bolesti, njegove komplikacije i srednje patološke fenotipove koji su prisutni tokom razvoja bolesti. Za terapijsku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju kliničke rezultate kao što smanjenje intenziteta bola, trajanja ili učestalosti napada glavobolje, i smanjenje jednog ili više simptoma koji nastaju zbog glavobolje (biohemijski, histološki, i/ili bihejvioralni), uključujući njegove komplikacije i srednje patološke fenotipove koji se javljaju tokom razvoja bolesti, poboljšavajući kvalitet života onih koji pate od bolesti, smanjujući dozu drugih lekova potrebnih za lečenje bolesti, pojačavajući efekat drugog leka i/ili odlažući progresiju bolesti pacijenata. Efektivna doza može se dati u jednom ili više davanja. Za svrhe ovog pronalaska, efektivna doza leka, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije je količina dovoljna da se postigne profilaktičko ili terapijsko lečenje ili direktno ili posebno. Kao što se razume u kliničkom kontekstu, efektivna doza leka, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije može se postići ili može da se ne postigne u vezi s nekim drugim lekom, jedinjenjem ili farmaceutskom kompozicijom. Tako, "efektivna doza" može se razmatrati u kontekstu davanja jednog ili više terapijskih agenasa, a pojedinačan agens može se razmatrati da se daje u efektivnoj količini ako, u vezi sa jednim ili više drugih agenasa, može biti ili se može postići željeni rezultat.
[0224] [0117] "Pogodna ćelija domaćina" ili "ćelija domaćina" uopšteno uključuje bilo koju ćeliju, pri čemu se predmetna anti-PACAP antitela mogu proizvesti rekombinantno korišćenjem lako dostupnih tehnika i materijala. Na primer, anti-PACAP antitela ovog pronalaska mogu se proizvesti u genetski modifikovanim ćelijama domaćina prema uobičajenim tehnikama. Pogodne ćelije domaćina su one vrste ćelija koje se mogu transformisati ili transfektovati sa egzogenom DNK i uzgajati u kulturi, i uključuju bakterijske, gljivične ćelije (npr., kvasci), i kultivisane više eukariotske ćelije (uključujući kultivisane ćelije višećelijskih organizama), posebno kultivisane ćelije sisara, npr., humane ili nehumane ćelije sisara. U nekom primernom načinu ostvarivanja, ova antitela mogu da se eksprimiraju u CHO ćelije. Tehnike za manipulisanje kloniranim DNK molekulima i uvođenje egzogene DNK u različite ćelije domaćina opisane su od strane Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), i Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., editors, New York, NY: Green and Wiley and Sons (1993).
[0225] U nekim primernim načinima ostvarivanja, antitela mogu se ekprimirati kod kompetentnih kvasaca za parenje, npr., bilo koji haploidni, diploidni ili tetraploidni kvasac koji može da se razvija u kulturi. Kvasac koristan u postupcima ekspresije fermentacije može da postoji u haploidnom, diploidnom ili nekom drugom poliploidnom obliku. Ćelije date ploidije mogu, u odgovarajućim uslovima, da proliferišu za neodređeni broj generacija u tom obliku. Diploidne ćelije mogu takođe da sporulišu da bi se obrazovale haploidne ćelije. Sekvencijalno parenje može rezultirati tetraploidnim sojevima kroz dalje parenje ili fuziju diploidnih sojeva. Ovaj pronalazak razmatra upotrebu ćelija haploidnog kvasca, kao i ćelija diploidnog ili nekog drugog poliploidnog kvasca proizvedenih, na primer, parenjem ili spajanjem sferoplasta. Na primer, takav kvasac može da uključuje članove Saccharomycetaceae porodice, koja uključuje rodove Arxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia;
[0226] Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; i Zygosaccharomyces. Druge vrste kvasca potensijalno korisne u ovom pronalasku uključuju Yarrowia; Rhodosporidium; Candida;
[0227] Hansenula; Filobasium; Sporidiobolus; Bullera; Leucosporidium i Filobasidella.
[0228] U nekom poželjnom primernom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, kvasac kompetentan za parenje koji se koristi za ekspresiju antitela može da obuhvata člana roda Pichia. U nekom daljem poželjnom primernom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, kvasac kompetentan za parenje roda Pichia je neki od sledećih vrsta: Pichia pastoris, Pichia methanolica i Hansenula polymorpha (Pichia angusta). U nekom posebnom poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, kvasac kompetentan za parenje roda Pichia su vrste Pichia pastoris.
[0229] [0120] "Selektivni marker" ovde odnosi se na neki gen ili gen koji daje fenotip rasta (fizičku karakteristiku rasta) ćeliji koja prima taj gen kao, na primer, kroz transformacioni događaj. Selektivni marker omogućava da ćelija da preživi i raste u selektivnom medijumu za rast pod uslovima u kojima ne mogu da rastu ćelije koje ne primaju taj gen selektivnog markera. Geni selektivnog markera generalno podpadaju u nekoliko vrsta, uključujući pozitivni geni selektivnog markera kao što je gen koji ćeliji daje otpornost na neki antibiotik ili neki drugi lek, temperatura kada se ukrste dva temperaturno osetljiva ("ts") mutanta ili transformiše ts mutant; negativni geni selektivnog markera kao što je biosintetički gen koji ćeliji daje sposobnost rasta u podlozi bez određenog nutrijenta koji je potreban svim ćelijama koje nemaju taj biosintetički gen ili mutagenizovani biosintetički gen koji onemogućava ćelijama da rastu, a koje nemaju gen divljeg tipa; i slično. Pogodni markeri uključuju, ali nisu ograničeni na: ZEO; G418; LYS3; MET1; MET3a; ADE1; ADE3; URA3; i slično.
[0230] "Ekspresioni vektor" ovde odnosi se na DNK vektore koji sadrže elemente koji olakšavaju manipulaciju za ekspresiju stranog proteina unutar ciljne ćelije domaćina, npr., bakterijska ćelija, ćelija insekata, kvasaca, biljaka, amfibija, gmizavaca, ptica ili sisara, i najčešće ćelija kvasca ili sisara, npr., CHO ćelija. Pogodno je da se manipulacija sekvencama i proizvodnja DNK za transformaciju prvo izvodi u bakterijskom domaćinu, npr. E. coli, a obično vektori uključuju sekvence koje olakšavaju takve manipulacije, uključujući bakterijsko poreklo replikacije i odgovarajući bakterijski selekcioni marker. Selekcioni markeri kodiraju proteine neophodne za preživljavanje ili rast transformisanih ćelija domaćina uzgajanih u selektivnoj podlozi za kulturu. Ćelije domaćina koje nisu transformisane vektorom koji sadrži selekcioni gen neće preživeti u podlozi za kulturu. Tipični selekcioni geni kodiraju proteine koji (a) daju otpornost na antibiotike ili druge toksine, (b) dopunjuju auksotrofne nedostatke ili (c) snabdevaju kritičnim hranljivim materijama koje nisu dostupne iz složenih podloga. Primeri vektora i postupaka za transformaciju kvasca opisani su, na primer, u Burke, D., Dawson, D., & Stearns, T., Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual, Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000).
[0231] Ekspresioni vektori za upotrebu u postupcima ovog pronalaska mogu da uključuju specifične sekvence kvasaca ili sisara, uključujući selektibilni auksotrofni ili lekoviti marker za identifikovanje transformisanih sojeva domaćina. Lekoviti marker može dalje d a se koristi da se poveća broj kopija vektora u ćeliji domaćina kvasca.
[0232] Kodirajuća sekvenca polipetida od interesa radno je povezana sa transkripcionim i translacionim regulatornim sekvencama koje obezbeđuju ekspresiju polipeptida u željenim ćelijama domaćina, npr. ćelijama kvasca ili sisara. Ove komponente vektora mogu da uključuju, ali nisu ograničene na, jedno ili više od sledećeg: element pojačivača, promotor i sekvencu za terminaciju transkripcije. Sekvence za sekreciju polipeptida takođe mogu biti uključene, npr. signalna sekvenca i slično. Poreklo replikacije, npr. poreklo replikacije kvasca, je opciono, jer su ekspresioni vektori često integrisani u genom ćelije domaćina. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polipeptid od interesa je radno vezan, ili spojen, sa sekvencama koje obezbeđuju optimizovanu sekreciju polipeptida iz diploidnih ćelija kvasaca.
[0233] [0124] Nukleinske kiseline su "radno vezane" kada su u funkcionalnoj vezi sa nekom drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za signalnu sekvencu je radno vezana sa DNK za polipeptid ako se on eksprimira kao preprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promotor ili pojačavač je radno vezan za kodirajući sekvencu ako utiče na transkripciju sekvence. Generalno, "radno vezan" znači da su DNK sekvence koje su vezane susedne, i, u slučaju sekretornog lidera, susedne i u okviru za čitanje. Međutim, pojačavači ne moraju biti susedni. Povezivanje se postiže ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima ili alternativno putem PCR/rekombinacione metode poznate stručnjacima u ovoj oblasti (GATEWAY<R>Technology; Invitrogen, Carlsbad California). Ako takva mesta ne postoje, sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri se koriste u skladu sa konvencionalnom praksom.
[0234] Promotori su neprevedene sekvence koje se nalaze uzvodno (5') od startnog kodona strukturnog gena (generalno unutar oko100 do 1000 bp) i kontrolišu transkripciju i translaciju određenih sekvenci nukleinskih kiselina sa kojima su radno povezane. Takvi promotori spadaju u nekoliko klasa: inducibilni, konstitutivni i represibilni promotori (koji povećavaju nivoe transkripcije kao odgovor na odsustvo represora). Inducibilni promotori mogu pokrenuti povećane nivoe transkripcije iz DNK pod svojom kontrolom kao odgovor na neku promenu u uslovima kulture, npr. prisustvo ili odsustvo hranljive materije ili promenu temperature.
[0235] Promotor može da služi i kao mesto za homolognu rekombinaciju i integraciju ekspresionog vektora na isto mesto u ćeliji domaćina, npr., ćeliji kvasca, genomu; alternativno, selektivni marker može se koristiti kao mesto za homolognu rekombinaciju. Pichia transformacija opisana je u Cregg et al., Mol. Cell. Biol., 5:3376-3385 (1985).
[0236] Pogodni promotori za upotrebu u različitim eukariotskim i prokariotskim ćelijama dobro su poznati i komercijalno dostupni.
[0237] Polipeptidi od interesa mogu se proizvesti rekombinantno ne samo direktno, već i kao fuzioni polipeptid sa heterolognim polipeptidom, npr. signalnom sekvencom ili drugim polipeptidom koji ima specifično mesto cepanja na N-terminusu zrelog proteina ili polipeptida. Generalno, signalna sekvenca može biti komponenta vektora ili može biti deo kodirajuće sekvence polipeptida koja je umetnuta u vektor. Odabrana heterologna signalna sekvenca je poželjno ona koja se prepoznaje i obrađuje kroz jedan od standardnih puteva dostupnih unutar ćelije domaćina, npr. ćelija sisara, ćelija insekta ili ćelija kvasca. Pored toga, ove signalne peptidne sekvence mogu biti konstruisane da bi se obezbedila poboljšana sekrecija u ekspresionim sistemima. Signali sekrecije od interesa takođe uključuju signalne sekvence sisara i kvasca, koje mogu biti heterologne proteinu koji se sekretuje ili mogu biti prirodna sekvenca za protein koji se sekretuje. Signalne sekvence uključuju prepeptidne sekvence, a u nekim slučajevima mogu uključivati i propeptidne sekvence. Mnoge takve signalne sekvence su poznate u struci, uključujući signalne sekvence koje se nalaze na imunoglobulinskim lancima, npr. K28 preprotoksinska sekvenca, PHA-E, FACE, humana MCP-1, signalne sekvence humanog serumskog albumina, teški lanac humanog Ig, laki lanac humanog Ig, i slično. Na primer, videti Hashimoto et. al., Protein Eng., 11(2):75 (1998); i Kobayashi et. al., Therapeutic Apheresis, 2(4):257 (1998).
[0238] [0129] Transkripcija se može povećati umetanjem transkripcione aktivatorske sekvence u vektor. Ovi aktivatori su cis-delujući elementi DNK, obično od oko 10 do 300 bp, koji deluju na promotor da bi povećali njegovu transkripciju. Transkripcioni pojačavači su relativno nezavisni od orijentacije i položaja, a pronađeni su 5' i 3' u odnosu na transkripcionu jedinicu, unutar introna, kao i unutar same kodirajuće sekvence. Pojačavač može biti splajsovan u ekspresioni vektor na položaj 5' ili 3' u odnosu na kodirajuću sekvencu, ali je poželjno lociran na mestu 5' od promotora.
[0239] Ekspresioni vektori korišćeni u eukariotskim ćelijama domaćina mogu da sadrže i sekvence potrebne za završetak transkripcije i za stabilizaciju mRNK. Takve sekvence često su dostupne od 3' do kodona za terminaciju translacije, u neprevedenim regionima eukariotskih ili virusnih DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente transkribovane kao poliadenilirane u neprevedenom delu mRNK.
[0240] Konstruisanje pogodnih vektora koji sadrže jednu ili više od gorepomenutih komponenti koristi standardne tehnike ligacije ili PCR/postupke rekombinacije. Izolovani plazmidi ili DNK se cepaju, prilagođavaju i ponovo ligiraju u željenom obliku da bi se generisali potrebni plazmidi ili putem postupaka rekombinacije. Za analizu kojom se potvrđuju ispravne sekvence u konstruisanim plazmidima, mešavine za ligaciju se koriste za transformaciju ćelija domaćina, a uspešni transformanti se biraju na osnovu rezistencije na antibiotike (npr. ampicilin ili zeocin) gde je to prikladno. Plazmidi iz transformanata se pripremaju, analiziraju restrikcionom endonukleaznom digestijom i/ili sekvenciraju.
[0241] Kao alternativa restrikciji i ligaciji s, postupci rekombinacije zasnovani na specifičnim mestima vezivanja ("att") i rekombinacionim enzimima mogu se koristiti za umetanje DNK sekvenci u vektor. Takvi postupci opisani su, na primer, od strane Landy, Ann. Rev. Biochem., 58:913-949 (1989); i poznati su stručnjacima u ovoj oblasti. Takvi postupci koriste intermolekularnu DNK rekombinaciju koja je posredovana mešavinom lambda i E. coli -kodiranih rekombinacionih proteina. Rekombinacija se javlja između att mesta na interakcionim DNK molekulima. Radi opisa att mesta videti Weisberg and Landy, Site-Specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda II, p.211-250,Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (1983). DNK segmenti koji okružuju mesta rekombinacije se menjaju, tako da su nakon rekombinacije att mesta hibridne sekvence sastoje se od sekvenci koje je donirao svaki roditeljski vektor. Rekombinacija se može javiti između DNK bilo koje topologije.
[0242] Att mesta mogu se uvesti u sekvencu od interesa ligacijom sekvence od interesa u odgovarajući vektor; generisanjem PCR proizvoda koji sadrži att B mesta upotrebom specifičnih prajmera; generisanjem cDNK biblioteke klonirane u odgovarajući vektor koji sadrži att mesta; i slično.
[0243] [0134] Savijanje, kao što se ovde koristi, odnosi se na trodimenzionalnu strukturu polipeptida i proteina, gde interakcije između aminokiselinskih ostataka deluju na stabilizaciju strukture. Iako su nekovalentne interakcije važne u određivanju strukture, proteini od interesa obično imaju intra- i/ili intermolekulske kovalentne disulfidne veze formirane od dva ostatka cisteina. Za prirodne proteine i polipeptide ili njihove derivate i varijante, pravilno savijanje je tipično raspored koji rezultira optimalnom biološkom aktivnošću i može se pogodno pratiti testovima za aktivnost, npr. vezivanje liganda, enzimska aktivnost, itd.
[0244] U nekim slučajevima, na primer gde je željeni proizvod sintetičkog porekla, testovi zasnovani na biološkoj aktivnosti biće manje značajni. Pravilno savijanje takvih molekula može se odrediti na osnovu fizičkih svojstava, energetskih razmatranja, studija modelovanja i slično.
[0245] Ekspresioni domaćin može biti dalje modifikovan uvođenjem sekvenci koje kodiraju jedan ili više enzima koji poboljšavaju savijanje i obrazovanje disulfidnih veza, tj. foldaze, šaperonini, itd. Takve sekvence mogu biti konstitutivno ili inducibilno eksprimirane u ćeliji domaćina kvasca, korišćenjem vektora, markera, itd. kao što je poznato u ovoj oblasti. Poželjno je da sekvence, uključujući transkripcione regulatorne elemente dovoljne za željeni obrazac ekspresije, budu stabilno integrisane u genom kvasca putem ciljane metodologije.
[0246] Na primer, eukariotska proteinska disulfidna izomeraza ("PDI") nije samo efikasan katalizator oksidacije proteinskog cisteina i izomerizacije disulfidnih veza, već pokazuje i šaperonsku aktivnost. Koekspresija PDI može olakšati proizvodnju aktivnih proteina koji imaju višestruke disulfidne veze. Takođe je interesantna ekspresija proteina koji vezuje teške lance imunoglobulina ("BIP"); ciklofilina; i slično. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, svaki od haploidnih roditeljskih sojeva eksprimira različit enzim za savijanje, npr. jedan soj može eksprimirati BIP, dok drugi soj može eksprimirati PDI ili njihove kombinacije.
[0247] Kultivisane ćelije sisara takođe su poželjni primeri domaćina za proizvodnju otkrivenih anti-PACAP antitela . Kao što je pomenuto, CHO ćelije su posebno pogodne za ekspresiju antitela. Mnoge procedure poznate su u ovoj oblasti za proizvodnju monoklonalnih antitela u ćelijama sisara.
[0248] (videti, Galfre, G. and Milstein, C., Methods Enzym., 73:3-46, 1981; Basalp et al., Turk. J. Biol., 24:189-196, 2000; Wurm, F.M., Nat. Biotechnol., 22:1393-1398, 2004; i Li et al., mAbs, 2(5):466-477, 2010). Kao što je detaljnije pomenuto u nastavku, uobičajene ćelijske linije domaćina korišćene u proizvodnim šemama monoklonalnih antitela sisara uključuju, ali nisu ograničeni na, ćelijsku liniju humanog embrionalnog retinoblasta PER.C6<®>(Crucell N.V., Leiden, The Netherlands), NS0 ćelije mišjeg mijeloma (Medical Research Council, London, UK), CV1 ćelijsku liniju bubrega majmuna, 293 ćelijsku liniju humanog embrionalnog bubrega, BHK ćelijsku liniju bubrega mladunca hrčka, VERO ćelijsku liniju bubrega afričkog zelenog majmuna, ćelijsku liniju humanih ćelija karcinoma grlića materice HELA, MDCK pseće bubrežne ćelije, BRL bivolje ćelije jetre pacova ćelije, W138 humane plućne ćelije, HepG2 humane ćelije jetre ćelije, MMT ćelije tumora mlečnih žlezda miša ćelije, TRI ćelije, MRC5 ćelije, Fs4 ćelije, ćelije mijeloma ili limfoma, ili ćelije jajnika (CHO) kineskog hrčka (Cricetulus griseus), i slično. Mnogo različitih subklonova ili subćelijskih linija CHO ćelija poznatih u struci koje su korisne i optimizovane za proizvodnju rekombinantnih monoklonskih antitela, kao što je ćelijska linija DP12 (CHO K1 dhfr-), NS0 ćelije su subklon NS-1 ćelija koje ne luče Ig i ne sintetišu lake lance, a koje su otporne na azaguanin. Druge ćelije kineskog hrčka i CHO ćelije su komercijalno dostupne (od ATCC, itd.), uključujući CHO-DXB11 (CHO-DUKX), CHO-pro3, CHO-DG44, CHO 1-15, CHO DP-12, Lec2, M1WT3, Lec8, pgsA-745, i slično, a sve su genetski izmenjene da bi se optimizovala ćelijska linija za različite parametre.
[0249] Monoklonalna antitela se obično proizvode korišćenjem polukontinualnog postupka pri čemu se lanci monoklonalnih antitela eksprimiraju u ćelijskoj liniji sisara i izlučuju u podlogu za kulturu tkiva u bioreaktoru. Podloga (ili hrana) se kontinualno dovodi u bioreaktor da bi se maksimizirala ekspresija rekombinantnih proteina. Rekombinanto monoklonalno antitelo zatim se prečišćava iz sakupljene podloge. U nekim slučajevima, potrebne su dodatne faze da bi se ponovo sastavila antitela redukcijom disulfidnih veza, itd. Takvim postupcima proizvodnje može se povećati razmera na 10000 L u jednoj šarži ili više. Danas se rutinski dobija čak 20 pg/ćeliji/dan upotrebom takvih ćelijskih linija i metodologija, pri čemu se obezbeđuju titri čak od 10 g/L ili više, što iznosi 15 do 100 kg iz bioreaktora od 10 kL do 25 kL. (Li et al., 2010). U nastavku su dati razni detalji ove proizvodne metodologije, uključujući kloniranje polinukleotida koji kodiraju antitela u ekspresione vektore, transfekciju ćelija ovim ekspresionim vektorima, selekciju transfektovanih ćelija i ekspresiju i prečišćavanje rekombinantnih monoklonalnih antitela iz ovih ćelija.
[0250] Za rekombinantnu proizvodnju anti-PACAP antitela u ćelijama sisara, nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo ili se generalno umeću u replicirajući vektor za dalje kloniranje (amplifikacija DNK) ili za ekspresiju. DNK koja kodira antitelo se lako izoluje ili sintetiše korišćenjem konvencionalnih postupaka (npr., korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se specifično vežu za DNK koje kodiraju teške i lake lance antitela). Vektorske komponente generalno uključuju, ali nisu ograničene na, jedno ili više od sledećeg: signalnu sekvencu, mesto početka replikacije, jedan ili više marker gena, element pojačavača, promotor i sekvencu za terminaciju transkripcije. Izbor promotora, terminatora, selektivnih markera, vektora i drugih elemenata je stvar rutinskog dizajna u okviru nivoa prosečne stručnosti u ovoj oblasti. Mnogi takvi elementi su poznati u ovoj oblasti i dostupni su preko komercijalnih dobavljača.
[0251] Antitela ovog pronalaska mogu se proizvesti rekombinantno ne samo direktno, već i kao fuzioni polipeptid sa heterolognim polipeptidom, koji je poželjno signalna sekvenca ili drugi polipeptid koji ima specifično mesto cepanja na N-terminusu zrelog proteina ili polipeptida. Izabrana homologna ili heterologna signalna sekvenca je poželjno ona koju ćelija domaćina prepoznaje i obrađuje (tj. cepa signalnom peptidazom). U ekspresiji ćelija sisara, dostupne su signalne sekvence sisara, kao i virusne sekretorne liderske sekvence, na primer, gD signal herpes simpleksa.
[0252] [0141] Takvi ekspresioni vektori i vektori za kloniranje će generalno sadržati sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava vektoru da se replicira u jednoj ili više odabranih ćelija domaćina. Tipično, kod vektora za kloniranje ova sekvenca je ona koja omogućava vektoru da se replicira nezavisno od hromozomske DNK domaćina i uključuje poreklo replikacije ili autonomno replicirajuće sekvence. Takve sekvence su dobro poznate za razne bakterije, kvasac i viruse, npr. poreklo replikacije iz plazmida pBR322 je pogodno za većinu gram-negativnih bakterija, 2mu poreklo plazmida je pogodno za kvasac, a različita virusna porekla (Simian Virus 40 ("SV40"), polioma, adenovirus, virus vezikularnog stomatitisa ("VSV") ili goveđi papilomavirus ("BPV") su korisni za vektore kloniranja u ćelijama sisara. Generalno, poreklo komponente replikacije nije potrebno za ekspresione vektore sisara (SV40 poreklo obično se može koristiti samo zato što sadrži rani promotor).
[0253] Ovi vektor obično će sadržati i neki selektivni gen, koji se naziva i selektivni marker. Uobičajeni selektivni geni kodiraju proteine koji (a) daju otpornost na antibiotike ili druge toksine, npr., ampicilin, neomicin, metotreksat ili tetraciklin, (b) dopunjuju auksotrofne nedostatke ili (c) snabdevaju kritičnim hranljivim materijama koje nisu dostupne iz složenih podloga, npr., gen koji kodira D-alanin racemazu za bacile.
[0254] Jedan primer šeme selekcije koristi lek za zaustavljanje rasta ćelije domaćina. Selekcija lekova se generalno koristi za selekciju kultivisanih ćelija sisara u koje je umetnuta strana DNK. Takve ćelije se obično nazivaju "transfektantima". Ćelije koje su kultivisane u prisustvu selektivnog sredstva i koje su sposobne da prenesu gen od interesa svom potomstvu nazivaju se "stabilnim transfektantima." Primeri takve dominantne selekcije koriste lekove neomicin, mikofenolnu kiselinu i higromicin. Primer selektivnog markera je gen koji kodira otpornost na antibiotik neomicin. Selekcija se izvodi u prisustvu leka tipa neomicina, kao što je G-418 ili slično. Ove ćelije koje su uspešno transformisane sa heterolognim genom proizvode protein koji daje otpornost na lek i tako preživljavaju režim selekcije.
[0255] Sistemi selekcije mogu da se koriste i za povećanje nivoa ekspresije gena od interesa, postupak koji se naziva "amplifikacija." Amplifikacija transfektanata obično se javlja kultivisanjem ćelija u prisustvu niskog nivoa selektivnog sredstva i potom povećanjem količine selektivnog sredstva radi selekcije ćelija koje proizvode visoke nivoe proizvoda uvedenih gena. Primeri pogodnih selektivnih markera za ćelije sisara su oni koji omogućavaju identifikaciju ćelija koje mogu da apsorbuju nukleinsku kiselinu antitela, kao što je dihidrofolat reduktaza ("DHFR"), timidin kinaza, metalotionein-I i -II, poželjno metalotionein geni primata, adenozin deaminaza, ornitin dekarboksilaza, itd.
[0256] Na primer, pojačavajući selektivni marker za ćelije sisara je dihidrofolat reduktaza koja daje otpornost na metotreksat. Drugi geni otporni na lekove (npr. otpornost na higromicin, otpornost na više lekova, puromicin acetiltransferaza) mogu se takođe koristiti. Ćelije transformisane sa DHFR selekcionim genom najpre se identifikuju kultivisanjem svih transformanata u podlozi za kulturu koja sadrži metotreksat ("MTX"), kompetitivni antagonist DHFR. Pogodna ćelija domaćina kada se koristi DHFR divljeg tipa je ćelijska linija jajnika kineskog hrčka ("CHO") kojoj nedostaje DHFR aktivnost.
[0257] Alternativno, ćelije domaćina (posebno domaćini divljeg tipa koji sadrže endogenu DHFR) transformisane ili kotransformisane sa DNK sekvencama koje kodiraju antitelo, DHFR protein divljeg tipa, i drugi selektivni marker kao što je aminoglikozid 3'-fosfotransferaza ("APH") može se odabrati ćelijskim rastom u podlozi koja sadrži neko selektivno sredstvo za selektivni marker kao što je aminoglikozidni antibiotik, npr., kanamicin, neomicin, ili G-418. Videti U.S. Patent br.4,965,199.
[0258] Ovi vektori mogu da obuhvataju neku sekvencu pojačavača koja olakšava transkripciju DNK koja kodira antitelo. Mnoge sekvence pojačavača poznate su iz gena sisara (na primer, globin, elastaza, albumin, alfa-fetoprotein, i insulin). Često korišćeni pojačavač je onaj izveden iz virusa u eukariotskim ćelijama. Njihovi primeri uključuju SV40 pojačavač na kasnijoj strani mesta početka replikacije (bp 100-270), pojačavač ranog promotora citomegalovirusa, pojačavač polioma na kasnijoj strani početka replikacije i pojačavača adenovirusa (videti, takođe Yaniv, Nature, 297:17-18, 1982, o elementima pojačavanja za aktivaciju eukariotskih promotora). Pojačavač može biti splajsovan u vektor na položaju 5' ili 3' u odnosu na sekvencu koja kodira antitelo, ali se poželjno nalazi na mestu 5' iz promotora.
[0259] Vektori za ekspresiju i kloniranje će takođe generalno sadržati promotor koji prepoznaje organizam domaćin i koji je radno povezan sa nukleinskom kiselinom antitela. Promotorske sekvence su poznate kod eukariota. Gotovo svi eukariotski geni imaju region bogat AT koji se nalazi približno 25 do 30 baza uzvodno od mesta gde se transkripcija inicira. Još jedna sekvenca koja se nalazi 70 do 80 baza uzvodno od početka transkripcije mnogih gena je CNCAAT region gde N može biti bilo koji nukleotid. Na 3' kraju većine eukariotskih gena je AATAAA sekvenca koja može biti signal za dodavanje poli A repa na 3' kraju kodirajuće sekvence. Sve ove sekvence su pogodno umetnute u eukariotske ekspresione vektore.
[0260] Transkripcija antitela iz vektora u ćelijama domaćina sisara kontroliše se, na primer, promotorima dobijenim iz genoma virusa kao što su polioma virus, virus boginja živine, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), BPV, virus ptičjeg sarkoma, citomegalovirus, retrovirus, virus hepatitisa B, i najpoželjnije SV40, iz heterolognih promotora sisara, npr. promotor aktina ili promotor imunoglobulina, iz promotora toplotnog šoka, pod uslovom da su takvi promotori kompatibilni sa sistemima ćelija domaćina.
[0261] Rani i kasni promotori SV40 virusa se pogodno dobijaju kao SV40 restrikcija koja takođe sadrži SV40 virusno poreklo replikacije. Neposredni rani promotor humanog citomegalovirusa se pogodno dobija kao HindIII E restrikcija . Sistem za eksprimirajuću DNK u domaćinima sisarima koji koristi BPV kao vektor opisan je u U.S. Patentu br.4,419,446. Modifikacija ovog sistema opisana je u U.S. Patentu br. 4,601,978. Videti takođe Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982) na ekspresiju cDNK humanog betainterferona u mišjim ćelijama pod kontrolom promotor timidin kinaze iz virusa herpes simpleksa.
[0262] Alternativno, Alternativno, dugačko terminalno ponavljanje rous virusa sarkoma može se koristiti kao promotor.
[0263] Mogu se koristiti jaki transkripcioni promotori, kao što su promotori iz SV40, citomegalovirusa ili mijeloproliferativnog sarkoma virusa. Videti, npr., U.S. Patent br.4,956,288 i U.S. Objavu patenta br. 20030103986. Ostali pogodni promotori uključuju one iz gena metalotioneina (U.S. Patenti br.
[0264] 4,579,821 i 4,601,978) i glavni kasni promotor adenovirusa. Ekspresioni vektori za upotrebu u ćelijama sisara uključuju pZP-1, pZP-9 i pZMP21, koji su deponovani u Američkoj kolekciji tipskih kultura, 10801 University Blvd., Manassas, VA. SAD pod pristupnim brojevima 98669, 98668 i PTA-5266, tim redom, i derivate ovih vektora.
[0265] Ekspresioni vektori korišćeni u eukariotskim ćelijama domaćina (kvasac, gljive, insekt, biljka, životinja, čovek ili ćelija sa jezgrom iz drugog višećelijskog organizma) takođe će generalno sadržati sekvence neophodne za terminaciju transkripcije i za stabilizaciju mRNK. Takve sekvence su obično dostupne iz 5' i, povremeno 3', neprevedenih regiona eukariotskih ili virusnih DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente transkribovane kao poliadenilovani u neprevedenom delu mRNK koja kodira antitelo. Jedna korisna komponenta za terminaciju transkripcije je poliadenilacioni region goveđeg hormona rasta. Videti WO 94/11026 i u njoj otkriven ekspresioni vektor.
[0266] Pogodne ćelije domaćina za kloniranje ili eksprimiranje predmetnih antitela uključuju prethodno opisane prokariotske ćelije, ćelije kvasaca ili više eukariotske ćelije. Međutim, najveći interes je za ćelijama kičmenjaka, i propagacija ćelija kičmenjaka u kulturi postala je rutinska procedura. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-1 (ATCC No. CRL 1650); i COS-7, ATCC CRL 1651); linija humanog embrionskog bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane radi rasta u kulturi suspenzije, (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59-72 (1977)); ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK, ATCC CCL 10, ATCC No. CRL 1632; BHK 570, ATCC No. CRL 10314); CHO ćelije (CHO-K1, ATCC No. CCL 61; CHO-DG44, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-4220 (1980)); sertolijeve ćelije miša (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); humane ćelije karcinoma grlića materice ćelije (HELA, ATCC CCL 2); pseće bubrežne ćelije (MDCK, ATCC CCL 34); bivolje ćelije jetre pacova ćelije (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane plućne ćelije (W138, ATCC CCL 75); humane ćelije jetre (Hep G2, HB 8065); ćelije tumora mlečnih žlezda miša (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i linija humanog hepatoma (Hep G2). Dodatne pogodne ćelijske linije poznate su u ovoj oblasti i dostupne su iz javnih depozitara kao što je Američka kolekcija tipskih kultura, Manassas, VA.
[0267] Ćelije domaćina se transformišu gorepomenutim vektorima za ekspresiju ili kloniranje za proizvodnju antitela i kultivišu se u konvencionalnim hranljivim podlogama modifikovanim na odgovarajući način za indukovanje promotora, selekciju transformanata ili pojačavanje gena koji kodiraju željene sekvence kao što je opisano gore.
[0268] Ćelije domaćina sisara korišćene za proizvodnju antitela ovog pronalaska mogu se kultivisati u raznim podlogama. Komercijalno dostupne podloge kao što su Ham's F10 (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO), Minimalna osnovna podloga (("MEM" (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO), Roswell Park Memorial Institute-1640 podloga ("RPMI-1640", Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO), i Dulbekov modifikovan Eagle medijum (("DMEM" Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO) su pogodni za kultivisanje ćelija domaćina. Podloge opisane u Ham et al., Meth. Enz., 58:44 (1979); Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980); U.S. Patentima br.4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ili 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; ili U.S. Ponovnom ispitivanju patenta br.30,985, mogu da se koriste kao podloge za kulturu za ćelije domaćina. Bilo koja od ovih podloga može se obogatiti, po potrebi, hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što su insulin, transferin ili epidermalni faktor rasta), solima (kao što je natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum i fosfat), puferima (kao što je HEPES), nukleotidima (kao što je adenozin i timidin), antibioticima (kao što je Gentamicin lek), elementima u tragovima (definišu se kao neorganska jedinjenja koja su obično prisutna u krajnjim koncentracijama u mikromolarnom opsegu), i glukozom ili nekim ekvivalentnim izvorom energije. Bilo koji drugi potrebni suplementi mogu se takođe uključiti u odgovarajućim koncentracijama što bi bilo poznato stručnjacima u ovoj oblasti. Uslovi za kulture, kao što su temperatura, pH, i slično, su oni prethodno korišćeni sa ćeliju domaćina izabranu za ekspresiju, biće očigledni prosečnom stručnjaku. Postupci za razvoj i optimizaciju podloga i uslova za kulturu poznati su u ovoj oblasti. (videti, Gronemeyer et al., Bioengineering, 1(4):188-212, 2014).
[0269] [0156] Nakon optimizacije uslova za kulturu i nakon što se izabere poželjni klon ćelijske linije, ove ćelije se kultivišu (ili adherentne ćelije ili kulture suspenzije) obično u polukontinualnom postupku u bioreaktoru (mnogi modeli su komercijalno dostupni) koji obuhvata kontinualno snabdevanje ćelijske kulture podlogom i hranom, optimizovan za posebnu ćelijsku liniju odabranu i izabranu za ovu svrhu. (videti, Butler, M., Appl. Microbiol. Biotechnol., 68:283-291, 2005; i Kelley, B., mAb, 1(5):443-452, 2009). Takođe su dostupni perfuzioni sistemi u kojima se podloga i hrana kontinuirano dovode u kulturu dok se ista zapremina podloge odvodi iz bioreaktora. (Wurm, 2004). Sintetičke podloge, takođe komercijalno dostupne, dostupne su za razvoj ćelija u polukontinualnoj kulturi, gde se izbegava mogućnost kontaminacije od spoljnih izvora, kao što je sa upotrebom životinjskih komponenata, kao što goveđi serum albumin, itd. Međutim, hidrolizati bez životinjskih komponenti su komercijalno dostupni kako bi se poboljšala gustina ćelija, vijabilnost kulture i produktivnost. (Li et al., 2010). Mnoge studije su sprovedene u nastojanju da se optimizuju podloge za ćelijsku kulturu, uključujući pažljivu pažnju posvećenu prednjem prostoru dostupnom u valjkastim bocama, redoks potencijalima tokom faza rasta i ekspresije, prisustvu redukcionih sredstava za održavanje disulfidnih veza tokom proizvodnje, itd. (videti, na primer, Hutterer et al., mAbs, 5(4):608-613, 2013; i Mullan et al., BMC Proceed., 5(Suppl 8):P110, 2011). Razvijene su različite metodologije za rešavanje mogućnosti štetne oksidacije tokom proizvodnje rekombinantnih monoklonalnih antitela. (videti, na primer, U.S. Patent br.8,574,869). Kultivisane ćelije mogu se gajiti kontinuiranim hranjenjem hranljivim materijama ili u odvojenim količinama. Često se različiti parametri procesa, kao što su koncentracija ćelija, pH, temperatura, CO<2>, dO<2>, osmolalnost, količina metabolita kao što su glukoza, laktat, glutamin i glutamat i slično, prate upotrebom sondi tokom rasta ćelija, bilo onlajn direktnom vezom sa kalibrisanim analizatorima ili oflajn intervencijom operatera. Faza kultivisanja takođe obično obuhvata osiguravanje da ćelije koje rastu u kulturi održavaju transfektovane rekombinantne gene na bilo koji način poznat u struci za selekciju ćelija.
[0270] Nakon fermentacije, tj., nakon dostizanja maksimalnog ćelijskog rasta i ekspresije rekombinantnih proteina, faza kultivisanja je obično praćena fazom prikupljanja, pri čemu se ćelije odvajaju od podloge i time se dobija sakupljena podloga za ćelijsku kulturu. (videti, Liu et al., mAbs, 2(5):480-499, 2010). Tipično, nakon kultivisanja slede različite faze prečišćavanja, uključujući kolonsku hromatografiju i slično, da bi se odvojilo rekombinantno monoklonalno antitelo od ćelijskih komponenti i komponenti podloge za ćelijsku kulturu. Tačne faze prečišćavanja potrebne za ovu fazu proizvodnje rekombinantnih monoklonalnih antitela zavise od mesta ekspresije proteina, tj., u citozolu samih ćelija ili od češće poželjnog puta izlučivanja proteina u podlogu za ćelijsku kulturu. Različite ćelijske komponente mogu se odvojiti korišćenjem tehnika poznatih u struci, kao što su tehnike diferencijalnog centrifugiranja, taloženje ćelija zasnovano na gravitaciji i/ili tehnike hromatografije/filtracije po veličini koje mogu uključivati tangencijalnu protočnu mikrofiltraciju ili dubinsku filtraciju. (videti, Pollock et al., Biotechnol. Bioeng., 110:206-219, 2013, i Liu et al., 2010). Centrifugiranje ćelijskih komponenti može se postići u velikim razmerama upotrebom kontinuiranih centrifuga sa diskovima, nakon čega sledi bistrenje korišćenjem dubinskih i membranskih filtera. (videti, Kelley, 2009). Najčešće, nakon bistrenja, rekombinantni protein se dalje prečišćava hromatografijom proteina A zbog visokog afiniteta proteina A za Fc domen antitela, i obično se to dešava korišćenjem faze eluiranja sa niskim pH/zakiseljavanjem (obično se faza zakiseljavanja kombinuje sa fazom preventivne inaktivacije virusa). Faze flokulacije i/ili taloženja korišćenjem kiselih ili katjonskih polielektrolita takođe se mogu koristiti za odvajanje životinjskih ćelija u kulturama suspenzije iz rastvorljivih proteina. (Liu et al., 2010). Konačno, anjonsko- i katjonsko-izmenjivačka hromatografija, hidrofobno-interakcijski hromatograf ("HIC"), hidrofobnoindukcioni hromatograf naelektrisanja (HCIC), hidroksiapatitna hromatografija korišćenjem keramičkog hidroksiapatita (Ca<5>(PO<4>)<3>OH)<2>, i kombinacije ovih tehnika se obično koriste za poliranje rastvora rekombinantnog monoklonalnog antitela. Krajnja formulacija i koncentracija željenog monoklonalnog antitela može se postići upotrebom tehnika ultracentrifugiranja. Prinosi prečišćavanja su obično 70 do 80%. (Kelley, 2009).
[0271] Pojmovi "željeni protein" ili "željeno antitelo" koriste se naizmenično i generalno se odnose na matično antitelo specifično za ciljni, tj., PACAP humanizovan kao što je ovde opisano. Pojam "antitelo" treba da obuhvata bilo koju molekulsku strukturu koja sadrži polipeptidni lanac sa specifičnim oblikom koji odgovara i prepoznaje epitop, gde jedna ili više interakcija nekovalentog vezivanja stabilizuje kompleks između molekulske strukture i epitopa. Arhetipski molekul antitela je imunoglobulin, a svi tipovi imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, itd., iz svih izvora, npr. humani, glodara, zeca, krave, ovce, svinje, psa, drugih sisara, kokoške, drugih ptica, itd., smatra se "antitelima." Zečevi su poželjan izvor za proizvodnju antitela korisnih kao polazni materijal prema ovom pronalasku. Njihovi primeri uključuju humanizovana antitela (videti, Streltsov et al., Protein Sci., 14(11):2901-9, 2005; Greenberg et al., Nature, 374(6518):168-73, 1995; Nuttall et al., Mol. Immunol., 38(4):313-26, 2001; Hamers-Casterman et al., Nature, 363(6428):446-8, 1993; Gill et al., Curr. Opin. Biotechnol., (6):653-8, 2006).
[0272] Na primer, antitela se mogu proizvesti genetičkim inženjeringom. U ovoj tehnici, kao sa drugim postupcima, ćelije koje proizvode antitela su senzibilizovane na željeni antigen ili imunogen.
[0273] Informativna RNK izolovana iz ćelija koje proizvode antitela koristi se kao šablon za izradu cDNK korišćenjem PCR amplifikacije. Biblioteka vektora, pri čemu se svaki sadrži jedan gen teškog lanca i jedan gen lakog lanca koji zadržavaju početnu antigensku specifičnost, proizvodi umetanjem odgovarajućih delova amplifikovane cDNK imunoglobulina u ekspresione vektore. Kombinatorna biblioteka se konstruiše kombinovanjem biblioteke gena teškog lanca sa bibliotekom gena lakog lanca. Ovo rezultira bibliotekom klonova koji koekspresuju teški i laki lanac (koji podseća na Fab molekula antitela). Vektori koji nose ove gene se kotransfektuju u ćeliju domaćina. Kada se indukuje sinteza gena antitela u transfektovanom domaćinu, proteini teškog i lakog lanca se sami sastavljaju da bi proizveli aktivna antitela koja se mogu detektovati skriningom sa antigenom ili imunogenom.
[0274] [0160] Sekvence koje kodiraju antitela od interesa uključuju one kodirane prirodnim sekvencama, kao i nukleinske kiseline koje, zbog degeneracije genetskog koda, nisu identične po sekvenci sa otkrivenim nukleinskim kiselinama i njihovim varijantama. Varijantni polipeptidi mogu uključivati supstitucije, adicije ili delecije aminokiselina ("aa"). Supstitucije aminokiselina mogu biti konzervativne supstitucije aminokiselina ili supstitucije za eliminaciju neesencijalnih aminokiselina, kao što je promena mesta glikozilacije ili minimiziranje pogrešnog savijanja supstitucijom ili delecijom jednog ili više ostataka cisteina koji nisu neophodni za funkciju. Varijante mogu biti dizajnirane tako da zadrže ili imaju poboljšanu biološku aktivnost određenog regiona proteina (npr., funkcionalni domen, katalitički ostaci aminokiselina, itd.). Varijante takođe uključuju polipeptide opisane ovde, posebno biološki aktivne i/ili koji odgovaraju funkcionalnim domenima. Tehnike za in vitro mutagenezu kloniranih gena su poznate. Takođe, predmetni pronalazak uključuje polipeptide koji su modifikovani korišćenjem uobičajenih molekularno bioloških tehnika kako bi se poboljšala njihova otpornost na proteolitičku razgradnju ili optimizovala svojstva rastvorljivosti ili učinili pogodnijim kao terapijsko sredstvo.
[0275] Humanizovana antitela su konstruisana tako da sadrže još više humanih imunoglobulinskih domena i uključuju samo regione koji određuju komplementarnost antitela životinjskog porekla. Ovo se postiže pažljivim ispitivanjem sekvence hiper-varijabilnih petlji varijabilnih regiona monoklonalnog antitela i njihovim uklapanjem u strukturu lanaca humanih antitela. Iako na prvi pogled složen, postupak je u praksi jednostavan. Videti, npr., U.S. Patent br.6,187,287.
[0276] Imunoglobulini i mogu biti modifikovani posttranslaciono, npr. da bi se dodali efektorski delovi kao što su hemijski linkeri, detektabilni delovi, kao što su fluorescentne boje, enzimi, toksini, supstrati, bioluminiscentni materijali, radioaktivni materijali, hemiluminiscentni delovi i slično, ili specifični vezujući delovi, kao što su streptavidin, avidin ili biotin, i slično mogu se koristiti u postupcima i kompozicijama ovog pronalaska. Primeri dodatnih efektorskih molekula dati su u nastavku.
[0277] Polinukleotidna sekvenca "odgovara" polipeptidnoj sekvenci ako translacija polinukleotidne sekvence u skladu sa genetskim kodom daje polipeptidnu sekvencu (tj. polinukleotidna sekvenca "kodira" polipeptidnu sekvencu), jedna polinukleotidna sekvenca "odgovara" drugoj polinukleotidnoj sekvenci ako dve sekvence kodiraju istu polipeptidnu sekvencu.
[0278] "Heterologni" region ili domen DNK konstrukta je identifikovani segment DNK unutar većeg DNK molekula koji se ne nalazi u vezi sa većim molekulom u prirodi. Dakle, kada heterologni region kodira gen sisara, DNK koja okružuje gen obično ne okružuje genomsku DNK sisara u genomu izvornog organizma. Još jedan primer heterolognog regiona je konstrukcija gde se sama kodirajuća sekvenca ne nalazi u prirodi (npr., cDNK gde genomska kodirajuća sekvenca sadrži introne ili sintetičke sekvence sa kodonima različitim od nativnog gena). Alelske varijacije ili prirodno nastali mutacioni događaji ne dovode do heterolognog regiona DNK kako je ovde definisana.
[0279] "Kodirajuća sekvenca" je sekvenca kodona unutar okvira koji odgovara ili kodira protein ili peptidnu sekvencu. Dve kodirajuće sekvence odgovaraju jedna drugoj ako sekvence ili njihove komplementarne sekvence kodiraju iste aminokiselinske sekvence. Kodirajuća sekvenca u vezi sa odgovarajućim regulatornim sekvencama može biti transkribovana i prevedena u polipeptid. Signal poliadenilacije i sekvenca za terminaciju transkripcije će obično biti locirane 3' u odnosu na kodirajuću sekvencu. "Promotor sekvenca" je DNK regulatorni region koji može da pokrene transkripciju nizvodne (3' smer) kodirajuće sekvence i obično sadrži dodatna mesta za vezivanje regulatornih molekula, npr. transkripcionih faktora, koji utiču na transkripciju kodirajuće sekvence. Kodirajuća sekvenca je "pod kontrolom" promotor sekvence ili "radno vezana" za promotor kada RNK polimeraza vezuje promotor sekvencu u ćeliji i prevodi kodirajuću sekvencu u mRNK, koja se zatim prevodi u protein kodiran kodirajućom sekvencom.
[0280] Opšta struktura antitela kod kičmenjaka danas je dobro poznata. Videti Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190:5 (1971). Antitela se sastoje od dva identična laka polipeptidna lanca molekulske mase približno 23000 daltona ("laki lanac"), i dva identična teška lanca molekulske mase 53000-70000 ("teški lanac"). Četiri lanca spojena su disulfidnim vezama u "Y" konfiguraciji, pri čemu laki lanci drže teške lance počevši od ušća "Y" konfiguracije. "Razgranat" deo "Y" konfiguracije označen je kao F<ab>region; deo stabla "Y" konfiguracije označen je kao F<C>region. Orijentacija aminokiselinske sekvence ide od N-terminalnog kraja na vrhu "Y" konfiguracije do C-terminalnog kraja na završetku svakog lanca. N-terminalni kraj ima varijabilni region sa specifičnošću za antigen koji ga je izazvao, i približno je dužine od 100 aminokiselina, pri čemu postoje male varijacije između lakog i teškog lanca i od antitela do antitela.
[0281] Varijabilni region je u svakom lancu povezan sa konstantnim regionom koji se proteže preostalom dužinom lanca i koji se unutar određene klase antitela ne menja sa specifičnošću antitela (tj. antigenom koji ga izaziva). Postoji pet poznatih glavnih klasa konstantnih regiona koji određuju klasu molekula imunoglobulina (IgG, IgM, IgA, IgD i IgE koji odgovaraju γ, µ, α, δ i ε (gama, mi, alfa, delta ili epsilon) konstantnim regionima teškog lanca). Konstantni region ili klasa određuje naknadnu efektorsku funkciju antitela, uključujući aktivaciju komplementa (videti Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2nd Ed., p.413-436, New York, NY: Holt, Rinehart, Winston (1976)), i druge ćelijske odgovore (videti Andrews et al., Clinical Immunology, pp.1-18, W. B. Sanders, Philadelphia, PA (1980); Kohl et al., Immunology, 48:187 (1983)); dok varijabilni region određuje antigen sa kojim će reagovati. Laki lanci se klasifikuju ili kao κ (kapa) ili λ (lambda). Svaka klasa teških lanaca može se pripremiti sa kapa ili lambda lakim lancem. Laki i teški lanci su kovalentno vezani jedan za drugog, a "repni" delovi dva teška lanca su vezani jedan za drugog kovalentnim disulfidnim vezama kada imunoglobuline generišu ili hibridomi ili B-ćelije.
[0282] Izraz "varijabilni region" ili "VR" odnosi se na domene unutar svakog para lakog i teškog lanca u nekom antitelu koji su direktno uključeni u vezivanju antitela za antigen. Svaki teški lanac ima na jednom kraju varijabilni domen (V<H>), nakon čega sledi određeni broj konstantnih domena. Svaki laki lanac ima varijabilni domen (V<L>) na jednom kraju i konstantni domen na drugom kraju; konstantni domen lakog lanca je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, a varijabilni domen lakog lanca je poravnat sa varijabilnim domenom teškog lanca
[0283] [0169] Izrazi "region koji određuje komplementarnost," "hipervarijabilni region," ili "CDR" odnose se na jedan ili više hipervarijabilnih regiona ili regiona koji određuju komplementarnost ("CDR") koji se nalaze u varijabilnim regionima lakih ili teških lanaca antitela (Videti Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1987)). Ovi izrazi uključuju hipervarijabilne regione kako su definisali Kabat et al., (Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No.91-3242, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, National Institutes of Health (1983)) ili hipervarijabilne petlje u 3-dimenzionalnim strukturama antitela (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987). CDR-ovi u svakom lancu se nalaze u neposrednoj blizini okvirnih regiona ("FR") i, zajedno sa CDR-ovima iz drugog lanca, doprinose formiranju mesta vezivanja antigena. Unutar CDR-ova postoje odabrane aminokiseline koje su opisane kao regioni koji određuju selektivnost ("SDR") i koje predstavljaju kritične kontaktne ostatke koje CDR koristi u interakciji antitelo-antigen. (videti, Kashmiri et al., Methods, 36(1):25-34, 2005).
[0284] "Epitop" ili "mesto vezivanja" je područje ili region na antigenu za koji se specifično vezuje peptid koji vezuje antigen (kao što je antitelo). Proteinski epitop može da sadrži aminokiselinske ostatke direktno uključene u vezivanje (takođe nazvane imunodominantna komponenta epitopa) i druge aminokiselinske ostatke, koji nisu direktno uključeni u vezivanje, kao što su aminokiselinski ostaci koje efikasno blokira specifični peptid koji vezuje antigen (drugim rečima, aminokiselinski ostatak se nalazi unutar "otiska" peptida koji specifično vezuje antigen). Pojam epitop, ovde, uključuje oba vrste mesta vezivanja aminokiselina u bilo kom određenom regionu PACAP, tj., PACAP38 i PACAP27, koji se specifično vezuju za anti-PACAP antitelo. PACAP mogu da obuhvataju niz različitih epitopa, koji mogu da uključuju, bez ograničenja, (1) linearne peptidne antigene determinante, (2) konformacione antigene determinante koje se sastoje od jedne ili više nesusednih aminokiselina koje se nalaze blizu jedna druge u zreloj PACAP konformaciji; i (3) posttranslacione antigene determinante koje se sastoje, bilo u celini ili delimično, od molekularnih struktura kovalentno vezanih za PACAP protein kao što su grupe ugljenih hidrata. Određenije, pojam "epitop" uključuje specifične ostatke u proteinu ili peptidu, npr., PACAP, koji su uključeni u vezivanje nekog antitela za takav protein ili peptid kao što je određeno pomoću poznatih i prihvaćenih postupaka kao što su tehnike skeniranja alanina. Takvi postupci dati su ovde kao primeri.
[0285] Izraz da se antitelo (npr., prvo antitelo) vezuje "suštinski" ili "najmanje delimično" za isti epitop kao i drugo antitelo (npr., drugo antitelo) znači da mesto vezivanja epitopa za prvo antitelo obuhvata najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili više aminokiselinskih ostataka na antigenu koji čini mesto vezivanja epitopa drugog antitela. Takođe, to što se prvo antitelo vezuje suštinski ili delimično za isti ili preklapajući epitop kao i drugo antitelo znači da se prvo i drugo antitelo takmiče u vezivanju za antigen, kao što je gore opisano. Dakle, pojam "vezuje se za suštinski isti epitop ili determinantu kao" monoklonalno antitelo znači da se neko antitelo "takmiči" sa antitelom.
[0286] [0172] Izraz "vezuje se za isti ili preklapajući epitop ili determinantu kao" neko antitelo od interesa znači da se neko antitelo "takmiči" sa pomenutim antitelom od interesa za najmanje jedan, (npr., najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5) ili sve ostatke na PACAP za koje se pomenuto antitelo od interesa konkretno vezuje. Identifikacija jednog ili više antitela koja se vezuju suštinski ili značajno za isti epitop kao ovde opisana monoklonalna antitela može se lako odrediti pomoću skeniranja alanina. Pored toga, bilo koji od različitih imunoloških skrining testova u kojima se može proceniti konkurencija antitela. Više takvih testova se rutinski primenjuje i dobro je poznato u ovoj oblasti (videti, npr., U.S. Patent br.
[0287] 5,660,827, objavljen 26. avgusta, 1997.). Treba razumeti da stvarno određivanje epitopa za koji se antitelo opisano ovde vezuje nije ni na koji način potrebno da bi se identifikovalo antitelo koje se vezuje za isti ili suštinski isti ili preklapajući epitop kao ovde opisano monoklonalno antitelo.
[0288] Na primer, kada se ispitivana antitela koja treba ispitati dobijaju od različitih izvornih životinja ili su čak različitog Ig izotipa, može se koristiti jednostavan kompetitivni test u kome se kontrolno antitelo umešava sa ispitivanim antitelom, a zatim primenjuje na uzorak koji sadrži PACAP. Protokoli zasnovani na ELISA, radioimunološkim testovima, Western blotting-u i upotrebi BIACORE<®>(GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA) analize su pogodni za upotrebu u takvim jednostavnim kompetitivnim studijama.
[0289] U određenim načinima ostvarivanja, kontrolno anti-PACAP antitelo se prethodno umešava sa različitim količinama ispitivanog antitela (npr., u odnosima oko 1:1, 1:2, 1:10 ili oko 1:100) za neki vremenski period pre primene na PACAP38 ili PACAP27 antigenski uzorak. U drugim načinima ostvarivanja, kontrola i različite količine test antitela mogu se jednostavno dodati odvojeno i pomešati tokom izlaganja uzorku PACAP38 ili PACAP27 antigenskom uzorku. Sve dok se vezana antitela mogu razlikovati od slobodnih antitela (npr. korišćenjem tehnika razdvajanja ili ispiranja za eliminaciju nevezanih antitela) i kontrolno antitelo od ispitivanog antitela (npr. korišćenjem sekundarnih antitela specifičnih za vrstu ili izotip ili specifičnim obeležavanjem kontrolnog antitela detektabilnom oznakom), može se utvrditi da li test antitelo smanjuje vezivanje kontrolnog antitela za PACAP38 ili PACAP27 antigene, što ukazuje da ispitivano antitelo prepoznaje u suštini isti epitop kao i kontrolno anti-PACAP antitelo. Vezivanje (obeleženog) kontrolnog antitela u prisustvu potpuno irelevantnog antitela (koje se ne vezuje za PACAP) može poslužiti kao kontrolna visoka vrednost. Kontrolna niska vrednost može se dobiti inkubacijom obeleženog kontrolnog antitela sa istim, ali neobeleženim kontrolnim antitelom, gde bi došlo do konkurencije i smanjenja vezivanja obeleženog antitela. U test analizi, značajno smanjenje reaktivnosti obeleženog antitela u prisustvu ispitivanog antitela ukazuje na test antitelo koje prepoznaje suštinski isti epitop, tj. onaj koji se takmiči sa obeleženim kontrolnim antitelom. Na primer, svako ispitivano antitelo koje smanjuje vezivanje kontrolnog antitela za PACAP38 ili PACAP27 za najmanje oko 50%, kao što je najmanje oko 60% ili poželjnije najmanje oko 70% (npr., oko 65-100%), pri bilo kom odnosu ispitivanog antitela između oko 1:1 ili 1:10 i oko 1:100 smatra se antitelom koje se vezuje za suštinski isti ili preklapajući epitop ili determinantu kao kontrolno antitelo.
[0290] Poželjno, takvo ispitivano antitelo smanjiće vezivanje kontrolnog antitela za PACAP38 ili PACAP27 antigen, poželjno najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 80% ili najmanje oko 90% (npr., oko 95%) vezivanja kontrolnog antitela primećenog u odsustvu ispitivanog antitela.
[0291] Jednostavan test konkurencije u kome se test antitelo nanosi u zasićenoj koncentraciji na površinu na kojoj je imobilisan PACAP38 ili PACAP27 takođe se može povoljno koristiti. Površina u jednostavnom testu konkurencije je poželjno BIACORE<®>(GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA) čip (ili drugi medijum pogodan za analizu površinske plazmonske rezonance ("SPR")). Meri se vezivanje kontrolnog antitela koje vezuje PACAP38 ili PACAP27 za površinu obloženu PACAP-om. Ovo vezivanje za površinu koja sadrži PACAP38 ili PACAP27 samog kontrolnog antitela upoređuje se sa vezivanjem kontrolnog antitela u prisustvu ispitivanog antitela. Značajno smanjenje vezivanja za površinu koja sadrži PACAP38 ili PACAP27 od strane kontrolnog antitela u prisustvu ispitivanog antitela ukazuje na to da ispitivano antitelo prepoznaje suštinski isti epitop kao i kontrolno antitelo, tako da se ispitivano antitelo "takmiči" sa kontrolnim antitelom. Bilo koje ispitivano antitelo koje smanjuje vezivanje kontrolnog antitela za najmanje oko 20% ili više, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 70%, ili više, može se smatrati antitelom koje se vezuje za suštinski isti epitop ili determinantu kao kontrolno antitelo. Poželjno, takvo ispitivano antitelo smanjiće vezivanje kontrolnog antitela za PACAP38 ili PACAP27 za najmanje oko 50% (npr., najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, ili više). Smatra se da se redosled kontrolnih i ispitivanih antitela može obrnuti; tj. kontrolno antitelo se može prvo vezati za površinu, a potom da se ispitivano antitelo dovede u kontakt sa površinom nakon toga u testu nadmetanja.
[0292] Poželjno, koristi se test "sendvič-stil" vezivanja koji je dat u primeru 9 dole. Alternativno, antitelo koje ima veći afinitet za PACAP38 ili PACAP27 antigen najpre se vezuje za površinu koja sadrži PACAP38 ili PACAP27, jer se očekuje da će smanjenje vezivanja primećeno za drugo antitelo (pod pretpostavkom da se antitela takmiče) biti većeg obima. Dalji primeri takvih testova dati su u npr., Saunal and Regenmortel, J. Immunol. Methods, 183:33-41 (1995).
[0293] Pored toga, da li se antitelo vezuje za isti(e) ili preklapajući(e) epitop(e) na PACAP kao drugo antitelo ili epitop koji vezuje testirano antitelo može se posebno utvrditi korišćenjem testa zasnovanog na Western blot-u. U ovom testu se pravi biblioteka peptida koji odgovaraju antigenu koji je vezan antitelom, PACAP protein, koji obuhvataju preklapajuće delove proteina, obično dužine 10-25, 10-20, ili 10-15 aminokiselina. Ovi različiti preklapajući aminokiselinski peptidi koji obuhvataju PACAP sekvencu sintetišu se i kovalentno vezuju za PEPSPOTS<™>nitroceluloznu membranu (JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany). Zatim se pripremaju i ispituju blotovi prema preporukama proizvođača.
[0294] U suštini, imunoblot test zatim fluorometrijski detektuje koji se peptidi u biblioteci vezuju za testirano antitelo i time može da identifikuje koji ostaci na antigenu, tj. PACAP, međusobno reaguju sa testiranim antitelom. (Videti U.S. Patent br.7,935,340).
[0295] [0179] Različite tehnike mapiranja epitopa su poznate u struci. Na primer, rendgenska kokristalografija antigena i antitela; NMR; SPR (npr., na 25° ili 37°C); skeniranje oligopeptida zasnovano na nizu (ili "pepskan analiza"); mutageneza usmerena na mesto (npr., skeniranje alanina); mapiranje mutageneze; razmena vodonik-deuterijum; fagni prikaz; i ograničena proteoliza su sve tehnike mapiranja epitopa koje su dobro poznate u struci. (videti, npr., Epitope Mapping Protocols: Second Edition, Methods in Molecular Biology,, urednici Mike Schutkowski and Ulrich Reineke, 2nd Ed., New York, NY: Humana Press, 2009; i Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, editor Glenn Morris, 1st Ed., New York, NY: Humana Press, 1996).
[0296] Identifikacija jednog ili više antitela koja se vezuju za suštinski ili u suštini isti epitop kao monoklonska antitela opisana ovde, npr., Ab10, Ab10.H, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5, može se lako utvrditi korišćenjem bilo kog od različitih imunoloških skrining testova u kojima se može proceniti konkurencija antitela. Više takvih testova se rutinski primenjuje i dobro su poznati u struci (videti, npr., U.S. Patent br.5,660,827). Treba razumeti da određivanje epitopa za koji se ovde opisano antitelo vezuje nije ni na koji način potrebno za identifikaciju antitela koje se vezuje za isti ili u suštini isti epitop kao ovde opisano monoklonalno antitelo.
[0297] Na primer, kada se ispitivano antitela koja treba ispitati dobijaju od različitih izvornih životinja ili su čak različitog Ig izotipa, može se koristiti jednostavan kompetitivni test u kome se kontrolno antitelo (jedno od Ab10, Ab10.H, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5, na primer) meša sa ispitivanim antitelom, a zatim nanosi na uzorak koji sadrži jedan ili oba PACAP38 i PACAP27, za koje je poznato da se vezuju za Ab10, Ab10.H, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5. Protokoli zasnovani na ELISA testovima, radioimunološkim testovima, Western blotting-u i BIACORE<®>(GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA) analizi (kao što je opisano u odeljku sa primerima ovde) su pogodni za upotrebu u takvim jednostavnim studijama nadmetanja.
[0298] [0182] U određenim načinima ostvarivanja, postupak obuhvata prethodno mešanje kontrolnog antitela sa različitim količinama ispitivanog antitela (npr., u odnosima oko 1:1, 1:2, 1:10 ili oko 1:100) za vremenski period pre primene na uzorak PACAP antigena. U drugim načinima ostvarivanja, kontrola i i različite količine ispitivanog antitela mogu se dodati odvojeno i pomešati tokom izlaganja uzorku PACAP antigena. Sve dok se vezana antitela mogu razlikovati od slobodnih antitela (npr. korišćenjem tehnika odvajanja ili ispiranja za eliminaciju nevezanih antitela) i kontrolno antitelo od ispitivanog antitela (npr. korišćenjem sekundarnih antitela specifičnih za vrstu ili izotip ili specifičnim obeležavanjem kontrolnog antitela detektabilnom oznakom), postupak se može koristiti za utvrđivanje da ispitivano antitelo smanjuje vezivanje kontrolnog antitela za PACAP antigen, što ukazuje da test antitelo prepoznaje suštinski isti epitop kao i kontrolno antitelo (npr., Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5). Vezivanje (obeleženog) kontrolnog antitela u prisustvu potpuno irelevantnog antitela (koje se ne vezuje za PACAP) može poslužiti kao kontrolna visoka vrednost. Kontrolna niska vrednost može se dobiti inkubacijom obeleženog kontrolnog antitela sa istim, ali neobeleženim kontrolnim antitelom, gde bi došlo do konkurencije i smanjilo vezivanje obeleženog antitela. U test analizi, značajno smanjenje reaktivnosti obeleženog antitela u prisustvu ispitivanog antitela ukazuje na ispitivano antitelo koje prepoznaje u suštini isti epitop, tj. onaj koji se takmiči sa obeleženim kontrolnim antitelom. Na primer, bilo koje ispitivano antitelo koje smanjuje vezivanje Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5, za oba PACAP38 i PACAP27 antigena za najmanje oko 50%, kao što je najmanje oko 60% ili poželjnije najmanje oko 70% (npr., oko 65-100%), u bilo kom odnosu kontrolno Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5 između oko 1:1 ili 1:10 i oko 1:100 smatra se antitelom koje se suštinski vezuje za isti epitop ili determinantu kao Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5, tim redom. Poželjno, takvo ispitivano antitelo smanjiće vezivanje Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5 za najmanje jedan, poželjno svaki, od PACAP38 i PACAP27 antigena, poželjno najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 80% ili najmanje oko 90% (npr., oko 95%) vezivanja Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5 primećeno u odsustvu ispitivanog antitela. Ovi postupci se mogu prilagoditi za identifikaciju i/ili procenu antitela koja se takmiče sa drugim kontrolnim antitelima.
[0299] Jednostavan test nadmetanja u kome se ispitivano antitelo nanosi u zasićenoj koncentraciji na površinu na kojoj su imobilisani ili PACAP38 ili PACAP27, ili oba, takođe se može povoljno koristiti. Meri se površina u jednostavnom testu nadmetanja je poželjno od medijuma pogodnog za OCTET<®>i/ili PROTEON<®>. Vezivanje kontrolnog antitela (npr., Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5) za površinu obloženu PACAP. Ovo vezivanje za površinu koja sadrži PACAP samog kontrolnog antitela upoređuje se sa vezivanjem kontrolnog antitela u prisustvu ispitivanog antitela. Značajno smanjenje vezivanja za površinu koja sadrži PACAP od strane kontrolnog antitela u prisustvu ispitivanog antitela ukazuje na to da ispitivano antitelo prepoznaje u suštini isti epitop kao i kontrolno antitelo, tako da test antitelo "takmiči" sa kontrolnim antitelom. Bilo koje ispitivano antitelo koje smanjuje vezivanje kontrolnog antitela (kao što je Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5) za oba PACAP38 i PACAP27 antigena za najmanje oko 20% ili više, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 70%, ili više, može se smatrati antitelom koje se vezuje suštinski za isti epitop ili determinantu kao kontrolno antitelo (npr., Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5). Poželjno, takvo ispitivano antitelo smanjiće vezivanje kontrolnog antitela (npr., Ab10.H, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5) za PACAP antigen za najmanje oko 50% (npr., najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, ili više). Smatra se da redosled kontrolnih i ispitivanih antitela može biti obrnut; tj. kontrolno antitelo se prvo može vezati za površinu, a potom se ispitivano antitelo dodvodi u kontakt sa površinom nakon toga u testu nadmetanja. Poželjno, antitelo koje ima veći afinitet za PACAP38 i PACAP27 prvo se vezuje za površinu koja sadrži PACAP, jer se očekuje da će smanjenje vezivanja primećeno za drugo antitelo (pod pretpostavkom da se antitela takmiče) biti većeg obima. Dalji primeri takvih testova dati su u, npr., Saunal and Regenmortel, J. Immunol. Methods, 183:33-41 (1989).
[0300] Određivanje da li se antitelo, njegovo vezivanje antigena, ili derivat antitela vezuje unutar jednog prethodno definisanog epitopskog regiona može se izvesti na načine poznate stručnjaku u ovoj oblasti. U drugom primeru tih postupaka mapiranja/karakterizacije, epitopski region za anti-PACAP antitelo može se odrediti pomoću "otiska" epitopa korišćenjem hemijske modifikacije izloženih amina/karboksila u PACAP38 i PACAP27 proteinu. Jedan specifični primer te tehnike otiska je razmenom vodonikdeuterijum detektovanoj masenom spektrometrijom ("HXMS"), pri čemu dolazi do razmene vodonik/deuterijum protona receptorskih i ligandnih proteinskih amida, vezivanja i povratne razmene, pri čemu su amidne grupe u lancu koje učestvuju u vezivanju proteina zaštićene od povratne razmene i stoga će ostati deuterizovane. Relevantni regioni se mogu identifikovati u ovoj fazi peptičkom proteolizom, brzim razdvajanjem tečnom hromatografijom visokih performansi sa kolonama sa mikro otvorom, i/ili masenom spektrometrijom sa elektrosprej jonizacijom. (videti, npr., Ehring H., Anal.
[0301] Biochem., 267(2):252-259, 1999; i Engen, J. R. & Smith, D. L., Anal. Chem., 73:256A-265A, 2001). Drugi primer pogodne tehnike za identifikaciju epitopa je mapiranje epitopa nuklearnom magnetnom rezonancijom ("NMR"), gde se obično porede položaj signala u dvodimenzionalnim NMR spektrima slobodnog antigena i antigena u kompleksu sa peptidom za vezivanje antigena, kao što je neko antitelo. Antigen je obično selektivno izotopski obeležen sa<15>N tako da se samo signali koji odgovaraju antigenu i bez signala od peptida koji se vezuje za antigen vide u NMR-spektru. Signala antigena koji potiču iz aminokiselina uključenih u interakciji sa peptidom koji se vezuje za antigen, obično će pomeriti položaj u spektrima kompleksa u odnosu na spektre slobodnog antigena, a aminokiseline uključene u vezivanje mogu se identifikovati na taj način. (videti, npr., Ernst Schering Res. Found. Workshop, (44):149-67, 2004; Huang et al., J. Mol. Biol., 281(1):61-67, 1998; i Saito and Patterson, Methods, 9(3):516-24, 1996).
[0302] Mapiranje/karakterizacija epitopa može se izvesti i korišćenjem postupaka masene spektrometrije ("MS"). (videti, npr., Downard, J. Mass Spectrom., 35(4):493-503, 2000; i Kiselar and Downard, Anal. Chem., 71(9):1792-801, 1999).
[0303] [0186] Tehnike digestije proteaza takođe mogu biti korisne u kontekstu mapiranja i identifikacije epitopa. Regioni/sekvence relevantni za antigene determinante mogu se odrediti digestijom proteazom, npr. korišćenjem tripsina u odnosu od oko 1:50 do PACAP38 ili PACAP27 preko noći ("o/n") digestija na 37°C i pH 7-8, nakon čega sledi analiza masenom spektrometrijom ("MS") za identifikaciju peptida. Peptidi zaštićeni anti-PACAP antitelom od cepanja tripsinom mogu se naknadno identifikovati poređenjem uzoraka podvrgnutih digestiji tripsinom i uzoraka inkubiranih sa antitelom, a zatim podvrgnutih digestiji npr. tripsinom (čime se otkriva otisak antitela). Drugi enzimi poput himotripsina ili pepsina mogu se koristiti u sličnim metodama karakterizacije epitopa. Štaviše, enzimska digestija može pružiti brzu metodu za analizu da li se potencijalna sekvenca antigenih determinanti nalazi unutar regiona PACAP-a u kontekstu polipeptida koji se vezuje za PACAP. Ako polipeptid nije površinski izložen, najverovatnije nije relevantan u smislu imunogenosti/antigenosti. (videti, npr., Manca, Ann. Ist. Super. Sanità., 27(1):15-9, 1991, za diskusiju o sličnim tehnikama).
[0304] Mutageneza usmerena na mesto je još jedna tehnika korisna za karakterizaciju vezivnog epitopa. Na primer, kod mutageneze usmerene na mesto "skeniranje alanina" (takođe poznata kao skeniranje alanina, mutageneza skeniranja alanina, mutacije skeniranja alanina, kombinatorno skeniranje alanina, ili stvaranje tačkastih mutacija alanina, na primer), svaki ostatak unutar proteinskog segmenta zamenjuje se ostatkom alanina (ili drugim ostatkom kao što je valin gde je alanin prisutan u sekvenci divljeg tipa) putem metodologija kao što su direktna sinteza peptida ili proteina, mutageneza usmerena na mesto, GENEART<™>Mutagenesis Service (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA U.S.A.) ili nasumična mutageneza, na primer. Korišćenjem ove tehnike, generiše se niz mutanata molekula sa jednom tačkom; broj generisanih mutanata je ekvivalentan broju ostataka u molekulu, pri čemu se svaki ostatak zamenjuje, jedan po jedan, jednim ostatkom alanina. Alanin se generalno koristi za zamenu nativnih (divljeg tipa) ostataka zbog svoje neglomazne, hemijski inertne, metil funkcionalne grupe koja može da oponaša preferencije sekundarne strukture koje mnoge druge aminokiseline mogu posedovati. Nakon toga, efekti zamene nativnog ostatka alaninom na afinitet vezivanja mutanta skeniranja alanina i njegovog partnera u vezivanju mogu se izmeriti korišćenjem takvih postupaka kao što su, ali neograničavajući se na, eksperimente SPR vezivanja. Ako mutacija dovodi do značajnog smanjenja afiniteta vezivanja, najverovatnije je da je mutirani ostatak uključen u vezivanje. Monoklonalna antitela specifična za strukturne epitope (tj. antitela koja se ne vezuju za nesavijeni protein) mogu se koristiti kao pozitivna kontrola za eksperimente afiniteta vezivanja kako bi se potvrdilo da zamena alaninom ne utiče na ukupnu tercijarnu strukturu proteina (jer promene u ukupnom savijanju proteina mogu indirektno uticati na vezivanje i time proizvesti lažno pozitivan rezultat). (videti, npr., Clackson and Wells, Science, 267:383-386 (1995); Weiss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(16):8950-8954 (2000); i Wells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:1-6 (1996)). U primeru 12, postupci skeniranja alanina koriste se za identifikovanje specifičnog epitopa ili ostataka PACAP koji specifično uzajamno reaguju sa ovde otkrivenim anti-PACAP antitelima.
[0305] Elektronska mikroskopija se takođe može koristiti za "otisak" epitopa. Na primer, Wang et al., Nature, 355:275-278 (1992) koristili su koordinisanu primenu krioelektronske mikroskopije, trodimenzionalne rekonstrukcije slike i rendgenske kristalografije da bi odredili fizički otisak Fab- na površini kapsida prirodnog virusa mozaika crnog graška.
[0306] [0189] Ostali oblici testa "bez obeležavanja" za evaluaciju epitopa uključuju SPR (koji se komercijalno prodaje kao BIACORE<®>sistem, GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA) i reflektometrijsku interferentnu spektroskopiju ("RifS"). (videti, npr., Fagerstam et al., J. Mol. Recog., 3:208-14, 1990; Nice et al., J. Chromatogr., 646:159-168, 1993; Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed., 37:3308-3311, 1998; Kroger et al., Biosensors and Bioelectronics, 17:937-944, 2002).
[0307] Izrazi "okvirni region" ili "FR" odnose se na jedan ili više okvirnih regiona unutar varijabilnih regiona lakog i teškog lanca antitela. (videti, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edition, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, 1987). Ovi izrazi uključuju one regione aminokiselinskih sekvenci smeštene između CDR-ova unutar varijabilnih regiona lakog i teškog lanca antitela.
[0308] Pojam "Fc region" koristi se da definiše C-terminalni region teškog lanca imunoglobulina. "Fc region" može biti Fc region nativne sekvence ili varijantni Fc region. Iako granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu varirati, humani Fc region teškog lanca IgG obično je definisan da se proteže od aminokiselinskog ostatka na položaju Cys226, ili od Pro230, do njegovog karboksilnog kraja. Broj ostataka u Fc regionu je onaj EU indeksa kao u Kabat. (videti, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, 1991). Fc region imunoglobulina uopšteno obuhvata dva konstantna domena, CH2 i CH3.
[0309] Pojmovi "Fc receptor" i "FcR" opisuju receptor koji se vezuje za Fc region antitela. Poželjan FcR je humani FcR nativne sekvence. Osim toga, poželjni FcR je onaj koji vezuje IgG antitelo (gama receptor) i uključuje receptore FcγRI, FcγRII i FcγRIII podklasa, uključujući alelne varijante i alternativno splajsovane oblike ovih receptora. FcγRII receptori uključuju FcγRIIA ("aktivirajući receptor") i FcγRIIB ("inhibirajući receptor"), koji imaju slične aminokiselinske sekvence koje se pre svega razlikuju u njihovim citoplazmatičnim domenima. Pregled FcR-ova nalazi se u Ravitdh and Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); i de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). "FcR" takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za prenos majčinih IgG fetusu (Guyer et al., J. Immunol., 117:587, 1976; i Kim et al., J. Immunol., 24:249, 1994), i koji pre svega funkcioniše da modulira i/ili produži vreme eliminacije antitela u cirkulaciji. U meri u kojoj su otkrivena anti-PACAP antitela aglikozilovana, kao rezultat izraz sistem i/ili sekvenca, očekuje se da se predmetna antitela vezuju za FcRn receptore, ali da se ne vezuju (ili minimalno vezuju) za Fcγ receptore.
[0310] "Funkcionalni Fc region" ima najmanje jednu efektorsku funkciju Fc regiona nativne sekvence. Primeri "efektorskih funkcija" uključuju C1q vezivanje; citotoksičnost zavisnu od komplementa ("CDC"); vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela ("ADCC"); fagocitozu; smanjenu regulaciju receptora na površini ćelija (npr. receptor B ćelija ("BCR")), itd. Takve efektorske funkcije generalno zahtevaju da Fc region bude kombinovan sa domenom vezivanja (npr. varijabilnim domenom antitela) i mogu se proceniti korišćenjem različitih testova poznatih u struci za procenu takvih efektorskih funkcija antitela.
[0311] "Fc region nativne sekvence" obuhvata aminokiselinsku sekvencu identičnu aminokiselinskoj sekvenci Fc regiona koji se nalazi u prirodi. "Varijantni Fc region" obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one Fc regiona nativne sekvence na osnovu najmanje jedne modifikacije aminokiseline, ali zadržava najmanje jednu efektorsku funkciju Fc regiona nativne sekvence. Poželjno, varijantni Fc region ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na Fc region nativne sekvence ili Fc region matičnog polipeptida, npr. od oko jedan do oko deset aminokiselinskih supstitucija, i poželjno od oko jedan do oko pet aminokiselinskih supstitucija u Fc regionu nativne sekvence ili u Fc regionu matičnog polipeptida. Varijantni Fc region ovde poželjno ima najmanje oko 80% identiteta sekvenci sa Fc regionom nativne sekvence i/ili sa Fc regionom matičnog polipeptida, i najpoželjnije najmanje oko 90% identiteta sekvenci sa tim, poželjnije najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identiteta sekvenci sa tim.
[0313] Anti-PACAP antitela i vezivanje sa aktivnošću vezivanja za PACAP
[0315] PACAP je multifunkcionalni vazodilatatorni peptid sa ekspresijom u centralnom nervnom sistemu ("CNS") i periferno. PACAP je član sekretin/VIP/GRH porodice. PACAP postoji u dva α-amidovana aktivna oblika, PACAP38 (SEQ ID NO: 1241) i PACAP27 (SEQ ID NO: 1242). Ovde, pojam "PACAP" uključuje ili jedan ili oba PACAP38 i PACAP27 osim ako izričito nije drugačije naznačeno. PACAP je visoko očuvan između vrsta.
[0316] Kod ljudi, PACAP je izveden iz proteina prekursora 176 aminokiselina (preproPACAP) i gen je smešten na hromozomu 18p11, sa PACAP38 kodirano od strane eksona 5. (videti, Vaudry et al., Pharmacol. Rev., 61:283-357, 2009). PreproPACAP sadrži signalni protein od N-terminalnih 24 aminokiselina, PACAP-srodan peptid od 29 aminokiselina i PACAP u C-terminalnom domenu. Prekursor se metaboliše enzimom prohormon konvertaze u biološki aktivan PACAP38 i PACAP27.
[0317] VIP (SEQ ID NO: 1243) pripada istoj porodici proteina kao PACAP i deli visoku homologiju sa PACAP, tj., VIP i PACAP27 imaju 68% homologije sekvenci na aminokiselinskom nivou, kao i sličnu ukupnu sekundarnu strukturu, tj. duge alfa-spiralne strukture na C-kraju.
[0318] [0198] PACAP dejstva su posredovana preko tri različita G-protein spregnuta receptora: PAC1-R, VPAC1-R, i VPAC2-R. VPAC1-R može da se veže za sve membranske proteine povezane sa receptorom ("RAMP," videti Kaiser and Russo, Neuropeptides 47:451-461, 2013). PAC1-R je selektivan za PACAP, dok se VPAC1-R i VPAC2-R vezuju i za VIP i za PACAP s visokim afinitetom. PAC1-R vezuje se za PACAP sa 100-1000-puta većim afinitetom nego VIP, tj., K<D>~0.5 nM za PACAP27/PACAP38 vs. K<D>~500 nM za VIP. Obrnuto, VPAC1-R i VPAC2-R imaju iste afinitete za PACAP i VIP (K<D>~1 nM). (videti, Schytz et al., 2010). Sva tri receptora široko su eksprimirana i u perifernim tkivima i u CNS, pri čemu se PAC1-R pretežno eksprimira u CNS, najzastupljeniji u olfaktornom bulbusu, talamusu, hipotalamusu, dentatnom girusu hipokampusa i u granularnim ćelijama malog mozga. (videti, Hashimoto et al., J. Comp. Neurol., 371:567-577, 1996; i Shioda et al., Neurosci. Res., 28:345-354, 1997).
[0319] Aktivacija PAC1-R, VPAC1-R i/ili VPAC2-R dovodi do povećane aktivnosti adenilat ciklaze i, tako, povećane cAMP proizvodnje. Međutim, PACAP receptori mogu da posreduju i njihove efekte kroz PLC, što dovodi do povećanih Ca<2+>nivoa, i PLD.
[0320] PACAP ima širok opseg bioloških efekata, uključujući ulogu u neurorazvoju, neuroprotekciji, neuromodulaciji, neurogenu upalu i nocicepciju. Prijavljeno je da PACAP uzajamno reaguje i sa glikozaminoglikanima ("GAG"). GAG su dugi, nerazgranati polisaharidi koji se sastoje od ponavljajućih disaharidnih jedinica, kao što je heparin, hondroitin, keratin i hijaluronska kiselina. Pokazalo se da ćelijska apsorpcija PACAP zavisi od ekspresije GAG proteina i da se PACAP vezao za sulfatirane GAG. Posebno, određeno je da PACAP38 vezivanje za GAG-ove može indukovati ćelijsku apsorpciju PACAP38 nezavisnu od receptora. Ova studija dalje pokazuje da je slučajna tranzicija sa zavojnice na α-heliks u PACAP38 bila neophodna za GAG-zavisnu apsorpciju PACAP38, jer mutant PACAP38 koji nije mogao da prođe kroz strukturnu tranziciju nije internalizovan od strane ćelijskih linija koje sadrže GAG tako efikasno kao oblik PACAP38 divljeg tipa (Neree et al., FEBS Lett., 588(24):4590-4596, 2014). U naknadnoj studiji, utvrđeno je da je sposobnost PACAP-a da grupiše GAG-ove, tj., heparin, direktno povezana sa njegovom sposobnošću da funkcioniše kao peptid koji prodire u ćelije ("CPP"). Pretpostavlja se da se ova aktivnost može pripisati motivu vezivanja za heparin, ili Cardin-Weintraub motivu, koji se nalazi kod članova porodice sekretin/glukagon /GHRH, kao što je PACAP (Neree et al., Int. J. Mol. Sci., 16:27391-27400, 2015). Zanimljivo je da su Neree et al. (2015) predstavili podatke koji pokazuju da je PACAP38 bio u stanju da grupiše sulfatirane GAG-ove in vitro. Ovi podaci sugerišu da je primećeni efekat grupisanja važan za ćelijsku apsorpciju PACAP38 posredovanu GAG-ovima, jer drugi peptidi, kao što je glukagon, pokazuju veće afinitete vezivanja za sulfatirane GAG-ove (heparin) ali ih ćelije ne internalizuju tako efikasno kao PACAP38. Dalje, objavljeno je da je u in vitro studijama u kojima su ćelije izložene PACAP-u povećano formiranje hrskavice, uključujući hrskavičnu matricu koja je bogata sulfatiranim GAG proteinima, što je u skladu sa njenom pretpostavljenom zaštitnom ulogom izraženom tokom različitih ćelijskih stresnih odgovora (Juhász et al., PLoS ONE, 9(3):e91541, 2014). Koristeći tipove ćelija kojima nedostaju PACAP-specifični receptori na njihovim plazma membranama, kao što su CHO-K1 ćelije, Doan et al. su predstavili podatke koji pokazuju sposobnost takvih ćelija da se uključe u ćelijsku apsorpciju različitih oblika fluorescentno obeleženih PACAP38 i PACAP27 nezavisno od receptora (Doan et al., Biochem. Biophys. Acta, 1823:940-949, 2012).
[0321] [0201] Ovaj pronalazak obezbeđuje primere antitela koja vezuju PACAP. Neka druga antitela koja vezuju PACAP, uključujući ona koja imaju različite CDR-ove i epitopsku specifičnost, mogu se dobiti korišćenjem otkrivanja ove specifikacije i korišćenjem postupaka koji su generalno poznati u ovoj oblasti. Takva antitela antagonizuju biološke efekte PACAP in vivo i stoga su korisni u lečenju ili prevenciji PACAP-povezanih stanja uključujući, na primer, glavobolju, migrenu, bol, fotofobiju, valunge, PTSD i anksiozne poremećaje. U poželjnim načinima ostvarivanja, antitelo prema ovom pronalasku obuhvata jedan ili više CDR-ova, V<L>lanac i/ili V<H>lanac ovde opisanih anti-PACAP antitela.
[0322] U nekim načinima ostvarivanja, anti-PACAP antitelo prema ovom pronalasku će ometati, blokirati, smanjiti ili modulirati interakciju između PACAP i njegovog(ih) receptora (npr., PAC1-R, VPAC1-R i VPAC2-R). U nekim primerima, anti-PACAP antitelo prema ovom pronalasku je "neutrališuće", npr., ono u potpunosti sprečava specifičnu interakciju PACAP sa PAC1-R, VPAC1-R i/ili VPAC2-R. U nekim načinima ostvarivanja, antitelo neutrališe PACAP, npr., ostajući vezan za PACAP na mestu i/ili na način koji sprečava da se PACAP specifično veže za PAC1-R, VPAC1-R i/ili VPAC2-R.
[0323] U nekim načinima ostvarivanja, antitelo prema ovom pronalasku može da inhibira PACAP-posredovanu aktivnost (uključujući vezivanje za ćelije koje eksprimiraju PAC1R). U nekim načinima ostvarivanja, antitela prema ovom pronalasku su humanizovana, kao što su humanizovana zečja antitela za PACAP.
[0324] Kao što je pomenuto, anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku imaju razne upotrebe. Na primer, predmetna antitela i mogu biti korisna u terapijskim primenama, kao i dijagnostički u testovima vezivanja. Predmetna anti-PACAP antitela korisna su za afinitetno prečišćavanje PACAP-a, posebno humanog PACAP-a ili njegovih liganada i u skrining testovima za identifikaciju drugih antagonista PACAP aktivnosti. Neka od antitela korisna su za inhibiciju vezivanja PACAP-a za PAC1-R, VPAC1-R i/ili VPAC2-R, ili inhibiciju PACAP-posredovanih aktivnosti i/ili bioloških efekata.
[0325] Kao što se ovde koristi, pojam "jedan ili više bioloških efekata povezanih sa PACAP-om odnosi se na bilo koji biološki efekat posredovan, indukovan ili na drugi način pripisan PACAP-u, npr., svojstva vezivanja, funkcionalna svojstva i druga svojstva od biološkog značaja. Neograničavajući primeri bioloških efekata PACAP-a uključuju vezivanje PACAP za PAC1-R, VPAC1-R i/ili VPAC2-R; PACAP aktivirajuću PAC1-R, VPAC1-R i/ili VPAC2-R-posredovanu signalizaciju; PACAP-posredovano povećanje cAMP proizvodnje; PACAP-posredovano povećanje PLC aktivnosti; PACAP-posredovano povećanje PLD aktivnosti; PACAP-posredovano povećanje Ca<2+>nivoa; i PACAP-posredovanu vazodilataciju, fotofobiju, degranulaciju mastocita i/ili neuronsku aktivaciju. Predmetna anti-PACAP antitela su sposobna da inhibiraju jedan, kombinaciju, ili sve ove primere PACAP bioloških aktivnosti. Na primer, ovde obezbeđena anti-PACAP antitela su sposobna da inhibiraju PACAP-indukovanu vazodilataciju (videti Primer 7 i Primer 8).
[0326] [0206] Antitelo prema ovom pronalasku može se koristiti u raznim terapijskim primenama. Na primer, u nekim načinima ostvarivanja, anti-PACAP antitela su korisna za lečenje stanja povezanih sa PACAP-om, kao što su, ali neograničavajući se na, migrena (sa ili bez aure), hemiplegične migrene, klaster glavobolje, migrenozna neuralgija, hronične glavobolje, tenzione glavobolje, opšte glavobolje, valunzi, fotofobija, hronična paroksizmalna hemikranija, sekundarne glavobolje zbog osnovnog strukturnog problema u glavi ili vratu, kranijalna neuralgija, sinusne glavobolje (npr., glavobolja povezana sa sinusitisom), glavobolje ili migrene izazvane alergijom, bol, hronični bol, neuroinflamatorni ili inflamatorni bol, bol nakon operativnog reza, postoperativni bol, bol povezan sa traumom, bol u očima, zubobolja, kompleksni regionalni bolni sindrom, bol zbog raka (npr., bol zbog primarnog ili metastatskog raka kostiju), bol zbog preloma, bol zbog preloma kod osteoporoze, bol nastao usled opekotina, bol u zglobovima kod gihta, bol povezan sa krizom srpastih ćelija, bol povezan sa temporomandibularnim poremećajima, ciroza, hepatitis, neurogeni bol, neuropatski bol, nociceptivni bol, visceralni bol, trigeminalna neuralgija, postherpetična neuralgija, fantomski bol u ekstremitetima, fibromijalgija, menstrualni bolovi, ovarijalgija, refleksna simpatička distrofija, osteoartritis ili bol zbog reumatoidnog artritisa, bol u donjem delu leđa, dijabetesna neuropatija, išijas, dispepsija, sindrom iritabilnog creva, inflamatorna bolest creva, Kronova bolest, ileitis, ulcerativni kolitis, bubrežne kolike, dismenoreja, cistitis, intersticijalni cistitis, menstrualni period, porođaj, menopauza, pankreatitis, šizofrenija, depresija, PTSD, anksiozni poremećaji, dijabetes, autoimuni dijabetes, endotelna disfunkcija, ishemija, Rejnoov sindrom, koronarna bolest srca ("CHD"), koronarna arterijska bolest ("CAD"), srčana insuficijencija, periferna arterijska bolest ("PAD"), plućna hipertenzija ("PH"), poremećaji vezivnog tkiva, moždani udar, Sjogrenov sindrom, multipla skleroza, bronhijalna hiperreaktivnost, astma, bronhitis, bronhodilatacija, emfizem, hronična opstruktivna bolest pluća ("COPD"), inflamatorni dermatitis, adenokarcinom u tkivu žlezda, blastom u embrionalnom tkivu organa, karcinom u epitelnom tkivu, leukemija u tkivima koja formiraju krvne ćelije, limfom u limfnom tkivu, mijelom u koštanoj srži, sarkom u vezivnom ili potpornom tkivu, rak nadbubrežne žlezde, Limfom povezan sa AIDS-om, anemija, rak bešike, rak kostiju, rak mozga, rak dojke, karcinoidni tumori, rak grlića materice, hemioterapija, rak debelog creva, citopenija, rak endometrijuma, rak jednjaka, rak želuca, rak glave, rak vrata, hepatobilijarni rak, rak bubrega, leukemija, rak jetre, rak pluća, limfom, Hočkinova bolest, ne-Hočkinova, tumori nervnog sistema, rak usne duplje, rak jajnika, rak pankreasa, rak prostate, rak rektuma, rak kože, rak želuca, rak testisa, rak štitne žlezde, rak uretre, rak koštane srži, multipli mijelom, tumori koji metastaziraju u kost, tumori koji infiltriraju u nerv i šuplji organ, tumori u blizini nervnih struktura, akne vulgaris, atopijski dermatitis, urtikarija, keloidi, hipertrofični ožiljci i rozacea, alergijski dermatitis, psorijaza, pruritus, neurogeno crvenilo kože, eritem, gubitak mase, anoreksija, sarkoidoza, šok, sepsa, sindrom apstinencije od opijata, tolerancija na morfin, epilepsija, LUT poremećaji kao što su infekcija urinarnog trakta, abnormalno mokrenje, hitna potreba za mokrenjem, nokturija, urinarna inkontinencija, preaktivna bešika, i za prevenciju ili ublažavanje bola povezanog sa tim LUT stanjima.
[0327] Posebni primeri visceralnog bola, tj., bola povezanog sa unutrašnjim organima, ili unutrašnjim organima tela uključuju bol koja pogađa organe kao što su npr., srce, pluća, reproduktivni organi, bešika, ureteri, organi za varenje, jetra, pankreas, slezina i bubrezi. Stanja povezana sa ovim uključuju, na primer, pankreatitis, porođaj, abdominalnu hirurgiju povezanu sa ileusom, cistitis, menstrualni period ili dismenoreju. Slično tome, bol u bubrezima, epigastrični bol, pleuralni bol i bolne bilijarne kolike, bol usled apendicitisa mogu se smatrati visceralnim bolom. Substernalni bol ili pritisak od ranog infarkta miokarda je takođe visceralni. Bolesti želuca, dvanaestopalačnog creva ili debelog creva mogu izazvati visceralni bol. Uobičajeni gastrointestinalni ("GI") poremećaji koji se javljaju i koji izazivaju visceralni bol uključuju funkcionalni poremećaj creva ("FBD") i inflamatornu bolest creva ("IBD"). Takvi GI poremećaji mogu dalje uključivati gastroezofagealni refluks, dispepsiju, sindrom iritabilnog creva ("IBS") i sindrom funkcionalnog abdominalnog bola ("FAPS"), a, u vezi sa IBD, Kronovu bolest, ileitis i ulcerativni kolitis.
[0328] Predmetna anti-PACAP antitela mogu da se koriste sama ili u vezi sa drugim aktivnim agensima ili lekovima, uključujući druge biološke lekove, za lečenje bilo kog subjekta kod koga je terapeutski poželjno blokiranje, inhibiranje ili neutralizacija in vivo efekta PACAP ili blokiranje ili inhibiranje interakcije PACAP-a i njegovih receptora, PAC1-R, VPAC1-R i VPAC2-R.
[0329] Primeri anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku, i njihovi specifični CDR-ovi identifikovani su u ovom odeljku. Radi lakšeg snalaženja, svako njegovo primereno antitelo i odgovarajuće sekvence su odvojeno identifikovane specifičnom nomenklaturom, tj., Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3 i Ab10.H5.
[0330] Anti-PACAP antitela koja obuhvataju ovaj pronalazak imaju afinitet vezivanja za PACAP, pri čemu afinitet vezivanja obuhvata specifično vezivanje anti-PACAP antitela za PACAP38 i PACAP27, ali ne vezivanje VIP, i/ili specifično vezivanje antitela za PACAP38, ali ne vezivanje za PACAP27 ili VIP, i/ili specifično vezivanje antitela za linearni i/ili konformacioni epitop unutar PACAP38 i/ili PACAP27.
[0331] Određenije, epitopi iz PACAP38 i/ili PACAP27 za koje se antagonistička anti-PACAP antitela prema ovom pronalasku vezuju, uključivaće one koji su identifikovani u primeru 12 ili njihove ostatke (kao što su određeni korišćenjem skeniranja alanina) i/ili drugim postupcima identifikacije epitopa.
[0333] Polipeptidne sekvence anti-PACAP antitela
[0335] Antitelo Ab10.H
[0337] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, koja imaju sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 961 koja se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 962 vezanog za konstantni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 970.
[0338] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, koja sadrže sekvencu varijabilnog teškog lanca koja obuhvata sekvencu koja je navedena u nastavku:
[0340]
[0343] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, koja vezuju isti epitop kao Ab10.H, i koja sadrže konstantnu sekvencu teškog lanca koja obuhvata polipeptid iz SEQ ID NO: 1244, 1245, ili 1246, ili koja obuhvata sekvencu koja je navedena u nastavku:
[0345]
[0348] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, koja sadrže sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 981 koja se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 982 vezanog za konstantni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 990.
[0349] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, koja sadrže sekvencu varijabilnog lakog lanca koja obuhvata sekvencu koja je navedena u nastavku:
[0351]
[0354] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, koja se vezuju za isti epitop kao Ab10.H, i koja sadrže konstantnu sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu koja je navedena u nastavku:
[0356]
[0359] [0217] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, koja sadrže jednu, dve ili tri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 964; SEQ ID NO: 966; i SEQ ID NO: 968, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 961, ili koja sadrže sekvencu varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 962, i/ili koja dalje sadrže jednu, dve ili tri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 984; SEQ ID NO: 986; i SEQ ID NO: 988, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 981, ili koja sadrže sekvencu varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 982, ili antitela koja sadrže kombinacije sekvenci koje su im identične. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, kombinacije jedne ili više primernih sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca, ili sekvenci teškog lanca i lakog lanca koje su prethodno navedene, ili sekvenci koje su im identične.
[0360] Ovaj pronalazak dalje razmatra anti-PACAP antitela koja obuhvataju jednu, dve, tri ili četiri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 963; SEQ ID NO: 965; SEQ ID NO: 967; i SEQ ID NO: 969, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 961, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 962, i/ili jednu, dve, tri ili četiri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 983; SEQ ID NO: 985; SEQ ID NO: 987; i SEQ ID NO: 989, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 981, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 982, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci, ili sekvence koje su im identične.
[0361] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitela ovog pronalaska ili obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, kombinacije jednog ili više od FR-ova, CDR-ova, sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog lanca i lakog lanca navedenih gore, uključujući sve njih, ili sekvence koje su im identične.
[0362] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitela ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 961, ili SEQ ID NO: 962, ili polipeptida koji su im identični. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 981, ili SEQ ID NO: 982, ili polipeptida koji su im identični.
[0363] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu, dve ili tri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 964; SEQ ID NO: 966; i SEQ ID NO: 968, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 961, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 962, ili sekvence koje su im identične.
[0364] [0222] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu, dve ili tri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 984; SEQ ID NO: 986; i SEQ ID NO: 988, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 981 ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 982, ili sekvence koje su im identične.
[0365] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu, dve, tri ili četiri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 963; SEQ ID NO: 965; SEQ ID NO: 967; i SEQ ID NO: 969, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 961 ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 962, ili sekvence koje su im identične.
[0366] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, predmetna antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu, dve, tri ili četiri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 983; SEQ ID NO: 985; SEQ ID NO: 987; i SEQ ID NO: 989, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 981 ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 982, ili sekvence koje su im identične.
[0367] Ovaj pronalazak takođe razmatra anti-PACAP antitela koja uključuju jedno ili više ovde opisanih antitela. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jedno, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećeg antitela s: varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 962; varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 982; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 964; SEQ ID NO: 966; i SEQ ID NO: 968) varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 962; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 984; SEQ ID NO: 986; i SEQ ID NO: 988) varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 982, ili sekvence koje su im identične. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jedno, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećeg antitela s: varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 962; varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 982; okvirni regioni (SEQ ID NO: 963; SEQ ID NO: 965; SEQ ID NO: 967; i SEQ ID NO: 969) varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 962; i okvirni regioni (SEQ ID NO: 983; SEQ ID NO: 985; SEQ ID NO: 987; i SEQ ID NO: 989) varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 982, ili sekvence koje su im identične.
[0368] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitelo je Ab10.H, koje obuhvata, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 961 i SEQ ID NO: 981, ili SEQ ID NO: 962 i SEQ ID NO: 982, ili neko antitelo koje obuhvata CDR-ove iz Ab10.H i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti navedenih ovde, ili je anti-PACAP antitelo koje se takmiči sa Ab10.H u vezivanju PACAP, poželjno ono koje sadrži sekvence koje su identične onima iz Ab10.H, ili neko antitelo koje se vezuje za isti ili preklapajući epitop(e) na PACAP kao Ab10.H.
[0369] [0227] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, koji vezuje antigen obuhvata, ili se alternativno sastoji od, Fab koje ima specifičnost vezivanja za PACAP. Što se tiče antitela Ab10.H, Fab poželjno uključuje sekvencu varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 962 i sekvencu varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 982, ili sekvence koje su im identične. Ovaj način ostvarivanja ovog pronalaska dalje uključuje Fab koja sadrža adicije, delicije i varijante SEQ ID NO: 962 i/ili SEQ ID NO: 982 koje zadržavaju specifičnost vezivanja za PACAP.
[0370] U jednom načinu ostvarivanja ovde opisanog pronalaska, Fab može da se proizvede enzimskom digestijom (npr., papain) Ab10.H. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitela kao što su Ab10.H i Fab mogu se proizvesti ekspresijom u ćelijama sisara, kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, gljivični, insektski ili mikrobni sistemi, kao što su ćelije kvasca (na primer haploidni ili diploidni kvasac, kao što je haploidni ili diploidni Pichia) ili drugi sojevi kvasaca. Pogodne Pichia vrste uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
[0371] U nekom daljem načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak dalje je usmeren na polinukleotide koji kodiraju polipeptide antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, uključujući teške i/ili lake lance iz Ab10.H, kao i s, varijante, i kombinacije jednog ili više od FR-ova, CDR-ova, sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca i sekvenci teškog lanca i lakog lanca navedenih gore, uključujući sve njih, ili sekvence koje su im identične.
[0373] Antitelo Ab10.H2
[0375] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, koja imaju sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 1281 koja se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282 vezanog za konstantni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1290.
[0376] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, koja sadrže sekvencu varijabilnog teškog lanca koja obuhvata sekvencu koja je navedena u nastavku:
[0378]
[0381] [0232] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, koja vezuju isti epitop kao Ab10.H2, i koja sadrže konstantnu sekvencu teškog lanca koja obuhvata polipeptid iz SEQ ID NO: 1244, 1245, ili 1246, ili koja obuhvataju sekvencu koja je navedena u nastavku:
[0383]
[0386] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, koja sadrže sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 1301 koja se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1302 vezanog za konstantni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1310.
[0387] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP koja sadrže sekvencu varijabilnog lakog lanca koja obuhvata sekvencu koja je navedena u nastavku:
[0389]
[0392] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, koja vezuju isti epitop kao Ab10.H2, i koja sadrže konstantnu sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu koja je navedena u nastavku:
[0394]
[0397] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, koja sadrže jednu, dve ili tri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1284; SEQ ID NO: 1286; i SEQ ID NO: 1288, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1281, ili koja sadrže sekvencu varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282, i/ili koja dalje sadrže jednu, dve ili tri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1304; SEQ ID NO: 1306; i SEQ ID NO: 1308, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1301, ili koja sadrže sekvencu varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1302, ili antitela koja sadrže kombinacije sekvenci koje su im identične. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, kombinacija jedne ili više primernih sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca ili sekvenci teškog lanca i lakog lanca koje su prethodno navedene, ili sekvenci koje su im identične.
[0398] Ovaj pronalazak dalje razmatra anti-PACAP antitela koja obuhvataju jednu, dve, tri ili četiri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1283; SEQ ID NO: 1285; SEQ ID NO: 1287; i SEQ ID NO: 1289, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1281, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282, i/ili jednu, dve, tri ili četiri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1303; SEQ ID NO: 1305; SEQ ID NO: 1307; i SEQ ID NO: 1309, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1301, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1302, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci, ili sekvence koje su im identične.
[0399] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitela ovog pronalaska ili obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, kombinacija jednog ili više od FR-ova, CDR-ova, sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog lanca i lakog lanca navedenih gore, uključujući sve njih, ili sekvence koje su im identične.
[0400] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitela ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1281, ili SEQ ID NO: 1282, ili polipeptide koji su im identični. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polipeptidnu sekvencu iz SEQ ID NO: 1301, ili SEQ ID NO: 1302, ili polipeptide koji su im identični.
[0401] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu, dve ili tri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1284; SEQ ID NO: 1286; i SEQ ID NO: 1288, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1281, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282, ili sekvence koje su im identične.
[0402] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu, dve ili tri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1304; SEQ ID NO: 1306; i SEQ ID NO: 1308, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1301, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1302, ili sekvence koje su im identične.
[0403] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu, dve, tri ili četiri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1283; SEQ ID NO: 1285; SEQ ID NO: 1287; i SEQ ID NO: 1289, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1281, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282, ili sekvence koje su im identične.
[0404] [0243] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, predmetna antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu, dve, tri ili četiri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1303; SEQ ID NO: 1305; SEQ ID NO: 1307; i SEQ ID NO: 1309, koje odgovaraju FR ovima (konstantni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1301, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1302, ili sekvence koje su im identične.
[0405] Ovaj pronalazak takođe razmatra anti-PACAP antitela koja uključuju jedno ili više od ovde opisanih antitela. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jedno, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećeg antitela: varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282; varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1302; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 1284; SEQ ID NO: 1286; i SEQ ID NO: 1288) varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 1304; SEQ ID NO: 1306; i SEQ ID NO: 1308) varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1302, ili sekvence koje su im identične. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jedno, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećeg antitela s: varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282; varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1302; okvirni regioni (SEQ ID NO: 1283; SEQ ID NO: 1285; SEQ ID NO: 1287; i SEQ ID NO: 1289) varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282; i okvirni regioni (SEQ ID NO: 1303; SEQ ID NO: 1305; SEQ ID NO: 1307; i SEQ ID NO: 1309) varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1302, ili sekvence koje su im identične.
[0406] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitelo je Ab10.H2, koje obuhvata, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 1281 i SEQ ID NO: 1301, ili SEQ ID NO: 1282 i SEQ ID NO: 1302, ili neko antitelo koje obuhvata CDR-ove iz Ab10.H2 i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti navedenih ovde, ili je anti-PACAP antitelo koje se takmiči sa Ab10.H2 u vezivanju PACAP, poželjno ono koje sadrži sekvence koje su identične onima iz Ab10.H2, ili neko antitelo koje se vezuje za isti ili preklapajući epitop(e) na PACAP kao Ab10.H2.
[0407] U nekom daljem načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak je dalje usmeren na polinukleotide koji kodiraju polipeptide antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, uključujući teške i/ili lake lance iz Ab10.H2, kao i s, varijante, i kombinacije jednog ili više od FR-ova, CDR-ova, sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog lanca i lakog lanca navedenih gore, uključujući sve njih, ili sekvence koje su im identične.
[0409] Antitelo Ab10.H3
[0411] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP koje ima sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 1321 koja se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322 vezanog za konstantni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1330.
[0412] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP koja sadrže sekvencu varijabilnog teškog lanca koja obuhvata sekvencu koja je navedena u nastavku:
[0414]
[0417] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP koja vezuju isti epitop kao Ab10.H3, i koja sadrže konstantnu sekvencu teškog lanca koja obuhvata polipeptid iz SEQ ID NO: 1244, 1245, ili 1246, ili koja obuhvataju sekvencu koja je navedena u nastavku:
[0419]
[0422] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP koja sadrže sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 1341 koja se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342 vezanog za konstantni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1350.
[0423] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP koja sadrže sekvencu varijabilnog lakog lanca koja obuhvata sekvencu koja je navedena u nastavku:
[0425]
[0428] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, koja vezuju isti epitop kao Ab10.H3, i koja sadrže konstantnu sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu koja je navedena u nastavku:
[0429] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP koja sadrže jednu, dve ili tri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1324; SEQ ID NO: 1326; i SEQ ID NO: 1328, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1321, ili koja sadrže sekvencu varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322, i/ili koja dalje sadrže jednu, dve ili tri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1344; SEQ ID NO: 1346; i SEQ ID NO: 1348, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1341, ili koja sadrže sekvencu varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342, ili antitela koja sadrže kombinacije sekvenci koje su im identične. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, kombinacije jedne ili više primernih sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca, ili sekvenci teškog lanca i lakog lanca koje su prethodno navedene, ili sekvenci koje su im identične.
[0430] Ovaj pronalazak dalje razmatra anti-PACAP antitela koja obuhvataju jednu, dve, tri ili četiri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1323; SEQ ID NO: 1325; SEQ ID NO: 1327; i SEQ ID NO: 1329, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1321, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322, i/ili jednu, dve, tri ili četiri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1343; SEQ ID NO: 1345; SEQ ID NO: 1347; i SEQ ID NO: 1349, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1341, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci, ili sekvence koje su im identične.
[0431] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitela ovog pronalaska ili obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, kombinacija jednog ili više od FR-ova, CDR-ova, sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog lanca i lakog lanca navedenih gore, uključujući sve njih, ili sekvence koje su im identične.
[0432] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitela ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polipeptidnu sekvencu iz SEQ ID NO: 1321, ili SEQ ID NO: 1322, ili polipeptide koji su im identični. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polipeptidnu sekvencu iz SEQ ID NO: 1341, ili SEQ ID NO: 1342, ili polipeptide koji su im identični.
[0433] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu, dve ili tri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1324; SEQ ID NO: 1326; i SEQ ID NO: 1328, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1321, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322, ili sekvence koje su im identične.
[0434] [0258] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu, dve ili tri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1344; SEQ ID NO: 1346; i SEQ ID NO: 1348, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1341, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342, ili sekvence koje su im identične.
[0435] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu, dve, tri ili četiri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1323; SEQ ID NO: 1325; SEQ ID NO: 1327; i SEQ ID NO: 1329, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1321, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322, ili sekvence koje su im identične.
[0436] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, predmetna antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu, dve, tri ili četiri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1343; SEQ ID NO: 1345; SEQ ID NO: 1347; i SEQ ID NO: 1349, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1341, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342, ili sekvence koje su im identične.
[0437] Ovaj pronalazak takođe razmatra anti-PACAP antitela koja uključuju jedno ili više od ovde opisanih antitela. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jedno, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećeg antitela s: varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322; varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 1324; SEQ ID NO: 1326; i SEQ ID NO: 1328) varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 1344; SEQ ID NO: 1346; i SEQ ID NO: 1348) varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342, ili sekvence koje su im identične. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jedno, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećeg antitela s: varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322; varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342; okvirni regioni (SEQ ID NO: 1323; SEQ ID NO: 1325; SEQ ID NO: 1327; i SEQ ID NO: 1329) varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322; i okvirni regioni (SEQ ID NO: 1343; SEQ ID NO: 1345; SEQ ID NO: 1347; i SEQ ID NO: 1349) varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342, ili sekvence koje su im identične.
[0438] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitelo je Ab10.H3, koje obuhvata, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 1321 i SEQ ID NO: 1341, ili SEQ ID NO: 1322 i SEQ ID NO: 1342, ili neko antitelo koje obuhvata CDR-ove iz Ab10.H3 i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti navedenih ovde, ili je anti-PACAP antitelo koje se takmiči sa Ab10.H3 u vezivanju PACAP, poželjno ono koje sadrži sekvence koje su identične onima iz Ab10.H3, ili neko antitelo koje se vezuje za isti ili preklapajući epitop(e) na PACAP kao Ab10.H3.
[0439] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitela kao što je Ab10.H3 mogu se proizvesti ekspresijom u ćelijama sisara, kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, gljivični, insektski ili mikrobni sistemi, kao što su ćelije kvasaca (na primer haploidni ili diploidni kvasac, kao što je haploidni ili diploidni Pichia) i drugi sojevi kvasaca. Pogodne Pichia vrste uključuju, ali nisu ograničeni na, Pichia pastoris.
[0440] U nekom daljem načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak je dalje usmeren na polinukleotide koji kodiraju polipeptide antitela koji imaju specifičnost vezivanja za PACAP, uključujući teške i/ili lake lance iz Ab10.H3, kao i s, varijante i kombinacije jednog ili više od FR-ova, CDR-ova, sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca i sekvenci teškog lanca i lakog lanca navedenih gore, uključujući sve njih, ili sekvence koje su im identične.
[0442] Antitelo Ab10.H5
[0444] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, koja imaju sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 1401 koja se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402 vezanog za konstantni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1410.
[0445] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP koja sadrže sekvencu varijabilnog teškog lanca koja obuhvata sekvencu koja je navedena u nastavku:
[0447]
[0450] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP koja vezuju isti epitop kao Ab10.H5, i koja sadrže konstantnu sekvencu teškog lanca koja obuhvata polipeptid iz SEQ ID NO: 1244, 1245, ili 1246, ili koja obuhvataju sekvencu koja je navedena u nastavku:
[0451] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP koja sadrže sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 1421 koja se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422 vezanog za konstantni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1430.
[0452] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP koja sadrže sekvencu varijabilnog lakog lanca koja obuhvata sekvencu koja je navedena u nastavku:
[0454]
[0457] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, koja vezuju isti epitop kao Ab10.H5, i koja sadrže konstantnu sekvencu lakog lanca koja obuhvataju sekvencu koja je navedena u nastavku:
[0459]
[0462] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP koja sadrže jednu, dve ili tri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1404; SEQ ID NO: 1406; i SEQ ID NO: 1408, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1401, ili koja sadrže sekvencu varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402, i/ili koja dalje sadrže jednu, dve ili tri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1424; SEQ ID NO: 1426; i SEQ ID NO: 1428, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1421, ili koja sadrže sekvencu varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422, ili antitela koja sadrže kombinacije sekvenci koje su im identične. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, kombinacije jedne ili više primernih sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca, ili sekvenci teškog lanca i lakog lanca koje su prethodno navedene, ili sekvenci koje su im identične.
[0463] Ovaj pronalazak dalje razmatra anti-PACAP antitela koja obuhvataju jednu, dve, tri ili četiri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1403; SEQ ID NO: 1405; SEQ ID NO: 1407; i SEQ ID NO: 1409, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1401, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402, i/ili jednu, dve, tri ili četiri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1423; SEQ ID NO: 1425; SEQ ID NO: 1427; i SEQ ID NO: 1429, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1421, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422, ili kombinacije ovih polipeptidnih sekvenci, ili sekvence koje su im identične.
[0464] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitela ovog pronalaska ili obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, kombinacije jednog ili više od FR-ova, CDR-ova, sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog lanca i lakog lanca navedenih gore, uključujući sve njih, ili sekvenci koje su im identične.
[0465] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitela ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1401, ili SEQ ID NO: 1402, ili polipeptide koji su im identični. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1421, ili SEQ ID NO: 1422, ili polipeptide koji su im identični.
[0466] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu, dve ili tri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1404; SEQ ID NO: 1406; i SEQ ID NO: 1408, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1401, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402, ili sekvence koje su im identične.
[0467] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu, dve ili tri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1424; SEQ ID NO: 1426; i SEQ ID NO: 1428, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1421, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422, ili sekvence koje su im identične.
[0468] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu, dve, tri ili četiri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1403; SEQ ID NO: 1405; SEQ ID NO: 1407; i SEQ ID NO: 1409, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1401, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402, ili sekvence koje su im identične.
[0469] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, predmetna antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu, dve, tri ili četiri polipeptidne sekvence iz SEQ ID NO: 1423; SEQ ID NO: 1425; SEQ ID NO: 1427; i SEQ ID NO: 1429, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1421 ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422, ili sekvence koje su im identične.
[0470] [0279] Ovaj pronalazak takođe razmatra anti-PACAP antitela koja uključuju jedno ili više od ovde opisanog antitela. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jedno, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećeg antitela s: varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402; varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422; regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 1404; SEQ ID NO: 1406; i SEQ ID NO: 1408) varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402; i regioni koji određuju komplementarnost (SEQ ID NO: 1424; SEQ ID NO: 1426; i SEQ ID NO: 1428) varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422, ili sekvence koje su im identične. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jedno, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećeg antitela s: varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402; varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422; okvirni regioni (SEQ ID NO: 1403; SEQ ID NO: 1405; SEQ ID NO: 1407; i SEQ ID NO: 1409) varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402; i okvirni regioni (SEQ ID NO: 1423; SEQ ID NO: 1425; SEQ ID NO: 1427; i SEQ ID NO: 1429) varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422, ili sekvence koje su im identične.
[0471] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitelo je Ab10.H5, koje obuhvata, ili se alternativno sastoji od, SEQ ID NO: 1401 i SEQ ID NO: 1421, ili SEQ ID NO: 1402 i SEQ ID NO: 1422, ili neko antitelo koje obuhvata CDR-ove iz Ab10.H5 i koje ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti navedenih ovde, ili je anti-PACAP antitelo koje se takmiči sa Ab10.H5 u vezivanju PACAP, poželjno ono koje sadrži sekvence koje su identične onima iz Ab10.H5, ili neko antitelo koje se vezuje za isti ili preklapajući epitop(e) na PACAP kao Ab10.H5.
[0472] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitela kao što je Ab10.H5 mogu se proizvesti ekspresijom u ćelijama sisara, kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, gljivični, insektski ili mikrobni sistemi, kao što su ćelije kvasaca (na primer haploidni ili diploidni kvasac, kao što je haploidni ili diploidni Pichia) i drugi sojevi kvasaca. Pogodne Pichia vrste uključuju, ali nisu ograničeni na, Pichia pastoris.
[0473] U nekom daljem načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak je dalje usmeren na polinukleotide koji kodiraju polipeptide antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP, uključujući teške i/ili lake lance iz Ab10.H5, kao i s, varijante i kombinacije jednog ili više od FR-ova, CDR-ova, sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca i sekvenci teškog lanca i lakog lanca navedenih gore, uključujući sve njih, ili sekvence koje su im identične.
[0474] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, himerna ili humanizovana antitela ili V<H>ili V<L>polipeptidi potiču ili se izvode iz jednog ili više zečjih antitela, npr., neko zečje antitelo izolovano iz klonske populacije zečjih B ćelija.
[0475] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira anti-PACAP antitelo ili kao što je ovde otkriveno. U nekim načinima ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira anti-PACAP antitelo ili kao što je ovde otkriveno.
[0476] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se takmiči u vezivanju za PACAP sa nekim ovde opisanim antitelom.
[0477] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira neko antitelo kao što je ovde otkriveno.
[0478] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku ili dijagnostičku kompoziciju koja obuhvata najmanje jedno antitelo kao što je ovde otkriveno.
[0479] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje ili prevenciju stanja povezanog sa povišenim PACAP nivoima kod subjekta, koji obuhvata davanje, subjektu kom je to potrebno, efektivne količine najmanje jednog izolovanog antitela kao što je ovde otkriveno.
[0480] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za inhibiciju vezivanja PACAP za PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R kod subjekta, koji obuhvata davanje efektivne količine najmanje jednog antitela kao što je ovde otkriveno.
[0481] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje neko antitelo koje se selektivno vezuje za PACAP, pri čemu se antitelo vezuje za PACAP sa K<D>manjim od ili jednakim 5x10<-5>M, 10<-5>M, 5x10<-6>M, 10-
[0482] <6>M, 5x10<-7>M, 10<-7>M, 5x10<-8>M, 10<-8>M, 5x10<-9>M, 10<-9>M, 5x10<-10>M, 10<-10>M, 5x10<-11>M, 10<-11>M, 5x10-
[0483] <12>M, 10<-12>M, 5x10<-13>M, ili 10<-13>M; poželjno, sa K<D>manjim od ili jednakim 5x10<-10>M, 10<-10>M, 5x10<-11>M, 10<-11>M, 5x10<-12>M, ili 10<-12>M; poželjnije, sa K<D>koji je manji od oko 100 pM, manji od oko 50 pM, manji od oko 40 pM, manji od oko 25 pM, manji od oko 1 pM, između oko 10 pM i oko 100 pM, između oko 1 pM i oko 100 pM, ili između oko 1 pM i oko 10 pM. Poželjno, anti-PACAP antitelo nema unakrsnu reaktivnost ili minimalnu unakrsnu reaktivnost sa VIP.
[0484] Inventivna antitela mogu se modifikovati posttranslaciono da bi se dodale efektorske grupe kao što su hemijski linkeri, delovi koji se mogu detektovati kao što su, na primer, fluorescentne boje, enzimi, supstrati, bioluminescentni materijali, radioaktivni materijali i hemiluminescentni delovi, ili funkcionalne grupe kao što su, na primer, streptavidin, avidin, biotin, citotoksin, citotoksični agens i radioaktivni materijali.
[0485] Antitela se mogu i hemijski modifikovati da bi se obezbedile dodatne prednosti kao što su povećana rastvorljivost, stabilnost i vreme cirkulisanja (in vivo vreme eliminacije) polipeptida, ili smanjena imunogenost (Videti U.S. Patent br.4,179,337). Hemijske grupe za derivatizaciju mogu se izabrati od polimera rastvorljivih u vodi kao što su polietilen glikol, kopolimeri etilen glikola/propilen glikola, karboksimetil celuloza, dekstran, polivinil alkohol, i slično. Antitela i mogu da se modifikuju na slučajnim položajima u molekulu, ili na prethodno određenim položajima u molekulu i mogu da uključuju jednu, dve, tri ili više vezanih hemijskih grupa.
[0486] [0293] Polimer može biti bilo koje molekulske mase, i može biti razgranat ili nerazgranat. Za polietilen glikol, poželjna molekulska masa je između oko 1 kDa i oko 100 kDa (pojam "oko" označava da će u preparatima polietilen glikola, neki molekuli imati veću masu, a neki manju masu, od naznačene molekulske mase) radi lakšeg rukovanja i proizvodnje. Mogu da se koriste i druge veličine, zavisno od željenog terapijskog profila (npr., trajanje željenog produženog oslobađanja, efekti, da li ima neki na biološku aktivnost, jednostavno rukovanje, stepen antigenosti ili nedostatak iste i drugi poznati efekti polietilen glikola na terapijski protein ili analog). Na primer, polietilen glikol može imati prosečnu molekulsku masu od oko 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 10500, 11000, 11500, 12000, 12500, 13000, 13500, 14000, 14500, 15000, 15500, 16000, 16500, 17000, 17500, 18000, 18500, 19000, 19500, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000 ili 100000 kDa. Razgranati polietilen glikoli opisani su, na primer, u U.S. Patentu br.5,643,575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides and Nucleotides, 18:2745-2750 (1999); i Caliceti et al., Bioconjug. Chem., 10:638-646 (1999).
[0487] Stručnjacima u ovoj oblasti je dostupan niz postupaka spajanja (Videti npr., EP 0401384, koji opisuje postupak spajanja PEG sa G-CSF; i Malik et al., Exp. Hematol., 20:1028-1035 (1992) (koji opisuje pegilaciju GM-CSF korišćenjem trezil hlorida)). Na primer, polietilen glikol se može kovalentno vezati aminokiselinskim ostatacima preko reaktivne grupe, kao što je, slobodna amino ili karboksilna grupa. Reaktivne grupe su one za koje se može vezati neki aktivirani molekul polietilen glikola. Aminokiselinski ostaci koji imaju slobodnu amino grupu mogu da uključuju ostatke lizina i N-terminalne aminokiselinske ostatke; oni koji imaju slobodnu karboksilnu grupu mogu da uključuju ostatke asparaginske kiseline, ostatke glutaminske kiseline i C-terminalni aminokiselinski ostatak. Sulfhidrilne grupe mogu da se koriste i kao reaktivna grupa za vezivanje molekula polietilen glikola. Poželjno u terapijske svrhe je vezivanje na amino grupi, kao što je vezivanje na N-kraju ili lizin grupi.
[0488] Kao što je prethodno predloženo, polietilen glikol može se vezati za proteine vezivanjem za bilo koji broj aminokiselinskih ostataka. Na primer, polietilen glikol se može vezati za polipeptide kovalentnim vezama za ostatke lizina, histidina, asparaginske kiseline, glutaminske kiseline ili cisteina. Može se koristiti jedna ili više reakcionih hemijskih grupa za vezivanje polietilen glikola za određene aminokiselinske ostatke (npr., lizin, histidin, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina ili cistein) ili za više od jedne vrste aminokiselinskog ostatka (npr., lizin, histidin, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, cistein i njihove kombinacije).
[0489] Alternativno, antitela mogu povećati in vivo poluživote spajanjem sa albuminom (uključujući, ali neograničavajući se na, rekombinantni humani serumski albumin ili njegove varijante (videti, npr., U.S. Patent br.5,876,969, EP 0413622, i U.S. Patent br.5,766,883)), ili druge proteine koji cirkulišu u krvi kao što je transferin ili feritin. U poželjnom načinu ostvarivanja, polipeptidi i/ili antitela ovog pronalaska (uključujući ili njihove varijante) spajaju se sa zrelim oblikom humanog serumskog albumina (tj., aminokiseline 1-585 humanog serumskog albumina kao što je prikazano na FIG.1 i 2 u EP 0322094). Polinukleotidi koji kodiraju fuzione proteine ovog pronalaska takođe su obuhvaćeni ovim pronalaskom.
[0490] Što se tiče delova koji se mogu detektovati, dalji primeri enzima uključuju, ali nisu ograničeni na, peroksidazu iz rena, acetilholinesterazu, alkalnu fosfatazu, beta-galaktozidazu i luciferazu. Dalji primeri fluorescentnih materijala uključuju, ali nisu ograničeni na, rodamin, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, umbeliferon, dihlorotriazinilamin, fikoeritrin, i dansil hlorid. Dalji primeri hemiluminescentnih delova uključuju, ali nisu ograničeni na, luminol. Dalji primeri bioluminescentnih materijala uključuju, ali nisu ograničeni na, luciferin i ekvorin. Dalji primeri radioaktivnih materijala uključuju, ali nisu ograničeni na, jod 125 (<125>I), ugljenik 14 (<14>C), sumpor 35 (<35>S), tricijum (<3>H) i fosfor 32 (<32>P).
[0491] U ovoj oblasti poznati su postupci za konjugaciju nekog antitela za detektabilni deo i slično, kao što su, na primer, oni postupci opisani od strane Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); i Nygren, J., Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982).
[0492] Ovde opisani načini ostvarivanja dalje uključuju varijante i ekvivalentne koji su suštinski homologni sa ovde navedenim antitelima, antitelom s, dijatelima, SMIP-ovima, kameltelima, nanotelima, IgNAR, polipeptidima, varijabilnim regionima i CDR-ovima. Oni mogu da sadrže, npr., mutacije iz konzervativne supstitucije, (tj., supstitucija jedne ili više aminokiselina sličnim aminokiselinama). Na primer, konzervativna supstitucija odnosi se na supstituciju neke aminokiseline sa nekom drugom u okviru iste opšte klase, npr., jedna kisela aminokiselina sa nekom drugom kiselom aminokiselinom, jedna bazna aminokiselina sa nekom drugom baznom aminokiselinom, ili jedna neutralna aminokiselina sa nekom drugom neutralnom aminokiselinom. Šta se podrazumeva pod konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom dobro je poznato u ovoj oblasti.
[0493] Postupci za određivanje homologije između sekvenci nukleinskih kiselina i aminokiselinskih sekvenci dobro su poznati prosečnim stručnjacima u ovoj oblasti.
[0494] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak dalje razmatra gorepomenute polipeptidne homologe vezivanja za antigen s, varijabilne regione i CDR-ove, ovde navedene, koji dalje imaju anti-PACAP aktivnost. Neograničavajući primeri anti-PACAP aktivnosti navedeni su ovde, npr., sposobnost inhibicije vezivanja PACAP za PAC1-R, VPAC1-R, i/ili VPAC2-R, što dovodi do smanjene proizvodnje cAMP.
[0495] [0302] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak dalje razmatra generisanje i upotrebu antitela koja vezuju bilo koju od gorepomenutih sekvenci, uključujući, ali neograničavajući se na, anti-idiotipska antitela. U nekom primernom načinu ostvarivanja, takvo anti-idiotipsko antitelo može se dati subjektu koji je primio anti-PACAP antitelo radi modulacije, smanjenja ili neutralizacije efekta anti-PACAP antitela. Takva antitela mogu biti korisna i za lečenje autoimune bolesti okarakterisane prisustvom anti-PACAP antitela. Dalji primeri upotrebe takvih antitela, npr., anti-idiotipska antitela, su za detekciju anti-PACAP antitela ovog pronalaska, na primer za praćenje nivoa anti-PACAP antitela prisutnih u krvi ili drugim telesnim tečnostima subjekata. Na primer, u jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za korišćenje anti-idiotipskog antitela za praćenje in vivo nivoa pomenutog anti-PACAP antitela kod subjekta ili za neutralizaciju pomenutog anti-PACAP antitela kod subjekta kom se daje pomenuto anti-PACAP antitelo.
[0496] Ovaj pronalazak takođe razmatra anti-PACAP antitela koja obuhvataju bilo koje od ovde opisanih polipeptidnih ili polinukleotidnih sekvenci supstituisanih bilo kojima od drugih, ovde opisanih, polinukleotidnih sekvenci. Na primer, bez ograničenja na ovo, ovaj pronalazak razmatra antitela koja obuhvataju kombinaciju bilo kojih od sekvenci varijabilnog lakog lanca i varijabilnog teškog lanca, ovde opisani, i dalje razmatra antitela koja nastaju supstitucijom bilo kojih od ovde opisanih CDR sekvenci bilo kojima od drugih ovde opisanih CDR sekvenci.
[0498] Primeri polinukleotida koji kodiraju polipeptide anti-PACAP antitela
[0500] Ovaj pronalazak je dalje usmeren na polinukleotide koji kodiraju polipeptide antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP.
[0502] Antitelo Ab10.H
[0504] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak je dalje usmeren na polinukleotide koji kodiraju polipeptide antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polinukleotidne sekvence iz SEQ ID NO: 971 koja kodira sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO: 961 i koja se sastoji od kodirajuće sekvence varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 972 i kodirajuće sekvence konstantnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 980.
[0505] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, sledeće polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 962:
[0507]
[0510] [0307] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, sledeću polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu konstantnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 970:
[0512]
[0515] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polinukleotidnu sekvencu iz SEQ ID NO: 991 koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO: 981 i koja se sastoji od kodirajuće sekvence varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 992 i kodirajuće sekvence konstantnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1000.
[0516] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, sledeću polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 982:
[0518]
[0521] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, sledeću polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu konstantnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 990:
[0523]
[0526] [0311] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju vezivanje antigena koji imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu ili više polinukleotidnih sekvenci iz SEQ ID NO: 974; SEQ ID NO: 976; i SEQ ID NO: 978, koje odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju CDR-ove (hipervarijabilni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 961, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 962, i/ili jednu ili više polinukleotidnih sekvenci iz SEQ ID NO: 994; SEQ ID NO: 996; i SEQ ID NO: 998, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 981, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 982, ili kombinacije ovih polinukleotidnih sekvenci. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju antitela ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, kombinacije polinukleotida koji kodiraju jedan ili više od CDR-ova, sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog lanca i lakog lanca, prethodno navedenih, uključujući sve njih.
[0527] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju vezivanje antigena koji imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu ili više polinukleotidnih sekvenci iz SEQ ID NO: 973; SEQ ID NO: 975; SEQ ID NO: 977; i SEQ ID NO: 979, koje odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju FR-ove (konstantni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 961, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 962, i/ili jednu ili više polinukleotidnih sekvenci iz SEQ ID NO: 993; SEQ ID NO: 995; SEQ ID NO: 997; i SEQ ID NO: 999, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 981, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 982, ili kombinacije ovih polinukleotidnih sekvenci. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju antitela ovog pronalaska ili obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, kombinacije jednog ili više od FR-ova, sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog lanca i lakog lanca, prethodno navedenih, uključujući sve njih.
[0528] Ovaj pronalazak takođe razmatra polinukleotidne sekvence koje uključuju jednu ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju vezivanje antigena, ovde opisano. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju vezivanje antigena koji imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jedan, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju vezivanje antigena s: polinukleotid SEQ ID NO: 971 koji kodira sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO: 961; polinukleotid SEQ ID NO: 972 koji kodira sekvencu varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 962; polinukleotid SEQ ID NO: 991 koji kodira sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO: 981; polinukleotid SEQ ID NO: 992 koji kodira sekvencu varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 982; polinukleotidi koji kodiraju CDR-ove (SEQ ID NO: 974; SEQ ID NO: 976; i SEQ ID NO: 978) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 961, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 962; polinukleotidi koji kodiraju CDR-ove (SEQ ID NO: 994; SEQ ID NO: 996; i SEQ ID NO: 998) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 981, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 982; polinukleotidi koji kodiraju FR-ove (SEQ ID NO: 973; SEQ ID NO: 975; SEQ ID NO: 977; i SEQ ID NO: 979) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 961, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 962; i polinukleotidi koji kodiraju FR-ove (SEQ ID NO: 993; SEQ ID NO: 995; SEQ ID NO: 997; i SEQ ID NO: 999) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 981, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 982.
[0529] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polinukleotida koji kodiraju Fab koje ima specifičnost vezivanja za PACAP. Što se tiče antitela Ab10.H, polinukleotidi koji kodiraju Ab10.H antitelo pune dužine obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polinukleotid SEQ ID NO: 971 koji kodira sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO: 961, i polinukleotid SEQ ID NO: 991 koji kodira sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO: 981.
[0530] Neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska razmatra ove polinukleotide inkorporirane u ekspresioni vektor za ekspresiju u ćelijama sisara kao što su CHO, NSO ili HEK-293 ćelije, ili u gljivičnim, insektskim ili mikrobnim sistemima kao što su ćelije kvasaca kao što je kvasac Pichia. Pogodne Pichia vrste uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris. U jednom načinu ostvarivanja ovde opisanog pronalaska, Fab se može proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab10.H nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitela, kao što je Ab10.H ili Fab , se mogu proizvesti ekspresijom Ab10.H polinukleotida u ćelijama sisara kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, gljivičnim, insektskim ili mikrobnim sistemima kao što su ćelije kvasaca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasaca. Pogodne Pichia vrste uključuju, ali nisu ograničene na, Pichia pastoris.
[0532] Antitelo Ab10.H2
[0534] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak je dalje usmeren na polinukleotide koji kodiraju polipeptide antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polinukleotidnu sekvencu iz SEQ ID NO: 1291 koja kodira sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO: 1281 i koja se sastoji od kodirajuće sekvence varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1292 i kodirajuće sekvence konstantnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1300.
[0535] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, sledeću polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282:
[0537]
[0540] [0318] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, sledeću polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu konstantnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1290:
[0542]
[0545] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polinukleotidnu sekvencu iz SEQ ID NO: 1311 koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO: 1301 i koja se sastoji od kodirajuće sekvence varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1312 i kodirajuće sekvence konstantnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1320.
[0546] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, sledeću polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1302:
[0548]
[0551] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, sledeću polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu konstantnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1310:
[0553]
[0556] [0322] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju vezivanje antigena koji imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu ili više polinukleotidnih sekvenci iz SEQ ID NO: 1294; SEQ ID NO: 1296; i SEQ ID NO: 1298, koje odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju CDR-ove (hipervarijabilni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1281, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282, i/ili jednu ili više polinukleotidnih sekvenci iz SEQ ID NO: 1314; SEQ ID NO: 1316; i SEQ ID NO: 1318, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1301, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1302, ili kombinacije ovih polinukleotidnih sekvenci. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju antitela ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, kombinacije polinukleotida koji kodiraju jedan ili više od CDR-ova, sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog lanca i lakog lanca, prethodno navedenih, uključujući sve njih.
[0557] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju vezivanje antigena koji imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu ili više polinukleotidnih sekvenci iz SEQ ID NO: 1293; SEQ ID NO: 1295; SEQ ID NO: 1297; i SEQ ID NO: 1299, koje odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju FR-ove (konstantni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1281, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282, i/ili jednu ili više polinukleotidnih sekvenci iz SEQ ID NO: 1313; SEQ ID NO: 1315; SEQ ID NO: 1317; i SEQ ID NO: 1319, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1301, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1302, ili kombinacije ovih polinukleotidnih sekvenci. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju antitela ovog pronalaska ili obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, kombinacije jednog ili više od FR-ova, sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog lanca i lakog lanca, prethodno navedenih, uključujući sve njih.
[0558] Ovaj pronalazak takođe razmatra polinukleotidne sekvence koje uključuju jednu ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju vezivanje antigena, ovde opisano. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju vezivanje antigena koji imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jedan, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju vezivanje antigena s: polinukleotid SEQ ID NO: 1291 koji kodira sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO: 1281; polinukleotid SEQ ID NO: 1292 koji kodira sekvencu varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282; polinukleotid SEQ ID NO: 1311 koji kodira sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO: 1301; polinukleotid SEQ ID NO: 1312 koji kodira sekvencu varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1302; polinukleotidi koji kodiraju CDR-ove (SEQ ID NO: 1294; SEQ ID NO: 1296; i SEQ ID NO: 1298) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1281, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282; polinukleotidi koji kodiraju CDR-ove (SEQ ID NO: 1314; SEQ ID NO: 1316; i SEQ ID NO: 1318) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1301, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1302; polinukleotidi koji kodiraju FR-ove (SEQ ID NO: 1293; SEQ ID NO: 1295; SEQ ID NO: 1297; i SEQ ID NO: 1299) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1281, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282; i polinukleotidi koji kodiraju FR-ove (SEQ ID NO: 1313; SEQ ID NO: 1315; SEQ ID NO: 1317; i SEQ ID NO: 1319) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1301, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1302.
[0559] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polinukleotide koji kodiraju Fab koje ima specifičnost vezivanja za PACAP. Što se tiče antitela Ab10.H2, polinukleotidi koji kodiraju Ab10.H2 antitelo pune dužine obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polinukleotid SEQ ID NO: 1291 koji kodira sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO: 1281, i polinukleotid SEQ ID NO: 1311 koji kodira sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO: 1301.
[0560] Neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska razmatra ove polinukleotide inkorporirane u ekspresioni vektor za ekspresiju u ćelijama sisara kao što su CHO, NSO ili HEK-293 ćelije, ili u gljivičnim, insektskim ili mikrobnim sistemima kao što su ćelije kvasaca kao što je kvasac Pichia. Pogodne Pichia vrste uključuju, ali nisu ograničeni na, Pichia pastoris. U jednom načinu ostvarivanja ovde opisanog pronalaska, Fab se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab10.H2 nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitela, kao što je Ab10.H2 ili Fab, se mogu proizvesti ekspresijom Ab10.H2 polinukleotida u ćelijama sisara kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, gljivičnim, insektskim ili mikrobnim sistemima kao što su ćelije kvasaca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasaca.
[0561] Pogodne Pichia vrste uključuju, ali nisu ograničeni na, Pichia pastoris.
[0563] Antitelo Ab10.H3
[0565] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak je dalje usmeren na polinukleotide koji kodiraju polipeptide antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polinukleotidnu sekvencu iz SEQ ID NO: 1331 koja kodira sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO: 1321 i koja se sastoji od kodirajuće sekvence varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1332 i kodirajuće sekvence konstantnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1340.
[0566] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, sledeću polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322:
[0568]
[0571] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, sledeću polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu konstantnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1330:
[0572]
[0575] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polinukleotidnu sekvencu iz SEQ ID NO: 1351 koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO: 1341 i koja se sastoji od kodirajuće sekvence varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1352 i kodirajuće sekvence konstantnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1360.
[0576] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, sledeću polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342:
[0578]
[0581] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, sledeću polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu konstantnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1350:
[0583]
[0586] [0333] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju vezivanje antigena koji imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu ili više polinukleotidnih sekvenci iz SEQ ID NO: 1334; SEQ ID NO: 1336; i SEQ ID NO: 1338, koje odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju CDR-ove (hipervarijabilni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1321, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322, i/ili jednu ili više polinukleotidnih sekvenci iz SEQ ID NO: 1354; SEQ ID NO: 1356; i SEQ ID NO: 1358, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1341, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342, ili kombinacije ovih polinukleotidnih sekvenci. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju antitela ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, kombinacije polinukleotida koji kodiraju jedan ili više od CDR-ova, sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog lanca i lakog lanca, prethodno navedenih, uključujući sve njih.
[0587] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju vezivanje antigena koji imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu ili više polinukleotidnih sekvenci iz SEQ ID NO: 1333; SEQ ID NO: 1335; SEQ ID NO: 1337; i SEQ ID NO: 1339, koje odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju FR-ove (konstantni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1321, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322, i/ili jednu ili više polinukleotidnih sekvenci iz SEQ ID NO: 1353; SEQ ID NO: 1355; SEQ ID NO: 1357; i SEQ ID NO: 1359, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1341, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342, ili kombinacije ovih polinukleotidnih sekvenci. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju antitela ovog pronalaska ili obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, kombinacije jednog ili više od FR-ova, sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog lanca i lakog lanca, prethodno navedenih, uključujući sve njih.
[0588] Ovaj pronalazak takođe razmatra polinukleotidne sekvence koje uključuju jednu ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju vezivanje antigena, ovde opisano. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju vezivanje antigena koji imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jedan, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju vezivanje antigena s: polinukleotid SEQ ID NO: 1331 koji kodira sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO: 1321; polinukleotid SEQ ID NO: 1332 koji kodira sekvencu varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322; polinukleotid SEQ ID NO: 1351 koji kodira sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO: 1341; polinukleotid SEQ ID NO: 1352 koji kodira sekvencu varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342; polinukleotidi koji kodiraju CDR-ove (SEQ ID NO: 1334; SEQ ID NO: 1336; i SEQ ID NO: 1338) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1321, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322; polinukleotidi koji kodiraju CDR-ove (SEQ ID NO: 1354; SEQ ID NO: 1356; i SEQ ID NO: 1358) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1341, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342; polinukleotidi koji kodiraju FR-ove (SEQ ID NO: 1333; SEQ ID NO: 1335; SEQ ID NO: 1337; i SEQ ID NO: 1339) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1321, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322; i polinukleotidi koji kodiraju FR-ove (SEQ ID NO: 1353; SEQ ID NO: 1355; SEQ ID NO: 1357; i SEQ ID NO: 1359) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1341, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342.
[0589] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polinukleotide koji kodiraju Fab koje ima specifičnost vezivanja za PACAP. Što se tiče antitela Ab10.H3, polinukleotidi koji kodiraju Ab10.H3 antitelo pune dužine obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polinukleotid SEQ ID NO: 1331 koji kodira sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO: 1321, i polinukleotid SEQ ID NO: 1351 koji kodira sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO: 1341.
[0590] Neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska razmatra ove polinukleotide inkorporirane u ekspresioni vektor za ekspresiju u ćelijama sisara kao što su CHO, NSO ili HEK-293 ćelije, ili u gljivičnim, insektskim ili mikrobnim sistemima kao što su ćelije kvasaca kao što je kvasac Pichia. Pogodne Pichia vrste uključuju, ali nisu ograničeni na, Pichia pastoris. U jednom načinu ostvarivanja ovde opisanog pronalaska, Fab se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab10.H3 nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitela, kao što je Ab10.H3 ili Fab, se mogu proizvesti ekspresijom Ab10.H3 polinukleotida u ćelijama sisara kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, gljivičnim, insektskim ili mikrobnim sistemima kao što su ćelije kvasaca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasaca.
[0591] Pogodne Pichia vrste uključuju, ali nisu ograničeni na, Pichia pastoris.
[0593] Antitelo Ab10.H5
[0595] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak je dalje usmeren na polinukleotide koji kodiraju polipeptide antitela koja imaju specifičnost vezivanja za PACAP. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polinukleotidnu sekvencu iz SEQ ID NO: 1411 koja kodira sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO: 1401 i koja se sastoji od kodirajuće sekvence varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1412 i kodirajuće sekvence konstantnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1420.
[0596] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, sledeću polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402:
[0598]
[0601] [0340] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, sledeću polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu konstantnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1410:
[0603]
[0606] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polinukleotidnu sekvencu iz SEQ ID NO: 1431 koja kodira polipeptidnu sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO: 1421 i koja se sastoji od kodirajuće sekvence varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1432 i kodirajuće sekvence konstantnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1440.
[0607] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, sledeću polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422:
[0609]
[0612] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, sledeću polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu konstantnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1430:
[0614]
[0617] [0344] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju vezivanje antigena koji imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu ili više polinukleotidnih sekvenci iz SEQ ID NO: 1414; SEQ ID NO: 1416; i SEQ ID NO: 1418, koje odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju CDR-ove (hipervarijabilni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1401, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402, i/ili jednu ili više polinukleotidnih sekvenci iz SEQ ID NO: 1434; SEQ ID NO: 1436; i SEQ ID NO: 1438, koje odgovaraju CDR-ovima (hipervarijabilni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1421, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422, ili kombinacije ovih polinukleotidnih sekvenci. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju antitela ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, kombinacije polinukleotida koji kodiraju jedan ili više od CDR-ova, sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog lanca i lakog lanca, prethodno navedenih, uključujući sve njih.
[0618] U nekom daljem načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju vezivanje antigena koji imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jednu ili više polinukleotidnih sekvenci iz SEQ ID NO: 1413; SEQ ID NO: 1415; SEQ ID NO: 1417; i SEQ ID NO: 1419, koje odgovaraju polinukleotidima koji kodiraju FR-ove (konstantni regioni) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1401, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402, i/ili jednu ili više polinukleotidnih sekvenci iz SEQ ID NO: 1433; SEQ ID NO: 1435; SEQ ID NO: 1437; i SEQ ID NO: 1439, koje odgovaraju FR-ovima (konstantni regioni) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1421, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422, ili kombinacije ovih polinukleotidnih sekvenci. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju antitela ovog pronalaska ili obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, kombinacije jednog ili više od FR-ova, sekvenci varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca, i sekvenci teškog lanca i lakog lanca, prethodno navedenih, uključujući sve njih.
[0619] Ovaj pronalazak takođe razmatra polinukleotidne sekvence koje uključuju jednu ili više polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju vezivanje antigena, ovde opisano. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju vezivanje antigena koji imaju specifičnost vezivanja za PACAP obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, jedan, dva, tri ili više, uključujući sve od sledećih polinukleotida koji kodiraju vezivanje antigena s: polinukleotid SEQ ID NO: 1411 koji kodira sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO: 1401; polinukleotid SEQ ID NO: 1412 koji kodira sekvencu varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402; polinukleotid SEQ ID NO: 1431 koji kodira sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO: 1421; polinukleotid SEQ ID NO: 1432 koji kodira sekvencu varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422; polinukleotidi koji kodiraju CDR-ove (SEQ ID NO: 1414; SEQ ID NO: 1416; i SEQ ID NO: 1418) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1401, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402; polinukleotidi koji kodiraju CDR-ove (SEQ ID NO: 1434; SEQ ID NO: 1436; i SEQ ID NO: 1438) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1421, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422; polinukleotidi koji kodiraju FR-ove (SEQ ID NO: 1413; SEQ ID NO: 1415; SEQ ID NO: 1417; i SEQ ID NO: 1419) sekvence teškog lanca iz SEQ ID NO: 1401, ili sekvence varijabilnog teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402; i polinukleotidi koji kodiraju FR-ove (SEQ ID NO: 1433; SEQ ID NO: 1435; SEQ ID NO: 1437; i SEQ ID NO: 1439) sekvence lakog lanca iz SEQ ID NO: 1421, ili sekvence varijabilnog lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422.
[0620] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polinukleotide koji kodiraju Fab koje ima specifičnost vezivanja za PACAP. Što se tiče antitela Ab10.H5, polinukleotidi koji kodiraju Ab10.H5 antitelo pune dužine obuhvataju, ili se alternativno sastoje od, polinukleotid SEQ ID NO: 1411 koji kodira sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO: 1401, i polinukleotid SEQ ID NO: 1431 koji kodira sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO: 1421.
[0621] Neki drugi način ostvarivanja ovog pronalaska razmatra ove polinukleotide inkorporirane u ekspresioni vektor za ekspresiju u ćelijama sisara kao što su CHO, NSO ili HEK-293 ćelije, ili u gljivičnim, insektskim ili mikrobnim sistemima kao što su ćelije kvasaca kao što je kvasac Pichia. Pogodne Pichia vrste uključuju, ali nisu ograničeni na, Pichia pastoris. U jednom načinu ostvarivanja ovde opisanog pronalaska, Fab se mogu proizvesti enzimskom digestijom (npr., papain) Ab10.H5 nakon ekspresije polinukleotida pune dužine u pogodnom domaćinu. U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitela, kao što je Ab10.H5 ili Fab , se mogu proizvesti ekspresijom Ab10.H5 polinukleotida u ćelijama sisara kao što su CHO, NSO ili HEK 293 ćelije, gljivičnim, insektskim ili mikrobnim sistemima kao što su ćelije kvasaca (na primer diploidni kvasac kao što je diploidna Pichia) i drugi sojevi kvasaca. Pogodne Pichia vrste uključuju, ali nisu ograničeni na, Pichia pastoris.
[0623] Skrining i izolovanje B-ćelija
[0625] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak razmatra pripremu i izolovanje klonalnu populaciju antigen-specifičnih B-ćelija koje se mogu koristiti za izolovanje najmanje jedne PACAP antigen-specifične ćelije, koja se može koristiti za proizvodnju monoklonalnog antitela protiv PACAP, koje je specifično prema željenom PACAP antigenu, ili sekvence nukleinske kiseline koja odgovara takvom antitelu. Postupci za pripremu i izolovanje pomenute klonalne populacije antigen-specifičnih B-ćelija razmatrani su, na primer, u U.S. Objavi patenta br.2007/0269868 od Carvalho-Jensen et al.. Postupci za pripremu i izolovanje pomenute klonalne populacije antigen-specifičnih B-ćelija razmatrani su i ovde u primerima. Postupci za "obogaćivanje" ćelijske populacije po veličini ili gustini poznati su u ovoj oblasti (videti, npr., U.S. Patent br.5,627,052). Ove faze se mogu koristiti pored obogaćivanja ćelijske populacije za specifičnost prema antigenu.
[0627] Postupci za humanizovanje antitela
[0629] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak razmatra postupke za humanizovanje teškog i lakog lanca antitela. Postupci za humanizovanje teškog i lakog lanca antitela koji se mogu primeniti na anti-PACAP antitela razmatrani su, na primer, u U.S. Objavi patenta br.2009/0022659 od Olson et al, i u U.S. Patentu br.7,935,340 od Garcia-Martinez et al.,.
[0630] Postupci za proizvodnju antitela i
[0632] U drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak razmatra postupke za proizvodnju anti-PACAP antitela i . Postupci za proizvodnju anti-PACAP antitela i izlučenih iz poliploidnih, poželjno diploidnih ili tetraploidnih sojeva kvasca kompetentnog za parenje razmatrani su, na primer, u U.S. Objavi patenta br.
[0633] 2009/0022659 od Olson et al., i u U.S. Patentu br.7,935,340 od Garcia-Martinez et al.,.
[0634] Ostali postupci za proizvodnju antitela dobro su poznati prosečnim stručnjacima u ovoj oblasti. Na primer, postupci za proizvodnju himernih antitela dobro su poznati u ovoj oblasti (videti, na primer, U.S. Patent br.4,816,567 od Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:8651-55, 1984; Neuberger et al., Nature, 314:268-270, 1985; i Boulianne et al., Nature, 312:643-46, 1984).
[0635] Slično tome, ostali postupci za proizvodnju humanizovanih antitela dobro su poznati u ovoj oblasti (videti, na primer, U.S. Patente br.5,530,101, 5,585,089, 5,693,762, i 6,180,370 od Queen et al; U.S. Patente br.5,225,539 i 6,548,640 od Winter; U.S. Patente br.6,054,297, 6,407,213 i 6,639,055 od Carter et al; U.S. Patent br.6,632,927 od Adair; Jones, P.T. et al., Nature, 321:522-525
[0636] (1986); Reichmann, L. et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen, M. et al., Science, 239:1534-36 (1988).
[0637] Polipeptidi antitela ovog pronalaska koji imaju specifičnost vezivanja PACAP mogu se proizvesti i konstruisanjem, korišćenjem uobičajenih tehnika koje su dobro poznate prosečnim stručnjacima u ovoj oblasti, ekspresionog vektora koji sadrži neki promotor (opciono kao komponenta eukariotskog ili prokariotskog operona) i DNK sekvencu koja kodira teški lanac antitela u kojem je DNK sekvenca koja kodira CDR-ove potrebne za specifičnost antitela izvedena iz izvora nehumanih ćelija, poželjno iz izvora zečjih B-ćelija, dok je DNK sekvenca koja kodira preostale delove lanca antitela izvedena iz izvora humanih ćelija.
[0638] Drugi ekspresioni vektor proizvodi se korišćenjem istih uobičajenih sredstava koji su dobro poznati prosečnim stručnjacima u ovoj oblasti, pri čemu pomenuti ekspresioni vektor sadrži neki promotor (opciono kao komponentu eukariotskog ili prokariotskog operona) i DNK sekvencu koja kodira laki lanac antitela u kojem je DNK sekvenca koja kodira CDR-ove potrebne za specifičnost antitela izvedena iz izvora nehumanih ćelija, poželjno iz izvora zečjih B-ćelija, dok je DNK sekvenca koja kodira preostale delove lanca antitela izvedena iz izvora humanih ćelija.
[0639] Ekspresioni vektori transfektuju se u ćeliju domaćina uobičajenim tehnikama, koje su dobro poznate prosečnim stručnjacima u ovoj oblasti za proizvodnju transfektovane ćelije domaćina, pri čemu pomenuta transfektovana ćelija domaćina kultivisana uobičajenim tehnikama koje su dobro poznate prosečnim stručnjacima u ovoj oblasti za proizvodnju polipeptida pomenutih antitela.
[0640] [0357] Ćelija domaćina može da se kotransfektuje sa dva, prethodno opisana ekspresionina vektora, pri čemu prvi ekspresioni vektor sadrži DNK koja kodira promotor (opciono kao komponentu eukariotskog ili prokariotskog operona) i polipeptid izveden iz lakog lanca dok drugi vektor sadrži DNK koja kodira promotor (opciono kao komponentu eukariotskog ili prokariotskog operona) i polipeptid izveden iz teškog lanca. Dva vektora sadrže različite selektivne markere, ali poželjno postižu suštinski istu ekspresiju polipeptida teškog i lakog lanca. Alternativno se može koristiti pojedinačni vektor, pri čemu taj vektor uključuje DNK koja kodira i polipeptide teškog lanca i polipeptide lakog lanca. Kodirajuće sekvence za teški i laki lanac mogu da obuhvataju cDNK, genomsku DNK, ili obe.
[0641] Ćelije domaćina korišćene za ekspresiju polipeptida antitela može biti ili bakterijska ćelija kao što je E. coli, ili eukariotska ćelija kao što je P. pastoris. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, može da se koristi ćelija sisara dobro definisanog tipa za ovu svrhu, kao što je ćelija mijeloma, CHO ćelijska linija, NSO ćelijska linija, ili HEK293 ćelijska linija.
[0642] Opšti postupci pomoću kojih se vektori mogu konstruisati, postupci za transfekciju potrebni za proizvodnju ćelije domaćina i postupci za kultivisanje potrebni za proizvodnju polipeptida antitela iz pomenutih ćelija domaćina uključuju uobičajene tehnike. Iako je poželjno da ćelijska linija korišćena za proizvodnju antitela bude ćelijska linija sisara, alternativno se može koristiti bilo koja druga pogodna ćelijska linija, kao što je bakterijska ćelija linija kao što je bakterijski soj izveden iz E. coli, ili ćelijska linija kvasca.
[0643] Slično tome, kada se proizvedu polipeptidi antitela mogu se prečistiti prema standardnim procedurama u ovoj oblasti, kao što je, na primer, unakrsnom filtracijom, taloženje amonijum sulfata, afinitetna kolonska hromatografija, hidrofobna interakciona hromatografija ("HIC"), i slično.
[0644] Polipeptidi antitela, ovde opisana, mogu da se koriste i za dizajn i sintezu ili peptidnih ili nepeptidnih mimetika koji bi bili korisni za iste terapijske primene kao polipeptidi antitela ovog pronalaska. (videti, na primer, Saragobi et al., Science, 253:792-795, 1991).
[0646] Skrining testovi
[0648] Ovde opisani skrining testovi dizajnirani su za identifikovanje visoko afinitetnih anti-PACAP Ab koji mogu biti korisni u lečenju bolesti i poremećaja povezanih sa PACAP kod subjekata koji imaju simptome bolesti ili poremećaja povezanog sa PACAP.
[0649] U nekim načinima ostvarivanja, antitelo se koristi kao dijagnostički alat. Antitelo se može koristiti da bi se ispitala količina PACAP prisutna u uzorku i/ili subjektu. Kao što će stručnjak u ovoj oblasti ceniti, ta antitela ne moraju biti neutrališuća antitela. U nekim načinima ostvarivanja, dijagnostičko antitelo nije neutrališuće antitelo. U nekim načinima ostvarivanja, dijagnostičko antitelo vezuje se za različiti epitop u odnosu na onaj za koji se vezuje neutrališuće antitelo. U nekim načinima ostvarivanja, dva antitela se ne takmiče međusobno.
[0650] U nekim načinima ostvarivanja, ovde opisana antitela koriste se ili obezbeđuju u kompletu za ispitivanje i/ili postupku za detekciju PACAP u tkivima ili ćelijama sisara radi skrininga/dijagnoze neke bolesti ili poremećaja povezanog sa promenama nivoa PACAP. Komplet obuhvata neko antitelo koje vezuje PACAP i sredstva za indikaciju vezivanja antitela sa PACAP, ako je prisutan, i opciono PACAP proteinske nivoe. Različita sredstva za indikaciju prisustva nekog antitela mogu da se koriste. Na primer, fluorofori, druge molekularne sonde, ili enzimi mogu se vezati za antitelo i prisustvo antitela može se primetiti na razne načine. Postupak za skrining za takve poremećaje može da uključuje upotrebu kompleta, ili jednostavno upotrebu jednog od opisanih antitela i određivanje da li se to antitelo vezuje za PACAP u uzorku. Kao što će stručnjak u ovoj oblasti ceniti, visoki ili povišeni nivoi PACAP dovešće do većih količina antitela koje se vezuje za PACAP u uzorku. Tako, stepen vezivanja antitela može da se koristi za određivanje koliko je PACAP u uzorku. Subjekti ili uzorci sa količinom PACAP koja je veća od unapred određene količine (npr., količina ili opseg koji bi osoba bez PACAP-povezanog poremećaja trebalo da ima) mogu se okarakterisati kao oni sa PACAP-posredovanim poremećajem, npr., migrena, glavobolja, bol ili neko drugo stanje.
[0651] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje komplet za detektovanje vezivanja anti-PACAP antitela ovog pronalaska za PACAP. Posebno, komplet se može koristiti za detektovanje prisustva PACAP specifično reaktivnog sa anti-PACAP antitelom ovog pronalaska ili imunoreaktivnog sa njim. Komplet može da uključuje i neko antitelo vezano za neki supstrat, sekundarno antitelo reaktivno sa antigenom i reagens za detektovanje reakcije sekundarnog antitela sa antigenom. Takav komplet može biti ELISA komplet i može da obuhvata supstrat, primarna i sekundarna antitela po potrebi, i bilo koje druge potrebne reagense kao što su delovi koji se mogu detektovati, supstrati enzima i reagensi za obojenje, na primer kao što su ovde opisani. Dijagnostički komplet može biti i u obliku imunoblot kompleta. Dijagnostički komplet može biti i u obliku hemiluminescentnog kompleta (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). Dijagnostički komplet može biti i komplet za detekciju na bazi lantanida (PerkinElmer, San Jose, CA).
[0652] Iskusni kliničar razume da biološki uzorak uključuje, ali nije ograničen na, serume, plazmu, urin, pljuvačku, sluz, pleuralnu tečnost, sinovijalnu tečnost i spinalnu tečnost.
[0654] Postupci za ublažavanje ili smanjenje simptoma, ili lečenje, ili prevenciju, bolesti i poremećaja povezanih sa PACAP
[0656] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, ovde opisana anti-PACAP antitela, , korisna su za ublažavanje ili smanjenje simptoma, ili lečenje, ili prevenciju, bolesti i poremećaja povezanih sa PACAP. Anti-PACAP antitela, ovde opisana, kao i kombinacije, mogu se dati i u terapijski efektivnoj količini pacijentima kojima je potrebno lečenje bolesti i poremećaja povezanih sa PACAP u obliku farmaceutske kompozicije kao što je detaljnije opisano u nastavku.
[0657] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, ovde opisana anti-PACAP antitela korisna su (ili sama ili u kombinaciji sa nekim drugim agensom) za ublažavanje ili smanjenje simptoma, ili lečenje, ili prevenciju bolesti ili stanja povezanog sa PACAP.
[0658] [0369] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, ovde opisana anti-PACAP antitela, sa ili bez nekog drugog agensa, korisna su za ublažavanje ili smanjenje simptoma, ili lečenje, ili prevenciju, sledećeg neograničavajućeg spiska bolesti i poremećaja: migrena (sa ili bez aure), hemiplegične migrene, klaster glavobolje, migrenozna neuralgija, hronične glavobolje, tenzione glavobolje, opšte glavobolje, valunzi, fotofobija, hronična paroksizmalna hemikranija, sekundarne glavobolje zbog osnovnog strukturnog problema u glavi ili vratu, kranijalna neuralgija, sinusne glavobolje (npr., glavobolja povezana sa sinusitisom), glavobolje ili migrene izazvane alergijom, bol, hronični bol, neuroinflamatorni ili inflamatorni bol, bol nakon operativnog reza, postoperativni bol, bol povezan sa traumom, bol u očima, zubobolja, kompleksni regionalni bolni sindrom, bol zbog raka (npr., bol zbog primarnog ili metastatskog raka kostiju), bol zbog preloma, bol zbog preloma kod osteoporoze, bol nastao usled opekotina, bol u zglobovima kod gihta, bol povezan sa krizom srpastih ćelija, bol povezan sa temporomandibularnim poremećajima, ciroza, hepatitis, neurogeni bol, neuropatski bol, nociceptivni bol, visceralni bol, trigeminalna neuralgija, postherpetična neuralgija, fantomski bol u ekstremitetima, fibromijalgija, menstrualni bolovi, ovarijalgija, refleksna simpatička distrofija, osteoartritis ili bol zbog reumatoidnog artritisa, bol u donjem delu leđa, dijabetesna neuropatija, išijas, dispepsija, sindrom iritabilnog creva, inflamatorna bolest creva, Kronova bolest, ileitis, ulcerativni kolitis, bubrežne kolike, dismenoreja, cistitis, intersticijalni cistitis, menstrualni period, porođaj, menopauza, pankreatitis, šizofrenija, depresija, posttraumatski stresni poremećaj, anksiozni poremećaji, dijabetes, autoimuni dijabetes, endotelna disfunkcija, ishemija, Rejnoov sindrom, koronarna bolest srca ("CHD"), koronarna arterijska bolest ("CAD"), srčana insuficijencija, periferna arterijska bolest ("PAD"), plućna hipertenzija ("PH"), poremećaji vezivnog tkiva, moždani udar, Sjogrenov sindrom, multipla skleroza, bronhijalna hiperreaktivnost, astma, bronhitis, bronhodilatacija, emfizem, hronična opstruktivna bolest pluća ("COPD"), inflamatorni dermatitis, adenokarcinom u tkivu žlezda, blastom u embrionalnom tkivu organa, karcinom u epitelnom tkivu, leukemija u tkivima koja formiraju krvne ćelije, limfom u limfnom tkivu, mijelom u koštanoj srži, sarkom u vezivnom ili potpornom tkivu, rak nadbubrežne žlezde, limfom povezan sa AIDS-om, anemija, rak bešike, rak kostiju, rak mozga, rak dojke, karcinoidni tumori, rak grlića materice, hemioterapija, rak debelog creva, citopenija, rak endometrijuma, rak jednjaka, rak želuca, rak glave, rak vrata, hepatobilijarni rak, rak bubrega, leukemija, rak jetre, rak pluća, limfom, Hočkinova bolest, ne-Hočkinova, tumori nervnog sistema, rak usne duplje, rak jajnika, rak pankreasa, rak prostate, rak rektuma, rak kože, rak želuca, rak testisa, rak štitne žlezde, rak uretre, rak koštane srži, multipli mijelom, tumori koji metastaziraju u kost, tumori koji infiltriraju u nerv i šuplji organ, tumori u blizini nervnih struktura, akne vulgaris, atopijski dermatitis, urtikarija, keloidi, hipertrofični ožiljci i rozacea, alergijski dermatitis, psorijaza, pruritus, neurogeno crvenilo kože, eritem, gubitak mase, anoreksija, sarkoidoza, šok, sepsa, sindrom apstinencije od opijata, tolerancija na morfin, epilepsija, poremećaji donjeg urinarnog trakta ("LUT") kao što su infekcija urinarnog trakta, abnormalno mokrenje, hitna potreba za mokrenjem, nokturija, urinarna inkontinencija, preaktivna bešika i za prevenciju ili ublažavanje bola povezanog sa tim LUT stanjima. Poželjno, ovde opisana predmetna anti-PACAP antitela i vezivanje za antigen korisni su za ublažavanje ili smanjenje simptoma, lečenje, ili prevenciju migrena, glavobolja i bolesti ili stanja povezanog sa bolom.
[0659] Određenije, predmetna anti-PACAP antitela i vezivanje za antigen mogu biti korisna i za ublažavanje ili smanjenje simptoma, lečenje, ili prevenciju fotofobije, koja se javlja sa glavoboljom i/ili migrenom kao i koja se javlja nezavisno od glavobolje i/ili migrene.
[0660] Kod ljudi s migrenom obično se razvija pogoršanje bola i simptomi migrene kada se izlože svetlosti, fenomen poznat kao fotofobija. Fotofobija je takođe česta kod očnih poremećaja, kao što su iritis i uveitis, i intrakranijalnih poremećaja kao što je meningitis. U klasičnom vizuelnom putu, svetlost aktivira štapiće i kupe u mrežnjači, koje aktiviraju ganglijske ćelije mrežnjače koje se projektuju preko optičkog nerva do lateralnog genikularnog jezgra, gornjeg kolikulusa, a zatim i vizuelnog korteksa. Ovaj put uključuje podatke koji formiraju i one koji ne formiraju sliku. Novi put (informacije koje ne formiraju sliku) omogućava održavanje normalnih cirkadijalnih ritmova preko suprahijazmatičnog jezgra i regulisan je intrinzično fotosenzitivnim ganglijskim ćelijama mrežnjače (ipRGC). Ove ipRGC su nezavisne od štapića i kupa i sadrže melanopsin, fotopigment.
[0661] Noseda, R. et al., Nat. Neurosci., 13:239-245 (2010) proučavali su slepe osobe koje su imale migrenu i povezali su ove nalaze sa modelima pacova koji uključuju praćenje projekcija ipRGC do područja u percepciji bola iz dure. Od slepih pacijenata sa migrenom, 6 nije imalo percepciju svetlosti zbog teškog oštećenja optičkog nerva ili bilateralne enukleacije. Ovi subjekti su imali abnormalne obrasce spavanja i slabe reakcije zenica na svetlost. Njihove migrene se nisu pogoršavale izlaganjem svetlosti. Nasuprot tome, 14 slepih subjekata koji su bili u stanju da detektuju svetlost uprkos minimalnoj percepciji slika imali su normalne obrasce spavanja i normalan svetlosni refleks zenica.
[0662] Uprkos široko rasprostranjenoj degeneraciji štapića i čepića, ovi pacijenti su imali pogoršanje simptoma migrene sa izlaganjem svetlosti tokom napada migrene, što ukazuje na to da su ipRGC, a ne štapići i čepići, važni kod fotofobije.
[0663] [0373] Ove retinalne projekcije moždanih područja koja ne formiraju sliku projektuju se u kontralateralni dorzokaudalni region zadnjeg talamusa, što je pokazano anterogradnim praćenjem kod pacova. ipRGC unos u ovo područje modulira neurone bola osetljive na duru, koji se takođe projektuju u ovaj region. Talamički neuroni, dvostruko osetljivi na bol u duri i svetlosni ulaz, projektuju se široko u više kortikalnih regiona, uključujući primarni somatosenzorni korteks, primarni i sekundarni motorni korteks, parijetalni asocijacioni korteks i primarni i sekundarni vizuelni korteks. Ove kortikalne projekcije mogu pomoći u objašnjenju drugih uobičajenih simptoma migrene, pored fotofobije, kao što su motorna slabost ili nekoordinacija, poremećaji vida i loša koncentracija.
[0664] Fotofobija takođe prati druga ređa, ali podjednako invalidizirajuća stanja, kao što su klaster glavobolja i druge trigeminalne autonomne cefalalgije i blefarospazam. Mehanizmi koji leže u osnovi fotofobije uključuju trigeminalni sistem. Fotofobija kod slepih pacijenata ukazuje na doprinose iz nevizuelnog puta. Pored toga, trigeminalne autonomne cefalalgije, ređa grupa primarnih glavobolja, karakteriše se jednostranim bolom posredovanim trigeminalnim nervom, često povezanim sa ipsilateralnom fotofobijom.
[0665] Uobičajeni uzroci fotofobije uključuju migrenozne glavobolje, katarakte ili teške oftalmološke bolesti kao što su uveitis ili abrazija rožnjače. Opširniji spisak poremećaja povezanih sa fotofobijom uključuje uzroke povezane s očima kao što su ahromatopsija, aniridija, antiholinergički lekovi mogu izazvati fotofobiju paralizom mišića sfinktera irisa, afakija (odsustvo sočiva oka), buftalmos (abnormalno uzak ugao između rožnjače i irisa), katarakte, konusna distrofija, kongenitalne abnormalnosti oka, virusni konjunktivitis ("ružičasto oko"), abrazija rožnjače, distrofija rožnjače, čir na rožnjači, poremećaj epitela rožnjače, kao što je onaj izazvan od strane stranog tela rožnjače ili keratitis, ektopija sočiva, endoftalmitis, trauma oka izazvana bolešću, povredom ili infekcijom kao što je halazion, episkleritis, glaukom, keratokonus, ili hipoplazija očnog živca, hidroftalmos, ili kongenitalni glaukom iritis, optički neuritis, sindrom disperzije pigmenta, širenje zenica (prirodno ili hemijski izazvano), odvajanje mrežnjače, ožiljavanje rožnjače ili sklera i uveitis.
[0666] Pored toga, fotofobija ima uzroke povezane s nervnim sistemom ili neurološke uzroke uključujući: poremećaji autističnog spektra, Kiarijeva malformacija, disleksija, encefalitis uključujući mijalgični encefalomijelitis aka sindrom hroničnog umora, meningitis, subarahnoidno krvarenje, tumor zadnje kranijalne jame, kao i druge uzroke kao što su ankilozni spondilitis, albinizam, ariboflavinoza, benzodiazepini (dugotrajna upotreba ili odvikavanje od benzodiazepina), hemioterapija, čikungunja, cistinoza, Ehlers-Danlos sindrom, mamurluk, grip, infektivna mononukleoza, nedostatak magnezijuma, trovanje živom, migrena, besnilo, i tirozinemija tipa II, takođe poznata kao "Richner-Hanhart sindrom".
[0667] Pored toga, poznato je da je fotofobija povišena u depresiji, bipolarnom poremećaju i agorafobiji.
[0668] Predmetna anti-PACAP antitela i ovde opisano vezivanje za antigen može biti efektivno za lečenje ili prevenciju fotofobije u bilo kojem od ovih stanja, poželjno, kod subjekta sa posttraumatskim stresnim poremećajem ("PTSD") ili kod subjekta sa traumatskom povredom mozga.
[0669] Glavobolje se mogu klasifikovati prema uzroku, kao što je objašnjeno u nastavku.
[0670] Primarne glavobolje. Uzroci primarne glavobolje su problemi sa ili prekomerna aktivnost struktura osetljivih na boli u glavi. Generalna, primarna glavobolja smatra se da je simptom neke osnovne bolesti. Umesto toga, hemijska aktivnost u mozgu, nervi ili krvni sudovi glave izvan lobanje, ili mišići glave i vrata, ili neka kombinacija ovih faktora, može da ima ulogu kod primarnih glavobolja. Neki ljudi mogu da nose gene koji ih čine sklonijim razvoju takvih glavobolja. Primeri uobičajenih primarnih glavobolja uključuju, ali nisu ograničeni na, klaster glavobolju; tenzionu glavobolju (ili glavobolja tipa tenzije); i trigeminalna autonomna cefalalgija ("TAC"), uključujući paroksizmalna hemikranija. Postoje drugi obrasci glavobolje koji se mogu smatrati tipovima primarne glavobolje, npr., hronične dnevne glavobolje, glavobolje pri kašljanju, glavobolje pri treniranju i glavobolje pri seksu. Ove glavobolje su manje uobičajene i imaju posebne karakteristike, kao što je neobično trajanje ili bol povezan sa određenom aktivnošću. Iako su ove glavobolje uopšteno smatrane primarnim, svaka od njih može biti neki simptom osnovne bolesti. Pored toga, neke primarne glavobolje mogu biti izazvane faktorima načina života, uključujući: alkohol; određenu hranu (npr., prerađeno meso koje sadrži nitrate); promene kod spavanja ili nedostatak sna; loše držanje; preskakanje obroka; i stres.
[0671] Sekundarne glavobolje. Sekundarna glavobolja je simptom bolesti koja može da aktivira nerve glave osetljive na bol. Bilo koji broj stanja, koji može značajno varirati po težini, može izazvati sekundarne glavobolje. Primeri izvora sekundarnih glavobolja uključuju, ali nisu ograničeni na, akutni sinusitis; akutni sinusitis; arterijske rupture (karotidne ili vertebralne disekcije); vensku trombozu u mozgu; aneurizmu mozga; arteriovensku malformaciju mozga; trovanje ugljen-monoksidom; Kiarijevu malformaciju; potres mozga; dehidraciju; probleme sa zubima; infekciju uha (srednjeg uha); encefalitis; gigantocelularni arteritis; glaukom; mamurluke; grip (grip); intrakranijalni hematom; lekove za lečenje drugih poremećaja; meningitis; mononatrijum glutamat ("MSG"); prekomernu upotrebu lekova protiv bolova; napade panike; postkomocijski sindrom; pritisak od uskog pokrivala za glavu, npr. kacige ili zaštitnih naočara; pseudotumor cerebri; toksoplazmozu; i trigeminalnu neuralgiju. Specifične vrste sekundarnih glavobolja uključuju, ali nisu ograničeni na, glavobolje spoljašnje kompresije (posledica pokrivala za glavu koje izaziva pritisak); glavobolje od sladoleda (obično nazvane "zamrzavanje mozga"); povratne glavobolje (uzrokovane prekomernom upotrebom lekova protiv bolova); sinusne glavobolje (uzrokovane upalom i zagušenjem u sinusnim šupljinama); kičmene glavobolje (uzrokovane niskim nivoom cerebrospinalne tečnosti, moguće posledica traume, kičmene punkcije ili spinalne anestezije); i glavobolje tipa udara groma (grupa poremećaja koja uključuje iznenadne, jake glavobolje).
[0672] Na primer, neograničavajuće bolesti i poremećaji povezani sa bolom koji se mogu lečiti i/ili sprečiti davanjem anti-PACAP antitela ovog pronalaska uključuju bol koji nastaje usled bilo kog stanja povezanog sa neurogenim, neuropatskim, inflamatornim ili nociceptivnim bolom. Poželjno je da poremećaj povezan sa bolom bude povezan sa povećanim PACAP-om na mestu bola.
[0673] U određenim načinima ostvarivanja, poremećaj povezan s bolom koji se leči je bol zbog raka koji nastaje usled maligniteta ili raka izabranog od jednog ili više od: adenokarcinoma u tkivu žlezda, blastoma u embrionalnom tkivu organa, karcinoma u epitelnom tkivu, leukemije u tkivima koja formiraju krvne ćelije, limfoma u limfnom tkivu, mijeloma u koštanoj srži, sarkoma u vezivnom ili potpornom tkivu, raka nadbubrežne žlezde, limfoma povezanog sa AIDS-om, anemije, raka bešike, raka kostiju, raka mozga, raka dojke, karcinoidnih tumora, raka grlića materice, hemioterapije, raka debelog creva, citopenije, raka endometrijuma, rak jednjaka, rak želuca, rak glave, rak vrata, hepatobilijarni rak, rak bubrega, leukemija, rak jetre, raka pluća, limfoma, Hočkinove bolesti, ne-Hočkinove bolesti, tumora nervnog sistema, raka usne duplje, raka jajnika, raka pankreasa, raka prostate, raka rektuma, raka kože, raka želuca, raka testisa, raka štitne žlezde, raka uretre, raka koštane srži, multipli mijeloma, tumora koji metastaziraju u kost, tumora koji infiltriraju u nerv i šuplji organ, tumora u blizini nervnih struktura. Dalje poželjno, bol zbog raka obuhvata visceralni bol, poželjno visceralni bol koji nastaje usled raka pankreasa i/ili metastaza u stomaku. Dalje poželjno, bol zbog raka obuhvata somatski bol, poželjno somatski bol usled jednog ili više od metastaza u kostima, postoperativnog bola, sarkoma raka vezivnog tkiva, raka koštanog tkiva, raka krvotvornih ćelija koštane srži, multipli mijeloma, leukemije, primarnog ili sekundarnog raka kostiju.
[0674] U drugim načinima ostvarivanja, stanje povezano sa bolom koje se leči povezano je sa neuropatskim bolom i uključuje, na primer, trigeminalnu neuralgiju, postherpetičnu neuralgiju, fantomski bol u ekstremitetima, fibromijalgiju i refleksnu simpatičku distrofiju, koje se poželjno leče.
[0675] [0385] Dalji primeri bolesti ili stanja povezanih sa bolom uključuju, ali nisu ograničeni na, opšti bol, hronični bol, inflamatorni bol, bol nakon operativnog reza, postoperativni bol, bol povezan sa traumom, bol u donjem delu leđa, bol u očima, zubobolju, kompleksni regionalni bolni sindrom, bol zbog raka (npr., bol zbog primarnog ili metastatskog raka kostiju), bol zbog preloma, bol zbog preloma kod osteoporoze, bol nastao usled opekotina, bol u zglobovima kod gihta, bol povezan sa krizom srpastih ćelija, bol povezan sa temporomandibularnim poremećajima, cirozu, hepatitis, neurogeni bol, neuropatski bol, nociceptivni bol, visceralni bol, trigeminalnu neuralgiju, postherpetičnu neuralgiju, fantomski bol u ekstremitetima, fibromijalgiju, menstrualne bolove, ovarijalgiju, refleksnu simpatičku distrofiju, osteoartritis ili bol zbog reumatoidnog artritisa, bol u donjem delu leđa, dijabetesnu neuropatiju, išijas, dispepsiju, sindrom iritabilnog creva, inflamatornu bolest creva, Kronovu bolest, ileitis, ulcerativni kolitis, bubrežne kolike, dismenoreju, cistitis, intersticijalni cistitis, menstrualni period, porođaj, menopauzu, pankreatitis, šizofreniju, depresiju, posttraumatski stresni poremećaj, anksiozne poremećaje, dijabetes, autoimuni dijabetes, endotelnu disfunkciju, ishemiju, Rejnoov sindrom, koronarnu bolest srca ("CHD"), koronarnu arterijsku bolest ("CAD"), srčanu insuficijenciju, perifernu arterijsku bolest ("PAD"), plućnu hipertenziju ("PH"), poremećaje vezivnog tkiva, moždani udar, Sjogrenov sindrom, multipla sklerozu, preaktivnu bešiku, bronhijalnu hiperreaktivnost, astmu, bronhitis, bronhodilataciju, emfizem, hroničnu opstruktivnu bolest pluća ("COPD"), inflamatorni dermatitis, akne vulgaris, atopijski dermatitis, urtikariju, keloide, hipertrofične ožiljke i rozaceu, alergijski dermatitis, psorijazu, puritus, neurogeno crvenilo kože, eritem, sarkoidozu, šok, sepsu i sindrom apstinencije od opijata.
[0676] Tako, ovaj pronalazak uključuje postupke za lečenje, prevenciju i/ili ublažavanje bilo koje bolesti ili poremećaja povezanog sa PACAP aktivnošću ili pojačanom regulacijom PACAP-a (uključujući bilo koje od gorepomenutih primera bolesti, poremećaja i stanja povezanih sa bolom) upotrebom antitela i vezivanja za antigen ovog pronalaska.
[0677] Takođe, predmetna anti-PACAP antitela i vezivanje za antigen može da se koristi samo ili u vezi sa drugim aktivnim agensima, npr., opioidi i neopioidni analgetici kao što su NSAIL da izazove analgeziju ili da pojača efikasnost drugog analgetika.
[0678] Predmetna antitela potencijano se mogu kombinovati sa bilo kojim opioidnim analgetikom ili NSAIL ili nekim drugim analgetikom, potencijalno drugim antitelom ili drugim biološkim agensom kao što je, npr., anti-NGF ili anti-CGRP ili anti-CGRP-R antitelo ili antitelo ili NGF, CGRP ili CGRP-R polipeptid ili konjugat, kako bi se povećalo ili poboljšalo upravljanje bolom. Ovo može omogućiti da se takva analgetička jedinjenja primenjuju duže vreme ili u smanjenim dozama, čime se potencijalno ublažavaju neželjeni efekti povezani sa njima.
[0679] Od posebnog interesa je zajedničko davanje predmetnih anti-PACAP antitela i antitela sa anti-CGRP antitelom (npr., ALD403) ili anti-CGRP-R antitelom ili antitelom i, osim toga, upotreba predmetnih anti-PACAP antitela i antitela za lečenje subjekata koji su prethodno primili anti-CGRP ili anti-CGRP-R antitelo ili antitelo . Na primer, prethodno lečeni subjekat (koji je prethodno primio najmanje jedno anti-CGRP ili anti-CGRP-R antitelo ili davanje antitela) može biti čovek s migrenom koji nije adekvatno reagovao na lečenje anti-CGRP ili anti-CGRP-R antitelom ("pacijent s lošim odgovorom") i/ili kod kojeg je došlo do imunološkog odgovora na anti-CGRP ili anti-CGRP-R antitelo ili antitelo .
[0680] Slično tome, zajedničko davanje predmetnih anti-PACAP antitela i vezivanja za antigen sa BOTOX<®>(Botulinum toksin) je takođe od posebnog interesa, npr., kod lečenja čoveka s migrenom. U nekim primerima, čovek s migrenom može da nema adekvatni odgovor na prethodna lečenja ("pacijent s lošim odgovorom") i/ili se može kod njega javiti imunološki odgovor na prethodno lečenje.
[0681] U nekim načinima ostvarivanja, aspirin i/ili acetaminofen može se uzeti zajedno sa predmetnim anti-PACAP antitelom . Aspirin je druga vrsta nesteroidnog antiinflamatornog jedinjenja.
[0682] [0392] Subjekat kojem se daje farmaceutska formulacija može biti, npr., bilo koji čovek ili nehumana životinja kojoj je potrebno takvo lečenje, prevencija i/ili ublažavanje, ili koji bi inače imali koristi od inhibicije ili slabljenja PACAP-posredovane aktivnosti. Na primer, subjekat može biti neki pojedinac kojem je dijagnostikovana, ili za koga se smatra da je u riziku da oboli od bilo koje od gorepomenutih bolesti ili poremećaja. Ovaj pronalazak dalje uključuje upotrebu bilo koje od ovde opisanih farmaceutskih formulacija u proizvodnji leka za lečenje, prevenciju i/ili ublažavanje bilo koje bolesti ili poremećaja povezanog sa PACAP aktivnošću (uključujući bilo koji od gorepomenutih primera bolesti, poremećaja i stanja).
[0684] Davanje
[0686] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, ovde opisana anti-PACAP antitela, ili vezivanje PACAP , kao i kombinacije pomenutih antitela, daju se subjektu u koncentraciji od između 0.1 mg/ml i oko bilo koliko od 0.5, 1, 5, 10, 1520, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ili 200 mg/ml, /-10% greške.
[0687] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, anti-PACAP antitela i ovde opisano daju se subjektu u dozi od između oko 0.01 i 100.0 ili 200.0 mg/kg telesne mase primaoca. U određenim načinima ostvarivanja, zavisno od vrste i težine bolesti povezane sa PACAP-om, oko 1 µg/kg do 50 mg/kg (npr., 0.1-20 mg/kg) antitela je inicijalna kandidatna doza za davanje pacijentu, bilo, na primer, putem jednog ili u više odvojenih davanja, ili kontinuiranom infuzijom. U drugom načinu ostvarivanja, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr., 0.1 mg/kg-10 mg/kg) antitela je inicijalna kandidatna doza za davanje pacijentu. Uobičajena dnevna doza može biti u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, zavisno od nekoliko faktora, npr., određeni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, način davanja, raspored davanja, i drugi faktori poznati lekarima. Međutim, drugi režimi doziranja mogu biti korisni.
[0688] Na primer, pored ovde opisanih relativnih doza (mg/kg), predmetna anti-PACAP antitela mogu se dati subjektu u nekoj apsolutnoj dozi (mg). Prema tome, u jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, ovde opisana anti-PACAP antitela daju se subjektu u dozi od između oko 1 mikrograma i oko 1000 miligrama bez obzira na način davanja.
[0689] U poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, ovde opisana anti-PACAP antitela, ili anti-PACAP antigensko vezivanje, kao i kombinacije pomenutih antitela, daju se primaocu sa učestalošću od jedanput na svakih dvadeset šest nedelja ili kraće, kao što je jedanput na svakih šesnaest nedelja ili kraće, jedanput na svakih osam nedelja ili kraće, jedanput na svake četiri nedelje ili kraće, jedanput na svake dve nedelje ili kraće, jedanput svake nedelje ili kraće, ili jednom dnevno ili kraće.
[0690] [0397] Prema poželjnim načinima ostvarivanja, antitelo koje sadrži lek ili farmaceutska kompozicija periferno se daje subjektu načinom izabranim od jednog ili više od: oralno, sublingvalno, bukalno, topikalno, rektalno, inhalacijom, transdermalno, potkožno, intravenski, intraarterijski ili intramuskularno, intrakardijalnim davanjem, intraosealno, intradermalno, intraperitonealno, transmukozno, vaginalno, intravitrealno, epikutano, intraartikularno, periartikularno ili lokalno.
[0691] Fab se može davati na svake dve nedelje ili kraće, svake nedelje ili kraće, jednom dnevno ili kraće, više puta dnevno, i/ili na svakih nekoliko sati. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, pacijent prima Fab od 0.1 mg/kg do 40 mg/kg dnevno u podeljenim dozama od 1 do 6 puta dnevno, ili u obliku kontinuirane perfuzije, efikasan za postizanje željenih rezultata.
[0692] Podrazumeva se da koncentracija antitela ili Fab koje se daje određenom pacijentu može biti veća ili manja od gorepomenutih primera koncentracija za davanje.
[0693] Stručnjak u ovoj oblasti moći će da odredi efektivnu dozu i učestalost davanja kroz rutinsko eksperimentisanje, na primer vođeno ovde navedenim otkrivanjem i učenjima u, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Brunton, L.L. et al. editors, 11th edition, New York, New York: McGraw-Hill (2006); Howland, R. D. et al., Pharmacology, Volume 864, Lippincott's illustrated reviews., Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins (2006); i Golan, D. E., Principles of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy, Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins (2007).
[0694] U drugom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, ovde opisana anti-PACAP antitela, ili vezivanje PACAP , kao i kombinacije pomenutih antitela, daju se subjektu u farmaceutskoj formulaciji. U poželjnom načinu ostvarivanja, subjekat je čovek.
[0695] "Farmaceutska kompozicija" ili "lek" odnosi se na hemijsku ili biološku kompoziciju pogodnu za davanje subjektu, poželjno sisar, poželjnije čovek. Takve kompozicije mogu se konkretno formulisati za davanje na jedan ili više načina, uključujući, ali neograničavajući se na, bukalno, epikutano, epiduralno, inhalacijom, intraarterijsko, intrakardijalno, intracerebroventrikularno, intradermalno, intramuskularno, intranazalno, intraokularno, intraperitonealno, intraspinalno, intratekalno, intravenski, oralno, parenteralno, rektalno putem klistira ili supozitorija, potkožno, subdermalno, sublingvalno, transdermalno i transmukozalno. Pored toga, davanje se može izvesti putem injekcije, praha, tečnosti, gela, kapi, ili nekim drugim sredstvom davanja.
[0696] [0403] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, ovde opisana anti-PACAP antitela, ili vezivanje PACAP , kao i kombinacije pomenutih antitela, mogu se opciono dati u kombinaciji sa jednim ili više aktivnih agenasa. Takvi aktivni agensi uključuju analgetik, anti-histamin, antipiretik, antiinflamatorno sredstvo, antibiotik, antivirusne i anticitokinske agense. Aktivni agensi uključuju agoniste, antagoniste, i modulatore TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-α, IFN-γ, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, faktora rasta hepatocita ("HGF"), hepcidina, NGF, CGRP uključujući antitela reaktivna protiv bilo kojeg od gorepomenutih, i antitela reaktivna protiv bilo kojeg od njihovih receptora. Aktivni agensi takođe uključuju, ali nisu ograničeni na, 2-arilpropionske kiseline, aceklofenak, acemetacin, acetilsalicilnu kiselinu (aspirin), alklofenak, alminoprofen, amoksiprin, ampiron, arilalkanske kiseline, azapropazon, benorilat/benorilat, benoksaprofen, bromfenak, karprofen, celekoksib, holin magnezijum salicilat, klofezon, COX-2 inhibitore, deksibuprofen, deksketoprofen, diklofenak, diflunisal, droksikam, etenzamid, etodolak, etorikoksib, faislamin, fenaminske kiseline, fenbufen, fenoprofen, flufenaminsku kiselinu, flunoksaprofen, flurbiprofen, ibuprofen, ibuproksam, indometacin, indoprofen, kebuzon, ketoprofen, ketorolak, lornoksikam, loksoprofen, lumirakoksib, magnezijum salicilat, meklofenaminsku kiselinu, mefenaminsku kiselinu, meloksikam, metamizol, metil salicilat, mofebutazon, nabumeton, naproksen, N-arilantranilinske kiseline, NGF, oksametacin, oksaprozin, oksikame, oksifenbutazon, oksitocin, parekoksib, fenazon, fenilbutazon, fenilbutazon, piroksikam, pirprofen, profene, proglumetacin, derivate pirazolidina, rofekoksib, salicil salicilat, salicilamid, salicilate, supstancu P, sulfinpirazon, sulindak, suprofen, tenoksikam, tiaprofensku kiselinu, tolfenaminsku kiselinu, tolmetin, i valdekoksib. Na primer, odabrana anti-PACAP antitela, ili PACAP-vezivanje , kao i kombinacije ovih antitela s, mogu se opciono dati u kombinaciji sa oksitocinom, na primer daju se u nazalnoj formulaciji, za intranazalnu isporuku.
[0697] Anti-histamin može biti bilo koje jedinjenje koje se protivi akciji histamina ili njegovom oslobađaju iz ćelija (npr., mast ćelije). Anti-histamini uključuju, ali nisu ograničeni na akrivastin, astemizol, azatadin, azelastin, betatastin, bromfeniramin, buklizin, cetirizin, analoge cetirizina, hlorfeniramin, klemastin, CS 560, ciproheptadin, desloratadin, dekshlorfeniramin, ebastin, epinastin, feksofenadin, HSR 609, hidroksizin, levokabastin, loratadin, metskopolamin, mizolastin, norastemizol, fenindamin, prometazin, pirilamin, terfenadin i tranilast.
[0698] [0405] Antibiotici uključuju, ali nisu ograničeni na amikacin, aminoglikozide, amoksicilin, ampicilin, ansamicine, arsfenamin, azitromicin, azlocilin, aztreonam, bacitracin, karbacefem, karbapeneme, karbenicilin, cefaklor, cefadroksil, cefaleksin, cefalotin, cefalotin, cefamandol, cefazolin, cefdinir, cefditoren, cefepim, cefiksim, cefoperazon, cefotaksim, cefoksitin, cefpodoksim, cefprozil, ceftazidim, ceftibuten, ceftizoksim, ceftobiprol, ceftriakson, cefuroksim, cefalosporine, hloramfenikol, cilastatin, ciprofloksacin, klaritromicin, klindamicin, kloksacilin, colistin, ko-trimoksazol, dalfopristin, demeklociklin, dicloxacilin, diritromicin, doripenem, doksiciklin, enoksacin, ertapenem, eritromicin, etambutol, flukloksacilin, fosfomicin, furazolidon, fusidinska kiselina, gatifloksacin, geldanamicin, gentamicin, glikopeptide, herbimicin, imipenem, izoniazid, kanamicin, levofloksacin, linkomicin, linezolid, lomefloksacin, lorakarbef, makrolide, mafenid, meropenem, meticilin, metronidazol, mezlocilin, minociklin, monobaktame, moksifloksacin, mupirocin, nafcilin, neomicin, netilmicin, nitrofurantoin, norfloksacin, ofloksacin, oksacilin, oksitetraciklin, paromomicin, penicilin, peniciline, piperacilin, platensimicin, polimiksin B, polipeptide, prontozil, pirazinamid, kvinolone, kvinupristin, rifampicin, rifampin, roksitromicin, spektinomicin, streptomicin, sulfacetamid, sulfametizol, sulfanilamid, sulfasalazin, sulfizoksazol, sulfonamide, teikoplanin, telitromicin, tetraciklin, tetracikline, tikarcilin, tinidazol, tobramicin, trimetoprim, trimetoprim-sulfametoksazol, troleandomicin, trovafloksacin i vankomicin.
[0699] Aktivni agensi takođe uključuju aldosteron, beklometazon, betametazon, kortikosteroide, kortizol, kortizon acetat, deoksikortikosteron acetat, deksametazon, fludrokortizon acetat, glukokortikoide, hidrokortizon, metilprednizolon, prednizolon, prednizon, steroide i triamcinolon. Takođe se podrazumeva bilo koja pogodna kombinacija ovih aktivnih agenasa.
[0700] "Farmaceutsko pomoćno sredstvo" ili "farmaceutski prihvatljivo pomoćno sredstvo" je neki nosač, obično tečnost, u kojem je aktivni terapijski agens formulisan. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, aktivni terapijski agens je ovde opisano humanizovano antitelo, ili jedno ili više njih.
[0701] Pomoćno sredstvo generalno ne obezbeđuje bilo koju farmakološku aktivnost u formulaciji, mada može obezbediti hemijsku i/ili biološku stabilnost, i karakteristike oslobađanja. Primeri formulacija mogu se naći, na primer, u Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, A. editor, 19th edition, Philadelphia, PA: Williams and Wilkins (1995).
[0702] Kao što se ovde koristi "farmaceutski prihvatljivi nosač" ili "pomoćno sredstvo" uključuje bilo koji i sve razblaživače, disperziona sredstva, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične i agense za odlaganje apsorpcije koji su fiziološki kompatabilni. U jednom načinu ostvarivanja, nosač je pogodan za parenteralno davanje. Alternativno, nosač može biti pogodan za intravensko, intraperitonealno, intramuskularno ili sublingvalno davanje. Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za improvizovanu pripremu sterilnih injektibilnih rastvora ili disperzija. Upotreba tih sredstava i agenasa za farmaceutski aktivne supstance dobro je poznata u ovoj oblasti. Osim ako je bilo koji konvencionalno sredstvo ili agens nekompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njegova upotreba u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska. Dodatna aktivna jedinjenja se takođe mogu uključiti u kompozicije.
[0703] Farmaceutske kompozicije obično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Ovaj pronalazak predviđa da je farmaceutska kompozicija prisutna u liofilizovanom obliku. Kompozicija može da se formuliše kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili druga naručena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosal može biti rastvarač ili disperziono sredstvo koje sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol), i njihove pogodne mešavine. Ovaj pronalazak dalje razmatra uključivanje stabilizatora u farmaceutsku kompoziciju. Odgovarajuća fluidnost može se održati, na primer, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata.
[0704] [0410] U mnogim slučajevima, poželjno je da se uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi kao što su manitol i sorbitol, ili natrijum hlorid u kompoziciju. Apsorpcija injektibilnih kompozicija može se produžiti uključivanjem agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, soli monostearata i želatin. Osim toga, alkalni polipeptid može se formulisati u formulaciji sa produženim oslobađanjem, na primer, u kompoziciji koja uključuje polimer za sporo oslobađanje. Aktivna jedinjenja mogu se pripremiti sa nosačima koji će štititi jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante i mikroenkapsulirane sisteme za isporuku. Biorazgradivi, biokompatabilni polimeri mogu da se koriste, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, polimlečna kiselina, kopolimeri polimlečne i poliglikolne kiseline ("PLG"). Mnogi postupci za pripremu tih formulacija poznati su stručnjacima u ovoj oblasti.
[0705] Za svaki od pomenutih načina ostvarivanja, jedinjenja se mogu dati u različitim doznim oblicima. Podrazumeva se bilo koji biološki prihvatljiv dozni oblik poznat prosečnim stručnjacima u ovoj oblasti, i njihove kombinacije. Primeri tih doznih oblika uključuju, bez ograničenja, rekonstitutivne praškove, eliksire, tečnosti, rastvore, suspenzije, emulzije, praškove, granule, čestice, mikročestice, disperzibilne granule, tablete, inhalante, aerosol inhalante, flastere, inhalante čestica, implante, depo implante, injekcije (uključujući subkutane, intramuskularne, intravenske i intradermalne), infuzije i njihove kombinacije.
[0706] Određena učenja koja se odnose na postupke za dobijanje klonalne populacije antigenspecifičnih B-ćelija opisane su u U.S. Objavi patenta br.2013/0316353.
[0707] Određena učenja koja se odnose na humanizaciju monoklonalnih antitela dobijenih od zečeva i modifikaciju poželjnih sekvenci radi održavanja afiniteta vezivanja antigena otkrivena su u Međunarodnoj objavi br. WO 2008/144757, sa nazivom Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies, podnetoj 21. maja, 2008.
[0708] Određena učenja koja se odnose na proizvodnju antitela ili upotrebu kvasca kompetentnog za parenje i odgovarajuće postupke, opisana su u U.S. Objavi patenta br. US2006/0270045.
[0709] Određena učenja koja se odnose na proizvodnju antitela ili u Pichia i poželjne postupke za dobijanje i prečišćavanje antitela, takođe su opisana u U.S. Objavama patenata br.2014/0288272; 2014/0287952; 2013/0055888; i 2012/0277408.
[0710] Određena učenja koja se odnose na proizvodnju antitela ili i CHO ćelijama i primere postupaka za dobijanje i prečišćavanje antitela, takođe su opisana u U.S. Patentima i Objavama br.7,932,087;
[0711] 2009/0285795; 9,090,672; i 2010/0221781.
[0713] PRIMERI
[0715] Primer 1: Priprema antitela koja selektivno vezuju PACAP
[0716] Korišćenjem protokola za izbor antitela suštinski kako je ovde opisan, proizvedeni su panel antitela specifičnih prema PACAP38 i PACAP27, i panel antitela specifičnih prema PACAP38 samo.
[0718] Strategija imunizacije
[0720] Zečevi su imunizovani sa PACAP38 (American Peptide, Vista, CA) (SEQ ID NO: 1241). Peptidi su pripremljeni za imunizaciju kao što sledi.0.15 ml zapremine 10 mg/ml keyhole limpet hemocijanina ("KLH") rastvorenog u Dulbekovom fosfatom puferisanom slanom rastvoru ("DPBS") obogaćenog 1M NaCl kombinovano je sa 1.0 ml 1 mg/ml peptida (rastvoren u dejonizovanoj vodi). Zatim je 1.0 ml 40 mM karbodiimida dodato pre 12-časovne inkubacije na sobnoj temperaturi uz lagano mešanje. Višak karbodiimida i nekonjugovanog peptida uklonjeno je dijalizom do DPBS pre sterilne filtracije. Sledeći nekonjugovani peptid jednak početnoj masi KLH-a dodat je pre pripreme za injekciju u zečeve.
[0721] Alternativno, jednake mase sterilnog KLH i peptida umešane su bez hemije karbodiimida.
[0722] Imunizacije su izvedene razblaživanjem 200 µg antigena do 0.5 ml sa DPBS i umešavanjem sa jednakom zapreminom kompletnog Freund-ovog adjuvansa za potkožnu 1 ml injekciju Dana 1.
[0723] Buster injekcije od 100 µg izvedene su sa nekompletnim Freund-ovim adjuvansom na Dane 21 i 42.
[0725] Procena funkcionalnog titra odabira antitela
[0727] Da bi se identifikovala antitela koja neutrališu PACAP38 (SEQ ID NO: 1241) indukovanu signalizaciju preko PAC1-R, rastvori poliklonalnih antitela su najpre prečišćeni pomoću Proteina A i dijalizovani u neutralni pufer. Ukratko, rastvori antitela su inkubirani sa PACAP38 (SEQ ID NO: 1241) u 4x krajnjoj koncentraciji (100 pM) tokom 1 h. Dok su kompleksi antitelo/antigen inkubirani, PAC1-R eksprimirajuće PC-12 ćelije (Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank) su isprane i resuspendovane pri 2x10<6>ćelija po ml u podlogama za ćelijsku kulturu. Ćelije (10 µl) i kompleks antitelo/antigen (40 µl) preneti su na ploču za homogenu vremensku rezidualnu fluorescenciju ("HTRF") i mućkani na sobnoj temperaturi tokom 30 min. Nakon inkubacije dodato je 20 µl (1:20 razblaženog) Eu<3+>kriptat-obeleženog mAb anti-cAMP i 20 µl (1:20 razblaženog) d2-obeleženog cAMP u puferu za lizu, i ploča je inkubirana tokom 1 h uz mućkanje. Nakon inkubacije, ploče su očitane (ekscitacija 330 nm, emisija 620/665 nm), i određen je odnos 620:665 signala.
[0729] Sakupljanje tkiva
[0731] Kada se ustanove prihvatljivi titri, zec(zečevi) se žrtvuje(u). Slezina, limfni čvorovi i cela krv se sakupljaju i obrađuju kao što sledi:
[0732] Slezina i limfni čvorovi obrađuju se u suspenziju pojedinačnih ćelija disocijacijom tkiva i propuštanjem kroz sterilnu žičanu mrežu na 70 µm (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) pomoću klipa šprica od 20 cc. Ćelije su prikupljene u fosfatom puferisanom slanom rastvoru ("PBS"). Ćelije su zatim isprane dvaput centrifugiranjem. Nakon poslednjeg ispiranja, gustina ćelija je određena pomoću tripan plavog. Ćelije su centrifugirane sa 1500 O/MIN za 10 minuta; supernatant je zatim odbačen. Ćelije su resuspendovane u odgovarajućoj zapremini 10% dimetil sulfoksida ("DMSO", Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) u fetalnom goveđem serumu ("FBS" HYCLONE<™>, GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA) i odmerene u 1 ml/bočici. Bočice su čuvane na - 70°C u komori sa sporim zamrzavanjem tokom 24 sata i čuvane u tečnom azotu.
[0733] Mononuklearne ćelije periferne krvi ("PBMC") izolovane su mešanjem cele krvi sa jednakim delovima PBS.35 ml mešavine cele krvi pažljivo je naneto u slojevima na 8 ml LYMPHOLYTE<®>Rabbit (Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontario) u konusnu epruvetu od 45 ml (Corning, Corning, NY) i centrifugirano tokom 30 minuta sa 2500 O/MIN na sobnoj temperaturi bez pauza. Nakon centrifugiranja, PBMC slojevi su pažljivo uklonjeni korišćenjem staklene Pasterove pipete (VWR International, Radnor, PA), kombinovani i smešteni u čistu bočicu od 50 ml. Ćelije su isprane dvaput sa PBS centrifugiranjem sa 1500 O/MIN za 10 minuta na sobnoj temperaturi, i gustina ćelija je određena bojenjem tripan plavim. Nakon poslednjeg ispiranja, ćelije su resuspendovane u odgovarajućoj zapremini 10% DMSO/FBS podloge i zamrznute kao što je prethodno opisano.
[0735] Izbor B-ćelija, obogaćivanje i uslovi za kulturu
[0737] Na dan postavljanja B-ćelijske kulture, bočice sa PBMC, splenocitima ili limfnim čvorovima odmrznute su radi upotrebe. Bočice su uklonjene iz rezervoara sa tečnim azotom i smeštene u vodeno kupatilo na 37°C do odmrzavanja. Sadržaj bočica je prebačen u konusnu epruvetu za centrigugiranje od 15 ml (Corning, Inc., Corning, NY) i 10 ml modifikovanog RPMI je lagano dodato u epruvetu. Ćelije su centrifugirane tokom 5 minuta sa 2000 O/MIN, i supernatant je odbačen. Ćelije su resuspendovane u 10 ml sveže podloge. Gustina ćelija i vijabilnost su određeni pomoću tripan plavog.
[0738] [0426] Za pozitivnu selekciju B-ćelije koje proizvode anti-PACAP38, biotinilovan PACAP38 (SEQ ID NO: 1241) su prethodno napunjeni na streptavidin perlama kao što sledi.75 µl streptavidin perli (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) umešano je sa N-terminalnim biotinilovanim PACAP38 (10 µg/ml krajnje koncentracije) i 300 µl PBS obogaćenog sa 0.5% goveđeg seruma albumina bez biotina ("BSA") i 2 mM EDTA ("PBF"). Mešavina je inkubirana na 4°C tokom 30 minuta, i nevezani biotinilovani PACAP38 (AnaSpec, Fremont, CA) uklonjen je korišćenjem MACS<®>kolone za separaciju (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) sa ispiranjem od 1 ml da bi se uklonio nevezani materijal. Vezani materijal je izbačen odvajanjem od magneta i korišćen da bi se resuspendovale ćelije odozgo u 100 µl po 1X10<7>ćelija. Mešavina je zatim inkubirana na 4°C tokom 30 minuta i isprana jedanput sa 10 ml PBF. Nakon ispiranja, ćelije su resuspendovane u 500 µl PBF i izdvojene. MACS<®>MS kolona (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) je prethodno isprana sa 500 µl PBF na magnetnom stalku (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Ćelijska suspenzija je primenjena na koloni kroz pred-filter, i nevezana frakcija je prikupljena. Kolona je isprana sa 2.5 ml PBF pufera. Kolona je uklonjena sa magnetnog stalka i smeštena na čistu, sterilnu 1.5 ml EPPENDORF<™>epruvetu. 1 ml PBF pufera dodato je na vrh kolone, i Pozitivno selektovane ćelije su sakupljene. Prinos i vijabilnost pozitivne frakcije ćelija je određena bojenjem tripan plavim. Pozitivna selekcija dala je prosečan prinos od 1% od početne koncentracije ćelija.
[0739] Uspostavljen je pilotski skrining ćelija kako bi se obezbedile informacije o nivoima zasejavanja kulture. Ploče su zasejane u količini od 5, 10, 25, 50, 100 ili 200 obogaćenih B-ćelija/bunarčiću. Pored toga, svaki bunarčić sadržao je 25-50K ćelija/bunarčiću ozračenih EL-4.B5 ćelija (5000 Rad) i odgovarajući nivo supernatanta aktiviranih zečjih T-ćelija (videti U.S. Objavu prijave patenta br.20070269868) (u opsegu od 1-5% zavisno od preparata) u modifikovanoj RPMI podlozi sa visokim sadržajem glukoze u krajnjoj zapremini od 250 µl/bunarčiću. Kulture su inkubirane tokom 5 do 7 dana na 37°C u 4% CO<2>.
[0741] Skrining kulture B-ćelija prepoznavanjem antigena (ELISA)
[0743] Da bi se identifikovali bunarčići koji proizvode anti-PACAP38 antitela, supernatanti B-ćelija su ispitivani prepoznavanjem antigena (ELISA). Ukratko, NEUTRAVIDIN<™>-premazane ploče (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), premazane su ili sa N-terminalnim ili C-terminalnim biotinilovanim PACAP38 (AnaSpec Inc., Fremont, CA) (50 µl po bunarčiću; 1 µg/ml) razblaženim u ELISA puferu (0.5% želatin iz riblje kože u PBS pH 7.4) ili tokom približno 1 sata na sobnoj temperaturi ili alternativno preko noći na 4°C. Ploče su zatim dalje blokirane sa ELISA puferom tokom jednog sata na sobnoj temperaturi i isprane korišćenjem PBS sa 0.05% Tween 20 ("pufer za ispiranje"). Uzorci supernatanta B-ćelija (50 µl) su preneti na bunarčiće i inkubirani tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Nakon ove inkubacije, ploča je isprana puferom za ispiranje. Za razvoj, anti-zečja specifična Fc-peroksidaza rena ("Fc-HRP") (1:5000 razblaženje u ELISA puferu) je dodata na bunarčiće i inkubirana tokom 45 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon faze od 3X ispiranja rastvorom za ispiranje, ploča je razvijena korišćenjem supstrata 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina ("TMB") tokom dva minuta na sobnoj temperaturi, i reakcija je prekinuta pomoću 0.5M HCl. Apsorbancija bunarića je očitana na 450 nm.
[0744] Da bi se identifikovali bunarčići koji proizvode anti-PACAP38 antitela koja ne prepoznaju VIP (SEQ ID NO: 1243), supernatant iz bunarčića pozitivnih za PACAP38 vezivanje pomoću ELISA ispitani su pomoću ELISA za vezivanje za VIP. Ukratko, biotinilovani VIP (AnaSpec Inc., Fremont, CA) vezan je na ploče obložene sa NEUTRAVIDIN<™>(50 µg po bunarčiću, 1 µg/µl svakog peptida). Uzorci supernatanta Bćelija (50 µl) su ispitivani bez prethodnog razblaživanja. Prepoznavanje u ovom testu može da označava unakrsnu reaktivnost sa blisko povezanim peptidom, VIP.
[0746] Identifikacija funkcionalne aktivnosti u supernatantima B-ćelija korišćenjem jednog ili više testova
[0747] Da bi se identifikovali bunarčići koji proizvode anti-PACAP38 antitela koja blokiraju signalizaciju PACAP38 pomoću PAC1-R, supernatant iz pozitivnih bunarčića za PACAP38 vezivanje pomoću ELISA testirani su u cAMP HTRF testu (Cisbio US, Bedford, MA). Supernatanti (78 µl) su prethodno inkubirani sa 2 µl 5 nM PACAP38 (American Peptide Company, Sunnyvale, CA) tokom 1 sata na 37°C. Tokom inkubacije, PC-12 ćelije su pripremljene kao što je opisano za procenu titra. Ćelije (10 µl) i kompleks antitelo/antigen (40 µl) preneti su na HTRF ploču i mućkani na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Nakon inkubacije, dodato je 20 µl (1:20 razblaženog) Eu<3+>kriptatom obeleženog mAb anti-cAMP i 20 µl (1:20 razblaženog) d2-obeleženog cAMP u puferu za lizu, i ploča je inkubirana tokom 1 sata uz mućkanje. Nakon inkubacije, ploče su očitane (ekscitacija 330 nm, emisija 620/665 nm), i određen je odnos 620:665 signala.
[0749] Izolovanje antigen-specifičnih B-ćelija
[0751] Antigen-specifične B-ćelije izolovane su (za opšte postupke videti objavu br. WO 2014/146074 zajedničkih nosioca prava). Ploče koje sadrži bunarčiće od interesa su uklonjene sa -70°C, i ćelije iz svakog bunarčića su oporavljeni pomoću pet ispiranja od 200 µl podloge (10% RPMI kompletni, 55 µM βmerkaptoetanola ("BME")) po bunarčiću. Oporavljene ćelije su peletirane centrifugiranjem i supernatant je pažljivo uklonjen. Ćelije iz svakog bunarčića su zatim resuspendovane u 100 µl podloge i prenete na ploču sa 96 bunarčića. Ćelije su inkubirane tokom 90 minuta na 37°C. Nakon inkubacije, ćelije su peletirane centrifugiranjem, obojene fluorescein izotiocijanatom obeleženim ("FITC-obeležen") antizečjim IgG (krajnja koncentracija 6.25 µg/ml) (Creative Diagnostics, Shirley, NY), i isprane sa do 2 ml pufera za sortiranje ćelija aktiviran fluorescencijom ("FACS pufer") (Dulbekov PBS w/ 2%FBS) i resuspendovane u 250 µl FACS pufera.
[0752] [0432] Kontrolni bunarčići iz istih skupova kultura koji su bili sličnog sastava kao kombinovani bunarčići od interesa su odmrznuti i obojeni pored ciljnih bunarčića. Ovi uzorci su prvo analizirani na FACS (BD INFLUX<™>, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ), i uspostavljene su gejtovi za IgG, vijabilnost i fizičke parametre (direktno rasejanje ("FSC")/bočno rasejanje ("SSC")) koji diferenciraju B-ćelije od mišjih EL4 ćelija. Kada se ustanove gejtovi, uzorak od interesa se analizira, i vijabilne ćelije pozitivne za IgG koje su bile konzistentne fizičke (FSC/SSC) populacije sortirane su pojedinačno u bunarčiće ploče sa 96 bunarčića prethodno napunjene sa RT-PCR master mešavinom. Sortirano je više od 8 ćelija po bunarčiću. Sortirane ploče su uklonjene iz sortera i prenete direktno u termociklere za PCR.
[0754] Amplifikacija i određivanje sekvenci antitela iz FACS-sortiranih B-ćelija
[0756] Sekvence antitela su oporavljene korišćenjem postupka zasnovanog na kombinovanom RT-PCR iz B-ćelija sortiranih iz jedne ćelije. Prajmeri koji sadrže restrikcione enzime dizajnirani su da se vezuju u konzerviranim i konstantnim regionima ciljanih gena imunoglobulina (teški i laki), kao što su sekvence zečjeg imunoglobulina, i oporavak nakon dvostepene ugnežđene PCR je korišćen za amplifikaciju sekvence antitela. Amplikoni iz svakog bunarčića su sekvencirani i analizirani. Reprezentativna antitela iz dobijenih klastera sekvenci odabrani su za ekspresiju rekombinantnih proteina. Originalni teški i laki varijabilni regioni amplifikovani iz zečjih ćelija klonirani su u humane ekspresione vektore konstantnih regiona teškog i lakog lanca digestijom i ligacijom pomoću restrikcionih enzima, i pomoću Gibsonovog postupka. Vektori koji sadrže subkloniranu DNK su amplifikovani i prečišćeni. Sekvence subkloniranih teških i lakih lanaca potvrđeni su pre ekspresije.
[0758] Rekombinantna proizvodnja monoklonalnog antitela željene specifičnosti za antigen i/ili funkcionalnih svojstava
[0760] Da bi se odredila specifičnost antigena i funkcionalna svojstva oporavljenih antitela iz specifičnih B-ćelija, plazmidi teškog i lakog lanca su kotransfektovani da bi se generisala zečja/humana himerna antitela za ispitivanje. Ukratko, himerni plazmidi teškog i lakog lanca su prolazno transfektovani u HEK-293 ćelije. Transfekcije su ostavljene da se inkubiraju tokom 5-7 dana, i nakon prikupljanja, ćelije su peletirane centrifugiranjem. Supernatanti su podvrgnuti prečišćavanju pomoću Proteina A. Dobijena prečišćena himerna antitela zatim su ocenjena u raznim testovima da bi se potvrdila specifičnost i potentnost.
[0761] Korišćenjem gore opisanih postupaka, identifikovana su brojna funkcionalna (antagonistička) antitela koja vezuju PACAP38 i PACAP27, ili koja vezuju PACAP38 samo, ali koja se ne vezuju, ili se neprimetno vezuju, za VIP. Polipeptid i primeri kodirajućih sekvenci primera antagonističkih anti-PACAP antitela sadržani su u uključenom spisku bioloških sekvenci.
[0762] [0436] Antitela pune dužine Ab10, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab20, Ab21, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4 korišćena u ovim primerima eksprimiranu sa kao polipeptidi teškog lanca koji imaju sekvence iz SEQ ID NO: 401; 961; 1281; 1321; 1361; 1401; 441; 841; 1201; 881; 921; 1481; 1521; i 1561, tim redom, i polipeptidi lakog lanca iz SEQ ID NO: 421; 981; 1301; 1341; 1381; 1421; 461; 861; 1221; 901; 941; 1501; 1541; i 1581, tim redom. Polipeptidi teškog lanca antitela Ab10, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab20, Ab21, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4 eksprimirani su iz polinukleotida iz SEQ ID NO: 411; 971; 1291; 1331; 1371; 1411; 451; 851; 1211; 891; 931; 1491; 1531; i 1571, tim redom. Polipeptidi lakog lanca antitela Ab10, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab20, Ab21, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4 eksprimirani su iz polinukleotida iz SEQ ID NO: 431; 991; 1311; 1351; 1391; 1431; 471; 871; 1231; 911; 951; 1511; 1551; i 1591, tim redom. Dodatne karakteristike pomenutih antitela identifikovane su pomoću SEQ ID NO na FIG.1-12.
[0764] Specifičnost antitela u vezivanju za antigen pomoću testa kompetitivnog HTRF vezivanja
[0766] Svojstva vezivanja i funkcionalne karakteristike primera anti-PACAP38 i anti-PACAP27 antitela proizvedenih prema ovom pronalasku dalje su opisani u nastavku.
[0767] Da bi se identifikovala antitela koje preferencijalno vezuju PACAP38 (SEQ ID NO: 1241) i PACAP27 (SEQ ID NO: 1242), ali ne vezuju VIP (SEQ ID NO: 1243), ili da bi se identifikovala antitela koja specifično vezuju PACAP38, ali se ne vezuju značajno za PACAP27, ili se ne vezuju značajno za VIP, itd., izveden je test kompetitivnog HTRF vezivanja.
[0768] Paralelno, 10 µl serija razblaživanja antitela (najviša krajnja koncentracija od 100 nM) inkubirano je sa 10 µl N-terminalnog ili C-terminalnog biotinilovanog PACAP38 (35 nM krajnja) samo, ili u kombinaciji ili sa PACAP27 (350 nM krajnja) ili VIP (350 nM krajnja), tj., 10x PACAP27 ili 10x VIP, tim redom, na HTRF ploči.20 µl Eu<3+>kriptatom obeleženog anti-hu Fc donora i 20 µl d2-obeleženog streptavidin akceptora dodato je u svaki bunarčić i inkubirano tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Fluorescencija je izmerena na 620 i 665 nm sa kašnjenjem od 300 µs.
[0769] FIG.13A-D obezbeđuju reprezentativne podatke vezivanja za Ab10, Ab20, Ab21 i Ab1.H za PACAP38 i za PACAP27, i nesposobnost VIP da se takmiči u vezivanju za PACAP38. FIG.13E i FIG.
[0770] 13F obezbeđuju reprezentativne podatke vezivanja za anti-PACAP antitela Ab22 i Ab23 za PACAP38 i nesposobnost PACAP27 ili VIP da se takmiči u vezivanju za PACAP38. Nedostatak efekta VIP na vezivanje za PACAP38 pokazuje njegovu nesposobnost da se takmiči u vezivanju za PACAP38. Ovi rezultati demonstrirali su da se Ab10, Ab20, Ab21 i Ab1.H vezuju za PACAP38 i PACAP27, ali ne vezuju (ili ne vezuju značajno) VIP. Ovi rezultati takođe pokazuju da se Ab22 i Ab23 vezuju za PACAP38, ali ne vezuju (ili ne vezuju značajno) PACAP27 ili VIP.
[0771] EC<50>vrednosti, tj. koncentracija nekog antitela koja daje odgovor na pola puta između osnovne i maksimalne vrednosti u određenom vremenskom periodu, izračunate su za svako antitelo na osnovu njihovih krivih vezivanja i prikazane su u Tabeli 1 dole. Rezultati su pokazali da su se Ab10, Ab20, Ab21, Ab22 i Ab23 vezala za i prepoznala humani PACAP38 sa visokom afinitetom. Humanizovani oblik antitela Ab1 identifikovanog dodatnim ".H", tj., Ab1.H takođe vezuje PACAP38 sa visokom afinitetom.
[0773] TABELA 1
[0774] Vezivanje (EC<50>) PACAP38 pomoću anti-PACAP antitela
[0777]
[0780] Sposobnost anti-PACAP antitela da neutrališu PACAP38-indukovanu i PACAP27-indukovanu cAMP proizvodnju
[0782] Sposobnost anti-PACAP antitela da neutrališu PACAP38-indukovanu i PACAP27-indukovanu PAC1-R signalizaciju je ispitivana u ispitivanju na bazi ćelije.
[0783] Za Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4 da bi se identifikovala antitela koja su neutralisala PACAP38-indukovanu i PACAP27-indukovanu signalizaciju pomoću PAC1-R, rastvori antitela su inkubirani ili sa PACAP38 sa 4x krajnjom koncentracijom (100 pM) tokom 1 sata, ili sa PACAP27 sa 4x krajnjom koncentracijom (100 pM za Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22 i Ab23; i 1 nM za Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4) tokom 1 sata. Dok su kompleksi antitelo/antigen inkubirani, PAC1-R eksprimirajuće PC-12 ćelije (Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank) su isprane i resuspendovane sa 2x10<6>ćelija po ml u podlogama za ćelijsku kulturu. Ćelije (10 µl) i kompleks antitelo/antigen (40 µl) preneti su na HTRF ploču i mućkani na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Nakon inkubacije, dodato je 20 µl (1:20 razblaženog) Eu<3+>kriptatom obeleženog mAb anti-cAMP i 20 µl (1:20 razblaženog) d2-obeleženog cAMP u puferu za lizu, i ploča je inkubirana tokom 1 sata uz mućkanje. Nakon inkubacije, ploče su očitane (ekscitacija 330 nm, emisija 620/665 nm), i određen je odnos 620:665 signala. Krajnja koncentracija PACAP38 u svakom bunarčiću bila je 0.1 nM, a krajnja koncentracija PACAP27 u svakom bunarčiću bila je 0.1 nM za Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22 i Ab23; i 1 nM za Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4.
[0784] [0444] FIG.16A-O(PACAP38) i 17A-O (PACAP27) prikazuju krive inhibicije (za Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4) koje predstavljaju krive inhibicije dobijene sa ispitivanim antitelima. Rezultati inhibicija su kvantifikovani za svako antitelo da bi se dobila IC<50>vrednost, koje su sumirane u Tabelama 2 i 3 dole. Ovi rezultati pokazuju da su anti-PACAP antitela Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4 inhibirala PACAP38-indukovano cAMP povećanje u ćelijama koje eksprimiraju PAC1-R (videti FIG.16A-O). Pored toga, ovi rezultati pokazuju da su anti-PACAP antitela Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4, ali ne i Ab22 ili Ab23, inhibirala PACAP27-indukovano cAMP povećanje u ćelijama koje eksprimiraju PAC1-R (videti FIG.17A-O).
[0786] TABELA 2
[0787] Inhibicija (IC<50>) PACAP38-indukovanog i PACAP27-indukovanog cAMP povećanja u ćelijama koje eksprimiraju PAC1-R pomoću anti-PACAP antitela Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22 i Ab23
[0789]
[0791] *n/a: nije aktivno jer su ova Ab specifična za PACAP38
[0793] TABELA 3
[0794] Inhibicija (IC<50>) PACAP38-indukovanog i PACAP27-indukovanog cAMP povećanja u ćelijama koje eksprimiraju PAC1-R pomoću anti-PACAP antitela Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4
[0795]
[0798] Primer 2: Afiniteti vezivanja anti-PACAP antitela
[0800] Afiniteti vezivanja monoklonalnih antitela za humani PACAP procenjeni su korišćenjem SPR na PROTEON<™>XPR36 (Bio-Rad, Hercules, CA). Antitelo je imobilisano na površini čipova za opšte spajanja amina ("GLC" ili "GLM") (Bio-Rad, Hercules, CA). Serije razblaženja humanog PACAP38 (SEQ ID NO: 1241) pripremljenog u 1 x PBST puferu (4.3 mM Na fosfat, 1.4 mM K foskat, 135 mM NaCl, 2.7 mM KCl 0.05% Polisorbat-20) kupljenom od Teknova (Cat# P1192, Teknova, Hollister, CA) i obogaćenom sa 0.25 M argininom (od J.T. BAKER<®>), 0.2 mg/ml BSA (Jackson Immuno Research Labs, West Grove, PA) i 0.005% natrijum azid (VWR International, Radnor, PA) sa pH podešenom na 7, korišćeno je za ispitivanje antitela. Antigen (koji je u opsegu od 1.23 nM do 100 nM) je na uobičajen način ispitan sekvencijalno sa vremenom asocijacije od 2-4 minuta i vremenom disocijacije od 3-120 minuta grupisano sa PROTEON<™>upravljačkim softverom (v3.1.0.6 (Bio-Rad, Hercules, CA)) i podešen korišćenjem 1:1 Langmuir modela vezivanja. Površine su regenerisane između ispitivanja analita korišćenjem 0.85% fosforne kiseline. Jedna K<D>izračunata je za svako antitelo sa vremenom asocijacije ograničenim blisko brzini difuzije (1.0 X 10<6>) i vremenom disocijacije ograničenim na 1.5 X 10<-5>gde nije primećena primetna disocijacija.
[0801] Isti postupak je korišćen za određivanje afiniteta vezivanja antitela za humani VIP (SEQ ID NO: 1243) i PACAP27 (SEQ ID NO: 1242) iako su koncentracije peptida bile u rasponu od 1.23 nM do 1000 nM sa vremenom asocijacije od 200 sekundi i vremena disocijacije od 3-120 minuta.
[0802] Izmereni afiniteti antitela za PACAP38 navedeni su u Tabeli 4.
[0804] TABELA 4
[0805]
[0807] Primeri konstanti afiniteta antitela za VIP navedeni su u Tabeli 5.
[0809] TABELA 5
[0811]
[0812] Ab10.H4 1.5E+05 1.5E-02 9.8E-08
[0814] Primeri konstanti afiniteta antitela za PACAP27 navedeni su u Tabeli 6.
[0816] TABELA 6
[0819]
[0821] Rezultati afiniteta vezivanja iz Tabela 4 i 6 prikazuju podatke koji pokazuju da se Ab23 slabo vezalo za PACAP27 u odnosu na njegov afinitet vezivanja za PACAP38. Tabele 4 i 6, pored toga, prikazuju podatke koji pokazuju da Ab22 specifično ne prepoznaje PACAP27, ali da se Ab22 specifično vezalo za PACAP38.
[0823] Primer 3: Inhibicija PACAP38-indukovane signalizacije pomoću VPAC1-R
[0825] [0451] Da bi se identifikovala antitela koja neutrališu PACAP38-indukovanu signalizaciju pomoću humanog VPAC1-R, CHO-K1 ćelije koje eksprimiraju humani VPAC1-R korišćene su u ispitivanju cAMP zasnovanom na HTRF ćelijama. Razblaženja antitela inkubirana su sa PACAP38 sa 4x krajnjom koncentracijom (5 nM) tokom 1 sata. Dok su kompleksi antitelo/antigen inkubirani tokom 1 sata, CHO-K1 ćelije koje eksprimiraju VPAC1-R (generisane u Alder Biopharmaceuticals, stabilnom transfekcijom CHO-K1 ćelija (ATCC, katalog # CCL-61) sa humanim VPAC1-R cDNK; izabrani klon 1 je korišćen za in vitro testove na bazi ćelija) odvojene su sa 0.25% tripsinon za 4 minuta. Ćelije su isprane i resuspendovane sa 1x10<6>ćelija po ml podloge za kulturu.20 µl Ab/antigen mešavine umešano je sa 20 µl ćelija u HTRF pločama i inkubirano uz mućkanje tokom 30 minuta.20 µl Eu<3+>kriptatom obeleženog anti-cAMP mAb (1:20 razblažen) i 20 µl (1:20 razblaženog) d2-obeleženog cAMP u puferu za lizu dodato je u svaki bunarčić i inkubirano tokom 1 sata uz mućkanje. Krajnja koncentracija PACAP38 u svakom bunarčiću bila je 5 nM. Nakon inkubacije, ploče su očitane (ekscitacija 330 nm, emisija 620/665 nm), i određen je odnos 620:665 signala.
[0826] FIG.18A-L prikazuju krive inhibicije dobijene ovim postupkom (rezultati su prikazani za Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H3, Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4, tim redom). Izračunate IC<50>vrednosti za svako antitelo, koje su prikazane dole u Tabeli 7, koje pokazuju da su Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H3, Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4 inhibirala PACAP38-indukovano cAMP povećanje u ćelijama koje eksprimiraju humani VPAC1-R.
[0828] TABELA 7
[0830]
[0831] Primer 4: Inhibicija PACAP38-indukovane signalizacije pomoću VPAC2-R
[0833] Da bi se identifikovala antitela koja neutrališu PACAP38-indukovanu signalizaciju pomoću humanog VPAC2-R, CHO-K1 ćelije koje eksprimiraju humani VPAC2-R korišćene su u ispitivanju cAMP zasnovanom na HTRF ćelijama. Razblaženja antitela inkubirana su sa PACAP38 sa 4x krajnjom koncentracijom (1 nM) tokom 1 h. Dok su kompleksi antitelo/antigen inkubirani tokom 1 sata, CHO-K1 ćelije koje eksprimiraju VPAC2-R (generisane u Alder Biopharmaceuticals, stabilnom transfekcijom CHO-K1 ćelija (ATCC, katalog # CCL-61) sa humanom VPAC2-R cDNK; izabrani klon 8 je korišćen za in vitro testove na bazi ćelija) odvojene su sa 0.25% tripsinom tokom 4 minuta. Ćelije su isprane i resuspendovane sa 1x10<6>ćelija po ml podloge za kulturu.20 µl Ab/antigen mešavine umešano je sa 20 µl ćelija u HTRF pločama i inkubirano uz mućkanje tokom 30 minuta. Dodato je 20 µl Eu<3+>kriptatom obeleženog anti-cAMP mAb (1:20 razblažen) i 20 µl (1:20 razblaženog) d2-obeleženog cAMP u puferu za lizu u svaki bunarčić i inkubirano tokom 1 sata uz mućkanje. Krajnja koncentracija PACAP38 u bunarčićima bila je 1 nM. Nakon inkubacije, ploče su očitane (ekscitacija 330 nm, emisija 620/665 nm) i, određen je odnos 620:665 signala.
[0834] FIG.19A-L prikazuju krive inhibicije dobijene ovim postupkom (rezultati su prikazani za Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H3, Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4, tim redom). Izračunate IC<50>vrednosti za svako antitelo, koje su prikazane dole u Tabeli 8, pokazale su da su Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H3, Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4 inhibirala PACAP38-indukovano cAMP povećanje u ćelijama koje eksprimiraju humani VPAC2-R.
[0836] TABELA 8
[0838]
[0839] Ab23 1789.0
[0840] Ab10.H3 301.0
[0841] Ab21.H2 1060.0
[0843] Ab21.H3 1529.0
[0844] Ab21.H4 2879.0
[0846] Primer 5: Inhibicija PACAP38 vezivanja za PAC-1-R-eksprimirajuće ćelije
[0848] Da bi se identifikovala antitela koje blokiraju PACAP38 vezivanje za ćelije koje eksprimiraju PAC1-R, adherentne PC-12 ćelije (ATCC, Manassas, VA) koje eksprimiraju PAC1-R korišćene su u testovima vezivanja evropijum-baziranih ćelija koje eksprimiraju PAC1-R. Rastvori antitela su inkubirani sa N-terminalnim biotinilovanim PACAP38 sa 10x krajnjom koncentracijom (100 nM ili 30 nM) tokom 1 h, zatim dodati PC-12 ćelijama koje su 24 h ranije zasejane u crne ploče sa 96 bunarčića sa providnim dnom (COSTAR<™>, Corning Incorporated, Corning, NY) i dalje inkubirani tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Nakon tri ispiranja, ćelije su inkubirane sa 20 µl evropijumom-obeleženog streptavidina (PerkinElmer, Waltham, MA) tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprane tri puta, zatim je dodato 20 µl
[0849] DELFIA<®>Enhancement rastvora (PerkinElmer, Waltham, MA) u svaki bunarčić i inkubirano tokom 15 minuta u lagano mućkanje. Ploče su očitane (Vremenski razrešena fluorescencija ("TRF")) na SPECTRAMAX<®>(Molecular Devices, Sunnyvale, CA) čitaču ploča.
[0850] FIG.14A-H prikazuju krive inhibicije dobijene ovim postupkom (rezultati su prikazani za Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22 i Ab23, tim redom), pri čemu Ćelije koje eksprimiraju PAC1-R predstavljaju PC-12 ćelije. Izračunate IC<50>vrednosti za svako antitelo, koje su prikazane dole u Tabeli 9, pokazuju da su Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22 i Ab23 inhibirala PACAP38 vezivanje za PC-12 ćelije koje eksprimiraju PAC1-R.
[0852] TABELA 9
[0853] Inhibicija (IC<50>) PACAP38 vezivanja za PC-12 ćelije koje eksprimiraju PAC1-R pomoću anti-PACAP antitela ANTITELO Inhibicija 100 nM biotinilovanog PACAP38 koji se vezuje za PAC1R-eksprimirajuće PC-12 ćelije IC<50>(nM)
[0854] Ab10 17.8
[0855] Ab20 32.7
[0856] ANTITELO Inhibicija 30 nM biotinilovanog PACAP38 koji se vezuje za PAC1R-eksprimirajuće PC-12 ćelije IC<50>(nM)
[0858]
[0861] Primer 6: PACAP38-posredovano vezivanje anti-PACAP antitela za ćelijsku površinu ćelija koje eksprimiraju PAC1-R
[0863] [0457] Da bi se identifikovala anti-PACAP antitela koja se vezuju, pomoću PACAP38, za ćelijsku površinu PAC1-R eksprimirajućih ćelija, adherentne PC-12 ćelije (Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank) koje eksprimiraju PAC1-R korišćene su u ispitivanju na bazi vezivanja za površinu ćelija. Da bi se izveo eksperiment vezivanja, PC-12 ćelije koje eksprimiraju PAC1-R su najpre zasejane na Corning ploče sa 96 bunarčića sa belim punim dnom (Corning, Corning, NY). Ćelije su najpre zasejane sa 1x10<5>ćelija/bunarčiću u rastvoru kompletnog RPMI ("cRPMI": RPMI podloga obogaćena sa 10% sterilnim, toplotom-inaktiviranim FBS i 1% sterilnim antibiotikom/antimikotikom) 10% FBS, i ploče su ostavljene radi inkubacije preko noći na 37°C. Na dan ispitivanja vezivanja, antitela u početnoj koncentraciji od 15 µg/ml su razblažena u odnosu od 1:3 u DELFIA<®>puferu za vezivanje (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% azid, 2% konjski serum) (Perkin-Elmer, Waltham, MA) do ukupne zapremine od 60 µL u posebnoj ploči sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. PACAP38 je pripremljen za test vezivanja njegovim razblaživanjem u DELFIA<®>puferu za vezivanje do koncentracije od 200 nM, i zatim je 60 µl razblaženog PACAP38 dodato u svaki od bunarčića koji sadrže antitelo radi obrazovanja kompleksa antitelo:antigen. Nakon dodavanja PACAP38, kompleksi antitelo: antigen su inkubirani na sobnoj temperaturi na šejkeru tokom 1 sata. Odvojeno, PC-12 ćelije su pripremljene za dodavanje antitela: kompleksi antigena ispiranjem ćelija dva puta DELFIA<®>puferom za ispiranje (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 % Azid) (Perkin-Elmer, Waltham, MA). Nakon ispiranja ćelija dva puta i nakon 1-časovne inkubacije kompleksa antitelo:antigen na sobnoj temperaturi, 50 µl kompleksa antitelo:antigen dodato je u svaki bunarčić koji sadrži ćelije. Mešavine ćelija i kompleksa antitelo:antigen su potom inkubirane tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon ove 30-minutne inkubacije, svaka mešavina je isprana dva puta DELFIA<®>puferom za ispiranje (Perkin-Elmer, Waltham, MA).
[0864] DELFIA<®>evropijumom obeležen reagens za detekciju anti-humanog IgG (Kat # 1244-330, Perkin-Elmer, Waltham, MA) je razblažen do koncentracije od 300 ng/ml u DELFIA<®>puferu za vezivanje. Nakon razblaženja, 50 µl reagensa za detekciju anti-humanog IgG je dodato u svaki bunarčić koji sadrži ćelije, i 30-minutna inkubacija na sobnoj temperaturi pratila je ovo dodavanje reagensa za detekciju IgG. Po završetku 30-minutne inkubacije na sobnoj temperaturi, ćelije su potom isprane dva puta
[0865] DELFIA<®>puferom za ispiranje. Dalje, 50 µl DELFIA<®>Enhancement rastvora (Kat # 1244-105, Perkin-Elmer, Waltham, MA) dodato je u svaki bunarčić koji sadrži ćelije tokom krajnje 15-minutne inkubacije na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Ploče su zatim očitane (TRF, ekscitacija 330nm, emisija 620nm) na SPECTRAMAX<®>(Molecular Devices, Sunnyvale, CA) čitaču ploča.
[0866] FIG.15A-O prikazuju krive vezivanja dobijene ovim postupkom (rezultati su prikazani za Ab10, Ab20, Ab21, Ab1.H, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5, Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4, tim redom), pri čemu su ćelije koje eksprimiraju PAC1-R bile PC-12 ćelije. Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4 pokazali su ograničeno vezivanje za površinu ćelija koje eksprimiraju PAC1-R u prisustvu PACAP38. Ab1.H pokazalo je jako vezivanje za površinu ćelija koje eksprimiraju PAC1-R u prisustvu PACAP38, dok za Ab20, Ab21, Ab10.H, Ab21.H, Ab22, Ab23, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4 i Ab10.H5 nije izgledalo da se značajno vezuju za površinu ćelija koje eksprimiraju PAC1-R korišćenjem ovog testa. Antitela Ab1.H koja su se jako vezala i ograničeno vezivanje Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4, za ćelijsku površinu PAC1-R ćelija primećeno je samo u prisustvu PACAP38. Bez vezivanja za teoriju, postavljena je hipoteza da je vezivanje, ili jako ili ograničeno, antitela za ćelijsku površinu posredovano vezivanjem PACAP38 za GAG koji su bili prisutni na površini ćelija, budući da je vezivanje PACAP38 pomoću GAG prethodno pokazano kao mehanizam PACAP38 vezivanja nezavisan od PAC1-R receptora i internalizacije pomoću PC-12 ćelija (videti Doan et al. (2012), Juhász et al. (2014), i Neree et al. (2015)).
[0868] Primer 7: Inhibicija PACAP38-indukovane dermalne vazodilatacije kod zečeva pomoću anti-PACAP antitela Ab1.H
[0870] Pokazalo se da intradermalna injekcija PACAP38 izaziva lokalizovanu vazodilataciju kod zečeva i ljudi (Warren et al., J. Cardio. Pharmacol., 29(1): 83-87 (1992); i Videtilinger et al., Am. J. Path., 177(5):2563-2575, 2010). in vivo studija efikasnosti sprovedena je da bi se odredila aktivnost Ab1.H da inhibira lokalizovanu dermalnu vazodilataciju indukovanu intradermalnom injekcijom PACAP38 kod mužjaka belih zečeva sa Novog Zelanda.
[0871] [0461] Grupe od 4 zeca dozirane us ili sa 90 mg/kg Ab1.H ili sa vehikulumom negativne kontrole (25 mM histidin, 250 mM sorbitol, pH 6.0). Injekcije su izvedene IV (ušna vena) bolusnim davanjem na dan 0. Pre PACAP38 izazova kod svakog zeca, lopatica svake životinje je ošišana i obrisana sa 20% (zap./zap.) alkohola u vodi. Na dan 2, životinje su prethodno anestezirane sa ketamin hidrohloridom i održavane pod dubokom anestezijom izofluranskim gasom. Četiri mesta (region interesovanja) ("ROI")) za injekciju identifikovana su na leđima svake životinje pomoću SHARPIE<®>permanentnog markera. Dermalna vazodilatacija i perfuzija krvi je praćena pomoću PeriCam PSI NR sistema za snimanje pomoću analize laserskog kontrasta sa speklom ("LASCA") (Perimed, Järfälla, Sweden), pre (osnovna linija) i tokom 35 minuta nakon intradermalnog PACAP38 izazova. Intradermalni PACAP38 izazov izveden je kao što sledi: svaka životinja primila je pojedinačna intradermalna davanja (100 µl/mesto) vehikuluma (jedno mesto ili ROI) i PACAP38 pri 30 pmolova/mestu (3 mesta ili 3 ROI). Brzine perfuzije krvi za svaki ROI prijavljene su pomoću PeriCam PSI NR sistema u jedinicama perfuzije ("PU") i analizirane pomoću PIMSoft (Ver.1.5, Perimed, Järfälla, Sweden).
[0872] Za svaku grupu ispitivanja, relativna %PU promena nakon davanja Ab1.H ili negativne kontrole upoređena sa osnovnom linijom izračunata je za svaki ROI (%PU promena za svako mesto PACAP38 izazova - %PU promena za mesto vehikuluma). Relativna %PU promena u Ab1.H grupi upoređena je sa relativnom %PU promenom u grupi negativne kontrole izvođenjem dvosmerne neuparene t-test statističke procene korišćenjem GraphPad Prism (verzija 5.0d, GraphPad Software, La Jolla, CA) softvera.
[0873] FIG.20 prikazuje da je Ab1.H inhibiralo PACAP38-indukovanu dermalnu vazodilataciju kod zečeva, što pokazuje efikasnost antitela u neutralizaciji PACAP38 aktivnosti in vivo.
[0875] Primer 8: Inhibicija PACAP38-indukovane dermalne vazodilatacije kod zečeva pomoću anti-PACAP antitela Ab10
[0877] Pokazalo se da intradermalna injekcija PACAP38 izaziva lokalizovanu vazodilataciju kod zečeva i ljudi (Warren et al., 1992; i Videtilinger et al., 2010). In vivo studija efikasnosti sprovedena je da odredi aktivnost Ab10 da inhibira lokalizovanu dermalnu vazodilataciju indukovanu intradermalnom injekcijom PACAP38 kod mužjaka belih zečeva s Nju Zelanda.
[0878] [0465] Grupe 4 zečeva dozirane su ili sa 72 mg/kg Ab10 ili sa kontrolom sa izotipskim antitelom. Injekcije bile su (ušna vena) bolusnim intravenskim davanjem na dan 0. Pre PACAP38 izazova kod svakog zeca, lopatica svake životinje je ošišana i obrisana sa 20% (zap./zap.) alkoholom u vodi. Na dan 2, životinje su prethodno anestezirane ketamin hidrohloridom i održavane pod dubokom anestezijom izofluranskim gasom. Četiri mesta (ROI) za injekciju identifikovana su na leđima svake životinje pomoću SHARPIE<®>permanentnog markera. Dermalna vazodilatacija i perfuzija krvi je praćena pomoću PeriCam PSI NR sistema za LASCA snimanje (Perimed, Järfälla, Sweden), pre (osnovna linija) i za 35 minuta nakon intradermalnog PACAP38 izazova. Intradermalni PACAP38 izazov izveden je kao što sledi: svaka životinja primila je pojedinačna intradermalna davanja (100 µl/mesto) vehikuluma (jedno mesto ili ROI) i PACAP38 sa 30 pmolova/mestu (3 mesta ili 3 ROI). Brzine perfuzije krvi za svaki ROI prijavljene su pomoću PeriCam PSI NR sistema u PU i analizirane korišćenjem PIMSoft (Ver.1.5 (Perimed, Järfälla, Sweden)).
[0879] Za svaku grupu ispitivanja, relativna %PU promena nakon davanja Ab10 ili izotipske Ab kontrole upoređena sa osnovnom linijom izračunata je za svaki ROI (%PU promena za svako mesto PACAP38 izazova - %PU promena za mesto vehikuluma). Relativna %PU promena u Ab10 grupi upoređena je sa relativnom %PU promenom u izotipskoj Ab kontrolnoj grupi izvođenjem dvosmerne neuparene t-test statističke procene korišćenjem GraphPad Prism (version 5.0d, GraphPad Software, La Jolla, CA) softvera.
[0880] FIG.21 pokazuje da je Ab10 inhibiralo PACAP38-indukovanu dermalnu vazodilataciju kod zečeva, što ukazuje na efikasnost antitela u neutralizaciji PACAP38 aktivnosti in vivo.
[0882] Primer 9: Razvrstavanje epitopa anti-PACAP antitela, Ab1 i Ab10
[0884] Ab1 je biotinilovano u molarnom odnosu 10:1 sa biotinom (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) prema uputstvima proizvođača. Eksperiment interferometrije biosloja u 5 faza je izveden na sledeći način: U fazi 1, biosenzori streptavidina (Pall ForteBio LLC, Menlo Park, CA) su uravnoteženi za 50 sekundi u 1x kinetičkom puferu (1:10 razblaženje u DBS od Pall ForteBio LLC, Menlo Park, CA, kat# 18-5032). U fazi 2, 2µg/ml razblaženja biotinilovanog antitela Ab1 u 1x kinetičkom puferu imobilisano je za 500 sekundi na biosenzorima streptavidina. U fazi 3, antitelo-funkcionalizovani biosenzori su inkubirani u rastvoru 2µM neobeleženog PACAP peptida (American Peptide Company, Sunnyvale, CA, katalog # 34-0-20) u 1x kinetičkom puferu tokom 200 sekundi. U fazi 4, senzori su postavljeni u 67 nM ratvore ili neobeleženog antitela Ab10 (FIG.22A) ili neobeleženog antitela Ab1 kao kontrole (FIG.22B) u 1x kinetičkom puferu za fazu spajanja tokom 1000 sekundi. Stabilnost vezivanja praćena je tokom faze 5 za disocijaciju tokom 1000 sekundi u 1x kinetičkom puferu. Na FIG.22A, "sendvič-stil" hvatanje Ab10 preko Ab1-zarobljenog PACAP pokazuje simultano i nekompetitivno vezivanje ova dva antitela za PACAP. Kontrolni eksperiment na FIG.22B pokazuje minimalni "sendvič stil" hvatanje Ab1 preko Ab1-zarobljenog PACAP. Eksperiment je sproveden na ForteBio OCTET<®>QK instrumentu (Pall ForteBio LLC, Menlo Park, CA) na 30°C i 1000 RPM.
[0886] Primer 10: Inhibicija PACAP27 vezivanja za humani PAC1-R pomoću anti-PACAP antitela
[0888] [0469] Da bi se identifikovala antitela koja blokiraju PACAP27 vezivanje za PAC1-R, antitela u inicijalnoj koncentraciji 30 nM su razblaženi u puferu za inkubaciju (50 mM Hepes pH 7.4, 1 mM CaCl<2>, 5 mM MgCl<2>, 0.2% BSA) i izvedena su serijska 1:3 razblaženja. Razblaženja antitela (30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 0.3 nM, 0.1 nM, 0.03 nM, 0.01 nM, 0.003 nM i 0.001 nM) su zatim umešana i prethodno inkubirana na 25°C tokom 30 minuta sa 0.1 nM<125>I-obeleženim PACAP27 u puferu za inkubaciju. Antitelo:<125>I-obeležena PACAP27 mešavina zatim je dodata u 0.5 µg alikvota ćelijskih membrani izvedenih iz Chem-1 ćelija koje eksprimiraju humanu rekombinantnu PAC1-R dugačku izoformu u puferu za inkubaciju. Mešavina je potom inkubirana tokom 1 sata na 25°C. Nakon inkubacije, uzorci su filtrirani i isprani. Nakon toga, filteri su prebrojani da bi se kvantifikovao<125>I-obeležen PACAP27. Kao eksperimentalna kontrola, nespecifično vezivanje za ćelijske membrane procenjeno je korišćenjem 0.1 µM obeleženog PACAP27. Rezultati su pokazali da Ab1.H, Ab10.H, Ab10.H3 i Ab21.H mogu da blokiraju PACAP27 vezivanje za PAC1-R, čime je demonstrirana inhibicija vezivanja ligand-receptor pomoću ispitanih antitela prikazanih u Table 10.
[0889] Tabela 10
[0890] Inhibicija (IC<50>) 0.1 nM<125>I-PACAP27 vezivanja za PAC1-R pomoću anti-PACAP antitela
[0893]
[0896] Primer 11: Efekat anti-PACAP antitela na averziju prema svetlosti
[0898] Da bi se ispitao efekat anti-PACAP antitela na fotofobija, korišćen je mišji model u kojem je miševima dat PACAP da bi se izazvala fotofobija. Fotofobija je detektovana pomoću testa averzije prema svetlosti korišćenjem svetle-tamne kutije kao što je opisano u Kaiser et al., J. Neurosci., 32(44):15439-15449, 2012. Miševima su zatim data anti-PACAP antitela Ab1.H, Ab10.H ili Ab10.H3 ili nesrodno kontrolno antitelo i kvantifikovana je njihova averzija prema svetlosti. Rezultati su prikazani na FIG.23-25, FIG.32, i FIG.33A-33B.
[0900] Test averzije prema svetlosti
[0902] [0471] Kao što je opisano u Kaiser et al., komore za testiranje bile su otvoreno polje od pleksiglasa (27 cm širina × 27 cm dubina × 20.3 cm visina) koje sadrže tri seta infracrvenih nizova od 16 svetlosnih snopova (sva seta upravnih svetlosnih snopova koji se ukrštaju na visini od 1.0 cm da bi se detektovao položaj i kretanje miševa, i treći svetlosni snop se ukršta sa širinom komore na visini od 7.3 cm da bi se detektovala vertikalna aktivnost). Polje je bilo podeljeno na dve jednake zone tamnim umetkom, koji je petostrana, crna kutija od pleksiglasa sa vrhom, ali bez poda. Upotreba infracrvenih svetlosnih snopova omogućila je praćenje u obe zone. Otvor (5.2 cm × 6.8 cm) u tamnom umetku omogućavao je slobodno kretanje između zona. Iako je tamni umetak blokirao direktnu svetlost, mala količina svetlosti je i dalje mogla da prođe kroz otvor. Svaka komora za testiranje bila je smeštena unutar kabine za prigušivanje zvuka (56 cm širina × 38 cm dubina × 36 cm visina) sa ventilatorom za ventilaciju (Med Associates, Inc.<®>, St. Albans, VT). Za snimanje podataka iz šest komora korišćen je računar koji koristi program Activity Monitor v6.02 (Med Associated Inc.).
[0903] Za svaku komoru, LED panel je spojen sa plafonom kabine za prigušivanje zvuka. LED panel sadržao je 36 kolimirane LED diode od 1 vata (5500k bela svetlost) (LEDwholesalers.com, Burlingame, CA). Da bi se kontrolisao intenzitet svetlosti, svaki LED panel je bio povezan sa dimabilnim LED drajverom (LINEARdrive<®>; eldoLED America Inc., San Jose, CA) što je dovelo do potencijalnog opsega intenziteta svetlosti od 3.0×10<2>do 2.7×10<4>lx. Nivoi su dodatno oslabljeni na 5.5×10<1>lx korišćenjem voštanog papira postavljenog na providni pleksiglasni poslužavnik ispod LED dioda. Intenzitet svetlosti je meren pomoću merača svetlosti sa dva displeja sa mogućnošću praćenja (Control Company, Friendswood, TX) postavljenog na pod komore za testiranje. Pri 2.7×10<4>lx, LED svetla su generisala izvesnu toplotu u komori za prigušivanje zvuka, pri čemu je tamna zona bila na ~25 °C, a svetla zona na ~27 °C.
[0904] Na dan eksperimenta, miševi su transportovani iz smeštaja za životinje i ostavljeni su da se aklimatizuju na prostoriju za testiranje (~22 °C) tokom najmanje 30 do 60 minuta uz standardno fluorescentno osvetljenje iznad glave (~200 lx unutar kaveza za smeštaj). Svetla u prostoriji su ostala upaljena, osim ako nije drugačije naznačeno. Pored toga, sva oprema za generisanje zvuka je bila uključena tokom aklimatizacije i ostala je upaljena dok testiranje nije završeno. Ljudsko prisustvo u prostoriji je bilo minimalno tokom aklimatizacije. Testiranje ponašanja je sprovedeno između 08:00 CST i 14:00 CST. Zabeležena su sva abnormalna fizička stanja (npr. nedostatak oka).
[0905] Deset nedelja stari mužjaci i ženke CD1 miševa korišćeni su u studiji (soj #022, Charles River, Wilmington, MA, US). Miševima je dozvoljeno da se oporave od transporta jednu do dve nedelje pre testiranja.
[0907] Aklimatizacija
[0909] Svi miševi su aklimatizovani u prostoriji za testiranje najmanje 30 do 60 minuta pre nego što su smešteni u svetlu/tamnu komoru. Intenzitet svetlosti u komori je početno podešen na 2.7 x 10<3>lx.
[0910] Miševi su testirani trideset minuta u komori svakog dana kada su bili izloženi svetloj/tamnoj komori. Osnovno vreme na svetlosti za svakog miša je dobijeno izlaganjem miševa svetloj/tamnoj komori dva puta, sa periodom odmora od tri dana između osnovnih merenja (FIG.23 i 25, "Osnovna linija1" i "Osnovna linija2," ili "Osnovna linija", tim redom, i FIG.32, "Osnovna linija").
[0912] Lečenje
[0914] Na FIG.25 i 32, miševima je dato 0.6 mg/kg PACAP i.p. injekcijom i odmorili su tokom 30 minuta. Miševi su zatim smešteni u svetlu/tamnu komoru tokom 30 minuta (FIG.25 i 32, "Tretiranje 1"). Nakon perioda odmora od tri dana koje je usledilo nakon ili merenja Osnovne linije 1 i Osnovne linije 2 na FIG.
[0915] 23 ili merenja Tretiranja 1 na FIG.25 i 32, miševima je dato 30 mg/kg ili anti-PACAP antitela ili kontrolnog IgG antitela (antitelo negativne kontrole koje ima isti okvir kao testirana antitela i koji prepoznaje digoksigenin) i.p. injekcijom. Miševi su zatim vraćeni u svoj kućni kavez da se odmaraju jedan dan (24 sata) pre testiranja. Miševima je zatim dato 0.6 mg/kg PACAP ili vehikuluma i.p. injekcijom i odmorili su tokom 30 minuta. Miševi su zatim smešteni u svetlu/tamnu komoru tokom 30 minuta (FIG.
[0916] 23, "Tretiranje" FIG.25 i 32, "Tretiranje 2"). Nakon što je svaki miš izložen svetloj/tamnoj komori, svetla/tamna komora i komponente su očišćeni germicidnim maramicama i osušeni. Oko 5 do 7 minuta nakon što je miš smešten u svetlu/tamnu komoru, sledećem mišu koji se testira ubrizgan je PACAP ili vehikulum, kako je prethodno opisano. Ovaj interval bio je približno vreme potrebno za čišćenje svetle/tamne komore između eksperimenata.
[0918] Merenja pokretljivosti
[0920] Pokretljivost je merena u intervalima od 5 minuta tokom perioda testiranja od 30 minuta, kao što je opisano u Kaiser et al., J. Neurosci., 2012. Ukratko, broj vertikalnih pokreta, kao što je propinjanje, ambulatorno kretanje (cm, ukupno pređena udaljenost tokom ambulatornog kretanje), tranzicije i odmor (procenat vremena provedenog bez probijanja novih snopova), mereni su pomoću svetlosnog snopa. Svi parametri pokretljivosti su normalizovani na vreme provedeno u svakoj zoni kako bi se uzelo u obzir različito vreme provedeno u toj zoni; stoga je sirova vrednost za svaki parametar podeljena vremenom provedenim u toj zoni tokom intervala od 5 min. Vreme provedeno u svakoj komori je analizirano pomoću GraphPad Prism softvera (GraphPad Software, San Diego, CA), i prikazano kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti ("SEM"). Poređenje je izračunato dvosmernom ANOVA sa ponovljenim merenjem, sa Bonferonijevim testom višestrukog poređenja za post-hok analizu.
[0921] Miševi su isključeni na osnovu tri kriterijuma: (1) nakon prva dva izlaganja kutiji, analizirano je osnovno vreme na svetlosti i svaki miš koji je proveo /- jednu standardnu devijaciju srednjeg vremena na svetlosti na osnovnoj liniji je uklonjen iz eksperimenta i nije mu dat tretman lekovima, (2) miševi su isključeni iz analize ako su identifikovani kao statistički autlajeri (kutijasti dijagram, 10-90%), i (3) miševi su isključeni ako su se kretali manje od 10% vremena (kombinovano svetlo i tama).
[0922] U tri eksperimenta u kojima se upoređuje odgovor miševa kojima je dato antitelo Ab1.H, Ab10.H, ili Ab10.H3 radi kontrole IgG, rezultati ukazuju da su miševi kojima je dato anti-PACAP antitelo Ab1.H, Ab10.H, ili Ab10.H3 proveli više vremena na svetlosti u poređenju sa IgG kontrolnim miševima. FIG.23 prikazuje da su se miševi ponašali normalno i slično u oba merenja na osnovnoj liniji. S druge strane, podaci dati na FIG.23 pokazuju da su miševi tretirani kontrolnim IgG antitelom i potom PACAP proveli statistički manje vremena na svetlosti (kvadratići) nego miševi kojima je dato anti-PACAP antitelo Ab1.H i potom PACAP (kružići). (videti, FIG.23, "Tretiranje"). Podaci dati na FIG.25 takođe pokazuju da su se miševi ponašali normalno i slično u merenjima na osnovnoj liniji. S druge strane, podaci dati na FIG. 25 pokazuju da su miševi tretirani kontrolnim IgG antitelom i potom PACAP proveli statistički manje vremena na svetlosti (trouglovi) nego miševi kojima je dato anti-PACAP antitelo Ab10.H i potom PACAP (obrnuti trouglovi). (videti, FIG.25, "Tretiranje 2"). Vreme između svakog merenja, npr., između Osnovne linije i Tretiranja 1 (PACAP samo), npr., između Tretiranja 1 (PACAP samo) i Tretiranja 2 (antitelo, pa zatim PACAP), bilo je tri dana. Podaci dati na FIG.32 takođe pokazuju da su se miševi ponašali normalno i slično u merenjima na osnovnoj liniji. S druge strane, podaci dati na FIG.
[0923] 32 pokazuju da su miševi tretirani kontrolnim IgG antitelom i potom PACAP proveli statistički manje vremena na svetlosti (trouglovi) nego miševi kojima je dato anti-PACAP antitelo Ab10.H3 i potom PACAP (obrnuti trouglovi). (videti, FIG.32, "Tretiranje 2"). Vreme svakog merenja, npr., Osnovna linija i Tretiranje 1 (PACAP samo), npr., Tretiranje 1 (PACAP samo) i Tretiranje 2 (antitelo, pa zatim PACAP), bilo je tri dana. Srednja vrednost ± SEM obezbeđena je za svaki 5-minutni interval. Miševi kojima je dat vehikulum samo su se ponašali kao normalne kontrole. Podaci dati na FIG.24 pokazuju da davanje ili anti-PACAP antitela Ab1.H, ili kontrolnog IgG, i vehikuluma ("Veh PAC Ab" i "Veh Con Ab," tim redom) nije značajno promenilo ponašanje miševa. FIG.24 takođe pokazuje da se prosečno vreme miša na svetlosti smanjilo kada su dati PACAP i kontrolni IgG ("PACAP Con Ab"), dok su se miševima kojima su dati anti-PACAP antitelo Ab1.H i PACAP ponašali normalno, ponašanje bez osetljivosti na svetlost ("PACAP PAC Ab").
[0924] FIG.33A-33B sumiraju podatke prikazane na FIG.32, tako da je ukupno vreme provedeno na svetlu tokom celog perioda posmatranja od 30 minuta za svaku pojedinačnu životinju na osnovnoj liniji, Tretiranje 1 i Tretiranje 2, prikazano za životinje u grupama izotipskih antitela (FIG.33A) i životinje u Ab10.H3 grupama (FIG.33B).
[0926] Primer 12: Epitopsko mapiranje anti-PACAP antitela
[0928] [0481] Kako bi se odredili epitopi sadržani u PACAP za koja se vezuju anti-PACAP antitela ovog pronalaska, korišćeni su eksperimenti skeniranja alanina. Da bi se izveli ovi eksperimenti, PACAP peptidi su sintetizovani sa jednom tačkastom mutacijom na svakom položaju čime je zamenjena nativna aminokiselina sa alaninom ("Ala"), i izmerene su posledice te jedne tačkaste mutacije jer se odnose na afinitet vezivanja PACAP i nekog antitela. Budući da se ostatak alanina već nalazi na položajima 18, 24, i 25 u PACAP divljeg tipa, prema konvenciji, ovi Ala ostaci zamenjeni su valinom ("Val") kako bi se odredili mogući efekti uklanjanja alanina sa ovih položaja na vezivanje predmetnih anti-PACAP antitela za PACAP. Prema uobičajenoj konvenciji, ovi Ala mutanti su obeleženi prema položaju PACAP 1-38 nakon čega sledi slovni kod za supstituisanu aminokiselinu, npr., 10A ukazuje na PACAP 1-38 supstituisan alaninom na aminokiselinskom položaju 10. Vezivanje monoklonalnih antitela za humani PACAP i svaki mutantni peptid je detektovano korišćenjem SPR na PROTEON<™>XRP36 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
[0929] Uzorci i kontrole uzoraka su imobilisane na PROTEON<™>GLC senzorskom čipu (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) na jednoj gustini korišćenjem standardnog aminskog vezivanja. Pufer za elektroforezu korišćen za imobilizaciju bio je DPBS/modifikovani (HYCLONE<™>, GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA) i imobilizacija je sprovedena na 25°C. PROTEON<™>GLC senzorski čip (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) je inicijalizovano i prethodno uslovljeno prema protokolu proizvođača (dvosmerne injekcije 0.5% SDS, 50 mM NaOH, 100 mM HCl). Postupak imobilizacije izveden je korak po korak da bi se osiguralo jedinstveno antitelo na tačkama PROTEON<™>čipa (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Površina čipa aktivirana je sa 1:1 mešavinom 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimida/N-hidroksisukcinimida ("EDAC/NHS") i protok od 30 µL/min x 5 minuta. Uzorci antitela prethodno su dijalizovani ili zamenjeni sa 10 mM HEPES 150 mM NaCl pH 7.2, i koncentracija antitela je kvantifikovana korišćenjem NANODROP<™>2000 spektrofotometra (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Imobilizacija ciljanih 2000-3000 jedinica za reagovanje ("RU"). Uzorci antitela (5 µg/ml) u 10 mM natrijum acetata, pH 5.5, propuštena je sa 30 µL/min x 4 minuta.
[0930] Deaktivacija je postignuta sa protokom od 30 µL/min za 5 minuta korišćenjem 0.3 M etanolamina istovremeno sa sledećom aktivacijom.
[0931] Nakon imobilizacije, pufer za elektroforezu zamenjen je sa 1x PBST (4.3 mM natrijum fosfat, 1.4 mM kalijum fosfat, 135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN<®>) sa 0.2 M arginin HCl (da bi se smanjili nespecifično vezivanje), BSA (0.2 mg/ml, kao nosač) i PROCLIN300<®>(0.005% kao konzervans, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) i površina čipa omogućena je da se ponovo uravnoteži injekcijom novog pufera za elektroforezu. Pripremljeni rastvori humanog PACAP peptida (1-38) i alanin/valin mutantnih peptida (Molekulska(e) masa(e): 4.5 kD) u koncentraciji od 1 mg/ml dodati su puferu za elektroforezu do krajnjih koncentracija od 0.45 µg/ml (100 nM). Ove mešavine su potom korišćene za ispitivanje pojedinačnih tačaka na površini čipa sa protocima od 100 µL/min x 2 minuta i ostavljene su da disociraju tokom 600 sekundi. Površine čipa su regenerisane između analita dodavanjem 0.85% fosforne kiseline. Svako od antitela Ab10, Ab20, Ab21, Ab22, i Ab23 ispitivano je u istim uslovima kao što je ovde opisano.
[0932] Senzorgrami koji predstavljaju podatke afiniteta vezivanje mutantnih peptida za panel antitela ocenjeni su korišćenjem više parametara. Vizuelni pregled je najpre izveden za svaki senzorgram da bi se ocenio očigledni maksimalni odgovor ("R<max>") u odnosu na PACAP peptid divljeg tipa (1-38). Kao drugo, vizuelni pregled faze disocijacije izveden je sa naglaskom na oblik krive u odnosu na PACAP peptid divljeg tipa. Brzine disocijacije (stope disocijacije) izračunate su za PACAP peptid divljeg tipa i vezivanje svakog mutantnog peptida za panel antitela. Konačno, kao kontrolni eksperiment za potvrdu integriteta svake varijante peptida (divljeg tipa ili mutant), afinitet vezivanja svakog člana biblioteke peptida je pojedinačno određen za svaki član panela antitela za koji je bilo poznato da vezuje PACAP divljeg tipa, da bi se osiguralo da je svaki Ala mutant PACAP peptid pokazao afinitet vezivanja koji je bio sličan afinitetu vezivanja PACAP peptida divljeg tipa. Kolektivna procena svih opisanih parametara identifikovala je PACAP aminokiselinske ostatke važne za vezivanje PACAP/antitela.
[0933] Podaci o vezivanju i disocijaciji prikazani su na FIG.26A-30B za vezivanje antitela Ab10, Ab20, Ab21, Ab22 i Ab23 za PACAP divljeg tipa i PACAP mutante. Gornji panel na svakoj slici sadrži podatke vezivanja za ostatke u PACAP za koje se pokazalo da su značajni za vezivanje antitela (obeleženo na desnom kraju grafikona, npr., "10A" pokazuje podatke vezivanja za mutant koji sadrži alanin na položaju 10 u PACAP). Donji panel obezbeđuje podatke koji predstavljaju stepen vezivanja preostalih PACAP mutanata alanina, tj., PACAP mutanti alanina koji se vezuju za ispitivanje sličnosti antitela sa PACAP divljeg tipa. Na osnovu toga, utvrđeno je da ostatak verovatno nije važan za vezivanje antitela. Kao pozitivna kontrola, i gornji i donji paneli za svaku sliku takođe prikazuju podatke o vezivanju dobijene korišćenjem PACAP divljeg tipa (obeleženi huPACAP(1-38)).
[0934] FIG.31A-B sumira položaje PACAP ostataka da doprinesu afinitetu vezivanja antitela na osnovu podataka dobijenih u ovim ispitivanjima skeniranja alanina. Položaji dati u svakoj koloni identifikuju PACAP mutante skeniranja alanina čija je mutacija dovela do smanjenja afiniteta vezivanja PACAP/antitela. Položaji ostataka dati su u koloni 3 na FIG.31A-B prema prostornom rasporedu ostataka duž PACAP primarne sekvence (iz aminokiselinskog ostatka 1-38). Položaji PACAP ostataka koji najviše doprinose vezivanju antitela tumačeni su da zajedno obuhvataju epitope vezane svakim antitelom. Na osnovu podataka dobijenih u ovim ispitivanjima skeniranja alanina, epitopi vezani za svako antitelo zaključuje se da obuhvataju sledeće ostatke:
[0936] (i) Ab10: ostaci 19, 22, 23 i 27 iz humanog PACAP.
[0938] (ii) Ab20: ostaci 19, 22, 23, 24 i 27 iz humanog PACAP.
[0940] (iii) Ab21: ostaci 19, 22, 23 i 27 iz humanog PACAP.
[0942] (iv) Ab22: ostaci 22, 23, 27, 28 i 31 iz humanog PACAP.
[0943] (v) Ab23: ostaci 12, 20, 23, 24, 26, 27 i 28 iz humanog PACAP.
[0945] Dalje je naznačeno na osnovu eksperimentalnih rezultata skeniranja alanina da afinitet svakog od antitela Ab10, Ab20, Ab21, Ab22 i Ab23 za PACAP uključuje ili zavisi od ostataka 19, 22, 23 i/ili 27 humanog PACAP.
[0946] Pored toga, primećeno je da afinitet svakog od antitela Ab22 i Ab23 za PACAP uključuje ili zahteva specifične aminokiselinske ostatke koji su prisutni u humanom PACAP38 divljeg tipa, ali koji nisu prisutni u humanom PACAP27 divljeg tipa, npr., ostaci 28 i 31 iz PACAP38.
[0947] U vezi sa gore navedenim rezultatima skeniranja alanina, humanizovane varijante predmetnih anti-PACAP antitela trebalo bi da uzajamno reaguju sa identičnim ili suštinski identičnim ostacima humanog PACAP, jer humanizacija ne bi trebalo značajno da utiče na specifičnost vezivanja humanizovanog anti-PACAP antitela na humani PACAP u odnosu na matično (nehumanizovano) antitelo. Posebno, Ab10.H, Ab10.H2, Ab10.H3, Ab10.H4, Ab10.H5 i Ab10.H6 trebalo bi da uzajamno reaguju sa istim ostacima na humanom PACAP kao Ab10, a Ab21.H, Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4 bi trebalo da uzajamno reaguju sa istim ostacima na humanom PACAP kao Ab21.
[0948] Antitela koja se vezuju za iste ili preklapajuće epitope na humanom PACAP kao predmetna antitela mogu se proizvesti i identifikovati korišćenjem ovde opisanog postupka. Razumno je očekivati da će antitela koja se vezuju za isti ili preklapajući epitop kao bilo koje od ovde identifikovanih antitela verovatno posedovati sličnu biološku aktivnost, ukoliko ne postoji značajna razlika u kinetici vezivanja. Posebno, takva antitela bi trebalo da antagonizuju jedan ili više bioloških efekata koje izaziva PACAP, analogno primerima anti-PACAP antitela koja se vezuju za ove epitope. Pored toga, očekuje se da će antitela koja se vezuju za ove iste ili preklapajuće epitope, ili podskup njihovih ostataka, imitirati karakteristike vezivanja predmetnih antitela. Na primer, očekuje se da se takva antitela selektivno vezuju za PACAP, a ne vezuju ili se vezuju sa mnogo manjim afinitetom (slabijim) za VIP ili druge peptide unutar ove porodice neuropeptida.
[0950] Primer 13: Efekat anti-PACAP antitela na indukciju lakrimacije i povećanje temperature lica nakon intranazalne primene umbelulona
[0952] [0490] Pokazano je da štetna hemijska stimulacija sluzokože lica pacova povećava protok krvi u licu i intrakranijalni protok krvi, kao i lakrimaciju, kroz aktivaciju trigemino-parasimpatičkog refleksa, i stoga može poslužiti kao eksperimentalni model za vaskularne disfunkcije kod klaster glavobolje, trigeminalne neuralgije i moguće migrene (Gottselig & Messlinger, Cephalalgia 2004, 24, 206-214; Nassini et al., Brain 2012, 135, 376-390; Khan et al., Cephalalgia 2014, 34(5), 382-391). Da bi se ispitao efekat anti-PACAP antitela na intranazalnu lakrimaciju indukovanu iritantom, in vivo test lakrimacije izveden je u modelu pacova. U pomenutom testu, lakrimacija je izazvana intranazalnom primenom umbelulona (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), štetnog hemijskog agensa. Lakrimacija je određena udaljenošću vlaženja na Širmerovim test trakama, kao što je opisano u nastavku, a meren je efekat anti-PACAP ili anti-PAC1R antitela na pomenutu lakrimaciju. Pored toga, intranazalno davanje umbelulona dovelo je do porasta temperature kože na nosu životinja kao što je izmereno IR termometrom. Nisu primećene promene temperature na jastučićima stopala nakon davanja umbelulona. Efekat anti-PACAP ili anti-PAC1R antitela na promene temperature kože na nosu takođe je praćen Ova merenja efekata umbelulona na lakrimaciju i temperaturu lica predstavljaju, koliko je poznato podnosiocima zahteva, prvi model koji prikazuje antagonizam endogeno oslobođenog PACAP upotrebom hemijskog stimulanta.
[0953] Za ovo ispitivanje korišćeno je 60 mužjaka SPRAGUE DAWLEY<®>pacova (Envigo, Huntingdon, Cambridgeshire, United Kingdom) plus 3 dodatna pacova za randomizaciju. Masa pacova bila je između 250-275 grama u vreme njihovog dolaska, a aklimatizovani su tokom najmanje 7 dana nakon njihovog dolaska u prostor za ispitivanje.
[0954] Na dan ispitivanja -1, pacovi su randomizovani u grupe za tretiranje prema telesnoj masi. Nakon dodeljivanja grupama za tretiranje, pacovi su tretirani anti-PACAP antitelom Ab10.H3, izotip-upareno kontrolno antitelo, ili patentiranim anti-PAC1-R antitelom datim intravenski sa 20mg/kg.
[0955] Na dan ispitivanja 0, pripremljen je sveži umbelulon razblaživanjem ulja umbelulona do 0.2 µmol/kg u 0.5% DMSO u vodi u bočici od ćilibarnog stakla. Širmerove test trake, koje se koriste za merenje proizvodnje suza, modifikovane su isecanjem 2 mm širine od isporučene test trake širine 5mm, što je rezultiralo test trakom širine ~3 mm ("modifikovane Širmerove test trake). Pre doziranja, pacovi su imali temperaturu svog nosa i desnog stopala izmerenu termometra Thermoworks (American Fork, UT) TW2 IR sa emisivnošću podešenom na 0.97. Termometar je držan na ~2.5 cm od nosa ili jastučića stopala radi očitavanja. Životinje su anestezirane sa inhaliranim izofluranom. Nakon anestezije, 50 µl 0.2 µmol umbelulona ili 50 µl 0.5% DMSO (kontrola sa vehikulumom) dato je intranazalno 2 mm u desnu nozdrvu tokom perioda od 5 sekundi.5 minuta nakon intranazalnog doziranja, temperatura pacova je ponovo merena korišćenjem gore opisanog postupka.
[0956] 60 minuta nakon intranazalnog doziranja, pacovi su anestezirani i modifikovana Širmerova test traka je postavljena na medijalnu stranu donjeg desnog kapka u periodu od 5 minuta. Nakon 5 minuta, test traka je očitana na stvaranje suza korišćenjem unapred odštampanih oznaka (milimetarskih podeoka) na traci.
[0957] [0495] Anti-PACAP antitelo Ab10.H3 i patentirano anti-PAC1R antitelo pokazali su statistički značajno smanjenje u proizvodnji suza koje je proizašlo od intranazalnog davanja umbelulona u odnosu na životinje tretirane izotip-uparenim kontrolnim antitelom (FIG.34A-B). Pored toga, životinje tretirane sa Ab10.H3 i anti-PAC1R antitelom koja su data sa umbelulonom pokazale su statistički značajnu nižu temperaturu kože na nosu u odnosu na životinje tretirane izotip-uparenim kontrolnim antitelom i kojima je dat umbelulon (FIG.35A-B). Ovi rezultati pokazuju da anti-PACAP antitelo Ab10.H3 ili patentirano anti-PAC1R antitelo može uspešno da smanji trigeminalni parasimpatički refleks kao što je izmereno pomoću lakrimacije i temperature nosa nakon intranazalnog davanja umbelulona.
[0959] Primer 14: Afiniteti vezivanja anti-PACAP antitela Ab21.H2, Ab21.H3 i Ab21.H4
[0961] Afiniteti vezivanja monoklonalnih antitela za humani PACAP procenjeni su korišćenjem SPR na PROTEON<™>XPR36 (Bio-Rad, Hercules, CA). Antitelo je imobilisano na površini čipova opšteg spajanja amina ("GLC" ili "GLM") (Bio-Rad, Hercules, CA). Serije razblaženja humanog PACAP38 (SEQ ID NO: 1241) pripremljene su u 1 x PBST puferu (4.3 mM Na fosfat, 1.4 mM K fosfat, 135 mM NaCl, 2.7 mM KCl 0.05% Polisorbat-20) kupljenom od Teknova (kat# P1192, Teknova, Hollister, CA) i obogaćenom sa 0.25 M arginina (od J.T. BAKER<®>), 0.2 mg/ml BSA (Jackson Immuno Research Labs, West Grove, PA) i 0.005% natrijum azida (VWR International, Radnor, PA), pri čemu je pH podešen na 6.8-7.45 i korišćene su za ispitivanje antitela. Antigen (u opsegu od 1.23 nM do 100 nM) je na uobičajen način ispitan sekvencijalno sa vremenom asocijacije od 2-4 minuta i vremenom disocijacije od 3-120 minuta grupisan sa PROTEON<™>upravljačkim softverom (v3.1.0.6 (Bio-Rad, Hercules, CA)) i podešen korišćenjem 1:1 Langmuir modela vezivanja. Površine su regenerisane između ispitivanja analita korišćenjem 0.85% fosforne kiseline, 0.5% SDS i 0.1N NaOH. Jedna K<D>izračunata je za svako antitelo sa vremenom asocijacije ograničenim blisko brzini difuzije (1.0 X 10<6>) i vremenom disocijacije ograničenim na 1.5 X 10-
[0962] <5>gde nije primećena primetna disocijacija.
[0963] Isti postupak je korišćen za određivanje afiniteta vezivanja antitela za humani VIP (SEQ ID NO: 1243) i PACAP27 (SEQ ID NO: 1242) iako su koncentracije peptida bile u rasponu od 1.23 nM do 1000 nM sa vremenom asocijacije od 240 sekundi i vremenom disocijacije od 3-120 minuta.
[0964] Izmereni afiniteti antitela za PACAP38 navedeni su u Tabeli 11.
[0966] TABELA 11
[0967] Konstante afiniteta antitela za PACAP38
[0969] Antitelo ka (1/Ms) kd (1/s) K<D>(M)
[0970] Ab21.H2 5.86E+05 1.00E-05 1.71E-11
[0971] Ab21.H3 4.49E+05 1.00E-05 2.23E-11
[0972] Ab21.H4 4.20E+05 1.00E-05 2.38E-11
[0974] Primeri konstanti afiniteta antitela za VIP navedeni su u Tabeli 12.
[0976] TABELA 12

Claims (14)

1. Konstante afiniteta antitela za VIP
Antitelo ka (1/Ms) kd (1/s) K<D>(M)
Ab21.H2 4.88E+04 1.10E-02 2.25E-07
Ab21.H3 5.87E+04 2.49E-02 4.24E-07
Ab21.H4 5.53E+04 2.89E-02 5.23E-07
[0500] Primeri konstanti afiniteta antitela za PACAP27 navedeni su u Tabeli 13.
TABELA 13
Konstante afiniteta antitela za PACAP27
Antitelo ka (1/Ms) kd (1/s) K<D>(M)
Ab21.H2 4.30E+05 1.00E-05 2.33E-11
Ab21.H3 3.22E+05 1.00E-05 3.11E-11
Ab21.H4 2.85E+05 1.00E-05 3.51E-11
Patentni zahtevi
1. Humanizovano antitelo protiv peptida koji aktivira hipofiznu adenilat ciklazu ("PACAP") pri čemu:
(1) antitelo ima (a) sekvencu teškog lanca koja obuhvata varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 962 i (b) sekvencu lakog lanca koja obuhvata varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 982;
(2) antitelo ima (a) sekvencu teškog lanca koja obuhvata varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282 i (b) sekvencu lakog lanca koja obuhvata varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1302;
(3) antitelo ima (a) sekvencu teškog lanca koja obuhvata varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322 i (b) sekvencu lakog lanca koja obuhvata varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342;
(4) antitelo ima (a) sekvencu teškog lanca koja obuhvata varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1362 i (b) sekvencu lakog lanca koja obuhvata varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1382; ili
(5) antitelo ima (a) sekvencu teškog lanca koja obuhvata varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402 i (b) sekvencu lakog lanca koja obuhvata varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422.
2. Humanizovano anti-PACAP antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ima (a) sekvencu teškog lanca koja obuhvata varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 962 i (b) sekvencu lakog lanca koja obuhvata varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 982.
3. Humanizovano anti-PACAP antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ima (a) sekvencu teškog lanca koja obuhvata varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282 i (b) sekvencu lakog lanca koja obuhvata varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1302.
4. Humanizovano anti-PACAP antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ima (a) sekvencu teškog lanca koja obuhvata varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322 i (b) sekvencu lakog lanca koja obuhvata varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342.
5. Humanizovano anti-PACAP antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ima (a) sekvencu teškog lanca koja obuhvata varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1362 i (b) sekvencu lakog lanca koja obuhvata varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1382.
6. Humanizovano anti-PACAP antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ima (a) sekvencu teškog lanca koja obuhvata varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402 i (b) sekvencu lakog lanca koja obuhvata varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422.
7. Humanizovano anti-PACAP antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ima (a) sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 961 koja se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 962 vezanog za konstantni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 970 i (b) sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 981 koja se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 982 vezanog za konstantni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 990.
8. Humanizovano anti-PACAP antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ima (a) sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 1281 koja se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1282 vezanog za konstantni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1290 i (b) sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 1301 koja se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO:
1302 vezanog za konstantni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1310.
9. Humanizovano anti-PACAP antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ima (a) sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 1321 koja se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1322 vezanog za konstantni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1330 i (b) sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 1341 koja se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1342 vezanog za konstantni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1350.
10. Humanizovano anti-PACAP antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ima (a) sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 1361 koja se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1362 vezanog za konstantni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1370 i (b) sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 1381 koja se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1382 vezanog za konstantni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1390.
11. Humanizovano anti-PACAP antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ima (a) sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 1401 koja se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 1402 vezanog za konstantni region teškog lanca iz SEQ ID NO: 1410 i (b) sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu iz SEQ ID NO: 1421 koja se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 1422 vezanog za konstantni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 1430.
12. Humanizovano anti-PACAP antitelo prema bilo kom od zahteva 1-11, koje je eksprimirano ili izolovano iz Pichia pastoris ili CHO ćelije koja eksprimira humanizovano anti-PACAP antitelo.
13. Humanizovano anti-PACAP antitelo prema bilo kom od zahteva 1-12 za upotrebu u lečenju ili prevenciji migrene ili glavobolje.
14. Humanizovano anti-PACAP antitelo prema bilo kom od zahteva 1-12 za upotrebu prema zahtevu 13, pri čemu se pomenuta glavobolja ili migrena može izabrati iz grupe koju čine migrena sa aurom, migrena bez aure, hemiplegična migrena, klaster glavobolja, migrenozna neuralgija, hronična glavobolja, hronična migrena, glavobolja zbog prekomerne upotrebe lekova i tenziona glavobolja.
RS20251190A 2016-04-15 2017-04-14 Humanizovana anti-pacap antitela i njihove upotrebe RS67475B1 (sr)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662322939P 2016-04-15 2016-04-15
US201662323573P 2016-04-15 2016-04-15
US201662323495P 2016-04-15 2016-04-15
US201662322957P 2016-04-15 2016-04-15
US201662366902P 2016-07-26 2016-07-26
US201662408347P 2016-10-14 2016-10-14
PCT/US2017/027669 WO2017181039A1 (en) 2016-04-15 2017-04-14 Humanized anti-pacap antibodies and uses thereof
EP17783258.1A EP3426686B1 (en) 2016-04-15 2017-04-14 Humanized anti-pacap antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67475B1 true RS67475B1 (sr) 2025-12-31

Family

ID=60039434

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20251190A RS67475B1 (sr) 2016-04-15 2017-04-14 Humanizovana anti-pacap antitela i njihove upotrebe

Country Status (17)

Country Link
US (9) US10913783B2 (sr)
EP (3) EP3426288A4 (sr)
JP (2) JP2019515671A (sr)
KR (2) KR102444717B1 (sr)
CN (2) CN109311977B (sr)
AU (3) AU2017250815B2 (sr)
CA (2) CA3020990A1 (sr)
ES (1) ES3051716T3 (sr)
HR (1) HRP20251476T1 (sr)
IL (2) IL262092B2 (sr)
MX (1) MX2018012470A (sr)
PL (1) PL3426686T3 (sr)
RS (1) RS67475B1 (sr)
SG (4) SG11201808630WA (sr)
SM (1) SMT202500438T1 (sr)
TW (2) TW201738272A (sr)
WO (2) WO2017181031A2 (sr)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12533312B2 (en) 2011-02-04 2026-01-27 Seed Health, Inc. Method and system for preventing sore throat in humans
US12257272B2 (en) 2015-12-24 2025-03-25 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual
US11844720B2 (en) 2011-02-04 2023-12-19 Seed Health, Inc. Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis
US11951140B2 (en) 2011-02-04 2024-04-09 Seed Health, Inc. Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease
US11951139B2 (en) 2015-11-30 2024-04-09 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US12279989B2 (en) 2011-02-04 2025-04-22 Seed Health, Inc. Method and system for increasing beneficial bacteria and decreasing pathogenic bacteria in the oral cavity
US11998479B2 (en) 2011-02-04 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for addressing adverse effects on the oral microbiome and restoring gingival health caused by sodium lauryl sulphate exposure
US12005085B2 (en) 2013-12-20 2024-06-11 Seed Health, Inc. Probiotic method and composition for maintaining a healthy vaginal microbiome
US11833177B2 (en) 2013-12-20 2023-12-05 Seed Health, Inc. Probiotic to enhance an individual's skin microbiome
US11826388B2 (en) 2013-12-20 2023-11-28 Seed Health, Inc. Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation
US11998574B2 (en) 2013-12-20 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for modulating an individual's skin microbiome
US12329783B2 (en) 2013-12-20 2025-06-17 Seed Health, Inc. Method and system to improve the health of a person's skin microbiome
US12246043B2 (en) 2013-12-20 2025-03-11 Seed Health, Inc. Topical application to treat acne vulgaris
US11980643B2 (en) 2013-12-20 2024-05-14 Seed Health, Inc. Method and system to modify an individual's gut-brain axis to provide neurocognitive protection
US11969445B2 (en) 2013-12-20 2024-04-30 Seed Health, Inc. Probiotic composition and method for controlling excess weight, obesity, NAFLD and NASH
US11839632B2 (en) 2013-12-20 2023-12-12 Seed Health, Inc. Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris
US10899834B2 (en) 2015-04-16 2021-01-26 H. Lundbeck A/S Anti-PACAP antibodies
KR102444717B1 (ko) 2016-04-15 2022-09-16 하. 룬드벡 아크티에셀스카브 인간화 항-pacap 항체 및 그의 용도
EP3732203A4 (en) 2017-12-28 2021-12-15 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. ANTIBODIES AND THEIR VARIANTS DIRECTED AGAINST PD-L1
US20220363770A1 (en) 2019-06-28 2022-11-17 Amgen Inc. Anti-cgrp receptor/anti-pac1 receptor bispecific antigen binding proteins
WO2021108500A1 (en) 2019-11-26 2021-06-03 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education T cell receptors targeting mutations in rna splicing factors
CN114980862A (zh) * 2019-12-17 2022-08-30 拜尔哈文制药股份有限公司 Cgrp抑制剂的鼻内药物组合物
US20230348557A1 (en) 2020-02-06 2023-11-02 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education T cell receptors Targeting Defective DNA Repair Proteins
US10822379B1 (en) 2020-03-12 2020-11-03 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Molecules that bind to SARS-CoV-2
EP4147701A4 (en) * 2020-05-08 2024-06-12 Kagoshima University Antidepressant/anxiolytic drug in which pac1 receptor antagonist is used
WO2022109077A1 (en) * 2020-11-19 2022-05-27 Biohaven Pharmaceutical Holding Company Ltd. Compositions for improved delivery of cgrp inhibitors
CN113237873B (zh) * 2021-03-31 2022-11-29 西南科技大学 一种快速检测芬太尼含量的试剂及便携式检测设备
CN113239599A (zh) * 2021-06-15 2021-08-10 江苏理工学院 基于bp神经网络的智能轮胎磨损寿命预估方法及装置
PE20240809A1 (es) * 2021-07-29 2024-04-18 Cephalon Llc Composiciones y metodos de los anticuerpos anti-pacap
WO2023051786A1 (zh) * 2021-09-30 2023-04-06 江苏恒瑞医药股份有限公司 特异性结合cgrp和pacap的抗原结合分子及其医药用途
US20240092880A1 (en) * 2021-10-04 2024-03-21 Mark Hasleton Treatment of migraine
CN120693346A (zh) * 2023-02-14 2025-09-23 H.隆德贝克有限公司 阿片类药物诱发性疼痛的治疗
CR20250530A (es) 2023-06-23 2026-01-12 H Lundbeck As Tratamiento combinado
WO2025212730A1 (en) * 2024-04-02 2025-10-09 Nitrase Therapeutics, Inc. Ny39 alpha-synuclein antibodies and methods of use thereof
CN120192418B (zh) * 2025-04-08 2026-04-24 无锡傲锐东源生物科技有限公司 抗鼠免疫球蛋白G2b亚型（IgG2b）的兔单克隆抗体mAb8及其应用

Family Cites Families (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4579821A (en) 1981-11-23 1986-04-01 University Patents, Inc. Control of DNA sequence transcription
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
ATE135397T1 (de) 1988-09-23 1996-03-15 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
WO1990006952A1 (fr) 1988-12-22 1990-06-28 Kirin-Amgen, Inc. Facteur de stimulation de colonies de granulocytes modifies chimiquement
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5766883A (en) 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
US5198542A (en) 1989-06-20 1993-03-30 Takeda Chemical Industries, Inc. Dna encoding a pitvitary adenylate cyclase activating protein and use thereof
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
CA2077764C (en) * 1990-03-17 2002-12-10 Nobuhiro Suzuki Antibody to pacap and use thereof
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
FR2669336B1 (fr) 1990-11-20 1993-01-22 Adir Nouveaux derives d'oxazolo pyridines, leurs procedes de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5776427A (en) 1992-03-05 1998-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting the vasculature of solid tumors
DK0752248T3 (da) 1992-11-13 2000-11-13 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimæriske og radioaktivt mærkede antistoffer mod humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantig
US5604260A (en) 1992-12-11 1997-02-18 Merck Frosst Canada Inc. 5-methanesulfonamido-1-indanones as an inhibitor of cyclooxygenase-2
EP0618291A3 (en) 1993-02-26 1997-12-03 Takeda Chemical Industries, Ltd. PACAP receptor protein, method for preparing said protein, and use thereof
US5409944A (en) 1993-03-12 1995-04-25 Merck Frosst Canada, Inc. Alkanesulfonamido-1-indanone derivatives as inhibitors of cyclooxygenase
AU6445894A (en) 1993-03-19 1994-10-11 Duke University Method of treatment of tumors with an antibody binding to tenascin
US5436265A (en) 1993-11-12 1995-07-25 Merck Frosst Canada, Inc. 1-aroyl-3-indolyl alkanoic acids and derivatives thereof useful as anti-inflammatory agents
US5474995A (en) 1993-06-24 1995-12-12 Merck Frosst Canada, Inc. Phenyl heterocycles as cox-2 inhibitors
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US6399316B1 (en) 1994-02-25 2002-06-04 Takeda Chemical Industries, Ltd. PACAP receptor protein, method for preparing said protein, and use thereof
US5475995A (en) 1994-05-16 1995-12-19 Livingston; George G. Truck spare tire locking rod
US5616601A (en) 1994-07-28 1997-04-01 Gd Searle & Co 1,2-aryl and heteroaryl substituted imidazolyl compounds for the treatment of inflammation
DE69534530T2 (de) 1994-08-12 2006-07-06 Immunomedics, Inc. Für b-zell-lymphom und leukämiezellen spezifische immunkonjugate und humane antikörper
US5521213A (en) 1994-08-29 1996-05-28 Merck Frosst Canada, Inc. Diaryl bicyclic heterocycles as inhibitors of cyclooxygenase-2
US5593994A (en) 1994-09-29 1997-01-14 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Prostaglandin synthase inhibitors
US5552422A (en) 1995-01-11 1996-09-03 Merck Frosst Canada, Inc. Aryl substituted 5,5 fused aromatic nitrogen compounds as anti-inflammatory agents
US5639780A (en) 1995-05-22 1997-06-17 Merck Frosst Canada, Inc. N-benzyl indol-3-yl butanoic acid derivatives as cyclooxygenase inhibitors
US5604253A (en) 1995-05-22 1997-02-18 Merck Frosst Canada, Inc. N-benzylindol-3-yl propanoic acid derivatives as cyclooxygenase inhibitors
US5510368A (en) 1995-05-22 1996-04-23 Merck Frosst Canada, Inc. N-benzyl-3-indoleacetic acids as antiinflammatory drugs
CA2221637A1 (en) 1995-06-06 1996-12-12 Steven M. Ruben Human g-protein receptor hcegh45
EP0941327A1 (en) 1996-12-02 1999-09-15 Human Genome Sciences, Inc. Human g-protein receptor hcegh45, a pacap-like (g-protein pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-like) receptor
EP1068347A1 (en) * 1998-04-03 2001-01-17 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the diagnosis and treatment of neuropsychiatric disorders
US20020155533A1 (en) 1998-11-30 2002-10-24 Takeda Chemical PACAP receptor protein, method for preparing said protein, and use thereof
CA2379604A1 (en) 1999-09-28 2001-04-05 Bayer Corporation Pituitary adenylate cyclase activating peptide (pacap) receptor 3 (r3) agonists and their pharmacological methods of use
US20020182729A1 (en) 2001-01-11 2002-12-05 Dicicco-Bloom Emanuel Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) is an anti-mitogenic signal for selected neuronal precursors in vivo
BRPI0209933B8 (pt) 2001-05-24 2021-05-25 Zymogenetics Inc proteína de fusão, e, molécula de ácido nucleico
AU2003233451A1 (en) 2002-03-26 2003-10-13 Massachusetts Institute Of Technology Targets, methods, and reagents for diagnosis and treatment of schizophrenia
AU2003228050A1 (en) 2002-05-03 2003-11-17 Neuronova Ab Therapeutic use of PACAP, Maxadilan, PACAP receptor agonist and/or ADCYAP1R1 in the treatment of CNS disorders
PL377025A1 (pl) 2002-07-12 2006-01-23 Bayer Pharmaceuticals Corporation Agoniści receptora peptydu aktywującego przysadkową cyklazę adenylową (PACAP) -VPAC2 i ich farmakologiczne sposoby zastosowania
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
WO2004062684A2 (en) * 2003-01-16 2004-07-29 D. Collen Research Foundation Vzw Onderwijs En Navorsing Campus Gasthuisberg K.U. Leuven Treatment of thrombocytopenia with inhibitors of pacap
CA2541651C (en) 2003-10-22 2011-05-24 Keck Graduate Institute Methods of synthesizing heteromultimeric polypeptides in yeast using a haploid mating strategy
US20080070239A1 (en) * 2003-10-29 2008-03-20 University Of Rochester Detection of neureopeptides associated with pelvic pain disorders and uses thereof
US20050129687A1 (en) * 2003-11-03 2005-06-16 University Of Vermont And State Agricultural College Use of inhibitors of PACAP receptor activity for treatment of overactive bladder and pelvic floor pain syndrome
KR20070009554A (ko) 2004-01-27 2007-01-18 바이엘 파마슈티칼스 코포레이션 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 펩티드(ｐａｃａｐ) 수용체 (ｖｐａｃ２) 작용제 및 이의약리학적 사용 방법
US20070202099A1 (en) 2004-03-30 2007-08-30 Hiroshi Inooka Antibody Drug
MX2007004676A (es) 2004-10-27 2007-11-14 Univ Denver Analogos de la hormona adrenocorticotropica y metodos relacionados.
US20100068208A1 (en) 2005-04-28 2010-03-18 Kazuhiro Ogi Degranulation inhibitor
BRPI0610203A2 (pt) 2005-05-24 2010-06-01 Avestha Gengraine Tech Pvt Ltd processo de preparação in vivo de anti-corpo monoclonal anti-cd 20 biologicamente ativo e composição farmacêutica
JP5276982B2 (ja) 2005-08-26 2013-08-28 ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ オキシトシンの投与による頭痛の処置のための方法
EP3069731A1 (en) 2005-11-14 2016-09-21 Labrys Biologics Inc. Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same
EP2021463B1 (en) 2006-05-19 2016-11-23 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Culture method for obtaining a clonal population of antigen-specific b cells
US20100112601A1 (en) 2006-08-08 2010-05-06 Kyoto University Novel monoclonal antibody and use of the same
EP2460828A3 (en) 2006-11-10 2012-08-08 UCB Pharma, S.A. Antibodies and diagnostics
US8466118B2 (en) * 2007-04-23 2013-06-18 Saint Louis University Modulation of blood brain barrier protein expression
DK2164514T3 (en) 2007-05-21 2017-02-27 Alderbio Holdings Llc Antibodies to IL-6 and its use
TW201531484A (zh) 2007-05-21 2015-08-16 Alder Biopharmaceuticals Inc 抗ＴＮＦ-α之抗體及其用途
KR20170036814A (ko) 2007-05-21 2017-04-03 앨더바이오 홀딩스 엘엘씨 신규한 래빗 항체 인간화 방법 및 인간화된 래빗 항체
US20100104530A1 (en) * 2007-06-26 2010-04-29 Kathleen Freson Anti-vpac1 antibodies and their uses
EP2009026A1 (en) 2007-06-29 2008-12-31 ThromboGenics N.V. Anti-VPAC1 antibodies and their uses
KR102055873B1 (ko) 2007-07-09 2019-12-13 제넨테크, 인크. 폴리펩티드의 재조합 생산 동안의 디술피드 결합 환원의 방지
WO2009033489A2 (en) 2007-09-11 2009-03-19 Glostrup Hospital Selective pacl inhibitors for use in the treatment of migraine and headaches
PT2592148T (pt) 2007-10-12 2018-11-12 Hoffmann La Roche Expressão proteica de múltiplos ácidos nucleicos
BRPI0914251B1 (pt) * 2008-06-25 2022-07-19 Novartis Ag Imunoligante recombinante, seu fragmento de ligação ao antígeno, uso dos mesmos, e composição
US10611835B2 (en) 2008-07-10 2020-04-07 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and prevention of cancer
WO2010007175A2 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Galderma Research & Development Pacap signaling pathway modulators for treating inflammatory skin diseases with a neurogenic component, and more particularly rosacea and composition containing them
JP5172020B2 (ja) * 2008-11-12 2013-03-27 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 癌のマーカーとしてのｐａｃａｐ
WO2010064454A1 (ja) 2008-12-05 2010-06-10 株式会社カイオム・バイオサイエンス 細胞表面に発現したタンパク質に対する抗体作製法
JO3382B1 (ar) 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
US8609097B2 (en) 2009-06-10 2013-12-17 Hoffmann-La Roche Inc. Use of an anti-Tau pS422 antibody for the treatment of brain diseases
CN102740884A (zh) 2009-08-28 2012-10-17 瑞纳神经科学公司 通过施用针对降钙素基因相关肽的拮抗性抗体来治疗内脏痛的方法
JP5444088B2 (ja) 2010-03-31 2014-03-19 川崎重工業株式会社 バルブプレート、並びにこれを備えたアキシャルピストン式油圧ポンプ・モータ
CN103080725B (zh) 2010-07-21 2016-08-10 Imec公司 用于确定有效掺杂物分布的方法
EP2646468B1 (en) * 2010-12-01 2018-07-25 AlderBio Holdings LLC Anti-ngf compositions and use thereof
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9939449B2 (en) * 2011-02-01 2018-04-10 The University Of Vermont And State Agricultural College Diagnostic and therapeutic methods and products related to anxiety disorders
TWI705825B (zh) 2011-05-20 2020-10-01 美商艾爾德生物控股有限責任公司 抗降血鈣素基因相關胜肽（ａｎｔｉ－ｃｇｒｐ）或抗降血鈣素基因相關胜肽受器（ａｎｔｉ－ｃｇｒｐ－ｒ）抗體或抗體片段治療或預防慢性及急性型腹瀉之用途
PE20141787A1 (es) 2011-05-20 2014-12-07 Alderbio Holdings Llc Composiciones anti-cgrp y uso de las mismas
CN107827982B (zh) 2011-05-20 2021-07-06 H.伦德贝克公司 抗cgrp抗体和抗体片段用于在有需要的受试者中预防或抑制畏光或厌光的用途
US8524664B2 (en) 2011-06-02 2013-09-03 Colorado Seminary, Which owns and Operates The Univeristy of Denver Methods of treating overproduction of cortisol using ACTH antagonist peptides
US10052316B2 (en) 2011-06-06 2018-08-21 Cardero Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of mitochondrial toxicity
US10112987B2 (en) 2012-01-09 2018-10-30 Icb International, Inc. Blood-brain barrier permeable peptide compositions comprising a vab domain of a camelid single domain heavy chain antibody against an amyloid-beta peptide
US9255154B2 (en) * 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
US20160033504A1 (en) 2013-03-15 2016-02-04 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Protocol for identifying and isolating antigen-specific b cells and producing antibodies to desired antigens
CA2906737C (en) 2013-03-15 2023-08-15 Amgen Inc. Human pac1 antibodies
TWI670279B (zh) 2013-03-15 2019-09-01 Alder Biopharmaceuticals, Inc. 抗體純化及純度監測
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
EP3060579A1 (en) 2013-10-25 2016-08-31 Numab AG Bispecific constructs and their use in the treatment of various diseases
WO2015100353A1 (en) * 2013-12-27 2015-07-02 Dignity Health Diagnosing and treating alzheimer's disease
EP3107569A4 (en) 2014-02-20 2018-02-21 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Anti-acth antibodies and use thereof
US10899834B2 (en) 2015-04-16 2021-01-26 H. Lundbeck A/S Anti-PACAP antibodies
US10822408B2 (en) * 2015-12-15 2020-11-03 Amgen Inc. PACAP antibodies and uses thereof
KR102444717B1 (ko) * 2016-04-15 2022-09-16 하. 룬드벡 아크티에셀스카브 인간화 항-pacap 항체 및 그의 용도
AR113022A1 (es) * 2017-09-29 2020-01-15 Lilly Co Eli Anticuerpo anti-pacap

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017181031A3 (en) 2017-11-09
MX2018012470A (es) 2019-07-01
TW201738272A (zh) 2017-11-01
JP7116685B2 (ja) 2022-08-10
US11938185B2 (en) 2024-03-26
US10202435B2 (en) 2019-02-12
US20170298115A1 (en) 2017-10-19
TWI770020B (zh) 2022-07-11
EP3426686A1 (en) 2019-01-16
ES3051716T3 (en) 2025-12-29
IL262092B (en) 2022-10-01
IL262092B2 (en) 2023-02-01
NZ746720A (en) 2025-05-02
EP3426288A4 (en) 2019-10-30
AU2017250815A1 (en) 2018-10-25
CN109311977B (zh) 2022-06-14
AU2017250807A1 (en) 2018-10-25
US20200181230A1 (en) 2020-06-11
US11352409B2 (en) 2022-06-07
US12545725B2 (en) 2026-02-10
SMT202500438T1 (it) 2026-01-12
US20250009876A1 (en) 2025-01-09
CN109451728A (zh) 2019-03-08
US10913783B2 (en) 2021-02-09
SG11201808632YA (en) 2018-10-30
US20200181229A1 (en) 2020-06-11
IL262095A (en) 2018-11-29
US20170298127A1 (en) 2017-10-19
US10975135B2 (en) 2021-04-13
US10954285B2 (en) 2021-03-23
SG11201808630WA (en) 2018-10-30
KR20190005873A (ko) 2019-01-16
SG10202109689QA (en) 2021-10-28
JP2019513398A (ja) 2019-05-30
SG10202109691UA (en) 2021-10-28
US20210179688A1 (en) 2021-06-17
AU2024200599A1 (en) 2024-02-22
PL3426686T3 (pl) 2026-01-19
CA3020839A1 (en) 2017-10-19
EP3426686B1 (en) 2025-10-08
JP2019515671A (ja) 2019-06-13
EP4640706A2 (en) 2025-10-29
EP4640706A3 (en) 2026-02-18
EP3426686A4 (en) 2019-11-06
WO2017181031A2 (en) 2017-10-19
US20190233498A1 (en) 2019-08-01
CN109311977A (zh) 2019-02-05
WO2017181039A1 (en) 2017-10-19
HRP20251476T1 (hr) 2026-01-02
CA3020990A1 (en) 2017-10-19
IL262092A (en) 2018-11-29
US20200165316A1 (en) 2020-05-28
TW201738273A (zh) 2017-11-01
EP3426686C0 (en) 2025-10-08
US10968268B2 (en) 2021-04-06
KR102444717B1 (ko) 2022-09-16
AU2017250815B2 (en) 2023-11-23
EP3426288A2 (en) 2019-01-16
KR20190005874A (ko) 2019-01-16
US20230125604A1 (en) 2023-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12545725B2 (en) Anti-PACAP antibodies, nucleic acids and methods of making thereof
JP7219308B2 (ja) 抗ｐａｃａｐ抗体及びそれらの使用