BRPI0706430A2 - método para triar uma população de plantas ou parte de plantas quanto à presença nas mesmas de indivìduos, planta, progênie de uma planta, parte de uma planta, semente de uma planta, progênie de uma semente, produto de hortaliça, fruto, e, flor - Google Patents

Abstract

METODO PARA TRIAR UMA POPULAçãO DE PLANTAS OU PARTES DE PLANTAS QUANTO à PRESENçA NAS MESMAS DE INDIVìDUOS, PLANTA, PROGêNIE DE UMA PLANTA, PARTE DE UMA PLANTA, SEMENTE DE UMA PLANTA, PROGENIE DE UMA SEMENTE, PRODUTO DE HORTALIçA, FRUTO, E, FLOR A presente invenção refere-se a um método para triar uma população de plantas ou partes de plantas pela presença nas mesmas de indivíduos que apresentam uma descoloração superficial induzida por ferimento reduzida em comparação a uma planta ou parte de planta de controle, cujo método compreende prover uma população de plantas ou partes de plantas da população; criar uma superficie do ferimento sobre as plantas ou partes de plantas a serem triadas e sobre as plantas ou partes de plantas de controle; incubar as superficies do ferimento criadas para permitir que ocorra descoloração nas, ou, sobre as mesmas; observar a descoloração da superficie do ferimento na, ou, sobre as plantas ou partes de plantas; comparar a descoloração da superficie do ferimento na, ou, sobre as plantas ou partes de plantas a serem triadas com a descoloração observada sobre, ou na planta ou parte de planta de controle. A invenção refere-se ainda a plantas assim selecionadas.

Description

"MÉTODO PARA TRIAR UMA POPULAÇÃO DE PLANTAS OUPARTES DE PLANTAS QUANTO À PRESENÇA NAS MESMAS DEINDIVÍDUOS, PLANTA, PROGÊNIE DE UMA PLANTA, PARTE DEUMA PLANTA, SEMENTE DE UMA PLANTA, PROGÊNIE DE UMASEMENTE, PRODUTO DE HORTALIÇA, FRUTO, E, FLOR"

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a um método para triar umapopulação de plantas ou de partes de planta quanto à presença de indivíduosapresentando descoloração superficial reduzida induzida por lesão emcomparação a uma planta de controle. A invenção refere-se igualmente aplantas e partes de plantas derivadas delas apresentando descoloraçãosuperficial ausente ou reduzida, induzida por lesão, obtida por meio destemétodo e para partes e progênie destas.

Fundamento da invenção

Devido à demanda crescente, o processamento de produtofresco, em particular alface, expandiu-se significativamente nos anos recentes.A colheita e o processamento da alface envolvem o corte extensivo dasfolhas, o que induz uma forte resposta às lesões. Esta resposta à lesão leva auma deterioração rápida do produto processado. Esta deterioração émanifestada pela descoloração devido ao acastanhamento ou rosadoenzimático na, e em torno da superfície lesionada, respiração e dessecaçãodevido à transpiração. Especialmente o acastanhamento ou rosado enzimáticoé considerado de importância significativa, determinando direta ouindiretamente a qualidade global da alface recém-colhida, embalada.

Além disto, como uma conseqüência da deterioração, micro-organismos podem aumentar significativamente em número, o que podecomprometer a segurança alimentar. A natureza altamente perecível da alfaceprocessada leva a uma forte percepção pelo consumidor da falta de cor, cheiroe textura, o que está atrasando um crescimento mais rápido do que o atual do,assim chamado, mercado de conveniência.

A fim de inibir o processo de deterioração, muitos tratamentosquímicos ou físicos pós-colheita foram desenvolvidos e podem ser aplicadospara retardar a deterioração da alface processada.

Entre estes estão o acondicionamento da alface recém-colhida,sob uma atmosfera modificada, a aplicação de tegumentos comestíveis,tratamento de choque termal e adição de produtos químicos, que inibem oacastanhamento enzimático. Quando alface recém-colhida é embalada sobuma atmosfera de oxigênio reduzido a baixas temperaturas, o acastanhamentoenzimático pode ser substancialmente reduzido. Porém, este ambientemodificado, com pouco oxigênio leva à respiração anaeróbica, que cria umproduto sem gosto e sem cheiro que é percebido como muito desinteressante.

Tegumentos comestíveis são camadas finas de materiais, queatuam como barreira de isolação física e que protegem eficazmente o produtode diferentes formas de deterioração tais, como evaporação e acastanhamento.Estes tegumentos podem ser feitos de resinas, de polissacarídeos ou deproteína.

Além disto, demonstrou-se que o acastanhamento da alfacerecém-colhida pode ser impedido aplicando-se um breve choque termal de 90segundos a 45°C, imediatamente depois do processamento. Possivelmente, ochoque termal desvia a biossíntese da proteína das enzimas envolvidas nadescoloração para as proteínas do choque termal reduzindo deste modo acapacidade de acastanhamento enzimático. Alternativamente, o efeito dotratamento de choque termal no acastanhamento pode ser explicado pelatermo-sensibilidade das enzimas envolvidas no caminho da descoloração.

Produtos químicos, que podem ser aplicados podem, porexemplo, ser agentes redutores como a vitamina C, agentes de quelação comoo EDTA, agentes complexos como a ciclodextrina e inibidores enzimáticoscomo a L-cisteína. A aplicação de produtos químicos no alimento frescoenvolve obviamente itens da segurança alimentar e exigem aprovaçãoreguladora. As combinações de tecnologias pós-colheita descritas acimapodem ser lembradas e, ao final das contas, o procedimento aplicado é umapermuta entre a eficácia tecnológica, custo e segurança alimentar.

Independentemente da tecnologia aplicada, a melhoria daqualidade pós-colheita da alface processada, virá há um custo econseqüentemente na técnica existe uma necessidade clara de se forneceralternativas, que eliminem ou reduzam a necessidade de aplicar tecnologiasfísicas ou químicas pós-colheita

Sumário da invenção

E objetivo da presente invenção prover um método de triagempara selecionar plantas que apresentem uma resposta reduzida dedescoloração induzida por lesão para prover plantas e progênie delasderivadas que sejam resistentes às lesões do processamento pós-colheita, taiscomo, o acastanhamento ou rosado enzimático. E um objetivo adicional dainvenção prover plantas que apresentem uma descoloração rosada ouacastanhada significativamente reduzida por lesão Descoloração por lesãopode igualmente ser visível em partes de plantas, tais como caules, sementes,frutas, folhas, flores, tubérculos, brotos. E, assim, um objetivo adicional dainvenção prover um método de triagem para selecionar plantas, queapresentam uma resposta reduzida à descoloração induzida por lesão em suaspartes de planta.

A invenção provê, deste modo, um método para triar umapopulação de plantas ou de partes de planta quanto à presença de indivíduosque apresentam uma descoloração superficial reduzida induzida por lesão emcomparação a uma planta ou parte de planta de controle, o métodocompreendendo:

a) prover uma população de plantas ou partes de plantas dapopulação;b) opcionalmente, criar uma superfície lesionada sobre asplantas ou partes de planta a serem tríadas e nas plantas ou partes de planta decontrole;

c) incubar as superfícies lesionadas para permitir que ocorradescoloração nas, ou, sobre as mesmas;

d) observar a descoloração superficial da lesão na, ou sobre asplantas ou partes de plantas;

e) comparar a descoloração superficial de lesão observada na,ou sobre as plantas ou partes de plantas com aquela observada sobre, ou naplanta ou parte de planta de controle para identificar plantas ou partes deplantas que não apresentam descoloração ou descoloração que é reduzida emcomparação com a planta ou parte de planta de controle.

O método da invenção pode ser usado para qualquer plantaque possa estar sujeita à descoloração, mas é, em particular, útil para produzir,em particular hortaliças ou frutas, ou flores. O método é, inter alia,apropriado para hortaliças com folhas, tais como alface, para tubérculos,como batata ou batata doce, para raízes, tal como o aipo, para brotos, taiscomo a chicória-endívia, ou para cogumelos. O método pode, além disto, serusado para frutas, tais como maçã, banana, abacate, pêssego, pêra, damasco,manga, berinjela e para flores ou caules de flores, tais como caules da gérbera,flores de crisântemo, fundos de alcachofra etc.

O método de triagem da invenção pretende identificar plantasque têm uma pequena superfície de descoloração induzida por lesão em umaou mais de suas partes ou tecidos. Para a triagem, é conseqüentemente muitoprático usar a parte ou tecido que tem tendência à descoloração. Na alface,esta pode ser a folha ou uma parte dela, como um furo, pode serapropriadamente usada em fatias de banana da fruta descascada e, fatias decaule de flores, são um veículo de teste muito prático.

Em um modo de realização específico o método é emparticular útil para selecionar as plantas que pertencem à família Asteraceae,em particular plantas do gênero Lactuca e mais em particular às espéciesLactuca sativa ou às plantas que pertencem ao gênero Cichorium e emparticular às espécies Cichorium intybus e Ciehorium endívia que apresentamuma ausência ou redução de descoloração superficial induzida por lesão.

A população de planta que é tríada com o método da invençãopode ser qualquer população de planta, mas é preferivelmente uma populaçãode planta variável que tenha muitos membros diferentes para aumentar aspossibilidades de se encontrar uma planta que apresente uma descoloraçãoinduzida por lesão reduzida. Uma população tão variável pode ser criada pormeio de um tratamento mutagênico usando-se, por exemplo, produtosquímicos e/ou irradiação e é chamada então, aqui, uma população de plantamutante. Populações alternativas são as coleções de plasma germinativo, quesão coleções de plantas apresentando variação natural. Além disto, umapopulação de plantas transgênicas pode ser usada.

O método da invenção é executado apropriadamente compartes de planta que têm uma superfície lesionada. Amostras-teste muito úteissão os discos que são perfurados de uma folha, os assim chamados discos defolha. Alternativamente, o tecido da nervura central de hortaliças com folhasvenadas pode ser usado. Apropriadamente, os discos são cortados destasnervuras.

A incubação ocorre apropriadamente em um ambiente aquoso.O método da invenção pode ser muito bem praticado com discos de folha quesejam incubados sobre, ou entre papel de filtro umedecido. A resposta dadescoloração é então muito bem visível em torno das bordas da lesão sobre opapel. No caso de plantas do gênero Laetuea e Ciehorium a descoloração é aresposta rosada.

Alternativamente, o ambiente aquoso compreende água ouuma solução. Em um modo de realização específico que será ilustrado maisabaixo a solução contém L-3,4-dihidroxifenilalanina. Este composto éconvertido para a produção do pigmento preto melanina pela oxidase daenzima de polifenol. Os compostos da alternativa que podem ser usados emrelação a isto incluem, mas não estão limitados ao ácido clorogênico, ácidoisoclorogênico, L-tirosina e catecol.

A invenção refere-se, além disto, a uma planta apresentandouma descoloração superficial induzida por lesão reduzida, planta estaobtenível submetendo-se uma população de plantas ao método de triagem dainvenção e selecionando-se plantas da população que não apresentamdescoloração superficial na triagem ou apresentam uma descoloraçãosuperficial na triagem que é reduzida em comparação a uma planta decontrole.

Apropriadamente a planta é uma hortaliça com folhas, maisem particular uma planta que pertence ao gênero Lactuca e, em particular, àespécie Laetuea sativa ou uma planta que pertence ao gênero Ciehorium e,em particular, às espécies Ciehorium intybus e Ciehorium endívia.

Preferivelmente a planta da invenção é identificada na triageme subseqüentemente selecionada como tendo descoloração superficialinduzida por lesão reduzida ou ausente, mas, subseqüentemente, é testadapara determinar se tem modo de vida normal. Mais em particular, a planta,preferivelmente, não deveria apresentar efeitos pleiotrópicos negativos.

De acordo com a invenção foram identificadas e selecionadasplantas que não apresentaram, ou que apresentaram uma descoloraçãosuperficial induzida por lesão significativamente reduzida. A progênie desementes destas plantas foram depositadas com o NCIMB e receberam umnúmero de acesso como listado na Tabela 1. Detalhes sobre a descendênciadas sementes dos depósitos estão dados no Exemplo 4 e no Exemplo 6. Estesdepósitos são criados por que têm a característica específica única dadescoloração induzida por lesão significativamente reduzida, ou não. Eles nãoforam testados pelos critérios DUS para registro de variedade, isto é,capacidade distintiva, uniformidade estabilidade em todas as características deregistro, e não é esperado que, de qualquer maneira, satisfaçam estes critérios

Tabela 1

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Além disto, a invenção refere-se a plantas tendo umadescoloração superficial induzida por lesão reduzida ou ausente e que sãoobteníveis cruzando-se uma planta da invenção com outra planta da mesmaespécie. A característica "descoloração superficial induzida por lesão reduzidaou ausente" pode, então, ser levada a outras plantas que não tenham,originalmente, a característica. Se as plantas resultantes deste cruzamento sãorealmente plantas da invenção pode ser testado submetendo-se estas plantasao método de triagem da invenção. Preferivelmente, as plantas que sãoselecionadas da invenção são igualmente testadas para se têm modo de vidanormal.

A invenção refere-se, além disto, à progênie de uma plantaoriginária da invenção que retém a ausência ou redução da descoloração dafolha induzida por lesão como encontrada na planta originária. Esta progêniepose ser qualquer uma das gerações retiradas da originária. Enquanto acaracterística "descoloração superficial induzida por lesão reduzida ouausente" for mantida a planta é uma planta da invenção.

A invenção refere-se adicionalmente a partes de plantas dainvenção. Partes de plantas como cabeças ou folhas da alface ou endívia sãonormalmente as partes que têm uma superfície de corte que pode estar sujeitaà descoloração.

Partes de planta da invenção podem ser usadas na cultura detecidos para regenerar plantam que retêm a ausência ou redução dadescoloração da folha induzida por lesão como encontrada na planta da qual otecido para a cultura de tecido é derivado. Estas plantas regeneradas tambémsão parte desta invenção.

A invenção refere-se, alem disto, à semente de uma planta dainvenção. A partir da semente podem ser cultivadas plantas que também têm acaracterística "descoloração superficial induzida por lesão reduzida ouausente". Se, ou não, as sementes e, por conseguinte, as plantas cultivadas dasmesmas retiveram esta característica pode ser testado no método de triagemda invenção. A invenção também se refere a geração adicional de sementesque retêm a ausência ou redução de descoloração de folha induzida por lesãocomo encontrada nas sementes originais.

A invenção é comercialmente muito interessante para omercado da hortaliça processada. Como explicado acima, a descoloração doproduto, em particular frutas e verduras frescas é considerada indesejável umavez que o produto descolorido é rejeitado pelo consumidor. A característica"descoloração superficial induzida por lesão reduzida ou ausente" dainvenção é, portanto, encontrada de maneira adequada em produtos vegetaisprocessados, como alface, endívia ou chicória-endívia cortadas, oucombinações destes. Quando tríadas usando-se o método da invenção,hortaliças processadas da invenção não apresentam, ou apresentam umadescoloração de folha induzida por lesão limitada. Todas as hortaliçasprocessadas, em particular alface, endívia e chicória-endívia que satisfazem atriagem são parte da invenção uma vez que foi demonstrado que elas têm umamodificação levando a um fluxo metabólico dependente de PAL e/ou PPOreduzido.

Descrição detalhada da invenção

Quando a alface é colhida e processada por corte, são geradasmuitas superfícies de folhas lesionadas o que leva a uma resposta significativada planta ou de partes de planta, manifestada por uma descoloraçãoacastanhada ou rosada na, ou junto à superfície lesionada. O rosado podeigualmente ser observado em locais distantes da superfície lesionada nanervura central da folha assim como na extremidade. As vezes o rosado podeser igualmente observado em estágios logo antes da colheita que éconsiderado ser devido ao dano abiótico ou sobrematuridade da safra.

As diferentes formas de descoloração são afetadas pelaatividade enzimática, que é fortemente realçada como uma conseqüência dalesão e que gera diversas formas de polifenóis e produtos de reação derivadosdos mesmos.

Uma atividade enzimática importante envolvida na reação deacastanhamento é PPO. Atividade de PPO com relação ao acastanhamentoenzimático não está restrita à alface e foi descrita para muitas outras espéciesde plantas envolvidas na deterioração pós-colheita como maçã, banana e abatata. De fato, PPO é reconhecida extensamente por ser uma das enzimasmais importantes envolvida na deterioração pós-colheita de muitas frutas everduras frescas processadas.

Por este motivo a PPO tem sido alvo de muitas tecnologias,visando a redução ou a prevenção destas atividades a fim de aumentar aqualidade pós-colheita de produtos de alimentação. A PPO catalisa umareação na qual polifenóis que residem no tecido da planta são oxidadosprovocando a formação de o-quinonas. Subseqüentemente, as reaçõesenzimáticas e não-enzimáticas levam à formação de pigmentos marrons oupretos.

Em muitas espécies de plantas a PPO é codificada por umapequena família de gene cujos membros individuais podem ter padrões deexpressões temporais e espaciais diferentes indicativos de divergênciafuncional. Por exemplo, mostrou-se que a alface contém isoformas de PPOdiferentes nos tecidos fotossintético e vascular da folha.

O substrato natural da PPO pode diferir entre as diferentesespécies. Na alface, derivados do ácido cafeico como ácido clorogênico eisoclorogênico atuam, principalmente, como substrato da PPO.

O nível da enzima PPO não é especificamente induzido pelalesão dos tecidos da planta e reside, inertemente no cloroplasto. Com a lesão aPPO é ativada o que é manifestado devido ao fato do substrato fenólico quereside nos vacúolos ser posto em contato com a PPO devido ao rompimentodo tecido.

Na alface, a produção de polifenóis, que são o substrato daPPO, é induzida pela lesão. Conseqüentemente, o potencial deacastanhamento do tecido da alface parece não estar limitado ao aumento daPPO no tecido da folha, mas, na verdade, pela taxa de biossíntese de polifenolpela lesão.

A este respeito, a situação pode diferir entre colheitas. Porexemplo, na maçã a quantidade de polifenóis é suficiente para gerar umaresposta de acastanhamento das frutas dentro de uma hora após a lesão,enquanto que, na alface, a reação de acastanhamento pode levar alguns diasdevido ao fato de que, na alface, a associação de polifenóis exige muito sersintetizada de novo com a lesão.

A síntese dos polifenóis ocorre através de um caminhobioquímico bem caracterizado, chamado o caminho do fenilpropanóide.Primeiramente, a etapa executada deste caminho é catalisação pela enzima defenilalanina amônia liase (PAL, Hahlbrock, K e Scheel, D (1989) Annu. Rev.Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40, 347-369). A PAL converte a fenilalaninado aminoácido sintetizado através de via shiquímica em ácido cinâmico.

Na alface, a lesão das folhas leva a uma indução forte daexpressão de gene da PAL e da atividade da PAL. A formação de polifenóis écorrelacionada com esta atividade enzimática, que sugere que a atividade daPAL induzida pela lesão da alface é um fator importante responsável peloacastanhamento (Campos, R. e outros (2004) Physiologica Plantarum 121,429-438 e referências da mesma). Entretanto, é atualmente obscuro que outrosfatores determinam o resultado final da reação de descoloração induzida porlesão. Por exemplo, a atividade das peroxidases (POD) foi sugerida comosendo também importante para estabelecer o nível final de descoloração(Fukumoto, L.R. e outros (2002) J. Agric. Food Chem. 540, 4503-4511;

Martin-Diana A. e outros (2005) Biosci. Biotechnol. Biochem. 69, 1677-1685).

Uma vez que a atividade da enzima depende dadisponibilidade de água oxigenada interna, a contribuição da POD àdescoloração pode ser limitada.

É, além disto, evidente que a lesão é percebida de algum modopela planta e, por isto, um sinal é gerado através de uma ondulação, queatualmente é mal definida para a alface. Parece óbvio que estas atividadesserão direcionadas primariamente para a cicatrização da lesão e para a defesacontra micróbios patógenos. Conseqüentemente, é provável que muitosfatores genéticos estejam envolvidos na criação da resposta da descoloraçãode tecido lesionado da alface e cada um destes são alvos potenciais paramodificação genética para reduzir ou eliminar a descoloração induzida porlesão.

A maioria destes fatores genéticos é atualmente desconhecidae para aqueles conhecidos por seu envolvimento não é claro qual a extensãodo papel específico que estes fatores desempenham na reação de descoloraçãoou se talvez tenham uma função mais geral em relação à fisiologia da lesão daplanta.

Por exemplo, embora a atividade da PAL induzida por lesãoseja considerada para determinar o nível de acastanhamento da alface, sabe-seque produtos do caminho fenil propanóide estão envolvidos inter alia nabiossíntese ou, também, na resposta de defesa. Conseqüentemente reduzindo-se a atividade da PAL induzida por lesão a fim de reduzir o potencial deacastanhamento pode comprometer outras funções além do acastanhamentoinduzido por lesão o que pode ser menos desejável em relação a outrosaspectos do cultivo da alface.

Do mesmo modo, a atividade da PPO tem sido inferida comoenvolvida na resposta de defesa e conseqüentemente a redução do potencialde acastanhamento reduzindo-se níveis da PPO pode aumentar asusceptibilidade aos patógenos (Thipyapong, P. e outros (2004) Planta 220,105-117). Conseqüentemente, os inventores raciocinaram que umaabordagem mais imparcial poderia ser mais bem sucedida a este respeito. Estaabordagem compreende as seguintes etapas:

1. Geração de uma população mutável de plantas, emparticular uma população mutante. Esta população mutante pode ser geradapelo tratamento de sementes ou tecidos da planta com agentes mutagênicoscomo o sulfonato etil metano (ems) ou raios-x.

2. Estabelecimento de uma triagem fenotípica eficiente na quala seleção é baseada em uma resposta à descoloração induzida por lesão daplanta, em particular uma hortaliça com folhas, mais em particular alface,endívia ou chicória-endívia, que é canalizada através da PAL e/ou da PPO.

3. Caracterização dos mutantes modificados por sua resposta àlesão no que diz respeito ao potencial de descoloração pós-colheita e àausência de efeitos pleiotrópicos da modificação, que comprometem o cultivoe o processamento da planta, em particular uma hortaliça com folhas, mais emparticular alface, endívia ou chicória-endívia, de acordo com a práticacomum.

A invenção refere-se assim a um método de triagem imparcialpara identificar, selecionar e obter uma planta apresentando uma descoloraçãoinduzida por lesão e lesões de processamento pós-colheita tais como oacastanhamento ou rosado enzimático reduzidas

A invenção, em outro modo de realização, refere-se a ummétodo imparcial que usa um substrato que é convertido em um pigmentopela PPO. Nesta análise, a triagem é especificamente para mutantes da PPO.Um substrato apropriado é a L-DOPA que é convertida no pigmento pretomelanina.

A invenção está ilustrada aqui em referência a hortaliças comfolhas, como alface, mas também pode ser praticada, da mesma maneira, comoutras plantas conforme indicado acima.

Uma população de planta mutante para uso no método dainvenção pode, por exemplo, ser preparada como segue:

a) tratar sementes MO de uma espécie de planta a sermodificada com um agente mutagênico para obter sementes Ml;

b) cultivar plantas das sementes Ml assim obtidas para obterplantas Ml;

c) opcionalmente repetir as etapas b) e c) η vezes para obterMl+ η sementes;

d) germinar as Ml+n sementes assim obtidas e cultivar asplantas destas sementes.

De acordo com a invenção estas plantas são subseqüentementeanalisadas para suas respostas à descoloração induzida por lesão. Plantas quenão apresentam, ou apresentam uma resposta reduzida à descoloração pelalesão são selecionadas. Deste modo, a progênie das plantas selecionadas écultivada e a resposta da descoloração induzida por lesão é medida.

A fim de criar variabilidade genética pode ser feito uso damutagênese. Diversos produtos químicos ou tratamentos físicos sãoconhecidos dos peritos na técnica e podem ser usados para induzir mutaçõesgenéticas em espécies de plantas como a alface. Por exemplo, alguém podetratar sementes da alface em uma solução contendo diferentes concentraçõesde um mutageno como o ems. Alquilatos de ems primariamente resíduos G deuma trança de ADN, que durante a duplicação do ADN provocam ocasamento com T em vez de C. Conseqüentemente, os pares-base GC mudampara pares-base AT a uma freqüência, que é determinada pela dose efetiva deems e pela atividade do sistema de reparação de má combinação da planta.

A dose efetiva de ems depende da concentração usada, dotamanho da semente e de outras propriedades físicas e do momento daincubação das sementes na solução de ems. Sementes, que foram tratadas comems são chamadas tipicamente de sementes Ml. Como uma conseqüência dotratamento, os tecidos das sementes Ml contêm mutações de pontos aleatóriosnos genomas de suas células e aqueles presentes na subpopulação das células,que formam o tecido da linha germinativa (células germinais) serãotransferidas para a geração seguinte, que é chamada M2. Mutações oucombinações destas que são haplo-insuficientes, deste modo, provocandoesterilidade ou que induzam à mortalidade do embrião não serão transferidaspara a geração M2.

Um procedimento similar ao descrito acima para o uso de emsse aplica, igualmente, a outros agentes mutagênicos. Agentes mutagênicosapropriados são bem conhecidos na técnica. Particularmente úteis são os

agentes mutagênicos alquilantes, como o sulfato dietil (DES), etileneimina(ei), propano sultona, N-metil-N-nitrosouretano (mnu), N-nitroso-Nmetilureia (NMU)5 N-etil-N-nitrosoureia (enu), azida de sódio.

Alternativamente, as mutações são induzidas por meio deirradiação, que, por exemplo, é selecionada de raios X, nêutrons rápidos,irradiação UV.

Em outro modo de realização da invenção, as mutações sãoinduzidas por meio da engenharia genética, como por meio do uso deoligonucleotídeos quiméricos, recombinação homóloga introdução de genes-alvo modificados que competem com o produto endógeno, regulaçãodecrescente através de interferência de RNA, etc.

A população do M2 de um tratamento de mutagênese pode serusada nos procedimentos de triagem dirigidos à resposta da lesão que écanalizada através da PAL e da PPO. E óbvio ao artesão experiente quequalquer população de plantas, que porte variação genética pode ser tomadacomo material inicial para esta triagem fenotípica.

Preferivelmente, a invenção refere-se a alelos piramidaisprovocando resposta reduzida à descoloração induzida por lesão.

A produção de sementes Ml e Ml+n é efetuadaapropriadamente por meio de autopolinização.

A invenção refere-se, além disto, a obtenção de plantas oupartes de plantas com genótipos alterados, plantas estas, ou partes de plantasque apresentam uma susceptibilidade reduzida às lesões fisiológicas deprocessamento pós-colheita, tal como acastanhamento ou rosado enzimático.A invenção refere-se a plantas ou partes de plantas que têm em seus genomasinformações genéticas que são responsáveis pela susceptibilidade reduzida àslesões de processamento pós-colheita tal como acastanhamento ou rosadoenzimático e é encontrada no genoma de uma planta de alface.

As progênies das plantas como reivindicadas são também partedesta invenção. "Progênie" como usada aqui pretende englobar todas asplantas tendo a mesma, ou uma similar, susceptibilidade reduzida às lesões deprocessamento pós-colheita, em particular, acastanhamento ou rosadoenzimático, que as plantas originais descritas aqui e sendo derivadas delas porqualquer maneira, tal como reprodução sexual, como autofertilização oufertilização cruzada com outra planta do mesmo gênero, ou reproduçãovegetativa como corte, cultura de tecido, cultura haplóide, cultura deprotoplasta, fusão de protoplasta, ou outras técnicas. Esta progênie não éapenas a primeira geração de plantas derivadas por uma ou mais destastécnicas, mas, também, qualquer geração posterior de plantas derivadas deuma ou mais destas técnicas provido que as plantas derivadas tenhamsusceptibilidade reduzida.

A fim realizar a triagem fenotípica da invenção, umasuperfície lesionada deve ser gerada uma vez que a reação de descoloraçãoenzimática é induzida pela lesão. Lesão é um distúrbio irreversível da plantanatural, tecido e/ou estrutura celular por métodos como cortar, perfurar, fatiar,abradar, espremer, quebrar, descascar, esmagar, pressionar, reduzir, moer,injeção fluida, choque osmótico, remover, segar, rasgar.

Subseqüentemente, uma característica fenotípica que sejadiagnostica para o caminho que leva à descoloração do tecido e que possa serusada muito eficientemente em uma triagem da população mutante deve setornar evidente.

Descobriu-se, surpreendentemente, que estas característicasfenotípicas poderiam ser obtidas coletando-se partes de plantas e incubando-as sob condições muito específicas que favoreceriam a ocorrência de formasdiferentes de descoloração da superfície lesionada. Subseqüentemente, estasanálises puderam ser aplicadas a um grande número de plantas mutantes, demodo a selecionar aquelas plantas que apresentassem uma redução à respostada descoloração induzida por lesão.

Um modo de realização desta invenção está baseado nadescoberta surpreendente de que quando discos de folhas, em particular folhasda alface, são coletados e incubados entre papéis de filtro umedecidos a 5°C,após aproximadamente 4 dias a formação de uma pigmentação rosada nasbordas dos discos de folha torna-se aparente. O papel de filtro apropriado é opapel tipo 1450 CV de filtro, Ref. n°. 10. 313 281 de Schleier & Schuell,Microscience GmbH, Dassel, Alemanha. Com incubação adicional, o sinal seintensifica e, após aproximadamente uma semana, a intensidade máxima foiatingida. A formação da pigmentação rosada ocorre especificamente nassuperfícies lesionadas.

A descoloração pode ser medida marcando-se sobre umaescala visual a partir de 0, que significa nenhum acastanhamento ou rosado,até 10, que significa acastanhamento ou rosado igual a uma variedade padrãoda alface (L. sativà). No presente exemplo a variedade "Troubadour" da L.sativa é usada como um padrão para 10. Se desejado, fotos podem ser usadaspara comparação com resultados de classes intermediárias entre 0 e 10. Alémdisto, fotos digitais podem ser tiradas do papel de filtro com a pigmentaçãorosada, seguido da contagem por posição do disco de folha do número depixéis com uma cor rosada intensa. Usando-se uma destas medidas, análisesestatísticas simples como o teste-t, bastante conhecido dos peritos na técnica,podem ser executadas para determinar se uma planta ou grupo de plantas ésignificativamente menos rosado do que o padrão, como a variedade cultivada'Troubadour'. O nível de significância aplicado de um teste unilateral é 0,001.

Para mutantes, a comparação estatística pode ser feita entre ascontagens rosadas da variedade original, que é o melhor padrão disponível, eas contagens rosadas de mutantes individuais e/ou sua descendência.

Para encontrar a feição da invenção em plantas existentes,amostras representativas de variedades, linhas de reprodução e/ou acessos abancos de genes podem ser usados. A comparação estatística pode, então, serfeita entre as contagens rosadas do acesso individual sob investigação e orestante da população. Quando testando estatisticamente indivíduos parasignificativamente menos rosado, testes de comparação múltiplos podem sernecessários para manter os níveis de significância total apropriados, porexemplo, o teste de comparação múltiplo de Dunnett com um padrão (DunnettCW, J. Amer. Statist. Assoc. 50:1096 - 1121 (1955)).

Além disto, mostrou-se que a resposta à descoloração induzidapor lesão pode ser obtida usando-se muitos tipos diferentes de tecido de folhasde diferentes estágios de desenvolvimento. Por exemplo, o tecido da nervuracentral pode igualmente ser induzido para dar esta resposta pela lesão.Quando aplicada aos diferentes tipos de alfaces, tais como, cabeça-gigante,crocante, romana, da Batávia ou serrilhada, nenhum acesso individual foiencontrado que apresentasse significativamente menos rosado do que orestante da população investigada.

Demonstrou-se, ainda, que de acordo com invenção, uminibidor específico da PPO, L-cisteína, quando aplicado durante a reação,reprimiu fortemente a formação da pigmentação rosada. Além disto,descobriu-se que a formação da pigmentação rosada foi inibida pelocinamaldeído, que é um inibidor da atividade da PAL e do acastanhamento daalface recém-colhida (Fujita, N. e outros (2006) Biosci. Biotechnol. Biochem.70, 672-676). Estes resultados mostraram que a resposta rosada dadescoloração da alface é dependente da PAL e da PPO.

Sabe-se que o acastanhamento enzimático da alface recém-colhida pode ser impedido muito eficazmente pela aplicação de um rápidochoque termal. O efeito observado pode ser explicado supondo-seredistribuição da biossíntese da proteína do caminho fenil propanóide para asproteínas do choque termal reduzindo, deste modo, o fluxo metabólico para aformação de polifenóis.

Alternativamente, o efeito pode ser explicado supondo-se queas enzimas envolvidas na oxidação do polifenol, tais como a PPO e a POD,são inativadas pelo tratamento de choque termal. Quando o choque termal foiaplicado à alface, que foi analisada subseqüentemente para a resposta rosada,foi mostrado que esta resposta, bem como o acastanhamento enzimático,foram inibidos eficazmente. Isto demonstra que a resposta rosada da alface,que é parte desta invenção é fisiologicamente muito similar à resposta doacastanhamento enzimático bastante conhecido.

Esta descoberta foi consubstanciada posteriormente aplicando-se L-cisteína como um agente redutor. A L-cisteína além de ser um inibidorda PPO, é conhecida igualmente por reagir com o-quinonas coloridas e porconvertê-las de volta em difenóis incolores em uma reação química deredução. Quando a pigmentação rosada formada por discos de folha da alfaceé tratada com a L-cisteína, demonstrou-se que o composto rosado foiconvertido em um composto incolor. Parece conseqüentemente que sejaprovável que a pigmentação rosada seja uma o-quinona formada pela PPO.

Isto foi corroborado pela descoberta de que agentes redutorescomo o ácido ascórbico ou a glutationa igualmente convertem a pigmentaçãorosada em um composto incolor.

Além disto, quando plantas que foram colhidas no campo,apresentando rosado, são tratadas com L-cisteína, a descoloração rosada éigualmente eliminada. Isto demonstra que a resposta rosada do disco de folharepresenta o fenômeno rosado natural, que pode algumas vezes ser visto emplantas cultivadas sob condições de campo.

Um modo de realização adicional desta invenção é baseadoexperiência a seguir. Partes de uma folha de uma cabeça da alface sãoproduzidas por corte e incubadas a 16°C no ar. Como uma resposta, asuperfície lesionada torna-se castanha após aproximadamente 4 dias.Especialmente na superfície lesionada da nervura principal o acastanhamentopode claramente ser observado. Além disso, a reação de acastanhamento podeigualmente ser observada por toda a planta, sobre folhas danificadas pelocorte ou pela abrasão.

Todas estas reações de acastanhamento podem sercompletamente inibidas pela L-cisteína, um inibidor da PPO, o que demonstraque estes fenótipos são manifestados através da atividade da PPO e podemconseqüentemente ser considerados diagnósticos para o acastanhamento pós-colheita como observado durante o processamento e embalagem da alface.

Estas reações de acastanhamento induzidas por lesão podemser geradas de uma maneira eficiente que pode ser explorada em umprocedimento de triagem fenotípica para identificar plantas mutantes quetenham potencial de acastanhamento induzido por lesão reduzido.

Um modo de realização adicional desta invenção é baseado nadescoloração em superfícies lesionadas de tecidos da alface induzida pelaaplicação de substratos que podem ser convertidos pelas enzimas de oxidaçãodo fenol em compostos coloridos.

Por exemplo, quando os discos de folha da alface sãoincubados com um substrato da PPO5 L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA),uma descoloração castanho escuro a preto é observada na superfície lesionadaque é a manifestação da formação de melanina via PPO. Quando a L-cisteínafoi aplicada simultaneamente, a descoloração preta foi totalmente inibida oque confirma a suposição de que esta descoloração é mediada pela PPO.

Embora L-DOPA não seja considerado um substrato naturalpara a PPO da alface ela pode ser útil nas análises direcionadas para aidentificação de mutantes que apresentam descoloração induzida por lesãoreduzida.

De maneira similar à descrita para L-DOPA outros substratospodem ser aplicados a fim de provocar uma resposta de descoloração. Estesincluem, mas não de modo limitativo, o ácido clorogênico, ácidoisoclorogênico, L-tirosina, e catecol.

Tomadas em conjunto, a formação de pigmentações diferentesnas superfícies lesionadas geradas nas plantas, monitora modificações em umcaminho que começa pela indução de um sinal de lesão, canalizado através daPAL e da PPO e levando à descoloração. Como descritas, estas reações dedescoloração induzida por lesão podem prontamente ser avaliadas porinspeção visual que permite um procedimento de triagem muito eficiente damutante. A lógica em que se baseia o método descrito por esta invenção estáilustrada na Figura 1.

De acordo com esta invenção descobriu-se, assim, que ocaminho da descoloração induzida por lesão de discos de folha in vitrojustapõe-se amplamente com a descoloração induzida por lesão da alfaceprocessada em escala industrial e pode conseqüentemente ser consideradodiagnóstico para este processo. Isto é corroborado pela noção que osinibidores da PAL ou da PPO inibem o acastanhamento enzimático da alfaceprocessada e embalada sob condições práticas, industriais. Significativamente,uma vez que o procedimento compreende a etapa de indução isto é, lesão euma das conversões metabólicas finais mediadas pela PPO, o procedimentopermite capturar todos os fatores genéticos direta ou indiretamente envolvidosneste processo fisiológico. Além disso, como esta resposta pode ser geradausando-se uma gama inteira de tecidos de folha das folhas de estágios dedesenvolvimento diferentes, triagens de mutantes podem ser direcionadaspara estes estágios ou tecidos diferentes quando considerado relevante.

Plantas mutantes, que foram identificadas como tendo sidomodificadas no que diz respeito ao processo fisiológico levando de umadescoloração por lesão a uma dependente da PAL e da PPO baseada em umaou mais das análises fenotípicas descritas acima podem ser adicionalmentecaracterizadas. Esta caracterização pode ser feita a níveis diferentes, porexemplo, a nível molecular, bioquímico, fisiológico e fenotípico.

É óbvio àqueles peritos na técnica que níveis variáveis dedescoloração podem ser observados o que pode refletir a presença de lócusmutantes diferentes ou formas alélicas diferentes de lócus idênticos afetando afeição da descoloração na população original.

No caso das mutações recessivas estas duas possibilidadespodem ser facilmente distinguidas pela execução de testes de alelismo, quecompreendem o cruzamento de duas plantas mutantes e a determinação dofenótipo do híbrido. No caso de alelismo das mutações, a feição reduzida dadescoloração será aparente em Fl enquanto que, caso do fenótipo nosmutantes é determinada por lócus recessivo diferente o que não seria o caso.

Uma vez que mutagênese aleatória foi aplicada para gerar apopulação inicial, mutações no fundo genético podem igualmente contribuirpara a variação do fenótipo sob condições experimentais. A fim dediscriminar entre mutações exclusivas de resistências diferentes e um efeitocombinado de mutações no fundo genético, retrocruzamentos deveriam serexecutados para criar fundos genéticos uniformes para eventos diferentes dedescoloração reduzida.

Este procedimento é adicionalmente relevante para determinarse mutações em lócus específicos envolvidos em descoloração induzida porlesão apresentam efeitos pleiotrópicos.

As plantas M2 assim selecionadas com base em uma respostareduzida da descoloração são usadas para cultivar as sementes M3.Subseqüentemente, as linhas endogâmicas descendentes de eventos dedescoloração reduzida são reavaliadas para sua resposta reduzida à lesão.Além disto, o acastanhamento ou rosado reduzido pode ser avaliado emfundos genéticos diferentes e sob condições diferentes de cultivo da colheita edo processamento.

Estudos bioquímicos podem ser executados para tratar dequestões relacionadas aos caminhos afetados pela modificação genética.Estudos moleculares podem ser executados para determinar se os genes decandidatos putativamente envolvidos na resposta de acastanhamentoenzimático ou rosado como genes codificando a PAL, PPO ou peroxidases,foram modificados. Análise genética pode, além disto, ser realizada parademonstrar se a modificação encontrada em um gene de candidato é causaiem relação ao fenótipo alterado.

Embora mutagênese induzida seja o método preferido para serusado nesta invenção, uma pessoa experiente na técnica sabe que existetecnologia que permite modificar genes-alvo residentes no genoma de umaplanta de uma maneira específica. Por exemplo, tem sido demonstrado queoligonucleotídeos quiméricos são agentes mutagênicos eficazes com ummodo específico de ação.

Outra abordagem é modificar genes-alvo via recombinaçãohomóloga ou alvejamento do gene. Usando-se esta abordagem, um fragmentode um gene é trocado por um fragmento introduzido do ADN contendo umamodificação desejada. Abordagens transgênicas são igualmente praticáveispelas quais os genes modificados do alvo são introduzidos para competir como produto endógeno. Isto pode levar a efeitos negativos dominantes. Alémdisso, a regulação decrescente específica da expressão dos genes é praticávelcom a interferência do RNA.

No caso dos oligonucleotídeos mutagênicos, o alvejamento dogene ou abordagens transgênicas são usados para modificar um fator genéticoenvolvido na resposta da descoloração induzida por lesão, obviamente, aestrutura primária dos genes relevantes deveria ser conhecida.

Uma parte adicional desta invenção refere-se a mutantes daalface e à progênie derivada dos mesmos que são identificadas na base dadescoloração rosada induzida por lesão de discos de folha da alface.Aplicando-se estas análises de rosado às plantas de uma população M2 quecontém mutações aleatórias induzidas por ems resultou na identificação de umnúmero de mutantes que apresentaram uma redução significativa da respostarosada em comparação com as plantas de controle que não contêm asmutações induzidas por ems.

A maior parte dos mutantes apresentou um fenótipoapequenado e, freqüentemente, clorótico. No entanto, surpreendentemente,descobriu-se que alguns mutantes com uma resposta rosada reduzidaapresentaram um habitus de cultivo normal, isto é, um tamanho, forma,crescimento e cor muito semelhante aos das plantas de controle.

Quando plantas da progênie deste mutante particular cultivadode sementes obtidas via autofertilização são analisadas pelo rosado, éobservada uma redução similar à encontrada para o mutante originalmenteidentificado. Isto demonstra que uma resposta da descoloração rosadareduzida pode ser hereditária e provocada por uma modificação do genoma.

Uma descoberta ainda mais surpreendente foi o fato de quequando as plantas da progênie são cultivadas à maturidade e testadas paraacastanhamento enzimático de tecido lesionado da nervura central, estaresposta é também fortemente inibida.

Isto mostra que a análise do rosado do disco de folha que éparte desta invenção está causalmente relacionada ao acastanhamentoenzimático na alface e que a análise do rosado pode ser usada paraprognosticar o nível de acastanhamento enzimático de uma planta de alfacemadura.

Conseqüentemente, a análise do rosado do disco de folha podeser usada como uma ferramenta de seleção para identificar plantas da alfacecom um potencial de acastanhamento enzimático reduzido. Esta ferramentapode ser usada para identificar plantas da alface com potencial deacastanhamento enzimático reduzido de qualquer tipo de população de plantaindependentemente da causa da variação genética, que reside nesta população.Por exemplo, além das populações de ems, alguém pode usar acessos naturaisou populações de cultivos.

Um ou mais dos métodos de triagem providos por estainvenção pode, ser aplicado a qualquer espécie de hortaliça com folhas para aqual a qualidade de processamento pós-colheita precisar de melhoria.Conseqüentemente, esta invenção pode, além da alface cultivada serigualmente aplicada a outras espécies de plantas, por exemplo, pertencentes àsAsteraceae, bem como à espécie selvagem do gênero Lactuca. Além disto, ainvenção pode ser aplicada em particular às espécies de plantas pertencentesao gênero de planta Cichorium ao qual espécies como endívia {Cichoriumendívia), chicória e chicória-endívia (Cichorium intybus) pertencem.

A presente invenção refere-se a uma característica fenotípicaque pode ser detectada em uma planta executando-se um dos métodos queestão aqui apresentados. Plantas da invenção são aquelas plantas que,comparadas a uma planta de controle, apresentam ausência ou uma reduçãona descoloração superficial induzida por lesão. A presença da característica édeterminada por meio de um ou mais de três testes de descoloração, a saber, aocorrência de rosado ou acastanhamento ou a capacidade de converter osubstrato L-DOPA em melanina. Uma planta da invenção é uma planta emque pelo menos um destes três testes apresentou uma descoloração que é pelomenos reduzida em comparação a um controle.

O "controle", como usado aqui, é qualquer planta que, se sabeque apresenta uma ou mais das reações de descoloração rosada, deacastanhamento, e conversão de L-DOPA em melanina, cujas reações podemser inibidas pela L-cisteína ou pelo cinamaldeído. Apropriadamente, umaplanta é usada, da qual um disco de folha quando incubado entre papel defiltro umedecido a 5 0C por 7 dias apresenta descoloração rosada em torno dasbordas do disco.

A presente invenção será adicionalmente ilustrada pelosExemplos a seguir e que não pretendem limitá-la de nenhuma maneira. OsExemplos referem-se à alface, mas em vez da alface, outras plantas deprodução ou partes delas, em particular frutas e verduras frescas, podem serusadas. Nos Exemplos referência é feita às seguintes figuras.

Figura 1: Esboço esquemático da lógica por trás do projeto doprocedimento de triagem do mutante de populações de alface paradescoloração enzimática reduzida pós-colheita. O sinal de entrada da triagemé a lesão do tecido da folha, que é detectada pela planta e que gera umaresposta de sinalização divergente que leva a vários processos fisiológicosincluindo senescência, respiração e descoloração do tecido. Este sinal deentrada pode ser combinado com a aplicação de compostos fenólicos comosubstratos da PPO.

O sinal de saída da triagem é uma descoloração acastanhadaou rosada, dependendo das condições aplicadas, do diagnóstico da superfícielesionada para acastanhamento e rosado pós-colheita. Isto é pressuposto pelofato do sinal de saída estar completamente inibido por cinamaldeído e; L-cisteína, que são inibidores específicos da PAL e da PPOj respectivamente.

Figura 2: Imagem representativa do fenótipo de saída datriagem baseada na descoloração rosada de discos de folha. Os discos de folhadas plantas da alface (1 disco por planta) são arranjados entre papéis de filtroumedecidos e incubados a 50C por 7 dias. Uma descoloração rosada pode serclaramente observada em torno de cada disco de folha na superfície lesionada.

Figura 3: Análise do rosado do disco de folha (4 discos porprato) realizada na presença de concentrações diferentes de cinamaldeídoinibidor da PAL. O número acima de cada prato mostra os % de cinamaldeídousados.

Figura 4: Efeito inibitório da L-cisteína, inibidor da PPO nadescoloração rosada dos discos de folha da alface (4 discos por prato)incubados entre papéis de filtro umedecidos. O número acima de cada pratomostra os % de L-cisteína usados.

Figura 5: Efeito inibitório da L-cisteína, inibidor da PPO nadescoloração preta dos discos de folha da alface (4 discos, por prato)incubados entre papéis de filtro umedecidos na presença de L-DOPA 1,5 mM.O número acima de cada prato mostra a concentração usada de mM de L-cisteína.

Figura 6: Efeito do pré-tratamento por choque termal emrosado do disco de folha da alface. O choque termal foi aplicado por 90segundos em folhas intactas na temperatura indicada em cada prato.

Figura 7: Conversão da pigmentação rosada formada pelaresposta à lesão da alface em um composto incolor pela L-cisteína. A fileirasuperior dos pratos mostra a análise de L-DOPA enquanto que a fileirainferior dos pratos mostra a análise do rosado Os mais baixos de dois discosem cada prato foram tratados com L-cisteína depois que a resposta à lesãoterminou. A concentração de L-cisteína usada foi O, 0,001, 0,01, 0,1, 1 e 10mM, que está indicada acima.

Figura 8: Redução do rosado na alface cultivada carregadacom L-cisteína. O painel superior mostra sintomas típicos do rosado de umafolha da alface colhida de uma planta, que foi extremamente estressada porsaturação com água As nervuras principais mostram a presença de umapigmentação rosada. O painel inferior direito mostra um disco coletado dafolha que mostra sintomas de rosado após o tratamento com L-cisteína 1 mMpor 30 minutos na temperatura ambiente. O painel inferior esquerdo mostraum disco de folha similar após o tratamento com água por 30 minutos natemperatura ambiente.

Figura 9: Painel A: Análise fenotípica das plantas M2individuais da alface (agrupadas em lotes) para descoloração do disco defolha de acordo com o método descrito por esta invenção. Um total de 138amostras de 12000 é mostrado neste painel das quais a indicada por uma setaapresentou descoloração rosada fortemente reduzida. Painel B: Novo teste doindivíduo selecionado indicado no painel A confirmou a quase ausência deformação da descoloração rosada (amostra na posição média) em comparaçãoàs amostras de controle que apresentaram uma resposta da descoloração clara.

Figura 10: Fenótipos de plantas M2 da alface. As plantasetiquetadas 1, 2, 4, 5, 7, 10 e 12 apresentaram descoloração rosada reduzidado disco de folha usando-se a análise de acordo com esta invenção. As plantas3, 6, 8, 9, e 11 sãos plantas, que apresentaram um nível de descoloraçãorosada do disco de folha comparável ao controle do tipo selvagem. A planta 1é o único exemplo de um mutante que apresentou uma redução forte nadescoloração rosada e um habitus normal de cultivo. As plantas 2, 4, 5,1, 10e 12 apresentaram descoloração rosada reduzida e um fenótipo apequenado,descorado.

Figura 11: Teste da progênie de um mutante da alfacemostrando uma descoloração reduzida. A esquerda, 25 amostras de controlesão mostradas apresentando uma resposta normal da descoloração induzidapor lesão. A direita, um grupo de amostra é mostrado coletadas de uma sériede 35 plantas da progênie derivada de um único mutante, que tiveram suasrespostas da descoloração induzida por lesão reduzidas severamente.

Figura 12: Imagem representativa do fenótipo de saída datriagem baseado na descoloração acastanhada de partes da nervura central dafolha coletadas de plantas maduras da alface. A foto mostra discos do tecidoexterno da nervura central da folha da alface após incubação por 3 dias a16°C. A descoloração acastanhada típica pode claramente ser observada nasuperfície lesionada. Cada prato contém 3 discos coletados em posiçõesdiferentes da nervura central (verde, verde claro e branco). O número acimado prato indica a concentração em mM de L-cisteína que foi adicionada aofiltro.

Figura 13: Conversão de L-DOPA na superfície da folha daalface em melanina. O painel A mostra a análise em uma solução de L-DOPA1,5 mM. O tubo superior é o controle negativo, os outros 3 tubos sãoidênticos. O painel B mostra o resultado da incubação de discos de folha entrepapéis de filtro umedecidos contendo L-DOPA 1,5 mM.

Figura 14: Teste da progênie de um mutante da alface queapresenta uma descoloração rosada reduzida induzida por lesão noacastanhamento da nervura central. O painel A mostra os discos da nervuracentral de 8 plantas da progênie, numerados 1 a 8 (3 discos por planta) domutante com rosado reduzido. O painel B mostra os discos da nervura centralde 8 plantas de controle numerados de 9 a 16 (3 discos por planta) queapresentaram uma resposta normal de acastanhamento.

Figura 15: Avaliação de um mutante da alface que apresentauma resposta reduzida de descoloração rosada induzida por lesão ouacastanhamento após o corte e embalagem sob atmosfera ambiente. Partes defolha da cabeça de uma planta de controle são mostradas à esquerda e partesda folha do mutante com descoloração reduzida são mostradas à direita. Omaterial da folha recém-colhida foi armazenado por 6 dias a 4°C. Adescoloração acastanhada pôde ser claramente observada nas amostras decontrole enquanto que as amostras do mutante permaneceram imutáveis.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Modificação genética da alface usando-se ems

Aproximadamente 2000 sementes das variedades da alfaceTroubadour, Apache, Yorvik.e Roderick foram incubadas em uma soluçãoventilada de 0.05% (w/v) ou 0.07% (w/v) ems durante 24 horas natemperatura ambiente. Após o tratamento do ems as sementes Ml foramenxaguadas: com água e plantadas em uma estufa a 20°C por em regime de 16horas com luz, 8 horas no escuro para cultivar as plantas maduras e caule efloração induzidos para produzir sementes M2. Após a maturação, assementes M2 foram colhidas, inchadas e armazenadas até uso posterior. Afreqüência da mutação foi estimada com base no número relativo de plantasindividuais com um fenótipo descorado que foram perturbadas na biossínteseda clorofila.

EXEMPLO 2

Desenvolvimento de um diagnóstico de triagem fenotípica para adescoloração induzida por lesão da alface baseada na formação de pigmentorosado

Uma análise fenotípica foi desenvolvida na qual adescoloração induzida por lesão da folha da alface pôde ser prontamenteavaliada. Esta abordagem permite a triagem da planta nova para descoloração.Discos de folha com diâmetro de 5mm foram coletados de plantas jovens, oumaduras e colocados entre papéis de filtro umedecidos em uma bandeja. Osistema foi incubado a 5°C por 7 dias. Durante a incubação uma pigmentaçãorosada desenvolveu-se no local lesionado do disco de folha e tornou-seclaramente visível como um círculo impresso no papel de filtro (Figura 2).

A fim de demonstrar que a produção da pigmentação rosadaexige um caminho fenilpropanóide ativo, os efeitos dos inibidores da PAL(cinamaldeído, Figura 3) e da PPO (L-cisteína, Figura 4) foram testadosnesta análise. Quando o cinamaldeído foi aplicado durante a análise, adescoloração rosada foi completamente inibida em uma concentração de0,01% ou mais alta.

Um resultado semelhante foi obtido usando-se L-cisteína emuma concentração de 0,001% e mais alta, enquanto outros aminoácidos comoa L-Ieucina ou L-alanina não apresentaram nenhum efeito. Isto demonstra quea L-cisteína pode inibir a resposta rosada dos discos da folha da alface e que oefeito inibitório da L-cisteína é específico.

A fim de demonstrar que a L-cisteína está atuandoverdadeiramente como um inibidor da atividade da PPO neste sistema, osdiscos de folha da alface foram incubados com substrato da PPO, L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). Embora L-DOPA não seja considerado, umsubstrato natural para a PPO da alface, uma descoloração castanho escuro apreto foi observada na superfície lesionada que é a manifestação da formaçãode melanina via PPO. Quando 1 mM ou uma concentração mais alta de L-cisteína foi aplicada simultaneamente, a descoloração foi inibidacompletamente segundo as indicações da Figura 5.

A resposta rosada do disco de folha da alface foiadicionalmente caracterizada aplicando-se um choque termal antes de induzira resposta à lesão. Folhas destacadas foram incubadas durante 90 segundos a21, 40, 50 e 60°C. Após este tratamento discos de folha foram coletados eanalisados para o rosado. A resposta rosada foi inibida completamente quandoo choque termal foi realizado a uma temperatura de 50°C ou mais alta. Esteresultado é mostrado na Figura 6.

Como a L-cisteína é conhecida por reagir com as o-quinonas,que são produtos da PPO5 convertendo-os de novo em difenóis incolores, osefeitos da L-cisteína na pigmentação rosada que vem dos discos da folha daalface foram determinados. Paralelamente o efeito da L-cisteína foideterminado na formação da melanina pela incubação com L-DOPA.

Discos de folha foram coletados e incubados de acordo com osprocedimentos descritos acima. Depois que a resposta da lesão foicompletada, uma série da concentração de L-cisteína foi adicionada ao discode folha e a mudança na cor foi monitorada. O resultado é mostrado naFigura 7. A experiência demonstrou claramente que a L-cisteína estavaconvertendo a pigmentação rosada de novo em um composto incolorenquanto que a melanina preta formada na análise de L-DOPA não foi afetadapela L-cisteína. Isto demonstra que a pigmentação rosada é muitoprovavelmente uma o-quinona que é formada pelo sistema de oxidação dopolifenol da alface.

Para demonstrar que a resposta in vitro observada reflete umaresposta que é fisiologicamente relevante a descoloração baseada em L-cisteína foi aplicada no material de planta cultivada no campo. Isto foirealizado colhendo-se uma folha de uma planta da alface cultivada no campoque apresentou severos sintomas de rosado ao longo das nervuras. Isto éobservado tipicamente quando as plantas foram forçadas, por exemplo, emcondições de saturação severa com água. A folha foi usada para preparar osdiscos de folha que foram incubados imediatamente com L-cisteína ImM.Após uma incubação de aproximadamente 30 minutos na temperaturaambiente, a descoloração rosada desapareceu segundo as indicações daFigura 8.

Considerados em conjunto, estes dados experimentais mostramque discos de folha da alface podem ser induzidos por lesão para produzirdescoloração rosada que é dependente da PAL e da PPO. Este fenótipopermite um procedimento de triagem eficiente e eficaz para os mutantes daalface que têm uma resposta de descoloração induzida por lesão modificadacanalizada via PAL, PPO ou ambos.

EXEMPLO 3

Triagem para mutantes com descoloração reduzida induzida por lesãoA fim de identificar mutantes da alface com baixo potencial deacastanhamento enzimático ou rosado induzido por lesão, a análise do discode folha descrito no Exemplo 2 foi aplicada às plantas de uma população dealface mutante.

Doze mil plantas foram cultivadas em uma estufa(Localização: De Lier, semeadura em 28 de março, plantio em 18 de abril;crescimento sob condições de cultivo regular da alface) e, de cada plantaindividual, foi coletado um disco de folha (amostragem de 15 de maio emdiante) e incubadas como grupos de (em média) 25 amostras entre papéis defiltro umedecidos a 50C por 7 dias. Um escore visual foi atribuído a cadadisco de folha dependendo da intensidade da descoloração rosada. Com basenesta avaliação, as plantas foram selecionadas daquelas cujos discos de folhaou não apresentaram, ou apresentaram um grau relativamente baixo dedescoloração da superfície lesionada. A planta com traços mal visíveis dedescoloração foi numerada como 06D.210202.

Das 12000 plantas, 1 planta foi finalmente selecionada, a queapresentou apenas traços de descoloração dificilmente visíveis e 11 queapresentaram um nível relativamente baixo de descoloração. O resultado deuma destas análises é mostrado na Figura 9.

A análise da descoloração foi repetida para os 12 indivíduosinicialmente selecionados e para a maioria dos casos individuais o resultadooriginal foi confirmado. Somente indivíduos confirmados foram selecionadospara uma análise posterior e produção de semente.

EXEMPLO 4

Triagem para mutantes com uma descoloração reduzida induzida por lesãoA fim de identificar mutantes da alface com baixo potencial deacastanhamento enzimático induzido por lesão a análise do disco da folhadescrito no Exemplo 2 foi aplicado às plantas de uma população da alfacemutante. 8500 plantas foram cultivadas em uma estufa até 3 semanas de idade(estágio de folha 6-8) e de cada planta individual um disco de folha foicoletado e incubado entre papéis de filtro umedecidos a 5°C por 7 dias.

Foi atribuído um escore visual para cada disco de folhadependendo da intensidade da descoloração rosada. Com base nestaavaliação, as plantas foram selecionadas daquelas cujos discos de folha ounão apresentaram, ou apresentaram um grau relativamente baixo dedescoloração da superfície lesionada. Das 8500 plantas 8 plantas que nãoapresentaram nenhuma descoloração visível foram selecionadas bem como 10que apresentaram descoloração relativamente baixa. A análise dadescoloração foi repetida para os 18 indivíduos que foram inicialmenteselecionados e para a maioria dos casos individuais o resultado original foiconfirmado. Doze indivíduos são mostrados na Figura 10. Somente osindivíduos confirmados foram selecionados para uma análise posterior eprodução de semente. Uma planta mutante sem efeitos pleiotrópicos colaterais(por exemplo, descoramento, encolhimento de tamanho) foi numerada como05D.202539. A semente produzida por autopolinização desta planta foinumerada como 050.810596 A semente produzida autopolinização de trêsplantas cultivadas de sementes da 05D.810596 foram numeradas como07G.9979 e depositadas em NCIMB. O número NCIAlB é 41441 (depositadoaos 10 de outubro de 2006).

EXEMPLO 5

Análise fenotípica de mutantes selecionados apresentando, descoloraçãoreduzida induzida por lesão

Dos 12 mutantes selecionados pela triagem apresentada noExemplo 3, 6 apresentaram um fenótipo de crescimento e descoramentofortemente reduzidos. Outros mutantes desenvolveram-se normalmente, istoé, de acordo com o tipo da população inicial da experiência de mutagênese.

Os mutantes apequenados e descorados são provavelmenteperturbados em função do cloroplasto. Uma vez que a PPO reside nestasorganelas celulares isto pode explicar a resposta relativamente baixa nasanálises do disco de folha. Porque estas mutações pleiotrópicas sãoindesejáveis, estes mutantes foram considerados como menos relevantes.

A planta mutante 06D.210202 que apresentou a redução maisforte da descoloração do disco de folha apresentou fenótipo normal e amutação é considerada, deste modo, específica para a descoloração semefeitos pleiotrópicos fortes.

EXEMPLO 6

Confirmação da quase ausência de fenótipo de descoloração na descendênciaPara demonstrar que a descoloração reduzida de mutantes daalface como a planta. 06D.210202 dos Exemplos 3 e 5 foi produzida por umefeito genético gerado pelo tratamento de mutagênese aqui descrito, sementefoi produzida por autopolinização. A semente produzida por autopolinizaçãoda planta 06D.210202 foi numerada como 06D.819784. As sementes foramgerminadas no solo e as plantas foram testadas para a descoloração usando-sea análise do rosado do disco de folha.

Esta experiência mostrou claramente que o fenótipo alteradotinha uma base genética uma vez que todas as plantas da progênieapresentaram um fenótipo similar, isto é, uma redução forte na descoloraçãorosada, como o mutante que foi usado para produzir as sementes. Esteresultado está ilustrado na Figura 11.

A semente produzida por autopolinização de três plantascultivadas das sementes da 06D.819784 foi numerada como 06D.863B2 edepositada em NCIMB. O número NCIMB é 41454 (depositado aos 3 dejaneiro de 2007).EXEMPLO 7

Desenvolvimento de um diagnóstico de triagem fenotípica para adescoloração induzida por lesão da alface baseada na formação do pigmentoacastanhado

As plantas da alface foram cultivadas à maturidade e partes defolhas externas foram coletadas cortando-se discos do tecido da nervura. Osdiscos foram incubados em papel de filtro umedecido a 16°C. Apósaproximadamente 72 horas, a superfície lesionada tornou-se acastanhada. Napresença de L-cisteína 10 mM a resposta de acastanhamento foi inibidaindicando que a descoloração observada foi mediada pela PPO. Um resultadorepresentativo desta experiência está mostrado na Figura 12.

Uma vez que a resposta como indicada na Figura 12 é umaresposta de acastanhamento mediada da PPO o procedimento de triagemcomo descrito neste exemplo pode ser considerado como eficaz e imparcialpara triar mutantes apresentando descoloração acastanhada reduzida queocorra durante o processamento da alface.

EXEMPLO 8

Desenvolvimento de um diagnóstico de triagem fenotípica para adescoloração induzida por lesão da alface baseada na conversão de L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) em um pigmento preto chamado melanina

Além das análises que tratam a descoloração induzida por lesãode maneira ampla, o método, de acordo com esta invenção, igualmentepermite triar de maneira mais específica mutantes que têm uma atividadereduzida da PPO. Uma análise fenotípica que seja indicativa da atividade daPPO foi desenvolvida usando-se discos de folha que foram incubados napresença de L-DOPA 1,5 mM. Uma vez a descoloração preta tornadaaparente pôde-se concluir que L-DOPA pode prontamente ser convertida pelosistema de oxidação de polifenol na superfície lesionada das folhas da alfaceem um pigmento preto chamado melanina. L-DOPA é convertida pela PPOem L-DOPA-quinona reativa que é convertida não-enzimaticamente viadopacromo e indol quinona em melanina preta.

Além disso, mostrou-se, que a reação pode ser inibidaadicionando-se L-cisteína 1 mM durante a reação (Figura 5).

Conseqüentemente, esta análise permite a identificação de mutantes que sãomodificados pela capacidade de criar uma atividade da PPO em umasuperfície lesionada de uma folha. A resposta de discos de folha da alface àpresença de L-DOPA pode ser observada tanto na solução quanto entre papéisde filtro umedecidos como mostrado na Figura 13.

EXEMPLO 9

Avaliando a descendência de um mutante apresentando uma quase ausênciade descoloração por resposta reduzida de acastanhamento usando-se análisedo acastanhamento do disco de nervura

Para demonstrar que a descoloração reduzida de mutantes daalface como a planta número 06D.210202 dos exemplos 3, 5 e 6 que temdescoloração rosada de superfícies lesionadas de discos de folhasignificativamente reduzida é, também, efetivamente reduzida na resposta deacastanhamento induzida por lesão, uma progênie de várias plantas foicultivada à maturidade.

Nesta etapa do desenvolvimento, 3 discos da nervura centralforam coletados das folhas externas de várias plantas da progênie. Estesdiscos da nervura foram incubados de acordo com o procedimento descrito noExemplo 7. Foi mostrado que as plantas da progênie do mutante queinicialmente foram apresentadas como fortemente reduzidas na descoloraçãorosada induzida por lesão foram, também, fortemente reduzidas noacastanhamento da nervura central induzido por lesão. O resultado destaexperiência está mostrado na Figura 14.

EXEMPLO 10

Avaliando a descendência de um mutante apresentando quase ausência dedescoloração por resposta reduzida do acastanhamento usando-se cabeçasde alfaces recém-colhidas embaladas em sacos de plástico

Cabeças maduras das plantas da alface cultivadas da sementenúmero 06D.819784 do Exemplo 6, que tem descoloração rosada desuperfícies lesionadas de discos de folha significativamente reduzida, foramcortadas em partes usando-se uma faca e embaladas em um saco de plásticocontendo atmosfera ambiente. Plantas de controle que apresentaram umaresposta normal da descoloração rosada do disco de folha foram tratadas demaneira idêntica. Os sacos foram armazenados a 4°C durante 6 dias depois doque o material da folha foi avaliado para sua resposta de acastanhamento.

Foi mostrado, nesta experiência, que as plantas da progênie domutante que inicialmente foram apresentadas como fortemente reduzidas nadescoloração rosada induzida por lesão foram, também, fortemente reduzidasno acastanhamento da nervura central induzido por lesão quando processadase armazenadas em sacos de plástico usando-se atmosfera ambiente. Oresultado desta experiência está mostrado na figura 15.

Claims (41)

1. Método para triar uma população de plantas ou partes deplantas quanto à presença nas mesmas de indivíduos apresentando umadescoloração superficial induzida por ferimento reduzida em comparação auma planta ou parte de planta de controle, caracterizado pelo fato decompreender:a) prover uma população de plantas ou partes de plantas dapopulação;b) criar uma superfície do ferimento sobre as plantas ou partesde planta a ser tríada e sobre as plantas ou partes de planta de controle;c) incubar as superfícies do ferimento para permitir que ocorradescoloração nas, ou, sobre as mesmas;d) observar a descoloração da superfície do ferimento na, ou,sobre as plantas ou partes de plantas;e) comparar a descoloração da superfície do ferimentoobservada com aquela observada na, ou, sobre as plantas ou partes de plantasa serem tríadas com a descoloração que é observada sobre, ou na planta ouparte de planta de controle para identificar plantas ou partes de plantas quenão apresentam descoloração ou uma descoloração reduzida em comparaçãocom a planta ou parte de planta de controle.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato das plantas serem hortaliças, plantas frutíferas ou plantas florescentes.

3. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato das plantas serem plantas hortaliças selecionadas dentre alface, endívia,escarola, batata, batata doce, aipo, cogumelos, alcachofra e berinjela.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato das plantas serem plantas frutíferas selecionadas dentre macieira,bananeira, abacateiro, pessegueiro, pereira, damasqueiro e mangueira.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato das plantas serem plantas selecionadas dentre gérbera e crisântemo.

6. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato das plantas pertencerem à família de Asteraceae, emparticular ao gênero Lactuca, mais em particular à espécie Lactuca sativa.

7. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato das plantas pertencerem ao gênero Cichorium e, emparticular, às espécies Ciehorium intybus e Ciehorium endivia.

8. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato das partes de plantas serem selecionadas de folhas, cabeças, brotos,raízes, tubérculos, caules, flores, frutas, sementes, sementes germinadas, oupedaços e células dos mesmos.

9. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizadopelo fato das partes de plantas serem discos de folha.

10. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7,caracterizado pelo fato das partes de plantas serem discos de tecido de nervuracentral.

11. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10,caracterizado pelo fato da população de plantas ser uma população de plantasmutantes, uma coleção de germoplasma, uma população de plantastransgênicas ou uma suspensão de célula mutada.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato da população de plantas mutantes ser obtida por um tratamento demutagênese usando produtos químicos e/ou irradiação.

13. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12,caracterizado pelo fato da incubação ocorrer em um ambiente aquoso.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato do ambiente aquoso compreender papel de filtro umedecido.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato do ambiente aquoso compreender água ou uma solução.

16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15,caracterizado pelo fato do ambiente aquoso conter um composto selecionadode L-3-4-dihidroxifenilalanina, ácido clorogênico, ácido isoclorogênico, L-tirosina e catecol.

17. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 16,caracterizado pelo fato da planta de controle ser uma planta da qual um discode folha, quando incubado entre duas lâminas de papel de filtro umedecidopor 7 dias a 5°C apresentar uma descoloração rósea ao redor das bordas.

18. Planta que apresenta uma descoloração superficialinduzida por ferimento reduzida, caracterizada pelo fato da planta poder serobtida pela sujeição de uma população de plantas a um método de triagemcomo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, e selecionarplantas da população que não apresentem descoloração superficial na triagemou apresentem uma descoloração superficial na triagem que seja reduzida emcomparação a uma planta de controle.

19. Planta de acordo com a reivindicação 18, caracterizadapelo fato da planta ser uma planta hortaliça, planta frutífera ou plantaflorescente.

20. Planta de acordo com a reivindicação 19, caracterizadapelo fato da planta ser uma planta hortaliça selecionada dentre alface, endívia,escarola, batata, batata doce, aspargo, cogumelos, alcachofra e berinjela.

21. Planta de acordo com a reivindicação 19, caracterizadapelo fato da planta ser uma planta frutífera selecionada dentre macieira,bananeira, abacateiro, pessegueiro, pereira, damasqueiro e mangueira.

22. Planta de acordo com a reivindicação 19, caracterizadapelo fato pelo fato da planta ser uma planta florescente selecionada dentregérbera e crisântemo.

23. Planta de acordo com a reivindicação 18, caracterizadapelo fato de pertencer à família de Asteraceae, em particular ao gêneroLactuca, mais em particular às espécies Lactuca sativa.

24. Planta de acordo com a reivindicação 18, caracterizadapelo fato de pertencer ao gênero Ciehorium e, em particular, às espéciesCiehorium intybus e Ciehorium endivia.

25. Planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 18a 24, caracterizada pelo fato da planta apresentar uma descoloração da folhainduzida por ferimento reduzida e nenhum efeito pleiotrópico negativo.

26. Planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 18a 20 e 23, caracterizada pelo fato da planta ser um pé de alface cuja sementefoi depositada com o NCIMB na data e sob o número de acesso listado naTabela 1.

27. Planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 18a 25, caracterizada pelo fato da planta poder ser obtida pelo cruzamento deuma planta como definida na reivindicação 26 com outra planta da mesmaespécie.

28. Progênie de uma planta originária como definida emqualquer uma das reivindicações 18a 27, caracterizada pelo fato de apresentara ausência ou redução de descoloração de folha induzida por ferimento comoencontrada na planta originária.

29. Parte de uma planta, caracterizada pelo fato de ser comodefinida em qualquer uma das reivindicações 18 a 28.

30. Parte de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelofato da parte ser selecionada dentre folha, cabeça, caule, broto, raiz, tubérculo,fruto, flor, semente ou pedaços dos mesmos, e células.

31. Parte de acordo com a reivindicação 29 ou 30,caracterizada pelo fato da parte poder ser obtida pelo método como definidoem qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

32. Planta regenerada de uma parte de planta como definida nareivindicação 29, 30 ou 31, caracterizada pelo fato de apresentar a ausência ouredução de descoloração de folha induzida por ferimento como encontrada naorigem.

33. Semente de uma planta, caracterizada pelo fato de sercomo definida em qualquer uma das reivindicações 18 a 28 e 32.

34. Progênie de uma semente como definida na reivindicação-33, caracterizada pelo fato de apresentar a ausência ou redução dedescoloração de folha induzida por ferimento como encontrada na origem.

35. Produto de hortaliça, caracterizado pelo fato decompreender uma planta de hortaliça ou sua parte como definida em qualqueruma das reivindicações 18 a 20, 23 a 34.

36. Produto de hortaliça de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato da hortaliça ser uma hortaliça folhosa.

37. Produto de hortaliça de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato da hortaliça ser selecionada dentre alface, endívia echicória.

38. Produto de hortaliça de acordo com a reivindicação 37,caracterizado pelo fato do produto ser alface processada, chicória processada,endívia processada ou suas combinações.

39. Fruto, caracterizado pelo fato de ser derivado de umaplanta como definida em qualquer uma das reivindicações 18 a 19, 21, 28 a 34.

40. Flor, caracterizada pelo fato de ser derivada de uma plantacomo definida em qualquer uma das reivindicações 18 a 19, 22, 28 a 34.

41. Produto de acordo com qualquer uma das reivindicações-38 a 41, caracterizado pelo fato do produto, ao ser triado pelo método comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, apresentar nenhuma oulimitada descoloração de folha induzida por ferimento.