ES3055122T3 - Therapy guidance and/or therapy monitoring for treatment of shock - Google Patents

Therapy guidance and/or therapy monitoring for treatment of shock

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ES3055122T3 ES20764639T ES20764639T ES3055122T3 ES 3055122 T3 ES3055122 T3 ES 3055122T3 ES 20764639 T ES20764639 T ES 20764639T ES 20764639 T ES20764639 T ES 20764639T ES 3055122 T3 ES3055122 T3 ES 3055122T3
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Abstract

El objeto de la presente invención es un método para predecir o diagnosticar un shock refractario en un sujeto que presenta o ha presentado shock. Dicho método comprende los siguientes pasos: * determinar el nivel de DPP3 en una muestra de fluido corporal del sujeto; * comparar dicho nivel de DPP3 determinado con un umbral predeterminado, previendo o diagnosticando shock refractario si dicho nivel de DPP3 supera dicho umbral. También se refiere a vasopresores, agonistas del receptor de angiotensina y/o sus precursores, inhibidores de la actividad de DPP3 y anticuerpos anti-ADM para su uso en el tratamiento del shock en un sujeto que presenta o ha presentado shock. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Guía de terapia y/o monitorización de terapia para el tratamiento de choque
[0003] La presente invención se refiere a un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, y vasopresores, agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos, inhibidores de DPP3 y también describe anti- anticuerpos de ADM para su uso en la terapia de choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, y métodos para tratar dicho choque o choque refractario. La invención se define en las reivindicaciones.
[0004] Estado de la técnica
[0005] Dipeptidil peptidasa 3 - también conocida como Dipeptidil aminopeptidasa III, Dipeptidil arilamidasa III, Dipeptidil peptidasa III, Encefalinasa B o angiotensinasa de glóbulos rojos; nombre corto: DPP3, DPPIII - es una metalopeptidasa que elimina dipéptidos de péptidos fisiológicamente activos, tales como encefalinas y angiotensinas.
[0006] DPP3 se identificó por primera vez y su actividad se midió en extractos de hipófisis anterior bovina purificada por Ellis & Nuenke 1967. La enzima, que se enumera como EC 3.4.14.4, tiene una masa molecular de aproximadamente 83 kDa y está altamente conservada en procariotas y eucariotas (Prajapati & Chauhan 2011).La secuencia de aminoácidos de la variante humana se representa en la SEQ ID NO 1. La dipeptidil peptidasa III es una peptidasa principalmente citosólica que se expresa de manera ubicua. A pesar de carecer de una secuencia de señal, algunos estudios informaron actividad membranosa (Lee & Snyder 1982).
[0007] DPP3 es una exo-peptidasa dependiente de zinc que pertenece a la familia de peptidasas M49. Tiene una amplia especificidad de sustrato para oligopéptidos de tres/cuatro a diez aminoácidos de diversas composiciones y también es capaz de escindir después de la prolina. Se sabe que DPP3 hidroliza dipéptidos del extremo N-terminal de sus sustratos, incluyendo angiotensina II, III y IV; leu- y met-encefalina; endomorfina 1 y 2. La metalopeptidasa DPP3 tiene su actividad óptima a pH 8,0-9,0 y puede activarse mediante la adición de iones metálicos divalentes, como Co<2+>y magnesio<2+>.
[0008] El análisis estructural de DPP3 reveló los motivos catalíticos HELLGH (hDPP3450-455) y EECRAE (hDPP3507-512), así como los siguientes aminoácidos, que son importantes para la unión e hidrólisis del sustrato: Glu316, Tyr, 318, Asp366, Asn391, Asn394, His568, Arg572, Arg577, Lys666 y Arg669 (Prajapati & Chauhan 2011; Kumar et al.
[0009] 2016; la numeración se refiere a la secuencia de DPP3 humana, véase SEQ ID NO. 1). Considerando todos los aminoácidos conocidos o regiones de secuencia que están implicadas en la unión e hidrólisis del sustrato, el sitio activo de la DPP3 humana puede definirse como el área entre los aminoácidos 316 y 669.
[0010] El sustrato más destacado de DPP3 es la angiotensina II (Ang II), el principal efector del sistema renina-angiotensina (RAS). El RAS se activa en enfermedades cardiovasculares (Dostal et al. 1997. J Mol Cell Cardiol-29:2893-902;Roks et al. 1997. Heart Vessels. Suppl 12:119-24), sepsis, and septic shock (Corrêa et al.2015.Crit Care 2015;19:98).Se ha demostrado que Ang II, en particular, modula muchas funciones cardiovasculares, incluido el control de la presión sanguínea y la remodelación cardíaca.
[0011] No se comprende la función biológica exacta de DPP3 en la fisiología celular, pero los hallazgos recientes indican su papel no solo en el metabolismo de las proteínas, sino también en la modulación del dolor y los procesos inflamatorios (Prajapati & Chauhan 2011).Además, DPP3 redujo la presión arterial en ratones hipertensos infundidos con AngII, sin cambiar la frecuencia cardíaca (Pang et al. 2016).Sin embargo, los ratones normotensos no tenían alteración en la presión sanguínea cuando se inyectó DPP3.
[0012] La reducción de la presión arterial mediante la administración de DPP3 junto con un antagonista del receptor de angiotensina en ratones infundidos con Ang II fue similar a la de la inyección de DPP3 sola o al antagonista del receptor de angiotensina solo (Pang et al.2016. Hypertension 68:630-41).
[0013] La angiotensina II (AngII) es una hormona peptídica producida naturalmente por el cuerpo que regula la presión sanguínea a través de la vasoconstricción y la reabsorción de sodio. Los efectos hemodinámicos de la administración de Ang II han sido objeto de numerosos estudios clínicos, demostrando efectos significativos sobre el flujo sanguíneo sistémico y renal (Harrison-Bernard 2009. Adv. Physiol Edu.33(4): 270).
[0014] El tratamiento con AngII se analiza actualmente por su efecto beneficioso en el choque vasodilatador y el choque séptico (Khanna. A.et al., 2017; Antonucci, E. et al. 2017, Tumlin, J.A. et al. 2018).Los pacientes con choque vasodilatador (80 % en choque séptico) tratados con angiotensina II tenían más probabilidades de sobrevivir hasta los 28 días y mostraron una corrección significativa de la hipotensión (Khanna, A. et al., 2017; Tumlin, JA et al.
[0015] 2018).
[0016] Se supone que la enzima convertidora de angiotensina (ACE) está altamente desregulada en pacientes con choque, lo que conduce a una relación alterada de angiotensina I/II) y que la infusión de angiotensina II puede compensar dicha desregulación (Tumlin, JA et al.2018).
[0017] Recientemente, se generaron, caracterizaron y validaron dos ensayos para detectar específicamente DPP3 en fluidos corporales humanos (por ejemplo, sangre, plasma, suero): un inmunoensayo de luminiscencia (LIA) para detectar la concentración de proteína DPP3 y un ensayo de actividad de captura de enzimas (ECA) para detectar actividad específica de DPP3 (Rehfeld et al. 2019 JALM 3(6):943-953).Una etapa de lavado en ambos métodos elimina todas las sustancias que interfieren antes de que se realice la detección real de la proteína o actividad DPP3. Ambos métodos son altamente específicos y permiten la detección reproducible de DPP3 en muestras de sangre. El objeto de la presente invención es la provisión de un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque.
[0018] La presente invención también describe una provisión de vasopresores, agonistas de receptores de angiotensina y/o precursores de los mismos, inhibidores de DPP3 y anticuerpos anti-ADM para su uso en terapia de choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque.
[0019] El objeto de la presente invención es un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho método comprende las etapas:
[0020] · determinar el nivel de DPP3 en una muestra de fluido corporal de dicho sujeto; dicha muestra de fluido corporal se selecciona del grupo de sangre total, plasma y suero;
[0021] · comparar dicho nivel de DPP3 determinado con un umbral predeterminado,
[0022] en donde se predice que dicho sujeto sufrirá un choque refractario o se diagnostica que tiene un choque refractario si dicho nivel determinado de DPP3 está por encima de dicho umbral predeterminado.
[0023] El objeto de la presente invención es un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho método comprende las etapas:
[0024] · determinar el nivel de DPP3 en una muestra de fluido corporal de dicho sujeto, dicha muestra de fluido corporal se selecciona del grupo de sangre total, plasma y suero;
[0025] · comparar dicho nivel de DPP3 determinado con un umbral predeterminado, y
[0026] · determinar el nivel de pro-adrenomedulina de fragmentos de la misma en una muestra de fluido corporal de dicho sujeto, y
[0027] · comparar dicho nivel de pro-adrenomedulina determinada o fragmentos de la misma con un umbral predeterminado,
[0028] en donde se predice que dicho sujeto sufrirá un choque refractario o se diagnostica que tiene un choque refractario si dicho nivel determinado de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma y/o dicho nivel de DPP3 está por encima de dicho umbral predeterminado.
[0029] En una realización específica de dicho método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, dicho choque se selecciona del grupo que comprende choque debido a hipovolemia, choque cardiogénico, choque obstructivo y choque distributivo.
[0030] En otra realización específica de dicho método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, dicho choque se selecciona del grupo que comprende choque debido a hipovolemia, choque cardiogénico, choque obstructivo y choque distributivo, en particular, choque cardiogénico o séptico.
[0031] En una realización específica de dicho método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, dicho choque se selecciona del grupo que comprende:
[0032] · en caso de choque cardiogénico dicho sujeto ha sufrido un síndrome coronario agudo (por ejemplo, infarto agudo de miocardio) o tiene insuficiencia cardíaca (por ejemplo, insuficiencia cardíaca aguda descompensada), miocarditis, arritmia, cardiomipatía, enfermedad cardíaca valcular, disección aórtica con estenosis aórtica aguda, cordal traumática ruptura o embolia pulmonar masiva, o
[0033] · en caso de choque hipovolémico, dicho sujeto puede haber sufrido una enfermedad hemorrágica que incluye hemorragia gastrointestinal, traumatismo, etiologías vasculares (por ejemplo, aneurisma aórtico abdominal roto, tumor que erosiona un vaso sanguíneo principal) y hemorragia espontánea en el contexto del uso de anticoagulantes o una enfermedad no hemorrágica que incluye vómitos, diarrea, pérdida renal, pérdidas cutáneas/pérdidas insensibles (por ejemplo, quemaduras, golpe de calor) o pérdida hacia el tercer espacio en el contexto de pancreatitis, cirrosis, obstrucción intestinal, traumatismo o
[0034] · en caso de choque obstructivo dicho paciente puede haber sufrido un taponamiento cardíaco, neumotórax a tensión, embolia pulmonar o estenosis aórtica, o
[0035] · en caso de choque distributivo dicho paciente tiene choque séptico, choque neurogénico, choque anafiláctico o choque debido a una crisis suprarrenal.
[0036] En otra realización de dicho método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, dicho método se usa para la iniciación y/o terminación y/o estratificación y/o guía de tratamiento.
[0037] Como se usa en el presente documento, la expresión "guía de terapia" o "guía de tratamiento" se refiere a la aplicación de ciertas terapias o intervenciones médicas basándose en el valor de uno o más biomarcadores y/o parámetro clínico y/o puntuaciones clínicas.
[0038] La expresión "monitorización de terapia" en el contexto de la presente invención se refiere a la monitorización y/o ajuste de un tratamiento terapéutico de dicho paciente, por ejemplo, obteniendo retroalimentación sobre la eficacia de la terapia.
[0039] La expresión "estratificación de terapia" en particular se refiere a agrupar o clasificar pacientes en diferentes grupos, tales como grupos de terapia que reciben o no reciben medidas terapéuticas dependiendo de su clasificación.
[0040] El término "predicción" significa correlacionar una probabilidad de un resultado con un resultado obtenido en la medición de un analito. Un ejemplo de esto es la medición de un cierto marcador, tal como DPP3, en una muestra, cuyo nivel medido se correlaciona con la probabilidad de que un sujeto que o bien sufre una descarga o que haya desarrollado una descarga, desarrolle una descarga refractaria.
[0041] La presente invención también comprende un método para la predicción a corto plazo de un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en el que a corto plazo significa un período igual o inferior a 14 días, preferentemente igual o inferior a 7 días, más preferentemente igual o menos de 3 días, más preferentemente igual o menos de 48 horas.
[0042] En otra realización de dicho método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, dicho tratamiento se inicia y/o mantiene y/o se retiene y/o finaliza si dicho nivel determinado de DPP3 es por encima de dicho umbral predeterminado.
[0043] En otra realización de dicho método para predecir o diagnosticar una descarga refractaria en un sujeto que sufre una descarga o que ha desarrollado una descarga, dicho tratamiento se inicia y/o mantiene y/o se retiene y/o finaliza si dicho nivel determinado de DPP3 y / o pro-adrenomedulina y/o fragmentos de la misma está por encima de dicho umbral predeterminado.
[0044] En una realización preferida de dicho método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, dicho tratamiento se selecciona del grupo de vasopresores, agonistas del receptor de angiotensina o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3.
[0045] En otra realización preferida de dicho método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, dicho tratamiento se selecciona del grupo de vasopresores, agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos, inhibidores de la actividad de DPP3 y anticuerpos anti-adrenomedulina o fragmentos de anticuerpos anti-adrenomedulina.
[0046] En otra realización de dicho método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, se determina el nivel de proteína DPP3 y/o el nivel de DPP3 activa y se compara con un umbral predeterminado.
[0047] En otra realización de dicho método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, el nivel de DPP3 se determina poniendo en contacto dicha muestra de fluido corporal con un aglutinante de captura que se une específicamente a DPP3.
[0048] En otra realización preferida de dicho método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, dicho aglutinante de captura para determinar el nivel de DPP3 puede seleccionarse del grupo de anticuerpo, fragmento de anticuerpo o no -armazón de IgG.
[0049] En una realización específica de dicho método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, dicho aglutinante de captura es un anticuerpo.
[0050] En otra realización específica de dicho método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, dicho aglutinante de captura es un anticuerpo monoclonal.
[0051] En otra realización de dicho método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, dicha muestra de fluido corporal se selecciona del grupo de sangre total, plasma y suero.
[0052] En una realización específica de dicho método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, dicho método de diagnóstico o predicción se realiza al menos dos veces.
[0053] El choque se caracteriza por un suministro de oxígeno disminuido y/o un consumo de oxígeno aumentado o una utilización inadecuada de oxígeno que conduce a hipoxia celular y tisular. Es una condición potencialmente mortal de insuficiencia circulatoria y se manifiesta más comúnmente como hipotensión (presión arterial sistólica inferior a 90 mm Hg o PAM inferior a 65 mm Hg). El choque se divide en cuatro tipos principales según la causa subyacente: choque hipovolémico, cardiogénico, obstructivo y distributivo (Vincent y De Backer 2014. N. Engl. J. Med. 370(6): 583).
[0054] El choque hipovolémico se caracteriza por una disminución del volumen intravascular y se puede dividir en dos subtipos amplios: hemorrágico y no hemorrágico. Las causas comunes de choque hipovolémico hemorrágico incluyen hemorragia gastrointestinal, traumatismo, etiologías vasculares (por ejemplo, aneurisma aórtico abdominal roto, tumor que erosiona un vaso sanguíneo principal) y hemorragia espontánea en el contexto del uso de anticoagulantes. Las causas comunes de choque hipovolémico no hemorrágico incluyen vómitos, diarrea, pérdida renal, pérdidas cutáneas/pérdidas insensibles (por ejemplo, quemaduras, golpe de calor) o pérdida hacia el tercer espacio en el contexto de pancreatitis, cirrosis, obstrucción intestinal, traumatismo. Para revisión véase Koya y Paul 2018. Shock. StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2019-2018 Oct 27.
[0055] El choque cardiogénico (CS) se define como un estado de hipoperfusión crítica de órgano terminal debido a un gasto cardíaco reducido. En particular, CS forma un espectro que varía desde una hipoperfusión leve hasta un choque profundo. Los criterios establecidos para el diagnóstico de SC son: (i) presión sanguínea sistólica, •90 mmHg durante >30 min o vasopresores necesarios para alcanzar una presión sanguínea •90 mmHg; (ii) congestión pulmonar o presiones de llenado ventricular izquierda elevadas; (iii) signos de alteración de la perfusión de órganos con al menos uno de los siguientes criterios: (a) estado mental alterado; (b) piel fría y húmeda; (c) oliguria (< 0,5 ml/kg/h o <30 ml/h); (d) aumento del lactato sérico (Reynolds and Hochman 2008. Circulation 117: 686-697).El infarto agudo de miocardio (IAM) con disfunción ventricular posterior es la causa más frecuente de SC y representa aproximadamente el 80 % de los casos. Las complicaciones mecánicas como la ruptura del tabique ventricular (4%) o de la pared libre (2%) y la insuficiencia mitral aguda grave (7%) son causas menos frecuentes de SC después de un IAM. (Hochman et al.2000. J Am Coli Cardiol 36: 1063-1070).El SC no relacionado con IAM puede ser causado por una enfermedad cardíaca valvular descompensada, miocarditis aguda, arritmias, etc. con opciones de tratamiento heterogéneas. Esto se traduce en 40000 a 50000 pacientes por año en los EE. UU. y 60000 a 70000 en Europa. A pesar de los avances en el tratamiento, principalmente mediante la revascularización temprana con la posterior reducción de la mortalidad, el SC sigue siendo la principal causa de muerte en el IAM con tasas de mortalidad que aún se acercan al 40-50 % según registros recientes y ensayos aleatorizados (Goldberg et al.2009. Circulation 119: 1211-1219).
[0056] El choque obstructivo se debe a una obstrucción física de los grandes vasos o del propio corazón. Varias condiciones pueden dar como resultado esta forma de choque (por ejemplo, taponamiento cardíaco, neumotórax a tensión, embolia pulmonar, estenosis aórtica). Para revisión véase Kova y Paul 2018. Shock. StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2019-201827 de octubre.
[0057] De acuerdo con la causa, hay cuatro tipos de choque distributivo: choque neurogénico (estimulación simpática disminuida que conduce a un tono vasal disminuido), choque anafiláctico, choque séptico y choque debido a una crisis suprarrenal. Además de la sepsis, el choque distributivo puede ser causado por el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) debido a afecciones distintas de la infección, tales como pancreatitis, quemaduras o traumatismos. Otras causas incluyen, síndrome de choque tóxico (TSS), anafilaxia (una reacción alérgica repentina y grave), insuficiencia suprarrenal (empeoramiento agudo de insuficiencia suprarrenal crónica, destrucción o extirpación de las glándulas suprarrenales, supresión de la función de la glándula suprarrenal debido a esteroides exógenos, hipopituitarismo y fallo metabólico de la producción de hormonas), reacciones a fármacos o toxinas, envenenamiento por metales pesados, insuficiencia hepática (hígado) y daño al sistema nervioso central. Para revisión véase Koya and Paul 2018. Shock. StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2019-201827 de octubre.
[0058] En general, el choque refractario se ha definido como el requisito de infusión de noradrenalina de >0,5 µg/kg/min a pesar de la reanimación con volumen adecuado. La mortalidad en estos pacientes puede ser tan alta como 94% y la evaluación y manejo de estos pacientes requiere un enfoque mucho más agresivo para la supervivencia. El término "choque refractario" se usa cuando la perfusión tisular no se puede restaurar con las medidas correctivas iniciales empleadas (por ejemplo, vasopresores) y, por lo tanto, puede denominarse choque "altamente dependiente de vasopresores" o "resistente a vasopresores" (Udupa y Shetty 2018. Indian J Respir Care 7: 67-72). Los pacientes con choque refractario pueden tener características de perfusión inadecuada, tales como hipotensión (presión arterial media <65 mmHg), taquicardia, periferias frías, tiempo de llenado capilar prolongado y taquipnea como consecuencia de la hipoxia y la acidosis. La fiebre puede observarse en el choque séptico. También se pueden observar otros signos de hipoperfusión, como sensorio alterado, hiperlactatemia y oliguria. Estos signos bien conocidos de choque no son útiles para identificar si el problema está en la bomba (corazón) o en los circuitos (vasos y tejidos). Pueden coexistir diferentes tipos de choque, y todas las formas de choque pueden volverse refractarias, como lo demuestra la falta de respuesta a los vasopresores en dosis altas (Udupa y Shetty 2018. Indian J Respir Care 7:67-72).
[0059] En una realización específica de la invención, dicho choque refractario es resistente a vasopresores, que se define por la falta de respuesta del paciente a vasopresores de dosis alta (por ejemplo, >0,5 µg/kg/min de noradrenalina). La consecuencia del diagnóstico o la predicción de que un sujeto se encuentra con un choque refractario resistente a vasopresores o se le diagnostica un choque refractario resistente a vasopresores puede ser la administración de un tratamiento como la administración de inhibidores de angiotensina II y/o inhibidores de DPP3. Además, otra consecuencia puede ser la retención de vasopresores.
[0060] En una realización preferida de dicho método para predecir un choque refractario, en particular un choque resistente a vasopresores, en un sujeto que potencialmente sufre un choque, en donde se predice si dicho sujeto sufre un choque refractario, en particular un choque resistente a vasopresores, desde el momento en que se toma la muestra en un plazo de 14 días, o en particular en un plazo de 10 días, o en particular en un plazo de 7 días, o en particular en un plazo de 5 días, o en particular en un plazo de 48 horas, o en particular en un plazo de 24 horas, o en particular, entre 24 y 48 horas.
[0061] Otra realización de la presente invención se refiere a un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde un tratamiento con agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 se inicia y/o continúa cuando el nivel de DPP3 en dicha muestra está por encima de un cierto umbral y/o en donde se retiene y/o termina un tratamiento con vasopresores si dicho nivel determinado de DPP3 está por encima de dicho umbral predeterminado.
[0062] Otra realización específica de la presente invención se refiere a un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde se inicia y/o continúa un tratamiento con vasopresores cuando el nivel de DPP3 en dicho la muestra está por debajo de un cierto umbral y/o en donde un tratamiento con agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 se retiene y/o termina si dicho nivel determinado de DPP3 está por debajo de dicho umbral predeterminado.
[0063] Una realización adicional de la presente invención se refiere a un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde se inicia y/o continúa un tratamiento con vasopresores cuando el nivel de DPP3 en dicho la muestra está por debajo de un cierto umbral y/o en donde un tratamiento con agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 se retiene y/o termina si dicho nivel determinado de DPP3 está por debajo de dicho umbral predeterminado y se determina el nivel de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma y en donde se inicia y/o continúa el tratamiento con un anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM cuando el nivel de proadrenomedulina o fragmentos de la misma en dicha muestra está por encima de un cierto umbral y/o en donde un tratamiento con un anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM se retiene y/o termina si dicho nivel determinado de pro-adrenomedulina o fragmentos del mismo está por debajo de dicho umbral predeterminado. Una realización adicional de la presente invención se refiere a un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque de acuerdo con la presente invención, en donde
[0064] · dicho sujeto puede haber sufrido un síndrome coronario agudo (por ejemplo, infarto agudo de miocardio) o en donde dicho sujeto tiene insuficiencia cardíaca (por ejemplo, insuficiencia cardíaca aguda descompensada), miocarditis, arritmia, miocardiopatía, enfermedad cardíaca valvular, disección aórtica con estenosis aórtica aguda, ruptura cordal traumática o embolia pulmonar masiva (en caso de choque cardiogénico), o
[0065] · dicho sujeto puede haber sufrido una enfermedad hemorrágica que incluye sangrado gastrointestinal, traumatismo, etiologías vasculares (por ejemplo, aneurisma aórtico abdominal roto, tumor que erosiona un vaso sanguíneo principal) y sangrado espontáneo en el contexto del uso de anticoagulantes o una enfermedad no hemorrágica que incluye vómitos, diarrea, pérdida renal, pérdidas cutáneas/pérdidas insensibles (por ejemplo, quemaduras, golpe de calor) o pérdida hacia el tercer espacio en el contexto de pancreatitis, cirrosis, obstrucción intestinal, traumatismo (en caso de choque hipovolémico) o
[0066] · dicho paciente puede haber sufrido un taponamiento cardíaco, neumotórax a tensión, embolia pulmonar o estenosis aórtica (en caso de choque obstructivo), o
[0067] · dicho paciente puede tener choque séptico, choque neurogénico, choque anafiláctico o choque debido a una crisis suprarrenal (en caso de choque distributivo).
[0068] Una realización adicional de la presente invención se refiere a un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque de acuerdo con la presente invención, en donde dicho método se usa para la iniciación y/o terminación y/ o estratificación y/o guía de tratamiento.
[0069] Una realización adicional de la presente invención se refiere a un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque de acuerdo con la presente invención, en donde se inicia y/o mantiene y/o retiene un tratamiento y/o terminado si dicho nivel determinado de DPP3 está por encima de dicho umbral predeterminado.
[0070] Otra realización de la presente invención se refiere a un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde el tratamiento con un anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM y/o agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 se inicia y/o continúa si el nivel de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma en dicha muestra está por encima de un cierto umbral y dicho nivel determinado de DPP3 está por encima de dicho umbral predeterminado de DPP3.
[0071] En una realización específica de la invención, el umbral está dentro de un intervalo de umbral para DPP3 de plasma que está entre 20 y 200 ng/ml, preferentemente entre 25 y 150 ng/ml, incluso más preferentemente entre 30 y 100 ng/ml, incluso más preferentemente entre 35 y 75 ng/ml, lo más preferentemente se aplica un umbral de 50 ng/ml. En particular, el choque refractario de dicho paciente es un choque resistente a vasopresores.
[0072] El péptido adrenomedulina (ADM) se describió como un péptido hipotensor novedoso que comprende 52 aminoácidos, que se había aIledo de un feocromocitoma humano (Kitamura et al.1993. Biochemical and Biophysical Research Communications 192 (2): 553-560).La escisión de la secuencia señal N-terminal de 21 aminoácidos a partir de pre-pro-adrenomedulina (pre-proADM) da como resultado el péptido precursor pro-adrenomedulina (proADM) (SEQ ID NO: 31). Pro-ADM se escinde adicionalmente en PAMP (SEQ ID NO 32), MR-proADM (SEQ ID NO 33), ADM-Gly (SEQ ID NO: 35) y CT-proADM (SEQ ID NO 36). El péptido de adrenomedulina maduro es un péptido amidado (ADM-NH<2>), que comprende 52 aminoácidos (SEQ ID NO: 34) y que comprende los aminoácidos 95 a 146 de pre-proADM, a partir de los cuales se forma por escisión proteolítica. ADM madura, bio-ADM y ADM-NH<2>se usa como sinónimo a lo largo de esta solicitud y es una molécula de acuerdo con SEQ ID NO: 34.
[0073] En una realización de la materia objeto de la presente invención, dicho fragmento de pro-adrenomedulina se selecciona de un grupo que comprende PAMP (SEQ ID NO 32), MR-proADM (SEQ ID NO 33), ADM amidada (SEQ ID NO 34), ADM-Gly (SEQ ID NO: 35) y CT-proADM (SEQ ID NO 36).
[0074] ADM puede considerarse como un péptido regulador polifuncional. Se libera a la circulación parcialmente en una forma inactiva extendida por glicina (Kitamura et al. 1998. Biochem.Biophys.Res. Commun. 244(2): 551-535).También hay una proteína de unión (Pío et al.2001. The Journal of Biological Chemistry 276(15): 12292-12300), que es específica para ADM y probablemente modula de manera similar el efecto de ADM.
[0075] Esos efectos fisiológicos de ADM así como de PAMP, que son de importancia primaria en las investigaciones hasta la fecha, fueron los efectos que influyeron en la presión sanguínea. Por lo tanto, ADM es un vasodilatador eficaz. Se encontró que las concentraciones de ADM, que pueden medirse en la circulación y otros fluidos biológicos, están en una serie de estados patológicos, significativamente por encima de las concentraciones que se encuentran en personas de control sanas. Por lo tanto, el nivel de ADM en pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva, infarto de miocardio, enfermedades renales, trastornos hipertensivos, diabetes mellitus, en la fase aguda de choque y en sepsis y choque séptico aumenta significativamente, aunque en diferentes grados. Las concentraciones de PAMP también aumentan en algunos de dichos estados patológicos, pero los niveles plasmáticos se reducen en relación con ADM (Eto et al.2001. Peptides 22: 1693-1711).
[0076] Además, se sabe que se observarán concentraciones inusualmente altas de ADM en la sepsis o en el choque séptico(Eto et al. 2001. Peptides 22: 1693-1711:Hirata et al. 1996. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 81(4): 1449-1453:Ehlenz et al. 1997. Exp Clin Endocrinol Diabetes 105: 156-162;Tomoda et al.
[0077] 2001.Peptides 22: 1783-1794:Ueda et al. 1999 Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160: 132-136:Wang et al. 2001. Peptides 22: 1835-1840).Los hallazgos están relacionados con los cambios hemodinámicos típicos que se conocen como fenómenos típicos del curso de una enfermedad en pacientes con sepsis y otros síndromes graves, tales como, por ejemplo, SIRS. La adrenomedulina desempeña un papel fundamental durante el desarrollo de la sepsis (Wang, Shock 1998, 10(5):383-384;Wang et al. 1998. Archivos de cirugía 133(12): 1298-1304) y en numerosas enfermedades agudas y crónicas (Parlapiano et al. 1999. European Review for Medical and Pharmacological Sciences 3:53-61;Hinson et al. 2000 Endocrine Reviews 21(2):138-167).MR-proADM se ha identificado como un marcador de pronóstico que puede estratificar el riesgo de mortalidad en pacientes con sepsis con diferentes grados de insuficiencia orgánica. Puede ser útil en la identificación temprana y la evaluación del riesgo individual de sepsis y también puede facilitar el manejo clínico posterior de la sepsis y el choque séptico (para una revisión, véase Önal et al.2018. Atención sanitaria 6: 110).
[0078] Se describieron varios métodos para medir los niveles circulantes de ADM: ya sea ADM directa o indirectamente determinando un fragmento más estable de su péptido precursor afín. Recientemente se publicó un método que describe un ensayo para medir la ADM madura circulante (Weber et al.2017. JALM 2: 222-233).
[0079] Se han descrito otros métodos para cuantificar fragmentos derivados del precursor de ADM, por ejemplo, la medición de MR-proADM (Morgenthaler et al. 2005.Clin Chem 51(10):1823-9),PAMP (Washimine et al. 1994. Biochem Biophys Res Commun 202(2):1081-7) y CT-proADM (EP 2 111 552). Está disponible un fluoroinmunoensayo comercial homogéneo de resolución temporal para la medición de MR-proADM en plasma en un sistema totalmente automatizado (BRAHMS MR-proADM KRYPTOR; BRAHMS GmbH, Hennigsdorf, Alemania) (Caruhel et al. 2009. Clin Biochem 42(7-8):725-8).Como estos péptidos se generan en una relación estequiométrica a partir del mismo precursor, sus niveles en plasma se correlacionan hasta cierto punto.
[0080] La generación de anticuerpos anti-ADM se conoce en la técnica (por ejemplo, WO2013072512 y WO2019057992 incorporados en el presente documento por referencia).
[0081] También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo anti-ADM para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho anticuerpo o fragmento o armazón se une a la parte N-terminal (aa 1-21) de ADM madura: YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID NO 37).
[0082] En otra realización preferida, dicho anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo anti-ADM reconoce y se une al extremo N-terminal (aa1) de ADM. Extremo N-terminal significa que el aminoácido 1, es decir, "Y" de SEQ ID NO 34 y 35 es obligatorio para la unión de anticuerpos. Dicho anticuerpo o fragmento o armazón no de Ig no se uniría ni a ADM N-terminal extendida ni N-terminalmente modificada ni a ADM N-terminalmente degradada.
[0083] También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo anti-ADM para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho anticuerpo o fragmento es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento que se une a la región N-terminal (aa 1-21) de ADM madura (SEQ ID NO 37) o un fragmento de anticuerpo de la misma en donde la cadena pesada comprende las secuencias:
[0084] GYTFSRYW (CDR1: SEQ ID NO: 38), ILPGSGST (CDR2: SEQ ID NO: 39), TEGYEYDGFDY (CDR3: SEQ ID NO: 40) y
[0085] en donde la cadena ligera comprende las secuencias:
[0086] QSIVYSNGNTY (CDR1: SEQ ID NO: 41), RVS (CDR2), FQGSHIPYT (CDR3: SEQ ID NO: 42).
[0087] También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo anti-ADM para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que comprende la siguiente secuencia como un pesado cadena:
[0090]
[0092] y donde dicho anticuerpo monoclonal comprende la siguiente secuencia como cadena ligera:
[0093]
[0096] La disfunción endotelial resulta de y/o contribuye a varios procesos de enfermedad, como ocurre en el choque, especialmente el choque séptico. A partir de experimentos preclínicos en modelos de sepsis/choque séptico se sabe que la administración del anticuerpo anti-ADM induce un aumento de la concentración de bio-ADM en plasma y que esto coincide con una mayor tasa de supervivencia (Struck et al. 2013. Intensive Care Med Exp 1(1):22).El mecanismo subyacente a este efecto se ha descrito en Geven et al. 2018 (Geven et al. 2018. SHOCK 50 (2): 132-140).Brevemente, el anticuerpo, cuando se administra i.v., debido a su tamaño no puede cruzar la barrera endotelial hacia el intersticio, sino que permanece en la circulación sanguínea. En contraste, ADM, como un péptido pequeño, puede difundirse libremente a través de la barrera endotelial. Por lo tanto, el anticuerpo, cuando se administra en un gran exceso molar sobre la ADM endógena, se une virtualmente a toda la ADM en el plasma y, como una simple consecuencia de alcanzar el equilibrio de unión, conduce a una translocación de ADM desde el intersticio a la circulación sanguínea. La ADM ubicada intersticialmente puede unirse a las células del músculo liso vascular e induce la relajación que da como resultado la vasodilatación. Esto se reduce mediante la administración del anticuerpo. Por otro lado, la ADM en plasma se une a las células endoteliales y, de este modo, estabiliza o incluso restaura la integridad vascular. Por lo tanto, esta función se fortalece cuando los niveles de ADM en plasma aumentan como consecuencia de la administración del anticuerpo, que es un anticuerpo no neutralizante. Finalmente, la unión del anticuerpo a ADM reduce la descomposición proteolítica de ADM. Tomados en conjunto, el anticuerpo anti-ADM Adrecizumab puede restaurar la función endotelial en estado de choque, p. en choque séptico.
[0097] Si dicho nivel de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma está por encima de un cierto nivel umbral, el anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a ADM se administra como terapia.
[0099] También se describe en el presente documento dicho anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM que se une a ADM para la terapia, en donde una muestra de fluido corporal tomada de dichos pacientes muestra un nivel elevado de proADM y/o fragmentos del mismo que tienen al menos 5 aminoácidos por encima de un cierto umbral. Por lo tanto, el método de diagnóstico que usa dicho proADM y/o fragmentos sirve como método de diagnóstico complementario.
[0101] En una realización específica de la invención, el umbral está dentro de un intervalo umbral para ADM-NH<2>en plasma, es decir, entre 50 y 250 pg/ml, preferentemente entre 55 y 200 pg/ml, incluso más preferentemente entre 60 y 150 pg/ml, incluso más preferentemente entre 65 y 100 pg/ml, lo más preferentemente un umbral de 70 pg/ml se aplica.
[0103] En una realización específica de la invención, el umbral está dentro de un intervalo de umbral para MR-proADM de plasma que está entre 0,5 y 3 nmol/L, preferentemente entre 0,6 y 2 nmol/L, incluso más preferentemente entre 0,7 y 1 ng/mL, la mayoría se aplica preferentemente un umbral de 0,8 nmol/l.
[0105] En una realización específica de la invención, el umbral está dentro de un intervalo umbral para CT-proADM de plasma que está entre 85 y 500 pmol/L, preferentemente entre 90 y 350 pmol/L, incluso más preferentemente entre 95 y 250 pmol/L, incluso más preferentemente entre 100 y 200 pmol/L, lo más preferentemente se aplica un umbral de 150 pmol/L.
[0107] Los niveles de ADM-NH<2>de la presente invención o niveles de proADM o fragmentos de los mismos, respectivamente, se han determinado con el ensayo de ADM-NH<2>descrito, como se describe en los ejemplos (o ensayos de proADM o fragmentos del mismo, respectivamente) (Weber et al. 2017. JALM 2(2):1-4). Los niveles de DPP3 de la presente invención se han determinado con los ensayos de DPP3 descritos como se describe en los ejemplos. Los valores umbral mencionados anteriormente pueden ser diferentes en otros ensayos, si estos se han calibrado de manera diferente de los sistemas de ensayo usados en la presente invención. Por lo tanto, los valores de corte mencionados anteriormente se aplicarán para tales ensayos calibrados de manera diferente en consecuencia, teniendo en cuenta las diferencias en la calibración. Una posibilidad de cuantificar la diferencia en la calibración es un análisis de comparación de métodos (correlación) del ensayo en cuestión con el ensayo de biomarcador respectivo usado en la presente invención midiendo el biomarcador respectivo (por ejemplo, bio-ADM, DPP3) en muestras usando ambos métodos. Otra posibilidad es determinar con el ensayo en cuestión, dado que esta prueba tiene suficiente sensibilidad analítica, el nivel medio de biomarcadores de una población normal representativa, comparar los resultados con los niveles medios de biomarcadores como se describe en la bibliografía y recalcular la calibración basándose en la diferencia obtenida por esta comparación. Con la calibración utilizada en la presente invención, se han medido muestras de sujetos normales (sanos): bio-ADM de plasma mediana (ADM-NH<2>maduro) fue de 24,7 pg/ml, el valor más bajo de 11 pg/ml y el percentil 99 de 43 pg/ml (Marino et al. 2014. Critical Care 18:R34).Con la calibración utilizada en la presente invención, se han medido muestras de 5.400 sujetos normales (sanos) (estudio prospectivo basado en la población de un solo centro sueco (MPP-RES)): la mediana (rango intercuartílico) de DPP3 en plasma fue de 14,5 ng/ml (11,3 ng/ml - 19 ng/ml).
[0108] La concentración de MR-proADM mediana en plasma en sujetos normales (sanos) fue de 0,41 (rango intercuartil 0,23 - 0,64) nmol/L (Smith et al. 2009. Clin Chem 55:1593-1595) usando el ensayo de fluorescencia en sándwich automatizado para la detección de MR-proADM como se describe en Caruhel et al. (Caruhel et al. 2009. Clin Biochem 42:725-8).
[0109] La concentración plasmática media de CT-proADM en sujetos sanos normales (n=200) fue de 77,6 pmol/L (mín.46,6 pmol/L, máx.136,2 pmol/L) y el percentil del 95 % fue 113,8 pmol/L (EP 2111552 B1).
[0110] En una realización específica de la invención, un umbral para ADM-NH<2>en plasma es la concentración media de 5 veces, preferentemente la concentración media de 4 veces, más preferentemente la concentración media de 3 veces, lo más preferentemente la concentración media de 2 veces de una población sana normal. En una realización específica de la invención, un umbral para MR-proADM en plasma es la concentración media de 5 veces, preferentemente la concentración media de 4 veces, más preferentemente la concentración media de 3 veces, lo más preferentemente la concentración media de 2 veces de una población sana normal.
[0111] En una realización específica de la invención, un umbral para CT-proADM en plasma es la concentración media de 5 veces, preferentemente la concentración media de 4 veces, más preferentemente la concentración media de 3 veces, lo más preferentemente la concentración media de 2 veces de una población sana normal.
[0112] También se describe en el presente documento que el anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo anti-ADM para su uso en un tratamiento de un paciente que lo necesite, puede administrarse en una dosis de al menos 0,5 mg/kg de peso corporal, particularmente al menos 1,0 mg/ kg de peso corporal, más particularmente, de 1,0 a 20,0 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, de 2,0 a 10 mg/kg de peso corporal, de 2,0 a 8,0 mg/kg de peso corporal, o de 2,0 a 5,0 mg/kg de peso corporal.
[0113] También se describe en el presente documento un vasopresor para su uso en la terapia de choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho sujeto tiene un nivel de DPP3 en una muestra de fluido corporal de dicho sujeto que está por debajo de un umbral predeterminado, cuando se determina mediante cualquiera de los métodos de predicción o diagnóstico de un choque refractario de acuerdo con la presente invención.
[0114] También se describe en el presente documento un vasopresor para su uso en la terapia de choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho vasopresor se selecciona del grupo que comprende dopamina, norepinefrina, un equivalente de norepinefrina, epinefrina, fenilefrina y vasopresina.
[0115] También se describe en el presente documento un vasopresor para su uso en la terapia del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho vasopresor se administra a dicho sujeto en una formulación farmacéutica.
[0116] También se describe en el presente documento un vasopresor para su uso en la terapia de choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho sujeto tiene una presión sanguínea igual o inferior a 65 mm Hg.
[0117] También se describe en el presente documento un inhibidor de la actividad de DPP3 para su uso en la terapia de choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho sujeto tiene un nivel de DPP3 en una muestra de fluido corporal de dicho sujeto que es por encima de un umbral predeterminado cuando se determina mediante un método descrito en las realizaciones mencionadas anteriormente.
[0118] También se describe en el presente documento un inhibidor de la actividad de DPP3 para su uso en la terapia de choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde el inhibidor de la actividad de DPP3 se selecciona del grupo que comprende anticuerpo anti-DPP3 o fragmento de anticuerpo anti-DPP3 o armazón no Ig anti-DPP3.
[0119] También se describe en el presente documento un inhibidor de la actividad de DPP3 para su uso en la terapia de choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho inhibidor tiene una afinidad de unión mínima a DPP3 igual o inferior a 10<-7>M.
[0120] También se describe en el presente documento un inhibidor de la actividad de DPP3 para su uso en terapia de choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado choque, en donde el inhibidor de la actividad de DPP3 es un anticuerpo.
[0121] También se describe en el presente documento un inhibidor de la actividad de DPP3 para su uso en la terapia de choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho inhibidor es un anticuerpo que es monoclonal.
[0122] También se describe en el presente documento un inhibidor de la actividad de DPP3 para su uso en la terapia de choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho inhibidor es un anticuerpo monoclonal, en donde las regiones determinantes de complementariedad (CDR) en el pesado cadena comprende las secuencias: SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO: 8 y/o SEQ ID NO.: 9 y las regiones determinantes de complementariedad (CDR) en la cadena ligera comprenden las secuencias: SEQ ID NO.: 10, KVS y/o SEQ ID NO.: 11.
[0123] También se describe en el presente documento un inhibidor de la actividad de DPP3 para su uso en la terapia de choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho inhibidor es un anticuerpo monoclonal humanizado o un fragmento de anticuerpo monoclonal humanizado, en donde la cadena pesada comprende la secuencia: SEQ ID NO.: 12 y en donde la cadena ligera comprende la secuencia: SEQ ID NO.: 13.
[0124] Dicho inhibidor de la actividad de DPP3 puede administrarse por inhalación.
[0125] También se describe en el presente documento un inhibidor de la actividad de DPP3 para su uso en la terapia de choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho inhibidor se administra en combinación con un agonista del receptor de angiotensina y/o precursores del mismo.
[0126] También se describe en el presente documento un inhibidor de la actividad de DPP3 para su uso en la terapia de choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho agonista del receptor de angiotensina y/o precursores del mismo se selecciona del grupo que comprende angiotensina I, angiotensina II, angiotensina III, angiotensina IV, en particular angiotensina II.
[0127] También se describe en el presente documento un agonista del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde el tratamiento con dicha antagonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 se inicia y/o continúa cuando el nivel de DPP3 en una muestra de dicho sujeto está por encima de un cierto umbral y/o en donde se retiene un tratamiento con vasopresores y / o terminado si dicho nivel determinado de DPP3 está por encima de dicho umbral predeterminado.
[0128] También se describe en el presente documento un vasopresor para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde el tratamiento con dicho vasopresor se inicia y/o continúa cuando el nivel de DPP3 en una muestra de fluido corporal de dicho sujeto está por debajo de un cierto umbral y/o en donde un tratamiento con agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 se retiene y/o termina si dicho nivel determinado de DPP3 está por debajo de dicho umbral predeterminado.
[0129] También se describe en el presente documento un vasopresor para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde el tratamiento con dicho vasopresor se inicia y/o continúa cuando el nivel de DPP3 en una muestra de fluido corporal de dicho sujeto está por debajo de un cierto umbral y/o en donde un tratamiento con agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 se retiene y/o termina si dicho nivel determinado de DPP3 está por debajo de dicho umbral predeterminado y en donde se determina el nivel de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma y en donde el tratamiento con dicho anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM se inicia y/o continúa cuando el nivel de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma en dicha muestra está por encima un cierto umbral y/o en donde un tratamiento con un anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM se retiene y/o termina si dicho nivel determinado de Pro-adrenomedular en o fragmentos del mismo está por debajo de dicho umbral predeterminado.
[0130] También se describe en el presente documento un agonista del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde el tratamiento con dicho vasopresor es iniciado y/o continuado cuando el nivel de DPP3 en una muestra de fluido corporal de dicho sujeto está por debajo de un cierto umbral y/o en donde se realiza un tratamiento con agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 retenida y/o terminada si dicho nivel determinado de DPP3 está por debajo de dicho umbral predeterminado, y en donde se determina el nivel de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma y en donde se inicia el tratamiento con dicho anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM y/ o continúa cuando el nivel de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma en dicha muestra está por encima de un cierto umbral y/o en donde un tratamiento con un anticuerpo anti-ADM o un anticuerpo anti-ADM fra el tratamiento se retiene y/o finaliza si dicho nivel determinado de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma está por debajo de dicho umbral predeterminado.
[0131] También se describe en el presente documento un anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde el tratamiento con dicho anticuerpo anti-ADM o anticuerpo anti-ADM y /o agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 se inicia y/o continúa si el nivel de proadrenomedulina o fragmentos de la misma en dicha muestra está por encima de un cierto umbral y dicho nivel determinado de DPP3 está por encima de dicho umbral predeterminado de DPP3.
[0132] En caso de que se determine el nivel de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma en dicha muestra y se determine el nivel de DPP3 en dicha muestra, dicha determinación puede realizarse mediante un dispositivo de punto de atención que proporciona tanto: una prueba para determinar el nivel de Pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma y una prueba para determinar el nivel de DPP3 en dicha muestra.
[0133] El inicio del tratamiento con un agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo está indicado cuando un paciente tiene una cantidad de proteína DPP3 y/o actividad de DPP3 en una muestra de fluido corporal que está por encima de un nivel umbral predeterminado.
[0134] También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar un vasopresor a dicho sujeto, en donde dicho sujeto tiene un nivel de DPP3 en una muestra de fluido corporal de dicho sujeto que está por debajo de un umbral predeterminado, cuando se determina mediante un método descrito en realizaciones anteriores.
[0135] También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar un vasopresor a dicho sujeto, en donde dicho vasopresor se selecciona del grupo que comprende dopamina, norepinefrina, un equivalente de norepinefrina, epinefrina, fenilefrina y vasopresina.
[0136] También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar un vasopresor a dicho sujeto, en donde dicho vasopresor se administra a dicho sujeto en una formulación farmacéutica.
[0137] También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar un vasopresor a dicho sujeto, en donde dicho sujeto tiene una presión sanguínea igual o inferior a 65 mm Hg.
[0138] O También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar un inhibidor de la actividad de DPP3 a dicho sujeto, en donde dicho sujeto tiene un nivel de DPP3 en una muestra de fluido de dicho sujeto que está por encima de un umbral predeterminado cuando se determina mediante un método descrito en realizaciones anteriores. También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar inhibidor de la actividad de DPP3 a dicho sujeto, en donde el inhibidor de la actividad de DPP3 se selecciona del grupo que comprende anticuerpo anti-DPP3 o fragmento de anticuerpo anti-DPP3 o armazón no Ig anti-DPP3.
[0139] También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar inhibidor de la actividad de DPP3 a dicho sujeto, en donde dicho inhibidor tiene una afinidad de unión mínima a DPP3 igual o menor de 10<-7>M.
[0140] También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar inhibidor de la actividad de DPP3 a dicho sujeto, en donde el inhibidor de la actividad de DPP3 es un anticuerpo.
[0141] También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar inhibidor de la actividad de DPP3 a dicho sujeto, en donde dicho inhibidor es un anticuerpo que es monoclonal.
[0142] También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar inhibidor de la actividad de DPP3 a dicho sujeto, en donde dicho inhibidor es un anticuerpo monoclonal, en donde las regiones determinantes de complementariedad (CDR) en la cadena pesada comprende las secuencias: SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO: 8 y/o SEQ ID NO.: 9 y las regiones determinantes de complementariedad (CDR) en la cadena ligera comprenden las secuencias: SEQ ID NO.: 10, KVS y/o SEQ ID NO.: 11.
[0143] También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar un inhibidor de la actividad de DPP3 a dicho sujeto, en donde dicho inhibidor es un anticuerpo monoclonal humanizado o un fragmento de anticuerpo monoclonal humanizado, en donde la cadena pesada comprende la secuencia: SEQ ID NO.: 12 y en donde la cadena ligera comprende la secuencia: SEQ ID NO.: 13.
[0144] También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar un inhibidor de la actividad de DPP3 a dicho sujeto, en donde dicho inhibidor se administra en combinación con un agonista del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos.
[0145] También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar un inhibidor de la actividad de DPP3 a dicho sujeto, en donde se selecciona dicho agonista del receptor de angiotensina y/o precursores del mismo del grupo que comprende angiotensina I, angiotensina II, angiotensina III, angiotensina IV, en particular angiotensina II. También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidor de la actividad de DPP3 a dicho sujeto, en donde el tratamiento con dichos agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 se inicia y/o continúa cuando el nivel de DPP3 en una muestra de dicho sujeto está por encima de un cierto umbral y/o en donde un tratamiento con vasopresores se retiene y/o termina si dicho nivel determinado de DPP3 está por encima de dicho umbral predeterminado.
[0146] También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar un vasopresor a dicho sujeto, en donde el tratamiento con dichos vasopresores se inicia y/o continúa cuando el nivel de DPP3 en una muestra de fluido corporal de dicho sujeto está por debajo de un cierto umbral y/o en donde un tratamiento con agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 se retiene y/o finaliza si dicho nivel determinado de DPP3 está por debajo de dicho umbral predeterminado.
[0147] También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidor de la actividad de DPP3 a dicho sujeto, en donde el tratamiento con dichos agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 se inicia y/o continúa cuando el nivel de DPP3 en una muestra de dicho sujeto está por encima de un cierto umbral y/o en donde un tratamiento con vasopresores se retiene y/o termina si dicho nivel determinado de DPP3 está por encima de dicho umbral predeterminado y en donde se determina el nivel de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma y en donde se inicia el tratamiento con dicho anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM y /o continúa cuando el nivel de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma en dicha muestra está por encima de un cierto umbral y/o en donde un tratamiento con un anticuerpo anti-ADM o el fragmento de anticuerpo anti-ADM se retiene y/o termina si dicho nivel determinado de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma está por debajo de dicho umbral predeterminado.
[0148] También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar un vasopresor a dicho sujeto, en donde el tratamiento con dichos vasopresores se inicia y/o continúa cuando el nivel de DPP3 en una muestra de fluido corporal de dicho sujeto está por debajo de un cierto umbral y/o en donde un tratamiento con agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 se retiene y/o finaliza si dicho nivel determinado de DPP3 está por debajo de dicho umbral predeterminado y en donde se determina el nivel de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma y en donde el tratamiento con dicho anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM se inicia y/o continúa cuando el nivel de pro-adrenomedulina o fragmentos del mismo en dicha muestra está por encima de un cierto umbral y/o en donde se retiene y/o termina un tratamiento con un anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM si dicho nivel determinado de proadrenomedulina o fragmentos de la misma está por debajo de dicho umbral predeterminado.
[0149] También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar un anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo anti-ADM a dicho sujeto, en donde el nivel de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma y en donde el tratamiento con dicho anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM se inicia y/o continúa cuando el nivel de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma en dicha muestra está por encima de un cierto umbral y/o en donde un tratamiento con un anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo anti-ADM se retiene y/o termina si dicho nivel determinado de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma está por debajo de dicho umbral predeterminado y en donde el tratamiento con agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y /o inhibidores de la actividad de DPP3 se inicia y/o continúa cuando el nivel de DPP3 en una muestra de dicho sujeto está por encima de un cierto umbral y/o en donde un tratamiento con vasopresores se retiene y/o termina si dicho nivel determinado de DPP3 está por encima de dicho umbral predeterminado También se describe en el presente documento un método de tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, comprendiendo el método administrar un anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo anti-ADM a dicho sujeto, en donde el tratamiento con dicho anticuerpo anti-ADM o anticuerpo anti-ADM y/o agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 se inicia y/o continúa si el nivel de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma en dicha muestra está por encima de un cierto umbral y dicho nivel determinado de DPP3 está por encima de dicho umbral predeterminado de DPP3.
[0150] Un agonista significa una sustancia química que se une a un receptor y activa el receptor para producir una respuesta biológica. Los receptores pueden activarse por agonistas endógenos (tales como hormonas y neurotransmisores) o agonistas exógenos (tales como fármacos), dando como resultado una respuesta biológica. Los agonistas completos se unen a y activan un receptor con la respuesta máxima que un agonista puede provocar en el receptor. Los agonistas parciales son fármacos que se unen a y activan un receptor dado, pero tienen solo una eficacia parcial en el receptor en relación con un agonista completo. La potencia es la cantidad de agonista necesaria para provocar una respuesta deseada. La potencia de un agonista está inversamente relacionada con su valor de CE<50>. La CE<50>se puede medir para un agonista dado determinando la concentración de agonista necesaria para provocar la mitad de la respuesta biológica máxima del agonista. La CE<50>el valor es útil para comparar la potencia de fármacos con eficacias similares que producen efectos fisiológicamente similares. Cuanto menor sea la CE<50>cuanto mayor sea la potencia del agonista, menor será la concentración de fármaco que se requiere para provocar la respuesta biológica máxima.
[0151] El tratamiento con un agonista de receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo puede continuarse siempre que el paciente tenga una cantidad de proteína DPP3 y/o actividad de DPP3 en una muestra de fluido corporal que esté por encima de un nivel umbral predeterminado.
[0152] La cantidad de proteína DPP3 y/o la actividad de DPP3 se mide al menos cada 24 horas, preferentemente cada 12 horas, más preferentemente cada 8 horas, incluso más preferentemente cada 6 horas, incluso más preferentemente cada 4 horas, incluso más preferentemente cada 2 horas, incluso más preferentemente cada hora, lo más preferentemente cada 30 minutos.
[0153] El tratamiento con un agonista de receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo puede interrumpirse cuando el paciente tiene una cantidad de proteína DPP3 y/o actividad de DPP3 en una muestra de fluido corporal que está por debajo de un nivel umbral predeterminado.
[0154] Terapia con angiotensina:
[0155] La angiotensina I, también llamada proangiotensina, se forma por la acción de la renina sobre el angiotensinógeno. La renina escinde el enlace peptídico entre los residuos de leucina (Leu) y valina (Val) en el angiotensinógeno, creando el decapéptido (diez aminoácidos) (des-Asp) angiotensina I. La angiotensina I se convierte en angiotensina II mediante la eliminación de dos C-terminal residuos por la enzima convertidora de angiotensina (ACE), principalmente a través de ACE dentro del pulmón (pero también presente en células endoteliales, células epiteliales de riñón y el cerebro).
[0156] La angiotensina II, la angiotensina III y la angiotensina IV son hormonas peptídicas producidas naturalmente por el cuerpo que regulan la presión sanguínea a través de la vasoconstricción y la reabsorción de sodio. Los efectos hemodinámicos de la administración de angiotensina II han sido objeto de numerosos estudios clínicos, demostrando efectos significativos sobre el flujo sanguíneo sistémico y renal (Harrison-Bernard, LM, The renal reninangiotensin system. Adv Physiol Educ, 33(4): 270 (2009)).
[0157] La angiotensina II es una hormona producida por el sistema renina angiotensina aldosterona (RAAS) que modula la presión sanguínea a través de la regulación del tono del músculo liso vascular y la homeostasis del fluido extracelular. La angiotensina II media sus efectos sobre la vasculatura al inducir la vasoconstricción y la retención de sodio, por lo que es el objetivo de muchas terapias para la hipertensión. Además de sus efectos sistémicos, la angiotensina II tiene un efecto pronunciado sobre las arteriolas eferentes del riñón, manteniendo la filtración glomerular cuando disminuye el flujo sanguíneo. La angiotensina II también regula la reabsorción de sodio en el riñón al estimular los intercambiadores de Na+/H+ en el túbulo proximal e inducir la liberación de aldosterona y vasopresina (Harrison-Bernard 2009. El sistema renal renina-angiotensina. Adv Physiol Educ, 33(4):270).
[0158] El agente terapéutico de angiotensina II que puede usarse en las composiciones y métodos de esta divulgación puede ser Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 13), también denominada 5-isoleucina angiotensina II. SEQ ID NO: 13 es un octa-péptido presente de forma natural en humanos y otras especies, tales como equinos, cerdos, etc. La isoleucina puede sustituirse por valina para dar como resultado 5-vaina angiotensina II, Asp-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro -Phe (SEQ ID NO: 14). Otros análogos de angiotensina II tales como [Asn<1>-Phe<4>]-angiotensina II (SEQ ID NO: 15), hexapéptido Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 16), nonapéptido Asn-Arg-Val-Tyr-Tyr-Val-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 17), [Asn<1>Ile<5>Ile<B>]-angiotensina II (SEQ ID NO: 18), [Asn<1>-Ile<5>-Ala<8>]-angiotensina II (SEQ ID NO: 19), y [Asn<1>-diyodoTyr<4>-Ile<5>-angiotensina II (SEQ ID NO: 20) también se puede utilizar. La angiotensina II puede sintetizarse, por ejemplo, mediante síntesis de péptidos en fase sólida para incorporar modificaciones, tales como amidación C-terminal. El término "angiotensina II", sin especificidad adicional, pretende referirse a cualquiera de estas diversas formas, así como a combinaciones de las mismas.
[0159] En algunos aspectos, una composición que comprende angiotensina II puede seleccionarse de 5-valina angiotensina II, 5-valina angiotensina II amida, 5-L-isoleucina angiotensina II y 5-L-isoleucina angiotensina II amida, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, fabricado preferentemente en las buenas condiciones de fabricación actuales (cGMP). En algunos aspectos, la composición puede incluir diferentes formas de angiotensina II en diferentes porcentajes, por ejemplo, una mezcla de hexapéptido y nonapéptido angiotensina II. La composición que comprende angiotensina II puede ser adecuada para administración parenteral, por ejemplo, para inyección o infusión intravenosa.
[0160] La secuencia de angiotensina II usada en las composiciones y métodos divulgados en el presente documento puede ser homóloga a las secuencias de angiotensina II descritas anteriormente. En ciertos aspectos, la invención incluye secuencias de aminoácidos aIledas, sintéticas o recombinantes que son al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y/o 20. Cualquier secuencia variante de este tipo puede usarse en lugar de una angiotensina II como se describe en el párrafo anterior.
[0161] La identidad de secuencia para todas las secuencias se determina de acuerdo con el siguiente método: El porcentaje de identidad se calcula multiplicando el número de coincidencias en el par por 100 y dividiendo por la longitud de la región alineada, incluyendo huecos (Porcentaje de Identidad = [Coincidencias x 100]/Longitud de región alineada [con huecos]).
[0162] La angiotensina III es un metabolito de la angiotensina II con aproximadamente el 40 % de la actividad de la angiotensina II. Un agente terapéutico de angiotensina III que puede usarse en las composiciones y métodos de esta divulgación puede ser Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 21). SEQ ID NO: 21 es un hepta-péptido presente de forma natural en seres humanos y otras especies, tales como equinos, cerdos, etc. La isoleucina puede sustituirse por valina para dar como resultado Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 22). Otros análogos de angiotensina III tales como [Phe<3>]-angiotensina III (SEQ ID NO: 23), [Ile<4>-Ala<7>]-angiotensina III (SEQ ID NO: 24), y [diyodoTyr<3>-Ile<4>]-angiotensina III (SEQ ID NO: 25) también se puede utilizar. La angiotensina III puede sintetizarse, por ejemplo, mediante síntesis de péptidos en fase sólida para incorporar modificaciones, tales como amidación C-terminal. El término "angiotensina III", sin especificidad adicional, pretende referirse a cualquiera de estas diversas formas, así como a combinaciones de las mismas.
[0163] En algunos aspectos, una composición que comprende angiotensina III puede seleccionarse de 4-valina angiotensina III, 4-valina angiotensina III amida, 4-L-isoleucina angiotensina III y 4-L-isoleucina angiotensina III amida, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, fabricado preferentemente en las buenas condiciones de fabricación actuales (cGMP). Una composición que comprende angiotensina III puede ser adecuada para administración parenteral, por ejemplo, para inyección o infusión intravenosa.
[0164] La secuencia de angiotensina III usada en las composiciones y métodos divulgados en el presente documento puede ser homóloga a las secuencias de angiotensina III descritas anteriormente. En ciertos aspectos, la invención incluye secuencias de aminoácidos aIledas, sintéticas o recombinantes que son al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 y/o 25. Cualquier secuencia variante de este tipo puede usarse en lugar de una angiotensina II como se describe en el párrafo anterior.
[0165] La angiotensina IV es un metabolito de la angiotensina III con menos actividad que la angiotensina II. Un agente terapéutico de angiotensina IV que puede usarse en las composiciones y métodos de esta divulgación puede ser Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 26). SEQ ID NO: 26 es un hexapéptido presente de forma natural en humanos y otras especies. La isoleucina puede sustituirse por valina para dar como resultado Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 27). Otros análogos de angiotensina IV tales como [Phe<2>]-angiotensina III (SEQ ID NO: 28), [Ile<3>-Ala<6>]-angiotensina IV (SEQ ID NO: 29), y [diyodoTyr<2>-Ile<3>]-angiotensina IV (SEQ ID NO: 30) también se puede utilizar. La angiotensina IV puede sintetizarse, por ejemplo, mediante síntesis de péptidos en fase sólida para incorporar modificaciones, tales como amidación C-terminal. El término "angiotensina IV", sin más especificidad, pretende referirse a cualquiera de estas diversas formas, así como a combinaciones de las mismas.
[0166] En algunos aspectos, una composición que comprende angiotensina IV puede seleccionarse de 3-valina angiotensina IV, 3-valina angiotensina IV amida, 3-L-isoleucina angiotensina IV y 3-L-isoieucina angiotensina IV amida, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, fabricado preferentemente en las buenas condiciones de fabricación actuales (cGMP). Una composición que comprende angiotensina IV puede ser adecuada para administración parenteral, por ejemplo, para inyección o infusión intravenosa.
[0167] La secuencia de angiotensina IV usada en las composiciones y métodos divulgados en el presente documento puede ser homóloga a las secuencias de angiotensina IV descritas anteriormente. En ciertos aspectos, la invención incluye secuencias de aminoácidos aIledas, sintéticas o recombinantes que son al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29 y/o 30. Cualquier secuencia variante de este tipo puede usarse en lugar de una angiotensina IV como se describe en el párrafo anterior.
[0168] Un agente terapéutico de angiotensina II, angiotensina III o angiotensina IV puede usarse como cualquier sal adecuada (por ejemplo, acetato), forma desprotegida, forma acetilada, forma desacetilada y/o forma de profármaco de los péptidos mencionados anteriormente, incluidas las formas pegiladas de los péptidos o conjugados como se divulga en la publicación de patente de Estados Unidos 2011/0081371 (incorporada por referencia). El término "profármaco" se refiere a cualquier compuesto precursor que sea capaz de generar o liberar el péptido mencionado anteriormente en condiciones fisiológicas. Tales profármacos o precursores pueden ser péptidos más grandes que se escinden selectivamente para formar el péptido de la invención. Por ejemplo, en algunos aspectos, el profármaco o precursor puede ser angiotensinógeno, angiotensina I o sus homólogos que pueden dar como resultado angiotensina II por la acción de ciertas enzimas endógenas o exógenas. Otros profármacos o precursores incluyen péptidos con aminoácidos protegidos, por ejemplo, que tienen grupos protectores en uno o más grupos ácido carboxílico y/o amino. Los grupos protectores adecuados para los grupos amino incluyen el grupo benciloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo (BOC), fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC), formilo y acetilo o acilo. Los grupos protectores adecuados para el grupo ácido carboxílico incluyen ésteres tales como ésteres de bencilo o ésteres de t-butilo. La presente invención también contempla el uso de angiotensina II, angiotensina III, angiotensina IV y/o péptidos precursores que tienen sustituciones, deleciones, adiciones de aminoácidos, incluyendo las sustituciones y adiciones los aminoácidos D y L convencionales y aminoácidos modificados, tales como, por ejemplo, aminoácidos amidados y acetilados, en donde la actividad terapéutica de la secuencia peptídica de base se mantiene a un nivel farmacológicamente útil.
[0170] En una realización preferida, la angiotensina II es acetato de angiotensina II. El acetato de angiotensina II es la sal de acetato de L-aspartil-L-arginil-L-valil-Ltirosil-L-isoleucil-L-histidil-L-prolil-L-fenilalanina. El contraión acetato está presente en una relación no estequiométrica. La fórmula molecular del acetato de angiotensina II es C<50>H<71>N<13>O<12>•(C<2>H<4>O<2>)n; (n = número de moléculas de acetato; n teórico = 3) con un peso molecular promedio de 1046,2 (como base libre).
[0172] También se describe en el presente documento un agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un sujeto, en donde dicho sujeto tiene una cantidad de proteína DPP3 y/o actividad de DPP3 en una muestra de fluido corporal que es por encima de un umbral predeterminado, en donde la determinación de la cantidad de proteína DPP3 y/o actividad de DPP3 en una muestra de fluido corporal se usa como guía de terapia y/o monitorización de terapia para dicho tratamiento con agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo.
[0174] En una realización de la invención, la cantidad de proteína DPP3 y/o actividad de DPP3 en una muestra de fluido corporal se determina antes del tratamiento del sujeto con un agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo. En una realización de la invención, la cantidad de proteína DPP3 y/o actividad de DPP3 en una muestra de fluido corporal se determina durante el tratamiento del sujeto con un agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo al menos una vez durante el tratamiento, preferentemente en al menos dos veces o preferentemente al menos una vez al día durante el tratamiento. En una realización de la invención, la cantidad de proteína DPP3 y/o actividad de DPP3 en una muestra de fluido corporal se determina después del tratamiento del sujeto con un agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo. En una realización de la invención, la cantidad de proteína DPP3 y/o actividad de DPP3 en una muestra de fluido corporal se determina antes y/o durante y/o después del tratamiento del sujeto con un agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo.
[0176] También se describe en el presente documento un agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho sujeto tiene una cantidad de proteína DPP3 y/o DPP3 actividad en una muestra de fluido corporal que está por encima de un umbral predeterminado, en donde dicha muestra de fluido corporal de dicho sujeto se selecciona de sangre total, plasma sanguíneo y suero sanguíneo.
[0178] También se describe en el presente documento un agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo se administra a dicho sujeto en una formulación farmacéutica.
[0180] La expresión "formulación farmacéutica" significa un ingrediente farmacéutico (activo) en combinación con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
[0182] También se describe en el presente documento un agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo es angiotensina II y dicha formulación farmacéutica es una solución, preferentemente una solución lista para usar. En otra realización objeto de la presente invención es además una formulación farmacéutica de acuerdo con la presente invención en donde dicha formulación farmacéutica está en un estado seco para reconstituirse antes de su uso.
[0183] La formulación farmacéutica como se divulga en el presente documento también puede contener diluyentes, cargas, sales, tampones, estabilizadores, solubilizantes y otros materiales bien conocidos en la técnica. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo no tóxico que puede administrarse a un paciente, junto con una sustancia terapéuticamente eficaz (tal como la angiotensina II) de esta invención, y que no destruye la actividad farmacológica de la sustancia terapéuticamente eficaz. sustancia. La expresión "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente o ingredientes activos.
[0184] Las características del vehículo dependerán de la vía de administración. El término "excipiente" se refiere a un aditivo en una formulación o composición que no es un ingrediente farmacéuticamente activo.
[0185] La expresión "ingrediente (activo) farmacéutico" significa una composición terapéutica que puede combinarse opcionalmente con excipientes farmacéuticamente aceptables para proporcionar una formulación o forma de dosificación farmacéutica.
[0186] Un experto en la materia apreciaría que la elección de cualquier excipiente puede influir en la elección de cualquier otro excipiente. Por ejemplo, la elección de un excipiente particular puede excluir el uso de uno o más excipientes adicionales porque la combinación de excipientes produciría efectos indeseables. Los excipientes de la invención pueden incluir, pero sin limitación, codisolventes, agentes solubilizantes, tampones, agentes de ajuste de pH, agentes de carga, tensioactivos, agentes de encapsulación, agentes de ajuste de tonicidad, agentes estabilizadores, protectores y modificadores de viscosidad.
[0187] En algunos aspectos, puede ser beneficioso incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable en las composiciones como se divulga en el presente documento.
[0188] En algunos aspectos, puede ser beneficioso incluir un agente solubilizante en las composiciones de la invención. Los agentes solubilizantes pueden ser útiles para aumentar la solubilidad de cualquiera de los componentes de la formulación o composición, incluyendo una sustancia terapéuticamente eficaz (por ejemplo, angiotensina II, angiotensina III o angiotensina IV) o un excipiente. Los agentes solubilizantes descritos en el presente documento no pretenden constituir una lista exhaustiva, sino que se proporcionan simplemente como ejemplos de agentes solubilizantes que pueden usarse en las composiciones de la invención. En ciertos aspectos, los agentes solubilizantes incluyen, pero sin limitación, alcohol etílico, alcohol terc-butílico, polietilenglicol, glicerol, metilparabeno, propilparabeno, polietilenglicol, polivinilpirrolidona y cualquier sal farmacéuticamente aceptable y/o combinaciones de los mismos.
[0189] En algunos aspectos, puede ser beneficioso ajustar el pH de las composiciones incluyendo un agente de ajuste de pH en las composiciones de la invención. La modificación del pH de una formulación o composición puede tener efectos beneficiosos sobre, por ejemplo, la estabilidad o solubilidad de una sustancia terapéuticamente eficaz, o puede ser útil para hacer una formulación o composición adecuada para la administración parenteral. Los agentes de ajuste de pH son bien conocidos en la técnica. Por consiguiente, los agentes de ajuste de pH descritos en el presente documento no pretenden constituir una lista exhaustiva, sino que se proporcionan simplemente como agentes de ajuste de pH ilustrativos que pueden usarse en las composiciones de la invención. Los agentes de ajuste de pH pueden incluir, por ejemplo, ácidos y bases. En algunos aspectos, un agente de ajuste de pH incluye, pero sin limitación, ácido acético, ácido clorhídrico, ácido fosfórico, hidróxido de sodio, carbonato de sodio y combinaciones de los mismos.
[0190] El pH de las composiciones como se divulga en el presente documento puede ser cualquier pH que proporcione propiedades deseables para la formulación o composición. Las propiedades deseables pueden incluir, por ejemplo, estabilidad de la sustancia terapéuticamente eficaz (por ejemplo, angiotensina II, angiotensina III o angiotensina IV), retención de sustancia terapéuticamente eficaz aumentada en comparación con composiciones a otros pH y eficacia de filtración mejorada. En algunos aspectos, el pH de las composiciones de la invención puede ser de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 9,0, por ejemplo, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0. En aspectos particulares, el pH de las composiciones de la invención puede ser 5,5±0,1, 5,6±0,1, 5,7±0,1, 5,8±0,1, 5,9±0,1, 6,0+0,1, 6,1±0,1, 6,2±0,1, 6,3:L0.1, 6,4±0,1 o 6,5±0,1.
[0191] En algunos aspectos, puede ser beneficioso tamponar el pH incluyendo uno o más tampones en las composiciones. En ciertos aspectos, un tampón puede tener un pKa de, por ejemplo, aproximadamente 5,5, aproximadamente 6,0 o aproximadamente 6,5. Un experto en la materia apreciaría que se puede elegir un tampón apropiado para su inclusión en las composiciones de la invención basándose en su pKa y otras propiedades.
[0192] Los tampones son bien conocidos en la técnica. Por consiguiente, los tampones descritos en el presente documento no pretenden constituir una lista exhaustiva, sino que se proporcionan simplemente como tampones ilustrativos que pueden usarse en las composiciones de la invención. En ciertos aspectos, una memoria intermedia puede incluir uno o más de lo siguiente: Tris, Tris HCl, fosfato de potasio, fosfato de sodio, citrato de sodio, ascorbato de sodio, combinaciones de fosfato de sodio y potasio, Tris/Tris HCl, bicarbonato de sodio, fosfato de arginina, clorhidrato de arginina, clorhidrato de histidina, cacodilato, succinato, 2-(N- ácido morfolino)etanosulfónico (MES), maleato, bis-tris, fosfato, carbonato y cualquier sal farmacéuticamente aceptable y/o combinaciones de los mismos.
[0193] En algunos aspectos, puede ser beneficioso incluir un tensioactivo en las composiciones de la invención. Los tensioactivos, en general, disminuyen la tensión superficial de una composición líquida. Esto puede proporcionar propiedades beneficiosas tales como un caso mejorado de filtración. Los tensioactivos también pueden actuar como agentes emulsionantes y/o agentes solubilizantes. Los tensioactivos son bien conocidos en la técnica. Por consiguiente, los tensioactivos descritos en el presente documento no pretenden constituir una lista exhaustiva, sino que se proporcionan simplemente como tensioactivos ilustrativos que pueden usarse en las composiciones de la invención. Los tensioactivos que pueden incluirse incluyen, pero sin limitación, ésteres de sorbitán tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbato 20 y polisorbato 80), lipopolisacáridos, polietilenglicoles (por ejemplo, PEG 400 y PEG 3000), poloxámeros (es decir, plurónicos), etileno óxidos y óxidos de polietileno (por ejemplo, Triton X-100), saponinas, fosfolípidos (por ejemplo, lecitina) y combinaciones de los mismos.
[0194] En algunos aspectos, puede ser beneficioso incluir un agente de ajuste de la tonicidad en las composiciones de la invención: La tonicidad de una composición líquida es una consideración importante cuando se administra la composición a un paciente, por ejemplo, mediante administración parenteral. Los agentes de ajuste de la tonicidad, por lo tanto, pueden usarse para ayudar a hacer una formulación o composición adecuada para la administración. Los agentes de ajuste de la tonicidad son bien conocidos en la técnica. Por consiguiente, los agentes de ajuste de la tonicidad descritos en el presente documento no pretenden constituir una lista exhaustiva, sino que se proporcionan simplemente como ejemplos de agentes de ajuste de la tonicidad que pueden usarse en las composiciones de la invención. Los agentes de ajuste de la tonicidad pueden ser iónicos o no iónicos e incluyen, pero sin limitación, sales inorgánicas, aminoácidos, carbohidratos, azúcares, alcoholes de azúcar y carbohidratos. Las sales inorgánicas ilustrativas pueden incluir cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio y sulfato de potasio. Un aminoácido ilustrativo es la glicina. Los azúcares ilustrativos pueden incluir alcoholes de azúcar tales como glicerol, propilenglicol, glucosa, sacarosa, lactosa y manitol.
[0195] En algunos aspectos, puede ser beneficioso incluir un agente estabilizador en las composiciones de la invención. Los agentes estabilizadores ayudan a aumentar la estabilidad de una sustancia terapéuticamente eficaz en las composiciones de la invención. Esto puede ocurrir, por ejemplo, reduciendo la degradación o evitando la agregación de una sustancia terapéuticamente eficaz. Sin desear estar ligado a la teoría, los mecanismos para mejorar la estabilidad pueden incluir el secuestro de la sustancia terapéuticamente eficaz de un disolvente o inhibir la oxidación por radicales libres del compuesto de antraciclina. Los agentes estabilizadores son bien conocidos en la técnica. Por consiguiente, los agentes estabilizantes descritos en el presente documento no pretenden constituir una lista exhaustiva, sino que se proporcionan simplemente como agentes estabilizantes ilustrativos que pueden usarse en las composiciones de la invención. Los agentes estabilizadores pueden incluir, pero sin limitación, emulsionantes y tensioactivos.
[0196] Las composiciones como se divulgan en el presente documento se pueden administrar en una variedad de formas convencionales. En algunos aspectos, las composiciones de la invención son adecuadas para administración parenteral. Estas composiciones pueden administrarse, por ejemplo, por vía intraperitoneal, intravenosa, intrarrenal, intratecal o por inhalación. En algunos aspectos, las composiciones de la invención se inyectan por vía intravenosa. Un experto en la materia apreciaría que un método de administración de una formulación o composición de sustancia terapéuticamente eficaz de la invención dependería de factores tales como la edad, el peso y la condición física del paciente que se está tratando, y la enfermedad o condición que se está tratando. El experto en la materia, por lo tanto, podría seleccionar un método de administración óptimo para un paciente caso por caso.
[0197] El agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo pueden administrarse de cualquier manera adecuada, pero normalmente se administran mediante infusión continua. En consecuencia, aumentar o disminuir una tasa de administración se puede lograr cambiando la tasa de flujo de un goteo intravenoso, cambiando la concentración del agente en un goteo intravenoso, etc. Sin embargo, la manera en que se cambia la tasa de administración dependerá sobre el modo de administración del agente terapéutico. Cuando el agente terapéutico se administra por vía transmucosa o transdérmica, la tasa puede aumentarse cambiando a un parche de tasa de liberación más alta o composición transdérmica, por ejemplo. Cuando el agente terapéutico se administra por vía oral, la tasa puede aumentarse cambiando a una forma de dosis más alta, administrando dosis adicionales o administrando formas de dosificación de liberación controlada con una tasa de liberación más alta, por ejemplo. Cuando el agente terapéutico se administra por inhalación, la velocidad puede aumentarse administrando bolos adicionales, un bolo más concentrado o un bolo de liberación más rápida, por ejemplo. Otros modos de administración (a través de una bomba de inyección subcutánea, supositorio, etc.) se pueden modular de manera análoga, y se puede lograr la disminución de la tasa de administración haciendo lo contrario de una acción que aumentaría la tasa de administración del agente terapéutico.
[0198] También se describe en el presente documento un agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo es la angiotensina II que se administra a una velocidad entre 0,1 y 200 ng/kg/min, preferentemente entre 1 y 100 ng/kg/min, más preferentemente entre 2 y 80 ng/kg/min, incluso más preferentemente entre 5 y 60 ng /kg/min, incluso más preferentemente entre 10 y 50 ng/kg/min, incluso más preferentemente entre 15 y 40 ng/kg/min, lo más preferentemente a una velocidad de 20 ng/kg/min.
[0199] En una realización específica de la presente divulgación, la dosificación inicial (tasa inicial) de angiotensina II es 80 ng/kg/min, más preferentemente 40 ng/kg/min, lo más preferentemente 20 ng/kg/min mediante infusión intravenosa continua.
[0200] En otra realización específica de la invención para la titulación de angiotensina II, se monitoriza la respuesta de la presión sanguínea (por ejemplo, presión arterial media; PAM). La titulación de la angiotensina II puede llevarse a cabo cada 60 minutos, más preferentemente cada 45 minutos, incluso más preferentemente cada 30 minutos, incluso más preferentemente cada 15 minutos, incluso más preferentemente cada 10 minutos, lo más preferentemente cada 5 minutos. La titulación de angiotensina II puede llevarse a cabo mediante incrementos de hasta 40 ng/kg/min, más preferentemente hasta 20 ng/kg/min, lo más preferentemente hasta 15 ng/kg/min según sea necesario para alcanzar o mantener la presión arterial objetivo. En otra realización preferida, la dosificación no debe exceder los 80 ng/kg/min de angiotensina II durante las primeras 3 horas de tratamiento. Lo más preferido es que las dosis de mantenimiento no superen los 40 ng/kg/min y se pueden usar dosis tan bajas como 1,25 ng/kg/min. En algunas realizaciones, el paciente tiene una presión arterial media inicial (MAP) de no más de aproximadamente 40 mm Hg, aproximadamente 45 mm Hg, aproximadamente 50 mm Hg, 55 mm Hg, aproximadamente 60 mm Hg, aproximadamente 65 mm Hg, aproximadamente 70 mm Hg, o aproximadamente 75 mm Hg antes de administrar la composición. El método puede comprender medir una presión sanguínea auricular media del paciente y aumentar la velocidad de administración de angiotensina II si la presión sanguínea arterial media es inferior a aproximadamente 40 mm Hg, aproximadamente 45 mm Hg, aproximadamente 50 mm Hg, 55 mm Hg, aproximadamente 60 mm Hg, aproximadamente 65 mm Hg, aproximadamente 70 mm Hg o aproximadamente 75 mm Hg.
[0201] En una realización, el paciente puede estar recibiendo un vasopresor (por ejemplo, una catecolamina, tal como norepinefrina, un equivalente de norepinefrina, epinefrina, dopamina, fenilefrina) o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el vasopresor es vasopresina (por ejemplo, terlipresina, argipresina, desmopresina, felipresina, lipresina u ornipresina).
[0202] También se describe en el presente documento un agonista del receptor de la angiotensina y/o un precursor del mismo para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho agonista del receptor de la angiotensina y/o un precursor del mismo, en particular Angiotensina II, se administra en combinación con un inhibidor de DPP3.
[0203] También se describe en el presente documento un agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en combinación con un inhibidor de DPP3, en donde dicho inhibidor de DPP3 se selecciona del grupo que comprende un anticuerpo anti-DPP3 o fragmento de anticuerpo anti-DPP3 o armazón no Ig anti-DPP3.
[0204] De acuerdo con la invención, el "anticuerpo anti-DPP3" es un anticuerpo que se une específicamente a DPP3, un "fragmento de anticuerpo anti-DPP3" es un fragmento de dicho anticuerpo anti-DPP3, en donde dicho fragmento se une específicamente a DPP3. Un "armazón anti-DPP3 no Ig" es un armazón no Ig que se une específicamente a DPP3.
[0205] También se describe en el presente documento un agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en combinación con un inhibidor de DPP3, en donde dicho inhibidor de DPP3 es un anticuerpo anti-DPP3 o fragmento de anticuerpo anti-DPP3 o armazón no Ig anti-DPP3 que se une a la SEQ ID NO.1, en particular que se une a la SEQ ID NO.2.
[0206] También se describe en el presente documento un agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en combinación con un inhibidor de DPP3, en donde dicho inhibidor de DPP3 es un anticuerpo o fragmento o armazón que muestra una afinidad de unión mínima a DPP3 igual o menor que 10<7>M.
[0207] De acuerdo con la presente invención, el experto en la materia es muy consciente de que la afinidad de unión del aglutinante de DPP3 divulgado en el presente documento a DPP3 puede medirse mediante diversos ensayos adecuados conocidos en la técnica. Los ejemplos respectivos se proporcionan a continuación, pero estos no deben interpretarse como posibilidades limitantes para medir la afinidad de unión del aglutinante de DPP3 divulgado en el presente documento a DPP3.
[0208] Por ejemplo, puede determinarse la afinidad de unión del aglutinante de DPP3 a un epítopo. Se puede realizar un ensayo de unión para detectar y/o cuantificar la unión de anticuerpos a, por ejemplo, el péptido de inmunización del aglutinante respectivo. Por ejemplo, este péptido de inmunización puede inmovilizarse en una fase sólida. La muestra de prueba (por ejemplo, solución de anticuerpo) se pasa sobre el péptido de inmunización inmóvil y se puede detectar el anticuerpo unido. Para los fines de la presente descripción, el término "fase sólida" puede usarse para incluir cualquier material o recipiente en el que o sobre el que pueda realizarse el ensayo e incluye, pero sin limitación, materiales porosos, materiales no porosos, tubos de ensayo, pocillos, portaobjetos, perlas magnéticas, etc.
[0209] Métodos de detección ilustrativos:
[0210] - Etiquete el anticuerpo antes de entrar en contacto con la fase sólida y detecte la etiqueta respectiva (fluorescencia, quimioluminiscencia, enzimática, etc.).
[0211] - Utilice un anticuerpo secundario marcado contra la parte Fc específica de la muestra-anticuerpo. Incube el anticuerpo unido a la fase sólida con un anticuerpo secundario (por ejemplo, IgG anti humana, IgG anti murina) y detecte la etiqueta respectiva (fluorescencia, quimioluminiscencia, enzimática, etc.).
[0212] - Utilice un anticuerpo marcado como competidor para la unión de fase sólida (por ejemplo, AK1967 marcado). - Cuantificar la afinidad de unión por disminución de la señal.
[0213] Otro método para determinar la afinidad de los anticuerpos a DPP3, la cinética de unión de DPP3 al anticuerpo inmovilizado puede determinarse por medio de resonancia de plasmones de superficie sin etiqueta usando un sistema Biacore 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Alemania). La inmovilización reversible de los anticuerpos se puede realizar usando un anticuerpo anti-Fc de ratón acoplado covalentemente en alta densidad a una superficie de sensor de CMS (kit de captura de anticuerpos de ratón; GE.Healthcare) (Lorenz et al.
[0214] 2011.Antimicrob Agents Chemother.55(1):10-5173).
[0215] También se describe en el presente documento un agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en combinación con un inhibidor de DPP3, en donde dicho inhibidor de DPP3 es un anticuerpo o fragmento o armazón que es monoespecífico, en una realización dicho inhibidor de DPP3 es un anticuerpo o fragmento o armazón que es monoclonal.
[0216] Los anticuerpos o fragmentos monoespecíficos o armazones no Ig de acuerdo con la invención son anticuerpos o fragmentos o armazones no Ig que tienen todos afinidad por el mismo antígeno. Los anticuerpos monoclonales son monoespecíficos, pero los anticuerpos monoespecíficos también pueden producirse por otros medios que no sean producirlos a partir de una célula germinal común.
[0217] En una realización específica, dicho aglutinante de captura que se une a DPP3 de longitud completa inhibe específicamente menos del 50 % de la actividad de DPP3 en un ensayo en fase líquida, preferentemente menos del 40 %, más preferentemente el 30 %. Para la definición de ensayo en fase líquida, véase anteriormente. En una realización específica para evitar la inhibición de DPP3, el aglutinante de captura no debe unirse a DPP3 en el área alrededor del centro activo y la región de unión al sustrato (aminoácidos 316 - 669 de la SEQ ID NO 1).
[0218] También se describe en el presente documento un agonista del receptor de angiotensina y/o un precursor del mismo para su uso en el tratamiento del choque en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en combinación con un inhibidor de DPP3, en donde dicho inhibidor de DPP3 es un anticuerpo o fragmento o armazón que se une a DPP3 de longitud completa e inhibe la actividad de DPP3 de al menos el 10 %, o al menos el 50 %, más preferentemente al menos el 60 %, incluso más preferentemente más del 70 %, incluso más preferentemente más del 80 %, incluso más preferentemente más del 90 %, incluso más preferentemente más del 95 %.
[0219] La inhibición de la actividad de DPP3 en un ensayo en fase líquida por un aglutinante puede determinarse como sigue: Los posibles aglutinantes de captura de DPP3 se incuban con DPP3 nativa recombinante o purificada y sustratos de DPP3 específicos en un ensayo de fase líquida. Preferiblemente, como aglutinante de captura para el ECA se elige el que tiene la menor capacidad inhibidora. El aglutinante de captura debería inhibir la actividad de DPP3 menos del 50 %, preferentemente menos del 40 %, preferentemente menos del 30 %. El ensayo de actividad de DPP3 en fase líquida específica para determinar la capacidad inhibidora de posibles aglutinantes de captura comprende las siguientes etapas:
[0220] · Incubación de 25 ng/ml de DPP3 humana nativa con 5 µg/ml del respectivo aglutinante de captura y control de tampón en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 y ZnCl<2>100 µM durante 1 hora a temperatura ambiente.
[0221] · Adición del sustrato fluorogénico Arg-Arg-•NA (20 µl, 2 mM).
[0222] · Incubación a 37 °C y monitorización de la generación de •NA libre en un fluorómetro de microplacas Twinkle LB 970 (Berthold Technologies GmbH) durante 1 hora. La fluorescencia de •NA se detecta excitando a 340 nm y midiendo la emisión a 410 nm.
[0223] · Se calculan las pendientes (en RFU/min) de fluorescencia creciente de las diferentes muestras. La pendiente de DPP3 humana nativa con control de tampón se designa como 100 % de actividad. La capacidad inhibidora de un posible aglutinante de captura se define como la disminución de la actividad de DPP3 humana nativa mediante la incubación con dicho aglutinante de captura en porcentaje.
[0224] En un ensayo de fase líquida, las muestras de fluidos corporales se someten directamente a sustratos fluorogénicos (por ejemplo, Arg-Arg-•-NA). Dado que hay muchas amino peptidasas diferentes en el plasma (Sanderink et al.
[0225] 1988), es posible que el sustrato usado se escinda por peptidasas distintas de DPP3. Para sortear este problema, un método preferido de detección de actividad de DPP3 específica es el uso de un ensayo de actividad de captura de enzima.
[0226] En una realización específica, la determinación de DPP3 activa en un ensayo de captura enzimática comprende las etapas:
[0227] · Poner en contacto dicha muestra con un aglutinante de captura que se une a DPP3 de longitud completa pero que inhibe preferentemente la actividad de DPP3 en un ensayo en fase líquida en menos del 50 %, preferentemente en menos del 40 %, más preferentemente en el 30 %. Para evitar la inhibición de DPP3, el aglutinante de captura no debe unirse a DPP3 en el área alrededor del centro activo y la región de unión al sustrato (aminoácidos 316 - 669 de SEQ ID NO 1),
[0228] · separar la DPP3 unida a dicho aglutinante de captura de la muestra de fluido corporal,
[0229] · añadir sustrato de DPP3 a dicha DPP3 separada,
[0230] · cuantificar la actividad de DPP3 midiendo la conversión del sustrato de DPP3.
[0231] Un "anticuerpo" de acuerdo con la presente invención es una proteína que incluye uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina que se unen específicamente a un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen kappa, lambda, alfa (IgA), gamma (IgG<1>, IgG<2>, IgG<3>, IgG<4>), delta (IgD), épsilon (IgE) y genes de región constante mu (IgM), así como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras de inmunoglobulina de longitud completa son generalmente de aproximadamente 25 kDa o 214 aminoácidos de longitud.
[0232] Las cadenas pesadas de inmunoglobulina de longitud completa son generalmente de aproximadamente 50 kDa o 446 aminoácidos de longitud. Las cadenas ligeras están codificadas por un gen de región variable en el NH<2>-terminal (aproximadamente 110 aminoácidos de longitud) y un gen de región constante kappa o lambda en el extremo COOH-terminal. Las cadenas pesadas se codifican de manera similar por un gen de región variable (aproximadamente 116 aminoácidos de longitud) y uno de los otros genes de región constante.
[0233] La unidad estructural básica de un anticuerpo es generalmente un tetrámero que consiste en dos pares idénticos de cadenas de inmunoglobulina, teniendo cada par una cadena ligera y una cadena pesada. En cada par, las regiones variables de cadena ligera y pesada se unen a un antígeno, y las regiones constantes median funciones efectoras. Las inmunoglobulinas también existen en una variedad de otras formas que incluyen, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab')<2>, así como anticuerpos híbridos bifuncionales y cadenas sencillas (por ejemplo, Lanzaiveechia et al., Eur. J. Immunol.
[0234] 17:105,1987;Houston y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883,1988;Bird et al,, Science 242:423-426, 1988;Hood et al., Immunology. Benjamin, Nueva York, 2ª ed., 1984;Hunkapiller y Hood, Nature 323:15-161986).Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina incluye una región marco interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR) (véase, Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabat et al., Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., 1983). Como se ha indicado anteriormente, las CDR son principalmente responsables de la unión a un epítopo de un antígeno. Un complejo inmunitario es un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano, o un fragmento de anticuerpo funcional, específicamente unido al antígeno.
[0235] Los "anticuerpos quiméricos" son anticuerpos cuyos genes de cadena ligera y pesada se han construido, habitualmente mediante ingeniería genética, a partir de genes de región variable y constante de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a segmentos constantes humanos, tales como kappa y gamma 1 o gamma 3. En un ejemplo, un anticuerpo quimérico terapéutico es, por lo tanto, una proteína híbrida compuesta por el dominio variable o de unión a antígeno de un anticuerpo de ratón y el dominio constante o efector de un anticuerpo humano, aunque se pueden usar otras especies de mamíferos, o la región variable puede producirse por técnicas moleculares. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son bien conocidos en la técnica,por ejemplo,véase la Patente de Estados Unidos n.º 5.807.715. Una inmunoglobulina "humanizada" es una inmunoglobulina que incluye una región flanqueante humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (tal como una inmunoglobulina de ratón, de rata o sintética). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina "donante" y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se denomina "aceptor".
[0237] En una realización de la invención, todas las CDR son de la inmunoglobulina donante en una inmunoglobulina humanizada. No es necesario que estén presentes regiones constantes, pero si lo están, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de inmunoglobulina humana,es decir,al menos aproximadamente el 85-90 %, tal como aproximadamente el 95 % o más idénticos. Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de las secuencias de inmunoglobulina humana natural.
[0239] Un "anticuerpo humanizado" de acuerdo con la invención es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera humanizada y de cadena pesada humanizada. Un anticuerpo humanizado se une al mismo antígeno que el anticuerpo donante que proporciona las CDR. El marco aceptor de una inmunoglobulina o anticuerpo humanizado puede tener un número limitado de sustituciones por aminoácidos tomados del marco donante. Los anticuerpos humanizados u otros anticuerpos monoclonales tienen sustituciones de aminoácidos conservadoras adicionales que no tienen sustancialmente ningún efecto sobre la unión a antígeno u otras funciones de inmunoglobulina. Ejemplos de sustituciones conservativas son aquellas tales como gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; y phe, tyr. Las inmunoglobulinas humanizadas pueden construirse por medio de ingeniería genética (por ejemplo., véase la Patente de Estados Unidos n.º 5.585.089). Un anticuerpo humano es un anticuerpo en donde los genes de cadena ligera y pesada son de origen humano. Generar anticuerpos humanos usando métodos conocidos en la técnica. Los anticuerpos humanos pueden producirse inmortalizando una célula B humana que secreta el anticuerpo de interés. La inmortalización se puede lograr, por ejemplo, mediante infección por EBV o fusionando una célula B humana con una célula de mieloma o hibridoma para producir una célula de trioma. Los anticuerpos humanos también pueden producirse mediante métodos de expresión en fagos (véase,por ejemplo,Dower et al., Publicación PCT N.º WO 91/17271; McCafferty et al., Publicación PCT N.º WO 92/001047; y Winter, publicación PCT n.º WO 92/20791), o seleccionados de una biblioteca de anticuerpos monoclonales combinatorios humanos (véase el sitio web de Morphosys). Los anticuerpos humanos también se pueden preparar usando animales transgénicos que portan un gen de inmunoglobulina humana (por ejemplo, véase Lonberg et al., Publicación PCT N.º WO 93/12227; y Kucherlapati, Publicación PCT N.º WO 91/10741).
[0241] Por lo tanto, el anticuerpo anti-DPP3 o fragmento de anticuerpo anti-DPP3 de acuerdo con la invención puede tener los formatos conocidos en la técnica. Los ejemplos son anticuerpos humanos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR o fragmentos de anticuerpo de los mismos, pero sin limitación.
[0243] En una realización específica de la invención, el anticuerpo anti-DPP3 es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo. En una realización de la invención, el anticuerpo anti-DPP3 o el fragmento de anticuerpo anti-DPP3 es un anticuerpo humano o humanizado o se deriva del mismo. En una realización específica, se injertan una o más CDR (murinas) en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano.
[0245] En una realización preferida, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención son anticuerpos producidos de forma recombinante comopor ejemplo,IgG, una inmunoglobulina de longitud completa típica o fragmentos de anticuerpo que contienen al menos el dominio variable F de cadena pesada y/o ligera comopor ejemplo,anticuerpos acoplados químicamente (unión de antígeno de fragmento) que incluyen, entre otros, fragmentos Fab que incluyen minicuerpos Fab, anticuerpo Fab de cadena única, anticuerpo Fab monovalente con etiquetas de epítopo,por ejemplo,Fab-V5Sx2; Fab bivalente (mini-anticuerpo) dimerizado con el dominio CH3; Fab bivalente o Fab multivalente,por ejemploformada mediante multimerización con la ayuda de un dominio heterólogo,por ejemploa través de la dimerización de los dominios dHLX,por ejemplo,Fab-dHLX-FSx2; Fragmentos F(ab')2, fragmentos scFv, fragmentos scFv multimerizados multivalentes y/o multiespecíficos, diacuerpos bivalentes y/o biespecíficos, BITE<®>(enganchador de células T biespecífico), anticuerpos trifuncionales, anticuerpos polivalentes,por ejemplode una clase diferente a G; anticuerpos de dominio único,por ejemplo,nanocuerpos derivados de inmunoglobulinas de camélidos o peces y muchos otros.
[0247] Además de los anticuerpos anti-DPP3 o fragmentos de anticuerpo anti-DPP3, otros armazones de biopolímeros, denominados armazones no Ig, son bien conocidos en la técnica para complejar una molécula diana y se han usado para la generación de biopolímeros altamente específicos de diana. Los ejemplos son aptámeros, spiegelmers, anticalinas y conotoxinas.
[0249] Los armazones no Ig con el contexto de la invención pueden ser armazones de proteínas y pueden usarse como imitadores de anticuerpos, ya que son capaces de unirse a ligandos o antígenos. Los armazones no Ig pueden seleccionarse del grupo que comprende armazones no Ig basados en tetranectina (por ejemplo,descrito en US 2010/0028995), armazones de fibronectina (por ejemplo,descrito en el documento EP 1266 025; armazones basados en lipocalina(por ejemplo, descritoen el documento WO 2011/154420); armazones de ubiquitina (por ejemplo,descrito en el documento WO 2011/073214), armazones de transferencia (por ejemplo,descrito en US 2004/0023334), armazones de proteína A(por ejemplo, descritoen EP 2231860), armazones basados en repeticiones de anquirina(por ejemplo, descritoen el documento WO 2010/060748), microproteínas (preferiblemente microproteínas que forman un nudo de cistina) armazones (por ejemplo,descrito en EP 2314308), armazones basados en el dominio Fyn SH3 (por ejemplo,descrito en el documento WO 2011/023685), armazones basados en el dominio EGFR-A (por ejemplo,descrito en el documento WO 2005/040229) y armazones basados en el dominio de Kunitz (por ejemplo, descritoen EP 1941867). Los armazones no Ig pueden ser aptámeros peptídicos u oligonucleotídicos. Los aptámeros generalmente se crean seleccionándolos de un gran conjunto de secuencias aleatorias y son cadenas cortas de oligonucleótidos (ADN, ARN o XNA;Xu et al.2010, Deng et al.2014) o dominios peptídicos variables cortos unidos a un armazón de proteína(Li et al.2011).
[0250] En una realización alternativa, el formato de anticuerpo anti-DPP3 se selecciona del grupo que comprende fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento Fab, fragmento scFab, fragmento F(ab)<2>fragmento y proteína de fusión scFv-Fc. En otra realización preferida, el formato de anticuerpo se selecciona del grupo que comprende fragmento scFab, fragmento Fab, fragmento scFv y conjugados de biodisponibilidad optimizada de los mismos, tales como fragmentos PEGilados.
[0251] Con el contexto de la invención, el término "anticuerpo" generalmente comprende anticuerpos monoclonales y policlonales y fragmentos de unión de los mismos, en particular fragmentos Fc, así como los denominados "anticuerpos de cadena única" (Bird et al. 1988), quiméricos, humanizados, en particular anticuerpos injertados con CDR, y di- o tetracuerpos (Holliger et al.1993). También están comprendidas proteínas de tipo inmunoglobulina que se seleccionan a través de técnicas que incluyen, por ejemplo, expresión en fagos para unirse específicamente a la molécula de interés contenida en una muestra. En este contexto, la expresión "unión específica" se refiere a anticuerpos producidos contra la molécula de interés o un fragmento de la misma. Se considera que un anticuerpo es específico, si su afinidad hacia la molécula de interés o el fragmento de la misma mencionado anteriormente es al menos preferentemente 50 veces mayor, más preferentemente 100 veces mayor, lo más preferentemente al menos 1000 veces mayor que hacia otras moléculas comprendidas en una muestra que contiene la molécula de interés. Es bien conocido en la técnica cómo producir anticuerpos y seleccionar anticuerpos con una especificidad dada.
[0252] En una realización específica de la invención dicho anticuerpo anti-DPP3 o fragmento de anticuerpo anti-DPP3 se une a un epítopo de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, en donde dicho epítopo está comprendido en una proteína DPP3 o derivado funcional de la misma es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo monoclonal del mismo. En una realización de la invención, el anticuerpo anti-DPP3 o el fragmento de anticuerpo anti-DPP3 se une a un epítopo de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, en donde dicho epítopo está comprendido en una proteína DPP3 o derivado funcional de la misma es un anticuerpo humano o humanizado o derivado del mismo o fragmento de anticuerpo humanizado o derivado del mismo.
[0253] En una realización específica, se injertan una o más CDR (murinas) en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano.
[0254] En otro aspecto de la invención, la materia objeto proporcionada es un anticuerpo anti-DPP3 injertado con CDR humano o fragmento de anticuerpo anti-DPP3 del mismo que se dirige y se une a un epítopo de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, en donde dicho epítopo está comprendido en una proteína DPP3 o un derivado funcional de la misma, y en donde dicho anticuerpo anti-DPP3 injertado con CDR humano o fragmento de anticuerpo anti-DPP3 del mismo comprende una región variable de cadena pesada de anticuerpo (cadena H) que comprende:
[0255] SEQ ID NO.: 4
[0256] y/o comprende además una región variable de cadena ligera de anticuerpo (cadena L) que comprende:
[0257] SEQ ID NO.: 5.
[0258] Otra materia objeto de la presente invención en otro aspecto es un anticuerpo anti-DPP3 injertado con CDR humano o fragmento de anticuerpo anti-DPP3 del mismo que se dirige y se une a un epítopo de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, en donde dicho epítopo está comprendido en una proteína DPP3 o un derivado funcional de la misma, y en donde dicho anticuerpo anti-DPP3 injertado con CDR humano o fragmento de anticuerpo anti-DPP3 del mismo comprende una región variable de cadena pesada de anticuerpo (cadena H) que comprende:
[0259] SEQ ID NO.: 11
[0260] y/o comprende además una región variable de cadena ligera de anticuerpo (cadena L) que comprende:
[0261] SEQ ID NO.: 12.
[0262] En una realización específica de la invención, la materia objeto de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humano anti-DPP3 o un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-DPP3 del mismo que se dirige y se une a un epítopo de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, en donde dicho epítopo está comprendido en una proteína DPP3 o un derivado funcional de la misma, y en donde la cadena pesada comprende al menos una CDR de:
[0263] SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO.: 8
[0264] y en donde la cadena ligera comprende al menos una CDR de:
[0265] SEQ ID NO.: 9, KVS o SEQ ID NO.: 10.
[0266] La cantidad de proteína DPP3 y/o actividad de DPP3 en una muestra de fluido corporal de dicho sujeto puede determinarse mediante diferentes métodos, p. ej. inmunoensayos, ensayos de actividad, métodos de espectrometría de masas, etc.
[0267] La cantidad de proteína DPP3 y/o actividad de DPP3 en una muestra de fluido corporal de dicho sujeto puede determinarse, por ejemplo, mediante uno de los siguientes métodos:
[0268] 1. Inmunoensayo de luminiscencia para la cuantificación de las concentraciones de proteína DPP3 (LIA) (Rehfeld et al.2019 JALM 3(6):943-953).
[0269] El LIA es un inmunoensayo de tipo sándwich de quimioluminiscencia de una etapa que utiliza placas de microtitulación de poliestireno blanco de alta unión como fase sólida. Estas placas están recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-DPP3 AK2555 (anticuerpo de captura). El anticuerpo anti-DPP3 trazador AK2553 se marca con MA70-acridinio-NHS-éster y se usa a una concentración de 20 ng por pocillo. Veinte microlitros de muestras (por ejemplo, suero, heparina-plasma, citrato-plasma o EDTA-plasma derivado de la sangre de los pacientes) y calibradores se pipetean en placas de microtitulación blancas recubiertas. Después de añadir el anticuerpo trazador AK2553, las placas de microtitulación se incuban durante 3 h a temperatura ambiente y 600 rpm. A continuación, el trazador no unido se elimina mediante 4 etapas de lavado (350 µL por pocillo). La quimioluminiscencia restante se mide durante 1 s por pocillo usando un luminómetro de placa de microtitulación. La concentración de DPP3 se determina con una curva de calibración de 6 puntos. Los calibradores y las muestras se ejecutan preferentemente por duplicado.
[0270] 2. Ensayo de actividad de captura de enzimas para la cuantificación de la actividad de DPP3 (ECA)(Rehfeld et al.2019 JALM 3(6):943-953).
[0271] El ECA es un ensayo de actividad específico de DPP3 que utiliza placas de microtitulación de poliestireno negro de alta unión como fase sólida. Estas placas están recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-DPP3 AK2555 (anticuerpo de captura). Se pipetean veinte microlitros de muestras (por ejemplo, suero, heparina-plasma, citratoplasma, EDTA-plasma, líquido cefalorraquídeo y orina) y calibradores en placas de microtitulación negras recubiertas. Después de añadir tampón de ensayo (200 µL), las placas de microtitulación se incuban durante 2 h a 22 °C y 600 rpm. La DPP3 presente en las muestras se inmoviliza uniéndose al anticuerpo de captura. Los componentes de la muestra no unidos se eliminan mediante 4 etapas de lavado (350 µL por pocillo). La actividad específica de DPP3 inmovilizada se mide mediante la adición del sustrato fluorogénico, Arg-Arg-•-naftilamida (Arg2-•NA), en tampón de reacción seguido de incubación a 37 °C durante 1 h. DPP3 escinde específicamente Arg2-•NA en dipéptido Arg-Arg y •-naftilamina fluorescente. La fluorescencia se mide con un fluorómetro usando una longitud de onda de excitación de 340 nm y la emisión se detecta a 410 nm. La actividad de DPP3 se determina con una curva de calibración de 6 puntos. Los calibradores y las muestras se ejecutan preferentemente por duplicado.
[0272] 3. Ensayo en fase líquida para la cuantificación de la actividad de DPP3 (LAA) (modificado de Jones et al., Analytical Biochemistry, 1982).
[0273] El LAA es un ensayo en fase líquida que utiliza placas de microtitulación de poliestireno no vinculante negras para medir la actividad de DPP3. Se pipetean veinte microlitros de muestras (por ejemplo, suero, heparina-plasma, citrato-plasma) y calibradores en placas de microtitulación negras no vinculantes. Después de la adición del sustrato fluorogénico, Arg2-•NA, en tampón de ensayo (200 µL), se mide la fluorescencia de •NA inicial (T=0) en un fluorímetro usando una longitud de onda de excitación de 340 nm y se detecta la emisión a 410 nm. A continuación, la placa se incuba a 37 °C durante 1 hora. Se mide la fluorescencia final de (T=60). Se calcula la diferencia entre la fluorescencia final e inicial. La actividad de DPP3 se determina con una curva de calibración de 6 puntos. Los calibradores y las muestras se ejecutan preferentemente por duplicado.
[0274] Se conocen una diversidad de inmunoensayos y pueden usarse para los ensayos y métodos de la presente invención, estos incluyen: radioinmunoensayos ("RIA"), inmunoensayos homogéneos multiplicados por enzimas ("EMIT"), ensayos inmunoadsorbentes ligados a enzimas ("ELISA"), inmunoensayo de reactivación de apoenzimas ("ARIS"), inmunoensayos de quimioluminiscencia y fluorescencia, matrices de perlas basadas en Luminex, ensayos de micromatrices de proteínas y formatos de prueba rápida tales como, por ejemplo, pruebas de tira inmunocromatográfica ("inmunoensayos de tira reactiva") y ensayos de inmunocromatografía.
[0275] En una realización de la invención, un ensayo de este tipo es un inmunoensayo de tipo sándwich que usa cualquier tipo de tecnología de detección que incluye, pero sin limitación, marcador enzimático, marcador de quimioluminiscencia, marcador de electroquimioluminiscencia, preferentemente un ensayo completamente automatizado. En una realización de la invención, un ensayo de este tipo es un ensayo tipo sándwich marcado con enzima. Los ejemplos de ensayo automatizado o completamente automatizado comprenden ensayos que pueden usarse para uno de los siguientes sistemas: Roche Elecsys<®>, Abbott Architect<®>, Siemens Centauer<®>, Brahms Kryptor<®>, Biomerieux Vidas<®>, Alere Triage<®>.
[0276] En una realización de la invención, puede ser una denominada prueba POC (punto de atención), que es una tecnología de prueba que permite realizar la prueba en menos de 1 hora cerca del paciente sin el requisito de un ensayo totalmente automatizado sistema. Un ejemplo de esta tecnología es la tecnología de prueba inmunocromatográfica.
[0277] En una realización específica de la invención, dicha prueba POC combina la medición de más de un analito al mismo tiempo. En otra realización específica de la invención, dicho analito se selecciona del grupo de DPP3 y Proadrenomedulina o fragmentos de los mismos. En una realización muy específica de la invención, dicha prueba de POC combina la medición de DPP3 y ADM madura.
[0278] En una realización de la invención, al menos uno de los aglutinantes está marcado para detectarse.
[0279] En una realización preferida, dicho marcador se selecciona del grupo que comprende marcador quimioluminiscente, marcador enzimático, marcador de fluorescencia, marcador de yodo radioactivo.
[0280] Los ensayos pueden ser ensayos homogéneos o heterogéneos, ensayos competitivos y no competitivos. En una realización, el ensayo tiene la forma de un ensayo de tipo sándwich, que es un inmunoensayo no competitivo, en donde la molécula a detectar y/o cuantificar se une a un primer anticuerpo y a un segundo anticuerpo. El primer anticuerpo puede unirse a una fase sólida,por ejemplouna perla, una superficie de un pocillo u otro recipiente, un chip o una tira, y el segundo anticuerpo es un anticuerpo que está marcado,por ejemplo,con un colorante, con un radioisótopo o un resto reactivo o catalíticamente activo. La cantidad de anticuerpo marcado unido al analito se mide a continuación mediante un método apropiado. La composición general y los procedimientos involucrados con los "ensayos de sándwich" están bien establecidos y son conocidos por el experto en la materia.(The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, Elsevier LID, Oxford: 3ª ed. (mayo de 2005), ISBN-13: 978-0080445267;Hultschig C et al. Curr Opin Chem Biol. febrero de 2006; 10(1:4-10. PMID: 16376134).
[0281] En otra realización, el ensayo comprende dos moléculas de captura, preferentemente anticuerpos que están presentes como dispersiones en una mezcla de reacción líquida, en donde un primer componente de marcado se une a la primera molécula de captura, en donde dicho primer componente de marcado es parte de un sistema de marcado basado en extinción o amplificación de fluorescencia o quimioluminiscencia, y un segundo componente de marcado de dicho sistema de marcado se une a la segunda molécula de captura, de modo que tras la unión de ambas moléculas de captura al analito se genera una señal medible que permite la detección del formado complejos tipo sándwich en la solución que comprende la muestra.
[0282] En otra realización, dicho sistema de marcado comprende criptatos de tierras raras o quelatos de tierras raras en combinación con tinte de fluorescencia o tinte de quimioluminiscencia, en particular un tinte del tipo cianina.
[0283] En el contexto de la presente invención, los ensayos basados en fluorescencia comprenden el uso de colorantes, que pueden seleccionarse, por ejemplo, del grupo que comprende FAM (5-o 6-carboxifluoresceína), VIC, NED, Fluoresceína, Fluoresceinisotiocianato (FITC), IRD-700/800, colorantes de cianina, tales como CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Cy7, xanteno, 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), TET, 6 -Carboxy-4',5'-dicloro-2',7'-dimethodyfluorescein (JOE), N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA), 6-Carboxy-X-rhodamine (ROX), 5-carboxirrodamina-6G (R6G5), 6-carboxirrodamina-6G (RG6), rodamina, verde de rodamina, rojo de rodamina, rodamina 110, colorantes BODIPY, tales como BODIPY TMR, verde de Oregón, cumarinas tales como umbeliferona, bencimidas, tales como Hoechst 33258; Fenantridinas, tales como rojo Texas, amarillo Yakima, Alexa Fluor, PET, bromuro de etidio, colorantes de acridinio, colorantes de carbazol, colorantes de fenoxazina, colorantes de porfirina, colorantes de polimetina y similares.
[0284] En el contexto de la presente invención, los ensayos basados en quimioluminiscencia comprenden el uso de colorantes, basándose en los principios físicos descritos para materiales quimioluminiscentes en(Kirk-Othmer. Encyclopedia of Chemical Technology, 4ª ed., editor ejecutivo, JI Kroschwitz; editor, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993, vol. 15, p. 518-562; incorporado en el presente documento por referencia, incluidas las citas en las páginas 551-562). Los tintes quimioluminiscentes preferidos son los ésteres de acridinio.
[0285] Como se menciona en el presente documento, un "ensayo" o "ensayo de diagnóstico" puede ser de cualquier tipo aplicado en el campo del diagnóstico. Tal ensayo puede basarse en la unión de un analito a detectar a una o más sondas de captura con una cierta afinidad. Con respecto a la interacción entre las moléculas de captura y las moléculas diana o moléculas de interés, la constante de afinidad es preferentemente mayor que 10<8>M<-1>.
[0286] La actividad de DPP3 puede medirse mediante la detección de productos de escisión de sustratos específicos de DPP3. Los sustratos de hormona peptídica conocidos incluyen leu-encefalina, met-encefalina, endomorfina 1 y 2, valorfina, •-casomorfina, dinorfina, proctolina, ACTH (hormona adrenocorticotrópica) y MSH (hormona estimulante de melanocitos:Abramic et al. 2000. Baršun et al. 2007, Dhanda et al. 2008).La escisión de las hormonas peptídicas mencionadas, así como otros oligopéptidos no marcados (por ejemplo, Ala-Ala-Ala-Ala,Dhanda et al.
[0287] 2008)puede monitorizarse mediante la detección de los respectivos productos de escisión. Los métodos de detección incluyen, pero no se limitan a, análisis de HPLC(por ejemplo Lee y Snyder 1982),espectrometría de masas(por ejemplo Abramic et al. 2000), análisis de 1H RMN (por ejemploVandenberg et al. 1985),electroforesis de zona capilar (CE; p. ej.Baršun et al.2007), cromatografía en capa fina (por ejemploDhanda et al. 2008)o cromatografía de fase inversa (por ejemplo,Mazocco et al.2006).
[0288] La detección de fluorescencia debida a la hidrólisis de sustratos fluorogénicos por DPP3 es un procedimiento estándar para monitorizar la actividad de DPP3. Esos sustratos son di- o tripéptidos específicos (Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu-Ala, Leu-Gly, Lys -Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe) acoplados a un fluoróforo. Los fluoróforos incluyen, pero sin limitación, •-naftilamida (2-naftilamida, •NA, 2NA), 4-metoxi-•-naftilamida (4-metoxi-2-naftilamida) y 7-amido-4-metilcumarina (AMC, MCA;Abramic et al.2000, Ohkubo et al. 1999). La escisión de estos sustratos fluorogénicos conduce a la liberación de •-naftilamina fluorescente o 7-amino-4-metilcumarina respectivamente. En un ensayo de fase líquida o un sustrato de ECA y DPP3 se incuban en, por ejemplo, un formato de placa de 96 pocillos y la fluorescencia se mide usando un detector de fluorescencia(Ellis y Nuenke 1967). Adicionalmente, las muestras portadoras de DPP3 pueden inmovilizarse y dividirse en un gel mediante electroforesis, geles teñidos con sustrato fluorogénico (por ejemplo, Arg-Arg-•NA) y Fast Garnet GBC y bandas de proteína fluorescente detectadas por un lector de fluorescencia (Ohkubo et al. 1999).Los mismos péptidos (Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu-Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe) se pueden acoplar a cromóforos, tales como diacetato de p-nitroanilida. La detección del cambio de color debido a la hidrólisis de sustratos cromogénicos puede usarse para monitorizar la actividad de DPP3.
[0289] Otra opción para la detección de actividad de DPP3 es una Protease-Glo<™>Ensayo (disponible comercialmente en Promega). En esta realización de dicho método, los dipéptidos o tripéptidos específicos de DPP3 (Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu-Ala, Leu -Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe) se acoplan a aminoluciferina. Tras la escisión por DPP3, se libera aminoluciferina y sirve como sustrato para una reacción de luciferasa acoplada que emite luminiscencia detectable.
[0290] En una realización preferida, la actividad de DPP3 se mide mediante la adición del sustrato fluorogénico Arg-Arg-•NA y monitorizando la fluorescencia en tiempo real.
[0291] En una realización específica de dicho método para determinar la DPP3 activa en una muestra de fluido corporal de un sujeto, dicho aglutinante de captura reactivo con DPP3 se inmoviliza en una fase sólida.
[0292] La muestra de prueba se pasa sobre el aglutinante inmóvil, y DPP3, si está presente, se une al aglutinante y se inmoviliza para su detección. A continuación, se puede añadir un sustrato y se puede detectar el producto de reacción para indicar la presencia o cantidad de DPP3 en la muestra de prueba. Para los fines de la presente descripción, el término "fase sólida" puede usarse para incluir cualquier material o recipiente en el que o sobre el que pueda realizarse el ensayo e incluye, pero sin limitación: materiales porosos, materiales no porosos, tubos de ensayo, pocillos, portaobjetos, resinas de agarosa (por ejemplo, Sepharose de GE Healthcare Life Sciences), partículas magnéticas (por ejemplo, perlas magnéticas Dynabeads<™>o Pierce<™>de Thermo Fisher Scientific), etc. Los aglutinantes de origen proteico o peptídico (por ejemplo, anticuerpo, fragmentos de anticuerpo, armazón no Ig) se inmovilizan en la fase sólida mediante métodos que comprenden: adsorción física (por ejemplo, mediante interacción electrostática o interacción hidrófoba), inmovilización por bioafinidad (por ejemplo, avidina-biotina, proteína A / G/ L, His-tag y Ni<2+>-NTA, etiqueta GST y glutatión, hibridación de ADN, aptámeros), enlace covalente (por ejemplo, amina y N-hidroxisuccinimida) o una combinación de dichos métodos de inmovilización (Kim y Herr 2013).Los aglutinantes de origen oligonucleotídico (por ejemplo, aptámeros) pueden inmovilizarse en la fase sólida mediante la utilización del sistema de (estrepto)avidina-biotina (Müller et al.2012, Deng et al.2014).
[0293] En una realización específica de dicho método para determinar la actividad de DPP3 en una muestra de fluido corporal de un sujeto, dicha etapa de separación es una etapa de lavado que elimina los ingredientes de la muestra que no están unidos a dicho aglutinante de captura de la DPP3 capturada. Esa etapa de separación puede ser cualquier otra etapa que separe la DPP3 unida a dicho aglutinante de captura de los ingredientes de dicha muestra de fluido corporal.
[0294] En una realización específica de dicho método para determinar la actividad de DPP3 en una muestra de fluido corporal de un sujeto, dicha conversión de sustrato de DPP3 por DPP3 inmovilizada se mide (detecta) mediante un método seleccionado del grupo que comprende: fluorescencia de sustratos fluorogénicos (por ejemplo, Arg-Arg-•NA, Arg-Arg-AMC), cambio de color de sustratos cromogénicos, luminiscencia de sustratos acoplados a aminoluciferina (ensayo Promega Protease-Glo<™>), espectrometría de masas, HPLC/FPLC (cromatografía de fase reversa, cromatografía de exclusión por tamaño), cromatografía de capa fina, electroforesis de zona capilar, electroforesis en gel seguida de tinción de actividad (DPP3 activa inmovilizada) o transferencia de Western (productos de escisión).
[0295] En una realización específica de dicho método para determinar la actividad de DPP3 en una muestra de fluido corporal de un sujeto, dicho sustrato puede seleccionarse del grupo que comprende: Leu-encefalina, Met-encefalina, endomorfina 1 y 2, valorfina, •-casomorfina, dinorfina, proctolina, ACTH y MSH, o di- y tri-péptidos acoplados a un fluoróforo, un cromóforo o aminoluciferina (ensayo Promega Protease-Glo<™>). Los di- o tripéptidos que se escinden por DPP3 incluyen, pero sin limitación, Arg-Arg, Ala-Ala, Ala-Arg, Ala-Phe, Asp-Arg, Gly-Ala, Gly-Arg, Gly-Phe, Leu -Ala, Leu-Gly, Lys-Ala, Phe-Arg, Suc-Ala-Ala-Phe. Los fluoróforos incluyen, pero sin limitación, •-naftilamida (2-naftilamida, •NA, 2NA), 4-metoxi-•-naftilamida (4-metoxi-2-naftilamida) y 7-amido-4-metilcumarina (AMC, MCA; Abramic et al.2000, Ohkubo et al. 1999). La escisión de estos sustratos fluorogénicos conduce a la liberación de •-naftilamina fluorescente o 7-amino-4-metilcumarina respectivamente. Los cromóforos incluyen, pero sin limitación, diacetato de p-nitroanilida (pNA). La hidrólisis de un enlace péptido-pNA en los sustratos cromogénicos da como resultado la liberación de pNA que a su vez cambia de color. Por lo tanto, el cambio en la absorbancia (DA/min) es directamente proporcional a la actividad enzimática. Usando el ensayo Preotease-Glo<™>de Promega, tras la escisión por DPP3, se libera aminoluciferina y sirve como sustrato para una reacción de luciferasa acoplada que emite luminiscencia detectable.
[0296] La materia objeto de la presente invención también es un método para pronosticar un resultado y/o el riesgo de un evento adverso en un sujeto que ha desarrollado un choque refractario, en donde dicho método comprende las etapas:
[0297] · determinar el nivel de DPP3 en una muestra de fluido corporal de dicho sujeto; dicha muestra de fluido corporal se selecciona del grupo de sangre total, plasma y suero;
[0298] · comparar dicho nivel de DPP3 determinado con un umbral predeterminado,
[0299] · correlacionar dicho nivel de DPP3 con dicho riesgo de un evento adverso en dicho sujeto, en donde un nivel elevado por encima de un cierto umbral es predictivo de un riesgo aumentado de dichos eventos adversos o, · correlacionar dicho nivel de DPP3 con el éxito de una terapia o intervención en dicho sujeto, en donde un nivel por debajo de un cierto umbral es predictivo para un éxito de la terapia o intervención.
[0300] En el contexto de la presente invención, el término "pronóstico" indica una predicción de cómo progresará la condición médica de un paciente. Esto puede incluir una estimación de la posibilidad de recuperación o la posibilidad de un evento adverso para dicho paciente. El evento adverso se define como disfunción orgánica o mortalidad. La disfunción orgánica se define como deterioro renal, disfunción cardíaca o disfunción hepática.
[0301] Ejemplos
[0302] Ejemplo 1 - Métodos para la medición de la proteína DPP 3 y la actividad de DPP3
[0303] Generación de anticuerpos y determinación de la capacidad de unión a DPP3: Se produjeron y cribaron varios anticuerpos murinos por su capacidad de unión a DPP3 humana en un ensayo de unión específica (véase la Tabla 1).
[0304] Péptidos/ conjugados para inmunización:
[0305] Se sintetizaron péptidos de DPP3 para inmunización, véase la Tabla 1, (JPT Technologies, Berlín, Alemania) con un residuo de cisteína N-terminal adicional (si no hay cisteína presente dentro de la secuencia de DPP3 seleccionada) para la conjugación de los péptidos a albúmina de suero bovino (BSA). Los péptidos se unieron covalentemente a BSA usando gel de acoplamiento Sulfolink (Perbio-science, Bonn, Alemania). El procedimiento de acoplamiento se realizó de acuerdo con el manual de Perbio. La GST-hDPP3 recombinante fue producida por USBio (United States Biological, Salem, MA, EE. UU.).
[0306] Inmunización de ratones, fusión de células inmunitarias y cribado:
[0307] Ratones Balb/c se inyectaron por vía intraperitoneal (i.p.) con 84 µg de GST-hDPP3 o 100 µg de conjugados de DPP3-péptido-BSA el día 0 (emulsionados en adyuvante de oro TiterMax), 84 µg o 100 µg el día 14 (emulsionados en solución de Freund completa adyuvante) y 42 µg o 50 µg en los días 21 y 28 (en adyuvante de Freund incompleto). En el día 49, el animal recibió una inyección intravenosa (i.v.) de 42 µg de GST-hDPP3 o 50 µg de conjugados de DPP3-péptido-BSA disueltos en solución salina. Tres días después, se sacrificaron los ratones y se realizó la fusión de células inmunitarias.
[0308] Los esplenocitos de los ratones inmunizados y las células de la línea celular de mieloma SP2/0 se fusionaron con 1 ml de polietilenglicol al 50 % durante 30 s a 37 °C. Después del lavado, las células se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Los clones híbridos se seleccionaron cultivando en medio HAT [medio de cultivo RPMI 1640 complementado con suero de ternera fetal al 20 % y suplemento HAT]. Después de una semana, el medio HAT se reemplazó con medio HT durante tres pases seguidos de volver al medio de cultivo celular normal.
[0309] Los sobrenadantes de cultivo celular se examinaron principalmente para detectar anticuerpos IgG de unión a DPP3 recombinante dos semanas después de la fusión. Por lo tanto, se inmovilizó hDPP3 recombinante marcada con GST (USBiologicals, Salem, EE. UU.) en placas de 96 pocillos (100 ng/pocillo) y se incubó con 50 µl de sobrenadante de cultivo celular por pocillo durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar la placa, se añadieron 50 µl/pocillo de IgG anti-ratón de conejo POD y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de una siguiente etapa de lavado, 50 µl de una solución de cromógeno (o-fenilendiamina 3,7 mM en tampón de citrato/fosfato de hidrógeno, 0,012 % de H<2>O<2>) se añadieron a cada pocillo, se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente y la reacción cromogénica se detuvo mediante la adición de 50 µl de ácido sulfúrico 4N. La absorción se detectó a 490 mm.
[0310] Los microcultivos probados positivos se transfirieron a placas de 24 pocillos para su propagación. Después de volver a analizar, los cultivos seleccionados se clonaron y reclonaron usando la técnica de dilución limitante y se determinaron los isotipos.
[0311] Producción de anticuerpos monoclonales de ratón
[0312] Los anticuerpos producidos contra la DPP3 humana o los péptidos DPP3 marcados con GST se produjeron mediante métodos de producción de anticuerpos convencionales (Marx et al. 1997) y se purificó a través de la proteína A. Las purezas de los anticuerpos fueron • 90 % según el análisis de electroforesis en gel de SDS.
[0313] Caracterización de anticuerpos - unión a hDPP3 y/o péptido de inmunización
[0314] Para analizar la capacidad de unión de DPP3/péptido de inmunización por los diferentes anticuerpos y clones de anticuerpos, se realizó un ensayo de unión:
[0315] a) Fase sólida
[0316] La hDPP3 etiquetada con GST recombinante (SEQ ID NO.1) o un péptido de DPP3 (péptido de inmunización, SEQ ID NO.2) se inmovilizó sobre una superficie de placa de microtitulación de alta unión (microplacas de poliestireno de 96 pocillos, Greiner Bio-One international AG, Austria, 1 µg/pocillo en tampón de acoplamiento [50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,8], 1 h a RT). Después de bloquear con albúmina de suero bovino al 5 %, las microplacas se secaron al vacío.
[0317] b) Procedimiento de etiquetado (Trazador)
[0318] 100 µg (100 µl) de los diferentes anticuerpos antiDPP3 (anticuerpo de detección, 1 mg/ml en PBS, pH 7,4) se mezclaron con 10 µl de éster NHS de acridinio (1 mg/ml en acetonitrilo, InVent GmbH, Alemania; EP 0353971) y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. El anticuerpo antiDPP3 marcado se purificó mediante HPLC de filtración en gel en Shodex Protein 5 µm KW-803 (Showa Denko, Japón). El anticuerpo marcado purificado se diluyó en tampón de ensayo (50 mmol/l de fosfato de potasio, 100 mmol/l de NaCl, 10 mmol/l de Na<2>-EDTA, 5 g/l de albúmina de suero bovino, 1 g/l de IgG murina, 1 g/l de IgG bovina, 50 µmol/l de amastatina, 100 µmol/l de leupeptina, pH 7,4). La concentración final fue de aprox. 5-7*10<6>unidades de luz relativas (RLU) del compuesto marcado (aproximadamente 20 ng de anticuerpo marcado) por 200 µl. la quimioluminiscencia del éster de acridinio se midió usando un luminómetro Centro LB 960 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
[0319] c) Ensayo de unión de hDPP3
[0320] Las placas se llenaron con 200 µl de anticuerpo de detección marcado y diluido (trazador) y se incubaron durante 2-4 h a 2-8 °C. El trazador no unido se eliminó lavando 4 veces con 350 µl de solución de lavado (PBS 20 mM, pH 7,4, Triton X-100 al 0,1 %). La quimioluminiscencia bien unida se midió usando el luminómetro Centro LB 960 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
[0321] Caracterización de anticuerpos - análisis de inhibición de hDPP3
[0322] Para analizar la capacidad de inhibición de DPP3 por los diferentes anticuerpos y clones de anticuerpos, se realizó un ensayo de actividad de DPP3 con un procedimiento conocido (Jones et al., 1982). La hDPP3 etiquetada con GST recombinante se diluyó en tampón de ensayo (25 ng/ml de GST-DPP3 en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 y ZnCl<2>100 µM) y 200 µl de esta solución incubada con 10 µg del anticuerpo respectivo a temperatura ambiente. Después de 1 hora de preincubación, se añadió sustrato fluorogénico Arg-Arg-•NA (20 µl, 2 mM) a la solución y se monitorizó la generación de •NA libre a lo largo del tiempo usando el fluorómetro de microplacas Twinkle LB 970 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG) a 37 °C. La fluorescencia de •NA se detecta excitando a 340 nm y midiendo la emisión a 410 nm. Se calculan las pendientes (en RFU/min) de fluorescencia creciente de las diferentes muestras. La pendiente de GST-hDPP3 con control de tampón se designa como 100 % de actividad. La capacidad inhibidora de un posible aglutinante de captura se define como la disminución de la actividad de GST-hDPP3 por incubación con dicho aglutinante de captura en porcentaje.
[0323] La siguiente tabla representa una selección de anticuerpos obtenidos y su tasa de unión en Unidades de Luz Relativas (RLU), así como su capacidad inhibidora relativa (%; tabla 1). Los anticuerpos monoclonales generados contra las regiones de DPP3 representadas a continuación se seleccionaron por su capacidad para unirse a DPP3 recombinante y/o péptido de inmunización, así como por su potencial inhibidor.
[0324] Todos los anticuerpos generados contra la forma de longitud completa etiquetada con GST de hDPP3 recombinante muestran una fuerte unión a hDPP3 etiquetada con GST inmovilizada. También anticuerpos producidos contra la SEQ ID NO.: 2 péptido se unen a GST-hDPP3. La SEQ ID NO: 2 anticuerpos también se unen fuertemente al péptido de inmunización.
[0325] Tabla 1: lista de anticuerpos producidos contra secuencias de longitud completa o de hDPP3 y su capacidad para unirse a hDPP3 (SEQ ID NO.: 1) o péptido de inmunización (SEQ ID NO.: 2) en RLU, así como la inhibición máxima de GST-hDPP3 recombinante.
[0327]
[0329] Recientemente se ha descrito el desarrollo de un inmunoensayo de luminiscencia para la cuantificación de las concentraciones de proteína DPP3 (DPP3-LIA), así como un ensayo de actividad de captura de enzimas para la cuantificación de la actividad de DPP3 (DPP3-ECA) (Rehfeld et al. 2018. JALM. in press),que se incorpora aquí en su totalidad por referencia.
[0330] Ejemplo 2 - DPP3 para pronóstico de mortalidad a corto plazo
[0331] Se determinó la concentración de DPP3 en plasma de pacientes con sepsis/choque séptico y choque cardiogénico y se relacionó con la mortalidad a corto plazo de los pacientes.
[0332] Cohorte de estudio: sepsis/choque séptico
[0333] En 574 muestras de plasma de pacientes del estudio Adrenomedullin and Outcome in Severe Sepsis and Septic Shock (AdrenOSS) se midió la DPP3. AdrenOSS es un estudio prospectivo, observacional y multinacional que incluye 583 pacientes ingresados en la unidad de cuidados intensivos con sepsis o choque séptico (Hollinger et al., 2018).292 pacientes fueron diagnosticados con choque séptico.
[0334] Cohorte de estudio - Choque cardiogénico
[0335] Las muestras de plasma de 108 pacientes que fueron diagnosticados con choque cardiogénico se examinaron para DPP3. Se extrajo sangre dentro de las 6 h posteriores a la detección del choque cardiogénico. La mortalidad se siguió durante 7 días.
[0336] Inmunoensayo de hDPP3:
[0337] Se usó un inmunoensayo (LIA) o un ensayo de actividad (ECA) que detecta la cantidad de DPP3 humana (LIA) o la actividad de DPP3 humana (ECA), respectivamente, para determinar el nivel de DPP3 en el plasma del paciente. La inmovilización, el marcaje y la incubación de anticuerpos se realizaron como se describe en Rehfeld et al. (Rehfeld et al.2018).
[0338] Resultados
[0339] La supervivencia de los pacientes a corto plazo en pacientes con sepsis se relacionó con la concentración plasmática de DPP3 en el momento de la admisión. Los pacientes con una concentración plasmática de DPP3 por encima de 40,5 ng/ml (tercer cuartil) tenían un mayor riesgo de mortalidad en comparación con los pacientes con concentraciones plasmáticas de DPP3 por debajo de este umbral (Figura 1A). La aplicación de este límite a la subcohorte de pacientes con choque séptico reveló un riesgo aún más pronunciado de mortalidad a corto plazo en relación con concentraciones plasmáticas altas de DPP3 (Figura 1B). Cuando se aplica el mismo límite a pacientes con choque cardiogénico, también se observa un mayor riesgo de mortalidad a corto plazo dentro de los 7 días en pacientes con DPP3 alta (Figura 1C).
[0340] Ejemplo 3 - Purificación de DPP3 humana nativa
[0341] Se aplicó lisado de eritrocitos humanos en un total de 100 ml de resina Sepahrose 4B (Sigma-Aldrich) y se recogió el flujo a través. La resina se lavó con un total de 370 ml de tampón PBS, pH 7,4 y la fracción de lavado se combinó con el flujo a través recogido, dando como resultado un volumen total de 2370 ml.
[0342] Para la etapa de purificación por inmunoafinidad, se acoplaron 110 mg de mAb anti-hDPP3 monoclonal AK2552 a 25,5 ml de resina de hidrazida UltraLink (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante (GlycoLink Immobilization Kit, Thermo Fisher Scientific). La eficiencia de acoplamiento fue del 98 %, determinada por la cuantificación del anticuerpo desacoplado mediante la técnica de Bradford. El conjugado de resina-anticuerpo se equilibró con 10 volúmenes de lecho de tampón de unión de lavado (PBS, TritonX-100 al 0,1 %, pH 7,4), combinado con 2370 ml de lisado de glóbulos rojos aclarado y se incubó a 4 °C con agitación continua durante 2 h. En consecuencia, se extendieron 100 ml de la mezcla de incubación en diez columnas de polipropileno de 15 ml y el flujo a través se recogió por centrifugación a 1000xg durante 30 segundos. Esta etapa se repitió varias veces dando como resultado 2,5 ml de resina cargada con DPP3 por columna. Cada columna se lavó 5 veces con 10 ml de tampón de unión de lavado utilizando el enfoque de gravedad-brillo. DPP3 se eluyó colocando cada columna en un tubo falcon de 15 ml que contenía 2 ml de tampón de neutralización (Tris-HCl 1 M, pH 8,0), seguido de la adición de 10 ml de tampón de elución (glicina-HCl 100 mM, TritonX-100 al 0,1 %), pH 3,5) por columna y centrifugación inmediata durante 30 segundos a 1000xg. La etapa de elución se repitió 3 veces en total dando como resultado 360 ml de eluatos combinados. El pH de los eluatos neutralizados fue de 8,0.
[0343] Los eluatos combinados se cargaron en una columna HiTrap Q-sephare HP de 5 ml (GE Healthcare) equilibrada con tampón IEX A1 (glicina 100 mM, Tris 150 mM, pH 8,0) usando la bomba de muestra del sistema Äkta Start (GE Healthcare). Después de cargar la muestra, la columna se lavó con cinco volúmenes de columna de tampón IEX A2 (NaH<2>PO<4>12 mM, pH 7,4) para eliminar la proteína no unida. La elución de DPP3 se logró aplicando un gradiente de cloruro de sodio en 10 volúmenes de columna (50 ml) en un intervalo de NaCl 0 - 1 M usando el tampón B IEX (NaH<2>PO<4>12 mM, NaCl 1 M, pH 7,4). Los eluatos se recogieron en fracciones de 2 ml. Los tampones usados para la cromatografía de intercambio iónico se filtraron de manera estéril usando un filtro de tapa de botella de 0,22 µM. En la tabla 2 se proporciona una tabla de purificación con los respectivos rendimientos y actividades de cada etapa de purificación. La Figura 2 muestra una SDS-PAGE en un gel de gradiente (4-20 %) de hDPP3 nativa purificada a partir de lisado de eritrocitos humanos.
[0344] Tabla 2: Purificación de DPP 3 a artir de eritrocitos humanos
[0346]
[0348] Ejemplo 4 - Efecto de DPP3 nativa en un modelo animal
[0349] El efecto de la inyección de hDPP3 nativa en ratones sanos se estudió monitorizando la fracción de acortamiento y el índice de resistencia renal.
[0350] Se aclimataron ratones Black 6 de tipo salvaje (8-12 semanas, el tamaño del grupo se refiere a la tabla 3) durante 2 semanas y se realizó una ecocardiografía de referencia. Los ratones se asignaron aleatoriamente a uno de los dos grupos y, posteriormente, se inyectó por vía intravenosa proteína DPP3 nativa o PBS a través de una inyección retroorbital con una dosis de 600 µg/kg para la proteína DPP3.
[0351] Después de la inyección de DPP3 o PBS, la función cardíaca se evaluó mediante ecocardiografía (Gao et al.2011)y función renal evaluada por índice de resistencia renal(Lubas et al., 2014, Dewitte et al. 2012)a los 15, 60 y 120 minutos (Figura 3).
[0352] Tabla 3: lista de ru os de ex erimentos
[0355]
[0357] Resultados
[0358] Los ratones tratados con proteína DPP3 nativa muestran una fracción de acortamiento significativamente reducida en comparación con el grupo de control inyectado con PBS (figura 4A). El grupo WT+DPP3 también muestra un empeoramiento de la función renal como se observa por el aumento del índice de resistencia renal (Figura 4B). Ejemplo 5 - Desarrollo de Procizumab
[0359] Los anticuerpos producidos contra SEQ ID NO.2 se caracterizaron con más detalle (mapeo de epítopos, afinidades de unión, especificidad, potencial inhibidor). Aquí los resultados para el clon 1967 de SEQ ID NO.: 2 (AK1967; "Procizumab") se muestran como un ejemplo.
[0360] Determinación del epítopo AK1967 en DPP3:
[0361] Para el mapeo de epítopos de AK1967 se sintetizaron varios péptidos biotinilados N- o C-terminalmente (PE GmbH, Hennigsdorf, Alemania). Estos péptidos incluyen la secuencia del péptido de inmunización completo (SEQ ID NO 2) o fragmentos del mismo, con eliminación por etapas de un aminoácido del extremo C- o N-terminal (véase la tabla 5 para una lista completa de péptidos).
[0362] Se recubrieron placas de 96 pocillos de alta unión con 2 µg de avidina por pocillo (Greiner Bio-One international AG, Austria) en tampón de acoplamiento (Tris-HCl 500 mM, pH 7,8, NaCl 100 mM). Posteriormente, las placas se lavaron y se llenaron con soluciones específicas de péptidos biotinilados (10 ng/pocillo; tampón - 1xPBS con BSA al 0,5 %). El anticuerpo anti-DPP3 AK1967 se marcó con un marcador de quimioluminiscencia de acuerdo con el Ejemplo 1. Las placas se llenaron con 200 µl de anticuerpo de detección marcado y diluido (trazador) y se incubaron durante 4 h a temperatura ambiente. El trazador no unido se eliminó lavando 4 veces con 350 µl de solución de lavado (PBS 20 mM, pH 7,4, Triton X-100 al 0,1 %). La quimioluminiscencia bien unida se midió usando el luminómetro Centro LB 960 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG). La unión de AK1967 a los péptidos respectivos se determina mediante la evaluación de las unidades de luz relativas (RLU). Cualquier péptido que muestre una señal de RLU significativamente más alta que la unión inespecífica de AK1967 se define como aglutinante de AK1967. El análisis combinatorio de péptidos de unión y no unión revela el epítopo DPP3 específico de AK1967.
[0363] Determinación de afinidades de unión usando Octet:
[0364] El experimento se realizó usando Octet Red96 (ForteBio). AK1967 se capturó en biosensores anti-humanFc (AHC) de grado cinético. Los biosensores cargados se sumergieron a continuación en una serie de diluciones de DPP3 humana etiquetada con GST recombinante (100, 33,3, 11,1, 3,7 nM). Se observó asociación durante 120 segundos seguida de 180 segundos de disociación. Los tampones usados para el experimento se representan en la tabla 4. El análisis cinético se realizó usando un modelo de unión 1:1 y un ajuste global.
[0367]
[0369] Análisis de transferencia de Western de la especificidad de unión de AK1967:
[0370] Se lavaron células sanguíneas de sangre humana con EDTA (3x en PBS), se diluyeron en PBS y se lisaron mediante ciclos repetidos de congelación-descongelación. El lisado de células sanguíneas tenía una concentración de proteína total de 250 µg/ml y una concentración de DPP3 de 10 µg/ml. Las diluciones de lisado de células sanguíneas (1:40, 1:80, 1:160 y 1:320) y de His-DPP3 humana recombinante purificada (31,25-500 ng/ml) se sometieron a SDS-PAGE y transferencia de Western. Las transferencias se incubaron en 1.) tampón de bloqueo (1xPBS-T con 5% de leche desnatada en polvo), 2.) solución de anticuerpo primario (AK19671:2.000 en tampón de bloqueo) y 3.) Anticuerpo secundario marcado con HRP (IgG de cabra anti-ratón, 1:1.000 en tampón de bloqueo). El anticuerpo secundario unido se detectó usando el reactivo de detección de transferencia Western Amersham ECL y el Amersham Imager 600 UV (ambos de GE Healthcare).
[0371] Ensayo de inhibición de DPP3:
[0372] Para analizar la capacidad de inhibición de DPP3 por AK1967, un ensayo de actividad de DPP3 con un procedimiento conocido(Jones et al., 1982)se realizó como se describe en el ejemplo 1. La capacidad inhibidora de AK1967 se define como la disminución de la actividad de GST-hDPP3 mediante la incubación con dicho anticuerpo en porcentaje. Las actividades de DPP3 reducidas resultantes se muestran en una curva de inhibición en la Figura 1C.
[0373] Mapeo de epítopos:
[0374] El análisis de los péptidos a los que se une AK1967 y a los que no se une reveló la secuencia de DPP3 INPETG (SEQ ID NO: 3) como epítopo necesario para la unión de AK1967 (véase la tabla 5).
[0377]
[0379] Tabla 5: Péptidos usados para mapeado de epítopos de AK1967
[0380] Afinidad de unión:
[0381] AK1967 se une con una afinidad de 2,2*10<-9>M a GST-hDPP3 recombinante (véanse las curvas cinéticas en la Figura 5).
[0382] Especificidad y potencial inhibitorio;
[0383] La única proteína detectada con AK1967 como anticuerpo primario en lisado de células sanguíneas fue DPP3 a 80 kDa (Figura 6). La concentración de proteína total del lisado fue de 250 µg/ml mientras que la concentración de DPP3 estimada es de aproximadamente 10 µg/ml. Aunque hay 25 veces más proteína inespecífica en el lisado, AK1967 se une y detecta específicamente DPP3 y no tiene lugar ninguna otra unión inespecífica.
[0384] AK1967 inhibe 15 ng/m1 de DPP3 en un ensayo de actividad de DPP3 específico con una CI50 de aproximadamente 15 ng/ml (Figura 7).
[0385] Quimerización/Humanización:
[0386] El anticuerpo monoclonal AK1967 ("Procizumab"), con la capacidad de inhibir la actividad de DPP3 en un 70 %, se eligió como posible anticuerpo terapéutico y también se usó como plantilla para quimerización y humanización. La humanización de anticuerpos murinos puede realizarse de acuerdo con el siguiente procedimiento:
[0387] Para la humanización de un anticuerpo de origen murino, la secuencia de anticuerpo se analiza para la interacción estructural de las regiones marco (FR) con las regiones determinantes complementarias (CDR) y el antígeno. Basándose en el modelado estructural, se selecciona una FR apropiada de origen humano y las secuencias de CDR murinas se trasplantan en la FR humana. Pueden introducirse variaciones en la secuencia de aminoácidos de las CDR o FR para recuperar interacciones estructurales, que fueron abolidas por el cambio de especies para las secuencias de FR. Esta recuperación de interacciones estructurales puede lograrse mediante un enfoque aleatorio utilizando bibliotecas de expresión de fagos o mediante un enfoque dirigido guiado por modelado molecular (Almagro y Fransson, 2008. Humanización de anticuerpos. Front Biosci.13: 1619-33).
[0388] Con el contexto anterior, la región variable puede conectarse a cualquier subclase de regiones constantes (IgG, IgM, IgE. IgA), o solo armazones, fragmentos Fab, Fv, Fab y F(ab)2. En los ejemplos 6 y 7 a continuación, se usó la variante de anticuerpo murino con una estructura principal de IgG2a. Para la quimerización y humanización se usó un esqueleto de IgG1• humana.
[0389] Para la unión de epítopos, solo las CDR son de importancia. Las CDR para la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo anti-DPP3 murino (AK1967) se muestran en la SEQ ID NO 6, la SEQ ID NO 7 y la SEQ ID NO 8 para la cadena pesada y la SEQ ID NO 9, secuencia KVS y SEQ ID NO 10 para la cadena ligera, respectivamente. La secuenciación del anticuerpo anti-DPP3 (AK1967) reveló una región variable de cadena pesada de anticuerpo (cadena H) de acuerdo con SEQ ID NO: 11 y una región variable de cadena ligera de anticuerpo (cadena L) de acuerdo con SEQ ID NO: 12.
[0390] Ejemplo 6 - Efecto de Procizumab en insuficiencia cardíaca inducida por choque séptico
[0391] En este experimento, el efecto de la inyección de Procizumab en ratas con insuficiencia cardíaca inducida por sepsis (Rittirsch et al.2009) se estudió monitorizando la fracción de manteca.
[0392] Modelo de punción de ligadura cecal (CLP) de choque séptico:
[0393] Se asignaron aleatoriamente ratas Wistar macho (2-3 meses, 300 a 400 g, el tamaño del grupo se refiere a la tabla 6) del Centre d'élevage Janvier (Francia) a uno de tres grupos. Todos los animales se anestesiaron usando clorhidrato de ketamina (90 mg/kg) y xilazina (9 mg/kg) por vía intraperitoneal (i.p.). Para la inducción de sepsis polimicrobiana, se realizó CLP usando el protocolo de Rittirsch con modificaciones menores. Se realizó una incisión en la línea media ventral (1,5 cm) para permitir la exteriorización del ciego. A continuación, el ciego se liga justo debajo de la válvula ileocecal y se pincha una vez con una aguja de calibre 18. A continuación, la cavidad abdominal se cierra en dos capas, seguido de reanimación con fluidos (3 ml/100 g de peso corporal de solución salina inyectada por vía subcutánea) y devuelve el animal a su jaula. Los animales simulados se sometieron a cirugía, sin que se les perforara el ciego. Los animales CLP se aleatorizaron entre placebo y anticuerpo terapéutico.
[0394] Diseño del estudio:
[0395] El flujo de estudio se representa en la figura 8. Después de CLP o cirugía simulada, se permitió que los animales descansaran durante 20 horas con libre acceso a agua y comida. Posteriormente se anestesiaron, se realizó una traqueotomía y se colocaron una línea arterial y venosa. A las 24 horas después de la cirugía de CLP, se administró AK1967 o vehículo (solución salina) con 5 mg/kg como una inyección en bolo seguida de una infusión de 3 h con 7,5 mg/kg. Como medida de seguridad, la hemodinámica se monitorizó de forma invasiva y continua desde t = 0 hasta 3 h.
[0396] En t=0 (línea de base) todos los animales CLP están en choque séptico y desarrollaron una disminución en la función cardíaca (presión arterial baja, fracción de acortamiento baja). En este momento, se inyectó Procizumab o vehículo (PBS) (i.v.) y se inició la infusión de solución salina. Había 1 grupo de control y 2 grupos CLP que se resumen en la tabla a continuación (tabla 6). Al final del experimento, se sacrificó a los animales y se recolectaron los órganos para su posterior análisis.
[0397] Tabla 6: lista de ru os ex erimentales
[0400]
[0401] Presión arterial invasiva:
[0402] Las variables hemodinámicas se obtuvieron utilizando el sistema AcqKnowledge (BIOPAC Systems, Inc., EE. UU.). Proporciona un sistema de análisis de presión sanguínea totalmente automatizado. El catéter está conectado al sistema BIOPAC a través de un sensor de presión.
[0403] Para el procedimiento, se anestesiaron ratas (ketamina y xilazina). Los animales se movieron a la almohadilla térmica para la temperatura corporal deseada a 37-37,5 °C. La sonda de retroalimentación de temperatura se insertó en el recto. Las ratas se colocaron en la mesa de operaciones en posición supina. Se abrió la tráquea y se insertó un catéter (16G) para un ventilador externo sin dañar las arterias carótidas y los nervios vagos. El catéter arterial se insertó en la arteria carótida derecha. La arteria carótida se separa del vago antes de la ligadura. Se insertó un catéter venoso central a través de la vena yugular izquierda que permite la administración de PCZ o PBS.
[0404] Después de la cirugía, se permitió que los animales descansaran para la condición estable antes de las mediciones hemodinámicas. A continuación, se registró la presión arterial (PA) de referencia. Durante la recopilación de datos, se detuvo la infusión de solución salina a través de la línea arterial.
[0405] Ecocardiografía:
[0406] Los animales se anestesiaron usando clorhidrato de ketamina. Se afeitó el pecho y las ratas se colocaron en posición de decúbito. Para el examen ecocardiográfico transtorácico (ETT) se usó un sistema comercial de ultrasonido Vivid 7 de GE Healthcare equipado con una sonda lineal de alta frecuencia (14 MHz) y una sonda cardíaca de 10 MHz. Todos los exámenes se registraron digitalmente y se almacenaron para su posterior análisis fuera de línea.
[0407] Las imágenes en escala de grises se registraron a una profundidad de 2 cm. Se iniciaron exámenes bidimensionales en una vista de eje largo paraesternal para medir el diámetro del anillo aórtico y el diámetro de la arteria pulmonar. El modo M también se empleó para medir las dimensiones del ventrículo izquierdo (VI) y evaluar el acortamiento fraccional (FS%). La LVFS se calculó como diámetro telediastólico del VI - diámetro telesistólico del VI / diámetro telediastólico del VI y se expresó en %. Por lo tanto, el tiempo de fin de diástole se definió en el diámetro máximo del VI. Por consiguiente, la sístole final se definió como el diámetro mínimo en el mismo ciclo cardíaco. Todos los parámetros se midieron manualmente. Se promediaron tres ciclos cardíacos para cada medición.
[0408] Desde la misma vista de eje largo paraesternal, se registró el flujo de la arteria pulmonar usando Doppler de onda pulsada. Se midió la integral de tiempo de velocidad del flujo de salida de la arteria pulmonar.
[0409] Desde una vista apical de cinco cámaras, se registró el flujo mitral usando Doppler pulsado al nivel de la punta de las válvulas mitrales.
[0410] Resultados:
[0411] Las ratas con insuficiencia cardíaca inducida por choque séptico tratadas con PBS (CLP+PBS) muestran una fracción de acortamiento reducida en comparación con los animales simulados (figura 9A). El grupo CLP+PBS también muestra una alta tasa de mortalidad (figura 9B). En contraste, la aplicación de Procizumab a ratas con insuficiencia cardíaca inducida por sep mejora la fracción de acortamiento (figura 9A) y reduce drásticamente la tasa de mortalidad (figura 9B).
[0412] Ejemplo 7 - Efecto de Procizumab sobre la función cardíaca y renal
[0413] El efecto de Procizumab en la insuficiencia cardíaca inducida por isoproterenol en ratones se estudió monitorizando la fracción de acortamiento y el índice de resistencia renal.
[0414] Estrés cardíaco inducido por isoproterenol en ratones:
[0415] Se indujo insuficiencia cardíaca aguda en ratones macho a los 3 meses de edad mediante dos inyecciones subcutáneas diarias de 300 mg/kg de isoproterenol, un agonista •-adrenérgico no selectivo (clorhidrato de DL-Isoproterenol, Sigma Chemical Co) (ISO) durante dos días (Vergara et al, 2016). La dilución ISO se realizó en NaCl al 0,9%. Los ratones tratados con ISO se asignaron aleatoriamente a dos grupos (Tabla 7) y se inyectaron PBS o Procizumab (10 mg/kg) por vía intravenosa después de la ecocardiografía de referencia (Gao et al., 2011) y mediciones del índice de resistencia renal(Lubas et al., 2014. Dewitte et al, 2012) se realizaron el día 3 (Figura 10 A y B).
[0416] La función cardíaca se evaluó mediante ecocardiografía (Gao et al., 2011) y mediante el índice de resistencia renal (Lubas et al., 2014; Dewitte et al, 2012)a 1 hora, 6 horas y 24 horas (Figura 10 A y B). El grupo de ratones que se inyectó con vehículo (PBS) en lugar de isoproterenol no se sometió a ningún tratamiento farmacológico adicional y sirvió como grupo de control (Tabla 7).
[0417] Tabla 7: lista de ru os ex erimentales
[0420]
[0422] Resultados:
[0423] La aplicación de Procizumab a ratones con insuficiencia cardíaca inducida por isoproterenol restaura la función cardíaca dentro de la primera hora después de la administración (figura 11A). La función renal de los ratones enfermos muestra una mejora significativa a las 6 horas después de la inyección de procizumab y es comparable a la función renal de los animales simulados a las 24 horas (figura 11B).
[0424] Ejemplo 8 - DPP3 indica necesidad de vasopresor y respuesta a terapia vasopresora
[0425] Las concentraciones de DPP3 en plasma de pacientes con choque séptico se determinaron usando un inmunoensayo de hDPP3 y se relacionaron con la necesidad de terapia vasopresora.
[0426] Cohorte de estudio: choque séptico
[0427] Las muestras de plasma de 292 pacientes que fueron diagnosticados con choque séptico del estudio AdrenOSS (véase el ejemplo 2) se examinaron para DPP3. La DPP3 humana se midió como se describe en el Ejemplo 1. Resultados
[0428] Los pacientes con una necesidad aumentada de administración de vasopresores durante más de 5 días tenían concentraciones plasmáticas altas de DPP3 (Figura 12A). En contraste, los pacientes que respondieron a la administración de vasopresores y en los que la administración de vasopresores pudo interrumpirse dentro de los primeros 5 días, tenían concentraciones de DPP3 en plasma significativamente reducidas (Figura 12B). Esto indica que el desarrollo de choque refractario y, por lo tanto, una mayor necesidad de administración de vasopresores debido a una respuesta disminuida de esta terapia, está relacionado con altas concentraciones plasmáticas de DPP3 en pacientes con choque séptico.
[0429] Los pacientes con choque séptico refractario resistente a vasopresores (noradrenalina >0,5 µg/kg/min) muestran concentraciones de DPP3 en plasma significativamente más altas que en comparación con pacientes que requirieron dosis de noradrenalina de <0,5 µg/kg/min (p<0,001) (Figura 16A). Además, la concentración plasmática de DPP3 se asoció fuertemente con la mortalidad en pacientes con choque séptico refractario resistente a vasopresores (Figura 16B).
[0430] Ejemplo 9 - DPP3 está relacionado con choque refractario
[0431] Las concentraciones de DPP3 en plasma de pacientes con choque cardiogénico se determinaron usando un inmunoensayo de hDPP3 y se relacionaron con el desarrollo de choque refractario.
[0432] Cohorte de estudio - Choque cardiogénico
[0433] Las muestras de plasma de 57 pacientes que fueron diagnosticados con choque cardiogénico después de un infarto agudo de miocardio se examinaron para DPP3. La DPP3 humana se midió como se describe en el Ejemplo 1.
[0434] Resultados
[0435] Los pacientes con una concentración plasmática de DPP3 por encima de un cierto umbral al ingreso (59,1 ng/ml; 3<er>cuartil) desarrollaron choque refractario en mayor medida (47 %) que los pacientes con concentraciones plasmáticas de DPP3 por debajo de 59,1 ng/ml (12 %) (Figura 13).
[0436] Ejemplo 10 - DPP3 y bio-ADM indican mortalidad a corto plazo en estado de choque
[0437] Las concentraciones de DPP3 y bio-ADM en plasma de pacientes con choque séptico se determinaron usando un inmunoensayo de hDPP3 y bio-ADM y se relacionaron con la mortalidad a corto plazo de los pacientes.
[0438] Cohorte de estudio: choque séptico
[0439] Las muestras de plasma de 292 pacientes que fueron diagnosticados con choque séptico del estudio AdrenOSS se examinaron para DPP3 y bio-ADM. La DPP3 humana se midió como se describe en el Ejemplo 1. Bio-ADM se midió como se describe en Weber et al. (Weber et al.2017. JALM 2(2): 1-4).
[0440] Resultados
[0441] Las concentraciones plasmáticas de bio-ADM y DPP3 se midieron en pacientes con choque séptico. Los pacientes se agruparon de acuerdo con límites específicos determinados como los 3<er>cuartil de todas las concentraciones plasmáticas medidas del marcador respectivo (Tabla 8). Un número igual de pacientes tenía solo DPP3 alta o solo bio-ADM alta (15,4 %), mientras que un menor grado mostró concentraciones plasmáticas elevadas tanto en bio-ADM como en DPP3 (9,6 %).
[0442] Tabla 8: Números de pacientes con DPP3 baja/alta y bio-ADM baja/alta. Los puntos de corte se asignaron basándose en el Q3 el 25 % más alto ara ambos.
[0445]
[0447] La mortalidad dentro de las primeras 4 semanas después de la admisión se relacionó con la concentración de bio-ADM y DPP3 en la admisión. Los pacientes con solo una bio-ADM alta o solo una concentración plasmática alta de DPP3 tenían un riesgo sustancialmente mayor de morir dentro de las primeras 4 semanas en comparación con los pacientes que tenían una concentración plasmática de bio-ADM (Figura 14A) o DPP3 (Figura 14B) por debajo de un cierto umbral (3<rd>cuartil). La supervivencia en pacientes con bio-ADM alta fue mejor que la supervivencia en pacientes con DPP3 alta.
[0448] Cuando se combinaron ambos marcadores, bio-ADM y DPP3, se identificó un riesgo incluso mayor de mortalidad a corto plazo en comparación con la mortalidad que estaba relacionada con un aumento de uno de ambos marcadores únicamente (Figura 14C). Apenas el 28,6 % de los pacientes con concentraciones plasmáticas altas de bio-ADM y altas de DPP3 sobrevivieron las primeras 4 semanas después de la admisión.
[0449] Ejemplo 11 - DPP3 y bio-ADM DPP3 indican necesidad de vasopresor y respuesta a terapia vasopresora
[0450] Las concentraciones de DPP3 y bio-ADM en plasma de pacientes con choque séptico se determinaron usando un inmunoensayo de hDPP3 y bio-ADM y se relacionaron con la necesidad de terapia vasopresora.
[0451] Cohorte de estudio: choque séptico
[0452] En 292 muestras de plasma de pacientes que fueron diagnosticados con choque séptico del estudio AdrenOSS se midieron las concentraciones de DPP3 y bio-ADM. La DPP3 humana se midió como se describe en el Ejemplo 1. Bio-ADM se midió como se describe en Weber et al.(Weber et al.2017. JALM 2(2): 1-4).
[0453] Resultados
[0454] Las concentraciones plasmáticas de bio-ADM y DPP3 se midieron en pacientes con choque séptico. Los pacientes se agruparon de acuerdo con puntos de corte específicos determinados como los 3<er>cuartil de todas las concentraciones plasmáticas medidas del marcador respectivo en la cohorte de choque séptico (DPP3 baja < 48,4 ng/mL, bio-ADM baja < 213 pg/mL; bio-ADM alta • 213 pg/mL; DPP3 alta • 48,4 ng/ ml). Los pacientes con DPP3 alta, pero concentraciones plasmáticas de bio-ADM bajas tenían una mayor necesidad de administración de vasopresores consecutiva en comparación con pacientes con DPP3 baja bio-ADM baja o DPP3 baja bio-ADM alta (Figura 15; Tabla 9). Por el contrario, los pacientes que tenían DPP3 baja y concentraciones plasmáticas de bio-ADM bajas, o pacientes que tenían DPP3 baja, pero concentraciones plasmáticas de bio-ADM altas al ingreso podrían interrumpir la administración de vasopresores antes que los pacientes con concentraciones plasmáticas de DPP3 altas al ingreso (Figura 15; Tabla 9). Esto indica que la terapia vasopresora en pacientes con choque séptico con bio-ADM alta puede interrumpirse antes debido a una mejor respuesta terapéutica en comparación con pacientes con choque séptico con DPP3 alta. Estos pacientes (alta DPP3) necesitan un tratamiento más prolongado con vasopresores debido a la falta de respuesta.
[0455] Tabla 9: Los pacientes con vasopresor necesitan agruparse de acuerdo con su concentración plasmática de DPP3 y bio-ADM en el momento de la admisión. Los puntos de corte se asignaron basándose en el Q3 (el 25 % más alto de los valores determinados) para ambos; DPP3 baja < 48,4 ng/mL, bio-ADM baja < 213 pg/mL; alto bio-ADM • 213
[0456] /mL alta DPP3 • 484 n /mL 7: •7 días con vaso resor o muerto dentro de los 7 días.
[0458]
[0459] continuación
[0461]
[0463] EJEMPLOS DE SECUENCIASSEQ ID NO 1 - hDPP3 aa 1-737
[0466]
[0468] SEQ ID NO 2 - hDPP3 aa 474-493 (N-Cys) - péptido de inmunización con cisteína N-terminal adicional CETVINPETGEQIQSWYRSGE SEQ ID NO 3 - hDPP3 aa 477-482 - epítopo de AK1967
[0469] INPETG SEQ ID NO 4 - región variable de AK1967 murino en cadena pesada
[0472]
[0474] SEQ ID NO 5 - región variable de AK1967 murino en cadena ligera
[0477]
[0479] SEQ ID NO 6 - CDR1 de AK1967 murino en cadena pesada
[0480] GFSLSTSGMS SEQ ID NO 7 - CDR2 de AK1967 murino en cadena pesada
[0481] IWWNDNK SEQ ID NO 8 - CDR 3 de AK1967 murino en cadena pesada
[0482] ARNYSYDY SEQ ID NO 9 - CDR1 de AK1967 murino en cadena ligera
[0483] RSLVHSIGSTY CDR2 de AK1967 murino en cadena ligera
[0484] KVS
[0485] SEQ ID NO 10 - CDR3 de AK1967 murino en cadena ligera
[0486] SQSTHVPWT SEQ ID NO 11 - AK1967 humanizado - secuencia de cadena pesada (esqueleto de IgG1•)
[0489]
[0491] SEQ ID NO 12 - AK1967 humanizado - secuencia de cadena ligera (esqueleto de IgG1•)
[0494]
[0496] SEQ ID NO 13 - Angiotensina II (sinónimo: 5-isoleucina-angiotensina II)
[0497] DRVYIHPF SEQ ID NO 14 - Análogo de angiotensina II (5-valina-angiotensina II)
[0498] DRVYVHPF SEQ ID NO 15 - Análogo de angiotensina II (Asn<1>-Phe<4>)
[0499] NRVFIHPF SEQ ID NO 16 - Hexapéptido de angiotensina II
[0500] VYIHPF SEQ ID NO 17 - Nonapéptido de angiotensina II
[0501] NRVYYVHPF SEQ ID NO 18 - Análogo de angiotensina II ([Asn<1>-Ile<5>-Ile<8>]-angiotensina II)
[0502] NRVYIHPI SEQ ID NO 19 - Análogo de angiotensina II ([Asn<1>-Ile<s>-Ala<8>]-angiotensina II)
[0503] NRVYIHPA SEQ ID NO 20 - Análogo de angiotensina II ([Asn<1>-diyodoTyr<4>-Ile<5>]-angiotensina II
[0504] NRVYIHPF SEQ ID NO 21 - Angiotensina III
[0505] RVYIHPF SEQ ID NO 22 - Análogo de angiotensina III (Val<4>-angiotensina III)
[0506] RVYVHPF
[0507] SEQ ID NO 23 - Análogo de angiotensina III (Phe<3>-angiotensina III)
[0508] RVFIHPF SEQ ID NO 24 - Análogo de angiotensina III ([Ile<4>-Ala<7>]-angiotensina III)
[0509] RVYIHPA SEQ ID NO 25 - Análogo de angiotensina III (diyodoTyr<3>-Ile<4>]-angiotensina III)
[0510] RVYIHPF SEQ ID NO 26 - Angiotensina IV
[0511] VYIHPF SEQ ID NO 27 - Análogo de angiotensina IV (Val<3>-angiotensina IV)
[0512] VYVHPF SEQ ID NO 28 - Angiotensina IV análogo (Phe<2>-angiotensina IV)
[0513] VFIHPF SEQ ID NO 29 - Análogo de angiotensina IV ([Ile<3>-Ala<6>]-angiotensina IV)
[0514] VYIHPA SEQ ID NO 30 - Angiotensina IV análogo ([diyodoTyr<2>-Ile<3>-angiotensina IV)
[0515] VYIHPF SEQ ID NO 31 (proADM): 164 aminoácidos (22 - 185 de preproADM)
[0518]
[0520] SEQ ID NO 32 (péptido terminal N-20 de proadrenomedulina, PAMP): aminoácidos 22 - 41 de preproADM ARLDVASEF RKKWNKWALS R SEQ ID NO 33 (proadrenomedulina regional media, MR-proADM): aminoácidos 45 - 92 de preproADM ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV SEQ ID NO 34 (adrenomedulina madura (ADM madura); ADM amidada; bio-ADM; hADM): aminoácidos 95 - 146 - CONH<2>
[0523]
[0525] SEQ ID NO 35 (Adrenomedulina 1-52-Gly (ADM 1-52-Gly)): aminoácidos 95 - 147 de preproADM
[0526] YRQSMN NFQGIRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYG SEQ ID NO 36 (proadrenomedulina C-terminal, CT-proADlVI): aminoácidos 148 - 185 de preproADM
[0527] RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL SEQ ID NO 37 (parte N-terminal de ADM madura): aminoácidos 1-21 de ADM madura YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC SEQ ID NO 38 (anticuerpo anti-ADM de cadena pesada de CDR1)
[0528] GYTFSRYW SEQ ID NO 39 (anticuerpo anti-ADM de cadena pesada de CDR2)
[0529] ILPGSGST SEQ ID NO 40 (anticuerpo anti-ADM de cadena pesada de CDR3)
[0530] TEGYEYDGFDY SEQ ID NO 41 (anticuerpo anti-ADM de cadena ligera de CDR1)
[0531] QSIVYSNGNTY
[0532] SEQ ID NO 42 (anticuerpo anti-ADM de cadena ligera de CDR3)
[0533] FQGSHIPYT SEQ ID NO 43 (cadena pesada de anticuerpo anti-ADM (Adrecizumab))
[0536]
[0538] SEQ ID NO: 44 (cadena ligera de anticuerpo anti-ADM (Adrecizumab))
[0541]
[0543] Descripción de la figuras
[0544] Figura 1: Gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier en relación con concentraciones bajas (< 40,5 ng/ml) y altas (• 40,5 ng/ml) de DPP3. (A) Supervivencia de 7 días de pacientes con sepsis en relación con la concentración plasmática de DPP3; (B) Supervivencia de 7 días de pacientes con choque cardiogénico en relación con la concentración plasmática de DPP3; (C) Supervivencia de 7 días de pacientes con choque séptico en relación con la concentración plasmática de DPP3.
[0545] Figura 2: SDS-PAGE en un gel de gradiente (4-20 %) de hDPP3 nativa purificada a partir de lisado de eritrocitos humanos. El marcador de peso molecular se indica como flechas.
[0546] Figura 3: Diseño experimental - Efecto de DPP3 nativo en un modelo animal.
[0547] Figura 4: (A) La inyección de DPP3 provoca una reducción de la fracción de acortamiento y, por lo tanto, conduce a un deterioro de la función cardíaca. (B) También se observa una función renal disminuida a través de un índice de resistencia renal aumentado.
[0548] Figura 5: Curva de asociación y disociación del análisis de unión de AK1967-DPP3 usando Octet. Los biosensores cargados con AK1967 se sumergieron en una serie de diluciones de DPP3 humana etiquetada con GST recombinante (100, 33,3, 11,1, 3,7 nM) y se monitorizó la asociación y disociación.
[0549] Figura 6: Western Blot de diluciones de lisado de células sanguíneas y detección de DPP3 con AK1967 como anticuerpo primario.
[0550] Figura 7: Curva de inhibición de DPP3 nativa de células sanguíneas con anticuerpo inhibidor AK1967. La inhibición de DPP3 por un anticuerpo específico depende de la concentración, con un CI<50>a ~15 ng/ml cuando se analiza frente a 15 ng/ml de DPP3.
[0551] Figura 8: Configuración experimental: efecto de Procizumab en la insuficiencia cardíaca inducida por sepsis. Figura 9: Procizumab mejora drásticamente la fracción de acortamiento (A) y la tasa de mortalidad (B) en ratas con insuficiencia cardíaca inducida por sepsis.
[0552] Figura 10: Diseño experimental: estrés cardíaco inducido por isoproterenol en ratones seguido de tratamiento con procizumab (B) y control (A).
[0553] Figura 11: Procizumab mejoró la fracción de acortamiento (A) y redujo el índice de resistencia renal (B) dentro de 1 hora y 6 horas después de la administración, respectivamente, en ratones con insuficiencia cardíaca inducida por isoproterenol.
[0555] Figura 12: (A) Días con necesidad de terapia vasopresora en pacientes con choque séptico en relación con las concentraciones plasmáticas de DPP3. •7 días con vasopresor o muerto dentro de los 7 días; * p<0,05 en la comparación post hoc frente a los grupos 1-4 (B) Necesidad de terapia vasopresora en pacientes con choque séptico en relación con las concentraciones plasmáticas de DPP3. Los pacientes con terapia vasopresora durante un máximo de 5 días (•5) y los pacientes con terapia vasopresora de más de 5 días o que fallecieron dentro de los 7 días se agruparon juntos (>5).
[0557] Figura 13: DPP3 está relacionado con el choque refractario. Las concentraciones altas de DPP3 en plasma de pacientes con choque cardiogénico están relacionadas con un mayor riesgo de desarrollar choque cardiogénico refractario en comparación con pacientes que tienen concentraciones plasmáticas de DPP3 por debajo de un cierto umbral.
[0559] Figura 14: La supervivencia de Kaplan-Meier traza (A) la supervivencia de 4 semanas de pacientes con choque séptico en relación con la concentración plasmática de bio-ADM; los valores se agrupan en cuartiles (B) supervivencia de 4 semanas de pacientes con choque séptico en relación con la concentración plasmática de DPP3; los valores se agrupan en cuartiles (C) de supervivencia a las 4 semanas de pacientes con choque séptico en relación con la concentración plasmática de bio-ADM y DPP3; Los cortes se determinaron basándose en 3<er>cuartil de todas las concentraciones plasmáticas medidas del marcador respectivo: ambas DPP3 baja < 48,4 ng/ml, bio-ADM < 213 pg/ml; bio-ADM alta • 213 pg/mL; DPP3 alto • 48,4 ng/mL.
[0561] Figura 15: Los pacientes con vasopresor necesitan agruparse de acuerdo con su concentración plasmática de DPP3 y bio-ADM al ingreso. Las proporciones de pacientes que reciben vasopresores durante 1-7 días se muestran en escala de grises; los colores más claros representan una duración de tratamiento más larga. Los puntos de corte se asignaron basándose en el Q3 (el 25 % más alto de los valores determinados) para ambos; DPP3 baja < 48,4 ng/mL, bio-ADM baja < 213 pg/mL; alto bio-ADM • 213 pg/mL; alta DPP3 • 48,4 ng/mL; 7: •7 días con vasopresor o muerto dentro de los 7 días.
[0563] Figura 16: (A) Concentración de DPP3 en plasma en pacientes con choque séptico refractario que necesitan el vasopresor noradrenalina por debajo (n=186) y por encima (n=95) de 0,5 µg/kg/min (p<0,001). (B) Gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier (A) supervivencia de 4 semanas de pacientes con choque refractario séptico en relación con la concentración plasmática de DPP3; los valores se agrupan en cuartiles.
[0565] Referencias
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Claims (10)

1. REIVINDICACIONES
1. Un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque, en donde dicho método comprende las etapas de:
• determinar el nivel de DPP3 en una muestra de fluido corporal de dicho sujeto; dicha muestra de fluido corporal se selecciona del grupo de sangre total, plasma y suero;
• comparar dicho nivel de DPP3 determinado con un umbral predeterminado,
en donde se predice que dicho sujeto sufrirá un choque refractario o se diagnostica que tiene un choque refractario si dicho nivel determinado de DPP3 está por encima de dicho umbral predeterminado.
2. Un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho choque se selecciona del grupo que comprende choque debido a hipovolemia, choque cardiogénico, choque obstructivo y choque distributivo, en particular, choque cardiogénico o choque séptico.
3. Un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho choque es un choque resistente a vasopresores.
4. Un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en donde
• en caso de choque cardiogénico, dicho sujeto puede haber sufrido un síndrome coronario agudo (por ejemplo, infarto agudo de miocardio) o en donde dicho sujeto tiene insuficiencia cardíaca (por ejemplo, insuficiencia cardíaca aguda descompensada), miocarditis, arritmia, miocardiopatía, enfermedad cardíaca valvular, disección aórtica con estenosis aórtica aguda, ruptura cordal traumática o embolia pulmonar masiva, o
• en caso de choque hipovolémico, dicho sujeto puede haber sufrido una enfermedad hemorrágica, incluyendo sangrado gastrointestinal, traumatismo, etiologías vasculares (por ejemplo, aneurisma aórtico abdominal roto, tumor que erosiona un vaso sanguíneo principal) y sangrado espontáneo en el contexto del uso de anticoagulantes o una enfermedad no hemorrágica que incluye vómitos, diarrea, pérdida renal, pérdidas cutáneas/pérdidas insensibles (por ejemplo, quemaduras, golpe de calor) o pérdida hacia el tercer espacio en el contexto de pancreatitis, cirrosis, obstrucción intestinal, traumatismo, o
• en caso de choque obstructivo, dicho paciente puede haber sufrido un taponamiento cardíaco, neumotórax a tensión, embolia pulmonar o estenosis aórtica, o
• en caso de choque distributivo, dicho paciente puede tener choque séptico, choque neurogénico, choque anafiláctico o choque debido a una crisis suprarrenal.
5. Un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho método se usa para la iniciación y/o terminación y/o estratificación y/o guía de tratamiento.
6. Un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde un tratamiento con agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 se inicia y/o continúa cuando el nivel de DPP3 en dicha muestra está por encima de un cierto umbral y/o en donde un tratamiento con vasopresores se retiene y/o termina si dicho nivel determinado de DPP3 está por encima de dicho umbral predeterminado o en donde un tratamiento con vasopresores se inicia y/o continúa cuando el nivel de DPP3 en dicha muestra está por debajo de un cierto umbral y/o en donde un tratamiento con agonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 se retiene y/o termina si dicho nivel determinado de DPP3 está por debajo de dicho umbral predeterminado.
7. Un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde se determina el nivel de proteína DPP3 y/o el nivel de DPP3 activa y se compara con un umbral predeterminado, en donde el nivel de DPP3 se determina poniendo en contacto dicha muestra de fluido corporal con un aglutinante de captura que se une específicamente a DPP3.
8. Un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en donde además se determina el nivel de proadrenomedulina o fragmentos de la misma y en donde el tratamiento con un anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM debe iniciarse y/o continuarse cuando el nivel de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma en dicha muestra está por encima de un cierto umbral y/o en donde un tratamiento con un anticuerpo anti-ADM o fragmento de anticuerpo anti-ADM se debe retener y/o terminar si dicho nivel determinado de proadrenomedulina o fragmentos de la misma está por debajo de dicho umbral predeterminado.
9. Un método para predecir o diagnosticar un choque refractario en un sujeto que sufre un choque o que ha desarrollado un choque de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, en donde el tratamiento con un anticuerpo anti-ADM o un fragmento de anticuerpo anti-ADM y/o antagonistas del receptor de angiotensina y/o precursores de los mismos y/o inhibidores de la actividad de DPP3 se ha de iniciar y/o continuar si el nivel de pro-adrenomedulina o fragmentos de la misma en dicha muestra está por encima de un cierto umbral y dicho nivel determinado de DPP3 está por encima de dicho umbral predeterminado de DPP3.
10. Un método para pronosticar un resultado y/o el riesgo de un evento adverso en un sujeto que ha desarrollado un choque refractario, en donde dicho método comprende las etapas de:
• determinar el nivel de DPP3 en una muestra de fluido corporal de dicho sujeto; dicha muestra de fluido corporal se selecciona del grupo de sangre total, plasma y suero;
• comparar dicho nivel de DPP3 determinado con un umbral predeterminado,
• correlacionar dicho nivel de DPP3 con dicho riesgo de un evento adverso en dicho sujeto, en donde un nivel elevado por encima de un cierto umbral es predictivo de un riesgo potenciado de dichos eventos adversos o, • correlacionar dicho nivel de DPP3 con el éxito de una terapia o intervención en dicho sujeto, en donde un nivel por debajo de un cierto umbral es predictivo de un éxito de la terapia o intervención.
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