ES3058844T3 - Synthetic liver-tropic adeno-associated virus capsids and uses thereof - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a cápsides virales adenoasociadas sintéticas dirigidas al hígado y a vectores virales que las comprenden. La invención también se refiere a métodos para usar los vectores para dirigirse al hígado y proporcionar expresión hepática específica, así como para transducir hepatocitos primarios y líneas celulares humanas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Cápsides sintéticas de virus adenoasociados con tropismo hepático y sus usos

[0003] Antecedentes de la invención

[0004] El virus adenoasociado (AAV) es un vector prometedor para la terapia génicain vivodebido a su eficiente transferencia génica y a la expresión persistente del transgén en una variedad de tejidos. Los vectores AAV han demostrado un buen perfil de seguridad y han logrado efectos terapéuticos en ensayos clínicos de terapia génica. Algunos nuevos serotipos de AAV se caracterizaron por una mejora considerable de la eficiencia de transducción en el corazón, los músculos y el SNC mediante la administración sistémica de genes. Otros son eficaces en la transferencia génica al hígado en animales pequeños. Estos hallazgos arrojan luz sobre la terapia génica de numerosas enfermedades genéticas y metabólicas. Además de la identificación de nuevos serotipos, la modificación genética también podría mejorar aún más el vector AAV para su aplicación clínica. Una cuestión que se plantea al utilizar el vector AAV es su amplio tropismo tisular, que a menudo da lugar a la transferencia génica en tejidos no deseados y plantea posibles problemas de seguridad en la expresión génica ectópica. Para mejorar la especificidad tisular y la capacidad de orientación tisular de las partículas virales del AAV, la mutagénesis aleatoria de los genes de la cápside, además de la ingeniería racional, es una de las formas más poderosas de aumentar la diversidad de las cápsides y alterar su tropismo hacia los tejidos deseados. La evolución dirigida, como el reordenamiento del ADN, es uno de los enfoques desarrollados recientemente para la ingeniería genética de los genes de la cápside del AAV.

[0005] El reordenamiento del ADN es un método de fragmentación aleatoria seguido de un reensamblaje mediante PCR para introducir o intercambiar nuevas mutaciones genéticas en los genes mediante recombinación homóloga irregular. El AAV evoluciona de forma natural hacia diferentes serotipos con tropismo tisular o inmunogenicidad variables. Los genescapdel AAV de estos serotipos son también las plantillas ideales para la generación de nuevos recombinantes mediante el reordenamiento de su ADN y la selección de mutantes y variantes funcionalmente viables. Los genescapmodificados del AAV se clonan en un vector plasmídico adecuado para la producción de una biblioteca de virus quiméricos con propiedades biológicas muy diversificadas y para una mayor caracterización de su tropismo tisular. Se han utilizado varios sistemasin vitrobasados en líneas celulares cultivadas para el cribado de vectores virales después del reordenamiento del ADN. Sin embargo, en las aplicaciones de terapia génica, los vectores AAV tienen que enfrentarse a entornos fisiológicos más complicados en el cuerpo humano o animal, por ejemplo, un gran número de proteínas séricas, anticuerpos potencialmente neutralizantes y no neutralizantes, barreras endoteliales, el tropismo directo y la infectividad de las células diana, etc. A menudo, los vectores modificados que parecen ser trópicos para el hígado cuando se pruebanin vitrono se dirigen adecuadamente al hígado cuando se utilizanin vivo.

[0006] Existe la necesidad en la técnica de vectores AAV con tropismo hepático mejorados que proporcionen beneficios para su usoin vivo.

[0007] Compendio de la invención

[0008] La invención se describe en las reivindicaciones adjuntas.

[0009] La presente invención se basa, en parte, en el uso de una estrategia en la que los genescapde diferentes serotipos naturales de AAV se diversificaron drásticamente mediante recombinaciónin vitroutilizando el reordenamiento de ADN. Las bibliotecas de genes de la cápside de AAV resultantes, que contenían una amplia permutación de mutantes y variantes, se seleccionaron primero directamentein vivoen ratones. Teniendo en cuenta las barreras para identificar vectores que sean eficacesin vivo, las bibliotecas de AAV se seleccionaron directamente en ratones C57BL/6Jin vivoen el hígado para imitar el entorno realistain vivoen situaciones preclínicas o clínicas. Los genes de la cápside enriquecidos preliminarmente se seleccionaron posteriormente en células cultivadas, para una selección adicional de cápsides de AAV novedosas tropistas de tejidos y tipos celulares, incluidas las cápsides tropistas del hígado. Se descubrió que un gen de la cápside estaba muy enriquecido en el hígado de ratón y también era muy infeccioso para las líneas celulares de cáncer de hígado humano y los hepatocitos humanos primarios.

[0010] Breve descripción de los dibujos

[0011] LasFig. 1A-1Bmuestran la comparaciónin vivode las cápsides AAV XL12 y XL32 con tropismo hepático con AAV9 en cuanto a la eficiencia de transferencia génica al hígado. Los vectores informadores LacZ y GFP se empaquetaron en AAV9, AAVXL12 y AAVXL32. Los vectores se purificaron, se titularon y se inyectaron por vía intravenosa a través de la vena caudal de ratones C57B/6 adultos a una dosis de 5x10<12>vg (genomas vectoriales)/kg de peso corporal. Tres semanas después, se sacrificaron los ratones y se tiñeron secciones finas del hígado con X-gal para detectar la expresión de LacZ (Fig. 1A); o se montaron directamente y se tomaron fotografías fluorescentes para detectar la expresión de GFP (Fig.1B).

[0012] LaFig. 2muestra la comparaciónin vitrode las cápsides AAV XL12 y XL32 con tropismo hepático con AAV9 en cuanto a la eficiencia de transferencia génica en la línea celular Huh7 de cáncer de hígado humano. Se utilizaron vectores informadores LacZ empaquetados en AAV9, XL12 y XL32 para transducir células Huh7 a una multiplicidad de infección (moi) de 1x10<5>vg/célula y 1x10<4>vg/célula. Tres días después, se realizó una tinción con X-gal para detectar la expresión de LacZ.

[0013] LasFig.3A-3Dmuestran la comparaciónin vitrode las cápsides XL12 y XL32 del AAV con tropismo hepático con otros serotipos del AAV en cuanto a la eficiencia de transferencia génica en un cultivo de hepatocitos primarios humanos. Los vectores informadores GFP se empaquetaron en AAVXL12, AAVXL32 y otras múltiples cápsides de serotipos de uso común. Los vectores AAV-GFP se utilizaron para infectar un cultivo de hepatocitos primarios humanos a una moi de 1x10<5>vg/célula. Se tomaron fotografías con fluorescencia verde a las 24 y 48 horas, o diariamente hasta 7 días. (A) Expresión de GFP a las 24 horas tras la infección con vectores AAV-GFP en hepatocitos primarios humanos de tres donantes. (B) Expresión de GFP a las 48 horas. (C) Expresión del gen GFP AAVXL12 y AAVXL32 entre 1 y 7 días después de la infección en hepatocitos del paciente donante n.º 4021. (D) Expresión del gen GFP AAVXL12 y AAVXL32 entre 1 y 7 días después de la infección en hepatocitos del paciente donante n.º 4073. Se observó una expresión altamente eficaz y creciente del gen GFP.

[0014] LasFig.4A-4Cmuestran la comparaciónin vitrode las cápsides XL12 y XL32 del AAV con tropismo hepático con otros serotipos del AAV en cuanto a la eficiencia de transferencia génica en un cultivo de hepatocitos primarios caninos. Los vectores informadores GFP se empaquetaron en AAVXL12, AAVXL32 y otras múltiples cápsides de serotipos de uso común. Los vectores AAV-GFP se utilizaron para infectar un cultivo de hepatocitos primarios caninos a una moi de 1x10<5>vg/célula. Se tomaron fotografías con fluorescencia verde a las 24 y 48 horas. (A) Expresión de GFP a las 24 y 48 horas en hepatocitos primarios criopreservados (perro DBCP01). (B) Expresión de GFP a las 24 horas en hepatocitos primarios recién aislados (perro DBF24). (C) Expresión de GFP a las 48 horas en hepatocitos primarios aislados frescos (perro DBF24). Se observó una expresión altamente eficiente y creciente del gen GFP en las células infectadas con AAV6, AAVXL12 y AAVXL32.

[0015] LaFig. 5muestra la comparación de la eficiencia de transducción de AAVXL32 y AAV8 en el hígado de monos macacos rhesus adultos mediante la administración intravenosa del vector. Se inyectaron por vía intravenosa vectores AAV a monos macacos rhesus machos adultos de 3 a 5 años de edad con un título de anticuerpos neutralizantes en suero inferior a 1:8. A dos monos se les inyectó AAVXL32-CB-GFP y a otros dos se les inyectó AAV-CB-GFP en una dosis de 1x10<12>vg/kg de peso corporal. El casete de expresión del vector AAV estaba en forma de doble cadena (también llamada autocomplementaria) para una expresión génica más rápida y eficiente. Dos semanas después, se sacrificó a los monos y se tomaron muestras de tejido hepático para realizar secciones criogénicas finas y fotografías con fluorescencia verde. Algunos hepatocitos positivos para GFP se resaltan con flechas.

[0016] La Fig. 6 muestra el análisis en gel de proteínas de las cápsides AAVXL32 y AAVXL32.1. Se cargaron AAVXL32 y AAVXL32.1 altamente purificados a una concentración de 1x10<11>partículas por carril y se analizaron en gel SDS-PAGE y se visualizaron mediante tinción con plata. Las flechas resaltan las proteínas típicas de la cápside del AAV VP1, VP2 y VP3. La punta de flecha resalta la proteína extra de la cápside VPX en el AAVXL32, posiblemente como resultado de un codón de inicio más débil generado por una mutación de CTC a CTG. La reversión de CTG a CTC eliminó esta proteína en el AAVXL32.1.

[0017] Descripción detallada de la invención

[0019] La presente invención se basa, en parte, en el desarrollo de secuencias sintéticas de la cápside del AAV que son capaces de transducir hepatocitosin vivoein vitro. Las cápsides sintéticas pueden utilizarse para crear vectores AAV para su uso en aplicaciones de investigación o terapéuticas en las que se desea una transferencia génica específica del hígado sin una biodistribución extensa del vector a otros órganos.

[0020] La presente invención se explica con más detalle a continuación

[0021] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. La terminología utilizada en la descripción de la invención en el presente documento tiene como único objetivo describir realizaciones particulares y no pretende limitar la invención.

[0022] Las secuencias de nucleótidos se presentan aquí solo como cadenas simples, en la dirección 5' a 3', de izquierda a derecha, a menos que se indique específicamente lo contrario. Los nucleótidos y aminoácidos se representan aquí de la manera recomendada por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB, o (para los aminoácidos) mediante el código de una letra o el código de tres letras, ambos de conformidad con 37 C.F.R. §1.822 y el uso establecido.

[0023] Salvo que se indique lo contrario, se pueden utilizar métodos estándar conocidos por los expertos en la materia para la producción de polipéptidos recombinantes y sintéticos, anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, la manipulación de secuencias de ácido nucleico, la producción de células transformadas, la construcción de construcciones rAAV, proteínas de cápside modificadas, vectores de empaquetamiento que expresan las secuencias rep y/o cap del AAV, y células de empaquetamiento transfectadas de forma transitoria y estable. Dichas técnicas son conocidas por los expertos en la materia. Véase, p. ej., SAMBROOK et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2.ª Ed. (Cold Spring Harbor, Nueva York, EE. UU., 1989); F. M. AUSUBEL et al. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, EE. UU.).

[0024] I. Definiciones.

[0025] La designación de todas las posiciones de aminoácidos en las subunidades de la cápside del AAV en la descripción de la invención y en las reivindicaciones adjuntas se refiere a la numeración de la subunidad de la cápside VP1. Tal y como se utilizan en la descripción de la invención y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" pretenden incluir también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Tal y como se utiliza en el presente documento, "y/o" se refiere y abarca todas y cada una de las combinaciones posibles de uno o más de los elementos asociados enumerados, así como la ausencia de combinaciones cuando se interpreta de forma alternativa ("o").

[0026] Además, la presente invención también contempla que, en algunas realizaciones de la invención, cualquier característica o combinación de características aquí expuestas pueda excluirse u omitirse.

[0027] Además, el término "aproximadamente", tal y como se utiliza en el presente documento cuando se refiere a un valor medible, como la cantidad de un compuesto o agente de la presente invención, la dosis, el tiempo, la temperatura y similares, pretende abarcar variaciones de ± 10 %, ± 5 %, ± 1 %, ± 0,5 % o incluso ± 0,1 % de la cantidad especificada. El término "que consiste esencialmente en", tal y como se utiliza en el presente documento en relación con un ácido nucleico, una proteína o una estructura de cápside, significa que el ácido nucleico, la proteína o la estructura de cápside no contienen ningún elemento distinto del/de los elemento(s) mencionado(s) que altere significativamente (por ejemplo, en más de aproximadamente un 1 %, 5 % o 10 %) la función de interés del ácido nucleico, la proteína o la estructura de la cápside, por ejemplo, el perfil de tropismo de la proteína o la cápside o una proteína o cápside codificada por el ácido nucleico.

[0028] El término "virus adenoasociado" (AAV) en el contexto de la presente invención incluye, sin limitación, el AAV tipo 1, el AAV tipo 2, el AAV tipo 3 (incluidos los tipos 3A y 3B), AAV tipo 4, AAV tipo 5, AAV tipo 6, AAV tipo 7, AAV tipo 8, AAV tipo 9, AAV tipo 10, AAV tipo 11, AAV aviar, AAV bovino, AAV canino, AAV equino y AAV ovino, y cualquier otro AAV conocido actualmente o descubierto posteriormente. Véase, p. ej., BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volumen 2, capítulo 69 (4.ª ed., Lippincott-Raven Publishers). Se han identificado varios serotipos y clados adicionales de AAV (véase, p. ej., Gao et al., (2004) J. Virol.78:6381-6388 yTabla 1), que también están abarcados en el término "AAV".

[0029] Las secuencias genómicas de diversos AAV y parvovirus autónomos, así como las secuencias de los ITR, las proteínas Rep y las subunidades de la cápside, son conocidas en la técnica. Estas secuencias pueden encontrarse en la bibliografía o en bases de datos públicas como la base de datos GenBank<®>. Véanse, p. ej., los números de acceso a GenBank<®>NC 002077, NC 001401, NC 001729, NC 001863, NC 001829, NC 001862, NC 000883, NC 001701, NC 001510, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, NC 001358, NC 001540, AF513851, AF513852, AY530579, AY631965, AY631966. Véase, p. ej., Srivistava et al., (1983) J. Virol.45:555; Chiorini et al., (1998) J. Virol. 71:6823; Chiorini et al., (1999) J. Virol. 73:1309; Bantel-Schaal et al., (1999) J. Virol. 73:939; Xiao et al., (1999) J. Virol. 73:3994; Muramatsu et al., (1996) Virology 221:208; Shade et al., (1986) J. Virol.58:921; Gao et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854; publicaciones de patente internacional WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; patente de EE. UU. n.º 6,156,303. Véase también laTabla 1. Una descripción temprana de las secuencias de repetición terminal de AAV1, AAV2 y AAV3 es proporcionada por Xiao, X., (1996), "Characterization of Adeno- associated virus (AAV) DNA replication and integration," tesis doctoral, University of Pittsburgh, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU..

[0030] Una secuencia codificante de cápside de ácido nucleico AAV "quimérica" o proteína de cápside AAV es aquella que combina partes de dos o más secuencias de cápside. Un virión o partícula AAV "quimérica" comprende una proteína de cápside AAV quimérica.

[0031] El término "tropismo", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a la entrada preferencial del virus en determinados tipos de células o tejidos y/o a la interacción preferencial con la superficie celular que facilita la entrada en determinados tipos de células o tejidos, seguida opcionalmente y de forma preferente por la expresión (por ejemplo, la transcripción y, opcionalmente, traducción) de secuencias transportadas por el genoma viral en la célula, por ejemplo, para un virus recombinante, la expresión de la secuencia o secuencias de nucleótidos heterólogas. Los expertos en la materia comprenderán que la transcripción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga del genoma viral puede no iniciarse en ausencia de factores de acción trans, por ejemplo, para un promotor inducible o una secuencia de ácido nucleico regulada de otro modo. En el caso de un genoma rAAV, la expresión génica del genoma viral puede provenir de un provirus integrado de forma estable y/o de un episoma no integrado, así como de cualquier otra forma que pueda adoptar el ácido nucleico del virus dentro de la célula.

[0032] Tabla 1

[0033]

[0034]

[0036] El término "perfil de tropismo" se refiere al patrón de transducción de una o más células, tejidos y/u órganos diana. Los ejemplos representativos de cápsides AAV sintéticas tienen un perfil de tropismo caracterizado por una transducción eficiente de las células del hígado con una transducción baja de otros órganos.

[0037] El término "específico para hepatocitos", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un vector viral que, cuando se administrain vivo, transduce preferentemente los hepatocitos con una transducción mínima de células fuera del hígado. En algunas realizaciones, al menos alrededor del 80 % de las células transducidas son hepatocitos, por ejemplo, al menos alrededor del 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más hepatocitos.

[0038] El término "trastorno tratable mediante la expresión de un producto en el hígado", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una enfermedad, trastorno o lesión en la que la expresión de un producto (por ejemplo, una proteína o un polinucleótido) en el hígado proporciona un tratamiento o prevención eficaz del trastorno.

[0039] Tal y como se utiliza en el presente documento, la "transducción" de una célula por un vector viral (por ejemplo, un vector AAV) significa la entrada del vector en la célula y la transferencia de material genético a la célula mediante la incorporación de ácido nucleico en el vector viral y la posterior transferencia a la célula a través del vector viral. A menos que se indique lo contrario, la "transducción eficiente" o el "tropismo eficiente", o términos similares, pueden determinarse por referencia a un control positivo o negativo adecuado (por ejemplo, al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más de la transducción o el tropismo, respectivamente, de un control positivo, o al menos alrededor del 110 %, 120 %, 150 %, 200 %, 300 %, 500 %, 1000 % o más de la transducción o el tropismo, respectivamente, de un control negativo).

[0040] De manera similar, se puede determinar si un virus "no transduce de manera eficiente" o "no tiene un tropismo eficiente" para un tejido diana, o términos similares, por referencia a un control adecuado. En realizaciones particulares, el vector viral no transduce eficazmente (es decir, no tiene un tropismo eficaz para) tejidos fuera del hígado, por ejemplo, músculos, riñones, gónadas y/o células germinales. En realizaciones particulares, la transducción indeseable de tejido(s) (por ejemplo, el hígado) es del 20 % o menos, del 10 % o menos, del 5 % o menos, del 1 % o menos, del 0,1 % o menos del nivel de transducción del/de los tejido(s) diana deseado(s) (por ejemplo, hepatocitos). Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "polipéptido" abarca tanto péptidos como proteínas, a menos que se indique lo contrario.

[0041] Un "ácido nucleico" o "secuencia de nucleótidos" es una secuencia de bases nucleotídicas y puede ser ARN, ADN o secuencias híbridas de ADN-ARN (incluidos nucleótidos naturales y no naturales), pero es preferiblemente secuencias de ADN de cadena simple o doble

[0042] Tal y como se utiliza en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico o nucleótido "aislada" (por ejemplo, un "ADN aislado" o un "ARN aislado") significa una secuencia de ácido nucleico o nucleótido separada o sustancialmente libre de al menos algunos de los otros componentes del organismo o virus natural, por ejemplo, los componentes estructurales celulares o virales u otros polipéptidos o ácidos nucleicos que se encuentran comúnmente asociados con la secuencia de ácido nucleico o nucleótido.

[0043] Del mismo modo, un polipéptido "aislado" significa un polipéptido que está separado o sustancialmente libre de al menos algunos de los otros componentes del organismo o virus natural, por ejemplo, la célula o los componentes estructurales virales u otros polipéptidos o ácidos nucleicos que se encuentran comúnmente asociados con el polipéptido.

[0044] Por el término "tratar", "tratamiento" o "tratamiento de" (o términos gramaticalmente equivalentes) se entiende que la gravedad de la afección del sujeto se reduce o, al menos, mejora o alivia parcialmente, y/o que se logra algún alivio, mitigación o disminución de al menos un síntoma clínico, y/o que se retrasa la progresión de la afección, y/o se previene o retrasa la aparición de una enfermedad o trastorno.

[0045] Tal y como se utiliza en el presente documento, los términos "prevenir", "prevención" o "previene" (y sus equivalentes gramaticales) se refieren a un retraso en la aparición de una enfermedad o trastorno o a la disminución de los síntomas tras la aparición de la enfermedad o trastorno. Los términos no pretenden implicar la abolición completa de la enfermedad y abarcan cualquier tipo de tratamiento profiláctico que reduzca la incidencia de la afección o retrase su aparición y/o progresión.

[0046] Una cantidad "eficaz" o "terapéuticamente eficaz", tal y como se utiliza en el presente documento, es una cantidad suficiente para proporcionar alguna mejora o beneficio al sujeto. En otras palabras, una cantidad "eficaz" o "terapéuticamente eficaz" es una cantidad que proporcionará algún alivio, mitigación o disminución de al menos un síntoma clínico en el sujeto. Los expertos en la materia comprenderán que los efectos terapéuticos no tienen por qué ser completos o curativos, siempre que se proporcione algún beneficio al sujeto.

[0047] Una "secuencia de nucleótidos heteróloga" o "ácido nucleico heterólogo" es una secuencia que no se produce de forma natural en el virus. Generalmente, el ácido nucleico heterólogo o la secuencia de nucleótidos comprende un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido y/o un ARN no traducido.

[0048] Un "polipéptido terapéutico" puede ser un polipéptido que puede aliviar o reducir los síntomas que se derivan de la ausencia o el defecto de una proteína en una célula o sujeto. Además, un "polipéptido terapéutico" puede ser un polipéptido que de otro modo confiere un beneficio a un sujeto, por ejemplo, efectos anticancerígenos o mejora de la supervivencia tras un trasplante.

[0049] Tal y como se utiliza en el presente documento, los términos "vector", "vector viral", "vector de administración" (y términos similares) se refieren generalmente a una partícula viral que funciona como vehículo de administración de ácido nucleico y que comprende el ácido nucleico viral (es decir, el genoma del vector) empaquetado dentro del virión. Los vectores virales según la presente invención comprenden una cápside AAV sintética según la invención y pueden empaquetar un genoma AAV o rAAV o cualquier otro ácido nucleico, incluidos los ácidos nucleicos virales. Alternativamente, en algunos contextos, los términos "vector", "vector viral", "vector de administración" (y términos similares) pueden utilizarse para referirse al genoma del vector (por ejemplo, ADNv) en ausencia del virión y/o a una cápside viral que actúa como transportador para administrar moléculas unidas a la cápside o empaquetadas dentro de la cápside.

[0050] Un "genoma de vector AAV recombinante" o "genoma rAAV" es un genoma AAV (es decir, ADNv) que comprende al menos una repetición terminal invertida (por ejemplo, una, dos o tres repeticiones terminales invertidas) y una o más secuencias de nucleótidos heterólogos. Los vectores rAAV generalmente conservan las repeticiones terminales (TR) de 145 bases en cis para generar el virus; sin embargo, las TR de AAV modificadas y las TR no AAV, incluidas las secuencias parcial o totalmente sintéticas, también pueden servir para este propósito. Todas las demás secuencias virales son prescindibles y pueden suministrarse entrans(Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbial. Immunol.158:97). El vector rAAV comprende, opcionalmente, dos TR (por ejemplo, TR de AAV), que generalmente se encontrarán en los extremos 5' y 3' de la secuencia o secuencias de nucleótidos heterólogas, pero no es necesario que sean contiguos a ellas. Las TR pueden ser iguales o diferentes entre sí. El genoma del vector también puede contener un único ITR en su extremo 3' o 5'.

[0051] El término "repetición terminal" o "TR" incluye cualquier repetición terminal viral o secuencia sintética que forme una estructura en horquilla y funcione como una repetición terminal invertida (es decir, que medie las funciones deseadas, como la replicación, el empaquetamiento del virus, la integración y/o el rescate del provirus, y similares). La TR puede ser una TR de AAV o una TR no AAV. Por ejemplo, una secuencia TR no AAV, como las de otros parvovirus (por ejemplo, el parvovirus canino (CPV), el parvovirus murino (MVM) parvovirus humano B-19) o la horquilla SV40 que sirve como origen de la replicación del SV40, puede utilizarse como TR, que puede modificarse aún más mediante truncamiento, sustitución, deleción, inserción y/o adición. Además, el TR puede ser parcial o totalmente sintético, como la "secuencia doble D" descrita en la patente de EE. UU. n.º 5,478,745 de Samulski et al.

[0052] Una "repetición terminal del AAV" o "TR del AAV" puede proceder de cualquier AAV, incluidos, entre otros, los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11, o cualquier otro AAV conocido actualmente o descubierto posteriormente (véase, por ejemplo, laTabla 1). Una repetición terminal de AAV no necesita tener la secuencia de repetición terminal nativa (por ejemplo, una secuencia TR de AAV nativa puede modificarse mediante inserción, deleción, truncamiento y/o mutaciones sin sentido), siempre que la repetición terminal medie las funciones deseadas, por ejemplo, replicación, empaquetamiento del virus, integración y/o rescate del provirus, y similares.

[0053] Los términos "partícula rAAV" y "virión rAAV" se utilizan indistintamente aquí. Una "partícula rAAV" o "virión rAAV" comprende un genoma vectorial rAAV empaquetado dentro de una cápside AAV.

[0054] La estructura de la cápside AAV se describe con más detalle en BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volumen 2, capítulos 69 y 70 (4.ª ed., Lippincott-Raven Publishers).

[0055] Por "retener sustancialmente" una propiedad, se entiende que se retiene al menos aproximadamente el 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de la propiedad (por ejemplo, la actividad u otra característica medible).II. Cápsides de AAV sintéticas dirigidas al hígado.

[0056] Los inventores han identificado estructuras de cápsides de AAV sintéticas capaces de proporcionar la transducción de hepatocitos humanos y de otros mamíferosin vivoein vitrocon un tropismo mínimo para otros órganos. Por lo tanto, un aspecto de la divulgación se refiere a estructuras de cápsides de AAV sintéticas capaces de proporcionar la transferencia de genes al hígado en un sujeto, por ejemplo, un sujeto de tipo salvaje. En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a un ácido nucleico que codifica una cápside de AAV, el ácido nucleico comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia codificante de cápside de AAV que es al menos un 90 % idéntica a: (a) la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-3; o (b) una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las SEQ ID NO: 4-6; y virus que comprenden las cápsides AAV quiméricas En algunas realizaciones, la secuencia codificante de la cápside del AAV es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 % o 99,9 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de (a) o (b). En otra realización, la secuencia codificante de la cápside del AAV comprende, consiste esencialmente en o consiste en la secuencia de nucleótidos de (a) o (b).

[0058] Las SEQ ID NO: 4-6 muestran la secuencia de la proteína de la cápside VP1. La designación de todas las posiciones de aminoácidos en la descripción de la invención y en las reivindicaciones adjuntas se refiere a la numeración de VP1. Los expertos en la materia comprenderán que la cápside del AAV generalmente contiene también las proteínas de la cápside VP2 y VP3, que son más pequeñas. Debido a la superposición de las secuencias codificantes de las proteínas de la cápside del AAV, las secuencias codificantes de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la cápside VP2 y VP3 serán evidentes a partir de las secuencias VP1 mostradas en las secuencias descritas. En particular, la VP2 comienza en el nucleótido 412 (acg) de la SEQ ID NO:1 y la treonina 138 de la SEQ ID NO:4. La VP3 comienza en el nucleótido 610 (atg) de la SEQ ID NO:1 y la metionina 204 de la SEQ ID NO:4. En determinadas realizaciones, se contemplan proteínas de cápside VP2 y VP3 aisladas que comprenden la secuencia de SEQ ID NO:4-6 y ácidos nucleicos aislados que codifican las proteínas VP2 o VP3, o ambas.

[0060] La divulgación también proporciona proteínas de cápside AAV sintéticas y cápsides sintéticas, el cápside comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO:4-6. En algunas realizaciones, la secuencia de la cápside del AAV es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 % o 99,9 % idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NO: 4-6. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO:4-6, en la que 1, 2 o menos, 3 o menos, 4 o menos, 5 o menos, 6 o menos, 7 o menos, 8 o menos, 9 o menos, 10 o menos, 12 o menos, 15 o menos, 20 o menos, 25 o menos, 30 o menos, 40 o menos, o 50 o menos de los aminoácidos dentro de la secuencia codificante de la proteína de la cápside de SEQ ID NO:4-6 se sustituyen por otro aminoácido (natural, modificado y/o sintético), opcionalmente una sustitución conservadora de aminoácidos, y/o se eliminan y/o hay inserciones (incluidas extensiones N-terminales y C-terminales) de 1, 2 o menos, 3 o menos, 4 o menos, 5 o menos, 6 o menos, 7 o menos, 8 o menos, 9 o menos, 10 o menos, 12 o menos, 15 o menos, 20 o menos, 25 o menos, 30 o menos, 40 o menos, o 50 o menos aminoácidos o cualquier combinación de sustituciones, deleciones y/o inserciones, en las que las sustituciones, deleciones y/o inserciones no perjudican indebidamente la estructura y/o función de un virión (por ejemplo, un virión AAV) que comprende la proteína de la cápside variante o la cápside. En algunas realizaciones, los aminoácidos dentro de la secuencia codificante de la proteína de la cápside de SEQ ID NO:4-6 se sustituyen por otro aminoácido en la posición 220 y/o 643 (numeración con respecto a SEQ ID NO: 4). Por ejemplo, en realizaciones representativas de la divulgación, un virión AAV que comprende la proteína de cápside sintética conserva sustancialmente al menos una propiedad de un virión sintético que comprende una proteína de cápside sintética, tal como se muestra en SEQ ID NO:4-6. Por ejemplo, el virión que comprende la proteína de cápside sintética puede conservar sustancialmente el perfil de tropismo hepático de un virión que comprende la proteína de cápside AAV sintética, tal como se muestra en SEQ ID NO:4-6. Los métodos para evaluar propiedades biológicas tales como la transducción viral son bien conocidos en la técnica (véanse, p. ej., los Ejemplos).

[0062] Las sustituciones conservadoras de aminoácidos son conocidas en la técnica. En realizaciones particulares, una sustitución conservadora de aminoácidos incluye sustituciones dentro de uno o más de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y/o fenilalanina, tirosina.

[0064] Será evidente para los expertos en la materia que las secuencias de aminoácidos de la proteína de la cápside del AAV quimérico de SEQ ID NO:4-6 pueden modificarse aún más para incorporar otras modificaciones conocidas en la técnica con el fin de conferir las propiedades deseadas. Como posibilidades no limitativas, la proteína de la cápside puede modificarse para incorporar secuencias de orientación (por ejemplo, RGD) o secuencias que faciliten la purificación y/o la detección. Por ejemplo, la proteína de la cápside se puede fusionar con la totalidad o una parte de la glutatión-S-transferasa, la proteína de unión a maltosa, un dominio de unión a heparina/heparán sulfato, poli-His, un ligando y/o una proteína informadora (por ejemplo, proteína fluorescente verde, β-glucuronidasa, β-galactosidasa, luciferasa, etc.), un fragmento Fc de inmunoglobulina, un anticuerpo de cadena única, hemaglutinina, c-myc, epítopo FLAG y similares para formar una proteína de fusión. Los métodos para insertar péptidos de orientación en la cápside del AAV son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la publicación de patente internacional WO 00/28004; Nicklin et al., (2001) Mol. Ther. 474-181; White et al., (2004) Circulation 109:513-319; Muller et al., (2003) Nature Biotech.

[0065] 21:1040-1046.

[0067] Los virus de la divulgación pueden comprender además un genoma viral duplicado, tal como se describe en la publicación de patente internacional WO 01/92551 y patente de EE. UU. n.º 7,465,583.

[0069] La divulgación también proporciona cápsides de AAV que comprenden las proteínas sintéticas de la cápside de AAV de la divulgación y partículas víricas (es decir, viriones) que comprenden las mismas, en las que la partícula vírica empaqueta (es decir, encapsida) un genoma vectorial, opcionalmente un genoma vectorial de AAV. En realizaciones particulares, la divulgación proporciona una partícula de AAV que comprende una cápside de AAV que comprende una proteína de cápside de AAV de la divulgación, en donde la cápside de AAV empaqueta un genoma vectorial de AAV. La divulgación también proporciona una partícula de AAV que comprende una cápside de AAV o una proteína de cápside de AAV codificada por las secuencias codificantes de cápside de ácido nucleico sintético de la divulgación.

[0070] En realizaciones particulares, el virión es un vector recombinante que comprende un ácido nucleico heterólogo de interés, por ejemplo, para su administración a una célula. Por lo tanto, la presente divulgación es útil para la administración de ácidos nucleicos a célulasin vitro,ex vivoein vivo. En realizaciones representativas, el vector recombinante de la divulgación puede emplearse ventajosamente para administrar o transferir ácidos nucleicos a células animales (por ejemplo, de mamíferos).

[0072] Cualquier secuencia o secuencias de nucleótidos heterólogas pueden administrarse mediante un vector viral de la presente divulgación. Los ácidos nucleicos de interés incluyen ácidos nucleicos que codifican polipéptidos, opcionalmente terapéuticos (por ejemplo, para usos médicos o veterinarios) y/o inmunogénicos (por ejemplo, para vacunas).

[0074] Los polipéptidos terapéuticos incluyen, entre otros, la proteína reguladora transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), la distrofina (incluido el producto proteico de los minigenes o microgenes de la distrofina, véase, por ejemplo, Vincent et al., (1993) Nature Genetics 5:130; publicación de patente de EE. UU. n.º 2003017131; Wang et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13714-9 [minidistrofina]; Harper et al., (2002) Nature Med. 8:253-61 [microdistrofina]); mini-agrina, una laminina-α2, un sarcoglicano (α, β, γ o δ), proteína relacionada con la fukutina, propéptido de miostatina, folistatina, miostatina dominante negativa, un factor angiogénico (por ejemplo, VEGF, angiopoyetina-1 o 2), un factor antiapoptótico (por ejemplo, hemooxigenasa-1, TGF-β, inhibidores de señales proapoptóticas como caspasas, proteasas, quinasas, receptores de muerte [por ejemplo, CD-095], moduladores de la liberación de citocromo C, inhibidores de la apertura de poros mitocondriales y la hinchazón); receptor soluble de activina tipo II, polipéptidos antiinflamatorios como el mutante dominante Ikappa B, sarcospan, utrofina, mini-utrofina, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos contra la miostatina o el propéptido de la miostatina, moduladores del ciclo celular, moduladores de la Rho quinasa como Cethrin, que es una exoenzima C3 bacteriana modificada [disponible en BioAxone Therapeutics, Inc., Saint-Lauren, Quebec, Canadá], BCLxL, BCL2, XIAP, FLICEc-s, caspasa-8 dominante negativa, caspasa-9 dominante negativa, SPI-6 (véase, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense n.º 20070026076), factor transcripcional PGC-α1, gen Pinch, gen ILK y gen timosina β4), factores de coagulación (por ejemplo, factor VIII, factor IX, factor X, etc.), eritropoyetina, angiostatina, endostatina, catalasa, tirosina hidroxilasa, una superóxido dismutasa intracelular y/o extracelular, leptina, el receptor LDL, neprilisina, lipoproteína lipasa, ornitina transcarbamilasa, β-globina, α-globina, espectrina, α1-antitripsina, proteína 2 de unión a metilcitosina, adenosina desaminasa, hipoxantina guanina fosforibosil transferasa, β-glucocerebrosidasa, esfingomielinasa, hexosaminidasa A lisosomal, deshidrogenasa de cetoácidos de cadena ramificada, proteína RP65, una citocina (por ejemplo, interferón α, interferón β, interferón y, interleucinas 1 a 14, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, linfotoxina y similares), factores de crecimiento peptídicos, factores neurotróficos y hormonas (por ejemplo, somatotropina, insulina, factores de crecimiento similares a la insulina, incluidos IGF-1 e IGF-2, GLP-1, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento fibroblástico, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico -3 y -4, factor neurotrófico derivado del cerebro, factor de crecimiento derivado de glía, factor de crecimiento transformante -α y -β, y similares), proteínas morfogenéticas óseas (incluidas RANKL y VEGF, una proteína lisosomal, un receptor de glutamato, una linfocina, CD4 soluble, un receptor Fc, un receptor de células T, ApoE, ApoC, inhibidor 1 de la proteína fosfatasa inhibidora 1 (I-1), fosfolambano, serca2a, α-glucosidasa ácida lisosomal, α-galactosidasa A, Barkct, receptor β2-adrenérgico, quinasa del receptor β2-adrenérgico (BARK), fosfoinositida-3 quinasa (PI3 quinasa), calsarcina, un receptor (por ejemplo, el receptor soluble del factor de crecimiento tumor necrosis-α), un factor antiinflamatorio como IRAP, Pim-1, PGC-1α, SOD-1, SOD-2, ECF-SOD, calicreína, timosina-β4, factor de transcripción inducible por hipoxia [HIF], un factor angiogénico, S 100A1, parvalbúmina, adenilato ciclasa tipo 6, una molécula que afecta a la inhibición de la proteína quinasa del receptor acoplado a la proteína G tipo 2, como una bARKct truncada constitutivamente activa; moléculas inhibidoras o dominantes negativas del fosfolambano, como el fosfolambano S16E, un anticuerpo monoclonal (incluidos los anticuerpos monoclonales de cadena única) o un producto génico suicida (por ejemplo, timidina quinasa, citosina desaminasa, toxina diftérica y factores de necrosis tumoral como el TNF-α), y cualquier otro polipéptido que tenga un efecto terapéutico en un sujeto que lo necesite.

[0076] Las secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican polipéptidos incluyen aquellas que codifican polipéptidos informadores (por ejemplo, una enzima). Los polipéptidos informadores son conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, una proteína fluorescente (por ejemplo, EGFP, GFP, RFP, BFP, YFP o dsRED2), una enzima que produce un producto detectable, como la luciferasa (por ejemplo, deGaussia,RenillaoPhotinus), β-galactosidasa, βglucuronidasa, fosfatasa alcalina y gen de cloranfenicol acetiltransferasa, o proteínas que pueden detectarse directamente. Prácticamente cualquier proteína puede detectarse directamente utilizando, por ejemplo, anticuerpos específicos para la proteína. En Sambrook y Russell (2001), Molecular Cloning, 3.ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE. UU. ., y Ausubel et al. (1992), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, se describen marcadores adicionales (y antibióticos asociados) adecuados para la selección positiva o negativa de células eucariotas, incluidas actualizaciones periódicas.

[0077] Alternativamente, el ácido nucleico heterólogo puede codificar un ARN funcional, por ejemplo, un oligonucleótido antisentido, una ribozima (por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.º 5,877,022), ARN que efectúan el empalme trans mediado por el espliceosoma (véase, p. ej., Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech.17:246; la patente de EE. UU. n.º 6,013,487; la patente de EE. UU. n.º 6,083,702), ARN interferentes (ARNi), incluidos los ARN pequeños interferentes (ARNip) que median el silenciamiento génico (véase Sharp et al., (2000) Science 287:2431), microARN u otros ARN "funcionales" no traducidos, como los ARN "guía" (Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929; patente de EE. UU. n.º 5,869,248 de Yuan et al.),y similares. Entre los ejemplos de ARN no traducidos se incluyen el ARN de interferencia o el ARN antisentido contra el producto del gen de resistencia múltiple a fármacos (MDR) (por ejemplo, para tratar tumores y/o para su administración en el corazón con el fin de prevenir el daño causado por la quimioterapia), ARN de interferencia o ARN antisentido contra la miostatina (distrofia muscular de Duchenne o Becker), ARN de interferencia o ARN antisentido contra el VEGF o un inmunógeno tumoral, incluidos, entre otros, los inmunógenos tumorales descritos específicamente en el presente documento (para tratar tumores), ARN de interferencia u oligonucleótidos antisentido dirigidos a distrofinas mutadas (distrofia muscular de Duchenne o Becker), ARNi o ARN antisentido contra el gen del antígeno de superficie de la hepatitis B (para prevenir y/o tratar la infección por hepatitis B), ARNi o ARN antisentido contra los genes tat y/o rev del VIH (para prevenir y/o tratar el VIH) y/o ARNi o ARN antisentido contra cualquier otro inmunógeno de un patógeno (para proteger a un sujeto del patógeno) o un producto génico defectuoso (para prevenir o tratar enfermedades). El ARN de interferencia o el ARN antisentido contra los objetivos descritos anteriormente o cualquier otro objetivo también pueden emplearse como reactivo de investigación.

[0079] Como es conocido en la técnica, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido (por ejemplo, ADN o ARN) y ARN inhibidor (por ejemplo, microARN y ARNi, como ARNip o ARNsh) pueden utilizarse para inducir el "salto de exones" en pacientes con distrofia muscular derivada de defectos en el gen de la distrofina. Por lo tanto, el ácido nucleico heterólogo puede codificar un ácido nucleico antisentido o un ARN inhibidor que induzca el salto de exón adecuado. Los expertos en la materia comprenderán que el enfoque particular del salto de exón depende de la naturaleza del defecto subyacente en el gen de la distrofina, y se conocen numerosas estrategias de este tipo en la técnica. Los ácidos nucleicos antisentido y las secuencias de ARN inhibidor ilustrativos se dirigen al punto de ramificación aguas arriba y/o al sitio de empalme donante aguas abajo y/o a la secuencia potenciadora del empalme interno de uno o más de los exones de la distrofina (por ejemplo, los exones 19 o 23). Por ejemplo, en realizaciones particulares, el ácido nucleico heterólogo codifica un ácido nucleico antisentido o un ARN inhibidor dirigido contra el punto de ramificación aguas arriba y el sitio donante de empalme aguas abajo del exón 19 o 23 del gen de la distrofina. Dichas secuencias pueden incorporarse a un vector AAV que transporta un ARNsn U7 modificado y el ácido nucleico antisentido o ARN inhibidor (véase, por ejemplo, Goyenvalle et al., (2004) Science 306:1796-1799). Como otra estrategia, se puede incorporar un ARNsn U1 modificado en un vector AAV junto con ARNip, microARN o ARN antisentido complementario a los sitios de empalme aguas arriba y aguas abajo de un exón de distrofina (por ejemplo, el exón 19 o 23) (véase, por ejemplo, Denti et al., (2006) Proc. Nat. Acad. Sci. EE. UU. 103:3758-3763). Además, los ácidos nucleicos antisentido y el ARN inhibidor pueden dirigirse a las secuencias potenciadoras del empalme dentro de los exones 19, 43, 45 o 53 (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 6,653,467; la patente de EE. UU. n.º 6,727,355; y la patente de EE. UU. n.º 6,653,466).

[0081] Las ribozimas son complejos de ARN y proteínas que escinden los ácidos nucleicos de forma específica en un sitio concreto. Las ribozimas tienen dominios catalíticos específicos que poseen actividad endonucleasa (Kim et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8788; Gerlach et al., (1987) Nature 328:802; Forster y Symons, (1987) Cell 49:211). Por ejemplo, un gran número de ribozimas aceleran las reacciones de transferencia de fosfoéster con un alto grado de especificidad, a menudo escindiendo solo uno de varios fosfoésteres en un sustrato oligonucleótido (Michel y Westhof, (1990) J. Mol. Biol. 216:585; Reinhold-Hurek y Shub, (1992) Nature 357:173). Esta especificidad se ha atribuido al requisito de que el sustrato se una mediante interacciones específicas de emparejamiento de bases a la secuencia guía interna ("IGS") de la ribozima antes de la reacción química.

[0083] La catálisis ribozimática se ha observado principalmente como parte de reacciones de escisión/ligación específicas de secuencia que involucran ácidos nucleicos (Joyce, (1989) Nature 338:217). Por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 5,354,855 informa de que ciertas ribozimas pueden actuar como endonucleasas con una especificidad de secuencia mayor que la de las ribonucleasas conocidas y cercana a la de las enzimas de restricción del ADN. Por lo tanto, la inhibición mediada por ribozimas específica de secuencia de la expresión de ácidos nucleicos puede ser especialmente adecuada para aplicaciones terapéuticas (Scanlon et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10591; Sarver et al., (1990) Science 247:1222; Sioud et al., (1992) J. Mol. Biol.223:831).

[0085] Los microARN (mir) son moléculas de ARN celulares naturales que pueden regular la expresión de múltiples genes controlando la estabilidad del ARNm. La sobreexpresión o disminución de un microARN concreto puede utilizarse para tratar una disfunción y se ha demostrado su eficacia en varios estados patológicos y modelos animales de enfermedades (véase, por ejemplo, Couzin, (2008) Science 319:1782-4). El AAV quimérico puede utilizarse para administrar microARN en células, tejidos y sujetos para el tratamiento de enfermedades genéticas y adquiridas, o para mejorar la funcionalidad y promover el crecimiento de determinados tejidos. Por ejemplo, mir-1, mir-133, mir-206 y/o mir-208 pueden utilizarse para tratar enfermedades cardíacas y del músculo esquelético (véase, por ejemplo, Chen et al., (2006) Genet.38:228-33; van Rooij et al., (2008) Trends Genet.24:159-66). El microARN también se puede utilizar para modular el sistema inmunitario tras la administración de genes (Brown et al., (2007) Blood 110:4144-52).

[0086] El término "oligonucleótido antisentido" (incluido "ARN antisentido") tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un ácido nucleico que es complementario y se hibrida específicamente con una secuencia de ADN o ARN específica. Los oligonucleótidos antisentido y los ácidos nucleicos que los codifican pueden fabricarse de acuerdo con técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 5,023,243 de Tullis; la patente de EE. UU. n.º 5,149,797 de Pederson et al.

[0087] Los expertos en la materia comprenderán que no es necesario que el oligonucleótido antisentido sea totalmente complementario a la secuencia diana, siempre que el grado de similitud de la secuencia sea suficiente para que la secuencia de nucleótidos antisentido se hibride específicamente con su diana (tal y como se ha definido anteriormente) y reduzca la producción del producto proteico (por ejemplo, en al menos un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más).

[0088] Para determinar la especificidad de la hibridación, la hibridación de dichos oligonucleótidos con secuencias diana puede llevarse a cabo en condiciones de rigurosidad reducida, rigurosidad media o incluso rigurosidad elevada. Las condiciones adecuadas para lograr condiciones de hibridación reducidas, medias y rigurosas son las descritas en el presente documento.

[0089] Dicho de otro modo, en realizaciones particulares, los oligonucleótidos antisentido de la presente divulgación tienen al menos aproximadamente un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o más de identidad de secuencia con el complemento de la secuencia diana y reducen la producción del producto proteico (tal y como se ha definido anteriormente). En algunas realizaciones, la secuencia antisentido contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 desajustes en comparación con la secuencia diana.

[0090] Los métodos para determinar el porcentaje de identidad de las secuencias de ácido nucleico se describen con más detalle en otra parte del presente documento.

[0091] La longitud del oligonucleótido antisentido no es crítica, siempre que se hibride específicamente con el objetivo previsto y reduzca la producción del producto proteico (tal y como se ha definido anteriormente) y pueda determinarse de acuerdo con procedimientos rutinarios. En general, el oligonucleótido antisentido tiene una longitud de al menos unos ocho, diez o doce o quince nucleótidos y/o menos de unos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 o 150 nucleótidos.

[0092] La interferencia del ARN (ARNi) es otro enfoque útil para reducir la producción de un producto proteico (por ejemplo, ARNip o ARNsh). La ARNi es un mecanismo de silenciamiento génico postranscripcional en el que se introduce en una célula u organismo ARN bicatenario (ARNbc) correspondiente a una secuencia diana de interés, lo que da lugar a la degradación del ARNm correspondiente. El mecanismo por el cual el ARNi logra el silenciamiento génico ha sido revisado en Sharp et al., (2001) Genes Dev 15: 485-490; y Hammond et al., (2001) Nature Rev. Gen. 2:110-119). El efecto del ARNi persiste durante múltiples divisiones celulares antes de que se recupere la expresión génica. El efecto del ARNi persiste durante múltiples divisiones celulares antes de que se recupere la expresión génica. El ARNi ha demostrado su eficacia en células humanas, incluidas las células renales embrionarias humanas y las células HeLa (véase, por ejemplo Elbashir et al., Nature (2001) 411:494-8).

[0093] Los primeros intentos de utilizar el ARNi en células de mamíferos dieron lugar a mecanismos de defensa antiviral en los que intervenía la PKR en respuesta a las moléculas de ARN bicatenario (véase, por ejemplo, Gil et al., (2000) Apoptosis 5:107). Desde entonces se ha demostrado que el ARN bicatenario sintético corto de aproximadamente 21 nucleótidos, conocido como ARN interferente corto (ARNip), puede mediar el silenciamiento en células de mamíferos sin desencadenar la respuesta antiviral (véase, por ejemplo, Elbashir et al., Nature (2001) 411:494-8; Caplen et al., (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98:9742).

[0094] La molécula de ARNi (incluida una molécula de ARNip) puede ser un ARN en horquilla corto (ARNsh; véase Paddison et al., (2002), Proc. Paddison et al., (2002), Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:1443-1448), que se cree que se procesa en la célula por la acción de la enzima Dicer, similar a la RNasa III, en moléculas de ARNip de 20-25 meros. Los ARNsh suelen tener una estructura en horquilla en la que dos secuencias repetidas invertidas están separadas por una secuencia espaciadora corta que forma un bucle. Se han descrito ARNsh con bucles de entre 3 y 23 nucleótidos de longitud. La secuencia del bucle no suele ser crítica. Entre las secuencias de bucle ilustrativas se incluyen los siguientes motivos: AUG, CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU, CCACACC y UUCAAGAGA.

[0095] El ARNi puede comprender además una molécula circular que comprende regiones sentido y antisentido con dos regiones de bucle a cada lado para formar una estructura en forma de "mancuerna" tras la formación de ARN bicatenario entre las regiones sentido y antisentido. Esta molécula puede procesarsein vitrooin vivopara liberar la porción de ARN bicatenario, por ejemplo, un ARNip.

[0096] La publicación de patente internacional WO 01/77350 describe un vector para la transcripción bidireccional con el fin de generar transcripciones sentido y antisentido de una secuencia heteróloga en una célula eucariota. Esta técnica puede emplearse para producir ARNi para su uso de acuerdo con la divulgación.

[0097] En Shinagawa et al., (2003) Genes Dev. 17:1340 se describió un método para expresar ARN bicatenarios largos a partir de un promotor CMV (un promotor pol II), método que también es aplicable a promotores pol II específicos de tejidos. Del mismo modo, el enfoque deXia et al., (2002) Nature Biotech. 20:1006evita la adición de colas poli(A) y puede utilizarse en relación con promotores específicos de tejidos.

[0098] Los métodos para generar ARNi incluyen la síntesis química, la transcripciónin vitro, la digestión de ARN bicatenario largo por Dicer (in vitrooin vivo), la expresiónin vivoa partir de un vector de administración y la expresión in vivo a partir de un casete de expresión de ARNi derivado de PCR (véase, por ejemplo, TechNotes 10(3) "Five Ways to Produce siRNAs", de Ambion, Inc., Austin, Texas, EE. UU.).

[0099] Existen directrices para el diseño de moléculas de ARNip (véase, por ejemplo, la bibliografía de Ambion, Inc., Austin, Texas). En realizaciones particulares, la secuencia de ARNip tiene un contenido de G/C de entre el 30 y el 50 %. Además, generalmente se evitan los tramos largos de más de cuatro residuos de T o A si se utiliza ARN polimerasa III para transcribir el ARN. Existen buscadores de objetivos de ARNip en línea, por ejemplo, de Ambion, Inc., a través del Instituto Whitehead de Investigación Biomédica, o de Dharmacon Research, Inc.

[0100] La región antisentido de la molécula de ARNi puede ser completamente complementaria a la secuencia objetivo, pero no es necesario que sea tan larga siempre que se hibride específicamente con la secuencia objetivo (tal y como se ha definido anteriormente) y reduzca la producción del producto proteico (por ejemplo, en al menos un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más). En algunas realizaciones, la hibridación de dichos oligonucleótidos con secuencias diana puede llevarse a cabo en condiciones de rigurosidad reducida, rigurosidad media o incluso rigurosidad elevada, como se ha definido anteriormente.

[0101] En otras realizaciones, la región antisentido del ARNi tiene al menos aproximadamente un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o más de identidad de secuencia con el complemento de la secuencia diana y reduce la producción del producto proteico (por ejemplo, en al menos aproximadamente un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más). En algunas realizaciones, la región antisentido contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 desajustes en comparación con la secuencia diana. Los desajustes se toleran generalmente mejor en los extremos del ARN bicatenario que en la parte central.

[0102] En realizaciones particulares, el ARNi se forma mediante la complejación intermolecular entre dos moléculas sentido y antisentido separadas. El ARNi comprende una región ds formada por el emparejamiento de bases intermolecular entre las dos cadenas separadas. En otras realizaciones, el ARNi comprende una región ds formada por emparejamiento intramolecular de bases dentro de una sola molécula de ácido nucleico que comprende regiones sentido y antisentido, típicamente como una repetición invertida (por ejemplo, un ARNip u otra estructura de tallo y bucle, o una molécula de ARNi circular). El ARNi puede comprender además una región espaciadora entre las regiones sentido y antisentido.

[0103] En general, las moléculas de ARNi son muy selectivas. Si se desea, los expertos en la materia pueden eliminar fácilmente los ARNi candidatos que puedan interferir con la expresión de ácidos nucleicos distintos del objetivo buscando en bases de datos relevantes para identificar secuencias de ARNi que no tengan una homología sustancial con otras secuencias conocidas, por ejemplo, utilizando BLAST (disponible en www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

[0104] Existen kits para la producción de ARNi disponibles en el mercado, por ejemplo, de New England Biolabs, Inc. y Ambion, Inc.

[0105] El vector viral recombinante también puede comprender una secuencia de nucleótidos heteróloga que comparta homología y se recombine con un locus en el cromosoma del huésped. Este enfoque puede utilizarse para corregir un defecto genético en la célula huésped.

[0106] La presente divulgación también proporciona vectores virales recombinantes que expresan un polipéptido inmunogénico, por ejemplo, para la vacunación. El ácido nucleico heterólogo puede codificar cualquier inmunógeno de interés conocido en la técnica, incluyendo, entre otros, inmunógenos del virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la gripe, proteínas gag, antígenos tumorales, antígenos cancerosos, antígenos bacterianos, antígenos virales y similares. Alternativamente, el inmunógeno puede presentarse en la cápside del virus (por ejemplo, incorporado en ella) o unido a la cápside del virus (por ejemplo, mediante modificación covalente).

[0107] El uso de parvovirus como vacunas es conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Miyamura et al., (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:8507; la patente de EE. UU. n.º 5,916,563 de Young et al., 5,905,040 de Mazzara et al.,la patente de EE. UU. n.º 5,882,652, la patente de EE. UU. n.º 5,863,541 de Samulski et al.).El antígeno puede presentarse en la cápside del virus. Alternativamente, el antígeno puede expresarse a partir de un ácido nucleico heterólogo introducido en un genoma vector recombinante.

[0108] Un polipéptido inmunogénico, o inmunógeno, puede ser cualquier polipéptido adecuado para proteger al sujeto contra una enfermedad, incluyendo, entre otras, enfermedades microbianas, bacterianas, protozoarias, parasitarias, fúngicas y virales. Por ejemplo, el inmunógeno puede ser un inmunógeno ortomixovirus (por ejemplo, un inmunógeno del virus de la gripe, como la proteína de superficie hemaglutinina (HA) del virus de la gripe o el gen de la nucleoproteína del virus de la gripe, o un inmunógeno del virus de la gripe equina), o un inmunógeno de lentivirus (por ejemplo, un inmunógeno del virus de la anemia infecciosa equina, un inmunógeno del virus de la inmunodeficiencia simia (VIS) o un inmunógeno del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), como la proteína GP160 de la envoltura del VIH o del VIS, las proteínas de la matriz/cápside del VIH o del VIS y los productos de los genesgag,polyenvdel VIH o del VIS). El inmunógeno también puede ser un inmunógeno de arenavirus (por ejemplo, un inmunógeno del virus de la fiebre de Lassa, como el gen de la proteína de la nucleocápside del virus de la fiebre de Lassa y el gen de la glicoproteína de la envoltura de la fiebre de Lassa), un inmunógeno de poxvirus (por ejemplo, vaccinia, como los genes L1 o L8 de vaccinia), un inmunógeno de flavivirus (por ejemplo, un inmunógeno del virus de la fiebre amarilla o un inmunógeno del virus de la encefalitis japonesa), un inmunógeno de filovirus (por ejemplo, un inmunógeno del virus del Ébola o un inmunógeno del virus de Marburgo, como los genes NP y GP), un inmunógeno de bunyavirus (por ejemplo, RVFV, CCHF y SFS), o un inmunógeno de coronavirus (por ejemplo, un inmunógeno de coronavirus humano infeccioso, como el gen de la glicoproteína de la envoltura del coronavirus humano, o un inmunógeno del virus de la gastroenteritis transmisible porcina, o un inmunógeno del virus de la bronquitis infecciosa aviar, o un inmunógeno del síndrome respiratorio agudo grave (SARS), como una proteína S [S1 o S2], M, E o N o un fragmento inmunogénico de los mismos). El inmunógeno puede ser además un inmunógeno contra la poliomielitis, un inmunógeno contra el herpes (por ejemplo, inmunógenos contra el CMV, el VEB o el VHS), un inmunógeno contra las paperas, un inmunógeno contra el sarampión, un inmunógeno contra la rubéola, la toxina diftérica u otro inmunógeno contra la difteria, el antígeno contra la tos ferina, un inmunógeno contra la hepatitis (por ejemplo, hepatitis A, hepatitis B o hepatitis C) o cualquier otro inmunógeno vacunal conocido en la técnica.

[0110] Alternativamente, el inmunógeno puede ser cualquier antígeno tumoral o de células cancerosas. Opcionalmente, el antígeno tumoral o canceroso se expresa en la superficie de la célula cancerosa. En S.A. Rosenberg, (1999) Immunity 10:281) se describen ejemplos de antígenos de células cancerosas y tumorales. Entre los antígenos tumorales y cancerosos ilustrativos se incluyen, entre otros: producto del gen BRCA1, producto del gen BRCA2, gp100, tirosinasa, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, β-catenina, MUM-1, caspasa-8, KIAA0205, HPVE, SART-1, PRAME, p15, antígenos tumorales del melanoma (Kawakami et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515; Kawakami et al., (1994) J. Exp. Med., 180:347; Kawakami et al., (1994) Cancer Res. 54:3124) incluyendo MART-1 (Coulie et al., (1991) J. Exp. Med.180:35), gp100 (Wick et al., (1988) J. Cutan. Pathol. 4:201) y antígeno MAGE (MAGE-1, MAGE-2 y MAGE-3) (Van der Bruggen et al., (1991) Science, 254:1643), CEA, TRP-1; TRP-2; P-15 y tirosinasa (Brichard et al., (1993) J. Exp. Med.178:489); producto génico HER-2/neu (patente de EE. UU. n.º 4,968,603); CA 125; HE4; LK26; FB5 (endosialina); TAG 72; AFP; CA19-9; NSE; DU-PAN-2; CA50; Span-1; CA72-4; HCG; STN (antígeno sialil Tn); proteínas c-erbB-2; PSA; L-CanAg; receptor de estrógeno; globulina de grasa láctea; proteína supresora tumoral p53 (Levine, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623); antígenos de mucina (publicación de patente internacional WO 90/05142); telomerasas; proteínas de la matriz nuclear; fosfatasa ácida prostática; antígenos del virus del papiloma; y antígenos asociados con los siguientes tipos de cáncer: melanomas, adenocarcinoma, timoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer colorrectal, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias, cáncer de útero, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro, cáncer de riñón, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello y otros (véase, por ejemplo, Rosenberg, (1996) Annu. Rev. Med.47:481-91).

[0112] Alternativamente, la secuencia de nucleótidos heteróloga puede codificar cualquier polipéptido que se produzca de forma deseable en una célulain vitro,ex vivooin vivo. Por ejemplo, los vectores virales pueden introducirse en células cultivadas y el producto proteico expresado puede aislarse a partir de ellas.

[0114] Los expertos en la materia comprenderán que el ácido o los ácidos nucleicos heterólogos de interés pueden estar asociados de manera operativa con secuencias de control adecuadas. Por ejemplo, el ácido nucleico heterólogo puede estar asociado de manera operativa con elementos de control de la expresión, tales como señales de control de la transcripción/traducción, orígenes de replicación, señales de poliadenilación, sitios internos de entrada de ribosomas (IRES), promotores, potenciadores y similares.

[0116] Los expertos en la materia comprenderán además que se pueden utilizar diversos elementos promotores/potenciadores en función del nivel y la expresión específica del tejido deseados. El promotor/potenciador puede ser constitutivo o inducible, dependiendo del patrón de expresión deseado. El promotor/potenciador puede ser nativo o extraño y puede ser una secuencia natural o sintética. Por extraño se entiende que la región de iniciación transcripcional no se encuentra en el huésped de tipo salvaje en el que se introduce la región de iniciación transcripcional.

[0118] Los elementos promotores/potenciadores pueden ser nativos de la célula diana o del sujeto a tratar y/o nativos de la secuencia de ácido nucleico heterólogo. El elemento promotor/potenciador se elige generalmente de manera que funcione en la célula o células diana de interés. En realizaciones representativas, el elemento promotor/potenciador es un elemento promotor/potenciador de mamíferos. El elemento promotor/potenciador puede ser un promotor basado en la ARN polimerasa II o un promotor basado en la ARN polimerasa III. El elemento promotor/potenciador puede ser constitutivo o inducible.

[0120] Los elementos de control de expresión inducible se utilizan generalmente en aquellas aplicaciones en las que es deseable regular la expresión de la secuencia o secuencias de ácido nucleico heterólogo Los promotores/elementos potenciadores inducibles para la administración de genes pueden ser promotores/elementos potenciadores específicos de un tejido o preferidos por un tejido, e incluyen promotores/elementos potenciadores específicos o preferidos por el músculo (incluidos el músculo cardíaco, esquelético y/o liso), específicos o preferidos por el tejido neural (incluido el específico del cerebro), ojo (incluidos los específicos de la retina y la córnea), específicos o preferidos del hígado, específicos o preferidos de la médula ósea, específicos o preferidos del páncreas, específicos o preferidos del bazo y específicos o preferidos del pulmón. En una realización, se utiliza un promotor específico o preferido para los hepatocitos. Algunos ejemplos de promotores específicos o preferidos para los hepatocitos incluyen, sin limitación, la apolipoproteína AII, la albúmina, la alfa 1-antitripsina, la globulina fijadora de tiroxina, el citocromo P450 CYP3A4 o el microARN122 o una secuencia reguladora sintética específica del hígado. El uso de un promotor específico o preferido para los hepatocitos puede aumentar la especificidad lograda por el vector AAV sintético al limitar aún más la expresión del ácido nucleico heterólogo al hígado. Otros elementos promotores/potenciadores inducibles incluyen elementos inducibles por hormonas e inducibles por metales. Entre los promotores inducibles/elementos potenciadores ilustrativos se incluyen, entre otros, un elemento Tet on/off, un promotor inducible por RU486, un promotor inducible por ecdisona, un promotor inducible por rapamicina y un promotor de metalotioneína.

[0121] En las realizaciones en las que la secuencia o secuencias de ácido nucleico heterólogas se transcriben y luego se traducen en las células diana, se emplean generalmente señales de iniciación específicas para la traducción eficiente de las secuencias codificadoras de proteínas insertadas. Estas secuencias de control de la traducción exógenas, que pueden incluir el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes, pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos.

[0123] La divulgación también proporciona partículas de AAV sintéticas que comprenden una cápside de AAV y un genoma de AAV, en las que el genoma de AAV "corresponde" (es decir, codifica) a la cápside de AAV También se describen colecciones o bibliotecas de dichas partículas AAV quiméricas, en las que la colección o biblioteca comprende 2 o más, 10 o más, 50 o más, 100 o más, 1000 o más, 10<4>o más, 10<5>o más, o 10<6>o más secuencias distintas.

[0125] La presente divulgación abarca además partículas de cápside "vacías" (es decir, en ausencia de un genoma vectorial) que comprenden, consisten en o consisten esencialmente en las proteínas de cápside de AAV sintéticas de la divulgación. Las cápsides de AAV sintéticas de la divulgación pueden utilizarse como "vehículos de cápside", tal y como se ha descrito en la patente de EE. UU. n.º 5,863,541. Las moléculas que pueden unirse covalentemente, ligarse o empaquetarse por las cápsides del virus y transferirse a una célula incluyen ADN, ARN, un lípido, un carbohidrato, un polipéptido, una pequeña molécula orgánica o combinaciones de los mismos. Además, las moléculas pueden asociarse con (por ejemplo, "unirse a") el exterior de la cápside del virus para la transferencia de las moléculas a las células diana del huésped. En una realización de la divulgación, la molécula está unida covalentemente (es decir, conjugada o acoplada químicamente) a las proteínas de la cápside. Los métodos para unir covalentemente moléculas son conocidos por los expertos en la materia.

[0127] Las cápsides del virus de la divulgación también se utilizan para producir anticuerpos contra las nuevas estructuras de la cápside. Como alternativa adicional, se puede insertar una secuencia de aminoácidos exógena en la cápside del virus para la presentación de antígenos a una célula, por ejemplo, para su administración a un sujeto con el fin de producir una respuesta inmunitaria a la secuencia de aminoácidos exógena.

[0129] La divulgación también proporciona ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos aislados) que codifican las cápsides de virus sintéticas y las proteínas de cápside sintéticas de la divulgación. Además, se proporcionan vectores que comprenden los ácidos nucleicos y células (in vivoo en cultivo) que comprenden los ácidos nucleicos y/o vectores de la divulgación. Dichos ácidos nucleicos, vectores y células pueden utilizarse, por ejemplo, como reactivos (por ejemplo, construcciones auxiliares o células de empaquetamiento) para la producción de vectores virales como se describe en el presente documento.

[0131] En realizaciones ilustrativas, la divulgación proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican la cápside del AAV de SEQ ID NO: 4-6 o que son al menos un 90 % idénticas a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-3. La divulgación también proporciona ácidos nucleicos que codifican las variantes de la cápside del AAV, las variantes de la proteína de la cápside y las proteínas de fusión descritas anteriormente. En realizaciones particulares, el ácido nucleico se hibrida con el complemento de las secuencias de ácido nucleico específicamente descritas aquí en condiciones estándar conocidas por los expertos en la materia y codifica una variante de la cápside y/o la proteína de la cápside. Opcionalmente, la variante de la cápside o la proteína de la cápside conserva sustancialmente al menos una propiedad de la cápside y/o la proteína de la cápside codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1-3. Por ejemplo, una partícula viral que comprende la cápside variante o la proteína de cápside variante puede conservar sustancialmente el perfil de tropismo hepático de una partícula viral que comprende una cápside o una proteína de cápside codificada por una secuencia codificante de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1-3.

[0132] Por ejemplo, la hibridación de tales secuencias puede llevarse a cabo en condiciones de rigurosidad reducida, rigurosidad media o incluso condiciones rigurosas. Las condiciones ilustrativas para la hibridación reducida, media y rigurosa son las siguientes: (por ejemplo, condiciones representadas por una rigurosidad de lavado del 35-40 % de formamida con solución 5x de Denhardt, 0,5 % de SDS y 1x SSPE a 37 °C; condiciones representadas por una rigurosidad de lavado del 40-45 % de formamida con solución 5x Denhardt, 0,5 % de SDS y 1x SSPE a 42 °C; y condiciones representadas por una rigurosidad de lavado del 50 % de formamida con solución 5x Denhardt, 0,5 % de SDS y 1x SSPE a 42 °C, respectivamente). Véase, p. ej., Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2.ª Ed.1989) (Cold Spring Harbor Laboratory).

[0133] En otras realizaciones, las secuencias de ácido nucleico que codifican una variante de la cápside o la proteína de la cápside de la divulgación tienen al menos aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 % o 99,9 %, o una identidad de secuencia superior con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1-3 y, opcionalmente, codificar una variante de la cápside o la proteína de la cápside que conserve sustancialmente al menos una propiedad de la cápside o la proteína de la cápside codificada por un ácido nucleico de SEQ ID NO: 1-3.

[0134] Como es conocido en la técnica, se pueden utilizar varios programas diferentes para identificar si un ácido nucleico o un polipéptido tiene identidad de secuencia con una secuencia conocida. El porcentaje de identidad tal y como se utiliza en el presente documento significa que un ácido nucleico o fragmento del mismo comparte un porcentaje específico de identidad con otro ácido nucleico, cuando se alinea de forma óptima (con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas) con el otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), utilizando BLASTN. Para determinar el porcentaje de identidad entre dos ácidos nucleicos diferentes, el porcentaje de identidad se determina utilizando el programa BLASTN "secuencias BLAST 2". Este programa está disponible para uso público en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) a través de Internet (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402). Los parámetros que se utilizarán son cualquier combinación de los siguientes que produzca el mayor porcentaje de identidad calculado (como se calcula a continuación) con los parámetros predeterminados que se muestran entre paréntesis: Programa: blastn Matriz: 0 BLOSUM62 Recompensa por una coincidencia: 0 o 1 (1) Penalización por una discrepancia: 0, -1, -2 o -3 (-2) Penalización por espacio abierto: 0, 1, 2, 3, 4 o 5 (5) Penalización por espacio de extensión: 0 o 1 (1) Brecha x_dropoff: 0 o 50 (50) Esperado: 10.

[0135] El porcentaje de identidad o similitud, cuando se refiere a polipéptidos, indica que el polipéptido en cuestión presenta un porcentaje específico de identidad o similitud cuando se compara con otra proteína o una parte de la misma en las longitudes comunes determinadas mediante BLASTP. Este programa también está disponible para uso público en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) a través de Internet (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res.

[0136] 25(17):3389-3402). El porcentaje de identidad o similitud de los polipéptidos se mide normalmente utilizando un software de análisis de secuencias. Véase, por ejemplo, el paquete de software de análisis de secuencias del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin, EE. UU.

[0137] 53705. El software de análisis de proteínas compara secuencias similares utilizando medidas de homología asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones. Las sustituciones conservadoras suelen incluir sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina.

[0138] En realizaciones particulares, el ácido nucleico puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en un vector que incluye, entre otros, un plásmido, un fago, un vector viral (por ejemplo, un vector AAV, un vector adenoviral, un vector herpesviral o un vector baculoviral), un cromosoma artificial bacteriano (BAC) o un cromosoma artificial de levadura (YAC). Por ejemplo, el ácido nucleico puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un vector AAV que comprende una repetición terminal 5' y/o 3' (por ejemplo, repetición terminal 5' y/o 3' AAV).

[0139] En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la proteína de la cápside AAV sintética comprende además una secuencia codificante rep AAV. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser una construcción auxiliar para producir reservas virales.

[0140] La divulgación también proporciona células de empaquetamiento que comprenden de forma estable un ácido nucleico de la divulgación. Por ejemplo, el ácido nucleico puede incorporarse de forma estable al genoma de la célula o puede mantenerse de forma estable en una forma episomal (por ejemplo, un "episoma nuclear basado en EBV").

[0141] El ácido nucleico puede incorporarse a un vector de administración, como un vector de administración viral. A modo de ejemplo, el ácido nucleico de la divulgación puede empaquetarse en una partícula de AAV, una partícula de adenovirus, una partícula de herpesvirus, una partícula de baculovirus o cualquier otra partícula viral adecuada. Además, el ácido nucleico puede asociarse de manera operativa con un elemento promotor. Los elementos promotores se describen con más detalle en el presente documento.

[0142] La presente divulgación proporciona además métodos para producir los vectores virales de la divulgación. En una realización representativa, la presente divulgación proporciona un método para producir un vector viral recombinante, el método comprende proporcionar a una célulain vitro, (a) una plantilla que comprende (i) un ácido nucleico heterólogo, y (ii) secuencias de señal de empaquetamiento suficientes para la encapsidación de la plantilla AAV en partículas virales (por ejemplo, una o más (por ejemplo, dos) repeticiones terminales, tales como repeticiones terminales AAV), y (b) secuencias de AAV suficientes para la replicación y encapsidación de la plantilla en partículas virales (por ejemplo, las secuenciasrepycapde AAV que codifican una cápside de AAV de la divulgación). La plantilla y las secuencias de replicación y cápside del AAV se proporcionan en condiciones tales que se producen en la célula partículas de virus recombinante que comprenden la plantilla empaquetada dentro del cápside. El método puede comprender, además, el paso de recoger las partículas de virus de la célula. Las partículas de virus pueden recogerse del medio y/o lisando las células.

[0143] En una realización ilustrativa, la divulgación proporciona un método para producir una partícula rAAV que comprende una cápside AAV, el método comprende: proporcionar una célulain vitrocon un ácido nucleico que codifica una cápside AAV sintética de la divulgación, una secuencia codificante AAV rep, un genoma vector AAV que comprende un ácido nucleico heterólogo y funciones auxiliares para generar una infección AAV productiva; y permitir el ensamblaje de las partículas de AAV que comprenden la cápside de AAV y encapsulan el genoma del vector de AAV.

[0144] La célula es típicamente una célula que permite la replicación viral del AAV. Se puede emplear cualquier célula adecuada conocida en la técnica, como las células de mamíferos. También son adecuadas las líneas celulares de empaquetamiento transcomplementarias que proporcionan funciones eliminadas de un virus auxiliar con defecto de replicación, por ejemplo, células 293 u otras células transcomplementarias E1a.

[0145] Las secuencias de replicación y cápside del AAV pueden proporcionarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Los protocolos actuales suelen expresar los genesrep/capdel AAV en un único plásmido. No es necesario proporcionar juntas las secuencias de replicación y empaquetamiento del AAV, aunque puede ser conveniente hacerlo. Las secuenciasrepy/ocapdel AAV pueden proporcionarse mediante cualquier vector viral o no viral. Por ejemplo, las secuenciasrep/cappueden proporcionarse mediante un vector híbrido de adenovirus o herpesvirus (por ejemplo, insertado en las regiones E1a o E3 de un vector de adenovirus eliminado). También se pueden emplear vectores EBV para expresar los genescapyrepdel AAV. Una ventaja de este método es que los vectores EBV son episomales, pero mantienen un alto número de copias a lo largo de sucesivas divisiones celulares (es decir, se integran de forma estable en la célula como elementos extracromosómicos, designados como episoma nuclear basado en EBV). Como alternativa adicional, las secuenciasrep/cappueden transportarse de forma estable (episomal o integrada) dentro de una célula.

[0146] Normalmente, las secuenciasrep/capdel AAV no estarán flanqueadas por las secuencias de empaquetamiento del AAV (por ejemplo, ITR del AAV), para evitar el rescate y/o el empaquetamiento de estas secuencias.

[0147] La plantilla (por ejemplo, un genoma del vector rAAV) se puede proporcionar a la célula utilizando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la plantilla puede suministrarse mediante un vector no viral (por ejemplo, un plásmido) o viral. En realizaciones particulares, la plantilla se suministra mediante un vector de herpesvirus o adenovirus (por ejemplo, insertado en las regiones E1a o E3 de un adenovirus eliminado). Como otra ilustración, Palombo et al., (1998) J. Virol. 72:5025, describen un vector de baculovirus que porta un gen informador flanqueado por los ITR del AAV. También se pueden emplear vectores EBV para administrar la plantilla, como se ha descrito anteriormente con respecto a los genesrep/cap.

[0148] En otra realización representativa, la plantilla es proporcionada por un virus rAAV replicante. En otras realizaciones, un provirus AAV se integra de forma estable en el cromosoma de la célula.

[0149] Para obtener títulos víricos máximos, generalmente se proporcionan a la célula funciones de virus auxiliares (por ejemplo, adenovirus o herpesvirus) esenciales para una infección productiva por AAV. Las secuencias de virus auxiliares necesarias para la replicación del AAV son conocidas en la técnica. Normalmente, estas secuencias son proporcionadas por un vector adenovirus o herpesvirus auxiliar. Alternativamente, las secuencias de adenovirus o herpesvirus pueden ser proporcionadas por otro vector no viral o viral, por ejemplo, como un miniplásmido de adenovirus no infeccioso que porta todos los genes auxiliares necesarios para la producción eficiente de AAV, tal y como describen Ferrari et al., (1997) Nature Med.3:1295, y la patente de EE. UU. n.º 6,040,183 y 6,093,570.

[0150] Además, las funciones del virus auxiliar pueden ser proporcionadas por una célula de empaquetamiento con los genes auxiliares integrados en el cromosoma o mantenidos como un elemento extracromosómico estable. En realizaciones representativas, las secuencias del virus auxiliar no pueden empaquetarse en viriones AAV, por ejemplo, no están flanqueadas por ITR de AAV.

[0151] Los expertos en la materia apreciarán que puede ser ventajoso proporcionar las secuencias de replicación y cápside del AAV y las secuencias del virus auxiliar (por ejemplo, secuencias de adenovirus) en una única construcción auxiliar. Esta construcción auxiliar puede ser una construcción no viral o viral, pero opcionalmente es un adenovirus híbrido o un herpesvirus híbrido que comprende los genes rep/cap del AAV.

[0152] En una realización particular, las secuenciasrep/capdel AAV y las secuencias auxiliares del adenovirus son suministradas por un único vector auxiliar de adenovirus. Este vector contiene, además, la plantilla rAAV. Las secuenciasrep/capdel AAV y/o la plantilla rAAV pueden insertarse en una región eliminada (por ejemplo, las regiones E1a o E3) del adenovirus.

[0153] En una realización más, las secuenciasrep/capdel AAV y las secuencias auxiliares del adenovirus son suministradas por un único vector auxiliar de adenovirus. La plantilla rAAV se proporciona como una plantilla de plásmido.

[0154] En otra realización ilustrativa, las secuenciasrep/capdel AAV y las secuencias auxiliares del adenovirus son proporcionadas por un único vector auxiliar de adenovirus, y la plantilla rAAV se integra en la célula como un provirus. Alternativamente, la plantilla rAAV se proporciona mediante un vector EBV que se mantiene dentro de la célula como un elemento extracromosómico (por ejemplo, como un "episoma nuclear basado en EBV", véase Margolski, (1992) Curr. Top. Microbiol. Immun.158:67).

[0155] En otra realización ilustrativa, las secuenciasrep/capdel AAV y las secuencias auxiliares del adenovirus son proporcionadas por un único adenovirus auxiliar. La plantilla rAAV se proporciona como un vector viral replicante separado. Por ejemplo, la plantilla rAAV puede ser proporcionada por una partícula rAAV o una segunda partícula de adenovirus recombinante.

[0156] Según los métodos anteriores, el vector adenoviral híbrido comprende típicamente las secuenciascis5' y 3' del adenovirus suficientes para la replicación y el empaquetamiento del adenovirus (es decir, las repeticiones terminales del adenovirus y la secuencia PAC). Las secuenciasrep/capdel AAV y, si están presentes, la plantilla rAAV están incrustadas en la cadena principal del adenovirus y están flanqueadas por las secuenciascis5' y 3', de modo que estas secuencias pueden empaquetarse en cápsides de adenovirus. Como se ha descrito anteriormente, en las realizaciones representativas, las secuencias auxiliares del adenovirus y las secuenciasrep/capdel AAV no están flanqueadas por las secuencias de empaquetamiento del AAV (por ejemplo, las ITR del AAV), de modo que estas secuencias no se empaquetan en los viriones del AAV.

[0157] El virus del herpes también puede utilizarse como virus auxiliar en los métodos de empaquetamiento del AAV. Los virus del herpes híbridos que codifican la(s) proteína(s) rep del AAV pueden facilitar de manera ventajosa esquemas de producción de vectores AAV más escalables. Se ha descrito un vector híbrido del virus del herpes simple tipo I (HSV-1) que expresa los genesrepycapdel AAV-2 (Conway et al., (1999) Gene Therapy 6:986 y WO 00/17377). Como alternativa adicional, los vectores víricos de la presente divulgación pueden producirse en células de insectos utilizando vectores de baculovirus para administrar los genes rep/cap y la plantilla rAAV, tal y como describen Urabe et al., (2002) Human Gene Therapy 13:1935-43.

[0158] Otros métodos de producción de AAV utilizan células de empaquetamiento transformadas de forma estable (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 5,658,785).

[0159] Las reservas de vectores AAV libres de virus auxiliares contaminantes pueden obtenerse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el AAV y el virus auxiliar pueden diferenciarse fácilmente en función de su tamaño. El AAV también puede separarse del virus auxiliar basándose en la afinidad por un sustrato de heparina (Zolotukhin et al., (1999) Gene Therapy 6:973). En realizaciones representativas, se utilizan virus auxiliares defectuosos en la replicación eliminados, de modo que cualquier virus auxiliar contaminante no sea competente para la replicación. Como alternativa adicional, se puede emplear un virus auxiliar adenoviral que carezca de expresión génica tardía, ya que solo se requiere la expresión génica temprana del adenovirus para mediar el empaquetamiento del virus AAV. Los mutantes de adenovirus defectuosos para la expresión génica tardía son conocidos en la técnica (por ejemplo, los mutantes de adenovirus ts100K y ts149).

[0160] Los métodos de empaquetamiento inventivos pueden emplearse para producir reservas de partículas virales de alto título. En realizaciones particulares, la reserva de virus tiene un título de al menos aproximadamente 10<5>unidades de transducción (tu)/ml, al menos aproximadamente 10<6>tu/ml, al menos aproximadamente 10<7>tu/ml, al menos aproximadamente 10<8>tu/ml, al menos aproximadamente 10<9>tu/ml o al menos aproximadamente 10<10>tu/ml.

[0161] La nueva proteína de la cápside y las nuevas estructuras de la cápside se utilizan para producir anticuerpos, por ejemplo, para usos diagnósticos o terapéuticos o como reactivo de investigación. Por lo tanto, la divulgación también proporciona anticuerpos contra las nuevas proteínas de la cápside y las nuevas cápsides de la divulgación.

[0162] El término "anticuerpo" o "anticuerpos" tal y como se utiliza en el presente documento se refiere a todos los tipos de inmunoglobulinas, incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y puede ser de cualquier especie de origen, incluyendo (por ejemplo) ratón, rata, conejo, caballo, cabra, oveja o humano, o puede ser un anticuerpo quimérico. Véase, p. ej., Walker et al., Mol. Immunol.26, 403-11 (1989). Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales recombinantes, por ejemplo, producidos según los métodos descritos en la patente de EE.

[0163] UU. n.º 4,474,893 o la patente de EE. UU. n.º 4,816,567. Los anticuerpos también pueden construirse químicamente, por ejemplo, según el método descrito en la patente de EE. UU. n.º 4,676,980.

[0164] Los fragmentos de anticuerpos incluidos en el ámbito de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, F(ab')2 y Fc, y los fragmentos correspondientes obtenidos a partir de anticuerpos distintos de la IgG. Dichos fragmentos pueden producirse mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos F(ab')2 pueden producirse mediante la digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo, y los fragmentos Fab pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Alternativamente, se pueden construir bibliotecas de expresión Fab para permitir la identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada (Huse et al., (1989) Science 254, 1275-1281).

[0165] Los anticuerpos policlonales pueden producirse inmunizando a un animal adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, etc.) con un antígeno al que se une un anticuerpo monoclonal contra el objetivo, recogiendo el suero inmune del animal y separando los anticuerpos policlonales del suero inmune, de acuerdo con procedimientos conocidos.

[0166] Los anticuerpos monoclonales pueden producirse en una línea celular de hibridoma según la técnica de Kohler y Milstein, (1975) Nature 265, 495-97. Por ejemplo, se puede inyectar una solución que contenga el antígeno adecuado en un ratón y, tras un tiempo suficiente, sacrificar al ratón y obtener las células del bazo. A continuación, las células del bazo se inmortalizan fusionándolas con células de mieloma o con células de linfoma, normalmente en presencia de polietilenglicol, para producir células de hibridoma. A continuación, las células de hibridoma se cultivan en un medio adecuado y se analiza el sobrenadante en busca de anticuerpos monoclonales que tengan la especificidad deseada. Los fragmentos Fab monoclonales pueden producirse en E. colimediante técnicas recombinantes conocidas por los expertos en la materia. Véase, p. ej., W. Huse, (1989) Science 246, 1275-81.

[0167] Los anticuerpos específicos para un polipéptido diana también pueden obtenerse mediante técnicas de presentación en fagos conocidas en la materia.

[0168] Se pueden utilizar diversos inmunoensayos para la selección con el fin de identificar anticuerpos que tengan la especificidad deseada. En la técnica son bien conocidos numerosos protocolos para ensayos de unión competitiva o inmunorradiométricos que utilizan anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidad establecida. Dichos inmunoensayos suelen implicar la medición de la formación de complejos entre un antígeno y su anticuerpo específico (por ejemplo, la formación de complejos antígeno/anticuerpo). Se puede utilizar un inmunoensayo de dos sitios basado en anticuerpos monoclonales que utilice anticuerpos monoclonales reactivos a dos epítopos no interferentes, así como un ensayo de unión competitiva.

[0169] Los anticuerpos se pueden conjugar a un soporte sólido (por ejemplo, perlas, placas, portaobjetos o pocillos formados a partir de materiales como látex o poliestireno) de acuerdo con técnicas conocidas. Los anticuerpos también pueden conjugarse directa o indirectamente a grupos detectables, como marcadores radiactivos (por ejemplo,<35>S,<125>I,<131>I), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina) y marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína) de acuerdo con técnicas conocidas. La determinación de la formación de un complejo anticuerpo/antígeno en los métodos de esta divulgación puede realizarse mediante la detección, por ejemplo, de precipitación, aglutinación, floculación, radiactividad, desarrollo o cambio de color, fluorescencia, luminiscencia, etc., como es bien conocido en la técnica.

[0170] III. Métodos de uso de cápsides de AAV sintéticas.

[0171] La presente divulgación también se refiere a métodos para administrar secuencias de nucleótidos heterólogas en el hígado, minimizando al mismo tiempo la administración en otros órganos. Los vectores víricos de la divulgación pueden emplearse para administrar una secuencia de nucleótidos de interés a un hepatocitoin vitro, por ejemplo, para producir un polipéptido o ácido nucleicoin vitroo para terapia génicaex vivo. Los vectores útiles, además, en un método de administración de una secuencia de nucleótidos a un sujeto que la necesita, por ejemplo, para expresar un polipéptido o ácido nucleico terapéutico o inmunogénico. De esta manera, el polipéptido o el ácido nucleico pueden producirsein vivoen el sujeto. El sujeto puede necesitar el polipéptido o el ácido nucleico porque tiene una deficiencia del polipéptido, o porque la producción del polipéptido o del ácido nucleico en el sujeto puede conferir algún efecto terapéutico, como método de tratamiento o de otro tipo, tal y como se explica más adelante.

[0172] En realizaciones particulares, los vectores son útiles para expresar un polipéptido o ácido nucleico que proporciona un efecto beneficioso al sujeto en general. En otras realizaciones, los vectores son útiles para expresar un polipéptido o ácido nucleico que proporciona un efecto beneficioso a las células del hígado (por ejemplo, los hepatocitos). Por lo tanto, un aspecto de la divulgación se refiere a un método para administrar un ácido nucleico de interés a un hepatocito, el método comprende poner en contacto el hepatocito con la partícula AAV de la divulgación.

[0173] En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para administrar un ácido nucleico de interés a un hepatocito en un sujeto mamífero, el método comprende administrar una cantidad eficaz de la partícula AAV o la formulación farmacéutica de la divulgación a un sujeto mamífero, administrando así el ácido nucleico de interés a un hepatocito en el sujeto mamífero.

[0175] Otro aspecto de la divulgación se refiere a un método para tratar un trastorno en un sujeto mamífero que lo necesita, en el que el trastorno es tratable mediante la expresión de un producto en el hígado del sujeto, el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la partícula AAV de la divulgación al sujeto, en el que se expresa el producto, tratando así el trastorno.

[0177] En general, los vectores víricos de la invención pueden emplearse para administrar cualquier ácido nucleico extraño con un efecto biológico para tratar o mejorar los síntomas asociados con cualquier trastorno relacionado con la expresión génica. Además, la divulgación puede utilizarse para tratar cualquier estado de enfermedad para el que sea beneficioso administrar un polipéptido terapéutico. Entre los estados patológicos ilustrativos se incluyen, entre otros: fibrosis quística (proteína reguladora transmembrana de la fibrosis quística) y otras enfermedades pulmonares, hemofilia A (factor VIII), hemofilia B (factor IX), talasemia (β-globina), anemia (eritropoyetina) y otros trastornos sanguíneos, enfermedad de Alzheimer (GDF; neprilisina), esclerosis múltiple (interferón β), enfermedad de Parkinson (factor neurotrófico derivado de células gliales [GDNF]), enfermedad de Huntington (ARN inhibidor, incluyendo, sin limitación, ARNi como ARNip o ARNsh, ARN antisentido o microARN para eliminar repeticiones), esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia (galanina, factores neurotróficos) y otros trastornos neurológicos, cáncer (endostatina, angiostatina, TRAIL, ligando FAS, citocinas incluyendo interferones; ARN inhibidor, incluyendo sin limitación ARNi (como ARNip o ARNsh), ARN antisentido y microARN, incluyendo ARN inhibidor contra VEGF, el producto del gen de resistencia múltiple a fármacos o un inmunógeno contra el cáncer), diabetes mellitus (insulina, PGC-α1, GLP-1, propéptido de miostatina, transportador de glucosa 4), distrofias musculares, incluidas las de Duchenne y Becker (por ejemplo, distrofina, minidistrofina, microdistrofina, factor de crecimiento insulínico tipo I, un sarcoglicano [por ejemplo, α, β, γ], ARN inhibidor [por ejemplo, ARNi, ARN antisentido o microARN] contra la miostatina o el propéptido de la miostatina, laminina alfa 2, proteína relacionada con la fukutina, miostatina dominante negativa, folistatina, receptor soluble de activina tipo II, polipéptidos antiinflamatorios como el mutante dominante Ikappa B, sarcospan, utrofina, miniutrofina, ARN inhibidor [por ejemplo, ARNi, ARN antisentido o microARN] contra las uniones de empalme en el gen de la distrofina para inducir el salto de exones [véase, por ejemplo, WO/2003/095647], ARN inhibidor (por ejemplo, ARNi, ARN antisentido o microARN) contra los ARNsn U7 para inducir el salto de exones [véase, por ejemplo, WO/2006/021724], y anticuerpos o fragmentos de anticuerpos contra la miostatina o el propéptido de la miostatina), enfermedad de Gaucher (glucocerebrosidasa), enfermedad de Hurler (α-L-iduronidasa), deficiencia de adenosina desaminasa (adenosina desaminasa), enfermedades por almacenamiento de glucógeno (por ejemplo, enfermedad de Fabry [α-galactosidasa] y enfermedad de Pompe [α-glucosidasa ácida lisosomal]) y otros defectos metabólicos, incluidos otros trastornos por almacenamiento lisosomal y trastornos por almacenamiento de glucógeno, enfisema congénito (α1-antitripsina), síndrome de Lesch-Nyhan (hipoxantina guanina fosforibosil transferasa), enfermedad de Niemann-Pick (esfingomielinasa), enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce (deshidrogenasa de cetoácidos de cadena ramificada), enfermedades degenerativas de la retina (y otras enfermedades del ojo y la retina; por ejemplo, PDGF, endostatina y/o angiostatina para la degeneración macular), enfermedades de órganos sólidos como el cerebro (incluida la enfermedad de Parkinson [GDNF], astrocitomas [endostatina, angiostatina y/o ARNi contra el VEGF], glioblastomas [endostatina, angiostatina y/o ARNi contra el VEGF]), hígado (ARNi como ARNip o ARNip, microARN o ARN antisentido para los genes de la hepatitis B y/o la hepatitis C), riñón, corazón, incluyendo insuficiencia cardíaca congestiva o enfermedad arterial periférica (EAP) (por ejemplo, mediante la administración de inhibidor de la proteína fosfatasa I [I-1], fosfolambano, Ca2+-ATPasa del retículo endoplásmico sarcoplásmico [serca2a], proteínas con dedos de zinc que regulan el gen del fosfolambano, Pim-1, PGC-1α, SOD-1, SOD-2, ECF-SOD, calicreína, timosina-β4, factor de transcripción inducible por hipoxia [HIF], βarket, receptor β2-adrenérgico, quinasa del receptor β2-adrenérgico [βARK], fosfoinositida-3 quinasa [PI3 quinasa], calsarcina, un factor angiogénico, S100A1, parvalbúmina, adenilato ciclasa tipo 6, una molécula que afecta a la quinasa del receptor acoplado a la proteína G tipo 2, como una bARKct truncada constitutivamente activa, un ARN inhibidor [por ejemplo, ARNi, ARN antisentido o microARN] contra el fosfolambano; moléculas inhibidoras o dominantes negativas del fosfolambano, como el fosfolambano S16E, etc.), artritis (factores de crecimiento similares a la insulina), trastornos articulares (factores de crecimiento similares a la insulina), hiperplasia intimal (por ejemplo, mediante la administración de enos, inos), mejora de la supervivencia de los trasplantes de corazón (superóxido dismutasa), SIDA (CD4 soluble), atrofia muscular (factor de crecimiento similar a la insulina I, propéptido de miostatina, un factor antiapoptótico, folistatina), isquemia de las extremidades (VEGF, FGF, PGC-1α, EC-SOD, HIF), insuficiencia renal (eritropoyetina), anemia (eritropoyetina), artritis (factores antiinflamatorios como IRAP y receptor soluble de TNFα), hepatitis (interferón α), deficiencia del receptor de LDL (receptor de LDL), hiperamonemia (ornitina transcarbamilasa), ataxias cerebrales espinales, incluyendo SCA1, SCA2 y SCA3, fenilcetonuria (fenilalanina hidroxilasa), enfermedades autoinmunes y similares. La divulgación puede utilizarse además tras un trasplante de órganos para aumentar el éxito del trasplante y/o reducir los efectos secundarios negativos del trasplante de órganos o las terapias complementarias (por ejemplo, mediante la administración de agentes inmunosupresores o ácidos nucleicos inhibidores para bloquear la producción de citocinas). Como otro ejemplo, las proteínas morfogénicas óseas (incluidas RANKL y/o VEGF) pueden administrarse con un aloinjerto óseo, por ejemplo, tras una fractura o una extirpación quirúrgica en un paciente con cáncer.

[0179] Entre las enfermedades de almacenamiento lisosomal que pueden tratarse según la presente divulgación se incluyen, sin limitación: Síndrome de Hurler (MPS IH), síndrome de Scheie (MPS IS) y síndrome de Hurler-Scheie (MPS IH/S) (α-L-iduronidasa); Síndrome de Hunter (MPS II) (iduronato sulfato sulfatasa); Síndrome de Sanfilippo A (MPS IIIA) (heparano-S-sulfato sulfaminidasa), Síndrome de Sanfilippo B (MPS IIIB) (N-acetil-D-glucosaminidasa), Síndrome de Sanfilippo C (MPS IIIC) (acetil-CoAglucosaminida N-acetiltransferasa), síndrome de Sanfilippo D (MPS IIID) (N-acetilglucosaminina-6-sulfato sulfatasa); enfermedad de Morquio A (MPS IVA) (galactosamina-6-sulfato sulfatasa), enfermedad de Morquio B (MPS IV B) (β-galactosidasa); enfermedad de Maroteaux-Lmay (MPS VI) (arilsulfatasa B); síndrome de Sly (MPS VII) (β-glucuronidasa); eficiencia de hialuronidasa (MPS IX) (hialuronidasa); sialidosis (mucolipidosis I), mucolipidosis II (enfermedad de I-Cell) (subunidad catalítica de la N-actilglucosaminil-1-fosfotransferasa), mucolipidosis III (polidistrofia pseudo-Hurler) (N-acetilglucosaminil-1-fosfotransferasa; tipo IIIA [subunidad catalítica] y tipo IIIC [subunidad de reconocimiento de sustrato]); gangliosidosis GM1 (gangliosida βgalactosidasa), gangliosidosis GM2 tipo I (enfermedad de Tay-Sachs) (β-hexaminidasa A), gangliosidosis GM2 tipo II (enfermedad de Sandhoff) (β-hexosaminidasa B); Enfermedad de Niemann-Pick (tipos A y B) (esfingomielinasa); Enfermedad de Gaucher (glucocerebrosidasa); Enfermedad de Farber (ceraminidasa); Enfermedad de Fabry (agalactosidasa A); Enfermedad de Krabbe (galactosilceramida β-galactosidasa); leucodistrofia metacromática (arilsulfatasa A); deficiencia de lipasa ácida lisosomal, incluida la enfermedad de Wolman (lipasa ácida lisosomal); enfermedad de Batten (lipofuscinosis neuronal ceroidea juvenil) (proteína transmembrana lisosomal CLN3); sialidosis (neuraminidasa 1); galactosialidosis (síndrome de Goldberg) (proteína protectora/catepsina A); α-manosidosis (α-D-manosidasa); β-manosidosis (β-D-manosidosis); fucosidosis (α-D-fucosidasa); aspartilglucosaminuria (N-aspartilglucosaminidasa); y sialuria (cotransportador de fosfato de sodio).

[0181] Entre las enfermedades de almacenamiento de glucógeno que pueden tratarse según la presente divulgación se incluyen, entre otras, la GSD tipo Ia (enfermedad de von Gierke) (glucosa-6-fosfatasa), la GSD tipo Ib (translocasa de glucosa-6-fosfato), la GSD tipo Ic (transportador microsomal de fosfato o pirofosfato), GSD tipo Id (transportador de glucosa microsomal), GSD tipo II, incluida la enfermedad de Pompe o GSD infantil tipo IIa (α-glucosidasa ácida lisosomal) y tipo IIb (Danon) (proteína de membrana lisosomal 2), GSD tipo IIIa y IIIb (enzima desramificadora; amiloglucosidasa y oligoglucanotransferasa), GSD tipo IV (enfermedad de Andersen) (enzima ramificadora), GSD tipo V (enfermedad de McArdle) (fosforilasa muscular), GSD tipo VI (enfermedad de Hers) (fosforilasa hepática), GSD tipo VII (enfermedad de Tarui) (fosfofructoquinasa), GSD tipo VIII/IXa (fosforilasa quinasa ligada al cromosoma X), GSD tipo IXb (fosforilasa quinasa hepática y muscular), GSD tipo IXc (fosforilasa quinasa hepática), GSD tipo IXd (fosforilasa quinasa muscular), GSD O (glicógeno sintasa), Síndrome de Fanconi-Bickel (transportador de glucosa 2), deficiencia de fosfoglucoisomerasa, deficiencia de fosfoglicerato quinasa muscular, deficiencia de fosfoglicerato mutasa, deficiencia de fructosa 1,6-difosfatasa, deficiencia de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa y deficiencia de lactato deshidrogenasa.

[0183] La transferencia génica tiene un potencial considerable para comprender y tratar enfermedades. Existen varias enfermedades hereditarias en las que se conocen los genes defectuosos y se han clonado. En general, las enfermedades mencionadas anteriormente se dividen en dos clases: estados de deficiencia, normalmente de enzimas, que suelen heredarse de forma recesiva, y estados de desequilibrio, que pueden afectar a proteínas reguladoras o estructurales y que suelen heredarse de forma dominante. En el caso de las enfermedades por deficiencia, la transferencia génica puede utilizarse para introducir un gen normal en los tejidos afectados con fines de terapia de sustitución, así como para crear modelos animales de la enfermedad utilizando ARN inhibidor, como el ARNi (por ejemplo, ARNip o ARNsh), microARN o ARN antisentido. En el caso de las enfermedades por desequilibrio, la transferencia génica puede utilizarse para crear una enfermedad en un sistema modelo, que luego puede utilizarse en los esfuerzos por contrarrestar la enfermedad. Por lo tanto, los vectores virales según la presente divulgación permiten el tratamiento de enfermedades genéticas. Tal y como se utiliza en el presente documento, un estado de enfermedad se trata remediando parcial o totalmente la deficiencia o el desequilibrio que causa la enfermedad o la agrava. También es posible el uso de la recombinación específica de secuencias nucleicas para provocar mutaciones o corregir defectos.

[0185] Los vectores víricos según la presente divulgación también pueden emplearse para proporcionar un ácido nucleico antisentido o ARN inhibidor (por ejemplo, microARN o ARNi, como un ARNip o ARNsh) a una célulain vitrooin vivo. La expresión del ARN inhibidor en la célula diana disminuye la expresión de una o varias proteínas concretas por parte de la célula. En consecuencia, se puede administrar ARN inhibidor para disminuir la expresión de una proteína concreta en un sujeto que lo necesite. El ARN inhibidor también se puede administrar a célulasin vitropara regular la fisiología celular, por ejemplo, para optimizar los sistemas de cultivo celular o tisular.

[0187] Como aspecto adicional, los vectores virales de la presente divulgación se pueden utilizar para producir una respuesta inmunitaria en un sujeto. Según esta realización, se puede administrar a un sujeto un vector viral que comprende un ácido nucleico que codifica un inmunógeno, y el sujeto monta una respuesta inmunitaria activa (opcionalmente, una respuesta inmunitaria protectora) contra el inmunógeno. Los inmunógenos son los descritos anteriormente.

[0189] Alternativamente, el vector viral se puede administrar a una célulaex vivoy la célula alterada se administra al sujeto. El ácido nucleico heterólogo se introduce en la célula y la célula se administra al sujeto, donde el ácido nucleico heterólogo que codifica el inmunógeno se expresa opcionalmente e induce una respuesta inmunitaria en el sujeto contra el inmunógeno. En realizaciones particulares, la célula es una célula presentadora de antígenos (por ejemplo, una célula dendrítica).

[0191] Una "respuesta inmunitaria activa" o "inmunidad activa" se caracteriza por "la participación de los tejidos y células del huésped tras entrar en contacto con el inmunógeno. Implica la diferenciación y proliferación de células inmunocompetentes en los tejidos linforreticulares, lo que conduce a la síntesis de anticuerpos o al desarrollo de reactividad mediada por células, o ambas cosas". Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation, en IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti ed., 1985). Dicho de otro modo, el huésped genera una respuesta inmunitaria activa tras la exposición a inmunógenos por infección o vacunación. La inmunidad activa puede contrastarse con la inmunidad pasiva, que se adquiere mediante la "transferencia de sustancias preformadas (anticuerpos, factor de transferencia, injerto tímico, interleucina-2) de un huésped inmunizado activamente a un huésped no inmunizado".Id.

[0192] Una respuesta inmunitaria "protectora" o inmunidad "protectora", tal y como se utiliza en el presente documento, indica que la respuesta inmunitaria confiere algún beneficio al sujeto, ya que previene o reduce la incidencia de la enfermedad. Alternativamente, una respuesta inmunitaria protectora o una inmunidad protectora pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades, en particular el cáncer o los tumores (por ejemplo, provocando la regresión de un cáncer o tumor y/o previniendo la metástasis y/o previniendo el crecimiento de nódulos metastásicos). Los efectos protectores pueden ser completos o parciales, siempre que los beneficios del tratamiento superen cualquier desventaja del mismo.

[0193] Los vectores virales de la presente divulgación también pueden administrarse para la inmunoterapia contra el cáncer mediante la administración de un vector viral que exprese un antígeno de células cancerosas (o una molécula inmunológicamente similar) o cualquier otro inmunógeno que produzca una respuesta inmunitaria contra una célula cancerosa. A modo de ejemplo, se puede producir una respuesta inmunitaria contra un antígeno de células cancerosas en un sujeto mediante la administración de un vector viral que comprenda una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifique el antígeno de células cancerosas, por ejemplo, para tratar a un paciente con cáncer. El vector viral se puede administrar a un sujetoin vivoo mediante métodosex vivo, tal y como se describe en el presente documento. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "cáncer" abarca los cánceres que forman tumores. Del mismo modo, el término "tejido canceroso" abarca los tumores. Un "antígeno de células cancerosas" abarca los antígenos tumorales.

[0194] El término "cáncer" tiene su significado entendido en la técnica, por ejemplo, un crecimiento incontrolado de tejido que tiene el potencial de extenderse a sitios distantes del cuerpo (es decir, metastatizar). Entre los ejemplos de cánceres se incluyen, entre otros, la leucemia, el linfoma (por ejemplo, los linfomas de Hodgkin y no Hodgkin), el cáncer colorrectal, el cáncer renal, el cáncer de hígado, el cáncer de mama, el cáncer de pulmón, el cáncer de próstata, el cáncer de testículo, el cáncer de ovario, el cáncer de útero, el cáncer de cuello uterino, el cáncer de cerebro (por ejemplo, gliomas y glioblastoma), cáncer de huesos, sarcoma, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer de tiroides y similares. En las realizaciones de la divulgación, la divulgación se practica para tratar y/o prevenir cánceres que forman tumores.

[0195] El término "tumor" también se entiende en la técnica, por ejemplo, como una masa anómala de células indiferenciadas dentro de un organismo multicelular. Los tumores pueden ser malignos o benignos. En aspectos representativos de la divulgación, los métodos aquí descritos se utilizan para prevenir y tratar tumores malignos.

[0196] Los antígenos de las células cancerosas se han descrito anteriormente. Por los términos "tratar el cáncer" o "tratamiento del cáncer" se entiende que se reduce la gravedad del cáncer o que se previene o, al menos, se elimina parcialmente. Por ejemplo, en contextos particulares, estos términos indican que se previene o se reduce la metástasis del cáncer o, al menos, se elimina parcialmente. En otras realizaciones representativas, estos términos indican que se previene o reduce, o al menos se elimina parcialmente, el crecimiento de nódulos metastásicos (por ejemplo, tras la extirpación quirúrgica de un tumor primario). Por los términos "prevención del cáncer" o "prevenir el cáncer" se entiende que los métodos eliminan o reducen, al menos parcialmente, la incidencia o la aparición del cáncer. En otras palabras, la aparición o progresión del cáncer en el sujeto puede ralentizarse, controlarse, disminuir su probabilidad o retrasarse. En realizaciones particulares, las células pueden extraerse de un sujeto con cáncer y ponerse en contacto con un vector viral según la presente divulgación. A continuación, la célula modificada se administra al sujeto, lo que provoca una respuesta inmunitaria contra el antígeno de la célula cancerosa. Este método se emplea de forma especialmente ventajosa en sujetos inmunodeprimidos que no pueden generar una respuesta inmunitaria suficientein vivo(es decir, que no pueden producir anticuerpos potenciadores en cantidades suficientes).

[0197] Es conocido en la técnica que las respuestas inmunitarias pueden potenciarse mediante citocinas inmunomoduladoras (por ejemplo, interferón α, interferón β, interferón γ, interferón ω, interferón τ, interleucina-1α, interleucina-1β, interleucina-2, interleucina-3, interleucina-4, interleucina 5, interleucina-6, interleucina-7, interleucina-8, interleucina-9, interleucina-10, interleucina-11, interleucina 12, interleucina-13, interleucina-14, interleucina-18, factor de crecimiento de células B, ligando CD40, factor de necrosis tumoral alfa, factor de necrosis tumoral beta, proteína quimioatrayente de monocitos 1, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos y linfotoxina). En consecuencia, las citocinas inmunomoduladoras (por ejemplo, citocinas inductoras de CTL) pueden administrarse a un sujeto junto con los vectores virales.

[0198] Las citocinas pueden administrarse por cualquier método conocido en la técnica. Las citocinas exógenas pueden administrarse al sujeto o, alternativamente, puede administrarse al sujeto una secuencia de nucleótidos que codifica una citocina utilizando un vector adecuado, y la citocina se producein vivo.

[0199] Los vectores virales son además útiles para dirigirse a las células hepáticas con fines de investigación, por ejemplo, para el estudio de la función hepáticain vitroo en animales, o para su uso en la creación y/o el estudio de modelos animales de enfermedades. Por ejemplo, los vectores pueden utilizarse para administrar ácidos nucleicos heterólogos a hepatocitos en modelos animales de lesión hepática, por ejemplo, fibrosis o cirrosis, o en modelos animales de enfermedades hepáticas como infecciones virales (por ejemplo, virus de la hepatitis).

[0200] Además, los vectores virales según la presente divulgación encuentran un uso adicional en métodos de diagnóstico y cribado, mediante los cuales un gen de interés se expresa de forma transitoria o estable en un sistema de cultivo celular o, alternativamente, en un modelo animal transgénico. La divulgación también puede ponerse en práctica para administrar un ácido nucleico con fines de producción de proteínas, por ejemplo, con fines de laboratorio, industriales o comerciales.

[0201] Los vectores virales recombinantes según la presente divulgación encuentran uso tanto en aplicaciones veterinarias como médicas. Los sujetos adecuados incluyen tanto aves como mamíferos. El término "ave", tal y como se utiliza aquí, incluye, entre otros, pollos, patos, gansos, codornices, pavos, faisanes, loros y periquitos. El término "mamífero", tal y como se utiliza en el presente documento, incluye, entre otros, a los seres humanos, los primates no humanos (por ejemplo, monos y babuinos), el ganado vacuno, ovino y caprino, los cerdos, los caballos, los gatos, los perros, los conejos, los roedores (por ejemplo, ratas, ratones, hámsters y similares), etc. Los sujetos humanos incluyen a los recién nacidos, los lactantes, los jóvenes y los adultos Opcionalmente, el sujeto "necesita" los métodos de la presente divulgación, por ejemplo, porque el sujeto padece o se cree que está en riesgo de padecer un trastorno, incluidos los descritos en el presente documento, o porque se beneficiaría de la administración de un ácido nucleico, incluidos los descritos en el presente documento. Como otra opción, el sujeto puede ser un animal de laboratorio y/o un modelo animal de enfermedad.

[0202] En realizaciones particulares, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un vector viral de la divulgación en un vehículo farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, agentes estabilizadores, tampones, vehículos, adyuvantes, diluyentes, etc. Para la inyección, el vehículo será típicamente un líquido. Para otros métodos de administración, el vehículo puede ser sólido o líquido. Para la administración por inhalación, el vehículo será respirable y, preferiblemente, estará en forma de partículas sólidas o líquidas.

[0203] Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende un material que no es tóxico ni indeseable de otro modo, es decir, el material puede administrarse a un sujeto sin causar ningún efecto biológico indeseable.

[0204] Un aspecto de la presente divulgación es un método para transferir una secuencia de nucleótidos a una célulain vitro. El vector viral puede introducirse en las células con la multiplicidad de infección adecuada según los métodos de transducción estándar apropiados para las células diana concretas. Los títulos del vector viral o la cápside que se administran pueden variar en función del tipo y número de células diana, así como del vector viral o la cápside concretos, y pueden ser determinados por expertos en la materia sin necesidad de realizar experimentos innecesarios. En realizaciones particulares, se introducen en la célula al menos unas 10<3>unidades infecciosas, más preferiblemente al menos unas 10<5>unidades infecciosas.

[0205] Las células en las que se puede introducir el vector viral pueden ser de cualquier tipo, incluyendo, entre otras, células neurales (incluidas las células del sistema nervioso periférico y central, en particular, células cerebrales como neuronas, oligodendrocitos, células gliales y astrocitos), células pulmonares, células oculares (incluidas células retinianas, epitelio pigmentario retiniano y células corneales), células epiteliales (por ejemplo, células epiteliales intestinales y respiratorias), células del músculo esquelético (incluidos mioblastos, miotubos y miofibras), células del músculo diafragmático, células dendríticas, células pancreáticas (incluidas las células de los islotes), células hepáticas, células del tracto gastrointestinal (incluidas las células del músculo liso y las células epiteliales), células cardíacas (incluidos los cardiomiocitos), células óseas (por ejemplo, células madre de la médula ósea), células madre hematopoyéticas, células del bazo, queratinocitos, fibroblastos, células endoteliales, células de la próstata, células articulares (incluidas, por ejemplo, cartílago, menisco, sinovial y médula ósea), células germinales no humanas y similares. Alternativamente, la célula puede ser cualquier célula progenitora. Como otra alternativa más, la célula puede ser una célula madre (por ejemplo, célula madre neural, célula madre hepática). Como otra alternativa más, la célula puede ser una célula cancerosa o tumoral (los cánceres y tumores se describen anteriormente). Además, las células pueden ser de cualquier especie de origen, como se ha indicado anteriormente.

[0206] Los vectores víricos pueden introducirse en célulasin vitrocon el fin de administrar la célula modificada a un sujeto. En realizaciones particulares, las células se han extraído de un sujeto, se introduce el vector vírico en ellas y, a continuación, las células se vuelven a introducir en el sujeto. Los métodos para extraer células de un sujeto para su tratamientoex vivo, seguidos de su reintroducción en el sujeto, son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 5,399,346). Alternativamente, el vector viral recombinante se introduce en células de otro sujeto, en células cultivadas o en células de cualquier otra fuente adecuada, y las células se administran a un sujeto que las necesita.

[0207] Las células adecuadas para la terapia génicaex vivoson las descritas anteriormente. Las dosis de las células que se administran a un sujeto variarán en función de la edad, el estado y la especie del sujeto, el tipo de célula, el ácido nucleico que expresa la célula, el modo de administración y otros factores similares. Normalmente, se administrarán al menos entre 10<2>y 10<8>o entre 10<3>y 10<6>células por dosis en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En realizaciones particulares, las células transducidas con el vector viral se administran al sujeto en una cantidad eficaz en combinación con un vehículo farmacéutico.

[0208] En algunas realizaciones, las células que han sido transducidas con el vector viral pueden administrarse para provocar una respuesta inmunogénica contra el polipéptido administrado (por ejemplo, expresado como un transgén o en la cápside). Normalmente, se administra una cantidad de células que expresan una cantidad eficaz del polipéptido en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, la dosis es suficiente para producir una respuesta inmunitaria protectora (tal y como se ha definido anteriormente). El grado de protección conferido no tiene por qué ser completo o permanente, siempre que los beneficios de la administración del polipéptido inmunogénico superen cualquier desventaja del mismo.

[0209] Otro aspecto de la divulgación es un método para administrar los vectores virales o cápsides de la divulgación a sujetos. En realizaciones particulares, el método comprende un método para administrar un ácido nucleico de interés a un sujeto animal, el método comprende: administrar una cantidad eficaz de un vector viral según la divulgación a un sujeto animal. La administración de los vectores virales de la presente divulgación a un sujeto humano o a un animal que lo necesite puede realizarse por cualquier medio conocido en la técnica. Opcionalmente, el vector viral se administra en una dosis eficaz en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0210] Los vectores víricos de la presente divulgación pueden administrarse además a un sujeto para provocar una respuesta inmunogénica (por ejemplo, como vacuna). Normalmente, las vacunas de la presente divulgación comprenden una cantidad eficaz de virus en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, la dosis es suficiente para producir una respuesta inmunitaria protectora (tal y como se ha definido anteriormente). El grado de protección conferido no tiene por qué ser completo o permanente, siempre que los beneficios de la administración del polipéptido inmunogénico superen cualquier desventaja del mismo. Los sujetos y los inmunógenos son los descritos anteriormente.

[0211] Las dosis de los vectores víricos que se administrarán a un sujeto dependerán del modo de administración, la enfermedad o afección que se vaya a tratar, el estado de cada sujeto, el vector vírico concreto y el ácido nucleico que se vaya a administrar, y se pueden determinar de forma rutinaria. Las dosis ilustrativas para lograr efectos terapéuticos son títulos víricos de al menos aproximadamente 10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>, 10<9>, 10<10>, 10<11>, 10<12>, 10<13>, 10<14>, 10<15>, 10<16>, 10<17>, 10<18>unidades de transducción o más, preferiblemente alrededor de 10<7>o 10<8>, 10<9>, 10<10>, 10<11>, 10<12>, 10<11>, 10<14>o 10<15>unidades de transducción, y más preferiblemente alrededor de 10<12>a 10<14>unidades de transducción.

[0212] En realizaciones particulares, se puede emplear más de una administración (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más administraciones) para alcanzar el nivel deseado de expresión génica durante un período de varios intervalos, por ejemplo, diario, semanal, mensual, anual, etc.

[0213] Los modos de administración ilustrativos incluyen oral, rectal, transmucoso, tópico, intranasal, inhalación (por ejemplo, mediante un aerosol), bucal (por ejemplo, sublingual), vaginal, intratecal, intraocular, transdérmica, intrauterina (oin ovo), parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramuscular [incluida la administración en el músculo esquelético, el diafragma y/o el músculo cardíaco], intradérmica, intrapleural, intracerebral e intraarticular), tópica (por ejemplo, tanto en la piel como en las superficies mucosas, incluidas las superficies de las vías respiratorias, y la administración transdérmica), intralinfática y similares, así como la inyección directa en tejidos u órganos (por ejemplo, en el hígado, el músculo esquelético, el músculo cardíaco, el músculo diafragmático o el cerebro). La administración también puede realizarse en un tumor (por ejemplo, en o cerca de un tumor o un ganglio linfático). La vía más adecuada en cada caso dependerá de la naturaleza y la gravedad de la afección que se esté tratando y de la naturaleza del vector concreto que se esté utilizando.

[0214] En algunas realizaciones, el vector viral se administra directamente al hígado. La administración directa puede dar lugar a una alta especificidad de transducción de los hepatocitos, por ejemplo, en la que al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o más de las células transducidas son hepatocitos. Se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para administrar vectores directamente al hígado. El vector puede introducirse mediante inyección directa en el hígado o inyección en una arteria o vena que irriga el hígado, por ejemplo, administración intraportal.

[0215] Normalmente, el vector viral se administrará en una formulación líquida mediante administración sistémica o inyección directa en la región o compartimento deseado del hígado. En algunas realizaciones, el vector puede administrarse a través de un depósito y/o una bomba. En otras realizaciones, el vector puede administrarse mediante aplicación tópica en la región deseada o mediante administración intranasal de una formulación en aerosol. La administración en el ojo o en el oído puede realizarse mediante la aplicación tópica de gotas líquidas. Como alternativa adicional, el vector puede administrarse como una formulación sólida de liberación lenta. La liberación controlada de vectores de parvovirus y AAV se describe en la publicación de patente internacional WO 01/91803.

[0216] La administración a cualquiera de estos tejidos también puede lograrse mediante la administración de un depósito que comprenda el vector viral, que puede implantarse en el tejido, o bien el tejido puede ponerse en contacto con una película u otra matriz que comprenda el vector viral. En la patente de EE. UU. n.º 7,201,898 se describen ejemplos de tales matrices o sustratos implantables.

[0217] Los inyectables pueden prepararse en formas convencionales, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones, formas sólidas adecuadas para su disolución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Alternativamente, se puede administrar el vector viral de forma local en lugar de sistémica, por ejemplo, en un depósito o en una formulación de liberación sostenida. Además, el vector viral puede administrarse seco en una matriz implantable quirúrgicamente, como un sustituto de injerto óseo, una sutura, un stent y similares (por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.º 7,201,898).

[0218] Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral pueden presentarse en unidades discretas, tales como cápsulas, cápsulas, pastillas o comprimidos, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada de la composición de la presente divulgación; en forma de polvo o gránulos; en forma de solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o en forma de emulsión de aceite en agua o de agua en aceite. La administración oral puede realizarse compleja un vector viral de la presente divulgación a un portador capaz de resistir la degradación por las enzimas digestivas en el intestino de un animal. Ejemplos de tales portadores incluyen cápsulas o comprimidos de plástico, como se conoce en la técnica. Tales formulaciones se preparan por cualquier método farmacéutico adecuado, que incluye el paso de asociar la composición y un portador adecuado (que puede contener uno o más ingredientes accesorios como se ha señalado anteriormente). En general, la composición farmacéutica según las realizaciones de la presente divulgación se prepara mezclando de manera uniforme e íntima la composición con un portador líquido o sólido finamente dividido, o ambos, y luego, si es necesario, dando forma a la mezcla resultante. Por ejemplo, se puede preparar un comprimido comprimiendo o moldeando un polvo o gránulos que contengan la composición, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos se preparan comprimiendo, en una máquina adecuada, la composición en forma fluida, como polvo o gránulos, mezclados opcionalmente con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte y/o agente(s) tensioactivo(s)/dispersante(s). Los comprimidos moldeados se fabrican moldeando, en una máquina adecuada, el compuesto en polvo humedecido con un aglutinante líquido inerte.

[0219] Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración bucal (sublingual) incluyen pastillas que comprenden la composición de esta divulgación en una base aromatizada, normalmente sacarosa y acacia o tragacanto; y pastillas que comprenden la composición en una base inerte, como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia.

[0220] Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral pueden comprender soluciones inyectables estériles, acuosas y no acuosas, de la composición de la presente divulgación, preparaciones que son opcionalmente isotónicas con la sangre del receptor previsto. Estas preparaciones pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos, que hacen que la composición sea isotónica con la sangre del receptor previsto. Las suspensiones, soluciones y emulsiones estériles acuosas y no acuosas pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Ejemplos de disolventes no acuosos son el propilenglicol, el polietilenglicol, los aceites vegetales como el aceite de oliva y los ésteres orgánicos inyectables como el oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de líquidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (como los basados en dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Las composiciones pueden presentarse en envases unitarios/monodosis o multidosis, por ejemplo, en ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en condiciones liofilizadas (liofilizadas) que solo requieren la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, solución salina o agua para inyección, inmediatamente antes de su uso.

[0221] Las soluciones y suspensiones inyectables extemporáneas pueden prepararse a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente. Por ejemplo, se puede proporcionar una composición inyectable, estable y estéril de la presente divulgación en una forma de dosificación unitaria en un envase sellado. La composición se puede proporcionar en forma de liofilizado, que se puede reconstituir con un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado para formar una composición líquida adecuada para su inyección en un sujeto. La forma de dosificación unitaria puede ser de aproximadamente 1 µg a aproximadamente 10 gramos de la composición de esta divulgación. Cuando la composición es sustancialmente insoluble en agua, se puede incluir una cantidad suficiente de agente emulsionante, que sea fisiológicamente aceptable, en cantidad suficiente para emulsionar la composición en un vehículo acuoso. Un agente emulsionante útil es la fosfatidilcolina.

[0222] Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración rectal pueden presentarse en forma de supositorios de dosis unitaria. Estos pueden prepararse mezclando la composición con uno o más excipientes sólidos convencionales, como por ejemplo manteca de cacao, y luego dando forma a la mezcla resultante.

[0223] Las composiciones farmacéuticas de esta divulgación adecuadas para la aplicación tópica sobre la piel pueden adoptar la forma de pomada, crema, loción, pasta, gel, espray, aerosol o aceite. Los excipientes que se pueden utilizar incluyen, entre otros, vaselina, lanolina, polietilenglicoles, alcoholes, potenciadores transdérmicos y combinaciones de dos o más de los mismos. En algunas realizaciones de la presente divulgación, por ejemplo, la administración tópica puede realizarse mezclando una composición farmacéutica de la presente divulgación con un reactivo lipofílico (por ejemplo, DMSO) que sea capaz de pasar a la piel.

[0224] Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración transdérmica pueden adoptar la forma de parches discretos adaptados para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del sujeto durante un período de tiempo prolongado. Las composiciones adecuadas para la administración transdérmica también pueden administrarse mediante iontoforesis (véase, por ejemplo, Pharm. Res. 3:318 (1986)) y suelen adoptar la forma de una solución acuosa, opcionalmente tamponada, de la composición de la presente divulgación. Las formulaciones adecuadas pueden comprender citrato o tampón bis\tris (pH 6) o etanol/agua y pueden contener de 0,1 a 0,2 M de ingrediente activo.

[0225] Los vectores virales descritos en la presente pueden administrarse a los pulmones de un sujeto por cualquier medio adecuado, por ejemplo, administrando una suspensión en aerosol de partículas respirables compuestas por los vectores virales, que el sujeto inhala. Las partículas respirables pueden ser líquidas o sólidas. Los aerosoles de partículas líquidas que comprenden los vectores virales pueden producirse por cualquier medio adecuado, como con un nebulizador de aerosol impulsado por presión o un nebulizador ultrasónico, como es conocido por los expertos en la materia. Véase, p. ej., la patente de EE. UU. n.º 4,501,729. Los aerosoles de partículas sólidas que comprenden los vectores virales pueden producirse igualmente con cualquier generador de aerosoles de medicamentos en partículas sólidas, mediante técnicas conocidas en el campo farmacéutico.

[0226] Una vez descrita la presente invención, se explicará con mayor detalle en los siguientes ejemplos.

[0227] EJEMPLO 1

[0228] Construcción de una biblioteca de genes de cápside de AAV reordenados

[0229] La construcción de una biblioteca de genes de cápside de AAV reordenados se realizó tal y como se ha descrito anteriormente (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106(10):3946 (2009); Yang et al., Meth. Mol. Biol. 709:127 (2011)). Los genes de la cápside de los serotipos 1, 2, 3B, 4, 6, 7, 8 y 9 del AAV se clonaron en el mismo vector pXX-UF1-AAV que contiene repeticiones terminales invertidas (ITR) del AAV2 y el gen Rep del AAV2. Estos plásmidos que contienen ITR, AAV2 Rep y cada uno de los ocho genes Cap diferentes se denominaron pXX-UF1-AAVn de forma secuencial. Los genes de la cápside se amplificaron mediante los cebadores CAP-5' 5'-CCC-AAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA-3'(SEQ ID NO:7)y CAP-3' 5'-ATAAGAAT-GCGGCCGC-AGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA-3'(SEQIDNO:8),mezclados en la misma proporción para el reordenamiento del ADN (Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747 (1994)). En resumen, se trataron 4 µg de las plantillas de ADN con 0,04 U de DNasa I a 15 °C brevemente y se purificaron fragmentos de 300-500 y 500-1000 pb del gel de agarosa para el reensamblaje de los genes de la cápside utilizando ADN polimerasapfu. Los genes de la cápside reensamblados se reamplificaron mediante ADN polimerasapfuutilizando cebadores CAP5'/CAP3', se digirieron con HindIII / NotI y se ligaron al vector pXX-UF1-AAV digerido con HindIII / NotI que contenía ITR de AAV2 flanqueando los genes Rep y Cap de AAV2. La digestión con HindIII/Not I eliminó eficazmente el gen de la cápside AAV2 para la sustitución de los fragmentos amplificados por PCR de los genes Cap enriquecidos en el hígado. El programa de PCR fue de 94 °C durante 5 min; 94 °C durante I min, 75 °C durante 5 min para el inicio en caliente, 60 °C durante 1 min, 72 °C durante 4,5 min; 29 ciclos de 94 °C durante I min, 60 °C durante 1 min, 72 °C durante 4,5 min; 72 °C durante 10 minutos. Los plásmidos reconstruidos se transformaron en célulasE. coliDH10B y se seleccionaron aleatoriamente varios clones para el análisis con enzimas de restricción con el fin de determinar la frecuencia de recombinación y la viabilidad del empaquetamiento. La biblioteca de plásmidos AAV infecciosos que contenían ITR resultante se utilizó para producir una biblioteca de partículas virales AAV autoempaquetadas.

[0230] EJEMPLO 2

[0231] Enriquecimiento in vivo en hígado de ratón

[0232] Para el cribadoin vivode variantes de AAV dirigidas al hígado, se administraron 1x10<11>vg (genomas vectoriales)/ratón de la biblioteca de AAV quiméricos a ratones C57BL/6J adultos a través de la vena caudal. Dos semanas después, se recogieron tejidos de ratón, incluyendo hígado y otros tejidos, para aislar el ADN genómico mediante extracción con fenol/cloroformo. Tras la amplificación por PCR del ADN total del hígado utilizando los cebadores comunes para los genes de la cápside, los productos de la PCR se reclonaron en la cadena principal del plásmido AAV que contenía los ITR de AAV2 y el gen Rep. Así, los productos de PCR del gen de la cápside y el vector pXX-UF1-AAV se digirieron con HindIII / NotI y se ligaron para su clonación. La segunda ronda de producción de partículas AAV infecciosas se generó a partir del enriquecimientoin vivode la primera ronda y se inyectó de nuevo en ratones. Este proceso de enriquecimientoin vivose repitió en ratones tres veces.

[0233] El producto final de la PCR de los genes de la cápside altamente enriquecidos se clonó en un precursor universal del plásmido de empaquetamiento del AAV que contenía el gen Rep del AAV2 sin las repeticiones terminales invertidas (ITR) del AAV. Los genes de la cápside se ligaron aguas abajo del gen Rep y aguas arriba de la secuencia de señal de poliadenilación del AAV para reconstituir los casetes de expresión de los genes Rep y Cap. Los productos de ligación se electroporaron en la cepa DH10B deE. coliy se cultivaron en placas resistentes a Amp. Se seleccionaron colonias individuales y se aisló ADN miniprep para la secuenciación del ADN de los genes de la cápside. Se encontraron varios genes de cápside nuevos y dos de ellos estaban altamente enriquecidos. Estos dos genes de cápside se denominaron AAVXL32 y AAVXL12. Sus secuencias de ADN se muestran en SEQ ID NO:1 y 2, y sus secuencias de aminoácidos se muestran en SEQ ID NO:4 y 5. Mientras que las secuencias de ADN de AAVXL12 y AAVXL32 difieren en 23 nucleótidos (23 de 2214 nucleótidos), sus secuencias de aminoácidos solo difieren en 2 residuos (2 de 737 aminoácidos). El aminoácido 220 es S en XL12 y D en XL32; y el aminoácido 643 es N en XL12 y H en XL32.

[0234] EJEMPLO 3

[0235] Producción de vectores AAV que contienen genes informadores

[0236] Los plásmidos de empaquetamiento específicos de la cápside se produjeron mediante el método convencional de preparación a gran escala y se purificaron mediante ultracentrifugación de densidad CsCl dos veces. Estos plásmidos se utilizaron para el empaquetamiento de vectores AAV que contienen genes informadores, como los genes de la proteína fluorescente verde GFP y la beta-galactosidasa Lac-Z, bajo el control transcripcional de los promotores ubicuos CMV o CB (potenciador CMV más promotor basal de beta-actina de pollo). Los vectores AAV se empaquetaron en cada cápside novedosa y se purificaron mediante la doble ultracentrifugación convencional en CsCl. Los títulos de los vectores informadores se determinaron mediante el método de transferencia de puntos de ADN frente a números de copias conocidos del ADN plasmídico del vector informador correspondiente. Todos los rendimientos de los vectores se encontraban dentro del rango normal.

[0237] EJEMPLO 4

[0238] Examen in vivo de cápsides de AAV enriquecidas en hígado en ratones

[0239] Para examinar si las nuevas cápsides enriquecidas y seleccionadasin vivoson potentes en la transducción del hígado, se utilizaron AAVXL12 y AAVXL32 para empaquetar por separado dos genes informadores, GFP y LacZ. Los vectores se purificaron, se titularon y se inyectaron por vía intravenosa a través de la vena caudal de ratones C57B/6 a una dosis de 5x10<12>vg/kg de peso corporal. Se utilizaron vectores AAV9 que empaquetaban los mismos genes GFP y LacZ como control positivo, ya que la transferencia génica AAV9 es robusta en el hígado de ratón. Como se muestra en lasFIG. 1A-1B, los resultados revelaron que, tanto para los genes informadores GFP como LacZ, AAVXL12 y AAVXL32 alcanzaron esencialmente los mismos niveles de expresión génica en el hígado que el control AAV9, lo que confirma la estrategia de selecciónin vivoque enriqueció los genes de la cápside trópica hepática en ratones.

[0240] EJEMPLO 5

[0241] Examen in vitro de cápsides de AAV enriquecidas en hígado en una línea celular de cáncer de hígado humanoPara ver si las cápsides tropistas del hígado son capaces de transducir células hepáticas de origen humano, los vectores se examinaron primeroin vitroen una línea celular de cáncer de hígado humano denominada Huh7. Huh7 se utiliza ampliamente para ensayosin vitrode expresión génica de vectores AAV con promotores específicos del hígado. La línea celular conserva algunas de las características de los hepatocitos humanos y muestra una correlación positiva con los hepatocitos humanos primarios cultivados. Por lo tanto, esta línea celular puede utilizarse para realizar pruebas iniciales del tropismo hepático de las cápsides AAV para células de origen humano. Una vez más, se utilizó AAV9 como control positivo. Como se muestra en laFIG. 2, tanto AAVXL12 como AAVXL32 lograron una expresión génica altamente eficiente a una multiplicidad de infección (moi) de 1x10<5>vg/célula y 1x10<4>vg/célula. Por otro lado, el AAV9 no fue eficaz en la transducción de las células Huh7. Solo se detectaron unas pocas células lacZ positivas en la moi más alta. Estos resultados sugieren que el AAVXL12 y el AAVXL32 podrían poseer una alta afinidad por las células hepáticas humanas, además de por las células hepáticas de ratón.

[0242] EJEMPLO 6

[0243] Examen in vitro de cápsides de AAV enriquecidas en hígado en hepatocitos primarios humanos y caninosDado que ciertos serotipos de AAV transducen muy bien el hígado de ratón, pero transducen mal el hígado humano o no humano (mono) (Hurlbut et al., Mol. Ther.18:1983 (2010)), mientras que otros serotipos transducen mal el hígado de ratón, pero funcionan muy bien en un modelo de ratón con hígado humanizado (Lisowski et al., Nature 506(7488):382 (2014)) y monos (Li et al., Mol. Ther.12:1867 (2015)), esta discrepancia llevó a examinar si las nuevas cápsides de AAV con tropismo hepático también transducen eficazmente cultivos de hepatocitos primarios humanos y caninos.

[0245] Los vectores se examinaron primeroin vitroen hepatocitos primarios humanos aislados de tres donantes humanos. Los hepatocitos se adquirieron de TRL (Triangle Research Laboratories, actualmente una filial de Invitrogen) y se cultivaron con medios proporcionados por el proveedor y de acuerdo con sus protocolos. Se utilizó GFP bajo el control del promotor CMV ubicuo como gen informador y se empaquetó en AAVXL12, AAVXL32 y AAV2, 6, 7, 8, 9, etc. Estos vectores se utilizaron para infectar el cultivo de hepatocitos primarios con una confluencia celular de aproximadamente el 80 % y una dosis de vector de 1x10<5>vg/célula. Se tomaron fotografías fluorescentes en diferentes momentos de las células para observar la expresión de GFP, que mostraba un color verde. Como se muestra en laFIG. 3A-3D, los resultados revelaron que, mientras que las cápsides de serotipos ampliamente descritas, como AAV8 y AAV9, transducían de forma robusta el hígado de ratón, estos vectores mostraban una infectividad muy pobre en los hepatocitos humanos primarios. Por el contrario, las nuevas cápsides AAV tropistas del hígado enriquecidas en el hígado de ratón también transducían los hepatocitos humanos primarios con la mayor eficacia entre todos los demás vectores naturales probados en este estudio. A las 24 horas tras la infección (FIG.3A), otros serotipos de AAV apenas presentaban expresión de GFP, mientras que AAVXL12 y AAVXL32 ya presentaban una expresión significativa de GFP. A las 48 horas tras la infección (FIG.3B), AAVXL12 y AAVXL32 volvieron a mostrar el nivel más alto de expresión de GFP. Los hepatocitos infectados con los dos vectores anteriores se mantuvieron en cultivo durante 7 días y se tomaron fotografías de GFP a diario. La intensidad de la fluorescencia de GFP aumenta con el tiempo y alcanzó el nivel más alto en el día 7 (FIG.3Cy3D). Por lo tanto, las nuevas cápsides contrastan claramente con otras cápsides de AAV, como AAV3 y AAVLK03 (Lisowski et al., Nature 506(7488):382 (2014)) y monos (Li et al., Mol. Ther.12:1867 (2015)) que transducen muy mal el hígado de ratón, pero transducen de forma robusta los hepatocitos humanos en el hígado de ratón humanizado, así como en el hígado de primates no humanos. Se ha descrito que otros serotipos de AAV, como el AAV2 y el AAV5, transducen mal tanto el hígado de ratón como el de primates no humanos. El hallazgo anterior sugiere claramente que tanto el AAVXL12 como el AAVXL32 poseen propiedades únicas que no se observan en otras cápsides de AAV conocidas.

[0247] Posteriormente, también se utilizaron hepatocitos primarios de perro para examinar la infectividad del AAV tropista del hígado y compararlo con varias cápsides de AAV de uso común que contienen el gen informador GFP. Las partículas del genoma del vector AAV se utilizaron a una concentración de 1x10<5>vg/célula. Se utilizaron hepatocitos criopreservados y frescos de dos perros. A las 24 y 48 horas después de la infección, se tomaron fotografías de fluorescencia verde de las células infectadas con el vector AAV GFP. Como se muestra en laFIG. 4A-4C, AAVXL12 y AAVXL32 mostraron una mayor eficiencia de transferencia génica que otros serotipos probados, excepto AAV6, que es similar o ligeramente superior a AAVXL12 y AAVXL32. Cabe destacar que, aunque el AAV6 mostró un alto nivel de transferencia génica en los hepatocitos de perro, esto no se observó en el cultivo de hepatocitos primarios humanos. Estos resultados demuestran que tanto el AAVXL12 como el AAVXL32 tenían una alta infectividad en los hepatocitos caninos.

[0248] EJEMPLO 7

[0250] Examen in vivo del AAVXL32 en el hígado de primates no humanos

[0252] A continuación, se examinó si las cápsides tropistas para el hígado también son capaces de lograr una transferencia génica eficaz en los hígados de primates no humanos. Se eligió el AAVXL32 para compararlo con el AAV8. Se ha descrito anteriormente que este último es capaz de transducir hígados de monos y también se ha utilizado en terapia génica dirigida al hígado en humanos para ensayos clínicos de hemofilia B. Se seleccionaron monos macacos rhesus machos adultos de entre 3 y 5 años de edad para detectar anticuerpos neutralizantes séricos contra AAVXL32 y AAV8, de acuerdo con artículos publicados anteriormente. Se seleccionaron cuatro monos con títulos de anticuerpos neutralizantes inferiores a 1:8 para inyectarles vectores AAV por vía intravenosa. A dos monos se les inyectó AAVXL32-CB-GFP y a otros dos se les inyectó AAV-CB-GFP en una dosis de 1x10<12>vg/kg de peso corporal. El casete de expresión del vector AAV estaba en forma de doble cadena (también llamada autocomplementaria) para una expresión génica más rápida y eficiente. Dos semanas después, se sacrificó a los monos y se tomaron muestras de tejido hepático para realizar secciones criogénicas finas y fotografías con fluorescencia verde. Como se muestra en laFIG.5, AAVXL32 alcanzó niveles significativamente más altos de expresión de GFP que AAV8 en los hígados de los monos. Las células positivas para GFP se detectan fácilmente con una mayor intensidad fluorescente y más células positivas (como se indica con las flechas) en los monos tratados con AAVXL32. Por otro lado, los monos tratados con AAV8 mostraron muchas menos células positivas y una intensidad fluorescente más débil. Estos resultados sugieren claramente que el AAVXL32 es significativamente más tropista para el hígado que el AAV8 en primates no humanos.

[0254] EJEMPLO 8

[0256] Caracterización de las proteínas de la cápside del AAVXL32 y eliminación de un codón de inicio débil para una tercera proteína de la cápside

[0258] Para caracterizar la proteína de la cápside, se analizó la cápside AAVXL32 purificada mediante doble ultracentrifugación con CsCl y titulada mediante dot blot de ADN. Los vectores purificados se cargaron en un gel SDS PAGE para determinar el peso molecular de las proteínas VP después de la tinción con plata. Como se muestra en laFIG. 6, el AAVXL32 mostró 4 bandas. Además de las proteínas VP1, VP2 y VP3 típicas de todos los AAV naturales, había una banda adicional (denominada aquí VPX) entre VP1 y VP2. Esta banda adicional era el resultado de una mutagénesis dirigida a un solo nucleótido de los genes de la cápside AAV7 y AAV8 en el sitio de restricción XhoI situado en la región única de la proteína grande VP1. El propósito original de realizar esta mutación era facilitar la clonación del ADN en la biblioteca de reordenación del ADN de los genes de la cápside del AAV, que incluía los genes de la cápside de los serotipos 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8 y 9 del AAV (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106(10):3946 (2009)). La mutación simple de C a G en el sitio XhoI (CTCGAG a CTGGAG) en el nucleótido 219 contando desde el codón de inicio VP1 creó una mutación con sentido para el aminoácido leucina en los genes de la cápside AAV7 y AAV8. No alteró la secuencia de aminoácidos de la proteína VP1. Sin embargo, se sospechó que esta mutación creaba un codón de inicio CTG no consensuado más débil (frente al codón de inicio clásico ATG). Esto podría haber dado lugar a la generación de la proteína de cápside adicional VPX entre VP1 y VP2. Aparentemente, esta banda adicional no comprometió el empaquetamiento del ADN del vector ni la infectividad de manera perceptible. Para confirmar que la mutación con sentido creó un codón de inicio débil para la proteína de cápside adicional, se realizó una mutagénesis dirigida al sitio para revertir la mutación de C a G al C original de las secuencias de AAV7 y AAV8 de tipo salvaje. El nuevo gen de la cápside con la mutación revertida, denominado AAVXL32.1, inactivó efectivamente el codón de inicio débil y eliminó la banda de cápside adicional entre VP1 y VP2 (FIG.6). El vector del gen informador LacZ empaquetado en XL32 o XL32.1 no mostró diferencias aparentes en el rendimiento y la infectividad del vector, lo que sugiere que la banda de cápside adicional desempeñaba un papel insignificante o desconocido en las funciones de la cápside del AAV.

[0260] EJEMPLO 9

[0262] Prevalencia de anticuerpos neutralizantes en muestras de suero humano

[0264] Los anticuerpos neutralizantes (Nab) preexistentes contra las cápsides del AAV en la población humana son un problema importante para la terapia génicain vivomediada por AAV. Algunos serotipos de AAV, como el AAV2 y el AAV3, tienen una prevalencia muy alta de Nabs (Ling, J. Integr. Med. 5:341 (2015)). Se realizó una evaluación preliminar de la prevalencia de Nab contra la cápside AAVXL32 tropista del hígado. Se examinó la prevalencia de Nab en las muestras de suero de un grupo de pacientes chinos con sus identidades completamente ocultas. Concretamente, se analizaron los sueros de 100 personas diferentes para detectar la presencia de NAb preexistentes contra las cápsides AAVXL32. El ensayo de Nab se realizó esencialmente de acuerdo con los métodos publicados anteriormente por Ling et al. y las referencias allí citadas (Ling, J. Integr. Med. 5:341 (2015)). Se realizó una modificación utilizando una luciferasa secretada (luciferasa Gaussia) como gen informador y una línea celular hepática humana Huh7 como células de prueba. En resumen, se sembraron 5x10<4>células/pocillo de células Huh7 en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Al día siguiente, las muestras de suero individuales se diluyeron en serie con un incremento del doble. El control positivo Nab consistió en sueros combinados de ratones inmunizados con AAVXL32 y el control negativo consistió en sueros combinados de ratones sin tratar adquiridos a Sigma. Las muestras de suero diluidas y el AAV se incubaron a 37 °C durante 1 hora y se añadieron a la placa que se había sembrado con células Huh7 un día antes. A las 48 horas tras la infección con AAVXL32, se tomó una pequeña alícuota del medio de cultivo celular de cada pocillo para el ensayo de actividad de luciferasa. A diferencia de la luciferasa de luciérnaga, la luciferasa de Gaussia es una enzima secretada y no es necesario lisar las células para medir la actividad enzimática. Los resultados mostraron que más del 50 % de las muestras de suero tenían un título de Nab inferior a una dilución de 1:8 y aproximadamente el 70 % inferior a una dilución de 1: 16. Estos datos indican que la prevalencia de Nab de AAVXL32 era mucho menor que los datos publicados anteriormente sobre AAV2, AAV3, AAVKL3, AAV5 y AAV8 en la población china. En esos estudios, se encontró que AAV2, AAV3 y AAVK03 eran positivos para anticuerpos neutralizantes en más del 90 % de los sujetos con un corte de dilución sérica de 1:20, mientras que AAV8 tenía una tasa positiva de Nab superior al 80 % y AAV5 superior al 70 % con el mismo corte de dilución de 1:20.

[0266] Secuencias de la cápside de AAV

[0268] SEQ ID NO:1 secuencia de ADN del gen de la cápside de AAVXL12

[0269]

[0271] SEQ ID NO:2 secuencia de ADN del gen de la cápside de AAVXL32

[0272]

[0274] SEQ ID NO:3 secuencia de ADN del gen de la cápside de AAVXL32.1

[0275]

[0277] SEQ ID NO:4 secuencia de aminoácidos de la cápside de AAVXL12

[0278]

[0280] SEQ ID NO:5 secuencia de aminoácidos de la cápside de AAVXL32

[0282]

[0284] SEQ ID NO:6 secuencia de aminoácidos de la cápside de AAV XL32.1

[0286] 32

[0287]

[0290] SEQ ID NO:7 cebador de ADN CAP-5'

[0291] 5'-CCC-AAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAA-3'

[0292] SEQ ID NO:8 cebador de ADN CAP-3'

[0293] 5'-ATAAGAAT-GCGGCCGC-AGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA-3'

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

1. Un ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside de AAV, comprendiendo el ácido nucleico una secuencia codificante de la proteína de la cápside de AAV que es al menos un 99 % idéntica a:

(a) la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 2-3; o

(b) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 5;

en donde la proteína de la cápside de AAV codificada confiere tropismo hepático a un vector AAV.

2. El ácido nucleico de la reivindicación 1,

en donde la secuencia codificante de la proteína de la cápside de AAV es al menos un 99,5 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de (a) o (b), o

en donde la secuencia codificante de la proteína de la cápside de AAV comprende la secuencia de nucleótidos de (a) o (b).

3. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el ácido nucleico es un plásmido, un fago, un vector viral, un cromosoma artificial bacteriano o un cromosoma artificial de levadura, opcionalmente en donde el ácido nucleico es un vector AAV que comprende la secuencia codificante, opcionalmente, además en donde el ácido nucleico comprende, además, una secuencia codificante rep de AAV.

4. Una célulain vitroque comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 incorporado de forma estable en el genoma.

5. Una partícula viral que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, opcionalmente

en donde la partícula viral es una partícula de AAV, una partícula de adenovirus, una partícula de herpesvirus o una partícula de baculovirus.

6. Una proteína de la cápside de AAV que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 5, o

que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99,5 % idéntica a la SEQ ID NO: 5, o que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5;

en donde la proteína de la cápside de AAV confiere tropismo hepático a un vector AAV.

7. Una cápside de AAV que comprende la proteína de la cápside de AAV de la reivindicación 6 o la proteína de la cápside de AAV codificada por el ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2.

8. La cápside de AAV de la reivindicación 7 unida covalentemente, ligada o encapsidando un compuesto seleccionado del grupo que consiste en una molécula de ADN, una molécula de ARN, un polipéptido, un carbohidrato, un lípido, y una molécula orgánica pequeña.

9. Una partícula de AAV que comprende:

un genoma del vector AAV; y

la cápside de AAV de la reivindicación 7, en donde la cápside de AAV encapsida el genoma del vector AAV.

10. La partícula de AAV de la reivindicación 9, en donde el genoma del vector AAV comprende un ácido nucleico heterólogo, opcionalmente

en donde el ácido nucleico heterólogo codifica un ARN antisentido, microARN o ARNi, o un polipéptido, opcionalmente

en donde el ácido nucleico heterólogo codifica un polipéptido terapéutico, o

una proteína informadora.

11. La partícula de AAV de una cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en donde el ácido nucleico heterólogo está operativamente unido a un promotor basado en la ARN polimerasa II o en la ARN polimerasa III, por ejemplo, un promotor constitutivo o un promotor inducible, opcionalmente en donde el ácido nucleico heterólogo está operativamente unido a un promotor específico del hígado o preferido por el hígado, opcionalmente, además, en donde el promotor específico del hígado o preferido por el hígado es un promotor de la apolipoproteína AII, la

albúmina, la alfa 1-antitripsina, la globulina fijadora de tiroxina, el citocromo P450 CYP3A4 o el microARN122, o una secuencia reguladora sintética específica del hígado.

12. Un método para producir una partícula de AAV recombinante que comprende una cápside de AAV, comprendiendo el método:

proporcionar a una célulain vitroun ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, una secuencia codificante rep de AAV, un genoma del vector AAV que comprende un ácido nucleico heterólogo, y funciones auxiliares para generar una infección productiva por AAV; y

permitir el ensamblaje de la partícula de AAV recombinante que comprende la cápside de AAV y encapsidando el genoma del vector AAV.

13. Una formulación farmacéutica que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, la partícula viral de la reivindicación 5, la proteína de la cápside de AAV de una cualquiera de las reivindicaciones 6-7, la cápside de AAV de la reivindicación 7, o la partícula de AAV de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Un métodoin vitrooex vivopara administrar un ácido nucleico de interés a un hepatocito, comprendiendo el método poner en contacto el hepatocito con la partícula de AAV de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11.

15. Una cantidad eficaz de la partícula de AAV de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 o de la formulación farmacéutica de la reivindicación 13, para su uso en terapia, en donde dicha partícula de AAV o formulación farmacéutica se administra a un sujeto mamífero, administrando así el ácido nucleico de interés a un hepatocito en el sujeto mamífero, opcionalmente

en donde la partícula de AAV o la formulación farmacéutica se destinan al uso en un sujeto humano, opcionalmente, además

en donde la partícula de AAV se administra al hígado, opcionalmente, además

en donde la partícula de AAV se administra directamente al hígado mediante inyección en el hígado, inyección en la vena porta o cualquier combinación de las mismas.

16. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una partícula de AAV de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 o la formulación farmacéutica de la reivindicación 13, para su uso en el tratamiento de un trastorno tratable mediante la expresión de un producto en el hígado del sujeto, en donde se expresa el producto, tratando así el trastorno, en donde el trastorno se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de almacenamiento de glucógeno (GSD) tipo Ia, GSD tipo Ib, GSD tipo Ic, GSD tipo Id, GSD tipo II, enfermedad de Pompe, GSD infantil tipo IIa y tipo IIb, GSD tipo IIIa y IIIb, GSD tipo IV (enfermedad de Andersen), GSD tipo V (enfermedad de McArdle), GSD tipo VI (enfermedad de Hers), GSD tipo VII (enfermedad de Tarui), GSD tipo VIII/IXa, GSD tipo IXb, GSD tipo IXc, GSD tipo IXd, GSD 0, síndrome de Fanconi-Bickel, deficiencia de fosfoglucoisomerasa, deficiencia de fosfoglicerato quinasa muscular, deficiencia de fosfoglicerato mutasa, deficiencia de fructosa 1,6-difosfatasa, deficiencia de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, deficiencia de lactato deshidrogenasa, síndrome de Hurler, síndrome de Scheie y síndrome de Hurler-Scheie, síndrome de Hunter, síndrome de Sanfilippo A, síndrome de Sanfilippo, enfermedad de Morquio, enfermedad de Maroteaux-Imay, síndrome de Sly, deficiencia de hialuronidasa, sialidosis, mucolipidosis, gangliosidosis GM1, gangliosidosis GM2, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Farber, enfermedad de Fabry, enfermedad de Krabbe, leucodistrofia metacromática, enfermedad de Wolman, enfermedad de Batten, sialidosis, galactosialidosis, α-manosidosis, β-manosidosis, fucosidosis, sialuria y fenilcetonuria.