ES3060885T3 - Improved methods of assessing gfap status in patient samples - Google Patents

Improved methods of assessing gfap status in patient samples

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Beth Mcquiston
Elaine Brate
John Ramp
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Abstract

En el presente documento se describen métodos mejorados para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en un sujeto (como, por ejemplo, como medida de lesión cerebral traumática o por otras razones clínicas). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Métodos mejorados para evaluar el estado de GFAP en muestras de pacientes
[0003] CAMPO TÉCNICO
[0004] La presente divulgación se refiere a métodos mejorados para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), por ejemplo, como medida de traumatismo craneoencefálico o por otras razones clínicas.
[0005] ANTECEDENTES
[0006] Hay muchos casos en los que se observan lesiones cerebrales, medulares y otras lesiones neurológicas inducidas por traumatismos. Por ejemplo, los proveedores de atención médica en el campo militar informaron de dolores intensos experimentados por las víctimas con lesiones en la columna vertebral y la cabeza cuando se sometían a transportes terrestres y aéreos con baches y altas vibraciones. Los golpes y vibraciones repetidos que experimentan los pacientes durante el transporte médico pueden afectar a los resultados médicos. Las víctimas con lesiones de la médula espinal (LM), traumatismos craneoencefálicos (TCE) y/u otras lesiones neurológicas graves son las más vulnerables a los golpes y vibraciones repetidos del vehículo. Los marcadores fluidos de daño neuronal, axonal y astroglial serían valiosos para ayudar en el diagnóstico de conmoción cerebral en pacientes, así como para evaluar su necesidad de pruebas de imagenología con traumatismo craneoencefálico, para predecir los resultados clínicos a corto y largo plazo y para determinar cuándo se ha recuperado el cerebro del TCE. Los candidatos actuales a biomarcadores están limitados por su insuficiente sensibilidad en la detección sérica, su especificidad para señalar el cerebro y la falta de estandarización de los ensayos. Se carece de un marcador agudo para un ensayo de campo que evalúe el espectro de lesiones del TCE, desde hiperagudas hasta agudas. Además, actualmente no hay forma de identificar un TCE leve (TCEL) con daño cerebral duradero después de una conmoción cerebral que pueda provocar trastorno de estrés postraumático (PTSD) o neurodegeneración crónica (encefalopatía traumática crónica, ECT, "síndrome del boxeado").
[0007] El TCE leve o conmoción cerebral es mucho más difícil de detectar de forma objetiva y supone un desafío diario en las unidades de cuidados de urgencias, en el ámbito militar, en las salas de urgencias, en los hospitales y en las clínicas ambulatorias, en los campos deportivos y en los estadios de todo el mundo. La conmoción cerebral normalmente no provoca patologías graves, como hemorragias, ni anomalías en las tomografías computarizadas convencionales del cerebro, sino más bien una disfunción neuronal de aparición rápida que se resuelve de forma espontánea en unos pocos días o semanas. Aproximadamente el 15% de los pacientes con TCE leve padecen una disfunción cognitiva persistente.
[0008] Hay una necesidad no satisfecha de herramientas para evaluar a las víctimas de TCE leves en el lugar de los hechos, en salas de urgencias, hospitales y clínicas, en el ámbito deportivo y en actividades militares (por ejemplo, combate).
[0009] RESUMEN
[0010] La presente divulgación describe un método para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de un sujeto. La presente divulgación también describe un método para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de un sujeto como medida del traumatismo craneoencefálico, en donde se sabe que dicho sujeto ha sufrido una lesión en la cabeza. El método incluye los pasos de:
[0011] a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, con un primer miembro de unión específico y un segundo miembro de unión específico, en el que el primer miembro de unión específico y el segundo miembro de unión específico se unen específicamente a GFAP, produciendo de este modo uno o más primeros complejos que comprenden el primer miembro de unión-GFAP-segundo miembro de unión, en el que el primer o el segundo miembro de unión específico comprende un marcador detectable; y
[0012] b) evaluar una señal procedente de uno o más de los primeros complejos, en el que la cantidad de señal detectable procedente del marcador detectable indica la cantidad de GFAP que hay en la muestra, de tal manera que la cantidad de señal detectable procedente del marcador detectable puede emplearse para evaluar el estado de GFAP de dicho sujeto como medida de traumatismo craneoencefálico,
[0013] en el que el método (i) puede usarse para determinar niveles de hasta 50.000 pg/ml de GFAP, (ii) no requiere la dilución de la muestra biológica, y (iii) se lleva a cabo usando un dispositivo de punto de atención.
[0014] [0006] La presente divulgación describe un método para medir la GFAP en una muestra biológica de un sujeto que puede haber sufrido una lesión en la cabeza. La presente divulgación también se refiere a un método para medir la GFAP en una muestra biológica de un sujeto que se sabe que ha sufrido una lesión en la cabeza. El método comprende (a) obtener una muestra biológica de dicho sujeto, (b) poner en contacto la muestra biológica, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden con:
[0015] (1) un anticuerpo de captura, que se une a un epítopo en GFAP o fragmento de GFAP para formar un complejo anticuerpo de captura-antígeno de GFAP, y (2) un anticuerpo de detección que incluye un marcador detectable y se une a un epítopo en GFAP al que no se une el anticuerpo de captura, para formar un complejo antígeno de GFAP-anticuerpo de detección, de tal manera que se forma un complejo anticuerpo de captura-antígeno de GFAP-anticuerpo de detección, y
[0016] (c) determinar la cantidad o concentración de GFAP en la muestra biológica sobre la base de la señal generada por el marcador detectable en el complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GFAP-anticuerpo de detección, en el que el método puede usarse para determinar los niveles de GFAP en una cantidad de menos de o igual a 50.000 pg/ml, y en el que dicho método tiene un intervalo dinámico de 5 log y es lineal a lo largo de dicho intervalo dinámico.
[0017] La presente divulgación describe un método para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de un sujeto como medida de un traumatismo craneoencefálico en el que dicho sujeto puede haber sufrido una lesión en la cabeza. La presente divulgación también se refiere a un método para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de un sujeto como medida de un traumatismo craneoencefálico en el que se sabe que dicho sujeto ha sufrido una lesión en la cabeza. El método comprende los pasos de: detectar por lo menos un biomarcador en una muestra biológica de dicho sujeto, en el que por lo menos uno de los biomarcadores es GFAP y en el que el método (i) puede usarse para determinar los niveles de GFAP en una cantidad de menos de o igual a 50.000 pg/ml, (ii) tiene un intervalo dinámico de 5 log, y (iii) es lineal a lo largo de dicho intervalo dinámico.
[0018] La presente divulgación describe un método para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) como medida de un traumatismo craneoencefálico en un sujeto que puede haber sufrido una lesión en la cabeza. La presente divulgación también se refiere a un método para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) como medida de un traumatismo craneoencefálico en un sujeto que se sabe que ha sufrido una lesión en la cabeza. El método comprende los pasos de:
[0019] a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, con un primer miembro de unión específico y un segundo miembro de unión específico, en el que el primer miembro de unión específico y el segundo miembro de unión específico se unen específicamente a GFAP, produciendo de este modo uno o más primeros complejos que comprenden el primer miembro de unión-GFAP-segundo miembro de unión, en el que el segundo miembro de unión específico comprende un marcador detectable; y
[0020] b) evaluar una señal procedente de uno o más de los primeros complejos, en el que la presencia de una señal detectable procedente del marcador detectable indica que en la muestra hay GFAP, y la presencia de una señal detectable procedente del marcador detectable puede emplearse para evaluar el estado de GFAP del sujeto como medida de traumatismo craneoencefálico,
[0021] en el que el método puede usarse para determinar niveles de GFAP en una cantidad de menos de o igual a 50.000 pg/ml, y en el que dicho método tiene un intervalo dinámico de 5 log y es lineal a lo largo de dicho intervalo dinámico.
[0022] La presente divulgación describe un método para medir el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) como medida de un traumatismo craneoencefálico en un sujeto que puede haber sufrido una lesión en la cabeza. La presente divulgación también se refiere a un método para medir el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) como medida de un traumatismo craneoencefálico en un sujeto que se sabe que ha sufrido una lesión en la cabeza. El método comprende los pasos de:
[0023] a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, con un primer miembro de unión específico y un segundo miembro de unión específico, en el que el primer miembro de unión específico y el segundo miembro de unión específico se unen específicamente a GFAP, produciendo de este modo uno o más primeros complejos que comprenden el primer miembro de unión-GFAP-segundo miembro de unión, en el que el segundo miembro de unión específico comprende un marcador detectable; b) detectar una señal procedente de uno o más de los primeros complejos, en los que la presencia de una señal detectable procedente del marcador detectable indica que en la muestra hay GFAP, y
[0024] c) medir la cantidad de señal detectable del marcador detectable indica la cantidad de GFAP que hay en la muestra, de tal manera que la cantidad de señal detectable del marcador detectable puede emplearse para evaluar el estado de GFAP del sujeto como una medida de traumatismo craneoencefálico,
[0025] en el que dicho ensayo es capaz de determinar una cantidad de GFAP de menos de o igual a 50.000 pg/ml en un volumen de menos de 20 microlitros de muestra de prueba, en el que dicho ensayo tiene un intervalo dinámico de 5 log y es lineal sobre dicho intervalo dinámico.
[0026] Cada uno de los métodos descritos anteriormente puede proporcionar una ventana de detección ampliada.
[0027] La ventana de detección ampliada es una ventana de detección amplia, como una ventana de detección que es más amplia que los ensayos del estado de la técnica. Específicamente, los métodos descritos anteriormente pueden llevarse a cabo en cualquier sujeto independientemente del estado clínico del sujeto, los valores de laboratorio, el estado clínico y los valores de laboratorio, la clasificación como paciente con TCE leve, moderado o grave, la presencia de niveles bajos o altos de GFAP, y/o independientemente del momento en que el sujeto haya sufrido una lesión en la cabeza. Los métodos descritos anteriormente también pueden llevarse a cabo en cualquier sujeto independientemente del estado clínico del sujeto, los valores de laboratorio, el estado clínico y los valores de laboratorio, la clasificación como afectado por un TCE leve, moderado o grave, niveles bajos o altos de GFAP, y/o independientemente del momento en que se produjo cualquier evento en el que se sepa que el sujeto sufrió una lesión en la cabeza. Además de, o alternativamente, los métodos anteriores pueden tener un límite inferior de detección (LoD) de aproximadamente 10 pg/ml.
[0028] Además, cada uno de los métodos anteriores puede realizarse usando un volumen de menos de 20 microlitros de dicha muestra biológica.
[0029] Además, cada uno de los métodos anteriores puede usarse para determinar los niveles de GFAP en un intervalo seleccionado del grupo que consiste en de aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, y de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml.
[0030] Además, en los métodos descritos anteriormente, o el primer miembro de unión específico o el segundo miembro de unión específico, cualquiera que no comprenda el marcador detectable, puede inmovilizarse en un soporte sólido.
[0031] Además, en los métodos descritos anteriormente, la GFAP puede evaluarse junto con uno o más biomarcadores.
[0032] Además, en los métodos descritos anteriormente, la muestra biológica no requiere dilución. Por ejemplo, en los métodos descritos anteriormente, la muestra biológica puede seleccionarse del grupo que consiste en una muestra de sangre completa, una muestra de suero, una muestra de líquido cefalorraquídeo y una muestra de plasma. En los métodos descritos anteriormente, la muestra biológica es de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 microlitros.
[0033] Además, en los métodos descritos anteriormente, el método se lleva a cabo en un intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 minutos. Alternativamente, el método se lleva a cabo en menos de aproximadamente 30 minutos, por ejemplo, en menos de aproximadamente 25 minutos, en menos de aproximadamente 20 minutos o en menos de aproximadamente 15 minutos.
[0034] Además, en los métodos descritos anteriormente, es posible que se desconozca el intervalo de tiempo entre la obtención de la muestra biológica y el momento en que el sujeto pudo haber sufrido una lesión en la cabeza. Alternativamente, el intervalo de tiempo entre la obtención de la muestra biológica y el momento en que el sujeto pudo haber sufrido una lesión en la cabeza puede seleccionarse del grupo que consiste en de cero a aproximadamente 12 horas, de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 horas, de aproximadamente 24 a aproximadamente 36 horas, de aproximadamente 36 a aproximadamente 48 horas, de aproximadamente 48 a aproximadamente 72 horas, de aproximadamente 72 a aproximadamente 96 horas, de aproximadamente 96 a aproximadamente 120 horas, de aproximadamente 120 horas a aproximadamente 7 días, de aproximadamente 7 días a aproximadamente 1 mes, de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 3 meses, de aproximadamente 3 meses a aproximadamente 6 meses, de aproximadamente 6 meses a aproximadamente 1 año, de aproximadamente 1 año a aproximadamente 3 años, de aproximadamente 3 años a aproximadamente 6 años, de aproximadamente 6 años a aproximadamente 12 años, de aproximadamente 12 años a aproximadamente 20 años, de aproximadamente 20 años a aproximadamente 30 años, y de aproximadamente 30 años a aproximadamente 50 años. Alternativamente, el intervalo de tiempo entre la obtención de la muestra biológica y el momento en que el sujeto pudo haber sufrido una lesión en la cabeza puede seleccionarse del grupo que consiste en menos de 50 años, menos de 30 años, menos de 20 años, menos de 12 años, menos de 6 años, menos de 3 años, menos de 1 año, menos de aproximadamente 6 meses, menos de aproximadamente 3 meses, menos de aproximadamente 1 mes, menos de aproximadamente 7 días, menos de aproximadamente 120 horas, menos de aproximadamente 96 horas, menos de aproximadamente 72 horas, menos de aproximadamente 48 horas, menos de aproximadamente 36 horas, menos de aproximadamente 24 horas o menos de aproximadamente 12 horas.
[0035] [0019] En los métodos anteriores, la muestra biológica puede obtenerse después de que el sujeto haya sufrido una lesión en la cabeza provocada por sacudidas físicas, impactos contundentes por una fuerza mecánica externa u otra fuerza que provoque un traumatismo craneal cerrado o abierto, una o más caídas, explosiones o estallidos u otros tipos de traumatismos por fuerza contundente.
[0036] En los métodos anteriores, la muestra biológica puede obtenerse después de que el sujeto haya ingerido o haya estado expuesto a una sustancia química, una toxina o una combinación de una sustancia química y una toxina.
[0037] En los métodos anteriores, la sustancia química o toxina puede ser fuego, moho, amianto, un pesticida, un insecticida, un disolvente orgánico, una pintura, un pegamento, un gas, un metal orgánico, una droga de abuso o una o más combinaciones de los mismos.
[0038] En los métodos anteriores, la muestra biológica puede obtenerse de un sujeto que padezca una enfermedad, como una enfermedad autoinmune, un trastorno metabólico, un tumor cerebral, hipoxia, un virus, meningitis, hidrocefalia o combinaciones de los mismos. En los métodos anteriores, la enfermedad también puede ser una lesión vascular.
[0039] En los métodos anteriores, el método puede realizarse para confirmar la presencia o ausencia de un traumatismo craneoencefálico. Por ejemplo, el método puede usarse para ayudar en el diagnóstico, determinar el riesgo, confirmar, evaluar y/o pronosticar un traumatismo craneoencefálico o la ausencia de un traumatismo craneoencefálico en un sujeto. En los métodos anteriores, el método puede usarse para evaluar lesiones en la cabeza y/o conmociones cerebrales, para predecir la necesidad de realizar pruebas de imagen, para predecir la gravedad del traumatismo craneoencefálico, como un TCE leve, y para pronosticar el traumatismo craneoencefálico.
[0040] En los métodos anteriores, el traumatismo craneoencefálico puede ser un traumatismo craneoencefálico leve. En los métodos anteriores, el contacto puede realizarse simultáneamente. Alternativamente, el contacto puede realizarse secuencialmente.
[0041] En los métodos anteriores, el estado puede evaluarse midiendo el nivel o la cantidad de GFAP en un único punto temporal. Alternativamente, en los métodos anteriores, el estado de GFAP del sujeto puede evaluarse midiendo el nivel o la cantidad de GFAP en múltiples puntos temporales.
[0042] En cualquiera de los métodos anteriores, el primer miembro de unión específico y el segundo miembro de unión específico se unen a la GFAP humana.
[0043] En cualquiera de los métodos anteriores, el primer miembro de unión específico y el segundo miembro de unión específico pueden ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Por ejemplo, en cualquiera de los métodos anteriores, el primer miembro de unión específico y el segundo miembro de unión específico pueden ser cada uno un anticuerpo monoespecífico, como un anticuerpo monoclonal que se une a la GFAP humana.
[0044] La presente divulgación describe un método para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de un sujeto. El método comprende los pasos de: a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, con un primer miembro de unión específico y un segundo miembro de unión específico, en el que el primer miembro de unión específico y el segundo miembro de unión específico se unen cada uno específicamente a la GFAP, produciendo de este modo uno o más primeros complejos que comprenden el primer miembro de unión-GFAP-segundo miembro de unión, en el que el primer o el segundo miembro de unión específico comprende un marcador detectable; y b) evaluar una señal procedente de uno o más de los primeros complejos, en los que la cantidad de señal detectable procedente del marcador detectable indica la cantidad de GFAP que hay en la muestra, en los que el método (i) puede usarse para determinar niveles de hasta 50.000 pg/ml de GFAP, (ii) no requiere la dilución de la muestra biológica, y (iii) se lleva a cabo usando un dispositivo de punto de atención.
[0045] La presente divulgación describe un método para medir la GFAP en una muestra biológica de un sujeto. El método comprende (a) obtener una muestra biológica de dicho sujeto, (b) poner en contacto la muestra biológica, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden con: (1) un anticuerpo de captura, que se une a un epítopo en GFAP o fragmento de GFAP para formar un complejo anticuerpo de captura-antígeno de GFAP, y (2) un anticuerpo de detección que incluye un marcador detectable y se une a un epítopo en GFAP al que no se une el anticuerpo de captura, para formar un complejo antígeno de GFAP-anticuerpo de detección, de tal manera que se forma un complejo anticuerpo de captura-antígeno de GFAP-anticuerpo de detección, y (c) determinar la cantidad o concentración de GFAP en la muestra biológica sobre la base de la señal generada por el marcador detectable en el complejo anticuerpo de captura-antígeno de GFAP-anticuerpo de detección, en el que el método puede usarse para determinar los niveles de GFAP en una cantidad de menos de o igual a 50.000 pg/ml, y en el que dicho método tiene un intervalo dinámico de 5 log y es lineal a lo largo de dicho intervalo dinámico.
[0046] [0030] La presente divulgación describe un método para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de un sujeto. El método comprende el paso de: detectar por lo menos un biomarcador en una muestra biológica de dicho sujeto, en el que por lo menos uno de los biomarcadores es GFAP y en el que el método (i) puede usarse para determinar los niveles de GFAP en una cantidad de menos de o igual a 50.000 pg/ml, (ii) tiene un intervalo dinámico de 5 log, y (iii) es lineal a lo largo de dicho intervalo dinámico.
[0048] La presente divulgación describe un método para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP). El método comprende los pasos de: a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, con un primer miembro de unión específico y un segundo miembro de unión específico, en el que el primer miembro de unión específico y el segundo miembro de unión específico se unen cada uno específicamente a la GFAP, produciendo de este modo uno o más primeros complejos que comprenden el primer miembro de unión-GFAP-segundo miembro de unión, en el que el segundo miembro de unión específico comprende un marcador detectable; y b) evaluar una señal procedente de uno o más de los primeros complejos, en el que la presencia de una señal detectable procedente del marcador detectable indica que en la muestra hay GFAP, en el que el método puede usarse para determinar los niveles de GFAP en una cantidad de menos de o igual a 50.000 pg/ml, y en el que dicho método tiene un intervalo dinámico de 5 log y es lineal a lo largo de dicho intervalo dinámico.
[0050] La presente divulgación describe un método para medir el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP). El método comprende los pasos de: a) poner en contacto una muestra biológica del sujeto, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, con un primer miembro de unión específico y un segundo miembro de unión específico, en el que el primer miembro de unión específico y el segundo miembro de unión específico se unen cada uno específicamente a la GFAP, produciendo de este modo uno o más primeros complejos que comprenden el primer miembro de unión-GFAP-segundo miembro de unión, en el que el segundo miembro de unión específico comprende un marcador detectable; b) detectar una señal procedente de uno o más de los primeros complejos, en los que la presencia de una señal detectable procedente del marcador detectable indica que en la muestra hay GFAP, y c) medir la cantidad de señal detectable procedente del marcador detectable indica la cantidad de GFAP que hay en la muestra, en el que dicho ensayo es capaz de determinar una cantidad de GFAP de menos de o igual a 50.000 pg/ml en un volumen de menos de 20 microlitros de muestra de prueba, en el que dicho ensayo tiene un intervalo dinámico de 5 log y es lineal a lo largo de dicho intervalo dinámico.
[0052] La presente divulgación describe un método para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de un sujeto como medida del traumatismo craneoencefálico en una muestra biológica obtenida de un sujeto humano, en el que dicho sujeto puede haber sufrido una lesión en la cabeza o se sabe que ha sufrido una lesión en la cabeza, método que comprende los pasos de: (a) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un sujeto humano, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, con: (1) un anticuerpo de captura que está inmovilizado en un soporte sólido y que se une a un epítopo de la GFAP humana para formar un complejo anticuerpo de capturaantígeno de GFAP, y (2) un anticuerpo de detección que incluye un marcador detectable y que se une a un epítopo en GFAP humano al que no se une el anticuerpo de captura, para formar un complejo de anticuerpo de detecciónantígeno de GFAP, de tal manera que se forma un complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GFAP-anticuerpo de detección, en el que el anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección son anticuerpos monoclonales, (b) determinar el nivel de GFAP en la muestra biológica sobre la base de la señal generada por el marcador detectable en el complejo anticuerpo de captura-antígeno de GFAP-anticuerpo de detección, en el que el método es capaz de cuantificar el nivel de GFAP en un intervalo dinámico de 5 pg/ml a 50.000 pg/ml con una precisión del ≤10% CV y con menos de un 10% de desviación de la linealidad (DL) a lo largo del intervalo dinámico.
[0054] a presente divulgación describe un método para medir el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) como medida de un traumatismo craneoencefálico en un sujeto que puede haber sufrido una lesión en la cabeza o que se sabe que ha sufrido una lesión en la cabeza, método que comprende los pasos de: a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, con un primer miembro de unión específico y un segundo miembro de unión específico, en el que el primer miembro de unión específico y el segundo miembro de unión específico se unen cada uno específicamente a la GFAP, produciendo de este modo uno o más primeros complejos que comprenden el primer miembro de unión-GFAP-segundo miembro de unión, en el que el segundo miembro de unión específico comprende un marcador detectable, en el que el primer miembro de unión específico está inmovilizado en un soporte sólido; b) detectar una señal procedente de uno o más de los primeros complejos, en los que la presencia de una señal detectable procedente del marcador detectable indica que en la muestra hay GFAP, y c) medir la cantidad de señal detectable procedente del marcador detectable indica la cantidad de GFAP que hay en la muestra, de tal manera que la cantidad de señal detectable procedente del marcador detectable puede emplearse para evaluar el estado de GFAP del sujeto como medida de traumatismo craneoencefálico, en el que dicho ensayo es capaz de determinar el nivel de GFAP en un intervalo dinámico de 5 pg/ml a 50.000 pg/ml, como de aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml o de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, con una precisión del ≤10% CV y con menos de un 10% de desviación de la linealidad (DL) a lo largo del intervalo dinámico usando un volumen de menos de 20 microlitros de dicha muestra biológica.
[0056] [0035] La presente divulgación describe un método para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de un sujeto. El método incluye los pasos de: a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, con por lo menos un primer miembro de unión específico y por lo menos un segundo miembro de unión específico, en el que el primer miembro de unión específico y el segundo miembro de unión específico se unen cada uno específicamente a la GFAP, produciendo de este modo uno o más primeros complejos que comprenden por lo menos un primer miembro de unión específico-GFAP-por lo menos un segundo miembro de unión específico, en el que por lo menos uno de los primeros miembros de unión específicos o por lo menos uno de los segundos miembros de unión específicos comprende un marcador detectable; y b) evaluar una señal procedente de uno o más de los primeros complejos, en el que la cantidad de señal detectable procedente del marcador detectable indica la cantidad de GFAP que hay en la muestra, en el que el método (i) puede usarse para determinar niveles de hasta 50.000 pg/ml de GFAP, (ii) no requiere la dilución de la muestra biológica, y (iii) se lleva a cabo usando un dispositivo de punto de atención.
[0058] La presente divulgación describe un método para medir la GFAP en una muestra biológica de un sujeto. El método incluye: (a) obtener una muestra biológica de dicho sujeto, (b) poner en contacto la muestra biológica con, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden: (1) por lo menos un anticuerpo de captura, que se une a un epítopo en GFAP o fragmento de GFAP para formar por lo menos un complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GFAP, y (2) por lo menos un anticuerpo de detección que incluye un marcador detectable y se une a un epítopo en GFAP al que no se une el por lo menos un anticuerpo de captura, para formar por lo menos un complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GFAP-por lo menos un anticuerpo de detección, y (c) determinar la cantidad o concentración de GFAP en la muestra biológica sobre la base de la señal generada por el marcador detectable en el complejo de por lo menos un anticuerpo de captura-antígeno de GFAP-por lo menos un anticuerpo de detección, en el que el método puede usarse para determinar los niveles de GFAP en una cantidad de menos de o igual a 50.000 pg/ml, y en el que dicho método tiene un intervalo dinámico de 5 log y es lineal a lo largo de dicho intervalo dinámico.
[0060] La presente divulgación describe un método para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de un sujeto. El método incluye el paso de: detectar por lo menos un biomarcador en una muestra biológica de dicho sujeto, en el que por lo menos uno de los biomarcadores es GFAP y en el que el método (i) puede usarse para determinar los niveles de GFAP en una cantidad de menos de o igual a 50.000 pg/ml, (ii) tiene un intervalo dinámico de 5 log, y (iii) es lineal a lo largo de dicho intervalo dinámico.
[0062] La presente divulgación describe un método para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en un sujeto. El método incluye los pasos de: a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, con por lo menos un primer miembro de unión específico y por lo menos un segundo miembro de unión específico, en el que el por lo menos un primer miembro de unión específico y el por lo menos un segundo miembro de unión específico se unen específicamente a la GFAP, produciendo de este modo uno o más primeros complejos que comprenden por lo menos un primer miembro de unión específico-GFAP-por lo menos un segundo miembro de unión específico, en el que el por lo menos un segundo miembro de unión específico comprende un marcador detectable; y b) evaluar una señal procedente de uno o más de los primeros complejos, en el que la presencia de una señal detectable procedente del marcador detectable indica que en la muestra hay GFAP, en el que el método puede usarse para determinar los niveles de GFAP en una cantidad de menos de o igual a 50.000 pg/ml, y en el que dicho método tiene un intervalo dinámico de 5 log y es lineal a lo largo de dicho intervalo dinámico.
[0064] La presente divulgación describe un método para medir el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP). El método incluye los pasos de: a) poner en contacto una muestra biológica del sujeto, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, con por lo menos un primer miembro de unión específico y por lo menos un segundo miembro de unión específico, en el que el por lo menos un primer miembro de unión específico y el por lo menos un segundo miembro de unión específico se unen específicamente a la GFAP, produciendo de este modo uno o más primeros complejos que comprenden por lo menos un primer miembro de unión específico-GFAP- por lo menos un segundo miembro de unión específico, en el que el por lo menos un segundo miembro de unión específico comprende un marcador detectable; b) detectar una señal procedente de uno o más de los primeros complejos, en los que la presencia de una señal detectable procedente del marcador detectable indica que en la muestra hay GFAP, y c) medir la cantidad de señal detectable procedente del marcador detectable indica la cantidad de GFAP que hay en la muestra, de tal manera que la cantidad de señal detectable procedente del marcador detectable puede emplearse para evaluar el estado de GFAP del sujeto, en el que dicho ensayo es capaz de determinar una cantidad de GFAP de menos de o igual a 50.000 pg/ml en un volumen de menos de 20 microlitros de muestra de prueba, en el que dicho ensayo tiene un intervalo dinámico de 5 log y es lineal a lo largo de dicho intervalo dinámico.
[0066] [0040] La presente divulgación describe un método para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de un sujeto. El método incluye los pasos de: (a) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un sujeto humano, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, con: (1) por lo menos un anticuerpo de captura que está inmovilizado en un soporte sólido y que se une a un epítopo en la GFAP humana para formar por lo menos un complejo anticuerpo de captura-antígeno de GFAP, y (2) por lo menos un anticuerpo de detección que incluye un marcador detectable y que se une a un epítopo de la GFAP humana al que no se une el anticuerpo de captura, para formar por lo menos un complejo de anticuerpo de captura-antígeno de GFAP-por lo menos un anticuerpo de detección, en el que el por lo menos un anticuerpo de captura y el por lo menos un anticuerpo de detección son anticuerpos monoespecíficos y, opcionalmente, son anticuerpos monoclonales, (b) detectar una señal generada por el marcador detectable en el complejo de por lo menos un anticuerpo de captura-antígeno de GFAP-por lo menos un anticuerpo de detección, en el que la presencia de una señal detectable del marcador detectable indica que hay GFAP en la muestra, y (c) medir la cantidad de señal detectable procedente del marcador detectable indica la cantidad de GFAP que hay en la muestra, en el que el método es capaz de cuantificar el nivel de GFAP en un intervalo dinámico de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml con una precisión de menos del 10% CV y con una desviación desde la linealidad (DL) de menos del 10% a lo largo del intervalo dinámico.
[0068] La presente divulgación describe un método para medir el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP). El método incluye los pasos de: a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, con por lo menos un primer miembro de unión específico y por lo menos un segundo miembro de unión específico, en el que el por lo menos un primer miembro de unión específico y el por lo menos un segundo miembro de unión específico se unen específicamente a la GFAP, produciendo de este modo uno o más primeros complejos que comprenden el por lo menos un primer miembro de unión específico-GFAP-por lo menos un segundo miembro de unión específico, en el que el por lo menos un segundo miembro de unión específico comprende un marcador detectable, en el que el por lo menos un primer miembro de unión específico está inmovilizado en un soporte sólido; b) detectar una señal procedente de uno o más de los primeros complejos, en el que la presencia de una señal detectable procedente del marcador detectable indica que en la muestra hay GFAP, y c) medir la cantidad de señal detectable procedente del marcador detectable indica la cantidad de GFAP que hay en la muestra, en el que dicho ensayo es capaz de determinar el nivel de GFAP en un intervalo dinámico de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml con una precisión de menos del 10% CV y con una desviación desde la linealidad (DL) de menos del 10% en el intervalo dinámico en un volumen de menos de 20 microlitros de muestra de prueba.
[0070] La presente divulgación describe un método para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de un sujeto. El método incluye el paso de: detectar por lo menos un biomarcador en una muestra biológica de dicho sujeto, en el que por lo menos uno de los biomarcadores es GFAP y en el que el método (i) puede usarse para determinar los niveles de GFAP en una cantidad de menos de o igual a 50.000 pg/ml, (ii) tiene un intervalo dinámico de 5 log, y (iii) es lineal a lo largo del intervalo dinámico.
[0072] La presente divulgación describe un método para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de un sujeto. El método incluye los pasos de: a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, con por lo menos un primer miembro de unión específico y por lo menos un segundo miembro de unión específico, en el que el primer miembro de unión específico y el segundo miembro de unión específico se unen cada uno específicamente a la GFAP, produciendo de este modo uno o más primeros complejos que comprenden el primer miembro de unión específico-GFAP-segundo miembro de unión específico; y b) detectar GFAP en uno o más de los primeros complejos presentes en la muestra, en el que el método: (i) puede usarse para determinar niveles de menos de o iguales a 50.000 pg/ml de GFAP y no requiere la dilución de la muestra biológica; o (ii) puede usarse para determinar niveles de GFAP en una cantidad de menos de o igual a 50.000 pg/ml, y en el que dicho método tiene un intervalo dinámico de 5 log y es lineal a lo largo de dicho intervalo dinámico, o (iii) es capaz de cuantificar el nivel de GFAP en un intervalo dinámico de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml con una precisión de menos del 10% CV y con una desviación desde la linealidad (DL) de menos del 10% a lo largo del intervalo dinámico.
[0074] La presente divulgación describe un método para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de un sujeto. El método incluye los pasos de: a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, con por lo menos un primer miembro de unión específico y por lo menos un segundo miembro de unión específico, en el que el primer miembro de unión específico y el segundo miembro de unión específico se unen cada uno específicamente a la GFAP, produciendo de este modo uno o más primeros complejos que comprenden el primer miembro de unión específico-GFAP-segundo miembro de unión específico, en el que el primer miembro de unión específico o el segundo miembro de unión específico comprende un marcador detectable; y b) evaluar una señal de uno o más primeros complejos, en los que la cantidad de señal detectable del marcador detectable indica la cantidad de GFAP que hay en la muestra, en los que el método: (i) puede utilizarse para determinar niveles de hasta 50.000 pg/ml de GFAP y no requiere la dilución de la muestra biológica; o (ii) puede utilizarse para determinar niveles de GFAP en una cantidad de menos de o igual a 50.000 pg/ml, y en el que dicho método tiene un intervalo dinámico de 5 log y es lineal a lo largo de dicho intervalo dinámico, o (iii) es capaz de cuantificar el nivel de GFAP en un intervalo dinámico de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml con una precisión de menos del 10% CV y con una desviación desde la linealidad (DL) de menos del 10% a lo largo del intervalo dinámico.
[0076] [0045] La presente divulgación se refiere a un método para medir GFAP en una muestra biológica de un sujeto. El método incluye (a) poner en contacto la muestra biológica, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden con: (1) por lo menos un anticuerpo de captura, que se une a un epítopo en un fragmento de GFAP de 38 kDa definido por los aminoácidos 60-383 de la SEQ ID NO: 1 para formar un complejo anticuerpo de captura-antígeno de GFAP, y (2) por lo menos un primer anticuerpo de detección que incluye un marcador detectable y se une a un epítopo en el fragmento de GFAP de 38 kDa definido por los aminoácidos 60-383 de la SEQ ID NO: 1 al que no se une el anticuerpo de captura, para formar por lo menos un complejo anticuerpo de captura-antígeno de GFAP-por lo menos un primer anticuerpo de detección, y (b) determinar la cantidad o concentración de GFAP en la muestra biológica sobre la base de la señal generada por el marcador detectable en el complejo de por lo menos un anticuerpo de capturaantígeno de GFAP-por lo menos un primer anticuerpo de detección, en el que la muestra biológica no requiere dilución, en el que el método se realiza en de 5 a 20 minutos, y en el que el método: (i) puede usarse para determinar los niveles de GFAP en una cantidad de menos de o igual a 50.000 pg/ml, y en el que dicho método tiene un intervalo dinámico de 5 log y es lineal a lo largo de dicho intervalo dinámico; o (ii) es capaz de cuantificar el nivel de GFAP en un intervalo dinámico de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml con una precisión de menos del 10% CV y con una desviación desde la linealidad (DL) de menos del 10% a lo largo del intervalo dinámico.
[0077] Cada uno de los métodos descritos anteriormente puede realizarse en un dispositivo de punto de atención. En cada uno de los métodos descritos anteriormente, la GFAP puede detectarse mediante un inmunoensayo o un ensayo de detección de moléculas individuales.
[0078] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0079]
[0080] La FIG.1 muestra una curva de calibración de GFAP.
[0081] La FIG.2 muestra la distribución de muestras de GFAP en donantes normales (es decir, aparentemente sanos). La FIG.3 muestra los perfiles de biomarcadores de GFAP. Los puntos temporales son los descritos en el Ejemplo 3.
[0082] La FIG. 4 muestra diagramas de cajas que muestran una distribución amplia de los resultados de GFAP en la población de pacientes. Los puntos temporales de las muestras son como en la FIG.3.
[0083] La FIG.5 muestra las concentraciones esperadas frente a las observadas de GFAP en la Dilución 1 (tal como se describe en el Ejemplo 1).
[0084] La FIG.6 muestra las concentraciones esperadas frente a las observadas de GFAP en la Dilución 2 (tal como se describe en el Ejemplo 1).
[0085] DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0086] La presente divulgación se refiere a ensayos mejorados para ayudar en la detección, el análisis o la detección y el análisis de los niveles de GFAP en una muestra biológica o de prueba. Los ensayos mejorados descritos en la presente pueden ser cualquier tipo de ensayo conocido en la técnica. Un tipo de ensayo preferido es un inmunoensayo. Los ensayos mejorados pueden emplearse para detectar, analizar o detectar y analizar o evaluar la GFAP para cualquier propósito. En una realización, los ensayos mejorados pueden usarse para detectar, analizar, detectar y analizar o evaluar los niveles de GFAP en una muestra biológica o de prueba para ayudar rápidamente en el diagnóstico de un traumatismo craneoencefálico (TCE), monitorizar la progresión y/o predecir el resultado en sujetos o que se sospecha que han sufrido una lesión en la cabeza o que han sufrido una lesión real en la cabeza.
[0087] Sorprendentemente, los inmunoensayos mejorados pueden usarse para medir o evaluar la GFAP a niveles bajos en una muestra biológica a lo largo de un amplio intervalo de concentraciones y, por lo tanto, proporcionar un ensayo más versátil y sensible, por ejemplo, para ayudar en el diagnóstico y la distinción del TCE en un paciente. En particular, el intervalo aumentado de concentración de los inmunoensayos descritos proporciona un ensayo más preciso y sensible y puede usarse opcionalmente para ayudar en el diagnóstico y la distinción del TCE en un paciente, para evaluar lesiones craneales y/o conmociones cerebrales, para predecir la necesidad de realizar pruebas de imagen, para predecir la gravedad del traumatismo craneoencefálico y para pronosticar el traumatismo craneoencefálico. Por tanto, los inmunoensayos divulgados pueden usarse para determinar el aumento o la disminución de las concentraciones de GFAP a niveles bajos o más altos de GFAP en una muestra diluida o sin diluir en comparación con una muestra de control o calibradora y, por lo tanto, pueden usarse opcionalmente para identificar un TCE en un paciente. Además, los inmunoensayos divulgados son lineales a lo largo del intervalo dinámico del ensayo. Por otra parte, los inmunoensayos divulgados tienen un intervalo dinámico igual o menor que cinco logs (es decir, 5 - 50.000). El uso del inmunoensayo GFAP puede, por ejemplo, ayudar al diagnóstico preciso y al tratamiento posterior de pacientes, por ejemplo, pacientes con TCE.
[0088] [0050] Los ensayos del estado de la técnica, como los inmunoensayos, usados para determinar los niveles de GFAP en una muestra biológica o de prueba pueden no ser capaces de detectar niveles de GFAP que se encuentren fuera del intervalo dinámico de los ensayos mejorados descritos en la presente. Cuando ocurre esto, los niveles de GFAP deben volver a medirse después de la dilución (por ejemplo, en el caso de que la concentración de la muestra supere el límite superior de detección) o usando volúmenes de muestra más altos (por ejemplo, en el caso de que las concentraciones de GFAP medidas estén por debajo del límite de detección (LoD)). Estas nuevas mediciones son problemáticas debido al gasto adicional en el que se incurre y a la pérdida de tiempo, lo que resulta particularmente problemático cuando el ensayo se usa para ayudar en el diagnóstico, diagnosticar, monitorizar la progresión o predecir el resultado en sujetos que se sospecha que han sufrido o que han sufrido un TCE real (u otra enfermedad, trastorno o afección críticos asociados a la GFAP), en los que es fundamental una detección rápida, precisa y rentable. Por lo tanto, los ensayos mejorados que aumentan o amplían el intervalo dinámico de los ensayos conocidos en la técnica reducirían el número de repeticiones y permitirían una ayuda rápida, precisa y rentable en el diagnóstico de pacientes, incluyendo aquellos con traumatismo craneoencefálico, en sujetos que lo necesiten.
[0090] Los ensayos de la presente divulgación presentan una serie de mejoras con respecto a los ensayos conocidos en la técnica. Específicamente, los ensayos de la presente divulgación presentan un intervalo dinámico y sensibilidad aumentados. En un aspecto, los ensayos de la presente divulgación presentan un límite de detección (LoD) inferior de aproximadamente 1 pg/ml, 5 pg/ml, aproximadamente 10 pg/ml, aproximadamente 15 pg/ml, aproximadamente 20 pg/ml, aproximadamente 25 pg/ml o aproximadamente 30 pg/ml. Además, los ensayos de la presente divulgación presentan un intervalo dinámico igual o de menos de cinco logs (es decir, 5 pg/ml - 50.000 pg/ml). Un ejemplo de un ensayo mejorado de la presente divulgación es un inmunoensayo que tiene un LoD de aproximadamente 10 pg/ml o aproximadamente 20 pg/ml. Otro ejemplo de un ensayo mejorado es un inmunoensayo con un intervalo dinámico igual o de menos de cinco logs. La sensibilidad mejorada en el extremo inferior de los ensayos de la presente divulgación evita el problema de la nueva medición de muestras analizado anteriormente en la presente. Además, las muestras biológicas o de prueba usadas en los ensayos de la presente divulgación no requieren dilución.
[0092] Además, los ensayos mejorados de la presente divulgación pueden realizarse o llevarse a cabo rápidamente, y proporcionan resultados en menos de aproximadamente 5 minutos, menos de aproximadamente 6 minutos, menos de aproximadamente 7 minutos, menos de aproximadamente 8 minutos, menos de aproximadamente 9 minutos, menos de aproximadamente 10 minutos, menos de aproximadamente 11 minutos, menos de aproximadamente 12 minutos, menos de aproximadamente 13 minutos, menos de aproximadamente 14 minutos, menos de aproximadamente 15 minutos, menos de aproximadamente 16 minutos, menos de aproximadamente 17 minutos, menos de aproximadamente 18 minutos, menos de aproximadamente 19 minutos y menos de aproximadamente 20 minutos desde el inicio o comienzo del ensayo. Un ejemplo de un ensayo mejorado de la presente divulgación es un inmunoensayo que proporciona un resultado en menos de aproximadamente 10 minutos desde su inicio o comienzo. Otro ejemplo de un ensayo mejorado de la presente divulgación es un inmunoensayo que tiene un LoD de aproximadamente 10 pg/ml y que proporciona un resultado en menos de 10 minutos. Otro ejemplo más de un ensayo mejorado de la presente divulgación es un inmunoensayo que tiene un LoD de aproximadamente 20 pg/ml y que proporciona un resultado en menos de 10 minutos.
[0094] Como los ensayos de la presente divulgación se realizan y proporcionan resultados rápidamente, se controla la cantidad de señal producida por el ensayo y se reduce la sobresaturación de la señal. Como dicha sobresaturación de la señal se reduce en comparación con los ensayos conocidos en la técnica, los ensayos de la presente divulgación presentan un efecto gancho menor o reducido en comparación con otros ensayos conocidos en la técnica.
[0096] Los ensayos mejorados de la presente divulgación, cuando se usan para medir o evaluar GFAP a niveles bajos en una muestra biológica a lo largo de un intervalo amplio de concentraciones, proporcionan un ensayo más versátil y sensible para evaluar traumatismos craneoencefálicos en comparación con los ensayos conocidos actualmente en la técnica. Como resultado, el intervalo aumentado de concentración de los ensayos descritos proporciona un ensayo más preciso y sensible para ayudar en el diagnóstico y la distinción de traumatismos craneoencefálicos en un paciente. Por tanto, los ensayos mejorados de la presente divulgación pueden usarse para determinar el aumento o la disminución de las concentraciones de GFAP a niveles bajos o más altos de GFAP en una muestra diluida o sin diluir en comparación con una muestra de control o calibrador, y por tanto pueden usarse para identificar TCE en un paciente.
[0098] Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que hay una serie de razones que contribuyen y dan como resultado los sorprendentes ensayos mejorados de la presente divulgación. Una razón clave parece ser la reducción del tiempo de ensayo, lo que reduce la probabilidad del efecto gancho. El efecto gancho (o fenómeno prozona) también puede evitarse por otros medios conocidos en la técnica (por ejemplo, aumentando la concentración de conjugado), algunos de los cuales pueden destruir la sensibilidad del extremo inferior de un ensayo y provocar potencialmente la saturación de la señal en el extremo superior. Sin embargo, en este caso se tuvo cuidado de mantener la sensibilidad del extremo inferior del ensayo, por ejemplo, mediante la optimización de la concentración de los reactivos usados en el ensayo. Además, se tuvo cuidado en el cribado y la selección de anticuerpos que tuviesen diferentes especificidades de unión para GFAP, permitiendo que los anticuerpos se uniesen a diferentes sitios y, por tanto, se empleasen para la captura o la detección. Dicha optimización puede realizarse usando técnicas turinarias en la técnica.
[0100] [0056] Además, se ha descubierto que el uso de por lo menos dos anticuerpos que se unen a epítopos no superpuestos dentro de los productos de la degradación de la GFAP (BDP), como el BDP de 38 kDa definido por los aminoácidos 60-383 de la secuencia de la proteína GFAP (SEQ ID NO:1), puede ayudar a mantener el intervalo dinámico y la sensibilidad en el extremo inferior de los inmunoensayos. En un aspecto, por lo menos dos anticuerpos se unen a epítopos no superpuestos cerca del extremo N-terminal del BDP de 38 kDa. En otro aspecto, por lo menos dos anticuerpos se unen a epítopos no superpuestos entre los aminoácidos 60-383 de SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, por lo menos un primer anticuerpo (como un anticuerpo de captura) se une a un epítopo cerca del extremo N-terminal del BDP de 38 kDa y por lo menos un segundo anticuerpo (como un anticuerpo de detección) se une a un epítopo cerca del centro del BDP de 38 kDa que no se superpone con el primer anticuerpo. En otro aspecto, por lo menos un primer anticuerpo (como un anticuerpo de captura) se une a un epítopo entre los aminoácidos 60-383 de la SEQ ID NO:1 y por lo menos un segundo anticuerpo se une a un epítopo entre los aminoácidos 60-383 de la SEQ ID NO:1 que no se superpone con el primer anticuerpo. El epítopo al que se une el primer anticuerpo puede tener una longitud de 10 aminoácidos, 11 aminoácidos, 12 aminoácidos, 13 aminoácidos, 14 aminoácidos o 15 aminoácidos. El epítopo al que se une el segundo anticuerpo puede tener una longitud de 10 aminoácidos, 11 aminoácidos, 12 aminoácidos, 13 aminoácidos, 14 aminoácidos o 15 aminoácidos. Un experto en la materia podría determinar fácilmente los anticuerpos que se unen a epítopos no superpuestos dentro de los BDP de 38 kDa definidos por los aminoácidos 60-383 de la SEQ ID NO:1 usando técnicas rutinarias conocidas en la materia.
[0101] De igual manera, es posible seleccionar otros anticuerpos que puedan ayudar de manera similar a mantener el intervalo dinámico y la sensibilidad en el extremo inferior de los inmunoensayos. Por ejemplo, puede ser útil seleccionar por lo menos un primer anticuerpo (como un anticuerpo de captura) que se una a un epítopo cerca del extremo N-terminal del BDP de 38 kDa y por lo menos un segundo anticuerpo (como un anticuerpo de detección) que se una a un epítopo cerca del centro del BDP de 38 kDa, por ejemplo, cerca del centro de la BDP de 38 kDa, y que no se superponga con el primer anticuerpo. Son posibles otras variaciones, que podrían ser fácilmente probadas por un experto en la materia (por ejemplo, usando los métodos expuestos en la presente en el Ejemplo 1). Por ejemplo, confirmando que los anticuerpos se unen a diferentes epítopos mediante el examen de la unión a péptidos cortos y, a continuación, cribando pares de anticuerpos usando una concentración baja de calibrador. Además, la selección de anticuerpos con diferente afinidad por la GFAP también puede ayudar a mantener o aumentar el intervalo dinámico del ensayo. Los anticuerpos contra GFAP se han descrito en la bibliografía y están disponibles comercialmente (por ejemplo, sección 4.e de la presente).
[0102] Los encabezamientos de las secciones usados en esta sección y en toda la divulgación de la presente tienen únicamente propósitos organizativos y no se pretende que sean limitativos.
[0103] 1. Definiciones
[0104] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia. En caso de conflicto, prevalecerá el presente documento, incluyendo las definiciones. A continuación se describen los métodos y materiales preferidos, aunque en la puesta en práctica o en las pruebas de la presente divulgación pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente. Los materiales, métodos y ejemplos divulgados en la presente son meramente ilustrativos y no se pretende que sean limitativos.
[0105] Los términos "comprende", "incluye", "que tiene", "tiene", "puede", "contiene" y variantes de los mismos, tal como se usan en la presente, se pretende que sean frases, términos o palabras de transición abiertas que no excluyen la posibilidad de actos o estructuras adicionales. Las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La presente divulgación también contempla otras realizaciones "que comprenden", "que consisten en" y "que consisten esencialmente en" las realizaciones o elementos presentados en al presente, ya sea que se expongan explícitamente o no.
[0106] Para la enumeración de intervalos numéricos en la presente, se contempla explícitamente cada número intermedio con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6 a 9, se contemplan los números 7 y 8 además de 6 y 9, y para el intervalo de 6,0 a 7,0, se contemplan explícitamente los números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.
[0107] En la presente, el término "anticuerpo madurado por afinidad" se usa para referirse a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más CDR, que dan como resultado una mejora en la afinidad (es decir, K<D>, k<d>o k<a>) del anticuerpo para un antígeno diana en comparación con un anticuerpo original, que no posee la alteración o alteraciones. Los anticuerpos madurados por afinidad ejemplares tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. En la técnica se conocen una variedad de procedimientos para producir anticuerpos madurados por afinidad, que incluyen el cribado de una biblioteca combinatoria de anticuerpos que se ha preparado usando bio-presentación. Por ejemplo, Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992) describen la maduración de la afinidad mediante la reordenamiento de los dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de los residuos de CDR y/o marco se describe por Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809- 3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310-3319 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992). La mutación selectiva en posiciones de mutagénesis selectiva y en posiciones de contacto o hipermutación con un residuo de aminoácido que potencia la actividad se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 6.914.128 B1.
[0108] [0063] "Anticuerpo" y "anticuerpos" tal como se usan en la presente se refieren a anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoespecíficos (por ejemplo, que pueden ser monoclonales o también pueden producirse mediante otros medios distintos a su producción a partir de una célula germinal común), anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados (total o parcialmente humanizados), anticuerpos animales tales como, pero no limitados a, aves (por ejemplo, un pato o un ganso), un tiburón, una ballena y un mamífero, incluyendo un no primate (por ejemplo, una vaca, un cerdo, un camello, una llama, un caballo, una cabra, un conejo, una oveja, un hámster, una cobaya, un gato, un perro, una rata, un ratón, etc.) o un primate no humano (por ejemplo, un mono, un chimpancé, etc.), anticuerpos recombinantes, anticuerpos quiméricos, Fv de cadena única ("scFv"), anticuerpos de cadena única, anticuerpos de dominio único, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')<2>, Fv enlazados por disulfuro ("sdFv") y anticuerpos anti-idiotípicos ("anti-Id"), anticuerpos de dominio dual, anticuerpos de dominio variable dual (DVD) o de dominio variable triple (TVD) (las inmunoglobulinas de dominio variable dual y los métodos para su elaboración se describen en Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25(11):1290-1297 (2007) y en la Solicitud Internacional de PCT WO 2001/058956, o anticuerpos de dominio (dAbs) (por ejemplo, como se describe en Holt et al. (2014) Trends in Biotechnology 21:484-490), e incluyendo anticuerpos de dominio único sdAbs que se producen de manera natural, por ejemplo, como en peces cartilaginosos y camélidos, o que son sintéticos, por ejemplo, nanocuerpos, VHH u otra estructura de dominio), y fragmentos de unión a epítopos funcionalmente activos de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, concretamente, moléculas que contienen un sitio de unión al analito. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase. En aras de la simplicidad, un anticuerpo contra un analito se denomina frecuentemente en la presente "anticuerpo anti-analito" o simplemente "anticuerpo contra analito" (por ejemplo, un anticuerpo anti-GFAP o un anticuerpo contra GFAP).
[0110] "Fragmento de anticuerpo" tal como se usa en la presente se refiere a una parte de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión al antígeno o la región variable. La parte no incluye los dominios constantes de la cadena pesada (es decir, CH2, CH3 o CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo) de la región Fc del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fab'-SH, fragmentos F(ab')<2>, fragmentos Fd, fragmentos Fv, diacuerpos, moléculas Fv de cadena única (scFv), polipéptidos de cadena única que contienen solo un dominio variable de cadena ligera, polipéptidos de cadena única que contienen las tres CDR del dominio variable de cadena ligera, polipéptidos de cadena única que contienen solo una región variable de cadena pesada y polipéptidos de cadena única que contienen las tres CDR de la región variable de cadena pesada.
[0112] El "área bajo la curva" o "AUC" se refiere al área bajo una curva ROC. El AUC bajo una curva ROC es una medida de precisión. Una AUC de 1 representa una prueba perfecta, mientras que una AUC de 0,5 representa una prueba insignificante. Una AUC preferida puede ser de por lo menos aproximadamente 0,700, por lo menos aproximadamente 0,750, por lo menos aproximadamente 0,800, por lo menos aproximadamente 0,850, por lo menos aproximadamente 0,900, por lo menos aproximadamente 0,910, por lo menos aproximadamente 0,920, por lo menos aproximadamente 0,930, por lo menos aproximadamente 0,940, por lo menos aproximadamente 0,950, por lo menos aproximadamente 0,960, por lo menos aproximadamente 0,970, por lo menos aproximadamente 0,980, por lo menos aproximadamente 0,990 o por lo menos aproximadamente 0,995.
[0114] "Perla" y "partícula" se usan en la presente indistintamente y se refieren a un soporte sólido sustancialmente esférico. Un ejemplo de perla o partícula es una micropartícula. Las micropartículas que pueden usarse en la presente pueden ser de cualquier tipo conocido en la técnica. Por ejemplo, la perla o partícula puede ser una perla magnética o una partícula magnética. Las perlas/partículas magnéticas pueden ser ferromagnéticas, ferrimagnéticas, paramagnéticas, superparamagnéticas o ferrofluídicas. Los materiales ferromagnéticos ejemplares incluyen Fe, Co, Ni, Gd, Dy, CrO<2>, MnAs, MnBi, EuO, y NiO/Fe. Los ejemplos de materiales ferrimagnéticos incluyen NiFe<2>O<4>, CoFe<2>O<4>, Fe<3>O<4>(o FeO·Fe<2>O<3>). Las perlas pueden tener una parte de núcleo sólida que es magnética y está rodeada por una o más capas no magnéticas. Alternativamente, la parte magnética puede ser una capa alrededor de un núcleo no magnético. Las micropartículas pueden ser de cualquier tamaño que funcione en los métodos descritos en la presente, por ejemplo, de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 5 nm, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 nm, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 nm.
[0116] El término "proteína de unión" se usa en la presente para referirse a una proteína monomérica o multimérica que se une y forma un complejo con un compañero de unión como, por ejemplo, un polipéptido, un antígeno, un compuesto químico u otra molécula, o un sustrato de cualquier tipo. Una proteína de unión se une específicamente a un compañero de unión. Las proteínas de unión incluyen anticuerpos, así como fragmentos de unión a antígenos de los mismos y varias otras formas y derivados de los mismos que se conocen en la técnica y se describen a continuación en la presente, y otras moléculas que comprenden uno o más dominios de unión a antígenos que se unen a una molécula de antígeno o a un sitio particular (epítopo) en la molécula de antígeno. Por consiguiente, una proteína de unión incluye, pero no se limita a, un anticuerpo, una inmunoglobulina tetramérica, una molécula de IgG, una molécula de IgG1, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo madurado por afinidad y fragmentos de cualquiera de tales anticuerpos que conserven la capacidad de unirse a un antígeno.
[0118] [0068] "Anticuerpo biespecífico" se usa en la presente para referirse a un anticuerpo de longitud completa que se genera mediante tecnología de cuadroma (véase Milstein et al., Nature, 305(5934): 537-540 (1983)), mediante la conjugación química de dos anticuerpos monoclonales diferentes (véase Staerz et al., Nature, 314(6012): 628-631 (1985)), o mediante enfoques de tipo "knob-into-hole (saliente-en-cavidad)" o similares, que introducen mutaciones en la región Fc (véase Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(14): 6444-6448 (1993)), lo que da como resultado múltiples especies diferentes de inmunoglobulinas, de las cuales solo una es el anticuerpo biespecífico funcional. Un anticuerpo biespecífico se une a un antígeno (o epítopo) en uno de sus dos brazos de unión (un par de HC/LC) y se une a un antígeno (o epítopo) diferente en su segundo brazo (un par diferente de HC/LC). Según esta definición, un anticuerpo biespecífico tiene dos brazos de unión a antígenos distintos (tanto en especificidad como en secuencias de CDR) y es monovalente para cada antígeno al que se une.
[0120] En la presente, "CDR" se usa para referirse a la "región determinante de la complementariedad" dentro de una secuencia variable de un anticuerpo. En cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera hay tres CDR. Partiendo desde el extremo N-terminal de una cadena pesada o ligera, para cada una de las regiones variables estas regiones se denotan "CDR1", "CDR2" y "CDR3". El término "conjunto de CDR" tal como se usa en la presente se refiere a un grupo de tres CDR que se producen en una única región variable que se une al antígeno. Por lo tanto, un sitio de unión al antígeno puede incluir seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR de cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera. Un polipéptido que comprenda una única CDR (por ejemplo, una CDR1, CDR2 o CDR3) puede denominarse "unidad de reconocimiento molecular". Los análisis cristalográficos de los complejos antígeno-anticuerpo han demostrado que los residuos de aminoácidos de las CDR forman un contacto extenso con el antígeno unido, en el que el contacto más amplio con el antígeno se produce con la CDR3 de la cadena pesada. Por lo tanto, las unidades de reconocimiento molecular pueden ser las principales responsables de la especificidad de un sitio de unión al antígeno. En general, los residuos de las CDR están directa y más sustancialmente implicados en influir en la unión al antígeno.
[0122] Los límites exactos de estas CDR se han definido de manera diferente de acuerdo con diferentes sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991)) no solo proporciona un sistema de numeración de residuos inequívoco aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, sino que también proporciona límites de residuos precisos que definen las tres CDR. Estas CDR pueden denominarse "CDR de Kabat". Chothia y sus colaboradores (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987); y Chothia et al., Nature, 342: 877-883 (1989)) descubrieron que ciertas subporciones dentro de las CDR de Kabat adoptan conformaciones de cadena principal peptídica casi idénticas, a pesar de presentar una gran diversidad a nivel de secuencia de aminoácidos. Estas subporciones se designaron como "L1", "L2" y "L3", o "H1", "H2" y "H3", donde "L" y "H" designan las regiones de la cadena ligera y la cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden denominarse "CDR de Chothia" que tienen límites que se solapan con los de las CDR de Kabat. Otros límites que definen las CDR que se solapan con las CDR de Kabat han sido descritos por Padlan, FASEB J., 9: 133-139 (1995), y MacCallum, J. Mol. Biol., 262(5): 732-745 (1996). Otras definiciones más de los límites de las CDR pueden no seguir estrictamente ninguno de los sistemas de la presente, pero no obstante se solaparán con las CDR de Kabat, aunque pueden acortarse o alargarse a la luz de descubrimientos de predicciones o experimentales de que residuos o grupos de residuos, o incluso CDR completas, particulares no afectan significativamente a la unión al antígeno. Los métodos usados en la presente pueden utilizar CDR definidas de acuerdo con cualquiera de estos sistemas, aunque ciertas realizaciones usan las CDR definidas por Kabat o por Chothia.
[0124] El "coeficiente de variación" (CV), también conocido como "variabilidad relativa", es igual a la desviación estándar de una distribución dividida por su media.
[0126] "Componente", "componentes" o "por lo menos un componente" se refieren de manera general a un anticuerpo de captura, una detección o conjugado, un calibrador, un control, un panel de sensibilidad, un recipiente, un tampón, un diluyente, una sal, una enzima, un cofactor para una enzima, un reactivo de detección, un reactivo/solución de pretratamiento, un sustrato (por ejemplo, como una solución), una solución de parada y similares que pueden incluirse en un kit para el ensayo de una muestra de prueba, como una muestra de orina, sangre completa, suero o plasma de un paciente, de acuerdo con los métodos descritos en la presente y otros métodos conocidos en la técnica. Algunos componentes pueden estar en solución o liofilizados para su reconstitución para su uso en un ensayo.
[0128] "Tomografía computarizada", tal como se usa en la presente, se refiere a una exploración por tomografía computarizada (TC). Una tomografía computarizada combina una serie de imágenes de rayos X tomadas desde diferentes ángulos y usa procesamiento informático para crear imágenes, o cortes, en sección transversal de los huesos, los vasos sanguíneos y los tejidos blandos del interior del cuerpo. La tomografía computarizada puede usar tomografía computarizada por rayos X, tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), tomografía axial computarizada (exploración CAT) o tomografía asistida por ordenador. La tomografía computarizada puede ser una tomografía computarizada convencional o una tomografía computarizada espiral/helicoidal. En una tomografía computarizada convencional, la exploración se realiza corte a corte y, después de cada corte, la exploración se detiene y se desplaza al corte siguiente,por ejemplo, desde la parte superior del abdomen hacia abaja hasta la pelvis. La tomografía computarizada convencional requiere que los pacientes contengan la respiración para evitar artefactos de movimiento. La tomografía computarizada espiral/helicoidal es una exploración continua que se realiza en forma de espiral y es un proceso mucho más rápido en el que las imágenes escaneadas son contiguas.
[0130] [0074] "Derivado" de un anticuerpo, tal como se usa en la presente, puede referirse a un anticuerpo que tenga una o más modificaciones en su secuencia de aminoácidos en comparación con un anticuerpo genuino u original y que presente una estructura de dominio modificada. El derivado todavía puede ser capaz de adoptar la configuración de dominio típica que se encuentra en los anticuerpos nativos, así como una secuencia de aminoácidos, que es capaz de unirse a dianas (antígenos) con especificidad. Ejemplos típicos de derivados de anticuerpos son anticuerpos acoplados a otros polipéptidos, dominios de anticuerpos reordenados o fragmentos de anticuerpos. El derivado también puede comprender por lo menos un compuesto adicional, por ejemplo, un dominio proteico, dominio proteico que está enlazado por enlaces covalentes o no covalentes. El enlace puede basarse en la fusión genética de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. El dominio adicional presente en la proteína de fusión que comprende el anticuerpo puede estar enlazado preferiblemente por un conector flexible, ventajosamente un conector peptídico, en el que dicho conector peptídico comprende varios aminoácidos hidrófilos unidos por enlaces peptídicos de una longitud suficiente para abarcar la distancia entre el extremo C-terminal del dominio proteico adicional y el extremo N-terminal del anticuerpo o viceversa. El anticuerpo puede estar enlazado a una molécula efectora que tenga una conformación adecuada para la actividad biológica o la unión selectiva a un soporte sólido, una sustancia biológicamente activa (por ejemplo, una citoquina o una hormona de crecimiento), un agente químico, un péptido, una proteína o un fármaco, por ejemplo.
[0132] En la presente, "drogas de abuso" se usa para referirse a una o más sustancias adictivas (como una droga) que se consumen por razones no médicas (por ejemplo, por sus efectos recreativos y/o psicoactivos). El consumo excesivo, el uso o la dependencia de tales drogas de abuso se denomina a menudo "abuso de sustancias". Los ejemplos de drogas de abuso incluyen alcohol, barbitúricos, benzodiazepinas, cannabis, cocaína, alucinógenos (como la ketamina, la mescalina (peyote), PCP, psilocibina, DMT y/o LSD), metacualona, opioides, anfetaminas (incluyendo las metanfetaminas), esteroides anabólicos, inhalantes (concretamente, sustancias que contienen sustancias volátiles con propiedades psicoactivas, como, por ejemplo, nitritos, pinturas en aerosol, líquidos de limpieza, rotuladores, pegamentos, etc.) y combinaciones de los mismos.
[0134] En la presente, "anticuerpo de especificidad dual" se usa para referirse a un anticuerpo de longitud completa que puede unirse a dos antígenos (o epítopos) diferentes en cada uno de sus dos brazos de unión (un par de HC/LC) (véase la publicación de PCT WO 02/02773). Por consiguiente, una proteína de unión de especificidad dual tiene dos brazos de unión a antígenos idénticos, con especificidad idéntica y secuencias de CDR idénticas, y es bivalente para cada antígeno con el que se une.
[0136] En la presente, "dominio variable dual" se usa para referirse a dos o más sitios de unión a antígenos en una proteína de unión, que pueden ser proteínas de unión divalentes (dos sitios de unión a antígenos), tetravalentes (cuatro sitios de unión a antígenos) o multivalentes. Los DVD pueden ser monoespecíficos, es decir,capaces de unirse a un antígeno (o un epítopo específico), o multiespecíficos, es decir,capaces de unirse a dos o más antígenos (es decir, dos o más epítopos de la misma molécula de antígeno diana o dos o más epítopos de diferentes antígenos diana). Una proteína de unión de DVD preferida comprende dos polipéptidos de DVD de cadena pesada y dos polipéptidos de DVD de cadena ligera y se denomina "inmunoglobulina de DVD" o "DVD-Ig". Por tanto, tal proteína de unión a DVD-Ig es tetramérica y recuerda a una molécula de IgG, pero proporciona más sitios de unión a antígenos que una molécula de IgG. Por tanto, cada mitad de una molécula tetramérica de DVD-Ig se asemeja a la mitad de una molécula de IgG y comprende un polipéptido de DVD de cadena pesada y un polipéptido de DVD de cadena ligera pero, a diferencia de un par de cadenas pesadas y ligeras de una molécula de IgG que proporciona un único dominio de unión a antígenos, un par de cadenas pesada y ligera de una DVD-Ig proporciona dos o más sitios de unión a antígenos.
[0138] Cada sitio de unión al antígeno de una proteína de unión a DVD-Ig puede derivarse de un anticuerpo monoclonal donante ("original") y comprende por tanto un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) con un total de seis CDR implicadas en la unión al antígeno por sitio de unión al antígeno. Por consiguiente, una proteína de unión a DVD-Ig que se une a dos epítopos diferentes (es decir, dos epítopos diferentes de dos moléculas de antígeno diferentes o dos epítopos diferentes de la misma molécula de antígeno) comprende un sitio de unión al antígeno derivado de un primer anticuerpo monoclonal original y un sitio de unión al antígeno de un segundo anticuerpo monoclonal original.
[0140] [0079] En la Publicación de PCT Nº WO 2007/024715, la Patente de Estados Unidos Nº 7.612.181 y Wu et al., Nature Biotech., 25: 1290-1297 (2007) se proporciona una descripción del diseño, la expresión y la caracterización de las moléculas de unión a DVD-Ig. Un ejemplo preferido de tales moléculas de DVD-Ig comprende una cadena pesada que comprende la fórmula estructural VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en la que VD1 es un primer dominio variable de cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de cadena pesada, C es un dominio constante de cadena pesada, X1 es un conector con la condición de que no sea CH1, X2 es una región Fc y n es 0 o 1, pero preferiblemente 1; y una cadena ligera que comprende la fórmula estructural VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, en la que VD1 es un primer dominio variable de cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de cadena ligera, C es un dominio constante de cadena ligera, X1 es un conector con la condición de que no sea CH1, y X2 no comprende una región Fc; y n es 0 o 1, pero preferiblemente 1. Dicha DVD-Ig puede comprender dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, en la que cada cadena comprende dominios variables enlazados en tándem sin una región constante intermedia entre las regiones variables, en las que una cadena pesada y una cadena ligera se asocian para formar sitios funcionales de unión a antígenos en tándem, y un par de cadenas pesadas y ligeras pueden asociarse con otro par de cadenas pesadas y ligeras para formar una proteína de unión tetramérica con cuatro sitios funcionales de unión a antígenos. En otro ejemplo, una molécula de DVD-Ig puede comprender cadenas pesadas y ligeras que comprenden cada una tres dominios variables (VD1, VD2, VD3) enlazados en tándem sin una región constante intermedia entre los dominios variables, en el que un par de cadenas pesadas y ligeras pueden asociarse para formar tres sitios de unión a antígenos, y en el que un par de cadenas pesada y ligera pueden asociarse con otro par de cadenas pesada y ligera para formar una proteína de unión tetramérica con seis sitios de unión a antígenos.
[0141] En una realización preferida, una proteína de unión a DVD-Ig no solo se une a las mismas moléculas diana a las que se unen sus anticuerpos monoclonales originales, sino que también posee una o más propiedades deseables de uno o más de sus anticuerpos monoclonales originales. Preferiblemente, dicha propiedad adicional es un parámetro de anticuerpo de uno o más de los anticuerpos monoclonales originales. Los parámetros de anticuerpo que pueden contribuir a una proteína de unión a DVD-Ig a partir de uno o más de sus anticuerpos monoclonales originales incluyen, pero no se limitan a, la especificidad del antígeno, la afinidad por el antígeno, la potencia, la función biológica, el reconocimiento de epítopos, la estabilidad de la proteína, la solubilidad de la proteína, la eficiencia de producción, la inmunogenicidad, la farmacocinética, la biodisponibilidad, la reactividad cruzada tisular y la unión de antígenos ortólogos.
[0142] Una proteína de unión a DVD-Ig se une por lo menos a un epítopo de GFAP. Los ejemplos no limitativos de una proteína de unión a DVD-Ig incluyen una proteína de unión a DVD-Ig que se une a uno o más epítopos de GFAP, una proteína de unión a DVD-Ig que se une a un epítopo de una GFAP humana y a un epítopo de GFAP de otra especie (por ejemplo, ratón), y una proteína de unión a DVD-Ig que se une a un epítopo de una GFAP humana y a un epítopo de otra molécula diana.
[0143] En la presente, "drogas de abuso" se usa para referirse a una o más sustancias adictivas (como una droga) que se consumen por razones no médicas (por ejemplo, por sus efectos recreativos y/o psicoactivos). El consumo excesivo, el uso o la dependencia de tales drogas de abuso se denomina a menudo "abuso de sustancias". Los ejemplos de drogas de abuso incluyen alcohol, barbitúricos, benzodiazepinas, cannabis, cocaína, alucinógenos (como la ketamina, la mescalina (peyote), PCP, psilocibina, DMT y/o LSD), metacualona, opioides, anfetaminas (incluyendo las metanfetaminas), esteroides anabólicos, inhalantes (concretamente, sustancias que contienen sustancias volátiles con propiedades psicoactivas, como, por ejemplo, nitritos, pinturas en aerosol, líquidos de limpieza, rotuladores, pegamentos, etc.) y combinaciones de los mismos.
[0144] Tal como se usa en la presente, "intervalo dinámico", se refiere al intervalo a lo largo del cual una lectura del ensayo es proporcional a la cantidad de analito o molécula diana en la muestra que se está analizando. El intervalo dinámico puede ser el intervalo de linealidad de la curva estándar.
[0145] "Epítopo", "epítopos" o "epítopos de interés" se refieren a un sitio o sitios de cualquier molécula que se reconocen y pueden unirse a un sitio o sitios complementarios de su compañero de unión específico. La molécula y el compañero de unión específico forman parte de un par de unión específico. Por ejemplo, un epítopo puede estar en un polipéptido, una proteína, un hapteno, un antígeno de carbohidrato (como, pero no limitados a, glicolípidos, glicoproteínas o lipopolisacáridos) o un polisacárido. Su compañero de unión específico puede ser, pero no se limita a, un anticuerpo.
[0146] Como se usa en la presente, "ventana de detección ampliada" se refiere al hecho de que los métodos mejorados descritos y/o reivindicados pueden llevarse a cabo en o bajo una variedad de escenarios clínicos en comparación con otros ensayos de GFAP. Por ejemplo, los métodos de la presente divulgación pueden llevarse a cabo en cualquier sujeto sin tener en cuenta factores seleccionados del grupo que consiste en el estado clínico del sujeto (por ejemplo, si existen o no afecciones comórbidas además de la razón para comprobar la GFAP, o si se está evaluando alguna situación clínica distinta de un TCE), los valores de laboratorio del sujeto (por ejemplo, valores de laboratorio distintos de los niveles de GFAP que incluyen, pero no se limitan a, los valores de las pruebas estándar de laboratorio que se realizan para evaluar la salud general del paciente, y los valores de pruebas más específicas que se realizan cuando se sospecha que un sujeto ha sufrido un accidente o ha estado expuesto a algún tipo de traumatismo, incluyendo, pero no limitados a, los que pueden provocar lesiones en la cabeza), la clasificación del sujeto como que padece un TCE leve, moderado o grave, la manifestación por parte del sujeto (por ejemplo, demostración o posesión) de niveles bajos o altos de GFAP, y el momento en que se produjo cualquier evento (por ejemplo, en relación con las pruebas) en el que el sujeto pudo haber sufrido una lesión en la cabeza. La ventana ampliada de detección de los métodos reivindicados difiere de otros métodos conocidos del estado de la técnica que pueden requerir dilución o, alternativamente, pueden carecer de una o más de las ventajas de los ensayos mejorados descritos en la presente (por ejemplo, medición de hasta 50.000 pg/ml, intervalo dinámico de 5 log, linealidad del ensayo a lo largo del intervalo dinámico, medición de GFAP en un volumen de menos de 20 microlitros de muestra, ventana de detección ampliada, etc.).
[0147] [0086] Tal como se usa en la presente, "fragmento de unión a antígeno" o "fragmento Fab" se refiere a un fragmento de un anticuerpo que se une a los antígenos y que contiene un sitio de unión al antígeno, una cadena ligera completa y parte de una cadena pesada. El Fab es un fragmento monovalente que consiste en los dominios de VL, VH, CL y CH1. El Fab está compuesto de un dominio constante y un dominio variable de cada una de la cadena pesada y la ligera. El dominio variable contiene el parátopo (el sitio de unión al antígeno), que comprende un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad, en el extremo terminal amino del monómero. Cada brazo de la Y se une por tanto a un epítopo del antígeno. Los fragmentos Fab pueden generarse tal como se ha descrito en la técnica, por ejemplo, usando la enzima papaína, que puede usarse para escindir un monómero de inmunoglobulina en dos fragmentos Fab y un fragmento Fc, o pueden producirse mediante medios recombinantes.
[0148] Tal como se usa en la presente, "fragmento F(ab')<2>" se refiere a los anticuerpos generados por la digestión con pepsina de anticuerpos de IgG completos para eliminar la mayor parte de la región Fc, dejando intacta parte de la región bisagra. Los fragmentos F(ab')<2>tienen dos porciones F(ab) de unión al antígeno enlazadas entre sí por enlaces disulfuro y, por lo tanto, son divalentes con un peso molecular de aproximadamente 110 kDa. Los fragmentos de anticuerpos divalentes (fragmentos F(ab')<2>) son más pequeños que las moléculas de IgG completas y permiten una mejor penetración en el tejido, lo que facilita un mejor reconocimiento de antígenos en inmunohistoquímica. El uso de fragmentos F(ab')<2>también evita la unión inespecífica al receptor Fc en células vivas o a la proteína A/G. Los fragmentos F(ab')<2>pueden unirse y precipitar antígenos.
[0149] Tal como se usan en la presente, "región marco" (FR) o "secuencia de región marco", pueden significar las secuencias restantes de una región variable menos las CDR. Como la definición exacta de una secuencia de CDR puede determinarse mediante diferentes sistemas (véase, por ejemplo, más arriba), el significado de una secuencia marco está sujeto a interpretaciones correspondientemente diferentes. Las seis CDR (CDR-L1, -L2 y -L3 de la cadena ligera y CDR-H1, -H2 y -H3 de la cadena pesada) también dividen las regiones marco de la cadena ligera y la cadena pesada en cuatro subregiones (FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en las que la CDR1 se sitúa entre FR1 y FR2, la CDR2 entre FR2 y FR3, y la CDR3 entre FR3 y FR4. Sin especificar las subregiones particulares como FR1, F'R2, FR3 o FR4, una región marco, tal como la denominan otros, representa las FR combinadas dentro de la región variable de una única cadena de inmunoglobulina de origen natural. Tal como se usa en la presente, una FR representa una de las cuatro subregiones, y las FR representan dos o más de las cuatro subregiones que constituyen una región marco.
[0150] En la técnica se conocen las secuencias de FR de la cadena pesada y la cadena ligera humanas y pueden usarse como secuencias marco "aceptoras" de la cadena pesada y la cadena ligera (o simplemente, secuencias "aceptoras") para humanizar un anticuerpo no humano usando técnicas conocidas en la técnica. En una realización, las secuencias aceptoras de la cadena pesada y la cadena ligera humanas se seleccionan entre las secuencias marco enumeradas en bases de datos disponibles públicamente, como V-base (hypertext transfer protocol://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/) o en el sistema de información internacional ImMunoGeneTics® (IMGT®) (hypertext transfer protocol://imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/LocusGenes/).
[0151] Tal como se usa en la presente, "sitio de unión funcional al antígeno" puede referirse a un sitio en una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) que es capaz de unirse a un antígeno diana. La afinidad de unión al antígeno del sitio de unión al antígeno puede no ser tan fuerte como la de la proteína de unión original, por ejemplo, el anticuerpo original, del que se deriva el sitio de unión al antígeno, pero la capacidad de unirse al antígeno debe poderse medir usando cualquiera de una variedad de métodos conocidos para evaluar la unión de proteínas, por ejemplo, anticuerpos, a un antígeno. Además, la afinidad de unión al antígeno de cada uno de los sitios de unión al antígeno de una proteína multivalente, por ejemplo, un anticuerpo multivalente, de la presente no tiene por qué ser cuantitativamente la misma.
[0152] "GFAP" se usa en la presente para describir la proteína ácida fibrilar glial. La GFAP es una proteína codificada por el genGFAPen los humanos y que puede producirse en otras especies (por ejemplo, mediante medios recombinantes).
[0153] "Estado de GFAP" puede significar el nivel o la cantidad de GFAP en un punto temporal (por ejemplo, con una única medida de GFAP), el nivel o la cantidad de GFAP asociado con la monitorización (por ejemplo, con una prueba repetida en un sujeto para identificar un aumento o una disminución en la cantidad de GFAP), el nivel o la cantidad de GFAP asociado con el tratamiento para un traumatismo craneoencefálico (ya sea una lesión cerebral primaria y/o una lesión cerebral secundaria) o combinaciones de los mismos.
[0154] Tal como se usa en la presente, "escala de Coma de Glasgow" o "GCS" se refiere a una escala de 15 puntos para estimar y categorizar los resultados de una lesión cerebral sobre la base de la capacidad social general o la dependencia de otros. La prueba mide la respuesta motora, la respuesta verbal y la respuesta de apertura de los ojos con estos valores: I. Respuesta motora (6 - Obedece las órdenes completamente; 5 - Localiza los estímulos nocivos; 4 - Se retira de los estímulos nocivos; 3 - Flexión anormal, es decir, postura de descorticación; 2 - Respuesta extensora, es decir,postura de descerebración; y 1 - Sin respuesta); II. Respuesta verbal (5 - Alerta y orientado; 4 - Lenguaje confuso pero coherente; 3 - Palabras inapropiadas y frases confusas que consisten en palabras; 2 - Sonidos incomprensibles; y 1 - Sin sonidos); y III. Apertura de ojos (4 - Apertura espontánea de los ojos; 3 - Ojos abiertos al hablar; 2 - Ojos abiertos al dolor; y 1 - Sin apertura de ojos). La puntuación final se determina sumando los valores de I+II+III. La puntuación final puede categorizarse en cuatro niveles posibles de supervivencia, en los que un número más bajo indica una lesión más grave y un pronóstico más desfavorable: Leve (13-15); Discapacidad moderada (912) (Pérdida de conciencia de más de 30 minutos; Deterioro físico o cognitivo que puede resolverse o no: y Beneficio de la rehabilitación); Discapacidad grave (3-8) (Coma: estado inconsciente. Sin respuesta significativa, sin actividades voluntarias); y Estado vegetativo (Menos de 3) (Ciclos de sueño-vigilia; Excitación, pero sin interacción con el entorno; Sin respuesta localizada al dolor). La lesión cerebral moderada se define como una lesión cerebral que provoca una pérdida de conciencia de 20 minutos a 6 horas y una puntuación en la Escala de Coma de Glasgow de 9 a 12. La lesión cerebral grave se define como una lesión cerebral que provoca una pérdida de conciencia de más de 6 horas y una puntuación en la Escala de Coma de Glasgow de 3 a 8.
[0156] Tal como se usa en la presente, la "Escala de Resultados de Glasgow" se refiere a una escala global de resultados funcionales que clasifica el estado del paciente en una de cinco categorías: Fallecido, Estado vegetativo, Discapacidad grave, Discapacidad moderada o Buena recuperación.
[0158] Tal como se usa indistintamente en la presente, la "Escala de Resultados de Glasgow Ampliada" o "GOSE" proporciona una categorización más detallada en ocho categorías subdividiendo las categorías de Discapacidad grave, Discapacidad moderada y buena recuperación en una categoría inferior y otra superior, tal como se muestra en la Tabla 1.
[0160] Tabla 1
[0163]
[0166] [0096] En la presente, "anticuerpo humanizado" se usa para describir un anticuerpo que comprende secuencias de regiones variables de cadenas pesadas y ligeras de una especie no humana (por ejemplo, un ratón), pero en el que por lo menos una parte de la secuencia VH y/o VL ha sido alterada para que sea más "similar a la humana", es decir,más similar a las secuencias variables de la línea germinal humana. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo o una variante, derivado, análogo o fragmento del mismo, que se une inmunospecíficamente a un antígeno de interés y que comprende una región marco (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano y una región determinante de la complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. Tal como se usa en la presente, el término "sustancialmente" en el contexto de una CDR se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 98% o por lo menos un 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de una CDR de anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todos, por lo menos uno y típicamente dos, los dominios variables (Fab, Fab', F(ab')<2>, FabC, Fv) en los que todas o sustancialmente todas las regiones de CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, el anticuerpo donante) y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. En una realización, un anticuerpo humanizado también comprende por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado contiene la cadena ligera, así como por lo menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado solo contiene una cadena ligera humanizada. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado solo contiene una cadena pesada humanizada. En realizaciones específicas, un anticuerpo humanizado solo contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o una cadena pesada humanizada.
[0168] Un anticuerpo humanizado puede seleccionarse entre cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo, sin limitación, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Un anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo, y pueden seleccionarse dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas usando técnicas bien conocidas en la técnica.
[0170] No es necesario que las regiones marco y las CDR de un anticuerpo humanizado se correspondan exactamente con las secuencias originales, por ejemplo, la CDR del anticuerpo donante o la región marco de consenso puede mutagenizarse mediante la sustitución, inserción y/o deleción de por lo menos un residuo de aminoácido, de tal manera que el residuo de la CDR o de la región marco en ese sitio no se corresponda ni con el anticuerpo donante ni con la región marco de consenso. Sin embargo, en una realización preferida, tales mutaciones no serán extensas. Habitualmente, por lo menos el 80%, preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90% y, lo más preferible, por lo menos el 95% de los residuos del anticuerpo humanizado se corresponderán con los de las secuencias FR y CDR originales. Tal como se usa en la presente, el término "región marco de consenso" se refiere a la región marco en la secuencia de inmunoglobulina de consenso. Tal como se usa en la presente, el término "secuencia de inmunoglobulina de consenso" se refiere a la secuencia formada a partir de los aminoácidos (o nucleótidos) que aparecen con mayor frecuencia en una familia de secuencias de inmunoglobulina relacionadas (véase, por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1987)). Por lo tanto, una "secuencia de inmunoglobulina de consenso" puede comprender "una o más regiones marco de consenso" y/o "una o más CDR de consenso". En una familia de inmunoglobulinas, cada posición de la secuencia de consenso está ocupada por el aminoácido que aparece con mayor frecuencia en esa posición en la familia. Si dos aminoácidos aparecen con la misma frecuencia, en la secuencia de consenso puede incluirse cualquiera de ellos. "Idéntica" o "identidad", tal como se usa en la presente en el contexto de dos o más secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, puede significar que las secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos que son iguales a lo largo de una región especificada. El porcentaje puede calcularse alineando de manera óptima las dos secuencias, comparando las dos secuencias a lo largo de la región especificada, determinando el número de posiciones en las que el residuo idéntico aparece en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la región especificada y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de la secuencia. En los casos en los que las dos secuencias tienen diferentes longitudes o la alineación produce uno o más extremos escalonados y la región especificada de comparación incluye solo una única secuencia, los residuos de la única secuencia se incluyen en el denominador, pero no en el numerador del cálculo.
[0172] Como se usan indistintamente en la presente, "lesión en la cabeza" o "lesión craneal" se refieren a cualquier traumatismo en el cuero cabelludo, el cráneo o el cerebro. Tales lesiones pueden incluir solo un golpe leve en el cráneo o pueden ser una lesión cerebral grave. Tales lesiones incluyen lesiones primarias en el cerebro y/o lesiones secundarias en el cerebro. Las lesiones cerebrales primarias se producen durante el evento lesivo inicial y son el resultado del desplazamiento de las estructuras físicas del cerebro. Más específicamente, una lesión cerebral primaria es el daño físico al parénquima (tejido, vasos) que se produce durante el evento traumático, lo que da como resultado el cizallamiento y la compresión del tejido cerebral circundante. Las lesiones cerebrales secundarias se producen después de la lesión primaria y pueden implicar una serie de procesos celulares. Más específicamente, una lesión cerebral secundaria se refiere a los cambios que evolucionan durante un periodo de tiempo (desde horas hasta días) después de la lesión cerebral primaria. Incluye toda una cascada de cambios celulares, químicos, tisulares o de vasos sanguíneos en el cerebro que contribuyen a una destrucción adicional del tejido cerebral.
[0174] [0100] Una lesión en la cabeza puede ser cerrada o abierta (penetrante). Una lesión cerrada en la cabeza se refiere a un traumatismo en el cuero cabelludo, el cráneo o el cerebro en el que no hay penetración del cráneo por un objeto contundente. Una lesión abierta en la cabeza se refiere a un traumatismo en el cuero cabelludo, el cráneo o el cerebro en el que hay penetración del cráneo por un objeto contundente. Una lesión en la cabeza puede estar provocada por sacudidas físicas a una persona, por un impacto contundente de una fuerza mecánica externa u otra fuerza que provoque un traumatismo craneal cerrado o abierto (por ejemplo, un accidente con un vehículo como con un automóvil, avión, tren, etc.; golpe en la cabeza, como con un bate de béisbol o un arma de fuego), un accidente vascular cerebral (por ejemplo, un accidente cerebrovascular), una o más caídas (por ejemplo, en deportes u otras actividades), explosiones o estallidos (en conjunto, "lesiones por explosión") y otros tipos de traumatismos por fuerza contundente. Alternativamente, una lesión en la cabeza puede estar provocada por la ingestión y/o la exposición a una sustancia química, toxina o una combinación de sustancia química y toxina. Los ejemplos de tales sustancias químicas y/o toxinas incluyen incendios, mohos, amianto, pesticidas e insecticidas, disolventes orgánicos, pinturas, pegamentos, gases (como monóxido de carbono, sulfuro de hidrógeno y cianuro), metales orgánicos (como metilmercurio, tetraetilo de plomo y estaño orgánico) y/o una o más drogas de abuso. Alternativamente, una lesión en la cabeza puede ser provocada como resultado de que un sujeto padezca una enfermedad autoinmune, un trastorno metabólico, un tumor cerebral, uno o más virus, meningitis, hidrocefalia, hipoxia o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, no es posible determinar con certeza si se ha producido o tenido lugar tal evento o lesión. Por ejemplo, puede que no haya historial de un paciente o sujeto, que el sujeto no pueda hablar, que el sujeto sea consciente de los eventos a los que estuvo expuesto, etc. Tales circunstancias se describen en la presente como que el sujeto "puede haber sufrido una lesión en la cabeza". En ciertas realizaciones de la presente, la lesión cerrada en la cabeza no incluye y excluye específicamente un accidente vascular cerebral, como un accidente cerebrovascular.
[0176] Tal como se usa en la presente, "polinucleótido aislado" puede referirse a un polinucleótido (por ejemplo, de origen genómico, ADNc o sintético, o una combinación de los mismos) que, en virtud de su origen, el polinucleótido aislado no está asociado con la totalidad o una parte de un polinucleótido con el que se encuentra en la naturaleza el "polinucleótido aislado"; está enlazado operativamente a un polinucleótido al que no está enlazado en la naturaleza; o no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.
[0178] Tal como se usan en la presente, "marcador" y "marcador detectable" se refieren a una fracción unida a un anticuerpo o a un analito para hacer que la reacción entre el anticuerpo y el analito sea detectable, y el anticuerpo o analito así marcado se denomina "marcado detectablemente". Un marcador puede producir una señal que es detectable por medios visuales o instrumentales. Varios marcadores incluyen sustancias productoras de señales, como cromógenos, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, compuestos radiactivos y similares. Los ejemplos representativos de marcadores incluyen fracciones que producen luz, por ejemplo, compuestos de acridinio, y fracciones que producen fluorescencia, por ejemplo, fluoresceína. En la presente se describen otros marcadores. A este respecto, es posible que la propia fracción no sea detectable, pero que se vuelva detectable tras su reacción con otra fracción. Se pretende que el uso del término "marcado detectablemente" abarque este tipo de marcado.
[0180] Puede usarse cualquier marcador detectable adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, el marcador detectable puede ser un marcador radiactivo (como 3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho y 153Sm), un marcador enzimático (como peroxidasa de rábano picante, peroxidasa alcalina, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa y similares), un marcador quimioluminiscente (como ésteres de acridinio, tioésteres o sulfonamidas; luminol, isoluminol, ésteres de fenantridinio y similares), un marcador fluorescente (como fluoresceína (por ejemplo, 5-fluoresceína, 6-carboxifluoresceína, 3' 6-carboxifluoresceína, 5(6)-carboxifluoresceína, 6-hexacloro-fluoresceína, 6-tetracloro-fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína y similares)), rodamina, ficobiliproteínas, R-ficoeritrina, puntos cuánticos (por ejemplo, seleniuro de cadmio recubierto de sulfuro de zinc), un marcador termométrico o un marcador de reacción en cadena de la polimerasa inmunológica. En Polak y Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 2ª ed., Springer Verlag, N.Y. (1997), y en Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996), que es un manual y catálogo combinado publicado por Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregón, puede encontrarse una introducción a los marcadores, los procedimientos de marcado y la detección de marcadores. Un marcador fluorescente puede usarse en FPIA (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.593.896, 5.573.904, 5.496.925, 5.359.093 y 5.352.803). En un ensayo quimioluminiscente homogéneo puede usarse como marcador detectable un compuesto de acridinio (véase, por ejemplo, Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett.16: 1324-1328 (2006); Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett.4: 2313-2317 (2004); Adamczyk et al., Biorg. Med. Chem. Lett.14: 3917-3921 (2004); y Adamczyk et al., Org. Lett.5: 3779-3782 (2003)).
[0182] En un aspecto, el compuesto de acridinio es una acridinio-9-carboxamida. Los métodos para preparar acridinio 9-carboxamidas se describen en Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin.6: 107-114 (1991); Adamczyk et al., J. Org. Chem.63: 5636-5639 (1998); Adamczyk et al., Tetrahedron 55: 10899-10914 (1999); Adamczyk et al., Org. Lett.
[0183] 1: 779-781 (1999); Adamczyk et al., Bioconjugate Chem. 11: 714-724 (2000); Mattingly et al., In Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; Dyke, K. V. Ed.; CRC Press: Boca Raton, págs. 77-105 (2002); Adamczyk et al., Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003); y las Patentes de Estados Unidos Nº 5.468.646, 5.543.524 y 5.783.699.
[0185] [0105] Otro ejemplo de compuesto de acridinio es un éster arílico de acridinio-9-carboxilato. Un ejemplo de un éster arílico de acridinio-9-carboxilato de fórmula II es el fluorosulfonato de 10-metil-9-(fenoxicarbonil)acridinio (disponible de Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Los métodos para preparar ésteres arílicos de acridinio 9-carboxilato se describen en McCapra et al., Photochem. Photobiol. 4: 1111-21 (1965); Razavi et al., Luminescence 15: 245-249 (2000); Razavi et al., Luminescence 15: 239-244 (2000); y la Patente de Estados Unidos Nº 5.241.070. Tales ésteres arílicos de acridinio-9-carboxilato son indicadores quimioluminiscentes eficaces para el peróxido de hidrógeno producido en la oxidación de un analito por al menos una oxidasa en términos de intensidad de la señal y/o rapidez de la señal. El curso de la emisión quimioluminiscente del éster arílico de acridinio-9-carboxilato se completa rápidamente, es decir,en menos de 1 segundo, mientras que la emisión quimioluminiscente del acridinio-9-carboxamida se prolonga durante 2 segundos. Sin embargo, el éster arílico de acridinio-9-carboxilato pierde sus propiedades quimioluminiscentes en presencia de proteínas. Por lo tanto, su uso requiere la ausencia de proteínas durante la generación y detección de señales. Los métodos para separar o eliminar las proteínas de la muestra son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, pero no se limitan a, ultrafiltración, extracción, precipitación, diálisis, cromatografía y/o digestión (véase, por ejemplo, Wells, High Throughput Bioanalytical Sample Preparation. Methods and Automation Strategies, Elsevier (2003)). La cantidad de proteína eliminada o separada de la muestra de prueba puede ser de aproximadamente un 40%, aproximadamente un 45%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 55%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 65%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 75%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 85%, aproximadamente un 90% o aproximadamente un 95%. En la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 11/697.835, presentada el 9 de abril de 2007, se proporcionan detalles adicionales sobre el éster arílico de acridinio-9-carboxilato y su uso. Los ésteres arílicos de acridinio-9-carboxilato pueden disolverse en cualquier disolvente adecuado, como N,N-dimetilformamida (DMF) anhidra desgasificada o colato de sodio acuoso.
[0187] Tal como se usa en la presente "límite del blanco (LoB)", se refiere a la concentración aparente más alta del analito que se espera encontrar cuando se prueban réplicas de una muestra en blanco que no contiene analito.
[0189] Tal como se usa en la presente, "límite de detección (LoD)", se refiere a la concentración más baja de la magnitud a medir (es decir, una cantidad que se pretende medir) que puede detectarse con un nivel de confianza especificado. Típicamente, el nivel de confianza es del 95%, con una probabilidad del 5% de obtener una medición falsa negativa. El LoD es la concentración más baja de analito que es probable que se distinga de forma fiable del LoB y en la que la detección es factible. El LoD puede determinarse utilizando tanto el LoB medido como réplicas de prueba de una muestra que se sabe que contiene una baja concentración de analito. El término LoD usado en la presente se basa en la definición del protocolo EP17-A2 del Clinical and Laboratory Standards Institute (Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio) (CLSI) ("Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation; Approved Guideline - Segunda Edición", EP17A2E, por James F. Pierson-Perry et al., Clinical and Laboratory Standards Institute, 1 de junio de 2012).
[0191] Tal como se usa en la presente, "límite de cuantificación (LoQ)" se refiere a la concentración más baja a la que el analito no solo puede detectarse de manera fiable, sino en la que se cumplen algunos objetivos predefinidos de sesgo e imprecisión. El LoQ puede ser equivalente al LoD o puede estar a una concentración mucho más alta.
[0193] La "linealidad" se refiere al grado en el que el rendimiento real del método o ensayo en un intervalo operativo especificado se aproxima a una línea recta. La linealidad puede medirse en términos de desviación, o no linealidad, con respecto a una línea recta ideal. Las "desviaciones desde la linealidad" pueden expresarse en términos de porcentaje de la escala completa. En algunos de los métodos divulgados en la presente, a lo largo del intervalo dinámico del ensayo se consigue una desviación de la linealidad (DL) de menos del 10%. "Lineal" significa que hay una variación de menos de o igual a aproximadamente el 20%, aproximadamente el 19%, aproximadamente el 18%, aproximadamente el 17%, aproximadamente el 16%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 14%, aproximadamente el 13%, aproximadamente el 12%, aproximadamente el 11%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 9% o aproximadamente el 8% para o a lo largo de un intervalo o valor ejemplar mencionado.
[0195] "Secuencia de enlace" o "secuencia peptídica de enlace" se refiere a una secuencia polipeptídica natural o artificial que está conectada a una o más secuencias polipeptídicas de interés(por ejemplo, de longitud completa, fragmentos, etc.). El término "conectada" se refiere a la unión de la secuencia de enlace a la secuencia polipeptídica de interés. Tales secuencias polipeptídicas se unen preferiblemente mediante uno o más enlaces peptídicos. Las secuencias de enlace pueden tener una longitud de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 aminoácidos. Preferiblemente, la longitud de la secuencia de enlace es de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 aminoácidos. Las secuencias de enlace naturales pueden modificarse mediante sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos para crear secuencias de enlace artificiales. Las secuencias de enlace pueden usarse para muchos propósitos, incluyendo en Fabs recombinantes. Las secuencias de enlace ejemplares incluyen, pero no se limitan a: (i) Las etiquetas de histidina (His), como la etiqueta His 6X, que tiene una secuencia de aminoácidos de HHHHHH (SEQ ID NO:2), son útiles como secuencias de enlace para facilitar el aislamiento y la purificación de polipéptidos y anticuerpos de interés; (ii) Los sitios de escisión de la enteroquinasa, al igual que las etiquetas His, se usan en el aislamiento y la purificación de proteínas y anticuerpos de interés. A menudo, los sitios de escisión de la enteroquinasa se usan junto con las etiquetas His en el aislamiento y la purificación de proteínas y anticuerpos de interés. En la técnica se conocen varios sitios de escisión de enteroquinasas. Los ejemplos de sitios de escisión de enteroquinasas incluyen, pero no se limitan a, la secuencia de aminoácidos DDDDK (SEQ ID NO:3) y derivados de la misma (por ejemplo, ADDDDK (SEQ ID NO:4), etc.); (iii) para enlazar o conectar las regiones variables de la cadena ligera y/o pesada de fragmentos de región variable de cadena única pueden usarse secuencias diversas. Ejemplos de otras secuencias de enlace pueden encontrarse en Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); Huston et al., PNAS USA 85: 5879-5883 (1988); y McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990). Las secuencias de enlace también pueden modificarse para funciones adicionales, como la unión de fármacos o la unión a soportes sólidos. En el contexto de la presente divulgación, el anticuerpo monoclonal, por ejemplo, puede contener una secuencia de enlace, como una etiqueta His, un sitio de escisión de enteroquinasas o ambos.
[0197] [0111] Tal como se usa en la presente, "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir,los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, salvo por posibles mutaciones de origen natural que pueda haber en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, ya que se dirigen contra un único antígeno. Además, al contrario que las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. Los anticuerpos monoclonales de la presente incluyen específicamente los anticuerpos "quiméricos", en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenezcan a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten las propiedades biológicas deseadas.
[0198] Tal como se usan indistintamente en la presente, "imagenología por resonancia magnética" o "MRI" se refieren a una técnica de imagenología médica usada en radiología para formar imágenes de la anatomía y los procesos fisiológicos del cuerpo, tanto en estado de salud como de enfermedad. La MRI es una forma de imagenología médica que mide la respuesta de los núcleos atómicos de los tejidos corporales a las ondas de radio de alta frecuencia cuando se colocan en un campo magnético fuerte, y que produce imágenes de los órganos internos. Los escáneres de MRI, que se basan en la ciencia de la resonancia magnética nuclear (NMR), usan campos magnéticos fuertes, ondas de radio y gradientes de campo para generar imágenes del interior del cuerpo.
[0199] En la presente, el término "proteína de unión multivalente" se usa para referirse a una proteína de unión que comprende dos o más sitios de unión a antígenos (también denominados en la presente "dominios de unión a antígenos"). Una proteína de unión multivalente está manipulada preferiblemente para que tenga tres o más sitios de unión a antígenos y, por lo general, es un anticuerpo de origen no natural. El término "proteína de unión multiespecífica" se refiere a una proteína de unión que puede unirse a dos o más dianas relacionadas o no relacionadas, que incluyen una proteína de unión capaz de unirse a dos o más epítopos diferentes de la misma molécula diana.
[0200] Tal como se usan en la presente, los términos "punto de corte predeterminado" y "nivel predeterminado" se refieren a un valor de punto de corte del ensayo que se usa para evaluar los resultados de eficacia diagnóstica, pronóstica o terapéutica comparando los resultados del ensayo con el punto de corte/nivel predeterminado, donde el punto de corte/nivel predeterminado ya se ha vinculado o asociado con varios parámetros clínicos (por ejemplo, presencia de enfermedad, estadio de la enfermedad, gravedad de la enfermedad, progresión, no progresión o mejora de la enfermedad, etc.). La divulgación proporciona niveles predeterminados ejemplares. Sin embargo, es bien sabido que los valores de punto de corte pueden variar dependiendo de la naturaleza del inmunoensayo (por ejemplo, los anticuerpos empleados, las condiciones de reacción, la pureza de la muestra, etc.). Además, está dentro de las capacidades de un experto en la materia adaptar la presente divulgación a otros inmunoensayos para obtener valores de punto de corte específicos para esos otros inmunoensayos basándose en la descripción proporcionada por la presente divulgación. Aunque entre los distintos ensayos puede variar el valor preciso del punto de corte/nivel predeterminado, deberían ser generalmente aplicables las correlaciones descritas en la presente.
[0201] "Dispositivo de punto de atención" se refiere a un dispositivo usado para realizar pruebas de diagnóstico médico en o cerca del punto de atención (es decir, fuera de un laboratorio), en el momento y lugar de la atención al paciente (como en un hospital, consultorio médico, centro de urgencias u otro centro de atención médica, domicilio del paciente, residencia de ancianos y/o centro de cuidados a largo plazo y/o centro de cuidados paliativos). Los ejemplos de dispositivos para puntos de atención incluyen los producidos por Abbott Laboratories (Abbott Park, Illinois) (por ejemplo, i-STAT e i-STAT Alinity), Universal Biosensors (Rowville, Australia) (véase el documento US 2006/0134713), Axis-Shield PoC AS (Oslo, Noruega) y Clinical Lab Products (Los Ángeles, EE. UU.).
[0202] En el contexto de los inmunoensayos y kits descritos en la presente "reactivos de control de calidad" incluyen, pero no se limitan a, calibradores, controles y paneles de sensibilidad. Típicamente para establecer curvas de calibración (estándar) para la interpolación de la concentración de un analito, como un anticuerpo o un analito, se usa un "calibrador" o "estándar" (por ejemplo, uno o más, como una pluralidad). Alternativamente, puede usarse un único calibrador, que esté cerca de un punto de corte, un nivel de referencia o un nivel de control positivo/negativo predeterminado (por ejemplo, niveles "bajo", "medio" o "alto"). Para formar un "panel de sensibilidad" pueden usarse múltiples calibradores (es decir, más de un calibrador o una cantidad variable de calibradores) en conjunto.
[0203] Una curva de "características operativas del receptor" o curva "ROC" se refiere a un diagrama gráfico que ilustra el rendimiento de un sistema clasificador binario a medida que varía su umbral de discriminación. Por ejemplo, una curva ROC puede ser un diagrama de la tasa de verdaderos positivos frente a la tasa de falsos positivos para los diferentes puntos de corte posibles de una prueba diagnóstica. Se crea trazando la fracción de verdaderos positivos de los positivos (TPR = tasa de verdaderos positivos) frente a la fracción de falsos positivos de los negativos (FPR = tasa de falsos positivos), con varios ajustes de umbral. La TPR también se conoce como sensibilidad, y la FPR es uno menos la especificidad o tasa de verdaderos negativos. La curva ROC muestra el intercambio entre sensibilidad y especificidad (cualquier aumento de la sensibilidad irá acompañado de una disminución de la especificidad); cuanto más se acerque la curva al borde izquierdo y a continuación al borde superior del espacio de la ROC, más precisa será la prueba; cuanto más se acerque la curva a la diagonal de 45 grados del espacio de la ROC, menos precisa será la prueba; la pendiente de la línea tangente en un punto de corte proporciona la razón de verosimilitud (LR) para ese valor de la prueba; y el área bajo la curva es una medida de la precisión de la prueba.
[0204] [0118] "Anticuerpo recombinante" y "anticuerpos recombinantes" se refieren a anticuerpos preparados mediante uno o más pasos, que incluyen la clonación de secuencias de ácido nucleico que codifican la totalidad o parte de uno o más anticuerpos monoclonales en un vector de expresión adecuado mediante técnicas recombinantes y la posterior expresión del anticuerpo en una célula huésped adecuada. Los términos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales producidos recombinantemente, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados (total o parcialmente humanizados), estructuras multiespecíficas o multivalentes formadas a partir de fragmentos de anticuerpos, anticuerpos bifuncionales, anticuerpos heteroconjugados, los DVD-Ig® y otros anticuerpos descritos en (i) la presente. (Las inmunoglobulinas de dominio variable dual y los métodos para elaborrlas se describen en Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25:1290-1297 (2007)). El término "anticuerpo bifuncional", tal como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo que comprende un primer brazo que tiene especificidad para un sitio antigénico y un segundo brazo que tiene especificidad para un sitio antigénico diferente, es decir, los anticuerpos bifuncionales tienen una especificidad dual.
[0205] Tal como se usa en la presente, "nivel de referencia" se refiere a un valor de corte de ensayo que se usa para evaluar la eficacia diagnóstica, pronóstica o terapéutica y que se ha vinculado o se asocia en la presente con varios parámetros clínicos (por ejemplo, presencia de enfermedad, estadio de la enfermedad, gravedad de la enfermedad, progresión, no progresión o mejora de la enfermedad, etc.). La presente divulgación proporciona niveles de referencia ejemplares. Sin embargo, es bien sabido que los niveles de referencia pueden variar dependiendo de la naturaleza del inmunoensayo (por ejemplo, los anticuerpos empleados, las condiciones de reacción, la pureza de la muestra, etc.) y que los ensayos pueden compararse y estandarizarse. Además, está dentro de la capacidad de los expertos en la materia adaptar la presente divulgación a otros inmunoensayos para obtener niveles de referencia específicos del inmunoensayo para esos otros inmunoensayos basándose en la descripción proporcionada por la presente divulgación. Aunque el valor preciso del nivel de referencia puede variar entre los ensayos, los resultados descritos en la presente deben ser generalmente aplicables y extrapolables a otros ensayos.
[0206] Tal como se usan en la presente, "evaluación del riesgo", "clasificación del riesgo", "identificación del riesgo" o "estratificación del riesgo" de sujetos (por ejemplo, de pacientes) se refieren a la evaluación de factores, incluyendo biomarcadores, para predecir el riesgo de que se produzcan eventos futuros, incluyendo la aparición o la progresión de una enfermedad, de modo que puedan tomarse con mayor conocimiento de causa las decisiones sobre el tratamiento del sujeto.
[0207] Tal como se usan en la presente, "muestra", "muestra de prueba", "espécimen", "muestra de un sujeto" y "muestra de paciente", pueden usarse indistintamente y pueden ser una muestra de sangre, como sangre completa, tejido, orina, suero, plasma, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo, células o tejido placentario, células endoteliales, leucocitos o monocitos. La muestra puede usarse directamente tal como se obtiene del paciente o puede someterse a un tratamiento previo, como filtración, destilación, extracción, concentración, centrifugación, inactivación de componentes interferentes, adición de reactivos y similares, para modificar la naturaleza de la muestra de alguna manera, tal como se describe en la presente o de otro modo como se conoce en la técnica.
[0208] Para obtener una muestra pueden utilizarse una variedad de tipos de células, tejidos o fluidos corporales. Dichos tipos de células, tejidos y fluidos pueden incluir secciones de tejidos, como muestras de biopsias y autopsias, secciones congeladas tomadas con propósitos histológicos, sangre (como sangre completa), plasma, suero, glóbulos rojos, plaquetas, líquido intersticial, líquido cefalorraquídeo, etc. Los tipos de células y tejidos también pueden incluir líquido linfático, líquido cefalorraquídeo, un líquido recogido por un tipo de tejido o célula puede obtenerse extrayendo una muestra de células de un humano o de un animal no humano, pero también puede obtenerse usando células aisladas previamente (por ejemplo, aisladas por otra persona, en otro momento y/o para otro propósito). También pueden usarse tejidos archivados, como los que tienen un historial de tratamiento o resultados. Puede que no sea necesario aislar y/o purificar proteínas o nucleótidos.
[0209] Tal como se usa en la presente, la "sensibilidad" de un ensayo se refiere a la proporción de sujetos para los que el resultado es positivo y que se identifican correctamente como positivos.
[0210] Tal como se usa en la presente, la "especificidad" de un ensayo se refiere a la proporción de sujetos cuyo resultado es negativo y que se identifican correctamente como negativos.
[0211] "Serie de composiciones de calibración" se refiere a una pluralidad de composiciones que comprenden una concentración conocida de GFAP, en las que cada una de las composiciones difiere de las demás composiciones de la serie en la concentración de GFAP.
[0212] [0126] Tal como se usan indistintamente en la presente, "fase sólida" o "soporte sólido", se refieren a cualquier material que pueda usarse para unir y/o atraer e inmovilizar (1) uno o más agentes de captura o compañeros de unión específicos de captura, o (2) uno o más agentes de detección o compañeros de unión específicos de detección. La fase sólida puede elegirse por su capacidad intrínseca para atraer e inmovilizar un agente de captura. Alternativamente, la fase sólida puede tener fijado a la misma un agente de enlace que tenga la capacidad de atraer e inmovilizar (1) el agente de captura o el compañero de unión específico de captura, o (2) el agente de detección o el compañero de unión específico de detección. Por ejemplo, el agente de enlace puede incluir una sustancia cargada que tenga una carga opuesta con respecto al agente de captura (por ejemplo, un compañero de unión específico de captura) o al propio agente de detección (por ejemplo, un compañero de unión específico de detección) o a una sustancia cargada conjugada con (1) el agente de captura o el compañero de unión específico de captura o (2) el agente de detección o el compañero de unión específico de detección. En general, el agente de enlace puede ser cualquier compañero de unión (preferiblemente específico) que esté inmovilizado (unido) en la fase sólida y que tenga la capacidad de inmovilizar (1) el agente de captura o el compañero de unión específico de captura, o (2) el agente de detección o el compañero de unión específico de detección a través de una reacción de unión. El agente de enlace permite la unión indirecta del agente de captura a un material de fase sólida antes de la realización del ensayo o durante la realización del mismo. Por ejemplo, la fase sólida puede ser plástico, plástico derivado, metal magnético o no magnético, vidrio o silicio, incluyendo, por ejemplo, un tubo de ensayo, un pocillo de microtitulación, una lámina, una perla, una micropartícula, un chip y otras configuraciones conocidas por los expertos en la materia.
[0214] Tal como se usan en la presente, "unión específica" o "se une específicamente" pueden referirse a la interacción de un anticuerpo, una proteína o un péptido con una segunda especie química, en la que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante o epítopo antigénico) en la especie química; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura proteica específica en lugar de a las proteínas en general. Si un anticuerpo es específico para el epítopo "A", la presencia de una molécula que contenga el epítopo A (o A libre, sin marcar), en una reacción que contenga "A" marcado y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A marcado unido al anticuerpo.
[0216] "Compañero de unión específico" es un miembro de un par de unión específico. Un par de unión específico comprende dos moléculas diferentes, que se unen específicamente entre sí por medios químicos o físicos. Por lo tanto, además de los pares de unión específicos de antígenos y anticuerpos de los inmunoensayos comunes, otros pares de unión específicos pueden incluir biotina y avidina (o estreptavidina), carbohidratos y lectinas, secuencias de nucleótidos complementarias, moléculas efectoras y receptoras, cofactores y enzimas, enzimas e inhibidores enzimáticos, y similares. Además, los pares de unión específicos pueden incluir miembros que sean análogos de los miembros de unión específicos originales, por ejemplo, un análogo del analito. Los miembros de unión específicos inmunorreactivos incluyen antígenos, fragmentos de antígenos y anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y policlonales, así como complejos y fragmentos de los mismos, ya sean aislados o producidos recombinantemente.
[0218] Tal como se usan en la presente, "sujeto" y "paciente" se refieren indistintamente a cualquier vertebrado, que incluyen, pero no se limitan a, los mamíferos (por ejemplo, vacas, cerdos, camellos, llamas, caballos, cabras, conejos, ovejas, hámsteres, cobayas, gatos, perros, ratas y ratones, primates no humanos (por ejemplo, un mono, como un mono cynomolgous o rhesus, un chimpancé, etc.) y un humano). En algunas realizaciones, el sujeto puede ser humano o no humano. El sujeto o paciente se puede estar sometiendo a otras formas de tratamiento. En algunas realizaciones, cuando el sujeto es humano, el sujeto no incluye a ningún humano que haya sufrido un accidente cerebrovascular (por ejemplo, un derrame cerebral). En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto ha sufrido una lesión en la cabeza. En algunas realizaciones, se sabe que el sujeto ha sufrido una lesión en la cabeza. En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto padece un TCE leve, moderado o grave. En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto padece un TCE leve. En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto padece un TCE moderado. En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto padece un TCE grave.
[0220] En la presente, "tratar", "que trata" o "tratamiento" se usan indistintamente para describir la reversión, el alivio o la inhibición del progreso de una enfermedad y/o lesión, o uno o más síntomas de dicha enfermedad, a la que se aplica dicho término. Dependiendo de la condición del sujeto, el término también se refiere a la prevención de una enfermedad e incluye la prevención de la aparición de una enfermedad o la prevención de los síntomas asociados a una enfermedad. Un tratamiento puede realizarse de manera aguda o crónica. El término también se refiere a reducir la gravedad de una enfermedad o los síntomas asociados a dicha enfermedad antes de padecer la enfermedad. Dicha prevención o reducción de la gravedad de una enfermedad antes de padecerla se refiere a la administración de una composición farmacéutica a un sujeto que, en el momento de la administración, no padece la enfermedad. "Prevenir" también se refiere a prevenir la recurrencia de una enfermedad o de uno o más síntomas asociados a dicha enfermedad. "Tratamiento" y "terapéuticamente" se refieren al acto de tratar, tal como se ha definido "tratar" con anterioridad.
[0222] Tal como se usa en la presente, el término "detección de moléculas individuales" se refiere a la detección y/o medición de una única molécula de un analito en una muestra de prueba a niveles de concentración muy bajos (como niveles de pg/ml o femtogramos/ml). En la técnica se conocen una serie de analizadores o dispositivos de moléculas individuales diferentes que incluyen los dispositivos de nanoporos y nanopocillos. En la Publicación de Patente Internacional Nº WO 2016/161402 se describen ejemplos de dispositivos de nanoporos. En la Publicación de Patente Internacional Nº WO 2016/161400 se describen ejemplos de dispositivos de nanopocillos.
[0224] [0132] Tal como se usan indistintamente en la presente, "traumatismo craneoencefálico" o "TCE" se refieren a una lesión compleja con un amplio espectro de síntomas y discapacidades. Con mayor frecuencia el TCE es un evento agudo similar a otras lesiones. El TCE puede clasificarse como "leve", "moderado" o "grave". Las causas del TCE son diversas e incluyen, por ejemplo, sacudidas físicas por parte de una persona, un accidente de tráfico, lesiones por armas de fuego, accidentes vasculares cerebrales (por ejemplo, accidentes cerebrovasculares), caídas, explosiones o estallidos u otros tipos de traumatismos por fuerza contundente. Otras causas del TCE incluyen la ingestión y/o exposición a una o más sustancias químicas o toxinas (como incendios, mohos, amianto, pesticidas e insecticidas, disolventes orgánicos, pinturas, pegamentos, gases (como monóxido de carbono, sulfuro de hidrógeno y cianuro), metales orgánicos (como metilmercurio, tetraetilo de plomo y estaño orgánico), una o más drogas de abuso o combinaciones de las mismas). Alternativamente, el TCE puede producirse en sujetos que padecen una enfermedad autoinmune, un trastorno metabólico, un tumor cerebral, hipoxia, uno o más virus, meningitis, hidrocefalia o combinaciones de los mismos. Los adultos jóvenes y los ancianos son los grupos de edad con mayor riesgo de sufrir un TCE. En ciertas realizaciones de la presente, el traumatismo craneoencefálico o TCE no incluye y excluye específicamente los accidentes vasculares cerebrales, como los accidentes cerebrovasculares.
[0226] Tal como se usa en la presente, "TCE leve" se refiere a una lesión cerebral en la que la pérdida de conciencia es breve y habitualmente de unos pocos segundos o minutos, y/o la confusión y la desorientación duran menos de una hora. El TCE leve también se conoce como conmoción cerebral, traumatismo craneal leve, TCE menor, lesión cerebral leve y lesión craneal leve. Aunque las resonancias magnéticas y las tomografías computarizadas a menudo son normales, los individuos con TCE leve pueden tener problemas cognitivos como dolor de cabeza, dificultad para pensar, problemas de memoria, déficit de atención, cambios de humor y frustración.
[0228] El TCE leve es el TCE más frecuente y a menudo pasa desapercibido en el momento de la lesión inicial. Típicamente, un sujeto tiene una puntuación en la escala de coma de Glasgow de entre 13 y 15 (por ejemplo, de 13 a 15 o de 14 a 15). El quince por ciento (15%) de las personas con TCE leve presentan síntomas que duran tres meses o más. El TCE leve se define como el resultado de un movimiento brusco de la cabeza o un impacto que provoca un cambio breve en el estado mental (confusión, desorientación o pérdida de memoria) o una pérdida de conciencia de menos de 30 minutos. Los síntomas comunes del TCE leve incluyen fatiga, dolores de cabeza, alteraciones visuales, pérdida de memoria, falta de atención/concentración, alteraciones del sueño, mareos/pérdida de equilibrio, irritabilidad/alteraciones emocionales, sentimientos de depresión y convulsiones. Otros síntomas asociados con el TCE leve incluyen náuseas, pérdida del olfato, sensibilidad a la luz y los sonidos, cambios de humor, desorientación o confusión y/o lentitud en el pensamiento.
[0230] Tal como se usa en la presente, "TCE moderado" se refiere a una lesión cerebral en la que la pérdida de conciencia y/o la confusión y la desorientación duran entre 1 y 24 horas y el sujeto tiene una puntuación en la escala de coma de Glasgow de entre 9 y 12. Los individuos con TCE moderado presentan resultados anormales en las imágenes cerebrales. Tal como se usa en la presente, "TCE grave" se refiere a una lesión cerebral en la que la pérdida de conciencia es de más de 24 horas y la pérdida de memoria después de la lesión o la lesión craneal penetrante es de más de 24 horas, y el sujeto tiene una puntuación en la escala de coma de Glasgow de entre 3 y 8. Los déficits varían desde el deterioro de las funciones cognitivas de nivel más alto hasta estados comatosos. Los supervivientes pueden presentar una función limitada de los brazos o las piernas, habla o lenguaje anómalo, pérdida de la capacidad de pensar o problemas emocionales. Los individuos con lesiones graves pueden quedar en estado de inconsciencia prolongada. Muchas personas con TCE grave necesitan a menudo una rehabilitación a largo plazo para maximizar su función y su independencia.
[0232] Los síntomas comunes de los TCE moderados a graves incluyen déficits cognitivos, que incluyen dificultades de atención, concentración, distracción, memoria, velocidad de procesamiento, confusión, perseverancia, impulsividad, procesamiento del lenguaje y/o "funciones ejecutivas", incomprensión del lenguaje hablado (afasia receptiva), dificultad para hablar y ser comprendido (afasia expresiva), habla arrastrada, hablar muy rápido o muy lento, problemas para leer, problemas para escribir, dificultades para interpretar el tacto, la temperatura, el movimiento, la posición de las extremidades y la discriminación fina, la integración o el patrón de las impresiones sensoriales en datos psicológicamente significativos, pérdida parcial o total de la visión, debilidad de los músculos oculares y visión doble (diplopía), visión borrosa, problemas para juzgar la distancia, movimientos oculares involuntarios (nistagmo), intolerancia a la luz (fotofobia), audición, como disminución o pérdida de la audición, zumbido en los oídos (tinnitus), aumento de la sensibilidad a los sonidos, pérdida o disminución del sentido del olfato (anosmia), pérdida o disminución del sentido del gusto, convulsiones asociadas a la epilepsia, que pueden ser de varios tipos y pueden implicar alteraciones de la conciencia, la percepción sensorial o los movimientos motores, el control de los intestinos y la vejiga, trastornos del sueño, pérdida de resistencia, cambios en el apetito, regulación de la temperatura corporal, dificultades menstruales, comportamientos dependientes, capacidad emocional, falta de motivación, irritabilidad, agresividad, depresión, desinhibición o negación/falta de conciencia.
[0234] [0137] En la presente, "variante" se usa para describir un péptido o polipéptido que difiere en la secuencia de aminoácidos por la inserción, deleción o sustitución conservadora de aminoácidos, pero que conserva por lo menos una actividad biológica. Los ejemplos representativos de "actividad biológica" incluyen la capacidad de unirse a un anticuerpo específico o de promover una respuesta inmunitaria. En la presente, "variante" también se usa para describir una proteína con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una proteína de referencia con una secuencia de aminoácidos que conserva por lo menos una actividad biológica. En la técnica se reconoce que una sustitución conservadora de un aminoácido, es decir, la sustitución de un aminoácido por otro diferente con propiedades similares (por ejemplo, hidrofilia, grado y distribución de las regiones cargadas), implica un cambio típicamente menor. Estos cambios menores pueden identificarse, en parte, considerando el índice hidrofóbico de los aminoácidos, tal como se entiende en la técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol.157:105-132 (1982). El índice hidropático de un aminoácido se basa en la consideración de su hidrofobia y carga. En la técnica se sabe que los aminoácidos que tienen índices hidropáticos similares pueden sustituirse y seguir conservando la función de la proteína. En un aspecto, se sustituyen aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ±2. La hidrofilia de los aminoácidos también se puede utilizar para revelar sustituciones que darían lugar a proteínas que conservan la función biológica. La consideración de la hidrofilia de los aminoácidos en el contexto de un péptido permite calcular la mayor hidrofilia media local de ese péptido, una medida útil que, según se ha informado, se correlaciona bien con la antigenicidad y la inmunogenicidad. La Patente de Estados Unidos Nº 4.554.101. La sustitución de aminoácidos con valores de hidrofilia similares puede dar como resultado péptidos que conservan la actividad biológica, por ejemplo, la inmunogenicidad, como se entiende en la técnica. Las sustituciones pueden realizarse con aminoácidos que tengan valores de hidrofilia dentro de ±2 entre sí. Tanto el índice de hidrofobia como el valor de hidrofilia de los aminoácidos están influenciados por la cadena lateral particular de ese aminoácido. En consonancia con esa observación, se entiende que las sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos, y en particular de las cadenas laterales de esos aminoácidos, tal como revelan la hidrofobia, la hidrofilia, la carga, el tamaño y otras propiedades. El término "variante" también puede usarse para referirse a un fragmento antigénicamente reactivo de un anticuerpo anti-GFAP que difiere del fragmento correspondiente del anticuerpo anti-GFAP en la secuencia de aminoácidos, pero que sigue siendo antigénicamente reactivo y puede competir con el fragmento correspondiente del anticuerpo anti-GFAP para unirse a la GFAP. "Variante" también puede usarse para describir un polipéptido o un fragmento del mismo que ha sido procesado de manera diferencial, por ejemplo, mediante proteólisis, fosforilación u otra modificación postraduccional, pero que conserva su reactividad antigénica.
[0236] En la presente, "vector" se usa para describir una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN circular de cadena doble en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales al genoma viral. Ciertos vectores pueden replicarse de manera autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomales) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped después de su introducción en la célula huésped, y por lo tanto se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están enlazados operativamente. Tales vectores se denominan en la presente "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante se encuentran en la forma de plásmidos. Los términos "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente, ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, pueden usarse otras formas de vectores de expresión, como los vectores virales (por ejemplo, retrovirus con defecto de replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que cumplen funciones equivalentes. A este respecto, también pueden encontrar uso en el contexto de la presente divulgación las versiones de ARN de los vectores (incluyendo los vectores virales de ARN).
[0238] A menos que se defina de otro modo en la presente, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente divulgación tendrán los significados que son comúnmente entendidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, cualquier nomenclatura usada en relación con, y las técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas en la presente son aquellas que son bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. El significado y el alcance de los términos deben ser claros; sin embargo, en caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones proporcionadas en la presente prevalecerán sobre cualquier definición de diccionario o extrínseca. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán el plural y los términos en plural incluirán el singular.
[0240] 2. Métodos basados en el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP)
[0242] La presente divulgación describe métodos para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) usando un inmunoensayo mejorado para ayudar rápidamente en el diagnóstico de un traumatismo craneoencefálico (TCE), monitorizar la progresión y predecir el resultado en sujetos que lo necesiten (incluyendo aquellos sujetos que reciben tratamiento para el TCE, así como aquellos sujetos que no reciben tratamiento para el TCE). El método se define en las reivindicaciones adjuntas. El método se lleva a cabo usando un primer miembro de unión específico y un segundo miembro de unión específico que se unen cada uno específicamente a la GFAP y forman primeros complejos que incluyen el primer miembro de unión específico-GFAP-segundo miembro de unión específico. El segundo miembro de unión específico está marcado con un marcador detectable. En algunas realizaciones, el inmunoensayo se realiza en un dispositivo de punto de atención. Un ejemplo de dispositivo de punto de atención que puede usarse es el i-STAT® (Abbott, Laboratories, Abbott Park, IL).
[0244] [0141] El inmunoensayo mejorado puede usarse para determinar la GFAP tanto a niveles bajos como a niveles más altos de GFAP, lo que proporciona un medio para determinar la cantidad de GFAP en una muestra a lo largo de un intervalo ampliado o más amplio de concentraciones sin necesidad de diluir o concentrar la muestra biológica. El inmunoensayo proporciona un ensayo más versátil y sensible para evaluar las traumatismos craneoencefálicos. El inmunoensayo divulgado proporciona una detección en suero sensible de GFAP en suero y un ensayo estandarizado que puede usarse para evaluar el TCE, como los TCE leves. El inmunoensayo permite medir hasta 50.000 pg/ml de GFAP en una muestra biológica y no requiere la dilución de la muestra biológica. El inmunoensayo también permite medir menos de o igual a 50.000 pg/ml de GFAP en una muestra biológica y no requiere la dilución de la muestra biológica. El inmunoensayo se realiza en de 5 a 20 minutos. El inmunoensayo tiene un intervalo dinámico de 5 log y mantiene la linealidad del ensayo a lo largo del intervalo dinámico. En otras realizaciones más, los niveles bajos y altos de GFAP que pueden evaluarse en una muestra biológica se encuentran dentro del intervalo dinámico del ensayo sin necesidad de diluir o concentrar la muestra biológica. En otras realizaciones más, el inmunoensayo es capaz de medir una cantidad de GFAP de menos de o igual a 5 pg/ml en un volumen de menos de 20 microlitros de muestra de prueba. En otras realizaciones, el inmunoensayo: (1) es capaz de medir una cantidad de GFAP que sea de menos de o igual a 50.000 pg/ml en un volumen de menos de 20 microlitros de muestra de prueba; (2) tiene un intervalo dinámico de 5 log; y (3) es lineal a lo largo de dicho intervalo dinámico.
[0246] El intervalo aumentado de concentraciones de GFAP que pueden medirse con el inmunoensayo divulgado proporciona un ensayo más preciso y sensible para ayudar en el diagnóstico y a distinguir traumatismos craneoencefálicos en un paciente. Por tanto, el inmunoensayo divulgado puede usarse para medir o evaluar las concentraciones de GFAP aumentadas o disminuidas a niveles bajos de GFAP en una muestra no diluida en comparación con una muestra de control o calibradora y, por tanto, usarse para identificar un TCE en un paciente. El uso del inmunoensayo de GFAP puede proporcionar una ayuda precisa en el diagnóstico y el tratamiento posterior de pacientes con traumatismo craneoencefálico. Además, el inmunoensayo divulgado proporciona una ventana ampliada de detección.
[0248] En algunas realizaciones, los intervalos a lo largo de los cuales puede determinarse la GFAP tienen por lo menos aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 25%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 75%, aproximadamente un 100%, aproximadamente un 110%, aproximadamente un 120%, aproximadamente un 130%, aproximadamente un 140%, aproximadamente un 150%, aproximadamente un 160%, aproximadamente un 170%, aproximadamente un 180%, aproximadamente un 190%, aproximadamente un 200%, aproximadamente un 210%, aproximadamente un 220%, aproximadamente un 230%, aproximadamente un 240%, aproximadamente un 250%, aproximadamente un 260%, aproximadamente un 270%, aproximadamente un 280%, aproximadamente un 290%, aproximadamente un 300%, aproximadamente un 400% o aproximadamente un 500% de mejora en el intervalo en comparación con otros inmunoensayos GFAP disponibles en el mercado.
[0250] [0144] En algunas realizaciones, pueden determinarse, medirse o evaluarse intervalos de aproximadamente 0 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 0,0001 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 0,001 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 2,0 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 3,0 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 4,0 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 5,0 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 6,0 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 7,0 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 8,0 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 9,0 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 110 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 120 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 130 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 140 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 0,0001 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 0,001 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 2,0 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 3,0 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 4,0 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 5,0 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 6,0 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 7,0 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 8,0 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 9,0 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 110 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 120 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 130 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 140 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 140.000 pg/ml, de aproximadamente 0,0001 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 0,001 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 2,0 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 3,0 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 4,0 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 5,0 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 6,0 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 7,0 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 8,0 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 9,0 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 110 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 120 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 130 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 140 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 130.000 pg/ml, de aproximadamente 0,0001 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 0,001 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 2,0 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 3,0 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 4,0 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 5,0 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 6,0 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 7,0 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 8,0 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 9,0 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 110 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 120 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 130 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 140 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 125.000 pg/ml, de aproximadamente 0,0001 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 0,001 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 2,0 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 3,0 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 4,0 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 5,0 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 6,0 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 7,0 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 8,0 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 9,0 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 110 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 120 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 130 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 140 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 120.000 pg/ml, de aproximadamente 0,0001 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 0,001 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 2,0 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 3,0 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 4,0 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 5,0 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 6,0 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 7,0 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 8,0 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 9,0 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 110 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 120 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 130 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 140 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 110.000 pg/ml, de aproximadamente 0,0001 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 0,001 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 2,0 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 3,0 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 4,0 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 5,0 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 6,0 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 7,0 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 8,0 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 9,0 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 110 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 120 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 130 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 140 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 100.000 pg/ml, de aproximadamente 0,0001 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 0,001 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 2,0 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 3,0 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 4,0 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 5,0 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 6,0 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 7,0 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 8,0 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 9,0 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 110 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 120 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 130 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 140 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 90.000 pg/ml, de aproximadamente 0,0001 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 0,001 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 2,0 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 3,0 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 4,0 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 5,0 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 6,0 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 7,0 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 8,0 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 9,0 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 110 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 120 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 130 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 140 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 80.000 pg/ml, de aproximadamente 0,0001 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 0,001 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 2,0 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 3,0 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 4,0 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 5,0 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 6,0 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 7,0 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 8,0 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 9,0 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 110 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 120 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 130 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 140 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 75.000 pg/ml, de aproximadamente 0,0001 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 0,001 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 2,0 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 3,0 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 4,0 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 5,0 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 6,0 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 7,0 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 8,0 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 9,0 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 110 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 120 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 130 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 140 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 70.000 pg/ml, de aproximadamente 0,0001 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 0,001 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 2,0 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 3,0 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 4,0 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 5,0 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 6,0 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 7,0 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 8,0 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 9,0 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 110 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 120 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 130 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 140 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 60.000 pg/ml, de aproximadamente 0,0001 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 0,001 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 0,5 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 2,0 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 3,0 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 4,0 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 5,0 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 6,0 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 7,0 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 8,0 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 9,0 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 110 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 120 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 130 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 140 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, o de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml of GFAP
[0251] En algunas realizaciones, puede determinarse, medirse o evaluarse un intervalo seleccionado de aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, y de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml de GFAP.
[0252] En algunas realizaciones, puede determinarse, medirse o evaluarse un intervalo de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml.
[0253] En algunas realizaciones, puede determinarse, medirse o evaluarse un intervalo de aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml.
[0254] En algunas realizaciones, puede determinarse, medirse o evaluarse un intervalo de aproximadamente 12 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml.
[0255] En algunas realizaciones, puede determinarse, medirse o evaluarse un intervalo de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml.
[0256] Algunos instrumentos (como, por ejemplo, el instrumento ARCHITECT® de Abbott Laboratories y otros instrumentos de laboratorio básicos) distintos de los dispositivos para puntos de atención pueden ser capaces de medir niveles de GFAP en una muestra biológica más altos o mayores que 50.000 pg/ml. El uso de los métodos descritos en la presente puede proporcionar una o más de las ventajas descritas en la presente en dichos dispositivos (por ejemplo, medición de hasta 50.000 pg/ml, intervalo dinámico de 5 log, linealidad del ensayo a lo largo del intervalo dinámico, medición de GFAP en un volumen de menos de 20 microlitros de muestra, ventana de detección ampliada, etc.).
[0257] Otros métodos de detección incluyen el uso o pueden adaptarse para su uso en un dispositivo de nanoporos o un dispositivo de nanopocillos, por ejemplo, para la detección de moléculas individuales. Ejemplos de dispositivos de nanoporos se describen en la Publicación de Patente Internacional Nº WO2016/161402. Ejemplos de dispositivos de nanopocillos se describen en la Publicación de Patente Internacional Nº WO 2016/161400. También pueden emplearse otros dispositivos y métodos adecuados para la detección de moléculas individuales.
[0258] a. Métodos de evaluación del estado de la GFAP como medida del traumatismo craneoencefálico
[0259] [0152] En una realización, los métodos descritos en la presente pueden usarse para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de un sujeto como medida de un traumatismo craneoencefálico. El método incluye los pasos de: a) poner en contacto una muestra biológica con un primer miembro de unión específico y un segundo miembro de unión específico, en el que el primer miembro de unión específico y el segundo miembro de unión específico se unen cada uno específicamente a la GFAP, produciendo de este modo uno o más primeros complejos que comprenden el primer miembro de unión específico-GFAP-segundo miembro de unión específico, en el que el segundo miembro de unión específico comprende un marcador detectable; y b) evaluar una señal procedente de uno o más de los primeros complejos, en los que la presencia de una señal detectable procedente del marcador detectable indica que en la muestra hay GFAP y la cantidad de señal detectable procedente del marcador detectable indica la cantidad de GFAP que hay en la muestra, de tal manera que la presencia y/o la cantidad de señal detectable procedente del marcador detectable pueden emplearse para evaluar el estado de GFAP del sujeto como medida de traumatismo craneoencefálico. El método (i) puede usarse para determinar niveles de hasta 50.000 pg/ml de GFAP, (ii) no requiere la dilución de la muestra biológica y (iii) se realiza usando un dispositivo de punto de atención. Un ejemplo de dispositivo de punto de atención que puede usarse es el i-STAT® (Abbott, Laboratories, Abbott Park, IL).
[0261] En una realización, los métodos descritos en la presente pueden usarse para evaluar el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de un sujeto como medida de traumatismo craneoencefálico en una muestra biológica obtenida de un sujeto humano. Dicho sujeto puede haber sufrido una lesión en la cabeza o se sabe que ha sufrido una lesión en la cabeza. El método comprende los pasos de: (a) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un sujeto humano, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, con: (1) un anticuerpo de captura que está inmovilizado en un soporte sólido y que se une a un epítopo de la GFAP humana para formar un complejo anticuerpo de captura-antígeno de GFAP, y (2) un anticuerpo de detección que incluye un marcador detectable y que se une a un epítopo en GFAP humano al que no se une el anticuerpo de captura, para formar un complejo de anticuerpo de detección-antígeno de GFAP, de tal manera que se forma un complejo de anticuerpo de capturaantígeno de GFAP-anticuerpo de detección, en el que el anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección son anticuerpos monoclonales, (b) determinar el nivel de GFAP en la muestra biológica sobre la base de la señal generada por el marcador detectable en el complejo anticuerpo de captura-antígeno de GFAP-anticuerpo de detección. El método es capaz de cuantificar el nivel de GFAP dentro de un intervalo dinámico de 5 pg/ml a 50.000 pg/ml con una precisión de menos del 10% de CV y con una desviación desde la linealidad (DL) de menos del 10% lograda a lo largo del intervalo dinámico.
[0263] En una realización, los métodos descritos en la presente pueden usarse para medir el estado de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) como medida de un traumatismo craneoencefálico en un sujeto que puede haber sufrido una lesión en la cabeza o que se sabe que ha sufrido una lesión en la cabeza. El método comprende los pasos de: a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden, con un primer miembro de unión específico y un segundo miembro de unión específico, en el que el primer miembro de unión específico y el segundo miembro de unión específico se unen cada uno específicamente a la GFAP, produciendo de este modo uno o más primeros complejos que comprenden el primer miembro de unión específico-GFAP-segundo miembro de unión específico, en el que el segundo miembro de unión específico comprende un marcador detectable, en el que el primer miembro de unión específico está inmovilizado en un soporte sólido; b) detectar una señal procedente de uno o más de los primeros complejos, en los que la presencia de una señal detectable procedente del marcador detectable indica que en la muestra hay GFAP, y c) medir la cantidad de señal detectable procedente del marcador detectable indica la cantidad de GFAP que hay en la muestra, de tal manera que la cantidad de señal detectable procedente del marcador detectable puede emplearse para evaluar el estado de GFAP de dicho sujeto como medida de traumatismo craneoencefálico. Dicho ensayo es capaz de determinar el nivel de GFAP dentro de un intervalo dinámico de 20 pg/ml a 50.000 pg/ml con una precisión de menos del 10% de CV y con una desviación desde la linealidad (DL) de menos del 10% lograda a lo largo del intervalo dinámico en un volumen de menos de 20 microlitros de muestra de prueba.
[0265] [0155] En algunas realizaciones, el método puede usarse para determinar niveles de GFAP de aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, o de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml. En algunas realizaciones, el método puede usarse para determinar niveles de GFAP de aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, o de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml. En algunas realizaciones, el método puede usarse para determinar niveles de GFAP seleccionados del grupo que consiste ende aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, and de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml. En algunas realizaciones, el método puede usarse para determinar niveles de GFAP seleccionados del grupo que consiste ende aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 30 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 40 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 60 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 70 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 75 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 80 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 90 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, de aproximadamente 125 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml, o de aproximadamente 150 pg/ml a aproximadamente 150.000 pg/ml,
[0267] En algunas realizaciones, en una muestra biológica pueden detectarse niveles de por lo menos 0,5 pg/ml, 0,10 pg/ml, 0,50 pg/ml, 1 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 15 pg/ml, 20 pg/ml, 31 pg/ml, 32 pg/ml, 33 pg/ml, 34 pg/ml, 35 pg/ml, 40 pg/ml, 50 pg/ml, 60 pg/ml, 70 pg/ml, 80 pg/ml, 90 pg/ml o 100 pg/ml de GFAP (o fragmento de GFAP). En algunas realizaciones, en una muestra biológica pueden detectarse niveles de menos de aproximadamente 150.000 pg/ml, de menos de aproximadamente 100.000 pg/ml, de menos de aproximadamente 90.000 pg/ml, de menos de aproximadamente 80.000 pg/ml, de menos de aproximadamente 70.000 pg/ml, de menos de aproximadamente 60.000 pg/ml, menos de aproximadamente 50.000 pg/ml, menos de aproximadamente 40.000 pg/ml, de menos de aproximadamente 30.000 pg/ml o de menos de aproximadamente 25.000 pg/ml de GFAP (o fragmento de GFAP).
[0269] En algunas realizaciones, en una muestra biológica pueden detectarse niveles de por lo menos aproximadamente 10.000 pg/ml, por lo menos aproximadamente 15.000 pg/ml, por lo menos aproximadamente 20.000 pg/ml, por lo menos aproximadamente 25.000 pg/ml, por lo menos aproximadamente 30.000 pg/ml, por lo menos aproximadamente 35.000 pg/ml, por lo menos aproximadamente 40.000 pg/ml, por lo menos aproximadamente 45.000 pg/ml, por lo menos aproximadamente 50.000 pg/ml, por lo menos aproximadamente 60.000 pg/ml, por lo menos aproximadamente 70.000 pg/ml, por lo menos aproximadamente 80.000 pg/ml, por lo menos aproximadamente 90.000 pg/ml, por lo menos aproximadamente 100.000 pg/ml, o por lo menos aproximadamente 150.000 pg/ml de GFAP (o fragmento de GFAP).
[0271] En algunas realizaciones, el ensayo puede tener un límite inferior de detección (LoD) de aproximadamente 10 pg/ml, aproximadamente 15 pg/ml, aproximadamente 20 pg/ml, aproximadamente 25 pg/ml, aproximadamente 30 pg/ml, aproximadamente 40 pg/ml o aproximadamente 50 pg/ml.
[0273] En algunas realizaciones, el ensayo puede tener una desviación desde la linealidad (DL) de menos del 10% a lo largo de un intervalo de aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml. Por ejemplo, el ensayo puede tener una desviación desde la linealidad de menos del 10%, de menos del 9%, de menos del 8%, de menos del 7%, de menos del 6%, de menos del 5%, de menos del 4%, de menos del 3%, de menos del 2%, de menos del 1% y de menos del 0,5% en un intervalo de aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, un intervalo de aproximadamente 12 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, un intervalo de aproximadamente 12 pg/ml a aproximadamente 13.660 pg/ml, un intervalo de aproximadamente 12 pg/ml a aproximadamente 900 pg/ml, un intervalo de aproximadamente 370 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, o un intervalo de aproximadamente 420 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml.
[0275] En algunas realizaciones, el método tiene un intervalo de cuantificación de GFAP de 20 pg/ml a 50.000 pg/ml a un coeficiente de variación (CV) del 20%. En algunas realizaciones, el método tiene un intervalo de detección de GFAP de 20 pg/ml a 50.000 pg/ml a un coeficiente de variación (CV) del 20%.
[0277] [0161] En algunas realizaciones, el primer miembro de unión específico está inmovilizado sobre un soporte sólido. En algunas realizaciones, el segundo miembro de unión específico está inmovilizado sobre un soporte sólido. En algunas realizaciones, el primer miembro de unión específico es un anticuerpo contra GFAP como se describe a continuación. En algunas realizaciones, el segundo miembro de unión específico es un anticuerpo contra GFAP como se describe a continuación. En algunas realizaciones, tanto el primer miembro de unión específico como el segundo miembro de unión específico son anticuerpos contra GFAP.
[0279] En algunas realizaciones, la muestra biológica está diluida o no diluida. La muestra biológica puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 microlitros, de aproximadamente 1 a aproximadamente 24 microlitros, de aproximadamente 1 a aproximadamente 23 microlitros, de aproximadamente 1 a aproximadamente 22 microlitros, de aproximadamente 1 a aproximadamente 21 microlitros, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 microlitros, de aproximadamente 1 a aproximadamente 18 microlitros, de aproximadamente 1 a aproximadamente 17 microlitros, de aproximadamente 1 a aproximadamente 16 microlitros, de aproximadamente 15 microlitros o de aproximadamente 1 microlitro, de aproximadamente 2 microlitros, de aproximadamente 3 microlitros, de aproximadamente 4 microlitros, de aproximadamente 5 microlitros, de aproximadamente 6 microlitros, de aproximadamente 7 microlitros, de aproximadamente 8 microlitros, de aproximadamente 9 microlitros, de aproximadamente 10 microlitros, de aproximadamente 11 microlitros, de aproximadamente 12 microlitros, de aproximadamente 13 microlitros, de aproximadamente 14 microlitros, de aproximadamente 15 microlitros, de aproximadamente 16 microlitros, de aproximadamente 17 microlitros, de aproximadamente 18 microlitros, de aproximadamente 19 microlitros, de aproximadamente 20 microlitros, de aproximadamente 21 microlitros, de aproximadamente 22 microlitros, de aproximadamente 23 microlitros, de aproximadamente 24 microlitros o de aproximadamente 25 microlitros. En algunas realizaciones, la muestra biológica es de aproximadamente 1 a aproximadamente 150 microlitros o menos, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 microlitros o menos.
[0281] En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto ha sufrido una lesión en la cabeza. En algunas realizaciones, se sabe que el sujeto ha sufrido una lesión en la cabeza. En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto sufre un TCE leve, moderado o grave. En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto sufre un TCE leve. En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto sufre un TCE moderado. En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto sufre un TCE grave.
[0283] [0164] En algunas realizaciones, se desconoce el tiempo transcurrido entre la obtención de la muestra biológica y el momento en que el sujeto sufre una lesión. En algunas realizaciones, la muestra biológica se obtiene en un plazo de aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 25 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 35 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 55 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 90 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 25 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 27 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 29 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 31 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 33 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 37 horas, aproximadamente 38 horas, aproximadamente 39 horas, aproximadamente 40 horas, aproximadamente 41 horas, aproximadamente 42 horas, aproximadamente 43 horas, aproximadamente 44 horas, aproximadamente 45 horas, aproximadamente 46 horas, aproximadamente 47 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 8 días, aproximadamente 9 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 7 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 9 meses, aproximadamente 10 meses, aproximadamente 11 meses, aproximadamente 12 meses, aproximadamente 13 meses, aproximadamente 14 meses, aproximadamente 15 meses, aproximadamente 16 meses, aproximadamente 17 meses, aproximadamente 18 meses, aproximadamente 19 meses, aproximadamente 20 meses, aproximadamente 21 meses, aproximadamente 22 meses, aproximadamente 23 meses, aproximadamente 24 meses, aproximadamente 3 años, aproximadamente 4 años, aproximadamente 5 años, aproximadamente 6 años, aproximadamente 7 años, aproximadamente 8 años, aproximadamente 9 años o aproximadamente 10 años después de que el sujeto haya sufrido una lesión. Por ejemplo, la lesión puede ser una lesión en la cabeza. En algunas realizaciones, la muestra biológica se obtiene en el plazo de aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 25 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 35 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 55 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 90 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 25 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 27 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 29 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 31 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 33 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 37 horas, aproximadamente 38 horas, aproximadamente 39 horas, aproximadamente 40 horas, aproximadamente 41 horas, aproximadamente 42 horas, aproximadamente 43 horas, aproximadamente 44 horas, aproximadamente 45 horas, aproximadamente 46 horas, aproximadamente 47 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 8 días, aproximadamente 9 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 7 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 9 meses, aproximadamente 10 meses, aproximadamente 11 meses, aproximadamente 12 meses, aproximadamente 13 meses, aproximadamente 14 meses, aproximadamente 15 meses, aproximadamente 16 meses, aproximadamente 17 meses, aproximadamente 18 meses, aproximadamente 19 meses, aproximadamente 20 meses, aproximadamente 21 meses, aproximadamente 22 meses, aproximadamente 23 meses, aproximadamente 24 meses, aproximadamente 3 años, aproximadamente 4 años, aproximadamente 5 años, aproximadamente 6 años, aproximadamente 7 años, aproximadamente 8 años, aproximadamente 9 años o aproximadamente 10 años después de que el sujeto haya ingerido o haya estado expuesto a una sustancia química, toxina o una combinación de una sustancia química o una toxina. Los ejemplos de tales sustancias químicas y/o toxinas son incendios, mohos, amianto, pesticidas e insecticidas, disolventes orgánicos, pinturas, pegamentos, gases (como monóxido de carbono, sulfuro de hidrógeno y cianuro), metales orgánicos (como metilmercurio, tetraetilo de plomo y estaño orgánico) y/o una o más drogas de abuso. En algunas realizaciones, la muestra biológica se obtiene de un sujeto que padece una enfermedad, como una enfermedad autoinmune, un trastorno metabólico, un tumor cerebral, hipoxia, uno o más virus, meningitis, hidrocefalia o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo para confirmar la presencia de un traumatismo craneoencefálico o la ausencia del mismo. El método puede realizarse en aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 2 minutos, aproximadamente 3 minutos, aproximadamente 4 minutos, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 6 minutos, aproximadamente 7 minutos, aproximadamente 8 minutos, aproximadamente 9 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 11 minutos, aproximadamente 12 minutos, aproximadamente 13 minutos, aproximadamente 14 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 16 minutos, aproximadamente 17 minutos, aproximadamente 18 minutos, aproximadamente 19 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 90 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 48 horas, horas 72 horas, etc.
[0285] b. Métodos para proporcionar ayuda en el diagnóstico de un sujeto que tiene traumatismo craneoencefálico.
[0287] En otra realización, los métodos descritos en la presente pueden usarse para ayudar en el diagnóstico de un sujeto que tenga un traumatismo craneoencefálico mediante la determinación de los niveles de GFAP en el sujeto. El método puede usarse para detectar o evaluar un traumatismo craneoencefálico en un sujeto usando los anticuerpos anti-GFAP que se describen a continuación, o fragmentos de anticuerpos de los mismos. El método incluye los pasos de (a) obtener una muestra biológica de un sujeto, (b) determinar el nivel de GFAP en la muestra biológica usando anticuerpos anti-GFAP, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, (c) comparar el nivel de GFAP en la muestra biológica con un nivel de referencia de GFAP, (d) identificar que el sujeto tiene un traumatismo craneoencefálico si el nivel de GFAP en la muestra biológica es mayor que el nivel de referencia de GFAP, y opcionalmente (e) administrar un régimen de tratamiento al sujeto que se ha identificado que tiene un traumatismo craneoencefálico. En algunas realizaciones, el método se realiza usando un dispositivo de punto de atención.
[0289] Al medir y evaluar la GFAP, el método permite diagnosticar más enfermedades y con mayor precisión y, posteriormente, tratarlas con más éxito, en comparación con otros inmunoensayos de GFAP disponibles en el mercado. El método puede adaptarse para su uso en un sistema automatizado o semiautomatizado.
[0291] En general, puede emplearse un nivel predeterminado como punto de referencia para evaluar los resultados obtenidos al analizar una muestra de prueba para GFAP. Por lo general, al realizar dicha comparación, el nivel predeterminado se obtiene ejecutando un ensayo particular una cantidad suficiente de veces y en condiciones adecuadas, de tal manera que pueda establecerse una relación o asociación entre la presencia, la cantidad o la concentración del analito y una etapa o un punto de valoración particulares del TCE o con indicios particulares.
[0292] Típicamente, el nivel predeterminado se obtiene con ensayos de sujetos de referencia (o poblaciones de sujetos). La GFAP medida puede incluir fragmentos de GFAP, productos de la degradación de la misma y/o productos de escisión enzimática de la misma.
[0294] El nivel de referencia en este método puede ser el nivel de GFAP en un paciente que tenga un traumatismo craneoencefálico. En algunas realizaciones, el nivel de referencia se encuentra dentro del intervalo dinámico del método descrito en la presente. En algunas realizaciones, el intervalo dinámico es de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 10,0 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, de aproximadamente 12 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml, o de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 50.000 pg/ml. En algunas realizaciones, los niveles mayores que o iguales a 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, 30 pg/ml, 40 pg/ml, 50 pg/ml, 60 pg/ml, 70 pg/ml, 80 pg/ml, 90 pg/ml, 100 pg/ml, 500 pg/ml, 1000 pg/ml, 5000 pg/ml, 10000 pg/ml o 50000 pg/ml en el suero de GFAP identifican que el sujeto tiene un traumatismo craneoencefálico. Opcionalmente, en algunos casos, los niveles más altos que o iguales a 100.000 pg/ml, 500.000 pg/ml, 1.000.000 pg/ml, 150.000 pg/ml, 200.000 pg/ml o 500.000 pg/ml en suero de GFAP identifican que el sujeto tiene un traumatismo craneoencefálico. En algunas realizaciones, los niveles más altos que o iguales a 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, 30 pg/ml, 40 pg/ml, 50 pg/ml, 60 pg/ml, 70 pg/ml, 80 pg/ml, 90 pg/ml, 100 pg/ml, 500 pg/ml, 1000 pg/ml, 5000 pg/ml, 10.000 pg/ml o 50.000 pg/ml en plasma de GFAP identifican que el sujeto tiene un traumatismo craneoencefálico. Opcionalmente, en algunos casos, los niveles más altos que o iguales a 100.000 pg/ml, 500.000 pg/ml, 1.000.000 pg/ml, 150.000 pg/ml, 200.000 pg/ml o 500.000 pg/ml en plasma de GFAP identifican que el sujeto tiene un traumatismo craneoencefálico.
[0296] c. Métodos para predecir si un sujeto que ha sufrido un traumatismo craneoencefálico es candidato para terapia o tratamiento
[0298] En otra realización más, los métodos descritos en la presente también pueden usarse para predecir si un sujeto que ha sufrido previamente un TCE es candidato para recibir terapia determinando los niveles de GFAP en un sujeto usando los anticuerpos anti-GFAP que se describen a continuación, o fragmentos de anticuerpos de los mismos. Así, en realizaciones particulares, la divulgación también proporciona un método para determinar si un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, traumatismos craneoencefálicos, analizados en la presente y conocidos en la técnica, es candidato para recibir terapia o tratamiento. En general, el sujeto es por lo menos uno que: (i) ha sufrido una lesión en la cabeza; (ii) ha ingerido y/o ha estado expuesto a una o más sustancias químicas y/o toxinas; (iii) padece una enfermedad autoinmune, un trastorno metabólico, un tumor cerebral, hipoxia, uno o más virus, meningitis, hidrocefalia o cualquier combinación de los mismos; o (iv) cualquier combinación de (i)-(iii); o que haya sido diagnosticado como que tiene, o está en riesgo de tener, TCE (como, por ejemplo, sujetos que padecen una enfermedad autoinmune, un trastorno metabólico, un tumor cerebral, hipoxia, uno o más virus, meningitis, hidrocefalia o combinaciones de los mismos), y/o que presente una concentración o cantidad desfavorable (es decir, clínicamente indeseable) de GFAP o fragmentos de GFAP, tal como se describe en la presente.
[0300] Específicamente, dicho método puede comprender los pasos de: (a) determinar la concentración o cantidad en una muestra de prueba de un sujeto de GFAP usando los métodos descritos en la presente o métodos conocidos en la técnica); y (b) comparar la concentración o cantidad de GFAP determinada en el paso (a) con un nivel predeterminado, en el que, si la concentración o cantidad de GFAP determinada en el paso (a) es favorable con respecto a un nivel predeterminado, entonces se determina que el sujeto no es candidato para terapia o tratamiento. Sin embargo, si la concentración o cantidad de GFAP determinada en el paso (a) es desfavorable con respecto al nivel predeterminado, entonces se determina que el sujeto es candidato para terapia o tratamiento, tal como se describe en la sección f del presente documento y se conoce en la técnica. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo usando un dispositivo de punto de atención. Un ejemplo de dispositivo de punto de atención que puede usarse es i-STAT® (Abbott, Laboratories, Abbott Park, IL).
[0302] d. Métodos para monitorizar la progresión de un traumatismo craneoencefálico en un sujeto
[0304] [0171] En otra realización más, los métodos descritos en la presente también pueden usarse para monitorizar la progresión de una enfermedad y/o lesión, como un traumatismo craneoencefálico, en un sujeto, determinando los niveles de GFAP en un sujeto usando los anticuerpos anti-GFAP que se describen a continuación, o fragmentos de anticuerpos de los mismos. De manera óptima, el método incluye los pasos de (a) determinar la concentración o cantidad de GFAP en una muestra de prueba de un sujeto usando los anticuerpos anti-GFAP que se describen a continuación, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, (b) determinar la concentración o cantidad de GFAP en una muestra de prueba posterior de un sujeto usando los anticuerpos anti-GFAP que se describen a continuación, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, y (c) comparar la concentración o cantidad de GFAP determinada en el paso (b) con la concentración o cantidad de GFAP determinada en el paso (a), en donde si la concentración o cantidad determinada en el paso (b) no ha cambiado o es desfavorable en comparación con la concentración o cantidad de GFAP determinada en el paso (a), entonces se determina que la enfermedad en el sujeto ha continuado, progresado o empeorado. Por el contrario, si la concentración o cantidad de GFAP determinada en el paso (b) es favorable en comparación con la concentración o cantidad de GFAP determinada en el paso (a), se determina que la enfermedad del sujeto ha desaparecido, remitido o mejorado. En algunas realizaciones, el método se lleva a cabo usando un dispositivo de punto de atención. Un ejemplo de dispositivo de punto de atención que puede usarse es el i-STAT® (Abbott, Laboratories, Abbott Park, IL).
[0306] Opcionalmente, el método comprende además comparar la concentración o cantidad de GFAP determinada en el paso (b), por ejemplo, con un nivel predeterminado. Además, opcionalmente, el método comprende tratar al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas durante un periodo de tiempo si la comparación muestra que la concentración o cantidad de GFAP determinada en el paso (b), por ejemplo, se ha alterado desfavorablemente con respecto al nivel predeterminado.
[0308] Además, los métodos pueden usarse para monitorizar el tratamiento en un sujeto que esté recibiendo tratamiento con una o más composiciones farmacéuticas. Específicamente, tales métodos implican proporcionar una primera muestra de prueba de un sujeto antes de que al sujeto se le hayan administrado una o más composiciones farmacéuticas. A continuación, se determina la concentración o cantidad de GFAP en una primera muestra de prueba de un sujeto (por ejemplo, usando los métodos descritos en la presente o conocidos en la técnica). Después que se haya determinado la concentración o cantidad de GFAP, opcionalmente la concentración o cantidad de GFAP se compara con un nivel predeterminado. Si la concentración o cantidad de GFAP determinada en la primera muestra de prueba es menor que el nivel predeterminado, entonces el sujeto no se trata con una o más composiciones farmacéuticas o, alternativamente, al sujeto se le puede tratar con una o más composiciones farmacéuticas. Si la concentración o cantidad de GFAP determinada en la primera muestra de prueba es mayor que el nivel predeterminado, entonces el sujeto se trata con una o más composiciones farmacéuticas durante un período de tiempo o, alternativamente, el sujeto no se trata con una o más composiciones farmacéuticas. El periodo de tiempo durante el cual se trata al sujeto con una o más de las composiciones farmacéuticas puede ser determinado por un experto en la materia (por ejemplo, el periodo de tiempo puede ser de aproximadamente siete (7) días a aproximadamente dos años, preferiblemente de aproximadamente catorce (14) días a aproximadamente un (1) año).
[0310] Durante el curso del tratamiento con una o más de las composiciones farmacéuticas, se obtienen luego una segunda y posteriores muestras de prueba del sujeto. El número de muestras de prueba y el momento en que se obtienen dichas muestras de prueba del sujeto no son críticos. Por ejemplo, una segunda muestra de prueba podría obtenerse siete (7) días después de que se hayan administrado por primera vez al sujeto una o más de las composiciones farmacéuticas, una tercera muestra de prueba podría obtenerse dos (2) semanas después de que se hayan administrado por primera vez al sujeto una o más de las composiciones farmacéuticas, una cuarta muestra de prueba podría obtenerse tres (3) semanas después de que se hayan administrado por primera vez al sujeto una o más de las composiciones farmacéuticas, una quinta muestra de prueba podría obtenerse cuatro (4) semanas después de que se hayan administrado por primera vez al sujeto una o más de las composiciones farmacéuticas, etc.
[0312] Después de que se haya obtenido cada segunda o posterior muestra de prueba del sujeto, se determina la concentración o cantidad de GFAP en la segunda o posterior muestra de prueba (por ejemplo, usando los métodos descritos en la presente o conocidos en la técnica). A continuación, se compara la concentración o cantidad de GFAP determinada en cada una de las segundas y posteriores muestras de prueba con la concentración o cantidad de GFAP determinada en la primera muestra de prueba (por ejemplo, la muestra de prueba que originalmente se comparó opcionalmente con el nivel predeterminado). Si la concentración o cantidad de GFAP determinada en el paso (c) es favorable en comparación con la concentración o cantidad de GFAP determinada en el paso (a), se determina que la enfermedad del sujeto ha desaparecido, remitido o mejorado, y se puede continuar administrando al sujeto la composición farmacéutica del paso (b). Sin embargo, si la concentración o cantidad determinada en el paso (c) no ha cambiado o es desfavorable en comparación con la concentración o cantidad de GFAP determinada en el paso (a), se determina que la enfermedad del sujeto ha continuado, ha progresado o ha empeorado, y al sujeto se le puede tratar con una concentración más alta de una o más de las composiciones farmacéuticas administradas al sujeto en el paso (b) o al sujeto se le puede tratar con una o más composiciones farmacéuticas que sean diferentes de una o más de las composiciones farmacéuticas administradas al sujeto en el paso (b). Específicamente, al sujeto se le puede tratar con una o más composiciones farmacéuticas que sean diferentes de una o más de las composiciones farmacéuticas que el sujeto había recibido previamente para disminuir o reducir el nivel de GFAP de dicho sujeto.
[0314] [0176] En general, para los ensayos en los que pueden realizarse pruebas repetidas (por ejemplo, para monitorizar la progresión de la enfermedad y/o la respuesta al tratamiento), se obtiene una segunda o posterior muestra de prueba en un periodo de tiempo después de que se haya obtenido la primera muestra de prueba del sujeto. Específicamente, puede obtenerse del sujeto una segunda muestra de prueba minutos, horas, días, semanas o años después de que se haya obtenido la primera muestra de prueba del sujeto. Por ejemplo, la segunda muestra de prueba puede obtenerse del sujeto en un periodo de tiempo de aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 13 semanas, aproximadamente 14 semanas, aproximadamente 15 semanas, aproximadamente 16 semanas, aproximadamente 17 semanas, aproximadamente 18 semanas, aproximadamente 19 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 21 semanas, aproximadamente 22 semanas, aproximadamente 23 semanas, aproximadamente 24 semanas, aproximadamente 25 semanas, aproximadamente 26 semanas, aproximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 semanas, aproximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 semanas, aproximadamente 31 semanas, aproximadamente 32 semanas, aproximadamente 33 semanas, aproximadamente 34 semanas, aproximadamente 35 semanas, aproximadamente 36 semanas, aproximadamente 37 semanas, aproximadamente 38 semanas, aproximadamente 39 semanas, aproximadamente 40 semanas, aproximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 semanas, aproximadamente 43 semanas, aproximadamente 44 semanas, aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 46 semanas, aproximadamente 47 semanas, aproximadamente 48 semanas, aproximadamente 49 semanas, aproximadamente 50 semanas, aproximadamente 51 semanas, aproximadamente 52 semanas, aproximadamente 1,5 años, aproximadamente 2 años, aproximadamente 2,5 años, aproximadamente 3,0 años, aproximadamente 3,5 años, aproximadamente 4,0 años, aproximadamente 4,5 años, aproximadamente 5,0 años, aproximadamente 5,5. años, aproximadamente 6,0 años, aproximadamente 6,5 años, aproximadamente 7,0 años, aproximadamente 7,5 años, aproximadamente 8,0 años, aproximadamente 8,5 años, aproximadamente 9,0 años, aproximadamente 9,5 años o aproximadamente 10,0 años después de que se haya obtenido la primera muestra de prueba del sujeto.
[0316] Cuando se usa para monitorizar la progresión de la enfermedad, el ensayo anterior puede usarse para monitorizar la progresión de la enfermedad en sujetos que padecen afecciones agudas. Las afecciones agudas, también conocidas como afecciones de cuidados críticos, se refieren a enfermedades agudas que ponen en peligro la vida u otras afecciones médicas críticas que afectan, por ejemplo, al sistema cardiovascular o al sistema excretor. Típicamente, las afecciones de cuidados críticos se refieren a aquellas afecciones que requieren una intervención médica aguda en un entorno hospitalario (incluyendo, pero no limitados a, la sala de urgencias, la unidad de cuidados intensivos, el centro de traumatología u otros entornos de atención de urgencia) o la administración por parte de un paramédico u otro personal médico de campo. En el caso de las condiciones de cuidados críticos, la monitorización repetida se realiza generalmente en un marco temporal más corto, concretamente de minutos, horas o días (por ejemplo, aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días o aproximadamente 7 días), y el ensayo inicial también se realiza generalmente de igual manera en un periodo de tiempo más corto, por ejemplo, de aproximadamente minutos, horas o días desde el inicio de la enfermedad o afección.
[0318] [0178] Los ensayos también pueden usarse para monitorizar la progresión de la enfermedad en sujetos que padecen afecciones crónicas o no agudas. Las afecciones que no requieren cuidados críticos o las afecciones no agudas se refieren a afecciones distintas de las enfermedades agudas que ponen en peligro la vida u otras afecciones médicas críticas que afectan, por ejemplo, al sistema cardiovascular y/o al sistema excretor. Típicamente, las afecciones no agudas incluyen aquellas de duración más prolongada o crónica. En el caso de las afecciones no agudas, la monitorización repetida se realiza generalmente en un plazo más largo, por ejemplo, de horas, días, semanas, meses o años (por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 13 semanas, aproximadamente 14 semanas, aproximadamente 15 semanas, aproximadamente 16 semanas, aproximadamente 17 semanas, aproximadamente 18 semanas, aproximadamente 19 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 21 semanas, aproximadamente 22 semanas, aproximadamente 23 semanas, aproximadamente 24 semanas, aproximadamente 25 semanas, aproximadamente 26 semanas, aproximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 semanas, aproximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 semanas, aproximadamente 31 semanas, aproximadamente 32 semanas, aproximadamente 33 semanas, aproximadamente 34 semanas, aproximadamente 35 semanas, aproximadamente 36 semanas, aproximadamente 37 semanas, aproximadamente 38 semanas, aproximadamente 39 semanas, aproximadamente 40 semanas, aproximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 semanas, aproximadamente 43 semanas, aproximadamente 44 semanas, aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 46 semanas, aproximadamente 47 semanas, aproximadamente 48 semanas, aproximadamente 49 semanas, aproximadamente 50 semanas, aproximadamente 51 semanas, aproximadamente 52 semanas, aproximadamente 1,5 años, aproximadamente 2 años, aproximadamente 2,5 años, aproximadamente 3,0 años, aproximadamente 3,5 años, aproximadamente 4,0 años, aproximadamente 4,5 años, aproximadamente 5,0 años, aproximadamente 5,5. años, aproximadamente 6,0 años, aproximadamente 6,5 años, aproximadamente 7,0 años, aproximadamente 7,5 años, aproximadamente 8,0 años, aproximadamente 8,5 años, aproximadamente 9,0 años, aproximadamente 9,5 años o aproximadamente 10,0 años), y el ensayo inicial también se realiza generalmente de igual manera en un periodo de tiempo más largo, por ejemplo, de aproximadamente horas, días, meses o años desde el inicio de la enfermedad o afección.
[0320] Además, los ensayos anteriores pueden realizarse usando una primera muestra de prueba obtenida de un sujeto, en los que la primera muestra de prueba se obtiene de una fuente, como orina, sangre completa, suero o plasma. Opcionalmente, los ensayos anteriores pueden repetirse usando una segunda muestra de prueba obtenida del sujeto, en los que la segunda muestra de prueba se obtiene de otra fuente. Por ejemplo, si la primera muestra de prueba se obtuvo de la orina, la segunda muestra de prueba puede obtenerse de sangre completa, suero o plasma. Pueden compararse los resultados obtenidos de los ensayos usando la primera muestra de prueba y la segunda muestra de prueba. La comparación puede usarse para evaluar el estado de una enfermedad o afección en el sujeto.
[0322] En particular, con respecto a un nivel predeterminado empleado para monitorizar la progresión de la enfermedad y/o el tratamiento o para determinar el riesgo de que un sujeto desarrolle un traumatismo craneoencefálico, la cantidad o concentración de GFAP o del fragmento de GFAP puede ser "sin cambios", "favorable" (o "alterada favorablemente") o "desfavorable" (o "alterada desfavorablemente"). "Elevada" o "aumentada" se refiere a una cantidad o concentración en una muestra de prueba que es más alta o mayor que un nivel o intervalo típico o normal (por ejemplo, un nivel predeterminado), o que es más alta o mayor que otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, una muestra anterior o inicial). El término "disminuido" o "reducido" se refiere a una cantidad o concentración en una muestra de prueba que es más baja o menor que un nivel o intervalo típico o normal (por ejemplo, un nivel predeterminado), o que es más baja o menor que otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, una muestra anterior o inicial). El término "alterado" se refiere a una cantidad o concentración en una muestra que se ha alterado (aumentado o disminuido) con respecto a un nivel o intervalo típico o normal (por ejemplo, un nivel predeterminado), o con respecto a otro nivel o intervalo de referencia (por ejemplo, una muestra anterior o inicial).
[0324] El nivel o intervalo típico o normal para la GFAP se define de acuerdo con la práctica estándar. Puede considerarse que se ha producido un nivel denominado alterado o una alteración cuando hay un cambio neto en comparación con el nivel o intervalo típico o normal, o con el nivel o intervalo de referencia, que no puede explicarse por un error experimental o una variación de la muestra. Por tanto, el nivel medido en una muestra particular se comparará con el nivel o intervalo de niveles determinados en muestras similares de un sujeto denominado normal. En este contexto, un "sujeto normal" es un individuo sin ninguna enfermedad o trastorno detectable, y un paciente o población "normal" (a veces denominado "control") es aquel que no presenta ninguna enfermedad o trastorno detectable, respectivamente, por ejemplo. Un "sujeto aparentemente normal" es aquel en el que no se ha evaluado o no se está evaluando la GFAP. Se dice que el nivel de un analito está "elevado" cuando el analito es normalmente indetectable (por ejemplo, el nivel normal es cero, o está dentro de un intervalo de aproximante 25 a aproximadamente 75 percentiles de las poblaciones normales), pero se detecta en una muestra de prueba, así como cuando el analito está presente en la muestra de prueba a un nivel más alto que el normal. Así, entre otras cosas, la divulgación proporciona un método de cribado de sujetos que padecen o corren el riesgo de padecer un traumatismo craneoencefálico.
[0326] e. Otros factores
[0328] Los métodos de ayuda al diagnóstico, pronóstico y/o evaluación, tal como se han descrito anteriormente, pueden incluir además el uso de otros factores para ayudar al diagnóstico, así como al pronóstico y la evaluación. Los métodos de evaluación y predicción, tal como se han descrito anteriormente, pueden incluir además el uso de otros factores para la evaluación y la predicción. En algunas realizaciones, el traumatismo craneoencefálico puede diagnosticarse usando la Escala de Coma de Glasgow o la Escala de Resultados de Glasgow Ampliada (GOSE). También pueden usarse otras pruebas, escalas o índices, ya sea solos o en combinación con la Escala de Coma de Glasgow. Un ejemplo es la Escala de Ranchos Los Amigos. La Escala de Ranchos Los Amigos mide los niveles de conciencia, cognición, comportamiento e interacción con el entorno. La Escala de Ranchos Los Amigos incluye: Nivel I: Sin respuesta; Nivel II: Respuesta generalizada; Nivel III: Respuesta localizada; Nivel IV: Confuso-agitado; Nivel V: Confuso-inapropiado; Nivel VI: Confuso-apropiado; Nivel VII: Automático-apropiado; y Nivel VIII: Decidido-apropiado.
[0329] f. Tratamiento médico de sujetos que padecen traumatismos craneoencefálicos
[0330] El sujeto que en los métodos descritos anteriormente se ha identificado o evaluado que tiene un traumatismo craneoencefálico, como un traumatismo craneoencefálico leve o un traumatismo craneoencefálico de moderado a grave, puede tratarse usando técnicas médicas conocidas en la técnica. En algunas realizaciones, el método incluye además el tratamiento del sujeto humano que se ha evaluado que tiene un traumatismo craneoencefálico con un tratamiento para traumatismos craneoencefálicos, como cualquier tratamiento conocido en la técnica. Por ejemplo, el tratamiento del traumatismo craneoencefálico puede adoptar una variedad de formas dependiendo de la gravedad de la lesión en la cabeza. Por ejemplo, para los sujetos que padecen un TCE leve, el tratamiento puede incluir uno o varios de reposo, abstenerse de realizar actividades físicas, como deportes, evitar la luz o llevar gafas de sol cuando se está al aire libre, medicación para aliviar un dolor de cabeza o migraña, medicación contra las náuseas, etc. El tratamiento para pacientes que padecen un traumatismo craneoencefálico grave puede incluir la administración de uno o más medicamentos apropiados (como, por ejemplo, diuréticos, medicamentos anticonvulsivos, medicamentos para sedar y poner a una persona en coma inducido por fármacos, u otros medicamentos farmacéuticos o biofarmacéuticos (ya sean conocidos o se desarrollen en el futuro para el tratamiento de traumatismos craneoencefálicos), uno o más procedimientos quirúrgicos (como, por ejemplo, extirpación de un hematoma, reparación de una fractura de cráneo, craneotomía descompresiva, etc.) y una o más terapias (como, por ejemplo, una o más de rehabilitación, terapia cognitivo-conductual, control de la ira, psicología de asesoramiento, etc.).
[0332] g. Monitorización de sujetos que padecen un traumatismo craneoencefálico
[0334] El sujeto que se ha identificado o evaluado en los métodos descritos anteriormente que padece un traumatismo craneoencefálico, como un traumatismo craneoencefálico leve o un traumatismo craneoencefálico de moderado a grave, puede monitorizarse usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el paciente que padece un traumatismo craneoencefálico, como un traumatismo craneoencefálico leve o un traumatismo craneoencefálico grave, puede monitorizarse con una tomografía computarizada o una resonancia magnética.
[0336] 3. Combinaciones de GFAP con otros biomarcadores
[0338] Como se analizará con más detalle a continuación, los anticuerpos descritos en la presente pueden usarse en una variedad de métodos para detectar y medir los niveles y concentraciones de GFAP en combinación con uno o más biomarcadores o inmunoensayos específicos para la enfermedad. La presente divulgación contempla que la combinación de GFAP con uno o más biomarcadores o inmunoensayos específicos para la enfermedad puede proporcionar una mayor discriminación entre controles sanos e individuos con enfermedad en comparación con solo la medición de la GFAP. Por ejemplo, la medición de un panel de GFAP y biomarcadores adicionales de traumatismo craneoencefálico puede proporcionar una mayor discriminación entre controles sanos e individuos con enfermedad en comparación con un panel de GFAP sola. La combinación de GFAP con por lo menos uno o más biomarcadores puede proporcionar una mayor discriminación entre controles sanos e individuos que tienen un traumatismo craneoencefálico. Los ejemplos de uno o más de los biomarcadores incluyen la ubiquitina carboxi-terminal hidrolasa L1 (UCH-L1), la proteína S100 B de unión al calcio (S100b), la proteína de unión a lípidos cerebrales (BLBP), la aldolasa C (ALDOC), la fosfoproteína astrocítica 15 (PEA15), la glutamina sintetasa (GS), la cadena B de cristalina (CRYAB),la enolasa específica de neuronas (NSE), el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), Tau, P-tau, la proteína C reactiva (CRP), la apolipoproteína A-I (ApoA1) y la NFL. Tales ensayos de panel pueden realizarse opcionalmente comparando ensayos independientes (por ejemplo, ensayos simplex).
[0340] [0186] Alternativamente, los métodos descritos en la presente pueden realizarse usando ensayos multiplex. Tales métodos multiplex pueden incluir opcionalmente uno o más (o alternativamente dos o más) miembros de unión específicos para detectar uno o más (o alternativamente dos o más) analitos diana en la muestra en un ensayo multiplex. Cada uno de los uno o más (o, alternativamente, dos o más) miembros de unión específicos se une opcionalmente a un analito diana diferente y cada miembro de unión específico se conjuga con un compuesto generador de señales o sustrato generador de señales diferente. Por ejemplo, un primer miembro de unión específico se une a un primer analito diana, un segundo miembro de unión específico se une a un segundo analito diana, un tercer miembro de unión específico se une a un tercer analito diana, etc. y el primer miembro de unión específico está marcado con un primer compuesto generador de señales o un primer sustrato generador de señales, el segundo miembro de unión específico está marcado con un segundo compuesto generador de señales o un segundo sustrato generador de señales, el tercer miembro de unión específico está marcado con un tercer compuesto generador de señales o un tercer sustrato generador de señales, etc. En algunas realizaciones, una primera condición provoca la activación, escisión o liberación del primer compuesto generador de señales o del primer sustrato generador de señales si el primer miembro de unión específico está marcado con un compuesto generador de señales o un primer sustrato generador de señales, una segunda condición provoca la activación, escisión o liberación del segundo compuesto generador de señales o segundo sustrato generador de señales si el segundo miembro de unión específico está marcado con un compuesto generador de señales o sustrato generador de señales, una tercera condición provoca la activación, escisión o liberación del tercer compuesto generador de señales o tercer sustrato generador de señales si el tercer miembro de unión específico está marcado con un compuesto generador de señales o sustrato generador de señales, etc. En algunas realizaciones, durante el ensayo las condiciones de la muestra pueden cambiarse en varios momentos, lo que permite la detección del primer compuesto generador de señales o primer sustrato generador de señales, el segundo compuesto generador de señales o segundo sustrato generador de señales, el tercer compuesto generador de señales o tercer sustrato generador de señales, etc., detectando de este modo uno o más (o alternativamente dos o más) analitos diana. En algunas realizaciones, se detectan simultáneamente uno o más (o, alternativamente, dos o más) de los compuestos generadores de señales o sustratos generadores de señales activados o escindidos. En algunas realizaciones, uno o más (o, alternativamente, dos o más) de los compuestos generadores de señales activados o escindidos o sustratos generadores de señales activados o escindidos generan una señal detectable diferente, como una longitud de onda diferente de señal de fluorescencia.
[0341] Alternativamente, cada uno de los uno o más (o alternativamente dos o más) miembros de unión específicos se une a un analito diana diferente y cada miembro de unión específico se conjuga con un soporte sólido diferente, por ejemplo, como una perla de fluoróforo diferente. Por ejemplo, un primer miembro de unión específico se une a un primer analito diana, un segundo miembro de unión específico se une a un segundo analito diana, un tercer miembro de unión específico se une a un tercer analito diana, etc., el primer miembro de unión específico está marcado con un primer compuesto generador de señales o un primer sustrato generador de señales, el segundo miembro de unión específico está marcado con un segundo compuesto generador de señales o un segundo sustrato generador de señales, el tercer miembro de unión específico está marcado con un tercer compuesto generador de señales o un tercer sustrato generador de señales, etc., y el primer miembro de unión específico se inmoviliza en un primer soporte sólido, el segundo miembro de unión específico se inmoviliza en un segundo soporte sólido, el tercer miembro de unión específico se inmoviliza en un tercer soporte sólido, etc. En algunas realizaciones, uno o más (o alternativamente dos o más) de los compuestos generadores de señales o sustratos generadores de señales activados o escindidos generan una señal detectable diferente, como una longitud de onda o una señal de fluorescencia diferentes, y los diferentes soportes sólidos se detectan simultáneamente o consecutivamente.
[0342] En algunas realizaciones, un primer miembro de unión específico se une a un primer analito diana, un segundo miembro de unión específico se une a un segundo analito diana, un tercer miembro de unión específico se une a un tercer analito diana, etc., el primer miembro de unión específico, el segundo miembro de unión específico, el tercer miembro de unión específico, etc. están marcados con un compuesto generador de señales o un sustrato generador de señales, y el primer miembro de unión específico está inmovilizado en un primer soporte sólido, el segundo miembro de unión específico está inmovilizado en un segundo soporte sólido, el tercer miembro de unión específico está inmovilizado en un tercer soporte sólido, etc. En algunas realizaciones, los compuestos generadores de señales o los sustratos generadores de señales activados o escindidos generan una señal detectable, como una longitud de onda diferente o una señal de fluorescencia, y los diferentes soportes sólidos se detectan simultánea o consecutivamente.
[0343] 4. Anticuerpos contra GFAP
[0344] Los métodos descritos en la presente pueden usar un anticuerpo aislado que se une específicamente a la proteína ácida fibrilar glial humana ("GFAP") (o fragmentos de la misma), denominado "anticuerpo contra GFAP". Los anticuerpos contra GFAP reconocen y se unen específicamente a epítopos dentro de los productos de la degradación de la GFAP. Los anticuerpos contra GFAP pueden usarse para evaluar el estado de la GFAP como medida del traumatismo craneoencefálico, detectar la presencia de GFAP en una muestra biológica, cuantificar la cantidad de GFAP presente en una muestra biológica o detectar la presencia y cuantificar la cantidad de GFAP en una muestra biológica.
[0345] a. Proteína ácida fibrilar glial (GFAP)
[0346] La proteína ácida fibrilar glial (GFAP) es una proteína filamentosa intracitoplasmática de 50 kDa que constituye una parte del citoesqueleto de los astrocitos y ha demostrado ser el marcador más específico para las células de origen astrocítico. En los humanos la proteína GFAP está codificada por el gen GFAP. La GFAP es el principal filamento intermedio de los astrocitos maduros. En el dominio central con forma de bastón de la molécula, la GFAP comparte una considerable homología estructural con los demás filamentos intermedios. La GFAP participa en la motilidad y la forma de los astrocitos proporcionando estabilidad estructural a los procesos astrocíticos. La proteína ácida fibrilar glial y sus productos de la degradación (GFAP-BDP) son proteínas específicas del cerebro que se liberan en la sangre como parte de la respuesta fisiopatológica después de un traumatismo craneoencefálico (TCE). Después de una lesión del SNC humano provocada por un traumatismo, trastornos genéticos o sustancias químicas, los astrocitos proliferan y muestran una hipertrofia extensa del cuerpo y los procesos celulares, y la GFAP se regula al alza de manera notable. Por el contrario, con el aumento de la malignidad de los astrocitos, se produce una pérdida progresiva de la producción de GFAP. La GFAP también puede detectarse en las células de Schwann, las células gliales entéricas, las neoplasias de las glándulas salivales, los carcinomas renales metastásicos, el cartílago epiglótico, los pituicitos, los oligodendrocitos inmaduros, los meningiomas papilares y las células mioepiteliales de la mama.
[0347] La GFAP humana puede tener la siguiente secuencia de aminoácidos:
[0348]
[0350] La GFAP humana puede ser un fragmento o variante de la SEQ ID NO: 1. El fragmento de GFAP puede tener entre 5 y 400 aminoácidos, entre 10 y 400 aminoácidos, entre 50 y 400 aminoácidos, entre 60 y 400 aminoácidos, entre 65 y 400 aminoácidos, entre 100 y 400 aminoácidos, entre 150 y 400 aminoácidos, entre 100 y 300 aminoácidos, o entre 200 y 300 aminoácidos de longitud. El fragmento puede comprender un número contiguo de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. El fragmento o variante de GFAP humana de la SEQ ID NO: 1 puede ser un producto de la degradación de GFAP (BDP). El BDP de GFAP puede tener 38 kDa, 42 kDa (más débil 41 kDa), 47 kDa (más débil 45 kDa); 25 kDa (más débil 23 kDa); 19 kDa o 20 kDa.
[0351] b. Anticuerpo que reconoce la GFAP
[0352] El anticuerpo es un anticuerpo que se une a la GFAP, a un fragmento de la misma, a un epítopo de la GFAP o a una variante de la misma. El anticuerpo puede ser un fragmento del anticuerpo anti-GFAP o una variante o un derivado del mismo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena única, un anticuerpo madurado por afinidad, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo totalmente humano o un fragmento de anticuerpo, como un fragmento Fab, o una mezcla de los mismos. Los fragmentos o derivados de anticuerpos pueden comprender fragmentos F(ab')<2>, Fv o scFv. Los derivados de anticuerpos pueden producirse mediante peptidomiméticos. Además, pueden adaptarse las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena única para producir anticuerpos de cadena única.
[0353] Los anticuerpos anti-GFAP pueden ser anticuerpos anti-GFAP quiméricos o humanizados. En una realización, tanto el anticuerpo humanizado como el anticuerpo quimérico son monovalentes. En una realización, tanto el anticuerpo humanizado como el anticuerpo quimérico comprenden una única región Fab enlazada a una región Fc.
[0354] Los anticuerpos humanos pueden derivarse de la tecnología de presentación en fagos o de ratones transgénicos que expresan genes de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humano puede generarse como resultado de una respuesta inmunitaria in vivo humana y aislarse. Véase, por ejemplo, Funaro et al., BMC Biotechnology, 2008(8):85. Por lo tanto, el anticuerpo puede ser un producto del repertorio humano y no animal. Como es de origen humano, pueden minimizarse los riesgos de reactividad contra los autoantígenos. Alternativamente, para seleccionar y aislar anticuerpos humanos anti-GFAP pueden usarse bibliotecas de levadura y tecnologías de presentación estándar. Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos humanos anti-GFAP pueden usarse bibliotecas de fragmentos variables de cadena única (scFv) humanos vírgenes. Para expresar anticuerpos humanos pueden usarse animales transgénicos.
[0355] Los anticuerpos humanizados pueden ser moléculas de anticuerpos de especies no humanas que se unen al antígeno deseado y que tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de especies no humanas y regiones marco de una molécula de inmunoglobulina humana.
[0356] El anticuerpo puede distinguirse de los anticuerpos conocidos en que posee funciones biológicas diferentes a las conocidas en la técnica.
[0357] (1) Epítopo
[0358] [0198] El anticuerpo puede unirse inmunospecíficamente a GFAP (SEQ ID NO: 1), un fragmento de la misma o una variante de la misma. El anticuerpo puede reconocer y unirse inmunospecíficamente por lo menos tres aminoácidos, por lo menos cuatro aminoácidos, por lo menos cinco aminoácidos, por lo menos seis aminoácidos, por lo menos siete aminoácidos, por lo menos ocho aminoácidos, por lo menos nueve aminoácidos o por lo menos diez aminoácidos dentro de una región de epítopo. El anticuerpo puede reconocer y unirse inmunospecíficamente a un epítopo que tiene por lo menos tres aminoácidos contiguos, por lo menos cuatro aminoácidos contiguos, por lo menos cinco aminoácidos contiguos, por lo menos seis aminoácidos contiguos, por lo menos siete aminoácidos contiguos, por lo menos ocho aminoácidos contiguos, por lo menos nueve aminoácidos contiguos o por lo menos diez aminoácidos contiguos de una región de epítopo.
[0360] c. Preparación/producción de anticuerpos
[0362] Los anticuerpos pueden prepararse mediante cualquiera de una variedad de técnicas, incluyendo aquellas bien conocidas por los expertos en la materia. En general, los anticuerpos pueden producirse mediante técnicas de cultivo celular, incluyendo la generación de anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales, o mediante la transfección de genes de anticuerpos, cadenas pesadas y/o cadenas ligeras en huéspedes celulares bacterianos o mamíferos adecuados, con el fin de permitir la producción de anticuerpos, en los que los anticuerpos pueden ser recombinantes. Se pretende que las varias formas del término "transfección" abarquen una amplia variedad de técnicas usadas comúnmente para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, transfección con DEAE-dextrano y similares. Aunque es posible expresar los anticuerpos en células huésped o procariotas o eucariotas, se prefiere la expresión de anticuerpos en células eucariotas, y se prefiere aún más en células huésped de mamíferos, ya que dichas células eucariotas (y en particular las células de mamíferos) son más propensas que las células procariotas a ensamblar y secretar un anticuerpo correctamente plegado e inmunológicamente activo.
[0364] Las células huésped ejemplares de mamífero para expresar los anticuerpos recombinantes incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) (incluyendo las células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980)), usadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982), células de mieloma NS0, células COS y células SP2. Cuando en células huésped de mamífero se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpos, los anticuerpos se producen cultivando las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se cultivan las células huésped. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando métodos estándar de purificación de proteínas.
[0366] Las células huésped también pueden usarse para producir fragmentos de anticuerpos funcionales, como fragmentos Fab o moléculas scFv. Se entenderá que pueden realizarse variaciones del procedimiento anterior. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula huésped con ADN que codifique fragmentos funcionales de la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo. La tecnología del ADN recombinante también puede usarse para eliminar parte o la totalidad del ADN que codifica una o ambas cadenas ligeras y pesadas que no son necesarias para la unión a los antígenos de interés. En los anticuerpos también están comprendidas las moléculas expresadas a partir de dichas moléculas de ADN truncadas. Además, mediante la reticulación de un anticuerpo con un segundo anticuerpo mediante métodos químicos de reticulación estándar pueden producirse anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una cadena ligera son un anticuerpo (es decir, se unen a la GFAP humana) y la otra cadena pesada y la cadena ligera son específicas para un antígeno distinto de la GFAP humana.
[0368] En un sistema preferido para la expresión recombinante de un anticuerpo, o de la porción de unión al antígeno del mismo, se introduce en células dhfr-CHO un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo mediante transfección mediada por fosfato cálcico. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo están enlazados operativamente a elementos reguladores del potenciador de CMV/promotor de AdMLP para impulsar altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen DHFR, que permite la selección de células CHO que hayan sido transfectadas con el vector usando selección/amplificación con metotrexato. Las células huésped transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células huésped, seleccionar los transformantes, cultivar las células huésped y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo se usan técnicas estándar de biología molecular. Además, el método de síntesis de un anticuerpo recombinante puede consistir en cultivar una célula huésped en un medio de cultivo adecuado hasta que se sintetice un anticuerpo recombinante. El método puede comprender además aislar el anticuerpo recombinante del medio de cultivo.
[0370] Los métodos de preparación de anticuerpos monoclonales implican la preparación de líneas celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que tengan la especificidad deseada. Tales líneas celulares pueden producirse a partir de células del bazo obtenidas de un animal inmunizado. El animal puede inmunizarse con GFAP o un fragmento y/o variante del mismo. El péptido usado para inmunizar al animal puede comprender aminoácidos que codifican el Fc humano, por ejemplo, la región de fragmento cristalizable o la región de cola del anticuerpo humano. Las células del bazo pueden inmortalizarse, por ejemplo, mediante la fusión con un compañero de fusión de células de mieloma. Pueden emplear una variedad de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células del bazo y las células de mieloma pueden combinarse luego con un detergente no iónico durante unos minutos y luego inocularse en placas a baja densidad en un medio selectivo que favorezca el crecimiento de células híbridas, pero no de células de mieloma. Una de tales técnicas usa la selección con hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT). Otra técnica incluye la electrofusión. Después de un tiempo suficiente, habitualmente entre 1 y 2 semanas, se observan colonias de híbridos.
[0371] Se seleccionan colonias individuales y se analizan los sobrenadantes de sus cultivos para determinar su actividad de unión al polipéptido. Pueden usarse hibridomas que tengan alta reactividad y especificidad.
[0372] Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse a partir de los sobrenadantes de colonias de hibridomas en crecimiento. Además, para mejorar el rendimiento pueden emplearse varias técnicas, como la inyección de la línea celular de hibridoma en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado adecuado, como un ratón. A continuación, los anticuerpos monoclonales pueden recogerse del líquido ascítico o de la sangre. Los contaminantes pueden eliminarse de los anticuerpos mediante técnicas convencionales, como la cromatografía, la filtración en gel, la precipitación y la extracción. La cromatografía de afinidad es un ejemplo de un método que puede usarse en un proceso de purificación de anticuerpos.
[0373] La enzima proteolítica papaína escinde preferentemente las moléculas de IgG para producir varios fragmentos, dos de los cuales [los fragmentos F(ab)] comprenden cada uno un heterodímero covalente que incluye un sitio intacto de unión al antígeno. La enzima pepsina es capaz de escindir las moléculas de IgG para proporcionar varios fragmentos, incluyendo el fragmento F(ab')<2>, que comprende ambos sitios de unión al antígeno.
[0374] El fragmento Fv puede producirse mediante la escisión proteolítica preferencial de una molécula de inmunoglobulina de IgM y, en raras ocasiones, de IgG o IgA. El fragmento Fv puede derivarse usando técnicas recombinantes. El fragmento Fv incluye un heterodímero VH::VL no covalente que incluye un sitio de unión al antígeno que conserva gran parte de las capacidades de reconocimiento y de unión al antígeno de la molécula de anticuerpo nativa.
[0375] El anticuerpo, el fragmento de anticuerpo o el derivado pueden comprender un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada y cadena ligera, intercaladas respectivamente entre un conjunto de regiones marco (FR) de cadena pesada y cadena ligera que proporcionan soporte a las CDR y definen la relación espacial de las CDR unas con respecto a las otras. El conjunto de CDR puede contener tres regiones hipervariables de una región V de cadena pesada o ligera.
[0376] Para producir o aislar anticuerpos de la especificidad requerida pueden usarse otros métodos adecuados, que incluyen pero no se limitan a, métodos que seleccionan un anticuerpo recombinante de una biblioteca de péptidos o proteínas (por ejemplo, pero no limitados a, una biblioteca de presentación en bacteriófagos, ribosomas, oligonucleótidos, ARN, ADNc, levaduras o similares); por ejemplo, como las disponibles de varios proveedores comerciales, tales como Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, Reino Unido), MorphoSys (Martinsreid/Planegg, Delaware), Biovation (Aberdeen, Escocia, Reino Unido) y BioInvent (Lund, Suecia), usando métodos conocidos en la técnica. Véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 4.704.692; 5.723.323; 5.763.192; 5.814.476; 5.817.483; 5.824.514; 5.976.862. Los métodos alternativos se basan en la inmunización de animales transgénicos (por ejemplo, ratones SCID, Nguyen et al. (1997) Microbiol. Immunol.41:901-907; Sandhu et al. (1996) Crit. Rev. Biotechnol.16:95-118; Eren et al. (1998) Immunol.93:154-161) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos, tal como se conoce en la técnica y/o como se describe en la presente. Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a, la presentación en ribosomas (Hanes et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942; Hanes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135); tecnologías de producción de anticuerpos de células únicas (por ejemplo, el método de anticuerpos linfocitarios seleccionados ("SLAM") (Patente de Estados Unidos Nº 5.627.052, Wen et al. (1987) J. Immunol.17:887-892; Babcook et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848); microgotas de gel y citometría de flujo (Powell et al. (1990) Biotechnol. 8:333-337; One Cell Systems, (Cambridge, Mass).; Gray et al. (1995) J. Imm. Meth. 182:155-163; Kenny et al. (1995) Bio/Technol. 13:787-790); selección de células B (Steenbakkers et al. (1994) Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994)).
[0377] Un anticuerpo madurado por afinidad puede producirse mediante cualquiera de una serie de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, véase Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992), donde se describe la maduración por afinidad mediante el reordenamiento de los dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de los residuos de la CDR y/o de la región marco se describe en Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310-3319 (1995); Hawkins et al, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992). La mutación selectiva en posiciones selectivas de mutagénesis y en posiciones de contacto o hipermutación con un residuo de aminoácido que potencia la actividad se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 6.914.128 B1.
[0378] Las variantes de anticuerpos también pueden prepararse usando la administración de un polinucleótido que codifique un anticuerpo para un huésped adecuado, como para proporcionar animales transgénicos o mamíferos, como cabras, vacas, caballos, ovejas y similares, que producen dichos anticuerpos en su leche. Estos métodos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.827.690; 5.849.992; 4.873.316; 5.849.992; 5.994.616; 5.565.362; y 5.304.489.
[0379] [0211] Las variantes de anticuerpos también pueden prepararse mediante la administración de un polinucleótido para proporcionar plantas transgénicas y células vegetales cultivadas (por ejemplo, pero no limitadas a, tabaco, maíz y lenteja de agua) que produzcan dichos anticuerpos, partes específicas o variantes en las partes de la planta o en las células cultivadas a partir de ellas. Por ejemplo, Cramer et al. (1999) Curr. Top. Microbiol. Immunol.240:95-118 y las referencias citadas en el mismo, describen la producción de hojas de tabaco transgénicas que expresan grandes cantidades de proteínas recombinantes, por ejemplo, usando un promotor inducible. Para expresar proteínas de mamíferos a niveles de producción comercial, con actividades biológicas equivalentes a las producidas en otros sistemas recombinantes o purificadas a partir de fuentes naturales se ha usado maíz transgénico. Véase, por ejemplo, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. (1999) 464:127-147 y las referencias citadas en el mismo. También se han producido grandes cantidades de variantes de anticuerpos a partir de semillas de plantas transgénicas, incluyendo fragmentos de anticuerpos, como anticuerpos de cadena única (scFv), incluyendo semillas de tabaco y tubérculos de patata. Véase, por ejemplo, Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol.38:101-109 y las referencias citadas en el mismo. Por tanto, los anticuerpos también pueden producirse usando plantas transgénicas, de acuerdo con métodos conocidos.
[0380] Los derivados de anticuerpos pueden producirse, por ejemplo, añadiendo secuencias exógenas para modificar la inmunogenicidad o reducir, mejorar o modificar la unión, la afinidad, la constante de asociación, la constante de disociación, la avidez, la especificidad, la vida media o cualquier otra característica adecuada. En general, se mantiene parte o la totalidad de las secuencias de CDR no humanas o humanas, mientras que las secuencias no humanas de las regiones variables y constantes se sustituyen por aminoácidos humanos u otros aminoácidos.
[0381] Los fragmentos pequeños de anticuerpos pueden ser diacuerpos que tengan dos sitios de unión a antígenos, en los que los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH VL). Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448. Al usar un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Véase también, la Patente de Estados Unidos Nº 6.632.926 de Chen et al., que divulga variantes de anticuerpos que tienen uno o más aminoácidos insertados en una región hipervariable del anticuerpo original y una afinidad de unión por un antígeno diana que es por lo menos dos veces más fuerte que la afinidad de unión del anticuerpo original por el antígeno.
[0382] El anticuerpo puede ser un anticuerpo lineal. El procedimiento para elaborar un anticuerpo lineal se conoce en la técnica y se describe en Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062. Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que forman un par de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
[0383] Los anticuerpos pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante métodos conocidos que incluyen, pero no se limitan a, la purificación con proteína A, la precipitación con sulfato de amonio o etanol, la extracción con ácido, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la cromatografía con fosfocelulosa, la cromatografía de interacción hidrófoba, la cromatografía por afinidad, la cromatografía con hidroxiapatita y la cromatografía con lectina. Para la purificación también puede usarse cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC").
[0384] Puede ser útil marcar detectablemente el anticuerpo. En la técnica se conocen los métodos para conjugar anticuerpos con estos agentes. Solamente a modo de ilustración, los anticuerpos pueden marcarse con una fracción detectable, como un átomo radiactivo, un cromóforo, un fluoróforo o similar. Tales anticuerpos marcados pueden usarse para técnicas de diagnóstico, ya sea in vivo o en una muestra de prueba aislada. Pueden enlazarse a una citoquina, a un ligando o a otro anticuerpo. Los agentes adecuados para el acoplamiento con los anticuerpos con el fin de lograr un efecto antitumoral incluyen citoquinas, como la interleucina 2 (IL-2) y el factor de necrosis tumoral (TNF); fotosensibilizadores, para su uso en terapia fotodinámica, incluyendo tetrasulfonato de ftalocianina de aluminio (III), hematoporfirina y ftalocianina; radionucleidos, tales como el yodo-131 (1311), el itrio-90 (90Y), el bismuto-212 (212Bi), el bismuto-213 (213Bi), el tecnecio-99m (99mTc), el renio-186 (186Re) y el renio-188 (188Re); antibióticos, como la doxorrubicina, la adriamicina, la daunorrubicina, el metotrexato, la daunomicina, la neocarzinostatina y el carboplatino; toxinas bacterianas, vegetales y de otro tipo, como la toxina diftérica, la exotoxina A de Pseudomonas, la enterotoxina A estafilocócica, la toxina abrina-A, la ricina A (ricina A desglucosilada y ricina A nativa), la toxina TGF-alfa, la citotoxina de la cobra china (Naja naja atra) y la gelonina (una toxina vegetal); proteínas inactivadoras de ribosomas procedentes de plantas, bacterias y hongos, como la restrictocina (una proteína inactivadora de ribosomas producida por Aspergillus restrictus), la saporina (una proteína inactivadora de ribosomas de Saponaria officinalis) y la RNasa; inhibidores de la tirosina quinasa; ly207702 (un nucleósido de purina difluorado); liposomas que contienen agentes anticísticos (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, plásmidos que codifican toxinas, metotrexato, etc.); y otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, como F(ab).
[0385] A continuación se describe con más detalle la producción de anticuerpos mediante el uso de la tecnología de hibridomas, el método de anticuerpos linfocitarios seleccionados (SLAM), animales transgénicos y bibliotecas de anticuerpos recombinantes.
[0386] (1) Anticuerpos monoclonales anti-GFAP usando tecnología de hibridoma
[0387] Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de presentación en fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando técnicas de hibridoma, incluyendo las conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, segunda edición, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988); Hammerling, et al., In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, (Elsevier, N.Y., 1981). También se señala que el término "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en la presente no se limita a los anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un único clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no al método por el que se produce.
[0388] Los métodos para generar anticuerpos monoclonales, así como los anticuerpos producidos mediante el método, pueden comprender cultivar una célula de hibridoma que secreta un anticuerpo usado en la invención, en el que, preferiblemente, el hibridoma se genera mediante la fusión de esplenocitos aislados de un animal, por ejemplo, una rata o un ratón, inmunizados con GFAP con células de mieloma y, a continuación, cribando los hibridomas resultantes de la fusión para obtener clones de hibridoma que secretan un anticuerpo capaz de unirse a GFAP. Brevemente, las ratas pueden inmunizarse con un antígeno de GFAP. En una realización preferida, el antígeno de GFAP se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmunitaria. Tales adyuvantes incluyen el adyuvante completo o incompleto de Freund, RIBI (dipéptidos muramílicos) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes). Tales adyuvantes pueden proteger al polipéptido de una rápida dispersión al secuestrarlo en un depósito local, o pueden contener sustancias que estimulan al huésped para que secrete factores que sean quimiotácticos para los macrófagos y otros componentes del sistema inmunitario. Preferiblemente, si se administra un polipéptido, el programa de inmunización implicará dos o más administraciones del polipéptido, repartidas a lo largo de varias semanas; sin embargo, también puede usarse una única administración del polipéptido.
[0389] Después de la inmunización de un animal con un antígeno de GFAP, pueden obtenerse anticuerpos y/o células productoras de anticuerpos del animal. Se obtiene un suero que contiene anticuerpos anti-GFAP del animal mediante sangrado o sacrificando al animal. El suero puede usarse tal y como se obtiene del animal, puede obtenerse una fracción de inmunoglobulina del suero o pueden purificarse los anticuerpos anti-GFAP del suero. El suero o las inmunoglobulinas obtenidos de esta manera son policlonales, por lo que tienen una serie heterogénea de propiedades.
[0390] Una vez que se ha detectado una respuesta inmunitaria, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos para el antígeno de GFAP en el suero de rata, se extrae el bazo de la rata y se aíslan los esplenocitos. A continuación, los esplenocitos se fusionan mediante técnicas bien conocidas con cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo, células de la línea celular SP20 disponible en la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia, EE. UU.). Los hibridomas se seleccionan y clonan mediante dilución limitada. A continuación, los clones de hibridoma se analizan mediante métodos conocidos en la técnica para detectar células que secretan anticuerpos capaces de unirse a GFAP. El líquido ascítico, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, puede generarse inmunizando ratas con clones de hibridoma positivos.
[0391] En otra realización, a partir del animal inmunizado pueden prepararse hibridomas inmortalizados productores de anticuerpos. Después de la inmunización, se sacrifica al animal y se fusionan las células B esplénicas con células de mieloma inmortalizadas, como es bien conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, supra. En una realización preferida, las células de mieloma no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (una línea celular no secretora). Después de la fusión y la selección con antibióticos, los hibridomas se criban usando GFAP, o una parte de la misma, o una célula que exprese GFAP. En una realización preferida, el cribado inicial se realiza usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA), preferiblemente un ELISA. En la Publicación de PCT Nº WO 00/37504 se proporciona un ejemplo de cribado por ELISA.
[0392] Los hibridomas productores de anticuerpos anti-GFAP se seleccionan, clonan y se criban adicionalmente para determinar sus características deseables, que incluyen un crecimiento robusto del hibridoma, alta producción de anticuerpos y características deseables de los anticuerpos. Los hibridomas pueden cultivarse y expandirse in vivo en animales singénicos, en animales que carecen de sistema inmunitario, por ejemplo, ratones desnudos, o en cultivos celulares in vitro. Los métodos de selección, clonación y expansión de hibridomas son bien conocidos por los expertos en la materia.
[0393] En una realización preferida, los hibridomas son hibridomas de rata. En otra realización, los hibridomas se producen en especies no humanas y no de ratas, como ratones, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. En otra realización preferida más, los hibridomas son hibridomas humanos, en los que un mieloma humano no secretor se fusiona con una célula humana que expresa un anticuerpo anti-GFAP.
[0394] [0225] Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos pueden generarse mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')<2>pueden producirse mediante la escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas como la papaína (para producir dos fragmentos Fab idénticos) o la pepsina (para producir un fragmento F(ab')<2>). Un fragmento F(ab')<2>de una molécula de IgG conserva los dos sitios de unión al antígeno de la molécula de IgG más grande ("original"), que incluye ambas cadenas ligeras (que contienen las regiones de cadena ligera variable y cadena ligera constante), los dominios CH1 de las cadenas pesadas y una región bisagra formadora de disulfuro de la molécula de IgG original. Por consiguiente, un fragmento F(ab')<2>sigue siendo capaz de entrecruzar moléculas de antígeno como la molécula IgG original.
[0395] (2) Anticuerpos monoclonales anti-GFAP usando SLAM
[0396] Alternativamente, los anticuerpos recombinantes se generan a partir de linfocitos aislados individuales usando un procedimiento conocido en la técnica como el método de anticuerpos de linfocitos seleccionados (SLAM), tal como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.627.052; la Publicación de PCT Nº WO 92/02551; y Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 7843-7848 (1996). En este método, las células individuales secretoras de anticuerpos de interés, por ejemplo, linfocitos derivados de cualquiera de los animales inmunizados, se criban usando un ensayo de placa hemolítica específica de antígeno, en el que el antígeno de GFAP, una subunidad de GFAP o un fragmento de los mismos, se acopla a glóbulos rojos de oveja usando un conector, como la biotina, y se usa para identificar células individuales que secretan anticuerpos con especificidad para GFAP. Después de la identificación de las células secretoras de anticuerpos de interés, se rescatan los ADNc de la región variable de la cadena pesada y ligera de las células mediante PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) y, a continuación, estas regiones variables pueden expresarse, en el contexto de regiones constantes de inmunoglobulina apropiadas (por ejemplo, regiones constantes humanas), en células huésped de mamíferos, como células COS o CHO. Las células huésped transfectadas con las secuencias de inmunoglobulina amplificadas, derivadas de linfocitos seleccionados in vivo, pueden someterse a un análisis y una selección adicionales in vitro, por ejemplo, mediante la selección por cribado de las células transfectadas para aislar las células que expresan anticuerpos contra la GFAP. Las secuencias de inmunoglobulina amplificadas pueden manipularse adicionalmente in vitro, por ejemplo, mediante un método de maduración por afinidad in vitro. Véase, por ejemplo, la Publicación de PCT Nº WO 97/29131 y la Publicación de PCT Nº WO 00/56772.
[0397] (3) Anticuerpos monoclonales anti-GFAP usando animales transgénicos
[0398] Alternativamente, los anticuerpos se producen inmunizando a un animal no humano que comprende parte o la totalidad del locus de inmunoglobulina humana con un antígeno de GFAP. En una realización, el animal no humano es un ratón transgénico XENOMOUSE®, una cepa de ratón manipulada que comprende fragmentos grandes de los loci de inmunoglobulina humana y es deficiente en la producción de anticuerpos de ratón. Véanse, por ejemplo, Green et al., Nature Genetics, 7: 13-21 (1994) y las Patentes de Estados Unidos Nº 5.916.771; 5.939.598; 5.985.615; 5.998.209; 6.075.181; 6.091.001; 6.114.598; y 6.130.364. Véanse también las Publicaciones de PCT Nº WO 91/10741; WO 94/02602; WO 96/34096; WO 96/33735; WO 98/16654; WO 98/24893; WO 98/50433; WO 99/45031; WO 99/53049; WO 00/09560; y WO 00/37504. El ratón transgénico XENOMOUSE® produce un repertorio de anticuerpos humanos totalmente humanos similar al de los adultos y genera anticuerpos monoclonales humanos específicos para antígenos. El ratón transgénico XENOMOUSE® contiene aproximadamente el 80% del repertorio de anticuerpos humanos mediante la introducción de fragmentos YAC de configuración germinal del tamaño de megabases de los loci de la cadena pesada humana y los loci de la cadena ligera x. Véase Mendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997), Green y Jakobovits, J. Exp. Med., 188: 483-495 (1998).
[0399] (4) Anticuerpos monoclonales anti-GFAP usando bibliotecas de anticuerpos recombinantes
[0400] Para producir los anticuerpos usados en la invención también pueden usarse métodos in vitro, en los que se criba una biblioteca de anticuerpos para identificar un anticuerpo que tenga la especificidad de unión a GFAP deseada. Los métodos para dicho cribado de bibliotecas de anticuerpos recombinantes son bien conocidos en la técnica e incluyen métodos descritos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.223.409 (Ladner et al.); la Publicación de PCT Nº WO 92/18619 (Kang et al.); la Publicación de PCT Nº WO 91/17271 (Dower et al.); la Publicación de PCT Nº WO 92/20791 (Winter et al.); la Publicación de PCT Nº WO 92/15679 (Markland et al.); la Publicación de PCT Nº WO 93/01288 (Breitling et al.); la Publicación de PCT Nº WO 92/01047 (McCafferty et al.); la Publicación de PCT Nº WO 92/09690 (Garrard et al.); Fuchs et al., Bio/Technology, 9: 1369-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3: 81-85 (1992); Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992); Garrard et al., Bio/Technology, 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991); Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2003/0186374; y la Publicación de PCT Nº WO 97/29131.
[0401] [0229] La biblioteca de anticuerpos recombinantes puede proceder de un sujeto inmunizado con GFAP o una parte de GFAP. Alternativamente, la biblioteca de anticuerpos recombinantes puede proceder de un sujeto que no se ha sometido a tratamiento previo, es decir, uno que no haya sido inmunizado con GFAP, como una biblioteca de anticuerpos humanos de un sujeto humano que no haya sido inmunizado con GFAP humano. Los anticuerpos usados en la invención se seleccionan mediante el cribado de la biblioteca de anticuerpos recombinantes con el péptido que comprende GFAP humano para seleccionar de este modo aquellos anticuerpos que reconocen GFAP. Los métodos para llevar a cabo dicho cribado y selección son bien conocidos en la técnica, tal como se describe en las referencias del párrafo anterior. Para seleccionar los anticuerpos usados en la invención que tienen afinidades de unión particulares por GFAP, como los que se disocian de la GFAP humana con una constante de disociación, puede usarse el método conocido en la técnica de resonancia de plasmones de superficie para seleccionar anticuerpos que tengan la constante de disociación deseada. Para seleccionar anticuerpos usados en la invención que tengan una actividad neutralizante particular para hGFAP, tales como aquellos con una IC<50>particular<,>pueden usarse métodos estándar conocidos en la técnica para evaluar la inhibición de la actividad de GFAP.
[0403] En un aspecto, la invención usa un anticuerpo aislado, o una parte del mismo que se une al antígeno, que se une a la GFAP humana. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante. En varias realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante o un anticuerpo monoclonal.
[0405] Por ejemplo, los anticuerpos también pueden generarse usando varios métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación en fagos, los dominios funcionales de los anticuerpos se presentan en la superficie de partículas de fagos que transportan las secuencias de polinucleótidos que los codifican. Dichos fagos pueden utilizarse para presentar dominios de unión a antígenos expresados a partir de un repertorio o una biblioteca combinatoria de anticuerpos (por ejemplo, humanos o murinos). Los fagos que expresan un dominio de unión a antígenos que se une al antígeno de interés pueden seleccionarse o identificarse con antígenos, por ejemplo, usando antígenos marcados o antígenos unidos o capturados a una superficie sólida o a una perla. Los fagos usados en estos métodos son típicamente fagos filamentosos que incluyen dominios de unión fd y M13 expresados a partir de fagos con dominios de anticuerpos Fab, Fv o Fv estabilizados con disulfuro fusionados recombinantemente a la proteína del gen III o del gen VIII del fago. Los ejemplos de métodos de presentación en fagos que pueden usarse para elaborar los anticuerpos incluyen los divulgados en Brinkmann et al., J. Immunol. Methods, 182: 41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods, 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene, 187: 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology, 57: 191-280 (1994); Publicación de PCT Nº WO 92/01047; Publicaciones de PCT Nº WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y Patentes de Estados Unidos Nº 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743; y 5.969.108.
[0407] Tal como se describe en las referencias anteriores, después de la selección en fagos, las regiones codificantes de anticuerpos del fago pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de unión a antígenos deseado, y expresarse en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo, tal y como se describe detalladamente a continuación. Por ejemplo, también pueden emplearse técnicas para producir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' y F(ab')<2>usando métodos conocidos en la técnica, como los divulgados en la Publicación de PCT Nº WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques, 12(6): 864-869 (1992); Sawai et al., Am. J. Reprod. Immunol., 34: 26-34 (1995); y Better et al., Science, 240: 1041-1043 (1988). Los ejemplos de técnicas que pueden usarse para producir Fv y anticuerpos de cadena única incluyen los descritos en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science, 240: 1038-1041 (1988).
[0409] Como alternativa al cribado de bibliotecas de anticuerpos recombinantes mediante presentación en fagos, a la identificación de anticuerpos usados en la invención se le pueden aplicar otras metodologías conocidas en la técnica para el cribado de bibliotecas combinatorias grandes. Un tipo de sistema de expresión alternativo es aquel en el que la biblioteca de anticuerpos recombinantes se expresa como fusiones de ARN-proteína, tal como se describe en la Publicación de PCT Nº WO 98/31700 (Szostak y Roberts), y en Roberts y Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297-12302 (1997). En este sistema, se crea una fusión covalente entre un ARNm y el péptido o proteína que codifica mediante la traducción in vitro de ARNm sintéticos que llevan puromicina, un antibiótico aceptor de péptidos, en su extremo 3'. Por tanto, a partir de una mezcla compleja de ARNm (por ejemplo, una biblioteca combinatoria) puede enriquecerse un ARNm específico basándose en las propiedades del péptido o proteína codificados, por ejemplo, un anticuerpo o parte del mismo, como la unión del anticuerpo o parte del mismo al antígeno de especificidad dual. Las secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos, o partes de los mismos, recuperadas del cribado de dichas bibliotecas pueden expresarse por medios recombinantes como se ha descrito con anterioridad (por ejemplo, en células huésped de mamíferos) y, además, pueden someterse a una maduración por afinidad adicional mediante rondas adicionales de cribado de fusiones de ARNm-péptido en las que se han introducido mutaciones en la secuencia o secuencias seleccionadas originalmente, o mediante otros métodos para la maduración por afinidad in vitro de anticuerpos recombinantes, como se ha descrito con anterioridad. Un ejemplo preferido de esta metodología es la tecnología de visualización PROfusion.
[0411] En otro enfoque, los anticuerpos también pueden generarse usando métodos de presentación en levadura conocidos en la técnica. En los métodos de presentación en levadura, se usan métodos genéticos para atar los dominios de los anticuerpos a la pared celular de la levadura y presentarlos en la superficie de la levadura. En particular, dicha levadura puede utilizarse para presentar dominios de unión a antígenos expresados a partir de un repertorio o una biblioteca combinatoria de anticuerpos (por ejemplo, humanos o murinos). Los ejemplos de métodos de presentación en levadura que pueden usarse para elaborar los anticuerpos incluyen los divulgados en la Patente de Estados Unidos Nº 6.699.658 (Wittrup et al.)
[0412] d. Producción de anticuerpos recombinantes contra GFAP
[0413] Los anticuerpos pueden producirse mediante cualquiera de una serie de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la expresión a partir de células huésped, en la que el vector o vectores de expresión que codifican las cadenas pesadas y ligeras se transfectan en una célula huésped mediante técnicas estándar. Se pretende que las varias formas del término "transfección" abarquen una amplia variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, transfección con DEAE-dextrano y similares. Aunque es posible expresar los anticuerpos usados en la invención en células huésped procariotas o eucariotas, se prefiere la expresión de anticuerpos en células eucariotas, y se prefiere aún más en células huésped de mamíferos, ya que dichas células eucariotas (y en particular las células de mamíferos) son más propensas que las células procariotas a ensamblar y secretar un anticuerpo correctamente plegado e inmunológicamente activo.
[0414] Las células huésped de mamíferos ejemplares para expresar los anticuerpos recombinantes usados en la invención incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) (incluyendo las células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980), usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982), células de mieloma NS0, células COS y células SP2. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpos en células huésped de mamíferos, los anticuerpos se producen cultivando las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se cultivan las células huésped. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando métodos estándar de purificación de proteínas.
[0415] Las células huésped también pueden usarse para producir fragmentos de anticuerpos funcionales, como fragmentos Fab o moléculas scFv. Se entenderá que en el procedimiento anterior pueden realizarse variaciones. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula huésped con ADN que codifique fragmentos funcionales de la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo de la presente invención. La tecnología del ADN recombinante también puede usarse para eliminar parte o la totalidad del ADN que codifica una o ambas cadenas ligeras y pesadas que no son necesarias para la unión a los antígenos de interés. Las moléculas expresadas a partir de dichas moléculas de ADN truncadas también están comprendidas en los anticuerpos de la invención. Además, pueden producirse anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una cadena ligera son un anticuerpo usado en la invención (es decir, se une a GFAP humana) y la otra cadena pesada y ligera son específicas para un antígeno distinto de la GFAP humana mediante la reticulación de un anticuerpo usado en la invención con un segundo anticuerpo mediante métodos químicos de reticulación estándar.
[0416] En un sistema preferido para la expresión recombinante de un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, usado en la invención, se introduce en células dhfr-CHO un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo mediante transfección mediada por fosfato cálcico. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo están enlazados operativamente a elementos reguladores del potenciador de CMV/promotor de AdMLP para impulsar altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también lleva un gen DHFR, que permite la selección de células CHO que han sido transfectadas con el vector usando selección/amplificación con metotrexato. Se cultivan las células huésped transformantes seleccionadas para permitir la expresión de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células huésped, seleccionar los transformantes, cultivar las células huésped y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo se usan técnicas estándar de biología molecular. Además, la presente divulgación describe un método para sintetizar un anticuerpo recombinante usado en la invención mediante el cultivo de una célula huésped en un medio de cultivo adecuado hasta que se sintetiza un anticuerpo recombinante. El método puede comprender además el aislamiento del anticuerpo recombinante a partir del medio de cultivo.
[0417] (1) Anticuerpo humanizado
[0418] El anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo o una variante, derivado, análogo o porción del mismo que se une inmunospecíficamente a un antígeno de interés y que comprende una región marco (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano y una región determinante de la complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. El anticuerpo humanizado puede proceder de un anticuerpo de especie no humana que se une al antígeno deseado y que tiene una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la especie no humana y regiones marco de una molécula de inmunoglobulina humana.
[0419] [0240] Tal como se usa en la presente, el término "sustancialmente" en el contexto de una CDR se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 98% o por lo menos un 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de una CDR de anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todos de por lo menos uno, y típicamente dos, los dominios variables (Fab, Fab', F(ab')<2>, FabC, Fv), en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, el anticuerpo donante) y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. De acuerdo con un aspecto, un anticuerpo humanizado también comprende por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado contiene tanto la cadena ligera como por lo menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado solo contiene una cadena ligera humanizada. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado solo contiene una cadena pesada humanizada. En realizaciones específicas, un anticuerpo humanizado solo contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o de una cadena pesada.
[0421] El anticuerpo humanizado puede seleccionarse entre cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo, sin limitación, IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo, y pueden seleccionarse dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas usando técnicas bien conocidas en la técnica.
[0423] No es necesario que las regiones marco y CDR de un anticuerpo humanizado se correspondan con precisión a las secuencias originales, por ejemplo, la región CDR del anticuerpo donante o la región marco de consenso pueden mutarse mediante la sustitución, inserción y/o deleción de por lo menos un residuo de aminoácidos, de tal manera que el residuo de la CDR o de la región marco en ese sitio no se corresponda ni con el anticuerpo donante ni con la región marco de consenso. Sin embargo, en una realización, tales mutaciones no serán extensas. Habitualmente, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98% o por lo menos el 99% de los residuos del anticuerpo humanizado se corresponderán con los de las secuencias de FR y CDR originales. Tal como se usa en la presente, el término "región marco de consenso" se refiere a la región marco en la secuencia de inmunoglobulina de consenso. Tal como se usa en la presente, el término "secuencia de inmunoglobulina de consenso" se refiere a la secuencia formada a partir de los aminoácidos (o nucleótidos) que aparecen con mayor frecuencia en una familia de secuencias de inmunoglobulina relacionadas (véase, por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania 1987)). En una familia de inmunoglobulinas, cada posición de la secuencia de consenso está ocupada por el aminoácido que aparece con mayor frecuencia en esa posición en la familia. Si dos aminoácidos aparecen con la misma frecuencia, en la secuencia de consenso puede incluirse cualquiera de ellos.
[0425] El anticuerpo humanizado puede diseñarse para minimizar la respuesta inmunológica no deseada hacia los anticuerpos antihumanos de roedores, lo que limita la duración y la eficacia de las aplicaciones terapéuticas de esas fracciones en receptores humanos. El anticuerpo humanizado puede tener uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo procedentes de una fuente no humana. Estos residuos no humanos se denominan a menudo residuos "importados", que típicamente se toman de un dominio variable. La humanización puede realizarse sustituyendo secuencias de regiones hipervariables por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos en los que se ha sustituido sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567. El anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo humano en el que algunos residuos de la región hipervariable, y posiblemente algunos residuos de FR, se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La humanización o la manipulación de los anticuerpos de la presente divulgación puede realizarse usando cualquier método conocido como, pero no limitados a, los descritos en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.723.323; 5.976.862; 5.824.514; 5.817.483; 5.814.476; 5.763.192; 5.723.323; 5.766.886; 5.714.352; 6.204.023; 6.180.370; 5.693.762; 5.530.101; 5.585.089; 5.225.539; y 4.816.567.
[0427] El anticuerpo humanizado puede conservar una alta afinidad por la GFAP y otras propiedades biológicas favorables. El anticuerpo humanizado puede prepararse mediante un proceso de análisis de las secuencias originales y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina están comúnmente disponibles. Hay disponibles programas informáticos que ilustran y muestran las estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite analizar la función probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, pueden seleccionarse y combinarse los residuos FR de las secuencias receptoras e importadas de manera que se logren las características deseadas del anticuerpo, como una mayor afinidad por la GFAP. En general, los residuos de la región hipervariable pueden participar de manera directa y sustancial en la influencia de la unión al antígeno.
[0429] [0245] Como alternativa a la humanización, pueden generarse anticuerpos humanos (también denominados en la presente "anticuerpos totalmente humanos"). Por ejemplo, es posible aislar anticuerpos humanos de bibliotecas mediante PROfusion y/o tecnologías relacionadas con la levadura. También es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones que, tras la inmunización, son capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulina). Por ejemplo, la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (J<H>) en ratones quiméricos y mutantes de la línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz del gen de la inmunoglobulina de la línea germinal humana en tales ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno. Los anticuerpos humanizados o totalmente humanos pueden prepararse de acuerdo con los métodos descritos en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.770.429; 5.833.985; 5.837.243; 5.922.845; 6.017.517; 6.096.311; 6.111.166; 6.270.765; 6.303.755; 6.365.116; 6.410.690; 6.682.928; y 6.984.720.
[0430] e. Anticuerpos anti-GFAP
[0431] Los anticuerpos anti-GFAP pueden generarse usando las técnicas descritas anteriormente, así como usando técnicas rutinarias conocidas en la técnica. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-GFAP puede ser un anticuerpo contra GFAP no conjugado, tal como los anticuerpos contra GFAP disponibles de Dako (número de catálogo: M0761), ThermoFisher Scientific (números de catálogo: MAS-12023, A-21282, 13-0300, MA1-19170, MA1-19395, MA5-15086, MA5-16367, MA1-35377, MA1-06701 o MA1-20035), AbCam (números de catálogo: ab10062, ab4648, ab68428, ab33922, ab207165, ab190288, ab115898 o ab21837), EMD Millipore (números de catálogo: FCMAB257P, MAB360, MAB3402, 04-1031, 04-1062, MAB5628), Santa Cruz (números de catálogo: sc-166481, sc-166458, sc-58766, sc-56395, sc-51908, sc-135921, sc-71143, sc-65343 o sc-33673), Sigma-Aldrich (números de catálogo: G3893 o G6171) o Sino Biological Inc. (número de catálogo: 100140-R012-50). El anticuerpo anti-GFAP puede estar conjugado con un fluoróforo, como los anticuerpos contra GFAP conjugados disponibles de ThermoFisher Scientific (números de catálogo: A-21295 o A-21294), EMD Millipore (números de catálogo: MAB3402X, MAB3402B, MAB3402B o MAB3402C3) o AbCam (números de catálogo: ab49874 o ab194325).
[0432] 5. Una mejora de un método para evaluar el estado de GFAP de un sujeto como medida de traumatismo craneoencefálico
[0433] En otra realización más, la presente divulgación se refiere a una mejora de un método para evaluar el estado de GFAP de un sujeto como medida de un traumatismo craneoencefálico mediante la evaluación de la presencia o la cantidad de GFAP en una muestra biológica. La mejora consiste en que el método permite que el ensayo mida hasta 50.000 pg/ml de GFAP y no requiere la dilución de la muestra biológica. En algunas realizaciones, si el GFAP es el único biomarcador que se está evaluando, la mejora incluye además usar el método con un dispositivo de punto de atención. El método se lleva a cabo usando un primer miembro de unión específico y un segundo miembro de unión específico que se unen específicamente al GFAP y forman primeros complejos que incluyen el primer miembro de unión específico-GFAP-segundo miembro de unión específico. En algunas realizaciones, el segundo miembro de unión específico está marcado con un marcador detectable.
[0434] Otros métodos de detección incluyen el uso o pueden adaptarse para su uso en un dispositivo de nanoporos o un dispositivo de nanopocillos, por ejemplo, para la detección de moléculas individuales. Ejemplos de dispositivos de nanoporos se describen en la Publicación de Patente Internacional Nº WO 2016/161402. Ejemplos de dispositivos de nanopocillos se describen en la Publicación de Patente Internacional Nº WO 2016/161400. Para la detección de moléculas individuales también pueden emplearse otros dispositivos y métodos adecuados.
[0435] 6. Variaciones en los métodos
[0436] Los métodos divulgados para determinar la presencia o la cantidad de analito de interés (GFAP) presente en una muestra pueden ser los descritos en la presente. Los métodos también pueden adaptarse teniendo en cuenta otros métodos para analizar analitos. Los ejemplos de variaciones bien conocidas incluyen, pero no se limitan a, los inmunoensayos, como los inmunoensayos tipo sándwich (por ejemplo, inmunoensayos tipo sándwich monoclonalmonoclonal, inmunoensayos tipo sándwich monoclonal-policlonal, incluyendo la detección enzimática (inmunoensayo enzimático (EIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inhibición competitiva inmunoensayo (por ejemplo, directo e inverso), técnica de inmunoensayo multiplicado por enzimas (EMIT), un ensayo de unión competitiva, transferencia de energía por resonancia bioluminiscente (BRET), ensayo de detección de anticuerpos en un solo paso, ensayo homogéneo, ensayo heterogéneo, ensayo de captura en tiempo real, etc.
[0437] a. Inmunoensayo
[0438] El analito de interés y/o los péptidos de los fragmentos del mismo (por ejemplo, GFAP y/o péptidos o fragmentos de la misma, es decir, fragmentos de GFAP) pueden analizarse usando anticuerpos contra GFAP en un inmunoensayo. La presencia o la cantidad de analito (por ejemplo, GFAP) puede determinarse usando anticuerpos y detectando la unión específica al analito (por ejemplo, GFAP). Por ejemplo, el anticuerpo, o un fragmento del mismo, puede unirse específicamente al analito (por ejemplo, GFAP). Si se desea, pueden usarse uno o más de los anticuerpos en combinación con uno o más anticuerpos monoclonales/policlonales disponibles en el mercado. Tales anticuerpos están disponibles de empresas como R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN) y Enzo Life Sciences International, Inc. (Plymouth Meeting, PA).
[0439] La presencia o la cantidad de analito (por ejemplo, GFAP) presente en una muestra corporal puede determinarse fácilmente usando un inmunoensayo, como un inmunoensayo tipo sándwich (por ejemplo, inmunoensayos tipo sándwich monoclonal-monoclonal, inmunoensayos tipo sándwich monoclonal-policlonal, incluyendo la detección de radioisótopos (radioinmunoensayo (RIA)) y la detección de enzimas (inmunoensayo enzimático (EIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (por ejemplo, ensayos ELISA Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN)). Un ejemplo de un dispositivo para el punto de atención que puede usarse es el i-STAT® (Abbott, Laboratories, Abbott Park, IL). Otros métodos que pueden usarse incluyen un inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscentes, en particular uno que emplee el analizador automatizado ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), como ejemplo. Otros métodos incluyen, por ejemplo, la espectrometría de masas y la inmunohistoquímica (por ejemplo, con secciones de biopsias de tejido), usando anticuerpos anti-analito (por ejemplo, anti-GFAP) (monoclonales, policlonales, quiméricos, humanizados, humanos, etc.) o fragmentos de anticuerpos contra el analito (por ejemplo, GFAP). Otros métodos de detección incluyen los descritos, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.143.576; 6.113.855; 6.019.944; 5.985.579; 5.947.124; 5.939.272; 5.922.615; 5.885.527; 5.851.776; 5.824.799; 5.679.526; 5.525.524; y 5.480.792. La unión inmunológica específica del anticuerpo al analito (por ejemplo, GFAP) puede detectarse mediante marcadores directos, como etiquetas fluorescentes o luminiscentes, metales y radionucleidos unidos al anticuerpo, o mediante marcadores indirectos, como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante.
[0441] El uso de anticuerpos inmovilizados o fragmentos de anticuerpos de los mismos puede incorporarse al inmunoensayo. Los anticuerpos pueden inmovilizarse en una variedad de soportes, tales como partículas de matriz magnética o cromatográfica, la superficie de una placa de ensayo (como pocillos de microtitulación), piezas de un material de sustrato sólido y similares. Una tira de ensayo puede prepararse recubriendo el anticuerpo o la pluralidad de anticuerpos en una matriz sobre un soporte sólido. A continuación, esta tira puede sumergirse en la muestra biológica de prueba y procesarse rápidamente mediante lavados y pasos de detección para generar una señal medible, como una mancha de color.
[0443] Puede usarse un formato homogéneo. Por ejemplo, después de que se haya obtenido la muestra de prueba de un sujeto, se prepara una mezcla. La mezcla contiene la muestra de prueba que se está evaluando para el analito (por ejemplo, GFAP), un primer compañero de unión específico y un segundo compañero de unión específico. El orden en el que se añaden la muestra de prueba, el primer compañero de unión específico y el segundo compañero de unión específico para formar la mezcla no es crítico. La muestra de prueba se pone en contacto simultáneamente con el primer compañero de unión específico y el segundo compañero de unión específico. En algunas realizaciones, el primer compañero de unión específico y cualquier GFAP contenida en la muestra de prueba pueden formar un primer complejo compañero de unión específico-analito (por ejemplo, GFAP)-antígeno, y el segundo compañero de unión específico puede formar un primer complejo compañero de unión específico-analito de interés (por ejemplo, GFAP)-segundo compañero de unión específico. En algunas realizaciones, el segundo compañero de unión específico y cualquier GFAP contenida en la muestra de prueba pueden formar un segundo complejo compañero de unión específico-analito (por ejemplo, GFAP)-antígeno, y el primer compañero de unión específico puede formar un primer complejo compañero de unión específico-analito de interés (por ejemplo, GFAP)-segundo compañero de unión específico. El primer compañero de unión específico puede ser un anticuerpo anti-analito (por ejemplo, un anticuerpo anti-GFAP que se une a un epítopo que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos tres aminoácidos contiguos (3) de la SEQ ID NO: 1). El segundo compañero de unión específico puede ser un anticuerpo anti-analito (por ejemplo, un anticuerpo anti-GFAP que se une a un epítopo que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos tres aminoácidos contiguos (3) de la SEQ ID NO: 1). Además, el segundo compañero de unión específico está marcado con o contiene un marcador detectable como se ha descrito con anterioridad.
[0445] Puede usarse un formato heterogéneo. Por ejemplo, después de que se haya obtenido la muestra de prueba de un sujeto, se prepara una primera mezcla. La mezcla contiene la muestra de prueba que se está evaluando para el analito (por ejemplo, GFAP) y un primer compañero de unión específico, en el que el primer compañero de unión específico y cualquier GFAP contenidos en la muestra de prueba forman un primer complejo de compañero de unión específico-analito (por ejemplo, GFAP)-antígeno. El primer compañero de unión específico puede ser un anticuerpo anti-analito (por ejemplo, un anticuerpo anti-GFAP que se une a un epítopo que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos tres aminoácidos contiguos (3) de la SEQ ID NO: 1). El orden en el que se añaden la muestra de prueba y el primer compañero de unión específico para formar la mezcla no es crítico.
[0447] [0255] El primer compañero de unión específico puede inmovilizarse en una fase sólida. La fase sólida usada en el inmunoensayo (para el primer compañero de unión específico y, opcionalmente, el segundo compañero de unión específico) puede ser cualquier fase sólida conocida en la técnica como, pero no limitadas a, una partícula magnética, una perla, un tubo de ensayo, una placa de microtitulación, una cubeta, una membrana, una molécula de andamiaje, una película, un papel de filtro, un disco y un chip. En aquellas realizaciones en las que la fase sólida es una perla, la perla puede ser una perla magnética o una partícula magnética. Las perlas/partículas magnéticas pueden ser ferromagnéticas, ferrimagnéticas, paramagnéticas, superparamagnéticas o ferrofluídicas. Los materiales ferromagnéticos ejemplares incluyen Fe, Co, Ni, Gd, Dy, CrO<2>, MnAs, MnBi, EuO y NiO/Fe. Lo ejemplos de materiales ferrimagnéticos incluyen, por ejemplo, NiFe<2>O<4>, CoFe<2>O<4>, Fe<3>O<4>(o FeO·Fe<2>O<3>)). Las perlas pueden tener una parte de núcleo sólida que es magnética y está rodeada por una o más capas no magnéticas. Alternativamente, la parte magnética puede ser una capa alrededor de un núcleo no magnético. El soporte sólido sobre el que se inmoviliza el primer miembro de unión específico puede almacenarse en forma seca o en un líquido. Las perlas magnéticas pueden someterse a un campo magnético antes o después que la muestra entre en contacto con una perla magnética sobre la que está inmovilizado el primer miembro de unión específico.
[0448] Después de que se haya formado la mezcla que contiene el complejo de antígeno del primer compañero de unión específico-analito (por ejemplo, GFAP), se elimina del complejo cualquier analito no unido (por ejemplo, GFAP) usando cualquier técnica conocida en la técnica. Por ejemplo, el analito no unido (por ejemplo, GFAP) puede eliminarse mediante lavado. Sin embargo, es deseable que el primer compañero de unión específico esté presente en exceso con respecto a cualquier analito (por ejemplo, GFAP) que haya en la muestra de prueba, de tal manera que todo el analito (por ejemplo, GFAP) presente en la muestra de prueba se una al primer compañero de unión específico.
[0449] Después de eliminar cualquier analito no unido (por ejemplo, GFAP), se añade a la mezcla un segundo compañero de unión específico para formar un primer complejo de compañero de unión específico-analito de interés (por ejemplo, GFAP)-segundo compañero de unión específico. El segundo compañero de unión específico puede ser un anticuerpo anti-analito (por ejemplo, un anticuerpo anti-GFAP que se une a un epítopo que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos tres aminoácidos contiguos (3) de la SEQ ID NO: 1). Además, el segundo compañero de unión específico está marcado con o contiene un marcador detectable como se ha descrito con anterioridad.
[0450] Al inmunoensayo puede incorporarse el uso de anticuerpos inmovilizados o fragmentos de anticuerpos de los mismos. Los anticuerpos pueden inmovilizarse en una variedad de soportes, tales como partículas de matriz magnética o cromatográfica (como una cuenta magnética), partículas de látex o partículas de látex de superficie modificada, polímero o película de polímero, plástico o película de plástico, sustrato plano, la superficie de una placa de ensayo (como pocillos de microtitulación), piezas de un material de sustrato sólido y similares. Puede prepararse una tira de ensayo recubriendo el anticuerpo o la pluralidad de anticuerpos en una matriz sobre un soporte sólido. A continuación, esta tira puede sumergirse en la muestra biológica de prueba y procesarse rápidamente mediante lavados y pasos de detección para generar una señal medible, como una mancha de color.
[0451] (1) Inmunoensayo tipo sándwich
[0452] Un inmunoensayo tipo sándwich mide la cantidad de antígeno entre dos capas de anticuerpos (es decir,por lo menos un anticuerpo de captura) y un anticuerpo de detección (es decir, por lo menos un anticuerpo de detección). El anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección se unen a diferentes epítopos en el antígeno, por ejemplo, el analito de interés, como la GFAP. Deseablemente, la unión del anticuerpo de captura a un epítopo no interfiera con la unión del anticuerpo de detección a un epítopo. Como anticuerpos de captura y detección en el inmunoensayo tipo sándwich pueden usarse anticuerpos monoclonales o policlonales.
[0453] En general, para separar y cuantificar el analito (por ejemplo, GFAP) en una muestra de prueba se emplean por lo menos dos anticuerpos. Más específicamente, los por lo menos dos anticuerpos se unen a ciertos epítopos del analito (por ejemplo, GFAP) formando un complejo inmunitario que se denomina "sándwich". Para capturar el analito (por ejemplo, GFAP) en la muestra de prueba pueden usarse uno o más anticuerpos (estos anticuerpos se denominan frecuentemente anticuerpo de "captura" o anticuerpos "de captura") y se usan uno o más anticuerpos para unir un marcador detectable (es decir, cuantificable) al sándwich (estos anticuerpos se denominan frecuentemente anticuerpo de "detección" o anticuerpos "de detección"). En un ensayo tipo sándwich, es deseable que la unión de un anticuerpo a su epítopo no se vea disminuida por la unión de cualquier otro anticuerpo del ensayo a su epítopo respectivo. Los anticuerpos se seleccionan de tal manera que el anticuerpo o anticuerpos que entran en contacto con una muestra de prueba que se sospecha que contiene el analito (por ejemplo, GFAP) no se unan a todo o parte de un epítopo reconocido por el segundo anticuerpo o anticuerpos posteriores, interfiriendo de este modo con la capacidad del segundo anticuerpo o anticuerpos de detección para unirse al analito (por ejemplo, GFAP).
[0454] Los anticuerpos pueden usarse como primer anticuerpo en dicho inmunoensayo. El anticuerpo se une inmunospecíficamente a los epítopos del analito (por ejemplo, GFAP). Además de los anticuerpos de la presente divulgación, dicho inmunoensayo puede comprender un segundo anticuerpo que se une inmunospecíficamente a epítopos que no son reconocidos ni a los que se une el primer anticuerpo.
[0455] [0262] Una muestra de prueba que se sospecha que contiene analito (por ejemplo, GFAP) puede ponerse en contacto con por lo menos un primer anticuerpo (o anticuerpos) de captura y por lo menos un segundo anticuerpo de detección, ya sea simultáneamente o secuencialmente. En el formato de ensayo tipo sándwich, una muestra de prueba que se sospecha que contiene analito (por ejemplo, GFAP) se pone primero en contacto con por lo menos un primer anticuerpo de captura que se une específicamente a un epítopo particular en condiciones que permiten la formación de un primer complejo anticuerpo-analito (por ejemplo, GFAP). Si se usa más de un anticuerpo de captura, se forma un primer complejo múltiple de anticuerpo de captura-antígeno de GFAP. En un ensayo tipo sándwich, los anticuerpos, preferiblemente el anticuerpo de captura, se usan en cantidades molares superiores a la cantidad máxima de analito (por ejemplo, GFAP) esperada en la muestra de prueba. Por ejemplo, pueden usarse entre aproximadamente 5 µg/ml y aproximadamente 1 mg/ml de anticuerpo por ml de tampón de recubrimiento de micropartículas.
[0456] (a) Anticuerpo de captura anti-GFAP
[0457] Opcionalmente, antes de poner en contacto la muestra de prueba con el por lo menos un primer anticuerpo de captura, dicho anticuerpo puede unirse a un soporte sólido que facilite la separación del primer complejo anticuerpoanalito (por ejemplo, GFAP) de la muestra de prueba. Puede usarse cualquier soporte sólido conocido en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, soportes sólidos elaborados con materiales poliméricos en forma de pocillos, tubos o perlas (como micropartículas). El anticuerpo (o los anticuerpos) puede unirse al soporte sólido por adsorción, por enlace covalente usando un agente de acoplamiento químico o por otros medios conocidos en la técnica, siempre que dicha unión no interfiera con la capacidad del anticuerpo para unirse al analito (por ejemplo, GFAP). Además, si es necesario, el soporte sólido puede derivatizarse para permitir la reactividad con varios grupos funcionales del anticuerpo. Dicha derivatización requiere el uso de ciertos agentes de acoplamiento como, pero no limitados a, anhídrido maleico, N-hidroxisuccinimida y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida.
[0458] Después de que se haya incubado la muestra de prueba que se sospecha que contiene analito (por ejemplo, GFAP) para permitir la formación de un primer complejo de anticuerpo de captura (o anticuerpos múltiples)-analito (por ejemplo, GFAP). La incubación puede llevarse a cabo a un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 10,0, a una temperatura de aproximadamente 2 ºC a aproximadamente 45 ºC, y durante un periodo de por lo menos aproximadamente un (1) minuto a aproximadamente dieciocho (18) horas, de aproximadamente 2 a 6 minutos, de aproximadamente 7 a 12 minutos, de aproximadamente 5 a 15 minutos, o de aproximadamente 3 a 4 minutos.(b) Anticuerpo de detección
[0459] Después de la formación del complejo de primer/múltiple anticuerpo de captura-analito (por ejemplo, GFAP), el complejo se pone en contacto con por lo menos un segundo anticuerpo de detección (en condiciones que permitan la formación de un complejo de primer/múltiple anticuerpo-analito (por ejemplo, GFAP)-antígeno-segundo anticuerpo). En algunas realizaciones, la muestra de prueba se pone en contacto con el anticuerpo de detección simultáneamente con el anticuerpo de captura. Si el complejo de primer anticuerpo-analito (por ejemplo, GFAP) se pone en contacto con más de un anticuerpo de detección, se forma un complejo de primer/múltiple anticuerpo de captura-analito (por ejemplo, GFAP)-múltiple anticuerpo de detección. Al igual que con el primer anticuerpo, cuando el por lo menos segundo (y posteriores) anticuerpos se ponen en contacto con el complejo de primer anticuerpo-analito (por ejemplo, GFAP), se requiere un período de incubación en condiciones similares a las descritas anteriormente para la formación del complejo de primer/múltiple anticuerpo-analito (por ejemplo, GFAP)-segundo/múltiple anticuerpo. Preferiblemente, por lo menos un segundo anticuerpo contiene un marcador detectable. El marcador detectable puede unirse por lo menos a un segundo anticuerpo antes, simultáneamente o después de la formación del complejo de primer/múltiple anticuerpo-analito (por ejemplo, GFAP)-segundo/múltiple anticuerpo. Puede usarse cualquier marcador detectable conocida en la técnica.
[0460] Los ensayos quimioluminiscentes pueden realizarse de acuerdo con los métodos descritos en Adamczyk et al., Anal. Chim. Acta 579(1): 61-67 (2006). Aunque puede usarse cualquier formato de ensayo adecuado, un quimioluminímetro de microplacas (Mithras LB-940, Berthold Technologies U.S.A., LLC, Oak Ridge, TN) permite analizar rápidamente múltiples muestras de pequeños volúmenes. El quimioluminímetro puede equiparse con múltiples inyectores de reactivos utilizando microplacas de poliestireno negro de 96 pocillos (Costar Nº 3792). Cada muestra puede añadirse a un pocillo separado, seguido de la adición simultánea/secuencial de otros reactivos según lo determine el tipo de ensayo empleado. Deseablemente, se evita la formación de pseudobases en soluciones neutras o básicas que emplean un éster arílico de acridinio, por ejemplo, mediante acidificación. A continuación, se registra la respuesta quimioluminiscente pocillo por pocillo. A este respecto, el tiempo de registro de la respuesta quimioluminiscente dependerá, en parte, del retraso entre la adición de los reactivos y el acridinio particular empleado.
[0461] El orden en que se añaden la muestra de prueba y el compañero o compañeros de unión específicos para formar la mezcla para el ensayo quimioluminiscente no es crítico. Si el primer compañero de unión específico está marcado detectablemente con un compuesto de acridinio, se forman complejos de primer compañero de unión específico marcado detectablemente-antígeno de GFAP. Alternativamente, si se usa un segundo compañero de unión específico y el segundo compañero de unión específico está marcado detectablemente con un compuesto de acridinio, se forman complejos detectables del primer compañero de unión específico-analito (por ejemplo, GFAP)-segundo compañero de unión específico. Cualquier compañero de unión específico no unido, ya esté marcado o sin marcar, puede eliminarse de la mezcla usando cualquier técnica conocida en la técnica, como el lavado.
[0462] El peróxido de hidrógeno puede generarse in situ en la mezcla o proporcionarse o suministrarse a la mezcla antes, simultáneamente o después de la adición de un compuesto de acridinio descrito anteriormente. El peróxido de hidrógeno puede generarse in situ de varias maneras, como será evidente para un experto en la materia.
[0463] [0269] Alternativamente, simplemente, puede añadirse una fuente de peróxido de hidrógeno a la mezcla. Por ejemplo, la fuente de peróxido de hidrógeno puede ser uno o más tampones u otras soluciones que se sabe que contienen peróxido de hidrógeno. A este respecto, simplemente, puede añadirse una solución de peróxido de hidrógeno.
[0464] Tras la adición simultánea o posterior de por lo menos una solución básica a la muestra, se genera una señal detectable, concretamente una señal quimioluminiscente, indicativa de la presencia de GFAP. La solución básica contiene por lo menos una base y tiene un pH mayor de o igual a 10, preferiblemente mayor de o igual a 12. Los ejemplos de soluciones básicas incluyen, pero no se limitan a, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, hidróxido de amonio, hidróxido de magnesio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, hidróxido de calcio, carbonato de calcio y bicarbonato de calcio. La cantidad de solución básica añadida a la muestra depende de la concentración de la solución básica. Basándose en la concentración de la solución básica usada, un experto en la materia puede determinar fácilmente la cantidad de solución básica que debe añadirse a la muestra. Pueden emplearse otros marcadores distintos de los marcadores quimioluminiscentes. Por ejemplo, pueden emplearse marcadores enzimáticos (que incluyen, pero no se limitan a, la fosfatasa alcalina).
[0465] La señal quimioluminiscente, u otra señal, que se genera puede detectarse usando técnicas rutinarias conocidas por los expertos en la materia. Basándose en la intensidad de la señal generada, puede cuantificarse la cantidad de analito de interés (por ejemplo, GFAP) en la muestra. Específicamente, la cantidad de analito (por ejemplo, GFAP) en la muestra es proporcional a la intensidad de la señal generada. La cantidad de analito (por ejemplo, GFAP) presente puede cuantificarse comparando la cantidad de luz generada con una curva estándar para el analito (por ejemplo, GFAP) o mediante su comparación con un estándar de referencia. La curva estándar puede generarse usando diluciones en serie o soluciones de concentraciones conocidas de analito (por ejemplo, GFAP) mediante espectroscopia de masas, métodos gravimétricos y otras técnicas conocidas en la técnica.
[0466] (2) Ensayo de inhibición competitiva directa
[0467] En un formato competitivo directo, se usa una alícuota del analito marcado de interés (por ejemplo, un analito que tenga un marcador fluorescente, una etiqueta unida con un conector escindible, etc.) de concentración conocida para que compita con el analito de interés en una muestra de prueba por la unión al anticuerpo del analito de interés.
[0468] En un ensayo de competencia directa, un compañero de unión específico inmovilizado (como un anticuerpo) puede ponerse en contacto de manera secuencial o simultánea con la muestra de prueba y un analito de interés marcado, un fragmento del analito de interés o una variante del analito de interés del mismo. El péptido del analito de interés, el fragmento del analito de interés o la variante del analito de interés pueden marcarse con cualquier marcador detectable, incluyendo un marcador detectable compuesto por una etiqueta unida con un conector escindible. En este ensayo, el anticuerpo puede inmovilizarse en un soporte sólido. Alternativamente, el anticuerpo puede acoplarse a un anticuerpo, como un anticuerpo antiespecie, que se ha inmovilizado en un soporte sólido, como una micropartícula o un sustrato plano.
[0469] El analito de interés marcado, la muestra de prueba y el anticuerpo se incuban en condiciones similares a las descritas anteriormente en relación con el formato de ensayo tipo sándwich. A continuación, pueden generarse dos especies diferentes de complejos anticuerpo-analito de interés. Específicamente, uno de los complejos anticuerpoanalito de interés generados contiene un marcador detectable (por ejemplo, un marcador fluorescente, etc.), mientras que el otro complejo anticuerpo-analito de interés no contiene un marcador detectable. El complejo anticuerpo-analito de interés puede separarse, aunque no tiene por qué, del resto de la muestra de prueba antes de la cuantificación del marcador detectable. Independientemente de si el complejo anticuerpo-analito de interés se separa del resto de la muestra de prueba, se cuantifica la cantidad de marcador detectable en el complejo anticuerpo-analito de interés. A continuación, puede determinarse la concentración del analito de interés (como el analito de interés asociado a la membrana, el analito de interés soluble, los fragmentos del analito de interés soluble, las variantes del analito de interés (analito de interés asociado a la membrana o soluble) o cualquier combinación de los mismos) en la muestra de prueba, por ejemplo, como se ha descrito con anterioridad.
[0470] (3) Ensayo de inhibición competitiva inversa
[0471] En un ensayo de competencia inversa, puede ponerse en contacto de manera secuencial o simultánea un analito de interés inmovilizado con una muestra de prueba y por lo menos un anticuerpo marcado.
[0472] El analito de interés puede unirse a un soporte sólido, como los soportes sólidos descritos anteriormente en relación con el formato de ensayo sándwich.
[0473] [0277] El analito de interés inmovilizado, la muestra de prueba y por lo menos un anticuerpo marcado se incuban en condiciones similares a las descritas anteriormente en relación con el formato de ensayo sándwich. A continuación, se generan dos especies diferentes de complejos de analito de interés-anticuerpo. Específicamente, uno de los complejos de analito de interés-anticuerpo generados se inmoviliza y contiene un marcador detectable (por ejemplo, un marcador fluorescente, etc.), mientras que el otro complejo de analito de interés-anticuerpo no se inmoviliza y contiene un marcador detectable. El complejo analito de interés-anticuerpo no inmovilizado y el resto de la muestra de prueba se eliminan de la presencia del complejo analito de interés-anticuerpo inmovilizado mediante técnicas conocidas en la técnica, como el lavado. Una vez que se ha eliminado el complejo analito de interés-anticuerpo no inmovilizado, se cuantifica la cantidad de marcador detectable en el complejo analito de interés-anticuerpo inmovilizado después de la escisión de la etiqueta. A continuación, puede determinarse la concentración del analito de interés en la muestra de prueba comparando la cantidad de marcador detectable como se ha descrito con anterioridad.
[0474] (4) Inmunoensayo de un solo paso o ensayo "Captura en tiempo real"
[0475] En un inmunoensayo de captura en tiempo real, se recubre previamente un sustrato sólido con un agente de inmovilización. El agente de captura, el analito y el agente de detección se añaden juntos al sustrato sólido, seguido de un paso de lavado antes de la detección. El agente de captura puede unirse al analito y comprende un ligando para un agente de inmovilización. El agente de captura y los agentes de detección pueden ser anticuerpos o cualquier otra fracción capaz de capturar o detectar, tal como se describe en la presente o se conoce en la técnica. El ligando puede comprender una etiqueta peptídica y un agente de inmovilización puede comprender un anticuerpo anti-etiqueta peptídica. Alternativamente, el ligando y el agente de inmovilización pueden ser cualquier par de agentes capaces de unirse entre sí para ser empleados en un ensayo de captura en tiempo real (por ejemplo, un par de unión específico y otros conocidos en la técnica). Puede medirse más de un analito. En algunas realizaciones, el sustrato sólido puede estar recubierto con un antígeno y el analito que se va a analizar es un anticuerpo.
[0476] En ciertas otras realizaciones, en un inmunoensayo de un solo paso o "captura en tiempo real", se usa un soporte sólido (como una micropartícula) recubierto previamente con un agente de inmovilización (como biotina, estreptavidina, etc.) y por lo menos un primer miembro de unión específico y un segundo miembro de unión específico (que funcionan como reactivos de captura y detección, respectivamente). El primer miembro de unión específico comprende un ligando para el agente de inmovilización (por ejemplo, si el agente de inmovilización en el soporte sólido es estreptavidina, el ligando en el primer miembro de unión específico puede ser biotina) y también se une al analito de interés. El segundo miembro de unión específico comprende un marcador detectable y se une a un analito de interés. El soporte sólido y el primer y el segundo miembros de unión específicos pueden añadirse a una muestra de prueba (ya sea secuencialmente o simultáneamente). El ligando del primer miembro de unión específico se une al agente de inmovilización del soporte sólido para formar un complejo de soporte sólido/primer miembro de unión específico. Cualquier analito de interés que haya en la muestra se une al complejo de soporte sólido/primer miembro de unión específico para formar un complejo de soporte sólido/primer miembro de unión específico/analito. El segundo miembro de unión específico se une al complejo de soporte sólido/primer miembro de unión específico/analito y se detecta el marcador detectable. Antes de la detección puede emplearse un paso de lavado opcional. En ciertas realizaciones, en un ensayo de un solo paso puede medirse más de un analito. En ciertas otras realizaciones, pueden emplearse más de dos miembros de unión específicos. En ciertas otras realizaciones, pueden añadirse múltiples marcadores detectables. En ciertas otras realizaciones, pueden detectarse múltiples analitos de interés, o pueden medirse, determinarse o evaluarse sus cantidades, niveles o concentraciones.
[0477] El uso de un ensayo de captura en tiempo real puede realizarse en una variedad de formatos, tal y como se describe en la presente y se conoce en la técnica. Por ejemplo, el formato puede ser un ensayo tipo sándwich, tal como se ha descrito con anterioridad pero, alternativamente, puede ser un ensayo de competencia, puede emplear un único miembro de unión específico o usar otras variaciones conocidas.
[0478] 7. Muestras
[0479] a. Prueba o muestra biológica
[0480] Tal como se usan en la presente, los términos "muestra", "muestra de prueba" y "muestra biológica" se refieren a muestras de fluidos que contienen o se sospecha que contienen GFAP. La muestra puede proceder de cualquier fuente adecuada. En algunos casos, la muestra puede comprender un líquido, un sólido particulado fluido o una suspensión fluida de partículas sólidas. En algunos casos, la muestra puede procesarse antes del análisis descrito en la presente. Por ejemplo, la muestra puede separarse o purificarse de su fuente antes del análisis; sin embargo, en ciertas realizaciones, puede analizarse directamente una muestra sin procesar que contenga el analito. La fuente de la molécula del analito puede ser sintética (por ejemplo, producida en un laboratorio), el medio ambiente (por ejemplo, aire, suelo, muestras de fluidos, por ejemplo, suministros de agua, etc.), un animal, por ejemplo, un mamífero, una planta o cualquier combinación de los mismos. En un ejemplo particular, la fuente de un analito es una sustancia corporal humana (por ejemplo, fluidos corporales, sangre, como sangre completa, suero, plasma, orina, saliva, sudor, esputo, semen, moco, líquido lagrimal, líquido linfático, líquido amniótico, líquido intersticial, lavado pulmonar, líquido cefalorraquídeo, heces, tejido, órgano o similares). Los tejidos pueden incluir, pero no se limitan a, tejido muscular esquelético, tejido hepático, tejido pulmonar, tejido renal, tejido miocárdico, tejido cerebral, médula ósea, tejido cervical, piel, etc. La muestra puede ser una muestra líquida o un extracto líquido de una muestra sólida. En ciertos casos, la fuente de la muestra puede ser un órgano o tejido, como una muestra de biopsia, que puede solubilizarse mediante la disgregación del tejido o la lisis celular.
[0481] [0282] Puede analizarse una amplia variedad de volúmenes de la muestra de fluido. En unas pocas realizaciones ejemplares, el volumen de la muestra puede ser de aproximadamente 0,5 nl, aproximadamente 1 nl, aproximadamente 3 nl, aproximadamente 0,01 µl, aproximadamente 0,1 µl, aproximadamente 1 µl, aproximadamente 5 µl, aproximadamente 10 µl, aproximadamente 100 µl, aproximadamente 1 ml, aproximadamente 5 ml, aproximadamente 10 ml, o similar. En algunos casos, el volumen de la muestra de fluido está entre aproximadamente 0,01 µl y aproximadamente 10 ml, entre aproximadamente 0,01 µl y aproximadamente 1 ml, entre aproximadamente 0,01 µl y aproximadamente 100 µl, o entre aproximadamente 0,1 µl y aproximadamente 10 µl.
[0482] La muestra de fluido no se diluye antes de su uso en un ensayo.
[0483] En algunos casos, la muestra puede someterse a un procesamiento preanalítico. El procesamiento preanalítico puede ofrecer funcionalidades adicionales, como la eliminación de proteínas no específicas y/o una funcionalidad de mezclado eficaz y de implementación económica. Los métodos generales de procesamiento preanalítico pueden incluir el uso de trampa electrocinética, electrocinética de CA, ondas acústicas superficiales, isotacoforesis, dielectroforesis, electroforesis u otras técnicas de preconcentración conocidas en la técnica. En algunos casos, la muestra de fluido puede concentrarse antes de su uso en un ensayo. Por ejemplo, en realizaciones en las que la fuente de una molécula de analito es un fluido corporal humano (por ejemplo, sangre, suero), el fluido puede concentrarse mediante precipitación, evaporación, filtración, centrifugación o una combinación de las mismas. Una muestra de fluido puede concentrarse aproximadamente 1 vez, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 100 veces o más, antes de su uso.
[0484] b. Controles
[0485] Puede ser deseable incluir una muestra de control. La muestra de control puede analizarse concurrentemente con la muestra del sujeto, tal y como se ha descrito con anterioridad. Los resultados obtenidos de la muestra del sujeto pueden compararse con los resultados obtenidos de la muestra de control. Pueden proporcionarse curvas estándar con las que pueden compararse los resultados del ensayo de la muestra biológica. Dichas curvas estándar presentan los niveles del marcador en función de las unidades de ensayo, es decir, la intensidad de la señal fluorescente, si se utiliza un marcador fluorescente. Usando muestras tomadas de múltiples donantes, pueden proporcionarse curvas estándar para los niveles de control o de referencia de la GFAP en tejido sano normal, así como para los niveles "de riesgo" de la GFAP en tejido tomado de donantes que puedan tener una o más de las características expuestas con anterioridad.
[0486] Por tanto, en vista de lo anterior, se proporciona un método para determinar la presencia, la cantidad o la concentración de GFAP en una muestra de prueba. El método comprende analizar la muestra de prueba para detectar GFAP mediante un inmunoensayo, por ejemplo, empleando por lo menos un anticuerpo de captura que se une a un epítopo en GFAP y por lo menos un anticuerpo de detección que se une a un epítopo en GFAP que es diferente del epítopo para el anticuerpo de captura y que opcionalmente incluye un marcador detectable, y que comprende comparar una señal generada por el marcador detectable como una indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración de GFAP en la muestra de prueba con una señal generada como indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración de GFAP en un calibrador. El calibrador es opcional y, preferiblemente, parte de una serie de calibradores en los que cada uno de los calibradores difiere de los demás calibradores de la serie por la concentración de GFAP. En algunas realizaciones, el calibrador puede incluir GFAP o un fragmento de la misao, como se ha descrito con anterioridad en la sección 4a.
[0487] 8. Kit
[0488] La presente divulgación describe un kit que puede usarse para analizar o evaluar una muestra de prueba para detectar GFAP o un fragmento de GFAP. El kit comprende por lo menos un componente para analizar la muestra de prueba para detectar GFAP e instrucciones para analizar la muestra de prueba para detectar GFAP. Por ejemplo, el kit puede comprender instrucciones para analizar la muestra de prueba para detectar GFAP mediante un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscentes. Las instrucciones incluidas en los kits pueden adjuntarse al material de embalaje o incluirse como prospecto. Aunque las instrucciones están típicamente escritas o son materiales impresos, no se limitan a ello. La presente divulgación contempla cualquier medio capaz de almacenar dichas instrucciones y comunicarlas al usuario final. Tales medios incluyen, pero no se limitan a, medios de almacenamiento electrónico (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medios ópticos (por ejemplo, CD-ROM) y similares. Tal como se usa en la presente, el término "instrucciones" puede incluir la dirección de un sitio de Internet que proporcione las instrucciones.
[0489] El por lo menos un componente puede incluir por lo menos una composición que comprenda uno o más anticuerpos aislados o fragmentos de anticuerpos de los mismos que se unen específicamente a la GFAP. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de captura de GFAP y/o un anticuerpo de detección de GFAP.
[0490] [0289] Alternativamente o adicionalmente, el kit puede comprender un calibrador o control, por ejemplo, GFAP purificado y, opcionalmente, liofilizado, y/o por lo menos un recipiente (por ejemplo, un tubo, placas de microtitulación o tiras, que pueden estar ya recubiertas con un anticuerpo monoclonal anti-GFAP) para realizar el ensayo, y/o un tampón, como un tampón de ensayo o un tampón de lavado, cualquiera de los cuales puede proporcionarse como una solución concentrada, una solución de sustrato para el marcador detectable (por ejemplo, un marcador enzimático) o una solución de parada. En algunas realizaciones, el calibrador o control puede incluir una GFAP o un fragmento de la misma, como se ha descrito con anterioridad en la Sección 4a. Preferiblemente, el kit comprende todos los componentes, es decir, reactivos, estándares, tampones, diluyentes, etc., que son necesarios para realizar el ensayo. Las instrucciones también pueden incluir instrucciones para generar una curva estándar.
[0491] El kit puede comprender además estándares de referencia para cuantificar GFAP. Los estándares de referencia pueden emplearse para establecer curvas patrón para la interpolación y/o extrapolación de concentraciones de GFAP. Los estándares de referencia pueden incluir un nivel de concentración de GFAP alto, por ejemplo, aproximadamente 100.000 pg/ml, aproximadamente 125.000 pg/ml, aproximadamente 150.000 pg/ml, aproximadamente 175.000 pg/ml, aproximadamente 200.000 pg/ml, aproximadamente 225.000 pg/ml, aproximadamente 250.000 pg/ml, aproximadamente 275.000 pg/ml o aproximadamente 300.000 pg/ml; un nivel de concentración medio de GFAP, por ejemplo, de aproximadamente 25.000 pg/ml, aproximadamente 40.000 pg/ml, aproximadamente 45.000 pg/ml, aproximadamente 50.000 pg/ml, aproximadamente 55.000 pg/ml, aproximadamente 60.000 pg/ml, aproximadamente 75.000 pg/ml o aproximadamente 100.000 pg/ml; y/o un nivel de concentración de GFAP bajo, por ejemplo, de aproximadamente 1 pg/ml, aproximadamente 5 pg/ml, aproximadamente 10 pg/ml, aproximadamente 12,5 pg/ml, aproximadamente 15 pg/ml, aproximadamente 20 pg/ml, aproximadamente 25 pg/ml, aproximadamente 30 pg/ml, aproximadamente 35 pg/ml, aproximadamente 40 pg/ml, aproximadamente 45 pg/ml, aproximadamente 50 pg/ml, aproximadamente 55 pg/ml, aproximadamente 60 pg/ml, aproximadamente 65 pg/ml, aproximadamente 70 pg/ml, aproximadamente 75 pg/ml, aproximadamente 80 pg/ml, aproximadamente 85 pg/ml, aproximadamente 90 pg/ml, aproximadamente 95 pg/ml o aproximadamente 100 pg/ml.
[0492] Cualquier anticuerpo que se proporcione en el kit, como los anticuerpos recombinantes específicos para GFAP, puede incorporar un marcador detectable, como un fluoróforo, una fracción radioactiva, una enzima, un marcador de biotina/avidina, un cromóforo, un marcador quimioluminiscente o similar, o el kit puede incluir reactivos para marcar los anticuerpos o reactivos para detectar los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de detección) y/o para marcar los analitos o reactivos para detectar el analito. Los anticuerpos, calibradores y/o controles pueden proporcionarse en recipientes separados o dispensarse previamente en un formato de ensayo adecuado, por ejemplo, en placas de microtitulación.
[0493] Opcionalmente, el kit incluye componentes de control de calidad (por ejemplo, paneles de sensibilidad, calibradores y controles positivos). La preparación de reactivos de control de calidad es bien conocida en la técnica y se describe en las hojas de instrucciones de una variedad de productos de inmunodiagnóstico. Los miembros del panel de sensibilidad se usan opcionalmente para establecer las características de rendimiento del ensayo y, opcionalmente, son indicadores útiles de la integridad de los reactivos del kit de inmunoensayo y de la estandarización de los ensayos.
[0494] El kit también puede incluir opcionalmente otros reactivos necesarios para realizar un ensayo de diagnóstico o facilitar las evaluaciones de control de calidad, tales como tampones, sales, enzimas, cofactores enzimáticos, sustratos, reactivos de detección y similares. También pueden incluirse en el kit otros componentes, como tampones y soluciones para el aislamiento y/o tratamiento de una muestra de prueba (por ejemplo, reactivos de pretratamiento). El kit puede incluir además uno o más controles distintos. Uno o más de los componentes del kit pueden estar liofilizados, en cuyo caso el kit puede comprender además reactivos adecuados para la reconstitución de los componentes liofilizados.
[0495] Los varios componentes del kit se proporcionan opcionalmente en recipientes adecuados según sea necesario, por ejemplo, una placa de microtitulación. El kit puede incluir además recipientes para contener o almacenar una muestra (por ejemplo, un recipiente o cartucho para una muestra de orina, sangre completa, plasma o suero). Cuando sea apropiado, el kit también puede contener opcionalmente recipientes de reacción, recipientes de mezclado y otros componentes que faciliten la preparación de los reactivos o la muestra de prueba. El kit también puede incluir uno o más instrumentos para ayudar a obtener una muestra de prueba, como una jeringuilla, una pipeta, unos fórceps, una cuchara medidora o similares.
[0496] Si el marcador detectable es por lo menos un compuesto de acridinio, el kit puede comprender por lo menos una acridinio-9-carboxamida, por lo menos un éster arílico de acridinio-9-carboxilato o cualquier combinación de los mismos. Si el marcador detectable es por lo menos un compuesto de acridinio, el kit también puede comprender una fuente de peróxido de hidrógeno, como un tampón, una solución y/o por lo menos una solución básica. Si se desea, el kit puede contener una fase sólida, como una partícula magnética, perla, tubo de ensayo, placa de microtitulación, cubeta, membrana, molécula de andamiaje, película, papel de filtro, disco o chip.
[0497] Si se desea, el kit puede comprender además uno o más componentes, solos o en combinación adicional con instrucciones, para analizar la muestra de prueba en busca de otro analito, que puede ser un biomarcador, como un biomarcador de lesión o trastorno cerebral traumático.
[0498] a. Adaptación del kit y del método
[0500] El kit (o los componentes del mismo), así como el método para evaluar o determinar la concentración de GFAP en una muestra de prueba mediante un inmunoensayo como se describe en la presente, pueden adaptarse para su uso en una variedad de sistemas automatizados y semiautomatizados (incluyendo aquellos en los que la fase sólida comprende una micropartícula), como se describe, por ejemplo, en, la patente de Estados Unidos Nº 5.063.081 y las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2003/0170881, 2004/0018577, 2005/0054078 y 2006/0160164 y comercializados, por ejemplo, por Abbott Laboratories (Abbott Park, Illinois) como Abbott Point of Care (i-STAT® o i-STAT Alinity, Abbott Laboratories), así como los descritos en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.089.424 y 5.006.309, y comercializados, por ejemplo, por Abbott Laboratories (Abbott Park, Illinois) como ARCHITECT® o la serie de dispositivos Abbott Alinity.
[0502] Algunas de las diferencias entre un sistema automatizado o semiautomatizado en comparación con un sistema no automatizado (por ejemplo, ELISA) incluyen el sustrato al que se une el primer compañero de unión específico (por ejemplo, el anticuerpo de analito o el anticuerpo de captura) (que puede afectar a la formación del sándwich y a la reactividad del analito), y la duración y la temporización de la captura, la detección y/o cualquier paso de lavado opcional. Mientras que un formato no automatizado, como ELISA, puede requerir un tiempo de incubación relativamente más largo con la muestra y el reactivo de captura (por ejemplo, aproximadamente 2 horas), un formato automatizado o semiautomatizado (por ejemplo, ARCHITECT® y cualquier plataforma sucesora, Abbott Laboratories) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto (por ejemplo, aproximadamente 18 minutos para ARCHITECT®). De manera similar, mientras que un formato no automatizado, como ELISA, puede incubar un anticuerpo de detección, como el reactivo conjugado, durante un tiempo de incubación relativamente más largo (por ejemplo, unas 2 horas), un formato automatizado o semiautomatizado (por ejemplo, ARCHITECT® y cualquier plataforma sucesora) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto (por ejemplo, aproximadamente 4 minutos para ARCHITECT® y cualquier plataforma sucesora).
[0504] Otras plataformas disponibles de Abbott Laboratories incluyen, pero no se limitan a, AxSYM®, IMx® (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 5.294.404), PRISM®, EIA (perla) y Quantum™ II, así como otras plataformas. Además, los ensayos, kits y componentes de los kits pueden emplearse en otros formatos, por ejemplo, en sistemas de ensayo electroquímicos u otros sistemas de ensayo portátiles o de punto de atención. Como se ha mencionado con anterioridad, la presente divulgación es, por ejemplo, aplicable al sistema comercial de inmunoensayo electroquímico Abbott Point of Care (i-STAT®<,>Abbott Laboratories) que realiza inmunoensayos tipo sándwich. Los inmunosensores y sus métodos de fabricación y funcionamiento en dispositivos de pruebas de un solo uso se describen, por ejemplo, en, la Patente de Estados Unidos Nº 5.063.081 y, las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2003/0170881, 2004/0018577, 2005/0054078 y 206/0160164.
[0506] En particular, en lo referente a la adaptación de un ensayo al sistema i-STAT®, se prefiere la siguiente configuración. Se fabrica un chip de silicio microfabricado con un par de electrodos de trabajo amperométricos de oro y un electrodo de referencia de plata-cloruro de plata. En uno de los electrodos de trabajo, se adhieren perlas de poliestireno (0,2 mm de diámetro) con anticuerpo de captura inmovilizado a un recubrimiento polimérico de alcohol polivinílico en patrones sobre el electrodo. Este chip se ensambla en un cartucho i-STAT® con un formato fluídico adecuado para el inmunoensayo. En una parte del chip de silicio hay un compañero de unión específico para GFAP, como uno o más anticuerpos contra GFAP (uno o más anticuerpos monoclonales/policlonales o un fragmento de los mismos, una variante de los mismos o un fragmento de una variante de los mismos que pueda unirse a GFAP) o uno o más anti-GFAP DVD-Ig (o un fragmento de los mismos, una variante de los mismos o un fragmento de una variante de los mismos que pueda unirse a GFAP), cualquiera de los cuales puede estar marcado detectablemente. Dentro de la bolsa de líquido del cartucho hay un reactivo acuoso que incluye fosfato de p-aminofenol.
[0508] En funcionamiento, a la cámara de retención del cartucho de prueba se le añade una muestra de un sujeto que se sospecha que padece un traumatismo craneoencefálico y el cartucho se inserta en el lector i-STAT®. Un elemento de bombeo dentro del cartucho empuja la muestra hacia un conducto que contiene el chip. La muestra entra en contacto con los sensores, lo que permite que el conjugado enzimático se disuelva en la muestra. La muestra se oscila a través de los sensores para promover la formación del sándwich durante aproximadamente 2-12 minutos. En el penúltimo paso del ensayo, la muestra se empuja hacia una cámara de residuos y se usa un líquido de lavado, que contiene un sustrato para la enzima fosfatasa alcalina, para lavar el exceso de conjugado enzimático y la muestra del chip sensor. En el paso final del ensayo, el marcador de fosfatasa alcalina reacciona con el fosfato de p-aminofenol para escindir el grupo fosfato y permitir que el p-aminofenol liberado se oxide electroquímicamente en el electrodo de trabajo. Basándose en la corriente medida, el lector puede calcular la cantidad de GFAP en la muestra mediante un algoritmo integrado y una curva de calibración determinada de fábrica.
[0510] [0302] Los métodos y kits descritos en la presente abarcan necesariamente otros reactivos y métodos para llevar a cabo el inmunoensayo. Por ejemplo, se incluyen varios tampones conocidos en la técnica y/o que pueden prepararse u optimizarse fácilmente para su empleo, por ejemplo, para el lavado, como diluyente de conjugado y/o como diluyente de calibrador. Un diluyente conjugado ejemplar es el diluyente conjugado ARCHITECT® empleado en ciertos kits (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) y que contiene ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), una sal, un bloqueador de proteínas, un agente antimicrobiano y un detergente. Un diluyente calibrador ejemplar es el diluyente calibrador humano ARCHITECT® empleado en ciertos kits (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), que comprende un tampón que contiene MES, otra sal, un bloqueador de proteínas y un agente antimicrobiano. Además, tal como se describe en la Solicitud de patente de Estados Unidos Nº 61/142.048 presentada el 31 de diciembre de 2008, una generación de señal mejorada puede obtenerse, por ejemplo, en un formato de cartucho i-STAT®, usando una secuencia de ácido nucleico unida al anticuerpo de señal como amplificador de señal.
[0511] Aunque ciertas realizaciones de la presente son ventajosas cuando se emplean para evaluar enfermedades, como el traumatismo craneoencefálico, los ensayos y kits también pueden emplearse opcionalmente para evaluar la GFAP en otras enfermedades, trastornos y afecciones, según sea adecuado.
[0512] El método de ensayo también puede usarse para identificar un compuesto que mejore enfermedades, como el traumatismo craneoencefálico. Por ejemplo, puede ponerse en contacto una célula que expresa GFAP con un compuesto candidato. Usando el método de ensayo descrito en la presente puede compararse el nivel de expresión de GFAP en la célula en contacto con el compuesto con el de una célula de control.
[0513] La presente divulgación tiene múltiples aspectos, ilustrados mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
[0514] 9. Ejemplos
[0515] Para los expertos en la materia será evidente que son fácilmente aplicables y apreciables otras modificaciones y adaptaciones adecuadas de los métodos de la presente divulgación descritos en la presente, y pueden realizarse usando equivalentes adecuados sin apartarse del alcance de la presente divulgación o de los aspectos y realizaciones divulgados en la presente. Habiendo descrito con detalle la presente divulgación, esta se comprenderá más claramente con referencia a los siguientes ejemplos, que solo se pretende que ilustren algunos aspectos y realizaciones de la divulgación, y no deben considerarse limitativos del alcance de la divulgación. La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
[0516] La presente divulgación tiene múltiples aspectos, ilustrados mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
[0517] Ejemplo 1
[0518] Ensayo de GFAP i-STAT®
[0519] Los anticuerpos se cribaron usando el formato de ensayo de interés (i-STAT). Se seleccionaron los pares de anticuerpos que generaron señal en el ensayo. Los criterios de selección iniciales se basaron en una serie de factores que incluían la detección de señal por los pares de anticuerpos cuando se seleccionaban usando una concentración baja de calibrador. Se analizaron pares de anticuerpos monoclonales, como el anticuerpo A como anticuerpo monoclonal de captura y el anticuerpo B como anticuerpo monoclonal de detección. El anticuerpo A y el anticuerpo B son anticuerpos anti-GFAP ejemplares que se desarrollaron internamente en Abbott Laboratories (Abbott Park, Illinois). Tanto el anticuerpo A como el anticuerpo B se unen a epítopos dentro del mismo producto de degradación de GFAP (BDP). Cuando se usaron juntos, la combinación de los anticuerpos proporcionó un efecto sinérgico y proporcionó una señal aumentada. Estos datos se generaron mediante la adquisición de secuencias peptídicas cortas solapadas y la determinación del péptido al que se une el anticuerpo en un formato de placa de 96 pocillos. El diseño del ensayo GFAP se evaluó en función de los atributos clave de rendimiento. La configuración del cartucho fue la siguiente: Configuración de anticuerpos: Anticuerpo A (anticuerpo de captura)/Anticuerpo B (anticuerpo de detección); Condiciones del reactivo: 0,8% de sólidos, 250 µg/ml de conjugado de clúster de fosfatasa alcalina Fab; e Impresión de entrada de muestra: específica para GFAP. La duración del ensayo fue de 10 a 15 minutos (con un tiempo de captura de la muestra de 7 a 12 minutos).
[0520] Calibración del ensayo.Los calibradores se prepararon usando GFAP recombinante de OriGene (0-50.000 pg/ml) (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) en una agrupación de plasma EDTA. La concentración de GFAP se basó en la especificación en la etiqueta del fabricante. El calibrador se dividió en alícuotas y se almacenó congelado (-70 ºC). El ajuste de la curva fue 4PLC (curva logística de 4 parámetros). Véase la FIG.1; véase también la Tabla 2, que se basa en n = 75 repeticiones/nivel de calibración.
[0521] Tabla 2
[0524]
[0525] continuación
[0527]
[0529] Precisión del ensayo.El diseño del estudio de precisión de 5 días se basó en las directrices de los protocolos CLSI (EP5-A2 (NCCLS. Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods; Approved Guideline [Evaluación del rendimiento de precisión de los métodos de medición cuantitativa; Directriz aprobada] -Segunda edición. Documento NCCLS EP5-A2 [ISBN 1-56238-542-9]. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pensilvania 19087-1898 EE. UU., 2004) y EP15-A2 (Clinical and Laboratory Standards Institute. User Verification of Performance for Precision and Trueness; Approved Guideline [Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio. Verificación del rendimiento por parte del usuario en cuanto a precisión y veracidad; directriz aprobada] -segunda edición. Documento CLSI EP15-A2 [ISBN 1-56238-574-7]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pensilvania 19087-1898, EE. UU., 2005.)). El protocolo de pruebas incluyó 5 días, 2 series al día, 4 repeticiones por serie (n = 40 repeticiones por muestra). El análisis usó el programa de software JMP (un programa de descubrimiento estadístico de SAS, Cary, NC) para determinar los componentes de varianza del día, la serie y la repetición usando un modelo anidado. Se prepararon paneles (n = 6) con las concentraciones objetivo de GFAP que se muestran en la Tabla 3.
[0530] Tabla 3
[0532]
[0534] Como se muestra en la Tabla 4, en los cartuchos individuales para GFAP se observó un CV total menor del 10% en todos los paneles de 100 a 4400 pg/ml.
[0535] Tabla 4
[0537]
[0539] [0312]Límite de detección (LoD).El diseño del estudio del LoD se basó en las directrices del protocolo EP17-A2 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) ("Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation; Approved Guideline [Protocolos para la determinación de los límites de detección y los límites de cuantificación; Directrices aprobadas] - Segunda edición", EP17A2E, por James F. Pierson-Perry et al., Clinical and Laboratory Standards Institute, 1 de junio de 2012, 80 páginas [ISBN: 1562387952 ]). El protocolo de pruebas utilizó una agrupación de plasma de nivel cero para determinar el Límite del Blanco (LoB). Se probaron un total de 60 repeticiones. Se preparó un panel de GFAP de 50 pg/ml añadiendo una muestra de GFAP elevada a una agrupación de plasma. Se prepararon diluciones con una concentración objetivo de 10 a 40 pg/ml. Se realizaron 40 repeticiones para el panel de GFAP a lo largo de 3 días. El análisis de datos fue el siguiente: LoB = percentil 95 de las concentraciones de muestras con analito cero; LoD = LoB Cp × SD (dentro del laboratorio), Cp es un multiplicador que da el percentil 95 de SD (dentro del laboratorio). SD (dentro del laboratorio) fue la desviación estándar agrupada de los cinco paneles.
[0541] Resultados:El perfil de precisión de cada panel muestra que los CV varían del 5 al 8% para los paneles > 20 pg/ml. Véase la Tabla 5. Los resultados se usan para determinar la sensibilidad funcional ajustando la ecuación:
[0544]
[0547] Tabla 5
[0550]
[0553] Se determinó que el LoD era <10 pg/ml. Los resultados se basaron en un único lote de reactivos y lote de cartuchos. La sensibilidad funcional (a un CV del 20%) fue <20 pg/ml. Véase la Tabla 6. La sensibilidad funcional es una estimación del Límite de Cuantificación (LoQ).
[0555] Tabla 6
[0558]
[0561] Linealidad/intervalo del ensayo.La linealidad del ensayo se evaluó usando una serie de diluciones de la siguiente manera. En cada estudio de dilución, se preparó una serie de diluciones mezclando muestras de concentración alta y baja. La primera dilución que utilizó una muestra de alta concentración se preparó añadiendo lisado tisular a una agrupación de plasma EDTA hasta que se alcanzó una concentración objetivo de GFAP de aproximadamente 15.000 pg/ml. Una segunda dilución utilizó muestras de plasma EDTA agrupadas de pacientes que se sospechaba que tenían TCE. La concentración inicial objetivo de GFAP fue de aproximadamente 1000 pg/ml. Se evaluó un tercer estudio de dilución utilizando un lisado tisular añadido a una agrupación de plasma EDTA hasta que se alcanzó una concentración objetivo de GFAP de aproximadamente 50.000 pg/ml. Se evaluó un cuarto estudio de dilución utilizando un lisado tisular enriquecido en un grupo de sueros hasta que se alcanzó una concentración objetivo de GFAP de aproximadamente 50.000 pg/ml. Los datos se analizaron de la siguiente manera: se representaron gráficamente las concentraciones esperadas frente a las observadas y se determinó el coeficiente de correlación. La linealidad se evaluó según la norma CLSI EP6-A ajustando los datos a regresiones polinómicas de primer, segundo y tercer orden. Para determinar la desviación de la linealidad se usó el modelo que mejor se ajustaba.
[0563] Resultados:Dilución 1: El coeficiente de correlación (observado frente a esperado) fue r = 0,9985. Tabla 7; FIG. 5. Se logró una desviación desde la linealidad (DL) de menos del 10% entre 20 y 13.660 pg/ml. Dilución 2: El coeficiente de correlación (observado frente a esperado) fue r = 0,9989. Tabla 8; FIG. 6. Se logró una desviación desde la linealidad (DL) de menos del 10% de 12 a 900 pg/ml. Dilución 3: El coeficiente de correlación (observado frente a esperado) fue r = 0,9990. Tabla 9. Se logró una desviación desde la linealidad de menos del 10% entre 420 y >50.000 pg/ml. Dilución 4: El coeficiente de correlación (observado frente a esperado) fue r = 0,9993. Tabla 10. Se logró una desviación desde la linealidad de menos del 10% entre 370 y >50.000 pg/ml.
[0564] Tabla 7
[0566]
[0568] Tabla 8
[0569]
[0570] Tabla 9
[0572]
[0574] Tabla 10
[0576]
[0578] [0317]Muestras de donantes normales.En el ensayo i-STAT GFAP se probaron 100 muestras de plasma de donantes aparentemente sanos, obtenidas de fuentes comerciales,. Los niveles de GFAP eran bastante bajos, con un valor mediano de 12 pg/ml y un valor máximo de menos de 70 pg/ml. Véase la FIG.2 y la Tabla 11.
[0579] Tabla 11
[0582]
[0584] El ensayo de GFAP muestra: Límite de detección (LoD) <20 pg/ml; calibración del ensayo a 50.000 pg/ml y linealidad del ensayo a 50.000 pg/ml; precisión <10% CV de 100 a 4000 pg/ml; resultados en ≤ 15 min.
[0585] Ejemplo 2
[0586] Posibles interferencias en el ensayo
[0587] Se evaluó el ensayo de GFAP para detectar posibles interferencias y reactivos cruzados, tal y como se muestra en la Tabla 12. En resumen, se añadieron interferencias a un panel de GFAP con concentraciones objetivo de 150-200 pg/ml. Las concentraciones de prueba de las sustancias interferentes se basaron en la guía CLSI EP7-A2 (Clinical and Laboratory Standards Institute. Interference Testing in Clinical Chemistry; Approved Guideline [Pruebas de interferencia en química clínica; Guía aprobada] - Segunda edición. Documento CLSI EP7-A2 [ISBN 1-56238-584-4]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pensilvania 19087-1898 EE. UU., 2005.). Los posibles reactivos cruzados se analizaron a 500 ng/ml. El criterio de aceptación fue una interferencia de <10%.
[0588] Específicamente, se evaluó el ensayo de GFAP para detectar posibles interferencias endógenas. La sustancia potencialmente interferente se preparó en un tampón/disolvente de elección y se añadió a una muestra de prueba que contenía el analito de interés. Se preparó una muestra de control a la que solo se le añadió el tampón/disolvente de elección. La interferencia se calculó sobre la base de la diferencia porcentual de los resultados medidos entre la muestra de control y la muestra de prueba que contenía el interferente.
[0589] Se evaluó la interferencia de las muestras que contenían las siguientes sustancias endógenas potencialmente interferentes: bilirrubina (no conjugada y conjugada); triglicéridos; hemoglobina; proteína total; heparina; y anticuerpos endógenos (HAMA, RF). El panel de GFAP se preparó en una agrupación de plasma con heparina de litio usando lisado tisular con un objetivo de 150 a 200 pg/ml. Todas las muestras se analizaron en el cartucho de GFAP. El porcentaje de interferencia se calculó tomando la diferencia entre la solución de prueba y la solución de control dividida por la solución de control multiplicada por 100, como se muestra en la ecuación: % de interferencia = 100 x (Prueba -Control) / Control.
[0590] Bilirrubina:Se probaron por separado la bilirrubina conjugada y la no conjugada para detectar interferencias, como se recomienda en la guía CLSI EP7-A2, como se ha descrito con anterioridad. La concentración de bilirrubina se confirmó probando las muestras en el analizador químico clínico ARCHITECT. La Tabla 12 muestra una interferencia <10% a >20 mg/dl de bilirrubina para GFAP.
[0591] Triglicéridos:Para preparar la muestra de control se añadió el stock de triglicéridos (Intralipid) a la muestra que contenía GFAP y se añadió el tampón/matriz a la muestra que contenía GFAP. La concentración de triglicéridos se confirmó analizando las muestras en el analizador químico clínico ARCHITECT. La Tabla 12 muestra una interferencia <10% a >3000 mg/dl de triglicéridos para GFAP.
[0592] Hemoglobina:La hemoglobina se evaluó debido al potencial de hemólisis en los especímenes. Típicamente, la fuente de hemoglobina era un hemolisado preparado a partir de glóbulos rojos lavados. La cantidad de hemoglobina en la muestra se confirmó en un analizador hematológico. La Tabla 12 muestra un efecto de <10% a >500 mg/dl de hemoglobina para GFAP.
[0593] [0325]Proteína total:El contenido total de proteínas en las muestras humanas mostró cierta variabilidad, con la normal que variaba de 6,4 a 8,3 g/dl (Tietz) y el 99% de las muestras eran <9 g/dl (análisis interno). Para evaluar el efecto de la proteína total, se suplementaron las muestras con HSA (albúmina sérica humana) y se compararon con una muestra normal. El contenido de proteínas de las muestras se determinó independientemente usando la prueba de proteína total de química clínica ARCHITECT. La Tabla 12 muestra una interferencia de <10% a 8,8 g/dl de proteína total para GFAP.
[0594] Heparina:La heparina se usa como anticoagulante en los tubos de recogida de sangre y se evalúa como un posible interferente, ya que la sangre total y el plasma heparinizados son tipos de muestras potenciales en los ensayos i-STAT. Un tubo de heparina contiene aproximadamente 15 U/ml de heparina, por lo que la concentración de la prueba representa una concentración más alta que la que podría estar presente si el tubo de recogida no se llenase por completo (extracción corta). La Tabla 12 muestra una interferencia de <10% debido a 90 U/ml de heparina en la muestra para GFAP.
[0595] Anticuerpos endógenos (HAMA, RF):Los inmunoensayos se basan en interacciones específicas entre los anticuerpos y el analito de interés para obtener un rendimiento óptimo. Sin embargo, algunos especímenes pueden contener anticuerpos endógenos que reaccionan de forma cruzada con los anticuerpos empleados en el ensayo. Al ensayo se añadieron anticuerpos no específicos como proteínas bloqueantes de interacciones no específicas y se redujo la posibilidad de interferencia. Se usaron dos de las posibles fuentes de interferencia más comúnmente identificadas en los inmunoensayos: HAMA (anticuerpo humano anti-ratón) y RF (factor reumatoide). Los concentrados de HAMA y RF se obtuvieron de fuentes comerciales: Roche, Scantibodies y Bioreclamation. Estos concentrados se añadieron a una agrupación de plasma al que también se le habían añadido pequeñas cantidades de GFAP para evaluar la posible interferencia. Se preparó una muestra de control añadiendo tampón a las muestras correspondientes. La recuperación se determinó con respecto a la agrupación de plasma enriquecida con HAMA o RF. Los resultados se presentan en la Tabla 12. En presencia de HAMA y RF la recuperación de GFAP se situó entre el 100 ± 10%.
[0596] Reactividad cruzada e interferencia de proteínas homólogas: posibles reactivos cruzados de GFAP: tanto la vimentina como la desmina tienen una alta homología de secuencia (~60%) con la GFAP sobre la base de la alineación de secuencias primarias. Se evaluaron tanto la reactividad cruzada (ausencia de GFAP) como la interferencia (presencia de GFAP) de la vimentina y la desmina a una concentración de 500 ng/ml. La vimentina y la desmina recombinantes se adquirieron de OriGene. El porcentaje de reactividad cruzada se determinó mediante la ecuación: 100* (Prueba - Control)/Concentración del reactivo cruzado. Los resultados que se muestran en la Tabla 12 indican que en el ensayo de GFAP no hay una reactividad cruzada significativa y una interferencia de <10% con la vimentina y la desmina.
[0597] Tabla 12
[0600]
[0602] Ejemplo 3
[0603] Estudio poblacional de TCE
[0604] El ensayo de GFAP i-STAT se usó en un estudio de población de pacientes con TCE.
[0605] Especímenes del estudio:se inscribieron un total de 260 sujetos con TCE de moderado a grave con hasta 8 puntos temporales por sujeto; todas las muestras eran de suero. Tabla 13; FIG.3.
[0606] Tabla 13
[0609]
[0610] continuación
[0613]
[0615] Distribución de los especímenes del estudio.La FIG. 3 muestra los resultados medianos de todos los resultados del ensayo de GFAP en cada punto temporal, lo que muestra que el GFAP es alto en la muestra B1 y tiende a disminuir en los puntos temporales posteriores. La FIG.4 muestra un diagrama de caja (escala logarítmica) en cada punto temporal de la muestra, que muestra una amplia distribución de los resultados de GFAP en toda la población de pacientes. Las cajas representan los intervalos intercuartílicos (percentiles 25, 50 y 75).
[0616] En resumen, para las pruebas se dispuso de un total de 250 sujetos. No todos los puntos temporales estaban necesariamente disponibles para todos los sujetos. Algunas muestras tenían un volumen limitado o insuficiente. Los resultados de GFAP abarcaron todo el intervalo del ensayo (<0,1 a >50 ng/ml) y 20 muestras se leyeron en más de 50.000 pg/ml.
[0617] Se entiende que la descripción detallada anterior y los ejemplos que la acompañan son meramente ilustrativos y no deben considerarse limitaciones del alcance de la invención, que se define únicamente mediante las reivindicaciones adjuntas.
[0618] Para los expertos en la materia serán evidentes varios cambios y modificaciones en las realizaciones divulgadas. Tales cambios y modificaciones incluyendo, sin limitación, los relacionados con las estructuras químicas, los sustituyentes, los derivados, los productos intermedios, las síntesis, las composiciones, las formulaciones o los métodos de uso de la invención, pueden realizarse sin apartarse del alcance de la misma.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES
1. Un método para medir un producto de la degradación (BDP) de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en una muestra biológica de un sujeto humano, método que comprende
(a) poner en contacto una muestra biológica, ya sea simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden con: (1) por lo menos un anticuerpo de captura, que se une a un epítopo en un BDP de GFAP de 38 kDa definido por los aminoácidos 60-383 de la SEQ ID NO: 1 para formar un complejo anticuerpo de captura-antígeno de GFAP, y (2) por lo menos un anticuerpo de detección que incluye un marcador detectable y se une a un epítopo en el BDP de GFAP de 38 kDa definido por los aminoácidos 60-383 de la SEQ ID NO: 1 al que no se une el anticuerpo de captura, para formar por lo menos un complejo anticuerpo de captura-antígeno de GFAP-por lo menos un anticuerpo de detección, y
(b) determinar la cantidad o concentración del BDP de GFAP en la muestra biológica sobre la base de una señal generada por el marcador detectable en el complejo de por lo menos un anticuerpo de captura-antígeno de GFAP-por lo menos un anticuerpo de detección,
en el que la muestra biológica no requiere dilución,
en el que el método se realiza en de 5 a 20 minutos, y
en el que el método:
(i) determina los niveles del BDP de GFAP en una cantidad de menos de o igual a 50.000 pg/ml, tiene un intervalo dinámico de 5 log y es lineal a lo largo de dicho intervalo dinámico; o
(ii) cuantifica el nivel del BDP de GFAP en un intervalo dinámico de 5 pg/ml a 50.000 pg/ml con una precisión de menos del 10% del coeficiente de variación (CV) y con una desviación desde la linealidad (DL) de menos del 10% alcanzada a lo largo del intervalo dinámico.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el método determina los niveles del BDP de GFAP seleccionados del grupo que consiste en de 10 pg/ml a 50.000 pg/ml, de 20 pg/ml a 50.000 pg/ml, de 25 pg/ml a 50.000 pg/ml, de 30 pg/ml a 50.000 pg/ml, de 40 pg/ml a 50.000 pg/ml, de 50 pg/ml a 50.000 pg/ml, de 60 pg/ml a 50.000 pg/ml, de 70 pg/ml a 50.000 pg/ml, de 75 pg/ml a 50.000 pg/ml, de 80 pg/ml a 50.000 pg/ml, de 90 pg/ml a 50.000 pg/ml, de 100 pg/ml a 50.000 pg/ml, de 125 pg/ml a 50.000 pg/ml y de 150 pg/ml a 50.000 pg/ml.
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que
(a) el método se realiza usando un dispositivo de punto de atención; y/o
(b) el BDP de GFAP se evalúa junto con uno o más biomarcadores; y/o
(c) en el que el método detecta niveles del BDP de GFAP seleccionados del grupo que consiste en de 10 pg/ml a 50.000 pg/ml, de 35 pg/ml a 50.000 pg/ml, de 100 pg/ml a 50.000 pg/ml, de 125 pg/ml a 50.000 pg/ml, de 150 pg/ml a 15.000 pg/ml y de 175 pg/ml a 10.000 pg/ml.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho contacto se realiza simultáneamente o en el que dicho contacto se realiza secuencialmente.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el por lo menos un anticuerpo de captura está inmovilizado en un soporte sólido.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que
la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en una muestra de sangre completa, una muestra de suero, una muestra de líquido cefalorraquídeo, una muestra de tejido, un fluido corporal y una muestra de plasma.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el método se realiza en 15 minutos.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el nivel o la cantidad del BDP de GFAP se mide en un único punto temporal, o (b) el nivel o la cantidad del BDP de GFAP se monitoriza a lo largo del tiempo.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho método puede llevarse a cabo en cualquier sujeto independientemente de factores seleccionados del grupo que consiste en la condición clínica del sujeto, los valores de laboratorio del sujeto, la clasificación del sujeto como afectado por un TCE leve, moderado o grave, la manifestación por el sujeto de niveles bajos o altos de GFAP, y el momento de cualquier evento en el que dicho sujeto pudo haber sufrido una lesión en la cabeza.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el método se realiza usando un volumen de menos de 20 microlitros de dicha muestra.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que (a) dicho método tiene un límite inferior de detección (LoD) de 10 pg/ml o (b) tiene un límite inferior de detección (LoD) de 20 pg/ml; y/o (c) dicho método proporciona una ventana de detección ampliada.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección son anticuerpos monoespecíficos.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el BDP de GFAP se detecta mediante un inmunoensayo o un ensayo de detección de moléculas individuales.
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