ES3058542T3 - Screening method for selecting plants that show a reduced wound-induced surface discolouration and plant and plant parts thus obtained - Google Patents

Screening method for selecting plants that show a reduced wound-induced surface discolouration and plant and plant parts thus obtained

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Abstract

La invención se refiere a un método para cribar una población de plantas o partes de plantas para detectar la presencia de individuos con una menor decoloración superficial inducida por heridas en comparación con una planta o parte de control. Este método comprende proporcionar una población de plantas o partes de plantas de la población; crear una superficie de herida en las plantas o partes de planta a cribar y en las plantas o partes de control; incubar las superficies de la herida para permitir que se produzca la decoloración; observar la decoloración superficial de la herida en las plantas o partes de planta; comparar la decoloración superficial de la herida observada en las plantas o partes de planta a cribar con la decoloración observada en la planta o parte de control. La invención también se refiere a las plantas seleccionadas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Método de selección para seleccionar plantas que muestran una decoloración superficial inducida por herida reducida y una planta y partes de una planta obtenidas de este modo
[0003] Campo de la invención
[0004] La presente invención se refiere a plantas que presentan una decoloración superficial inducida por herida ausente o reducida, y a partes y progenie de las mismas.
[0005] Antecedentes de la invención
[0006] Debido a la creciente demanda, el procesamiento de productos frescos, en particular de lechuga, se ha expandido significativamente en los últimos años. La cosecha y el procesamiento de la lechuga implican un corte extensivo de las hojas, lo que induce una fuerte respuesta a la herida. Esta respuesta a la herida conduce a un rápido deterioro del producto procesado. Este deterioro se manifiesta por la decoloración debida al pardeamiento enzimático o enrojecimiento en la superficie de la herida y sus alrededores, así como por la respiración y la desecación debido a la transpiración. En particular, el pardeamiento enzimático o enrojecimiento se considera de gran importancia, ya que determina directa o indirectamente la calidad general de la lechuga recién cortada y envasada.
[0007] Además, como consecuencia del deterioro, el número de microorganismos puede aumentar significativamente, lo que puede comprometer la seguridad alimentaria. La naturaleza altamente perecedera de la lechuga procesada genera una fuerte percepción de color, olor y textura desagradables por parte del consumidor, lo que obstaculiza un crecimiento más rápido que el actual del llamado mercado de conveniencia.
[0008] Para inhibir el proceso de deterioro, se han desarrollado numerosos tratamientos químicos o físicos poscosecha que se pueden aplicar para ralentizar el deterioro de la lechuga procesada.
[0009] Entre ellos se encuentran el envasado de lechuga recién cortada en atmósfera modificada, la aplicación de recubrimientos comestibles, el tratamiento de choque térmico y la adición de productos químicos que inhiben el pardeamiento enzimático. Cuando la lechuga recién cortada se envasa en una atmósfera con oxígeno reducido a bajas temperaturas, el pardeamiento enzimático se puede reducir sustancialmente. Sin embargo, dicho entorno modificado con bajo oxígeno provoca respiración anaerobia, lo que genera un sabor y un olor desagradables en el producto, que se percibe como muy poco atractivo.
[0010] Los recubrimientos comestibles son finas capas de materiales que actúan como barrera de aislamiento físico y que protegen eficazmente el producto de diferentes formas de deterioro, tales como evaporación y pardeamiento. Estos recubrimientos pueden estar hechos, por ejemplo, de resinas, polisacáridos o proteínas.
[0011] Además, se ha demostrado que el pardeamiento de la lechuga recién cortada se puede prevenir aplicando un breve choque térmico de 90 segundos a 45 °C inmediatamente después del procesamiento. Posiblemente, el choque térmico desvía la biosíntesis de proteínas de las enzimas implicadas en la decoloración hacia las proteínas de choque térmico, reduciendo así la capacidad de pardeamiento enzimático. Alternativamente, el efecto del tratamiento de choque térmico sobre el pardeamiento podría explicarse por la termosensibilidad de las enzimas implicadas en la vía de la decoloración.
[0012] Los productos químicos que se pueden aplicar pueden ser, por ejemplo, agentes reductores como la vitamina C, agentes quelantes como el EDTA, agentes complejantes como la ciclodextrina e inhibidores enzimáticos como la L-cisteína. La aplicación de productos químicos en alimentos frescos obviamente implica cuestiones de seguridad alimentaria y requiere aprobación regulatoria. Se pueden considerar combinaciones de las tecnologías poscosecha descritas anteriormente y, en última instancia, el procedimiento aplicado es un equilibrio entre la eficacia tecnológica, el coste y la seguridad alimentaria.
[0013] Independientemente de la tecnología aplicada, la mejora de la calidad poscosecha de la lechuga procesada tendrá un coste y, por lo tanto, existe una clara necesidad en la técnica de proporcionar alternativas que eliminen o reduzcan la necesidad de aplicar tecnologías poscosecha físicas o químicas.
[0014] Resumen de la invención
[0015] El objetivo de la presente invención es proporcionar plantas que muestren una decoloración por enrojecimiento o pardeamiento significativamente reducida tras la lesión. La decoloración tras la lesión también puede ser visible en partes de las plantas, tales como tallos, semillas, frutos, hojas, flores, tubérculos y brotes. En la presente memoria se describe un método para cribar una población de plantas o partes de plantas para determinar la presencia de individuos que muestren una decoloración superficial reducida inducida por herida en comparación con una planta o parte de planta de control, cuyo método comprende:
[0016] a) proporcionar una población de plantas o partes de plantas de la población;
[0017] b) crear una superficie de herida en las plantas o partes de plantas que se van a examinar y en las plantas o partes de las plantas de control;
[0018] c) incubar las superficies de la herida para permitir que se produzca la decoloración en la misma o sobre la misma; d) observar la decoloración superficial de la herida en o sobre las plantas o partes de las plantas;
[0019] e) comparar la decoloración superficial de la herida observada en o sobre las plantas o partes de las plantas que se van a cribar con la decoloración que se observa sobre o en la planta o parte de la planta de control, para identificar plantas o partes de plantas que no muestren decoloración o que muestren una decoloración reducida en comparación con la planta o parte de la planta de control.
[0020] Este método se puede utilizar para cualquier planta susceptible de presentar decoloración, pero es especialmente útil para productos, en particular verduras o frutas, o para flores. El método es adecuado, entre otros, para verduras de hoja, tales como lechuga; para tubérculos, como patata o boniato; para raíces, tales como apionabo; para brotes, tales como endibia; o para setas. El método puede utilizarse además en frutas tales como manzana, plátano, aguacate, melocotón, pera, albaricoque, mango y berenjena, así como en flores o tallos florales, tales como tallos de gerbera, flores de crisantemo, bases de alcachofa, etc.
[0021] El método de cribado está diseñado para identificar plantas que tienen una decoloración superficial inducida por herida reducida en una o más de sus partes o tejidos. Por lo tanto, para el cribado, resulta muy práctico utilizar la parte o tejido propenso a la decoloración. En la lechuga, puede ser la hoja o una parte de la misma, tal como un fragmento obtenido con sacabocados; en el plátano, se pueden utilizar adecuadamente rodajas de la fruta pelada, y en flores, las rodajas del tallo son un vehículo de prueba muy práctico.
[0022] El método es útil en particular para seleccionar plantas pertenecientes a la familiaAsteraceae, en particular plantas del géneroLactucay, más concretamente, de la especieLactuca sativa, o plantas pertenecientes al géneroCichoriumy, en particular, de las especiesCichorium intybusyCichorium endivia, que muestran ausencia o reducción de la decoloración superficial inducida por herida.
[0023] La población vegetal que se puede cribar con el método puede ser cualquier población vegetal, pero preferiblemente es una población vegetal variable que tiene muchos miembros diferentes para aumentar las posibilidades de encontrar una planta que muestre una decoloración inducida por herida reducida. Tal población variable se puede generar por medio de un tratamiento mutagénico, por ejemplo, utilizando productos químicos y/o irradiación y, a continuación, se denomina en la presente memoria población vegetal mutante. Las poblaciones alternativas son las colecciones de germoplasma, que son colecciones de plantas que muestran variación natural. Además, se puede utilizar una población de plantas transgénicas.
[0024] El método se realiza adecuadamente con partes de plantas que presentan una superficie dañada. Muestras de prueba muy útiles son los discos que se perforan de una hoja, los denominados discos foliares. Alternativamente, se puede utilizar el tejido de la nervadura central de las verduras de hoja veteada. De manera adecuada, los discos se cortan a partir de tales nervaduras.
[0025] La incubación tiene lugar en un entorno acuoso. El método se puede poner en práctica muy bien con discos foliares incubados sobre o entre papel de filtro humedecido. La respuesta de decoloración es entonces claramente visible alrededor de los bordes de la herida en el papel. En el caso de plantas de los génerosLactucayCichorium, la decoloración se denomina enrojecimiento.
[0026] Alternativamente, el entorno acuoso comprende agua o una solución. En un aspecto específico que se ilustrará con más detalle a continuación, la solución contiene L-3,4-dihidroxifenilalanina. Este compuesto se convierte en la producción del pigmento de color negro melanina por la enzima polifenol oxidasa. Los compuestos alternativos que se pueden utilizar a este respecto se incluyen, pero sin limitación, ácido clorogénico, ácido isoclorogénico, L-tirosina y catecol.
[0027] La invención se refiere a una planta de lechuga mutante que tiene una modificación hereditaria inducida del genoma y que muestra una reducción de la respuesta de enrojecimiento y un hábito de crecimiento normal, en donde la modificación hereditaria, la reducción de la respuesta de enrojecimiento y el hábito de crecimiento normal son como los encontrados en una planta de lechuga, cuya semilla representativa se depositó en el NCIMB con el número de registro 41454 o 41441, en donde la planta de lechuga mutante se puede obtener cruzando dicha planta de depósito con otra planta de la misma especie.
[0028] La planta de la invención puede identificarse en el cribado y posteriormente seleccionarse por presentar una decoloración superficial inducida por herida reducida o ausente, pero posteriormente se ensaya para determinar si presenta un hábito normal. Más en particular, la planta preferiblemente no debería mostrar efectos pleiotrópicos negativos.
[0029] Según la invención, se identificaron y se seleccionaron plantas que no muestran decoloración superficial inducida por herida o la muestran significativamente reducida. La progenie de las semillas de estas plantas se depositó en el NCIMB y se les asignó el número de registro que se enumera en laTabla 1. Los detalles sobre la descendencia de las semillas de los depósitos se dan en el Ejemplo 4 y en el Ejemplo 6. Estos depósitos se realizan porque tienen la única característica específica de presentar una decoloración inducida por herida nula o significativamente reducida. No se han ensayado en cuanto a los criterios DUS para determinar el registro de variedades, es decir, distinguibilidad, uniformidad y estabilidad en todas las características de registro, y no se espera que cumplan estos criterios de ninguna manera.
[0030] Tabla 1
[0032]
[0034] La característica “decoloración superficial inducida por herida reducida o ausente” se puede incorporar en otras plantas que originalmente no presentan la característica. Para determinar si las plantas resultantes de tal cruce son realmente plantas de la invención, esto se puede comprobar sometiendo estas plantas al método de selección como se describe en la presente memoria. Preferiblemente, las plantas seleccionadas como plantas de la invención también se someten a ensayo para determinar su hábito de crecimiento normal.
[0035] La invención se refiere además a la progenie de una planta progenitora de la invención, cuya progenie tiene la modificación hereditaria inducida del genoma, la reducción de la respuesta de enrojecimiento y el hábito de crecimiento normal que se encuentra en la planta progenitora. Dicha progenie puede provenir de varias generaciones posteriores a la progenitora. Mientras se conserve la característica de “decoloración superficial inducida por herida reducida o ausente”, la planta se considera una planta de la invención.
[0036] La invención se refiere además a una parte de la planta de la invención, cuya parte se selecciona, en particular, de la hoja, cabeza, tallo, brote, raíz, tubérculo, fruto, flor, semilla o fragmentos de los mismos, y células. Las partes de las plantas, como las cabezas o las hojas de lechuga, suelen ser las partes que tienen una superficie cortada que puede someterse a decoloración.
[0037] Se pueden utilizar partes de plantas de la invención en cultivo tisular para regenerar plantas que conserven la modificación hereditaria del genoma, la reducción de la respuesta de enrojecimiento y el hábito de crecimiento normal, como se encuentra en la planta de la que se obtiene el tejido para el cultivo tisular. Dichas plantas regeneradas también forman parte de esta invención.
[0038] La invención se refiere además a la semilla de una planta de la invención, a partir de la cual se pueden cultivar plantas que presentan la modificación hereditaria inducida del genoma, la reducción de la respuesta de enrojecimiento y el hábito de crecimiento normal de la invención. Mediante el método de selección de la invención se puede comprobar si las semillas y, por lo tanto, las plantas que se cultivan a partir de las mismas han conservado esta característica. Además, en la presente memoria se describen semillas de generaciones posteriores que conservan la modificación hereditaria del genoma, la reducción de la respuesta de enrojecimiento y el hábito de crecimiento normal, como se encuentra en las semillas originales.
[0039] La invención es muy interesante desde el punto de vista comercial para el mercado de verduras procesadas. Como se ha explicado anteriormente, la decoloración de los productos agrícolas, en particular las frutas y verduras frescas, se considera no deseable, ya que el consumidor rechaza el producto decolorado. Por lo tanto, la característica “decoloración superficial inducida por herida reducida o ausente” de la invención se encuentra adecuada en productos vegetales procesados, como lechuga cortada, escarola o endibia, o combinaciones de las mismas. Cuando se criban utilizando el método de la invención, las verduras procesadas de la invención muestran una decoloración foliar inducida por herida nula o limitada. Todas las verduras procesadas, en particular la lechuga, escarola y endibia procesadas, que cumplen con el cribado, forman parte de la invención, ya que se ha demostrado que presentan una modificación que conduce a una reducción del flujo metabólico dependiente de PAL y/o PPO.
[0040] Descripción detallada de la invención
[0041] Cuando la lechuga se cosecha y se procesa mediante corte, se generan muchas superficies heridas en las hojas, lo que provoca una respuesta significativa de la planta o partes de la planta, que se manifiesta por una decoloración de color pardo o rosa en la superficie de la herida o adyacente a la misma. También se puede observar enrojecimiento en zonas alejadas de la superficie de la herida, en la nervadura central de la hoja, así como en el cogollo. En ocasiones, el enrojecimiento también se observa en etapas inmediatamente anteriores a la cosecha, lo que se considera debido al estrés abiótico o a la sobremaduración del cultivo.
[0042] Las diferentes formas de decoloración se efectúan mediante la actividad enzimática, que aumenta considerablemente como consecuencia de las lesiones y que genera varias formas de polifenoles y productos de reacción derivados de los mismos.
[0043] Una actividad enzimática importante implicada en la reacción de pardeamiento es la PPO. La actividad de la PPO en relación con el pardeamiento enzimático no se limita a la lechuga, sino que se ha descrito que muchas otras especies de plantas están involucradas en el deterioro poscosecha, como la manzana, el plátano y la patata. De hecho, la PPO es ampliamente reconocida como una de las enzimas más importantes implicadas en el deterioro poscosecha de muchas frutas y verduras frescas procesadas.
[0044] Por esta razón, la PPO ha sido el objetivo de muchas tecnologías, que tienen como objetivo la reducción o prevención de su actividad con el fin de aumentar la calidad poscosecha de los productos alimenticios. La PPO cataliza una reacción en la que los polifenoles presentes en el tejido vegetal se oxidan para dar lugar a la formación de o-quinonas. Posteriormente, las reacciones enzimáticas y no enzimáticas conducen a la formación de pigmentos marrones o negros.
[0045] En muchas especies de plantas, la PPO está codificada por una pequeña familia de genes cuyos miembros individuales pueden tener diferentes patrones de expresión temporal y espacial indicativos de divergencia funcional. Por ejemplo, se ha demostrado que la lechuga contiene diferentes isoformas de PPO en el tejido fotosintético y vascular de la hoja.
[0046] El sustrato natural de la PPO puede diferir entre las diferentes especies. En la lechuga, los derivados del ácido cafeico, como el ácido clorogénico y el isoclorogénico, actúan principalmente como sustrato de la PPO.
[0047] El nivel de la enzima PPO no se induce específicamente tras la lesión de los tejidos vegetales, sino que reside inactivamente en el cloroplasto. Tras la lesión, la PPO se activa, lo cual se manifiesta debido a que el sustrato fenólico que reside en las vacuolas entra en contacto con la PPO debido a la disrupción tisular.
[0048] En la lechuga, la producción de polifenoles, que son el sustrato de la PPO, se induce tras la lesión. Por lo tanto, el potencial de pardeamiento del tejido de la lechuga no parece estar limitado por la cantidad de PPO en el tejido foliar, sino por la velocidad de biosíntesis de polifenoles tras la lesión.
[0049] A este respecto, la situación puede diferir de un cultivo a otro. Por ejemplo, en la manzana, la cantidad de polifenoles es suficiente para generar una respuesta de pardeamiento en los frutos en el plazo de una hora tras la lesión, mientras que en la lechuga, la reacción de pardeamiento puede tardar varios días debido al hecho de que, en la lechuga, el conjunto de polifenoles debe sintetizarse en gran partede novotras la lesión.
[0050] La síntesis de polifenoles se produce a través de una vía bioquímica bien caracterizada denominada vía fenilpropanoide. La primera etapa comprometida de esta vía está catalizada por la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL, Hahlbrock, K y Scheel, D (1989) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40, 347-369). La PAL convierte el aminoácido fenilalanina, sintetizado a través de la vía del shikimato, en ácido cinámico.
[0051] En la lechuga, la lesión de las hojas conduce a una fuerte inducción de la expresión génica de y la actividad de PAL. La formación de polifenoles se correlaciona con esta actividad enzimática, lo que sugiere que la actividad de PAL inducida por la lesión de la lechuga es un factor importante responsable del pardeamiento (Campos, R. y col. (2004) Physiologica Plantarum 121, 429-438 y referencias en el mismo). Sin embargo, actualmente no está claro qué otros factores determinan el resultado final de la reacción de decoloración inducida por herida. Por ejemplo, se ha sugerido que la actividad de las peroxidasas (POD) también es importante para establecer el nivel final de decoloración (Fukumoto, L.R. y col. (2002) J. Agric. Food Chem. 540, 4503-4511; Martin-Diana A. y col. (2005) Biosci. Biotechnol. Biochem.69, 1677-1685).
[0052] Dado que la actividad enzimática depende de la disponibilidad de peróxido ácido interno, la contribución de la POD a la decoloración puede ser limitada.
[0053] Además, resulta evidente que la planta percibe de alguna manera la lesión y posteriormente se genera una señal a través de una cascada, que actualmente está poco definida para la lechuga. Parece obvio que estas actividades se dirigirán principalmente a la cicatrización de heridas y a la defensa contra los patógenos. Por lo tanto, es probable que muchos factores genéticos estén implicados en el aumento de la respuesta de decoloración del tejido de lechuga dañado y cada uno de ellos es un objetivo potencial para la modificación genética para reducir o eliminar la decoloración inducida por herida.
[0054] La mayoría de estos factores genéticos son actualmente desconocidos y, en el caso de aquellos que se sabe que están implicados, no está claro hasta qué punto estos factores desempeñan un papel específico en la reacción de decoloración o tal vez tienen una función más general en relación con la fisiología de la herida de la planta.
[0055] Por ejemplo, aunque se considera que la actividad de PAL inducida por herida determina el nivel de pardeamiento de la lechuga, se sabe que los productos de la vía fenilpropanoide también están involucrados, entre otros, en la biosíntesis de la pared celular o la respuesta de defensa. Por lo tanto, reducir la actividad de PAL inducida por herida para reducir el potencial de pardeamiento puede comprometer otras funciones además del pardeamiento inducido por herida, lo que puede ser menos deseable en relación con otros aspectos del cultivo de lechuga.
[0056] Asimismo, se ha implicado que la actividad de PPO participa en la respuesta de defensa y, por lo tanto, reducir el potencial de pardeamiento al reducir los niveles de PPO puede aumentar la susceptibilidad a los patógenos (Thipyapong, P. y col. (2004) Planta 220, 105-117). Por lo tanto, los inventores razonaron que un enfoque más imparcial podría tener más éxito a este respecto. Dicho enfoque comprende las siguientes etapas:
[0057] 1. Generación de una población variante de plantas, en particular una población mutante. Dicha población mutante se puede generar mediante el tratamiento de semillas o tejidos vegetales con agentes mutagénicos como metanosulfonato de etilo (ems) o rayos X
[0058] 2. El establecimiento de un cribado fenotípico eficiente en el que la selección se basa en una decoloración inducida por la respuesta a la herida en la planta, en particular en una verdura de hoja, más en particular lechuga, escarola o endibia, que se canaliza a través de la PAL y/o la PPO.
[0059] 3. Caracterización de los mutantes modificados en su respuesta a la herida con respecto al potencial de decoloración poscosecha y la ausencia de efectos pleiotrópicos de la modificación, que comprometen el crecimiento y procesamiento de la planta, en particular una verdura de hoja, más en particular lechuga, escarola o endibia, según la práctica común.
[0060] Por lo tanto, en la presente memoria se describe un método de selección para identificar, seleccionar y obtener una planta que muestra una reducción de la decoloración inducida por herida y los trastornos del procesamiento poscosecha, tales como el pardeamiento enzimático o el enrojecimiento.
[0061] En la presente memoria también se describe un método más selectivo que utiliza un sustrato que se convierte en un pigmento mediante la PPO. En este ensayo, el cribado es específicamente para los mutantes de PPO. Un sustrato adecuado es la L-DOPA, que se convierte en el pigmento negro melanina.
[0062] El método se ilustra en la presente memoria con referencia a verduras de hoja, como la lechuga, pero también puede ponerse en práctica de la misma manera con otras plantas, como se ha indicado anteriormente.
[0063] Una población de plantas mutantes para su uso en el método puede prepararse, por ejemplo, de la siguiente manera: a) tratar semillas M0 de una especie de planta a modificar con un agente mutagénico para obtener semillas M1; b) cultivar plantas a partir de las semillas M1 así obtenidas para obtener plantas M1;
[0064] c) opcionalmente repetir la etapa b) y c) n veces para obtener semillas M1+n;
[0065] d) germinar las semillas M1+n obtenidas de este modo y cultivar las plantas a partir estas semillas.
[0066] Estas plantas se ensayan posteriormente para determinar su respuesta de decoloración inducida por herida. Se seleccionan las plantas que no muestran o muestran una respuesta de decoloración reducida a las lesiones. A continuación, se cultiva la progenie de las plantas seleccionadas y se mide la respuesta de decoloración inducida por herida.
[0067] Para crear la variabilidad genética se puede utilizar mutagénesis. El experto en la técnica conoce varios tratamientos químicos o físicos que se pueden utilizar para inducir mutaciones genéticas en especies de plantas como la lechuga. Por ejemplo, se pueden tratar las semillas de lechuga en una solución que contenga diferentes concentraciones de un mutágeno como ems. El ems principalmente alquila residuos G de una cadena de ADN que durante la replicación del ADN provoca el emparejamiento con T en lugar de C. Por lo tanto, los pares de bases GC cambian a pares de bases AT con una frecuencia determinada que se determina por la dosis eficaz de ems y la actividad del sistema de reparación de errores de emparejamiento de la planta.
[0068] La dosis eficaz de ems depende de la concentración utilizada, el tamaño de la semilla y otras propiedades físicas y el tiempo de incubación de las semillas en la solución de ems. Las semillas, que se han tratado con ems se denominan típicamente semillas M1. Como consecuencia del tratamiento, los tejidos de las semillas M1 contienen mutaciones puntuales aleatorias en los genomas de sus células y las presentes en la subpoblación de células que formarán el tejido de la estirpe germinal (células germinales) se transferirán a la siguiente generación que se denomina M2. Las mutaciones o combinaciones de estas que sean haplo-insuficientes, provocando por lo tanto la esterilidad, o induciendo la letalidad del embrión, no se transferirán a la generación M2.
[0069] Un procedimiento similar al descrito anteriormente para el uso de ems se aplica también a otros agentes mutágenos. Los agentes mutagénicos adecuados son bien conocidos en la técnica. Son útiles en particular los agentes mutagénicos alquilantes, tales como sulfato de dietilo (des), etilenimina (ei), propanosultona, N-metil-N-nitrosouretano (mnu), N-nitroso-N-metilurea (NMU), N-etil-N-nitrosourea (enu) y azida de sodio.
[0070] Alternativamente, las mutaciones se inducen por medio de irradiación, que se selecciona, por ejemplo, de irradiación de rayos X, neutrones rápidos o UV.
[0071] Las mutaciones también se pueden inducir por medio de ingeniería genética, tal como mediante el uso de oligonucleótidos quiméricos, recombinación homóloga, direccionamiento génico, introducción de genes diana modificados que compiten con el producto endógeno, regulación a la baja a través de interferencia de ARN, etc. La población M2 de un tratamiento de mutagénesis se puede utilizar en procedimientos de cribado dirigidos a la respuesta a heridas, que se canaliza a través de PAL y PPO. Resulta obvio para el experto en la técnica que cualquier población de plantas que lleve variación genética puede tomarse como material de partida para dicho cribado fenotípico.
[0072] Preferiblemente, el método también se refiere a la piramidación de alelos que provoca una respuesta reducida de decoloración inducida por herida.
[0073] La producción de semillas M1 y M1+n se efectúa adecuadamente por medio de autopolinización.
[0074] En la presente memoria se describe además la obtención de plantas o partes de plantas con genotipos alterados, cuyas plantas o partes de plantas muestran una menor susceptibilidad a trastornos fisiológicos de procesamiento poscosecha, tales como pardeamiento enzimático o enrojecimiento.
[0075] La invención se refiere a plantas o partes de plantas que tienen en su genoma información genética que es responsable de la menor susceptibilidad a trastornos de procesamiento poscosecha, tales como pardeamiento enzimático o enrojecimiento, y se encuentra en el genoma de una planta de lechuga.
[0076] La progenie de las plantas reivindicadas también forma parte de esta invención. Como se utiliza en la presente memoria, “progenie” pretende abarcar todas las plantas que tienen la misma o similar susceptibilidad reducida a los trastornos de procesamiento poscosecha, en particular el pardeamiento enzimático o enrojecimiento, que las plantas originales descritas en la presente memoria y que se obtienen de las mismas de cualquier manera, tal como por reproducción sexual, como autofecundación o fecundación cruzada con otra planta del mismo género, o reproducción vegetativa, tal como esquejes, cultivo tisular, cultivo de haploides, cultivo de protoplastos, fusión de protoplastos u otras técnicas. Dicha progenie no es sólo la primera generación de plantas obtenidas mediante una o más de estas técnicas, sino también cada generación posterior de plantas obtenidas mediante una o más de estas técnicas, siempre que las plantas obtenidas tengan la susceptibilidad reducida.
[0077] Para realizar el cribado fenotípico, se debe generar una superficie de herida, ya que la reacción de decoloración enzimática se induce tras la lesión. La lesión es la alteración irreversible de la estructura natural de la planta, tejido y/o célula por métodos como corte, perforación, rebanado, abrasión, aplastamiento, rotura, pelado, trituración, prensado, desbrozado, molienda, inyección de fluidos, choque osmótico, desprendimiento, siega, fragmentación, frotamiento y desgarro.
[0078] Posteriormente, debe manifestarse una característica fenotípica que sea diagnóstica de la vía que conduce a la decoloración del tejido y que se pueda utilizar de manera muy eficiente en un cribado de la población mutante. Curiosamente, se encontró que dichas características fenotípicas se pueden obtener tomando partes de las hojas de plantas de lechuga e incubándolas en condiciones muy específicas que favorezcan la aparición de diferentes formas de decoloración superficial de la herida. Posteriormente, dichos ensayos se pueden aplicar a un gran número de plantas mutantes para seleccionar aquellas que muestren una reducción de la respuesta de decoloración inducida por herida.
[0079] Un aspecto de este método se basa en el sorprendente hallazgo de que, al tomar discos de las hojas, en particular de lechuga, e incubarlos entre papeles de filtro humedecidos a 5 °C, después de aproximadamente 4 días se observa la formación de un tinte de color rosa en los bordes de los discos foliares. El papel de filtro adecuado es el papel de filtro tipo 1450 CV, n.º de referencia 10313281 de Schleier y Schuell, Microscience GmbH, Dassel, Alemania. Tras una incubación adicional, la señal se intensifica y, después de aproximadamente una semana, se alcanza la intensidad máxima. La formación del tinte de color rosa se produce específicamente en las superficies de las heridas.
[0080] La decoloración se puede medir mediante la puntuación en una escala visual de 0, que significa ausencia de pardeamiento o enrojecimiento, a 10, que significa pardeamiento o enrojecimiento similar al de una variedad estándar de lechuga (L. sativa). En el presente ejemplo, se utiliza la variedad deL. sativa“Troubadour” como estándar para 10. Si se desea, se pueden utilizar imágenes para la comparación y para puntuar las clases intermedias entre 0 y 10. Además, se pueden tomar imágenes digitales del papel de filtro con el tinte de color rosa, seguido del recuento del número de píxeles con un color rosa intenso según la posición del disco foliar. utilizando una de estas mediciones, se pueden realizar análisis estadísticos sencillos, como la prueba de la t, bien conocida por los expertos en la técnica, para establecer si una planta o un grupo de plantas presenta un enrojecimiento significativamente menor que el estándar, como la cv. “Troubadour”. El nivel de significación aplicado de una prueba unilateral es 0,001.
[0081] En el caso de los mutantes, la comparación estadística se puede realizar entre las puntuaciones de la variedad original, que es el mejor estándar disponible, y las puntuaciones de enrojecimiento de los mutantes individuales y/o de su descendencia.
[0082] Para encontrar el rasgo de la invención en plantas existentes, se pueden utilizar muestras representativas de variedades, estirpes de mejoramiento y/o accesiones a bancos de genes. A continuación, la comparación estadística puede realizarse entre las puntuaciones de enrojecimiento del acceso individual en investigación y el resto de la población. Cuando se somete a ensayo estadístico a individuos para determinar significativamente menos enrojecimiento, pueden ser necesarias pruebas de comparación múltiple para mantener niveles de significación globales adecuados, por ejemplo, la prueba de comparación múltiple de Dunnett con un estándar (Dunnett CW, J. Amer. Statist. Assoc.50: 1096-1121 (1955)).
[0083] Además, se mostró que la respuesta de decoloración inducida por herida se puede obtener utilizando muchos tipos diferentes de tejido de hojas en diferentes etapas de desarrollo. Por ejemplo, el tejido de la nervadura central también se puede inducir para dar mostrar esta respuesta tras una lesión. Cuando se aplicó a diferentes tipos de lechugas, tales como mantecosa, iceberg, romana, batavia u hoja de roble, no se encontraron accesos individuales que mostraran significativamente menos enrojecimiento que el resto de la población investigada.
[0084] Se demostró además que un inhibidor específico de la PPO, la L-cisteína, cuando se aplicó durante la reacción, suprimió considerablemente la formación del tinte de color rosa. Además, se encontró que la formación del tinte de color rosa se inhibió por el cinamaldehído, que es un inhibidor de la actividad de PAL y del pardeamiento de la lechuga recién cortada (Fujita, N. y col. (2006) Biosci. Biotechnol. Biochem. 70, 672-676). Estos hallazgos muestran que la respuesta de decoloración rosada de la lechuga depende de la PAL y la PPO.
[0085] Se sabe que el pardeamiento enzimático de la lechuga recién cortada se previene de forma muy eficaz mediante la aplicación de un breve choque térmico. El efecto observado se puede explicar asumiendo que la biosíntesis de proteínas se desvía de la vía fenilpropanoide hacia las proteínas de choque térmico, reduciendo así el flujo metabólico hacia la formación de polifenoles.
[0086] Alternativamente, el efecto puede explicarse asumiendo que las enzimas implicadas en la oxidación de polifenoles, tal como la PPO y la POD, se inactivan mediante el tratamiento de choque térmico. Cuando se aplicó el choque térmico a la lechuga, que posteriormente se ensayó para determinar la respuesta de enrojecimiento, se demostró que esta respuesta, al igual que el pardeamiento enzimático, se inhibió eficazmente. Esto demuestra que la respuesta de enrojecimiento de la lechuga es fisiológicamente muy similar a la respuesta de pardeamiento enzimático conocida. Este hallazgo se confirmó además mediante la aplicación de L-cisteína como agente reductor. Además de ser un inhibidor de la PPO, se sabe que la L-cisteína reacciona con o-quinonas de color y las convierte de nuevo en difenoles incoloros en una reacción de reducción química. Cuando el tinte de color rosa formado por los discos foliares de lechuga se trata con L-cisteína, se demostró que el compuesto de color rosa se convirtió en un compuesto incoloro. Por lo tanto, parece probable que el tinte de color rosa sea una o-quinona formada por la PPO.
[0087] Esto se corroboró por el hallazgo de que los agentes reductores como el ácido ascórbico o el glutatión también convierten el tinte de color rosa en un compuesto incoloro.
[0088] Además, cuando las plantas, que se toman del campo, que muestran enrojecimiento, se tratan con L-cisteína, la decoloración rosada también se elimina. Esto demuestra que la respuesta de enrojecimiento del disco foliar representa el fenómeno natural de enrojecimiento, que a veces se observa en plantas que crecen en condiciones de campo. En la presente memoria se describe el siguiente experimento. Las partes de una hoja de lechuga de una cabeza se producen mediante corte y se incuban a 16 °C al aire. Como respuesta, la superficie de la herida se vuelve de color pardo después de aproximadamente 4 días. Especialmente en la superficie de la herida del nervio principal, se puede observar claramente el pardeamiento. Además, la reacción de pardeamiento también se puede observar en toda la planta al dañar las hojas por corte o abrasión.
[0089] Todas estas reacciones de pardeamiento se pueden inhibir completamente con L-cisteína, un inhibidor de la PPO, que demuestra que estos fenotipos se manifiestan a través de la actividad de PPO y, por lo tanto, se pueden considerar diagnósticos del pardeamiento poscosecha observado durante el procesamiento y envasado de la lechuga.
[0090] Estas reacciones de pardeamiento inducidas por herida se pueden generar de manera eficiente y aprovecharse en un procedimiento de cribado fenotípico para identificar plantas mutantes con un potencial de pardeamiento inducido por herida reducido.
[0091] Un aspecto adicional de este método se basa en la decoloración de las superficies de las heridas de los tejidos de lechuga, inducida mediante la aplicación de sustratos que las enzimas oxidantes del fenol pueden convertir en compuestos de color.
[0092] Por ejemplo, cuando se incuban discos foliares de lechuga con el sustrato de PPO, L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), se observa una decoloración de color pardo oscuro a negro en la superficie de la herida, lo que es la manifestación de la formación de melanina a través de la PPO. Cuando se aplicó simultáneamente L-cisteína, la decoloración de color negro se inhibió completamente, lo que confirma la hipótesis de que esta decoloración está mediada por la PPO.
[0093] Aunque la L-DOPA no se considera un sustrato natural para la PPO de la lechuga, puede ser útil en ensayos con el objetivo de identificar mutantes, que muestran una reducción de la decoloración inducida por herida.
[0094] De manera similar a lo descrito para la L-DOPA, se pueden aplicar otros sustratos para aumentar la respuesta de decoloración. Estos incluyen, pero sin limitación, ácido clorogénico, ácido isoclorogénico, L-tirosina y catecol.
[0095] En conjunto, la formación de los diferentes tintes en las superficies de las heridas generadas en las plantas monitoriza las modificaciones en una vía que comienza con la inducción de una señal de herida, canalizada a través de PAL y PPO, y que conduce a la decoloración. Como se ha descrito, estas reacciones de decoloración inducidas por herida se pueden evaluar fácilmente mediante inspección visual, lo que permite un procedimiento de cribado de mutantes muy eficiente. La lógica subyacente del método se ilustra en lafigura 1.
[0096] Por lo tanto, se encontró que la vía de decoloración inducida por herida en discos foliaresin vitrose superpone en gran medida con la decoloración inducida por herida en la lechuga procesada a escala industrial y, por lo tanto, se puede considerar diagnóstica para este proceso. Esto se corrobora con la idea de que los inhibidores de PAL o PPO inhiben el pardeamiento enzimático de la lechuga procesada y envasada en condiciones industriales prácticas. Es importante destacar que, como el procedimiento comprende la etapa de inducción, es decir, la lesión, y una de las conversiones metabólicas finales mediadas por PPO, el procedimiento permite capturar todos los factores genéticos implicados directa o indirectamente en este proceso fisiológico. Además, dado que esta respuesta se puede generar utilizando una amplia gama de tejidos foliares de hojas en diferentes etapas de desarrollo, el cribado de mutantes se puede dirigir a estas diferentes etapas o tejidos cuando se considere relevante.
[0097] Las plantas mutantes, que se han identificado como modificadas con respecto al proceso fisiológico que conduce desde la lesión hasta una decoloración dependiente de PAL y PPO, según uno o más de los ensayos fenotípicos descritos anteriormente, pueden caracterizarse con mayor detalle. Dicha caracterización se puede realizar a diferentes niveles, por ejemplo, a nivel molecular, bioquímico, fisiológico y fenotípico.
[0098] Resulta obvio para los expertos en la técnica que se pueden observar niveles variables de decoloración que pueden reflejar la presencia de diferentes loci mutantes o diferentes formas alélicas de loci idénticos que afectan al rasgo de decoloración en la población original.
[0099] En el caso de mutaciones recesivas, estas dos posibilidades se pueden distinguir fácilmente mediante pruebas de alelismo, que comprenden el cruce de las dos plantas mutantes y la determinación del fenotipo del híbrido. En caso de alelismo de las mutaciones, el rasgo de decoloración reducida resultará evidente en la F1, mientras que en caso de que el fenotipo en los mutantes esté determinado por diferentes loci recesivos, este no será el caso.
[0100] Como se aplicó mutagénesis aleatoria para generar la población inicial, las mutaciones en el acervo génico también pueden contribuir a la variación del fenotipo en las condiciones experimentales. Para discriminar entre mutaciones individuales de diferentes resistencias y un efecto combinado de las mutaciones en el acervo génico, deben realizarse retrocruces para crear acervos génicos uniformes para los diferentes eventos de decoloración reducida.
[0101] Tal procedimiento es más relevante para determinar si las mutaciones en loci específicos implicados en la decoloración inducida por herida muestran efectos pleiotrópicos.
[0102] Por lo tanto, las plantas M2 seleccionadas sobre la base de una respuesta de decoloración reducida se utilizan para cultivar semillas M3. Posteriormente, las estirpes endogámicas que descienden de los eventos de decoloración reducida se vuelven a evaluar para determinar su respuesta a lesiones reducida. Además, la reducción del pardeamiento o del enrojecimiento se puede evaluar en diferentes acervos genéticos y en diferentes condiciones de cultivo y procesamiento de cultivos.
[0103] Se pueden realizar estudios bioquímicos para abordar cuestiones relacionadas con las vías afectadas por la modificación genética. Se pueden realizar estudios moleculares para determinar si se han modificado genes candidatos presuntamente implicados en la respuesta de pardeamiento enzimático o de enrojecimiento, como los genes que codifican PAL, PPO o peroxidasas. Posteriormente, se realizará un análisis genético para demostrar si la modificación encontrada en un gen candidato es causal con respecto al fenotipo alterado.
[0104] Si bien la mutagénesis inducida es el método preferido a utilizar en la presente invención, los expertos en la técnica conocen la existencia de tecnología que permite modificar dianas génicas que residen en el genoma de una planta de manera específica. Por ejemplo, se ha demostrado que los oligonucleótidos quiméricos son mutágenos eficaces con un modo de acción específico.
[0105] Otro enfoque consiste en modificar dianas génicas mediante recombinación homóloga o direccionamiento de genes. Mediante este enfoque, se intercambia un fragmento de un gen por un fragmento de ADN introducido que contiene una modificación deseada. También son factibles los enfoques transgénicos en los que se introducen genes diana modificados que compiten con el producto endógeno. Esto puede provocar efectos negativos dominantes. Además, la regulación negativa específica de la expresión de genes es posible mediante la interferencia de ARN.
[0106] En caso de los oligonucleótidos mutagénicos, se utilizan enfoques de direccionamiento génico o transgénicos para modificar un factor genético implicado en la respuesta de decoloración inducida por herida, y obviamente se debe conocer la estructura primaria de los genes relevantes.
[0107] Los mutantes de lechuga y la progenie procedente de los mismos de la invención pueden identificarse basándose en la decoloración rosada inducida por herida en los discos foliares de lechuga. La aplicación de este ensayo de enrojecimiento a plantas de una población M2 que contienen mutaciones aleatorias inducidas por ems dio como resultado la identificación de varios mutantes que mostraron una reducción significativa de la respuesta de enrojecimiento en comparación con las plantas de control, que no contienen las mutaciones inducidas por ems. La mayoría de estos mutantes mostraron un fenotipo de enanismo y a menudo clorótico. Sin embargo, se encontró sorprendentemente que algunos mutantes con una respuesta de enrojecimiento reducida mostraron un hábito de crecimiento normal, es decir, un tamaño, forma, crecimiento y color muy similares a los de las plantas control.
[0108] Cuando las plantas de la progenie de este mutante en particular, cultivadas a partir de semillas obtenidas mediante autofecundación, se ensayan para determinar el enrojecimiento, se observa una reducción similar a la encontrada en el mutante identificado originalmente. Esto demuestra que una respuesta de decoloración rosada reducida puede ser hereditaria y estar causada por una modificación del genoma.
[0109] Un hallazgo sorprendente adicional fue que, cuando las plantas de la progenie se cultivan hasta la madurez y se ensaya el pardeamiento enzimático del tejido dañado de la nervadura central, esta respuesta también se inhibe considerablemente.
[0110] Esto demuestra que el ensayo de enrojecimiento del disco foliar está causalmente relacionado con el pardeamiento enzimático en la lechuga y que el ensayo de enrojecimiento se puede utilizar para predecir el nivel de pardeamiento enzimático de una planta de lechuga madura.
[0111] Por lo tanto, el ensayo de enrojecimiento del disco foliar se puede utilizar como herramienta de selección para identificar plantas de lechuga con un potencial de pardeamiento enzimático reducido. Dicha herramienta se puede utilizar para identificar plantas de lechuga con un potencial de pardeamiento enzimático reducido en cualquier tipo de población vegetal, independientemente de la causa de la variación genética, que reside en tal población. Por ejemplo, además de las poblaciones de ems, se pueden utilizar accesos naturales o poblaciones de fitomejoramiento.
[0112] Uno o más de los métodos de selección descritos en la presente memoria se pueden aplicar a cualquier especie de verdura de hoja cuya calidad de procesamiento poscosecha requiera mejoras. Por lo tanto, este método, además de a la lechuga cultivada, también se puede aplicar a otras especies de plantas pertenecientes a la familiaAsteraceae, tales como las especies silvestres del géneroLactuca. Además, el método se puede aplicar, en particular, a especies de plantas pertenecientes al género de plantasCichorium, al que pertenecen especies como la escarola (Cichorium endivia), la achicoria y la achicoria común (Cichorium intybus).
[0113] La presente invención describe una característica fenotípica que se puede detectar en una planta realizando uno de los métodos de selección que se describen en la presente memoria. Las plantas de la invención son aquellas que, en comparación con una planta de control, muestran la ausencia o reducción de la decoloración superficial inducida por herida. La presencia de la característica se determina por medio de una o más de tres pruebas de decoloración, concretamente, la aparición de enrojecimiento o pardeamiento, o la capacidad de convertir el sustrato L-DOPA en melanina. Una planta de la invención es una planta que, en al menos una de estas pruebas, muestra una decoloración que al menos se reduce en comparación con un control.
[0114] Como se utiliza en la presente memoria, el “control” se refiere a cualquier planta de la que se sabe que muestra una o más de las reacciones de decoloración: enrojecimiento, pardeamiento y conversión de L-DOPA en melanina, cuyas reacciones se pueden inhibir con L-cisteína o cinamaldehído. Se utiliza una planta cuyo disco foliar, cuando se incuba entre papel de filtro humedecido a 5 °C durante 7 días, muestra una decoloración rosada alrededor de los bordes del disco.
[0115] La presente invención se ilustrará adicionalmente en los ejemplos que siguen y que no pretenden limitar la invención de ninguna manera. En los ejemplos se hace referencia a las siguientes figuras.
[0116] Figura 1:Esquema de la justificación detrás del diseño del procedimiento de cribado de mutantes en poblaciones de lechuga para la decoloración enzimática poscosecha reducida. La señal de entrada del cribado es la lesión del tejido foliar, que la planta detecta y genera una respuesta de señalización divergente que provoca diversos procesos fisiológicos, incluyendo la senescencia, la respiración y la decoloración tisular. Esta señal de entrada se puede combinar con la aplicación de compuestos fenólicos como sustratos de PPO.
[0117] La señal de salida del cribado es una decoloración de color pardo o rosada, según las condiciones aplicadas, de la superficie de la herida, diagnóstica del pardeamiento y enrojecimiento poscosecha. Esto se deduce del hecho de que la señal de salida está completamente inhibida por cinamaldehído y L-cisteína, que son inhibidores específicos de PAL y PPO, respectivamente.
[0118] Figura 2:Imagen representativa del fenotipo de salida del cribado basado en la decoloración rosada de los discos foliares. Los discos foliares de plantas de lechuga (1 disco por planta) se colocan entre papeles de filtro humedecidos y se incuban a 5 °C durante 7 días. Se puede observar claramente una decoloración rosada alrededor de cada disco foliar en la superficie de la herida.
[0119] Figura 3:Ensayo de enrojecimiento de discos foliares (4 discos por placa) realizado en presencia de diferentes concentraciones del inhibidor de PAL, el cinamaldehído. El número sobre cada placa muestra el % de cinamaldehído utilizado.
[0120] Figura 4:Efecto inhibidor del inhibidor de PPO, L-cisteína, sobre la decoloración rosada de discos foliares de lechuga (4 discos por placa) incubados entre papeles de filtro humedecidos. El número sobre cada placa indica el % de L-cisteína utilizado.
[0121] Figura 5:Efecto inhibidor del inhibidor de PPO, L-cisteína, sobre la decoloración de color negro de discos foliares de lechuga (4 discos por placa) incubados entre papeles de filtro humedecidos en presencia de L-DOPA 1,5 mM. El número sobre cada placa muestra la concentración en mM de L-cisteína utilizada.
[0122] Figura 6:Efecto del tratamiento previo de choque térmico sobre el enrojecimiento de discos foliares de lechuga. El choque térmico se aplicó durante 90 segundos sobre las hojas intactas a la temperatura indicada en cada plato.Figura 7:Conversión del tinte de color rosa formado por la respuesta a la herida de la lechuga a un compuesto incoloro mediante L-cisteína. La fila superior de las placas muestra el ensayo de L-DOPA, mientras que la fila inferior de las placas muestra el ensayo de enrojecimiento. El inferior de los dos discos en cada placa se trató con L-cisteína una vez se había completado la respuesta a la herida. La concentración de L-cisteína utilizada es de 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 y 10 mM, que se ha indicado anteriormente.
[0123] Figura 8:Reducción del enrojecimiento en lechuga cultivada en campo mediante L-cisteína. El panel superior muestra los síntomas típicos de enrojecimiento de una hoja de lechuga tomada de una planta sometida a un estrés extremo por encharcamiento. Los nervios principales muestran la presencia de un tinte rosado. El panel inferior derecho muestra un disco extraído de la hoja que muestra síntomas de enrojecimiento tras el tratamiento con L-cisteína 1 mM durante 30 minutos a temperatura ambiente. El panel inferior izquierdo muestra un disco foliar similar después del tratamiento con agua durante 30 minutos a temperatura ambiente.
[0124] Figura 9:Panel A: Análisis fenotípico de plantas M2 individuales de lechuga (agrupadas en grupos) para determinar la decoloración del disco foliar según el método descrito en la presente memoria. En este panel se muestra un total de 138 muestras de 12000, de las cuales la indicada con una flecha mostró una marcada reducción de la decoloración de enrojecimiento. Panel B: La repetición del ensayo del individuo seleccionado, indicado en el panel A, confirmó la casi ausencia de la decoloración rosada (muestra en la posición central), en comparación con las muestras de control, que muestran una clara respuesta de decoloración.
[0125] Figura 10:Fenotipos de plantas de lechuga M2. Las plantas marcadas como 1, 2, 4, 5, 7, 10 y 12 muestran una reducción de la decoloración rosada del disco foliar mediante el ensayo descrito en la presente memoria. Las plantas 3, 6, 8, 9 y 11 son plantas que mostraron un nivel de decoloración rosada del disco foliar comparable al del control de tipo natural. La planta 1 es el único ejemplo de mutante que muestra una marcada reducción de la decoloración rosada y un hábito de crecimiento normal. Las plantas 2, 4, 5, 7, 10 y 12 muestran una reducción de la decoloración rosada y un fenotipo de enanismo y descolorido.
[0126] Figura 11:Pruebas de progenie de un mutante de lechuga que muestra una decoloración reducida. A la izquierda, se muestran 25 muestras de control que muestran una respuesta de decoloración inducida por herida normal. A la derecha, se muestra un grupo de muestras tomadas de una serie de 35 plantas de la progenie procedentes de un único mutante, cuya respuesta de decoloración inducida por herida se ve gravemente reducida.
[0127] Figura 12:Imagen representativa del fenotipo de salida del cribado basado en la decoloración de color pardo de las partes de la nervadura central de las hojas tomadas de plantas de lechuga maduras. La imagen muestra discos de tejido de la nervadura central de la hoja exterior de lechuga tras una incubación de 3 días a 16 °C. La típica decoloración de color pardo se puede observar claramente en la superficie de la herida. Cada placa contiene 3 discos tomados en diferentes posiciones de la nervadura central (verde, verde claro y blanco). El número sobre la placa indica la concentración en mM de L-cisteína que se añadió al filtro.
[0128] Figura 13:Conversión de L-DOPA en la superficie de la hoja de lechuga a melanina. El panel A muestra el ensayo en una solución 1,5 mM de L-DOPA. El tubo superior es el control negativo, los otros 3 tubos son idénticos. El panel B muestra el resultado de la incubación de discos foliares entre papeles de filtro humedecidos que contienen L-DOPA 1,5 mM.
[0129] Figura 14:Pruebas de progenie de un mutante de lechuga que muestra una decoloración rosada inducida por herida reducida en el pardeamiento de la nervadura central. El panel A muestra los discos de la nervadura central de 8 plantas de progenie, numeradas del 1 al 8 (3 discos por planta), del mutante con enrojecimiento reducido. El panel B muestra los discos de la nervadura central de 8 plantas de control, numeradas del 9 al 16 (3 discos por planta), que muestran una respuesta de pardeamiento normal.
[0130] Figura 15:Evaluación de un mutante de lechuga que muestra una respuesta reducida de pardeamiento o decoloración rosada inducida por herida tras el corte y envasado en atmósfera ambiental. A la izquierda se muestran fragmentos de hojas de la cabeza de una planta de control y a la derecha fragmentos de hojas del mutante con decoloración reducida. El material foliar recién cortado se almacenó durante 6 días a 4 °C. La decoloración de color pardo se puede observar claramente en las muestras de control, mientras que las muestras mutantes permanecen inalteradas.Ejemplos
[0131] Ejemplo 1
[0132] Modificación genética de la lechuga utilizando ems
[0133] Se incubaron aproximadamente 2000 semillas de las variedades de lechugaTroubadour,Apache,YorvikyRodericken una solución aireada de ems al 0,05 % (p/v) o al 0,07 % (p/v) durante 24 horas a temperatura ambiente. Después del tratamiento con ems, las semillas M1 se aclararon con agua y se plantaron en un invernadero a 20 °C con un régimen de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad para hacer crecer las plantas maduras e inducir el espigado y la floración para producir semillas M2. Después de la maduración, las semillas M2 se cosecharon, se agruparon y se almacenaron hasta su uso posterior. La frecuencia de mutación se estimó sobre la base del número relativo de plantas individuales con un fenotipo descolorido que están alteradas en la biosíntesis de la clorofila.
[0134] Ejemplo 2
[0135] Desarrollo de un diagnóstico de cribado fenotípico para la decoloración inducida por herida de lechuga en función de la formación de pigmento de color rosa
[0136] Se desarrolló un ensayo fenotípico en el que se puede evaluar fácilmente la decoloración foliar de la lechuga inducida por lesiones. Este enfoque permite a las plantas jóvenes detectar la decoloración. Se tomaron discos foliares de 5 mm de diámetro de plantas jóvenes o maduras y se colocaron entre papeles de filtro humedecidos en una bandeja. El sistema se incubó a 5 °C durante 7 días. Durante la incubación, se desarrolló un tinte de color rosa en el sitio de la herida del disco foliar, que se hizo claramente visible como un círculo impreso en el papel de filtro(figura 2).
[0137] Para demostrar que la producción del tinte de color rosa requiere una vía fenilpropanoide activa, en este ensayo se ensayó el efecto de los inhibidores de PAL (cinamaldehído,figura 3) y PPO (L-cisteína,figura 4). Cuando se aplicó cinamaldehído durante el ensayo, la decoloración rosada se inhibió completamente a una concentración del 0,01 % o superior.
[0138] Se obtuvo un resultado similar utilizando L-cisteína a una concentración del 0,001 % o superior, mientras que otros aminoácidos como L-leucina o L-alanina no mostraron ningún efecto. Esto demuestra que la L-cisteína puede inhibir la respuesta de enrojecimiento de los discos foliares de lechuga y que el efecto inhibidor de la L-cisteína es específico.
[0139] Para demostrar que la L-cisteína actúa efectivamente como inhibidor de la actividad de PPO en este sistema, los discos foliares de lechuga se incubaron con el sustrato de PPO, L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). Aunque la L-DOPA no se considera un sustrato natural para la PPO de lechuga, se observó una decoloración de color pardo oscuro a negro en la superficie de la herida, que es la manifestación de la formación de melanina a través de la PPO. Cuando se aplicó simultáneamente una concentración de 1 mM o superior de L-cisteína, la decoloración se inhibió completamente, como se muestra en lafigura 5.
[0140] La respuesta de enrojecimiento de los discos foliares de lechuga se caracterizó además mediante la aplicación de un choque térmico antes de inducir la respuesta a la herida. Las hojas desprendidas se incubaron durante 90 segundos a 21, 40, 50 y 60 °C. Después de este tratamiento, se tomaron discos foliares y se ensayaron para determinar el enrojecimiento. La respuesta de enrojecimiento se inhibió completamente cuando el choque térmico se realizó a una temperatura de 50 °C o superior. Este resultado se muestra en lafigura 6.
[0141] Como se sabe que la L-cisteína reacciona con las o-quinonas, que son productos de la PPO, convirtiéndolas de nuevo en difenoles incoloros, se determinaron los efectos de la L-cisteína sobre el tinte de color rosa procedente de los discos foliares de lechuga. En paralelo, se determinó el efecto de la L-cisteína sobre la formación de melanina tras la incubación con L-DOPA.
[0142] Los discos foliares se extrajeron y se incubaron según los procedimientos descritos anteriormente. Tras completarse la respuesta a la herida, se añadió una serie de concentraciones de L-cisteína al disco foliar y se monitorizó el cambio de color. El resultado se muestra en lafigura 7. El experimento demostró claramente que la L-cisteína convertía el tinte de color rosa de nuevo en un compuesto incoloro, mientras que la melanina de color negro formada en el ensayo de L-DOPA no se vio afectada por la L-cisteína. Esto demuestra que es muy probable que el tinte de color rosa sea una o-quinona, formada por el sistema de oxidación de polifenoles de la lechuga.
[0143] Para demostrar que la respuestain vitroobservada refleja una respuesta que es fisiológicamente relevante, la decoloración a base de L-cisteína se aplicó al material vegetal cultivado en campo. Esto se realizó cosechando una hoja de una planta de lechuga cultivada en campo que mostraba síntomas graves de enrojecimiento a lo largo de los nervios. Esto se observa típicamente cuando las plantas han estado estresadas, por ejemplo, por condiciones de encharcamiento grave. La hoja se usó para preparar discos foliares que se incubaron inmediatamente con L-cisteína 1 mM. Después de aproximadamente 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, la decoloración rosada desapareció, como se muestra en lafigura 8.
[0144] En conjunto, estos datos experimentales muestran que los discos foliares de lechuga se pueden inducir mediante lesiones para producir una decoloración rosada dependiente de PAL y PPO. Este fenotipo permite un procedimiento de cribado eficiente y eficaz para mutantes de lechuga que tienen una decoloración inducida por la respuesta a la herida modificada, canalizada a través de PAL, PPO o ambas.
[0145] Ejemplo 3
[0146] Selección de mutantes con una decoloración inducida por herida reducida
[0147] Para identificar mutantes de lechuga con bajo potencial de enrojecimiento o pardeamiento enzimático inducido por herida, se aplicó el ensayo de disco foliar descrito en elEjemplo 2a plantas de una población mutante de lechuga. Se cultivaron 12000 plantas en un invernadero (ubicación: De Lier, Países Bajos; siembra: 28 de marzo; plantación: 18 de abril; cultivo en condiciones habituales del productor de lechuga), y de cada planta individual se tomó un disco foliar (muestreo a partir del 15 de mayo) y se incubó en grupos de (un promedio de) 25 muestras entre papeles de filtro humedecidos a 5 °C durante 7 días. Se asignó una puntuación visual a cada disco foliar en función de la intensidad de la decoloración rosada. Basándose en esta evaluación, se seleccionaron las plantas cuyos discos foliares no mostraban decoloración superficial de la herida o la presentaban en un grado relativamente bajo. La planta con rastros de decoloración apenas visibles se numeró como 06D.210202.
[0148] De las 12000 plantas, se seleccionó finalmente 1 planta que solo mostró rastros de decoloración que apenas eran visibles y 11 que mostraron un nivel de decoloración relativamente bajo. El resultado de uno de estos ensayos se muestra en lafigura 9.
[0149] El ensayo de decoloración se repitió para los 12 individuos seleccionados inicialmente y para la mayoría de los casos individuales se confirmó el resultado original. Solo los individuos confirmados fueron seleccionados para su posterior análisis y producción de semillas.
[0150] Ejemplo 4
[0151] Selección de mutantes con una decoloración inducida por herida reducida
[0152] Para identificar mutantes de lechuga con bajo potencial de pardeamiento enzimático inducido por herida, se aplicó el ensayo de disco foliar descrito en el Ejemplo 2 a plantas de una población mutante de lechuga. Se cultivaron 8500 plantas en invernadero hasta las 3 semanas de edad (etapa de 6-8 hojas) y de cada planta individual se tomó un disco foliar y se incubó entre papeles de filtro humedecidos a 5 °C durante 7 días.
[0153] Se asignó una puntuación visual a cada disco foliar en función de la intensidad de la decoloración rosada. Basándose en esta evaluación, se seleccionaron las plantas cuyos discos foliares no mostraban decoloración superficial de la herida o la presentaban en un grado relativamente bajo. De las 8500 plantas, se seleccionaron 8 plantas que no mostraron ninguna decoloración visible y 10 mostraron una decoloración relativamente baja. El ensayo de decoloración se repitió para las 18 personas que se seleccionaron inicialmente y, en la mayoría de los casos individuales, se confirmó el resultado original. En lafigura 10se muestran doce individuos. Solo los individuos confirmados fueron seleccionados para su posterior análisis y producción de semillas. Una planta mutante sin efectos secundarios pleiotrópicos (por ejemplo, blanqueamiento o enanismo) recibió el número 05D.202539. La semilla producida por autofecundación de esta planta recibió el número 05D.810596. La semilla producida por autofecundación de tres plantas cultivadas a partir de semillas de 05D.810596 recibió el número 07G.9979 y se depositó en el NCIMB. El número NCIMB es 41441 (depositado el 10 de octubre de 2006).
[0154] Ejemplo 5
[0155] Análisis fenotípico de los mutantes seleccionados que muestra una decoloración reducida inducida por herida De los 12 mutantes seleccionados del cribado presentado en elEjemplo 3, 6 mostraron un marcado fenotipo de crecimiento reducido y blanqueamiento. Otros mutantes se desarrollaron con normalidad, es decir, según el tipo de población inicial del experimento de mutagénesis.
[0156] Los mutantes con enanismo y descoloridos probablemente presentan una función cloroplástica alterada. Dado que la PPO reside en estos orgánulos celulares, esto podría explicar la respuesta relativamente baja en los ensayos de disco foliar. Como tales mutaciones pleiotrópicas no son deseables, se consideró que estos mutantes eran menos relevantes.
[0157] La planta mutante 06D.210202, que mostró la mayor reducción de la decoloración del disco foliar, mostró un fenotipo normal y, por lo tanto, la mutación se considera específica para la decoloración, sin fuertes efectos pleiotrópicos. Ejemplo 6
[0158] Confirmación de la casi ausencia del fenotipo de decoloración en la descendencia
[0159] Para demostrar que la reducción de la decoloración de mutantes de lechuga como la planta 06D.210202 de los Ejemplos 3 y 5 se debe a un efecto genético generado por el tratamiento de mutagénesis descrito en la presente memoria, se produjeron semillas por autofecundación. La semilla producida por autofecundación de la planta 06D.210202 recibió el número 06D.819784. Las semillas se germinaron en el suelo y las plantas se ensayaron para determinar la decoloración mediante el ensayo de enrojecimiento del disco foliar.
[0160] Este experimento demostró claramente que el fenotipo alterado tenía una base genética, ya que todas las plantas de la progenie mostraron un fenotipo similar, es decir, una marcada reducción de la decoloración rosada, al igual que el mutante que se usó para producir las semillas. Este resultado se ilustra en lafigura 11.
[0161] La semilla producida por autofecundación de tres plantas cultivadas a partir de semillas de 06D.819784 recibió el número 06D.863B2 y se depositó en el NCIMB. El número NCIMB es 41454 (depositado el 3 de enero de 2007). Ejemplo 7
[0162] Desarrollo de un diagnóstico de cribado fenotípico para la decoloración inducida por herida de lechuga en función de la formación de pigmento de color pardo
[0163] Se cultivaron plantas de lechuga hasta la madurez y se extrajeron partes de las hojas exteriores cortando discos del tejido de la nervadura. Los discos se incubaron en papel de filtro humedecido a 16 °C. Después de aproximadamente 72 horas, la superficie de la herida se volvió de color pardo. En presencia de L-cisteína 10 mM, la respuesta de pardeamiento se inhibió, lo que indica que la decoloración observada está mediada por PPO. En lafigura 12se muestra un resultado representativo de este experimento.
[0164] Dado que la respuesta mostrada en lafigura 12es una respuesta de pardeamiento mediada por PPO, el procedimiento de cribado descrito en este ejemplo puede considerarse eficaz e imparcial para cribar mutantes que muestran una reducción de la decoloración de color pardo que se produce durante el procesamiento de la lechuga. Ejemplo 8
[0165] Desarrollo de un diagnóstico de cribado fenotípico para la decoloración inducida por herida en lechuga, basándose en la conversión de L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) en un pigmento de color negro llamado melanina Además de los ensayos que abordan la decoloración inducida por herida en sentido amplio, el método como se describe en la presente memoria también permite el cribado de manera más específica de mutantes que tienen una reducción de la actividad de PPO. Se desarrolló un ensayo fenotípico indicativo de la actividad de PPO utilizando discos foliares que se incubaron en presencia de L-DOPA 1,5 mM. A medida que la decoloración de color negro se vuelve evidente, se puede concluir que la L-DOPA se puede convertir fácilmente mediante el sistema oxidante de polifenoles en la superficie de las heridas de las hojas de lechuga en un pigmento de color negro llamado melanina. La L-DOPA se convierte mediante la PPO en la L-DOPA-quinona reactiva, que se convierte de forma no enzimática en melanina de color negro a través de dopacromo e indol-quinona.
[0166] Además, se demostró que la reacción se puede inhibir añadiendo L-cisteína 1 mM durante la reacción (figura 5). Por lo tanto, este ensayo permite la identificación de mutantes con capacidad modificada para generar actividad de PPO en la superficie de una herida de una hoja. La respuesta de los discos foliares de lechuga a la presencia de L-DOPA se puede observar tanto en solución como entre papeles de filtro humedecidos, como se muestra en lafigura 13. Ejemplo 9
[0167] Evaluación de la descendencia de un mutante que muestra una casi ausencia de decoloración para determinar una respuesta de pardeamiento reducida utilizando el ensayo de pardeamiento de la nervadura central
[0168] Para demostrar que la reducción de la decoloración de mutantes de lechuga como la planta número 06D.210202 de losEjemplos 3,5y6, que se reduce significativamente en la decoloración rosada de las superficies de las heridas de los discos foliares, también se reduce eficazmente en la respuesta de pardeamiento inducida por herida, se cultivaron varias plantas de la progenie hasta la madurez.
[0169] En esta etapa de desarrollo, se extraen 3 discos de la nervadura central de las hojas exteriores de varias plantas de la progenie. Estos discos de nervadura se incuban según el procedimiento descrito en elEjemplo 7. Se muestra que las plantas de la progenie del mutante, que previamente mostraron una marcada reducción de la decoloración rosada inducida por herida, también presentan una marcada reducción del pardeamiento de la nervadura central inducido por herida. El resultado de este experimento se muestra en lafigura 14.
[0170] Ejemplo 10
[0171] Evaluación de la descendencia de un mutante que muestra una casi ausencia de decoloración para una respuesta de pardeamiento reducida utilizando cabezas de lechuga recién cortadas y envasadas en bolsas de plástico
[0172] Las cabezas maduras de las plantas de lechuga cultivadas a partir de la semilla número 06D.819784 delEjemplo 6, que presenta una reducción significativa de la decoloración rosada en las superficies de las heridas de los discos foliares, se cortaron en trozos con un cuchillo y se envasaron en una bolsa de plástico que contenía atmósfera ambiental. Las plantas de control, que mostraron una respuesta de decoloración rosada normal de los discos foliares, se trataron de manera idéntica. Las bolsas se almacenaron a 4 °C durante 6 días, después de lo cual se evaluó el material foliar para determinar su respuesta de pardeamiento.
[0173] Mediante este experimento se demuestra que las plantas de la progenie del mutante, que previamente mostraron una marcada reducción de la decoloración rosada inducida por herida, también presentan una marcada reducción del pardeamiento de la nervadura central inducido por herida cuando se procesan y se almacenan en bolsas de plástico utilizando una atmósfera ambiental. El resultado de este experimento se muestra en lafigura 15.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES
1. Planta de lechuga mutante que tiene una modificación hereditaria inducida del genoma y que muestra una reducción de la respuesta de enrojecimiento y un hábito de crecimiento normal, en donde la modificación hereditaria, la reducción de la respuesta de enrojecimiento y el hábito de crecimiento normal son como los encontrados en una planta de lechuga, cuya semilla representativa se depositó en el NCIMB con el número de registro 41454 o 41441, en donde la planta de lechuga mutante se puede obtener cruzando dicha planta de depósito con otra planta de la misma especie.
2. Planta de lechuga mutante según la reivindicación 1, en donde el hábito de crecimiento normal comprende un tamaño, forma, crecimiento y color muy similares a las plantas de control.
3. Planta de lechuga mutante según la reivindicación 1 o 2, en donde las plantas muestran una fuerte inhibición de la respuesta de pardeamiento enzimático del tejido dañado de la nervadura central.
4. Planta de lechuga mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la modificación hereditaria comprende mutaciones inducidas por ems.
5. Progenie de una planta de lechuga progenitora según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, cuya progenie tiene la modificación hereditaria inducida del genoma, la reducción de la respuesta de enrojecimiento y el hábito de crecimiento normal que se encuentra en la planta de lechuga progenitora.
6. Parte de una planta según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, cuya parte se selecciona, en particular, de la hoja, cabeza, tallo, brote, raíz, tubérculo, fruto, flor o fragmentos de los mismos, y células.
7. Parte, según la reivindicación 6, para su uso en cultivo tisular para regenerar plantas que conservan la modificación hereditaria del genoma, la reducción de la respuesta de enrojecimiento y el hábito de crecimiento normal, como se encuentra en la planta de la que se obtiene el tejido para el cultivo tisular.
8. Planta de lechuga regenerada a partir de una parte de planta, según la reivindicación 6, que conserva la modificación hereditaria inducida del genoma, la reducción de la respuesta de enrojecimiento y el hábito de crecimiento normal, como se encuentra en la progenitora.
9. Semilla de una planta, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 8, de la cual se pueden cultivar plantas con semilla que tienen la modificación hereditaria inducida del genoma, la reducción de la respuesta de enrojecimiento y el hábito de crecimiento normal, como se ha definido en la reivindicación 1.
10. Progenie de una semilla según la reivindicación 9 que ha conservado la modificación hereditaria inducida del genoma, la reducción de la respuesta de enrojecimiento y el hábito de crecimiento normal, como se encuentra en la progenitora.
11. Producto procedente de una planta según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, 8 y 10, que comprende una planta de lechuga o parte de lechuga, opcionalmente lechuga procesada, en particular lechuga cortada, en donde el producto comprende la modificación hereditaria inducida del genoma y muestra la reducción de la respuesta de enrojecimiento, como se ha definido en la reivindicación 1.
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