RS60935B1 - Neutralizacija inhibitornih puteva u limfocitima - Google Patents

Description

Opis

OBLAST OVOG PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na kombinovanu upotrebu NKG2A-neutrališućih agenasa i PD-1 neutrališućih agenasa za lečenje kancera.

POZADINA OVOG PRONALASKA

[0002] Dejstvo NK ćelije reguliše kompleksan mehanizam koji uključuje i aktivirajuće i inhibitorne signale. Identifikovano je nekoliko različitih NK-specifičnih receptora koji igraju važnu ulogu u prepoznavanju posredovanom NK ćelijama i ubijanju ciljnih ćelija kojima nedostaje HLA klasa I. Prirodni citotoksični receptori (NCR) se odnosi na klasu aktivirajućih proteina receptora, i gene koji ih eksprimiraju, koji su specifično eksprimirani u NK ćelijama. Primeri NCR uključuju NKp30, NKp44, i NKp46 (videti, npr., Lanier (2001) Nat Immunol 2:23-27, Pende et al. (1999) J Exp Med.190:1505-1516, Cantoni et al. (1999) J Exp Med.189:787-796, Sivori et al (1997) J. Exp. Med.186:1129-1136, Pessino et al. (1998) J Exp Med.188(5):953-60; Mandelboim et al. (2001) Nature 409:1055-1060). Ovi receptori su članovi Ig superporodice, i njihovo umrežavanje, izazvano konkretnim mAb, dovodi do jake aktivacije NK ćelija što za rezultat ima povišene intracelularne Ca<++>nivoe, pokretanje citotoksičnosti, i oslobađanje limfokina, i aktivacije NK citotoksičnosti protiv mnogih vrsta ciljnih ćelija.

[0003] CD94/NKG2A je inhibitorni receptor koji je prisutan na podskupovima limfocita. CD94/NKG2A ograničava oslobađanje citokina i citotoksičnih odgovora određenih limfocita prema ćelijama koje eksprimiraju CD94/NKG2A-ligand HLA-E (videti, npr., WO99/28748). Za HLA-E je takođe utvrđeno da ga u čvrstom obliku izlučuju određene tumorske ćelije (Derre et al., J Immunol 2006;177:3100-7) i aktivirane endotelijalne ćelije (Coupel et al., U krvi 2007;109:2806-14). Antitela koja inhibiraju signaliziranje CD94/NKG2A mogu da povećaju oslobađanje citokina i citolitičko dejstvo limfocita prema HLA-E pozitivnim ciljnim ćelijama, kao što su odgovori CD94/NKG2A-pozitivnih NK ćelija prema HLA-E eksprimirajućim tumorskim ćelijama ili virusom inficiranim ćelijama. Stoga, terapijska antitela koja inhibiraju CD94/NKG2A ali ne izazivaju ubijanje CD94/NKG2A-eksprimirajuće ćelije (tj. antitela koja ne izazivaju depleciju), mogu da izazovu kontrolu rasta tumora kod pacijenata sa kancerom.

[0004] PD-1 je inhibitorni član CD28 porodice receptora koji takođe uključuje CD28, CTLA-4, ICOS i BTLA. PD-1 je eksprimiran na aktiviranim B ćelijama, T ćelijama, i mijeloidnim ćelijama Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol.14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8). Dva liganda za PD-1 su identifikovana, PD- L1 i PD-L2, za koja se pokazalo da nizvodno regulišu aktivaciju T ćelija nakon vezivanja za PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 obiluje raznim humanim kancerima (Dong et al. (2002) Nat. Med.8:787-9). Interakcija između PD-1 i PD-L1 dovodi do smanjenja tumor infiltrišućih limfocita, smanjenja proliferacije posredovane T-ćelijom, i imunološke evazije kancerskih ćelija.

Imunološka supresija može da se preokrene inhibiranjem lokalne interakcije PD-1 sa PD-L1, a efekat je aditivan kada je interakcija PD-1 sa PD-L2 takođe blokirana.

[0005] PD-1 blokada je dovela do upečatljivih anti-tumorskih odgovora u brojnim kliničkim ispitivanjima. Međutim, ne reaguju svi pacijenti anti-tumorskim odgovorima na lečenje, a štaviše, neki pacijenti imaju kancere koji se vraćaju nakon lečenja. Kao posledica, u tehnici postoji potreba za poboljšanom korišću za pacijente lečene inhibitorima PD-1 ose.

[0006] Perez-Gracia et al (2014, Current Opinion in Immunology, 27, 89-97) je naučni pregled koji se odnosi na blokadu imunološke kontrolne tačke za imunoterapiju kancera. Katou et al (2007, Cancer Research, 67, 11195-11201) se odnosi na određivanje ekspresije PD-1, NKG2A, NKG2D, CD69 i Ki-67 kod intraepitelijalnih i stromalnih limfocita u ranom stadijumu kancera jezika.

KRATAK SADRŽAJ OVOG PRONALASKA

[0007] Ovaj pronalazak je definisan priloženim zahtevima. U nastavku, tamo gde se koristi reč pronalazak i/ili su karakteristike predstavljene kao opcione, ovo bi se trebalo tumačiti tako da se zaštita traži samo za pronalazak kako je definisan u zahtevima. Obim ovog pronalaska je definisan zahtevima i bilo koja informacija koja ne potpada pod zahteve, data je samo informativno.

[0008] Ovo otkrivanje obezbeđuje poboljšane postupke pojačavanja anti-tumorskog imunološkog odgovora putem kombinovane neutralizacije inhibitornih receptora NKG2A i PD-1, npr. upotrebom antitela. Dok CD8T ćelije i NK ćelije (na periferiji) ne eksprimiraju i NKG2A i PD-1, utvrđeno je da tumor infiltrišući limfociti koji posreduju eliminaciju tumorskih ćelija mogu da eksprimiraju i inhibitorni receptor PD-1 i inhibitorni receptor NKG2A. Pored toga, lečenje anti-PD1 može da uzrokuje uzvodnu regulaciju NKG2A receptora na tumor infiltrišućim limfocitima, tako da NKG2A može da ograniči efikasnost agenasa koji blokiraju PD1 osu. Pošto ovi receptori mogu i da ograniče citotoksična dejstva tumor infiltrišućih limfocita, neutralizacija inhibitornog dejstva oba ova dva receptora antitelima omogućava da NKG2A+PD1+ limfociti efikasno eliminiše kancerske ćelije. U jednom aspektu, NKG2A+PD1+ limfociti predstavljaju citotoksične limfocite, opciono CD8+ T ćelije ili NK ćelije.

[0009] Inhibicija ili neutralizacija inhibitornog dejstva PD-1 može poželjno da uključi upotrebu polipeptida (npr. antitelo, polipeptid spojen sa Fc domenom, imunoadhezin, itd.) koji sprečava PD-1 signaliziranje izazvano PD-L1, npr. blokiranjem interakcije sa njegovim prirodnim ligandom PD-L1 (i opciono dalje blokiranjem interakcije između PD-1 i PD-L2. U jednom aspektu polipeptid predstavlja antitelo koje vezuje PD-1 (anti-PD-1 antitelo); takvo antitelo može da blokira interakciju između PD-1 i PD-L1 i/ili između PD-1 i PD-L2. U drugom aspektu polipeptid je antitelo koje vezuje PD-L1 (anti-PD-L1 antitelo) i blokira interakciju između PD-1 i PD-L1.

[0010] Samim tim, u jednom aspektu, obezbeđen je postupak za lečenje ili sprečavanje kancera kod pojedinca, pri čemu postupak obuhvata davanje pojedincu: (a) terapijski aktivne količine jedinjenja koja inhibira humani NKG2A polipeptid, i (b) terapijski aktivne količine jedinjenja koja inhibira humani PD-1 polipeptid. U jednom aspektu, kancer je čvrst tumor. U jednom aspektu, jedinjenje koje inhibira humani NKG2A polipeptid je antitelo koje neutrališe inhibitorno dejstvo NKG2A. U jednom aspektu, jedinjenje koje inhibira humani PD-1 polipeptid je anti-PD-1 ili anti-PDL-1 antitelo koje neutrališe inhibitorno dejstvo PD-1. Za pojedinca može biti naznačeno da to bude čovek.

[0011] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak aktiviranja ili potenciranja dejstva CD8+ tumorinfiltrišuće T ćelija kod pojedinca, pri čemu taj postupak obuhvata davanje pojedincu: (a) terapijski aktivne količine jedinjenja koja inhibira humani NKG2A polipeptid, i (b) terapijski aktivne količine jedinjenja koja inhibira humani PD-1 polipeptid. U jednom aspektu, obezbeđen je postupak aktiviranja ili potenciranja dejstva tumor-infiltrišuće NK ćelije kod pojedinca, pri čemu postupak obuhvata davanje pojedincu: (a) terapijski aktivne količine jedinjenja koja inhibira humani NKG2A polipeptid, (b) terapijski aktivne količine jedinjenja koja inhibira humani PD-1 polipeptid.

[0012] U jednom aspektu, obezbeđeno je lečenje koje obuhvata davanje kombinacije antitela koje neutrališe inhibitorno dejstvo NKG2A, i antitela koje neutrališe inhibitorno dejstvo PD-1.

[0013] U jednom aspektu obezbeđena je kompozicija koja obuhvata antitelo koje inhibira humani NKG2A polipeptid i antitelo koje inhibira humani PD-1 polipeptid. U jednom aspektu, kompozicija je za upotrebu u lečenju ili sprečavanju kancera, opciono čvrstog tumora, opciono hematološkog maligniteta.

[0014] U jednom aspektu, anti-NKG2A antitelo se daje u količini koja dovodi do neutralizacije inhibitornog dejstva humanog CD94/NKG2A kod humanog pacijenta (in vivo), npr., količini koja dovodi do neutralizacije inhibitornog dejstva humanog CD94/NKG2A na CD8 T ćelije i NK ćelije kod humanog pacijenta. U jednom aspektu, količina koja dovodi do neutralizacije inhibitornog dejstva humanog CD94/NKG2A kod humanog pacijenta je najmanje 10-struko (npr., 10-20 puta, 10-50 puta, 10-100 puta, 20-50 puta, 20-100 puta, 30-100 puta, 50-100 puta), opciono najmanje 50-, 60-, 80- ili 100-struko, od minimalne koncentracije potrebne da se suštinski zasite NKG2A receptori na površini NKG2A+ ćelija (npr., kod ispitivanja vezivanja gde je antitelo titrirano na PBMC). U jednom aspektu, anti-NKG2A antitelo stupa u kompeticiju sa HLA-E radi vezivanja za humani NKG2A.

[0015] U jednom aspektu, anti-NKG2A antitelo se daje tokom najmanje tokom jednog ciklusa davanja, pri čemu taj ciklus davanja obuhvata najmanje prvo i drugo (a opciono i 3., 4., 5., 6., 7. i/ili 8. Ili dalje) davanje anti-NKG2A antitela, pri čemu se anti-NKG2A antitelo daje u količini efektivnoj za postizanje kontinuirane (minimalne) koncentracije anti-NKG2A antitela u krvi od najmanje 10 µg/ml (ili, opciono najmanje 20, 30, 40 ili 50 µg/mL) između prvog i drugog (i opciono dalje) davanja. Postizanje ili održavanje naznačene koncentracije u krvi znači da koncentracija u krvi ne pada suštinski ispod naznačene koncentracije u krvi tokom trajanja naznačenog vremenskog perioda (npr. između dva davanja antitela, broja nedelja), tj. iako koncentracija u krvi može da varira tokom naznačenog vremenskog perioda, naznačena koncentracija u krvi predstavlja minimalnu ili "najnižu" koncentraciju.

[0016] U jednom aspektu, anti-NKG2A antitelo se daje u količini efektivnoj za postizanje najviše vrednosti koncentracije u krvi od oko ili najmanje oko 50, 60, 70 ili 80 µg/ml, opciono najmanje oko 100 µg/ml, nakon davanja (npr. u roku od 1 ili 2 dana davanja).

[0017] U jednom aspektu, anti-NKG2A antitelo se daje u količini efektivnoj za postizanje kontinuirane (minimalne) koncentracije anti-NKG2A antitela u krvi od oko ili najmanje oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 ili 80 µg/ml, opciono najmanje oko 100 µg/ml, tokom najmanje jedne nedelje, ili najmanje dve nedelje, nakon davanja antitela.

[0018] U jednom aspektu, anti-NKG2A antitelo se daje u količini efektivnoj za postizanje kontinuirane (minimalne) koncentracije anti-NKG2A antitela u krvi od oko ili najmanje oko 50, 60, 70 ili 80 µg/ml, opciono najmanje oko 100 µg/ml, između dva sukcesivna davanja. U jednom aspektu, prvo i drugo davanje su odvojeni vremenskim periodom od oko dve nedelje, opciono oko jedne nedelje.

[0019] Anti-NKG2A antitelo opciono može da se da u količini efektivnoj i prema učestalosti kojom se postiže kontinuirana (minimalna) koncentracija u krvi kako je naznačeno tokom čitavog trajanja ciklusa davanja.

[0020] U jednom aspektu, anti-NKG2A antitelo se daje u kombinaciji sa antitelom koje neutrališe humani PD-1 polipeptid, za lečenje čvrstog tumora kod pojedinca, pri čemu taj ciklus davanja obuhvata najmanje dva davanja anti-NKG2A antitela, pri čemu se anti-NKG2A antitelo daje u količini efektivnoj za postizanje kontinuirane (minimalne) koncentracije u ekstravaskularnom tkivu (npr. u tumorskom okruženju) od najmanje 4 µg/mL, opciono najmanje 10 µg/mL između dva sukcesivna davanja. Opciono, anti-NKG2A antitelo se daje u količini efektivnoj za postizanje kontinuirane (minimalne) koncentracije u ekstravaskularnom tkivu (npr. u tumorskom okruženju) od najmanje 4 µg/mL, opciono najmanje 10 µg/mL, tokom čitavog trajanja ciklusa davanja. U jednom aspektu, anti-NKG2A antitelo se daje u količini efektivnoj za postizanje kontinuirane (minimalne) koncentracije anti-NKG2A antitela u krvi od najmanje 40 µg/mL, opciono najmanje 100 µg/mL, između dva sukcesivna davanja, ili tokom trajanja ciklusa davanja.

[0021] U jednom aspektu, antitelo koje neutrališe humani PD-1 polipeptid se daje u količini koja dovodi do neutralizacije inhibitornog dejstva humanog PD-1 kod humanog pacijenta (in vivo), npr. količini koja dovodi do neutralizacije inhibitornog dejstva humanog PD-1 na CD8 T ćelije i NK ćelije kod humanog pacijenta. U jednom aspektu, ova kombinacija se daje (ili je za davanje) prema određenom kliničkom doznom režimu, naročito u određenoj doznoj količini i prema konkretnom rasporedu doziranja.

[0022] U jednom aspektu, antitelo koje neutrališe NKG2A predstavlja antitelo koje ne izaziva depleciju, npr. antitelo koje ne ubija, ne eliminiše, lizira ili izaziva takvo ubijanje, eliminaciju ili lizu, tako da negativno utiče na određeni broj NKG2A-eksprimirajućih ćelija prisutnih u uzorku ili u subjektu. U jednom aspektu antitelo koje neutrališe PD-1 predstavlja antitelo koje ne izaziva depleciju. Antitelu koje ne izaziva depleciju može, na primer, da nedostaje Fc domen ili može da ima Fc domen sa minimalnim ili bez vezivanja za jedan ili više Fcγ receptora (npr. CD16). Primer uključuje antitela sa konstantnim regionima od antitela humanog IgG4 izotipa, antitela bilo kog izotopa (npr. IgG1, IgG2, IgG3) sa konstantnim regionima modifikovanim da smanje ili ponište vezivanje za jedan ili više Fcγ receptora (npr. CD16).

[0023] U jednom aspektu kancer predstavlja uznapredovali i/ili refraktorni čvrsti tumor. U jednom aspektu, taj kancer (npr., uznapredovali refraktorni čvrsti tumor) je izabran iz grupe koju čine kancer pluća nemalih ćelija (NSCLC), kancer bubrega, adenokarcinom pankreasa ili ezofagusa, kancer dojke, karcinom renalnih ćelija (RCC), melanom, kolorektalni kancer, i kancer jajnika.

[0024] Jedinjenje koje inhibira NKG2A polipeptid (anti-NKG2A agens) je jedinjenje koje povećava mogućnost NKG2A-eksprimirajućih NK i/ili T ćelija da uzrokuju smrt HLA-E-eksprimirajuće ćelije.

Opciono, jedinjenje koje inhibira NKG2A polipeptid predstavlja polipeptid, opciono antitelo (npr. monoklonalno antitelo), koje vezuje NKG2A polipeptid.

[0025] U jednom aspektu, anti-NKG2A agens smanjuje inhibitorno dejstvo NKG2A blokiranjem vezivanja njegovog liganda, HLA-E, tj., anti-NKG2A agens se meša u vezivanje NKG2A putem HLA-E. Antitelo koje ima teški lanac bilo koje od SEQ ID NO: 4-8 i laki lanac SEQ ID NO: 9 predstavlja primer takvog antitela. U jednom aspektu, anti-NKG2A agens smanjuje inhibitorno dejstvo NKG2A bez blokiranja vezivanja njegovog liganda, HLA-E, tj., anti-NKG2A agens je antagonist koji ne ulazi u kompeticiju i ne meša se sa vezivanjem NKG2A putem HLA-E. Antitelo koje ima varijabilne regione teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 10 i 11 tim redom, predstavlja primer takvog antitela.

[0026] U jednom aspektu, anti-NKG2A agens je antitelo koje se vezuje sa značajno većim afinitetom za NKG2A nego za jedan ili više aktivirajućih NKG2 receptora. Na primer, u jednom aspektu, agens je antitelo koje se sa značajno većim afinitetom vezuje za NKG2A nego za NKG2C. U dodatnom ili alternativnom aspektu, agens je antitelo koje se vezuje sa značajno većim afinitetom za NKG2A nego za NKG2E. U dodatnom ili alternativnom aspektu, agens je antitelo koje se sa značajno većim afinitetom vezuje za NKG2A nego za NKG2H.

[0027] U jednom aspektu, anti-NKG2A agens stupa u kompeticiju sa antitelom koje ima teške i lake lance SEQ ID NO: 4-8 i 9 tim redom, ili antitelom koje ima varijabilne regione teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 10 i 11 tim redom, kod vezivanja za CD94/NKG2A. Ovaj agens može da bude, npr., humano ili humanizovano anti-NKG2A antitelo.

[0028] U jednom aspektu, anti-NKG2A antitelo je humanizovano antitelo koje ima CDR-ove teškog lanca bilo kog od teških lanaca bilo koje od SEQ ID NO: 4-8 i CDR-ove lakog lanca lakog lanca SEQ ID NO: 9, tim redom. U jednom aspektu, anti-NKG2A antitelo je humanizovano antitelo koje ima varijabilni region bilo kog od teških lanaca bilo koje od SEQ ID NO: 4-8 i varijabilni region lakog lanca lakog lanca SEQ ID NO: 9, tim redom. Obezbeđeni su primeri ostataka ili sekvenci regiona određivanja komplementarnosti (CDR) i/ili mesta za aminokiselinske supstitucije u okvirnom regionu (FR) takvih humanizovanih antitela poboljšanih svojstava kao što su, npr., niža imunogenost, poboljšano antigen-vezivanje ili druga funkcionalna svojstva, i/ili poboljšana fizičko-hemijska svojstva kao što je, npr., bolja stabilnost.

[0029] U određenim opcionim aspektima, pacijenti mogu da budu identifikovani za lečenje anti-NKG2A agensom i PD1-neutrališućim agensom ocenjivanjem prisustva u uzorku tumora (npr. tumorskom tkivu i/ili tkivu oko tumorskog) liganada za NKG2A, opciono dalje liganda PD-1. U jednom aspektu bilo koje od terapijskih upotreba ili ovde opisanih postupaka lečenja kancera ili sprečavanja, pri čemu lečenje ili sprečavanje kancera kod pojedinca obuhvata:

a) utvrđivanje polipeptidnog statusa HLA-E malignih ćelija kod pojedinca sa kancerom, i

b) nakon utvrđivanja da maligne ćelije (npr. tumorske ćelije) značajno eksprimiraju HLA-E polipeptide (npr. na površini), davanje jedinjenja koje neutrališe inhibitorno dejstvo humanog NKG2A polipeptida i agensa koji inhibira humani PD-1 polipeptid pojedincu.

[0030] U jednom aspektu bilo koje od terapijskih upotreba ili ovde opisanih postupaka lečenja kancera ili sprečavanja, pri čemu lečenje ili sprečavanje kancera kod pojedinca obuhvata:

a) utvrđivanje polipeptidnog statusa HLA-E i polipeptidnog statusa PD-L1 malignih ćelija (npr. tumorskih ćelija) kod pojedinca sa kancerom, i

b) nakon utvrđivanja da se HLA-E i PD-L1 polipeptidi značajno eksprimiraju na površini malignih ćelija, davanje pojedincu jedinjenja koje neutrališe inhibitorno dejstvo humanog NKG2A polipeptida i agensa koji inhibira humani PD-1 polipeptid.

[0031] U jednom aspektu, utvrđivanje da biološki uzorak (npr., uzorak koji obuhvata tumorske ćelije, tumorsko tkivo i/ili tkivo pored tumora) značajno eksprimira HLA-E nukleinsku kiselinu ili polipeptid ukazuje da pojedinac ima kancer koji može da se leči agensom koji inhibira NKG2A u kombinaciji sa agensom koji inhibira humani PD-1 polipeptid.

[0032] U jednom aspektu bilo kog od ovih postupaka, utvrđivanje polipeptidnog statusa HLA-E ili određivanje nivoa ekspresije u fazi (a) obuhvata određivanje nivoa ekspresije HLA-E nukleinske kiseline ili polipeptida malignih ćelija u biološkom uzorku i poređenje nivoa sa referentnim nivoom (npr. vrednošću, slabim ili jakim bojenjem površine ćelije, itd.). Referentni nivo može, na primer, da odgovara zdravom pojedincu, pojedincu koji ne izvlači nikakvu/malu kliničku korist od lečenja anti-NKG2A antitelom (opciono u kombinaciji sa agensom koji inhibira humani PD-1 polipeptid), ili pojedincu koji izvlači suštinsku kliničku korist od lečenja anti-NKG2A antitelom (opciono u kombinaciji sa agensom koji inhibira humani PD-1 polipeptid). Utvrđivanje da biološki uzorak eksprimira HLA-E nukleinsku kiselinu ili polipeptid na nivou koji je povećan (npr. visoka vrednost, jako bojenje površine, nivo koji odgovara onom od pojedinca koji izvlači suštinsku kliničku korist od lečenja anti-NKG2A antitelom, nivo koji je viši od onog koji odgovara pojedincu koji ne izvlači/izvlači nisku kliničku korist od lečenja anti-NKG2A antitelom, itd.) ukazuje da pojedinac ima kancer koji može da se leči anti-NKG2A antitelom u kombinaciji sa agensom koji inhibira humani PD-1 polipeptid, npr. prema ovde opisanim postupcima lečenja.

[0033] U jednom aspektu obezbeđen je postupak za identifikovanje NKG2A-inhibiranih PD-1-eksprimirajućih limfocita, pri čemu taj postupak obuhvata:

a) utvrđivanje NKG2A i PD-1 polipeptidnog statusa NK i/ili CD8 T limfocita u biološkom uzorku, i b) pri čemu utvrđivanje da se NKG2A i PD-1 polipeptidi eksprimiraju na površini značajne proporcije limfocita, ukazuje da ti limfociti predstavljaju NKG2A-inhibirane PD-1-eksprimirajuće limfocite.

Opciono ti limfociti predstavljaju tumor infiltrišuće limfocite. Opciono biološki uzorak predstavlja uzorak koji obuhvata tumorsko tkivo i/ili tkivo oko tumora.

[0034] U jednom aspektu obezbeđen je postupak za identifikovanje pojedinca sa kancerom kod kojeg je lečenje anti-NKG2A agensom pogodno, pri čemu taj postupak obuhvata:

a) određivanje NKG2A i PD-1 polipeptidnog statusa tumor infiltrišućih limfocita od pojedinca, i b) pri čemu utvrđivanje da se NKG2A i PD-1 polipeptidi eksprimiraju na površini značajne proporcije tumor infiltrišućih limfocita od pojedinca, opciono TIL-ova prethodno definisanog podskupa (npr. CD8 T ćelije, NK ćelije), ukazuje da je lečenje jedinjenjem koje neutrališe inhibitorno dejstvo humanog NKG2A polipeptida i agensom koji inhibira humani PD-1 polipeptid pogodno za pojedinca.

[0035] U jednom aspektu obezbeđen je postupak za lečenje ili sprečavanju kancera kod pojedinca obuhvata:

a) utvrđivanje NKG2A i PD-1 polipeptidnog statusa tumor infiltrišućih limfocita od pojedinca, i b) nakon određivanja da NKG2A i PD-1 polipeptidi eksprimiraju na površini značajne proporcije tumor infiltrišućih limfocita, opciono TIL-ova prethodno definisanog podskupa (npr. CD8 T ćelije, NK ćelije), od pojedinca, davanje pojedincu terapijskog režima koji obuhvata jedinjenje koje neutrališe inhibitorno dejstvo humanog NKG2A polipeptida i agens koji inhibira humani PD-1 polipeptid.

[0036] U jednom aspektu, tumor infiltrišući limfociti predstavljaju CD8 T ćelije. U jednom aspektu, tumor infiltrišući limfociti predstavljaju NK ćelije. U jednom aspektu, najmanje 10, 15, 20, 25% CD8 T ćelija predstavlja NKG2A<+>PD<+>. U jednom aspektu, najmanje 10%, 15%, 20% ili 25% CD8 T ćelija NKG2A<+>PD-1<+>. U jednom aspektu, najmanje 20%, 25%, 30% ili 35% NK ćelija predstavlja NKG2A<+>PD-1<+>.

[0037] U drugim aspektima, obezbeđene su farmaceutske kompozicije i kompleti, kao i postupci za njihovu upotrebu. U jednom aspektu, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja obuhvata jedinjenje koje neutrališe inhibitorno dejstvo humanog NKG2A polipeptida i agens koji inhibira humani PD-1 polipeptid. U jednom aspektu, obezbeđen je komplet koji obuhvata jedinjenje koje neutrališe inhibitorno dejstvo humanog NKG2A polipeptida i agens koji inhibira humani PD-1 polipeptid.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0038]

Fig.1A i 1B prikazuje PD-L1+ Qa-1+ RMA-S Qa-1 Qdm B2m i A20 tumorske ćelije su infiltrisane NK ćelijama koje eksprimiraju NKG2A i CD8 T ćelije koje eksprimiraju NKG2A i/ili PD-1.RMA-S Qa-1 Qdm B2m (gornji red) i A20 (donji red) miševi koji nose tumor su žrtvovani kada su zapremine tumora bile oko 500 mm<3>. Tumorske ćelije (Fig.1A) i tumor infiltrišući limfociti-TIL- (Fig.1B) su analizirani protočnom citometrijom tim redom zbog ekspresije Qa-1 i PDL-1 za tumorske ćelije i NKG2A/C/E i PD-1 za TIL. MFI:Srednja vrednost intenziteta fluorescencije.

Fig.2 prikazuje distribuciju NKG2A i PD-1 na podskupovima NK i T ćelija kod miševa. Limfociti su uzeti iz slezine, iz tumorskih drenažnih limfnih čvorova, i iz unutrašnjosti čvrstih tumorskih masa. PD-1 ekspresija nije bila učestala niti odsutna među svim ćelijskim podskupovima iz slezine i limfnih čvorova, međutim među tumor infiltrišućim limfocitima (TIL), svi ćelijski podskupovi su imali relativno visoke procente ćelija koje eksprimiraju PD-1. NKG2A je sa druge strane pronađen na NK ćelijama ali ne na podskupovima T ćelija u slezini i limfnim čvorovima, opet u tumoru je pronađen značajan procenat TIL-ova, srednje vrednosti od više od 30% NK ćelija i više od 19% CD8 T ćelija dvostruko pozitivnih na NKG2A i PD-1.

Fig.3A i 3B prikazuju NKG2A i PD-1 ekspresiju kod miševa koji nose tumor. RMA Rae1 (gornji red), MC38 (srednji red) i RMA (donji red) miševi koji nose tumor su žrtvovani kada su njihovi tumori dostigli zapremine od, redom, 500, 2000 i 800 mm<3>. NK ćelije (Fig.3A) i CD8 T ćelije (Fig.3B) su analizirane protočnom citometrijom u slezini, tumorskom drenažnom limfnom čvoru (LN) i tumoru za ekspresiju NKG2A/C/E i PD-1.

Fig.4 prikazuje da tretiranje miševa sa anti-PD-1 mAb povećava učestalost NKG2A eksprimirajućih TCD8 ćelija kod MC38 tumora. MC38 miševi koji nose tumor su bili tretirani ili sa 200 µg pacovske IgG2a izotipne kontrole (IC) ili anti-mišjim PD-1 antitelom 11., 14. i 17. dana nakon ukalemljenja ćelija. Miševi su žrtvovani 31. dana a CD8 T ćelije su okarakterisane protočnom citometrijom u slezini, tumorskom drenažnom limfnom čvoru (LN) i tumoru.

Fig.5 prikazuje srednju vrednost zapremine tumora tokom vremena kod miševa tretiranih izotipnom kontrolom, anti-mišjim NKG2A mAb (200 µg, iv), anti-mišjim PD-L1 mAb (200 µg, ip) ili kombinacijom anti-mNKG2A/mPDL-1, 11., 14. i 18 dana. Dok je anti-NKG2A obezbedio samo umeren anti-tumorski efekat u poređenju sa izotipnom kontrolom u ovom modelu, a anti-PD-L1 je obezbedio suštinski antitumorski efekat ali sa zapreminom tumora koja je rasla ka 28. danu, kombinovano tretiranje sa anti-NKG2A i anti-PD-L1 je u potpunosti poništilo rast tumora, bez značajnog porasta zapremine tumora koja nije primećena 28. dana.

DETALJAN OPIS

Definicije

[0039] Kako se upotrebljava u specifikaciji, "neki" ili "jedan" može da znači jedan ili više. Kako se upotrebljavaju u zahtevu(ima), kada se upotrebljavaju u vezi sa rečju "obuhvata", reči "neki" ili "jedan" mogu da znače jedan ili više od jednog. Kako se ovde upotrebljava "drugi" može da znači najmanje drugi ili više.

[0040] Gde se upotrebljava "koji obuhvata", opciono može da bude zamenjeno sa "suštinski se sastoji od" ili sa "koji čine".

[0041] NKG2A (OMIM 161555) je član NKG2 grupe transkripata (Houchins, et al. (1991) J. Exp. Med. 173:1017-1020). NKG2A kodira 7 eksona koji se protežu do 25 kb, pokazujući nešto diferencijalnog splajsovanja. Zajedno sa CD94, NKG2A stvara heterodimerni inhibitorni receptor CD94/NKG2A, koji se nalazi na površini podskupova NK ćelija, α/β T ćelija, γ/δ T ćelija, i NKT ćelija. Slično inhibitornim KIR receptorima, poseduje ITIM u svom citoplazmatskom domenu. Kako se ovde upotrebljava, "NKG2A" se odnosi na bilo koju varijantu, derivat, ili izoform NKG2A gena ili kodirani protein. Humani NKG2A obuhvata 233 aminokiseline u 3 domena, pri čemu citoplazmatski domen obuhvata ostatke 1-70, transmembranski region obuhvata ostatke 71-93, a ekstracelularni region obuhvata ostatke 94-233, sledeće sekvence:

.

[0042] NKG2C (OMIM 602891) i NKG2E (OMIM 602892) predstavljaju dva druga člana NKG2 grupe transkripata (Gilenke, et al. (1998) Immunogenetics 48:163-173). CD94/NKG2C i CD94/NKG2E receptori predstavljaju aktivirajuće receptore koji se nalaze na površini podskupova limfocita kao što su NK ćelije i T-ćelije.

[0043] HLA-E (OMIM 143010) je neklasičan MHC molekul koji je eksprimiran na površini ćelije i reguliše ga vezivanje peptida, npr. kao što su fragmenti derivirani iz signalne sekvence molekula druge MHC klase. Rastvorljive verzije HLA-E su takođe identifikovane. Pored njegovih osobina vezivanja za receptor T-ćelije, HLA-E vezuje podskupove ćelija prirodnih ubica, T-ćelija (NKT) prirodnih ubica i T ćelije (α/β i γ/δ), vezivanjem specifično za CD94/NKG2A, CD94/NKG2B, i CD94/NKG2C (videti, npr., Braud et al. (1998) Nature 391:795-799). Ekspresija HLA-E na površini štiti ciljne ćelije od lize pomoću CD94/NKG2A+ NK, T, ili NKT klonova ćelija. Kako se ovde upotrebljava, "HLA-E" se odnosi na bilo koju varijantu, derivat, ili izoform HLA-E gena ili kodiranog proteina.

[0044] U kontekstu ovog otkrivanja, "NKG2A" ili "CD94/NKG2A pozitivan limfocit" se odnosi na ćelije limfoidne linije (npr. NK-, NKT- i T-ćelije) koje eksprimiraju CD94/NKG2A na ćelijskoj površini, koji mogu biti detektovani npr. protočnom citometrijom pomoću antitela koja specifično prepoznaju kombinovani epitop na CD94 i NKG2A ili i epitop na samom NKG2A. "NKG2A pozitivan limfocit" takođe uključuje linije besmrtnih ćelija limfoidnog porekla (npr. NKL, NK-92).

[0045] U kontekstu ovog otkrivanja, "smanjuje inhibitorno dejstvo NKG2A", "neutrališe NKG2A" ili "neutrališe inhibitorno dejstvo NKG2A" se odnosi na postupak u kojem je CD94/NKG2A inhibiran u svom svojstvu da negativno utiče na intracelularne procese što dovodi do odgovora limfocita kao što su oslobađanje citokina i citotoksični odgovori. Ovo može na primer da se izmeri u ispitivanju citotoksičnosti baziranom na NK- ili T-ćelijama, u kojima je izmerena sposobnost terapijskog jedinjenja da stimuliše ubijanje HLA-E pozitivnih ćelija CD94/NKG2A pozitivnim limfocitima. U jednom aspektu, priprema antitela uzrokuje najmanje 10% augmentacije kod citotoksičnosti CD94/NKG2A-ograničenog limfocita, opciono najmanje 40% ili 50% augmentacije kod citotoksičnosti limfocita, opciono najmanje 70% augmentacije kod NK citotoksičnosti", i odnosi se na opisana ispitivanja citotoksičnosti. Ukoliko anti-NKG2A antitelo smanjuje ili blokira CD94/NKG2A interakcije sa HLA-E, može da poveća citotoksičnost CD94/NKG2A-ograničenih limfocita. Ovo na primer može da bude procenjeno, na primer, u standardnom 4-časovnom ispitivanju in vitro citotoksičnosti, npr., NK ćelija koje eksprimiraju CD94/NKG2A, i ciljnih ćelija koje eksprimiraju HLA-E. Takve NK ćelije ne ubijaju efikasno ciljeve koji eksprimiraju HLA-E zato što CD94/NKG2A prepoznaje HLA-E, što dovodi do početka i propagacija inhibitornog signaliziranja koje sprečava citolizu posredovanu limfocitima. Takvo ispitivanje in vitro citotoksičnosti može biti izvedeno standardnim postupcima koji su dobro poznati u tehnici, kako je opisano u primeru kod Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993). Oslobađanje hroma i/ili drugi parametri za ocenjivanje mogućnosti antitela da stimulišu limfocite kako bi ubijali ciljne ćelije kao što su P815, K562 ćelije, ili odgovarajuće tumorske ćelije su takođe otkriveni kod Sivori et al., J. Exp. Med.1997;186:1129-1136; Vitale et al., J. Exp. Med.1998; 187:2065-2072; Pessino et al. J. Exp. Med.1998;188:953-960; Neri et al. Clin. Diag. Lab. Immun.2001;8:1131-1135; Pende et al. J. Exp. Med.1999;190:1505-1516. Ciljne ćelije su obeležene sa<51>Cr pre dodavanja NK ćelija, a ubijanje je procenjeno kao proporcionalno oslobađanju<51>Cr iz ćelija na podlogu, kao rezultat ubijanja. Dodavanje antitela koje sprečava CD94/NKG2A od vezivanja za HLA-E dovodi do sprečavanja početka i propagacije inhibitornog signaliziranja preko CD94/NKG2A. Stoga, dodavanje takvih agenasa dovodi do povećanja limfocitima posredovanog ubijanja ciljanih ćelija. Ova faza samim tim identifikuje agense koji sprečavaju CD94/NKG2A-izazvano negativno signaliziranje, npr., blokiranjem vezivanja liganda. U

određenom ispitivanju citotoksičnosti<51>Cr-oslobođenog, CD94/NKG2A-eksprimirajuće NK efektorske ćelije mogu da ubiju HLA-E-negativne LCL 721.221 ciljne ćelije, ali manje dobre HLA-E-eksprimirajuće LCL 721.221-Cw3 kontrolne ćelije. Suprotno tome, YTS efektorske ćelije kojima nedostaje CD94/NKG2A efikasno ubijaju obe ćelijske linije. Stoga, NK efektorske ćelije manje efikasno ubijaju HLA-E<+>LCL 721.221-Cw3 ćelije usled HLA-E-izazvanog inhibitornog signaliziranja putem CD94/NKG2A. Kada su NK ćelije prethodno inkubirane blokiranjem anti-CD94/NKG2A antitela prema ovom otkrivanju kod takvog ispitivanja citotoksičnosti<51>Cr-oslobađanja, HLA-E-eksprimirajuće LCL 721.221-Cw3 ćelije su efikasnije ubijene, tako da su antitelo i koncentracija u zavisnom odnosu. Inhibitorno dejstvo (tj. citotoksičnost koja pojačava potencijal) anti-NKG2A antitela takođe može da bude ocenjeno na više drugih načina, putem njegovog dejstva na intracelularni slobodni kalcijum kako je opisano, npr., kod Sivori et al., J. Exp. Med.1997;186:1129-1136.. Aktivacija citotoksičnosti NK ćelija može da bude ocenjena na primer merenjem porasta u proizvodnji citokina (npr. IFN-γ proizvodnji) ili markerima citotoksičnosti (npr. CD107 ili CD137 mobilizacija). U jednom primernom protokolu, IFN-y proizvodnja iz PBMC je ocenjena ćelijskom površinom i intracitoplazmatskim bojenjem i analizom protočnom citometrijom nakon 4 dana u kulturi. Ukratko, dodaje se Brefeldin A (Sigma Aldrich) u konačnoj koncentraciji od 5 µg/ml tokom poslednja 4 sata kulture. Ćelije se zatim inkubiraju sa anti-CD3 i anti-CD56 mAb pre postupka propuštanja (IntraPrep™; Beckman Coulter) i bojenja sa PE-anti-IFN-y ili PE-IgG1 (Pharmingen). GM-CSF i IFN-y proizvodnja od poliklonalnih aktiviranih NK ćelija su izmerene u supernatantima pomoću ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN, IFN-y: OptEIA set, Pharmingen).

[0046] Kako se ovde upotrebljava, pojam "PD-1" se odnosi na proteinsku programiranu smrt 1 (PD-1) (koja je takođe označena kao "programirana ćelijska smrt 1"), inhibitorni član CD28 porodice receptora, koja takođe uključuje CD28, CTLA-4, ICOS i BTLA. Kompletna sekvenca humanog PD-1 može da se nađe pod GenBank pristupnim br. U64863, prikazana kao u nastavku:

"PD-1" takođe uključuje bilo koju varijantu, derivat, ili izoform PD-1 gena ili kodiranog proteina. PD-1 je eksprimirana na aktiviranim B ćelijama, T ćelijama,i mijeloidnim ćelijama Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol.14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8). Početni članovi porodice, CD28 i ICOS, su otkriveni funkcionalnim efektima na augmentovanje proliferacije T ćelija nakon dodavanja monoklonalnih antitela (Hutloff et al. (1999) Nature 397:263-266; Hansen et al. (1980) Immunogenics 10:247-260). Dva liganda za PD-1 su identifikovana, PD- L1 i PD-L2, za koja se pokazalo da nizvodno regulišu aktivaciju T ćelija nakon vezivanja za PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). I PD-L1 i PD-L2 predstavljaju B7 homologe koji se vezuju za PD-1, ali se ne vezuju za druge članove CD28 porodice.

[0047] Kompletna sekvenca humanog PD-L1 može da se nađe pod UniProtKB/Swiss-Prot, identifikacionom oznakom Q9NZQ7-1, prikazana kao u nastavku:

[0048] PD-L1 obiluje raznim humanim kancerima (Dong et al. (2002) Nat. Med.8:787-9). Interakcija između PD-1 i PD-L1 dovodi do smanjenja tumor infiltrišućih limfocita, smanjenja proliferacije posredovane receptorom T-ćelije, imunološke evazije kancerskim ćelijama (Dong et al. (2003) J. Mol. Med.81:281- 7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother.54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res.10:5094-100). Imunološka supresija može da se preokrene inhibiranjem lokalne interakcije PD-1 sa PD-L1, a efekat je aditivan kada je interakcija PD-1 sa PD-L2 takođe blokirana.

[0049] U kontekstu ovog otkrivanja, "smanjuje inhibitorno dejstvo humanog PD-1", "neutrališe PD-1" ili "neutrališe inhibitorno dejstvo humanog PD-1" se odnosi na postupak u kojem je PD-1 inhibiran u svom svojstvu signalne transdukcije koje potiče od interakcije PD-1 sa jednim ili više partnera za vezivanje, kao što je PD-L1 ili PD-L2. Agens koji neutrališe inhibitorno dejstvo PD-1 smanjuje, blokira, inhibira, poništava ili se meša sa signalnom transdukcijom koja proističe od interakcije PD-1 sa jednim ili više njegovih partnera za vezivanje, kao što su PD-L1, PD-L2. Takav agens samim tim može da smanji negativni kostimulativni signal posredovan ili putem proteina na površini ćelija eksprimiranih na T limfocitima, kako bi se pojačale funkcije efektora T-ćelija kao što su proliferacija, proizvodnja citokina i/ili citotoksičnost.

[0050] Kad god se u ovoj celoj specifikaciji "lečenje kancera" ili njemu slično pomene vezano za anti-NKG2A i anti-PD-1 ili anti-PD-L1 vezujući agens (npr. antitelo), obuhvaćeni su: (a) postupak lečenja kancera, pri čemu pomenuti postupak obuhvata fazu davanja (tokom najmanje jednog lečenja) NKG2A i anti-PD-1 ili anti-PD-L1 vezujućeg agensa, (npr.,zajedno ili svaki odvojeno u farmaceutski prihvatljivom materijalu nosača) pojedincu, sisaru, posebno čoveku, kome je takvo lečenje potrebno, u dozi koja omogućava lečenje kancera, (terapijski efektivnoj količini), opciono u dozi (količini) kako je ovde naznačeno; (b) upotreba anti-NKG2A i anti-PD-1 ili anti-PD-L1 vezujućeg agensa za lečenje kancera, ili anti-NKG2A vezujućeg agensa, za upotrebu u pomenutom lečenju (naročito kod čoveka); (c) upotreba anti-NKG2A i anti-PD-1 ili anti-PD-L1 vezujućeg agensa za proizvodnju farmaceutskog preparata za lečenje kancera, pri čemu postupak upotrebe anti-NKG2A i anti-PD-1 ili anti-PD-L1 vezujućeg agensa za proizvodnju farmaceutskog preparata za lečenje kancera obuhvata umešavanje anti-NKG2A i anti-PD-1 ili anti-PD-L1 vezujućeg agensa sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, ili farmaceutskog preparata koji obuhvata efektivnu dozu anti-NKG2A i anti-PD-1 ili anti-PD-L1 vezujućeg agensa koji je odgovarajući za lečenje kancera; ili (d) bilo koja kombinacija pod a), b), i c), u skladu sa predmetom koji omogućava patentiranje u zemlji u kojoj se ova prijava podnosi.

[0051] Pojam "biopsija" kako se ovde upotrebljava je definisan kao uklanjanje tkiva u svrhu ispitivanja, kao što je utvrđivanje dijagnoze. Primeri vrsta biopsija uključuju primenu isisavanja, kao što je kroz iglu pričvršćenu na špric; uklanjanje fragmenta tkiva pomoću instrumenta; uklanjanje odgovarajućim instrumentima kroz endoskop; hirurškim sečenjem, kao što je sečenje cele lezije; i njima slične.

[0052] Pojam "antitelo," kako se ovde upotrebljava, se odnosi na poliklonalna i monoklonalna antitela. U zavisnosti od vrste konstantnog domena u teškim lancima, antitela su naznačena jednom od pet glavnih klasa: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM. Nekoliko ovih su dalje podeljeni u potklase i izotipove, kao što su IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, i njima slični. Primerna strukturna jedinica imunoglobulina(antitela) obuhvata tetramer. Svaki tetramer je sastavljen od dva identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan "laki" (oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac (oko 50-70 kDa). N-terminus svakog lanca definiše varijabilni region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina koji je prvenstveno odgovoran za prepoznavanje antigena. Pojmovi varijabilni laki lanac (VL) i varijabilni teški lanac (VH) se odnose na ove lake i teške lance tim redom. Konstantni domeni teških lanaca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina su nazvani "alfa," "delta," "ipsilon," "gama" i "mu," tim redom. Podjedinične strukture i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate. IgG predstavljaju primerne klase antitela koje se ovde upošljavaju zato što su najuobičajenija antitela u fiziološkoj situaciji i zato što se najlakše prave u laboratorijskim uslovima. Opciono antitelo predstavlja monoklonalno antitelo. Određeni primeri antitela su humanizovano, himerno, humano, ili druga pogodna humana antitela. "Antitela" takođe uključuju bilo koji fragment ili derivat bilo kog ovde opisanog antitela.

[0053] Pojam "specifično se vezuje za " znači da antitelo može da se vezuje poželjno u ispitivanju kompetitivnog vezivanja za vezujućeg partnera, npr. NKG2A, PD-1, PD-L1, kako je ocenjeno upotrebom ili rekombinantnih oblika proteina, epitopa tamo, ili nativnih proteina prisutnih na površini izolovanih ciljnih ćelija. Ispitivanja kompetitivnog vezivanja i drugi postupci za određivanje specifičnog vezivanja su dobro poznati u tehnici. Na primer vezivanje može biti detektovano putem radio-obeležja, fizičkim postupcima kao što su masena spektrometrija, ili direktnim ili indirektnim fluorescentnim obeležjima detektovanim pomoću, npr., citofluorometrijske analize (npr. FACScan). Vezivanje iznad količine koja je primećena sa kontrolom, nespecifičnim agensom ukazuje da se taj agens vezuje za cilj. Agens koji se specifično vezuje za NKG2A može da se vezuje za sam NKG2A ili NKG2A u obliku dimera sa CD94.

[0054] Kada se pominje da antitelo "ulazi u kompeticiju sa" određenim monoklonalnim antitelom, to znači da to antitelo ulazi u kompeticiju sa monoklonalnim antitelom u ispitivanju vezivanja pomoću ili rekombinantnih molekula (npr., NKG2A, PD-1, PD-L1) ili molekula eksprimiranih na površini (npr., NKG2A, PD-1, PD-L1). Na primer, ukoliko ispitivano antitelo smanjuje vezivanje antitela sa teškim lancem bilo koje od SEQ ID NO: 4-8 i lakim lancem SEQ ID NO: 9 za NKG2A polipeptid ili NKG2A-eksprimirajuću ćeliju u ispitivanju vezivanja, za to antitelo se kaže da "ulazi u kompeticiju" tim redom sa takvim antitelom.

[0055] Pojam "afinitet", kako se ovde upotrebljava, označava jačinu vezivanja antitela za epitop. Afinitet antitela je obezbeđen konstantom disocijacije Kd, definisanom kao [Ab] x [Ag] / [Ab-Ag], gde [Ab-Ag] predstavlja molarnu koncentraciju kompleksa antitela-antigena, [Ab] predstavlja molarnu koncentraciju nevezanog antitela a [Ag] predstavlja molarnu koncentraciju nevezanog antigena. Konstanta afiniteta Kaje definisana 1/Kd. Postupci za određivanje afiniteta mAbs mogu da se nađu u Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), i Muller, Meth. Enzymol.92:589-601 (1983). Jedan standardni postupak dobro poznat u tehnici za određivanje afiniteta mAbs je upotreba skrininga rezonancije površinskog plazmona (SPR) (kao što je analizom sa BIAcore™ SPR analitičkim uređajem).

[0056] U ovom kontekstu "determinant" označava mesto interakcije ili vezivanja na polipeptidu.

[0057] Pojam "epitop" se odnosi na antigensku determinantu, i predstavlja oblast ili region na antigenu za koji se vezuje antitelo. Proteinski epitop može da obuhvata aminokiselinske ostatke koji su direktno uključeni u vezivanje kao i aminokiselinske ostatke koje efektivno blokira specifično antigen vezujuće antitelo ili peptid, tj., aminokiselinske ostatke u okviru "otiska" antitela. To je najjednostavniji oblik ili najmanja strukturna oblast na kompleksnom antigenskom molekulu koja može da se kombinuje sa npr., antitelom ili receptorom. Epitopi mogu da budu linearni ili konformacioni/strukturni. Pojam "linearni epitop" je definisan kao epitop sastavljen od aminokiselinskih ostataka koji su bliski na linearnoj sekvenci aminokiselina (primarna struktura). Pojam "konformacioni ili strukturni epitop" je definisan kao epitop koji se sastoji od aminokiselinskih ostataka koji nisu susedni i stoga predstavljaju odvojene delove linearne sekvence aminokiselina koje su približene jedna drugoj savijanjem molekula (sekundarne, tercijarne, i/ili kvaternarne strukture). Konformacioni epitop zavisi od 3-dimenzionalne strukture. Pojam 'konformacioni' se stoga često upotrebljava naizmenično sa pojmom 'strukturni'.

[0058] Pojam "agens" se ovde upotrebljava da bi označio hemijsko jedinjenje, mešavinu hemijskih jedinjenja, biološki makromolekul, ili ekstrakt napravljen od bioloških materijala. Pojam "terapijski agens" se odnosi na agens sa biološkim dejstvom.

[0059] Za ovde navedene svrhe, "humanizovano" ili "humano" antitelo se odnosi na antitelo u kojem je konstantni i varijabilni okvirni region jednog ili više imunoglobulina spojen sa vezujućim regionom, npr. CDR, životinjskog imunoglobulina. Takva antitela su dizajnirana da održavaju specifičnost vezivanja nehumanog antitela iz kojeg su vezujući regioni derivirani, ali da se izbegne imunološka reakcija na nehumano antitelo. Takva antitela mogu da se dobiju od transgenih miševa ili drugih životinja koje su "projektovane" da proizvedu specifična humana antitela kao odgovor na antigenski izazov (videti, npr., Green et al. (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856; Taylor et al. (1994) Int Immun 6:579). Potpuno humano antitelo takođe može da bude konstruisano postupcima genetičke ili hromozomske transfekcije, kao i tehnologijom prikazivanja faga, pri čemu su svi oni poznati u tehnici (videti, npr., McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553). Humana antitela takođe mogu da budu generisana in vitro aktiviranim B ćelijama (videti, npr., U.S. Pat. br.5,567,610 i 5,229,275).

[0060] "Himerno antitelo" je molekul antitela u kojem je (a) konstantni region, ili njegov deo, izmenjen, zamenjen ili promenjen tako da je antigen-vezujuće mesto (varijabilni region) povezano sa konstantnim regionom različite ili izmenjene klase, funkcijom efektora i/ili vrste, ili potpuno različitim molekulom koji obezbeđuje nova svojstva za himerno antitelo, npr., enzime, toksin, hormon, faktor rasta, lek, itd.; ili (b) varijabilni region, ili njegov deo, izmenjen, zamenjen ili promenjen sa varijabilnim regionom koji ima različitu ili izmenjenu antigensku specifičnost.

[0061] Pojmovi "Fc domen," "Fc deo," i "Fc region" se odnose na C-terminalni fragment teškog lanca antitela, npr., od oko aminokiseline (aa) 230 do oko aa 450 humanog γ (gama) teškog lanca ili njegove parne sekvence u drugim tipovima teških lanaca antitela (npr., α, δ, ε i µ za humana antitela), ili njegov alotip koji se prirodno javlja. Ukoliko nije drugačije naznačeno, kroz ovo otkrivanje se upotrebljava uobičajeno prihvaćeno numerisanje aminokiselina prema Kabatu za imunoglobuline (videti Kabat et al. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD).

[0062] Pojmovi "izolovan", "prečišćen" ili "biološki čist" se odnose na materijal koji suštinski ili u biti ne sadrži komponente koje ga normalno prate kao što je nađeno u njegovom izvornom stanju. Čistoća i homogenost se uglavnom određuju tehnikama analitičke hemije kao što je elektroforeza poliakrilamidnog gela ili tečna hromatografija visokog učinka A. Protein koji je najzastupljenija vrsta prisutna u preparatu je suštinski prečišćen.

[0063] Pojmovi "polipeptid," "peptid" i "protein" se ovde upotrebljavaju naizmenično i odnose se na polimer aminokiselinskih ostataka. Pojmovi se primenjuju na aminokiselinske polimere u kojima jedan ili više aminokiselinskih ostataka predstavlja veštačku hemijsku imitaciju odgovarajuće aminokiseline koja se prirodno javlja, kao i na aminokiselinske polimere koji se prirodno javljaju i aminokiselinski polimer koji se ne javlja prirodno.

[0064] Pojam "rekombinantni" kada se upotrebljava vezano za, npr., ćeliju, ili nukleinsku kiselinu, protein, ili vektor, ukazuje da su ta ćelija, nukleinska kiselina, protein ili vektor, modifikovani uvođenjem heterologne nukleinske kiseline ili proteina ili izmenom nativne nukleinske kiseline ili proteina, ili da je ta ćelija derivirana iz ćelije modifikovane na taj način. Stoga, na primer, rekombinantne ćelije eksprimiraju gene koji se nalaze unutar nativnog (nerekombinantnog) oblika ćelije ili eksprimiraju nativne gene koji se u drugim okolnostima abnormlano eksprimiraju, ne eksprimiraju dovoljno ili se ne eksprimiraju uopšte.

[0065] U ovom kontekstu, pojam antitelo koje "vezuje" polipeptid ili epitop označava antitelo koje vezuje pomenuti determinant sa specifičnošću i/ili afinitetom.

[0066] Pojam "identitet" ili "identičan", kada se upotrebljava u vezi između sekvenci dva ili više polipeptida, se odnosi na stepen povezanosti sekvenci između polipeptida, kako je određeno brojem parova između vlakana dva ili više aminokiselinskih ostataka. "Identitet" meri procenat identičnih parova između manje od dve ili više sekvenci sa poravnanjima razmaka (ukoliko postoje) obuhvaćenih određenim matematičkim modelom ili kompjuterskim programom (tj., "algoritmi"). Identitet povezanih polipeptida može lako da se izračuna pomenutim postupcima. Takvi postupci uključuju, ali bez ograničenja , one opisane u Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., i Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; i Carillo et al., SIAM J. Applied Math.48, 1073 (1988).

[0067] Postupci za određivanje identiteta su dizajnirani kako bi se dobila najveća podudarnost između ispitivanih sekvenci. Postupci određivanja identiteta su opisani u javno dostupnim kompjuterskim programima. Postupci kompjuterskog programa za određivanje identiteta između dve sekvence uključuju pakovanje GCG programa, uključujući GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res.12, 387 (1984); Genetics Computer Grupa, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, i FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol.215, 403-410 (1990)). BLASTX program je javno dostupan od Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) i drugih izvora (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md.20894; Altschul et al., supra). Dobro poznat Smit-Vatermanov algoritam takođe može da se koristi za utvrđivanje identiteta.

NKG2A-neutrališući terapijska agensi

[0068] Anti-NKG2A agens vezuje ekstracelularni deo humanog CD94/NKG2A receptora i smanjuje inhibitorno dejstvo humanog CD94/NKG2A receptora eksprimiranog na površini CD94/NKG2A pozitivnog limfocita. U jednom aspektu agens stupa u kompeticiju sa HLA-E u vezivanju za CD94/NKG2A, tj. taj agens blokira interakciju između CD94/NKG2A i njegovog liganda HLA-E. U drugom aspektu agens ne stupa u kompeticiju sa HLA-E u vezivanju za CD94/NKG2A; tj. agens može da vezuje CD94/NKG2A istovremeno sa HLA-E. Antitelo može da vezuje kombinovani epitop na CD94 i NKG2A ili epitop na samom NKG2A.

[0069] U jednom aspektu anti-NKG2A agens je antitelo izabrano iz grupe koju čine u potpunosti humano antitelo, humanizovano antitelo, i himerno antitelo. U jednom aspektu, agens obuhvata konstantni domen deriviran iz humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 antitela. U jednom aspektu, agens predstavlja fragment antitela izabran iz grupe koju čine IgA, IgD, IgG, IgE i IgM antitelo. U jednom aspektu, agens predstavlja fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fab fragment, Fab' fragment, Fab'-SH fragment, F(ab)2 fragment, F(ab')2 fragment, Fv fragment, teški lanac Ig (llama ili camel Ig), VHHfragment, pojedinačan domen FV, i fragment antitela pojedinačnog lanca. U jednom aspektu, agens predstavlja sintetički ili polusintetički molekul deriviran iz antitela iz grupe koju čine scFV, dsFV, minitelo,dijatelo, trijatelo, kapa telo, IgNAR; i multispecifično antitelo.

[0070] Opciono, anti-NKG2A antitela ne demonstriraju suštinsko specifično vezivanje za Fcγ receptore, npr. CD16. Takva antitela mogu da obuhvataju konstantne regione raznih teških lanaca za koje je poznato da se ne vezuju za Fc receptore. Jedan takav primer predstavlja konstantni region humanog IgG4. U jednom aspektu, IgG4 antitelo obuhvata modifikaciju za sprečavanje stvaranja polovine antitela (fab razmena kraka) in vivo, npr., antitelo obuhvata teški lanac IgG4 koji obuhvata mutaciju serlina u prolin u ostatku 241, što odgovara položaju 228 prema EU-indeksu (Kabat et al., "Sequences of proteins of immunological interest", 5th ed., NIH, Bethesda, ML, 1991). Takva modifikovana IgG4 antitela će ostati intaktna in vivo i održavaće bivalentno (visokog afiniteta) vezivanje za NKG2A, za razliku od nativnog IgG4 koje će biti podvrgnuto fab razmeni kraka in vivo tako da se vezuju za NKG2A na monovalentan način koji može da izmeni afinitet vezivanja. Alternativno, fragmenti antitela koji ne obuhvataju konstantne regione, kao što su Fab ili F(ab')2 fragmenti, mogu biti korišćeni kako bi se izbeglo vezivanje Fc receptora. Vezivanje Fc receptora može da bude ocenjeno prema postupcima poznatim u tehnici, uključujući na primer ispitivanje vezivanja antitela za protein Fc receptora u ispitivanju BIACORE. Takođe, bilo koji tip humanog antitela (npr. IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) može biti korišćen u kojem je Fc deo modifikovan kako bi se svelo na minimum ili eliminisalo vezivanje za Fc receptore (videti, npr., WO03101485). Ispitivanja kao što su, npr., ispitivanja bazirana na ćelijama, za ocenu vezivanja Fc receptora su dobro poznata u tehnici, i opisana su u, npr., WO03101485.

[0071] Ovo otkrivanje se stoga bavi antitelima ili drugim agensima koji se vezuju za NKG2A. U jednom aspektu, antitelo se vezuje za NKG2A sa KD najmanje 100-puta manje nego za humani NKG2C i/ili NKG2E.

[0072] U jednom aspektu ovog otkrivanja, agens smanjuje CD94/NKG2A-posredovanu inhibiciju CD94/NKG2A-eksprimirajućeg limfocita mešanjem sa signaliziranjem CD94/NKG2A putem, npr., mešanja sa vezivanjem HLA-E putem NKG2A, sprečavanjem ili izazivanjem konformacionih promena kod CD94/NKG2A receptora, i/ili uticanjem na dimerizaciju i/ili grupisanjem CD94/NKG2A receptora.

[0073] U jednom aspektu ovog otkrivanja, agens se vezuje za ekstracelularni deo NKG2A sa KD najmanje 100 puta manjom nego za NKG2C. U daljem poželjnom aspektu, agens se vezuje za ekstracelularni deo NKG2A sa KD najmanje 150, 200, 300, 400, ili 10000 puta manjom nego za NKG2C. U drugom aspektu ovog otkrivanja, agens se vezuje za ekstracelularni deo NKG2A sa KD najmanje 100 puta manjom nego za NKG2C, NKG2E i/ili NKG2H molekule. U daljem poželjnom aspektu, agens se vezuje za ekstracelularni deo NKG2A sa KD najmanje 150, 200, 300, 400, ili 10000 puta manjom nego za NKG2C, NKG2C i/ili NKG2H molekule. Ovo može biti izmereno, na primer, u BiaCore eksperimentima, u kojima je mogućnost agenasa da se vezuje za ekstracelularni deo imobilisanog CD94/NKG2A (npr. prečišćenog od CD94/NKG2 eksprimirajućih ćelija, ili proizvedenog u biosistemu) izmerena i upoređena sa vezivanjem agenasa za slično proizvedenim CD94/NKG2C i/ili drugim CD94/NKG2 varijantama u istom ispitivanju. Alternativno, vezivanje agenasa za ćelije koje ili prirodno eksprimiraju, ili prekomerno eksprimiraju (npr. nakon prolazne ili stabilne transfekcije), CD94/NKG2A može biti izmeren i upoređen sa vezivanjem ćelija koje eksprimiraju CD94/NKG2C i/ili druge CD94/NKG2 varijante. Anti-NKG2A antitela mogu opciono da vezuju NKG2B, koji predstavlja NKG2A splajs varijantu koja formira inhibitorni receptor zajedno sa CD94. U jednom aspektu, afinitet može da bude izmeren pomoću postupaka otkrivenih u U.S. patentu br.

8,206,709, na primer ocenjivanjem vezivanja za kovalentno imobilisani NKG2A-CD94-Fc fuzioni protein pomoću Biacore kako je prikazano u primeru 8 U.S. patenta br.8,206,709.

[0074] Anti-NKG2A antitelo može da bude humanizovano antitelo, na primer koje obuhvata VH humani okvir primaoca od sekvence humanog primaoca izabran iz grupe koju čine, npr., VH1_18, VH5_a, VH5_51, VH1_f, i VH1_46, i JH6 J-segment, ili druge VH okvirne sekvence humanih zametnih ćelija poznate u tehnici. Sekvenca humanog primaoca VL regiona može da bude, npr., VKI_O2/JK4.

[0075] U jednom aspektu, antitelo predstavlja humanizovano antitelo bazirano na antitelu Z270. Različiti lanci humanizovanog Z270VH su prikazani na SEQ ID NO: 4-8 (podvučena aminokiselina domena varijabilnog regiona). HumZ270VH6 (SEQ ID NO: 4) je bazirano na VH5_51; HumZ270VH1 (SEQ ID NO: 5) je bazirano na VH1_18; humZ270VH5 (SEQ ID NO: 6) je bazirano na VH5_a; humZ270VH7 (SEQ ID NO: 7) je bazirano na VH1_f; i humZ270VH8 (SEQ ID NO: 8) je bazirano na VH1_46; svi sa JH6 J-segmentom. Svako od ovih antitela zadržava visok afinitet vezivanja za NKG2A, sa malom verovatnoćom imunološkog odgovora domaćina na antitelo budući da su 6 C-terminalni aminokiselinski ostaci prema Kabatu CDR-H2 svakog od humanizovanih konstrukata identični okviru humanog primaoca. Upotrebom programa za poravnanje VectorNTI, dobijeni su identiteti sekvence između humZ270VH1 i humZ270VH5, -6, -7, i -8: 78,2% (VH1 nasuprot VH5), 79,0% (VH1 nasuprot VH6), 88,7% (VH1 nasuprot VH7), i 96,0% (VH1 nasuprot VH8).

[0076] U jednom aspektu, agens obuhvata (i) varijabilni region teškog lanca bilo koje od SEQ ID NO: 4-8, ili aminokiselinsku sekvencu koja mu je najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ili 99% identična, i (ii) varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 9, ili aminokiselinsku sekvencu koja mu je najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ili 99% identična. U jednom aspektu, agens obuhvata (i) teški lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 4-8, ili aminokiselinsku sekvencu koja joj je najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ili 99% identična, a (ii) laki lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9, ili aminokiselinsku sekvencu koja joj je najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ili 99% identična. Antitelo sa teškim lancem bilo koje od SEQ ID NO: 4-8 i lakim lancem SEQ ID NO: 9 neutrališe inhibitorno dejstvo NKG2A, ali suštinski ne vezuje aktivirajuće receptore NKG2C, NKGE ili NKG2H. Ovo antitelo dalje stupa u kompeticiju sa HLA-E zbog vezivanja za NKG2A na površini ćelije. U jednom aspektu, agens obuhvata HCDR1, HCDR2 i/ili HCDR3 sekvence derivirane iz teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom bilo koje od SEQ ID NO: 4-8. U jednom aspektu ovog otkrivanja, agens obuhvata LCDR1, LCDR2 i/ili LCDR3 sekvence derivirane od lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 9.

Teški lanci

[0077]

VH6:

VH5:

VH8:

[0078] U jednom aspektu, anti-NKG2A antitelo predstavlja antitelo koje obuhvata CDR-H1 koji odgovara ostacima 31-35 SEQ ID NOS: 4-8, CDR-H2 koji odgovara ostacima 50-60 (opciono 50-66 kada su uključene aminokiseline humanog porekla) SEQ ID NO: 4-8, i CDR-H3 koji odgovara ostacima 99-114 (95-102 prema Kabatu) SEQ ID NO: 4-8. U jednom aspektu, CDR-H2 odgovara ostacima 50-66 SEQ ID NO: 4-8. Opciono, CDR može da obuhvati jednu, dve, tri, četiri, ili više aminokiselinskih supstitucija.

[0079] U jednom aspektu, anti-NKG2A antitelo predstavlja antitelo koje obuhvata CDR-L1 koji odgovara ostacima 24-34 SEQ ID NO: 9, CDR-L2 koji odgovara ostacima 50-56 SEQ ID NO: 9, i CDR-L3 koji odgovara ostacima 89-97 SEQ ID NO: 9. Opciono, CDR može da obuhvati jednu, dve, tri, četiri, ili više aminokiselinskih supstitucija.

[0080] U jednom aspektu, anti-NKG2A antitelo predstavlja antitelo koje obuhvata CDR-H1 koji odgovara ostacima 31-35 SEQ ID NO: 4-8, CDR-H2 koji odgovara ostacima 50-60 (opciono 50-66) SEQ ID NO: 4-8, i CDR-H3 koji odgovara ostacima 99-114 (95-102 prema Kabatu) SEQ ID NO: 4-8, CDR-L1 koji odgovara ostacima 24-34 SEQ ID NO: 9, CDR-L2 koji odgovara ostacima 50-56 SEQ ID NO: 9, i CDR-L3 koji odgovara ostacima 89-97 SEQ ID NO: 9.

[0081] U jednom aspektu, agens obuhvata HCDR1, HCDR2 i/ili HCDR3 sekvence derivirane od VH sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 10. U jednom aspektu ovog otkrivanja, agens obuhvata LCDR1, LCDR2 i/ili LCDR3 sekvence derivirane od VL sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 11. U jednom aspektu, agens obuhvata HCDR1, HCDR2 i/ili HCDR3 sekvence derivirane od VH sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 10, i LCDR1, LCDR2 i/ili LCDR3 sekvence derivirane od VL sa aminokiselinskom sekvencom od SEQ ID NO: 11. Antitelo sa teškim lancem SEQ ID NO: 10 i lakim lancem SEQ ID NO: 11 neutrališe inhibitorno dejstvo NKG2A, i takođe vezuje aktivirajuće receptore NKG2C, NKG2E ili NKG2H. Antitelo ne stupa u kompeticiju sa HLA-E zbog vezivanja sa NKG2A na površini ćelije (tj. predstavlja nekompetitivni antagonist NKG2A).

[0082] U jednom aspektu, agens obuhvata aminokiselinske ostatke 31-35, 50-60, 62, 64, 66, i 99-108 varijabilnog-teškog (VH) domena (SEQ ID NO: 10) i aminokiselinske ostatke 24-33, 49-55, i 88-96 varijabilnog-lakog (VL) domena (SEQ ID NO: 11), opciono sa jednom, dve, tri, četiri, ili više aminokiselinskih supstitucija.

[0083] U jednom aspektu, agens predstavlja u potpunosti humano antitelo koje je podignuto protiv CD94/NKG2A epitopa za koji se vezuje bilo koje od gorepomenutih antitela.

[0084] Trebalo bi prihvatiti, da dok se gorepomenuta antitela mogu upotrebljavati, druga antitela mogu da prepoznaju i da budu podignuta protiv bilo kog dela NKG2A polipeptida toliko dugo da antitelo uzrokuje neutralizaciju inhibitornog dejstva NKG2A. Na primer, bilo koji fragment NKG2A, poželjno ali ne isključivo humani NKG2A, ili bilo koja kombinacija NKG2A fragmenata, mogu da se koriste kao imunogeni za podizanje antitela, i antitela mogu da prepoznaju epitope na bilo kojoj lokaciji unutar NKG2A polipeptida, toliko dugo koliko to mogu na NKG2A eksprimirajućim NK ćelijama kako je ovde opisano. Opciono, epitop predstavlja epitop koga specifično prepoznaje antitelo sa teškim lancem SEQ ID NO: 4-8 i lakim lancem SEQ ID NO: 9.

[0085] U jednom aspektu, agens stupa u kompeticiju sa humZ270 antitelom otkrivenim u U.S. patentu br. 8,206,709 u vezivanju za ekstracelularni deo humanog receptora. Kompetitivno vezivanje može da se izmeri, na primer, u BiaCore eksperimentima, u kojima se meri sposobnost agenasa, za vezivanje ekstracelularnog dela imobilisanog CD94/NKG2A receptora (npr. prečišćenog iz CD94/NKG2 eksprimirajućih ćelija, ili proizvedenog u biosistemu) zasićenog sa humZ270. Alternativno, vezivanje agenasa za ćelije se meri tako da ili prirodno eksprimira, ili prekomerno eksprimira (npr. nakon prolazne ili stabilne transfekcije), CD94/NKG2A receptor, a koji je prethodno inkubiran zasićenim dozama Z270. U jednom aspektu, kompetitivno vezivanje može biti izmereno primenom postupaka otkrivenih u U.S. patentu br.8,206,709, na primer ocenom vezivanja za Ba/F3-CD94-NKG2A ćelije protočnom citometrijom kako je prikazano u primeru 15 U.S. patenta br.8,206,709.

PD-1 neutrališući terapijski agensi

[0086] Trenutno postoji najmanje šest agenasa koji blokiraju PD-1/PD-L1 put koji se nalaze na tržištu ili su u postupku kliničke procene. Jedan agens je BMS-936558 (Nivolumab/ONO-4538, Bristol-Myers Squibb; bivši MDX-1106). Nivolumab, (trgovinskog naziva Opdivo®) je FDA-odobreno u potpunosti humano IgG4 anti-PD-L1 mAb koje inhibira vezivanje PD-L1 liganda i za PD-1 i CD80 i opisan je kao antitelo 5C4 u WO 2006/121168. Za pacijente sa melanomom, najznačajniji OR je primećen u dozi od 3 mg/kg, dok je za druge vrste kancera 10 mg/kg. Nivolumab se generalno daje u dozi 10 mg/kg svake 3 nedelje do progresije kancera.

[0087] MK-3475 (humano IgG4 anti-PD1 mAb od Merck-a), koje je takođe označeno kao lambrolizumab ili pembrolizumab (trgovinski naziv Keytruda®) je odobreno od strane FDA za lečenje melanoma i ispitano je kod drugih kancera. Pembrolizumab je ispitivan u dozi od 2 mg/kg ili 10 mg/kg svake 2 ili 3 nedelje do progresije bolesti. DNK konstrukti koji kodiraju varijabilne regione teških i lakih lanaca humanizovanog antitela h409 su svi deponovani u Trezoru patenata američke kolekcije uzoraka kultura (10801 University Blvd., Manassas, VA). Plazmid koji sadrži DNK koja kodira teški lanac h409A-I 1 je deponovan 9. juna 2008. godine i identifikovan je kao 081469_SPD-H, a plazmid koji sadrži DNK koja kodira laki lanac h409AI 1 je deponovan 9. juna 2008. godine i identifikovan je kao 0801470_SPD-L-I 1. MK-3475, takođe poznato kao Merck 3745 ili SCH-900475, je takođe opisano u WO2009/114335.

[0088] MPDL3280A/RG7446 (anti-PD-L1 od Roche/Genentech) predstavlja humano anti-PD-L1 mAb koje sadrži projektovan Fc domen dizajniran da optimizuje efikasnost i bezbednost svođenjem na minimum FcγR vezivanja i posledične celularne citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC). Doze od ≤1, 10, 15, i 25 mg/kg MPDL3280A se daju svake tri nedelje do 1 godine. U fazi 3 kliničkog ispitivanja, MPDL3280A se daje u dozi od 1200 mg intravenskom infuzijom svake tri nedelje kod NSCLC.

[0089] AMP-224 (Amplimmune i GSK) predstavlja imunoadhezin koji obuhvata PD-L2 ekstracelularni domen spojen sa Fc domenom. Drugi primeri agenasa koji neutrališu PD-1 mogu da uključuju antitelo koje vezuje PD-L2 (anti-PD-L2 antitelo) i blokira interakciju između PD-1 i PD-L2.

[0090] Pidlizumab (CT-011; CureTech) (humanizovano IgG1 anti-PD1 mAb from CureTech/Teva), Pidlizumab (CT-011; CureTech) (videti npr., WO2009/101611). Trideset pacijenata sa rituksimabsenzitivnom povratnom FL su lečeni sa 3 mg/kg intravenski CT-011 svake 4 nedelje sa 4 infuzije u kombinaciji sa rituksimabom datim u dozama od 375 mg/m2 nedeljno tokom 4 nedelje, sa početkom 2 nedelje nakon prve infuzije CT-011.

[0091] Dalje poznata PD-1 antitela i drugi PD-1 inhibitori uključuju AMP-224 (B7-DC/IgG1 fuzioni protein za koji je licenciran GSK), AMP- 514 opisan u WO 2012/145493, antitelo MEDI-4736 (anti-PD-L1 koje je razvila AstraZeneca/ Medimmune) opisano u WO2011/066389 i US2013/034559, antitelo YW243.55.S70 (anti-PD-L1) opisano u WO2010/077634, MDX-1105, takođe poznato kao BMS-936559, predstavlja anti-PD-L1 antitelo koje je razvio Bristol-Myers Squibb opisano u WO2007/005874, i antitela i inhibitore opisane u WO2006/121168, WO2009/014708, WO2009/114335 i WO2013/019906. Dalji primeri anti-PD1 antitela su otkriveni u WO2015/085847 (Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co. Ltd.), na primer antitela sa varijabilnim domenom lakog lanca CDR1, 2 i 3 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 i/ili SEQ ID NO: 8, tim redom, i varijabilni domen teškog lanca antitela CDR1, 2 i 3 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ili SEQ ID NO: 5, tim redom, pri čemu SEQ ID NO reference predstavljaju numerisanja prema WO2015/085847. Antitela koja stupaju kompeticiju sa bilo kojim od ovih antitela zbog vezivanja za PD-1 ili PD-L1 takođe mogu da se koriste.

[0092] Primer anti-PD-1 antitela je pembrolizumab (videti, npr., WO 2009/114335). Anti-PD-1 antitelo može biti antitelo h409AI 1 u WO 2008/156712, koje obuhvata varijabilne regione teškog lanca koje kodira DNK deponovana na ATCC kao 081469_SPD-H i varijabilne regione lakog lanca koje kodira DNK deponovana na ATCC as0801470_SPD-L-I 1. U drugim aspektima, antitelo obuhvata CDR-ove teškog i lakog lanca ili varijabilne regione pembrolizumaba. Samim tim, u jednom aspektu, antitelo obuhvata CDR1, CDR2, i CDR3 domene VH pembrolizumaba koje kodira DNK deponovana na ATCC kao 081469_SPD-H, i CDR1, CDR2 i CDR3 domene VL pembrolizumaba koje kodira DNK deponovana na ATCC kao 0801470_SPD-L-I 1.

[0093] U nekim aspektima, PD-1 neutrališući agens predstavlja anti-PD-L1 mAb koje inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1. U nekim aspektima, PD-1 neutrališući agens predstavlja anti-PD1 mAb koji inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1. U nekim aspektima, PD-1 neutrališući agens predstavlja imunoadhezin (npr., imunoadhezin koji obuhvata ekstracelularni ili PD-1 vezujući deo PD-L1 ili PD-L2 spojen sa konstantnim regionom (npr., Fc region imunoglobulinske sekvence).

[0094] Drugi primer anti-PD-1 antitela je nivolumab koji obuhvata teške i lake lance sa odgovarajućim sekvencama prikazanim u SEQ ID NO: 12 i 13 ili odgovarajućom aminokiselinskom sekvencom koja im je najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ili 99% identična, ili antigen vezujuće fragmente i njihove varijante. U drugim aspektima, antitelo obuhvata CDR-ove teškog i lakog lanca ili varijabilne regione nivolumaba. Samim tim, u jednom aspektu, antitelo obuhvata domene CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca nivolumaba sa sekvencom definisanom u SEQ ID NO: 12, i domene CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca nivolumaba sa sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 13.

[0095] Primer anti-PD-L1 antitela obuhvata varijabilne regione teškog i lakog lanca sa odgovarajućim sekvencama prikazanim u SEQ ID NO: 14 i 15, ili aminokiselinsku sekvencu koja im je najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ili 99% identična tim redom, ili njene antigen vezujuće fragmente. U drugim aspektima, antitelo obuhvata CDR-ove teškog i lakog lanca ili varijabilne regione MPDL3280A. Samim tim, u jednom aspektu, antitelo obuhvata domene CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca sa sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 14, i domene CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca sa sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 15.

[0096] Anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitelo može biti izabrano iz grupe koju čine potpuno humano antitelo, humanizovano antitelo, i himerno antitelo. U jednom aspektu ovog otkrivanja, agens obuhvata konstantni domen deriviran od humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 antitela. U jednom aspektu ovog otkrivanja, agens predstavlja fragment antitela izabran iz grupe koju čine IgA, IgD, IgG, IgE i IgM antitelo. U jednom aspektu ovog otkrivanja, agens je fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fab fragment, Fab' fragment, Fab'-SH fragment, F(ab)2 fragment, F(ab')2 fragment, Fv fragment, teški lanac Ig (llama ili camel Ig), VHHfragment, FV pojedinačnog domena, i fragment antitela pojedinačnog lanca. U jednom aspektu ovog otkrivanja, agens je sintetički ili polusintetički molekul deriviran iz antitela izabran iz grupe koju čine scFV, dsFV, minitelo, dijatelo, trijatelo, kapa telo, IgNAR; i multispecifično antitelo.

[0097] Anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitelu može da nedostaje suštinsko specifično vezivanje za Fcγ receptore, npr. CD16. Takva antitela mogu da obuhvataju konstantne regione raznih teških lanaca za koje je poznato da ne vezuju Fc receptore. Jedan takav primer je IgG4 konstantni region. IgG4 Alternativno, fragmenti antitela koji ne obuhvataju konstantne regione, kao što su Fab ili F(ab')2 fragmenti, mogu da se koriste kako bi se izbeglo vezivanje Fc receptora. Vezivanje Fc receptora može biti ocenjeno u skladu sa postupcima poznatim u tehnici, uključujući na primer ispitivanje vezivanja antitela za protein Fc receptora u BIACORE ispitivanju. Takođe, može da se upotrebljava bilo koja vrsta humanog antitela (npr. IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) u kojem je Fc deo modifikovan kako bi se vezivanje za Fcγ receptore svelo na minimum ili eliminisalo. Anti-PD-1 ili anti-PDL1 antitelo, pri čemu će antitelo samim tim obično smanjiti ili svesti na minimum funkciju efektora. U jednom aspektu, minimalna efektorska funkcija proizilazi iz proizvodnje u prokariotičnim ćelijama. U jednom aspektu minimalna funkcija efektora proizilazi iz "Fc mutacije bez efektora" ili aglikosilacije. Opet u daljem aspektu, Fc mutacija bez efektora predstavlja N297A ili D265A/N297A supstituciju u konstantnom regionu.

Formulacije

[0098] Anti-NKG2A ili anti-PD-1 ili anti-PD-L1 agens kao što je antitelo može biti inkorporisan u farmaceutskoj formulaciji koja obuhvata u koncentraciji od 1 mg/ml do 500 mg/ml, pri čemu pomenuta formulacija ima pH od 2.0 do 10.0. Formulacija može dalje da obuhvata sistem pufera, konzervans(e), agens(e) za elastičnost, helatni agens(e), stabilizatore i surfaktante. U jednom aspektu, farmaceutska formulacija predstavlja vodenu formulaciju, tj., formulaciju koja obuhvata vodu. Takva formulacija je obično rastvor ili suspenzija. U daljem aspektu, farmaceutska formulacija je vodeni rastvor. Pojam "vodena formulacija" je definisan kao formulacija koja obuhvata najmanje 50 mas.% vode. Slično tome, pojam "vodeni rastvor" je definisan kao rastvor koji obuhvata najmanje 50 mas.% vode, a pojam "vodena suspenzija" je definisan kao suspenzija koja obuhvata najmanje 50 mas.% vode.

[0099] U drugom aspektu, farmaceutska formulacija predstavlja formulaciju osušenu zamrzavanjem, u koju lekar ili pacijent dodaje rastvarače i/ili razblaživače pre upotrebe.

[0100] U drugom aspektu, farmaceutska formulacija predstavlja osušenu formulaciju (npr. osušenu zamrzavanjem ili u suvom spreju) spremnu za upotrebu bez prethodnog rastvaranja.

[0101] U daljem aspektu, farmaceutska formulacija obuhvata vodeni rastvor antitela, i pufer, pri čemu je to antitelo prisutno u koncentraciji od 1 mg/ml ili više, i pri čemu pomenuta formulacija ima pH od oko 2.0 do oko 10.0.

[0102] U drugom aspektu, pH formulacije je u opsegu izabranom sa liste koju čine od oko 2.0 do oko 10.0, oko 3.0 do oko 9.0, oko 4.0 do oko 8.5, oko 5.0 do oko 8.0, i oko 5.5 do oko 7.5.

[0103] U daljem aspektu, pufer je izabran iz grupe koju čine natrijumacetat, natrijumkarbonatcitrat, glicilglicin, histidin, glicin, lizin, arginin, natrijumdihidrogenfosfat, dinatrijumhidrogenfosfat, natrijumfosfat, i tris(hidroksimetil)-aminometan, bicin, tricin, jabučna kiselina, sukcinat, maleinska kiselina, fumarinska kiselina, tartarinska kiselina, aspartinska kiselina ili njihove mešavine. Svaki od ovih pufera čini alternativni aspekt ovog otkrivanja.

[0104] U daljem aspektu, formulacija dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv konzervans. U daljem aspektu, formulacija dalje obuhvata izotoničan agens. U daljem aspektu, formulacija takođe obuhvata helatni agens. U daljem aspektu ovog otkrivanja formulacija dalje obuhvata stabilizator. U daljem aspektu, formulacija dalje obuhvata surfaktant. Radi pouzdanosti referenca je Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.

[0105] Moguće je da i drugi sastojci budu prisutni u peptidnoj farmaceutskoj formulaciji ovog otkrivanja. Takvi dodatni sastojci mogu da uključuju agense za vlaženje, emulgatore, antioksidanse, agense za povećanje zapremine, modifikatore elastičnosti, helatne agense, metalne jone, uljane nosače, proteine (npr., humani serumski albumin, želatin ili proteine) i cviterjon (npr., aminokiselinu kao što je betain, taurin, arginin, glicin, lizin i histidin). Takvi dodatni sastojci ne bi, naravno, trebalo da imaju neželjeni uticaj na celokupnu stabilnost farmaceutske formulacije ovog otkrivanja.

[0106] Davanje farmaceutskih kompozicija prema ovom otkrivanju može biti izvedeno na nekoliko načina davanja, na primer, intravenski. Pogodna formulacija antitela takođe može da se odredi ispitivanjem iskustava sa drugim već razvijenim terapijskim monoklonalnim antitelima. Za nekoliko monoklonalnih antitela se pokazalo da su efikasna u kliničkim situacijama, kao što su Rituxan (rituksimab), Herceptin (trastuzumab), Xolair (omalizumab), Bexxar (tositumomab), Campath (alemtuzumab), Zevalin, Oncolym i slične formulacije mogu da se koriste sa antitelima ovog otkrivanja. Na primer, monoklonalno antitelo može da bude isporučeno u koncentraciji ili od 10 mg/mL ili od 100 mg (10 mL) ili 500 mg (50 mL) u bočicama za jednokratnu upotrebu, formulisano za IV davanje u 9.0 mg/mL natrijumhlorida, 7.35 mg/mL natrijumcitratdihidrata, 0.7 mg/mL polisorbata 80, i sterilnoj vodi za injekcije. pH je podešena na 6.5. U drugom aspektu, antitelo je isporučeno u formulaciji koja obuhvata oko 20 mM Na-Citrata, oko 150 mM NaCl, pri pH od oko 6.0.

[0107] Takođe su obezbeđeni kompleti koji uključuju farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-NKG2A antitelo, i anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitelo, i farmaceutski-prihvatljiv nosač, u terapijski efektivnoj količini podešenoj za upotrebu u postupcima koji prethode. Kompleti opciono takođe mogu da uključuju uputstva, npr., koja obuhvataju rasporede davanja, kako bi omogućila medicinskom radniku (npr.,lekaru, sestri, ili pacijentu) da daje kompoziciju koja je u istim sadržana pacijentu sa kancerom (npr., čvrstim tumorom). Komplet takođe može da uključuje i špric.

[0108] Opciono, kompleti uključuju višestruka pakovanja farmaceutskih kompozicija od jedne doze, pri čemu svaka sadrži efektivnu količinu anti- NKG2A, anti-PD-1 ili PD-L1 antitela za pojedinačno davanje u skladu sa ovde obezbeđenim postupcima. Instrumenti ili uređaji neophodni za davanje farmaceutske kompozicije(a) takođe mogu da budu uključeni u komplete. Na primer, u kompletu može da bude obezbeđen jedan ili više prethodno napunjenih špriceva koji sadrže količinu anti-NKG2A, anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitela.

[0109] U jednom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje komplet za lečenje kancera kod humanog pacijenta, pri čemu taj komplet obuhvata:

(a) dozu anti-NKG2A antitela koje obuhvata domene CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca sa sekvencom definisanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 4-8, i domene CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca sa sekvencom definisanom u SEQ ID NO:9;

(b) dozu anti-PD-1 antitela ili anti-PD-L1 antitelo; i

(c) opciono, uputstva za upotrebu anti-NKG2A antitela i anti-PD-1 antitela u bilo kom od ovde opisanih postupaka.

Dijagnostika, prognostika, i lečenje maligniteta

[0110] Ovde su opisani postupci koji su korisni u dijagnostici, prognostici, praćenju, lečenju i sprečavanju kancera kod pojedinca. Dok su ovde opisani režimi i postupci lečenja naročito korisni za lečenje čvrstih tumora, ovde opisani režimi i postupci lečenja takođe mogu da se koriste i za razne hematološke kancere, kao i za infektivnu bolest, i zapaljenje i autoimune poremećaje. Postupci i kompozicije ovog otkrivanja se koriste na primer u lečenju raznih kancera i drugih proliferativnih bolesti uključujući, ali bez ograničenja na: karcinom, uključujući karcinom bešike, dojke, debelog creva, bubrega, jetre, pluća, jajnika, prostate, pankreasa, želuca, grlića materice, tiroidne žlezde i kože; hematopoetske tumore linije limfoidnih čvorova, uključujući leukemiju, akutnu limfocitnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, akutnu limfoblastičnu leukemiju, limfom B-ćelija, limfom T-ćelija, Hodžkinov limfom, nehodžkinov limfom, limfom dlakavih ćelija i Burketov limfom, i multipli mijelom; hematopoetske tumore mijeloidne linije, uključujući akutnu i hroničnu mijelogenu leukemiju, promielocitnu leukemiju, i mijelodisplastični sindrom; tumore mezenhimalnog porekla, uključujući fibrosarkom i rabdomioscarkom; druge tumore, uključujući melanom, seminom, terato-karcinom, neuroblastom i gliom; tumore centralnog i perifernog nervnog sistema, uključujući astrocitom, neuroblastom, gliom, i švanome; tumore mezenhimalnog porekla, uključujući fibrosarkom, rabdomiosarkom, i osteosarkom; i druge tumore, uključujući melanom, kseroderma pigmentozum, keratoakantom, seminom, i folikulski tiroidni kancer.

[0111] Ovde obezbeđene kombinovane terapije za lečenje kancera podrazumevaju davanje neutrališućeg anti-NKG2A antitela i PD-1-neutrališućeg agensa, npr. neutrališućeg anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitela, za lečenje subjekata sa kancerom (npr., uznapredovalim refraktornim čvrstim tumorima). U jednom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje anti-NKG2A antitelo i anti-PD-1 antitelo u kombinaciji za lečenje subjekata sa čvrstim tumorom (npr., čvrstim tumorom, uznapredovalim refraktornim čvrstim tumorom) ili subjekata sa hematološkim tumorom. U određenom aspektu, anti-NKG2A antitelo obuhvata a teški lanac bilo koje od SEQ ID NO: 4-8 i laki lanac SEQ ID NO: 9. U jednom aspektu, antitelo koje neutrališe inhibitorno dejstvo PD-1 je izabrano iz grupe koju čine pembrolizumab, nivolumab, AMP-514, MEDI-4736, CT-011 i MPDL3280A.

[0112] Kako se ovde upotrebljava, pomoćno ili kombinovano davanje (istovremeno davanje) uključuje simultano davanje jedinjenja u istom ili različitom doznom obliku, ili odvojeno davanje jedinjenja (npr., sekvencijalno davanje). Stoga, anti-NKG2A i anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitela mogu simultano da se daju u pojedinačnoj formulaciji. Alternativno, anti-NKG2A i anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitela mogu biti formulisana za odvojeno davanje i daju se istovremeno ili sekvencijalno.

[0113] U jednom aspektu, kancer lečen ovde otkrivenim postupcima predstavlja HLA-E-eksprimirajući kancer. U jednom aspektu, kancer je izabran iz grupe koju čine kancer pluća (npr. kancer pluća nemalih ćelija (NSCLC)), karcinom renalnih ćelija (RCC), melanom, kolorektalni kancer, i kancer jajnika.

[0114] Pacijent sa kancerom može biti lečen anti-NKG2A agensima sa ili bez prethodne faze detekcije kako bi se ocenila ekspresija HLA-E na površini tumorskih ćelija. Poželjno, postupci lečenja mogu da obuhvate fazu detektovanja HLA-E nukleinske kiseline ili polipeptida u biološkom uzorku tumora (npr. na tumorskoj ćeliji) od pojedinca. Primer bioloških uzoraka uključuje bilo koji pogodan biološki fluid (na primer serum, limfu, krv), uzorak ćelije, ili uzorak tkiva. Na primer, uzorak tkiva može biti uzorak tumorskog tkiva ili tkiva oko tumora. Opciono, HLA-E polipeptid je detektovan na površini maligne ćelije. Utvrđivanje da biološki uzorak eksprimira HLA-E (npr. značajno eksprimira; eksprimira HLA-E na visokom nivou, visokog intenziteta bojenja anti-HLA-E antitelom, u poređenju sa referencom) ukazuje da pojedinac ima kancer koji može da ima veliku korist od lečenja agensom koji inhibira NKG2A. U jednom aspektu, postupak obuhvata određivanje nivoa ekspresije HLA-E nukleinske kiseline ili polipeptida u biološkom uzorku i poređenje nivoa sa referentnim nivoom (npr. vrednost, površinsko bojenje slabe ćelije, itd.) koji odgovara zdravom pojedincu. Utvrđivanje da biološki uzorak eksprimira HLA-E nukleinsku kiselinu ili polipeptid na nivou koji je povišen u poređenju sa referentnim nivoom ukazuje da pojedinac ima kancer koji može da se leči agensom koji inhibira NKG2A.

[0115] U jednom aspektu, utvrđivanje da biološki uzorak (npr. uzorak koji obuhvata tumorske ćelije, tumorsko tkivo i/ili tkivo oko tumora) značajno eksprimira HLA-E nukleinsku kiselinu ili polipeptid ukazuje da pojedinac ima kancer koji može da se leči agensom koji inhibira NKG2A. "Izrazito eksprimiran", kada se odnosi na HLA-E polipeptid, znači da je HLA-E polipeptid eksprimiran kod suštinskog broja tumorskih ćelija uzetih od datog pojedinca. I dok definicija pojma "izrazito eksprimiran" nije vezana za preciznu procentualnu vrednost, u nekim primerima, receptor koji je pomenut da je "izrazito eksprimiran" će biti prisutan na najmanje 30%, 40%, 50°%, 60%, 70%, 80%, ili više tumorskih ćelija uzetih od pacijenta (u uzorku).

[0116] Utvrđivanje da li pojedinac ima kancerske ćelije koje eksprimiraju HLA-E polipeptid može na primer da obuhvata dobijanje biološkog uzorka (npr. izvođenjem biopsije) od pojedinca koji obuhvata kancerske ćelije, pri čemu se pomenute ćelije dovode u kontakt sa antitelom koje vezuje HLA-E polipeptid, i detektovanje da li ćelije eksprimiraju HLA-E na njihovoj površini. Opciono, utvrđivanje da li pojedinac ima kancerske ćelije koje eksprimiraju HLA-E obuhvata izvođenje imunohistohemijskog ispitivanja. Opciono utvrđivanje da li pojedinac ima kancerske ćelije koje eksprimiraju HLA-E obuhvata izvođenje ispitivanja protočne citometrije.

[0117] Kod postupaka lečenja, anti-NKG2A antitelo i anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitela mogu da se daju odvojeno, zajedno ili sekvencijalno, ili u koktelu. U nekim aspektima, antigen-vezujuće jedinjenje se daje pre davanja anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitela. Na primer, anti-NKG2A antitelo može da se daje približno 0 do 30 dana pre davanja anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitela. U nekim aspektima, anti-NKG2A antitelo se daje od oko 30 minuta do oko 2 nedelje, od oko 30 minuta do oko 1 nedelje, od oko 1 sata do oko 2 sata, od oko 2 sata do oko 4 sata, od oko 4 sata do oko 6 sati, od oko 6 sati do oko 8 sati, od oko 8 sati do 1 dana, ili od oko 1 do 5 dana pre davanja anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitela. U nekim aspektima, anti-NKG2A antitelo se daje istovremeno sa davanjem anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitela. U nekim aspektima, anti-NKG2A antitelo se daje nakon davanja anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitela. Na primer, anti-NKG2A antitelo može da se daje približno 0 do 30 dana nakon davanja anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitela. U nekim aspektima, anti-NKG2A antitelo se daje od oko 30 minuta do oko 2 nedelje, od oko 30 minuta do oko 1 nedelje, od oko 1 sata do oko 2 sata, od oko 2 sata do oko 4 sata, od oko 4 sata do oko 6 sati, od oko 6 sati do oko 8 sati, od oko 8 sati do 1 dana, ili od oko 1 do 5 dana nakon davanja anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitela.

[0118] Pogodni protokoli lečenja za lečenje čoveka sa kancerom uključuju, na primer, davanje pacijentu efektivne količine svakog od antitela koje inhibira NKG2A i antitela koje neutrališe inhibitorno dejstvo humanog PD-1, pri čemu taj postupak obuhvata najmanje jedan ciklus davanja u kojem se najmanje jedna doza anti-NKG2A antitela daje u dozi od 1-10 mg/kg telesne mase a najmanje jedna doza anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitela se daje u dozi od 1-20 mg/kg telesne mase. U jednom aspektu, ciklus davanja traje između 2 nedelje i 8 nedelja.

[0119] U jednom aspektu, postupak obuhvata najmanje jedan ciklus davanja, pri čemu je taj ciklus period od osam nedelja ili manje, pri čemu se za svaki od najmanje jednog ciklusa, daju najmanje dve, tri ili četiri doze anti-NKG2A antitela u dozi od 1-10 mg/kg telesne mase i daju se dve, tri ili četiri doze anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitela u dozi od 1-20 mg/kg telesne mase.

[0120] Anti-NKG2A antitelo može poželjno da se daje u količini koja postiže koncentraciju u cirkulaciji koja je najmanje 10, 20, ili 30 puta veća od koncentracije potrebne za suštinski punu (npr., 90%, 95%) zasićenost receptora (npr., kako je ocenjeno titriranjem anti-NKG2A antitela na NKG2A-eksprimirajućim ćelijama, na primer u PBMC), ili opciono u količini koja postiže koncentraciju u ekstravaskularnom tkivu (npr. tumorskom tkivu ili okruženju) koja je najmanje 10, 20, ili 30 puta veća od koncentracije potrebne za suštinski punu zasićenost receptora (npr., kako je ocenjeno titriranjem anti-NKG2A antitela na NKG2A-eksprimirajućim ćelijama, na primer u PBMC).

[0121] NKG2A+ NK ćelijski odgovor može biti ocenjen pomoću prigodnog ispitivanja citotoksičnog dejstva NKG2A-eksprimirajućih NK ćelija prema HLA-E eksprimirajućim ciljnim ćelijama. Primeri uključuju ispitivanja zasnovana na markerima aktivacije NK ćelija, na primer CD107 ili CD137 ekspresije. EC50za NKG2A+ NK ćelijski odgovor (npr., kako je ocenjeno u ispitivanju mobilizacije CD107) blokiranja anti-NKG2A antitela humZ270 upotrebljenog u ovde datim primerima (npr. sa teškim lancem bilo koje od SEQ ID NO: 4-8 i lakim lancem SEQ ID NO: 9) iznosi oko 4 µg/ml, a EC100je oko 10 µg/ml. Stoga se daje količina anti-NKG2A antitela kako bi se održavala kontinuirana (minimalna) koncentracija u krvi od najmanje 4 µg/ml. Poželjno količina anti-NKG2A antitela može da se daje kako bi se postigla i/ili održavala kontinuirana (minimalna) koncentracija u krvi od najmanje 10 µg/ml. Na primer, koncentracija u krvi koja bi trebalo da se postigne i/ili održava može da bude između 10-12 µg/ml, 10-15 µg/ml, 10-20 µg/ml, 10-30 µg/ml, 10-40 µg/ml, 10-50 µg/ml, 10-70 µg/ml, 10-100 µg/ml, 10-150 µg/ml ili 10-200 µg/ml. Kada se ciljaju tkiva izvan vaskulature (npr. u lečenju čvrstih tumora), količina anti-NKG2A antitela se daje tako da se postigne i/ili održava koncentracija u tkivu od najmanje 10 µg/ml; na primer, davanje količine anti-NKG2A antitela za postizanje koncentracije u krvi od najmanje 100 µg/ml je očekivano za postizanje koncentracije u tkivu od najmanje 10 µg/ml. Na primer, koncentracija u krvi koja bi trebalo da se postigne i/ili održava kako bi se postiglo/održavalo 10 µg/ml u tkivu može biti između 100-110 µg/ml, 100-120 µg/ml, 100-130 µg/ml, 100-140 µg/ml, 100-150 µg/ml, 100-200 µg/ml, 100-250 µg/ml ili 100-300 µg/ml.

[0122] U nekim aspektima, količina anti-NKG2A antitela se daje kako bi se dobila koncentracija u krvi (npr., u krvnom serumu) koja odgovara najmanje EC50za NKG2A+ ćelijski odgovor limfocita (npr., NKG2A+ NK ćelijski odgovor), opciono na oko ili najmanje oko, EC100. "EC50" (ili "EC100") u smislu NKG2A+ ćelijski odgovor (npr. NK ćelijski odgovor), se odnosi na efikasnu koncentraciju anti-NKG2A antitela koje proizvodi 50% (ili 100% kada se odnosi na EC100) svog maksimalnog odgovora ili efekta u smislu takvog NKG2A+ ćelijskog odgovora (npr. NK ćelijski odgovor). U nekim aspektima, određenije za lečenje čvrstih tumora, postignuta koncentracija je napravljena da dovede do koncentracije u tkivima (izvan vaskulture, npr. u tumorskom okruženju) koja odgovara najmanje EC50za NKG2A+ NK ćelijski odgovor, opciono na oko, ili najmanje oko, EC100za NKG2A+ NK ćelijski odgovor.

[0123] Pogodni protokoli lečenja za anti-NKG2A antitelo kao što je humZ270 korišćen u ovde datim primerima sa EC100za NKG2A+ NK ćelijski odgovor od oko 10 µg/ml obuhvataju najmanje jedan ciklus davanja u kojem se najmanje jedna doza anti-NKG2A antitela daje u dozi od 2-10 mg/kg, opciono 4-10 mg/kg, opciono 6-10 mg/kg, opciono 2-6 mg/kg, opciono 2-8 mg/kg, ili opciono 2-4 mg/kg telesne mase. Opciono, daje se najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 doza anti-NKG2A antitela. U jednom aspektu, ciklus davanja je između 2 nedelje i 8 nedelja. U jednom aspektu, ciklus davanja je 8 nedelja. U jednom aspektu, ciklus davanja je 8 nedelja i obuhvata davanje jedne doze anti-NKG2A antitela svake dve nedelje (tj. zbira četiri doze).

[0124] U jednom aspektu od bilo kojih ovde pomenutih aspekata, anti-NKG2A antitelo se daje jednom otprilike na svake dve nedelje.

[0125] Pogodni protokoli lečenja za upotrebu sa anti-NKG2A antitelom, naročito za lečenje hematopoietskog tumora, uključuju na primer, davanje pacijentu anti-NKG2A antitela dva puta mesečno u količini efektivnoj kako bi se održala kontinuirana koncentracija u krvi anti-NKG2A antitela od najmanje 10 µg/ml između najmanje dva sukcesivna davanja anti-NKG2A antitela je između 2-10 mg/kg, opciono 2-6 mg/kg, opciono 2-8 mg/kg, opciono 2-4 mg/kg, opciono 2-6 mg/kg, opciono 2-4 mg/kg, opciono oko 4 mg/kg telesne mase. Ovde doze opciono mogu da se daju kako bi se obezbedila kontinuirana koncentracija anti-NKG2A antitela u krvi od najmanje 10 µg/ml tokom ciklusa lečenja. Postizanje koncentracije anti-NKG2A antitela od 10 µg/ml u krvi odgovara EC100za antitelo kao što je humanizovano Z270.

[0126] Pogodni protokoli lečenja za upotrebu sa anti-NKG2A antitelom, određenije za lečenje čvrstog tumora gde se koncentracija anti-NKG2A antitela EC50traži u ekstravaskularnom tkivu (npr., u tumoru ili tumorskom okruženju), uključuju na primer, davanje pacijentu anti-NKG2A antitela dva puta mesečno u količini efektivnoj za održavanje kontinuirane koncentracije u krvi anti-NKG2A antitela od najmanje 40 µg/ml između najmanje dva sukcesivna davanja anti-NKG2A antitela je između 2-10 mg/kg, opciono 2-6 mg/kg, opciono 2-4 mg/kg, opciono oko 4 mg/kg telesne mase. Ove doze opciono mogu da se daju kako bi se obezbedila kontinuirana koncentracija anti-NKG2A antitela u krvi od najmanje 40 µg/ml tokom ciklusa lečenja. Postizanje koncentracije anti-NKG2A antitela od 40 µg/ml u krvi je očekivano da bi se obezbedila koncentracija u tkivu (npr., ekstravaskularno tkivo, tumorsko okruženje) od oko 4 µg/ml, koja za uzvrat odgovara EC50za antitelo kao što je humanizovano Z270.

[0127] Pogodni protokoli lečenja za upotrebu sa anti-NKG2A antitelom, određenije za lečenje čvrstog tumora gde se EC50koncentracija anti-NKG2A antitela traži u ekstravaskularnom tkivu (npr., u tumoru ili tumorskom okruženju), uključuje na primer, davanje pacijentu efektivne količine anti-NKG2A antitela, pri čemu se antitelo daje 2 puta mesečno a efektivna količina za održavanje kontinuirane koncentracije anti-NKG2A antitela u krvi od najmanje 100 µg/ml između najmanje dva sukcesivna davanja anti-NKG2A antitela je između 4-10 mg/kg, opciono 4-6 mg/kg, opciono 4-8 mg/kg, opciono oko 4 mg/kg, opciono oko 6 mg/kg, opciono oko 8 mg/kg, ili opciono oko 10 mg/kg. Ove doze opciono mogu da se daju kako bi se obezbedila kontinuirana koncentracija anti-NKG2A antitela u krvi od najmanje 100 µg/ml tokom ciklusa lečenja. Postizanje koncentracije anti-NKG2A antitela u krvi od 100 µg/ml je očekivano kako bi se obezbedila koncentracija u tkivu (npr., ekstravaskularnom, tumorskom okruženju) od oko 10 µg/ml, koja za uzvrat odgovora EC100antitelu kao što je humanizovano Z270.

[0128] Dalje pogodni protokoli lečenja za upotrebu sa anti-NKG2A antitelom uključuju režime koji upošljavaju udarni period sa većom dozom, nakon kojeg sledi period održavanja. Na primer, udarni period može da obuhvati davanje pacijentu efektivne količine anti-NKG2A antitela, pri čemu se antitelo daje jednom ili više puta u količini efektivnoj za održavanje kontinuirane koncentracije anti-NKG2A antitela u krvi od najmanje 100 µg/ml do prvog davanje anti-NKG2A antitela tokom režima održavanja. Na primer, kada se daje jednom, udarna doza od 10 mg/kg anti-NKG2A antitela može da se daje, pri čemu se prvo davanje anti-NKG2A antitela u okviru režima održavanja dešava oko dve nedelje (ili manje) posle udarne doze. Režim održavanja može zatim da uposli nižu dozu i/ili nižu učestalost davanja kako bi se održavala kontinuirana koncentracija anti-NKG2A antitela u krvi od najmanje 100 µg/ml između sukcesivnih davanja u okviru režima održavanja. Na primer, režim održavanja može da obuhvati davanje anti-NKG2A antitela svake dve nedelje u dozi od između 2-10 mg/kg, opciono 4-10 mg/kg, opciono 2-4 mg/kg, opciono 4-6 mg/kg, opciono 4-8 mg/kg, opciono oko 4 mg/kg, opciono oko 6 mg/kg, opciono oko 8 mg/kg.

[0129] U određenim aspektima, doza (npr. svaka doza) anti-NKG2A antitela se daje na 4, 6, 8 ili 10 mg/kg. U određenim aspektima, doza (npr. svaka doza) anti-PD-1 antitela se daje na 1-20 mg/kg, opciono na 10 mg/kg. U određenim aspektima, doza (npr. svaka doza) anti-PD-L1 antitela se daje na 10, 15, 20 ili 25 mg/kg, opciono na 1200 mg ukupne doze. U određenim aspektima, kombinovana terapija dopušta da se anti-PD-1 ili PD-L1 antitelo daje u manjoj dozi; u jednom aspektu, svaka doza anti-PD-1 antitela se daje na 2 ili 3 mg/kg.

[0130] U jednom aspektu, anti-NKG2A antitelo i anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitelo se daju u sledećim dozama:

(a) 1-10 mg/kg anti-NKG2A antitelo i (i) 1-10 mg/kg anti-PD-1 antitela ili (ii) 1-20 mg/kg anti-PD-L1 antitela;

(b) 4, 6, 8 ili 10 mg/kg anti-NKG2A antitela i 10 mg/kg anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitela;

(c) 4, 6, 8 ili 10 mg/kg anti-NKG2A antitela i 3 mg/kg anti-PD-1 antitela; ili

(d) 4, 6, 8 ili 10 mg/kg anti-NKG2A antitela i 2 mg/kg anti-PD-1 antitela.

[0131] U jednom aspektu od bilo kog od ovde opisanih aspekata, anti-NKG2A antitelo se daje jednom na oko svake dve nedelje. U jednom aspektu, anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitelo se daje jednom na oko svake tri nedelje. U jednom aspektu, anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitelo se daje jednom na oko svake dve nedelje. U jednom aspektu, anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitelo se daje jednom na oko svake četiri nedelje.

[0132] U jednom aspektu anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitelo i anti-NKG2A antitelo se daju i.v. U jednom aspektu anti-PD-1 ili anti-PD-L1 antitelo i anti-NKG2A antitelo se daju istog dana, opciono dalje jednom na oko svake dve nedelje, opciono dalje i.v.

[0133] U drugim aspektima, obezbeđeni su postupci za identifikovanje NKG2A+PD1+ NK ćelija i/ili T ćelija. Ocenjivanje zajedničke ekspresije NKG2A i PD-1 na NK ćelijama i/ili T ćelijama može da se koristi u dijagnostičkim ili prognostičkim postupcima. Na primer, biološki uzorak može da se dobije od pojedinca (npr. od kancera ili tkiva oko kancera dobijenog od pacijenta sa kancerom) i da se analizira zbog prisustva NKG2A+PD1+ NK i/ili T ćelija. Ekspresija i NKG2A i PD-1 na takvim ćelijama može, na primer, da se koristi za identifikovanje pojedinaca sa tumor infiltrišućim NK i/ili T ćelijama koje inhibiraju i NKG2A i PD1 polipeptide. Postupak može, na primer, biti koristan kao prognostički u smislu odgovara na lečenje agensom koji neutrališe NKG2A, kao prognostički u smislu odgovora na lečenje agensom koje neutrališe PD1, ili kao prognostički u smislu odgovora za kombinovano lečenje agensom koji neutrališe NKG2A i agensom koji neutrališe PD1.

[0134] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za ocenu da li je pojedinac pogodan za lečenje agensom koji inhibira NKG2A i agensom koji neutrališe inhibitorno dejstvo humanog PD-1, pri čemu postupak obuhvata detektovanje populacije limfocita (npr. CD8+ T ćelije) koji eksprimiraju i NKG2A nukleinsku kiselinu ili polipeptid i PD-1 nukleinsku kiselinu ili polipeptid u biološkom uzorku od pojedinca. Utvrđivanje da pojedinac ima populaciju limfocita koji eksprimiraju i NKG2A nukleinsku kiselinu ili polipeptid i PD-1 nukleinsku kiselinu ili polipeptid ukazuje da pacijent ima kancer koji može da se leči agensom koji inhibira NKG2A u kombinaciji sa agensom koji neutrališe inhibitorno dejstvo humanog PD-1.

[0135] U drugim aspektima, obezbeđeni su postupci za identifikovanje NKG2A+PD1+ NK ćelije i/ili T ćelije. Nalaz da tumor infiltrišući efektorski limfociti mogu da eksprimiraju i inhibitorne receptore NKG2A i PD-1 dovodi do poboljšanih postupaka lečenja kao i postupaka za detektovanje takvih dvostrukoograničenih/inhibiranih efektorskih ćelija koje mogu da budu korisne u dijagnostici i prognostici.

[0136] Na primer, biološki uzorak može da se dobije od pojedinca (npr. od kancerskog ili tkiva oko kancera uzetog od pacijenta sa kancerom) i analizira na prisustvo NKG2A+PD1+ NK i/ili T ćelija.

Ekspresija i NKG2A i PD-1 na ćelijama može, na primer, da bude korisna za identifikovanje pojedinaca sa tumor infiltrišućim NK i/ili T ćelijama koje inhibiraju i NKG2A i PD1 polipeptide. Postupak može, na primer, biti koristan kao prognostički zbog odgovora na lečenje agensom koji neutrališe NKG2A, kao prognostički zbog odgovora na lečenje agensom koji neutrališe PD1, ili kao prognostički zbog kombinovanog lečenja agensom koji neutrališe NKG2A i agensom koji neutrališe PD1.

[0137] Detektovanje NKG2A- i PD-1 ograničenih NK i/ili CD8 T ćelija u biološkim uzorcima generalno može imati više prednosti za upotrebu u ovom ispitivanju, proceni, dijagnozi, prognozi i/ili predviđanju patologija gde je značajna karakterizacija NK i/ili CD8 T ćelija. Na primer, povoljna ili nepovoljna prognoza kancera može da se napravi ocenom da li su tumorsko ili tkivo pored tumora okarakterisani infiltrirajućim NK i/ili CD8 T ćelijama koje eksprimiraju i NKG2A i PD-1.

[0138] Na primer, kancer kod pacijenata može da bude okarakterisan ili ocenjen upotrebom anti-NKG2A i anti-PD1 antitela kako bi se ocenilo da li tumor-infiltrišuće NK i/ili CD8 T ćelije predstavljaju NKG2A+PD1+, uključujući da li su takve NK i/ili CD8 T ćelije prisutne na periferiji tumora (kod tkiva oko kancera). Postupci mogu biti korisni kako bi se odredilo da li pacijent ima patologiju koju karakterišu NK i/ili CD8 T ćelije koje mogu biti podložne modulaciji terapijskim agensima koji direktno dejstvuju na takve NK i/ili CD8 T ćelije (npr. vezivanjem za NKG2A i/ili PD-1, ili njihove odgovarajuće ligande HLA-E ili PD-L1) ili indirektno dejstvuju na takve NK i/ili CD8 T ćelije (npr., proizvodnjom citokina ili drugih molekula signaliziranja koji mogu da moduliraju dejstvo NK i/ili CD8 T ćelija). Opciono, u bilo kom aspektu, pacijent je tretiran agensom koji neutrališe PD-1. Ovde opisani postupci opciono mogu dalje da obuhvataju davanje pojedincu takvog terapijskog agensa ukoliko je utvrđeno da taj pojedinac ima patologiju koja bi mogla biti podložna modulaciji terapijskim agensima koji dejstvuju na tumor infiltrišuće NK i/ili CD8 T ćelije.

[0139] U jednom aspektu pronalazači obezbeđuju in vitro postupak za detektovanje NKG2A+ PD-1+ limfocit, opciono NK ili CD8+ T ćelija, pri čemu postupak obuhvata obezbeđuje biološki uzorak koji obuhvata tumor infiltrišuće limfocite i utvrđivanje da li limfociti eksprimiraju NKG2A i PD-1.

[0140] U jednom aspektu pronalazači obezbeđuju in vitro postupak detektovanja NKG2A i PD-1-eksprimirajućih (tj. dvostruko pozitivnih) CD8 T ćelija ili NK ćelija u uzorku od humanog pojedinca, pri čemu pomenuti postupak obuhvata obezbeđivanje uzorka od pojedinca, kontaktiranje ćelija u pomenutom uzorku pomoću monoklonalnog antitela koje se specifično vezuje za humani PD-1 polipeptid u uzorcima, i detektovanje vezivanja antitela za ćelije. U jednom aspektu ćelije predstavljaju CD8 T ćelije i/ili NK ćelije.

[0141] U jednom aspektu pronalazači obezbeđuje in vitro postupak detektovanja tkiva koje infiltrira humane CD8 T ćelije i/ili NK ćelije koje inhibiraju i NKG2A i PD-1 u uzorku od humanog pojedinca, pri čemu pomenuti postupak obuhvata obezbeđivanje uzorka od pojedinca, i detektovanje tkiva koje infiltrira CD8 T ćelije i/ili NK ćelije u pomenutom uzorku pomoću monoklonalnog antitela koje se specifično vezuje za humani NKG2A polipeptid i monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za humani PD-1 polipeptid u uzorcima, pri čemu detekcija NKG2A i PD-1 polipeptida ukazuje na prisustvo NKG2A- i PD-1-inhbiranog tkiva koje infiltrira CD8 T ćelije i/ili NK ćelije. Opciono, u bilo kom aspektu, pacijent je lečen agensom koji neutrališe PD-1. U jednom aspektu, uzorak obuhvata tumorske ćelije, tumorsko tkivo ili tkivo oko tumora. U jednom aspektu, CD8 T ćelije i/ili NK ćelije su identifikovane upotrebom postupaka imunohistohemije. U jednom aspektu, uzorak predstavlja uzorak sa obuhvaćenim parafinom; opciono uzorak sa obuhvaćenim parafinom je fiksiran, obuhvaćen parafinom, rastavljen, deparafinizovan, i prenesen na pločicu pre nego što je doveden u kontakt sa monoklonalnim antitelom. U jednom aspektu, CD8 T ćelije i/ili NK ćelije su identifikovane pomoću postupaka protočne citometrije.

Primeri

Primer 1 -RMA-S i A20 tumorske ćelije su infiltrirane NK ćelijama koje eksprimiraju NKG2A i CD8 T ćelije koje eksprimiraju NKG2A i/ili PD-1

[0142] Za limfocite generalno nije utvrđeno da zajedno eksprimiraju NKG2A i PD-1. Da bi se istražila ekspresija ovih receptora na tumor-infiltrišućim limfocitima, distribucija NKG2A i PD-1 je izučavana na podskupovima NK i T ćelija u tumoru od miševa. Limfociti su uzeti iz slezine, iz tumorskih drenažnih limfnih čvorova, kao i iz čvrstih tumora.

[0143] C57/BL6 miševima su ukalemljene (sc) PDL-1+ Qa-1+ RMA-S ćelije (Qa-1, Qdm, B2m) ili A20 tumorske ćelije. RMA-S Qa-1 Qdm B2m (gornji red) i A20 (donji red) miševi koji nose tumor su žrtvovani kada su zapremine tumora bile oko 500 mm<3>.

[0144] Rezultati su prikazani na Fig.1A i 1B. Tumorske ćelije (Fig.1 A) i tumor infiltrišući limfociti-TIL-(Fig.1 B) su analizirani protočnom citometrijom tim redom zbog ekspresije Qa-1 i PDL-1 za tumorske ćelije a NKG2A i PD-1 za TIL. Prikazan je jedan reprezentativan miš od 3. MFI:Srednja vrednost intenziteta fluorescencije.

[0145] Više od polovine infiltrišućih NK ćelija iz tumora obe vrste je eksprimiralo NKG2A, što ukazuje da tumor-infiltrišuće NK ćelije inhibira NKG2A. NKG2A+ NK ćelije generalno nisu eksprimirale značajne količine PD-1. Međutim, pronađene su CD8 T ćelije koje su bile pozitivne i na NKG2A i na PD-1, što ukazuje da CD8 T ćelije mogu biti ograničene sa oba inhibitorna receptora NKG2A i PD-1.

Primer 2 –Podskupovi NK i T ćelija od miševa koji nose rma-rae1 tumore mogu zajedno da eksprimiraju NKG2A i PD-1

[0146] Kako bi se dalje istražila ekspresija receptora NKG2A i PD-1, izučavana je distribucija NKG2A i PD-1 na podskupovima NK i T ćelija kod miševa. Limfociti su uzeti iz slezine, iz tumorskih drenažnih limfnih čvorova, kao i iz čvrstih tumora.

[0147] C57/BL6 miševima je ukalemljen (sc) RMA- Rae klon 6 (2 miliona ćelija). Ove tumorske ćelije eksprimiraju CD94/NKG2A ligand, Qa-1. Miševi su žrtvovani 12. dana srednje vrednosti zapremine tumora: 723 mm<3>, SD: 161 mm<3>, n=4. Nakon pripreme ćelijske suspenzije iz slezine, LN i tumora, ćelije su obojene na sledeći način: CD3e PerCP Cy5.5, NKP46 Alexa 647, NKG2A/C/E FITC, PD1 PE, CD8 Pacific Blue.

[0148] Rezultati su prikazani na Fig.2 i tabelama 1-3.

[0149] U podskupu NK ćelija, ćelije i u drenažnim limfnim čvorovima i slezini su bile pola NKG2Apozitivne i pola NKG2A-negativne, međutim ni u jednom slučaju nije bilo značajne ekspresije PD1. NK ćelije iz limfnih čvorova su bile NKG2A<+>PD-1<->(49.2%) i NKG2A<->PD-1<->(49.5%), a manje od 1% (srednja vrednost) NK ćelija su bile NKG2A<+>PD-1<+>. NK ćelije iz slezina su bile NKG2A<+>PD-1<->(44.1%) i NKG2A<->PD-1-(55.7%) a srednja vrednost od 0.1% (srednja vrednost) NK ćelija je bila NKG2A<+>PD-1<+>.

[0150] U podskupu T ćelija većina ćelija je bila NKG2A-negativna (samo 1.1% u limfnim čvorovima i 4.7% u slezini su NKG2A<+>), a mali deo ćelija je bio PD-1<+>(3.5% u limfnim čvorovima, a 10% u slezini je bilo PD-1<+>NKG2A-), bez značajnih dvostruko pozitivnih NKG2A PD-1 ćelija. Samo 0.1% (srednja vrednost) T ćelija u limfnim čvorovima je bilo NKG2A<+>PD-1<+>, a samo 0.4% (srednja vrednost) T ćelija u slezini je bilo NKG2A<+>PD-1<+>.95.1% T ćelija iz limfnih čvorova je bilo dvostruko negativno, a 85.6% T ćelija iz slezine je bilo dvostruko negativno.

[0151] U podskupu CD8 T ćelija, većina ćelija je ponovo bila NKG2A-negativna (samo 1.6% u limfnim čvorovima i 3.9% u slezini je NKG2A<+>), a mali deo ćelija je bio PD-1<+>(1.1% u limfnim čvorovima i 2.5% u slezini je bilo PD-1<+>NKG2A-), bez značajno dvostruko pozitivnih NKG2A PD-1 ćelija. Samo 0.2% (srednja vrednost) T ćelija u limfnim čvorovima je bilo NKG2A<+>PD-1<+>i samo 0.3% (srednja vrednost) T ćelija u slezini je bilo NKG2A<+>PD-1<+>.97.3% T ćelija iz limfnih čvorova je bilo dvostruko negativno, a 93.6% T ćelija iz slezine je bilo dvostruko negativno.

[0152] Međutim, među tumor infiltrišućim limfocitima (TIL), svi podskupovi ćelija su imali ćelije koje eksprimiraju PD-1. Za NK ćelije, za koje nije prethodno utvrđeno da u značajnom procentu eksprimiraju PD-1, je primećeno da su u tumoru PD-1-pozitivne, uključujući u NKG2A<+>podksupu, sa 31.8% (srednja vrednost) NK ćelija koje su bile NKG2A<+>PD-1<+>. Dok CD8 T ćelije van tumora gotovo nisu eksprimirale NKG2A ž, CD8 T ćelije koje eksprimiraju PD-1 su bile česte u tumoru (podskup tumor infiltrišućih CD8 T ćelija je imao srednju vrednost od 26.3% NKG2A+ pozitivne ćelije). Štaviše, u ovom podskupu NKG2A-pozitivnih CD8 T ćelija, većina ćelija je bila NKG2A<+>PD-1<+>(19.4% (srednja vrednost). Opet, među podskupom CD8<->T ćelija, bilo je malo razlike u NKG2A ekspresiji primećenoj između TIL-ova i slezine ili ćelija limfnih čvorova, jer je samo 5.1% T ćelija u tumoru eksprimiralo NKG2A, a samo 3.6% T ćelija je bilo NKG2A PD-1 dvostruko pozitivno.

Tabela 1: Slezina

Tabela 2: Drenažni limfni čvorovi tumora

Primer 3 -NKG2A i PD-1 ekspresija kod miševa koji nose tumor

[0153] Da bi se dalje istražila ekspresija NKG2A i PD-1 kod miševa koji nose tumor, C57/BL6 miševima su ukalemljene (sc) različite tumorske ćelije, ili RMA- Rae1, MC38 ili RMA linije. Da bi se procenio uticaj zapremine tumora, miševi su žrtvovani kada su njihovi tumori dostigli zapremine od, redom, 500, 2000 i 800 mm<3>.

[0154] Rezultati su prikazani na Fig.3A i 3B, sa RMA Rae1 (gornji red), MC38 (srednji red) i RMA (donji red). NK ćelije (Fig.3A) i CD8 T ćelije (Fig.3B) su analizirane protočnom citometrijom u slezini, tumorskom drenažnom limfnom čvoru (LN) i tumoru za NKG2A i PD-1 ekspresiju. Prikazan je jedan reprezentativni miš od 2 do 4.

[0155] U podskupu NK ćelija, ćelije u tumoru, limfnim čvorovima i slezini su bile pola NKG2A-pozitivne i pola NKG2A-negativne. Ni NK ćelije (nevezano za njihovu NKG2A ekspresiju) iz drenažnih limfnih čvorova ili slezine nisu pokazale bilo kakvu značajnu ekspresiju PD1. Međutim,tumor infiltrišuće NK ćelije iz RMA-Rae1 i RMA su eksprimirale značajne nivoe i NKG2A i PD1. Tumor infiltrišuće NK ćelije iz tumorske linije MC38 koji su žrtvovane sa naročito velikom zapreminom (2000 mm<3>) jesu eksprimirale NKG2A (50%) ali nisu značajno eksprimirale PD1 (3%).

[0156] Za razliku od NK ćelija koje eksprimiraju NKG2A kod oko polovine populacije, CD8 T ćelije iz slezine i limfnih čvorova su generalno nisu eksprimirle ni NKG2A ni PD1. Međutim, u tumorima, velike proporcije CD8 T ćelija su eksprimirale i NKG2A i PD1 (28% u RMA-Rae1, 43% MC38 i 40% RMA su bile dvostruko pozitivne). Rezultati ponovo ukazuju da tumor infiltrišuće CD8 T ćelije kao i NK ćelije mogu da budu ograničene i inhibitornim receptorom NKG2A i PD1, dalje kod različitih tumorskih ćelija.

Primer 4 -Lečenje anti-PD-1 mAb povećava učestalost NKG2A koji eksprimira CD8 T ćelije u tumorima [0157] Da bi se procenio efekat lečenja anti-PD1 antitelom na CD8 T ćelije, MC38 miševi koji nose tumor su bili tretirani ili sa 200 µg pacovske IgG2a izotipne kontrole (IC) ili neutrališućim anti-mišjim PD-1 monoklonalnim antitelima 11., 14. i 17. dana nakon ukalemljenja ćelija. Miševi (n=3/grupa) su žrtvovani 31. dana i CD8 T ćelije su okarakterisane protočnom citometrijom u slezini, tumorskom drenažnom limfnom čvoru (LN) i tumoru. Prikazane su srednje vrednosti /- SD (n=3) procenata CD8 NKG2A+ među CD8 T ćelijama. P<0,005 (*), P<0,0005 (*), statistička analiza izvedena dvosmernom ANOVA nakon

Claims (11)

1. koje je usledio Takijev test višestrukog poređenja.

   [0158] Rezultati su prikazani na Fig.4. Slično onim primećenim u drugim eksperimentima, CD8 T ćelije iz slezine limfnih čvorova nisu značajno eksprimirale NKG2A. Davanje anti-PD1 antitela nije uzrokovalo bilo koju promenu na nivou NKG2A ekspresije u slezini ili T ćelijama limfnog čvora. Međutim, u tumor infiltrišućoj CD8 T ćelijskoj populaciji, davanje anti-PD1 antitela je uzrokovalo više od 50% rasta kod NKG2A-eksprimirajućih CD8 T ćelija. Rezultati ukazuju da nakon lečenja anti-PD1 antitelom, NKG2A receptor može da ima povećan doprinos inhibiciji CD8 T ćelijskog odgovora na in vivo tumore.

   Neutralizacija NKG2A stoga može biti korisna kako bi se preokrenula inhibicija NKG2A ograničenih T ćelija kod pojedinaca tretiranih agensom koji neutrališe PD-1 osu kao što je anti-PD1 ili PDL1 antitelo.

   Primer 5 - Kombinatorna anti-NKG2A/anti-PD1 blokada inhibira rast tumora

   [0159] Da bi se procenio efekat kombinovanog lečenja neutrališućim anti-PD1 antitelom i neutrališućim anti-NKG2A antitelom, C57BL/6 miševima su ukalemljene (sc) RMA-S Qa-1 Qdm B2m tumorske ćelije i tretirani su neutrališućim anti-PD1 agensom (neutrališuće anti-PD-L1 antitelo) i neutrališućim anti-NKG2A antitelom.

   [0160] Ukratko, C57BL/6 miševi su randomizovani 11. dana kada je RMA-S Qa-1 Qdm B2m zapremina tumora iznosila oko 85 mm<3>(n=8 miševa/grupa) i tretirani izotipnom kontrolom, anti-mišjim NKG2A mAb (200 µg, iv), anti-mišjim PD-L1 mAb (200 µg, ip) ili anti-mNKG2A/mPDL-1 kombinacijom 11., 14., i 18. dana. Zapremina tumora je merena dva puta nedeljno kaliperom. Životinje su eutanazirane kada je tumor postao veliki (zapremina >2000 mm<3>), ulcerozan ili nekrotičan. Podaci predstavljaju srednju vrednost zapremine tumora po eksperimentu.

   [0161] Procena srednje vrednosti zapremine tumora tokom vremena je prikazana na Fig.5. Dok je anti-NKG2A obezbedio samo umeren anti-tumorski efekat u poređenju sa izotipnom kontrolom u ovom modelu, a anti-PD-L1 je obezbedio suštinski anti-tumorski efekat ali sa zapreminom tumora koja se povećavala prema 28. danu, kombinovano lečenje sa anti-NKG2A i anti-PD-L1 je u potpunosti poništilo rast tumora, bez značajnog rasta zapremine tumora primećenog 28. dana.

   Patentni zahtevi

   1. Antitelo koje neutrališe humani NKG2A za upotrebu u lečenju kancera kod humanog pacijenta, pri čemu to lečenje obuhvata davanje pacijentu efektivne količine svakog od: (a) antitela koje neutrališe humani NKG2A, i (b) antitela koje neutrališe humani PD-L1.
2. 2. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu se najmanje dve doze antitela koje neutrališe humani NKG2A daju u količini efektivnoj za postizanje kontinuirane koncentracije anti-NKG2A antitela u krvi od najmanje 10 µg/ml tokom najmanje jedne nedelje nakon njegovog davanja.
3. 3. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevima 1 ili 2, pri čemu lečenje obuhvata najmanje jedan ciklus davanja, opciono pri čemu je taj ciklus period od osam nedelja, pri čemu se za svaki ciklus, daju dve, tri ili četiri doze antitela koje neutrališe humani NKG2A, i daju se dve, tri ili četiri doze antitela koje neutrališe PD-L1 antitelo.
4. 4. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu su antitelo koje neutrališe humani NKG2A i antitelo koje neutrališe PD-L1 formulisani za odvojeno davanje i daju se istovremeno ili sekvencijalno.
5. 5. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od gornjih zahteva, pri čemu kancer predstavlja čvrst tumor.
6. 6. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu kancer predstavlja hematološki tumor.
7. 7. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 5, pri čemu je kancer izabran iz grupe koju čine kancer pluća, karcinom renalnih ćelija (RCC), melanom, kolorektalni kancer, i kancer jajnika.
8. 8. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od zahteva 5-7, pri čemu kancer predstavlja HLA-E-eksprimirajući kancer.
9. 9. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od gornjih zahteva, pri čemu antitelo koje neutrališe NKG2A obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 domene teškog lanca sa sekvencom definisanom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 4-8, i CDR1, CDR2 i CDR3 domene lakog lanca sa sekvencom definisanom u SEQ ID NO: 9.
10. 10. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od gornjih zahteva, pri čemu pomenuto antitelo koje neutrališe NKG2A predstavlja antitelo koje ne izaziva depleciju.
11. 11. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 10, pri čemu pomenuto antitelo predstavlja IgG4 antitelo, pri čemu pomenutom antitelu nedostaje Fc domen ili pri čemu pomenuto antitelo obuhvata Fc domen koji je modifikovan kako bi smanjio vezivanje između Fc domena i Fcγ receptora.