ES3057431T3 - Polymethine compounds and their use as fluorescent labels - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se refiere a nuevos compuestos y su uso como marcadores fluorescentes. Estos compuestos pueden utilizarse como marcadores fluorescentes para nucleótidos en aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes

[0003] La presente descripción se refiere a nuevos compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes. En particular, estos compuestos se pueden utilizar como etiquetas fluorescentes para nucleótidos en aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos.

[0004] Antecedentes

[0005] La detección no radiactiva de ácidos nucleicos que utilizan etiquetas fluorescentes es una tecnología importante en la biología molecular. Muchos procedimientos empleados en la ingeniería genética dependían anteriormente en gran medida del uso de nucleótidos o polinucleótidos marcados radiactivamente con, por ejemplo,<32>P. Los compuestos radiactivos permiten la detección sensible de ácidos nucleicos y otras moléculas de interés. Sin embargo, existen graves limitaciones en el uso de isótopos radioactivos, tales como su gasto, su período de validez limitado y, más importante, las razones de seguridad. La eliminación de la necesidad de etiquetas radiactivas mejora la seguridad, al tiempo que reduce el impacto medioambiental y los costes asociados, por ejemplo, con la eliminación de los reactivos. Los métodos susceptibles de detección fluorescente no radiactiva incluyen, a modo de ejemplo no limitativo, la secuenciación automatizada del ADN, los métodos de hibridación, la detección en tiempo real de productos de reacción de la cadena de la polimerasa, e inmunoensayos.

[0006] Para muchas aplicaciones, se prefiere emplear múltiples etiquetas fluorescentes espectralmente distinguibles para lograr la detección independiente de una pluralidad de analitos solapados espacialmente. En tales métodos multiplexados, se puede reducir el número de recipientes de reacción, lo que simplifica los protocolos experimentales y facilita la producción de kits de reactivos específicos para cada aplicación. En la secuenciación del ADN automatizada multicolor, por ejemplo, la detección fluorescente múltiple permite el análisis de múltiples bases nucleotídicas en un solo carril de electroforesis, aumentando de este modo el rendimiento con respecto a los métodos monocromáticos y reduciendo las incertidumbres asociadas a las variaciones de movilidad electroforética entre carriles.

[0007] Sin embargo, la detección fluorescente multiplexada puede ser problemática y existen cierto número de factores importantes que constriñen la selección de las etiquetas fluorescentes. En primer lugar, puede resultar difícil encontrar compuestos colorantes cuyos espectros de emisión se resuelvan de forma espectralmente adecuada en una aplicación dada. Además, cuando se utilizan varios colorantes fluorescentes juntos, puede resultar difícil generar señales de fluorescencia en regiones espectrales distinguibles mediante excitación simultánea, ya que las bandas de absorción de los colorantes que podrían ser utilizables para ello están usualmente muy separadas, por lo que es difícil alcanzar una eficiencia de excitación de la fluorescencia más o menos igual incluso para dos colorantes. Muchos métodos de excitación utilizan fuentes de luz de alta potencia, como el láser, y, por lo tanto, el colorante debe tener una fotoestabilidad suficiente para resistir tal excitación. Una última consideración de especial importancia en los métodos de biología molecular es el grado en que los colorantes fluorescentes deben ser compatibles con los reactivos químicos utilizados, tales como, por ejemplo, disolventes y reactivos de síntesis de ADN, tampones, enzimas polimerasa y enzimas ligasa.

[0008] A medida que avanza la tecnología de secuenciación, ha surgido la necesidad creciente de compuestos colorantes fluorescentes adicionales, sus conjugados de ácidos nucleicos y conjuntos de colorantes que satisfagan todas las restricciones anteriores y que sean particularmente adecuados para métodos moleculares de alta productividad tales como la secuenciación en fase sólida y similares.

[0009] Las moléculas de colorante fluorescente con propiedades fluorescentes mejoradas, tal como intensidad de la fluorescencia, forma y longitud de onda máxima de la banda de fluorescencia, pueden mejorar la velocidad y la precisión de la secuenciación de ácidos nucleicos. Una señal de fluorescencia fuerte es especialmente importante cuando las mediciones se realizan en tampones biológicos a base de agua y a temperaturas más altas, ya que la intensidad de fluorescencia de la mayoría de los colorantes es significativamente menor en tales condiciones. Es más, la naturaleza de la base a la que se une un colorante también afecta al máximo de fluorescencia, la intensidad de la fluorescencia y otras propiedades espectrales del colorante. Las interacciones específicas de la secuencia entre las bases nitrogenadas y los colorantes fluorescentes se pueden adaptar mediante el diseño específico de los colorantes fluorescentes. La optimización de la estructura de los colorantes fluorescentes puede mejorar la eficiencia de la incorporación de nucleótidos, reducir el nivel de errores de secuenciación y disminuir el uso de reactivos y, por lo tanto, los costes de la secuenciación de ácidos nucleicos.

[0010] Los compuestos de polimetina se conocen por publicaciones anteriores. Ciertos compuestos de polimetina se describen en publicaciones que incluyen WO2013041117, WO2005014723, EP1792949 y WO2014135221.

[0011] En la presente memoria, se describen construcciones de polimetina mejoradas y su uso como etiquetas de biomoléculas, particularmente como etiquetas para nucleótidos utilizados en la secuenciación de ácidos nucleicos. Se pueden observar mejoras particulares en la eficiencia de la incorporación de nucleótidos marcados y en la longitud de la lectura de secuenciación que se puede obtener utilizando las nuevas construcciones fluorescentes.

[0012] Resumen

[0013] La presente invención se define mediante las reivindicaciones. La invención proporciona un compuesto de la fórmula:

[0016]

[0018] o formas mesoméricas de la misma, en donde;

[0019] R1 es C<6>H<5>, R2 es H, R3 es SO<3>-, R4 es (CH<2>)<5>CO<2>H y R es C<4>H<8>SO<3>-; o

[0020] R1 es C<6>H<5>, R2 es H, R3 es SO<2>NH<2>, R4 es (CH<2>)<2>CO<2>H y R es CH<3>; o

[0021] R1 es C<6>H<5>, R2 es SO<3>-, R3 es SO<2>NH<2>, R4 es (CH<2>)<2>CO<2>H y R es CH<3>; o

[0022] R1 es C<6>H<5>, R2 es H, R3 es SO<2>NH<2>, R4 es (CH<2>)<2>CO<2>H y R es C<4>H<8>SO<3>-; o

[0023] R1 es C<6>H<5>, R2 es H, R3 es SO<2>NH<2>, R4 es (CH<2>)<5>CO<2>H y R es C<4>H<8>SO<3>-.

[0024] Según un primer aspecto, esta descripción proporciona compuestos de fórmula (I) o formas mesoméricas de los mismos:

[0027]

[0029] en donde mCat+ o mAn- es un contraión orgánico o inorgánico con carga positiva/negativa y

[0030] m es un número entero de 0-3;

[0031] n es un número entero de 1-5;

[0032] Rf es OH u O-;

[0033] cada uno de Ra<1>y Ra<2>es independientemente H, SO<3>-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente; en donde Ra<1>o Ra<2>es sulfonamida o SO<3>-; y

[0034] cada uno de Rc<1>y Rc<2>es independientemente alquilo o alquilo sustituido.

[0035] En ciertos ejemplos, donde Ra<1>o Ra<2>es SO<3>-; Rc<1>o Rc<2>pueden ser un grupo ácido alquilsulfónico.

[0036] En otra realización, los compuestos de la presente descripción se pueden conjugar con una variedad de restos de sustrato, tales como, por ejemplo, nucleósidos, nucleótidos, polinucleótidos, polipéptidos, carbohidratos, ligandos, partículas, células, superficies semisólidas (p. ej., geles) y superficies sólidas. La conjugación se puede llevar a cabo a través del grupo carboxilo CORf, que se puede convertir en una amida o un éster.

[0037] Por lo tanto, según un aspecto adicional de la descripción, se proporcionan compuestos colorantes que comprenden grupos conectores para permitir, por ejemplo, la unión covalente a tales restos de sustrato.

[0038] Según un aspecto adicional, la descripción proporciona un compuesto de nucleósido o nucleótido definido por la fórmula: N-L-Colorante, en donde N es un nucleótido, L es un resto conector opcional y Colorante es un compuesto fluorescente según la presente descripción.

[0039] En un aspecto adicional, la descripción proporciona métodos de secuenciación que utilizan los compuestos colorantes de la presente descripción.

[0040] Según un aspecto adicional, la descripción también proporciona kits que comprenden compuestos colorantes (libres o en forma conjugada) que se pueden utilizar en diversos ensayos inmunológicos, en el marcaje de oligonucleótidos y ácidos nucleicos y para la secuenciación del ADN por síntesis. En otro aspecto más, la descripción proporciona kits que comprenden “conjuntos” de colorantes particularmente adecuados para ciclos de secuenciación por síntesis en una plataforma de instrumentos automatizada.

[0041] Un aspecto adicional de la descripción es la preparación química de los compuestos de la descripción.

[0042] Descripción detallada

[0043] La presente descripción proporciona compuestos novedosos particularmente adecuados para métodos de detección por fluorescencia y secuenciación por síntesis. Los compuestos que tienen un resto de indol N-fenilo son ventajosos en cuanto a intensidad de la fluorescencia y la fotoestabilidad en comparación con los análogos de N-alquilo y, por lo tanto, mejoran ciertas aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos.

[0044] La presente invención se define mediante las reivindicaciones. La invención proporciona un compuesto con la fórmula:

[0047]

[0049] o formas mesoméricas de la misma, en donde;

[0050] R1 es C<6>H<5>, R2 es H, R3 es SO<3>-, R4 es (CH<2>)<5>CO<2>H y R es C<4>H<8>SO<3>-; o

[0051] R1 es C<6>H<5>, R2 es H, R3 es SO<2>NH<2>, R4 es (CH<2>)<2>CO<2>H y R es CH<3>; o

[0052] R1 es C<6>H<5>, R2 es SO<3>-, R3 es SO<2>NH<2>, R4 es (CH<2>)<2>CO<2>H y R es CH<3>; o

[0053] R1 es C<6>H<5>, R2 es H, R3 es SO<2>NH<2>, R4 es (CH<2>)<2>CO<2>H y R es C<4>H<8>SO<3>-; o

[0054] R1 es C<6>H<5>, R2 es H, R3 es SO<2>NH<2>, R4 es (CH<2>)<5>CO<2>H y R es C<4>H<8>SO<3>-.

[0055] Según un primer aspecto, la descripción proporciona compuestos de fórmula (I) o formas mesoméricas de los mismos:

[0058]

[0059] en donde mCat+ o mAn- es un contraión orgánico o inorgánico con carga positiva/negativa y

[0060] m es un número entero de 0-3;

[0061] n es un número entero de 1-5;

[0062] Rf es OH u O-;

[0063] cada uno de Ra<1>y Ra<2>es independientemente H, SO<3>-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente; en donde Ra<1>o Ra<2>es sulfonamida o SO<3>-; y

[0064] cada uno de Rc<1>y Rc<2>es independientemente alquilo o alquilo sustituido; en donde cuando Ra<1>o Ra<2>es SO<3>-, i) Rc<1>o Rc<2>es un grupo ácido alquilsulfónico, o ii) Ra<1>o Ra<2>es una sulfonamida.

[0065] Un aspecto alternativo de la descripción proporciona compuestos de fórmula (I) o formas mesoméricas de los mismos:

[0068]

[0070] en donde mCat+ o mAn- es un contraión orgánico o inorgánico con carga positiva/negativa y

[0071] m es un número entero de 0-3;

[0072] n es un número entero de 1-5;

[0073] Rf es OH u O-;

[0074] cada uno de Ra<1>y Ra<2>es independientemente H, SO<3>-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente; en donde Ra<1>o Ra<2>es sulfonamida o SO<3>-; y

[0075] cada uno de Rc<1>y Rc<2>es independientemente alquilo o alquilo sustituido; en donde, cuando Ra<1>o Ra<2>es SO<3>-, Rc<1>o Rc<2>es un grupo ácido alquilsulfónico.

[0076] Un aspecto alternativo de la descripción proporciona compuestos de fórmula (I) o formas mesoméricas de los mismos:

[0079]

[0081] en donde mCat+ o mAn- es un contraión orgánico o inorgánico con carga positiva/negativa y

[0082] m es un número entero de 0-3;

[0083] n es un número entero de 1-5;

[0084] Rf es OH u O<->o un conjugado de éster o amina de los mismos; cada uno de Ra<1>y Ra<2>es independientemente H, SO<3>-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente; en donde Ra<1>o Ra<2>es sulfonamida; y

[0085] cada uno de Rc<1>y Rc<2>es independientemente alquilo o alquilo sustituido.

[0086] Las moléculas pueden contener uno o más restos de sulfonamida o SO<3>-

en la posición Ra. Ra<1>y/o Ra<2>pueden ser sulfonamida. El otro Ra (Ra<1>o Ra<2>) puede ser independientemente H, SO<3>-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente. Ra<1>o Ra<2>pueden ser H. Ra<1>o Ra<2>pueden ser SO<3>-. Ra<1>puede ser diferente de Ra<2>, por ejemplo, la estructura puede tener un solo grupo sulfonamida en Ra<1>y H como Ra<2>. Ra<1>y Ra<2>pueden ser ambos sulfonamida. La sulfonamida puede ser SO<2>NH<2>o SO<2>NHR, donde R es un grupo alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido.

[0087] Ra<1>o Ra<2>pueden ser un anillo alifático, aromático o heterocíclico adicional fusionado a carbonos adyacentes del anillo indólico. Por ejemplo, en tales casos, cuando se fusiona un anillo aromático, el grupo terminal de los colorantes puede representar una estructura de tipo

[0090]

[0092] donde Rd puede ser H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, halógeno, carboxilo, sulfonamida o ácido sulfónico.

[0093] Por lo tanto los colorantes de la descripción se pueden describir mediante la fórmula (1A) o (IB):

[0096]

[0097]

[0099] donde

[0100] m es un número entero de 0-3;

[0101] n es un número entero de 1-5;

[0102] Rf es OH u O-;

[0103] Rd es H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, halógeno, carboxisulfonamida o ácido sulfónico; y cada uno de Rc<1>y Rc<2>es independientemente alquilo o alquilo sustituido; en donde Rc<1>o Rc<2>es un grupo ácido alquilsulfónico.

[0104] En la fórmula (IA) o (IB), los anillos adicionales fusionados a átomos de carbono adyacentes del anillo indólico pueden estar opcionalmente sustituidos, por ejemplo, con ácido sulfónico o sulfonamida.

[0105] El compuesto puede ser uno donde la sulfonamida es parte de una estructura de fórmula (II):

[0108]

[0110] en donde Rc<1>es alquilo o alquilo sustituido.

[0111] El compuesto puede ser uno donde la sulfonamida es parte de una estructura de fórmula (III):

[0112]

[0114] en donde m es un número entero de 0-3, n es un número entero de 1-5, Rf es OH o O-; y Rc<2>es alquilo o alquilo sustituido.

[0115] El grupo carboxilo CORf o sus derivados están unidos al átomo de nitrógeno del indol mediante una cadena alquílica de longitud n, donde n es 1-5 átomos de carbono o heteroátomos. La cadena puede ser (CH<2>)n, donde n es 1-5. El grupo puede ser (CH<2>)<5>COOH.

[0116] Las moléculas pueden contener uno o más restos de alquilsulfonato en la posición Rc. Rc<1>y/o Rc<2>pueden ser alquilo-SO<3>-. El otro Rc (Rc<1>o Rc<2>) puede ser independientemente alquilo o alquilo sustituido. Rc<1>y Rc<2>pueden ser metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo o (CH<2>)<q>SO<3>H, donde q es 1-6. q puede ser 1-4. q puede ser 4. Rc<1>y Rc<2>pueden ser un grupo alquilo sustituido. Rc<1>y Rc<2>pueden contener un resto de COOH o -SO<3>H o sus derivados éster o amida. En ciertas realizaciones, cuando uno de Ra<1>o Ra<2>es SO<3>-

y el otro de Ra<1>o Ra<2>es H o SO<3>-, Rc<1>o Rc<2>deben ser un grupo ácido alquilsulfónico. Los compuestos donde uno de Ra<1>o Ra<2>es SO<3>-

y el otro de Ra<1>o Ra<2>es H o SO<3>-

y Rc1 y Rc2 son metilo se pueden excluir de determinadas reivindicaciones si es necesario. La publicación WO2013041117 describe ciertos compuestos donde Ra<1>es H o SO<3>-

y Ra<2>es SO<3>-

y Rc1 y Rc2 son metilo. Esta publicación no describe moléculas en las que Rc es un grupo de ácido alquilsulfónico. Esta publicación no describe moléculas en las que Ra es sulfonamida.

[0117] El grupo COOH puede actuar como un resto conector para una unión adicional o estar unido a otra molécula. Una vez que se ha producido la conjugación, el COOH o COO<->se puede convertir en una amida o un éster.

[0118] Entre los ejemplos de compuestos se incluyen estructuras según la fórmula (IV):

[0121]

[0123] o una sal de los mismos, en donde mCat+ o mAn- es un contraión orgánico o inorgánico con carga positiva/negativa y

[0124] m es un número entero de 0-3;

[0125] n es un número entero de 1-5; y

[0126] cada uno de Rc<1>y Rc<2>es independientemente alquilo o alquilo sustituido.

[0127] Los ejemplos adicionales de compuestos incluyen estructuras según la fórmula (IVa) a (IVd):

[0129]

[0130]

[0132] o sales de los mismos, en donde mCat+ o mAn- es un contraión orgánico o inorgánico con carga positiva/negativa y m es un número entero de 0-3;

[0133] n es un número entero de 1-5; y

[0134] q es un número entero de 1-6.

[0135] Un compuesto particularmente útil es un nucleótido u oligonucleótido marcado con un colorante como se describe en la presente memoria.

[0136] El nucleótido u oligonucleótido marcado puede tener la etiqueta unida al átomo de nitrógeno del indol a través de un grupo alquilo-carboxilo para formar una amida. El nucleótido u oligonucleótido marcado puede tener la etiqueta unida a la posición C5 de una base de pirimidina o a la posición C7 de una base de 7-deazapurina a través de un resto conector.

[0137] El nucleótido u oligonucleótido marcado también puede tener un grupo bloqueante unido covalentemente al azúcar ribosa o desoxirribosa del nucleótido. El grupo bloqueante puede unirse en cualquier posición del azúcar ribosa o desoxirribosa. En realizaciones particulares, el grupo bloqueante está en la posición 3' OH del azúcar ribosa o desoxirribosa del nucleótido.

[0138] Se proporcionan en la presente memoria kits que incluyen uno o más nucleótidos, en donde al menos un nucleótido es un nucleótido marcado con un compuesto de la presente descripción. El kit puede incluir dos o más nucleótidos marcados. Los nucleótidos se pueden marcar con dos o más etiquetas fluorescentes. Dos o más de las etiquetas pueden excitarse utilizando una única fuente de excitación, que puede ser un láser. Por ejemplo, las bandas de excitación para las dos o más etiquetas se pueden solapar al menos parcialmente, de tal modo que la excitación en la región de solapamiento del espectro haga que ambas etiquetas emitan fluorescencia. En realizaciones particulares, la emisión a partir de las dos o más etiquetas se producirá en diferentes regiones del espectro, de tal modo que la presencia de al menos una de las etiquetas se puede determinar distinguiendo ópticamente la emisión.

[0139] El kit puede contener cuatro nucleótidos marcados, donde el primero de los cuatro nucleótidos está marcado con un compuesto según se describe en la presente memoria. En tal kit, el segundo, tercer y cuarto nucleótidos pueden estar marcados cada uno con un compuesto que es opcionalmente diferente de la etiqueta del primer nucleótido y opcionalmente diferente de las etiquetas entre sí. Por lo tanto, uno o más de los compuestos pueden tener un máximo de absorbancia y/o un máximo de emisión distintos, de tal modo que el (los) compuesto(s) sea(n) distinguible(s) de otros compuestos. Por ejemplo, cada compuesto puede tener un máximo de absorbancia y/o un máximo de emisión distintos, de tal modo que cada uno de los compuestos sea distinguible de los otros tres compuestos. Se entenderá que partes del espectro de absorbancia y/o espectro de emisión distintas de los máximos pueden diferir y estas diferencias pueden aprovecharse para distinguir los compuestos. El kit puede ser tal que dos o más de los compuestos tienen un máximo de absorbancia distinto por encima de 600 nm. Los compuestos de la invención típicamente absorben luz en la región por encima de 640 nm.

[0140] Los compuestos, nucleótidos o kits que se describen en la presente memoria se pueden utilizar para detectar, medir o identificar un sistema biológico (incluidos, por ejemplo, procesos o componentes de los mismos). Las técnicas ilustrativas que pueden emplear los compuestos, nucleótidos o kits incluyen secuenciación, análisis de expresión, análisis de hibridación, análisis genético, análisis de ARN, ensayo celular (p. ej., ensayo de unión celular o ensayo de función celular) o ensayo de proteínas (p. ej., ensayo de unión de proteínas o ensayo de actividad de proteínas). El uso puede ser en un instrumento automatizado para llevar a cabo una técnica particular, tal como un instrumento de secuenciación automática. El instrumento de secuenciación puede contener dos láseres que funcionan a diferentes longitudes de onda.

[0142] En la presente memoria, se describe un método para sintetizar compuestos de la descripción. Un compuesto de fórmula (X) y/o (X1), (X2) o una sal de los mismos se puede utilizar como material de partida para la síntesis de colorantes de polimetina simétricos o asimétricos:

[0145]

[0148] o una sal de los mismos en donde Ra es H, SO<3>-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente; R1, R2, R3 y R4 son independientemente H, alquilo o arilo; Rc<2>es alquilo o alquilo sustituido; Ar es un grupo aromático y R es un grupo alquilo.

[0150] En la presente memoria, se describe un método para sintetizar compuestos de la descripción. Un compuesto de fórmula (X3), (X4) o (X5) o una sal de los mismos se puede utilizar como material de partida para la síntesis de colorantes polimetínicos simétricos o asimétricos:

[0151]

[0153] o una sal de los mismos, en donde n es un número entero de 1-5; Rc<2>es alquilo o alquilo sustituido; Ar es un grupo aromático y R es un grupo alquilo.

[0154] Como se utiliza en la presente memoria, el término “alquilo” se refiere a hidrocarburos C<1>-C<20>y puede incluir anillos carbocíclicos no aromáticos C<3>-C<10>. En realizaciones particulares, los grupos alquilo son alquilo C<1>-C<6>, que se refiere a radicales hidrocarbonados saturados, de cadena lineal o ramificada, que contienen entre uno y seis átomos de carbono, respectivamente. Los grupos alquilo pueden incluir uno o más grupos insaturados y, por lo tanto incluyen el alquenilo y el alquinilo.

[0155] El término “halógeno”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a fluoro (a continuación en la memoria, F), cloro (a continuación en la memoria, Cl), bromo (a continuación en la memoria, Br) o yodo (a continuación en la memoria, I), y usualmente se refiere a la sustitución de un átomo de hidrógeno en un compuesto orgánico; esta sustitución es opcionalmente una sustitución completa del hidrógeno.

[0156] El término “alquilo sustituido” se refiere a los grupos alquilo, alquenilo o alquinilo tal y como se definen anteriormente, donde estos pueden estar opcionalmente sustituidos adicionalmente con, aunque no de forma limitativa, halo, ciano, SO<3>-, SRa, ORa, NRbRc, oxo, CONRbRc, COOH y COORb. Ra, Rb y Rc se pueden seleccionar cada uno independientemente de entre H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. Adicionalmente, dicho alquilo sustituido, alquenilo sustituido y alquinilo sustituido pueden estar opcionalmente interrumpidos por al menos un heteroátomo o grupo seleccionado de entre O, NRb, S(O)<t>donde t es 0 a 2, y similares. El alquilo sustituido también abarca grupos tales como el bencilo, donde los grupos alquilo comprenden un resto adicional de arilo o arilo sustituido.

[0157] Los colorantes según la presente descripción se pueden sintetizar a partir de una variedad de materiales de partida diferentes, incluidos los N-fenilindoles. Los colorantes se pueden fabricar de forma simétrica, de tal forma que el mismo indol se encuentre en ambos extremos de la cadena de trimetina, o de forma asimétrica, de tal forma que se encuentren indoles diferentes en cada extremo del cromóforo. Los métodos para preparar colorantes de polimetina son bien conocidos en la técnica.

[0158] Según un aspecto de la descripción, se proporcionan compuestos colorantes adecuados para la unión a restos de sustrato, que comprenden particularmente grupos conectores para permitir la unión a los grupos funcionales del sustrato. Los restos de sustrato pueden ser prácticamente cualquier molécula o sustancia a la que se puedan conjugar los colorantes de la descripción y, a modo de ejemplo no limitativo, pueden incluir nucleósidos, nucleótidos, polinucleótidos, carbohidratos, ligandos, partículas, superficies sólidas, polímeros orgánicos e inorgánicos, cromosomas, núcleos, células vivas y combinaciones o ensamblajes de los mismos. Los colorantes pueden conjugarse con un conector opcional mediante una serie de medios que incluyen la atracción hidrófoba, la atracción iónica y la unión covalente. Particularmente, los colorantes se conjugan con el sustrato mediante la unión covalente. Más particularmente, la unión covalente se realiza por medio de un grupo conector.

[0159] La conjugación del compuesto colorante con el sustrato se puede llevar a cabo a través del grupo carboxilo CORf, que se puede convertir en una amida o en un éster.

[0160] Los colorantes según la presente descripción pueden incluir un grupo conector reactivo en una de las posiciones sustituyentes para la unión covalente del colorante a otra molécula. Los grupos de unión reactivos son restos capaces de formar un enlace (p. ej., un enlace covalente o no covalente). En una realización particular, el conector puede ser un conector escindible. El uso del término “conector escindible” no pretende implicar que se requiera eliminar el conector completo. El sitio de escisión puede estar situado en una posición del conector que resulte en que parte del conector permanezca unida al colorante y/o al resto de sustrato después de la escisión. Los conectores escindibles pueden ser, a modo de ejemplo no limitativo, conectores escindibles electrófilamente, conectores escindibles enzimáticamente, conectores escindibles nucleofílicamente, conectores fotoscindibles, escindibles en condiciones reductivas (por ejemplo, conectores que contienen disulfuro o azida), condiciones oxidantes, escindibles mediante el uso de conectores de seguridad y escindibles por mecanismos de eliminación. El uso de un conector escindible para la unión del compuesto colorante a un resto de sustrato ofrece la opción de eliminar la etiqueta, por ejemplo, después de la detección, evitando de este modo cualquier señal interferente en las etapas posteriores.

[0161] En la publicación PCT número WO2004/018493, se pueden encontrar grupos conectores útiles, entre los que se incluyen conectores que se pueden escindir utilizando fosfinas soluble en agua o catalizadores de metales de transición solubles en agua formados a partir de un metal de transición y ligandos al menos parcialmente soluble en agua. En solución acuosa, este último forma, al menos parcialmente, complejos de metales de transición solubles en agua. Tales conectores escindibles se pueden utilizar para conectar bases de nucleótidos a etiquetas tales como los colorantes expuestos en la presente memoria.

[0162] En la publicación PCT número WO2004/018493, se pueden encontrar conectores concretos, tales como los que incluyen restos de la fórmula:

[0165]

[0166]

[0169] (en donde X se selecciona del grupo del grupo que comprende O, S, NH y NQ, en donde Q es un grupo alquilo C1-10 sustituido o no sustituido, Y es seleccionado del grupo que comprende O, S, NH y N(alilo), T es hidrógeno o un grupo alquilo C<1>-C<10>sustituido o no sustituido y * indica dónde el resto está conectado al resto del nucleótido o nucleósido).

[0170] En realizaciones particulares, la longitud del conector entre un colorante fluorescente (fluoróforo) y una base de guanina se puede alterar, por ejemplo, introduciendo un grupo espaciador de polietilenglicol, incrementando de este modo la intensidad de fluorescencia en comparación con el mismo fluoróforo unido a la base de guanina mediante otros enlaces conocidos en la técnica. Se describen conectores ilustrativos y sus propiedades en la solicitud de patente británica número 0517097.2, publicada como WO07020457. El diseño de conectores, y especialmente su longitud incrementada, pueden permitir mejorar el brillo de los fluoróforos unidos a las bases de guanina de los nucleótidos guanosina cuando se incorporan a polinucleótidos tales como ADN. Por lo tanto cuando el colorante se utiliza en cualquier método de análisis que emplee la detección de una etiqueta de colorante fluorescente unido a un nucleótido que contiene guanina, puede ser ventajoso utilizar un conector que tenga un grupo espaciador de fórmula -((CH<2>)<2>O)<n>-, en donde n es un número entero entre 2 y 50, por ejemplo, tal como se describe en WO07020457.

[0172] La presente descripción proporciona, adicionalmente, conjugados de nucleósidos y nucleótidos marcados con uno o más de los colorantes en la presente memoria (nucleótidos modificados). Los nucleósidos y nucleótidos marcados son útiles para marcar polinucleótidos formados por síntesis enzimática, tales como, a modo de ejemplo no limitativo, en la amplificación por PCR, amplificación isotérmica, amplificación en fase sólida, secuenciación de polinucleótidos (p. ej., secuenciación en fase sólida), reacciones de traducción de mella y similares.

[0174] Los nucleósidos y nucleótidos se pueden marcar en sitios del azúcar o la base nitrogenada. Como es conocido en la técnica, un “nucleótido” consiste en una base nitrogenada, un azúcar y uno o más grupos fosfato. En el ARN, el azúcar es una ribosa, y en el ADN es una desoxirribosa, es decir, un azúcar que carece de un grupo hidroxilo que está presente en la ribosa. La base nitrogenada es un derivado de la purina o la pirimidina. Las purinas pueden ser adenina (A) o guanina (G), y las pirimidinas pueden ser citosina (C), timina (T) o, en el contexto del ARN, uracilo (U). El átomo C-1 de la desoxirribosa se une al N-1 de una pirimidina o al N-9 de una purina. Un nucleótido también es un éster de fosfato de un nucleósido, teniendo la esterificación en el grupo hidroxilo unido a la C-3 o C-5 del azúcar. Los nucleótidos son usualmente mono-, di- o trifosfatos.

[0176] Un “nucleósido” es estructuralmente similar a un nucleótido, pero le faltan los restos de fosfato. Un ejemplo de un análogo de nucleósido sería uno en el que la etiqueta está unida a la base y no hay un grupo fosfato unido a la molécula de azúcar.

[0178] Aunque la base se denomina usualmente “purina” o “pirimidina”, el experto apreciará que los derivados y análogos disponibles no alteran la capacidad del nucleótido o nucleósido de someterse al emparejamiento de bases de Watson-Crick. “Derivado” o “análogo” significa que hace referencia a un compuesto o una molécula cuya estructura central es la misma que la de un compuesto precursor, o se asemeja mucho a ella, pero que tiene una modificación química o física, tal como, por ejemplo, un grupo lateral diferente o adicional, que permite que el nucleótido derivado o el nucleósido se conecte a otra molécula. Por ejemplo, la base puede ser una desazopurina. En realizaciones particulares, los derivados son capaces de sufrir emparejamiento de Watson-Crick. “Derivado” y “análogo” también incluyen, por ejemplo, un nucleótido sintético o el derivado de un nucleósido que tiene restos de base modificados y/o restos de azúcar modificados. Tales derivados y análogos se describen, por ejemplo, en Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) y Uhlman y col., Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Los análogos de nucleótidos también pueden tener enlaces fosfodiéster modificados, incluidos enlaces fosforotioato, fosforoditioato, alquilfosfonato, fosforanilidato, fosforamidato y similares.

[0180] Un colorante se puede unir a cualquier posición de una base nucleotídica, por ejemplo, a través de un conector. En realizaciones particulares, el emparejamiento de bases de Watson-Crick todavía se puede llevar a cabo para el análogo resultante. Los sitios particulares de marcaje de bases nitrogenadas incluyen la posición C5 de una base de pirimidina o la posición C7 de una base de 7-deazapurina. Como se ha descrito anteriormente, un grupo conector se puede utilizar para unir covalentemente un colorante al nucleósido o nucleótido.

[0181] En realizaciones particulares, el nucleósido o nucleótido marcado puede ser incorporable enzimáticamente y extensible enzimáticamente. En consecuencia, un resto conector puede ser de longitud suficiente para conectar el nucleótido al compuesto, de tal modo que el compuesto no interfiera significativamente en la unión general y el reconocimiento del nucleótido por una enzima de replicación de ácido nucleico. Por lo tanto, el conector también puede comprender una unidad espaciadora. Las distancias espaciadoras, por ejemplo, la base de los nucleótidos de un sitio de escisión o etiqueta.

[0182] Los nucleósidos o nucleótidos marcados con colorantes de la descripción pueden tener la fórmula:

[0185]

[0187] Donde Colorante es un compuesto colorante según la presente descripción, B es una base nitrogenada, tal como, por ejemplo, uracilo, timina, citosina, adenina, guanina y similares, y L es un grupo conector opcional que puede estar presente o no. R' puede ser H, monofosfato, difosfato, trifosfato, tiofosfato, un análogo de éster de fosfato, -O- unido a un grupo reactivo que contiene fósforo o -O- protegido por un grupo bloqueante. R" puede ser H, OH, un fosforamidito o un grupo bloqueante 3'OH, y R‴ es H u OH.

[0188] Donde R" es fosforamidito, R' es un grupo protector hidroxilo escindible con ácido que permite el acoplamiento de monómero posterior en condiciones de síntesis automatizadas.

[0189] En una realización particular, el grupo bloqueante está separado e independiente del compuesto colorante, es decir, no está unido directamente a él. En una realización alternativa, el colorante puede comprender todo o parte del grupo bloqueante 3'OH. Por lo tanto R" puede ser un grupo bloqueante 3'OH que puede o no comprender un compuesto colorante descrito en la presente memoria.

[0190] En otra realización alternativa más, no hay ningún grupo bloqueante en el carbono 3' del azúcar pentosa y el colorante (o el colorante y la construcción de conector) unido a la base, por ejemplo, puede tener un tamaño o una estructura suficientes para actuar como un bloqueo a la incorporación de un nucleótido adicional. Por lo tanto el bloqueo se puede deber a un impedimento estérico o a una combinación de tamaño, carga y estructura, independientemente de que el colorante esté unido o no a la posición 3' del azúcar.

[0191] En otra realización alternativa más, el grupo bloqueante está presente en el carbono 2' o 4' del azúcar pentosa y puede tener un tamaño o una estructura suficientes para actuar como bloqueo a la incorporación de un nucleótido adicional. El uso de un grupo bloqueante permite controlar la polimerización, tal como deteniendo la extensión cuando se incorpora un nucleótido modificado. Si el efecto bloqueante es reversible, por ejemplo, a modo de ejemplo no limitativo, cambiando las condiciones químicas o mediante la retirada de un bloqueo químico, la extensión se puede detener en ciertos puntos y dejar que continúe después.

[0192] En otra realización particular, un grupo bloqueante 3'OH comprenderá los restos descritos en WO2004/018497. Por ejemplo, el grupo bloqueante puede ser azidometilo (CH<2>N<3>) o alilo.

[0193] En una realización particular, un conector (entre el colorante y el nucleótido) y un grupo bloqueante están ambos presentes y son restos separados. En realizaciones particulares, el conector y el grupo bloqueante son ambos escindibles en condiciones sustancialmente similares. Por lo tanto los procesos de desprotección y desbloqueo pueden ser más eficientes, ya que solo se requerirá un único tratamiento para eliminar tanto el compuesto colorante como el bloqueo. Sin embargo, en algunas realizaciones, un conector y un grupo bloqueante no necesitan ser escindibles en condiciones similares, sino que se pueden escindir individualmente en condiciones distintas.

[0194] Esta descripción también abarca polinucleótidos que incorporan compuestos colorantes. Tales polinucleótidos pueden ser ADN o ARN que comprenden respectivamente de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos unidos en un enlace fosfodiéster. Los polinucleótidos según la descripción pueden comprender nucleótidos naturales, nucleótidos no naturales (o modificados) distintos de los nucleótidos modificados de la descripción o cualquier combinación de los mismos, junto con al menos un nucleótido modificado (p. ej., marcado con un compuesto colorante) descrito en la presente memoria. Los polinucleótidos según la descripción también pueden incluir enlaces de la estructura principal no naturales y/o modificaciones químicas no nucleotídicas. También se contemplan estructuras quiméricas compuestas por mezclas de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos que comprenden al menos un nucleótido modificado según la descripción.

[0195] Los nucleótidos modificados (o nucleósidos) que comprenden un compuesto colorante según la presente descripción se pueden utilizar en cualquier método de análisis, tal como los métodos que incluyen la detección de una etiqueta fluorescente unida a un nucleótido o nucleósido, ya sea por sí sola o incorporada o asociada a una estructura molecular más grande o un conjugado. En este contexto, el término “incorporado en un polinucleótido” puede significar que el fosfato 5' está unido en un enlace fosfodiéster al grupo hidroxilo 3' de un segundo nucleótido (modificado o no modificado), que a su vez puede formar parte de una cadena de polinucleótido más larga. El extremo 3' de un nucleótido modificado expuesto en la presente memoria puede estar unido o no a un enlace fosfodiéster al fosfato 5' de un nucleótido (modificado o no modificado) adicional. Por lo tanto en una realización no limitativa, la descripción proporciona un método para detectar un nucleótido modificado incorporado en un polinucleótido que comprende: (a) incorporar al menos un nucleótido modificado de la descripción en un polinucleótido y (b) detectar el nucleótido o nucleótidos modificados incorporados en el polinucleótido mediante la detección de la señal fluorescente del compuesto colorante unido a dicho nucleótido o nucleótidos modificados.

[0197] Este método puede incluir: una etapa sintética (a) en la que uno o más nucleótidos modificados según la descripción se incorporan a un polinucleótido y una etapa de detección (b) en la que uno o más nucleótidos modificados incorporados al polinucleótido se detectan detectando o midiendo cuantitativamente su fluorescencia.

[0199] En una realización de la presente descripción, al menos un nucleótido modificado se incorpora a un polinucleótido en una etapa sintética mediante la acción de una enzima polimerasa. Sin embargo, se pueden utilizar otros métodos para unir nucleótidos modificados a polinucleótidos, tales como, por ejemplo, la síntesis química de oligonucleótidos o la ligación de oligonucleótidos marcados a oligonucleótidos no marcados. Por lo tanto, el término “incorporar”, cuando se utiliza en referencia a un nucleótido y un polinucleótido, puede abarcar la síntesis de polinucleótidos por métodos químicos, así como por métodos enzimáticos.

[0201] En una realización específica, se lleva a cabo una etapa sintética que puede comprender opcionalmente la incubación de una cadena de polinucleótidos molde con una mezcla de reacción que comprende nucleótidos modificados marcados con fluorescencia de la descripción. También se puede proporcionar una polimerasa en condiciones que permitan la formación de un enlace fosfodiéster entre un grupo hidroxilo 3' libre en una cadena de polinucleótido hibridada con la cadena de polinucleótido molde y un grupo fosfato 5' en el nucleótido modificado. Por lo tanto, una etapa sintética puede incluir la formación de una cadena de polinucleótidos dirigida por el apareamiento de bases complementarias de nucleótidos con una cadena molde.

[0203] En todas las realizaciones del método, la etapa de detección se puede llevar a cabo mientras la cadena de polinucleótidos a la que se incorporan los nucleótidos modificados se hibrida con una cadena molde, o después de una etapa de desnaturalización en la que se separan las dos cadenas. Se pueden incluir etapas adicionales, por ejemplo, etapas de reacción química o enzimática o etapas de purificación, entre una etapa sintética y una etapa de detección. En particular, la cadena diana que incorpora el nucleótido o nucleótidos modificados se puede aislar o purificarse y, a continuación, someterse a un proceso adicional o utilizarse en un análisis posterior. A modo de ejemplo, los polinucleótidos diana marcados con nucleótidos modificados en una etapa sintética se pueden utilizar posteriormente como sondas o cebadores marcados. En otras realizaciones, el producto de una etapa sintética descrita en la presente memoria se puede someter a etapas de reacción adicionalmente y, si se desea, el producto de estas etapas posteriores se puede purificar o aislar.

[0205] Las condiciones adecuadas para una etapa sintética serán bien conocidas por quienes estén familiarizados con las técnicas estándar de la biología molecular. En una realización, una etapa sintética puede ser análoga a una reacción estándar de extensión de cebador utilizando precursores de nucleótidos, incluidos los nucleótidos modificados descritos en la presente memoria, para formar una cadena diana extendida complementaria a la cadena molde en presencia de una enzima polimerasa adecuada. En otras realizaciones, una etapa sintética puede formar parte de una reacción de amplificación que produce un producto de amplificación bicatenario marcado que comprende cadenas complementarias hibridadas derivadas de la copia de cadenas de polinucleótidos diana y cadenas molde. Otros pasos sintéticos ilustrativos incluyen traducción de mella, polimerización por desplazamiento de cadenas, marcaje de ADN con cebado aleatorio, etc. Una enzima polimerasa particularmente útil para una etapa sintética es una que es capaz de catalizar la incorporación de uno o más de los nucleótidos modificados descritos en la presente memoria. Se puede utilizar una variedad de polimerasas de origen natural o modificadas. A modo de ejemplo, puede utilizarse una polimerasa termoestable para una reacción sintética que se lleva a cabo utilizando condiciones de termociclado, mientras que puede no desearse una polimerasa termoestable para las reacciones de extensión de cebadores isotérmicas. Las polimerasas termoestables adecuadas que son capaces de incorporar los nucleótidos modificados según la descripción incluyen las descritas en WO 2005/024010 o WO06120433. En las reacciones sintéticas que se llevan a cabo a temperaturas inferiores, tal como 37 °C, las enzimas polimerasa no necesitan necesariamente ser las polimerasas termoestables; por lo tanto, la elección de la polimerasa dependerá de cierto número de factores, tal como la temperatura de reacción, el pH, la actividad de desplazamiento de la cadena y similares.

[0207] En realizaciones específicas no limitativas, la descripción abarca métodos de secuenciación de ácidos nucleicos, resecuenciación, secuenciación de genoma completo, puntuación de polimorfismos de un único nucleótido o cualquier otra aplicación que implique la detección del nucleótido o nucleósido modificado marcado con los colorantes descritos en la presente memoria cuando se incorpora a un polinucleótido. Una cualquiera de una variedad de otras aplicaciones que se benefician del uso de polinucleótidos marcados con los nucleótidos modificados que comprenden colorantes fluorescentes puede utilizar nucleótidos o nucleósidos modificados marcados con los colorantes descritos en la presente memoria.

[0209] En una realización particular, la descripción proporciona el uso de nucleótidos modificados que comprenden compuestos de colorante según la descripción en una reacción de secuenciación por síntesis de polinucleótidos. La secuenciación por síntesis generalmente implica la adición secuencial de uno o más nucleótidos u oligonucleótidos a una cadena de polinucleótido en crecimiento en la dirección 5' a 3' utilizando una polimerasa o ligasa para formar una cadena de polinucleótido extendida complementaria al ácido nucleico molde que se va a secuenciar. La identidad de la base presente en uno o más de los nucleótidos añadidos se puede determinar en una etapa de detección o “toma de imágenes”. La identidad de la base añadida puede determinarse después de cada etapa de incorporación de los nucleótidos. La secuencia del molde se puede inferir a continuación utilizando reglas convencionales de emparejamiento de bases Watson-Crick. El uso de los nucleótidos modificados marcados con los colorantes descritos en la presente memoria para determinar la identidad de una sola base puede ser útil, por ejemplo, en la puntuación de polimorfismos de un solo nucleótido, y tales reacciones de extensión de una sola base están dentro del alcance de la presente descripción.

[0211] En una realización de la presente descripción, la secuencia de un polinucleótido molde se determina detectando la incorporación de uno o más nucleótidos a una cadena naciente complementaria al polinucleótido molde que se va a secuenciar a través de la detección de etiquetas fluorescentes unidas al nucleótido o nucleótidos incorporados. La secuenciación del polinucleótido molde se puede iniciar con un cebador adecuado (o prepararse como una construcción en horquilla que contendrá el cebador como parte de la horquilla), y la cadena naciente se extiende por etapas mediante la adición de nucleótidos al extremo 3' del cebador en una reacción catalizada por polimerasa.

[0212] En realizaciones particulares, cada uno de los diferentes trifosfatos de nucleótidos (A, T, G y C) se puede marcar con un fluoróforo único y también comprende un grupo bloqueante en la posición 3' para impedir la polimerización incontrolada. Alternativamente, uno de los cuatro nucleótidos puede estar sin marcar (oscuro). La enzima polimerasa incorpora un nucleótido en la cadena naciente complementaria al polinucleótido molde, y el grupo bloqueante impide la incorporación adicional de nucleótidos. Los nucleótidos no incorporados se pueden eliminar por lavado y la señal fluorescente de cada nucleótido incorporado puede “leerse” ópticamente por medios adecuados, tal como un dispositivo de carga acoplado que utilice excitación láser y filtros de emisión adecuados. A continuación, el grupo bloqueante en 3' y los compuestos de colorante fluorescente se pueden eliminar (desprotegerse) (simultánea o secuencialmente) para exponer la cadena naciente para la incorporación adicional de nucleótidos. Típicamente, la identidad del nucleótido incorporado se determinará después de cada etapa de incorporación, pero esto no es estrictamente esencial. Similarmente, la patente US-5,302,509 describe un método para secuenciar polinucleótidos inmovilizados sobre un soporte sólido.

[0214] El método, como se ha ilustrado anteriormente, utiliza la incorporación de nucleótidos A, G, C y T marcados con fluorescencia y bloqueados en 3' en una cadena en crecimiento complementaria al polinucleótido inmovilizado, en presencia de ADN-polimerasa. La polimerasa incorpora una base complementaria al polinucleótido diana, pero se evitan adiciones adicionales por el grupo bloqueante en 3'. A continuación, se puede determinar la etiqueta del nucleótido incorporado y eliminar el grupo bloqueante mediante escisión química para permitir que se produzca una polimerización adicional. El molde de ácido nucleico que se va a secuenciar en una reacción de secuenciación por síntesis puede ser cualquier polinucleótido que se desee secuenciar. El molde de ácido nucleico para una reacción de secuenciación comprenderá típicamente de una región bicatenaria que tiene un grupo hidroxilo 3' libre que sirve como cebador o punto de iniciación para la adición de nucleótidos adicionales en la reacción de secuenciación. La región del molde que se va a secuenciar sobresaldrá este grupo hidroxilo 3' libre en la cadena complementaria. La región sobresaliente del molde que se va a secuenciar puede ser monocatenaria, pero puede ser bicatenaria, siempre y cuando que una “mella esté presente” en la cadena complementaria a la cadena molde que se va a secuenciar para proporcionar un grupo 3' OH libre al inicio de la reacción de secuenciación. En tales realizaciones, la secuenciación puede proceder por desplazamiento de cadena. En ciertas realizaciones, se puede añadir un cebador que lleve el grupo hidroxilo 3' libre como un componente separado (p. ej., un oligonucleótido corto) que se hibrida con una región monocatenaria de la plantilla que se va a secuenciar. Alternativamente, el cebador y la cadena molde que se va a secuenciar pueden formar parte de una cadena de ácido nucleico parcialmente autocomplementaria capaz de formar un dúplex intramolecular, tal como, por ejemplo, una estructura en bucle de horquilla. Los polinucleótidos de horquilla y los métodos por los que se pueden unir a soportes sólidos se describen en las publicaciones de solicitud internacional n.º WO0157248 y WO2005/047301. Los nucleótidos pueden añadirse sucesivamente a un cebador en crecimiento, resultando en la síntesis de una cadena de polinucleótido en la dirección 5' a 3'. La naturaleza de la base que se ha añadido puede determinarse, particularmente pero no necesariamente, después de cada adición de nucleótidos, lo que así proporciona información de la secuencia del molde de ácido nucleico. Por lo tanto, un nucleótido se incorpora a una cadena de ácido nucleico (o polinucleótido) mediante la unión del nucleótido al grupo hidroxilo 3' libre de la cadena de ácido nucleico mediante la formación de un enlace fosfodiéster con el grupo fosfato 5' del nucleótido.

[0215] El molde de ácido nucleico que se va a secuenciar puede ser ADN o ARN, o incluso una molécula híbrida que comprende desoxinucleótidos y ribonucleótidos. El molde de ácido nucleico puede comprender nucleótidos de origen natural y/o no natural y enlaces de la estructura principal naturales o no naturales, siempre y cuando estos no impidan copiar el molde en la reacción de secuenciación.

[0216] En ciertas realizaciones, la plantilla de ácido nucleico que se va a secuenciar se puede unir a un soporte sólido mediante cualquier método de enlace adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, mediante unión covalente. En ciertas realizaciones, los polinucleótidos molde se pueden unir directamente a un soporte sólido (p. ej., un soporte a base de sílice). Sin embargo, en otras realizaciones de la descripción, la superficie del soporte sólido se puede modificar de alguna manera para permitir la unión covalente directa de los polinucleótidos molde o para inmovilizar los polinucleótidos molde a través de un hidrogel o una multicapa de polielectrolito, que a su vez se puede unir de forma no covalente al soporte sólido.

[0217] Las matrices en las que los polinucleótidos se han unido directamente a soportes a base de sílice son, por ejemplo, las descritas en WO00006770, en donde los polinucleótidos se inmovilizan en un soporte de vidrio mediante la reacción entre un grupo epóxido colgante en el vidrio y un grupo amino interno en el polinucleótido. Además, los polinucleótidos que se pueden unir a un soporte sólido mediante la reacción de un nucleófilo a base de azufre con el soporte sólido, por ejemplo, como se describe en WO2005/047301. Otro ejemplo adicional de polinucleótidos molde con soporte sólido es cuando los polinucleótidos molde se unen a un hidrogel soportado sobre soportes a base de sílice u otros soportes sólidos, por ejemplo, como se describe en las patentes WO00/31148, WO01/01143, WO02/12566, WO03/014392, la patente US-6,465,178 y la patente WO00/53812.

[0218] Una superficie particular en la que se pueden inmovilizar los polinucleótidos molde es un hidrogel de poliacrilamida. Los hidrogeles de poliacrilamida se describen en las referencias citadas anteriormente y en la patente WO2005/065814.

[0219] Las moléculas de ADN molde se pueden unir a perlas o micropartículas, por ejemplo, tal y como se describe en la patente US-6,172,218. La unión a microesferas o micropartículas puede ser útil para aplicaciones de secuenciación. Se pueden preparar bibliotecas de microesferas en donde cada perla contiene diferentes secuencias de ADN. Se describen bibliotecas y métodos ilustrativos para su creación en Nature. 437, 376-380 (2005); Science. 309, 5741, 1728-1732 (2005). La secuenciación de las matrices de tales microesferas utilizando nucleótidos descritos en la presente memoria, está dentro del alcance de la presente descripción.

[0220] El molde o los moldes que se van a secuenciar pueden formar parte de una “matriz” sobre un soporte sólido, en cuyo caso la matriz puede tomar cualquier forma conveniente. Por lo tanto el método de la descripción es aplicable a todos los tipos de matrices de alta densidad, incluidas las matrices de moléculas únicas, las matrices agrupadas y las matrices de perlas. Los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la presente descripción se pueden utilizar para secuenciar plantillas en prácticamente cualquier tipo de matriz, aunque no de forma limitativa, las formadas por la inmovilización de moléculas de ácido nucleico en un soporte sólido.

[0221] Sin embargo, los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la descripción son particularmente ventajosos en el contexto de la secuenciación de matrices agrupadas. En las matrices agrupadas, las distintas regiones de la matriz (frecuentemente denominadas sitios o características) comprenden múltiples moléculas molde de polinucleótidos. Generalmente, las múltiples moléculas de polinucleótidos no se pueden resolver individualmente por medios ópticos y, en cambio, se detectan como un ensamblaje. Dependiendo de cómo se forme la matriz, cada sitio de la matriz puede comprender múltiples copias de una molécula de polinucleótido individual (p. ej., el sitio es homogéneo para una especie de ácido nucleico particular de cadena simple o doble) o incluso múltiples copias de un pequeño número de moléculas de polinucleótidos diferentes (p. ej., múltiples copias de dos especies de ácido nucleico diferentes). Las matrices agrupadas de moléculas de ácido nucleico pueden producirse mediante el uso de técnicas generalmente conocidas en la técnica. A modo de ejemplo, WO 98/44151 y WO00/18957, cada una de las cuales se incorpora a la presente memoria, describen métodos de amplificación de ácidos nucleicos en donde tanto la plantilla como los productos de amplificación permanecen inmovilizados en un soporte sólido para formar matrices que comprenden agrupaciones o “colonias” de moléculas de ácido nucleico inmovilizadas. Las moléculas de ácido nucleico presentes en las matrices agrupadas preparadas según estos métodos son plantillas adecuadas para la secuenciación utilizando los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la presente descripción.

[0222] Los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la presente descripción también son útiles en la secuenciación de plantillas en matrices de moléculas únicas. El término “matriz de moléculas individuales” o “SMA”, en inglés, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una población de moléculas de polinucleótidos, distribuidas (o dispuestas en matriz) sobre un soporte sólido, en donde la separación de cualquier polinucleótido individual de todos los demás de la población es tal que es posible resolver individualmente las moléculas de polinucleótido individuales. Las moléculas de ácido nucleico diana inmovilizadas en la superficie del soporte sólido pueden así ser resueltas por medios ópticos en algunas realizaciones. Esto significa que se producirán una o más señales distintas, cada una de las cuales representa un polinucleótido, dentro del área resoluble del dispositivo de obtención de imágenes particular utilizado.

[0223] La detección de moléculas individuales puede lograrse en donde la separación entre moléculas de polinucleótidos adyacentes en una matriz es al menos 100 nm, más particularmente al menos 250 nm, aún más particularmente al menos 300 nm, incluso más particularmente de al menos 350 nm. Por lo tanto, cada molécula se puede resolver individualmente y detectarse como un punto fluorescente de una sola molécula, y la fluorescencia de dicho punto fluorescente de molécula única también presenta un fotoblanqueamiento de una única etapa.

[0225] Los términos “resuelto individualmente” y “resolución individual” se utilizan en la presente memoria para especificar que, cuando se visualiza, es posible distinguir una molécula de la matriz de sus moléculas vecinas. La separación entre moléculas individuales en la matriz se determinará, en parte, por la técnica particular utilizada para resolver las moléculas individuales. Las características (en general) de las matrices de moléculas individuales se comprenderán por referencia a las solicitudes publicadas WO00/06770 y WO 01/57248. Aunque un uso de los nucleótidos modificados de la descripción está en las reacciones de secuenciación por síntesis, la utilidad de los nucleótidos modificados no se limita a tales métodos. De hecho, los nucleótidos se pueden utilizar de forma ventajosa en cualquier metodología de secuenciación que requiera la detección de etiquetas fluorescentes unidas a nucleótidos incorporados a un polinucleótido.

[0227] En particular, los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la descripción se pueden utilizar en protocolos de secuenciación fluorescente automatizados, particularmente en la secuenciación cíclica con terminadores fluorescentes basándose en el método de secuenciación por terminación de cadena de Sanger y sus colaboradores. Tales métodos utilizan generalmente enzimas y secuenciación cíclica para incorporar didesoxinucleótidos marcados con fluorescencia en una reacción de secuenciación por extensión de cebadores. Los denominados métodos de secuenciación de Sanger y los protocolos relacionados (tipo Sanger) utilizan la terminación aleatoria de la cadena con didesoxinucleótidos marcados.

[0229] Por lo tanto la presente descripción también abarca nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes que son didesoxinucleótidos que carecen de grupos hidroxilo en las posiciones 3' y 2', siendo tales didesoxinucleótidos modificados adecuados para utilizar en métodos de secuenciación de tipo Sanger y similares.

[0231] Los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la presente descripción que incorporan grupos bloqueantes en 3', como se reconocerá, también pueden ser útiles en los métodos de Sanger y protocolos relacionados, ya que el mismo efecto que se alcanza utilizando didesoxinucleótidos modificados se puede alcanzar utilizando nucleótidos modificados que tienen grupos bloqueantes -OH en 3': ambos impiden la incorporación de nucleótidos posteriores. Cuando se vayan a utilizar nucleótidos según la presente descripción y que tengan un grupo bloqueante en 3' en métodos de secuenciación de tipo Sanger, se apreciará que los compuestos colorantes o las etiquetas detectables unidas a los nucleótidos no necesitan estar conectados a través de conectores escindibles, ya que en cada caso en que se incorpore un nucleótido marcado de la descripción; no es necesario incorporar ningún nucleótido posteriormente y, por lo tanto, no es necesario eliminar la etiqueta del nucleótido.

[0233] La presente descripción también proporciona kits que incluyen nucleósidos y/o nucleótidos modificados marcados con colorantes. Tales kits incluirán generalmente al menos un nucleótido o nucleósido modificado marcado con un colorante descrito en la presente memoria, junto con al menos un componente adicional. El componente o componentes adicionales pueden ser uno o más de los componentes identificados en un método descrito anteriormente o en la sección Ejemplos que figura a continuación. A continuación, se exponen algunos ejemplos no limitativos de componentes que se pueden combinar en un kit de la presente descripción.

[0235] En una realización particular, un kit puede incluir al menos un nucleótido o nucleósido modificado marcado con un colorante descrito en la presente memoria junto con nucleótidos o nucleósidos modificados o no modificados. Por ejemplo, los nucleótidos modificados marcados con colorantes según la descripción se pueden suministrar junto con nucleótidos no marcados o nativos, y/o con nucleótidos marcados con fluorescencia o cualquier combinación de los mismos. En consecuencia, los kits pueden comprender nucleótidos modificados marcados con colorantes según la descripción y nucleótidos modificados marcados con otros compuestos colorantes, por ejemplo, compuestos colorantes del estado de la técnica. Las combinaciones de nucleótidos se pueden proporcionar como componentes individuales separados (p. ej., un tipo de nucleótido por recipiente o tubo) o como mezclas de nucleótidos (p. ej., dos o más nucleótidos mezclados en el mismo recipiente o tubo).

[0237] Donde los kits comprenden una pluralidad, particularmente dos, más particularmente cuatro, nucleótidos modificados marcados con un compuesto colorante, los diferentes nucleótidos se pueden marcar con diferentes compuestos colorantes, o uno puede ser oscuro, sin compuestos colorantes. Cuando los diferentes nucleótidos están marcados con diferentes compuestos colorantes, una característica de los kits es que dichos compuestos colorantes son colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles. Como se utiliza en la presente memoria, el término “colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles” se refiere a los colorantes fluorescentes que emiten energía fluorescente a longitudes de onda que se pueden distinguir por el equipo de detección fluorescente (por ejemplo, una plataforma comercial de secuenciación del ADN basada en capilares) cuando dos o más de tales colorantes están presentes en una muestra. Cuando se suministran dos nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes fluorescentes en forma de kit, una característica de algunas realizaciones es que los colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles se pueden excitar a la misma longitud de onda, tal como, por ejemplo, mediante el mismo láser. Cuando se suministran cuatro nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes fluorescentes en forma de kit, una característica de algunas realizaciones es que dos de los colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles se pueden excitar ambos a una única longitud de onda y los otros dos colorantes espectralmente distinguibles se pueden excitar ambos a otra longitud de onda. Las longitudes de onda de excitación particulares son 532 nm, 630 nm a 700 nm, particularmente 660 nm.

[0238] En una realización, un kit incluye un nucleótido modificado marcado con un compuesto de la presente descripción y un segundo nucleótido modificado marcado con un segundo colorante, en donde los colorantes tienen una diferencia en el máximo de absorbancia de al menos 10 nm, particularmente de 20 nm a 50 nm. Más particularmente, los dos compuestos colorantes tienen desplazamientos de Stokes de entre 15 y 40 nm, donde el “desplazamiento de Stokes” es la distancia entre las longitudes de onda de pico de absorción y pico de emisión.

[0239] En otra realización adicional, un kit puede incluir además otros dos nucleótidos modificados marcados con colorantes fluorescentes, en donde los colorantes son excitados por el mismo láser a 488 nm a 550 nm, particularmente a 532 nm. Los colorantes pueden tener una diferencia en la absorbancia máxima de al menos 10 nm, particularmente 20 nm a 50 nm. Más particularmente, los dos compuestos de colorante tienen desplazamientos de Stokes de entre 20-40 nm. Más particularmente aún, los dos compuestos colorantes pueden tener un máximo de absorbancia diferente por debajo de 640 nm, particularmente por debajo de 600 nm. Colorantes particulares que son espectralmente distinguibles de los colorantes de polimetina de la presente descripción y que cumplen los criterios anteriores son análogos de polimetina tal como se describen en la patente US-5,268,486 (por ejemplo, Cy3) o WO 0226891 (Alexa 532; Molecular Probes A20106) o polimetinas asimétricas según se describe en la patente US-6,924,372. Otros colorantes alternativos incluyen los análogos de la rodamina, por ejemplo, la tetrametilrodamina y análogos de los mismos.

[0240] En una realización alternativa, los kits de la descripción pueden contener nucleótidos donde la misma base está marcada con dos compuestos diferentes. Un primer nucleótido se puede marcar con un compuesto de la descripción. Un segundo nucleótido se puede marcar con un compuesto espectralmente distinto, por ejemplo, un colorante “verde” que absorba a menos de 600 nm. Un tercer nucleótido se puede marcar como una mezcla del compuesto de la descripción y el compuesto espectralmente distinto, y el cuarto nucleótido puede ser “oscuro” y no contener ninguna etiqueta. En términos sencillos, por lo tanto, los nucleótidos 1-4 se pueden marcar como “verde”, “rojo”, “rojo/verde” y oscuro. Para simplificar adicionalmente la instrumentación, los cuatro nucleótidos se pueden marcar con dos colorantes excitados con un único láser y así el marcado de los nucleótidos 1-4 puede ser “rojo 1”, “rojo 2”, “rojo 1/rojo 2” y oscuro.

[0241] Los nucleótidos pueden contener dos colorantes de la presente descripción. Colorantes donde Ra<1>o Ra<2>es un anillo aromático adicional fusionado a carbonos adyacentes del anillo indólico absorben en una longitud de onda más larga que los colorantes que no tienen la conjugación aromática adicional. Un kit puede contener dos o más nucleótidos marcados con colorantes de la descripción. Un kit puede contener un nucleótido marcado con un compuesto de la descripción donde cada uno de Ra<1>y Ra<2>es independientemente H, SO<3>-, sulfonamida o halógeno, y un solo nucleótido marcado con un compuesto de la descripción donde uno o ambos Ra<1>y Ra<2>son un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente. Los kits pueden contener un nucleótido adicional donde el nucleótido está marcado con un colorante que absorbe en la región de 520 nm a 560 nm. Los kits pueden contener además un nucleótido sin marcar.

[0242] Aunque los kits se ilustran anteriormente en relación con configuraciones que tienen diferentes nucleótidos marcados con diferentes compuestos colorantes, se entenderá que los kits pueden incluir 2, 3, 4 o más nucleótidos diferentes que tienen el mismo compuesto colorante.

[0243] En realizaciones particulares, un kit puede incluir una enzima polimerasa capaz de catalizar la incorporación de los nucleótidos modificados en un polinucleótido. Otros componentes que se incluirán en tales kits pueden incluir tampones y similares. Los nucleótidos modificados marcados con colorantes según la descripción, y cualquier otro componente nucleotídico, incluidas mezclas de diferentes nucleótidos, se pueden proporcionar en el kit en forma concentrada para ser diluidos antes de su uso. En tales realizaciones, también puede incluirse un regulador de dilución adecuado. De nuevo, uno o más de los componentes identificados en un método descrito en la presente memoria se pueden incluir en un kit de la presente descripción.

[0244] Cabe señalar que, como se utilizan en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “uno”, “una”, “el” y “la” incluyen referentes plurales, salvo que se limiten expresa e inequívocamente a un referente.

[0245] Detalles experimentales

[0246] 2,3,3-trimetil-1-fenil-3H-indolio-5-sulfonato (1)

[0247]

[0249] Se disolvió 2-metileno-3,3-trimetil-1-fenil-2,3-dihidro-1H-indol (1 g, 4,25 mmol) en 1 ml de ácido sulfúrico a una temperatura inferior a 5 °C y se añadió 1 ml de ácido sulfúrico fumante (20 %) con agitación. Se agitó la solución a temperatura ambiente durante 1 h y después se calentó a 60 °C durante 3 h. Se precipitó el producto con dietil éter y se lavó con acetona y etanol. Rendimiento 0,7 g (52 %). La estructura se confirmó mediante RMN.

[0250] 2-(4-anilinobutadienil-1)-3,3-trimetil-1-fenil-3H-indolio-5-sulfonato (2-1)

[0253]

[0255] Esquema de reacción:

[0258]

[0260] Se calentó una mezcla de 2,3,3-trimetil-1-fenil-3H-indolio-5-sulfonato (0,63 g), anilina (0,2 g) y 1,1,3,3-tetraetoxipropano (0,35 ml) a 70 °C durante 90 min. Se formó una masa fundida roja. El producto se trituró con dietil éter y se filtró. Rendimiento 0,6 g (68 %).

[0261] 2-(4-acetanilidobutadienil-1)-3,3-trimetil-1-fenil-3H-indolio-5-sulfonato (2-2)

[0264]

[0266] Esquema de reacción:

[0267]

[0269] Se calentó una mezcla de 2,3,3-trimetil-1-fenil-3H-indolio-5-sulfonato (0,315 g), clorhidrato de dialdehído dianil de ácido malónico (0,25 g), ácido acético (1 ml) y anhídrido acético (2 ml) a 60 °C durante 3 horas y después a 50 °C durante la noche. Se formó una solución de color naranja. Se filtró el producto y se lavó con dietil éter. Rendimiento 0,24 g (49 %).

[0270] 1,2-dimetil-1- (4-sulfonatobutil)-3-fenil-1H-benzo[e]indolio (3)

[0273]

[0275] Esquema de reacción:

[0278]

[0280] Se agitaron clorhidrato de N-(2-naftil),N-fenilhidrazina (19,51 mmol, 5,28 g), ácido 5-metil-6-oxoheptanosulfónico (17,18 mmol, 3,70 g) y ZnCl<2>anhidro (17,18 mmol, 2,34 g) en etanol absoluto (30 ml) a temperatura ambiente durante 30 minutos y, a continuación, a 80 °C durante 2 horas. El progreso de la reacción se comprobó mediante TLC (H<2>O al 10 % en CH<3>CN). Después de completarse, se enfrió la reacción y se retiró el disolvente al vacío. El residuo se disolvió en DCM y se purificó mediante columna ultrarrápida sobre gel de sílice. Rendimiento: 3,06 g, 42 %.

[0281] RMN de protón: (MeOH-D4): 8,28 (0,5H, d, J = 8 Hz); 8,05-8,02 (1H, m); 7,89 (0,5H, d, J = 8 Hz); 7,75-7,66 (3H, m); 7,65-7,60 (1H, m); 1,49-1,43 (1,5H, m); 7,31-7,25 (2H, m); 7,16 (0,5H, d, J = 9 Hz); 7,07 (0,5H, aparente, J = 7,4 Hz); 6,61 (0,5H, d, J = 8 Hz); 2,85-2,35 (4H, m); 1,88 (3H, doble aparente, J = 9 Hz); 1,75-1,4 (5H, m); 1,35-1,25 (0,5H, m); 1,1-0,95 (0,5H, m); 0,8-0,65 (0,5H, m); 0,58-0,45 (0,5H, m).

[0282] 1,2-dimetil-1- (3-sulfonatopropil)-3-fenil-1H-benzo[e]indolio (4)

[0285]

[0287] Esquema de reacción:

[0288]

[0290] Se preparó el compuesto base como el compuesto anterior a partir de clorhidrato de N-(2-naftil)-N-fenilhidrazina y ácido 4-metil-5-oxopentanosulfónico. El producto se purificó mediante columna ultrarrápida sobre gel de sílice. Rendimiento: 40 %. Estructura confirmada por espectro de RMN.

[0291] 2,3-dimetil-3-(4-sulfonatobutil)-1-fenil-3H-indolio (5)

[0294]

[0296] Esquema de reacción:

[0299]

[0301] Se agitaron clorhidrato de N,N-difenilhidrazina (0,01 mol, 2,2 g), ácido 5-metil-6-oxoheptanosulfónico (0,017 mol, 3,0 g) en ácido acético glacial (20 ml) a temperatura ambiente (~20 °C) durante una hora y después a 100 °C durante 3 horas (comprobación por TLC). Se enfrió la mezcla de reacción y el disolvente se retiró al vacío. El residuo se lavó con dietil éter y se purificó mediante columna ultrarrápida sobre gel de sílice. Rendimiento: 2 g (56 %). Estructura confirmada por espectro de RMN.

[0302] Nombre del producto: NR650C5

[0303] Esquema de síntesis del producto:

[0306]

[0308] Procedimiento de síntesis del colorante:

[0309] Se agitaron 2,3-dimetil-3-(4-sulfonatobutil)-1-fenil-3H-indolio (5) (70 mg) y clorhidrato de malondialdehído dianilo (II, 51 mg) se agitaron en una mezcla de anhídrido acético y ácido acético (4 ml / 1 ml) a 90 °C durante 2 h (reacción de control por TLC 15 % H<2>O en MeCN). La mezcla de reacción se dejó durante la noche a TA. Los disolventes se eliminaron a vacío, el residuo amarillo se lavó con dietil éter y se disolvió en ácido acético (5 ml). Se añadió la sal de indolio (III, 85 mg) a la solución del intermediario preparado en la etapa anterior, seguida de piridina (0,5 ml). Esta mezcla de reacción se agitó a 80 °C durante 3 h y se dejó reposar durante la noche a temperatura ambiente. Los disolventes se eliminaron al vacío. El residuo azul oscuro se lavó con dietil éter, se disolvió en una mezcla de agua y acetonitrilo (~5 %), se filtró y se purificó mediante HPLC preparativa. Se recogieron las fracciones de color azul (absorción máxima ~ 650 nm) y se eliminaron los disolventes al vacío

[0310] Los colorantes D1-D7 se prepararon similarmente utilizando los materiales de partida apropiados.

[0311] En la Tabla 1, se comparan las propiedades espectrales de algunos colorantes preparados de este modo (soluciones en agua) con parámetros similares del colorante análogo Estándar de estructura conocida (EP1810998A2). El colorante D4, tal y como se define en la Tabla 1, no entra dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas y se proporciona a modo de referencia.

[0312] Tabla 1

[0314]

[0316] Conjugado de nucleótido del colorante D4 (FFA4)

[0319]

[0321] Preparación:

[0322] Se añadieron DMA anhidro (5 ml) y base de Hünig (0,06 ml) a la muestra deshidratada del colorante D4 (88 mg). A continuación, se añadió una solución de TSTU (25 mg) en 5 ml de DMA seco. Se desarrolló el color azul del éster activado. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 1 h. Según la TLC (H<2>O al 20 % en CH<3>CN), la activación se completó. Después de completada la activación, esta solución se añadió a la solución de pppA-LN3 como sal de trietilamonio (47 mg) en agua (7 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante 3 h. Se comprobó el progreso del acoplamiento mediante TLC (H<2>O al 20 % en acetonitrilo). Se enfrió la mezcla de reacción hasta los ~4 °C con un baño de hielo, se añadió después una solución de TEAB 0,1 M (5 ml) en agua y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. La mezcla de reacción se aplicó a una columna con ~ 50 g de suspensión de resina DEAE sephadex en solución de TEAB 0,05 M en agua y se lavó con TEAB (gradiente de concentración de 0,1 M a 0,5 M). Las fracciones coloreadas se recogieron y se evaporaron, y se volvieron a evaporar después con agua para eliminar más TEAB y se secaron al vacío. A continuación, el residuo se volvió a disolver en TEAB 0,1 M. Esta solución se filtró a través de un filtro de jeringa con un tamaño de poro de 0,2 nm en un matraz Corning y se almacenó en el congelador. El producto se purificó por HPLC utilizando una columna de fase inversa C18 con acetonitrilo-TEAB 0,1 M. Rendimiento del 76 % (basándose en la densidad óptica de la solución utilizando el coeficiente de extinción estimado).

[0323] Conjugado de nucleótidos del colorante D7 (FFA7)

[0326]

[0328] Preparación:

[0329] Se añadieron DMA anhidro (5 ml) y base de Hünig (0,06 ml) a la muestra deshidratada del colorante D7 (100 mg). A continuación, se añadió una solución de TSTU (25 mg) en 5 ml de DMA seco. Se desarrolló el color azul del éster activado. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 1 h. Según la TLC (H<2>O al 20 % en CH<3>CN), la activación se completó. Después de completada la activación, esta solución se añadió a la solución de pppA-LN3 como sal de trietilamonio (47 mg) en agua (7 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante 3 h. Se comprobó el progreso del acoplamiento mediante TLC (H<2>O al 20 % en acetonitrilo). Se enfrió la mezcla de reacción hasta los ~4 °C con un baño de hielo, se añadió después una solución de TEAB 0,1 M (5 ml) en agua y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. La mezcla de reacción se aplicó a una columna con ~ 50 g de suspensión de resina DEAE sephadex en solución de TEAB 0,05 M en agua y se lavó con TEAB (gradiente de concentración de 0,1 M a 0,5 M). Las fracciones coloreadas se recogieron y se evaporaron, y se volvieron a evaporar después con agua para eliminar más TEAB y se secaron al vacío. A continuación, el residuo se volvió a disolver en TEAB 0,1 M. Esta solución se filtró a través de un filtro de jeringa con un tamaño de poro de 0,2 nm en un matraz Corning y se almacenó en el congelador. El producto se purificó por HPLC utilizando una columna de fase inversa C18 con acetonitrilo-TEAB 0,1 M. Rendimiento del 57 % (basándose en la densidad óptica de la solución utilizando el coeficiente de extinción estimado).

[0330] Los conjugados con los colorantes D1-D7 se prepararon similarmente utilizando los materiales de partida apropiados.

[0331] En la Tabla 2, se comparan las propiedades fluorescentes de algunos conjugados marcados con nuevos colorantes preparados de este modo con parámetros similares de análogos estructurales conocidos basándose en el colorante conocido Estándar (US7109314B2, EP1810998A2).

[0332] Tabla 2

[0335]

[0337] A partir de estos datos, se puede observar que las intensidades de fluorescencia de los nucleótidos marcados con nuevos colorantes donde R1 es fenilo son significativamente más altas en comparación con los nucleótidos marcados con análogos estructurales conocidos (Estándar) donde R1 no es un grupo fenilo.

[0338] Algunos de los nucleótidos marcados con nuevos colorantes se han ensayado en el sistema de secuenciación Illumina y los datos (que se muestran en la Tabla 3 a continuación) revelan que el uso de nuevos compuestos proporciona una menor tasa de error para las aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos en comparación con los análogos estructurales conocidos donde R1 no es fenilo.

[0339] Tabla 3

[0341]

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que es un compuesto de la fórmula:

o formas mesoméricas de la misma, en donde;

R1 es C<6>H<5>, R2 es H, R3 es SO<3>-, R4 es (CH<2>)<5>CO<2>H y R es C<4>H<8>SO<3>-; o

R1 es C<6>H<5>, R2 es H, R3 es SO<2>NH<2>, R4 es (CH<2>)<2>CO<2>H y R es CH<3>; o

R1 es C<6>H<5>, R2 es SO<3>-, R3 es SO<2>NH<2>, R4 es (CH<2>)<2>CO<2>H y R es CH<3>; o

R1 es C<6>H<5>, R2 es H, R3 es SO<2>NH<2>, R4 es (CH<2>)<2>CO<2>H y R es C<4>H<8>SO<3>-; o

R1 es C<6>H<5>, R2 es H, R3 es SO<2>NH<2>, R4 es (CH<2>)<5>CO<2>H y R es C<4>H<8>SO<3>-.

2. El compuesto según la reivindicación 1, en donde R1 es C<6>H<5>, R2 es H, R3 es SO<3>-, R4 es (CH<2>)<5>CO<2>H y R es C<4>H<8>SO<3>-.

3. El compuesto según la reivindicación 1, en donde R1 es C<6>H<5>, R2 es H, R3 es SO<2>NH<2>, R4 es (CH<2>)<2>CO<2>H y R es CH<3>.

4. El compuesto según la reivindicación 1, en donde R1 es C<6>H<5>, R2 es SO<3>-, R3 es SO<2>NH<2>, R4 es (CH<2>)<2>CO<2>H y R es CH<3>.

5. El compuesto según la reivindicación 1, en donde R1 es C<6>H<5>, R2 es H, R3 es SO<2>NH<2>, R4 es (CH<2>)<2>CO<2>H y R es C<4>H<8>SO<3>-.

6. El compuesto según la reivindicación 1, que es:

7. Un conjugado de nucleótido u oligonucleótido que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el grupo COOH del compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 actúa como un resto conector.

8. El conjugado según la reivindicación 7, que es:

o formas mesoméricas de los mismos.

9. Un kit que comprende dos o más nucleótidos en donde al menos un nucleótido es un conjugado según la reivindicación 7 o la reivindicación 8.

10. Uso de un conjugado según la reivindicación 7 o la reivindicación 8 o un kit según la reivindicación 9 en secuenciación, análisis de expresión, análisis de hibridación, análisis genético, análisis de ARN o ensayos de unión de proteínas.