ES3057032T3 - Assays for single molecule detection and use thereof - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a métodos para detectar una variación genética en una muestra genética de un sujeto utilizando sondas marcadas y contando el número de marcas en las sondas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Ensayos para la detección de moléculas individuales y su uso.

[0003] Antecedentes de la invención

[0004] La invención se refiere a métodos para detectar una variación genética en una muestra genética de un sujeto. Detectar una variación genética es importante en muchos aspectos de la biología humana.

[0005] Resumen

[0006] La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. La invención se refiere a métodos para detectar una variación genética en una muestra genética de un sujeto. La invención también se refiere a métodos para detectar una variación genética en una muestra genética de un sujeto utilizando sondas marcadas y contando el número de marcadores en las sondas.

[0007] Breve descripción de los dibujos.

[0008]

[0009] La figura 1 muestra miembros de matriz ejemplares que comprenden socios de unión, marcadores, marcadores de afinidad, sondas de marcado, conjuntos de sondas y/o conjuntos de sondas litigadas descritos en este documento en un sustrato.

[0010] La figura 2 muestra un histograma normalizado de la intensidad de la señal medida tanto en muestras de un solo marcador como en anticuerpos de múltiples marcadores.

[0011] La figura 3 muestra los perfiles de blanqueo promedio de varias marcas.

[0012] Las figuras 4 a 13 muestran los gráficos de intensidad de marcadores integrados a lo largo del tiempo para varios marcadores Alexa 488.

[0013] La figura 14 representa el espectro de excitación y el espectro de emisión a través de una operación estándar cuando la excitación de un fluoróforo se logra iluminando con una banda espectral estrecha alineada con los máximos de absorción de esa especie.

[0014] La figura 15 representa el espectro de excitación y el espectro de emisión a través de la interrogación con varios colores de excitación y bandas de emisión recopiladas diferentes de (o además de) el caso de la operación estándar.

[0015] La figura 16 muestra los resultados cuando se recoge la luz de estas diversas configuraciones de imágenes, por ejemplo, varios filtros de emisión, y se compara con los valores de calibración de los fluoróforos de interés. La figura 17 muestra los resultados recopilados con varias referencias, incluidas aquellas con un perfil de emisión plano (Contaminante 1; triángulos) o un perfil ponderado en azul (Contaminante 2; estrellas).

[0016] La figura 18 muestra bandas de excitación significativamente diferentes de dos fluoróforos.

[0017] La figura 19 muestra un diagrama de flujo del sistema ejemplar.

[0018] La figura 20 muestra un diagrama de flujo del sistema ejemplar que incluye varios métodos para analizar datos. Las figuras 21 a 46 representan conjuntos de sondas ejemplares descritos aquí.

[0019] Las figuras 47 y 48 muestran los patrones de fluorescencia resultantes cuando los productos contienen secuencias de marcadores de afinidad únicas y el sustrato subyacente contiene complementos de cada uno de los marcadores de afinidad únicos dentro de la misma ubicación (por ejemplo, como el mismo miembro) en un sustrato.

[0020] Las figuras 49 y 51 muestran los patrones de fluorescencia resultantes cuando diferentes productos contienen secuencias de marcadores de afinidad idénticos y el sustrato subyacente contiene el complemento del marcador de afinidad.

[0021] Las figuras 50 y 52 muestran ubicaciones ampliadas de las figuras 49 y 51, respectivamente.

[0022] Las figuras 53 y 54 muestran los patrones de fluorescencia resultantes cuando los productos contienen secuencias de marcadores de afinidad únicas y el sustrato subyacente tiene una ubicación (por ejemplo, como un miembro) que contiene el complemento de un complemento de etiqueta de afinidad, y otra ubicación separada (por ejemplo, como otro miembro) que contiene el complemento de la otra etiqueta de afinidad.

[0023] La figura 55 muestra dos conjuntos de sondas: un conjunto de sondas para el locus 1 y un conjunto de sondas para el locus 2, aunque como se mencionó anteriormente, se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas para cada locus genómico.

[0024] La figura 56 muestra el flujo de trabajo de procedimiento que se aplicaría a la recopilación de conjuntos de sondas.

[0025] La figura 57 muestra una versión modificada del flujo de trabajo de procedimiento ilustrado en la figura 56. La figura 58 proporciona un ejemplo de cómo los productos de sonda para el locus 1 y el locus 2 pueden marcarse con diferentes moléculas marcadoras.

[0026] La figura 59 proporciona evidencia de que los productos de sonda que representan una multitud de ubicaciones genómicas para un locus pueden generarse de una manera específica de la enzima ligasa utilizando el proceso de ligadura de hibridación.

[0027] La figura 60 proporciona datos que indican que se pueden utilizar conjuntos de sondas para detectar cambios relativos en el estado del número de copias.

[0028] La figura 61 proporciona evidencia de que se pueden utilizar mezclas de productos de sonda para generar datos de micromatrices cuantitativos.

[0029] Las figuras 62 a 64 ilustran modificaciones del procedimiento general descrito en las figuras 55 a 58.

[0030] La figura 65 representa una realización adicional del procedimiento modificado descrito en la figura 62.

[0031] La figura 66 representa otra realización del procedimiento representado en la figura 65.

[0032] La figura 67 muestra conjuntos de sondas ejemplares utilizados en los métodos descritos en este documento. La figura 68 representa conjuntos de sondas de ejemplo utilizados en los métodos descritos en este documento cuando se analizan translocaciones que tienen puntos de corte conocidos.

[0033] La figura 69 muestra conjuntos de sondas ejemplares utilizados en los métodos descritos aquí cuando se dirigen a mutaciones en SNP.

[0034] Descripción detallada.

[0035] Los métodos descritos en este documento pueden emplear, a menos que se indique lo contrario, técnicas y descripciones convencionales de biología molecular (incluidas las técnicas recombinantes), biología celular, bioquímica y tecnología de micromatrices y secuenciación, que son competencia de los expertos en la materia. Dichas técnicas convencionales incluyen la síntesis de matrices de polímeros, la hibridación y ligación de oligonucleótidos, la secuenciación de oligonucleótidos y la detección de la hibridación mediante un marcador. Se pueden obtener ilustraciones específicas de técnicas adecuadas consultando los ejemplos incluidos en este documento. Sin embargo, también se pueden utilizar procedimientos convencionales equivalentes. Dichas técnicas y descripciones convencionales se pueden encontrar, por ejemplo, en Kimmel y Oliver, DNA Micromatrices (2006), Elsevier; Campbell, DNA Micromatriz, Synthesis and Synthetic DNA (2012), Nova Science; Bowtell y Sambrook, DNA Micromatrices: Molecular Cloning Manual (2003), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Antes de describir las presentes composiciones, herramientas de investigación y métodos, debe entenderse que esta invención no está limitada a los métodos, composiciones, objetivos y usos específicos descritos, ya que los mismos pueden, por supuesto, variar.

[0036] [0005]La invención se refiere a métodos para detectar una variación genética en una muestra genética de un sujeto. La variación genética descrita en este documento puede incluir, entre otras, una o más sustituciones, inversiones, inserciones, deleciones o mutaciones en secuencias de nucleótidos (p. ej., ADN y ARN) y proteínas (p. ej., péptidos y proteínas), uno o más alelos raros, polimorfismos, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), polimorfismos genéticos a gran escala, como inversiones y translocaciones, diferencias en la abundancia o el número de copias (p. ej., variantes del número de copias, CNV) de una o más moléculas de nucleótidos (p. ej., ADN), trisomías, monosomías y reordenamientos genómicos. En algunas formas de realización, la variación genética puede estar relacionada con la metástasis, la presencia, ausencia o riesgo de una enfermedad, como el cáncer, la variabilidad farmacocinética, la toxicidad de fármacos, los eventos adversos, la recurrencia o la presencia, ausencia o riesgo de rechazo de trasplantes de órganos en el sujeto. Por ejemplo, los cambios en el número de copias del genHER2afectan si una paciente con cáncer de mama responderá o no al tratamiento con Herceptin. De manera similar, detectar un aumento en el número de copias del cromosoma 21 (o 18, o 13, o cromosomas sexuales) en la sangre de una mujer embarazada puede usarse como un diagnóstico no invasivo para el síndrome de Down en un feto. Un ejemplo adicional es la detección de alelos de un órgano trasplantado que no están presentes en el genoma del receptor: monitorear la frecuencia o el número de copias de estos alelos puede identificar signos de posible rechazo del órgano. Se pueden usar varios métodos para detectar dichos cambios (p. ej., rtPCR, secuenciación y micromatrices). Uno de los métodos es contar moléculas individuales marcadas para detectar la presencia de una mutación (p. ej., mutación de EGFR en cáncer) o un exceso de una secuencia o región genómica específica (p. ej., cromosoma 21 en el síndrome de Down). El conteo de moléculas individuales se puede realizar de varias maneras, pero una lectura común es depositar las moléculas en una superficie y tomar una imagen.

[0038] Además, la variación genética puede consistir en mutaciones genéticas de novo, como mutaciones de una o varias bases, translocaciones, amplificaciones y deleciones subcromosómicas y aneuploidía. En algunas formas de realización, la variación genética puede significar una secuencia de nucleótidos alternativa en un locus genético que puede estar presente en una población de individuos y que incluye sustituciones, inserciones y deleciones de nucleótidos con respecto a otros miembros de la población. En formas de realización adicionales, la variación genética puede ser aneuploidía. En formas de realización adicionales, la variación genética puede ser trisomía 13, trisomía 18, trisomía 21, aneuploidía de X (p. ej., trisomía XXX y trisomía XXY) o aneuploidía de Y (p. ej., trisomía XYY). En otras formas de realización, la variación genética puede estar en las regiones 22q11.2, 1q21.1, 9q34, 1p36, 4p, 5p, 7q11.23, 11q24.1, 17p, 11p15, 18q o 22q13. En otras formas de realización, la variación genética puede ser una microdeleción o una microamplificación.

[0040] En algunas formas de realización, detectar, descubrir, determinar, medir, evaluar, contar y valorar la variación genética se utilizan indistintamente e incluyen determinaciones cuantitativas y/o cualitativas, como, por ejemplo, identificar la variación genética, determinar su presencia y/o ausencia, y cuantificarla. En otras formas de realización, los métodos de la presente divulgación pueden detectar múltiples variaciones genéticas. El término "y/o" utilizado en este documento se define para indicar cualquier combinación de los componentes. Además, las formas singulares "un", "una" y "el/la" pueden incluir también referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una región de nucleótidos" se refiere a una, más de una o mezclas de dichas regiones, y la referencia a "un ensayo" puede incluir la referencia a pasos y métodos equivalentes conocidos por los expertos en la materia, y así sucesivamente.

[0042] "Muestra" se refiere a una cantidad de material de origen biológico, ambiental, médico o del paciente, en la que se busca la detección, medición o marcaje de ácidos nucleicos, péptidos o proteínas diana. Por un lado, incluye una muestra o cultivo (p. ej., cultivos microbiológicos). Por otro lado, incluye tanto muestras biológicas como ambientales. Una muestra puede ser de origen sintético. Las muestras ambientales incluyen material ambiental, como materia superficial, suelo, agua y muestras industriales, así como muestras obtenidas de instrumentos, aparatos, equipos, utensilios, artículos desechables y no desechables para el procesamiento de alimentos y lácteos. "Muestra genética" puede ser cualquier muestra líquida o sólida con información biológica hereditaria o no hereditaria codificada en las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos. La muestra puede obtenerse de una fuente, incluyendo, entre otras, sangre completa, suero, plasma, orina, saliva, sudor, materia fecal, lágrimas, fluido intestinal, muestras de membranas mucosas, tejido pulmonar, tumores, órganos trasplantados, fetos u otras fuentes. Las muestras genéticas pueden provenir de un animal, incluyendo un ser humano, de fluidos, sólidos (p. ej., heces) o tejidos. Pueden incluir materiales extraídos de un paciente, incluyendo, entre otros, cultivos, sangre, saliva, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, leche, linfa, esputo, semen, aspirados con aguja, etc. Además, la muestra genética puede ser material genético fetal de una muestra de sangre materna. El material genético fetal puede aislarse y separarse de la muestra de sangre materna. En la presente invención, la muestra genética es una mezcla de material genético fetal y materno. Además, la muestra genética puede incluir secuencias genéticas aberrantes derivadas de la formación o metástasis de tumores, y/o firmas de ADN de donantes presentes en un receptor de trasplante. Cuando la muestra genética es plasma, el método puede comprender el aislamiento del plasma de una muestra de sangre del sujeto. Cuando la muestra genética es suero, el método puede comprender el aislamiento del suero de una muestra de sangre del sujeto. Cuando la muestra genética es una muestra de ADN libre de células (ADNlc), el método comprende además el aislamiento de la muestra de ADN libre de células de una muestra obtenida de la fuente descrita en este documento. En este documento, la muestra de ADN libre de células se refiere a una población de moléculas de ADN que circulan libremente en el torrente sanguíneo, fuera de cualquier célula u orgánulo. En caso de embarazo, el ADN libre de células de la madre contiene una mezcla de ADN materno y fetal. Estos ejemplos no deben interpretarse como una limitación de los tipos de muestra aplicables a la presente invención.

[0044] [0009]El método de la presente divulgación puede comprender la selección o el aislamiento de uno o más locus genéticos de interés, y la cuantificación de la cantidad presente de cada locus (por ejemplo, para determinar el número de copias) o de las cantidades relativas de diferentes variantes del locus (por ejemplo, dos alelos de una secuencia de ADN dada). En el presente documento, el término «región», «región de interés», «locus» o «locus de interés» en referencia a un genoma o polinucleótido diana se refiere a una subregión o segmento contiguo del genoma o del polinucleótido diana. En el presente documento, «región», «regiones» o «interés», «locus», «locus» o «locus de interés» en una molécula de nucleótido puede referirse a la posición de un nucleótido, un gen o una porción de un gen en un genoma, incluyendo el ADN mitocondrial u otro ADN no cromosómico, o puede referirse a cualquier porción contigua de la secuencia genómica, independientemente de si se encuentra dentro de un gen o asociada a él. Una región, región de interés, locus, o locus de interés en una molécula de nucleótido puede abarcar desde un solo nucleótido hasta un segmento de varios cientos o miles de nucleótidos de longitud o más. En algunas formas de realización, una región o locus de interés puede tener una secuencia de referencia asociada. El término "secuencia de referencia" se refiere a la secuencia con la que se compara un locus de interés en un ácido nucleico. En ciertas formas de realización, una secuencia de referencia se considera una secuencia "natural" para un locus de interés. Un ácido nucleico que contiene un locus de interés con una secuencia que varía de la secuencia de referencia para dicho locus se denomina a veces "polimórfico", "mutante" o "variación genética". Un ácido nucleico que contiene un locus de interés con una secuencia que no varía de la secuencia de referencia para dicho locus se denomina a veces "no polimórfico", "natural" o "variación no genética". En ciertas formas de realización, un locus de interés puede tener más de una secuencia de referencia distinta asociada (p. ej., cuando se sabe que un locus de interés presenta un polimorfismo que se considera normal o silvestre). El método también puede comprender la selección o el aislamiento del péptido o péptidos de interés, y la determinación de la cantidad presente de cada péptido o de las cantidades relativas de los diferentes péptidos.

[0046] En otras formas de realización, la región de interés descrita en este documento puede incluir una "secuencia genética de consenso", que se refiere a la secuencia de ácido nucleico o proteína cuyos ácidos nucleicos o aminoácidos se sabe que aparecen con alta frecuencia en una población de individuos que portan el gen que codifica una proteína que no funciona normalmente, o en la que el propio ácido nucleico no funciona normalmente. Además, la región de interés descrita en este documento puede incluir una "secuencia genética normal de consenso", que se refiere a una secuencia de ácido nucleico cuyos ácidos nucleicos se sabe que aparecen en sus respectivas posiciones con alta frecuencia en una población de individuos que portan el gen que codifica una proteína que no funciona normalmente, o que en sí misma no funciona normalmente. En otras formas de realización, la región de control que no es la región de interés ni la secuencia de referencia descrita en este documento puede incluir una "secuencia normal de consenso", que se refiere a la secuencia de ácido nucleico o proteína cuyos ácidos nucleicos o aminoácidos se sabe que aparecen con alta frecuencia en una población de individuos que portan el gen que codifica una proteína que funciona normalmente, o en la que el propio ácido nucleico tiene una función normal.

[0048] Los métodos descritos en este documento pueden producir mediciones altamente precisas de la variación genética. Un tipo de variación descrito en este documento incluye la abundancia relativa de dos o más loci genómicos distintos. En este caso, los loci pueden ser pequeños (p. ej., de tan solo 300, 250, 200, 150, 100 o 50 nucleótidos o menos), de tamaño moderado (p. ej., de 1.000, 10.000, 100.000 o un millón de nucleótidos) y tan grandes como una porción de un brazo cromosómico o el cromosoma completo o conjuntos de cromosomas. Los resultados de este método pueden determinar la abundancia de un locus con respecto a otro. La precisión y exactitud de los métodos de la presente divulgación permiten detectar cambios muy pequeños en el número de copias (tan solo aproximadamente 25, 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,02 o 0,01 % o menos), lo que permite identificar una señal muy diluida de variación genética. Por ejemplo, se puede encontrar una señal de aneuploidía fetal en una muestra de sangre materna donde la aberración genética fetal se diluye con la sangre materna, y un cambio observable en el número de copias de aproximadamente el 2 % indica trisomía fetal.

[0050] En el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a la modificación, por ejemplo, de la longitud de las secuencias de nucleótidos, los grados de error, las dimensiones, la cantidad de un ingrediente en una composición, las concentraciones, los volúmenes, la temperatura y el tiempo de proceso, los rendimientos, los caudales, las presiones y valores similares, así como sus rangos. Se refiere a la variación en la cantidad numérica que puede producirse, por ejemplo, mediante los procedimientos habituales de medición y manipulación utilizados para elaborar compuestos, composiciones, concentrados o formulaciones de uso; por errores involuntarios en estos procedimientos; por diferencias en la fabricación, el origen o la pureza de las materias primas o los ingredientes utilizados para llevar a cabo los métodos; y consideraciones similares. El término "aproximadamente" también abarca las cantidades que difieren debido al envejecimiento de, por ejemplo, una composición, formulación o cultivo celular con una concentración o mezcla inicial determinada, y las cantidades que difieren debido a la mezcla o el procesamiento de una composición o formulación con una concentración o mezcla inicial determinada. El término "aproximadamente" puede referirse además a un rango de valores similares al valor de referencia indicado. En ciertas formas de realización, el término "aproximadamente" se refiere a un rango de valores que se encuentran dentro del 50, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 por ciento o menos del valor de referencia establecido.

[0052] El sujeto puede ser una embarazada, un ser humano, un sujeto con alto riesgo de padecer una enfermedad genética (p. ej., cáncer), cualquier familia de animales domésticos, así como animales salvajes o asilvestrados. En algunas formas de realización, la variación genética puede ser una variación genética en el feto de la embarazada (p. ej., variantes en el número de copias y aneuploidía en el feto). En algunas formas de realización, la embarazada es una variación genética en el feto de la embarazada en una región seleccionada del grupo que consiste en 22q11.2, 1q21, l, 9q34, 1p36, 4p, 5p, 7q11.23, 11q24,1, 17p, 11p15, 18q y 22q13 (p. ej., una mutación o un cambio en el número de copias en cualquiera de las regiones 22q11.2, 1q21.1, 9q34, 1p36, 4p, 5p, 7q11.23, 11q24.1, 17p, 11p15, 18q y 22q13). El término "feto" se refiere a una cría no nacida de un ser humano u otro animal. En algunas formas de realización, el feto puede ser la cría más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 semanas después de la concepción. En otras formas de realización, el feto puede ser un hijo concebido mediante implantes, fertilización in vitro, embarazos múltiples o gemelarismo. En otras formas de realización, el feto puede formar parte de un par de gemelos (idénticos o no idénticos) o de un trío de trillizos (idénticos o no idénticos).

[0054] [0014]Algunas formas de realización comprenden al menos dos componentes principales: un ensayo para la identificación selectiva de loci genómicos y una tecnología para cuantificar estos loci con alta precisión. El ensayo puede incluir métodos para marcar y/o aislar selectivamente una o más secuencias de ácidos nucleicos, de tal manera que el propio paso de marcado sea suficiente para obtener moléculas (definidas en esta invención como "productos de sonda", "conjunto de sondas ligadas", "conjunto de sondas conjugadas", "sondas ligadas", "sondas conjugadas" o "moléculas marcadas") que contengan toda la información necesaria para la identificación de una secuencia particular en el contexto de un ensayo específico. Por ejemplo, el ensayo puede comprender poner en contacto, unir y/o hibridar sondas con una muestra, ligar y/o conjugar las sondas, opcionalmente amplificar las sondas ligadas/conjugadas e inmovilizar las sondas en un sustrato. En algunas formas de realización, los ensayos y métodos descritos en este documento pueden realizarse en una sola muestra de entrada en paralelo como un ensayo multiplex, como se describe en este documento.

[0056] El producto de sonda, el conjunto de sondas ligadas, el conjunto de sondas conjugadas, las sondas ligadas, las sondas conjugadas y las moléculas marcadas pueden ser moléculas individuales y contiguas resultantes de la acción enzimática sobre un conjunto de sondas, como en un ensayo. En un producto de sonda o una molécula marcada, una o más sondas individuales de un conjunto de sondas pueden modificarse covalentemente de forma que formen una especie molecular singular y distinta, en comparación con las sondas o los conjuntos de sondas. Como resultado, los productos de sonda o una molécula marcada pueden ser químicamente distintos y, por lo tanto, pueden identificarse, contarse, aislarse o manipularse independientemente de las sondas o los conjuntos de sondas.

[0058] Por ejemplo, las sondas producto pueden contener uno o más marcadores de identificación y uno o más marcadores de afinidad para su aislamiento o inmovilización. En algunas formas de realización, no es necesario realizar modificaciones adicionales en las sondas producto (p. ej., determinación de la secuencia de ADN). En otras formas de realización, no se requieren interrogaciones adicionales de la secuencia de ADN. Las sondas producto que contienen los marcadores pueden contarse directamente, normalmente tras un paso de inmovilización sobre un sustrato sólido. Por ejemplo, se utilizan marcadores fluoróforos orgánicos para marcar las sondas producto, y estas se cuentan directamente inmovilizándolas sobre un sustrato de vidrio y obteniéndose imágenes posteriormente mediante un microscopio de fluorescencia y una cámara digital. En otras formas de realización, la etiqueta puede inactivarse o eliminarse selectivamente, dependiendo de si la molécula marcada ha interactuado con su locus genómico complementario. En otras formas de realización, dos marcadores en porciones opuestas de la sonda producto pueden actuar conjuntamente para emitir una señal de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), dependiendo de si la molécula marcada ha interactuado con su locus genómico complementario. Para un locus genómico dado, se pueden diseñar sondas de marcado que contengan los marcadores para cualquier región de secuencia dentro de ese locus. También se puede diseñar un conjunto de sondas de marcado con marcadores iguales o diferentes para un solo locus genómico. En este caso, una sonda puede aislar y marcar selectivamente una región diferente dentro de un locus particular, o regiones superpuestas dentro de un locus. Los productos de sonda que contienen marcadores de afinidad se inmovilizan en el sustrato mediante los marcadores de afinidad. Por ejemplo, los marcadores de afinidad se utilizan para inmovilizar los productos de sonda en el sustrato, y los productos de sonda que contienen los marcadores de afinidad se cuentan directamente. Para un locus genómico dado, se pueden diseñar sondas de marcado con marcadores de afinidad para cualquier región de secuencia dentro de ese locus. También se puede diseñar un conjunto de sondas de marcado con marcadores de afinidad iguales o diferentes para un solo locus genómico. En este caso, una sonda puede aislar y marcar selectivamente una región diferente dentro de un locus particular, o regiones superpuestas dentro de un locus.

[0060] Los métodos de la presente divulgación pueden comprender la puesta en contacto de los conjuntos de sondas descritos en este documento con la muestra genética descrita en este documento. Los métodos de la presente divulgación pueden comprender la puesta en contacto de múltiples conjuntos de sondas, como el primer y el segundo conjunto de sondas, con la muestra genética. Cada conjunto de sondas comprende una sonda de marcado y una sonda de marcado. Por ejemplo, el primer conjunto de sondas comprende una primera sonda de marcado y una primera sonda de etiquetado, y el segundo conjunto de sondas comprende una segunda sonda de marcado y una segunda sonda de etiquetado.

[0062] El contacto de los conjuntos de sondas con la muestra genética puede realizarse simultáneamente o después de hibridar, ligar, amplificar o inmovilizar las sondas. Además, el contacto de los conjuntos de sondas con la muestra genética puede realizarse simultáneamente o antes de hibridar, ligar, amplificar o inmovilizar las sondas.

[0064] [0019]Para un locus o región genómica determinada de una molécula de nucleótido en la muestra genética, se puede interrogar y/o cuantificar una o varias secuencias de ácidos nucleicos dentro de ese locus mediante la creación de productos de sonda. Las secuencias interrogadas dentro de un locus genómico pueden ser distintas y/o solaparse, y pueden contener o no polimorfismos genéticos. Un producto de sonda se forma mediante el diseño de uno o más oligonucleótidos denominados "conjunto de sondas". Por ejemplo, el producto de sonda puede formarse ligando el conjunto de sondas a las sondas que lo componen. Un conjunto de sondas comprende al menos una sonda que hibrida, conjuga, se une o inmoviliza a una molécula diana, incluyendo ácidos nucleicos (p. ej., ADN y ARN), péptidos y proteínas. En algunas formas de realización, una sonda puede comprender un material aislado, purificado, de origen natural, de origen no natural y/o artificial, por ejemplo, incluyendo oligonucleótidos de cualquier longitud (por ejemplo, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 150 nucleótidos o menos), en el que al menos una(s) porción(es) (por ejemplo, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %) de las secuencias de oligonucleótidos es complementaria a un motivo de secuencia y/o dominio de hibridación presente en una o más moléculas diana, de modo que la sonda está configurada para hibridar (o interactuar de manera similar) en parte o en su totalidad con una o más moléculas diana o región de ácido nucleico de interés. La parte de la molécula objetivo o la región de ácido nucleico de interés a la que se hibrida una sonda se denomina "dominio de hibridación" de la sonda, que puede ser parte o la totalidad de la molécula objetivo o de la región de ácido nucleico de interés como se describe en este documento.

[0066] Una sonda puede ser monocatenaria o bicatenaria. En ocasiones, la sonda puede prepararse a partir de una digestión de restricción purificada o producirse de forma sintética, recombinante o mediante amplificación por PCR. En ocasiones, la sonda puede estar compuesta por un material que se une a una secuencia peptídica específica. Un conjunto de sondas puede estar compuesto por una o más sondas diseñadas para corresponder a una única ubicación genómica o a un péptido en una secuencia proteica.

[0068] El término "nucleótido" en este documento se refiere a un desoxirribonucleótido, un ribonucleótido o cualquier análogo de nucleótido (p. ej., ADN y ARN). Los análogos de nucleótidos incluyen nucleótidos con modificaciones en la estructura química de la base, azúcar y/o fosfato, incluyendo, entre otras, modificaciones de pirimidina en la posición 5', modificaciones de purina en la posición 8, modificaciones en aminas exocíclicas de citosina, sustitución de 5-bromouracilo, etc.; y modificaciones de azúcar en la posición 2', incluyendo, entre otras, ribonucleótidos modificados con azúcar en los que el 2'-OH se sustituye por un grupo seleccionado entre H, OR, R, halo, SH, SR, NH₂, NHR, NR₂ o CN. Los ARNhc también pueden contener elementos no naturales, como nucleótidos no naturales (p. ej., ionosina y xantina), azúcares no naturales (p. ej., 2'-metoxi ribosa) o enlaces fosfodiéster no naturales (p. ej., metilfosfonatos, fosforotioatos y péptidos). El ARNhc puede contener además un elemento o una modificación que lo hace resistente a la digestión por nucleasas. "Polinucleótido" u "oligonucleótido" se utilizan indistintamente y cada uno significa un polímero lineal de monómeros de nucleótidos. Los monómeros que componen los polinucleótidos y oligonucleótidos son capaces de unirse específicamente a un polinucleótido natural o artificial mediante un patrón regular de interacciones monómero a monómero, como el apareamiento de bases de tipo Watson-Crick, el apilamiento de bases, el apareamiento de bases de tipo Hoogsteen o Hoogsteen inverso, o similares. Dichos monómeros y sus enlaces internucleosídicos pueden ser de origen natural o análogos de los mismos, por ejemplo, análogos naturales o artificiales. Los análogos artificiales pueden incluir PNA, LNA, enlaces internucleosídicos de fosforotioato, nucleótidos que contienen grupos de enlace que permiten la fijación de marcadores, como fluoróforos o haptenos, entre otros. Cuando el uso de un oligonucleótido o polinucleótido requiere procesamiento enzimático, como la extensión por una polimerasa, la ligación por una ligasa, etc., un experto en la materia comprenderá que, en esos casos, los oligonucleótidos o polinucleótidos no contendrán ciertos análogos de enlaces internucleosídicos, grupos de azúcar o nucleótidos en ninguna o algunas posiciones. El tamaño de los polinucleótidos suele variar desde unas pocas unidades monoméricas, cuando se les denomina "oligonucleótidos", hasta varios miles de unidades monoméricas. Siempre que un polinucleótido u oligonucleótido se represente mediante una secuencia de letras (mayúsculas o minúsculas), como "ATGCCTG", se entenderá que los nucleótidos están en orden 5'→3' de izquierda a derecha. Generalmente, los polinucleótidos comprenden los cuatro nucleósidos naturales (p. ej., desoxiadenosina, desoxicitidina, desoxiguanosina y desoxitimidina para el ADN o sus homólogos ribosa para el ARN) unidos por enlaces fosfodiéster; sin embargo, también pueden comprender análogos de nucleótidos no naturales, como nucleótidos modificados, azúcares o enlaces internucleosídicos. Es evidente para los expertos en la materia que, cuando una enzima requiere sustratos específicos de oligonucleótidos o polinucleótidos para su actividad (p. ej., ADN monocatenario, ARN, dúplex ARN/ADN, etc.), la selección de la composición adecuada para los sustratos de oligonucleótidos o polinucleótidos es un conocimiento básico.

[0070] Los métodos comprenden la hibridación de al menos partes del primer y segundo conjunto de sondas con la primera y segunda región de ácido nucleico de interés en las moléculas de nucleótidos de la muestra genética, respectivamente. La hibridación de las sondas con el ácido nucleico de interés puede realizarse simultáneamente o después de ponerlas en contacto con la muestra genética, ligarlas, amplificarlas o inmovilizarlas. Además, la hibridación de las sondas con el ácido nucleico de interés puede realizarse simultáneamente o antes de ligarlas, amplificarlas o inmovilizarlas. Una parte o la totalidad de la sonda puede hibridar con una parte o la totalidad de la región de interés en moléculas de nucleótidos monocatenarios o bicatenarios, proteínas o anticuerpos de la muestra. La región de interés hibridada con la sonda puede tener de 1 a 50 nucleótidos, de 50 a 1000 nucleótidos, de 100 a 500 nucleótidos, 5, 10, 50, 100, 200 nucleótidos o menos, o 2, 5, 10, 50, 100, 200, 500, 1000 nucleótidos o más. Las sondas pueden diseñarse o configurarse para hibridar perfectamente con una región o molécula diana, o pueden diseñarse de tal manera que un desajuste de una sola base (p. ej., en un polimorfismo de un solo nucleótido o sitio SNP), o un pequeño número de estos desajustes, no produzca un híbrido entre la sonda y la molécula diana.

[0072] [0023]La primera sonda de marcado y/o la primera sonda de marcado se hibridan con la primera región de ácido nucleico de interés, y la segunda sonda de marcado y/o las segundas sondas de marcado se hibridan con la segunda región de ácido nucleico de interés. Varias o todas las sondas y/o otros componentes (p. ej., sondas de marcado, sondas de marcado y sondas gap) de un conjunto de sondas que se hibridan con una región de ácido nucleico de interés son adyacentes entre sí. Cuando dos sondas y/o componentes hibridados con la región de ácido nucleico de interés son adyacentes o inmediatamente adyacentes, no hay ningún nucleótido entre los dominios de hibridación de las dos sondas en la región de ácido nucleico de interés. Las diferentes sondas de un conjunto de sondas se ligan covalentemente para formar una molécula de oligonucleótido más grande. Un conjunto de sondas puede diseñarse para hibridar con una porción no contigua, pero proximal, de la región de ácido nucleico de interés, de modo que exista un espacio de uno o más nucleótidos en la región de ácido nucleico de interés, entre las sondas hibridadas de un conjunto de sondas, que no esté ocupado por una sonda. Se puede utilizar una ADN polimerasa u otra enzima para sintetizar una nueva secuencia de polinucleótidos, en algunos casos uniendo covalentemente dos sondas de un único conjunto de sondas. Dentro de un conjunto de sondas, cada sonda puede llevar uno o más marcadores, o marcadores de afinidad, utilizados para la identificación o el aislamiento del locus. La primera y la segunda sonda de marcado se hibridan con la primera y la segunda región de ácido nucleico de interés en las moléculas de nucleótidos de la muestra genética, respectivamente; la primera y la segunda sonda de marcado se hibridan con la primera y la segunda región de ácido nucleico de interés en las moléculas de nucleótidos de la muestra genética, respectivamente; la primera sonda de marcado se hibrida con una región adyacente a la de la primera sonda de marcado y la segunda sonda de marcado se hibrida a una región adyacente a donde se hibrida la segunda sonda de marcado.

[0074] La hibridación se produce de tal manera que las sondas de un conjunto de sondas pueden modificarse para formar una nueva entidad molecular de mayor tamaño (p. ej., un producto de sonda). Las sondas de este estudio pueden hibridar con las regiones de ácidos nucleicos de interés en condiciones rigurosas. El término "rigurosidad" se refiere a las condiciones de temperatura, fuerza iónica y presencia de otros compuestos, como disolventes orgánicos, en las que se llevan a cabo las hibridaciones de ácidos nucleicos. La "rigurosidad" se presenta típicamente en un rango de aproximadamente T<m>ºC a aproximadamente 20 ºC a 25 ºC por debajo de la T<m>. Una hibridación rigurosa puede utilizarse para aislar y detectar secuencias de polinucleótidos idénticas o similares o relacionadas. En condiciones rigurosas, la secuencia de nucleótidos, en su totalidad o en partes de ella, hibridará con su complemento exacto y secuencias estrechamente relacionadas. Las condiciones de baja rigurosidad comprenden condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 68 ºC en una solución que consiste en 5xSSPE (43,8 g/l NaCl, 6,9 g/l NaH<2>PO<4>.H<2>O y 1,85 g/l EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), 0,1 % SDS, 5x reactivo de Denhardt (50x Denhardt contiene por 500 ml: 5 g de Ficoll (Tipo 400), 5 g de BSA) y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado seguido de lavado en una solución que comprende 2,0+SSPE, 0,1 % SDS a temperatura ambiente cuando se emplea una sonda de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud. Es bien conocido en la técnica que se pueden emplear numerosas condiciones equivalentes para comprender condiciones de baja rigurosidad; Factores como la longitud y la naturaleza (ADN, ARN, composición de bases) de la sonda y la naturaleza de la diana (ADN, ARN, composición de bases, presente en solución o inmovilizada, etc.) y la concentración de sales y otros componentes (p. ej., la presencia o ausencia de formamida, sulfato de dextrano, polietilenglicol), así como los componentes de la solución de hibridación, pueden variarse para generar condiciones de hibridación de baja rigurosidad, diferentes, pero equivalentes, a las condiciones mencionadas anteriormente. Además, las condiciones que promueven la hibridación en condiciones de alta rigurosidad (p. ej., aumento de la temperatura en los pasos de hibridación o lavado, uso de formamida en la solución de hibridación, etc.) son bien conocidas en la técnica. Las condiciones de alta rigurosidad, cuando se utilizan en referencia a la hibridación de ácidos nucleicos, comprenden condiciones equivalentes a la unión o hibridación a una solución de 68 ºC que consiste en 5+SSPE, 1 % SDS, 5 x reactivo de Denhardt y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado seguido de un lavado en una solución que comprende 0,1+SSPE y 0,1 % SDS a 68 ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud.

[0076] En algunas formas de realización, la sonda producto solo puede formarse si las sondas de un conjunto de sondas están correctamente hibridadas. Por lo tanto, la formación de las sondas producto se realiza con alta rigurosidad y precisión. Además, las sondas producto pueden contener suficiente información para identificar la secuencia genómica para la que fueron diseñadas. Por lo tanto, la generación y cuantificación directa de una sonda producto en particular (en este caso, mediante conteo molecular) puede reflejar la abundancia de una secuencia genética específica en la muestra original.

[0078] En otras formas de realización, las regiones de ácido nucleico de interés, con las que las sondas están configuradas para hibridar, se encuentran en cromosomas diferentes. Por ejemplo, la primera región de ácido nucleico de interés se encuentra en el cromosoma 21, y la segunda región de ácido nucleico de interés no se encuentra en dicho cromosoma (p. ej., se encuentra en el cromosoma 18).

[0080] Los métodos comprenden la ligadura de la primera sonda de marcado y la primera sonda de marcado, y la ligadura de la segunda sonda de marcado y la segunda sonda de marcado. La ligadura de las sondas puede realizarse simultáneamente o después de ponerlas en contacto con la muestra genética, amplificarlas o inmovilizarlas. Además, la ligadura de las sondas puede realizarse simultáneamente o antes de ponerlas en contacto con la muestra genética, amplificarlas o inmovilizarlas. En este contexto, la ligadura se refiere al proceso de unión de dos sondas (p. ej., la unión de dos moléculas de nucleótidos). Por ejemplo, la ligadura puede implicar la formación de un enlace 3',5'-fosfodiéster que une dos nucleótidos, y el agente de unión capaz de provocar la ligadura puede ser una enzima o una sustancia química.

[0082] [0028]Los métodos comprenden la amplificación de las sondas ligadas y/o conjuntos de sondas ligadas. La amplificación de las sondas ligadas puede realizarse simultáneamente o tras contactarlas con la muestra genética, ligarlas, hibridarlas y/o inmovilizarlas. Además, la amplificación de las sondas ligadas puede realizarse simultáneamente o antes de inmovilizarlas. La amplificación se define aquí como la producción de copias adicionales de la sonda y/o del producto de la sonda y puede llevarse a cabo mediante tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocidas en la técnica. En este contexto, el término "reacción en cadena de la polimerasa" ("PCR") se refiere a un método para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana (p. ej., en una mezcla de ADN genómico) sin clonación ni purificación. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada está determinada por las posiciones relativas de dos cebadores oligonucleotídicos entre sí y, por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. Debido al aspecto repetitivo del proceso, el método se denomina "reacción en cadena de la polimerasa" (en adelante, "PCR"). Dado que los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que están "amplificados por PCR". Con la PCR, es posible amplificar una sola copia de una secuencia diana específica en ADN genómico hasta un nivel detectable mediante diversas metodologías (p. ej., hibridación con una sonda marcada). Además del ADN genómico, cualquier secuencia de oligonucleótidos puede amplificarse con el conjunto adecuado de moléculas cebadoras. En particular, los segmentos amplificados creados por el propio proceso de PCR son, en sí mismos, plantillas eficaces para posteriores amplificaciones por PCR. Una amplificación puede ser una amplificación "en tiempo real" si se encuentra disponible una química de detección que permite medir un producto de reacción a medida que avanza la reacción de amplificación, por ejemplo, "PCR en tiempo real" o "NASBA en tiempo real", como se describe en Leone et al, Nucleic Acids Research, 26: 2150-2155 (1998).

[0084] Los cebadores suelen ser monocatenarios para una máxima eficiencia en la amplificación, pero también pueden ser bicatenarios. Si es bicatenario, el cebador suele tratarse primero para separar sus cadenas antes de usarse para preparar productos de extensión. Esta desnaturalización suele estar influenciada por el calor, pero también puede realizarse con álcali, seguida de una neutralización. Por lo tanto, un cebador es complementario a un molde y forma complejos mediante enlaces de hidrógeno o hibridación con este para dar lugar a un complejo cebador/molde que inicia la síntesis por una polimerasa. Este complejo se extiende mediante la adición de nucleótidos covalentemente unidos en su extremo 3', complementarios al molde, durante el proceso de síntesis de ADN.

[0086] Un "par de cebadores", como se usa en este documento, se refiere a un cebador directo y un cebador inverso correspondiente, con secuencias de ácidos nucleicos adecuadas para la amplificación de un ácido nucleico diana. Dichos pares de cebadores generalmente incluyen un primer cebador con una secuencia igual o similar a la de una primera porción de un ácido nucleico diana, y un segundo cebador con una secuencia complementaria a una segunda porción de un ácido nucleico diana para permitir la amplificación del ácido nucleico diana o un fragmento del mismo. La referencia a "primer" y "segundo" cebador en este documento es arbitraria, a menos que se indique específicamente lo contrario. Por ejemplo, el primer cebador puede diseñarse como un "cebador directo" (que inicia la síntesis de ácidos nucleicos a partir del extremo 5' del ácido nucleico diana) o como un "cebador inverso" (que inicia la síntesis de ácidos nucleicos a partir del extremo 5' del producto de extensión producido a partir de la síntesis iniciada por el cebador directo). Asimismo, el segundo cebador puede diseñarse como un cebador directo o un cebador inverso.

[0088] En algunas formas de realización, la región de ácido nucleico de interés en la molécula de nucleótido descrita en este documento puede amplificarse mediante los métodos de amplificación descritos en este documento. Los ácidos nucleicos de una muestra pueden o no amplificarse antes del análisis, utilizando un método de amplificación universal (p. ej., amplificación del genoma completo y PCR de genoma completo). La amplificación de la región de ácido nucleico de interés puede realizarse simultáneamente o después de poner en contacto las sondas con la muestra genética, ligarlas, amplificarlas o inmovilizarlas. Además, la amplificación de las sondas ligadas puede realizarse simultáneamente o antes de ponerlas en contacto con la muestra genética, ligarlas, inmovilizarlas o contar los marcadores.

[0090] En otras formas de realización, el método excluye la amplificación de las moléculas de nucleótidos de la muestra genética tras la hibridación o la ligación.

[0092] Los métodos comprenden la inmovilización de las sondas de marcado en una ubicación predeterminada sobre un sustrato. La inmovilización de la sonda al sustrato puede realizarse simultáneamente o después de contactar las sondas con la muestra genética, hibridar las sondas con la región de ácido nucleico de interés, ligar y/o amplificar las sondas. Además, la inmovilización de la sonda al sustrato puede realizarse simultáneamente o antes de contactar las sondas con la muestra genética, hibridar las sondas con la región de ácido nucleico de interés, ligar, amplificar y/o contar las sondas. En este contexto, la inmovilización significa unir directa o indirectamente las sondas de marcado a la ubicación predeterminada del sustrato mediante un enlace físico o químico. En algunas formas de realización, el sustrato puede comprender una pareja de unión configurada para contactar y unirse a una etiqueta parcial o total de la sonda de marcado descrita en este documento e inmovilizar la etiqueta y, por lo tanto, la sonda de marcado que la comprende. La etiqueta de la sonda de marcado puede comprender una pareja de unión correspondiente a la pareja de unión del sustrato, como se describe en este documento.

[0094] [0034]La inmovilización puede realizarse hibridando una sonda de marcado parcial o total con un compañero de unión parcial o total en el sustrato. Por ejemplo, la etapa de inmovilización comprende hibridar al menos una parte del marcador o secuencia de nucleótidos de marcado con una molécula de nucleótido correspondiente inmovilizada en el sustrato. Aquí, la molécula de nucleótido correspondiente es un compañero de unión del marcador o secuencia de nucleótidos de marcado que está configurada para hibridar parcial o totalmente con la etiqueta o secuencia de nucleótidos de marcado. En algunas formas de realización, los compañeros de unión de oligonucleótidos o polinucleótidos pueden ser monocatenarios y pueden estar unidos covalentemente al sustrato, por ejemplo, por el extremo 5' o un extremo 3'. La inmovilización también puede realizarse mediante los siguientes compañeros de unión ejemplares y medios de unión: Biotina-oligonucleótido complejado con avidina, estreptovidina o neutravidina; oligonucleótido SH unido covalentemente mediante un enlace disulfuro a una superficie SH; amina-oligonucleótido unido covalentemente a un grupo carboxilato activado o un grupo aldehído; oligonucleótido de ácido fenilborónico (PBA) complejado con ácido salicilhidroxámico (SHA); oligonucleótido de acridita reaccionado con una superficie de tiol o silano, o copolimerizado con monómero de acrilamida para formar poliacrilamida, o mediante otros métodos conocidos en la técnica. Para algunas aplicaciones donde se prefiere una superficie cargada, las capas superficiales pueden estar compuestas por una estructura multicapa de polielectrolito (PEM), como se muestra en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. n.° 2002/025529. En algunas formas de realización, la inmovilización puede realizarse mediante procedimientos bien conocidos, por ejemplo, poniendo en contacto las sondas con el soporte que tiene las parejas de unión unidas durante un período determinado y, una vez agotadas las sondas para la extensión, el soporte con los productos de extensión inmovilizados se enjuaga opcionalmente con un líquido adecuado. En otras formas de realización, la inmovilización de los productos de la sonda sobre un sustrato puede permitir un lavado riguroso para eliminar los componentes de la muestra biológica y del ensayo, reduciendo así el ruido de fondo y mejorando la precisión.

[0096] Los términos "soporte sólido", "soporte", "sustrato" y "soporte de fase sólida" se utilizan indistintamente y se refieren a un material o grupo de materiales con una o varias superficies rígidas o semirrígidas. En algunas formas de realización, al menos una superficie del sustrato será sustancialmente plana o presentará pocillos, zonas elevadas, salientes, surcos grabados o similares. En otras formas de realización, el sustrato puede comprender al menos un soporte de fase sólida plano (p. ej., un portaobjetos de vidrio). Según otras formas de realización, el sustrato o los sustratos adoptarán la forma de perlas, resinas, geles, microesferas u otras configuraciones geométricas. En un aspecto, el sustrato, según algunas formas de realización de la presente divulgación, excluye perlas, resinas, geles y/o microesferas.

[0098] Como se muestra en la figura 1, los socios de unión, los marcadores, los marcadores de afinidad, las marcas, las sondas (p. ej., sondas de marcado y sondas de marcado) y/o los conjuntos de sondas descritos en este documento pueden inmovilizarse en un sustrato (1) como una matriz (2). La matriz tiene múltiples miembros (3-10) que pueden o no tener una superposición (6) entre los miembros. Cada miembro puede tener al menos un área sin superposición con otro miembro (3-5 y 7-10). Algunas veces, cada miembro puede tener diferentes formas (p. ej., puntos circulares (3-8), triángulos (9) y cuadrados (10)) y dimensiones. Un miembro de una matriz puede tener un área de aproximadamente de 1 a 10<7>micras<2>, de 100 a 10<7>micras<2>, de 10<3>a 10<8>micras<2>, de 10<4>a 10<7>micras<2>; de 10<5>a 10<7>micras<2>; aproximadamente 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 10<3>, 10<4>, 10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>o más micras<2>; y/o aproximadamente 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 10<3>, 10<4>, 10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>o menos micras<2>. La imagen de un miembro ejemplar (8) según algunas formas de realización de la presente invención se muestra como elemento 12. Además, dos o más miembros que comprenden las parejas de unión, los marcadores, los marcadores de afinidad, los marcadores, las sondas (p. ej., sondas de marcado y sondas de marcado) y/o los conjuntos de sondas del mismo tipo pueden tener la misma forma y dimensión. Específicamente, los elementos de una matriz que comprende las parejas de unión, los marcadores, los marcadores de afinidad, los marcadores, las sondas de marcado y/o los conjuntos de sondas configurados o utilizados para detectar la misma variación genética o un control, según los métodos descritos en este documento, pueden tener las mismas formas y dimensiones. Además, todos los elementos de las matrices sobre el sustrato pueden tener las mismas formas y dimensiones. En ocasiones, los elementos de una matriz que comprende las parejas de unión, los marcadores, los marcadores de afinidad, los marcadores, las sondas y/o los conjuntos de sondas configurados o utilizados para detectar diferentes variaciones genéticas y/o controles, según los métodos descritos en este documento, pueden tener las mismas formas y dimensiones. En ocasiones, cada elemento de la matriz puede comprender diferentes parejas de unión, los marcadores, los marcadores de afinidad, los marcadores, las sondas y/o los conjuntos de sondas.

[0100] A veces, dos miembros de la matriz pueden estar separados por (i) una distancia, en la que puede no haber o solo muy pocos socios de unión, los marcadores, los marcadores de afinidad, los marcadores, las sondas (p. ej., sondas de marcado y sondas de marcado) y/o los conjuntos de sondas inmovilizados, y/o (ii) cualquier separador que distinga a un miembro del otro (p. ej., sustrato aumentado, cualquier material que evite la unión de los socios de unión, los marcadores, los marcadores de afinidad, las sondas (p. ej., sondas de marcado) y/o los conjuntos de sondas al sustrato, y cualquier material que no sea sonda entre los miembros). A veces, los miembros de la matriz pueden distinguirse entre sí al menos solo por sus ubicaciones. Los miembros de la matriz pueden estar separados por una distancia de aproximadamente 0 a 10<4>micras, de 0 a 10<3>micras, de 10<2>a 10<4>micras o de 10<2>a 10<3>micras; aproximadamente 0, 0,001, 0,1, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 50, 100, 10<3>, 10<4>, 10<5>, 10<6>, 10<7>o 10<8>micras o más; y/o aproximadamente 0, 0,001, 0,1, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 50, 100, 10<3>, 10<4>, 10<5>, 10<6>, 10<7>o 10<8>micras o menos. En este caso, la distancia entre dos elementos del conjunto puede determinarse por la distancia más corta entre sus bordes. Por ejemplo, en la figura 1, la distancia entre dos elementos, los elementos 3 y 4, del conjunto (2), es la distancia indicada por el elemento n. Además, por ejemplo, la distancia mínima entre los elementos del arreglo (2) en un sustrato (1) es 0, como la distancia entre dos elementos, los elementos 10 y 11, del arreglo. En ocasiones, dos elementos del arreglo pueden no estar separados y solaparse (6). En ocasiones, cada elemento puede tener al menos un área sin solapamiento con otro elemento (7).

[0102] En ocasiones, una matriz y sus componentes (pares de unión, marcadores, marcadores de afinidad, marcadores, sondas o conjuntos de sondas) descritos en este documento pueden ubicarse en ubicaciones predeterminadas del sustrato. Las formas y dimensiones de cada componente de la matriz, así como la distancia entre ellos, pueden predeterminarse antes de la inmovilización. En este contexto, la ubicación predeterminada se refiere a una ubicación que se determina o identifica antes de la inmovilización. Por ejemplo, la forma y las dimensiones de cada componente de una matriz se determinan o identifican antes de la inmovilización.

[0104] [0039]En ocasiones, el sustrato puede comprender una matriz de parejas de unión, cada una de las cuales comprende las parejas de unión, como oligonucleótidos o polinucleótidos, inmovilizadas (p. ej., mediante un enlace químico que no se rompería durante la hibridación de las sondas con las parejas de unión del sustrato descrito aquí) en una región o ubicación espacialmente definida; es decir, las regiones o ubicaciones son espacialmente discretas o están separadas por una región o ubicación definida en el sustrato. En ocasiones, el sustrato puede comprender una matriz, cada una de las cuales comprende parejas de unión que se unen a una región o ubicación espacialmente definida. Cada una de las ubicaciones espacialmente definidas configuradas para comprender las parejas de unión puede ser, además, "direccionable", ya que su ubicación y la identidad de sus parejas de unión inmovilizadas son conocidas o predeterminadas, por ejemplo, antes de su uso, análisis o unión a sus parejas de unión en sondas de marcado o conjuntos de sondas. El término "direccionable", en relación con los conjuntos de sondas inmovilizados al sustrato, significa que la secuencia de nucleótidos u otras características físicas o químicas de una parte unida al extremo (p. ej., un compañero de unión del compañero de unión del sustrato, etiqueta, etiqueta de afinidad y sonda de marcado) de un conjunto de sondas descrito en este documento puede determinarse a partir de su dirección, es decir, una correspondencia biunívoca entre la secuencia u otra propiedad de la parte unida al extremo del conjunto de sondas y una ubicación espacial en, o característica del, sustrato al que está inmovilizado el conjunto de sondas. Por ejemplo, la dirección de una parte unida al extremo de un conjunto de sondas es una ubicación espacial, p. ej., las coordenadas planas de una región particular que inmoviliza copias de la parte unida al extremo del conjunto de sondas. Sin embargo, las partes unidas al extremo de los conjuntos de sondas también pueden direccionarse de otras maneras, p. ej., por color, frecuencia del microtranspondedor o similar, p. ej., Chandler et al., publicación PCT WO 97/14028. En ocasiones, los métodos descritos en este documento excluyen el "micromatriz aleatorio", que se refiere a un micromatriz cuyas regiones espacialmente discretas de las parejas de unión (p. ej., oligonucleótidos o polinucleótidos) del sustrato o las partes unidas a los extremos de los conjuntos de sondas no están direccionadas espacialmente. Es decir, la identidad de las parejas de unión, la etiqueta, la etiqueta de afinidad, la sonda de marcado o los conjuntos de sondas no es discernible, al menos inicialmente, a partir de su ubicación. En ocasiones, los métodos descritos en este documento excluyen los micromatrices aleatorios, que son conjuntos planos de microperlas.

[0106] Una matriz de ácido nucleico, según algunas formas de realización de la presente divulgación, puede producirse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, entre otros, los descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2013/0172216; Schena, Micromatrices: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 2000). Por ejemplo, puede utilizarse una matriz de captura de ADN. La matriz de captura de ADN es un sustrato sólido (p. ej., un portaobjetos de vidrio) con oligonucleótidos localizados unidos covalentemente a la superficie. Estos oligonucleótidos pueden tener uno o más tipos en la superficie y, además, pueden estar segregados geográficamente a lo largo del sustrato. En condiciones de hibridación, las matrices de captura de ADN se unirán preferentemente a dianas complementarias en comparación con otras fracciones no específicas, actuando así para localizar dianas en la superficie y separarlas de especies no deseadas.

[0108] Las sondas de marcado primera y segunda y/o las sondas de marcado amplificadas de las mismas ligadas a las sondas de marcado inmovilizadas comprenden marcadores primero y segundo, respectivamente.

[0110] En este documento, la sonda de marcado se refiere a una sonda que comprende o está configurada para unirse a un marcador. La sonda de marcado puede comprender un marcador o puede modificarse para comprender o unirse a un marcador. La sonda amplificada se define como las copias adicionales de una sonda inicial producidas tras la amplificación de la sonda inicial, como se describe en este documento. Por consiguiente, las sondas amplificadas pueden tener una secuencia que corresponde a las secuencias de nucleótidos de las sondas iniciales y/o una secuencia complementaria de las secuencias de nucleótidos de las sondas iniciales. Las sondas amplificadas pueden contener una secuencia que coincide parcial o totalmente con las secuencias de nucleótidos de las sondas iniciales. Los términos "complementario" o "complementariedad" se utilizan en referencia a una secuencia de nucleótidos relacionada por las reglas de apareamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "5'-CAGT-3'" es complementaria a la secuencia "5'-ACTG-3'". La complementariedad puede ser "parcial" o "total". La complementariedad parcial se da cuando uno o más nucleótidos de un ácido nucleico en una sonda no coinciden según las reglas de apareamiento de bases, mientras que otros sí lo hacen. La complementariedad total o completa entre ácidos nucleicos se da cuando cada base de un ácido nucleico en la sonda coincide con otra base según las reglas de apareamiento de bases.

[0112] En este documento, se define como sonda inmovilizada una sonda que se une directa o indirectamente al sustrato mediante un enlace físico o químico. En algunas formas de realización, una sonda de marcado puede inmovilizarse indirectamente a un sustrato mediante la ligadura a una sonda de marcado inmovilizada al sustrato descrito en este documento.

[0114] [0044]En el presente documento, se entiende por marcador una molécula, colorante o fracción orgánica, natural, sintética, artificial o artificial, que posee una propiedad o característica detectable y, opcionalmente, cuantificable. Un marcador puede ser directamente detectable (p. ej., radioisótopos, fluoróforos, quimioluminóforos, enzimas, partículas coloidales, sustancias fluorescentes, puntos cuánticos u otras nanopartículas, nanoestructuras, compuestos metálicos, marcadores organometálicos y aptámeros peptídicos); o indirectamente detectable mediante ligantes específicos. Entre las sustancias fluorescentes se incluyen colorantes fluorescentes como la fluoresceína, el fósforo, la rodamina, los derivados de colorantes de polimetina y similares. Entre los ejemplos de sustancias fluorescentes disponibles comercialmente se incluyen tintes fluorescentes como BODYPY FL (marca registrada, producida por Molecular Probes, Inc.), FluorePrime (nombre del producto, producido por Amersham Pharmacia Biotech, Inc.), Fluoredite (nombre del producto, producido por Millipore Corporation), FAM (producido por ABI Inc.), Cy 3 y Cy 5 (producidos por Amersham Pharmacia), TAMRA (producido por Molecular Probes, Inc.), Pacific Blue, TAMRA, Alexa 488, Alexa 594, Alexa 647, Atto 488, Atto 590, Atto 647N, etc. Un «punto cuántico» (QD) se refiere a una estructura cristalina semiconductora a escala nanométrica, generalmente hecha de seleniuro de cadmio, que absorbe la luz y la reemite un par de nanosegundos después en un color específico. Los QD con una variedad de superficies conjugadas o reactivas, por ejemplo, amino, carboxilo, estreptavidina, proteína A, biotina e inmunoglobulinas, también están abarcados en la presente divulgación.

[0116] Los marcadores primero y segundo son diferentes para que puedan distinguirse entre sí. En otras formas de realización, las propiedades físicas, ópticas y/o químicas de los marcadores primero y segundo difieren.

[0118] Los marcadores inmovilizados son ópticamente resolubles. El término "marcador ópticamente resoluble" o "marcador ópticamente resoluble individualmente" se refiere en este documento a un grupo de etiquetas que pueden distinguirse entre sí por su emisión fotónica u otras propiedades ópticas, por ejemplo, tras la inmovilización descrita en este documento. En ocasiones, aunque los marcadores tengan las mismas propiedades ópticas o de emisión espectral, los marcadores inmovilizados pueden distinguirse espacialmente. En ocasiones, los marcadores del mismo tipo (definidos como marcadores con las mismas propiedades ópticas) se inmovilizan sobre el sustrato, por ejemplo, como parte de una matriz descrita en este documento, con una densidad o espaciamiento tal que las sondas producto individuales son resolubles, como se muestra en el punto 12 de la figura 1. En esta divulgación, los "mismos marcadores" se definen como marcadores con idéntica composición química y física. En este documento, los "diferentes marcadores" se refieren a marcadores con diferentes composiciones químicas o físicas, incluyendo "marcadores de diferentes tipos" con diferentes propiedades ópticas. En el presente documento, "diferentes marcadores del mismo tipo" significa marcadores que tienen diferentes composiciones químicas y/o físicas, pero las mismas propiedades ópticas.

[0120] El elemento 12 de la figura 1 muestra la imagen de un miembro ejemplar de una matriz que comprende marcadores inmovilizados. En ocasiones, los marcadores son direccionables espacialmente, ya que la ubicación de una molécula especifica su identidad (y en la síntesis combinatoria espacial, la identidad es consecuencia de la ubicación). Un miembro de la matriz sobre el sustrato puede tener una o varias sondas marcadas inmovilizadas. Cuando se inmovilizan varias sondas marcadas en un miembro de la matriz, los marcadores del mismo tipo en las sondas marcadas inmovilizadas en dicho miembro de la matriz sobre el sustrato pueden distinguirse espacialmente, como se muestra en el elemento 12 de la figura 1. En algunas formas de realización, los marcadores inmovilizados del mismo tipo están separados por una distancia aproximada de 1 a 1000 nm, de 5 a 100 nm o de 10 a 100 nm; aproximadamente 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 nm o más; y/o aproximadamente 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 nm o menos en todas las dimensiones. La densidad de los productos de sonda y sus marcadores en los sustratos puede alcanzar varios millones (y hasta mil millones o más) de productos de sonda por sustrato. La capacidad de contar grandes cantidades de productos de sonda que contienen los marcadores permite una cuantificación precisa de las secuencias de ácidos nucleicos.

[0122] En ocasiones, las sondas de marcado inmovilizadas primera y segunda, o sus sondas de marcado amplificadas, comprenden marcadores primero y segundo, respectivamente. En el presente documento, la sonda de marcado se refiere a una sonda configurada para unirse directa o indirectamente al sustrato. La sonda de marcado puede unirse al sustrato o modificarse para unirse a él. En el presente documento, un marcador o marcador de afinidad se refiere a un motivo para el aislamiento, enriquecimiento o inmovilización específicos de los productos de la sonda. Entre los ejemplos del marcador o marcador de afinidad se incluyen un compañero de unión descrito en el presente documento, secuencias de ADN únicas que permiten la captura específica de la secuencia, incluyendo secuencias genómicas naturales o no genómicas artificiales, biotina-estreptavidina, marcadores His, octapéptido FLAG, química clic (p. ej., pares de grupos funcionales que reaccionan rápida y selectivamente entre sí en condiciones acuosas suaves) y anticuerpos (p. ej., azida-ciclina). Por ejemplo, la etapa de inmovilización comprende hibridar al menos una parte del marcador, el marcador de afinidad o la secuencia de nucleótidos de marcado con la molécula de nucleótido correspondiente inmovilizada en el sustrato. La etiqueta o el marcador de afinidad está configurada para unirse a entidades que incluyen, entre otras, una perla, una perla magnética, un portaobjetos, un cubreobjetos, una micromatriz o una molécula. En algunas formas de realización, la etapa de inmovilización se realiza inmovilizando los marcadores en la ubicación predeterminada del sustrato.

[0124] Se contabiliza el número de diferentes marcadores inmovilizados en el sustrato y, por lo tanto, el número de diferentes sondas producto inmovilizadas que las componen. En ocasiones, las sondas producto de cada locus genético se agrupan y se contabilizan los marcadores de las sondas producto inmovilizadas. En ocasiones, se pueden analizar múltiples secuencias dentro de un locus genómico mediante la creación de múltiples tipos de sondas producto. En este ejemplo, se pueden combinar diferentes sondas producto para el mismo locus genómico (posiblemente mediante inmovilización en una ubicación común de un sustrato, p. ej., como miembro de una matriz descrita en este documento), y los marcadores de estas sondas producto pueden contabilizarse directamente. También se pueden separar diferentes sondas producto para el mismo locus genómico (posiblemente mediante inmovilización en diferentes ubicaciones de un sustrato, p. ej., como miembros de una matriz descrita en este documento), y los marcadores de estas sondas producto pueden contabilizarse directamente. En otras formas de realización, el sustrato puede tener uno o más marcadores de afinidad específicas en cada ubicación del sustrato, p. ej., como miembro de una matriz del sustrato. Por lo tanto, otro método para cuantificar secuencias de ácidos nucleicos consiste en inmovilizar sondas producto de un único locus genómico (puede ser un tipo de sonda producto o un conjunto de más de una sonda producto para un locus genómico específico) en la misma ubicación de un sustrato (p. ej., como el mismo miembro de una matriz descrita en este documento) que las sondas producto de un segundo locus genómico, que puede o no servir como locus de referencia o control. En este caso, las sondas producto del primer locus genómico se distinguirán de las sondas producto del segundo locus genómico, basándose en la presencia de diferentes marcadores utilizados en su generación.

[0125] En un ejemplo, para detectar la trisomía 21 (aneuploidía) de un feto mediante el análisis de una muestra de sangre materna, se generaría un conjunto de productos de sonda correspondientes al cromosoma 21, por ejemplo, con un fluoróforo rojo, y se contarían. También se generaría un segundo conjunto de productos de sonda a partir de un locus de referencia o control, por ejemplo, el cromosoma 18, y se contarían. Este segundo conjunto de productos de sonda podría generarse, por ejemplo, con un fluoróforo verde.

[0127] En ocasiones, estos productos de sonda pueden prepararse de forma que se agrupen por locus (en este caso, el cromosoma 21 o el cromosoma 18) y se cuenten por separado en un sustrato. Es decir, los productos de sonda correspondientes al cromosoma 21 pueden aislarse y contarse por separado, y los productos de sonda correspondientes al cromosoma 18 pueden aislarse y contarse por separado. Estos productos de sonda también pueden prepararse de forma que se agrupen en la misma ubicación de un sustrato (por ejemplo, como el mismo miembro de una matriz descrita en este documento). En este caso, en la misma región de un sustrato, los productos de sonda con fluoróforo rojo corresponderán al cromosoma 21, y los productos de sonda con fluoróforo verde corresponderán al cromosoma 18. Por ejemplo, dado que todos estos productos de sonda se pueden resolver individualmente y, por lo tanto, pueden contabilizarse con gran precisión, una mayor frecuencia de productos de sonda del cromosoma 21 en relación con los productos de sonda del cromosoma 18 (incluso tan pequeña como 0,01 %, 0,1 %, uno o más por ciento o menos) indicará la presencia de trisomía 21 en un feto. En este caso, los productos de sonda del cromosoma 18 pueden servir como control.

[0129] Los métodos comprenden el recuento de los marcadores de los conjuntos de sondas inmovilizados en el sustrato. Los métodos comprenden el recuento de (i) un primer número de el primer marcador inmovilizado en el sustrato y (ii) un segundo número del segundo marcador inmovilizado en el sustrato. El recuento puede realizarse después de inmovilizar el conjunto de sondas ligado a un sustrato, y el sustrato con los conjuntos de sondas ligados inmovilizados puede almacenarse en condiciones que eviten la degradación de los conjuntos de sondas ligados (por ejemplo, a temperatura ambiente o inferior) antes del recuento.

[0131] Para cuantificar con precisión la abundancia relativa de diferentes secuencias genómicas, por ejemplo, para cuantificar el número de copias de ADN o la frecuencia alélica, se puede contar un gran número de productos de sonda. Por ejemplo, un marcador puede detectarse y contarse midiendo, por ejemplo, propiedades fisicoquímicas, electromagnéticas, eléctricas, optoelectrónicas o electroquímicas, o las características del marcador inmovilizada.

[0133] En algunas formas de realización, la etiqueta puede detectarse mediante microscopía de sonda de barrido (SPM), microscopía de efecto túnel de barrido (STM) y microscopía de fuerza atómica (AFM), microscopía electrónica, técnicas de interrogación/detección óptica, incluyendo, entre otras, microscopía óptica de barrido de campo cercano (NSOM), microscopía confocal y excitación de ondas evanescentes. Versiones más específicas de estas técnicas incluyen la microscopía confocal de campo lejano, la microscopía de dos fotones, la iluminación epi de campo amplio y la microscopía de reflexión interna total (TIR). Muchas de las técnicas mencionadas también pueden utilizarse en modo espectroscópico. La detección real se realiza mediante cámaras con dispositivo de carga acoplada (CCD) y CCD intensificados, fotodiodos o tubos fotomultiplicadores. En algunas formas de realización, el recuento comprende un análisis óptico que detecta una propiedad óptica de un marcador. En otras formas de realización, el análisis óptico comprende un análisis de imagen, como se describe en el presente documento.

[0135] En otro aspecto, el paso de conteo comprende la lectura del sustrato en los canales de imagen primero y segundo que corresponden a las marcas primera y segunda, respectivamente, y la generación de una o más imágenes del sustrato, donde las sondas de marcado primera y segunda se pueden resolver en dichas imágenes. En algunas formas de realización, el paso de conteo comprende el filtrado espacial para la segmentación de imágenes. En otras formas de realización, el paso de conteo comprende el análisis de cuencas hidrográficas o un método híbrido para la segmentación de imágenes.

[0137] Los métodos también pueden observar la frecuencia de diferentes alelos en el mismo locus genético (p. ej., dos alelos de un polimorfismo de un solo nucleótido dado). La precisión de estos métodos puede detectar cambios muy pequeños en la frecuencia (p. ej., tan bajos como aproximadamente 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,1 o 0,01 % o menos). Como ejemplo, en el caso del trasplante de órganos, una muestra de sangre contendrá una firma genética muy diluida del órgano donado. Esta firma puede ser la presencia de un alelo que no está en el genoma del receptor del órgano donado. Los métodos pueden detectar desviaciones muy pequeñas en la frecuencia de los alelos (p. ej., tan bajas como aproximadamente 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,1 o 0,01 % o menos) y pueden identificar la presencia de ADN del donante en una muestra del huésped (p. ej., muestra de sangre). Un órgano trasplantado en mal estado puede resultar en niveles elevados de ADN del donante en la sangre del receptor, con un aumento de tan solo un pequeño porcentaje (p. ej., tan solo un 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 % o 0,01 % o menos). Los métodos pueden ser lo suficientemente sensibles como para identificar cambios en la frecuencia alélica con la sensibilidad necesaria y, por lo tanto, determinar con precisión la presencia y las cantidades cambiantes de ADN del donante en la sangre del receptor.

[0139] Los métodos comprenden la comparación del primer y segundo número para determinar la variación genética en la muestra genética. En algunas formas de realización, la etapa de comparación comprende obtener una estimación del número relativo de moléculas de nucleótidos que tienen la primera y la segunda región de ácido nucleico de interés.

[0140] En otro aspecto, los métodos de la presente divulgación pueden comprender el marcado de la primera y la segunda sonda de marcado con el primer y el segundo marcador, respectivamente, antes de la etapa de contacto (p. ej., durante la fabricación de las sondas). El marcado de la sonda puede realizarse simultáneamente o después de poner en contacto las sondas con la muestra genética, hibridar, ligar, amplificar o inmovilizar las sondas. Además, el marcado de la sonda puede realizarse simultáneamente o antes de poner en contacto las sondas con la muestra genética, hibridar, ligar, amplificar o inmovilizar las sondas. El marcado de una sonda puede comprender la adición, inmovilización o unión de un marcador a la sonda mediante un enlace físico o químico. Los marcadores pueden colocarse en cualquier lugar de la secuencia de una sonda, incluso en el extremo 5' o 3'.

[0142] En otro aspecto, los métodos de la presente divulgación pueden comprender el marcado de la primera y la segunda sonda de marcado con una primera y una segunda etiqueta, respectivamente, antes de la etapa de contacto (p. ej., durante la fabricación de las sondas). El marcado de la sonda puede realizarse simultáneamente o después de poner en contacto las sondas con la muestra genética, hibridar, ligar, amplificar o marcar las sondas. Además, el marcado de la sonda puede realizarse simultáneamente o antes de poner en contacto las sondas con la muestra genética, hibridar, ligar, amplificar, inmovilizar o marcar las sondas. El marcado de una sonda puede comprender la adición, inmovilización o unión de un marcador a la sonda mediante un enlace físico o químico. Los marcadores pueden colocarse en cualquier punto de la secuencia de una sonda, incluyendo el extremo 5' o 3'.

[0144] En otro aspecto, los conjuntos de sondas de este documento pueden diseñarse para tener marcadores según las ubicaciones predeterminadas donde se inmovilizarán. En algunas formas de realización, los marcadores de todos los conjuntos de sondas configurados para detectar una variación genética son las mismas y están configuradas para inmovilizarse en las mismas ubicaciones del sustrato, directa o indirectamente. En otras formas de realización, los marcadores primero y segundo son las mismas, y cada una de las demás es diferente de la primera o la segunda. En ocasiones, cada miembro de un grupo de múltiples ubicaciones predeterminadas en un sustrato puede tener un marcador único para inmovilizar.

[0146] Los conjuntos de sondas se amplifican y, durante el proceso de amplificación, se producen conjuntos de sondas marcados. Cada sonda de marcado puede comprender una secuencia de cebador directo o inversa, y cada sonda de marcado puede comprender una secuencia de cebador inverso o directa correspondiente y una secuencia de nucleótidos de marcado como etiqueta. Las secuencias de cebador directo e inversa son las secuencias configuradas para hibridar con los cebadores directo e inverso correspondientes, respectivamente. En algunas formas de realización, la etapa de amplificación comprende amplificar (i) las primeras sondas de marcado y etiquetado ligadas con los primeros cebadores directo e inverso que hibridan con las secuencias de cebador directo e inversa, respectivamente, donde el primer cebador directo o inverso que hibrida con la primera sonda de marcado comprende el primer marcador, y (ii) las segundas sondas de marcado y etiquetado ligadas con los segundos cebadores directo e inverso que hibridan con las secuencias de cebador directo e inversa, respectivamente, donde el segundo cebador directo o inverso que hibrida con la segunda sonda de marcado comprende el segundo marcador. En otras formas de realización, las secuencias de nucleótidos de marcado amplificadas de las sondas de marcado se inmovilizan en una ubicación predeterminada sobre un sustrato, donde las secuencias de nucleótidos de marcado amplificadas de la primera y la segunda sonda de marcado son los marcadores primero y segundo. Los marcadores primero y segundo son los mismos o están configurados para unirse a la misma ubicación sobre el sustrato. En ocasiones, los marcadores primero y segundo son diferentes o están configurados para unirse a diferentes ubicaciones sobre el sustrato. El método comprende el recuento del número de marcadores en las sondas amplificadas o en los conjuntos de sondas inmovilizadas sobre el sustrato. Por ejemplo, el primer número corresponde al número de el primer marcador en el primer conjunto de sondas amplificadas inmovilizadas sobre el sustrato, y el segundo número corresponde al número del segundo marcador en el segundo conjunto de sondas amplificadas inmovilizadas sobre el sustrato.

[0148] En ocasiones, los conjuntos de sondas, según algunas formas de realización, pueden amplificarse y producirse conjuntos de sondas marcados utilizando cebadores inversos marcados sin utilizar un cebador directo. En ocasiones, cada sonda de marcado puede comprender una secuencia de cebador inverso, y cada sonda de marcado puede comprender una secuencia de nucleótidos de marcado como etiqueta. En algunas formas de realización, la etapa de amplificación puede comprender: (i) la primera sonda de marcado y etiquetado ligada con un primer cebador inverso que hibrida con una primera secuencia de cebador inverso de la primera sonda de marcado, donde el primer cebador inverso comprende el primer marcador, y (ii) la segunda sonda de marcado y etiquetado ligada con un segundo cebador inverso que hibrida con una segunda secuencia de cebador inverso de la segunda sonda de marcado, donde el segundo cebador inverso comprende el segundo marcador. A veces, las secuencias de nucleótidos de marcado amplificadas de las sondas de marcado se inmovilizan en una ubicación predeterminada sobre un sustrato, en donde las secuencias de nucleótidos de marcado amplificadas de la primera y la segunda sonda de marcado son los marcadores primero y segundo. A veces, el primer número es el número de el primer marcador en el primer conjunto de sondas amplificadas inmovilizadas en el sustrato, y el segundo número es el número del segundo marcador en el segundo conjunto de sondas amplificadas inmovilizadas en el sustrato.

[0150] [0063]En otro aspecto, los conjuntos de sondas ligadas, según algunas formas de realización, pueden producirse mediante una reacción en cadena de la ligasa. En otro aspecto, el método descrito en este documento comprende la puesta en contacto de un tercer y un cuarto conjunto de sondas con la muestra genética, donde el tercer conjunto de sondas comprende una tercera sonda de marcado y una tercera sonda de marcado, y el cuarto conjunto de sondas comprende una cuarta sonda de marcado y una cuarta sonda de marcado. El método puede comprender además la hibridación del primer y el segundo conjunto de sondas con la primera y la segunda cadena de ácido nucleico sentido de interés en moléculas de nucleótidos monocatenarios de las moléculas de nucleótidos bicatenarios de la muestra genética, respectivamente; y la hibridación del tercer y el cuarto conjunto de sondas con las cadenas de ácido nucleico antisentido de la primera y la segunda cadena de ácido nucleico sentido de interés, respectivamente. El método puede comprender además la producción de conjuntos de sondas ligadas primero, segundo, tercero y cuarto, al menos mediante la ligadura de (i) la primera sonda de marcado y la primera sonda de marcado, (ii) la segunda sonda de marcado y la segunda sonda de marcado, (iii) la tercera sonda de marcado y la tercera sonda de marcado, y (iv) la cuarta sonda de marcado y la cuarta sonda de marcado. El método puede comprender además la realización de una reacción en cadena de la ligasa conocida en la técnica para amplificar la sonda o los conjuntos de sondas ligadas. En algunas formas de realización, la reacción en cadena de la ligasa puede comprender la hibridación de conjuntos de sondas no ligadas primero, segundo, tercero y cuarto con los conjuntos de sondas ligadas tercero, cuarto, primero y segundo, respectivamente, y la ligadura de al menos (i) la primera sonda de marcado y la primera sonda de marcado, (ii) la segunda sonda de marcado y la segunda sonda de marcado, (iii) la tercera sonda de marcado y la tercera sonda de marcado, y (iv) la cuarta sonda de marcado y la cuarta sonda de marcado de los conjuntos de sondas no ligadas. El método puede comprender además la inmovilización de las sondas de marcado en la ubicación predeterminada sobre un sustrato. Las sondas de marcado primera, segunda, tercera y cuarta, ligadas a las sondas de marcado inmovilizadas, comprenden respectivamente marcas primera, segunda, tercera y cuarta; las marcas inmovilizadas son ópticamente resolubles; las sondas de marcado inmovilizadas comprenden marcas primera, segunda, tercera y cuarta, respectivamente, y la etapa de inmovilización se realiza inmovilizando las marcas en la ubicación predeterminada. El método puede comprender además el recuento de (i) la primera suma de las marcas primera y tercera inmovilizadas en el sustrato, y (ii) la segunda suma de las marcas segunda y cuarta inmovilizadas en el sustrato, y la comparación de estas sumas para determinar la variación genética en la muestra genética. En otras formas de realización, el método comprende además el marcado de las sondas de marcado primera, segunda, tercera y cuarta con las marcas primera, segunda, tercera y cuarta, respectivamente, antes de la etapa de contacto. En otras formas de realización adicionales, la primera y la tercera etiqueta son la misma, y la segunda y la cuarta etiqueta son la misma.

[0152] En otro aspecto, el método descrito en este documento comprende la puesta en contacto de un tercer y un cuarto conjunto de sondas con la muestra genética. El tercer conjunto de sondas comprende una tercera sonda de marcado y una tercera sonda de marcado, y el cuarto conjunto de sondas comprende una cuarta sonda de marcado y una cuarta sonda de marcado. Las sondas de marcado comprenden una primera secuencia de cebador inverso, las sondas de marcado comprenden una segunda secuencia de cebador inverso, y cada sonda de marcado comprende una secuencia de nucleótidos de marcado como etiqueta. El método puede comprender además la hibridación del primer y el segundo conjunto de sondas con la primera y la segunda cadena de ácido nucleico sentido de interés, respectivamente, en moléculas de nucleótidos monocatenarios de moléculas de nucleótidos bicatenarios de la muestra genética; e hibridación de al menos partes del tercer y el cuarto conjunto de sondas con cadenas de ácido nucleico antisentido de la primera y la segunda cadena de ácido nucleico sentido de interés, respectivamente. Producción de conjuntos de sondas ligadas primero, segundo, tercero y cuarto mediante la ligadura de (i) la primera sonda de marcado y la primera sonda de marcado, (ii) la segunda sonda de marcado y la segunda sonda de marcado, (iii) la tercera sonda de marcado y la tercera sonda de marcado, y (iv) la cuarta sonda de marcado y la cuarta sonda de marcado. El método puede comprender además una reacción en cadena de la ligasa. En algunas formas de realización, la reacción en cadena de la ligasa comprende la hibridación de al menos partes de los conjuntos de sondas no ligadas primero, segundo, tercero y cuarto con los conjuntos de sondas ligadas tercero, cuarto, primero y segundo, respectivamente, y la ligadura de (i) la primera sonda de marcado y la primera sonda de marcado, (ii) la segunda sonda de marcado y la segunda sonda de marcado, (iii) la tercera sonda de marcado y la tercera sonda de marcado, y (iv) la cuarta sonda de marcado y la cuarta sonda de marcado del conjunto de sondas no ligadas. El método puede comprender además amplificar (i) los conjuntos de sondas primero y tercero ligados con un primer cebador inverso que hibrida con la primera secuencia de cebador inverso, donde el primer cebador inverso comprende el primer marcador, y (ii) los conjuntos de sondas segundo y cuarto ligados con un segundo cebador inverso que hibrida con la segunda secuencia de cebador inverso, donde el segundo cebador inverso comprende el segundo marcador, las secuencias de nucleótidos de marcado amplificadas de las sondas de marcado están inmovilizadas en una ubicación predeterminada sobre un sustrato, donde las secuencias de nucleótidos de marcado amplificadas de las sondas de marcado primera, segunda, tercera y cuarta son marcadores primero, segundo, tercero y cuarto, el primer número es el número del primer marcador en los conjuntos de sondas primero y tercero amplificados inmovilizados en el sustrato, y el segundo número es el número del segundo marcador en los conjuntos de sondas segundo y cuarto amplificados inmovilizados en el sustrato.

[0154] En otro aspecto, las sondas de marcado primera y segunda ligadas se encuentran en el extremo 3' del primer y segundo conjunto de sondas ligadas y comprenden una primera y una segunda secuencia de cebador inverso que hibridan con el primer y segundo cebador inverso, respectivamente. En algunas formas de realización, el primer y segundo cebador inverso comprenden el primer y segundo marcador. En formas de realización adicionales, las sondas de marcado primera y segunda ligadas se encuentran en el extremo 5' del primer y segundo conjunto de sondas ligadas. En otras formas de realización, las sondas de marcado primera y segunda ligadas se encuentran en el extremo 5' del primer y segundo conjunto de sondas ligadas y comprenden una primera y una segunda secuencia de cebador directo correspondientes que hibridan con el primer y segundo cebador directo, respectivamente.

[0156] [0066]En otro aspecto, el método descrito comprende la digestión de moléculas bicatenarias en la muestra para producir moléculas monocatenarias. En algunas formas de realización, la etapa de amplificación comprende poner en contacto una exonucleasa con la sonda o conjunto de sondas amplificadas, y digerir la sonda o conjunto de sondas amplificadas desde el extremo 5' de una de las hebras de la sonda o conjunto de sondas bicatenarias. Por ejemplo, la etapa de amplificación comprende poner en contacto una exonucleasa con la sonda amplificada en un conjunto de sondas, y digerir el conjunto de sondas amplificadas desde el extremo 5' de una de las hebras del conjunto de sondas bicatenarias. En otras formas de realización, la hebra de la sonda o conjunto de sondas amplificadas que entra en contacto con la exonucleasa no tiene ningún marcador en el extremo 5'. El contacto de la exonucleasa con las sondas bicatenarias sin marcar puede digerir la hebra sin marcar desde el extremo 5', produciendo sondas monocatenarias. En otro aspecto, el extremo 5' del conjunto de sondas amplificadas que comprende la etiqueta en el extremo 5' puede protegerse de la digestión con exonucleasa.

[0158] En otro aspecto, el método puede detectar de 1 a 100, de 1 a 50, de 2 a 40 o de 5 a 10 variaciones genéticas; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más variaciones genéticas; y 100, 50, 30, 20, 10 o menos variaciones genéticas. En algunas formas de realización, el método descrito en este documento puede detectar x número de variaciones genéticas utilizando al menos (x+1) número de conjuntos de sondas diferentes. En estas formas de realización, se pueden comparar varios marcadores de un tipo de conjunto de sondas con uno o más marcadores del resto de los diferentes tipos de conjuntos de sondas. En algunas formas de realización, el método descrito en este documento puede detectar variación genética de forma continua en todo el genoma a diversas resoluciones, por ejemplo, a una resolución de 300.000 bases, de modo que 100 variaciones distribuidas en todos los cromosomas se interroguen y cuantifiquen por separado. En formas de realización adicionales, la resolución base está en el rango de uno o diez a 100 mil nucleótidos hasta un millón, diez millones o 100 millones o más de nucleótidos.

[0160] En otro aspecto, el método, según algunas formas de realización, puede detectar al menos dos variaciones genéticas. En algunas formas de realización, el método descrito en este documento puede comprender además la puesta en contacto de un quinto conjunto de sondas con la muestra genética, donde dicho conjunto comprende una quinta sonda de marcado y una quinta sonda de marcado. El método puede comprender además la hibridación de al menos una parte del quinto conjunto de sondas con la tercera región de ácido nucleico de interés en moléculas de nucleótidos de la muestra genética, donde la tercera región de ácido nucleico de interés es diferente de las regiones primera y segunda de ácido nucleico de interés. El método puede comprender además la ligadura del quinto conjunto de sondas, al menos mediante la ligadura de la quinta sonda de marcado y la quinta sonda de marcado. El método puede comprender además la amplificación de los conjuntos de sondas ligados. El método puede comprender además la inmovilización de cada sonda de marcado en una ubicación predeterminada sobre un sustrato. La quinta sonda de marcado y/o su sonda de marcado amplificada, ligada a la sonda de marcado inmovilizada, comprende un quinto marcador; este marcador es diferente de los marcadores primero y segundo; los marcadores inmovilizados son ópticamente resolubles; la quinta sonda de marcado inmovilizada y/o su sonda de marcado amplificada comprende un quinto marcador; la etapa de inmovilización se realiza inmovilizando los marcadores en la ubicación predeterminada. El método puede comprender el recuento de un tercer número de la quinta etiqueta inmovilizada en el sustrato y la comparación de este tercer número con el primer y/o segundo número para determinar la segunda variación genética en la muestra genética. En algunas formas de realización, el sujeto puede ser una mujer embarazada, la primera variación genética es la trisomía 21 en el feto de la mujer embarazada, y la segunda variación genética se selecciona del grupo que consiste en trisomía 13, trisomía 18, aneuploidía de X y aneuploidía de Y en el feto de la mujer embarazada.

[0162] En otro aspecto, el método, según algunas formas de realización, puede detectar al menos tres variaciones genéticas. En algunas formas de realización, el método descrito en este documento comprende además la puesta en contacto de un sexto conjunto de sondas con la muestra genética, donde dicho sexto conjunto comprende una sexta sonda de marcado y una sexta sonda de marcado. El método puede comprender además la hibridación de al menos una parte del sexto conjunto de sondas con la cuarta región de ácido nucleico de interés en las moléculas de nucleótidos de la muestra genética, donde la cuarta región de ácido nucleico de interés es diferente de la primera, segunda y tercera regiones de ácido nucleico de interés. El método puede comprender además la ligadura del sexto conjunto de sondas, al menos mediante la ligadura de la sexta sonda de marcado y la sexta sonda de marcado. El método puede comprender además la amplificación de los conjuntos de sondas ligados. El método puede comprender además la inmovilización de cada sonda de marcado en una ubicación predeterminada sobre un sustrato. La sexta sonda de marcado y/o su sonda de marcado amplificada, ligada a la sonda de marcado inmovilizada, comprende un sexto marcador; este marcador es diferente de los marcadores primero y segundo; los marcadores inmovilizados son ópticamente resolubles; la sexta sonda de marcado inmovilizada y/o su sonda de marcado amplificada comprenden un sexto marcador; la etapa de inmovilización se realiza inmovilizando los marcadores en la ubicación predeterminada. El método puede comprender además el recuento de un cuarto número del sexto marcador inmovilizado en el sustrato y la comparación de este cuarto número con el primero, el segundo y/o el tercer número para determinar la tercera variación genética en la muestra genética.

[0164] [0070]En otro aspecto, el método, según algunas formas de realización, puede detectar al menos cuatro variaciones genéticas. En algunas formas de realización, el método descrito en este documento comprende además la puesta en contacto de un séptimo conjunto de sondas con la muestra genética, donde dicho séptimo conjunto comprende una séptima sonda de marcado y una séptima sonda de marcado. El método puede además comprender la hibridación de al menos una parte del séptimo conjunto de sondas con la quinta región de ácido nucleico de interés en las moléculas de nucleótidos de la muestra genética, donde la quinta región de ácido nucleico de interés es diferente de la primera, segunda, tercera y cuarta regiones de ácido nucleico de interés. El método puede además comprender la ligadura del séptimo conjunto de sondas, al menos mediante la ligadura de la séptima sonda de marcado y la séptima sonda de marcado. El método puede además comprender, opcionalmente, la amplificación de los conjuntos de sondas ligados. El método puede comprender además la inmovilización de cada sonda de marcado en una ubicación predeterminada sobre un sustrato. La séptima sonda de marcado y/o su sonda de marcado amplificada, ligada a la sonda de marcado inmovilizada, comprende una séptima etiqueta; esta séptima etiqueta es diferente de las marcadores primero y segundo; los marcadores inmovilizados son ópticamente resolubles; la séptima sonda de marcado inmovilizada y/o su sonda de marcado amplificada comprenden una séptima etiqueta; la etapa de inmovilización se realiza inmovilizando los marcadores en la ubicación predeterminada. El método puede comprender además el recuento de un quinto número de la séptima etiqueta inmovilizada en el sustrato y la comparación de este quinto número con el primer, segundo, tercer y/o cuarto número para determinar la cuarta variación genética en la muestra genética.

[0166] En otro aspecto, el método, según algunas formas de realización, puede detectar al menos cinco variaciones genéticas. En algunas formas de realización, el método descrito en este documento comprende además la puesta en contacto de un octavo conjunto de sondas con la muestra genética, donde dicho conjunto comprende una octava sonda de marcado y una octava sonda de marcado. El método puede comprender además la hibridación de al menos una parte del octavo conjunto de sondas con la sexta región de ácido nucleico de interés en las moléculas de nucleótidos de la muestra genética, donde la sexta región de ácido nucleico de interés es diferente de las regiones de ácido nucleico de interés primera, segunda, tercera, cuarta y quinta. El método puede comprender además la ligadura del octavo conjunto de sondas, al menos mediante la ligadura de la octava sonda de marcado y la octava sonda de marcado. El método puede comprender además la amplificación de los conjuntos de sondas ligados. El método puede comprender además la inmovilización de cada sonda de marcado en una ubicación predeterminada sobre un sustrato. La octava sonda de marcado y/o su sonda de marcado amplificada, ligada a la sonda de marcado inmovilizada, comprende un octavo marcador; este marcador es diferente de los marcadores primero y segundo; los marcadores inmovilizados son ópticamente resolubles; la octava sonda de marcado inmovilizada y/o su sonda de marcado amplificada comprenden un octavo marcador; la etapa de inmovilización se realiza inmovilizando los marcadores en la ubicación predeterminada. El método puede comprender además el recuento de un sexto número del octavo marcador inmovilizado en el sustrato y la comparación de este sexto número con el primer, segundo, tercer, cuarto y/o quinto número para determinar la quinta variación genética en la muestra genética. En algunas formas de realización, el sujeto es una mujer embarazada, y la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta variación genética son trisomía 13, trisomía 18, trisomía 21, aneuploidía X y aneuploidía Y en el feto de la mujer embarazada.

[0168] En otro aspecto, el sujeto es una mujer embarazada, la variación genética es trisomía 21 en el feto de la mujer embarazada, la primera región de ácido nucleico de interés está ubicada en el cromosoma 21 y la segunda región de ácido nucleico de interés no está ubicada en el cromosoma 21.

[0170] En otro aspecto, el sujeto es una mujer embarazada, la variación genética es la trisomía 21 en el feto de la mujer embarazada, la primera región de ácido nucleico de interés está ubicada en el cromosoma 21 y la segunda región de ácido nucleico de interés está ubicada en el cromosoma 18.

[0172] En un aspecto, el conjunto de sondas descrito en este documento puede comprender dos, tres, cuatro, cinco o más sondas de marcado, y/o dos, tres, cuatro, cinco o más marcadores. En algunas formas de realización, el método descrito en este documento puede comprender además que el primer y el segundo conjunto de sondas contengan, respectivamente, una tercera y una cuarta sonda de marcado; el primer conjunto de sondas inmovilizado y/o el primer conjunto de sondas amplificado contengan, además, un noveno marcador en la tercera sonda de marcado y/o en su producto amplificado; y el segundo conjunto de sondas inmovilizado y/o el segundo conjunto de sondas amplificado contengan, además, un décimo marcador en la cuarta sonda de marcado y/o en su producto amplificado. En estas formas de realización, si los marcadores noveno y décimo son diferentes de los marcadores primero y segundo, este método puede utilizarse para confirmar el número contado de los marcadores primero y segundo. Si los marcadores noveno y décimo son iguales a los marcadores primero y segundo, respectivamente, este método puede utilizarse para mejorar la precisión de los marcadores de detección inmovilizados en cada una de las regiones de ácido nucleico de interés. Por ejemplo, usar múltiples marcadores sería más brillante que usar un solo marcador y, por lo tanto, múltiples marcadores pueden detectarse más fácilmente que un solo marcador.

[0174] En otras formas de realización, (i) el primer conjunto de sondas inmovilizado y/o el primer conjunto de sondas amplificado comprenden además una undécima marca en la sonda de marcado, y (ii) el segundo conjunto de sondas inmovilizado y/o el segundo conjunto de sondas amplificado comprenden además una duodécima marca diferente de la undécima marca en la sonda de marcado. En otras formas de realización, donde las marcas primera, segunda, undécima y duodécima son diferentes entre sí, el paso de recuento comprende además el recuento de las marcas undécima y duodécima inmovilizadas en el sustrato.

[0176] En otro aspecto, el método descrito en este documento puede realizarse con una muestra de control. En algunas formas de realización, el método puede comprender además la repetición de los pasos con una muestra de control diferente de la muestra genética del sujeto. El método puede comprender además el recuento de los números de control de las marcas inmovilizadas en el sustrato y la comparación de estos números con el primer, segundo, tercer, cuarto, quinto y/o sexto número para confirmar la variación genética en la muestra.

[0177] En la presente invención, la paciente es una embarazada y la variación genética se presenta en su feto. En estas formas de realización, el método puede utilizar un sitio de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) para determinar si la proporción (p. ej., concentración y porcentaje numérico basado en el número de moléculas de nucleótidos en la muestra) de material fetal (p. ej., la fracción fetal) es suficiente para detectar la variación genética del feto en una muestra de la embarazada con una significancia estadística razonable. En otras formas de realización, el método puede comprender además la puesta en contacto de conjuntos de sondas maternas y paternas con la muestra genética, donde el conjunto de sondas maternas comprende una sonda de marcado materna y una sonda de marcado maternas, y el conjunto de sondas paternas comprende una sonda de marcado paterna y una sonda de marcado paternas. El método puede comprender además la hibridación de al menos una parte de cada conjunto de sondas maternas y paternas con una región de ácido nucleico de interés en las moléculas de nucleótidos de la muestra genética. Dicha región de ácido nucleico de interés comprende un sitio SNP predeterminado, donde al menos una parte del conjunto de sondas maternas hibrida con un primer alelo en el sitio SNP, al menos una parte del conjunto de sondas paternas hibrida con un segundo alelo en el sitio SNP, y los alelos primero y segundo son diferentes entre sí. El método puede comprender además la ligadura de los conjuntos de sondas maternas y paternas mediante la ligadura de (i) las sondas de marcado y etiquetado maternas, y (ii) las sondas de marcado y etiquetado paternas. El método puede comprender además la amplificación de las sondas ligadas. El método puede comprender además la inmovilización de las sondas de marcado en una ubicación predeterminada sobre un sustrato. Las sondas de marcado maternas y paternas, o sus sondas de marcado amplificadas, ligadas a las sondas de marcado inmovilizadas, comprenden marcadores maternos y paternos, respectivamente; estos marcadores son diferentes y los marcadores inmovilizados se pueden resolver ópticamente. El método puede comprender además el recuento de los marcadores maternos y paternos, y determinar si una proporción de material fetal en la muestra genética es suficiente para detectar la variación genética en el feto, basándose en la cantidad de marcadores maternos y paternos. El método puede comprender además la determinación de la proporción de material fetal en la muestra genética.

[0179] En algunas formas de realización, cuando el sujeto es una mujer embarazada, y la variación genética es una variación genética en el feto de la mujer embarazada, el método puede comprender además poner en contacto conjuntos de sondas de alelo A y alelo B que son específicos del alelo para la muestra genética, en donde el conjunto de sondas de alelo A comprende una sonda de marcado de alelo A y una sonda de marcado de alelo A, y el conjunto de sondas de alelo B comprende una sonda de marcado de alelo B y una sonda de marcado de alelo B. El método puede comprender además hibridar al menos una parte de cada uno de los conjuntos de sondas del alelo A y del alelo B con una región de ácido nucleico de interés en moléculas de nucleótidos de la muestra genética, comprendiendo la región de ácido nucleico de interés un sitio de polimorfismo de nucleótido único (SNP) predeterminado para el cual un perfil alélico materno (es decir, genotipo) difiere de un perfil alélico fetal en el sitio SNP (por ejemplo, la composición alélica materna puede ser AA y la composición alélica fetal puede ser AB o BB. En otro ejemplo, la composición alélica materna puede ser AB y la composición alélica fetal puede ser AA o BB), en donde al menos una parte del conjunto de sondas del alelo A se hibrida con un primer alelo en el sitio SNP, al menos una parte del conjunto de sondas del alelo B se hibrida con un segundo alelo en el sitio SNP, y el primer y el segundo alelo son diferentes entre sí. El método puede comprender además la ligadura de los conjuntos de sondas de los alelos A y B, al menos mediante la ligadura de (i) las sondas de marcado y etiquetado del alelo A, y (ii) las sondas de marcado y etiquetado del alelo B. El método puede comprender además la amplificación de los conjuntos de sondas ligadas. El método puede comprender además la inmovilización de las sondas de marcado en una ubicación predeterminada sobre un sustrato, donde las sondas de marcado de los alelos A y B, y/o sus sondas de marcado amplificadas, ligadas a las sondas de marcado inmovilizadas, comprenden marcas de los alelos A y B, respectivamente, marcas diferentes de los alelos A y B, y las marcas inmovilizadas son ópticamente resolubles. El método puede comprender además el recuento de las marcas de los alelos A y B, y determinar si una proporción de material fetal en la muestra genética es suficiente para detectar la variación genética en el feto basándose en la cantidad de marcas de los alelos A y B. El método puede comprender además la determinación de la proporción de material fetal en la muestra genética.

[0181] [0079]En algunas formas de realización, cuando la paciente es una embarazada, la variación genética es una variación genética en el feto de la embarazada y la muestra genética comprende un cromosoma Y. El método puede comprender además la puesta en contacto de conjuntos de sondas maternas y paternas con la muestra genética. El conjunto de sondas maternas comprende una sonda de marcado y una sonda de marcado maternas, y el conjunto de sondas paternas comprende una sonda de marcado y una sonda de marcado paternas. El método puede comprender además la hibridación de al menos partes de los conjuntos de sondas maternas y paternas con las regiones de ácido nucleico maternas y paternas de interés en las moléculas de nucleótidos de la muestra genética, respectivamente, donde la región de ácido nucleico paterna de interés se encuentra en el cromosoma Y y la región de ácido nucleico materna de interés no se encuentra en dicho cromosoma. El método puede comprender además la ligadura de los conjuntos de sondas maternas y paternas mediante la ligadura de (i) las sondas de marcado y etiquetado maternas, y (ii) las sondas de marcado y etiquetado paternas. El método puede comprender además la amplificación de las sondas ligadas. El método puede comprender además una región de ácido nucleico de interés que comprende un sitio predeterminado de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) que contiene más de un SNP, por ejemplo, dos o tres. Además, el sitio de SNP puede contener SNP con un alto desequilibrio de ligamiento, de modo que las sondas de marcado y etiquetado se configuran para aprovechar la energía mejorada de múltiples coincidencias o desapareamientos de SNP en lugar de una sola. El método puede comprender además la inmovilización de las sondas de marcado en una ubicación predeterminada sobre un sustrato, donde las sondas de marcado maternas y paternas, o sus sondas de marcado amplificadas, ligadas a las sondas de marcado inmovilizadas, comprenden marcas maternas y paternas, respectivamente, marcas maternas y paternas diferentes, y las marcas inmovilizadas son ópticamente resolubles. El método puede comprender además el recuento de las marcas maternas y paternas, y determinar si una proporción de material fetal en la muestra genética es suficiente para detectar la variación genética en el feto basándose en la cantidad de marcas maternas y paternas. El método puede comprender además determinar la proporción del material fetal en la muestra genética.

[0183] En formas de realización adicionales, se pueden utilizar otras variaciones genéticas (por ejemplo, eliminación de una sola base, microsatélites y pequeñas inserciones) en lugar de la variación genética en el sitio SNP descrito en este documento.

[0185] En ocasiones, el conjunto de sondas descrito en este documento puede comprender tres o más sondas, incluyendo al menos una sonda entre las sondas de marcado y etiquetado. En ocasiones, el primer y el segundo conjunto de sondas comprenden además una primera y una segunda sonda gap, respectivamente; la primera sonda gap hibrida con una región entre las regiones donde hibridan la primera sonda de marcado y la primera sonda de marcado; la segunda sonda gap hibrida con una región entre las regiones donde hibridan la segunda sonda de marcado y la segunda sonda de marcado. El método puede comprender además la etapa de ligadura, que consiste en ligar al menos (i) la primera sonda de marcado, la primera sonda de marcado y la primera sonda gap, y (ii) la segunda sonda de marcado, la segunda sonda de etiquetado y la segunda sonda gap. En ocasiones, la sonda gap puede incluir un marcador. Por ejemplo, la primera y la segunda sonda gap, o sus productos amplificados, se marcan con marcadores (p. ej., el decimotercer y el decimocuarto, respectivamente), y cada uno de los marcadores puede ser diferente del resto (p. ej., el primero y el segundo). Los marcadores en las sondas gap (p. ej., marcadores decimotercero y decimocuarto) pueden ser iguales o diferentes entre sí. Algunas veces, las sondas de marcado primera y segunda se hibridan con las regiones primera y segunda de ácido nucleico de interés en las moléculas de nucleótidos de la muestra genética, respectivamente; las sondas de marcado primera y segunda se hibridan con las regiones primera y segunda de ácido nucleico de interés en las moléculas de nucleótidos de la muestra genética, respectivamente; las sondas gap primera y segunda se hibridan con las regiones primera y segunda de ácido nucleico de interés en las moléculas de nucleótidos de la muestra genética, respectivamente. Algunas veces, hay de 0 a 100 nucleótidos, de 1 a 100 nucleótidos, de 2 a 50 nucleótidos; de 3 a 30 nucleótidos, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 o 200 o más; o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 25, 35, 45, 55, 110, 160 o 300 o menos entre las regiones donde se hibridan la primera sonda de marcado y las sondas de marcado; y hay de 0 a 100 nucleótidos, de 1 a 100 nucleótidos, de 2 a 50 nucleótidos; de 3 a 30 nucleótidos, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 o 200 nucleótidos o más; o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 25, 35, 45, 55, 110, 160 o 300 nucleótidos o menos entre las regiones donde se hibridan la segunda sonda de marcado y las sondas de marcado. En ocasiones, la sonda gap entre una sonda de marcado y una sonda de marcado puede tener una longitud de 0 a 100 nucleótidos, de 1 a 100 nucleótidos, de 2 a 50 nucleótidos; de 3 a 30 nucleótidos, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 o 200 o más; o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 25, 35, 45, 55, 110, 160 o 300 o menos.

[0187] En ocasiones, el conjunto de sondas descrito en este documento puede comprender un espaciador ligado y/o conjugado con la sonda de marcado y la sonda de etiquetado. El espaciador puede contener oligonucleótidos o no. Puede comprender un material aislado, purificado, natural o artificial, incluyendo oligonucleótidos de cualquier longitud (p. ej., 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 150 nucleótidos o menos). En ocasiones, la sonda puede estar en una digestión de restricción purificada o producirse sintéticamente, recombinantemente o mediante amplificación por PCR. Por ejemplo, las primeras sondas de marcado y etiquetado se conjugan con un primer espaciador, las segundas sondas de marcado y etiquetado se conjugan con un segundo espaciador, y los espaciadores primero y segundo no se hibridan con las moléculas de nucleótidos de la muestra genética. En ocasiones, el método comprende además la digestión de la muestra genética hibridada con una enzima y la ruptura de un enlace en el primer y el segundo espaciador tras la digestión.

[0189] En otro aspecto, el método descrito en este documento excluye la identificación de una secuencia en las moléculas de nucleótidos de la muestra genética y/o la secuenciación de la(s) región(es) de ácido nucleico de interés y/o las sondas. En algunas formas de realización, el método que excluye la secuenciación de las sondas incluye la exclusión de la secuenciación de un código de barras y/o un marcador de afinidad en una sonda de marcado. En otras formas de realización, los conjuntos de sondas inmovilizadas para detectar diferentes variaciones genéticas, regiones de nucleótidos de interés y/o péptidos de interés no necesitan detectarse ni escanearse por separado, ya que la secuenciación no es necesaria en los métodos descritos en este documento. En otras formas de realización, el número de diferentes marcadores inmovilizados en el sustrato se contabilizó simultáneamente (p. ej., mediante un único escaneo y/o adquisición de imágenes), por lo que no se contabilizó por separado. En otro aspecto, el método descrito en este documento excluye la lectura masiva de matrices y la cuantificación analógica. La lectura de matriz masiva, en este documento, se refiere a una única medición que mide la señal acumulada y combinada de múltiples marcadores de un solo tipo, opcionalmente combinada con una segunda medición de la señal acumulada y combinada de numerosos marcadores de un segundo tipo, sin resolver la señal de cada marcador. Se obtiene un resultado de la combinación de una o más de dichas mediciones en las que los marcadores individuales no se resuelven. En otro aspecto, el método descrito en este documento puede incluir una única medición que mide los mismos marcadores, diferentes marcadores del mismo tipo o marcadores del mismo tipo en los que los marcadores individuales se resuelven. El método descrito en este documento puede excluir la cuantificación analógica y emplear la cuantificación digital, en la que solo se determina el número de marcadores (determinado mediante mediciones de la intensidad y la forma de cada marcador), y no la intensidad óptica acumulada o combinada de los marcadores.

[0191] [0084]En otro aspecto, el conjunto de sondas descrito en este documento puede comprender un aglutinante. El aglutinante es el mismo material que la etiqueta o el marcador de afinidad descrita en este documento. En algunas formas de realización, el método comprende además la inmovilización del aglutinante en una fase sólida después de los pasos de ligadura. El método puede comprender además el aislamiento de los conjuntos de sondas ligadas de las sondas no ligadas. En otras formas de realización, el aglutinante comprende biotina y la fase sólida comprende una perla magnética.

[0193] En otro aspecto, el paso de conteo descrito aquí puede comprender además la calibración, verificación y/o confirmación de los números contados. Calibrar aquí significa comprobar y/o ajustar la precisión del número contado. Verificar y confirmar aquí significa determinar si el número contado es preciso o no, y/o la magnitud del error, si este existe.

[0195] En otro aspecto, se utiliza la intensidad y/o la relación señal-ruido como método para identificar marcadores individuales. Cuando las moléculas de colorante u otros marcadores ópticos están muy cerca, a menudo es imposible discriminarlos con imágenes basadas en fluorescencia debido al límite intrínseco de la difracción de la luz. Es decir, dos marcadores que están cerca serán indistinguibles sin un espacio visible entre ellos. Un método ejemplar para determinar el número de marcadores en una ubicación dada es examinar la señal relativa y/o la relación señal-ruido en comparación con ubicaciones que se sabe que tienen un solo flúor. Dos o más marcadores generalmente emitirán una señal más brillante (y una que se puede diferenciar más claramente del fondo) que un solo flúor. La figura 2 muestra el histograma normalizado de la intensidad de la señal medida tanto a partir de muestras de un solo marcador como de anticuerpos multimarca (ambos Alexa 546; verificados mediante perfiles de blanqueamiento). Las dos poblaciones fueron claramente separables, y los marcadores múltiples pueden distinguirse claramente de los marcadores individuales.

[0197] En algunas formas de realización, el paso de conteo puede comprender la medición de las señales ópticas de los marcadores inmovilizados y la calibración de los números contados mediante la distinción entre la señal óptica de un solo marcador y el resto de las señales ópticas del fondo o de múltiples marcadores. En algunas formas de realización, la distinción comprende el cálculo de la intensidad relativa de la señal óptica y/o de la relación señal-ruido de la señal óptica en comparación con la intensidad de la señal óptica de un solo marcador. La distinción puede comprender además la determinación de si la señal óptica proviene de un solo marcador. En otras formas de realización, la señal óptica proviene de un solo marcador si la intensidad relativa de la señal óptica y/o de la relación señal-ruido de la señal óptica difiere de la intensidad de la señal óptica de un solo marcador en una cantidad predeterminada o menos. En otras formas de realización, la cantidad predeterminada es de 0 % a 100 %, de 0 % a 150 %, 10 % a 200 %, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30 o 40 % o más, y/o 300, 200, 100, 50, 30, 10 o 5 % o menos de la intensidad de la señal óptica de un solo marcador.

[0199] En otro aspecto, diferentes marcadores pueden tener diferentes propiedades de parpadeo y blanqueamiento. También pueden tener diferentes propiedades de excitación. Para comparar el número de moléculas de colorante de dos marcadores diferentes, es necesario asegurar que ambos colorantes se comporten de manera similar y tengan características de emisión similares. Por ejemplo, si un colorante es mucho más tenue que otro, el número de moléculas puede estar subcontado en este canal. Se pueden valorar varios factores para obtener la equivalencia óptima entre los colorantes. Por ejemplo, el paso de conteo o calibración puede comprender la optimización de (i) la potencia de las fuentes de luz para excitar los marcadores, (ii) los tipos de fuentes de luz, (ii) los tiempos de exposición de los marcadores, y/o (iv) los conjuntos de filtros para que los marcadores coincidan con las señales ópticas de los marcadores, y la medición de las señales ópticas de los marcadores. Estos factores pueden variar individualmente o en combinación. Además, la métrica que se optimiza puede variar. Por ejemplo, puede ser la intensidad general, la relación señal-ruido, el mínimo fondo, la mínima varianza en la intensidad o cualquier otra característica.

[0201] Los perfiles de blanqueo son específicos de cada marcador y pueden utilizarse para añadir información que permita distinguir los tipos de etiqueta. La figura 3 muestra los perfiles de blanqueo promedio de varios marcadores. El gráfico muestra los recuentos normalizados por tipo de etiqueta en función de imágenes sucesivas obtenidas durante un intervalo de 60 segundos. El elemento c1 es fluoruro Cy3, el elemento c2 es fluoruro Atto647 y el elemento c3 es fluoruro Alexa488.

[0203] En otro aspecto, el comportamiento de parpadeo puede utilizarse como método para identificar marcadores individuales. Se sabe que muchas moléculas de colorante entran temporalmente en un estado oscuro (p. ej., Burnette et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2011) 108: 21081-21086). Esto produce un efecto de parpadeo, en el que un marcador pasará por uno o más pasos de brillante-oscuro-brillante. La duración y el número de estos periodos oscuros pueden variar. La presente invención utiliza este comportamiento de parpadeo para discriminar un marcador de dos o más marcadores que pueden parecer similares en imágenes limitadas por difracción. Si hay varios marcadores presentes, es poco probable que la señal desaparezca por completo durante el parpadeo. Es más probable que la intensidad disminuya a medida que uno de los marcadores se oscurece, pero las demás no. La probabilidad de que todos los marcadores parpadeen simultáneamente (y, por lo tanto, parezcan un único flúor) puede calcularse en función de las características específicas de parpadeo de un colorante.

[0205] [0091]En algunas formas de realización, las señales ópticas de los marcadores se miden durante al menos dos puntos de tiempo, y se considera que una señal óptica proviene de un solo marcador si su intensidad se reduce en una función de un solo paso. En algunas formas de realización, los dos puntos de tiempo pueden estar separados por una separación de entre 0,1 y 30 minutos, de 1 segundo a 20 minutos, de 10 segundos a 10 minutos; 0,01, 0,1, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 segundos o más; y/o 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 segundos o menos. En formas de realización adicionales, la intensidad de la señal óptica de un solo marcador disminuye gradualmente con el tiempo, y la intensidad de la señal óptica de dos o más marcadores disminuye gradualmente con el tiempo. En otras formas de realización, las señales ópticas de los marcadores se miden durante al menos dos puntos temporales y se normalizan según sus perfiles de blanqueo. En otro aspecto, el método descrito en este documento y/o la etapa de recuento pueden comprender además la medición de una señal óptica de un marcador de control durante al menos dos puntos temporales y la comparación de dicha señal con las señales ópticas de los marcadores para determinar un aumento o una disminución de la señal óptica de los marcadores.

[0207] En otro aspecto, el paso de recuento comprende además la confirmación del recuento mediante una molécula de control. Esta molécula puede utilizarse para determinar el cambio en la frecuencia de un tipo de molécula. A menudo, el objetivo experimental es determinar la abundancia de dos o más tipos de moléculas, ya sea en términos absolutos o en relación entre sí. Consideremos el ejemplo de dos moléculas marcadas con dos colorantes diferentes. Si la hipótesis nula es que tienen la misma frecuencia, pueden enumerarse en una matriz de una sola molécula y comparar la razón de los recuentos con la hipótesis nula. La "matriz de una sola molécula" se define aquí como una matriz configurada para detectar una sola molécula, incluyendo, por ejemplo, las matrices descritas en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2013/0172216. Si la razón varía de 1:1, esto implica que las dos moléculas tienen frecuencias diferentes. Sin embargo, puede que no esté claro a priori si una tiene mayor abundancia o la otra menor. Si se utiliza un tercer colorante como molécula de control, que también debería tener la misma frecuencia, esta debería tener una proporción de 1:1 con los otros dos colorantes. Consideremos el ejemplo de dos moléculas marcadas con los colorantes A y B, cuyo objetivo es determinar si la molécula marcada con el colorante B tiene una frecuencia mayor o menor que la molécula marcada con el colorante A. Se incluye en el experimento una tercera molécula marcada con el colorante C de forma que su abundancia sea la misma que la de las otras dos moléculas. Si la proporción de las moléculas marcadas con A y B, respectivamente, es de 1:2, entonces la primera molécula tiene una frecuencia menor o la segunda una mayor. Si la proporción de las moléculas marcadas con A y C es de 1:1 y la proporción de las moléculas marcadas con B y C es de 1:2, es probable que la molécula marcada con el colorante B tenga una frecuencia mayor que la molécula marcada con el colorante A. Un ejemplo de esto sería la determinación de los cambios en el número de copias de ADN en un genoma diploide. Es importante saber si una secuencia se amplifica o la otra se elimina, y el uso de una molécula de control permite esta determinación. Tenga en cuenta que el control puede ser otra región del genoma o una secuencia de control artificial.

[0209] En algunas formas de realización, los resultados del método descrito en este documento (p. ej., el recuento de marcadores) pueden confirmarse utilizando marcadores diferentes, pero con los mismos marcadores utilizados en el método inicial. Dicha confirmación puede realizarse simultáneamente con el método inicial o después de este. En formas de realización adicionales, la confirmación descrita en este documento comprende la puesta en contacto de un primer y un segundo conjunto de sondas de control con la muestra genética. El primer conjunto de sondas de control comprende una primera sonda de marcado de control y una primera sonda de marcado, que es el mismo marcador del primer conjunto de sondas descrito en este documento, y el segundo conjunto de sondas de control comprende una segunda sonda de marcado de control y una segunda sonda de marcado, que es el mismo marcador del segundo conjunto de sondas descrito en este documento. La confirmación puede comprender además la hibridación de al menos una parte del primer y segundo conjunto de sondas de control con la primera y la segunda región de ácido nucleico de interés en las moléculas de nucleótidos de la muestra genética, respectivamente. La confirmación puede comprender además la ligadura del primer conjunto de sondas de control mediante la ligadura de la primera sonda de marcado de control y la primera sonda de marcado. La confirmación puede comprender además la ligadura del segundo conjunto de sondas de control, al menos mediante la ligadura de la segunda sonda de marcado de control y la segunda sonda de marcado. La confirmación puede comprender además la amplificación de los conjuntos de sondas ligados. La confirmación puede comprender además la inmovilización de cada sonda de marcado en una ubicación predeterminada sobre un sustrato, donde las sondas de marcado primera y segunda de control, y/o sus sondas de marcado amplificadas, ligadas a las sondas de marcado inmovilizadas, comprenden una primera y una segunda marca de control, respectivamente. Estas marcas de control son diferentes, y las marcas inmovilizadas se pueden resolver ópticamente. La confirmación puede comprender además la medición de las señales ópticas de las marcas de control inmovilizadas en el sustrato. La confirmación puede comprender además la comparación de las señales ópticas de las marcas de control inmovilizadas con las señales ópticas de las marcas inmovilizadas para determinar si existe un error basado en las marcas. El término "error basado en una marca" se refiere a cualquier error causado por la marca que podría no haberse producido si se hubiera utilizado una marca diferente en el método. En algunas formas de realización, el primer marcador y el segundo marcador de control son iguales, y el segundo marcador y el primer marcador de control son iguales.

[0211] El blanqueo puede utilizarse como método para identificar marcadores individuales. Un elemento clave de la lectura es que los marcadores individuales sean "resolubles", es decir, distintos. Esto es trivial a bajas densidades en una superficie, cuando la probabilidad de encontrar marcadores muy próximos es muy baja. Para densidades más altas, suponiendo que los marcadores se encuentran en ubicaciones aleatorias (es decir, poissonianas), la probabilidad de encontrar marcadores vecinos aumenta hasta el punto en que un número significativo de marcadores tiene vecinas cuya emisión fluorescente se superpone parcial (o totalmente) con su propia emisión. En este punto, los marcadores ya no son "resolubles" y existe un régimen de transición entre la detección de un solo marcador (es decir, la detección digital) y la detección clásica de matriz de múltiples marcadores (por ejemplo, la detección analógica), donde se mide la señal promedio de muchas moléculas. Dicho de otro modo, un régimen de conteo digital de moléculas individuales se cambia a un régimen analógico de intensidad fluorescente promedio de muchas moléculas.

[0212] Una solución para aumentar el rango de carga, manteniendo la resolución individual, es aprovechar el blanqueamiento de fluoróforos. La exposición prolongada a la luz puede provocar el blanqueamiento de los marcadores, es decir, la pérdida de su fluorescencia. Es decir, con el tiempo, un marcador puede extinguirse. Esto suele ocurrir como una función escalonada, donde la etiqueta parece "apagarse". La presente invención puede utilizar este comportamiento de blanqueamiento para discriminar un marcador de dos o más que puedan parecer similares en imágenes limitadas por difracción. Para múltiples marcadores, se esperaría que la extinción se produjera mediante una serie de disminuciones escalonadas de la intensidad de la señal. Por ejemplo, las figuras 4-13 muestran los gráficos integrados de intensidad de marcador vs. tiempo (que muestran los eventos de blanqueamiento como cambios de intensidad) obtenidos para varios marcadores Alexa 488. Es fácil diferenciar especies de marcadores individuales de múltiples (por ejemplo, dependiendo de si la intensidad de la señal óptica se reduce en un solo paso o en múltiples pasos, como se muestra en los gráficos).

[0214] En otro aspecto, el método descrito puede comprender la calibración o confirmación de los números contados mediante intercambio de marcadores o de colorantes. En algunas formas de realización donde los productos sonda 1 y 2 están marcados con los marcadores 1 y 2, respectivamente, diversos modos de error pueden simular la frecuencia diferencial de los productos sonda. Por ejemplo, si se observa una relación de 1:2 entre el marcador 1 y el 2, esto puede deberse a diferencias reales de frecuencia (el producto sonda 2 es el doble de común que el 1), diferencias en la eficiencia de hibridación (los productos sonda tienen la misma abundancia, pero el 2 hibrida con mayor eficiencia que el 1) o diferencias en las propiedades de los marcadores (por ejemplo, si los marcadores son colorantes fluorescentes, el 1 puede decolorarse más rápido, parpadear con mayor frecuencia, presentar una señal más baja o una relación señal-ruido más baja que el 2). Si se repite el mismo experimento con los marcadores intercambiados, la proporción debería invertirse si se trata de una observación genuina de diferentes frecuencias de las moléculas, con la etiqueta 1 ahora dos veces más común que el marcador 2. Sin embargo, si se debe a la eficiencia de hibridación diferencial, la proporción será de 2:1. Si la proporción 1:2 se debió a las propiedades de los marcadores, la proporción cambiará a 2:1 entre el marcador 1 y el marcador 2 si realmente tienen la misma frecuencia. Este enfoque puede extenderse a cualquier número de conjuntos de sondas marcadas.

[0216] En algunas formas de realización, la primera región de ácido nucleico de interés se encuentra en un primer cromosoma y la segunda región de ácido nucleico de interés se encuentra en un segundo cromosoma, diferente del primero. El paso de recuento puede comprender además la confirmación del recuento, que comprende la puesta en contacto de los conjuntos de sondas de control primero y segundo con la muestra genética. El primer conjunto de sondas de control comprende una primera sonda de marcado de control y una primera sonda de marcado de control, y el segundo conjunto de sondas de control comprende una segunda sonda de marcado de control y una segunda sonda de marcado de control. El paso de confirmación puede comprender además la hibridación de al menos una parte del primer y segundo conjunto de sondas de control con las regiones de control primera y segunda ubicadas en los cromosomas primero y segundo, respectivamente, siendo las regiones de control primera y segunda diferentes de las regiones de ácido nucleico de interés primera y segunda. El paso de confirmación puede comprender además la ligadura del primer y segundo conjunto de sondas de control, al menos mediante la ligadura de (i) las primeras sondas de marcado y etiquetado de control, y (ii) las segundas sondas de marcado y etiquetado de control. El paso de confirmación puede comprender además la amplificación de los conjuntos de sondas ligados. El paso de confirmación puede comprender además la inmovilización de (i) el primer conjunto de sondas y el segundo conjunto de sondas de control en una primera ubicación predeterminada, y (ii) el segundo conjunto de sondas y el primer conjunto de sondas de control en una segunda ubicación predeterminada. En algunas formas de realización, las sondas de marcado de control primera y segunda, o sus sondas de marcado amplificadas, ligadas a las sondas de marcado inmovilizadas comprenden una primera y una segunda marca de control, respectivamente; la primera marca y la segunda marca de control son diferentes; la segunda marca y las primeras marcas de control son diferentes; las marcas inmovilizadas son ópticamente resolubles; las sondas de marcado de control primera y segunda inmovilizadas, o sus sondas de marcado amplificadas, comprenden una primera y una segunda marca de control, respectivamente; y el paso de inmovilización se realiza inmovilizando las marcas en las ubicaciones predeterminadas. El paso de confirmación puede comprender además la medición de las señales ópticas de las marcas de control inmovilizadas en el sustrato. La etapa de confirmación puede comprender además la comparación de las señales ópticas de los marcadores de control inmovilizadas con las señales ópticas de los marcadores primero y segundo inmovilizados para determinar si existe un error en la región de ácido nucleico de interés. En otras formas de realización, el primer marcador y el segundo marcador de control son iguales, y el segundo marcador y el primer marcador de control son iguales.

[0218] [0098]En otro aspecto, el paso de recuento del método descrito en este documento puede comprender además la calibración o confirmación de los números contados mediante (i) la repetición de algunos o todos los pasos de los métodos descritos en este documento (p. ej., los pasos que incluyen contacto, unión, hibridación, ligación, amplificación o inmovilización) con diferentes conjuntos de sondas configurados para unirse o hibridar con la misma región nucleotídica o peptídica de interés o con diferentes regiones del mismo cromosoma de interés, y (ii) el promediado del número de marcadores contados en los conjuntos de sondas unidos o hibridados con la misma región nucleotídica o peptídica de interés o con el mismo cromosoma de interés. En algunas formas de realización, el promediado puede realizarse antes del paso de comparación, de modo que se compare el promedio del número de marcadores contados en un grupo de diferentes conjuntos de sondas que se unen o hibridan con la misma región nucleotídica o peptídica de interés, en lugar del número de marcadores contados en los conjuntos de sondas individuales. En otro aspecto, el método descrito en este documento puede comprender además la calibración o confirmación de la detección de la variación genética mediante (i) la repetición de algunos o todos los pasos de los métodos (p. ej., los pasos que incluyen contacto, unión, hibridación, ligación, amplificación, inmovilización o recuento) descritos en este documento con diferentes conjuntos de sondas configurados para unirse o hibridar con regiones de control sin variación genética conocida, y (ii) el promedio del número de marcadores contados en los conjuntos de sondas unidos o hibridados con las regiones de control. En algunas formas de realización, el promedio del número de marcadores en los conjuntos de sondas que se unen o hibridan con las regiones de control se compara con el número de marcadores en los conjuntos de sondas que se unen o hibridan con las regiones de interés descritas en este documento para confirmar la variación genética en la muestra genética. En otro aspecto, los pasos de calibración o confirmación pueden repetirse simultáneamente con los pasos iniciales o después de realizarlos.

[0220] En otro aspecto, las marcas (p. ej., colorantes fluorescentes) de una o más poblaciones pueden medirse o identificarse en función de sus características espectrales subyacentes. La mayoría de los sistemas de imágenes fluorescentes incluyen la opción de recopilar imágenes en múltiples canales espectrales, controlados mediante la combinación de la fuente de luz y los filtros espectrales de excitación/emisión/dicroicos. Esto permite analizar la misma especie fluorescente en una muestra dada con múltiples bandas de color de luz de entrada diferentes, así como capturar las bandas de color de luz de salida deseadas. En condiciones normales de funcionamiento, la excitación de un fluoróforo se logra iluminando con una banda espectral estrecha alineada con los máximos de absorción de esa especie (p. ej., con un LED de banda ancha o una lámpara de arco y un filtro de excitación para moldear espectralmente la salida, o un láser espectralmente homogéneo), y la mayor parte de la emisión del fluoróforo se recopila con un filtro de emisión adaptado y un dicroico de paso largo para diferenciar la excitación de la emisión (Figura 14). En operaciones alternativas, la identidad única de una fracción fluorescente puede confirmarse mediante la interrogación con varios colores de excitación y bandas de emisión recopiladas diferentes (o adicionales) al caso de la operación estándar (Figura 15). La luz de estas diversas configuraciones de imagen, p. ej., varios filtros de emisión, se recopila y se compara con los valores de calibración de los fluoróforos de interés (Figura 16). En el caso del ejemplo, la medición experimental (puntos) coincide con los datos de calibración/referencia esperados para ese fluoróforo (triángulos), pero no concuerda bien con una hipótesis alternativa (cuadrados). Dados los datos de prueba y calibración para uno o más canales, se puede calcular la bondad de ajuste o chi-cuadrado para cada espectro de calibración de hipótesis y seleccionar el mejor ajuste de forma automatizada y robusta. Varias referencias pueden ser de interés, incluyendo fluoróforos utilizados en el sistema, así como contaminantes fluorescentes comunes, p. ej., aquellos con un perfil de emisión plano (Contaminante 1; triángulo) o un perfil ponderado en azul (Contaminante 2; estrellas) (Figura 17).

[0222] Las restricciones de diseño para la selección de filtros pueden ser diferentes a las de los diseños estándar, cuyo objetivo es simplemente maximizar la luz captada en un solo canal, evitando contribuciones significativas de otros canales. El objetivo puede ser la selectividad espectral, en lugar de la captación exclusiva de luz. Por ejemplo, considere dos fluoróforos con bandas de excitación significativamente diferentes, como se muestra en la figura 18 (nota: solo se muestran las regiones de excitación, no los espectros de excitación). Un diseño estándar maximizaría la captura de la emisión de Fluor 1 (con el filtro Em1, línea continua) y minimizaría la captura del borde de ataque de Fluor 2. Fluor 2 sería capturado óptimamente por Em2 (que presenta un ligero desplazamiento al rojo para evitar una captación significativa de luz de Fluor 1). En nuestro diseño, se busca verificar la presencia de Fluor 2 con el filtro Em1, lo que conlleva una ampliación de la banda a capturar ("Em1+", línea discontinua fina). Esto genera información adicional para verificar la identidad de Fluor 2. De igual forma, Em2 puede ampliarse o desplazarse hacia Fluor 1 para captar más luz de este fluoróforo (Em2+, línea discontinua fina). Este aumento de la información espectral también debe equilibrarse con la luz total disponible de un fluoróforo dado para mantener la detectabilidad. Dicho de otro modo, la contribución de un fluoróforo dado en un canal dado solo es significativa si la señal correspondiente está por encima del ruido de fondo y, por lo tanto, es informativa, a menos que se pretenda un control negativo. De esta manera, la firma espectral de una entidad fluorescente puede utilizarse para una identificación robusta, y la captación de más luz puede ser una segunda prioridad si las características únicas de la especie pueden cuantificarse con mayor eficacia.

[0224] Los productos de sonda dados pueden marcarse con más de un tipo de fluoróforo, de modo que la firma espectral sea más compleja. Por ejemplo, los productos de sonda siempre pueden llevar un fluoróforo universal, p. ej., Alexa 647, y un fluoróforo específico del locus, p. ej., Alexa 555 para el locus 1 y Alexa 594 para el locus 2. Dado que los contaminantes rara vez producirán la firma de dos fluoróforos, esto puede aumentar aún más la confianza del rechazo de la contaminación. La implementación implicaría la obtención de imágenes en tres o más canales en este ejemplo, de modo que se pueda determinar la presencia o ausencia de cada fluoróforo, mediante el método de bondad de ajuste mencionado anteriormente, comparando la prueba con la referencia, lo que produce llamadas de locus 1, locus 2 o no un producto de locus. Agregar fluoróforos adicionales facilita la identificación de fluoróforos, ya que hay más luz disponible para la recolección, pero a expensas del rendimiento de productos de ensayo correctamente formados y el tiempo total de obtención de imágenes (pueden requerirse canales adicionales). También se pueden utilizar otros modificadores espectrales para aumentar la información espectral y la singularidad, incluidos pares FRET que cambian el color cuando están muy cerca u otras fracciones.

[0226] [0102]En ocasiones, se puede utilizar un método para detectar una variación genética en péptidos o proteínas. En este caso, los métodos pueden comprender la puesta en contacto de un primer y un segundo conjunto de sondas con la muestra genética, donde el primer conjunto de sondas comprende una primera sonda de marcado y una primera sonda de etiquetado, y el segundo conjunto de sondas comprende una segunda sonda de marcado y una segunda sonda de etiquetado. Los métodos pueden comprender además la unión de los conjuntos de sondas a las regiones peptídicas de interés mediante un enlace físico o químico, en lugar de la etapa de hibridación descrita aquí para la detección de la variación genética en moléculas de ácido nucleico. Específicamente, los métodos pueden comprender además la unión de al menos partes del primer y segundo conjunto de sondas a las regiones peptídicas de interés de un péptido o proteína de la muestra genética, respectivamente. Por ejemplo, la unión puede realizarse mediante la presencia de un aglutinante en al menos una sonda del conjunto de sondas que se une específicamente a la región peptídica de interés.

[0228] En ocasiones, los métodos para detectar una variación genética en péptidos o proteínas pueden comprender además la conjugación del primer conjunto de sondas mediante un enlace químico, al menos mediante la conjugación de la primera sonda de marcado y la primera sonda de marcado, y la conjugación del segundo conjunto de sondas, al menos mediante la conjugación de la segunda sonda de marcado y la segunda sonda de marcado, en lugar del paso de ligadura descrito aquí para detectar la variación genética en moléculas de ácido nucleico. El método puede comprender además la inmovilización de las sondas de marcado en una ubicación predeterminada sobre un sustrato, como se describe aquí. En ocasiones, la primera y la segunda sonda de marcado conjugadas con las sondas de marcado inmovilizadas comprenden una primera y una segunda marca, respectivamente; estas marcas son diferentes; las marcas inmovilizadas son ópticamente resolubles; las sondas de marcado primera y segunda inmovilizadas y/o sus sondas de marcado amplificadas comprenden una primera y una segunda marca, respectivamente; y el paso de inmovilización se realiza inmovilizando las marcas en la ubicación predeterminada. Los métodos pueden comprender, además, como se describe en este documento, contar (i) un primer número del primer marcador inmovilizado al sustrato, y (ii) un segundo número del segundo marcador inmovilizado al sustrato; y comparar el primer y el segundo número para determinar la variación genética en la muestra genética.

[0230] Un sistema para detectar una variación genética según los métodos descritos en este documento incluye varios elementos. Algunos elementos incluyen la transformación de una muestra biológica sin procesar en un analito útil. Este analito se detecta entonces, generando datos que luego se procesan en un informe. Varios módulos que pueden incluirse en el sistema se muestran en la figura 19. Más detalles de varios métodos para analizar datos, incluyendo p. ej., procesamiento de imágenes, se muestran en la figura 20. El análisis puede realizarse en una computadora e implica tanto una red conectada al dispositivo que genera los datos como un servidor de datos para el almacenamiento de datos e informe. Opcionalmente, información adicional más allá de los datos del analito puede incorporarse en el informe final, p. ej., edad materna o riesgos previos conocidos. A veces, el sistema de prueba incluye una serie de módulos, algunos de los cuales son opcionales o pueden repetirse dependiendo de los resultados de módulos anteriores. La prueba puede comprender: (1) recibir una solicitud, por ejemplo, de un médico o clínico solicitante, (2) recibir una muestra de un paciente, (3) realizar un ensayo que incluya controles de calidad en esa muestra dando como resultado un producto de ensayo en un sustrato de obtención de imágenes adecuado (por ejemplo, poner en contacto, unir y/o hibridar sondas con una muestra, ligar las sondas, amplificar opcionalmente las sondas ligadas e inmovilizar las sondas en un sustrato como se describe en este documento), (4) obtener imágenes del sustrato en uno o más canales espectrales, (5) analizar datos de imágenes, (6) realizar cálculos estadísticos (por ejemplo, comparar el primer y el segundo número para determinar la variación genética en la muestra genética), (7) crear y aprobar el informe clínico y (8) devolver el informe al médico o clínico solicitante. El sistema de prueba puede comprender un módulo configurado para recibir una solicitud, por ejemplo, de un médico o clínico solicitante, un módulo configurado para recibir una muestra de paciente, (3) un módulo configurado para realizar un ensayo que incluye controles de calidad en esa muestra dando como resultado un producto de ensayo en un sustrato de imágenes apropiado, (4) un módulo configurado para obtener imágenes del sustrato en uno o más canales espectrales, (5) un módulo configurado para analizar los datos de la imagen, (6) un módulo configurado para realizar cálculos estadísticos, (7) un módulo configurado para crear y confirmar el informe clínico, y/o (8) un módulo configurado para devolver el informe al médico o clínico solicitante.

[0232] Los ensayos y métodos pueden realizarse simultáneamente en una sola muestra de entrada. Por ejemplo, el método puede comprender la verificación de la presencia de moléculas genómicas fetales en o por encima de un umbral mínimo, como se describe aquí, seguido de un paso para estimar el número de copias de la diana si y solo si se alcanza dicho umbral mínimo. Por lo tanto, se puede ejecutar por separado un ensayo específico de alelo en la muestra de entrada para calcular la fracción fetal y un ensayo de diana genómica para calcular el número de copias. Tanto los ensayos como los métodos descritos aquí pueden realizarse en paralelo en la misma muestra, al mismo tiempo y en el mismo volumen fluídico. También pueden realizarse ensayos de control de calidad adicionales en paralelo con los mismos pasos de procesamiento de ensayos universales. Dado que los marcadores, los marcadores de afinidad y/o las sondas de marcado en los productos de sonda, el conjunto de sondas ligadas o la molécula marcada que se inmovilizará en el sustrato pueden diseñarse de forma única para cada ensayo y cada producto de ensayo, todos los productos de ensayo paralelos pueden localizarse, visualizarse y cuantificarse en diferentes ubicaciones físicas del sustrato de imagen. El mismo ensayo o método (o algunos de sus pasos) que utiliza las mismas sondas o detecta la misma variación genética o control puede realizarse simultáneamente en varias muestras, ya sea en el mismo módulo o en módulos diferentes (p. ej., un tubo de ensayo) descritos en este documento. Los ensayos y métodos (o algunos de sus pasos) que utilizan diferentes sondas o detectan diferentes variaciones genéticas o controles pueden realizarse simultáneamente en una o varias muestras, ya sea en el mismo módulo o en módulos diferentes (p. ej., un tubo de ensayo).

[0234] [0106]El análisis de imágenes puede incluir el preprocesamiento, la segmentación para identificar los marcadores, la caracterización de la calidad de los marcadores, el filtrado de la población de marcadores detectados según su calidad y la realización de cálculos estadísticos según la naturaleza de los datos de la imagen. En algunos casos, como al realizar un ensayo específico de alelos y obtener imágenes, se puede calcular la fracción fetal. En otros, como el ensayo y la obtención de imágenes de dianas genómicas, se calcula el número relativo de copias entre dos regiones genómicas diana. El análisis de los datos de la imagen puede realizarse en tiempo real en el mismo ordenador que controla la adquisición de imágenes o en un ordenador en red, de modo que los resultados del análisis se puedan incorporar al árbol de decisiones del flujo de trabajo de la prueba casi en tiempo real.

[0236] Los pasos (4) y (5) de la prueba anterior pueden repetirse varias veces para diferentes partes del sustrato de imagen, de modo que los resultados determinen los pasos siguientes. Por ejemplo, las pruebas y métodos descritos en este documento comprenden la confirmación de la presencia y el nivel preciso de una muestra fetal en una muestra genética obtenida de un sujeto antes de analizar el estado relativo del número de copias de las dianas genómicas. Como se describe en este documento, se puede utilizar un ensayo sensible a alelos para cuantificar los niveles de ADN fetal en relación con el ADN materno. Los productos de la sonda resultantes pueden extraerse hasta una región de fracción fetal 1 en el sustrato y obtenerse una imagen. En ocasiones, si y solo si la fracción fetal calculada supera el requisito mínimo del sistema, la prueba puede continuar y obtener un resultado válido. De esta manera, el análisis de muestras que no confirmen al menos la fracción fetal mínima de entrada puede interrumpirse antes de que se realicen imágenes y análisis adicionales. Por el contrario, si la fracción fetal supera el umbral mínimo, se pueden realizar más imágenes (paso 4 de la prueba) de las dianas genómicas (p. ej., cromosomas 21, 18 o 13), seguidas de un análisis adicional (paso 5 de la prueba). También se pueden utilizar y evaluar otros criterios.

[0238] No todos los SNP investigados en el ensayo alelo-específico pueden generar información útil. Por ejemplo, el material genómico materno puede tener alelos heterocigotos para un SNP dado (p. ej., par de alelos AB), y el material fetal también puede ser heterocigoto en ese sitio (p. ej., AB); por lo tanto, el material fetal es indistinguible y el cálculo de la fracción fetal falla. Sin embargo, otro sitio SNP para la misma muestra de entrada puede mostrar nuevamente que el material materno es heterocigoto (p. ej., AB) mientras que el material fetal es homocigoto (p. ej., AA). En este ejemplo, el ensayo alelo-específico puede producir ligeramente más recuentos A que B debido a la presencia del ADN fetal, a partir del cual se puede calcular la fracción fetal. Dado que el perfil SNP (es decir, el genotipo) no se puede conocer a priori para una muestra dada, se deben diseñar múltiples o numerosos sitios SNP de manera que casi todas las muestras posibles produzcan un sitio SNP informativo. Cada sitio de SNP puede localizarse en una ubicación física diferente en el sustrato de imagen, por ejemplo, utilizando un marcador distinto para cada SNP. Sin embargo, para una prueba determinada, la fracción fetal solo puede calcularse correctamente una vez. Por lo tanto, se pueden obtener imágenes y analizar una o varias ubicaciones en el sustrato utilizado para interrogar los SNP (p. ej., en grupos de uno, dos, tres, cuatro, cinco, diez, veinte, cincuenta o menos, o uno, dos, tres, cuatro, cinco, diez, veinte, cincuenta o más) hasta que se detecte un SNP informativo. Al alternar la obtención de imágenes y el análisis, se puede omitir la obtención de imágenes de todos los posibles puntos de SNP y reducir significativamente la duración promedio de la prueba, manteniendo la precisión y la robustez.

[0240] Determinar la fracción fetal de una muestra puede ayudar a otros aspectos del sistema más allá de terminar pruebas para las cuales la porción de fracción fetal en una muestra es inadecuada. Por ejemplo, si la fracción fetal es alta (p. ej., 20 %), entonces para una potencia estadística dada, el número de conteos requeridos por diana genética (p. ej., chr21) será menor; si la fracción fetal es baja (p. ej., 1 %), entonces para la misma potencia estadística, se requiere un número muy alto de conteos por diana genómica para alcanzar la misma significancia estadística. Por lo tanto, después de (4-1) la obtención de imágenes de la región 1 de la fracción fetal, (5-1) el análisis de esos datos que resulta en un rendimiento de conteo requerido por diana genómica, (4-2) la obtención de imágenes de la región 2 de la diana genómica comienza en el rendimiento requerido, seguido por (5-2) el análisis de esos datos de imagen y el resultado de la prueba para la variación genómica de las dianas de entrada.

[0242] Los pasos (4) y (5) de la prueba anterior pueden repetirse para fines de control de calidad, incluyendo la evaluación de los niveles de fondo de fluorescencia en el sustrato de imagen, fracciones contaminantes, controles positivos u otras causas de variación en el número de copias más allá de la prueba inmediata (p. ej., cáncer en la madre o el feto, quimeras fetales, gemelares). Dado que el análisis de imágenes puede ser en tiempo real y no requiere la finalización de todo el procesamiento de imágenes antes de generar resultados (a diferencia de los métodos de secuenciación de ADN), los resultados intermedios pueden dictar los siguientes pasos a partir de un árbol de decisiones y adaptar la prueba para un rendimiento óptimo en una muestra individual. El control de calidad también puede abarcar la verificación de que la muestra sea de calidad aceptable y esté presente, que el sustrato de imagen esté configurado correctamente, que el producto de ensayo esté presente y/o en la concentración o densidad correctas, que haya niveles aceptables de contaminación, que el instrumento de imagen funcione y que el análisis esté produciendo resultados adecuados, todo lo cual alimenta un informe final de prueba para su revisión por parte del equipo clínico.

[0244] A veces, la prueba anterior comprende uno o más de los siguientes pasos: (1) recibir una solicitud (por ejemplo, de un médico o clínico solicitante), (2) recibir una muestra de paciente, (3) realizar un ensayo (que incluye una porción específica de alelo, una porción genómica diana y controles de calidad) en esa muestra, lo que da como resultado un sustrato de imágenes que contiene el producto del ensayo, (4-1) obtener imágenes de la región específica de alelo del sustrato en uno o más canales espectrales, (5-1) analizar los datos de imágenes específicas de alelo para calcular la fracción fetal (en espera de una fracción fetal suficiente), (4-2) obtener imágenes de la región genómica diana del sustrato en uno o más canales espectrales, (5-2) analizar los datos de imágenes de la región genómica diana para calcular el estado del número de copias de las dianas genómicas, (4-3) obtener imágenes de la región de control de calidad del sustrato en uno o más canales espectrales, (5-3) analizar los datos de imágenes de control de calidad para calcular, validar y verificar la prueba, (6) realizar cálculos estadísticos, (7) crear y aprobar el informe clínico, y (8) enviando el informe de vuelta al médico o clínico que lo solicitó.

[0245] En la siguiente descripción se exponen varios métodos ejemplares teniendo en cuenta las figuras.

[0247] La figura 21 muestra la implementación de un ensayo para cuantificar el número de copias genómicas en dos locus genómicos. En este ensayo, 105 y 106 son moléculas diana.105 contiene la secuencia correspondiente al primer locus genómico, "Locus 1", para el que se ha interrogado el número de copias (por ejemplo, cromosoma 21), y 106 contiene la secuencia correspondiente al segundo locus genómico, "Locus 2", para el que se ha interrogado el número de copias (por ejemplo, cromosoma 18). La figura 21 muestra un ejemplo de un conjunto de sondas por locus genómico, pero se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas para interrogar múltiples regiones dentro de un locus genómico. Por ejemplo, se pueden diseñar más de 10, 100 o 500 conjuntos de sondas correspondientes al cromosoma 21. La figura 21 ilustra solo un conjunto de sondas para cada locus genómico, pero es importante destacar que este método permite múltiples conjuntos de sondas para cada locus genómico. La figura 21 también ilustra un único evento de hibridación entre una molécula diana y un conjunto de sondas. En la práctica, una muestra de ensayo contiene múltiples moléculas diana. Muchas de ellas contienen las secuencias necesarias para la hibridación con un conjunto de sondas y la formación de un producto de sonda. Diferentes moléculas diana pueden hibridar con conjuntos de sondas, ya que algunas presentan polimorfismos genéticos. Además, las moléculas diana que surgen del ADN genómico pueden presentar una variedad aleatoria de tamaños moleculares, así como diversas secuencias iniciales y finales. En esencia, existen múltiples moléculas diana que pueden hibridar con un conjunto de sondas determinado. En un solo ensayo, se añaden múltiples copias de un conjunto de sondas determinado. Por lo tanto, en un solo ensayo se pueden formar hasta miles, cientos de miles o millones de productos de sonda específicos.

[0249] La figura 21 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el locus 1 y otro para el locus 2. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, se pueden diseñar varios conjuntos de sondas para cada locus genómico. El primer conjunto de sondas contiene las sondas miembro 101, 102 y 103. El elemento 101 contiene un marcador (100) de tipo "A". El elemento 103 contiene un marcador de afinidad (104) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación de la sonda. El elemento 102 puede no contener modificaciones, como un marcador o un código de barras. Un segundo conjunto de sondas con las sondas miembro 108, 109 y 110 presenta las mismas características que el primer conjunto de sondas. Sin embargo, el elemento 108 contiene un marcador (107) de tipo "B", que se distingue del tipo "A". El elemento 110 contiene un marcador de afinidad (111) que puede ser idéntica o única a la del elemento 104. Se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 1", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de etiqueta "A". De igual manera, se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 2", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de etiqueta "B". En esta implementación, los marcadores de afinidad de los múltiples conjuntos de sondas para el Locus 1 pueden ser idénticas o únicas, y los marcadores de afinidad de los múltiples conjuntos de sondas para el Locus 2 pueden ser idénticas o únicas.

[0251] Se agregan uno o más conjuntos de sondas a las moléculas objetivo en un solo recipiente y se exponen a condiciones de hibridación específicas de la secuencia.

[0253] Para cada conjunto de sondas, las tres sondas (p. ej., 101, 102, 103) se hibridan (o se unen mediante una interacción similar sonda-diana) a la molécula diana (105), de modo que no haya espacios entre ellas en la molécula diana. Es decir, las sondas del conjunto son adyacentes y presentan capacidad de ligación.

[0255] Se añade ligasa a las sondas hibridadas y se exponen a condiciones estándar de ligasa. Las sondas ligadas forman un producto sonda. Todos (o la mayoría) de los productos sonda del locus 1 tienen el tipo de etiqueta "A". Todos los productos sonda del locus 2 tienen el tipo de etiqueta "B". La cuantificación de los productos sonda correspondientes a los locus genómicos 1 y 2 se realiza utilizando los marcadores "A" y "B".

[0257] En ocasiones, los productos de la sonda se inmovilizan sobre un sustrato mediante sus marcadores de afinidad. Por ejemplo, si el marcador de afinidad es una secuencia de ADN, los productos de la sonda pueden hibridarse con regiones de una matriz de captura de ADN a la densidad adecuada para su posterior obtención de imágenes.

[0259] En ocasiones, los marcadores de afinidad 104 y 111 contienen secuencias únicas y ortogonales que permiten su posicionamiento superficial en una o más ubicaciones, que pueden ser compartidas o no entre productos de hibridación. Las figuras 47 y 48 muestran los patrones de fluorescencia resultantes cuando los productos contienen secuencias de marcadores de afinidad únicas y el sustrato subyacente contiene complementos de cada uno de los marcadores de afinidad únicas dentro de la misma región (p. ej., como el mismo miembro de una matriz) en un sustrato. Las imágenes corresponden a la misma región de un sustrato, pero la figura 47 muestra los marcadores Cy3 (unidas covalentemente al producto del cromosoma 18) y la figura 48 muestra los marcadores Alexa Fluor 647 (unidas covalentemente al producto del cromosoma 21). Se pueden generar patrones similares para otras formas de realización de ensayo que se presentan a continuación.

[0261] [0120]En ocasiones, los marcadores de afinidad 104 y 111 contienen secuencias idénticas que permiten su posicionamiento superficial en la misma región (p. ej., como el mismo miembro de una matriz) de un sustrato. Es decir, productos diferentes compiten por los mismos sitios de unión. Las figuras 49 y 51 muestran los patrones de fluorescencia resultantes cuando productos diferentes contienen secuencias de marcadores de afinidad idénticas y el sustrato subyacente contiene el complemento del marcador de afinidad. Las imágenes corresponden a la misma ubicación en un sustrato, pero la figura 49 muestra los marcadores Cy3 (unidas covalentemente al producto del cromosoma 18) y la figura 51 muestra los marcadores Alexa Fluor 647 (unidas covalentemente al producto del cromosoma 21). Las figuras 50 y 52 muestran regiones ampliadas de las figuras 49 y 51, respectivamente, que demuestran claramente la resolución de moléculas individuales y los marcadores individualmente distinguibles. Se pueden generar patrones similares para otras formas de realización de ensayo que se presentan a continuación.

[0262] En ocasiones, los marcadores de afinidad 104 y 111 contienen secuencias únicas y ortogonales que permiten su posicionamiento superficial en más de una ubicación del sustrato. Las figuras 53 y 54 muestran los patrones de fluorescencia resultantes cuando los productos contienen secuencias únicas de marcadores de afinidad y el sustrato subyacente presenta una región que contiene el complemento de un marcador de afinidad y otra región separada que contiene el complemento del otro marcador de afinidad. Las imágenes muestran dos regiones separadas de un sustrato, cada una con un único complemento de marcador de afinidad, como se describió previamente. La figura 53 muestra los marcadores Cy3 (unidas covalentemente al producto del cromosoma 21) y la figura 54 muestra los marcadores Alexa Fluor 647 (unidas covalentemente al producto del cromosoma 18). Se pueden generar patrones similares para otras formas de realización de ensayo que se describen a continuación.

[0263] La especificidad se puede lograr mediante la combinación de múltiples sondas adyacentes que deben ligarse correctamente para que la sonda producto se forme, capture y detecte correctamente. Si una sonda producto no se forma correctamente por cualquier motivo, no se puede aislar ni enriquecer para usar un marcador de afinidad y detectarlo. Por ejemplo, si la sonda 101 no se liga correctamente a la sonda 102, el producto resultante no se puede detectar. De igual manera, si la sonda 103 no se liga correctamente a la sonda 102, el producto resultante no se puede aislar ni enriquecer usando un marcador de afinidad.

[0264] Requerir que todas las sondas del conjunto de sondas se hibriden con éxito con la molécula objetivo y se liguen entre sí con éxito proporciona una alta especificidad y reduce en gran medida los problemas de hibridación cruzada y, por lo tanto, las señales positivas falsas.

[0265] En este ensayo, la especificidad se logra mediante hibridación y ligación específicas de secuencia. En ocasiones, la especificidad de la formación de sondas se produce en el recipiente de reacción, antes del aislamiento o el enriquecimiento de las sondas, por ejemplo, mediante la inmovilización sobre una superficie u otro sustrato sólido. Esto evita el reto de la hibridación estándar basada en superficies (p. ej., micromatrices genómicos), en la que la especificidad debe lograrse exclusivamente mediante la hibridación con secuencias largas de oligonucleótidos (>40 pb) (p. ej., matrices de Agilent y Affymetrix).

[0266] El uso de marcadores de afinidad permite inmovilizar las sondas producto en un sustrato y, por lo tanto, eliminar el exceso de sondas no unidas mediante métodos estándar. Por lo tanto, la mayoría de los marcadores en la superficie forman parte de una sonda específicamente formada que se inmoviliza en la superficie.

[0267] En ocasiones, la captura superficial no afecta la precisión. Es decir, no introduce sesgos. Por ejemplo, si se utiliza el mismo marcador de afinidad para conjuntos de sondas de diferentes locus genómicos, y cada conjunto de sondas se dirige a un locus con un marcador diferente, los productos de sonda de ambos locus genómicos pueden inmovilizarse en la misma ubicación del sustrato utilizando el mismo marcador de afinidad. Es decir, los productos de sonda del locus 1 y del locus 2 se capturarán con la misma eficiencia, sin introducir sesgos específicos del locus.

[0268] En ocasiones, se eliminan algunas o todas las sondas o moléculas diana no unidas antes de la captura superficial mediante métodos estándar. Esto reduce la interferencia entre las sondas o moléculas diana no unidas y los productos de la sonda durante la captura superficial.

[0269] Se pueden colocar múltiples tipos de marcadores de afinidad en la misma región del sustrato (por ejemplo, el mismo punto o miembro de la matriz). Esto ofrece numerosas ventajas, como la colocación de marcadores de control o calibración. Las figuras 22-46 describen métodos de ejemplo adicionales. Estas figuras no representan todos los métodos posibles. Además, todas las características del método descrito en la figura 21 son aplicables a todos los demás ensayos descritos en esta solicitud.

[0270] [0129]La figura 22 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 22 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el locus 1 y otro para el locus 2. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas para cada locus genómico. 207 y 214 son moléculas diana correspondientes a los locus 1 y 2, respectivamente. Un primer conjunto de sondas contiene las sondas miembro 202, 204 y 206. La sonda 202 contiene un marcador (201) de tipo "A". La sonda 206 contiene un marcador de afinidad (205) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda. Un segundo conjunto de sondas, con las sondas miembro 209, 211 y 231, presenta las mismas características que el primer conjunto de sondas. Sin embargo, la sonda 209 contiene un marcador (208) de tipo "B", distinguible del tipo "A". La sonda 213 contiene un marcador de afinidad (212) que puede ser idéntica o única a la sonda 205. Se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 1", que contiene secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de etiqueta "A". De igual forma, se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 2", que contiene secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de etiqueta "B". Los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas del Locus 1 pueden ser idénticas, únicas o una combinación de ambas, y los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas del Locus 2 pueden ser idénticas, únicas o una combinación de ambas. Las sondas 204 y 211 pueden contener uno o más marcadores (203, 210) de tipo "C". Por lo tanto, las sondas producto contendrán una combinación de marcadores. Para el Locus 1, las sondas producto contendrán marcadores de tipo "A" y tipo "C", mientras que las sondas producto del Locus 2 contendrán marcadores de tipo "B" y tipo "C".

[0272] La figura 23 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 23 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el locus 1 y otro para el locus 2. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas para cada locus genómico. 307 y 314 son moléculas diana correspondientes a los locus 1 y 2, respectivamente. Un primer conjunto de sondas contiene las sondas miembro 302, 303 y 305. La sonda 302 contiene un marcador (301) de tipo "A". La sonda 305 contiene un marcador de afinidad (306) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda. Un segundo conjunto de sondas, con las sondas miembro 309, 310 y 312, presenta las mismas características que el primer conjunto de sondas. Sin embargo, la sonda 309 contiene un marcador (308) de tipo "B", distinguible del tipo "A". La sonda 312 contiene un marcador de afinidad (313) que puede ser idéntica o única a la sonda 306. Se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 1", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de etiqueta "A". De igual forma, se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 2", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de etiqueta "B". Los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas del Locus 1 pueden ser idénticos o únicos, y los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas del Locus 2 pueden ser idénticos o únicos. Las sondas 305 y 312 contienen uno o más marcadores (304, 311) de tipo "C". Por lo tanto, las sondas producto contendrán una combinación de marcadores. Para el Locus 1, las sondas producto contendrán marcadores de tipo "A" y tipo "C", mientras que las sondas producto del Locus 2 contendrán marcadores de tipo "B" y tipo "C".

[0274] La figura 24 representa una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 24 representa dos conjuntos de sondas, un conjunto de sondas para el Locus 1 y un conjunto de sondas para el Locus 2, aunque como se mencionó anteriormente, se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas para cada locus genómico.

[0275] 407 y 414 son moléculas diana correspondientes al Locus 1 y al Locus 2, respectivamente.

[0277] Un primer conjunto de sondas contiene las sondas miembro 402, 405. La 402 contiene un marcador (401) de tipo "A". La 405 contiene un marcador de afinidad (406) que puede usarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda.

[0279] Un segundo conjunto de sondas, compuesto por las sondas miembro 409 y 412, presenta las mismas características que el primer conjunto. Sin embargo, la sonda 409 contiene un marcador (408) de tipo "B", distinguible del tipo "A". La sonda 412 contiene un marcador de afinidad (413) que puede ser idéntica o única a la sonda 406. Se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 1", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de etiqueta "A". De igual forma, se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 2", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de etiqueta "B". Los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 1 pueden ser idénticos o únicos, y los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 2 pueden ser idénticos o únicos.

[0281] Las sondas 402 y 405 hibridan con las secuencias correspondientes al locus 1, pero existe un "hueco" en la molécula diana, compuesto por uno o más nucleótidos, entre las sondas hibridadas 402 y 405. Se puede utilizar una ADN polimerasa u otra enzima para sintetizar una nueva especie de polinucleótido (404) que une covalentemente 402 y 405. Es decir, la sonda producto formada en este ejemplo es una única molécula de ácido nucleico contigua con una secuencia correspondiente al locus 1 y que lleva las marcas y/o marcadores de afinidad mencionados anteriormente. Además, 404 puede contener una o más marcas de tipo "C", posiblemente como resultado de la incorporación de uno o más nucleótidos con una marca de tipo "C". Este ejemplo también se aplica a la sonda producto formada para el locus 2, que contiene las sondas 409 y 412. Por lo tanto, las sondas producto contendrán una combinación de marcas. Para el Locus 1, los productos de sonda contendrán marcadores de tipo "A" y tipo "C", mientras que los productos de sonda del Locus 2 contendrán marcadores de tipo "B" y tipo "C".

[0283] La figura 25 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 25 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el locus 1 y otro para el locus 2. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas para cada locus genómico. 505 y 510 son moléculas diana correspondientes a los locus 1 y 2, respectivamente. Un primer conjunto de sondas contiene las sondas miembro 502 y 503. La sonda 502 contiene un marcador (501) de tipo "A". La sonda 503 contiene un marcador de afinidad (504) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda. Un segundo conjunto de sondas, con las sondas miembro 507 y 508, presenta las mismas características que el primer conjunto de sondas. Sin embargo, la sonda 507 contiene un marcador

[0285] [0136](506) de tipo "B", distinguible del tipo "A". El 508 contiene un marcador de afinidad (509) que puede ser idéntico o único al 504. Se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 1", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de etiqueta "A". De igual forma, se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 2", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de etiqueta "B". Los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 1 pueden ser idénticos o únicos, y los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 2 pueden ser idénticos o únicos.

[0287] La figura 26 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 26 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el locus 1 y otro para el locus 2. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas para cada locus genómico. 606 y 612 son moléculas diana correspondientes a los locus 1 y 2, respectivamente. Un primer conjunto de sondas contiene las sondas miembro 602 y 603. La sonda 602 contiene un marcador (601) de tipo "A". La sonda 603 contiene un marcador de afinidad (605) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda. Un segundo conjunto de sondas, con las sondas miembro 608 y 609, presenta las mismas características que el primer conjunto de sondas. Sin embargo, la sonda 608 contiene un marcador

[0289] (607) de tipo "B", distinguible del tipo "A". La 609 contiene un marcador de afinidad (611) que puede ser idéntico o único a la del 605. Se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 1", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de etiqueta "A". De igual manera, se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 2", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de marcador "B". Los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 1 pueden ser idénticos o únicos, y los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 2 pueden ser idénticos o únicos.

[0291] Las sondas 603 y 609 contienen uno o más marcadores (604, 610) de tipo "C". Por lo tanto, las sondas contendrán una combinación de marcadores. Para el Locus 1, las sondas contendrán marcadores de tipo "A" y tipo "C", mientras que las sondas del Locus 2 contendrán marcadores de tipo "B" y tipo "C".

[0293] La figura 27 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 27 muestra dos conjuntos de sondas para identificar varios alelos del mismo locus genómico. Por ejemplo, para distinguir alelos maternos y fetales, en el caso del ADN libre aislado de una mujer embarazada, o para distinguir alelos del huésped y del donante, en el caso del ADN libre de un receptor de trasplante de órgano. La figura 27 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el alelo 1 y otro para el alelo 2. 706 y 707 son moléculas diana correspondientes a los alelos 1 y 2, respectivamente. Un primer conjunto de sondas contiene las sondas miembro 702, 703 y 704. La sonda 702 contiene un marcador (701) de tipo "A". La sonda 704 contiene un marcador de afinidad (705) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda. Un segundo conjunto de sondas, compuesto por las sondas 709, 703 y 704, presenta las mismas características que el primer conjunto. En esta forma de realización, 703 y 704 son idénticos en ambos conjuntos. Sin embargo, 709 contiene un marcador (708) de tipo "B", distinguible de la de tipo "A". 702 y 709 contienen secuencias prácticamente idénticas, con una única diferencia de nucleótido. Por lo tanto, las secuencias de hibridación de estas dos sondas, configuradas para hibridar con las regiones de los alelos 1 y 2, contienen regiones complementarias para los alelos 1 (702) y 2 (709). Además, la longitud de cada dominio de hibridación en 702 y 709, así como las condiciones de hibridación experimental, están diseñadas de tal manera que la sonda 702 solo se hibridará con el alelo 1 y la sonda 709 solo se hibridará con el alelo 2. El propósito de este tipo de ensayo es cuantificar con precisión la frecuencia del alelo 1 y el alelo 2 en una muestra.

[0295] La figura 28 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 28 muestra dos conjuntos de sondas para identificar varios alelos del mismo locus genómico. Por ejemplo, para distinguir alelos maternos y fetales, en el caso del ADN libre aislado de una mujer embarazada, o para distinguir alelos del huésped y del donante, en el caso del ADN libre de un receptor de trasplante de órgano. La figura 28 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el alelo 1 y otro para el alelo 2. 807 y 810 son moléculas diana correspondientes al alelo 1 y al alelo 2, respectivamente. Un primer conjunto de sondas contiene las sondas miembro 802, 804 y 805. La sonda 802 contiene un marcador (801) de tipo "A". La sonda 805 contiene un marcador de afinidad (806) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda. Un segundo conjunto de sondas, compuesto por las sondas 809, 804 y 805, presenta las mismas características que el primer conjunto. Las sondas 804 y 805 son idénticas en ambos conjuntos. Sin embargo, la sonda 809 contiene un marcador (808) de tipo "B", distinguible de la de tipo "A". Las sondas 802 y 809 contienen secuencias prácticamente idénticas, con una única diferencia de nucleótido. Por lo tanto, las secuencias de hibridación de estas dos sondas contienen regiones complementarias para el alelo 1 (802) y el alelo 2 (809). Además, la longitud de cada dominio de hibridación en las sondas 802 y 809, así como las condiciones experimentales de hibridación, están diseñadas de forma que la sonda 802 solo hibride con el alelo 1 y la sonda 809 solo con el alelo 2. El objetivo de este tipo de ensayo es cuantificar con precisión la frecuencia de los alelos 1 y 2 en una muestra. La sonda 804 contiene uno o más marcadores (803) de tipo "C". Por lo tanto, las sondas producto contendrán una combinación de marcadores. Para el alelo 1, las sondas producto contendrán marcadores de tipo "A" y tipo "C", mientras que las sondas producto del alelo 2 contendrán marcadores de tipo "B" y tipo "C".

[0297] La figura 29 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 29 muestra dos conjuntos de sondas para identificar varios alelos del mismo locus genómico. Por ejemplo, para distinguir los alelos maternos y fetales, en el caso del ADN libre aislado de una mujer embarazada, o para distinguir los alelos del huésped y del donante, en el caso del ADN libre de un receptor de trasplante de órgano. La figura 29 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el alelo 1 y otro para el alelo 2.

[0298] 907 y 910 son moléculas diana correspondientes al alelo 1 y al alelo 2, respectivamente. Un primer conjunto de sondas contiene las sondas miembro 902 y 905. La sonda 902 contiene un marcador (901) de tipo "A". La sonda 905 contiene un marcador de afinidad (906) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación de la sonda producto. Un segundo conjunto de sondas, con las sondas miembro 909 y 905, presenta las mismas características que el primer conjunto de sondas. La sonda 905 es idéntica en ambos conjuntos de sondas. Sin embargo, la sonda 909 contiene un marcador (908) de tipo "B", distinguible del tipo "A". Las sondas 902 y 909 contienen secuencias prácticamente idénticas, con una única diferencia de nucleótido. Por lo tanto, las secuencias de hibridación de estas dos sondas contienen regiones complementarias para el alelo 1 (902) y el alelo 2 (909). Además, la longitud de cada dominio de hibridación en 902 y 909, así como las condiciones de hibridación experimental, están diseñadas de tal manera que la sonda 902 solo se hibridará con el alelo 1 y la sonda 909 solo se hibridará con el alelo 2. El propósito de este tipo de ensayo es poder cuantificar con precisión la frecuencia del alelo 1 y el alelo 2 en una muestra.

[0300] Las sondas 902 y 905 hibridan con las secuencias correspondientes al alelo 1, de modo que existe un espacio en la molécula diana compuesto por uno o más nucleótidos entre las sondas hibridadas 902 y 905. Se puede utilizar una ADN polimerasa u otra enzima para sintetizar una nueva especie de polinucleótido (904) que une covalentemente 902 y 905. Es decir, la sonda resultante en este ejemplo es una única molécula de ácido nucleico contigua con una secuencia correspondiente al alelo 1, que lleva las marcas y/o marcadores de afinidad mencionados anteriormente. Además, 904 puede contener una o más marcas de tipo "C", posiblemente como resultado de la incorporación de un nucleótido con una marca de tipo "C". Este ejemplo también se aplica a la sonda resultante para el alelo 2, que contiene las sondas 909 y 905.

[0302] La figura 30 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 30 muestra dos conjuntos de sondas para identificar varios alelos del mismo locus genómico. Por ejemplo, para distinguir los alelos maternos y fetales, en el caso del ADN libre aislado de una mujer embarazada, o para distinguir los alelos del huésped y del donante, en el caso del ADN libre de un receptor de trasplante de órgano. La figura 30 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el alelo 1 y otro para el alelo 2.

[0304] 1006 y 1007 son moléculas diana correspondientes a los alelos 1 y 2, respectivamente. Un primer conjunto de sondas contiene las sondas miembro 1001, 1003 y 1004. La sonda 1003 contiene un marcador (1002) de tipo "A". La sonda 1004 contiene un marcador de afinidad (1005) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda.

[0306] Un segundo conjunto de sondas, compuesto por las sondas 1001, 1009 y 1004, presenta las mismas características que el primer conjunto. La sonda 1001 es idéntica para ambos conjuntos de sondas y la sonda 1004 también lo es para ambos. Sin embargo, la sonda 1009 contiene un marcador (1008) de tipo "B", que se distingue del tipo "A".

[0308] Las sondas 1003 y 1009 contienen secuencias prácticamente idénticas, con una única diferencia de nucleótido. Por lo tanto, las secuencias de hibridación de estas dos sondas contienen regiones complementarias para el alelo 1 (1003) y el alelo 2 (1009), respectivamente. Además, la longitud de cada dominio de hibridación en las sondas 1003 y 1009, así como las condiciones experimentales de hibridación, están diseñadas de forma que la sonda 1003 solo hibride con el alelo 1 y la sonda 1009 solo con el alelo 2. El objetivo de este tipo de ensayo es cuantificar con precisión la frecuencia de los alelos 1 y 2 en una muestra. La sonda 1001 contiene uno o más marcadores (1000) de tipo "C". Por lo tanto, las sondas resultantes contendrán una combinación de marcadores. Para el alelo 1, los productos de sonda contendrán marcadores de tipo "A" y tipo "C", mientras que los productos de sonda del alelo 2 contendrán marcadores de tipo "B" y tipo "C".

[0310] La figura 31 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 31 muestra dos conjuntos de sondas para identificar varios alelos del mismo locus genómico. Por ejemplo, para distinguir alelos maternos y fetales, en el caso del ADN libre aislado de una mujer embarazada, o para distinguir alelos del huésped y del donante, en el caso del ADN libre de un receptor de trasplante de órgano. La figura 31 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el alelo 1 y otro para el alelo 2. 1104 y 1105 son moléculas diana correspondientes al alelo 1 y al alelo 2, respectivamente. Un primer conjunto de sondas contiene las sondas miembro 1101 y 1102. La sonda 1101 contiene un marcador (1100) de tipo "A". La sonda 1102 contiene un marcador de afinidad (1103) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda. Un segundo conjunto de sondas, compuesto por las sondas 1107 y 1102, presenta las mismas características que el primer conjunto. La sonda 1102 es idéntica en ambos conjuntos. Sin embargo, la sonda 1107 contiene un marcador (1106) de tipo "B", distinguible de la de tipo "A". Las sondas 1101 y 1107 contienen secuencias prácticamente idénticas, diferenciándose solo en un nucleótido. Por lo tanto, las secuencias de hibridación de estas dos sondas contienen regiones complementarias para el alelo 1 (1101) y el alelo 2 (1107). Además, la longitud de cada dominio de hibridación en las sondas 1101 y 1107, así como las condiciones experimentales de hibridación, están diseñadas de tal manera que la sonda 1101 solo hibride con el alelo 1 y la sonda 1107 solo con el alelo 2. El objetivo de este tipo de ensayo es cuantificar con precisión la frecuencia de los alelos 1 y 2 en una muestra.

[0312] [0150]La figura 32 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 32 muestra dos conjuntos de sondas para identificar varios alelos del mismo locus genómico. Por ejemplo, para distinguir alelos maternos y fetales, en el caso del ADN libre aislado de una mujer embarazada, o para distinguir alelos del huésped y del donante, en el caso del ADN libre de un receptor de trasplante de órgano. La figura 32 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el alelo 1 y otro para el alelo 2. 1206 y 1207 son moléculas diana correspondientes al alelo 1 y al alelo 2, respectivamente. Un primer conjunto de sondas contiene las sondas miembro 1202 y 1203. La sonda 1202 contiene un marcador (1201) de tipo "A". La sonda 1203 contiene un marcador de afinidad (1205) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda. Un segundo conjunto de sondas, compuesto por las sondas 1209 y 1203, presenta las mismas características que el primer conjunto. La sonda 1203 es idéntica en ambos conjuntos. Sin embargo, la sonda 1209 contiene un marcador (1208) de tipo "B", distinguible de la de tipo "A". Las sondas 1202 y 1209 contienen secuencias prácticamente idénticas, diferenciándose solo en un nucleótido. Por lo tanto, las secuencias de hibridación de estas dos sondas contienen regiones complementarias para el alelo 1 (1202) y el alelo 2 (1209). Además, la longitud de cada dominio de hibridación en las sondas 1202 y 1209, así como las condiciones experimentales de hibridación, están diseñadas de tal manera que la sonda 1202 solo hibride con el alelo 1 y la sonda 1209 solo con el alelo 2. El objetivo de este tipo de ensayo es cuantificar con precisión la frecuencia de los alelos 1 y 2 en una muestra. La sonda 1203 contiene uno o más marcadores (1204) de tipo "C". Por lo tanto, el producto de la sonda contendrá una combinación de marcadores. Para el alelo 1, el producto de la sonda contendrá marcadores de tipo "A" y tipo "C", mientras que el producto de la sonda del alelo 2 contendrá marcadores de tipo "B" y tipo "C".

[0314] La figura 33 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 33 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el locus 1 y otro para el locus 2. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas para cada locus genómico. 1304 y 1305 son moléculas diana correspondientes a los locus 1 y 2, respectivamente. Un primer conjunto de sondas contiene las sondas miembro 1301 y 1302. La sonda 1301 contiene un marcador (1300) de tipo "A". La sonda 1301 contiene un marcador de afinidad (1303) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda. Un segundo conjunto de sondas, con las sondas miembro 1307 y 1308, presenta las mismas características que el primer conjunto de sondas. Sin embargo, la sonda 1307 contiene un marcador (1306) de tipo "B", distinguible del tipo "A". La sonda 1307 contiene un marcador de afinidad (1309) que puede ser idéntica o única a la sonda 1303. Se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 1", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de marcador "A". De forma similar, se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 2", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de marcador "B". Los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 1 pueden ser idénticos o únicos, y los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 2 pueden ser idénticos o únicos. Las sondas 1301 y 1307 tienen estructuras similares. Por ejemplo, en la sonda 1301 existen dos dominios de hibridación distintos, de modo que la sonda 1302 puede ligarse a cada extremo de la sonda 1301, formando un producto de sonda consistente en una molécula de ADN contigua y topológicamente cerrada (p. ej., una molécula circular). La secuencia no hibridante de la sonda 1301 puede contener características adicionales, posiblemente sitios de enzimas de restricción o sitios de unión de cebadores para una amplificación universal.

[0316] Una característica de este método es que todos los productos de sonda son moléculas circulares contiguas. De esta manera, los productos de sonda pueden aislarse de todos los demás ácidos nucleicos mediante la degradación enzimática de todas las moléculas de ácidos nucleicos lineales, por ejemplo, utilizando una exonucleasa.

[0318] La figura 34 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 34 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el locus 1 y otro para el locus 2. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas para cada locus genómico. 1405 y 1406 son moléculas diana correspondientes a los locus 1 y 2, respectivamente. Un primer conjunto de sondas contiene las sondas miembro 1401 y 1403. La sonda 1401 contiene un marcador (1400) de tipo "A". La sonda 1401 contiene un marcador de afinidad (1404) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda. Un segundo conjunto de sondas, con las sondas miembro 1408 y 1410, presenta las mismas características que el primer conjunto de sondas. Sin embargo, la sonda 1408 contiene un marcador (1407) de tipo "B", distinguible del tipo "A". La sonda 1408 contiene un marcador de afinidad (1411) que puede ser idéntica o única a la sonda 1404. Se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 1", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de marcador "A". De forma similar, se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 2", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de marcador "B". Los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 1 pueden ser idénticos o únicos, y los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 2 pueden ser idénticos o únicos. Las sondas 1401 y 1408 tienen estructuras similares. Por ejemplo, en la sonda 1401 existen dos dominios de hibridación distintos, de modo que la sonda 1403 puede ligarse a cada extremo de la sonda 1401, formando un producto de sonda consistente en una molécula de ADN contigua y topológicamente cerrada (p. ej., una molécula circular). La secuencia no hibridante de la sonda 1401 puede contener características adicionales, posiblemente sitios de enzimas de restricción o sitios de unión de cebadores para una amplificación universal.

[0320] Una característica de este método es que todos los productos de sonda son moléculas circulares contiguas. De esta manera, los productos de sonda pueden aislarse de todos los demás ácidos nucleicos mediante la degradación enzimática de todas las moléculas de ácidos nucleicos lineales, por ejemplo, utilizando una exonucleasa. Las sondas 1403 y 1410 contienen una o más marcas (1402, 1409) de tipo "C". Por lo tanto, los productos de sonda contendrán una combinación de marcas. Para el locus 1, los productos de sonda contendrán marcas de tipo "A" y tipo "C", mientras que los productos de sonda del locus 2 contendrán marcas de tipo "B" y tipo "C".

[0322] [0155]La figura 35 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 35 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el locus 1 y otro para el locus 2. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas para cada locus genómico. 1505 y 1506 son moléculas diana correspondientes a los locus 1 y 2, respectivamente. Un primer conjunto de sondas contiene la sonda miembro 1501. La sonda miembro 1501 contiene un marcador (1500) de tipo "A". La sonda miembro 1501 contiene un marcador de afinidad (1504) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación de la sonda producto. Un segundo conjunto de sondas, con la sonda miembro 1508, presenta las mismas características que el primer conjunto de sondas. Sin embargo, la sonda miembro 1508 contiene un marcador (1507) de tipo "B", distinguible del tipo "A". La sonda 1508 contiene un marcador de afinidad (1511) que puede ser idéntica o única a la sonda 1504. Se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 1", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de marcador "A". De igual manera, se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 2", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de marcador "B". Los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 1 pueden ser idénticos o únicos, y los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 2 pueden ser idénticos o únicos. Las sondas 1501 y 1508 tienen estructuras similares.

[0324] Por ejemplo, en la sonda 1501 existen dos dominios de hibridación distintos, de modo que, al hibridar con una molécula diana, se crea un espacio entre ambos. Se puede utilizar una ADN polimerasa u otra enzima para sintetizar una nueva especie de polinucleótido (1503) que rellene covalentemente el espacio entre los dominios de hibridación de 1501. Es decir, la sonda producto formada en este ejemplo es una única molécula de ADN contigua y topológicamente cerrada (p. ej., una molécula circular) con una secuencia correspondiente al locus 1 y que lleva los marcadores y/o marcadores de afinidad mencionados anteriormente. Además, 1503 puede contener uno o más marcadores de tipo "C", posiblemente como resultado de la incorporación de un nucleótido con un marcador de tipo "C". Este ejemplo también se aplica a la sonda producto formada para el locus 2, que contiene la sonda 1508. La secuencia no hibridante de las sondas 1501 y 1508 puede contener características adicionales, posiblemente sitios para enzimas de restricción. Una característica de este método es que todos los productos de sonda son moléculas circulares contiguas. De esta manera, los productos de sonda pueden aislarse de todos los demás ácidos nucleicos mediante la degradación enzimática de todas las moléculas de ácidos nucleicos lineales, por ejemplo, utilizando una exonucleasa. Los productos de sonda contendrán una combinación de marcadores. Para el locus 1, los productos de sonda contendrán marcadores de tipo "A" y tipo "C", mientras que los productos de sonda del locus 2 contendrán marcadores de tipo "B" y tipo "C".

[0326] La figura 36 representa una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 36 representa dos conjuntos de sondas, un conjunto de sondas para el Locus 1 y un conjunto de sondas para el Locus 2, aunque como se mencionó anteriormente, se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas para cada locus genómico.

[0327] 1605 y 1606 son moléculas diana correspondientes al Locus 1 y al Locus 2, respectivamente.

[0329] Un primer conjunto de sondas contiene la sonda miembro 1602.1602 contiene un marcador (1600) de tipo "A".

[0330] 1602 contiene un marcador de afinidad (1601) que puede usarse para el aislamiento e identificación del producto de la sonda.

[0332] Un segundo conjunto de sondas, con la sonda miembro 1609, presenta las mismas características que el primer conjunto. Sin embargo, la sonda 1609 contiene un marcador (1608) de tipo "B", distinguible del tipo "A". La sonda 1609 contiene un marcador de afinidad (1607) que puede ser idéntica o única a la sonda 1601. Se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 1", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de marcador "A". De igual forma, se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 2", que contienen secuencias de sonda únicas, pero el mismo tipo de marcador "B". Los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 1 pueden ser idénticos o únicos, y los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 2 pueden ser idénticos o únicos.

[0334] Las sondas 1602 y 1609 hibridan con las secuencias correspondientes al locus 1 o al locus 2, respectivamente, y se puede utilizar una ADN polimerasa u otra enzima para sintetizar una nueva secuencia de polinucleótidos, por ejemplo, 1603 en el caso del locus 1 o 1611 en el caso del locus 2.1603 y 1611 pueden contener una o más marcas (1604) de tipo "C", posiblemente como resultado de la incorporación de uno o más nucleótidos con una marca de tipo "C". Este ejemplo también se aplica al producto de sonda formado para el locus 2. Por lo tanto, los productos de sonda contendrán una combinación de marcas. Para el locus 1, los productos de sonda contendrán marcas de tipo "A" y tipo "C", mientras que los productos de sonda del locus 2 contendrán marcas de tipo "B" y tipo "C". Este método produce productos de sonda con alta especificidad para las secuencias del locus 1 o del locus 2, respectivamente.

[0336] La figura 37 representa una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 37 representa dos conjuntos de sondas, un conjunto de sondas para el Locus 1 y un conjunto de sondas para el Locus 2, aunque como se mencionó anteriormente, se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas para cada locus genómico.

[0337] 1704 y 1705 son moléculas diana correspondientes al Locus 1 y al Locus 2, respectivamente.

[0339] Un primer conjunto de sondas contiene la sonda miembro 1702.1702 contiene un marcador de afinidad (1700) que puede usarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda.

[0341] [0163]Un segundo conjunto de sondas, con la sonda miembro 1708, presenta las mismas características que el primer conjunto de sondas. La sonda 1708 contiene un marcador de afinidad (1706) que puede ser idéntica o única a la sonda 1700. Se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 1", que contiene secuencias de sonda únicas. De igual forma, se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 2", que contiene secuencias de sonda únicas. Los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 1 pueden ser idénticos o únicos, y las de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 2 pueden ser idénticas o únicas.

[0342] Las sondas 1702 y 1708 hibridan con las secuencias correspondientes a los locus 1 y 2, respectivamente. El diseño de cada sonda para los locus 1 y 2 permite que el primer nucleótido adyacente a los dominios de hibridación contenga un nucleótido diferente para el locus 1 y el del locus 2. En este ejemplo, el primer nucleótido adyacente al dominio de hibridación de 1702 es una "A", mientras que el primer nucleótido adyacente al dominio de hibridación de 1708 es una "T". Todas las sondas para el locus 1 se diseñarán de forma que el primer nucleótido inmediatamente adyacente al dominio de hibridación contenga uno o más nucleótidos diferentes a los del primer nucleótido inmediatamente adyacente al dominio de hibridación de las sondas para el locus 2. Es decir, por diseño, los conjuntos de sondas de los locus 1 y 2 pueden distinguirse entre sí en función de la identidad del primer nucleótido inmediatamente adyacente al dominio de hibridación.

[0343] Se utilizará una ADN polimerasa u otra enzima para añadir al menos un nucleótido adicional a cada secuencia de sonda. En este ejemplo, los sustratos nucleotídicos de la ADN polimerasa son capaces de una sola adición; por ejemplo, los nucleótidos pueden ser terminadores de cadena didesoxi. Es decir, solo se añadirá un nucleótido nuevo a cada secuencia de sonda. En este ejemplo, el nucleótido añadido a la sonda 1702 contendrá uno o más marcadores (1703) de tipo "A". El nucleótido añadido a la sonda 1708 contendrá uno o más marcadores (1709) de tipo "B", de modo que los productos de la sonda del locus 1 puedan distinguirse de los productos de la sonda del locus 2.

[0344] La figura 38 representa una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 38 representa dos conjuntos de sondas, un conjunto de sondas para el Locus 1 y un conjunto de sondas para el Locus 2, aunque como se mencionó anteriormente, se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas para cada locus genómico.

[0345] 1804 y 1805 son moléculas diana correspondientes al Locus 1 y al Locus 2, respectivamente.

[0346] Un primer conjunto de sondas contiene la sonda miembro 1802.1802 contiene un marcador de afinidad (1800) que puede usarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda.

[0347] Un segundo conjunto de sondas, con la sonda miembro 1808, presenta las mismas características que el primer conjunto de sondas. La sonda 1808 contiene un marcador de afinidad (1806) que puede ser idéntica o única a la sonda 1800. Se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 1", que contiene secuencias de sonda únicas. De igual forma, se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 2", que contiene secuencias de sonda únicas. Los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 1 pueden ser idénticos o únicos, y las de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 2 pueden ser idénticas o únicas.

[0348] Las sondas 1802 y 1808 hibridan con las secuencias correspondientes a los locus 1 y 2, respectivamente. El diseño de cada sonda para los locus 1 y 2 permite que el primer nucleótido adyacente a los dominios de hibridación contenga un nucleótido diferente para el locus 1 y el del locus 2. En este ejemplo, el primer nucleótido adyacente al dominio de hibridación de 1802 es una "A", mientras que el primer nucleótido adyacente al dominio de hibridación de 1808 es una "T". Todas las sondas para el locus 1 deben diseñarse de manera que el primer nucleótido inmediatamente adyacente al dominio de hibridación contenga uno o más nucleótidos diferentes a los del primer nucleótido inmediatamente adyacente al dominio de hibridación de las sondas para el locus 2. Es decir, por diseño, los conjuntos de sondas de los locus 1 y 2 pueden distinguirse entre sí según la identidad del primer nucleótido inmediatamente adyacente al dominio de hibridación.

[0349] Se utilizará una ADN polimerasa u otra enzima para añadir al menos un nucleótido adicional a cada secuencia de sonda. En este ejemplo, los sustratos nucleotídicos de la ADN polimerasa son capaces de una sola adición, posiblemente porque los nucleótidos añadidos a la mezcla de reacción son didesoxinucleótidos. Es decir, solo se añadirá un nucleótido nuevo a cada secuencia de sonda. En este ejemplo, el nucleótido añadido a la sonda 1802 contendrá uno o más marcadores (1803) de tipo "A". El nucleótido añadido a la sonda 1808 contendrá uno o más marcadores (1809) de tipo "B", de modo que los productos de la sonda del locus 1 puedan distinguirse de los productos de la sonda del locus 2.

[0350] Las sondas 1802 y 1808 contienen uno o más marcadores (1801, 1806) de tipo "C". Por lo tanto, las sondas producto contendrán una combinación de marcadores. Para el locus 1, las sondas producto contendrán marcadores de tipo "A" y tipo "C", mientras que las sondas producto del locus 2 contendrán marcadores de tipo "B" y tipo "C".

[0351] La figura 39 representa una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 39 representa dos conjuntos de sondas, un conjunto de sondas para el Locus 1 y un conjunto de sondas para el Locus 2, aunque como se mencionó anteriormente, se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas para cada locus genómico.

[0352] 1906 y 1907 son moléculas diana correspondientes al Locus 1 y al Locus 2, respectivamente.

[0353] Un primer conjunto de sondas contiene la sonda miembro 1902.1902 contiene un marcador de afinidad (1901) que puede usarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda.

[0354] Un segundo conjunto de sondas, con la sonda miembro 1910, presenta las mismas características que el primer conjunto de sondas. La sonda 1910 contiene un marcador de afinidad (1908) que puede ser idéntica o única a la sonda 1901. Se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 1", que contiene secuencias de sonda únicas. De igual forma, se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 2", que contiene secuencias de sonda únicas. Los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 1 pueden ser idénticos o únicos, y las de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 2 pueden ser idénticas o únicas.

[0356] Las sondas 1902 y 1910 hibridan con las secuencias correspondientes a los locus 1 y 2, respectivamente. El diseño de cada sonda para los locus 1 y 2 permite que el primer nucleótido adyacente a los dominios de hibridación contenga un nucleótido diferente para el locus 1 y el locus 2. En este ejemplo, el primer nucleótido adyacente al dominio de hibridación de 1902 es una "A", mientras que el primer nucleótido adyacente al dominio de hibridación de 1910 es una "T". Todas las sondas para el locus 1 deben diseñarse de manera que el primer nucleótido inmediatamente adyacente al dominio de hibridación contenga uno o más nucleótidos diferentes al primer nucleótido inmediatamente adyacente al dominio de hibridación de las sondas para el locus 2. Es decir, por diseño, los conjuntos de sondas de los locus 1 y 2 pueden distinguirse entre sí por la identidad del primer nucleótido inmediatamente adyacente al dominio de hibridación. Un nucleótido diferente, distinto del utilizado para distinguir las sondas del Locus 1 o del Locus 2, servirá como terminador de cadena. En este ejemplo, se utiliza un nucleótido "A" en una molécula diana para distinguir las sondas del Locus 1 y un nucleótido "T" para distinguir las sondas del Locus 2. En este ejemplo, un nucleótido "C" puede servir como terminador de cadena. En este caso, se añadirá al ensayo un nucleótido "C" que no sea capaz de elongación de cadena (por ejemplo, un didesoxi C). Una restricción adicional es que las secuencias de sonda están diseñadas de tal manera que no haya casos de un nucleótido identificador del Locus 2 presente en 1906 entre el nucleótido distintivo del Locus 1 y el nucleótido de terminación de cadena. En este ejemplo, no habrá nucleótidos "T" presentes en 1906 después del dominio de hibridación de 1902 y antes de la G, que se emparejará con el terminador de cadena C.

[0358] Se utilizará la ADN polimerasa o una enzima similar para sintetizar nuevas secuencias de nucleótidos. El nucleótido añadido en la posición distintiva del locus 1 contendrá una o más marcas (1903) de tipo "A". El nucleótido añadido en la posición distintiva del locus 2 contendrá una o más marcas (1911) de tipo "B", de modo que las sondas producto del locus 1 puedan distinguirse de las sondas producto del locus 2. El nucleótido añadido en la posición de terminación de la cadena contendrá una o más marcas (1912) de tipo "C". Por lo tanto, las sondas producto contendrán una combinación de marcas. Para el locus 1, las sondas producto contendrán marcas de tipo "A" y tipo "C", mientras que las sondas producto del locus 2 contendrán marcas de tipo "B" y tipo "C".

[0360] El terminador de cadena puede no contener ninguna marca. Se puede añadir al ensayo un cuarto nucleótido que contenga una o más marcas de tipo "C". Este cuarto nucleótido no se aparea con el nucleótido identificador del alelo 1 (en este ejemplo, A), ni con el nucleótido identificador del alelo 2 (en este ejemplo, T) ni con el nucleótido de terminación de cadena (en este ejemplo, G). En este ejemplo, el cuarto nucleótido que llevaría una o más marcas de tipo "C" es G y se apareará con las posiciones C en 1906 y 1907. Por lo tanto, las sondas producto contendrán una combinación de marcas. Para el locus 1, las sondas producto contendrán marcas de tipo "A" y tipo "C", mientras que las sondas producto del locus 2 contendrán marcas de tipo "B" y tipo "C".

[0362] La figura 40 representa una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 40 representa dos conjuntos de sondas, un conjunto de sondas para el Locus 1 y un conjunto de sondas para el Locus 2, aunque como se mencionó anteriormente, se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas para cada locus genómico.

[0363] 2005 y 2006 son moléculas diana correspondientes al Locus 1 y al Locus 2, respectivamente.

[0365] Un primer conjunto de sondas contiene la sonda miembro 2001.2001 contiene un marcador de afinidad (2000) que puede usarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda.

[0367] Un segundo conjunto de sondas, con la sonda miembro 2008, presenta las mismas características que el primer conjunto de sondas.2008 contiene un marcador de afinidad (2007) que puede ser idéntica o única a la sonda 2000. Se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 1", que contiene secuencias de sonda únicas. De igual forma, se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 2", que contiene secuencias de sonda únicas. Los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 1 pueden ser idénticos o únicos, y las de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 2 pueden ser idénticas o únicas.

[0369] Las sondas 2001 y 2008 hibridan con las secuencias correspondientes a los locus 1 y 2, respectivamente. El diseño de cada sonda para los locus 1 y 2 permite que exista una o más instancias de un nucleótido distintivo (en este ejemplo, "A" es un nucleótido distintivo para el locus 1 y "T" es un nucleótido distintivo para el locus 2) seguido de un nucleótido de terminación de cadena (en este ejemplo, "G") adyacente al dominio de hibridación de las sondas. Cabe destacar que no habrá ninguna instancia del nucleótido distintivo para el locus 2 (en este ejemplo, "T") presente entre el dominio de hibridación de 2001 en 2005 y el nucleótido de terminación de cadena en 2005. De igual manera, no habrá ninguna instancia del nucleótido distintivo para el locus 1 (en este ejemplo, "A") presente entre el dominio de hibridación de 2008 en 2006 y el nucleótido de terminación de cadena en 2006.

[0371] [0182]Se utilizará la ADN polimerasa o una enzima similar para sintetizar nuevas secuencias de nucleótidos (2004, 2011) hasta la adición de un nucleótido de terminación de cadena; un posible ejemplo sería un didesoxi C. Los nucleótidos añadidos en las posiciones distintivas del locus 1 contendrán una o más marcas (2003) de tipo "A". Los nucleótidos añadidos en las posiciones distintivas del locus 2 contendrán una o más marcas (2010) de tipo "B", de modo que los productos de la sonda del locus 1 puedan distinguirse claramente de los productos de la sonda del locus 2.

[0372] La figura 41 representa una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 41 representa dos conjuntos de sondas, un conjunto de sondas para el Locus 1 y un conjunto de sondas para el Locus 2, aunque como se mencionó anteriormente, se pueden diseñar múltiples conjuntos de sondas para cada locus genómico.

[0373] 2105 y 2106 son moléculas diana correspondientes al Locus 1 y al Locus 2, respectivamente.

[0374] Un primer conjunto de sondas contiene la sonda miembro 2102.2102 contiene un marcador de afinidad (2100) que puede usarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda.

[0375] Un segundo conjunto de sondas, con la sonda miembro 2109, presenta las mismas características que el primer conjunto de sondas. La sonda 2109 contiene un marcador de afinidad (2107) que puede ser idéntica o única a la sonda 2100. Se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 1", que contiene secuencias de sonda únicas. De igual forma, se pueden diseñar numerosos conjuntos de sondas dirigidos al "Locus 2", que contiene secuencias de sonda únicas. Los marcadores de afinidad de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 1 pueden ser idénticos o únicos, y los de los numerosos conjuntos de sondas para el Locus 2 pueden ser idénticos o únicos.

[0376] Las sondas 2102 y 2109 hibridan con las secuencias correspondientes a los locus 1 y 2, respectivamente. El diseño de cada sonda para los locus 1 y 2 permite que exista una o más instancias de un nucleótido distintivo (en este ejemplo, "A" es un nucleótido distintivo para el locus 1 y "T" es un nucleótido distintivo para el locus 2) seguido de un nucleótido de terminación de cadena (en este ejemplo, "G") adyacente al dominio de hibridación de las sondas. Cabe destacar que no habrá ninguna instancia del nucleótido distintivo para el locus 2 (en este ejemplo, "T") presente entre el dominio de hibridación de 2102 en 2105 y el nucleótido de terminación de cadena en 2105. De igual manera, no habrá ninguna instancia del nucleótido distintivo para el locus 1 (en este ejemplo, "A") presente entre el dominio de hibridación de 2109 en 2106 y el nucleótido de terminación de cadena en 2106.

[0377] Se utilizará la ADN polimerasa o una enzima similar para sintetizar nuevas secuencias de nucleótidos (2104, 2110) hasta la adición de un nucleótido de terminación de cadena; un posible ejemplo sería un didesoxi C. Los nucleótidos añadidos en las posiciones distintivas del locus 1 contendrán una o más marcas (2103) de tipo "A". Los nucleótidos añadidos en las posiciones distintivas del locus 2 contendrán una o más marcas (2110) de tipo "B", de modo que las sondas producto del locus 1 se distingan claramente de las sondas producto del locus 2.

[0378] Las sondas 2102 y 2109 contienen uno o más marcadores (2101, 2108) de tipo "C". Por lo tanto, las sondas contendrán una combinación de marcadores. Para el locus 1, las sondas contendrán marcadores de tipo "A" y tipo "C", mientras que las sondas del locus 2 contendrán marcadores de tipo "B" y tipo "C".

[0379] La figura 42 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 42 muestra dos conjuntos de sondas para identificar varios alelos del mismo locus genómico. Por ejemplo, para distinguir los alelos maternos y fetales, en el caso del ADN libre aislado de una mujer embarazada, o para distinguir los alelos del huésped y del donante, en el caso del ADN libre de un receptor de trasplante de órgano. La figura 42 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el alelo 1 y otro para el alelo 2.2203 y 2204 son moléculas diana correspondientes al alelo 1 y al alelo 2, respectivamente.

[0380] Un primer conjunto de sondas contiene la sonda miembro 2201. Esta sonda contiene un marcador de afinidad (2200) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda. Los conjuntos de sondas utilizados para la identificación de los dos alelos diferentes son los mismos. Es decir, el conjunto de sondas para el alelo 2 consta de la sonda miembro 2201. La sonda 2201 hibrida con una secuencia correspondiente al alelo 1 y al alelo 2, respectivamente, en la figura 42. El diseño de la sonda 2201 permite que el primer nucleótido adyacente al dominio de hibridación contenga un nucleótido diferente para el alelo 1 y el alelo 2. En otras palabras, el primer nucleótido adyacente al dominio de hibridación puede ser un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). En este ejemplo, el primer nucleótido adyacente en 2203 junto al dominio de hibridación de 2201 es una "A", mientras que el primer nucleótido adyacente en 2204 junto al dominio de hibridación de 2201 es una "T". Es decir, los productos de la sonda del alelo 1 y del alelo 2 pueden distinguirse entre sí basándose en la identidad del primer nucleótido inmediatamente adyacente al dominio de hibridación.

[0381] Se utilizará una ADN polimerasa u otra enzima para añadir al menos un nucleótido adicional a cada secuencia de sonda. En este ejemplo, los sustratos nucleotídicos de la ADN polimerasa son competentes para una sola adición, posiblemente porque los nucleótidos añadidos a la mezcla de reacción son didesoxinucleótidos. Es decir, solo se añadirá un nucleótido nuevo a cada secuencia de sonda. En este ejemplo, el nucleótido añadido a la sonda 2201 para el alelo 1 contendrá una o más marcas (2202) de tipo "A". El nucleótido añadido a la sonda 2201 para el alelo 2 contendrá una o más marcas (2205) de tipo "B", de modo que los productos de la sonda para el alelo 1 puedan distinguirse claramente de los productos de la sonda para el alelo 2. Es decir, el producto de la sonda para el alelo 1 consiste en la sonda 2201 más un nucleótido adicional con una o más marcas de tipo "A", y los productos de la sonda para el alelo 2 consisten en la sonda 2201 más un nucleótido adicional con una o más marcas de tipo "B".

[0382] La figura 43 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 43 muestra dos conjuntos de sondas para identificar varios alelos del mismo locus genómico. Por ejemplo, para distinguir los alelos maternos y fetales, en el caso del ADN libre aislado de una mujer embarazada, o para distinguir los alelos del huésped y del donante, en el caso del ADN libre de un receptor de trasplante de órgano. La figura 43 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el alelo 1 y otro para el alelo 2.2304 y 2305 son moléculas diana correspondientes al alelo 1 y al alelo 2, respectivamente.

[0384] Un primer conjunto de sondas contiene la sonda miembro 2302. Esta sonda contiene un marcador de afinidad (2300) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda. Los conjuntos de sondas utilizados para la identificación de los dos alelos diferentes son los mismos. Es decir, el conjunto de sondas para el alelo 2 consta de la sonda miembro 2302. La sonda 2302 hibrida con una secuencia correspondiente al alelo 1 y al alelo 2, respectivamente, en la figura 43. El diseño de la sonda 2302 permite que el primer nucleótido adyacente a los dominios de hibridación contenga un nucleótido diferente para el alelo 1 y el alelo 2. En otras palabras, el primer nucleótido adyacente al dominio de hibridación puede ser un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). En este ejemplo, el primer nucleótido adyacente en 2304 junto al dominio de hibridación de 2302 es una "A", mientras que el primer nucleótido adyacente en 2305 junto al dominio de hibridación de 2302 es una "T". Es decir, los productos de la sonda del alelo 1 y del alelo 2 pueden distinguirse entre sí basándose en la identidad del primer nucleótido inmediatamente adyacente al dominio de hibridación.

[0386] Se utilizará una ADN polimerasa u otra enzima para añadir al menos un nucleótido adicional a cada secuencia de sonda. En este ejemplo, los sustratos nucleotídicos de la ADN polimerasa son capaces de una sola adición, posiblemente porque los nucleótidos añadidos a la mezcla de reacción son didesoxinucleótidos. Es decir, solo se añadirá un nucleótido nuevo a cada secuencia de sonda. En este ejemplo, el nucleótido añadido a la sonda 2302 para el alelo 1 contendrá una o más marcas (2303) de tipo "A". El nucleótido añadido a la sonda 2302 para el alelo 2 contendrá una o más marcas (2306) de tipo "B", de modo que los productos de la sonda para el alelo 1 puedan distinguirse claramente de los productos de la sonda para el alelo 2. Es decir, el producto de la sonda para el alelo 1 consiste en la sonda 2302 más un nucleótido adicional con una o más marcas de tipo "A", y los productos de la sonda para el alelo 2 consisten en la sonda 2302 más un nucleótido adicional con una o más marcas de tipo "B".

[0388] Las sondas 2302 contienen uno o más marcadores (2301) de tipo "C". Por lo tanto, las sondas producto contendrán una combinación de marcadores. Para el alelo 1, las sondas producto contendrán marcadores de tipo "A" y tipo "C", mientras que las sondas producto del alelo 2 contendrán marcadores de tipo "B" y tipo "C".

[0390] La figura 44 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 44 muestra dos conjuntos de sondas para identificar varios alelos del mismo locus genómico. Por ejemplo, para distinguir los alelos maternos y fetales, en el caso del ADN libre aislado de una mujer embarazada, o para distinguir los alelos del huésped y del donante, en el caso del ADN libre de un receptor de trasplante de órgano. La figura 44 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el alelo 1 y otro para el alelo 2.2405 y 2406 son moléculas diana correspondientes al alelo 1 y al alelo 2, respectivamente.

[0392] Un primer conjunto de sondas contiene la sonda miembro 2401. Esta sonda contiene un marcador de afinidad (2400) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda. Los conjuntos de sondas utilizados para la identificación de dos alelos diferentes son los mismos. Es decir, el conjunto de sondas para el alelo 2 consta de la sonda miembro 2401. La sonda 2401 hibrida con una secuencia correspondiente al alelo 1 y al alelo 2, respectivamente, en la figura 44. El diseño de la sonda para 2401 es tal que el primer nucleótido adyacente a los dominios de hibridación contiene un nucleótido diferente para el alelo 1 y el alelo 2. En otras palabras, el primer nucleótido adyacente al dominio de hibridación puede ser un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). En este ejemplo, el primer nucleótido adyacente en 2405 junto al dominio de hibridación de 2401 es una "A", mientras que el primer nucleótido adyacente en 2406 junto al dominio de hibridación de 2401 es una "T". Es decir, los productos de la sonda del alelo 1 y del alelo 2 pueden distinguirse entre sí basándose en la identidad del primer nucleótido inmediatamente adyacente al dominio de hibridación.

[0394] [0198]Se utilizará una ADN polimerasa u otra enzima para añadir al menos un nucleótido adicional a cada secuencia de sonda. En este ejemplo, el nucleótido añadido a la sonda 2401 para el alelo 1 contendrá una o más marcas (2402) de tipo "A". El nucleótido añadido a la sonda 2401 para el alelo 2 contendrá una o más marcas (2407) de tipo "B", de modo que las sondas producto del locus 1 puedan distinguirse claramente de las sondas producto del locus 2. Es decir, la sonda producto del alelo 1 contiene la sonda 2401 más un nucleótido adicional con una o más marcas de tipo "A", y la sonda producto del alelo 2 contiene la sonda 2401 más un nucleótido adicional con una o más marcas de tipo "B". Un nucleótido diferente, distinto del utilizado para distinguir el alelo 1 del alelo 2, servirá como terminador de cadena. En este ejemplo particular, se utiliza un nucleótido "A" en una molécula diana para identificar el alelo 1 y un nucleótido "T" para identificar el alelo 2. En este ejemplo, un nucleótido "C" puede servir como terminador de cadena. En este caso, se añadirá al ensayo un nucleótido "C" que no sea capaz de elongación de cadena (por ejemplo, un didesoxi C). Una restricción adicional es que las secuencias de sonda están diseñadas de tal manera que no haya casos de un nucleótido identificador del alelo 2 presente en 2405 entre el nucleótido distintivo del alelo 1 y el nucleótido de terminación de cadena. En este ejemplo, no habrá nucleótidos "T" presentes en 2405 después del dominio de hibridación de 2401 y antes de una G, que se emparejará con el terminador de cadena C.

[0396] Se utilizará la ADN polimerasa o una enzima similar para sintetizar nuevas secuencias de nucleótidos. El nucleótido añadido en la posición distintiva del alelo 1 contendrá una o más marcas (2402) de tipo "A". El nucleótido añadido en la posición distintiva del alelo 2 contendrá una o más marcas (2407) de tipo "B", de modo que las sondas producto del alelo 1 puedan distinguirse claramente de las sondas producto del alelo 2. El nucleótido añadido en la posición de terminación de la cadena contendrá una o más marcas (2403) de tipo "C". Por lo tanto, las sondas producto contendrán una combinación de marcas. Para el alelo 1, las sondas producto contendrán marcas de tipo "A" y tipo "C", mientras que las sondas producto del alelo 2 contendrán marcas de tipo "B" y tipo "C".

[0398] La figura 45 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 45 muestra dos conjuntos de sondas para identificar varios alelos del mismo locus genómico. Por ejemplo, para distinguir los alelos maternos y fetales, en el caso del ADN libre aislado de una mujer embarazada, o para distinguir los alelos del huésped y del donante, en el caso del ADN libre de un receptor de trasplante de órgano. La figura 45 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el alelo 1 y otro para el alelo 2.2505 y 2506 son moléculas diana correspondientes al alelo 1 y al alelo 2, respectivamente.

[0400] Un primer conjunto de sondas contiene la sonda miembro 2501. Esta sonda contiene un marcador de afinidad (2500) que puede utilizarse para el aislamiento y la identificación del producto de la sonda. Los conjuntos de sondas utilizados para la identificación de dos alelos diferentes son los mismos. Es decir, el conjunto de sondas para el alelo 2 consta de la sonda miembro 2501. La sonda 2501 hibrida con una secuencia correspondiente al alelo 1 y al alelo 2, respectivamente, en la figura 45. El diseño de la sonda para 2501 es tal que el primer nucleótido adyacente a los dominios de hibridación contiene un nucleótido diferente para el alelo 1 y el alelo 2. En otras palabras, el primer nucleótido adyacente al dominio de hibridación puede ser un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). En este ejemplo, el primer nucleótido adyacente en 2505 junto al dominio de hibridación de 2501 es una "A", mientras que el primer nucleótido adyacente en 2506 junto al dominio de hibridación de 2501 es una "T". Es decir, los productos de la sonda del alelo 1 y del alelo 2 pueden distinguirse entre sí basándose en la identidad de la primera base inmediatamente adyacente al dominio de hibridación.

[0402] Se utilizará una ADN polimerasa u otra enzima para añadir al menos un nucleótido adicional a cada secuencia de sonda. En este ejemplo, el nucleótido añadido a la sonda 2501 para el alelo 1 contendrá una o más marcas (2502) de tipo "A". El nucleótido añadido a la sonda 2501 para el alelo 2 contendrá una o más marcas (2507) de tipo "B", de modo que las sondas producto del locus 1 puedan distinguirse claramente de las sondas producto del locus 2. Es decir, la sonda producto del alelo 1 contiene la sonda 2501 más un nucleótido adicional con una o más marcas de tipo "A", y la sonda producto del alelo 2 contiene la sonda 2501 más un nucleótido adicional con una o más marcas de tipo "B". Un nucleótido diferente, distinto del utilizado para distinguir el alelo 1 del alelo 2, servirá como terminador de cadena. En este ejemplo particular, se utiliza un nucleótido "A" en una molécula diana para identificar el alelo 1 y un nucleótido "T" para identificar el alelo 2. En este ejemplo, un nucleótido "C" puede servir como terminador de cadena. En este caso, se añadirá al ensayo un nucleótido "C" que no sea capaz de elongación de cadena (por ejemplo, un didesoxi C). Una restricción adicional es que las secuencias de sonda están diseñadas de tal manera que no hay instancias de un nucleótido identificador para el alelo 2 en 2505 entre el nucleótido distintivo del alelo 1 y el nucleótido de terminación de cadena. En este ejemplo, no habrá nucleótidos "T" presentes en 2505 después del dominio de hibridación de 2501 y antes de una G, que se emparejará con el terminador de cadena C.

[0404] Se utilizará la ADN polimerasa o una enzima similar para sintetizar nuevas secuencias de nucleótidos. El nucleótido añadido en la posición distintiva del alelo 1 contendrá una o más marcas (2502) de tipo "A". El nucleótido añadido en la posición distintiva del alelo 2 contendrá una o más marcas (2507) de tipo "B", de modo que las sondas producto del alelo 1 se distingan claramente de las sondas producto del alelo 2. En esta forma de realización, se puede añadir al ensayo un cuarto nucleótido que contenga una o más marcas (2508, 2503) de tipo "C". Este cuarto nucleótido no se aparea con el nucleótido identificador del alelo 1 (en este ejemplo, A), ni con el nucleótido identificador del alelo 2 (en este ejemplo, T) ni con el nucleótido de terminación de cadena (en este ejemplo, G). En este ejemplo, el cuarto nucleótido que llevaría uno o más marcadores de tipo "C" es G y se emparejará con las ubicaciones C en 2505 y 2506. Por lo tanto, las sondas producto contendrán una combinación de marcadores. Para el alelo 1, las sondas producto contendrán marcadores de tipo "A" y tipo "C", mientras que las sondas producto del alelo 2 contendrán marcadores de tipo "B" y tipo "C".

[0406] La figura 46 muestra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 21. La figura 46 muestra dos conjuntos de sondas para identificar varios alelos del mismo locus genómico. Por ejemplo, para distinguir alelos maternos y fetales, en el caso del ADN libre aislado de una mujer embarazada, o para distinguir alelos del huésped y del donante, en el caso del ADN libre de un receptor de trasplante de órgano. La figura 46 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el alelo 1 y otro para el alelo 2. 2605 y 2606 son moléculas diana correspondientes al alelo 1 y al alelo 2, respectivamente. Un primer conjunto de sondas contiene la sonda miembro 2602.2602 contiene un marcador (2601) de tipo "A". 2602 contiene un marcador de afinidad (2600) que puede utilizarse para el aislamiento e identificación del producto de la sonda.

[0407] Un segundo conjunto de sondas, con la sonda miembro 2609, presenta las mismas características que el primer conjunto de sondas. Sin embargo, la sonda 2609 contiene un marcador (2608) de tipo "B", distinguible del tipo "A". La sonda 2609 contiene un marcador de afinidad (2607) que puede ser idéntica o única a la sonda 2600.

[0409] Las sondas 2602 y 2609 contienen secuencias prácticamente idénticas, con una única diferencia de nucleótido. Por lo tanto, las secuencias de hibridación de estas dos sondas son complementarias al alelo 1 (2605) o al alelo 2 (2606). Además, la longitud de cada dominio de hibridación en las sondas 2602 y 2609, así como las condiciones experimentales de hibridación, están diseñadas de forma que la sonda 2602 solo hibride con el alelo 1 y la sonda 2609 solo con el alelo 2. El objetivo de este tipo de ensayo es cuantificar con precisión la frecuencia de los alelos 1 y 2 en una muestra.

[0411] Se puede utilizar la ADN polimerasa u otra enzima para sintetizar una nueva secuencia de polinucleótidos, por ejemplo, 2604 en el caso del alelo 1 o 2611 en el caso del alelo 2.2604 y 2611 pueden contener una o más marcas (2603, 2610) de tipo "C", posiblemente como resultado de la incorporación de uno o más nucleótidos con una marca de tipo "C". Por lo tanto, las sondas producto contendrán una combinación de marcas. Para el alelo 1, las sondas producto contendrán marcas de tipo "A" y tipo "C", mientras que las sondas producto del alelo 2 contendrán marcas de tipo "B" y tipo "C". Esto da como resultado sondas producto con alta especificidad para las secuencias del alelo 1 o del alelo 2, respectivamente.

[0413] Las figuras 55-58 ilustran una modificación del procedimiento general descrito con respecto a las figuras 21-46. La figura 55 muestra dos conjuntos de sondas: uno para el locus 1 y otro para el locus 2; aunque, como se mencionó anteriormente, se pueden diseñar varios conjuntos de sondas para cada locus genómico. El brazo izquierdo del conjunto de sondas del locus 1 consta de una secuencia de cebador directo, una secuencia de marcador de afinidad y un homólogo de la secuencia del locus 1. El brazo derecho del conjunto de sondas del locus 1 consta de un homólogo de la secuencia del locus 1 y una secuencia de cebador inverso para marcar el conjunto de sondas del locus 1 con el marcador A. El brazo izquierdo del conjunto de sondas del locus 2 consta de una secuencia de cebador directo, una secuencia de marcador de afinidad y un homólogo de la secuencia del locus 2. El brazo derecho del conjunto de sondas del Locus 2 consta de una secuencia homóloga del Locus 2 y una secuencia de cebador inverso para marcar dicho conjunto con el marcador B. La secuencia de cebador directo y la secuencia del marcador de afinidad son idénticas para los conjuntos de sondas de los Locus 1 y 2. Las secuencias homólogas son específicas de un único locus genómico. Las secuencias homólogas de cada conjunto de sondas son inmediatamente adyacentes, de modo que, al hibridar con sus locus diana, se unen inmediatamente y, por lo tanto, pueden ligarse para formar una molécula continua. La secuencia de cebador inverso es específica del marcador (p. ej., marcador A o marcador B) que se utilizará para marcar las sondas para un locus específico y una secuencia de marcador de afinidad específica.

[0415] La figura 56 representa el flujo de trabajo procedimental que se aplicaría a la colección de conjuntos de sondas, como los conjuntos de sondas ilustrados en la figura 55. Esta representación se basa en un conjunto de sondas para un locus genómico (p. ej., el conjunto de sondas para el Locus 1 que se muestra en la figura 55). En el Paso 1, la colección de conjuntos de sondas se mezcla con ADN libre de células purificado. En el Paso 2, las secuencias específicas del locus en cada conjunto de sondas hibridan con sus secuencias homólogas correspondientes en la muestra de ADN libre de células. En el Paso 3, se añade una enzima ligasa para catalizar la formación de un enlace fosfodiéster entre la base 3' del homólogo del brazo izquierdo y el brazo 5' del homólogo derecho, cerrando la muesca entre los dos brazos y formando así una molécula continua que es el producto de la sonda. En el Paso 4, se añaden cebadores modificados y componentes de la reacción de PCR (Taqpolimerasa, dNTP y tampón de reacción) para amplificar el producto de la sonda ligada. El cebador directo se modifica porque tiene un grupo fosfato 5' que lo convierte en una plantilla preferida para la exonucleasa Lambda utilizada en el paso 6 y el cebador inverso se modifica porque contiene el marcador (círculo azul) que es específico para los productos de la sonda para un locus particular para un marcador de afinidad particular. En el paso 5, el producto de la sonda se amplifica por PCR para producir un producto de PCR bicatenario en el que la cadena directa contiene un grupo fosfato 5' y la cadena inversa contiene un marcador 5'. En el paso 6, se añade la exonucleasa Lambda para digerir la cadena directa en una dirección 5' a 3': el grupo fosfato 5' en la cadena directa la convierte en una plantilla preferida para la digestión con la exonucleasa Lambda. El material resultante es monocatenario (solo la cadena inversa) con un marcador 5'. Esto representa el material diana marcado para la hibridación con un micromatriz o una monocapa.

[0417] La figura 57 muestra una versión modificada del flujo de trabajo ilustrado en la figura 56. El brazo izquierdo de cada conjunto de sondas contiene una molécula de biotina terminal, como se indica con una "B" en los pasos 1 a 6 de la figura. Esta biotinilación permite la purificación del conjunto de sondas producto tras la finalización de la reacción de hibridación-ligación y antes de la amplificación por PCR. El flujo de trabajo de este método es idéntico al descrito en la figura 57 para los pasos 1 a 3. En el paso 4, se añaden microesferas magnéticas recubiertas de estreptavidina a la reacción de hibridación-ligación. La molécula de biotina contenida en las sondas producto unirá estas a la estreptavidina. En el paso 5, se lavan las microesferas magnéticas para eliminar el ADN no biotinilado (ADN genómico libre de células y oligonucleótidos del brazo derecho), lo que da como resultado una sonda producto purificada. Los pasos 6 a 9 se realizan de la misma manera que los pasos 4 a 7 de la figura 56.

[0419] [0211]Las figuras 58A, 58B y 58C muestran un ejemplo de cómo las sondas producto de los locus 1 y 2 pueden marcarse con diferentes moléculas marcadoras. En la figura 58A, las sondas producto de los locus 1 se marcan con el marcador A (verde) y las sondas producto de los locus 2 con el marcador B (roja) en una misma reacción de amplificación por PCR. Las sondas producto de ambos locus contienen la secuencia del marcador de afinidad A. En la figura 58B, la mezcla de sondas producto con marcaje diferencial se hibrida con una ubicación de micromatriz donde la secuencia de la sonda de captura es complementaria a la secuencia del marcador de afinidad A. En la figura 58C, se visualiza la ubicación de micromatriz y se cuenta el número de moléculas de los marcadores A y B para obtener una medida relativa de los niveles de los locus 1 y 2 presentes en la muestra.

[0420] La figura 59 evidencia que los productos de sonda que representan múltiples localizaciones genómicas para un locus pueden generarse mediante el proceso de hibridación-ligación, específicamente para la enzima ligasa. Ocho conjuntos de sondas, cada uno compuesto por un brazo izquierdo y uno derecho, como se describe en la figura 55, y que contienen homólogos de ocho localizaciones del cromosoma 18, se hibridaron con moldes de oligonucleótidos sintéticos (aproximadamente 48 nucleótidos) y se ligaron mediante una enzima ligasa para unir los brazos izquierdo y derecho de cada uno. Los productos de reacción se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. La línea 1 del gel contiene una escala de pesos moleculares que indica el tamaño de las bandas de ADN. Las líneas 2 a 9 contienen los productos de la reacción de hibridación-ligación de los ocho conjuntos de sondas del cromosoma 18. Una banda de ADN de aproximadamente 100 nucleótidos, que representa el producto de la sonda del brazo izquierdo (de aproximadamente 60 nucleótidos) y del brazo derecho (de aproximadamente 40 nucleótidos), está presente en cada uno de los carriles 2 a 9. Los carriles 10 y 11 contienen reacciones de control negativo a las que no se añadió la enzima ligasa. No hay ninguna banda de ADN de aproximadamente 100 nucleótidos presente en los carriles 10 y 11.

[0421] Las figuras 60A y 60B proporcionan datos que indican que los conjuntos de sondas pueden utilizarse para detectar cambios relativos en el número de copias. Se utilizó una mezcla de ocho conjuntos de sondas con homólogos de ocho localizaciones distintas del cromosoma X para analizar las líneas celulares con diferentes números de cromosoma X, como se indica en la Tabla 1.

[0422] Tabla 1:Líneas celulares con diferentes números de copias del cromosoma X.

[0425]

[0427] Se utilizó PCR cuantitativa para determinar la cantidad de producto sonda presente en cada línea celular tras los procesos de hibridación-ligación y purificación descritos en la figura 57 (Pasos 1 a 5). Como se ilustra en la figura 60A, el número de copias medido para las distintas líneas celulares siguió la tendencia esperada indicada en la Tabla 1. Por ejemplo, la qPCR indicó un número de copias inferior a dos para NA12138, que tiene una copia del cromosoma X. El número de copias medido para NA00254 (tres copias de X) fue superior a dos, para NA01416 (cuatro copias de X) fue superior a tres y para NA0606 l (cinco copias de X) fue superior a cuatro. La capacidad de respuesta del proceso para detectar diferencias en el número de copias se ilustra con más detalle en la figura 60B, en la que se grafica el número de copias medido frente al número de copias teórico.

[0428] Las figuras 61A, 61B y 61C proporcionan evidencia de que se pueden utilizar mezclas de productos de sonda para generar datos de micromatrices cuantitativos como se describe en las figuras 56 y 57.

[0429] La figura 61A muestra imágenes representativas de fluorescencia de dos puntos de matriz en dos canales de imagen ortogonales (Alexa 488: verde, Alexa 594; rojo). Se selecciona automáticamente una región de interés (ROI) (círculo grande), y cualquier contaminante brillante no deseado se oculta de la imagen (regiones más pequeñas delineadas dentro de la ROI). Los fluoróforos individuales en productos de ensayo hibridados individuales se visualizan como pequeñas características puntiformes dentro del punto de matriz. (i) Un punto "Balanceado" (que representa las dianas genómicas introducidas con una concentración 1:1 respecto al ensayo) se visualiza en el canal verde y (ii) el mismo punto se visualiza en el canal rojo. (iii) Un punto "Aumentado" (que representa las dianas genómicas introducidas con una concentración > 1:1 respecto al ensayo) se visualiza en el canal verde y (iv) el mismo punto se visualiza en el canal rojo.

[0430] La figura 61B presenta los recuentos brutos de fluoróforos detectados en dos canales para cinco puntos de cada una de las condiciones "Equilibrada" y "Aumentada". A pesar de cierta variación en el número absoluto de fluoróforos, las cifras en los dos canales se asemejan en el caso "Equilibrado", pero muestran una clara separación en el caso "Aumentado".

[0431] [0218]La figura 61C presenta los valores calculados de la razón para el número de fluorescencias en el canal verde dividido por el número de fluorescencias en el canal rojo, para los cinco puntos de cada una de las condiciones "Equilibrada" y "Aumentada". El caso "Equilibrado" se centra en una razón de 1,0, mientras que el caso "Aumentada" presenta una razón elevada. Considerando el caso "Equilibrado" como la comparación de dos locus genómicos equilibrados, y el caso "Aumentado" como uno en el que un locus aumenta con respecto al otro, podemos calcular la confianza de separación de las dos condiciones mediante una prueba T independiente de dos grupos, que arroja un valor p de 8 x 10<-14>.

[0433] La figura 62 ilustra una modificación del procedimiento general descrito en las figuras 55 a 58. Un segundo conjunto de sondas, el Conjunto de Sondas B, está diseñado para cada ubicación genómica, de modo que las secuencias homólogas del genoma del Conjunto de Sondas B constituyen un complemento inverso de las secuencias homólogas del genoma del Conjunto de Sondas A. El Conjunto de Sondas A hibridará con la cadena inversa del ADN genómico y el Conjunto de Sondas B con la cadena directa. Esto proporcionará una mayor sensibilidad en comparación con la forma de realización descrita en las figuras 55 a 58, ya que producirá aproximadamente el doble de productos de sonda por locus.

[0435] La figura 63 ilustra una modificación del procedimiento general descrito en la figura 57. El cebador inverso utilizado en el Paso 6 se modifica adicionalmente, ya que los cuatro enlaces que unen los primeros cinco nucleótidos de la secuencia de oligonucleótidos son enlaces fosforotioato. Esta modificación hará que todos los productos de PCR generados durante la amplificación por PCR (Paso 7) presenten una modificación fosforotioato en el extremo 5'. Esta modificación protegerá la cadena inversa de cualquier digestión que pueda ocurrir durante el tratamiento con la exonucleasa Lambda en el Paso 8.

[0437] Aunque el grupo fosfato 5' de la cadena anterior la convierte en una plantilla preferida para la digestión con la exonucleasa Lambda, la cadena inversa aún puede presentar cierta vulnerabilidad a la digestión. La modificación con fosforotioato del extremo 5' de la cadena inversa reducirá su vulnerabilidad a la digestión con la exonucleasa Lambda.

[0439] La figura 64 ilustra una modificación del procedimiento general descrito en las figuras 55 a 58. La amplificación por PCR del producto de la sonda se sustituye por una amplificación lineal añadiendo el cebador inverso, pero no el cebador directo, a la reacción de amplificación en el Paso 6. Si solo está presente el cebador inverso, el producto de amplificación será monocatenario (la cadena inversa con un marcador en el extremo 5'). Dado que el producto de amplificación ya es monocatenario, no requiere procesamiento adicional antes de la hibridación con un micromatriz; es decir, se puede omitir la digestión con la exonucleasa Lambda. Dado que en esta forma de realización no se utiliza un cebador directo, no es necesario que el brazo izquierdo del conjunto de sondas contenga una secuencia de cebador directo. El brazo izquierdo consistiría únicamente en una secuencia de marcador de afinidad y una secuencia homóloga del locus, como se ilustra en la figura 64.

[0441] Otro método del procedimiento general descrito en las figuras 55 a 58 consiste en sustituir la reacción de ligación simple del Paso 3 por una reacción de ligación cíclica. Esto se consigue sustituyendo la enzima ligasa termolábil (p. ej., la ligasa T4) utilizada para catalizar la reacción de ligación por una ligasa termoestable (p. ej., la ligasa Taq). Cuando se utiliza una ligasa termoestable, la reacción de hibridación-ligación puede calentarse a una temperatura que funda todos los dúplex de ADN (p. ej., 95 ºC) tras el ciclo inicial de hibridación y ligación. Esto hará que el ADN molde genómico esté completamente disponible para la hibridación y ligación de otro conjunto de sondas. Una reducción posterior de la temperatura (p. ej., a 45 ºC) permitirá que se produzca la siguiente hibridación y ligación. Cada termociclado de la reacción de hibridación y ligación entre una temperatura que funda los dúplex de ADN y otra que permita la hibridación y la ligación aumentará linealmente la cantidad de sonda producto obtenida de la reacción. Si la reacción se expone a 30 ciclos de este tipo, se obtendrá hasta 30 veces la cantidad de producto de sonda que en un proceso en el que se utiliza una sola reacción de ligadura.

[0443] Las figuras 65A y 65B representan métodos adicionales del procedimiento modificado descrito en la figura 62. Este método aprovecha la reacción en cadena de la ligasa (LCR) al combinar la presencia del complemento inverso para cada conjunto de sondas con el uso de una ligasa termoestable para permitir una reacción de ligación cíclica en la que el producto se amplifica exponencialmente. Las figuras 65A y 65B representan dos conjuntos de sondas, el Conjunto de Sondas A y el Conjunto de Sondas B para un locus; donde las secuencias homólogas del genoma en el Conjunto de Sondas B son el complemento inverso de las secuencias homólogas del genoma en el Conjunto de Sondas A. El brazo 5' de cada Conjunto de Sondas consiste en una secuencia de marcador de afinidad y un homólogo, mientras que el brazo 3' de cada Conjunto de Sondas consiste en una secuencia homóloga con un marcador adjunta. En el primer ciclo de una reacción termociclada, el ADN genómico será la única plantilla disponible para permitir que ocurra la hibridación y la ligación para generar un producto de sonda, como se ilustra en la figura 65A. Sin embargo, en el segundo ciclo, el producto sonda B generado en el primer ciclo actuará como plantilla adicional para el conjunto de sondas A, y, de igual manera, el producto sonda A generado en el primer ciclo actuará como plantilla adicional para el conjunto de sondas B, como se ilustra en la figura 65B. De igual manera, los productos sonda de cada ciclo sucesivo actuarán como plantilla para la hibridación y ligación del conjunto de sondas en el siguiente ciclo. Este proceso eliminaría la necesidad de amplificar por PCR el producto sonda, que podría utilizarse directamente como diana de micromatriz.

[0445] Otro método del procedimiento mostrado en las figuras 65A y 65B emplea LCR, pero utiliza conjuntos de sondas con la estructura descrita en la figura 55; es decir, los brazos izquierdo y derecho están flanqueados por secuencias de cebado, el brazo izquierdo contiene una molécula de biotina y el brazo derecho no contiene un marcador. Tras completar la LCR, las sondas se purifican mediante microesferas magnéticas (opcional), se amplifican por PCR y se prepara la diana de micromatriz, como se ilustra en las figuras 56 y 57.

[0446] Las figuras 66A, 66B y 66C muestran otros métodos del procedimiento descrito en las figuras 65A y 65B. El brazo 5' de cada conjunto de sondas consta de una secuencia de marcador de afinidad y un homólogo, mientras que el brazo 3' de cada conjunto de sondas consta de una secuencia homóloga y una secuencia de cebador sin marcador, como se ilustra en la figura 66A. Tras completar la LCR, la sonda producto puede purificarse. El producto de LCR se amplifica linealmente mediante la adición de un único cebador con marcador, junto con los componentes de reacción (Taq polimerasa, dNTP y tampón de reacción), como se ilustra en la figura 66B. El producto de esta amplificación sería monocatenario (solo la cadena inversa) con un marcador 5', como se ilustra en la figura 66C. Por lo tanto, no sería necesario tratarlo con la exonucleasa Lambda, sino que podría utilizarse directamente como diana de micromatriz.

[0447] En ocasiones, la variación genética determinada mediante un método indica la presencia o ausencia de cáncer, variabilidad farmacocinética, toxicidad farmacológica, rechazo de trasplantes o aneuploidía en el sujeto. En otras ocasiones, la variación genética determinada indica la presencia o ausencia de cáncer. Por consiguiente, se puede realizar un método para diagnosticar el cáncer.

[0448] Un desafío significativo en oncología es la detección temprana del cáncer. Esto es particularmente cierto en cánceres que son difíciles de visualizar o biopsiar (p. ej., cáncer de páncreas, cáncer de pulmón). El ADN tumoral libre de células (ADNlc tumoral) en la sangre de un paciente ofrece un método para detectar un tumor de forma no invasiva. Estos pueden ser tumores sólidos, tumores benignos, microtumores, tumores líquidos, metástasis u otros crecimientos somáticos. La detección puede realizarse en cualquier etapa del desarrollo del tumor, aunque idealmente es temprana (estadio I o estadio II). La detección temprana permite la intervención (p. ej., cirugía, quimioterapia, tratamiento farmacéutico) que puede prolongar la vida o llevar a la remisión. Otros problemas en oncología incluyen el monitoreo de la eficacia del tratamiento, la titulación de la dosis de un agente terapéutico, la recurrencia de un tumor ya sea en el mismo órgano que el tumor primario o en ubicaciones distales y la detección de metástasis.

[0449] En ocasiones, los conjuntos de sondas pueden configurarse para identificar variaciones genéticas conocidas asociadas con tumores. Estas pueden incluir mutaciones, SNP, variantes en el número de copias (p. ej., amplificaciones, deleciones), variantes de copia neutra (p. ej., inversiones, translocaciones) o combinaciones complejas de estas variantes. Por ejemplo, las variaciones genéticas conocidas asociadas con tumores incluyen las que se enumeran en cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic;

[0450] nature.com/ng/joumal/v45/n10/full/ng.2760.html#supplementary-information; y en las Tablas 2 y 3 a continuación:<B>GEN = valor p corregido a FDR dentro del pico;<K>Oncogén conocido frecuentemente amplificado o TSG delecionado;<P>Gen canceroso putativo;<E>Regulador epigenético;<M>Gen asociado a mitocondrias;

[0451] *Inmediatamente adyacente a la región del pico;<T>Adyacente al telómero o centrómero del cromosoma acrocéntrico.;[0452] ;[0453] ;[0454] ;[0455] ;[0456] ;[0457] ;[0458] ;[0459] ;[0460] ;[0463] En el método de diagnóstico del cáncer, las inversiones que ocurren en ubicaciones conocidas (Figura 67A) pueden ser fácilmente dirigidas mediante el diseño de sondas que se superpongan, al menos parcialmente, al punto de ruptura en un brazo de la sonda. Una primera sonda, que se une a la secuencia "normal", se dirige al material genómico no invertido (Figura 67B) y porta un primer tipo de marcador. Una segunda sonda, que se une a la diana "invertida", porta un segundo tipo de marcador (Figura 67C). Un brazo derecho común de la sonda se une a la secuencia nativa, no susceptible a la inversión, inmediatamente adyacente a las dos primeras sondas. Este brazo derecho de la sonda, además, porta un marcador pull-down común que localiza los productos de la sonda en la misma región de un sustrato de imagen. De esta manera, los pares de sondas pueden hibridar con las dianas genómicas, ligarse y ser visualizados para obtener recuentos relativos de las dos especies subyacentes.;[0464] De forma similar, también se pueden analizar las translocaciones con puntos de ruptura conocidos. La figura 68A muestra dos elementos genéticos que se encuentran en su orden nativo o translocados. Los brazos de sonda que se superponen, al menos parcialmente, a estos puntos de ruptura de translocación permiten diferenciar entre órdenes normales y transpuestos de material genético. Como se muestra en las figuras 68B y 68C, al seleccionar marcadores únicos en los dos brazos izquierdos, los productos de sonda ligados resultantes se pueden distinguir y contar durante la obtención de imágenes.;[0465] Estos métodos para detectar cambios neutrales en cuanto a la copia (por ejemplo, inversiones, translocación) también pueden usarse para detectar variantes de la línea germinal en el cáncer o en otras enfermedades o afecciones.;[0466] Las mutaciones o SNP también están implicadas en numerosos tipos de cáncer y se dirigen de forma similar a las que se interrogan para determinar la fracción fetal en aplicaciones de diagnóstico prenatal. En algunos métodos mostrados en las figuras 69A y 69B, los brazos de sonda izquierdos están diseñados para aprovechar un desequilibrio energético causado por uno o más SNP no coincidentes. Esto provoca que un brazo de sonda (1101, con un marcador) se una de forma más favorable que un segundo brazo de sonda (1107, con un segundo tipo de marcador). Ambos diseños se ligan al mismo brazo de sonda derecho (1102), que lleva el marcador pull-down universal.;[0467] La sangre de un paciente puede analizarse mediante un método o una combinación de varios. Además, en algunos casos, puede ser útil personalizar sondas específicas para cada paciente. Esto implica caracterizar las características tumorales (SNP, translocaciones, inversiones, etc.) en una muestra del tumor primario (p. ej., una biopsia) y crear uno o más conjuntos de sondas personalizados, optimizados para detectar dichas variaciones genéticas específicas en la sangre del paciente, lo que proporciona un método de monitorización no invasivo y económico. Esto podría ser muy útil en caso de recaída, donde lo ideal es detectar la recurrencia de bajo nivel de un tipo de tumor (idéntico o relacionado con el tumor original) lo antes posible.;[0468] Para las vías comunes de progresión de enfermedades, se pueden diseñar paneles adicionales para anticipar y monitorear el avance de la enfermedad. Por ejemplo, si las mutaciones tienden a acumularse en un orden determinado, se pueden diseñar sondas para monitorear el estado actual y los puntos de control de la progresión, y así orientar las opciones terapéuticas.;[0469] Detección temprana del cáncer: Por ejemplo, la translocación ALK se ha asociado con el cáncer de pulmón. Una sonda diseñada para analizar la translocación ALK podría utilizarse para detectar tumores de este tipo mediante una muestra de sangre. Esto resultaría muy ventajoso, ya que el método estándar para detectar tumores pulmonares es la radiografía de tórax, un procedimiento costoso que puede ser perjudicial para la salud del paciente y, por lo tanto, no se realiza habitualmente.;[0470] Detección de la recurrencia del tumor primario: Por ejemplo, si se extirpa quirúrgicamente un tumor de mama HER2+ y la paciente se encuentra en remisión, se puede utilizar una sonda dirigida al gen HER2 para monitorizar la amplificación de dicho gen en uno o más puntos temporales. Si se detectan estas, la paciente podría presentar un segundo tumor HER2+, ya sea en el tumor primario o en otra parte.;[0471] Detección de tipos de tumores no primarios: Por ejemplo, si se extirpa quirúrgicamente un tumor de mama HER2+ y la paciente se encuentra en remisión, se puede utilizar una sonda dirigida al gen EGFR para detectar tumores EGFR+. Si se detectan, la paciente podría tener un segundo tumor EGFR+, ya sea en el tumor primario o en otra parte.;[0472] Detección de metástasis: Por ejemplo, si la paciente tiene un tumor de mama HER2+, se puede utilizar una sonda diseñada para analizar la translocación ALK y detectar tumores de este tipo mediante una muestra de sangre. Es posible que este tumor no se encuentre en la mama, sino en el pulmón. Si se detectan estas metástasis, la paciente podría tener un tumor metastásico distal al órgano primario.;[0473] Determinación de la heterogeneidad tumoral: Muchos tumores presentan múltiples poblaciones clonales caracterizadas por diferentes variantes genéticas. Por ejemplo, un tumor de mama puede tener una población de células HER2+ y otra población de células EGFR+. El uso de sondas diseñadas para identificar ambas variantes permitiría identificar esta heterogeneidad genética subyacente.;[0474] Medición de la carga tumoral: En todos los ejemplos anteriores, se puede medir la cantidad de ADNc tumoral y utilizarla para determinar el tamaño, la tasa de crecimiento, la agresividad, el estadio, el pronóstico, el diagnóstico y otros atributos del tumor y del paciente. Idealmente, las mediciones se realizan en más de un momento para mostrar los cambios en la cantidad de ADNc tumoral.;[0475] Monitoreo del tratamiento: Por ejemplo, un tumor de mama HER2+ se trata con Herceptin. Se puede usar una sonda dirigida al gen HER2 para monitorear la cantidad de ADNc tumoral, que puede ser un indicador del tamaño del tumor. Esto permite determinar si el tumor está cambiando de tamaño y modificar el tratamiento para optimizar el pronóstico del paciente. Esto puede incluir cambiar la dosis, suspender el tratamiento, cambiar a otra terapia o combinar múltiples terapias.;[0476] Detección de ADN tumoral: Actualmente no existe una prueba universal para el cáncer. La presente invención ofrece una forma de detectar tumores en algunas o todas las localizaciones del cuerpo. Por ejemplo, se desarrolla un panel de sondas con una separación de 100 kb a lo largo del genoma. Este panel puede utilizarse para detectar variación genética en el genoma. En un ejemplo, el panel detecta cambios en el número de copias de un tamaño determinado en el genoma. Dichos cambios se asocian con células tumorales, por lo que la prueba detecta su presencia. Los diferentes tipos de tumores pueden producir distintas cantidades de ADN libre tumoral o presentar variaciones en diferentes partes del genoma. Por lo tanto, la prueba puede identificar el órgano afectado. Además, la cantidad de ADN libre tumoral medida puede indicar el estadio, el tamaño o la localización del tumor. De esta manera, la prueba constituye un cribado del genoma completo para muchos o todos los tipos de tumores.;[0478] Para todas las pruebas mencionadas, a fin de mitigar los falsos positivos, se puede utilizar un umbral para determinar la presencia o certeza de un tumor. Además, la prueba puede repetirse con múltiples muestras o en diferentes momentos para aumentar la certeza de los resultados. Los resultados también pueden combinarse con otra información o síntomas para proporcionar más información o información más precisa sobre el tumor.;[0480] En la Tabla 4 se listan ejemplos de conjuntos de sondas y cebadores que pueden utilizarse en el método descrito para medir el número de copias de las regiones de ácidos nucleicos de interés. Cada conjunto de sondas de la Tabla 4 consta de dos sondas. La primera sonda (de marcado) tiene una estructura que incluye un sitio de cebador directo, un marcador y homología 1. La segunda sonda (de marcado) tiene una estructura que incluye homología 2 y un sitio de cebador inverso, que se utiliza en el marcado. También se muestran las secuencias de los componentes de las sondas (marcador, secuencia de homología, etc.).;[0481] ;[0482] ;[0483] ;[0486] En la Tabla 5 se listan ejemplos de conjuntos de sondas y cebadores que pueden utilizarse en el método descrito para detectar un polimorfismo en un sitio SNP. Cada conjunto de sondas de la Tabla 5 consta de tres sondas: dos sondas específicas de alelo (utilizadas para el marcaje) y una sonda de marcado. En estos ejemplos, las dos sondas específicas de alelo presentan secuencias de homología diferentes en uno o más nucleótidos. La estructura de la primera sonda alélica incluye un sitio de cebador directo (alelo 1) y un alelo de homología (alelo 1); y la estructura de la segunda sonda alélica incluye un sitio de cebador directo (alelo 2) y un alelo de homología (alelo 2). En la práctica, se pueden utilizar cebadores marcados con diferentes marcas en ambos (de modo que las marcas sean específicas de cada alelo). En estos ejemplos, también se incluye una sonda 3' universal que incluye una región de homología (sin ningún SNP), la secuencia de marcado y un sitio de cebador inverso. También se muestran las secuencias que componen las sondas (marcador, secuencia de homología, etc.).;[0487] ;[0488] ;[0489] ;[0490] ;[0491] ;[0492] ;[0493] ;[0494] ;[0495] ;[0496] ;[0499] EJEMPLOS;[0500] El siguiente protocolo describe el procesamiento de hasta 24 muestras de ADN libres de células mediante hibridación-ligación, purificación, amplificación, preparación de dianas de micromatrices, hibridación de micromatrices y lavado de micromatrices.;[0501] [0248]Se prepararon u obtuvieron los siguientes materiales: ADN libre de células (ADNlc) en un volumen de 20 µL de agua; mezcla de sondas: mezcla de todos los oligonucleótidos de sonda de marcado y marcaje a una concentración de 2 nM cada uno;TaqLigasa (40 U/µl); Perlas magnéticas: MyOne Streptavidin C1 Dynabeads; Tampón de unión y lavado de perlas, concentraciones 1X y 2X; Cebador de amplificación directa, modificado con fosfato 5'; Cebador de amplificación inversa, marcado; Enzima AmpliTaq Gold (5 U/µl); Mezcla de dNTP; Exonucleasa Lambda (5 U/µl); Tampón de hibridación, 1,25X; Oligonucleótidos de control de hibridación; Tampón de lavado de micromatrices A; Tampón de lavado de micromatrices B; Tampón de lavado de micromatrices C;[0502] Reacción de hibridación-ligación:Las muestras de ADNlc (20 µl) se añadieron a los pocillos A3-H3 de una placa de reacción de 96 pocillos. Se añadieron los siguientes reactivos a cada muestra de ADNlc para un volumen total de reacción de 50 µl y se mezclaron pipeteando de 5 a 8 veces.;[0505] ;[0507] La placa se colocó en un termociclador y se ligó utilizando el siguiente perfil de ciclado: (i) 95 ºC durante 5 minutos; (ii) 95 ºC durante 30 segundos; (iii) 45 ºC durante 25 minutos; (iv) Repetir los pasos b a c 4 veces; y (v) Mantener a 4 ºC.;[0508] Purificación del producto de hibridación-ligación:;[0509] Lavado de Dynabeads: un vial de Dynabeads se agitó en vórtex a la máxima potencia durante 30 segundos. Se transfirieron 260 µl de perlas a un tubo de 1,5 ml. Se mezclaron 900 µL de tampón de unión y lavado de perlas 2X y perlas mixtas pipeteando de 5 a 8 veces. El tubo se colocó en un soporte magnético durante 1 minuto y se descartó el sobrenadante. Se retiró el tubo del soporte magnético y se resuspendieron las perlas magnéticas lavadas en 900 µl de tampón de unión y lavado de perlas 2X pipeteando de 5 a 8 veces. El tubo se colocó en el soporte magnético durante 1 minuto y se descartó el sobrenadante. Se retiró el tubo del soporte magnético y se añadieron 1230 µl de tampón de unión y lavado de perlas 2X. Las perlas se resuspendieron pipeteando de 5 a 8 veces.;[0510] Inmovilizar productos HL: se transfirieron 50 µl de perlas lavadas a cada producto de reacción de hibridaciónligación en la placa de reacción de 96 pocillos y se mezclaron pipeteando hacia arriba y hacia abajo 8 veces, se incubó durante 15 min a temperatura ambiente, se mezcló en un imán de placa dos veces durante el tiempo de incubación. Las perlas se separaron en un imán de placa durante 3 min y luego se retiró y descartó el sobrenadante. La placa se retiró del imán de placa, se añadieron 200 µl de tampón de unión y lavado de perlas IX y las perlas se resuspendieron pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 5 a 8 veces. La placa se colocó en el imán de placa durante 1 min y se descartó el sobrenadante. La placa se retiró del imán de placa, se añadieron 180 µl de SSC IX y las perlas se resuspendieron pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 5 a 8 veces. La placa se colocó en el imán de placa durante 1 min y se descartó el sobrenadante.;[0511] Purificar los productos de Hib-Ligación: Se añadieron 50 µl de NaOH 0,15 M recién preparado a cada pocillo y las perlas se resuspendieron pipeteando arriba y abajo de 5 a 8 veces, incubándose a temperatura ambiente durante 10 minutos. La placa se colocó sobre el imán durante 2 minutos y luego se retiró, descartando el sobrenadante. La placa se retiró del imán, se añadieron 200 µl de NaOH 0,1 M recién preparado y las perlas se resuspendieron pipeteando arriba y abajo de 5 a 8 veces. La placa se colocó sobre el imán durante 1 minuto, descartando el sobrenadante. La placa se retiró del imán, se añadieron 180 µl de NaOH 0,1 M y las perlas se resuspendieron pipeteando arriba y abajo de 5 a 8 veces. La placa se colocó sobre el imán durante 1 minuto, descartando el sobrenadante. Se retiró la placa del imán, se añadieron 200 µl de tampón de unión IX y de lavado, y las microesferas se resuspendieron pipeteando de 5 a 8 veces. Se colocó la placa sobre el imán durante 1 minuto y se descartó el sobrenadante. Se retiró la placa del imán, se añadieron 180 µl de TE y las microesferas se resuspendieron pipeteando de 5 a 8 veces. Se colocó la placa sobre el imán durante 1 minuto y se descartó el sobrenadante. Se añadieron 20 µl de agua a cada pocillo y las microesferas se resuspendieron pipeteando de 5 a 8 veces. La placa se selló y se conservó a 4 ºC hasta su uso posterior.;[0512] Amplificación:Los siguientes reactivos se añadieron a cada producto de reacción de hibridación-ligación en la placa de reacción de 96 pocillos para un volumen de reacción total de 50 µl.;[0513] ;[0516] La placa se colocó en un ciclador térmico y las sondas se ligaron utilizando el siguiente perfil de ciclado: (i) 95 ºC durante 5 minutos; (ii) 95 ºC durante 30 segundos; (iii) 45 ºC durante 25 minutos; (iv) Repetir los pasos b a c 4 veces; y (v) Mantener a 4 ºC.;[0518] Purificación del producto por hibridación-ligación: Los reactivos se mezclaron pipeteando de 5 a 8 veces. La placa se colocó en un termociclador y las sondas se amplificaron utilizando el siguiente perfil de ciclo: (i) 95 ºC durante 5 minutos; (ii) 95 ºC durante 30 segundos; (iii) 54 ºC durante 30 segundos; (iv) 72 ºC durante 60 segundos; (v) Repetir los pasos b a d 29 veces; (vi) 72 ºC durante 5 minutos; (vii) Repetir los pasos b a c 4 veces; y (v) Mantener a 4 ºC.;[0520] Preparación del objetivo de micromatriz (digestión de cadena simple):se agregaron los siguientes reactivos a cada producto de reacción amplificado en la placa de reacción de 96 pocillos para un volumen de reacción total de 60 µl.;[0523] ;[0526] Los reactivos se mezclaron pipeteando de 5 a 8 veces. La placa se colocó en un termociclador y las sondas se digirieron siguiendo el siguiente perfil de ciclo: (i) 37 ºC durante 60 minutos; (ii) 80 ºC durante 30 minutos; (iii) mantenimiento a 4 ºC. La placa se colocó en un Speed-vac y las muestras se secaron a temperatura media durante aproximadamente 60 minutos o hasta que se evaporó todo el líquido. Las muestras se almacenaron a 4 ºC en un lugar oscuro hasta su uso en los pasos posteriores.;[0528] Hibridación de micromatrices:se añadieron los siguientes reactivos a cada diana de micromatriz seca en la placa de reacción de 96 pocillos para un volumen total de reacción de 20 µl.;[0531] ;[0534] Los reactivos se mezclaron pipeteando arriba y abajo de 10 a 20 veces para resuspenderlos y se centrifugaron brevemente para llevar el contenido al fondo de los pocillos de la placa. La placa se colocó en un termociclador y las sondas se desnaturalizaron utilizando el siguiente perfil de ciclado: (i) 70 ºC durante 3 minutos; (ii) 42 ºC de mantenimiento. El código de barras del micromatriz que se utilizaría se registró para cada muestra en la Hoja de seguimiento. Se preparó una cámara de hibridación que contenía un Lifter Slip para cada micromatriz que se procesaría. Para cada muestra, se añadieron 15 µL de Micromatriz Target al centro de un Lifter Slip en una cámara de hibridación, y el micromatriz apropiado se colocó inmediatamente sobre el fluido objetivo colocando el borde superior hacia abajo sobre el lifter slip y dejándolo caer lentamente. Las cámaras de hibridación se cerraron y se incubaron a 42 ºC durante 60 minutos. Las cámaras de hibridación se abrieron, y cada micromatriz se retiró de los Lifter Slips y se colocó en un bastidor sumergido en el tampón de lavado de micromatrices A. Una vez que todos los micromatrices estaban en el bastidor, el bastidor se agitó a 650 rpm durante 5 minutos. El bastidor de micromatrices se retiró del tampón de lavado de micromatrices A, el exceso de líquido en una toallita de sala limpia se retiró con un golpecito y el bastidor se colocó rápidamente en el tampón de lavado de micromatrices B. El bastidor se agitó a 650 rpm durante 5 minutos. El bastidor de micromatrices se retiró del tampón de lavado de micromatrices B, el exceso de líquido se retiró con un golpecito en una toallita de sala limpia y el bastidor se colocó rápidamente en el tampón de lavado de micromatrices C. El bastidor se agitó a 650 rpm durante 5 minutos.;[0535] Inmediatamente después de completar el lavado de 5 minutos en el tampón de lavado de micromatrices C, el bastidor de micromatrices se retiró lentamente del tampón. Esto tomó de 5 a 10 segundos para maximizar la lámina del tampón de lavado de la superficie del cubreobjetos. El exceso de líquido se retiró con un paño limpio. Se utilizó una aspiradora para eliminar cualquier gota de tampón restante presente en cualquiera de las superficies de cada micromatriz. Los micromatrices se almacenaron en una gradilla para portaobjetos bajo nitrógeno y en oscuridad hasta su análisis.*

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar una variación genética en una muestra genética de un sujeto, que comprende:

(a) poner en contacto un primer y un segundo conjunto de sondas con la muestra genética, donde la muestra genética es una mezcla de material genético fetal y materno de una muestra de sangre materna, donde (i) el primer conjunto de sondas comprende una primera sonda de marcado y una primera sonda de etiquetado que comprende un marcador de afinidad, donde la primera sonda de marcado hibrida adyacente a la primera sonda de etiquetado en una primera región de ácido nucleico de interés, y (ii) el segundo conjunto de sondas comprende una segunda sonda de marcado y una segunda sonda de etiquetado que comprende el marcador de afinidad, donde la segunda sonda de marcado hibrida adyacente a la segunda sonda de etiquetado en una segunda región de ácido nucleico de interés; (b) ligar la primera sonda de marcado a la primera sonda de etiquetado, proporcionando así un primer conjunto de sondas ligadas, y ligar la segunda sonda de marcado a la segunda sonda de etiquetado, proporcionando así un segundo conjunto de sondas ligadas,

(c) amplificar el primer y el segundo conjunto de sondas ligadas para formar un primer y un segundo conjunto de sondas ligadas amplificadas, respectivamente, en donde,

(i) el primer conjunto de sondas ligadas se amplifica utilizando un primer cebador que hibrida con una porción de la primera sonda de marcado, o su complemento, y comprende un primer marcador y un segundo cebador que hibrida con una porción de la primera sonda de marcado, o su complemento, en donde el primer conjunto de sondas amplificadas comprende el primer marcador y el marcador de afinidad, o un complemento de las mismas, y

(ii) El segundo conjunto de sondas ligadas se amplifica utilizando un primer cebador que hibrida con una porción de la segunda sonda de marcaje, o su complemento, y comprende una segunda marca y un segundo cebador, donde el segundo cebador hibrida con una porción de la segunda sonda de marcado, o su complemento, donde el segundo conjunto de sondas amplificadas comprende la segunda marca y la marca de afinidad, o su complemento,

donde la primera y la segunda marca son diferentes,

y donde el primer cebador para el primer conjunto de sondas ligadas y el primer cebador para el segundo conjunto de sondas ligadas son diferentes, y el segundo cebador para el primer conjunto de sondas ligadas y el segundo cebador para el segundo conjunto de sondas ligadas son el mismo; e

(d) inmovilizar el marcador de afinidad o un complemento del mismo, del primer y segundo conjunto de sondas ligadas amplificadas en una ubicación predeterminada en una matriz, donde los marcadores primero y segundo se pueden resolver ópticamente de forma individual en la matriz,

(e) determinar un recuento de (i) un primer número de el primer marcador en la matriz, y (ii) un segundo número del segundo marcador en la matriz, y

(f) comparar el primer y el segundo número para determinar la presencia o ausencia de la variación genética en la muestra genética fetal.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la primera sonda de marcado comprende una primera secuencia de cebado, las sondas de marcado primera y segunda comprenden una segunda secuencia de cebado, y la segunda sonda de marcado comprende una tercera secuencia de cebado, y opcionalmente, en donde el primer cebador hibrida con la primera secuencia de cebado o su complemento, el segundo cebador hibrida con la segunda secuencia de cebado o su complemento, y el tercer cebador hibrida con la tercera secuencia de cebado o su complemento.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que

(i) la primera región de ácido nucleico de interés comprende un locus en un primer cromosoma y la segunda región de ácido nucleico de interés comprende un locus en un segundo cromosoma, diferente del primero, y/o (ii) en el que la variación genética es una variación en el número de copias o una aneuploidía.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, en el que (d) comprende además inmovilizar el marcador de afinidad de un tercer conjunto de sondas ligadas amplificadas que comprende el primer marcador en la matriz, e inmovilizar el marcador de afinidad de un cuarto conjunto de sondas ligadas amplificadas que comprende el segundo marcador en la matriz, en el que el tercer conjunto de sondas ligadas amplificadas es diferente del primer conjunto de sondas ligadas amplificadas y el cuarto conjunto de sondas ligadas amplificadas es diferente del segundo conjunto de sondas ligadas amplificadas, opcionalmente en el que el tercer conjunto de sondas ligadas amplificadas comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a una tercera región de ácido nucleico de interés, diferente de la primera o la segunda región de ácido nucleico de interés, y el cuarto conjunto de sondas ligadas amplificadas comprende una

secuencia de ácido nucleico complementaria a una cuarta región de ácido nucleico de interés, diferente de la primera, la segunda o la tercera región de ácido nucleico de interés.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, en el que la matriz comprende un primer elemento en el que se inmoviliza el marcador de afinidad, o su complemento, del primer y segundo conjunto de sondas ligadas amplificadas, y un segundo elemento con una ubicación predefinida diferente en la matriz. El segundo elemento comprende un tercer conjunto de sondas ligadas amplificadas inmovilizadas que comprende un segundo marcador de afinidad y un tercer marcador, y un cuarto conjunto de sondas ligadas amplificadas que comprende el segundo marcador de afinidad y un cuarto marcador, diferente del tercer marcador, en el que el tercer conjunto de sondas ligadas amplificadas comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a una tercera región de ácido nucleico de interés, diferente de la primera o la segunda región de ácido nucleico de interés, y el cuarto conjunto de sondas ligadas amplificadas comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a una cuarta región de ácido nucleico de interés, diferente de la primera, la segunda o la tercera región de ácido nucleico de interés. La determinación de (e) comprende además determinar un tercer recuento del tercer marcador inmovilizado en el segundo elemento, y un cuarto recuento del cuarto marcador inmovilizado en el segundo miembro; y la presencia o ausencia de variación genética en el feto se determina según al menos los recuentos primero, segundo, tercero y cuarto.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el método comprende además determinar la proporción del material genético en la muestra derivada del feto con respecto al material genético en la muestra derivada de la madre.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la inmovilización de (d) comprende hibridar el marcador de afinidad, o un complemento del mismo, con una secuencia de ácido nucleico ubicada en la matriz.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que una porción de la primera sonda de marcado no hibrida con la primera región de ácido nucleico de interés, o en el que una porción de la primera sonda de etiquetado no hibrida con la primera región de ácido nucleico de interés, y/o en el que una porción de la segunda sonda de marcado no hibrida con la segunda región de ácido nucleico de interés, o en el que una porción de la segunda sonda de etiquetado no hibrida con la segunda región de ácido nucleico de interés.

9. Un método para detectar una variación genética en una muestra genética de un sujeto, que comprende:

(a) poner en contacto un primer y un segundo conjunto de sondas con la muestra genética, donde la muestra genética es una mezcla de material genético fetal y materno de una muestra de sangre materna, donde (i) el primer conjunto de sondas comprende una primera sonda de marcado y una primera sonda de etiquetado que comprende un marcador de afinidad, donde la primera sonda de marcado hibrida adyacente a la primera sonda de marcado en un primer alelo de una región de ácido nucleico de interés, y

(ii) el segundo conjunto de sondas comprende una segunda sonda de marcado y una segunda sonda de etiquetado que comprende el marcador de afinidad, donde la segunda sonda de marcado hibrida adyacente a la segunda sonda de marcado en un segundo alelo de la región de ácido nucleico de interés;

(b) ligar la primera sonda de marcado a la primera sonda de etiquetado, proporcionando así un primer conjunto de sondas ligadas, y ligar la segunda sonda de marcado a la segunda sonda de etiquetado, proporcionando así un segundo conjunto de sondas ligadas,

(c) amplificar el primer y el segundo conjunto de sondas ligadas para formar un primer y un segundo conjunto de sondas ligadas amplificadas, respectivamente, en donde,

(i) el primer conjunto de sondas ligadas se amplifica utilizando un primer cebador que hibrida con una porción de la primera sonda de marcado, o su complemento, y comprende un primer marcador y un segundo cebador que hibrida con una porción de la primera sonda de etiquetado, o su complemento, en donde el primer conjunto de sondas amplificadas comprende el primer marcador y el marcador de afinidad, o un complemento de las mismas, y

(ii) el segundo conjunto de sondas ligadas se amplifica utilizando un primer cebador que hibrida con una porción de la segunda sonda de marcado, o su complemento, y comprende una segunda marca y un segundo cebador, donde el segundo cebador hibrida con una porción de la segunda sonda de etiquetado, o su complemento, donde el segundo conjunto de sondas amplificadas comprende la segunda marca y la marca de afinidad, o su complemento,

donde la primera y la segunda marca son diferentes,

y donde el primer cebador para el primer conjunto de sondas ligadas y el primer cebador para el segundo conjunto de sondas ligadas son diferentes, y el segundo cebador para el primer conjunto de sondas ligadas y el segundo cebador para el segundo conjunto de sondas ligadas son el mismo; y

(d) inmovilizar el marcador de afinidad o un complemento de esta, del primer y segundo conjunto de sondas ligadas amplificadas a una ubicación predeterminada en una matriz, donde los marcadores primero y segundo se pueden resolver ópticamente individualmente en la matriz,

(e) determinar un recuento de (i) un primer número del primer marcador en la matriz, y (ii) un segundo número del segundo marcador en la matriz, y

(f) comparar el primer y el segundo número para determinar la presencia o ausencia de la variación genética en la muestra genética fetal.

10. El método de la reivindicación 9, en el que la primera sonda de marcado comprende un primer sitio de unión del cebador, las sondas de etiquetado primera y segunda comprenden un segundo sitio de unión del cebador, y la segunda sonda de marcado comprende un tercer sitio de unión del cebador. Opcionalmente, el primer cebador hibrida con el primer sitio de unión del cebador o su complemento, el segundo cebador hibrida con el segundo sitio de unión del cebador o su complemento, y el tercer cebador hibrida con el tercer sitio de unión del cebador o su complemento.

11. El método de las reivindicaciones 9 o 10, en el que la variación genética es un polimorfismo de un solo nucleótido.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que el método comprende además determinar la proporción del material genético de la muestra derivada del feto con respecto al material genético de la muestra derivada de la madre, según al menos el primer y el segundo recuento.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en el que la primera sonda de etiquetado y la segunda sonda de etiquetado son iguales.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una porción de la primera sonda de marcado no hibrida con la primera región de ácido nucleico de interés, o en el que una porción de la primera sonda de etiquetado no hibrida con la primera región de ácido nucleico de interés, y/o en el que una porción de la segunda sonda de marcado no hibrida con la primera región de ácido nucleico de interés, o en el que una porción de la segunda sonda de etiquetado no hibrida con la segunda región de ácido nucleico de interés.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra genética es una muestra de ADN libre de células (ADNlc).