ES3061929T3

ES3061929T3 - Method of treating an allergy with allergen-specific monoclonal antibodies

Info

Publication number: ES3061929T3
Application number: ES17829806T
Authority: ES
Inventors: Jamie Orengo; Namita Gandhi; Allen Radin; Ana Kostic; Andrew Murphy; George Yancopoulos
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2026-04-08
Anticipated expiration: 2037-12-15
Also published as: EP3558347A1; PT3558347T; US20200255503A1; DK3558347T3; FI3558347T3; RS67826B1; EP4717709A2; SMT202600052T1; US11352417B2; SI3558347T1; US20230203141A1; EP3558347B1; HRP20260303T1; WO2018118713A1; LT3558347T; PL3558347T3

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Método de tratamiento de una alergia con anticuerpos monoclonales específicos de alérgenos

[0003] Campo de la invención

[0004] La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales y a fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a un alérgeno, para su uso en el tratamiento de pacientes que muestran sensibilidad a un alérgeno o una reacción alérgica frente a un alérgeno.

[0005] Exposición de la técnica relacionada

[0006] Los alérgenos son sustancias ambientales o alimentarias inocuas que provocan una respuesta inmunitaria aberrante que produce rinitis alérgica, asma alérgica, alergias alimentarias o dermatitis atópica. Después de la exposición inicial al alérgeno, las células presentadoras de antígenos capturan, procesan y presentan péptidos alergénicos a linfocitos T afines. En presencia de citocinas tales como IL-4 o IL-13, los linfocitos T adquieren un fenotipo de tipo 2, se expanden y activan a los linfocitos B para que experimenten recombinación de cambio de clase dando lugar a la producción policlonal de inmunoglobulina de subclase E (IgE). La IgE interacciona con el receptor Fc épsilon de alta afinidad (FcεR1) en la superficie de los mastocitos y basófilos para crear "receptores de alérgenos". La unión del alérgeno a la IgE provoca el entrecruzamiento del complejo IgE:FcεR1 desencadenando la desgranulación y la liberación de mediadores inflamatorios, lo que se denomina respuesta de fase temprana (RFT). La RFT se produce inmediatamente después de la exposición y se correlaciona con síntomas tales como congestión nasal, rinorrea, estornudos y picor (Hansen, I.,et al., (2004); Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 4 (3): 159-63). La infiltración posterior de células efectoras en el tejido y la producción continuada de IgE comprenden la respuesta de fase tardía (RFT) que se produce entre 4 y 8 horas después de la exposición al alérgeno (Hansen, I.,et al., (2004); Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 4 (3): 159-63).

[0007] El pelo y la caspa de los animales son la fuente de muchos alérgenos, que suponen un riesgo de respuesta alérgica grave en personas sensibilizadas. Por ejemplo, la proteína Fel d1 es una proteína secretada de gato, que pertenece a la familia de las secretoglobinas que son pequeñas proteínas heterodiméricas unidas por disulfuro que sólo se encuentran en mamíferos (Klug, J.et al.(2000), Ann. N.Y. Acad. Sci.923:348-354). Es la principal causa de alergia a los gatos en los seres humanos (Platts-Mills, T.A.,et al.(1997), J. Allergy Clin. Immunol. 100:S2-S24). Aproximadamente entre el 90 y el 95 % de los pacientes alérgicos a los gatos presentan una respuesta de IgE frente a la proteína Fel d 1 (van Ree,et al.(1999), J. Allergy Clin. Immunol.104:1223-1230). Los síntomas en un paciente que experimenta una respuesta alérgica a la proteína Fel d1 pueden variar desde rinitis y conjuntivitis leves hasta respuestas asmáticas potencialmente mortales.

[0008] El tratamiento de las alergias incluye esteroides para suprimir la actividad inmunitaria y broncodilatadores para aliviar los síntomas del asma. La terapia de desensibilización también se usa en pacientes gravemente alérgicos. Se han probado combinaciones de vacunas peptídicas para desensibilizar a individuos frente a alérgenos particulares, p. ej., Fel d1 (véanse los documentos US2010/0239599A1 y EP2380591A2).

[0009] También se han propuesto anticuerpos como tratamiento para las alergias, ya que pueden bloquear la entrada de moléculas alergénicas en los tejidos de la mucosa, o pueden unirse al alérgeno antes de que tenga la oportunidad de unirse a la IgE unida al receptor de alta afinidad de los mastocitos o basófilos, impidiendo así la liberación de histamina y otros mediadores inflamatorios desde estas células. En la patente de EE. UU. número 5.670.626 se describe el uso de anticuerpos monoclonales para el tratamiento de enfermedades alérgicas mediadas por IgE, tales como rinitis alérgica, asma alérgica y conjuntivitis alérgica al bloquear la unión de los alérgenos al tejido mucoso. En la patente de EE. UU. número 6.849.259 se describe el uso de anticuerpos específicos contra alérgenos para inhibir la inflamación alérgica en un modelo de alergia de ratónin vivo. Se han descrito sistemas de anticuerpos basados en leche y en huevo. Por ejemplo, en el documento US20030003133A1 se desvela el uso de la leche como portador de alérgenos para inducir tolerancia oral a la caspa de gato y otros alérgenos. En el documento US2010/0143266 se describen composiciones y métodos para reducir la respuesta alérgica de un animal a un alérgeno presente en el medio ambiente, utilizando una molécula que inhibe la capacidad del alérgeno de unirse a los mastocitos. Groot et. al. (de Groot et. al., (1988), J. Allergy Clin. Immunol. 82:778-786), describieron otros anticuerpos dirigidos, por ejemplo, al alérgeno Fel d1.

[0010] La inmunoterapia alergénica especifica (IAE) es una opción de tratamiento para los pacientes con rinitis alérgica desencadenada por aeroalérgenos (tales como polen, caspa de animales o polvo) cuando se administran terapias farmacológicas, tales como antihistamínicos, son insuficientes. La IAE también un tratamiento en fase de investigación para las alergias alimentarias. La IAE es un proceso de inmunización activa mediante el cual se administran a los pacientes dosis en aumento del alérgeno causante, seguidas de una dosis de mantenimiento durante un período de hasta varios años. El objetivo de la IAE es inducir cambios inmunológicos, a través de los efectos sobre la inmunidad humoral y celular, que dan lugar a una mejora de los síntomas y a una tolerancia y desensibilización sostenidas. La IAE puede proporcionar una protección duradera contra las enfermedades alérgicas, conlleva un riesgo de reacciones adversas, tiene una eficacia variable entre pacientes y puede tardar entre 3 y 5 años en inducir tolerancia (Durham, M.D.,et al., (1999), The New England Journal of Medicine 341 (7): 468-75, Durham, M.D.,et al., (2016), Journal of Allergy and Clinical Immunology 138 (4). Elsevier Inc.: 1-12, Reismann, R.E.,et al., (1992), Journal of Allergy and Clinical Immunology 90 (3 Pt 1): 335-39). En el documento WO 2015/027154 se desvelan pruebas y métodos de diagnósticoin vitroein vivopara determinar la seguridad, eficacia o resultado de la IAE en un paciente. En el documento WO 2013/166236 se desvelan anticuerpos humanos que se unen a Fel d1.

[0012] Como tal, existe la necesidad en la técnica de un enfoque más rápido y fiable para el tratamiento de las alergias. Los estudios descritos en el presente documento responden a esa necesidad.

[0014] Breve sumario de la invención

[0016] Cualquier referencia a métodos de tratamiento realizados en el cuerpo humano o animal debe interpretarse como que se refiere sustancias y composiciones para su uso en dichos métodos. En su aspecto más amplio, la divulgación proporciona métodos de tratamiento de un paciente que muestra sensibilidad a un alérgeno o una reacción alérgica frente a un alérgeno, o de prevención o mejora de al menos un síntoma o complicación asociados al alérgeno, a través de la administración de uno o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, específicos para el alérgeno (inmunoterapia pasiva). Los resultados descritos en el presente documento demuestran que, cuando a un paciente que padece alergia se le administran anticuerpos específicos para un alérgeno, puede impedir una respuesta alérgica inducida el alérgeno. Como tal, se considera que un enfoque de inmunoterapia pasiva, como el descrito en el presente documento, puede utilizarse en lugar de la inmunoterapia convencional (IAE, inmunoterapia alergénica especifica), que generalmente requiere años de desensibilización para proporcionar un alivio eficaz al paciente, mientras que pueden obtenerse resultados positivos en cuestión de semanas administrando anticuerpos específicos contra alérgenos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos. Los resultados positivos pueden medirse como una mejoría de al menos un síntoma asociado a la alergia, o mediante una mejoría de uno o más parámetros clínicos medidos mediante una o más de las siguientes puntuaciones de resultados comunicados por el paciente: la puntuación total de síntomas nasales (TNSS,Total Nasal Symptom Score), la puntuación analógica visual (VAS,Visual Analog Score), la puntuación del flujo inspiratorio nasal máximo (PNIF,Peak Nasal Inspiratory Flow) y la prueba de punción cutánea (SPT,Titrated Skin Prick) con titulación.

[0018] Aunque se cree que el enfoque terapéutico descrito en el presente documento puede ser eficaz para utilizar uno o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos frente a cualquier alérgeno, los estudios de prueba de concepto descritos en el presente documento se llevaron a cabo utilizando anticuerpos monoclonales (Acm) completamente humanos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al alérgeno de gato, Fel d1. Dichos anticuerpos pueden ser útiles para unir el alérgeno Fel d1in vivotras la exposición de un paciente sensibilizado al alérgeno de gato, y de tal manera que, puede actuar favoreciendo la eliminación de Fel d1 o bloqueando la unión del alérgeno a la IgE previamente formada en la superficie de los mastocitos o basófilos. Al hacer esto, los anticuerpos pueden impedir la liberación de histamina u otros mediadores inflamatorios desde los mastocitos o basófilos, impidiendo de este modo o disminuyendo los efectos adversos observados en pacientes sensibilizados al alérgeno de gato. Los anticuerpos pueden reducir, minimizar o impedir al menos un síntoma en un paciente sensible al alérgeno de gato Fel d1, tal como estornudos, congestión, obstrucción nasal, tos, respiración sibilante, broncoconstricción, rinitis o conjuntivitis. Los anticuerpos pueden impedir complicacionesin vivoaún más graves asociadas a la exposición al alérgeno de gato en individuos sensibilizados, tal como respuestas asmáticas, anafilaxia, o incluso la muerte.

[0020] Los anticuerpos utilizados en la invención pueden ser anticuerpos de IgG4 de longitud completa

[0022] Un primer aspecto de la divulgación proporciona métodos para tratar a un paciente que padece una alergia, o para impedir o mejorar al menos un síntoma asociado a la exposición a alérgenos. En aspectos, un método comprende la administración de uno o más anticuerpos monoclonales humanos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos aislados que se unen específicamente al alérgeno.

[0024] En otros aspectos de la divulgación, un paciente puede explorarse para seleccionar uno o más anticuerpos terapéuticos específicos de alérgeno o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, utilizando los métodos descritos en el presente documento. En un aspecto, un método de tratamiento de un paciente que muestra sensibilidad a un alérgeno o una reacción alérgica frente a un alérgeno, o de prevención o mejora de al menos un síntoma o complicación asociados al alérgeno, comprende: (a) recoger del paciente una muestra de tejido o un extracto de la misma, o un líquido biológico, o una muestra de sangre; (b) extraer una IgE específica de alérgeno, o células que contengan o estén unidas a una IgE específica de alérgeno, de una o más de las muestras del paciente de la etapa (a); (c) mezclar la IgE, o las células que contengan la IgE o estén unidas a ella, de la muestra del paciente, con el alérgeno y con uno o más anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, específicos del alérgeno; (d) determinar si la adición de uno o más anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, específicos del alérgeno, bloquea la unión de la IgE específica del alérgeno de la etapa b) con el alérgeno, y si los resultados de la etapa d) demuestran un bloqueo eficaz de la unión de la IgE específica del alérgeno con el alérgeno mediante los anticuerpos específicos del alérgeno de la etapa (c), administrar al paciente una composición farmacéutica que comprenda una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los anticuerpos específicos de alérgenos o fragmentos de unión a antígeno de la etapa (c).

[0025] En algunos aspectos, para determinar la eficacia del tratamiento, se controla al paciente antes y después de la administración de los anticuerpos específicos contra alérgenos o de los fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunos aspectos, un método comprende administrar al paciente una o más dosis terapéuticamente eficaces de uno o más anticuerpos específicos del alérgeno o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y medir la gravedad, la duración o la frecuencia de aparición de uno o más síntomas asociados a una respuesta alérgica en un paciente. En algunos aspectos, se lleva a cabo una medición para determinar un valor de referencia antes de la administración y a continuación en varios puntos temporales después de la administración con el fin de determinar la eficacia de la terapia y determinar si se requieren dosis adicionales o un cambio en los anticuerpos para aumentar la eficacia. En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la muestra de tejido es cualquier muestra de tejido, o extracto de la misma, líquido biológico o muestra de sangre que contenga células portadoras de IgE; o la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre completa, suero y plasma. Las células pueden aislarse de la muestra de tejido. En realizaciones específicas, las células son células mononucleares de sangre periférica (CMSP). En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el alérgeno puede seleccionarse de un producto animal, un alérgeno alimentario, polen de plantas, esporas de hongos, ácaros del polvo doméstico, cucarachas, perfume, detergentes, limpiadores domésticos, látex, un producto farmacéutico o el veneno de un insecto.

[0026] El producto animal puede seleccionarse del grupo que consiste en pieles de animales, caspa de animales, lana y excreciones de ácaros.

[0027] El producto animal puede seleccionarse del grupo que consiste en caspa de gato, pelo de gato o un extracto de los mismos, o en la proteína Fel d1.

[0028] En la invención, el alérgeno es la proteína Fel d1.

[0029] En determinados aspectos de la divulgación, el producto animal puede contener el alérgeno can f1, can f2, can f3, can f4, can f5 o can f6.

[0030] En un aspecto de la divulgación, el alérgeno alimentario puede seleccionarse del grupo que consiste en huevos, carne, fruta, legumbres, leche u otros productos lácteos, marisco, sésamo, soja, trigo, avena, cebada, apio o apionabo, maíz o elote y frutos secos. Las legumbres pueden seleccionarse del grupo que consiste en cacahuetes, judías, guisantes y soja. Los frutos secos pueden seleccionarse del grupo que consiste en nueces pacanas, almendras, anacardos, avellanas (nueces de avellano), nueces, nueces de Brasil, nueces de macadamia, castañas, piñones y pistachos. En un aspecto, el alérgeno puede seleccionarse del grupo que consiste en el polen de gramíneas, polen de plantas herbáceas y de árboles. El polen de los árboles puede seleccionarse del grupo que consiste en polen de abedul, polen de cedro, polen de roble, polen de aliso, polen de carpe, polen deAesculus, polen de sauce, polen de álamo, polen dePlatanus, polen de tilo, polen de olivo, polen de enebro de Ashe y polen deAlstonia scholaris.

[0031] En un aspecto, el polen de abedul contiene el alérgeno Betv 1.

[0032] En un aspecto, el polen de cedro contiene el alérgeno Cryj 1 o Cryj2.

[0033] En un aspecto, el polen de gramínea es de raigrás o de hierba Timotea.

[0034] En un aspecto, el polen de plantas herbáceas se selecciona del grupo que consiste en ambrosía, plantago, ortiga,Artemisia vulgaris,Chenopodium albumy acedera.

[0035] En un aspecto, el veneno de los insectos lo producen las abejas, avispas u hormigas de fuego.

[0036] En determinadas realizaciones, los métodos comprenden además la administración de una cantidad eficaz de un segundo agente terapéutico útil para disminuir una reacción alérgica contra un alérgeno, en donde el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un broncodilatador, un antihistamínico, epinefrina, un descongestionante, un corticoesteroide, un antagonista de IL-4R, un anticuerpo contra IgE, o uno o más anticuerpos diferentes contra el alérgeno.

[0037] En un aspecto de la divulgación, cuando se explora a un paciente para seleccionar uno o más anticuerpos específicos de alérgenos, la etapa de determinación se lleva a cabo mediante un métodoin vitroseleccionado del grupo que consiste en un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA,enzyme-linked immunosorbent assay), un radioinmunoensayo (RIA), un ensayo inmunorradiométrico (IRMA), un inmunoensayo de luminiscencia (LIA), una inmunotransferencia, análisis de FACS (clasificación de células activada por fluorescencia), un ensayo de unión a alérgeno facilitada por IgE (FAB), un ensayo de activación de basófilos (p. ej. un ensayo funcional de fosfoflujo o un ensayo de activación de basófilos), y un ensayo que utiliza una estirpe celular genomodificada que expresa FCεR1.

[0038] En otros aspectos de la divulgación, la etapa de determinación se lleva a caboin vivoutilizando un modelo animal específico de alérgeno tal como un modelo de anafilaxia cutánea pasiva (ACP). En algunos aspectos, puede utilizarse un ensayo tantoin vitrocomoin vivo.

[0039] En determinadas realizaciones, el método comprende además la administración de una terapia paliativa útil para reducir la gravedad de la reacción alérgica o para mejorar al menos un síntoma asociado a la reacción alérgica. En una realización, el tratamiento produce una disminución de la gravedad y/o duración de al menos un síntoma o complicación asociado a la reacción alérgica contra el alérgeno, en donde el síntoma o la complicación asociado a la reacción alérgica se selecciona del grupo que consiste en estornudos, rinorrea, picor nasal y congestión nasal. En una realización, el tratamiento produce una reducción de la rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, rinoconjuntivitis, asma alérgica, exacerbaciones de asma, o una respuesta anafiláctica tras la exposición del paciente a un alérgeno. En la invención, se administran dos anticuerpos que se unen específicamente a la proteína Fel d1 (como se define en las reivindicaciones).

[0040] En una realización, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, tiene un isotipo seleccionado del grupo que consiste en una IgG1, una IgG2 y una IgG4. En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, se une específicamente a Fel d1 con una KD igual o inferior a 10-6 M. En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, se une a Fel d1 con una KD igual o inferior a 1,8 nM.

[0041] En algunos aspectos, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a la Fel d1 monomérica con una KD igual o inferior a 1 x 10<-8>, 1 x 10<-9>o 1 x 10<-10>. En algunos aspectos, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a la Fel d1 dimérica con una KD igual o inferior a 1 x 10<-8>, 1 x 10<-9>, 1 x 10<-10>o 1 x 10<-11>.

En aspectos, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a la Fel d1 dimérica con una T1/2 de al menos 150 min, 160 min, 170 min, 180 min, 190 min, 200 min, 210 min, 220 min, 230 min, 240 min o 250 min. En aspectos, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a la Fel d1 monomérica con una T1/2 de al menos 25 min, 30 min, 35 min, 40 min, 45 min o 50 min.

[0042] En otros aspectos, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, bloquean la unión del alérgeno a la IgE específica del alérgeno. En aspectos, se seleccionan uno o más anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que bloquean la activación de basófilos inducida por Fel d1 que tiene una CI<50>de aproximadamente 10 pM, 20 pM, 30pM, 40 pM, 50 pM, 100pM, 1 nM o inferior. En un ensayo ELISA, se seleccionan uno o más anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que bloquean la unión de Fel d1 a IgE policlonal que tiene una CI<50>de aproximadamente 600 pM o inferior. Se seleccionan uno o más anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que bloquean la unión de Fel d1 a la IgE del paciente que tiene una CI<50>de aproximadamente 500 pM o inferior.

[0043] En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende las tres CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas en una cualquiera de las secuencias de la región variable de cadena pesada (HCVR,heavy chain variable region) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 y 460; y las tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas en una cualquiera de las secuencias de la región variable de la cadena ligera (LCVR,light chain variable region) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 y 468. En la materia se conocen bien los métodos y las técnicas para identificar las CDR en las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR y pueden utilizarse para identificar las CDR en las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR específicas desveladas en el presente documento. Las convenciones ilustrativas que pueden utilizarse para identificar los límites de las CDR incluyen, p. ej., la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales y la definición de AbM es un término medio entre los enfoques de Kabat y Chothia. Véase, p. ej., Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikaniet al., (1997), J. Mol. Biol. 273:927-948; y Martinet al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272. También hay disponibles bases de datos públicas para identificar secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.

[0044] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende tres CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas en una cualquiera de las secuencias de la región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 y 460; y las tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas en una cualquiera de las secuencias de la región variable de la cadena ligera (LCVR,light chain variable region) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 y 468.

[0045] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 y 460.

[0046] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 y 460.

[0047] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 y 468.

[0048] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 y 468.

[0049] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende: (a) una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 y 460; y (b) una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 y 468.

[0050] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende: (a) una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 y 460; y (b) una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 y 468.

[0051] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende:

[0052] (a) un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372 y 462;

[0053] (b) un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 374 y 464;

[0054] (c) un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376 y 466;

[0055] (d) un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380 y 470;

[0056] (e) un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382 y 472; y

[0057] (f) un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384 y 474.

[0058] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende:

[0059] (a) un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 20, 68, 132, 164, 244.308, 324, 372 y 462;

[0060] (b) un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22, 70, 134, 166, 246, 310, 326, 374 y 464;

[0061] (c) un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 24, 72, 136, 168, 248, 312, 328, 376 y 466;

[0062] (d) un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 28, 76, 140, 172, 252, 316, 332, 380 y 470;

[0063] (e) un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 30, 78, 142, 174, 254, 318, 334, 382 y 472; y

[0064] (f) un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 32, 80, 144, 176, 256, 320, 336, 384 y 474.

[0065] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 370/378 y 460/468.

[0066] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 y 460/468.

[0067] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138 y 162/170.

[0068] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26 y 322/330.

[0069] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26 y 306/314.

[0070] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26 y 370/378.

[0071] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 242/250 y 306/314.

[0072] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, comprende el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 242/250 y 322/330.

[0073] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, interacciona con al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 15 hasta aproximadamente la posición 24 de la SEQ ID NO: 396; restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 85 hasta aproximadamente la posición 103 de la SEQ ID NO: 396; restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 85 hasta aproximadamente la posición 104 de la SEQ ID NO: 396; restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 113 hasta aproximadamente la posición 116 de la SEQ ID NO: 396; restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 113 hasta aproximadamente la posición 127 de la SEQ ID NO: 396; y restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 128 hasta la 141 de la SEQ ID NO: 396. En determinados aspectos, los epítopos a los que se unen los anticuerpos contra Fel D1, se identifican utilizando intercambio de deuterio por hidrógeno (HDX,hydrogen deuterium exchange).

[0074] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, interacciona con restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 15 hasta aproximadamente la posición 24 de la SEQ ID NO: 396.

[0075] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, interacciona con restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 85 hasta aproximadamente la posición 103 de la SEQ ID NO: 396.

[0076] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, interacciona con restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 85 hasta aproximadamente la posición 104 de la SEQ ID NO: 396.

[0077] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, interacciona con restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 113 hasta aproximadamente la posición 116 de la SEQ ID NO: 396.

[0078] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, interacciona con al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 402, 403, 404, 406 y 412.

[0079] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, interacciona con la SEQ ID NO: 402.

[0080] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, interacciona con la SEQ ID NO: 403.

[0081] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, interacciona con la SEQ ID NO: 404.

[0082] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, interacciona con la SEQ ID NO: 406.

[0083] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, interacciona con la SEQ ID NO: 412.

[0084] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une específicamente a Fel d1, interacciona con la SEQ ID NO: 426.

[0085] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que interacciona con las SEQ ID NO: 402, 403, 404, 406 y/o 426, comprende las tres HCDR contenidas en la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 18 y las tres LCDR contenidas en la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 26. En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que interacciona con las SEQ ID NO: 402, 403, 404, 406 y/o 426, comprende una HCDR1 de SEQ ID NO: 20; una HCDR2 de SEQ ID NO: 22; una HCDR3 de SEQ ID NO: 24; una LCDR1 de SEQ ID NO: 28; una LCDR2 de SEQ ID NO: 30 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 32.

[0086] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que interacciona con SEQ ID NO: 412, comprende las tres HCDR contenidas en la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 306 y las tres LCDR contenidas en la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 314.

[0087] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que interacciona con SEQ ID NO: 412 comprende un HCDR1 de SEQ ID NO: 308; una HCDR2 de SEQ ID NO: 310; una HCDR3 de SEQ ID NO: 312; una LCDR1 de SEQ ID NO: 316; una LCDR2 de SEQ ID NO: 318 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 320.

[0088] En un aspecto, el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la cadena 2 de Fel d 1 interacciona con números de restos de aminoácidos que varían des aproximadamente el resto 12 al resto 54 de SEQ ID NO: 396.

[0089] En un aspecto, el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la cadena 2 de Fel d 1 interacciona con números de restos de aminoácidos que varían des aproximadamente el resto 21 al resto 47 de SEQ ID NO: 396.

[0090] En un aspecto, el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la cadena 2 de Fel d 1 interacciona con al menos uno o más de los siguientes restos de aminoácidos en SEQ ID NO: 396: la N en la posición 21, la E en la posición 22, la L en la posición 23, la L en la posición 24, la D en la posición 26, la L en la posición 27, la T en la posición 30, la K en la posición 31, la E en la posición 36, la R en la posición 39, la K en la posición 43, la D en la posición 47.

[0091] En un aspecto, el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la cadena 2 de Fel d 1 se une a un epítopo que comprende una pluralidad de los siguientes restos de aminoácidos de SEQ ID NO: 396: N21, E22, L23, L24, D26, L27, T30, K31, E36, R39, K43, D47.

[0092] En la invención, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que interacciona con al menos uno o más de los siguientes restos de aminoácidos de SEQ ID NO: 396, incluido la N en la posición 21, la E en la posición 22, la L en la posición 23, la L en la posición 24, la D en la posición 26, la L en la posición 27, la T en la posición 30, la K en la posición 31, la E en la posición 36, la R en la posición 39, la K en la posición 43, la D en la posición 47, comprende el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de las SEQ ID NO: 306/314.

[0093] En determinados aspectos de la divulgación, los epítopos a los que se unen los anticuerpos contra Fel D1 se identifican utilizando análisis cristalográfico por rayos X.

[0094] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, comprende las secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 20, 22 y 24, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 28, 30 y 32, respectivamente.

[0095] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, comprende las secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 68, 70 y 72, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 76, 78 y 80, respectivamente.

[0096] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, comprende las secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 132, 134 y 136, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 140, 142 y 144, respectivamente.

[0097] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, comprende las secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 164, 166 y 168, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 172, 174 y 176, respectivamente.

[0098] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, comprende las secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 244, 246 y 248, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 252, 254 y 256, respectivamente.

[0099] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, comprende las secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 308, 310 y 312, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 316, 318 y 320, respectivamente.

[0100] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, comprende las secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 324, 326 y 328, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 332, 334 y 336, respectivamente.

[0101] En un aspecto, el anticuerpo humano, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, comprende las secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 372, 374 y 376, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 380, 382 y 384, respectivamente.

[0102] En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, completamente humano, que se une a Fel d1, en donde el anticuerpo, o fragmento del mismo, presenta una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 y 460, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 y 468, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 24, 72, 136, 168, 248, 312, 328, 376 y 466, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 32, 80, 144, 176, 256, 320, 336, 384 y 474, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 20, 68, 132, 164, 244, 308, 324, 372 y 462, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 22, 70, 134, 166, 246, 310, 326, 374 y 464, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 28, 76, 140, 172, 252, 316, 332, 380 y 470, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 30, 78, 142, 174, 254, 318, 334, 382 y 472, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (v) se une a Fel d1 con una KD igual o inferior a 10<-6>y preferentemente igual o inferior a 10<-9>; (vi) demuestra eficacia en al menos un modelo animal de anafilaxia o inflamación; o (vii) compite con un anticuerpo de referencia por la unión a Fel d1.

[0103] En un aspecto, un "anticuerpo de referencia" puede incluir, por ejemplo, anticuerpos que tienen una combinación de pares de secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera seleccionados del grupo que consiste en 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 y 460/468.

[0104] En un aspecto, el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, completamente humano, que se une específicamente a Fel d1, comprende una secuencia HCDR1 que comprende la fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 (SEQ ID NO:386) en donde X1 es Gly, X2 es Phe, Tyr o Gly, X3 es Thr o Ser, X4 es Phe o Ile, X5 es Ser, Arg, Thr o Asn, X6 es Asn, Thr, Asp o Ser, X7 es Tyr y X8 es Asn, Tyr o Ala; una secuencia HCDR2 que comprende la fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 (SEQ ID NO: 387), en donde X1 es Ile, X2 es Tyr, Ser o Asn, X3 es Tyr, Ser, Gly, Pro o Asp, X4 es Asp, Arg o Ser, X5 es Gly, Val o Ser, X6 es Ser, Gly, Arg o Tyr, X7 es Tyr, Arg, Thr, Ser o Asn y X8 es Ile, Thr, Ala, Ser, o no está presente; una secuencia HCDR3 que comprende la fórmula X1 - X2 -X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 - X10 - X11 - X12 - X13 - X14 - X15 - X16 (SEQ ID NO: 388), en donde X1 es Ala, X2 es Lys o Arg, X3 es Arg, Gly, His, Ser, Asp, Leu o Thr, X4 es Thr, Pro, Arg, Gly o Glu, X5 es Leu, Val, Gly, Lys, Tyr o Asn, X6 es Ser, Arg, Thr, Ala, Tyr, Phe o Trp, X7 es Tyr, Gly, Arg, Ala, Asn, Asp, His o Asn, X8 es Tyr, Thr, Ser o His, X9 es Val, Ser, Ala, Phe, Pro, o no está presente, X10 es Met, Gly, Asp, Pro, Val, o no está presente, X11 es Asp, Tyr, Ser, Gly, Phe, o no está presente, X12 es Val, Asp, Phe, o no está presente, X13 es Phe, Asp, o no está presente, X14 es Phe, Tyr, o no está presente, X15 es Asp, o no está presente, X16 es Tyr, o no está presente; una secuencia LCDR1 que comprende la fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 - X10 - X11 - X12 (SEQ ID NO: 389), en donde X1 es Gln, X2 es Gly, Ser o Asp, X3 es Ile o Val, X4 es Ser, Leu, Asn o Gly, X5 es Asn, Tyr, Gly o Ser, X6 es Tyr, Ser, Phe o Trp, X7 es Ser, o no está presente, X8 es Asn, o no está presente, X9 es Asn, o no está presente, X10 es Lys, o no está presente, X11 es Gln, o no está presente, X12 es Tyr, o no está presente; una secuencia LCDR2 que comprende la fórmula X1 - X2 - X3 (SEQ ID NO: 390), en donde X1 es Ala, Trp, Asp, Tyr, Lys, Gly o Ser, X2 es Ala o Thr y X3 es Ser; y una secuencia LCDR3 que comprende la fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 (SEQ ID NO: 391), en donde X1 es Gln, Leu o His, X2 es Lys, Gln o His, X3 es Tyr, Ser o Leu, X4 es Tyr, Asn, Gly, Asp o Ser, X5 es Ser, Asp o Asn, X6 es Leu, Ala, Tyr, Thr o Phe, X7 es Pro o Arg, X8 es Leu, Phe, Tyr o Thr y X9 es Thr, o no está presente.

[0105] En un aspecto, la divulgación describe un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno específico para Fel d1, que comprende una HCVR codificada por segmentos de secuencia de nucleótidos procedentes de secuencias germinales VH, DH y JH, y una LCVR codificada por segmentos de secuencia de nucleótidos procedentes de secuencias germinales VK y JK, con las combinaciones mostradas en la Tabla 2.

[0106] La invención abarca anticuerpos que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunas aplicaciones, puede ser útil realizar modificaciones para eliminar sitios de glucosilación no deseables o, p. ej., eliminar un residuo de fucosa para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) (véase, Shieldet al.(2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones, puede realizarse una modificación de galactosilación para modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

[0107] Un segundo aspecto de la divulgación proporciona un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, para su uso en el tratamiento de un paciente que padece alergia a los gatos, en donde el anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, compite por la unión específica a Fel d1 con un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde cada HCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 y 460; y las CDR de una región variable de cadena ligera (LCVR), en donde cada LCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 y 468. Un aspecto proporciona un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que compite por la unión específica a Fel d1 con un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde cada HCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 y 460; y las CDR de una región variable de cadena ligera (LCVR), en donde cada LCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 y 468. En un aspecto relacionado, la invención proporciona un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que compite por la unión específica a Fel d1 con un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, que comprende las CDR de cadena pesada y ligera contenidas en pares de secuencias de cadena pesada y ligera seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 y 460/468.

[0108] Un tercer aspecto de la divulgación proporciona el uso un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une al mismo epítopo en Feld 1 que un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde cada HCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 y 460; y las CDR de una región variable de cadena ligera (LCVR), en donde cada LCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 y 468.

[0109] Un aspecto proporciona el uso de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une al mismo epítopo en Fel d1 que un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde cada HCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 y 460; y las CDR de una región variable de cadena ligera (LCVR), en donde cada LCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 y 468.

[0110] En un aspecto relacionado, la divulgación proporciona el uso un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, aislado, que se une al mismo epítopo en Fel d1 que un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, que comprende las CDR de cadena pesada y ligera contenidas en pares de secuencias de cadena pesada y ligera seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 y 460/468.

[0111] En aspectos de la divulgación, una composición farmacéutica comprende más de un anticuerpo, o fragmentos de unión a antígeno, que se unen específicamente al alérgeno. En determinados aspectos, cuando se utiliza más de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, los anticuerpos no compiten entre sí por unirse al alérgeno. En otros aspectos, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a diferentes epítopos. En determinados aspectos, uno o más anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a diferentes epítopos en Fel d1. En aspectos, una composición farmacéutica comprende un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a un epítopo que comprende los aminoácidos 15 a 54 de SEQ ID NO:396, y un segundo anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a un epítopo que comprende los aminoácidos 113 a 116 de SEQ ID NO:396.

[0112] Un cuarto aspecto de la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une específicamente a Fel d1, que comprende dos dominios (dos brazos) de unión a antígeno que comprenden una secuencia de aminoácidos HCVR y una secuencia de aminoácidos LCVR de cualquiera de dos o más anticuerpos descritos en el presente documento.

[0113] En un aspecto, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos HCVR como se expone en SEQ ID NO: 370 y una secuencia de aminoácidos LCVR como se expone en SEQ ID NO: 378, y un segundo dominio de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos HCVR como se expone en SEQ ID NO: 18 y una secuencia de aminoácidos LCVR como se expone en SEQ ID NO: 378.

[0114] En un aspecto, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 372, 374 y 376, respectivamente, y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 380, 382 y 384, respectivamente; y en donde el segundo dominio de unión a antígeno comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 20, 22 y 24, respectivamente, y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 380, 382 y 384, respectivamente.

[0115] En un aspecto, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos HCVR como se expone en SEQ ID NO: 306 y una secuencia de aminoácidos LCVR como se expone en SEQ ID NO: 314, y un segundo dominio de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos HCVR como se expone en SEQ ID NO: 18 y una secuencia de aminoácidos LCVR como se expone en SEQ ID NO: 314.

[0116] En un aspecto, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 308, 310 y 312, respectivamente, y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 316, 318 y 320, respectivamente; y en donde el segundo dominio de unión a antígeno comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 20, 22 y 24, respectivamente, y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 316, 318 y 320, respectivamente.

[0117] En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado específico para Fel d1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite por la unión a Fel d1 con una cualquiera de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la divulgación.

[0118] En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado específico para Fel d1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une al mismo epítopo en Fel d1 que cualquiera de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la divulgación.

[0119] En un aspecto, la molécula de unión a antígeno biespecífica es un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une específicamente a Fel d1.

[0120] En un aspecto, la molécula de unión a antígeno biespecífica es un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une específicamente a Fel d1, en donde el anticuerpo monoclonal humano es un anticuerpo monoespecífico o un anticuerpo biespecífico.

[0121] En un aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de unión a antígeno biespecífica como se describe en el presente documento y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

[0122] En un aspecto, la divulgación proporciona un método para el tratamiento de un paciente que muestra sensibilidad o reacción alérgica frente a un gato, caspa de gato, pelo de gato o a un extracto de los mismos, o a la proteína Fel d1, o para el tratamiento de al menos un síntoma o complicación asociado a la sensibilidad o reacción alérgica frente a un gato, caspa de gato, pelo de gato o a un extracto de los mismos, o a la proteína Fel d1, que comprende la administración de una cantidad eficaz de una o más de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la divulgación, o de una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una o más de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la divulgación, a un paciente que lo necesite, en donde el paciente muestra una sensibilidad reducida o una reacción alérgica disminuida frente a un gato, caspa de gato, pelo de gato o un extracto de los mismos, o a la proteína Fel d1, o no manifiesta sensibilidad ni reacción alérgica a un gato, caspa de gato, pelo de gato o a un extracto de los mismos, o a la proteína Fel d1, o en donde el paciente muestra una reducción de al menos un síntoma o complicación asociado a una sensibilidad o a una reacción alérgica frente, un gato, caspa de gato, pelo de gato o a un extracto de los mismos, o a la proteína Fel d1, o una reducción de la frecuencia y/o duración de al menos un síntoma o complicación asociado a una sensibilidad o a una reacción alérgica frente, un gato, caspa de gato, pelo de gato o a un extracto de los mismos, o a la proteína Fel d1, después de la administración de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas o de una composición que comprende las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la divulgación.

[0123] En una realización, la divulgación proporciona la administración de una cantidad eficaz de un segundo agente terapéutico junto con al menos una molécula de unión a antígeno biespecífica de la divulgación útil para disminuir una reacción alérgica a un gato, caspa de gato, o a la proteína Fel d1. El segundo agente antifúngico puede seleccionarse del grupo que consiste en un corticoesterioide, un broncodilatador, un antihistamínico, epinefrina, un descongestionante, un corticoesteroide, otro anticuerpo diferente contra Fel d1 y una vacuna peptídica.

[0124] En un aspecto, el tratamiento con una o más moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la divulgación, en solitario, o junto con un segundo agente terapéutico, puede producir una reducción de la rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, asma alérgica o una respuesta anafiláctica, después de la exposición del paciente a un gato, caspa de gato o a la proteína Fel d1.

[0125] En un quinto aspecto, la divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos contra Fel d1 o fragmentos de los mismos. También se incluyen vectores de expresión recombinante portadores de los ácidos nucleicos de la divulgación y las células hospedadoras en las que se han introducido dichos vectores, así como los métodos de producción de los anticuerpos mediante el cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permitan la producción de los anticuerpos y la recuperación de los anticuerpos producidos.

[0126] En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo, o fragmento del mismo, que comprende una HCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369 y 459, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología con la misma.

[0127] En un aspecto, la HCVR está codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17, 65, 129, 161, 241, 305, 321, 369 y 459.

[0128] En un aspecto, el anticuerpo, o fragmento del mismo, comprende además una LCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377 y 467, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología con la misma. En un aspecto, la LCVR está codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 25, 73, 137, 169, 249, 313, 329, 377 y 467.

[0129] En un aspecto, la divulgación también proporciona un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprende un dominio HCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375 y 465, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383 y 473, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia. En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo, o fragmento del mismo, que comprende además un dominio HCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371 y 461, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373 y 463, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379 y 469, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381 y 471, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.

[0130] Un sexto aspecto de la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más anticuerpos humanos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a Fel d1, junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En un aspecto, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de dos o más anticuerpos humanos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a Fel d1 junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

[0131] En un aspecto, la composición farmacéutica comprende:

[0132] a) un primer anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, completamente humano, aislado, que se une específicamente a Fel d1, que comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 18; y una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 26; y

[0133] b) un segundo anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, completamente humano, aislado, que se une específicamente a Fel d1, que comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 66, 130, 162, 306, 322, 370 y 460; y una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 74, 138, 170, 314, 330, 378 y 468.

[0134] En un aspecto, la composición farmacéutica comprende:

[0135] a) un primer anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, completamente humano, aislado, que se une específicamente a Fel d1, que comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 242; y una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 250; y

[0136] b) un segundo anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, completamente humano, aislado, que se une específicamente a Fel d1, que comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 306, 322 y 460; y una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 314, 330 y 468.

[0137] En un aspecto, la composición farmacéutica comprende:

[0138] a) un primer anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, completamente humano, aislado, que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 18/26; y

[0139] b) un segundo anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, completamente humano, aislado, que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/ LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 66/74, 130/138, 162/170, 306/314, 322/330370/378 y 460/468.

[0140] En un aspecto, la composición farmacéutica comprende:

[0141] a) un primer anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 18/26; y

[0142] b) un segundo anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 130/138.

[0143] En un aspecto, la composición farmacéutica comprende:

[0144] a) un primer anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 18/26; y

[0145] b) un segundo anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 322/330.

[0146] En un aspecto, la composición farmacéutica comprende:

[0147] a) un primer anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 18/26; y

[0148] b) un segundo anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 306/314.

[0149] En un aspecto, la composición farmacéutica comprende:

[0150] a) un primer anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 18/26; y

[0151] b) un segundo anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 370/378.

[0152] En un aspecto, la composición farmacéutica comprende:

[0153] a) un primer anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, completamente humano, aislado, que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 242/250; y

[0154] b) un segundo anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, completamente humano, aislado, que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/ LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 306/314 y 322/330.

[0155] En un aspecto, la composición farmacéutica comprende

[0156] a) un primer anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 242/250; y

[0157] b) un segundo anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 306/314.

[0158] En un aspecto, la composición farmacéutica comprende

[0159] a) un primer anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 242/250; y

[0160] b) un segundo anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 322/330.

[0161] En un aspecto, la composición farmacéutica comprende dos o más anticuerpos monoclonales humanos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a Fel d1, que comprende pares de secuencias de aminoácidos de HCVR/ LCVR seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 y 460/468.

[0162] En un aspecto, la composición farmacéutica comprende cuatro anticuerpos monoclonales humanos aislados, o a fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a Fel d1, en donde los anticuerpos humanos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, comprenden los pares de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de las SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138 y 162/170.

[0163] En un aspecto, la divulgación presenta una composición, que es una combinación de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más anticuerpos contra Fel d1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la divulgación, y una cantidad terapéuticamente eficaz de un segundo agente terapéutico.

[0164] El segundo agente terapéutico puede ser un fármaco de molécula pequeña, una proteína/polipéptido, un anticuerpo, una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula antisentido, o un ARNip. El segundo agente terapéutico puede ser de origen sintético o natural.

[0165] El segundo agente terapéutico puede ser cualquier agente que se combine ventajosamente con un anticuerpo o fragmento del mismo de la divulgación, por ejemplo, un segundo anticuerpo distinto de los descritos en el presente documento que pueda bloquear la unión de Fel d1 a la IgE presente en mastocitos o basófilos. Un segundo agente terapéutico puede ser también cualquier agente que se utilice como norma asistencial en el tratamiento de una respuesta alérgica a cualquier alérgeno. Dicho segundo agente terapéutico puede ser un antihistamínico, epinefrina, un descongestionante, un corticoesteroide o una vacuna peptídica.

[0166] En determinados aspectos, el segundo agente terapéutico puede ser un agente que ayude a contrarrestar o reducir cualquier posible efecto o efectos secundarios asociados con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la divulgación, si ocurriera dicho efecto o efectos secundarios.

[0167] También se apreciará que los anticuerpos y las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente divulgación pueden emplearse en combiterapias, es decir, los anticuerpos y las composiciones farmacéuticamente aceptables se pueden administrar simultáneamente con, antes de o después de, uno o más agentes terapéuticos o procedimientos médicos deseados distintos. La combinación particular de terapias (agentes terapéuticos o procedimientos) para emplear en un régimen de combinación tendrá en cuenta la compatibilidad de los agentes terapéuticos y/o procedimientos deseados y el efecto terapéutico deseado que se debe lograr. Se apreciará también que las terapias empleadas pueden lograr un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, un anticuerpo puede administrarse simultáneamente con otro agente utilizado para tratar el mismo trastorno) o pueden lograr efectos diferentes (por ejemplo, control de cualquier efecto adverso). Como se utiliza en el presente documento, los agentes terapéuticos adicionales que se administran normalmente para tratar o prevenir una enfermedad, o afección, en particular, son adecuados para la enfermedad, o afección, que se va a tratar.

[0168] Cuando se administran de forma simultánea múltiples agentes terapéuticos, las dosis pueden ajustarse en consecuencia, como se reconoce en el campo pertinente.

[0169] Un séptimo aspecto de la divulgación proporciona un método de tratamiento de un paciente que muestra sensibilidad, o una reacción alérgica, frente a un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato, o a la proteína Fel d1, o para prevenir o mejorar al menos un síntoma o complicación asociado a una sensibilidad o reacción alérgica frente a un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato, o a la proteína Fel d1, que comprende la administración de una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos monoclonales humanos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a Fel d1, o de una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos monoclonales humanos aislados o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a Fel d1, o de una cantidad eficaz de una o más de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen específicamente a Fel d1, o de una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una o más de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen específicamente a Fel d1, a un paciente que lo necesite, en donde la sensibilidad o reacción alérgica frente a un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato, o a la proteína Fel d1, se previene o disminuye en gravedad y/o duración, o al menos un síntoma o complicación asociado a la sensibilidad o reacción alérgica frente a un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato, o a la proteína Fel d1, se previene, o mejora, o la frecuencia y/o duración de la gravedad de la sensibilidad o reacción alérgica contra un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato, o a la proteína Fel d1, se reduce después de la administración de uno o más de los anticuerpos monoclonales humanos aislados, o fragmentos de los mismos, que se unen específicamente a Fel d1, o después de la administración de una o más de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen específicamente a Fel d1, o después de la administración de una composición que comprende uno cualquiera o más de los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas anteriores.

[0170] La invención proporciona dos anticuerpos monoclonales, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, específicos de alérgeno, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consisten en las SEQ ID NO: 18/26 y 306/314 que se unen específicamente a la proteína Fel d1 para su uso en un método para reducir la gravedad, la duración o la frecuencia de aparición de uno o más síntomas asociados a una respuesta alérgica en un paciente humano provocada por un producto de origen animal que contiene el alérgeno Fel d1, medida mediante una o más puntuaciones de los resultados comunicados por el paciente, el método comprende la administración al paciente humano de una o más dosis terapéuticamente eficaces de dichos dos anticuerpos monoclonales, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, específicos de alérgeno. En una realización, el uno o más síntomas pueden seleccionarse del grupo que consiste en congestión nasal, picor nasal, rinorrea y estornudos. En la invención, la puntuación de los resultados comunicados por el paciente se selecciona del grupo que consiste en una puntuación total de síntomas nasales (TNSS), una puntuación de síntomas nasales en una Escala Visual Analógica (VAS) y una mejoría del flujo inspiratorio nasal máximo (PNIF). En una realización, el método se asocia a una reducción del diámetro del habón en una prueba cutánea de alergia. En una realización, la prueba cutánea de alergia es una prueba de punción cutánea (SPT) con titulación, en donde hay una reducción significativa del diámetro del habón en un paciente tratado con los anticuerpos monoclonales específicos de alérgeno en comparación con el diámetro del habón observado antes del tratamiento del paciente con dichos anticuerpos.

[0171] En la invención, los dos anticuerpos específicos de alérgeno se administran por vía subcutánea.

[0172] En un aspecto de la divulgación, los anticuerpos específicos de alérgeno se administran por vía subcutánea, cada uno a una dosis de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 800 mg.

[0173] En un aspecto de la divulgación, los anticuerpos específicos de alérgeno se administran por vía subcutánea, cada uno a una dosis de aproximadamente 600 mg.

[0174] En la invención, los dos anticuerpos específicos de alérgeno se administran como una única dosis subcutánea de 600 mg, que comprende 300 mg de cada anticuerpo.

[0175] En la invención, el tratamiento produce una reducción de al menos un 20 % con respecto al valor de referencia en al menos un parámetro clínico. Específicamente, el tratamiento produce una reducción de al menos un 20 % con respecto al valor de referencia en al menos una puntuación de resultado comunicada por el paciente 8 días después de la dosis única subcutánea.

[0176] En una realización, el tratamiento produce una reducción de al menos un 50 % con respecto al valor de referencia en al menos un parámetro clínico.

[0177] En un aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más de los anticuerpos de la divulgación, o una o más de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen específicamente a Fel d1, para su uso en el tratamiento de un paciente que muestra sensibilidad o una reacción alérgica frente a un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato, o a la proteína Fel d1, o para tratar al menos un síntoma o complicación asociado a una sensibilidad o reacción alérgica contra un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato, o a la proteína Fel d1, en donde la sensibilidad o reacción alérgica frente a un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato, o a la proteína Fel d1, se previene o disminuye en gravedad y/o duración, o al menos un síntoma o complicación asociado a la sensibilidad o reacción alérgica frente, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato, o a la proteína Fel d1, se previene, o mejora, o la frecuencia y/o duración de la gravedad de la sensibilidad o reacción alérgica contra un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato, o a la proteína Fel d1, se reduce.

[0178] En un aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más de los anticuerpos de la divulgación, o una o más de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen específicamente a Fel d1, para su uso en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de un paciente que muestra sensibilidad o una reacción alérgica frente a un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato, o a la proteína Fel d1, o para tratar al menos un síntoma o complicación asociado a una sensibilidad o reacción alérgica contra un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato, o a la proteína Fel d1, en donde la sensibilidad o reacción alérgica frente a un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato, o a la proteína Fel d1, se previene o disminuye en gravedad y/o duración, o al menos un síntoma o complicación asociado a la sensibilidad o reacción alérgica frente, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato, o a la proteína Fel d1, se previene, o mejora, o la frecuencia y/o duración de la gravedad de la sensibilidad o reacción alérgica frente, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato, o a la proteína Fel d1, se reduce.

[0179] En una realización, la composición puede administrarse junto con un segundo agente terapéutico útil para disminuir una reacción alérgica a un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato, o a la proteína Fel d1. En una realización, el segundo agente terapéutico se selecciona de un corticoesteroide, un broncodilatador, un antihistamínico, epinefrina, un descongestionante, otro anticuerpo diferente contra Fel d1 y una vacuna peptídica.

[0180] En determinadas realizaciones, los anticuerpos pueden reducir, minimizar o impedir al menos un síntoma en un paciente sensible al alérgeno de gato Fel d1, tal como estornudos, congestión, obstrucción nasal, tos, respiración sibilante, broncoconstricción, rinitis o conjuntivitis.

[0182] En una realización, los anticuerpos pueden utilizarse para impedir complicacionesin vivomás graves asociadas a una alergia a Fel d1, incluidas respuestas asmáticas, choque anafiláctico, o incluso la muerte, como consecuencia de anafilaxia.

[0184] En una realización, la composición farmacéutica se administra al paciente junto con un segundo agente terapéutico.

[0185] En otra realización, el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste un antihistamínico, epinefrina, un descongestionante, un corticoesteroide, otro anticuerpo diferente contra Fel d1, una vacuna peptídica y cualquier otra terapia paliativa útil para reducir la gravedad de la reacción alérgica o para mejorar al menos un síntoma asociado a la reacción alérgica.

[0187] En otro aspecto, un método para predecir si un paciente que padece una alergia responderá a la terapia con uno o más anticuerpos específicos de alérgenos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, o si un paciente que padece una alergia sería un buen candidato para la terapia con uno o más anticuerpos específicos de alérgenos, comprendiendo el método:

[0189] (a) recoger del paciente una muestra de tejido o un extracto de la misma, o un líquido biológico, o una muestra de sangre;

[0190] (b) extraer una IgE específica de alérgeno, o células que contengan o estén unidas a una IgE específica de alérgeno, de una o más de las muestras del paciente de la etapa (a);

[0191] (c) mezclar la IgE, o las células que contengan la IgE o estén unidas a ella, de la muestra del paciente, con el alérgeno y con uno o más anticuerpos específicos de alérgeno, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos; y

[0192] (d) determinar si la adición de uno o más anticuerpos específicos del alérgeno, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, bloquea la unión de la IgE específica del alérgeno de la etapa b) con el alérgeno,

[0193] en donde la capacidad del uno o más anticuerpos específicos de alérgeno, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, para bloquear la unión de la IgE específica de alérgeno de la etapa (b) con el alérgeno, es indicativa de que el paciente responderá a la terapia con el uno o más anticuerpos específicos de alérgeno, y/o de que el paciente que padece una alergia sería un buen candidato para la terapia con el uno o más anticuerpos específicos de alérgeno.

[0195] Breve descripción de las figuras

[0197] La figura 1 muestra los títulos de IgG específicos para Fel d1, determinados en sueros de pacientes que no han recibido inmunoterapia alergénica específica (Sin-IAE) y de los que sí han recibido inmunoterapia alergénica específica contra alérgenos de gato (IAE-gato), medidos con un ensayo ELISA.

[0198] La Figura 2 muestra la inhibición máxima porcentual de la respuesta pErk a la estimulación con 200 nM de nFel d1 en relación con el anticuerpo de control, determinada mediante análisis de citometría de flujo de basófilos seleccionados (CD123+ HLA-DR-) de 10 donantes alérgicos a los gatos en presencia de REGN1908, REGN1909 o REGN1908-1909.

[0199] La figura 3 muestra (en el modelo de anafilaxia cutánea pasiva (ACP)) datos de ratones expuestos a Fel d1 (n=10) expresados como ng de colorante azul de Evans extraído por mg de tejido del pabellón auricular de orejas sensibilizadas con antisueros de control y de orejas sensibilizadas con antisueros de cacahuete.

[0200] La Figura 4 muestra grupos de ratones (n=9-10) a los que se administraron inyecciones subcutáneas (SC) de REGN1908, REGN1909, una combinación de REGN1908-1909 (proporción 1:1), o un anticuerpo de control IgG4P a las dosis indicadas 3 días antes de iniciar el modelo de ACP. Se administró pasivamente por vía intradérmica (ID) en las orejas, un antisuero policlonal que contenía IgE, generado contra Fel d1 o contra el alérgeno de cacahuete (control no relevante, no mostrado) antes de la administración IV de 0,25 µg de nFel d1. Los datos se muestran como media /- e.e.m. (error estándar de la media) La significación estadística se representa como ****p<0,0001, ***p<0,001 o *p<0,05.

[0201] La Figura 5 muestra grupos de ratones (n=9-10) a los que se administraron inyecciones SC de REGN1908, REGN1909, una combinación de REGN1908-1909 (proporción 1:1), o un anticuerpo de control IgG4P a las dosis indicadas 3 días antes de iniciar el modelo de ACP. Se administró pasivamente por vía intradérmica (ID) en las orejas, un antisuero policlonal que contenía IgE, generado contra extracto de pelo de gato o contra el alérgeno de cacahuete (control no relevante, no mostrado) antes de la administración IV de 250 UAB (Unidades Alérgicas Bioequivalentes) de extracto de pelo de gato. Los datos se muestran como media /- e.e.m. La significación estadística se representa como **p<0,01 o *p<0,05.

[0202] La Figura 6 muestra grupos de ratones (n=9-10) a los que se administraron inyecciones SC de REGN1908, REGN1909, una combinación de REGN1908-1909 (proporción 1:1), un anticuerpo de control IgG4P o IgG concentrada de pacientes IAE- gato (que han recibido inmunoterapia alergénica específica contra alérgenos de gato) o de pacientes Sin-IAE (que no han recibido inmunoterapia alergénica específica), antes del modelo de ACP utilizando nFel d1. Los datos se expresan como ng de colorante azul de Evans extraído por mg de tejido auricular y se muestran como media /- e.e.m. Los anticuerpos inyectados por ratón se indican en la Tabla 24. La significación estadística se representa como **p<0,01 o *p<0,05.

[0203] La figura 7 muestra un esquema del diseño del estudio clínico.

[0204] La figura 8 muestra un esquema del procedimiento de exposición nasal a alérgenos.

[0205] La Figura 9 muestra el cambio porcentual con respecto al valor de referencia en el ABC (área bajo la curva) de la TNSS (puntuación total de síntomas nasales) (0-1h); Media de mínimos cuadrados (Least Squares) /- e.e. del conjunto completo del análisis.

[0206] La figura 10 muestra el porcentaje de sujetos con una reducción ≥60 % del ABC de la TNSS (0-1h) en cada punto temporal del estudio. Los números sobre las barras indican el número de pacientes representados del total de pacientes Media de mínimos cuadrados /e.e. del conjunto completo del análisis.

[0207] La Figura 11 muestra el cambio porcentual con respecto al valor de referencia en el ABC(0-1h) del PNIF (flujo inspiratorio nasal máximo); Media de mínimos cuadrados (Least Squares) /- e.e. del conjunto completo del análisis.

[0208] La figura 12 muestra el cambio porcentual con respecto al valor de referencia en el ABC del diámetro promedio normalizado del habón en la prueba de punción cutánea con titulación contra extracto de pelo de gato (100-33.000 UCE (unidades de calidad estandarizadas), cuya lectura se realizó 15 minutos después de la administración; Media de mínimos cuadrados (Least Squares) /- e.e. del conjunto de análisis de seguridad.Descripción detallada

[0209] Antes de describir los presentes métodos, debe entenderse que la presente invención no se limita a los métodos ni a las condiciones experimentales descritos en particular, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el habitualmente entendido por un experto con conocimientos en la materia a la que pertenece esta invención.

[0210] Como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se utiliza en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más del 1 %. Por ejemplo, como se utiliza en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 así como todos los valores intermedios (p. ej., 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

[0211] Aunque en la práctica o el ensayo de la presente invención, pueden utilizarse cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen métodos y materiales preferidos.

[0212] Definiciones

[0213] El término "Fel d1" o "FELD1", como se utiliza en el presente documento, se refiere a al menos a una proteína Fel d1, ya sea en forma natural/nativa, o producida de forma recombinante. La proteína Fel d1 comprende, o alternativamente consiste en, la cadena 1 (también denominada cadena A) de Fel d1 (SEQ ID NO: 392) y la cadena 2 (también denominada cadena B) de Fel d1 (SEQ ID NO: 393). La proteína natural Fel d1 es una glucoproteína heterodimérica de aproximadamente 18 kDa compuesta por dos cadenas procedentes de dos genes independientes (véase Duffort, O.A.et al., (1991), Mol. Immunol.28:301-309; Kristensen, A.K.et al., (1997), Biol. Chem.378:899-908; Kaiser L.et al.(2003), J. Biol. Chem. 278(39):37730-37735). También se muestra una proteína Fel d1 producida de forma recombinante como SEQ ID NO: 396, en donde esta secuencia contiene los restos de aminoácidos 18 a 109 de la cadena B de Fel d1 del número de registro del GenBank NP_001041619.1 (sin la secuencia señal) fusionados en línea con los restos de aminoácidos 19-88 de la cadena A de Fel d1 del número de registro del GenBank NP_001041618.1 (sin la secuencia señal y con una mutación D27G, que corresponde a la glicina en la posición 101 de la SEQ ID NO: 396). Otras construcciones de Fel d1 de la invención, producidas de forma recombinante, se ilustran en las SEQ ID NO: 385, 394, 395 y 397

[0214] La "cadena 1" o "cadena A" de Fel d1, es un polipéptido que comprende, o que alternativamente consiste en, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 392, o una secuencia homóloga de la misma. La expresión secuencia homóloga de SEQ ID NO:392, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una identidad con SEQ ID NO:392 superior al 70 %, preferentemente superior al 80 %, más preferentemente superior al 90 % e incluso más preferentemente superior al 95 %. La secuencia de aminoácidos de la cadena 1 de Fel d1 también se proporciona en GenBank como número de registro P30438, o como número de registro NP_001041618.1, que también incluye el péptido señal que se elimina en la proteína madura.

[0215] La "cadena 2" o "cadena B" de Fel d1 es un polipéptido que comprende, o alternativamente consiste en, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 393, o una secuencia homóloga de la misma. La expresión secuencia homóloga de SEQ ID NO: 393, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una identidad con SEQ ID NO:393 superior al 70 %, preferentemente superior al 80 %, más preferentemente superior al 90 % e incluso más preferentemente superior al 95 %. La secuencia de aminoácidos de la cadena 2 de Fel d1 también se proporciona en GenBank como número de registro P30440, o como número de registro NP_001041619.1, que incluye el péptido señal que se elimina en la proteína madura.

[0217] La expresión "fragmento Fel d1", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende o alternativamente consiste en, al menos un sitio antigénico de Fel d1. La expresión "fragmento Fel d1", como se utiliza en el presente documento, puede referirse a un polipéptido que comprende o alternativamente consiste en al menos dos sitios antigénicos de Fel d1. Los sitios antigénicos pueden estar unidos por enlace covalente. Los sitios antigénicos pueden estar unidos por al menos un enlace peptídico. Los dos sitios antigénicos pueden estar unidos por al menos un enlace peptídico y un espaciador entre los sitios antigénicos. Los al menos dos sitios antigénicos pueden proceder tanto de la cadena 1 de Fel d1 como de la cadena 2 de Fel d1. Los al menos dos sitios antigénicos pueden comprender las secuencias de aminoácidos 23-92 del número de registro del GenBank P30438 y las secuencias de aminoácidos 18-109 del número de registro del GenBank P30440. Los al menos dos sitios antigénicos pueden proceder tanto de la cadena 1 de Fel d1 como de la cadena 2 de Fel d1. Los al menos dos sitios antigénicos pueden comprender las secuencias de aminoácidos 19-88 del número de registro del GenBank NP_001041618.1 y las secuencias de aminoácidos 18-109 del número de registro del GenBank NP_001041619. 1. Los al menos dos sitios antigénicos pueden comprender una secuencia de aminoácidos dentro de cualquiera de las SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 o 397. Cualquiera de los fragmentos de Fel d1 puede inducir la producción de anticuerposin vivoque se unen específicamente a Fel d1 de origen natural, o a Fel d1 producido de forma recombinante.

[0219] El término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, significa cualquier molécula o complejo molecular de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que se une específicamente a, o interacciona con, un antígeno particular (p. ej., Fel d1). El término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, pretende hacer referencia a moléculas de inmunoglobulina compuestas por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H,heavy) y dos cadenas ligeras (L,light) interconectadas por enlaces disulfuro (es decir, "moléculas de anticuerpo completas"), así como multímeros de las mismas (p. ej., IgM) o fragmentos de unión a antígenos de las mismas. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada ("HCVR" o "VH") y una región constante de cadena pesada (que comprende los dominios CH1, CH2 y CH3). Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR,framework regions). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amínico al extremo carboxílico en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En determinados aspectos de la divulgación, las FR del anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la estirpe germinal humana, o pueden modificarse natural o artificialmente. Una secuencia de aminoácidos consenso puede definirse basándose en un análisis en paralelo de dos o más CDR.

[0220] También es posible la sustitución de uno o más restos de CDR o la omisión de una o más CDR. Se han descrito anticuerpos en la bibliografía científica en los que se puede prescindir de una o dos CDR para la unión. Padlanet al.(1995 FASEB J.9:133-139) analizaron las regiones de contacto entre los anticuerpos y sus antígenos, basándose en estructuras cristalinas publicadas, y concluyeron que solo aproximadamente de un quinto a un tercio de los restos de CDR realmente entran en contacto con el antígeno. Padlan también descubrió muchos anticuerpos en los que una o dos CDR carecían de aminoácidos en contacto con un antígeno (véase también, Vajdoset al.(2002), J Mol Biol 320:415-428).

[0222] Los restos de CDR que no entran en contacto con el antígeno se pueden identificar basándose en estudios anteriores (por ejemplo, los restos H60-H65 en CDRH2 con frecuencia no son necesarios), de regiones de CDR de Kabat que se encuentran fuera de CDR de Chothia, por modelización molecular y/o empíricamente. Si se omite una CDR o uno o más restos de la misma, generalmente se sustituye con un aminoácido que ocupa la posición correspondiente en otra secuencia de anticuerpo humano o un consenso de dichas secuencias. Las posiciones para la sustitución dentro de CDR y los aminoácidos a sustituir también pueden seleccionarse empíricamente. Las sustituciones empíricas pueden ser sustituciones conservativas o no conservativas.

[0224] Los anticuerpos monoclonales completamente humanos que se unen específicamente a Fel d1, como los desvelados en el presente documento, pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones marco conservadas y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias germinales correspondientes. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento con secuencias germinales disponibles, por ejemplo, en bases de datos públicas de secuencias de anticuerpos. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que proceden de cualquiera de las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco conservadas y/o CDR se mutan al resto o restos correspondientes de la secuencia germinal de la que procede el anticuerpo, o al resto o restos correspondientes de otra secuencia germinal humana, o a una sustitución de aminoácidos conservativa del resto o restos germinal(es) correspondiente(s) (dichos cambios de secuencia se denominan en conjunto en el presente documento "mutaciones germinales"). Un experto en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera desveladas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la estirpe germinal o combinaciones de las mismas. En determinados aspectos, todos los restos de la región marco conservada y/o CDR dentro de los dominios VH y/o VL se retromutan a los restos encontrados en la secuencia germinal original de la que se obtuvo el anticuerpo. En otros aspectos, únicamente determinados restos se retromutan a la secuencia germinal original, p. ej., únicamente los restos mutados encontrados dentro de los 8 primeros aminoácidos de FR1 o dentro de los 8 últimos aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otros aspectos, uno o más del resto o restos de las regiones marco conservadas y/o CDR se mutan al resto o restos correspondientes de una secuencia germinal diferente (es decir, una secuencia germinal que es diferente de la secuencia germinal de la cual se obtuvo originalmente el anticuerpo). Así mismo, los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones germinales dentro de las regiones marco conservadas y/o CDR, p. ej., en donde determinados restos individuales mutan al resto correspondiente de una secuencia de la estirpe germinal particular, mientras que otros restos determinados, que difieren de los de la secuencia de la estirpe germinal original, se mantienen o se mutan al resto correspondiente de una secuencia de estirpe germinal distinta. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones germinales pueden analizarse fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas, tales como, mejora de la especificidad de unión, aumento de la afinidad de unión, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), inmunogenicidad reducida, etc. En la presente divulgación se incluyen anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general.

[0226] La presente divulgación también incluye anticuerpos monoclonales completamente humanos que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR desveladas en el presente documento, que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos que tienen secuencias de aminoácidos de VHCR, LCVR y/o CDR con, p. ej., 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservativas de aminoácidos respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR desveladas en el presente documento.

[0228] La expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana. Los Acm humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulinas de la estirpe germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitioin vitroo mediante mutación somáticain vivo), por ejemplo en las CDR y, en particular, en la CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, no pretende incluir Acm en los que las secuencias de CDR procedentes de la estirpe germinal de otra especie de mamífero (p. ej., ratón), se han injertado en secuencias FR humanas.

[0230] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula de unión a antígeno" significa una proteína, un polipéptido o un complejo molecular que comprende o consiste en al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que sola, o junto con una o más CDR y/o regiones marco conservadas (FR) adicionales, se une específicamente a un antígeno particular. En determinados aspectos, una molécula de unión a antígeno es un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo, como se definen esos términos en otras partes en el presente documento.

[0231] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula de unión a antígeno biespecífica" significa una proteína, un polipéptido o un complejo molecular que comprende al menos un primer dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de unión a antígeno (es decir, dos brazos). Cada dominio de unión a antígeno dentro de la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende al menos una CDR que sola, o junto con una o más CDR y/o FR adicionales, se une específicamente a un antígeno particular. En el contexto de la presente divulgación, el primer dominio de unión a antígeno se une específicamente a un primer antígeno en Fel d1 y el segundo dominio de unión a antígeno se une específicamente a un segundo, antígeno distinto en Fel d1.

[0233] La expresión "se une específicamente", o "se une específicamente a", o expresiones similares, significa que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica puede caracterizarse por una constante de disociación en equilibrio de al menos aproximadamente 1 x 10<-6>M o inferior (p. ej., una KD menor indica una unión más estrecha). Los métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis en equilibrio, resonancia de plasmón superficial y similares. Como se describe en el presente documento, se ha identificado anticuerpos mediante resonancia de plasmón superficial, p. ej., BIACORE<™>, que se unen específicamente a Fel d1. Por otro lado los anticuerpos multiespecíficos que se unen a Fel d1 y a uno o más antígenos adicionales o un anticuerpo biespecífico que se une a dos regiones diferentes de Fel d1 (por ejemplo, a la cadena 1 y/o a la cadena 2 de Fel d1) se consideran, no obstante, anticuerpos que "se unen específicamente", como se utiliza en el presente documento.

[0235] La expresión anticuerpo de "alta afinidad", se refiere a aquellos Acm que tienen una afinidad de unión por Fel d1, expresada como KD, de al menos 10<-8>M; preferentemente de 10<-9>M; más preferentemente de 10<-10>M, incluso más preferentemente de 10<-11>M, incluso más preferentemente de 10<-12>M, medida por resonancia de plasmón superficial, p. ej., BIACORE<™>o ELISA de afinidad en solución.

[0237] Por la expresión "disociación lenta", "Koff" o "kd", se entiende un anticuerpo que se disocia de Fel d1, con una constante de velocidad de 1 x 10<-3>s<-1>o inferior, preferentemente de 1 x 10<-4>s<-1>o inferior, determinada por resonancia de plasmón superficial, p. ej., BIACORE<™>,

[0238] Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo, y similares, como se utiliza en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o genomodificado, que se una específicamente a un antígeno para formar un complejo. Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo o "fragmento de anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse al alérgeno, p. ej., Fel d1.

[0239] En realizaciones específicas, un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo de la invención, pueden conjugarse con un residuo terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como un corticoesteroide, un segundo anticuerpo antialérgeno (p. ej., Fel d1), o epinefrina, una vacuna, o cualquier otro residuo terapéutico útil para tratar una respuesta alérgica contra un alérgeno, p. ej., Fel d1.

[0240] Un "anticuerpo aislado", como se utiliza en el presente documento, se entiende que se refiere a un anticuerpo que carece sustancialmente de otros anticuerpos (Ac) que tienen especificidades antigénicas diferentes (p. ej., un anticuerpo aislado que se une específicamente, p. ej., a Fel d1, o un fragmento del mismo, carece sustancialmente de Ac que se unen específicamente a antígenos distintos de Fel d1).

[0241] Un "anticuerpo bloqueante" o un "anticuerpo neutralizante", como se utiliza en el presente documento (o un "anticuerpo que neutraliza la actividad de Fel d1"), se entiende que se refiere a un anticuerpo, o a una parte de unión a antígeno del mismo, cuya unión a Fel d1 produce la inhibición de al menos una actividad biológica de Fel d1. Por ejemplo, un anticuerpo de la divulgación puede ayudar a prevenir la respuesta alérgica primaria a Fel d1. Como alternativa, un anticuerpo de la divulgación puede demostrar la capacidad de prevenir una respuesta alérgica secundaria a Fel d1, o al menos un síntoma de una respuesta alérgica a Fel d1, incluidos estornudos, tos, una afección asmática, o una respuesta anafiláctica causada por Fel d1. Esta inhibición de la actividad biológica de Fel d1 puede evaluarse midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de Fel d1 mediante uno o más de diversos ensayos estándarin vitrooin vivo(tal como un ensayo de anafilaxia cutánea pasiva, como se describe en el presente documento) u otros ensayosin vivoconocidos en la técnica (por ejemplo, otros modelos animales para observar la protección frente a la exposición a Fel d1 tras la administración de uno o más de los anticuerpos descritos en el presente documento). La expresión "resonancia de plasmón superficial", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones biomoleculares en tiempo real mediante la detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz biosensora, por ejemplo, usando el sistema BIACORE<™>(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.).

[0242] El término "KD ", como se utiliza en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación en equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno particular.

[0243] El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interacciona con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un solo antígeno puede tener más de un epítopo. Por tanto, distintos anticuerpos pueden unirse a distintas áreas de un antígeno y pueden tener distintos efectos biológicos. El término "epítopo" también se refiere a un sitio en un antígeno al que responden linfocitos B y/o T. También se refiere a una región de un antígeno a la que se une un anticuerpo. Los epítopos pueden ser lineales o conformacionales. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. Un epítopo conformacional se produce mediante aminoácidos yuxtapuestos espacialmente de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. En determinados aspectos, los epítopos pueden incluir determinantes que son agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y, en determinadas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Los epítopos también pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y tienen aquellos restos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente se conservan con la exposición con disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario normalmente se pierden al tratarlos con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.

[0244] La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea de forma óptima con inserciones o deleciones de nucleótidos adecuadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente 90 % y, más preferentemente, en al menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases nucleotídicas, medida con cualquier algoritmo de identidad de secuencia bien conocido, tal como FASTA, BLAST o GAP, como se expone más adelante. Una molécula de ácido nucleico que tiene una identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en determinados casos, codificar un polipéptido que tenga la misma secuencia de aminoácidos, o una sustancialmente similar, que la del polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.

[0246] Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar", significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten una identidad de secuencia de al menos 90 %, incluso más preferentemente, una identidad de secuencia de al menos 95 %, 98 % o 99 %. Preferentemente, las posiciones de restos, que no son idénticas, difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la que un resto de aminoácido se sustituye por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (p. ej., carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservativas, el porcentaje o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, p. ej., Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxiloalifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Los grupos preferidos de sustitución de aminoácidos conservativa son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisinaarginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un remplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnetet al.(1992) Science 256: 144345. Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

[0248] La similitud de secuencia para polipéptidos se mide normalmente usando un programa informático de análisis de secuencia. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diferentes sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como GAP y BESTFIT que pueden utilizarse con parámetros predeterminados para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de distintas especies de organismos o entre una proteína de tipo natural y una muteína de la misma. Véase, p. ej., GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse utilizando FASTA con parámetros predeterminados o recomendados; un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (p. ej., FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) citado anteriormente). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, utilizando parámetros predeterminados. Véase, p. ej., Altschulet al.(1990) J. Mol. Biol.215: 403410 y (1997) Nucleic Acids Res.25:3389402.

[0250] En aspectos específicos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, para su uso en el método de la divulgación, puede ser monoespecífico, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para epítopos de más de un polipéptido diana. Un formato de anticuerpo biespecífico ilustrativo que puede usarse en el contexto de la presente divulgación, implica el uso de un primer dominio CH3 de inmunoglobulina (Ig) y de un segundo dominio CH3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio CH3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico con la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En un aspecto, el primer dominio CH3 de Ig está unido a proteína A y el segundo dominio CH3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a la proteína A tal como una modificación H95R (según la numeración de exones IMGT; H435R según la numeración EU). El segundo CH3 puede comprender además una modificación Y96F (según la IMGT; Y436F según la EU). Otras modificaciones que se pueden encontrar en el segundo CH3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (según IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de los Acm de IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de los Acm de IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (según IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de los Acm de IgG4. Se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.

[0252] Por la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una cantidad que produce el efecto deseado para el que se administra. La cantidad exacta dependerá del propósito del tratamiento, y un experto en la técnica podrá determinarla usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).

[0254] Los anticuerpos de la divulgación pueden usarse para "desensibilizar" a un individuo sensible a los gatos. En el presente documento, el término "desensibilizar" se define como disminuir la reactividad alérgica de una persona sensible a los gatos frente a la exposición a gatos, a caspa de gato o a productos derivados de estos, p. ej., a Fel d1 (a un nivel inferior al que la persona sensible a los gatos experimentaría de otro modo).

[0255] La "puntuación total de síntomas nasales" (TNSS); con una puntuación posible de 0 a 12, se basa en la evaluación de 4 síntomas calificados en una escala de 0 (ninguno) a 3 (grave) para la congestión, picor y rinorrea, y de 0 (ninguno) a 3 (5 o más estornudos) para los estornudos. Cada uno de los 4 síntomas se evalúa utilizando la siguiente escala de 0=Ninguno, 1 = Leve, 2 = Moderado o 3 = Grave.

[0256] La "escala visual analógica" (VAS) es una medición cuantitativa ampliamente validada en muchas enfermedades. Estas escalas se han utilizado ampliamente para evaluar la gravedad de la rinitis

[0257] así como la eficacia de la intervención terapéutica. Para evaluar la gravedad de los síntomas nasales combinados, se utilizó una VAS que variaba de 0 (sin síntomas nasales) a 100 cm (síntomas nasales máximos).

[0258] El "flujo inspiratorio nasal máximo" (PNIF) es un método objetivo, que usa un espirómetro nasal para medir el flujo de aire nasal (medido en l/min).

[0259] La "prueba de punción cutánea" (SPT) con titulación, es un método fiable para diagnosticar la enfermedad alérgica mediada por IgE en pacientes con rinoconjuntivitis, asma, urticaria, anafilaxia, eccema atópico y sospecha de alergia a alimentos y medicamentos. Proporciona pruebas de sensibilización y puede ayudar a confirmar el diagnóstico de una sospecha de alergia de tipo I. La interpretación de la SPT utiliza la presencia y el grado de reactividad cutánea como marcador indirecto de sensibilización dentro de órganos diana, es decir, ojos, nariz, pulmón, intestino y piel. Cuando se introducen alérgenos relevantes en la piel, la IgE específica unida a los receptores de superficie de los mastocitos se entrecruza, los mastocitos desgranulan y se liberan histamina y otros mediadores. Esto produce una respuesta de habón y eritema, que puede cuantificarse. Los resultados de la SPT se correlacionan con los de la exposición nasal, que también puede utilizarse como marcador indirecto para comprobar la sensibilización clínicamente relevante. (Bousquet J,et al., (1987), Clin Allergy, 17(6):529-536).

[0260] Descripción general

[0261] La inmunoterapia alergénica especifica (IAE) se utiliza desde hace más de cien años (Noon, L., (1911), Lancet, 1:1572-1573) como un medio de inducción de cambios inmunológicos en un paciente que padece una alergia, que dan lugar a una mejora de los síntomas y a una tolerancia y desensibilización sostenidas. Sin embargo, el uso de extractos de alérgeno en la IAE (inmunoterapia alergénica específica) convencional presenta un arma de doble filo para los pacientes: es beneficioso porque permite la modificación de la enfermedad a largo plazo mediante respuestas inmunitarias celulares y humorales frente al alérgeno originario, pero perjudicial para el perfil de seguridad debido al entrecruzamiento de la IgE específica del alérgeno ya existente y a la generación de IgE de nueva aparición (Valenta, R.et al., (2016), J Allergy & Clin Immunol, 137(2): 351-357). Las vacunas peptídicas alergénicas intentan recapitular el componente celular de la IAE (inmunoterapia alergénica específica) para inducir tolerancia al alérgeno, evitando al mismo tiempo los efectos secundarios mediados por IgE (Larche, M.,et al., (2011), Immunology 6 (10): 761-71). Otro enfoque se centra en la identificación y administración de péptidos alergénicos cortos que se corresponden con los principales epítopos de células T, pero que no se unen a IgE ni inducen una respuesta humoral a IgE o IgG (Worm, M.et al., (2011), Journal of Allergy and Clinical Immunology 127 (1): 89-97; Patel, D.,et al., (2013), J Allergy & Clin Immunol., 131(1):103-107; Couroux, P.,et al., (2015), J. Brit Soc for Allergy & Clin. Immunol., 45(5):974-981). Sin embargo, en un estudio clínico reciente, este enfoque no logró demostrar beneficios significativos, lo que llevó a reconsiderar la importancia de la IgG bloqueadora en el éxito de la IAE (inmunoterapia alergénica específica). También se encuentran en desarrollo clínico vacunas orientadas a generar títulos elevados de IgG contra alérgenos mediante inmunizaciones con péptidos de linfocitos B más largos, proteínas de fusión, o péptidos continuos superpuestos (COPS,continuous overlapping peptides) que comprenden toda la secuencia del alérgeno (Valenta, R.et al., (2016), J Allergy & Clin Immunol, 137(2): 351-357; Spertini, F.et al., (2016), J. Allergy & Clin. Immunol., 138(1):162-168). Sin embargo, estos métodos pueden tener una baja probabilidad de producir IgG de bloqueo funcional, como se observa con la IAE. Los estudios descritos en el presente documento abordan el uso de la inmunoterapia pasiva con una combinación de anticuerpos específicos de alérgeno para el tratamiento de pacientes que padecen alergia a los gatos. En estos estudios, como alérgeno se utilizó la proteína de gato Fel d1. Como se describe en el presente documento, los datos demuestran que los anticuerpos de IgG bloqueadores de IgE específicos de alérgeno (Fel d1), son eficaces en modelos animales preclínicos tantoin vitrocomoin vivo,así como en el entorno clínico. De hecho, una sola dosis subcutánea de los anticuerpos específicos de alérgeno, redujo los síntomas clínicos en respuesta a la provocación nasal, observándose una magnitud el día 8 comparable a años de IAE (inmunoterapia alergénica específica).

[0262] Alérgeno de gato Fel d1

[0263] El gato doméstico es una fuente de muchos alérgenos de interior y la gravedad de los síntomas en personas que demuestran sensibilidad a los alérgenos de gato varía desde una rinitis y conjuntivitis relativamente leves hasta una afección asmática potencialmente mortal (Lau, S.et al.(2000), Lancet 356:1392-1397). Aunque los pacientes que demuestran dicha sensibilidad a los gatos parecen responder a diferentes moléculas presentes en la caspa y en la piel de los gatos, el alérgeno principal parece ser Fel d1 (alérgeno 1 deFelis domesticus). Se ha demostrado que más del 80 % de los pacientes alérgicos a los gatos tienen anticuerpos de IgE contra a este alérgeno (van Ree, R.et al.(1999), J. Allergy Clin. Immunol 104:1223-1230).

[0264] La proteína Fel d1 es una glucoproteína ácida heterodimérica de aproximadamente 18 kDa que contiene aproximadamente un 10-20 % de hidratos de carbono ligados a N. Cada heterodímero comprende dos cadenas polipeptídicas codificadas por dos genes distintos (Duffort, OA,et al., (1991), Mol. Immunol.28:301-309; Morgenstern, JP,et al., (1991), PNAS 88:9690-9694; Griffith, I.J.,et al.(1992), Gene 113:263-268). La cadena 1 comprende aproximadamente 70 restos de aminoácidos y la cadena 2 comprende aproximadamente 90-92 restos de aminoácidos. Se han propuesto tres enlaces disulfuro intercadena que unen las dos cadenas en Fel d1 natural (Kristensen, A.K.et al.(1997), Biol. Chem.378:899-908) y se han confirmado para Fel d1 recombinante en la estructura cristalina (Kaiser, L.et al.(2003), J. Biol. Chem.278:37730-37735; Kaiser, L.et al., (2007), J. Mol. Biol.370:714-727). Aunque a veces cada cadena se denomina individualmente "Fel d 1", ambas cadenas son necesarias para el alérgeno proteico completo.

[0266] Fel d1 se produce en las glándulas sebáceas, las glándulas escamosas y las células epiteliales escamosas, y se transfiere al pelaje al lamerse y acicalarse (Bartholome, K.et al.(1985), J. Allergy Clin. Immunol.76:503-506; Charpin, C.et al.(1991), J. Allergy Clin. Immunol.88:77-82; Dabrowski, A.J. (1990),et al.J. Allergy Clin. Immunol.86:462-465). También está presente en la saliva, en las glándulas perianales y lagrimales (Andersen, M.C.,et al.(1985), J. Allergy Clin. Immunol. 76:563-569; van Milligen, F.J.et al., (1992), Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 92:375-378) y los principales reservorios parecen ser la piel y el pelaje (Mata, P.et al.(1992), Ann. Allergy 69(4):321-322).

[0268] La proteína Fel d1 tiene una función desconocida para el animal, pero provoca una reacción IgG o IgE en seres humanos sensibles (ya sea como respuesta alérgica o asmática). Aunque se conocen otros alérgenos de gato, incluidos Fel d2 (albúmina) y Fel d3 (cistatina), entre un 60 % y un 90 % del anticuerpo contra la IgE de gato producida se dirige contra Fel d1 (Leitermann, K.et al., (1984), J Allergy Clin. Immunol.74:147-153; Lowenstein, H.et al., (1985), Allergy 40:430-441; van Ree, R.et al., (1999), J. Allergy Clin. Immunol. 104:1223-1230; Ichikawa, K.et al., (2011), Clin. Exp. Allergy, 31:1279-1286).

[0270] La inmunoglobulina E (IgE) es responsable de la hipersensibilidad de tipo 1, que se manifiesta en forma de rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, rinitis alérgica estacional, asma alérgica, alergia al veneno de abeja y alergias alimentarias. La IgE circula por la sangre y se une a receptores de Fc de alta afinidad por IgE en basófilos y mastocitos. En la mayoría de las respuestas alérgicas, los alérgenos entran en el organismo por inhalación, ingestión o a través de la piel. A continuación, el alérgeno se une a la IgE preformada ya unida al receptor de alta afinidad de las superficies de los mastocitos y los basófilos, lo que provoca el entrecruzamiento de varias moléculas de IgE y desencadena la liberación de histamina y otros mediadores inflamatorios que causan los diversos síntomas alérgicos.

[0272] El tratamiento de las alergias a los gatos incluye la terapia de desensibilización, que consiste en inyecciones repetidas con dosis crecientes de un extracto crudo de caspa de gato o de péptidos cortos procedentes de Fel d1. Utilizando el extracto crudo de caspa de gato, Lilja et. al., demostraron que, después de tres años de tratamiento de dicho tratamiento, los pacientes alérgicos a los gatos seguían presentando síntomas sistémicos (Lilja, Q.et al., (1989), J. Allergy Clin. Immunol. 83:37-44 and Hedlin,et al.(1991), J. Allergy Clin. Immunol. 87:955-964). El uso de péptidos cortos procedentes de Fel d1 para la desensibilización dio lugar a una diferencia no significativa entre el grupo que recibe péptido y el grupo de control que recibe placebo (Oldfield, W.L.et al., (2002), Lancet, 360:47-53). Sólo se observó eficacia cuando se administraron grandes cantidades (750 ug) del péptido corto a los pacientes (Norman, P.S.et al.(1996), Am. J. Respir. Crit. Care Med.154:1623-1628). Así mismo, se han notificado reacciones asmáticas en pacientes a los que se administraron extractos crudos de caspa de gato, así como en pacientes sometidos a tratamiento con el péptido Fel d1 corto. En consecuencia, en el campo del tratamiento de la alergia a los gatos se necesitan estrategias alternativas para tratar a los pacientes sensibles a los alérgenos de gato, en particular Fel d1.

[0273] Los anticuerpos se han propuesto como estrategia de tratamiento general de las alergias, ya que pueden bloquear la entrada de moléculas alergénicas en los tejidos de la mucosa, o pueden unirse al alérgeno antes de que tenga la oportunidad de unirse a la IgE unida al receptor de alta afinidad de los mastocitos o basófilos, impidiendo así la liberación de histamina y otros mediadores inflamatorios desde estas células. En la patente de EE. UU. número 5.670.626 se describe el uso de anticuerpos monoclonales para el tratamiento de enfermedades alérgicas mediadas por IgE, tales como rinitis alérgica, asma alérgica y conjuntivitis alérgica al bloquear la unión de los alérgenos al tejido mucoso. En la patente de EE. UU. número 6.849.259 se describe el uso de anticuerpos específicos contra alérgenos para inhibir la inflamación alérgica en un modelo de alergia de ratónin vivo. Se han descrito sistemas de anticuerpos basados en leche y en huevo. Por ejemplo, en el documento US20030003133A1 se desvela el uso de la leche como portador de alérgenos para inducir tolerancia oral a la caspa de gato y otros alérgenos. En el documento US2010/0143266 se describen composiciones y métodos para reducir la respuesta alérgica de un animal a un alérgeno presente en el medio ambiente, utilizando una molécula que inhibe la capacidad del alérgeno de unirse a los mastocitos. Otros anticuerpos contra Fel d1 fueron descritos por de Groot et. al. (de Groot et. al., (1988), J. Allergy Clin. Immunol.82:778-786).

[0275] Los anticuerpos completamente humanos descritos en el presente documento demuestran unión específica a Fel d1 y pueden ser útiles para tratar a pacientes que padecen alergia a los gatos, en particular, en pacientes que demuestran sensibilidad al alérgeno Fel d1. El uso de dichos anticuerpos puede ser un medio eficaz para tratar a pacientes que padecen alergia a la caspa de gato, o pueden usarse para impedir una respuesta aumentada al Fel d1 tras una exposición secundaria, o los síntomas acompañantes asociados a la alergia, o pueden usarse para disminuir la gravedad y/o la duración de la respuesta alérgica asociada a una exposición primaria a un gato que lleva el alérgeno Fel d1 o con la recurrencia de los síntomas tras una exposición secundaria. Pueden utilizarse solos o como terapia adyuvante con otras modalidades o residuos terapéuticos conocidos en la técnica para el tratamiento de alergias, tal como, pero sin limitación, tratamiento con corticoesteroides o epinefrina. Pueden utilizarse junto con un segundo o tercer anticuerpo diferente específico de Fel d1. Pueden utilizarse con inmunoterapia alergénica especifica (IAE).

[0276] En determinados aspectos, los anticuerpos de la divulgación se obtienen de ratones inmunizados con un inmunógeno primario, tal como Fel d1 natural, que puede adquirirse en el comercio (Véase, por ejemplo, Indoor Biotech, #NA-FD1-2), o puede producirse de forma recombinante. En determinados aspectos, el inmunógeno puede ser la cadena 1 de Fel d1 o la cadena 2 de Fel d1, o una combinación de ambas cadenas, la 1 y la 2, administradas forma secuencial o simultánea. La secuencia de aminoácidos completa de la cadena 1 (también denominada FELD1 A) se muestra como SEQ ID NO: 392. Las secuencias de aminoácidos completas de la cadena 1 pueden encontrarse también en los números de registro P30438 y NP_001041618.1 del GenBank. La secuencia completa de aminoácidos de la cadena 2 (también denominada FELD1 B) se muestra como SEQ ID NO: 393. Las secuencias de aminoácidos completas de la cadena 2 pueden encontrarse también en los números de registro PP30440 y NP_001041619.1 del GenBank.

[0277] En determinados aspectos, el inmunógeno Fel d1 producido por medios recombinantes puede fabricarse por fusión directa de las dos cadenas de Fel d1, como describen Kaiser et. al., para producir un producto de fusión con un patrón de replegamiento similar al del Fel d1 natural (Kaiser, L.et al., (2003), J. Biol. Chem. 278(39):37730-37735). En determinados aspectos, el inmunógeno puede ser una proteína de fusión tal como la que se muestra en las construcciones de las SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 o 397, seguida de inmunización con un inmunógeno secundario, o con un fragmento inmunogénicamente activo de Fel d1 natural o por medios recombinantes.

[0279] El inmunógeno puede ser un fragmento biológicamente activo y/o inmunogénico de Fel d1 natural o producido por medios recombinantes, o ADN que codifica el fragmento activo del mismo. El fragmento puede proceder de la región aminoterminal o carboxiterminal de la cadena 1 o de la cadena 2, o de la región aminoterminal o carboxiterminal tanto de la cadena 1 como de la cadena 2. Pueden obtenerse fragmentos de cualquier sitio dentro de la cadena 1 o de la cadena 2 para usarlos como inmunógeno en la preparación de anticuerpos contra Fel d1.

[0281] En determinados aspectos, el inmunógeno puede ser una proteína de fusión que comprenda uno cualquiera o más de los siguientes: i) los restos de aminoácidos 18-109 de la cadena 2 de Fel d1 (véase el número de registro P30440 del GenBank y también la SEQ ID NO: 393) fusionados a través del extremo carboxilo directamente con el extremo amino de los restos de aminoácidos 23-92 de la cadena 1 de Fel d1 (véase el número de registro P30438 del GenBank y también la SEQ ID NO: 392); ii) los restos de aminoácidos 23-92 de la cadena 1 de Fel d1 (véase el número de registro P30438 del GenBank y también la SEQ ID NO: 392) fusionados a través del extremo carboxilo al extremo amino de los restos de aminoácidos 18-109 de la cadena 2 de Fel d1 (véase el número de registro P30440 del GenBank y también la SEQ ID NO: 393); iii) los restos de aminoácidos 18-109 de la cadena 2 de Fel d1 (véase el número de registro NP_001041619.1 del GenBank) fusionados a través del extremo C directamente con el extremo N de los restos de aminoácidos 19-88 de la cadena 1 de Fel d1 (véase el número de registro NP_001041618.1 del GenBank), tal como la construcción mostrada en la SEQ ID NO: 394 o 396; iv) los restos de aminoácidos 19-88 de la cadena 1 de Fel d1 (véase el número de registro NP_001041618.1 del GenBank) fusionados a través del extremo carboxilo con el extremo amino de los restos de aminoácidos 18-109 de la cadena 2 de Fel d1 (véase el número de registro NP_001041619.1 del GenBank). Véase también la SEQ ID NO: 395. En determinados aspectos, la proteína de fusión puede tener una etiqueta en el extremo carboxílico de la construcción, tal como una etiqueta myc-myc-hexahistidina (véanse las SEQ ID NO: 385, 396 o 397 para dichas construcciones). En aspectos relacionados, la proteína de fusión puede tener una región Fc de anticuerpo de ratón acoplada al extremo carboxílico de la construcción (véanse las SEQ ID NO: 394 o 395 para dichas construcciones). En determinados aspectos, las cadenas 1 y 2 están acopladas a través de un enlazador conocido por los expertos en la materia, p. ej., (G4S)3 (véanse las SEQ ID NO: 395 y 397 para dicha construcción).

[0283] En determinados aspectos, los anticuerpos que se unen específicamente a Fel d1 pueden prepararse utilizando fragmentos de las regiones anteriormente mencionadas, o péptidos que se extienden más allá de las regiones designadas en aproximadamente 5 a aproximadamente 20 restos de aminoácidos de cualquiera, o ambos, de los extremos aminoterminal o carboxiterminal de las regiones descritas en el presente documento. En determinados aspectos, en la preparación de anticuerpos específicos de Fel d1, puede utilizarse cualquier combinación de las regiones indicadas anteriormente o fragmentos de las mismas. En determinados aspectos, para preparar anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos, puede utilizarse una cualquiera o más de las regiones de Fel d1, o fragmentos de las mismas, indicadas anteriormente.

[0285] Fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos

[0287] A menos que se indique específicamente otra cosa, el término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, debe entenderse que abarca moléculas de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina (es decir, "moléculas de anticuerpo completo") así como sus fragmentos de unión a antígeno. Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo, y similares, como se utiliza en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o genomodificado, que se una específicamente a un antígeno para formar un complejo. Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo o "fragmento de anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a la cadena 1 y/o a la cadena 2 de Fel d1. Un fragmento de anticuerpo puede incluir un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento dAb, un fragmento que contiene una CDR, o una CDR aislada. Los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo pueden proceder, p. ej., de moléculas de anticuerpo completas usando cualquier técnica convencional adecuada, tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante, que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables y (opcionalmente) constantes de anticuerpos. Dicho ADN se conoce y/o puede adquirirse fácilmente, p. ej., en fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, p. ej., fagotecas de anticuerpos) o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o mediante técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o delecionar aminoácidos, etc.

[0289] Como ejemplos no limitativos de fragmentos de unión a antígeno se incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas genomodificadas, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos con dominio delecionado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos con CDR injertadas, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (p. ej., nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se incluyen en la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se utiliza en el presente documento.

[0291] Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y en general comprenderá al menos una CDR, que sea adyacente a, o en fase con, una o más secuencias marco conservadas. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio VH asociado a un dominio VL, los dominios VH y VL pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros VH-VH, VH-VL o VL-VL. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio VH o VL monomérico.

[0293] En determinados aspectos, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido por enlace covalente a al menos un dominio constante. Como configuraciones no limitativas e ilustrativas de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación se incluyen: (i) VH -CH1; (ii) VH -CH2; (iii) VH -CH3; (iv) VH -CH1-CH2; (v) VH -CH1-CH2-CH3; (vi) VH -CH2-CH3; (vii) VH -CL; (viii) VL -CH1; (ix) VL -CH2; (x) VL -CH3; (xi) VL -CH1-CH2; (xii) VL -CH1-CH2-CH3; (xiii) VL -CH2-CH3; y (xiv) VL -CL. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, que incluya cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos, lo que da como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una sola molécula polipeptídica. Por otro lado un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación, puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios VH o VL monoméricos (p. ej., mediante enlace(s) disulfuro).

[0295] Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (p. ej., biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno diferente o a un epítopo distinto en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico ilustrativos divulgados en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación usando técnicas habituales disponibles en la materia.

[0297] Preparación de anticuerpos humanos

[0299] En la técnica se conocen métodos para generar anticuerpos humanos en ratones transgénicos. Cualquiera de dichos métodos conocidos puede usarse en el contexto de la presente divulgación para preparar anticuerpos humanos que se unan específicamente a Fel d1.

[0301] Utilizando tecnología VELOCIMMUNE<™>(véase, por ejemplo, el documento US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE<®>) o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, inicialmente se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra Fel d1 que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. La tecnología VELOCIMMUNE<®>implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera humanas unidas operativamente a locus endógenos de región constante de ratón de manera que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se aísla y se une operativamente al ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas. A continuación, el ADN se expresa en una célula capaz de expresar el anticuerpo totalmente humano.

[0302] Generalmente, un ratón VELOCIMMUNE<®>se expone al antígeno de interés y se recuperan las células linfáticas (tal como linfocitos B) de los ratones que expresan los anticuerpos. Las células linfáticas se pueden fusionar con una estirpe celular de mieloma para preparar estirpes celulares de hibridoma inmortales y dichas estirpes celulares de hibridoma se exploran de manera sistemática y se seleccionan para identificar estirpes celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. El ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera puede aislarse y unirse a regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y la cadena ligera. Dicho un anticuerpo puede producirse en una célula, tal como una célula CHO. Como alternativa, el ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas puede aislarse directamente de linfocitos específicos de antígeno.

[0303] Inicialmente, se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Al igual que en la siguiente sección experimental, los anticuerpos se caracterizan y se seleccionan con respecto a características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se remplazan por una región constante humana deseada para generar el anticuerpo totalmente humano de la invención, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificada. Aunque la región constante seleccionada puede variar según el uso específico, las características de alta afinidad de unión al antígeno y especificidad de la diana residen en la región variable.

[0304] En general, los anticuerpos de la presente divulgación poseen afinidades muy altas, normalmente con una KD de entre aproximadamente 10<-12>y aproximadamente 10<-9>M, cuando se mide mediante la unión al antígeno inmovilizado en fase sólida o en fase de solución. Las regiones constantes de ratón se remplazan por regiones constantes humanas deseadas para generar los anticuerpos totalmente humanos de la divulgación. Aunque la región constante seleccionada puede variar según el uso específico, las características de alta afinidad de unión al antígeno y especificidad de la diana residen en la región variable. En algunos aspectos, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a la Fel d1 monomérica con una KD igual o inferior a 1 x 10<-8>, 1 x 10<-9>o 1 x 10<-10>. En algunos aspectos, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a la Fel d1 dimérica con una KD igual o inferior a 1 x 10<-8>, 1 x 10<-9>, 1 x 10<-10>o 1 x 10<-11>. En aspectos, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a la Fel d1 dimérica con una T1/2 de al menos 150 min, 160 min, 170 min, 180 min, 190 min, 200 min, 210 min, 220 min, 230 min, 240 min o 250 min. En aspectos, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a la Fel d1 monomérica con una T1/2 de al menos 25 min, 30 min, 35 min, 40 min, 45 min o 50 min.

[0305] Bioequivalentes

[0306] Los anticuerpos contra Fel d1, y fragmentos de anticuerpo de la presente divulgación, abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían respecto a las de los anticuerpos descritos, pero que conservan la capacidad de unirse a Fel d1. Dichos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero presentan una actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. Del mismo modo, las secuencias de ADN que codifican los anticuerpos de la presente invención, abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos cuando se comparan con la secuencia desvelada, pero que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la divulgación.

[0307] Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya tasa y grado de absorción no muestran ninguna diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, ya sea en una sola dosis o en múltiples dosis. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en cuanto a su grado de absorción pero no en cuanto a su tasa de absorción y, sin embargo, pueden considerarse bioequivalentes porque tales diferencias en la tasa de absorción son intencionadas y se reflejan en el etiquetado, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo, p. ej., con uso crónico, y desde el punto de vista médico, se consideran irrelevantes para el producto farmacéutico concreto estudiado.

[0308] En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente significativas en cuanto a su seguridad, pureza y fuerza.

[0309] En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin que se espera un aumento en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad o una disminución de la eficacia, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.

[0310] En un aspecto, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan mediante un mecanismo o mecanismos de acción comunes para la condición o condiciones de uso, en la medida en que se conozcan dichos mecanismos.

[0311] La bioequivalencia puede demostrarse por métodosin vivoy/oin vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, p. ej., (a) un ensayoin vivoen seres humanos u otros mamíferos, en donde se mide la concentración del anticuerpo o de sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) una pruebain vitroque se haya correlacionado con datos de biodisponibilidadin vivoen seres humanos y que sea razonablemente predictiva de dichos datos; (c) una pruebain vivoen seres humanos u otros mamíferos en donde se mide el efecto farmacológico agudo adecuado del anticuerpo (o su diana) en función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.

[0312] Las variantes bioequivalentes de los anticuerpos de la divulgación pueden construirse, por ejemplo, haciendo diversas sustituciones de restos o secuencias o delecionando secuencias o restos terminales o internos no necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo, los restos de cisteína que no son esenciales para la actividad biológica pueden delecionarse o reemplazarse por otros aminoácidos para impedir la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos durante la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpo que comprenden cambios de aminoácidos, los cuales modifican las características de glucosilación de los anticuerpos, p. ej., mutaciones que eliminan o suprimen la glucosilación.

[0313] Características biológicas de los anticuerpos

[0314] En general, los anticuerpos de la presente divulgación pueden funcionar uniéndose a/interaccionando con la cadena 1 o con la cadena 2 de Fel d1, o con ambas cadenas 1 y 2 de Fel d1 o con un fragmento de la cadena 1 o de la cadena 2.

[0315] En determinados aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación pueden unirse a un epítopo localizado en al menos la región carboxiterminal de la cadena 1 o de la cadena 2 de Fel d1. En un aspecto, los anticuerpos pueden unirse a un epítopo dentro de la región aminoterminal de la cadena 1 o de la cadena 2 de Fel d1.

[0316] En determinados aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación pueden funcionar bloqueando o inhibiendo la unión de IgE a mastocitos o basófilos en un paciente sensible al alérgeno Fel d1.

[0317] En determinados aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación pueden funcionar uniéndose a cualquier otra región o fragmento de la cadena 1 o cadena 2 de longitud completa de la proteína Fel d1 natural, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 392 (cadena 1) y SEQ ID NO: 393 (cadena 2).

[0318] En determinados aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos de la divulgación pueden unirse a un epítopo de la cadena 1 y pueden unirse también a un epítopo de la cadena 2. En determinados aspectos, los anticuerpos biespecíficos de la divulgación pueden unirse a dos epítopos diferentes de la cadena 1. En determinados aspectos, los anticuerpos biespecíficos de la divulgación pueden unirse a dos epítopos diferentes de la cadena 2. En determinados aspectos, los anticuerpos biespecíficos de la divulgación pueden unirse a dos sitios diferentes dentro de la misma hélice en una de las cadenas 1 o 2, o pueden unirse a la misma hélice tanto en la cadena 1 como en la cadena 2. La estructura de Fel d1 se describe con más detalle en Kaiser et. al. (Kaiser, L. et. al. (2003), J. Biol. Chem. 278 (39):37730-37735), de modo que los autores observan que Fel d1 consiste en ocho hélices, H1-H4 y H5-H8, que corresponden a las cadenas 2 y 1, respectivamente, en Fel d1 natural.

[0319] En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano, o un fragmento de unión a antígeno del mismo o una combinación de anticuerpos, que se une a la cadena 1 y/o a la cadena 2 de Fel d1, en donde cada anticuerpo o fragmento del mismo presenta una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354 y 370, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362 y 378, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360 y 376, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368 y 384, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356 y 372, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358 y 374, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364 y 380, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366 y 382, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (v) se une a la cadena 1 y/o a la cadena 2 de Fel d1 con una KD igual o inferior a 10<-9>; (vi) no presenta reacción cruzada con, ni se une a, la uteroglobina; o vii) bloquea la extravasación de colorantein vivoen un modelo de ratón de anafilaxia cutánea pasiva (ACP) utilizando IgE de ratón específica de Fel d1.

[0321] En los ejemplos 4 del presente documento se ilustran ensayosin vitrono limitativos e ilustrativos para medir la actividad de unión. En los ejemplos 4, las afinidades de unión y las constantes cinéticas de los anticuerpos contra Feld d1 humana se determinaron mediante resonancia de plasmón superficial y las mediciones se realizaron en un instrumento T200 Biacore. Determinados anticuerpos Fel d1 de la presente divulgación, cuando se utilizan solos o combinados, son capaces de unirse y neutralizar al menos un efecto biológico de Fel d1, según lo determinado en ensayosin vitrooin vivo. La capacidad de los anticuerpos de la divulgación para unirse a Fel d1 y neutralizar la actividad de Fel d1 puede medirse usando cualquier método convencional conocido por los expertos en la materia, incluidos ensayos de unión, o ensayos de neutralización de la actividad (p. ej., protección frente a la anafilaxia), como se describe en el presente documento.

[0323] En aspectos, se seleccionan uno o más anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que inhiben la activación de basófilos inducida por Fel d1 y que tienen una CI<50>de aproximadamente 10 pM, 20 pM, 30pM, 40 pM, 50 pM, 100pM, 1 nM o menor. En un ensayo ELISA, se seleccionan uno o más anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que inhiben la unión de Fel d1 a la IgE policlonal con una CI<50>de aproximadamente 600 pM o menor. Se seleccionan uno o más anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que inhiben la unión de Fel d1 a la IgE del paciente con una CI<50>de aproximadamente 500 pM o menor.

[0325] Los péptidos o las proteínas Fel d1 pueden modificarse para que incluyan la adición o sustitución de determinados restos con fines de etiquetado o de conjugación con moléculas transportadoras, tal como, KLH. Por ejemplo, puede añadirse una cisteína en el extremo aminoterminal o carboxiterminal de un péptido, o puede añadirse una secuencia enlazadora para preparar el péptido para conjugarlo con, por ejemplo, KLH para inmunización. Los anticuerpos específicos de Fel d1 pueden no contener marcadores o fracciones adicionales, o pueden contener un marcador o fracción aminoterminal o carboxiterminal. En una realización, el marcador o residuo es biotina. En un ensayo de unión, la ubicación de un marcador (si lo hay) puede determinar la orientación del péptido con respecto a la superficie sobre la que se une el péptido. Por ejemplo, si una superficie está recubierta con avidina, un péptido que contiene una biotina aminoterminal se orientará de manera que la parte carboxiterminal del péptido estará distal a la superficie.

[0327] Mapeo de epítopos y tecnologías relacionadas

[0329] El término "epítopo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un determinante antigénico que interacciona con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un solo antígeno puede tener más de un epítopo. Por tanto, distintos anticuerpos pueden unirse a distintas áreas de un antígeno y pueden tener distintos efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce mediante aminoácidos yuxtapuestos espacialmente de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En una determinada circunstancia, un epítopo puede incluir residuos de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.

[0331] La presente divulgación incluye anticuerpos contra Fel d1 que interaccionan con uno o más aminoácidos que se encuentran dentro de una o más regiones de la cadena 1 o cadena 2 de la molécula Fel d1, incluyendo, p. ej., la cadena 1 (cadena A) como se muestra en SEQ ID NO: 392, o la cadena 2 (cadena B) como se muestra en SEQ ID NO: 393, o dentro de regiones comparables de una proteína Fel d1 producida por medios recombinantes, como se muestra en una cualquiera de las SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 o 397. El epítopo al que se unen los anticuerpos puede consistir en una sola secuencia contigua de 3 o más (p. ej., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos situados dentro de cualquiera de las regiones o segmentos antes mencionados de la molécula Fel d1 (es decir, un epítopo lineal en la cadena 1 o en la cadena 2, o en una región que abarque tanto la cadena 1 como la cadena 2). Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos (o secuencias de aminoácidos) no contiguos localizados dentro de una o ambas de las regiones o segmentos de la molécula Fel d1 anteriormente mencionados (p. ej., un epítopo conformacional).

[0332] Para determinar si un anticuerpo "interacciona con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o una proteína, pueden usarse diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia. Como técnicas ilustrativas se incluyen, por ejemplo, ensayos de bloqueo cruzado habituales, tales como los descritos en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Otros métodos incluyen análisis mutacional de alanina dirigida, análisis de inmunotransferencia de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248: 443-63) o análisis por escisión de péptidos, estudios cristalográficos y análisis por RMN. Además, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interacciona un anticuerpo, es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio de hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. Seguidamente, el complejo proteína/anticuerpo se transfiere al agua y los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que están protegidos por el complejo del anticuerpo experimentan un intercambio inverso de deuterio a hidrógeno a una velocidad más lenta que los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que no forman parte de la interfaz. Como resultado, los aminoácidos que forman parte de la interfaz proteína/anticuerpo pueden conservar deuterio y, por lo tanto, presentan una masa relativamente mayor en comparación con los aminoácidos no incluidos en la interfaz. Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión por proteasas y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interacciona el anticuerpo. Véase, p. ej., Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. Para fines de mapeo de epítopos también puede usarse cristalografía de rayos X del complejo antígeno/anticuerpo.

[0333] El perfilado asistido por modificaciones (MAP,Modification-Assisted Profiling), también conocido como perfilado de anticuerpos basado en la estructura del antígeno (ASAP,Antigen Structure-based Antibody Profiling), es un método que categoriza una gran cantidad de anticuerpos monoclonales (Acm) dirigidos contra el mismo antígeno de acuerdo con las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a las superficies de antígenos que se han modificad química o enzimáticamente (US 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un epítopo exclusivo diferente o parcialmente superpuesto con el epítopo representado por otra categoría. Esta tecnología permite el filtrado rápido de anticuerpos genéticamente idénticos, de modo que la caracterización puede centrarse en anticuerpos genéticamente distintos. Cuando se aplica a la exploración de hibridomas, MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridomas raros que producen Acm que tienen las características deseadas. MAP se puede usar para clasificar los anticuerpos de la divulgación en grupos de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos.

[0334] En determinados aspectos, los anticuerpos contra Fel d1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen a un epítopo dentro de una cualquiera o más de las regiones ilustradas en la cadena 1 o cadena 2 de Fel d1, ya sea producida de forma natural, como se ilustra en SEQ ID NO: 392 (cadena 1) y SEQ ID NO: 393 (cadena 2), o de forma recombinante, como se ilustra en cualquiera de las SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 y 397, o en un fragmento de las mismas. En determinados aspectos, los anticuerpos de la divulgación, como se muestra en la Tabla 1, interaccionan con al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 15 hasta aproximadamente la posición 24 de la SEQ ID NO: 396; restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 85 hasta aproximadamente la posición 103 de la SEQ ID NO: 396; restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 85 hasta aproximadamente la posición 104 de la SEQ ID NO: 396; restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 113 hasta aproximadamente la posición 116 de la SEQ ID NO: 396; restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 113 hasta aproximadamente la posición 127 de la SEQ ID NO: 396; restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 128 hasta aproximadamente la posición 141 de la SEQ ID NO: 396. Estas regiones se ilustran además en las SEQ ID NO: 402, 403, 404, 406, 412 y 426.

[0335] Un anticuerpo que interacciona con/se une a un epítopo dentro de la cadena A de Fel d 1 comprende el par de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 18/26.

[0336] En determinados aspectos, los anticuerpos de la divulgación, como se muestra en la Tabla 1, interaccionan con uno o más restos de aminoácidos cuya posición varía desde aproximadamente la posición 12 a aproximadamente la posición 54 de SEQ ID NO: 396.

[0337] En un aspecto, un anticuerpo de la divulgación, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la cadena 2 de Fel d 1, interacciona con números de restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente el resto 12 hasta el resto 54 de SEQ ID NO: 396.

[0338] En un aspecto, un anticuerpo de la divulgación, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la cadena 2 de Fel d 1, interacciona con números de restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente el resto 15 hasta el resto 24 de SEQ ID NO: 396.

[0339] En un aspecto, un anticuerpo de la divulgación, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la cadena 2 de Fel d 1, interacciona con números de restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente el resto 21 hasta el resto 47 de SEQ ID NO: 396.

[0340] En un aspecto, un anticuerpo de la divulgación, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la cadena 2 de Fel d 1, interacciona con al menos uno o más de los siguientes restos de aminoácidos en SEQ ID NO: 396: la N en la posición 21, la E en la posición 22, la L en la posición 23, la L en la posición 24, la D en la posición 26, la L en la posición 27, la T en la posición 30, la K en la posición 31, la E en la posición 36, la R en la posición 39, la K en la posición 43, la D en la posición 47.

[0341] En un aspecto, un anticuerpo de la divulgación, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la cadena 2 de Fel d 1, se une a un epítopo que comprende una pluralidad de los siguientes restos de aminoácidos de SEQ ID NO: 396: N21, E22, L23, L24, D26, L27, T30, K31, E36, R39, K43, D47.

[0342] Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que interacciona con al menos uno o más de los siguientes restos de aminoácidos de SEQ ID NO: 396, incluido la N en la posición 21, la E en la posición 22, la L en la posición 23, la L en la posición 24, la D en la posición 26, la L en la posición 27, la T en la posición 30, la K en la posición 31, la E en la posición 36, la R en la posición 39, la K en la posición 43, la D en la posición 47, puede comprender el par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR de SEQ ID NO: 306/314. En la invención se utiliza un anticuerpo que comprende secuencias HCVR/LCVR de SEQ ID NO: 306/314.

[0343] En determinados aspectos, el epítopo o epítopos de los anticuerpos de la divulgación, puede(n) identificarse mediante intercambio de deuterio por hidrógeno (HDX) o mediante análisis cristalográfico por rayos X.

[0344] La presente divulgación incluye anticuerpos contra Fel d1 que se unen al mismo epítopo, o a una parte del epítopo, como cualquiera de los anticuerpos específicos ilustrativos descritos en el presente documento en la tabla 1, o un anticuerpo que tiene las secuencias CDR de cualquiera de los anticuerpos ilustrativos descritos en la tabla 1. Del mismo modo, la presente divulgación también incluye anticuerpos contra Fel d1 que compiten por unirse a Fel d1 o un fragmento de Fel d1 con cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento en la Tabla 1, o un anticuerpo que tiene las secuencias CDR de cualquiera de los anticuerpos ilustrativos descritos en la Tabla 1.

[0345] Puede determinarse fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo contra Fel d1 de referencia usando métodos habituales conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo contra Fel d1 de referencia de la invención, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína o péptido Fel d1 en condiciones de saturación. Seguidamente, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo para unirse a la molécula de Fel d1. Si el anticuerpo de ensayo puede unirse a Fel d1 después de la unión por saturación con el anticuerpo contra Feld d1 de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente al del anticuerpo contra Fel d1 de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no puede unirse a la molécula Fel d1 después de la unión por saturación con el anticuerpo contra Fel d1 de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo que el epítopo al que se une el anticuerpo contra Fel d1 de referencia.

[0346] Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo contra Fel d1 de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una molécula Fel d1 en condiciones de saturación, seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula Fel d1. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula Fel d1 en condiciones de saturación, seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula Fel d1. Si, en ambas orientaciones, únicamente el primer anticuerpo (de saturación) puede unirse a la molécula Feld d1, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a Fel d1. Como apreciará un experto familiarizado con la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede que no se una necesariamente al epítopo idéntico al anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.

[0347] Dos anticuerpos se unen al mismo epítopo o a epítopos solapantes si cada uno inhibe (bloquea) competitivamente la unión del otro con el antígeno. Es decir, un exceso de 1, 5, 10, 20 o 100 veces de un anticuerpo, inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, pero preferentemente en un 75 %, 90 % o incluso 99 %, medido en un ensayo de unión competitiva (véase, p. ej., Junghanset al., Cancer Res.199050:1495-1502). Como alternativa, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos solapantes si algunas mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. A continuación, puede realizarse experimentación habitual adicional (p. ej., análisis de mutación de péptidos y de unión) para confirmar si la falta de unión observada del anticuerpo de ensayo se debe efectivamente a que se une al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, o si la ausencia de unión observada se debe a un bloqueo estérico (u otro fenómeno). Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, resonancia de plasmón superficial, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la materia.

[0349] Inmunoconjugados

[0351] Un anticuerpo monoclonal humano contra Fel d1 puede conjugarse con un residuo terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como un agente capaz de reducir la gravedad de una respuesta alérgica al alérgeno Fel d1 presente en la caspa de gato o en los gatos, o en una zona del entorno donde puedan residir gatos, o de mejorar al menos un síntoma asociado a la exposición a los gatos, a la caspa de gato o al alérgeno Fel d1, incluida la rinitis, la conjuntivitis o dificultades respiratorias o la gravedad de la mismas. Dicho agente puede ser un corticoesteroide, un segundo anticuerpo diferente a Fel d1, o una vacuna. El tipo de residuo terapéutico que puede conjugarse con el anticuerpo Fel d1 tendrá en cuenta la afección que se vaya a tratar y el efecto terapéutico deseado que se vaya a lograr. Como alternativa, si el efecto terapéutico deseado es tratar las secuelas o los síntomas asociados a la exposición al alérgeno Fel d1, o cualquier otra afección resultante de dicha exposición, tal como, pero sin limitación, rinitis o conjuntivitis, puede ser ventajoso conjugar un agente apropiado para tratar las secuelas o los síntomas de la afección, o para aliviar cualquier efecto secundario de los anticuerpos. En la materia se conocen ejemplos de agentes adecuados para formar inmunoconjugados, véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081.

[0353] Anticuerpos multiespecíficos

[0355] Los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, p. ej., Tuttet al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kuferet al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos de la presente invención pueden unirse a otra molécula funcional o coexpresarse con ella, p. ej., otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse funcionalmente (p. ej., por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos biespecíficos en donde un brazo de una inmunoglobulina puede ser específico para la cadena 1 de Fel d1, o un fragmento de la misma, y el otro brazo de la inmunoglobulina puede ser específico para la cadena 2 de Fel d1, o una segunda diana terapéutica, o puede estar conjugado con un residuo terapéutico.

[0357] Determinadas realizaciones ilustrativas de la presente divulgación incluyen una molécula de unión a antígeno biespecífica, que es un anticuerpo biespecífico. Cada dominio de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable de cadena pesada (HCVR) y un dominio variable de cadena ligera (LCVR). El HCVR también puede denominarse región VH, y el LCVR también puede denominarse región VL. Normalmente, cada HCVR y LCVR comprende tres CDR intercaladas con cuatro FR, dispuestas del extremo amínico al extremo carboxílico en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En el presente documento, las tres CDR dentro de un HCVR pueden denominarse HCDR1, HCDR2 y HCDR3; mientras que en el presente documento las tres CDR dentro de un LCVR pueden denominarse LCDR1, LCDR2 y LCDR3.

[0359] Enlas moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación, cada dominio de unión a antígeno puede comprender o consistir en una molécula de anticuerpo completa o en un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo, y similares, como se utiliza en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o genomodificado, que se una específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo pueden proceder, p. ej., de moléculas de anticuerpo completas usando cualquiera de las técnicas convencionales adecuadas tales como digestión proteolítica o técnicas recombinantes de ingeniería genética que implican la manipulación y la expresión de ADN que codifica los dominios variables y, opcionalmente, los constantes, de un anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o puede adquirirse fácilmente, p. ej., en fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, p. ej., fagotecas de anticuerpos) o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o mediante técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o delecionar aminoácidos, etc.

[0361] Como ejemplos no limitativos de fragmentos de unión a antígeno que pueden incluirse en las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación se incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades mínimas de reconocimiento que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo. Otras moléculas genomodificadas, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos con dominio delecionado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos con CDR injertadas, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (p. ej., nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se incluyen en la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se utiliza en el presente documento.

[0362] Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y en general comprenderá al menos una CDR, que sea adyacente a, o en fase con, una o más secuencias marco conservadas. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio VH asociado a un dominio VL, los dominios VH y VL pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros VH-VH, VH-VL o VL-VL. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio VH o VL monomérico.

[0364] En determinados aspectos, un fragmento de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno biespecífica puede contener al menos un dominio variable unido por enlace covalente a al menos un dominio constante. Como configuraciones no limitativas e ilustrativas de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un dominio de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno biespecífica pueden incluirse: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; y (xiv) VL-CL. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, que incluya cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos, lo que da como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una sola molécula polipeptídica. Por otro lado un fragmento de unión a antígeno de una molécula de unión a antígeno biespecífica puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios VH o VL monoméricos (p. ej., mediante enlace(s) disulfuro).

[0366] El primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar conectados directa o indirectamente entre sí para formar una molécula de unión a antígeno biespecífica. Como alternativa, el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar unidos a un dominio de multimerización separado. La asociación de un dominio de multimerización con otro dominio de multimerización facilita la asociación entre los dos dominios de unión a antígeno, formando de este modo una molécula de unión a antígeno biespecífica. Como se utiliza en el presente documento, un "dominio de multimerización" es cualquier macromolécula, proteína, polipéptido, péptido o aminoácido que tiene la capacidad de asociarse con un segundo dominio de multimerización de la misma estructura o constitución o similar. Por ejemplo, un dominio multimerizante puede ser un polipéptido que comprende un dominio CH3 de inmunoglobulina. Un ejemplo no limitante de un componente de multimerización es una porción Fc de una inmunoglobulina, p. ej., un dominio Fc de una IgG seleccionada de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4, así como cualquier alotipo dentro de cada grupo de isotipo. En determinados aspectos, el dominio de multimerización puede ser un fragmento Fc o una secuencia de aminoácidos de 1 a aproximadamente 200 aminoácidos de longitud que contenga al menos un resto de cisteína. En otros aspectos, el dominio de multimerización es un resto de cisteína o un péptido corto que contiene cisteína. Otros dominios de multimerización incluyen péptidos o polipéptidos que comprenden o consisten en una cremallera de leucina, un motivo de bucle de hélice o un motivo de hélice superenrollada.

[0368] Puede utilizarse cualquier formato o tecnología de anticuerpo biespecífico para preparar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene una primera especificidad de unión al antígeno, puede unirse funcionalmente (p. ej., por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tenga una segunda especificidad de unión a antígeno para producir una molécula de unión a antígeno biespecífica.

[0370] Un formato de anticuerpo biespecífico ilustrativo que puede usarse en el contexto de la presente divulgación, implica el uso de un primer dominio CH3 de inmunoglobulina (Ig) y de un segundo dominio CH3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio CH3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico con la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En un aspecto, el primer dominio CH3 de Ig está unido a proteína A y el segundo dominio CH3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a la proteína A tal como una modificación H95R (según la numeración de exones IMGT; H435R según la numeración EU). El segundo CH3 puede comprender además una modificación Y96F (según IMGT; Y436F según la EU). Otras modificaciones que se pueden encontrar en el segundo CH3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (según IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I según EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I según EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (según IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I según EU) en el caso de anticuerpos IgG4. Se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.

[0372] Otros formatos biespecíficos ilustrativos que pueden usarse en el contexto de la presente divulgación incluyen, sin limitación, p. ej., formatos biespecíficos basados en scFv o de diacuerpo, fusiones IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-Ig, cuadroma, botón en ojal, cadena ligera común (p. ej., cadena ligera común con botón en ojal, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, Duocuerpo, IgG1/IgG2, Fab de acción doble (DAF)-IgG y formatos biespecíficos de Acm2 (véase, p. ej., Kleinet al.2012, mAbs 4:6, 1-11, y las referencias citadas en el mismo, para una revisión de los formatos anteriores). Además, pueden construirse anticuerpos biespecíficos utilizando conjugación de péptido/ácido nucleico, p. ej., en donde se usan aminoácidos no naturales con reactividad química ortogonal para generar conjugados de anticuerpo-oligonucleótido específicos de sitio que después se autoensamblan en complejos multiméricos con composición, valencia y geometría definidas. (Véase, por ejemplo, Kazaneet al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: 4 de diciembre de 2012]).

[0373] Selección de anticuerpos específicos de alérgeno

[0374] Cualquiera de los anticuerpos específicos de alérgeno o fragmentos de unión a antígeno del mismos descritos en el presente documento puede evaluarse para determinar la capacidad de unirse y/o inhibir uno o más acciones de la IgE específica de alérgeno, especialmente la IgE específica de alérgeno obtenida del paciente. En un aspecto, el método de tratamiento de un paciente que muestra sensibilidad a un alérgeno o una reacción alérgica frente a un alérgeno, o de prevención o mejora de al menos un síntoma o complicación asociado al alérgeno, comprende: (a) recoger una muestra de tejido o un extracto del mismo, o un líquido biológico, o una muestra de sangre del paciente; (b) extraer una IgE específica de alérgeno, o células que contengan o estén unidas a una IgE específica de alérgeno, de una o más de las muestras del paciente de la etapa (a); (c) mezclar la IgE, o las células que contengan la IgE o estén unidas a ella, de la muestra del paciente, con el alérgeno y con uno o más anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, específicos de alérgeno; (d) determinar si la adición de uno o más anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, específicos del alérgeno, bloquea la unión de la IgE específica del alérgeno de la etapa b) con el alérgeno, y si los resultados de la etapa d) demuestran un bloqueo eficaz de la unión de la IgE específica del alérgeno con el alérgeno mediante los anticuerpos específicos del alérgeno de la etapa (c), administrar al paciente una composición farmacéutica que comprenda una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los anticuerpos específicos de alérgenos o fragmentos de unión a antígeno de la etapa (c).

[0375] La muestra de tejido es cualquier muestra de tejido, o extracto de la misma, líquido biológico o muestra de sangre que contenga células portadoras de IgE; o la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre completa, suero y plasma. En aspectos, las células se aíslan de la muestra de tejido. En aspectos específicos, las células son células mononucleares de sangre periférica.

[0376] En un aspecto, la etapa de determinación se lleva a cabo mediante un métodoin vitroseleccionado del grupo que consiste en un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), un ensayo inmunorradiométrico (IRMA), un inmunoensayo de luminiscencia (LIA), una inmunotransferencia, análisis de FACS (clasificación de células activada por fluorescencia), un ensayo de unión a alérgeno facilitada por IgE (FAB), un ensayo de activación de basófilos (p. ej. un ensayo funcional de fosfoflujo o un ensayo de activación de basófilos, como el descrito en el Ejemplo 10), y un ensayo que utiliza una estirpe celular genomodificada que expresa FCεR1.

[0377] En un aspecto, la etapa de determinación se lleva a caboin vivoutilizando un modelo animal específico de alérgeno. En aspectos, la mezcla de la IgE o de las células que la contienen o están unidas a la IgE de la muestra del paciente, el alérgeno, y el uno o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, específica para el alérgeno, se inyecta en el modelo animal. El modelo animal específico de alérgeno es un modelo de ratón de Anafilaxia Cutánea Pasiva (ACP), en donde el modelo comprende además las siguientes etapas:

[0378] (a) inyectar al animal IgE específica de alérgeno, o antisuero que contenga IgE específica de alérgeno, por vía intradérmica en un lugar de la piel e inyectar al animal IgE no específica de alérgeno, o antisuero que contenga IgE no específica de alérgeno, por vía intradérmica en un segundo lugar de la piel;

[0379] (b) inyectar al animal por vía sistémica el alérgeno, junto con un colorante; y

[0380] (c) evaluar el grado de extravasación del colorante en el lugar de la inyección del alérgeno; en donde la cantidad de colorante extravasado en el tejido está directamente relacionada con la cantidad de activación de mastocitos en el animal y en donde un cambio en la cantidad de colorante extravasado en el tejido en comparación con un animal al que se inyectó IgG específica de alérgeno, es indicativo de un resultado terapéutico positivo previsto en el paciente.

[0381] En otro aspecto, la evaluación de que el uno o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos específicos del alérgeno, bloquean la unión de la IgE específica del alérgeno se lleva a caboin vivoutilizando un modelo animal específico del alérgeno. En este aspecto, el uno o más anticuerpos específicos de alérgeno o fragmentos de unión a antígeno, se inyectan en ratones. La IgE específica de alérgeno, opcionalmente, la IgE específica de alérgeno del paciente, se inyecta por vía intradérmica en una oreja y la IgE de control se inyecta por vía intradérmica en la otra oreja. Los ratones se exponen al alérgeno y reciben una inyección de colorante. Una disminución de la extravasación de colorante en los animales que reciben uno o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno específicos de alérgeno, es indicativa de que los anticuerpos inhiben la desgranulación de mastocitos inducida por la IgE específica de alérgeno.

[0382] En determinados aspectos, la muestra del paciente puede analizarse primeroin vitroutilizando los métodos y pruebas de diagnóstico descritos anteriormente, seguido de un análisis de confirmación en el modelo animalin vivo, tal como el modelo de ACP descrito en el presente documento. En aspectos, se seleccionan anticuerpos específicos de alérgeno o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que inhiben la unión del alérgeno a la IgE específica de alérgeno, o inhiben la desgranulación de los mastocitos inducida por la IgE específica de alérgeno, especialmente la IgE específica de alérgeno obtenida del paciente.

[0383] Administración terapéutica y formulaciones

[0384] La invención utiliza composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos contra Fel d1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Las composiciones terapéuticas de acuerdo con la divulgación se administrarán por una vía adecuada que incluye, pero sin limitación, la vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, intranasal, con portadores, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en las formulaciones para proporcionar una mejor transferencia, suministro, tolerancia y similares. Una multitud de formulaciones adecuadas puede encontrarse en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN<™>), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también Powellet al."Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm. Sci. Technol.52:238-311.

[0385] La dosis del anticuerpo puede variar dependiendo de la edad y de la estatura del sujeto que va a recibir la administración, de la enfermedad diana, las afecciones, vía de administración y similares. Cuando el anticuerpo de la presente divulgación se utiliza para tratar la rinitis o la conjuntivitis asociada a la exposición a un gato, o a la caspa de gato en un individuo que tiene una sensibilidad a Fel d1, o para impedir una respuesta anafiláctica al alérgeno de gato, o para disminuir la gravedad de la respuesta alérgica, es ventajoso administrar por vía intravenosa el anticuerpo de la presente divulgación, normalmente en una sola dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. En determinados aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la divulgación, puede administrarse como una dosis inicial de al menos aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 800 mg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 600 mg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 300 mg o de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 mg, hasta aproximadamente 100 mg, o hasta aproximadamente 50 mg. En determinados aspectos, la dosis inicial puede ir seguida de la administración de una segunda o una pluralidad de dosis posteriores del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en una cantidad que puede ser aproximadamente la misma o menor que la de la dosis inicial, en donde las dosis posteriores están separadas por al menos 1 día a 3 días; al menos una semana, al menos 2 semanas; al menos 3 semanas; al menos 4 semanas; al menos 5 semanas; al menos 6 semanas; al menos 7 semanas; al menos 8 semanas; al menos 9 semanas; al menos 10 semanas; al menos 12 semanas; o al menos 14 semanas.

[0386] Se conocen diversos sistemas de suministro y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica, p. ej., encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wuet al.(1987) J. Biol. Chem.262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, la vía intradérmica, transdérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en embolada, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (p. ej., mucosa oral, rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

[0387] La composición farmacéutica también puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase, por ejemplo, Langer (1990) Science 249:1527-1533).

[0388] En determinadas situaciones, la composición farmacéutica puede suministrase en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba. En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos. En otra realización más, un sistema de liberación controlada puede colocarse cerca de la diana de la composición, siendo necesaria, por lo tanto, solo una fracción de la dosis sistémica.

[0389] Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse mediante métodos de conocimiento público. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, p. ej., disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrita anteriormente, en un medio acuoso estéril o en un medio oleaginoso usado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para las inyecciones, puede nombrase, por ejemplo, una solución salina fisiológica, una solución isotónica que contenga glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que pueden usarse junto con un agente de solubilización apropiado, tal como un alcohol (p. ej., etanol), un polialcohol (p. ej., propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [p. ej., polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleaginoso, se emplea, p. ej., aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse junto con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección preparada de esta manera se carga preferentemente en una ampolla apropiada.

[0390] Una composición farmacéutica puede administrarse por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Además, con respecto al suministro subcutáneo, un dispositivo de suministro tipo pluma tiene aplicaciones idóneas para la administración de una composición farmacéutica. Dicho dispositivo de suministro tipo pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo de suministro tipo pluma reutilizable generalmente utiliza un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez administrada toda la composición farmacéutica contenida en el cartucho y estando éste vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y reemplazarse por un nuevo cartucho que contenga la composición farmacéutica. Después, el dispositivo de suministro tipo pluma puede reutilizarse. En un dispositivo de suministro tipo pluma desechable, no hay ningún cartucho reemplazable. En cambio, el dispositivo de suministro tipo pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica contenida un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se ha vaciado de la composición farmacéutica, se desecha todo el dispositivo.

[0391] Numerosos dispositivos reutilizables tipo pluma y autoinyectores tienen aplicaciones en el suministro subcutáneo de una composición farmacéutica. Como ejemplos se incluyen, pero ciertamente sin limitación, AUTOPEN<™>(Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), la pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), la pluma HUMALOG MIX 75/25<™>, la pluma HUMALOG<™>, la pluma HUMALIN 70/30<™>(Eli Lilly and Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN<™>I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR<™>(Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), la pluma BD<™>(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN<™>, OPTIPEN PRO<™>, OPTIPEN STARLET<™>y OPTICLIK<™>(sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Como ejemplos de dispositivos de suministro tipo pluma desechables que tienen aplicaciones en el suministro subcutáneo de una composición farmacéutica de la presente invención se incluyen, pero ciertamente sin limitación, la pluma SOLOSTAR<™>(Sanofi-Aventis), la pluma FLEXPEN<™>(Novo Nordisk) y la pluma KWIKPEN<™>(Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK<™>(Amgen, Thousand Oaks, CA), la pluma PENLET<™>(Haselmeier, Stuttgart, Alemania), la pluma EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA<™>(Abbott Labs, Abbott Park, IL), por nombrar solo algunos.

[0392] De manera ventajosa, las composiciones farmacéuticas de uso oral o parenteral descritas anteriormente, se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenida es generalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma farmacéutica en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo anteriormente mencionado esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas farmacéuticas.

[0393] Usos terapéuticos de los anticuerpos

[0394] Debido a su interacción con Fel d1, los presentes anticuerpos son útiles para tratar la respuesta primaria tras la exposición de un individuo a un gato, a caspa de gato o a un entorno que contenga la proteína Fel d1, o al menos un síntoma asociado a la respuesta alérgica, tal como picor de ojos, conjuntivitis, rinitis, respiración sibilante, dificultades respiratorias, o para impedir una respuesta secundaria al alérgeno Fel d1, incluyendo una respuesta anafiláctica más grave, o para disminuir la gravedad, duración y/o frecuencia de los síntomas tras la reexposición al alérgeno de gato. En consecuencia, se contempla que los anticuerpos puedan usarse profiláctica o terapéuticamente.

[0395] En la invención, los presentes anticuerpos (tal como se definen en las reivindicaciones) se utilizan para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de pacientes que padecen sensibilidad a los gatos, caspa de gato, al pelo de gato o a un extracto de los mismos, y/o a la proteína Fel d1. En la invención, los anticuerpos se utilizan para la preparación de una composición farmacéutica para reducir la gravedad de la exposición primaria a Fel d1, o para reducir la gravedad, duración y/o número de respuestas alérgicas a Fel d1. Los presentes anticuerpos pueden utilizarse como terapia adyuvante con cualquier otro agente útil para tratar alérgenos de gato, incluidos corticoesteroides, vacunas, inmunoterapia alergénica específica (IAE), o cualquier otra terapia paliativa conocida por los expertos en la materia.

[0396] En aspectos de la divulgación, una composición farmacéutica comprende más de un anticuerpo, o fragmentos de unión a antígeno, que se unen específicamente al alérgeno. En determinados aspectos, cuando se utiliza más de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, los anticuerpos no compiten entre sí por unirse al alérgeno. En otros aspectos, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a diferentes epítopos. En determinados aspectos, uno o más anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a diferentes epítopos en Fel d1. En aspectos, una composición farmacéutica comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un epítopo que comprende los aminoácidos 15 a 54 de la SEQ ID NO:396, y un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un epítopo que comprende los aminoácidos 113 a 116 de la SEQ ID NO:396.

[0397] En el presente documento se proporcionan métodos para controlar la eficacia de los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, específicos de alérgeno. En la invención, los anticuerpos (tal como se definen en las reivindicaciones) son para su uso en un método para reducir la gravedad, la duración o la frecuencia de aparición de uno o más síntomas asociados a una respuesta alérgica en un paciente, medida mediante una o más puntuaciones de los resultados comunicados por el paciente, comprendiendo el método, la administración al paciente de una o más dosis terapéuticamente eficaces de los anticuerpos monoclonales, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, específicos de alérgeno y la medición de la gravedad, la duración o la frecuencia de aparición de uno o más síntomas asociados a una respuesta alérgica en un paciente. En algunas realizaciones, antes de la administración se realiza una medición para determinar un valor de referencia y, después, al menos en un punto temporal posterior a la administración, para determinar la eficacia de la terapia y si se requieren dosis adicionales o un cambio de anticuerpos para aumentar la eficacia.

[0399] En la invención, las mediciones se realizan antes de la terapia y después de la administración al paciente de los anticuerpos monoclonales específicos de alérgeno o de los fragmentos de unión a antígeno de los mismos tras la exposición al alérgeno. En algunas realizaciones, las mediciones se realizan en uno o más momentos temporales después de la administración, tal como una semana después de la administración, un mes después de la administración, dos meses después de la administración, tres meses después de la administración, seis meses después de la administración, doce meses y/o veinticuatro meses después de la administración. Si las mediciones muestran que, después de la administración al paciente de los anticuerpos monoclonales, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, específicos de alérgeno, la gravedad, la duración o la frecuencia de aparición de uno o más síntomas asociados a una respuesta alérgica en un paciente, disminuye en comparación con las mediciones previas a la terapia, el tratamiento prosigue o puede interrumpirse hasta que los síntomas vuelvan a los niveles previos a la administración. Si las mediciones muestran que, después de la administración al paciente de los anticuerpos monoclonales, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, específicos de alérgeno, la gravedad, la duración o la frecuencia de aparición de uno o más síntomas asociados a una respuesta alérgica en un paciente, no disminuye en comparación con las mediciones previas a la terapia, el tratamiento puede interrumpirse, la dosis del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, específico de alérgeno, puede cambiarse, o pueden utilizarse un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno o combinaciones de los mismos, diferentes.

[0401] En una realización, el uno o más síntomas pueden seleccionarse del grupo que consiste en congestión nasal, picor nasal, rinorrea y estornudos. En la invención, la puntuación de los resultados comunicados por el paciente se selecciona del grupo que consiste en una puntuación total de síntomas nasales (TNSS), una puntuación de síntomas nasales en una Escala Visual Analógica (VAS) y una mejoría del flujo inspiratorio nasal máximo (PNIF). En una realización, el método se asocia a una reducción del diámetro del habón en una prueba cutánea de alergia. En una realización, la prueba cutánea de alergia es una prueba de punción cutánea (SPT) con titulación, en donde hay una reducción significativa del diámetro del habón en un paciente tratado con los anticuerpos monoclonales específicos de alérgeno en comparación con el diámetro del habón observado antes del tratamiento del paciente con dichos anticuerpos.

[0403] En algunas realizaciones, el tratamiento se controla determinando uno o más criterios de valoración de eficacia. Un ejemplo de criterio de valoración de eficacia es determinar el cambio en el área bajo la curva (ABC) de la TNSS entre el tratamiento previo y el día 8 después de la exposición nasal a alérgeno (ENA) durante la primera hora de exposición (de 0 a 1 hora, respuesta alérgica en fase temprana). Otros criterios de valoración incluyen el cambio porcentual en el ABC de la TNSS desde el tratamiento previo hasta la ENA el día 8 durante la primera hora; el cambio y cambio porcentual en el ABC de la TNSS desde el tratamiento previo con ENA hasta los días 29, 57 y 85 durante la primera hora; y el cambio y el cambio porcentual en el ABC de la TNSS desde la hora 1 hasta la hora 8 después de la exposición (RFT, respuesta de fase tardía) desde la ENA previa al tratamiento hasta los días 8, 29, 57 y 85. Incluso en otras realizaciones, los criterios de valoración incluyen el cambio y el cambio porcentual desde el tratamiento previo con ENA hasta los días 8, 29, 57 y 85 en la TNSS máxima, puntuación máxima de síntomas nasales en la Escala Visual Analógica (VAS) y fujo inspiratorio nasal máximo (PNIF); así como el ABC de la puntuación de síntomas nasales en la VAS y el ABC de 0-1 hora y de 1 a 8 horas del PNIF.

[0405] En algunas realizaciones, se administran una o más dosis de los anticuerpos específicos de alérgeno en función de si gravedad, la duración y/o la frecuencia de aparición de uno o más síntomas asociados a una respuesta alérgica en un paciente después de la administración, disminuyen o aumentan en comparación con la gravedad, la duración y/o la frecuencia de aparición de uno o más síntomas asociados a una respuesta alérgica en un paciente antes de la administración. En determinadas realizaciones, si el paciente presenta al menos un 30 %, al menos un 40 % o al menos un 50 % de disminución de la gravedad, duración y/o frecuencia de aparición de uno o más síntomas asociados a una respuesta alérgica en un paciente en un punto temporal medido en comparación con las mediciones antes de la administración (es decir, puntuación de referencia), no se requieren dosis adicionales de los anticuerpos específicos de alérgeno. En otras realizaciones, si el paciente presenta una reducción del área bajo la curva (ABC) para la TNSS de al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos 50 % o al menos un 60 %, en un punto temporal medido en comparación con el ABC para la TNSS antes de la administración (es decir, la puntuación de referencia), no se requieren más dosis

[0407] Combiterapias

[0409] Las combiterapias pueden incluir un anticuerpo contra Fel d1 y cualquier agente terapéutico adicional que pueda combinarse de manera ventajosa con un anticuerpo de la divulgación, o con un fragmento biológicamente activo de un anticuerpo de la divulgación.

[0410] Por ejemplo, para ayudar a reducir los síntomas alérgicos después de la exposición a un gato, a la caspa de gato, a pelo de gato o a un extracto de los mismos, o a Fel d1, o al estar expuesto a un entorno en el que reside un gato, puede emplearse un segundo agente terapéutico, tal como un corticoesteroide. Los anticuerpos también pueden usarse junto con otras terapias, tal como una vacuna específica para el alérgeno Fel d1. El componente o componentes terapéuticamente activo(s) adicional(es) puede(n) administrarse antes de, simultáneamente con, o después de, la administración del anticuerpo contra Fel d1 de la presente invención. Para los fines de la presente divulgación, dichas pautas de administración se consideran la administración de un anticuerpo contra Fel d1 "junto con" un segundo componente terapéuticamente activo.

[0411] Pautas de administración

[0412] De acuerdo con determinados aspectos de la divulgación, a un sujeto se le puede administrar dosis múltiples de uno o más anticuerpos contra Fel d1 (una combinación de anticuerpos) o una molécula de unión a antígeno biespecífica durante un periodo de tiempo definido. Los métodos de acuerdo con este aspecto, comprenden la administración secuencial a un sujeto, de múltiples dosis de un anticuerpo, una combinación de anticuerpos o una molécula de unión a antígeno biespecífica. Como se utiliza en el presente documento, "administración secuencial" significa que cada dosis de un anticuerpo, una combinación de anticuerpos o una molécula de unión a antígeno biespecífica, se administra al sujeto en un punto temporal diferente, p. ej., en días diferentes separados por un intervalo predeterminado (p. ej., horas, días, semanas o meses). La presente divulgación incluye métodos, que comprenden la administración secuencial al paciente de una sola dosis inicial de un anticuerpo, una combinación de anticuerpos o una molécula de unión a antígeno biespecífica, seguida de una o más dosis secundarias del anticuerpo y seguida opcionalmente de una o más dosis terciarias del anticuerpo.

[0413] Las expresiones "dosis inicial", "dosis secundarias", y "dosis terciarias", se refieren a la secuencia temporal de administración de un anticuerpo, de una combinación de anticuerpos o de una molécula de unión a antígeno biespecífica de la divulgación. Por tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio de la pauta de tratamiento (también denominada "dosis de referencia"); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis inicial, secundaria y terciaria, pueden contener todas, la misma cantidad de un anticuerpo, una combinación de anticuerpos o una molécula de unión a antígeno biespecífica, pero generalmente pueden diferir entre sí en términos de frecuencia de administración. Sin embargo, en determinados aspectos, la cantidad de un anticuerpo, combinación de anticuerpos o molécula de unión a antígeno biespecífica contenida en la dosis inicial, secundaria y/o terciaria, varía entre sí (p. ej., ajustándose hacia arriba o hacia abajo según corresponda) durante el ciclo del tratamiento. En determinados aspectos, se administran dos o más (p. ej., 2, 3, 4 o 5) dosis al comienzo de la pauta terapéutica como "dosis de carga" seguidas de dosis posteriores que se administran con menos frecuencia (p. ej., "dosis de mantenimiento").

[0414] En un aspecto ilustrativo, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra de 1 a 26 (p. ej., 1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 19½, 20, 20½, 21, 21½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½ o más) semanas después de la dosis inmediatamente anterior. La expresión "la dosis inmediatamente anterior", como se utiliza en el presente documento, significa, en una secuencia de administraciones múltiples, la dosis de un anticuerpo, una combinación de anticuerpos o una molécula de unión a antígeno biespecífica, que se administra a un paciente antes de la administración de la siguiente dosis en la secuencia, sin dosis intermedias.

[0415] Los métodos de acuerdo con este aspecto, pueden comprender administrar a un paciente cualquier cantidad de dosis secundarias y/o terciarias de un anticuerpo, combinación de anticuerpos, o una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une específicamente a Fel d1. Por ejemplo, en determinados aspectos, al paciente se le administra únicamente una sola dosis secundaria. En otros aspectos, al paciente se le administran dos o más (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis secundarias. Del mismo modo, en determinados aspectos, al paciente se le administra únicamente una sola dosis terciaria. En otros aspectos, al paciente se le administran dos o más (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias.

[0416] En aspectos que implican múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria puede administrarse al paciente de 1 a 2 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. De manera similar, en realizaciones que implican múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria puede administrarse al paciente de 2 a 4 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. Como alternativa, la frecuencia a la que se administran las dosis secundarias y/o terciarias a un paciente puede variar en el transcurso del régimen de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ajustarla un médico en el transcurso del tratamiento, dependiendo de las necesidades del paciente individual, después de la exploración clínica.

[0417] En algunas realizaciones, se administra una o más dosis de los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, específicos de alérgeno, dependiendo de la gravedad, la duración y/o la frecuencia de aparición de uno o más síntomas asociados a una respuesta alérgica en un paciente después de la administración, disminuyen o aumentan en comparación con la gravedad, la duración y/o la frecuencia de aparición de uno o más síntomas asociados a una respuesta alérgica en un paciente antes de la administración. En determinadas realizaciones, si el paciente presenta al menos un 30 %, al menos un 40 % o al menos un 50 % de disminución de la gravedad, duración y/o frecuencia de aparición de uno o más síntomas asociados a una respuesta alérgica en un paciente en un punto temporal medido después de la administración en comparación con las mediciones antes de la administración (es decir, puntuación de referencia), no se requieren dosis adicionales de los anticuerpos específicos de alérgeno. En otras realizaciones, si el paciente presenta una reducción del área bajo la curva (ABC) para la TNSS de al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos el 50 % o al menos el 60 %, en un punto temporal medido tras la administración en comparación con el AUC para la TNSS antes de la administración (es decir, la puntuación de referencia), no se requieren más dosis.

[0418] En algunas realizaciones, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, específico de alérgeno, se administra una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada seis meses o una vez al año. En algunas realizaciones, la frecuencia de administración se determina en función de si el paciente presenta al menos un 30 %, al menos un 40 % o al menos un 50 % de disminución de la gravedad, duración y/o frecuencia de aparición de uno o más síntomas asociados a una respuesta alérgica en un paciente en un punto temporal medido después de la administración en comparación con las mediciones antes de la administración (es decir, puntuación de referencia). Si la gravedad, la duración y/o la frecuencia de aparición de uno o más síntomas asociados a una respuesta alérgica disminuye en más de un 50 %, es posible que el paciente ya no necesite la administración del anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, específico de alérgeno. Si los síntomas no se reducen o reaparecen después de una reducción, la administración del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, específico de alérgeno, puede reanudarse hasta que se obtenga el nivel deseado de reducción de los síntomas.

[0419] Usos diagnósticos de los anticuerpos

[0420] Los anticuerpos contra Fel d1 de la presente divulgación también pueden usarse para detectar y/o medir Fel d1 en una muestra, p. ej., con fines diagnósticos. Se contempla que la confirmación de una respuesta alérgica atribuida a Fel d1 pueda realizarse midiendo la presencia de Fel d1 mediante el uso de uno o más de los anticuerpos de la presente divulgación. Los ensayos diagnósticos ilustrativos para Fel d1 pueden comprender, p. ej., poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo contra Fel d1 de la divulgación, en donde el anticuerpo contra Fel d1 está marcado con un marcador detectable o molécula indicadora o se usa como un ligando de captura para aislar selectivamente la proteína Fel d1 de las muestras del paciente. Como alternativa, en aplicaciones diagnósticas, puede usarse un anticuerpo contra Fel d1 no marcado junto con un anticuerpo secundario que de por sí está marcado de forma detectable. El marcador detectable o la molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; un residuo fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Como análisis ilustrativos específicos que pueden utilizarse para detectar o medir Fel d1 en una muestra, se incluyen, ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA,enzyme-linked immunosorbent assay), radioinmunoensayo (RIA,radioimmunoassay) y clasificación de células activada por fluorescencia (FACS,Fluorescence-Activated Cell Sorting). Las muestras que pueden utilizarse en ensayos diagnósticos de Fel d1 de acuerdo con la presente divulgación, incluyen cualquier muestra de tejido o líquido que pueda obtenerse de un paciente, que contenga cantidades detectables de proteína d1, o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. Generalmente, los niveles de Fel d1 en una muestra particular obtenida de un paciente sano/no alérgico (es decir, un paciente no afectado por una sensibilidad asociada a la presencia de Fel d1) se medirán para establecer inicialmente un nivel de referencia, o estándar, de Fel d1. Este nivel de referencia de Fel d1 puede compararse después con los niveles de Fel d1 medidos en muestras obtenidas de personas con sospecha de tener una sensibilidad a Fel d1 en caspa de gato, o síntomas asociados a dicha afección.

[0421] Ejemplos

[0422] Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de proporcionar a los expertos familiarizados con la materia, una divulgación y descripción completa de cómo preparar y utilizar los métodos y las composiciones de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran que es su invención. Se han realizado intentos para garantizar la exactitud con respecto a los números usados (p. ej., cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.

[0423] Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos contra Fel d1

[0424] Para generar anticuerpos contra Fel d1 puede utilizarse un inmunógeno que comprenda uno cualquiera de lo siguiente. En determinados aspectos, los anticuerpos se obtienen de ratones inmunizados con un inmunógeno primario, tal como Fel d1 natural de longitud completa (nFel d1), que puede adquirirse en el comercio (p. ej, de Indoor Biotechnologies, n.º LTN-FD1-1), o aislarse de pelo o caspa de gato mediante cromatografía en columna multietapa (véase, por ejemplo, Chapman MD,et al.(1988), J. Immunol. 140:812-818), o que pueden producirse de forma recombinante (véanse los números de registro P30438 o NP_001041618.1 del GenBank para la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena 1 de Fel d1 (también denominada cadena A o FELD1 A; véase también SEQ ID NO: 392) y el número de registro P30440 o NP_001041619.1 del GenBank para la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena 2 de Fel d1 (también denominada cadena B o FELD B; véase también SEQ ID NO: 393), o fragmentos de la cadena 1 o de la cadena 2, o fragmentos tanto de la cadena 1 como de la cadena 2 de la proteína Fel d1, seguido de inmunización con un inmunógeno secundario, o con un fragmento inmunogénicamente activo de la proteína natural. Los animales pueden inmunizarse con la proteína de cadena 1 sola o con la proteína de cadena 2 sola, o con ambas proteínas, la de cadena 1 y la de cadena 2, administradas de manera secuencial o simultánea. Pueden prepararse diversas construcciones utilizando partes de la cadena 1 y la cadena 2 junto con diversas estrategias de enlazador o espaciador conocidas por los expertos en la materia. Estas construcciones pueden usarse solas, o en varias combinaciones para suscitar respuestas de anticuerposin vivo. Por ejemplo, como inmunógenos pueden utilizarse construcciones de Fel d1 recombinantes, tales como las que se ilustran en las SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 o 397, o fragmentos de las mismas.

[0426] En determinados aspectos, los anticuerpos de la divulgación se obtienen de ratones inmunizados con un inmunógeno primario, tal como un fragmento biológicamente activo y/o inmunogénico de Fel d1 natural, o ADN que codifica el fragmento activo del mismo. El fragmento puede proceder del dominio aminoterminal o carboxiterminal de la cadena 1 y/o de la cadena 2 de Fel d1.

[0428] En determinados aspectos, el inmunógeno Fel d1 producido por medios recombinantes puede fabricarse por fusión directa de las dos cadenas de Fel d1, como describen Kaiser et. al., para producir un producto de fusión con un patrón de replegamiento similar al del Fel d1 natural (Kaiser, L.et al., (2003), J. Biol. Chem. 278(39):37730-37735). En determinados aspectos, el inmunógeno puede ser una proteína de fusión tal como la que se muestra en las construcciones de las SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 o 397, seguida de inmunización con un inmunógeno secundario, o con un fragmento inmunogénicamente activo de Fel d1 natural o por medios recombinantes.

[0430] En determinados aspectos, las construcciones de la proteína Fel d1 recombinante utilizadas en los estudios descritos en el presente documento comprenden i) la cadena B de Fel d1 (cadena 2) y la cadena A de Fel d1 (cadena 1) unidas como una fusión en línea continua (con la cadena B de Fel d1 en el extremo amino) o ii) una fusión en línea con la cadena A de Fel d1 en el extremo amino seguido de un enlazador flexible [(Gly4Ser)3] seguido de la cadena B de Fel d1. Estas construcciones también pueden incluir una etiqueta carboxiterminal (myc-myc-His6 o una región Fc de IgG2a de ratón), como se indica más adelante. Las proteínas se expresaron en células de ovario de hámster chino (CHO,Chinese Hamster Ovary). En los listados de secuencias, no se incluye ninguna secuencia de señal exógena utilizada para promover la expresión en células CHO.

[0432] En determinados aspectos, el inmunógeno puede ser una proteína de fusión que comprenda uno cualquiera o más de los siguientes: i) los restos de aminoácidos 18-109 de la cadena 2 de Fel d1 (véase el número de registro P30440 del GenBank y también la SEQ ID NO: 393) fusionados a través del extremo carboxilo directamente con el extremo amino de los restos de aminoácidos 23-92 de la cadena 1 de Fel d1 (véase el número de registro P30438 del GenBank y también la SEQ ID NO: 392); ii) los restos de aminoácidos 23-92 de la cadena 1 de Fel d1 (véase el número de registro P30438 del GenBank y también la SEQ ID NO: 392) fusionados a través del extremo carboxilo al extremo amino de los restos de aminoácidos 18-109 de la cadena 2 de Fel d1 (véase el número de registro P30440 del GenBank y también la SEQ ID NO: 393); iii) los restos de aminoácidos 18-109 de la cadena 2 de Fel d1 (véase el número de registro NP_001041619.1 del GenBank) fusionados a través del extremo carboxilo directamente con el extremo amino de los restos de aminoácidos 19-88 de la cadena 1 de Fel d1 (véase el número de registro NP_001041618 del GenBank), tal como la construcción mostrada en SEQ ID NO: 394 o 396; iv) los restos de aminoácidos 19-88 de la cadena 1 de Fel d1 (véase el número de registro NP_001041618.1 del GenBank) fusionados a través del extremo carboxilo con el extremo amino de los restos de aminoácidos 18-109 de la cadena 2 de Fel d1 (véase el número de registro NP_001041619.1 del GenBank). Véase también SEQ ID NO: 395). En determinados aspectos, la proteína de fusión puede tener una etiqueta en el extremo carboxílico de la construcción, tal como una etiqueta myc-mychexahistidina (véanse las SEQ ID NO: 385, 396 o 397 para dichas construcciones). En aspectos relacionados, la proteína de fusión puede tener un Fc de ratón acoplado al extremo carboxiterminal de la construcción (véanse las SEQ ID NO: 394 o 395 para dichas construcciones). En determinados aspectos, las cadenas 1 y 2 están acopladas a través de un enlazador conocido por los expertos en la materia, p. ej., (G4S)3 (véanse las SEQ ID NO: 395 y 397 para dicha construcción).

[0434] En determinados aspectos, los anticuerpos que se unen específicamente a Fel d1 pueden prepararse utilizando fragmentos de las regiones anteriormente mencionadas, o péptidos que se extienden más allá de las regiones designadas en aproximadamente 5 a aproximadamente 20 restos de aminoácidos de cualquiera, o ambos, de los extremos aminoterminal o carboxiterminal de las regiones descritas en el presente documento. En determinados aspectos, en la preparación de anticuerpos específicos de Fel d1, puede utilizarse cualquier combinación de las regiones, o fragmentos de las mismas, indicadas anteriormente. En determinados aspectos, para preparar anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos, puede utilizarse una cualquiera o más de las regiones de Fel d1, o fragmentos de las mismas, indicadas anteriormente.

[0435] Las proteínas de longitud completa, o fragmentos de las mismas, que se usaron como inmunógenos, como se ha indicado anteriormente, se administraron directamente, con un adyuvante para estimular la respuesta inmunitaria, a un ratón VELOCIMMUNE® que comprende ADN que codifica las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana. La respuesta inmunitaria del anticuerpo se controló con un inmunoensayo específico de Fel d1. Cuando se logró una respuesta inmunitaria deseada, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar estirpes celulares de hibridoma. Las estirpes celulares de hibridoma se exploraron y seleccionaron para identificar estirpes celulares que produjeran anticuerpos específicos contra Fel d1. Utilizando esta técnica y los diversos inmunógenos descritos anteriormente, varios contra Fel d1, se obtuvieron anticuerpos quiméricos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón); determinados anticuerpos ilustrativos generados de esta manera, se denominaron H1M1230N, H1M1234N, H1M1241N, H2M1233N, H2M1236N, H2M1237N y H2M1242N.

[0436] También se aislaron anticuerpos contra Fel d1 directamente de linfocitos B positivos a antígeno sin fusión a células de mieloma, como se describe en el documento U.S. 2007/0280945A1. Usando este método, se obtuvieron diversos anticuerpos contra Fel d1 completamente humanos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes humanos); los anticuerpos ilustrativos generados de esta manera se denominaron del siguiente modo: H4H2574P, H4H2590S, H4H2592B, H4H2594S, H4H2597P, H4H2606B, H4H2607B, H4H2608B, H4H2636P, H4H2645P, H4H2793P, H4H2797P y H4H2864P.

[0437] Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos ilustrativos generados de acuerdo con los métodos de este ejemplo se describen en detalle en los ejemplos que se exponen a continuación.

[0438] Ejemplo 2. Secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera

[0439] En la Tabla 1 se exponen los pares de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera de los anticuerpos específicos para Fel d1 seleccionados y sus identificadores de anticuerpo correspondientes. Los anticuerpos se denominan normalmente en el presente documento de acuerdo con la siguiente nomenclatura: prefijo Fc (por ejemplo, "H4H", "H1M, "H2M"), seguido de un identificador numérico (por ejemplo, "1232" como se muestra en la tabla 1), seguido de un sufijo "P" o "N". Por tanto, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede denominarse, por ejemplo, "H1M1232N". El H4H, H1M y H2M en las denominaciones de anticuerpo usadas en el presente documento indican la región Fc particular del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H2M" tiene una Fc de IgG2 de ratón, mientras que un anticuerpo "H4H" tiene una Fc de IgG4 humana. Como apreciará un experto familiarizado con la materia, un anticuerpo H1M o H2M puede convertirse en un anticuerpo H4H, y viceversa, pero en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDR), los cuales se indican con los identificadores numéricos mostrados en la Tabla 1, seguirán siendo los mismos. Los anticuerpos que tienen la misma designación numérica de anticuerpo, pero que se diferencian por un sufijo de letra de N, B, S o P, se refieren a anticuerpos que tienen cadenas pesadas y ligeras con secuencias CDR idénticas, pero con variaciones de secuencia en las regiones que están fuera de las secuencias CDR (es decir, en las regiones marco conservadas). Por tanto, las variantes N, B, S y P de un anticuerpo particular tienen secuencias CDR idénticas dentro de sus regiones variables de las cadenas pesada y ligera, pero difieren entre sí en sus regiones marco conservadas.

[0440] Tabla 1

[0443]

[0444] continuación

[0447]

[0450] Ejemplo 3. Análisis de utilización de genes variables

[0452] Para analizar la estructura de los anticuerpos producidos, los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables del anticuerpo se clonaron y secuenciaron. A partir de la secuencia de ácido nucleico y de la secuencia de aminoácidos prevista de los anticuerpos, se identificó el uso de genes (VH, D, JH, VK o JK) de cada Región Variable de Cadena Pesada (HCVR) y Región Variable de Cadena Ligera (LCVR). En la Tabla 2 se expone el uso de genes de los anticuerpos seleccionados de acuerdo con la divulgación.

[0454] Tabla 2

[0457]

[0458] continuación

[0461]

[0464] Ejemplo 4. Unión de anticuerpos a Fel d1 determinada mediante resonancia de plasmón superficial

[0465] Las constantes de velocidad de asociación y disociación (ka y kd, respectivamente) de la unión, así como las constantes de disociación en equilibrio y las semividas de disociación (KD y t1/2, respectivamente) calculadas para la unión del antígeno con los anticuerpos monoclonales contra Fel d1, se determinaron utilizando un ensayo con un biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real (Biacore T200 o Biacore 2000). La superficie del sensor Biacore se derivatizó con un anticuerpo policlonal de conejo contra ratón (GE Healthcare, n.º BR-1008-38) o con un anticuerpo monoclonal de ratón contra Fc humano (GE Healthcare, n.º BR-1008-39) para capturar anticuerpos contra Fel d1, expresados con Fc de ratón (prefijo de ID de anticuerpo H1M, H2M, H2aM, H2bM) o con Fc de IgG4 humana (prefijo de ID de anticuerpo H4H), respectivamente. Para los ajustes cinéticos, al menos dos concentraciones diferentes (que variaban entre 390 pM y 67 nM) de Fel d1 natural (Indoor Biotech, n.º NA-FD1-2) o de una versión recombinante de la proteína, Fel d1 (B-A)-mmH (SEQ ID NO: 396), se inyectaron sobre la superficie con anticuerpos monoclonales contra Fel d1 capturados, a 25 °C y a un caudal de 50 µl/min, en tampón de migración (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, P20 al 0,05 %, MgCl<2>3 mM, CaCl<2>3 mM). Fel d1 (B-A)-mmH se expresó en células de ovario de hámster chino (CHO) y comprendía los aminoácidos 18-109 de Fel d1 B (registro n.º P30440) fusionados en línea con los aminoácidos 23-92 de Fel d1 A (registro n.º P30438) con una etiqueta myc-myc-hexahistidina carboxiterminal. La asociación antígeno-anticuerpo se controló durante 3 a 5 minutos, y la disociación del antígeno del anticuerpo monoclonal capturado (en tampón de migración solo a 25 °C) se controló durante 10 o 15 minutos. Las constantes cinéticas de velocidad de asociación (k<a>) y disociación (kd) se determinaron procesando y ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 usando el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0. Las constantes de disociación en equilibrio (KD) y las semividas de disociación (t1/2) de la unión, se calcularon a partir de las constantes cinéticas de velocidad de la siguiente manera: KD = kd/ka y t1/2 = ln(2)/kd. En las Tablas 3 y 4 se muestran los parámetros de unión de los diferentes anticuerpos monoclonales contra Fel d1. En la Tabla 3 se muestra las afinidades determinadas por Biacore a 25 °C para la unión de Fel d1 natural a anticuerpos monoclonales contra Fel d1 capturados y en la Tabla 4 se muestra las afinidades determinadas por Biacore a 25 °C para la unión de Fel d1 recombinante a anticuerpos monoclonales contra Fel d1 capturados.

[0467] Como se muestra en la Tabla 3, 10 de los 25 anticuerpos analizados presentaron valores de KD inferiores a 1 nM para la unión al Fel d1 natural, que variaban entre 207 pM y 982 pM). Como se muestra en la Tabla 4, 17 de los 25 anticuerpos analizados presentaron valores de KD inferiores a 1 nM para la unión a Fel d1 recombinante, que variaban entre 144 pM y 924 pM). Dos de los anticuerpos, H4H2574B y H4H2793P, se unieron a Fel d1 recombinante, pero no a Fel d1 natural, en estas condiciones experimentales

[0468] Tabla 3

[0469]

[0471] Tabla 4

[0472]

[0473] continuación

[0475]

[0478] Ejemplo 5. Competencia cruzada de los anticuerpos contra Fel d1 para unirse a Fel d1 natural (n)

[0480] Se realizó un experimento de unión utilizando un sistema biosensor Octet Red (Fortebio Inc,) para determinar la competencia cruzada de un panel de 8 anticuerpos contra Fel d1 en su unión a Fel d1 natural (nFel d1; Indoor Biotechnologies, n.º NA-FD1-2). El experimento se realizó a 25 °C en tampón HBST (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v) que contenía BSA 0,1 mg/ml. Se realizó una etapa de lavado con el tampón HBST entre cada etapa de unión, y las placas se agitaron durante las etapas de unión y lavado utilizando un agitador orbital de placas a 1000 rpm. Se capturó un primer anticuerpo contra Fel d1 (Acm-1) durante 2 minutos sobre la superficie del biosensor contra hFc a partir de soluciones madre de anticuerpo a 10 ug/ml (niveles finales de captura ~1,5 nm unidades de respuesta). A continuación, las puntas del sensor recubiertas se bloquearon durante 5 minutos con una solución de 100 ug/ml de un anticuerpo irrelevante. Después, las puntas del sensor se sumergieron en pocillos que contenían 500 nM de nFel d1 durante 5 minutos y, a continuación, en pocillos que contenían soluciones de 50 ug/ml de un segundo anticuerpo contra Fel d1 (Acm-2). Las soluciones del AcM-2 se complementaron con 100 ug/ml de un anticuerpo irrelevante para minimizar la unión inespecífica. Se midieron las respuestas de unión del Acm-2 al unirse a nFel d1 previamente formando un complejo con el Acm-1 para la matriz de anticuerpos 8x8 (Tabla 5). Cada valor de unión del Acm-2 a una superficie de captura Acm-1/Fel d1 diferente (columna inferior de la Tabla 5) se restó del valor de autocompetencia Acm-1/Fel d1/Acm-2 (donde Amc-1 = Acm-2; en la diagonal de la Tabla 5). Los valores inferiores a 0,10 nm indican una competencia cruzada del Acm-1 y Acm-2 hacia un sitio de unión común en Fel d1.

[0482] Cuatro anticuerpos, H4H2636P, H4H1616N, H4H2645P y H4H2864P, compiten bidireccionalmente entre sí por la unión a nFel d1, pero no compiten con ninguno de los otros anticuerpos contra Fel d1. Dos anticuerpos, H4H1232N y H4H2597P, compiten bidireccionalmente entre sí por la unión a nFel d1. Tanto H4H1232N como H4H2597P compiten unidireccionalmente con H4H1300N. La competencia bidireccional con H4H1300N no pudo determinarse porque H4H1300N no formó previamente un complejo con nFel d1. H4H1238N no compitió con ninguno de los anticuerpos contra Fel d1 en la unión a nFel d1.

[0483] Tabla 5

[0485]

[0488] Ejemplo 6. Efecto de los anticuerpos contra Fel d1 en un modelo in vivo de anafilaxia cutánea pasiva (ACP)

[0489] Para evaluar la desgranulaciónin vivode los mastocitos, se utilizó el modelo de anafilaxia cutánea pasiva (ACP)in vivo.El modelo consiste en la inyección intradérmica de un antisuero específico de alérgeno en una zona local de la piel, seguido de inyección intravenosa de un antígeno junto con un colorante. La reacción alérgica provoca dilatación capilar y aumento de la permeabilidad vascular en el lugar de sensibilización, dando lugar a una acumulación preferencial de colorante en este lugar. El colorante puede extraerse del tejido y cuantificarse mediante espectrofotometría. La extravasación de colorante en el tejido sensibilizado con el antisuero de ensayo se compara con la extravasación en el tejido sensibilizado con un antisuero no relevante.

[0491] Los antisueros se generaron inmunizando ratones Balb/c con 5 µg de proteína Fel d1 natural purificada de extracto de pelo de gato (Indoor Biotechnologies, n.º LTN-FD1-1), con 5 µg de extracto crudo de alérgeno de cacahuete (Greer Laboratories, n.º XPF171D3A25) o con 1250 (UAB, unidades alérgicas bioequivalentes) de extracto normalizado de pelo de gato (Greer Laboratories, n.º GTE3A01) en una solución de 1 mg/ml de alumbre (Pierce, n.º 77161) en solución salina tamponada con fosfato 1X. Dos semanas después (día 14), los ratones sensibilizados recibieron dosis de refuerzo de alérgeno, idénticas a las utilizadas en la inmunización inicial. Dos semanas después del refuerzo (día 28), se sacrificó a los ratones y se recogió su suero. La concentración total de IgE en los antisueros aislados se determinó mediante ELISA. La concentración final de antisuero se diluyó a 2400 ng/ml de IgE en solución salina tamponada con fosfato 1X.

[0493] Para determinar el efecto de los anticuerpos contra Fel d1 sobre la desgranulación de los mastocitos en el modelo de ACP, antes de la sensibilización auricular con antisuero generado como se ha descrito anteriormente, grupos de ratones Balb/c se inyectaron primero por vía subcutánea con un anticuerpo de control de isotipo IgG4 humano, con un anticuerpo contra Fel d1 o con una combinación de anticuerpos contra Fel d1 a dosis de 5 mg/kg (dosis total de anticuerpo, 2,5 mg/kg de cada anticuerpo) para experimentos univariados, salvo que se indique lo contrario, o a concentraciones que variaban entre 0,06 mg/kg y 2 mg/kg, para experimentos de determinación de intervalo de dosis. Tres días después del tratamiento previo con anticuerpos, un grupo de ratones ("grupo con Fel d1 natural") se sensibilizó mediante inyección intradérmica con 10 µl de antisuero derivado de Fel d1 natural o 10 µl de antisuero derivado de cacahuete (control negativo) en las orejas derecha e izquierda, respectivamente, de cada ratón. Un segundo grupo de ratones ("grupo con extracto de gato") se sensibilizó con 20 µl de antisuero derivado de extracto de pelo de gato o con 20 µl de antisuero derivado de cacahuete (control negativo) en las orejas derecha e izquierda, respectivamente, de cada ratón. Veinticuatro horas después de la sensibilización, los ratones del grupo con Fel d1 natural se expusieron mediante inyección intravenosa (100 µl por ratón) de una solución de 0,25 µg/ml de Fel d1 natural (Indoor Biotechnologies, n.º LTN-FD1-1) disuelto en solución salina tamponada con fosfato 1X que contenía colorante azul de Evans al 0,5 % (p/v) (Sigma, n.º E2129). De manera similar, 24 horas después de la sensibilización, los ratones del grupo con extracto de gato se expusieron a 250 UAB de extracto normalizado de pelo de gato [extracto normalizado de pelo de gato (Greer Laboratories, #GTE3A01)] disuelto en solución salina tamponada con fosfato 1X que contenía colorante azul de Evans al 0,5 % (p/v) (Sigma,n.º E2129). Una hora después de la exposición al antígeno, los ratones se sacrificaron, se extirparon las orejas, se colocaron en 1 ml de formamida y se incubaron durante 3 días a 56 °C para extraer del tejido el colorante azul de Evans. Después, el tejido del pabellón auricular se retiró de la formamida, se secó con papel absorbente para eliminar el exceso de líquido y se pesó. Partes alícuotas de doscientos microlitros de cada extracto de formamida se transfirieron a placas de 96 pocillos por duplicado. La absorbancia de los sobrenadantes resultantes se midió a 620 nm. La DO se convirtió a concentración de colorante azul de Evans utilizando una curva estándar. Se calculó la concentración promedio del colorante azul de Evans extravasado en el tejido del pabellón auricular sensibilizado con antisueros (normalizado por peso de tejido de pabellón auricular) del grupo tratado con el anticuerpo de control de isotipo y se definió como F(isotipo,promedio). La reducción de la extravasación de colorante azul de Evans resultante del pretratamiento con anticuerpo, se calculó por ratón restando la cantidad de colorante azul de Evans de la oreja sensibilizada con Fel d1 o con extracto del grupo tratado con el anticuerpo, definida como F(Acm,i), de F(isotipo,promedio). A continuación, este valor se dividió por la diferencia entre F(isotipo,promedio) y la cantidad de colorante en la oreja sensibilizada con cacahuete del grupo tratado con el anticuerpo [P(Acm,i)] y se multiplicó por 100 para obtener el porcentaje total de reducción de la extravasación del colorante por cada ratón (% de Reducción).

[0494] % de reducción (por ratón) = 100*[F(isotipo,promedio) - F(Acm,i)]/[F(isotipo,promedio) - P(Acm,i)]

[0495] Después, se calculó el porcentaje promedio de reducción de la filtración de colorante para cada grupo de anticuerpo. Los resultados, expresados como (media ± DE) del porcentaje promedio de reducción de colorante azul de Evans, se muestran en las Tablas 6 y Tabla 7 para el grupo con Fel d1 natural y en la Tabla 8 para el grupo con extracto de pelo de gato.

[0496] Como se muestra en la Tabla 6, siete grupos de ratones del grupo con Fel d1 natural, cuando se trataron con combinaciones específicas de anticuerpos contra Fel d1 a concentraciones fijas, mostraron reducciones en la extravasación del colorante que variaron entre el 79 % y el 103 % en comparación con los ratones que recibieron el anticuerpo de control. Los ratones tratados con combinaciones de anticuerpos por pares H4H2590S/H4H1238N, H4H2590S/H4H2574P o H4H1232N/H4H1616N, mostraron una reducción inferior al 3 % en la extravasación del colorante en comparación con los ratones que recibieron anticuerpo de control, lo que demuestra que no todos los anticuerpos contra Fel d1 analizados en este modelo fueron eficaces.

[0497] Además, se realizaron experimentos de determinación de la dosis con ratones del grupo con Fel d1 natural, como se muestra en la Tabla 7. Los anticuerpos individuales no fueron tan eficaces para reducir la extravasación de colorante como las combinaciones de anticuerpos contra Fel d1 a las dosis analizadas.

[0498] Un par específico de anticuerpos contra Fel d1 (H4H2636P y H4H1232N) a niveles de dosis múltiples, así como cada uno de estos anticuerpos contra Fel d1 en solitario a un solo nivel de dosis (el más alto), se analizó adicionalmente en el modelo de ACP utilizando ratones sensibilizados y expuestos a extracto de pelo de gato, como se muestra en la Tabla 8. A 2 mg/kg, estos anticuerpos contra Fel d1 por sí solos no fueron tan eficaces para reducir la extravasación de colorante como la combinación de los dos anticuerpos. La combinación de H4H2636P y H4H1232N tanto a 2 mg/kg como a 1 mg/kg redujo la extravasación de colorante en más del 90 % en comparación con el control de isotipo en el modelo de ACP utilizando extracto de pelo de gato como antígeno.

[0499] Se señalan con un asterisco (*) todas las reducciones que fueron estadísticamente significativas (p<0,05) en comparación con el control de isotipo, según se determinó mediante ANOVA bidireccional con la prueba posterior de Bonferroni. En las tablas, el número de ratones utilizados por grupo (n) se indica entre paréntesis.

[0500] Tabla 6

[0503]

[0504] continuación

[0507]

[0509] Tabla 7

[0511]

[0513] Tabla 8

[0516]

[0518] Ejemplo 7. Efecto de los anticuerpos contra Fel d1 en un modelo de inflamación pulmonar in vivo

[0519] El modelo de ratón de inflamación pulmonarin vivose utiliza para evaluar la inflamación pulmonar inducida por alérgenos y la acumulación de mucosidad que podría estar asociada al asma o la rinoconjuntivitis. El modelo consiste en la administración intranasal repetida de un alérgeno a ratones previamente sensibilizados al alérgeno. La inflamación asociada al alérgeno puede provocar aumentos de la acumulación de mucosidad pulmonar, la migración de eosinófilos al pulmón, los niveles en suero IgE total y los niveles de IgG1 específica de alérgeno.

[0521] Se inmunizó a ratones Balb/c por vía intraperitoneal con 1 ug de proteína Fel d 1 natural purificada de extracto de pelo de gato (Indoor Biotechnologies, n.º LTN-FD1-1) en una solución de 1 mg/ml de alumbre (Pierce, n.º 77161) en solución salina tamponada con fosfato 1X. Siete días después, los ratones sensibilizados recibieron dosis de refuerzo por vía intraperitoneal con 1 ug de Fel d 1 natural en una solución de 1 mg/ml de alumbre en solución salina tamponada con fosfato 1X. Los días 17, 21 y 25, grupos de ratones (n=5) recibieron una inyección subcutánea de un anticuerpo de control del isotipo IgG4 humano o de una combinación 1:1 de anticuerpos contra Fel d 1, H4H1232N y H4H2636P, a 20 mg/kg (dosis total de anticuerpo). Los días 20, 24 y 28, los ratones se expusieron por vía intranasal a 0,05 ug de Fel d 1 natural diluido en 20 ul de solución salina tamponada con fosfato 1X. Los mismos días, los ratones de control se expusieron a 20 ul de solución salina tamponada con fosfato 1X. El día 32, todos los ratones se sacrificaron y se extrajeron sus pulmones. El protocolo experimental de dosificación y tratamiento de los grupos de ratones se muestra en la Tabla 9.

[0523] Para determinar la IgE total circulante y la IgG1 específica de Fel d 1 en el suero de los ratones, se recogieron muestras de suero de cada ratón mediante punción cardíaca terminal utilizando una jeringa TB 27G1/2 de 1 ml (Becton Dickinson, n.º 309306) con una aguja acoplada. Las muestras de sangre se colocaron en tubos separadores de suero BD microtainer® (Becton Dickinson, n.º 365956), se centrifugaron y, posteriormente, el suero se transfirió a un tubo nuevo para su almacenamiento hasta el momento del análisis.

[0525] Para determinar la concentración total de IgE en las muestras de suero de cada ratón, se utilizó un kit ELISA OPTEIA en sándwich (BD Biosciences, n.º 555248) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras de suero se diluyeron y se incubaron con el anticuerpo de captura contra IgE recubierto en placas de 96 pocillos. La IgE total se detectó con anticuerpo secundario contra IgE de ratón biotinilado. Como patrón se utilizó IgE de ratón purificada marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP,horseradish peroxidase). Para detectar la actividad de la HRP, se utilizó el cromógeno 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (conjunto de reactivos sustrato BD OPTEIA, BD, n.º 555214). A continuación, se añadió una solución de parada de ácido sulfúrico 1 M y se midió la absorbancia a 450 nm en un lector de placas SpectraMax M5 de Molecular Devices. El análisis de los datos se realizó con el programa informático Prism<™>. Las cantidades medias de los niveles circulantes de IgE en suero de cada grupo experimental se expresan en ng/ml (± EEM) como se muestra en la Tabla 10. Los ratones expuestos a Fel d 1 por vía intranasal cuando se trataron con la combinación de anticuerpos contra Fel d 1 presentaron una disminución significativa de la cantidad de IgE circulante [6683 (±1394) ng/ml] en comparación con los ratones que recibieron el anticuerpo de control del isotipo [14080 (±1505) ng/ml].

[0527] Para determinar los niveles de IgG1 específica de Fel d 1 en las muestras de suero de cada ratón, se utilizó un ELISA. Las placas recubiertas con Fel d 1 se incubaron con muestras de suero de ratón diluidas en serie, seguido de incubación con anticuerpo contra IgG1 de ratón conjugado con HRP (BD Biosciences, n.º 559626). Todas las muestras se revelaron con una solución de TMB y se analizaron como se ha descrito anteriormente. Los niveles relativos de IgG1 circulante en suero se representaron como unidades de título (las unidades de título se calcularon multiplicando la DO medida por un factor de dilución necesario para alcanzar una DO450 superior a dos veces el fondo). Los niveles circulantes medios de IgG1 específica de Fel d 1 en suero de cada grupo experimental se expresan como título x 10<3>(±EEM) como se muestra en la Tabla 11. Los ratones expuestos a Fel d 1 por vía intranasal, cuando se trataron con la combinación de anticuerpos contra Fel d 1 presentaron una disminución significativa de la cantidad de niveles de IgG1 específica de Fel d 1 en suero [título de 105,3 (±31,33) x10<3>] en comparación con los ratones que recibieron anticuerpos de control del isotipo [título de 526,1 (±144,0) x10<3>].

[0529] Extracción de pulmones para análisis de infiltrado celular:

[0531] Después del desangramiento, el pulmón derecho de cada ratón se extrajo y se colocó en una pequeña placa de Petri que contenía medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Irvine Scientific, n.º 9033), y se cortó en cubos de aproximadamente 2 a 3 mm de tamaño. A continuación, los cubos se transfirieron a un tubo que contenía una solución de 20 µg/ml de ADNasa (Roche, n.º 10104159001) y 0,7 U/ml de Liberasa TH (Roche, n.º 05401151001) diluida en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) (Gibco, n.º 14025) y se colocaron en un baño de agua a 37 °C durante 20 minutos con agitación en vórtex cada 5 minutos. A continuación, esta reacción se detuvo añadiendo ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (Gibco, n.º 15575) a una concentración final de 10 mM. Cada pulmón se trituró, se filtró a través de un filtro de 70 µm, se centrifugó y, a continuación, el sedimento pulmonar se resuspendió en 4 ml de tampón de lisis ACK (Gibco, n.º 10492) para eliminar los glóbulos rojos. Después de una incubación durante 3 minutos a temperatura ambiente, se añadió DMEM para desactivar el tampón ACK. Las suspensiones celulares se centrifugaron, y los sedimentos celulares se resuspendieron a continuación en 10 ml de solución tampón MACS [una mezcla de Miltenyi auto MACS Rinsing Solution (Militenyi Biotec, n.º 130-091-222) y MACS BSA (Militenyi Biotec, n.º 130-091-376)]. Las muestras resuspendidas se filtraron a través de un filtro de 70 µm y se sembraron 1x10<6>células en una placa de 96 pocillos con fondo en V. A continuación, las células se centrifugaron y los sedimentos se resuspendieron en bloque Fc de rata contra CD16/CD32 de ratón purificado, (BD Biosciences Clone: 2.4G2, n.º 553142) diluido en tampón MACS durante 15 minutos a 40 °C. Las células se lavaron dos veces y a continuación se incubaron en la mezcla de anticuerpos adecuada (descrita en la Tabla 12) diluida en tampón MACS durante 30 minutos a 4 °C protegida de la luz. Después de la incubación de anticuerpos, las células se lavaron dos veces en tampón MACS y se resuspendieron en BD cytofix (BD Biosciences, n.º 554655) durante 15 minutos a 4 °C mientras se protegían de la luz. Las células se lavaron, se resuspendieron en tampón MACS y a continuación se transfirieron a tubos BD FACS (BD Biosciences, n.º 352235) para el análisis de los eosinófilos mediante citometría de flujo. Los eosinófilos se definieron como células CD45+, GR1-, CD11clo, SiglecFhi. Los datos se expresan como frecuencia de eosinófilos en células CD45+ (± EEM) en la Tabla 13.

[0532] Los ratones expuestos a Fel d 1 por vía intranasal, cuando se trataron con la combinación de anticuerpos contra Fel d 1 presentaron una disminución significativa en la frecuencia de eosinófilos en la población de células CD45+ en comparación con los ratones que no recibieron ningún anticuerpo (disminución del 67 %) o que recibieron anticuerpos de control del isotipo (disminución del 46 %) como se muestra en la Tabla 13.

[0533] Extracción de pulmones para análisis histológico:

[0534] Después del desangramiento, se extrajeron los pulmones izquierdos y se colocaron en tubos que contenían una solución de 5 ml de paraformaldehído al 4 % (p/v) (Boston Bioproducts, n.º BM-155) en solución salina tamponada con fosfato 1X y se conservaron a temperatura ambiente durante 3 días. A continuación, las muestras de pulmón se secaron con papel absorbente y se transfirieron a tubos que contenían etanol al 70 % para su análisis histológico. Las muestras se enviaron a Histoserv, Inc (Germantown, MD) para el seccionamiento y la tinción con ácido peryódico de Schiff (PAS,periodic acid Schiff).

[0535] Se adquirieron aproximadamente 35 imágenes digitales de toda la zona de cada sección pulmonar teñida con PAS utilizando un microscopio óptico Zeiss Axioplan 2 Imaging con una cámara Zeiss AxioCam MRc. A continuación, se construyó una imagen de todo el pulmón a partir de las imágenes más pequeñas y se analizó utilizando el programa informático ImageJ con la ayuda de un complemento de umbral de color. Las regiones de acumulación de mucosidad en la luz bronquial se identificaron y cuantificaron mediante un umbral de color elegido por el usuario y se normalizaron con respecto a la zona total de la luz que se identificó y cuantificó mediante un ajuste de umbral de color independiente. El porcentaje de la luz bronquial ocupada por acumulación de mucosidad en cada pulmón se expresó como [(zona de mucosidad/zona de la luz) x 100] y se calculó para cada grupo de tratamiento. Los resultados, expresados como porcentaje medio de obstrucción pulmonar (± EEM) se muestran en la Tabla 14.

[0536] Los ratones tratados con la combinación de anticuerpos contra Fel d 1 presentaron una tendencia a la reducción de la acumulación de mucosidad en los bronquios pulmonares (5,21+/-0,81 % de acumulación de mucosidad) en comparación con los ratones que recibieron el anticuerpo de control (10,81+/- 1,13 % de acumulación de mucosidad) en el modelo de inflamación pulmonar, como se muestra en la Tabla 14. No se observaron diferencias en el tamaño de la luz bronquial ni en el tamaño total del pulmón entre los grupos de ratones.

[0537] Tabla 9: Protocolo ex erimental de dosificación tratamiento ara ru os de ratones Balb/c

[0539]

[0541] Tabla 10: Niveles totales de I E circulante en suero de ratón

[0543]

[0544] Tabla 11: I G1 es ecífica de Fel d 1 circulante en suero de ratón

[0546]

[0548] Tabla 12: Anticuer os utilizados ara el análisis or citometría de fluo

[0551]

[0553] Tabla 13: Frecuencia de eosinófilos en células CD45+ determinada or citometría de fluo

[0555]

[0557] Tabla 14: Obstrucción ulmonar zona con mucosidad/zona de lumen, %

[0559]

[0561] Ejemplo 8. Mapeo de epítopos mediante intercambio de hidrógeno y deuterio

[0562] Para determinar los epítopos de Fel d1 (una proteína heterodimérica comprendida por la cadena A de Fel d1 y la cadena B de FELD1) reconocidos por dos anticuerpos contra Fel d1, se realizaron estudios utilizando intercambio de hidrógeno y deuterio (H/D).

[0563] Se realizaron estudios de cada anticuerpo que formaba conjuntamente un complejo con Fel d1. Antes de los experimentos de intercambio de H/D, la proteína Fel d1 recombinante expresada en células CHO, que comprendía los aminoácidos 18-109 de la cadena B de Feld1 (número de registro NP_001041619.1 de GenBank) fusionados en línea con los aminoácidos 19-88 de FELD1 A (número de registro NP_001041618.1 de GenBank) expresada con una etiqueta de myc-myc-hexahistidina carboxiterminal y con una mutación D27G (Fel d1B-A-mmH; SEQ ID: 396) se desglucosiló a 37 °C durante 4 horas en condiciones naturales utilizando PNGasa F (New England BioLabs, n.º 0704). Para este estudio, siguiendo el protocolo del fabricante, dos anticuerpos contra FELD1 (H4H1232N y H4H2636P) se unieron por enlace covalente a perlas de agarosa N-hidroxisuccinimida (NHS) (GE Lifescience, n.º 17-0906-01).

[0564] Para mapear el epítopo de unión a Fel d1B-A-mmH reconocido por H4H1232N, se realizaron dos series de experimentos de intercambio de H/D (todas las reacciones de unión e intercambio se llevaron a cabo a temperatura ambiente). En el primer experimento se utilizó un formato "en solución/fuera de perlas (intercambio en solución seguido de intercambio fuera de perlas). Para el intercambio, la proteína Fel d1B-A-mmH desglucosilada se deuteró durante 5 y 10 minutos (en dos subexperimentos distintos) en tampón PBS a pH 7,4 preparado con D<2>O (PBS-D) y a continuación, se unió a las perlas H4H1232N durante una incubación de 2 minutos en PBS-D. El cocomplejo de Fel d1B-A-mmH unido a las perlas H4H1232N se lavó después con tampón PBS a pH 7,4 preparado con H<2>O (PBS-H) y se incubó en PBS-H durante la mitad del tiempo de intercambio activo (intercambio fuera de las perlas), permitiendo que sólo los epítopos de Fel d1B-A-mmH protegidos por la unión del anticuerpo H4H1232N permanezcan deuterados. Después del intercambio fuera de perlas, la proteína Fel d1B-A-mmH unida se eluyó de las perlas utilizando una solución acuosa helada de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 %. A continuación, la proteína Fel d1B-A-mmH eluida se digirió con pepsina inmovilizada (Thermo Scientific, n.º 20343) durante 5 minutos a 4 °C. Los péptidos resultantes se desalinizaron a 4 °C utilizando puntas de pipeta cromatográficas ZipTip (Millipore, n.º ZTC18S096) según el protocolo del fabricante y a continuación se analizaron inmediatamente en un espectrómetro de masas (MS) UltrafleXtreme de ionización por desorción láser asistida por matriz con tiempo de vuelo (MALDI-TOF,matrix assisted laser desorption ionization time of flight).

[0566] El segundo experimento se denomina 'en perlas/fuera de perlas' (intercambio en perlas seguido de intercambio fuera de perlas). Para este experimento, la proteína Fel d1B-A-mmH desglucosilada se unió primero a las perlas H4H1232N y, a continuación, se incubó durante 5 o 10 minutos (en subexperimentos distintos) en PBS-D para permitir el intercambio en perlas. Las siguientes etapas (intercambio fuera de perlas, digestión con pepsina y análisis por espectroscopia de masas (EM)) se realizaron como se ha descrito en el procedimiento anterior 'en solución/fuera de perlas'. Se calcularon los valores centroide o la relación de masa-carga (m/z) promedio de todos los péptidos detectados y se compararon entre los experimentos en solución/fuera de perlas y en perlas/fuera de perlas. Los péptidos que presentan un aumento de masa tras el procedimiento en solución/fuera de perlas en comparación con el procedimiento en perlas/fuera de perlas incluyen aminoácidos dentro de la proteína Fel d1 protegidos del intercambio como resultado de la unión de anticuerpos y, por tanto, revelan regiones epitópicas de unión.

[0568] El experimento de intercambio de H/D para detectar la unión de Fel d1B-A-mmH al anticuerpo contra Fel d1, H4H2636P, se realizó utilizando el mismo procedimiento que el descrito anteriormente para H4H1232N, pero con perlas H4H2636P en lugar de perlas H4H1232N.

[0570] En la Tabla 15 se muestra una comparación de los valores m/z del centroide de todos los péptidos detectados en el experimento de intercambio de H/D de Fel d1B-A-mmH con H4H1232N. Estos péptidos se identificaron mediante EM por desorción/ionización láser asistida por matriz acoplada a cromatografía líquida (LC-MALDI). La mayoría de los péptidos pépticos dieron valores centroide similares (diferencias < 0,3 unidades m/z) tanto para los protocolos en solución/fuera de perlas como en perlas/fuera de perlas, para cada uno de los dos diferentes tiempos de intercambio, dentro y fuera. Sin embargo, tres péptidos con aminoácidos comprendidos entre 85-103, 85-104 y 113-127 de Fel d1B-A-mmH (SEQ ID NO: 396) tenían diferencias en los valores centroide m/z > 0,3 tanto en los experimentos de 5 minutos como en los de 10 minutos. Las diferencias entre estos valores centroide del protocolo en solución/fuera de perlas y en perlas/fuera de perlas se destacan en negrita en la Tabla 15. Dado que otro péptido, aminoácidos 117-127 de SEQ ID NO: 396, no mostró retención de deuterio después del intercambio fuera de perlas, la región de protección del intercambio en el péptido 113-127 puede reducirse a los restos 113-116 de SEQ ID NO: 396. Las dos regiones, restos 85-104 (SEQ ID NO: 403) y 113-116 (SEQ ID NO: 426), están frente al intercambio completo fuera en perlas como resultado de la unión de H4H1232N a Fel d1B-A-mmH después del intercambio en perlas. Por lo tanto, estos dos segmentos se definen mediante el método de intercambio de H/D como un epítopo discontinuo para el anticuerpo H4H1232N que se une a la proteína Fel d1B-A-mmH.

[0572] Las comparaciones de los valores m/z del centroide de los péptidos detectados en el experimento de intercambio de H/D de Fel d1B-A-mmH formando complejo con H4H2636P se muestran en la Tabla 16. Sólo un péptido, aminoácidos 15-24 del FELD1B-A-mmH, mostró un aumento de los valores m/z del centroide > 0,3 m/z para la condición en solución/fuera de perlas en comparación con la condición en perlas/sin perlas, lo que indica que este segmento estaba protegido desde el intercambio total fuera de perlas por la unión de H4H2636P. Las diferencias en los valores centroide superiores a 0,3 m/z se destacan en negrita en la Tabla 16. Por lo tanto, los aminoácidos dentro de esta región 15-24 (SEQ ID NO: 412), en base al método de intercambio de H/D, incluyen un epítopo para la unión del anticuerpo H4H2636P a la proteína Fel d1B-A-mmH.

[0573] Tabla 15:El efecto sobre el intercambio de H/D de la unión de H4H1232N a Fel d1B-A-mmH medido por los valores centroides m/z de los étidos é ticos

[0574]

[0575] continuación

[0576]

[0578] Tabla 16:El efecto sobre el intercambio de H/D de la unión de H4H2636P a Fel d1B-A-mmH medido por los valores centroides m/z de los étidos é ticos

[0579]

[0580] (continuación)

[0581]

[0582] (continuación)

[0584]

[0586] Ejemplo 9. Generación de anticuerpos biespecíficos

[0587] Descripción de los anticuerpos biespecíficos Fel d 1 producidos

[0588] Los anticuerpos biespecíficos que comprenden dominios de unión de cadena pesada y ligera de pares de determinados anticuerpos contra Fel d1 descritos en la presente invención, se construyeron utilizando metodologías estándar. Los anticuerpos contra Fel d1 utilizados para construir los anticuerpos biespecíficos de este ejemplo, se obtuvieron inmunizando un ratón VelocImmune<®>con un inmunógeno primario, tal como Fel d1 natural de longitud completa, que puede adquirirse en el comercio (p. ej, de Indoor Biotechnologies, n.º LTN-FD1-1), o aislarse de pelo o caspa de gato mediante cromatografía en columna multietapa (véase, por ejemplo, Chapman MD,et al.(1988), J. Immunol.140:812-818), o que pueden producirse de forma recombinante (véanse los números de registro P30438 o NP_001041618.1 del GenBank para la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena 1 de Fel d1 (también denominada cadena A o FELD1 A; véase también SEQ ID NO: 392) y el número de registro P30440 o NP_001041619.1 del GenBank para la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena 2 de Fel d1 (también denominada cadena B o FELD B; véase también SEQ ID NO: 393), o fragmentos de la cadena 1 o de la cadena 2, o fragmentos tanto de la cadena 1 como de la cadena 2 de la proteína Fel d1, seguido de inmunización con un inmunógeno secundario, o con un fragmento inmunogénicamente activo de la proteína natural. En una realización, el inmunógeno utilizado se ilustra en la SEQ ID NO: 394 (fusión en línea de la cadena 2 de Fel d1-cadena1-mFc) o en la SEQ ID NO: 395 (fusión de la cadena 1 de Fel d1 utilizando un enlazador y cadena 2-mFc).

[0589] Los anticuerpos biespecíficos producidos de acuerdo con el presente Ejemplo comprenden dos dominios de unión a antígeno (es decir, "brazos de unión 1 y 2").

[0590] Uno de los anticuerpos biespecíficos, denominado H4H3467D, comprende una cadena ligera kappa común en ambos brazos Fab, derivada del anticuerpo H4H2864P (SEQ ID NO: 378). Un brazo Fab de H4H3467D utiliza la región variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo H4H2864P (SEQ ID NO: 370), mientras que el otro brazo Fab utiliza la región VH de H4H1232N (SEQ ID NO: 18).

[0591] Un segundo anticuerpo biespecífico de la invención, denominado H4H8751D, comprende una cadena ligera kappa común en ambos brazos Fab, derivada del anticuerpo H4H2636P (SEQ ID NO: 314). Un brazo Fab de H4H8751D utiliza la región VH de H4H2636P (SEQ ID NO: 306), mientras que el otro brazo Fab utiliza la región VH de H4H1232N (SEQ ID NO: 18).

[0592] La Tabla 17 a continuación proporciona las partes componentes de los dominios de unión a antígeno de los dos anticuerpos biespecíficos fabricados de acuerdo con el Ejemplo 9. Los identificadores de secuencia de aminoácidos de las diversas regiones variables de cadena pesada y cadena ligera que derivaron de los anticuerpos precursores (utilizados para preparar los anticuerpos biespecíficos) también se proporcionan en la Tabla 17.

[0593] Tabla 17. Com onentes de los dos brazos de los anticuer os bies ecíficos roducidos

[0595]

[0597] En las Tablas 18A y 18B a continuación se exponen los identificadores de secuencia de aminoácidos de las diversas regiones variables de cadena pesada (Tabla 18A) y regiones variables de cadena ligera (Tabla 18B) y sus correspondientes secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR) de los dos anticuerpos biespecíficos descritos en el presente documento.

[0598] Tabla 18A. Identificadores de secuencia de HCVR HCDR de los anticuer os bies ecíficos roducidos

[0600]

[0602] Tabla 18B. Identificadores de secuencia de LCVR LCDR de los anticuer os bies ecíficos roducidos

[0604]

[0606] Análisis Biacore de anticuerpos biespecíficos para determinar los valores de asociación y disociaciónLas constantes de velocidad de asociación y disociación de unión (ka y kd, respectivamente), las constantes de disociación en equilibrio y las semividas de disociación (KD y t1/2, respectivamente) de la unión de Fel d 1 natural (posteriormente denominado nFel d 1) a los anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos contra Fel d 1 purificados, se determinaron utilizando un ensayo biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real en un instrumento Biacore 2000. En una microplacaCM5, utilizando la química EDC-NHS, la superficie del sensor Biacore se derivatizó con un anticuerpo contra Fc humano de ratón monoclonal (GE, n.º BR-1008-39) para capturar anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos contra Fel d 1. Todos los estudios de unión Biacore se realizaron a 25 °C en tampón de migración HBSP+ (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, CaCl23 mM, MgCl23 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v). Diferentes concentraciones de nFel d 1 (Indoor Biotech, n.º NA-FD1-2) (en un intervalo de 600 nM a 2,34 nM, diluciones séxtuples) preparadas en tampón de migración HBSP+ se inyectaron sobre la superficie capturada del anticuerpo contra Fel d 1 a un caudal de 50 µl/min. La asociación de nFel d 1 a los anticuerpos monoclonales capturados se monitorizó durante 4 minutos y la disociación de nFel d 1 en el tampón de migración HBSP+ se monitorizó durante 7 minutos. Se determinaron las constantes cinéticas de asociación (ka) y disociación (kd) ajustando los sensorgramas de unión en tiempo real a un modelo de unión 1:1 con limitación de transporte de masa utilizando el programa informático de ajuste a la curva Scrubber 2.0c. Las constantes en equilibrio de disociación de unión (KD) y las semividas (t½) disociativas se calcularon a continuación a partir de las constantes de velocidad cinética de la siguiente manera: KD (M) = kd / ka y t½ (min) = [ln2/(60*kd)].

[0607] En la Tabla 19 se muestra la cinética de unión de nFel d1 a diferentes anticuerpos mono y biespecíficos contra Fel d 1 a 25 °C. Los tres anticuerpos monoespecíficos contra Fel d 1 se unieron al nFel d1 con valores de KD en el intervalo de 155 pM a 1,6 nM. Los dos anticuerpos biespecíficos contra Fel d1, H4H3467D y H4H8751D, se unieron nFel d1 con valores de KD de 250 pM y 347 pM respectivamente.

[0608] Tabla 19: Cinética de unión de los anticuer os mono bies ecíficos contra Fel d1 a nFel d 1 a 25 °C.

[0610]

[0612] Para determinar la eficaciain vivode los anticuerpos biespecíficos contra Fel d 1 en comparación con sus anticuerpos precursores monoespecíficos, estos anticuerpos, junto con un anticuerpo de control de isotipo, se analizaron en el modeloin vivode ACP utilizando Fel d 1 natural tanto para la sensibilización como para la exposición, que se ha descrito anteriormente (véase el Ejemplo 6). Los anticuerpos de este estudio se administraron a una concentración de 1 mg/kg de anticuerpo total (se utilizaron 0,5 mg/kg de cada anticuerpo cuando se administraron dos anticuerpos simultáneamente) utilizando 8 ratones por grupo experimental. En la Tabla 20 se muestran los datos de cada grupo experimental expresados como reducción porcentual de la extravasación de colorante ± DE.

[0613] Los anticuerpos monoespecíficos H4H1232N y H4H2864P causaron una reducción del 67 (± 26)% y del 81 (± 26)% en la extravasación del colorante, respectivamente. La combinación de los anticuerpos monoespecíficos, H4H1232N y H4H2864P, causó una reducción del 98 (± 3,5)% en la extravasación de colorante, mientras que el biespecífico, H4H3467D, compuesto por los anticuerpos monoespecíficos H4H1232N y H4H2864P, causó una reducción del 93 (± 11)% en la extravasación de colorante.

[0614] Los anticuerpos monoespecíficos H4H1232N y H4H2636P causaron una reducción del 64 (± 33)% y del 8,7 (± 79)% en la extravasación del colorante, respectivamente, en otro experimento. La combinación de los anticuerpos monoespecíficos, H4H1232N y H4H2636P, causó una reducción del 90 (± 15)% en la extravasación de colorante, mientras que el biespecífico, H4H8751D, compuesto por los anticuerpos monoespecíficos H4H1232N y H4H2636P, causó una reducción del 77 (± 20)% en la extravasación de colorante.

[0615] Tabla 20:Efecto de los anticuerpos biespecíficos contra Fel d1 y de sus anticuerpos monoespecíficos precursores en el modeloin vivode anafilaxia cutánea asiva ACP

[0617]

[0619] Ejemplo 10: Direccionamiento a alérgenos mediante inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales para el tratamiento de la alergia: Materiales y métodos

[0620] Generación de REGN1908 (H4H1232N) y REGN1909 (H4H2636P):

[0621] REGN1908 y REGN1909 se produjeron como se describe en el Ejemplo 1. REGN1908 también se denomina H4H1232N y comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada (HCVR) de SEQ D NO: 18 y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera (LCVR) de SEQ ID NO: 26. REGN1908 también tiene las siguientes secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad de las cadenas pesada y ligera (HCDR y LCDR, respectivamente): HCDR1, 2 y 3: SEQ ID NO: 20, 22 y 24; LCDR1, 2 y 3: SEQ ID NO: 28, 30 y 32. REGN1909 se denomina también H4H2636P y comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada (HCVR) de SEQ D NO:306 y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera (LCVR) de SEQ ID NO: 314. REGN1909 también tiene las siguientes secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad de las cadenas pesada y ligera (HCDR y LCDR, respectivamente): HCDR1, 2 y 3: SEQ ID NO: 308, 310 y 312; LCDR1, 2 y 3: SEQ ID NO: 316, 318 y 320. Tanto Fel d1 natural (nFel d1; obtenido en Indoor Biotech) como Fel d1 recombinante (rFel d1) se utilizaron en ensayosin vitro. Fel d1 recombinante se produjo siguiendo el diseño de Kaiseret al.(Kaiser, L.et al., (2003), The Journal of Biological Chemistry 278 (39): 37730-35) que demostraron que las fusiones de cadena única eran estructural y funcionalmente equivalentes a las del heterodímero Fel d1 natural. Las proteínas recombinantes producidas por Regeneron incluyen los aminoácidos 18-109 de la cadena 2 de Fel d1 (NP_001041619.1) en el extremo amino fusionados directamente en línea con los aminoácidos 23-92 de la cadena 1 de Fel d1 (NP_001041618.1) con una mutación D27G y una etiqueta Myc-Myc-6xHis en el extremo carboxilo. Las proteínas se expresaron en células de ovario de hámster chino (CHO) y se fabricaron con una etiqueta carboxiterminal monomérica (myc-myc-hexahistidina) o dimérica (IgG2a Fc de ratón) (rFel d1-mmH y rFel d1-mFc, respectivamente). La fusión Fc dimérica de FcεR1α se generó para dar soporte al desarrollo del ensayo de competencia basado en ELISA.

[0622] Aislamiento y concentración de IgG de sueros de pacientes:

[0623] En primer lugar, el suero de pacientes alérgicos a los gatos que se sometieron a una inmunoterapia satisfactoria determinada por el médico (según la prueba de punción cutánea de la alergia y los síntomas clínicos) (IAE-gato) y el de los pacientes de control alérgicos a los gatos (Sin IAE), se separó de la sangre del donante mediante centrifugación a 3000 rpm. Posteriormente, el suero se pasó por un filtro de 0,22 µm y, tras incubarlo durante una noche con 50 ml de perlas de sefarosa de proteína G a 4 °C, se vertió en la columna y la IgG de IAE se eluyó con tampón de elución de IgG de Pierce. Después de la neutralización del eluido con Tris 1 M, pH 8,5, las muestras se dializaron frente a PBS, pH 7,2. Todas las muestras se concentraron aproximadamente 10 veces utilizando un Amicon Ultracel con un corte de PM de 50 k.

[0625] Cuantificación de IgG total y específica frente a Fel d1 en sueros de pacientes sometidos a IAE:

[0627] Los niveles de IgG total y específica frente a Fel d1 se cuantificaron en muestras de suero de pacientes humanos sometidos a inmunoterapia alergénica específica (IAE) utilizando un ELISA estándar. Placas de microtitulación de noventa y seis pocillos (Thermo Scientific) se recubrieron con 2 µg/ml de Fel d1 natural (LoTox Indoor Biotechnologies) o de IgG contra ser humano (Jackson Immunoresearch) en solución salina tamponada con fosfato (PBS, Irvine Scientific) durante una noche a 4 °C. Al día siguiente, las placas se lavaron con PBS que contenía Tween 20 al 0,05 % (PBS-T, Sigma-Aldrich) cuatro veces utilizando un lavador de placas (Molecular Devices). A continuación, se bloquearon las placas incubándolas durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) con 250 µl de albúmina de suero bovino (BSA, Sigma-Aldrich) al 0,5 % en PBS. Los sueros o las IgG purificadas de pacientes humanos sometidos a IAE se diluyeron en serie al triple en BSA-PBS al 0,5 % empezando a 1:1000 (para las IgG específicas de Fel d1) y a 1:27000 (para las IgG totales), se añadieron a las placas bloqueadas por duplicado, y a continuación se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Los dos últimos pocillos se dejaron en blanco para utilizarlos como control de anticuerpo secundario solo (control de fondo). Para la cuantificación de IgG total, se generó una curva estándar utilizando IgG humana (Thermo Scientific, nº 31154) comenzando a 1 µg/ml y se diluyó 3 veces en la placa. Para la cuantificación de IgG específica de Fel d1, se generó una curva estándar utilizando un anticuerpo monoclonal contra Fel d1 (H4H1238N) también a partir de 1 µg/ml y diluido 3 veces en la placa. A continuación, se añadió a las placas el anticuerpo secundario de cabra contra Fc-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) (Jackson Immunoresearch) a una dilución de 1:5000 y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). Las placas se lavaron con PBS-T entre cada etapa del protocolo. Para revelar la reacción colorimétrica, se añadió sustrato TMB/H<2>O<2>a las placas y se incubó durante 20 minutos. La reacción se detuvo con ácido sulfúrico 2 N (H<2>SO<4>, VWR). La absorbancia se midió posteriormente en un espectrofotómetro (Victor, Perkin Elmer) a 450 nm. La IgG total y específica de Fel d1 se calcularon a partir de los respectivos gráficos de curvas estándar utilizando el programa informático Graphpad PRISM.

[0629] ELISA de bloqueo de la unión de Fel d1 a IgE específica de alérgeno mediante anticuerpos de IgG contra Fel d1:

[0631] La capacidad de los anticuerpos monoclonales contra Fel d1 o de la IgG purificada del suero de pacientes con IAE (inmunoterapia alergénica específica) para bloquear la unión de Fel d1 a la IgE capturada en placa del plasma/suero de donantes humanos alérgicos, se determinó utilizando un ELISA de bloqueo. Las placas de microtitulación se recubrieron durante la noche a 4 °C con proteína de dominio extracelular FcεR1α humana (el receptor de alta afinidad de IgE) con una etiqueta Fc carboxiterminal de ratón (hFc □R1a-mFc). Las placas se bloquearon con BSA al 0,5 % (p/v) durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). El plasma de donantes alérgicos se diluyó 5 veces y la IgE total se capturó sobre la superficie recubierta del receptor. Se premezcló una cantidad constante de Fel d1-mmH recombinante (0,7 nM) con diluciones en serie de anticuerpos monoclonales contra Fel d1 y de IgG IAE (inmunoterapia alergénica específica) específica de Fel d1 a partir de 10 µg/ml cada una en dilución triple en serie y se incubó durante 1 hora a TA para permitir que la interacción entre Fel d1 y el anticuerpo alcanzara el equilibrio. A continuación, se añadió la mezcla de anticuerpo-Fel d1 a la placa recubierta con IgE durante 1 hora. Las placas se lavaron posteriormente y la cantidad de Fel d1-mmH libre unida a la placa se detectó utilizando un anticuerpo contra myc (clon 9E10 de producción propia como isotipo de IgG1 humana) conjugado con HRP, y se incubó a una dilución 1:10.000, incubando durante 1 hora a TA. Las placas se lavaron con PBS-T entre cada etapa del protocolo. Para revelar la reacción colorimétrica, se añadió sustrato TMB/H<2>O<2>a las placas y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente (TA). La reacción se detuvo con ácido sulfúrico 2 N (H<2>SO<4>; VWR, n.º BDH3500-1). La absorbancia se midió posteriormente en un espectrofotómetro (Victor, Perkin Elmer) a 450 nm. La concentración de anticuerpo necesaria para inhibir la señal de una concentración constante de Fel d1 al 50 % (CI50) se determinó utilizando el programa informático Prism.

[0633] Experimentos con ratones

[0635] Para todos los estudios con ratones, se utilizaron ratones hembra Balb/c de 7-8 semanas de vida procedentes de Jackson Laboratories. Durante todo el experimento, los animales permanecieron alojados en las instalaciones para animales de Regeneron en condiciones estándar, y se les permitió aclimatarse durante al menos 7 días antes de su inclusión en el estudio. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Regeneron. En los estudios preclínicos con ratones, no se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Los ratones se asignaron a los grupos de tratamiento de forma aleatoria, sin criterios predefinidos, y debido al evidente cambio de color de la oreja no se pudo realizar el enmascaramiento.

[0636] Modelo de ratón de anafilaxia cutánea pasiva:

[0637] Los antisueros utilizados para la administración intradérmica (ID) pasiva se generaron previamente inmunizando ratones Balb/c con Fel d1, extracto normalizado de pelo de gato o extracto crudo de alérgeno de cacahuete (antisueros de control irrelevantes) utilizando adyuvante de alumbre. Se agruparon sueros de 10-20 ratones y se utilizaron para la administración pasiva. El día 1, los ratones Balb/c recibieron una inyección SC de REGN1908,

[0638] REGN1909, REGN1908-1909, IgG IAE-gato o IgG Sin IAE concentrada o un anticuerpo de control de isotipo IgG4P. Tres días más tarde, los antisueros generados frente a Fel d1 o extracto de pelo de gato, o cacahuete (control negativo) se inyectaron por vía ID en los pabellones auriculares derecho e izquierdo, respectivamente, permitiendo que la IgE específica de alérgeno se uniese a FcεR en los mastocitos. Cada antisuero se normalizó para contener 1-25 ng de IgE por inyección (dependiendo del experimento). Veinticuatro horas después de la administración local de los antisueros específicos de alérgeno, los ratones se expusieron mediante inyección intravenosa (IV) de 0,250 µg-1µg de Fel d1 o 250 unidades alérgicas bioequivalentes (UAB) de extracto de pelo de gato diluido en PBS que contenía colorante azul de Evans al 0,5 %(Sigma). Una hora después de la exposición al alérgeno, se sacrificaron los ratones. El colorante azul de Evans se extrajo del tejido del pabellón auricular y se cuantifico mediante espectrofotometría utilizando una curva estándar. A continuación, se secaron y pesaron las orejas.

[0639] Estudios de unión de IgG con IAE-gato:

[0640] Los estudios de unión de IgG con inmunoterapia alergénica específica contra alérgenos de gato (IAE-gato), se realizaron en el biosensor Octet HTX y todas las muestras se prepararon en tampón que contenía HEPES 10 mM, NaCl 500 mM, BSA 1 mg/ml, azida sódica al 0,02 %, tensioactivo Tween-20 al 0,05 %, pH 7,4 (HBS-BT). Los biosensores Octet HIS1K se sumergieron primero en pocillos que contenían 2 µg/ml de rFel d1.mmh durante 60 segundos para capturar 0,05 nm de rFel d1.mmh, seguido de la inmersión de los biosensores Octet en pocillos que contenían 100 nM de IgG específica de Fel d1 presente en diferentes muestras de IgG IAE-gato purificada con Proteína G. Los sensorgramas de unión específica se generaron mediante un procedimiento de doble referenciación sustrayendo cualquier interacción de IgG IAE-gato sobre la superficie de referencia (biosensor Octec HIS1K en blanco) de la unión de IgG IAE-gato a la superficie con Fel d1.mmh capturado; eliminando de este modo cualquier señal de unión inespecífica observada. Además, los biosensores con rFel d1.mmh capturado se sumergieron en tampón HBS-BT para permitir la sustracción de los cambios de señal resultantes de la disociación natural de rFel d1.mmh capturado del biosensor HIS1K. Los datos de unión obtenidos con Octet se corrigieron mediante doble sustracción de referencia, y los parámetros cinéticos de unión se midieron ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 con limitación de transporte de masa utilizando Scrubber 2.0c.

[0641] Tinción de Erk fosforilada intracelular utilizando basófilos de pacientes alérgicos a los gatos:

[0642] La sangre extraída de pacientes alérgicos se envió a temperatura ambiente para su suministro el mismo día por Bioreclamation IVT. Las CMSP se purificaron por centrifugación en una capa de Ficoll, se lavaron tres veces en medio RPMI precalentado (Gibco), se resuspendieron en medio X-Vivo 15 (Lonza) precalentado y exento de suero, y se sembraron en una placa de 96 pocillos. Las células se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. En paralelo, se preparó una placa de estimulación 2X que incluía una respuesta a la dosis de nFel d1 purificado, así como respuestas a dosis de anticuerpos contra Fel d1 mezclados con una dosis constante (concentración final 200 pM) de Fel d1 natural purificado (Indoor Biotechnologies). La placa de estimulación también se incubó durante 30 minutos a 37 °C. A continuación, las células se estimularon a 37 °C con una pipeta multicanal de 96 pocillos, y la estimulación se detuvo exactamente después de 5 minutos añadiendo 1 volumen de Cytofix (BD) precalentado. Después de 15 minutos de fijación, las células se lavaron dos veces en tampón MACS y se hicieron permeables resuspendiéndolas y conservándolas en metanol helado durante una noche a -20 grados. Después, las placas se lavaron tres veces con tampón MACS, se resuspendieron durante 10 minutos en bloqueador Fc humano (ebioscience) y después se tiñeron con un cóctel de anticuerpos que contenía pErk-Alexa 488 (Cell Signaling), anticuerpos CD123-BUV395 (BD) y HLA-DR-APC (BD) durante 30 minutos. Las células se lavaron dos veces con tampón MACS, se incubaron durante 15 minutos con Cytofix (BD) diluido a 1:4 en PBS para fijar la tinción, se resuspendieron en tampón MACS y se analizaron en un citómetro LSR-Fortessa. Los datos se analizaron calculando la IMF de la tinción de Erk fosforilada dentro de la ventana de selección de basófilos. El porcentaje de inhibición máxima se calculó como

[0643] 100 - (100 X Respuesta Máxima de Anticuerpo)/Respuesta de Isotipo

[0644] La respuesta máxima de anticuerpo se definió como el promedio de la intensidad media de fluorescencia (IFM) de Erk fosforilada en las tres dosis más altas del anticuerpo Fel d1 en la curva de respuesta a la dosis (meseta de la curva) menos la IFM de referencia (promedio de muestras repetidas no estimuladas), y la respuesta del isotipo se definió como el promedio de todos los valores de IFM en la curva de respuesta a la dosis de un anticuerpo de control de isotipo IgG4 menos la IFM de referencia.

[0645] Pruebas de activación de basófilos utilizando basófilos de pacientes alérgicos a los gatos:

[0647] Para evaluar la inhibición de la activación de los basófilos mediada por anticuerpos, una concentración constante final de 20 pM de Fel d1 (Indoor Biotechnologies) se preincubó durante 30 minutos a 37 °C con REGN1908, REGN1909, REGN1908-1909 combinados o anticuerpo de control de isotipo IgG4P a concentraciones finales que variaban entre 0,8 fM y 1,0 µM. De manera simultánea con la preincubación de Fel d1 y el anticuerpo, las CMSP (BioreclamationIVT) se purificaron de sangre total reciente de donantes alérgicos mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll. La CMSP purificadas se lavaron, se resuspendieron en medio X-VIVO 15 (Lonza) y se sembraron en columnas duplicadas en una placa de 96 pocillos con fondo en V de polipropileno (aproximadamente 5×10⁵ células/pocillo). Para iniciar la activación de los basófilos contenidos en la población de CMSP total, se añadió hIL-3 (R&D Systems, 0,3 nM) a la suspensión celular y la placa se incubó a 37 °C durante 10 minutos. A continuación, los anticuerpos y Fel d1 preincubados se añadieron a las CMSP activadas. Como muestras de control negativo se incluyeron células sin la adición de anticuerpo y como control positivo se incluyó una curva de respuesta a la dosis de Fel d1 con concentraciones finales que variaban entre 7,8 aM y 10,0 nM. A continuación, para facilitar la activación de los basófilos, las células se incubaron a 37 °C durante 20 minutos. Después, la activación se detuvo con una incubación a 4 °C durante 5 minutos. Seguidamente, la activación de los basófilos se evaluó mediante citometría de flujo. Las células se tiñeron a 4 °C durante 20 minutos con un cóctel de anticuerpos que contenía anticuerpos contra HLA-DR-FITC (Beckman Coulter, Catálogo #IM0463U, clon B8.12.2), contra CD123-APC (BD, clon 7G3, Catálogo n.º 560087), y contra CD203c-PE (Beckman Coulter, Catálogo n.º IM3575, clon 97A6) o un cóctel que contenía anticuerpos contra HLA-DR-PE-Cy7 (Biolegend, Catálogo n.º 307616, clon L243), contra CD123-APC (BD, Catálogo n.º 560087,clon 7G3), y contra CD63-FITC (Beckman Coulter Catálogo n.º IM1165U clon CLBGran/12). Después de la tinción, las células se lavaron en una dilución 1:20 de solución de reserva MACS BSA (Miltenyi Biotec) en solución de aclarado autoMACS (Miltenyi Biotec), se fijaron en Cytofix (BD) diluido 1:4 en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (Gibco), y se analizaron en un citómetro de flujo (BD LSRFortessa X-20). La estrategia de selección se utilizó para identificar basófilos dentro de una población más grande de CMSP y para determinar los niveles de activación de los basófilos. Se procesaron las muestras para recopilar aproximadamente 1000 eventos determinados como basófilos. Los basófilos se definieron como células singletas, de linaje linfoide, HLA-DR negativas (HLA-DR⁻) y CD123 positivas (CD123⁺). Los basófilos activados se definieron además como CD203cHi o CD63Hi (basófilos con niveles elevados (High, Hi) de los marcadores CD203c o CD63). Para especificar un nivel de activación de referencia, las ventanas de selección se establecieron de manera que el 10 % de los eventos de basófilos de las muestras preactivadas con hIL-3 pero no estimuladas (sin Fel d1) se consideraran positivos con respecto a su activación (CD203cHi o CD63hi). Estas ventanas de selección se aplicaron después a todas las demás condiciones experimentales para determinar el nivel relativo de activación de basófilos.

[0649] Determinación de los parámetros cinéticos de unión de la interacción de REGN1908 y REGN1909 con Fel d1

[0650] Todo el procedimiento de acoplamiento se realizó utilizando tampón HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % (v/v) filtrado y desgasificado, utilizando la química estándar de acoplamiento de aminas. La superficie del sensor CM5 se activó inyectando una mezcla 1:1 (en volumen) de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida 0,2 M y N hidroxisuccinimida 0,05 M a un caudal de 10 µl/minuto durante 7 minutos, seguido de la inyección de 50 µg/ml de anticuerpo de cabra contra Fcy humano (preparado en tampón de acoplamiento de acetato 0,01 M, pH 5,0) hasta obtener una señal de unidad de resonancia (UR) de aproximadamente 8600 UR. Los grupos activos restantes en la superficie de la microplaca CM5 se bloquearon posteriormente inyectando etanolamina 1 M, pH8.0 sobre la superficie durante 7 minutos a un caudal de 10 µl/minuto. A continuación, se lavaron las superficies de la microplaca y la superficie de referencia acopladas y se trataron con glicina-HCl 10 mM, pH 1,5 para eliminar las proteínas residuales no acopladas.

[0652] Los estudios de cinética de unión de REGN1908 y REGN1909 se realizaron en un Biacore T200 utilizando HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, MgCl<2>3 mM, CaCl<2>3 M, tensioactivo P20 al 0,05 % (v/v), pH 7,4 (HBSP++) como tampón de migración a un caudal de 50 µl/minuto. Inicialmente se capturaron alrededor de 94-163 UR de REGN1908 o REGN1909 en diferentes cubetas de flujo utilizando la superficie del sensor acoplada con anticuerpo de cabra contra Fcγ humano. Diferentes concentraciones de nFel d1 o rFel d1.mmh, diluidas en serie 2 veces en tampón HBSP++, se inyectaron posteriormente sobre las superficies con anticuerpos capturados durante 2,5 minutos, seguido de 15 minutos de fase de disociación. Se obtuvieron sensorgramas de unión Biacore específicos mediante un procedimiento de doble referenciación, restando primero cualquier interacción de nFel d1 o rFel d1.mmh sobre la superficie de referencia (solo superficie acoplada con anticuerpo de cabra contra Fcγ humano) de la señal de unión de nFel d1 o rFel d1.mmh a las superficies con REGN1908 o REGN1909 capturados; eliminando de este modo cualquier cambio en el índice de refracción. Además, se realizaron inyecciones de tampón HBSP++ para permitir la sustracción de los cambios de señal de UR resultantes de la disociación natural de REGN1908 o REGN1909 capturados de la superficie acoplada del anticuerpo de cabra contra Fcγ humano. Los parámetros cinéticos de unión se obtuvieron ajustando globalmente los datos sustraídos de doble referencia a un modelo de unión 1:1 con limitación de transporte de masa utilizando el programa informático de Evaluación Biacore T200, versión 1.0.

[0654] Evaluación de la unión no exclusiva de REGN1908 y REGN1909 a Fel d1

[0656] La capacidad de REGN1908 y REGN1909 para unirse simultáneamente a Fel d1 se examinó utilizando Biacore T200 en un formato de ensayo de inyección de un anticuerpo sobre la proteína Fel d1 capturada por otro anticuerpo en la superficie del sensor. Similar a lo descrito anteriormente, la densidad superficial en el intervalo de 4682 a 6683 UR de REGN1908 y REGN1909 se inmovilizó sobre cubetas de flujo separadas de una microplaca sensora CM5 utilizando la química estándar de acoplamiento de aminas descrita anteriormente. Durante todas las etapas de acoplamiento, como tampón de migración se utilizó tampón HBS-P recién preparado y desgasificado (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %) a pH 7,4. A continuación, se lavó la superficie de la microplaca acoplada y se trató con glicina-HCl 10 mM, pH 1,5 para eliminar las proteínas residuales no acopladas. Primero se inyectó nFel d1200 nM sobre la superficie del sensor acoplado con REGN1908 o REGN1909 durante 10 minutos, seguido de inyecciones individuales de REGN1908 y REGN1909 (25 µg/ml). Todo el experimento se realizó utilizando el tampón de migración HBS-P++ a un caudal de 10 µl/minuto.

[0657] Estadística preclínica:

[0658] El análisis estadístico se evaluó utilizando GraphPad Prism 6. El análisis de las diferencias entre dos grupos se evaluó utilizando la prueba de la t de Student para datos emparejados o la prueba de la t de Student bilateral para datos no emparejados. Para estudios con grupos múltiples de animales, la normalidad de los datos se evaluó utilizando la prueba de Shapiro-Wilk si n>7 o la de Kolmogorov-Smirnov si n<7. Si los datos superaban la prueba de normalidad y las desviaciones estándar de los distintos grupos no eran estadísticamente diferentes entre sí según la prueba de Brown-Forsythe, los resultados se interpretaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) unidireccional seguido de la prueba posterior de Tukey para comparaciones múltiples. Si los datos no superaban la prueba de normalidad o las desviaciones estándar eran estadísticamente diferentes, los resultados se interpretaron utilizando la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba posterior de Dunn para comparaciones múltiples. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando p < 0,05

[0659] Resultados

[0660] La IgG específica de alérgeno inducida por IAE muestra variabilidad entre pacientes en el perfil y fuerza de unión

[0661] Para caracterizar las IgG inducidas por IAE (inmunoterapia alergénica específica), se utilizaron sueros de pacientes alérgicos a los gatos que se sometieron con éxito a IAE con extracto de pelo de gato (IAE-gato) (intervalo: 13-86 meses con una mediana de 33 meses) o sueros de pacientes de control alérgicos a los gatos (Sin IAE), para confirmar mediante ELISA que los pacientes IAE-gato tenían un porcentaje más alto de IgG específica de Fel d1 en comparación con los pacientes alérgicos a los gatos Sin IAE, aunque constituyó menos del 0,2 % de la IgG total (Fig.1). Utilizando un ensayo cinético de unión en tiempo real, la afinidad de unión aparente de la IgG policlonal específica de Fel d1 (IgG de IAE-gato) se determinó inyectando 9 muestras de IgG purificadas de IAE-gato que contenían, cada una de ellas, 100 nM de IgG específica de Fel d1, sobre un biosensor Octet recubierto con Feld1.mmh recombinante (rFel d1.mmh). Todas las IgG IAE-gato se unieron a Fel d1, con valores de KD aparente que variaban entre 0,36 nM y 9,8 nM y una diferencia de ~30 veces en la constante de velocidad de disociación. También se examinó la capacidad de la IgG inducida por IAE-gato purificada para bloquear la unión de Fel d1 a la IgE procedente de pacientes alérgicos a los gatos en un ELISA de bloqueo. La IgG inducida por IAE-gato purificada bloquea la unión de Feld1.mmh a IgE, sin embargo, la fuerza de bloqueo es baja (valores de CI<50>que varían entre 0,18 µM y 2,3 µM) (Fig.1). No hubo correlación entre la duración de la IAE-gato (Tabla 21) y los títulos, la afinidad o la fuerza específicos de Fel d1. En conjunto, estos datos sugieren que la IAE (inmunoterapia alergénica específica)-gato induce un aumento de IgG específica de Fel d1 circulante, que puede unirse a Fel d1 con cinéticas variables, pero que, en general, la IgG inducida por IAE-gato bloquea de manera ineficaz la unión de Fel d1 a la IgE policlonal del paciente.

[0662] Tabla 21

[0665]

[0666] REGN1908 y REGN1909 se unen simultáneamente a Fel d1 e impiden la unión de Fel d1 a la IgE policlonal de pacientes específica de Fel d1

[0668] Para determinar si los anticuerpos monoclonales podían bloquear la unión del alérgeno a la IgE tan bien o mejor que los producidos de manera natural durante la IAE, se generaron anticuerpos monoclonales completamente humanos específicos de Feld d1 utilizando la plataforma de ratón para anticuerpos humanos VelocImmune<®>de Regeneron (Macdonald, L.et al., (2014), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111 (14): 5147-52; Murphy, A.,et al., (2014), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111 (14): 5153-58). Dada la policlonalidad de la respuesta de IgE específica de alérgeno, se planteó a hipótesis de que sería necesario bloquear múltiples epítopos del alérgeno para impedir la activación de células efectoras mediada por IgE. Por lo tanto, dos anticuerpos con perfiles de unión óptimos, REGN1908 y REGN1909, se seleccionaron para su desarrollo. Los estudios de unión mediante Resonancia de Plasmón Superficial (RPS) con Biacore demostraron que cada uno de REGN1908 y REGN1909 se unieron con afinidad subnanomolar a la proteína Fel d1 recombinante y natural (rFel d 1 y nFel d1, respectivamente) (Tabla 22), y los ensayos de unión secuencial confirmaron una unión independiente y no competitiva a nFel d1 (Tabla 23).

[0670] Tabla 22

[0672]

[0675] Tabla 23

[0677]

[0680] Primero se inyectaron 200 nM de nFel d 1 sobre la superficie del sensor CM5 inmovilizada con REGN1908 (panel izquierdo) o REGN1909 (panel derecho) seguido de la inyección de 25 µg/ml de REGN1908 (línea azul claro) o REGN1909 (línea azul oscuro); nFel d1: Fel d1 natural. rFel d1-mmH: Fel d1 recombinante con una etiqueta myc-mychexahistidina.ka

: constante de velocidad de asociación.kd

: constante velocidad de disociación.KD

: constante de disociación de equilibrio. t<1/2>: semivida disociativa.

[0682] A continuación, se evaluó la capacidad de REGN1908 y REGN1909, individualmente y combinados, para bloquear la unión de Fel d1 a la IgE humana policlonal específica de alérgeno de gato. En un ELISA de bloqueo, cada anticuerpo bloqueó parcialmente la unión de nFel d1 a IgE, con un bloqueo máximo del 51 %, mientras que la combinación de REGN1908 y REGN1909 (REGN1908-1909) bloqueó con más fuerza la unión de Fel d1 a la IgE derivada del paciente: El bloqueo máximo aumentó al 83 % con un valor de CI<50>de 0,45 nM. Seguidamente, utilizando dos ensayos diferentes, se analizó la capacidad de REGN1908-1909 para bloquear la activación inducida por Fel d1 de basófilos humanos de donantes alérgicos a los gatos. Para evaluar el acoplamiento y la activación de FcεR, los basófilos se sometieron a un ensayo funcional de fosfoflujo que mide la fosforilación de la cinasa ERK, un marcador proximal de activación y desgranulación de basófilos (Liu, Y.,et al., (2007), The Journal of Experimental Medicine 204 (1): 93-103; Zhu, M.,et al., (2012), The Journal of Biological Chemistry 287 (11): 8135-43). Los basófilos de los 10 donantes alérgicos a los gatos respondieron a la estimulación de Fel d1 con intensidades variables (datos no mostrados). REGN1908-1909 inhibió al menos el 80 % de la activación de los basófilos en 7/10 donantes, mientras que un único anticuerpo (REGN1908) alcanzó el mismo nivel de inhibición en solo 3/7 donantes (Fig.2). En la prueba de activación de basófilos (PAB), que mide la regulación positiva inducida por alérgenos de los marcadores de activación de basófilos, CD203c y CD63 por citometría de flujo (Sturm, E.M.,et al., (2010), Cytometry Part B: Clinical Cytometry 78B (5): 308-18; Ocmant, A.,et al., (2007), Journal of Immunological Methods 320 (1-2): 40-48), REGN1908-1909 bloqueó con fuerza la activación de los basófilos inducida por Fel d1 (valores de CI<50>de 55 pM y 10 pM, respectivamente). Estos datos establecen que cada uno de REGN1908 y REGN1909 se une con alta afinidad, simultáneamente y de una manera no competitiva, a Fel d1, y son más eficaces en combinación cuando bloquean la unión de Fel d1 a la IgE policlonal de sujetos alérgicos a los gatos.

[0683] La combinación REGN1908-1909 inhibe sinérgicamente la desgranulación de mastocitos inducida por alérgenos de gato en ratones

[0684] La fuerza de REGN1908 y REGN1909 se evaluóin vivoutilizando el modelo de ratón de anafilaxia cutánea pasiva (ACP) con nFel d1 o extracto de pelo de gato, que contiene una mezcla heterogénea de proteínas de gato, entre ellas Fel d1. El modelo de ACP evalúa la hipersensibilidad de tipo 1 y mide la permeabilidad vascular inducida por la activación local de mastocitos en el tejido del pabellón auricular (Bradley, B.L.,et al., (1991), J Allergy Clin Immunol 1991;88(4):661-74.). Después de la sensibilización pasiva con antisueros de ratón nFel d1 o antisueros de control, la exposición a Fel d1 indujo una desgranulación significativa de los mastocitos únicamente en el pabellón auricular sensibilizado con nFel d1 (Fig. 3), validando el modelo y confirmando la especificidad de la respuesta alérgica. La combinación de REGN1908-1909 bloqueó significativamente la desgranulación de mastocitos inducida por nFel d1 a una dosis de 1 mg/kg (anticuerpo total; proporción 1:1). Cabe destacar que la combinación demostró un efecto sinérgico- únicamente se necesitaron 0,5 mg/kg de cada anticuerpo para bloquear significativamente la desgranulación, mientras que 1 mg/kg de cada anticuerpo en solitario tuvo un efecto mínimo (Fig. 4). De manera similar, REGN1908-1909 también bloqueó la anafilaxia cutánea inducida por el extracto de pelo de gato (Fig. 5), lo que demuestra que, en este modelo, Fel d1 es el principal impulsor de la desgranulación de mastocitos inducida por el extracto de pelo de gato. Estos datos revelan que REGN1908 y REGN1909 deben administrarse conjuntamente para obtener eficacia en el modelo de ACP, demostrando que es necesario unir múltiples epítopos de Fel d1 para impedir el entrecruzamiento de IgE policlonal inducido por Fel d1 y la activación posterior de las células efectoras.

[0685] La inmunoterapia pasiva con REGN1908-1909 bloquea la desgranulación de mastocitos in vivo con mayor eficacia que las IgG naturales de pacientes con IAE-gato

[0686] Para comparar la capacidad de REGN1908-1909 o de la IgG inducida por IAE (inmunoterapia alergénica específica)-gato para inhibir la unión de Fel d1 a la IgE policlonal, se utilizó tanto un ELISA de bloqueo como el modelo de ACP en ratón. Tanto REGN1908-1909 como la IgG inducida por IAE-gato, bloquearon la unión de Fel d1 a la IgE policlonal alérgica a los gatos del donante. La IgG inducida por IAE-gato bloqueó la unión a los niveles basales; sin embargo, se requirió una concentración elevada de IgG (intervalo de CI<50>: de 0,309 µM a 23,15 µM). En cambio, REGN1908-1909 demostró una fuerza 5 órdenes de magnitud mayor que la IgG de IAE-gato con una CI<50>de ~580 pM.

[0687] En el modelo de ACP, la IgG inducida por IAE-gato purificada de 3 donantes, o la IgG Sin IAE (inmunoterapia alergénica específica), se concentró y se inyectó por vía subcutánea en ratones para reconstituir el nivel de IgG circulante presente en cada donante individual de IAE. La cantidad de anticuerpo inyectada por ratón se indica en la Tabla 24. Los donantes seleccionados representaban distintas duraciones de tratamiento con IAE (13, 20 y 35 meses), e incluían al donante con el título más alto de IgG específica de Fel d1, que mostró la mayor fuerzain vitro(Donante 10, véase la Tabla 25). Mientras que la IgG Sin IAE (inmunoterapia alergénica específica) no impidió la desgranulación, REGN1908-1909 inhibió la desgranulación tan bien o mejor que la IgG inducida por IAE-gato purificada (Fig. 6). El grado de protección conferido por la IgG inducida por IAE-gato fue proporcional a la cantidad de IgG específica de Fel d1 en las muestras individuales, y, cabe destacar que, se necesitó aproximadamente 5 veces más IgG específica de Fel d1 de muestras de IgG inducida por IAE-gato (o 1000 veces más IgG total) por ratón, para conseguir la misma eficacia bloqueadora que REGN1908-1909 [(IgG específica de Fel d1: 0,02 mg/ratón para REGN1908-1909 frente a 0,092 mg/ratón para IAE (inmunoterapia alergénica específica) donante 10 (Fig. 6). Estos datos demuestran que REGN1908-1909 bloquea la desgranulación de mastocitosin vivocon mayor eficacia que las IgG policlonales específicas de Fel d1 del paciente con IAE-gato, generadas de manera natural tras años con IAE (inmunoterapia alergénica específica) y respaldan el concepto de que la mayoría de la IgG generada por la IAE no actúa como bloqueadora funcional.

[0688] Tabla 24

[0691]

[0692] La tabla muestra la cantidad de anticuerpo que se inyecta en los ratones de la Figura 6.

[0693] Tabla 25

[0696]

[0698] Características de los pacientes cuyos sueros se usaron en el modelo de ACP, Figura 6. * indica donantes recurrentesEjemplo 11: REGN1908-1909 reduce significativamente los síntomas clínicos en respuesta a la exposición nasal a alérgenos en sujetos humanos alérgicos a los gatos: Estudio de dosis única sobre la eficacia, seguridad, tolerabilidad y farmacocinética de REGN1908-1909 en sujetos con rinitis alérgica expuestos por vía intranasal a extracto de alérgeno

[0699] Diseño del estudio clínico:

[0700] Se realizó un estudio multicéntrico de fase 1b, demostrativo del mecanismo de acción, aleatorizado, con doble ocultación, controlado con placebo y de dosis única subcutánea, en 6 centros de Europa y Asia-Pacífico.

[0701] Los sujetos elegibles para la asignación al azar se estratificaron en 2 bloques: el centro de Londres (Unidad de Fase I de Quintiles), y todos los demás centros del estudio combinados, lo cual se llevó a cabo mediante un sistema central de respuesta de voz interactiva. Los sujetos se asignaron al azar 1:1 el día 1 para recibir una dosis única SC (subcutánea) de REGN1908-1909 (600 mg en total, proporción de anticuerpos 1:1; n=37) o placebo (n=36).

[0702] El protocolo fue aprobado por los comités de ética/revisión institucional correspondientes, y cada paciente dio su consentimiento por escrito en la visita de exploración 1. El estudio se llevó a cabo de conformidad con las normas del comité de ética institucional, las Directrices de la Conferencia Internacional sobre Armonización para las Buenas Prácticas Clínicas y la Declaración de Helsinki.

[0703] Población de pacientes:

[0704] Los sujetos elegibles tenían entre 18 y 55 años y padecían rinitis alérgica inducida por gatos y sensibilización a los gatos confirmada en la exploración. Para confirmar la sensibilización a los gatos, los sujetos se sometieron a dos visitas de exploración, el día -28 y día -14 (+/- 2 días). En la visita de exploración 1, los sujetos se exploraron para detectar IgE específica de alérgeno, se sometieron a una prueba de punción cutánea con extracto de pelo de gato (SPT de gato, del inglésSkin Prick Test-cat), Aquagen<©>, ALK-Abello) y otros extractos de alérgenos, y se sometieron a pruebas de función pulmonar (FEF1, volumen espiratorio forzado en el primer segundo). Los sujetos fueron elegibles para la visita de exploración 2 basándose en cada uno títulos de IgE específicos de Fel d 1 y en extracto de pelo de gato >0,35 kUA/l, un diámetro medio de habón en la prueba de punción cutánea (SPT) frente a gato > 3 mm en comparación con una SPT de control negativo, y una función pulmonar normal. Se excluyeron los sujetos que tenían antecedentes de IAE o vacunación con alérgenos de gato, o terapia contra IgE; IAE (inmunoterapia alergénica específica) a otros alérgenos en los 3 meses anteriores a la exploración; o convivían con un gato o estaban expuestos crónicamente a él.

[0705] En la visita de exploración 2, se realizó una sola exposición nasal a alérgeno (ENA) utilizando dosis crecientes de extractos de pelo de gato (100-33.000 UCE/ml). Resumiendo, el extracto de pelo de gato se aplicó por vía intranasal cada 10 min durante 1 hora, o hasta que se alcanzó una puntuación total de síntomas nasales (TNSS) >7. La TNSS (medida en una escala de 0-12) es una evaluación compuesta de síntomas de congestión, picor y rinorrea (cada uno de ellos calificado en una escala de 0 a 3, siendo 3 grave), y estornudos (siendo 3 >5 estornudos) del paciente. Los sujetos sensibilizados al gato fueron elegibles para la inclusión en el estudio si antes de la ENA (tiempo 0) de exploración tenían una TNSS<2 y si una hora después de iniciar dicha ENA tenían una TNSS máxima>7.

[0706] Los sujetos elegibles se asignaron al azar para recibir el fármaco del estudio o placebo el día 1 del estudio (14 días después de la visita de exploración 2). Los días 8, 29, 57 y 85 del estudio, los sujetos se sometieron a ENA utilizando la misma titulación de alérgeno necesaria para que cada sujeto individual alcanzara una TNSS>7 en su 2ª visita de exploración, sin superar la dosis máxima establecida en la visita de exploración, independientemente de que se haya alcanzado una TNSS>7. En cada visita del estudio, antes de la ENA, se midieron la TNSS, la puntuación de los síntomas nasales en la VAS, escala visual Analógica, (escala de 0 a 100) y el flujo inspiratorio nasal máximo (PNIF, medido en permeabilidad nasal, l/min), después, a los 10, 30 y 60 minutos durante la primera hora, y una vez por hora durante 8 horas para medir la respuesta de fase tardía (RFT). Se recogieron muestras de suero en cada visita del estudio y los días 29 y 85 del estudio se repitió la prueba de punción cutánea frente a gato.

[0707] Criterios de valoración de eficacia:

[0708] El criterio principal de valoración de eficacia fue el cambio del ABC de la TNSS entre el pretratamiento y el día 8 de la exposición nasal a alérgeno (ENA) durante la primera hora de la exposición (de 0 a 1 hora, respuesta alérgica de fase temprana). Los criterios secundarios de valoración fueron el cambio porcentual del ABC de la TNSS desde el pretratamiento hasta el día 8 de la ENA durante la primera hora; el cambio y cambio porcentual en el ABC de la TNSS desde el tratamiento previo con ENA hasta los días 29, 57 y 85 durante la primera hora; y el cambio y cambio porcentual en el ABC de la TNSS desde la hora 1 hasta la hora 8 después de la exposición (RFT, respuesta de fase tardía) desde la ENA previa al tratamiento hasta los días 8, 29, 57 y 85. Los criterios de valoración exploratorios incluían el cambio y el cambio porcentual desde la ENA previa al tratamiento hasta los días 8, 29, 57 y 85 en la TNSS máxima, puntuación máxima de síntomas nasales en la Escala Visual Analógica (VAS) y fujo inspiratorio nasal máximo (PNIF); así como el ABC de la puntuación de síntomas nasales en la VAS y el ABC de 0-1 hora y de 1 a 8 horas del PNIF. El análisis de las respuestas se realizó para este propósito. También se midieron parámetros farmacocinéticos.

[0709] El cambio porcentual desde el inicio hasta el día 29 o el día 85 en el ABC del diámetro medio del habón para la prueba de punción cutánea con titulación con extracto de pelo de gato (100-33.000 UCE/ml) medido 15 min después de la aplicación, fue un criterio de valoración exploratorio adicional. La prueba se realizó con diluciones en serie por duplicado de extracto de pelo de gato Aquagen (ALK-Abello) utilizando seis titulaciones de dosis que variaban de 100 a 33.000 UCE/ml. Se administraron por duplicado sondas individuales con una solución de control negativo (solución salina) y un control positivo de histamina simultáneamente con sondas de extracto de pelo de gato en el brazo opuesto. Quince minutos después de la aplicación, se registraron los diámetros de los habones. Los diámetros medios de los habones se calcularon sumando el diámetro más largo al diámetro ortogonal más largo y dividiendo por 2.

[0710] Para cada una de las pruebas de punción cutánea por duplicado, deben registrarse los diámetros ortogonales largo y más largo y calcular el diámetro medio de cada habón con dos decimales. Después, se calcula la media de los diámetros promedio de los habones obtenidos en las dos punciones cutáneas.

[0711] Para la prueba de punción cutánea con titulación en gatos, la fórmula utilizada para calcular el ABC del diámetro promedio normalizado del habón fue la siguiente:

[0712] [(t1 - t0)(D1 D0)/2 (t2 - t1)(D2 D1)/2 (t3 - t2)(D3 D2)/2+ (t4 - t3)(D4 D3)/2+ (t5 - t4)(D5 D4)/2] /(t5 - t0) en la que:

[0713] ti es la concentración (en UCE/ml) para la que se mide Di;

[0714] t0 = 100, t1 = 330, t2 = 1000, t3 = 3300, t4 = 10000 y t5 = 33000

[0715] Di es el diámetro promedio del habón obtenido a la concentración ti.

[0716] El control negativo no se restó de este valor.

[0717] Seguridad:

[0718] Las evaluaciones de seguridad incluyeron las tasas de acontecimientos adversos que se presentan durante el tratamiento (AADT) o acontecimientos adversos graves (AAG) hasta el día 85, según los informes de los investigadores, junto con las constantes vitales y las pruebas de laboratorio. Los acontecimientos adversos se describieron en el diccionario médico para actividades de registro farmacéutico (Medical Dictionary for Regulatory Activities, MedDRA; versión 17.0) a los términos de nivel más bajo.

[0719] Análisis estadístico clínico:

[0720] Se necesitó un tamaño de muestra de al menos 70 sujetos alérgicos a los gatos para obtener al menos una fuerza del 90 % en la detección de las diferencias medias esperadas en el criterio principal de valoración entre los dos grupos de tratamiento, con la suposición de un valor medio del ABC de la TNSS de 5 para el grupo con placebo y de 3 para el grupo de tratamiento durante el periodo de 0-1 hora después de la exposición. La desviación estándar supuesta de 2,43 es coherente con el efecto de los corticoesteroides nasales tópicos (Wuet al.(2013), Allergy Asthma Proc May-June 34(3):283-291, Nicholson,et al., (2011), J. Allergy Clin. Immunol, 128:800-807). Los análisis primarios de eficacia se realizaron en el conjunto de análisis completo (CAC), que incluye a todos los sujetos aleatorizados que recibieron cualquier fármaco del estudio el día 1 y que tenían resultados de evaluación de la TNSS el día 8 (n=36 y n=34, para los grupos con placebo y REGN1908-1909, respectivamente). Los criterios de valoración de eficacia se analizaron utilizando un modelo de análisis de la covarianza (ANCOVA) con el grupo de tratamiento como factor y el valor de referencia como covariable. Los resultados del modelo ANCOVA incluyeron el resumen de la media de mínimos cuadrados (MC) de cada grupo de tratamiento, con su correspondiente error estándar (EE), la diferencia de MC entre los grupos de tratamiento con su correspondiente EE e intervalo de confianza (IC) del 95 %, y el valor de p (probabilidad) correspondiente a la diferencia entre los grupos de tratamiento. Se realizaron análisis de sensibilidad para todos los análisis de eficacia excluyendo a 4 sujetos de un centro del estudio que finalizó anticipadamente por incumplimiento, según lo determinado por el investigador/patrocinador, y para el criterio principal de valoración de la eficacia imputando tres valores de ABC(0-1h) de TNSS que faltaban el día 8 con los valores de referencia. Los criterios secundarios de valoración y eficacia exploratorios se analizaron utilizando el mismo modelo ANCOVA que el análisis primario; no se realizó ningún control de la multiplicidad para los criterios secundarios de valoración y exploratorios, por lo que los valores de p se consideran nominales. El conjunto de análisis de seguridad incluyó a todos los sujetos aleatorizados que recibieron cualquier fármaco del estudio el día 1, en función del tratamiento recibido.

[0722] Resultados

[0724] REGN1908-1909 bloquea la respuesta alérgica de fase temprana a la exposición nasal a alérgenos en pacientes alérgicos a los gatos

[0726] Para determinar si la protección preclínica ofrecida por REGN1908-1909 podría traducirse en eficacia clínica, se realizó un estudio de fase 1b, demostrativo del mecanismo de acción (MDA), aleatorizado, con doble ocultación y controlado con placebo, para evaluar si una dosis única subcutánea (SC) de REGN1908-1909 (600 mg; 1:1) podía inhibir los síntomas alérgicos inducidos por el extracto de pelo de gato en sujetos alérgicos a los gatos (Fig. 7). Se seleccionó una prueba de exposición nasal con alérgeno (ENA) con extracto de pelo de gato para la demostración del mecanismo de acción (MDA), por ser un método fiable, reproducible y controlado para medir los síntomas alérgicos (Fig.8A y 8B). La instilación intranasal del alérgeno provoca síntomas alérgicos locales, tal como congestión nasal, picor, estornudos y rinorrea, que se asocian a la desgranulación de mastocitos y basófilos mediada por IgE y alcanzan su máximo en la respuesta de fase temprana (RFT) (Durham, M.D.,et al., (2016), Journal of Allergy and Clinical Immunology 138 (4). Elsevier Inc.: 1-12;Scadding, G.,et al., (2015), Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology 45 (3): 613-23). Por lo tanto, el análisis primario de eficacia fue el cambio en el área bajo la curva (ABC) de la puntuación total de síntomas nasales (TNSS) durante la primera hora después de una ENA [ABC(0-1h) de la TNSS] desde el pretratamiento hasta la exposición el día 8.

[0728] Setenta y tres sujetos se asignaron al azar y recibieron el fármaco del estudio previsto (placebo=37 sujetos; REGN1908-1909=36 sujetos). Las características iniciales estaban generalmente equilibradas entre los grupos, y la mayoría de los sujetos eran polialérgicos. Sesenta y ocho sujetos finalizaron el estudio (34 por grupo); se excluyeron 4 sujetos del estudio debido al incumplimiento de un centro de estudio y 1 sujeto del grupo de tratamiento retiró su consentimiento.

[0730] El cambio en los síntomas clínicos [ABC(0-1h) de la TNSS] desde el inicio hasta la ENA el día 8, se redujo significativamente en pacientes que recibieron una dosis única SC de REGN1908-1909 (600 mg) en comparación con placebo (diferencia de la media de MC -1,771, p=0,0003; IC del 95 %[-2,704,-0,838]) (Tabla 26). Los análisis de sensibilidad del criterio principal de valoración mostraron un resultado similar (Tabla 27). Ningún efecto sobre los criterios de valoración clínicos se atribuyó a un centro de estudio individual (p=0,5518). Ni los niveles de referencia de IgE frente a caspa de gato ni los títulos de IgE frente a Fel d 1 se correlacionaron con el cambio porcentual respecto al valor de referencia en el AUC(0-1h) de la TNSS (p=0,4492, p=0,8157, respectivamente). Aunque el modelo de ENA no induce sólidamente una respuesta de fase tardía, el AUC(1-8h) de la TNSS se redujo en los sujetos tratados con REGN1908-1909 en comparación con los que recibieron placebo los días 8 y 29 (p=0,0094, y p=0,0074, respectivamente. El análisis de componentes de la TNSS reveló que REGN1908-1909 tuvo el mayor impacto en dos de los componentes de la TNSS, "Congestión nasal" y "Rinorrea", que contribuyeron con un 34 % y un 39 % de mejora en la puntuación total del criterio principal de valoración, respectivamente.

[0732] El efecto de REGN1908-1909 se mantuvo durante al menos un mes después de la primera dosis, con pruebas que sugieren su eficacia a lo largo de los 85 días del estudio. El tratamiento con REGN1908-1909 produjo una mejora prolongada y clínicamente significativa de los síntomas (definida comúnmente como una reducción >20 % en la puntuación total de los síntomas en comparación con el placebo): El tratamiento con REGN1908-1909 redujo el AUC(0-1h) de la TNSS en un 56 %, 61 %, 51 % y 51 % los días 8, 29, 57 y 85, respectivamente; lo que supone una reducción del 29 %, 33 %, 14 % y 23 % frente al placebo y alcanzan una significación estadística nominal frente al placebo en cada punto temporal excepto el día 57 (p=0,0005, 0,0004, 0,1321, 0,0187, respectivamente) (Tabla 26, Fig. 9). Además, el análisis de los pacientes que responden al tratamiento mostró que al menos el 50 % de los que recibieron REGN1908-1909 lograron una reducción >60 % del ABC(0-1h) de la TNSS en cada día del estudio, en comparación con el placebo (Fig. 10) y únicamente 4 pacientes que recibieron REGN1908-1909 no alcanzaron una respuesta > 30 % en ningún momento. La duración y la magnitud de los resultados de la TNSS se reflejaron en otra puntuación de síntomas comunicada por el paciente, en la puntuación en una Escala Visual Analógica (VAS) (datos no mostrados) y también en la medición objetiva de la congestión nasal y el flujo inspiratorio nasal máximo (PNIF) (Fig. 11), con una mejora del 39 % los días 8 y 85.

[0734] El tratamiento con REGN1908-1909 también redujo la respuesta de hipersensibilidad al extracto de pelo de gato suministrado en la piel en una prueba de punción cutánea con titulación (SPT de gato) (Fig.12). Esta prueba cutánea es mucho menos subjetiva que la sintomatología alérgica notificada por el paciente, como refleja la ausencia de respuesta al placebo, y puede ser la mejor medición farmacodinámica del bloqueo de la respuesta inducida por IgE. A diferencia de los sujetos que recibieron placebo, en los que no se observaron cambios en el diámetro del habón, el tratamiento con REGN1908-1909 produjo una reducción del 52 % en comparación con el valor inicial el día 29, con la magnitud del efecto sin cambios el día 85. Estos datos confirman aún más que REGN1908-1909 suprime la respuesta de fase temprana (RFT) alérgica y muestran además que el mecanismo de acción de REGN1908-1909 dilucidado en el modelo de ACP en ratón, se traduce en seres humanos alérgicos a los gatos. En conjunto, para las tres medidas (TNSS, PNIF y SPT-gato), la magnitud de eficacia similar observada el día 8, cuando la concentración total del fármaco del estudio era >75 mg/l (Cmáx), y el día 85, cuando los niveles eran de ~5 mg/l, respalda la idea de que niveles muy bajos de anticuerpos bloqueadores fuertes pueden impedir la respuesta alérgica inducida por alérgenos.

[0736] En general, REGN1908-1909 fue seguro y se toleró bien. Se observó un total de 107 acontecimientos adversos, que en general estaban equilibrados entre los grupos. Dos acontecimientos adversos se clasificaron como graves, pero que el investigador determinó que no estaban relacionados con el tratamiento (1 apendicitis en el grupo con placebo y 1 pielonefritis en el grupo con REGN1908-1909). Se observó al menos un acontecimiento adverso 23 (63,9 %) de los sujetos del grupo con REGN1908-1909 y en 23 (62,2 %) del grupo con placebo. El acontecimiento adverso más frecuente fue la cefalea en ambos grupos (6 en el grupo con REGN1908-1909; 5 en el grupo con placebo). Se observaron dos reacciones leves en el lugar de la inyección, una en cada grupo. Ningún sujeto abandonó el estudio debido a un acontecimiento adverso y no hubo ningún fallecido.

[0738] Sumario

[0740] Aunque la IAE (inmunoterapia alergénica específica) se utiliza desde hace más de 100 años para tratar las alergias, el uso de extractos de alérgenos heterogéneos en la IAE convencional presenta un arma de doble filo para los pacientes. En algunos pacientes, el tratamiento requiere inyecciones frecuentes durante muchos años y conlleva el riesgo de inducir reacciones alérgicas a las inyecciones. Otros enfoques han intentado reproducir el efecto protector de la IAE mediante el uso de componentes mínimamente protectores centrándose en las respuestas celulares o humorales, al tiempo que se evitan los efectos secundarios mediados por IgE. Se han probado algunas vacunas peptídicas de linfocitos T para alérgenos, pero no han demostrado beneficios significativos, mientras que otras vacunas peptídicas han demostrado su eficacia en la alergia al abedul o a las gramíneas.

[0742] A diferencia de las vacunas peptídicas, el enfoque descrito en el presente documento permite seleccionar la combinación más fuerte de anticuerpos bloqueadores generados en respuesta a alérgenos enteros de forma natural y agnóstica por ratones VelocImmune<®>humanizados genéticamente (Macdonald, L. E.et al.Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111, 5147-5152, (2014); Murphy, A. J.et al.Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111, 5153-5158, (2014). Curiosamente, REGN1908 y REGN1909, los dos anticuerpos bloqueadores más fuertes, se unen a epítopos Fel d 1 conformacionales. Así mismo, la administración pasiva permite el suministro directo de altas concentraciones uniformes de dos anticuerpos bloqueadores (>75 mg/l en total) con una sola dosis, evitando la necesidad de administraciones repetidas de alérgenos o péptidos, adyuvantes y la consiguiente respuesta inmunitaria del paciente para generar títulos elevados de anticuerpos.

[0744] Así mismo, los estudios descritos en el presente documento demostraron la prueba de principio de que la administración directa de anticuerpos monoclonales específicos contra alérgenos constituye un método bien tolerado, rápido y eficaz para reducir los síntomas alérgicos. Utilizando Fel d1, el alérgeno dominante de gato para la prueba de principio, se demostró sistemáticamente que la combinación de dos anticuerpos monoclonales IgG4 específicos para Fel d1, de alta afinidad y no competitivos, REGN1908 y REGN1909, bloquea la unión de Fel d1 a la IgE policlonal alérgica de gatoin vitroe impide la desgranulación de los mastocitosin vivo, de manera más eficaz que la IgG purificada de pacientes que se sometieron con éxito a IAE de gato. Este enfoque preclínico se tradujo en una eficacia clínica en la que una única dosis SC de REGN1908-1909 en sujetos alérgicos a los gatos dio lugar a una reducción clínicamente significativa y sostenida de los síntomas nasales totales al bloquear la respuesta alérgica temprana a la exposición nasal con alérgeno de gato.

[0746] De manera más específica, este estudio clínico de prueba de principio examinó el potencial de la inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales frente a Fel d 1 para bloquear los síntomas alérgicos intensos desencadenados por la provocación nasal con extracto de gato. La mayoría de los sujetos que recibieron REGN1908-1909 experimentaron una mejoría de los síntomas, alcanzando al menos un 50 % de los sujetos una mejora del 60 % en la TNSS en cada punto temporal, estableciendo clínicamente la inmunodominancia de Fel d 1 como causante de los síntomas de la alergia a los gatos. Aunque no todos los pacientes lograron una respuesta clínica, se observó una variabilidad similar entre pacientes en un ensayo funcionalex vivocon basófilos en fase preclínica: se observó una inhibición del 80 % de la activación de los basófilos en 7/10 donantes. La variabilidad observada tanto en la fase preclínica como e la clínica sugiere que REGN1908-1909 no bloquea la unión de Fel d 1 a una proporción del repertorio de IgE de los pacientes o que Fel d 1 no es el principal causante de los síntomas alérgicos a los gatos en estos pacientes. Sin embargo, exclusivo de un enfoque de inmunización pasiva, estos datos también sugieren un posible mecanismo para predecir la respuesta de los pacientes al tratamiento con REGN1908-1909: Dado que se ha demostrado que las pruebas de activación de los basófilosex vivose correlacionan con la respuesta nasal a la exposición a alérgenos (Paterniti, M.et al.La reactividad de los basófilos sanguíneos inducida por alérgenosin vitropredice las respuestas a la exposición intensa con alérgenos humanosin vivo. Clinical and experimental allergy: journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology 41, 963-969, (2011)), puede ser posible determinar si, mediante una prueba previa de la capacidad de REGN1908-1909 para bloquear que Fel d 1 reaccione de manera cruzada con la IgE del paciente en un bioensayo funcionalex vivocon basófilos, se puede dirigir la terapia a aquellos pacientes que recibirán el máximo beneficio.

[0747] Tomados en conjunto, nuestros datos confirman la hipótesis de que los anticuerpos bloqueadores antialérgenos de alta calidad son suficientes para impulsar la reducción de los síntomas que ofrece la inmunoterapia alergénica específica (TIE) (Flicker, S.et al., (2011), Current Topics in Microbiology and Immunology 352: 141-59). La mejoría relativa en la reducción de los síntomas el Día 8 en este estudio fue numéricamente superior a la comunicada en pacientes que completaron de 1 a 2 años de inmunoterapia subcutánea con gramíneas (Durham, S. sin publicar). Así mismo, la mejoría observada en este estudio puede ser de 4 a 8 veces más eficaz en comparación con los esteroides nasales y los antihistamínicos, respectivamente (Durham, S.et al., (2016), J. of Allergy & Clin. Immunol.138(4): 1-12). Este estudio valida un nuevo paradigma para el desarrollo de anticuerpos contra alérgenos: la selección preclínica de anticuerpos contra alérgenos fuertes y completamente humanos que bloquean la unión del alérgeno a la mayoría de las IgE específicas de alérgeno produce una eficacia clínica. La aplicación de esta enfoque novedoso y sistemático a otros alérgenos podría permitir el desarrollo de un repertorio de terapias antialérgicas para la gestión personalizada de las alergias.

[0748] Tabla 26

[0750]

[0751] continuación

[0753]

[0755] Tabla 27

[0757]

[0759] Ejemplo 12. Determinación del lugar o lugares de unión de H4H2636P en la cadena 2 del Fel d 1 mediante cristalografía de rayos X

[0760] Se realizó un estudio para determinar el lugar o lugares de unión de H4H2636P en la Cadena 2 de Fel d 1 mediante Cristalografía de Rayos X. En este estudio, se clonó un fragmento Fab de H4H2636P y se expresó en células HEK293, después se purificó mediante cromatografía de afinidad con proteína A. La proteína Fel d1 recombinante (cadena 2(N50A) - cadena 1(G31D), con una etiqueta de afinidad carboxiterminal myc-myc-His6) se purificó como se ha descrito anteriormente (véase el Ejemplo 8). rFel d1 y Fab de H4H2636P se mezclaron en una proporción molar de aproximadamente 1:1 y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se separó el complejo de un ligero exceso de Fab mediante cromatografía de exclusión por tamaño. El complejo rFel d1 - Fab se concentró a 20 mg/ml en solución salina tamponada con HEPES, a continuación se cristalizó contra una solución de reserva de acetato de calcio 0,2 M, cacodilato sódico 0,1 M pH 6,5, 40 % (v/v) de polietilenglicol 300. Los cristales se recogieron directamente del licor madre y se congelaron en nitrógeno líquido.

[0761] Los datos de difracción a 2,9 Å se recogieron en un cristal rFel d1 - Fab en la línea de haz 5.0.2 de la Fuente de Luz Avanzada, Lawrence Berkeley National Laboratory. La estructura se resolvió mediante sustitución molecular usando el programa Phaser, con el código PDB 1PUO como modelo de búsqueda para el componente Fel d1, y el código PDB 2R8S para el componente Fab. La estructura se refinó con refmac5 y se reconstruyó con coot. Las coordenadas de la estructura final rFel d1 - Fab se han depositado en el Banco de Datos de Proteínas RCSB con el código de registro 5VYF.

[0763] Una estructura cristalina de rayos X del fragmento Fab del H4H2636P unido al Fel d1 mostró que múltiples restos del péptido protegido con HDX entran en contacto con H4H2636P. En particular, dentro del péptido protegido con HDX, que abarca desde el resto 15 hasta el resto 24 de SEQ ID NO: 396, el análisis cristalográfico de rayos X muestra la unión a los restos N21, E22, L23 y L24 de la SEQ ID NO: 396. El análisis cristalográfico de rayos X muestra también varios contactos adicionales realizados por restos Fel d1 en un péptido de la Cadena 2 no detectado por HDX. Entre ellos se incluyen los siguientes restos: D26, L27, T30, K31, E36, R39, K43 y D47 de la SEQ ID NO: 396. En conjunto estos datos, junto con los mostrados en el Ejemplo 8, confirman un modelo en el que H4H1232N y H4H2636P se unen simultánea y no competitivamente a epítopos conformacionales en regiones opuestas de la superficie del heterodímero Fel d1.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Dos anticuerpos monoclonales específicos de alérgeno, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 18/26 y 306/314 y cada uno de ellos comprende un Fc de IgG4 humana que se une específicamente a la proteína Fel d1 para su uso en un método de reducción de la gravedad, la duración o la frecuencia de aparición de uno o más síntomas asociados a una respuesta alérgica en un paciente humano provocada por un producto de origen animal que contiene el alérgeno Fel d1, medida mediante la puntuación total de síntomas nasales (TNSS), comprendiendo el método, la administración al paciente humano de una dosis terapéuticamente eficaz de dichos dos anticuerpos monoclonales específicos de alérgeno, en donde los dos anticuerpos específicos de alérgeno se administran como una única dosis subcutánea de 600 mg que comprende 300 mg del par de secuencias de aminoácidos que consiste en las SEQ ID NO: 18/26 y 300 mg del par de secuencias de aminoácidos que consiste en las SEQ ID NO: 306/314.

2. Los anticuerpos monoclonales específicos de alérgeno para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el uno o más síntomas se seleccionan del grupo que consiste en congestión nasal, picor nasal, rinorrea y estornudos.

3. Los anticuerpos monoclonales específicos de alérgeno para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el método se asocia a una reducción del diámetro del habón en una prueba cutánea de alergia.

4. Los anticuerpos monoclonales específicos de alérgeno para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el producto animal se selecciona del grupo que consiste en caspa de gato, pelo de gato o extracto de pelo de gato.

5. Los anticuerpos monoclonales específicos de alérgeno para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el tratamiento produce una reducción de al menos un 50 % de la TNSS con respecto al valor de referencia.