ES3061962T3 - Variant icos ligand immunomodulatory proteins and related compositions and methods - Google Patents

Variant icos ligand immunomodulatory proteins and related compositions and methods

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ES3061962T3 ES18803814T ES18803814T ES3061962T3 ES 3061962 T3 ES3061962 T3 ES 3061962T3 ES 18803814 T ES18803814 T ES 18803814T ES 18803814 T ES18803814 T ES 18803814T ES 3061962 T3 ES3061962 T3 ES 3061962T3
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Lawrence Evans
Michael Kornacker
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Alpine Immune Sciences Inc
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Abstract

En este documento se describen proteínas inmunomoduladoras que comprenden variantes de ICOSL y los ácidos nucleicos que las codifican. Estas proteínas inmunomoduladoras ofrecen utilidad terapéutica para diversas afecciones inmunológicas y oncológicas. Se proporcionan composiciones y métodos para la síntesis y el uso de dichas proteínas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Proteínas inmunomoduladoras de ligando ICOS variante y composiciones y métodos relacionados
[0003] Referencia Cruzada a Aplicaciones Relacionadas
[0004] La presente solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente provisional de EE. UU.62/574,161, depositada el 18 de octubre de 2017, titulada "VARIANT ICOS LIGAND IMMUNOMODULATORY PROTEINS AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS".
[0005] Campo
[0006] La presente divulgación se refiere a composiciones terapéuticas para modular la respuesta inmunitaria en el tratamiento del cáncer y las enfermedades inmunológicas. En algunos aspectos, la presente divulgación se refiere a variantes particulares del ligando ICOS (ICOSL) que presentan una unión mejorada, tal como una afinidad o selectividad mejorada para una o ambas proteínas asociadas de unión ICOS o CD28.
[0007] Fondo
[0008] La modulación de la respuesta inmunitaria mediante la intervención en los procesos que tienen lugar en la sinapsis inmunológica (IS) formada por y entre las células presentadoras de antígenos (APC) o las células diana y los linfocitos reviste un interés médico cada vez mayor. Mecánicamente, las proteínas de la superficie celular en el SI pueden implicar la interacción coordinada y a menudo simultánea de múltiples dianas proteicas con una única proteína a la que se unen. Las interacciones IS se producen en estrecha asociación con la unión de dos células, y una sola proteína en esta estructura puede interactuar tanto con una proteína de la misma célula (cis) como con una proteína de la célula asociada (trans), probablemente al mismo tiempo. Aunque se conocen terapias que pueden modular el SI, es necesario mejorarlas. Se proporcionan proteínas inmunomoduladoras, incluidas proteínas solubles o proteínas inmunomoduladoras transmembrana capaces de expresarse en células, que satisfacen tales necesidades.
[0009] Resumen
[0010] Las realizaciones que no estén comprendidas en el ámbito literal de las reivindicaciones anexas deben considerarse simplemente como antecedentes o ejemplos de referencia adecuados para comprender la invención.
[0011] En el presente documento se proporciona una variante del polipéptido ligando ICOS (ICOSL), de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.
[0012] En algunas de dichas realizaciones, el truncamiento C-terminal es de al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 125 residuos de aminoácidos. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido de referencia ICOSL está alterado o carece de un sitio de escisión de proteasa establecido como los aminoácidos 204-209 de SEQ ID N.º:32. En algunos ejemplos, el polipéptido de referencia ICOSL contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 545. En algunos aspectos, el polipéptido de referencia ICOSL consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 545.
[0013] Se proporciona aquí un polipéptido variante del ligando ICOSL (ICOSL) que contiene una o más modificaciones de aminoácidos en un polipéptido de referencia ICOSL, en el que el polipéptido de referencia ICOSL consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 545. También se proporciona en el presente documento una variante del polipéptido ligando ICOSL (ICOSL) que contiene una o más modificaciones de aminoácidos en un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) de un polipéptido de referencia ICOSL, en el que el polipéptido de referencia ICOSL está alterado en uno o más aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 204-209 con referencia a SEQ ID N.º: 32. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante muestra una unión alterada a uno o más de sus socios de unión en comparación con la unión del polipéptido ICOSL de referencia a uno o más socios de unión. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante muestra una mayor unión a uno o más de sus socios de unión en comparación con la unión del polipéptido ICOSL de referencia a uno o más socios de unión.
[0014] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la alteración (por ejemplo, modificación) incluye una supresión de uno o más aminoácidos contiguos correspondientes a los aminoácidos 204-209 con referencia a SEQ ID N.º: 32. En algunos casos, el polipéptido de referencia ICOSL comprende la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 600-605. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido de referencia ICOSL consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 600-605.
[0015] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la alteración (por ejemplo, modificación) incluye al menos una sustitución de aminoácidos en una o ambas posiciones 207 y 208 correspondientes a las posiciones establecidas en SEQ ID N.º: 32. En algunos ejemplos, la sustitución de al menos un aminoácido es N207A, N207G o L208G, o una sustitución conservadora de aminoácidos de los mismos.
[0016] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL de referencia contiene la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 623-628. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL de referencia consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 623-628.
[0018] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL presenta una escisión proteolítica reducida cuando se expresa a partir de una célula. En algunos ejemplos, la célula es una célula de mamífero. En algunos casos, la célula es una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) o un derivado de la misma.
[0020] En algunas de dichas realizaciones, la modificación de aminoácidos es una sustitución, inserción o deleción de aminoácidos. En algunas de cualquiera de las realizaciones proporcionadas, la una o más modificaciones de aminoácidos están en una posición correspondiente a posición(es) seleccionada(s) de 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 148, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225, o 227 con referencia a SEQ ID N.º:32. En algunas de cualquiera de las realizaciones proporcionadas, la una o más modificaciones de aminoácidos están en una posición correspondiente a posición(es) seleccionada(s) de 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 26, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225, o 227 con referencia a SEQ ID N.º:32.
[0022] En algunas de las realizaciones proporcionadas, una o más modificaciones de aminoácidos se seleccionan entre M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20V, S25G, F27S, F27C, N30D, Y33del, Q37R, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57Y, N57W, R61S, R61C, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, E90A, K92R, F93L, H94E, H94D, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110D, V110N, V110A, E111del, T113E, H115R, H115Q, V116A, A117T, N119Q, F120I, S121G, V122A, V122M, F120S, S126T, S126R, H129P, S130G,S132F, Q133H, E135K, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F,I143V, I143T, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H,W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161P, L161M, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193M, N194D, C198R, N201S, L203P, L203F, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217V, I218T, I218N, E220G, R221G, R221I, I224V, T225A, N227K, o una sustitución aminoacídica conservadora de los mismos.
[0024] En algunas de las realizaciones proporcionadas, una o más modificaciones de aminoácidos se seleccionan entre M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20T, A20V, S25G, R26S, F27C, F27S, N30D, Y33del, Q37R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R61S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110A, V110D, V110N, E111del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S, S121G, V122A, V122M, S126R,S126T, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, I143T, I143V, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H, W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161M, L161P, Q164L, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193A, V193M, N194D, C198R, N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, I218N, I218T, E220G, R221G, R221I, R221K, I224V, T225A, T225S, N227K, o una sustitución aminoacídica conservadora de los mismos.
[0026] [0015]En algunas de las realizaciones proporcionadas, la modificación de uno o más aminoácidos se encuentra en una posición correspondiente a la(s) posición(es) 52, 57 ó 100. En algunas de las realizaciones proporcionadas, las modificaciones de uno o más aminoácidos se seleccionan entre N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57Y, N57W, Q100A, Q100D, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T o Q100V. En algunas de las realizaciones proporcionadas, una o más modificaciones de aminoácidos se seleccionan entre N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57Y, N57W, Q100A, Q100D, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T o Q100V. En algunos ejemplos, la una o más modificaciones de aminoácidos se seleccionan entre N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R. N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52D/V151A, N52H/I143T, N52S/L80P, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S, N52H/F78L/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D, N52H/Q100R, N52H/S121G, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y, N52S/F120S, N52S/V97A, N52S/G72R, N52S/A71T/A117T, N52S/E220G, Y47H/N52S/V107A/F120S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, Q37R/N52H/N57Y/QIOOR/Vl ION/SI42F/CI98R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R, F27S/N52H/N57Y/V110N, N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q, S18R/N52S/F93L/I143V/R221G, A20T/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52S/H94E/L96I/V122M, N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N, M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R, N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I, M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/1143V/F172S/V193M/C198R, N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V11OD/N144D/F172S/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N52S/E90A, N30D/K42E/N52S, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N52S/F120S/N227K, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, N52D, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G, N52Q/N207Q, N52Q/N168Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/M143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R, N52H/V122A/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52S/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/ N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L o N57Q/Q100P.
[0028] [0016]En algunas de las realizaciones proporcionadas, la modificación de uno o más aminoácidos se selecciona entre N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R. N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52D/V151A, N52H/I143T, N52S/L80P, F120S/Y152H/N201S, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S, N52S/G103E, N52H/F78L/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D, N52H/Q100R, N52H/S121G, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y, N52S/F120S, N52SN97A, N52S/G72R, N52S/A71T/A117T, N52S/E220G, Y47H/N52S/V107A/F120S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R, F27S/N52H/N57Y/V110N, N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q, S18R/N52S/F93L/I143V/R221G, A20T/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52S/H94E/L96I/V122M, N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N, M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R, N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I, M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/1143V/F172S/V193M,C198R, N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N52S/E90A, N30D/K42E/N52S, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N52S/F120S/N227K, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G, N52Q/N207Q, N52Q/N168Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R, N52H/V122A/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52S/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L, N57Q/Q100P, o R26S/N52H/N57Y/V110D/T137A/C198R.
[0030] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la modificación de uno o más aminoácidos es N52H/Q100R. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL tiene la secuencia establecida en SEQ ID N.º:567.
[0032] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la modificación de uno o más aminoácidos es N52H/N57Y/Q100R. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL contiene la secuencia establecida en SEQ ID N.º:565.
[0034] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la modificación de uno o más aminoácidos es N52L/N57H/Q100R. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL contiene la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 761.
[0036] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la modificación de uno o más aminoácidos es N52D. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL contiene la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 548.
[0038] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la modificación de uno o más aminoácidos es N52H/N57Y/Q100P. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL contiene la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 570.
[0040] En algunas de las realizaciones proporcionadas, una o más modificaciones de aminoácidos se seleccionan entre F120S/Y152H/N201S, E111del, Y33del, N168Q/N207Q, N84Q/N207Q, N155Q/N207Q, N119Q/N168Q, N119Q/N207Q, N119Q/N155Q, N84Q/N119Q, N84Q/N155Q/N168Q, N84Q/N168Q/N207Q, N84Q/N155H/N207Q, N155Q/N168Q/N207Q, N119Q N155Q/N168Q, N119Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N207Q, N119Q/N155H/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q, N84Q/N155Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q o F138L/L203P.
[0042] [0023]En algunas de tales realizaciones, la una o más modificaciones de aminoácidos se seleccionan de C198R, D158G, E16V, E90A, F120S, F138L, F172S, H115R, H115X, I143T, I143V, I224V, K156M, K42E, K92R, L102R, L203P, L208P, N194D, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52Y, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57S, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100D, Q100E, Q100K, Q100M, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q133H, R221I, R75Q, S54A, S54P, T113E, T225A, V110D, V122A, Y146C, Y152C, A117T, A20V, A71T, A91G, A91G, AE88D, C140del, C198R, D158G, D77G, D90K, E117G, E135K, E16V, E81A, E88D, E90A, F120I, F120S, F138L, F172S, F27C, F92Y, G72R, H115R, H115X, H129P, H94E, I118V, I127T, I143T, I143V, I154F, I218N, I218T, I224V, K156M, K169E, K36G, K42E, K89R, K92R, K93R, L102R, L161P, L166Q, L173S, L203F, L203P, L208P, L209P, L40M, L70Q, L70R, L74Q, L80P, L96I, L98F, M10I, M10V, N115Q, N119Q, N122S, N144D, N155X, N168Q, N168X, N178S, N194D, N207Q, N207X, N227K, N25S, N30D, N52V, N57A, N57F, N57H, N57L, N57M, N57S, N57V, N57W, N57Y, N63S, N84Q, Q100G, Q100N, Q100V, R221G, S109G, S109N, S114T, S121G, S126R, S126T, S130G, S132F, S13G, S18R, S192G, S212G, S25G, S54A, S54P, S99G, T113E, T120S, T130A, T139S, T190A, T199S, T225A, T41I, V107I, V110A, V110D, V11E, V122A, V122M, V193M, V210A, W153R, Y146C, Y152C, o Y152H.
[0044] [0024]En algunas de las realizaciones proporcionadas, la modificación de uno o más aminoácidos se selecciona entre N52S, N52H, N52D, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y, N52S/C198R, N52S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52H/I143T, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/E90A, N52S/F120S/1143V/1224V, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N57Y/Q100P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R. N52H/N57Y/Q100R/L102R, H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/I143T F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N30D/K42E/N52S/H115R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52T/N57H/Q100S, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G o N52T/N57K/Q100P; o N52S, N52H, N52D, N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140del/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y, N57Y/Q100P, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52H/I143T, N52S/L80P, N52S/D158G, N52D/Q133H, L70Q/A91G/N144D, L70Q/A91G/E117G/I118V/T120S/T130A, L70R/A91G/I118V/T120S/T130A/T199S, L70Q/E81A/A91G/I118V/T120S/I127T/ T130A, N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V /T120S/T130A, T41I/A91G, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/ N178S, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, AE88D/K89R/D90K/ A91G/F92Y/K93R, K36G/L40M, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R, N52S/F120S/N227K, N52S/N194D, N52S/F120S, N52S/G72R, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/S132F/I154F/C198R/R221G, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52S/H94E/L96I/V122M, N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N, M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R, N52H/N57Y/V110A/C198R/R2211, M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M,C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N52S/E90A, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F172S/C198R, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q/, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/Q100R, N52H/S121G/C198R, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A/K169E, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/I143T F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R R2211, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R, N52S/H115R/F172S/C198R, N119Q, N207Q, N52Q/N207X, N168X/N207X, N52Q/N168Q, N84Q/N207Q, N119Q N155X, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N207Q, N119Q/N155Q/N168Q, N52H/N84Q/N119Q, N52Q/N84Q/N155X/N168X, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q 100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q 100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G, o N52T/N57K/Q100P. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante muestra una mayor unión al ectodominio de ICOS o CD28 en comparación con la unión del polipéptido ICOSL de referencia al mismo ectodominio.
[0046] En algunas de las realizaciones proporcionadas, una o más modificaciones de aminoácidos se seleccionan entre C198R, D158G, E16V, E90A, F120S, F138L, F172S, H115R, I143V, I224V, K156M, K42E, K92R, L102R, L203P, L208P, N194D, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52Y, N57F, N57H, N57L, N57M, N57S, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100E, Q100G, Q100K, Q100M, Q100P, Q100R, Q100S, Q133H, S212G, S54A, S54P, T113E, V110D, V122A, Y146C, Y152C, o T225A.
[0048] En algunos ejemplos, la una o más modificaciones de aminoácidos se seleccionan entre N52A/N57Y/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52T/N57H/Q100S, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52S, N52H, N52D, N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y, N52S/C198R, N52S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52H/I143T, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52H/N57Y/Q100R/V11OD/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/E90A, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N52S/E90A/H115R, N52S/E90A/H115R, o N30D/K42E/N52S/H115R. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante muestra una mayor unión al ectodominio de ICOS y CD28 en comparación con la unión del polipéptido ICOSL de referencia a los mismos ectodominios.
[0050] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL contiene la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 546-599, 734-781, 783, 786, 788, 792, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 811, 813, 815, 817, 818, 820, 822, 824, 826, 827, 829, 831, 833, 834, 836, 838, 840-843, 845, 847, 848, 850-853, 855, 857, 907, 910, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 90%, 91%%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de los SEQ ID N.º: 546-599, 734-781, 783, 786, 788, 792, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 811, 813, 815, 817, 818, 820, 822, 824, 826, 827, 829, 831, 833, 834, 836, 838, 840-843, 845, 847, 848, 850-853, 855, 857, 907, 910. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 546-599, 734-781, 783, 786, 788, 792, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 811, 813, 815, 817, 818, 820, 822, 824, 826, 827, 829, 831, 833, 834, 836, 838, 840-843, 845, 847, 848, 850-853, 855, 857, 907, 910, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 90%, 91%%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de los SEQ ID N.º: 546-599, 734-781, 783, 786, 788, 792, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 811, 813, 815, 817, 818, 820, 822, 824, 826, 827, 829, 831, 833, 834, 836, 838, 840-843, 845, 847, 848, 850-853, 855, 857, 907, 910.
[0052] [0028]En algunas de las realizaciones proporcionadas de la variante del polipéptido ligando ICOS (ICOSL) que contiene un dominio IgV o un fragmento de unión específico del mismo, un dominio IgC o un fragmento de unión específico del mismo, o ambos, la variante del polipéptido ICOSL contiene una o más modificaciones de aminoácidos en un polipéptido de referencia ICOSL o un fragmento de unión específico del mismo correspondientes a modificaciones de aminoácidos se seleccionan de N52A, N52C, N52D, N52G, N52K, N52L, N52M, N52R, N52T, N52V, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, Q100A, Q100D, Q100G, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100S, Q100T o Q100V con referencia a SEQ ID N.º:32. En algunas de las realizaciones proporcionadas, las modificaciones de uno o más aminoácidos se seleccionan entre N52A/N57F/Q100S, N52A,/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/ N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L o N57Q/Q100P.
[0053] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido de referencia ICOSL es un ICOSL de mamífero o un fragmento de unión específico del mismo. En algunos ejemplos, el polipéptido de referencia ICOSL es un ICOSL humano o un fragmento de unión específico del mismo.
[0054] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido de referencia ICOSL contiene (i) la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º:32, (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID N.º:32; o (iii) una porción de (i) o (ii) que comprende un dominio IgV o un dominio IgC o fragmentos de unión específicos de los mismos o ambos. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el fragmento de unión específica del dominio IgV o del dominio IgC tiene una longitud de al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o más aminoácidos; o el fragmento de unión específica del dominio IgV contiene una longitud que es al menos el 80% de la longitud del dominio IgV establecido como aminoácidos 19-129 de SEQ ID N.º:5 y/o el fragmento de unión específico del dominio IgC comprende una longitud que es al menos el 80% de la longitud del dominio IgC establecida como aminoácidos 141-227 de SEQ ID N.º:5. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL comprende el dominio IgV o un fragmento específico del mismo y el dominio IgC o un fragmento específico del mismo.
[0055] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL contiene la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 638-685, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 90%, 91%%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de los SEQ ID N.º: 638-685. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 638-685, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 90%, 91%%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de los SEQ ID N.º: 638-685.
[0056] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL contiene el dominio IgV o un fragmento de unión específico del mismo. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL contiene la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 686-781, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 90%, 91%%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de los SEQ ID N.º: 686-781. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 686-781, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 90%, 91%%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de los SEQ ID N.º: 686-781.
[0057] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el dominio IgV o fragmento de unión específico del mismo es la única porción ICOSL de la variante del polipéptido ICOSL. En algunos ejemplos, el dominio IgC o fragmento de unión específico del mismo es la única porción ICOSL de la variante del polipéptido ICOSL.
[0058] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante muestra una unión alterada al ectodominio de ICOS o CD28 en comparación con la unión del polipéptido ICOSL de referencia para el mismo ectodominio. En algunos aspectos, el polipéptido ICOSL variante presenta una mayor unión al ectodominio o ectodominios de ICOS o CD28 en comparación con la unión del polipéptido ICOSL de referencia al mismo ectodominio o ectodominios. En algunos ejemplos, la unión aumenta más de 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 60 veces.
[0059] En algunas de dichas realizaciones, el ICOS es un ICOS humano. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la CD28 es una CD28 humana.
[0060] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante muestra una unión disminuida al ectodominio de CTLA-4 en comparación con la unión del polipéptido ICOSL de referencia para el mismo ectodominio. En algunos ejemplos, la unión disminuye más de 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 60 veces. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el CTLA-4 es un CTLA-4 humano.
[0061] [0037]En algunas de las realizaciones proporcionadas, la unión alterada (aumentada o disminuida) es una afinidad de unión alterada (aumentada o disminuida). En algunas de dichas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 modificaciones de aminoácidos, opcionalmente sustituciones de aminoácidos, inserciones y/o deleciones. En algunos casos, el polipéptido ICOSL variante presenta al menos o aproximadamente un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,98% o 99% de identidad de secuencia con el polipéptido ICOSL de referencia.
[0062] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL es una proteína soluble. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante carece de un dominio transmembrana y de un dominio de señalización intracelular; y/o cuando se expresa a partir de una célula, el polipéptido ICOSL variante no se expresa en la superficie de la célula.
[0063] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL contiene además un dominio transmembrana. En algunos casos, el dominio transmembrana contiene la secuencia de aminoácidos establecida como residuos 257-277 de la SEQ ID N.º:5 o una variante funcional de la misma que presenta al menos un 85% de identidad de secuencia con los residuos 257-277 de la SEQ ID N.º:5. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL contiene además un dominio de señalización citoplasmática unido al dominio transmembrana. En algunos casos, el dominio de señalización citoplasmática contiene la secuencia de aminoácidos establecida como residuos 278-302 de la SEQ ID N.º:5 o una variante funcional de la misma que presenta al menos un 85% de identidad de secuencia con los residuos 278-302 de la SEQ ID N.º:5.
[0064] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante está deglicosilado o parcialmente deglicosilado en comparación con la secuencia de referencia ICOSL.
[0065] Se proporciona aquí una proteína inmunomoduladora que contiene cualquiera de las variantes del polipéptido ICOSL y una fracción de extensión de la vida media. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la fracción que prolonga la semivida comprende un dominio de multimerización, albúmina, un polipéptido de unión a albúmina, Pro/Ala/Ser (PAS), un péptido C-terminal (CTP) de la subunidad beta de la gonadotropina coriónica humana, polietilenglicol (PEG), secuencias hidrofílicas largas no estructuradas de aminoácidos (XTEN), hidroxietilalmidón (HES), una pequeña molécula de unión a albúmina o una combinación de las mismas. En algunos casos, la fracción prolongadora de la semivida es o comprende Pro/Ala/Ser (PAS) y el polipéptido ICOSL variante está PASilado. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la fracción prolongadora de la semivida contiene la secuencia establecida en SEQ ID N.º:904.
[0066] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la fracción que prolonga la semivida es o contiene un dominio de multimerización. En algunos casos, el dominio de multimerización se selecciona entre una región Fc de una inmunoglobulina, una cremallera de leucina, una cremallera de isoleucina o un dedo de zinc. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante está unido, directa o indirectamente a través de un enlazador, al dominio de multimerización.
[0067] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la proteína inmunomoduladora es un multímero que contiene una primera variante del polipéptido ICOSL unido a un primer dominio de multimerización y una segunda variante del polipéptido ICOSL unido a un segundo dominio de multimerización, en el que los dominios de multimerización primero y segundo interactúan para formar un multímero que comprende la primera y segunda variante del polipéptido ICOSL. En algunos casos, el multímero es un dímero.
[0068] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la primera variante del polipéptido ICOSL y la segunda variante del polipéptido ICOSL son iguales. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el dímero es un homodímero. En algunos casos, el dímero es un heterodímero.
[0069] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el dominio de multimerización es o contiene una región Fc de una inmunoglobulina. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la región Fc es de una proteína inmunoglobulina G1 (IgG1) o inmunoglobulina G2 (IgG2). En algunos ejemplos, la proteína inmunoglobulina es humana y/o la región Fc es humana. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la región Fc contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 227 o una variante de la misma que presente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N.º:227. En algunos aspectos, la región Fc contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 226 o una variante de la misma que presente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N.º:226. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la región Fc exhibe una o más funciones efectoras. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la región Fc exhibe una o más funciones efectoras reducidas en comparación con una región Fc de tipo silvestre, opcionalmente en la que la Fc humana de tipo silvestre es de IgG1 humana.
[0070] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la función efectora se selecciona entre citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), citotoxicidad dependiente de complemento, muerte celular programada y fagocitosis celular. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la región Fc es una región Fc variante que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con la región Fc de tipo silvestre.
[0071] En algunos de los ejemplos proporcionados, la sustitución de uno o más aminoácidos de la variante de la región Fc se selecciona entre N297G, E233PAL234VAL235A/G236del/S267K o L234A/L235E/G237A, donde el residuo se numera según el índice UE de Kabat. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la región Fc variante contiene además la sustitución de aminoácidos C220S, en la que los residuos se numeran según el índice UE de Kabat. En algunos aspectos, la región Fc contiene la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 476-478 o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID N.º:476-478 y contenga las sustituciones de aminoácidos. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la región Fc contiene K447del, donde el residuo se numera según el índice UE de Kabat.
[0073] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la región Fc contiene la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 632-634 o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de los SEQ ID N.º: 632-634 y contiene las sustituciones de aminoácidos.
[0075] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la región Fc contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 474 ó 637, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID Nº: 474 o 637 y contiene las sustituciones de aminoácidos.
[0077] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la región Fc contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 478 o SEQ ID N.º: 634. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la región Fc contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 477. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la región Fc contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 633. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la región Fc contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 474. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la región Fc contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º:637.
[0079] Se proporciona aquí una proteína inmunomoduladora que contiene (a) un polipéptido ICOSL variante que contiene una o más modificaciones de aminoácidos en un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) de un polipéptido ICOSL de referencia, en el que el polipéptido ICOSL variante exhibe una unión alterada al ectodominio o ectodominios de ICOS o CD28 en comparación con la unión del polipéptido ICOSL de referencia para el mismo ectodominio o ectodominios; y b) una región Fc variante que contiene sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre N297G/K447del, E233P/L234V/L235A/G236dellS267K/K447del o L234A/L235E/G237A/K447del en comparación con la IgG1 humana de tipo silvestre, en la que los residuos se numeran según el índice UE de Kabat. En algunos casos, la proteína inmunomoduladora es un dímero. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la región Fc variante contiene además la sustitución de aminoácidos C220S, en la que los residuos se numeran según el índice UE de Kabat. En algunos ejemplos, la región Fc contiene la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 632-634 o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID N.º:632-634 y contenga las sustituciones de aminoácidos. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la región Fc contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 474 ó 637, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID Nº: 474 o 637 y contiene las sustituciones de aminoácidos.
[0081] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante está unido, directa o indirectamente a través de un enlazador, a la región Fc variante. En algunos ejemplos, el enlazador contiene de 1 a 10 aminoácidos. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el enlazador se selecciona entre AAA, G4S (SEQ ID N.º: 636), (G<4>S)<2>(SEQ ID N.º: 229) o el enlazador GSGGGGS (SEQ ID N.º: 635). En algunas de las realizaciones proporcionadas, el enlazador es (G<4>S)<3>(SEQ ID N.º: 228).
[0083] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el enlazador es AAA. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el enlazador es G4S (SEQ ID N.º:636). En algunas de las realizaciones proporcionadas, el enlazador es (G<4>S)<2>(SEQ ID N.º:229). En algunas de las realizaciones proporcionadas, el enlazador es el enlazador GSGGGGS (SEQ ID N.º: 635).
[0085] [0054]En algunas de las realizaciones proporcionadas de una proteína de fusión, por ejemplo una proteína de fusión variante ICOSL-Fc, el polipéptido variante ICOSL es o comprende un dominio IgV. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL contiene las modificaciones aminoacídicas N52H/Q100R. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL tiene la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 567. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL comprende las modificaciones aminoacídicas N52H/N57Y/Q100R. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL tiene la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 565. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante comprende modificaciones de aminoácidos son N52L/N57H/Q100R. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL tiene la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 761. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL comprende las modificaciones aminoacídicas N52H/N57Y/Q100P. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL tiene la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 570. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante comprende la modificación de aminoácidos es N52D. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido tiene la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 548.
[0086] En algunas de las realizaciones proporcionadas, se proporciona una variante de la proteína de fusión ICOSL-Fc que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 928. En algunas de las realizaciones proporcionadas, se proporciona una proteína de fusión ICOSL-Fc variante que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 928.
[0087] En realizaciones particulares, las proteínas inmunomoduladoras proporcionadas, tales como proteínas de fusión, por ejemplo proteínas de fusión ICOSL-Fc variantes, se unen a CD28 e ICOS. En algunas realizaciones, la proteína de fusión ICOSL-Fc variante muestra una mayor afinidad de unión a CD28 y/o ICOS en comparación con una proteína de fusión ICOSL-Fc humana de tipo silvestre, por ejemplo, que contiene una porción IgV ICOSL establecida en SEQ ID N.º:545 unida mediante un enlazador, por ejemplo, establecido en SEQ ID N.º:229, a una región Fc. En dicho ejemplo, la región Fc es una Fc inerte o sin efector que contiene las mutaciones L234A, L235E y L235E en una Fc IgG1 humana, por ejemplo, la establecida en SEQ ID N.º:637,
[0088] Se proporciona aquí una proteína inmunomoduladora que contiene cualquiera de los polipéptidos ICOSL variantes unidos a un segundo polipéptido que comprende un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF). En algunos casos, el dominio IgSF se modifica por afinidad y muestra una unión alterada a uno o más de sus socios de unión afines en comparación con el dominio IgSF no modificado o de tipo silvestre. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el dominio IgSF muestra una mayor unión a uno o más de sus socios de unión afines en comparación con el dominio IgSF no modificado o de tipo silvestre.
[0089] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante es un primer polipéptido ICOSL variante y el dominio IgSF del segundo polipéptido es un dominio IgSF de un segundo polipéptido ICOSL variante proporcionado en el presente documento, en el que la primera y la segunda variante ICOSL son iguales o diferentes.
[0090] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante es capaz de unirse específicamente a CD28 o ICOS y el dominio IgSF del segundo polipéptido es capaz de unirse a un socio de unión distinto de aquel unido específicamente por el polipéptido ICOSL variante. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el dominio IgSF es de un miembro de la familia B7.
[0091] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el dominio IgSF es una fracción localizadora de tumores que se une a un ligando expresado en un tumor o es una fracción localizadora de inflamaciones que se une a un ligando expresado en una célula o tejido de un entorno inflamatorio. En algunos casos, el ligando es B7H6. En algunos ejemplos, el dominio IgSF es de NKp30.
[0092] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el dominio IgSF del segundo polipéptido es o comprende un dominio IgV. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el dominio IgSF del segundo polipéptido es una variante de la molécula NKp30 que contiene L30V/A60V/S64P/S86G. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el dominio IgSF del segundo polipéptido tiene la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 504.
[0093] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el dominio IgSF es o comprende un dominio IgV. En algunos casos, la variante del polipéptido ICOSL es o contiene un dominio IgV.
[0094] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL es o comprende un dominio IgV. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL contiene las modificaciones aminoacídicas N52H/Q100R. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL tiene la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 567. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL comprende las modificaciones aminoacídicas N52H/N57Y/Q100R. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL tiene la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 565. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante comprende modificaciones de aminoácidos son N52L/N57H/Q100R. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL tiene la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 761. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL comprende las modificaciones aminoacídicas N52H/N57Y/Q100P. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL tiene la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 570. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante comprende la modificación de aminoácidos es N52D. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido tiene la secuencia establecida en SEQ ID N.º:548.
[0095] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la proteína inmunomoduladora comprende un dominio de multimerización unido a uno o ambos del polipéptido ICOSL variante o del segundo polipéptido que comprende el dominio IgSF. En algunos casos, el dominio de multimerización es un dominio Fc o una variante del mismo con función efectora reducida.
[0096] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la proteína inmunomoduladora es dimérica. En algunos casos, la proteína inmunomoduladora es homodimérica. En algunos aspectos, la proteína inmunomoduladora es heterodimérica.
[0098] Se proporciona aquí un conjugado que contiene cualquiera de los polipéptidos ICOSL variantes proporcionados o cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras proporcionadas y una fracción heteróloga. En algunos casos, el polipéptido ICOSL variante está unido, directa o indirectamente mediante un enlazador, a la fracción heteróloga. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la fracción diana es una proteína, un péptido, un ácido nucleico, una molécula pequeña o una nanopartícula. En algunos ejemplos, la fracción diana es una proteína o un péptido. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el conjugado es una proteína de fusión.
[0100] Se proporciona una proteína de fusión que contiene cualquiera de los polipéptidos ICOSL variantes proporcionados o cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras proporcionadas y una fracción heteróloga. En algunos casos, la fracción es una fracción diana que se une específicamente a una molécula de la superficie de una célula. En algunos ejemplos, la fracción diana se une específicamente a una molécula de la superficie de una célula inmunitaria. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la célula inmunitaria es una célula presentadora de antígeno o un linfocito. En algunos casos, la fracción diana es una fracción localizadora de tumores que se une a una molécula de la superficie de un tumor.
[0102] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la molécula diana se une a una molécula HER1/EGFR, HER2/ERBB2, CD20, CD25 (receptor IL-2Rα), CD33, CD52, CD133, CD206, CEA, CEACAM1, CEACAM3, CEACAM5, CEACAM6, antígeno del cáncer 125 (CA125), alfa-fetoproteína (AFP), Lewis Y, TAG72, Caprin-1, mesotelina, receptor PDGF (PDGFR; como PDGF-R α), PD-1, PD-L1, CTLA-4, receptor de IL-2, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), CD30, EpCAM, EphA2, Glypican-3, gpA33, mucinas, CAIX, PSMA, proteína de unión a folatos, gangliósidos (como GD2, GD3, GM1 y GM2), receptor de VEGF (VEGFR),VEGFR2, VEGF-A, integrina αVβ3, integrina α5β1, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, tenascina, AFP, complejo BCR, CD3, CD18, CD44, CTLA-4, gp72, HLA-DR 10 β, antígeno HLA-DR, IgE, MUC-1, nuC242, antígeno PEM, metaloproteinasas, receptor de efrina, ligandos de efrina, receptor HGF, CXCR4, CXCR4, receptor de bombesina, antígeno SK-1, Bcr-abl, RET, MET, TRKB, TIE2, ALK, ROS, EML4-ALK, ROS1, BRAFV600E, SRC, c-KIT, mTOR, TSC1, TSC2, BTK, KIT, BRCA, CDK 4/6, JAK1, JAK2, BRAF, FLT-3, MEK1, MEK2, SMO o B7-H6 (NCR3LG1). En algunos aspectos, la fracción diana se une a PD-L1.
[0104] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la fracción diana es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el anticuerpo se selecciona entre cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, trastuzumab, Ado-trastuzumab emtansina, Tositumomab (Bexxar<®>), Rituximab (Rituxan, Mabthera), Ibritumomab tiuxetan (Zevalin), Daclizumab (Zenapax), Gemtuzumab (Mylotarg), Alemtuzumab, fragmento Fab de CEA-scan, anticuerpo monoclonal OC125, ab75705, B72.3, Bevacizumab (Avastin<®>), Afatinib, Axitinib, Bosutinib, Cabozantinib, Ceritinib, Crizotinib, Dabrafenib, Dasatinib, Dinutuximab (Unituxin<™>), Erlotinib, Everolimus, Ibrutinib, Imatinib, Lapatinib, Lenvatinib, Nilotinib, Olaparib, Olaratumab (Lartruvo<™>), Palbociclib, Pazopanib, Pertuzumab (Perjeta<®>), Ramucirumab (Cyramza<®>), Regorafenib, Ruxolitinib, Sorafenib, Sunitinib, Temsirolimus, Trametinib, Vandetanib, Vemurafenib, Vismodegib, Basiliximab, Ipilimumab, Nivolumab, pembrolizumab, MPDL3280A, Pidilizumab (CT-011), AMP-224, MSB001078C, o MEDI4736, BMS-935559, LY3300054, atezolizumab, avelumab o durvalumab o es un fragmento de unión a antígeno de los mismos.
[0106] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante está unido, directa o indirectamente a través de un enlazador, al extremo N-terminal de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno. En algunos casos, el polipéptido ICOSL variante está unido, directa o indirectamente mediante un enlazador, al extremo C-terminal de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.
[0108] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el conjugado es divalente, tetravalente, hexavalente u octavalente. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la fracción heteróloga es o contiene una etiqueta para la detección o purificación de la variante del polipéptido ICOSL.
[0110] Se proporciona aquí una proteína de fusión monovalente que contiene un polipéptido ICOSL variante que contiene una o más modificaciones de aminoácidos en un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) de un polipéptido ICOSL de referencia, en el que el polipéptido ICOSL variante presenta una unión alterada al ectodominio o ectodominios de ICOS o CD28 en comparación con la unión del polipéptido ICOSL de referencia para el mismo ectodominio o ectodominios; y una etiqueta para la detección o purificación del polipéptido ICOSL variante. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la etiqueta para la detección o purificación se selecciona entre una etiqueta de poli-histidina (His), una etiqueta FLAG, una etiqueta Myc o una etiqueta de proteína fluorescente.
[0112] [0073]En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante contiene una o más modificaciones de aminoácidos en una posición correspondiente a la(s) posición(es) seleccionada(s) de 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99. En algunas realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante contiene una o más modificaciones de aminoácidos en una posición correspondiente a la(s) posición(es) seleccionada(s) de 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 148, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225, o 227 con referencia a SEQ ID N.º:32. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL contiene una o más modificaciones de aminoácidos en una posición correspondiente a la(s) posición(es) seleccionada(s) de 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 26, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99. En algunas realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL contiene una o más modificaciones de aminoácidos en una posición correspondiente a la(s) posición(es) seleccionada(s) de 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225, o 227 con referencia a SEQ ID N.º:32.
[0113] En algunos casos, la una o más modificaciones de aminoácidos se seleccionan entre M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20V, S25G, F27S, F27C, N30D, Y33del, Q37R, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N52K, S54A, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57Y, N57W, R61S, R61C, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, E90A, K92R, F93L, H94E, H94D, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110D, V110N, V110A, E111del, T113E, H115R, H115Q, V116A, A117T, N119Q, F120I, S121G, V122A, V122M, F120S, S126T, S126R, H129P, S130G,S132F, Q133H, E135K, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F,I143V, I143T, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H,W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161P, L161M, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193M, N194D, C198R, N201S, L203P, L203F, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217V, I218T, I218N, E220G, R221G, R221I, I224V, T225A, N227K, o una sustitución aminoacídica conservadora de los mismos. En algunos casos, la una o más modificaciones de aminoácidos se seleccionan entre M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20T, A20V, S25G, R26S, F27C, F27S, N30D, Y33del, Q37R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R61S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110A, V110D, V110N, E111del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S, S121G, V122A, V122M, S126R,S126T, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, I143T, I143V, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H, W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161M, L161P, Q164L, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193A, V193M, N194D, C198R, N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, I218N, I218T, E220G, R221G, R221I, R221K, I224V, T225A, T225S, N227K, o una sustitución aminoacídica conservadora de los mismos.
[0114] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido de referencia ICOSL contiene (i) la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º:32, (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID N.º:32; o (iii) una porción de (i) o (ii) que comprende un dominio IgV o un dominio IgC o fragmentos de unión específicos de los mismos o ambos.
[0115] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido de referencia ICOSL comprende la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 196, 545, 600-605 y 623-628. En algunos aspectos, el polipéptido de referencia ICOSL consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 32, 196, 545, 600-605 y 623-628.
[0116] Se proporciona una molécula(s) de ácido nucleico que codifica(n) cualquiera de las variantes de polipéptidos ICOSL, proteínas inmunomoduladoras o proteínas de fusión proporcionadas. En algunos casos, las moléculas de ácido nucleico son ácidos nucleicos sintéticos. En algunos ejemplos, la molécula o moléculas de ácido nucleico son cDNA.
[0117] Se proporciona un vector que contiene cualquiera de las moléculas de ácido nucleico proporcionadas. En algunos casos, el vector es un vector de expresión. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el vector es un vector de expresión de mamíferos o un vector viral.
[0118] Se proporciona una célula que contiene cualquiera de los vectores proporcionados. En algunos casos, la célula es una célula de mamífero. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO) o un derivado de la misma.
[0119] Se proporciona un método para producir una proteína inmunomoduladora que contenga cualquiera de los polipéptidos ICOSL variantes, incluyendo la introducción de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico o vectores proporcionados en una célula huésped en condiciones para expresar la proteína en la célula. En algunos ejemplos, la célula huésped es una célula de mamífero. En algunos casos, la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino o un derivado de la misma. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el método incluye además aislar o purificar la proteína de la célula.
[0120] Se proporciona una proteína producida por cualquiera de los métodos proporcionados.
[0121] [0082]Se proporciona una composición que contiene una proteína que contiene cualquiera de los polipéptidos ICOSL variantes proporcionados, o proteínas inmunomoduladoras, en la que al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de las secuencias individuales de la proteína o la proteína inmunomoduladora en la composición tienen una longitud de secuencia idéntica, opcionalmente en la que la composición es una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la proteína o proteína inmunomoduladora se purifica a partir de células de ovario de hámster chino o un derivado de las mismas.
[0122] Se proporciona un polinucleótido que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido ICOSL variante que contiene un dominio transmembrana proporcionado y uno o más ácidos nucleicos que codifican una o más cadenas de un receptor de antígeno recombinante. En algunos casos, el receptor de antígeno recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR) modificado genéticamente. En algunas de las realizaciones proporcionadas, cada uno de los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido ICOSL variante y el uno o más ácidos nucleicos que codifican una o más cadenas del receptor recombinante están separados por un ácido nucleico que codifica un péptido de autodestrucción o un péptido que provoca la omisión de ribosomas.
[0123] En algunos ejemplos, el polinucleótido contiene el ácido nucleico que codifica la variante del polipéptido ICOSL, un ácido nucleico que codifica un péptido de autodestrucción o un péptido que provoca la omisión del ribosoma y un ácido nucleico que codifica un CAR. En algunos ejemplos, el polinucleótido comprende el ácido nucleico que codifica la variante del polipéptido ICOSL, un ácido nucleico que codifica un primer péptido autodestructor o un péptido que provoca la omisión de ribosomas, un ácido nucleico que codifica una de las cadenas TCRalfa o TCRbeta modificadas genéticamente, un ácido nucleico que codifica un segundo péptido de autocicatrización o un péptido que provoca la omisión de ribosomas, y un ácido nucleico que codifica la otra cadena TCRalfa o cadena TCRbeta modificadas genéticamente. En algunos aspectos, el primer y el segundo péptido de autodestrucción codificados son el mismo. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el péptido autodestructor o el péptido que provoca la omisión de ribosomas es un T2A, un P2A, un E2A o un F2A.
[0124] Se proporciona un vector que contiene cualquiera de los polinucleótidos proporcionados. En algunos casos, el vector es un vector viral. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el vector viral es un vector retroviral o un vector lentiviral.
[0125] Se proporciona una célula modificada genéticamente que contiene cualquiera de los polinucleótidos o vectores proporcionados. También se proporciona una célula modificada genéticamente que contiene cualquiera de las variantes de polipéptidos ICOSL, proteínas inmunomoduladoras o proteínas de fusión proporcionadas.
[0126] Se proporciona una célula modificada genéticamente que contiene cualquiera de las moléculas de ácido nucleico o los vectores proporcionados. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica la variante del polipéptido ICOSL, la proteína inmunomoduladora o la proteína de fusión codifica un péptido señal. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL, la proteína inmunomoduladora o la proteína de fusión no contiene un dominio transmembrana y/o no se expresa en la superficie de la célula. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante del polipéptido ICOSL, la proteína inmunomoduladora o la proteína de fusión es secretada por la célula modificada genéticamente. En algunos aspectos, la célula modificada genéticamente contiene una variante del polipéptido ICOSL que contiene un dominio transmembrana. En algunos aspectos, el polipéptido ICOSL variante se expresa en la superficie de la célula.
[0127] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la célula es una célula inmunitaria. En algunos casos, la célula inmunitaria es una célula presentadora de antígeno (CPA) o un linfocito. En algunos ejemplos, la célula modificada genéticamente es una célula primaria. En algunos casos, la célula es una célula de mamífero. En algunos casos, la célula es humana. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el linfocito es una célula T. En algunos ejemplos, la célula modificada genéticamente es una APC y la APC es una APC artificial.
[0128] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la célula modificada genéticamente contiene además un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T manipulado.
[0129] Se proporciona un agente infeccioso que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una variante proporcionada del polipéptido ICOSL o una proteína inmunomoduladora proporcionada, una proteína de fusión proporcionada. En algunos casos, la variante codificada del polipéptido ICOSL, la proteína inmunomoduladora o la proteína de fusión no contiene un dominio transmembrana y/o no se expresa en la superficie de una célula en la que se expresa. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la variante codificada del polipéptido ICOSL, la proteína inmunomoduladora o la proteína de fusión es secretada por el agente infeccioso cuando se expresa. En algunos casos, la variante codificada del polipéptido ICOSL comprende un dominio transmembrana.
[0130] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el polipéptido ICOSL variante codificado se expresa en la superficie de una célula en la que se expresa. En algunos casos, el agente infeccioso es una bacteria o un virus. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el virus es un virus oncolítico. En algunos ejemplos, el virus oncolítico es un adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, virus del herpes simple, virus de la estomatitis vesticular, reovirus, virus de la enfermedad de Newcastle, parvovirus, virus del sarampión, virus de la estomatitis vesticular (VSV), virus Coxsackie o un virus Vaccinia.
[0131] En algunas de las realizaciones proporcionadas, el virus se dirige específicamente a las células dendríticas (DC) y/o es dendrítico-trópico. En algunos casos, el virus es un vector lentiviral pseudotipado con un producto de la envoltura del virus Sindbis modificado. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el agente infeccioso contiene además una molécula de ácido nucleico que codifica otro producto génico que provoca la muerte de una célula diana o que puede aumentar o potenciar una respuesta inmunitaria. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el producto génico adicional se selecciona de entre un agente anticanceroso, un agente antimetastásico, un agente antiangiogénico, una molécula inmunomoduladora, un inhibidor del punto de control inmunitario, un anticuerpo, una citocina, un factor de crecimiento, un antígeno, un producto génico citotóxico, un producto génico proapoptótico, un producto génico antiapoptótico, un gen degradativo de la matriz celular, genes para la regeneración de tejidos o una reprogramación de células somáticas humanas a pluripotencia.
[0133] Se proporciona una composición farmacéutica que contiene cualquiera de los polipéptidos ICOSL variantes, proteínas inmunomoduladoras, conjugados o proteínas de fusión o cualquiera de las células modificadas genéticamente o agentes infecciosos proporcionados. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la composición farmacéutica contiene un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la composición farmacéutica es estéril.
[0135] En algunas de las realizaciones proporcionadas, se proporciona un artículo de fabricación que contiene la composición farmacéutica en un vial. En algunos casos, el vial está precintado.
[0137] Se proporciona un kit que contiene cualquiera de las composiciones proporcionadas e instrucciones de uso. También se proporciona un kit que contiene cualquiera de los artículos de fabricación proporcionados e instrucciones de uso.
[0139] Se proporciona un método para modular una respuesta inmunitaria en un sujeto, que incluye la administración de la composición farmacéutica al sujeto. También se proporciona un método de modulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto que incluye la administración de las células modificadas genéticamente. En algunos casos, las células modificadas genéticamente son autólogas del sujeto. En algunas de las realizaciones proporcionadas, las células modificadas genéticamente son alogénicas al sujeto.
[0141] En algunas de las realizaciones proporcionadas, la modulación de la respuesta inmunitaria trata una enfermedad o afección en el sujeto. En algunos aspectos, la respuesta inmunitaria aumenta.
[0143] En algunas de las realizaciones proporcionadas, se administra al sujeto una proteína inmunomoduladora o un conjugado que contiene una variante del polipéptido ICOSL unido a una fracción localizadora de tumores. En algunos casos, la fracción localizadora de tumores es o comprende una molécula de unión que reconoce un antígeno tumoral. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la molécula de unión contiene un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo o comprende un dominio IgSF de tipo silvestre o una variante del mismo. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la proteína inmunomoduladora o el conjugado o proteína de fusión se administra al sujeto. En algunas de las realizaciones proporcionadas, se administra al sujeto una variante del polipéptido ICOSL que es una proteína inmunomoduladora transmembrana. En algunos casos, la célula modificada genéticamente que contiene una variante del polipéptido ICOSL que es una proteína inmunomoduladora transmembrana se administra al sujeto. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la enfermedad o afección es un tumor o cáncer. En algunos ejemplos, la enfermedad o afección se selecciona entre melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, un tumor hematológico maligno, cáncer de hígado, cáncer cerebral, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer de bazo, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de ovario, cáncer uterino, carcinoma gástrico, un cáncer musculoesquelético, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer gastrointestinal, un cáncer de células germinales o un cáncer endocrino y neuroendocrino. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la respuesta inmunitaria disminuye.
[0145] En algunas de las realizaciones proporcionadas, se administra al sujeto una variante del polipéptido ICOSL o proteína inmunomoduladora soluble. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la proteína inmunomoduladora soluble es una proteína de fusión Fc inmunomoduladora. En algunas de las realizaciones previstas, se administra al sujeto un polipéptido ICOSL variante, una proteína inmunomoduladora o una proteína de fusión. En algunas de las realizaciones proporcionadas, se administra al sujeto una célula modificada genéticamente que contiene una variante secretable del polipéptido ICOSL. En algunas de las realizaciones previstas, se administra al sujeto una célula modificada genéticamente. En algunas de las realizaciones proporcionadas, se administra al sujeto un agente infeccioso que codifica una variante del polipéptido ICOSL que es una proteína inmunomoduladora secretable, opcionalmente en condiciones en las que el agente infeccioso infecta una célula tumoral o inmunitaria y la proteína inmunomoduladora secretable se secreta a partir de la célula infectada. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección inflamatoria o autoinmune. En algunos ejemplos, la enfermedad o afección es una vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA), una vasculitis, una enfermedad cutánea autoinmune, un trasplante, una enfermedad reumática, una enfermedad gastrointestinal inflamatoria, una enfermedad ocular inflamatoria, una enfermedad neurológica inflamatoria, una enfermedad pulmonar inflamatoria, una enfermedad endocrina inflamatoria o una enfermedad hematológica autoinmune. En algunos casos, la enfermedad o afección se selecciona entre enfermedad inflamatoria intestinal, trasplante, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple, asma, artritis reumatoide o psoriasis.
[0146] Breve Descripción de los Dibujos
[0148]
[0150] LaFIG.1muestra los resultados de impedancia que reflejan la actividad citotóxica letal de las células modificadas genéticamente con un receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-CD19 solo o con un TIP inmunomodulador transmembrana ejemplar (CD80-TIP o ICOSL-TIP) o la correspondiente proteína transmembrana CD80 o ICOSL de tipo silvestre tras el co-cultivo con células que expresan el antígeno diana. La impedancia se evaluó utilizando el analizador celular en tiempo real Acea (RTCA), que mide las variaciones de impedancia en el medio de cultivo de una placa microelectrónica de 96 pocillos (placa E).
[0151] LaFIG.2Amuestra que las células T primarias se transducen eficazmente con virus que codifican las proteínas CAR y TIP. Células T humanas primarias activadas 48 horas con microesferas anti-CD3 más anti-CD28 y transducidas a continuación con un Lenti-virus que codifica un CAR anti-CD19 con un reportero BFP, más un segundo Lenti-virus que codifica un TIP ICOSL con un reportero GFP. El gráfico FACs muestra la expresión de BFP en el eje y y la expresión de GFP en el eje x y se indica el porcentaje de células T que caen en cada cuadrante. Los resultados muestran que los cultivos incluyen células transducidas sólo con CAR (cuadrante superior izquierdo), células transducidas sólo con TIP (cuadrante inferior derecho), células transducidas con ambos virus (cuadrante superior derecho) y células que no fueron transducidas con ninguno de los dos (cuadrante inferior izquierdo). EnFIG.2B,las TIPs expresadas en las células CAR-T proporcionan coestimulación a las células CAR-T. Las células CAR-T con o sin cotransducción TIP fueron marcadas con Cell-Trace Far Red e incubadas con la línea celular CD19+ NALM6 para enganchar el CAR. La proliferación se evaluó mediante el porcentaje de células con expresión de CAR que habían diluido el colorante fluorescente. Las células transducidas con TIPs mutados mostraron un aumento de la proliferación de células T CAR+ en comparación con las que no tenían TIPs o las transducidas con ICOSL de tipo silvestre. Las células transducidas simuladas que carecían de expresión CAR no proliferaron en este ensayo.
[0152] LaFIG.3A-3Bdemuestran, a través de la liberación de citocinas, la capacidad costimuladora de ICOSL de tipo silvestre (WT) o variante cuando se coinmovilizan con anti-CD3. Se aplicó una capa húmeda de 10 nM de anti-CD3 en los pocillos de placas de cultivo tisular de poliestireno de fondo plano de 96 pocillos con 40 nM (flechas) o 10 nM de ICOSL WT o variante. Se añadieron 100.000 células T<CD4+>y<CD8+>(pan) purificadas y se recogió el sobrenadante 72 horas después para el análisis ELISA de la liberación de citocinas. LaFIG. 3Amuestra IFN-gamma yFIG. 3Bmuestra los niveles de proteína IL-17 secretada por las células T pan. Los gráficos son representativos de las respuestas típicas de IFN-gamma e IL-17 de la coestimulación de células T pan.
[0153] LaFIG.4A-4Bdemuestran, a través de la proliferación, la capacidad costimuladora de ICOSL de tipo silvestre (WT) o variante cuando se coinmovilizan con anti-CD3. Las células pan T marcadas con CFSE se incubaron en placas recubiertas con anti-CD3 e ICOSL como se ha descrito previamente durante 72 horas. Se recogieron las células, se lavaron, se tiñeron con anticuerpos anti-CD4 o anti-CD8 conjugados con fluorescencia y se analizaron mediante citometría de flujo. Las puertas y los voltajes del citómetro se ajustaron utilizando células T marcadas con CFSE de control no estimuladas. La proliferación se determinó por dilución de CFSE a partir del control. LaFIG.4Amuestra el porcentaje de células T proliferantes totales (flechas), CD4<+>(barra continua) y CD8<+>(barra sombreada) tras la coestimulación con ICOSL 40 nM. LaFIG.4Bmuestra el porcentaje de proliferación total de células pan T tras la coestimulación con ICOSL 10 nM. Los gráficos son representativos de la respuesta proliferativa típica de la coestimulación de células T pan.
[0154] LaFIG.5representa la función candidata de ICOSL vIgD en una Reacción Linfocitaria Mixta (MLR) humana. Las variantes de ICOSL y sus mutaciones se enumeran en el eje x, junto con ICOSL de tipo silvestre, los controles negativos PDL2-Fc e IgG humana, así como la molécula de referencia de control positivo CTLA-Ig Belatacept. La línea que atraviesa el gráfico representa la cantidad basal de IFN-gamma detectada en los sobrenadantes de los cultivos de control negativo. Para cada variante ICOSL candidata o control, se probaron tres concentraciones diferentes con flechas indicando la concentración más alta de proteína en cultivos a 40nM. La mayoría de las variantes candidatas de ICOSL muestran una actividad antagonista superior en las tres concentraciones probadas en comparación con belatacept, como refleja la menor concentración de IFN-gamma en esos cultivos. LaFIG.6A-6Dmuestra la inhibición de las proteínas solubles de fusión Fc ICOSL en las respuestas de células B y T en un ensayo de co-cultivo B-T. LaFIG.6Amuestra la inhibición de la proliferación de células B impulsada por células T por parte de las proteínas solubles de fusión Fc ICOSL. Las células T CD4+ purificadas y las células B de un único donante se marcaron con CFSE y se coincubaron en una proporción 1:1 en presencia o ausencia de los mitógenos indicados con o sin las proteínas de fusión Fc ICOSL indicadas. Las células se estimularon con enterotoxina estafilocócica B (SEB) a 100 ng/mL, mitógeno Pokeweed (PWM) a 1 mg/mL, o ambos. Las proteínas de fusión Fc ICOSL se incluyeron a una concentración final de 40 nM y los cultivos se incubaron durante 7 días y se sometieron a análisis FACS. El número de células B divididas se determinó a partir del número de células de los cultivos que habían diluido su CFSE. Todas las proteínas de fusión Fc ICOSL probadas, excepto la de tipo silvestre, redujeron la proliferación de células B. LaFIG.6B-6Dmuestran que las proteínas de fusión Fc ICOSL inhibieron la producción de citocinas de células T en cocultivos B-T. Los sobrenadantes de los cultivos descritos anteriormente se recogieron el día 7 y se analizó el contenido de citoquinas utilizando un panel de citoquinas Th humanas LEGENDplex (Biolegend). Producción de IL-5 por las células T (FIG.6B), IL-13 (FIG.6C) e IL-21 (FIG.
[0155] 6D) se atenúa con la inclusión de proteínas de fusión Fc ICOSL.
[0156] Las FIG.7A-7Fmuestran diferentes criterios de valoración en un modelo de ratón de enfermedad injerto contra huésped (GVHD) en el que se transfirieron células PBMC humanas de forma adoptiva a huéspedes murinos NSG inmunodeficientes. LaFIG.7Amuestra las curvas de supervivencia de los animales tratados. Se observó una evolución agresiva de la enfermedad y la consiguiente mortalidad en los animales de control tratados con solución salina, y una supervivencia similar en los animales tratados con ICOSL-Fc de tipo silvestre, así como con la variante N52H/I143T de ICOSL. La variante N52H/N57Y/Q100P presentó unas tasas de supervivencia mejoradas comparables a las de la referencia clínica belatacept. LaFIG.7Bmuestra tendencias similares en la pérdida de peso corporal, con la variante ICOSL N52H/N57Y/Q100P demostrando un mantenimiento de peso similar al de los animales tratados con belatacept, aunque todos los demás grupos experimentaron una rápida pérdida de peso. LaFIG.7Cmuestra las puntuaciones clínicas de las observaciones estandarizadas del Índice de Actividad de la Enfermedad (DAI) de la GVHD, mostrando de nuevo puntuaciones más bajas en los animales tratados con la variante N52H/N57Y/Q100P de ICOSL que son comparables a la referencia clínica belatacept, mientras que los otros grupos de animales experimentaron puntuaciones IAD más altas. LaFIG.7Drepresenta una medición por citometría de flujo de los porcentajes de CD4 y CD8 en la sangre de animales experimentales medidos el día 14. El porcentaje de células CD8 entre los grupos experimentales fue prácticamente el mismo, sin embargo, los animales tratados con la variante ICOSL N52H/N57Y/Q100P y belatacept tienen porcentajes más bajos de células CD4 en comparación con los otros grupos experimentales.
[0157] LaFIG.7Emuestra las curvas de supervivencia de un experimento similar en el que se probaron otras moléculas variantes de ICOSL. LaFIG. 7Frepresenta las puntuaciones clínicas de un experimento similar en el que se probaron otras moléculas variantes de ICOSL.
[0158] LaFIG.8muestra la actividad costimuladora localizada transmitida por la variante indicada de la molécula apilada vIgD C-L, donde C representa un dominio costimulador ICOSL y L representa un dominio localizador NKp30. En este ensayo, las células diana K562 que expresan la proteína de superficie localizadora, B7-H6, se cultivaron en presencia de anti-CD3 con células T humanas y la activación de las células T se evaluó mediante los niveles de IFN-gamma en los sobrenadantes del cultivo. La inclusión de moléculas Fc anti-CD3 solas o sin variantes apiladas no indujo la activación de las células T. Del mismo modo, las células cultivadas sólo con el dominio NKp30 localizador de tipo silvestre o sólo con el dominio ICOSL costimulador de tipo silvestre como proteínas de fusión Fc no dieron lugar a la activación de células T. Sin embargo, la variante de la pila costimuladora localizadora indujo niveles de IFN-gamma más de dos veces superiores en la concentración más alta, y niveles de IFN-gamma que se siguieron observando a medida que se disminuían las concentraciones.
[0159] LaFIG.9resume los cambios en el grosor de las orejas en ratones de un modelo estándar de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH). Los animales tratados con PBS sensibilizados con ovoalbúmina y posteriormente desafiados en el oído con la misma proteína, muestran el nivel más alto de hinchazón del oído medido. Los ratones tratados con Abatacept de referencia clínica presentan una ligera reducción de la inflamación del oído tras la provocación auricular. Los cinco grupos de tratamiento de la variante ICOSL demostraron reducciones iguales o mejores de la inflamación de las orejas en comparación con Abatacept.
[0160] LaFIG. 10A-10Crepresenta varias configuraciones ejemplares de un dominio IgSF variante (vIgD) conjugado con un anticuerpo (V-Mab). LaFIG.10Amuestra varias configuraciones en las que un vIgD está unido, directa o indirectamente, al N- y/o C-terminal de la cadena ligera de un anticuerpo. LaFIG. 10Bmuestra varias configuraciones en las que un vIgD está unido, directa o indirectamente, al N- y/o C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo. LaFIG. 10Crepresenta las configuraciones V-Mab resultantes cuando una cadena ligera de laFIG.10Ay una cadena pesada de laFIG.10Bse coexpresan en una célula.
[0161] LaFIG. 11A-11Bdemuestran la especificidad de los V-Mab para sus compañeros de unión. Los ensayos de unión se realizaron en células Expi293 transfectadas transitoriamente con DNA para la expresión en superficie de mamíferos de HER2, CD28, CTLA-4 o ICOS humanos. Se incubaron 200.000 células transfectadas con 100.000 pM a 100 pM de anticuerpo parental (C1) o varios V-Mabs (C2-9). Se eliminó el anticuerpo no unido, se detectó el anticuerpo unido con IgG antihumana conjugada con fluorescencia y se analizaron las células mediante citometría de flujo para determinar la IMF y el porcentaje positivo en función de los controles de Fc. LaFIG.11Amuestra la unión de los V-Mabs a transfectantes HER2 a niveles similares a los del anticuerpo parental. La unión a células transfectadas simuladas se observa con todos los V-Mabs, aunque no con el ICOSL WT, debido a los bajos niveles de expresión endógena de HER2 en las células parentales Expi293. LaFIG. 11Bmuestra que se mantiene o aumenta la unión del dominio IgSF parental (N52H/N57Y/Q100P) a sus parejas afines (C2, C3, C4, C5, C6, C8, C9) mediante V-Mabs.
[0162] LaFIG. 12demuestra la capacidad coestimuladora y proliferativa de V-Mab cuando se coinmoviliza con anti-CD3. 10 nM anti-CD3 se recubrieron en húmedo en los pocillos de placas de cultivo tisular de poliestireno de fondo plano de 96 pocillos con 30 nM a 3 nM de anticuerpo parental, V-Mabs o controles Fc. Se añadieron células pan T marcadas con CFSE durante 72 horas. La secreción de IFN-gamma se midió mediante ELISA y la proliferación total de células T se midió mediante citometría de flujo de la dilución de CFSE. La secreción de IFN-gamma y la proliferación de IgSF-dominio (N52H/N57Y/Q100P) es mayor que la de ICOSL WT. Los V-Mabs demuestran una mayor capacidad coestimuladora proliferativa y de citocinas que el IgSF parental.
[0163] LaFIG. 13A-13Crepresenta varios formatos de las moléculas de dominio IgSF variantes proporcionadas. LaFIG.13Arepresenta moléculas solubles, incluyendo: (1) un dominio IgSF variante (vIgD) fusionado a una cadena Fc; (2) una molécula apilada que contiene un primer dominio IgSF variante (primer vIgD) y un segundo dominio IgSF, tal como un segundo dominio IgSF variante (segundo vIgD); (3) una molécula IgSF dirigida al tumor que contiene un primer dominio IgSF variante (vIgD) y un dominio IgSF dirigido a un antígeno tumoral, como un dominio IgSF NKp30; y (4) un dominio IgSF variante (vIgD) unido a un anticuerpo (V-Mab). LaFIG. 13Brepresenta una proteína inmunomoduladora transmembrana (TIP) que contiene una variante del dominio IgSF (vIgD), por ejemplo, la variante ICOSL, expresada en la superficie de una célula. En una realización ejemplar, la pareja de unión afín de la vIgD unida a la transmembrana es un receptor costimulador, por ejemplo CD28, y la TIP que contiene la vIgD (por ejemplo ICOSL vIgD) agoniza el receptor costimulador de manera que la TIP induce una señal positiva en la célula que expresa el receptor costimulador. LaFIG. 13Crepresenta una proteína inmunomoduladora secretada (SIP) en la que un dominio IgSF variante (vIgD), por ejemplo, ICOSL variante, se secreta a partir de una célula, tal como una primera célula T (por ejemplo, célula T CAR). En una realización ejemplar, el socio de unión afín de la vIgD secretada es un receptor activador, por ejemplo, CD28, que puede expresarse en la primera célula (por ejemplo, célula T, como una célula T CAR) y/o en una segunda célula (por ejemplo, célula T; endógena o modificada genéticamente, como una célula T CAR). Cuando el SIP se une a su pareja de unión, se bloquea la señalización a través del receptor activador. En todos los casos, la vIgD puede ser sólo un dominio V (IgV), la combinación del dominio V (IgV) y el dominio C (IgC), incluido todo el dominio extracelular (ECD), o cualquier combinación de dominios Ig del miembro de la superfamilia IgSF.
[0164] LaFIG.14representa un esquema ejemplar de la actividad de un dominio IgSF variante (vIgD) fusionado a un Fc (vIgD-Fc) en el que el vIgD es una variante de un dominio IgSF de ICOSL. Como se ha demostrado, una vIgD soluble de ICOSL interactúa con sus socios de unión afines para bloquear las interacciones de CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2) o ICOSL con CD28 o ICOS, respectivamente, bloqueando así la coestimulación por los receptores coestimuladores CD28 y/o ICOS.
[0165] LaFIG.15representa un esquema ejemplar de una molécula apilada para localizar la variante del dominio IgSF (vIgD) en una célula tumoral. En este formato, la molécula apilada contiene una primera variante del dominio IgSF (primera vIgD) y un segundo dominio IgSF (por ejemplo, una segunda vIgD) en el que el segundo dominio IgSF (por ejemplo, una segunda vIgD) es un dominio IgSF dirigido al tumor que se une a un antígeno tumoral. Un dominio IgSF dirigido a tumores ejemplar es un dominio IgSF de NKp30, que se une al antígeno tumoral B7-H6. En esta representación, la vIgD es una variante de un dominio IgSF de ICOSL. Como se ha demostrado, la unión del dominio IgSF dirigido al tumor a la superficie de la célula tumoral localiza el primer vIgD en la superficie de la célula tumoral donde puede interactuar con uno o más de sus socios de unión afines (por ejemplo, CD28 o ICOS) expresados en la superficie de una célula inmunitaria adyacente (por ejemplo, célula T) para estimular el receptor coestimulador.
[0166] LaFIG.16Arepresenta varias configuraciones ejemplares de una molécula apilada que contiene una primera variante del dominio IgSF (primera vIgD), por ejemplo, la variante ICOSL, y un segundo dominio IgSF, tal como una segunda variante del dominio IgSF (segunda vIgD). Como se muestra, el primer dominio vIgD y el segundo dominio IgSF están unidos de forma independiente, directa o indirectamente, al extremo N- o C-terminal de una región Fc. Para generar una molécula Fc homodimérica, la región Fc es aquella capaz de formar un homodímero con una subunidad Fc emparejada mediante la coexpresión de las regiones Fc individuales en una célula. Para generar una molécula Fc heterodimérica, las regiones Fc individuales contienen mutaciones (por ejemplo, mutaciones "knob-into-hole" en el dominio CH3), de modo que la formación del heterodímero se ve favorecida en comparación con los homodímeros cuando las regiones Fc individuales se coexpresan en una célula.
[0167] LaFIG. 16Brepresenta diversas configuraciones ejemplares de una molécula apilada que contiene un primer dominio IgSF variante (primer vIgD), un segundo dominio IgSF, tal como un segundo dominio IgSF variante (segundo vIgD), y un tercer dominio IgSF, tal como un tercer dominio IgSF variante (tercer vIgD). Como se muestra, el primer dominio vIgD, el segundo dominio IgSF y el tercer dominio IgSF están unidos de forma independiente, directa o indirectamente, al N-terminal o al C-terminal de una región Fc. Para generar una molécula Fc homodimérica, la región Fc es aquella capaz de formar un homodímero con una región Fc emparejada mediante la coexpresión de las regiones Fc individuales en una célula.
[0168] LaFIG.17representa un esquema ejemplar de la actividad de un dominio IgSF variante (vIgD) conjugado con un anticuerpo (V-Mab) en el que el anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo anti-HER2) se une a un antígeno en la superficie de la célula tumoral. En esta representación, la vIgD es una variante de un dominio IgSF de ICOSL. Como se muestra, la unión del anticuerpo a la superficie de la célula tumoral localiza el vIgD en la superficie de la célula tumoral donde puede interactuar con uno o más de sus compañeros de unión afines expresados en la superficie de una célula inmune adyacente (por ejemplo, célula T) para agonizar la señalización del receptor. En una realización ejemplar como se muestra, la variante del dominio IgSF (vIgD) es una variante de un dominio IgSF de ICOSL. La unión de la vIgD ICOSL a los receptores costimuladores CD28 o ICOS proporciona una señal agonista o costimuladora.
[0169] LaFIG.18representa la firma transcripcional Nanostring de células T humanas primarias cuando se incuban 10 nM anti-CD3 con 40 nM de una proteína Fc-control, ICOSL-Fc de tipo silvestre, CD80-Fc de tipo silvestre, ambas proteínas, o una variante de proteínas ICOSL Fc-fusión con mutaciones como se indica. El RNA total de las muestras se preparó a partir de las células cosechadas y el RNA se transfirió a Nanostring y se utilizó un chip Cancer Immune para cuantificar los transcritos de 750 genes en cada muestra. Las transcripciones alteradas incluyen aquellas cuyo nivel está por encima o por debajo de la línea diagonal, incluidas las transcripciones anotadas.
[0170] LaFIG.19representa los niveles de transcripción de transcritos ejemplares tras la incubación descrita en laFIG.
[0171] 18 durante los tiempos indicados en presencia de las distintas proteínas inmunomoduladoras.
[0172] LaFIG.20A-20Bdemuestra la proliferación de células T mediada por VmAb cuando se co-cultivan con dianas que expresan HER2. Las células pan T marcadas con CFSE se activaron con células diana artificiales derivadas de K562 que mostraban anti-CD3 de cadena simple Fv (OKT3) y HER2 en la superficie celular en presencia de VmAbs o proteínas de control. La proliferación se midió mediante análisis de citometría de flujo de la dilución de CFSE en células T teñidas con CD4+ (panel izquierdo) o CD8<->(panel derecho). EnFIG.20A, las células K562 fueron tituladas y sembradas con células T para una proporción efector:diana (E:T) de 40 a 1280: 1. Los VmAbs, el dominio IgSF parental o el ICOSL WT se añadieron a 1000pM. EnFIG.20B, se añadieron células K562 a células T para una proporción E:T de 160:1. Se valoraron los VmAbs o las proteínas de control y se añadieron entre 3000 y 37pM.
[0173] LaFIG. 21representa los estudios de proliferación de células T transducidas con varias proteínas inmunomoduladoras transmembrana (TIP) que contienen dominios IgSF y un TCR recombinante E6 específico ejemplar en células T humanas primarias.
[0174] LaFIG.22A-22Gmuestra el análisis SEC de la proteólisis en moléculas de fusión Fc de ICOSL variantes que contienen mutaciones N52H/N57Y/Q100R/F172S generadas en diversas secuencias de referencia, como la fusión Fc ECD de ICOSL truncada, una fusión Fc de ICOSL de dominio IgV solo, y/o proteínas de fusión Fc de ICOSL variantes con mutaciones en N207G/L208G con referencia a la secuencia de dominio extracelular (ECD) de ICOSL de referencia establecida en SEQ ID N.º:32. Las moléculas se expresaron utilizando células derivadas de ExpiCHO-S.
[0175] LaFIG. 23A-23Brepresenta la proliferación de células T humanas CD4 y CD8 estimuladas con células K652 que expresan TIPs ICOSL variantes que contienen un ECD que contiene una IgSF modificada por afinidad con mutaciones de aminoácidos correspondientes a N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID N.º: 288), N52H/N57Y/Q100R (SEQ ID N.º: 283), y E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R (SEQ ID N.º: 300).
[0176] LaFIG.24Arepresenta la unión de V-mAbs a HER2 y CD28. LaFIG.24B-24Frepresenta los resultados de la coestimulación de células T por VmAb utilizando un sistema celular transfectado que utiliza células Jurkat con un reportero de luciferasa promotor de IL-2, mostrando que los V-mAbs proporcionaron una señal coestimuladora significativa en presencia de células BER2+ K562/OKT3.
[0177] LaFIG.25A-25Drepresenta la unión de moléculas de fusión Fc apiladas a células que expresan socios de unión afines B7H6(FIG.25A), ICOS(FIG.25B), CD28(FIG.25C), y CTLA-4(FIG.25D).
[0178] LaFIG.26A-26Brepresenta estudios de bioactividad para proteínas de pila ICOSL/NKp30 probadas a modo de ejemplo.
[0179] LaFIG. 27representa la proliferación inducida por las proteínas apiladas ICOSL/NKp30, medida mediante análisis de citometría de flujo de dilución CFSE en células T teñidas con CD4+ o CD8<+>.
[0180] LaFIG.28representa los efectos antitumorales de la combinación de la proteína apilada ICOSL/NKp30 probada y el mAb mPD-1.
[0181] LaFIG. 29A-29Emuestra la actividad antiinflamatoria de la dosificación profiláctica de la molécula de fusión ICOSL IgV-Fc ejemplar en el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA), incluida la puntuación media de la pata (FIG. 29A), detectó IgG CII(FIG. 29B), los niveles séricos de citoquinas(FIG. 29C), células T activadas CD44+ o células T<FH>(FIG.29D), y la fracción de células B en el ganglio linfático de drenaje (FIG.29E).
[0182] LaFIG. 30A-30Dmuestra la actividad antiinflamatoria de la dosificación retardada de la molécula de fusión ICOSL IgV-Fc ejemplar en el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA), incluida la puntuación media de la suma de la pata(FIG.30A)y los niveles séricos de citocinas(FIG.30C-30D).
[0183] LaFIG. 31A-31Dmuestra la actividad antiinflamatoria de la dosificación retardada de la molécula de fusión ICOSL IgV-Fc ejemplar en el modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), incluida la puntuación EAE(FIG.31A),análisis de citometría de flujo de células T del ganglio linfático inguinal(FIG.31C),y citoquinas proinflamatorias(FIG.31D).
[0184] LaFIG.32A-32Brepresenta la supervivencia y la puntuación DAI de ratones con enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) tratados con varias dosis (20, 100 o 500 µg) de una variante de la molécula ICOSL IgV-Fc. LaFIG.33A-33Fmuestra los resultados del análisis de citometría de flujo de la relación injerto contra huésped (GvHD) de células humanas/células de ratón en la sangre recogida(FIG. 33A) o en el recuento total de células T(FIG.33B) al final del estudio, y evaluación de células ICOS+ CD4+ o CD8<+>(FIG.33C-33D), o células CD28+ CD4+ o CD8<+>(FIG. 33E-33F) de ratones con enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) tratados con diversas dosis (20, 100 o 500 µg) de una variante de la molécula IgV-Fc de ICOSL.
[0185] LaFIG. 34A-34Brepresenta la expresión de marcadores de activación o agotamiento de células T de ratones con enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) tratados con diversas dosis (20, 100 o 500 µg) de una molécula IgV-Fc variante de ICOSL.
[0186] LaFIG. 34Crepresenta la proporción de células efectoras T (Teff) frente a células reguladoras T (Treg) de ratones con enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) tratados con varias dosis (20, 100 o 500 µg) de una variante de la molécula ICOSL IgV-Fc.
[0187] LaFIG. 35A-35Dmuestra las citocinas proinflamatorias séricas de ratones con enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) tratados con varias dosis (20, 100 o 500 µg) de una molécula IgV-Fc variante de ICOSL. LaFIG. 35Erepresenta la exposición sérica de la variante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) en el modelo de GVHD en comparación con ratones normales.
[0188] LaFIG.36Arepresenta los resultados del DAI y laFIG.36Brepresenta los resultados histológicos del tratamiento con una variante ejemplar de ICOSL IgV-Fc sobre el índice de actividad de la enfermedad (DAI) calculado a partir de las puntuaciones de peso corporal y heces en un modelo de colitis inducida por CD4+CD45RB.
[0190] Descripción Detallada
[0192] [0101]En el presente documento se proporcionan proteínas inmunomoduladoras que son o comprenden variantes o mutantes del ligando ICOS (ICOSL) o fragmentos de unión específicos del mismo que muestran actividad para unirse al menos a un compañero de unión cognado del ligando diana (también denominado proteína de contraestructura). En algunas realizaciones, los polipéptidos ICOSL variantes contienen una o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos) en comparación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos) se encuentran en un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) (por ejemplo, IgV) de un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL presenta una actividad de unión o afinidad alterada, por ejemplo aumentada o disminuida, para al menos un socio de unión afín, como al menos uno de ICOS, CD28 o CTLA-4. El polipéptido ICOSL variante presenta una actividad de unión o afinidad alterada, por ejemplo aumentada o disminuida. En algunas realizaciones, las proteínas inmunomoduladoras son solubles. En algunas realizaciones, las proteínas inmunomoduladoras son proteínas inmunomoduladoras transmembrana capaces de expresarse en la superficie de las células. En algunas realizaciones, también se proporcionan en el presente documento una o más proteínas inmunomoduladoras que son conjugados o fusiones que contienen una variante del polipéptido ICOSL proporcionado en el presente documento y otra u otras moléculas o polipéptidos.
[0194] En algunas realizaciones, los polipéptidos ICOSL variantes y las proteínas inmunomoduladoras modulan una respuesta inmunitaria inmunológica, como una respuesta inmunitaria aumentada o disminuida. En algunas realizaciones, los polipéptidos ICOSL variantes y las proteínas inmunomoduladoras proporcionadas en el presente documento pueden utilizarse para el tratamiento de enfermedades o afecciones que están asociadas con una respuesta inmunitaria desregulada.
[0196] En algunas realizaciones, los polipéptidos ICOSL variantes proporcionados modulan la activación de células T a través de interacciones con moléculas de señalización costimuladoras. En general, la activación de las células T específica de antígeno requiere dos señales distintas. La primera señal la proporciona la interacción del receptor de células T (TCR) con los antígenos asociados al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) presentes en las células presentadoras de antígenos (APC). La segunda señal es coestimuladora de la participación del TCR y necesaria para evitar la apoptosis o la anergia de las células T.
[0198] En algunas realizaciones, en condiciones fisiológicas normales, la respuesta inmunitaria mediada por células T se inicia por el reconocimiento del antígeno por el receptor de células T (TCR) y está regulada por un equilibrio de señales coestimuladoras e inhibidoras (por ejemplo, receptores de punto de control inmunitario). El sistema inmunitario depende de los receptores de puntos de control inmunitarios para evitar la autoinmunidad (es decir, la autotolerancia) y proteger los tejidos de daños excesivos durante una respuesta inmunitaria, por ejemplo durante un ataque contra una infección patógena. En algunos casos, sin embargo, estas proteínas inmunomoduladoras pueden estar desreguladas en enfermedades y afecciones, incluidos los tumores, como mecanismo para evadir el sistema inmunitario.
[0200] En algunas realizaciones, entre los receptores costimuladores de células T conocidos se encuentra CD28, que es el receptor costimulador de células T para los ligandos B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86), ambos presentes en las APC. Estos mismos ligandos también pueden unirse al receptor inhibidor de células T CTLA4 (proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos) con mayor afinidad que para CD28; la unión a CTLA-4 actúa para modular a la baja la respuesta inmunitaria. El ICOS (coestimulador inducible) es otro receptor coestimulador de células T que se une al ligando ICOS (ICOSL) en las APC. En algunos casos, se sabe que CD28 y CTLA-4 también interactúan con ICOSL en un sitio de unión que se solapa con la unión de ICOSL al receptor costimulador de células T ICOS (Yao et al. (2011) Immunity, 34:729-740). Aunque CD28 e ICOS son receptores activadores relacionados de la familia CD28 y comparten algunos motivos de señalización intracelular, los efectos costimuladores entre CD28 e ICOS difieren. Por ejemplo, CD28 se expresa tanto en células T activadas como no activadas y su señalización es importante para la producción de IL-2 y la posterior función efectora de las células T. Por lo general, ICOS no se expresa en la superficie de las células T hasta después de su activación, y la señalización a través de ICOS en las células T activadas favorece la diferenciación de subconjuntos de células T especializadas. Así, en algunos casos, la coestimulación por CD28 e ICOS produce efectos solapados y complementarios.
[0202] En algunos aspectos, las células T expresan las moléculas costimuladoras CD28 e ICOS, que interactúan con CD80/CD86 e ICOSL respectivamente, en las células presentadoras de antígeno (APC). En los órganos linfoides, las APC profesionales (es decir, las células dendríticas, los macrófagos y las células B) expresan CD80, CD86 e ICOSL y atraen a las células T CD28+/ICOS+. En algunas realizaciones, las células T activadas pueden diferenciarse en células efectoras como células T citotóxicas (CTL) CD8<+>, células Th17 CD4+ secretoras de IL-17A/F o células auxiliares foliculares (T<FH>) CD4+. Los CD40L que expresan T<FH>captan células B en los folículos linfoides y liberan citocinas (por ejemplo, IL-21) que inducen la diferenciación de las células B en células plasmáticas secretoras de anticuerpos (Ab). Las células plasmáticas pueden producir anticuerpos dañinos para los tejidos, por ejemplo, factor reumatoide (RF) y anticuerpos antipéptido citrulinado (ACPA) en humanos, y anticuerpos anticolágeno (CII) en ratones, que pueden formar complejos inmunes y depósitos en las articulaciones y otros tejidos. El ICOSL también puede expresarse en APC no profesionales, lo que provoca la activación de células T en tejidos no linfoides y mayores daños en los tejidos y las articulaciones.
[0204] [0107]En algunos aspectos, las células CD4+Th1-, Th9-y Th17, están implicadas como contribuyentes clave a la esclerosis múltiple (MS) al aumentar la inflamación dentro del CNS tanto en la esclerosis múltiple como en la encefalomielitis autoinmune experimental y las células T foliculares helper CD4+ICOS+CXCR5+ están aumentadas en PBMC en la recaída-remisión y se correlacionan con la progresión de la enfermedad en la EM secundaria progresiva. En algunas realizaciones, hay un aumento significativo de la expresión del gen ICOS en las células del líquido cefalorraquídeo, en la EM secundaria progresiva, y se observa un aumento del porcentaje de monocitos totales y monocitos que expresan ICOSL. ICOSL también se expresa en APC no profesionales, lo que provoca la activación de células T en tejidos no linfoides y un mayor daño tisular
[0206] Entre los polipéptidos ICOSL variantes proporcionados se encuentran polipéptidos que, cuando se modifican mediante una o más modificaciones de aminoácidos de un dominio IgSF de un polipéptido ICOSL de referencia, presentan una afinidad de unión mejorada para CD28 y/o ICOS. En algunos casos, el aumento global de la unión a ICOS en las variantes proporcionadas es menor que el aumento de la unión a CD28 porque el ICOSL de tipo silvestre ya demuestra una afinidad de unión a ICOS sustancialmente mayor que CD28. También se proporcionan diversos formatos de los polipéptidos variantes proporcionados. Como se muestra en el presente documento, los formatos alternativos pueden facilitar la manipulación de la respuesta inmunitaria y, por tanto, la aplicación terapéutica. Por ejemplo, se ha demostrado que la administración de proteínas ICOSL mejoradas en formatos solubles antagoniza la activación de células T mediante la inhibición de la señalización CD28 y/o ICOS. En otros ejemplos, la unión de las moléculas ICOSL variantes a una superficie facilita la activación de las células T al proporcionar una señal coestimuladora. Se proporcionan varias estrategias de fijación para localizar la entrega de una señal coestimuladora de células T, incluyendo, entre otras, el recubrimiento directo al plástico, el uso de otra variante del dominio IgSF para localizar una diana proteica unida a una placa o expresada en la superficie celular, o la fusión de la variante ICOSL con un anticuerpo monoclonal específico de tumor.
[0208] En algunas realizaciones, la modulación de la señalización inmunitaria lograda por los polipéptidos ICOSL variantes proporcionados y los polipéptidos inmunomoduladores ofrece ventajas para el tratamiento de trastornos inflamatorios y autoinmunitarios y otras enfermedades y afecciones en comparación con otros tratamientos. En algunos casos, las terapias para intervenir y alterar los efectos coestimuladores de ambos receptores se ven restringidas por los requisitos de orientación espacial, así como por las limitaciones de tamaño impuestas por los confines de la sinapsis inmunológica. En algunos aspectos, los fármacos terapéuticos existentes, incluidos los anticuerpos, pueden no ser capaces de interactuar simultáneamente con las múltiples proteínas diana implicadas en la modulación de estas interacciones. Además, en algunos casos, los fármacos terapéuticos existentes sólo pueden antagonizar una respuesta inmunitaria, pero no agonizarla. Además, las diferencias farmacocinéticas entre los fármacos que se dirigen independientemente a uno u otro de estos dos receptores pueden crear dificultades para mantener adecuadamente una concentración sanguínea deseada de dichas combinaciones de fármacos a lo largo del tratamiento.
[0210] En algunas realizaciones, los polipéptidos ICOSL variantes proporcionados o las proteínas inmunomoduladoras modulan (por ejemplo, aumentan o disminuyen) la actividad inmunológica inducida por los receptores costimuladores CD28 o ICOS. Así, en algunas realizaciones, los polipéptidos proporcionados superan estas limitaciones proporcionando variantes de ICOSL (ligando costimulador inducible) con afinidades de unión alteradas (por ejemplo, aumentadas o disminuidas) tanto a CD28 como a ICOS y, en algunos casos, a CTLA-4, agonizando o antagonizando así los efectos complementarios de la coestimulación por los receptores. También se proporcionan métodos para fabricar y utilizar estas variantes de ICOSL.
[0212] En algunos aspectos, las moléculas proporcionadas también pueden ser más eficaces que otros agentes proteicos terapéuticos solubles. Por ejemplo, se ha demostrado que abatacept (CTLA-4-Fc) interfiere con la coestimulación de células T para atenuar las respuestas de células T en entornos de enfermedades autoinmunes, como para el tratamiento de la artritis reumatoide, la artritis psoriásica y la artritis idiopática juvenil, y belatacept, una variante de la molécula CTLA-4-Fc, para el rechazo de trasplantes. Sin embargo, estas proteínas CTLA-4-Fc se unen a CD80 y CD86 e impiden que estos ligandos costimuladores se enganchen y activen únicamente a CD28. Los polipéptidos ICOSL variantes proporcionados en el presente documento, en algunos casos, presentan afinidad de unión y actividad mejorada tanto para CD28 como para ICOS.
[0214] Además, la capacidad de formatear los polipéptidos variantes en diversas configuraciones para, dependiendo del contexto, antagonizar o agonizar una respuesta inmunitaria, ofrece flexibilidad en aplicaciones terapéuticas basadas en la misma unión y actividad aumentadas de un ICOSL variante para socios de unión. En algunas realizaciones, el formato concreto puede elegirse para la aplicación terapéutica deseada. Por ejemplo, como se ha descrito, un polipéptido inmunomodulador que comprende una variante del polipéptido ICOSL se proporciona en un formato, por ejemplo como una proteína de fusión Fc, para antagonizar o bloquear la actividad de su pareja de unión afín, por ejemplo ICOS y/o CD28. En algunas realizaciones, bloquear o inhibir la señalización costimuladora a través de CD28 o ICOS puede ser útil para suprimir una respuesta inmunitaria, lo que puede ser útil en el tratamiento de trastornos inflamatorios o autoinmunitarios (por ejemplo, esclerosis múltiple o inflamación cerebral), o trasplante de órganos. Por ejemplo, el anclaje de proteínas ICOSL variantes a una superficie puede proporcionar una señal costimuladora localizada, que, en algunos aspectos, puede utilizarse para dirigirse al tejido tumoral con el fin de proporcionar costimulación localizada a las células T infiltrantes del tumor. La mayoría de los tumores primarios carecen de expresión de moléculas coestimuladoras como CD80, CD86 o ICOSL, por lo que las respuestas antitumorales de las células T pueden verse comprometidas por la falta de coestimulación (Yu et al. (1998) Int. Immunol. 10:791-797). Mediante la localización de dominios costimuladores en células tumorales utilizando una fracción localizadora de tumores, como Nkp30 localizada en células tumorales B7H6 o un anticuerpo específico de tumores, se pueden potenciar las respuestas de células T en ausencia de proteínas costimuladoras expresadas en tumores.
[0215] Si una definición establecida en el presente documento es contraria o incoherente con una definición establecida en las patentes, solicitudes, aplicaciones publicadas y otras publicaciones a las que se hace referencia en el presente documento, la definición establecida en el presente documento prevalece sobre la definición a la que se hace referencia.
[0217] Los títulos de las secciones que se utilizan en el presente documento tienen únicamente fines organizativos y no deben interpretarse como una limitación de la materia descrita.
[0219] I. DEFINICIONES
[0221] A menos que se defina de otro modo, todos los términos de la técnica, notaciones y otros términos o terminología técnica y científica utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece la materia reivindicada. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen aquí para mayor claridad y/o para facilitar la referencia, y la inclusión de tales definiciones aquí no debe interpretarse necesariamente como una diferencia sustancial sobre lo que generalmente se entiende en la técnica.
[0223] Los términos utilizados a lo largo de esta especificación se definen como sigue a menos que se limite de otro modo en casos específicos. Tal como se utilizan en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un/una" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos, acrónimos y abreviaturas utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece la invención. Salvo que se indique lo contrario, las abreviaturas y símbolos de los nombres químicos y bioquímicos corresponden a la nomenclatura IUPAC-IUB. A menos que se indique lo contrario, todos los intervalos numéricos incluyen los valores que definen el intervalo, así como todos los valores enteros intermedios.
[0225] El término "afinidad modificada" utilizado en el contexto de un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas, significa un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas de mamíferos (IgSF) que tiene una secuencia de aminoácidos alterada (en relación con el correspondiente dominio IgSF de tipo silvestre parental o no modificado) de tal manera que tiene una afinidad o avidez de unión aumentada o disminuida con al menos uno de sus socios de unión afines (alternativamente "contraestructuras") en comparación con el dominio parental de tipo silvestre o no modificado (es decir.e., no modificado por afinidad) del dominio de control IgSF. En este contexto se incluye un dominio IgSF de ICOSL modificado por afinidad. En algunas realizaciones, el dominio IgSF modificado por afinidad puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más diferencias de aminoácidos, tales como sustituciones de aminoácidos, en un dominio IgSF de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. El aumento o disminución de la afinidad o avidez de unión puede determinarse mediante ensayos de unión bien conocidos, como la citometría de flujo. Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453 (2005). Véase también, Linsley et al., Immunity, Vol 1: 793-801 (1994). Un aumento de la afinidad o avidez de unión de una proteína a su(s) pareja(s) de unión afín(es) es un valor al menos un 10% mayor que el del control del dominio IgSF de tipo silvestre y, en algunas realizaciones, al menos un 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 200%, 300%, 500%, 1000%, 5000% o 10000% mayor que el valor de control del dominio IgSF de tipo silvestre. Una disminución de la afinidad o avidez de unión de una proteína con al menos uno de sus compañeros de unión afines es a un valor no superior al 90% del control pero no inferior al 10% del valor de control del dominio IgSF de tipo silvestre y, en algunas realizaciones, no superior al 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% o 20% pero no inferior al 10% del valor de control del dominio IgSF de tipo silvestre. Una proteína modificada por afinidad ve alterada su secuencia primaria de aminoácidos por sustitución, adición o eliminación de residuos de aminoácidos. El término "dominio IgSF modificado por afinidad" no debe interpretarse como la imposición de una condición para cualquier composición de partida o método particular por el que se haya creado el dominio IgSF modificado por afinidad. Así pues, los dominios IgSF modificados por afinidad de la presente invención no se limitan a dominios IgSF de tipo silvestre que se transforman a continuación en un dominio IgSF modificado por afinidad mediante cualquier proceso particular de modificación por afinidad. Un polipéptido del dominio IgSF modificado por afinidad puede, por ejemplo, generarse a partir de la información de la secuencia del dominio IgSF de mamífero de tipo silvestre, luego modelarse in silico para la unión a su pareja de unión afín, y finalmente sintetizarse recombinante o químicamente para producir la composición de materia del dominio IgSF modificado por afinidad. En un ejemplo alternativo, puede crearse un dominio IgSF modificado por afinidad mediante mutagénesis dirigida al sitio de un dominio IgSF de tipo silvestre. Así pues, el dominio IgSF modificado por afinidad denota un producto y no necesariamente un producto producido por un proceso determinado. Pueden emplearse diversas técnicas, incluidos métodos recombinantes, síntesis química o combinaciones de los mismos.
[0227] El término "alogénico", tal como se utiliza aquí, significa una célula o tejido que se extrae de un organismo y luego se infunde o se transfiere adoptivamente a un organismo genéticamente distinto de la misma especie. En algunas realizaciones de la invención, la especie es murina o humana.
[0229] [0119]El término "autólogo", tal como se utiliza aquí, significa una célula o tejido que se extrae del mismo organismo al que posteriormente se infunde o transfiere adoptivamente. Una célula o tejido autólogo puede ser alterado, por ejemplo, mediante metodologías de DNA recombinante, de forma que deje de ser genéticamente idéntico a la célula o tejido nativo que se extrae del organismo. Por ejemplo, una célula T autóloga nativa se puede manipular genéticamente mediante técnicas de DNA recombinante para convertirla en una célula autóloga manipulada que exprese una proteína inmunomoduladora transmembrana y/o un receptor de antígeno quimérico (CAR), lo que en algunos casos implica manipular una célula T o TIL (linfocito infiltrante de tumor). A continuación, las células modificadas genéticamente se infunden en un paciente del que se aislaron las células T nativas. En algunas realizaciones, el organismo es humano o murino.
[0231] Los términos "afinidad de unión" y "avidez de unión" utilizados en el presente documento se refieren a la afinidad de unión específica y la avidez de unión específica, respectivamente, de una proteína por su contraestructura en condiciones de unión específicas. En cinética bioquímica, la avidez se refiere a la fuerza acumulada de afinidades múltiples de interacciones de unión no covalentes individuales, como entre ICOSL y sus contraestructuras ICOS y/o CD28. Como tal, la avidez es distinta de la afinidad, que describe la fuerza de una única interacción. El aumento o la atenuación de la afinidad de unión de una variante de ICOSL que contiene un dominio IgSF de ICOSL modificado por afinidad a su contraestructura se determina en relación con la afinidad de unión del ICOSL no modificado, como un ICOSL no modificado que contiene el dominio IgSF nativo o de tipo silvestre, como el dominio IgV. Los métodos para determinar la afinidad o avidez de unión son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453 (2005). En algunas realizaciones, una variante ICOSL de la invención (es decir, una proteína ICOSL que contiene un dominio IgSF de afinidad modificada) se une específicamente a CD28 y/o ICOS medidos por citometría de flujo con una afinidad de unión que produce un valor de Intensidad de Fluorescencia Media (MFI) al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100% mayor que un control ICOSL de tipo silvestre en un ensayo de unión como el descrito en el Ejemplo 6.
[0233] El término "semivida biológica" se refiere a la cantidad de tiempo que tarda una sustancia, como un polipéptido inmunomodulador que comprende una variante ICOSL de la presente invención, en perder la mitad de su actividad o concentración farmacológica o fisiológica. La semivida biológica puede verse afectada por la eliminación, la excreción, la degradación (por ejemplo, enzimática) de la sustancia o la absorción y concentración en determinados órganos o tejidos del cuerpo. En algunas realizaciones, la semivida biológica puede evaluarse determinando el tiempo que tarda la concentración de la sustancia en el plasma sanguíneo en alcanzar la mitad de su nivel de estado estacionario ("semivida plasmática"). Los conjugados que pueden utilizarse para derivatizar y aumentar la semivida biológica de los polipéptidos de la invención son conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, polietilenglicol (PEG), hidroxietilalmidón (HES), XTEN (péptidos recombinantes extendidos; véase, documento WO2013130683), albúmina sérica humana (HSA), albúmina sérica bovina (BSA), lípidos (acilación), y poli-Pro-Ala-Ser (PAS), ácido poliglutámico (glutamilación).
[0235] El término "receptor de antígeno quimérico" o "CAR", tal como se utiliza aquí, se refiere a una proteína transmembrana artificial (es decir, hecha por el hombre) expresada en una célula de mamífero que comprende al menos un ectodominio, una transmembrana y un endodominio. Opcionalmente, la proteína CAR incluye un "espaciador" que une covalentemente el ectodominio al dominio transmembrana. Un espaciador suele ser un polipéptido que une el ectodominio al dominio transmembrana mediante enlaces peptídicos. El CAR se expresa normalmente en un linfocito de mamífero. En algunas realizaciones, el CAR se expresa en una célula de mamífero como una célula T o un linfocito infiltrante de tumor (TIL). Un CAR expresado en una célula T se denomina en el presente documento "célula T CAR" o "CAR-T". En algunas realizaciones, la CAR-T es una célula T auxiliar, una célula T citotóxica, una célula T asesina natural, una célula T de memoria, una célula T reguladora o una célula T gamma delta. Cuando se utiliza clínicamente, por ejemplo en la transferencia celular adoptiva, un CAR-T con especificidad de unión a antígenos para el tumor del paciente se suele modificar genéticamente para que se exprese en una célula T nativa obtenida del paciente. La célula T modificada genéticamente que expresa el CAR se infunde de nuevo al paciente. Así pues, la CAR-T suele ser una CAR-T autóloga, aunque las CAR-T alogénicas se incluyen en el ámbito de la invención. El ectodominio de un CAR comprende una región de unión a antígeno, como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, scFv), que se une específicamente en condiciones fisiológicas con un antígeno diana, como un antígeno específico de tumor. Tras la unión específica, una cadena bioquímica de acontecimientos (es decir, la transducción de señales) da lugar a la modulación de la actividad inmunológica de la CAR-T. Así, por ejemplo, tras la unión específica de la región de unión a antígeno de la CAR-T a su antígeno diana pueden producirse cambios en la actividad inmunológica de la actividad de las células T, reflejados en cambios en la citotoxicidad, la proliferación o la producción de citocinas. La transducción de señales tras la activación de CAR-T se consigue en algunas realizaciones mediante la cadena CD3-zeta ("CD3-z"), que participa en la transducción de señales en células T de mamíferos nativos. Los CAR-T pueden comprender además múltiples dominios de señalización, como CD28, 41BB u OX40, para modular aún más la respuesta inmunomoduladora de la célula T. CD3-z comprende un motivo conservado conocido como motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM) que interviene en la transducción de señales del receptor de células T.
[0237] El término "colectivamente" o "colectivo" cuando se utiliza en referencia a la producción de citocinas inducida por la presencia de dos o más variantes de ICOSL de la invención en un ensayo in vitro, significa el nivel global de expresión de citocinas independientemente de la producción de citocinas inducida por variantes individuales de ICOSL. En algunas realizaciones, la citocina que se ensaya es IFN-gamma en un ensayo de células T primarias in vitro como el descrito en el Ejemplo 6 y el Ejemplo 7.
[0239] [0124]El término "socio de unión afín" (utilizado indistintamente con "contraestructura") en referencia a un polipéptido, como en referencia a un dominio IgSF de una variante ICOSL, se refiere a al menos una molécula (típicamente una proteína nativa de mamífero) a la que el polipéptido referenciado se une específicamente en condiciones de unión específicas. En algunos aspectos, una variante ICOSL que contiene un dominio IgSF de afinidad modificada se une específicamente a la contraestructura de la correspondiente ICOSL nativa o de tipo silvestre pero con afinidad aumentada o atenuada. Una especie de ligando reconocido y que se une específicamente a su receptor afín en condiciones de unión específicas es un ejemplo de contraestructura o pareja de unión afín de ese receptor. Un "compañero de unión de superficie celular afín" es un compañero de unión afín expresado en la superficie de una célula de mamífero. Una "especie molecular de superficie celular" es un compañero de unión afín de los ligandos de la sinapsis inmunológica (SI), expresado en y por las células, como las células de mamíferos, que forman la sinapsis inmunológica.
[0241] Como se usa aquí, "conjugado", "conjugación" o variaciones gramaticales de los mismos se refiere a la unión o enlace de dos o más compuestos que resulta en la formación de otro compuesto, por cualquier método de unión o enlace conocido en la técnica. También puede referirse a un compuesto generado por la unión o enlace de dos o más compuestos. Por ejemplo, un polipéptido ICOSL variante unido directa o indirectamente a una o más moléculas químicas o polipéptido es un conjugado ejemplar. Tales conjugados incluyen las proteínas de fusión, las producidas por conjugados químicos y las producidas por cualquier otro método.
[0243] El término "unión competitiva", tal como se utiliza en el presente documento, significa que una proteína es capaz de unirse específicamente a al menos dos socios de unión afines, pero que la unión específica de un socio de unión afín inhibe, como impide o excluye, la unión simultánea del segundo socio de unión afín. Así, en algunos casos, no es posible que una proteína se una a los dos compañeros de unión afines al mismo tiempo. Generalmente, los ligantes competitivos contienen el mismo sitio de unión o un sitio de unión solapado para una unión específica, pero esto no es un requisito. En algunas realizaciones, la unión competitiva causa una inhibición medible (parcial o completa) de la unión específica de una proteína a uno de sus compañeros de unión afines debido a la unión específica de un segundo compañero de unión afín. Se conocen varios métodos para cuantificar la unión competitiva, como los ensayos ELISA (ensayo inmunoenzimático).
[0245] El término "sustitución conservadora de aminoácidos", tal como se utiliza en el presente documento, significa una sustitución de aminoácidos en la que un residuo de aminoácido se sustituye por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). Algunos ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares son: 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales alifáticas-hidroxiladas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amidas: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: ácido aspártico y ácido glutámico; y 7) cadenas laterales azufradas: cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina.
[0247] El término, "correspondiente a" con referencia a posiciones de una proteína, tal como la recitación de que nucleótidos o posiciones de aminoácidos "corresponden a" nucleótidos o posiciones de aminoácidos en una secuencia divulgada, tal como se establece en el Listado de Secuencias, se refiere a nucleótidos o posiciones de aminoácidos identificados tras la alineación con la secuencia divulgada basada en la alineación de secuencia estructural o utilizando un algoritmo de alineación estándar, tal como el algoritmo GAP. Por ejemplo, los residuos correspondientes pueden determinarse mediante la alineación de una secuencia de referencia con la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 32 (dominio ECD) o establecido en SEQ ID N.º: 196 o 545 (dominio IgV) por métodos de alineación estructural como se describe en el presente documento. Al alinear las secuencias, un experto en la materia puede identificar los residuos correspondientes, por ejemplo, utilizando residuos de aminoácidos conservados e idénticos como guías.
[0249] Los términos "disminuir" o "atenuar" "o suprimir" utilizados en el presente documento significan disminuir en una cantidad estadísticamente significativa. Una disminución puede ser de al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de un valor de control, como un valor de control distinto de cero.
[0251] Los términos "disminuido" o "reducido", tal como se utilizan en el presente documento en el contexto de la disminución de la actividad inmunológica de un linfocito de mamífero, significa disminuir una o más actividades del linfocito, en comparación con un control, como un control no tratado o un control en el que se empleó un tratamiento con un control no modificado o no variante en las mismas condiciones. Una actividad disminuida puede referirse a una o más de las siguientes: inhibición del ciclo celular, reducción de la supervivencia celular, reducción de la proliferación celular, reducción de la producción de citoquinas o reducción de la citotoxicidad de las células T, por ejemplo en una cantidad estadísticamente significativa. En algunas realizaciones, la referencia a la reducción de la actividad inmunológica significa reducir la producción de interferón gamma (IFN-gamma) en comparación con la ausencia de tratamiento, por ejemplo en una cantidad estadísticamente significativa. En algunas realizaciones, la actividad inmunológica puede evaluarse en un ensayo de reacción linfocitaria mixta (MLR). Los métodos para llevar a cabo ensayos MLR son conocidos en la técnica. Wang et al., Cancer Immunol Res.2014 Sep: 2(9):846-56. En la técnica se conocen otros métodos para evaluar las actividades de los linfocitos, incluido cualquier ensayo como el descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una mejora puede ser una disminución de al menos el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%, en comparación con un valor de control, como un valor de control no tratado o un valor de control distinto de cero.
[0253] [0131]Los términos "derivados" o "derivatizados" se refieren a la modificación de una proteína mediante su unión covalente, directa o indirecta, a una composición con el fin de alterar características como la semivida biológica, la biodisponibilidad, la inmunogenicidad, la solubilidad, la toxicidad, la potencia o la eficacia, conservando o mejorando su beneficio terapéutico. Los derivados de los polipéptidos inmunomoduladores de la invención están dentro del alcance de la invención y pueden hacerse, por ejemplo, por glicosilación, pegilación, lipidación o fusión Fc.
[0255] Tal como se utiliza aquí, dominio (típicamente una secuencia de tres o más, generalmente 5 o 7 o más aminoácidos, tales como 10 a 200 residuos de aminoácidos) se refiere a una porción de una molécula, tal como una proteína o ácido nucleico codificante, que es estructural y/o funcionalmente distinta de otras porciones de la molécula y es identificable. Por ejemplo, los dominios incluyen aquellas porciones de una cadena polipeptídica que pueden formar una estructura plegada independientemente dentro de una proteína compuesta por uno o más motivos estructurales y/o que se reconoce en virtud de una actividad funcional, como la actividad de unión. Una proteína puede tener uno o más dominios distintos. Por ejemplo, un dominio puede identificarse, definirse o distinguirse por homología de la secuencia o estructura primaria con miembros de la familia relacionados, como la homología con motivos. En otro ejemplo, un dominio puede distinguirse por su función, como la capacidad de interactuar con una biomolécula, como un socio de unión afín. Un dominio independientemente puede exhibir una función o actividad biológica tal que el dominio independientemente o fusionado a otra molécula puede realizar una actividad, como por ejemplo la unión. Un dominio puede ser una secuencia lineal de aminoácidos o una secuencia no lineal de aminoácidos. Muchos polipéptidos contienen una pluralidad de dominios. Tales dominios son conocidos y pueden ser identificados por los expertos en la materia. A modo de ejemplo, aquí se proporcionan definiciones, pero se entiende que está bien dentro de la habilidad en el arte para reconocer dominios particulares por su nombre. Si es necesario, se puede emplear un software adecuado para identificar los dominios.
[0257] El término "ectodominio", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la región de una proteína de membrana, como una proteína transmembrana, que se encuentra fuera de la membrana vesicular. Los ectodominios a menudo comprenden dominios de unión que se unen específicamente a ligandos o receptores de superficie celular, como por ejemplo a través de un dominio de unión que se une específicamente al ligando o receptor de superficie celular. El ectodominio de una proteína transmembrana celular se denomina alternativamente dominio extracelular.
[0259] Los términos "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refieren a una cantidad y/o concentración de una composición terapéutica de la invención, incluida una composición proteica o una composición celular, que cuando se administra ex vivo (por contacto con una célula de un paciente) o in vivo (por administración a un paciente) bien sola (es decir, como monoterapia) o en combinación con agentes terapéuticos adicionales, produce una disminución estadísticamente significativa de la progresión de la enfermedad como, por ejemplo, mejorando o eliminando los síntomas y/o la causa de la enfermedad. Una cantidad eficaz puede ser una cantidad que alivia, disminuye o mitiga al menos un síntoma o respuesta biológica o efecto asociado con una enfermedad o trastorno, previene la progresión de la enfermedad o trastorno, o mejora el funcionamiento físico del paciente. En el caso de la terapia celular, la cantidad eficaz es una dosis o número eficaz de células administradas a un paciente mediante terapia celular adoptiva. En algunas realizaciones, el paciente es un mamífero, como un primate no humano o un paciente humano.
[0261] El término "endodominio", tal como se utiliza aquí, se refiere a la región que se encuentra en algunas proteínas de membrana, como las proteínas transmembrana, que se extiende hacia el espacio interior definido por la membrana de la superficie celular. En las células de mamíferos, el endodominio es la región citoplasmática de la proteína de membrana. En las células, el endodominio interactúa con componentes intracelulares y puede desempeñar un papel en la transducción de señales, por lo que, en algunos casos, puede ser un dominio de señalización intracelular. El endodominio de una proteína transmembrana celular se denomina alternativamente dominio citoplasmático, que, en algunos casos, puede ser un dominio de señalización citoplasmática.
[0263] Los términos "mejorado" o "aumentado", tal como se utilizan en el presente documento en el contexto del aumento de la actividad inmunológica de un linfocito de mamífero, significan aumentar una o más actividades del linfocito, en comparación con un control, como un control no tratado o un control en el que se empleó un tratamiento con un control no modificado o no variante en las mismas condiciones. Un aumento de la actividad puede ser uno o más de los siguientes: aumento de la supervivencia celular, de la proliferación celular, de la producción de citocinas o de la citotoxicidad de las células T, por ejemplo en una cantidad estadísticamente significativa. En algunas realizaciones, la referencia al aumento de la actividad inmunológica significa aumentar la producción de interferón gamma (IFN-gamma), como por ejemplo en una cantidad estadísticamente significativa. En algunas realizaciones, la actividad inmunológica puede evaluarse en un ensayo de reacción linfocitaria mixta (MLR). Los métodos para llevar a cabo ensayos MLR son conocidos en la técnica. Wang et al., Cancer Immunol Res.2014 Sep: 2(9):846-56. En la técnica se conocen otros métodos para evaluar las actividades de los linfocitos, incluido cualquier ensayo como el descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una mejora puede ser un aumento de al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 400% o 500% mayor que un valor de control distinto de cero.
[0265] [0137]El término "célula modificada genéticamente", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una célula de mamífero que ha sido modificada genéticamente por intervención humana, como por métodos de DNA recombinante o transducción viral. En algunas realizaciones, la célula es una célula inmunitaria, como un linfocito (por ejemplo, célula T, célula B, célula NK) o una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, célula dendrítica). La célula puede ser una célula primaria de un paciente o puede ser una línea celular. En algunas realizaciones, una célula modificada genéticamente de la invención comprende una variante ICOSL proporcionada en el presente documento. En algunas realizaciones, la variante ICOSL es una proteína inmunomoduladora transmembrana (en lo sucesivo denominada "TIP") que se expresa en la célula modificada genéticamente. En algunas realizaciones, la TIP contiene el dominio extracelular o una porción del mismo que contiene el dominio IgV unido a un dominio transmembrana (por ejemplo, un dominio transmembrana ICOSL) y, opcionalmente, un dominio de señalización intracelular. En algunos casos, el TIP está formateado como un receptor quimérico que contiene un dominio de señalización citoplasmática heterólogo o un endodominio. En algunas realizaciones, una célula modificada genéticamente es capaz de expresar y secretar una proteína inmunomoduladora como se describe en el presente documento. Entre las células modificadas genéticamente proporcionadas también hay células que contienen además un receptor de células T (TCR) manipulado o un receptor de antígeno quimérico (CAR).
[0267] El término "célula T modificada genéticamente", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una célula T, como una célula T auxiliar, una célula T citotóxica (alternativamente, linfocito T citotóxico o CTL), una célula T asesina natural, una célula T reguladora, una célula T de memoria o una célula T gamma delta, que ha sido modificada genéticamente por intervención humana, como por métodos de DNA recombinante o métodos de transducción viral. Una célula T modificada genéticamente comprende una variante de la proteína inmunomoduladora transmembrana (TIP) ICOSL o una proteína inmunomoduladora secretada (SIP) de la presente invención que se expresa en la célula T y está modificada genéticamente para modular la actividad inmunológica de la propia célula T modificada genéticamente, o de una célula de mamífero a la que se une específicamente la variante ICOSL expresada en la célula T. Una célula T modificada genéticamente puede comprender una variante de la proteína inmunomoduladora secretada (SIP) ICOSL de la presente invención expresada y/o secretada por la célula T y modificada genéticamente para modular la actividad inmunológica de la propia célula T modificada genéticamente, o de una célula de mamífero a la que se une específicamente la variante ICOSL cuando es secretada por la célula T.
[0269] El término "receptor de células T manipulado" o "TCR manipulado" se refiere a un receptor de células T (TCR) manipulado para unirse específicamente con una afinidad deseada a un antígeno diana del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC)/péptido que se selecciona, clona y/o posteriormente se introduce en una población de células T, a menudo utilizada para inmunoterapia adoptiva. A diferencia de los TCR modificados genéticamente, los CAR están modificados genéticamente para unirse a los antígenos diana de forma independiente del MHC.
[0271] El término "expresado en", tal como se utiliza aquí, se usa en referencia a una proteína expresada en la superficie de una célula, como una célula de mamífero. Así, la proteína se expresa como una proteína de membrana. En algunas realizaciones, la proteína expresada es una proteína transmembrana. En algunas realizaciones, la proteína se conjuga con una molécula pequeña, como un fármaco o una etiqueta detectable. Las proteínas expresadas en la superficie de una célula pueden incluir proteínas de la superficie celular, como los receptores de la superficie celular que se expresan en las células de mamíferos.
[0273] El término "fracción prolongadora de la semivida" se refiere a una fracción de una fusión polipeptídica o conjugado químico que prolonga la semivida de una proteína que circula en el suero sanguíneo de mamíferos en comparación con la semivida de la proteína que no está conjugada de ese modo con la fracción. En algunas realizaciones, la semivida se prolonga más o menos 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o 6 veces. En algunas realizaciones, la semivida se prolonga más de 6 horas, más de 12 horas, más de 24 horas, más de 48 horas, más de 72 horas, más de 96 horas o más de 1 semana tras la administracióninvivo en comparación con la proteína sin la fracción prolongadora de la semivida. La semivida se refiere al tiempo que tarda la proteína en perder la mitad de su concentración, cantidad o actividad. La semivida puede determinarse, por ejemplo, mediante un ensayo ELISA o un ensayo de actividad. Las moléculas de extensión de la semivida ejemplares incluyen un dominio Fc, un dominio de multimerización, polietilenglicol (PEG), hidroxietilalmidón (HES), XTEN (péptidos recombinantes extendidos; véase, documento WO2013130683), albúmina sérica humana (HSA), albúmina sérica bovina (BSA), lípidos (acilación), y poli-Pro-Ala-Ser (PAS), y ácido poliglutámico (glutamilación).
[0275] El término "sinapsis inmunológica" o "sinapsis inmunológica", tal como se utiliza aquí, significa la interfaz entre una célula de mamífero que expresa MHC I (complejo mayor de histocompatibilidad) o MHC II, como una célula presentadora de antígeno o célula tumoral, y un linfocito de mamífero como una célula T efectora o una célula asesina natural (NK).
[0277] Una región o dominio Fc (fragmento cristalizable) de una molécula de inmunoglobulina (también denominado polipéptido Fc) corresponde en gran medida a la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, y es responsable de diversas funciones, incluida(s) la(s) función(es) efectoras del anticuerpo. El dominio Fc contiene parte o la totalidad de un dominio bisagra de una molécula de inmunoglobulina más un dominio CH2 y un dominio CH3. El dominio Fc puede formar un dímero de dos cadenas polipeptídicas unidas por uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el Fc es una variante del Fc que presenta una actividad reducida (por ejemplo, una reducción superior al 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más) para facilitar una función efectora. En algunas realizaciones, la referencia a las sustituciones de aminoácidos en una región Fc se hace mediante el sistema de numeración EU, a menos que se describa con referencia a una SEQ ID N.º. específica. La numeración comunitaria es conocida y se ajusta a la Carta Científica IMGT más recientemente actualizada (IMGT<®>, the international ImMunoGeneTics information system<®>http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html (creado: 17 de mayo de 2001, última actualización: 10 de enero de 2013) y el índice de la UE recogido en Kabat, E.A. et al. Secuencias de proteínas de interés inmunológico.5ª ed. Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., Publicación NIH N.º 91-3242 (1991).
[0278] Una fusión Fc de inmunoglobulina ("fusión Fc"), como una proteína de fusión Fc inmunomoduladora, es una molécula que comprende uno o más polipéptidos (o una o más moléculas pequeñas) unidos de forma operable a una región Fc de una inmunoglobulina. Una fusión Fc puede comprender, por ejemplo, la región Fc de un anticuerpo (que facilita las funciones efectoras y la farmacocinética) y una variante ICOSL. Una región Fc de inmunoglobulina puede estar unida indirecta o directamente a una o más variantes de ICOSL o moléculas pequeñas (socios de fusión). Se conocen varios enlazadores en la técnica y pueden utilizarse opcionalmente para enlazar un Fc a un compañero de fusión para generar una fusión Fc. Las fusiones Fc de especies idénticas pueden dimerizarse para formar homodímeros de fusión Fc, o utilizando especies no idénticas para formar heterodímeros de fusión Fc. En algunas realizaciones, el Fc es un Fc de mamífero, como un Fc murino o humano.
[0280] El término "célula huésped" se refiere a una célula que puede utilizarse para expresar una proteína codificada por un vector de expresión recombinante. Una célula huésped puede ser un procariota, por ejemplo, E. coli, o puede ser un eucariota, por ejemplo, un eucariota unicelular (por ejemplo, una levadura u otro hongo), una célula vegetal (por ejemplo, una célula vegetal de tabaco o tomate), una célula animal (por ejemplo, una célula humana, una célula de mono, una célula de hámster, una célula de rata, una célula de ratón o una célula de insecto) o un hibridoma. Entre los ejemplos de células huésped se incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) o sus derivados, como Veggie CHO y líneas celulares relacionadas que crecen en medios libres de suero o la cepa CHO DX-B11, que es deficiente en DHFR. En algunas realizaciones, una célula huésped es una célula de mamífero (por ejemplo, una célula humana, una célula de mono, una célula de hámster, una célula de rata, una célula de ratón o una célula de insecto).
[0282] El término "inmunoglobulina" (abreviado "Ig"), tal como se utiliza aquí, se refiere a una proteína inmunoglobulina de mamífero que incluye cualquiera de las cinco clases humanas de anticuerpos: IgA (que incluye las subclases IgA1 e IgA2), IgD, IgE, IgG (que incluye las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) e IgM. El término también incluye las inmunoglobulinas que no son de longitud completa, ya sean total o parcialmente sintéticas (p. ej, recombinantes o de síntesis química) o producidas naturalmente, como el fragmento de unión al antígeno (Fab), el fragmento variable (Fv) que contiene<VH>y<VL>, el fragmento variable de cadena única (scFv) que contiene<VH>y<VL>unidos en una cadena, así como otros fragmentos de la región V de los anticuerpos, como los fragmentos de polipéptidos Fab', F(ab<)2>, F(ab<')2>, dsFv diabody, Fc y Fd. Los anticuerpos biespecíficos, homobiespecíficos y heteroespecíficos, se incluyen en el significado del término.
[0284] El término "superfamilia de inmunoglobulinas" o "IgSF", tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia al grupo de proteínas solubles y de superficie celular que participan en los procesos de reconocimiento, unión o adhesión de las células. Las moléculas se clasifican como miembros de esta superfamilia en función de las características estructurales que comparten con las inmunoglobulinas (es decir, los anticuerpos); todas poseen un dominio conocido como dominio o pliegue de inmunoglobulina. Los miembros del IgSF incluyen receptores de antígenos de la superficie celular, correceptores y moléculas coestimuladoras del sistema inmunitario, moléculas implicadas en la presentación de antígenos a los linfocitos, moléculas de adhesión celular, ciertos receptores de citocinas y proteínas musculares intracelulares. Se suelen asociar a funciones del sistema inmunitario. Las proteínas de la sinapsis inmunológica suelen ser miembros del IgSF. Las IgSF también pueden clasificarse en "subfamilias" basadas en propiedades compartidas, como la función. Estas subfamilias suelen estar formadas por entre 4 y 30 miembros de IgSF.
[0286] Los términos "dominio IgSF" o "dominio de inmunoglobulina" o "dominio Ig" utilizados en el presente documento se refieren a un dominio estructural de las proteínas IgSF. Los dominios Ig deben su nombre a las moléculas de inmunoglobulina. Contienen entre 70 y 110 aminoácidos y se clasifican según su tamaño y función. Los dominios Ig poseen un pliegue Ig característico, que tiene una estructura tipo sándwich formada por dos láminas de cadenas beta antiparalelas. Las interacciones entre los aminoácidos hidrófobos de la cara interna del sándwich y los enlaces disulfuro altamente conservados que se forman entre los residuos de cisteína de las cadenas B y F estabilizan el pliegue de la Ig. Un extremo del dominio Ig tiene una sección denominada región determinante de la complementariedad que es importante para la especificidad de los anticuerpos para sus ligandos. Los dominios Ig like pueden clasificarse (en clases) como: IgV, IgC1, IgC2 o IgI. La mayoría de los dominios Ig son variables (IgV) o constantes (IgC). Los dominios IgV con 9 cadenas beta suelen ser más largos que los dominios IgC con 7 cadenas beta. Los dominios Ig de algunos miembros del IgSF se parecen a los dominios IgV en la secuencia de aminoácidos, aunque son similares en tamaño a los dominios IgC. Éstos se denominan dominios IgC2, mientras que los dominios IgC estándar se denominan dominios IgC1. Las cadenas del receptor de células T (TCR) contienen dos dominios Ig en la porción extracelular: un dominio IgV en el extremo N-terminal y un dominio IgC1 adyacente a la membrana celular. ICOSL contiene dos dominios Ig: IgV e IgC.
[0288] [0149]El término "especie de IgSF", tal como se utiliza en el presente documento, significa un conjunto de proteínas miembros de IgSF con una secuencia de aminoácidos primaria idéntica o sustancialmente idéntica. Cada miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas de mamíferos (IgSF) define una identidad única de todas las especies de IgSF que pertenecen a ese miembro de la IgSF. Así pues, cada miembro de la familia IgSF es único con respecto a otros miembros de la familia IgSF y, en consecuencia, cada especie de un miembro concreto de la familia IgSF es única con respecto a la especie de otro miembro de la familia IgSF. No obstante, pueden producirse variaciones entre moléculas de la misma especie de IgSF debido a diferencias en las modificaciones postraduccionales, como la glicosilación, la fosforilación, la ubiquitinación, la nitrosilación, la metilación, la acetilación y la lipidación. Además, las pequeñas diferencias de secuencia dentro de una misma especie de IgSF debidas a polimorfismos genéticos constituyen otra forma de variación dentro de una misma especie de IgSF, al igual que las formas truncadas de tipo silvestre de especies de IgSF debidas, por ejemplo, a la escisión proteolítica. Una "especie IgSF de superficie celular" es una especie IgSF expresada en la superficie de una célula, generalmente una célula de mamífero.
[0290] El término "actividad inmunológica", tal como se utiliza aquí en el contexto de linfocitos de mamíferos como las células T, se refiere a una o más actividades de supervivencia celular, proliferación celular, producción de citoquinas (por ejemplo, interferón-gamma) o citotoxicidad de células T. En algunos casos, una actividad inmunológica puede significar la expresión celular de citocinas, como quimiocinas o interleucinas. Los ensayos para determinar la potenciación o supresión de la actividad inmunológica incluyen los ensayos MLR (reacción linfocitaria mixta) que miden los niveles de citoquinas interferón-gamma en los sobrenadantes de cultivo (Wang et al., Cancer Immunol Res.2014 Sep: 2(9):846-56), ensayo de estimulación de células T SEB (enterotoxina estafilocócica B) (Wang et al., Cancer Immunol Res.2014 Sep: 2(9):846-56), y ensayos de estimulación de células T anti-CD3 (Li y Kurlander, J Transl Med.2010: 8: 104). Dado que la activación de las células T está asociada a la secreción de la citocina IFN-gamma, la detección de los niveles de IFN-gamma en los sobrenadantes de cultivo de estos ensayos in vitro de células T humanas puede analizarse utilizando kits ELISA comerciales (Wu et al, Immunol Lett 2008 Apr 15; 117(1): 57-62). La inducción de una respuesta inmunitaria se traduce en un aumento de la actividad inmunológica en relación con los linfocitos quiescentes. Una proteína inmunomoduladora, tal como un polipéptido ICOSL variante que contiene un dominio IgSF modificado por afinidad, tal como se proporciona en el presente documento puede, en algunas realizaciones, aumentar o, en realizaciones alternativas, disminuir la expresión de IFN-gamma (interferón-gamma) en un ensayo de células T primarias en relación con un miembro de IgSF de tipo silvestre o un control de dominio IgSF. Los expertos reconocerán que el formato del ensayo de células T primarias utilizado para determinar un aumento de la expresión de IFN-gamma diferirá del empleado para ensayar una disminución de la expresión de IFN-gamma. Al ensayar la capacidad de una proteína inmunomoduladora o dominio IgSF modificado por afinidad de la invención para disminuir la expresión de IFN-gamma en un ensayo de células T primarias, puede usarse un ensayo de reacción linfocitaria mixta (MLR) como se describe en el Ejemplo 6. Convenientemente, puede emplearse una forma soluble de un dominio IgSF modificado por afinidad de la invención para determinar su capacidad de antagonizar y, por tanto, disminuir la expresión de IFN-gamma en una MLR como se describe igualmente en el Ejemplo 6. Alternativamente, al ensayar la capacidad de una proteína inmunomoduladora o dominio IgSF modificado por afinidad de la invención para aumentar la expresión de IFN-gamma en un ensayo de células T primarias, puede utilizarse un ensayo de co-inmovilización. En un ensayo de co-inmovilización, se utiliza una señal de receptor de células T, proporcionada en algunas realizaciones por un anticuerpo anti-CD3, junto con un dominio IgSF de afinidad modificada co-inmovilizado, como la variante ICOSL, para determinar la capacidad de aumentar la expresión de IFN-gamma en relación con un control de dominio IgSF de tipo silvestre. Los métodos para evaluar la actividad inmunológica de las células modificadas genéticamente, incluida la actividad de una variante de la proteína inmunomoduladora transmembrana ICOSL, son conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, la capacidad de expandir las células T tras la estimulación con antígenos, mantener la expansión de las células T en ausencia de reestimulación y las actividades anticancerígenas en modelos animales apropiados. Los ensayos también incluyen ensayos para evaluar la citotoxicidad, incluido un ensayo estándar de liberación de<51>Cr (véase, por ejemplo, Milone et al., (2009) Molecular Therapy 17: 1453-1464) o ensayos de citotoxicidad basados en flujo, o un ensayo de citotoxicidad basado en impedancia (Peper et al. (2014) Journal of Immunological Methods, 405:192-198).
[0292] Un "polipéptido inmunomodulador" o "proteína inmunomoduladora" es un polipéptido o molécula proteica que modula la actividad inmunológica. Por "modulación" o "modular" una respuesta inmunitaria se entiende aumentar o disminuir la actividad inmunológica. Una proteína inmunomoduladora puede ser una cadena polipeptídica única o un multímero (dímeros o multímeros de orden superior) de al menos dos cadenas polipeptídicas unidas covalentemente entre sí mediante, por ejemplo, enlaces disulfuro entre cadenas. Así pues, los polipéptidos monoméricos, diméricos y multiméricos de orden superior entran en el ámbito del término definido. Los polipéptidos multiméricos pueden ser homomultiméricos (de cadenas polipeptídicas idénticas) o heteromultiméricos (de cadenas polipeptídicas no idénticas). Una proteína inmunomoduladora de la invención comprende una variante ICOSL.
[0294] El término "aumento", tal como se utiliza aquí, significa aumentar en una cantidad estadísticamente significativa. Un aumento puede ser de al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100% o mayor que un valor de control distinto de cero.
[0296] Una "isoforma" de ICOSL (ligando costimulador inducible; CD275) es uno de una pluralidad de polipéptidos ICOSL de origen natural que difieren en la secuencia de aminoácidos. Las isoformas pueden ser el producto de variantes de empalme de un transcrito de RNA expresado por un único gen, o el producto de la expresión de genes muy similares pero diferentes que dan lugar a una proteína funcionalmente similar, como puede ocurrir por duplicación génica. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "isoforma" de ICOSL también se refiere al producto de diferentes alelos de un gen ICOSL (por ejemplo, ICOSLG).
[0298] El término "linfocito", tal como se utiliza aquí, significa cualquiera de los tres subtipos de glóbulos blancos del sistema inmunitario de los mamíferos. Incluyen las células asesinas naturales (células NK) (que funcionan en la inmunidad innata citotóxica mediada por células), las células T (para la inmunidad adaptativa citotóxica mediada por células) y las células B (para la inmunidad adaptativa humoral, impulsada por anticuerpos). Las células T incluyen: Células T auxiliares, células T citotóxicas, células T asesinas naturales, células T de memoria, células T reguladoras o células T gamma delta. Las células linfoides innatas (CLI) también se incluyen en la definición de linfocito.
[0299] Los términos "mamífero" o "paciente" incluyen específicamente la referencia a al menos uno de los siguientes: humano, chimpancé, mono rhesus, mono cynomolgus, perro, gato, ratón o rata.
[0301] El término "proteína de membrana", tal como se utiliza aquí, significa una proteína que, en condiciones fisiológicas, está unida directa o indirectamente a una bicapa lipídica. Una bicapa lipídica que forma una membrana puede ser una membrana biológica como una membrana celular eucariota (por ejemplo, de mamífero) o una membrana artificial (es decir, hecha por el hombre) como la que se encuentra en un liposoma. La unión de una proteína de membrana a la bicapa lipídica puede realizarse mediante una unión covalente o mediante interacciones no covalentes, como las interacciones hidrofóbicas o electrostáticas. Una proteína de membrana puede ser una proteína de membrana integral o una proteína de membrana periférica. Las proteínas de membrana que son proteínas periféricas de membrana están unidas de forma no covalente a la bicapa lipídica o unidas de forma no covalente a una proteína integral de membrana. Una proteína de membrana periférica forma una unión temporal a la bicapa lipídica de tal manera que, bajo el intervalo de condiciones que son fisiológicas en un mamífero, la proteína de membrana periférica puede asociarse y/o disociarse de la bicapa lipídica. A diferencia de las proteínas periféricas de membrana, las proteínas integrales de membrana forman una unión sustancialmente permanente a la bicapa lipídica de la membrana, de modo que en la gama de condiciones que son fisiológicas en un mamífero, las proteínas integrales de membrana no se disocian de su unión a la bicapa lipídica. Una proteína de membrana puede unirse a la membrana a través de una capa de la bicapa lipídica (monotópica) o a través de ambas capas de la membrana (politópica). Una proteína integral de membrana que sólo interactúa con una bicapa lipídica es una "proteína integral monotópica". Una proteína integral de membrana que interactúa con ambas bicapas lipídicas es una "proteína integral politópica" denominada alternativamente en el presente documento "proteína transmembrana".
[0303] Los términos "modular" o "modular" como se usan aquí en el contexto de una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta inmunitaria de mamíferos, se refieren a cualquier alteración, tal como un aumento o una disminución, de respuestas inmunitarias existentes o potenciales que se produce como resultado de la administración de un polipéptido inmunomodulador que comprende una variante ICOSL de la presente invención o como resultado de la administración de células modificadas genéticamente que expresan una proteína inmunomoduladora, tal como una proteína inmunomoduladora transmembrana ICOSL variante de la presente invención. Por lo tanto, se refiere a una alteración, como un aumento o una disminución, de una respuesta inmunitaria en comparación con la respuesta inmunitaria que se produce o está presente en ausencia de la administración de la proteína inmunomoduladora que comprende la variante ICOSL o las células que expresan dicho polipéptido inmunomodulador. Dicha modulación incluye cualquier inducción, activación, supresión o alteración en grado o extensión de la actividad inmunológica de una célula inmunitaria. Las células inmunitarias incluyen células B, células T, células NK (asesinas naturales), células NK T, células presentadoras de antígenos profesionales (APC) y células presentadoras de antígenos no profesionales, y células inflamatorias (neutrófilos, macrófagos, monocitos, eosinófilos y basófilos). La modulación incluye cualquier cambio impartido en una respuesta inmunitaria existente, una respuesta inmunitaria en desarrollo, una respuesta inmunitaria potencial o la capacidad de inducir, regular, influir o responder a una respuesta inmunitaria. La modulación incluye cualquier alteración en la expresión y/o función de genes, proteínas y/u otras moléculas en las células inmunitarias como parte de una respuesta inmunitaria. La modulación de una respuesta inmunitaria o la modulación de la actividad inmunológica incluye, por ejemplo, lo siguiente: eliminación, deleción o secuestro de células inmunitarias; inducción o generación de células inmunitarias que puedan modular la capacidad funcional de otras células, como linfocitos autorreactivos, células presentadoras de antígenos o células inflamatorias; inducción de un estado de falta de respuesta en las células inmunitarias (es decir, anergia); potenciación o supresión de la actividad o función de las células inmunitarias, incluyendo, pero sin limitarse a ello, la alteración del patrón de proteínas expresadas por estas células. Los ejemplos incluyen la alteración de la producción y/o secreción de ciertas clases de moléculas como citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, factores de transcripción, quinasas, moléculas coestimuladoras u otros receptores de la superficie celular o cualquier combinación de estos eventos moduladores. La modulación puede evaluarse, por ejemplo, mediante una alteración en la expresión de IFN-gamma (interferón gamma) en relación con el control ICOSL de tipo silvestre en un ensayo de células T primarias (véase, Zhao y Ji, Exp Cell Res.2016 Jan1; 340(1) 132-138). La modulación puede evaluarse, por ejemplo, mediante una alteración de una actividad inmunológica de las células modificadas genéticamente, como una alteración de la actividad citotóxica de las células modificadas genéticamente o una alteración de la secreción de citocinas de las células modificadas genéticamente en relación con las células modificadas genéticamente con una proteína transmembrana ICOSL de tipo silvestre.
[0305] [0158]El término "especie molecular", tal como se utiliza en el presente documento, significa un conjunto de proteínas con una secuencia primaria de aminoácidos idéntica o sustancialmente idéntica. Cada miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas de mamíferos (IgSF) define una colección de especies moleculares idénticas o sustancialmente idénticas. Así, por ejemplo, el ICOSL humano es un miembro del IgSF y cada molécula de ICOSL humano es una especie de molécula de ICOS. La variación entre moléculas de la misma especie molecular puede deberse a diferencias en la modificación postraduccional, como la glicosilación, la fosforilación, la ubiquitinación, la nitrosilación, la metilación, la acetilación y la lipidación. Además, las pequeñas diferencias de secuencia dentro de una misma especie molecular debidas a polimorfismos genéticos constituyen otra forma de variación dentro de una misma especie molecular, al igual que las formas truncadas de tipo silvestre de una misma especie molecular debidas, por ejemplo, a la escisión proteolítica. Una "especie molecular de superficie celular" es una especie molecular expresada en la superficie de una célula de mamífero. Dos o más especies diferentes de proteínas, cada una de las cuales está presente exclusivamente en una o exclusivamente en otra (pero no en ambas) de las dos células de mamífero que forman el SI, se dice que están en "cis" o "configuración cis" entre sí. Dos especies diferentes de proteínas, la primera de las cuales está presente exclusivamente en una de las dos células de mamífero que forman el SI y la segunda de las cuales está presente exclusivamente en la segunda de las dos células de mamífero que forman el SI, se dice que están en "configuración trans" o "trans". Dos especies diferentes de proteínas, cada una de las cuales está presente en las dos células de mamífero que forman el SI, se encuentran en configuraciones cis y trans en estas células.
[0307] El término "dominio de multimerización" se refiere a una secuencia de aminoácidos que promueve la interacción estable de una molécula polipeptídica con una o más moléculas polipeptídicas adicionales, cada una de las cuales contiene un dominio de multimerización complementario (por ejemplo, un primer dominio de multimerización y un segundo dominio de multimerización), que puede ser el mismo o un dominio de multimerización diferente. Las interacciones entre dominios de multimerización complementarios, por ejemplo, la interacción entre un primer dominio de multimerización y un segundo dominio de multimerización, forman una interacción proteína-proteína estable para producir un multímero de la molécula polipeptídica con la molécula polipeptídica adicional. En algunos casos, el dominio de multimerización es el mismo e interactúa consigo mismo para formar una interacción proteína-proteína estable entre dos cadenas polipeptídicas. Generalmente, un polipéptido se une directa o indirectamente al dominio de multimerización. Los dominios de multimerización ejemplares incluyen las secuencias de inmunoglobulina o porciones de las mismas, cremalleras de leucina, regiones hidrofóbicas, regiones hidrofílicas y dominios de interacción proteína-proteína compatibles. El dominio de multimerización, por ejemplo, puede ser una región o dominio constante de inmunoglobulina, como, por ejemplo, el dominio Fc o porciones del mismo de IgG, incluidos los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA, IgE, IgD e IgM y sus formas modificadas.
[0309] Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se utilizan indistintamente para referirse a un polímero de residuos de ácido nucleico (por ejemplo, desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos) en forma monocatenaria o bicatenaria. A menos que se limiten específicamente, los términos abarcan los ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales y que tienen propiedades de unión similares a él y se metabolizan de forma similar a los nucleótidos naturales. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácido nucleico también abarca implícitamente variantes conservadoramente modificadas de la misma (por ejemplo, sustituciones degeneradas de codones) y secuencias de nucleótidos complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada (una "secuencia de referencia"). Específicamente, las sustituciones degeneradas de codones pueden lograrse generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxiinosina. El término ácido nucleico o polinucleótido engloba el cDNA o el mRNA codificado por un gen.
[0311] El término "unión no competitiva", tal como se utiliza en el presente documento, significa la capacidad de una proteína para unirse específicamente de forma simultánea a al menos dos socios de unión afines. De este modo, la proteína es capaz de unirse al menos a dos socios de unión afines diferentes al mismo tiempo, aunque no es necesario que la interacción de unión tenga la misma duración, de modo que, en algunos casos, la proteína se une específicamente sólo a uno de los socios de unión afines. En algunas realizaciones, la unión se produce en condiciones de unión específicas. En algunas realizaciones, la unión simultánea es tal que la unión de un compañero de unión afín no inhibe sustancialmente la unión simultánea a un segundo compañero de unión afín. En algunas realizaciones, la unión no competitiva significa que la unión de un segundo socio de unión afín a su sitio de unión en la proteína no desplaza la unión de un primer socio de unión afín a su sitio de unión en la proteína. Los métodos para evaluar la unión no competitiva son bien conocidos en la técnica, como el método descrito en Perez de La Lastra et al., Immunology, 1999 Apr: 96(4): 663-670. En algunos casos, en las interacciones no competitivas, el primer socio de unión cognado se une específicamente a un sitio de interacción que no se solapa con el sitio de interacción del segundo socio de unión cognado, de manera que la unión del segundo socio de unión cognado no interfiere directamente con la unión del primer socio de unión cognado. Por lo tanto, cualquier efecto sobre la unión del socio de unión cognado por la unión del segundo socio de unión cognado se produce a través de un mecanismo distinto de la interferencia directa con la unión del primer socio de unión cognado. Por ejemplo, en el contexto de las interacciones enzima-sustrato, un inhibidor no competitivo se une a un sitio distinto del sitio activo de la enzima. La unión no competitiva engloba las interacciones de unión no competitivas en las que un segundo socio de unión cognado se une específicamente a un sitio de interacción que no se solapa con la unión del primer socio de unión cognado, pero se une al segundo sitio de interacción sólo cuando el primer sitio de interacción está ocupado por el primer socio de unión cognado.
[0313] El término "composición farmacéutica" se refiere a una composición adecuada para uso farmacéutico en un sujeto mamífero, a menudo un ser humano. Una composición farmacéutica comprende típicamente una cantidad eficaz de un agente activo (por ejemplo, un polipéptido inmunomodulador que comprende una variante de ICOSL o células modificadas genéticamente que expresan una variante de la proteína inmunomoduladora transmembrana ICOSL) y un portador, excipiente o diluyente. El portador, excipiente o diluyente es típicamente un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable, respectivamente.
[0315] [0163]Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a una cadena molecular de dos o más aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. Los términos no se refieren a una longitud específica del producto. Así pues, los "péptidos" y los "oligopéptidos" están incluidos en la definición de polipéptido. Los términos incluyen modificaciones postraduccionales del polipéptido, por ejemplo, glucosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Los términos también incluyen moléculas en las que se incluyen uno o más análogos de aminoácidos o aminoácidos no canónicos o no naturales que pueden sintetizarse o expresarse recombinantemente utilizando técnicas conocidas de modificación genética de proteínas. Además, las proteínas pueden derivatizarse.
[0317] El término "ensayo de células T primarias", tal como se utiliza aquí, se refiere a un ensayo in vitro para medir la expresión de interferón-gamma ("IFN-gamma"). En la técnica se conocen diversos ensayos de células T primarias, como el descrito en el Ejemplo 7. En una realización preferida, el ensayo utilizado es un ensayo de coimmobilización anti-CD3. En este ensayo, se estimulan células T primarias con anti-CD3 inmovilizado con o sin proteínas recombinantes adicionales. Los sobrenadantes de los cultivos se recogen en momentos determinados, normalmente entre 24 y 72 horas. En otra realización, el ensayo utilizado es el MLR. En este ensayo, las células T primarias se estimulan con APC alogénicas. Los sobrenadantes de los cultivos se recogen en momentos determinados, normalmente entre 24 y 72 horas. Los niveles de IFN-gamma humano se miden en los sobrenadantes de cultivo mediante técnicas ELISA estándar. Los proveedores ofrecen kits comerciales y el ensayo se realiza de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
[0319] El término "purificado" aplicado a los ácidos nucleicos, como los que codifican proteínas inmunomoduladoras de la invención, generalmente denota un ácido nucleico o polipéptido que está sustancialmente libre de otros componentes según se determina mediante técnicas analíticas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido purificado forma una banda discreta en un gel electroforético, eluido cromatográfico y/o un medio sometido a centrifugación en gradiente de densidad). Por ejemplo, un ácido nucleico o polipéptido que da lugar esencialmente a una banda en un gel electroforético se "purifica". Un ácido nucleico o proteína purificados de la invención tienen una pureza de al menos un 50%, normalmente de al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 99% o más (por ejemplo, porcentaje en peso o en base molar).
[0321] El término "recombinante" indica que el material (por ejemplo, un ácido nucleico o un polipéptido) ha sido alterado artificialmente (es decir, no naturalmente) por intervención humana. La alteración puede realizarse en el material dentro de su entorno o estado natural, o retirarse de él. Por ejemplo, un "ácido nucleico recombinante" es aquel que se fabrica recombinando ácidos nucleicos, por ejemplo, durante la clonación, la modificación por afinidad, la mezcla de DNA u otros procedimientos biológicos moleculares bien conocidos. Una "molécula de DNA recombinante" se compone de segmentos de DNA unidos mediante estas técnicas de biología molecular. El término "proteína recombinante" o "polipéptido recombinante", tal y como se utiliza aquí, se refiere a una molécula de proteína que se expresa utilizando una molécula de DNA recombinante. Una "célula huésped recombinante" es una célula que contiene y/o expresa un ácido nucleico recombinante o que se altera de otro modo mediante modificación genética, por ejemplo introduciendo en la célula una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína recombinante, como una proteína inmunomoduladora transmembrana proporcionada en el presente documento. Las señales de control transcripcional en eucariotas comprenden elementos "promotores" y "potenciadores". Los promotores y potenciadores consisten en series cortas de secuencias de DNA que interactúan específicamente con proteínas celulares implicadas en la transcripción. Se han aislado elementos promotores y potenciadores de diversas fuentes eucariotas, incluidos genes de levaduras, insectos y células de mamíferos y virus (también se encuentran elementos de control análogos, es decir, promotores, en procariotas). La selección de un promotor y un potenciador concretos depende del tipo de célula que se vaya a utilizar para expresar la proteína de interés. Los términos "en combinación operable", "en orden operable" y "enlazados operablemente", tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a la unión de secuencias de ácido nucleico de tal manera u orientación que se produce una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la transcripción de un gen determinado y/o la síntesis de una molécula de proteína deseada.
[0323] El término "vector de expresión recombinante", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de DNA que contiene una secuencia codificante deseada y las secuencias de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante enlazada operablemente en una célula huésped particular. Las secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión en procariotas incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de unión al ribosoma y posiblemente otras secuencias. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, potenciadores y señales de terminación y poliadenilación. Opcionalmente, el vector de expresión recombinante también puede codificar una secuencia peptídica señal secretora, unida operablemente a la secuencia codificadora de la proteína recombinante, como una proteína de fusión recombinante, de modo que la proteína de fusión expresada pueda ser secretada por la célula huésped recombinante, para facilitar el aislamiento de la proteína de fusión a partir de la célula, si se desea. El término incluye el vector como estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Entre los vectores se encuentran los vectores virales, como los vectores lentivirales.
[0325] El término "selectividad" se refiere a la preferencia de una proteína o polipéptido sujeto por la unión específica de un sustrato, como un compañero de unión relacionado, en comparación con la unión específica de otro sustrato, como un compañero de unión relacionado diferente de la proteína sujeto. La selectividad puede reflejarse como una relación entre la actividad de unión (por ejemplo, afinidad de unión) de una proteína y un primer sustrato, como un primer compañero de unión afín, (por ejemplo,<Kd1>) y la actividad de unión (por ejemplo, afinidad de unión) de la misma proteína con un segundo compañero de unión afín (por ejemplo, K<d2>).
[0327] [0169]El término "identidad de secuencia", tal como se utiliza aquí, se refiere a la identidad de secuencia entre genes o proteínas a nivel de nucleótidos o aminoácidos, respectivamente. "Identidad de secuencia" es una medida de identidad entre proteínas a nivel de aminoácidos y una medida de identidad entre ácidos nucleicos a nivel de nucleótidos. La identidad de secuencia de la proteína puede determinarse comparando la secuencia de aminoácidos en una posición dada en cada secuencia cuando las secuencias están alineadas. Del mismo modo, la identidad de la secuencia de ácido nucleico puede determinarse comparando la secuencia de nucleótidos en una posición dada en cada secuencia cuando las secuencias están alineadas. Los métodos para el alineamiento de secuencias para su comparación son bien conocidos en la técnica, tales métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. El algoritmo BLAST calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar el análisis BLAST está a disposición del público en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI).
[0329] El término "soluble", tal como se utiliza aquí en referencia a las proteínas, significa que la proteína no es una proteína de membrana. En general, una proteína soluble contiene sólo el dominio extracelular de un receptor miembro de la familia IgSF, o una porción del mismo que contiene un dominio o dominios IgSF o fragmentos de unión específica de los mismos, pero no contiene el dominio transmembrana y/o no es capaz de expresarse en la superficie de una célula. En algunos casos, la solubilidad de una proteína puede mejorarse mediante el enlace o la unión, directa o indirectamente a través de un enlazador, a un dominio Fc, que, en algunos casos, también puede mejorar la estabilidad y/o la semivida de la proteína. En algunos aspectos, una proteína soluble es una proteína de fusión Fc.
[0331] El término "especie", tal como se utiliza aquí con respecto a polipéptidos o ácidos nucleicos, significa un conjunto de moléculas con secuencias idénticas o sustancialmente idénticas. La variación entre polipéptidos de la misma especie puede deberse a diferencias en la modificación postraduccional, como la glicosilación, la fosforilación, la ubiquitinación, la nitrosilación, la metilación, la acetilación y la lipidación. Las secuencias ligeramente truncadas de polipéptidos que difieren (o codifican una diferencia) de la especie de longitud completa en el amino-terminal o carboxi-terminal en no más de 1, 2 o 3 residuos de aminoácidos se consideran de una sola especie. Estas microheterogeneidades son una característica común de las proteínas fabricadas.
[0333] El término "fragmento de unión específica", tal como se utiliza en el presente documento en referencia a un polipéptido ICOSL de mamífero de tipo silvestre de longitud completa o un dominio IgV o IgC del mismo, significa un polipéptido que tiene una subsecuencia de un dominio IgV y/o IgC y que se une específicamente in vitro y/o in vivo a un ICOS de mamífero y/o CD28 de mamífero tal como un ICOS o CD28 humano o murino. En algunas realizaciones, el fragmento de unión específico de ICOSL IgV o ICOSL IgC tiene al menos un 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la longitud de secuencia de la secuencia de tipo silvestre de longitud completa. El fragmento de unión específico puede alterarse en su secuencia para formar una variante ICOSL de la invención.
[0335] El término "se une específicamente", tal como se utiliza aquí, significa la capacidad de una proteína, en condiciones de unión específicas, de unirse a una proteína diana de tal manera que su afinidad o avidez es al menos 5 veces mayor, pero opcionalmente al menos 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250 o 500 veces mayor, o incluso al menos 1000 veces mayor que la afinidad o avidez media de la misma proteína a una colección de péptidos o polipéptidos aleatorios de tamaño estadístico suficiente. Una proteína de unión específica no tiene por qué unirse exclusivamente a una única molécula diana, sino que puede unirse específicamente a una molécula no diana debido a la similitud en la conformación estructural entre la diana y la no diana (por ejemplo, paralogos u ortólogos). Los expertos reconocerán que la unión específica a una molécula que tenga la misma función en una especie animal diferente (es decir, ortóloga) o a una molécula no diana que tenga un epítopo sustancialmente similar al de la molécula diana (por ejemplo, paralógica) es posible y no va en detrimento de la especificidad de la unión que se determina en relación con una colección estadísticamente válida de no dianas únicas (por ejemplo, polipéptidos aleatorios). Así, un polipéptido de la invención puede unirse específicamente a más de una especie distinta de molécula diana debido a la reactividad cruzada. Para determinar la unión específica entre dos proteínas pueden utilizarse inmunoensayos ELISA en fase sólida o mediciones Biacore. Generalmente, las interacciones entre dos proteínas de unión tienen constantes de disociación (K<d>) inferiores a 1x10<-5>M, y a menudo tan bajas como 1 x 10<-12>M. En ciertas realizaciones de la presente divulgación, las interacciones entre dos proteínas de unión tienen constantes de disociación de 1x10<-6>M, 1x10<-7>M, 1x10<-8>M, 1x10<-9>M, 1x10<-10>M o 1x10<-11>M.
[0337] Los términos "expresa en la superficie", "expresión en la superficie" o "expresado en la superficie" en referencia a una célula de mamífero que expresa un polipéptido significa que el polipéptido se expresa como una proteína de membrana. En algunas realizaciones, la proteína de membrana es una proteína transmembrana.
[0339] Como se usa aquí, "sintético", con referencia a, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico sintética o un gen sintético o un péptido sintético se refiere a una molécula de ácido nucleico o molécula polipeptídica que se produce por métodos recombinantes y/o por métodos de síntesis química.
[0341] [0176]El término "fracción diana", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una composición unida de forma covalente o no covalente a, o que encapsula físicamente, un polipéptido que comprende una variante ICOSL de la presente invención. En algunas realizaciones, la molécula diana tiene afinidad de unión específica por una molécula diana, como una molécula diana expresada en una célula. Normalmente, la molécula diana se localiza en un tejido o tipo celular específico. Las moléculas diana incluyen: los anticuerpos, el fragmento de unión al antígeno (Fab), el fragmento variable (Fv) que contiene V<H>y V<L>, el fragmento variable de cadena única (scFv) que contiene V<H>y V<L>unidos en una cadena, así como otros fragmentos de la región V del anticuerpo, como Fab', F(ab)<2>, F(ab')<2>, diacuerpo dsFv, nanocuerpos, receptores solubles, ligandos de receptores, receptores o ligandos madurados por afinidad, así como composiciones de moléculas pequeñas (<500 dalton) (por ejemplo, composiciones de receptores de unión específica). Las moléculas diana también pueden unirse de forma covalente o no covalente a la membrana lipídica de los liposomas que encapsulan un polipéptido de la presente invención.
[0343] El término "proteína transmembrana", tal como se utiliza en el presente documento, significa una proteína de membrana que abarca sustancial o completamente una bicapa lipídica, como las bicapas lipídicas que se encuentran en una membrana biológica, como una célula de mamífero, o en una construcción artificial, como un liposoma. La proteína transmembrana comprende un dominio transmembrana ("dominio transmembrana") por el que se integra en la bicapa lipídica y por el que la integración es termodinámicamente estable en condiciones fisiológicas. Los dominios transmembrana son generalmente predecibles a partir de su secuencia de aminoácidos mediante cualquier número de aplicaciones de software bioinformático disponibles en el mercado, basándose en su elevada hidrofobicidad en relación con las regiones de la proteína que interactúan con entornos acuosos (por ejemplo, citosol, fluido extracelular). Un dominio transmembrana suele ser una hélice alfa hidrófoba que atraviesa la membrana. Una proteína transmembrana puede atravesar las dos capas de la bicapa lipídica una o varias veces. Una proteína transmembrana incluye las proteínas inmunomoduladoras transmembrana aquí descritas. Además del dominio transmembrana, una proteína inmunomoduladora transmembrana de la invención comprende además un ectodominio y, en algunas realizaciones, un endodominio.
[0345] Los términos "tratar", "tratamiento" o "terapia" de una enfermedad o trastorno tal como se utilizan en el presente documento significan ralentizar, detener o invertir la progresión de la enfermedad o trastorno, tal como se evidencia por la disminución, el cese o la eliminación de los síntomas clínicos o de diagnóstico, mediante la administración de una composición terapéutica (por ejemplo, que contenga una proteína inmunomoduladora o células modificadas genéticamente) de la invención, ya sea sola o en combinación con otro compuesto tal como se describe en el presente documento. "Tratar", "tratamiento" o "terapia" también significa una disminución de la gravedad de los síntomas en una enfermedad o trastorno agudo o crónico o una disminución de la tasa de recaída como, por ejemplo, en el caso de un curso de enfermedad autoinmune remitente o recidivante o una disminución de la inflamación en el caso de un aspecto inflamatorio de una enfermedad autoinmune. Tal como se utilizan aquí en el contexto del cáncer, los términos "tratamiento" o, "inhibir", "inhibir" o "inhibición" del cáncer se refieren al menos a uno de: una disminución estadísticamente significativa de la tasa de crecimiento tumoral, un cese del crecimiento tumoral o una reducción del tamaño, la masa, la actividad metabólica o el volumen del tumor, medidos según criterios estándar como, entre otros, los Criterios de Evaluación de la Respuesta para Tumores Sólidos (RECIST), o un aumento estadísticamente significativo de la supervivencia libre de progresión (PFS) o la supervivencia global (OS). "Prevenir", "profilaxis" o "prevención" de una enfermedad o trastorno como se utiliza en el contexto de esta invención se refiere a la administración de un polipéptido inmunomodulador o células modificadas genéticamente de la invención, ya sea solo o en combinación con otro compuesto, para prevenir la aparición o inicio de una enfermedad o trastorno o algunos o todos los síntomas de una enfermedad o trastorno o para disminuir la probabilidad de la aparición de una enfermedad o trastorno.
[0347] El término "antígeno específico tumoral" o "TSA", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una contraestructura que está presente principalmente en las células tumorales de un sujeto mamífero, pero que generalmente no se encuentra en las células normales del sujeto mamífero. Un antígeno específico tumoral no tiene por qué ser exclusivo de las células tumorales, pero el porcentaje de células de un mamífero concreto que tienen el antígeno específico tumoral es lo suficientemente alto o los niveles del antígeno específico tumoral en la superficie del tumor son lo suficientemente altos como para que pueda ser objeto de terapias antitumorales, como los polipéptidos inmunomoduladores de la invención, y proporcionar prevención o tratamiento del mamífero frente a los efectos del tumor. En algunas realizaciones, en una muestra estadística aleatoria de células de un mamífero con un tumor, al menos el 50% de las células que muestran un TSA son cancerosas. En otras realizaciones, al menos el 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de las células que muestran un TSA son cancerosas.
[0349] [0180]El término "variante" (también "modificado" o mutante") utilizado en referencia a un ICOSL variante significa un ICOSL, como un ICOSL de mamífero (por ejemplo, humano o murino) creado por intervención humana. La variante ICOSL es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos alterada, en relación con un ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. La variante ICOSL es un polipéptido que difiere de un ICOSL de referencia, como una secuencia de isoforma ICOSL de tipo silvestre, por una o más modificaciones, como una o más sustituciones de aminoácidos, deleciones, adiciones o combinaciones de las mismas. A efectos del presente documento, la variante ICOSL contiene al menos un dominio de afinidad modificada, en el que una o más de las diferencias de aminoácidos se producen en un dominio IgSF (por ejemplo, dominio IgV). Una variante ICOSL puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más diferencias de aminoácidos, como sustituciones de aminoácidos. Una variante del polipéptido ICOSL generalmente presenta al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con una referencia correspondiente (por ejemplo, ICOSL no modificado) o de tipo silvestre, como la secuencia de SEQ ID N.º:5, una secuencia madura de la misma o una parte de la misma que contenga el dominio extracelular o un dominio IgSF del mismo. En algunas realizaciones, un polipéptido ICOSL variante exhibe al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con un ICOSL de referencia correspondiente (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre, como un ICOSL de referencia establecido en SEQ ID N.º:32 o SEQ ID N.º: 196 o 545. Tanto los aminoácidos no naturales como los naturales están incluidos en el ámbito de las sustituciones o adiciones permitidas. Una variante ICOSL no se limita a ningún método particular de fabricación e incluye, por ejemplo, síntesis química de novo, técnicas de DNA recombinante de novo o combinaciones de las mismas. Una variante ICOSL de la invención se une específicamente a CD28, ICOS, y/o CTLA-4 de una especie de mamífero. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos alterada resulta en una afinidad o avidez de unión alterada (es decir, aumentada o disminuida) a ICOS y/o CD28 en comparación con la proteína ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificada) o de tipo silvestre. El aumento o disminución de la afinidad o avidez de unión puede determinarse mediante ensayos de unión bien conocidos, como la citometría de flujo. Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5: 443-453 (2005). Véase también, Linsley et al., Immunity, Vol. 1(9): 793-801 (1994). Un aumento de la afinidad o avidez de unión de la variante ICOSL a ICOS y/o CD28 es un valor al menos un 5% mayor que el de la referencia (por ejemplo, no modificada) o ICOSL de tipo silvestre y, en algunas realizaciones, al menos un 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100% mayor que el valor de control de la referencia (por ejemplo, no modificada) o ICOSL de tipo silvestre. Una disminución de la afinidad o avidez de unión de ICOSL a ICOS y/o CD28 es a un valor no superior al 95% de los valores de control de tipo silvestre, y en algunas realizaciones no superior al 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, o ninguna afinidad o avidez de unión detectable de los valores de control de tipo silvestre de ICOS y/o CD28. Una variante ICOSL está alterada en la secuencia primaria de aminoácidos por sustitución, adición o eliminación de residuos de aminoácidos. El término "variante" en el contexto de la variante ICOSL no debe interpretarse como la imposición de ninguna condición para cualquier composición de partida particular o método por el que se crea la variante ICOSL. Una variante de ICOSL puede, por ejemplo, generarse a partir de un ICOSL de referencia o información de secuencia de ICOSL de mamífero de tipo silvestre, luego modelarse in silico para la unión a ICOS y/o CD28, y finalmente sintetizarse recombinante o químicamente para producir una variante de ICOSL de la presente invención. En un ejemplo alternativo, puede crearse una variante de ICOSL mediante mutagénesis dirigida a un sitio de un ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. Por lo tanto, la variante ICOSL denota una composición y no necesariamente un producto producido por un proceso determinado. Pueden emplearse diversas técnicas, incluidos métodos recombinantes, síntesis química o combinaciones de los mismos.
[0351] El término "de tipo silvestre" o "natural" o "nativo", tal como se utiliza en el presente documento, en relación con materiales biológicos como moléculas de ácido nucleico, proteínas (por ejemplo, ICOSL), miembros de IgSF, células huésped y similares, se refiere a aquellos que se encuentran en la naturaleza y no han sido modificados por la intervención humana.
[0353] II. VARIANTES DE LOS POLIPÉPTIDOS ICOSL
[0355] Aquí se proporcionan polipéptidos ICOSL variantes que muestran una actividad de unión o afinidad alterada (aumentada o disminuida) por uno o más de un socio de unión cognado ICOSL. En algunas realizaciones, el compañero de unión cognado de ICOSL es uno o más de CD28, ICOS, o CTLA-4. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante contiene una o más modificaciones de aminoácidos, tales como una o más sustituciones (alternativamente, "mutaciones" o "sustituciones"), deleciones o adiciones, en un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) (IgD) en relación con un polipéptido ICOSL de tipo silvestre o no modificado o una porción de un ICOSL de tipo silvestre o no modificado que contiene un dominio de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) o un fragmento de unión específico del mismo. Así, un polipéptido ICOSL variante proporcionado es o comprende una IgD variante (en lo sucesivo denominada "vIgD") en la que la una o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) se encuentra en una IgD.
[0357] En algunas realizaciones, la IgD comprende un dominio IgV o un dominio IgC (por ejemplo, IgC2) o un fragmento de unión específico del dominio IgV o del dominio IgC (por ejemplo, IgC2), o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la IgD puede ser una IgV solamente, la combinación de la IgV y la IgC, incluido todo el dominio extracelular (ECD), o cualquier combinación de dominios Ig de ICOSL. La Tabla 2 proporciona residuos ejemplares que corresponden a regiones IgV o IgC de ICOSL. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante contiene un dominio IgV o un dominio IgC o fragmentos de unión específicos de los mismos en los que la al menos una de las modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) se encuentra en el dominio IgV o en el dominio IgC o en un fragmento de unión específico de los mismos. En algunas realizaciones, en virtud de la actividad de unión o afinidad alterada, el dominio IgV o el dominio IgC es un dominio IgSF modificado por afinidad.
[0359] En algunas realizaciones, la variante está modificada en uno más dominios IgSF en relación con la secuencia de una secuencia ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificada). En algunas realizaciones, la secuencia ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificada) es una ICOSL de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre tiene la secuencia de un ICOSL nativo o un ortólogo del mismo. En algunas realizaciones, el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre es o comprende el dominio extracelular (ECD) del ICOSL o una porción del mismo que contiene uno o más dominios IgSF (véase la Tabla 2). En algunas realizaciones, el dominio extracelular de un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre comprende un dominio IgV y un dominio o dominios IgC. Sin embargo, no es necesario que el polipéptido ICOSL variante comprenda tanto el dominio IgV como el dominio o dominios IgC. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL comprende o consiste esencialmente en el dominio IgV o en un fragmento de unión específico del mismo. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL comprende o consiste esencialmente en el dominio IgC o fragmentos de unión específicos del mismo. En algunas realizaciones, la variante ICOSL es soluble y carece de dominio transmembrana. En algunas realizaciones, la variante ICOSL comprende además un dominio transmembrana y, en algunos casos, también un dominio citoplasmático.
[0361] [0185]En algunas realizaciones, la secuencia ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificada) o de tipo silvestre es una secuencia ICOSL de mamífero. En algunas realizaciones, la secuencia ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificada) o de tipo silvestre puede ser una ICOSL de mamífero que incluye, pero no se limita a, humano, ratón, mono cynomolgus o rata. En algunas realizaciones, la secuencia ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificada) o de tipo silvestre es humana.
[0363] En algunas realizaciones, la secuencia ICOSL de referencia (por ejemplo, (i) la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º:5 o una forma madura de la misma que carece de la secuencia señal, (ii) una secuencia de aminoácidos que presenta al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con SEQ ID N.º:5 o la forma madura de la misma, o (iii) es una porción de (i) o (ii) que contiene un dominio IgV o un dominio IgC o fragmentos de unión específicos de los mismos.
[0365] En algunas realizaciones, la secuencia ICOSL de referencia es o comprende un dominio extracelular del ICOSL o una porción del mismo. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL de referencia o de tipo silvestre comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º:32, o un ortólogo de la misma.
[0368]
[0371] En algunos casos, el polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre puede comprender (i) la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º:32, (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 32, o (iii) es un fragmento de unión específica de la secuencia de (i) o (ii) que comprende un dominio IgV o un dominio IgC.
[0373] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL de referencia comprende un dominio extracelular truncado que comprende un truncamiento C-terminal con referencia a la secuencia del dominio extracelular ICOSL de referencia establecida en SEQ ID N.º:32. En algunas realizaciones, el truncamiento C-terminal es de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 125 residuos de aminoácidos. En algunas realizaciones, el truncamiento C-terminal es de al menos 1, al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35 residuos de aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL que comprende un truncamiento C-terminal no contiene, más allá del C-terminal del punto de truncamiento, residuos de aminoácidos contiguos de un ICOSL de tipo silvestre. Por lo tanto, entre las secuencias de referencia ICOSL proporcionadas se encuentran aquellas que son más cortas que el dominio extracelular completo de un ICOSL de tipo silvestre, por ejemplo, el establecido en SEQ ID N.º: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL que comprende un truncamiento C-terminal no contiene o no está fusionado a residuos aminoácidos de un dominio ICOSL más allá del dominio extracelular.
[0375] En algunas realizaciones, el polipéptido de referencia ICOSL está alterado, tal como mutado o suprimido, en uno o más sitios de escisión de proteasas. Como se ha descubierto en el presente documento, el polipéptido ICOSL de tipo silvestre contiene un sitio de escisión de proteasa que, en algunos casos, da lugar a la escisión de la proteína tras la expresión en células, por ejemplo, células de ovario de hámster chino, dando lugar así a un producto heterogéneo de múltiples especies, incluidas especies de diferentes longitudes o tamaños. Por ejemplo, la escisión del polipéptido ICOSL puede producirse en el sitio de escisión de la proteasa LQQN/LT entre los residuos 207 y 208 de SEQ ID N.º: 32 ("/" indica el sitio potencial de escisión). En algunas realizaciones, el polipéptido de referencia ICOSL está alterado en o carece de un sitio de escisión de proteasa establecido como aminoácidos 204-209 de SEQ ID N.º:32. En algunas realizaciones, un polipéptido ICOSL truncado es más resistente a la escisión por proteasas en comparación con un polipéptido ICOSL de tipo silvestre o no truncado. En las SEQ ID N.º se proporcionan truncamientos ECD ejemplares del polipéptido ICOSL truncado que carecen de todo o parte del sitio de escisión de la proteasa LQQN/LT (designados Truncamientos #2, #3, #4, #5, #6, #7 u #8): 600-606.
[0377] Truncamiento N.º 2:
[0380]
[0383] Truncamiento N.º 3:
[0384]
[0386] Truncamiento N.º 4:
[0389]
[0391] Truncamiento N.º 5:
[0394]
[0396] Truncamiento N.º 6:
[0399]
[0401] Truncamiento N.º 7:
[0404]
[0406] Truncamiento N.º 8:
[0409]
[0411] [0191]En algunas realizaciones, el polipéptido de referencia ICOSL se altera en uno o más aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 204-209 con referencia a SEQ ID N.º:32. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, sustitución en un ICOSL de referencia o fragmento de unión específico del mismo correspondiente a la(s) posición(es) 207 y/o 208 con referencia a la numeración de SEQ ID N.º:32. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, sustitución, seleccionadas entre N207A, N207G, L208G, o una modificación conservadora de aminoácidos, por ejemplo, sustitución de los mismos. En algunas realizaciones, la modificación de uno o más aminoácidos, por ejemplo, la sustitución es N207A/L208G o N207G/L208G. En algunas realizaciones, los DCE de referencia de longitud completa o los DCE de referencia truncados del polipéptido ICOSL variante se modifican para contener una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones, seleccionadas entre N207A, N207G, L208G, o una modificación conservadora de aminoácidos. En las SEQ ID N.º se exponen ECD de referencia ejemplares de longitud completa o truncada con una o más modificaciones: 607-628. Las secuencias de referencia ejemplares que contienen mutaciones en el sitio de corte N207 y/o L208 con referencia a las posiciones se establecen en SEQ ID N.º: 32 se exponen en SEQ ID N.º: 624-628. En algunos casos, las modificaciones proporcionadas pueden reducir la escisión por proteasas del polipéptido ICOSL, como la escisión que puede producirse en el sitio de escisión por proteasas LQQN/LT.
[0413] En algunas realizaciones, pueden emplearse combinaciones de las estrategias de truncamiento y modificación anteriores en una secuencia ECD ICOSL de referencia. En algunas realizaciones, las modificaciones, por ejemplo, sustituciones, se realizan en un polipéptido ICOSL de referencia truncado, como la secuencia ICOSL de referencia ejemplar establecida en SEQ ID N.º: 600-606. Las secuencias variantes ejemplares del polipéptido ICOSL con modificaciones en el (los) sitio(s) potencial(es) de escisión de la proteasa N207 y/o L208 se exponen en las SEQ ID N.º: 607-628. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL presenta una disminución de la escisión de la proteasa en comparación con el polipéptido ICOSL de tipo silvestre, como el que contiene la secuencia ECD establecida en SEQ ID N.º:32.
[0415] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre comprende un dominio IgV o un dominio IgC, o un fragmento de unión específico de los mismos. En algunas realizaciones, un polipéptido de referencia ICOSL que contiene un dominio IgV comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 196 (correspondientes a los residuos de aminoácidos 19-129 de SEQ ID N.º:5), o un ortólogo del mismo.
[0418]
[0421] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL de referencia que contiene el dominio IgV contiene al menos los aminoácidos 1-112, 1-113, 1-114, 1-115, 1-116, 1-117, 1-118, 1-119, 1-120, 1-121, 1-122, con referencia a la numeración establecida en SEQ ID N.º:32. El polipéptido ICOSL de referencia que contiene el dominio IgV contiene al menos los aminoácidos 1-112, 1-113, 1-114, 1-115, 1-116, 1-117, 1-118, 1-119, 1-120, 1-121, 1-122. En algunas realizaciones, un polipéptido de referencia ICOSL que contiene un dominio IgV comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 545 (correspondientes a los residuos de aminoácidos 19-140 de SEQ ID N.º:5), o un ortólogo del mismo. En algunas realizaciones, el dominio IgV es el único dominio IgSF del polipéptido de referencia ICOSL.
[0424]
[0427] En algunas realizaciones, el dominio IgV del polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre puede contener (i) la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 196 o 545, (ii) una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 196 ó 545, o (iii) un fragmento de unión específico de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 196 o 545 o un fragmento de unión específico de una secuencia de (i) o (ii). En algunas realizaciones, el dominio IgV de referencia (por ejemplo, no modificado) es capaz de unir una o más proteínas de unión afines de ICOSL, tales como una o más de CD28, ICOS o CTLA-4. El dominio IgV de referencia (por ejemplo, no modificado) es capaz de unir una o más proteínas de unión afines de ICOSL, tales como una o más de CD28, ICOS o CTLA-4.
[0429] En algunas realizaciones, el dominio IgC del polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre comprende la secuencia de aminoácidos establecida como residuos 141-227 de SEQ ID N.º: 5, o un ortólogo del mismo. Por ejemplo, el dominio IgC del polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre puede contener (i) la secuencia de aminoácidos establecida en los residuos 141-227 de SEQ ID N.º: 5, (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con los residuos 141-227 de SEQ ID N.º: 5, o (iii) (i) o (ii). En algunas realizaciones, el dominio IgV de referencia es capaz de unir una o más proteínas de unión afines ICOSL.
[0431] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre contiene un fragmento de unión específico de ICOSL, tal como un fragmento de unión específico del dominio IgV o del dominio IgC. En algunas realizaciones, el fragmento de unión específico puede unirse a CD28, ICOS y/o CTLA-4. El fragmento de unión específico puede tener una longitud de aminoácidos de al menos 50 aminoácidos, como al menos 60, 70, 80, 90, 100 o 110 aminoácidos. En algunas realizaciones, el fragmento de unión específico del dominio IgV contiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de la longitud del dominio IgV establecido como aminoácidos 19-129 de SEQ ID N.º: 5. En algunas realizaciones, el fragmento de unión específico del dominio IgC comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de la longitud del dominio IgC establecido como aminoácidos 141-227 de SEQ ID N.º: 5.
[0433] [0198]En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende el dominio ECD, un dominio ECD truncado, o una porción del mismo que comprende uno o más dominios IgSF modificados por afinidad. En algunas realizaciones, los polipéptidos ICOSL variantes pueden comprender un dominio IgV o un dominio IgC, en los que uno o más de los dominios IgSF (IgV o IgC) o un fragmento de unión específico del dominio IgV o un fragmento de unión específico del dominio IgC contiene la una o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones). En algunas realizaciones, los polipéptidos ICOSL variantes pueden comprender un dominio IgV y un dominio IgC, o un fragmento de unión específico del dominio IgV y un fragmento de unión específico del dominio IgC. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende un dominio IgV de longitud completa. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende un dominio IgC de longitud completa. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL comprende un fragmento de unión específico del dominio IgV. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL comprende un fragmento de unión específico del dominio IgC. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende un dominio IgV de longitud completa y un dominio IgC de longitud completa. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL comprende un dominio IgV de longitud completa y un fragmento de unión específica de un dominio IgC. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende un fragmento de unión específico de un dominio IgV y un dominio IgC de longitud completa. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende un fragmento de unión específico de un dominio IgV y un fragmento de unión específico de un dominio IgC.
[0435] En cualquiera de dichas realizaciones, la modificación de uno o más aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) de la variante de polipéptidos ICOSL puede localizarse en uno o más de los dominios de polipéptidos ICOSL. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una o más sustituciones de aminoácidos se localizan en el dominio extracelular (ECD) de la variante del polipéptido ICOSL, tal como se establece en SEQ ID N.º: 32. En algunas realizaciones, una o más sustituciones de aminoácidos se localizan en el dominio IgV o fragmento de unión específico del dominio IgV. En algunas realizaciones, una o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) se localizan en el dominio IgC o fragmento de unión específico del dominio IgC.
[0437] En general, cada uno de los diversos atributos de los polipéptidos se divulgan por separado a continuación (por ejemplo, polipéptidos solubles, secretables y unidos a membrana, afinidad de ICOSL por CD28, ICOS y CTLA-4, número de variaciones por cadena polipeptídica, número de cadenas polipeptídicas enlazadas, número y naturaleza de las alteraciones aminoacídicas por variante de ICOSL, etc.). Sin embargo, como quedará claro para el artesano experto, cualquier polipéptido particular puede comprender una combinación de estos atributos independientes. Se entiende que la referencia a aminoácidos, incluida una secuencia específica establecida como SEQ ID N.º utilizada para describir la organización de dominio de un dominio IgSF, tiene fines ilustrativos y no pretende limitar el alcance de las realizaciones proporcionadas. Se entiende que los polipéptidos y la descripción de sus dominios se derivan teóricamente a partir de análisis de homología y alineamientos con moléculas similares. Así pues, el locus exacto puede variar y no es necesariamente el mismo para cada proteína. Por lo tanto, el dominio IgSF específico, como el dominio IgV específico o el dominio IgC, puede ser varios aminoácidos (como uno, dos, tres o cuatro) más largo o más corto.
[0439] Además, varias realizaciones de la invención como se discute a continuación se proporcionan con frecuencia dentro del significado de un término definido como se divulgó anteriormente.
[0441] A. Modificaciones Ejemplares
[0443] Se proporcionan en el presente documento polipéptidos ICOSL variantes que contienen al menos un dominio IgSF modificado por afinidad (por ejemplo, IgV o IgC) o un fragmento de unión específico del mismo en un dominio IgSF contenido en un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre, de tal manera que el polipéptido ICOSL variante presenta una actividad de unión o afinidad alterada (aumentada o disminuida) para uno o más ligandos ICOS, CD28 o CTLA-4 en comparación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, un polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión para CD28, ICOS, y/o CTLA-4 que difiere de la de una secuencia de control de polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificada) o de tipo silvestre, según se determine mediante, por ejemplo, inmunoensayos ELISA en fase sólida, citometría de flujo o ensayos Biacore. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una mayor afinidad de unión para CD28, ICOS, y/o CTLA-4. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión disminuida para CD28, ICOS, y/o CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (no modificado) o de tipo silvestre. El CD28, el ICOS y/o el CTLA-4 pueden ser una proteína de mamífero, como una proteína humana o una proteína murina.
[0445] Las afinidades de unión para cada uno de los socios de unión afines son independientes; es decir, en algunas realizaciones, un polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión aumentada para uno, dos o tres de CD28, ICOS, y/o CTLA-4, y una afinidad de unión disminuida para uno, dos o tres de CD28, ICOS, y CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre.
[0447] [0204]En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión aumentada para CD28, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una mayor afinidad de unión para ICOS, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una mayor afinidad de unión para CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión disminuida para CD28, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión disminuida por ICOS, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión disminuida para CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre.
[0449] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una mayor afinidad de unión para CD28 e ICOS, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión aumentada por CD28 y una afinidad de unión disminuida por ICOS, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión disminuida para CD28 e ICOS, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión disminuida por CD28 y una afinidad de unión aumentada por ICOS, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre.
[0451] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una mayor afinidad de unión para CD28 y CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión aumentada por CD28 y una afinidad de unión disminuida por CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión disminuida para CD28 y CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión disminuida por CD28 y una afinidad de unión aumentada por CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre.
[0453] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión aumentada para ICOS y CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOS de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión aumentada por ICOS y una afinidad de unión disminuida por CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión disminuida para ICOS y CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión disminuida por ICOS y una afinidad de unión aumentada por CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre.
[0455] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una mayor afinidad de unión para CD28, ICOS y CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una mayor afinidad de unión por CD28 e ICOS, y una menor afinidad de unión por CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión aumentada para CD28 y CTLA-4, y una afinidad de unión disminuida para ICOS, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión disminuida por CD28 e ICOS, y una afinidad de unión aumentada por CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión disminuida por CD28 y una afinidad de unión aumentada por ICOS y CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión aumentada por CD28, y una afinidad de unión disminuida por ICOS y CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión disminuida para CD28, CTLA-4 e ICOS, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una afinidad de unión disminuida por CD28, y una afinidad de unión aumentada por ICOS y CTLA-4, en relación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre.
[0457] En algunas realizaciones, un polipéptido ICOSL variante con afinidad de unión aumentada o mayor a CD28, ICOS, y/o CTLA-4 tendrá un aumento en la afinidad de unión relativa a la referencia (por ejemplo, no modificada) o control de polipéptido ICOSL de tipo silvestre de al menos aproximadamente 5%, tal como al menos aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 35%, o 50% para el CD28, ICOS, y/o CTLA-4. El polipéptido ICOSL variante tendrá un aumento en la afinidad de unión relativa a la referencia (por ejemplo, no modificada) o control de polipéptido ICOSL de al menos aproximadamente 5%, tal como al menos aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 35%, o 50% para el CD28, ICOS, y/o CTLA-4. En algunas realizaciones, el aumento de la afinidad de unión en relación con el polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre es superior a 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces o 50 veces. En tales ejemplos, el polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre tiene la misma secuencia que el polipéptido ICOSL variante, salvo que no contiene la modificación de uno o más aminoácidos (por ejemplo, sustituciones).
[0459] [0210]En algunas realizaciones, un polipéptido ICOSL variante con afinidad de unión reducida o disminuida a CD28, ICOS, y/o CTLA-4 tendrá disminución en la afinidad de unión relativa a la referencia (por ejemplo, no modificada) o control de polipéptido ICOSL de tipo silvestre de al menos 5%, tal como al menos aproximadamente 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más para el CD28, ICOSL, y/o CTLA-4. En algunas realizaciones, la disminución de la afinidad de unión en relación con el polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre es superior a 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces o 50 veces. En tales ejemplos, el polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre tiene la misma secuencia que el polipéptido ICOSL variante, salvo que no contiene la modificación de uno o más aminoácidos, por ejemplo, sustituciones.
[0461] En algunas realizaciones, la constante de disociación en equilibrio (K<d>) de cualquiera de las realizaciones anteriores a CD28, ICOS, y/o CTLA-4 puede ser menor que 1x10<-5>M, 1x10<-6>M, 1x10<-7>M, 1x10<-8>M, 1x10<-9>M, 1x10<-10>M o 1x10<-11>M, o 1x10<-12>M.
[0463] En algunas realizaciones, una variante del polipéptido ICOSL tiene una mayor afinidad de unión a CD28. En algunas realizaciones, un polipéptido ICOSL variante con afinidad de unión aumentada o mayor a CD28 tendrá un aumento en la afinidad de unión en relación con el control de polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre de al menos alrededor del 25%, tal como al menos alrededor del 30%, 40%, 50% o 60% para CD28. En algunas realizaciones, un polipéptido ICOSL variante con afinidad de unión aumentada o mayor a CD28 tiene una constante de disociación de equilibrio (<Kd>) de menos de 200 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, o 600 pM para CD28. En algunas realizaciones, el polipéptido variante se une específicamente al ectodominio de uno de los ICOS, CD28 o CTLA4 con mayor selectividad en comparación con el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la selectividad aumentada es para CD28. En algunas realizaciones, la selectividad aumentada comprende una mayor relación de unión del polipéptido ICOSL variante para un socio de unión cognado seleccionado de entre ICOS, CD28 y CTLA4 frente a otro del socio de unión cognado en comparación con la relación de unión del polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre para un socio de unión cognado frente a otro del socio de unión cognado. En algunas realizaciones, la proporción es mayor en al menos o aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o más.
[0465] La secuencia ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificada) o de tipo silvestre no tiene que utilizarse necesariamente como composición de partida para generar polipéptidos ICOSL variantes descritos en el presente documento. Por lo tanto, el uso del término "modificación", como "sustitución", no implica que las presentes realizaciones se limiten a un método particular de fabricación de polipéptidos ICOSL variantes. Los polipéptidos ICOSL variantes pueden fabricarse, por ejemplo, mediante síntesis peptídicade novoy, por tanto, no requieren necesariamente una modificación, como una "sustitución", en el sentido de alterar un codón para codificar la modificación, por ejemplo, la sustitución. Este principio también se extiende a los términos "adición" y "supresión" de un residuo de aminoácido, que tampoco implican un método concreto de fabricación. Los medios por los que se diseñan o crean los polipéptidos ICOSL variantes no se limitan a ningún método en particular. En algunas realizaciones, sin embargo, un ácido nucleico codificante de ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre se mutageniza a partir de material genético de ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre y se examina para determinar la afinidad de unión específica deseada y/o la inducción de la expresión de IFN-gamma u otra actividad funcional. En algunas realizaciones, se sintetizade novoun polipéptido ICOSL variante utilizando secuencias de proteínas o ácidos nucleicos disponibles en cualquier número de bases de datos de acceso público y posteriormente se somete a cribado. El Centro Nacional de Información Biotecnológica (National Center for Biotechnology Information) proporciona este tipo de información y su sitio web es de acceso público a través de Internet, al igual que la base de datos UniProtKB, como se ha comentado anteriormente.
[0467] A menos que se indique lo contrario, como se indica a lo largo de la presente divulgación, la(s) modificación(es) de aminoácidos se designan mediante el número de posición de aminoácidos correspondiente a la numeración de posiciones de la secuencia ECD de referencia establecida en SEQ ID N.º:32. Está dentro del nivel de un artesano experto identificar la posición correspondiente de una modificación, por ejemplo sustitución de aminoácidos, en un polipéptido ICOSL, incluyendo la porción del mismo que contiene un dominio IgSF (por ejemplo IgV) del mismo, como por alineación de una secuencia de referencia (por ejemplo SEQ ID N.º:196, 545, 600-628) con SEQ ID N.º:32. En la enumeración de las modificaciones a lo largo de esta divulgación, la posición del aminoácido se indica en el centro, con el aminoácido de referencia correspondiente (por ejemplo, no modificado o de tipo silvestre) enumerado antes del número y la sustitución del aminoácido variante identificada enumerada después del número. Si la modificación es una supresión de la posición se indica "del" y si la modificación es una inserción en la posición se indica "ins". En algunos casos, una inserción se enumera con la posición del aminoácido indicada en el centro, con el aminoácido de referencia correspondiente enumerado antes y después del número y la inserción de aminoácido variante identificada enumerada después del aminoácido no modificado (por ejemplo, de tipo silvestre).
[0469] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene uno o más aminoácidos modificados, por ejemplo, sustituidos en una secuencia ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificada) o de tipo silvestre. La modificación de uno o más aminoácidos, por ejemplo, la sustitución, puede producirse en el ectodominio (dominio extracelular) de la secuencia ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificada) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la modificación de uno o más aminoácidos, por ejemplo, la sustitución, se produce en el dominio IgV o en un fragmento de unión específico del mismo. En algunas realizaciones, la modificación de uno o más aminoácidos, por ejemplo, la sustitución, se produce en el dominio IgC o en un fragmento de unión específico del mismo. En algunas realizaciones del polipéptido ICOSL variante, parte de la modificación de uno o más aminoácidos, por ejemplo, la sustitución, se encuentra en el dominio IgV o en un fragmento de unión específico del mismo, y parte de la modificación de uno o más aminoácidos, por ejemplo la sustitución, se encuentra en el dominio IgC o en un fragmento de unión específico del mismo.
[0470] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 modificación(es) de aminoácidos, por ejemplo, sustitución. La modificación, por ejemplo la sustitución, puede producirse en el dominio IgV o en el dominio IgC. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 sustituciones de aminoácidos en el dominio IgV o fragmento de unión específico del mismo. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 sustituciones de aminoácidos en el dominio IgC o fragmento de unión específico del mismo. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL tiene al menos un 85%, 86%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con el polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre o con un fragmento de unión específico del mismo, como por ejemplo con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.º: 32, 196 o 545.
[0472] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo sustitución en un ICOSL de referencia o fragmento de unión específico del mismo correspondiente a la posición o posiciones 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 27, 30, 33, 37, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 77, 78, 75, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225, o 227 con referencia a la numeración de SEQ ID N.º:32. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo sustitución en un ICOSL de referencia o fragmento de unión específico del mismo correspondiente a la(s) posición(es) 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 26, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225, o 227 con referencia a la numeración de SEQ ID N.º:32.
[0474] En algunas realizaciones, tales polipéptidos ICOSL variantes exhiben afinidad de unión alterada a uno o más de CD28, ICOS, y/o CTLA-4 en comparación con el polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante presenta una mayor afinidad de unión a CD28, ICOS y/o CTLA-4 en comparación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante muestra una afinidad de unión disminuida a CD28, ICOS o CTLA-4 en comparación con un polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre.
[0476] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo sustitución seleccionada de M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20V, S25G, F27S, F27C, N30D, Y33del, Q37R, K42E, Y47H, T43A, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52L, N52K, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54P, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61S, R61C, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94E, H94D, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100P, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110D, V110N, V110A, E111del, T113E, H115R, H115Q, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S, S121G, V122A, V122M, S126T, S126R, H129P, S130G,S132F, Q133H, E135K, F138L, T139S, C140D, C140del, S142F,I143V, I143T, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H,W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161P, L161M, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190S, T190A, S192G, V193M, N194D, C198R, N201S, L203P, L203F, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217V, I218T, I218N, E220G, R221G, R221I, I224V, T225A, N227K o una modificación conservadora de aminoácidos, por ejemplo, sustitución de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo sustitución seleccionada entre M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20T, A20V, S25G, R26S, F27C, F27S, N30D, Y33del, Q37R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R61S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110A, V110D, V110N, E111del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S, S121G, V122A, V122M, S126R,S126T, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, I143T, I143V, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H, W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161M, L161P, Q164L, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193A, V193M, N194D, C198R, N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, I218N, I218T, E220G, R221G, R221I, R221K, I224V, T225A, T225S, N227K, o una sustitución aminoacídica conservadora de los mismos.
[0478] Una modificación conservadora de aminoácidos, por ejemplo una sustitución, es cualquier aminoácido que pertenezca a la misma clase de aminoácidos que los aminoácidos sustituidos, distinto del aminoácido de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. Las clases de aminoácidos son alifáticos (glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina), hidroxilados o azufrados (serina, cisteína, treonina y metionina), cíclicos (prolina), aromáticos (fenilalanina, tirosina y triptófano), básicos (histidina, lisina y arginina) y ácido-amídicos (aspartato, glutamato, asparagina y glutamina).
[0480] [0221]En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo sustitución seleccionada de M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20V, S25G, F27S, F27C, N30D, Y33del, Q37R, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52L, N52K, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54P, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y,R61S, R61C, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94E, H94D, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100P, Q100S, Q100T, Q100V, G103E, L102R, V107A, V107I, S109G, S109N, V110D, V110N, V110A, E111del, T113E, H115R, H115Q, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S, S121G, V122A, V122M, S126T, S126R, H129P, S130G,S132F, Q133H, E135K, F138L, T139S, C140D, C140del, S142F, I143V, I143T, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H,W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161P, L161M, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193M, N194D, C198R, N201S, L203P, L203F, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217V, 1218T, I218N, E220G, R221G, R221I, I224V, T225A, o N227K. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo sustitución seleccionada entre M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20T, A20V, S25G, R26S, F27C, F27S, N30D, Y33del, Q37R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R61S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110A, V110D, V110N, E111del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S, S121G, V122A, V122M, S126R,S126T, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, I143T, I143V, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H, W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161M, L161P, Q164L, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193A, V193M, N194D, C198R, N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, I218N, 1218T, E220G, R221G, R221I, R221K, 1224V, T225A, T225S, N227K, o una sustitución aminoacídica conservadora de los mismos.
[0482] [0222]En algunas realizaciones, la modificación de uno o más aminoácidos, por ejemplo sustitución es N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N52S/G103E, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52D/V151A, N52H/I143T, N52S/L80P, F120S/Y152H/N201S, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S, N52H/F78L/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D, N52H/Q100R, N52H/S121G, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/Q100P, N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y, N52S/F120S, N52S/V97A, N52S/G72R, N52S/A71T/A117T, N52S/E220G, Y47H/N52S/V107A/F120S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V 110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R, F27S/N52H/N57Y/V110N, N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q, S18R/N52S/F93L/I143V/R221G, A20T/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52S/H94E/L96I/V122M, N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N, M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R, N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I, M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M,C198R, N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N52S/E90A, N30D/K42E/N52S, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N52S/F120S/N227K, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G, Q100R, F138L/L203P, N57Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, Q100R/F138L, L203P, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R, N52H/V122A/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52S/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115Q/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R /F172S/C198R, N52Q/N207Q, N168Q/N207Q, N52Q/N168Q, N84Q/N207Q, N155Q/N207Q, N119Q/N168Q, N119Q/N207Q, N119Q/N155Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N84Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N84Q/N155Q/N168Q, N84Q/N168Q/N207Q, N84Q/N155H/N207Q, N155Q/N168Q/N207Q, N119Q/N155Q/N168Q, N119Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N207Q, N119Q/N155H/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q, N52H/N84Q/N207Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/N155Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q, N84Q/N155Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L, o N57Q/Q100P.
[0484] [0223]En algunas realizaciones, la una o más modificaciones de aminoácidos se seleccionan entre N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R. N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52D/V151A, N52H/I143T, N52S/L80P, F120S/Y152H/N201S, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S, N52S/G103E, N52H/F78L/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D, N52H/Q100R, N52H/S121G, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y, N52S/F120S, N52S/V97A, N52S/G72R, N52S/A71T/A117T, N52S/E220G, Y47H/N52S/V107A/F120S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y 152C/K156M/C198R, Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R, F27S/N52H/N57Y/V110N, N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q, S18R/N52S/F93L/I143V/R221G, A20T/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52S/H94E/L96I/V122M, N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N, M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R, N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I, M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M,C198R, N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N52S/E90A, N30D/K42E/N52S, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N52S/F120S/N227K, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G, N52Q/N207Q, N168Q/N207Q, N52Q/N168Q, N84Q/N207Q, N155Q/N207Q, N119Q/N168Q, N119Q/N207Q, N119Q/N155Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N84Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N84Q/N155Q/N168Q, N84Q/N168Q/N207Q, N84Q/N155H/N207Q, N155Q/N168Q/N207Q, N119Q N155Q/N168Q, N119Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N207Q, N119Q/N155H/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q, N84Q/N155Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q, F138L/L203P, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R, N52H/V122A/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/T143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52S/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L, N57Q/Q100P, S54F/V193A o R26S/N52H/N57Y/V110D/T137A/C198R.
[0486] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende cualquiera de las mutaciones enumeradas en la Tabla 1. La Tabla 1 también proporciona secuencias ejemplares por referencia a SEQ ID N.º para el dominio extracelular (ECD) o dominio IgV de los polipéptidos ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificados) o de tipo silvestre o de variantes ejemplares de ICOSL. Como se ha indicado, el locus o los residuos exactos correspondientes a un dominio determinado pueden variar, por ejemplo en función de los métodos utilizados para identificar o clasificar el dominio. Además, en algunos casos, los aminoácidos N- y/o C-terminales adyacentes de un dominio dado (por ejemplo, IgV) también pueden incluirse en una secuencia de un polipéptido IgSF variante, como para asegurar el plegamiento adecuado del dominio cuando se expresa. Por lo tanto, se entiende que la ejemplificación de las SEQ ID N.º en la Tabla 1 no debe interpretarse como limitativa. Por ejemplo, el dominio particular, como el dominio ECD, de una variante del polipéptido ICOSL puede ser varios aminoácidos más largo o más corto, como 1-10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos más largo o más corto, que la secuencia de aminoácidos establecida en la respectiva SEQ ID N.º.
[0488] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende cualquiera de las mutaciones enumeradas en la Tabla 1. En algunos ejemplos, las mutaciones se realizan en un ICOSL de referencia que contiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 32, un ICOSL de referencia que contiene el dominio IgV del ICOSL establecido en SEQ ID N.º: 196 o 545, o un ICOSL de referencia truncado y/o modificado que contenga la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 600-628. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende cualquiera de las secuencias de dominio extracelular (ECD) enumeradas en la Tabla 1 (es decir, cualquiera de SEQ ID N.º: 109-142, 239, 280-325, 364-381, 387-424, 427-433, 435-470, 638-685). En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL comprende una secuencia polipeptídica que presenta al menos un 90% de identidad, al menos un 91% de identidad, al menos un 92% de identidad, al menos un 93% de identidad, al menos un 94% de identidad, al menos un 95% de identidad, como al menos un 96% de identidad, un 97% de identidad, un 98% de identidad o un 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de dominio extracelular (DCE) enumeradas en la Tabla 1 (es decir, cualquiera de las SEQ ID N.º: 109-142, 239, 280-325, 364-381, 387-424, 427-433, 435-470, 638-685) y contiene la(s) modificación(es) de aminoácidos, es decir, la(s) sustitución(es) no presente(s) en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende un fragmento de unión específico de cualquiera de las secuencias de dominio extracelular (ECD) enumeradas en la Tabla 1 (es decir, cualquiera de SEQ ID N.º: 109-142, 239, 280-325, 364-381, 387-424, 427-433, 435-470, 638-685) y contiene la(s) modificación(es) aminoacídica(s), es decir, la(s) sustitución(es) no presente(s) en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre.
[0490] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende cualquiera de las secuencias de dominio extracelular (ECD) enumeradas en la Tabla 1 (es decir, cualquiera de SEQ ID N.º: 109-142, 239, 280-325, 364-381, 387-424, 427-433, 435-470, 638-685, 905, 908). En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL comprende una secuencia polipeptídica que presenta al menos un 90% de identidad, al menos un 91% de identidad, al menos un 92% de identidad, al menos un 93% de identidad, al menos un 94% de identidad, al menos un 95% de identidad, como al menos un 96% de identidad, un 97% de identidad, un 98% de identidad o un 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de dominio extracelular (DCE) enumeradas en la Tabla 1 (es decir, cualquiera de las SEQ ID N.º: 109-142, 239, 280-325, 364-381, 387-424, 427-433, 435-470, 638-685, 905, 908) y contiene la(s) modificación(es) de aminoácidos, es decir, la(s) sustitución(es) no presente(s) en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende un fragmento de unión específico de cualquiera de las secuencias de dominio extracelular (ECD) enumeradas en la Tabla 1 (es decir, cualquiera de SEQ ID N.º: 109-142, 239, 280-325, 364-381, 387-424, 427-433, 435-470, 638-685, 905, 908) y contiene la(s) modificación(es) de aminoácidos, por ejemplo, la(s) sustitución(es) no presente(s) en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre.
[0492] [0227]En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende cualquiera de las secuencias IgV enumeradas en la Tabla 1 (es decir, cualquiera de SEQ ID N.º: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857). En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL comprende una secuencia polipeptídica que presenta al menos un 90% de identidad, al menos un 91% de identidad, al menos un 92% de identidad, al menos un 93% de identidad, al menos un 94% de identidad, al menos un 95% de identidad, como al menos un 96% de identidad, un 97% de identidad, un 98% de identidad o un 99% de identidad con cualquiera de las secuencias IgV enumeradas en la Tabla 1 (es decir, cualquiera de SEQ ID N.º: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857) y contiene la(s) modificación(es) de aminoácidos, es decir, la(s) sustitución(es) no presente(s) en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende un fragmento de unión específico de cualquiera de las secuencias IgV enumeradas en la Tabla 1 (es decir, cualquiera de SEQ ID N.º: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857) y contiene la sustitución o sustituciones de aminoácidos no presentes en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre.
[0494] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende cualquiera de las secuencias IgV enumeradas en la Tabla 1 (es decir, cualquiera de SEQ ID N.º: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857, 906-907, 909-910). En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL comprende una secuencia polipeptídica que presenta al menos un 90% de identidad, al menos un 91% de identidad, al menos un 92% de identidad, al menos un 93% de identidad, al menos un 94% de identidad, al menos un 95% de identidad, como al menos un 96% de identidad, un 97% de identidad, un 98% de identidad o un 99% de identidad con cualquiera de las secuencias IgV enumeradas en la Tabla 1 (es decir, cualquiera de SEQ ID N.º: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857, 906-907, 909-910) y contiene la(s) modificación(es) de aminoácidos, por ejemplo, sustitución(es) no presente(s) en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende un fragmento de unión específico de cualquiera de las secuencias IgV enumeradas en la Tabla 1 (es decir, cualquiera de SEQ ID N.º: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857, 906-907, 909-910) y contiene la sustitución o sustituciones de aminoácidos no presentes en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre.
[0496] Las mutaciones designadas con una "X" indican que la posición designada contiene una Q o el residuo de tipo silvestre establecido en la posición correspondiente de SEQ ID N.º: 32.
[0499]
[0500] continuación
[0501]
[0502]
[0503] continuación
[0504]
[0505] continuación
[0506]
[0507]
[0508] continuación
[0509]
[0510]
[0511] continuación
[0512]
[0513] continuación
[0514]
[0515] continuación
[0518]
[0521] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante exhibe mayor afinidad por el ectodominio de CD28 en comparación con el polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre, tal como el que comprende la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 32, 196 o 545. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL muestra una mayor afinidad por el ectodominio de ICOS en comparación con el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre, como el que comprende la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 32, 196 o 545. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL muestra mayor afinidad por el ectodominio de CD28 y el ectodominio de ICOS en comparación con el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre, como el que comprende la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 32, 196 o 545.
[0523] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, la sustitución correspondiente a la posición o posiciones 52, 54 o 57. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, una sustitución seleccionada entre N52H, N52D, N52Q, N52S, N52Y, N52K, S54A, S54P o N57Y o una modificación conservadora de aminoácidos, por ejemplo, una sustitución de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, una sustitución seleccionada entre N52H, N52D, N52S, N52K o N57Y o una modificación conservadora de aminoácidos, por ejemplo, una sustitución de los mismos.
[0525] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante puede contener una o más modificaciones de aminoácidos adicionales, por ejemplo, una sustitución además de una modificación de aminoácidos, por ejemplo, una sustitución en una posición correspondiente a la posición 52, 54 o 57. En algunas realizaciones, la modificación de uno o más aminoácidos adicionales, por ejemplo sustitución es en una posición correspondiente a 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 27, 30, 37, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ó 227. En algunas realizaciones, la modificación de uno o más aminoácidos adicionales, por ejemplo sustitución es en una posición correspondiente a 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 26, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225, o 227 con referencia a SEQ ID N.º:32.
[0527] [0233]En algunas realizaciones, la variante ICOSL contiene una o más modificaciones adicionales de aminoácidos, por ejemplo sustitución seleccionada de M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20V, S25G, F27S, F27C, N30D, Y33del, Q37R, K42E, T43A, Y47H, N52H, N52D, N52S, N52Y, N52K, N52Q, S54A, S54P, N57D, N57Y, R61S, R61C, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94E, H94D, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100R, Q100K, Q100P, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110D, V110N, V110A, E111del, T113E, H115R, H115Q, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S,S121G, V122A, V122M, S126T, S126R, H129P, S130G,S132F, Q133H, E135K, F138L, T139S, C140del, S142F,I143V, I143T, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H,W153R, I154F, K156M, D158G, L161P, L161M, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193M, N194D, C198R, N201S, L203P, L203F, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217V, I218T, I218N, E220G, R221G, R221I, I224V, T225A, N227K, o una sustitución aminoacídica conservadora de los mismos. En algunas realizaciones, la variante ICOSL contiene una o más modificaciones adicionales de aminoácidos, por ejemplo sustitución seleccionada entre M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20T, A20V, S25G, R26S, F27C, F27S, N30D, Y33del, Q37R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R61S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110A, V110D, V110N, E111del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S, S121G, V122A, V122M, S126R,S126T, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, I143T, I143V, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H, W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161M, L161P, Q164L, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193A, V193M, N194D, C198R, N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, I218N, 1218T, E220G, R221G, R221I, R221K, I224V, T225A, T225S, N227K, o una sustitución aminoacídica conservadora de los mismos.
[0529] En algunas realizaciones de cualquiera de los polipéptidos ICOSL variantes descritos anteriormente, el polipéptido ICOSL variante comprende además una o más deleciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 140 de SEQ ID N.º: 32.
[0531] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo sustitución seleccionada entre N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140del/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y/Q100P, N52S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, N52S/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52H/I143T, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N52S/F120S/N227K, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T,N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G, N52Q/N207Q, N52Q/N168Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q, N52H/N84Q/N207Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/N155Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R, N52H/V122A/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52S/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, o N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R.
[0533] [0236]En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, sustitución en un ICOSL de referencia o fragmento de unión específico del mismo correspondiente a la(s) posición(es) 52, 57 o 100 con referencia a la numeración de SEQ ID N.º:32. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo sustitución seleccionada entre N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52L, N52K, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100P, Q100S, Q100T o Q100V. En algunas realizaciones, la modificación de uno o más aminoácidos, por ejemplo sustitución es N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52D/V151A, N52H/I143T, N52S/L80P, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S, N52H/F78L/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D, N52H/Q100R, N52H/S121G, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y, N52S/F120S, N52S/V97A, N52S/G72R, N52S/A71T/A117T, N52S/E220G, Y47H/N52S/V107A/F120S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y 152C/K156M/C198R, Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R, F27S/N52H/N57Y/V110N, N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q, S18R/N52S/F93L/I143V/R221G, A20T/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52S/H94E/L96I/V122M, N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N, M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R, N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I, M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M,C198R, N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N52S/E90A, N30D/K42E/N52S, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N52S/F120S/N227K, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, N52D, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G, N52Q/N207Q, N168Q/N207Q, N52Q/N168Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R, N52H/V122A/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/T143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52S/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L o N57Q/Q100P.
[0535] [0237]En algunas realizaciones, la una o más modificaciones de aminoácidos se seleccionan entre N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52D/V151A, N52H/I143T, N52S/L80P, F120S/Y152H/N201S, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S, N52S/G103E, N52H/F78L/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D, N52H/Q100R, N52H/S121G, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y, N52S/F120S, N52S/V97A, N52S/G72R, N52S/A71T/A117T, N52S/E220G, Y47H/N52S/V107A/F120S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V 110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R, F27S/N52H/N57Y/V110N, N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q, S18R/N52S/F93L/1143V/R221G, A20T/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52S/H94E/L96I/V122M, N52H/N57Y/H94E/L96I/F1201/S126T/W153R/I218N, M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V 110D/E135K/L.173S/C198R, N52H/N57Y/V110A/C198R/R2211, M101/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M,C198R, N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N52S/E90A, N30D/K42E/N52S, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N52S/F120S/N227K, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/I154F/C198R/R221G, N52Q/N207Q, N52Q/N168Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R, N52H/V122A/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R2211, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52S/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L, N57Q/Q100P, o R26S/N52H/N57Y/V110D/T137A/C198R.
[0537] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo sustitución seleccionada de entre N52A, N52C, N52D, N52G, N52K, N52L, N52M, N52R, N52T, N52V, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, Q100A, Q100D, Q100G, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100S, Q100T o Q100V. con referencia a SEQ ID N.º:32. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones de aminoácidos se seleccionan entre N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L o N57Q/Q100P.
[0539] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo sustitución seleccionada entre N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52Y/N57Y/F138L/L203P, V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52H/N57Y/Q100R/L102R /V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R, N52H/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/V152C/K156M/C198R, N30D/K42E/N52S, N52S/F120S/I143V/I224V, N52S/E90A, N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I, N52H/N57Y/Q100P, o N52S/N194D.
[0541] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, sustitución seleccionada de N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R, o N52H/N57Y/Q100R/C198R. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, una sustitución seleccionada entre E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, N52H/N57Y/Q100R y N52H/N57Y/Q100P.
[0542] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo sustitución seleccionada entre N52H/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52H/K92R, N52H/C140del/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y/Q100P, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52K/L208P o N52H/I143T.
[0544] En algunas realizaciones, la una o más modificaciones de aminoácidos se seleccionan entre F120S/Y152H/N201S, E111del, Y33del, N168Q/N207Q, N84Q/N207Q, N155Q/N207Q, N119Q/N168Q, N119Q/N207Q, N119Q/N155Q, N84Q/N119Q, N84Q/N155Q/N168Q, N84Q/N168Q/N207Q, N84Q/N155H/N207Q, N155Q/N168Q/N207Q, N119Q N155Q/N168Q, N119Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N207Q, N119Q/N155H/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q, N84Q/N155Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q o F138L/L203P.
[0546] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante muestra una mayor afinidad de unión para unirse a uno de los ectodominios de CD28 o ICOS y muestra una menor afinidad de unión para unirse al otro de los ectodominios de CD28 o ICOS en comparación con el polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre, tal como el que comprende la secuencia establecida en SEQ ID N.º: 32, 196 o 545.
[0548] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante exhibe una mayor afinidad de unión para ICOS. En algunas realizaciones, la sustitución de uno o más aminoácidos se encuentra en una posición correspondiente a 16, 30, 42, 52, 54, 57, 75, 90, 92, 100, 102, 110, 113, 115, 120, 122, 133, 138, 143, 146, 152, 156, 158, 172, 194, 198, 203, 208, 221, 224 o 225. En algunas realizaciones, la variante ICOSL contiene una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre C198R, D158G, E16V, E90A, F120S, F138L, F172S, H115R, H115X, I143T, I143V, 1224V, K156M, K42E, K92R, L102R, L203P, L208P, N194D, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52Y, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57S, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100D, Q100E, Q100K, Q100M, Q100P, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q133H, R221I, R75Q, S54A, S54P, T113E, T225A, V110D, V122A, Y146C, Y152C, o una sustitución aminoacídica conservadora de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre N52S, N52H, N52D, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y, N52S/C198R, N52S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52H/I143T, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/E90A, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y 152C/K156M/F172S/C198R, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N57Y/Q100P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R, H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/I143T F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N30D/K42E/N52S/H115R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52T/N57H/Q100S, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G o N52T/N57K/Q100P.
[0550] En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL presenta una mayor afinidad de unión por ICOS y una menor afinidad de unión por CD28. En algunas realizaciones, la sustitución de uno o más aminoácidos adicionales se encuentra en una posición correspondiente a 52, 57, 80100, 130, 152, 161 o 198. En algunas realizaciones, la variante ICOSL contiene una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre N52S, N52H, N52Y, N52H, N57Y, L80P, Q100P Q100R, Q100K, V110D, S130G, Y152C, L161P, L161M, C198R, R221G, o una sustitución conservadora de aminoácidos de las mismas. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre N57Y/Q100P, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52Y/N57Y/Y152C, N52H/L161P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/L80P, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/S132F/I154F/C198R/R221G, Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, F27S/N52H/N57Y/V110N, S18R/N52S/F93L/I143V/R221G, A20T/N52D/Y146C/Q164L, N52H/N57Y/H94E/L961/F120I/S126T/W153R/I218N, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R,
[0551] M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M/C198R.
[0552] En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL presenta una mayor afinidad de unión a CD28. En algunas realizaciones, la sustitución de uno o más aminoácidos se encuentra en una posición correspondiente a 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 27, 30, 36, 40, 41, 42, 52, 54, 57, 63, 70, 71, 72, 74, 77, 80, 81, 84, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 96, 98, 99, 100, 102, 107, 109, 110, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 126, 127, 129, 130, 132, 133, 135, 138, 139, 140, 143, 144, 146, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 166, 168, 169, 172, 173, 178, 190, 192, 193, 194, 198, 199, 201, 203, 207, 208, 209, 212, 218, 221, 224, 225 ó 227.
[0554] En algunas realizaciones, la variante ICOSL contiene una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre A117T, A20V, A71T, A91G, A91G, AE88D, C140del, C198R, D158G, D77G, D90K, E117G, E135K, E16V, E81A, E88D, E90A, F120I, F120S, F138L, F172S, F27C, F92Y, G72R, H115R, H115X, H129P, H94E, I118V, I127T, I143T, I143V, I154F, I218N, I218T, I224V, K156M, K169E, K36G, K42E, K89R, K92R, K93R, L102R, L161P, L166Q, L173S, L203F, L203P, L208P, L209P, L40M, L70Q, L70R, L74Q, L80P, L96I, L98F, M10I, M10V, N115Q, N119Q, N122S, N144D, N155X, N168Q, N168X, N178S, N194D, N207Q, N207X, N227K, N25S, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N57A, N57F, N57H, N57L, N57M, N57S, N57V, N57W, N57Y, N63S, N84Q, Q100A, Q100E, Q100G, Q100K, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, Q133H, R221G, R221I, S109G, S109N, S114T, S121G, S126R, S126T, S130G, S132F, S13G, S18R, S192G, S212G, S25G, S54A, S54P, S99G, T113E, T120S, T130A, T139S, T190A, T199S, T225A, T41I, V107I, V110A, V110D, V11E, V122A, V122M, V193M, V210A, W153R, Y146C, Y152C, Y152H, o una sustitución aminoacídica conservadora de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre N52S, N52H, N52D, N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140del/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y, N57Y/Q100P, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52H/I143T, N52S/L80P, N52S/D158G, N52D/Q133H, L70Q/A91G/N144D, L70Q/A91G/E117G/ I118V/T120S/T130A, L70R/A91G/I118V/T120S/T130A/T199S, L70Q/E81A/A91G/ I118V/T120S/I127T/T130A, N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V /T120S/T130A, T41I/A91G, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/ N178S, E88D/K89R/D90K/A91G/ F92Y/K93R, AE88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K36G/L40M, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R, N52S/F120S/N227K, N52S/N194D, N52S/F120S, N52S/G72R, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/S132F/I154F/C198R/R221G, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52S/H94E/L96I/V122M, N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N, M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R, N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I, M101/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M,C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N52S/E90A, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F172S/C198R, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q/, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/Q100R, N52H/S121G/C198R, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A/K169E, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/1143V/F172S/C198R. N52H/N57Y/Q100R/L102RH115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/I143T F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R R221I, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R, N52S/H115R/F172S/C198R, N119Q, N207Q, N52Q/N207X, N168X/N207X, N52Q/N168Q, N84Q/N207Q, N119Q N155X, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N207Q, N119Q/N155Q/N168Q, N52H/N84Q/N119Q, N52Q/N84Q/N155X/N168X, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G, o N52T/N57K/Q100P.
[0556] [0248]En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL presenta una mayor afinidad de unión con CD28 y una menor afinidad de unión con ICOS. En algunas realizaciones, la sustitución de uno o más aminoácidos se encuentra en una posición correspondiente a 52, 75 o 203. En algunas realizaciones, la variante ICOSL contiene una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre N52S, R75Q, L203F o L203P. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene sustituciones de aminoácidos N52S/R75Q/L203P.
[0558] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, sustitución en un ICOSL de referencia o fragmento de unión específico del mismo correspondiente a la(s) posición(es) 16, 30, 42, 52, 57, 90, 100, 102, 110, 115, 120, 122, 138, 143, 152, 156, 172, 194, 198, 203, 221, o 224 con referencia a la numeración de SEQ ID N.º: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo sustitución seleccionada entre E16V, N30D, K42E, N52H, N52Y, N52S, N57Y, E90A, Q100R, Q100P, L102R, V110D, H115R, F120S, V122A, F138L, I143V, I143T, H152C, K156M, F172S, N194D, C198R, L203P, R221I, o I224V. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, sustitución en un ICOSL de referencia o fragmento de unión específico del mismo correspondiente a la(s) posición(es) 115, 172 o 198 con referencia a la numeración de SEQ ID N.º:32. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene uno o más aminoácidos modificados, por ejemplo, una sustitución seleccionada entre H115R, F172S o C198R. En algunas realizaciones, la modificación de uno o más aminoácidos, por ejemplo sustitución es N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R, N52H/V122A/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52S/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R o N52H/N57Y/Q100R /F172S/C198R. En algunas realizaciones, los polipéptidos ICOSL variantes presentan una solubilidad potencialmente mejorada de la proteína o una expresión mejorada de la proteína ("mutaciones de solubilidad") en comparación con el polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre.
[0560] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende cualquiera de las secuencias de dominio extracelular (ECD) establecidas en SEQ ID N.º: 435-470. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL comprende una secuencia polipeptídica que presenta al menos un 90% de identidad, al menos un 91% de identidad, al menos un 92% de identidad, al menos un 93% de identidad, al menos un 94% de identidad, al menos un 95% de identidad, como al menos un 96% de identidad, un 97% de identidad, un 98% de identidad o un 99% de identidad con cualquiera de los dominios extracelulares (ECD) establecidos en SEQ ID N.º: 435-470 y contiene la(s) modificación(es) de aminoácidos, por ejemplo, la(s) sustitución(es) no presente(s) en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende un fragmento de unión específico de cualquiera de las secuencias de dominio extracelular (ECD) establecidas en SEQ ID N.º: 435-470 y contiene la(s) modificación(es) de aminoácidos, por ejemplo, la(s) sustitución(es) no presente(s) en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre.
[0562] [0251]En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL presenta una mayor afinidad de unión a CD28 y una mayor afinidad de unión a ICOS. En algunas realizaciones, la sustitución de uno o más aminoácidos se encuentra en una posición correspondiente a 16, 30, 42, 52, 54, 57, 90, 92, 100, 102, 110, 113, 115, 120, 122, 133, 138, 143, 146, 152, 156, 158, 172, 194, 198, 203, 208, 212, 224, o 225. En algunas realizaciones, la variante ICOSL contiene una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre C198R, D158G, E16V, E90A, F120S, F138L, F172S, H115R, I143V, 1224V, K156M, K42E, K92R, L102R, L203P, L208P, N194D, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52Y, N57F, N57H, N57L, N57M, N57S, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100E, Q100G, Q100K, Q100M, Q100P, Q100R, Q100S, Q133H, S212G, S54A, S54P, T113E, T225A, V110D, V122A, Y146C, Y152C, o una sustitución aminoacídica conservadora de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre N52A/N57Y/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52T/N57H/Q100S, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52S, N52H, N52D, N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y, N52S/C198R, N52S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52H/I143T, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/E90A, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N52S/E90A/H115R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R.
[0564] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, sustitución en un ICOSL de referencia o fragmento de unión específico del mismo correspondiente a la(s) posición(es) 52, 57, 100, 138, 198, o 203 con referencia a la numeración de SEQ ID N.º:32. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, una sustitución seleccionada entre N52H, N52Y, N57Y, Q100R, Q100P, F138L, C198R o L203P. En algunas realizaciones, la modificación de uno o más aminoácidos, por ejemplo, la sustitución es Q100R, F138L/L203P, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, Q100R/F138L, o L203P.
[0566] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende cualquiera de las secuencias de dominio extracelular (ECD) establecidas en SEQ ID N.º: 427-433. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL comprende una secuencia polipeptídica que presenta al menos un 90% de identidad, al menos un 91% de identidad, al menos un 92% de identidad, al menos un 93% de identidad, al menos un 94% de identidad, al menos un 95% de identidad, como al menos un 96% de identidad, un 97% de identidad, un 98% de identidad o un 99% de identidad con cualquiera de los dominios extracelulares (ECD) establecidos en SEQ ID N.º: 427-433 y contiene la(s) modificación(es) de aminoácidos, por ejemplo, la(s) sustitución(es) no presente(s) en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende un fragmento de unión específico de cualquiera de las secuencias de dominio extracelular (ECD) establecidas en SEQ ID N.º: 427-433 y contiene la(s) modificación(es) de aminoácidos, por ejemplo, la(s) sustitución(es) no presente(s) en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL comprende la secuencia IgV establecida en SEQ ID N.º: 434. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL comprende una secuencia polipeptídica que presenta al menos un 90% de identidad, al menos un 91% de identidad, al menos un 92% de identidad, al menos un 93% de identidad, al menos un 94% de identidad, al menos un 95% de identidad, como al menos un 96% de identidad, un 97% de identidad, un 98% de identidad o un 99% de identidad con la secuencia IgV establecida en SEQ ID N.º: 434 y contiene la(s) modificación(es) de aminoácidos, por ejemplo, la(s) sustitución(es) no presente(s) en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende un fragmento de unión específico de la secuencia IgV establecida en SEQ ID N.º: 434 y contiene la sustitución o sustituciones de aminoácidos no presentes en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre.
[0568] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, sustitución en un ICOSL de referencia o fragmento de unión específico del mismo correspondiente a la(s) posición(es) 52, 84, 91, 119, 155, 168, 207 con referencia a la numeración de SEQ ID N.º:32. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene uno o más aminoácidos modificados, por ejemplo, una sustitución seleccionada entre A91S, N52H, N52Q, N84Q, N119Q, N155H, N155Q, N168Q, N207Q. En algunas realizaciones, la modificación de uno o más aminoácidos, por ejemplo sustitución es N84Q, N119Q, N168Q, N207Q, N52Q, N52Q/N207Q, N168Q/N207Q, N52Q/N168Q, N84Q/N207Q, N155Q/N207Q, N119Q/N168Q, N119Q/N207Q, N119Q/N155Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N84Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N84Q/N155Q/N168Q, N84Q/N168Q/N207Q, N84Q/N155H/N207Q, N155Q/N168Q/N207Q, N119Q N155Q/N168Q, N119Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N207Q, N119Q/N155H/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q, N52H/N84Q/N207Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/N155Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q, N84Q/N155Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q o A91S/N119Q/N168Q/N207Q. En algunas realizaciones, los polipéptidos ICOSL variantes presentan una glicosilación potencialmente reducida en comparación con el polipéptido ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre.
[0570] [0255]En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende cualquiera de las secuencias de dominio extracelular (ECD) establecidas en SEQ ID N.º: 387-424, 427-433, 435-470. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL comprende una secuencia polipeptídica que presenta al menos un 90% de identidad, al menos un 91% de identidad, al menos un 92% de identidad, al menos un 93% de identidad, al menos un 94% de identidad, al menos un 95% de identidad, como al menos un 96% de identidad, un 97% de identidad, un 98% de identidad o un 99% de identidad con cualquiera de los dominios extracelulares (ECD) establecidos en SEQ ID N.º: 387-424, 427-433, 435-470 y contiene la(s) modificación(es) de aminoácidos, por ejemplo, sustitución(es) no presente(s) en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende un fragmento de unión específico de cualquiera de las secuencias de dominio extracelular (ECD) establecidas en SEQ ID N.º: 387-424, 427-433, 435-470 y contiene la(s) modificación(es) de aminoácidos, por ejemplo, la(s) sustitución(es) no presente(s) en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende cualquiera de las secuencias IgV establecidas en SEQ ID N.º: 425-426. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL comprende una secuencia polipeptídica que presenta al menos un 90% de identidad, al menos un 91% de identidad, al menos un 92% de identidad, al menos un 93% de identidad, al menos un 94% de identidad, al menos un 95% de identidad, como al menos un 96% de identidad, un 97% de identidad, un 98% de identidad o un 99% de identidad con cualquiera de las secuencias IgV establecidas en SEQ ID N.º: 425-426 y contiene la(s) modificación(es) de aminoácidos, por ejemplo, la(s) sustitución(es) no presente(s) en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante comprende un fragmento de unión específico de cualquiera de las secuencias IgV establecidas en SEQ ID N.º: 425-426 y contiene la(s) sustitución(es) de aminoácidos no presente(s) en el ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre.
[0571] III. FORMATO DE POLIPÉPTIDOS VARIANTES
[0572] El polipéptido inmunomodulador que comprende una variante ICOSL proporcionada en el presente documento puede formatearse de diversas maneras, incluyendo como proteína soluble, proteína unida a membrana, proteína secretada, conjugado o fusión o para expresión por una célula modificada genéticamente o agente infeccioso como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, tanto los polipéptidos inmunomoduladores que comprenden uno o más vIgD de ICOSL como los polipéptidos inmunomoduladores que comprenden múltiples dominios IgSF pueden formatearse de diversas maneras.
[0573] En algunas realizaciones, el formato particular puede elegirse para la aplicación terapéutica deseada. En algunos casos, un polipéptido inmunomodulador que comprende una variante del polipéptido ICOSL se proporciona en un formato para antagonizar o bloquear la actividad de su pareja de unión afín, por ejemplo, CD28. En algunas realizaciones, el antagonismo de CD28 puede ser útil para tratar la inflamación o la autoinmunidad. En algunos casos, un polipéptido inmunomodulador que comprende una variante del polipéptido ICOSL se proporciona en un formato para agonizar o estimular la actividad de su pareja de unión afín, por ejemplo, CD28. En algunas realizaciones, el agonismo de CD28 puede ser útil para tratar indicaciones oncológicas. Un artesano experto puede determinar fácilmente la actividad de un formato particular, como por ejemplo para antagonizar o agonizar uno o más compañeros de unión afines específicos. En el presente documento se proporcionan métodos ejemplares para evaluar dichas actividades, incluidos en los ejemplos.
[0574] En algunas realizaciones, un polipéptido inmunomodulador soluble, tal como una variante ICOSL que contiene una vIgD, puede encapsularse dentro de un liposoma que a su vez puede conjugarse con cualquiera de los conjugados proporcionados o cualquier combinación de los mismos (por ejemplo, una fracción diana). En algunas realizaciones, los polipéptidos inmunomoduladores solubles o unidos a membrana de la invención están desglicosilados. En realizaciones más específicas, la secuencia variante ICOSL está desglicosilada. En formas de realización aún más específicas, el dominio o dominios IgV y/o IgC (por ejemplo, IgC2) de la variante ICOSL están desglicosilados.
[0575] Ejemplos no limitantes de formatos proporcionados se describen en lasFIGS. 13A-13Cy que se describen más adelante.
[0576] A. POLIPÉPTIDOS SOLUBLES
[0577] En algunos aspectos, se proporcionan polipéptidos inmunomoduladores que comprenden una vIgD de ICOSL. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora que contiene una variante del polipéptido ICOSL es una proteína soluble. Los expertos apreciarán que las proteínas de la superficie celular tienen típicamente un dominio intracelular, transmembrana y extracelular (ECD) y que una forma soluble de tales proteínas puede hacerse usando el dominio extracelular o una subsecuencia inmunológicamente activa del mismo. Así, en algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora que contiene una variante del polipéptido ICOSL carece de un dominio transmembrana o de una porción del dominio transmembrana. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora que contiene una variante ICOSL carece del dominio intracelular (citoplasmático) o de una porción del dominio intracelular. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora que contiene el polipéptido ICOSL variante sólo contiene la porción vIgD que contiene el dominio ECD o una porción de la misma que contiene un dominio IgV y/o un dominio o dominios IgC (por ejemplo, IgC2) o fragmentos de unión específicos de los mismos que contienen la(s) modificación(es) aminoacídica(s).
[0578] En algunas realizaciones, un polipéptido inmunomodulador que comprende un ICOSL variante puede incluir uno o más polipéptidos ICOSL variantes. En algunos aspectos, uno o más dominios IgSF adicionales, como uno o más vIgD adicionales, pueden unirse a un vIgD de ICOSL como se proporciona en el presente documento. En algunos aspectos, tanto los polipéptidos inmunomoduladores que comprenden uno o más vIgD de ICOSL como los polipéptidos inmunomoduladores que comprenden múltiples dominios IgSF pueden formatearse de diversas maneras, como se describe en la subsección C de la Sección III.
[0579] En algunas realizaciones, un polipéptido inmunomodulador que comprende un ICOSL variante puede incluir uno o más polipéptidos ICOSL variantes de la invención. En algunas realizaciones un polipéptido de la invención comprenderá exactamente 1, 2, 3, 4, 5 secuencias variantes ICOSL. En algunas realizaciones, al menos dos de las secuencias variantes ICOSL son secuencias variantes ICOSL idénticas.
[0580] [0263]En algunas realizaciones, el polipéptido inmunomodulador proporcionado comprende dos o más secuencias vIgD de ICOSL. Los polipéptidos ICOSL variantes múltiples dentro de la cadena polipeptídica pueden ser idénticos (es decir, de la misma especie) entre sí o ser secuencias ICOSL variantes no idénticas (es decir, de especies diferentes). Además de las realizaciones con una sola cadena polipeptídica, en algunas realizaciones dos, tres, cuatro o más de los polipéptidos de la invención pueden estar unidos entre sí de forma covalente o no covalente. Así, en el presente documento se proporcionan proteínas monoméricas, diméricas y multiméricas de orden superior (por ejemplo, 3, 4, 5 o más). Por ejemplo, en algunas realizaciones, exactamente dos polipéptidos de la invención pueden unirse covalentemente o no covalentemente entre sí para formar un dímero. En algunas realizaciones, la unión se realiza a través de enlaces disulfuro de cisteína entre cadenas. Las composiciones que comprenden dos o más polipéptidos de la invención pueden ser de una especie idéntica o de especies sustancialmente idénticas de polipéptidos (por ejemplo, un homodímero) o de especies no idénticas de polipéptidos (por ejemplo, un heterodímero). Una composición que tenga una pluralidad de polipéptidos enlazados de la invención puede, como se ha indicado anteriormente, tener uno o más polipéptidos ICOSL variantes idénticos o no idénticos de la invención en cada cadena polipeptídica.
[0582] En algunos aspectos, uno o más dominios IgSF adicionales, tales como uno o más vIgD adicionales, pueden unirse a un vIgD de ICOSL tal como se proporciona en el presente documento (en lo sucesivo denominada proteína inmunomoduladora "apilada" o "apilada"). En algunas realizaciones, el formato modular de las proteínas inmunomoduladoras proporcionadas proporciona flexibilidad para la modificación genética o generación de proteínas inmunomoduladoras para modular la actividad de múltiples contraestructuras (múltiples socios de unión afines). En algunas realizaciones, dichas moléculas "apiladas" pueden proporcionarse en un formato soluble o, en algunos casos, pueden proporcionarse como proteínas unidas a membranas o secretadas.
[0584] En algunas realizaciones, las proteínas inmunomoduladoras pueden contener cualquiera de los polipéptidos ICOSL variantes aquí proporcionados unidos, directa o indirectamente, a otro u otros dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF) (construcción de proteína inmunomoduladora "apilada" y también denominada proteína inmunomoduladora "Tipo II"). En algunos aspectos, esto puede crear proteínas inmunomoduladoras multidominio únicas que se unen a dos o más, como tres o más, socios de unión afines, proporcionando así una modulación multiobjetivo de la sinapsis inmunitaria.
[0586] En algunas realizaciones, una proteína inmunomoduladora comprende una combinación (una "combinación de tipo no silvestre") y/o disposición (una "disposición de tipo no silvestre" o "permutación de tipo no silvestre") de un dominio ICOSL variante con una o más secuencias de dominio IgSF modificadas por afinidad y/o no modificadas por afinidad de otro miembro de la familia IgSF (por ejemplo, miembro de la familia IgSF de mamífero) que no se encuentran en los miembros de la familia IgSF de tipo silvestre.por ejemplo, un miembro de la familia IgSF de mamíferos) que no se encuentran en los miembros de la familia IgSF de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora contiene 2, 3, 4, 5 o 6 dominios de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF), donde al menos uno de los dominios IgSF es un dominio IgSF variante de ICOSL (vIgD de ICOSL) según la descripción proporcionada.
[0588] En algunas realizaciones, las secuencias de los dominios IgSF adicionales pueden ser un dominio IgSF modificado que contiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones, en comparación con un dominio IgSF de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el dominio IgSF puede ser no modificado por afinidad (por ejemplo, de tipo silvestre) o haber sido modificado por afinidad. En algunas realizaciones, el dominio IgSF de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre puede ser de origen de ratón, rata, mono cynomolgus o humano, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los dominios IgSF adicionales pueden ser un dominio IgSF de un miembro de la familia IgSF establecido en la Tabla 2. En algunas realizaciones, el dominio IgSF adicional puede ser un dominio IgSF modificado por afinidad que contiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones, en comparación con un dominio IgSF contenido en un miembro de la familia IgSF establecido en la Tabla 2.
[0590] En algunas realizaciones, el dominio IgSF adicional es un dominio IgSF con afinidad modificada o sin modificación de afinidad, contenido en un miembro de la familia IgSF perteneciente a una familia seleccionada del grupo que consiste en la familia de proteínas reguladoras de señalización (SIRP), la familia de receptores desencadenantes expresados en células mieloides tipo (TREML), la familia de moléculas de adhesión celular relacionadas con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM), la familia de lectinas tipo inmunoglobulina que se unen a ácido siálico (SIGLEC), la familia butirofilina, la familia B7, la familia CD28, la familia que contiene dominio de tipo V y dominio de inmunoglobulina (VSIG), la familia con dominio transmembrana de tipo V (VSTM), la familia del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), la familia de moléculas de activación linfocítica señalizadora (SLAM), la familia de receptores similares a inmunoglobulina de leucocitos (LIR), la familia nectina (Nec), la familia similar a nectina (NECL), la familia relacionada con el receptor de poliovirus (PVR), la familia de receptores desencadenantes de citotoxicidad natural (NCR), la familia de inmunoglobulina de células T y mucina (TIM) o la familia de receptores similares a inmunoglobulina de células asesinas (KIR). En algunas realizaciones, los dominios IgSF adicionales se derivan independientemente de una proteína IgSF seleccionada del grupo que consiste en CD80(B7-1), CD86(B7-2), CD274 (PD-L1, B7-H1), PDCD1LG2(PD-L2, CD273), ICOSLG(B7RP1, CD275, ICOSL, B7-H2), CD276(B7-H3), VTCN1(B7-H4), CD28, CTLA4, PDCD1(PD-1), ICOS, BTLA(CD272), CD4, CD8A(CD8-alfa), CD8B(CD8-beta), LAG3, HAVCR2(TIM-3), CEACAM1, TIGIT, PVR(CD155), PVRL2(CD112), CD226, CD2, CD160, CD200, CD200R1(CD200R) y NCR3 (NKp30).
[0592] [0269]La primera columna de la Tabla 2 proporciona el nombre y, opcionalmente, el nombre de algunos posibles sinónimos de ese miembro concreto del IgSF. La segunda columna proporciona el identificador de proteína de la base de datos UniProtKB, una base de datos de acceso público accesible a través de Internet en uniprot.org o, en algunos casos, el número GenBank. Universal Protein Resource (UniProt) es un recurso exhaustivo de datos sobre secuencias y anotaciones de proteínas. Las bases de datos UniProt incluyen la base de conocimientos UniProt (UniProtKB). UniProt es fruto de la colaboración entre el Instituto Europeo de Bioinformática (EMBL-EBI), el Instituto Suizo de Bioinformática (SIB) y el Recurso de Información sobre Proteínas (PIR), y cuenta con el apoyo principal de una subvención de EE.UU. Institutos Nacionales de Salud (NIH). GenBank es la base de datos de secuencias genéticas de los NIH, una colección anotada de todas las secuencias de DNA disponibles públicamente (Nucleic Acids Research, 2013 Jan;41(D1):D36-42). La tercera columna indica la región en la que se encuentra el dominio IgSF indicado. La región se especifica como un intervalo en el que el dominio incluye los residuos que definen el intervalo. La columna 3 también indica la clase de dominio IgSF para la región IgSF especificada. La columna 4 muestra la región en la que se encuentran los dominios adicionales indicados (péptido señal, S; dominio extracelular, E; dominio transmembrana, T; dominio citoplasmático, C). Se entiende que la descripción de los dominios puede variar en función de los métodos utilizados para identificar o clasificar el dominio, y puede identificarse de forma diferente a partir de distintas fuentes. La descripción de los residuos correspondientes a un dominio en la Tabla 2 es sólo a título de ejemplo y pueden ser varios aminoácidos (como uno, dos, tres o cuatro) más largos o más cortos. La columna 5 indica, para algunos de los miembros del IgSF enumerados, algunos de sus socios de unión a la superficie celular afines.
[0594]
[0595] continuación
[0596]
[0597]
[0598] continuación
[0599]
[0600]
[0601] (continuación)
[0603]
[0606] En algunas realizaciones, las proteínas inmunomoduladoras proporcionadas, además de contener un polipéptido ICOSL variante, también contienen al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 dominios adicionales de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF), tales como un dominio IgD de un miembro de la familia IgSF establecido en la Tabla 2.
[0608] [0271]En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora proporcionada contiene al menos un dominio IgSF adicional (por ejemplo, un segundo dominio IgSF). En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora proporcionada contiene al menos dos dominios IgSF adicionales (por ejemplo, segundo y tercer dominio IgSF). En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora proporcionada contiene al menos tres dominios IgSF adicionales (por ejemplo, segundo, tercero y cuarto). En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora proporcionada contiene al menos cuatro dominios IgSF adicionales (por ejemplo, segundo, tercero, cuarto y quinto). En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora proporcionada contiene al menos cinco dominios IgSF adicionales (por ejemplo, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto). En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora proporcionada contiene al menos seis dominios IgSF adicionales (por ejemplo, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto y séptimo). En algunas realizaciones, cada uno de los dominios IgSF de la proteína inmunomoduladora es diferente. En algunas realizaciones, al menos uno de los dominios IgSF adicionales es el mismo que al menos otro dominio IgSF de la proteína inmunomoduladora. En algunas realizaciones, cada uno de los dominios IgSF procede o se deriva de un miembro diferente de la familia IgSF. En algunas realizaciones, al menos dos de los dominios IgSF proceden o derivan del mismo miembro de la familia IgSF.
[0610] En algunas realizaciones, el dominio IgSF adicional comprende un dominio IgV o un dominio o dominios IgC (por ejemplo, IgC2), o un fragmento de unión específico del dominio IgV o un fragmento de unión específico del dominio o dominios IgC (por ejemplo, IgC2). En algunas realizaciones, el dominio IgSF adicional es o comprende un dominio IgV de longitud completa. En algunas realizaciones, el dominio IgSF adicional es o comprende un dominio o dominios IgC de longitud completa (por ejemplo, IgC2). En algunas realizaciones, el dominio IgSF adicional es o comprende un fragmento de unión específico del dominio IgV. En algunas realizaciones, el dominio IgSF adicional es o comprende un fragmento de unión específico del dominio o dominios IgC (por ejemplo, IgC2). En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora contiene al menos dos dominios IgSF adicionales de un único (mismo) miembro IgSF. Por ejemplo, en algunos aspectos, la proteína inmunomoduladora contiene un ECD o porción del mismo de un miembro de IgSF que contiene un dominio IgV de longitud completa y un dominio o dominios IgC (por ejemplo, IgC2) de longitud completa o fragmentos de unión específicos de los mismos.
[0612] En algunas realizaciones, las proteínas inmunomoduladoras proporcionadas contienen al menos un dominio IgSF adicional (por ejemplo, un segundo o, en algunos casos, también un tercer dominio IgSF) en el que al menos un dominio IgSF adicional, por ejemplo, segundo o tercero, es un dominio IgSF establecido en un dominio IgSF de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre o un fragmento de unión específico del mismo contenido en la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 1-27 y 341. En algunas realizaciones, el dominio IgSF de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre es un dominio IgV o un dominio IgC, tal como un dominio IgC1 o IgC2.
[0614] En algunas realizaciones, las proteínas inmunomoduladoras proporcionadas, además de contener un polipéptido ICOSL variante, también contienen al menos un dominio IgSF adicional (por ejemplo a o, en algunos casos, también un tercer dominio IgSF modificado por afinidad y así sucesivamente) en el que al menos un dominio IgSF adicional es una vIgD que contiene una o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustitución, deleción o mutación) en comparación con un dominio IgSF en una referencia (por ejemplo, de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre, tal como un dominio IgSF de un miembro de la familia IgSF de la Tabla 2. En algunas realizaciones, el dominio IgSF adicional, por ejemplo, segundo o tercero, modificado por afinidad comprende al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con un dominio IgSF de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre o un fragmento de unión específico del mismo contenido en la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 1-27 y 341. En algunas realizaciones, el dominio IgSF de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre es un dominio IgV o un dominio IgC, tal como un dominio IgC1 o IgC2. En algunas realizaciones, el dominio IgSF adicional, por ejemplo, segundo o tercero, es un dominio IgV modificado por afinidad y/o un dominio IgC. En algunas realizaciones, el uno o más dominios IgSF adicionales es un dominio IgSF modificado por afinidad que contiene un dominio IgV y/o un dominio o dominios IgC (por ejemplo, IgC2), o un fragmento de unión específico del dominio IgV y/o un fragmento de unión específico del dominio o dominios IgC (por ejemplo, IgC2), en el que el dominio IgV y/o IgC contiene(n) la(s) modificación(es) aminoacídica(s) (por ejemplo, sustitución(es)). En algunas realizaciones, el dominio IgSF modificado por afinidad contiene un dominio IgV que contiene la(s) modificación(es) de aminoácidos (por ejemplo, sustitución(es)). En algunas realizaciones, el uno o más dominios IgSF adicionales modificados por afinidad incluyen dominios IgSF presentes en el ECD o una parte del ECD del miembro de la familia IgSF de referencia correspondiente, como un dominio IgV de longitud completa y un dominio o dominios IgC (por ejemplo, IgC2) de longitud completa, o fragmentos de unión específicos de los mismos, en los que uno o ambos de los dominios IgV e IgC contienen la modificación o modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustitución o sustituciones). En algunas realizaciones, el dominio particular o cada uno de los dominios particulares (por ejemplo, adicional, por ejemplo, segundo o tercer dominio IgSF) de un polipéptido de dominio IgSF variante puede ser varios aminoácidos más largo o más corto, tal como 1-10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos más largo o más corto, que la secuencia de aminoácidos establecida en la respectiva SEQ ID N.º.
[0616] En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora proporcionada contiene al menos un dominio IgSF adicional, (por ejemplo, segundo o, en algunos casos, también un tercer dominio IgSF y así sucesivamente) o segundo dominio IgSF que es un vIgD que contiene una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con un dominio IgSF (por ejemplo, IgV) de un dominio IgSF de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre distinto de ICOSL.
[0618] [0276]En algunas realizaciones, el dominio IgSF adicional o segundo contiene una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con un dominio IgSF en un dominio IgSF de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre, tal como un dominio IgSF en un miembro de la familia IgSF establecido en la Tabla 2. En algunas realizaciones, el dominio IgSF adicional o segundo modificado por afinidad comprende al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con un dominio IgSF de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre o un fragmento de unión específico del mismo contenido en la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 1-27. En algunas realizaciones, el dominio IgSF de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre es un dominio IgV o un dominio IgC, tal como un dominio IgC1 o IgC2. En algunas realizaciones, el dominio IgSF adicional o segundo es un dominio IgV modificado por afinidad o un dominio IgC. Las Tablas 3-5 proporcionan polipéptidos ejemplares que contienen uno o más dominios IgSF modificados por afinidad que pueden utilizarse en las construcciones apiladas proporcionadas en el presente documento.
[0620] En algunas realizaciones, el uno o más dominio IgSF adicional (por ejemplo, segundo dominio IgSF) es un dominio IgSF (por ejemplo, IgV) de otro miembro de la familia IgSF que se une o reconoce un antígeno tumoral. En tales realizaciones, el miembro de la familia IgSF sirve como una molécula localizadora de tumores, acercando así la vIgD de ICOSL a las células inmunitarias del microambiente tumoral. En algunas realizaciones, el dominio IgSF adicional (por ejemplo, el segundo dominio IgSF) es un dominio IgSF de NKp30, que se une o reconoce B7-H6 expresado en una célula tumoral. En algunas realizaciones, el al menos un dominio IgSF adicional (por ejemplo, el segundo), por ejemplo NKp30, es una vIgD que contiene una o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, deleciones o adiciones). En algunas realizaciones, la una o más modificaciones de aminoácidos aumentan la afinidad de unión y/o la selectividad a B7-H6 en comparación con el dominio IgSF de referencia, por ejemplo NKp30, por ejemplo en al menos o aproximadamente 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces o 50 veces.
[0623]
[0624] (continuación)
[0625]
[0626] (continuación)
[0628]
[0629]
[0630] (continuación)
[0633]
[0637]
[0639] El número de tales dominios IgSF modificados por afinidad o no modificados por afinidad presentes en una construcción de proteína inmunomoduladora "apilada" (ya sean combinaciones de tipo no silvestre o disposiciones de tipo no silvestre) es de al menos 2, 3, 4 o 5 y en algunas realizaciones exactamente 2, 3, 4 o 5 dominios IgSF (por lo que la determinación del número de dominios IgSF modificados por afinidad no tiene en cuenta ninguna secuencia fraccional de unión no específica de los mismos y/o secuencias fraccionales sustancialmente inmunológicamente inactivas de los mismos).
[0640] En algunas realizaciones de una proteína inmunomoduladora apilada proporcionada en el presente documento, el número de dominios IgSF es al menos 2, donde el número de dominios IgSF modificados por afinidad y el número de dominios IgSF no modificados por afinidad es cada uno independientemente al menos: 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Así, el número de dominios IgSF modificados por afinidad y el número de dominios IgSF no modificados por afinidad, respectivamente, (dominio IgSF modificado por afinidad: dominio IgSF no modificado por afinidad), puede ser exactamente o como mínimo: 2:0 (afinidad modificada: tipo silvestre), 0:2, 2:1, 1:2, 2:2, 2:3, 3:2, 2:4, 4:2, 1:1, 1:3, 3:1, 1:4, 4:1, 1:5 o 5:1.
[0641] En algunas realizaciones de una proteína inmunomoduladora apilada, al menos dos de los dominios IgSF no modificados por afinidad y/o modificados por afinidad son dominios IgSF idénticos.
[0642] En algunas realizaciones, una proteína inmunomoduladora apilada proporcionada en el presente documento comprende al menos dos dominios IgSF modificados por afinidad y/o no modificados por afinidad de un único miembro IgSF pero en una disposición de tipo no silvestre (alternativamente, "permutación"). Un ejemplo ilustrativo de una disposición o permutación no de tipo silvestre es una proteína inmunomoduladora que comprende un orden no de tipo silvestre de secuencias de dominio IgSF modificadas por afinidad y/o no modificadas por afinidad en relación con las que se encuentran en el ICOSL de tipo silvestre cuyas secuencias de dominio IgSF sirvieron como fuente de los dominios IgSF variantes según se proporciona en el presente documento. Así, en un ejemplo, la proteína inmunomoduladora puede comprender una IgV proximal y una IgC distal al dominio transmembrana aunque en una forma modificada sin afinidad y/o modificada con afinidad. La presencia, en una proteína inmunomoduladora proporcionada en el presente documento, de combinaciones de tipo no silvestre y disposiciones de tipo no silvestre de dominios IgSF modificados por afinidad y/o no modificados por afinidad también está dentro del ámbito de la materia proporcionada.
[0643] [0282]En algunas realizaciones de una proteína inmunomoduladora apilada, los dominios IgSF no modificados por afinidad y/o modificados por afinidad son dominios IgSF no idénticos (es decir, diferentes). Los dominios IgSF modificados por afinidad no idénticos se unen específicamente, en condiciones de unión específicas, a diferentes socios de unión afines y son "no idénticos" independientemente de si los dominios IgSF de referencia (por ejemplo, no modificados) o de tipo silvestre a partir de los cuales se han modificado genéticamente eran los mismos. Así, por ejemplo, una combinación de tipo no silvestre de al menos dos dominios IgSF no idénticos en una proteína inmunomoduladora puede comprender al menos una secuencia de dominio IgSF cuyo origen sea de y exclusivo de un ICOSL, y al menos una de una segunda secuencia de dominio IgSF cuyo origen sea de y exclusivo de otro miembro de la familia IgSF que no sea ICOSL, en la que los dominios IgSF de la proteína inmunomoduladora estén en forma modificada por afinidad y/o no modificada por afinidad. Sin embargo, en realizaciones alternativas, los dos dominios IgSF no idénticos se originan a partir de la misma secuencia de dominio IgSF, pero al menos uno está modificado por afinidad de manera que se unen específicamente a diferentes socios de unión afines.
[0645] Una pluralidad de dominios IgSF modificados por afinidad y/o no modificados por afinidad en una cadena polipeptídica de proteína inmunomoduladora apilada no necesita estar unida covalentemente de forma directa entre sí. En algunas realizaciones, un tramo intermedio de uno o más residuos de aminoácidos une indirectamente de forma covalente los dominios IgSF modificados sin afinidad y/o modificados por afinidad entre sí. La unión puede ser a través de los residuos N-terminal a C-terminal.
[0647] En algunas realizaciones, la unión puede hacerse a través de cadenas laterales de residuos de aminoácidos que no están localizados en el N-terminal o C-terminal del dominio IgSF no modificado por afinidad y/o modificado por afinidad. Así, los enlaces pueden realizarse a través de residuos de aminoácidos terminales o internos, o combinaciones de los mismos.
[0649] En algunas realizaciones, los dos o más dominios IgSF, incluyendo un vIgD de ICOSL y uno o más dominios IgSF adicionales (por ejemplo, la segunda o tercera variante del dominio IgSF) de otro miembro de la familia IgSF, están unidos covalentemente o no covalentemente. En algunas realizaciones, los dos o más dominios IgSF están unidos directa o indirectamente, como por ejemplo mediante un enlazador. En algunas realizaciones, un tramo intermedio de uno o más residuos de aminoácidos une covalentemente de forma indirecta los dominios IgSF entre sí. La unión puede ser a través de los residuos N-terminal a C-terminal. En algunas realizaciones, la unión puede hacerse a través de cadenas laterales de residuos de aminoácidos que no están situados en el N-terminal o el C-terminal del (de los) dominio(s) IgSF. Así, los enlaces pueden realizarse a través de residuos de aminoácidos terminales o internos, o combinaciones de los mismos.
[0651] En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora contiene al menos dos dominios IgSF, cada uno unido directa o indirectamente a través de un enlazador. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora contiene al menos tres proteínas inmunomoduladoras, cada una de ellas unida directa o indirectamente a través de un enlazador. En laFIG.16A y 16B.
[0653] En algunas realizaciones, uno o más "enlazadores peptídicos" enlazan la vIgD de ICOSL y uno o más dominios IgSF adicionales (por ejemplo, la segunda o tercera variante del dominio IgSF). En algunas realizaciones, un enlazador peptídico puede tener un solo residuo de aminoácido o una longitud mayor. En algunas realizaciones, el enlazador peptídico tiene al menos un residuo de aminoácido, pero no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 residuo de aminoácido de longitud. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador flexible. En algunas realizaciones, el enlazador es (en código de aminoácidos de una letra): GGGGS ("4GS"; SEQ ID N.º: 636) o multímeros del enlazador 4GS, como repeticiones de 2, 3, 4 o 5 enlazadores 4GS. En algunas realizaciones, el enlazador peptídico es (GGGGS)<2>o (GGGGS)<3>como se establece en SEQ ID N.º: 229 y 228, respectivamente. En algunas realizaciones, el enlazador también puede incluir una serie de residuos de alanina solos o además de otro enlazador peptídico (como un enlazador 4GS o un multímero del mismo). En algunas realizaciones, el número de residuos de alanina en cada serie es: 2, 3, 4, 5 o 6 alaninas. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador rígido. Por ejemplo, el enlazador es un enlazador α-helicoidal. En algunas realizaciones, el enlazador es (en código de aminoácidos de una letra): EAAAK o multímeros del enlazador EAAAK, como repeticiones de 2, 3, 4 ó 5 enlazadores EAAAK, como los expuestos en SEQ ID N.º: 629 (1xEAAAK), SEQ ID N.º: 630 (3xEAAAK) o SEQ ID N.º: 631 (5xEAAAK). En algunas realizaciones, el enlazador puede incluir además aminoácidos introducidos por clonación y/o a partir de un sitio de restricción, por ejemplo, el enlazador puede incluir los aminoácidos GS (en código de aminoácidos de una letra) introducidos mediante el uso del sitio de restricción BAMHI. En algunas realizaciones, el enlazador (en código de aminoácidos de una letra) es GSGGGGS (SEQ ID N.º: 635). En algunos ejemplos, el enlazador es un 2xGGGGS seguido de tres alaninas (GGGGSGGGGSAAA; SEQ ID N.º: 230).
[0655] En algunas realizaciones, los dominios IgSF modificados sin afinidad y/o modificados por afinidad están unidos por "enlazadores peptídicos de tipo silvestre" insertados en el N-terminal y/o C-terminal de un segundo dominio IgSF modificado sin afinidad y/o modificado por afinidad. En algunas realizaciones, está presente un enlazador peptídico principal insertado en el N-terminal del primer dominio IgSF y/o una primera secuencia de arrastre insertada en el C-terminal del primer dominio IgSF no modificado por afinidad y/o modificado por afinidad. En algunas realizaciones, está presente un segundo enlazador peptídico principal insertado en el N-terminal del segundo dominio IgSF y/o una segunda secuencia final insertada en el C-terminal del segundo dominio IgSF modificado sin afinidad y/o modificado con afinidad. Cuando los dominios IgSF modificados por afinidad y/o modificados por afinidad primero y segundo se derivan de la misma proteína parental y se conectan en la misma orientación, los enlazadores peptídicos de tipo silvestre entre los dominios IgSF modificados por afinidad y/o modificados por afinidad primero y segundo no se duplican. Por ejemplo, cuando el primer enlazador peptídico de arrastre de tipo silvestre y el segundo enlazador peptídico de arrastre de tipo silvestre son iguales, la proteína inmunomoduladora de tipo II no comprende ni el primer enlazador peptídico de arrastre de tipo silvestre ni el segundo enlazador peptídico de arrastre de tipo silvestre.
[0657] [0289]En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora de tipo II comprende un primer enlazador peptídico líder de tipo silvestre insertado en el N-terminal del primer dominio IgSF modificado sin afinidad y/o modificado con afinidad, en el que el primer enlazador peptídico líder de tipo silvestre comprende al menos 5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 6, 7.8.9.10.11.12.13.14.15 o más) aminoácidos consecutivos de la secuencia interviniente en la proteína de tipo silvestre de la que el primer dominio IgSF modificado sin afinidad y/o modificado con afinidad procede, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o más) aminoácidos consecutivos de la secuencia intermedia en la proteína de tipo silvestre de la que se deriva el primer dominio IgSF modificado sin afinidad y/o modificado por afinidad entre el dominio IgSF parental y el dominio inmediatamente precedente (tal como un péptido señal o un dominio IgSF). En algunas realizaciones, el primer enlazador peptídico principal de tipo silvestre comprende toda la secuencia intermedia en la proteína de tipo silvestre de la que se deriva el primer dominio IgSF no modificado por afinidad y/o modificado por afinidad entre el dominio IgSF parental y el dominio inmediatamente precedente (tal como un péptido señal o un dominio IgSF).
[0659] En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora de tipo II comprende además un primer enlazador peptídico de tipo silvestre insertado en el extremo C-terminal del primer dominio IgSF modificado sin afinidad y/o modificado con afinidad, en el que el primer enlazador peptídico de tipo silvestre comprende al menos 5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 6., 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o más) aminoácidos consecutivos de la secuencia intermedia en la proteína de tipo silvestre de la que se deriva el primer dominio IgSF modificado sin afinidad y/o modificado por afinidad entre el dominio IgSF parental y el dominio inmediatamente siguiente (tal como un dominio IgSF o un dominio transmembrana). En algunas realizaciones, el primer enlazador peptídico de tipo silvestre de arrastre comprende toda la secuencia intermedia en la proteína de tipo silvestre de la que se deriva el primer dominio IgSF no modificado por afinidad y/o modificado por afinidad entre el dominio IgSF parental y el dominio inmediatamente siguiente (tal como un dominio IgSF o un dominio transmembrana).
[0661] En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora de Tipo II comprende además un segundo enlazador peptídico líder de tipo silvestre insertado en el N-terminal del segundo dominio IgSF modificado sin afinidad y/o modificado con afinidad, en el que el segundo enlazador peptídico líder de tipo silvestre comprende al menos 5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 6., 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o más) aminoácidos consecutivos de la secuencia intermedia en la proteína de tipo silvestre de la que se deriva el segundo dominio IgSF modificado sin afinidad y/o modificado por afinidad entre el dominio IgSF parental y el dominio inmediatamente precedente (tal como un péptido señal o un dominio IgSF). En algunas realizaciones, el segundo péptido enlazador principal de tipo silvestre comprende toda la secuencia intermedia en la proteína de tipo silvestre de la que se deriva el segundo dominio IgSF no modificado por afinidad y/o modificado por afinidad entre el dominio IgSF parental y el dominio inmediatamente precedente (tal como un péptido señal o un dominio IgSF).
[0663] En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora de tipo II comprende además un segundo enlazador peptídico de tipo silvestre insertado en el extremo C-terminal del segundo dominio IgSF modificado sin afinidad y/o modificado con afinidad, en el que el segundo enlazador peptídico de tipo silvestre comprende al menos 5 (como al menos cualquiera de 6., 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o más) aminoácidos consecutivos de la secuencia intermedia en la proteína de tipo silvestre de la que se deriva el segundo dominio IgSF modificado sin afinidad y/o modificado por afinidad entre el dominio IgSF parental y el dominio inmediatamente siguiente (tal como un dominio IgSF o un dominio transmembrana). En algunas realizaciones, el segundo enlazador peptídico de tipo silvestre de arrastre comprende toda la secuencia intermedia en la proteína de tipo silvestre de la que se deriva el segundo dominio IgSF no modificado por afinidad y/o modificado por afinidad entre el dominio IgSF parental y el dominio inmediatamente siguiente (tal como un dominio IgSF o un dominio transmembrana).
[0665] En SEQ ID N.º:231 y SEQ ID N.º:232 se presenta un ejemplo de secuencia inicial y secuencia final para una proteína de tipo II que contiene un dominio CD80 IgSF. Un ejemplo de secuencia inicial y secuencia final para una proteína de tipo II que contiene un dominio IgSF de ICOSL se expone en SEQ ID N.º: 233 y 234. Un ejemplo de secuencia inicial y secuencia final para una proteína de tipo II que contiene un dominio IgSF de CD86 se expone en cualquiera de los SEQ ID N.º: 236-238. Un ejemplo de secuencia enlazadora de tipo silvestre para una proteína de tipo II que contiene un dominio IgSF NKp30 se expone en SEQ ID N.º: 235.
[0667] 1. Monovalente
[0669] Aquí se proporcionan proteínas inmunomoduladoras que contienen una variante del polipéptido ICOSL que es monovalente. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante de la proteína inmunomoduladora monovalente está unido, directa o indirectamente, a otra fracción. En algunas realizaciones, la fracción adicional es una proteína, un péptido, una molécula pequeña o un ácido nucleico. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora monovalente es una proteína de fusión.
[0671] En algunas realizaciones, la fracción es una molécula que prolonga la vida media. Ejemplos de tales moléculas prolongadoras de la semivida incluyen, pero no se limitan a, albúmina, un polipéptido de unión a albúmina, Pro/Ala/Ser (PAS), un péptido C-terminal (CTP) de la subunidad beta de la gonadotropina coriónica humana, polietilenglicol (PEG), secuencias hidrofílicas largas no estructuradas de aminoácidos (XTEN), hidroxietilalmidón (HES), una pequeña molécula de unión a albúmina, o una combinación de las mismas.
[0673] [0296]En algunas realizaciones, el polipéptido inmunomodulador que comprende una variante ICOSL puede incluir secuencias polipeptídicas conformacionalmente desordenadas compuestas por los aminoácidos Pro, Ala y Ser (Véase, por ejemplo, documento WO2008/155134; SEQ ID N.º: 904). En algunos casos, la repetición de aminoácidos es de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más residuos de aminoácidos, donde cada repetición comprende (un) residuo(s) Ala, Ser y Pro. Así, se proporciona en el presente documento una proteína inmunomoduladora es una proteína PASilada en la que el polipéptido variante ICOSL está unido, directa o indirectamente a través de un enlazador, a Pro/Ala/Ser (PAS). En algunas realizaciones, pueden utilizarse una o más estructuras enlazadoras adicionales.
[0675] En algunas realizaciones, la fracción facilita la detección o purificación de la variante del polipéptido ICOSL. En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador comprende una etiqueta o dominio de fusión, por ejemplo, etiqueta de afinidad o purificación, unida, directa o indirectamente, al N- y/o c-terminal del polipéptido ICOSL. Se conocen varias etiquetas polipeptídicas y/o dominios de fusión adecuados, que incluyen, entre otros, una etiqueta de poli-histidina (His), una etiqueta FLAG (SEQ ID N.º: 865), una etiqueta Myc y etiquetas de proteínas fluorescentes (por ejemplo, EGFP, según SEQ ID N.º: 858, 859 o 896). En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador que comprende una variante ICOSL comprende al menos seis residuos de histidina (establecidos en SEQ ID N.º: 864). En algunos casos, el polipéptido inmunomodulador que comprende una variante ICOSL comprende además diversas combinaciones de moléculas. Por ejemplo, el polipéptido inmunomodulador que comprende una variante ICOSL comprende además una o más etiquetas de polihistidina y FLAG.
[0677] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL está unido a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina modificada (Fc) que permanece en forma monovalente tal como se establece en SEQ ID N.º: 472.
[0679] 2. Bivalente
[0681] En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora que contiene una variante ICOSL es multivalente, tal como bivalente. En algunos aspectos, la proteína inmunomoduladora está unida, directa o indirectamente a través de un enlazador, a un dominio de multimerización. En algunos aspectos, el dominio de mutlimerización aumenta la semivida de la molécula.
[0683] La interacción de dos o más polipéptidos ICOSL variantes puede facilitarse mediante su unión, directa o indirecta, a cualquier fracción u otro polipéptido que sean capaces de interactuar para formar una estructura estable. Por ejemplo, cadenas polipeptídicas ICOSL variantes codificadas separadas pueden unirse por multimerización, por lo que la multimerización de los polipéptidos está mediada por un dominio de multimerización. Típicamente, el dominio de multimerización proporciona la formación de una interacción proteína-proteína estable entre una primera variante del polipéptido ICOSL y una segunda variante del polipéptido ICOSL. Pueden generarse polipéptidos homo o heteromultiméricos a partir de la coexpresión de polipéptidos ICOSL variantes separados. La primera y la segunda variante de polipéptidos ICOSL pueden ser iguales o diferentes.
[0685] En algunas realizaciones, un dominio de multimerización incluye cualquiera capaz de formar una interacción proteína-proteína estable. Los dominios de multimerización pueden interactuar a través de una secuencia de inmunoglobulina (por ejemplo, dominio Fc; véase, por ejemplo, Pub. de Patente Internacional N.º WO 93/10151 y WO 2005/063816 EE.UU.; EE.UU. Pub. de EE. UU. N.º 2006/0024298; Pat. de EE. UU. Nº 5.457.035); cremallera de leucina (por ejemplo, de las proteínas transformadoras nucleares fos y jun o del protooncogen c-myc o del Control General del Nitrógeno (GCN4)) (por ejemplo, Busch y Sassone-Corsi (1990) Trends Genetics, 6:36-40; Gentz et al., (1989) Science, 243:1695-1699); una región hidrofóbica; una región hidrofílica; o un tiol libre que forma un enlace disulfuro intermolecular entre las moléculas quiméricas de un homo- o heteromultimero. Además, un dominio de multimerización puede incluir una secuencia de aminoácidos que comprende una protuberancia complementaria a una secuencia de aminoácidos que comprende un agujero, tal como se describe, por ejemplo, en Pat. de EE. UU. N.º 5.731.168; Pub. de Patente Internacional N.º WO 98/50431 y WO 2005/063816; Ridgway et al. 1996, Protein Engineering 9:617-621). Dicha región de multimerización puede modificarse genéticamente de forma que las interacciones estéricas no sólo promuevan una interacción estable, sino que además promuevan la formación de heterodímeros frente a homodímeros a partir de una mezcla de monómeros quiméricos. Generalmente, las protuberancias se construyen sustituyendo pequeñas cadenas laterales de aminoácidos de la interfaz del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Las cavidades compensatorias de tamaño idéntico o similar a las protuberancias se crean opcionalmente en la interfaz del segundo polipéptido mediante la sustitución de grandes cadenas laterales de aminoácidos por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). A continuación se describen dominios de multimerización ejemplares.
[0687] El polipéptido ICOSL variante puede unirse en cualquier lugar, pero típicamente a través de su N- o C-terminal, al N- o C-terminal de un dominio de multimerización para formar un polipéptido quimérico. El enlace puede ser directo o indirecto a través de un enlazador. Asimismo, el polipéptido quimérico puede ser una proteína de fusión o puede formarse por enlace químico, por ejemplo mediante interacciones covalentes o no covalentes. Por ejemplo, cuando se prepara un polipéptido quimérico que contiene un dominio de multimerización, el ácido nucleico que codifica la totalidad o parte de una variante del polipéptido ICOSL puede unirse de forma operable al ácido nucleico que codifica la secuencia del dominio de multimerización, directa o indirectamente u opcionalmente a través de un dominio enlazador. En algunos casos, la construcción codifica una proteína quimérica en la que el C-terminal del polipéptido ICOSL variante se une al N-terminal del dominio de multimerización. En algunos casos, una construcción puede codificar una proteína quimérica en la que el N-terminal del polipéptido ICOSL variante se une al N-terminal o al C-terminal del dominio de multimerización.
[0688] Un multímero polipeptídico contiene dos proteínas quiméricas creadas mediante la unión, directa o indirecta, de dos polipéptidos ICOSL variantes iguales o diferentes, directa o indirectamente, a un dominio de multimerización. En algunos ejemplos, cuando el dominio de multimerización es un polipéptido, se inserta en un vector de expresión apropiado una fusión génica que codifica la variante del polipéptido ICOSL y el dominio de multimerización. La proteína quimérica o de fusión resultante puede expresarse en células huésped transformadas con el vector de expresión recombinante, y se le permite ensamblarse en multímeros, donde los dominios de multimerización interactúan para formar polipéptidos multivalentes. La unión química de los dominios de multimerización a polipéptidos ICOSL variantes puede efectuarse utilizando enlazadores heterobifuncionales.
[0690] Los polipéptidos quiméricos resultantes, como las proteínas de fusión, y los multímeros formados a partir de ellas, pueden purificarse por cualquier método adecuado como, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad sobre columnas de proteína A o proteína G. Cuando dos moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos diferentes se transforman en células, se produce la formación de homo- y heterodímeros. Las condiciones de expresión pueden ajustarse de modo que se favorezca la formación de heterodímeros frente a la de homodímeros.
[0692] Dominio de inmunoglobulina
[0694] En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora comprende un polipéptido ICOSL variante unido a una región Fc de una inmunoglobulina (dando lugar a una "fusión Fc inmunomoduladora", como una "fusión ICOSL-Fc variante", también denominada fusión ICOSL vIgD-Fc). En algunas realizaciones, la fusión variante ICOSL-Fc también comprende uno o más dominio(s) IgSF adicional(es), como uno o más vIgD adicional(es) unido(s) a un vIgD de ICOSL. En algunas realizaciones, la unión del polipéptido ICOSL variante o del dominio IgSF adicional se produce en el extremo N-terminal del Fc. En algunas realizaciones, la unión de la variante ICOSL o del polipéptido de dominio IgSF adicional es en el C-terminal del Fc. En algunas realizaciones, dos o más polipéptidos ICOSL o variantes adicionales del dominio IgSF (iguales o diferentes) se unen independientemente en el N-terminal y en el C-terminal.
[0696] En algunas realizaciones, el Fc es Fc murino o humano. En algunas realizaciones, el Fc es una región Fc IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 de mamífero o humana. En algunas realizaciones, el Fc se deriva de IgG1, como IgG1 humana. En algunas realizaciones, el Fc comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 226, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID Nº: 226.
[0698] En algunas realizaciones, la región Fc contiene una modificación más para alterar (por ejemplo, reducir) una o más de sus funciones normales. En general, la región Fc es responsable de funciones efectoras, como la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), además de la capacidad de unión al antígeno, que es la función principal de las inmunoglobulinas. Además, la secuencia FcRn presente en la región Fc desempeña la función de regular el nivel de IgG en el suero aumentando la semivida in vivo mediante la conjugación con un receptor FcRn in vivo. En algunas realizaciones, dichas funciones pueden reducirse o alterarse en un Fc para su uso con las proteínas de fusión Fc proporcionadas.
[0700] En algunas realizaciones, pueden introducirse una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de una fusión variante ICOSL-Fc proporcionada en el presente documento, generando así una variante de la región Fc. En algunas realizaciones, la variante de la región Fc tiene una función efectora disminuida. Hay muchos ejemplos de cambios o mutaciones en las secuencias Fc que pueden alterar la función efectora. Por ejemplo, WO 2000/42072, WO2006/019447, WO2012/125850, WO2015/107026, US2016/0017041 y Shields et al. J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) describen variantes ejemplares de Fc con unión mejorada o disminuida a los FcR.
[0702] [0309]En algunas realizaciones, las fusiones variantes ICOSL-Fc proporcionadas comprenden una región Fc que exhibe funciones efectoras reducidas (también denominada Fc inerte o Fc sin efector), lo que la convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida de la fusión variante ICOSL-Fcin vivoes importante pero ciertas funciones efectoras (como CDC y ADCC) son innecesarias o deletéreas. Pueden realizarse ensayos de citotoxicidadin vitroy/oin vivopara confirmar la reducción/eliminación de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, pueden realizarse ensayos de unión al receptor Fc (FcR) para garantizar que la fusión de la variante ICOSL-Fc carece de unión al FcγR (por lo que probablemente carezca de actividad ADCC), pero conserva la capacidad de unión al FcRn. Las células primarias mediadoras de la ADCC, las células NK, expresan únicamente FcγRIII, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcγRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991). Ejemplos no limitantes de ensayosin vitropara evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describen en Pat. de EE. UU. Nº 5.500.362 (véase,por ejemplo,Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); Pat. de EE. UU. N.º 5,821,337 (véase Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Como alternativa, pueden emplearse métodos de ensayo no radiactivos (véase, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radiactivo para citometría de flujo ACTI<™>(Cell Technology, Inc. Mountain View, Calif.; y ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96<™>(Promega, Madison, Wis.). Entre las células efectoras útiles para estos ensayos se encuentran las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células asesinas naturales (NK). Alternativa o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarsein vivo, por ejemplo,en un modelo animal como el divulgado en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 95:652-656(1998): También pueden realizarse ensayos de unión a C1q para confirmar que la fusión de la variante ICOSL-Fc es incapaz de unirse a C1q y, por tanto, carece de actividad CDC. Véanse,por ejemplo, los ELISA de unión a C1q y C3c en WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M. S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M. S. and M. J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Las determinaciones de la unión del FcRn y del aclaramiento/vida mediain vivotambién pueden realizarse mediante métodos conocidos en la técnica (véase, porejemplo,Petkova, S. B. et al., Int'l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006)).
[0704] Las fusiones variantes ICOSL-Fc con función efectora reducida incluyen aquellas con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 por numeración UE ( Pat. de EE. UU. N.º 6,737,056). Dichos mutantes Fc incluyen mutantes Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327 según la numeración UE, incluido el denominado mutante Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina ( Pat. de EE. UU. N.º 7,332,581).
[0706] En algunas realizaciones, la región Fc de las fusiones variantes ICOSL-Fc tiene una región Fc en la que uno o más de los aminoácidos en las posiciones 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325 y 329 (indicados por la numeración UE) se sustituyen con aminoácidos diferentes en comparación con la región Fc nativa. Tales alteraciones de la región Fc no se limitan a las alteraciones descritas anteriormente, e incluyen, por ejemplo, alteraciones tales como cadenas deglicosiladas (N297A y N297Q), IgG1-N297G, IgG1-L234A/L235A, IgG1-L234A/L235E/G237A, IgG1-A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG1-S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A, e IgG4-L236E descritas en Current Opinion in Biotechnology (2009) 20 (6), 685-691; alteraciones como G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R, y N325LL328R descritas en WO 2008/092117; inserciones de aminoácidos en las posiciones 233, 234, 235, y 237 (indicadas por la numeración EU); y alteraciones en los sitios descritos en WO 2000/042072.
[0708] Se describen ciertas variantes de Fc con unión mejorada o disminuida a FcRs.Véase,por ejemplo, Pat. de EE. UU. N.º 6,737,056; WO 2004/056312, WO2006/01944 y Shields et al., J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001).)
[0710] En algunas realizaciones, se proporciona una fusión variante ICOSL-Fc que comprende una región Fc variante que comprende una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la semivida y/o mejoran la unión al receptor Fc neonatal (FcRn). Los anticuerpos con mayor vida media y mejor unión al FcRn se describen en US2005/0014934A1 (Hinton et al.) o WO2015107026. Dichos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc al FcRn. Dichas variantes Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434 por numeración UE, por ejemplo, sustitución del residuo 434 de la región Fc ( Pat. de EE. UU. N.º 7,371,826).
[0712] En algunas realizaciones, la región Fc de una fusión variante ICOSL-Fc comprende una o más sustituciones de aminoácidos E356D y M358L por numeración UE. En algunas realizaciones, la región Fc de una fusión variante ICOSL-Fc comprende una o más sustituciones de aminoácidos C220S, C226S, y/o C229S por numeración UE. En algunas realizaciones, la región Fc de una variante de fusión ICOSL comprende una o más sustituciones de aminoácidos R292C y V302C.Véasetambién Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); Pat. de EE. UU. N.º 5.648.260; Pat. de EE. UU. Nº 5.624.821; y WO 94/29351 relativos a otros ejemplos de variantes de la región Fc.
[0714] En algunas realizaciones, el Fc IgG1 de tipo silvestre puede ser el Fc establecido en SEQ ID N.º: 226 que tengan un alotipo que contenga residuos Glu (E) y Met (M) en las posiciones 356 y 358 según la numeración UE (por ejemplo, alotipo f). En otras realizaciones, la IgG1 Fc de tipo silvestre contiene aminoácidos del alotipo humano G1m1, como residuos que contienen Asp (D) y Leu (L) en las posiciones 356 y 358, por ejemplo, como se establece en SEQ ID N.º: 927. Así, en algunos casos, un Fc proporcionado en el presente documento puede contener sustituciones de aminoácidos E356D y M358L para reconstituir residuos del alotipo G1 m1 (por ejemplo, alotipo alfa). En algunos aspectos, un Fc de tipo silvestre se modifica mediante una o más sustituciones de aminoácidos para reducir la actividad efectora o para hacer que el Fc sea inerte para la función efectora del Fc. Las mutaciones sin efector o inertes ejemplares incluyen las descritas en el presente documento. Entre las mutaciones sin efector que pueden incluirse en un Fc de las construcciones proporcionadas en el presente documento se encuentran L234A, L235E y G237A por numeración UE. En algunas realizaciones, un Fc de tipo silvestre se modifica adicionalmente mediante la eliminación de uno o más residuos de cisteína, como por ejemplo mediante la sustitución de los residuos de cisteína por un residuo de serina en la posición 220 (C220S) por numeración UE. Las regiones Fc inertes ejemplares con función efectora reducida se exponen en SEQ ID N.º: 633 o 477 y SEQ ID N.º: 474 o 637, que se basan en los alotipos establecidos en SEQ ID N.º: 226 o SEQ ID N.º: 927), respectivamente. En algunas realizaciones, una región Fc utilizada en una construcción proporcionada en el presente documento puede carecer además de un residuo de lisina C-terminal.
[0716] En algunas realizaciones, se realizan alteraciones en la región Fc que resultan en una disminución de la unión a C1q y/o Citotoxicidad Dependiente del Complemento (CDC),por ejemplo,como se describe en Pat. de EE. UU. Nº 6.194.551, WO 99/51642, y Idusogie et al., J. Immunol.164: 4178-4184 (2000).
[0718] [0317]En algunas realizaciones, se proporciona una fusión variante ICOSL-Fc que comprende una región Fc variante que comprende una o más modificaciones de aminoácidos, en la que la región Fc variante se deriva de IgG1, tal como IgG1 humana. En algunas realizaciones, la región Fc variante se deriva de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 226. En algunas realizaciones, el Fc presenta una función efectora reducida. En algunas realizaciones, el Fc contiene al menos una sustitución de aminoácidos que es N82G según la numeración de SEQ ID N.º: 226 (correspondiente a N297G según la numeración de la UE). En algunas realizaciones, el Fc contiene además al menos una sustitución de aminoácidos que es R77C o V87C según la numeración de SEQ ID N.º: 226 (correspondiente a R292C o V302C según la numeración de la UE). En algunas realizaciones, la región Fc variante comprende además una modificación del aminoácido C5S por numeración de SEQ ID N.º: 226 (correspondiente al C220S según la numeración de la UE). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la región Fc variante comprende las siguientes modificaciones de aminoácidos: V297G y una o más de las siguientes modificaciones de aminoácidos C220S, R292C o V302C por numeración UE (correspondiente a N82G y una o más de las siguientes modificaciones de aminoácidos C5S, R77C o V87C con referencia a SEQ ID N.º:226), por ejemplo, la región Fc comprende la secuencia establecida en SEQ ID N.º:476. En algunas realizaciones, la región Fc variante comprende una o más de las modificaciones de aminoácidos C220S, L234A, L235E o G237A, por ejemplo, la región Fc comprende la secuencia establecida en SEQ ID N.º:477. En algunas realizaciones, la variante de la región Fc comprende una o más de las modificaciones de aminoácidos C220S, E233P, L234V, L235A, G236del o S267K, por ejemplo, la región Fc comprende la secuencia establecida en SEQ ID N.º:478. En algunas realizaciones, la variante Fc comprende una o más de las modificaciones de aminoácidos C220S, L234A, L235E, G237A, E356D o M358L, por ejemplo, la región Fc comprende la secuencia establecida en SEQ ID N.º:474.
[0720] En algunas realizaciones, la región Fc carece de la lisina C-terminal correspondiente a la posición 232 del Fc de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre establecido en SEQ ID N.º: 56 (correspondiente a K447del según la numeración de la UE). En algunas realizaciones, debido a que la lisina C-terminal puede eliminarse diferencialmente durante la biosíntesis, la eliminación del residuo de lisina C-terminal da como resultado un producto más homogéneo cuando la proteína se expresa en células. En algunos aspectos, dicha región Fc puede incluir adicionalmente una o más modificaciones adicionales, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos, como cualquiera de las descritas. Un ejemplo de dicha región Fc es la SEQ ID N.º: 632, 633, 634 o 637.
[0722] En algunas realizaciones, se proporciona una fusión variante ICOSL-Fc que comprende una región Fc variante en la que la Fc variante comprende la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º:474, 476, 477, 478, 507, 632, 633, 634, o 637 o una secuencia de aminoácidos que presenta al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID N.º: 474, 476, 477, 478, 507, 632, 633, 634 o 637. En algunas realizaciones, el Fc presenta una función efectora reducida.
[0724] En algunas realizaciones, el Fc se deriva de IgG2, como IgG2 humana. En algunas realizaciones, el Fc comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 227, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID Nº: 227.
[0726] En algunas realizaciones, el Fc comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 505, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID Nº: 505. En algunas realizaciones, el Fc de IgG4 es un Fc estabilizado en el que el dominio CH3 de IgG4 humana se sustituye con el dominio CH3 de IgG1 humana y que muestra una formación de agregados inhibida, un anticuerpo en el que los dominios CH3 y CH2 de IgG4 humana se sustituyen con los dominios CH3 y CH2 de IgG1 humana, respectivamente, o un anticuerpo en el que la arginina en la posición 409 indicada en el índice UE propuesto por Kabat et al. de IgG4 humana se sustituye por lisina y que muestra una formación de agregados inhibida (véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. N.º 8,911,726). En algunas realizaciones, el Fc es una IgG4 que contiene la mutación S228P, que se ha demostrado que impide la recombinación entre un anticuerpo terapéutico y una IgG4 endógena por intercambio del brazo Fab (véase, por ejemplo, Labrijin et al. (2009) Nat. Biotechnol., 27(8)767-71.) En algunas realizaciones, el Fc comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 506, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID Nº: 506.
[0728] [0322]En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante está directamente unido a la secuencia Fc. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante está unido indirectamente a la secuencia Fc, por ejemplo mediante un enlazador. En algunas realizaciones, uno o más "enlazadores peptídicos" enlazan el polipéptido ICOSL variante y el dominio Fc. En algunas realizaciones, un enlazador peptídico puede tener un solo residuo de aminoácido o una longitud mayor. En algunas realizaciones, el enlazador peptídico tiene al menos un residuo de aminoácido, pero no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 residuo de aminoácido de longitud. En algunas realizaciones, el enlazador es de tres alaninas (AAA). En algunas realizaciones, el enlazador es (en código de aminoácidos de una letra): GGGGS ("4GS"; SEQ ID N.º:636) o multímeros del enlazador 4GS, como repeticiones de 2, 3, 4, 5 ó 6 enlazadores 4GS, como los expuestos en SEQ ID N.º: 229 (2xGGGGS) o SEQ ID N.º: 228 (3xGGGGS). En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador rígido. Por ejemplo, el enlazador es un enlazador α-helicoidal. En algunas realizaciones, el enlazador es (en código de aminoácidos de una letra): EAAAK o multímeros del enlazador EAAAK, como repeticiones de 2, 3, 4 ó 5 enlazadores 4GS, como los expuestos en SEQ ID N.º: 629 (EAAAK) o SEQ ID N.º: 630 (3xEAAAK) o SEQ ID N.º: 631 (5xEAAAK). En algunas realizaciones, los enlazadores comienzan con una o más unidades EAAAK y pueden alargarse mediante la adición de secuencias A, AA, AAA, AAAA, EAAAA y EAAAK. En algunas realizaciones, el enlazador puede incluir además aminoácidos introducidos por clonación y/o a partir de un sitio de restricción, por ejemplo, el enlazador puede incluir los aminoácidos GS (en código de aminoácidos de una letra) introducidos mediante el uso del sitio de restricción BAMHI. En algunas realizaciones, el enlazador (en código de aminoácidos de una letra) es GSGGGGS (SEQ ID N.º: 635). En algunos ejemplos, el enlazador es un 2xGGGGS seguido de tres alaninas (GGGGSGGGGSAAA; SEQ ID N.º: 230).
[0730] En algunas realizaciones, la proteína de fusión ICOSL-Fc variante es un dímero formado por dos polipéptidos ICOSL Fc variantes unidos a un dominio Fc. En algunas realizaciones específicas, especies idénticas o sustancialmente idénticas (permitiendo 3 o menos diferencias de secuencia de aminoácidos N-terminal o C-terminal) de polipéptidos de fusión variante ICOSL-Fc se dimerizarán para crear un homodímero. En algunas realizaciones, el dímero es un homodímero en el que los dos polipéptidos Fc ICOSL variantes son iguales. Alternativamente, diferentes especies de polipéptidos de fusión variante ICOSL-Fc pueden dimerizarse para dar lugar a un heterodímero. Así, en algunas realizaciones, el dímero es un heterodímero en el que los dos polipéptidos Fc ICOSL variantes son diferentes.
[0732] En algunas realizaciones, se proporciona una proteína de fusión ICOSL-Fc variante que contiene un polipéptido ICOSL variante que incluye una o más modificaciones de aminoácidos en un ICOSL de referencia como se describe en la Sección II que está unido, directa o indirectamente, a una región Fc. En algunos casos, el C-terminal del polipéptido ICOSL variante se une al N-terminal de la región Fc. En algunas realizaciones, la variante ICOSL de una fusión ICOSL-Fc contiene una o más modificaciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos el dominio IgV de referencia establecido en SEQ ID N.º:545. En casos particulares, dicha proteína inmunomoduladora contiene una variante del polipéptido ICOSL que contiene un dominio IgV, tal como un dominio IgV establecido en cualquiera de los SEQ ID N.º: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857, 906-907, 909-910, o un dominio IgV que tenga al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de cualquiera de los SEQ ID N.º: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857, 906-907, 909-910 y contiene una o más modificaciones de aminoácidos de la respectiva SEQ ID N.º. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL tiene un dominio IgSF (por ejemplo, dominio IgV) que muestra una mayor afinidad de unión a CD28 o ICOS, como cualquiera de las modificaciones de aminoácidos descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene un dominio IgSF (por ejemplo, dominio IgV) que contiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, sustitución en un ICOSL de referencia o fragmento de unión específico, correspondiente a la posición o posiciones 52, 57 o 100 con referencia a la numeración de SEQ ID N.º: 32. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo sustitución seleccionada entre N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52L, N52K, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100P, Q100S, Q100T o Q100V. Ejemplos de tales moléculas variantes incluyen cualquiera de las aquí descritas. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante contiene las modificaciones de aminoácidos N52H/N57Y/Q100R (por ejemplo, es o incluye un dominio IgV establecido en SEQ ID N.º: 565). En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante contiene las modificaciones de aminoácidos N52D (por ejemplo, es o incluye un dominio IgV establecido en SEQ ID N.º: 548). En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante contiene las modificaciones de aminoácidos N52H/Q100R (por ejemplo, es o incluye un dominio IgV establecido en SEQ ID N.º: 567). En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL contiene las modificaciones de aminoácidos N52L/N57H/Q100R (por ejemplo, es o incluye un dominio IgV establecido en SEQ ID N.º: 761). En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL contiene las modificaciones de aminoácidos N52H/N57Y/Q100P (por ejemplo, es o incluye un dominio IgV establecido en SEQ ID N.º: 570).
[0734] En realizaciones particulares de tales proteínas de fusión ICOSL-Fc variantes, el polipéptido Fc es una variante de una región Fc IgG1 humana que presenta funciones efectoras reducidas, como cualquiera de las descritas. En algunas realizaciones, la región Fc es una IgG1 humana que contiene las modificaciones aminoacídicas N297G, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K o L234A/L235E/G237A, en las que el residuo se numera según el índice UE de Kabat. En algunas realizaciones, la variante de la región Fc de IgG1 contiene además la sustitución aminoacídica C220S, en la que los residuos se numeran según el índice UE de Kabat. En algunas realizaciones, la región Fc contiene K447del, donde el residuo se numera según el índice UE de Kabat. En algunos aspectos, la región Fc contiene la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 474, 476, 477, 478, 633 o 637 o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de los SEQ ID N.º: 474, 476, 477, 478, 633 o 637 y contiene las sustituciones de aminoácidos de las respectivas SEQ ID N.º. La unión entre el polipéptido variante IgSF de ICOSL (por ejemplo, IgV) y el Fc puede realizarse mediante un enlazador peptídico, como cualquiera de los descritos. En algunas realizaciones, el enlazador es GGGGS ("4GS"; SEQ ID N.º: 636, SEQ ID N.º: 229 (2xGGGGS) o SEQ ID N.º: 228 (3xGGGGS). En ejemplos particulares, el C-terminal del polipéptido ICOSL variante se une al N-terminal de la región Fc, de forma que el orden de los componentes es ICOSL variante-enlazador-Fc.
[0736] [0326]En algunas realizaciones, se proporciona una proteína de fusión ICOSL-Fc variante, por ejemplo, ICOSL-enlazador-Fc variante, que contiene un dominio IgV ICOSL variante establecido en SEQ ID N.º:565, un enlazador establecido en SEQ ID N.º:636 y un polipéptido Fc establecido en SEQ ID N.º: 637. En algunas realizaciones, se proporciona una proteína de fusión ICOSL-Fc variante, por ejemplo, ICOSL-linker-Fc variante, que contiene un dominio IgV ICOSL variante establecido en SEQ ID N.º:565, un enlazador establecido en SEQ ID N.º:636 y un polipéptido Fc establecido en SEQ ID N.º: 474. En algunas realizaciones, se proporciona una proteína de fusión ICOSL-Fc variante, por ejemplo, ICOSL-linker-Fc variante, que contiene un dominio IgV ICOSL variante establecido en SEQ ID N.º:565, un enlazador establecido en SEQ ID N.º:636 y un polipéptido Fc establecido en SEQ ID N.º: 477. En algunas realizaciones, se proporciona una proteína de fusión ICOSL-Fc variante, por ejemplo, ICOSL-linker-Fc variante, que contiene un dominio IgV ICOSL variante establecido en SEQ ID N.º:565, un enlazador establecido en SEQ ID N.º:636 y un polipéptido Fc establecido en SEQ ID N.º: 633.
[0738] En algunas realizaciones, se proporciona una proteína de fusión ICOSL-Fc variante, por ejemplo, ICOSL-enlazador-Fc variante, que contiene un dominio IgV ICOSL variante establecido en SEQ ID N.º:565, un enlazador establecido en SEQ ID N.º: 229 y un polipéptido Fc establecido en SEQ ID N.º: 637. En algunas realizaciones, se proporciona una proteína de fusión ICOSL-Fc variante, por ejemplo, ICOSL-linker-Fc variante, que contiene un dominio IgV ICOSL variante establecido en SEQ ID N.º:565, un enlazador establecido en SEQ ID N.º:229 y un polipéptido Fc establecido en SEQ ID N.º: 474. En algunas realizaciones, se proporciona una proteína de fusión ICOSL-Fc variante, por ejemplo, ICOSL-linker-Fc variante, que contiene un dominio IgV ICOSL variante establecido en SEQ ID N.º:565, un enlazador establecido en SEQ ID N.º: 229 y un polipéptido Fc establecido en SEQ ID N.º: 477. En algunas realizaciones, se proporciona una proteína de fusión ICOSL-Fc variante, por ejemplo, ICOSL-linker-Fc variante, que contiene un dominio IgV ICOSL variante establecido en SEQ ID N.º:565, un enlazador establecido en SEQ ID N.º:229 y un polipéptido Fc establecido en SEQ ID N.º: 633.
[0740] En algunas realizaciones, se proporciona una proteína de fusión variante ICOSL-Fc, por ejemplo, variante ICOSL-enlazador-Fc, que contiene un dominio IgV ICOSL variante establecido en SEQ ID N.º:565, un enlazador establecido en SEQ ID N.º:228 y un polipéptido Fc establecido en SEQ ID N.º: 637. En algunas realizaciones, se proporciona una proteína de fusión ICOSL-Fc variante, por ejemplo, ICOSL-linker-Fc variante, que contiene un dominio IgV ICOSL variante establecido en SEQ ID N.º:565, un enlazador establecido en SEQ ID N.º: 228 y un polipéptido Fc establecido en SEQ ID N.º: 474. En algunas realizaciones, se proporciona una proteína de fusión ICOSL-Fc variante, por ejemplo, ICOSL-enlazador-Fc variante, que contiene un dominio IgV ICOSL variante establecido en SEQ ID N.º:565, un enlazador establecido en SEQ ID N.º:228 y un polipéptido Fc establecido en SEQ ID N.º: 477. En algunas realizaciones, se proporciona una proteína de fusión ICOSL-Fc variante, por ejemplo, ICOSL-enlazador-Fc variante, que contiene un dominio IgV ICOSL variante establecido en SEQ ID N.º: 565, un enlazador descrito en SEQ ID N.º:228 y un polipéptido Fc descrito en SEQ ID N.º: 633.
[0742] En algunas realizaciones, se proporciona una variante de la proteína de fusión ICOSL IgSF Fc que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 928, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a SEQ ID N.º:928. En algunas realizaciones, la variante de la proteína de fusión ICOSL IgSF Fc se une a CD28 e ICOS, por ejemplo con una mayor afinidad de unión en comparación con la proteína de fusión ICOSL-Fc de referencia (tipo silvestre). En algunas realizaciones, la fusión Fc de la variante ICOSL IgSF presenta una función efectora Fc reducida en comparación con la fusión con un Fc de una IgG1 humana de tipo silvestre.
[0744] En algunas realizaciones, se proporciona una proteína inmunomoduladora multidominio apilada en la que dos o más dominios IgSF, incluyendo un vIgD de ICOSL y uno o más dominios IgSF adicionales (por ejemplo, una segunda variante de dominio IgSF) de otro miembro de la familia IgSF, están enlazados o unidos a un Fc para formar una fusión Fc, que, al expresarse en una célula puede, en algunos aspectos, producir una proteína inmunomoduladora multidominio apilada dimérica. Por lo tanto, también se proporcionan proteínas inmunomoduladoras multidominio diméricas.
[0746] En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante y uno o más dominios IgSF adicionales están unidos independientemente, directa o indirectamente, al N- o C-terminal de una región Fc. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante y al menos uno de los uno o más dominios IgSF adicionales están unidos, directa o indirectamente, y uno de los ICOSL variantes o y uno de los uno o más dominios IgSF adicionales también está unido, directa o indirectamente, al N- o C-terminal de una región Fc. En algunas realizaciones, el N- o C-terminal de la región Fc está unido al polipéptido ICOSL variante o al uno o más dominio IgSF adicional y el otro del N- o C-terminal de la región Fc está unido al otro de la variante ICOSL u otro del uno o más dominio IgSF adicional. En algunas realizaciones, la unión al Fc se realiza mediante un enlazador peptídico, por ejemplo, un enlazador peptídico, como el descrito anteriormente. En algunas realizaciones, la unión entre la variante ICOSL y el segundo dominio IgSF se realiza mediante un enlazador peptídico, por ejemplo, un enlazador peptídico, como el descrito anteriormente. En algunas realizaciones, la unión entre la variante ICOSL y el uno o más dominios IgSF adicionales se realiza mediante un enlazador peptídico, por ejemplo, un enlazador peptídico, tal como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, la vIgD de ICOSL, el uno o más dominios IgSF adicionales y el dominio Fc pueden unirse en cualquiera de las numerosas configuraciones representadas en la FIG.16A y 16B. En algunas realizaciones, la variante de fusión ICOSL-Fc puede contener además un péptido señal, como un péptido señal ejemplar contenido en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 59 o 225. En los Ejemplos se describen configuraciones ejemplares.
[0748] En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora apilada es un dímero formado por dos polipéptidos de fusión Fc inmunomoduladores. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras apiladas. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora de apilamiento multidominio dimérica puede producirse en células por expresión, o en algunos casos coexpresión, de polipéptidos de la región Fc inmunomoduladores de apilamiento, como se describe más adelante.
[0749] En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora dimérica multidominio apilada es divalente para cada subunidad Fc, monovalente para cada subunidad, o divalente para una subunidad y tetravalente para la otra.
[0751] En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora dimérica multidominio apilada es una proteína Fc homodimérica multidominio apilada. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora dimérica multidominio apilada comprende un primer polipéptido de fusión Fc inmunomodulador apilado y un segundo polipéptido de fusión Fc inmunomodulador apilado en el que el primer y el segundo polipéptido son el mismo. En algunas realizaciones, la porción Fc del polipéptido puede ser cualquier Fc descrito anteriormente.
[0753] En algunas realizaciones, la molécula apilada multidominio contiene un primer polipéptido de fusión Fc que contiene una variante ICOSL y un segundo dominio de fusión IgSF y un segundo polipéptido Fc que contiene la variante ICOSL y el segundo dominio IgSF. En algunas realizaciones, la molécula apilada multidominio contiene un primer polipéptido de fusión Fc que contiene una variante ICOSL y un segundo dominio IgSF, y un tercer dominio IgSF y un segundo polipéptido de fusión Fc que contiene la variante ICOSL, el segundo dominio IgSF, y el tercer dominio IgSF. En algunas realizaciones, la porción Fc del primer y/o segundo polipéptido de fusión puede ser cualquier Fc como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, la porción o región Fc del primer y segundo polipéptido de fusión es la misma.
[0755] En algunas realizaciones, se proporciona una proteína inmunomoduladora que es una pila multidominio ICOSL-NKp30 que contiene cualquiera de los polipéptidos ICOSL variantes y uno o más dominios IgF de NKp30, por ejemplo, NKp30 de tipo silvestre o no modificado, como un dominio IgV establecido en SEQ ID N.º: 929 o un ECD o una porción de unión del mismo establecidos en SEQ ID N.º: 215 o una parte de unión del mismo. En algunas realizaciones, se proporciona una proteína inmunomoduladora que contiene cualquiera de los polipéptidos variantes ICOSL y uno o más dominios IgSF de una variante NKp30 que contiene una o más modificaciones de aminoácidos en la secuencia de tipo silvestre o no modificada establecida en SEQ ID N.º: 215 o 929. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) incluyen una o más de L30V, A60V, S64P, S86G, tales como 1, 2, 3 o 4 de tales modificaciones de aminoácidos. En algunos aspectos, una variante NKp30 de los polipéptidos apilados multidominio es o incluye una variante de dominio IgV, tal como una variante de dominio IgV establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 504, 930, 931, 932 o 933, o un dominio IgV que tenga al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a cualquiera de los SEQ ID N.º:504, 930, 931, 932 o 933 y contenga una o más modificaciones de aminoácidos de las respectivas SEQ ID N.º. En algunos aspectos, una variante NKp30 de los polipéptidos de pila multidominio es o incluye una variante de dominio ECD, tal como una variante ECD establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 215, 216, 217, 218 o 219, o un dominio ECD que tenga al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a cualquiera de SEQ ID N.º: 215, 216, 217, 218 o 219 y contiene una o más modificaciones de aminoácidos de la respectiva SEQ ID N.º.
[0757] En cualquiera de dichas realizaciones de una pila multidominio ICOSL-NKp30, el polipéptido ICOSL variante puede incluir cualquiera de los descritos en la Sección II que contenga un dominio IgSF variante (por ejemplo, IgV o ECD), tal como incluir cualquiera de las modificaciones de aminoácidos establecidas en una Tabla 1. En algunos casos, dicha proteína inmunomoduladora contiene una variante del polipéptido ICOSL que contiene un dominio ECD, tal como un dominio ECD establecido en cualquiera de los SEQ ID N.º: 109-142, 239, 280-325, 364-381, 387-424, 427-433, 435-470, 638-685, 905, 908, o un dominio ECD que tenga al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a cualquiera de SEQ ID N.º: 109-142, 239, 280-325, 364-381, 387-424, 427-433, 435-470, 638-685, 905, 908 y contiene una o más modificaciones de aminoácidos de las respectivas SEQ ID N.º. En casos particulares, dicha proteína inmunomoduladora contiene una variante del polipéptido ICOSL que contiene un dominio IgV, tal como un dominio IgV establecido en cualquiera de los SEQ ID N.º: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857, 906-907, 909-910, o un dominio IgV que tenga al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de cualquiera de los SEQ ID N.º: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857, 906-907, 909-910 y contiene una o más modificaciones de aminoácidos de la respectiva SEQ ID N.º. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL tiene un dominio IgSF (por ejemplo, dominio IgV) que muestra una mayor afinidad de unión a CD28 o ICOS, como cualquiera de los descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene un dominio IgSF (por ejemplo, dominio IgV) que contiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, sustitución en un ICOSL de referencia o fragmento de unión específico, correspondiente a la posición o posiciones 52, 57 o 100 con referencia a la numeración de SEQ ID N.º:32. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante tiene una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo sustitución seleccionada entre N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52L, N52K, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100P, Q100S, Q100T o Q100V. Ejemplos de tales moléculas variantes incluyen cualquiera de las aquí descritas. En algunas realizaciones, el polipéptido ICOSL variante contiene las modificaciones de aminoácidos N52D (por ejemplo, es o incluye un dominio IgV establecido en SEQ ID N.º:548), N52H/Q100R (por ejemplo es o incluye un dominio IgV establecido en SEQ ID N.º:567), N52H/N57Y/Q100R (por ejemplo, es o incluye un dominio IgV establecido en SEQ ID N.º:565), o N52L/N57H/Q100R (por ejemplo, es o incluye un dominio IgV establecido en SEQ ID N.º:761).
[0759] [0338]En algunas realizaciones, las proteínas inmunomoduladoras de apilamiento multidominio proporcionadas, tales como una proteína inmunomoduladora de apilamiento multidominio ICOSL-NKp30, se fusionan a un polipéptido Fc. En realizaciones particulares, el polipéptido Fc es una variante de una región Fc de IgG1 humana que presenta funciones efectoras reducidas, como cualquiera de las descritas. En algunas realizaciones, la región Fc es una IgG1 humana que contiene las modificaciones aminoacídicas N297G, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K o L234A/L235E/G237A, en las que el residuo se numera según el índice UE de Kabat. En algunas realizaciones, la variante de la región Fc de IgG1 contiene además la sustitución aminoacídica C220S, en la que los residuos se numeran según el índice UE de Kabat. En algunas realizaciones, la región Fc contiene K447del, donde el residuo se numera según el índice UE de Kabat. En algunos aspectos, la región Fc contiene la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 474, 476, 477, 478, 633 o 637 o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de los SEQ ID N.º: 474, 476, 477, 478, 633 o 637 y contiene las sustituciones de aminoácidos de las respectivas SEQ ID N.º.
[0761] Ejemplos de tales configuraciones se exponen en las FIGS. 16A-16B y descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, cualquiera de los polipéptidos inmunomoduladores de pila multidominio ICOSL-NKp30 proporcionados puede contener dos copias de un polipéptido que tenga la estructura: variante ICOSL IgSF (por ejemplo, IgV, como se establece en SEQ ID N.º: 548, 565, 567 o 761) - enlazador 1 - variante NKp30 IgSF (por ejemplo, IgV, como la que figura en SEQ ID N.º: 504) - enlazador 2 - Fc. En algunas realizaciones, cualquiera de los polipéptidos inmunomoduladores de pila multidominio ICOSL-NKp30 proporcionados puede contener dos copias de un polipéptido que tenga la estructura: variante ICOSL IgSF (por ejemplo, IgV, como se establece en SEQ ID N.º: 548, 565, 567 o 761) -enlazador 1 - variante NKp30 IgSF (por ejemplo, IgV, como la expuesta en SEQ ID N.º:504) - enlazador 2 - Fc. En algunas realizaciones, el enlazador 1 y el enlazador 2 son enlazadores peptídicos, como cualquiera de los descritos. En algunas realizaciones, el enlazador 1 y el enlazador 2 son el mismo. En algunas realizaciones, el enlazador 1 y el enlazador 2 son diferentes. En algunas realizaciones, el enlazador 1 es 3x GGGGS (SEQ ID N.º: 228). En algunas realizaciones, el enlazador 2 es GSGGGS (SEQ ID N.º: 635).
[0763] Los apilamientos multidominio ICOSL-NKp30 ejemplares tienen la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924 o 926, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a cualquiera de los SEQ ID N.º: 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924 o 926.
[0765] En algunas realizaciones, cualquiera de las proteínas inmunomoduladoras de apilamiento multidominio ICOSL-NKp30 proporcionadas se une a ICOS y/o CD28 y se une a B7-H6. En algunas realizaciones, las proteínas inmunomoduladoras de apilamiento multidominio ICOSL-NKp30 proporcionadas proporcionan una molécula de unión capaz de localización tumoral adyacente a una célula inmunitaria que expresa ICOS y/o CD28 (por ejemplo, una célula T). En algunas realizaciones, tales proteínas inmunomoduladoras de pila multidominio ICOSL-NKp30 pueden usarse para aumentar una respuesta inmunitaria mediante el acoplamiento de receptores costimuladores ICOS y/o CD28 en células T en un microambiente tumoral. En algunos casos, dichas proteínas inmunomoduladoras de pila multidominio ICOSL-NKp30, o composiciones farmacéuticas de las mismas, pueden utilizarse para tratar un tumor o cáncer.
[0767] En algunas realizaciones, la molécula de apilamiento multidominio es heterodimérica y comprende dos polipéptidos de fusión Fc diferentes, por ejemplo, un primer y un segundo polipéptido Fc, en los que al menos uno es un polipéptido de fusión Fc que contiene al menos un polipéptido ICOSL variante y/o al menos uno es un polipéptido Fc que contiene un segundo dominio IgSF (por ejemplo, un segundo dominio IgSF variante). En algunas realizaciones, el primer o segundo polipéptido de fusión Fc contiene además un tercer dominio IgSF (por ejemplo, una tercera variante del dominio IgSF). En algunas realizaciones, la molécula de pila multidominio contiene un primer polipéptido de fusión Fc que contiene una variante ICOSL y un segundo polipéptido de fusión Fc que contiene en un segundo dominio IgSF, en el que, en algunos casos, el primer o segundo polipéptido de fusión Fc contiene adicionalmente un tercer dominio IgSF. En algunas realizaciones, la molécula apilada multidominio contiene un primer polipéptido de fusión Fc que contiene una variante ICOSL, un segundo dominio IgSF y, en algunos casos, un tercer dominio IgSF y un segundo polipéptido de fusión Fc que no está unido ni a un polipéptido variante ICOSL ni a un dominio IgSF adicional. En algunas realizaciones, la porción o región Fc del primer y segundo polipéptido de fusión es la misma. En algunas realizaciones, la porción o región Fc del primer y segundo polipéptido de fusión es diferente. En algunas realizaciones, la molécula multidominio apilada contiene un primer polipéptido Fc de fusión que contiene 1, 2, 3, 4 o más polipéptidos ICOSL variantes y/o 1, 2, 3, 4 o más dominios IgSF adicionales, donde el número total de dominios IgSF en el primer polipéptido Fc de fusión apilado es superior a 2, 3, 4, 5, 6 o más. En un ejemplo de tal realización, el segundo polipéptido de fusión Fc apilado contiene 1, 2, 3, 4 o más polipéptidos ICOSL variantes y/o 1, 2, 3, 4 o más segundos dominios IgSF, donde el número total de dominios IgSF en el segundo polipéptido de fusión Fc apilado es superior a 2, 3, 4, 5, 6 o más. En otro ejemplo de dicha realización, el segundo polipéptido de fusión Fc no está unido a un polipéptido ICOSL variante ni a un dominio IgSF adicional.
[0769] [0343]En algunas realizaciones, la molécula de apilamiento heterodimérica contiene un primer polipéptido de fusión Fc inmunomodulador de apilamiento y un segundo polipéptido de fusión Fc inmunomodulador de apilamiento en el que el primer y el segundo polipéptido son diferentes. En algunas realizaciones, una molécula de pila heterodimérica contiene una primera fusión de polipéptido Fc que contiene una región Fc y una primera variante del polipéptido ICOSL y/o un segundo dominio IgSF (por ejemplo, una segunda variante del dominio IgSF) y una segunda fusión de polipéptido Fc que contiene una región Fc y la otra de la primera variante del polipéptido ICOSL o del segundo dominio IgSF. En algunas realizaciones, una molécula de pila heterodimérica contiene una primera fusión de polipéptido Fc que contiene una región Fc y una primera variante del polipéptido ICOSL y/o un segundo dominio IgSF (por ejemplo, una segunda variante del dominio IgSF) y una segunda fusión de polipéptido Fc que contiene tanto la primera variante del polipéptido ICOSL como el segundo dominio IgSF (por ejemplo, una segunda variante del dominio IgSF) pero en una orientación o configuración diferente de la primera región Fc. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo polipéptido de fusión Fc también contiene un tercer dominio IgSF (por ejemplo, una tercera variante del dominio IgSF).
[0771] En algunas realizaciones, el dominio Fc de uno o ambos del primer y segundo polipéptido de fusión Fc inmunomodulador apilado comprende una modificación (por ejemplo, sustitución) tal que la interfaz de la molécula Fc se modifica para facilitar y/o promover la heterodimerización. En algunas realizaciones, las modificaciones incluyen la introducción de una protuberancia (knob) en un primer polipéptido Fc y una cavidad (hole) en un segundo polipéptido Fc de tal manera que la protuberancia es posicionable en la cavidad para promover la complejación del primer y segundo polipéptidos que contienen Fc. Los aminoácidos objeto de sustitución y/o modificación para crear protuberancias o cavidades en un polipéptido son típicamente aminoácidos de interfase que interactúan o contactan con uno o más aminoácidos en la interfase de un segundo polipéptido.
[0773] En algunas realizaciones, se añade una secuencia de aminoácidos precediendo a la secuencia Fc para construcciones en las que la secuencia Fc es la porción N-terminal de la secuencia. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos HMSSVSAQ (SEQ ID N.º:475) se añade inmediatamente antes de la secuencia Fc para construcciones en las que la secuencia Fc es la porción N-terminal de la secuencia. En algunas realizaciones, una molécula de pila heterodimérica contiene una primera fusión de polipéptido Fc que contiene una región Fc (knob) y una primera variante del polipéptido ICOSL y/o un segundo dominio IgSF (por ejemplo, una segunda variante del dominio IgSF) y una segunda fusión de polipéptido Fc que contiene una región Fc (cavidad) y una secuencia de relleno HMSSVSAQ (SEQ ID N.º:475) añadida inmediatamente antes de ambas regiones Fc de la primera y segunda fusión de polipéptido Fc.
[0775] En algunas realizaciones, un primer polipéptido que se modifica para contener aminoácidos de protuberancia (hole) incluye la sustitución de un aminoácido nativo u original por un aminoácido que tiene al menos una cadena lateral que se proyecta desde la interfaz del primer polipéptido y es, por lo tanto, posicionable en una cavidad (hole) compensatoria en una interfaz adyacente de un segundo polipéptido. En la mayoría de los casos, el aminoácido sustituto es uno que tiene un volumen de cadena lateral mayor que el residuo de aminoácido original. Un experto en la materia sabe cómo determinar y/o evaluar las propiedades de los residuos de aminoácidos para identificar aquellos que son aminoácidos de sustitución ideales para crear una protuberancia. En algunas realizaciones, los residuos de sustitución para la formación de una protuberancia son residuos de aminoácidos naturales e incluyen, por ejemplo, arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) o triptófano (W). En algunos ejemplos, el residuo original identificado para su sustitución es un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral pequeña como, por ejemplo, alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina o valina.
[0777] En algunas realizaciones, un segundo polipéptido que se modifica para contener una cavidad (agujero) es aquel que incluye la sustitución de un aminoácido nativo u original por un aminoácido que tiene al menos una cadena lateral que está rebajada desde la interfaz del segundo polipéptido y por lo tanto es capaz de acomodar una protuberancia correspondiente desde la interfaz de un primer polipéptido. En la mayoría de los casos, el aminoácido de sustitución tiene un volumen de cadena lateral menor que el residuo de aminoácido original. Un experto en la materia sabe cómo determinar y/o evaluar las propiedades de los residuos de aminoácidos para identificar aquellos que son residuos de sustitución ideales para la formación de una cavidad. Generalmente, los residuos de sustitución para la formación de una cavidad son aminoácidos naturales e incluyen, por ejemplo, alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V). En algunos ejemplos, el aminoácido original identificado para su sustitución es un aminoácido que tiene una cadena lateral grande como, por ejemplo, tirosina, arginina, fenilalanina o triptófano.
[0779] La interfaz CH3 de la IgG1 humana, por ejemplo, implica dieciséis residuos en cada dominio situados en cuatro βhebras antiparalelas que sepultan 1090 Å2 de cada superficie (véase, por ejemplo, Deisenhofer et al. (1981) Biochemistry, 20:2361-2370; Miller et al., (1990) J Mol. Biol., 216, 965-973; Ridgway et al., (1996) Prot. Engin., 9: 617-621; Pat. de EE. UU. N.º 5,731,168). Las modificaciones de un dominio CH3 para crear protuberancias o cavidades se describen, por ejemplo, en Pat. de EE. UU. Nº 5.731.168; las solicitudes internacionales de patente WO98/50431 y WO 2005/063816; y Ridgway et al., (1996) Prot. Engin., 9: 617-621. En algunos ejemplos, las modificaciones de un dominio CH3 para crear protuberancias o cavidades se dirigen típicamente a residuos situados en las dos hebras β centrales antiparalelas. El objetivo es minimizar el riesgo de que las protuberancias que se creen puedan acomodarse sobresaliendo en el disolvente circundante en lugar de ser acomodadas por una cavidad compensatoria en el dominio CH3 asociado.
[0781] [0349]En algunas realizaciones, la molécula heterodimérica contiene una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena deknobs" y mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena deholes". En algunos casos, también puede utilizarse un puente disulfuro adicional entre cadenas entre los dominios CH3 (Merchant, A. M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681) por ejemplo, introduciendo una mutación Y349C en el dominio CH3 de la cadena "knobs" o "hole" y una mutación E356C o una mutación S354C en el dominio CH3 de la otra cadena. En algunas realizaciones, la molécula heterodimérica contiene mutaciones S354C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3. En algunas realizaciones, la molécula heterodimérica comprende mutaciones E356C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3. En algunas realizaciones, la molécula heterodimérica comprende mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y mutaciones E356C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3. En algunas realizaciones, la molécula heterodimérica comprende mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3. En la técnica se conocen ejemplos de otras tecnologías deknob-into-hole, por ejemplo, las descritas en documento EP 1870 459 A1.
[0782] En algunas realizaciones, las regiones Fc de la molécula heterodimérica pueden contener adicionalmente otra u otras mutaciones Fc, como cualquiera de las descritas anteriormente. En algunas realizaciones, la molécula heterodímera contiene una región Fc con una mutación que reduce la función efectora.
[0783] En algunas realizaciones, una variante Fc que contiene modificaciones de protuberancia(knob) o cavidad(hole) CH3 puede unirse a un polipéptido inmunomodulador apilado en cualquier lugar, pero típicamente a través de su N- o C-terminal, al N- o C-terminal de un primer y/o segundo polipéptido inmunomodulador apilado, tal como para formar un polipéptido de fusión. El enlace puede ser directo o indirecto a través de un enlazador. Típicamente, una moléculaknobinto-holese genera por coexpresión de un primer polipéptido inmunomodulador apilado unido a una variante Fc que contiene modificación(es) de protuberancia CH3 con un segundo polipéptido inmunomodulador apilado unido a una variante Fc que contiene modificación(es) de cavidad CH3.
[0784] También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican la variante de la proteína de fusión ICOSL-Fc. En algunas realizaciones, para la producción de una proteína de fusión Fc, se inserta una molécula de ácido nucleico que codifica una variante de la proteína de fusión ICOSL-Fc en un vector de expresión apropiado. La proteína de fusión ICOSL-Fc variante resultante puede expresarse en células huésped transformadas con la expresión en la que el ensamblaje entre los dominios Fc se produce por enlaces disulfuro entre cadenas formados entre las moléculas Fc para producir proteínas de fusión ICOSL-Fc variantes diméricas, como divalentes.
[0785] Las proteínas de fusión Fc resultantes pueden purificarse fácilmente mediante cromatografía de afinidad sobre columnas de proteína A o proteína G. Para la generación de heterodímeros, pueden ser necesarios pasos adicionales para la purificación. Por ejemplo, cuando dos ácidos nucleicos que codifican diferentes polipéptidos variantes de ICOSL se transforman en células, la formación de heterodímeros debe lograrse bioquímicamente, ya que las moléculas variantes de ICOSL que llevan el dominio Fc se expresarán también como homodímeros unidos por disulfuro. Así, los homodímeros pueden reducirse en condiciones que favorecen la disrupción de los disulfuros entre cadenas, pero no afectan a los disulfuros intracadena. En algunos casos, se mezclan diferentes monómeros Fc variant-ICOSL en cantidades equimolares y se oxidan para formar una mezcla de homo- y heterodímeros. Los componentes de esta mezcla se separan mediante técnicas cromatográficas. Alternativamente, la formación de este tipo de heterodímero puede sesgarse mediante la modificación genética y la expresión de moléculas de fusión Fc que contengan una variante del polipéptido ICOSL utilizando los métodosknob-into-holedescritos a continuación.
[0786] B. CONJUGADOS Y FUSIONES DE POLIPÉPTIDOS VARIANTES Y PROTEÍNAS INMUNOMODULADORAS [0354]En algunas realizaciones, los polipéptidos variantes aquí proporcionados, que son proteínas inmunomoduladoras que comprenden variantes de un dominio Ig de la familia IgSF (vIgD), pueden conjugarse con, tal como fusionarse directa o indirectamente, a, una fracción, tal como una fracción efectora, tal como otra proteína, directa o indirectamente, para formar un conjugado ("conjugado IgSF"). En algunas realizaciones, una variante de la proteína inmunomoduladora ICOSL se proporciona como un conjugado en el que está contenida una vIgD de ICOSL unida, directa o indirectamente, a un agente o fracción diana, por ejemplo, a un anticuerpo u otras moléculas de unión que se unen específicamente a un ligando, por ejemplo, un antígeno, por ejemplo, para dirigir o localizar la vIgD a un entorno o célula específicos, como cuando se administra a un sujeto. En algunas realizaciones, el agente diana, por ejemplo, un anticuerpo u otra molécula de unión, se une a un antígeno tumoral, localizando así la variante ICOSL que contiene la vIgD en el microambiente tumoral, por ejemplo, para modular la actividad de los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) específicos del microambiente tumoral. En algunas realizaciones, la unión puede ser covalente o no covalente, por ejemplo, mediante una interacción no covalente biotina-estreptavidina. En algunas realizaciones, el conjugado es una proteína de fusión de una variante del polipéptido ICOSL unido, directamente o mediante un enlazador, a otra proteína o fracción polipeptídica.
[0787] En algunas realizaciones, la proteína de fusión es una fusión variante ICOSL-Fc, en la que dos o más de los polipéptidos variantes anteriores pueden unirse a un Fc.
[0788] En algunas realizaciones, el conjugado IgSF, como la proteína de fusión, comprende el ECD de un polipéptido ICOSL de tipo silvestre (de longitud completa o truncada) o de una variante. En algunas realizaciones, el conjugado IgSF, como la proteína de fusión, comprende un dominio IgV o un dominio o dominios IgC (por ejemplo, IgC2), o un fragmento de unión específico del dominio IgV o un fragmento de unión específico del dominio o dominios IgC (por ejemplo, IgC2). En algunas realizaciones, el conjugado IgSF, como la proteína de fusión, comprende un dominio IgV de ICOSL como se establece en SEQ ID N.º: 196 o 545.
[0789] [0357]En algunas realizaciones, la molécula puede ser una molécula diana, un fármaco de molécula pequeña (fármaco no polipeptídico de menos de 500 daltons de masa molar), una toxina, un agente citostático, un agente citotóxico, un agente inmunosupresor, un agente radiactivo adecuado para fines de diagnóstico, un ion metálico radiactivo para fines terapéuticos, una enzima activadora de fármacos, un agente que aumenta la semivida biológica o un agente de diagnóstico o detectable.
[0791] En algunas realizaciones, la fracción efectora es un agente terapéutico, tal como un agente terapéutico contra el cáncer, que es citotóxico, citostático o proporciona algún beneficio terapéutico. En algunas realizaciones, la fracción efectora es una fracción o agente diana, como un agente que se dirige a un antígeno de la superficie celular, por ejemplo, un antígeno de la superficie de una célula tumoral. En algunas realizaciones, la fracción efectora es una etiqueta que puede generar una señal detectable, directa o indirectamente. En algunas realizaciones, la fracción efectora es una toxina. En algunas realizaciones, la fracción efectora es una proteína, un péptido, un ácido nucleico, una molécula pequeña o una nanopartícula.
[0793] En algunas realizaciones, 1, 2, 3, 4, 5 o más moléculas efectoras, que pueden ser iguales o diferentes, se conjugan, enlazan o fusionan al polipéptido o proteína variante para formar un conjugado IgSF. En algunas realizaciones, dichas moléculas efectoras se pueden unir al polipéptido variante o a la proteína inmunomoduladora utilizando diversos métodos de conjugación y unión molecular biológica o química conocidos en la técnica y descritos a continuación. En algunas realizaciones, se pueden utilizar enlazadores tales como enlazadores peptídicos, enlazadores escindibles, enlazadores no escindibles o enlazadores que ayudan en la reacción de conjugación, para enlazar o conjugar las moléculas efectoras con el polipéptido variante o la proteína inmunomoduladora.
[0795] En algunas realizaciones, el conjugado IgSF comprende los siguientes componentes:
[0796] (proteína o polipéptido), (L)<q>y (fracción efectora)<m>, en la que la proteína o polipéptido es cualquiera de las variantes de polipéptidos o proteínas inmunomoduladoras descritas capaz de unirse a uno o más ligandos de contraestructura afines según se describe; L es un enlazador para unir la proteína o polipéptido a la fracción; m es al menos 1; q es 0 o más; y el conjugado IgSF resultante se une a uno o más ligandos de contraestructura. En determinadas realizaciones, m es de 1 a 4 y q es de 0 a 8. En algunas realizaciones, el enlazador es un péptido. En algunas realizaciones, la fracción efectora es una proteína o polipéptido.
[0798] En algunas realizaciones, se proporciona un conjugado IgSF que comprende un polipéptido variante o proteína inmunomoduladora proporcionada en el presente documento conjugado con un agente de orientación que se une a una molécula de superficie celular, por ejemplo, para la administración dirigida del polipéptido variante o proteína inmunomoduladora a una célula específica. En algunas realizaciones, el agente diana es una molécula(s) que tiene(n) la capacidad de localizar y unirse a una molécula presente en una célula/tejido normal y/o célula tumoral/tumor en un sujeto. En otras palabras, los conjugados IgSF que comprenden un agente diana pueden unirse a un ligando (directa o indirectamente), que está presente en una célula, como una célula tumoral. Los agentes diana de la invención contemplados para su uso incluyen anticuerpos, polipéptidos, péptidos, aptámeros, otros ligandos, o cualquier combinación de los mismos, que puedan unirse a un componente de una célula o molécula diana.
[0800] En algunas realizaciones, el agente diana se une a una(s) célula(s) tumoral(es) o puede unirse en la vecindad de una(s) célula(s) tumoral(es) (por ejemplo, vasculatura tumoral o microambiente tumoral) tras la administración al sujeto. El agente diana puede unirse a un receptor o ligando en la superficie de la célula cancerosa. En otro aspecto de la invención, se selecciona un agente diana específico para células o tejidos no cancerosos. Por ejemplo, un agente diana puede ser específico para una molécula presente normalmente en una célula o tejido concreto. Además, en algunas realizaciones, la misma molécula puede estar presente en células normales y cancerosas. Se conocen varios componentes y moléculas celulares. Por ejemplo, si un agente diana es específico para el EGFR, el conjugado IgSF resultante puede dirigirse a las células cancerosas que expresan EGFR, así como a las células epidérmicas de la piel normal que expresan EGFR. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un conjugado IgSF de la invención puede funcionar mediante dos mecanismos separados (dirigido a células cancerosas y no cancerosas).
[0802] [0363]En varios aspectos de la invención aquí divulgada, un conjugado IgSF de la invención comprende un agente diana que puede unirse/apuntar a un componente celular, tal como un antígeno tumoral, un antígeno bacteriano, un antígeno viral, un antígeno de micoplasma, un antígeno fúngico, un antígeno de prión, un antígeno de un parásito. En algunos aspectos, un componente celular, un antígeno o una molécula pueden utilizarse cada uno para significar, una diana deseada para un agente diana. Por ejemplo, en diversas realizaciones, un agente de direccionamiento es específico para o se une a un componente, que incluye, entre otros, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbB-1, HER1), ErbB-2 (HER2/neu), ErbB-3/HER3, ErbB-4/HER4, la familia de ligandos de EGFR; la familia del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina (IGFR), proteínas de unión a IGF (IGFBP), la familia de ligandos de IGFR; la familia del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), la familia de ligandos de PDGFR; la familia del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), la familia de ligandos de FGFR; la familia del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), la familia de VEGF; la familia del receptor de HGF; la familia de receptores TRK; la familia de receptores de efrina (EPH); la familia de receptores AXL; la familia del receptor tirosina quinasa leucocitaria (LTK); la familia de receptores TIE, angiopoyetina-1 y -2; la familia del receptor huérfano similar a receptor tirosina quinasa (ROR), por ejemplo ROR1; CD171 (L1CAM); B7-H6 (NCR3LG1); PD-L1; antígenos de glicosilación tumoral, por ejemplo sTn o Tn, tales como el antígeno sTn de MUC1; LHR (LHCGR); fosfatidilserina; la familia de receptores con dominio discoidina (DDR); la familia de receptores RET; la familia de receptores KLG; la familia de receptores RYK; la familia de receptores MuSK; receptores del factor de crecimiento transformante alfa (TGF-α), TGF-β; receptores de citocinas de clase I (familia de hematopoyetinas) y de clase II (familia de interferón/IL-10); la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFRSF); la familia de receptores de muerte; antígenos cáncer-testículo (CT), antígenos específicos de linaje, antígenos de diferenciación, alfa-actinina-4, ARTCl, productos de fusión del gen región de agrupamiento de puntos de ruptura-Abelson (Bcr-abl), B-RAF, caspasa-5 (CASP-5), caspasa-8 (CASP-8), βcatenina (CTNNB1), ciclo celular 27 (CDC27), quinasa dependiente de ciclina 4 (CDK4), CDKN2A, COA-I, proteína de fusión dek-can, EFTUD-2, factor de elongación 2 (ELF2), proteína de fusión Ets variant gene 6/leucemia mieloide aguda 1 (ETV6-AML1), fibronectina (FN), por ejemplo el extradominio A (EDA) de la fibronectina, GPNMB, proteína de fusión receptor de lipoproteínas de baja densidad/fucosa:β-D-galactosa 2-α-L-fucosiltransferasa (LDLR/FUT), HLA-A2 con sustitución de arginina por isoleucina en el residuo 170 de la hélice α del dominio α2 del gen HLA-A2 (HLA-A*201-R170I), HLA-A11, proteína de choque térmico 70-2 mutada (HSP70-2M), KIAA0205, MART-2, melanoma ubiquitario mutado 1, 2 y 3 (MUM-1, 2, 3), fosfatasa ácida prostática (PAP), neo-PAP, miosina clase I, NFYC, OGT, OS-9, proteína de fusión PML-RARα, PRDX5, PTPRK, K-ras (KRAS2), N-ras (NRAS), HRAS, BRAF600, SIRT2, SNRPD1, proteína de fusión SYT-SSX1 o -SSX2, isomerasa de triosa-fosfato, BAGE, BAGK-1, BAGE-2,-3,-4,-5, GAGE-1,-2,-3,-4,-5,-6,-7,-8, GnT-V (transferasa aberrante N-acetilglucosaminil V, MGAT5), HERV-K-MEL, KK-LC, KM-HN-1, LAGE, LAGE-1, antígeno reconocido por CTL en melanoma (CAMEL), MAGE-A1 (MAGE-1), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-3, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, mucina-1 (MUC1), MART-1/Melan-A (MLANA), gp100, gp100/Pmel17 (SILV), tirosinasa (TYR), TRP-1, HAGE, NA-88, NY-ESO-1, NY-ESO-1/LAGE-2, SAGE, SP17, SSX-1,-2,-3,-4, TRP2-INT2, antígeno carcinoembrionario (CEA), calicreína-4, mamaglobina-A, OA1, antígeno prostático específico (PSA), TRP-1/gp75, TRP-2, adipofilina, proteína inducible por interferón ausente en melanoma-2 (AIM-2), BING-4, CPSF, ciclina D1, molécula de adhesión celular epitelial (Ep-CAM), EphA3, factor de crecimiento de fibroblastos-5 (FGF-5), glicoproteína-250 (gp250), EGFR (ERBB1), HER-2/neu (ERBB2), cadena α2 del receptor de interleucina-13 (IL13Rα2), receptor de IL-6, carboxilesterasa intestinal (iCE), alfa-fetoproteína (AFP), M-CSF, mdm-2, MUC1, p53 (TP53), PBF, PRAME, PSMA, RAGE-1, RNF43, RU2AS, SOX10, STEAP1, survivina (BIRC5), transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT), telomerasa, gen del tumor de Wilms (WT1), SYCP1, BRDT, SPANX, XAGE, ADAM2, PAGE-5, LIP1, CTAGE-1, CSAGE, MMA1, CAGE, BORIS, HOM-TES-85, AF15q14, HCA661, LDHC, MORC, SGY-1, SPO11, TPX1, NY-SAR-35, FTHL17, NXF2, TDRD1, TEX15, FATE, TPTE, idiotipos de inmunoglobulinas, proteína de Bence-Jones, receptores de estrógenos (ER), receptores de andrógenos (AR), CD40, CD30, CD20, CD19, CD33, antígeno cancerígeno 72-4 (CA 72-4), antígeno cancerígeno 15-3 (CA 15-3), antígeno cancerígeno 27-29 (CA 27-29), antígeno cancerígeno 125 (CA 125), antígeno cancerígeno 19-9 (CA 19-9), βgonadotropina coriónica humana, β-2-microglobulina, antígeno de carcinoma de células escamosas, enolasa específica de neuronas, proteína de choque térmico gp96, GM2, sargramostim, CTLA-4, 707 alanina-prolina (707-AP), antígeno de adenocarcinoma reconocido por células T-4 (ART-4), péptido-1 del antígeno carcinoembrionario (CAP-1), canal de cloruro activado por calcio-2 (CLCA2), ciclofilina-B (Cyp-B), tumor de células en anillo de sello humano-2 (HST-2), proteínas del virus del papiloma humano (HPV-E6, HPV-E7, antígenos de la cápside mayor o menor, entre otros), proteínas del virus de Epstein-Barr (EBV) (proteínas de membrana latente EBV-LMP1, LMP2; entre otras), proteínas del virus de la hepatitis B o C y proteínas del HIV.
[0804] En algunas realizaciones, un agente diana es específico para o se une a un componente, que incluye, pero no se limita a, HER1/EGFR, HER2/ERBB2, CD20, CD25 (receptor IL-2Rα), CD33, CD52, CD133, CD206, CEA, CEACAM1, CEACAM3, CEACAM5, CEACAM6, antígeno del cáncer 125 (CA125), alfafetoproteína (AFP), Lewis Y, TAG72, Caprin-1, mesotelina, receptor de PDGF (PDGFR; como PDGF-R α), PD-1, PD-L1, CTLA-4, receptor de IL-2, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), CD30, EpCAM, EphA2, Glypican-3, gpA33, mucinas, CAIX, PSMA, proteína de unión a folatos, gangliósidos (como GD2, GD3, GM1 y GM2), receptor de VEGF (VEGFR),VEGFR2, VEGF-A, integrina αVβ3, integrina α5β1, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, tenascina, AFP, complejo BCR, CD3, CD18, CD44, CTLA-4, gp72, HLA-DR 10 β, antígeno HLA-DR, IgE, MUC-1, nuC242, antígeno PEM, metaloproteinasas, receptor de efrina, ligandos de efrina, receptor HGF, CXCR4, CXCR4, receptor de bombesina, antígeno SK-1, Bcr-abl, RET, MET, TRKB, TIE2, ALK, ROS, EML4-ALK, ROS1, BRAFV600E, SRC, c-KIT, mTOR, TSC1, TSC2, BTK, KIT, BRCA, CDK 4/6, JAK1, JAK2, BRAF, FLT-3, MEK1, MEK2, SMO o B7-H6 (NCR3LG1).
[0806] En algunas realizaciones, un conjugado IgSF, a través de su agente diana, se unirá a un componente celular de una célula tumoral, vasculatura tumoral o microambiente tumoral, promoviendo así la destrucción de las células diana a través de la modulación de la respuesta inmunitaria, (por ejemplo, mediante la activación de moléculas coestimuladoras o la inhibición de moléculas reguladoras negativas de la activación de células inmunitarias), la inhibición de señales de supervivencia (por ejemplo, antagonistas de receptores de factores de crecimiento o citoquinas u hormonas), la activación de señales de muerte y/o la citotoxicidad mediada por el sistema inmunitario, como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Tales conjugados de IgSF pueden funcionar a través de varios mecanismos para prevenir, reducir o eliminar células tumorales, como facilitar la entrega de moléculas efectoras conjugadas a la diana tumoral, como a través de endocitosis mediada por receptores del conjugado de IgSF; o tales conjugados pueden reclutar, unirse y/o activar células inmunitarias (por ejemplo, células NK, monocitos/macrófagos, células dendríticas, células T, células B). Además, en algunos casos, una o más de las vías anteriores pueden funcionar tras la administración de uno o más conjugados IgSF de la invención.
[0808] [0366]En algunas realizaciones, un conjugado IgSF, a través de su agente diana, se localizará, como por ejemplo se unirá, a un componente celular de una célula tumoral, vasculatura tumoral o microambiente tumoral, modulando así las células de la respuesta inmunitaria en las proximidades del tumor. En algunas realizaciones, el agente diana facilita la administración de la IgSF conjugada (por ejemplo, vIgD) a la diana tumoral, de modo que interactúa con su pareja de unión afín para alterar la señalización de las células inmunitarias (por ejemplo, células NK, monocitos/macrófagos, células dendríticas, células T, células B) que llevan la pareja de unión afín. En algunas realizaciones, la administración localizada agoniza o estimula el receptor costimulador.
[0810] En algunas realizaciones, el agente diana es una inmunoglobulina. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "inmunoglobulina" incluye anticuerpos monovalentes o polivalentes naturales o artificiales, incluidos, entre otros, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena simple, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab, Fv de cadena simple (scFv); anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluidos, por ejemplo, anticuerpos anti-Id de anticuerpos de la invención), y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores. El término "anticuerpo", tal y como se utiliza aquí, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, por ejemplo, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.
[0812] En algunas realizaciones, un conjugado IgSF, a través de su fracción de anticuerpo diana, se unirá a un componente celular de una célula tumoral, vasculatura tumoral o microambiente tumoral, promoviendo así la apoptosis de las células diana a través de la modulación de la respuesta inmunitaria, (por ejemplo, mediante la activación de moléculas coestimuladoras o la inhibición de moléculas reguladoras negativas de la activación de células inmunitarias), la inhibición de señales de supervivencia (por ejemplo, antagonistas de receptores de factores de crecimiento o citoquinas u hormonas), la activación de señales de muerte y/o la citotoxicidad mediada por el sistema inmunitario, como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Tales conjugados de IgSF pueden funcionar a través de varios mecanismos para prevenir, reducir o eliminar células tumorales, como facilitar la entrega de moléculas efectoras conjugadas a la diana tumoral, como a través de endocitosis mediada por receptores del conjugado de IgSF; o tales conjugados pueden reclutar, unirse y/o activar células inmunitarias (por ejemplo, células NK, monocitos/macrófagos, células dendríticas, células T, células B).
[0814] En algunas realizaciones, un conjugado IgSF, a través de su fracción de anticuerpo diana, se unirá a un componente celular de una célula tumoral, vasculatura tumoral o microambiente tumoral, modulando así la respuesta inmunitaria (por ejemplo, mediante la activación de moléculas coestimuladoras o la inhibición de moléculas reguladoras negativas de la activación de células inmunitarias). En algunas realizaciones, dichos conjugados pueden reconocer, unirse y/o modular (por ejemplo, inhibir o activar) células inmunitarias (por ejemplo, células NK, monocitos/macrófagos, células dendríticas, células T, células B).
[0816] Las moléculas diana de anticuerpo de la invención incluyen fragmentos de anticuerpo que incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs de cadena única (scFv), anticuerpos de cadena única, Fvs ligados a disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden un dominio VL o VH. Los fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno, incluidos los anticuerpos de cadena simple, pueden comprender la(s) región(es) variable(s) sola(s) o en combinación con la totalidad o una parte de lo siguiente: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También se incluyen en la invención los fragmentos de unión a antígeno que también comprenden cualquier combinación de región(es) variable(s) con una región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También se incluyen en la invención los fragmentos Fc, las proteínas de fusión antígeno-Fc, y los conjugados o productos de fusión de moléculas Fc (péptido Fc, aptámero Fc). Los anticuerpos diana de la invención pueden ser de cualquier origen animal, incluyendo aves y mamíferos. En un aspecto, las moléculas diana de anticuerpos son humanas, murinas (por ejemplo, ratón y rata), de burro, oveja, conejo, cabra, cobaya, camello, caballo o pollo. Además, dichos anticuerpos pueden ser versiones humanizadas de anticuerpos animales. Los anticuerpos diana de la invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de mayor multiespecificidad.
[0818] En varias realizaciones, una fracción de anticuerpo/objetivo recluta, se une y/o activa células inmunitarias (por ejemplo, células NK, monocitos/macrófagos, células dendríticas) mediante interacciones entre Fc (en anticuerpos) y receptores Fc (en células inmunitarias) y mediante los polipéptidos variantes conjugados o proteínas inmunomoduladoras proporcionadas en el presente documento. En algunas realizaciones, una fracción de anticuerpo/objetivo reconoce o se une a un agente tumoral a través de y localiza en la célula tumoral los polipéptidos variantes conjugados o las proteínas inmunomoduladoras proporcionadas en el presente documento para facilitar la modulación de las células inmunitarias en las proximidades del tumor.
[0820] [0372] Ejemplos de anticuerpos que pueden incorporarse en conjugados IgSF incluyen pero no se limitan a anticuerpos como Cetuximab (IMC-C225; Erbitux<®>), Trastuzumab (Herceptin<®>), Rituximab (Rituxan<®>; MabThera<®>), Bevacizumab (Avastin<®>), Alemtuzumab (Campath<®>; Campath-1H<®>; Mabcampath<®>), Pertuzumab (Perjeta<®>), Panitumumab (ABX-EGF; Vectibix<®>), Ranibizumab (Lucentis<®>), Ibritumomab, Ibritumomab tiuxetan, (Zevalin<®>), Tositumomab, Iodine I 131 Tositumomab (BEXXAR<®>), Catumaxomab (Removab<®>), Dinutuximab (Unituxin<™>), Gemtuzumab, Gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg<®>), Abatacept (CTLA4-Ig; Orencia<®>), Belatacept (L104EA29YIg; LEA29Y; LEA), Ipilimumab (MDX-010; MDX-101), Tremelimumab (ticilimumab; CP-675.206), PRS-010, PRS-050, Aflibercept (VEGF Trap, AVE005), Volociximab (M200), F200, MORAb-009, SS1P (CAT-5001), Cixutumumab (IMC-A12), Matuzumab (EMD72000), Nimotuzumab (h-R3), Zalutumumab (HuMax-EGFR), Necitumumab IMC-11F8, mAb806/ch806, Sym004, mAb-425, Panorex @ (17-1A) (anticuerpo monoclonal murino); Panorex @ (17-1A) (anticuerpo monoclonal murino quimérico); IDEC-Y2B8 (murino, MAb anti CD2O); BEC2 (MAb antiidiotípico, imita el epítopo GD) (con BCG); Olaratumab (Lartruvo<™>); Oncolym (anticuerpo monoclonal Lym-1); SMART MI95 Ab, humanizado 13' I LYM-I (Oncolym), Ovarex (B43.13, MAb antiidiotípico de ratón); Ramucirumab (Cyramza<®>); MDX-210 (anticuerpo biespecífico humanizado anti-HER-2); 3622W94 MAb que se une al antígeno de pancarcinoma EGP40 (17-1A) en adenocarcinomas; Anti-VEGF, Zenapax (SMART Anti-Tac (receptor de IL-2); SMART MI95 Ab, Ab humanizado, humanizado); MDX-210 (anticuerpo biespecífico anti HER-2 humanizado); MDX-447 (anticuerpo biespecífico anti-receptor de EGF humanizado); NovoMAb-G2 (Ab específico de pancarcinoma); TNT (MAb quimérico frente a antígenos histónicos); TNT (MAb quimérico frente a antígenos histónicos); Gliomab-H (Monoclon s - Abs humanizados); GNI-250 Mab; EMD-72000 (antagonista quimérico-EGF); LymphoCide (anticuerpo humanizado LL2); y MDX-260 biespecífico, diana GD-2, Ab ANA, Ab SMART IDlO, Ab SMART ABL 364 o ImmuRAIT-CEA. Como ilustra la lista anterior, es habitual fabricar anticuerpos contra un epítopo diana concreto.
[0822] En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de los conjugados proporcionados, incluidas las moléculas de fusión, es cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, trastuzumab, Adotrastuzumab emtansina, Tositumomab (Bexxar<®>), Rituximab (Rituxan, Mabthera), Ibritumomab tiuxetan (Zevalin), Daclizumab (Zenapax), Gemtuzumab (Mylotarg), Alemtuzumab, CEA-scan fragmento Fab, OC125 anticuerpo monoclonal, ab75705, B72.3, Bevacizumab (Avastin<®>), Afatinib, Axitinib, Bosutinib, Cabozantinib, Ceritinib, Crizotinib, Dabrafenib, Dasatinib, Dinutuximab (Unituxin<™>), Erlotinib, Everolimus, Ibrutinib, Imatinib, Lapatinib, Lenvatinib, Nilotinib, Olaparib, Olaratumab (Lartruvo<™>), Palbociclib, Pazopanib, Pertuzumab (Perjeta<®>), Ramucirumab (Cyramza<®>), Regorafenib, Ruxolitinib, Sorafenib, Sunitinib, Temsirolimus, Trametinib, Vandetanib, Vemurafenib, Vismodegib, Basiliximab, Ipilimumab, Nivolumab, pembrolizumab, MPDL3280A, Pidilizumab (CT-011), AMP-224, MSB001078C, o MEDI4736, BMS-935559, LY3300054, atezolizumab, avelumab o durvalumab o es un fragmento de unión a antígeno de los mismos.
[0824] En algunas realizaciones, los anticuerpos PD-L1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden incorporarse a los conjugados IgSF. Ejemplos de anticuerpos contra PD-L1 que pueden incorporarse en conjugados IgSF incluyen, entre otros, anticuerpos como BMS-936559, 12A4, LY3300054, Atezolizumab (Tecentriq<®>), Avelumab (Bavencio<®>), Durvalumab (Imfinzi<®>). Véase, por ejemplo, WO2007/005874, WO2017/034916, WO2010/077634, WO2013/079174, WO2011/066389. En algunas realizaciones, la vIgD está unida, directa o indirectamente, al extremo N o C de la cadena ligera y/o pesada de un anticuerpo anti-PD-L1. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es BMS-936559, LY3300054, atezolizumab, avelumab o durvalumab. La cadena ligera y la cadena pesada ejemplares de un anticuerpo anti-PD-L1 atezolizumab se exponen en SEQ ID N.º: 866 y 867, respectivamente. Los conjugados IgSF ejemplares que incluyen el anticuerpo anti-PD-L1 Atezolizumab se exponen en SEQ ID N.º: 868-895.
[0826] En algunas realizaciones, la fracción diana de anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que contiene un dominio Fc. En algunas realizaciones, el polipéptido variante o la proteína inmunomoduladora se conjuga con la porción Fc de la fracción diana del anticuerpo, por ejemplo, mediante conjugación con el extremo N-terminal de la porción Fc del anticuerpo.
[0828] En algunas realizaciones, la vIgD está unida, directa o indirectamente, al N- o C-terminal de la cadena ligera y/o pesada del anticuerpo. En algunas realizaciones, la unión puede realizarse mediante un enlazador peptídico, como cualquiera de los descritos anteriormente. En algunas realizaciones, el enlazador puede incluir además aminoácidos introducidos por clonación y/o a partir de un sitio de restricción. En algunas realizaciones, el enlazador puede incluir aminoácidos adicionales en cada extremo introducidos por un sitio de restricción. Por ejemplo, el enlazador puede incluir aminoácidos adicionales como SA (en código de aminoácidos de una letra) introducidos mediante el uso del sitio de restricción AFEI. Se pueden construir varias configuraciones. LaFIG.10A-10Crepresentan configuraciones ejemplares. En algunas realizaciones, el conjugado de anticuerpo puede producirse por co-expresión de la cadena pesada y ligera del anticuerpo en una célula.
[0830] En un aspecto de la invención, el agente diana es una molécula aptámera. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el aptámero se compone de ácidos nucleicos que funcionan como un agente de orientación. En diversas realizaciones, un conjugado IgSF de la invención comprende un aptámero que es específico para una molécula en una célula tumoral, vasculatura tumoral, y/o un microambiente tumoral. En algunas realizaciones, el propio aptámero puede comprender una secuencia biológicamente activa, además del módulo de orientación (secuencia), en la que la secuencia biológicamente activa puede inducir una respuesta inmunitaria a la célula diana. En otras palabras, una molécula aptámera de este tipo es un agente de doble uso. En algunas realizaciones, un conjugado IgSF de la invención comprende la conjugación de un aptámero con un anticuerpo, en el que el aptámero y el anticuerpo son específicos para unirse a moléculas separadas en una célula tumoral, vasculatura tumoral, microambiente tumoral y/o células inmunitarias.
[0832] El término "aptámero" incluye DNA, RNA o péptidos que se seleccionan basándose en propiedades específicas de unión a una molécula concreta. Por ejemplo, un aptámero o aptámeros pueden seleccionarse para unirse a un gen o producto génico particular en una célula tumoral, vasculatura tumoral, microambiente tumoral y/o una célula inmunitaria, como se describe en el presente documento, donde la selección se realiza mediante métodos conocidos en la técnica y familiares para un experto en la materia.
[0834] [0379]En algunos aspectos de la invención el agente diana es un péptido. Por ejemplo, los polipéptidos variantes o las proteínas inmunomoduladoras aquí proporcionadas pueden conjugarse con un péptido que pueda unirse con un componente de un cáncer o de células tumorales. Por lo tanto, dichos conjugados IgSF de la invención comprenden agentes peptídicos diana que se unen a un componente celular de una célula tumoral, vasculatura tumoral, y/o un componente de un microambiente tumoral. En algunas realizaciones, los péptidos agentes diana pueden ser antagonistas o agonistas de una integrina. Las integrinas, que comprenden una subunidad alfa y una subunidad beta, incluyen numerosos tipos bien conocidos por un artesano experto.
[0836] En una realización, el agente diana es Vvβ3. La integrina Vvβ3 se expresa en diversas células y se ha demostrado que interviene en varios procesos biológicamente relevantes, como la adhesión de los osteoclastos a la matriz ósea, la migración de las células musculares lisas vasculares y la angiogénesis. Las moléculas diana adecuadas para las integrinas incluyen péptidos RGD o peptidomiméticos, así como péptidos no RGD o peptidomiméticos (véase, por ejemplo, Pat. de EE. UU. N.º 5.767.071 y 5.780.426) para otras integrinas como V4.βi (VLA-4), V4-P7 (véase, por ejemplo, Pat. de EE. UU. No. 6,365,619; Chang et al, Bioorganic & Medicinal Chem Lett, 12:159-163 (2002); Lin et al., Bioorganic & Medicinal Chem Lett, 12:133-136 (2002)), y similares.
[0838] En algunas realizaciones, se proporciona un conjugado IgSF que comprende una variante de polipéptido o proteína inmunomoduladora proporcionada en el presente documento conjugada con un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente terapéutico incluye, por ejemplo, daunomicina, doxorrubicina, metotrexato y vindesina (Rowland et al., Cancer Immunol. Immunother. 21:183-187, 1986). En algunas realizaciones, el agente terapéutico tiene una actividad intracelular. En algunas realizaciones, el conjugado IgSF se internaliza y el agente terapéutico es una citotoxina que bloquea la síntesis proteica de la célula, lo que conduce a la muerte celular. En algunas realizaciones, el agente terapéutico es una citotoxina que comprende un polipéptido con actividad inactivadora del ribosoma que incluye, por ejemplo, gelonina, bouganina, saporina, ricina, cadena A de ricina, briodina, toxina diftérica, restrictocina, exotoxina A de Pseudomonas y sus variantes. En algunas realizaciones, cuando el agente terapéutico es una citotoxina que comprende un polipéptido con actividad inactivadora del ribosoma, el conjugado IgSF debe internalizarse al unirse a la célula diana para que la proteína sea citotóxica para las células.
[0840] En algunas realizaciones, se proporciona un conjugado IgSF que comprende un polipéptido variante o proteína inmunomoduladora proporcionada aquí conjugada con una toxina. En algunas realizaciones, la toxina incluye, por ejemplo, toxinas bacterianas como la toxina diftérica, toxinas vegetales como la ricina, toxinas de moléculas pequeñas como la geldanamicina (Mandler et al., J.Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581 (2000); Mandler et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025- 1028 (2000); Mandler et al., Bioconjugate Chem. 13:786-791 (2002)), maytansinoides (EP 1391213; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)), y caliqueamicina (Lode et al., Cancer Res.58:2928 (1998); Hinman et al., Cancer Res.53:3336-3342 (1993)). Las toxinas pueden ejercer sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen la unión a la tubulina, la unión al DNA o la inhibición de la topoisomerasa.
[0842] En algunas realizaciones, se proporciona un conjugado IgSF que comprende una variante de polipéptido o proteína inmunomoduladora proporcionada en el presente documento conjugada con una etiqueta, que puede generar una señal detectable, indirecta o directamente. Estos conjugados IgSF pueden utilizarse para aplicaciones de investigación o diagnóstico, como la detección in vivo del cáncer. Preferiblemente, la etiqueta es capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la etiqueta puede ser radioopaca o un radioisótopo, como 3H, 14C, 32P, 35S, 123I, 125I, 131I; un compuesto fluorescente (fluoróforo) o quimioluminiscente (cromóforo), como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina; una enzima, como fosfatasa alcalina, β-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante; un agente de imagen; o un ion metálico. En algunas realizaciones, la marcación es un átomo radiactivo para estudios escintigráficos, por ejemplo 99Tc o 123I, o una marcación de espín para estudios de resonancia magnética nuclear (NMR) (también conocida como imagen por resonancia magnética, MRI), como circonio-89, yodo-123, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. El circonio-89 puede complejarse con diversos agentes quelantes metálicos y conjugarse con anticuerpos, por ejemplo, para la obtención de imágenes PET (WO 2011/056983). En algunas realizaciones, el conjugado IgSF es detectable indirectamente. Por ejemplo, puede utilizarse un anticuerpo secundario que sea específico para el conjugado IgSF y contenga una etiqueta detectable para detectar el conjugado IgSF.
[0844] Los conjugados IgSF pueden prepararse utilizando cualquier método conocido en la técnica. Véanse, por ejemplo, documentos WO 2009/067800, WO 2011/133886, y Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.º 2014322129.
[0846] Los polipéptidos variantes o las proteínas inmunomoduladoras de un conjugado IgSF pueden "unirse" a la fracción efectora por cualquier medio por el que los polipéptidos variantes o las proteínas inmunomoduladoras puedan asociarse o unirse a la fracción efectora. Por ejemplo, los polipéptidos variantes o las proteínas inmunomoduladoras de un conjugado IgSF pueden unirse a la fracción efectora por medios químicos o recombinantes. Los medios químicos para preparar fusiones o conjugados son conocidos en la técnica y pueden utilizarse para preparar el conjugado IgSF. El método utilizado para conjugar los polipéptidos variantes o las proteínas inmunomoduladoras y la fracción efectora debe ser capaz de unir los polipéptidos variantes o las proteínas inmunomoduladoras con la fracción efectora sin interferir con la capacidad de los polipéptidos variantes o las proteínas inmunomoduladoras de unirse a su uno o más ligandos de contraestructura.
[0848] Los polipéptidos variantes o las proteínas inmunomoduladoras de un conjugado IgSF pueden unirse indirectamente a la fracción efectora. Por ejemplo, los polipéptidos variantes o las proteínas inmunomoduladoras de un conjugado IgSF pueden unirse directamente a un liposoma que contenga la fracción efectora de uno de varios tipos. La(s) molécula(s) efectora(s) y/o los polipéptidos variantes o las proteínas inmunomoduladoras también pueden unirse a una superficie sólida.
[0849] En algunas realizaciones, los polipéptidos variantes o proteínas inmunomoduladoras de un conjugado IgSF y la fracción efectora son ambas proteínas y pueden conjugarse utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Existen varios cientos de reticulantes que pueden conjugar dos proteínas. (Véase por ejemplo "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking," 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor). El reticulante se elige generalmente en función de los grupos funcionales reactivos disponibles o insertados en los polipéptidos variantes o las proteínas inmunomoduladoras y/o la fracción efectora. Además, si no hay grupos reactivos, puede utilizarse un reticulante fotoactivo. En ciertos casos, puede ser deseable incluir un espaciador entre los polipéptidos variantes o las proteínas inmunomoduladoras y la fracción efectora. Los agentes reticulantes conocidos en la técnica incluyen los agentes homobifuncionales: glutaraldehído, dimetiladipimidato y Bis(diazobenzidina) y los agentes heterobifuncionales: m Maleimidobenzoil-N-Hidroxisuccinimida y Sulfo-m Maleimidobenzoil-N-Hidroxisuccinimida.
[0851] En algunas realizaciones, los polipéptidos variantes o las proteínas inmunomoduladoras de un conjugado IgSF pueden modificarse genéticamente con residuos específicos para la unión química de la fracción efectora. Los residuos específicos utilizados para la unión química de moléculas conocidas en la técnica incluyen la lisina y la cisteína. El reticulante se elige en función de los grupos funcionales reactivos insertados en los polipéptidos variantes o proteínas inmunomoduladoras, y disponibles en la fracción efectora.
[0853] También puede prepararse un conjugado IgSF mediante técnicas de DNA recombinante. En tal caso, una secuencia de DNA que codifica los polipéptidos variantes o las proteínas inmunomoduladoras se fusiona con una secuencia de DNA que codifica la fracción efectora, dando lugar a una molécula quimérica de DNA. La secuencia de DNA quimérico se transfecta en una célula huésped que expresa la proteína de fusión. La proteína de fusión puede recuperarse del cultivo celular y purificarse mediante técnicas conocidas en la técnica.
[0855] Ejemplos de fijación de una fracción efectora, que es una etiqueta, a los polipéptidos variantes o proteínas inmunomoduladoras incluyen los métodos descritos en Hunter, et al., Nature 144:945 (1962); David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982); Wensel y Meares, Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y. (1983); y Colcher et al., "Use Of Monoclonal Antibodies as Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice", Meth. Enzymol.
[0857] Las etiquetas radioeléctricas o de otro tipo pueden incorporarse en el conjugado de formas conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o sintetizarse mediante síntesis química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácidos adecuados que incluyan, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Etiquetas como 99Tc o 123I, 186Re, 188Re y 111In pueden fijarse a través de un residuo de cisteína en el péptido. El itrio-90 puede unirse a través de un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.80:49-57 (1978)) pueden utilizarse para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe detalladamente otros métodos.
[0859] Los conjugados de los polipéptidos variantes o proteínas inmunomoduladoras y un agente citotóxico pueden hacerse usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 -carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimetil adipimidato HCI), ésteres activos (como el suberato de disuccinimidilo), aldehídos (como el glutaraldehído), compuestos bis-azido (como la bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bisdiazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (como tolueno 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bisactivos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-p-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético marcado con carbono-14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. Véase, por ejemplo, documento WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilite la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, un enlazador lábil al ácido, un enlazador sensible a la peptidasa, un enlazador fotolábil, un enlazador dimetilado o un enlazador que contenga disulfuro (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); Patente de EE.UU. N.º 5.208.020, puede utilizarse.
[0861] Los conjugados IgSF de la invención contemplan expresamente, pero no se limitan a, conjugados de fármacos preparados con reactivos reticulantes: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que están disponibles en el comercio (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, EE.UU.). Véanse las páginas 467-498 del Manual de Solicitudes y Catálogo 2003-2004.
[0863] C. PROTEÍNAS INMUNOMODULADORAS TRANSMEMBRANA Y SECRETABLES Y CÉLULAS MODIFICADAS GENÉTICAMENTE
[0865] [0394]Se proporcionan aquí células modificadas genéticamente que expresan la variante inmunomoduladora de los polipéptidos ICOSL (alternativamente, "células modificadas genéticamente"). En algunas realizaciones, la variante del polipéptido ICOSL se expresa en una célula, como una célula inmunitaria (por ejemplo, una célula T o una célula presentadora de antígeno), en forma unida a la membrana, proporcionando así una proteína inmunomoduladora transmembrana (en lo sucesivo también denominada "TIP"). En algunos aspectos, el polipéptido ICOSL variante se expresa en una célula, como una célula inmunitaria (por ejemplo, célula T o célula presentadora de antígeno), en forma secretable para producir así una forma secretada o soluble del polipéptido ICOSL variante (en lo sucesivo también denominada "SIP"), como cuando las células se administran a un sujeto. En algunos aspectos, un SIP puede antagonizar a un compañero de unión afín en el entorno (por ejemplo, el microentorno tumoral) en el que se secreta.
[0867] 1. Proteínas Transmembrana Inmunomoduladoras
[0869] En algunas realizaciones, un polipéptido inmunomodulador que comprende una variante ICOSL puede ser una proteína unida a membrana. Como se describe con más detalle a continuación, el polipéptido inmunomodulador puede ser un polipéptido inmunomodulador transmembrana que comprende una variante ICOSL en la que está contenido: un ectodominio que contiene al menos un dominio IgSF modificado por afinidad (IgV o IgC), un dominio transmembrana y, opcionalmente, un dominio citoplasmático. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora transmembrana puede expresarse en la superficie de una célula inmunitaria, como una célula de mamífero, incluyendo en la superficie de un linfocito (por ejemplo, célula T o célula NK) o célula presentadora de antígeno. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora transmembrana se expresa en la superficie de una célula T de mamífero, incluyendo células T como: una célula T ayudante, una célula T citotóxica (alternativamente, linfocito T citotóxico o CTL), una célula T asesina natural, una célula T reguladora, una célula T de memoria o una célula T gamma delta. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es una célula presentadora de antígeno (APC). Típicamente, pero no exclusivamente, el ectodominio (alternativamente, "dominio extracelular") de comprender la una o más variaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos) de la variante ICOSL de la invención. Así, por ejemplo, en algunas realizaciones una proteína transmembrana comprenderá un ectodominio que comprende una o más sustituciones de aminoácidos de una variante ICOSL de la invención.
[0871] En algunas realizaciones, las células modificadas genéticamente expresan polipéptidos ICOSL variantes que son polipéptidos inmunomoduladores transmembrana (TIP) que pueden ser una proteína de membrana tal como una proteína transmembrana. En realizaciones típicas, el ectodominio de una proteína de membrana comprende un dominio extracelular o un dominio IgSF del mismo de una variante ICOSL proporcionada en el presente documento en la que está contenida una o más sustituciones de aminoácidos en al menos un dominio IgSF como se describe. Las proteínas inmunomoduladoras transmembrana proporcionadas en el presente documento contienen además un dominio transmembrana unido al ectodominio. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana da lugar a una proteína codificada para la expresión en la superficie celular de una célula. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana está unido directamente al ectodominio. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana está unido indirectamente al ectodominio a través de uno o más enlazadores o espaciadores. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana contiene residuos de aminoácidos predominantemente hidrofóbicos, como leucina y valina.
[0873] En algunas realizaciones, se puede utilizar un dominio de anclaje transmembrana de longitud completa para asegurar que las TIPs se expresarán en la superficie de la célula modificadas genéticamente, tal como la célula T modificadas genéticamente. Convenientemente, esto podría ser de una proteína nativa particular que está siendo modificada por afinidad (por ejemplo, ICOSL u otra proteína IgSF nativa), y simplemente fusionada a la secuencia del primer dominio proximal de membrana de manera similar a la proteína IgSF nativa (por ejemplo, ICOSL). En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora transmembrana comprende un dominio transmembrana del correspondiente miembro IgSF de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre, tal como un dominio transmembrana contenido en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º:5 (Tabla 2). En algunas realizaciones, la forma unida a la membrana comprende un dominio transmembrana del correspondiente polipéptido de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre, tal como el correspondiente a los residuos 257-277 de SEQ ID N.º:5.
[0875] En algunas realizaciones, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana no nativo que no es el dominio transmembrana de ICOSL nativo. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana se deriva de un dominio transmembrana de otro polipéptido no miembro de la familia ICOSL que es una proteína unida a membrana o es una proteína transmembrana. En algunas realizaciones, se puede utilizar un dominio de anclaje transmembrana de otra proteína de las células T. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana se deriva de CD8. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana puede contener además una porción extracelular de CD8 que sirve como dominio espaciador. Un dominio transmembrana derivado de CD8 ejemplar se expone en SEQ ID N.º: 246 o 483 o una porción del mismo que contenga el dominio transmembrana CD8. En algunas realizaciones, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana sintético.
[0877] En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora transmembrana contiene además un endodominio, tal como un dominio de señalización citoplasmática, unido al dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el dominio de señalización citoplasmática induce la señalización celular. En algunas realizaciones, el endodominio de la proteína inmunomoduladora transmembrana comprende el dominio citoplasmático del correspondiente polipéptido de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre, tal como un dominio citoplasmático contenido en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º:5 (véase la Tabla 2).
[0879] [0400]En algunas realizaciones, una proteína inmunomoduladora transmembrana proporcionada que es o comprende una variante ICOSL comprende una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 257 y contiene un ectodominio que comprende al menos un dominio IgSF de ICOSL modificado por afinidad como se ha descrito y un dominio transmembrana. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora transmembrana contiene una o más sustituciones de aminoácidos en un dominio IgSF (por ejemplo, dominio IgV) como se describe, incluyendo cualquiera de las establecidas en la Tabla 1. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora transmembrana puede comprender además un dominio citoplasmático como se ha descrito. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora transmembrana puede contener además un péptido señal. En algunas realizaciones, el péptido señal es el péptido señal nativo del miembro IgSF de tipo silvestre, como el contenido en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: Véase, por ejemplo, la Tabla5.
[0881] En algunas realizaciones, se proporcionan proteínas inmunomoduladoras transmembrana que comprenden las sustituciones de aminoácidos E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, N52H/N57Y/Q100R, o N52H/N57Y/Q100P. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora transmembrana proporcionada es o comprende una variante ICOSL que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º:257, pero en la que están contenidas las sustituciones amino E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, N52H/N57Y/Q100R, o N52H/N57Y/Q100P en las posiciones correspondientes en SEQ ID N.º:257, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 257 y contiene las sustituciones de aminoácidos E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, N52H/N57Y/Q100R, o N52H/N57Y/Q100P.
[0883] En algunas realizaciones, se proporcionan proteínas inmunomoduladoras transmembrana que comprenden la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 496 o 497 (cada uno de los cuales contiene la sustitución de aminoácidos N52D), SEQ ID N.º: 498 ó 499 (cada una de las cuales contiene las sustituciones de aminoácidos N52H/N57Y/Q100P), SEQ ID N.º: 500 o 501 (cada una de las cuales contiene las sustituciones de aminoácidos E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R) o SEQ ID N.º: 502 o 503 (cada una de las cuales contiene las sustituciones de aminoácidos N52H/N57Y/Q100R), o una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID N.º: 495-503 y que contiene las sustituciones de aminoácidos indicadas. En algunas realizaciones, cuando se expresan en una célula modificadas genéticamente, dichas proteínas inmunomoduladoras transmembrana se expresan en la superficie de la célula.
[0885] También se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica dichas proteínas inmunomoduladoras transmembrana. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína inmunomoduladora transmembrana comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que presenta al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 257 y contiene un ectodominio que comprende al menos un dominio IgSF modificado por afinidad como se ha descrito, un dominio transmembrana y, opcionalmente, un dominio citoplasmático. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico puede comprender además una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal. En algunas realizaciones, el péptido señal es el péptido señal nativo del miembro de IgSF de tipo silvestre correspondiente (véase, por ejemplo, la Tabla 2).
[0887] Un ejemplo de proteína inmunomoduladora transmembrana es un TIP ICOSL que comprende i) la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º:383 o ii) una secuencia de aminoácidos que presenta al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 243 y que comprende el dominio modificado por afinidad contenido en SEQ ID N.º: 243 o las sustituciones de aminoácidos en los mismos. También se proporciona i) una secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID N.º: 244, ii) una secuencia que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 244 y que codifica un TIP que comprende el dominio modificado por afinidad de SEQ ID N.º: 243, o iii) una secuencia de i) o ii) con codones degenerados.
[0889] [0405]En algunas realizaciones, se proporcionan proteínas inmunomoduladoras transmembrana relacionadas con CAR en las que el endodominio de una proteína inmunomoduladora transmembrana comprende un dominio de señalización citoplasmática que comprende al menos un dominio de señalización que contiene ITAM (motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora). ITAM es un motivo conservado que se encuentra en una serie de dominios de señalización de proteínas implicadas en la transducción de señales de las células inmunitarias, incluida la cadena CD3-zeta ("CD3-z") implicada en la transducción de señales del receptor de células T. En algunas realizaciones, el endodominio comprende un dominio de señalización CD3-zeta. En algunas realizaciones, el dominio de señalización CD3-zeta comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 243 o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a SEQ ID N.º:247 y conserve la actividad de señalización de células T. En algunas realizaciones, el endodominio de una proteína inmunomoduladora transmembrana relacionada con CAR puede comprender además un dominio de señalización coestimulador para modular aún más las respuestas inmunomoduladoras de la célula T. En algunas realizaciones, el dominio de señalización coestimuladora es CD28, ICOS, 41BB u OX40. En algunas realizaciones, el dominio de señalización costimulatorio es un derivado de CD28 o 4-1BB y comprende la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 484-487 o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de SEQ ID N.º: 484-487 y conserva la actividad de la señalización costimuladora de las células T. En algunas realizaciones, las proteínas inmunomoduladoras transmembrana relacionadas con CAR proporcionadas tienen características de CAR para estimular la señalización de células T tras la unión de un dominio IgSF modificado por afinidad a una contraestructura o pareja de unión afín. En algunas realizaciones, la unión específica del dominio IgSF modificado por afinidad a su contraestructura puede provocar cambios en la actividad inmunológica de la célula T, como se refleja en cambios en la citotoxicidad, la proliferación o la producción de citoquinas.
[0891] En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora transmembrana no contiene un endodominio capaz de mediar la señalización citoplasmática. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora transmembrana carece del mecanismo de transducción de señales del polipéptido de tipo silvestre o no modificado y, por lo tanto, no induce por sí misma la señalización celular. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora transmembrana carece de un dominio intracelular (citoplasmático) o de una porción del dominio intracelular del correspondiente polipéptido de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre, tal como un dominio de señalización citoplasmática contenido en la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º:5 (véase la Tabla 2). En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora transmembrana no contiene un ITIM (motivo de inhibición basado en tirosina inmunorreceptora), como el que contienen ciertos receptores inhibidores, incluidos los receptores inhibidores de la familia IgSF (por ejemplo, PD-1 o TIGIT). Así, en algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora transmembrana sólo contiene el ectodominio y el dominio transmembrana, como cualquiera de los descritos.
[0892] 2. Proteínas Inmunomoduladoras Secretadas y Células Modificadas Genéticamente
[0894] En algunas realizaciones, el polipéptido inmunomodulador variante de ICOSL que contiene una o más de las mutaciones de aminoácidos descritas en el presente documento es secretable, como cuando se expresa a partir de una célula. Dicha variante de la proteína inmunomoduladora ICOSL no comprende un dominio transmembrana. En algunas realizaciones, la variante de la proteína inmunomoduladora ICOSL no se conjuga con una fracción de extensión de la vida media (como un dominio Fc o un dominio de multimerización). En algunas realizaciones, la variante de la proteína inmunomoduladora ICOSL comprende un péptido señal, por ejemplo, un péptido señal de anticuerpo u otra secuencia señal eficaz para obtener dominios fuera de la célula. Cuando la proteína inmunomoduladora comprende un péptido señal y es expresada por una célula modificada genéticamente, el péptido señal hace que la proteína inmunomoduladora sea secretada por la célula modificada genéticamente. Generalmente, el péptido señal, o una porción del péptido señal, se escinde de la proteína inmunomoduladora con la secreción. La proteína inmunomoduladora puede estar codificada por un ácido nucleico (que puede formar parte de un vector de expresión). En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora es expresada y secretada por una célula (como una célula inmunitaria, por ejemplo una célula inmunitaria primaria).
[0896] Así, en algunas realizaciones, se proporcionan proteínas inmunomoduladoras ICOSL variantes que comprenden además un péptido señal. En algunas realizaciones, se proporciona en el presente documento una molécula de ácido nucleico que codifica la variante de la proteína inmunomoduladora ICOSL operablemente conectada a una secuencia de secreción que codifica el péptido señal.
[0898] Un péptido señal es una secuencia en el extremo N-terminal de una proteína inmunomoduladora que señala la secreción de la proteína inmunomoduladora de una célula. En algunas realizaciones, el péptido señal tiene entre 5 y 40 aminoácidos de longitud (por ejemplo, entre 5 y 7, entre 7 y 10, entre 10 y 15, entre 15 y 20, entre 20 y 25, entre 25 y 30, entre 30 y 35, o entre 35 y 40 aminoácidos de longitud).
[0900] En algunas realizaciones, el péptido señal es un péptido señal nativo del correspondiente ICOSL de tipo silvestre (ver Tabla 6). En algunas realizaciones, el péptido señal es un péptido señal no nativo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el péptido señal no nativo es un péptido señal nativo mutante del correspondiente ICOSL de tipo silvestre, y puede incluir una o más (tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 o más) sustituciones inserciones o deleciones. En algunas realizaciones, el péptido señal no nativo es un péptido señal o mutante del mismo de un miembro de la misma familia IgSF que el miembro de la familia IgSF de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el péptido señal no nativo es un péptido señal o mutante del mismo de un miembro de la familia IgSF de una familia IgSF diferente a la del miembro de la familia IgSF de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el péptido señal es un péptido señal o un mutante del mismo procedente de una familia de proteínas no perteneciente a IgSF, tal como un péptido señal de una inmunoglobulina (como la cadena pesada de IgG o la cadena ligera kappa de IgG), una citocina (como interleukin-2 (IL-2) o CD33), una proteína de albúmina sérica (por ejemplo, HSA o albúmina), una secuencia señal de preproteína de azurocidina humana, una luciferasa, un tripsinógeno (por ejemplo, quimotripsinógeno o tripsinógeno) u otro péptido señal capaz de secretar eficientemente una proteína desde una célula. Los péptidos señal ejemplares incluyen cualquiera de los descritos en la Tabla 6.
[0901]
[0903] En algunas realizaciones de una proteína inmunomoduladora ICOSL variante secretable, la proteína inmunomoduladora comprende un péptido señal cuando se expresa, y el péptido señal (o una porción del mismo) se escinde de la proteína inmunomoduladora durante la secreción.
[0904] En algunas realizaciones, las células modificadas genéticamente expresan una variante del polipéptido ICOSL que es secretado por la célula. En algunas realizaciones, dicha variante del polipéptido ICOSL está codificada por una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína inmunomoduladora bajo el control operable de una secuencia señal para la secreción. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora codificada es secretada cuando se expresa a partir de una célula. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora codificada por la molécula de ácido nucleico no comprende un dominio transmembrana. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora codificada por la molécula de ácido nucleico no comprende una fracción de extensión de la semivida (como un dominio Fc o un dominio de multimerización). En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora codificada por la molécula de ácido nucleico comprende un péptido señal. En algunas realizaciones, un ácido nucleico de la invención comprende además una secuencia nucleotídica que codifica un péptido secretor o señal unido operablemente al ácido nucleico que codifica la proteína inmunomoduladora, permitiendo así la secreción de la proteína inmunomoduladora.
[0905] 3. Células y Células Modificadas Genéticamente
[0906] Se proporcionan aquí células modificadas genéticamente que expresan cualquiera de los polipéptidos inmunomoduladores proporcionados. En algunas realizaciones, las células modificadas genéticamente expresan en su superficie cualquiera de los polipéptidos inmunomoduladores transmembrana proporcionados. En algunas realizaciones, las células modificadas genéticamente expresan y son capaces o pueden secretar la proteína inmunomoduladora de las células en condiciones adecuadas para la secreción de la proteína. En algunas realizaciones, la proteína inmunomoduladora se expresa en o sobre un linfocito, como un linfocito infiltrante de tumor (TIL), una célula T o una célula NK, o en una célula mieloide. En algunas realizaciones, las células modificadas genéticamente son células presentadoras de antígenos (APC). En algunas realizaciones, las células modificadas genéticamente son células T de mamífero modificadas genéticamente o células presentadoras de antígeno (APC) de mamífero modificadas genéticamente. En algunas realizaciones, las células T o APC modificadas genéticamente son células humanas o murinas.
[0908] En algunas realizaciones, las células T modificadas genéticamente incluyen, pero no se limitan a, células T auxiliares, células T citotóxicas (alternativamente, linfocitos T citotóxicos o CTL), células T asesinas naturales, células T reguladoras, células T de memoria o células T gamma delta. En algunas realizaciones, las células T modificadas genéticamente son CD4+ o CD8+. Además de la señal del CMH, las células T modificadas genéticamente también requieren una señal coestimuladora que, en algunas realizaciones, es proporcionada por una variante del polipéptido inmunomodulador transmembrana ICOSL expresado en forma unida a la membrana, como se ha comentado anteriormente.
[0910] En algunas realizaciones, las APC modificadas genéticamente incluyen, por ejemplo, APC que expresan MHC II tales como macrófagos, células B, y células dendríticas, así como APC artificiales (aAPC) incluyendo tanto aAPC celulares como acelulares (por ejemplo, micropartículas poliméricas biodegradables). Las APC artificiales (aAPC) son versiones sintéticas de las APC que pueden actuar de forma similar a las APC en el sentido de que presentan antígenos a las células T y las activan. La presentación del antígeno la realiza el MHC (Clase I o Clase II). En algunas realizaciones, en las APC modificadas genéticamente, como las aAPC, el antígeno que se carga en el MHC es, en algunas realizaciones, un antígeno específico del tumor o un antígeno asociado al tumor. El antígeno cargado en el MHC es reconocido por un receptor de células T (TCR) de una célula T, que, en algunos casos, puede expresar ICOS, CD28 u otra molécula reconocida por los polipéptidos variantes de ICOSL aquí proporcionados. Entre los materiales que pueden utilizarse para diseñar una aAPC figuran: poli (ácido glicólico), poli (ácido láctico-co-glicólico), óxido de hierro, liposomas, bicapas lipídicas, sefarosa y poliestireno.
[0912] En algunas realizaciones una aAPC celular puede ser modificada genéticamente para contener un agonista TIP y TCR que es usado en terapia celular adoptiva. En algunas realizaciones, una aAPC celular puede modificarse genéticamente para contener un agonista de TIP y TCR que se utiliza en la expansión ex vivo de células T humanas, como antes de la administración, por ejemplo, para la reintroducción en el paciente. En algunos aspectos, la aAPC puede incluir la expresión de al menos un clon de anticuerpo anti-CD3, por ejemplo, como, por ejemplo, OKT3 y/o UCHT1. En algunos aspectos, las aAPC pueden inactivarse (por ejemplo, irradiarse). En algunas realizaciones, la TIP puede incluir cualquier variante del dominio IgSF que muestre afinidad de unión por una pareja de unión afín en una célula T.
[0914] En algunas realizaciones, una proteína inmunomoduladora proporcionada aquí, tal como una proteína inmunomoduladora transmembrana o una proteína inmunomoduladora secretable, es co-expresada o modificada genéticamente en una célula que expresa un receptor de unión a antígeno, tal como un receptor recombinante, tal como un receptor de antígeno quimérico (CAR) o receptor de célula T (TCR). En algunas realizaciones, la célula modificada genéticamente, como una célula T modificada genéticamente, reconoce un antígeno deseado asociado con el cáncer, trastornos inflamatorios y autoinmunes, o una infección viral. En determinadas realizaciones, el receptor de unión a antígeno contiene una fracción de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno específico del tumor o a un antígeno asociado al tumor. En algunas realizaciones, la célula T modificada genéticamente es una célula T CAR (receptor de antígeno quimérico) que contiene un dominio de unión a antígeno (por ejemplo, scFv) que se une específicamente a un antígeno, como un antígeno específico de tumor o un antígeno asociado a tumor. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno (por ejemplo, scFv) es específico para un antígeno concreto, por ejemplo, CD19. Un ejemplo de CAR es un CAR anti-CD19, como un CAR que contiene un scFv anti-CD19 establecido en SEQ ID N.º:482 o SEQ ID N.º:245. En algunas realizaciones, la proteína TIP se expresa en una célula receptora de células T modificada genéticamente o en una célula receptora de antígenos quiméricos modificada genéticamente. En tales realizaciones, la célula modificada genéticamente co-expresa el TIP y el CAR o TCR. En algunas realizaciones, la proteína SIP se expresa en una célula receptora de células T modificada genéticamente o en una célula receptora de antígenos quiméricos modificada genéticamente. En tales realizaciones, la célula modificada genéticamente co-expresa el SIP y el CAR o TCR.
[0916] [0418]Los receptores quiméricos de antígenos (CAR) son receptores recombinantes que incluyen un dominio de unión a antígeno (ectodominio), un dominio transmembrana y una región de señalización intracelular (endodominio) que es capaz de inducir o mediar una señal de activación a la célula T tras la unión al antígeno. En algunos ejemplos, las células que expresan CAR están modificadas genéticamente para expresar un fragmento variable de cadena única (scFv) extracelular con especificidad para un antígeno tumoral concreto unido a una parte de señalización intracelular que comprende un dominio activador y, en algunos casos, un dominio coestimulador. El dominio coestimulador puede derivarse de, por ejemplo, CD28, OX-40, 4-1BB/CD137 o coestimulador inducible de células T (ICOS). El dominio activador puede derivarse, por ejemplo, de CD3, como CD3 zeta, épsilon, delta, gamma o similares. En ciertas realizaciones, el CAR está diseñado para tener dos, tres, cuatro o más dominios costimuladores. El scFv CAR puede diseñarse para dirigirse a un antígeno expresado en una célula asociada con una enfermedad o afección, por ejemplo, un antígeno tumoral, como, por ejemplo, CD19, que es una proteína transmembrana expresada por células en el linaje de células B, incluidas todas las células B normales y las malignidades de células B, incluidos, entre otros, NHL, CLL y ALL de células no T. Se describen ejemplos de terapias y constructos de células T CAR+ en las Publicaciones de Patentes de EE.UU. N.º 2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309; 2014/0050708; 4,740,461 y 4,959,455.
[0918] En algunos aspectos, el dominio de unión a antígeno es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como un fragmento de cadena simple (scFv). En algunas realizaciones, el antígeno se expresa en una célula tumoral o cancerosa. Un ejemplo de antígeno es el CD19. Un ejemplo de CAR es un CAR anti-CD19, como un CAR que contiene un scFv anti-CD19 establecido en SEQ ID N.º: 245. En algunas realizaciones, el CAR contiene además un espaciador, un dominio transmembrana y un dominio o región de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización ITAM, como un dominio de señalización CD3zeta. En algunas realizaciones, el CAR incluye además un dominio de señalización costimulatoria.
[0920] En algunas realizaciones, el CAR contiene además un espaciador o bisagra, un dominio transmembrana, y un dominio de señalización intracelular (endodominio) que comprende un dominio de señalización ITAM, tal como un dominio de señalización CD3zeta. En algunas realizaciones, el CAR incluye además un dominio de señalización costimulatoria. El dominio coestimulador puede derivarse de, por ejemplo, CD28, OX-40, 4-1BB/CD137 o coestimulador inducible de células T (ICOS). En ciertas realizaciones, el CAR está diseñado para tener dos, tres, cuatro o más dominios costimuladores. El scFv CAR puede diseñarse para dirigirse a un antígeno expresado en una célula asociada con una enfermedad o afección, por ejemplo, un antígeno tumoral, como, por ejemplo, CD19, que es una proteína transmembrana expresada por células en el linaje de células B, incluidas todas las células B normales y las malignidades de células B, incluidos, entre otros, NHL, CLL y ALL de células no T. Se describen ejemplos de terapias y constructos de células T CAR+ en las Publicaciones de Patentes de EE.UU. N.º 2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309; 2014/0050708; 4,740,461 y 4,959,455. En algunas realizaciones, el espaciador o bisagra está presente entre el dominio de unión a antígeno y el dominio transmembrana, tal como está entre el dominio de unión a antígeno y la membrana plasmática cuando se expresa en una célula. En algunas realizaciones, el espaciador o bisagra se deriva de la subclase IgG (como IgG1 e IgG4, IgD o CD8 (véase, por ejemplo, Qin et al. (2017) J. Hematol. Oncol., 10:68). En algunas realizaciones, el espaciador o bisagra se deriva de IgG1.
[0922] En algunas realizaciones, el espaciador y el dominio transmembrana son la bisagra y el dominio transmembrana derivados de CD8, tales como tener una secuencia ejemplar establecida en SEQ ID N.º: 246, 483 ó 897, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID Nº: En algunas realizaciones, el endodominio comprende un dominio de señalización CD3-zeta. En algunas realizaciones, el dominio de señalización CD3-zeta comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 243 ó 85, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID Nº: 247 y conserva la actividad de señalización de las células T. En algunas realizaciones, el endodominio de un CAR puede comprender además un dominio o región de señalización coestimuladora para modular aún más las respuestas inmunomoduladoras de la célula T. En algunas realizaciones, el dominio de señalización costimulatorio es o comprende una región costimulatoria, o se deriva de una región costimulatoria, de CD28, ICOS, 41BB u OX40. En algunas realizaciones, el dominio de señalización costimulatorio es un derivado de CD28 o 4-1BB y comprende la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 484-487 o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID N.º:484-487 y conserve la actividad de señalización coestimuladora de células T.
[0924] Aquí se proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido ICOSL y codifica una o más proteínas, tales como un receptor de antígeno recombinante (por ejemplo, receptor de antígeno quimérico (CAR) o receptor de células T (TCR) modificado genéticamente), un marcador y uno o más péptidos de autodestrucción. En algunas realizaciones, la construcción que codifica el CAR codifica además una segunda proteína, como un marcador, por ejemplo una proteína detectable, separada del CAR por una secuencia peptídica de autodestrucción. En algunos ejemplos, el ácido nucleico que codifica el polipéptido ICOSL variante se separa de la(s) secuencia(s) que es un ácido nucleico que codifica una proteína, en la que la proteína codifica un receptor de antígeno recombinante (por ejemplo, CAR o TCR), un marcador, una citocina o una quimiocina. Cualquiera de las secuencias de nucleótidos puede estar en un vector, como un vector viral. En algunos ejemplos, el vector viral es un vector lentiviral o un vector retroviral.
[0926] [0423]En algunas realizaciones, la secuencia de péptido autodestructor es un péptido autodestructor F2A, T2A, E2A o P2A. Las secuencias ejemplares de un péptido autodestructor T2A se establecen en cualquiera de los SEQ ID N.º: 250, 488, 860-862 o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de los SEQ ID N.º: 250, 488, 860-862. En algunas realizaciones, la T2A está codificada por la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID N.º:249 o una secuencia que presenta al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias SEQ ID N.º: 249. Una secuencia ejemplar de un péptido autodesintegrador P2A se establece en SEQ ID N.º: 863 ó 85, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID Nº: 863. En algunos casos, una construcción de ácido nucleico que codifica más de un péptido autodesintegrador P2A (como un P2A1 y un P2A2), en la que la secuencia de nucleótidos P2A1 y P2A2 codifican cada uno el P2A establecido en SEQ ID N.º:863, la secuencia de nucleótidos puede ser diferente para evitar la recombinación entre secuencias.
[0928] En algunas realizaciones, el marcador es una proteína detectable, tal como una proteína fluorescente, por ejemplo, una proteína verde fluorescente (GFP) o una proteína azul fluorescente (BFP). Secuencias ejemplares de un marcador de proteína fluorescente se establecen en SEQ ID N.º:489, 858, 859, 903 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más identidad de secuencia con SEQ ID N.º: 489, 858, 859, 903.
[0930] En algunas realizaciones, el CAR es un CAR anti-CD19 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID N.º: 479, 490, 491, 492, 898, 899, 901 o 902 o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de los SEQ ID N.º: 479, 490, 491, 492, 898, 899, 901 o 902. En algunas realizaciones, el CAR está codificado por una secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID N.º: 248 o 900 o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de los SEQ ID N.º: 248 o 900.
[0932] En otra realización, la célula T modificada genéticamente posee un TCR, incluyendo un TCR recombinante o manipulado. En algunas realizaciones, el TCR puede ser un TCR nativo. Los expertos en la materia reconocerán que, por lo general, los receptores nativos de células T de mamíferos comprenden una cadena alfa y una cadena beta (o una cadena gamma y una cadena delta) que participan en el reconocimiento y la unión específicos del antígeno. En algunas realizaciones, el TCR es un TCR modificado genéticamente. En algunas realizaciones, el TCR de una célula T modificada genéticamente se une específicamente a un antígeno asociado al tumor o específico del tumor presentado por una APC.
[0934] En algunas realizaciones, los polipéptidos inmunomoduladores, tales como polipéptidos inmunomoduladores transmembrana o polipéptidos inmunomoduladores secretables, pueden ser incorporados en células modificadas genéticamente, tales como células T modificadas genéticamente o APC modificadas genéticamente, por una variedad de estrategias tales como las empleadas para células huésped recombinantes. Se conocen diversos métodos para introducir una construcción de DNA en células T primarias. En algunas realizaciones, se emplea la transducción viral o la electroporación de plásmidos. En realizaciones típicas, la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína inmunomoduladora, o el vector de expresión, comprende un péptido señal que localiza las proteínas inmunomoduladoras transmembrana expresadas a la membrana celular o para su secreción. En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica una proteína inmunomoduladora transmembrana de la invención se subclona en un vector viral, tal como un vector retroviral, que permite la expresión en la célula de mamífero huésped. El vector de expresión puede introducirse en una célula huésped de mamífero y, en condiciones de cultivo de la célula huésped, la proteína inmunomoduladora se expresa en la superficie o se secreta.
[0936] En un ejemplo ejemplar, las células T primarias pueden ser purificadas ex vivo (células CD4 o células CD8 o ambas) y estimuladas con un protocolo de activación que consiste en varios agonistas TCR/CD28, tales como perlas recubiertas anti-CD3/anti-CD28. Tras un proceso de activación de 2 o 3 días, se puede introducir de forma estable un vector de expresión recombinante que contenga un polipéptido inmunomodulador en las células T primarias mediante protocolos de transducción lentiviral o retroviral estándar o estrategias de electroporación de plásmidos. La expresión del polipéptido inmunomodulador en las células puede controlarse, por ejemplo, mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos antiepítopo o anticuerpos de reacción cruzada con la molécula parental nativa y los polipéptidos que comprenden la variante ICOSL. Las células T que expresan el polipéptido inmunomodulador pueden enriquecerse mediante clasificación con anticuerpos antiepítopo o enriquecerse por alta o baja expresión dependiendo de la aplicación.
[0938] [0429]Después de la expresión del polipéptido inmunomodulador, la célula T modificada genéticamente puede ser ensayada para una función apropiada por una variedad de medios. La co-expresión de CAR o TCR modificados genéticamente puede validarse para demostrar que esta parte de la célula T modificadas genéticamente no se vio afectada significativamente por la expresión de la proteína inmunomoduladora. Una vez validadas, pueden utilizarse ensayos estándar in vitro de citotoxicidad, proliferación o citocinas (por ejemplo, expresión de IFN-gamma) para evaluar la función de las células T modificadas genéticamente. Ejemplos de criterios de valoración estándar son el porcentaje de lisis de la línea tumoral, la proliferación de las células T modificadas genéticamente o la expresión de la proteína IFN-gamma en los sobrenadantes de cultivo. Puede seleccionarse una construcción modificadas genéticamente que produzca un aumento estadísticamente significativo de la lisis de la línea tumoral, un aumento de la proliferación de la célula T modificadas genéticamente o un aumento de la expresión de IFN-gamma con respecto a la construcción de control. Además, las células T primarias o endógenas no manipuladas, como las manipuladas, también podrían incorporarse al mismo ensayo in vitro para medir la capacidad de la construcción de polipéptido inmunomodulador expresada en las células modificadas genéticamente, como las células T manipuladas, para modular la actividad, incluyendo, en algunos casos, activar y generar función efectora en células T nativas transeúntes. El aumento de la expresión de marcadores de activación como CD69, CD44 o CD62L podría monitorizarse en las células T endógenas, y el aumento de la proliferación y/o la producción de citocinas podría indicar la actividad deseada de la proteína inmunomoduladora expresada en las células T modificadas genéticamente.
[0940] En algunas realizaciones, los ensayos similares pueden usarse para comparar la función de células T modificadas genéticamente que contienen el CAR o TCR solo con aquellas que contienen el CAR o TCR y una construcción TIP. Normalmente, estos ensayos in vitro se llevan a cabo colocando en cultivo varias proporciones de la célula T modificada genéticamente y una línea celular "tumoral" que contiene el antígeno CAR o TCR afín. Los criterios de valoración estándar son el porcentaje de lisis de la línea tumoral, la proliferación de la célula T modificada genéticamente o la producción de IFN-gamma en los sobrenadantes de cultivo. Se puede seleccionar una proteína inmunomoduladora modificada genéticamente que produzca un aumento estadísticamente significativo de la lisis de la línea tumoral, un aumento de la proliferación de la célula T modificada genéticamente o un aumento de la producción de IFN-gamma en comparación con la misma construcción de TCR o CAR sola.
[0942] Las células T humanas modificadas genéticamente pueden analizarse en ratones inmunocomprometidos, como la cepa NSG, que carece de células T, NK y B de ratón. Las células T humanas modificadas genéticamente en las que el CAR o TCR se une a una contraestructura diana en el xenoinjerto y se co-expresa con el dominio IgSF modificado por afinidad TIP pueden transferirse adoptivamente in vivo en diferentes números y proporciones de células en comparación con el xenoinjerto. Por ejemplo, el injerto de líneas tumorales de leucemia CD19+ que contienen un vector de luciferasa/GFP puede controlarse mediante bioluminiscencia o ex vivo por citometría de flujo. En una realización común, el xenoinjerto se introduce en el modelo murino, seguido de las células T modificadas genéticamente varios días después. Las células T modificadas genéticamente que contienen la proteína inmunomoduladora pueden ensayarse para detectar un aumento de la supervivencia, la eliminación del tumor o la expansión del número de células T modificadas genéticamente en comparación con las células T manipuladas que contienen el CAR o el TCR solo. Al igual que en el ensayo in vitro, las células T humanas endógenas y nativas (es decir, no modificadas genéticamente) podrían transferirse de forma coadoptiva para buscar la propagación exitosa del epítopo en esa población, lo que se traduciría en una mejor supervivencia o eliminación del tumor.
[0944] D. AGENTES INFECCIOSOS QUE EXPRESAN POLIPÉPTIDOS VARIANTES Y PROTEÍNAS INMUNOMODULADORAS
[0946] También se proporcionan agentes infecciosos que contienen ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos variantes, como los polipéptidos ICOSL vIgD, incluidas las proteínas inmunomoduladoras secretables o transmembrana descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, dichos agentes infecciosos pueden administrar los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos inmunomoduladores variantes descritos en el presente documento, como los polipéptidos ICOSL vIgD, a una célula diana de un sujeto, por ejemplo, una célula inmunitaria y/o una célula presentadora de antígeno (APC) o una célula tumoral de un sujeto. También se proporcionan ácidos nucleicos contenidos en dichos agentes infecciosos, y/o ácidos nucleicos para la generación o modificación de dichos agentes infecciosos, como vectores y/o plásmidos, y composiciones que contienen dichos agentes infecciosos. En algunas realizaciones, un polipéptido ICOSL variante se expresa en un agente infeccioso (por ejemplo, un agente vírico o bacteriano) que, tras su administración a un sujeto, es capaz de infectar una célula in vivo, como una célula inmunitaria (por ejemplo, una célula T o una célula presentadora de antígeno) o un tumor, para la administración o expresión del polipéptido variante como un TIP o un SIP en la célula.
[0948] En algunas realizaciones, el agente infeccioso es un microorganismo o un microbio. En algunas realizaciones, el agente infeccioso es un virus o una bacteria. En algunas realizaciones, el agente infeccioso es un virus. En algunas realizaciones, el agente infeccioso es una bacteria. En algunas realizaciones, dichos agentes infecciosos pueden entregar secuencias de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos variantes, como los polipéptidos ICOSL vIgD, incluidas las proteínas inmunomoduladoras secretables o transmembrana, descritas en el presente documento. Así, en algunas realizaciones, la célula de un sujeto que está infectada o en contacto con los agentes infecciosos se puede hacer que exprese en la superficie celular o secrete los polipéptidos inmunomoduladores variantes. En algunas realizaciones, el agente infeccioso también puede administrar una o más terapias o ácidos nucleicos que codifican otras terapias a la célula y/o a un entorno dentro del sujeto. En algunas realizaciones, otras terapias que pueden ser administradas por los agentes infecciosos incluyen citocinas u otras moléculas inmunomoduladoras.
[0950] En algunas realizaciones, el agente infeccioso, por ejemplo, virus o bacteria, contiene secuencias de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos variantes, tales como polipéptidos ICOSL vIgD, incluyendo proteínas inmunomoduladoras secretables o transmembrana, descritos en el presente documento, y en virtud del contacto y/o infección de una célula en el sujeto, la célula expresa los polipéptidos variantes, tales como polipéptidos ICOSL vIgD, incluyendo proteínas inmunomoduladoras secretables o transmembrana, codificados por las secuencias de ácido nucleico contenidas en el agente infeccioso. En algunas realizaciones, el agente infeccioso puede administrarse al sujeto. En algunas realizaciones, el agente infeccioso puede introducirse en las células del sujetoex vivo.
[0952] [0435]En algunas realizaciones, los polipéptidos variantes, tales como los polipéptidos ICOSL vIgD, incluyendo proteínas inmunomoduladoras transmembrana, expresados por la célula infectada por el agente infeccioso es una proteína transmembrana y es expresada en superficie. En algunas realizaciones, los polipéptidos variantes, como los polipéptidos ICOSL vIgD, incluidas las proteínas inmunomoduladoras secretables, expresados por la célula infectada por el agente infeccioso se expresan y secretan a partir de la célula. La proteína inmunomoduladora transmembrana o la proteína inmunomoduladora secretada puede ser cualquiera de las descritas en el presente documento.
[0954] En algunas realizaciones, las células en el sujeto que son blanco del agente infeccioso incluyen una célula tumoral, una célula inmune, y/o una célula presentadora de antígeno (APC). En algunas realizaciones, el agente infeccioso se dirige a una célula del microambiente tumoral (TME). En algunas realizaciones, el agente infeccioso entrega los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos variantes, tales como polipéptidos ICOSL vIgD, incluyendo proteínas inmunomoduladoras secretables o transmembrana, a una célula apropiada (por ejemplo, una APC, tal como una célula que muestra un complejo péptido/MHC en su superficie celular, tal como una célula dendrítica) o tejido (por ejemplo, tejido linfoide) que modulan una respuesta inmunitaria y/o una respuesta inmunitaria específica mediada por células, por ejemplo, una respuesta de células T CD4 y/o CD8, cuya respuesta de células T CD8 puede incluir una respuesta de células T citotóxicas (CTL). En algunas realizaciones, el agente infeccioso se dirige a una APC, como una célula dendrítica (DC). En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico suministrada por los agentes infecciosos descritos en el presente documento incluye secuencias de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de las secuencias codificantes enlazadas operablemente que codifican los polipéptidos inmunomoduladores variantes, en una célula diana particular, por ejemplo, elementos reguladores tales como promotores.
[0956] En algunas realizaciones, el agente infeccioso que contiene secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos inmunomoduladores también puede contener secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más productos génicos adicionales, por ejemplo, citoquinas, enzimas convertidoras de profármacos, citotoxinas y/o productos génicos detectables. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el agente infeccioso es un virus oncolítico y el virus puede incluir secuencias de ácido nucleico que codifican productos génicos terapéuticos adicionales (véase, por ejemplo, Kirn et al., (2009) Nat Rev Cancer 9:64-71; Garcia-Aragoncillo et al., (2010) Curr Opin Mol Ther 12:403-411; véase Pat. de EE. UU. N.º 7,588,767, 7,588,771, 7,662,398; 7,754,221; 2007/0184089; 2006/0233860; 2005/0244500; 2005/0244471; y 2005/0244462, y en las Pat. de EE. UU. Pat. Int. N.º 2007/0202572, 2007/0212727, 2010/0062016, 2009/0098529, 2009/0053244, 2009/0155287, 2009/0117034, 2010/0233 078, 2009/0162288, 2010/0196325, 2009/0136917; 2011/0064650; 5,837,243; 5,922,845; 6,017,517; 6,096,311; 6,111,1 66; 6,270,765; 6,303,755; 6,365,116, 6,410,690; 6,682,928; y 6,984,720. En algunas realizaciones, el producto génico adicional puede ser un producto génico terapéutico que puede provocar la muerte de la célula diana (por ejemplo, una célula tumoral) o productos génicos que pueden aumentar o potenciar o regular una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una citoquina). Los productos génicos ejemplares también incluyen entre otros un agente anticancerígeno, un agente antimetastásico, un agente antiangiogénico, una molécula inmunomoduladora, un inhibidor del punto de control inmunitario, un anticuerpo, una citoquina, un factor de crecimiento, un antígeno, un producto génico citotóxico, un producto génico proapoptótico, un producto génico antiapoptótico, un gen degradativo de la matriz celular, genes para la regeneración de tejidos y la reprogramación de células somáticas humanas a pluripotencia, y otros genes descritos en el presente documento o conocidos por un experto en la materia. En algunas realizaciones, el producto génico adicional es el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF).
[0958] 1. Virus
[0960] En algunas realizaciones, el agente infeccioso es un virus. En algunas realizaciones, el agente infeccioso es un virus oncolítico, o un virus que se dirige a células concretas, por ejemplo, células inmunitarias. En algunas realizaciones, el agente infeccioso se dirige a una célula tumoral y/o cancerosa del sujeto. En algunas realizaciones, el agente infeccioso se dirige a una célula inmunitaria o a una célula presentadora de antígenos (APC).
[0962] En algunas realizaciones, el agente infeccioso es un virus oncolítico. Los virus oncolíticos son virus que se acumulan en las células tumorales y se replican en ellas. En virtud de la replicación en las células tumorales, y la administración opcional de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos ICOSL variantes o polipéptidos inmunomoduladores descritos en el presente documento, las células tumorales son lisadas, y el tumor se reduce y puede ser eliminado. Los virus oncolíticos también pueden tener una amplia gama de hospedadores y tipos celulares. Por ejemplo, los virus oncolíticos pueden acumularse en células inmunoprivilegiadas o tejidos inmunoprivilegiados, incluyendo tumores y/o metástasis, y también incluyendo tejidos y células heridas, permitiendo así la entrega y expresión de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos inmunomoduladores variantes descritos en el presente documento en una amplia gama de tipos celulares. Los virus oncolíticos también pueden replicarse de forma específica en las células tumorales, lo que provoca la lisis de éstas y una regresión tumoral eficaz.
[0964] Los virus oncolíticos ejemplares incluyen adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, virus del herpes simple, virus estomático vesticular, reovirus, virus de la enfermedad de Newcastle, parvovirus, virus del sarampión, virus de la estomatitis vesticular (VSV), virus Coxsackie y virus Vaccinia. En algunas realizaciones, los virus oncolíticos pueden colonizar específicamente tumores sólidos, mientras que no infectan otros órganos, y pueden utilizarse como agente infeccioso para administrar los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos inmunomoduladores variantes descritos en el presente documento a dichos tumores sólidos.
[0966] [0441]Los virus oncolíticos que se utilizan para liberar los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos ICOSL variantes o los polipéptidos inmunomoduladores descritos en el presente documento pueden ser cualquiera de los conocidos por un experto en la materia e incluyen, por ejemplo, el virus de la estomatitis vesicular, véase, por ejemplo, Pat. de EE. UU. N.º 7,731,974, 7,153,510, 6,653,103; 5,807,706; 5,821,333; y Pat. de EE. UU. Pub. de EE. UU. N.º 2010/0178684, 2010/0172877, 2010/0113567, 2007/0098743, 20050260601, 20050220818 y Pat. EP N.º 1385466, 1606411 y 1520175; virus del herpes simple, véase, por ejemplo, Pat. de EE. UU. N.º 7,897,146, 7,731,952, 7,550,296, 7,537,924, 6,723,316, 6,428,968; y Pat. de EE. UU. Pub. de EE. UU. N.º 2014/0154216, 2011/0177032, 2011/0158948, 2010/0092515, 2009/0274728, 2009/0285860, 2009/0215147, 2009/0010889, 2007/0110720, 2006/0039894, 2004/0009604, 2004/0063094, International Patent Pub. N.º WO 2007/052029, WO 1999/038955; retrovirus, véase, por ejemplo, Pat. de EE. UU. N.º 6,689,871, 6,635,472, 5,851,529, 5,716,826, 5,716,613; y Pat. de EE. UU. Pub. de EE. UU. N.º 20110212530; virus vaccinia, véase, por ejemplo, 2016/0339066, y virus adenoasociados, véase, por ejemplo, Pat. de EE. UU. N.º 8,007,780, 7,968,340, 7,943,374, 7,906,111, 7,927,585, 7,811,814, 7,662,627, 7,241,447, 7,238,526, 7,172,893, 7,033,8 26, 7,001,765, 6,897,045, y 6,632,670.
[0968] Los virus oncolíticos también incluyen virus que han sido alterados genéticamente para atenuar su virulencia, mejorar su perfil de seguridad, mejorar su especificidad tumoral, y también han sido equipados con genes adicionales, por ejemplo citotoxinas, citoquinas, enzimas convertidoras de profármacos para mejorar la eficacia general de los virus (véase, por ejemplo, Kirn et al., (2009) Nat Rev Cancer 9:64-71; Garcia-Aragoncillo et al., (2010) Curr Opin Mol Ther 12:403-411; véase Pat. de EE. UU. N.º 7,588,767, 7,588,771, 7,662,398 y 7,754,221 y Pat. de EE. UU. Pat. Int. N.º 2007/0202572, 2007/0212727, 2010/0062016, 2009/0098529, 2009/0053244, 2009/0155287, 2009/0117034, 2010/0233 078, 2009/0162288, 2010/0196325, 2009/0136917; 2011/0064650; 5,837,243; 5,922,845; 6,017,517; 6,096,311; 6,111,1 66; 6,270,765; 6,303,755; 6,365,116, 6,410,690; 6,682,928; y 6,984,720. En algunas realizaciones, los virus oncolíticos pueden ser aquellos que han sido modificados para que se repliquen selectivamente en células cancerosas y, por tanto, sean oncolíticos. Por ejemplo, el virus oncolítico es un adenovirus que ha sido modificado genéticamente para tener un tropismo modificado para la terapia tumoral y también como vectores de terapia génica. Ejemplos de ello son ONYX-015, H101 y Ad5ΔCR (Hallden y Portella (2012) Expert Opin Ther Targets, 16:945-58) y TNFerade (McLoughlin et al. (2005) Ann. Surg. Oncol., 12:825-30), o un adenovirus Oncorine<®>de replicación condicional.
[0970] En algunas realizaciones, el agente infeccioso es un virus del herpes simple modificado. En algunas realizaciones, el agente infeccioso es una versión modificada de Talimogene laherparepvec (también conocido como T-Vec, Imlygic u OncoVex GM-CSF), que se modifica para contener ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos ICOSL variantes o polipéptidos inmunomoduladores descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el agente infeccioso es un virus del herpes simple modificado que se describe, por ejemplo, en WO 2007/052029, WO 1999/038955, US 2004/0063094, US 2014/0154216, o, variantes de los mismos.
[0972] En algunas realizaciones, el agente infeccioso es un virus que se dirige a un tipo particular de células en un sujeto al que se le administra el virus, por ejemplo, un virus que se dirige a células inmunes o células presentadoras de antígenos (APC). Las células dendríticas (DC) son APC esenciales para el inicio y el control de las respuestas inmunitarias. Las DC pueden captar y procesar antígenos, migrar desde la periferia a un órgano linfoide y presentar los antígenos a las células T en reposo de forma restringida por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). En algunas realizaciones, el agente infeccioso es un virus que puede dirigirse específicamente a las DC para liberar ácidos nucleicos que codifican la variante del polipéptido ICOSL o polipéptidos inmunomoduladores para su expresión en las DC. En algunas realizaciones, el virus es un lentivirus o una variante o derivado del mismo, como un vector lentiviral de integración deficiente. En algunas realizaciones, el virus es un lentivirus pseudotipado para unirse eficientemente e infectar productivamente células que expresan el marcador de superficie celular molécula de adhesión intercelular específica de células dendríticas-3-no integrina (DC-SIGN), como las DC. En algunas realizaciones, el virus es un lentivirus pseudotipado con una glicoproteína E2 del virus Sindbis o una forma modificada de la misma, como las descritas en WO 2013/149167. En algunas realizaciones, el virus permite el suministro y la expresión de una secuencia de interés (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos ICOSL variantes o polipéptidos inmunomoduladores descritos en el presente documento) a una DC. En algunas realizaciones, el virus incluye los descritos en WO 2008/011636, US 2011/0064763, Tareen et al. (2014) Mol. Ther., 22:575-587, o sus variantes. Un ejemplo de plataforma vectorial con células dendríticas es ZVex<™>.
[0974] 2. Bacterias
[0976] En algunas realizaciones, el agente infeccioso es una bacteria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las bacterias pueden entregar ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos inmunomoduladores variantes descritos en el presente documento, por ejemplo, polipéptido ICOSL variante o polipéptido inmunomodulador, a una célula diana en el sujeto, como una célula tumoral, una célula inmunitaria, una célula presentadora de antígeno y/o una célula fagocítica. En algunas realizaciones, la bacteria puede dirigirse preferentemente a un entorno específico dentro de un sujeto, como un microambiente tumoral (TME), para la expresión y/o secreción de los polipéptidos inmunomoduladores variantes y/o para dirigirse a células específicas en el entorno para la expresión de los polipéptidos inmunomoduladores variantes.
[0978] [0446]En algunas realizaciones, la bacteria suministra los ácidos nucleicos a las células a través de la transferencia mediada por bacterias de DNA plasmídico a células de mamíferos (también denominada "bactofección"). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la entrega de material genético se consigue mediante la entrada de toda la bacteria en las células diana. En algunas realizaciones, la lisis bacteriana espontánea o inducida puede conducir a la liberación del plásmido para su posterior expresión en células eucariotas. En algunas realizaciones, la bacteria puede entregar ácidos nucleicos a células de mamífero no fagocíticas (por ejemplo, células tumorales) y/o a células fagocíticas, por ejemplo, ciertas células inmunitarias y/o APC. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos suministrados por la bacteria pueden transferirse al núcleo de la célula del sujeto para su expresión. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos también incluyen secuencias de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de las secuencias enlazadas operablemente que codifican los polipéptidos inmunomoduladores variantes en una célula huésped particular, por ejemplo, elementos reguladores como promotores o potenciadores. En algunas realizaciones, el agente infeccioso que es una bacteria puede entregar ácidos nucleicos que codifican las proteínas inmunomoduladoras en forma de RNA, como un RNA preelaborado competente para la traducción entregado al citoplasma de la célula diana para su traducción por la maquinaria de la célula diana.
[0980] En algunas realizaciones, la bacteria puede replicarse y lisar las células diana, por ejemplo, células tumorales. En algunas realizaciones, la bacteria puede contener y/o liberar secuencias de ácido nucleico y/o productos génicos en el citoplasma de las células diana, matando así la célula diana, por ejemplo, la célula tumoral. En algunas realizaciones, el agente infeccioso es una bacteria que puede replicarse específicamente en un entorno particular del sujeto, por ejemplo, el microambiente tumoral (TME). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la bacteria puede replicarse específicamente en microambientes anaeróbicos o hipóxicos. En algunas realizaciones, las condiciones o factores presentes en entornos particulares, por ejemplo, aspartato, serina, citrato, ribosa o galactosa producidos por las células en la TME, pueden actuar como quimioatrayentes para atraer a la bacteria al entorno. En algunas realizaciones, la bacteria puede expresar y/o secretar las proteínas inmunomoduladoras descritas en el presente documento en el medio ambiente, por ejemplo, la TME.
[0982] En algunas realizaciones, el agente infeccioso es una bacteria que es una Listeria sp., una Bifidobacterium sp., una Escherichia sp., una Clostridium sp., una Salmonella sp., una Shigella sp., una Vibrio sp. o una Yersinia sp. En algunas realizaciones, la bacteria se selecciona entre una o más deListeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Vibrio cholera, Clostridium perfringens, Clostridium butyricum, Clostridium novyi, Clostridium acetobutylicum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longumyBifidobacterium adolescentis.En algunas realizaciones, la bacteria es una bacteria modificada genéticamente. En algunas realizaciones, la bacteria es una bacteria modificada genéticamente como las descritas en, por ejemplo, Seow and Wood (2009) Molecular Therapy 17(5):767-777; Baban et al. (2010) Bioengineered Bugs 1:6, 385-394; Patyar et al. (2010) J Biomed Sci 17:21; Tangney et al. (2010) Bioengineered Bugs 1:4, 284-287; van Pijkeren et al. (2010) Hum Gene Ther. 21(4):405-416; WO 2012/149364; WO 2014/198002; US 9103831; US 9453227; US 2014/0186401; US 2004/0146488; US 2011/029370; US 2015/0359909 y EP 3020816. La bacteria puede modificarse para liberar secuencias de ácido nucleico que codifiquen cualquiera de los polipéptidos inmunomoduladores variantes, conjugados y/o fusiones aquí proporcionados, y/o para expresar dichos polipéptidos inmunomoduladores variantes en el sujeto.
[0984] IV. ÁCIDOS NUCLEICOS, VECTORES Y MÉTODOS DE PRODUCCIÓN DE POLIPÉPTIDOS O CÉLULAS
[0985] En el presente documento se proporcionan ácidos nucleicos aislados o recombinantes denominados colectivamente "ácidos nucleicos" que codifican cualquiera de las diversas realizaciones proporcionadas de los polipéptidos ICOSL variantes o polipéptidos inmunomoduladores proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos proporcionados en el presente documento, incluidos todos los descritos a continuación, son útiles en la producción recombinante (por ejemplo, expresión) de polipéptidos ICOSL variantes o polipéptidos inmunomoduladores proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos proporcionados en el presente documento, incluidos todos los descritos a continuación, son útiles en la expresión de polipéptidos ICOSL variantes o polipéptidos inmunomoduladores proporcionados en el presente documento en células, como en células modificadas genéticamente, por ejemplo, células inmunitarias o células de agentes infecciosos. Los ácidos nucleicos aquí proporcionados pueden estar en forma de RNA o en forma de DNA, e incluyen mRNA, cRNA, RNA recombinante o sintético y cDNA. Los ácidos nucleicos aquí proporcionados son típicamente moléculas de DNA, y generalmente moléculas de DNA bicatenario. Sin embargo, también se proporcionan DNA monocatenario, RNA monocatenario, RNA bicatenario y ácidos nucleicos híbridos de DNA/RNA o combinaciones de los mismos que comprenden cualquiera de las secuencias de nucleótidos de la invención.
[0987] También se proporcionan en el presente documento vectores de expresión recombinantes y células huésped recombinantes útiles para producir los polipéptidos ICOSL variantes o polipéptidos inmunomoduladores proporcionados en el presente documento.
[0989] También se proporcionan aquí células modificadas genéticamente, tales como células inmunes modificadas genéticamente, que contienen cualquiera de las moléculas de ácido nucleico proporcionadas o cualquiera de los polipéptidos ICOSL variantes o polipéptidos inmunomoduladores, tales como cualquiera de los polipéptidos inmunomoduladores transmembrana o polipéptidos inmunomoduladores secretables.
[0991] También se proporcionan aquí agentes infecciosos, tales como células bacterianas o virales, que contienen cualquiera de las moléculas de ácido nucleico proporcionadas o cualquiera de los polipéptidos ICOSL variantes o polipéptidos inmunomoduladores, tales como cualquiera de los polipéptidos inmunomoduladores transmembrana o polipéptidos inmunomoduladores secretables.
[0993] [0453]En cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos variantes o polipéptidos inmunomoduladores aquí proporcionados pueden introducirse en células utilizando DNA recombinante y técnicas de clonación. Para ello, se prepara una molécula de DNA recombinante que codifica un polipéptido inmunomodulador. Los métodos de preparación de tales moléculas de DNA son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias que codifican los péptidos podrían extraerse del DNA utilizando enzimas de restricción adecuadas. Alternativamente, la molécula de DNA podría sintetizarse mediante técnicas de síntesis química, como el método de la fosforamidita. También podría utilizarse una combinación de estas técnicas. En algunos casos, un ácido nucleico recombinante o sintético puede generarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En algunas realizaciones, puede generarse un inserto de DNA que codifique uno o más polipéptidos ICOSL variantes que contengan al menos un dominio IgSF modificado por afinidad y, en algunas realizaciones, un péptido señal, un dominio transmembrana y/o un endodominio de acuerdo con la descripción proporcionada. Este inserto de DNA puede clonarse en un vector de transducción/transfección apropiado, como es sabido por los expertos en la materia. También se proporcionan vectores de expresión que contienen las moléculas de ácido nucleico.
[0995] En algunas realizaciones, los vectores de expresión son capaces de expresar las proteínas inmunomoduladoras en una célula apropiada bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico o un vector de expresión comprende la molécula de DNA que codifica la proteína inmunomoduladora operativamente unida a secuencias de control de expresión apropiadas. Los métodos para efectuar este enlace operativo, ya sea antes o después de insertar la molécula de DNA en el vector, son bien conocidos. Las secuencias de control de la expresión incluyen promotores, activadores, potenciadores, operadores, sitios de unión ribosómica, señales de inicio, señales de parada, señales cap, señales de poliadenilación y otras señales implicadas en el control de la transcripción o la traducción.
[0997] En algunas realizaciones, la expresión de la proteína inmunomoduladora es controlada por un promotor o potenciador para controlar o regular la expresión. El promotor está operativamente unido a la porción de la molécula de ácido nucleico que codifica la variante del polipéptido o de la proteína inmunomoduladora. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor constitutivamente activo (como un promotor constitutivamente activo específico de tejido u otro promotor constitutivo). En algunas realizaciones, el promotor es un promotor inducible, que puede responder a un agente inductor (como una señal de activación de células T).
[0999] En algunas realizaciones, un promotor constitutivo está unido operativamente a la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido variante o la proteína inmunomoduladora. Los promotores constitutivos ejemplares incluyen el promotor del virus vacuolador simio 40 (SV40), el promotor del citomegalovirus (CMV), el promotor de la ubiquitina C (UbC) y el promotor de EF-1 alfa (EF1a). En algunas realizaciones, el promotor constitutivo es específico del tejido. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el promotor permite la expresión constitutiva de la proteína inmunomoduladora en tejidos específicos, como células inmunitarias, linfocitos o células T. Algunos ejemplos de promotores específicos de tejido se describen en Patente de EE. UU. N.º 5.998.205, incluyendo, por ejemplo, una fetoproteína, DF3, tirosinasa, CEA, proteína surfactante y promotores de ErbB2.
[1001] En algunas realizaciones, un promotor inducible está unido operativamente a la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido variante o la proteína inmunomoduladora de tal manera que la expresión del ácido nucleico es controlable mediante el control de la presencia o ausencia del inductor de transcripción apropiado. Por ejemplo, el promotor puede ser un promotor regulado y un sistema de expresión del factor de transcripción, como los sistemas regulados por tetraciclina publicados u otros sistemas regulables (véase, por ejemplo, la Sol. Internacional PCT N.º WO 01/30843), para permitir la expresión regulada del polipéptido codificado. Un sistema promotor regulable ejemplar es el sistema Tet-On (y Tet-Off) disponible, por ejemplo, en Clontech (Palo Alto, CA). Este sistema promotor permite la expresión regulada del transgén controlado por tetraciclina o derivados de la tetraciclina, como la doxiciclina. Se conocen otros sistemas de promotores regulables (véase, por ejemplo, la Solicitud de EE. UU. N.º 2002-0168714, titulada "Regulation of Gene Expression Using Single-Chain, Monomeric, Ligand Dependent Polypeptide Switches", que describe interruptores génicos que contienen dominios de unión a ligandos y dominios de regulación transcripcional, como los de los receptores hormonales).
[1003] En algunas realizaciones, el promotor responde a un elemento que responde a la señalización de activación de células T. Sólo a modo de ejemplo, en algunas realizaciones, una célula T modificada genéticamente comprende un vector de expresión que codifica la proteína inmunomoduladora y un promotor vinculado operativamente para controlar la expresión de la proteína inmunomoduladora. La célula T modificada genéticamente puede activarse, por ejemplo, mediante la señalización a través de un receptor de célula T modificado (TCR) o un rector de antígeno quimérico (CAR), y desencadenar así la expresión y secreción de la proteína inmunomoduladora a través del promotor sensible.
[1005] [0459]En algunas realizaciones, un promotor inducible está operativamente unido a la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína inmunomoduladora de tal manera que la proteína inmunomoduladora se expresa en respuesta a un factor nuclear de células T activadas (NFAT) o al factor nuclear potenciador de cadena ligera kappa de células B activadas (NF-κB). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el promotor inducible comprende un sitio de unión para NFAT o NF-κB. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el promotor es un promotor NFAT o NF-κB o una variante funcional del mismo. Así, en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos permiten controlar la expresión de la proteína inmunomoduladora al tiempo que reducen o eliminan la toxicidad de la proteína inmunomoduladora. En particular, las células inmunitarias modificadas genéticamente que comprenden los ácidos nucleicos de la invención expresan y secretan la proteína inmunomoduladora sólo cuando la célula (por ejemplo, un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR) expresado por la célula) es estimulada específicamente por un antígeno y/o la célula (por ejemplo, la vía de señalización de calcio de la célula) es estimulada inespecíficamente por, por ejemplo, acetato de miristato de forbol (PMA)/Ionomicina. En consecuencia, la expresión y, en algunos casos, la secreción, de la proteína inmunomoduladora puede controlarse para que se produzca sólo cuando y donde sea necesaria (por ejemplo, en presencia de un agente infeccioso causante de enfermedad, cáncer o en el lugar de un tumor), lo que puede disminuir o evitar interacciones indeseadas de la proteína inmunomoduladora.
[1007] En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica una proteína inmunomoduladora descrita en el presente documento comprende una secuencia nucleotídica adecuada que codifica un promotor NFAT, un promotor NF-κB o una variante funcional de los mismos. "Promotor NFAT", tal como se utiliza en el presente documento, significa uno o más elementos que responden a NFAT unidos a un promotor mínimo. "Promotor de NF-κB" se refiere a uno o más elementos que responden a NF-κB unidos a un promotor mínimo. En algunas realizaciones, el promotor mínimo de un gen es un promotor mínimo de IL-2 humana o un promotor de CMV. Los elementos sensibles a NFAT pueden comprender, por ejemplo, elementos sensibles a NFAT1, NFAT2, NFAT3 y/o NFAT4. El promotor de NFAT, el promotor de NF-κB o una variante funcional del mismo puede comprender cualquier número de motivos de unión, por ejemplo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once o hasta doce motivos de unión.
[1009] El vector de expresión recombinante resultante que contiene la molécula de DNA se utiliza para transformar un huésped apropiado. Esta transformación puede realizarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, un ácido nucleico proporcionado en el presente documento comprende además una secuencia nucleotídica que codifica un péptido secretor o señal enlazado operablemente al ácido nucleico que codifica un polipéptido inmunomodulador de tal manera que un polipéptido inmunomodulador soluble resultante se recupera del medio de cultivo, de la célula huésped o del periplasma de la célula huésped. En otras realizaciones, las señales de control de expresión apropiadas se eligen para permitir la expresión en membrana de un polipéptido inmunomodulador. Además, los kits disponibles en el mercado y las empresas de fabricación por contrato también pueden utilizarse para fabricar las células modificadas genéticamente o las células huésped recombinantes que se proporcionan en el presente documento.
[1011] En algunas realizaciones, el vector de expresión resultante que contiene la molécula de DNA se utiliza para transformar, como transducir, una célula apropiada. La introducción puede realizarse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Los métodos ejemplares incluyen aquellos para la transferencia de ácidos nucleicos que codifican los receptores, incluyendo vía viral,por ejemplo, retroviral o lentiviral, transducción, transposones y electroporación. En algunas realizaciones, el vector de expresión es un vector viral. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se transfiere a las células mediante métodos de transducción lentiviral o retroviral.
[1013] En la preparación de los polipéptidos o las células modificadas genéticamente puede utilizarse cualquiera de un gran número de células huésped de mamífero conocidas y disponibles públicamente, incluidas células T de mamífero o APC. La selección de una célula depende de una serie de factores reconocidos por la técnica. Entre ellos figuran, por ejemplo, la compatibilidad con el vector de expresión elegido, la toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de DNA, la velocidad de transformación, la facilidad de recuperación de los péptidos, las características de expresión, la bioseguridad y los costes. Hay que encontrar un equilibrio entre estos factores teniendo en cuenta que no todas las células pueden ser igual de eficaces para la expresión de una determinada secuencia de DNA.
[1015] En algunas realizaciones, las células huésped pueden ser una variedad de células eucariotas, como en células de levadura, o con células de mamífero como ovario de hámster chino (CHO) o células HEK293. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula en suspensión y el polipéptido se modifica genéticamente o produce en suspensión cultivada, como en células CHO en suspensión cultivada, por ejemplo, células CHO-S. En algunos ejemplos, la línea celular es una línea celular CHO deficiente en DHFR (DHFR-), como DG44 y DUXB11. En algunas realizaciones, la célula es deficiente en glutamina sintasa (GS), por ejemplo, células CHO-S, células CHOK1 SV y células CHOZN((R)) GS-/-. En algunas realizaciones, las células CHO, como las células CHO en suspensión, pueden ser células CHO-S-2H2, células CHO-S-clon 14 o células ExpiCHO-S.
[1017] En algunas realizaciones, la expresión de los polipéptidos ICOSL proporcionados a partir de células CHO resulta en una composición más homogénea de las proteínas producidas. En algunas realizaciones, los polipéptidos ICOSL proporcionados dan lugar a un producto más homogéneo cuando las proteínas se expresan a partir de células CHO en comparación con los polipéptidos ICOSL que contienen la secuencia de referencia ECD completa y/o que contienen el sitio de escisión de la proteasa (por ejemplo, LQQN/LT). En algunas realizaciones, al menos el 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la composición de proteínas producidas que contienen un polipéptido variante de ICOSL producido en el presente documento, tienen la misma longitud de aminoácidos o son del mismo tamaño. Las técnicas para evaluar la homogeneidad del tamaño incluyen la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), la cromatografía de exclusión por tamaño, la página SDS o la secuenciación.
[1019] [0466]En algunas realizaciones, las células huésped también pueden ser células procariotas, como en el caso deE. coli.El hospedador recombinante transformado se cultiva en condiciones de expresión del polipéptido y, a continuación, se purifica para obtener una proteína soluble. Las células huésped recombinantes pueden cultivarse en condiciones de fermentación convencionales para que se expresen los polipéptidos deseados. Estas condiciones de fermentación son bien conocidas en la técnica. Por último, los polipéptidos proporcionados en el presente documento pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, como la precipitación con sulfato de amonio o etanol, la extracción ácida, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la cromatografía de fosfocelulosa, la cromatografía de interacción hidrofóbica y la cromatografía de afinidad. Los pasos de replegamiento de la proteína pueden utilizarse, según se desee, para completar la configuración de la proteína madura. Por último, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) puede emplearse en los pasos finales de purificación.
[1021] En algunas realizaciones, la célula es una célula inmune, como cualquiera descrita anteriormente en relación con la preparación de células modificadas genéticamente. En algunas realizaciones, dichas células modificadas genéticamente son células primarias. En algunas realizaciones, las células modificadas genéticamente son autólogas del sujeto. En algunas realizaciones, las células modificadas genéticamente son alogénicas al sujeto. En algunas realizaciones, las células modificadas genéticamente se obtienen de un sujeto, por ejemplo por leucaféresis, y se transforman ex vivo para la expresión del polipéptido inmunomodulador, por ejemplo el polipéptido inmunomodulador transmembrana o el polipéptido inmunomodulador secretable.
[1023] También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos inmunomoduladores variantes contenidos en los agentes infecciosos descritos aquí. En algunas realizaciones, los agentes infecciosos entregan los ácidos nucleicos a una célula del sujeto, y/o permiten la expresión de los polipéptidos variantes codificados en la célula. También se proporcionan ácidos nucleicos que se utilizan para generar, producir o modificar dichos agentes infecciosos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se proporcionan vectores y/o plásmidos que contienen ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos inmunomoduladores variantes, para la generación de los agentes infecciosos, la administración a las células de un sujeto y/o la expresión de los polipéptidos inmunomoduladores variantes en las células del sujeto.
[1025] En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos proporcionados son vectores virales o bacterianos recombinantes que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos inmunomoduladores variantes. En algunas realizaciones, los vectores recombinantes pueden utilizarse para producir un agente infeccioso que contenga secuencias de ácido nucleico que codifiquen los polipéptidos inmunomoduladores variantes y/o para ser administrados a una célula diana en el sujeto para su expresión por la célula diana. En algunas realizaciones, el vector recombinante es un vector de expresión. En algunas realizaciones, el vector recombinante incluye secuencias apropiadas necesarias para la generación y/o producción del agente infeccioso y la expresión en la célula diana.
[1027] En algunas realizaciones, el vector recombinante es un plásmido o cósmido. El plásmido o cósmido que contiene secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos inmunomoduladores variantes, tal como se describen en el presente documento, se construye fácilmente utilizando técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Para la generación del agente infeccioso, el vector o genoma puede construirse en forma de plásmido que luego puede transfectarse en una línea celular de empaquetamiento o productora o en una bacteria huésped. Los vectores recombinantes pueden generarse utilizando cualquiera de las técnicas recombinantes conocidas en la técnica. En algunas realizaciones, los vectores pueden incluir un origen procariota de replicación y/o un gen cuya expresión confiere un marcador detectable o seleccionable, como la resistencia a un fármaco para la propagación y/o selección en sistemas procariotas.
[1029] En algunas realizaciones, el vector recombinante es un vector viral. Los vectores virales recombinantes ejemplares incluyen un genoma de vector lentiviral, un genoma de vector de poxvirus, un genoma de vector de virus vaccinia, un genoma de vector de adenovirus, un genoma de vector de virus asociado a adenovirus, un genoma de vector de virus herpes y un genoma de vector de virus alfa. Los vectores virales pueden ser vivos, atenuados, de replicación condicional o de replicación deficiente, no patógenos (defectuosos), vectores virales de replicación competente, y/o modificados para expresar un producto génico heterólogo, por ejemplo, los polipéptidos inmunomoduladores variantes proporcionados en el presente documento. Los vectores para la generación de virus también pueden modificarse para alterar la atenuación del virus, lo que incluye cualquier método para aumentar o disminuir la carga transcripcional o traslacional.
[1031] Los vectores virales ejemplares que pueden utilizarse incluyen vectores de virus vaccinia modificados (véase, por ejemplo, Guerra et al., J. Virol. 80:985-98 (2006); Tartaglia et al., AIDS Research and Human Retroviruses 8: 1445-47 (1992); Gheradi et al., J. Gen. Virol.86:2925-36 (2005); Mayr et al., Infection 3:6-14 (1975); Hu et al., J. Virol.75: 10300-308 (2001); Patentes de EE.UU. N.º 5.698.530, 6.998.252, 5.443.964, 7.247.615 y 7.368.116); vector de adenovirus o vectores de virus asociados a adenovirus (véase, por ejemplo, Molin et al., J. Virol.72:8358-61 (1998); Narumi et al., Am J. Respir. Cell Mol. Biol. 19:936-41 (1998); Mercier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6188-93 (2004); Patentes de EE.UU. N.º 6.143.290; 6.596.535; 6.855.317; 6.936.257; 7.125.717; 7.378.087; 7.550.296); vectores retrovirales, incluidos los basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia de los simios gibones (GaLV), los retrovirus ecotrópicos, el virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS), el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), y combinaciones (véanse, por ejemplo, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-39 (1992); Johann et al., J. Virol. 66: 1635-40 (1992); Sommerfelt et al., Virology 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-78 (1989); Miller et al., J. Virol.
[1032] 65:2220-24 (1991); Miller et al., Mol. Cell Biol.10:4239 (1990); Kolberg, NIH Res.4:431992; Cornetta et al., Hum. Gene Ther. 2:215 (1991)); vectores lentivirales, incluidos los basados en el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1), el HIV-2, el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), el virus de la anemia infecciosa equina, el virus de la inmunodeficiencia simia (SIV) y el virus maedi/visna (véase, por ejemplo, Pfeifer et al., Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2: 177-211 (2001); Zufferey et al., J. Virol.72: 9873, 1998; Miyoshi et al., J. Virol.72:8150, 1998; Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Engelman et al., J. Virol. 69: 2729, 1995; Nightingale et al., Mol. Therapy, 13: 1121, 2006; Brown et al., J. Virol. 73:9011 (1999); WO 2009/076524; WO 2012/141984; WO 2016/011083; McWilliams et al., J. Virol. 77: 11150, 2003; Powell et al., J. Virol.70:5288, 1996) o cualquiera de sus variantes, y/o vectores que puedan utilizarse para generar cualquiera de los virus descritos anteriormente. En algunas realizaciones, el vector recombinante puede incluir secuencias reguladoras, como secuencias promotoras o potenciadoras, que pueden regular la expresión del genoma viral, como en el caso de los virus RNA, en la línea celular de empaquetamiento (véase, por ejemplo, Patentes de EE.UU. n.º 5.385.839 y 5.168.062).
[1034] En algunas realizaciones, el vector recombinante es un vector de expresión, por ejemplo, un vector de expresión que permite la expresión del producto génico codificado cuando se administra en la célula diana, por ejemplo, una célula del sujeto, por ejemplo, una célula tumoral, una célula inmunitaria y/o una APC. En algunas realizaciones, los vectores de expresión recombinantes contenidos en el agente infeccioso son capaces de expresar las proteínas inmunomoduladoras en la célula diana del sujeto, en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína.
[1036] En algunos aspectos, los ácidos nucleicos o un vector de expresión comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína inmunomoduladora operativamente unida a secuencias de control de expresión apropiadas. Los métodos para afectar a esta unión operativa, ya sea antes o después de que la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína inmunomoduladora se inserte en el vector, son bien conocidos. Las secuencias de control de la expresión incluyen promotores, activadores, potenciadores, operadores, sitios de unión ribosómica, señales de inicio, señales de parada, señales cap, señales de poliadenilación y otras señales implicadas en el control de la transcripción o la traducción. El promotor puede estar unido de forma operable a la parte de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína inmunomoduladora. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor constitutivamente activo en la célula diana (como un promotor constitutivamente activo específico de tejido u otro promotor constitutivo). Por ejemplo, el vector de expresión recombinante también puede incluir elementos reguladores transcripcionales (ERT) específicos de tejido linfoide, como un ERT específico de linfocitos B, linfocitos T o células dendríticas. Los TRE específicos de tejido linfoide son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Thompson et al., Mol. Cell. Biol.12:1043-53 (1992); Todd et al., J. Exp. Med. 177:1663-74 (1993); Penix et al., J. Exp. Med. 178:1483-96 (1993)). En algunas realizaciones, el promotor es un promotor inducible, que puede responder a un agente inductor (como una señal de activación de células T). En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos administrados a la célula diana en el sujeto, por ejemplo, célula tumoral, célula inmunitaria y/o APC, pueden unirse de forma operable a cualquiera de los elementos reguladores descritos anteriormente.
[1038] En algunas realizaciones, el vector es un vector bacteriano, por ejemplo, un plásmido bacteriano o cósmido. En algunas realizaciones, el vector bacteriano se administra a la célula diana, por ejemplo, células tumorales, células inmunitarias y/o APC, mediante la transferencia mediada por bacterias de DNA plasmídico a células de mamífero (también denominada "bactofección"). En algunas realizaciones, el vector bacteriano suministrado también contiene secuencias de control de expresión apropiadas para la expresión en las células diana, como una secuencia promotora y/o secuencias potenciadoras, o cualquier secuencia reguladora o de control descrita anteriormente. En algunas realizaciones, el vector bacteriano contiene secuencias de control de expresión apropiadas para la expresión y/o secreción de los polipéptidos variantes codificados en el agente infeccioso, por ejemplo, la bacteria.
[1040] En algunas realizaciones, los polipéptidos aquí proporcionados también pueden fabricarse por métodos sintéticos. La síntesis en fase sólida es la técnica preferida para fabricar péptidos individuales, ya que es el método más rentable para fabricar péptidos pequeños. Por ejemplo, las técnicas de síntesis en fase sólida bien conocidas incluyen el uso de grupos protectores, enlazadores y soportes en fase sólida, así como condiciones específicas de reacción de protección y desprotección, condiciones de escisión del enlazador, uso de secuestrantes y otros aspectos de la síntesis peptídica en fase sólida. A continuación, los péptidos pueden ensamblarse en los polipéptidos tal y como se indica en el presente documento.
[1042] V. MÉTODOS DE EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD INMUNOMODULADORA DE POLIPÉPTIDOS ICOSL VARIANTES Y PROTEÍNAS INMUNOMODULADORAS
[1044] En algunas realizaciones, los polipéptidos ICOSL variantes proporcionados en el presente documento (por ejemplo, de longitud completa y/o fragmentos de unión específicos o conjugados, construcciones de apilamiento o fusión de los mismos) exhiben actividad inmunomoduladora para modular la activación de células T. En algunas realizaciones, los polipéptidos ICOSL modulan la expresión de IFN-gamma en un ensayo de células T primarias en relación con un control ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre. En algunos casos, la modulación de la expresión de IFN-gamma puede aumentar o disminuir la expresión de IFN-gamma en relación con el control. Los ensayos para determinar la unión específica y la expresión de IFN-gamma son bien conocidos en la técnica e incluyen los ensayos MLR (reacción linfocitaria mixta) que miden los niveles de citocina interferón-gamma en sobrenadantes de cultivo (Wang et al., Cancer Immunol Res.2014 Sep: 2(9):846-56), ensayo de estimulación de células T SEB (enterotoxina estafilocócica B) (Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846-56), y ensayos de estimulación de células T anti-CD3 (Li y Kurlander, J Transl Med.2010: 8: 104).
[1045] En algunas realizaciones, un polipéptido ICOSL variante puede, en algunas realizaciones, aumentar o, en realizaciones alternativas, disminuir la expresión de IFN-gamma (interferón-gamma) en un ensayo de células T primarias en relación con un control ICOSL de tipo silvestre. En algunas realizaciones de los polipéptidos proporcionados que contienen una secuencia ICOSL variante soluble, el polipéptido puede aumentar la expresión de IFN-gamma y, en realizaciones alternativas, disminuir la expresión de IFN-gamma en un ensayo de células T primarias en relación con un control ICOSL de tipo silvestre. En algunas realizaciones de los polipéptidos proporcionados que contienen secuencias ICOSL variantes múltiples, el polipéptido puede aumentar la expresión de IFN-gamma y, en realizaciones alternativas, disminuir la expresión de IFN-gamma en un ensayo de células T primarias en relación con un control ICOSL de tipo silvestre.
[1047] Los expertos reconocerán que el formato del ensayo de células T primarias utilizado para determinar un aumento en la expresión de IFN-gamma puede diferir del empleado para ensayar una disminución en la expresión de IFN-gamma. Al ensayar la capacidad de una variante ICOSL para disminuir la expresión de IFN-gamma en un ensayo de células T primarias, puede utilizarse un ensayo de reacción linfocitaria mixta (MLR) como se describe en el Ejemplo 6. En algunos casos, puede emplearse una forma soluble de una variante de ICOSL para determinar la capacidad de la variante de ICOSL para antagonizar y, por tanto, disminuir la expresión de IFN-gamma en una MLR, como se describe asimismo en el Ejemplo 6.
[1049] Alternativamente, al ensayar la capacidad de una variante ICOSL para aumentar la expresión de IFN-gamma en un ensayo de células T primarias, puede usarse un ensayo de co-inmovilización como se describe en el Ejemplo 6. En un ensayo de co-inmovilización, una señal TCR, proporcionada en algunas realizaciones por un anticuerpo anti-CD3, se utiliza junto con una variante ICOSL co-inmovilizada para determinar la capacidad de aumentar la expresión de IFN-gamma en relación con un control ICOSL. En algunos casos, puede emplearse una forma soluble de una variante de ICOSL multimerizada hasta un grado que proporcione una unión multivalente para determinar la capacidad de la variante de ICOSL para agonizar y, de este modo, aumentar la expresión de IFN-gamma en una MLR, como se describe asimismo en el Ejemplo 6.
[1051] En algunas realizaciones, al ensayar la capacidad de una variante ICOSL para modular un aumento o disminución de la expresión de IFN-gamma, se puede utilizar un ensayo reportero de células T. En algunas realizaciones, la célula T es una línea de células T Jurkat o se deriva de líneas de células T Jurkat. En los ensayos reporteros, la línea celular reportera (por ejemplo, la célula reportera Jurkat) también se genera para sobreexpresar un receptor inhibidor que es el socio de unión afín del polipéptido de dominio IgSF variante. En algunas realizaciones, las células T informadoras también contienen un constructo informador que contiene un promotor inducible que responde a la activación de células T unido de forma operable a un informador. En algunas realizaciones, el informador es fluorescente o luminiscente. En algunas realizaciones, el reportero es luciferasa. En algunas realizaciones, el promotor responde a la señalización CD3. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor NFAT. En algunas realizaciones, el promotor responde a la señalización costimuladora, por ejemplo, la señalización costimuladora CD28. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor de IL-2.
[1053] En aspectos de un ensayo reportero, una línea celular reportera es estimulada, tal como por co-incubación con células presentadoras de antígeno (APC) expresando el ligando de tipo silvestre del receptor inhibidor, por ejemplo ICOSL. En algunas realizaciones, las APC son APC artificiales. Los APC artificiales son bien conocidos por un artesano experto. En algunas realizaciones, las APC artificiales se derivan de una o más líneas celulares de mamíferos, como las células K562, CHO o 293.
[1055] En algunas realizaciones, las células reporteras Jurkat son co-incubadas con APC artificiales que sobreexpresan el ligando inhibidor en presencia de la molécula de dominio IgSF variante o proteína inmunomoduladora, por ejemplo, polipéptido ICOSL variante o proteína inmunomoduladora. En algunas realizaciones, se monitoriza la expresión del reportero, por ejemplo determinando la luminiscencia o fluorescencia de las células. En algunas realizaciones, las interacciones normales entre su receptor inhibitorio y el ligando dan lugar a una represión o disminución de la señal del informador, por ejemplo en comparación con el control, por ejemplo la expresión del informador por coincubación de células T de control y APC en las que no está presente la interacción del receptor inhibitorio y el ligando, por ejemplo APC que no sobreexpresan ICOSL. En algunas realizaciones, una variante del polipéptido ICOSL o de la proteína inmunomoduladora proporcionada en el presente documento antagoniza la interacción, por ejemplo, cuando se proporciona en forma soluble como una variante de ICOSL-Fc o cuando se expresa a partir de la APC como una proteína inmunomoduladora secretable, lo que resulta en un aumento de la señal del reportero en comparación con la ausencia de la variante del polipéptido ICOSL o de la proteína inmunomoduladora. En algunos casos, ciertos formatos de una variante del polipéptido ICOSL o de la proteína inmunomoduladora según se proporciona en el presente documento pueden proporcionar una actividad agonista, disminuyendo así la expresión del informador en comparación con la ausencia de la variante del polipéptido ICOSL o de la proteína inmunomoduladora.
[1057] [0484]El uso de controles apropiados es conocido por los expertos en la materia, sin embargo, en las realizaciones antes mencionadas, el control típicamente implica el uso del ICOSL de referencia, tal como una isoforma ICOSL nativa de tipo silvestre de la misma especie de mamífero de la cual se derivó o desarrolló la variante ICOSL. Independientemente de si la afinidad de unión a uno o ambos de ICOS y CD28 aumenta o disminuye, una variante ICOSL en algunas realizaciones aumentará la expresión de IFN-gamma y, en realizaciones alternativas, disminuirá la expresión de IFN-gamma en un ensayo de células T primarias en relación con un control ICOSL de tipo silvestre.
[1058] En algunas realizaciones, una variante ICOSL aumenta la expresión de IFN-gamma (es decir, la expresión de proteína) en relación con un control ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificado) o de tipo silvestre en al menos: 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o superior. En otras realizaciones, una variante ICOSL disminuye la expresión de IFN-gamma (es decir, la expresión de proteínas) en relación con un control ICOSL de tipo silvestre o no modificado en al menos: 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o superior. En algunas realizaciones, el control de ICOSL de tipo silvestre es ICOSL murino, como el que se utilizaría típicamente para una variante de ICOSL alterada en su secuencia con respecto a la secuencia de ICOSL murino de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el control ICOSL de tipo silvestre es ICOSL humano, como el que se utilizaría típicamente para una variante ICOSL alterada en la secuencia a partir de la secuencia ICOSL humana de tipo silvestre, como una secuencia ICOSL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.º:32 o SEQ ID N.º:196 o 545.
[1059] VI. FORMULACIONES FARMACÉUTICAS
[1060] Se proporcionan aquí composiciones que contienen cualquiera de los polipéptidos ICOSL variantes, proteínas inmunomoduladoras, conjugados, células modificadas genéticamente o agentes infecciosos descritos aquí. La composición farmacéutica puede comprender además un excipiente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede contener uno o más excipientes para modificar, mantener o preservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o liberación, la adsorción o la penetración de la composición. En algunos aspectos, un artesano experto entiende que una composición farmacéutica que contiene células puede diferir de una composición farmacéutica que contiene una proteína.
[1061] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es un sólido, como un polvo, cápsula o comprimido. Por ejemplo, los componentes de la composición farmacéutica pueden liofilizarse. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica sólida se reconstituye o disuelve en un líquido antes de su administración.
[1062] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es un líquido, por ejemplo polipéptidos ICOSL variantes disueltos en una solución acuosa (como solución salina fisiológica o solución de Ringer). En algunas realizaciones, el pH de la composición farmacéutica está entre 4,0 y 8,5 (por ejemplo, entre 4,0 y 5,0, entre 4,5 y 5,5, entre 5,0 y 6,0, entre 5,5 y 6,5, entre 6,0 y 7,0, entre 6,5 y 7,5, entre 7,0 y 8,0, o entre 7,5 y 8,5).
[1063] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo una carga, ligante, recubrimiento, conservante, lubricante, agente aromatizante, agente edulcorante, agente colorante, un disolvente, un agente amortiguador, un agente quelante o estabilizador. Ejemplos de cargas farmacéuticamente aceptables son la celulosa, el fosfato cálcico dibásico, el carbonato cálcico, la celulosa microcristalina, la sacarosa, la lactosa, la glucosa, el manitol, el sorbitol, el maltol, el almidón pregelatinizado, el almidón de maíz o el almidón de patata. Algunos ejemplos de ligantes farmacéuticamente aceptables son polivinilpirrolidona, almidón, lactosa, xilitol, sorbitol, maltitol, gelatina, sacarosa, polietilenglicol, metilcelulosa o celulosa. Algunos ejemplos de recubrimientos farmacéuticamente aceptables son la hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), la goma laca, la proteína de maíz zeína o la gelatina. Algunos ejemplos de desintegrantes farmacéuticamente aceptables son la polivinilpirrolidona, la carboximetilcelulosa o el glicolato sódico de almidón. Algunos ejemplos de lubricantes farmacéuticamente aceptables son el polietilenglicol, el estearato de magnesio o el ácido esteárico. Algunos ejemplos de conservantes farmacéuticamente aceptables son el metilparabeno, el etilparabeno, el propilparabeno, el ácido benzoico o el ácido sórbico. Algunos ejemplos de edulcorantes farmacéuticamente aceptables son la sacarosa, la sacarina, el aspartamo o el sorbitol. Algunos ejemplos de agentes amortiguadores farmacéuticamente aceptables son carbonatos, citratos, gluconatos, acetatos, fosfatos o tartratos.
[1064] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un agente para la liberación controlada o sostenida del producto, como microesferas inyectables, partículas bioerodibles, compuestos poliméricos (ácido poliláctico, ácido poliglicólico), microesferas o liposomas.
[1065] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es estéril. La esterilización puede realizarse por filtración a través de membranas de filtración estériles o por radiación. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización mediante este método puede realizarse antes o después de la liofilización y reconstitución. La composición para administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en solución. Además, las composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
[1066] [0492]En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen las proteínas inmunomoduladoras transmembrana, incluyendo células modificadas genéticamente que expresan dichas proteínas inmunomoduladoras transmembrana. En algunas realizaciones, las composiciones y formulaciones farmacéuticas incluyen uno o más portadores o excipientes opcionales farmacéuticamente aceptables. Dichas composiciones pueden comprender tampones como solución salina neutra tamponada, solución salina fosfatada tamponada y similares; carbohidratos como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos como glicina; antioxidantes; agentes quelantes como EDTA o glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones de la presente invención se formulan preferentemente para administración intravenosa.
[1068] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica contiene agentes infecciosos que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos variantes inmunomoduladores. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica contiene una dosis de agentes infecciosos adecuada para su administración a un sujeto apto para el tratamiento. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica contiene un agente infeccioso que es un virus, en una cantidad de dosificación única o múltiple, de entre aproximadamente o entre aproximadamente 1×10<5>y aproximadamente 1×10<12>unidades formadoras de placa (pfu), 1×10<6>y 1×10<10>pfu, o 1×10<7>y 1×10<10>pfu, cada una inclusive, como al menos o al menos entre o entre aproximadamente 1×10<6>, 1×10<7>, 1×10<8>, 1×10<9>, 2×10<9>, 3×10<9>, 4×10<9>, 5×10<9>pfu o aproximadamente 1×10<10>pfu. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede contener una concentración de virus de o de aproximadamente 10<5>a aproximadamente 10<10>pfu/mL, por ejemplo, de 5×10<6>a 5×10<9>o de 1×10<7>a 1×10<9>pfu/mL, como al menos o al menos de o a aproximadamente 10<6>pfu/mL, 10<7>pfu/mL, 10<8>pfu/mL o 10<9>pfu/mL. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica contiene un agente infeccioso que es una bacteria, en una cantidad de dosificación única o múltiple, de entre aproximadamente o entre aproximadamente<1×103>y aproximadamente<1×109>unidades formadoras de colonias (cfu), 1×10<4>y 1×10<9>cfu, o 1×10<5>y 1×10<7>cfu, cada una inclusive, como al menos o al menos aproximadamente o aproximadamente 1×10<4>, 1×10<5>, 1×10<6>, 1×10<7>, 1×10<8>o 1×10<9>cfu. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede contener una concentración bacteriana de o de aproximadamente 10<3>a aproximadamente 10<8>cfu/mL, por ejemplo, de 5×10<5>a 5×10<7>o de 1×10<6>a 1×10<7>cfu/mL, tal como al menos o al menos de o aproximadamente 10<5>cfu/mL, 10<6>cfu/mL, 10<7>cfu/mL o 10<8>cfu/mL
[1070] Dicha formulación puede, por ejemplo, estar en una forma adecuada para infusión intravenosa. Un portador farmacéuticamente aceptable puede ser un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable que participa en el acarreo o transporte de células de interés desde un tejido, órgano o porción del cuerpo a otro tejido, órgano o porción del cuerpo. Por ejemplo, el portador puede ser una carga líquida o sólida, un diluyente, un excipiente, un disolvente o un material de encapsulación, o alguna combinación de los mismos. Cada componente del soporte debe ser "farmacéuticamente aceptable", es decir, debe ser compatible con los demás ingredientes de la formulación. También debe ser adecuado para el contacto con cualquier tejido, órgano o porción del cuerpo que pueda encontrar, lo que significa que no debe conllevar un riesgo de toxicidad, irritación, respuesta alérgica, inmunogenicidad o cualquier otra complicación que supere excesivamente sus beneficios terapéuticos.
[1072] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra a un sujeto. Generalmente, las dosis y vías de administración de la composición farmacéutica se determinan en función del tamaño y estado del sujeto, según la práctica farmacéutica habitual. Por ejemplo, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales como ratones, ratas, conejos, perros, cerdos o monos. También puede utilizarse un modelo animal para determinar el intervalo de concentración y la vía de administración adecuados. Esta información puede utilizarse después para determinar las dosis y vías de administración útiles en humanos. La dosis exacta se determinará en función de factores relacionados con el sujeto que requiera tratamiento. La dosis y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del compuesto activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, el tiempo y la frecuencia de administración, la combinación o combinaciones de fármacos, las sensibilidades a las reacciones y la respuesta a la terapia.
[1074] Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada pueden administrarse cada 3 a 4 días, cada semana o quincenalmente, dependiendo de la vida media y la tasa de eliminación de la formulación en particular. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la molécula en la formulación utilizada. Normalmente, una composición se administra hasta alcanzar una dosis que logre el efecto deseado. Por lo tanto, la composición puede administrarse como dosis única, o como dosis múltiples (a la misma o a diferentes concentraciones/dosis) a lo largo del tiempo, o como infusión continua. La dosificación adecuada se afina de forma rutinaria. Las dosis adecuadas pueden determinarse mediante el uso de datos dosis-respuesta apropiados. Pueden controlarse varios biomarcadores o marcadores fisiológicos del efecto terapéutico, como la activación o proliferación de células T, la síntesis o producción de citocinas (por ejemplo, producción de TNF-α, IFN-γ, IL-2), la inducción de diversos marcadores de activación (por ejemplo, CD25, receptor de IL-2), inflamación, hinchazón o sensibilidad articular, nivel sérico de proteína C reactiva, producción de anticuerpos anticolágeno y/o respuesta(s) de anticuerpos dependiente(s) de células T.
[1076] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra a un sujeto a través de cualquier vía, incluyendo oralmente, transdérmicamente, por inhalación, intravenosamente, intraarterialmente, intramuscularmente, aplicación directa al sitio de una herida, aplicación a un sitio quirúrgico, intraperitonealmente, por supositorio, subcutáneamente, intradérmicamente, transcutáneamente, por nebulización, intrapleuralmente, intraventricularmente, intraarticularmente, intraocularmente, o intraespinalmente.
[1078] [0498]En algunas realizaciones, la dosificación de la composición farmacéutica es una dosis única o una dosis repetida. En algunas realizaciones, las dosis se administran a un sujeto una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, o cuatro o más veces al día. En algunas realizaciones, se administran alrededor de 1 o más (como alrededor de 2 o más, alrededor de 3 o más, alrededor de 4 o más, alrededor de 5 o más, alrededor de 6 o más, o alrededor de 7 o más) dosis en una semana. En algunos casos, se administran varias dosis a lo largo de días, semanas, meses o años. En algunas realizaciones, un ciclo de tratamiento es de aproximadamente 1 o más dosis (como aproximadamente 2 o más dosis, aproximadamente 3 o más dosis, aproximadamente 4 o más dosis, aproximadamente 5 o más dosis, aproximadamente 7 o más dosis, aproximadamente 10 o más dosis, aproximadamente 15 o más dosis, aproximadamente 25 o más dosis, aproximadamente 40 o más dosis, aproximadamente 50 o más dosis, o aproximadamente 100 o más dosis).
[1080] En algunas realizaciones, una dosis administrada de la composición farmacéutica es de aproximadamente 1 µg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más (tal como aproximadamente 2 µg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, aproximadamente 5 µg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, aproximadamente 10 µg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, aproximadamente 25 µg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, unos 50 µg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, unos 100 µg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, unos 250 µg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, unos 500 µg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, unos 1 mg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, unos 2 mg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más, o unos 5 mg de proteína por kg de masa corporal del sujeto o más).
[1082] En algunas realizaciones, se administra una cantidad terapéutica de una composición celular. Típicamente, la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención a administrar puede ser determinada por un médico teniendo en cuenta las diferencias individuales de edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o metástasis y estado del paciente (sujeto). En general, puede afirmarse que una composición farmacéutica que comprende células modificadas genéticamente, por ejemplo células T, según se describe en el presente documento, puede administrarse a una dosis de 10<4>a 10<9>células/kg de peso corporal, por ejemplo de 10<5>a 10<6>células/kg de peso corporal, incluidos todos los valores enteros dentro de dichos intervalos. Las composiciones celulares modificadas genéticamente, como las composiciones de células T, también pueden administrarse varias veces a estas dosis. Las células pueden administrarse mediante técnicas de infusión comúnmente conocidas en inmunoterapia (véase, por ejemplo, Rosenberg et al, New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988). Un experto en medicina puede determinar fácilmente la dosis y el régimen de tratamiento óptimos para un paciente concreto controlando al paciente en busca de signos de enfermedad y ajustando el tratamiento en consecuencia.
[1084] Se conocen diversos medios para determinar si la administración de una composición terapéutica de la invención modula suficientemente la actividad inmunológica eliminando, secuestrando o inactivando células inmunitarias que median o son capaces de mediar una respuesta inmunitaria no deseada; induciendo, generando o activando células inmunitarias que median o son capaces de mediar una respuesta inmunitaria protectora; cambiando las propiedades físicas o funcionales de las células inmunitarias; o una combinación de estos efectos. Los ejemplos de mediciones de la modulación de la actividad inmunológica incluyen, entre otros, el examen de la presencia o ausencia de poblaciones de células inmunitarias (mediante citometría de flujo, inmunohistoquímica, histología, microscopía electrónica, reacción en cadena de la polimerasa (PCR)); medición de la capacidad funcional de las células inmunitarias, incluida la capacidad o resistencia a proliferar o dividirse en respuesta a una señal (por ejemplo, mediante ensayos de proliferación de células T y análisis pepscan basados en la incorporación de 3H-timidina tras la estimulación con anticuerpos anti-CD3, anticuerpos contra el receptor de células T, anticuerpos anti-CD28, ionóforos de calcio, células presentadoras de antígeno PMA (forbol 12-miristato 13-acetato) cargadas con un antígeno peptídico o proteico; ensayos de proliferación de células B); medición de la capacidad de matar o lisar otras células (como los ensayos de células T citotóxicas); mediciones de las citocinas, quimiocinas, moléculas de la superficie celular, anticuerpos y otros productos de las células (por ejemplo, mediante citometría de flujo, ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas, análisis Western blot, análisis de micromatrices de proteínas, análisis de inmunoprecipitación); medición de marcadores bioquímicos de activación de células inmunitarias o vías de señalización dentro de las células inmunitarias (por ejemplo, análisis por Western blot e inmunoprecipitación de la fosforilación de tirosina, serina o treonina, la escisión de polipéptidos y la formación o disociación de complejos proteicos; análisis de matrices de proteínas; perfiles transcripcionales de DNA mediante matrices de DNA o hibridación sustractiva); mediciones de la muerte celular por apoptosis, necrosis u otros mecanismos (por ejemplo, tinción con anexina V, ensayos TUNEL, electroforesis en gel para medir el escalamiento del DNA, histología; ensayos fluorogénicos de caspasas, análisis Western blot de sustratos de caspasas); medición de los genes, proteínas y otras moléculas producidas por las células inmunitarias (por ejemplo, análisis Northern blot, reacción en cadena de la polimerasa, micromatrices de DNA, micromatrices de proteínas, electroforesis bidimensional en gel, análisis Western blot, ensayos inmunoenzimáticos, citometría de flujo); y medición de síntomas o resultados clínicos, como la mejora de enfermedades autoinmunes, neurodegenerativas y otras enfermedades en las que intervienen autoproteínas o autopolipéptidos (puntuaciones clínicas, requisitos para el uso de terapias adicionales, estado funcional, estudios de imagen), por ejemplo, midiendo la tasa de recaída o la gravedad de la enfermedad (utilizando puntuaciones clínicas conocidas por el artesano normalmente experto) en el caso de la esclerosis múltiple, midiendo la glucosa en sangre en el caso de la diabetes de tipo I, o la inflamación articular en el caso de la artritis reumatoide.
[1086] VII. ARTÍCULOS DE FABRICACIÓN Y KITS
[1088] También se proporcionan aquí artículos de fabricación que comprenden las composiciones farmacéuticas descritas aquí en envases adecuados. Los envases adecuados para las composiciones (como las composiciones oftálmicas) aquí descritas son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, viales (como viales sellados), recipientes, ampollas, botellas, frascos, envases flexibles (por ejemplo, bolsas selladas de Mylar o de plástico), y similares. Estos artículos de fabricación pueden además esterilizarse y/o sellarse.
[1089] Se proporcionan además kits que comprenden las composiciones farmacéuticas (o artículos de fabricación) descritas en el presente documento, que pueden comprender además instrucciones sobre métodos de uso de la composición, como los usos descritos en el presente documento. Los kits aquí descritos también pueden incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones para realizar cualquiera de los métodos aquí descritos.
[1091] VIII. APLICACIONES TERAPÉUTICAS
[1093] Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento (incluida la composición farmacéutica que comprende los polipéptidos ICOSL variantes, las proteínas inmunomoduladoras, los conjugados, las células modificadas genéticamente y los agentes infecciosos descritos en el presente documento) pueden utilizarse en una variedad de aplicaciones terapéuticas, como el tratamiento de una enfermedad. Por ejemplo, en algunas realizaciones la composición farmacéutica se utiliza para tratar trastornos inflamatorios o autoinmunes, cáncer, trasplante de órganos, infecciones víricas y/o infecciones bacterianas en un mamífero. La composición farmacéutica puede modular (por ejemplo, aumentar o disminuir) una respuesta inmunitaria para tratar la enfermedad.
[1095] Tales usos incluyen usos terapéuticos, por ejemplo, que implican la administración de las moléculas o células modificadas genéticamente, o composiciones que contienen las mismas, a un sujeto que padece una enfermedad, afección o trastorno. En algunos casos, como los descritos, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno autoinmune o inflamatorio. En algunos casos, como los descritos, la enfermedad o trastorno es un tumor o cáncer. En algunas realizaciones, la molécula o célula modificada genéticamente se administra en una cantidad eficaz para el tratamiento de la enfermedad o trastorno. Los usos incluyen usos de moléculas que contienen un polipéptido ICOSL variante, proteína inmunomoduladora, conjugado, célula modificada genéticamente y agentes infecciosos en tales tratamientos, y en la preparación de un medicamento para llevar a cabo tales tratamientos En algunas realizaciones, un polipéptido ICOSL variante, proteína inmunomoduladora, conjugado, célula modificada genéticamente y agente infeccioso, o composiciones que comprenden los mismos, para uso terapéutico se administra al sujeto que tiene o se sospecha que tiene la enfermedad o afección tratando así la enfermedad o afección o trastorno en el sujeto.
[1097] En algunas realizaciones, los métodos proporcionados son aplicables a la administración terapéutica de polipéptidos ICOSL variantes, las proteínas inmunomoduladoras, los conjugados, las células modificadas genéticamente y los agentes infecciosos aquí descritos. Está al alcance de un artesano experto, a la vista de la divulgación proporcionada, elegir un formato para la indicación dependiendo del tipo de modulación de la respuesta inmunitaria, por ejemplo, aumento o disminución que se desee.
[1099] En algunas realizaciones, se administra una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento que estimula la respuesta inmunitaria, que puede ser útil, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer, infecciones víricas o infecciones bacterianas. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica contiene una variante del polipéptido ICOSL en un formato que exhibe actividad agonista de su pareja de unión CD28 o ICOS y/o que estimula o inicia la señalización coestimuladora a través de CD28 o ICOS. Formatos ejemplares de un polipéptido ICOSL para su uso en relación con dichas aplicaciones terapéuticas incluyen, a modo de ejemplo, una proteína inmunomoduladora o una "pilla" de un polipéptido ICOSL variante y un dominio IgSF o una variante del mismo que se une a un antígeno tumoral (por ejemplo, NKp30 o una variante con afinidad modificada) (también denominado "dominio IgSF localizador de tumor"), un conjugado que contiene un polipéptido ICOSL variante unido a una entidad dirigida a tumores (también denominada entidad localizadora de tumores), una célula modificada genéticamente que expresa una proteína inmunomoduladora transmembrana, o un agente infeccioso que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína inmunomoduladora transmembrana, tal como para la expresión de la proteína inmunomoduladora transmembrana en una célula infectada (por ejemplo, una célula tumoral o una APC, por ejemplo, una célula dendrítica).
[1101] Las composiciones farmacéuticas que comprenden células modificadas genéticamente y los métodos aquí descritos pueden utilizarse en aplicaciones de transferencia celular adoptiva. En algunas realizaciones, las composiciones celulares que comprenden células modificadas genéticamente pueden utilizarse en métodos asociados para, por ejemplo, modular la actividad inmunológica en un enfoque de inmunoterapia para el tratamiento de, por ejemplo, un cáncer de mamífero o, en otras realizaciones, el tratamiento de trastornos autoinmunes. Los métodos empleados comprenden generalmente un método de contacto de un TIP de la presente invención con una célula de mamífero en condiciones permisivas para la unión específica del dominio IgSF modificado por afinidad y la modulación de la actividad inmunológica de la célula de mamífero. En algunas realizaciones, las células inmunitarias (como los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), las células T (incluidas las células T CD8+ o CD4+) o las APC) se modifican genéticamente para que expresen como proteína de membrana y/o como variante soluble el polipéptido ICOSL, la proteína inmunomoduladora o el conjugado descritos en el presente documento. A continuación, las células modificadas genéticamente pueden entrar en contacto con una célula de mamífero, como una APC, un segundo linfocito o una célula tumoral en la que se desee modular la actividad inmunológica en condiciones que permitan la unión específica del dominio IgSF modificado por afinidad a una contraestructura de la célula de mamífero, de modo que pueda modularse la actividad inmunológica en la célula de mamífero. Las células pueden ponerse en contacto in vivo o ex vivo.
[1103] [0509]En algunas realizaciones, las células modificadas genéticamente son células autólogas. En otras realizaciones, las células son alogénicas. En algunas realizaciones, las células son células modificadas genéticamente autólogas reinfundidas en el mamífero del que fueron aisladas. En algunas realizaciones, las células son células modificadas genéticamente alogénicas infundidas en el mamífero. En algunas realizaciones, las células se obtienen de la sangre o del tumor de un paciente, se modifican genéticamente para que expresen un polipéptido (como la variante del polipéptido ICOSL, la proteína inmunomoduladora o el conjugado descrito en el presente documento), se expanden en un sistema de cultivoin vitro(por ejemplo, estimulando las células) y se reinfunden en el paciente para mediar en la destrucción del tumor. En algunas realizaciones, los métodos se llevan a cabo mediante transferencia celular adoptiva en la que las células que expresan el TIP (por ejemplo, una célula T) se infunden de nuevo en el paciente. En algunas realizaciones, las composiciones terapéuticas y los métodos de la invención se utilizan en el tratamiento de un paciente mamífero de cánceres tales como linfoma, leucemia linfoide, leucemia mieloide, cáncer cervical, neuroblastoma o mieloma múltiple.
[1105] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede utilizarse para inhibir el crecimiento de células cancerosas de mamíferos (como células cancerosas humanas). Un método de tratamiento del cáncer puede incluir la administración de una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento a un sujeto con cáncer. La cantidad eficaz de la composición farmacéutica puede administrarse para inhibir, detener o revertir la progresión de los cánceres.
[1107] Los cánceres que pueden tratarse mediante las composiciones farmacéuticas y los métodos de tratamiento descritos en el presente documento incluyen, entre otros, melanoma, cáncer de vejiga, neoplasias hematológicas (leucemia, linfoma, mieloma), cáncer de hígado, cáncer cerebral, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de páncreas (adenocarcinoma), cáncer colorrectal, cáncer de pulmón (cáncer de pulmón de células pequeñas y cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de bazo, cáncer de timo o de células sanguíneas (es decir, leucemia), cáncer de próstata, cáncer de testículo, cáncer de ovario, cáncer de útero, carcinoma gástrico, cáncer musculoesquelético, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gastrointestinal, cáncer de células germinales o cáncer endocrino y neuroendocrino. En algunas realizaciones, el cáncer es un sarcoma de Ewing. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga y una neoplasia hematológica. En algunas realizaciones, el cáncer es un linfoma, una leucemia linfoide, una leucemia mieloide, un cáncer cervical, un neuroblastoma o un mieloma múltiple.
[1109] Las células cancerosas humanas pueden tratarse in vivo o ex vivo. En el tratamiento ex vivo de un paciente humano, el tejido o los fluidos que contienen células cancerosas se tratan fuera del cuerpo y luego el tejido o los fluidos se reintroducen de nuevo en el paciente. En algunas realizaciones, el cáncer se trata en un paciente humano in vivo mediante la administración de la composición terapéutica al paciente.
[1111] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra como monoterapia (es decir, como agente único) o como terapia combinada (es decir, en combinación con uno o más agentes anticancerígenos adicionales, como un fármaco quimioterapéutico, una vacuna contra el cáncer o un inhibidor del punto de control inmunitario. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica también puede administrarse con radioterapia.
[1113] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra como monoterapia (es decir, como agente único) o como terapia combinada (es decir, en combinación con uno o más agentes anticancerígenos adicionales, como un fármaco quimioterapéutico, una vacuna contra el cáncer o un inhibidor del punto de control inmunitario. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica también puede administrarse con radioterapia. En algunos aspectos, el inhibidor de puntos de control inmunitarios bloquea las interacciones de PD-1 con PD-L1 y/o PD-L2. En algunos casos, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, PD-L1 o PD-L2. En algunos casos, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo anti-PD-1, como nivolumab o pembrolizumab, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, el inhibidor del punto de control inmunitario bloquea o es un antagonista de CTLA-4, como un anticuerpo anti-CTLA-4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos aspectos de la presente divulgación, el inhibidor de puntos de control inmunitarios es tremelimumab o ipilimumab.
[1115] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica suprime una respuesta inmunitaria, lo que puede ser útil en el tratamiento de trastornos inflamatorios o autoinmunitarios, o el trasplante de órganos. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica contiene una variante del polipéptido ICOSL en un formato que exhibe actividad antagonista de su pareja de unión CD28 o ICOS y/o que bloquea o inhibe la señalización costimuladora a través de CD28 o ICOS. Formatos ejemplares de un polipéptido ICOSL para su uso en relación con dichas aplicaciones terapéuticas incluyen, a modo de ejemplo, un polipéptido ICOSL variante que es soluble (por ejemplo, una proteína de fusión ICOSL-Fc variante), una proteína inmunomoduladora o una "pilla" de un polipéptido ICOSL variante y otro dominio IgSF, incluidas formas solubles de los mismos que son fusiones Fc, una célula modificada genéticamente que expresa una proteína inmunomoduladora secretables, o un agente infeccioso que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína inmunomoduladora secretable, tal como para la expresión y secreción de la proteína inmunomoduladora secretable en una célula infectada (por ejemplo, una célula tumoral o una APC, por ejemplo, una célula dendrítica).
[1117] [0516]En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio o autoinmune es una vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA), una vasculitis, una enfermedad cutánea autoinmune, un trasplante, una enfermedad reumática, una enfermedad gastrointestinal inflamatoria, una enfermedad ocular inflamatoria, una enfermedad neurológica inflamatoria, una enfermedad pulmonar inflamatoria, una enfermedad endocrina inflamatoria o una enfermedad hematológica autoinmune.
[1119] En algunas realizaciones, los trastornos inflamatorios y autoinmunitarios que pueden tratarse mediante la composición farmacéutica descrita en la presente incluyen la enfermedad de Addison, alergias, alopecia areata, enfermedad de Alzheimer, vasculitis asociada a anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA), espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido (síndrome de Hughes), asma, aterosclerosis, artritis reumatoide, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria del oído interno, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario, miocarditis autoinmunitaria, ooforitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, azoospermia, enfermedad de Behçet, enfermedad de Berger, penfigoide ampolloso, miocardiopatía, enfermedad cardiovascular, esprúe celíaco / enfermedad celíaca, síndrome de disfunción inmunitaria por fatiga crónica (CFIDS), polineuritis idiopática crónica, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), polineuropatía crónica recidivante (síndrome de Guillain-Barré), síndrome de Churg-Strauss (CSS), penfigoide cicatricial, enfermedad por aglutininas frías (CAD), EPOC (enfermedad pulmonar obstructiva crónica; COPD), síndrome CREST, enfermedad de Crohn, dermatitis herpetiforme, dermatomiositis, diabetes, lupus discoide, eczema, epidermólisis bullosa adquirida, crioglobulinemia mixta esencial, síndrome de Evans, exoftalmos, fibromialgia, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía por IgA, enfermedad o trastorno inmunoproliferativo, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), enfermedad pulmonar intersticial, artritis juvenil, artritis idiopática juvenil (JIA), enfermedad de Kawasaki, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, liquen plano, nefritis lúpica, hipofisitis linfocítica, enfermedad de Ménière, síndrome de Miller Fisher / encefalomielorradiculopatía diseminada aguda, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple (MS), reumatismo muscular, encefalomielitis miálgica (ME), miastenia gravis, inflamación ocular, pénfigo foliáceo, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nudosa, policondritis, síndromes poliglandulares (síndrome de Whitaker), polimialgia reumática, polimiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria / colangiopatía autoinmunitaria, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter / artritis reactiva, reestenosis, fiebre reumática, enfermedad reumática, sarcoidosis, síndrome de Schmidt, esclerodermia, síndrome de Sjögren, síndrome de la persona rígida, lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerodermia sistémica, arteritis de Takayasu, arteritis temporal / arteritis de células gigantes, tiroiditis, diabetes tipo 1, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis, vitíligo, enfermedad intestinal intersticial o granulomatosis de Wegener. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio o autoinmune se selecciona entre la enfermedad intestinal intersticial, el trasplante, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la esclerosis múltiple, el asma, la artritis reumatoide y la psoriasis.
[1121] En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio o autoinmune es una enfermedad autoinmune crónica. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio o autoinmune es el Síndrome de Sjogren (pSS) o el Lupus Eritematoso Sistémico (SLE). En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio o autoinmune es una enfermedad inflamatoria intestinal (IBD). En algunos ejemplos, el trastorno inflamatorio o autoinmune es la enfermedad de Crohn. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio o autoinmune es una enfermedad o trastorno relacionado con la IBD, por ejemplo, la enfermedad pulmonar intersticial (ILD). En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio o autoinmune es la artritis psoriásica o la artritis reumatoide. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra para modular una enfermedad autoinmune. Por ejemplo, la supresión de una respuesta inmunitaria puede ser beneficiosa en métodos para inhibir el rechazo de un trasplante de tejidos, células u órganos de un donante por parte de un receptor. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas aquí descritas se utilizan para limitar o prevenir enfermedades o trastornos relacionados con el injerto o el trasplante, como la enfermedad injerto contra huésped (GvHD). En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se utilizan para suprimir el rechazo autoinmune de médula ósea, órganos, piel, músculo, neuronas, islotes o células parenquimatosas trasplantadas o injertadas.
[1123] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica aquí descrita, tal como una proteína de fusión Fc de una variante ICOSL IgSF (por ejemplo, IgV), se emplea en el tratamiento de la artritis psoriásica (PsA). En algunos casos, la PsA afecta a una o más articulaciones, como dedos de manos y pies, brazos o piernas, incluidos codos, muñecas, manos y pies, o articulación sacroilíaca. En algunos casos, la PsA es leve y/o afecta a cuatro o menos articulaciones. En algunos casos, la PsA es moderada y/o afecta a cuatro o más articulaciones. En algunos casos, un sujeto con PsA puede presentar dolor, rigidez o inflamación en la columna vertebral o el cuello, o en una más articulaciones.
[1125] En algunas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento, tal como una variante de la proteína de fusión Fc ICOSL IgSF (por ejemplo, IgV) proporcionada en el presente documento, se utiliza para tratar la artritis reumatoide (RA). En algunos casos, la RA afecta a las articulaciones, al revestimiento de las articulaciones y/o a estructuras no articulares del organismo (por ejemplo, piel, ojos, pulmones, corazón, riñones, glándulas salivales, tejido nervioso, médula ósea o vasos sanguíneos). En algunas realizaciones, la RA o los síntomas de la RA son crónicos.
[1127] En algunas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento, como una variante de la proteína de fusión Fc ICOSL IgSF (por ejemplo, IgV) proporcionada en el presente documento, se utiliza para tratar la GVHD. En algunas realizaciones, la GVHD es una GVHD aguda (aGVHD). En algunos casos, la aGVHD se produce tras un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (HSCT) y/o una reacción de las células inmunitarias del donante contra los tejidos del huésped. En algunos casos, la aGVHD se manifiesta en la piel, el hígado o el tracto gastrointestinal.
[1129] [0522]En algunas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento, tal como una proteína de fusión Fc variante ICOSL IgSF (por ejemplo IgV) proporcionada en el presente documento, se utiliza para tratar una afección autoinmune asociada con un trasplante de órgano. En algunos casos, el tratamiento de la afección autoinmunitaria asociada a un trasplante de órgano puede prolongar la supervivencia del huésped y del órgano trasplantado. En algunas realizaciones, el tratamiento de la afección autoinmunitaria asociada a un trasplante de órgano incluye la profilaxis o la inhibición o prevención de los rechazos de trasplante por parte de un sujeto que es el receptor del trasplante de órgano.
[1130] En algunas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento, tal como una variante de la proteína de fusión Fc ICOSL IgSF (por ejemplo IgV) proporcionada en el presente documento, se utiliza para tratar una enfermedad inflamatoria intestinal (IBD). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento, como una variante de la proteína de fusión Fc IgSF de ICOSL (por ejemplo, IgV) proporcionada en el presente documento, se utiliza para tratar la enfermedad de Crohn. En algunas realizaciones, la enfermedad de Crohn puede incluir un subtipo de colitis de Crohn, enteritis de Crohn, iletis de Crohn o enterocolitis de Crohn.
[1131] En algunas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento, tal como una proteína de fusión Fc IgSF (por ejemplo IgV) variante de ICOSL proporcionada en el presente documento, se utiliza para tratar el lupus eritematoso sistémico (SLE). En algunas realizaciones, una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento, como una variante de la proteína de fusión Fc IgSF de ICOSL (por ejemplo, IgV) proporcionada en el presente documento, se utiliza para tratar el síndrome de Sjogren.
[1132] IX. EJEMPLOS
[1133] Los siguientes ejemplos se incluyen únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención. Los ejemplos que no entran en el ámbito literal de las reivindicaciones se incluyen a título meramente informativo o comparativo.
[1134] EJEMPLO 1
[1135] Ejemplo 1 Generación de constructos de DNA mutante de dominios IgSF
[1136] El Ejemplo 1 describe la generación de construcciones de DNA mutante de dominios IgSF ICOSL humanos para su traducción y expresión en la superficie de levadura como bibliotecas de visualización de levadura.
[1137] A. Bibliotecas Degeneradas
[1138] Se generaron construcciones de DNA mutante que codifican una variante del dominio ECD de ICOSL. Se generaron constructos basados en una secuencia ICOSL humana de tipo silvestre establecida en SEQ ID N.º:32 que contenía el dominio ECD de la siguiente manera:
[1141]
[1143] Para las bibliotecas que se dirigen a residuos específicos para la aleatorización completa o parcial con codones degenerados, el DNA que codifica SEQ ID N.º:32 se pidió a Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) como un conjunto de oligonucleótidos superpuestos de hasta 80 pares de bases (pb) de longitud. Para generar una biblioteca de diversas variantes del ECD, los oligonucleótidos contenían codones degenerados deseados, como conjuntos de bases mixtas específicas para codificar diversas sustituciones de aminoácidos, en posiciones de aminoácidos deseadas. Los codones degenerados se generaron utilizando un algoritmo en la URL: rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/.
[1144] En general, las posiciones para mutar y degenerar codones se eligieron a partir de modelos de homología (ICOSL) de los pares diana-ligando de interés para identificar los residuos de contacto con el ligando, como los residuos de la cadena lateral de la diana que interactúan con el ligando, así como los residuos que se encuentran en la interfaz de interacción de la proteína. Este análisis se realizó utilizando un visor de estructuras disponible en la URL: spdbv.vitalit.ch).
[1145] [0530]El siguiente paso en el diseño de la biblioteca fue la alineación de secuencias ICOSL humanas, de ratón, rata y mono para identificar residuos conservados. Basándose en este análisis, los residuos diana conservados se mutaron con codones degenerados que sólo especificaban cambios conservadores de aminoácidos más el residuo de tipo silvestre. Los residuos no conservados se mutaron de forma más agresiva, pero también se incluyó el residuo de tipo silvestre. Se utilizaron codones degenerados que también codificaban el residuo de tipo silvestre para evitar una mutagénesis excesiva de la proteína diana. Por la misma razón, sólo se seleccionaron para mutagénesis hasta 20 posiciones a la vez. Estos residuos eran una combinación de residuos de contacto y residuos de interfaz sin contacto.
[1146] Los oligonucleótidos se disolvieron en agua estéril, se mezclaron en proporciones equimolares, se calentaron a 95°C durante cinco minutos y se enfriaron lentamente a temperatura ambiente para el recocido. A continuación, se utilizaron cebadores oligonucleotídicos específicos de los ECD que se anillan al inicio y al final de los ECD, respectivamente, para generar el producto de la PCR. A continuación, se utilizaron oligonucleótidos específicos de ECD que se solapan en 40-50 pb con una versión modificada del vector de clonación pBYDS03 (Life Technologies USA), más allá e incluyendo los sitios de clonación BamH1 y Kpn1, para amplificar 100ng de producto PCR del paso anterior y generar un total de 5 µg de DNA. Ambas PCR se realizaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando la mezcla maestra OneTaq 2x PCR (New England Biolabs, EE.UU.). Los segundos productos de PCR se purificaron utilizando un kit de purificación de PCR (Qiagen, Alemania) y se resuspendieron en agua desionizada estéril.
[1147] Para preparar la inserción de la biblioteca, se digirió una versión modificada del vector pBYDS03 con las enzimas de restricción BamHI y KpnI (New England Biolabs, EE.UU.) y el fragmento grande del vector se purificó en gel y se disolvió en agua estéril desionizada. El DNA listo para la electroporación para el siguiente paso se generó mezclando 12 µg de DNA de biblioteca por cada electroporación con 4 µg de vector linealizado en un volumen total de 50 µl de agua desionizada y estéril. Una forma alternativa de generar bibliotecas dirigidas, fue llevar a cabo mutagénesis dirigida al sitio (kit Multisite, Agilent, EE.UU.) de la ECD diana con oligonucleótidos que contienen codones degenerados. Este enfoque se utilizó para generar sublibrerías que sólo se dirigen a tramos específicos de la proteína diana para la mutagénesis. En estos casos, se mezclaron las sublibrerías antes de proceder a los pasos de selección. En general, el tamaño de las bibliotecas oscilaba entre 10E7 y 10E8 clones, salvo en el caso de las sublibrerías, que sólo se situaban entre 10E4 y 10E5. Se generan grandes bibliotecas y sublibrerías para ICOSL.
[1148] B. Bibliotecas Aleatorias
[1149] También se construyeron bibliotecas aleatorias para identificar variantes del ECD de ICOSL expuestas en SEQ ID N.º:32 que contienen el dominio ECD. El DNA que codifica el ECD de tipo silvestre se clonó entre los sitios de restricción BamHI y KpnI del vector de visualización de levadura modificado pBYDS03. A continuación, el DNA se mutagenizó con el kit Genemorph II (Agilent, EE.UU.) para generar una media de tres a cinco cambios de aminoácidos por variante de la biblioteca. A continuación, el DNA mutagenizado se amplificó mediante la PCR en dos pasos y se procesó como se ha descrito anteriormente para las bibliotecas dirigidas.
[1150] EJEMPLO 2
[1151] Introducción de bibliotecas de DNA en levaduras
[1152] El Ejemplo 2 describe la introducción de bibliotecas de DNA ICOSL en levadura.
[1153] Para introducir DNA de biblioteca degenerado y aleatorio en la levadura, se prepararon células competentes para electroporación de la cepa de levadura BJ5464 (ATCC.org; número ATCC 208288) y se electroporaron en un Gene Pulser II (Biorad, USA) con el DNA listo para electroporación del paso anterior esencialmente como se describe (Colby, D.W. et al.2004 Methods Enzymology 388, 348-358). La única excepción es que las células transformadas se cultivaron en medio SCD-Leu selectivo mínimo no inductor para acomodar el marcador seleccionable LEU2 transportado por el plásmido modificado pBYDS03. Un litro de medio SCD-Leu se compone de 14,7 gramos de citrato de sodio, 4,29 gramos de ácido cítrico monohidratado, 20 gramos de dextrosa, 6,7 gramos de base nitrogenada de levadura y 1,6 gramos de suplemento de medio de goteo sintético de levadura sin leucina. El medio se esterilizó por filtración antes de su uso utilizando un dispositivo de filtración al vacío de 0,22 µm.
[1154] El tamaño de la biblioteca se determinó sembrando diluciones seriadas de células recién recuperadas en placas de agar SCD-Leu y luego extrapolando el tamaño de la biblioteca a partir del número de colonias individuales del sembrado que generó al menos 50 colonias por placa. En general, los tamaños de las bibliotecas oscilaron entre 10E8 y 10E9 transformantes según este ensayo de dilución. El resto del cultivo electroporado se cultivó hasta la saturación en SCD-Leu y las células de este cultivo se subcultivaron (por ejemplo, 1/100) en SCD-Leu fresco una vez más para minimizar la fracción de células no transformadas. Para mantener la diversidad de la biblioteca, este paso de subcultivo se llevó a cabo utilizando un inóculo que contenía al menos 10 veces más células que el tamaño calculado de la biblioteca. Las células del segundo cultivo saturado se resuspendieron en medio fresco que contenía un 25% (peso/volumen) de glicerol estéril hasta una densidad de 10E10/mL y se congelaron y almacenaron a -80°C (reserva de biblioteca congelada).
[1155] El tamaño de la biblioteca se determinó sembrando diluciones de células recién recuperadas en placas de agar SCD-Leu y luego extrapolando el tamaño de la biblioteca a partir del número de colonias individuales de un sembrado que generara al menos 50 colonias por placa.
[1156] [0538]Para segregar el plásmido de las células que contienen dos o más clones de biblioteca diferentes, se tomó un número de células correspondiente a 10 veces el tamaño de la biblioteca, del cultivo SCD-Leu de una noche y se subcultivó 1/100 en medio SCD-Leu fresco y se cultivó durante la noche. Las células de este cultivo nocturno se resuspendieron en glicerol estéril al 25% (peso/volumen) hasta una densidad de 10E10/mL y se congelaron y almacenaron a -80°C (reserva de biblioteca congelada).
[1157] EJEMPLO 3
[1158] Selección de la levadura
[1159] El Ejemplo 3 describe la selección de levaduras que expresan variantes de ICOSL modificadas por afinidad.
[1160] se descongeló un número de células igual al menos a 10 veces el tamaño de la biblioteca a partir de stocks de bibliotecas individuales, se suspendieron a 0,1 x 10e6 células/ml en medio scd-leu no inductor y se cultivaron durante la noche. Al día siguiente, un número de células igual a 10 veces el tamaño de la biblioteca se centrifugó a 2000 RPM durante dos minutos y se resuspendió a 0,5 x 10E6 células/mL en medio SCDG-Leu inductor. Un litro del medio de inducción SCDG-Leu consta de 5,4 gramos de<Na2HPO4>, 8,56 gramos de<NaH2PO4-H20>, 20 gramos de galactosa, 2,0 gramos de dextrosa, 6,7 gramos de base nitrogenada de levadura Difco y 1,6 gramos de suplemento de medio de goteo sintético de levadura sin leucina disuelto en agua y esterilizado a través de un dispositivo de filtro de membrana de 0,22 µm. El cultivo se cultivó durante dos días a 20°C para inducir la expresión de las proteínas de la biblioteca en la superficie celular de la levadura.
[1161] Las células se procesaron con perlas magnéticas para reducir los no ligantes y enriquecer para todas las variantes ICOSL con capacidad de ligar sus proteínas recombinantes exógenas de contraestructura. A continuación, se realizaron dos o tres rondas de clasificación por citometría de flujo utilizando tinción exógena de proteínas de contraestructura para enriquecer la fracción de células de levadura que presenta mejores ligantes. El enriquecimiento con microesferas magnéticas y las selecciones por citometría de flujo se describen esencialmente en Miller, K.D. Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30, julio de 2008.
[1162] Con las bibliotecas ICOSL, las proteínas ligando diana se obtuvieron de R&D Systems (EE.UU.) como sigue: rCD28.Fc humana (es decir, proteína de fusión CD28-Fc recombinante), rCTLA4.Fc y rICOS.Fc. Las perlas magnéticas de estreptavidina se obtuvieron de New England Biolabs, EE.UU.. Para la biotinilación de la proteína de contraestructura, se utilizó el kit de biotinilación cat# 21955, Life Technologies, EE.UU. Para la clasificación por citometría de flujo de dos colores, se utilizó un clasificador FACS Aria II de Becton Dickinson. Los niveles de visualización de ICOSL se controlaron con un anticuerpo antihemaglutinina marcado con Alexafluor 488 (Life Technologies, EE.UU.). Las proteínas de fusión Fc de unión a ligando rCD28.Fc, rCTLA4.Fc o rICOS.Fc se detectaron con Ig humana específica de cabra Fab conjugada con PE (Jackson ImmunoResearch, EE.UU.). Las levaduras de doblete se separaron utilizando parámetros de dispersión frontal (FSC) / dispersión lateral (SSC), y las separaciones se basaron en una mayor unión del ligando detectada en FL4 que poseía una unión más limitada de la expresión de la etiqueta en FL1.
[1163] Las salidas de levadura de las clasificaciones citométricas de flujo se ensayaron para una mayor afinidad de unión específica. Las levaduras seleccionadas se expandieron y se volvieron a inducir para que expresaran las variantes del dominio modificado por afinidad IgSF que codificaban. A continuación, esta población puede compararse con la cepa de levadura parental de tipo silvestre, o con cualquier otra salida seleccionada, como la población de levadura de salida de microesferas, mediante citometría de flujo.
[1164] Para ICOSL, los resultados de la segunda clasificación (F2) se compararon con la levadura ICOSL parental para la unión de cada rICOS.Fc, rCD28.Fc, y rCTLA4.Fc mediante tinción doble de cada población con expresión de etiqueta anti-HA (hemaglutinina) y el secundario anti-Fc humano para detectar la unión del ligando.
[1165] En el caso de las variantes de levadura ICOSL seleccionadas para unirse a ICOS, los resultados de la clasificación F2 dieron valores de Intensidad de Fluorescencia Media (MFI) de 997, cuando se tiñeron con 5.6 nM rICOS.Fc, mientras que la MFI de la cepa parental ICOSL se midió en 397 cuando se tiñó con la misma concentración de rICOS.Fc. Esto representa una mejora de aproximadamente el triple de la unión media en este conjunto de clones seleccionados F2, y se predice que los clones individuales de ese conjunto tendrán una MFI/afinidad mucho mejor cuando se prueben individualmente.
[1166] En el caso de las variantes de levadura ICOSL seleccionadas para unirse a CD28, los resultados de la clasificación F2 dieron valores de MFI de 640 cuando se tiñeron con 100nM rCD28.Fc, mientras que la MFI de la cepa ICOSL parental se midió en 29 cuando se tiñó con la misma concentración de rCD28.Fc (mejora de 22 veces). En el caso de las variantes de levadura ICOSL seleccionadas para unirse a CTLA4, los resultados de la clasificación F2 dieron valores de MFI de 949 cuando se tiñeron con 100nM rCTLA4.Fc, mientras que la MFI de la cepa ICOSL parental se midió en 29 cuando se tiñó con la misma concentración de rCTLA4.Fc (mejora de 32 veces).
[1167] Es importante destacar que las MFIs de todas las salidas F2 descritas anteriormente cuando se midieron con el anticuerpo anti-HA tag en FL1 no aumentaron y a veces disminuyeron en comparación con las cepas de tipo silvestre, lo que indica que el aumento de la unión no era una función del aumento de la expresión de las variantes seleccionadas en la superficie de la levadura, y validó las estrategias de gating de sólo seleccionar expresores medios a bajos con alta unión al ligando.
[1168] Los dominios ECD ICOSL variantes seleccionados se formatearon además como proteínas de fusión y se probaron para la unión y la actividad funcional como se describe a continuación.
[1170] EJEMPLO 4
[1172] Reformateo de los Resultados de la Selección como Fusiones Fc y en Varios Tipos de Proteínas Inmunomoduladoras
[1174] El Ejemplo 4 describe el reformateo de los resultados de selección identificados en el Ejemplo 3 como proteínas inmunomoduladoras que contienen un dominio extracelular (ECD) modificado por afinidad (variante) de ICOSL fusionado a una molécula Fc (moléculas de fusión ECD-Fc variantes).
[1176] Las células de salida de las clasificaciones ICOSL de citometría de flujo finales se cultivaron a densidad terminal en medio SCD-Leu. El DNA plasmídico de cada salida se aisló utilizando un kit de aislamiento de DNA plasmídico de levadura (Zymo Research, EE.UU.). Para las fusiones Fc, se utilizaron cebadores PCR con sitios de restricción añadidos adecuados para la clonación en el vector de fusión Fc elegido para amplificar por lotes a partir de las preparaciones de DNA plasmídico el DNA codificante para los ECD mutantes diana. Tras la digestión de restricción, los productos de la PCR se ligaron a un vector de fusión Fc apropiado seguido de la transformación química en la cepaE. coliXL1 Blue (Agilent, EE.UU.) o NEB5alpha (New England Biolabs, EE.UU.) según las indicaciones del proveedor. Un ejemplo de vector de fusión Fc es pFUSE-hIgG1-Fc2 (InvivoGen, EE.UU.).
[1178] Las diluciones de las reacciones de transformación se sembraron en LB-agar con 100 µg/mL de carbenicilina (Teknova, EE.UU.) para generar colonias individuales. A continuación, se cultivaron hasta 96 colonias de cada transformación en placas de 96 pocillos hasta la saturación durante la noche a 37 °C en caldo LB (Teknova cat # L8112) y se envió una pequeña alícuota de cada pocillo para la secuenciación del DNA del inserto ECD con el fin de identificar la mutación o mutaciones en todos los clones. La preparación de las muestras para la secuenciación del DNA se llevó a cabo siguiendo los protocolos proporcionados por el proveedor del servicio (Genewiz; South Plainfield, NJ). Después de retirar la muestra para la secuenciación del DNA, se añadió glicerol a los cultivos restantes para obtener un contenido final de glicerol del 25% y las placas se almacenaron a -20°C para su uso futuro como placas maestras (véase más abajo). Alternativamente, las muestras para la secuenciación del DNA se generaron mediante la replicación de cultivos líquidos en placas de agar sólido utilizando un replicador desechable de 96 pocillos (VWR, EE.UU.). Estas placas se incubaron durante la noche para generar parches de crecimiento y las placas se enviaron a Genewiz para la secuenciación del DNA siguiendo sus especificaciones. En algunos casos, se realizó resecuenciación para verificar las mutaciones.
[1180] Tras el análisis de los datos de secuenciación de DNA generados por Genewiz, los clones de interés se recuperaron de las placas maestras y se cultivaron individualmente hasta la saturación en 5 mL de caldo LB líquido que contenía 100 µg/mL de carbenicilina (Teknova, EE.UU.) y 2 mL de cada cultivo se utilizaron para la preparación de aproximadamente 10 µg de DNA plasmídico miniprep de cada clon utilizando un kit estándar como el kit Pureyield (Promega, EE.UU.). La identificación de clones de interés generalmente implicaba los siguientes pasos. En primer lugar, se descargaron los archivos de datos de secuencias de DNA del sitio web Genewiz. A continuación, todas las secuencias se curaron manualmente para que comenzaran al principio de la región codificante del ECD. A continuación, las secuencias seleccionadas se tradujeron por lotes utilizando un programa adecuado disponible en la dirección: www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/. A continuación, las secuencias traducidas se alinearon utilizando un programa adecuado disponible en la URL: multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html. Alternativamente, las secuencias de Genewiz se procesaron para generar alineaciones utilizando el programa Ugene (http://ugene.net).
[1182] A continuación se identificaron los clones de interés utilizando los siguientes criterios: 1.) un clon idéntico aparece al menos dos veces en el alineamiento y 2.) una mutación aparece al menos dos veces en el alineamiento y preferiblemente en clones distintos. Los clones que cumplían al menos uno de estos criterios eran clones que habían sido enriquecidos por el proceso de clasificación, muy probablemente debido a una mejor unión.
[1184] Para generar proteínas inmunomoduladoras recombinantes que son proteínas de fusión Fc que contienen un ECD de ICOSL con al menos un dominio modificado por afinidad (por ejemplo variante ICOSL ECD-Fc), la molécula de ácido nucleico codificante se generó para codificar una proteína diseñada como sigue: péptido señal seguido por la variante (mutante) ICOSL ECD seguido por un enlazador de tres alaninas (AAA) seguido por una IgG1 Fc humana que contiene la mutación N82G con referencia a la IgG1 Fc humana de tipo silvestre establecida en SEQ ID N.º: 226 (correspondiente a N297G según la numeración de la UE). Este Fc ejemplar también contenía las mutaciones estabilizadoras de cisteína R77C y V87C y la sustitución del residuo de cisteína por un residuo de serina en la posición 220 (C220S) por numeración UE (correspondiente a la posición 5 (C5S) con referencia con referencia al Fc IgG1 humano de tipo silvestre establecido en SEQ ID N.º:226 (correspondiente a R292C, V302C y C220S, respectivamente, por numeración UE). En algunos casos, se eliminó el sitio de clonación NotI que contribuye a la secuencia enlazadora AAA para generar una fusión directa del ECD ICOSL y el comienzo del Fc. Dado que la construcción no incluye ninguna cadena ligera de anticuerpo que pueda formar un enlace covalente con una cisteína, el Fc IgG1 humano también contiene la sustitución de los residuos de cisteína por un residuo de serina en la posición 5 (C5S) en comparación con el Fc de tipo silvestre o no modificado establecido en SEQ ID N.º: 226.
[1185] EJEMPLO 5
[1186] Expresión y Purificación de Fusiones Fc
[1187] El Ejemplo 5 describe la expresión y purificación de alto rendimiento de proteínas de fusión Fc que contienen la variante ECD ICOSL como se describe en los Ejemplos anteriores.
[1188] Las proteínas de fusión Fc variantes recombinantes se produjeron a partir de células de riñón embrionario humano (HEK) 293 adaptadas en suspensión utilizando el sistema de expresión Expi293 (Invitrogen, EE.UU.). Se añadieron 4µg de cada DNA plasmídico del paso anterior a 200µLOpti MEM (Invitrogen, EE.UU.) al mismo tiempo que se añadían por separado 10,8µL de ExpiFectamine a otros 200µL de Opti-MEM. Después de 5 minutos, los 200µL de DNA plasmídico se mezclaron con los 200µL de ExpiFectamine y se incubaron durante 20 minutos más antes de añadir esta mezcla a las células. Se dispensaron diez millones de células Expi293 en pocillos separados de una placa de crecimiento estéril de 10 ml, fondo cónico y 24 pocillos profundos (Thomson Instrument Company, EE.UU.) en un volumen de 3,4 ml de medio Expi293 (Invitrogen, EE.UU.). Las placas se agitaron durante 5 días a 120 RPM en una incubadora de cultivos celulares de mamíferos con una humedad del 95% y un 8% de<CO2>. Tras 5 días de incubación, las células se precipitaron y se retuvo el sobrenadante de cultivo.
[1189] Las proteínas se purificaron a partir de los sobrenadantes utilizando un kit de purificación de Proteína A de 96 pocillos de alto rendimiento siguiendo el protocolo del fabricante (Número de catálogo 45202, Life Technologies, EE.UU.). Las fracciones de elución resultantes se intercambiaron con tampón en PBS utilizando la placa desalinizadora Zeba de 96 pocillos (número de catálogo 89807, Life Technologies, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante. La proteína purificada se cuantificó utilizando una absorbancia de 280 nm medida con el instrumento Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.), y la pureza de la proteína se evaluó cargando 5 µg de proteína en geles de poliacrilamida NUPAGE prefabricados (Life Technologies, EE.UU.) en condiciones desnaturalizantes y reductoras y la posterior electroforesis en gel. Las proteínas se visualizaron en el gel mediante la tinción estándar de Coomassie.
[1190] EJEMPLO 6
[1191] Evaluación de la Unión y la Actividad de Moléculas con Dominio IgSF Maduradas por Afinidad
[1192] A. Unión a Contraestructuras Expresadas por Células
[1193] Este Ejemplo describe estudios de unión de fusión Fc de proteínas purificadas de los Ejemplos anteriores para evaluar la especificidad y afinidad de las proteínas inmunomoduladoras variantes de dominio ICOSL para socios de unión afines.
[1194] Para producir células que expresen socios de unión afines, se diseñaron constructos de expresión de superficie de mamífero de longitud completa para cada uno de los CD28 e ICOS humanos en el vector de expresión pcDNA3.1 (Life Technologies) y se obtuvieron de Genscript, EE.UU.. Los estudios de unión se llevaron a cabo en células HEK293 transfectadas generadas para expresar los ligandos de superficie de mamífero de longitud completa utilizando el sistema de transfección transitoria (Life Technologies, EE.UU.) descrito anteriormente. Como control, también se evaluó la unión a células simuladas (no transfectadas). Se determinó el número de células necesarias para el experimento y se realizó la transfección a la escala adecuada de 30 ml siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. Para cada transfección de CD28, ICOS o simulacro de 30 ml, se incubaron 75 millones de células Expi293F con 30 µg de DNA del constructo de expresión y 1,5 ml de reactivo ExpiFectamine 293 diluido durante 48 horas, momento en el que se cosecharon las células para la tinción.
[1195] Para la tinción por citometría de flujo, se sembraron 200.000 células de la transfección transitoria apropiada o del control negativo (mock) en placas de fondo redondo de 96 pocillos. Las células se centrifugaron y se resuspendieron en tampón de tinción (PBS (solución salina tamponada con fosfato), 1% de BSA (albúmina sérica bovina) y 0,1% de azida sódica) durante 20 minutos para bloquear la unión no específica. Después, las células se centrifugaron de nuevo y se resuspendieron en tampón de tinción que contenía de 100nM a 1nM de proteína inmunomoduladora variante, dependiendo del experimento de cada Fc variante CD80 candidata, Fc variante ICOSL o proteína de fusión Fc variante IgSF apilada en 50 µl. La tinción primaria se realizó en hielo durante 45 minutos, antes de lavar las células en tampón de tinción dos veces. El anti Fc humano conjugado con PE (Jackson ImmunoResearch, EE.UU.) se diluyó 1:150 en 50 µl de tampón de tinción, se añadió a las células y se incubó otros 30 minutos en hielo. El anticuerpo secundario se lavó dos veces, las células se fijaron en formaldehído al 4%/PBS y las muestras se analizaron en el citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, EE.UU.) o en un citómetro de flujo Hypercyt (Intellicyte, EE.UU.).
[1196] Se calculó la Intensidad de Fluorescencia Media (IFM) para cada línea transfectante y parental negativa con el software Cell Quest Pro (Becton Dickinson, EE.UU.) o un citómetro de flujo Hypercyt (Intellicyte, EE.UU.).
[1197] B. Caracterización de la Bioactividad
[1198] [0562]Este Ejemplo describe además la caracterización de la bioactividad de la variante de proteína de fusión Fc en ensayosin vitrode células T primarias humanas.
[1200] 1. Reacción Linfocitaria Mixta (MLR)
[1202] La bioactividad de rICOSL.Fc soluble se probó en una Reacción Linfocitaria Mixta (MLR) humana. Las células dendríticas (DC) primarias humanas se generaron cultivando in vitro monocitos aislados de PBMC (BenTech Bio, EE.UU.) durante 7 días con 500U/mL de rIL-4 (R&D Systems, EE.UU.) y 250U/mL de rGM-CSF (R&D Systems, EE.UU.) en medio Ex-Vivo 15 (Lonza, Suiza). Se co-cultivaron 10.000 DC maduradas y 100.000 células T CD4+ alogénicas purificadas (BenTech Bio, EE.UU.) con proteínas de fusión Fc variante ICOSL y controles en placas de fondo redondo de 96 pocillos en 200µl de volumen final de medio Ex-Vivo 15. El día 5, se analizó la secreción de IFN-gamma en los sobrenadantes de cultivo utilizando el kit ELISA Duoset de IFN-gamma humano (R&D Systems, EE.UU.). La densidad óptica se midió con el lector de microplacas VMax ELISA (Molecular Devices, EE.UU.) y se cuantificó frente al estándar rIFN-gamma titulado incluido en el kit IFN-gamma Duo-set (R&D Systems, EE.UU.). Un segundo protocolo de MLR consistió en células dendríticas (DC) primarias humanas generadas cultivando monocitos aislados de PBMC (BenTech Bio, EE.UU.) in vitro durante 7 días con 50 ng/mL de rIL-4 (R&D Systems, EE.UU.) y 80ng/mL de rGM-CSF (R&D Systems, EE.UU.) en medio Ex-Vivo 15 (Lonza, Suiza). Los días 3 y 5, se eliminó la mitad del medio y se sustituyó por medio fresco con 50 ng/mL de rIL-4 y 80 ng/mL de rGM-CSF. Para inducir plenamente la maduración de las DC, se añadió lipopolisacárido (LPS) (InvivoGen Corp., EE.UU.) a 100 ng/mL a los cultivos de DC el día 6 y se incubaron las células durante 24 horas más. Aproximadamente 10.000 DC maduradas y 100.000 células T CD3+ alogénicas purificadas (BenTech Bio, EE.UU.) se cocultivaron con proteínas de fusión Fc variante ICOSL y controles en placas de 96 pocillos de fondo redondo en 200µl de volumen final de medio Ex-Vivo 15. El día 4-5, se analizó la secreción de IFN-gamma en los sobrenadantes de los cultivos utilizando el kit ELISA Duoset de IFN-gamma humano (R&D Systems, EE.UU.). La densidad óptica se midió en un lector de microplacas BioTek Cytation Multimode Microplate Reader (BioTek Corp., EE.UU.) y se cuantificó frente al estándar rIFN-gamma titulado incluido en el kit IFN-gamma Duo-set (R&D Systems, EE.UU.).
[1204] 2. Ensayo de Coimmovilización Anti-CD3
[1206] La bioactividad coestimuladora de las variantes de fusión ICOSL se determinó en ensayos de coimmovilización anti-CD3. Se diluyó 1nM o 10 nM de CD3 antihumano de ratón (OKT3, Biolegends, EE.UU.) en PBS con proteínas variantes rICOSL.Fc de 1nM a 80nM. Esta mezcla se añadió a placas de 96 pocillos de fondo plano tratadas con cultivo tisular (Corning, EE.UU.) durante la noche para facilitar la adherencia de las proteínas estimuladoras a los pocillos de la placa. Al día siguiente, se lavó la proteína no ligada de las placas y se añadieron 100.000 células pan T humanas purificadas (BenTech Bio, EE.UU.) o el clon de células T humanas BC3 (Astarte Biologics, EE.UU.) a cada pocillo en un volumen final de 200 µl de medio Ex-Vivo 15 (Lonza, Suiza). En algunos casos, las células pan T humanas se marcaron con 0,25 uM de éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE, ThermoFisher Scientific, EE.UU.). Las células se cultivaron 3 días antes de recoger los sobrenadantes de cultivo y medir los niveles de IFN-gamma humano con el kit Duoset ELISA (R&D Systems, EE.UU.), como se ha mencionado anteriormente. La proliferación celular se determinó mediante el porcentaje de células de entrada que entraron en división, medido por dilución de CFSE en células teñidas con anticuerpos anti-CD4, anti-CD8 conjugados con fluorescencia (BD, EE.UU.) o células T totales mediante análisis de citometría de flujo en un LSR II (BD, EE.UU.),
[1208] C. Resultados
[1210] Los resultados de los estudios de unión y actividad para variantes probadas ejemplares se muestran en la Tabla 7, que indica sustituciones (reemplazos) de aminoácidos del dominio IgSF ejemplares en el ECD de ICOSL seleccionado en el cribado de afinidad-maduración contra las respectivas estructuras afines ICOS y CD28. En las Tablas, las sustituciones de aminoácidos ejemplares se designan por el número de posición del aminoácido correspondiente a la respectiva secuencia ECD de referencia (por ejemplo, no modificada), como sigue. Por ejemplo, la secuencia ECD de referencia (por ejemplo, no modificada) de la Tabla 7 (ICOSL WT) es la secuencia ECD (por ejemplo, no modificada) de ICOSL establecida en SEQ ID N.º: 32. La posición del aminoácido se indica en el centro, con el aminoácido de referencia correspondiente (por ejemplo, no modificado o de tipo silvestre) enumerado antes del número y la sustitución del aminoácido variante identificada enumerada después del número. La columna 2 establece el identificador de la SEQ ID N.º de la variante ECD para cada molécula de fusión ECD-Fc variante.
[1212] También se muestra la actividad de unión medida por el valor de Intensidad de Fluorescencia Media (IFM) para la unión de cada molécula de fusión Fc variante a células transfectadas para expresar el ligando cognado y la relación de la IFM comparada con la unión de la correspondiente molécula de fusión ECD-Fc de referencia (por ejemplo, no modificada) que no contiene la(s) sustitución(es) de aminoácido al mismo ligando de contraestructura expresado en células. La actividad funcional de las moléculas de fusión Fc variantes para modular la actividad de las células T también se muestra basándose en los niveles calculados de IFN-gamma en sobrenadantes de cultivo (pg/mL) generados i) con la molécula de fusión ECD-Fc variante indicada coinmovilizada con anti-CD3 o ii) con la molécula de fusión ECD-Fc variante indicada en un ensayo MLR. La Tabla también muestra la proporción de IFN-gamma producida por cada variante de ECD-Fc en comparación con la ECD-Fc de referencia correspondiente (por ejemplo, no modificada o de tipo silvestre) en ambos ensayos funcionales.
[1214] [0567]Como se muestra, las selecciones resultaron en la identificación de un número de variantes del dominio ICOSL IgSF que fueron modificadas por afinidad para exhibir una unión aumentada para al menos uno, y en algunos casos más de un, ligando de contraestructura afín. Además, los resultados mostraron que la modificación por afinidad de las moléculas variantes también presentaba actividades mejoradas tanto para aumentar como para disminuir la actividad inmunológica en función del formato de la molécula. Por ejemplo, la coimmovilización del ligando probablemente proporciona una interacción multivalente con la célula para agrupar o aumentar la avidez para favorecer la actividad agonista y aumentar la activación de células T en comparación con la molécula ECD-Fc de referencia (por ejemplo, no modificada o de tipo silvestre) que no contiene el reemplazo o reemplazos de aminoácidos. Sin embargo, cuando la molécula se suministra como una molécula Fc bivalente en solución, las mismas variantes del dominio IgSF mostraron una actividad antagonista para disminuir la activación de células T en comparación con la molécula ECD-Fv de referencia (por ejemplo, no modificada o de tipo silvestre) que no contenía la sustitución o sustituciones de aminoácidos.
[1217]
[1218] (continuación)
[1219]
[1220] (continuación)
[1223]
[1227]
[1229] Los ensayos de unión se repitieron sustancialmente como se ha descrito anteriormente, excepto que la unión también se evaluó frente a células que expresaban CTLA4 humano de longitud completa. Las proteínas de fusión Fc variantes ICOSL también se evaluaron en un ensayo de coimmovilización anti-CD3 sustancialmente como se ha descrito anteriormente. Los resultados confirmaron la identificación de una serie de variantes del dominio IgSF de ICOSL que mostraban una mayor afinidad de unión por al menos un ligando afín, y en algunos casos por más de uno. Además, los resultados mostraron que la modificación de la afinidad de las moléculas variantes también presentaba actividades mejoradas en el ensayo de coinmovilización.
[1230] EJEMPLO 7
[1231] Otros Dominios IgSF Modificados por Afinidad
[1232] estos ejemplos describen el diseño, la creación y el cribado de proteínas inmunomoduladoras cd80 (b7-1), cd86 (b7-2) y nkp30 adicionales modificadas por afinidad, que son otros componentes de la sinapsis inmunitaria (si) que tienen un papel dual demostrado tanto en la activación como en la inhibición inmunitarias. Estos ejemplos demuestran que la modificación por afinidad de los dominios IgSF da lugar a proteínas que pueden actuar tanto para aumentar como para disminuir la actividad inmunológica. En este trabajo también se describen las diversas combinaciones de esos dominios fusionados por pares (es decir, apilados) con una variante de ICOSL modificada por afinidad para formar una proteína inmunomoduladora de tipo II con el fin de lograr una actividad inmunomoduladora.
[1233] Se generaron construcciones de DNA mutante de dominios IgSF CD80, CD86 y NKp30 humanos para traducción y expresión como bibliotecas de visualización de levadura sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1. Para las bibliotecas que se dirigen a residuos específicos de la proteína diana para la aleatorización completa o parcial con codones degenerados, los DNA codificantes para los dominios extracelulares (ECD) de CD80 humano (SEQ ID N.º:28), y NKp30 (SEQ ID N.º:54) se pidieron a Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) como un conjunto de oligonucleótidos solapados de hasta 80 pares de bases (pb) de longitud. Alternativamente, los residuos se mutaron mediante mutagénesis dirigida al sitio, sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1. Alternativamente, se construyeron bibliotecas aleatorias para identificar variantes de la ECD de CD80 (SEQ ID N.º:28), CD86 (SEQ ID N.º: 29) y NKp30 (SEQ ID N.º:54) sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1.
[1234] El DNA de la biblioteca dirigida y aleatoria se introdujo en levadura sustancialmente como se describe en el Ejemplo 2 para generar bibliotecas de levadura. Las bibliotecas se utilizaron para seleccionar levaduras que expresaran variantes modificadas por afinidad de CD80, CD86 y NKp30 sustancialmente como se describe en el Ejemplo 3. Las células se procesaron para reducir los no ligantes y para enriquecer variantes de CD80, CD86 o NKp30 con capacidad de unirse a sus proteínas contraestructura recombinantes exógenas sustancialmente como se describe en el Ejemplo 3. Por ejemplo, se seleccionaron bibliotecas CD80 dirigidas o aleatorias mostradas por levadura contra cada uno de los CD28, CTL-4 y PD-L1, por separado. A continuación, se realizaron dos o tres rondas de clasificación por citometría de flujo utilizando tinción exógena de proteínas de contraestructura para enriquecer la fracción de células de levadura que presenta mejores ligantes. El enriquecimiento con microesferas magnéticas y las selecciones por citometría de flujo son esencialmente como se describe en Keith D. Miller,1 Noah B. Pefaur,2 y Cheryl L. Baird1 Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30, July 2008.
[1235] [0572]Con las bibliotecas CD80, CD86 y NKp30, las proteínas ligando diana se obtuvieron de R&D Systems (EE.UU.) como sigue: rCD28.Fc humana (es decir, proteína de fusión CD28-Fc recombinante), rPDL1.Fc, rCTLA4.Fc, y rB7H6.Fc. La citometría de flujo de dos colores se realizó sustancialmente como se describe en el Ejemplo 3. Se ensayaron las salidas de levadura de las clasificaciones de citometría de flujo para una mayor afinidad de unión específica. Las levaduras seleccionadas se expandieron y se volvieron a inducir para que expresaran las variantes del dominio modificado por afinidad IgSF que codificaban. A continuación, esta población puede compararse con la cepa de levadura parental de tipo silvestre, o con cualquier otra salida seleccionada, como la población de levadura de salida de microesferas, mediante citometría de flujo.
[1237] En el caso de las variantes de levadura NKp30 seleccionadas para unirse a B7-H6, los resultados de la clasificación F2 dieron valores de MFI de 533 cuando se tiñeron con 16.6nM rB7H6.Fc, mientras que la MFI de la cepa NKp30 parental se midió en 90 cuando se tiñó con la misma concentración de rB7H6.Fc (mejora de 6 veces).
[1239] Entre las variantes de NKp30 que se identificaron, había una variante que contenía las mutaciones L30V/A60V/S64P/S86G con referencia a posiciones en el dominio extracelular de NKp30 correspondientes a posiciones establecidas en SEQ ID N.º:54. Entre las variantes CD86 que se identificaron, había una variante que contenía las mutaciones Q35H/H90L/Q102H con referencia a posiciones en el dominio extracelular CD86 correspondientes a posiciones establecidas en SEQ ID N.º: 29. Entre las variantes de CD80 que se identificaron, había variantes expuestas en la Tabla 8 y descritas más adelante.
[1241] Al igual que con ICOSL, las MFIs de todas las salidas F2 descritas anteriormente cuando se midieron con el anticuerpo anti-HA tag en FL1 no aumentaron y a veces disminuyeron en comparación con las cepas de tipo silvestre, lo que indica que el aumento de la unión no era una función del aumento de la expresión de las variantes seleccionadas en la superficie de la levadura, y validó las estrategias de gating de sólo seleccionar expresores medios a bajos con alta unión al ligando.
[1243] Los productos de selección ejemplares se reformatearon como proteínas inmunomoduladoras que contenían un dominio extracelular (ECD) de CD80 modificado por afinidad (variante) fusionado a una molécula Fc (moléculas de fusión ECD-Fc variantes) sustancialmente como se describe en el Ejemplo 4 y la proteína de fusión Fc se expresó y purificó sustancialmente como se describe en el Ejemplo 5.
[1245] La unión de variantes ejemplares de CD80 Fc-fusión a contraestructuras expresadas en células se evaluó entonces sustancialmente como se describe en el Ejemplo 6. Para producir células que expresen socios de unión afines, se produjeron constructos de expresión de superficie de mamífero de longitud completa para cada uno de CD28, CTLA4 y PD-L1 humanos sustancialmente como se describe en el Ejemplo 6. Los estudios de unión y la citometría de flujo se llevaron a cabo sustancialmente como se describe en el Ejemplo 6. Además, la bioactividad de la proteína variante de fusión Fc se caracterizó mediante reacción linfocitaria mixta (MLR) o ensayo de coimmovilización anti-CD3 sustancialmente como se describe en el Ejemplo 6.
[1247] En las Tablas 8 y 9 se muestran los resultados de los estudios de unión y actividad para variantes probadas ejemplares. En particular, la Tabla 8 indica sustituciones (reemplazos) de aminoácidos del dominio IgSF ejemplares en el ECD de CD80 seleccionadas en el cribado para la maduración por afinidad frente a la respectiva estructura afín CD28. En la Tabla 9 se indican sustituciones (reemplazos) de aminoácidos ejemplares del dominio IgSF en el ECD de CD80 seleccionadas en el cribado de afinidad-maduración frente a la respectiva estructura afín PD-L1. Como en el caso anterior, para cada Tabla, las sustituciones de aminoácidos ejemplares se designan por el número de posición del aminoácido correspondiente a la respectiva secuencia ECD de referencia (por ejemplo, no modificada), como sigue. Por ejemplo, la secuencia ECD de referencia (por ejemplo, no modificada) en las Tablas 8 y 9 es la secuencia ECD CD80 no modificada establecida en SEQ ID N.º:28. La posición del aminoácido se indica en el centro, con el aminoácido de referencia correspondiente (por ejemplo, no modificado) enumerado antes del número y la sustitución del aminoácido variante identificada enumerada después del número. La columna 2 establece el identificador de la SEQ ID N.º de la variante ECD para cada molécula de fusión ECD-Fc variante.
[1249] También se muestra la actividad de unión medida por el valor de Intensidad de Fluorescencia Media (IFM) para la unión de cada molécula de fusión Fc variante a células diseñadas para expresar el ligando de contraestructura afín y la relación de la IFM comparada con la unión de la molécula de fusión ECD-Fc de referencia correspondiente (por ejemplo, no modificada) que no contiene la(s) sustitución(es) de aminoácidos al mismo ligando de contraestructura expresado en células. La actividad funcional de las moléculas de fusión Fc variantes para modular la actividad de las células T también se muestra basándose en los niveles calculados de IFN-gamma en sobrenadantes de cultivo (pg/mL) generados i) con la molécula de fusión ECD-Fc variante indicada coinmovilizada con anti-CD3 o ii) con la molécula de fusión ECD-Fc variante indicada en un ensayo MLR. Las tablas también muestran la proporción de IFN-gamma producida por cada variante de ECD-Fc en comparación con la ECD-Fc de referencia correspondiente (por ejemplo, sin modificar) en ambos ensayos funcionales.
[1251] [0580]Como se muestra, las selecciones resultaron en la identificación de un número de variantes del dominio CD80 IgSF que fueron modificadas por afinidad para exhibir una unión aumentada para al menos uno, y en algunos casos más de un, ligando de contraestructura cognado. Además, los resultados mostraron que la modificación por afinidad de las moléculas variantes también presentaba actividades mejoradas tanto para aumentar como para disminuir la actividad inmunológica en función del formato de la molécula. Por ejemplo, la coimmovilización del ligando probablemente proporciona una interacción multivalente con la célula para agrupar o aumentar la avidez para favorecer la actividad agonista y aumentar la activación de células T en comparación con la molécula ECD-Fc de referencia (por ejemplo, no modificada o de tipo silvestre) que no contiene el reemplazo o reemplazos de aminoácidos. Sin embargo, cuando la molécula se proporciona como una molécula Fc bivalente en solución, las mismas variantes del dominio IgSF mostraron una actividad antagonista para disminuir la activación de células T en comparación con la molécula ECD-Fc de referencia (por ejemplo, no modificada o de tipo silvestre) que no contenía el reemplazo o reemplazos de aminoácidos.
[1253]
[1254] nin i n
[1255]
[1256] continuación
[1258]
[1259]
[1260] continuación
[1263]
[1266] EJEMPLO 8
[1267] Generación y Evaluación de Moléculas Apiladas que Contienen Distintos Dominios Modificados por Afinidad [0581]En este Ejemplo se describen otras proteínas inmunomoduladoras que se generaron como construcciones apiladas que contenían al menos dos dominios modificados por afinidad diferentes de polipéptidos ICOSL variantes identificados y una variante adicional más de moléculas CD80, CD86, ICOSL y NKp30 unidas y fusionadas a una Fc.
[1268] Las moléculas variantes seleccionadas descritas anteriormente que se modificaron por afinidad para uno o más ligandos de contraestructura se utilizaron para generar moléculas "apiladas" (es decir, proteínas inmunomoduladoras de tipo II) que contenían dos o más dominios IgSF modificados por afinidad. Las construcciones de pila se obtuvieron como geneblocks (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) que codifican la pila en un formato que permite su fusión con Fc mediante ensamblaje Gibson estándar utilizando un kit de ensamblaje Gibson (New England Biolabs, EE.UU.).
[1269] [0583]La molécula de ácido nucleico codificante de todas las pilas se generó para codificar una proteína diseñada como sigue: Péptido señal, seguido de la primera variante de IgV de interés, seguida de un enlazador de 15 aminoácidos compuesto de tres motivos GGGGS(G4S) (SEQ ID N.º:228), seguido de la segunda IgV de interés, seguida de dos enlazadores GGGGS (SEQ ID N.º: 229) seguido de tres alaninas (AAA), seguido de un Fc IgG1 humano como se ha descrito anteriormente. Para maximizar la posibilidad de un plegamiento correcto de los dominios IgV en cada pila, la primera IgV fue precedida por todos los residuos que normalmente se encuentran en la proteína de tipo silvestre entre esta IgV y el péptido señal (secuencia líder). Del mismo modo, a la primera IgV le siguieron todos los residuos que normalmente la conectan en la proteína de tipo silvestre con el siguiente dominio Ig (normalmente un dominio IgC) o, si no existe un segundo dominio IgV, los residuos que la conectan con el dominio transmembrana (secuencia de arrastre). El mismo principio de diseño se aplicó al segundo dominio IgV, salvo que cuando ambos dominios IgV derivaban de la misma proteína parental (por ejemplo, una IgV ICOSL apilada con otra IgV ICOSL), no se duplicó el enlazador entre ambas.
[1271] La Tabla 10 expone el diseño de construcciones apiladas ejemplares. Las moléculas de apilamiento ejemplares mostradas en la Tabla 10 contienen los dominios Ig (por ejemplo, el dominio IgV) como se indica y secuencias de arrastre adicionales como se ha descrito anteriormente. En la Tabla, los siguientes componentes están presentes en orden: péptido señal (SP; SEQ ID N.º:225), dominio Ig 1 (por ejemplo Ig1), secuencia de arrastre 1 (TS1), enlazador 1 (LR1; SEQ ID N.º:228), dominio Ig 2 (Ig2), secuencia de arrastre 2 (TS2), enlazador 2 (LR2; SEQ ID N.º:230) y dominio Fc (SEQ ID N.º:226 que contiene la sustitución de aminoácidos C5S/R77C/N82G/V87C). En algunos casos, una secuencia líder 1 (LS1) está presente entre el péptido señal y la IgV1 y en algunos casos una secuencia líder 2 (LS2) está presente entre el enlazador y la IgV2.
[1274]
[1275] continuación
[1276]
[1277] (continuación)
[1278]
[1279] (continuación)
[1280]
[1281] (continuación)
[1282]
[1283] (continuación)
[1284]
[1285] (continuación)
[1288]
[1291] La expresión y purificación de alto rendimiento de las moléculas de fusión IgV-apiladas-Fc variantes que contienen diversas combinaciones de dominios IgV variantes de CD80, CD86, ICOSL o Nkp30 que contienen al menos un dominio IgV modificado por afinidad se generaron sustancialmente como se describe en el Ejemplo 5. La unión de las moléculas de fusión IgV-apiladas-Fc variantes a las respectivas contraestructuras y la actividad funcional mediante ensayo de coimmovilización anti-CD3 también se evaluaron sustancialmente como se describe en el Ejemplo 6. Por ejemplo, la bioactividad coestimuladora de las proteínas de fusión Fc IgSF apiladas se determinó en un ensayo anti-CD3 inmovilizado similar al anterior. En este caso, se coinmovilizaron 4 nM de anti-CD3 (OKT3, Biolegend, EE.UU.) con 4 nM a 120 nM de rB7-H6.Fc humano (R&D Systems, EE.UU.) o rPD-L1.Fc humano (R&D Systems, EE.UU.) durante la noche en placas de 96 pocillos tratadas con cultivo tisular (Corning, EE.UU.). Al día siguiente se lavó la proteína no unida con PBS y se añadieron 100.000 células pan T purificadas a cada pocillo en 100 µl de medio Ex-Vivo 15 (Lonza, Suiza). Posteriormente se añadieron los dominios apilados de IgSF a concentraciones que oscilaban entre 8 nM y 40 nM en un volumen de 100 µl para un volumen total de 200 µl. Las células se cultivaron 3 días antes de recoger los sobrenadantes de cultivo y medir los niveles de IFN-gamma humano con el kit Duoset ELISA (R&D Systems, EE.UU.), como se ha mencionado anteriormente.
[1293] Los resultados se exponen en las Tablas 11-13. Específicamente, la Tabla 11 expone los resultados de unión y actividad funcional de las moléculas de fusión IgV-apiladas-Fc variantes que contienen un dominio IgV NKp30 y un dominio IgV ICOSL. En las Tablas 12 y 13 se exponen los resultados de unión y actividad funcional de moléculas de fusión IgV-apiladas-Fc variantes que contienen un dominio IgV ICOSL variante y un dominio IgV CD80 o IgV CD86 variante.
[1295] Para cada una de las Tablas 11-13, la Columna 1 indica la organización estructural y la orientación de los dominios apilados, modificados por afinidad o de tipo silvestre (WT) empezando por el dominio amino terminal (N terminal), seguido por el dominio WT medio o modificado por afinidad situado antes de los dominios Fc de IgG1 humana C terminal. En la columna 2 figura el identificador de la SEQ ID N.º de la secuencia de cada dominio IgV contenido en una molécula "apilada" respectiva. La columna 3 muestra los socios de unión contra los que se seleccionaron los dominios apilados modificados por afinidad indicados de la columna 1.
[1297] También se muestra la actividad de unión medida por el valor de Intensidad de Fluorescencia Media (IFM) para la unión de cada molécula apilada a células transfectadas para expresar varios ligandos de contraestructura y la relación de la IFM comparada con la unión de la molécula apilada correspondiente que contiene dominios IgV de referencia (por ejemplo, no modificados) que no contienen la(s) sustitución(es) de aminoácido al mismo ligando de contraestructura expresado en células. La actividad funcional de las moléculas apiladas variantes para modular la actividad de las células T también se muestra basándose en los niveles calculados de IFN-gamma en sobrenadantes de cultivo (pg/mL) generados con la molécula apilada variante indicada en solución y el ligando apropiado coinmovilizado con anti-CD3 como se describe en el Ejemplo 6. La Tabla también representa la proporción de IFN-gamma producida por cada molécula apilada variante en comparación con la correspondiente molécula apilada de referencia (por ejemplo, no modificada) en el ensayo de coimmovilización.
[1299] Como se muestra, los resultados mostraron que era posible generar moléculas apiladas que contenían al menos una variante de dominio IgSF que exhibía actividad de afinidad modificada de unión aumentada para al menos un ligando de contraestructura afín en comparación con una molécula apilada correspondiente que contenía el dominio IgV de referencia respectivo (por ejemplo, de tipo silvestre o no modificado). En algunos casos, la molécula apilada, ya sea a partir de uno o de una combinación de los dos dominios IgSF variantes de la molécula, mostró un aumento de la unión para más de un ligando de contraestructura afín. Los resultados también mostraron que el orden de los dominios IgV en las moléculas apiladas podía, en algunos casos, alterar el grado de mejora de la actividad de unión. En algunos casos, la actividad funcional de las células T también se vio alterada cuando se evaluó en el ensayo de coimmovilización dirigida.
[1300]
[1301] continuación
[1302]
[1305]
[1306] continuación
[1307]
[1308] (continuación)
[1309]
[1310]
[1311] (continuación)
[1312]
[1313] (continuación)
[1314]
[1315] (continuación)
[1318]
[1320] EJEMPLO 9
[1321] Generación y evaluación de células modificadas genéticamente que expresan una proteína inmunomoduladora transmembrana
[1322] Se generaron células T modificadas genéticamente en las que una proteína inmunomoduladora transmembrana (TIP) que contenía un dominio extracelular (ECD) que contenía una variante CD80 como se ha descrito anteriormente o un dominio IgSF modificado por afinidad ICOSL se coexpresó con un receptor de antígeno quimérico (CAR). La TIP también contenía un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático de la secuencia correspondiente de la proteína transmembrana CD80 o ICOSL de tipo silvestre. La actividad inmunomoduladora de las células modificadas genéticamente se comparó con la de las células que sólo expresaban el CAR o con la de las células que coexpresaban la correspondiente proteína transmembrana CD80 o ICOSL de tipo silvestre con el CAR.
[1323] El CD80-TIP ejemplar era una variante CD80 que tenía un dominio IgSF modificado por afinidad que contenía mutaciones de aminoácidos en los dominios IgV e IgC correspondientes a I67T/L70Q/A91G/T120S con referencia a posiciones en el dominio extracelular CD80 establecido en SEQ ID N.º:28 y un dominio transmembrana y citoplasmático correspondiente a los residuos 243-288 de SEQ ID N.º: 1. La secuencia de aminoácidos de la CD80-TIP ejemplar se expone en SEQ ID N.º: 241 y está codificada por la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID N.º:242. La correspondiente proteína transmembrana CD80 de tipo silvestre tenía la secuencia de aminoácidos establecida como residuos de aminoácidos 35-288 de SEQ ID N.º:1 y codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 251.
[1324] El ICOSL-TIP ejemplar era una variante ICOSL que tenía un dominio IgSF modificado por afinidad que contenía mutaciones de aminoácidos en el dominio IgV correspondientes a N52H/I143T con referencia a posiciones en el dominio extracelular ICOSL establecido en SEQ ID N.º:32 y un dominio transmembrana y citoplasmático correspondiente a los residuos 257-302 de SEQ ID N.º:5. La secuencia de aminoácidos de la ICOSL-TIP ejemplar se expone en SEQ ID N.º:243 y está codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID N.º:244. La correspondiente proteína transmembrana ICOSL de tipo silvestre tenía la secuencia de aminoácidos establecida como residuos de aminoácidos 19-302 de SEQ ID N.º:5 y codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 252.
[1325] La TIP que contiene el dominio modificado por afinidad o la proteína transmembrana de tipo silvestre que contiene un dominio IgSF correspondiente no modificado por afinidad se coexpresaron en células T con un receptor de antígeno quimérico (CAR) de 1ª generación que contiene un dominio de señalización intracelular CD3zeta. El CAR de<primera>generación incluía un scFv específico para CD19 (SEQ ID N.º:245), un dominio bisagra y transmembrana derivado de CD8 (SEQ ID N.º:246) y un dominio de señalización intracelular derivado de CD3zeta (establecido en SEQ ID N.º:47). La secuencia de nucleótidos que codifica el CD19 scFv - CD3zeta CAR se establece en SEQ ID N.º: 248 y la secuencia de aminoácidos del CD19 scFv - CD3zeta CAR se establece en SEQ ID N.º: 479.
[1326] Se generaron moléculas de ácido nucleico que codifican el CAR solo o también codifican una de las TIP ejemplares o proteínas transmembrana de tipo silvestre separadas del CAR por una secuencia T2A de autocicatrización (SEQ ID N.º:250 y codificada por la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID N.º:249). Construcciones ejemplares contenían secuencias de ácido nucleico establecidas en la Tabla 14. Como control, se generó una construcción de ácido nucleico que codifica un CAR de 2ª generación que contiene además un dominio coestimulador CD28 (CD19 scFv - CD28 - CD3zeta).
[1327]
[1330] Las moléculas de ácido nucleico se clonaron individualmente en un vector lentiviral, que se utilizó para transducir células T aisladas de muestras de PBMC humanas obtenidas de tres donantes sanos diferentes. Se produjeron partículas lentivirus que contenían las secuencias de ácidos nucleicos tras la cotransfección de células HEK293 con los vectores y las construcciones de empaquetamiento lentivirus. Las partículas lentivirus se recogieron del medio de cultivo por ultracentrifugación y se tituló por qRT-PCR. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) de tres donantes de sangre normales mediante sedimentación por densidad. Las PBMC se cultivaron durante la noche con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 e IL-2, y a continuación se transdujeron con las preparaciones de lentivirus a una multiplicidad de infección de 5:1. Los vectores lentivirales que codifican el CAR de control de 2ª generación sólo se utilizaron para transducir células de un donante.
[1332] Después de dos semanas (14 días) de cultivo, se analizó la citotoxicidad de las células tras el co-cultivo con células que expresan el antígeno diana utilizando el Analizador Celular en Tiempo Real Acea (RTCA), que mide las variaciones de impedancia en el medio de cultivo de una placa microelectrónica de 96 pocillos (E-plate), y muestra los cambios en el número de células y la morfología en un gráfico en tiempo real. Se sembraron células diana HeLa que expresaban CD19 (HeLa-CD19) en una placa E de 96 pocillos y se monitorizó la impedancia de cada monocapa durante 24 horas utilizando el sistema RTCA. Las células T modificadas genéticamente se añadieron a los pocillos en una proporción efector:diana de 10:1 y los pocillos se monitorizaron durante otras 48 horas. Los resultados se mostraron y registraron como valor del índice celular (IC) derivado del cambio en la impedancia eléctrica medida y, a continuación, se transformaron en relación dividiendo las lecturas de IC de todos los pocillos en todos los puntos temporales entre el valor de IC de pocillos individuales en un mismo momento (momento base) para obtener un valor de índice celular normalizado que representara el porcentaje del valor en el momento base (véase Zhang et al. "Introduction to the Data Analysis of the Roche xCELLigence ® System with RTCA Package." Bioconductor. 3 de mayo de 2016, bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/RTCA/inst/doc/aboutRTCA.pdf. Consultado el 9 de septiembre de 2016). En este ensayo, una disminución de la impedancia de una monocapa refleja la muerte de las células diana por las células transducidas.
[1334] Los resultados mostraron que se observó una disminución de la impedancia en las células que expresaban el CAR de 1ª generación en comparación con las células T no transducidas, aunque el grado de disminución de la impedancia de las células que expresaban el CAR de 1ª generación fue menor que el de las células que expresaban el CAR de 2ª generación. La disminución de la impedancia en las células que expresan el CAR de 1ª generación continuó en general hasta las primeras 8 horas del ensayo, mientras que sólo las células que expresan el CAR de 2ª generación siguieron disminuyendo la impedancia a partir de entonces.
[1336] [0598]Como se muestra en la FIG.1,en un donante, cada una de las células que coexpresaban la TIP o la correspondiente proteína transmembrana de tipo silvestre con el CAR de 1ª generación presentaba una mayor disminución de la impedancia, lo que indicaba una mayor actividad citotóxica, en comparación con las células que sólo expresaban el CAR de 1ª generación. Además, los resultados mostraron que la actividad citotóxica era mayor en las células que expresaban CAR y que coexpresaban CD80-TIP o ICOSL-TIP que en las células que expresaban CAR y que coexpresaban las correspondientes proteínas transmembrana CD80 o ICOSL de tipo silvestre que contenían un dominio IgSF modificado sin afinidad. Los resultados observados de estas células modificadas genéticamente con TIP mostraron que la actividad citotóxica de las células que coexpresan el CD80-TIP o el ICOSL-TIP con el CAR presentan una mayor actividad para modular la respuesta inmunitaria citotóxica de las células T específicas de antígeno, como las células T que expresan el CAR.
[1337] En los otros dos donantes, las células que expresaban la CD80-TIP no produjeron una mayor disminución de la impedancia en comparación con las células que expresaban la correspondiente proteína transmembrana CD80 de tipo silvestre. En un donante, no había suficientes células para transducir con el constructo de proteína transmembrana de tipo silvestre, aunque en este donante el TIP ICOS-L dio la mejor citotoxicidad en comparación con los otros constructos probados. En el otro donante, las células que expresaban la ICOS-L-TIP no presentaban una mayor disminución de la impedancia en comparación con las células que expresaban la correspondiente proteína transmembrana ICOS-L de tipo silvestre. En las células ensayadas, todas las células que coexpresaban una CD80-TIP, una ICOSL-TIP o la correspondiente proteína transmembrana de tipo silvestre con el CAR mostraron una mayor actividad citotóxica que las células que sólo expresaban el CAR de 1ª generación. Las diferencias en los resultados observados entre los donantes pueden estar relacionadas con las diferencias en las células T entre los donantes, las diferencias en los niveles de expresión de las diversas proteínas modificadas genéticamente en la superficie de las células, las condiciones particulares utilizadas en este ensayo ejemplar para evaluar la destrucción en las células (por ejemplo, evaluar las células transducidas del día 14, evaluar una única proporción efector:célula diana) u otros factores.
[1338] EJEMPLO 10
[1339] Evaluación de la Unión y la Actividad de las Variantes del Dominio IgSF de ICOSL
[1340] Se identificaron variantes ECD ICOSL adicionales mediante el método de selección de levadura sustancialmente como se ha descrito anteriormente y se utilizaron para producir proteínas de fusión ECD-Fc como se describe en el Ejemplo 5. Se llevaron a cabo estudios de unión para evaluar la especificidad y afinidad de las proteínas inmunomoduladoras variantes del dominio ICOSL por socios de unión afines sustancialmente como se describe en el Ejemplo 6.
[1341] A. Unión y Caracterización Funcional
[1342] La unión se evaluó con células que expresaban socios de unión afines de longitud completa CD28, ICOS y CTLA-4 sustancialmente como se describe en el Ejemplo 6. La bioactividad de las variantes ECD ICOSL también se evaluó en un ensayo de coimmovilización anti-CD3 o Reacción de Linfocitos Mixtos humanos (MLR) sustancialmente como se describe en el Ejemplo 6, excepto que para el ensayo de coimmovilización, la actividad costimuladora se determinó mediante cultivo de células T humanas con una mezcla de 10 nM de anti-CD3 unido a placa y 40nM de proteínas de variante Fc ICOSL.
[1343] La Tabla 15 muestra resultados ejemplares para las variantes de dominio ICOSL IgSF adicionales para la unión a contraestructuras expresadas en células y bioactividad en el ensayo de coimmovilización anti-CD3 o ensayo MLR. Las sustituciones de aminoácidos ejemplares representadas en la Tabla 15 se designan por el número de posición de aminoácido correspondiente a la respectiva secuencia ICOSL ECD de referencia (por ejemplo, no modificada) establecida en SEQ ID N.º:32. La posición del aminoácido se indica en el centro, con el correspondiente aminoácido no modificado (por ejemplo, de tipo silvestre) enumerado antes del número y la sustitución del aminoácido variante identificada enumerada después del número. La columna 2 establece el identificador de la SEQ ID N.º de la variante ECD para cada molécula de fusión ECD-Fc variante.
[1344] Los resultados de la Tabla 15 representan la actividad de unión medida por el valor de Intensidad de Fluorescencia Media (IFM) para la unión de cada molécula de fusión Fc variante a células diseñadas para expresar el ligando de contraestructura afín y la relación de la IFM comparada con la unión de la molécula de fusión ECD-Fc de referencia correspondiente (por ejemplo, no modificada) que no contiene la(s) sustitución(es) de aminoácidos al mismo ligando de contraestructura expresado en células. La actividad funcional de las moléculas de fusión Fc variantes para modular la actividad de las células T también se muestra basándose en los niveles calculados de IFN-gamma en sobrenadantes de cultivo (pg/mL) generados i) con la molécula de fusión ECD-Fc variante indicada coinmovilizada con anti-CD3 o ii) con la molécula de fusión ECD-Fc variante indicada en un ensayo MLR. La tabla también muestra la proporción de IFN-gamma producida por cada variante de ECD-Fc en comparación con la correspondiente ECD-Fc no modificada (parental) en ambos ensayos funcionales.
[1345] Los resultados muestran una afinidad de unión alterada, incluso aumentada, de las variantes de dominio ICOSL IgSF modificadas por afinidad para al menos un ligando de contraestructura afín y/o una actividad inmunológica mejorada. Específicamente, de forma similar a los aciertos iniciales identificados en el Ejemplo 6, las selecciones dieron lugar a la identificación de una serie de variantes adicionales del dominio IgSF de ICOSL que se modificaron por afinidad para mostrar una mayor unión con al menos un ligando de contraestructura afín, y en algunos casos con más de uno. Además, los resultados mostraron que la modificación por afinidad de las moléculas variantes también presentaba actividades mejoradas tanto para aumentar como para disminuir la actividad inmunológica dependiendo del formato de la molécula como se describe en el Ejemplo 6.
[1346]
[1347] (continuación)
[1348]
[1349] (continuación)
[1350]
[1351] (continuación)
[1354]
[1357] B. Producción de Citoquinas en Ensayos de Coestimulación Anti-CD3
[1358] Las moléculas de fusión Fc ECD ICOSL variantes ejemplares descritas anteriormente se evaluaron además para la estimulación de citocinas IL-17 en el ensayo de bioactividad coestimuladora (coimmovilización) anti-CD3 descrito anteriormente. Se cultivó una mezcla de 10 nM de proteínas anti-CD3 unidas a placas y 40nM de variantes Fc ICOSL con células T humanas. Se recogieron los sobrenadantes y se determinaron los niveles de IL-17 mediante ELISA. Se midió la cantidad de IL-17 en sobrenadantes de cultivo (pg/mL) generados con la molécula de fusión ECD-Fc variante indicada y la correspondiente ECD-Fc no modificada (parental) coinmovilizada con anti-CD3. A título comparativo, también se muestran en esta Tabla los resultados para la producción de IFN-gamma en el mismo ensayo que se representa en la Tabla 15 para las variantes ejemplares.
[1359] Los resultados se muestran en la Tabla 16, que representa las pg/mL de IL-17 medidas en el sobrenadante así como la proporción (aumento del pliegue) de IL-17 producida por cada variante de ECD-Fc comparada con la ECD-Fc no modificada correspondiente (tipo silvestre). Resultados similares se muestran para IFN-gamma. También se muestra el % de citocina IL-17 o IFN-gamma total producida por las células. Los resultados mostraron que la modificación por afinidad de las moléculas variantes alteraba la actividad funcional de las células T para aumentar la IL-17 además del IFN-gamma en el ensayo de coestimulación.
[1361]
[1362] continuación
[1364]
[1366] EJEMPLO 11
[1367] Generación de células T modificadas genéticamente adicionales que expresan una proteína inmunomoduladora transmembrana y evaluación de la proliferación
[1368] Este Ejemplo describe la generación de células T modificadas genéticamente adicionales en las que una proteína inmunomoduladora transmembrana (TIP) que contiene un dominio extracelular (ECD) con dominio IgSF modificado por afinidad ICOSL se coexpresó con un receptor de antígeno quimérico (CAR). Específicamente, la TIP se generó para incluir el ECD de la variante ejemplar de ICOSL que contenía las mutaciones de aminoácidos N52D, N52H/N57Y/Q100P, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R o N52H/N57Y/Q100R con referencia a las posiciones en el dominio extracelular de ICOSL establecido en SEQ ID N.º:32. El TIP también contenía un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático de la correspondiente secuencia de proteína transmembrana ICOSL de tipo silvestre correspondiente a los residuos 257-302 de SEQ ID N.º:5. La secuencia del TIP con y sin su péptido señal es la siguiente: N52D (SEQ ID N.º: 496 y 497); N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID N.º: 498 y 499); E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R (SEQ ID N.º: 500 y 501) y N52H/N57Y/Q100R (SEQ ID N.º: 502 y 503). A modo de comparación, también se expresó en células el ICOSL transmembrana de longitud completa de tipo silvestre (residuos de aminoácidos 19-302 de SEQ ID N.º:5). La secuencia de la TIP de tipo silvestre con y sin su péptido señal se establece en SEQ ID N.º: 494 y 495. El ácido nucleico que codifica la TIP también incluía una secuencia que codifica una proteína verde fluorescente (GFP) separada de la TIP por una secuencia T2A de autocicatrización.
[1369] La TIP que contiene el dominio modificado por afinidad o la proteína transmembrana de tipo silvestre que contiene un dominio IgSF correspondiente no modificado por afinidad se coexpresaron en células T con un receptor de antígeno quimérico (CAR). La secuencia de nucleótidos que codifica el CAR codifica, en orden: una secuencia señal CD8 (SEQ ID N.º: 481), un scFv anti-CD19 (SEQ ID N.º: 482), una región bisagra/transmembrana derivada de CD8 (SEQ ID N.º: 483), un dominio de señalización costimuladora derivado de 4-1BB (SEQ ID N.º: 484), y un dominio de señalización CD3zeta (SEQ ID N.º: 247). El CAR anti-CD19 resultante tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N.º: 490. El ácido nucleico que codifica el CAR también incluía una secuencia que codifica una proteína azul fluorescente (BFP; SEQ ID N.º: 489) separada de la CAR por una secuencia T2A de autocicatrización (expuesta en SEQ ID N.º: 488).
[1370] [0609]Se generaron por separado construcciones de vectores virales en las que se clonó la molécula de ácido nucleico que codifica el CAR solo o una molécula de ácido nucleico que codifica uno de los TIP ejemplares o el ICOSL de tipo silvestre. El vector viral que codifica el CAR y el vector viral que codifica el TIP o el ICOSL de tipo silvestre se transdujeron conjuntamente en células T. Para la transducción, se activaron células T primarias con microesferas anti-CD3 y anti-CD28 (Dynal) en una proporción de microesfera:célula de 1:1 y se incubaron en presencia de 100IU/mL de IL-2 a 37°C durante 2 días. A continuación, se cosecharon células T y se transdujeron con 400 µl de sobrenadante viral CAR y 400 µl de sobrenadante viral TIP en presencia de 8 µg/mL de polibreno. Las células se centrifugaron a 1000g durante 30 minutos a 30°C. A continuación, se transfirieron las células y se incubaron durante la noche a 37 °C. Tras la incubación, se recogieron las células y se eliminó el sobrenadante viral. Las células se resuspendieron con medio completo y 50IU/mL de IL-2. Las células se expandieron, se repusieron con IL-2 y medios cada dos días durante un total de 6 días. Las perlas se retiraron de las células utilizando un imán y se contaron antes de ser evaluadas en un ensayo de proliferación. En laFIG.se muestra un perfil de expresión ejemplar de un TIP y un CAR en unas células T transducidas ejemplares.2A.
[1371] Para evaluar la proliferación de células T CAR y células T CAR-TIP en respuesta al antígeno, las células se marcaron con colorante rojo far celular. Las células diana Nalm6 que expresan CD19 se titularon partiendo de una proporción diana:célula T de 1,5:1 y mediante diluciones 1:2 con dilución en 8 puntos. Se añadieron células T CAR marcadas o células T CAR-TIP a células Nalm6 y se incubó el cultivo durante 4 días antes de analizar las células mediante citometría de flujo. Se recogió el sobrenadante y se evaluó posteriormente en un ensayo de liberación de citocinas.
[1372] Como se muestra en la FIG.2B,Las células T primarias CAR+ proliferan de forma dependiente de la dosis de células CD19+ NALM6. En comparación con las células T que sólo expresan CAR, las células T que coexpresan CAR e ICOSL de tipo silvestre o uno de los TIP ICOSL ejemplares mostraron una mayor proliferación en comparación con las células T que sólo expresan CAR. La coexpresión de un CAR y un TIP que contenía la variante ICOSLECD N52H/N57Y/Q100P, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R o N52H/N57Y/Q100R mostró una mayor proliferación que las células T que coexpresaban el CAR y el ICOSL de tipo silvestre, lo que indica que los TIP expresados en células T primarias proporcionan una señal costimuladora mejorada para potenciar la proliferación de células T.
[1373] EJEMPLO 12
[1374] Purificación y Evaluación de Variantes Purificadas del Dominio IgSF de ICOSL
[1375] Se empleó una estrategia de purificación para los éxitos candidatos ejemplares descritos en los Ejemplos 6 y 10. Las células humanas derivadas de la línea celular 293 (Expi293) se transfectaron transitoriamente con el constructo de expresión y la molécula de fusión ECD ICOSL Fc se expresó en las células. A continuación, las proteínas de fusión Fc se purificaron a partir de sobrenadantes con proteína A mediante cromatografía de afinidad (MabSelect SuRe). A este paso inicial de purificación le siguió un paso de cromatografía preparativa de exclusión por tamaño (SEC) para purificar aún más las proteínas (Superdex20016x60). Las muestras de ambos pasos de purificación se conservaron y compararon mediante SEC analítico. La concentración de la proteína se determinó tras la purificación de la proteína A. Las proteínas purificadas resultantes también se analizaron mediante SEC analítica en una cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para evaluar la pureza.
[1376] Se determinó el porcentaje de pico principal en las muestras purificadas y se comparó con la proteína purificada en el paso inicial de Proteína A (% Pico Principal pool Prot A) frente a la proteína purificada con Proteína A seguida de SEC preparativa (% Pico Principal conjunto SEC T=D0). Como se muestra en la Tabla 17, el paso adicional de SEC aumentó sustancialmente la pureza de las proteínas purificadas. Para evaluar aún más la estabilidad de las proteínas, las proteínas purificadas mediante SEC preparativa se dejaron a temperatura ambiente durante 24 horas y, a continuación, se evaluó el % de pico principal por HPLC (% de pico principal conjunto SEC T=D24) y se comparó con la muestra D0. Se determinó el cambio en el % de Pico Principal en D0 frente a D24 (▲% Pico Principal conjunto SEC). Como se muestra en la Tabla 17, la mayoría de las moléculas de fusión ECD ICOSL Fc variantes ejemplares probadas exhibieron poco cambio en el % de Pico Principal en este momento, indicando que había ocurrido una agregación mínima de las variantes de proteína.
[1379]
[1380] (continuación)
[1383]
[1385] Ejemplo 13.
[1386] Evaluación de la bioactividad coestimuladora de variantes purificadas del dominio IgSF de ICOSL
[1387] Moléculas de fusión ECD ICOSL Fc ejemplares purificadas como se describe en el Ejemplo 12 se evaluaron para bioactividad por MLR sustancialmente como se describe en el Ejemplo 6. Una mezcla de 10 nM o 40nM de proteínas variantes ICOSL Fc se unió durante la noche a placas de 96 pocillos en presencia de 10nM anti-CD3. Se lavaron las placas y se añadieron 100.000 células pan T marcadas con CFSE durante 96 horas. Se recogieron los sobrenadantes y se midieron los niveles de IFN-gamma e IL-17 mediante ELISA.
[1388] Los resultados para la secreción de citoquinas inducida por la coestimulación anti-CD3 con variantes probadas ejemplares (10nM y 40nM ICOSL Fc) se muestran en laFIG. 3A y 3B,que indican sustituciones (reemplazos) de aminoácidos del dominio IgSF ejemplares en el ECD de ICOSL. Los gráficos de barras deFIG. 3A y 3Brepresentan la cantidad de IFN-gamma e IL-17 secretadas, respectivamente, por ELISA en los sobrenadantes (pg/mL). La línea horizontal indica el nivel de liberación de citocinas inducido por la coestimulación anti-CD3 con las variantes probadas en comparación con el nivel inducido por la coestimulación anti-CD3 con ICOSL WT. Los resultados mostraron que la modificación por afinidad de las moléculas variantes mostraba actividad para modular la actividad funcional de las células T, incluyendo el aumento sustancial de la secreción de IFN-gamma e IL-17 en el ensayo de coestimulación. Se observó una mayor actividad inmunológica con algunas variantes.
[1389] EJEMPLO 14
[1390] Evaluación de la Proliferación de las Variantes Purificadas del Dominio IgSF de ICOSL
[1391] [0616]Se evaluó la capacidad de moléculas de fusión Fc ECD ICOSL variantes ejemplares purificadas como se describe en el Ejemplo 12 para coestimular la proliferación de células T inducida por anti-CD3. Las células T primarias se marcaron con éster succinidílico de carboxifluoresceína (CFSE). Una mezcla de 10 nM o 40nM de la variante ECD ICOSL Fc o de las proteínas ECD ICOSL de tipo silvestre se unió durante la noche a placas de 96 pocillos en presencia de 10nM anti CD3, y después se añadieron células T marcadas y se incubaron durante 3 días. Como control, también se evaluó la proliferación en presencia de anti-CD3 e IgG unidos o de IgG sola. Se tiñeron las células para los marcadores de superficie CD4 o CD8 y se determinó la proliferación de células T totales, células T CD4+ o células T CD8+ evaluando la dilución de CFSE mediante citometría de flujo.
[1392] Los resultados se exponen en laFIG.4A y FIG.4Bpara variantes ejemplares probadas a 40nM y 10nM ICOSL, respectivamente. Como se muestra en laFIG.4A,casi todas las moléculas de fusión ECD ICOSL Fc variantes probadas indujeron una proliferación mayor que el control WT. Como se muestra en laFIG.4B,las diferencias en la proliferación eran más evidentes a 10 nM, con ciertas variantes que proporcionaban una proliferación máxima incluso a esta concentración más baja.
[1393] EJEMPLO 15
[1394] Evaluación de la Unión y la Actividad de las Variantes Purificadas del Dominio IgSF de ICOSL
[1395] Las moléculas de fusión ECD ICOSL Fc variantes ejemplares purificadas como se describe en el Ejemplo 12 se evaluaron para actividades de unión y funcionales usando métodos sustancialmente como se describe en el Ejemplo 6 o el Ejemplo 10.
[1396] A. Ensayos de Unión por Citometría de Flujo
[1397] Células humanas derivadas de la línea celular 293 (Expi293) fueron transfectadas con CD28, CTLA-4, ICOS o transfectadas simuladamente. A continuación, las células se incubaron con moléculas de fusión ECD ICOSL Fc o ECD ICOSL-Fc de tipo silvestre que se titularon de 100.000 pM a 46 pM, y se observó la unión utilizando un anti-Fc humano conjugado con PE como se describe en el Ejemplo 6. La unión se evaluó mediante citometría de flujo y la intensidad media de fluorescencia (IMF) y el porcentaje (%) de células positivas para la señal se determinaron utilizando el software Cell Quest Pro (Becton Dickinson, EE.UU.). Se determinó la concentración de ICOSL-Fc que dio una respuesta MFI semimáxima (MFI EC50) o % de células positivas (% (+) EC50).
[1398] La tabla 18 presenta los resultados. Las sustituciones de aminoácidos ICOSL representadas en la Tabla 18 se designan por el número de posición de aminoácido correspondiente a la respectiva secuencia ECD ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificada) establecida en SEQ ID N.º:32. Para algunos valores (por ejemplo, la unión de WT a CD28) no fue posible obtener una EC50, por lo que se eligió arbitrariamente 1000000 pM para dar formato a los datos. De forma similar a los resultados obtenidos en los ensayos de unión anteriores descritos en el Ejemplo 10 anterior, se observó una afinidad de unión alterada de la molécula de fusión ICOSL ECD-Fc variante por al menos un ligando de contraestructura afín.
[1399]
[1401] B. Ensayo de Unión ForteBio
[1402] Las interacciones proteína-proteína entre los receptores y las proteínas inmunomoduladoras variantes del dominio ICOSL se evaluaron además mediante ensayos de unión Fortebio. Los receptores ICOS, CD28 y CTLA-4 se cargaron individualmente en sensores de captura antihumanos (ForteBio Octet AHC) y la molécula de fusión ICOSL ECD-Fc de tipo silvestre no modificada, la molécula de fusión PD-L2 ED-Fc de tipo silvestre o las moléculas de fusión ICOSL Fc variantes se unieron a los receptores en valoraciones de 4 puntos. Cada valoración se ajustó globalmente para calcular la asociación (kon<)>y la disociación (Kdis<)>de cada proteína. Se determinó la respuesta de carga de los sensores de captura antihumanos de cada receptor ensayado con la molécula de fusión ICOSL ECD-Fc variante. La constante de disociación (KD) se calculó y se comparó con el tipo silvestre para determinar un valor de mejora en múltiplos (mej. del pliegue).
[1403] Los resultados de unión a ICOS se exponen en la Tabla 19, a CD28 se exponen en la Tabla 20 y a CTLA-4 se exponen en la Tabla 21. Las sustituciones de aminoácidos ejemplares representadas en la Tabla 19-21 se designan por el número de posición de aminoácido correspondiente a la respectiva secuencia ECD ICOSL no modificada de referencia establecida en SEQ ID N.º:32.
[1404]
[1405]
[1406]
[1407]
[1411]
[1414] C. Ensayo de Coimmovilización
[1416] [0623]La bioactividad coestimuladora de las variantes de fusión ICOSL se determinó en ensayos de coimmovilización anti-CD3 sustancialmente como se describe en el Ejemplo 6. Se diluyó aproximadamente 0,37nM, 1,3nM o 10nM de CD3 antihumano de ratón (OKT3, Biolegends, EE.UU.) en PBS con 10nM o 40nM de ECD-Fc variante de ICOSL o ECD-Fc de tipo silvestre de ICOSL. Esta mezcla se añadió a placas de 96 pocillos de fondo plano tratadas con cultivo tisular durante la noche para facilitar la adherencia de las proteínas estimuladoras a los pocillos de la placa. Al día siguiente, se lavó la proteína no unida de las placas y se añadieron 100.000 células pan T humanas purificadas a cada pocillo. Las células se cultivaron 3 días antes de recoger los sobrenadantes de cultivo y medir los niveles de IFN-gamma humano con un kit ELISA.
[1418] La Tabla 22 establece la cantidad de IFN-gamma (pg/mL) producida por las células bajo las diversas condiciones en el ensayo de coimmovilización anti-CD3. En la tabla, las sustituciones de aminoácidos de fusiones ECD ICOSL-Fc variantes ejemplares se designan por el número de posición de aminoácido correspondiente a la secuencia ECD ICOSL no modificada establecida en SEQ ID N.º: 32 y se establece el correspondiente identificador de la SEQ ID N.º de la ECD variante para cada molécula de fusión ICOSL ECD-Fc variante. Se muestra la proporción de IFN-gamma producida en presencia de cada variante ICOSL ECD-Fc en el ensayo funcional en comparación con la producida en presencia del ECD-Fc no modificado correspondiente (tipo silvestre) (Pliegue ↑WT). Como se muestra, la señalización costimulatoria de las moléculas variantes ICOSL-ECD-Fc fue sustancialmente mayor en comparación con ICOSL de tipo silvestre.
[1421]
[1422] continuación
[1425]
[1427] D. Reacción Linfocitaria Mixta para la Evaluación de la Supresión de la Biorreactividad
[1428] La modulación de la actividad de células T por variantes de fusión se determinó en una reacción de linfocitos mixtos (MLR) sustancialmente como se describe en el Ejemplo 6. Los monocitos humanos se incubaron durante 6 días en presencia de IL-4 y GM-CSF y maduraron a células dendríticas con la adición de LPS durante las últimas 24 horas. Se colocaron 1x10<4>células dendríticas y 1x10<5>células T humanas marcadas con CFSE por pocillo y se incubaron durante 4 días en presencia de tres concentraciones diferentes (40 nM, 13,3 nM o 4,4 nM) de moléculas ECD-Fc de tipo silvestre o de variante recombinante de ICOSL diluidas en PBS. Como controles se utilizaron las mismas concentraciones de IgG humana, PD-L2-Fc o Belatacept (CTLA4-Fc con mutaciones L104E y A29Y). Se recogieron los sobrenadantes y se caracterizaron las respuestas de IFN-gamma mediante ELISA.
[1429] La FIG.5representa la producción de IFN-gamma en las distintas condiciones. Los niveles de IFN-gamma producidos por las células en presencia de ICOSL de tipo silvestre se establecen mediante la línea horizontal. No se observó ninguna supresión de la producción de IFN-gamma en presencia de la proteína de control negativa PD-L2-Fc. Por el contrario, la mayoría de las variantes ICOSL probadas mostraron cierto grado de inhibición de la producción de IFN-gamma en la MLR. Ciertas variantes mostraron una inhibición sustancial del IFN-gamma con una producción de IFN-gamma muy baja o nula en los cultivos, incluso a la concentración más baja de 4,4 nM probada. El porcentaje de supresión de MLR en presencia de 4,4nM de la variante de ECD ICOSL-Fc se expone en la Tabla 23. En la Tabla, los valores negativos indican un efecto inflamatorio en el ensayo.
[1430]
[1432] E. Evaluación de la Proliferación y Marcadores de Citocinas Intracelulares Mediante Citometría de Flujo [0627]Células T pan marcadas con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) procedentes de estudios de MLR, tal como se describe anteriormente, que habían sido incubadas durante 4 días en presencia de moléculas ECD-Fc de ICOSL de tipo silvestre o variantes recombinantes, se evaluaron adicionalmente para determinar los niveles de citocinas mediante reestimulación con acetato de forbol miristato (PMA)/ionomicina durante 6 horas, en presencia de un inhibidor del aparato de Golgi (Golgi/Block/Plug). También se volvió a estimular a las células T del estudio MLR que habían sido incubadas con IgG humana, anti-CD28, anti-ICOSL, PD-L2-Fc o Belatacept (CTLA4-Fc con mutaciones L104E y A29Y). Las células T se tiñeron para los marcadores de superficie CD4 o CD8, se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron intracelularmente para diversas citocinas, tal como se establece en las Tablas 24 y 25.
[1433] El porcentaje (%) de células T CD4+ y CD8+ que fueron positivas para citocinas intracelulares específicas se muestran en la Tabla 24, respectivamente. Los resultados mostraron que varias de las variantes de las moléculas ICOSL ECD-Fc eran capaces de suprimir una o más citocinas, incluyendo, en algunos casos, la mayoría de las citocinas. Se calculan una puntuación total y una puntuación media para evaluar la suma de los efectos de las moléculas individuales probadas sobre los parámetros examinados en este ensayo. También se evaluó la proliferación y en las Tablas 24 y 25 se muestra el porcentaje de células que se han dividido, determinado mediante dilución con CFSE. Entre los resultados proporcionados, los resultados muestran que ciertas variantes muestran una actividad comparable o mejor que Belatacept, en particular a partir de las células CD8+.
[1434]
[1435]
[1439]
[1442] EJEMPLO 16
[1443] Evaluación de la Producción de Citocinas en el Co-cultivo de Células B-T
[1444] [0629]Se purificaron células B y células T CD4+ del mismo donante y se marcaron con CSFE y se colocaron en placas de 96 pocillos en proporciones celulares 1:1 a 5 x 10<4>células de cada una por pocillo. Se añadieron moléculas de fusión ICOSL ECD-Fc variantes o Belatacept a una concentración final de 40nM por pocillo. Las células se dejaron sin estimular o se incubaron con 100 ng/mL de enterotoxina de estafilococo B (SEB), 1 µg/mL de mitógeno de Pokeweed (PWM) o ambos durante 7 días a 37°C en un volumen final de 200 µl/pocillo.
[1446] Las células fueron cosechadas y teñidas en superficie para los siguientes marcadores de linaje de células B y T (IgM, IgD, CD38, CD138, CD27, CD19, CD4, CD3). La proliferación se evaluó mediante citometría de flujo y los sobrenadantes de cultivo se analizaron en busca de citocinas IL-5, IL-13 o IL-21 utilizando un kit de detección de citocinas Th humanas LEGENDplex (Biolegend, EE.UU.).
[1448] Como se muestra en la FIG.6A,el número de células B en división se redujo en los cocultivos de células B/T cuando se incubaron en presencia de moléculas de fusión Fc ICOSL ECD variantes en comparación con los controles sin proteínas. El grado de efecto antagonista de las variantes ejemplares probadas fue similar al de CTLA-4-Ig Belatacept (L104E, A29Y). Asimismo, como se muestra en lasFIGS.6B-6D,las moléculas de fusión Fc de la variante ICOSL ECD inhibieron la producción de citocinas en cocultivos primarios de células B y células T humanasin vitroen comparación con los controles sin proteína, así como con los cultivos que contenían el control ICOSL de tipo silvestre. En comparación con Belatacept, las moléculas de fusión Fc ICOSL ECD variantes probadas fueron más eficaces para bloquear la producción de citoquinas en algunos casos.
[1450] EJEMPLO 17
[1452] Evaluación de la supervivencia y la actividad de la enfermedad en un modelo de enfermedad de injerto contra huésped (GvHD)
[1454] Se evaluó la actividad de la proteína ECD-Fc variante ICOSL ejemplar en un modelo de enfermedad de injerto contra huésped (GvHD). Se irradiaron ratones NSG hembra (n = 10 por grupo) (100 rad) y se les administraron 10 mg de gammaglobulina por vía subcutánea el Día -1. El día 0, los ratones recibieron 10 millones de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) y una inyección intraperitoneal de 100µg de ECD Fc WT-ICOSL, una molécula de ECD Fc ICOSL variante N52H/I143T (ECD establecida en SEQ ID N.º: 135), una variante ICOSL ECD Fc molécula N52H/N57Y/Q100P (ECD establecido en SEQ ID N.º: 113), 75µg de Belatacept (CTLA-4-Ig L104E/A29Y; Número de Publicación de la Solicitud de Patente US20160271218) o solución salina como control. El día 15, las células CD45+ humanas injertadas fueron fenotipadas mediante citometría de flujo. Una vez finalizado el estudio el día 35, se evaluaron los criterios de valoración de la supervivencia, la pérdida de peso corporal y la actividad de la enfermedad.
[1456] La FIG.7Amuestra la supervivencia de ratones con GVHD tratados con solución salina, WT ICOSL-ECD Fc, las moléculas variantes ICOSL ECD-Fc o Belatacept. Se observó una diferencia significativa en la supervivencia de los ratones a los que se administró la variante ICOSL ECD- Fc N52H/N57Y/Q100P (ECD establecida en SEQ ID N.º: 113) en comparación con los ratones administrados con solución salina o WT ICSOL ECD-Fc (p <0,0001 mediante las pruebas de Mantel-Cox y Gehan-Breslow-Wilcoxon). LaFIG. 7Bmuestra diferencias similares entre la pérdida de peso corporal de los ratones tratados con solución salina, WT ICOSL ECD- Fc, la variante ICOSL ECD-Fc moléculas, o Belatacept en el transcurso del estudio.
[1458] Se determinó un índice de actividad de la enfermedad (DAI) tres veces por semana durante el estudio y se evaluó la puntuación de la pérdida de peso, la postura, la actividad, el aspecto de la capa de pelo y la piel de los ratones. El grado de la enfermedad a lo largo del estudio se muestra en laFIG. 7C. Los grupos de tratamiento que recibieron ICOSL Fc variante N52H/N57Y/Q100P (ECD establecido SEQ ID N.º: 113) o Belatacept mostraron una mejora significativa en las puntuaciones del DAI. El porcentaje de células T humanas en la sangre periférica el día 14 del estudio también se evaluó mediante citometría de flujo. Las mediciones se promediaron por grupo de tratamiento y las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). LaFIG.7Dmuestra el porcentaje de células CD3+/CD4+ o CD3+/CD8+ vivas en la sangre. Los grupos de tratamiento que recibieron la variante ICOSL ECD Fc con N52H1N57Y/Q100P (ECD establecido SEQ ID N.º: 113) o Belatacept mostraron niveles significativamente diferentes de células T CD4+ en comparación con el grupo de tratamiento salino (p = 0,008 y 0,006, respectivamente, mediante la prueba t no apareada). Este estudio demuestra el efecto terapéutico de la variante de la proteína ICOSL Fc sobre las células T primarias humanas y la GVHD durante el modeladoin vivo.
[1460] [0635]Se llevó a cabo un estudio similar con moléculas de fusión ICOSL ECD-Fc variantes adicionales, incluyendo la variante ICOSL ECD- Fc N52H/N57Y/Q100R/C198R (ECD establecida en SEQ ID N.º: 365), N52H/N57Y/Q100R/F172S(ECD establecido en SEQ ID N.º: 291), y N52H/N57Y/Q100P (ECD establecido en SEQ ID N.º: 288). N52H/Q100R (ECD establecido en SEQ ID N.º: 285), que presentaba una actividad reducida en los estudios de MLR in vitro como se ha mostrado anteriormente, también se probó. Los ratones NSG (n=9/grupo) fueron tratados como se ha descrito anteriormente. En este estudio, la dosificación con el ICOSL-Fc o Belatacept continuó 3 veces por semana desde el día 0 hasta el día 37 y los ratones supervivientes fueron eliminados en el día 49. Para determinar las diferencias estadísticas en las proporciones de supervivencia entre los grupos, los datos se analizaron mediante la prueba de Mantel-Cox (log-rank). Las curvas de supervivencia resultantes se muestran en laFIG.7E.Belatacept y las variantes de ICOSL-Fc N52H/N57Y/Q100R/C198R (ECD establecido en SEQ ID N.º: 365), N52H/N57Y/Q100R/F172S (ECD establecido en SEQ ID N.º: 291), y N52H/N57Y/Q100P (ECD establecido en SEQ ID N.º: 288) prolongaron significativamente la supervivencia en comparación con la solución salina y WT ICOSL-Fc (p<0,001). Se trazaron las puntuaciones medias del DAI para el transcurso temporal del experimento, con la última observación (es decir, las puntuaciones medias recogidas en los días de finalización) adelantada en el gráfico para los grupos finalizados antes del último día de estudio previsto (día 49). Las diferencias significativas entre los grupos para los datos a lo largo del tiempo (es decir, las puntuaciones DAI) se determinaron utilizando ANOVA de medidas repetidas de 2 vías para los efectos del "tratamiento". Las puntuaciones DAI resultantes se muestran en laFIG. 7F.Belatacept y las variantes de ICOSL-Fc N52H/N57Y/Q100R/C198R (ECD establecido en SEQ ID N.º: 365), N52H/N57Y/Q100R/F172S (ECD establecido en SEQ ID N.º: 291), y N52H/N57Y/Q100P (ECD establecido en SEQ ID N.º: 288) redujo significativamente las puntuaciones DAI en comparación con la solución salina y WT ICOSL-Fc (p<0,001), y entre Belatacept y la variante ICOSL-Fc con N52H/N57Y/Q100R/C198R mediante ANOVA de 2 vías para las puntuaciones DAI (p = 0,035).
[1461] La actividad de la variante ICOSL-Fc, en algunos casos, mejoró en comparación con el tratamiento con belatacept. La administración de variantes de ICOSL-Fc protegió de los efectos de la GVHD, como demuestra la mejora de la supervivencia y la atenuación del desarrollo de la enfermedad, a niveles comparables o mejores que los de belatacept. La actividad en este modelo se correlacionó con la actividad in vitro, ya que WT ICOSL-Fc y la variante ICOSL-Fc con las mutaciones N52H/Q100R (ECD establecida en SEQ ID N.º: 285) no fueron tan eficaces en este modelo.
[1462] EJEMPLO 18
[1463] Evaluación de la Activación por Moléculas Apiladas
[1464] Se generaron y evaluaron proteínas de fusión IgV Fc variantes apiladas que contenían un dominio IgV NKp30 como dominio localizador (designado "L") y un dominio IgV ICOSL como dominio costimulador (designado "C") sustancialmente como se describe en el Ejemplo 8. En concreto, los constructos que se prueban en este experimento incluyen: (1) una construcción apilada con proteína de fusión IgV Fc variante (vIgD C-L) que contiene un NKp30 compuesto de Ig de la variante NKp30 consenso (SEQ ID N.º:143) con el dominio IgV de la variante ICOSL N52H/N57Y/Q100P (ECD establecido en SEQ ID N.º: 113 e IgV establecidos en SEQ ID N.º:201); (2) una construcción apilada con el dominio Ig de NKp30 de tipo silvestre (SEQ ID N.º:214) y el dominio V de ICOSL de tipo silvestre (WT C-L) (SEQ ID N.º:196); (3) una construcción con el dominio IgV de ICOSL de tipo silvestre (dominio WT C; SEQ ID N.º:196), y (3) una construcción con el dominio NKp30 de tipo silvestre (dominio WT L; SEQ ID N.º: 214).
[1465] Las células CD32+ K562 fueron modificadas genéticamente para expresar de forma estable B7-H6 en la superficie celular. A continuación, las células se trataron con mitomicina y se colocaron en placas con células T pan en presencia o ausencia de 10 nM de anti-CD3 y variantes apiladas o dominios de control a 100, 33, 11 o 3,7 nM. Las células se cultivaron 3 días antes de recoger los sobrenadantes de cultivo y medir los niveles de IFN-gamma humano mediante un ELISA.
[1466] Como se muestra en la FIG.8A,tanto la variante como el tipo silvestre de dominios de localización costimuladora fueron capaces de localizarse en las células K562 modificadas genéticamente y emitir una señal coestimuladora a las células pan-T para inducir la secreción de IFN-gamma. La construcción apilada con proteína de fusión IgV Fc variante (vIgD C-L) mostró resultados de actividad funcional aumentada en todas las concentraciones probadas, mientras que los componentes de dominio individuales no tuvieron ningún efecto cuando no se combinaron entre sí.
[1467] EJEMPLO 19
[1468] Evaluación de la Hipersensibilidad de Tipo Retardado in vivo
[1469] Se evaluó la actividad antiinflamatoria in vivo de las moléculas de fusión ICOSL ECD-Fc variantes en el modelo de hipersensibilidad retardada (DTH) en ratón. Se provocaron reacciones inmunitarias de hipersensibilidad retardada en ratones sensibilizados a la ovoalbúmina (OVA) y se evaluó la respuesta tras la provocación. Las moléculas de fusión ICOSL ECD-Fc variantes probadas contenían una ECD variante con las siguientes sustituciones de aminoácidos: N52H/N57Y/Q100P (ECD establecido en SEQ ID N.º: 113), N52H/Q100R (ECD establecido en SEQ ID N.º: 285), o N52H/N57Y/Q100R/F172S (ECD establecido en SEQ ID N.º: 291). Las variantes se fusionaron a una columna vertebral Fc que contenía las mutaciones C220S/L234A/L235E/G237A por numeración UE (designada Fc#1) establecidas en SEQ ID N.º: 477) o una columna vertebral Fc que contiene las mutaciones C220S/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K por numeración UE (designada Fc#2) expuestas en SEQ ID N.º:478) con o sin un G4S (GGGGS; SEQ ID N.º: engarce El cuadro 26 presenta los constructos probados:
[1470]
[1472] Para la sensibilización, se inyectaron ratones BALB/c hembras de 8 semanas de edad por vía subcutánea con 100µg de OVA emulsionado en adyuvante Sigma (100µL; número de catálogo S6322-1VL) en la base de la cola el día 0. Los días 1 y 4, se administró a los ratones la variante de las proteínas de fusión ICOSL ECD-Fc, 75 µg de CTLA-4 Fc (abatacept), o PBS como control negativo mediante inyección intraperitoneal. El día 7, dos o tres horas antes de la provocación con OVA, se administró a los ratones PBS como control, 75µg de CTLA-4 Fc (abatacept de Orencia) o la variante indicada del polipéptido ICOSL mediante inyección intraperitoneal. Abatacept y las moléculas de fusión ICOSL-Fc variantes se dosificaron en equivalentes molares.
[1473] Para la provocación con OVA, se administró una inyección intradérmica de 10µg de OVA en el pabellón auricular izquierdo en un volumen de 10 µL de PBS bajo anestesia de gas isoflurano 2 - 3 horas después del tratamiento terapéutico. Se midió el grosor basal de la oreja antes de la provocación con OVA.
[1474] El día 8, se midió el grosor de la oreja bajo anestesia de isoflurano usando calibradores Mitutoyo y se determinó el cambio en el grosor de la oreja antes y después de la provocación con OVA. Como se muestra en laFIG.9,los ratones tratados con la variante indicada de moléculas de fusión ICOSL ECD-Fc mostraron una hinchazón de orejas inducida por OVA significativamente menor en comparación con el control PBS (< 0,0001 por ANOVA de 1 vía). No hubo diferencias significativas entre el grosor de las orejas de los ratones tratados con abatacept en comparación con cualquiera de las moléculas de fusión ICOSL ECD-Fc variantes indicadas probadas o entre los tratamientos ICOSL variantes. Estos resultados demuestran que las moléculas ICOSL variantes pueden reducir las respuestas inmunitariasin vivo.
[1475] EJEMPLO 20
[1476] Generación y Evaluación de la Unión y la Actividad de Moléculas Variantes del Dominio IgSF de ICOSL [0644]Se generaron moléculas variantes adicionales que contienen dominio ICOSL IgSF (por ejemplo, ECD), como se describe a continuación. En cada una de las Tablas siguientes, la Tabla indica las sustituciones de aminoácidos en el ECD de la variante ICOSL tal como se designa por el número de posición de aminoácidos correspondiente a las posiciones de aminoácidos en la respectiva secuencia de dominio extracelular (ECD) ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificada) establecida en SEQ ID N.º:32. En algunos casos, la eliminación de la secuencia enlazadora AAA de la variante ICOSL ECD-Fc se indica mediante "ΔAAA". La columna 2 establece el identificador de la SEQ ID N.º para cada dominio ECD variante contenido en la molécula de fusión ECD-Fc variante.
[1477] A. Generación de Variantes Adicionales
[1478] 1. Variantes de Solubilidad
[1479] De una colección de mutantes que contenían las siguientes mutaciones incluyendo E16V, N30D, K42E, N52H, N52Y, N52S, N57Y, E90A, Q100R, Q100P, L102R, V110D, H115R, F120S, V122A, F138L, 1143V, 1143T, H152C, K156M, F172S, N194D, C198R, L203P, R221I, 1224V, las mutaciones H115R, F172S y C198R se identificaron como mutaciones que potencialmente pueden aumentar la solubilidad de la proteína o aumentar su expresión ('mutaciones de solubilidad"). Estas tres mutaciones (H115R, F172S y C198R) se introdujeron aleatoriamente mediante mutagénesis dirigida al sitio en el mismo conjunto de clones para generar una colección de derivados que contienen una o más de estas mutaciones de solubilidad. Dado que la reacción de mutagénesis dirigida al sitio se llevó a cabo con oligos mutagénicos agrupados que reaccionaron con clones parentales agrupados en una única reacción, algunos de los clones también contienen algunas mutaciones de otros clones parentales. Las variantes generadas contenían entre 3 y 10 mutaciones aminoacídicas diferentes en diversas combinaciones, como se resume en la Tabla 27A.
[1480]
[1481] 2. Variantes Revertidas
[1483] Mutaciones ejemplares particulares incluyendo N52H, N52Y, N57Y, Q100R, Q100P, F138L, C198R, L203P identificadas en variantes selectas descritas en el Ejemplo 6 se combinaron adicionalmente en el ECD del ICOSL de referencia (por ejemplo, de tipo silvestre) con referencia a posiciones establecidas en SEQ ID N.º:32 para generar variantes de combinación adicionales. Las variantes generadas contenían entre 1 y 3 mutaciones de aminoácidos diferentes en diversas combinaciones, como se indica en la Tabla 27B.
[1486]
[1489] 3. Variantes de Glicosilación
[1491] Mutaciones de glicosilación ejemplares seleccionadas de N52H, N52Q, N84Q, N119Q, N155H, N155Q, N168Q, N207Q se combinaron en diversas permutaciones en el ECD del ICOSL de referencia (por ejemplo, de tipo silvestre) con referencia a posiciones establecidas en SEQ ID N.º:32 para generar variantes de combinación adicionales. Las variantes generadas contenían entre 1 y 5 mutaciones de aminoácidos diferentes en diversas combinaciones, como se indica en la Tabla 27C. Las mutaciones designadas con una "X" indican una N o una Q en la posición indicada.
[1492]
[1493] continuación
[1496]
[1498] B. Unión a Contraestructuras Expresadas por Células
[1499] Las variantes adicionales se formatearon como proteínas de fusión Fc como se describe en el Ejemplo 4. Las moléculas de fusión Fc variantes se evaluaron en estudios de unión para valorar la especificidad y la afinidad de las proteínas inmunomoduladoras variantes del dominio ICOSL por los socios de unión afines. Las células Expi293 transfectadas con socios de unión afines, CD28 humano, ICOS y CTLA4, se utilizaron en estudios de unión como se describe en el Ejemplo 6. Se determinó la IMF para cada transfectante y se comparó con la correspondiente ECD-Fc no modificada (parental).
[1500] Los resultados de la unión para moléculas de fusión ICOSL ECD-Fc variantes ejemplares se muestran en las Tablas 28A-C. Como se muestra en la Tabla 28A-C, las variantes del dominio IgSF de ICOSL (por ejemplo, ECD) generadas con las diversas combinaciones de mutaciones específicas mostraron un aumento de la unión para al menos un ligando de contraestructura afín, y en algunos casos más de uno.
[1501] C. Caracterización de la Bioactividad con Ensayo de Coimmovilización anti-CD3
[1502] La bioactividad coestimuladora de las moléculas de fusión Fc variantes generadas también se evaluó en ensayos de coimmovilización anti-CD3 como se describe en el Ejemplo 6. La Tabla 28A-C muestra la proporción de IFN-gamma producida por cada variante de ECD-Fc comparada con la correspondiente ECD-Fc ICOSL no modificada (tipo silvestre) en el ensayo. Las mutaciones designadas con una "X" indican una Q o el residuo de tipo silvestre correspondiente a la posición indicada de SEQ ID N.º: 32 en la posición indicada. Como se ha demostrado, las moléculas de fusión Fc variantes generadas mostraron actividades mejoradas para aumentar la actividad inmunológica.
[1505]
[1506] continuación
[1507]
[1508] (continuación)
[1509]
[1510]
[1511] continuación
[1512]
[1513] continuación
[1514]
[1515]
[1516] continuación
[1517]
[1518] EJEMPLO 21
[1519] Generación y Evaluación de Moléculas de Fusión con Anticuerpo Dirigido a HER2
[1520] Este Ejemplo describe la generación y evaluación de moléculas de fusión ICOSL ECD-Fc variantes conjugadas con un agente dirigido a tumores para formar un conjugado ("conjugado vIgD").
[1521] Sólo el dominio V de la vIgD de ICOSL (N52H/N57Y/Q100P; establecido en SEQ ID N.º: 201) a los extremos amino y carboxilo de la cadena ligera(FIG. 10A)y la cadena pesada(FIG. 10B)de un anticuerpo HER2 con enlaces GGGSGGGS intercalados. En laFIG.se muestran configuraciones ejemplares de conjugados de vIgD.10C.
[1522] Para evaluar la unión de HER2, el DNA de HER2 o transfectantes Expi293 simulados se tiñeron con cantidades tituladas de un anticuerpo dirigido a HER2 que contenía el conjugado ICOSL variante (conjugado vIgD N52H/N57Y/Q100P) a una concentración de 100pM a 100nM. También se analizaron las proteínas de control, incluida la fusión ECD-Fc de ICOSL de tipo silvestre, la fusión IgV-Fc de PD-L2 de tipo silvestre y la molécula de fusión ECD-Fc de ICOSL variante con mutaciones en N52H/N57Y/Q100P. Se determinó la intensidad de fluorescencia media (IFM) o el porcentaje de células positivas para cada transfectante, tal como se describe en el Ejemplo 6. Todos los conjugados IgSF generados como se muestra enlas FIG 11A-11Bretuvieron la unión a HER2 en comparación con el nivel endógeno de expresión de HER2 observado en las células Expi293. Del mismo modo, los conjugados vIgD también mostraron unión a socios de unión afines de ICOSL, incluidos CD28, CTLA-4 e ICOS.
[1523] La bioactividad de la proteína y la proliferación de ensayos in vitro de células T primarias humanas también se caracterizaron como se describe en el Ejemplo 6. Los conjugados vIgD se unieron durante la noche a placas de 96 pocillos a 30-0,1nM en presencia de 10nM anti-CD3. Se lavaron las placas y se añadieron 100.000 células pan T marcadas con CFSE a las placas y se incubaron durante 72 horas. Los niveles de IFN gamma en el sobrenadante se analizaron mediante ELISA. Como se muestra en laFIG. 12,los conjugados vIgD con las configuraciones indicadas mostraron una mayor secreción y proliferación de IFN gamma en comparación con el conjugado de molécula de fusión ICOSL ECD-Fc de tipo silvestre parental.
[1524] EJEMPLO 22
[1525] Firma Transcripcional Nanostring de Células T Humanas Primarias
[1526] Las placas de cultivo tisular se recubrieron con 10 nM anti-CD3 con 40 nM de una proteína Fc-control, ICOSL-Fc de tipo silvestre, CD80-Fc de tipo silvestre, ambas proteínas, o proteínas de fusión Fc ICOSL variantes con mutaciones como se indica. A continuación, las células T humanas purificadas se sembraron en las placas recubiertas de proteínas y se incubaron a 37 °C. Los cultivos de cada grupo de tratamiento descrito anteriormente se cosecharon a las 24, 48 y 72 horas y se preparó RNA total a partir de cada muestra celular. El RNA se transfirió a Nanostring y se utilizó un chip Cancer Immune para cuantificar los transcritos de 750 genes en cada muestra. Los valores de transcripción se normalizaron utilizando el software patentado de Nanostring, lo que permitió comparar los niveles de transcripción entre los grupos de tratamiento y en los distintos puntos temporales. Como se muestra en laFIG.18yFIG.19,los polipéptidos ECD-Fc ICOSL variantes probados muestran una actividad inflamatoria alterada en comparación con el ECD-Fc CD80 de tipo silvestre, el ECD-Fc ICOSL de tipo silvestre o una combinación de ambos.
[1527] EJEMPLO 23
[1528] Generación y Evaluación de Moléculas de Fusión con Anticuerpo Dirigido a HER2
[1529] También se caracterizó la proliferación de células T humanas co-cultivadas con VmAbs y células diana que expresan HER2. Se estimularon células pan T marcadas con CFSE durante 72 horas con células diana artificiales derivadas de K562 que mostraban Fv de cadena simple anti-CD3 (OKT3) y HER2 en la superficie celular en presencia de VmAbs o proteínas de control. La proliferación se midió mediante análisis de citometría de flujo de la dilución de CFSE en células T teñidas con CD4<+>o CD8<+>. Los Vmabs se ensayaron variando el número de células diana o la concentración del VmAb utilizado. En el primer ensayo, las células diana K562 se valoraron de 2500 a 78 células/pocillo y se añadieron a 100.000 células T para un intervalo efector:diana (E:T) de 40 a 1280:1. Los VmAbs, el dominio IgSF parental o el ICOSL WT se añadieron a 1000pM. En el segundo ensayo, se añadieron células diana K562 a razón de 625 células/pocillo por cada 100.000 células T, lo que supone una proporción efector:diana de 160:1. Se valoraron los VmAbs o las proteínas de control y se añadieron entre 3000 y 37pM. Como se muestra en laFIG. 20Ay20B,ambas configuraciones del ensayo demuestran que los VmAbs que contienen el conjugado vIgD proporcionan una proliferación superior en comparación con el anticuerpo parental, el dominio IgSF parental o el ICOSL WT. Además, los conjugados vIgD mediaron la proliferación a bajas relaciones E:T (1280: 1) o a bajas concentraciones de proteínas (37pM).
[1530] EJEMPLO 24
[1531] Generación y evaluación de células modificadas genéticamente que expresan una proteína inmunomoduladora transmembrana y un receptor de células T
[1532] Este Ejemplo describe la expresión de diversas variantes de proteínas inmunomoduladoras transmembrana (TIPs) que contienen dominio IgSF de ICOSL con un receptor de células T (TCR) específico de E6 recombinante ejemplar en células T humanas y la evaluación de la proliferación de células T.
[1534] Las células T humanas HLA-A2+ se activaron el día 0 con perlas de activación anti-CD3/anti-CD28 (ThermoFisher Scientific, EE.UU.) y se transdujeron, el día 1, con un TCR específico del VPH E6 (descrito en documento WO 2015/009606) y varias proteínas inmunomoduladoras transmembrana (TIP) que contenían una variante del dominio ICOSL IgSF. Las ICOSL-TIP ejemplares tenían un dominio IgSF modificado por afinidad que contenía mutaciones de aminoácidos correspondientes a E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R o N52H/N57Y/Q100R con referencia a posiciones en el dominio extracelular ICOSL establecido en SEQ ID N.º: 32. Las TIP de ICOSL también incluían un dominio transmembrana y citoplasmático correspondiente a los residuos 257-302 de SEQ ID N.º: 5. A modo de comparación, las células T también se transdujeron conjuntamente con el TCR E6 del VPH y un CD80-TIP WT (establecido como aminoácidos 35-288 de SEQ ID N.º: 1 y codificada por la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID N.º:251) o una ICOSL-TIP WT (establecida como los aminoácidos 19-302 de SEQ ID N.º:5 y codificada por la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID N.º:252). Para la transducción, las células se transducían con una construcción de vector viral en la que se insertaba un polinucleótido que codificaba el TIP y las secuencias de las cadenas TCRα y TCRβ, cada una separada de la otra por una secuencia que codificaba una secuencia de omisión del ribosoma P2A (SEQ ID N.º: 863), para la coexpresión del TIP y del TCR que contiene la cadena TCRα y TCRβ en las células modificadas genéticamente. En concreto, la construcción de ácido nucleico tenía la siguiente estructura: ICOSL - P2A1 - TCRβ - P2A2 - TCRα, en la que la secuencia de nucleótidos P2A1 y P2A2 codificaban cada una el P2A establecido en SEQ ID N.º: 863 pero diferían en la secuencia de nucleótidos para evitar la recombinación entre secuencias.
[1536] Como control, las células T fueron transducidas en simulacro o transducidas sólo con el TCR E6 ejemplar.
[1538] Las perlas de activación de células T se retiraron el día 3 y se añadieron al cultivo las citocinas IL-2, IL-7 e IL-15. El día 6 después de la transducción, se evaluó la expresión en la superficie celular del TIP y el TCR mediante citometría de flujo, con un 35-65% de células modificadas genéticamente doblemente positivas para el TCR y el TIP. Las células que expresaban el TCR se expandieron en presencia del péptido E6 del VPH para dar lugar a una población de células que eran >90% doblemente positivas para el TCR/TIP según se evaluó el día 14. El día 14, las células modificadas genéticamente se incubaron con células infectadas por el VPH, bien una línea celular de carcinoma de células escamosas UPCI:SCC152 (ATCC<®>CRL-3240<™>; HPV+, HLA-A2+), células de carcinoma epidermoide CaSki (ATCC<®>N.º CRL-1550<™>; HPV+, HLA-A2+), o células de carcinoma de células escamosas SiHa (ATCC<®>HTB-35<™>; HPV+, HLA-A2-). La proliferación de las células modificadas genéticamente se evaluó el día 3 tras el inicio del co-cultivo con las células diana. Como se muestra en laFIG.21,se observó un aumento de la proliferación de células T modificadas genéticamente con el TCR E6 en las dos líneas celulares VPH+, pero no de forma significativa en la línea SiHa VPH-. Las células modificadas genéticamente que coexpresaban la variante ICOSL TIPS presentaban una mayor proliferación en respuesta a las líneas celulares diana HLA-A2+HPV+ SCC152 y Caski.
[1540] EJEMPLO 25
[1542] Generación y Evaluación de Proteínas Inmunomoduladoras de Fusión Fc
[1544] Las moléculas variantes que contienen dominio ICOSL IgSF (por ejemplo ECD) se formatearon como proteínas de fusión Fc sustancialmente como se describe en el Ejemplo 4, excepto usando diversos enlazadores y moléculas Fc. Para generar proteínas inmunomoduladoras que sean proteínas de fusión Fc que contengan un ECD de ICOSL con al menos un dominio modificado por afinidad (por ejemplo, variante ICOSL ECD-Fc), se generó la molécula de ácido nucleico codificante para codificar una proteína diseñada como sigue: ECD variante (mutante) unido directa o indirectamente mediante un enlazador a un Fc IgG1 humano inerte. En concreto, las proteínas inmunomoduladoras generadas no contenían un enlazador (ninguno) o contenían un AAA o un G4S (SEQ ID N.º: engarce La IgG1 Fc humana inerte contenía las siguientes mutaciones, según la numeración de la UE: C220S/R292C/N297G/V302C (SEQ ID N.º: 476), C220S/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K (SEQ ID N.º: 478), C220S/L234A/L235E/G237A (SEQ ID N.º: 477), o sus alotipos. La sustitución C220S se incluyó porque las proteínas resultantes no incluyen una cadena ligera de anticuerpos que pueda formar un enlace covalente con una cisteína. Las proteínas de fusión Fc variantes recombinantes se produjeron en células 293 y se purificaron con Proteína A sustancialmente como se describe en el Ejemplo 5.
[1546] Las proteínas inmunomoduladoras de fusión Fc ICOSL variantes se evaluaron en estudios de unión para evaluar la unión para socios de unión afines. Las células Expi293 transfectadas con socios de unión afines, CD28 humano, ICOS y CTLA4, se utilizaron como células diana en estudios de unión como se describe en el Ejemplo 6. Se determinó la IMF de unión de las proteínas inmunomoduladoras de fusión ICOSL Fc variantes para la célula diana que expresaba cada socio de unión y se comparó con la unión de la correspondiente ICOSL ECD-Fc no modificada (tipo silvestre) a las mismas células diana. También se determinó la modulación de la actividad de células T por las proteínas inmunomoduladoras de fusión Fc ICOSL variantes utilizando una reacción linfocitaria mixta (MLR) sustancialmente como se describe en el Ejemplo 6.
[1548] [0663]Los resultados para la unión de proteínas inmunomoduladoras de fusión ICOSL ECD-Fc variantes ejemplares que contienen diversos enlazadores y regiones Fc se muestran en la Tabla 29. La Tabla indica las sustituciones de aminoácidos en el ECD de la variante de ICOSL, designadas por el número de posición de aminoácido correspondiente a las posiciones de aminoácido en la respectiva secuencia de dominio extracelular (ECD) de ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificada) establecida en SEQ ID N.º:32. La columna 1 también establece el identificador de la SEQ ID N.º para cada dominio ECD variante contenido en la fusión Fc ICOSL variante. La columna 2 indica el enlazador utilizado en la proteína de fusión Fc y el identificador de la SEQ ID N.º del enlazador. La columna 3 establece las mutaciones en el Fc por numeración UE y el identificador de la SEQ ID N.º para el Fc contenido en la proteína de fusión Fc ICOSL variante.
[1550] Como se muestra en la Tabla 29, se observaron resultados similares para la unión a socios de unión afines entre las proteínas de fusión Fc ICOSL variantes probadas. Estos resultados indican que el formato de la fusión Fc con diferentes moléculas Fc o diferentes enlazadores no impactó en la unión de las variantes del dominio IgSF de ICOSL para su compañero de unión cognado. Además, todos los formatos de fusión Fc, cuando se suministraron como moléculas Fc bivalentes en solución en una reacción MLR, mostraron actividad antagonista para disminuir la activación de células T en comparación con la molécula ECD-Fc de referencia (por ejemplo, no modificada o de tipo silvestre) que no contenía la sustitución de aminoácidos. En algunos casos, no se midió IFN-gamma detectable en el sobrenadante, lo que concuerda con el bloqueo completo de las interacciones de los ligandos costimuladores con sus ligandos para inducir la secreción de IFN-gamma.
[1553]
[1554] (continuación)
[1557]
[1559] EJEMPLO 26
[1560] Expresión de Moléculas ICOSL Variantes en Células CHO
[1561] Como alternativa a la expresión de proteínas de fusión Fc ICOSL variantes en células Expi293 como se describe en el Ejemplo 5, se utilizaron células de ovario de hámster chino en suspensión (ExpiCHO-S) para producir diversas moléculas ICOSL. Una construcción de DNA que codifica la variante ejemplar ICOSL IgSF (por ejemplo ECD) de proteínas de fusión Fc que contiene la variante (mutante) ECD N52H/N57Y/Q100R/F172S (SEQ ID N.º:291) unida a una Fc inerte que contiene las mutaciones C220S/L234A/L235E/G237A por numeración UE establecidas en SEQ ID N.º: 477 o un alotipo del mismo que figura en SEQ ID N.º: 637, con un enlazador GSGGGGS (SEQ ID N.º: 635) para transfectar las células.
[1562] las células expicho-s, y los reactivos para la transfección utilizando el sistema de expresión expicho™, fueron adquiridos de thermofisher scientific (cat #a29133). Las células se descongelaron y se expandieron según el protocolo recomendado por el fabricante. Tras al menos 2 pases, las células se dividieron 24 horas antes de la transfección y se dejaron expandir hasta alcanzar una alta densidad. A continuación, se diluyeron las células hasta alcanzar el número de células para la transfección, se formó el complejo de DNA con el reactivo ExpiFectamine<™>CHO y se añadió a las células. Un día después de la adición del complejo de DNA, se añadieron al cultivo el pienso ExpiCHO<™>y el potenciador de CHO ExpiFectamine<™>, que se colocó en una incubadora a 32 grados C. Se controlaron la viabilidad y la masa celular y se cosechó el cultivo cuando la viabilidad cayó por debajo del 80%. A continuación, el cultivo se centrifugó a baja velocidad para eliminar el sedimento celular, y el sobrenadante aclarado se filtró estérilmente 0,2 um. La proteína se purificó como se describe en el Ejemplo 5.
[1563] A. Análisis de Proteínas
[1564] [0667]La variante purificada de la proteína de fusión ICOSL Fc se procesó en SDS-PAGE y se analizó mediante tinción de proteínas. Se observaron múltiples bandas en células producidas a partir de células CHO, pero no a partir de células 293, lo que concuerda con la observación de que se producía un recorte por proteólisis del ICOSL cuando se expresaba en células CHO. La Tabla 30A muestra el peso molecular de las proteínas intactas, de clip simple y de clip doble, calculado a partir de las secuencias de aminoácidos y carbohidratos potenciales observados por SDS-PAGE. Se observó la proteólisis de las proteínas de fusión Fc ICOSL expresadas en células derivadas de ExpiCHO-S, como indica la presencia de especies recortadas reducidas/no reducidas con un peso molecular inferior (recorte simple y doble). Basándose en el tamaño de las bandas observadas y en el análisis de espectrometría de masas, estos resultados concuerdan con un posible sitio de escisión en la ECD de ICOSL correspondiente a la secuencia LQQN/LT ("/" indica posible sitio de escisión), lo que da lugar a la escisión antes de la región peduncular de la ECD y a la eliminación de la porción Fc de la secuencia en una o ambas cadenas de la proteína de fusión Fc. La escisión por proteasa observada puede dar lugar a un producto proteico heterogéneo cuando se produce en células CHO. Además, en el caso de los formatos expresados como proteínas inmunomoduladoras transmembrana, la escisión por proteasas, que se produce en determinadas células, podría dar lugar a la liberación de proteína soluble de las células, reduciendo así las formas expresadas en la superficie celular de la proteína variante en las células modificadas genéticamente.
[1567]
[1570] EJEMPLO 27
[1572] Generación de Variantes Resistentes a la Proteólisis de Moléculas que Contienen el Dominio IgSF de ICOSL
[1574] Para hacer que los polipéptidos ICOSL variantes sean resistentes a la proteólisis tras la expresión en células, como en células CHO, se generaron varias formas adicionales de polipéptidos ICOSL variantes. Se generaron las siguientes secuencias de referencia modificadas adicionales del ECD ICOSL: (1) varios truncamientos ECD que carecen de todo o parte del sitio de corte de la proteasa LQQN/LT (designados Trunc #4, #5, #6, #7, o #8); (2) secuencias de referencia variantes ICOSL que contienen mutaciones en el sitio de corte N207 y/o L208 con referencia a las posiciones establecidas en SEQ ID N.º:32; o una secuencia de referencia IgV sola ICOSL que contiene el dominio IgV como único dominio IgSF de la molécula (establecida en SEQ ID N.º: 545, correspondiente a los aminoácidos 1-122 de SEQ ID N.º:32). En algunos casos, se emplearon combinaciones de las estrategias anteriores en una secuencia de referencia ICOSL ECD. En la Tabla 30B se presentan varias secuencias de referencia generadas.
[1576] Las mutaciones ejemplares N52H/N57Y/Q100R/F172S, con referencia a la numeración establecida en SEQ ID N.º: 32, se introdujeron en las distintas secuencias de referencia. Dado que la IgV ICOSL de referencia establecida en SEQ ID N.º: 545 no contiene una posición correspondiente a F172S, la variante ICOSL IgV no contenía la mutación F172S. Los polipéptidos ICOSL variantes generados se formatearon como una proteína de fusión Fc que contenía el dominio IgSF ICOSL de referencia generado unido mediante un enlazador (G<4>S)2 (SEQ ID N.º:229) a un Fc inerte que contenía las mutaciones C220S/L234A/L235E/G237A/K447del mediante la numeración UE establecida en SEQ ID N.º: 633, o un alotipo del mismo establecido en SEQ ID N.º:637.
[1577]
[1580] A. Evaluación de la Proteólisis
[1581] Las construcciones de DNA que codifican las moléculas de fusión Fc ICOSL variantes descritas anteriormente se transfectaron en células de ovario de hámster chino (ExpiCHO-S). A continuación, las proteínas de fusión Fc ICOSL se purificaron a partir de sobrenadantes con proteína A mediante cromatografía de afinidad como se describe en el Ejemplo 5. La proteína purificada se analizó mediante SEC analítica.
[1582] Por SEC, la proteína intacta se mostró como un solo pico mientras que la proteína recortada se mostró como múltiples picos, incluyendo especies de menor peso molecular. En consonancia con los resultados de SDS-PAGE descritos en el Ejemplo 26, se observó proteólisis evaluada por SEC cuando la variante de la proteína ICOSL ECD Fcfusión se expresó en células derivadas de ExpiCHO-S, como indican los múltiples picos mostrados en laFIG.22A.Como se muestra en lasFIGS.22B-22G,se observaron picos únicos mediante análisis SEC de las proteínas de fusión Fc ICOSL variantes generadas utilizando polipéptidos ICOSL de referencia modificados en los que se eliminó o mutó el sitio putativo de escisión de la proteasa ECD, lo que indica que se produjo una escisión reducida de las proteínas. En un lote de purificación, sin embargo, se observaron especies de menor peso molecular mediante análisis SEC de la proteína de fusión Fc ICOSL variante generada utilizando el polipéptido ICOSL de referencia establecido en SEQ ID N.º: 604 (Trunc. nº 5), aunque no estaba claro el motivo de la presencia de estas especies en este lote. Como se muestra en laFIG.22G,la generación de especies de menor peso molecular, y por tanto la proteólisis, tampoco se observó mediante el análisis SEC de las proteínas de fusión Fc ICOSL variantes generadas utilizando la secuencia de referencia ICOSL IgV sola.B. Unión y Actividad
[1583] Se comparó la unión y la actividad de la proteína producida y purificada tras la transfección de las construcciones de DNA que codifican las proteínas inmunomoduladoras de fusión Fc ICOSL variantes en varias secuencias de referencia descritas anteriormente en células CHO. En algunos casos, se descubrió posteriormente que los clones purificados evaluados a continuación contenían mutaciones adicionales a las descritas anteriormente, que no se creía que afectaran a la actividad inmunomoduladora de las proteínas analizadas.
[1584] Las proteínas inmunomoduladoras de fusión Fc ICOSL variantes purificadas resultantes se evaluaron para la unión a socios de unión afines y para la modulación de la actividad de células T utilizando una reacción linfocitaria mixta (MLR) sustancialmente como se describió anteriormente. La Tabla 30C indica las sustituciones de aminoácidos en la secuencia de referencia ICOSL, designadas por el número de posición de aminoácido correspondiente a las posiciones de aminoácido en la respectiva secuencia de dominio extracelular (ECD) ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificada) establecida en SEQ ID N.º: 32, y establece el identificador de la SEQ ID N.º para cada secuencia de referencia ICOSL. Como se muestra, la unión y la actividad antagonista de la MLR fueron en general similares para todos los formatos probados.
[1585]
[1587] C. Unión y Actividad de Proteínas Expresadas en Células 293 (Expi293) o CHO
[1588] Las proteínas de fusión Fc ICOSL variantes, generadas en base a las secuencias de referencia ICOSL descritas anteriormente, se evaluaron para la unión y la actividad tras la expresión en células 293 (Expi293) o CHO. Además, una construcción de DNA que codifica variantes ICOSL de dominio IgSF ejemplares N52H/N57Y/Q100R/C198R o N52H/Q100R, en secuencias de referencia ICOSL ejemplares según se establece en la Tabla 30D, también se unió a un Fc inerte que contenía mutaciones C220S/L234A/L235E/G237A mediante la numeración UE establecida en SEQ ID N.º: 477, y se produjeron y purificaron tras la transfección de células 293 o CHO con las construcciones de DNA. Además, se generó una proteína inmunomoduladora variante ejemplar como monómero en el que las células se transfectaron con una construcción de DNA que codifica la variante en la secuencia de referencia ICOSL ECD variante pero sin fusión con una secuencia Fc.
[1590] Las proteínas de fusión Fc ICOSL variantes purificadas resultantes o el monómero ICOSL variante se evaluaron para la unión a socios de unión afines y para la modulación de la actividad de células T usando una reacción de linfocitos mixtos (MLR) sustancialmente como se describió anteriormente. La Tabla 30D indica las sustituciones de aminoácidos en la secuencia de referencia de la variante ICOSL designada por el número de posición de aminoácido correspondiente a las posiciones de aminoácido en la respectiva secuencia de dominio extracelular (ECD) ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificada) establecida en SEQ ID N.º:32, y establece el identificador de la SEQ ID N.º para cada secuencia ICOSL de referencia. La columna 3 indica el tipo celular (ExpiCHO-S o Expi293) utilizado para producir la proteína ICOSL. Como se muestra en la Tabla 30D, los resultados indican una unión y actividad sustancialmente similares, tanto si la variante de la proteína inmunomoduladora ICOSL se produjo en células CHO o 293 como si no.
[1593]
[1594] continuación
[1597]
[1599] EJEMPLO 28
[1600] Generación de una Biblioteca de Variantes NNK de Variantes del Dominio IgSF de ICOSL y Evaluación de la Unión y la Actividad
[1601] Se generaron moléculas variantes adicionales que contienen dominio ICOSL IgSF con mutaciones en la posición 52, 57 y 100 con referencia a las posiciones establecidas en SEQ ID N.º:32. Las variantes se generaron a partir de una biblioteca NNK, donde K=T o G, de forma que los codones codificantes codifican todos los aminoácidos potenciales, pero impiden la codificación de dos residuos de parada TAA y TGA. El DNA de la biblioteca NNK se introdujo en levadura sustancialmente como se describe en el Ejemplo 2 para generar bibliotecas de levadura. Las bibliotecas se utilizaron para seleccionar levaduras que expresaran variantes de ICOSL modificadas por afinidad sustancialmente como se describe en el Ejemplo 3.
[1602] Las moléculas variantes seleccionadas que contenían el dominio ICOSL IgSF se formatearon además como una proteína de fusión Fc sustancialmente como se describe en el Ejemplo 4, excepto que contenía el dominio ICOSL IgSF generado unido mediante un enlazador GSGGGGS (SEQ ID N.º:635) a un Fc inerte que contenía las mutaciones C220S/L234A/L235E/G237A/K447del mediante la numeración UE establecida en SEQ ID N.º: 633, o un alotipo del mismo establecido en SEQ ID N.º:637.
[1603] Las proteínas inmunomoduladoras de fusión Fc ICOSL variantes se evaluaron en estudios de unión para evaluar la unión para socios de unión afines. Las células Expi293 transfectadas con socios de unión afines, CD28 humano, ICOS y CTLA4, se utilizaron como células diana en estudios de unión como se describe en el Ejemplo 6. Se determinó la IMF de unión de 100 nM de proteínas inmunomoduladoras de fusión ICOSL Fc variantes para células diana que expresan cada socio de unión y se comparó con la unión de la correspondiente referencia (por ejemplo, IgV-Fc ICOSL no modificada o de tipo silvestre) para la misma célula diana. La bioactividad costimuladora de las moléculas de fusión Fc variantes de ICOSL generadas también se evaluó en ensayos de coimmovilización anti-CD3 (10mM) como se describe en el Ejemplo 6. También se determinó la modulación de la actividad de las células T por las proteínas inmunomoduladoras de fusión Fc ICOSL variantes utilizando una reacción de linfocitos mixtos (MLR) con 1 nM ICOSL-Fc sustancialmente como se describe en el Ejemplo 6. Se determinó la secreción de IFN-gamma en pocillos triplicados.
[1604] [0679]Los resultados de la actividad de unión y funcional, basados en la bioactividad coestimuladora o actividad en un ensayo MLR, para moléculas de fusión ICOSL IgV-Fc variantes ejemplares se muestran en la Tabla 31. En la tabla siguiente se indican las sustituciones de aminoácidos en la variante ICOSL, designadas por el número de posición de aminoácido correspondiente a las posiciones de aminoácido en la respectiva secuencia de dominio extracelular (ECD) ICOSL de referencia (por ejemplo, no modificada) establecida en SEQ ID N.º:32. La columna 2 establece el identificador de la SEQ ID N.º para cada dominio IgV variante contenido en la molécula de fusión IgV-Fc variante. Como se muestra, las variantes del dominio ICOSL IgSF (por ejemplo IgV) generadas con las diversas combinaciones de mutaciones específicas en las posiciones 52, 57 y 100, mostraron una unión alterada para al menos uno, y en algunos casos más de un, compañero de unión afín. Las dos últimas columnas de la Tabla también representan la actividad funcional de las moléculas de fusión Fc variantes para modular la actividad de las células T basándose en los niveles calculados de IFN-gamma en sobrenadantes de cultivo (pg/mL) generados bien i) con la molécula soluble de fusión IgV-Fc variante indicada coinmovilizada con anti-CD3 o ii) con la molécula de fusión IgV-Fc variante indicada en un ensayo MLR. La Tabla también muestra la proporción de IFN-gamma producida por cada variante de ECD-Fc en comparación con la ECD-Fc de referencia correspondiente (por ejemplo, no modificada o de tipo silvestre) en ambos ensayos funcionales. Las proteínas de fusión Fc variantes también mostraron una actividad inmunológica alterada. La señalización coestimuladora de algunas moléculas variantes fue sustancialmente mayor en comparación con ICOSL de tipo silvestre. Ciertas variantes mostraron una inhibición sustancial del IFN-gamma con una producción muy baja o nula de IFN-gamma detectable en los cultivos en el ensayo MLR.
[1607]
[1608] continuación
[1611]
[1614] EJEMPLO 29
[1615] Evaluación de Células K562 que Expresan una Proteína Inmunomoduladora Transmembrana (TIP)
[1616] Las células K562 fueron modificadas genéticamente para expresar una Proteína Inmunomoduladora Transmembrana (TIP) que contenía el ECD de los dominios vIgD ICOSL fusionados al dominio transmembrana e intracelular nativo del ICOSL humano WT establecido en SEQ ID N.º: 5. La variante ejemplar ICOSL-TIP tenía un dominio IgSF modificado por afinidad que contenía mutaciones de aminoácidos correspondientes a N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID N.º: 288), N52H/N57Y/Q100R (SEQ ID N.º: 283), o E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R (SEQ ID N.º: 300) con referencia a posiciones en el dominio extracelular ICOSL establecido en SEQ ID N.º:32.
[1617] Las células K562 (ATCC) fueron marcadas con CFSE para distinguirlas mejor de las células T en ensayos de cocultivo. Las células T humanas primarias purificadas se marcaron con Cell Trace Far Red (ambos de Thermo-Fisher) y se coagularon en placas de cultivo tisular de fondo redondo de 96 pocillos con anticuerpo anti-CD3. Para proporcionar una señal TCR a las células T, se incluyó el anticuerpo anti-CD3 en formato soluble en un intervalo de concentraciones que permitió la presentación en K562 de este anticuerpo estimulante a través del receptor Fc CD32 expresado por las células. Las células se incubaron 72 horas y se observó la proliferación de CD4+(FIG. 23A)y CD8+(FIG. 23B)y se presentó como porcentaje de células divididas frente a la concentración de anti-CD3. Cada punto representa la media de pocillos triplicados con barras de error que muestran la desviación estándar.
[1618] Las células K562 de tipo silvestre estimularon la proliferación de células T cuando se coincubaron con anticuerpos solubles anti-CD3 de una manera dependiente de la dosis, mientras que las células K562 en ausencia de anti-CD3 no lo hicieron. Como se muestra en laFIG.23A y 23B,la expresión de WT ICOSL TIP en la superficie mejoró las respuestas, pero los efectos fueron mayores cuando las células K562 expresaron la variante ICOSL TIP, lo que indica que estas moléculas expresadas en la superficie de las células proporcionaron una coestimulación superior para las células T.
[1619] EJEMPLO 30
[1621] Evaluación de la Unión y la Función Coestimuladora de Moléculas de Fusión con Anticuerpos Dirigidos Contra HER2
[1623] Una variante ejemplar ICOSL ECD, que contiene las mutaciones N52H/N57Y/Q100R se fusionó a los extremos N o C-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo anti-HER2 ejemplar, trastuzumab, como se representa en las diversas configuraciones mostradas en laFIG. 24A-24F.VmAbs DNA que codifica cada una de las construcciones diagramadas en laFIG. 24A-24Fse transfectó en células HEK-293 y las proteínas secretadas se purificaron mediante proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño. A continuación, se evaluó si las proteínas V-mAb resultantes conservaban las propiedades de unión adecuadas. Las células HEK-293 se transfectaron transitoriamente con vectores de expresión de HER2, CD28 o ICOS y, a continuación, cada transfectante se incubó con proteínas V-mAb individuales más un anticuerpo secundario para la detección de los reactivos unidos. Como se muestra en laFIG. 24A,todos los V-mAbs mantuvieron la unión a HER2, aunque la magnitud de la unión se redujo ligeramente. Además, la unión de los V-mAbs a las células transfectadas con CD28 se mantuvo prácticamente intacta, aunque algunas formas mostraron cierta reducción de la unión(FIG.24A).Estos datos indicaban que las variantes de ICOSL fusionadas a cadenas pesadas y/o ligeras de anticuerpos para formar proteínas de fusión conservaban en gran medida la contraestructura y la actividad de unión a anticuerpos.
[1625] Para probar si los VmAbs podrían impulsar la coestimulación de células T específica de diana, se utilizó un sistema celular transfectado que incluía una línea reportera de células T para medir la coestimulación. Para evaluar la función coestimuladora se utilizaron células Jurkat con un reportero de luciferasa del promotor de IL-2. Para estimular las células, se diseñaron células K562 como células modificadas genéticamente presentadoras de antígenos. En concreto, se transdujeron células K562 con un lentivirus que codificaba una versión Fv de cadena simple del anticuerpo anti-CD3 OKT3 con o sin transducción con un lentivirus separado que dirigía la expresión de HER2. Las células K562 que mostraban anti-CD3 de cadena simple Fv de superficie celular (OKT3) con o sin expresión HER2 de superficie se colocaron en tampón de ensayo Jurkat (RPMI1640 5%FBS) a 2x10<4>células/pocillo. Las células diana se incubaron con V-mAbs titulados de 20.000 pM a 6 pM o con proteínas de control durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron células efectoras Jurkat que expresaban un gen reportero de IL-2-luciferasa (Promega) a 1x10<5>células/pocillo para llevar el volumen final/pocillo a 100 µl. Las células diana y Jurkat se incubaron durante 5 horas a 37°C. Las placas se sacaron de la incubadora y se aclimataron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadieron 100 µl de solución de lisis celular y sustrato de luciferasa (reactivo de luciferasa BioGlo, Promega) a cada pocillo y se incubaron las placas en un agitador orbital durante 10 minutos. La luminiscencia se midió con un tiempo de integración de 1 segundo por pocillo utilizando un lector de imágenes Cytation 3 (BioTek Instruments). Se determinaron los valores relativos de luminiscencia (RLU) para cada muestra de ensayo y se comunicaron.
[1627] Como se muestra en la FIG.24B,la inclusión de trastuzumab nativo no tuvo ningún efecto sobre la inducción de luciferasa. Del mismo modo, la inclusión de la variante de la proteína ICOSL-Fc N52H/N57Y/Q100R (no fusionada a trastuzumab) no afectó a las respuestas(FIG.24B).Sin embargo, la inclusión de múltiples V-mAbs proporcionó una señal costimuladora significativa en presencia de células K562/OKT3 HER2+ que fue mucho más robusta que con K562/OKT3 que carecían de expresión HER2(FIG.24C-24F).En algunos casos, se indujo señal en células K562/OKT3 que carecían de HER2, pero lo más probable es que esto se debiera a que el dominio Fc de los V-mAbs permitía la presentación de los V-mAbs mediada por CD32. Los resultados indican que la fusión de una variante del polipéptido ICOSL con un anticuerpo puede utilizarse para emitir una señal costimuladora de células T localizada.
[1629] EJEMPLO 31
[1631] Generación de Moléculas Apiladas que Contienen Dominios ICOSL y NKp30 Modificados por Afinidad
[1632] [0686]En este Ejemplo se describen proteínas inmunomoduladoras que se generaron como construcciones apiladas multidominio que contienen un dominio IgV modificado por afinidad a partir de polipéptidos ICOSL variantes identificados y polipéptidos NKp30 variantes identificados descritos anteriormente. Específicamente, una variante ejemplar ICOSL IgV (N52D como se establece en SEQ ID N.º:548; N52H/Q100R como se establece en SEQ ID N.º:567; N52H/N57Y/Q100R como se establece en SEQ ID N.º: 565; N52L/N57H/Q100R según SEQ ID N.º: 761), y la variante ejemplar de la molécula NKp30 IgV L30V/A60V/S64P/S86G (SEQ ID N.º: 504) se unieron y fusionaron a un Fc inerte (que contiene las mutaciones L234A, L235E y L235E en un Fc IgG1 humano, por ejemplo, establecido en SEQ ID N.º:637) en diversas configuraciones. Se generaron construcciones homodiméricas apiladas que contenían subunidades Fc idénticas en las que la variante ICOSL IgV y la variante NKp30 IgV estaban unidas al extremo N o C de la región Fc a través de un GSGGGS (SEQ ID N.º: 635) y/o 3x GGGGS (SEQ ID N.º: 228) enlazador peptídico. Otros enlazadores y regiones Fc también son adecuados para la generación de moléculas apiladas. A continuación se presentan ejemplos de pilas generadas.
[1634] La molécula de ácido nucleico que codifica las proteínas inmunomoduladoras también contenía residuos que codifican el péptido señal ejemplar MGSTAILALLLAVLQGVSA (establecido en SEQ ID N.º: 225). Los constructos de expresión que codifican las proteínas de fusión Fc de interés se expresaron transitoriamente en células Expi293 HEK293 de Invitrogen utilizando los reactivos y medios comerciales Expifectamine del fabricante. Se recogieron los sobrenadantes y las proteínas se capturaron y eluyeron de una columna de proteína A utilizando un sistema de purificación de proteínas AKTA.
[1636] La molécula de ácido nucleico codificante se diseñó para producir pilas homodiméricas en varias configuraciones de secuencias en el orden mostrado en la Tabla 32.
[1639]
[1640] EJEMPLO 32
[1641] Evaluación de la Unión a Contraestructuras Expresadas en Células y de la Bioactividad de Moléculas Apiladas que Contienen Dominios ICOSL y NKp30
[1642] Este Ejemplo describe estudios de unión para mostrar la especificidad y afinidad de proteínas inmunomoduladoras de pila ICOSL/NKp30 ejemplares generadas en el Ejemplo 31 para socios de unión afines. Las proteínas inmunomoduladoras de la pila ICOSL/NKp30 ejemplares generadas en el Ejemplo 31 también se evaluaron para la caracterización de la bioactividad en un ensayoin vitrode células T primarias humanas.
[1643] A. Unión a la Contraestructura Expresada por las Células
[1644] Los estudios de unión en pila ICOSL/NKp30 se realizaron en células con expresión estable o transitoria en la superficie celular de socios de unión afines específicos para proteínas inmunomoduladoras variantes del dominio ICOSL o NKp30-Fc.
[1645] Para evaluar la unión a un socio de unión de dominios ICOSL variantes, se utilizaron células ováricas de hámster chino (CHO) que habían sido transducidas con lentivirus para la expresión en superficie de CD28 humano de longitud completa, CTLA-4, o ICOS.
[1646] Para producir células que expresen el socio de unión cognado de NKp30, se clonó una construcción de expresión de superficie de mamífero de longitud completa que contenía B7-H6 humano en un vector de expresión pcDNA3.1 (Life Technologies). Los estudios de unión se llevaron a cabo utilizando el sistema de transfección transitoria Expi293F (Life Technologies, EE.UU.). Brevemente, para una transfección de 30 ml, se incubaron aproximadamente 75 millones de células Expi293F con 30 µg de DNA del constructo de expresión y 1,5 ml de reactivo ExpiFectamine 293 diluido durante 48 horas, momento en el que se cosecharon las células para la tinción.
[1647] Para el análisis citométrico de flujo, 200.000 células de una determinada línea celular estable, transfección transitoria o control negativo apropiado se colocaron en placas de fondo redondo de 96 pocillos. Las células se centrifugaron y se suspendieron en tampón de tinción (PBS (solución salina tamponada con fosfato), 1% de BSA (albúmina sérica bovina) y 0,1% de azida sódica) durante 20 minutos para bloquear la unión no específica. Después, las células se centrifugaron de nuevo y se suspendieron en tampón de tinción que contenía de 100nM a 32 pM de pila ICOSL/NKp30 o proteína de control en 50 µL. La tinción primaria se realizó durante 45 minutos, antes de lavar las células en tampón de tinción dos veces. La proteína unida se detectó con IgG antihumana conjugada con PE (Jackson ImmunoResearch, EE.UU.) diluida 1:150 en 50 µl de tampón de tinción y se incubó durante 30 minutos. Tras la incubación final, las células se lavaron dos veces para eliminar los anticuerpos conjugados no unidos, se fijaron en formaldehído al 2%/PBS y se analizaron en un citómetro de flujo LSRII (Becton Dickinson, EE.UU.). La intensidad media de fluorescencia (IMF) se calculó para cada muestra con el software FlowJo Versión 10 (FlowJo LLC, EE.UU.).
[1648] La actividad de unión medida por MFI se evaluó para todas las proteínas de fusión Fc ICOSL-NKp30 o controles. Como se muestra en laFIG. 25A-25D,proteínas de apilamiento ejemplares unidas a proteínas afines tanto de ICOSL como de NKp30 con alta afinidad.
[1649] B. Evaluación de la Bioactividad de Moléculas con Dominios IgSF Madurados por Afinidad
[1650] La bioactividad de la proteína soluble ICOSL/NKp30 stack fue probada en un co-cultivo con células B7-H6+ para la inducción de la producción de citoquinas en células T humanas primarias. Células K562 que expresan endógenamente B7-H6 fueron transducidas con lentivirus para expresar Fv de cadena simple anti-CD3 humano de superficie celular (OKT3) dando lugar a dianas K562/OTK3. Células T primarias humanas fueron co-cultivadas en una proporción efector a diana (E:T) de 2,5 o 10:1 con la pila ICOSL/Nkp30 o proteínas de control tituladas de 100 nM a 49pM en 200 µL de volumen final de medio Ex-Vivo 15. El día 3-5, se finalizó el ensayo y se analizaron los sobrenadantes de los cultivos con los kits ELISA MAX de IL-2 y TNF-alfa (Biolegend, EE.UU.). La densidad óptica se midió en un lector de microplacas BioTek Cytation Multimode Microplate Reader (BioTek Corp., EE.UU.) y se cuantificó frente a los estándares titulados de rIL-2 y rTNF-alfa incluidos en los kits ELISA.
[1651] Los resultados de los estudios de bioactividad para las proteínas de pila ICOSL/NKp30 probadas ejemplarmente se muestran en laFIG.26A y 26B,que establece los niveles calculados de IL-2 o IFN-gamma en los sobrenadantes de cultivo (pg/mL). El identificador de secuencia (SEQ ID N.º) para cada proteína apilada se expone en laFIG.26A y 26B.La incubación en presencia de las proteínas ICOSL/NKp30 ejemplares apiladas en este ensayo dio lugar a un aumento de los niveles de inducción de citocinas dependientes de B7-H6 en células T humanas primarias demostrado por un aumento de la producción de citocinas con las proteínas ICOSL/NKp30 apiladas en comparación con las proteínas parentales ICOSL o NKp30 únicamente.
[1652] C. Evaluación de la Proliferación
[1653] [0697]También se caracterizó la proliferación de células T humanas co-cultivadas con proteínas apiladas ICOSL/NKp30 y células B7-H6+. Células T primarias humanas marcadas con CFSE fueron estimuladas durante 3 - 5 días con K562/OKT3 en una proporción E:T de 2,5 a 10:1 en presencia de proteínas apiladas ICOSL/NKp30 o proteínas de control. Se valoraron proteínas de pila ICOSL/NKp30 ejemplares de 100 nM a 49 pM en 200 µl de volumen final de medio Ex-Vivo 15. La proliferación se midió mediante análisis de citometría de flujo de la dilución de CFSE en células T teñidas con CD4+ o CD8+ utilizando el citómetro de flujo LSRII y el software Flowjo, tal como se ha descrito anteriormente.
[1654] Como se muestra enla FIG.27,las proteínas de la pila ICOSL/NKp30 probadas de forma ejemplar coestimularon la proliferación de células T CD4+ humanas primarias de forma dependiente de B7H6, lo que se demostró por un aumento de la proliferación de la pila ICOSL/NKp30 en comparación con las proteínas parentales ICOSL o NKp30 solamente.EJEMPLO 33
[1655] Evaluación de moléculas ICOSL y moléculas apiladas que contienen el dominio NKp30 en combinación con el anticuerpo anti-PD-1 en un modelo tumoral
[1656] Este Ejemplo describe la evaluación de la actividad antitumoral de una pila de proteínas ICOSL/NKp30 ejemplar, generada como se describe en el Ejemplo 31,evaluada sola o en combinación con un anticuerpo monoclonal anti PD-1 de ratón (mAb mPD-1) en ratones portadores de células de carcinoma de colon B7-H6+ CT26.
[1657] Se implantaron ratones por vía subcutánea con aproximadamente 0,3 x 10<5>células tumorales B7-H6+ CT26. Los tumores crecieron hasta el día 13 y los ratones fueron estadificados y se midieron los volúmenes tumorales medios (80 a 120 mm<3>). Los tumores se midieron bidimensionalmente con calibradores electrónicos a partir del día 6 tras el implante de las células tumorales. Se midió el volumen tumoral y se determinó el volumen tumoral medio. Se excluyeron del análisis tres ratones/grupo con los tumores iniciales más pequeños (~75 mm<3>).
[1658] Como se muestra en la FIG.28,la combinación de la proteína ICOSL/NKp30 stack probada y el mAb mPD-1 redujo significativamente el crecimiento tumoral (volúmenes tumorales medios) a lo largo del tiempo en comparación con los grupos tratados con control Fc, ICOSL o NKp30 solos, ICOSL/NKp30 stack solos o mAb anti PD-1 de ratón solos. No se observaron diferencias en el crecimiento de ningún grupo de tratamiento con los tumores parentales CT26 (B7-H6 negativos). La actividad antitumoral de la combinación mostrada en laFIG. 28es coherente con el hallazgo de que la combinación de la proteína apilada ICOSL/NKp30 probada y el anticuerpo anti-PD-1 es mejor que los reactivos individuales por sí solos.
[1659] EJEMPLO 34
[1660] Evaluación de la dosificación y in vivo efectos de las moléculas de fusión IgV-Fc ICOSL en un modelo de CIA [0702]Se evaluó la actividad antiinflamatoria de las moléculas de fusión IgV-Fc ICOSL variantes en el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) con dosificación profiláctica o terapéutica. La variante de la molécula de fusión ICOSL IgV-Fc se dosificó un máximo de 4 veces antes o justo después de la aparición de la enfermedad. La molécula de fusión variante ICOSL IgV-Fc probada contenía una variante ICOSL IgV con N52H/N57Y/Q100P como se establece en SEQ ID N.º: 570 o N52H/N57Y/Q100R como se establece en SEQ ID N.º: 565, fusionado a un Fc inerte (que contiene las mutaciones L234A, L235E y L235E en un Fc IgG1 humano, por ejemplo, establecido en SEQ ID N.º:637).
[1661] Para la inducción de la inflamación articular, se inyectó a los ratones el día -18 o -21 con una emulsión de colágeno II o bovino/CFA en la cola y con una emulsión de colágeno II o bovino/IFA ("refuerzo") el día 0. Para la dosificación profiláctica, se dosificó a los ratones con la variante de la molécula de fusión IgV-Fc de ICOSL (N52H/N57Y/Q100P) con cuatro dosis que comenzaron el día del refuerzo, antes de la aparición de la enfermedad. Para el tratamiento terapéutico/retrasado, se dosificó a los ratones con la molécula de fusión IgV-Fc ICOSL variante (N52H/N57Y/Q100R) comenzando cuando la puntuación observada en la pata era superior a uno, y se dosificó cada dos días durante un total de cuatro dosis. Como control, también se probaron moléculas de sólo Fc y una molécula CTLA-4-Fc (abatacept). Se determinó la puntuación de la pata en función del enrojecimiento o la hinchazón. También se recogió suero para medir los anticuerpos anticolágeno (CII IgG) y las citocinas proinflamatorias IL-6 y TNFα. Se recogieron células de los ganglios linfáticos de drenaje, se tiñeron para CD4, CD8, CD44 o marcadores de células T foliculares auxiliares (T<FH>) (CD25-CD4+PD-1+CXCR5+). LaFIG.29A-29Dmuestran los resultados de la dosificación profiláctica. Los ratones tratados con la molécula de fusión IgV-Fc ICOSL variante en el tratamiento profiláctico de dosificación mostraron una supresión de la enfermedad en el modelo de ratón CIA de artritis reumatoide, como lo demuestra una menor puntuación media de la suma de la pata(FIG.29A),y disminución de la IgG CII detectada(FIG.29B).* p<0,05 para ICOSL IgV-Fc frente a abatacept ** p<0,001 para ICOSL IgV-Fc frente a abatacept. PBS (mediante ANOVA de medidas repetidas de 2 vías). Niveles más bajos de citocinas séricas(FIG. 29C)y células T activadas CD44+ o células T<FH>(FIG. 29D)
también se observaron en ratones tratados con la molécula de fusión ICOSL IgV-Fc variante en comparación con el control Fc; * p< 0,05, ** p< 0,01, *** p< 0,001, **** p< 0,0001 (mediante ANOVA de 1 vía). La fracción de células B en el ganglio linfático de drenaje también se redujo significativamente en el grupo tratado con ICOSL IgV-Fc frente al grupo de control Fc (p<0,05)(FIG.29E).
[1662] LaFIG.30A-30Dmuestran los resultados de la dosificación retardada. La variante ICOSL-IgV Fc dio lugar a la puntuación media más baja de la suma de las patas (FIG.30A) y el mayor cambio porcentual en el peso corporal (FIG.
[1663] 30B) en comparación con otros grupos, incluido el control con abatacept. Como se muestra en laFIG. 30C y FIG.30D, las citocinas séricas también se suprimieron en el modelo terapéutico de CIA en ratones tratados con la variante ICOS IgV-Fc. Significación estadística entre grupos: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 mediante la prueba t de Student no apareada. En FIG.30C y FIG.30D, las líneas horizontales discontinuas indican el límite inferior de cuantificación (LLOQ) del ensayo para cada citocina.
[1664] En conjunto, estos datos evidencian que las vías CD28 e ICOS desempeñan papeles importantes en la artritis inflamatoria. En particular, la actividad superior de la variante ICOSL antagonista dual CD28/ICOS es coherente con la observación de que el bloqueo de ambas vías es necesario y que sólo se consigue un beneficio parcial con el bloqueo de una única vía.
[1665] EJEMPLO 35
[1666] Evaluación in vivo Efectos de las moléculas de fusión IgV-Fc ICOSL en un modelo de EAE
[1667] Se evaluó la actividad antiinflamatoria de una molécula de fusión IgV-Fc ICOSL variante en un modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) por transferencia adoptiva. La molécula de fusión ICOSL IgV-Fc variante probada que contiene una variante ICOSL IgV (N52H/ N57Y/Q100R; SEQ ID N.º: 565) fusionado a un Fc inerte (que contiene las mutaciones L234A, L235E y L235E en un Fc IgG1 humano).
[1668] Ratones hembra C57BL/6 fueron inyectados subcutáneamente con una emulsión de MOG<35-55>/CFA. Tras 11 días, se obtuvieron células del bazo y se cultivaron con el péptido MOG<35-55>, IL-12 y anti-IFNγ. Tres días después del cultivo, se administraron células T encefalitogénicas mediante inyección intraperitoneal (Día 0). Los ratones recibieron dosis de la molécula de fusión IgV-Fc variante de ICOSL en días alternos a partir del día 0 hasta un total de cinco dosis. Como control, también se probaron moléculas sólo Fc y una molécula CTLA-4-Fc (abatacept). Durante los 20 días posteriores a la inyección de las células T, los ratones fueron pesados, monitorizados y evaluados para la puntuación EAE como se describe en la Tabla 33. Al final del estudio, se recogió suero para analizar las citocinas proinflamatorias y se recogieron células de los ganglios linfáticos drenantes para realizar análisis citométricos de flujo.
[1671]
[1675]
[1677] Como se muestra en laFIG.31A, los ratones tratados con la molécula de fusión IgV-Fc variante de ICOSL suprimieron la enfermedad en el modelo de ratón EAE, como lo demuestra una puntuación EAE inferior, *p<0,0001 mediante ANOVA de 1 vía Área bajo la curva (AUC); molécula de fusión IgV-Fc variante de ICOSL en comparación con los controles.
[1678] Para el análisis citométrico de flujo de las células T de los ganglios linfáticos inguinales, las células se tiñeron con colorante de viabilidad y se analizaron con anti CD44, anti CD62L, anti CD4, anti CD8 y se evaluó el porcentaje de células T viables ingenuas (CD62L+CD44-) y células T de memoria efectoras (Tem) (CD62L- CD44+) CD4+ y CD8+. Como se muestra en laFIG.31C, Las células Tem CD4+ y CD8+ se redujeron con el tratamiento con la variante de la molécula de fusión ICOSL IgV-Fc (**** p<0,0001; *** p<0,001 mediante ANOVA de 1 vía).
[1679] Se evaluaron las citocinas séricas el Día 0 (2 horas después de la 1ª dosis) y el Día 6 (1 hora antes de la 4ª dosis). Como se muestra en laFIG.31D, la variante probada de la molécula de fusión ICOSL IgV-Fc produjo una reducción de las citocinas proinflamatorias en suero el Día 0, incluidas IL-5, IL-10, IL-12p70 y TNFα. En el día 6, los niveles séricos de IFN-gamma e IL-6 se redujeron con el tratamiento con la variante de la molécula de fusión ICOSL IgV-Fc en comparación con el control Fc.
[1680] EJEMPLO 36
[1681] Estudio de Intervalo de Dosis de la Fc ICOSL-IgV Variante en un Modelo de Enfermedad de Injerto Contra Huésped (GvHD)
[1682] Se realizó un estudio de rango de dosis con 20, 100 o 500 µg de una molécula de IgV-Fc de ICOSL variante, que contenía una IgV de ICOSL variante (N52H/N57Y/Q100R; SEQ ID N.º: 565) fusionado a un Fc inerte (que contiene las mutaciones L234A, L235E y L235E en un Fc IgG1 humano, por ejemplo, establecido en SEQ ID N.º:637), en un modelo de ratón de enfermedad de injerto contra huésped (GVHD). La actividad de la variante de la molécula ICOSL IgV-Fc se comparó con belatacept (CTLA-4-FcL104E/A29Y; Número de Publicación de la Solicitud de Patente de EE. UU. US2016/0271218).
[1683] A ratones NSG hembra (n = 5 por grupo para el Grupo 1, sin tratamiento; n= 10 por grupo para los Grupos de tratamiento 2-7) se les administró 10 mg de gammaglobulina por vía subcutánea y luego se les irradió (100 cGy/rad) el Día -1. El Día 0 (dentro de las 24 horas posteriores a la irradiación), los ratones de los Grupos 2-7 fueron dosificados con artículos de prueba según lo establecido en la Tabla34y, a continuación, todos los ratones recibieron 1x10<7>PBMC humanas inyectadas por vía IV a través de la vena de la cola tras la dosificación.
[1684] Se determinó un índice de actividad de la enfermedad (DAI) evaluando a los ratones tres veces por semana durante el estudio y puntuando la enfermedad en función de la pérdida de peso corporal, la postura, la actividad y el aspecto del pelaje y la piel de los ratones. Una vez finalizado el estudio el día 42, se evaluaron los criterios de valoración de la supervivencia, la pérdida de peso corporal y la actividad de la enfermedad. Se generaron gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier que representaban el porcentaje de animales que sobrevivían hasta el punto final del estudio y las comparaciones de las curvas de supervivencia se analizaron mediante las pruebas de Mantel-Cox y Gehan-Breslow-Wilcox (IC del 95%). Se recogieron muestras de sangre/suero de los ratones supervivientes al final del estudio (día 42) y se evaluaron las células mediante citometría de flujo para detectar marcadores de células T, incluidos marcadores de ratón o humanos, CD4, CD8, CD28, ICOS, marcadores de activación o agotamiento (PD-1, Ki67) y FoxP3 (un marcador de Tregs). También se evaluaron los niveles de citocinas proinflamatorias séricas (por ejemplo, IFN-gamma, IL-10, IL-12(p70), IL-17A, IL-4, IL-5 y TNFα).
[1687]
[1688] LaFIG.32A-32Bmuestran las puntuaciones de supervivencia e DAI de los ratones con GVHD tratados de acuerdo con cada esquema de dosificación. Como se muestra, la variante probada ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) en todos los niveles de dosis probados aumentó significativamente la supervivencia (FIG. 32A) y puntuaciones reducidas de la enfermedad (FIG.32B) en comparación con los ratones tratados con belatacept (es decir, el 100% frente al32B). 40% de supervivencia en el día 42, respectivamente; p <0,01 mediante la prueba de rangos logarítmicos de Mantel-Cox). En particular, la administración de una dosis única (100 µg) de la variante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) dio lugar a una protección similar frente a la enfermedad que la administración repetida de 100 µg de belatacept.
[1689] El análisis de citometría de flujo de la sangre recogida al final del estudio demostró que la variante probada ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) suprimió eficazmente la expansión de las células T humanas transferidas, como se observó por una relación reducida de células humanas/células de ratón (FIG. 33A) y los recuentos totales de células T muy reducidos (FIG.33B). Como se muestra en lasFIGS.33C-33F, tinción por citometría de flujo de sangre recogida al final del estudio de células T CD4+ y CD8+ co-teñidas para ICOS (FIGS.33C-33D) y CD28 (FIGS.33E-33F) no demostraron prácticamente ninguna tinción en los grupos tratados con la variante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R), aunque las células T CD4+ y CD8+ que expresaban ICOS eran fácilmente detectables en los ratones tratados con belatacept. Estos resultados son coherentes con la falta de células T restantes en los ratones tratados con ICOSL IgV-Fc, y también con la capacidad de la variante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) para unirse a sus moléculas diana CD28 e ICOS y bloquear su detección por los anticuerpos de citometría de flujo. La unión de la variante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) a los pocos linfocitos T humanos restantes se confirmó mediante detección con anti-Human IgG Fc. En particular, mientras que la mayoría de las células T humanas transferidas expresaban inicialmente CD28 y sólo un 10-20% eran ICOS+, las células T activadas que quedaban en los ratones tratados con solución salina o belatacept al final del estudio eran >80% ICOS+.
[1690] La presencia de marcadores de activación o agotamiento de las células T también se suprimió en los grupos tratados con la variante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R), como lo demuestra la menor expresión de PD1 en las células T CD4+ y CD8+ y la menor expresión de Ki67 en las células T CD4+, (FIG. 34A-3B). La proporción entre células T efectoras y Tregs permaneció estable en los grupos tratados con la variante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) en comparación con belatacept (FIG. 34C). Las citocinas proinflamatorias séricas también se suprimieron en los grupos tratados con la variante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) en comparación con belatacept (FIG.35A-35D).
[1691] También se llevó a cabo un análisis farmacocinético (PK) para monitorizar la exposición sérica de la variante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R). Las concentraciones del artículo de ensayo se midieron en muestras de suero de ratón mediante un ELISA PK cuantitativo utilizando un anticuerpo de captura mAb ICOSL antihumano y una IgG antihumana de ratón específica de Fc como reactivo de detección.
[1692] La exposición sérica observada de la variante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) en el modelo de GVHD fue un 45% inferior a la de los ratones normales, determinada en un estudio separado (FIG.35E). La semivida terminal más larga de la variante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) en el modelo de GvHD puede deberse a una diana reducida (CD28, ICOS) en momentos posteriores de la GvHD (a medida que desaparecen las células T humanas), y/o a la formación de anticuerpos antifármaco (ADA) en ratones normales, que puede interferir con la exposición al fármaco. La observación de que la variante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) tenía una menor exposición sérica en comparación con los ratones normales puede deberse a la disposición del fármaco mediada por la diana (TMDD) en el modelo de GvHD (es decir, su mayor afinidad por CD28 e ICOS humanos en comparación con los ortólogos de ratón), y/o a la falta de FcRn en los ratones NOD/SCID (NSG) utilizados en este modelo.
[1693] En conjunto, estos resultados son coherentes con la observación de que la variante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) presenta una potente actividad antagonista, incluso con una sola dosis, y una actividad superior a belatacept. Esta observación puede atribuirse a que la variante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) presenta un control superior de las células T ICOS+, que de otro modo escapan al bloqueo único de ICOS o de la vía CD28, como el que se consigue con el antagonista de la vía CD28 belatacept.
[1694] EJEMPLO 37
[1695] Evaluación de la variante ICOSL-IgV Fc en el modelo de colitis inducida por CD4+CD45RBhigh
[1696] El efecto de la variante ICOSL IgV-Fc ejemplar que contiene una variante ICOSL IgV (N52H/ N57Y/Q100R; SEQ ID N.º: 565) fusionado a un Fc inerte (que contiene las mutaciones L234A, L235E y L235E en un Fc IgG1 humano, por ejemplo, establecido en SEQ ID N.º:637) sobre el desarrollo de la enfermedad en el modelo de colitis inducida por CD4+CD45RB.
[1697] Las células donantes CD4+CD45RBaltas se enriquecieron mediante selección negativa a partir de suspensiones de células del bazo obtenidas de 15 ratones donantes BALB/C macho. El día 0, se inyectaron por vía intravenosa 0,3 millones de células donantes CD4+CD25-CD45RBhigh (Treg depleted) en ratones inmunodeficientes C.B17 (SCID) (n=12 o 21 por grupo) para inducir colitis. Como control, se inyectaron 0,3 millones de células CD4+ (que contienen células Treg), que no inducen el desarrollo de colitis en este modelo, en ratones SCID receptores (n=12). El día de la transferencia celular, los ratones de cada grupo fueron dosificados con la variante ICOSL-IgV Fc o sólo Fc o controles con vehículo. La Tabla35resume el régimen de tratamiento para los grupos probados.
[1698]
[1701] El peso corporal (tomado a partir del Día 0) y la puntuación de la consistencia de las heces (tomada a partir del Día 10), se evaluaron tres veces por semana. El índice diario de actividad de la enfermedad (DAI) se calculó a partir de las puntuaciones de peso corporal y heces. Tras finalizar el estudio el día 42, se recogió el colon para determinar su longitud y peso y realizar un análisis histológico. El análisis estadístico del peso corporal final y del peso y longitud finales del colon del grupo tratado con la variante ICOSL-IgV Fc respecto al grupo del vehículo se evaluó mediante la prueba t de Student de dos colas. Las puntuaciones de las heces y del DAI se compararon mediante la prueba T no paramétrica de Wilcoxon.
[1703] Los resultados del DAI se muestran en las Tablas 36 (IAD) yFIG.36A,las medidas del colon se muestran en la Tabla 37, y los resultados histológicos del colon se muestran en la Tabla 38 y en laFIG.36B.Como se ha demostrado, la variante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) mostró una reducción significativa del desarrollo de colitis en este modelo, lo que concuerda con la utilidad de este antagonista dual CD28/ICOS para tratar eficazmente la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD).
[1706]
[1710]
[1713]
[1714]
[1715]
[1716]
[1717] continuación
[1718]
[1719] (continuación)
[1722]
[1725] La presente invención no pretende limitarse en su alcance a las realizaciones particulares divulgadas, que se proporcionan, por ejemplo, para ilustrar diversos aspectos de la invención. Varias modificaciones de las composiciones y métodos descritos resultarán evidentes a partir de la descripción y las enseñanzas del presente documento. La presente invención se define en las reivindicaciones. Cualquier materia que se describa en el presente documento, pero que no se reivindique, no forma parte de la invención.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES
1.Una proteína de fusión inmunomoduladora, que comprende una variante del polipéptido ICOSL y una región Fc de una inmunoglobulina, en la que la proteína de fusión inmunomoduladora comprende la secuencia establecida en SEQ ID N.º:928.
2.La proteína de fusión inmunomoduladora de la reivindicación 1 que es un homodímero.
3.Molécula(s) de ácido nucleico que codifica(n) la proteína de fusión inmunomoduladora de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2.
4.Un vector, que comprende la(s) molécula(s) de ácido nucleico de la reivindicación 3.
5.Una célula, que comprende la(s) molécula(s) de ácido nucleico de la reivindicación 3 o el vector de la reivindicación 4.
6.Un método para producir una proteína de fusión inmunomoduladora que comprende un polipéptido ICOSL variante y una región Fc de una inmunoglobulina, que comprende introducir la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3 o el vector de la reivindicación 4 en una célula huésped en condiciones para expresar la proteína en la célula, opcionalmente en las que la célula es una célula de mamífero.
7.El método de la reivindicación 6, en el que la célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO) o un derivado de la misma, opcionalmente CHO DG44.
8.El método de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7, comprende además aislar o purificar la proteína de la célula.
9.Una proteína producida por el método de cualquiera de las reivindicaciones 6-8.
10.Una composición farmacéutica, que comprende la proteína de fusión inmunomoduladora de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
11.La proteína de fusión inmunomoduladora de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2 o la composición farmacéutica de la reivindicación 10 para su uso como medicamento.
12.La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 11, para modular una respuesta inmunitaria, en la que la respuesta inmunitaria disminuye.
13.Una composición farmacéutica de la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección en un sujeto, en el que la enfermedad o afección es una enfermedad o afección inflamatoria o autoinmune.
14.La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 13, en la que la enfermedad o afección es la enfermedad de Addison, alergias, alopecia areata, enfermedad de Alzheimer, vasculitis asociada a anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA), espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido (síndrome de Hughes), asma, aterosclerosis, artritis reumatoide, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad autoinmune del oído interno, síndrome linfoproliferativo autoinmune, miocarditis autoinmune, ooforitis autoinmune, orquitis autoinmune, azoospermia, enfermedad de Behcet, enfermedad de Berger, penfigoide ampolloso, cardiomiopatía, enfermedad cardiovascular, esprúe celíaco/enfermedad celíaca, síndrome de disfunción inmunitaria asociado a fatiga crónica (CFIDS), polineuritis idiopática crónica, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), polineuropatía crónica recidivante (síndrome de Guillain-Barré), síndrome de Churg-Strauss (CSS), penfigoide cicatricial, enfermedad por crioaglutininas (CAD), EPOC (enfermedad pulmonar obstructiva crónica), síndrome CREST, enfermedad de Crohn, dermatitis herpetiforme, dermatomiositis, diabetes, lupus discoide, eccema, epidermólisis ampollosa adquirida, crioglobulinemia mixta esencial, síndrome de Evans, exoftalmos, fibromialgia, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía por IgA, enfermedad o trastorno inmunoproliferativo, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), enfermedad pulmonar intersticial, artritis juvenil, artritis idiopática juvenil (JIA), enfermedad de Kawasaki, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, liquen plano, nefritis lúpica, hipofisitis linfocítica, enfermedad de Ménière, síndrome de Miller Fisher/encefalomielorradiculopatía aguda diseminada, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple (MS), reumatismo muscular, encefalomielitis miálgica (ME), miastenia gravis, inflamación ocular, pénfigo foliáceo, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nudosa, policondritis, síndromes poliglandulares (síndrome de Whitaker), polimialgia reumática, polimiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria/colangiopatía autoinmune, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter/artritis reactiva, reestenosis, fiebre reumática, enfermedad reumática, sarcoidosis, síndrome de Schmidt, esclerodermia, síndrome de Sjögren, síndrome del hombre rígido, lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerodermia sistémica, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, tiroiditis, diabetes de tipo 1, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis, vitíligo, enfermedad intestinal intersticial o granulomatosis de Wegener.
15.La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en la que la enfermedad o afección
es lupus eritematoso sistémico (SLE).
16.La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 13, en la que la enfermedad o afección es enfermedad inflamatoria intestinal (IBD); enfermedad o trastorno relacionado con la IBD, opcionalmente enfermedad pulmonar intersticial; enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), opcionalmente GVHD aguda (aGVHD); artritis psoriásica (PsA); artritis reumatoide; afección autoinmune asociada a trasplante de órganos; o síndrome de Sjögren.
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