ES3053745T3

ES3053745T3 - Neutralization of inhibitory pathways in lymphocytes

Info

Publication number: ES3053745T3
Application number: ES20181825T
Authority: ES
Inventors: Pascale Andre; Mathieu Blery; Carine Paturel; Nicolaï Wagtmann
Original assignee: Innate Pharma SA
Current assignee: Innate Pharma SA
Priority date: 2014-09-16
Filing date: 2015-09-15
Publication date: 2026-01-26
Anticipated expiration: 2035-09-15
Also published as: US11572410B2; KR20230088521A; SG10202008228XA; PL3193931T3; JP2020147572A; CN113929782A; EP3799885A1; HUE051193T2; US20200332008A1; HUE072688T2; DK3193931T3; FI3799885T3; IL250587B; NZ729207A; RU2017105118A; MX2017003303A; KR20170067732A; EP3799885B1; IL250587A0; NZ767837A

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para el tratamiento, la prevención y el diagnóstico de enfermedades mediante compuestos que se unen específicamente a la proteína NKG2A humana y la inhiben, en combinación con compuestos que se unen a la proteína PD-1 humana y la inhiben. La invención también se refiere a ensayos para identificar células NK y/o células T CD8+ infiltrantes en tumores con NKG2A+PD1+. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Neutralización de las vías inhibidoras en los linfocitos

[0003] CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0004] Esta invención se refiere al uso combinado de anticuerpos neutralizantes de NKG2A y anticuerpos neutralizantes de PD-1 para su uso en el tratamiento del cáncer.

[0005] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0006] La actividad de las células NK está regulada por un mecanismo complejo que implica señales tanto activadoras como inhibidoras. Se han identificado varios receptores específicos de NK distintos que desempeñan un papel importante en el reconocimiento mediado por células NK y la destrucción de células diana deficientes en HLA de clase I. Los receptores de citotoxicidad natural (NCR) se refieren a una clase de proteínas receptoras activadoras, y los genes que las expresan, que se expresan específicamente en células NK. Ejemplos de NCR incluyen NKp30, NKp44 y NKp46 (véase, por ejemplo, Lanier (2001) Nat Immunol 2:23-27, Pende y col. (1999) J Exp Med. 190:1505-1516, Cantoni y col. (1999) J Exp Med. 189:787-796, Sivori y col. (1997) J. Exp. Med.

[0007] 186:1129-1136, Pessino y col. (1998) J Exp Med. 188(5): 953-60; Mandelboim y col. (2001) Nature 409:1055-1060). Estos receptores son miembros de la superfamilia de las Ig, y su reticulación, inducida por mAb específicos, conduce a una fuerte activación de las células NK, que da como resultado un aumento de los niveles de Ca<++>intracelular, activación de la citotoxicidad y liberación de linfoquinas, y una activación de la citotoxicidad NK contra muchos tipos de células diana.

[0008] CD94/NKG2A es un receptor inhibidor encontrado en subconjuntos de linfocitos. CD94/NKG2A restringe la liberación de citoquinas y las respuestas citotóxicas de ciertos linfocitos hacia células que expresan el ligando HLA-E de CD94/NKG2A (véase, por ejemplo, W099/28748). También se ha observado que HLA-E es secretado en forma soluble por ciertas células tumorales (Derre y col., J Immunol 2006; 177:3100-7) y células endoteliales activadas (Coupel y col., Blood 2007; 109:2806-14). Los anticuerpos que inhiben la señalización de CD94/NKG2A pueden aumentar la liberación de citoquinas y la actividad citolítica de los linfocitos hacia células diana positivas para HLA-E, tales como las respuestas de células NK positivas para CD94/NKG2A hacia células tumorales que expresan HLA-E o células infectadas por virus. Por lo tanto, los anticuerpos terapéuticos que inhiben CD94/NKG2A, pero que no provocan la muerte de células que expresan CD94/NKG2A (es decir, anticuerpos no deplecionantes), pueden inducir el control del crecimiento tumoral en pacientes con cáncer.

[0009] PD-1 es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28 que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. El PD-1 se expresa en células B activadas, células T y células mieloides (Okazaki y col. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett y col. (2003) J Immunol 170:711-8). Se han identificado dos ligandos para PD-1 , PD-L1 y PD-L2, que se ha demostrado que regulan negativamente la activación de células T tras la unión a PD-1 (Freeman y col. (2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman y col. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Cárter y col. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 es abundante en una variedad de cánceres humanos (Dong y col. (2002) Nat. Med. 8:787-9). La interacción entre PD-1 y PD-L1 da como resultado una disminución en los linfocitos infiltrantes de tumores, una disminución en la proliferación mediada por receptores de células T y una evasión inmunitaria por las células cancerosas. La supresión inmunitaria puede invertirse inhibiendo la interacción local de PD-1 con PD-L1, y el efecto es aditivo cuando la interacción de PD-1 con PD-L2 también se bloquea.

[0010] Perez-Gracia y col. (2014, Current Opinión in Immunology, 27, 89-97) es una revisión científica relacionada con el bloqueo del punto de control inmunitario para inmunoterapia del cáncer. Katou y col. (2007, Cáncer Research, 67(23), 11195-11201) se refiere a la determinación de la expresión de PD-1, NKG2A, NKG2D, CD69 y Ki-67 en linfocitos intraepiteliales y estromales en cáncer de lengua en estadio temprano.

[0011] El bloqueo de PD-1 ha dado como resultado impresionantes respuestas antitumorales en numerosos ensayos clínicos. Sin embargo, no todos los pacientes responden al tratamiento con respuestas antitumorales y, además, algunos pacientes tienen cánceres que recidivan después del tratamiento. Por consiguiente, se advierte la necesidad en la técnica de un beneficio mejorado para pacientes tratados con inhibidores del eje de PD-1.COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

[0012] [0007]La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas. La presente invención proporciona métodos mejorados para potenciar una respuesta inmunitaria antitumoral a través de la neutralización combinada de los receptores inhibidores NKG2A y PD-1 mediante el uso de anticuerpos, siempre que los métodos de tratamiento formen parte de la invención, deben leerse como la combinación de anticuerpo neutralizante contra NKG2A humano con anticuerpo que neutraliza el PD-1 humano para su uso en el tratamiento del cáncer. Aunque las células CD8T y las células NK (en la periferia) no expresan tanto NKG2A como PD-1, se ha observado que los linfocitos infiltrantes de tumores que median en la eliminación de células tumorales son capaces de expresar tanto el receptor inhibidor PD-1 como el receptor inhibidor NKG2A. Asimismo, el tratamiento con anti-PD1 puede provocar la regulación al alza de los receptores NKG2A en linfocitos infiltrantes de tumores, de manera que NKG2A puede restringir la eficacia de agentes que bloquean el eje de PD1. Puesto que estos receptores pueden restringir las actividades citotóxicas de los linfocitos infiltrantes de tumores, la neutralización de la actividad inhibidora de ambos de estos dos receptores mediante anticuerpos permite que las células NKG2A+PD1+ eliminen eficazmente las células cancerosas. En una realización, las células NKG2A+PD1+ son linfocitos citotóxicos, opcionalmente, células T CD8+ o células NK.

[0013] La inhibición o neutralización de la actividad inhibidora de PD-1 puede implicar, ventajosamente, el uso de un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo, un polipéptido fusionado a un dominio Fe, una inmunoadhesina, etc.) que previene la señalización de PD-1 inducida por PD-L1, por ejemplo, bloqueando la interacción con su ligando natural PD-L1 (y, opcionalmente, bloqueando, además, la interacción entre PD-1 y PD-L2. En un aspecto, el polipéptido es un anticuerpo que se une a PD-1 (un anticuerpo anti-PD-1); dicho anticuerpo puede bloquear la interacción entre PD-1 y PD-L1 y/o entre PD-1 y PD-L2. En otro aspecto, el polipéptido es un anticuerpo que se une a PD-L1 (un anticuerpo anti-PD-L1) y bloquea la interacción entre PD-1 y PD-L1.

[0014] Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona un anticuerpo que neutraliza NKG2A humano para su uso en el tratamiento de un cáncer en un paciente humano, comprendiendo el tratamiento administrar al paciente una cantidad eficaz de cada uno de: (a) un anticuerpo que neutraliza NKG2A humano, y (b) un anticuerpo que neutraliza PD-1 humano. Como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se proporciona un método para tratar o prevenir un cáncer en un individuo, comprendiendo el método administrar a un individuo: (a) una cantidad terapéuticamente activa de un compuesto que inhibe un polipéptido NKG2A humano, y (b) una cantidad terapéuticamente activa de un compuesto que inhibe un polipéptido PD-1 humano.

[0015] En una realización, el cáncer es un tumor sólido. El compuesto que inhibe un polipéptido NKG2A humano es un anticuerpo que neutraliza la actividad inhibidora de NKG2A. En una realización, el anticuerpo que neutraliza un polipéptido PD-1 humano es un anticuerpo anti-PD-1 o anti-PDL-1.

[0016] Como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se proporciona un método para activar o potenciar la actividad de una célula T infiltrante de tumor CD8+ en un individuo, comprendiendo el método administrar a un individuo: (a) una cantidad terapéuticamente activa de un compuesto que inhibe un polipéptido NKG2A humano, y (b) una cantidad terapéuticamente activa de un compuesto que inhibe un polipéptido PD-1 humano. Como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se proporciona un método para activar o potenciar la actividad de una célula NK infiltrante de tumor en un individuo, comprendiendo el método administrar a un individuo: (a) una cantidad terapéuticamente activa de un compuesto que inhibe un polipéptido NKG2A humano, y (b) una cantidad terapéuticamente activa de un compuesto que inhibe un polipéptido PD-1 humano.

[0017] En un aspecto, el tratamiento comprende administrar una combinación de un anticuerpo que neutraliza la actividad inhibidora de NKG2A, y un anticuerpo que neutraliza la actividad inhibidora de PD-1.

[0018] En un aspecto, se proporciona una composición que comprende un anticuerpo que inhibe un polipéptido NKG2A humano y un anticuerpo que inhibe un polipéptido PD-1 humano para su uso en el tratamiento de un cáncer, opcionalmente, un tumor sólido, opcionalmente, una neoplasia maligna hematológica. En un aspecto útil para comprender la divulgación, la composición es para su uso en la prevención de un cáncer, opcionalmente, un tumor sólido, opcionalmente, una neoplasia maligna hematológica.

[0019] En una realización, el anticuerpo anti-NKG2A se administra en una cantidad que da como resultado la neutralización de la actividad inhibidora de CD94/NKG2A humano en el paciente humano(¡n vivo),por ejemplo, una cantidad que da como resultado la neutralización de la actividad inhibidora de CD94/NKG2A humano en células T CD8 y células NK en el paciente humano. En una realización, la cantidad que da como resultado la neutralización de la actividad inhibidora de CD94/NKG2A humano en el paciente humano es al menos 10 veces (por ejemplo, 10-20 veces, 10-50 veces, 10-100 veces, 20-50 veces, 20-100 veces, 30-100 veces, 50-100 veces), opcionalmente al menos 50, 60, 80 o 100 veces, la concentración mínima requerida para saturar sustancialmente los receptores de NKG2A en la superficie de las células NKG2A+ (por ejemplo, en un ensayo de unión en el que se titula el anticuerpo en PBMC). En una realización, el anticuerpo anti-NKG2A compite con HLA-E por la unión a NKG2A humano.

[0020] [0015]En una realización, el anticuerpo anti-NKG2A se administra durante al menos un ciclo de administración, comprendiendo el ciclo de administración al menos una primera y segunda (y, opcionalmente, una tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima y/u octava, o adicional) administración del anticuerpo anti-NKG2A, en donde el anticuerpo anti-NKG2A se administra en una cantidad efectiva para lograr una concentración sanguínea continua (mínima) del anticuerpo anti-NKG2A de al menos 10 μg/ml (u, opcionalmente al menos 20, 30, 40 o 50 μg/ml) entre la primera y segunda (y, opcionalmente, la adicional) administración. El hecho de lograr o mantener una concentración sanguínea continua especificada significa que la concentración sanguínea no cae sustancialmente por debajo de la concentración sanguínea especificada durante el periodo de tiempo especificado (por ejemplo, entre dos administraciones de anticuerpo, número de semanas), es decir, aunque la concentración sanguínea puede variar durante el periodo de tiempo especificado, la concentración sanguínea especificada representa una concentración mínima o "valle".

[0021] En una realización, el anticuerpo anti-NKG2A se administra en una cantidad eficaz para lograr una concentración máxima en sangre de aproximadamente o al menos aproximadamente 50, 60, 70 u 80 μg/ml, opcionalmente, al menos aproximadamente 100 μg/ml, tras la administración (por ejemplo, en 1 o 2 días después de la administración).

[0022] En una realización, el anticuerpo anti-NKG2A se administra en una cantidad eficaz para lograr una concentración sanguínea continua (mínima) de anticuerpo anti-NKG2A de aproximadamente o al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 u 80 μg/ml, opcionalmente, al menos aproximadamente 100 μg/ml, durante al menos una semana, o al menos dos semanas, después de la administración del anticuerpo.

[0023] En una realización, el anticuerpo anti-NKG2A se administra en una cantidad eficaz para lograr una concentración sanguínea continua (mínima) de anticuerpo anti-NKG2A de aproximadamente o al menos aproximadamente 50, 60, 70 u 80 μg/ml, opcionalmente al menos aproximadamente 100 μg/ml, entre dos administraciones sucesivas. En una realización, la primera y segunda administración están separadas en el tiempo por aproximadamente dos semanas, opcionalmente, aproximadamente una semana.

[0024] El anticuerpo anti-NKG2A puede administrarse opcionalmente en una cantidad eficaz y según una frecuencia que consiga una concentración sanguínea continua (mínima) tal como se especifica durante la duración completa de un ciclo de administración.

[0025] En una realización, el anticuerpo anti-NKG2A se administra en combinación con un anticuerpo que neutraliza un polipéptido PD-1 humano, para su uso en el tratamiento de un tumor sólido en un individuo, en donde el ciclo de administración comprende al menos dos administraciones del anticuerpo anti-NKG2A, en donde el anticuerpo anti-NKG2A se administra en una cantidad eficaz para lograr una concentración continua (mínima) en un tejido extravascular (por ejemplo, en el entorno tumoral) de al menos 4 μg/ml, opcionalmente al menos 10 μg/ml, entre dos administraciones sucesivas. Opcionalmente, el anticuerpo anti-NKG2A se administra en una cantidad efectiva para lograr una concentración continua (mínima) en un tejido extravascular (por ejemplo, en el entorno tumoral) de al menos 4 μg/ml, opcionalmente, al menos 10 μg/ml, durante la duración completa del ciclo de administración. En una realización, el anticuerpo anti-NKG2A se administra en una cantidad eficaz para lograr una concentración sanguínea continua (mínima) de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 40 μg/ml, opcionalmente, al menos 100 μg/ml, entre dos administraciones sucesivas, o durante la duración del ciclo de administración.

[0026] En una realización, el anticuerpo que neutraliza un polipéptido PD-1 humano se administra en una cantidad que da como resultado la neutralización de la actividad inhibidora de PD-1 humano en el paciente humano(¡n vivo),por ejemplo, una cantidad que da como resultado la neutralización de la actividad inhibidora de PD-1 humano en células T CD8 y células NK en el paciente humano. En un aspecto, la combinación se administra (o es para administración) según un régimen de dosificación clínica particular, en concreto, en una cantidad de dosis particular y de acuerdo con un programa de dosificación específico.

[0027] En un aspecto, un anticuerpo que neutraliza NKG2A es un anticuerpo no deplecionante, por ejemplo, un anticuerpo que no destruye, elimina, lisa o induce tal destrucción, eliminación o lisis, para afectar negativamente al número de células que expresan NKG2A presentes en una muestra o en un sujeto. En un aspecto, un anticuerpo que neutraliza PD-1 es un anticuerpo no deplecionante. Un anticuerpo no deplecionante puede carecer, por ejemplo, de un dominio Fe o tener un dominio Fe con mínima o nula unión a uno o más receptores Fcy (por ejemplo, CD16). Ejemplos incluyen anticuerpos con regiones constantes de anticuerpos de isotipo lgG4 humano, anticuerpos de cualquier isotipo (por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3) con regiones constantes modificadas para reducir o suprimir la unión a uno o más receptores Fcy (por ejemplo, CD16).

[0028] En una realización, el cáncer es un tumor sólido avanzado y/o refractario. En una realización no limitativa, el cáncer (por ejemplo, el tumor sólido refractario avanzado) se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPNM), cáncer de riñón, adenocarcinoma pancreático o de esófago, cáncer de mama, carcinoma de células renales (RCC), melanoma, cáncer colorrectal y cáncer de ovario.

[0029] El anticuerpo que inhibe un polipéptido NKG2A (anticuerpo anti-NKG2A) es un anticuerpo que aumenta la capacidad de una célula NK y/o T que expresa NKG2A para causar la muerte de la célula que expresa HLA-E. Opcionalmente, el anticuerpo que inhibe un polipéptido NKG2A es un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo monoclonal), que se une a un polipéptido NKG2A.

[0030] [0025]En una realización, el anticuerpo anti-NKG2A reduce la actividad inhibidora de NKG2A bloqueando la unión de su ligando, HLA-E, es decir, el anticuerpo anti-NKG2A interfiere con la unión de NKG2A por HLA-E. El anticuerpo que tiene la cadena pesada de cualquiera de las SEQ ID NO: 4-8 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 9 es un ejemplo de dicho anticuerpo. En una realización, el anticuerpo anti-NKG2A reduce la actividad inhibidora de NKG2A sin bloquear la unión de su ligando, HLA-E, es decir, el anticuerpo anti-NKG2A es un antagonista no competitivo y no interfiere con la unión de NKG2A por HLA-E. El anticuerpo que tiene las regiones variables de cadena pesada y ligera de SEQ ID NO: 10 y 11, respectivamente, es un ejemplo de dicho anticuerpo.

[0031] En una realización, el anticuerpo anti-NKG2A se une con una afinidad significativamente mayor por NKG2A que por uno o más receptores de NKG2 activadores. Por ejemplo, en una realización, el anticuerpo se une con una afinidad significativamente mayor por NKG2A que por NKG2C. En una realización adicional o alternativa, el anticuerpo se une con una afinidad significativamente mayor por NKG2A que por NKG2E. En una realización adicional o alternativa, el anticuerpo se une con una afinidad significativamente mayor por NKG2A que por NKG2H.

[0032] En una realización, el anticuerpo anti-NKG2A compite con el anticuerpo que tiene las cadenas pesada y ligera de SEQ ID NO: 4-8 y 9, respectivamente, o el anticuerpo que tiene las regiones variables de cadena pesada y ligera de SEQ ID NO: 10 y 11, respectivamente, en la unión a CD94/NKG2A. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo anti-NKG2A humano o humanizado.

[0033] En una realización, el anticuerpo anti-NKG2A es un anticuerpo humanizado que tiene las CDR de cadena pesada de cualquiera de las cadenas pesadas de cualquiera de las SEQ ID NO: 4-8 y las CDR de cadena ligera de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 9, respectivamente. En una realización, el anticuerpo anti-NKG2A es un anticuerpo humanizado que tiene la región variable de cadena pesada de cualquiera de las cadenas pesadas de cualquiera de las SEQ ID NO: 4-8 y la región variable de cadena ligera de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 9, respectivamente. Se proporcionan ejemplos de restos o secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR) y/o sitios para sustituciones de aminoácidos en la región marco (FR) de tales anticuerpos humanizados que tienen propiedades mejoradas tales como, por ejemplo, inmunogenicidad inferior, unión a antígeno mejorada u otras propiedades funcionales, y/o propiedades fisicoquímicas mejoradas tales como, por ejemplo, mejor estabilidad.

[0034] En ciertos aspectos opcionales, los pacientes pueden identificarse para el tratamiento con un anticuerpo anti-NKG2A y un anticuerpo neutralizante de PD1 evaluando la presencia en una muestra tumoral (por ejemplo, tejido tumoral y/o tejido adyacente a tumor) de ligandos para NKG2A, opcionalmente, además, un ligando de PD-1. En una realización de cualquiera de los usos terapéuticos de la invención, el tratamiento de un cáncer en un individuo comprende:

[0035] a) determinar el estado del polipéptido HLA-E de células malignas dentro del individuo que tiene un cáncer, y

[0036] b) tras una determinación de que los polipéptidos HLA-E son expresados de manera prominente (por ejemplo, en la superficie) por células malignas (por ejemplo, células tumorales), administrar al individuo un anticuerpo que neutraliza la actividad inhibidora de un polipéptido NKG2A humano y un anticuerpo que inhibe un polipéptido PD-1 humano.

[0037] En una realización de cualquiera de los usos terapéuticos de la invención, el tratamiento de un cáncer en un individuo comprende:

[0038] a) determinar el estado del polipéptido HLA-E y el estado del polipéptido PD-L1 de células malignas (por ejemplo, células tumorales) dentro del individuo que tiene un cáncer, y

[0039] b) tras una determinación de que los polipéptidos HLA-E y PD-L1 se expresan de manera prominente en la superficie de células malignas, administrar al individuo un anticuerpo que neutraliza la actividad inhibidora de un polipéptido NKG2A humano y un anticuerpo que inhibe un polipéptido PD-1 humano.

[0040] En una realización, una determinación de que una muestra biológica (por ejemplo, una muestra que comprende células tumorales, tejido tumoral y/o tejido adyacente al tumor) expresa de manera prominente ácido nucleico o polipéptido de HLA-E indica que el individuo tiene un cáncer que puede tratarse con un anticuerpo que inhibe NKG2A en combinación con un anticuerpo que inhibe un polipéptido PD-1 humano.

[0041] [0032]En una realización de cualquiera de los usos terapéuticos de la invención, determinar el estado del polipéptido HLA-E o determinar el nivel de expresión en la etapa (a) comprende determinar el nivel de expresión de un ácido nucleico o polipéptido HLA-E de células malignas en una muestra biológica y comparar el nivel con un nivel de referencia (por ejemplo, un valor, tinción débil o fuerte de la superficie celular, etc.). El nivel de referencia puede corresponder, por ejemplo, a un individuo sano, a un individuo que deriva poco/nada de beneficio clínico del tratamiento con un anticuerpo anti-NKG2A (opcionalmente, en combinación con un anticuerpo que inhibe un polipéptido PD-1 humano), o a un individuo que deriva un beneficio clínico sustancial del tratamiento con un anticuerpo anti-NKG2A (opcionalmente, en combinación con un anticuerpo que inhibe un polipéptido PD-1 humano). Una determinación de que una muestra biológica expresa el ácido nucleico o polipéptido HLA-E a un nivel que está aumentado (por ejemplo, un valor alto, tinción de superficie fuerte, un nivel que corresponde al de un individuo que deriva un beneficio clínico sustancial del tratamiento con un anticuerpo anti-NKG2A, un nivel que es mayor que el correspondiente a un individuo que deriva un beneficio clínico nulo/bajo del tratamiento con un anticuerpo anti-NKG2A, etc.) indica que el individuo tiene un cáncer que puede tratarse con un anticuerpo anti-NKG2A en combinación con un anticuerpo que inhibe un polipéptido PD-1 humano, por ejemplo, de acuerdo con los usos terapéuticos de la invención.

[0042] Como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se proporciona un método para identificar linfocitos que expresan PD-1 inhibidos por NKG2A, comprendiendo el método:

[0043] a) determinar el estado de los polipéptidos NKG2A y PD-1 de linfocitos T NK y/o CD8 en una muestra biológica, y

[0044] b) en donde una determinación de que los polipéptidos NKG2A y PD-1 se expresan en la superficie de una proporción significativa de los linfocitos indica que los linfocitos son linfocitos que expresan PD-1 inhibido por NKG2A. Opcionalmente, los linfocitos son linfocitos infiltrantes de tumores. Opcionalmente, la muestra biológica es una muestra que comprende tejido tumoral y/o tejido adyacente al tumor.

[0045] Como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se proporciona un método para identificar a un individuo que tiene un cáncer para el que es adecuado el tratamiento con un agente anti-NKG2A, comprendiendo el método:

[0046] a) determinar el estado de los polipéptidos NKG2A y PD-1 de linfocitos infiltrantes de tumores del individuo, y

[0047] b) en donde una determinación de que los polipéptidos NKG2A y PD-1 se expresan en la superficie de una proporción significativa de linfocitos infiltrantes de tumor del individuo, opcionalmente, TIL de un subconjunto predefinido (por ejemplo, células T CD8, células NK), indica que el tratamiento con un compuesto que neutraliza la actividad inhibidora de un polipéptido NKG2A humano y un agente que inhibe un polipéptido PD-1 humano es adecuado para el individuo.

[0048] En una realización de los usos terapéuticos de la invención, el tratamiento comprende:

[0049] a) determinar el estado de los polipéptidos NKG2A y PD-1 de linfocitos infiltrantes de tumores del individuo, y

[0050] b) tras una determinación de que los polipéptidos NKG2A y PD-1 se expresan en la superficie de una proporción significativa de linfocitos infiltrantes de tumores, opcionalmente TIL de un subconjunto predefinido (por ejemplo, células T CD8, células NK), del individuo, administrar al individuo un régimen terapéutico que comprende un anticuerpo que neutraliza la actividad inhibidora de un polipéptido NKG2A humano y un anticuerpo que inhibe un polipéptido PD-1 humano.

[0051] En una realización, los linfocitos infiltrantes de tumores son células T CD8. En una realización, los linfocitos infiltrantes de tumores son células NK. En una realización, al menos un 10, 15, 20, 25 % de las células T CD8 son NKG2A<+>PD<+>. En una realización, al menos el 10 %, 15 %, 20 % o 25 % de las células T CD8 son NKG2A<+>PD-1<+>. En una realización, al menos el 20 %, 25 %, 30 % o 35 % de las células NK son NKG2A<+>PD-1<+>.

[0052] Como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se proporcionan composiciones farmacéuticas y kits, así como métodos para usarlos. En una realización de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que neutraliza la actividad inhibidora de un polipéptido NKG2A humano y un anticuerpo que inhibe un polipéptido PD-1 humano para su uso en los tratamientos descritos en el presente documento. Como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se proporciona un kit que comprende un compuesto que neutraliza la actividad inhibidora de un polipéptido NKG2A humano y un agente que inhibe un polipéptido PD-1 humano.

[0053] Estos aspectos se describen más completamente, y otros aspectos, características y ventajas serán evidentes, a partir de la descripción de la invención proporcionada en el presente documento.

[0054] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0055]

[0056] Las Figuras 1A y 1B muestran que las células tumorales PD-L1+ Qa-1+ RMA-S Qa-1 Qdm B2m y A20 son infiltradas por células NK que expresan células T NKG2A y CD8 que expresan NKG2A y/o PD-1. Los ratones portadores de tumores RMA-S Qa-1 Qdm B2m (fila superior) y A20 (fila inferior) se sacrificaron cuando los volúmenes tumorales eran de aproximadamente 500 mm<3>. Se analizaron células tumorales (Figura 1A) y linfocitos infiltrantes de tumores TIL (Figura 1B) por citometría de flujo, respectivamente, para la expresión de Qa-1 y PDL-1 para células tumorales y NKG2A/C/E y PD-1 para TIL. MFI: Mediana de la intensidad de fluorescencia.

[0057] La Figura 2 muestra la distribución de NKG2A y PD-1 en subconjuntos de células NK y T en ratones. Se tomaron linfocitos del bazo, de ganglios linfáticos de drenaje tumoral y de dentro de masas tumorales sólidas. La expresión de PD-1 fue infrecuente o ausente entre todos los subconjuntos de células del bazo y ganglios linfáticos; sin embargo, entre los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), todos los subconjuntos de células tenían porcentajes relativamente altos de células que expresaban PD-1. Por otro lado, se observó NKG2A en células NK, pero no en subconjuntos de células T, en el bazo y ganglios linfáticos, pero, en el tumor, se observó en un porcentaje significativo de TIL, con una media de más del 30 % de células NK y más del 19 % de células T CD8 doble positivas para NKG2A y PD-1.

[0058] Las Figuras 3A y 3B muestran la expresión de NKG2A y PD-1 en ratones portadores de tumores. Se sacrificaron ratones portadores de tumores RMA Rae1 (fila superior), MC38 (fila media) y RMA (fila inferior) cuando sus tumores alcanzaron, respectivamente, los volúmenes de 500, 2000 y 800 mm<3>. Se analizaron células NK (Figura 3A) y células T CD8 (Figura 3B) mediante citometría de flujo en bazo, ganglio linfático de drenaje tumoral (LN) y tumor para la expresión de NKG2A/C/E y PD-1.

[0059] La Figura 4 muestra que el tratamiento de ratones con mAb anti-PD-1 aumenta la frecuencia de células TCD8 que expresan NKG2A en tumores MC38. Los ratones portadores de tumor MC38 se trataron con 200 μg de control de isotipo (IC) de lgG2a de rata o anticuerpos anti-PD-1 de ratón los días 11, 14 y 17 después del injerto de células. Los ratones se sacrificaron el día 31 y las células T CD8 se caracterizaron por citometría de flujo en bazo, ganglio linfático de drenaje tumoral (LN) y tumor.

[0060] La Figura 5 muestra la mediana del volumen tumoral a lo largo del tiempo en ratones tratados con control de isotipo, mAb anti-NKG2A de ratón (200 μg, iv), mAb anti-PD-L1 de ratón (200 μg, ip) o combinación antimNKG2A/mPDL-1 los días 11, 14 y 18. Aunque anti-NKG2A produjo solo un efecto antitumoral modesto en comparación con el control de isotipo en este modelo y anti-PD-L1 produjo un efecto antitumoral sustancial, pero con un volumen tumoral que aumenta hacia el día 28, el tratamiento combinado con anti-NKG2A y anti-PD-L1 suprimió completamente el crecimiento tumoral, sin que se observara ningún crecimiento significativo en el volumen tumoral el día 28.

[0061] DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0062] Definiciones

[0063] Como se usa en la memoria descriptiva, "un" o "una" puede significar uno o más. Como se usa en la(s) reivindicación(es), cuando se usa junto con la expresión "que comprende", las palabras "un" o "una" pueden significar uno o más de uno. Como se usa en el presente documento, "otro" puede significar al menos un segundo o más.

[0064] Cuando se usa "que comprende", este puede reemplazarse opcionalmente por "que consiste esencialmente en" o "que consiste en".

[0065] El NKG2A (OMIM 161555) es un miembro del grupo de transcritos de NKG2 (Houchins y col. (1991) J. Exp. Med. 173:1017-1020). El NKG2A está codificado por 7 exones que abarcan 25 kb, mostrando algún corte y empalme diferencial. Junto con CD94, NKG2A forma el receptor inhibidor heterodimérico CD94/NKG2A, observado en la superficie de subconjuntos de células NK, células T α/β, células T γ/δ, y células NKT. De manera similar a los receptores KIR inhibidores, posee un ITIM en su dominio citoplasmático. Como se usa en el presente documento, "NKG2A" se refiere a cualquier variante, derivado o isoforma del gen de NKG2A o proteína codificada. El NKG2A humano comprende 233 aminoácidos en 3 dominios, con un dominio citoplasmático que comprende los residuos 1-70, una región transmembrana que comprende los residuos 71-93, y una región extracelular que comprende los residuos 94-233, de la siguiente secuencia:

[0068]

[0070] NKG2C (OMIM 602891) y NKG2E (OMIM 602892) son otros dos miembros del grupo de transcritos de NKG2 (Gilenke y col. (1998) Immunogenetics 48:163-173). Los receptores CD94/NKG2C y CD94/NKG2E son receptores activadores encontrados en la superficie de subconjuntos de linfocitos tales como células NK y células T.

[0071] [0044]HLA-E (OMIM 143010) es una molécula de MHC no clásica que se expresa en la superficie celular y se regula mediante la unión de péptidos, por ejemplo, tales como fragmentos derivados de la secuencia señal de otras moléculas de MHC de clase I. También se han identificado versiones solubles de HLA-E. Además de sus propiedades de unión al receptor de células T, HLA-E se une a subconjuntos de células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT) y células T (α/β y γ/δ), mediante la unión específica a CD94/NKG2A, CD94/NKG2B y CD94/NKG2C (véase, por ejemplo, Braud y col. (1998) Nature 391:795-799). La expresión en la superficie de HLA-E protege las células diana frente a la lisis por los clones de células NK, T o NKT CD94/NKG2A+. Como se usa en el presente documento, "HLA-E" se refiere a cualquier variante, derivado o isoforma del gen de HLA-E o proteína codificada.

[0073] En el contexto de la presente invención, "NKG2A" o "linfocito positivo para CD94/NKG2A" se refiere a células del linaje linfoide (por ejemplo, células NK, NKT y T) que expresan CD94/NKG2A en la superficie celular, que se pueden detectar, por ejemplo, mediante citometría de flujo usando anticuerpos que reconocen específicamente un epítopo combinado en CD94 y NKG2A o un epítopo en NKG2A solo. "Linfocito positivo para NKG2A" también incluye líneas celulares inmortales de origen linfoide (por ejemplo, NKL, NK-92).

[0075] En el contexto de la presente invención, "reduce la actividad inhibidora de NKG2A", "neutraliza NKG2A" o "neutraliza la actividad inhibidora de NKG2A" se refiere a un proceso en el que CD94/NKG2A se inhibe en su capacidad para afectar negativamente a procesos intracelulares que conducen a respuestas de linfocitos tales como la liberación de citoquinas y respuestas citotóxicas. Esto puede medirse, por ejemplo, en un ensayo de citotoxicidad basado en células NK o T, en el que se mide la capacidad de un anticuerpo terapéutico para estimular la destrucción de células positivas para HLA-E por linfocitos positivos para CD94/NKG2A. En una realización, una preparación de anticuerpos provoca al menos un aumento del 10 % en la citotoxicidad de un linfocito restringido a CD94/NKG2A, opcionalmente, al menos un aumento del 40 % o 50 % en la citotoxicidad de linfocitos, opcionalmente, al menos un aumento del 70 % en la citotoxicidad de NK", y haciendo referencia a los ensayos de citotoxicidad descritos. Si un anticuerpo anti-NKG2A reduce o bloquea las interacciones CD94/NKG2A con HLA-E, puede aumentar la citotoxicidad de los linfocitos restringidos por CD94/NKG2A. Esto puede evaluarse, por ejemplo, en un ensayo de citotoxicidadin vitrode 4 horas convencional usando, por ejemplo, células NK que expresan CD94/NKG2A, y células diana que expresan HLA-E. Tales células NK no destruyen eficazmente las dianas que expresan HLA-E porque CD94/NKG2A reconoce HLA-E, lo que conduce al inicio y la propagación de la señalización inhibidora que previene la citolisis mediada por linfocitos. Dicho ensayo de citotoxicidadin vitropuede llevarse a cabo mediante métodos convencionales que son bien conocidos en la técnica, tal como se describe, por ejemplo, en Coligan y col., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, Nueva York, (1992, 1993). La liberación de cromo y/u otros parámetros para evaluar la capacidad del anticuerpo para estimular linfocitos para destruir células diana tales como células P815, K562, o células tumorales apropiadas también se describen en Sivori y col., J. Exp. Med. 1997; 186: 1129-1136; Vítale y col., J. Exp. Med. 1998; 187:2065-2072; Pessino y col. J. Exp. Med. 1998; 188:953-960; Neri y col. Clin. Diag. Lab. Immun. 2001;8:1131-1135; Pende y col. J. Exp. Med. 1999;190:1505-1516. Las células diana se marcan con<51>Cr antes de la adición de células NK, y luego la destrucción se estima como proporcional a la liberación de<51>Cr de las células al medio, como resultado de la destrucción. La adición de un anticuerpo que previene que CD94/NKG2A se una a HLA-E da como resultado la prevención de la iniciación y propagación de la señalización inhibidora a través de CD94/NKG2A. Por lo tanto, la adición de tales anticuerpos da como resultado aumentos en la destrucción mediada por linfocitos de las células diana. Esta etapa identifica, de este modo, anticuerpos que previenen la señalización negativa inducida por CD94/NKG2A, por ejemplo, bloqueando la unión del ligando. En un ensayo particular de citotoxicidad de liberación de<51>Cr, las células efectoras NK que expresan CD94/NKG2A pueden destruir células diana LCL 721.221 negativas para HLA-E, pero peor las células de control LCL 721.221-Cw3 que expresan HLA-E. Por el contrario, las células efectoras YTS que carecen de CD94/NKG2A destruyen ambas líneas celulares de manera eficiente. Por lo tanto, las células efectoras NK destruyen menos eficazmente las células LCL 721.221-Cw3 de HLA-E<+>debido a la señalización inhibidora inducida por HLA-E a través de CD94/NKG2A. Cuando las células NK se preincuban con anticuerpos anti-CD94/NKG2A bloqueantes de acuerdo con la presente invención en dicho ensayo de citotoxicidad de liberación de<51>Cr, las células LCL 721.221-Cw3 que expresan HLA-E se destruyen más eficazmente, de una manera dependiente de la concentración de anticuerpos. La actividad inhibidora (es decir, potencial potenciador de citotoxicidad) de un anticuerpo anti-NKG2A también puede evaluarse en cualquiera de una serie de otras maneras, por ejemplo, mediante su efecto sobre el calcio libre intracelular como se describe, por ejemplo, en Sivori y col., J. Exp. Med. 1997; 186:1129-1136. La activación de la citotoxicidad de las células NK se puede evaluar, por ejemplo, midiendo un aumento en la producción de citoquinas (por ejemplo, producción de IFN-y) o marcadores de citotoxicidad (por ejemplo, movilización de CD107 o CD137). En un ejemplo de protocolo, la producción de IFN-y a partir de PBMC se evalúa mediante la superficie celular y la tinción intracitoplasmática y el análisis mediante citometría de flujo después de 4 días en cultivo. En resumen, se añade Brefeldina A (Sigma Aldrich) a una concentración final de 5 μg/ml durante las últimas 4 horas de cultivo. Las células se incuban después con mAb anti-CD3 y anti-CD56 antes de la permeabilización (IntraPrep™; Beckman Coulter) y se tiñen con PE-anti-IFN-y o PE-lgG1 (Pharmingen). La producción de GM-CSF e IFN-y a partir de células NK activadas policlonales se mide en sobrenadantes usando ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, EE. UU., IFN-y: conjunto OptEIA, Pharmingen).

[0077] Como se usa en el presente documento, los términos "PD-1" se refieren a la proteína Programmed Death 1 (PD-1) (también denominada "Programmed Cell Death 1"), un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28, que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. La secuencia de PD-1 humana completa puede encontrarse con el número de acceso de GenBank U64863, mostrado de la siguiente manera:

[0078]

[0080] "PD-1" también incluye cualquier variante, derivado o isoforma del gen de PD-1 o proteína codificada. El PD-1 se expresa en células B activadas, células T y células mieloides (Okazaki y col. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett y col. (2003) J Immunol 170:711-8). Los miembros iniciales de la familia, CD28 e ICOS, se descubrieron por efectos funcionales sobre el aumento de la proliferación de células T después de la adición de anticuerpos monoclonales (Hutloff y col. (1999) Nature 397:263-266; Hansen y col. (1980) Immunogenics 10:247-260). Se han identificado dos ligandos para PD-1 , PD-L1 y PD-L2, que se ha demostrado que regulan a la baja la activación de células T tras la unión a PD-1 (Freeman y col. (2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman y col. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Cárter y col. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). Tanto PD-L1 como PD-L2 son homólogos de B7 que se unen a PD-1, pero no se unen a otros miembros de la familia de CD28.

[0082] La secuencia de PD-L1 humana completa puede encontrarse bajo el identificador Q9NZQ7-1 de UniProtKB/Swiss-Prot, mostrado de la siguiente manera:

[0085]

[0087] PD-L1 es abundante en una variedad de cánceres humanos (Dong y col. (2002) Nat. Med. 8: 787-9). La interacción entre PD-1 y PD-L1 da como resultado una disminución en los linfocitos infiltrantes de tumores, una disminución en la proliferación mediada por receptores de células T y evasión inmunitaria por las células cancerosas (Dong y col. (2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blank y col. (2005) Cáncer Immunol. Inmunother. 54:307-314; Konishi y col. (2004) Clin. 10:5094-100). La supresión inmunitaria puede invertirse inhibiendo la interacción local de PD-1 con PD-L1, y el efecto es aditivo cuando la interacción de PD-1 con PD-L2 también se bloquea.

[0089] En el contexto de la presente invención, "reduce la actividad inhibidora de PD-1 humano", "neutraliza PD-1" o "neutraliza la actividad inhibidora de PD-1 humano" se refiere a un proceso en el que PD-1 se inhibe en su capacidad de transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con uno o más de sus compañeros de unión, tales como PD-L1 o PD-L2. Un anticuerpo que neutraliza la actividad inhibidora de PD-1 disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere con la transducción de señales resultante de la interacción de PD-1 con uno o más de sus compañeros de unión, tales como PD-L1, PD-L2. Dicho anticuerpo puede reducir, de este modo, la señal coestimuladora negativa mediada, o a través de proteínas de la superficie celular expresadas en linfocitos T, para potenciar las funciones efectoras de las células T, tales como proliferación, producción de citoquinas y/o citotoxicidad.

[0091] Siempre que, en esta memoria descriptiva completa, se mencione "tratamiento del cáncer" con referencia a anticuerpo de unión anti-NKG2A y anti-PD-1 o anti-PD-L1, está comprendido: un anticuerpo de unión anti-NKG2A y anti-PD-1 o anti-PD-L1 para su uso en el tratamiento del cáncer (especialmente en un ser humano)

[0093] El término "biopsia", como se usa en el presente documento, se define como la retirada de un tejido con el propósito de examen, tal como para establecer un diagnóstico. Los ejemplos de tipos de biopsias incluyen mediante la aplicación de succión, tal como a través de una aguja unida a una jeringa; mediante la extracción instrumental de un fragmento de tejido; mediante la extracción con instrumentos apropiados a través de un endoscopio; mediante escisión quirúrgica, tal como de toda la lesión.

[0095] [0053]El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos policlonales y monoclonales. Dependiendo del tipo de dominio constante en las cadenas pesadas, los anticuerpos se asignan a una de cinco clases principales: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Varios de estos se dividen, además, en subclases o isotipos, tales como IgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4 y similares. Un ejemplo de unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). El extremo N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos que es responsable principalmente del reconocimiento de antígenos. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas, respectivamente. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan "alfa", "delta", "épsilon", "gamma" y "mu", respectivamente. Las estructuras subunitarias y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Las IgG son los ejemplos de clases de anticuerpos empleados en el presente documento porque son los anticuerpos más comunes en la situación fisiológica y porque se preparan más fácilmente en un entorno de laboratorio. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Los ejemplos particulares de anticuerpos son anticuerpos humanizados, quiméricos, humanos o de otro modo adecuados para humanos. "Anticuerpos" también incluye cualquier fragmento o derivado de cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento.

[0097] El término "se une específicamente a" significa que un anticuerpo puede unirse, preferiblemente en un ensayo de unión competitiva, al compañero de unión, por ejemplo, NKG2A, PD-1, PD-L1, como se evalúa usando formas recombinantes de las proteínas, epítopos en las mismas o proteínas nativas presentes en la superficie de células diana aisladas. Los ensayos de unión competitiva y otros métodos para determinar la unión específica son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la unión se puede detectar mediante radiomarcadores, métodos físicos, tales como espectrometría de masas, o marcadores fluorescentes directos o indirectos detectados usando, por ejemplo, análisis citofluorométrico (por ejemplo, FACScan). La unión por encima de la cantidad observada con un agente no específico de control indica que el anticuerpo se une a la diana. Un anticuerpo que se une específicamente a NKG2A puede unirse a NKG2A solo o a NKG2A como un dímero con CD94.

[0099] Cuando se dice que un anticuerpo "compite con" un anticuerpo monoclonal particular, significa que el anticuerpo compite con el anticuerpo monoclonal en un ensayo de unión usando moléculas recombinantes (por ejemplo, NKG2A, PD-1, PD-L1) o moléculas expresadas en la superficie (por ejemplo, NKG2A, PD-1, PD-L1). Por ejemplo, si un anticuerpo de ensayo reduce la unión de un anticuerpo que tiene una cadena pesada de cualquiera de las SEQ ID NO: 4-8 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 9 a un polipéptido NKG2A o célula que expresa NKG2A en un ensayo de unión, se dice que el anticuerpo "compite", respectivamente, con dicho anticuerpo.

[0101] El término "afinidad", como se usa en el presente documento, significa la fuerza de la unión de un anticuerpo a un epítopo. La afinidad de un anticuerpo viene dada por la constante de disociación Kd, definida como [Ab] x [Ag] / [Ab-Ag], donde [Ab-Ag] es la concentración molar del complejo anticuerpo-antígeno, [Ab] es la concentración molar del anticuerpo no unido y [Ag] es la concentración molar del antígeno no unido. La constante de afinidad K<a>se define por 1/Kd. Pueden encontrarse métodos para determinar la afinidad de los mAb en Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, Nueva York, 1988), Coligan y col., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, Nueva York (1992, 1993) y Müller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983). Un método convencional bien conocido en la técnica para determinar la afinidad de los mAb es el uso de cribado por resonancia de plasmón superficial (SPR) (tal como mediante análisis con un dispositivo analítico SPR de BIAcore™).

[0103] En el contexto de la presente memoria, un "determinante" designa un sitio de interacción o unión en un polipéptido.

[0105] El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico, y es la zona o región en un antígeno a la que se une un anticuerpo. Un epítopo proteico puede comprender restos de aminoácidos directamente implicados en la unión, así como restos de aminoácidos que están bloqueados eficazmente por el anticuerpo o péptido de unión a antígeno específico, es decir, residuos de aminoácidos dentro de la "huella" del anticuerpo. Es la forma más simple o la zona estructural más pequeña en una molécula de antígeno compleja que puede combinarse con, por ejemplo, un anticuerpo o un receptor. Los epítopos pueden ser lineales o conformacionales/estructurales. El término "epítopo lineal" se define como un epítopo compuesto por residuos de aminoácidos que son contiguos en la secuencia lineal de aminoácidos (estructura primaria). El término "epítopo conformacional o estructural" se define como un epítopo compuesto por residuos de aminoácidos que no son todos contiguos y, por lo tanto, representan partes separadas de la secuencia lineal de aminoácidos que se aproximan entre sí mediante el plegamiento de la molécula (estructuras secundarias, terciarias y/o cuaternarias). Un epítopo conformacional depende de la estructura tridimensional. El término 'conformacional' se suele usar, por lo tanto, indistintamente con 'estructural'.

[0107] El término "agente" se usa en el presente documento para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto hecho de materiales biológicos. El término "agente terapéutico" se refiere a un agente que tiene actividad biológica.

[0108] Para los fines del presente documento, un anticuerpo "humanizado" o "humano" se refiere a un anticuerpo en el que la región de marco constante y variable de una o más inmunoglobulinas humanas se fusiona con la región de unión, por ejemplo, la CDR, de una inmunoglobulina animal. Tales anticuerpos se diseñan para mantener la especificidad de unión del anticuerpo no humano del que derivan las regiones de unión, pero para evitar una reacción inmunitaria contra el anticuerpo no humano. Tales anticuerpos pueden obtenerse de ratones transgénicos u otros animales que se han "modificado" para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a la exposición antigénica (véase, por ejemplo, Green y col. (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg y col. (1994) Nature 368:856; Taylor y col. (1994) Int Immun 6:579). Un anticuerpo completamente humano también puede construirse mediante métodos de transfección genéticos o cromosómicos, así como tecnología de presentación en fagos, todos los cuales son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, McCafferty y col. (1990) Nature 348:552-553). Los anticuerpos humanos también pueden generarse mediante células B activadasin vitro(véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5,567,610 y 5,229,275).

[0109] Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en la que (a) la región constante, o una porción de la misma, se altera, reemplaza o intercambia de modo que el sitio de unión al antígeno (región variable) se une a una región constante de una clase, función efectora y/o especie diferente o alterada, o una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una porción de la misma, se altera, reemplaza o intercambia con una región variable que tiene una especificidad de antígeno diferente o alterada.

[0110] Los términos "dominio Fe", "porción Fe" y "región Fe" se refieren a un fragmento C-terminal de una cadena pesada de anticuerpo, por ejemplo, de aproximadamente el aminoácido (aa) 230 a aproximadamente el aa 450 de la cadena pesada y (gamma) humana o su secuencia homologa en otros tipos de cadenas pesadas de anticuerpo (por ejemplo, α, δ, ε y μ para anticuerpos humanos), o un alotipo de origen natural de los mismos. A menos que se especifique lo contrario, la numeración de aminoácidos de Kabat comúnmente aceptada para inmunoglobulinas se usa a lo largo de esta divulgación (véase Kabat y col. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5.<a>ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Maryland, EE. UU.).

[0111] Los términos "aislado", "purificado" o "biológicamente puro" se refieren a material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan como se encuentra en su estado nativo. La pureza y homogeneidad se determinan típicamente usando técnicas de química analítica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alto rendimiento. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación está sustancialmente purificada.

[0112] Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural.

[0113] El término "recombinante", cuando se usa haciendo referencia, por ejemplo, a una célula, o ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o proteína heterólogo o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativa, o que la célula deriva de una célula modificada de este modo. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinantes) de la célula o expresan genes nativos que de otro modo se expresan de manera anormal, se expresan insuficientemente o no se expresan en absoluto.

[0114] En el contexto de la presente memoria, el término anticuerpo que "se une" a un polipéptido o epítopo designa un anticuerpo que se une a dicho determinante con especificidad y/o afinidad.

[0115] El término "identidad" o "idéntico", cuando se usa en una relación entre las secuencias de dos o más polipéptidos, se refiere al grado de relación de secuencia entre polipéptidos, según lo determinado por el número de coincidencias entre cadenas de dos o más residuos de aminoácidos. "Identidad" mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la más pequeña de dos o más secuencias con alineamientos de huecos (si los hay) direccionados por un modelo matemático o programa informático particular (es decir, "algoritmos"). La identidad de polipéptidos relacionados puede calcularse fácilmente mediante métodos conocidos. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo y col., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).

[0116] Los métodos para determinar la identidad se diseñan para dar la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en programas informáticos disponibles públicamente. Los métodos de programa informático para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen el paquete de programas GCG, incluyendo GAP (Devereux y col., Nucí. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, Wisconsin, EE. UU.), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul y col., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). El programa BLASTX está disponible públicamente en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul y col. NCB/NLM/NIH Bethesda, Maryland, EE. UU. 20894; Altschul y col., anteriormente). El algoritmo de Smith Waterman bien conocido también puede usarse para determinar la identidad.

[0117] Anticuerpos terapéuticos neutralizantes de NKG2A

[0118] El anticuerpo anti-NKG2A se une a una porción extracelular del receptor CD94/NKG2A humano y reduce la actividad inhibidora del receptor CD94/NKG2A humano expresado en la superficie de un linfocito positivo para CD94/NKG2A. En una realización, el anticuerpo compite con HLA-E en la unión a CD94/NKG2A, es decir, el anticuerpo bloquea la interacción entre CD94/NKG2A y su ligando HLA-E. En otra realización, el anticuerpo no compite con HLA-E en la unión a CD94/NKG2A; es decir, el anticuerpo es capaz de unirse a CD94/NKG2A simultáneamente con HLA-E. El anticuerpo puede unirse a un epítopo combinado en CD94 y NKG2A o a un epítopo en NKG2A solo.

[0119] En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A es un anticuerpo seleccionado de un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo quimérico. En un aspecto, el anticuerpo comprende un dominio constante derivado de un anticuerpo IgG 1 , lgG2, lgG3 o lgG4 humano. En un aspecto, el anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo seleccionado de IgA, un IgD, un IgG, un IgE y un anticuerpo IgM. En un aspecto, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado de un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento Fab'-SH, un fragmento F(ab)2, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, una Ig de cadena pesada (una Ig de llama o camello), un fragmento VHH, un FV de dominio único, y un fragmento de anticuerpo de cadena única. En un aspecto, el anticuerpo es una molécula derivada de anticuerpo sintético o semisintético seleccionada de un scFV, un dsFV, un minicuerpo, un diacuerpo, un triacuerpo, un cuerpo kappa, un IgNAR; y un anticuerpo multiespecífico.

[0120] Opcionalmente, los anticuerpos anti-NKG2A no demuestran una unión específica sustancial a receptores Fcy, por ejemplo, CD16. Tales anticuerpos pueden comprender regiones constantes de diversas cadenas pesadas que se sabe que no se unen a receptores de Fe. Un ejemplo de este tipo es una región constante de lgG4 humana. En una realización, el anticuerpo lgG4 comprende una modificación para prevenir la formación de medios anticuerpos (intercambio de brazo fab)in vivo,por ejemplo, el anticuerpo comprende una cadena pesada de lgG4 que comprende una mutación de serina a prolina en el residuo 241, correspondiente a la posición 228 según el índice EU (Kabat y col., “Sequences of proteins of immunological interest”, 5.<a>ed., NIH, Bethesda, Maryland, EE. UU., 1991). Tales anticuerpos lgG4 modificados permanecerán intactosin vivoy mantendrán una unión bivalente (alta afinidad) a NKG2A, al contrario que la lgG4 nativa que experimentará intercambio de brazo fabin vivode manera que se unan a NKG2A de manera monovalente, que puede alterar la afinidad de unión. Alternativamente, los fragmentos de anticuerpo que no comprenden regiones constantes, tales como fragmentos Fab o F(ab')2, pueden usarse para evitar la unión al receptor de Fe. La unión al receptor de Fe puede evaluarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, incluyendo por ejemplo probar la unión de un anticuerpo a la proteína del receptor de Fe en un ensayo BIACORE. También, puede usarse cualquier tipo de anticuerpo humano (por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4) en el que la porción Fe se modifica para minimizar o eliminar la unión a receptores Fe (véase, por ejemplo, W003101485). Ensayos tales como, por ejemplo, ensayos basados en células, para evaluar la unión al receptor de Fe, son bien conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en WO03101485.

[0121] La presente invención se refiere, por tanto, a anticuerpos que se unen a NKG2A para su uso en los tratamientos descritos en el presente documento. En un aspecto, el anticuerpo se une a NKG2A con una KD al menos 100 veces menor que a NKG2C y/o NKG2E humanas.

[0122] En un aspecto de la invención, el anticuerpo reduce la inhibición mediada por CD94/NKG2A de un linfocito que expresa CD94/NKG2A interfiriendo con la señalización de CD94/NKG2A, por ejemplo, interfiriendo con la unión de HLA-E por NKG2A, previniendo o induciendo cambios conformacionales en el receptor CD94/NKG2A, y/o afectando a la dimerización y/o agrupamiento del receptor CD94/NKG2A.

[0123] [0074]En un aspecto de la invención, el anticuerpo se une a una porción extracelular de NKG2A con una KD al menos 100 veces menor que a NKG2C. En un aspecto preferido adicional, el anticuerpo se une a una porción extracelular de NKG2A con una KD al menos 150, 200, 300, 400 o 10.000 veces menor que a NKG2C. En otro aspecto de la invención, el anticuerpo se une a una porción extracelular de NKG2A con una KD al menos 100 veces menor que a moléculas de NKG2C, NKG2E y/o NKG2H. En un aspecto preferido adicional, el anticuerpo se une a una porción extracelular de NKG2A con una KD al menos 150, 200, 300, 400 o 10.000 veces menor que a moléculas de NKG2C, NKG2C y/o NKG2H. Esto puede medirse, por ejemplo, en experimentos BiaCore, en los que la capacidad de los anticuerpos para unirse a la porción extracelular de CD94/NKG2A inmovilizado (por ejemplo, purificado a partir de células que expresan CD94/NKG2, o producido en un biosistema) se mide y se compara con la unión de anticuerpos a CD94/NKG2C producido de manera similar y/u otras variantes de CD94/NKG2 en el mismo ensayo. Alternativamente, la unión de anticuerpos a células que expresan de forma natural, o sobreexpresan (por ejemplo, después de transfección transitoria o estable), CD94/NKG2A, puede medirse y compararse con la unión de células que expresan CD94/NKG2C y/u otras variantes de CD94/NKG2. Los anticuerpos anti-NKG2A pueden unirse, opcionalmente, a NKG2B, que es una variante de corte y empalme de NKG2A que forma un receptor inhibidor junto con CD94. En una realización, la afinidad puede medirse usando los métodos descritos en la patente de EE. UU. n.° 8,206,709, por ejemplo, evaluando la unión a la proteína de fusión NKG2A-CD94-Fc inmovilizada covalentemente por Biacore como se muestra en el Ejemplo 8 de la patente de EE. UU. n.° 8,206,709.

[0124] El anticuerpo anti-NKG2A puede ser un anticuerpo humanizado, por ejemplo, que comprende un marco aceptor humano VH de una secuencia aceptora humana seleccionada de, por ejemplo, VH1 18, VH5_a, VH5 51, VH1_f y VH1 46 y un segmento J de JH6 u otras secuencias marco VH de línea germinal humana conocidas en la técnica. La secuencia aceptora humana de la región VL puede ser, por ejemplo, VKI 02/JK4.

[0125] En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado basado en el anticuerpo Z270. Se muestran diferentes cadenas de Z270VH humanizadas en las SEQ ID NO: 4-8 (aminoácido subrayado del dominio de la región variable). HumZ270VH6 (SEQ ID NO: 4) se basa en VH5_51; HumZ270VH1 (SEQ ID NO: 5) se basa en VH1_18; humZ270VH5 (SEQ ID NO: 6) se basa en VH5_a; humZ270VH7 (SEQ ID NO: 7) se basa en VH1_f; y humZ270VH8 (SEQ ID NO: 8) se basa en VH1 46; todos con un segmento J de JH6. Cada uno de estos anticuerpos retiene una unión de alta afinidad a NKG2A, con baja probabilidad de una respuesta inmunitaria del huésped contra el anticuerpo, ya que los 6 residuos de aminoácidos C-terminales de la CDR-H2 de Kabat de cada una de las construcciones humanizadas son idénticos al marco aceptor humano. Utilizando el programa de alineamiento VectorNTI, se obtuvieron las siguientes identidades de secuencia entre humZ270VH1 y humZ270VH5, -6, -7 y -8: 78,2 % (VH1 frente a VH5), 79,0 % (VH1 frente a VH6), 88,7 % (VH1 frente a VH7) y 96,0 % (VH1 frente a VH8).

[0126] En un aspecto, el anticuerpo comprende (i) una región variable de cadena pesada de cualquiera de las SEQ ID NO: 4-8, o una secuencia de aminoácidos al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la misma, y (ii) una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 9, o una secuencia de aminoácidos al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la misma. En un aspecto, el anticuerpo comprende (i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 4-8, o una secuencia de aminoácidos al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la misma, y (ii) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, o una secuencia de aminoácidos al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la misma. El anticuerpo que tiene la cadena pesada de cualquiera de las SEQ ID NO: 4-8 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 9 neutraliza la actividad inhibidora de NKG2A, pero no se une sustancialmente a los receptores activadores NKG2C, NKGE o NKG2H. Este anticuerpo compite, además, con HLA-E por la unión a NKG2A en la superficie de una célula. En un aspecto, el anticuerpo comprende secuencias de HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3 derivadas de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 4-8. En un aspecto de la invención, el anticuerpo comprende secuencias LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3 derivadas de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

[0127] Cadenas pesadas

[0128]

[0129] VH6:

[0132]

[0133] VH1:

[0135]

[0137] VH5:

[0139]

[0141] VH7:

[0142]

[0144] VH8:

[0146]

[0147] Cadena ligera

[0150]

[0152] En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A es un anticuerpo que comprende una CDR-H1 correspondiente a los residuos 31-35 de las SEQ ID NO: 4-8, una CDR-H2 correspondiente a los residuos 50-60 (opcionalmente, 50-66 cuando incluye aminoácidos de origen humano) de las SEQ ID NO: 4-8, y una CDR-H3 correspondiente a los residuos 99-114 (95-102 de acuerdo con Kabat) de las SEQ ID NO: 4-8. En una realización, la CDR-H2 correspondiente a los residuos 50-66 de las SEQ ID NO: 4-8. Opcionalmente, una CDR puede comprender una, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácidos.

[0153] En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A es un anticuerpo que comprende una CDR-L1 correspondiente a los residuos 24-34 de la SEQ ID NO: 9, una CDR-L2 correspondiente a los residuos 50-56 de la SEQ ID NO: 9, y una CDR-L3 correspondiente a los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 9. Opcionalmente, una CDR puede comprender una, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácidos.

[0154] En un aspecto, el anticuerpo anti-NKG2A es un anticuerpo que comprende una CDR-H1 correspondiente a los residuos 31-35 de SEQ ID NO: 4-8, una CDR-H2 correspondiente a los residuos 50-60 (opcionalmente, 50-66) de SEQ ID NO: 4-8, y una CDR-H3 correspondiente a los residuos 99-114 (95-102 de acuerdo con Kabat) de SEQ ID NO: 4-8, una CDR-L1 correspondiente a los residuos 24-34 de SEQ ID NO: 9, una CDR-L2 correspondiente a los residuos 50-56 de SEQ ID NO: 9, y una CDR-L3 correspondiente a los residuos 89-97 de SEQ ID NO: 9.

[0155] En un aspecto, el anticuerpo comprende secuencias HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3 derivadas de la VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. En un aspecto de la invención, el anticuerpo comprende secuencias LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3 derivadas de la VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. En un aspecto, el anticuerpo comprende secuencias HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3 derivadas de la VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y secuencias LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3 derivadas de la VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. El anticuerpo que tiene la cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 11 neutraliza la actividad inhibidora de NKG2A, y también se une a los receptores activadores NKG2C, NKG2E o NKG2H. El anticuerpo no compite con HLA-E por la unión a NKG2A en la superficie de una célula (es decir, es un antagonista no competitivo de NKG2A).

[0158]

[0160] En un aspecto, el anticuerpo comprende los residuos de aminoácidos 31-35, 50-60, 62, 64, 66 y 99-108 del dominio variable-pesado (VH) (SEQ ID NO: 10) y residuos de aminoácidos 24-33, 49-55 y 88-96 del dominio variable-ligero (VL) (SEQ ID NO: 11), opcionalmente, con una, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácidos.

[0161] En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano que se ha generado contra el epítopo CD94/NKG2A al que se une cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente.

[0162] Se apreciará que, aunque pueden usarse los anticuerpos mencionados anteriormente, pueden reconocerse otros anticuerpos y generarse contra cualquier parte del polipéptido NKG2A siempre que el anticuerpo provoque la neutralización de la actividad inhibidora de NKG2A. Por ejemplo, cualquier fragmento de NKG2A, preferiblemente, pero no exclusivamente, NKG2A humano, o cualquier combinación de fragmentos de NKG2A, puede ser usado como inmunógenos para generar anticuerpos, y los anticuerpos pueden reconocer epítopos en cualquier ubicación dentro del polipéptido NKG2A, siempre que puedan hacerlo en células NK que expresan NKG2A como se describe aquí. Opcionalmente, el epítopo es el epítopo reconocido específicamente por el anticuerpo que tiene la cadena pesada de SEQ ID NO: 4-8 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 9.

[0163] En un aspecto, el anticuerpo compite con el anticuerpo humZ270 descrito en la patente de EE. UU. n.° 8,206,709 en la unión a la porción extracelular del receptor CD94/NKG2A humano. La unión competitiva se puede medir, por ejemplo, en experimentos BiaCore, en los que se mide la capacidad de los anticuerpos, para unir la porción extracelular del receptor CD94/NKG2A inmovilizado (por ejemplo, purificado a partir de células que expresan CD94/NKG2, o producido en un biosistema) saturado con humZ270. Alternativamente, se mide la unión de anticuerpos a células que expresan de manera natural, o sobreexpresan (por ejemplo, después de transfección transitoria o estable), el receptor CD94/NKG2A, y que se han preincubado con dosis saturantes de Z270. En una realización, la unión competitiva puede medirse usando los métodos descritos en la patente de EE. UU. n.° 8,206,709, por ejemplo, evaluando la unión a células Ba/F3-CD94-NKG2A por citometría de flujo como se muestra en el Ejemplo 15 de la patente de EE. UU. n.° 8,206,709.

[0164] Anticuerposterapéuticos neutralizantes PD-1

[0165] Actualmente hay al menos seis agentes que bloquean la ruta de PD-1/PD-L1 comercializados o en evaluación clínica. Un agente es BMS-936558 (Nivolumab/ONO-4538, Bristol-Myers Squibb; anteriormente MDX-1106). Nivolumab (nombre comercial Opdivo<®>) es un mAb anti-PD-L1 de lgG4 completamente humano aprobado por la FDA que inhibe la unión del ligando de PD-L1 tanto a PD-1 como a CD80 y se describe como anticuerpo 5C4 en WO 2006/121168. Para pacientes con melanoma, se observó la OR más significativa a una dosis de 3 mg/kg, mientras que para otros tipos de cáncer fue de 10 mg/kg. El nivolumab se dosifica generalmente a 10 mg/kg cada 3 semanas hasta la progresión del cáncer.

[0166] MK-3475 (mAb anti-PD1 de Merck de lgG4 humana), también denominado lambrolizumab o pembrolizumab (nombre comercial Keytruda<®>La FDA) ha sido aprobado por la FDA para el tratamiento del melanoma y está siendo probado en otros cánceres. Se probó pembrolizumab a 2 mg/kg o 10 mg/kg cada 2 o 3 semanas hasta la progresión de la enfermedad. Las construcciones de ADN que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos humanizados h409AII se han depositado en el Depósito de Patentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo (10801 University Blvd., Manassas, Virginia, EE. UU.). El plásmido que contenía el ADN que codificaba la cadena pesada de h409A-l1 se depositó el 9 de junio de 2008 y se identificó como 081469 SPD-H y el plásmido que contenía el ADN que codificaba la cadena ligera de h409AI1 se depositó el 9 de junio de 2008 y se identificó como 0801470 SPD-L-I 1. MK-3475, también conocido como Merck 3745 o SCH-900475, también se describe en el documento W02009/114335.

[0167] El MPDL3280A/RG7446 (anti-PD-L1 de Roche/Genentech) es un mAb anti-PD-L1 humano que contiene un dominio Fe diseñado para optimizar la eficacia y la seguridad minimizando la unión a FcyR y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) consecuente. Se administraron dosis de <1, 10, 15 y 25 mg/kg de MPDL3280A cada 3 semanas durante hasta 1 año. En el ensayo de fase 3, se administra MPDL3280A a 1200 mg por infusión intravenosa cada tres semanas en NSCLC.

[0168] AMP-224 (Amplimmune y GSK) es una inmunoadhesina que comprende un dominio extracelular de PD-L2 fusionado a un dominio Fe. Otros ejemplos de agentes que neutralizan PD-1 pueden incluir un anticuerpo que se une a PD-L2 (un anticuerpo anti-PD-L2) y bloquea la interacción entre PD-1 y PD-L2.

[0169] Pidlizumab (CT-011 ; CureTech) (mAb anti-PD1 de IgG 1 humanizado de CureTech/Teva), Pidlizumab (CT-011; CureTech) (véase, por ejemplo, el documento W02009/101611). Treinta pacientes con FL recidivante sensible a rituximab se trataron con 3 mg/kg de CT-011 intravenoso cada 4 semanas para 4 infusiones en combinación con rituximab dosificado a 375 mg/m2 semanalmente durante 4 semanas, comenzando 2 semanas después de la primera infusión de CT-011.

[0170] Otros anticuerpos PD-1 conocidos y otros inhibidores de PD-1 incluyen AMP-224 (una proteína de fusión B7-DC/lgG1 autorizada por GSK), AMP-514 descrita en el documento WO 2012/145493, anticuerpo MEDI-4736 (un anti-PD-L1 desarrollado por AstraZeneca/Medimmune) descrito en el documento WO2011/066389 y US2013/034559, anticuerpo YW243.55.S70 (un anti-PD-L1) descrito en el documento WO2010/077634, MDX-1105, también conocido como BMS-936559, es un anticuerpo anti-PD-L1 desarrollado por Bristol-Myers Squibb descrito en el documento W02007/005874 y anticuerpos e inhibidores descritos en el documento W02006/121 168, W02009/014708, W02009/114335 y WO2013/019906. Se describen ejemplos adicionales de anticuerpos anti-PD1 en el documento WO2015/085847 (Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co. Ltd.), por ejemplo, anticuerpos que tienen CDR1, 2 y 3 del dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y/o SEQ ID NO: 8, respectivamente, y CDR1, 2 y 3 del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, respectivamente, en donde las referencias de la SEQ ID NO son la numeración de acuerdo con el documento WO2015/085847. También se pueden usar anticuerpos que compiten con cualquiera de estos anticuerpos por la unión a PD-1 o PD-L1.

[0171] [0093]Un ejemplo de anticuerpo anti-PD-1 es pembrolizumab (véase, por ejemplo, el documento WO 2009/114335). El anticuerpo anti-PD-1 puede ser el anticuerpo h409AI1 en el documento WO 2008/156712, que comprende regiones variables de cadena pesada codificadas por el ADN depositado en la ATCC como 081469_SPD-H y regiones variables de cadena ligera codificadas por el ADN depositado en la ATCC como 00801470 SPD-L-I1. En otras realizaciones, el anticuerpo comprende las CDR de cadena pesada y ligera o regiones variables de pembrolizumab. Por consiguiente, en una realización, el anticuerpo comprende los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la VH de pembrolizumab codificado por el ADN depositado en la ATCC como 081469 SPD-H, y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la VL de pembrolizumab codificado por el ADN depositado en la ATCC como 0801470 SPD-L-I1.

[0173] En algunas realizaciones, el anticuerpo neutralizante PD-1 es un mAb anti-PD-L1 que inhibe la unión de PD-L1 a PD-1. En algunas realizaciones, el anticuerpo neutralizante PD-1 es un mAb anti-PD1 que inhibe la unión de PD-1 a PD-L1. En algunas realizaciones, el anticuerpo neutralizante PD-1 es una inmunoadhesina (por ejemplo, una inmunoadhesina que comprende una porción extracelular o de unión a PD-1 de PD-L1 o PD-L2 fusionada con una región constante (por ejemplo, una región Fe de una secuencia de inmunoglobulina).

[0175] Otro ejemplo de anticuerpo anti-PD-1 es nivolumab que comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias respectivas mostradas en las SEQ ID NO: 12 y 13 o una secuencia de aminoácidos respectiva al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la misma, o fragmentos de unión a antígeno y variantes de la misma. En otras realizaciones, el anticuerpo comprende las CDR de cadena pesada y ligera o regiones variables de nivolumab. Por consiguiente, en una realización, el anticuerpo comprende los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de nivolumab que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 12, y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de nivolumab que tienen las secuencias expuestas en la SEQ ID NO: 13.

[0178]

[0181] Un ejemplo de anticuerpo anti-PD-L1 comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que tienen las secuencias respectivas mostradas en las SEQ ID NO: 14 y 15, o una secuencia de aminoácidos al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a las mismas, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno y variantes de las mismas. En otras realizaciones, el anticuerpo comprende las CDR de cadena pesada y ligera o regiones variables de MPDL3280A. Por consiguiente, en una realización, el anticuerpo comprende los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 14, y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera que tiene las secuencias expuestas en la SEQ ID NO: 15.

[0182]

[0184] El anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 puede seleccionarse de un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo quimérico. En un aspecto de la invención, el anticuerpo comprende un dominio constante derivado de un anticuerpo IgG 1 , lgG2, lgG3 o lgG4 humano. En un aspecto de la invención, el anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo seleccionado de IgA, un IgD, un IgG, un IgE y un anticuerpo IgM. En un aspecto de la invención, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado de un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento Fab'-SH, un fragmento F(ab)2, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, una Ig de cadena pesada (una Ig de llama o camello), un fragmento VHH, un FV de dominio único, y un fragmento de anticuerpo de cadena única. En un aspecto de la invención, el anticuerpo es una molécula derivada de anticuerpo sintética o semisintética seleccionada de un scFV, un dsFV, un minicuerpo, un diacuerpo, un triacuerpo, un cuerpo kappa, un IgNAR; y un anticuerpo multiespecífico.

[0185] El anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 puede carecer de una unión específica sustancial a receptores Fcy, por ejemplo, CD16. Tales anticuerpos pueden comprender regiones constantes de diversas cadenas pesadas que se sabe que no se unen a receptores de Fe. Un ejemplo de este tipo es una región constante de lgG4. Alternativamente, pueden usarse fragmentos de anticuerpo que no comprenden regiones constantes, tales como fragmentos Fab o F(ab')2, para evitar la unión al receptor de Fe. La unión al receptor de Fe puede evaluarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, el ensayo de la unión de un anticuerpo a la proteína del receptor de Fe en un ensayo BIACORE. Además, puede usarse cualquier tipo de anticuerpo humano (por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4) en el que la porción Fe se modifica para minimizar o eliminar la unión a receptores Fcy. En un aspecto, la función efectora mínima se deriva de la producción en células procariotas. En un aspecto, la función efectora mínima da como resultado una "mutación Fe sin efector" o aglicosilación. En otra realización más, la mutación Fe sin efector es una sustitución N297A o D265A/N297A en la región constante.

[0186] Formulaciones

[0187] Un anticuerpo anti-NKG2A o anti-PD-1 o anti-PD-L1 puede incorporarse en una formulación farmacéutica que comprende en una concentración de 1 mg/ml a 500 mg/ml, en donde dicha formulación tiene un pH de 2,0 a 10,0. La formulación puede comprender, además, un sistema tampón, conservante(s), agente(s) de tonicidad, agente(s) quelante(s), estabilizantes y tensioactivos. En una realización, la formulación farmacéutica es una formulación acuosa, es decir, una formulación que comprende agua. Tal formulación es normalmente una solución o una suspensión. En una realización adicional, la formulación farmacéutica es una solución acuosa. El término "formulación acuosa" se define como una formulación que comprende al menos un 50 % p/p de agua. Asimismo, el término "solución acuosa" se define como una solución que comprende al menos un 50 % p/p de agua, y el término "suspensión acuosa" se define como una suspensión que comprende al menos un 50 % p/p de agua.

[0188] En otra realización, la formulación farmacéutica es una formulación liofilizada, a la que el médico o el paciente añade disolventes y/o diluyentes antes de su uso.

[0189] En otra realización, la formulación farmacéutica es una formulación seca (por ejemplo, liofilizada o secada por pulverización) lista para su uso sin ninguna disolución previa.

[0190] En un aspecto adicional, la formulación farmacéutica comprende una solución acuosa de dicho anticuerpo, y un tampón, en donde el anticuerpo está presente en una concentración de 1 mg/ml o superior, y en donde dicha formulación tiene un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0.

[0191] En otra realización, el pH de la formulación está en el intervalo seleccionado de la lista que consiste en de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0, de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 9,0, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 8,5, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0, y de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,5.

[0192] En una realización adicional, el tampón se selecciona del grupo que consiste en acetato de sodio, carbonato de sodio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrogenofosfato de sodio, hidrogenofosfato disódico, fosfato de sodio, y tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido mélico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico o mezclas de los mismos. Cada uno de estos tampones específicos constituye una realización alternativa de la invención.

[0193] En una realización adicional, la formulación comprende, además, un conservante farmacéuticamente aceptable. En una realización adicional, la formulación comprende, además, un agente isotónico. En una realización adicional, la formulación también comprende un agente quelante. En una realización adicional de la invención, la formulación comprende, además, un estabilizante. En una realización adicional, la formulación comprende, además, un tensioactivo. En aras de la comodidad, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19.<a>edición, 1995.

[0194] Es posible que puedan estar presentes otros ingredientes en la formulación farmacéutica peptídica usada para los tratamientos de la presente invención. Dichos ingredientes adicionales pueden incluir agentes humectantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes de carga, modificadores de tonicidad, agentes quelantes, iones metálicos, vehículos oleaginosos, proteínas (por ejemplo, albúmina de suero humano, gelatina o proteínas) y un zwitterión (por ejemplo, un aminoácido, tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Evidentemente, tales ingredientes adicionales no deberían afectar adversamente a la estabilidad global de la formulación farmacéutica usada para los tratamientos de la presente invención.

[0195] La administración de composiciones farmacéuticas usadas para los tratamientos de acuerdo con la invención puede ser a través de varias vías de administración, por ejemplo, intravenosa. Las formulaciones de anticuerpos adecuadas también pueden determinarse examinando experiencias con otros anticuerpos monoclonales terapéuticos ya desarrollados. Se ha demostrado que varios anticuerpos monoclonales son eficaces en situaciones clínicas, tales como rituxan (rituximab), herceptina (trastuzumab), xolair (omalizumab), bexxar (tositumomab), campath (alemtuzumab), zevalin, oncolym y formulaciones similares pueden usarse con los anticuerpos de esta invención. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal puede suministrarse a una concentración de 10 mg/ml en viales de un solo uso de 100 mg (10 mi) o 500 mg (50 mi), formulados para administración IV en cloruro sódico de 9,0 mg/ml, citrato sódico dihidratado de 7,35 mg/ml, polisorbato 80 de 0,7 mg/ml y agua estéril para inyección. El pH se ajusta a 6,5. En otra realización, el anticuerpo se suministra en una formulación que comprende aproximadamente 20 mM de citrato de sodio, aproximadamente 150 mM de NaCI, a pH de aproximadamente 6,0.

[0196] Como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, también se proporcionan kits que incluyen una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo anti-NKG2A, y un anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 , y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en una cantidad terapéuticamente eficaz adaptada para su uso en los métodos anteriores. Opcionalmente, los kits también pueden incluir instrucciones, por ejemplo, que comprenden programas de administración, para permitir que un médico (por ejemplo, un médico, enfermera o paciente) administre la composición contenida en los mismos para administrar la composición a un paciente que tiene cáncer (por ejemplo, un tumor sólido). El kit también puede incluir una jeringa.

[0197] Opcionalmente, los kits incluyen múltiples envases de las composiciones farmacéuticas de dosis única que contienen, cada uno, una cantidad eficaz del anticuerpo anti-NKG2A, anti-PD-1 o PD-L1 para una única administración de acuerdo con los métodos proporcionados anteriormente. También pueden incluirse en los kits instrumentos o dispositivos necesarios para administrar la(s) composición(es) farmacéutica(s). Por ejemplo, un kit puede proporcionar una o más jeringas precargadas que contienen una cantidad del anticuerpo anti-NKG2A, anti-PD-1 o anti-PD-L1.

[0198] Como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se proporciona un kit para tratar un cáncer en un paciente humano, comprendiendo el kit:

[0199] (a) una dosis de un anticuerpo anti-NKG2A que comprende los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de una cadena pesada que tiene la secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 4-8, y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de una cadena ligera que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 9;

[0200] (b) una dosis de un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1; y

[0201] (c) opcionalmente, instrucciones para usar el anticuerpo anti-NKG2A y el anticuerpo anti-PD-1 en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento.

[0202] Diagnóstico, pronóstico y tratamiento de tumores malignos

[0203] [0111]Se describen usos terapéuticos para el tratamiento de un cáncer en un individuo. Aunque los usos terapéuticos descritos en el presente documento son particularmente útiles para el tratamiento de tumores sólidos, los usos terapéuticos descritos en el presente documento también pueden usarse para una variedad de cánceres hematológicos, así como enfermedades infecciosas, e inflamación y trastornos autoinmunitarios. Las composiciones se utilizan, por ejemplo, para su uso en el tratamiento de una variedad de cánceres y otras enfermedades proliferativas incluyendo, pero sin limitación: carcinoma, incluyendo el de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, ovario, próstata, páncreas, estómago, cuello uterino, tiroides y piel; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkins, linfoma no de Hodgkins, linfoma de células pilosas y linfoma de Burketts, y mieloma múltiple; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluyendo leucemias mielógenas agudas y crónicas, leucemia promielocítica, y síndrome mielodisplásico; tumores de origen mesenquimal, incluyendo fibrosarcoma y rhabdomioscarcoma; otros tumores, incluyendo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma, y schwannomas; tumores de origen mesenquimal, incluyendo fibrosarcoma, rhabdomioscaroma y osteosarcoma; y otros tumores, incluyendo melanoma, xerodermia pigmentosa, queratoacantoma, seminoma, y cáncer folicular de tiroides.

[0205] Las terapias de combinación para el tratamiento del cáncer proporcionadas en el presente documento implican la administración de un anticuerpo neutralizante anti-NKG2A y un anticuerpo neutralizante de PD-1, por ejemplo, anticuerpo neutralizante anti-PD-1 o anti-PD-L1, para tratar sujetos afectados por cáncer (por ejemplo, tumores sólidos refractarios avanzados). En una realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-NKG2A y un anticuerpo anti-PD-1 en combinación para su uso en el tratamiento de sujetos que tienen un tumor sólido (por ejemplo, un tumor sólido, un tumor sólido refractario avanzado) o sujetos que tienen un tumor hematológico. En una realización particular, el anticuerpo anti-NKG2A comprende una cadena pesada de cualquiera de las SEQ ID NO: 4-8 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 9. En una realización, el anticuerpo que neutraliza la actividad inhibidora de PD-1 se selecciona del grupo que consiste en pembrolizumab, nivolumab, AMP-514, MEDI-4736, CT-011 y MPDL3280A.

[0207] Como se usa en el presente documento, la administración coadyuvante o combinada (coadministración) incluye la administración simultánea de los compuestos en la misma forma de dosificación o diferente, o la administración separada de los compuestos (por ejemplo, administración secuencial). Por lo tanto, los anticuerpos anti-NKG2A y anti-PD-1 o anti-PD-L1 pueden administrarse simultáneamente en una única formulación. Alternativamente, los anticuerpos anti-NKG2A y anti-PD-1 o anti-PD-L1 pueden formularse para administración separada y se administran simultánea o secuencialmente.

[0209] En una realización, el cáncer tratado con los usos terapéuticos divulgados en el presente documento es un cáncer que expresa HLA-E. En una realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPNM)), carcinoma de células renales (RCC), melanoma, cáncer colorrectal y cáncer de ovario.

[0211] Un paciente que tiene un cáncer puede tratarse con los anticuerpos anti-NKG2A con o sin una etapa de detección previa para evaluar la expresión de HLA-E en la superficie de células tumorales. Ventajosamente, los usos terapéuticos pueden comprender una etapa de detección de un ácido nucleico o polipéptido de HLA-E en una muestra biológica de un tumor (por ejemplo, en una célula tumoral) de un individuo. Los ejemplos de muestras biológicas incluyen cualquier fluido biológico adecuado (por ejemplo, suero, linfa, sangre), muestra celular o muestra de tejido. Por ejemplo, una muestra de tejido puede ser una muestra de tejido tumoral o tejido adyacente al tumor. Opcionalmente, el polipéptido HLA-E se detecta en la superficie de una célula maligna. Una determinación de que una muestra biológica expresa HLA-E (por ejemplo, expresa de manera prominente; expresa HLA-E a un nivel alto, alta intensidad de tinción con un anticuerpo anti-HLA-E, en comparación con una referencia) indica que el individuo tiene un cáncer que puede tener un fuerte beneficio del tratamiento con un anticuerpo que inhibe NKG2A. En una realización, el uso terapéutico comprende determinar el nivel de expresión de un ácido nucleico o polipéptido HLA-E en una muestra biológica y comparar el nivel con un nivel de referencia (por ejemplo, un valor, tinción débil de la superficie celular, etc.) correspondiente a un individuo sano. Una determinación de que una muestra biológica expresa un ácido nucleico o polipéptido HLA-E a un nivel que está aumentado en comparación con el nivel de referencia indica que el individuo tiene un cáncer que puede tratarse con un anticuerpo que inhibe NKG2A.

[0213] En una realización, una determinación de que una muestra biológica (por ejemplo, una muestra que comprende células tumorales, tejido tumoral y/o tejido adyacente al tumor) expresa de manera prominente ácido nucleico o polipéptido de HLA-E indica que el individuo tiene un cáncer que puede tratarse con un anticuerpo que inhibe NKG2A. "Expresado de manera prominente", cuando se refiere a un polipéptido HLA-E, significa que el polipéptido HLA-E se expresa en un número sustancial de células tumorales tomadas de un individuo dado. Aunque la definición del término "expresado de manera prominente" no está limitada por un valor de porcentaje preciso, en algunos ejemplos, un receptor que se dice que está "expresado de manera prominente" estará presente en al menos el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o más de las células tumorales tomadas de un paciente (en una muestra).

[0215] [0117]El hecho de determinar si un individuo tiene células cancerosas que expresan un polipéptido HLA-E puede comprender, por ejemplo, la obtención de una muestra biológica (por ejemplo, realizando una biopsia) del individuo que comprende células cancerosas, poner dichas células en contacto con un anticuerpo que se une a un polipéptido HLA-E, y detectar si las células expresan HLA-E en su superficie. Opcionalmente, el hecho de determinar si un individuo tiene células cancerosas que expresan HLA-E comprende realizar un ensayo de inmunohistoquímica. Opcionalmente, el hecho de determinar si un individuo tiene células cancerosas que expresan HLA-E comprende realizar un ensayo de citometría de flujo.

[0217] En los usos terapéuticos de la invención, el anticuerpo anti-NKG2A y los anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1 pueden administrarse por separado, juntos o secuencialmente, o en un cóctel. En algunas realizaciones, el compuesto de unión a antígeno se administra antes de la administración de los anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1. Por ejemplo, el anticuerpo anti-NKG2A puede administrarse aproximadamente de 0 a 30 días antes de la administración de los anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-NKG2A se administra de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 2 semanas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 semana, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas, de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 4 horas, de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 6 horas, de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 8 horas, de aproximadamente 8 horas a 1 día, o de aproximadamente 1 a 5 días antes de la administración de los anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-NKG2A se administra simultáneamente con la administración de los anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1. En algunas realizaciones, se administra un anticuerpo anti-NKG2A después de la administración de los anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1. Por ejemplo, un anticuerpo anti-NKG2A puede administrarse aproximadamente de 0 a 30 días después de la administración de los anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-NKG2A se administra de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 2 semanas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 semana, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas, de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 4 horas, de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 6 horas, de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 8 horas, de aproximadamente 8 horas a 1 día, o de aproximadamente 1 a 5 días después de la administración de los anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1.

[0219] Los protocolos de tratamiento adecuados para tratar a un ser humano que tiene cáncer incluyen, por ejemplo, administrar al paciente una cantidad eficaz de cada uno de un anticuerpo que inhibe NKG2A y un anticuerpo que neutraliza la actividad inhibidora de PD-1 humano, en donde el tratamiento comprende al menos un ciclo de administración en el que al menos una dosis del anticuerpo anti-NKG2A se administra a una dosis de 1-10 mg/kg de peso corporal y al menos una dosis del anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 se administra a una dosis de 1-20 mg/kg de peso corporal. En una realización, el ciclo de administración es de entre 2 semanas y 8 semanas.

[0221] En una realización, el tratamiento comprende al menos un ciclo de administración, en donde el ciclo es un periodo de ocho semanas o menos, en donde, para cada uno del al menos un ciclo, se administran dos, tres o cuatro dosis del anticuerpo anti-NKG2A a una dosis de 1-10 mg/kg de peso corporal y se administran dos, tres o cuatro dosis del anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 a una dosis de 1-20 mg/kg de peso corporal.

[0223] El anticuerpo anti-NKG2A puede administrarse ventajosamente en una cantidad que alcanza una concentración en circulación que es al menos 10, 20 o 30 veces mayor que la concentración requerida para la saturación de receptor sustancialmente completa (por ejemplo, 90 %, 95 %) (por ejemplo, tal como se evalúa valorando el anticuerpo anti-NKG2A en células que expresan NKG2A, por ejemplo en PBMC) u, opcionalmente, en una cantidad que alcanza una concentración en un tejido extravascular (por ejemplo, el tejido tumoral o entorno) que es al menos 10, 20 o 30 veces mayor que la concentración requerida para la saturación de receptor sustancialmente completa (por ejemplo, tal como se evalúa valorando el anticuerpo anti-NKG2A en células que expresan NKG2A, por ejemplo, en PBMC).

[0225] La respuesta de las células NK NKG2A+ puede evaluarse usando un ensayo adecuado de actividad citotóxica de células NK que expresan NKG2A hacia células diana que expresan HLA-E. Los ejemplos incluyen ensayos basados en marcadores de activación de células NK, por ejemplo, expresión de CD107 o CD137. El EC<50>para la respuesta de células NK NKG2A+ (por ejemplo, tal como se evalúa en un ensayo de movilización de CD107) de bloqueo del anticuerpo anti-NKG2A humZ270 usado en los ejemplos en el presente documento (por ejemplo, que tiene la cadena pesada de cualquiera de las SEQ ID NO: 4-8 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 9) es de aproximadamente 4 μg/ml, y la ECioo es aproximadamente 10 μg/ml. Por lo tanto, se administra una cantidad de anticuerpo anti-NKG2A para mantener una concentración sanguínea continua (mínima) de al menos 4 μg/ml. Ventajosamente, se puede administrar una cantidad de anticuerpo anti-NKG2A para lograr y/o mantener una concentración sanguínea continua (mínima) de al menos 10 μg/ml. Por ejemplo, la concentración sanguínea que se va a lograr y/o mantener puede ser de entre 10-12 μg/ml, 10-15 μg/ml, 10-20 μg/ml, 10-30 μg/ml, 10-40 μg/ml, 10-50 μg/ml, 10-70 μg/ml, 10-100 μg/ml, 10-150 μg/ml o 10-200 μg/ml. Cuando se dirigen tejidos fuera de la vasculatura (por ejemplo, en el tratamiento de tumores sólidos), se administra una cantidad de anticuerpo anti-NKG2A, de manera que se consiga y/o mantenga una concentración de tejido de al menos 10 μg/ml; por ejemplo, se espera que la administración de una cantidad de anticuerpo anti-NKG2A para conseguir una concentración sanguínea de al menos 100 μg/ml consiga una concentración de tejido de al menos 10 μg/ml. Por ejemplo, la concentración sanguínea que se va a lograr y/o mantener para lograr/mantener 10 μg/ml en un tejido puede ser de entre 100-110 μg/ml, 100-120 μg/ml, 100-130 μg/ml, 100-140 μg/ml, 100-150 μg/ml, 100-200 μg/ml, 100-250 μg/ml o 100-300 μg/ml.

[0226] En algunas realizaciones, se administra una cantidad de anticuerpo anti-NKG2A para obtener una concentración sanguínea (por ejemplo, suero sanguíneo) que corresponde a al menos la EC<50>para la respuesta celular de linfocitos NKG2A+ (por ejemplo, la respuesta de células NK NKG2A+), opcionalmente, a aproximadamente, o al menos aproximadamente, EC<100>· "EC<50>" (o "EC<100>"), con respecto a la respuesta celular NKG2A+ (por ejemplo, respuesta de células NK), se refiere a la concentración eficiente del anticuerpo anti-NKG2A que produce el 50 % (o 100 % cuando se refiere a la EC<100>) de su respuesta o efecto máximo con respecto a tal respuesta de células NKG2A+ (por ejemplo, respuesta de células NK). En algunas realizaciones, particularmente para el tratamiento de tumores sólidos, la concentración lograda se diseña para conducir una concentración en tejidos (fuera de la vasculatura, por ejemplo, en el entorno tumoral) que corresponde a al menos la EC<50>para la respuesta de células NK NKG2A+, opcionalmente, aproximadamente, o al menos aproximadamente, la EC<100>para la respuesta de las células NK NKG2A+.

[0228] Los protocolos de tratamiento adecuados para un anticuerpo anti-NKG2A, tal como humZ270, usado en los ejemplos en el presente documento que tiene una EC<100>para la respuesta de células NK NKG2A+ de aproximadamente 10 μg/ml comprenden al menos un ciclo de administración en el que al menos una dosis del anticuerpo anti-NKG2A se administra a una dosis de 2-10 mg/kg, opcionalmente 4-10 mg/kg, opcionalmente 6-10 mg/kg, opcionalmente 2-6 mg/kg, opcionalmente 2-8 mg/kg, u opcionalmente 2-4 mg/kg de peso corporal. Opcionalmente, se administran al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 dosis del anticuerpo anti-NKG2A. En una realización, el ciclo de administración es de entre 2 semanas y 8 semanas. En una realización, el ciclo de administración es de 8 semanas. En una realización, el ciclo de administración es de 8 semanas y comprende administrar una dosis del anticuerpo anti-NKG2A cada dos semanas (es decir, un total de cuatro dosis).

[0230] En un aspecto de cualquiera de las realizaciones en el presente documento, el anticuerpo anti-NKG2A se administra una vez aproximadamente cada dos semanas.

[0232] Los protocolos de tratamiento adecuados para su uso con un anticuerpo anti-NKG2A, particularmente para el tratamiento de un tumor hematopoyético, incluyen, por ejemplo, administrar al paciente un anticuerpo anti-NKG2A dos veces al mes en una cantidad eficaz para mantener una concentración sanguínea continua del anticuerpo anti-NKG2A de al menos 10 μg/ml entre al menos dos administraciones sucesivas del anticuerpo anti-NKG2A es de entre 2-10 mg/kg, opcionalmente 2-6 mg/kg, opcionalmente 2-8 mg/kg, opcionalmente 2-4 mg/kg, opcionalmente 2-6 mg/kg, opcionalmente 2-4 mg/kg, opcionalmente, aproximadamente, 4 mg/kg de peso corporal. Estas dosis pueden administrarse, opcionalmente, para proporcionar una concentración sanguínea continuada de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 10 μg/ml durante todo el ciclo de tratamiento. El hecho de lograr una concentración sanguínea de anticuerpo anti-NKG2A de 10 μg/ml corresponde a la EC<100>para un anticuerpo tal como Z270 humanizado.

[0234] Los protocolos de tratamiento adecuados para su uso con un anticuerpo anti-NKG2A, particularmente para el tratamiento de un tumor sólido en el que la concentración EC<50>del anticuerpo anti-NKG2A se busca en tejido extravascular (por ejemplo, en el tumor o entorno tumoral), incluyen, por ejemplo, administrar al paciente un anticuerpo anti-NKG2A dos veces al mes en una cantidad eficaz para mantener una concentración sanguínea continua de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 40 μg/ml entre al menos dos administraciones sucesivas del anticuerpo anti-NKG2A es de entre 2-10 mg/kg, opcionalmente, 2-6 mg/kg, opcionalmente, 2-4 mg/kg, opcionalmente, aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal. Estas dosis pueden administrarse, opcionalmente, para proporcionar una concentración sanguínea continuada de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 40 μg/ml durante todo el ciclo de tratamiento. Se espera que el hecho de lograr una concentración sanguínea de anticuerpo anti-NKG2A de 40 μg/ml proporcione una concentración tisular (por ejemplo, tejido extravascular, entorno tumoral) de aproximadamente 4 μg/ml, que a su vez corresponde a la EC<50>para un anticuerpo tal como Z270 humanizado.

[0236] Los protocolos de tratamiento adecuados para su uso con un anticuerpo anti-NKG2A, particularmente para el tratamiento de un tumor sólido en el que la concentración EC<50>del anticuerpo anti-NKG2A se busca en tejido extravascular (por ejemplo, en el tumor o entorno tumoral) incluyen por ejemplo, administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NKG2A, en donde el anticuerpo se administra 2 veces al mes y la cantidad eficaz para mantener una concentración sanguínea continua del anticuerpo anti-NKG2A de al menos 100 μg/ml entre al menos dos administraciones sucesivas del anticuerpo anti-NKG2A es de entre 4-10 mg/kg, opcionalmente, 4-6 mg/kg, opcionalmente, 4-8 mg/kg, opcionalmente, aproximadamente 4 mg/kg, opcionalmente, aproximadamente 6 mg/kg, opcionalmente, aproximadamente 8 mg/kg, u opcionalmente aproximadamente 10 mg/kg. Estas dosis pueden administrarse, opcionalmente, para proporcionar una concentración sanguínea continuada de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 100 μg/ml durante todo el ciclo de tratamiento. Se espera que el hecho de lograr una concentración sanguínea de anticuerpo anti-NKG2A de 100 μg/ml proporcione una concentración tisular (por ejemplo, extravascular, entorno tumoral) de aproximadamente 10 μg/ml, que a su vez corresponde a la EC<100>para un anticuerpo tal como Z270 humanizado.

[0238] Otros protocolos de tratamiento adecuados para su uso con un anticuerpo anti-NKG2A incluyen regímenes que emplean un periodo de carga con una dosis más alta, seguido de un periodo de mantenimiento.

[0239] Por ejemplo, un periodo de carga puede comprender administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NKG2A, en donde el anticuerpo se administra una o más veces en una cantidad eficaz para mantener una concentración sanguínea continua de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 100 μg/ml hasta la primera administración de anticuerpo anti-NKG2A en el régimen de mantenimiento. Por ejemplo, cuando se administra una vez, se puede administrar una dosis de carga de 10 mg/kg de anticuerpo anti-NKG2A, en donde la primera administración de anticuerpo anti-NKG2A dentro del régimen de mantenimiento ocurre aproximadamente dos semanas (o menos) después de la dosis de carga. El régimen de mantenimiento puede emplear entonces una dosis más baja y/o una frecuencia de administración más baja con el fin de mantener una concentración sanguínea continua de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 100 μg/ml entre administraciones sucesivas dentro del régimen de mantenimiento. Por ejemplo, un régimen de mantenimiento puede comprender administrar anticuerpo anti-NKG2A cada dos semanas a una dosis de entre 2-10 mg/kg, opcionalmente 4-10 mg/kg, opcionalmente 2-4 mg/kg, opcionalmente 4-6 mg/kg, opcionalmente 4-8 mg/kg, opcionalmente aproximadamente 4 mg/kg, opcionalmente aproximadamente 6 mg/kg, opcionalmente aproximadamente 8 mg/kg.

[0240] En ciertas realizaciones, una dosis (por ejemplo, cada dosis) del anticuerpo anti-NKG2A se administra a 4, 6, 8 o 10 mg/kg. En ciertas realizaciones, una dosis (por ejemplo, cada dosis) del anticuerpo anti-PD-1 se administra a 1-20 mg/kg, opcionalmente a 10 mg/kg. En ciertas realizaciones, una dosis (por ejemplo, cada dosis) del anticuerpo anti-PD-L1 se administra a 10, 15, 20 o 25 mg/kg, opcionalmente a 1200 mg de dosis total. En ciertas realizaciones, la terapia combinada permite que el anticuerpo anti-PD-1 o PD-L1 se administre a una dosis más baja; en una realización, cada dosis del anticuerpo anti-PD-1 se administra a 2 o 3 mg/kg.

[0241] En una realización, el anticuerpo anti-NKG2A y el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 se administran a las siguientes dosis:

[0242] (a) 1-10 mg/kg de anticuerpo anti-NKG2A y (i) 1-10 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 o (ii) 1-20 mg/kg de anticuerpo anti-PD-L1;

[0243] (b) 4, 6, 8 o 10 mg/kg de anticuerpo anti-NKG2A y 10 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1;

[0244] (c) 4, 6, 8 o 10 mg/kg de anticuerpo anti-NKG2A y 3 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 ; o

[0245] (d) 4, 6, 8 o 10 mg/kg de anticuerpo anti-NKG2A y 2 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1.

[0246] En un aspecto de cualquiera de las realizaciones en el presente documento, el anticuerpo anti-NKG2A se administra aproximadamente una vez cada dos semanas. En un aspecto de cualquiera de las realizaciones en el presente documento, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 se administra aproximadamente una vez cada tres semanas. En un aspecto de cualquiera de las realizaciones en el presente documento, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 se administra aproximadamente una vez cada dos semanas. En un aspecto de cualquiera de las realizaciones en el presente documento, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 se administra aproximadamente una vez cada cuatro semanas.

[0247] En una realización, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 y el anticuerpo anti-NKG2A se administran por vía i.v. En una realización, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 y el anticuerpo anti-NKG2A se administran el mismo día, opcionalmente, aproximadamente una vez más cada dos semanas, opcionalmente, además, por vía i.v.

[0248] Como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se proporcionan métodos para identificar células NK y/o células T NKG2A+PD1+. La evaluación de la coexpresión de NKG2A y PD-1 en células NK y/o células T puede usarse en métodos de diagnóstico o pronóstico. Por ejemplo, se puede obtener una muestra biológica de un individuo (por ejemplo, de cáncer o tejido adyacente al cáncer obtenido de un paciente con cáncer) y analizar la presencia de células NK y/o T NKG2A+PD1+. La expresión de NKG2A y PD-1 en tales células puede usarse, por ejemplo, para identificar individuos que tienen células NK y/o T infiltrantes de tumores que se inhiben tanto por polipéptidos NKG2A como PD1. El método puede ser útil, por ejemplo, como pronóstico para la respuesta al tratamiento con un agente que neutraliza NKG2A, como pronóstico para la respuesta al tratamiento con un agente que neutraliza PD1, o como pronóstico para la respuesta para el tratamiento combinado con un agente que neutraliza NKG2A y un agente que neutraliza PD1.

[0249] Como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se proporciona un método para evaluar si un individuo es adecuado para el tratamiento con un agente que inhibe NKG2A y un agente que neutraliza la actividad inhibidora de PD-1 humano, comprendiendo el método detectar una población de linfocitos (por ejemplo, células T CD8+) que expresan tanto un ácido nucleico o polipéptido NKG2A como un ácido nucleico o polipéptido PD-1 en una muestra biológica de un individuo. Una determinación de que el individuo tiene una población de linfocitos que expresa tanto un ácido nucleico o polipéptido NKG2A como un ácido nucleico o polipéptido PD-1 indica que el paciente tiene un cáncer que puede tratarse con un agente que inhibe NKG2A en combinación con un agente que neutraliza la actividad inhibidora de PD-1 humano.

[0250] [0136]Como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se proporcionan métodos para identificar células NK y/o células T NKG2A+PD1+. El hallazgo de que los linfocitos efectores infiltrantes de tumores pueden expresar tanto los receptores inhibidores NKG2A como PD-1 da lugar a métodos de tratamiento mejorados, así como a métodos para detectar tales células efectoras doblemente restringidas/inhibidas que pueden ser útiles en diagnósticos y pronósticos.

[0251] Por ejemplo, se puede obtener una muestra biológica de un individuo (por ejemplo, de cáncer o tejido adyacente al cáncer obtenido de un paciente con cáncer) y analizar la presencia de células NK y/o T NKG2A+PD1+. La expresión de NKG2A y PD-1 en tales células puede usarse, por ejemplo, para identificar individuos que tienen células NK y/o T infiltrantes de tumores que se inhiben tanto por polipéptidos NKG2A como PD1. El método puede ser útil, por ejemplo, como pronóstico para la respuesta al tratamiento con un agente que neutraliza NKG2A, como pronóstico para la respuesta al tratamiento con un agente que neutraliza PD1, o como pronóstico para la respuesta para el tratamiento combinado con un agente que neutraliza NKG2A y un agente que neutraliza PD1.

[0252] La detección de células T NK y/o CD8 restringidas por NKG2A y PD-1 dentro de muestras biológicas puede tener, más generalmente, ventajas para su uso en el estudio, evaluación, diagnóstico, pronóstico y/o predicción de patologías en las que es de interés la caracterización de células T NK y/o CD8. Por ejemplo, se puede hacer un pronóstico de cáncer favorable o desfavorable evaluando si el tumor o los tejidos adyacentes al tumor se caracterizan por células T NK y/o CD8 infiltrantes que expresan tanto NKG2A como PD-1.

[0253] Por ejemplo, el cáncer en pacientes puede caracterizarse o evaluarse usando anticuerpos anti-NKG2A y anti-PD1 para evaluar si las células T NK y/o CD8 infiltrantes de tumor son NKG2A+PD1+, incluyendo si dichas células T NK y/o CD8 están presentes en la periferia tumoral (en tejido adyacente al cáncer). Los métodos pueden ser útiles para determinar si un paciente tiene una patología caracterizada por células T NK y/o CD8 que podrían ser susceptibles de modulación por agentes terapéuticos que actúan directamente sobre tales células T NK y/o CD8 (por ejemplo, mediante la unión a NKG2A y/o PD-1, o sus respectivos ligandos HLA-E o PD-L1) o que actúan indirectamente sobre tales células T NK y/o CD8 (por ejemplo, produciendo citoquinas u otras moléculas de señalización que pueden modular la actividad de las células T NK y/o CD8). Opcionalmente, el paciente se ha tratado con un agente que neutraliza PD-1. Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender, además, opcionalmente, administrar a un individuo dicho agente terapéutico si se determina que el individuo tiene una patología que podría ser susceptible de modulación por agentes terapéuticos que actúan sobre las células T NK y/o CD8 infiltrantes de tumor.

[0254] Como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se proporciona un métodoin vitropara detectar un linfocito NKG2A+ PD-1+, opcionalmente, una célula T NK o CD8+, comprendiendo el método proporcionar una muestra biológica que comprende linfocitos infiltrantes de tumores y determinar si los linfocitos expresan NKG2A y PD-1.

[0255] Como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se proporciona un métodoin vitropara detectar células T CD8 o células NK que expresan NKG2A y PD-1 (es decir, doble positivo) dentro de una muestra de un individuo humano, comprendiendo dicho método proporcionar una muestra de un individuo, poner en contacto células en dicha muestra usando un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido NKG2A humano y un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido PD-1 humano en las muestras, y detectar la unión de los anticuerpos a las células. En una realización, las células son células T CD8 y/o células NK.

[0256] Como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se proporciona un métodoin vitropara detectar células T CD8 humanas infiltrantes de tejido y/o células NK que son inhibidas tanto por NKG2A como por PD-1 dentro de una muestra de un individuo humano, comprendiendo dicho método proporcionar una muestra de un individuo, y detectar células T CD8 infiltrantes de tejido y/o células NK en dicha muestra usando un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido NKG2A humano y un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido PD-1 humano en las muestras, en donde una detección de un polipéptido NKG2A y PD-1 indica la presencia de células T CD8 y/o células NK infiltrantes de tejido inhibidas por NKG2A y PD-1. Opcionalmente, el paciente se ha tratado con un agente que neutraliza PD-1. La muestra puede comprender células tumorales, tejido tumoral o tejido adyacente a tumor. Las células T CD8 y/o las células NK pueden identificarse usando métodos de inmunohistoquímica. La muestra puede ser una muestra incrustada en parafina; opcionalmente, la muestra incrustada en parafina se ha fijado, incrustado en parafina, seccionado, desparafinado y transferido a un portaobjetos antes de ser puesta en contacto con el anticuerpo monoclonal. Las células T CD8 y/o las células NK pueden identificarse usando métodos de citometría de flujo.Ejemplos

[0257] Ejemplo 1 - Las células tumorales RMA-S y A20 se infiltran mediante células NK que expresan NKG2A y células T CD8 que expresan NKG2A y/o PD-1

[0258] [0143]Generalmente, no se observa que los linfocitos coexpresen NKG2A y PD-1. Para investigar la expresión de estos receptores en linfocitos infiltrantes de tumores, se estudió la distribución de NKG2A y PD-1 en subconjuntos de células NK y T en tumores de ratones. Se tomaron linfocitos del bazo, de ganglios linfáticos de drenaje tumoral, así como de dentro de tumores sólidos.

[0259] Se injertaron (se) ratones C57/BL6 con células PDL-1+ Qa-1+ RMA-S (Qa-1, Qdm, B2m) o con células tumorales A20. Se sacrificaron ratones portadores de tumores RMA-S Qa-1 Qdm B2m (fila superior) y A20 (fila inferior) cuando los volúmenes tumorales eran de aproximadamente 500 mm<3>.

[0260] Los resultados se muestran en las Figuras 1A y 1B. Se analizaron células tumorales (Figura 1 A) y linfocitos infiltrantes de tumores TIL (Figura 1 B) por citometría de flujo, respectivamente, para la expresión de Qa-1 y PDL-1 para células tumorales y NKG2A y PD-1 para TIL. Se muestra un ratón representativo de 3. MFI: Mediana de la intensidad de fluorescencia.

[0261] Más de la mitad de las células NK infiltrantes de ambos tipos de tumores expresaron NKG2A, lo que sugiere que las células NK infiltrantes de tumores son inhibidas por NKG2A. Las células NK NKG2A+ generalmente no expresaron cantidades significativas de PD-1. Sin embargo, se encontraron células T CD8 que eran positivas tanto para NKG2A como para PD-1, lo que sugiere que las células T CD8 pueden estar restringidas por ambos receptores inhibidores NKG2A y PD-1.

[0262] Ejemplo 2 - Los subconjuntos de células NK y T de ratones portadores de tumores rma-rae1 son capaces de coexpresar NKG2A y PD-1

[0263] Para investigar aún más la expresión de los receptores NKG2A y PD-1, se estudió la distribución de NKG2A y PD-1 en subconjuntos de células NK y T en ratones. Se tomaron linfocitos del bazo, de ganglios linfáticos de drenaje tumoral, así como de dentro de tumores sólidos.

[0264] Se injertaron (se) ratones C57/BL6 con el clon 6 de RMA-Rae (2 millones de células). Estas células tumorales expresan el ligando CD94/NKG2A, Qa-1. Los ratones se sacrificaron el día 12 con un volumen tumoral medio: 723 mm<3>, SD: 161 mm<3>, n=4. Después de la preparación de la suspensión celular del bazo, LN y tumor, las células se tiñeron de la siguiente manera: CD3e PerCP Cy5.5, NPP46 Alexa 647, NKG2A/C/E FITC, PD1 PE, CD8 Pacific Blue.

[0265] Los resultados se muestran en la Figura 2 y las Tablas 1-3.

[0266] En el subconjunto de células NK, las células tanto en los ganglios linfáticos de drenaje como en el bazo fueron aproximadamente la mitad de NKG2A positivas y la mitad de NKG2A negativas; sin embargo, en ningún caso hubo una expresión significativa de PD1. Las células NK de ganglios linfáticos fueron NKG2A<+>PD-T (49,2 %) y NKG2A<'>PD-T (49,5 %) y menos del 1 % (media) de las células NK fueron NKG2A<+>PD-T. Las células NK del bazo fueron NKG2A<+>PD-T (44,1 %) y NKG2A<'>PD-T (55,7 %) y una media de 0,1 % (media) de células NK fueron NKG2A<+>PD-T.

[0267] En el subconjunto de células T, la mayoría de las células eran negativas para NKG2A (solo el 1,1 % en los ganglios linfáticos y el 4,7 % en el bazo son NKG2A<+>), y una pequeña fracción de células fue PD-T (3,5 % en ganglios linfáticos y 10 % en bazo fueron PD-T NKG2A<'>), sin células NKG2A PD-1 doble positivas significativas. Solo el 0,1 % (media) de células T en ganglios linfáticos eran NKG2A<+>PD-T y solo el 0,4 % (media) de células T en el bazo eran NKG2A<+>PD-T. El 95,1 % de las células T de los ganglios linfáticos fueron doble negativas y el 85,6 % de las células T del bazo fueron doble negativas.

[0268] En el subconjunto de células T CD8, la mayoría de las células fueron nuevamente negativas para NKG2A (solo el 1,6 % en los ganglios linfáticos y el 3,9 % en el bazo son NKG2A<+>), y una pequeña fracción de células fue PD-T (1,1 % en ganglios linfáticos y 2,5 % en bazo fueron PD-T NKG2A<'>), sin células NKG2A PD-1 doble positivas significativas. Solo el 0,2 % (media) de células T en ganglios linfáticos eran NKG2A<+>PD-T y solo el 0,3 % (media) de células T en bazo eran NKG2A<+>PD-T. El 97,3 % de células T de ganglios linfáticos fueron doble negativo y el 93,6 % de células T del bazo fueron doble negativo.

[0269] Sin embargo, entre los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), todos los subconjuntos de células tenían células que expresaban PD-1. Se observó que las células NK, que no se encontraron previamente en porcentajes significativos para expresar PD-1, eran positivas en el tumor para PD-1, incluyendo dentro del subconjunto NKG2A<+>, con 31,8 % (media) de células NK que eran NKG2A<+>PD-T. Aunque casi ninguna célula T CD8 fuera del tumor tenía expresión de NKG2A, las células T CD8 que expresaban PD-1 eran frecuentes en el tumor (el subconjunto de células T CD8 infiltrantes de tumor tenía una media de 26,3 % de células positivas para NKG2A+). Además, dentro de este subconjunto de células T CD8 positivas para NKG2A, la mayoría de las células eran NKG2A<+>PD-T (19,4 % (media)). Sin embargo, entre el subconjunto de células T CD8 , hubo poca diferencia en la expresión de NKG2A observada entre los TIL y células de bazo o ganglios linfáticos, ya que solo el 5,1 % de las células T en el tumor expresó NKG2A, y solo el 3,6 % de las células T fueron NKG2A PD-1 doble positivo.

[0270] Tabla 1: Bazo

[0271]

[0273] Tabla 2: Ganglios linfáticos drenantes del tumor

[0274]

[0276] Ejemplo 3 - Expresión de NKG2A y PD-1 en ratones portadores de tumores

[0277] [0154]Para investigar adicionalmente la expresión de NKG2A y PD-1 en ratones portadores de tumores, se injertaron (se) ratones C57/BL6 con diferentes células tumorales, líneas RMA-Rae1, MC38 o RMA. Para evaluar la influencia del volumen tumoral, se sacrificaron los ratones cuando sus tumores alcanzaron respectivamente los volúmenes de 500, 2000 y 800 mm<3>.

[0278] Los resultados se muestran en las Figuras 3A y 3B, con RMA Rae1 (fila superior), MC38 (fila media) y RMA (fila inferior). Se analizaron células NK (Figura 3A) y células T CD8 (Figura 3B) mediante citometría de flujo en bazo, ganglio linfático de drenaje tumoral (LN) y tumor para la expresión de NKG2A y PD-1. Se muestra un ratón representativo de entre 2 y 4.

[0279] En el subconjunto de células NK, las células en el tumor, ganglios linfáticos y bazo fueron aproximadamente la mitad positivas para NKG2A y la mitad negativas para NKG2A. Ni las células NK (independientemente de su expresión de NKG2A) de los ganglios linfáticos de drenaje ni el bazo mostraron ninguna expresión significativa de PD1. Sin embargo, las células NK infiltrantes de tumores de RMA-Rae1 y RMA expresaron niveles significativos tanto de NKG2A como de PD1. Las células NK infiltrantes de tumores de la línea tumoral MC38 que se sacrificaron con un volumen particularmente grande (2000 mm<3>) expresaron NKG2A (50 %), pero no expresaron significativamente PD1 (3 %).

[0280] A diferencia de las células NK que expresan NKG2A en aproximadamente la mitad de la población, las células T CD8 del bazo y los ganglios linfáticos generalmente no expresaron ni NKG2A ni PD1. Sin embargo, en tumores, una gran proporción de células T CD8 expresaron tanto NKG2A como PD1 (28 % en RMA-Rae1, 43 % de MC38 y 40 % de RMA fueron doble positivo). Los resultados sugieren, de nuevo, que las células T CD8 infiltrantes de tumores, así como las células NK, pueden ser capaces de ser restringidas tanto por el receptor inhibidor NKG2A como por el PD1; además, a través de diferentes tipos de células tumorales.

[0281] Ejemplo 4 - El tratamiento con mAb anti-PD-1 aumenta la frecuencia de células T CD8 que expresan NKG2A en tumores

[0282] Para evaluar el efecto del tratamiento con anticuerpo anti-PD1 en las células T CD8, los ratones portadores de tumores MC38 se trataron con 200 μg de control de isotipo (IC) de lgG2a de rata o anticuerpos monoclonales anti-PD-1 de ratón neutralizantes en los días 11, 14 y 17 después del injerto de células. Los ratones (n=3/grupo) se sacrificaron el día 31 y las células T CD8 se caracterizaron mediante citometría de flujo en bazo, ganglio linfático de drenaje tumoral (LN) y tumor. Se representan las medias /- SD (n=3) de los porcentajes de CD8 NKG2A+ entre las células T CD8. P<0,005 (*), P<0,0005 (*), análisis estadístico realizado con ANOVA bidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.

[0283] Los resultados se muestran en la Figura 4. De manera similar a lo que se observa en otros experimentos, las células T CD8 del bazo de ganglios linfáticos no expresaron significativamente NKG2A. La administración del anticuerpo anti-PD1 no provocó ningún cambio en el nivel de expresión de NKG2A en el bazo o en las células T de los ganglios linfáticos. Sin embargo, en la población de células T CD8 infiltrantes de tumores, la administración de anticuerpo anti-PD1 provocó un aumento de más del 50 % en las células T CD8 que expresan NKG2A. Los resultados sugieren que, tras el tratamiento con anticuerpo anti-PD1, el receptor NKG2A puede tener una contribución aumentada a la inhibición de la respuesta de células T CD8 hacia tumoresin vivo.La neutralización de NKG2A puede ser, por lo tanto, útil para invertir la inhibición de las células T restringidas a NKG2A en individuos tratados con un agente que neutralice el eje PD-1, tal como un anticuerpo anti-PD1 o PDL1.

[0284] Ejemplo 5 - El bloqueo combinatorio anti-NKG2A/anti-PD1 inhibe el crecimiento tumoral

[0285] Para evaluar el efecto del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-PD1 neutralizante y anticuerpo anti-NKG2A neutralizante, se injertaron (se) ratones C57BL/6 con células tumorales RMA-S Qa-1 Qdm B2m y se trataron con agente anti-PD1 neutralizante (un anticuerpo anti-PD-L1 neutralizante) y anticuerpo anti-NKG2A neutralizante.

[0286] En resumen, se aleatorizaron ratones C57BL/6 el día 11 cuando el volumen tumoral RMA-S Qa-1 Qdm B2m era de aproximadamente 85 mm<3>(n=8 ratones/grupo) y se trataron con control de isotipo, mAb anti-NKG2A de ratón (200 μg, iv), mAb anti-PD-L1 de ratón (200 μg, ip) o combinación de anti-mNKG2A/mPDL-1 los días 11, 14 y 18. El volumen tumoral se midió dos veces a la semana con un calibrador. Los animales se sacrificaron cuando el tumor se volvió grande (volumen >2000 mm<3>), se ulceraron o necrotizaron. Los datos representan la mediana del volumen tumoral por experimento.

[0287] La evolución de la mediana del volumen tumoral a lo largo del tiempo se muestra en la Figura 5. Aunque anti-NKG2A produjo solo un efecto antitumoral modesto en comparación con el control de isotipo en este modelo y anti-PD-L1 produjo un efecto antitumoral sustancial, pero con un volumen tumoral que aumenta hacia el día 28, el tratamiento combinado con anti-NKG2A y anti-PD-L1 suprimió completamente el crecimiento tumoral, sin que se observara ningún crecimiento significativo en el volumen tumoral el día 28.

[0288] El uso de los términos "un" y "una", "el" y "la", y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención debe interpretarse como que abarca tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto.

[0289] A menos que se indique lo contrario, todos los valores exactos proporcionados en el presente documento son representativos de los valores aproximados correspondientes (por ejemplo, se puede considerar que todos los ejemplos de valores exactos proporcionados con respecto a un factor o medición particular también proporcionan una medición aproximada correspondiente, modificada por "aproximadamente", cuando sea apropiado). Cuando se usa "aproximadamente" en relación con un número, esto puede especificarse como que incluye valores correspondientes a /-10 % del número especificado.

[0290] La descripción en el presente documento de cualquier aspecto o realización de la invención que usa términos tales como "que comprende", "que tiene", "que incluye" o "que contiene" con referencia a un elemento o elementos está destinada a proporcionar soporte para un aspecto o realización similar de la invención que "consiste en", "consiste esencialmente en" o "comprende sustancialmente" ese elemento o elementos particulares, a menos que se indique lo contrario o se contradiga claramente por el contexto (por ejemplo, una composición descrita en el presente documento que comprende un elemento particular debe entenderse como que también describe una composición que consiste en ese elemento, a menos que se indique lo contrario o se contradiga claramente por el contexto).

[0291] El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje de ejemplo (por ejemplo, "tal como"), proporcionados en el presente documento, pretende meramente iluminar mejor la invención y no supone una limitación en el alcance de la invención a menos que se reivindique lo contrario. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva debe interpretarse como indicativo de que cualquier elemento no reivindicado es esencial para la práctica de la invención.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1.Anticuerpo que neutraliza NKG2A humano para su uso en el tratamiento de un cáncer en un paciente humano, comprendiendo el tratamiento administrar al paciente una cantidad eficaz de cada uno de: (a) un anticuerpo que neutraliza NKG2A humano, y (b) un anticuerpo que neutraliza PD-1 humano.

2. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 1 , en donde al menos dos dosis del anticuerpo que neutraliza NKG2A humano se van a administrar en una cantidad eficaz para lograr una concentración sanguínea continua de anticuerpo anti-NKG2A de al menos 10 μg/ml durante al menos una semana después de la administración del mismo.

3. Anticuerpo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el tratamiento comprende al menos un ciclo de administración, opcionalmente en donde el ciclo es un periodo de ocho semanas, en donde, para cada ciclo, se administran dos, tres o cuatro dosis del anticuerpo que neutraliza el NKG2A humano y se administran dos, tres o cuatro dosis del anticuerpo que neutraliza PD-1.

4. Anticuerpo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el anticuerpo que neutraliza NKG2A humano y el anticuerpo que neutraliza PD-1 se formulan para su administración separada y se administran de manera simultánea o secuencial, o se formulan administrados de manera simultánea en una única formulación, o se formulan administrados de manera simultánea en el mismo día.

5. Anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el cáncer es un tumor sólido o tumor hematológico, preferiblemente un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, carcinoma de células renales (RCC), melanoma, cáncer colorrectal y cáncer de ovario.

6. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 5, en donde el cáncer es un cáncer que expresa HLA-E.

7. Anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el cáncer es cáncer de pulmón, preferiblemente cáncer de pulmón de células no pequeñas.

8. Anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo que neutraliza NKG2A humano comprende los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de una cadena pesada que tiene la secuencia expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NO: 4-8, y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de una cadena ligera que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 9.

9. Anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humano o humanizado.

10. Anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo que neutraliza NKG2A es un anticuerpo no deplecionante.

11. Anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo que neutraliza PD-1 es un anticuerpo no deplecionante.

12. Anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo lgG4.

13. Anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo carece de un dominio Fe o comprende un dominio Fe que se modifica para reducir la unión entre el dominio Fe y un receptor Fcy.

14. Anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, seleccionándose opcionalmente dicho fragmento de anticuerpo de entre Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, un diacuerpo, un fragmento de anticuerpo monocatenario, o un anticuerpo multiespecífico que comprende múltiples fragmentos de anticuerpo diferentes.

15. Anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo que neutraliza NKG2A humano comprende una cadena pesada que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 9, y en donde dicho anticuerpo que neutraliza PD-1 humano es un anticuerpo anti-PD-L1 que inhibe la unión de PD-L1 a PD-1.

16. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 15, en donde el anticuerpo anti-PD-L1 es MEDI-4736.

17. Anticuerpo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el anticuerpo que neutraliza NKG2A humano comprende una cadena pesada que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 9, y en donde el anticuerpo que neutraliza

PD-1 humano se selecciona del grupo que consiste en pembrolizumab, nivolumab, AMP-514, MEDI-4736, CT-011 y MPDL3280A.

18. Anticuerpo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en donde el cáncer es cáncer de pulmón de células no pequeñas.