ES3061720T3 - Nucleus-encoded male sterility through mutation in cytochrome p450 oxidase - Google Patents

Nucleus-encoded male sterility through mutation in cytochrome p450 oxidase

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ES3061720T3
ES3061720T3 ES17720379T ES17720379T ES3061720T3 ES 3061720 T3 ES3061720 T3 ES 3061720T3 ES 17720379 T ES17720379 T ES 17720379T ES 17720379 T ES17720379 T ES 17720379T ES 3061720 T3 ES3061720 T3 ES 3061720T3
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Wolfgang Mechelke
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Abstract

La invención se refiere a plantas con un fenotipo masculino estéril recesivo codificado en el núcleo y al locus genético (gst) asociado, incluyendo el gen responsable del fenotipo fértil/estéril, el cual se encuentra mutado en el fenotipo estéril. La invención también proporciona métodos para identificar el genotipo asociado a la expresión de las características mencionadas, así como las herramientas genéticas correspondientes, tales como sondas de hibridación y oligonucleótidos. Asimismo, se describe el uso de las plantas obtenidas según la invención en el mejoramiento genético híbrido y en la producción de productos derivados de materias primas renovables, como bioetanol, biogás y productos a base de azúcar. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Esterilidad masculina codificada nuclearmente por mutación en la oxidasa del citocromo P450
[0003] Campo de la invención
[0004] La presente solicitud se refiere al ámbito de la simplificación de programas de mejora que requieren un elevado esfuerzo laboral mediante métodos de biología molecular, tecnología de marcadores y la ingeniería genética. En particular, se divulgan plantas que, mediante mutación espontánea de una región génica en el genoma nuclear, presentan en estado homocigótico un fenotipo de esterilidad masculina codificada nuclearmente, caracterizado por que la mutación, a diferencia de la CMS (cytoplasmic male sterility), se mantiene mediante una expresión recesiva del carácter y, de este modo, se elimina la conservación paralela de genotipos estériles y fértiles en programas de mejora. A este respecto, la presente solicitud divulga plantas, en particular remolacha azucarera o patata, en las que mediante tecnología de marcadores se ha detectado una mutación en un gen de oxidasa del citocromo P450 (CYPgst) que conduce a la manifestación del carácter mencionada anteriormente, así como el procedimiento correspondiente para la identificación de dicha mutación. Adicionalmente, se divulgan una proteína CYPgst, una molécula de ADN que contiene el gen mutado que conduce a la manifestación del carácter mencionada anteriormente, una molécula de ADN recombinante que contiene el gen de tipo silvestre, un promotor para la expresión específica de dicho gen o de un gen heterólogo en flores y/o frutos de plantas y/o una secuencia de nucleótidos que codifica inhibidores del gen CYPgst, así como los vectores y células huésped correspondientes.
[0005] Además, la presente solicitud se refiere a plantas modificadas genéticamente que presentan un fenotipo recesivo de esterilidad masculina codificada nuclearmente mediante inhibición de la expresión del gen CYPgst, así como a los inhibidores correspondientes y a procedimientos para la inhibición del gen y procedimientos para la restauración de la fertilidad. La solicitud se refiere asimismo al uso de las plantas en procedimientos de obtención de híbridos, procedimientos de mejora para resistencia y/o en la producción de semillas. Asimismo, quedan comprendidos semillas o descendencia, órganos, partes de plantas, tejidos o células de dichas plantas, así como su utilización.
[0006] Antecedentes de la invención
[0007] Para la generación controlada de variación genética se realizan cruzamientos en remolacha azucarera (Beta vulgaris subsp. vulgaris), así como también en todas las demás especies de plantas cultivadas. En este contexto, las anteras portadoras de polen se eliminan manualmente de flores aún cerradas del progenitor productor de semillas. La polinización se lleva a cabo asimismo de forma manual mediante la aplicación del polen del donante de polen sobre el estigma del progenitor productor de semillas. Alternativamente, tras la eliminación de las anteras en flores del progenitor productor de semillas, la polinización también puede lograrse haciendo que el progenitor donante de polen florezca y libere polen en proximidad espacial al progenitor productor de semillas. En cualquier caso, se trata de protocolos extraordinariamente laboriosos que son ciertamente susceptibles de errores, ya que, por ejemplo, una eliminación involuntariamente solo parcial de las anteras de una flor puede dar lugar a la autopolinización.
[0008] La producción de semilla híbrida (comercial) se realiza actualmente con frecuencia mediante la introgresión de la componente del progenitor productor de semillas en genotipos portadores de CMS (cytoplasmic male sterility) y la posterior retrocruzamiento con el fin de aumentar la proporción genética de la componente del progenitor productor de semillas. La componente del progenitor productor de semillas resultante, con esterilidad masculina, puede posteriormente cultivarse a gran escala y la polinización se efectúa mediante progenitores donantes de polen que crecen en proximidad espacial (procedimientotopcross). Dado que la CMS se hereda de forma materna dominante, la utilización de líneas CMS requiere la disponibilidad paralela de líneas mantenedoras fértiles (es decir, tipos O no incorporados en CMS), que aseguran la polinización de las líneas CMS. Ello conlleva un elevado esfuerzo de planificación y producción, así como una logística compleja. Por ejemplo, actualmente las remolachas azucareras comerciales se producen como híbridos triples con el fin de obtener semilla de calidad suficientemente elevada. La producción de híbridos en los programas de mejora es igualmente costosa y laboriosa y se lleva a cabo actualmente mediante la instalación de pantallas separadoras. En numerosas especies vegetales existen descripciones de líneas o genotipos que presentan una esterilidad masculina ms (male sterile) codificada nuclearmente de aparición natural. Esta se debe por lo general a una mutación espontánea de un gen en el genoma nuclear y dicha mutación se mantiene mediante una expresión recesiva del carácter. El uso de genotipos con fenotipos de esterilidad masculina codificada nuclearmente es adecuado para simplificar partes de los procesos de mejora y/o para emplearlos en la producción de semilla híbrida. En este contexto, los fenotipos con esterilidad masculina presentan la ventaja de que no es necesario eliminar manualmente las anteras para los cruzamientos y se elimina la conservación paralela de genotipos fértiles y estériles, puesto que, mediante autofecundación, en cada etapa de multiplicación, los genotipos heterocigotos se segregan nuevamente en individuos fértiles y estériles.
[0009] Por consiguiente, la tarea de la presente invención fue poner a disposición medios y procedimientos para la utilización de la esterilidad masculina codificada nuclearmente en plantas útiles, en particular en la remolacha azucarera. La tarea se resuelve conforme a la invención mediante las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones y en la descripción.
[0010] Resumen de la invención
[0011] La presente solicitud se refiere al ámbito de la simplificación de programas de mejora que requieren un elevado esfuerzo laboral, de la tecnología de marcadores y de la ingeniería genética. Se refiere a plantas que, mediante una mutación en un segmento de ADN que comprende una oxidasa del citocromo P450 (CYPgst), presentan un fenotipo recesivo de esterilidad masculina codificada nuclearmente. El gen CYPgst, así como la mutación, fueron identificados mediante tecnología de marcadores y métodos de biología molecular. Dado que la mutación se mantiene mediante la expresión recesiva del carácter y que, por autofecundación, en cada etapa de multiplicación, los genotipos heterocigotos se segregan nuevamente en genotipos fértiles y estériles, se elimina la conservación paralela de líneas mantenedoras fértiles. Adicionalmente, los conocimientos pueden utilizarse para generar plantas transgénicas con un fenotipo recesivo de esterilidad masculina codificada nuclearmente y para restaurar la fertilidad.
[0012] La presente solicitud divulga a continuación
[0013] una planta, en particular una planta útil, que presenta un fenotipo recesivo de esterilidad masculina codificada nuclearmente, caracterizada por que el fenotipo se correlaciona con una mutación comprendida en el gen endógeno de oxidasa del citocromo P450 (CYPgst) o con la ausencia o, en comparación con una planta de tipo silvestre correspondiente (fértil masculina), con un contenido o actividad reducidos de una proteína CYPgst funcional codificada por el gen de tipo silvestre de CYPgst, caracterizada por que el gen CYPgstno mutado es a) el genBvCYPgst de Beta vulgaris, que preferentemente comprende una de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID nº: 1 o 2, o codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 3, o bien un homólogo, análogo u ortólogo de la misma; b) el genStCYPgst deSolanum tuberosum, que preferentemente comprende una de las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID nº: 12 o 13, o codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 14, o bien un homólogo, análogo u ortólogo de la misma; o c) el genZmCYPgst de Zea mays, que preferentemente comprende una de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID nº: 9 o 10, o codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 11, o bien un homólogo, análogo u ortólogo de la misma;
[0014] así como una planta de este tipo que es heterocigota para la mutación y fértil masculina o homocigota para la mutación y estéril masculina, en la que en la planta estéril la formación de polen funcional está impedida, preferentemente completamente impedida;
[0015] así como una planta de este tipo en la que el gen CYPgstse expresa al menos en flores cerradas y frutos; asimismo, una planta de este tipo en la que la mutación impide la transcripción y/o traducción de una proteína funcional, siendo preferentemente la mutación una deleción, adición, inserción o sustitución en la secuencia nucleotídica codificante del gen CYPgst, en una señal de splicing o en una secuencia reguladora, preferentemente en la secuencia promotora, del gen CYPgst. En una forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico presenta una mutación que también se encuentra en la secuencia de nucleótidos conforme a la SEQ ID nº: 8 en comparación con el gen de tipo silvestre de la SEQ ID nº: 1. En particular, la mutación puede ser una deleción entre las posiciones nucleotídicas 1560 y 2095 de la SEQ ID nº: 1 o de las posiciones correspondientes de la SEQ ID nº: 12 o 9. La deleción puede presentar una longitud de al menos 20, 30 o 50 pares de bases consecutivos, preferentemente de al menos 100, 150, 200 o 250 pares de bases consecutivos y especialmente preferentemente de al menos 300, 400 o 500 pares de bases consecutivos. En una forma de realización especialmente preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos conforme a la SEQ ID nº: 8. En otra forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico presenta una mutación puntual en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID nº: 1 conforme a la Tabla 1, preferentemente entre las posiciones nucleotídicas 1560 y 2095 de la SEQ ID nº: 1;
[0016] así como una planta de este tipo en la que, enBeta vulgaris, preferentementeBeta vulgarissubsp.vulgaris, la deleción puede demostrarse mediante la ausencia de uno o de ambos loci marcadores sle5983d14 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID nº: 4 y 5) y sle5983d17 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID nº: 6 y 7) y mediante la presencia de un marcador ubicuo;
[0017] además, dicha planta, en la que enBeta vulgaris, preferentementeBeta vulgarissubsp.vulgaris, el gen está localizado en un segmento del cromosoma 1 entre los loci marcadores sxn2151s01 y s1e3305s02, en el que la secuencia marcadora sxn2151s01 mostrada en SEQ ID No. 24 y la secuencia marcadora sle3305s02 mostrada en SEQ ID NO: 26 indican la presencia del locus gst y la secuencia marcadora sxn2151s01 mostrada en SEQ ID NO: 25 y la secuencia marcadora sle3305s02 mostrada en SEQ ID NO: 27 indican la secuencia de referencia;
[0018] así como una planta de este tipo en la que el segmento tiene un tamaño de aproximadamente 50 a 5000 kbp, preferentemente de 100 a 1000 kbp, más preferentemente de 100 a 500 kbp y especialmente preferentemente de 200 a 250 kbp;
[0019] así como una planta de este tipo en la que el gen no mutado es el gen funcionalBvCYPgstdeBeta vulgaris, preferentementeBeta vulgarissubsp.vulgaris, o un gen funcional homólogo, análogo u ortólogo de otra planta cultivada y útil;
[0020] así como una planta de este tipo en la que el gen homólogo, análogo u ortólogo es un gen deZea mays, que preferentemente comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID nº: 9 o 10, o codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 11, deSolanum tuberosum, que preferentemente comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID nº: 12 o 13, o codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 14, deTriticum aestivum, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 15, deHelianthus annuus, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 16, deHordeum vulgare, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 17, deBrassica napus, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 18, deBrassica oleracea, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 19, deBrassica rapa, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 20, deGlycine max, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 21, deGossypium, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 22, deSorghum bicolor, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 23.
[0021] así como una planta de este tipo en la que el gen no mutado (gen de tipo silvestre) presenta una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
[0022] (a) una secuencia de nucleótidos que presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID nº: 1 o la SEQ ID nº: 2 o un fragmento funcional de la misma (véase, por ejemplo, las figuras 4A y 4B);
[0023] (b) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 3; (c) una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar, en condiciones rigurosas, con una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos conforme a (a) o (b);
[0024] (d) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que, con respecto a la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID nº: 3, presenta divergencias en forma de deleciones de aminoácidos, sustituciones, adiciones y/o inserciones en la secuencia de aminoácidos y que preferentemente presenta una identidad de secuencia de al menos el 60 % a lo largo de la secuencia completa de aminoácidos;
[0025] (e) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con la misma actividad enzimática que la proteína codificada por una secuencia de nucleótidos conforme a cualquiera de (a) a (d); y
[0026] (f) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 200 o 400, preferentemente al menos 600 u 800, especialmente preferentemente al menos 1000 nucleótidos consecutivos del promotor de la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID nº: 1 desde las posiciones nucleotídicas 1 a 1518, preferentemente desde las posiciones nucleotídicas 518 a 1518, especialmente preferentemente desde las posiciones nucleotídicas 1318-1518, o una secuencia que hibrida con esta región, siendo capaz la secuencia de nucleótidos de dirigir específicamente la expresión del gen o de una molécula de ácido nucleico heteróloga que esté operativamente vinculada a la secuencia de nucleótidos en flores cerradas y/o frutos;
[0027] una secuencia de nucleótidos conforme a (c), (d) o (e) es, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID nº: 12 o la SEQ ID nº: 13 o un fragmento funcional de la misma, o que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 14. Además, una secuencia de nucleótidos conforme a (c), (d) o (e) es, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID nº: 9 o la SEQ ID nº: 10 o un fragmento funcional de la misma, o que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 11. Asimismo, una secuencia de nucleótidos conforme a (c), (d) o (e) es, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID nº: 15-23;
[0028] así como una molécula de ácido nucleico o una molécula de ADN recombinante que comprende una de las secuencias de nucleótidos mencionadas anteriormente;
[0029] así como una molécula de ADN recombinante de este tipo que (i) comprende un promotor con una secuencia de nucleótidos tal como se define en [10] (f), que está operativamente vinculado a una molécula de ácido nucleico heteróloga, o que (ii) comprende una secuencia de nucleótidos codificante tal como se define en [10] (a) - (e), que está operativamente vinculada a un promotor heterólogo que es preferentemente capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos específicamente en flores cerradas y/o frutos;
[0031] así como una molécula de ADN recombinante de este tipo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una shRNA (small hairpin RNA), siRNA (small interfering RNA), ARN antisentido, ARN sentido o ARN de doble cadena, que tras su expresión en una célula vegetal o tras su introducción en una célula vegetal conduce a la inhibición de la expresión del gen CYPgst funcional (no mutado). En una forma de realización preferida, la secuencia de nucleótidos presenta al menos 15, 16, 17, 18, 19 o 20, preferentemente al menos 21, 22, 23, 24 o 25, especialmente preferentemente al menos 30, 35, 40, 45 o 50, y muy especialmente preferentemente al menos 100, 200, 300, 500 o 1000 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID nº: 1, 2, 9, 10, 12 o 13 en orientación sentido o antisentido, o de al menos un exón de la SEQ ID nº: 1, 9 o 12 en orientación sentido o antisentido. En este contexto, el exón 1 de la SEQ ID nº: 1 se extiende desde la posición nucleotídica 1762 a 2679 y el exón 2 de la SEQ ID nº: 1 desde la posición nucleotídica 3507 a 4142. El exón 1 de la SEQ ID nº: 12 se extiende desde la posición nucleotídica 1762 a 2032, el exón 2 de la SEQ ID nº: 12 desde la posición nucleotídica 2449 a 3161 y el exón 3 de la SEQ ID nº: 12 desde la posición nucleotídica 4032 a 4694. El exón 1 de la SEQ ID nº: 9 se extiende desde la posición nucleotídica 2001 a 2927 y el exón 2 de la SEQ ID nº: 9 desde la posición nucleotídica 3018 a 3683. En otra forma de realización preferida, la secuencia de nucleótidos presenta al menos 15, 16, 17, 18, 19 o 20, preferentemente al menos 21, 22, 23, 24 o 25, especialmente preferentemente al menos 30, 35, 40, 45 o 50, y muy especialmente preferentemente al menos 100, 200, 300, 500 o 1000 nucleótidos consecutivos que son capaces de hibridar específicamente con una secuencia de nucleótidos definida como en [10] o [16];
[0033] así como una molécula de ácido nucleico de este tipo que comprende una secuencia de nucleótidos con una mutación en forma de deleción, adición, inserción o sustitución, en la que dicha mutación da lugar a que no se sintetice ninguna proteína CYPgstfuncional. Preferentemente, la mutación está localizada en la secuencia nucleotídica codificante del gen CYPgst, en una señal de splicing o en una secuencia reguladora del gen CYPgst, preferentemente en el promotor del gen CYPgst. En una forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico presenta una mutación que también se encuentra en la secuencia de nucleótidos conforme a la SEQ ID nº: 8. En particular, la mutación puede ser una deleción entre las posiciones nucleotídicas 1560 y 2095 de la SEQ ID nº: 1 o de las posiciones correspondientes de la SEQ ID nº: 12 o 9. La deleción puede presentar una longitud de al menos 20, 30 o 50 pares de bases consecutivos, preferentemente de al menos 100, 150, 200 o 250 pares de bases consecutivos y especialmente preferentemente de al menos 300, 400 o 500 pares de bases consecutivos. En una forma de realización especialmente preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos conforme a la SEQ ID nº: 8. En otra forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico presenta una mutación puntual en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID nº: 1 conforme a la Tabla 1, preferentemente entre las posiciones nucleotídicas 1560 y 2095 de la SEQ ID nº: 1;
[0035] así como una molécula de ácido nucleico de este tipo de al menos 15, 16, 17, 18, 19 o 20, preferentemente al menos 21, 22, 23, 24 o 25, especialmente preferentemente al menos 30, 35, 40, 45 o 50, y muy especialmente preferentemente al menos 100, 200, 300, 500 o 1000 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID nº: 1, 2, 9, 10, 12 o 13 en orientación sentido y/o antisentido o de al menos un exón de la SEQ ID nº: 1, 9 o 12 en orientación sentido o antisentido. En este contexto, el exón 1 de la SEQ ID nº: 1 se extiende desde la posición nucleotídica 1762 a 2679 y el exón 2 de la SEQ ID nº: 1 desde la posición nucleotídica 3507 a 4142. El exón 1 de la SEQ ID nº: 12 se extiende desde la posición nucleotídica 1762 a 2032, el exón 2 de la SEQ ID nº: 12 desde la posición nucleotídica 2449 a 3161 y el exón 3 de la SEQ ID nº: 12 desde la posición nucleotídica 4032 a 4694. El exón 1 de la SEQ ID nº: 9 se extiende desde la posición nucleotídica 2001 a 2927 y el exón 2 de la SEQ ID nº: 9 desde la posición nucleotídica 3018 a 3683. En una forma de realización particular, la molécula de ácido nucleico se extiende a lo largo de al menos un intrón de la SEQ ID nº: 1, de la SEQ ID nº: 9 o de la SEQ ID nº: 12, es decir, la molécula de ácido nucleico comprende de forma consecutiva i) al menos un nucleótido del extremo 3’ del exón 1 de la SEQ ID nº: 1 (preferentemente el último nucleótido del exón 1 de la SEQ ID nº: 1 en dirección 5’-3’; correspondiente al nucleótido en la posición 583 de la SEQ ID nº: 2) y al menos un nucleótido del extremo 5’ del exón 2 de la SEQ ID nº: 1 (preferentemente el primer nucleótido del exón 2 de la SEQ ID nº: 1 en dirección 5’-3’; correspondiente al nucleótido en la posición 584 de la SEQ ID nº: 2), ii) al menos un nucleótido del extremo 3’ del exón 1 de la SEQ ID nº: 12 (preferentemente el último nucleótido del exón 1 de la SEQ ID nº: 12 en dirección 5’-3’; correspondiente al nucleótido en la posición 271 de la SEQ ID nº: 13) y al menos un nucleótido del extremo 5’ del exón 2 de la SEQ ID nº: 12 (preferentemente el primer nucleótido del exón 2 de la SEQ ID nº: 12 en dirección 5’-3’; correspondiente al nucleótido en la posición 272 de la SEQ ID nº: 13), ii) al menos un nucleótido del extremo 3’ del exón 2 de la SEQ ID nº: 12 (preferentemente el último nucleótido del exón 2 de la SEQ ID nº: 12 en dirección 5’-3’; correspondiente al nucleótido en la posición 984 de la SEQ ID nº: 13) y al menos un nucleótido del extremo 5’ del exón 3 de la SEQ ID nº: 12 (preferentemente el primer nucleótido del exón 3 de la SEQ ID nº: 12 en dirección 5’-3’; correspondiente al nucleótido en la posición 985 de la SEQ ID nº: 13), o iv) al menos un nucleótido del extremo 3’ del exón 1 de la SEQ ID nº: 9 (preferentemente el último nucleótido del exón 1 de la SEQ ID nº: 9 en dirección 5’-3’; correspondiente al nucleótido en la posición 927 de la SEQ ID nº: 10) y al menos un nucleótido del extremo 5’ del exón 2 de la SEQ ID nº: 9 (preferentemente el primer nucleótido del exón 2 de la SEQ ID nº: 9 en dirección 5’-3’; correspondiente al nucleótido en la posición 928 de la SEQ ID nº: 10). En otra forma de realización preferida, la secuencia de nucleótidos presenta al menos 15, 16, 17, 18, 19 o 20, preferentemente al menos 21, 22, 23, 24 o 25, especialmente preferentemente al menos 30, 35, 40, 45 o 50, y muy especialmente preferentemente al menos 100, 200, 300, 500 o 1000 nucleótidos consecutivos que es capaz de hibridar específicamente con una secuencia de nucleótidos definida como en [10] o [16]; así como un oligonucleótido de este tipo, preferentemente con una longitud máxima de 50 nucleótidos, que constituye una molécula de ácido nucleico de este tipo o una molécula de ácido nucleico que es capaz de hibridar específicamente con una secuencia de nucleótidos conforme a la SEQ ID nº: 8, comprende y/o presenta preferentemente una de las siguientes secuencias de nucleótidos:
[0036] (i) SEQ ID nº: 4, 6 o un complemento de los mismos, o
[0037] (ii) SEQ ID nº: 5, 7 o un complemento de los mismos;
[0038] un vector, preferentemente un vector vegetal, que comprende una molécula de ADN o una molécula de ácido nucleico de este tipo;
[0039] así como un vector de este tipo en el que la molécula de ADN o la molécula de ácido nucleico, como transgén, es capaz de expresar un CYPgstfuncional y está preferentemente acoplada genéticamente a otro transgén que impide la transmisión de la molécula de ADN o de la molécula de ácido nucleico a través del polen, presentando preferentemente además el vector o el transgén un cassette de expresión que conduce a la marcación de las semillas, preferentemente mediante marcación por fluorescencia;
[0040] así como una célula huésped, preferentemente una célula vegetal, que contiene una molécula de ADN recombinante o una molécula de ácido nucleico de este tipo;
[0041] así como una proteína CYPgstcodificada por una secuencia de nucleótidos definida como anteriormente o un fragmento funcional y/o inmunológicamente activo de la misma; preferentemente, la proteína CYPgstes a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID nº: 3, la SEQ ID nº: 11 y las SEQ ID nº: 14-23, o b) una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID nº: 3 en al menos el 80 %, 82 %, 84 %, 86 % u 88 %, preferentemente en al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 %, especialmente preferentemente en al menos el 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 %, preferentemente a lo largo de toda su longitud;
[0042] así como un anticuerpo que se une específicamente a la proteína CYPgsto a un fragmento de la misma; así como un kit que comprende una molécula de ADN o una molécula de ácido nucleico de este tipo, un oligonucleótido, un vector, una proteína CYPgsto un fragmento de la misma y/o un anticuerpo, y en su caso reactivos para procedimientos de detección basados en ácidos nucleicos o inmunológicos;
[0043] así como un procedimiento para la obtención de una planta, en particular una planta útil, que presenta en estado homocigótico un fenotipo recesivo de esterilidad masculina codificada nuclearmente, caracterizado por que se inhibe la expresión del gen CYPgst;
[0044] así como un procedimiento de este tipo, caracterizado por que el procedimiento comprende una etapa de introducción de dicha molécula de ADN recombinante, de la molécula de ácido nucleico o del vector, por ejemplo mediante transformación con Agrobacterium, etiquetado por T-DNA, recombinación homóloga, mutagénesis como TILLING, así como mutagénesis dirigida, por ejemplo mediante el empleo de nucleasas de dedos de zinc, nucleasas TALE (Transcription Activator-Like Effector) y el sistema CRISPR/Cas, como consecuencia de lo cual la expresión del gen se inhibe, por ejemplo, mediante RNAi o cosupresión o debido a la mutación introducida;
[0045] así como un procedimiento de este tipo para la restauración de la fertilidad de dicha planta o de una planta obtenible mediante el procedimiento mencionado anteriormente, que comprende la introducción de un gen CYPgstfuncional en la planta;
[0046] así como un procedimiento de este tipo en el que el gen CYPgstse introduce mediante una molécula de ADN recombinante de este tipo o mediante un vector, o mediante el cruzamiento con una planta que porta el gen CYPgstde tipo silvestre o un gen CYPgstfuncional, preferentemente en estado homocigótico; opcionalmente, tras el cruzamiento puede realizarse una selección de la presencia del gen CYPgstde tipo silvestre o del gen CYPgstfuncional en la generación descendiente;
[0047] así como una planta que contiene células vegetales y/o obtenible mediante un procedimiento mencionado anteriormente; así como un órgano, una parte de planta, un tejido o una célula de dicha planta;
[0048] así como una semilla o descendencia de una planta de este tipo, en la que la semilla o la descendencia presenta la mutación definida anteriormente y/o una molécula de ADN recombinante o una molécula de ácido nucleico o un vector;
[0049] así como un procedimiento para la identificación de una planta de este tipo mediante la detección de una mutación en el gen CYPgst o de un marcador que está acoplado a la mutación;
[0050] así como el uso de una molécula de ADN o de ácido nucleico de este tipo, una molécula de ácido nucleico, un oligonucleótido, un vector, una proteína CYPgsto un fragmento de la misma, un anticuerpo y/o kits para la identificación de una planta de este tipo, en la obtención de una planta recesiva con esterilidad masculina codificada nuclearmente, en la obtención de una planta con fertilidad restaurada, en la obtención de una planta híbrida, en programas de mejora para resistencia o para la producción de semillas;
[0051] así como un uso de este tipo de la molécula de ADN o del promotor definido anteriormente para la expresión específica de moléculas de ácido nucleico heterólogas en flores y/o frutos de plantas;
[0052] así como el uso de este tipo de una planta, órgano, parte de planta, tejido o célula, semilla o descendencia de este tipo, o de una planta identificada mediante tal procedimiento o obtenible mediante dicho uso, o de su tejido, célula, descendencia o semilla, en la fabricación de alimentos, materiales, medicamentos o precursores de los mismos, productos de diagnóstico, cosméticos, productos químicos finos, azúcar, jarabe, bioetanol o biogás;
[0053] así como un alimento, pienso o material que contiene una planta, órgano, parte de planta, tejido o célula, semilla o descendencia de este tipo, o una planta identificada mediante tal procedimiento o obtenible mediante dicho uso, o su tejido, célula, descendencia o semilla;
[0054] así como dicho uso de una planta de este tipo para la mejora o para la obtención de una planta descendiente, en el que el fenotipo de esterilidad masculina codificada nuclearmente se utiliza para la selección recurrente. En primer lugar, a continuación, se explican con mayor detalle algunos de los términos utilizados en la presente solicitud: La expresión «segmento cromosómico», así como variaciones de los términos como «segmento cromosomal» o «segmento en el cromosoma», se utilizan de manera equivalente salvo indicación en contrario y designan un segmento específico de ADN cromosómico de un cromosoma determinado que comprende al menos un gen.
[0055] El «gen CYPgst» o el «gen de tipo silvestre de CYPgst» codifica la «proteína CYPgst», que desempeña un papel en la formación de polen viable, ya que una mutación en CYPgst da lugar a plantas con esterilidad masculina al impedir la formación de polen funcional. Esto se demostró experimentalmente en la remolacha azucarera (Beta vulgarissubsp.vulgaris). Mediante comparaciones de homología se pudo constatar una similitud con el gen CYP703 deArabidopsis thaliana, que, según el estado actual de la técnica (Morant et al., The Plant Cell, 19 (2007), 1473-1487), desempeña una función esencial en la síntesis de la esporopolenina (componente principal del polen viable) y cataliza preferentemente la conversión de ácidos grasos saturados de cadena media en los correspondientes ácidos grasos mono-hidroxilados, con una hidroxilación preferente del ácido láurico en la posición C-7. La inactivación del gen CYP703 enArabidopsis thalianacondujo a una esterilidad masculina parcial. La cantidad de polen estaba reducida, pero se pudo formar polen funcional. Por consiguiente, el gen deBeta vulgarissubsp.vulgarisparece desempeñar una función diferente, ya que en este caso su inactivación conduce a una esterilidad masculina de la planta. Sin quedar vinculados a una teoría, parece plausible que el gen CYPgst deba asignarse a otra clase de genes CYP o que en plantas cultivadas, en particular en plantas útiles como la remolacha azucarera, tenga una función o importancia diferente de la que presenta en la planta modelo inferiorArabidopsis thaliana; véase también la discusión en el Ejemplo 1. El experto en la materia puede obtener otras proteínas CYPgst a partir de bases de datos utilizando perfiles de búsqueda adecuados y programas informáticos para el cribado de secuencias homólogas o para comparaciones de secuencias. Una posible verificación de si los genes identificados cumplen la misma función que el gen CYPgstenBeta vulgarissubsp.vulgarispuede llevarse a cabo mediante la restauración de la función de CYPgst en una planta de remolacha azucarera con esterilidad masculina mediante la expresión heteróloga de los genes identificados, es decir, mediante la restauración de la fertilidad a través del transgén.
[0056] Sin quedar vinculados a una teoría determinada, tampoco puede excluirse que el gen CYPgstdeBeta vulgarissubsp.vulgarisy el gen CYP703 deArabidopsis thalianapertenezcan a la misma familia CYP y, por tanto, desempeñen la misma o al menos una función similar en la síntesis de la esporopolenina, pero que en plantas cultivadas que han sido optimizadas mediante años de selección dirigida y cruzamientos con respecto, entre otros, al rendimiento, la resistencia a plagas, la tolerancia frente a factores de estrés abióticos, así como al contenido de componentes vegetales, se haya perdido la capacidad de compensar la ausencia de esporopolenina y que, en consecuencia, la ausencia de esporopolenina conduzca a que se impida la formación de polen y la planta sea, por tanto, estéril masculina.
[0057] El término «locusgst» designa conforme a la invención una región de ADN genómico en una planta, en particular una planta útil, en la que una mutación se correlaciona con una esterilidad masculina codificada nuclearmente heredada de forma recesiva, comprendiendo la mutación el gen de oxidasa del citocromo P450 (CYPgst) y dando lugar a que, en una planta afectada que contiene la mutación en el locus gst y que en particular es homocigota para la mutación, el contenido o la actividad de una proteína CYPgst funcional sea menor o esté completamente ausente en comparación con una planta correspondiente (fértil masculina) que contiene el locus de tipo silvestre (planta de tipo silvestre). Típicamente, la mutación en el gen CYPgstimpide la transcripción y/o traducción de una proteína CYPgstfuncional.
[0059] Por el término «estrechamente flanqueante» se entiende que dos loci (por ejemplo, dos marcadores (loci marcadores)) en un mapa genético están separados entre sí por menos de 15 cM, menos de 12 cM, menos de 10 cM, menos de 8 cM, menos de 7 cM, menos de 6 cM, menos de 5 cM, menos de 4 cM, menos de 3 cM, menos de 2 cM, menos de 1 cM, menos de 0,5 cM, menos de 0,2 cM, menos de 0,1 cM o menos de 0,05 cM.
[0060] Por «hibridar» o «hibridación» se entiende un proceso en el que una molécula de ácido nucleico monocatenaria se une a una cadena de ácido nucleico en gran medida complementaria, es decir, forma apareamientos de bases con la misma. Los procedimientos estándar de hibridación se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. Preferentemente, por ello se entiende que al menos el 60 %, más preferentemente al menos el 65 %, 70 %, 75 %, 80 % u 85 %, especialmente preferentemente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases de la molécula de ácido nucleico establecen apareamientos de bases con la cadena de ácido nucleico en gran medida complementaria. La posibilidad de dicha unión depende de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. El término «rigurosidad» se refiere a las condiciones de hibridación. Existe una alta rigurosidad cuando se dificulta el apareamiento de bases, y una baja rigurosidad cuando se facilita el apareamiento de bases. La rigurosidad de las condiciones de hibridación depende, por ejemplo, de la concentración de sal o de la fuerza iónica y de la temperatura. En general, la rigurosidad puede aumentarse mediante un incremento de la temperatura y/o una disminución del contenido de sal. Por «condiciones de hibridación rigurosas» se entienden aquellas condiciones en las que la hibridación tiene lugar predominantemente solo entre moléculas de ácido nucleico homólogas y homólogos. El término «condiciones de hibridación» no se refiere únicamente a las condiciones que prevalecen durante la unión propiamente dicha de los ácidos nucleicos, sino también a las condiciones que prevalecen durante las etapas posteriores de lavado. Condiciones de hibridación rigurosas son, por ejemplo, condiciones bajo las cuales hibridan predominantemente solo aquellas moléculas de ácido nucleico que presentan al menos un 70 %, preferentemente al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad de secuencia. Las condiciones de hibridación rigurosas son, por ejemplo: hibridación en 4 × SSC a 65 °C y posterior lavado repetido en 0,1 × SSC a 65 °C durante aproximadamente 1 hora en total. El término «condiciones de hibridación rigurosas» utilizado en el presente documento también puede significar: hibridación a 68 °C en 0,25 M de fosfato sódico, pH 7,2, 7 % de SDS, 1 mM de EDTA y 1 % de BSA durante 16 horas y posterior lavado dos veces con 2 × SSC y 0,1 % de SDS a 68 °C. Preferentemente, la hibridación tiene lugar en condiciones rigurosas.
[0062] Una secuencia de nucleótidos «complementaria» significa, con referencia a un ácido nucleico en forma de ADN de doble cadena, que la segunda cadena de ADN complementaria a la primera cadena de ADN presenta, de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases, los nucleótidos que corresponden a las bases de la primera cadena.
[0064] El término «marcador (molecular)» es una secuencia de nucleótidos que se utiliza como punto de referencia u orientación. Un marcador para detectar un acontecimiento de recombinación debe ser adecuado para vigilar diferencias o polimorfismos dentro de una población vegetal. En el caso de los marcadores, estas diferencias se encuentran a nivel de ADN y son, por ejemplo, diferencias en secuencias de polinucleótidos tales como SSRs (simple sequence repeats), RFLPs (restriction fragment length polymorphisms), FLPs (fragment length polymorphisms) o SNPs (single nucleotide polymorphisms). Los marcadores pueden derivarse de ácidos nucleicos genómicos o expresados, como por ejemplo ARN empalmado, ADNc o ESTs, y también pueden referirse a ácidos nucleicos que se emplean como sondas o pares de cebadores y que, como tales, son adecuados para amplificar un fragmento de secuencia mediante procedimientos basados en PCR. Los marcadores que afectan a polimorfismos genéticos entre partes de una población pueden detectarse mediante procedimientos establecidos del estado de la técnica (An Introduction to Genetic Analysis.7ª edición, Griffiths, Miller, Suzuki et al., 2000). Entre ellos se incluyen, por ejemplo: la secuenciación de ADN, la amplificación específica de secuencia basada en PCR, la detección de RFLPs, la detección de polimorfismos de polinucleótidos mediante hibridación específica de alelos (ASH), la detección de SSRs, SNPs o RFLPs. Además, también son conocidos procedimientos para la detección de ESTs (expressed sequence tags) y RAPD (randomly amplified polymorphic DNA). Según el contexto, el término marcador en la descripción también puede referirse a una posición cromosómica específica en el genoma de una especie en la que puede encontrarse un marcador específico (por ejemplo, un SNP). En la presente invención, los marcadores también se utilizan para la detección de acontecimientos de deleción.
[0065] El término «planta útil» incluye tanto plantas silvestres como plantas cultivadas. Como plantas útiles se designan aquellas plantas que son utilizadas por el ser humano de alguna forma directa o indirecta, por ejemplo, como alimentos, productos de consumo, remedios medicinales, así como proveedoras de madera, o también como pienso para animales de producción.
[0066] Una «planta cultivada», a diferencia de una planta silvestre, es una planta cultivada, cuidada y mejorada por el ser humano que se utiliza como planta útil o como planta ornamental. La base genética del surgimiento de las plantas cultivadas son las mutaciones puntuales, las mutaciones somáticas, las mutaciones cromosómicas, así como la poliploidización. Estas mutaciones proporcionan la base para la selección. Constituyen el material de partida natural o ampliado mediante medios artificiales (incremento de la tasa de mutación, mejora por cruzamientos, tratamiento con colchicina, métodos de ingeniería genética) de una evolución dirigida por el ser humano. Entre las plantas cultivadas se incluyen, entre otras, las plantas alimentarias, las plantas industriales (por ejemplo, plantas fibrosas), las plantas forrajeras y las plantas ornamentales. Entre las características importantes de estas plantas cultivadas se incluyen, entre otras, el aumento del tamaño de la planta, en particular de los órganos aprovechados, la pérdida de sustancias amargas, la resistencia a plagas y/o un alto contenido en nutrientes.
[0067] «Operativamente vinculado» significa unido en una misma molécula de ácido nucleico de tal manera que los elementos unidos están posicionados y orientados entre sí de modo que pueda tener lugar la transcripción de la molécula de ácido nucleico. Un ADN que está operativamente vinculado a un promotor se encuentra bajo el control transcripcional de dicho promotor.
[0068] Una «planta» en el sentido de la presente solicitud puede ser, salvo indicación en contrario, de cualquier especie de entre las plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas. Preferentemente se trata de plantas destinadas a la agricultura o la horticultura o a la producción de bioenergía (bioetanol, biogás, etc.). Preferentemente, las plantas mostradas en la presente solicitud se caracterizan por órganos de reserva tales como tubérculos, raíces, semillas, granos, frutos, etc. Entre ellas se incluyen, a modo de ejemplo,Zea mays, Solanum tuberosum, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum spelta, Helianthus annuus, Secale cereale, Hordeum vulgare, Hordeum bulbosum, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Brassica juncea, Brassica nigra, Glycine max, Gossypium sp., Sorghum bicolor, Triticale, Saccharum officinarum, Setaria italica, Oryza sativa, Oryza minuta, Oryza australiensis, Oryza alta, Brachypodium distachyon, Hordeum marinum, Aegilops tauschii, Daucus glochidiatus, Daucus pusillus, Daucus muricatus, Daucus carota, Eucalyptus grandis, Erythranthe guttata, Genlisea aurea, Musa sp., Avena sp., Nicotiana sylvestris, Nicotiana tabacum, Nicotiana tomentosiformis, Solanum lycopersicum, Coffea canephora, Vitis vinifera, Cucumis sativus, Morus notabilis, Crucihimalaya himalaica, Crucihimalaya wallichii, Cardamine flexuosa, Lepidium virginicum, Capsella bursapastoris, Olmarabidopsis pumila, Arabis hirsuta, Raphanus sativus, Eruca vesicaria sativa, Citrus sinensis, Jatropha curcas, Populus trichocarpa o Beta vulgaris. Una planta conforme a la invención es preferentemente una planta del género Beta, en particular de la especie remolacha azucarera (Beta vulgaris), así como de la subespecieBeta vulgarissubsp. vulgaris.
[0069] Los «órganos» vegetales incluyen, por ejemplo, hojas, tallos, troncos, raíces, yemas vegetativas, meristemos, embriones, anteras, óvulos, semillas o frutos, en particular granos de semilla. El término «parte de planta» o «partes de planta» incluye, aunque no se limita a, el tallo o la caña, hojas, flores, inflorescencias, raíces, frutos y semillas, así como polen. Las «partes» vegetales se refieren, además, a una combinación de varios órganos, por ejemplo una flor o una semilla, o a una parte de un órgano, por ejemplo una sección transversal del tallo. Los «tejidos» vegetales son, por ejemplo, tejidos de callo, tejidos de reserva, tejidos meristemáticos, tejidos foliares, tejidos del tallo, tejidos radiculares, tejidos tumorales vegetales o tejidos reproductivos, así como el tejido formador, el tejido fundamental (el denominado parénquima), el tejido conductor, el tejido de sostén y el tejido de revestimiento (la denominada epidermis). No obstante, mediante esta enumeración no se limita el concepto de tejido. Por «células» vegetales se entienden, por ejemplo, células aisladas con pared celular o agregados de las mismas, o protoplastos.
[0070] El término «secuencia reguladora» se refiere a una secuencia de nucleótidos que influye en la especificidad y/o en la intensidad de la expresión, por ejemplo, al conferir la secuencia reguladora una determinada especificidad tisular. Una secuencia reguladora de este tipo puede estar localizada aguas arriba del punto de iniciación de la transcripción de un promotor mínimo, pero también aguas abajo del mismo, por ejemplo, en una secuencia líder transcrita pero no traducida o dentro de un intrón.
[0071] Un «promotor» es un segmento de ADN no traducido, típicamente situado aguas arriba de una región codificante, que contiene el sitio de unión para la ARN polimerasa e inicia la transcripción del ADN. Un promotor contiene además otros elementos que actúan como reguladores de la expresión génica (por ejemplo, elementos cis-reguladores). Un «promotor central o mínimo» es un promotor que presenta al menos los elementos básicos necesarios para la iniciación de la transcripción (por ejemplo, caja TATA y/o iniciador). Una «planta transgénica» se refiere a una planta en cuyo genoma está integrado al menos un polinucleótido, preferentemente un polinucleótido heterólogo. Preferentemente, el polinucleótido está integrado de forma estable, lo que significa que el polinucleótido integrado se mantiene de manera estable en la planta, se expresa y también puede heredarse de forma estable a la descendencia. La introducción estable de un polinucleótido en el genoma de una planta incluye también la integración en el genoma de una planta de la generación parental precedente, pudiendo el polinucleótido heredarse posteriormente de forma estable. El término «heterólogo» significa que el polinucleótido introducido procede, por ejemplo, de una célula u organismo con un trasfondo genético diferente de la misma especie o de otra especie, o es homólogo a la célula huésped procariótica o eucariótica, pero entonces está localizado en un entorno genético distinto y se diferencia así de un polinucleótido correspondiente que pudiera estar presente de forma natural. Un polinucleótido heterólogo puede estar presente adicionalmente a un gen endógeno correspondiente.
[0072] Las configuraciones y formas de realización de la presente invención se describen a modo de ejemplo con referencia a las figuras y secuencias adjuntas:
[0073] Fig.1: A, C) flores de remolacha azucarera fértiles (Beta vulgarissubsp.vulgaris) y B, D) flores de remolacha azucarera con esterilidad masculina, cuyo fenotipo se remonta al donante C311 [2043_K5]. A, B) flores cerradas cuyos sépalos y pétalos fueron retirados manualmente. Se observan claramente las anteras claras (amarillas) y viables del genotipo fértil (A). En contraste, las anteras de los genotipos estériles presentan una coloración claramente oscura (marrón). Durante la maduración floral, las anteras de los genotipos fértiles se abren y liberan polen (C), mientras que las anteras de los genotipos estériles no continúan su maduración y no contienen polen.
[0074] Fig.2: Modelo génico de BvCYPgst(g6845.t1) anotado en RefBeet 1.2 en el genotipo de referencia KWS2320. La proteína, con una longitud de 517 aminoácidos, está codificada por dos exones con una longitud total de 1554 pb. Los genotipos que presentan un fenotipo de esterilidad masculina muestran una deleción de 533 pb que comprende partes de la región 5’UTR y del primer exón del gen. Con ello queda excluida una transcripción correcta del ARNm y la traducción de una proteína funcional.
[0075] Fig. 3: Alineamiento de un fragmento genómico de ADN de 4721 pb que codifica el modelo génico de remolacha azucarera BvCYPgst(g6845.t1) procedente de genotipos estériles y fértiles. La secuencia de los genotipos estériles presenta una deleción de 533 pb.
[0076] Fig.4: Análisis de secuencia del fragmento genómico de ADN de 4721 pb que codifica el gen de remolacha azucarera BvCYPgst(g6845.t1) procedente de genotipos estériles y fértiles. A) Se muestra la secuencia genómica de ADN del gen CYPgstdeBeta vulgarissubsp.vulgaris, incluyendo la región promotora putativa, así como la 5’UTR y la 3’UTR. La región promotora putativa se muestra en «negrita», la 5’UTR y la 3’UTR están subrayadas, el exón 1 está en «negrita» y subrayado, el exón 2 está en «cursiva» y subrayado y el intrón se muestra en «cursiva». Esta secuencia corresponde a la secuencia depositada en la SEQ ID nº: 1. Las regiones funcionales del gen están localizadas como sigue: Promotor putativo 1..1518; 5’UTR 1519..1761; región transcrita 1519..4275; exón 1762..2679; intrón 2680..3506; exón 3507..4142; 3’UTR 4143..4275. B) Se muestra la secuencia de ADNc del gen CYPgstdeBeta vulgarissubsp.vulgaris, incluyendo la 5’UTR y la 3’UTR. La 5’UTR y la 3’UTR están subrayadas, el exón 1 se muestra en «negrita» y subrayado y el exón 2 se muestra en «cursiva» y subrayado. Esta secuencia corresponde a la secuencia depositada en la SEQ ID nº: 2. Las regiones funcionales del ADNc están localizadas como sigue: 5'UTR 1..243; exón 244..1161; exón 1162..1797; 3'UTR 1798..1930. C) Se muestra la secuencia de aminoácidos del gen CYPgstdeBeta vulgarissubsp.vulgaris. Esta secuencia corresponde a la secuencia depositada en la SEQ ID nº: 3. D) Se muestra la secuencia genómica de ADN del gen CYPgst mutado deBeta vulgarissubsp.vulgaris, incluyendo la región promotora putativa así como la 3’UTR. La región promotora putativa se muestra en «negrita», la 3’UTR está subrayada, el exón 1 acortado está en «negrita» y subrayado, el exón 2 está en «cursiva» y subrayado y el intrón se muestra en «cursiva». Esta secuencia corresponde a la secuencia depositada en la SEQ ID nº: 8. Las regiones funcionales del gen CYPgst mutado están localizadas como sigue: promotor putativo 1..1353; región transcrita 1354..3542; exón truncado 1354..1938; intrón 1939..2755; exón 2756..3394; 3’UTR 3395..3542.
[0077] Fig. 5: Análisis de expresión del genBvCYPgst(GST, g6845.t1) mediante qRT-PCR. El ARN se aisló de distintos tejidos de plantas fértiles y se representó la expresión del genGSTen comparación con la expresión del gen g4645.t1. n.d.: no se detectó expresión. En el experimento mostrado, elGSTse expresa con mayor intensidad en flores cerradas. En comparación, no se detecta expresión deGSTen las flores cerradas de los genotipos estériles.
[0078] Descripción detallada de la invención
[0079] La presente invención se define por las características de las reivindicaciones independientes.
[0080] En un aspecto, la invención se refiere a una planta de la especieBeta vulgarisque presenta un fenotipo recesivo de esterilidad masculina codificada nuclearmente, caracterizada por que el fenotipo se correlaciona con una mutación en el gen endógeno de oxidasa del citocromo P450, caracterizada por que el gen de oxidasa del citocromo P450 no mutado es un gen seleccionado del grupo que consiste en:
[0081] (a) una secuencia de nucleótidos que presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID nº: 1 o la SEQ ID nº: 2 o un fragmento funcional de la misma;
[0082] (b) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 3; (c) una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar, en condiciones rigurosas, con una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos conforme a (a) o (b); y
[0083] (d) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de al menos el 80 % a lo largo de toda la secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID nº: 3,
[0084] en la que la mutación es una deleción, adición, inserción o sustitución en la secuencia nucleotídica codificante del gen de oxidasa del citocromo P450, en una señal de splicing o en una secuencia reguladora, preferentemente la secuencia promotora, del gen de oxidasa del citocromo P450, y en la que dicha mutación reduce o impide la transcripción y/o traducción de una proteína de oxidasa del citocromo P450 funcional.
[0085] Conforme a una realización preferente de la presente invención, la citada planta es homocigota para la mutación y estéril masculina, estando inhibida en la planta estéril la formación de polen funcional.
[0086] Preferentemente, la mutación consiste en una deleción entre las posiciones nucleotídicas 1560 y 2095 de la SEQ ID nº: 1.
[0087] Preferentemente, la citada deleción puede identificarse mediante la ausencia de uno o de ambos loci marcadores sle5983d14 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID nº: 4 y 5) y sle5983d17 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID nº: 6 y 7) y mediante la presencia de un marcador ubicuo;
[0088] Conforme a una realización preferente de la presente invención, en la planta según la invención el gen está localizado en un segmento del cromosoma 1 entre los loci marcadores sxn2151s01 y sle3305s02, estando representada la secuencia del marcador sxn2151s01 en la SEQ ID nº: 24 y la secuencia del marcador sle3305s02 en la SEQ ID nº: 26 indicando la presencia del locus que causa la esterilidad masculina codificada nuclearmente, y estando representadas la secuencia del marcador sxn2151s01 en la SEQ ID nº: 25 y la secuencia del marcador sle3305s02 representada en la SEQ ID nº25 y la secuencia del marcador sle3305s02 en la SEQ ID nº: 27 indicando la secuencia de referencia.
[0089] En otro aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una shRNA (small hairpin RNA), una siRNA (small interfering RNA), un ARN antisentido, un ARN sentido o un ARN de doble cadena que, tras su expresión en una célula vegetal o tras su introducción en una célula vegetal, conduce a la reducción o inhibición de la expresión del citado gen funcional (no mutado) de citocromo P450 oxidasa, tal como se ha definido anteriormente.
[0090] En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula vegetal que contiene la citada molécula de ADN recombinante.
[0091] En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de una planta estéril masculina de la especieBeta vulgaris, caracterizado por que se reduce o inhibe la expresión del gen de la citocromo P450 oxidasa conforme a una de las secuencias nucleotídicas mencionadas anteriormente (a), (b), (c) o (d), comprendiendo dicho procedimiento una etapa de introducción de la molécula de ADN recombinante según la reivindicación 8, en donde dicha etapa del procedimiento comprende una transformación mediada por Agrobacterium, un etiquetado por T-DNA o una mutagénesis mediante TILLING, o bien una etapa de mutagénesis dirigida de las secuencias nucleotídicas (a), (b), (c) o (d), como consecuencia de la cual la expresión del gen se reduce o inhibe, por ejemplo, mediante RNAi o cosupresión o debido a la mutación introducida.
[0092] En otro aspecto, la presente invención se refiere a una planta según la invención que contiene una célula vegetal que comprende la citada molécula de ADN recombinante y/o que es obtenible mediante uno de los procedimientos anteriormente mencionados para la obtención de una planta estéril masculina de la especieBeta vulgaris.
[0093] En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la restauración de la fertilidad de una planta según la invención, que comprende la introducción en la planta de un gen funcional (no mutado) de citocromo P450 oxidasa mediante transformación con un ADN recombinante que comprende una secuencia nucleotídica no mutada con una secuencia codificante conforme a las secuencias nucleotídicas anteriormente mencionadas (a)–(d), que operativamente está vinculada a un promotor heterólogo que es preferentemente capaz de dirigir la expresión de la secuencia nucleotídica de forma específica en flores cerradas y/o frutos. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un órgano, parte vegetal, tejido o célula de la planta según la invención, o a una semilla o descendencia de la planta según la invención, en donde la semilla o la descendencia presenta o presentan la mutación definida conforme a la invención y/o la molécula de ADN recombinante conforme a la invención.
[0094] En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la identificación de una planta según la invención mediante la detección de la mutación en el gen de citocromo P450 oxidasa o de un marcador que está acoplado a dicha mutación.
[0095] En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud que hibrida específicamente con una de las secuencias nucleotídicas definidas anteriormente (a)–(d) y/o de un oligonucleótido, preferentemente con una longitud máxima de 50 nucleótidos, que presenta una de las siguientes secuencias nucleotídicas:
[0096] (i) SEQ ID nº: 4, 6 o un complemento de los mismos, o
[0097] (ii) SEQ ID nº: 5, 7 o un complemento de las mismas,
[0098] para la identificación de una planta según la invención.
[0099] La presente invención proporciona una planta que presenta, como consecuencia de una mutación en un segmento de ADN del genoma nuclear que comprende un gen de citocromo P450 oxidasa (CYPgst), un fenotipo de esterilidad masculina codificado nuclearmente. Este se caracteriza por que la mutación se mantiene mediante una expresión recesiva del carácter y, por consiguiente, la planta puede utilizarse para la simplificación de programas de mejora que requieren una elevada carga de trabajo. La identificación del gen responsable de esta expresión del carácter se llevó a cabo en la remolacha azucarera (Beta vulgarissubsp.vulgaris), tal como se describe en los ejemplos 1 y 2 junto con las figuras 1 a 5. El gen en cuestión fue clasificado, en virtud de sus características estructurales determinadas mediante análisis de secuencia, como miembro de las citocromo P450 oxidasas (CYP) y, en función del fenotipo de esterilidad masculina codificada nuclearmente observado para su mutante, se designó con el sufijo «gst». Dado que el gen fue identificado en la remolacha azucarera, se utiliza además el prefijo «Bv» cuando se hace referencia específicamente al gen descrito en los ejemplos.
[0100] En general, la presente invención se refiere a una planta, en particular una planta cultivada o útil, que presenta un fenotipo recesivo de esterilidad masculina codificada nuclearmente, caracterizada por que dicho fenotipo se correlaciona con una mutación que afecta al gen endógeno de citocromo P450 oxidasa (CYPgst), o con la ausencia, o con un contenido o actividad reducidos en comparación con una planta silvestre correspondiente (fértil masculina), de una proteína CYPgstfuncional codificada por el gen silvestre CYPgst, y caracterizada por que el gen CYPgstno mutado es el genBvCYPgstdeBeta vulgaris, que comprende una de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID nº: 1 o 2, o bien codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 3, o su homólogo, análogo u ortólogo. Tal como se ha descrito anteriormente y se explica en los ejemplos, mediante enfoques bioinformáticos clásicos (búsquedas en bases de datos y programas informáticos para el cribado de secuencias homólogas) pueden identificarse en plantas otras proteínas CYPgsty sus genes codificantes, es decir, homólogos, análogos y ortólogos, siendo de esperar que una mutación produzca el mismo fenotipo que el observado en la remolacha azucarera. Por consiguiente, también se divulga una planta caracterizada por que el gen CYPgstno mutado es el genStCYPgstdeSolanum tuberosum, que comprende preferentemente una de las secuencias mostradas en la SEQ ID nº: 12 o 13, o bien codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 14, o su homólogo, análogo u ortólogo; o bien por que el gen CYPgst no mutado es el genZmCYPgstdeZea mays, que comprende preferentemente una de las secuencias mostradas en la SEQ ID nº: 9 o 10, o bien codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº: 11, o su homólogo, análogo u ortólogo.
[0101] El término homólogo(s) significa en este contexto que los genes en cuestión (procedentes de dos especies vegetales diferentes) presentan esencialmente la misma función y un antecesor común y, por lo tanto, muestran típicamente una identidad significativa en sus secuencias de ácido nucleico y/o en las secuencias de aminoácidos que codifican. Sin embargo, también existen muchos genes que son homólogos entre sí sin que las secuencias proteicas permitan un alineamiento pareado significativo. Por el contrario, el término análogo(s) describe genes o proteínas que (igualmente) presentan una función idéntica o similar, pero que no se han originado a partir de la misma estructura, es decir, que no tienen un antecesor común. En este caso, a menudo no puede detectarse una identidad significativa en sus secuencias de ácido nucleico y/o en las secuencias de aminoácidos que codifican, o, en el mejor de los casos, en determinados dominios funcionales.
[0102] En el contexto de la secuenciación genómica, los homólogos se clasifican con mayor precisión para fines de anotación. Para ello se introdujeron los conceptos de ortología y paralogía. Los ortólogos son genes que están relacionados mediante un acontecimiento de especiación. Los parálogos son genes que están relacionados mediante un acontecimiento de duplicación.
[0103] Un gen se considera, en el sentido de la presente invención, un homólogo, análogo u ortólogo cuando es capaz de complementar el fenotipo de esterilidad masculina del gen de referencia CYPgsten la remolacha azucarera (BvCYPgst) y/o cuando una mutación dirigida en el gen correspondiente o alteraciones de la actividad biológica del producto génico codificado por el homólogo o el análogo provocan un fenotipo de esterilidad masculina en la planta de la que procede el gen. En consecuencia, el homólogo o el análogo correspondiente del gen CYPgstde la presente invención ilustrado en los ejemplos puede caracterizarse preferentemente por ser capaz de complementar el fenotipo de esterilidad masculina observado para la mutante CYPgstde la remolacha azucarera, es decir, de restaurar el fenotipo fértil. Adicional o alternativamente, el homólogo o análogo CYPgstpuede caracterizarse preferentemente por que, mediante la inhibición de su expresión o de la actividad biológica del producto génico codificado por el homólogo o el análogo, se provoca un fenotipo de esterilidad masculina. Preferentemente, el fenotipo de esterilidad masculina presenta las características ejemplificadas para la mutante CYPgstde la remolacha azucarera, en particular las descritas en los ejemplos; véanse también las realizaciones descritas anteriormente.
[0104] Las técnicas y procedimientos correspondientes de genética de complementación son conocidos por el experto en la materia a partir del estado de la técnica; véase, por ejemplo, Napoli et al., Plant Physiology 120 (1999), 615-622, que describen una mutación en una línea endogámica de petunia que presenta, entre otros, un fenotipo de esterilidad masculina, el cual fue revertido mediante complementación transgénica con una cDNA funcional de chalcona sintasa A, pudiéndose así determinar que el gen de la chalcona sintasa A es esencial para el fenotipo de esterilidad masculina, o bien que dicho fenotipo de esterilidad masculina es causado por una mutación en este gen.
[0105] En Jeong et al., J. Exp. Bot.65 (2014), 6693-6709, la esterilidad masculina en la denominada mutante ms10<35>de tomate fue complementada y revertida mediante complementación y expresión transgénica de diversos genes candidatos. Los procedimientos para la obtención de esterilidad masculina en plantas transgénicas mediante la inhibición de un gen diana, en este caso CYPgst, son igualmente conocidos por el experto en la materia; véase, por ejemplo, la solicitud internacional WO 1996/017945, así como las realizaciones descritas a continuación.
[0106] Así, en una realización de la presente invención, una planta que presenta un fenotipo recesivo de esterilidad masculina codificada nuclearmente se caracteriza por que dicho fenotipo es provocado por una mutación que afecta al gen endógeno de citocromo P450 oxidasa (CYPgst). No obstante, la planta según la invención también puede caracterizarse por la ausencia o, en comparación con una planta silvestre correspondiente fértil masculina, por un contenido o una actividad reducidos de una proteína CYPgstfuncional codificada por el gen silvestre CYPgst. Se divulga en la SEQ ID nº 8 una secuencia genómica del gen mutado que ya no puede ser traducido. En particular, la solicitud se refiere a una planta que pertenece a una planta cultivada o útil.
[0107] En el estado de la técnica (Morant et al., The Plant Cell, 19 (2007), 1473-1487) se describe que la inactivación del gen CYP703 enArabidopsis thaliana(CYP703A2) conduce a una reducción en la formación de polen y, por consiguiente, a una esterilidad masculina parcial. Esto se debe a que la esporopolenina, como componente principal de la capa de exina del polen, estaba ausente o estructuralmente alterada. Aunque resulta plausible que el gen CYPgstdesempeñe una función distinta, dado que una mutación conduce a una esterilidad masculina recesiva codificada nuclearmente y no se produce la formación de polen, no debe excluirse que el gen CYPgsty el gen CYP703 deArabidopsis thalianapertenezcan a la misma familia génica y, por tanto, desempeñen la misma función o, al menos, una función similar en la síntesis de la esporopolenina. Sin quedar vinculados a ninguna teoría determinada, resulta sin embargo plausible que, en plantas cultivadas que han sido optimizadas durante años mediante selección dirigida y cruzamientos, entre otros, en cuanto a rendimiento, resistencia a plagas, tolerancia frente a factores de estrés abiótico, así como al contenido de componentes vegetales, se haya perdido la capacidad de compensar la ausencia de esporopolenina y que, en consecuencia, la ausencia de esporopolenina dé lugar a que se impida la formación de polen y que la planta sea, por tanto, estéril masculina.
[0108] Dado que en Morant et al. (2007) se describe que el gen CYP703A2 o las correspondientes líneas knockout de Arabidopsis presentan únicamente un fenotipo parcialmente estéril masculino, y que un fenotipo de este tipo no es adecuado para la obtención de híbridos, en una forma de realización el gen CYP703A2 deArabidopsis thaliana, así como los mutantes descritos en Morant et al., en particular aquellos con las secuencias mostradas en la figura 1, quedan excluidos de la presente invención.
[0109] Las plantas, como eucariotas, poseen dos o más copias de su información genética por célula. Cada gen está representado por lo general por dos alelos, que pueden ser idénticos en estado homocigótico o diferentes en estado heterocigótico. El fenotipo de la planta conforme a la invención está causado por una mutación en el genoma nuclear y se mantiene mediante una expresión recesiva del carácter. En consecuencia, la planta es fértil masculina cuando la mutación está presente en estado heterocigótico y es estéril masculina cuando la mutación está presente en estado homocigótico.
[0110] En una planta estéril, la formación de polen funcional está impedida, preferentemente impedida por completo, entendiéndose en el contexto de la presente invención que el término «impedido» significa que, en una planta que es homocigótica para la mutación en el locus CYPgsty estéril masculina, la formación de polen no tiene lugar en un 95 %, preferentemente en un 96 %, más preferentemente en un 97 %, especialmente preferentemente en un 98 % y, en particular, preferentemente en un 99 %, mientras que «impedido por completo» significa que la formación de polen está impedida en más del 99 %, preferentemente en un 100 %. Preferentemente, en este contexto, «impedido» significa que, al intentar cruzar dicha planta como progenitor masculino con una planta de tipo silvestre correspondiente, esencialmente no se produce formación de semillas y/o no se generan descendientes.
[0111] En el caso deBeta vulgarissubsp.vulgaris, ello se pone de manifiesto en la figura 1. En flores cerradas, cuyos sépalos y pétalos se retiraron manualmente, se reconocen las anteras claras (amarillas) y vitales del genotipo fértil (A). Por el contrario, las anteras de los genotipos estériles están claramente oscurecidas (marrones) (B). Durante la maduración floral, las anteras de los genotipos fértiles se abren y liberan polen (C), mientras que las anteras de los genotipos estériles no continúan madurando y no liberan polen (D).
[0112] EnArabidopsis thaliana, la proteína CYP703 cataliza la conversión de ácidos grasos saturados de cadena media en los correspondientes ácidos grasos monohidroxilados, con una hidroxilación preferente del ácido láurico C14 en la posición C7. Sin quedar vinculados a ninguna teoría determinada, resulta plausible que la proteína CYPgstno desempeñe exactamente la misma función que la proteína CYP703 deArabidopsis thaliana, pero sí una función similar, dado que la inactivación de ambos genes influye en la formación de polen. Así, puede atribuirse a CYPgstuna función en la síntesis de la esporopolenina, el componente principal de la capa de exina del polen viable.
[0113] Por tanto, la proteína CYPgstpodría presentar una función en la síntesis de la esporopolenina y catalizar la conversión de ácidos grasos saturados de cadena media en los correspondientes ácidos grasos monohidroxilados, preferentemente la hidroxilación del ácido láurico en la posición C7.
[0114] Mediante análisis de transcripción (ejemplo 2) se demostró que, en genotipos fértiles deBeta vulgarissubsp.vulgaris, el gen CYPgstse expresaba en flores cerradas y frutos, y que en raíces y hojas no se detectaba expresión alguna (figura 5). En consecuencia, la solicitud divulga una planta como la descrita anteriormente, en la que el gen CYPgst se expresa al menos en flores cerradas y frutos, preferentemente de manera específica en flores cerradas y frutos.
[0115] En una forma de realización, la mutación impide la transcripción y/o traducción de una proteína funcional en la planta conforme a la invención, tratándose preferentemente la mutación de una deleción, adición, inserción o sustitución en la secuencia nucleotídica codificante del gen CYPgst, en una señal de splicing o en una secuencia reguladora, preferentemente la secuencia promotora, del gen CYPgst.
[0116] Se divulga una deleción de al menos 500-600 pb que afecta a la región codificante o a la región promotora del gen CYPgst. No obstante, la deleción también puede presentar una longitud de al menos 20, 30 o 50 pares de bases consecutivos, de al menos 100, 150, 200 o 250 pares de bases consecutivos, o preferentemente de al menos 300, 400 o 500 pares de bases consecutivos. En el caso de la adición, se trata preferentemente de una inserción de uno o varios nucleótidos en la secuencia genómica, preferentemente en la secuencia génica codificante, que conduce a un desplazamiento del marco de lectura. En el caso de la sustitución, se trata preferentemente de una mutación puntual en la secuencia genómica, preferentemente en la secuencia génica codificante, que genera codones de parada o errores de splicing.
[0117] Mediante la secuenciación comparativa de fragmentos de ADN genómico que comprenden el gen CYPgsty la región promotora putativa tanto de plantas con esterilidad masculina como de plantas con fertilidad masculina deBeta vulgarissubsp.vulgaris, se determinó que una deleción de 533 pb es responsable del fenotipo estéril masculino (véase el ejemplo 2 y la figura 3), y que dicha deleción se sitúa entre las posiciones nucleotídicas 1560 y 2095 de la SEQ ID nº 1.
[0118] Así, en una forma de realización adicional preferente, se trata de una deleción de 533 pb que comprende partes de la región 5’UTR y del primer exón del gen CYPgstdeBeta vulgarissubsp.vulgaris; véase la figura 3. El gen funcionalBvCYPgstcomprende dos exones con una longitud total de 1554 pb. Un modelo génico anotado en RefBeet 1.2 se muestra en la figura 2, y la secuencia de ADN genómico de CYPgst con la deleción que da lugar a un exón 1 truncado se recoge en la SEQ ID nº 8. Las posibles mutaciones puntuales que podrían dar lugar a una interrupción prematura de la transcripción del gen CYPgstdeBeta vulgarissubsp.vulgariso provocar un splicing defectuoso se enumeran en la tabla 1, situándose preferentemente entre las posiciones nucleotídicas 1560 y 2095 de la SEQ ID nº 1.
[0119] Como se muestra en el ejemplo 1 de la presente invención, en el marco del mapeo fino pudieron identificarse marcadores estrechamente flanqueantes del gen CYPgsty, de este modo, determinarse la posición del gen CYPgsten el genoma deBeta vulgarissubsp.vulgaris. Esto, a su vez, constituyó la base para el desarrollo de marcadores genéticos mediante los cuales pudo detectarse la deleción en el gen CYPgst.
[0120] En consecuencia, en una forma de realización de la presente invención, la planta se caracteriza por que, en remolacha azucarera (Beta vulgarissubsp.vulgaris), la deleción se detecta mediante la ausencia de uno o de ambos loci marcadores sle5983d14 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID nº: 4 y 5) y sle5983d17 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID nº: 6 y 7), y por la presencia de un marcador ubicuo. El marcador ubicuo confirma en este caso la calidad suficiente de la extracción de ADN. Además, en una forma de realización, el gen deBeta vulgarissubsp.vulgaris(remolacha azucarera) está localizado en un segmento del cromosoma 1 entre los loci marcadores sxn2151s01 y sle3305s02. En una forma de realización preferente, estos loci marcadores se sitúan en 33,42 y 35,15 cM en el cromosoma 1 (basándose en el mapa genético ZR INT 1202) y, con base en el mapa físico del genoma (Physmapv2), dicha región presenta un tamaño físico de 215,4 kbp y se encuentra entre las posiciones 3185718 pb y 3401120 pb. Para ambos loci marcadores mencionados anteriormente se desarrollaron marcadores KASP (KASP™, química de genotipado de SNP de LGC Limited), mediante los cuales puede identificarse el SNP que debe detectarse o la secuencia de referencia correspondiente. La secuencia marcadora sxn2151s01 representada en la SEQ ID nº 24 y la secuencia marcadora sle3305s02 representada en la SEQ ID nº 26 indican la presencia del locus gst; la secuencia marcadora sxn2151s01 representada en la SEQ ID nº 25 y la secuencia marcadora sle3305s02 representada en la SEQ ID nº 27 indican la secuencia de referencia, diferenciándose las secuencias marcadoras en cada caso en la posición nucleotídica 21, encontrándose en dicha posición una «G» en el genotipo portador del locus gst y una «A» en dicha posición en el genotipo de referencia KWS2320.
[0121] Según la presente divulgación, el segmento puede tener un tamaño aproximado de 50 a 5000 kbp, preferentemente de 100 a 1000 kbp, más preferentemente de 100 a 500 kbp y especialmente preferentemente de 200 a 250 kbp, comprendiendo dicho segmento otros genes codificantes de proteínas, preferentemente 21 genes.
[0122] Según la presente divulgación, el gen no mutado es el gen funcionalBvCYPgstdeBeta vulgaris, preferentemente deBeta vulgarissubsp.vulgaris, o un gen funcional homólogo, análogo u ortólogo de otra planta útil o cultivada.
[0123] El experto en la materia puede obtener otras proteínas CYPgstde la bibliografía pertinente, así como de bases de datos, utilizando perfiles de búsqueda y programas informáticos adecuados para el cribado de secuencias homólogas o para comparaciones de secuencias. Además, el experto en la materia puede identificar por sí mismo, mediante técnicas de biología molecular convencionales, otras secuencias de ADN que codifican proteínas CYPgsty utilizarlas en el marco de la presente invención. Así, por ejemplo, pueden derivarse sondas de hibridación adecuadas a partir de la secuencia del gen CYPgsty emplearse para el cribado de bancos genómicos y/o de ADNc del organismo deseado. En este caso, el experto en la materia puede recurrir a métodos habituales de hibridación, clonación y secuenciación, como los descritos, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. Asimismo, el experto en la materia puede sintetizar y utilizar oligonucleótidos cebadores basándose en secuencias conocidas para amplificar secuencias de CYPgst.
[0124] Se divulga en este contexto, en relación con el gen homólogo, análogo u ortólogo, un gen procedente deZea mays, que preferentemente comprende una de las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID nº 9 o 10 o bien codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº 11; deSolanum tuberosum, que preferentemente comprende una de las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID nº 12 o 13 o bien codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº 14; deTriticum aestivum, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº 15; deHelianthus annuus, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº 16; deHordeum vulgare, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº 17; deBrassica napus, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº 18; deBrassica oleracea, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº 19; deBrassica rapa, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº 20; deGlycine max, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº 21; deGossypium, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº 22; y deSorghum bicolor, que preferentemente codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº 23. Las plantas mencionadas pueden clasificarse como plantas útiles y, preferentemente, como plantas cultivadas.
[0125] Una forma de realización de la planta conforme a la invención es una planta como la descrita anteriormente, en la que el gen no mutado (gen de tipo silvestre) presenta una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID nº 1 o 2.
[0126] En una forma de realización, el gen no mutado (gen de tipo silvestre) presenta una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº 3.
[0127] La secuencia de nucleótidos puede modificarse mediante procedimientos convencionales conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo por mutagénesis sitio-dirigida, mutagénesis mediada por PCR, mutagénesis mediante transposones, edición del genoma, etc., pudiendo introducirse en el gen sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones y/o cualquier otra modificación, ya sea de forma individual o en combinación, que alteren la secuencia de nucleótidos pero conserven la misma función que la secuencia de partida.
[0128] Por tanto, la invención comprende asimismo una planta como la descrita anteriormente, en la que la secuencia de nucleótidos puede comprender igualmente un fragmento funcional de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID nº 1 o 2. El término «fragmento» comprende genes con una secuencia de nucleótidos suficientemente similar a la secuencia de nucleótidos mencionada anteriormente. El término «suficientemente similar» significa una primera secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos que presenta un número suficiente o mínimo de nucleótidos o residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes en relación con una segunda secuencia de nucleótidos o una segunda secuencia de aminoácidos. Con respecto a la secuencia de aminoácidos, esta presenta, incluso tras una modificación mediante uno de los procedimientos mencionados anteriormente, un dominio estructural común y/o posee una actividad funcional común. Las secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos que presentan al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 91 %, al menos aproximadamente un 92 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 94 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 % o al menos aproximadamente un 100 % de identidad se definen en el presente documento como suficientemente similares. Preferentemente, en el caso de los fragmentos funcionales, se considera que existe una similitud suficiente cuando la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos presenta en general la misma propiedad que las secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos de la presente invención mencionadas anteriormente.
[0129] En consecuencia, en una forma de realización, el gen no mutado (gen de tipo silvestre) comprendido en la planta presenta una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar, en condiciones estrictas, con una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID nº 1, 2, o con la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº 3. Además, otra forma de realización comprende el gen no mutado (gen de tipo silvestre), que presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que, con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nº 3, presenta desviaciones en forma de deleciones, sustituciones, adiciones y/o inserciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos, preferentemente no superiores al 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o no superiores al 1 % sobre la totalidad de la secuencia de aminoácidos.
[0130] En otra o adicional forma de realización, la secuencia de nucleótidos del gen no mutado (gen de tipo silvestre) codifica una proteína con la misma actividad enzimática que la proteína codificada por el ADN de las formas de realización anteriores.
[0131] En otra forma de realización, el gen no mutado (gen de tipo silvestre) comprendido en la planta presenta un ADN que comprende al menos 200 o 400, preferentemente al menos 600 u 800, y especialmente preferentemente al menos 1000 nucleótidos consecutivos del promotor de la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID nº 1 desde las posiciones nucleotídicas 1 a 1518, preferentemente desde las posiciones nucleotídicas 518 a 1518, y especialmente preferentemente desde las posiciones nucleotídicas 1318 a 1518, o una secuencia que hibrida con dicha región, siendo la secuencia de nucleótidos capaz de controlar la expresión del gen o de una molécula de ácido nucleico heteróloga que esté operativamente vinculada con el ADN, de manera específica en flores cerradas y/o frutos.
[0132] Según la presente divulgación, la planta puede ser una planta endogámica o una planta híbrida. La planta endogámica puede utilizarse como planta parental para la obtención de híbridos. La ventaja de utilizar una planta endogámica heterocigótica para el carácter de esterilidad masculina recesiva codificada nuclearmente es que, en cada etapa de multiplicación, se segrega en individuos fértiles y estériles. El individuo con esterilidad masculina puede utilizarse para la obtención de híbridos, eliminándose así la necesidad de una eliminación manual de las anteras y dejando asimismo de ser necesaria la conservación paralela de una línea mantenedora estéril.
[0133] Otra forma de realización de la presente invención comprende no solo la planta conforme a la invención que presenta una mutación en el gen CYPgst, sino también una molécula de ADN que presenta una secuencia de nucleótidos como la definida anteriormente con una mutación en forma de deleción, adición, inserción o sustitución, en la que dicha mutación provoca que no se sintetice ninguna proteína CYPgstfuncional.
[0135] En una forma de realización preferente, la mutación está localizada en la secuencia de nucleótidos codificante del gen CYPgst, en una señal de splicing o en una secuencia reguladora del gen CYPgst, preferentemente en el promotor del gen CYPgst. En particular, la mutación puede ser una deleción entre las posiciones nucleotídicas 1560 y 2095 de la SEQ ID nº: 1. La deleción puede presentar una longitud de al menos 20, 30 o 50 pares de bases consecutivos, preferentemente de al menos 100, 150, 200 o 250 pares de bases consecutivos y especialmente preferentemente de al menos 300, 400 o 500 pares de bases consecutivos. En otra forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico presenta una mutación puntual en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID nº: 1 conforme a la Tabla 1, preferentemente entre las posiciones nucleotídicas 1560 y 2095 de la SEQ ID nº: 1.
[0137] Como se ha descrito anteriormente, las sondas de hibridación de ADN derivadas de la secuencia del gen CYPgstpueden emplearse para el cribado de bancos genómicos y/o de ADNc de otros organismos con el fin de identificar genes homólogos. Para lograr una hibridación específica, dichas sondas deben ser específicas y presentar una longitud mínima de 15 nucleótidos, preferentemente de al menos 20 nucleótidos. Las sondas pueden utilizarse para amplificar los genes homólogos identificados mediante el conocido proceso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Además, estas sondas pueden emplearse también para la detección de mutaciones en el gen CYPgst. Puede encontrarse una descripción detallada de la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte 1, capítulo 2, «Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays», Elsevier, Nueva York (1993); y en Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2, Ausubel et al., eds., Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1995).
[0139] Por consiguiente, un ácido nucleico de una longitud de al menos 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos, preferentemente de al menos 21, 22, 23, 24 o 25, especialmente preferentemente de al menos 30, 35, 40, 45 o 50 y, muy especialmente preferentemente, de al menos 100, 200, 300, 500 o 1000 constituye objeto de la presente invención, en el que dicho ácido nucleico hibrida específicamente con una secuencia de nucleótidos descrita anteriormente que comprende el gen CYP703 no mutado de tipo silvestre o con una molécula de ADN descrita anteriormente que presenta una mutación en forma de deleción, adición, inserción o sustitución que da lugar a que no se forme ninguna proteína CYP703 funcional.
[0141] Mediante el mapeo fino descrito anteriormente pudo determinarse la posición del gen CYPgsten el genoma deBeta vulgarissubsp.vulgaris. Esto, a su vez, constituyó la base para el desarrollo de marcadores genéticos mediante los cuales pudo detectarse la deleción en el gen CYPgst.
[0143] Por tanto, la presente invención se refiere, además de a las plantas descritas anteriormente, a marcadores en forma de oligonucleótidos, en particular oligonucleótidos cebadores. Estos comprenden una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud, que hibrida específicamente con una secuencia de nucleótidos definida anteriormente o con una molécula de ADN definida anteriormente que presenta una mutación en forma de deleción, adición, inserción o sustitución que da lugar a que no se sintetice ninguna proteína CYPgst funcional. Preferentemente, dichos oligonucleótidos presentan una longitud máxima de 50 nucleótidos. Más preferentemente, los oligonucleótidos son más cortos y presentan una longitud comprendida entre 15 y 25 nucleótidos. Como se muestra en el ejemplo 2 de la presente invención, los oligonucleótidos presentan preferentemente una de las siguientes secuencias de nucleótidos: (i) SEQ ID nº 4 o 6, o un complemento de las mismas, o (ii) SEQ ID nº 5 o 7, o un complemento de las mismas.
[0145] Asimismo, se divulga una proteína CYPgst codificable por una secuencia de nucleótidos descrita anteriormente, así como un fragmento funcional y/o inmunológicamente activo de la misma, y un anticuerpo que se une específicamente a la proteína CYPgst o a su fragmento aquí descrito. La producción recombinante de proteínas y fragmentos es conocida por el experto en la materia y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001.
[0146] 2008. Production of Recombinant Proteins. Current Protocols in Protein Science. 52:5.0:5.0.1-5.0.4. Los anticuerpos policlonales o monoclonales frente a la proteína pueden ser producidos por el experto en la materia mediante procedimientos conocidos, como los descritos en E. Harlow et al., editores, Antibodies: A Laboratory Manual 3rd Ed. La producción de anticuerpos monoclonales, así como de fragmentos Fab y F(ab’)₂, que también resultan útiles en métodos de detección de proteínas, puede llevarse a cabo mediante diversos métodos habituales, como los descritos en Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, S.98-118, New York: Academic Press (1983). El anticuerpo puede utilizarse entonces para el cribado de bibliotecas de ADNc de expresión con el fin de identificar genes idénticos, homólogos o heterólogos mediante cribado inmunológico (Sambrook et al., Molecular Cloning:). A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 o Ausubel et al, 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).
[0148] La proteína CYPgst es la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID nº 3, o una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID nº 3 en al menos un 80 %, 82 %, 84 %, 86 % u 88 %, preferentemente en al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 %, especialmente preferentemente en al menos un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 %, preferentemente a lo largo de toda su longitud.
[0149] Asimismo, se divulga una molécula de ADN recombinante que comprende el gen CYPgstno mutado (gen de tipo silvestre) y que presenta las propiedades de la secuencia de nucleótidos mencionadas anteriormente. Preferentemente, la molécula de ADN recombinante presenta un promotor y/o otros elementos de control de la transcripción o de la traducción, o bien está asociada con los mismos. Los promotores utilizados serán principalmente promotores específicos de tipo celular que permiten la transcripción del ADN únicamente en células predeterminadas. Además de los promotores, existe una pluralidad de otros elementos de control de la transcripción, tales como, a modo de ejemplo y sin limitarse a ellos, potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, que están funcionalmente vinculados con el ADN para permitir una transcripción dirigida y específica de tipo celular. Los promotores y otros elementos de regulación de la transcripción son generalmente conocidos y accesibles para el experto en la materia en el estado de la técnica; véase, por ejemplo, WO 00/75359, desde la página 23, línea 5, hasta la página 24, línea 17. Esta molécula de ADN recombinante puede utilizarse para restaurar la fertilidad en plantas que presentan un fenotipo de esterilidad masculina recesiva codificada nuclearmente.
[0150] Dado que, como se ha descrito anteriormente, el gen CYPgstse expresa en flores cerradas y frutos y no en raíces y/o hojas, la molécula de ADN recombinante comprende, en una forma de realización preferente, o bien un promotor que presenta una secuencia de nucleótidos descrita anteriormente y que está operativamente vinculado a una molécula de ácido nucleico heteróloga, o bien una secuencia de nucleótidos codificante como la definida anteriormente que comprende el gen CYPgst de tipo silvestre y que está operativamente vinculada a un promotor heterólogo. Preferentemente, dicho promotor es capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos de manera específica en flores cerradas y/o frutos. Más preferentemente, la molécula de ADN recombinante comprende el promotor nativo del gen CYPgst no mutado deBeta vulgarissubsp.vulgaris(SEQ ID nº 1).
[0151] En consecuencia, la presente invención comprende asimismo el uso de la molécula de ADN aquí descrita o del promotor aquí descrito para la expresión específica de moléculas de ácido nucleico heterólogas en flores y/o frutos de plantas. Para ello es necesaria una vinculación operativa de la molécula de ácido nucleico heteróloga con el promotor correspondiente, así como la introducción de dicha molécula de ADN recombinante en la célula diana, que es preferentemente una célula vegetal. Los procedimientos para la expresión heteróloga de moléculas de ADN recombinante se describen con mayor detalle más adelante.
[0152] Otro objeto de la presente invención es una molécula de ADN recombinante que presenta una secuencia de nucleótidos conforme a la invención, que codifica una shRNA (small hairpin RNA), una siRNA (small interfering RNA), ARN antisentido, ARN sentido o ARN de doble cadena. Estas median, mediante apareamiento de bases, la inhibición de la traducción del ARNm deCYPgsto la degradación del ARNm de CYPgst en la célula. En consecuencia, la introducción y/o la expresión de la molécula de ADN recombinante en una planta conduce a la inhibición de la expresión del gen CYPgst funcional (no mutado).
[0153] En el presente documento se divulgan vectores que comprenden moléculas de ADN recombinante o secuencias de ácidos nucleicos o, respectivamente, moléculas de ácidos nucleicos. Un vector puede contener el gen CYPgst no mutado (gen de tipo silvestre) con las propiedades de la secuencia de nucleótidos mencionadas anteriormente y, preferentemente, uno de los promotores descritos anteriormente. Otro vector puede contener una molécula de ADN recombinante que comprende el promotor del gen CYPgstde tipo silvestre no mutado, que está vinculado a una molécula de ácido nucleico heteróloga, o puede contener una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos descrita anteriormente que está operativamente vinculada a un promotor heterólogo, siendo el promotor, en ambos casos, preferentemente capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos de manera específica en flores cerradas y/o frutos. Además, un vector puede contener una molécula de ADN recombinante que presenta una secuencia de nucleótidos que codifica una shRNA, siRNA, ARN antisentido, ARN sentido o ARN de doble cadena y que, tras su expresión en una célula vegetal, conduce a la inhibición de la expresión del gen CYPgst.
[0154] Asimismo, un vector puede contener una molécula de ADN con una mutación definida anteriormente o puede contener la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente que se une específicamente a la secuencia de nucleótidos CYPgstno mutada (de tipo silvestre) o a la secuencia de nucleótidos CYPgstmutada.
[0155] El vector descrito puede ser un plásmido, un cósmido, un fago o un vector de expresión, un vector de transformación, un vector lanzadera o un vector de clonación; puede ser de doble o de cadena sencilla, lineal o circular, o puede transformar un hospedador procariota o eucariota ya sea mediante integración en su genoma o de forma extracromosómica. Preferentemente, la molécula de ADN conforme a la invención o la molécula de ácido nucleico está operativamente vinculada en un vector de expresión con una o varias secuencias reguladoras que permiten la transcripción y, opcionalmente, la expresión en una célula hospedadora procariota o eucariota; véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001 y la solicitud internacional WO 00/75359 en la página 21, línea 20 a la página 22, línea 32. Preferentemente, estas secuencias reguladoras son promotores o terminadores, en particular un punto de inicio de la transcripción, un sitio de unión al ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, una señal de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación. Los vectores contienen adicionalmente por lo general genes indicadores/de reporte o genes de resistencia para detectar la transferencia del vector o de la molécula de ADN/de ácido nucleico deseado y para seleccionar los individuos que los contienen, ya que una detección directa a través de la expresión del gen suele ser más bien difícil. Ejemplos de genes indicadores/de reporte son, por ejemplo, el gen de la luciferasa y el gen que codifica la proteína verde fluorescente (GFP). Estos permiten además realizar estudios sobre la actividad y/o la regulación de un promotor del gen. Ejemplos de genes de resistencia, en particular para transformaciones de plantas, son el gen de la neomicina fosfotransferasa, el gen de la higromicina fosfotransferasa o el gen que codifica la fosfinotricina acetiltransferasa. Esto no excluye otros genes indicadores/de reporte o genes de resistencia conocidos por el experto en la materia. En una realización preferida, el vector es un vector vegetal.
[0156] Asimismo, se divulga un vector descrito anteriormente en el que la molécula de ADN, como transgén, es capaz de expresar un gen CYPgstfuncional y está preferentemente acoplada genéticamente a otro transgén que impide la transmisión de la molécula de ADN a través del polen. Mediante la introducción de este vector en una mutante que es estéril masculina debido a una mutación en el gen CYPgst, puede restaurarse la fertilidad. Al impedirse la transmisión del gen CYPgst funcional transgénico a través del polen, en la autofecundación de la línea transgénica se obtiene únicamente semilla hemicigótica.
[0158] Preferentemente, el vector o el transgén comprende además una casete de expresión que conduce al marcaje de las semillas, preferentemente mediante marcaje fluorescente. Mediante este enfoque pueden distinguirse fácilmente las semillas transgénicas de las no transgénicas. Este sistema para la utilización de la esterilidad masculina codificada nuclearmente fue desarrollado por la empresa Pioneer. El sistema denominado SEED PRODUCTION TECHNOLOGY (SPT) (US 2006288440 A1) fue desarrollado para maíz y se basa en que una mutante estéril, causada por una mutación en un gen conocido codificado nuclearmente, puede restaurarse mediante la inserción de un transgén. En este caso, el transgén contiene el alelo no mutado del gen de esterilidad, de modo que el transgén actúa como alelo de tipo silvestre. El transgén restaurador de la fertilidad está acoplado genéticamente a otro transgén que impide la transmisión del transgén a través del polen (eliminador de polen). De este modo, en las autofecundaciones de la línea transgénica se obtiene únicamente semilla hemicigótica, lo cual es muy importante para la eficiencia del sistema.
[0160] El transgén contiene además una casete de expresión que conduce a la fluorescencia roja de las semillas. De este modo, pueden distinguirse fácilmente las semillas transgénicas de las no transgénicas. Dado que las semillas transgénicas son fértiles, se produce así automáticamente una separación en plantas fértiles y estériles. Mediante la siembra de las semillas no transgénicas se obtienen así las plantas madre necesarias para la producción de híbridos; las semillas transgénicas pueden utilizarse, por un lado, como línea paterna para la posterior multiplicación de la línea madre (línea mantenedora) y, además, pueden multiplicarse mediante autofecundación simple (figura 5). El sistema SPT puede aplicarse teóricamente en todas las especies vegetales. No obstante, el requisito es la existencia de una línea con esterilidad masculina génica, así como el conocimiento del gen responsable del fenotipo de esterilidad masculina génica. Por consiguiente, el sistema SPT podría utilizarse teóricamente también para el desarrollo de un sistema híbrido en cualquier cultivo, como la remolacha azucarera o la patata.
[0162] Se divulgan asimismo células hospedadoras que contienen los vectores descritos, las moléculas de ADN recombinante y/o las moléculas de ácido nucleico. Una célula hospedadora puede ser una célula procariota (por ejemplo, bacteriana) o una célula eucariota (por ejemplo, una célula vegetal o una célula de levadura). Preferentemente, la célula hospedadora es una Agrobacterium o una célula vegetal. La presente invención se refiere a una célula vegetal transgénica que comprende, como transgén, la molécula de ácido nucleico conforme a la invención o el vector de la presente invención. Una célula vegetal transgénica de este tipo es, por ejemplo, una célula vegetal que ha sido transformada, preferentemente de manera estable, con la molécula de ácido nucleico conforme a la invención o con el vector de la presente invención. En una configuración preferente de la célula vegetal transgénica, la molécula de ácido nucleico está operativamente vinculada a una o varias secuencias reguladoras que permiten la transcripción y, opcionalmente, la expresión en la célula vegetal. El constructo completo formado por la molécula de ácido nucleico conforme a la invención y la(s) secuencia(s) reguladora(s) constituye entonces el transgén. Dichas secuencias reguladoras son, por ejemplo, un promotor o un terminador. El experto en la materia conoce numerosos promotores y terminadores funcionales aplicables en plantas.
[0164] En un aspecto adicional de la invención, la identificación del genCYPgst, responsable de la manifestación del carácter de esterilidad masculina recesiva codificada nuclearmente, se utiliza para producir plantas transgénicas con dicha manifestación del carácter y para restaurar la fertilidad.
[0166] Se divulga en el presente documento un kit que comprende las moléculas de ADN recombinante o moléculas de ácido nucleico y los vectores aquí descritos anteriormente, necesarios para producir plantas con esterilidad masculina recesiva codificada nuclearmente y también para restaurar la fertilidad en plantas que presentan dicho fenotipo. Este kit contiene asimismo moléculas de ADN recombinante que comprenden bien el promotor con una secuencia de nucleótidos definida anteriormente o bien un promotor heterólogo, estando el primero vinculado a una molécula de ácido nucleico heteróloga y el segundo vinculado a una secuencia de nucleótidos definida anteriormente que codifica el gen CYPgstno mutado (de tipo silvestre). Además, el kit puede contener un vector en el que la molécula de ADN, como transgén, es capaz de expresar un gen CYPgst funcional y está preferentemente acoplada genéticamente a otro transgén que impide la transmisión de la molécula de ADN a través del polen y que comprende una casete de expresión que conduce al marcaje de las semillas. Para la identificación de la mutación en el gen CYPgst, el kit puede contener una molécula de ácido nucleico definida anteriormente que hibrida con una secuencia de nucleótidos descrita anteriormente que comprende el gen CYPgst no mutado (de tipo silvestre) o con el gen correspondiente que presenta una mutación definida anteriormente, o puede contener los oligonucleótidos definidos anteriormente. El kit puede contener además la proteína CYPgstdescrita anteriormente o un fragmento de la misma, así como el anticuerpo descrito. Preferentemente, el kit contiene también reactivos para procedimientos de detección basados en ácidos nucleicos o en métodos inmunológicos.
[0168] Una planta transgénica es, por ejemplo, una planta que contiene células vegetales que han sido transformadas con la molécula de ADN o de ácido nucleico conforme a la invención o con el vector de la presente invención. En una forma de realización preferente de la planta transgénica, la molécula de ADN o de ácido nucleico está operativamente vinculada a una o varias secuencias reguladoras que permiten la transcripción y, opcionalmente, la expresión en la planta. El constructo completo formado por la molécula de ácido nucleico conforme a la invención y la(s) secuencia(s) reguladora(s) constituye entonces el transgén. Por consiguiente, por el término «transgén» se entiende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante.
[0170] Para la obtención de una planta transgénica pueden ser útiles asimismo los oligonucleótidos, los ácidos nucleicos, las moléculas de ADN y los vectores descritos anteriormente. Por tanto, la presente invención se refiere asimismo al uso de los mismos en la obtención de una planta transgénica que presenta un fenotipo de esterilidad masculina recesiva codificada nuclearmente en estado homocigótico, caracterizado por que la expresión del gen CYPgstestá inhibida, en la obtención de una planta conforme a la invención con fertilidad restaurada o en la obtención de una célula vegetal transgénica. Además, los oligonucleótidos, los ácidos nucleicos, las moléculas de ADN y los vectores descritos anteriormente se utilizan asimismo en los procedimientos correspondientes para la obtención de dichas plantas transgénicas o células vegetales. La planta transgénica es preferentemente una planta útil y, más preferentemente, una planta cultivada.
[0172] Existen diversos procedimientos en el estado de la técnica mediante los cuales pueden obtenerse y también identificarse o seleccionarse plantas transgénicas en las que se inhibe la transcripción y/o traducción de una proteína o se introduce el rasgo de restauración. Los procedimientos para la obtención de plantas cultivadas transgénicas y su identificación mediante métodos de biología molecular son conocidos por el experto en la materia; véanse, por ejemplo, para remolachas azucareras transgénicas resistentes al glifosato las solicitudes internacionales WO 99/023232 y WO 2004/074492, así como, en general para la transformación de plantas, WO 2000/018939 y WO 2013/138309.
[0174] Una forma de realización de la presente invención es, por consiguiente, un procedimiento para la obtención de una planta que presenta un fenotipo de esterilidad masculina recesiva codificada nuclearmente en estado homocigótico, caracterizado por que se inhibe la expresión del gen CYPgst. Para la obtención de esta planta transgénica conforme a la invención, puede introducirse en la célula vegetal, por ejemplo, mediante transformación con ayuda de un vector, una molécula de ADN recombinante que expresa un polinucleótido, de modo que la expresión del polinucleótido conduzca a la inhibición de la proteína CYPgst.
[0176] Por ejemplo, la mutación descrita anteriormente que conduce a la inhibición de la expresión de CYPgstpuede lograrse mediante recombinación genética durante un proceso de cruzamiento entre dos plantas, en el que una de las plantas porta el alelo CYPgst mutado. Además del uso de técnicas de mejora convencionales para generar recombinación genética, la biotecnología moderna pone a disposición del experto en la materia diversas herramientas adicionales que permiten una ingeniería genómica precisa. Por ejemplo, podría utilizarse el etiquetado mediante T-DNA para destruir el gen CYPgstpor mutagénesis por inserción. Asimismo, el gen CYPgstpodría eliminarse total o parcialmente mediante mutagénesis génica utilizando nucleasas TALE (TALENs) o nucleasas de dedos de zinc (ZFNs), así como sistemas CRISPR/Cas, descritos, entre otros a modo de ejemplo, en WO 2014/144155 A1 (Engineering plant genomes using CRISPR/Cas systems) y en Osakabe y Osakabe, Plant Cell Physiol., 56 (2015), 389-400, de modo que quede excluida la expresión del gen CYPgst. Esto podría lograrse asimismo mediante el uso del método denominado TILLING (Targeted Induced Local Lesions in Genomes), en el que, como se describe por ejemplo en la solicitud de patente alemana DE 102013 101617, se inducen mutaciones puntuales en el gen de tipo silvestre y posteriormente se seleccionan plantas que presentan una mutación adecuada, es decir, que confiere resistencia, como por ejemplo una cebada resistente al virus del mosaico amarillo; véase la DE 102013101617 en las páginas 4, 8 y 12, en los párrafos
[0177] , [0026] y [0038]. El método TILLING se describe asimismo detalladamente en la publicación de Henikoffet al.(Henikoff et al., Plant Physiol.135, 2004, 630-636. Las mutaciones puntuales en el gen CYPgst deBeta vulgarissubsp.vulgarisque podrían dar lugar a codones de parada o a errores de splicing se enumeran en la tabla 1.
[0178] La inhibición de la expresión también es posible mediante un enfoque de RNAi o por cosupresión. Este comprende la introducción en la planta de la molécula de ADN recombinante o de ácido nucleico definida anteriormente, o del vector correspondiente, en la que la expresión de las moléculas codificadas de shRNA, ARN antisentido o ARN sentido conduce a la inhibición de la expresión del gen CYPgst. Tales procedimientos basados en RNAi y/o cosupresión son métodos habituales para la inhibición de la expresión génica y son conocidos por el experto en la materia. Asimismo, un enfoque sense, que comprende una molécula de ARN no poliadenilada específica de la diana, puede conducir a la inhibición de la expresión del gen CYPgst. Este método se describe, por ejemplo, en la solicitud internacional WO 2001/012824.
[0179] Otra forma de realización de la invención es un procedimiento para la restauración de la fertilidad de una planta conforme a la invención, que comprende la introducción de un gen CYPgstfuncional en la planta. En este caso, el gen CYPgstpuede introducirse mediante métodos de ingeniería genética, por medio de una molécula de ADN recombinante conforme a la invención que contiene preferentemente elementos de control de la transcripción, preferentemente un promotor para la expresión específica del gen en flores cerradas y/o frutos, o por medio de los vectores conforme a la invención. El gen CYPgstpuede introducirse asimismo mediante cruzamiento con una planta que porta el gen CYPgstde tipo silvestre o un gen CYPgstfuncional, preferentemente en estado homocigótico. Opcionalmente, tras el cruzamiento puede realizarse una selección en la generación descendiente para la presencia del gen CYPgstde tipo silvestre o del gen CYPgstfuncional. Objeto de la presente invención es una planta que contiene una célula vegetal definida anteriormente y/o que ha sido obtenida mediante los procedimientos descritos anteriormente. Es decir, una planta con un fenotipo de esterilidad masculina recesiva codificada nuclearmente, así como una planta con fertilidad restaurada, se ha obtenido bien mediante recombinación genética utilizando métodos de mejora convencionales, o bien es una planta transgénica en la que, mediante los diversos procedimientos mencionados anteriormente, se ha inhibido la expresión del gen CYPgst, lo que da lugar a un fenotipo de esterilidad masculina recesiva codificada nuclearmente, o en la que la fertilidad ha sido restaurada mediante la introducción de moléculas de ADN recombinante.
[0180] Además de las plantas que presentan un fenotipo de esterilidad masculina recesiva codificada nuclearmente debido a una mutación en el gen CYPgst, o de las plantas en las que dicho fenotipo se ha inducido mediante ingeniería del genoma utilizando biotecnología moderna, así como de las plantas en las que la fertilidad ha sido restaurada mediante los procedimientos correspondientes, la invención se refiere también a órganos, partes de plantas, tejidos, células, así como semillas o descendencia de dichas plantas. En una forma de realización, las semillas o la descendencia presentan una o varias de las mutaciones definidas anteriormente que conducen a la inhibición de la expresión del gen CYPgsty/o las semillas o la descendencia presentan una molécula de ADN recombinante o de ácido nucleico, o un vector, descritos anteriormente.
[0181] En la presente invención, un procedimiento para la identificación de una planta conforme a la invención constituye asimismo otra forma de realización. Mediante este procedimiento puede identificarse tanto una planta que presenta un fenotipo de esterilidad masculina recesiva codificada nuclearmente debido a una mutación en el gen CYPgst, como una planta en la que dicho fenotipo ha sido inducido mediante ingeniería del genoma utilizando biotecnología moderna. Además, mediante este procedimiento puede identificarse una planta en la que la fertilidad ha sido restaurada mediante los procedimientos correspondientes. Para la identificación de esta planta conforme a la invención puede utilizarse como sonda de hibridación una molécula de ácido nucleico definida anteriormente que tiene una longitud mínima de 15 nucleótidos y que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos definida anteriormente que comprende el gen CYPgstno mutado (de tipo silvestre), así como al gen CYPgstcon una mutación definida anteriormente que conduce a la inhibición de la expresión del gen. Aquí se divulga que, para la identificación, pueden utilizarse el oligonucleótido definido anteriormente, la proteína CYPgstdefinida anteriormente o un fragmento de la misma y el anticuerpo, así como componentes del kit descrito anteriormente.
[0182] La presente invención se refiere asimismo al uso de moléculas de ADN recombinante o de ácido nucleico conforme a la invención en la obtención de una planta con esterilidad masculina recesiva codificada nuclearmente, en la obtención de una planta con fertilidad restaurada.
[0183] Un procedimiento para la obtención de esterilidad masculina reversible en una planta, en el que puede utilizarse el gen CYPgst, se describe, por ejemplo, en la solicitud internacional WO 96/017945, que comprende:
[0184] (a) la introducción de una primera molécula de ADN recombinante en el genoma de una planta productora de polen que puede ser transformada genéticamente, en la que la primera molécula de ADN recombinante comprende:
[0185] (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico que, tras su expresión en una planta, inhibe la formación del polen o su función, siendo en la presente invención el gen o producto génico CYPgst, por ejemplo, mediante la expresión de una secuencia RNAi;
[0186] (ii) un operador que controla la expresión de la secuencia de nucleótidos; y
[0187] (iii) un promotor que es específico de células que son críticas para la formación del polen o su función, estando dicho promotor funcionalmente enlazado con la secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico;
[0188] (b) cultivar opcionalmente la planta obtenida en la etapa (a) en condiciones que permitan que se alcance la esterilidad masculina como resultado de la expresión de las secuencias de nucleótidos;
[0189] (c) cruzar la planta con esterilidad masculina de (a) o (b) con polen procedente de una línea fértil masculina para producir una planta híbrida que sea fértil masculina, en la que dicho polen tenga integrado en su genoma una segunda molécula de ADN recombinante, comprendiendo dicha segunda molécula de ADN recombinante: una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de unión al ADN y que provoca la represión de la transcripción, y un promotor que controla la expresión de la secuencia de nucleótidos, siendo dicha proteína de unión al ADN capaz de unirse al operador del ADN recombinante de la planta con esterilidad masculina y provocar la represión de la transcripción.
[0190] Otro sistema para la obtención de plantas con esterilidad de polen, en las que se introduce ADN exógeno en el genoma nuclear y que puede utilizarse conforme a la presente invención, se describe en la solicitud de patente europea EP 0344029.
[0191] Asimismo, aquí se divulga el uso de las plantas conforme a la invención para la mejora vegetal o para la obtención de una planta descendiente, utilizándose el fenotipo de esterilidad masculina codificado nuclearmente para la selección recurrente. Asimismo, se divulgan semillas o descendencia, o órganos, partes de planta, tejidos o células de las mismas, para su utilización en la fabricación de productos habitualmente elaborados a partir de materias primas renovables, tales como alimentos y piensos, preferentemente azúcar o jarabe (melaza), utilizándose asimismo la melaza para aplicaciones industriales, por ejemplo en la obtención de alcohol o como medio nutritivo para la producción de productos biotecnológicos, en la fabricación de materiales o sustancias para la industria química, por ejemplo productos químicos finos, medicamentos o precursores de los mismos, diagnósticos, cosméticos, bioetanol o biogás. Un ejemplo del uso de la remolacha azucarera como materia prima biogénica en plantas de biogás se describe en la solicitud DE 102012022178 A1, véase por ejemplo el párrafo 10.
[0192] Asimismo, aquí se divulgan productos obtenibles a partir de las plantas, órganos, partes de planta, tejidos, células, semillas y descendencia, tales como alimentos, piensos y materiales, que contienen una planta conforme a la invención, semillas, descendencia, órganos, partes de planta, tejidos o células, o componentes de los mismos.
[0193] Salvo que se indique lo contrario, en los ejemplos siguientes se emplearon métodos estándar de biología molecular, véase por ejemplo (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001), Fritsch et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989; Mayer et al, Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, eds, Academic Press, Londres, 1987) y Weir et al, Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, Blackwell, eds, 1986).
[0194] Ejemplos
[0195] 1. Identificación de un locus que provoca esterilidad masculina codificada nuclearmente
[0196] Como planta de partida para la identificación de un locus que provoca esterilidad masculina codificada nuclearmente en remolacha azucarera, se utilizó un donante con la designación interna C311 [2043_K5], que presenta un fenotipo recesivo de esterilidad masculina codificada nuclearmente (nombre de trabajogst). Sin embargo, en el material de mejora no fue posible comprobar de antemano (es decir, antes de la floración) la presencia y el grado de cigosis del locus gst procedente de dicho donante y subyacente a la expresión del carácter. Por el contrario, fue necesario llevar a floración un gran número de plantas putativamente estériles en el campo o en un bloque de autofecundación (bloque S). A continuación, las plantas en floración se evaluaron manualmente en cuanto a los caracteres de fertilidad o esterilidad (Fig.1). Posteriormente, pudieron eliminarse los individuos fértiles y recolectarse las semillas de los individuos estériles.
[0197] Para la delimitación genética y física del locus gst, que provoca esterilidad masculina codificada nuclearmente, se generó una población de cartografiado de remolacha azucarera segregante para dicho carácter. A partir de información preliminar de un cartografiado a escala genómica, ya se conocía la región diana en el cromosoma 1. Para la posterior cartografía fina, se cruzaron individuos con esterilidad masculina del donante gst C311 [2043_K5] con una línea anual, y los individuos F1 resultantes se multiplicaron mediante autofecundación. Para la cartografía, finalmente se fenotiparon descendientes de la generación S1 y se caracterizaron mediante marcadores de ADN KASP (KASP™, química de genotipado de SNP de LGC Limited). Se desarrollaron dos marcadores de ADN KASP, sxn2151s01 y s1e3305s02, mediante los cuales puede distinguirse el genotipo portador del locusgstdel genotipo de referencia KWS2320 mediante la identificación de un SNP. La secuencia marcador sxn2151s01 representada en SEQ ID nº 24 y la secuencia marcador sle3305s02 representada en SEQ ID nº 26 indican la presencia del locus gst; la secuencia marcador sxn2151s01 representada en SEQ ID nº 25 y la secuencia marcador sle3305s02 representada en SEQ ID nº 27 indican la secuencia de referencia, diferenciándose en cada caso las secuencias marcadoras en la posición nucleotídica 21, encontrándose una “G” en dicha posición en el genotipo portador del locus gst y una “A” en dicha posición en el genotipo de referencia KWS2320. Como resultado de esta cartografía fina, la región del cromosoma 1 del genoma de la remolacha azucarera que está flanqueada por los marcadores de ADN KASP sxn2151s01 en 33,42 cM y s1e3305s02 en 35,15 cM (basándose en el mapa genético ZR INT 1202) y que porta el locus gst quedó fuertemente delimitada. Basándose en el mapa genómico físico (Physmapv2), esta región tiene un tamaño físico de 215,4 kbp y se sitúa entre las posiciones 3185718 bp y 3401120 bp. Basándose en la posición identificada y en la anotación genómica disponible públicamente RefBeet 1.2 (http://bvseq.molgen.mpg.de/), se identificaron 21 genes codificantes de proteínas localizados en dicho segmento genómico.
[0199] Para los 21 modelos génicos se buscaron, mediante enfoques bioinformáticos, genes homólogos en plantas modelo (por ejemplo,Arabidopsis thalianayOryza sativa). Basándose en los homólogos identificados en plantas modelo, se llevó a cabo un análisis y una evaluación exhaustivos. Sobre la base de este análisis exhaustivo de la secuencia y de las estructuras predichas, se identificó uno de los genes codificados en el locus gst como miembro de la familia de las monooxigenasas del citocromo P450 (CYP). A pesar de la considerable diversidad de secuencia de las monooxigenasas del citocromo P450, todos los CYP presentan características estructurales comunes que están altamente conservadas, en particular en la región del centro activo (véase, por ejemplo, Fischer et al, Bioinformatics 23 (2007), 2015-2017), y que también se encontraron para el gengstputativo. Por consiguiente, este gen se denominó CYPgst.
[0201] En una caracterización más detallada de este gen se identificó un gen CYP deArabidopsis thaliana, es decir,CYP703A2, que mostraba una elevada identidad de secuencia con este gen procedente del locusgst. Una mutante de Arabidopsis thaliana en la que dicho gen fue inactivado mediante la inserción de un ADN-T presenta un fenotipo de esterilidad masculina parcial o semimasculina (Morant et al. Plant Cell 19 (2007), 1473-1487). Desde un punto de vista mecanístico, ello se explica por una función de CYP703A2 en la síntesis de la esporopolenina, el principal componente de la capa de exina de polen viable. La ausencia de la capa de exina interrumpe la maduración del polen o lo vuelve muy sensible a influencias ambientales. Sin embargo, existen dos diferencias esenciales en el fenotipo gst de la remolacha azucarera con respecto al fenotipo de la mutante deArabidopsisdescrita:
[0203] (i) a diferencia deArabidopsis, elknockoutdel gen en la remolacha azucarera produce una esterilidad masculina completa,
[0204] y
[0205] (ii) mientras que en mutantes deArabidopsisse forman en principio granos de polen que, no obstante, son estériles, según el estado actual de los análisis en remolachas azucarerasgstno se produce la formación de polen.
[0207] Por consiguiente, no puede excluirse que se trate de diferentes miembros de la familia CYP y/o que las funciones de ambas proteínas enArabidopsisy en la remolacha azucarera sean diferentes. Además,Arabidopsises una planta silvestre de la familia de las crucíferas con un genoma compacto y pequeño, mientras que la remolacha azucarera es una planta cultivada, es decir, una planta sembrada, cuidada y mejorada por el ser humano, que se utiliza como planta útil. Por consiguiente, los experimentos realizados enArabidopsiscomo organismo de estudio y sus resultados no pueden transferirse sin más a plantas cultivadas. Además, existen procesos importantes y de relevancia agrícola en plantas útiles que no se dan enArabidopsis. Entre ellos se incluyen, por ejemplo, la formación de cuerpos de remolacha, tubérculos y grano, que sirven como órganos de reserva y como órganos de propagación vegetativa, así como interacciones con hongos micorrícicos simbióticos o con patógenos que no están asociadas conArabidopsis.
[0209] 2. Caracterización del gen CYPgst
[0211] Tras la identificación del gen potencial que provoca el fenotipo gst, se llevó a cabo la secuenciación comparativa de un fragmento de ADN genómico de aproximadamente 5 kbp. Se secuenciaron el genotipo de referencia fértil de remolacha azucarera KWS2320, el donante gst estéril C311 y, respectivamente, tres individuos clasificados como estériles y tres como homocigotos fértiles según fenotipos y datos de marcadores de la población de cartografía fina antes mencionada. La región genómica secuenciada comprendía el modelo génico deBvCYP703A2(GST, g6845.t1) representado en la Figura 2 y, adicionalmente, aproximadamente 1,5 kbp de la región promotora putativa. La secuenciación comparativa reveló, además deSmall Nucleotide-Plymorphisms(SNPs) entre individuos estériles y fértiles, una deleción de 533 bp en genotipos estériles que abarca la región 5′ UTR y el primer exón del modelo génico (Figura 2 y Figura 3).
[0212] El análisis de todos los polimorfismos identificados mostró que únicamente la deleción tiene efectos sobre la proteína codificada, mientras que todas las demás mutaciones se localizan bien en regiones no traducidas o bien generan codones sinónimos. La deleción mencionada, por el contrario, impide una transcripción correcta del ARNm y, por consiguiente, queda excluida la traducción de una proteína funcional. Los análisis de transcripción realizados posteriormente confirman este hallazgo (Figura 5). En genotipos fértiles,BvCYP703A2(GST, g6845.t1) se expresa de forma muy específica en flores cerradas y frutos. En raíces y hojas no se detecta expresión. En genotipos estériles, por el contrario, no se detecta expresión del gen GST en flores cerradas, por lo que puede concluirse que el gen presenta un knockout completo en los genotipos estériles.
[0213] Finalmente, se desarrollaron marcadores de ADN capaces de discriminar entre genotipos estériles y fértiles. Para ello se desarrollaron marcadores KASP que indican de forma dominante el alelo fértil (inserción) (sle5983d14, s1e5983d17).
[0216]
[0218] Mediante los mismos puede inferirse indirectamente la presencia homocigota de la deleción cuando ambos marcadores dominantes (sle5983d14, s1e5983d17) indican un alelo nulo y un tercer marcador ubicuo confirma la calidad suficiente de la extracción de ADN. Las posibles mutaciones puntuales en el genBvCYPgstque podrían dar lugar a una terminación prematura de la transcripción del gen CYPgst o provocar un splicing defectuoso, y que pueden analizarse mediante procedimientos habituales para la detección de mutaciones puntuales en el ADN (análisis de SNP), se recopilan en la Tabla 1 siguiente.
[0219] Tabla 1: Mutaciones puntuales potenciales en el gen CYPgstdeBeta vulgarissubsp.vulgaris, que pueden conducir a la terminación prematura de la transcripción del gen CYPgsto causar un splicing deficiente.
[0220]
[0223] 
[0224]
[0227] 
[0228]
[0231] 
[0232]
[0235] 
[0236] 3. Uso del gen CYPgst o del locus en la mejora híbrida
[0238] Como ya se ha descrito anteriormente, el fenotipo de esterilidad masculina provocado por el locus gst se utiliza en programas de mejora para resistencia para facilitar los cruzamientos en el marco de la selección recurrente. Antes de la clonación del gen en el marco de la presente invención y del desarrollo asociado de marcadores genómicos, debido a la esperada segregación fenotípica 3:1 fue necesario cultivar y establecer en campo cuatro veces más plantas de las requeridas. Estas plantas tuvieron que ser evaluadas en cuanto a esterilidad en un corto intervalo al iniciarse la floración, y los individuos fértiles tuvieron que eliminarse para evitar la autopolinización. Si se toma como base un número de varios miles de plantas por año, esta selección manual resulta muy laboriosa y también propensa a errores. En la presente invención se proporcionan ahora marcadores genómicos, véase el Ejemplo 2 y la Figura 2, con los que fue posible, por ejemplo, analizar 30000 plantas y seleccionar 7500 individuos con esterilidad masculina, que posteriormente se plantaron.
[0240] Existe un esfuerzo constante por simplificar los programas de mejora y la producción de semillas para la remolacha azucarera y, de este modo, ahorrar costes. Así, en la actualidad las remolachas azucareras comerciales se producen como híbridos triples con el fin de obtener semillas de calidad suficientemente elevada. La producción de híbridos en los programas de mejora, es decir, en el ámbito no comercial, también es costosa y requiere mucho trabajo y actualmente se garantiza mediante la instalación de barreras de separación. Con ayuda del fenotipo gst conforme a la invención y de los marcadores de ADN asociados, es ahora posible —tras la introducción del locus gst o la mutación/inhibición del gen CYPgst en los programas de mejora— seleccionar plantas con esterilidad masculina antes del trasplante mediante marcadores de ADN y simplificar con ello los procesos de producción. De este modo, también dejaría de ser necesaria la evolución paralela de genotipos probadores multigermen (probadores MUS). A largo plazo, también es concebible sustituir la tecnología CMS utilizada actualmente por un sistema alternativo mediante el cual el componente parental productor de semillas pueda ponerse en un estado de esterilidad masculina, por ejemplo mediante el sistema SPT mencionado anteriormente y mostrado en la Figura 5. En consecuencia, también es razonable suponer que el sistema CYPgst conforme a la invención encuentre aplicación en otras plantas cultivadas, en particular plantas útiles, tales como en la producción comercial de híbridos simples, como en el maíz. En el maíz (Zea mays), losgenes msdesempeñan un papel importante en el desarrollo de sistemas alternativos para la producción de semillas híbridas. Los análisis de secuencia revelaron que existe un homólogo putativo en maíz deBvCYPgst(GRMZM5g830329). Asimismo, existe un gran número de mutantesmsen maíz, de los cuales hasta la fecha solo se ha clonado una parte. Mediante la presente invención pueden aislarse ahora mutantes ms cuyo fenotipomses atribuible a una mutación o inhibición del homólogo en maíz deBvCYPgst, y emplearse de forma dirigida en la producción de semillas. Asimismo, la presente invención se emplea en el desarrollo de una patata híbrida, por ejemplo, para introducir de forma dirigida mutaciones en el homólogo en patata del genBvCYPgsty utilizar la esterilidad masculina así adquirida en patata con el fin de desarrollar, en el sentido del sistema SPT, una patata híbrida diploide.
[0242] Finalmente, la expresión específica del genBvCYPgsten flores y en el tapete permite una utilización biotecnológica del promotor, por ejemplo, para la expresión de un ARN sense/antisense o de una ribozima para la inhibición del genBvCYPgst, o para la expresión de una proteína CYPgstfuncional, o bien de un homólogo, análogo u ortólogo putativo del genBvCYPgst, para la complementación de la mutación y la restauración del fenotipo fértil masculino. Se considera que la puesta a disposición del locus génico y de las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del genBvCYPgst, junto con los marcadores genéticos y las realizaciones derivadas de los mismos, conlleva una simplificación sustancial y un ahorro de costes por parte de los programas de mejora, dado que, entre otras cosas, ya permite una selección temprana de individuos estériles. Asimismo, con ello puede lograrse una simplificación logística y una ampliación de mejora de los programas implicados.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES
1. Planta de la especieBeta vulgarisque presenta un fenotipo recesivo de esterilidad masculina codificada nuclearmente, caracterizada por que dicho fenotipo se correlaciona con una mutación en el gen endógeno de citocromo P450 oxidasa, caracterizada por que el gen de citocromo P450 oxidasa no mutado es un gen seleccionado del grupo que consiste en:
a. una secuencia de nucleótidos que presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID nº 1 o la SEQ ID nº: 2 o un fragmento funcional de la misma;
b. una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID nº 3; c. una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar, en condiciones rigurosas, con una secuencia de nucleótidos complementaria de una secuencia de nucleótidos conforme a (a) o (b); y
d. una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de al menos el 80 % a lo largo de la secuencia de aminoácidos completa conforme a SEQ ID nº 3, siendo la mutación una deleción, adición, inserción o sustitución en la secuencia de nucleótidos codificante del gen de la citocromo P450 oxidasa, en una señal de splicing o en una secuencia reguladora, preferentemente la secuencia promotora, del gen de la citocromo P450 oxidasa, y en donde dicha mutación reduce o impide la transcripción y/o la traducción de una proteína de citocromo P450 oxidasa funcional.
2. Planta según la reivindicación 1, que es homocigota para la mutación y presenta esterilidad masculina, en la que en la planta estéril se impide la formación de polen funcional.
3. Planta según la reivindicación 1, en la que la mutación es una deleción entre las posiciones nucleotídicas 1560 y 2095 de la SEQ ID nº 1.
4. Planta según la reivindicación 1, en la que la deleción se caracteriza por la ausencia de uno o de ambos loci marcadores sle5983d14 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID nº: 4 y 5) y sle5983d17 (producto de amplificación de los cebadores con SEQ ID nº: 6 y 7), y por la presencia de un marcador ubicuo.
5. Planta según una de las reivindicaciones 1–2, en la que el gen está localizado en un segmento del cromosoma 1 entre los loci marcadores sxn2151s01 y sle3305s02, en la que la secuencia marcadora sxn2151s01 representada en SEQ ID nº: 24 y la secuencia del marcador sle3305s02 representada en la SEQ ID nº: 26 indican la presencia del locus que provoca esterilidad masculina codificada nuclearmente y la secuencia marcadora sxn2151s01 representada en SEQ ID nº: 25 y la secuencia del marcador sle3305s02 representada en la SEQ ID nº27 indican la secuencia de referencia.
6. Molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una shRNA (small hairpin RNA), una siRNA (small interfering RNA), ARN antisentido, ARN sentido o ARN de doble cadena que, tras su expresión en una célula vegetal o tras su introducción en una célula vegetal, conduce a la reducción o inhibición de la expresión del gen funcional (no mutado) de citocromo P450 oxidasa tal como se define en la reivindicación 1.
7. Célula vegetal que contiene la molécula de ADN recombinante según la reivindicación 6.
8. Procedimiento para la obtención de una planta con esterilidad masculina de la especie Beta vulgaris, caracterizado por que se reduce o inhibe la expresión del gen de citocromo P450 oxidasa conforme a una de las secuencias de nucleótidos según la reivindicación 1 (a), (b), (c) o (d), comprendiendo el procedimiento una etapa de introducción de la molécula de ADN recombinante según la reivindicación 6, en la que dicha etapa del procedimiento comprende una transformación mediante Agrobacterium, un etiquetado con ADN-T o una mutagénesis mediante TILLING, o comprende una etapa de mutagénesis dirigida de las secuencias de nucleótidos según la reivindicación 1 (a), (b), (c) o (d), como consecuencia de la cual la expresión del gen se reduce o inhibe, por ejemplo mediante RNAi o cosupresión, o debido a la mutación introducida.
9. Planta que contiene células vegetales según la reivindicación 7 y/o obtenible mediante un procedimiento según la reivindicación 8.
10. Procedimiento para la restauración de la fertilidad de una planta según una de las reivindicaciones 1 a 5 o de una planta según la reivindicación 9, que comprende la introducción en la planta de un gen funcional (no mutado) de citocromo P450 oxidasa mediante transformación con una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos no mutada con una secuencia codificante conforme a una
de las reivindicaciones 1 (a)–(d), estando operativamente enlazada a un promotor heterólogo que es preferentemente capaz de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos de forma específica en flores cerradas y/o frutos.
11. Órgano, parte de planta, tejido o célula de la planta según una de las reivindicaciones 1 a 5 o 9, o semillas o descendencia de la planta según una de las reivindicaciones 1 a 5 o 9, en donde la semilla o la descendencia presenta la mutación definida en una de las reivindicaciones 1 a 5 y/o la molécula de ADN recombinante según la reivindicación 6.
12. Procedimiento para la identificación de una planta según una de las reivindicaciones 1 a 5 mediante la detección de la mutación en el gen de citocromo P450 oxidasa o de un marcador que está ligado a dicha mutación.
13. Uso de una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud que hibrida específicamente con una secuencia de nucleótidos tal como se define en la reivindicación 1 y/o de un oligonucleótido, preferentemente con una longitud máxima de 50 nucleótidos, que presenta una de las siguientes secuencias de nucleótidos:
(i) SEQ ID nº: 4, 6 o un complemento de los mismos, o
(ii) SEQ ID nº: 5, 7 o un complemento de las mismas, para la identificación de una planta según una de las reivindicaciones 1 a 5.
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