RS67712B1 - Imunomodulatorni proteini varijanti icos liganda i povezane kompozicije i postupci - Google Patents

Imunomodulatorni proteini varijanti icos liganda i povezane kompozicije i postupci

Info

Publication number
RS67712B1
RS67712B1 RS20260125A RSP20260125A RS67712B1 RS 67712 B1 RS67712 B1 RS 67712B1 RS 20260125 A RS20260125 A RS 20260125A RS P20260125 A RSP20260125 A RS P20260125A RS 67712 B1 RS67712 B1 RS 67712B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
icosl
variant
cell
domain
polypeptide
Prior art date
Application number
RS20260125A
Other languages
English (en)
Inventor
Lawrence Evans
Michael Kornacker
Ryan Swanson
Original Assignee
Alpine Immune Sciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alpine Immune Sciences Inc filed Critical Alpine Immune Sciences Inc
Publication of RS67712B1 publication Critical patent/RS67712B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/20—Cellular immunotherapy characterised by the effect or the function of the cells
    • A61K40/22—Immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/418—Antigens related to induction of tolerance to non-self
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4203—Receptors for growth factors
    • A61K40/4205—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4211—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/41—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a Myc-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

[0001] Opis
[0003] Unakrsna referenca na srodne prijave
[0005] Ova prijava polaže pravo prvenstva od U.S. privremene patentne prijave 62/574,161, podnete 18. oktobra 2017, pod nazivom „VARIANT ICOS LIGAND IMMUNOMODULATORY PROTEINS AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS“.
[0007] Oblast pronalaska
[0009] Predmetni pronalazak se odnosi na terapeutske kompozicije za modulaciju imunog odgovora u lečenju raka i imunoloških bolesti. U nekim aspektima, predmetni pronalazak se odnosi na posebne varijante ICOS liganda (ICOSL) koje ispoljavaju poboljšano vezivanje, kao što je poboljšani afinitet ili selektivnost za jedan ili oba srodna proteina partnera za vezivanje ICOS ili CD28.
[0011] Stanje tehnike
[0013] Modulacija imunog odgovora intervencijom u procesima koji se odvijaju u imunološkoj sinapsi (IS) koju formiraju ćelije koje prezentuju antigen (APC) ili ciljne ćelije i limfociti je od sve većeg medicinskog interesa. Mehanički, proteini ćelijske površine u IS mogu da uključuju koordinisanu i često istovremenu interakciju više proteinskih ciljeva sa jednim proteinom za koji se vezuju. IS interakcije se javljaju u bliskoj vezi sa spojem dve ćelije, a jedan protein u ovoj strukturi može da interaguje i sa proteinom na istoj ćeliji (cis), kao i sa proteinom na vezanoj ćeliji (trans), verovatno istovremeno. Iako su poznati lekovi koji mogu da moduliraju IS, potrebni su poboljšani terapeutici. Obezbeđeni su imunomodulatorni proteini, uključujući rastvorljive proteine ili transmembranske imunomodulatorne proteine sposobne da se eksprimuju na ćelijama, koji ispunjavaju takve potrebe.
[0015] Kratak opis pronalaska
[0017] Bilo koju realizaciju, koja ne spada u doslovni obim priloženih patentnih zahteva treba posmatrati samo kao stanje tehnike ili referentni primer pogodan za razumevanje pronalaska.
[0018] Ovde je dat polipeptid varijante ICOSL liganda (ICOSL), u skladu sa priloženim skupom patentnih zahteva.
[0020] U nekim od takvih realizacija, skraćivanje na C-terminusu je od najmanje 30, najmanje 40, najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, najmanje 80, najmanje 90, najmanje 100, najmanje 125 amino-kiselinskih ostataka. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, ICOSL referentni polipeptid je izmenjen ili mu nedostaje mesto cepanja proteaze navedeno kao amino-kiseline 204-209 SEQ ID NO:32. U nekim primerima, ICOSL referentni polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO: 545. U nekim aspektima, ICOSL referentni polipeptid se sastoji od sekvence amino-kiselina navedene u SEQ ID NO: 545.
[0022] Ovde je dat polipeptid varijante ICOSL liganda (ICOSL) koji sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina u ICOSL referentnom polipeptidu, pri čemu se ICOSL referentni polipeptid sastoji od sekvence amino-kiselina navedenih u SEQ ID NO: 545. Takođe je ovde dat polipeptid varijante ICOSL liganda (ICOSL) koji sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina u domenu superfamilije imunoglobulina (IgSF) ICOSL referentnog polipeptida, pri čemu je ICOSL referentni polipeptid izmenjen u jednoj ili više amino-kiselina koje odgovaraju aminokiselinama 204-209 u odnosu na SEQ ID NO: 32. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijantni ICOSL polipeptid ispoljava izmenjeno vezivanje za jednog ili više svojih partnera za vezivanje u poređenju sa vezivanjem ICOSL referentnog polipeptida za jednog ili više partnera za vezivanje. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijantni ICOSL polipeptid ispoljava povećano vezivanje za jednog ili više svojih partnera za vezivanje u poređenju sa vezivanjem ICOSL referentnog polipeptida za jednog ili više partnera za vezivanje.
[0024] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, izmena (npr. modifikacija) uključuje deleciju jedne ili više susednih amino-kiselina koje odgovaraju amino-kiselinama 204-209 u odnosu na SEQ ID NO: 32. U nekim slučajevima, ICOSL referentni polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina navedenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 600-605. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, ICOSL referentni polipeptid se sastoji od sekvence amino-kiselina navedene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 600-605.
[0026] [0009] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, izmena (npr. modifikacija) uključuje najmanje jednu supstituciju amino-kiseline na jednoj ili obe pozicije 207 i 208, što odgovara pozicijama navedenim u SEQ ID NO: 32. U nekim primerima, najmanje jedna supstitucija amino-kiseline je N207A, N207G ili L208G, ili njihova konzervativna supstitucija amino-kiseline.
[0028] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, referentni ICOSL polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu u bilo kom od SEQ ID NO: 623-628. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, referentni ICOSL polipeptid se sastoji od sekvence amino-kiselina navedene u bilo kom od SEQ ID NO: 623-628.
[0030] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida ispoljava smanjeno proteolitičko razlaganje kada se eksprimuje iz ćelije. U nekim primerima, ćelija je ćelija sisara. U nekim slučajevima, ćelija je ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili njen derivat.
[0032] U nekim od takvih realizacija, modifikacija amino-kiseline je supstitucija, umetanje ili delecija amino-kiseline. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina nalaze se na poziciji koja odgovara poziciji(ama) izabranoj iz 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 148, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ili 227 uz upućivanje na SEQ ID NO:32. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina nalaze se na poziciji koja odgovara poziciji(ama) izabranoj iz 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 26, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ili 227 uz upućivanje na SEQ ID NO:32.
[0034] [0013] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane iz M M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20V, S25G, F27S, F27C, N30D, Y33del, Q37R, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57Y, N57W, R61S, R61C, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, E90A, K92R, F93L, H94E, H94D, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110D, V110N, V110A, E111del, T113E, H115R, H115Q, V116A, A117T, N119Q, F120I, S121G, V122A, V122M, F120S, S126T, S126R, H129P, S130G,S132F, Q133H, E135K, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F,I143V, I143T, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H,W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161P, L161M, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193M, N194D, C198R, N201S, L203P, L203F, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217V, I218T, I218N, E220G, R221G, R221I, I224V, T225A, N227K ili njihove konzervativne amino-kiselinske supstitucije.
[0036] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane iz M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20T, A20V, S25G, R26S, F27C, F27S, N30D, Y33del, Q37R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R61S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110A, V110D, V110N, E111del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S, S121G, V122A, V122M, S126R,S126T, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, I143T, I143V, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H, W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161M, L161P, Q164L, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193A, V193M, N194D, C198R, N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, I218N, I218T, E220G, R221G, R221I, R221K, I224V, T225A, T225S, N227K ili njihove konzervativne amino-kiselinske supstitucije.
[0038] [0015] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina nalaze se na poziciji koji odgovara poziciji(ama) 52, 57 ili 100. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane iz N N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57Y, N57W, Q100A, Q100D, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T ili Q100V. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57Y, N57W, Q100A, Q100D, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T ili Q100V. U nekim primerima, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane iz grupe N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R. N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52D/V151A, N52H/I143T, N52S/L80P, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S, N52H/F78L/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D, N52H/Q100R, N52H/S121G, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y, N52S/F120S, N52S/V97A, N52S/G72R, N52S/A71T/A117T, N52S/E220G, Y47H/N52S/V107A/F120S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T,
[0039] E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R,
[0040] Q37R/N52H/N57Y/QIOOR/Vl ION/SI42F/CI98R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R,
[0041] N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R, F27S/N52H/N57Y/V110N, N52S/H94E/-L96I/S109N/L166Q, S18R/N52S/F93L/I143V/R221G, A20T/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/-L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52S/H94E/L96I/V122M, N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N,
[0042] M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S,
[0043] N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R,
[0044] N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I,
[0045] M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/1143V/F172S/V193M/C198R,
[0046] N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R,
[0047] N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R,
[0048] N52H/N57Y/Q100R/V11OD/N144D/F172S/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N52S/E90A, N30D/K42E/N52S, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N52S/F120S/N227K, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, N52D, N52H/N57Y/Q100R/-V107I/V110D/I154F/C198R/R221G, N52Q/N207Q, N52Q/N168Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/M143V/F172S/C198R,
[0049] N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R, N52H/V122A/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115-R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/-R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52S/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/ N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L ili N57Q/Q100P.
[0051] [0016] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane iz grupe N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R. N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52D/V151A, N52H/I143T, N52S/L80P, F120S/Y152H/N201S, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S, N52S/G103E, N52H/F78L/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D, N52H/Q100R, N52H/S121G, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y, N52S/F120S, N52SN97A, N52S/G72R, N52S/A71T/A117T, N52S/E220G, Y47H/N52S/V107A/F120S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115-R/Y152C/K156M/C198R, Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R,
[0052] 52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R, F27S/N52H/N57Y/V110N, N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q, S18R/N52S/F93L/I143V/R221G, A20T/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52S/H94E/L96I/V122M, N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N,
[0053] M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S, N52H/N57Y/Q100R/V110-D/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110-D/E135K/L173S/C198R,
[0054] N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I, M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/-V110A/H129P/1143V/F172S/V193M,C198R,
[0055] N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R,
[0056] N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R,
[0057] N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N52S/E90A, N30D/K42E/N52S, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N52S/F120S/N227K, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, N52H/N57Y/Q100R/-V107I/V110D/I154F/C198R/R221G, N52Q/N207Q, N52Q/N168Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R,
[0058] N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R, N52H/V122A/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52S/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L, N57Q/Q100P, ili R26S/N52H/N57Y/V110D/-T137A/C198R.
[0060] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su N52H/Q100R. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO:567.
[0061] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su N52H/N57Y/Q100R. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:565.
[0063] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su N52L/N57H/Q100R. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 761.
[0065] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina je N52D. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 548.
[0067] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina je N52H/N57Y/Q100P. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 570.
[0069] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane iz F120S/Y152H/N201S, E111del, Y33del, N168Q/N207Q, N84Q/N207Q, N155Q/N207Q, N119Q/N168Q, N119Q/N207Q, N119Q/N155Q, N84Q/N119Q, N84Q/N155Q/N168Q, N84Q/N168Q/N207Q, N84Q/N155H/N207Q, N155Q/N168Q/N207Q, N119Q N155Q/N168Q, N119Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N207Q, N119Q/N155H/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q, N84Q/N155Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q ili F138L/L203P.
[0071] [0023] U nekim od takvih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane iz C198R, D158G, E16V, E90A, F120S, F138L, F172S, H115R, H115X, I143T, I143V, I224V, K156M, K42E, K92R, L102R, L203P, L208P, N194D, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52Y, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57S, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100D, Q100E, Q100K, Q100M, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q133H, R221I, R75Q, S54A, S54P, T113E, T225A, V110D, V122A, Y146C, Y152C, A117T, A2V, A71T, A91G, A91G, AE88D, C140del, C198R, D158G, D77G, D90K, E117G, E135K, E16V, E81A, E88D, E90A, F120I, F120S, F138L, F172S, F27C, F92Y, G72R, H115R, H115X, H129P, H94E, I118V, I127T, I143T, I143V, I154F, I218N, I218T, I224V, K156M, K169E, K36G, K42E, K89R, K92R, K93R, L102R, L161P, L166Q, L173S, L203F, L203P, L208P, L209P, L40M, L70Q, L70R, L74Q, L80P, L96I, L98F, M10I, M10V, N115Q, N119Q, N122S, N144D, N155X, N168Q, N168X, N178S, N194D, N207Q, N207X, N227K, N25S, N30D, N52V, N57A, N57F, N57H, N57L, N57M, N57S, N57V, N57W, N57Y, N63S, N84Q, Q100G, Q100N, Q100V, R221G, S109G, S109N, S114T, S121G, S126R, S126T, S130G, S132F, S13G, S18R, S192G, S212G, S25G, S54A, S54P, S99G, T113E, T120S, T130A, T139S, T190A, T199S, T225A, T41I, V107I, V110A, V110D, V11E, V122A, V122M, V193M, V210A, W153R, Y146C, Y152C ili Y152H.
[0073] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane iz N52S, N52H, N52D, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y, N52S/C198R, N52S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52H/I143T, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/E90A, N52S/F120S/1143V/1224V, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52Y/N57Y/Q100P/F172S,
[0074] E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R,
[0075] N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N57Y/Q100P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R. N52H/N57Y/Q100R/L102R, H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/I143T F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N30D/K42E/N52S/H115R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52T/N57H/Q100S, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G ili N52T/N57K/Q100P; ili N52S, N52H, N52D, N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140del/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y, N57Y/Q100P, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52H/I143T, N52S/L80P, N52S/D158G, N52D/Q133H, L70Q/A91G/N144D, L70Q/A91G/E117G/I118V/T120S/T130A, L70R/A91G/I118V/T120S/T130A/T199S, L70Q/E81A/A91G/I118V/T120S/I127T/ T130A, N63S/L70Q/A91G/-S114T/I118V /T120S/T130A, T41I/A91G, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R/N122S/ N178S, E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, AE88D/K89R/D90K/ A91G/F92Y/K93R, K36G/L40M, N52H/N57Y/Q100R/-V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R, N52S/F120S/N227K, N52S/N194D, N52S/F120S, N52S/G72R, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/S132F/I154F/C198R/R221G,
[0076] E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R,
[0077] 52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, V11E/N30D/-N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52S/H94E/L96I/V122M, N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/-W153R/I218N,
[0078] M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R,
[0079] S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R,
[0080] N52H/N57Y/V110A/C198R/R2211,
[0081] M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M,C198R,
[0082] N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R,
[0083] N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N52S/E90A, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F172S/C198R, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115-R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q/, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/Q100R, N52H/S121G/C198R, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A/K169E, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/I143T F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R R2211, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R, N52S/H115R/F172S/C198R, N119Q, N207Q, N52Q/N207X, N168X/N207X, N52Q/N168Q, N84Q/N207Q, N119Q N155X, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N207Q, N119Q/N155Q/N168Q, N52H/N84Q/N119Q, N52Q/N84Q/N155X/N168X, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q 100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q 100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G ili N52T/N57K/Q100P. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida ispoljava povećano vezivanje za ektodomen ICOS ili CD28 u poređenju sa vezivanjem referentnog ICOSL polipeptida za isti ektodomen.
[0085] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane iz C198R, D158G, E16V, E90A, F120S, F138L, F172S, H115R, I143V, I224V, K156M, K42E, K92R, L102R, L203P, L208P, N194D, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52Y, N57F, N57H, N57L, N57M, N57S, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100E, Q100G, Q100K, Q100M, Q100P, Q100R, Q100S, Q133H, S212G, S54A, S54P, T113E, V110D, V122A, Y146C, Y152C ili T225A.
[0087] U nekim primerima, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane iz N52A/N57Y/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52T/N57H/Q100S, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52S, N52H, N52D, N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y, N52S/C198R, N52S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52H/I143T, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52H/N57Y/Q100R/V11OD/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/E90A, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52Y/N57Y/Q100P/F172S,
[0088] E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R,
[0089] N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N52S/E90A/H115R, N52S/E90A/H115R ili N30D/K42E/N52S/H115R. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida ispoljava povećano vezivanje za ektodomen ICOS i CD28 u poređenju sa vezivanjem referentnog ICOSL polipeptida za iste ektodomene.
[0091] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida (varijantni ICOSL peptid) sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 546‑599, 734‑781, 783, 786, 788, 792, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 811, 813, 815, 817, 818, 820, 822, 824, 826, 827, 829, 831, 833, 834, 836, 838, 840‑843, 845, 847, 848, 850‑853, 855, 857, 907, 910, ili sekvencu amino-kiselina, koja ispoljava najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO: 546‑599, 734‑781, 783, 786, 788, 792, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 811, 813, 815, 817, 818, 820, 822, 824, 826, 827, 829, 831, 833, 834, 836, 838, 840‑843, 845, 847, 848, 850‑853, 855, 857, 907, 910. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida se sastoji od sekvence amino-kiselina navedenih u bilo kojoj od SEQ ID NO: 546‑599, 734‑781, 783, 786, 788, 792, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 811, 813, 815, 817, 818, 820, 822, 824, 826, 827, 829, 831, 833, 834, 836, 838, 840‑843, 845, 847, 848, 850‑853, 855, 857, 907, 910, ili sekvenca amino-kiselina koja ispoljava najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 546‑599, 734‑781, 783, 786, 788, 792, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 811, 813, 815, 817, 818, 820, 822, 824, 826, 827, 829, 831, 833, 834, 836, 838, 840‑843, 845, 847, 848, 850‑853, 855, 857, 907, 910.
[0092] U nekim od bilo kojih od datih realizacija varijante ICOS liganda (ICOSL) polipeptida koji sadrži IgV domen ili njegov specifični vezujući fragment, IgC domen ili njegov specifični vezujući fragment, ili oba, varijanta ICOSL polipeptida sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina u ICOSL referentnom polipeptidu ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu koje odgovaraju modifikacijama amino-kiselina izabranim iz N52A, N52C, N52D, N52G, N52K, N52L, N52M, N52R, N52T, N52V, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, Q100A, Q100D, Q100G, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100S, Q100T ili Q100V uz upućivanje na SEQ ID NO:32. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane iz N52A/N57F/Q100S, N52A,/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/ N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L ili N57Q/Q100P.
[0094] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, ICOSL referentni polipeptid je ICOSL sisara ili njegov specifični vezujući fragment. U nekim primerima, ICOSL referentni polipeptid je humani ICOSL ili njegov specifični vezujući fragment.
[0096] [0030] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, ICOSL referentni polipeptid sadrži (i) sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO:32, (ii) sekvencu amino-kiselina koja ima najmanje 95% identiteta sekvence sa SEQ ID NO:32; ili (iii) deo (i) ili (ii) koji sadrži IgV domen ili IgC domen ili njihove specifične vezujuće fragmente ili oba. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, specifični vezujući fragment IgV domena ili IgC domena ima dužinu od najmanje 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 ili više amino-kiselina; ili specifični vezujući fragment IgV domena sadrži dužinu koja je najmanje 80% dužine IgV domena navedenog kao amino-kiseline 19-129 u SEQ ID NO:5 i/ili specifični vezujući fragment IgC domena sadrži dužinu koja je najmanje 80% dužine IgC domena navedenog kao amino-kiseline 141-227 u SEQ ID NO:5. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži IgV domen ili njegov specifični fragment i IgC domen ili njegov specifični fragment.
[0098] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 638-685, ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 638-685. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida se sastoji od sekvence amino-kiselina navedene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 638-685, ili sekvence amino-kiselina koja ispoljava najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 638-685.
[0100] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži IgV domen ili njegov specifični vezujući fragment. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 686-781, ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 686-781. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida se sastoji od sekvence amino-kiselina navedene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 686-781, ili sekvence amino-kiselina koja ispoljava najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 686-781.
[0102] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, IgV domen ili njegov specifični vezujući fragment je jedini ICOSL deo varijante ICOSL polipeptida. U nekim primerima, IgC domen ili njegov specifični vezujući fragment je jedini ICOSL deo varijante ICOSL polipeptida.
[0104] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida ispoljava izmenjeno vezivanje za ektodomen ICOS ili CD28 u poređenju sa vezivanjem ICOSL referentnog polipeptida za isti ektodomen. U nekim aspektima, varijanta ICOSL polipeptida ispoljava povećano vezivanje za ektodomen(e) ICOS ili CD28 u poređenju sa vezivanjem ICOSL referentnog polipeptida za isti ektodomen(e). U nekim primerima, vezivanje je povećano više od 1,2 puta, 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta ili 60 puta.
[0105] U nekim od takvih realizacija, ICOS je humani ICOS. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, CD28 je humani CD28.
[0107] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida ispoljava smanjeno vezivanje za ektodomen CTLA-4 u poređenju sa vezivanjem referentnog ICOSL polipeptida za isti ektodomen. U nekim primerima, vezivanje je smanjeno više od 1,2 puta, 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta ili 60 puta. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, CTLA-4 je humani CTLA-4.
[0109] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, izmenjeno (povećano ili smanjeno) vezivanje je izmenjeni (povećani ili smanjeni) afinitet vezivanja. U nekim od takvih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 modifikacija amino-kiselina, opciono supstitucija amino-kiselina, insercija i/ili delecija. U nekim slučajevima, varijanta ICOSL polipeptida ispoljava najmanje ili najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa referentnim ICOSL polipeptidom.
[0111] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida je rastvorljivi protein. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida nema transmembranski domen i intracelularni signalni domen; i/ili kada se eksprimuje iz ćelije, varijanta ICOSL polipeptida se ne eksprimuje na površini ćelije.
[0113] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida dalje sadrži transmembranski domen. U nekim slučajevima, transmembranski domen sadrži sekvencu aminokiselina navedenu kao ostaci 257-277 u SEQ ID NO:5 ili njegovu funkcionalnu varijantu koja ispoljava najmanje 85% identiteta sekvence sa ostacima 257-277 u SEQ ID NO:5. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida dalje sadrži citoplazmatski signalni domen vezan sa transmembranskim domenom. U nekim slučajevima, citoplazmatski signalni domen sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu kao ostaci 278-302 u SEQ ID NO:5 ili njegovu funkcionalnu varijantu koja ispoljava najmanje 85% identiteta sekvence sa ostacima 278-302 u SEQ ID NO:5.
[0115] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida je deglikozilovana ili delimično deglikozilovana u poređenju sa ICOSL referentnom sekvencom.
[0116] Ovde je dat imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju od datih varijanti ICOSL polipeptida i deo koji produžava poluživot. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, deo koji produžava poluživot sadrži multimerizacioni domen, albumin, polipeptid koji vezuje albumin, Pro/Ala/Ser (PAS), C-terminalni peptid (CTP) beta podjedinice humanog horionskog gonadotropina, polietilen glikol (PEG), duge nestrukturirane hidrofilne sekvence amino-kiselina (XTEN), hidroksietilni skrob (HES), mali molekul koji vezuje albumin ili njihovu kombinaciju. U nekim slučajevima, deo koji produžava poluživot jeste ili sadrži Pro/Ala/Ser (PAS), a varijanta ICOSL polipeptida je PAS-ilovana. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, deo koji produžava poluživot sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:904.
[0118] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, deo koji produžava vreme poluraspada jeste ili sadrži domen multimerizacije. U nekim slučajevima, domen multimerizacije je izabran iz Fc regiona imunoglobulina, leucinskog zatvarača, izoleucinskog zatvarača ili cinkovog prsta. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida je vezana, direktno ili indirektno preko linkera, sa domenom multimerizacije.
[0120] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, imunomodulatorni protein je multimer koji sadrži prvu varijantu ICOSL polipeptida vezanu sa prvim domenom multimerizacije i drugu varijantu ICOSL polipeptida vezanu sa drugim domenom multimerizacije, pri čemu prvi i drugi domen multimerizacije interaguju da bi formirali multimer koji sadrži prvu i drugu varijantu ICOSL polipeptida. U nekim slučajevima, multimer je dimer.
[0122] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, prva varijanta ICOSL polipeptida i druga varijanta ICOSL polipeptida su iste. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, dimer je homodimer. U nekim slučajevima, dimer je heterodimer.
[0124] [0045] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, multimerizacioni domen jeste ili sadrži Fc region imunoglobulina. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, Fc region je proteina imunoglobulina G1 (IgG1) ili imunoglobulina G2 (IgG2). U nekim primerima, imunoglobulinski protein je humani i/ili je Fc region humani. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, Fc region sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO: 227 ili njenu varijantu koja ispoljava najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa SEQ ID NO:227. U nekim aspektima, Fc region sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO: 226 ili njenu varijantu koja ispoljava najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 226. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, Fc region ispoljava jednu ili više efektorskih funkcija. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, Fc region ispoljava jednu ili više smanjenih efektorskih funkcija u poređenju sa Fc regionom divljeg tipa, pri čemu je opciono humani Fc divljeg tipa humani IgG1.
[0126] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, jedna ili više efektorskih funkcija je izabrana iz grupe ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), citotoksičnosti zavisne od komplementa, programirane ćelijske smrti i ćelijske fagocitoze. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, Fc region je varijanta Fc regiona koja sadrži jednu ili više supstitucija amino-kiselina u poređenju sa Fc regionom divljeg tipa.
[0128] U nekim od navedenih primera, jedna ili više amino-kiselinskih supstitucija varijante Fc regiona su izabrane iz N297G, E233PAL234VAL235A/G236del/S267K ili L234A/L235E/G237A, pri čemu je ostatak numerisan prema EU indeksu Kabata. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta Fc regiona dalje sadrži amino-kiselinsku supstituciju C220S, pri čemu su ostaci numerisani prema EU indeksu Kabata. U nekim aspektima, Fc region sadrži sekvencu amino-kiselinskih sekvenci navedenih u bilo kojoj od SEQ ID NO: 476-478 ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 476-478 i sadrži supstitucije aminokiselina. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, Fc region sadrži K447del, pri čemu je ostatak numerisan prema EU indeksu Kabat.
[0130] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, Fc region sadrži sekvencu amino-kiselinskih sekvenci navedenih u bilo kojoj od SEQ ID NO: 632-634 ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 632-634 i sadrži supstitucije amino-kiselina.
[0132] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, Fc region sadrži sekvencu amino-kiseline navedenu u SEQ ID NO: 474 ili 637, ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 474 ili 637 i sadrži supstitucije amino-kiselina.
[0134] [0050] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, Fc region sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO: 478 ili SEQ ID NO: 634. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, Fc region sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO: 477. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, Fc region sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO: 633. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, Fc region sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO: 474. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, Fc region sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO: 637.
[0136] Ovde je dat imunomodulatorni protein koji sadrži (a) varijantu ICOSL polipeptida koja sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina u domenu superfamilije imunoglobulina (IgSF) ICOSL referentnog polipeptida, pri čemu varijanta ICOSL polipeptida ispoljava izmenjeno vezivanje za ektodomen(e) ICOS ili CD28 u poređenju sa vezivanjem ICOSL referentnog polipeptida za isti ektodomen(e); i (b) varijantu Fc regiona koja sadrži supstitucije amino-kiselina izabrane iz N297G/K447del, E233P/L234V/L235A/G236dellS267K/K447del ili L234A/L235E/G237A/K447del u poređenju sa divljim tipom humanog IgG1, pri čemu su ostaci numerisani prema EU indeksu Kabata. U nekim slučajevima, imunomodulatorni protein je dimer. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta Fc regiona dalje sadrži supstituciju aminokiseline C220S, pri čemu su ostaci numerisani prema EU indeksu Kabata. U nekim primerima, Fc region sadrži sekvencu amino-kiseline navedenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 632-634 ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 632-634 i sadrži supstitucije aminokiselina. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, Fc region sadrži sekvencu amino-kiseline navedenu u SEQ ID NO: 474 ili 637, ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 474 ili 637 i sadrži supstitucije amino-kiselina.
[0138] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida je vezana, direktno ili indirektno preko linkera, sa varijantom Fc regiona. U nekim primerima, linker sadrži 1 do 10 amino-kiselina. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, linker je izabran iz AAA, G4S (SEQ ID NO: 636), (G<4>S)<2>(SEQ ID NO: 229) ili GSGGGGS linker (SEQ ID NO: 635). U nekim od bilo kojih od datih realizacija, linker je (G<4>S)<3>(SEQ ID NO: 228).
[0140] [0053] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, linker je AAA. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, linker je G4S (SEQ ID NO:636). U nekim od bilo kojih od datih realizacija, linker je (G<4>S)<2>(SEQ ID NO: 229). U nekim od bilo kojih od datih realizacija, linker je GSGGGGS linker (SEQ ID NO: 635).
[0142] U nekim od bilo kojih od datih realizacija fuzionog proteina, npr. varijanta ICOSL-Fc fuzionog proteina, varijanta ICOSL polipeptida jeste ili sadrži IgV domen. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži modifikacije amino-kiselina N52H/Q100R. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 567. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži modifikacije amino-kiselina N52H/N57Y/Q100R. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 565. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži modifikacije amino-kiselina N52L/N57H/Q100R. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 761. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži modifikacije amino-kiselina N52H/N57Y/Q100P. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 570. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži modifikaciju amino-kiselina N52D. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, polipeptid ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 548.
[0144] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, data je varijanta ICOSL-Fc fuzionog proteina koja ima sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO: 928. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, data je varijanta ICOSL-Fc fuzionog proteina koja ima sekvencu amino-kiselina koja ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 928.
[0146] U određenim realizacijama, obezbeđeni imunomodulatorni proteini, kao što su fuzioni proteini, npr. varijanta ICOSL-Fc fuzionih proteina, vezuje CD28 i ICOS. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL-Fc fuzionog proteina ispoljava povećan afinitet vezivanja za CD28 i/ili ICOS u poređenju sa humanim divljim tipom ICOSL-Fc fuzionog proteina, npr. koji sadrži ICOSL IgV deo naveden u SEQ ID NO:545 vezan preko linkera, npr. navedenog u SEQ ID NO:229, sa Fc regionom. U takvom primeru, Fc region je inertan ili Fc bez efektora koji sadrži mutacije L234A, L235E i L235E u humanom IgG1 Fc, npr. navedenom u SEQ ID NO:637.
[0147] Ovde je dat imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koji od varijantnih ICOSL polipeptida vezanih sa drugim polipeptidom, koji obuhvata domen superfamilije imunoglobulina (IgSF). U nekim slučajevima, IgSF domen je afinitetno modifikovan i ispoljava izmenjeno vezivanje za jednog ili više svojih srodnih partnera za vezivanje u poređenju sa nemodifikovanim ili IgSF domenom divljeg tipa. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, IgSF domen ispoljava povećano vezivanje za jednog ili više svojih srodnih partnera za vezivanje u poređenju sa nemodifikovanim ili IgSF domenom divljeg tipa.
[0149] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida je prvi varijantni ICOSL polipeptid, a IgSF domen drugog polipeptida je IgSF domen iz drugog varijantnog ICOSL polipeptida date ovde, pri čemu su prva i druga ICOSL varijanta iste ili različite.
[0151] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida je sposobna da se specifično veže za CD28 ili ICOS, a IgSF domen drugog polipeptida je sposoban da se veže za partnera za vezivanje koji nije specifično vezan varijantom ICOSL polipeptida. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, IgSF domen je od člana porodice B7.
[0153] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, IgSF domen je deo koji lokalizuje tumor i vezuje se za ligand eksprimovan na tumoru ili je deo koji lokalizuje upalu i vezuje se za ligand eksprimovan na ćeliji ili tkivu inflamatornog okruženja. U nekim slučajevima, ligand je B7H6. U nekim primerima, IgSF domen je iz NKp30.
[0155] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, IgSF domen drugog polipeptida jeste ili sadrži IgV domen. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, IgSF domen drugog polipeptida je varijanta NKp30 molekula koja sadrži L30V/A60V/S64P/S86G. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, IgSF domen drugog polipeptida ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 504.
[0157] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, IgSF domen jeste ili sadrži IgV domen. U nekim slučajevima, varijanta ICOSL polipeptida jeste ili sadrži IgV domen.
[0159] [0063] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida jeste ili sadrži IgV domen. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži modifikacije amino-kiselina N52H/Q100R. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 567. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži modifikacije amino-kiselina N52H/N57Y/Q100R. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 565. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži modifikacije amino-kiselina N52L/N57H/Q100R. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 761. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži modifikacije amino-kiselina N52H/N57Y/Q100P. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 570. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži modifikaciju amino-kiselina N52D. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, polipeptid ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 548.
[0161] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, imunomodulatorni protein sadrži multimerizacioni domen vezan sa jednim ili oba od varijante ICOSL polipeptida ili drugog polipeptida koji sadrži IgSF domen. U nekim slučajevima, multimerizacioni domen je Fc domen ili njegova varijanta sa smanjenom efektorskom funkcijom.
[0163] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, imunomodulatorni protein je dimeran. U nekim slučajevima, imunomodulatorni protein je homodimeran. U nekim aspektima, imunomodulatorni protein je heterodimeran.
[0165] Ovde je dat konjugat koji sadrži bilo koji od obezbeđenih varijantnih ICOSL polipeptida ili bilo koji od obezbeđenih imunomodulatornih proteina i heterologni deo. U nekim slučajevima, varijantni ICOSL polipeptid je vezan, direktno ili indirektno preko linkera, sa heterolognim delom. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, ciljajući deo je protein, peptid, nukleinska kiselina, mali molekul ili nanočestica. U nekim primerima, ciljajući deo je protein ili peptid. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, konjugat je fuzioni protein.
[0167] Obezbeđen je fuzioni protein koji sadrži bilo koji od obezbeđenih varijantnih ICOSL polipeptida ili bilo koji od obezbeđenih imunomodulatornih proteina i heterologni deo. U nekim slučajevima, deo je ciljajući deo koji se specifično vezuje za molekul na površini ćelije. U nekim primerima, ciljajući deo se specifično vezuje za molekul na površini imune ćelije. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, imuna ćelija je ćelija koja prezentuje antigen ili limfocit. U nekim slučajevima, ciljajući deo je tumor-lokalizujući deo koji se vezuje za molekul na površini tumora.
[0168] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, ciljajući deo se vezuje za molekul HER1/EGFR, HER2/ERBB2, CD20, CD25 (IL‑2Rα receptor), CD33, CD52, CD133, CD206, CEA, CEACAM1, CEACAM3, CEACAM5, CEACAM6, antigen raka 125 (CA125), alfa-fetoprotein (AFP), Lewis Y, TAG72, Caprin-1, mezotelin, PDGF receptor (PDGFR; kao što je PDGF-Rα), PD-1, PD-L1, CTLA-4, IL-2 receptor, faktor rasta vaskularnog endotela (VEGF), CD30, EpCAM, EphA2, Glypican-3, gpA33, mucine, CAIX, PSMA, protein koji vezuje folat, gangliozide (kao što su GD2, GD3, GM1 i GM2), VEGF receptor (VEGFR), VEGFR2, VEGF-A, integrin αVβ3, integrin α5β1, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, tenascin, AFP, BCR kompleks, CD3, CD18, CD44, CTLA-4, gp72, HLA-DR 10 β, HLA-DR antigen, IgE, MUC-1, nuC242, PEM antigen, metaloproteinaze, efrinski receptor, efrinske ligande, HGF receptor, CXCR4, CXCR4, bombezin receptor, SK-1antigen, Bcr-abl, RET, MET, TRKB, TIE2, ALK, ROS, EML4-ALK, ROS1, BRAFV600E, SRC, c-KIT, mTOR, TSC1, TSC2, BTK, KIT, BRCA, CDK 4/6, JAK1, JAK2, BRAF, FLT-3, MEK1, MEK2, SMO ili B7-H6 (NCR3LG1). U nekim aspektima, ciljajući deo se vezuje za PD-L1.
[0170] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, ciljajući deo je antitelo ili fragment koji vezuje antigen. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, antitelo je izabrano iz grupe: cetuksimab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, trastuzumab, Ado-trastuzumab emtanzin, Tozitumomab (Bexxar<®>), Rituksimab (Rituxan, Mabthera), Ibritumomab tiuksetan (Zevalin), Daklizumab (Zenapax), Gemtuzumab (Mylotarg), Alemtuzumab, CEA-scan Fab fragment, OC125 monoklonsko antitelo, ab75705, B72.3, Bevacizumab (Avastin®), Afatinib, Aksitinib, Bosutinib, Kabozantinib, Ceritinib, Krizotinib, Dabrafenib, Dasatinib, Dinutuksimab (Unituxin™), Erlotinib, Everolimus, Ibrutinib, Imatinib, Lapatinib, Lenvatinib, Nilotinib, Olaparib, Olaratumab (Lartruvo™), Palbociclib, Pazopanib, Pertuzumab (Perjeta®), Ramucirumab (Cyramza®), Regorafenib, Ruxolitinib, Sorafenib, Sunitinib, Temsirolimus, Trametinib, Vandetanib, Vemurafenib, Vismodegib, Basiliximab, Ipilimumab, Nivolumab, pembrolizumab, MPDL3280A, Pidilizumab (CT‑011), AMP‑224, MSB001078C, ili MEDI4736, BMS‑935559, LY3300054, atezolizumab, avelumab ili durvalumab ili je njihov fragment koji se vezuje za antigen.
[0172] [0070] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida je vezana, direktno ili indirektno preko linkera, sa N-terminusom teškog i/ili lakog lanca antitela ili fragmenta koji vezuje antigen. U nekim slučajevima, varijanta ICOSL polipeptida je vezana, direktno ili indirektno preko linkera, sa C-terminusom teškog i/ili lakog lanca antitela ili fragmenta koji vezuje antigen.
[0174] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, konjugat je dvovalentni, četvorovalentni, šestovalentni ili oktavalentni. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, heterologni deo jeste ili sadrži oznaku za detekciju ili prečišćavanje varijante ICOSL polipeptida.
[0176] Ovde je dat monovalentni fuzioni protein koji sadrži varijantu ICOSL polipeptida koja sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina u domenu superfamilije imunoglobulina (IgSF) referentnog ICOSL polipeptida, pri čemu varijanta ICOSL polipeptida ispoljava izmenjeno vezivanje za ektodomen(e) ICOS ili CD28 u poređenju sa vezivanjem ICOSL referentnog polipeptida za isti ektodomen(e); i oznaku za detekciju ili prečišćavanje varijante ICOSL polipeptida. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, oznaka za detekciju ili prečišćavanje je izabrana iz polihistidinske (His) oznake, FLAG-oznake, Myc-oznake ili fluorescentne proteinske oznake.
[0178] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji(ama) izabranim iz 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 148, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225, ili 227 uz upućivanje na SEQ ID NO:32. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina koje se nalaze na poziciji koja odgovara poziciji(ama) izabranim iz 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 26, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ili 227 uz upućivanje na SEQ ID NO:32.
[0180] [0074] U nekim slučajevima, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane iz M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20V, S25G, F27S, F27C, N30D, Y33del, Q37R, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N52K, S54A, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57Y, N57W, R61S, R61C, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, E90A, K92R, F93L, H94E, H94D, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110D, V110N, V110A, E111del, T113E, H115R, H115Q, V116A, A117T, N119Q, F120I, S121G, V122A, V122M, F120S, S126T, S126R, H129P, S130G,S132F, Q133H, E135K, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F,I143V, I143T, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H,W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161P, L161M, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193M, N194D, C198R, N201S, L203P, L203F, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217V, I218T, I218N, E220G, R221G, R221I, I224V, T225A, N227K, ili njihove konzervativne amino-kiselinske supstitucije. U nekim slučajevima, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane iz M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20T, A20V, S25G, R26S, F27C, F27S, N30D, Y33del, Q37R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R61S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110A, V110D, V110N, E111del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S, S121G, V122A, V122M, S126R,S126T, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, I143T, I143V, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H, W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161M, L161P, Q164L, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193A, V193M, N194D, C198R, N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, I218N, I218T, E220G, R221G, R221I, R221K, I224V, T225A, T225S, N227K ili njihove konzervativne amino-kiselinske supstitucije.
[0182] [0075] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, ICOSL referentni polipeptid sadrži (i) sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO:32, (ii) sekvencu amino-kiselina koja ima najmanje 95% identiteta sekvence sa SEQ ID NO:32; ili (iii) deo (i) ili (ii) koji sadrži IgV domen ili IgC domen ili njihove specifične vezujuće fragmente ili oba.
[0184] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, ICOSL referentni polipeptid sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 196, 545, 600-605 i 623-628. U nekim aspektima, ICOSL referentni polipeptid se sastoji od sekvence amino-kiselina navedene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 32, 196, 545, 600-605 i 623-628.
[0186] Obezbeđen je molekul(i) nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koji od obezbeđenih varijantnih ICOSL polipeptida, imunomodulatornih proteina ili fuzionih proteina. U nekim slučajevima, molekul(i) nukleinske kiseline su sintetičke nukleinske kiseline. U nekim primerima, molekul(i) nukleinske kiseline su cDNK.
[0188] Obezbeđen je vektor koji sadrži bilo koji od obezbeđenih molekula nukleinske kiseline. U nekim slučajevima, vektor je ekspresioni vektor. U nekim od bilo kojih obezbeđenih realizacija, vektor je ekspresioni vektor sisara ili virusni vektor.
[0190] Obezbeđena je ćelija koja sadrži bilo koji od obezbeđenih vektora. U nekim slučajevima, ćelija je ćelija sisara. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, ćelija je ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili njen derivat.
[0192] Obezbeđen je postupak proizvodnje imunomodulatornog proteina koji sadrži bilo koji od varijantnih ICOSL polipeptida, uključujući unošenje bilo kog od obezbeđenih molekula nukleinske kiseline ili vektora u ćeliju domaćina pod uslovima za ekspresiju proteina u ćeliji. U nekim primerima, ćelija domaćin je ćelija sisara. U nekim slučajevima, ćelija sisara je ćelija jajnika kineskog hrčka ili njen derivat. U nekim od bilo kojih obezbeđenih realizacija, postupak dalje uključuje izolovanje ili prečišćavanje proteina iz ćelije.
[0194] Obezbeđen je protein proizveden bilo kojim od navedenih postupaka.
[0196] [0082] Obezbeđena je kompozicija koja sadrži protein koji sadrži bilo koji od obezbeđenih varijantnih ICOSL polipeptida ili imunomodulatornih proteina, pri čemu najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% pojedinačnih sekvenci proteina ili imunomodulatornog proteina u kompoziciji imaju identičnu dužinu sekvence, opciono pri čemu je kompozicija farmaceutska kompozicija koja sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, protein ili imunomodulatorni protein je prečišćen iz ćelija jajnika kineskog hrčka ili njihovog derivata.
[0198] Obezbeđen je polinukleotid koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira varijantu ICOSL polipeptida koja sadrži obezbeđeni transmembranski domen i jednu ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju jedan ili više lanaca rekombinantnog antigenskog receptora. U nekim slučajevima, rekombinantni antigenski receptor je himerni antigenski receptor (CAR) ili konstruisani T ćelijski receptor (TCR). U nekim od bilo kojih od datih realizacija, svaka od nukleinskih kiselina koje kodiraju varijantu ICOSL polipeptida i jedne ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju jedan ili više lanaca rekombinantnog receptora su razdvojene nukleinskom kiselinom koja kodira samocepljujući peptid ili peptid koji izaziva preskakanje ribozoma.
[0200] U nekim primerima, polinukleotid sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira varijantu ICOSL polipeptida, nukleinsku kiselinu koja kodira samocepajući peptid ili peptid koji izaziva preskakanje ribozoma i nukleinsku kiselinu koja kodira CAR. U nekim primerima, polinukleotid obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira varijantu ICOSL polipeptida, nukleinsku kiselinu koja kodira prvi samocepajući peptid ili peptid koji izaziva preskakanje ribozoma, nukleinsku kiselinu koja kodira jedan od konstruisanog TCRalfa lanca ili konstruisanog TCRbeta lanca, nukleinsku kiselinu koja kodira drugi samocepajući peptid ili peptid koji izaziva preskakanje ribozoma i nukleinsku kiselinu koja kodira drugi od konstruisanog TCRalfa lanca ili konstruisanog TCRbeta lanca. U nekim aspektima, kodirani prvi i drugi samocepajući peptid su isti. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, samocepajući peptid ili peptid koji izaziva preskakanje ribozoma je T2A, P2A, E2A ili F2A.
[0202] Obezbeđen je vektor koji sadrži bilo koji od obezbeđenih polinukleotida. U nekim slučajevima, vektor je virusni vektor. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, virusni vektor je retrovirusni vektor ili lentivirusni vektor.
[0204] Obezbeđena je konstruisana ćelija koja sadrži bilo koji od obezbeđenih polinukleotida ili vektora. Takođe je obezbeđena konstruisana ćelija koja sadrži bilo koji od obezbeđenih varijantnih ICOSL polipeptida, imunomodulatornih proteina ili fuzionih proteina.
[0206] [0087] Obezbeđena je genetski modifikovana ćelija koja sadrži bilo koji od obezbeđenih molekula nukleinske kiseline ili vektora. U nekim slučajevima, nukleinska kiselina koja kodira varijantni ICOSL polipeptid, imunomodulatorni protein ili fuzioni protein kodira signalni peptid. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijantni ICOSL polipeptid, imunomodulatorni protein ili fuzioni protein ne sadrži transmembranski domen i/ili se ne eksprimuje na površini ćelije. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijantni ICOSL polipeptid, imunomodulatorni protein ili fuzioni protein se luči iz genetski modifikovane ćelije. U nekim aspektima, genetski modifikovana ćelija sadrži varijantni ICOSL polipeptid koji sadrži transmembranski domen. U nekim aspektima, varijantni ICOSL polipeptid se eksprimuje na površini ćelije.
[0208] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, ćelija je imuna ćelija. U nekim slučajevima, imuna ćelija je ćelija koja prezentuje antigen (APC) ili limfocit. U nekim primerima, konstruisana ćelija je primarna ćelija. U nekim slučajevima, ćelija je ćelija sisara. U nekim slučajevima, ćelija je humana ćelija. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, limfocit je T ćelija. U nekim primerima, konstruisana ćelija je APC, a APC je veštačka APC.
[0210] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, genetski modifikovana ćelija dodatno sadrži himerni antigenski receptor (CAR) ili genetski modifikovani T-ćelijski receptor.
[0212] Obezbeđen je infektivni agens koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira obezbeđeni varijantni ICOSL polipeptid ili obezbeđeni imunomodulatorni protein, kao i obezbeđeni fuzioni protein. U nekim slučajevima, kodirani varijantni ICOSL polipeptid, imunomodulatorni protein ili fuzioni protein ne sadrži transmembranski domen i/ili se ne eksprimuje na površini ćelije u koju se eksprimuje. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, kodirani varijantni ICOSL polipeptid, imunomodulatorni protein ili fuzioni protein se izlučuje iz infektivnog agensa kada se eksprimuje. U nekim slučajevima, kodirani varijantni ICOSL polipeptid sadrži transmembranski domen.
[0214] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, kodirana varijanta ICOSL polipeptida se eksprimuje na površini ćelije u kojoj se eksprimuje. U nekim slučajevima, infektivni agens je bakterija ili virus. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, virus je onkolitički virus. U nekim primerima, onkolitički virus je adenovirus, adeno asocirani virus, virus herpesa, virus herpes simpleksa, virus vezikularnog stomatitisa, reovirus, virus Njukaslske bolesti, parvovirus, virus malih boginja, virus vezikularnog stomatitisa (VSV), koksaki virus ili virus vakcinije.
[0215] [0092] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, virus specifično cilja dendritske ćelije (DC) i/ili je tropan za dendritske ćelije. U nekim slučajevima, virus je lentivirusni vektor koji je pseudotipizovan modifikovanim proizvodom omotača virusa Sindbis. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, infektivni agens dalje sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira dodatni genski proizvod koji rezultira smrću ciljne ćelije ili koji može pojačati ili podstaći imuni odgovor. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, dodatni genski proizvod je izabran iz antikancerogenog sredstva, antimetastatskog sredstva, antiangiogenog sredstva, imunomodulatornog molekula, inhibitora imunološke kontrolne tačke, antitela, citokina, faktora rasta, antigena, citotoksičnog genskog proizvoda, pro-apoptotičkog genskog proizvoda, anti-apoptotičkog genskog proizvoda, gena za degradaciju ćelijskog matriksa, gena za regeneraciju tkiva ili reprogramiranja humanih somatskih ćelija u pluripotentnost.
[0217] Obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži bilo koji od varijantnih ICOSL polipeptida, imunomodulatornih proteina, konjugata ili fuzionih proteina ili bilo koji od obezbeđenih konstruisanih ćelija ili infektivnih agenasa. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, farmaceutska kompozicija sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, farmaceutska kompozicija je sterilna.
[0219] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, obezbeđen je proizvodni artikal koji sadrži farmaceutsku kompoziciju u bočici. U nekim slučajevima, bočica je zapečaćena.
[0221] Obezbeđen je komplet koji sadrži bilo koju od obezbeđenih kompozicija i uputstva za upotrebu. Takođe je obezbeđen komplet koji sadrži bilo koji od obezbeđenih proizvodnih artikala i uputstva za upotrebu.
[0223] Obezbeđen je postupak modulacije imunog odgovora kod subjekta, uključujući davanje farmaceutske kompozicije subjektu. Takođe je obezbeđen postupak modulacije imunog odgovora kod subjekta, uključujući davanje konstruisanih/genetski modifikovanih ćelija. U nekim slučajevima, genetski modifikovane ćelije su autologne subjektu. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, genetski modifikovane ćelije su alogene subjektu.
[0225] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, moduliranje imunog odgovora leči bolest ili stanje kod subjekta. U nekim aspektima, imuni odgovor je pojačan.
[0227] [0098] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, imunomodulatorni protein ili konjugat koji sadrži varijantu ICOSL polipeptida vezanu sa delom koji lokalizuje tumor se daje subjektu. U nekim slučajevima, deo koji lokalizuje tumor jeste ili sadrži vezujući molekul koji prepoznaje tumorski antigen. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, vezujući molekul sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ili sadrži IgSF domen divljeg tipa ili njegovu varijantu. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, imunomodulatorni protein ili konjugat ili fuzioni protein se daje subjektu. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida koji je transmembranski imunomodulatorni protein se daje subjektu. U nekim slučajevima, konstruisana ćelija koja sadrži varijantu ICOSL polipeptida koji je transmembranski imunomodulatorni protein se daje subjektu. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, bolest ili stanje je tumor ili rak. U nekim primerima, bolest ili stanje je izabrano iz melanoma, raka pluća, raka bešike, hematološkog maligniteta, raka jetre, raka mozga, raka bubrega, raka dojke, raka pankreasa, kolorektalnog karcinoma, raka slezine, raka prostate, raka testisa, raka jajnika, raka materice, karcinoma želuca, mišićno-skeletnog karcinoma, raka glave i vrata, gastrointestinalnog karcinoma, raka germinativnih ćelija ili endokrinog i neuroendokrinog karcinoma. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, imuni odgovor je smanjen.
[0229] U nekim od bilo kojih od datih realizacija, varijanta ICOSL polipeptida ili imunomodulatornog proteina koji je rastvorljiv se daje subjektu. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, rastvorljivi imunomodulatorni protein je imunomodulatorni Fc fuzioni protein. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, obezbeđena varijanta ICOSL polipeptida, imunomodulatornog proteina ili fuzionog proteina se daje subjektu. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, subjektu se daje konstruisana ćelija koja sadrži sekretibilnu varijantu ICOSL polipeptida. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, subjektu se daje konstruisana ćelija. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, infektivni agens koji kodira varijantu ICOSL polipeptida koji je sekretibilni imunomodulatorni protein se daje subjektu, opciono pod uslovima u kojima infektivni agens inficira tumorsku ćeliju ili imunološku ćeliju, a sekretibilni imunomodulatorni protein se sekretuje iz inficirane ćelije. U nekim od bilo kojih od datih realizacija, bolest ili stanje je inflamatorna ili autoimuna bolest ili stanje. U nekim primerima, bolest ili stanje je vaskulitis vezan sa antineutrofilnim citoplazmatskim antitelima (ANCA), vaskulitis, autoimuna kožna bolest, transplantacija, reumatska bolest, inflamatorna gastrointestinalna bolest, inflamatorna bolest oka, inflamatorna neurološka bolest, inflamatorna plućna bolest, inflamatorna endokrina bolest ili autoimuna hematološka bolest. U nekim slučajevima, bolest ili stanje je izabrano iz inflamatorne bolesti creva, transplantacije, Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa, multiple skleroze, astme, reumatoidnog artritisa ili psorijaze.
[0230] Kratak opis slika
[0232]
[0234] Sl. 1 prikazuje rezultate impedanse koji odražavaju citotoksičnu aktivnost ubijanja ćelija konstruisanih sa anti-CD19 himernim antigenskim receptorom (CAR) samim ili sa primernim transmembranskim imunomodulatornim TIP-om (CD80-TIP ili ICOSL-TIP) ili odgovarajućim CD80 ili ICOSL transmembranskim proteinom divljeg tipa nakon kokultivisanja sa ciljnim ćelijama koje eksprimuju antigen. Impedansa je procenjena pomoću Acea Real-Time Cell Analyzer-a (RTCA), koji meri varijacije impedanse u medijumu za kultivaciju mikroelektronske ploče sa 96 ležišta (E-ploča).
[0236] Slika 2A prikazuje da su primarne T ćelije efikasno transdukovane virusima koji kodiraju i CAR i TIP proteine. Primarne humane T ćelije su aktivirane 48 sati sa anti-CD3 plus anti-CD28 perlama, a zatim su transdukovane sa Lenti-virusom koji kodira anti-CD19 CAR sa BFP reporterom, plus drugim Lenti-virusom koji kodira i ICOSL TIP sa GFP reporterom. FAC grafikon prikazuje ekspresiju BFP na y-osi i ekspresiju GFP na x-osi, a naznačen je i procenat T ćelija koje spadaju u svaki kvadrant. Rezultati pokazuju da kulture uključuju ćelije transdukovane samo CAR-om (gornji levi kvadrant), ćelije transdukovane samo TIP-om (donji desni kvadrant), ćelije transdukovane sa oba virusa (gornji desni kvadrant) i ćelije koje nisu transdukovane ni sa jednim (dole levo). Na Sl.2B, TIP-ovi eksprimovani na CAR-T ćelijama obezbeđuju kostimulaciju CAR-T ćelijama. CAR-T ćelije sa ili bez TIP kotransdukcije su obeležene sa Cell-Trace Far Red i inkubirane sa CD19+ NALM6 ćelijskom linijom da bi angažovale CAR. Proliferacija je procenjena procentom ćelija koje eksprimuju CAR i koje su razblažile fluorescentnu boju. Ćelije transdukovane mutiranim TIP-ovima pokazale su povećanu proliferaciju CAR+ T ćelija u poređenju sa onima bez TIP-ova ili onima transdukovanim sa divljim tipom ICOSL. Ćelije lažno transdukovane kojima je nedostajala CAR ekspresija nisu uspele da se razmnože u ovom testu.
[0238] Sl. 3A-3B demonstriraju, putem oslobađanja citokina, kostimulativni kapacitet divljeg tipa (WT) ili varijante ICOSL kada su koimobilizovani sa anti-CD3. 10 nM anti-CD3 je vlažno obloženo u ležišta polistirenskih ploča za uzgoj tkiva sa ravnim dnom od 96 ležišta sa 40 nM (strelice) ili 10 nM WT ili varijantom ICOSL. Dodato je 100.000 prečišćenih CD4<+>i CD8<+>(pan) T-ćelija i supernatant je sakupljen 72 sata kasnije za ELISA analizu za oslobađanje citokina. Sl.3A ispoljava IFN-gama i Sl. 3B prikazuje nivoe proteina IL-17 koje luče pan T-ćelije. Grafikoni su reprezentativni za uobičajene odgovore IFN-gama i IL-17 iz pan T-ćelijske kostimulacije.
[0240] Sl. 4A-4B demonstriraju, putem proliferacije, kostimulativni kapacitet divljeg tipa (WT) ili varijante ICOSL kada su koimobilizovane sa anti-CD3. CFSE-obeležene pan T-ćelije su inkubirane u pločama obloženim anti-CD3 i ICOSL kao što je prethodno opisano tokom 72 sata. Ćelije su sakupljene, isprane, obojene fluorescentno konjugovanim anti-CD4 ili anti-CD8 antitelima i analizirane protočnom citometrijom. Gejtovi i naponi citometra su podešeni korišćenjem nestimulisanih kontrolnih CFSE-obeleženih T-ćelija. Proliferacija je određena CFSE razblaživanjem iz kontrole. Sl. 4A prikazuje procenat ukupnih proliferirajućih (strelice), CD4<+>(puna traka) i CD8<+>ćelija (šrafirana traka) T-ćelija nakon kostimulacije sa 40 nM ICOSL. Slika 4B prikazuje procenat ukupne proliferacije pan T-ćelija nakon kostimulacije sa 10 nM ICOSL. Grafikoni predstavljaju uobičajeni proliferativni odgovor kostimulacije pan T-ćelija.
[0242] Sl. 5 prikazuje funkciju ICOSL vIgD kandidata u reakciji mešovitih humanih limfocita (MLR). ICOSL varijante i njihove mutacije su navedene na x-osi, zajedno sa divljim tipom ICOSL, negativnim kontrolama PDL2-Fc i humanim IgG, kao i pozitivnim kontrolnim referentnim molekulom CTLA-Ig Belatacept. Linija preko grafikona predstavlja osnovnu količinu IFN-γ detektovanu u supernatantima kultura negativne kontrole. Za svakog kandidata ili kontrolu ICOSL varijante, testirane su tri različite koncentracije sa strelicama koje označavaju najveću koncentraciju proteina u kulturama na 40nM. Većina kandidata ICOSL varijanti ispoljava superiornu antagonističku aktivnost pri sve tri testirane koncentracije u poređenju sa belataceptom, što se ogleda u nižoj koncentraciji IFN-γ u tim kulturama.
[0244] Sl. 6A-6D prikazuje inhibiciju rastvorljivih ICOSL Fc-fuzionih proteina na odgovore B i T ćelija u testu kokulture B-T. Sl. 6A prikazuje inhibiciju proliferacije B ćelija izazvane T ćelijama od strane rastvorljivih ICOSL Fc-fuzionih proteina. Prečišćene CD4+ T ćelije i B ćelije od jednog donora su obeležene CFSE i koinkubirane u odnosu 1:1 u prisustvu ili odsustvu naznačenih mitogena sa ili bez naznačenih ICOSL Fc-fuzionih proteina. Ćelije su stimulisane Staph enterotoxin B (SEB) u koncentraciji od 100 ng/ml, Pokeweed mitogenom (PWM) u koncentraciji od 1 mg/ml, ili oba. ICOSL Fc-fuzioni proteini su uključeni u konačnoj koncentraciji od 40 nM i kulture su inkubirane 7 dana i podvrgnute FACS analizi. Broj podeljenih B ćelija je određen iz broja ćelija u kulturama koje su razblažile svoj CFSE. Svi testirani ICOSL Fc-fuzioni proteini, osim divljeg tipa, smanjili su proliferaciju B ćelija. Sl.6B-6D pokazuju da su ICOSL Fc-fuzioni proteini inhibirali proizvodnju citokina T ćelija u B-T kokulturama. Supernatanti iz kultura opisanih gore su sakupljeni 7. dana i analizirani na sadržaj citokina korišćenjem LEGENDplex Human Th Cytokine Panel-a (Biolegend). Proizvodnja IL-5 T ćelija (Sl.6B), IL-13 (Sl.6C) i IL-21 (Sl.6D) je oslabljen uključivanjem ICOSL Fc-fuzionih proteina.
[0246] Sl. 7A-7F prikazuje različite krajnje tačke u mišjem modelu bolesti graft verse domaćina (GVHD) gde su humane PBMC ćelije adoptivno prenete u imunodeficijentne NSG mišje domaćine. Slika 7A prikazuje krive preživljavanja tretiranih životinja. Agresivan tok bolesti i naknadni mortalitet primećeni su kod kontrolnih životinja koje su primale fiziološki rastvor, sa sličnim preživljavanjem primećenim kod životinja tretiranih divljim tipom ICOSL-Fc, kao i varijantom N52H/I143T ICOSL. Varijanta N52H/N57Y/Q100P imala je poboljšane stope preživljavanja uporedive sa kliničkim referentnim belataceptom. Sl.7B ispoljava slične trendove u gubitku telesne težine, pri čemu je ICOSL varijanta N52H/N57Y/Q100P pokazala slično održavanje težine kao i životinje tretirane belataceptom, iako su sve ostale grupe doživele brz gubitak težine. Sl. 7C prikazuje kliničke rezultate iz standardizovanih posmatranja indeksa aktivnosti bolesti GVHD (DAI), ponovo pokazujući niže rezultate kod životinja tretiranih ICOSL varijantom N52H/N57Y/Q100P koji su uporedivi sa kliničkim referentnim belataceptom, dok su druge grupe životinja imale više DAI rezultate. Sl.7D prikazuje merenje protočne citometrije za procente CD4 i CD8 ćelija u krvi eksperimentalnih životinja 14. dana. Procenat CD8 ćelija između eksperimentalnih grupa bio je uglavnom isti, međutim, životinje tretirane ICOSL varijantom N52H/N57Y/Q100P i belataceptom imaju niže procente CD4 ćelija u poređenju sa drugim eksperimentalnim grupama.
[0248] Sl. 7E prikazuje krive preživljavanja iz sličnog eksperimenta koji testira dodatne molekule varijante ICOSL. Sl. 7F prikazuje kliničke rezultate iz sličnog eksperimenta koji testira dodatne molekule varijante ICOSL.
[0250] Sl. 8 ispoljava lokalizovanu kostimulativnu aktivnost koju prenosi naznačeni molekul varijante steka vIgD C-L, gde C predstavlja ICOSL kostimulativni domen, a L predstavlja NKp30 lokalizacioni domen. U ovom testu, ciljne K562 ćelije koje eksprimuju lokalizacioni površinski protein, B7-H6, kultivisane su u prisustvu anti-CD3 sa humanim T ćelijama, a aktivacija T ćelija je procenjena nivoima IFN-γ u supernatantima kulture. Uključivanje samo anti-CD3 ili bez steka varijante Fc molekula nije indukovalo aktivaciju T ćelija. Slično tome, ćelije kultivisane samo sa lokalizacionim NKp30 domenom divljeg tipa ili samo sa kostimulativnim ICOSL domenom divljeg tipa kao Fc fuzionim proteinima nisu dovele do aktivacije T ćelija. Stekani domen koji sadrži verziju divljeg tipa i kostimulativnog domena i lokalizacionog domena indukovao je merljivi IFN-γ pri najvišoj testiranoj koncentraciji, međutim, varijanta lokalizacionog kostimulativnog steka indukovala je više od dva puta veće nivoe IFN-γ pri najvišoj koncentraciji, i nivoe IFN-γ koji su i dalje primećeni kako su koncentracije titrirane nadole.
[0252] Sl. 9 sumira promene u debljini uha kod miševa iz standardnog modela preosetljivosti odloženog tipa (DTH). Životinje tretirane PBS, senzibilizovane ovalbuminom i uhom naknadno izloženom istim proteinom, pokazuju najviši nivo izmerenog otoka uha. Miševi tretirani kliničkim benčmarkom Abataceptom imaju blago smanjen otok uha nakon izlaganja uhu. Svih pet grupa tretmana ICOSL varijantom pokazalo je jednako ili poboljšano smanjenje otoka uha u poređenju sa Abataceptom.
[0254] Sl. 10A-10C prikazuje različite primerne konfiguracije varijante IgSF domena (vIgD) konjugovanog sa antitelom (V-Mab). Sl. 10A prikazuje različite konfiguracije u kojima je vIgD vezan, direktno ili indirektno, sa N- i/ili C-terminusom lakog lanca antitela. Sl. 10B prikazuje različite konfiguracije u kojima je vIgD vezan, direktno ili indirektno, sa N- i/ili C-terminusom teškog lanca antitela. Sl. 10C prikazuje rezultujuće V-Mab konfiguracije kada se laki lanac Sl.
[0255] 10A i težak lanac Sl.10B koeksprimuju u ćeliji.
[0257] Sl. 11A-11B demonstriraju specifičnost V-Mab za srodne partnere za vezivanje. Testovi vezivanja su sprovedeni na ćelijama Expi293 prolazno transfektovanim sa DNK za ekspresiju humanog HER2, CD28, CTLA-4 ili ICOS na površini sisara. 200.000 transfektovanih ćelija je inkubirano sa 100.000 pM do 100 pM roditeljskog antitela (C1) ili različitih V-Mab (C2-9). Nevezano antitelo je uklonjeno, vezano antitelo je detektovano fluorescentno konjugovanim antihumanim IgG, a ćelije su analizirane protočnom citometrijom na MFI i procenat pozitivnih na osnovu Fc kontrola. Sl. 11A pokazuje vezivanje V-Mab za HER2 transfektante na nivoima sličnim roditeljskom antitelu. Vezivanje za lažno transfektovane ćelije je primećeno kod svih V-Mab, mada ne i WT ICOSL, zbog niskih nivoa endogene HER2 ekspresije na roditeljskim ćelijama Expi293. Sl. 11B pokazuje da se vezivanje roditeljskog IgSF-domena (N52H/N57Y/Q100P) za njegove srodne partnere održava ili povećava (C2, C3, C4, C5, C6, C8, C9) pomoću V-Mab.
[0258] Sl. 12 pokazuje kostimulativni i proliferativni kapacitet V-Mab kada se koimobilizuje sa anti-CD3.
[0259] 10 nM anti-CD3 je vlažno obloženo u ležišta polistirenskih ploča za kulturu tkiva sa ravnim dnom od 96 ležišta sa 30 nM do 3 nM roditeljskog antitela, V-Mab ili Fc kontrola. CFSE-obeležene pan T-ćelije su dodate tokom 72 sata. Sekrecija IFN-γ je merena ELISA testom, a ukupna proliferacija T-ćelija je merena protočnom citometrijskom analizom CFSE-razblaženja. Sekrecija IFN-γ i proliferacija IgSF-domena (N52H/N57Y/Q100P) je veća nego kod WT ICOSL. V-Mab pokazuju povećan kostimulativni kapacitet citokina i proliferacije u odnosu na roditeljski IgSF.
[0261] Sl. 13A-13C prikazuju različite formate datih varijanti molekula IgSF domena. Sl.13A prikazuje rastvorljive molekule, uključujući: (1) varijantni IgSF domen (vIgD) spojen sa Fc lancem; (2) stek (steking) molekul koji sadrži prvi varijantni IgSF domen (prvi vIgD) i drugi IgSF domen, kao što je drugi varijantni IgSF domen (drugi vIgD); (3) molekul IgSF usmeren ka tumoru koji sadrži prvi varijantni IgSF domen (vIgD) i IgSF domen koji usmeren ka tumorskom antigenu, kao što je NKp30 IgSF domen; i (4) varijantni IgSF domen (vIgD) vezan sa antitelom (V-Mab). Sl.
[0262] 13B prikazuje transmembranski imunomodulatorni protein (TIP) koji sadrži varijantni IgSF domen (vIgD), npr. varijantu ICOSL, eksprimovanu na površini ćelije. U jednom primeru realizacije, srodni vezujući partner transmembranski vezanog vIgD je kostimulativni receptor, npr. CD28, a TIP koji sadrži vIgD (npr. ICOSL vIgD) agonizuje kostimulativni receptor tako da TIP indukuje pozitivan signal u ćeliji koja eksprimuje kostimulativni receptor. Sl. 13C prikazuje sekretovani imunomodulatorni protein (SIP) u kome se varijantni IgSF domen (vIgD), npr. varijanta ICOSL, sekretuje iz ćelije, kao što je prva T ćelija (npr. CAR T ćelija). U jednom primeru realizacije, srodni vezujući partner sekretovanog vIgD je aktivacioni receptor, npr. CD28, koji se može eksprimovati na prvoj ćeliji (npr. T ćeliji, kao što je CAR T ćelija) i/ili na drugoj ćeliji (npr. T ćeliji; bilo endogenoj ili inženjerskoj, kao što je CAR T ćelija). Nakon vezivanja SIP-a sa njegovim srodnim vezujućim partnerom, signalizacija preko aktivacionog receptora je blokirana. U svim slučajevima, vIgD može biti samo V-domen (IgV), kombinacija V-domena (IgV) i C-domena (IgC), uključujući ceo ekstracelularni domen (ECD), ili bilo koja kombinacija Ig domena člana IgSF superfamilije.
[0264] Sl. 14 prikazuje primer shematskog prikaza aktivnosti varijante IgSF domena (vIgD) spojene sa Fc (vIgD-Fc) u kome je vIgD varijanta IgSF domena ICOSL. Kao što je prikazano, rastvorljivi vIgD ICOSL interaguje sa svojim srodnim partnerima za vezivanje kako bi blokirao interakcije CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2) ili ICOSL sa CD28 ili ICOS, redom, čime blokira kostimulaciju CD28 i/ili ICOS kostimulativnim receptorima.
[0266] Sl. 15 prikazuje primer shematskog prikaza stek molekula za lokalizaciju varijante IgSF domena (vIgD) na tumorsku ćeliju. U ovom formatu, molekul steka sadrži prvi varijantu IgSF domena (prvi vIgD) i drugi IgSF domen (npr. drugi vIgD) u kome je drugi IgSF domen (npr. drugi vIgD) IgSF domen usmeren ka tumoru koji se vezuje za tumorski antigen. Primer IgSF domena usmerenog ka tumoru je IgSF domen NKp30, koji se vezuje za tumorski antigen B7-H6. U ovom prikazu, vIgD je varijanta IgSF domena ICOSL. Kao što je prikazano, vezivanje tumorski ciljanog IgSF domena za površinu tumorske ćelije lokalizuje prvi vIgD na površini tumorske ćelije gde može da interaguje sa jednim ili više svojih srodnih partnera za vezivanje (npr. CD28 ili ICOS) eksprimovanih na površini susedne imune ćelije (npr. T ćelije) da bi stimulisao kostimulativni receptor.
[0268] Sl. 16A Slika prikazuje različite primerne konfiguracije stek molekula koji sadrži prvi varijantni IgSF domen (prvi vIgD), npr. varijantu ICOSL, i drugi IgSF domen, kao što je drugi varijantni IgSF domen (drugi vIgD). Kao što je prikazano, prvi vIgD i drugi IgSF domen su nezavisno vezani, direktno ili indirektno, sa N- ili C-terminusom Fc regiona. Za generisanje homodimernog Fc molekula, Fc region je onaj koji je sposoban da formira homodimer sa uparenom Fc podjedinicom koekspresijom pojedinačnih Fc regiona u ćeliji. Za generisanje heterodimernog Fc molekula, pojedinačni Fc regioni sadrže mutacije (npr. mutacije „knob-into-hole“ u CH3 domenu), tako da je formiranje heterodimera favorizovanije u poređenju sa homodimerima kada su pojedinačni Fc regioni koeksprimovani u ćeliji.
[0270] Sl. 16B prikazuje različite primerne konfiguracije stek molekula koji sadrži prvi varijantni IgSF domen (prvi vIgD), drugi IgSF domen, kao što je drugi varijantni IgSF domen (drugi vIgD), i treći IgSF domen, kao što je treći varijantni IgSF domen (treći vIgD). Kao što je prikazano, prvi vIgD, drugi IgSF i treći IgSF domen su nezavisno vezani, direktno ili indirektno, sa N- ili C-terminusom Fc regiona. Za generisanje homodimernog Fc molekula, Fc region je onaj koji je sposoban da formira homodimer sa uparenim Fc regionom koekspresijom pojedinačnih Fc regiona u ćeliji.
[0271] Sl. 17 prikazuje primer shematskog prikaza aktivnosti varijante IgSF domena (vIgD) konjugovanog sa antitelom (V-Mab) u kojem se antitelo (npr. anti-HER2 antitelo) vezuje za antigen na površini tumorske ćelije. U ovom prikazu, vIgD je varijanta IgSF domena ICOSL. Kao što je prikazano, vezivanje antitela za površinu tumorske ćelije lokalizuje vIgD na površini tumorske ćelije gde može da interaguje sa jednim ili više svojih srodnih partnera za vezivanje eksprimovanim na površini susedne imunske ćelije (npr. T ćelije) da bi agonizovao signalizaciju receptora. U jednom primeru realizacije kao što je prikazano, varijanta IgSF domena (vIgD) je varijanta IgSF domena ICOSL. Vezivanje ICOSL vIgD za CD28 ili ICOS kostimulativne receptore obezbeđuje agonistički ili kostimulativni signal.
[0273] Sl. 18 prikazuje transkripcioni potpis primarnih humanih T ćelija pomoću Nanostring-a kada se inkubiraju sa 10 nM anti-CD3 sa 40 nM Fc-kontrolnog proteina, divljeg tipa ICOSL-Fc, divljeg tipa CD80-Fc, oba ova proteina ili varijantom ICOSL Fc-fuzionih proteina sa naznačenim mutacijama. Ukupna RNK iz uzoraka je pripremljena iz sakupljenih ćelija, a RNK je preneta u Nanostring, a čip Cancer Immune je korišćen za kvantifikaciju transkripata gena 750 u svakom uzorku. Izmenjeni transkripti uključuju one čiji je nivo iznad ili ispod dijagonalne linije, uključujući i naznačene transkripte.
[0275] Sl. 19 prikazuje nivoe transkripata primernih transkripata nakon inkubacije kao što je opisano na Sl. 18 za naznačeno vreme u prisustvu različitih imunomodulatornih proteina.
[0277] Sl. 20A-20B ispoljava proliferaciju T-ćelija posredovanu VmAb kada se kokultiviše sa ciljevima koji eksprimuju HER2. Pan T-ćelije obeležene CFSE su aktivirane veštačkim ciljnim ćelijama izvedenim iz K562, koje prikazuju površinski anti-CD3 jednolančani Fv (OKT3) i HER2 u prisustvu VmAb ili kontrolnih proteina. Proliferacija je merena protočnom citometrijskom analizom CFSE-razblaženja na CD4+ (levi panel) ili CD8<->(desni panel) obojenim T-ćelijama. Na Sl. 20A, K562 ćelije su titrirane i zasejane T-ćelijama za odnos efektor:cilj (E:T) od 40 do 1280:1. VmAbs, roditeljski IgSF domen ili WT ICOSL su dodati u koncentraciji od 1000pM. Na Sl.20B, K562 ćelije su dodate T-ćelijama za odnos E:T od 160:1. VmAbs ili kontrolni proteini su titrirani i dodati u koncentraciji od 3000 do 37 pM.
[0279] Sl. 21 Slika prikazuje studije proliferacije T ćelija transdukovanih različitim transmembranskim imunomodulatornim proteinima (TIP) koji sadrže IgSF domen i primernim rekombinantnim E6-specifičnim TCR u primarnim humanim T ćelijama.
[0281] Sl. 22A-22G prikazuje SEC analizu proteolize u varijantnim ICOSL Fc-fuzionim molekulima koji sadrže mutacije N52H/N57Y/Q100R/F172S generisane u različitim referentnim sekvencama, kao što su skraćena ICOSL ECD Fc-fuzija, ICOSL IgV domen samo Fc-fuzija i/ili ICOSL varijantni Fc fuzioni proteini sa mutacijama na N207G/L208G u odnosu na referentnu sekvencu ICOSL ekstracelularnog domena (ECD) navedenu u SEQ ID NO:32. Molekuli su eksprimovani korišćenjem ćelija izvedenih iz ExpiCHO-S.
[0283] Sl. 23A-23B prikazuje proliferaciju CD4 i CD8 humanih T ćelija stimulisanih sa K652 ćelijama koje eksprimuju varijante ICOSL TIP-ova koji sadrže ECD koji sadrži afinitetno modifikovani IgSF sa mutacijama amino-kiselina koje odgovaraju N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 288), N52H/N57Y/Q100R (SEQ ID NO: 283), i E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R (SEQ ID NO: 300).
[0285] Slika 24A prikazuje vezivanje V-mAb za HER2 i CD28. Sl.24B-24F prikazuje rezultate VmAb kostimulacije T ćelija korišćenjem transfektovanog ćelijskog sistema sa Jurkat ćelijama i reporterom IL-2 promotora luciferaze, pokazujući da V-mAb obezbeđuju značajan kostimulativni signal u prisustvu BER2+ K562/OKT3 ćelija.
[0287] Sl. 25A-25D prikazuje vezivanje molekula fuzije Fc na ćelije koje eksprimuju srodne partnere za vezivanje B7H6 (Sl.25A), ICOS (Sl.25B), CD28 (Sl.25C) i CTLA-4 (Sl.25D).
[0289] Sl. 26A-26B prikazuje studije bioaktivnosti za primerne testirane ICOSL/NKp30 stek proteine.
[0291] Sl. 27 prikazuje proliferaciju izazvanu ICOSL/NKp30 stek proteinima mereno protočnom citometrijskom analizom CFSE-razblaženja na CD4+ ili CD8<+>obojene T-ćelije.
[0293] Sl. 28 prikazuje antitumorske efekte kombinacije testiranog ICOSL/NKp30 stek proteina i mPD-1 mAb.
[0295] Sl. 29A-29E prikazuju antiinflamatornu aktivnost profilaktičkog doziranja primernog ICOSL IgV-Fc fuzionog molekula u modelu artritisa indukovanog kolagenom (CIA), uključujući prosečnu zbirnu ocenu šape (Sl. 29A), detektovani CII IgG (Sl. 29B), nivoe citokina u serumu (Sl. 29C), CD44+ aktivirane T ćelije ili T<FH>ćelije (Sl.29D), i frakciju B ćelija u drenirajućem limfnom čvoru (Sl. 29E).
[0297] Sl. 30A-30D prikazuju antiinflamatornu aktivnost odloženog doziranja primernog ICOSL IgV-Fc fuzionog molekula u modelu artritisa indukovanog kolagenom (CIA), uključujući prosečnu zbirnu ocenu šape (Slika 30A) i nivoe citokina u serumu (Sl.30C-30D).
[0298] Sl. 31A-31D prikazuju antiinflamatornu aktivnost odloženog doziranja primernog ICOSL IgV-Fc fuzionog molekula u eksperimentalnom modelu autoimunog encefalomijelitisa (EAE), uključujući EAE rezultat (Slika 31A), analizu protočne citometrije T ćelija ingvinalnih limfnih čvorova (Sl.
[0299] 31C), i proinflamatorne citokine (Sl.31D).
[0301] Sl. 32A-32B prikazuju preživljavanje i DAI rezultat miševa obolelih od bolesti kalem protiv domaćina (GvHD) tretiranih različitim dozama (20, 100 ili 500 µg) varijante ICOSL IgV-Fc molekula.
[0303] Sl. 33A-33F prikazuju rezultate protočne citometrijske analize odnosa ćelija kalema protiv domaćina (GvHD) humanih ćelija i ćelija miša u prikupljenoj krvi (Sl.33A) ili u ukupnom broju T ćelija (Sl.33B) na kraju studije i procena ICOS+ CD4+ ili CD8<+>ćelija (Sl.33C-33D), ili CD28+ CD4+ ili CD8<+>ćelija (Sl. 33E-33F) od miševa sa bolešću kalem protiv domaćina (GvHD) tretiranih različitim dozama (20, 100 ili 500 µg) varijante ICOSL IgV-Fc molekula.
[0305] Sl. 34A-34B prikazuju ekspresiju markera aktivacije ili iscrpljivanja T ćelija kod miševa obolelih od bolesti kalem protiv domaćina (GvHD) tretiranih različitim dozama (20, 100 ili 500 µg) varijante ICOSL IgV-Fc molekula.
[0307] Sl. 34C prikazuje odnos T efektorskih ćelija (Teff) i T regulatornih ćelija (Treg) kod miševa obolelih od bolesti kalem protiv domaćina (GvHD) tretiranih različitim dozama (20, 100 ili 500 µg) varijante ICOSL IgV-Fc molekula.
[0309] Sl. 35A-35D prikazuju serumske proinflamatorne citokine kod miševa obolelih od bolesti kalem protiv domaćina (GvHD) tretiranih različitim dozama (20, 100 ili 500 µg) varijante ICOSL IgV-Fc molekula. Sl. 35E prikazuje serumsku izloženost varijante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) u GVHD modelu u poređenju sa normalnim miševima.
[0311] Sl. 36A prikazuje rezultate DAI-a i Sl.36B prikazuje rezultate histologije tretmana sa primernom varijantom ICOSL IgV-Fc na indeksu aktivnosti bolesti (DAI) izračunatom iz telesne težine i rezultata stolice u modelu kolitisa indukovanog CD4+CD45RBhigh.
[0313] Detaljan opis
[0315] [0101] Ovde su dati imunomodulatorni proteini koji su ili sadrže varijante ili mutante ICOS liganda (ICOSL) ili njegove specifične vezujuće fragmente koji pokazuju aktivnost vezivanja za najmanje jednog srodnog vezujućeg partnera ciljnog liganda (takođe nazvanog protein kontrastrukture). U nekim realizacijama, varijantni ICOSL polipeptidi sadrže jednu ili više modifikacija amino-kiselina (npr. supstitucije, delecije ili adicije amino-kiselina) u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim) ili divljim tipom ICOSL polipeptida. U nekim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina (npr. supstitucije, delecije ili adicije amino-kiselina) nalaze se u domenu superfamilije imunoglobulina (IgSF) (npr. IgV) referentnog (npr. nemodifikovanog) ili divljeg tipa ICOSL polipeptida. U nekim realizacijama, varijantni ICOSL polipeptid ispoljava izmenjenu, kao što je povećana ili smanjena, aktivnost vezivanja ili afinitet za najmanje jednog srodnog vezujućeg partnera, kao što je najmanje jedan od ICOS, CD28 ili CTLA-4. U nekim realizacijama, imunomodulatorni proteini su rastvorljivi. U nekim realizacijama, imunomodulatorni proteini su transmembranski imunomodulatorni proteini sposobni da se eksprimuju na površini ćelija. U nekim realizacijama, ovde su takođe dati jedan ili više drugih imunomodulatornih proteina koji su konjugati ili fuzije koje sadrže varijantu ICOSL polipeptida ovde obezbeđenu i jedan ili više drugih delova ili polipeptida.
[0317] U nekim realizacijama, varijantni ICOSL polipeptidi i imunomodulatorni proteini moduliraju imunološki imuni odgovor, kao što je povećan ili smanjen imuni odgovor. U nekim realizacijama, varijantni ICOSL polipeptidi i imunomodulatorni proteini koji su ovde dati mogu se koristiti za lečenje bolesti ili stanja koja su vezana sa disregulisanim imunim odgovorom.
[0319] U nekim realizacijama, obezbeđeni varijantni ICOSL polipeptidi moduliraju aktivaciju T ćelija putem interakcija sa kostimulativnim signalnim molekulima. Generalno, antigen specifična aktivacija T ćelija zahteva dva različita signala. Prvi signal se obezbeđuje interakcijom T-ćelijskog receptora (TCR) sa antigenima vezanim sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti (MHC) prisutnim na ćelijama koje prezentuju antigen (APC). Drugi signal je kostimulativan za angažovanje TCR i neophodan je da bi se izbegla apoptoza ili anergija T ćelija.
[0321] [0104] U nekim realizacijama, pod normalnim fiziološkim uslovima, imuni odgovor posredovan T ćelijama pokreće se prepoznavanjem antigena od strane T ćelijskog receptora (TCR) i regulisan je ravnotežom kostimulativnih i inhibitornih signala (npr. receptori imunih kontrolnih tačaka). Imuni sistem se oslanja na receptore imunih kontrolnih tačaka kako bi sprečio autoimunost (tj. samotoleranciju) i zaštitio tkiva od prekomernog oštećenja tokom imunog odgovora, na primer tokom napada na patogenu infekciju. U nekim slučajevima, međutim, ovi imunomodulatorni proteini mogu biti disregulisani kod bolesti i stanja, uključujući tumore, kao mehanizam za izbegavanje imunog sistema.
[0323] U nekim realizacijama, među poznatim kostimulativnim T-ćelijskim receptorima je CD28, koji je kostimulativni T-ćelijski receptor za ligande B7-1 (CD80) i B7-2 (CD86), koji su oba prisutni na APC. Ovi isti ligandi se, takođe, mogu vezati za inhibitorni T-ćelijski receptor CTLA4 (citotoksični protein 4 vezan sa T-limfocitima) sa većim afinitetom nego za CD28; vezivanje za CTLA-4 deluje na smanjenje imunog odgovora. ICOS (inducibilni kostimulator) je još jedan T-ćelijski kostimulativni receptor koji se vezuje za ICOS ligand (ICOSL) na APC. U nekim slučajevima, poznato je i da CD28 i CTLA-4 interaguju sa ICOSL na mestu vezivanja koje se preklapa sa vezivanjem ICOSL za kostimulativni T-ćelijski receptor ICOS (Yao et al. (2011) Immunity, 34:729‑740). Iako su CD28 i ICOS srodni receptori za aktiviranje CD28 porodice i dele neke intracelularne signalne motive, kostimulativni efekti između CD28 i ICOS se razlikuju. Na primer, CD28 se eksprimuje i na neaktiviranim i na aktiviranim T ćelijama i njegova signalizacija je važna za proizvodnju IL-2 i naknadnu efektorsku funkciju T ćelija. ICOS se generalno ne eksprimuje na površini T ćelija sve do aktivacije T ćelija, a signalizacija putem ICOS na aktiviranim T ćelijama podržava specijalizovanu diferencijaciju podskupova T ćelija. Stoga, u nekim slučajevima, kostimulacija pomoću CD28 i ICOS daje preklapajuće i komplementarne efekte.
[0325] [0106] U nekim aspektima, T ćelije eksprimuju kostimulativne molekule CD28 i ICOS, koji interaguju sa CD80/CD86 i ICOSL redom, na ćelijama koje prezentuju antigen (APC). U limfoidnim organima, profesionalne APC (tj. dendritske ćelije, makrofagi i B ćelije) eksprimuju CD80, CD86 i ICOSL i angažuju CD28+/ICOS+ T ćelije. U nekim realizacijama, aktivirane T ćelije se zatim mogu diferencirati u efektorske ćelije kao što je CD8<+>citotoksične T ćelije (CTL), CD4+ Th17 ćelije koje luče IL-17A/F ili CD4+ folikularne ćelije pomagači (T<FH>) ćelije. T<FH->eksprimujući CD40L, angažujući B ćelije u limfoidnim folikulima i oslobađajući citokine (npr. IL-21) indukuju diferencijaciju B ćelija u plazma ćelije koje luče antitela (Ab). Plazma ćelije mogu da proizvode antitela koja oštećuju tkivo, npr. reumatoidni faktor (RF) i anti-citrulinisani peptidni antitela (ACPA) kod ljudi, i anti-kolagenska (CII) antitela kod miševa, koja mogu da formiraju imune komplekse i naslage u zglobovima i drugim tkivima. ICOSL se takođe može eksprimovati na neprofesionalnim APC, što dovodi do aktivacije T ćelija u nelimfoidnim tkivima i daljeg oštećenja tkiva i zglobova.
[0327] U nekim aspektima, CD4+Th1-, Th9- i Th17-ćelije se smatraju ključnim doprinosiocima multiploj sklerozi (MS) povećanjem upale unutar CNS-a i kod multiple skleroze i kod eksperimentalnog autoimunog encefalomijelitisa, a CD4+ICOS+CXCR5+ T folikularne ćelije pomagači su povećane u PBMC kod relapsno-remitentne forme i koreliraju sa progresijom bolesti kod sekundarno progresivne MS. U nekim realizacijama, postoji značajno povećana ekspresija ICOS gena u ćelijama cerebrospinalne tečnosti, kod sekundarno progresivne MS, i primećen je povećan procenat ukupnih monocita i monocita koji eksprimuju ICOSL. ICOSL se, takođe, eksprimuje na neprofesionalnim APK, što dovodi do aktivacije T ćelija u nelimfoidnim tkivima i daljeg oštećenja tkiva.
[0329] Među obezbeđenim varijantama ICOSL polipeptida nalaze se polipeptidi koji, kada su modifikovani jednom ili više amino-kiselinskih modifikacija IgSF domena referentnog ICOSL polipeptida, pokazuju poboljšani afinitet vezivanja za CD28 i/ili ICOS. U nekim slučajevima, ukupno povećanje vezivanja za ICOS u obezbeđenim varijantama je manje od povećanja vezivanja za CD28, jer divlji tip ICOSL već ispoljava znatno veći afinitet vezivanja za ICOS nego CD28. Takođe su obezbeđeni različiti formati obezbeđenih varijanti polipeptida. Kao što je ovde prikazano, alternativni formati mogu olakšati manipulaciju imunim odgovorom, a samim tim i terapijsku primenu. Na primer, ovde je prikazano da isporuka poboljšanih ICOSL proteina u rastvorljivim formatima antagonizuje aktivaciju T ćelija inhibiranjem CD28 i/ili ICOS signalizacije. U drugim primerima, vezivanje varijanti ICOSL molekula za površinu olakšava aktivaciju T ćelija obezbeđivanjem kostimulativnog signala. Obezbeđene su različite strategije povezivanja za lokalizaciju isporuke kostimulativnog signala T ćelija, uključujući, ali ne ograničavajući se na, direktno premazivanje na plastiku, upotrebu drugog varijantnog IgSF domena za lokalizaciju na ciljni protein vezan za ploču ili eksprimovan na površini ćelije, ili fuziju varijante ICOSL sa monoklonskim antitelom specifičnim za tumor.
[0331] [0109] U nekim realizacijama, modulacija imune signalizacije postignuta obezbeđenim varijantnim ICOSL polipeptidima i imunomodulatornim polipeptidima nudi prednosti za lečenje inflamatornih i autoimunih poremećaja i drugih bolesti i stanja u poređenju sa drugim tretmanima. U nekim slučajevima, terapije za intervenciju i promenu kostimulativnih efekata oba receptora ograničene su zahtevima prostorne orijentacije, kao i ograničenjima veličine koja nameću granice imunološke sinapse. U nekim aspektima, postojeći terapijski lekovi, uključujući lekove antitela, možda neće moći istovremeno da interaguju sa višestrukim ciljnim proteinima koji su uključeni u modulaciju ovih interakcija. Pored toga, u nekim slučajevima, postojeći terapijski lekovi mogu imati samo sposobnost da antagonizuju, ali ne i da agonizuju imuni odgovor. Pored toga, farmakokinetske razlike između lekova koji nezavisno ciljaju jedan ili drugi od ova dva receptora mogu stvoriti poteškoće u pravilnom održavanju željene koncentracije takvih kombinacija lekova u krvi tokom čitavog lečenja.
[0333] U nekim realizacijama, obezbeđeni varijantni ICOSL polipeptidi ili imunomodulatorni proteini moduliraju (npr. povećavaju ili smanjuju) imunološku aktivnost indukovanu kostimulativnim receptorima CD28 ili ICOS. Stoga, u nekim realizacijama, obezbeđeni polipeptidi prevazilaze ova ograničenja obezbeđivanjem varijante ICOSL (inducibilnog kostimulativnog liganda) sa izmenjenim (npr. povećanim ili smanjenim) afinitetom vezivanja za CD28 i ICOS, a u nekim slučajevima i za CTLA-4, čime se agonizuju ili antagonizuju komplementarni efekti kostimulacije receptorima. Takođe su obezbeđeni postupci za pravljenje i korišćenje ovih varijanti ICOSL.
[0335] U nekim aspektima, obezbeđeni molekuli mogu biti efikasniji od drugih rastvorljivih terapeutskih proteinskih agenasa. Na primer, pokazalo se da abatacept (CTLA-4-Fc) ometa kostimulaciju T ćelija kako bi ublažio odgovore T ćelija kod autoimunih bolesti, kao što je lečenje reumatoidnog artritisa, psorijatičnog artritisa i juvenilnog idiopatskog artritisa, a belatacept, varijanta molekula CTLA-4-Fc, za odbacivanje transplantata. Međutim, ovi CTLA-4-Fc proteini se vezuju za CD80 i CD86 i sprečavaju ove kostimulativne ligande da se angažuju i pokreću samo CD28. Varijantni ICOSL polipeptidi koji su ovde obezbeđeni, u nekim slučajevima, pokazuju afinitet vezivanja i poboljšanu aktivnost i za CD28 i za ICOS.
[0337] [0112] Štaviše, mogućnost formatiranja varijantnih polipeptida u različitim konfiguracijama da bi se, u zavisnosti od konteksta, antagonizovali ili agonizirali imuni odgovor, nudi fleksibilnost u terapijskim primenama zasnovanim na istom povećanom vezivanju i aktivnosti varijante ICOSL za partnere za vezivanje. U nekim realizacijama, određeni format može biti izabran za željenu terapijsku primenu. Na primer, kao što je opisano, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL polipeptida je obezbeđen u formatu, npr. kao Fc-fuzioni protein, da bi antagonizovao ili blokirao aktivnost svog srodnog partnera za vezivanje, npr. ICOS i/ili CD28. U nekim realizacijama, blokiranje ili inhibiranje kostimulativne signalizacije putem CD28 ili ICOS može biti korisno za suzbijanje imunog odgovora, što može biti korisno u lečenju inflamatornih ili autoimunih poremećaja (npr. multipla skleroza ili upala mozga) ili transplantacije organa. Na primer, vezivanje varijanti ICOSL proteina za površinu može isporučiti lokalizovani kostimulativni signal, koji se, u nekim aspektima, može koristiti za ciljanje tumorskog tkiva radi isporuke lokalizovane kostimulacije T ćelijama koje infiltriraju tumor. Većina primarnih tumora nema ekspresiju kostimulativnih molekula kao što su CD80, CD86 ili ICOSL, i stoga antitumorski odgovori T ćelija mogu biti ugroženi nedostatkom kostimulacije (Yu et al. (1998) Int. Immunol.
[0338] 10:791‑797). Lokalizacijom kostimulativnih domena na tumorske ćelije korišćenjem tumorlokalizujućeg dela, kao što je Nkp30 lokalizovan na B7H6 tumorskim ćelijama ili tumor-specifično antitelo (antitelo specifično za tumor), T ćelijski odgovori mogu biti pojačani u odsustvu tumoreksprimovanih kostimulativnih proteina.
[0340] Ako je definicija navedena ovde suprotna ili na drugi način neskladna sa definicijom navedenom u patentima, prijavama, objavljenim prijavama i drugim publikacijama na koje se ovde poziva, definicija navedena ovde ima prednost nad definicijom na koju se poziva.
[0342] Naslovi odeljaka koji se ovde koriste služe samo u organizacione svrhe i ne treba ih tumačiti kao ograničavanje opisane teme.
[0344] I. DEFINICIJE
[0346] Osim ako nije drugačije definisano, svi izrazi iz tenhike, oznake i drugi tehnički i naučni izrazi ili terminologija koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što ga obično razume stručnjak u oblasti na koju se odnosi predmet zahteva. U nekim slučajevima, izrazi sa opšteprihvaćenim značenjima su ovde definisani radi jasnoće i/ili radi lakšeg upoznavanja, a uključivanje takvih definicija ovde ne treba nužno tumačiti kao značajnu razliku u odnosu na ono što se generalno podrazumeva u tehnici.
[0348] [0116] Izrazi koji se koriste u ovoj specifikaciji definisani su na sledeći način, osim ako nije drugačije ograničeno u određenim slučajevima. Kako se koriste u specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, jednina „a“, „an“ i „the“ (u engl. verziji teksta) uključuje i množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi, akronimi i skraćenice koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što ih obično razume stručnjak u oblasti na koju se pronalazak odnosi. Osim ako nije drugačije naznačeno, skraćenice i simboli za hemijska i biohemijska imena su prema IUPAC-IUB nomenklaturi. Osim ako nije drugačije naznačeno, svi numerički rasponi uključuju vrednosti koje definišu raspon, kao i sve celobrojne vrednosti između.
[0350] [0117] Izraz „afinitetno modifikovan“, kako se koristi u kontekstu domena superfamilije imunoglobulina, označava domen superfamilije sisarskog imunoglobulina (IgSF) koji ima izmenjenu amino-kiselinsku sekvencu (u odnosu na odgovarajući roditeljski domen divljeg tipa ili nemodifikovani IgSF) tako da ima povećan ili smanjen afinitet vezivanja ili avidnost za najmanje jednog od svojih srodnih partnera za vezivanje (alternativno „kontrastrukture“) u poređenju sa roditeljskim kontrolnim domenom divljeg tipa ili nemodifikovanim (tj. neafinitetno modifikovanim) IgSF. U ovaj kontekst je uključen i afinitetno modifikovani ICOSL IgSF domen. U nekim realizacijama, afinitetno modifikovani IgSF domen može da sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ili više razlika u amino-kiselinama, kao što su supstitucije amino-kiselina, u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili IgSF domenu divljeg tipa. Povećanje ili smanjenje afiniteta ili avidnosti vezivanja može se odrediti korišćenjem dobro poznatih testova vezivanja kao što je protočna citometrija. Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5: 443‑453 (2005). Videti takođe, Linsley et al., Immunity, Vol 1: 793‑801 (1994). Povećanje afiniteta ili avidnosti vezivanja proteina za njegove srodne partnere za vezivanje je do vrednosti koja je najmanje 10% veća od vrednosti kontrolnog domena IgSF divljeg tipa, a u nekim realizacijama, najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 200%, 300%, 500%, 1000%, 5000% ili 10000% veće od vrednosti kontrolnog domena IgSF divljeg tipa. Smanjenje afiniteta ili avidnosti vezivanja proteina za najmanje jednog od njegovih srodnih partnera za vezivanje je na vrednost ne veću od 90% kontrolne, ali ne manju od 10% kontrolne vrednosti domena IgSF divljeg tipa, a u nekim realizacijama ne veću od 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% ili 20%, ali ne manju od 10% kontrolne vrednosti domena IgSF divljeg tipa. Protein modifikovanog afiniteta je izmenjen u primarnoj amino-kiselinskoj sekvenci supstitucijom, dodavanjem ili brisanjem amino-kiselinskih ostataka. Izraz „afinitetno modifikovani IgSF domen“ ne treba tumačiti kao nametanje bilo kakvog uslova za bilo koji poseban početni sastav ili metod kojim je kreiran afinitetno modifikovani IgSF domen. Dakle, afinitetno modifikovani IgSF domeni predmetnog pronalaska nisu ograničeni na domene IgSF divljeg tipa koji se zatim transformišu u afinitetno modifikovani IgSF domen bilo kojim posebnim postupkom modifikacije afiniteta. Polipeptid afinitetno modifikovanog IgSF domena može se, na primer, generisati počevši od informacija o sekvenci divljeg tipa IgSF domena sisara, zatim modelirati in silico za vezivanje za svog srodnog partnera za vezivanje, i konačno rekombinantno ili hemijski sintetizovati da bi se dobio sastav afinitetno modifikovanog IgSF domena. U samo jednom alternativnom primeru, afinitetno modifikovani IgSF domen može se stvoriti mutagenezom divljeg tipa IgSF domena usmerenom na mesto. Dakle, afinitetno modifikovani IgSF domen označava proizvod, a ne nužno proizvod proizveden bilo kojim datim postupkom. Mogu se koristiti različite tehnike, uključujući rekombinantne postupke, hemijsku sintezu ili njihove kombinacije.
[0352] Izraz „alogeni“, kako se ovde koristi, označava ćeliju ili tkivo koje je uklonjeno iz jednog organizma, a zatim infuzirano ili adoptivno preneto u genetski različit organizam iste vrste. U nekim realizacijama pronalaska, vrsta je mišja ili ljudska.
[0354] Izraz „autologni“, kako se ovde koristi, označava ćeliju ili tkivo koje je uklonjeno iz istog organizma u koji je kasnije infuzirano ili adoptivno preneto. Autologna ćelija ili tkivo može biti izmenjeno, na primer, metodologijama rekombinantne DNK, tako da više nije genetski identično nativnoj ćeliji ili nativnom tkivu koje je uklonjeno iz organizma. Na primer, nativna autologna T-ćelija može biti genetski modifikovana tehnikama rekombinantne DNK da bi postala autologna modifikovana ćelija koja eksprimuje transmembranski imunomodulatorni protein i/ili himerni antigenski receptor (CAR), što u nekim slučajevima uključuje modifikaciju T-ćelije ili TIL-a (tumor infiltrirajući limfocit). Modifikovane ćelije se zatim ubrizgavaju u pacijenta od koga je nativna T-ćelija izolovana. U nekim realizacijama, organizam je humani ili mišji.
[0356] Izrazi „afinitet vezivanja“ i „avidnost vezivanja“, kako se ovde koriste, označavaju specifični afinitet vezivanja i specifičnu avidnost vezivanja, redom, proteina za njegovu kontrastrukturu pod specifičnim uslovima vezivanja. U biohemijskoj kinetici, avidnost se odnosi na akumuliranu snagu višestrukih afiniteta pojedinačnih nekovalentnih interakcija vezivanja, kao što je između ICOSL i njegovih kontrastruktura ICOS i/ili CD28. Kao takva, avidnost se razlikuje od afiniteta, koji opisuje snagu jedne interakcije. Povećanje ili slabljenje afiniteta vezivanja varijante ICOSL koja sadrži modifikovani afinitet ICOSL IgSF domena za njegovu kontrastrukturu određuje se u odnosu na afinitet vezivanja nemodifikovanog ICOSL, kao što je nemodifikovani ICOSL koji sadrži nativni ili divlji tip IgSF domena, kao što je IgV domen.
[0357] Postupci za određivanje afiniteta vezivanja ili avidnosti su poznati u tehnici. Videti, na primer, Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5: 443‑453 (2005). U nekim realizacijama, varijanta ICOSL pronalaska (tj. ICOSL protein koji sadrži afinitetno modifikovani IgSF domen) specifično se vezuje za CD28 i/ili ICOS mereno protočnom citometrijom sa afinitetom vezivanja koji daje vrednost srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) od najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100% veću od kontrole ICOSL divljeg tipa u testu vezivanja kao što je opisano u Primeru 6.
[0359] Izraz „biološki poluživot“ odnosi se na vreme potrebno da supstanca, kao što je imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL predmetnog pronalaska, izgubi polovinu svoje farmakološke ili fiziološke aktivnosti ili koncentracije. Na biološki poluživot može uticati eliminacija, izlučivanje, razgradnja (npr. enzimska) supstance ili apsorpcija i koncentracija u određenim organima ili tkivima tela. U nekim realizacijama, biološki poluživot može se proceniti određivanjem vremena potrebnog da koncentracija supstance u krvnoj plazmi dostigne polovinu svog stabilnog nivoa („poluživot u plazmi“). Konjugati koji se mogu koristiti za derivatizaciju i povećanje biološkog poluživota polipeptida predmetnog pronalaska poznati su u tehnici i uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol (PEG), hidroksietil skrob (HES), XTEN (produženi rekombinantni peptidi; videti, WO2013130683), humani serumski albumin (HSA), goveđi serumski albumin (BSA), lipidi (acilacija) i poli-Pro-Ala-Ser (PAS), poliglutaminska kiselina (glutamilacija).
[0361] [0122] Izraz „himerni antigenski receptor“ ili „CAR“, kako se ovde koristi, odnosi se na veštački (tj. veštački napravljen) transmembranski protein eksprimovan na ćeliji sisara, koji sadrži najmanje ektodomen, transmembranu i endodomen. Opciono, CAR protein uključuje „spejser“ koji kovalentno povezuje ektodomen sa transmembranskim domenom. Spejser je često polipeptid koji povezuje ektodomen sa transmembranskim domenom putem peptidnih veza. CAR se obično eksprimuje na limfocitu sisara. U nekim realizacijama, CAR se eksprimuje na ćeliji sisara kao što je T-ćelija ili tumor infiltrirajući limfocit (TIL). CAR eksprimovan na T-ćeliji se ovde naziva „CAR T-ćelija“ ili „CAR-T“. U nekim realizacijama, CAR-T je T ćelija pomagač, citotoksična T-ćelija, prirodna T-ćelija ubica, memorijska T-ćelija, regulatorna T-ćelija ili gama delta T-ćelija. Kada se klinički koristi u, npr. adoptivnom ćelijskom transferu, CAR-T sa specifičnošću vezivanja antigena za tumor pacijenta se obično genetski modifikuje da se eksprimuje na nativnoj T-ćeliji dobijenoj od pacijenta. Genetski modifikovana T-ćelija koja eksprimuje CAR se zatim infuzira nazad u pacijenta. CAR-T je stoga često autologni CAR-T, iako su alogeni CAR-T uključeni u obim pronalaska. Ektodomen CAR-T sadrži region koji vezuje antigen, kao što je antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen (npr. scFv), koji se specifično vezuje pod fiziološkim uslovima sa ciljnim antigenom, kao što je tumorski specifičan antigen. Nakon specifičnog vezivanja, biohemijski lanac događaja (tj. transdukcija signala) rezultira modulacijom imunološke aktivnosti CAR-T. Tako, na primer, nakon specifičnog vezivanja regiona koji vezuje antigen CAR-T za njegov ciljni antigen može dovesti do promena u imunološkoj aktivnosti T-ćelija, što se ogleda u promenama u citotoksičnosti, proliferaciji ili proizvodnji citokina. Transdukcija signala nakon aktivacije CAR-T se u nekim realizacijama postiže pomoću CD3-zeta lanca („CD3-z“) koji je uključen u transdukciju signala u izvornim T-ćelijama sisara. CAR-T mogu dalje da sadrže više signalnih domena kao što su CD28, 41BB ili OX40, kako bi se dodatno modulirao imunomodulatorni odgovor T-ćelije. CD3-z sadrži konzervirani motiv poznat kao motiv aktivacije zasnovan na tirozinu imunoreceptora (ITAM) koji je uključen u transdukciju signala T-ćelijskog receptora.
[0363] Izraz „kolektivno“ ili „kolektivni“ kada se koristi u vezi sa proizvodnjom citokina indukovanom prisustvom dve ili više varijanti ICOSL pronalaska u in vitro testu, označava ukupni nivo ekspresije citokina bez obzira na proizvodnju citokina indukovanu pojedinačnom varijantom ICOSL. U nekim realizacijama, citokin koji se testira je IFN-gama u in vitro primarnom T-ćelijskom testu kao što je opisano u Primeru 6 i Primeru 7.
[0365] Izraz „srodni partner za vezivanje“ (koristi se naizmenično sa „kontrastrukturom“) u vezi sa polipeptidom, kao što je u vezi sa IgSF domenom varijante ICOSL, odnosi se na najmanje jedan molekul (obično prirodni protein sisara) za koji se referentni polipeptid specifično vezuje pod specifičnim uslovima vezivanja. U nekim aspektima, varijanta ICOSL koja sadrži afinitetno modifikovani IgSF domen specifično se vezuje za kontrastrukturu odgovarajućeg prirodnog ili divljeg tipa ICOSL, ali sa povećanim ili oslabljenim afinitetom. Vrsta liganda koja se prepoznaje i specifično se vezuje za svoj srodni receptor pod specifičnim uslovima vezivanja je primer kontrastrukture ili srodnog partnera za vezivanje tog receptora. „Srodni partner za vezivanje na površini ćelije“ je srodni partner za vezivanje koji se eksprimuje na površini ćelije sisara.
[0366] „Molekularna vrsta na površini ćelije“ je srodni partner za vezivanje liganda imunološke sinapse (IS), eksprimovanih na i od strane ćelija, kao što su ćelije sisara, koji formira imunološku sinapsu.
[0368] Kako se ovde koristi, „konjugat“, „konjugacija“ ili njihove gramatičke varijacije odnose se na spajanje ili povezivanje dva ili više jedinjenja što rezultira formiranjem drugog jedinjenja, bilo kojim postupcima spajanja ili povezivanja poznatim u tehnici. Takođe se može odnositi na jedinjenje koje je generisano spajanjem ili povezivanjem dva ili više jedinjenja. Na primer, varijanta ICOSL polipeptida vezana direktno ili indirektno sa jednim ili više hemijskih delova ili polipeptida je primer konjugata. Takvi konjugati uključuju fuzione proteine, one proizvedene hemijskim konjugatima i one proizvedene bilo kojim drugim postupcima.
[0370] Izraz „kompetitivno vezivanje“, kako se ovde koristi, znači da je protein sposoban da se specifično veže za najmanje dva srodna partnera za vezivanje, ali da specifično vezivanje jednog srodnog partnera za vezivanje inhibira, kao što je sprečavanje ili zaustavljanje, istovremeno vezivanje drugog srodnog partnera za vezivanje. Stoga, u nekim slučajevima, nije moguće da se protein veže za dva srodna partnera za vezivanje istovremeno. Generalno, konkurentna veziva sadrže isto ili preklapajuće mesto vezivanja za specifično vezivanje, ali to nije uslov. U nekim realizacijama, konkurentno vezivanje izaziva merljivu inhibiciju (delimičnu ili potpunu) specifičnog vezivanja proteina za jednog od njegovih srodnih partnera za vezivanje zbog specifičnog vezivanja drugog srodnog partnera za vezivanje. Poznat je niz postupaka za kvantifikaciju konkurentnog vezivanja, kao što su ELISA (enzimski imunosorbentni test) testovi.
[0372] Izraz „konzervativna supstitucija amino-kiselina“, kako se ovde koristi, označava supstituciju amino-kiselina u kojoj je ostatak amino-kiseline supstituisan drugim ostatkom aminokiseline koji ima R grupu bočnog lanca sa sličnim hemijskim svojstvima (npr. naelektrisanje ili hidrofobnost). Primeri grupa amino-kiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju 1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatičnohidroksilne bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance koji sadrže amide: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin i triptofan; 5) bazne bočne lance: lizin, arginin i histidin; 6) kisele bočne lance: asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; i 7) bočne lance koji sadrže sumpor: cistein i metionin. Konzervativne grupe za supstituciju amino-kiselina su: valinleucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i asparaginglutamin.
[0373] Izraz „koji odgovara“ u vezi sa pozicijama proteina, kao što je navođenje da nukleotidi ili pozicije amino-kiselina „odgovaraju“ nukleotidima ili pozicijama amino-kiselina u opisanoj sekvenci, kao što je navedeno u Listi sekvenci, odnosi se na nukleotide ili pozicije amino-kiselina identifikovane nakon poravnanja sa opisanom sekvencom na osnovu strukturnog poravnanja sekvence ili korišćenjem standardnog algoritma za poravnanje, kao što je GAP algoritam. Na primer, odgovarajući ostaci mogu se odrediti poravnanjem referentne sekvence sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 32 (ECD domen) ili navedenom u SEQ ID NO: 196 ili 545 (IgV domen) postupcima strukturnog poravnanja kao što je ovde opisano. Poravnavanjem sekvenci, stručnjak u tehnici može identifikovati odgovarajuće ostatke, na primer, koristeći konzervirane i identične ostatke amino-kiselina kao vodiče.
[0375] Izrazi „smanjiti“ ili „ublažiti“ „ili potisnuti“, kako se ovde koriste, znače smanjenje za statistički značajan iznos. Smanjenje može biti najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100% kontrolne vrednosti, kao što je kontrolna vrednost koja nije nula.
[0377] Izrazi „smanjen“ ili „reduciran“, kako se ovde koriste u kontekstu smanjenja imunološke aktivnosti limfocita sisara, označavaju smanjenje jedne ili više aktivnosti limfocita, u poređenju sa kontrolom, kao što je netretirana kontrola ili kontrola u kojoj je primenjen tretman korišćenjem nemodifikovane ili nevarijante kontrole pod istim uslovima. Smanjena aktivnost može se odnositi na jedno ili više od sledećeg: inhibicija ćelijskog ciklusa, smanjeno preživljavanje ćelija, smanjena proliferacija ćelija, smanjena proizvodnja citokina ili smanjena citotoksičnost T-ćelija, na primer u statistički značajnoj količini. U nekim realizacijama, referenca na smanjenu imunološku aktivnost znači smanjenje proizvodnje interferona gama (IFN-γ) u poređenju sa stanjem u odsustvu tretmana, na primer u statistički značajnoj količini. U nekim realizacijama, imunološka aktivnost se može proceniti u testu reakcije mešovitih limfocita (MLR). Postupci sprovođenja MLR testova su poznati u tehnici. Wang et al., Cancer Immunol Res.2014 Sep: 2(9):846‑56. Drugi postupci za procenu aktivnosti limfocita su poznati u tehnici, uključujući bilo koji test kao što je ovde opisano. U nekim realizacijama, poboljšanje može biti smanjenje za najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%, u poređenju sa kontrolnom vrednošću, kao što je netretirana kontrolna vrednost ili kontrolna vrednost koja nije nula.
[0379] [0131] Izrazi „derivati“ ili „derivatizovan“ odnose se na modifikaciju proteina kovalentnim vezivanjem, direktno ili indirektno, za kompoziciju, kako bi se izmenile karakteristike kao što su biološki poluživot, bioraspoloživost, imunogenost, rastvorljivost, toksičnost, potencija ili efikasnost, uz zadržavanje ili poboljšanje njegove terapeutske koristi. Derivati imunomodulatornih polipeptida predmetnog pronalaska spadaju u obim pronalaska i mogu se napraviti, na primer, glikozilacijom, pegilacijom, lipidacijom ili Fc-fuzijom.
[0381] Kako se ovde koristi, domen (obično sekvenca od tri ili više, generalno 5 ili 7 ili više aminokiselina, kao što su 10 do 200 amino-kiselinskih ostataka) odnosi se na deo molekula, kao što je protein ili kodirajuća nukleinska kiselina, koji je strukturno i/ili funkcionalno različit od drugih delova molekula i koji se može identifikovati. Na primer, domeni uključuju one delove polipeptidnog lanca koji mogu formirati nezavisno presavijenu strukturu unutar proteina sastavljenog od jednog ili više strukturnih motiva i/ili koji se prepoznaju na osnovu funkcionalne aktivnosti, kao što je aktivnost vezivanja. Protein može imati jedan ili više različitih domena. Na primer, domen se može identifikovati, definisati ili razlikovati homologijom primarne sekvence ili strukture sa srodnim članovima porodice, kao što je homologija sa motivima. U drugom primeru, domen se može razlikovati po svojoj funkciji, kao što je sposobnost interakcije sa biomolekulom, kao što je srodni partner za vezivanje. Domen može nezavisno pokazivati biološku funkciju ili aktivnost tako da domen nezavisno ili spojen sa drugim molekulom može obavljati aktivnost, kao što je, na primer, vezivanje. Domen može biti linearni niz amino-kiselina ili nelinearni niz aminokiselina. Mnogi polipeptidi sadrže više domena. Takvi domeni su poznati i mogu ih identifikovati stručnjaci u tehnici. Radi ilustracije, ovde su date definicije, ali se podrazumeva da je u okviru stručnosti u tehnici prepoznavanje određenih domena po imenu. Ako je potrebno, može se koristiti odgovarajući softver za identifikaciju domena.
[0383] Izraz „ektodomen“, kako se ovde koristi, odnosi se na region membranskog proteina, kao što je transmembranski protein, koji se nalazi izvan vezikularne membrane. Ektodomeni često obuhvataju vezujuće domene koji se specifično vezuju za ligande ili receptore na površini ćelije, kao što je putem vezujućeg domena koji se specifično vezuje za ligand ili receptor na površini ćelije. Ektodomen ćelijskog transmembranskog proteina se alternativno naziva ekstracelularnim domenom.
[0385] [0134] Izrazi „efikasna količina“ ili „terapeutski efikasna količina“ odnose se na količinu i/ili koncentraciju terapeutskog sastava pronalaska, uključujući proteinski sastav ili ćelijski sastav, koji kada se primenjuje ex vivo (kontaktom sa ćelijom pacijenta) ili in vivo (primenom u pacijenta) bilo samostalno (tj. kao monoterapija) ili u kombinaciji sa dodatnim terapeutskim sredstvima, dovodi do statistički značajnog smanjenja progresije bolesti, na primer, ublažavanjem ili eliminisanjem simptoma i/ili uzroka bolesti. Efikasna količina može biti količina koja ublažava, smanjuje ili olakšava barem jedan simptom ili biološki odgovor ili efekat vezan sa bolešću ili poremećajem, sprečava progresiju bolesti ili poremećaja ili poboljšava fizičko funkcionisanje pacijenta. U slučaju ćelijske terapije, efikasna količina je efikasna doza ili broj ćelija koje se primenjuju na pacijenta putem adoptivne ćelijske terapije. U nekim realizacijama pacijent je sisar kao što je nehumani primat ili humani pacijent.
[0387] Izraz „endodomen“, kako se ovde koristi, odnosi se na region koji se nalazi u nekim membranskim proteinima, kao što su transmembranski proteini, koji se proteže u unutrašnji prostor definisan površinskom membranom ćelije. U ćelijama sisara, endodomen je citoplazmatski region membranskog proteina. U ćelijama, endodomen interaguje sa intracelularnim sastojcima i može igrati ulogu u prenosu signala i stoga, u nekim slučajevima, može biti intracelularni signalni domen. Endodomen ćelijskog transmembranskog proteina se alternativno naziva citoplazmatskim domenom, koji, u nekim slučajevima, može biti citoplazmatski signalni domen.
[0389] Izrazi „poboljšano“ ili „povećano“, kako se ovde koriste u kontekstu povećanja imunološke aktivnosti limfocita sisara, označavaju povećanje jedne ili više aktivnosti limfocita, u poređenju sa kontrolom, kao što je netretirana kontrola ili kontrola u kojoj je korišćen tretman korišćenjem nemodifikovane ili nevarijante kontrole pod istim uslovima. Povećana aktivnost može biti jedno ili više od povećanja preživljavanja ćelija, proliferacije ćelija, proizvodnje citokina ili citotoksičnosti T-ćelija, kao što je statistički značajna količina. U nekim realizacijama, referenca na povećanu imunološku aktivnost znači povećanje proizvodnje interferona gama (IFN-γ), kao što je statistički značajna količina. U nekim realizacijama, imunološka aktivnost se može proceniti u testu reakcije mešovitih limfocita (MLR). Metode sprovođenja MLR testova su poznate u tehnici. Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846‑56. Drugi postupci za procenu aktivnosti limfocita su poznati u tehnici, uključujući bilo koji test kao što je ovde opisano. U nekim realizacijama, poboljšanje može biti povećanje od najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 400% ili 500% veće od kontrolne vrednosti koja nije nula.
[0391] [0137] Izraz „konstruisana ćelija“, kako se ovde koristi, odnosi se na ćeliju sisara koja je genetski modifikovana humanom intervencijom, kao što su metode rekombinantne DNK ili virusna transdukcija. U nekim realizacijama, ćelija je imunska ćelija, kao što je limfocit (npr. T ćelija, B ćelija, NK ćelija) ili ćelija koja prezentuje antigen (npr. dendritska ćelija). Ćelija može biti primarna ćelija pacijenta ili može biti ćelijska linija. U nekim realizacijama, konstruisana ćelija pronalaska sadrži varijantu ICOSL koja je ovde data. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL je transmembranski imunomodulatorni protein (u daljem tekstu „TIP“) koji se eksprimuje na konstruisanoj ćeliji. U nekim realizacijama, TIP sadrži ekstracelularni domen ili njegov deo koji sadrži IgV domen vezan sa transmembranskim domenom (npr. transmembranski domen ICOSL) i, opciono, intracelularni signalni domen. U nekim slučajevima, TIP je formatiran kao himerni receptor koji sadrži heterologni citoplazmatski signalni domen ili endodomen. U nekim realizacijama, genetski modifikovana ćelija je sposobna da eksprimuje i luči imunomodulatorni protein kao što je ovde opisano. Među obezbeđenim genetski modifikovanim ćelijama su i ćelije koje dodatno sadrže genetski modifikovani T-ćelijski receptor (TCR) ili himerni antigenski receptor (CAR).
[0393] Izraz „konstruisana T-ćelija“, kako se ovde koristi, odnosi se na T-ćeliju kao što je T ćelija pomagač, citotoksična T-ćelija (alternativno, citotoksični T limfocit ili CTL), prirodna T-ćelija ubica, regulatorna T-ćelija, memorijska T-ćelija ili gama delta T-ćelija, koja je genetski modifikovana humanom intervencijom, kao što su metode rekombinantne DNK ili metode virusne transdukcije. Konstruisana T-ćelija sadrži varijantu ICOSL transmembranskog imunomodulatornog proteina (TIP) ili sekretovanog imunomodulatornog proteina (SIP) predmetnog pronalaska koji se eksprimuje na T-ćeliji i koji je konstruisan da modulira imunološku aktivnost same konstruisane T-ćelije ili ćelije sisara za koju se varijanta ICOSL eksprimovana na T-ćeliji specifično vezuje. Konstruisana T-ćelija može da sadrži varijantu ICOSL sekretovanog imunomodulatornog proteina (SIP) predmetnog pronalaska koji se eksprimuje i/ili sekretuje od strane T-ćelije i koji je konstruisan da modulira imunološku aktivnost same konstruisane T-ćelije ili ćelije sisara za koju se varijanta ICOSL, kada je sekretuje T-ćelija, specifično vezuje.
[0395] Izraz „konstruisani T-ćelijski receptor“ ili „konstruisani TCR“ odnosi se na T-ćelijski receptor (TCR) konstruisan da se specifično veže sa željenim afinitetom za glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC)/peptidni ciljni antigen koji je odabran, kloniran i/ili naknadno uveden u populaciju T-ćelija, često korišćenih za adoptivnu imunoterapiju. Za razliku od konstruisanih TCR, CAR su konstruisani da se vezuju za ciljne antigene na način nezavisan od MHC.
[0396] Izraz „eksprimovan na“, kako se ovde koristi, koristi se u odnosu na protein eksprimovan na površini ćelije, kao što je ćelija sisara. Dakle, protein se eksprimuje kao membranski protein. U nekim realizacijama, eksprimovani protein je transmembranski protein. U nekim realizacijama, protein je konjugovan sa delom male molekulske mase kao što je lek ili detektabilna oznaka. Proteini eksprimovani na površini ćelije mogu da uključuju proteine ćelijske površine kao što su receptori ćelijske površine koji se eksprimuju na ćelijama sisara.
[0398] Izraz „deo koji produžava poluživot“ odnosi se na deo polipeptidne fuzije ili hemijskog konjugata koji produžava poluživot proteina koji cirkuliše u serumu krvi sisara u poređenju sa poluživotom proteina koji nije tako konjugovan sa delom. U nekim realizacijama, poluživot je produžen za više od ili više od oko 1,2 puta, 1,5 puta, 2,0 puta, 3,0 puta, 4,0 puta, 5,0 puta ili 6,0 puta. U nekim realizacijama, poluživot je produžen za više od 6 sati, više od 12 sati, više od 24 sata, više od 48 sati, više od 72 sata, više od 96 sati ili više od 1 nedelje nakon in vivo primene u poređenju sa proteinom bez dela koji produžava poluživot. Poluživot se odnosi na vreme potrebno da protein izgubi polovinu svoje koncentracije, količine ili aktivnosti. Poluživot se može odrediti, na primer, korišćenjem ELISA testa ili testa aktivnosti. Primeri delova koji produžavaju poluživot uključuju Fc domen, domen multimerizacije, polietilen glikol (PEG), hidroksietil skrob (HES), XTEN (produženi rekombinantni peptidi; videti, WO2013130683), humani serumski albumin (HSA), goveđi serumski albumin (BSA), lipide (acilacija) i poli-Pro-Ala-Ser (PAS) i poliglutaminsku kiselinu (glutamilacija).
[0400] Izraz „imunološka sinapsa“ ili „imunska sinapsa“, kako se ovde koristi, označava interfejs između ćelije sisara koja eksprimuje MHC I (glavni kompleks histokompatibilnosti) ili MHC II, kao što je ćelija koja prezentuje antigen ili tumorska ćelija, i limfocita sisara kao što je efektorska T ćelija ili prirodna ćelija ubica (NK).
[0402] [0143] Fc (fragment koji se može kristalizovati) region ili domen molekula imunoglobulina (takođe nazvan Fc polipeptid) uglavnom odgovara konstantnom regionu teškog lanca imunoglobulina i odgovoran je za različite funkcije, uključujući efektorsku funkciju(e) antitela. Fc domen sadrži deo ili ceo zglobni domen molekula imunoglobulina plus CH2 i CH3 domen. Fc domen može formirati dimer od dva polipeptidna lanca spojena jednom ili više disulfidnih veza. U nekim realizacijama, Fc je varijanta Fc koja ispoljava smanjenu (npr. smanjenu za više od 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više) aktivnost kako bi olakšala efektorsku funkciju. U nekim realizacijama, referenca na supstitucije amino-kiselina u Fc regionu je prema EU sistemu numeracije, osim ako nije opisano sa referencom na određeni SEQ ID NO. EU numeracija je poznata i prema najnovije ažuriranoj IMGT naučnoj tabeli (IMGT<®>, ImMunoGeneTics information system® http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html (kreirano: 17. maj 2001, poslednji put ažurirano: 10. januar 2013) i indeksu EU kako je objavljeno u Kabat, E.A. et al. Sequences of Proteins of Immunological interest. 5th ed. US Department of Health and Human Services, NIH publication No.91‑3242 (1991).
[0404] Fuzija imunoglobulina sa Fc-om („Fc-fuzija“), kao što je imunomodulatorni Fc fuzioni protein, je molekul koji sadrži jedan ili više polipeptida (ili jedan ili više malih molekula) operativno vezanih sa Fc regionom imunoglobulina. Fc-fuzija može da sadrži, na primer, Fc region antitela (koji olakšava efektorske funkcije i farmakokinetiku) i varijantu ICOSL. Fc region imunoglobulina može biti indirektno ili direktno vezan sa jednom ili više varijanti ICOSL ili malih molekula (fuzioni partneri). Različiti linkeri su poznati u tehnici i opciono se mogu koristiti za povezivanje Fc sa fuzionim partnerom da bi se generisala Fc-fuzija. Fc-fuzije identičnih vrsta mogu se dimerizovati da bi se formirali Fc-fuzioni homodimeri, ili korišćenjem neidentičnih vrsta da bi se formirali Fc-fuzioni heterodimeri. U nekim realizacijama, Fc je sisarski Fc kao što je mišji ili humani Fc.
[0406] Izraz „ćelija domaćin“ odnosi se na ćeliju koja se može koristiti za ekspresiju proteina kodiranog rekombinantnim vektorom ekspresije. Ćelija domaćin može biti prokariot, na primer, E. coli, ili može biti eukariot, na primer, jednoćelijski eukariot (npr. kvasac ili druga gljivica), biljna ćelija (npr. ćelija biljke duvana ili paradajza), životinjska ćelija (npr. humana ćelija, ćelija majmuna, ćelija hrčka, ćelija pacova, ćelija miša ili ćelija insekta) ili hibridom. Primeri ćelija domaćina uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili njihove derivate kao što su Veggie CHO i srodne ćelijske linije koje rastu u medijumu bez seruma ili CHO soj DX-B11, koji je deficijentan u DHFR. U nekim realizacijama, ćelija domaćin je ćelija sisara (npr. humana ćelija, ćelija majmuna, ćelija hrčka, ćelija pacova, ćelija miša ili ćelija insekta).
[0408] [0146] Izraz „imunoglobulin“ (skraćeno „Ig“), kako se ovde koristi, odnosi se na imunoglobulinski protein sisara, uključujući bilo koju od pet humanih klasa antitela: IgA (što uključuje podklase IgA1 i IgA2), IgD, IgE, IgG (što uključuje podklase IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4) i IgM. Izraz, takođe, uključuje imunoglobuline koji su kraći od pune dužine, bilo da su potpuno ili delimično sintetički (npr. rekombinantnom ili hemijskom sintezom) ili prirodno proizvedeni, kao što su fragment koji vezuje antigen (Fab), varijabilni fragment (Fv) koji sadrži V<H>i V<L>, jednolančani varijabilni fragment (scFv) koji sadrži V<H>i V<L>vezane zajedno u jednom lancu, kao i drugi fragmenti V regiona antitela, kao što su Fab’, F(ab)<2>, F(ab’)<2>, dsFv dijatelo, Fc i Fd polipeptidni fragmenti. Bispecifična antitela, homobispecifična i heterobispecifična, uključena su u značenje termina.
[0410] Izraz „imunoglobulinska superfamilija“ ili „IgSF“, kako se ovde koristi, označava grupu proteina ćelijske površine i rastvorljivih proteina koji su uključeni u procese prepoznavanja, vezivanja ili adhezije ćelija. Molekuli su kategorisani kao članovi ove superfamilije na osnovu zajedničkih strukturnih karakteristika sa imunoglobulinima (tj. antitelima); svi oni poseduju domen poznat kao imunoglobulinski domen ili nabor. Članovi IgSF uključuju receptore antigena ćelijske površine, koreceptore i kostimulativne molekule imunog sistema, molekule uključene u prezentaciju antigena limfocitima, molekule ćelijske adhezije, određene citokinske receptore i intracelularne mišićne proteine. Oni su obično vezani sa ulogama u imunom sistemu. Proteini u imunološkoj sinapsi su često članovi IgSF. IgSF se, takođe, može klasifikovati u „podfamilije“ na osnovu zajedničkih svojstava kao što je funkcija. Takve podfamilije se obično sastoje od 4 do 30 članova IgSF.
[0412] [0148] Izrazi „IgSF domen“ ili „imunoglobulinski domen“ ili „Ig domen“, kako se ovde koriste, odnose se na strukturni domen IgSF proteina. Ig domeni su nazvani po molekulima imunoglobulina. Sadrže oko 70-110 amino-kiselina i kategorisani su prema svojoj veličini i funkciji. Ig-domeni poseduju karakterističan Ig-nabor, koji ima strukturu sličnu sendviču koju formiraju dva sloja antiparalelnih beta lanaca. Interakcije između hidrofobnih amino-kiselina na unutrašnjoj strani sendviča i visoko konzerviranih disulfidnih veza formiranih između ostataka cisteina u B i F lancima, stabilizuju Ig-nabor. Jedan kraj Ig domena ima deo koji se naziva region koji određuje komplementarnost, a koji je važan za specifičnost antitela za njihove ligande. Igslični domeni mogu se klasifikovati (u klase) kao: IgV, IgC1, IgC2 ili IgI. Većina Ig domena je ili varijabilna (IgV) ili konstantna (IgC). IgV domeni sa 9 beta lanaca su generalno duži od IgC domena sa 7 beta lanaca. Ig domeni nekih članova IgSF podsećaju na IgV domene u aminokiselinskoj sekvenci, ali su sličnih veličina IgC domenima. Oni se nazivaju IgC2 domeni, dok se standardni IgC domeni nazivaju IgC1 domeni. Lanci T-ćelijskih receptora (TCR) sadrže dva Ig domena u ekstracelularnom delu; jedan IgV domen na N-terminusu i jedan IgC1 domen pored ćelijske membrane. ICOSL sadrži dva Ig domena: IgV i IgC.
[0414] Izraz „IgSF vrste“, kako se ovde koristi, označava skup proteina članova IgSF sa identičnom ili suštinski identičnom primarnom amino-kiselinskom sekvencom. Svaki član superfamilije sisarskih imunoglobulina (IgSF) definiše jedinstveni identitet svih IgSF vrsta koje pripadaju tom IgSF članu. Dakle, svaki član IgSF porodice je jedinstven u odnosu na druge članove IgSF porodice i, shodno tome, svaka vrsta određenog člana IgSF porodice je jedinstvena u odnosu na vrstu drugog člana IgSF porodice. Ipak, varijacije između molekula koji su iste IgSF vrste mogu se javiti zbog razlika u posttranslacionoj modifikaciji kao što su glikozilacija, fosforilacija, ubikvitinacija, nitrozilacija, metilacija, acetilacija i lipidacija. Pored toga, manje razlike u sekvencama unutar jedne IgSF vrste zbog genskih polimorfizama predstavljaju drugi oblik varijacije unutar jedne IgSF vrste, kao i skraćeni oblici IgSF vrsta divljeg tipa zbog, na primer, proteolitičkog cepanja. „IgSF vrsta na ćelijskoj površini“ je IgSF vrsta eksprimovana na površini ćelije, generalno ćelije sisara.
[0416] [0150] Izraz „imunološka aktivnost“, kako se ovde koristi u kontekstu limfocita sisara kao što su T-ćelije, odnosi se na jednu ili više aktivnosti preživljavanja ćelija, proliferacije ćelija, proizvodnje citokina (npr. interferon-gama) ili citotoksičnosti T-ćelija. U nekim slučajevima, imunološka aktivnost može značiti ćelijsku ekspresiju citokina, kao što su hemokini ili interleukini. Testovi za određivanje pojačanja ili suzbijanja imunološke aktivnosti uključuju MLR (mešana limfocitna reakcija) testove koji mere nivoe citokina interferon-gama u supernatantima kulture Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846‑56), test stimulacije T ćelija SEB (stafilokokni enterotoksin B) Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846‑56), i testovi stimulacije T ćelija protiv CD3 (Li and Kurlander, J Transl Med. 2010: 8: 104). Pošto je aktivacija T ćelija vezana sa lučenjem citokina IFN-γ, detekcija nivoa IFN-γ u supernatantima kulture iz ovih in vitro testova na humanim T ćelijama može se testirati korišćenjem komercijalnih ELISA kompleta (Wu et al, Immunol Lett 15. april 2008; 117(1): 57-62). Indukcija imunog odgovora dovodi do povećanja imunološke aktivnosti u odnosu na mirujuće limfocite. Imunomodulatorni protein, kao što je varijanta ICOSL polipeptida koja sadrži afinitetno modifikovani IgSF domen, kao što je ovde dato, može u nekim realizacijama povećati ili, u alternativnim realizacijama, smanjiti ekspresiju IFN-γ (interferon-γ) u primarnom T-ćelijskom testu u odnosu na člana divljeg tipa IgSF ili kontrolu IgSF domena. Stručnjaci će podrazumevati da će se format primarnog T-ćelijskog testa koji se koristi za određivanje povećanja ekspresije IFN-γ razlikovati od onog koji se koristi za ispitivanje smanjenja ekspresije IFN-γ. U ispitivanju sposobnosti imunomodulatornog proteina ili afinitetno modifikovanog IgSF domena pronalaska da smanji ekspresiju IFN-γ u primarnom T-ćelijskom testu, može se koristiti test reakcije mešovitih limfocita (MLR) kao što je opisano u Primeru 6. Pogodno, rastvorljivi oblik afinitetno modifikovanog IgSF domena pronalaska može se koristiti za određivanje njegove sposobnosti da antagonizuje i time smanji ekspresiju IFN-γ u MLR kao što je takođe opisano u Primeru 6. Alternativno, u ispitivanju sposobnosti imunomodulatornog proteina ili afinitetno modifikovanog IgSF domena pronalaska da poveća ekspresiju IFN-γ u primarnom T-ćelijskom testu, može se koristiti test ko-imobilizacije. U testu koimobilizacije, signal T-ćelijskog receptora, koji u nekim realizacijama obezbeđuje anti-CD3 antitelo, koristi se zajedno sa koimobilizovanim afinitetno modifikovanim IgSF domenom, kao što je varijanta ICOSL, da bi se odredila sposobnost povećanja ekspresije IFN-γ u odnosu na kontrolu divljeg tipa IgSF domena. Postupci za ispitivanje imunološke aktivnosti konstruisanih ćelija, uključujući procenu aktivnosti varijante ICOSL transmembranskog imunomodulatornog proteina, poznate su u tehnici i uključuju, ali nisu ograničene na, sposobnost širenja T ćelija nakon stimulacije antigenom, održavanje širenja T ćelija u odsustvu ponovne stimulacije i antikancerogene aktivnosti u odgovarajućim životinjskim modelima. Testovi takođe uključuju testove za procenu citotoksičnosti, uključujući standardni Test oslobađanja<51>Cr (videti npr. Milone et al., (2009) Molecular Therapy 17: 1453‑1464) ili testovr citotoksičnosti zasnovanr na protoku, ili test citotoksičnosti zasnovan na impedansi (Peper et al. (2014) Journal of Immunological Methods, 405:192‑198).
[0418] „Imunomodulatorni polipeptid“ ili „imunomodulatorni protein“ je polipeptid ili proteinski molekul koji modulira imunološku aktivnost. Pod „modulacijom“ ili „moduliranjem“ imunog odgovora podrazumeva se da je imunološka aktivnost ili povećana ili smanjena. Imunomodulatorni protein može biti jedan polipeptidni lanac ili multimer (dimeri ili multimeri višeg reda) od najmanje dva polipeptidna lanca kovalentno vezana jedan za drugi, na primer, međulančanim disulfidnim vezama. Dakle, monomerni, dimerni i multimerni polipeptidi višeg reda spadaju u obim definisanog termina. Multimerni polipeptidi mogu biti homomultimerni (identičnih polipeptidnih lanaca) ili heteromultimerni (neidentičnih polipeptidnih lanaca). Imunomodulatorni protein pronalaska sadrži varijantu ICOSL.
[0419] Izraz „povećanje“, kako se ovde koristi, znači povećanje za statistički značajan iznos. Povećanje može biti najmanje 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100% ili veće od kontrolne vrednosti koja nije nula.
[0421] „Izoforma“ ICOSL (inducibilni kostimulativni ligand; CD275) je jedan od mnoštva prirodnih ICOSL polipeptida koji se razlikuju u amino-kiselinskoj sekvenci. Izoforme mogu biti proizvod splajs varijanti RNK transkripta koji eksprimuje jedan gen ili proizvod ekspresije veoma sličnih, ali različitih gena koji daju funkcionalno sličan protein, kao što može nastati duplikacijom gena. Kako se ovde koristi, izraz „izoforma“ ICOSL se, takođe, odnosi na proizvod različitih alela ICOSL gena (npr. ICOSLG).
[0423] Izraz „limfocit“, kako se ovde koristi, označava bilo koji od tri podtipa belih krvnih zrnaca u imunom sistemu sisara. One uključuju prirodne ćelije ubice (NK ćelije) (koje funkcionišu u ćelijski posredovanom, citotoksičnom urođenom imunitetu), T ćelije (za ćelijski posredovan, citotoksični adaptivni imunitet) i B ćelije (za humoralni, antitelima vođen adaptivni imunitet). T ćelije uključuju: T ćelije pomagače, citotoksične T-ćelije, prirodne T-ćelije ubice, memorijske T-ćelije, regulatorne T-ćelije ili gama delta T-ćelije. Urođene limfoidne ćelije (ILC) su, takođe, uključene u definiciju limfocita.
[0425] Izrazi „sisar“ ili „pacijent“ posebno uključuju referencu na najmanje jedno od sledećeg: čoveka, šimpanzu, rezus majmuna, cinomolgus majmuna (makaki rakojeda), psa, mačku, miša ili pacova.
[0427] [0156] Izraz „membranski protein“, kako se ovde koristi, označava protein koji je, pod fiziološkim uslovima, direktno ili indirektno vezan za lipidni dvosloj. Lipidni dvosloj koji formira membranu može biti biološka membrana kao što je eukariotska (npr. sisarska) ćelijska membrana ili veštačka (tj. napravljena) membrana kao što je ona koja se nalazi na lipozomu. Vezivanje membranskog proteina za lipidni dvosloj može biti putem kovalentnog vezivanja ili putem nekovalentnih interakcija kao što su hidrofobne ili elektrostatičke interakcije. Membranski protein može biti integralni membranski protein ili periferni membranski protein. Membranski proteini koji su periferni membranski proteini su nekovalentno vezani za lipidni dvosloj ili nekovalentno vezani za integralni membranski protein. Periferni membranski protein formira privremeno vezivanje za lipidni dvosloj tako da se pod rasponom uslova koji su fiziološki kod sisara, periferni membranski protein može povezati i/ili disocirati od lipidnog dvosloja. Za razliku od perifernih membranskih proteina, integralni membranski proteini formiraju suštinski trajnu vezu sa lipidnim dvoslojem membrane tako da se pod rasponom uslova koji su fiziološki kod sisara, integralni membranski proteini ne odvajaju od svoje veze sa lipidnim dvoslojem. Membranski protein može formirati vezu sa membranom preko jednog sloja lipidnog dvosloja (monotopski) ili vezan preko oba sloja membrane (politopski). Integralni membranski protein koji interaguje samo sa jednim lipidnim dvoslojem je „integralni monotopski protein“. Integralni membranski protein koji interaguje sa oba lipidna dvosloja je „integralni politopski protein“, alternativno se ovde naziva „transmembranski protein“.
[0429] [0157] Izrazi „moduliranje“ ili „modulirati“, kako se ovde koriste u kontekstu imunog odgovora, kao što je imuni odgovor sisara, odnose se na bilo koju promenu, kao što je povećanje ili smanjenje, postojećih ili potencijalnih imunih odgovora koja se javlja kao rezultat primene imunomodulatornog polipeptida koji sadrži varijantu ICOSL predmetnog pronalaska ili kao rezultat primene konstruisanih ćelija koje eksprimuju imunomodulatorni protein, kao što je varijanta ICOSL transmembranskog imunomodulatornog proteina predmetnog pronalaska. Dakle, odnosi se na promenu, kao što je povećanje ili smanjenje, imunog odgovora u poređenju sa imunim odgovorom koji se javlja ili je prisutan u odsustvu primene imunomodulatornog proteina koji sadrži varijantu ICOSL ili ćelija koje eksprimuju takav imunomodulatorni polipeptid. Takva modulacija uključuje bilo kakvu indukciju, aktivaciju, supresiju ili promenu stepena ili obima imunološke aktivnosti imune ćelije. Imunske ćelije uključuju B ćelije, T ćelije, NK (prirodne ćelije ubice), NK T ćelije, profesionalne ćelije koje prezentuju antigen (APC), neprofesionalne ćelije koje prezentuju antigen, i inflamatorne ćelije (neutrofili, makrofagi, monociti, eozinofili i bazofili). Modulacija obuhvata bilo koju promenu koja se daje postojećem imunološkom odgovoru, imunološkom odgovoru u razvoju, potencijalnom imunološkom odgovoru, ili sposobnost da se indukuje, reguliše, utiče ili odgovori na imuni odgovor. Modulacija obuhvata bilo kakvu promenu u ekspresiji i/ili funkciji gena, proteina i/ili drugih molekula u imunim ćelijama kao deo imunološkog odgovora. Modulacija imunološkog odgovora ili modulacija imunološke aktivnosti obuhvata, na primer, sledeće: eliminaciju, deleciju ili sekvestraciju imunih ćelija; indukciju ili stvaranje imunih ćelija koje mogu modulirati funkcionalni kapacitet drugih ćelija kao što su autoreaktivni limfociti, ćelije koje prezentuju antigen ili inflamatorne ćelije; indukciju stanja neodziva u imunim ćelijama (tj. anergiju); pojačavanje ili suzbijanje aktivnosti ili funkcije imunih ćelija, uključujući, ali ne ograničavajući se na promenu obrasca proteina koje ove ćelije eksprimuju. Primeri uključuju izmenjenu proizvodnju i/ili sekreciju određenih klasa molekula kao što su citokini, hemokini, faktori rasta, transkripcioni faktori, kinaze, kostimulativni molekuli ili drugi receptori na ćelijskoj površini ili bilo koja kombinacija ovih modulatornih događaja. Modulacija se može proceniti, na primer, promenom ekspresije IFN-γ (interferon gama) u odnosu na kontrolu divljeg tipa ICOSL u primarnom testu T ćelija (videti, Zhao and Ji, Exp Cell Res.2016 Jan1; 340(1) 132‑138). Modulacija se može proceniti, na primer, promenom imunološke aktivnosti konstruisanih ćelija, kao što je promena citotoksične aktivnosti konstruisanih ćelija ili promena u sekreciji citokina konstruisanih ćelija u odnosu na ćelije konstruisane sa transmembranskim proteinom divljeg tipa ICOSL.
[0431] Izraz „molekularna vrsta“, kako se ovde koristi, označava skup proteina sa identičnom ili suštinski identičnom primarnom amino-kiselinskom sekvencom. Svaki član superfamilije sisarskog imunoglobulina (IgSF) definiše kolekciju identičnih ili suštinski identičnih molekularnih vrsta. Tako, na primer, humani ICOSL je član IgSF, a svaki molekul humanog ICOSL je molekulska vrsta ICOS. Varijacije između molekula koji su iste molekularne vrste mogu se javiti zbog razlika u posttranslacionoj modifikaciji kao što su glikozilacija, fosforilacija, ubikvitinacija, nitrozilacija, metilacija, acetilacija i lipidacija. Pored toga, manje razlike u sekvencama unutar jedne molekularne vrste zbog polimorfizama gena predstavljaju drugi oblik varijacije unutar jedne molekularne vrste, kao i skraćeni oblici divljeg tipa jedne molekularne vrste zbog, na primer, proteolitičkog cepanja. „Molekularna vrsta ćelijske površine“ je molekularna vrsta eksprimovana na površini ćelije sisara. Za dve ili više različitih vrsta proteina, od kojih je svaka prisutna isključivo na jednoj ili isključivo na drugoj (ali ne na obema) od dve ćelije sisara koje formiraju IS, kaže se da su u „cis“ ili „cis konfiguraciji“ jedna sa drugom. Dve različite vrste proteina, od kojih je prva isključivo prisutna na jednoj od dve ćelije sisara koje formiraju IS, a druga je prisutna isključivo na drugoj od dve ćelije sisara koje formiraju IS, nazivaju se „trans“ ili „trans konfiguracijom“. Dve različite vrste proteina, od kojih je svaka prisutna na obe ćelije sisara koje formiraju IS, nalaze se i u cis i u trans konfiguracijama na ovim ćelijama.
[0433] [0159] Izraz „multimerizacioni domen“ odnosi se na sekvencu amino-kiselina koja pospešuje stabilnu interakciju molekula polipeptida sa jednim ili više dodatnih molekula polipeptida, od kojih svaki sadrži komplementarni multimerizacioni domen (npr. prvi multimerizacioni domen i drugi multimerizacioni domen), koji može biti isti ili različit multimerizacioni domen. Interakcije između komplementarnih multimerizacionih domena, npr. interakcija između prvog multimerizacionog domena i drugog multimerizacionog domena, formiraju stabilnu proteinprotein interakciju da bi se proizveo multimer molekula polipeptida sa dodatnim molekulom polipeptida. U nekim slučajevima, multimerizacioni domen je isti i interaguje sam sa sobom da bi formirao stabilnu protein-protein interakciju između dva polipeptidna lanca. Generalno, polipeptid je direktno ili indirektno vezan sa multimerizacionim domenom. Primeri multimerizacionih domena uključuju imunoglobulinske sekvence ili njihove delove, leucinske rajsferšluse, hidrofobne regione, hidrofilne regione i kompatibilne domene protein-protein interakcije. Multimerizacioni domen, na primer, može biti konstantni region ili domen imunoglobulina, kao što je, na primer, Fc domen ili njegovi delovi iz IgG, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 podtipove, IgA, IgE, IgD i IgM i njihove modifikovane oblike.
[0435] Izrazi „nukleinska kiselina“ i „polinukleotid“ koriste se naizmenično da bi se odnosili na polimer ostataka nukleinskih kiselina (npr. dezoksiribonukleotida ili ribonukleotida) u jednolančanom ili dvolančanom obliku. Osim ako nije drugačije ograničeno, izrazi obuhvataju nukleinske kiseline koje sadrže poznate analoge prirodnih nukleotida i koje imaju slična svojstva vezivanja kao i oni i metabolišu se na način sličan prirodnim nukleotidima. Osim ako nije drugačije naznačeno, određena sekvenca nukleinske kiseline, takođe, implicitno obuhvata njene konzervativno modifikovane varijante (npr. degenerisane supstitucije kodona) i komplementarne nukleotidne sekvence, kao i sekvencu koja je eksplicitno naznačena („referentna sekvenca“). Konkretno, degenerisane supstitucije kodona mogu se postići generisanjem sekvenci u kojima je treća pozicija jednog ili više odabranih (ili svih) kodona supstituisana ostacima mešovite baze i/ili dezoksiinozina. Izraz nukleinska kiselina ili polinukleotid obuhvata cDNK ili iRNK kodiranu genom.
[0437] [0161] Izraz „nekonkurentno vezivanje“, kako se ovde koristi, označava sposobnost proteina da se specifično istovremeno veže za najmanje dva srodna partnera za vezivanje. Dakle, protein je sposoban da se veže za najmanje dva različita srodna partnera za vezivanje istovremeno, iako interakcija vezivanja ne mora biti istog trajanja, tako da je u nekim slučajevima protein specifično vezan samo za jednog od srodnih partnera za vezivanje. U nekim realizacijama, vezivanje se odvija pod specifičnim uslovima vezivanja. U nekim realizacijama, istovremeno vezivanje je takvo da vezivanje jednog srodnog partnera za vezivanje značajno ne inhibira istovremeno vezivanje za drugog srodnog partnera za vezivanje. U nekim realizacijama, nekonkurentno vezivanje znači da vezivanje drugog srodnog partnera za vezivanje za njegovo mesto vezivanja na proteinu ne potiskuje vezivanje prvog srodnog partnera za vezivanje za njegovo mesto vezivanja na proteinu. Postupci procene nekonkurentnog vezivanja su dobro poznati u tehnici, kao što je posutpak opisan u Perez de La Lastra et al., Immunology, 1999 Apr: 96(4): 663‑670. U nekim slučajevima, u nekompetitivnim interakcijama, prvi srodni partner za vezivanje se specifično vezuje za mesto interakcije koje se ne preklapa sa mestom interakcije drugog srodnog partnera za vezivanje, tako da vezivanje drugog srodnog partnera za vezivanje ne ometa direktno vezivanje prvog srodnog partnera za vezivanje. Stoga, svaki efekat na vezivanje srodnog partnera za vezivanje vezivanjem drugog srodnog partnera za vezivanje je kroz mehanizam koji nije direktno ometanje vezivanja prvog srodnog partnera za vezivanje. Na primer, u kontekstu interakcija enzim-supstrat, nekompetitivni inhibitor se vezuje za mesto koje nije aktivno mesto enzima. Nekonkurentno vezivanje obuhvata nekompetitivne interakcije vezivanja u kojima se drugi srodni partner za vezivanje specifično vezuje za mesto interakcije koje se ne preklapa sa vezivanjem prvog srodnog partnera za vezivanje, ali se vezuje za drugo mesto interakcije samo kada je prvo mesto interakcije zauzeto prvim srodnim partnerom za vezivanje.
[0439] Izraz „farmaceutska kompozicija“ odnosi se na kompoziciju pogodnu za farmaceutsku upotrebu kod sisara, često čoveka. Farmaceutska kompozicija obično sadrži efikasnu količinu aktivnog sredstva (npr. imunomodulatornog polipeptida koji sadrži varijantu ICOSL ili konstruisane ćelije koje eksprimuju varijantu ICOSL transmembranskog imunomodulatornog proteina) i nosač, ekscipijens ili razblaživač. Nosač, ekscipijens ili razblaživač je obično farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijens ili razblaživač, redom.
[0441] Izrazi „polipeptid“ i „protein“ se ovde koriste naizmenično i odnose se na molekularni lanac od dve ili više amino-kiselina vezanih peptidnim vezama. Izrazi se ne odnose na određenu dužinu proizvoda. Stoga su „peptidi“ i „oligopeptidi“ uključeni u definiciju polipeptida. Izrazi uključuju posttranslacione modifikacije polipeptida, na primer, glikozilacije, acetilacije, fosforilacije i slično. Izrazi, takođe, uključuju molekule u koje su uključeni jedan ili više analoga amino-kiselina ili nekanonskih ili neprirodnih amino-kiselina, koje se mogu sintetizovati ili rekombinantno eksprimovati korišćenjem poznatih tehnika proteinskog inženjeringa. Pored toga, proteini se mogu derivatizovati.
[0442] Izraz „test primarnih T-ćelija“, kako se ovde koristi, odnosi se na in vitro test za merenje ekspresije interferona-gama („IFN-gama“). U tehnici je poznat niz takvih testova primarnih T-ćelija, kao što je onaj opisan u Primeru 7. U poželjnoj realizaciji, korišćeni test je test koimobilizacije anti-CD3. U ovom testu, primarne T ćelije se stimulišu anti-CD3 imobilizovanim sa ili bez dodatnih rekombinantnih proteina. Supernatanti kulture se sakupljaju u vremenskim tačkama, obično 24-72 sata. U drugoj realizaciji, korišćeni test je MLR. U ovom testu, primarne T ćelije se stimulišu alogenim APC. Supernatanti kulture se sakupljaju u vremenskim tačkama, obično 24-72 sata. Nivoi humanog IFN-gama se mere u supernatantima kulture standardnim ELISA tehnikama. Komercijalni kompleti su dostupni od dobavljača, a test se izvodi prema preporuci proizvođača.
[0444] Izraz „prečišćen“, kako se primenjuje na nukleinske kiseline, kao što su one koje kodiraju imunomodulatorne proteine pronalaska, generalno označava nukleinsku kiselinu ili polipeptid koji je u suštini slobodan od drugih komponenti, što je određeno analitičkim tehnikama dobro poznatim u tehnici (npr. prečišćeni polipeptid ili polinukleotid formira diskretnu traku u elektroforetskom gelu, hromatografskom eluatu i/ili medijumu podvrgnutom centrifugiranju u gradijentu gustine). Na primer, nukleinska kiselina ili polipeptid koji daje u suštini jednu traku u elektroforetskom gelu je „prečišćen“. Prečišćena nukleinska kiselina ili protein pronalaska je najmanje oko 50% čist, obično najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 99% ili više čist (npr. procenat po težini ili na molarnoj osnovi).
[0446] [0166] Izraz „rekombinantni“ ukazuje na to da je materijal (npr. nukleinska kiselina ili polipeptid) veštački (tj. neprirodno) izmenjen humanom intervencijom. Izmena se može izvršiti na materijalu unutar ili uklonjenom iz njegovog prirodnog okruženja ili stanja. Na primer, „rekombinantna nukleinska kiselina“ je ona koja je napravljena rekombinacijom nukleinskih kiselina, npr. tokom kloniranja, modifikacije afiniteta, premeštanja DNK ili drugih dobro poznatih molekularnobioloških postupaka. „Rekombinantni molekul DNK“ sastoji se od segmenata DNK spojenih pomoću takvih molekularno-bioloških tehnika. Izraz „rekombinantni protein“ ili „rekombinantni polipeptid“, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul proteina koji se eksprimuje pomoću molekula rekombinantne DNK. „Rekombinantna ćelija domaćin“ je ćelija koja sadrži i/ili eksprimuje rekombinantnu nukleinsku kiselinu ili koja je na drugi način izmenjena genetskim inžinjeringom, kao što je unošenje u ćeliju molekula nukleinske kiseline koji kodira rekombinantni protein, kao što je transmembranski imunomodulatorni protein koji je ovde dat. Kontrolni signali transkripcije kod eukariota obuhvataju „promoterske“ i „pojačivače“. Promoteri i pojačivači se sastoje od kratkih nizova DNK sekvenci koje specifično interaguju sa ćelijskim proteinima uključenim u transkripciju. Promoterski i pojačivači su izolovani iz različitih eukariotskih izvora, uključujući gene u ćelijama kvasca, insekata i sisara i virusima (analogni kontrolni elementi, tj. promoteri, nalaze se i kod prokariota). Izbor određenog promotera i pojačivača zavisi od toga koji tip ćelije će se koristiti za ekspresiju proteina od interesa. Izrazi „u operativnoj kombinaciji“, „u operativnom redosledu“ i „operativno vezano“, kako se ovde koriste, odnose se na povezivanje sekvenci nukleinskih kiselina na takav način ili u takvu orijentaciju da se proizvodi molekul nukleinske kiseline sposoban da usmeri transkripciju datog gena i/ili sintezu željenog molekula proteina.
[0448] Izraz „rekombinantni ekspresioni vektor“, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul DNK koji sadrži željenu kodirajuću sekvencu i odgovarajuće sekvence nukleinskih kiselina neophodne za ekspresiju operativno vezane kodirajuće sekvence u određenoj ćeliji domaćina. Sekvence nukleinskih kiselina neophodne za ekspresiju u prokariotima uključuju promotor, opciono operatorsku sekvencu, mesto vezivanja ribozoma i moguće druge sekvence. Poznato je da eukariotske ćelije koriste promotore, pojačivače i signale za terminaciju i poliadenilaciju. Sekretorna signalna peptidna sekvenca takođe može, opciono, biti kodirana rekombinantnim ekspresionim vektorom, operativno vezanim sa kodirajućom sekvencom za rekombinantni protein, kao što je rekombinantni fuzioni protein, tako da eksprimovani fuzioni protein može biti izlučen od strane rekombinantne ćelije domaćina, radi lakše izolacije fuzionog proteina iz ćelije, ako je potrebno. Izraz uključuje vektor kao samoreplicirajuću strukturu nukleinskih kiselina, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Među vektorima su virusni vektori, kao što su lentivirusni vektori.
[0450] [0168] Izraz „selektivnost“ odnosi se na preferenciju predmetnog proteina, ili polipeptida, za specifično vezivanje jednog supstrata, kao što je jedan srodni partner za vezivanje, u poređenju sa specifičnim vezivanjem za drugi supstrat, kao što je drugi srodni partner za vezivanje predmetnog proteina. Selektivnost se može odraziti kao odnos aktivnosti vezivanja (npr. afiniteta vezivanja) predmetnog proteina i prvog supstrata, kao što je prvi srodni partner za vezivanje (npr. K<d1>) i aktivnost vezivanja (npr. afinitet vezivanja) istog proteina sa drugim srodnim partnerom za vezivanje (npr. K<d2>).
[0452] Izraz „identitet sekvence“, kako se ovde koristi, odnosi se na identitet sekvence između gena ili proteina na nivou nukleotida ili amino-kiseline, redom. „Identitet sekvence“ je mera identiteta između proteina na nivou amino-kiseline i mera identiteta između nukleinskih kiselina na nivou nukleotida. Identitet sekvence proteina može se odrediti poređenjem sekvence aminokiseline na datoj poziciji u svakoj sekvenci kada su sekvence poravnate. Slično tome, identitet sekvence nukleinske kiseline može se odrediti poređenjem sekvence nukleotida na datoj poziciji u svakoj sekvenci kada su sekvence poravnate. Postupci za poravnanje sekvenci za poređenje su dobro poznati u tehnici, a takvi postupci uključuju GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA i TFASTA. BLAST algoritam izračunava procenat identiteta sekvence i vrši statističku analizu sličnosti između dve sekvence. Softver za izvođenje BLAST analize je javno dostupan preko internet stranice Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI).
[0454] Izraz „rastvorljiv“, kako se ovde koristi u vezi sa proteinima, znači da protein nije membranski protein. Generalno, rastvorljivi protein sadrži samo ekstracelularni domen receptora člana porodice IgSF, ili njegov deo koji sadrži IgSF domen ili domene ili njihove specifično vezujuće fragmente, ali ne sadrži transmembranski domen i/ili nije sposoban da se eksprimuje na površini ćelije. U nekim slučajevima, rastvorljivost proteina može se poboljšati povezivanjem ili vezivanjem, direktno ili indirektno preko linkera, za Fc domen, što, u nekim slučajevima, takođe može poboljšati stabilnost i/ili poluživot proteina. U nekim aspektima, rastvorljivi protein je Fc fuzioni protein.
[0456] Izraz „vrsta“, kako se ovde koristi u vezi sa polipeptidima ili nukleinskim kiselinama, označava skup molekula sa identičnim ili suštinski identičnim sekvencama. Varijacije između polipeptida iste vrste mogu se javiti zbog razlika u posttranslacionoj modifikaciji kao što su glikozilacija, fosforilacija, ubikvitinacija, nitrozilacija, metilacija, acetilacija i lipidacija. Blago skraćene sekvence polipeptida koje se razlikuju (ili kodiraju razliku) od vrste pune dužine na amino-terminusu ili karboksi-terminusu za ne više od 1, 2 ili 3 amino-kiselinska ostatka smatraju se pripadnicima jedne vrste. Takve mikroheterogenosti su uobičajena karakteristika proizvedenih proteina.
[0457] Izraz „specifični vezujući fragment“, kako se ovde koristi u vezi sa sisarskim ICOSL polipeptidom divljeg tipa pune dužine ili njegovim IgV ili IgC domenom, označava polipeptid koji ima podsekvencu IgV i/ili IgC domena i koji se specifično vezuje in vitro i/ili in vivo za ICOS sisara i/ili CD28 sisara, kao što su humani ili mišji ICOS ili CD28. U nekim realizacijama, specifični vezujući fragment ICOSL IgV ili ICOSL IgC je najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% dužine sekvence divljeg tipa pune dužine. Specifični vezujući fragment može biti izmenjen u sekvenci da bi se formirala varijanta ICOSL pronalaska.
[0459] Izraz „specifično se vezuje“, kako se ovde koristi, označava sposobnost proteina, pod specifičnim uslovima vezivanja, da se veže za ciljni protein tako da je njegov afinitet ili avidnost najmanje 5 puta veća, ali opciono najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250 ili 500 puta veća, ili čak najmanje 1000 puta veća od prosečnog afiniteta ili avidnosti istog proteina prema skupu slučajnih peptida ili polipeptida dovoljne statističke veličine. Specifično vezujući protein ne mora se isključivo vezati za jedan ciljni molekul, već se može specifično vezati za neciljni molekul zbog sličnosti u strukturnoj konformaciji između cilja i neciljnog molekula (npr. paralozi ili ortolozi). Stručnjaci će prepoznati da je specifično vezivanje za molekul koji ima istu funkciju kod druge vrste životinja (tj. ortolog) ili za molekul koji nije cilj i ima suštinski sličan epitop kao ciljni molekul (npr. paralog) moguće i ne umanjuje specifičnost vezivanja koja se određuje u odnosu na statistički validnu kolekciju jedinstvenih molekula koji nisu ciljevi (npr. slučajni polipeptidi). Stoga, polipeptid predmetnog pronalaska može se specifično vezati za više od jedne različite vrste ciljnog molekula zbog unakrsne reaktivnosti. Imunotestovi ELISA u čvrstoj fazi ili Biacore merenja mogu se koristiti za određivanje specifičnog vezivanja između dva proteina. Generalno, interakcije između dva vezujuća proteina imaju konstante disocijacije (K<d>) manje od 1x10<-5>M, a često i do 1 x 10<-12>M. U određenim realizacijama predmetnog pronalaska, interakcije između dva vezujuća proteina imaju konstante disocijacije od 1x10<-6>M, 1x10<-7>M, 1x10<-8>M, 1x10<-9>M, 1x10<-10>M ili 1x10<-11>M.
[0461] Izrazi „površinski eksprimuje“, „površinska ekspresija“ ili „eksprimovano na površini“ u vezi sa ćelijom sisara koja eksprimuje polipeptid znače da je polipeptid eksprimovan kao membranski protein. U nekim realizacijama, membranski protein je transmembranski protein.
[0463] [0175] Kako se ovde koristi, „sintetički“, kada se odnosi na, na primer, molekul sintetičke nukleinske kiseline ili sintetički gen ili sintetički peptid, odnosi se na molekul nukleinske kiseline ili molekul polipeptida koji je proizveden rekombinantnim metodama i/ili metodama hemijske sinteze.
[0465] Izraz „ciljajući deo“, kako se ovde koristi, odnosi se na kompoziciju koja je kovalentno ili nekovalentno vezana za, ili fizički inkapsulira, polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL predmetnog pronalaska. U nekim realizacijama, ciljani deo ima specifičan afinitet vezivanja za ciljni molekul, kao što je ciljni molekul eksprimovan na ćeliji. Obično, ciljni molekul je lokalizovan na specifičnom tkivu ili tipu ćelije. Ciljani delovi uključuju: antitela, fragment koji vezuje antigen (Fab), varijabilni fragment (Fv) koji sadrži V<H>i V<L>, jednolančani varijabilni fragment (scFv) koji sadrži V<H>i V<L>vezane zajedno u jednom lancu, kao i drugi fragmenti V regiona antitela, kao što su Fab’, F(ab)<2>, F(ab’)<2>, dsFv diatelo, nanotela, rastvorljivi receptori, ligandi receptora, receptori ili ligandi sa zrelim afinitetom, kao i kompozicije malih molekula (<500 daltona) (npr. kompozicije receptora za specifično vezivanje). Ciljajući delovi, takođe, mogu biti kovalentno ili nekovalentno vezane za lipidnu membranu lipozoma koji inkapsuliraju polipeptid predmetnog pronalaska.
[0467] Izraz „transmembranski protein“, kako se ovde koristi, označava membranski protein koji u suštini ili potpuno prekriva lipidni dvosloj, kao što su lipidni dvoslojevi koji se nalaze u biološkoj membrani, kao što je ćelija sisara, ili u veštačkoj konstrukciji kao što je lipozom. Transmembranski protein sadrži transmembranski domen („transmembranski domen“) kojim je integrisan u lipidni dvosloj i kojim je integracija termodinamički stabilna pod fiziološkim uslovima. Transmembranski domeni su generalno predvidljivi iz njihove amino-kiselinske sekvence putem bilo kog broja komercijalno dostupnih bioinformatičkih softverskih aplikacija na osnovu njihove povišene hidrofobnosti u odnosu na regione proteina koji interaguju sa vodenim sredinama (npr. citosol, ekstracelularna tečnost). Transmembranski domen je često hidrofobna alfa spirala koja prekriva membranu. Transmembranski protein može proći kroz oba sloja lipidnog dvosloja jednom ili više puta. Transmembranski protein uključuje ovde opisane transmembranske imunomodulatorne proteine. Pored transmembranskog domena, transmembranski imunomodulatorni protein predmetnog pronalaska dalje sadrži ektodomen i, u nekim realizacijama, endodomen.
[0469] [0178] Izrazi „lečenje“, „tretman“ ili „terapija“ bolesti ili poremećaja, kako se ovde koriste, znače usporavanje, zaustavljanje ili preokretanje progresije bolesti ili poremećaja, što se dokazuje smanjenjem, prestankom ili eliminacijom kliničkih ili dijagnostičkih simptoma, primenom terapeutske kompozicije (npr. koja sadrži imunomodulatorni protein ili konstruisane ćelije) predmetnog pronalaska, bilo samostalno ili u kombinaciji sa drugim jedinjenjem, kako je ovde opisano. „Lečenje“, „tretman“ ili „terapija“, takođe, znači smanjenje težine simptoma kod akutne ili hronične bolesti ili poremećaja ili smanjenje stope recidiva, kao na primer u slučaju recidivirajućeg ili remitentnog toka autoimune bolesti ili smanjenje upale u slučaju inflamatornog aspekta autoimune bolesti. Kako se ovde koriste u kontekstu raka, izrazi „lečenje“ ili „inhibiranje“, „inhibiranti“ ili „inhibicija“ raka odnose se na najmanje jedno od: statistički značajno smanjenje stope rasta tumora, prestanak rasta tumora ili smanjenje veličine, mase, metaboličke aktivnosti ili zapremine tumora, mereno standardnim kriterijumima kao što su, ali ne ograničavajući se na, Kriterijumi za procenu odgovora na solidne tumore (RECIST), ili statistički značajno povećanje preživljavanja bez progresije (PFS) ili ukupnog preživljavanja (OS). „Sprečavanje“, „profilaksa“ ili „prevencija“ bolesti ili poremećaja, kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska, odnosi se na primenu imunomodulatornog polipeptida ili konstruisanih ćelija pronalaska, bilo samostalno ili u kombinaciji sa drugim jedinjenjem, kako bi se sprečila pojava ili početak bolesti ili poremećaja ili neki ili svi simptomi bolesti ili poremećaja ili kako bi se smanjila verovatnoća pojave bolesti ili poremećaja.
[0471] Izraz „tumor specifični antigen (antigen specifičan za tumor)“ ili „TSA“, kako se ovde koristi, odnosi se na kontrastrukturu koja je prisutna prvenstveno na tumorskim ćelijama sisara, ali se generalno ne nalazi na normalnim ćelijama sisara. Tumor specifični antigen ne mora biti isključiv za tumorske ćelije, ali je procenat ćelija određenog sisara koje imaju tumor specifični antigen dovoljno visok ili su nivoi tumor specifičnog antigena na površini tumora dovoljno visoki da on može biti ciljan antitumorskom terapijom, kao što su imunomodulatorni polipeptidi pronalaska, i da obezbedi prevenciju ili lečenje sisara od efekata tumora. U nekim realizacijama, u nasumičnom statističkom uzorku ćelija sisara sa tumorom, najmanje 50% ćelija koje pokazuju TSA su kancerogene. U drugim realizacijama, najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% ćelija koje ispoljavaju TSA su kancerogene.
[0473] [0180] Izraz „varijanta“ (takođe „modifikovan“ ili „mutant“), kako se koristi u vezi sa varijantom ICOSL, označava ICOSL, kao što je ICOSL sisara (npr. humani ili mišji) stvoren humanom intervencijom. Varijanta ICOSL je polipeptid koji ima izmenjenu amino-kiselinska sekvencu u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL divljeg tipa. Varijanta ICOSL je polipeptid koji se razlikuje od referentnog ICOSL, kao što je izoformna sekvenca ICOSL divljeg tipa, jednom ili više modifikacija, kao što su jedna ili više supstitucija, delecija, adicija ili njihovih kombinacija amino-kiselina. Za potrebe ovog teksta, varijanta ICOSL sadrži najmanje jedan afinitetno modifikovani domen, pri čemu se jedna ili više razlika u amino-kiselinama javljaju u IgSF domenu (npr. IgV domenu). Varijanta ICOSL može da sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ili više razlika u amino-kiselinama, kao što su supstitucije amino-kiselina. Varijanta ICOSL polipeptida generalno ispoljava najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa odgovarajućom referencom (npr. nemodifikovanim ICOSL) ili divljim tipom, kao što je sekvenca SEQ ID NO:5, zrela sekvenca istog ili deo istog koji sadrži ekstracelularni domen ili njegov IgSF domen. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptid ispoljava najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa odgovarajućim referentnim (npr. nemodifikovanim) ili divljim tipom ICOSL, kao što je referentni ICOSL naveden u SEQ ID NO:32 ili SEQ ID NO: 196 ili 545. Neprirodno prisutne amino-kiseline, kao i prirodno prisutne aminokiseline, uključene su u obim dozvoljenih supstitucija ili dodavanja. Varijanta ICOSL nije ograničena na bilo koji poseban postupak proizvodnje i uključuje, na primer, de novo hemijsku sintezu, de novo tehnike rekombinantne DNK ili njihove kombinacije. Varijanta ICOSL pronalaska se specifično vezuje za CD28, ICOS i/ili CTLA-4. vrsta sisara. U nekim realizacijama, izmenjena sekvenca amino-kiselina rezultira izmenjenim (tj. povećanim ili smanjenim) afinitetom vezivanja ili avidnošću za ICOS i/ili CD28 u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim) ili divljim tipom ICOSL proteina. Povećanje ili smanjenje afiniteta vezivanja ili avidnosti može se odrediti korišćenjem dobro poznatih testova vezivanja kao što je protočna citometrija. Larsen et al., American Journal of Transplantation, Vol 5: 443‑453 (2005). Vidi takođe, Linsley et al., Immunity, Vol. 1(9): 793‑801 (1994). Povećanje afiniteta ili avidnosti vezivanja varijante ICOSL za ICOS i/ili CD28 je na vrednost koja je najmanje 5% veća od vrednosti referentnog (npr. nemodifikovanog) ili ICOSL divljeg tipa, a u nekim realizacijama, najmanje 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100% veća od vrednosti kontrole referentnog (npr. nemodifikovanog) ili ICOSL divljeg tipa. Smanjenje afiniteta ili avidnosti vezivanja ICOSL za ICOS i/ili CD28 je na vrednost koja nije veća od 95% vrednosti kontrole divljeg tipa, a u nekim realizacijama nije veće od 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, ili nema detektabilnog afiniteta vezivanja ili avidnosti kontrolnih vrednosti ICOS i/ili CD28 divljeg tipa. Varijanta ICOSL je izmenjena u primarnoj amino-kiselinskoj sekvenci supstitucijom, dodavanjem ili brisanjem amino-kiselinskih ostataka. Izraz „varijanta“ u kontekstu varijante ICOSL ne treba tumačiti kao nametanje bilo kakvog uslova za bilo koji poseban početni sastav ili postupak kojim se stvara varijanta ICOSL. Varijanta ICOSL može, na primer, biti generisana počevši od informacija o referentnoj ICOSL ili sekvenci divljeg tipa sisara ICOSL, zatim modelovana in silico za vezivanje za ICOS i/ili CD28, i konačno rekombinantno ili hemijski sintetizovana da bi se dobila varijanta ICOSL predmetnog pronalaska. U samo jednom alternativnom primeru, varijanta ICOSL može biti kreirana mutagenezom usmerenom na mesto reference (npr. nemodifikovane) ili divljeg tipa ICOSL. Dakle, varijanta ICOSL označava sastav, a ne nužno proizvod proizveden bilo kojim datim postupkom. Mogu se koristiti različite tehnike, uključujući rekombinantne postupke, hemijsku sintezu ili njihove kombinacije.
[0475] Izraz „divlji tip“ ili „prirodni“ ili „nativni“, kako se ovde koristi, koristi se u vezi sa biološkim materijalima kao što su molekuli nukleinskih kiselina, proteini (npr. ICOSL), članovi IgSF-a, ćelije domaćina i slično, a odnosi se na one koji se nalaze u prirodi i nisu modifikovani humanom intervencijom.
[0477] II. VARIJANTNI ICOSL POLIPEPTIDI
[0479] Ovde su dati varijantni ICOSL polipeptidi (varijante ICOSL peptida) koji pokazuju izmenjenu (povećanu ili smanjenu) aktivnost vezivanja ili afinitet za jednog ili više ICOSL srodnih partnera za vezivanje. U nekim realizacijama, ICOSL srodni partner za vezivanje je jedan ili više od CD28, ICOS ili CTLA-4. U nekim realizacijama, varijantni ICOSL polipeptid sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina, kao što su jedna ili više supstitucija (alternativno, „mutacije“ ili „zamene“), delecije ili adicije, u domenu superfamilije imunoglobulina (IgSF) (IgD) u odnosu na ICOSL polipeptid divljeg tipa ili nemodifikovani ICOSL polipeptid ili deo ICOSL divljeg tipa ili nemodifikovanog koji sadrži domen superfamilije imunoglobulina (IgSF) ili njegov specifični fragment za vezivanje. Dakle, dati varijantni ICOSL polipeptid jeste ili sadrži varijantni IgD (u daljem tekstu „vIgD“) u kojem se jedna ili više modifikacija amino-kiselina (npr. supstitucije) nalazi u IgD.
[0481] [0183] U nekim realizacijama, IgD sadrži IgV domen ili IgC (npr. IgC2) domen ili specifični vezujući fragment IgV domena ili IgC (npr. IgC2) domena, ili njihove kombinacije. U nekim realizacijama, IgD može biti samo IgV, kombinacija IgV i IgC, uključujući ceo ekstracelularni domen (ECD), ili bilo koja kombinacija Ig domena ICOSL. Tabela 2 navodi primerne ostatke koji odgovaraju IgV ili IgC regionima ICOSL. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži IgV domen ili IgC domen ili njegove specifične vezujuće fragmente u kojima je najmanje jedna od modifikacija amino-kiselina (npr. supstitucije) u IgV domenu ili IgC domenu ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu. U nekim realizacijama, zbog izmenjene aktivnosti vezivanja ili afiniteta, IgV domen ili IgC domen je afinitetno modifikovani IgSF domen.
[0483] U nekim realizacijama, varijanta je modifikovana u još jednom IgSF domenu u odnosu na sekvencu referentne (npr. nemodifikovane) ICOSL sekvence. U nekim realizacijama, referentna (npr. nemodifikovana) ICOSL sekvenca je ICOSL divljeg tipa. U nekim realizacijama, referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL divljeg tipa ima sekvencu nativnog ICOSL ili njegovog ortologa. U nekim realizacijama, referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL divljeg tipa jeste ili sadrži ekstracelularni domen (ECD) ICOSL ili njegov deo koji sadrži jedan ili više IgSF domena (videti Tabelu 2). U nekim realizacijama, ekstracelularni domen referentnog (npr. nemodifikovanog) ili ICOSL polipeptida divljeg tipa sadrži IgV domen i IgC domen ili domene. Međutim, varijanta ICOSL polipeptida ne mora nužno da sadrži i IgV domen i IgC domen ili domene. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži ili se u suštini sastoji od IgV domena ili njegovog specifičnog vezujućeg fragmenta. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži ili se u suštini sastoji od IgC domena ili njegovih specifičnih vezujućih fragmenata. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL je rastvorljiva i nema transmembranski domen. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL dalje sadrži transmembranski domen i, u nekim slučajevima, takođe i citoplazmatski domen.
[0485] U nekim realizacijama, referentna (npr. nemodifikovana) ili ICOSL sekvenca divljeg tipa je ICOSL sekvenca sisara. U nekim realizacijama, referentna (npr. nemodifikovana) ili ICOSL sekvenca divljeg tipa može biti ICOSL sekvenca sisara koja uključuje, ali nije ograničena na, ljude, miševe, cinomolgus majmune ili pacove. U nekim realizacijama, referentna (npr. nemodifikovana) ili ICOSL sekvenca divljeg tipa je ljudska.
[0487] [0186] U nekim realizacijama, referentna (npr. nemodifikovana) ili ICOSL sekvenca divljeg tipa ima (i) sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO:5 ili njen zreli oblik kome nedostaje signalna sekvenca, (ii) sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa SEQ ID NO:5 ili njenim zrelim oblikom, ili (iii) je deo (i) ili (ii) koji sadrži IgV domen ili IgC domen ili njihove specifične vezujuće fragmente.
[0489] U nekim realizacijama, referentna ICOSL sekvenca jeste ili sadrži ekstracelularni domen ICOSL ili njegov deo. U nekim realizacijama, referentni ili ICOSL polipeptid divljeg tipa obuhvata amino-kiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO:32, ili njen ortolog.
[0491]
[0494] U nekim slučajevima, referentni (npr. nemodifikovani) ili divlji tip ICOSL polipeptida može da sadrži (i) sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO:32, (ii) sekvencu aminokiselina koja ima najmanje oko 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 32, ili (iii) je specifični vezujući fragment sekvence (i) ili (ii) koji sadrži IgV domen ili IgC domen.
[0496] U nekim realizacijama, referentni ICOSL polipeptid sadrži skraćeni ekstracelularni domen koji sadrži C-terminalno skraćivanje u odnosu na sekvencu referentnog ICOSL ekstracelularnog domena navedenu u SEQ ID NO:32. U nekim realizacijama, C-terminalno skraćivanje je od najmanje 10, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 40, najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, najmanje 80, najmanje 90, najmanje 100, najmanje 125 amino-kiselinskih ostataka. U nekim realizacijama, C-terminalno skraćivanje je od najmanje 1, najmanje 5, najmanje 10, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 25, najmanje 30, najmanje 35 amino-kiselinskih ostataka. U nekim realizacijama, ICOSL polipeptid koji sadrži C-terminalno skraćivanje ne sadrži, izvan C-terminusa tačke skraćivanja, susedne amino-kiselinskie ostatke ICOSL divljeg tipa. Stoga, među datim ICOSL referentnim sekvencama su one koje su kraće od punog ekstracelularnog domena ICOSL divljeg tipa, npr. navedene u SEQ ID NO: 32. U nekim realizacijama, ICOSL polipeptid koji sadrži C-terminalno skraćenje ne sadrži ili nije fuzionisan sa amino-kiselinskim ostacima ICOSL domena izvan ekstracelularnog domena.
[0497] U nekim realizacijama, ICOSL referentni polipeptid je izmenjen, kao što je mutiranje ili brisanje, na jednom ili više mesta cepanja proteazom. Kao što je ovde utvrđeno, ICOSL polipeptid divljeg tipa sadrži mesto cepanja proteazom koje, u nekim slučajevima, dovodi do cepanja proteina nakon ekspresije u ćelijama, npr. ćelijama jajnika kineskog hrčka, što rezultira heterogenim proizvodom više vrsta, uključujući vrste različitih dužina ili veličina. Na primer, cepanje ICOSL polipeptida može se desiti na mestu cepanja proteazom LQQN/LT između ostataka 207 i 208 SEQ ID NO: 32 („/“ označava potencijalno mesto cepanja). U nekim realizacijama, ICOSL referentni polipeptid je izmenjen ili mu nedostaje mesto cepanja proteazom navedeno kao amino-kiseline 204-209 SEQ ID NO:32. U nekim realizacijama, skraćeni ICOSL polipeptid je otporniji na cepanje proteazom u poređenju sa ICOSL polipeptidom divljeg tipa ili neskraćenim. Primeri skraćenih ECD ICOSL polipeptida kojima nedostaje celokupno ili deo mesta cepanja LQQN/LT proteaze (označeni kao skraćenja br.2, br. 3, br.4, br.5, br.6, br. 7 ili br.8) dati su u SEQ ID NO: 600-606.
[0499] Skraćenje br.2:
[0501]
[0504] Skraćenje br.4:
[0505] Skraćenje br.6:
[0507]
[0510] Skraćenje br.8:
[0512]
[0515] U nekim realizacijama, ICOSL referentni polipeptid je izmenjen u jednoj ili više aminokiselina koje odgovaraju amino-kiselinama 204-209 u odnosu na SEQ ID NO:32. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstituciju u referentnom ICOSL ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu koja odgovara poziciji(ama) 207 i/ili 208 u odnosu na numeraciju SEQ ID NO:32. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstituciju, izabranu iz N207A, N207G, L208G, ili konzervativnu modifikaciju amino-kiselina, npr. njihovu supstituciju. U nekim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucija je N207A/L208G ili N207G/L208G. U nekim realizacijama, referentni ECD pune dužine ili skraćeni referentni ECD varijante ICOSL polipeptida su modifikovani tako da sadrže jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucije, izabrane iz N207A, N207G, L208G, ili konzervativnu modifikaciju amino-kiselina. Primeri referentnih ECD pune dužine ili skraćeni sa jednom ili više modifikacija navedeni su u SEQ ID NO: 607-628. Primeri referentnih sekvenci koje sadrže mutacije na mestu cepanja N207 i/ili L208 sa referencom na pozicije navedeni su u SEQ ID NO: 32 i navedeni su u SEQ ID NO: 624-628. U nekim slučajevima, date modifikacije mogu smanjiti cepanje ICOSL polipeptida proteazom, kao što je cepanje koje se može dogoditi na mestu cepanja proteazom LQQN/LT.
[0516] U nekim realizacijama, kombinacije gore navedenih strategija skraćivanja i modifikacije mogu se koristiti u referentnoj ICOSL ECD sekvenci. U nekim realizacijama, modifikacije, npr. supstitucije, se vrše u skraćenom referentnom ICOSL polipeptidu kao što je primerna referentna ICOSL sekvenca navedena u SEQ ID NO: 600-606. Primerne varijante ICOSL polipeptidnih sekvenci sa modifikacijama na potencijalnom mestu (mestima) cepanja proteaze N207 i/ili L208 navedene su u SEQ ID NO: 607-628. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ispoljava smanjeno cepanje proteaze u poređenju sa ICOSL polipeptidom divljeg tipa, kao što je sadržaj ECD sekvence navedene u SEQ ID NO:32.
[0518] U nekim realizacijama, referentni (npr. nemodifikovani) ili divlji tip ICOSL polipeptida sadrži IgV domen ili IgC domen, ili njihov specifični vezujući fragment. U nekim realizacijama, ICOSL referentni polipeptid koji sadrži IgV domen sadrži amino-kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 196 (što odgovara amino-kiselinskim ostacima 19-129 SEQ ID NO:5), ili njegov ortolog.
[0520]
[0523] U nekim realizacijama, referentni ICOSL polipeptid koji sadrži IgV domen sadrži najmanje amino-kiseline 1-112, 1-113, 1-114, 1-115, 1-116, 1-117, 1-118, 1-119, 1-120, 1-121, 1-122, uz upućivanje na numeraciju navedenu u SEQ ID NO:32. U nekim realizacijama, ICOSL referentni polipeptid koji sadrži IgV domen sadrži amino-kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 545 (što odgovara amino-kiselinskim ostacima 19-140 SEQ ID NO:5), ili njen ortolog. U nekim realizacijama, IgV domen je jedini IgSF domen ICOSL referentnog polipeptida.
[0525]
[0528] U nekim realizacijama, IgV domen referentnog (npr. nemodifikovanog) ili divljeg tipa ICOSL polipeptida može da sadrži (i) sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO: 196 ili 545, (ii) sekvencu amino-kiselina koja ima najmanje oko 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 196 ili 545, ili (iii) specifičan vezujući fragment sekvence amino-kiselina navedene u SEQ ID NO: 196 ili 545 ili specifičan vezujući fragment sekvence (i) ili (ii). U nekim realizacijama, referentni (npr.
[0529] nemodifikovani) IgV domen je sposoban da se veže za jedan ili više ICOSL srodnih vezujućih proteina, kao što su jedan ili više CD28, ICOS ili CTLA-4.
[0531] U nekim realizacijama, IgC domen referentnog (npr. nemodifikovanog) ili divljeg tipa ICOSL polipeptida sadrži amino-kiselinska sekvenca navedena kao ostaci 141-227 SEQ ID NO: 5, ili njegov ortolog. Na primer, IgC domen referentnog (npr. nemodifikovanog) ili divljeg tipa ICOSL polipeptida može da sadrži (i) sekvencu amino-kiselina navedenu kao ostaci 141-227 SEQ ID NO: 5, (ii) sekvencu amino-kiselina koja ima najmanje oko 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identiteta sekvence sa ostacima 141-227 SEQ ID NO: 5, ili (iii) (i) ili (ii). U nekim realizacijama, referentni IgV domen je sposoban da se veže za jedan ili više ICOSL srodnih vezujućih proteina.
[0533] U nekim realizacijama, referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa sadrži specifični vezujući fragment ICOSL, kao što je specifični vezujući fragment IgV domena ili IgC domena. U nekim realizacijama, specifični vezujući fragment može da se veže za CD28, ICOS i/ili CTLA-4. Specifični vezujući fragment može imati dužinu amino-kiselina od najmanje 50 amino-kiselina, kao što je najmanje 60, 70, 80, 90, 100 ili 110 amino-kiselina. U nekim realizacijama, specifični vezujući fragment IgV domena sadrži amino-kiselinska sekvenca koja je najmanje oko 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% dužine IgV domena navedene kao amino-kiseline 19-129 SEQ ID NO: 5. U nekim realizacijama, specifični vezujući fragment IgC domena sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% dužine IgC domena navedene kao amino-kiseline. 141-227 od SEQ ID NO: 5.
[0535] [0198] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži ECD domen, skraćeni ECD domen ili njegov deo koji sadrži jedan ili više afinitetno modifikovanih IgSF domena. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida može da sadrži IgV domen ili IgC domen, u kome jedan ili više IgSF domena (IgV ili IgC) ili specifični vezujući fragment IgV domena ili specifični vezujući fragment IgC domena sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina (npr. supstitucije). U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida može da sadrži IgV domen i IgC domen, ili specifični vezujući fragment IgV domena i specifični vezujući fragment IgC domena. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži IgV domen pune dužine. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži IgC domen pune dužine. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži specifični vezujući fragment IgV domena. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži specifični vezujući fragment IgC domena. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži IgV domen pune dužine i IgC domen pune dužine. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži IgV domen pune dužine i specifični vezujući fragment IgC domena. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži specifični vezujući fragment IgV domena i IgC domen pune dužine. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži specifični vezujući fragment IgV domena i specifični vezujući fragment IgC domena.
[0537] U bilo kojoj od takvih realizacija, jedna ili više modifikacija amino-kiselina (npr. supstitucije) varijanti ICOSL polipeptida mogu se nalaziti u bilo kom ili više domena ICOSL polipeptida. Na primer, u nekim realizacijama, jedna ili više supstitucija amino-kiselina nalaze se u ekstracelularnom domenu (ECD) varijante ICOSL polipeptida, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 32. U nekim realizacijama, jedna ili više supstitucija amino-kiselina nalaze se u IgV domenu ili specifičnom vezujućem fragmentu IgV domena. U nekim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina (npr. supstitucije) nalaze se u IgC domenu ili specifičnom vezujućem fragmentu IgC domena.
[0539] Generalno, svaki od različitih atributa polipeptida je odvojeno opisan u daljem tekstu (npr. rastvorljivi, sekretibilni i membranski vezani polipeptidi, afinitet ICOSL za CD28, ICOS i CTLA-4, broj varijacija po polipeptidnom lancu, broj vezanih polipeptidnih lanaca, broj i priroda promena amino-kiselina po varijanti ICOSL, itd.). Međutim, kao što će biti jasno stručnjaku u tehnici, svaki određeni polipeptid može da sadrži kombinaciju ovih nezavisnih atributa. Podrazumeva se da su reference na amino-kiseline, uključujući i specifičnu sekvencu navedenu kao SEQ ID NO koja se koristi za opis organizacije domena IgSF domena, u ilustrativne svrhe i nisu namenjene da ograniče obim datih realizacija. Podrazumeva se da su polipeptidi i opis njihovih domena teoretski izvedeni na osnovu analize homologije i poravnanja sa sličnim molekulima. Dakle, tačan lokus može da varira i nije nužno isti za svaki protein. Stoga, specifični IgSF domen, kao što je specifični IgV domen ili IgC domen, može biti nekoliko amino-kiselina (kao što je jedna, dve, tri ili četiri) duži ili kraći.
[0541] Dalje, različite realizacija pronalaska, kao što je objašnjeno u daljem tekstu, često su date u značenju definisanog izraza kao što je gore opisano.
[0542] A. Primeri modifikacija
[0544] Ovde su dati varijantni ICOSL polipeptidi koji sadrže najmanje jedan afinitetno modifikovani IgSF domen (npr. IgV ili IgC) ili njegov specifični vezujući fragment u IgSF domenu sadržanom u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili ICOSL polipeptidu divljeg tipa, tako da varijantni ICOSL polipeptid ispoljava izmenjenu (povećanu ili smanjenu) aktivnost vezivanja ili afinitet za jedan ili više liganda ICOS, CD28 ili CTLA-4 u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim) ili ICOSL polipeptidom divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijantni ICOSL polipeptid ima afinitet vezivanja za CD28, ICOS i/ili CTLA-4 koji se razlikuje od afiniteta vezivanja referentne (npr. nemodifikovane) ili kontrolne sekvence ICOSL polipeptida divljeg tipa, što je određeno, na primer, imunotestovima čvrste faze ELISA, protočnom citometrijom ili Biacore testovima. U nekim realizacijama, varijantni ICOSL polipeptid ima povećan afinitet vezivanja za CD28, ICOS i/ili CTLA-4. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima smanjen afinitet vezivanja za CD28, ICOS i/ili CTLA-4, u odnosu na referentni (nemodifikovani) ili divlji tip ICOSL polipeptida. CD28, ICOS i/ili CTLA-4 mogu biti protein sisara, kao što je humani protein ili mišji protein.
[0546] Afiniteti vezivanja za svakog od srodnih partnera za vezivanje su nezavisni; to jest, u nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima povećan afinitet vezivanja za jedan, dva ili tri od CD28, ICOS i/ili CTLA-4, i smanjen afinitet vezivanja za jedan, dva ili tri od CD28, ICOS i CTLA-4, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa.
[0548] [0204] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima povećan afinitet vezivanja za CD28, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima povećan afinitet vezivanja za ICOS, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima povećan afinitet vezivanja za CTLA-4, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima smanjen afinitet vezivanja za CD28, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima smanjen afinitet vezivanja za ICOS, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima smanjen afinitet vezivanja za CTLA-4, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa.
[0550] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima povećan afinitet vezivanja za CD28 i ICOS, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima povećan afinitet vezivanja za CD28 i smanjen afinitet vezivanja za ICOS, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima smanjen afinitet vezivanja za CD28 i ICOS, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima smanjen afinitet vezivanja za CD28 i povećan afinitet vezivanja za ICOS, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa.
[0552] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima povećan afinitet vezivanja za CD28 i CTLA-4, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima povećan afinitet vezivanja za CD28 i smanjen afinitet vezivanja za CTLA-4, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima smanjen afinitet vezivanja za CD28 i CTLA-4, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima smanjen afinitet vezivanja za CD28 i povećan afinitet vezivanja za CTLA-4, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa.
[0554] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima povećan afinitet vezivanja za ICOS i CTLA-4, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOS polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima povećan afinitet vezivanja za ICOS i smanjen afinitet vezivanja za CTLA-4, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima smanjen afinitet vezivanja za ICOS i CTLA-4, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima smanjen afinitet vezivanja za ICOS i povećan afinitet vezivanja za CTLA-4, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa.
[0555] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima povećan afinitet vezivanja za CD28, ICOS i CTLA-4, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima povećan afinitet vezivanja za CD28 i ICOS, i smanjen afinitet vezivanja za CTLA-4, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima povećan afinitet vezivanja za CD28 i CTLA-4, i smanjen afinitet vezivanja za ICOS, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima smanjen afinitet vezivanja za CD28 i ICOS, i povećan afinitet vezivanja za CTLA-4, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima smanjen afinitet vezivanja za CD28 i povećan afinitet vezivanja za ICOS i CTLA-4, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima povećan afinitet vezivanja za CD28 i smanjen afinitet vezivanja za ICOS i CTLA-4, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima smanjen afinitet vezivanja za CD28, CTLA-4 i ICOS, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima smanjen afinitet vezivanja za CD28 i povećan afinitet vezivanja za ICOS i CTLA-4, u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa.
[0557] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sa povećanim ili većim afinitetom vezivanja za CD28, ICOS i/ili CTLA-4 imaće povećanje afiniteta vezivanja u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili kontrolni ICOSL polipeptid divljeg tipa od najmanje oko 5%, kao što je najmanje oko 10%, 15%, 20%, 25%, 35% ili 50% za CD28, ICOS i/ili CTLA-4. U nekim realizacijama, povećanje afiniteta vezivanja u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili ICOSL polipeptid divljeg tipa je više od 1,2 puta, 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta ili 50 puta. U takvim primerima, referentni (npr. nemodifikovani) ili divlji tip ICOSL polipeptida ima istu sekvencu kao i varijanta ICOSL polipeptida, osim što ne sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina (npr. supstitucije).
[0559] [0210] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sa smanjenim afinitetom vezivanja za CD28, ICOS i/ili CTLA-4 imaće smanjenje afiniteta vezivanja u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili kontrolni ICOSL polipeptid divljeg tipa od najmanje 5%, kao što je najmanje oko 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više za CD28, ICOSL i/ili CTLA-4. U nekim realizacijama, smanjenje afiniteta vezivanja u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili divlji tip ICOSL polipeptida je više od 1,2 puta, 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta ili 50 puta. U takvim primerima, referentni (npr. nemodifikovani) ili divlji tip ICOSL polipeptida ima istu sekvencu kao i varijanta ICOSL polipeptida, osim što ne sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucije.
[0561] U nekim realizacijama, konstanta ravnotežne disocijacije (K<d>) bilo koje od gore datih realizacija za CD28, ICOS i/ili CTLA-4 može biti manja od 1x10<-5>M, 1x10<-6>M, 1x10<-7>M, 1x10<-8>M, 1x10<-9>M, 1x10<-10>M ili 1x10<-11>M, ili 1x10<-12>M.
[0563] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima povećan ili veći afinitet vezivanja za CD28. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sa povećanim ili većim afinitetom vezivanja za CD28 imaće povećanje afiniteta vezivanja u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili kontrolni ICOSL polipeptid divljeg tipa od najmanje oko 25%, kao što je najmanje oko 30%, 40%, 50% ili 60% za CD28. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sa povećanim ili većim afinitetom vezivanja za CD28 ima ravnotežnu konstantu disocijacije (K<d>) manje od 200 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM ili 600 pM za CD28. U nekim realizacijama, varijantni polipeptid se specifično vezuje za ektodomen jednog od ICOS, CD28 ili CTLA4 sa povećanom selektivnošću u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim) ili divljim tipom ICOSL. U nekim realizacijama, povećana selektivnost je za CD28. U nekim realizacijama, povećana selektivnost obuhvata veći odnos vezivanja varijantnog ICOSL polipeptida za jednog srodnog partnera za vezivanje izabranog iz grupe ICOS, CD28 i CTLA4 u odnosu na drugog srodnog partnera za vezivanje u poređenju sa odnosom vezivanja referentnog (npr. nemodifikovanog) ili divljeg tipa ICOSL polipeptida za jednog srodnog partnera za vezivanje u odnosu na drugog srodnog partnera za vezivanje. U nekim realizacijama, odnos je veći za najmanje ili najmanje oko 1,5 puta, 2,0 puta, 3,0 puta, 4,0 puta, 5 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta, 50 puta ili više.
[0565] [0213] Referentna (npr. nemodifikovana) ili sekvenca divljeg tipa ICOSL ne mora nužno biti korišćena kao početni sastav za generisanje varijantnih ICOSL polipeptida opisanih ovde. Stoga, upotreba izraza „modifikacija“, kao što je „supstitucija“, ne podrazumeva da su sadašnje realizacije ograničena na određeni postupak pravljenja varijantnih ICOSL polipeptida. Varijantni ICOSL polipeptidi mogu se napraviti, na primer, putem de novo sinteza peptida i stoga ne zahteva nužno modifikaciju, kao što je „supstitucija“, u smislu promene kodona za kodiranje modifikacije, npr. supstitucija. Ovaj princip se, takođe, proteže na izraze „adicija“ (dodavanje) i „delecija“ (brisanje) ostatka amino-kiseline koji, takođe, ne podrazumevaju poseban postupak proizvodnje. Način na koji se varijantni ICOSL polipeptidi dizajniraju ili kreiraju nije ograničen na bilo koji poseban postupak. Međutim, u nekim realizacijama, referentna (npr. nemodifikovana) ili nukleinska kiselina divljeg tipa koja kodira ICOSL se mutagenizuje iz referentnog (npr. nemodifikovanog) ili divljeg tipa ICOSL genetskog materijala i skrinira se na željeni specifični afinitet vezivanja i/ili indukciju ekspresije IFN-γ ili drugu funkcionalnu aktivnost. U nekim realizacijama, varijantni ICOSL polipeptid se sintetiše de novo koristeći proteinske ili nukleinske kiselinske sekvence dostupne u brojnim javno dostupnim bazama podataka, a zatim naknadno skrinirane. Nacionalni centar za biotehnološke informacije pruža takve informacije, a njegova internet stranica je javno dostupna putem interneta, kao i baza podataka UniProtKB o kojoj je prethodno bilo reči.
[0567] Osim ako nije drugačije naznačeno, kao što je naznačeno u predmetnom pronalasku, modifikacija(e) amino-kiselina su označene brojem pozicije amino-kiseline koji odgovara numeraciji pozicija referentne ECD sekvence navedene u SEQ ID NO:32. U nivou veštog stručnjaka je da identifikuje odgovarajuću poziciju modifikacije, npr. supstitucije amino-kiseline, u ICOSL polipeptidu, uključujući i njegov deo koji sadrži IgSF domen (npr. IgV), kao što je poravnanje referentne sekvence (npr. SEQ ID NO:196, 545, 600-628) sa SEQ ID NO:32. U navođenju modifikacija u predmetnom pronalasku, pozicija amino-kiseline je naznačena u sredini, sa odgovarajućom referentnom (npr. nemodifikovanom ili divljeg tipa) amino-kiselinom navedenom pre broja i identifikovanom varijantom supstitucije amino-kiseline navedenom posle broja. Ako je modifikacija delecija pozicije, naznačeno je „del“, a ako je modifikacija insercija na poziciji, naznačeno je „ins“. U nekim slučajevima, insercija je navedena sa naznačenom pozicijom amino-kiseline u sredini, sa odgovarajućom referentnom amino-kiselinom navedenom pre i posle broja i identifikovanom varijantom insercije amino-kiseline navedenom posle nemodifikovane (npr. divljeg tipa) amino-kiseline.
[0568] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija aminokiselina, npr. supstituciju u referentnoj (npr. nemodifikovanoj) ili ICOSL sekvenci divljeg tipa. Jedna ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucija, mogu biti u ektodomenu (ekstracelularnom domenu) referentne (npr. nemodifikovane) ili ICOSL sekvence divljeg tipa. U nekim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucija, nalaze se u IgV domenu ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu. U nekim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucija, nalaze se u IgC domenu ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu. U nekim realizacijama varijante ICOSL polipeptida, neke od jedne ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucija, nalaze se u IgV domenu ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu, a neke od jedne ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucija, nalaze se u IgC domenu ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu.
[0570] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 modifikacija amino-kiselina, npr. supstituciju. Modifikacija, npr. supstitucija može biti u IgV domenu ili IgC domenu. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 supstitucija amino-kiselina u IgV domenu ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 amino-kiselinskih supstitucija u IgC domenu ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima najmanje oko 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa referentnim (npr. nemodifikovanim) ili divljim tipom ICOSL polipeptida ili njegovim specifičnim vezujućim fragmentom, kao što je sa amino-kiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 32, 196 ili 545.
[0572] [0217] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija aminokiselina, npr. supstitucija u referentnom ICOSL ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu koja odgovara poziciji(ama) 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 27, 30, 33, 37, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 77, 78, 75, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109,110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ili 227 uz upućivanje na numeraciju SEQ ID NO:32. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucija u referentnom ICOSL ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu koja odgovara poziciji(ama) 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 26, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ili 227 uz upućivanje na numeraciju SEQ ID NO:32.
[0574] U nekim realizacijama, takvi varijantni ICOSL polipeptidi pokazuju izmenjeni afinitet vezivanja za jedan ili više CD28, ICOS i/ili CTLA-4 u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim) ili divljim tipom ICOSL polipeptida. Na primer, u nekim realizacijama, varijantni ICOSL polipeptid ispoljava povećan afinitet vezivanja za CD28, ICOS i/ili CTLA-4 u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim) ili divljim tipom ICOSL polipeptida. U nekim realizacijama, varijantni ICOSL polipeptid ispoljava smanjen afinitet vezivanja za CD28, ICOS ili CTLA-4 u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim) ili divljim tipom ICOSL polipeptida.
[0576] [0219] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija aminokiselina, npr. supstitucija izabrana iz M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20V, S25G, F27S, F27C, N30D, Y33del, Q37R, K42E, Y47H, T43A, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52L, N52K, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54P, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61S, R61C, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94E, H94D, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100P, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110D, V110N, V110A, E111del, T113E, H115R, H115Q, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S, S121G, V122A, V122M, S126T, S126R, H129P, S130G,S132F, Q133H, E135K, F138L, T139S, C140D, C140del, S142F,I143V, I143T, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H,W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161P, L161M, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190S, T190A, S192G, V193M, N194D, C198R, N201S, L203P, L203F, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217V, I218T, I218N, E220G, R221G, R221I, I224V, T225A, N227K ili konzervativne modifikacije amino-kiselina, npr. njihove supstitucije. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucija izabrana iz M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20T, A20V, S25G, R26S, F27C, F27S, N30D, Y33del, Q37R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R61S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110A, V110D, V110N, E111del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S, S121G, V122A, V122M, S126R,S126T, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, I143T, I143V, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H, W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161M, L161P, Q164L, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193A, V193M, N194D, C198R, N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, I218N, I218T, E220G, R221G, R221I, R221K, I224V, T225A, T225S, N227K, ili njihove konzervativne amino-kiselinske supstitucije.
[0578] Konzervativna modifikacija amino-kiseline, npr. supstitucija, je bilo koja amino-kiselina koja spada u istu klasu amino-kiselina kao i supstituisane amino-kiseline, osim referentne (npr. nemodifikovane) ili amino-kiseline divljeg tipa. Klase amino-kiselina su alifatične (glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin), hidroksilne ili one koje sadrže sumpor (serin, cistein, treonin i metionin), ciklične (prolin), aromatične (fenilalanin, tirozin, triptofan), bazne (histidin, lizin i arginin) i kisele/amidne (aspartat, glutamat, asparagin i glutamin).
[0580] [0221] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija aminokiselina, npr. supstituciju izabrana iz M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20V, S25G, F27S, F27C, N30D, Y33del, Q37R, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52L, N52K, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54P, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y,R61S, R61C, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94E, H94D, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100P, Q100S, Q100T, Q100V, G103E, L102R, V107A, V107I, S109G, S109N, V110D, V110N, V110A, E111del, T113E, H115R, H115Q, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S, S121G, V122A, V122M, S126T, S126R, H129P, S130G,S132F, Q133H, E135K, F138L, T139S, C140D, C140del, S142F, I143V, I143T, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H,W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161P, L161M, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193M, N194D, C198R, N201S, L203P, L203F, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217V, 1218T, I218N, E220G, R221G, R221I, I224V, T225A ili N227K. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstituciju izabranu iz M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20T, A20V, S25G, R26S, F27C, F27S, N30D, Y33del, Q37R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R61S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110A, V110D, V110N, E111del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S, S121G, V122A, V122M, S126R,S126T, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, I143T, I143V, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H, W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161M, L161P, Q164L, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193A, V193M, N194D, C198R, N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, I218N, 1218T, E220G, R221G, R221I, R221K, 1224V, T225A, T225S, N227K ili njihove konzervativne amino-kiselinske supstitucije.
[0582] [0222] U nekim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina, npr. zamena je N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N52S/G103E, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52D/V151A, N52H/I143T, N52S/L80P, F120S/Y152H/N201S, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S, N52H/F78L/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D, N52H/Q100R, N52H/S121G, 20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/Q100P, N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y, N52S/F120S, N52S/V97A, N52S/G72R, N52S/A71T/A117T, N52S/E220G, Y47H/N52S/V107A/F120S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V 110D/H115R/Y152C/K156M/C198R,
[0583] Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G,
[0584] N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R,
[0585] N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R, F27S/N52H/N57Y/V110N, N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q, S18R/N52S/F93L/I143V/R221G, A20T/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52S/H94E/L96I/V122M, N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N,
[0586] M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S, N52H/N57Y/Q100R/V110-D/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110- D/E135K/L173S/C198R, N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I, M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129-P/I143V/F172S/V193M,C198R, N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R,
[0587] N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N52S/E90A, N30D/K42E/N52S, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N52S/F120S/N227K, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, T43A/N52-H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110-D/I154F/C198R/R221G, Q100R, F138L/L203P, N57Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, Q100R/F138L, L203P, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R, N52H/V122A/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R,
[0588] E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52S/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115Q/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R /F172S/C198R, N52Q/N207Q, N168Q/N207Q, N52Q/N168Q, N84Q/N207Q, N155Q/N207Q, N119Q/N168Q, N119Q/N207Q, N119Q/N155Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N84Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N84Q/N155Q/N168Q, N84Q/N168Q/N207Q, N84Q/N155H/N207Q, N155Q/N168Q/N207Q, N119Q/N155Q/N168Q, N119Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N207Q, N119Q/N155H/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q, N52H/N84Q/N207Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/N155Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q, N84Q/N155Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/-Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L ili N57Q/Q100P.
[0590] U nekim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane iz grupe N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R. N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52D/V151A, N52H/I143T, N52S/L80P, F120S/Y152H/N201S, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S, N52S/G103E, N52H/F78L/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D, N52H/Q100R, N52H/S121G, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y, N52S/F120S, N52S/V97A, N52S/G72R, N52S/A71T/A117T, N52S/E220G, Y47H/N52S/V107A/F120S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y 152C/K156M/C198R, Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R,
[0591] N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R, F27S/N52H/N57Y/V110N, N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q, S18R/N52S/F93L/I143V/R221G, A20T/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52S/H94E/L96I/V122M, N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N,
[0592] M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S, N52H/N57Y/Q100R/V110-D/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110-D/E135K/L173S/C198R,
[0593] N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I, M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M,C198R, N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R,
[0594] N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N52S/E90A, N30D/K42E/N52S, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N52S/F120S/N227K, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, N52H/N57Y/Q100R/-V107I/V110D/I154F/C198R/R221G, N52Q/N207Q, N168Q/N207Q, N52Q/N168Q, N84Q/N207Q, N155Q/N207Q, N119Q/N168Q, N119Q/N207Q, N119Q/N155Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N84Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N84Q/N155Q/N168Q, N84Q/N168Q/N207Q, N84Q/N155H/N207Q, N155Q/N168Q/N207Q, N119Q N155Q/N168Q, N119Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N207Q, N119Q/N155H/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q, N84Q/N155Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q, F138L/L203P, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115-R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R, N52H/V122A/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/T143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115-R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/-R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52S/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L, N57Q/Q100P, S54F/V193A ili R26S/N52H/N57Y/V110D/T137A/C198R.
[0596] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži bilo koju od mutacija navedenih u Tabeli 1. Tabela 1 takođe daje primerne sekvence pozivajući se na SEQ ID NO za ekstracelularni domen (ECD) ili IgV domen referentnog (npr. nemodifikovanog) ili divljeg tipa ICOSL ili primernih varijantnih ICOSL polipeptida. Kao što je naznačeno, tačan lokus ili ostaci koji odgovaraju datom domenu mogu varirati, kao što zavisi od metoda koje se koriste za identifikaciju ili klasifikaciju domena. Takođe, u nekim slučajevima, susedne N- i/ili C-terminalne aminokiseline datog domena (npr. IgV) takođe mogu biti uključene u sekvencu varijante IgSF polipeptida, kao što je osiguranje pravilnog savijanja domena kada se eksprimuje. Stoga se razume da primeri SEQ ID NO u Tabeli 1 ne treba da se tumače kao ograničavajući. Na primer, određeni domen, kao što je ECD domen, varijante ICOSL polipeptida može biti nekoliko amino-kiselina duži ili kraći, kao što je 1-10, npr. 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 amino-kiselina duži ili kraći, od sekvence amino-kiselina navedene u odgovarajućem SEQ ID NO.
[0597] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži bilo koju od mutacija navedenih u Tabeli 1. U nekim primerima, mutacije su napravljene u referentnom ICOSL koji sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO: 32, referentnom ICOSL koji sadrži IgV domen ICOSL naveden u SEQ ID NO: 196 ili 545, ili referentnom ICOSL koji je skraćen i/ili modifikovan i sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 600-628. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži bilo koju od sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) navedenih u Tabeli 1 (tj. bilo koju od SEQ ID NO: 109‑142, 239, 280‑325, 364‑381, 387‑424, 427‑433, 435‑470, 638‑685). U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži polipeptidnu sekvencu koja ispoljava najmanje 90% identiteta, najmanje 91% identiteta, najmanje 92% identiteta, najmanje 93% identiteta, najmanje 94% identiteta, najmanje 95% identiteta, kao što je najmanje 96% identiteta, 97% identiteta, 98% identiteta ili 99% identiteta sa bilo kojom od sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) navedenih u Tabeli 1 (tj. bilo koja od SEQ ID NO: 109‑142, 239, 280‑325, 364‑381, 387‑424, 427‑433, 435‑470, 638‑685) i sadrži modifikaciju(e) amino-kiselina, npr. supstituciju(e) koja nije prisutna u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili divljem tipu ICOSL. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži specifični vezujući fragment bilo koje od sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) navedenih u Tabeli 1 (tj. bilo koju od SEQ ID NO: 109‑142, 239, 280‑325, 364‑381, 387‑424, 427‑433, 435‑470, 638‑685) i sadrži modifikaciju(e) amino-kiselina, npr. supstituciju(e) koja(e) nije(su) prisutna(e) u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili divljem tipu ICOSL.
[0599] [0226] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži bilo koju od sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) navedenih u Tabeli 1 (tj. bilo koju od SEQ ID NO: 109‑142, 239, 280‑325, 364‑381, 387‑424, 427‑433, 435‑470, 638‑685, 905, 908). U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži polipeptidnu sekvencu koja ispoljava najmanje 90% identiteta, najmanje 91% identiteta, najmanje 92% identiteta, najmanje 93% identiteta, najmanje 94% identiteta, najmanje 95% identiteta, kao što je najmanje 96% identiteta, 97% identiteta, 98% identiteta ili 99% identiteta sa bilo kojom od sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) navedenih u Tabeli 1 (tj. bilo koja od SEQ ID NO: 109‑142, 239, 280‑325, 364‑381, 387‑424, 427‑433, 435‑470, 638‑685, 905, 908) i sadrži modifikaciju(e) amino-kiselina, npr. supstituciju(e) koja nije prisutna u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili divljem tipu ICOSL. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži specifični vezujući fragment bilo koje od sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) navedenih u Tabeli 1 (tj. bilo koju od SEQ ID NO: 109‑142, 239, 280‑325, 364‑381, 387‑424, 427‑433, 435‑470, 638‑685, 905, 908) i sadrži modifikaciju(e) aminokiselina, npr. supstituciju(e) koja(e) nije(su) prisutna(e) u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili divljem tipu ICOSL.
[0601] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži bilo koju od IgV sekvenci navedenih u Tabeli 1 (tj. bilo koju od SEQ ID NO: 197‑199, 201‑208, 210, 212, 240, 326‑340, 382‑386, 425‑426, 434, 546‑599, 686‑857). U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži polipeptidnu sekvencu koja ispoljava najmanje 90% identiteta, najmanje 91% identiteta, najmanje 92% identiteta, najmanje 93% identiteta, najmanje 94% identiteta, najmanje 95% identiteta, kao što je najmanje 96% identiteta, 97% identiteta, 98% identiteta ili 99% identiteta sa bilo kojom od IgV sekvenci navedenih u Tabeli 1 (tj. bilo kojom od SEQ ID NO: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857) i sadrži modifikaciju(e) amino-kiselina, npr. supstituciju(e) koja nije prisutna u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili divljem tipu ICOSL. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži specifični vezujući fragment bilo koje od IgV sekvenci navedenih u Tabeli 1 (tj. bilo koju od SEQ ID NO: 197‑199, 201‑208, 210, 212, 240, 326‑340, 382‑386, 425‑426, 434, 546‑599, 686‑857) i sadrži supstituciju(e) amino-kiselina koje nisu prisutne u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili divljem tipu ICOSL.
[0603] [0228] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži bilo koju od IgV sekvenci navedenih u Tabeli 1 (tj. bilo koju od SEQ ID NO: 197‑199, 201‑208, 210, 212, 240, 326‑340, 382‑386, 425‑426, 434, 546‑599, 686‑857, 906‑907, 909‑910). U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži polipeptidnu sekvencu koja ispoljava najmanje 90% identiteta, najmanje 91% identiteta, najmanje 92% identiteta, najmanje 93% identiteta, najmanje 94% identiteta, najmanje 95% identiteta, kao što je najmanje 96% identiteta, 97% identiteta, 98% identiteta ili 99% identiteta sa bilo kojom od IgV sekvenci navedenih u Tabeli 1 (tj. bilo kojom od SEQ ID NO: 197‑199, 201‑208, 210, 212, 240, 326‑340, 382‑386, 425‑426, 434, 546‑599, 686‑857, 906‑907, 909‑910) i sadrži modifikaciju(e) amino-kiselina, npr. supstitucija(e) koje nisu prisutne u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili divljem tipu ICOSL. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži specifični vezujući fragment bilo koje od IgV sekvenci navedenih u Tabeli 1 (tj. bilo koju od SEQ ID NO: 197‑199, 201‑208, 210, 212, 240, 326‑340, 382‑386, 425‑426, 434, 546‑599, 686‑857, 906‑907, 909‑910) i sadrži supstituciju(e) amino-kiselina koje nisu prisutne u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili divljem tipu ICOSL.
[0605] Mutacije označene sa „X“ ukazuju na to da označena pozicija sadrži Q ili ostatak divljeg tipa naveden u odgovarajućoj poziciji SEQ ID NO: 32.
[0607]
[0608]
[0609]
[0610]
[0611]
[0612]
[0613]
[0614]
[0615]
[0616]
[0617]
[0620] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ispoljava povećan afinitet za ektodomen CD28 u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim) ili divljim tipom ICOSL polipeptida, kao što je obuhvatanje sekvence navedene u SEQ ID NO: 32, 196 ili 545. U nekim realizacijama, ICOSL polipeptid ispoljava povećan afinitet za ektodomen ICOS u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim) ili divljim tipom ICOSL, kao što je obuhvatanje sekvence navedene u SEQ ID NO: 32, 196 ili 545. U nekim realizacijama, ICOSL polipeptid ispoljava povećan afinitet za ektodomen CD28 i ektodomen ICOS u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim) ili divljim tipom ICOSL, kao što je obuhvatanje sekvence navedene u SEQ ID NO: 32, 196 ili 545.
[0622] [0231] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija aminokiselina, npr. supstituciju koja odgovara poziciji(ama) 52, 54 ili 57. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstituciju izabranu iz N52H, N52D, N52Q, N52S, N52Y, N52K, S54A, S54P, ili N57Y ili konzervativnu modifikaciju amino-kiselina, npr. njihovu supstituciju. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstituciju izabranu iz N52H, N52D, N52S, N52K ili N57Y ili konzervativnu modifikaciju amino-kiselina, npr. njihovu supstituciju.
[0624] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida može da sadrži jednu ili više dodatnih modifikacija amino-kiselina, npr. supstituciju pored modifikacije amino-kiselina, npr. supstituciju na poziciji koja odgovara poziciji 52, 54 ili 57. U nekim realizacijama, jedna ili više dodatnih modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucija je na poziciji koja odgovara 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 27, 30, 37, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ili 227. U nekim realizacijama, jedna ili više dodatnih modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucija je na poziciji koja odgovara 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 26, 27, 30, 33, 37, 38, 42, 43, 47, 52, 54, 57, 61, 62, 67, 71, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 84, 89, 90, 92, 93, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 107, 109, 110, 111, 113, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 126, 129, 130, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 143, 144, 146, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 164, 166, 168, 172, 173, 175, 190, 192, 193, 194, 198, 201, 203, 207, 208, 210, 212, 217, 218, 220, 221, 224, 225 ili 227uz upućivanje na SEQ ID NO:32.
[0626] [0233] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL sadrži jednu ili više dodatnih modifikacija aminokiselina, npr. supstituciju izabranu iz M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20V, S25G, F27S, F27C, N30D, Y33del, Q37R, K42E, T43A, Y47H, N52H, N52D, N52S, N52Y, N52K, N52Q, S54A, S54P, N57D, N57Y, R61S, R61C, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94E, H94D, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100R, Q100K, Q100P, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110D, V110N, V110A, E111del, T113E, H115R, H115Q, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S,S121G, V122A, V122M, S126T, S126R, H129P, S130G,S132F, Q133H, E135K, F138L, T139S, C140del, S142F,I143V, I143T, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H,W153R, I154F, K156M, D158G, L161P, L161M, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193M, N194D, C198R, N201S, L203P, L203F, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217V, I218T, I218N, E220G, R221G, R221I, I224V, T225A, N227K ili njihovu konzervativnu amino-kiselinsku supstituciju. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL sadrži jednu ili više dodatnih aminokiselinskih modifikacija, npr. supstituciju izabranu iz M10V, M10I, V11E, S13G, E16V, S18R, A20T, A20V, S25G, R26S, F27C, F27S, N30D, Y33del, Q37R, T38P, K42E, T43A, Y47H, N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, S54A, S54F, S54P, N57A, N57D, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, R61C, R61S, Y62F, L67P, A71T, G72R, L74Q, R75Q, D77G, F78L, L80P, N84Q, D89G, E90A, K92R, F93L, H94D, H94E, L96F, L96I, V97A, L98F, S99G, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, L102R, G103E, V107A, V107I, S109G, S109N, V110A, V110D, V110N, E111del, T113E, H115Q, H115R, V116A, A117T, N119Q, F120I, F120S, S121G, V122A, V122M, S126R,S126T, H129P, S130G, S132F, Q133H, E135K, T137A, F138L, T139S, C140del, C140D, S142F, I143T, I143V, N144D, Y146C, V151A, Y152C, Y152H, W153R, I154F, N155H, N155Q, K156M, D158G, L161M, L161P, Q164L, L166Q, N168Q, F172S, L173S, M175T, T190A, T190S, S192G, V193A, V193M, N194D, C198R, N201S, L203F, L203P, N207Q, L208P, V210A, S212G, D217G, D217V, I218N, 1218T, E220G, R221G, R221I, R221K, I224V, T225A, T225S, N227K ili njihovu konzervativnu amino-kiselinsku supstituciju.
[0628] U nekim realizacijama bilo koje od gore opisanih varijantnih ICOSL polipeptida, varijantni ICOSL polipeptid dalje sadrži jednu ili više delecija amino-kiselina koje odgovaraju pozicijama 140 SEQ ID NO: 32.
[0630] [0235] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija aminokiselina, npr. supstituciju izabranu iz N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140del/-T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y/Q100P, N52S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, N52S/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52H/I143T, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N52S/F120S/N227K, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S,
[0631] N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T,N52H/N57Y/Q100R/-V107I/V110D/I154F/C198R/R221G, N52Q/N207Q, N52Q/N168Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q, N52H/N84Q/N207Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/N155Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R, N52H/V122A/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115-R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/-R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52S/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R ili N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R.
[0633] [0236] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija aminokiselina, npr. supstituciju u referentnom ICOSL ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu koja odgovara poziciji(ama) 52, 57 ili 100 u odnosu na numeraciju SEQ ID NO:32. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstituciju izabranu iz N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52L, N52K, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100P, Q100S, Q100T ili Q100V. U nekim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucija je N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52D/V151A, N52H/I143T, N52S/L80P, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S, N52H/F78L/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D, N52H/Q100R, N52H/S121G, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y, N52S/F120S, N52S/V97A, N52S/G72R, N52S/A71T/A117T, N52S/E220G, Y47H/N52S/V107A/F120S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y 152C/K156M/C198R, Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R,
[0634] N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R, F27S/N52H/N57Y/V110N, N52S/H94E/-L96I/S109N/L166Q, S18R/N52S/F93L/I143V/R221G, A20T/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/-L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52S/H94E/L96I/V122M, N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N,
[0635] M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S,
[0636] N52H/N57Y/Q100R/V110D/A117T/T190S/C198R,N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R,
[0637] N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I,
[0638] M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M,C198R,
[0639] N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R,
[0640] N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R,
[0641] N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N52S/E90A, N30D/K42E/N52S, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N52S/F120S/N227K, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, N52D, N52H/N57Y/Q100R/-V107I/V110D/I154F/C198R/R221G, N52Q/N207Q, N168Q/N207Q, N52Q/N168Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R,
[0642] N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R, N52H/V122A/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/T143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R,
[0643] E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52S/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L ili N57Q/Q100P.
[0645] U nekim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane iz grupe N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140D/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y/Q100P, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52D/V151A, N52H/I143T, N52S/L80P, F120S/Y152H/N201S, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R, N52S/N57Y/H94D/L96F/L98F/Q100R/G103E/F120S, N52S/G103E, N52H/F78L/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D, N52H/N57Y/R75Q/Q100R/V110D, N52H/N57Y/Q100R, N52H/N57Y/L74Q/Q100R/V110D, N52H/Q100R, N52H/S121G, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y, N52S/F120S, N52S/V97A, N52S/G72R, N52S/A71T/A117T, N52S/E220G, Y47H/N52S/V107A/F120S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V 110D/H115R/Y152C/K156M/C198R,
[0646] Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G,
[0647] N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R,
[0648] N52H/N57Y/Q100R/V110D/V116A/L161M/F172S/S192G/C198R, F27S/N52H/N57Y/V110N, N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q, S18R/N52S/F93L/1143V/R221G, A20T/N52D/Y146C/Q164L, V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52S/H94E/L96I/V122M, N52H/N57Y/H94E/L96I/F1201/S126T/W153R/I218N, M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N30D/N52S/L67P/Q100K/D217G/R221K/T225S, N52H/N57Y/Q100R/V110-D/A117T/T190S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V 110D/E135K/L.173S/C198R, N52H/N57Y/V110A/C198R/R2211, M101/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129-P/I143V/F172S/V193M,C198R, N52H/N57Y/R61C/Y62F/Q100R/V110N/F120S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R,
[0649] N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N52S/E90A, N30D/K42E/N52S, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/S54P, T38P/N52S/N57D, N52H/C140del/T225A, N52H/F78L/Q100R/C198R, N52H/N57Y/R75Q/Q100P/V110D, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/S121G/C198R, N52S/F120S/N227K, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, T43A/N52H/N57Y/L74Q/D89G/V110D/F172S, N52H/N57Y/Q100R/V110D/S132F/M175T, N52H/N57Y/Q100R/-V107I/V110D/I154F/C198R/R221G, N52Q/N207Q, N52Q/N168Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R,
[0650] N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R, N52H/V122A/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R2211, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52S/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L, N57Q/Q100P, ili R26S/N52H/N57Y/V110D/-T137A/C198R.
[0652] [0238] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija aminokiselina, npr. supstituciju izabranu iz N52A, N52C, N52D, N52G, N52K, N52L, N52M, N52R, N52T, N52V, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, Q100A, Q100D, Q100G, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100S, Q100T ili Q100V uz upućivanje na SEQ ID NO:32. U nekim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane iz N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57H/Q100K, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52R/N57Y/Q100R, N52C/N57E/Q100S, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52P/N57P, N52P/N57S/Q100G, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52V/N57T/Q100L ili N57Q/Q100P.
[0654] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija aminokiselina, npr. supstituciju izabranu iz N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52Y/N57Y/F138L/L203P, V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52H/N57Y/Q100R/L102R /V110D/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R, N52H/Q100R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G,
[0655] N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R,
[0656] E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/V152C/K156M/C198R, N30D/K42E/N52S, N52S/F120S/I143V/I224V, N52S/E90A, N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I, N52H/N57Y/Q100P, ili N52S/N194D.
[0658] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija aminokiselina, npr. supstituciju izabranu iz N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R ili N52H/N57Y/Q100R/C198R. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstituciju izabranu iz E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, N52H/N57Y/Q100R i N52H/N57Y/Q100P.
[0660] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija aminokiselina, npr. supstituciju izabranu iz N52H/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52H/K92R, N52H/C140del/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y/Q100P, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52K/L208P ili N52H/I143T.
[0662] [0242] U nekim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina su izabrane iz F120S/Y152H/N201S, E111del, Y33del, N168Q/N207Q, N84Q/N207Q, N155Q/N207Q, N119Q/N168Q, N119Q/N207Q, N119Q/N155Q, N84Q/N119Q, N84Q/N155Q/N168Q, N84Q/N168Q/N207Q, N84Q/N155H/N207Q, N155Q/N168Q/N207Q, N119Q N155Q/N168Q, N119Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N207Q, N119Q/N155H/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q, N84Q/N155Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q ili F138L/L203P.
[0664] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ispoljava povećan afinitet vezivanja za jedan od ektodomena CD28 ili ICOS i ispoljava smanjen afinitet vezivanja za vezivanje za drugi od ektodomena CD28 ili ICOS u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim) ili divljim tipom ICOSL polipeptida, kao što je onaj koji sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 32, 196 ili 545.
[0666] [0244] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ispoljava povećan afinitet vezivanja za ICOS. U nekim realizacijama, jedna ili više amino-kiselinskih supstitucija je na poziciji koja odgovara 16, 30, 42, 52, 54, 57, 75, 90, 92, 100, 102, 110, 113, 115, 120, 122, 133, 138, 143, 146, 152, 156, 158, 172, 194, 198, 203, 208, 221, 224 ili 225. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL sadrži jednu ili više amino-kiselinskih supstitucija izabranih iz C198R, D158G, E16V, E90A, F120S, F138L, F172S, H115R, H115X, I143T, I143V, 1224V, K156M, K42E, K92R, L102R, L203P, L208P, N194D, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52Y, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57S, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100D, Q100E, Q100K, Q100M, Q100P, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q133H, R221I, R75Q, S54A, S54P, T113E, T225A, V110D, V122A, Y146C, Y152C, ili njihove konzervativne amino-kiselinske supstitucije. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više amino-kiselinskih supstitucija izabranih iz N52S, N52H, N52D, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y, N52S/C198R, N52S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52H/I143T, N52S/R75Q/L203P, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/E90A, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y 152C/K156M/F172S/C198R, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R , N57Y/F138L/L203P, N57Y/Q100P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R, H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/I143T F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N30D/K42E/N52S/H115R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52T/N57H/Q100S, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57P/Q100D, N52G/N57V/Q100G, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G ili N52T/N57K/Q100P.
[0668] [0245] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ispoljava povećan afinitet vezivanja za ICOS i ispoljava smanjen afinitet vezivanja za CD28. U nekim realizacijama, jedna ili više dodatnih amino-kiselinskih supstitucija nalazi se na poziciji koja odgovara 52, 57, 80, 100, 130, 152, 161 ili 198. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL sadrži jednu ili više amino-kiselinskih supstitucija izabranih iz N52S, N52H, N52Y, N52H, N57Y, L80P, Q100P Q100R, Q100K, V110D, S130G, Y152C, L161P, L161M, C198R, R221G, ili njihovu konzervativnu aminokiselinska supstitucija. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više amino-kiselinskih supstitucija izabranih iz N57Y/Q100P, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52Y/N57Y/Y152C, N52H/L161P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/L80P, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/R61S/Q100R/V110D/L173S, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/S132- F/I154F/C198R/R221G, Q37R/N52H/N57Y/Q100R/V110N/S142F/C198R/D217V/R221G,
[0669] N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R, F27S/N52H/N57Y/V110N, S18R/N52S/F93L/I143V/R221G, A20T/N52D/Y146C/Q164L, N52H/N57Y/H94E/L961/F120I/S126T/W153R/I218N,
[0670] N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R,
[0671] S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110D/E135K/L173S/C198R,
[0672] M10I/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129P/I143V/F172S/V193M/C198R.
[0674] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ispoljava povećan afinitet vezivanja za CD28. U nekim realizacijama, jedna ili više supstitucija amino-kiselina je na poziciji koja odgovara 10, 11, 13, 16, 18, 20, 25, 27, 30, 36, 40, 41, 42, 52, 54, 57, 63, 70, 71, 72, 74, 77, 80, 81, 84, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 96, 98, 99, 100, 102, 107, 109, 110, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 126, 127, 129, 130, 132, 133, 135, 138, 139, 140, 143, 144, 146, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 161, 166, 168, 169, 172, 173, 178, 190, 192, 193, 194, 198, 199, 201, 203, 207, 208, 209, 212, 218, 221, 224, 225 ili 227.
[0676] [0247] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL sadrži jednu ili više amino-kiselinskih supstitucija izabranih iz A117T, A20V, A71T, A91G, A91G, AE88D, C140del, C198R, D158G, D77G, D90K, E117G, E135K, E16V, E81A, E88D, E90A, F120I, F120S, F138L, F172S, F27C, F92Y, G72R, H115R, H115X, H129P, H94E, I118V, I127T, I143T, I143V, I154F, I218N, I218T, I224V, K156M, K169E, K36G, K42E, K89R, K92R, K93R, L102R, L161P, L166Q, L173S, L203F, L203P, L208P, L209P, L40M, L70Q, L70R, L74Q, L80P, L96I, L98F, M10I, M10V, N115Q, N119Q, N122S, N144D, N155X, N168Q, N168X, N178S, N194D, N207Q, N207X, N227K, N25S, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N57A, N57F, N57H, N57L, N57M, N57S, N57V, N57W, N57Y, N63S, N84Q, Q100A, Q100E, Q100G, Q100K, Q100M, Q100N, Q100P, Q100R, Q100S, Q100T, Q100V, Q133H, R221G, R221I, S109G, S109N, S114T, S121G, S126R, S126T, S130G, S132F, S13G, S18R, S192G, S212G, S25G, S54A, S54P, S99G, T113E, T120S, T130A, T139S, T190A, T199S, T225A, T41I, V107I, V110A, V110D, V11E, V122A, V122M, V193M, V210A, W153R, Y146C, Y152C, Y152H ili njihova konzervativna amino-kiselinska supstitucija. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više amino-kiselinskih supstitucija izabranih iz N52S, N52H, N52D, N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C140del/T225A, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N52H/S99G, N57Y, N57Y/Q100P, N52S/S130G/Y152C, N52S/Y152C, N52S/C198R, N52Y/N57Y/Y152C, N52Y/N57Y/H129P/C198R, N52H/L161P/C198R, N52S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52S/Y152H, N52H/I143T, N52S/L80P, N52S/D158G, N52D/Q133H, L70Q/A91G/N144D, L70Q/A91G/E117G/ I118V/T120S/T130A, L70R/A91G/I118V/T120S/T130A/T199S, L70Q/E81A/A91G/
[0677] I118V/T120S/I127T/T130A, N63S/L70Q/A91G/S114T/I118V /T120S/T130A, T41I/A91G, E88D/K89R/D90K/A91G/- F92Y/K93R/N122S/ N178S, E88D/K89R/D90K/A91G/ F92Y/K93R, AE88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R, K36G/L40M, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R, N52S/F120S/N227K, N52S/N194D, N52S/F120S, N52S/G72R, N52S/A71T/A117T/T190A/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V107I/V110D/S132-F/I154F/C198R/R221G, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R,
[0678] V11E/N30D/N52H/N57Y/H94E/L96I/L98F/N194D/V210A/I218T, N52S/H94E/-L96I/V122M, N52H/N57Y/H94E/L96I/F120I/S126T/W153R/I218N,
[0679] M10V/S18R/N30D/N52S/S126R/T139S/L203F, S25G/N30D/N52S/F120S/N227K, N52H/N57Y/Q100R/V110D/F172S/C198R, S25G/F27C/N52H/N57Y/Q100R/V110-D/E135K/L173S/C198R, N52H/N57Y/V110A/C198R/R221I, M101/S13G/N52H/N57Y/D77G/V110A/H129-P/I143V/F172S/V193M,C198R,
[0680] N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R,
[0681] N52H/N57Y/Q100R/V110D/N144D/F172S/C198R, N52S/H94E/L98F/Q100R, N52S/E90A, N52S/F120S/I143V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/ F172S/C198R, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R,
[0682] N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52S/H94E/L96I/S109N/L166Q/, N52H/N57Y/Q100R/C198R, N52H/N57Y/L74Q/V110D/S192G, N52H/Q100R, N52H/S121G/C198R, A20V/N52H/N57Y/Q100R/S109G, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, L70Q/A91G/I118A/T120S/T130A/K169E, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/1143V/F172S/C198R. N52H/N57Y/Q100R/L102RH115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/I143T F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R R221I, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R, N52S/H115R/F172S/C198R, N119Q, N207Q, N52Q/N207X, N168X/N207X, N52Q/N168Q, N84Q/N207Q, N119Q N155X, N52Q/N119Q, N52Q/N84Q/N207Q, N119Q/N155Q/N168Q, N52H/N84Q/N119Q, N52Q/N84Q/N155X/N168X, N52A/N57F/Q100S, N52A/N57H/Q100S, N52A/N57Y/Q100A, N52D/N57A/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52H/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57F, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52R/N57Y/Q100P, N52R/N57Y/Q100S, N52S/N57A/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52S/N57Y/Q100V, N52T/N57H/Q100S, N52T/N57H/Q100A, N52T/N57Y/Q100A, N52V/N57L/Q100A, N52H/N57Y/Q100K, N52K/N57Y/Q100R, N52L/N57H/Q100R, N52R/N57F/Q100N, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100R, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57L/Q100S, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G ili N52T/N57K/Q100P.
[0684] [0248] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ispoljava povećan afinitet vezivanja za CD28 i ispoljava smanjen afinitet vezivanja za ICOS. U nekim realizacijama, jedna ili više amino-kiselinska supstitucija je na poziciji koja odgovara 52, 75 ili 203. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL sadrži jednu ili više amino-kiselinskih supstitucija izabranih od N52S, R75Q, L203F ili L203P. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima amino-kiselinske supstitucije N52S/R75Q/L203P.
[0686] [0249] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija aminokiselina, npr. supstituciju u referentnom ICOSL ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu koja odgovara poziciji(ama) 16, 30, 42, 52, 57, 90, 100, 102, 110, 115, 120, 122, 138, 143, 152, 156, 172, 194, 198, 203, 221 ili 224 u odnosu na numeraciju SEQ ID NO: 32. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucija izabrana iz E16V, N30D, K42E, N52H, N52Y, N52S, N57Y, E90A, Q100R, Q100P, L102R, V110D, H115R, F120S, V122A, F138L, I143V, I143T, H152C, K156M, F172S, N194D, C198R, L203P, R221I ili I224V. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstituciju u referentnom ICOSL ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu koja odgovara poziciji(ama) 115, 172 ili 198 u odnosu na numeraciju SEQ ID NO:32. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucija izabrana iz H115R, F172S ili C198R. U nekim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucija je N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R/H115R/F172S/C198R, N52H/V122A/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, N52Y/N57Y/Q100P/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115-R/Y152C/K156M/F172S/C198R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E N52S/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R/-R221I, N30D/K42E/N52S/H115R/C198R, N30D/K42E/N52S/H115R/F172S/N194D, N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52S/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R ili N52H/N57Y/Q100R /F172S/C198R. U nekim realizacijama, varijante ICOSL polipeptida pokazuju potencijalno poboljšanu rastvorljivost proteina ili poboljšanu ekspresiju proteina („mutacije rastvorljivosti“) u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim) ili divljim tipom ICOSL polipeptida.
[0688] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida obuhvata bilo koju od sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) navedenih u SEQ ID NO: 435-470. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida obuhvata polipeptidnu sekvencu koja ispoljava najmanje 90% identiteta, najmanje 91% identiteta, najmanje 92% identiteta, najmanje 93% identiteta, najmanje 94% identiteta, najmanje 95% identiteta, kao što je najmanje 96% identiteta, 97% identiteta, 98% identiteta ili 99% identiteta sa bilo kojim od ekstracelularnog domena (ECD) navedenog u SEQ ID NO: 435-470 i sadrži modifikaciju(e) amino-kiselina, npr. supstituciju(e) koja nije prisutna u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili divljem tipu ICOSL. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži specifični vezujući fragment bilo koje od sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) navedenih u SEQ ID NO: 435-470 i sadrži modifikaciju(e) amino-kiselina, npr. supstituciju(e) koja(e) nije(su) prisutna(e) u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili divljem tipu ICOSL.
[0690] [0251] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ispoljava povećan afinitet vezivanja za CD28 i ispoljava povećan afinitet vezivanja za ICOS. U nekim realizacijama, jedna ili više amino-kiselinskih supstitucija je na poziciji koja odgovara 16, 30, 42, 52, 54, 57, 90, 92, 100, 102, 110, 113, 115, 120, 122, 133, 138, 143, 146, 152, 156, 158, 172, 194, 198, 203, 208, 212, 224 ili 225. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL sadrži jednu ili više amino-kiselinskih supstitucija izabranih iz C198R, D158G, E16V, E90A, F120S, F138L, F172S, H115R, I143V, 1224V, K156M, K42E, K92R, L102R, L203P, L208P, N194D, N30D, N52A, N52D, N52G, N52H, N52K, N52L, N52M, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52Y, N57F, N57H, N57L, N57M, N57S, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100E, Q100G, Q100K, Q100M, Q100P, Q100R, Q100S, Q133H, S212G, S54A, S54P, T113E, T225A, V110D, V122A, Y146C, Y152C ili konzervativnu supstituciju amino-kiselina. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više supstitucija amino-kiselina izabranih iz N52A/N57Y/Q100A, N52D/Q100S, N52G/Q100A, N52M/N57H/Q100S, N52M/N57W/Q100P, N52Q/N57S/Q100A, N52R/N57L/Q100A, N52S/N57H/Q100E, N52S/N57L/Q100S, N52S/N57M/Q100S, N52S/N57Y/Q100M, N52T/N57H/Q100S, N52R/N57F/Q100P, N52R/N57F/Q100T, N52R/N57W/Q100K, N52R/N57W, N52G/N57V, N52L/N57V, N52S/N57L/Q100G, N52T/N57K/Q100P, N52S, N52H, N52D, N52Y/N57Y/F138L/L203P, N52H/N57Y/Q100P, N52S/Y146C/Y152C, N52H/C198R, N52H/C198R/T225A, N52H/K92R, N57Y, N52S/C198R, N52S/T113E, S54A, N52D/S54P, N52K/L208P, N52H/I143T, N52S/D158G, N52D/Q133H, N52H/N57Y/Q100R/V110D/C198R/S212G, N52H/N57Y/Q100R/V122A, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R, N52S/N194D, N52H/N57Y/Q100R/L102R/V110D/H115R/C198R, N52S/E90A, N52S/F120S/I143-V/I224V, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52Y/N57Y/Q100P/F172S,
[0691] E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/F172S/C198R,
[0692] N52S/H115R/F120S/I143V/C198R, N52H/N57Y/Q100P/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100P/H115R, N52H/N57Y/Q100P/H115R/C198R, N52H/Q100R/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S, N52H/Q100R/H115X/F172S/C198R, N52H/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, Q100R, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, Q100R/F138L, N52H/N57Y/Q100R/H115R, N52H/N57Y/Q100R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/I224V, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/Q100R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/I143V/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/L102R H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R F172S/N194D, N52H/N57Y/H115R/F172S/C198R, N52H/N57Y/Q100R/H115R/C198R, N52H/N57Y/H115R, N52H/Q100R/H115R/I143T/F172S, N52H/N57Y/Q100P/H115R/F172S, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/C198R, N52S/E90A/H115R, N52S/E90A/H115R, N30D/K42E/N52S/H115R.
[0694] [0252] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija aminokiselina, npr. supstituciju u referentnom ICOSL ili specifičnom vezujućem fragmentu istog koji odgovara poziciji(ama) 52, 57, 100, 138, 198 ili 203 u odnosu na numeraciju SEQ ID NO:32. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstituciju izabranu od N52H, N52Y, N57Y, Q100R, Q100P, F138L, C198R ili L203P. U nekim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucija je Q100R, F138L/L203P, N52Y/F138L/L203P, N57Y/Q100R/C198R, N57Y/F138L/L203P, N52H, N57Y, N57Y/Q100P, Q100R/F138L ili L203P.
[0696] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida obuhvata bilo koju od sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) navedenih u SEQ ID NO: 427-433. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida obuhvata polipeptidnu sekvencu koja ispoljava najmanje 90% identiteta, najmanje 91% identiteta, najmanje 92% identiteta, najmanje 93% identiteta, najmanje 94% identiteta, najmanje 95% identiteta, kao što je najmanje 96% identiteta, 97% identiteta, 98% identiteta ili 99% identiteta sa bilo kojim od ekstracelularnog domena (ECD) navedenog u SEQ ID NO: 427-433 i sadrži modifikaciju(e) amino-kiselina, npr. supstituciju(e) koja nije prisutna u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili divljem tipu ICOSL. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži specifični vezujući fragment bilo koje od sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) navedenih u SEQ ID NO: 427-433 i sadrži modifikaciju(e) amino-kiselina, npr. supstituciju(e) koja(e) nije prisutna u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili divljem tipu ICOSL. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži IgV sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 434. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži polipeptidnu sekvencu koja ispoljava najmanje 90% identiteta, najmanje 91% identiteta, najmanje 92% identiteta, najmanje 93% identiteta, najmanje 94% identiteta, najmanje 95% identiteta, kao što je najmanje 96% identiteta, 97% identiteta, 98% identiteta ili 99% identiteta sa IgV sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 434 i sadrži modifikaciju(e) amino-kiselina, npr. supstitucija(e) koje nisu prisutne u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili divljem tipu ICOSL. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži specifični vezujući fragment IgV sekvence navedene u SEQ ID NO: 434 i sadrži supstituciju(e) amino-kiselina koje nisu prisutne u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili divljem tipu ICOSL.
[0698] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija aminokiselina, npr. supstituciju u referentnom ICOSL ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu koja odgovara poziciji(ama) 52, 84, 91, 119, 155, 168, 207 uz upućivanje na numeraciju SEQ ID NO:32. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija aminokiselina, npr. supstituciju izabranu iz A91S, N52H, N52Q, N84Q, N119Q, N155H, N155Q, N168Q, N207Q. U nekim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina, npr.
[0699] supstitucija je N84Q, N119Q, N168Q, N207Q, N52Q, N52Q/N207Q, N168Q/N207Q, N52Q/N168Q, N84Q/N207Q, N155Q/N207Q, N119Q/N168Q , N119Q/N207Q, N119Q/N155Q, N52Q/N84Q, N52Q/N119Q, N84Q/N119Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N207Q, N84Q/N155Q/N168Q, N84Q/N168Q/N207Q, N84Q/N155H/N207Q, N155Q/N168Q/N207Q, N119Q N155Q/N168Q, N119Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N207Q, N119Q/N155H/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N119Q/N155Q, N52H/N84Q/N119Q, N52H/N84Q, N52H/N84Q/N168Q, N52H/N84Q/N207Q, N52H/N84Q/N168Q/N207Q, N52Q/N84Q/N155Q, N52Q/N84Q/N168Q, N52Q/N84Q/N155Q/N168Q, N52Q/N84Q/N119Q/N168Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q, N84Q/N155Q/N168Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N207Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q, N52Q/N84Q/N119Q/N155Q/N207Q, N84Q/N119Q/N155Q/N168Q/N207Q ili A91S/N119Q/N168Q/N207Q. U nekim realizacijama, varijante ICOSL polipeptida pokazuju potencijalno smanjenu glikozilaciju u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim) ili divljim tipom ICOSL polipeptida.
[0701] [0255] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida obuhvata bilo koju od sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) navedenih u SEQ ID NO: 387-424, 427-433, 435-470. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida obuhvata polipeptidnu sekvencu koja ispoljava najmanje 90% identiteta, najmanje 91% identiteta, najmanje 92% identiteta, najmanje 93% identiteta, najmanje 94% identiteta, najmanje 95% identiteta, kao što je najmanje 96% identiteta, 97% identiteta, 98% identiteta ili 99% identiteta sa bilo kojim od ekstracelularnog domena (ECD) navedenog u SEQ ID NO: 387-424, 427-433, 435-470 i sadrži modifikaciju(e) amino-kiselina, npr. supstituciju(e) koja nije prisutna u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili divljem tipu ICOSL. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži specifični vezujući fragment bilo koje od sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) navedenih u SEQ ID NO: 387-424, 427-433, 435-470 i sadrži modifikaciju(e) amino-kiselina, npr. supstituciju(e) koja(e) nije(su) prisutna(e) u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili divljem tipu ICOSL. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži bilo koju od IgV sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 425-426. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži polipeptidnu sekvencu koja ispoljava najmanje 90% identiteta, najmanje 91% identiteta, najmanje 92% identiteta, najmanje 93% identiteta, najmanje 94% identiteta, najmanje 95% identiteta, kao što je najmanje 96% identiteta, 97% identiteta, 98% identiteta ili 99% identiteta sa bilo kojom od IgV sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 425-426 i sadrži modifikaciju(e) amino-kiselina, npr. supstituciju(e) koja nije prisutna u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili ICOSL divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži specifični vezujući fragment bilo koje od IgV sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 425-426 i sadrži supstituciju(e) amino-kiselina koja nije prisutna u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili ICOSL divljeg tipa.
[0703] III. FORMAT VARIJANTNIH POLIPEPTIDA
[0705] Imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL koja je ovde data može se formatirati na različite načine, uključujući kao rastvorljivi protein, protein vezan za membranu, sekretovani protein, konjugat ili fuziju ili za ekspresiju pomoću konstruisane ćelije ili infektivnog agensa kao što je opisano na drugom mestu ovde. U nekim aspektima, i imunomodulatorni polipeptidi koji sadrže jedan ili više vIgD ICOSL ili imunomodulatorni polipeptidi koji sadrže više IgSF domena mogu se formatirati na različite načine.
[0707] U nekim realizacijama, određeni format može biti izabran za željenu terapeutsku primenu. U nekim slučajevima, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL polipeptida je dat u formatu za antagonizaciju ili blokiranje aktivnosti njegovog srodnog partnera za vezivanje, npr. CD28. U nekim realizacijama, antagonizam CD28 može biti koristan za lečenje upale ili autoimunosti. U nekim slučajevima, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL polipeptid je dat u formatu za agonizaciju ili stimulaciju aktivnosti njegovog srodnog partnera za vezivanje, npr. CD28. U nekim realizacijama, agonizam CD28 može biti koristan za lečenje onkoloških indikacija. Vešt stručnjak može lako odrediti aktivnost određenog formata, kao što je antagonizacija ili agonizacija jednog ili više specifičnih srodnih partnera za vezivanje. Primeri postupaka za procenu takvih aktivnosti su dati ovde, uključujući i primere.
[0709] U nekim realizacijama, rastvorljivi imunomodulatorni polipeptid, kao što je varijanta ICOSL koja sadrži vIgD, može biti inkapsuliran unutar lipozoma koji sam može biti konjugovan sa bilo kojim od ili bilo kojom kombinacijom obezbeđenih konjugata (npr. ciljnim delom). U nekim realizacijama, rastvorljivi ili membranski vezani imunomodulatorni polipeptidi pronalaska su deglikozilovani. U specifičnijim realizacijama, varijantna ICOSL sekvenca je deglikozilovana. U još specifičnijim realizacijama, IgV i/ili IgC (npr. IgC2) domen ili domeni varijante ICOSL su deglikozilovani.
[0710] Neograničavajući primeri obezbeđenih formata opisani su na Sl.13A-13C i dalje opisano u daljem tekstu.
[0712] A. RASTVORLJIVI POLIPEPTIDI
[0714] U nekim aspektima, obezbeđeni su imunomodulatorni polipeptidi koji sadrže vIgD ICOSL. U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein koji sadrži varijantu ICOSL polipeptida je rastvorljivi protein. Stručnjaci će razumeti da proteini ćelijske površine obično imaju intracelularni, transmembranski i ekstracelularni domen (ECD) i da se rastvorljivi oblik takvih proteina može napraviti korišćenjem ekstracelularnog domena ili njegove imunološki aktivne podsekvence. Dakle, u nekim realizacijama, imunomodulatornom proteinu koji sadrži varijantu ICOSL polipeptid nedostaje transmembranski domen ili deo transmembranskog domena. U nekim realizacijama, imunomodulatornom proteinu koji sadrži varijantu ICOSL nedostaje intracelularni (citoplazmatski) domen ili deo intracelularnog domena. U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein koji sadrži varijantu ICOSL polipeptid sadrži samo vIgD deo koji sadrži ECD domen ili njegov deo koji sadrži IgV domen i/ili IgC (npr. IgC2) domen ili domene ili njihove specifične vezujuće fragmente koji sadrže modifikaciju(e) amino-kiselina.
[0716] U nekim realizacijama, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL može da sadrži jednu ili više varijantnih ICOSL polipeptida. U nekim aspektima, jedan ili više dodatnih IgSF domena, kao što je jedan ili više dodatnih vIgD, mogu biti vezani sa vIgD ICOSL kao što je ovde dato. U nekim aspektima, i imunomodulatorni polipeptidi koji sadrže jedan ili više vIgD ICOSL ili imunomodulatorni polipeptidi koji sadrže više IgSF domena mogu biti formatirani na različite načine, kao što je opisano u pododeljku C Odeljka III.
[0718] U nekim realizacijama, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL može da sadrži jedan ili više varijantnih ICOSL polipeptida predmetnog pronalaska. U nekim realizacijama, polipeptid predmetnog pronalaska će obuhvatiti tačno 1, 2, 3, 4, 5 varijantnih ICOSL sekvenci. U nekim realizacijama, najmanje dve od varijantnih ICOSL sekvenci su identične varijantne ICOSL sekvence.
[0720] [0263] U nekim realizacijama, obezbeđeni imunomodulatorni polipeptid sadrži dve ili više vIgD sekvenci ICOSL. Višestruke varijante ICOSL polipeptida unutar polipeptidnog lanca mogu biti identične (tj. iste vrste) jedna drugoj ili biti neidentične (tj. različite vrste) varijante ICOSL sekvenci. Pored realizacija sa jednim polipeptidnim lancem, u nekim realizacijama dva, tri, četiri ili više polipeptida predmetnog pronalaska mogu biti kovalentno ili nekovalentno vezani jedan za drugog. Stoga su ovde dati monomerni, dimerni i multimerni proteini višeg reda (npr. 3, 4, 5 ili više). Na primer, u nekim realizacijama tačno dva polipeptida predmetnog pronalaska mogu biti kovalentno ili nekovalentno vezana jedan za drugog da bi formirala dimer. U nekim realizacijama, vezivanje se vrši putem međulančanih cisteinskih disulfidnih veza. Kompozicije koje sadrže dva ili više polipeptida pronalaska mogu biti identične vrste ili suštinski identične vrste polipeptida (npr. homodimer) ili neidentičnih vrsta polipeptida (npr. heterodimer). Kompozicija koja ima više vezanih polipeptida pronalaska može, kao što je gore navedeno, imati jednu ili više identičnih ili neidentičnih varijanti ICOSL polipeptida pronalaska u svakom polipeptidnom lancu.
[0722] U nekim aspektima, jedan ili više dodatnih IgSF domena, kao što je jedan ili više dodatnih vIgD, mogu biti vezani sa vIgD ICOSL kako je ovde dato (u daljem tekstu nazvano „stek“ ili „steking/stekovani“ imunomodulatorni protein). U nekim realizacijama, modularni format obezbeđenih imunomodulatornih proteina pruža fleksibilnost za inženjering ili generisanje imunomodulatornih proteina za modulaciju aktivnosti višestrukih kontrastruktura (višestruki srodni partneri za vezivanje). U nekim realizacijama, takvi „stek“ molekuli mogu biti obezbeđeni u rastvorljivom formatu ili, u nekim slučajevima, mogu biti obezbeđeni kao membranski vezani ili sekretovani proteini.
[0724] U nekim realizacijama, imunomodulatorni proteini mogu da sadrže bilo koji od varijantnih ICOSL polipeptida ovde datih, direktno ili indirektno, vezanih sa jednim ili više drugih domena superfamilije imunoglobulina (IgSF) („stek“ imunomodulatorni proteinski konstrukt, takođe nazvan imunomodulatorni protein „tipa
U nekim aspektima, ovo može da stvori jedinstvene višedomenske imunomodulatorne proteine koji vezuju dva ili više, kao što su tri ili više, srodnih partnera za vezivanje, čime se obezbeđuje višestruko usmerena modulacija imune sinapse.
[0726] [0266] U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein sadrži kombinaciju („kombinacija koja nije divljeg tipa“) i/ili aranžman („aranžman koji nije divljeg tipa“ ili „permutacija koja nije divljeg tipa“) varijante ICOSL domena sa jednom ili više drugih afinitetno modifikovanih i/ili neafinitetno modifikovanih sekvenci IgSF domena drugog člana IgSF porodice (npr. člana IgSF porodice sisara) koje se ne nalaze kod članova IgSF porodice divljeg tipa. U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein sadrži 2, 3, 4, 5 ili 6 domena imunoglobulinske superfamilije (IgSF), pri čemu je najmanje jedan od IgSF domena varijanta ICOSL IgSF domena (vIgD od ICOSL) prema datom opisu.
[0728] U nekim realizacijama, sekvence dodatnih IgSF domena mogu biti modifikovani IgSF domen koji sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucije, u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim) ili IgSF domenom divljeg tipa. U nekim realizacijama, IgSF domen može biti neafinitetno modifikovan (npr. divljeg tipa) ili je afinitetno modifikovan. U nekim realizacijama, referentni (npr. nemodifikovani) ili IgSF domen divljeg tipa može biti mišjeg, pacovskog, cinomolgus majmuna ili humanog porekla, ili njihove kombinacije. U nekim realizacijama, dodatni IgSF domeni mogu biti IgSF domen člana IgSF porodice navedenog u Tabeli 2. U nekim realizacijama, dodatni IgSF domen može biti afinitetno modifikovani IgSF domen koji sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucije, u poređenju sa IgSF domenom koji se nalazi u članu IgSF porodice navedenom u Tabeli 2.
[0730] U nekim realizacijama, dodatni IgSF domen je afinitetno ili neafinitetno modifikovani IgSF domen koji se nalazi u članu IgSF porodice, izabrane iz porodice proteina regulatornih signala (SIRP), porodice TREM-sličnih receptora eksprimovanig na mijeloidnim ćelijama (TREML), porodice molekula ćelijske adhezije povezanih sa karcinoembrionalnim antigenom (CEACAM), porodice imunoglobulinu sličnih lektina koji vezuju sijalinsku kiselinu (SIGLEC), porodice butirofilina, porodice B7, porodice CD28, porodice koja sadrži V-set i domen imunoglobulina (VSIG), porodice V-set transmembranskog domena (VSTM), porodice glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC), porodice molekula aktivacije signalnih limfocita (SLAM), porodice leukocitnih receptora sličnih imunoglobulinu (LIR), porodice nektina (Nec), porodice slične nektinu (NECL), porodice vezanih sa receptorom poliovirusa (PVR), porodice receptora koji okidaju prirodnu citotoksičnost (NCR), porodice imunoglobulina i mucina T ćelija (TIM) ili porodica imunoglobulinima sličnih receptora ćelija ubica (KIR). U nekim realizacijama, dodatni IgSF domeni su nezavisno izvedeni iz IgSF proteina izabranog iz grupe koja se sastoji od CD80(B7‑1), CD86(B7‑2), CD274 (PD-L1, B7-H1), PDCD1LG2(PD-L2, CD273), ICOSLG(B7RP1, CD275, ICOSL, B7-H2), CD276(B7-H3), VTCN1(B7-H4), CD28, CTLA4, PDCD1(PD‑1), ICOS, BTLA(CD272), CD4, CD8A(CD8-alpha), CD8B(CD8-beta), LAG3, HAVCR2(TIM‑3), CEACAM1, TIGIT, PVR(CD155), PVRL2(CD112), CD226, CD2, CD160, CD200, CD200R1(CD200R), i NCR3 (NKp30).
[0731] Prva kolona Tabele 2 daje naziv i, opciono, naziv nekih mogućih sinonima za tog određenog člana IgSF. Druga kolona daje identifikator proteina iz baze podataka UniProtKB, javno dostupne baze podataka dostupne preko interneta na uniprot.org ili, u nekim slučajevima, GenBank broj. Univerzalni proteinski resurs (UniProt) je sveobuhvatni resurs za podatke o sekvencama proteina i anotacijama. UniProt baze podataka uključuju UniProt bazu znanja (UniProtKB). UniProt je saradnja između Evropskog instituta za bioinformatiku (EMBL-EBI), Švajcarskog instituta za bioinformatiku SIB i Resursa informacija o proteinima (PIR) i uglavnom je podržan grantom Nacionalnog instituta za zdravlje SAD (NIH). GenBank je baza podataka genetskih sekvenci NIH, anotirana kolekcija svih javno dostupnih DNK sekvenci (Istraživanje nukleinskih kiselina, 2013. januar;41(D1):D36-42). Treća kolona prikazuje region gde se nalazi naznačeni IgSF domen. Region je naveden kao raspon gde domen uključuje ostatke koji definišu raspon. Kolona 3, takođe, označava klasu IgSF domena za navedeni IgSF region. Kolona 4 prikazuje region gde se nalaze naznačeni dodatni domeni (signalni peptid, S; ekstracelularni domen, E; transmembranski domen, T; citoplazmatski domen, C). Razume se da opis domena može da varira u zavisnosti od postupaka koje se koriste za identifikaciju ili klasifikaciju domena i da se mogu različito identifikovati iz različitih izvora. Opis ostataka koji odgovaraju domenu u Tabeli 2 je samo za primer i može biti nekoliko amino-kiselina (kao što je jedna, dve, tri ili četiri) duži ili kraći. Kolona 5 označava, za neke od navedenih IgSF članova, neke od njegovih srodnih partnera za vezivanje na ćelijskoj površini.
[0733]
[0734]
[0735]
[0736]
[0737]
[0740] U nekim realizacijama, obezbeđeni imunomodulatorni proteini, pored toga što sadrže varijantu ICOSL polipeptida, takođe sadrže najmanje 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 dodatnih domena superfamilije imunoglobulina (IgSF), kao što je IgD domen člana porodice IgSF navedenog u Tabeli 2.
[0741] U nekim realizacijama, obezbeđeni imunomodulatorni protein sadrži najmanje jedan dodatni IgSF domen (npr. drugi IgSF domen). U nekim realizacijama, obezbeđeni imunomodulatorni protein sadrži najmanje dva dodatna IgSF domena (npr. drugi i treći IgSF domen). U nekim realizacijama, obezbeđeni imunomodulatorni protein sadrži najmanje tri dodatna IgSF domena (npr. drugi, treći i četvrti). U nekim realizacijama, obezbeđeni imunomodulatorni protein sadrži najmanje četiri dodatna IgSF domena (npr. drugi, treći, četvrti i peti). U nekim realizacijama, obezbeđeni imunomodulatorni protein sadrži najmanje pet dodatnih IgSF domena (npr. drugi, treći, četvrti, peti i šesti). U nekim realizacijama, obezbeđeni imunomodulatorni protein sadrži najmanje šest dodatnih IgSF domena (npr. drugi, treći, četvrti, peti, šesti i sedmi). U nekim realizacijama, svaki od IgSF domena u imunomodulatornom proteinu je različit. U nekim realizacijama, najmanje jedan od dodatnih IgSF domena je isti kao najmanje jedan drugi IgSF domen u imunomodulatornom proteinu. U nekim realizacijama, svaki od IgSF domena je od ili je izveden od različitog člana IgSF porodice. U nekim realizacijama, najmanje dva od IgSF domena su od ili su izvedena od istog člana IgSF porodice.
[0743] U nekim realizacijama, dodatni IgSF domen obuhvata IgV domen ili IgC (npr. IgC2) domen ili domene, ili specifični vezujući fragment IgV domena ili specifični vezujući fragment IgC (npr. IgC2) domena ili domena. U nekim realizacijama, dodatni IgSF domen jeste ili sadrži IgV domen pune dužine. U nekim realizacijama, dodatni IgSF domen jeste ili sadrži IgC (npr. IgC2) domen ili domene pune dužine. U nekim realizacijama, dodatni IgSF domen jeste ili sadrži specifični vezujući fragment IgV domena. U nekim realizacijama, dodatni IgSF domen jeste ili sadrži specifični vezujući fragment IgC (npr. IgC2) domena ili domena. U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein sadrži najmanje dva dodatna IgSF domena iz jednog (istog) IgSF člana. Na primer, u nekim aspektima, imunomodulatorni protein sadrži ECD ili njegov deo IgSF člana koji sadrži IgV domen pune dužine i IgC (npr. IgC2) domen ili domene pune dužine ili njihove specifične vezujuće fragmente.
[0745] [0273] U nekim realizacijama, obezbeđeni imunomodulatorni proteini sadrže najmanje jedan dodatni IgSF domen (npr. drugi ili, u nekim slučajevima, i treći IgSF domen) u kome je najmanje jedan dodatni, npr. drugi ili treći IgSF domen, IgSF domen naveden u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili IgSF domenu divljeg tipa ili njegovom specifičnom vezujućem fragmentu sadržanom u sekvenci amino-kiselina navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-27 i 341. U nekim realizacijama, referentni (npr. nemodifikovani) ili IgSF domen divljeg tipa je IgV domen ili IgC domen, kao što je IgC1 ili IgC2 domen.
[0747] U nekim realizacijama, obezbeđeni imunomodulatorni proteini, pored toga što sadrže varijantu ICOSL polipeptida, takođe sadrže najmanje jedan dodatni IgSF domen (npr. jedan ili, u nekim slučajevima, takođe treći afinitetno modifikovani IgSF domen itd.) u kome je najmanje jedan dodatni IgSF domen vIgD koji sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina (npr. supstituciju, deleciju ili mutaciju) u poređenju sa IgSF domenom u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili IgSF domenu divljeg tipa, kao što je IgSF domen u članu IgSF porodice navedenom u Tabeli 2. U nekim realizacijama, dodatni, npr. drugi ili treći afinitetno modifikovani IgSF domen sadrži najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence. na referentni (npr. nemodifikovani) ili IgSF domen divljeg tipa ili njegov specifični vezujući fragment sadržan u sekvenci amino-kiselina navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-27 i 341. U nekim realizacijama, referentni (npr. nemodifikovani) ili IgSF domen divljeg tipa je IgV domen ili IgC domen, kao što je IgC1 ili IgC2 domen. U nekim realizacijama, dodatni, npr. drugi ili treći IgSF domen je afinitetno modifikovani IgV domen i/ili IgC domen. U nekim realizacijama, jedan ili više dodatnih IgSF domena je afinitetno modifikovani IgSF domen koji sadrži IgV domen i/ili IgC (npr. IgC2) domen ili domene, ili specifični vezujući fragment IgV domena i/ili specifični vezujući fragment IgC (npr. IgC2) domena ili domena, u kojima IgV i/ili IgC domen sadrži modifikaciju(e) amino-kiseline (npr. supstituciju(e)). U nekim realizacijama, jedan ili više dodatnih afinitetno modifikovanih IgSF domena sadrži IgV domen koji sadrži modifikaciju(e) amino-kiseline (npr. supstituciju(e)). U nekim realizacijama, jedan ili više dodatnih afinitetno modifikovanih IgSF domena uključuju IgSF domene prisutne u ECD ili delu ECD odgovarajućeg referentnog člana IgSF porodice, kao što su IgV domen pune dužine i IgC (npr. IgC2) domen ili domeni pune dužine, ili njihovi specifični vezujući fragmenti, u kojima jedan ili oba, IgV i IgC, sadrže modifikaciju(e) amino-kiselina (npr. supstituciju(e)). U nekim realizacijama, određeni domen ili svaki od određenih domena (npr. dodatni, npr. drugi ili treći IgSF domen) varijante polipeptida IgSF domena može biti za nekoliko amino-kiselina duži ili kraći, kao što je 1-10, npr.1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 amino-kiselina duži ili kraći, od sekvence aminokiselina navedene u odgovarajućoj SEQ ID NO.
[0748] U nekim realizacijama, obezbeđeni imunomodulatorni protein sadrži najmanje jedan dodatni (npr. drugi ili, u nekim slučajevima, i treći IgSF domen i tako dalje) ili drugi IgSF domen koji je vIgD koji sadrži jednu ili više amino-kiselinskih supstitucija u poređenju sa IgSF domenom (npr. IgV) referentnog (npr. nemodifikovanog) ili IgSF domena divljeg tipa, osim ICOSL.
[0750] U nekim realizacijama, dodatni ili drugi IgSF domen sadrži jednu ili više amino-kiselinskih supstitucija u poređenju sa IgSF domenom u referentnom (npr. nemodifikovanom) ili IgSF domenu divljeg tipa, kao što je IgSF domen u članu IgSF porodice navedenom u Tabeli 2. U nekim realizacijama, dodatni ili drugi afinitetno modifikovani IgSF domen sadrži najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa referentnim (npr. nemodifikovanim) ili IgSF domenom divljeg tipa ili njegovim specifičnim vezujućim fragmentom sadržanim u sekvenci amino-kiselina navedenoj u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-27. U nekim realizacijama, referentni (npr. nemodifikovani) ili IgSF domen divljeg tipa je IgV domen ili IgC domen, kao što je IgC1 ili IgC2 domen. U nekim realizacijama, dodatni ili drugi IgSF domen je afinitetno modifikovani IgV domen ili IgC domen. Tabele 3-5 daju primerne polipeptide koji sadrže jedan ili više afinitetno modifikovanih IgSF domena koji se mogu koristiti u ovde datim stek konstruktima.
[0752] U nekim realizacijama, jedan ili više dodatnih domena IgSF domena (npr. drugi IgSF) je IgSF domen (npr. IgV) drugog člana IgSF porodice koji se vezuje ili prepoznaje tumorski antigen. U takvim realizacijama, član IgSF porodice služi kao deo za lokalizaciju tumora, čime se vIgD ICOSL dovodi u neposrednu blizinu imunih ćelija u tumorskom mikrookruženju. U nekim realizacijama, dodatni domen IgSF domena (npr. drugi IgSF) je IgSF domen NKp30, koji se vezuje ili prepoznaje B7-H6 eksprimovan na tumorskoj ćeliji. U nekim realizacijama, najmanje jedan dodatni (npr. drugi) IgSF domen, npr. NKp30, je vIgD koji sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina (npr. supstitucije, delecije ili adicije). U nekim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina povećavaju afinitet vezivanja i/ili selektivnost za B7-H6 u poređenju sa referentnim IgSF domenom, npr. NKp30, kao što je najmanje ili najmanje oko 1,2 puta, 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 20 puta, 30 puta, 40 puta ili 50 puta.
[0753]
[0754]
[0755]
[0756]
[0757]
[0758]
[0759] Broj takvih neafinitetno modifikovanih ili afinitetno modifikovanih IgSF domena prisutnih u „složenom“ imunomodulatornom proteinskom konstruktu (bilo da su u pitanju kombinacije nedivljeg tipa ili aranžmani nedivljeg tipa) najmanje je 2, 3, 4 ili 5, a u nekim realizacijama tačno 2, 3, 4 ili 5 IgSF domena (pri čemu određivanje broja afinitetno modifikovanih IgSF domena zanemaruje sve njihove nespecifične vezujuće frakcione sekvence i/ili njihove suštinski imunološki neaktivne frakcione sekvence).
[0761] U nekim realizacijama stek imunomodulatornog proteina koji je ovde dat, broj IgSF domena je najmanje 2, pri čemu je broj afinitetno modifikovanih i broj neafinitetno modifikovanih IgSF domena svaki nezavisno najmanje: 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. Dakle, broj afinitetno modifikovanih IgSF domena i broj neafinitetno modifikovanih IgSF domena, redom, (afinitetno modifikovani IgSF domen: neafinitetno modifikovani IgSF domen), može biti tačno ili najmanje: 2:0 (afinitetno modifikovani: divlji tip), 0:2, 2:1, 1:2, 2:2, 2:3, 3:2, 2:4, 4:2, 1:1, 1:3, 3:1, 1:4, 4:1, 1:5 ili 5:1.
[0763] U nekim realizacijama stek imunomodulatornog proteina, najmanje dva od neafinitetno modifikovanih i/ili afinitetno modifikovanih IgSF domena su identični IgSF domeni.
[0765] U nekim realizacijama, stek imunomodulatorni protein koji je ovde dat sadrži najmanje dva afinitetno modifikovana i/ili neafinitetno modifikovana IgSF domena iz jednog IgSF člana, ali u rasporedu koji nije divlji tip (alternativno, „permutacija“). Jedan ilustrativan primer rasporeda ili permutacije nedivljeg tipa je imunomodulatorni protein koji sadrži nedivlji tip redosleda afinitetno modifikovanih i/ili neafinitetno modifikovanih IgSF domena u odnosu na one koje se nalaze u ICOSL divljeg tipa čije su sekvence IgSF domena služile kao izvor varijantnih IgSF domena kao što je ovde dato. Dakle, u jednom primeru, imunomodulatorni protein može da sadrži IgV proksimalno i IgC distalno od transmembranskog domena, iako u neafinitetno modifikovanom i/ili afinitetno modifikovanom obliku. Prisustvo, u imunomodulatornom proteinu koji je ovde dat, i kombinacija nedivljeg tipa i rasporeda nedivljeg tipa neafinitetno modifikovanih i/ili afinitetno modifikovanih IgSF domena takođe je u okviru predmeta ovog pronalaska.
[0767] [0282] U nekim realizacijama naslaganog imunomodulatornog proteina, IgSF domeni modifikovani sa neafinitetom i/ili afinitetom su neidentični (tj. različiti) IgSF domeni. IgSF domeni modifikovani sa neidentičnim afinitetom specifično se vezuju, pod specifičnim uslovima vezivanja, za različite srodne partnere za vezivanje i „neidentični su“ bez obzira na to da li su referentni (npr. nemodifikovani) ili IgSF domeni divljeg tipa iz kojih su konstruisani isti. Tako, na primer, kombinacija najmanje dva neidentična IgSF domena u imunomodulatornom proteinu, koja nije divljeg tipa, može da sadrži najmanje jednu sekvencu IgSF domena čije je poreklo iz i jedinstveno za jedan ICOSL, i najmanje jednu iz druge sekvence IgSF domena čije je poreklo iz i jedinstveno za drugog člana IgSF porodice koji nije ICOSL, pri čemu su IgSF domeni imunomodulatornog proteina u obliku modifikovanom sa neafinitetom i/ili afinitetom. Međutim, u alternativnim realizacijama, dva neidentična IgSF domena potiču iz iste sekvence IgSF domena, ali barem jedan je afinitetno modifikovan tako da se specifično vezuju za različite srodne partnere za vezivanje.
[0769] Višestruki IgSF domeni modifikovani sa neafinitetom i/ili afinitetom u naslaganom lancu imunomodulatornog proteinskog polipeptida ne moraju biti direktno kovalentno vezani jedan sa drugim. U nekim realizacijama, međuprostor jednog ili više amino-kiselinskih ostataka indirektno kovalentno vezuje IgSF domene modifikovane sa neafinitetom i/ili afinitetom jedne sa drugima. Veza može biti preko N-terminalnih do C-terminalnih ostataka.
[0771] U nekim realizacijama, veza može biti uspostavljena preko bočnih lanaca aminokiselinskih ostataka koji se ne nalaze na N-terminusu ili C-terminusu IgSF domena modifikovanog i/ili modifikovanog afinitetom. Dakle, veze mogu biti uspostavljene preko terminalnih ili internih amino-kiselinskih ostataka ili njihovih kombinacija.
[0773] U nekim realizacijama, dva ili više IgSF domena, uključujući vIgD iz ICOSL i jedan ili više dodatnih IgSF domena (npr. drugi ili treći varijantni IgSF domen) iz drugog člana IgSF porodice, su kovalentno ili nekovalentno vezani. U nekim realizacijama, dva ili više IgSF domena su direktno ili indirektno vezani, kao što je preko linkera. U nekim realizacijama, međuprostor jednog ili više amino-kiselinskih ostataka indirektno kovalentno vezuje IgSF domene jedan za drugi. Veza može biti preko N-terminalnih do C-terminalnih ostataka. U nekim realizacijama, veza može biti uspostavljena preko bočnih lanaca amino-kiselinskih ostataka koji se ne nalaze na N-terminalu ili C-terminalu IgSF domena. Dakle, veze mogu biti uspostavljene preko terminalnih ili internih amino-kiselinskih ostataka ili njihovih kombinacija.
[0775] U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein sadrži najmanje dva IgSF domena, svaki direktno ili indirektno vezan preko linkera. U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein sadrži najmanje tri imunomodulatorna proteina, svaki direktno ili indirektno vezan preko linkera. Različite konfiguracije su prikazane na Sl.16A i 16B.
[0776] U nekim realizacijama, jedan ili više „peptidnih linkera“ povezuju vIgD ICOSL i jedan ili više dodatnih IgSF domena (npr. drugi ili treći varijantni IgSF domen). U nekim realizacijama, peptidni linker može biti jedan amino-kiselinski ostatak ili duži. U nekim realizacijama, peptidni linker ima najmanje jedan amino-kiselinski ostatak, ali nije duži od 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 amino-kiselinskog ostatka. U nekim realizacijama, linker je fleksibilni linker. U nekim realizacijama, linker je (u jednoslovnom kodu amino-kiseline): GGGGS („4GS“; SEQ ID NO: 636) ili multimeri 4GS linkera, kao što su ponavljanja od 2, 3, 4 ili 5 4GS linkera. U nekim realizacijama, peptidni linker je (GGGGS)<2>ili (GGGGS)<3>kao što je navedeno u SEQ ID NO: 229 i 228, redom. U nekim realizacijama, linker takođe može da sadrži niz ostataka alanina samostalnog ili pored drugog peptidnog linkera (kao što je 4GS linker ili njegov multimer). U nekim realizacijama, broj ostataka alanina u svakoj seriji je: 2, 3, 4, 5 ili 6 alanina. U nekim realizacijama, linker je kruti linker. Na primer, linker je α-heliksni linker. U nekim realizacijama, linker je (u jednoslovnom kodu amino-kiseline): EAAAK ili multimeri EAAAK linkera, kao što su ponavljanja od 2, 3, 4 ili 5 EAAAK linkera, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 629 (1xEAAAK), SEQ ID NO: 630 (3xEAAAK) ili SEQ ID NO: 631 (5xEAAAK). U nekim realizacijama, linker može dalje da sadrži amino-kiseline uvedene kloniranjem i/ili sa mesta restrikcije, na primer, linker može da sadrži amino-kiseline GS (u jednoslovnom kodu amino-kiseline) kako je uvedeno korišćenjem mesta restrikcije BAMHI. U nekim realizacijama, linker (u jednoslovnom kodu amino-kiseline) je GSGGGGS (SEQ ID NO: 635). U nekim primerima, linker je 2xGGGGS praćen sa tri alanina (GGGGSGGGGSAAA; SEQ ID NO: 230).
[0778] [0288] U nekim realizacijama, neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani IgSF domeni su vezani „peptidnim linkerima divljeg tipa“ umetnutim na N-terminus i/ili C-terminus drugog neafinitetno modifikovanog i/ili afinitetno modifikovanog IgSF domena. U nekim realizacijama, prisutan je vodeći peptidni linker umetnut na N-terminus prvog IgSF domena i/ili prva prateća sekvenca umetnuta na C-terminus prvog neafinitetno modifikovanog i/ili afinitetno modifikovanog IgSF domena. U nekim realizacijama, prisutan je drugi vodeći peptidni linker umetnut na N-terminus drugog IgSF domena i/ili druga prateća sekvenca umetnuta na C-terminus drugog neafinitetno modifikovanog i/ili afinitetno modifikovanog IgSF domena. Kada su prvi i drugi IgSF domen modifikovanog neafiniteta i/ili afiniteta izvedeni iz istog matičnog proteina i vezani su u istoj orijentaciji, linkeri peptida divljeg tipa između prvog i drugog IgSF domena modifikovanog neafiniteta i/ili afiniteta nisu duplirani. Na primer, kada su prvi prateći linker peptida divljeg tipa i drugi vodeći linker peptida divljeg tipa isti, imunomodulatorni protein tipa II ne sadrži ni prvi prateći linker peptida divljeg tipa niti drugi vodeći linker peptida divljeg tipa.
[0780] U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein tipa II sadrži prvi vodeći linker peptida divljeg tipa umetnut na N-terminus prvog neafinitetno modifikovanog i/ili afinitetno modifikovanog IgSF domena, pri čemu prvi vodeći linker peptida divljeg tipa sadrži najmanje 5 (kao što je najmanje oko bilo kojih 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili više) uzastopnih aminokiselina iz interventne sekvence u proteinu divljeg tipa iz koje je izveden prvi neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani IgSF domen između roditeljskog IgSF domena i neposredno prethodnog domena (kao što je signalni peptid ili IgSF domen). U nekim realizacijama, prvi vodeći linker peptida divljeg tipa sadrži celu interventnu sekvencu u proteinu divljeg tipa iz koje je izveden prvi neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani IgSF domen između roditeljskog IgSF domena i neposredno prethodnog domena (kao što je signalni peptid ili IgSF domen).
[0782] U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein tipa II dalje sadrži prvi prateći linker peptida divljeg tipa umetnut na C-terminus prvog neafinitetno modifikovanog i/ili afinitetno modifikovanog IgSF domena, pri čemu prvi prateći linker peptida divljeg tipa sadrži najmanje 5 (kao što je najmanje oko bilo koje od 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili više) uzastopnih aminokiselina iz interventne sekvence u proteinu divljeg tipa iz koje je izveden prvi neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani IgSF domen između roditeljskog IgSF domena i neposredno sledećeg domena (kao što je IgSF domen ili transmembranski domen). U nekim realizacijama, prvi prateći linker peptida divljeg tipa obuhvata celu posrednu sekvencu u proteinu divljeg tipa iz koje je izveden prvi IgSF domen modifikovan neafinitetom i/ili afinitetom, između roditeljskog IgSF domena i neposredno sledećeg domena (kao što je IgSF domen ili transmembranski domen).
[0784] [0291] U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein tipa II dalje sadrži drugi vodeći linker peptida divljeg tipa umetnut na N-terminus drugog neafinitetno modifikovanog i/ili afinitetno modifikovanog IgSF domena, pri čemu drugi vodeći linker peptida divljeg tipa sadrži najmanje 5 (kao što je najmanje oko bilo kojih od 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili više) uzastopnih aminokiselina iz interventne sekvence u proteinu divljeg tipa iz koje je izveden drugi neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani IgSF domen između roditeljskog IgSF domena i neposredno prethodnog domena (kao što je signalni peptid ili IgSF domen). U nekim realizacijama, drugi vodeći linker peptida divljeg tipa sadrži celu interventnu sekvencu u proteinu divljeg tipa iz koje je izveden drugi neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani IgSF domen između roditeljskog IgSF domena i neposredno prethodnog domena (kao što je signalni peptid ili IgSF domen).
[0786] U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein tipa II dodatno sadrži drugi prateći linker peptida divljeg tipa umetnut na C-terminus drugog neafinitetno modifikovanog i/ili afinitetno modifikovanog IgSF domena, pri čemu drugi prateći linker peptida divljeg tipa sadrži najmanje 5 (kao što je najmanje oko bilo koje od 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili više) uzastopnih aminokiselina iz interventne sekvence u proteinu divljeg tipa iz koje je izveden drugi neafinitetno modifikovani i/ili afinitetno modifikovani IgSF domen između roditeljskog IgSF domena i neposredno sledećeg domena (kao što je IgSF domen ili transmembranski domen). U nekim realizacijama, drugi prateći linker peptida divljeg tipa obuhvata celu posrednu sekvencu u proteinu divljeg tipa iz koje je izveden drugi IgSF domen modifikovanog neafiniteta i/ili afiniteta između roditeljskog IgSF domena i neposredno sledećeg domena (kao što je IgSF domen ili transmembranski domen).
[0788] Primer vodeće sekvence i prateće sekvence za protein tipa II koji sadrži CD80 IgSF domen naveden je u SEQ ID NO:231 i SEQ ID NO:232. Primer vodeće sekvence i prateće sekvence za protein tipa II koji sadrži ICOSL IgSF domen naveden je u SEQ ID NO:233 i 234. Primer vodeće sekvence i prateće sekvence za protein tipa II koji sadrži CD86 IgSF domen naveden je u bilo kom od SEQ ID NO:236-238. Primer sekvence linkera divljeg tipa za protein tipa II koji sadrži NKp30 IgSF domen naveden je u SEQ ID NO:235.
[0790] 1. Monovalentni
[0792] Ovde su dati imunomodulatorni proteini koji sadrže varijantu ICOSL polipeptida koja je monovalentna. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida monovalentnog imunomodulatornog proteina je vezana, direktno ili indirektno, sa dodatnim delom. U nekim realizacijama, dodatni deo je protein, peptid, mali molekul ili nukleinska kiselina. U nekim realizacijama, monovalentni imunomodulatorni protein je fuzioni protein.
[0793] U nekim realizacijama, deo je molekul koji produžava poluživot. Primeri takvih molekula koji produžavaju poluživot uključuju, ali nisu ograničeni na, albumin, polipeptid koji vezuje albumin, Pro/Ala/Ser (PAS), C-terminalni peptid (CTP) beta podjedinice humanog horionskog gonadotropina, polietilen glikol (PEG), dugačke nestrukturirane hidrofilne sekvence aminokiselina (XTEN), hidroksietil skrob (HES), mali molekul koji vezuje albumin ili njihovu kombinaciju.
[0795] U nekim realizacijama, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL može da uključuje konformaciono neuređene polipeptidne sekvence sastavljene od amino-kiselina Pro, Ala i Ser (videti npr. WO2008/155134; SEQ ID NO: 904). U nekim slučajevima, ponavljanje aminokiseline je najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ili više ostataka amino-kiseline, pri čemu svako ponavljanje sadrži (jedan) Ala, Ser i Pro ostatak(ke). Stoga, ovde je obezbeđen imunomodulatorni protein koji je PAS-ilovani protein pri čemu je varijanta ICOSL polipeptida vezana, direktno ili indirektno preko linkera, sa Pro/Ala/Ser (PAS). U nekim realizacijama, mogu se koristiti jedna ili više dodatnih struktura linkera.
[0797] U nekim realizacijama, deo olakšava detekciju ili prečišćavanje varijante ICOSL polipeptida. U nekim slučajevima, imunomodulatorni polipeptid sadrži oznaku ili fuzioni domen, npr. afinitetnu ili oznaku za prečišćavanje, vezanu, direktno ili indirektno, sa N- i/ili C-terminusom ICOSL polipeptida. Različite pogodne polipeptidne oznake i/ili fuzioni domeni su poznati i uključuju, ali nisu ograničeni na, polihistidinsku (His) oznaku, FLAG-oznaku (SEQ ID NO: 865), Myc-oznaku i fluorescentne proteinske oznake (npr. EGFP, navedene u SEQ ID NO: 858, 859 ili 896). U nekim slučajevima, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL sadrži najmanje šest histidinskih ostataka (navedenih u SEQ ID NO: 864). U nekim slučajevima, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL dalje sadrži različite kombinacije delova. Na primer, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL dalje sadrži jednu ili više polihistidinskih oznaka i FLAG oznaka.
[0799] U nekim realizacijama, ICOSL polipeptid je vezan sa modifikovanim konstantnim regionom teškog lanca imunoglobulina (Fc) koji ostaje u monovalentnom obliku, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 472.
[0801] 2. Bivalentni
[0802] U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein koji sadrži varijantu ICOSL je multivalentan, kao što je bivalentan. U nekim aspektima, imunomodulatorni protein je vezan, direktno ili indirektno preko linkera, sa domenom multimerizacije. U nekim aspektima, domen multimerizacije povećava poluživot molekula.
[0804] Interakcija dva ili više varijantnih ICOSL polipeptida može biti olakšana njihovim povezivanjem, direktno ili indirektno, sa bilo kojim delom ili drugim polipeptidom koji su sami sposobni da interaguju i formiraju stabilnu strukturu. Na primer, odvojeni kodirani lanci varijantnih ICOSL polipeptida mogu se spojiti multimerizacijom, pri čemu je multimerizacija polipeptida posredovana domenom multimerizacije. Obično, domen multimerizacije omogućava formiranje stabilne interakcije protein-protein između prve varijante ICOSL polipeptida i druge varijante ICOSL polipeptida. Homo- ili heteromultimerni polipeptidi mogu se generisati koekspresijom odvojenih varijanti ICOSL polipeptida. Prva i druga varijanta ICOSL polipeptida mogu biti isti ili različiti.
[0806] [0301] U nekim realizacijama, multimerizacioni domen uključuje bilo koji domen sposoban za formiranje stabilne protein-protein interakcije. Multimerizacioni domeni mogu interagovati putem imunoglobulinske sekvence (npr. Fc domen; videti npr. Međunarodne objave patenata br. WO 93/10151 i WO 2005/063816 SAD; U.S. objava br. 2006/0024298; U.S. Pat. br. 5,457,035); leucinski zatvarač (npr. iz proteina koji transformišu jedro fos i jun ili proto-onkogena c-myc ili iz Opšte kontrole azota (GCN4)) (videti npr. Busch and Sassone-Corsi (1990) Trends Genetics, 6:36‑40; Gentz et al., (1989) Science, 243:1695‑1699); hidrofobni region; hidrofilni region; ili slobodni tiol koji formira intermolekularnu disulfidnu vezu između himernih molekula homo- ili heteromultimera. Pored toga, domen multimerizacije može da uključuje amino-kiselinsku sekvencu koja sadrži izbočinu (knob) komplementarnu amino-kiselinskoj sekvenci koja sadrži šupljinu (hole), kao što je opisano, na primer, u U.S. Pat. br. 5,731,168; Međunarodne patentne objave br. WO 98/50431 i WO 2005/063816; Ridgway et al. (1996) Protein Engineering, 9:617‑621. Takav multimerizacioni region može biti konstruisan tako da sterske interakcije ne samo da podstiču stabilnu interakciju, već dodatno podstiču formiranje heterodimera preko homodimera iz smeše himernih monomera. Generalno, izbočine se konstruišu zamenom malih bočnih lanaca amino-kiselina sa interfejsa prvog polipeptida većim bočnim lancima (npr. tirozin ili triptofan). Kompenzacione šupljine identične ili slične veličine kao izbočine se opciono stvaraju na interfejsu drugog polipeptida zamenom velikih bočnih lanaca amino-kiselina manjim (npr. alanin ili treonin). Primeri domena multimerizacije su opisani u daljem tekstu.
[0808] Varijantni ICOSL polipeptid može se spojiti bilo gde, ali obično preko svog N- ili C-terminusa, sa N- ili C-terminusom multimerizacionog domena da bi se formirao himerni polipeptid. Veza može biti direktna ili indirektna preko linkera. Takođe, himerni polipeptid može biti fuzioni protein ili se može formirati hemijskom vezom, kao što je putem kovalentnih ili nekovalentnih interakcija. Na primer, kada se priprema himerni polipeptid koji sadrži multimerizacioni domen, nukleinska kiselina koja kodira ceo ili deo varijante ICOSL polipeptida može se operativno povezati sa nukleinskom kiselinom koja kodira sekvencu multimerizacionog domena, direktno ili indirektno ili opciono preko linkerskog domena. U nekim slučajevima, konstrukt kodira himerni protein pri čemu je C-terminus varijante ICOSL polipeptida spojen sa N-terminusom multimerizacionog domena. U nekim slučajevima, konstrukt može kodirati himerni protein pri čemu je N-terminus varijante ICOSL polipeptida spojen sa N- ili C-terminusom multimerizacionog domena.
[0810] Polipeptidni multimer sadrži dva himerna proteina stvorena povezivanjem, direktnim ili indirektnim, dva ista ili različita varijantna ICOSL polipeptida direktno ili indirektno sa multimerizacionim domenom. U nekim primerima, pri čemu je multimerizacioni domen polipeptid, genska fuzija koja kodira varijantni ICOSL polipeptid i multimerizacioni domen se ubacuje u odgovarajući ekspresioni vektor. Dobijeni himerni ili fuzioni protein može se eksprimovati u ćelijama domaćinima transformisanim rekombinantnim ekspresionim vektorom i dozvoliti mu se da se sklopi u multimere, gde multimerizacioni domeni interaguju i formiraju multivalentne polipeptide. Hemijsko povezivanje multimerizacionih domena sa varijantnim ICOSL polipeptidima može se izvršiti korišćenjem heterobifunkcionalnih linkera.
[0812] Dobijeni himerni polipeptidi, kao što su fuzioni proteini i multimeri formirani od njih, mogu se prečistiti bilo kojim pogodnim postupkom, kao što je, na primer, afinitetna hromatografija preko kolona sa proteinom A ili proteinom G. Kada se dva molekula nukleinske kiseline koji kodiraju različite polipeptide transformišu u ćelije, doći će do formiranja homo- i heterodimera. Uslovi za ekspresiju mogu se podesiti tako da formiranje heterodimera bude favorizovanije od formiranja homodimera.
[0814] Imunoglobulinski domen
[0815] U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein sadrži varijantu ICOSL polipeptida vezanu za Fc region imunoglobulina (što daje „imunomodulatornu Fc fuziju“, kao što je „ICOSL-Fc varijantna fuzija“, takođe nazvana ICOSL vIgD-Fc fuzija). U nekim realizacijama, ICOSL-Fc varijantna fuzija, takođe, sadrži jedan ili više dodatnih IgSF domena, kao što je jedan ili više dodatnih vIgD vezanih sa vIgD ICOSL. U nekim realizacijama, vezivanje varijante ICOSL polipeptida ili dodatnog IgSF domena je na N-terminusu Fc. U nekim realizacijama, vezivanje varijante ICOSL ili dodatnog polipeptida IgSF domena je na C-terminusu Fc. U nekim realizacijama, dva ili više ICOSL ili dodatnih varijanti IgSF domena polipeptida (istih ili različitih) su nezavisno vezani na N-terminusu i na C-terminusu.
[0817] U nekim realizacijama, Fc je mišji ili humani Fc. U nekim realizacijama, Fc je Fc region sisarskog ili humanog IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4. U nekim realizacijama, Fc je izveden iz IgG1, kao što je humani IgG1. U nekim realizacijama, Fc sadrži amino-kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 226 ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 226.
[0819] U nekim realizacijama, Fc region sadrži još jednu modifikaciju da bi se izmenila (npr. redukovala) jedna ili više njegovih normalnih funkcija. Generalno, Fc region je odgovoran za efektorske funkcije, kao što su citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) i ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), pored kapaciteta vezivanja antigena, što je glavna funkcija imunoglobulina. Pored toga, FcRn sekvenca prisutna u Fc regionu igra ulogu regulisanja nivoa IgG u serumu povećavanjem poluživota in vivo konjugacijom sa in vivo FcRn receptorom. U nekim realizacijama, takve funkcije mogu biti smanjene ili izmenjene u Fc za upotrebu sa obezbeđenim Fc fuzionim proteinima.
[0821] U nekim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina mogu biti uvedene u Fc region ICOSL-Fc varijante fuzije koja je ovde data, čime se generiše varijanta Fc regiona. U nekim realizacijama, varijanta Fc regiona ima smanjenu efektorsku funkciju. Postoji mnogo primera promena ili mutacija Fc sekvenci koje mogu izmeniti efektorsku funkciju. Na primer, WO 2000/42072, WO2006/019447, WO2012/125850, WO2015/107026, US2016/0017041 i Shields et al. J Biol. Chem. 9(2): 6591‑6604 (2001) opisuju primere Fc varijante sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR.
[0822] U nekim realizacijama, obezbeđene varijante ICOSL-Fc fuzije sadrže Fc region koji ispoljava smanjene efektorske funkcije (takođe se naziva inertni Fc ili Fc bez efektora), što ga čini poželjnim kandidatom za primene u kojima je poluživot ICOSL-Fc varijante fuzije in vivo je važno, ali određene efektorske funkcije (kao što su CDC i ADCC) su nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti mogu se sprovesti kako bi se potvrdila redukcija/smanjenje aktivnosti CDC i/ili ADCC. Na primer, testovi vezivanja za Fc receptor (FcR) mogu se sprovesti kako bi se osiguralo da fuzija ICOSL-Fc varijante nema vezivanje za FcγR (stoga verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja za FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimuju samo FcγRIII, dok monociti eksprimuju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je sumirana u Tabeli 3 na strani 464. Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457‑492 (1991). Neograničavajući primeri in vitro testova za procenu ADCC aktivnosti molekula od interesa opisani su u U.S. Pat. br.
[0823] 5,500,362 (vidi, npr. Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059‑7063 (1986)) i Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499‑1502 (1985); U.S. Pat. No. 5,821,337 (videti Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351‑1361 (1987)). Alternativno, mogu se koristiti neradioaktivne metode ispitivanja (videti, na primer, ACTI<™>neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (Cell Technology, Inc. Mountain View, Calif.; i CytoTox 96™ test neradioaktivne citotoksičnosti (Promega, Madison, Wis.). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i prirodne ćelije ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, može se proceniti ADCC aktivnost molekula od interesa in vivo, npr. u životinjskom modelu kao što je onaj objavljen u Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652‑656 (1998). Testovi vezivanja C1q mogu se, takođe, sprovesti kako bi se potvrdilo da fuzija ICOSL-Fc varijante nije u stanju da se veže za C1q i stoga nema CDC aktivnost. Videti, npr. ELISA za vezivanje C1q i C3c u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se procenila aktivacija komplementa, može se izvršiti CDC test (videti, na primer, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M. S. et al., Blood 101:1045‑1052 (2003); i Cragg, M. S. and M. J. Glennie, Blood 103:2738‑2743 (2004)). Vezivanje FcRn-a i in vivo određivanje klirensa/poluživota može se, takođe, izvršiti korišćenjem metoda poznatih u tehnici (videti, npr. Petkova, S. B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759‑1769 (2006)).
[0824] [0310] ICOSL-Fc varijante fuzije sa smanjenom efektorskom funkcijom uključuju one sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 EU numeracijom (U.S. Pat. br.6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dve ili više amino-kiselinskih pozicija 265, 269, 270, 297 i 327 prema EU numeraciji, uključujući takozvani „DANA“ Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (U.S. Pat. br. 7,332,581).
[0826] U nekim realizacijama, Fc region ICOSL-Fc varijanti fuzija ima Fc region u kome je bilo koja jedna ili više amino-kiselina na pozicijama 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325 i 329 (označeno EU numeracijom) supstituisana različitim amino-kiselinama u poređenju sa nativnim Fc regionom. Takve izmene Fc regiona nisu ograničene na gore opisane izmene i uključuju, na primer, izmene kao što su deglikozilovani lanci (N297A i N297Q), IgG1-N297G, IgG1-L234A/L235A, IgG1-L234A/L235E/G237A, IgG1-A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG1-S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A i IgG4-L236E opisane u Current Opinion in Biotechnology (2009) 20 (6), 685‑691; izmene kao što su G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R i N325LL328R, opisane u WO 2008/092117; umetanja amino-kiselina na pozicijama 233, 234, 235 i 237 (označeno EU numeracijom); i izmene na mestima opisanim u WO 2000/042072.
[0828] Opisane su određene Fc varijante sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. (Videti, npr. U.S. Pat. br.6,737,056; WO 2004/056312, WO2006/019447 i Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591‑6604 (2001).)
[0830] U nekim realizacijama, obezbeđena je varijantna fuzija ICOSL-Fc koja obuhvata varijantni Fc region koji sadrži jednu ili više amino-kiselinskih supstitucija koje povećavaju vreme poluraspada i/ili poboljšavaju vezivanje za neonatalni Fc receptor (FcRn). Antitela sa povećanim vremenom poluraspada i poboljšanim vezivanjem za FcRn opisana su u US2005/0014934A1 (Hinton et al.) ili WO2015107026. Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija u njemu koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijama na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434 prema EU numeraciji, npr. supstitucijom ostatka Fc regiona 434 (U.S. Pat. br.7,371,826).
[0831] U nekim realizacijama, Fc region ICOSL-Fc varijante fuzije sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija E356D i M358L prema EU numeraciji. U nekim realizacijama, Fc region ICOSL-Fc varijante fuzije sadrži jednu ili više amino-kiselinskih supstitucija C220S, C226S i/ili C229S prema EU numeraciji. U nekim realizacijama, Fc region ICOSL varijante fuzije sadrži jednu ili više amino-kiselinskih supstitucija R292C i V302C. Videti, takođe, Duncan & Winter, Nature 322:738‑40 (1988); U.S. Pat. br.5,648,260; U.S. Pat. br.5,624,821; i WO 94/29351 u vezi sa drugim primerima varijanti Fc regiona.
[0833] U nekim realizacijama, Fc divljeg tipa IgG1 može biti Fc naveden u SEQ ID NO: 226 koji ima alotip koji sadrži ostatke Glu (E) i Met (M) na pozicijama 356 i 358 prema EU numeraciji (npr. f alotip). U drugim realizacijama, Fc IgG1 divljeg tipa sadrži amino-kiseline humanog G1m1 alotipa, kao što su ostaci koji sadrže Asp (D) i Leu (L) na pozicijama 356 i 358, npr. kao što je navedeno u SEQ ID NO: 927. Stoga, u nekim slučajevima, Fc ovde dat može da sadrži supstitucije amino-kiselina E356D i M358L da bi se rekonstituisali ostaci alotipa G1 m1 (npr. alfa alotip). U nekim aspektima, Fc divljeg tipa je modifikovan jednom ili više supstitucija amino-kiselina da bi se smanjila efektorska aktivnost ili da bi se Fc učinio inertnim za efektorsku funkciju Fc. Primerne mutacije bez efektora ili inertne mutacije uključuju one opisane ovde. Među mutacijama bez efektora koje mogu biti uključene u Fc konstrukte ovde date su L234A, L235E i G237A prema EU numeraciji. U nekim realizacijama, Fc divljeg tipa je dodatno modifikovan uklanjanjem jednog ili više ostataka cisteina, kao što je zamena ostataka cisteina serinskim ostatkom na poziciji 220 (C220S) prema EU numeraciji. Primerni inertni Fc regioni sa smanjenom efektorskom funkcijom navedeni su u SEQ ID NO: 633 ili 477 i SEQ ID NO: 474 ili 637, koji su zasnovani na alotipovima navedenim u SEQ ID NO: 226 ili SEQ ID NO: 927, redom. U nekim realizacijama, Fc region koji se koristi u konstruktu ovde datom može dalje da nema C-terminalni lizinski ostatak.
[0835] U nekim realizacijama, promene se vrše u Fc regionu što rezultira smanjenim vezivanjem C1q i/ili citotoksičnošću zavisnom od komplementa (CDC). npr. kao što je opisano u U.S. Pat. br.
[0836] 6,194,551, WO 99/51642 i Idusogie et al., J. Immunol.164: 4178-4184 (2000).
[0838] [0317] U nekim realizacijama, obezbeđena je varijantna fuzija ICOSL-Fc koja obuhvata varijantni Fc region koji sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina, pri čemu je varijantni Fc region izveden iz IgG1, kao što je humani IgG1. U nekim realizacijama, varijantni Fc region je izveden iz amino-kiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 226. U nekim realizacijama, Fc ispoljava smanjenu efektorsku funkciju. U nekim realizacijama, Fc sadrži najmanje jednu amino-kiselinska supstitucija koja je N82G numerisanjem SEQ ID NO: 226 (što odgovara N297G prema EU numeraciji). U nekim realizacijama, Fc dalje sadrži najmanje jednu amino-kiselinska supstitucija koja je R77C ili V87C numerisanjem SEQ ID NO: 226 (što odgovara R292C ili V302C prema EU numeraciji). U nekim realizacijama, varijantni Fc region dalje sadrži C5S modifikaciju aminokiselina numerisanjem SEQ ID NO: 226 (što odgovara C220S prema EU numeraciji). Na primer, u nekim realizacijama, varijantni Fc region sadrži sledeće modifikacije amino-kiselina: V297G i jednu ili više sledećih modifikacija amino-kiselina C220S, R292C ili V302C prema EU numeraciji (što odgovara N82G i jednoj ili više sledećih modifikacija amino-kiselina C5S, R77C ili V87C uz upućivanje na SEQ ID NO:226), npr. Fc region sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:476. U nekim realizacijama, varijantni Fc region sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina C220S, L234A, L235E ili G237A, npr. Fc region sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:477. U nekim realizacijama, varijantni Fc region sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina C220S, E233P, L234V, L235A, G236del ili S267K, npr. Fc region obuhvata sekvencu navedenu u SEQ ID NO:478. U nekim realizacijama, varijanta Fc obuhvata jednu ili više modifikacija amino-kiselina C220S, L234A, L235E, G237A, E356D ili M358L, npr. Fc region obuhvata sekvencu navedenu u SEQ ID NO:474.
[0840] U nekim realizacijama, Fc regionu nedostaje C-terminalni lizin koji odgovara poziciji 232 referentnog (npr. nemodifikovanog) ili Fc divljeg tipa navedenog u SEQ ID NO: 56 (što odgovara K447del prema EU numeraciji). U nekim realizacijama, pošto se C-terminalni lizin može diferencijalno ukloniti tokom biosinteze, uklanjanje C-terminalnog ostatka lizina rezultira homogenijim proizvodom kada se protein eksprimuje u ćelijama. U nekim aspektima, takav Fc region može dodatno da uključuje jednu ili više dodatnih modifikacija, npr. supstitucije aminokiselina, kao što je bilo koja opisana. Primer takvog Fc regiona je naveden u SEQ ID NO: 632, 633, 634 ili 637.
[0842] [0319] U nekim realizacijama, obezbeđena je varijantna fuzija ICOSL-Fc koja obuhvata varijantni Fc region u kome varijanta Fc sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 474, 476, 477, 478, 507, 632, 633, 634 ili 637 ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 474, 476, 477, 478, 507, 632, 633, 634 ili 637. U nekim realizacijama, Fc ispoljava smanjenu efektorsku funkciju.
[0844] U nekim realizacijama, Fc je izveden iz IgG2, kao što je humani IgG2. U nekim realizacijama, Fc sadrži amino-kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 227 ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 227.
[0846] U nekim realizacijama, Fc sadrži amino-kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 505 ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 505. U nekim realizacijama, IgG4 Fc je stabilizovani Fc u kome je CH3 domen humanog IgG4 supstituisan CH3 domenom humanog IgG1 i koji ispoljava inhibirano formiranje agregata, antitelo u kome su CH3 i CH2 domeni humanog IgG4 supstituisani CH3 i CH2 domenima humanog IgG1, redom, ili antitelo u kome je arginin na poziciji 409 naznačen u EU indeksu koji su predložili Kabat et al. humanog IgG4 je supstituisan lizinom i koji ispoljava inhibirano formiranje agregata (videti npr. U.S. Patentu br. 8,911,726). U nekim realizacijama, Fc je IgG4 koji sadrži S228P mutaciju, za koju je pokazano da sprečava rekombinaciju između terapeutskog antitela i endogenog IgG4 putem razmene Fab-kraka (videti npr. Labrijin et al. (2009) Nat. Biotechnol., 27(8)767‑71.) U nekim realizacijama, Fc sadrži amino-kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 506 ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 506.
[0848] [0322] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida je direktno vezana sa Fc sekvencom. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida je indirektno vezana sa Fc sekvencom, kao što je preko linkera. U nekim realizacijama, jedan ili više „peptidnih linkera“ povezuju varijantu ICOSL polipeptida i Fc domen. U nekim realizacijama, peptidni linker može biti jedan aminokiselinski ostatak ili duži. U nekim realizacijama, peptidni linker ima najmanje jedan aminokiselinski ostatak, ali nije duži od 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 amino-kiselinskog ostatka. U nekim realizacijama, linker su tri alanina (AAA). U nekim realizacijama, linker je (u jednoslovnom amino-kiselinskom kodu): GGGGS („4GS“; SEQ ID NO:636) ili multimeri 4GS linkera, kao što su ponavljanja od 2, 3, 4, 5 ili 64GS linkera, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 229 (2xGGGGS) ili SEQ ID NO: 228 (3xGGGGS). U nekim realizacijama, linker je kruti linker. Na primer, linker je α-heliksni linker. U nekim realizacijama, linker je (u jednoslovnom amino-kiselinskom kodu): EAAAK ili multimeri EAAAK linkera, kao što su ponavljanja od 2, 3, 4 ili 54GS linkera, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 629 (EAAAK) ili SEQ ID NO: 630 (3xEAAAK) ili SEQ ID NO: 631 (5xEAAAK). U nekim realizacijama, linkeri počinju sa jednom ili više EAAAK jedinica i mogu se produžiti dodavanjem A, AA, AAA, AAAA, EAAAA i EAAAK sekvenci. U nekim realizacijama, linker može dalje da uključuje aminokiseline uvedene kloniranjem i/ili sa mesta restrikcije, na primer, linker može da uključuje aminokiseline GS (u jednoslovnom kodu amino-kiseline) kao što je uvedeno korišćenjem mesta restrikcije BAMHI. U nekim realizacijama, linker (u jednoslovnom kodu amino-kiseline) je GSGGGGS (SEQ ID NO: 635). U nekim primerima, linker je 2xGGGGS praćen sa tri alanina (GGGGSGGGGSAAA; SEQ ID NO: 230).
[0850] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL-Fc fuzionog proteina je dimer formiran od dva varijantna ICOSL Fc polipeptida vezana sa Fc domenom. U nekim specifičnim realizacijama, identične ili suštinski identične vrste (dozvoljavajući 3 ili manje razlika u amino-kiselinskim sekvencama na N-terminusu ili C-terminusu) ICOSL-Fc varijanti fuzionih polipeptida biće dimerizovane da bi se stvorio homodimer. U nekim realizacijama, dimer je homodimer u kome su dva varijantna ICOSL Fc polipeptida ista. Alternativno, različite vrste ICOSL-Fc varijanti fuzionih polipeptida mogu biti dimerizovane da bi se dobio heterodimer. Dakle, u nekim realizacijama, dimer je heterodimer u kome su dva varijantna ICOSL Fc polipeptida različita.
[0852] [0324] U nekim realizacijama, obezbeđen je varijantni ICOSL-Fc fuzioni protein koji sadrži varijantni ICOSL polipeptid koji uključuje jednu ili više modifikacija amino-kiselina u referentnom ICOSL kao što je opisano u Odeljku II, a koji je direktno ili indirektno vezan sa Fc regionom. U nekim slučajevima, C-terminus varijantnog ICOSL polipeptida je spojen sa N-terminusom Fc regiona. U nekim realizacijama, varijantni ICOSL ICOSL-Fc fuzije sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina u sekvenci amino-kiselina referentnog IgV domena navedenog u SEQ ID NO:545. U posebnim slučajevima, takav imunomodulatorni protein sadrži varijantu ICOSL polipeptida koja sadrži IgV domen, kao što je IgV domen naveden u bilo kojoj od SEQ ID NO: 197‑199, 201‑208, 210, 212, 240, 326‑340, 382‑386, 425‑426, 434, 546‑599, 686‑857, 906‑907, 909‑910, ili IgV domen koji ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% u odnosu na bilo koju od SEQ ID NO: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857, 906-907, 909-910 i sadrži jednu ili više amino-kiselinskih modifikacija odgovarajuće SEQ ID NO. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima IgSF domen (npr. IgV domen) koji ispoljava povećan afinitet vezivanja za CD28 ili ICOS, kao što je bilo koja od ovde opisanih amino-kiselinskih modifikacija. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima IgSF domen (npr. IgV domen) koji sadrži jednu ili više amino-kiselinskih modifikacija, npr. supstitucija u referentnom ICOSL ili specifičnom vezujućem fragmentu, koja odgovara poziciji(ama) 52, 57 ili 100 u odnosu na numeraciju SEQ ID NO: 32. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucija izabrana iz N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52L, N52K, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100P, Q100S, Q100T ili Q100V. Primeri takvih varijantnih molekula uključuju bilo koji od onih opisanih ovde. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži amino-kiselinske modifikacije N52H/N57Y/Q100R (npr. jeste ili uključuje IgV domen naveden u SEQ ID NO: 565). U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži amino-kiselinske modifikacije N52D (npr. jeste ili uključuje IgV domen naveden u SEQ ID NO: 548). U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži amino-kiselinske modifikacije N52H/Q100R (npr. jeste ili uključuje IgV domen naveden u SEQ ID NO: 567). U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži aminokiselinske modifikacije N52L/N57H/Q100R (npr. jeste ili uključuje IgV domen naveden u SEQ ID NO: 761). U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži modifikacije aminokiselina N52H/N57Y/Q100P (npr. jeste ili uključuje IgV domen naveden u SEQ ID NO: 570).
[0854] [0325] U posebnim realizacijama takvih varijanti ICOSL-Fc fuzionih proteina, Fc polipeptid je varijanta Fc regiona humanog IgG1 koja ispoljava smanjene efektorske funkcije, kao što je bilo koja opisana. U nekim realizacijama, Fc region je humani IgG1 koji sadrži modifikacije aminokiselina N297G, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K ili L234A/L235E/-G237A, pri čemu je ostatak numerisan prema EU indeksu Kabata. U nekim realizacijama, varijanta Fc regiona IgG1 dalje sadrži supstituciju amino-kiseline C220S, gde su ostaci numerisani prema EU indeksu Kabata. U nekim realizacijama, Fc region sadrži K447del, pri čemu je ostatak numerisan prema EU indeksu Kabata. U nekim aspektima, Fc region sadrži sekvencu amino-kiselinskih sekvenci navedenih u bilo kojoj od SEQ ID NO: 474, 476, 477, 478, 633 ili 637 ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 474, 476, 477, 478, 633 ili 637 i sadrži supstitucije amino-kiselina odgovarajuće SEQ ID NO. Veza između varijante ICOSL IgSF (npr. IgV) polipeptida i Fc može biti preko peptidnog linkera, kao što je bilo koji opisani. U nekim realizacijama, linker je GGGGS („4GS“; SEQ ID NO: 636), SEQ ID NO: 229 (2xGGGGS) ili SEQ ID NO: 228 (3xGGGGS). U određenim primerima, C-terminus varijante ICOSL polipeptida je spojen sa N-terminusom Fc regiona, tako da je redosled komponenti varijanta ICOSL-linker-Fc.
[0856] U nekim realizacijama, obezbeđen je varijantni ICOSL-Fc fuzioni protein, npr. varijanta ICOSL-linker-Fc, koja sadrži varijantni ICOSL IgV domen naveden u SEQ ID NO:565, linker naveden u SEQ ID NO:636 i Fc polipeptid naveden u SEQ ID NO:637. U nekim realizacijama, obezbeđen je varijantni ICOSL-Fc fuzioni protein, npr. varijanta ICOSL-linker-Fc, koja sadrži varijantni ICOSL IgV domen naveden u SEQ ID NO:565, linker naveden u SEQ ID NO:636 i Fc polipeptid naveden u SEQ ID NO:474. U nekim realizacijama, obezbeđen je varijantni ICOSL-Fc fuzioni protein, npr. varijanta ICOSL-linker-Fc, koja sadrži varijantni ICOSL IgV domen naveden u SEQ ID NO:565, linker naveden u SEQ ID NO:636 i Fc polipeptid naveden u SEQ ID NO:477. U nekim realizacijama, obezbeđen je varijantni ICOSL-Fc fuzioni protein, npr. varijanta ICOSL-linker-Fc, koja sadrži varijantni ICOSL IgV domen naveden u SEQ ID NO:565, linker naveden u SEQ ID NO:636 i Fc polipeptid naveden u SEQ ID NO:633.
[0858] U nekim realizacijama, obezbeđen je varijantni ICOSL-Fc fuzioni protein, npr. varijanta ICOSL-linker-Fc, koja sadrži varijantni ICOSL IgV domen naveden u SEQ ID NO:565, linker naveden u SEQ ID NO:229 i Fc polipeptid naveden u SEQ ID NO:637. U nekim realizacijama, obezbeđen je varijantni ICOSL-Fc fuzioni protein, npr. varijanta ICOSL-linker-Fc, koja sadrži varijantni ICOSL IgV domen naveden u SEQ ID NO:565, linker naveden u SEQ ID NO:229 i Fc polipeptid naveden u SEQ ID NO:474. U nekim realizacijama, obezbeđen je varijantni ICOSL-Fc fuzioni protein, npr. varijanta ICOSL-linker-Fc, koja sadrži varijantni ICOSL IgV domen naveden u SEQ ID NO:565, linker naveden u SEQ ID NO: 229 i Fc polipeptid naveden u SEQ ID NO: 477. U nekim realizacijama, obezbeđen je varijantni ICOSL-Fc fuzioni protein, npr. varijanta ICOSL-linker-Fc, koja sadrži varijantni ICOSL IgV domen naveden u SEQ ID NO:565, linker naveden u SEQ ID NO:229 i Fc polipeptid naveden u SEQ ID NO: 633.
[0859] U nekim realizacijama, obezbeđen je varijantni ICOSL-Fc fuzioni protein, npr. varijanta ICOSL-linker-Fc, koja sadrži varijantni ICOSL IgV domen naveden u SEQ ID NO:565, linker naveden u SEQ ID NO:228 i Fc polipeptid naveden u SEQ ID NO:637. U nekim realizacijama, obezbeđen je varijantni ICOSL-Fc fuzioni protein, npr. varijanta ICOSL-linker-Fc, koja sadrži varijantni ICOSL IgV domen naveden u SEQ ID NO:565, linker naveden u SEQ ID NO:228 i Fc polipeptid naveden u SEQ ID NO:474. U nekim realizacijama, obezbeđen je varijantni ICOSL-Fc fuzioni protein, npr. varijanta ICOSL-linker-Fc, koja sadrži varijantni ICOSL IgV domen naveden u SEQ ID NO:565, linker naveden u SEQ ID NO:228 i Fc polipeptid naveden u SEQ ID NO:477. U nekim realizacijama, obezbeđen je varijantni ICOSL-Fc fuzioni protein, npr. varijanta ICOSL-linker-Fc, koja sadrži varijantni ICOSL IgV domen naveden u SEQ ID NO:565, linker naveden u SEQ ID NO:228 i Fc polipeptid naveden u SEQ ID NO:633.
[0861] U nekim realizacijama, obezbeđen je varijantni ICOSL IgSF Fc fuzioni protein koji ima sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO: 928, ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% u odnosu na SEQ ID NO:928. U nekim realizacijama, varijantni ICOSL IgSF Fc fuzioni protein se vezuje za CD28 i ICOS, na primer, sa povećanim afinitetom vezivanja u poređenju sa referentnim (divljeg tipa) ICOSL-Fc fuzionim proteinom. U nekim realizacijama, varijantni ICOSL IgSF Fc fuzioni protein ispoljava smanjenu efektorsku funkciju Fc u poređenju sa fuzijom sa Fc divljeg tipa humanog IgG1.
[0863] U nekim realizacijama, obezbeđen je imunomodulatorni protein sa više domena u kome su dva ili više IgSF domena, uključujući vIgD iz ICOSL i jedan ili više dodatnih IgSF domena (npr. drugi varijantni IgSF domen) iz drugog člana IgSF porodice, vezani ili pričvršćeni za Fc da bi se formirala Fc fuzija, koja, nakon ekspresije u ćeliji, u nekim aspektima može da proizvede dimerni imunomodulatorni protein sa više domena. Stoga su, takođe, obezbeđeni dimerni imunomodulatorni proteini sa više domena.
[0865] [0331] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida i jedan ili više dodatnih IgSF domena su nezavisno vezani, direktno ili indirektno, sa N- ili C-terminusom Fc regiona. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida i barem jedan od jednog ili više dodatnih IgSF domena su vezani, direktno ili indirektno, i jedan od varijante ICOSL ili i jedan od jednog ili više dodatnih IgSF domena je takođe vezan, direktno ili indirektno, sa N- ili C-terminusom Fc regiona. U nekim realizacijama, N- ili C-terminus Fc regiona je vezan sa varijantom ICOSL polipeptida ili jednim ili više dodatnih IgSF domena, a drugi od N- ili C-terminusa Fc regiona je vezan sa drugim od ICOSL varijante ili drugim od jednog ili više dodatnih IgSF domena. U nekim realizacijama, povezivanje sa Fc je preko peptidnog linkera, npr. peptidnog linkera, kao što je gore opisano. U nekim realizacijama, veza između varijante ICOSL i drugog IgSF domena je putem peptidnog linkera, npr. peptidnog linkera, kao što je gore opisano. U nekim realizacijama, veza između varijante ICOSL i jednog ili više dodatnih IgSF domena je putem peptidnog linkera, npr. peptidnog linkera, kao što je gore opisano. U nekim realizacijama, vIgD ICOSL, jedan ili više dodatnih IgSF domena i Fc domen mogu biti vezani zajedno u bilo kojoj od brojnih konfiguracija kao što je prikazano na Sl.16A i 16B. U nekim realizacijama, fuzija varijante ICOSL-Fc može dalje da sadrži signalni peptid, kao što je primerni signalni peptid koji je u sekvenci amino-kiselina navedenoj u SEQ ID NO: 59 ili 225. Primerne konfiguracije su opisane u Primerima.
[0867] U nekim realizacijama, stek imunomodulatorni protein je dimer formiran od dva imunomodulatorna Fc fuziona polipeptida. Takođe su obezbeđeni molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koji od stek imunomodulatornih proteina. U nekim realizacijama, dimerni višedomenski stek imunomodulatorni protein može se proizvesti u ćelijama ekspresijom, ili u nekim slučajevima koekspresijom, stek imunomodulatornih Fc regionalnih polipeptida, kao što je detaljnije opisano u daljem tekstu.
[0869] U nekim realizacijama, dimerni višedomenski imunomodulatorni protein je dvovalentan za svaku Fc podjedinicu, monovalentan za svaku podjedinicu ili dvovalentan za jednu podjedinicu i tetravalentan za drugu.
[0871] U nekim realizacijama, dimerni višedomenski imunomodulatorni protein je homodimerni višedomenski Fc protein. U nekim realizacijama, dimerni višedomenski imunomodulatorni protein sadrži prvi imunomodulatorni Fc fuzioni polipeptid i drugi imunomodulatorni Fc fuzioni polipeptid u kojima su prvi i drugi polipeptid isti. U nekim realizacijama, Fc deo polipeptida može biti bilo koji Fc kao što je gore opisano.
[0873] [0335] U nekim realizacijama, molekul višedomenskog steka sadrži prvi Fc fuzioni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL i drugi fuzioni IgSF domen i drugi Fc polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL i drugi IgSF domen. U nekim realizacijama, molekul višedomenskog steka sadrži prvi Fc fuzioni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL i drugi IgSF domen, i treći IgSF domen i drugi Fc fuzioni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL, drugi IgSF domen i treći IgSF domen. U nekim realizacijama, Fc deo prvog i/ili drugog fuzionog polipeptida može biti bilo koji Fc kao što je gore opisano. U nekim realizacijama, Fc deo ili region prvog i drugog fuzionog polipeptida je isti.
[0875] U nekim realizacijama, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji je ICOSL-NKp30 višedomenski stek koji sadrži bilo koji od varijantnih ICOSL polipeptida i jedan ili više IgF domena NKp30, npr. NKp30 divljeg tipa ili nemodifikovani NKp30, kao što je IgV domen naveden u SEQ ID NO: 929 ili ECD ili njegov vezujući deo naveden u SEQ ID NO: 215 ili njegov vezujući deo. U nekim realizacijama, obezbeđen je imunomodulatorni protein koji sadrži bilo koju od varijanti ICOSL polipeptida i jedan ili više IgSF domena varijante NKp30 koji sadrže jednu ili više modifikacija amino-kiselina u sekvenci divljeg tipa ili nemodifikovanoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 215 ili 929. U nekim realizacijama, jedna ili više modifikacija amino-kiselina (npr. supstitucije) uključuju jednu ili više od L30V, A60V, S64P, S86G, kao što su 1, 2, 3 ili 4 takve modifikacije amino-kiselina. U nekim aspektima, varijanta NKp30 polipeptida višedomenskog steka je ili uključuje varijantni IgV domen, kao što je varijantni IgV domen naveden u bilo kom od SEQ ID NO: 504, 930, 931, 932 ili 933, ili IgV domen koji ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% u odnosu na bilo koji od SEQ ID NO: 504, 930, 931, 932 ili 933 i sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina odgovarajuće SEQ ID NO. U nekim aspektima, varijanta NKp30 polipeptida višedomenskog steka je ili uključuje varijantni ECD domen, kao što je varijanta ECD navedena u bilo kom od SEQ ID NO: 215, 216, 217, 218 ili 219, ili ECD domen koji ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% u odnosu na bilo koji od SEQ ID NO: 215, 216, 217, 218 ili 219 i sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina odgovarajućeg SEQ ID NO.
[0877] [0337] U bilo kojoj od takvih realizacija ICOSL-NKp30 višedomenskog steka, varijanta ICOSL polipeptida može da uključuje bilo koji opisan u Odeljku II koji sadrži varijantni IgSF domen (npr. IgV ili ECD), kao što je uključivanje bilo koje od modifikacija amino-kiselina navedenih u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takav imunomodulatorni protein sadrži varijantu ICOSL polipeptida koja sadrži ECD domen, kao što je ECD domen naveden u bilo kojoj od SEQ ID NO: 109‑142, 239, 280‑325, 364‑381, 387‑424, 427‑433, 435‑470, 638‑685, 905, 908, ili ECD domen koji ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% u odnosu na bilo koji od SEQ ID NO: 109‑142, 239, 280‑325, 364‑381, 387‑424, 427‑433, 435‑470, 638‑685, 905, 908 i sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina odgovarajuće SEQ ID NO. U posebnim slučajevima, takav imunomodulatorni protein sadrži varijantu ICOSL polipeptida koja sadrži IgV domen, kao što je IgV domen naveden u bilo kojoj od SEQ ID NO: 197-199, 201-208, 210, 212, 240, 326-340, 382-386, 425-426, 434, 546-599, 686-857, 906-907, 909-910, ili IgV domen koji ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% u odnosu na bilo koju od SEQ ID NO: 197‑199, 201‑208, 210, 212, 240, 326‑340, 382‑386, 425‑426, 434, 546‑599, 686‑857, 906‑907, 909‑910 i sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina odgovarajuće SEQ ID NO. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima IgSF domen (npr. IgV domen) koji ispoljava povećan afinitet vezivanja za CD28 ili ICOS, kao što je bilo koji ovde opisan. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima IgSF domen (npr. IgV domen) koji sadrži jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstituciju u referentnom ICOSL ili specifičnom vezujućem fragmentu, što odgovara poziciji(ama) 52, 57 ili 100 u odnosu na numeraciju SEQ ID NO:32. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ima jednu ili više modifikacija amino-kiselina, npr. supstitucija izabrana iz N52A, N52C, N52D, N52G, N52H, N52L, N52K, N52M, N52P, N52Q, N52R, N52S, N52T, N52V, N52Y, N57A, N57E, N57F, N57H, N57K, N57L, N57M, N57P, N57Q, N57S, N57T, N57V, N57W, N57Y, Q100A, Q100D, Q100E, Q100G, Q100K, Q100L, Q100M, Q100N, Q100R, Q100P, Q100S, Q100T ili Q100V. Primeri takvih varijantnih molekula uključuju bilo koji od onih opisanih ovde. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida sadrži modifikacije amino-kiselina N52D (npr. jeste ili uključuje IgV domen naveden u SEQ ID NO:548), N52H/Q100R (npr. jeste ili uključuje IgV domen naveden u SEQ ID NO:567), N52H/N57Y/Q100R (npr. jeste ili uključuje IgV domen naveden u SEQ ID NO:565) ili N52L/N57H/Q100R (npr. jeste ili uključuje IgV domen naveden u SEQ ID NO:761).
[0879] [0338] U nekim realizacijama, obezbeđeni višedomenski imunomodulatorni proteini, kao što je ICOSL-NKp30 višedomenski imunomodulatorni protein, fuzionisani su sa Fc polipeptidom. U određenim realizacijama, Fc polipeptid je varijanta Fc regiona humanog IgG1 koja ispoljava smanjene efektorske funkcije, kao što je bilo koja opisana. U nekim realizacijama, Fc region je humani IgG1 koji sadrži modifikacije amino-kiselina N297G, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K ili L234A/L235E/G237A, pri čemu je ostatak numerisan prema EU indeksu Kabata. U nekim realizacijama, varijanta Fc regiona IgG1 dalje sadrži supstituciju amino-kiselina C220S, gde su ostaci numerisani prema EU indeksu Kabata. U nekim realizacijama, Fc region sadrži K447del, pri čemu je ostatak numerisan prema EU indeksu Kabata. U nekim aspektima, Fc region sadrži sekvencu amino-kiselinskih sekvenci navedenih u bilo kojoj od SEQ ID NO: 474, 476, 477, 478, 633 ili 637 ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 474, 476, 477, 478, 633 ili 637 i sadrži supstitucije amino-kiselina odgovarajuće SEQ ID NO.
[0881] Primeri takvih konfiguracija su prikazani na Sl. 16A-16B i opisani ovde. U nekim realizacijama, bilo koji od obezbeđenih ICOSL-NKp30 višedomenskih stek imunomodulatornih polipeptida može da sadrži dve kopije polipeptida koji ima strukturu: varijanta ICOSL IgSF (npr. IgV, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 548, 565, 567 ili 761) - linker 1 - varijanta NKp30 IgSF (npr. IgV, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 504) - linker 2 - Fc. U nekim realizacijama, bilo koji od obezbeđenih ICOSL-NKp30 višedomenskih stek imunomodulatornih polipeptida može da sadrži dve kopije polipeptida koji ima strukturu: varijanta ICOSL IgSF (npr. IgV, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 548, 565, 567 ili 761) - linker 1 - varijanta NKp30 IgSF (npr. IgV, kao što je navedeno u SEQ ID NO:504) - linker 1 - varijanta NKp30 IgSF (npr. IgV, kao što je navedeno u SEQ ID NO:504) - linker 2 - Fc. U nekim realizacijama, linker 1 i linker 2 su peptidni linkeri, kao što je bilo koji opisan. U nekim realizacijama, linker 1 i linker 2 su isti. U nekim realizacijama, linker 1 i linker 2 su različiti. U nekim realizacijama, linker 1 je 3x GGGGS (SEQ ID NO: 228). U nekim realizacijama, linker 2 je GSGGGS (SEQ ID NO: 635).
[0883] Primeri ICOSL-NKp30 višedomenskih stek imaju sekvencu amino-kiselina navedenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924 ili 926, ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% u odnosu na bilo koju od SEQ ID NO: 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924 ili 926.
[0885] [0341] U nekim realizacijama, bilo koji od obezbeđenih ICOSL-NKp30 višedomenskih stek imunomodulatornih proteina vezuje se za ICOS i/ili CD28 i vezuje se za B7-H6. U nekim realizacijama, obezbeđeni ICOSL-NKp30 višedomenski stek imunomodulatorni proteini obezbeđuju vezujući molekul sposoban za lokalizaciju tumora pored imune ćelije koja eksprimuje ICOS i/ili CD28 (npr. T ćelija). U nekim realizacijama, takvi ICOSL-NKp30 višedomenski stek imunomodulatorni proteini mogu se koristiti za povećanje imunog odgovora angažovanjem ICOS i/ili CD28 kostimulativnih receptora na T ćelijama u mikrookruženju tumora. U nekim slučajevima, takvi ICOSL-NKp30 višedomenski stek imunomodulatorni proteini, ili njihove farmaceutske kompozicije, mogu se koristiti za lečenje tumora ili raka.
[0887] U nekim realizacijama, molekul višedomenskog steka je heterodimeren, koji sadrži dva različita Fc fuziona polipeptida, npr. prvi i drugi Fc polipeptid, pri čemu je najmanje jedan Fc fuzioni polipeptid koji sadrži najmanje jedan varijantni ICOSL polipeptid i/ili je najmanje jedan Fc polipeptid koji sadrži drugi IgSF domen (npr. drugi varijantni IgSF domen). U nekim realizacijama, prvi ili drugi Fc fuzioni polipeptid dalje sadrži treći IgSF domen (npr. treći varijantni IgSF domen). U nekim realizacijama, molekul višedomenskog steka sadrži prvi Fc fuzioni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL i drugi Fc fuzioni polipeptid koji sadrži drugi IgSF domen, gde, u nekim slučajevima, prvi ili drugi Fc fuzioni polipeptid dodatno sadrži treći IgSF domen. U nekim realizacijama, molekul višedomenskog steka sadrži prvi Fc fuzioni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL, drugi IgSF domen, a u nekim slučajevima, treći IgSF domen i drugi Fc fuzioni polipeptid koji nije vezan ni sa varijantom ICOSL polipeptida ni sa dodatnim IgSF domenom. U nekim realizacijama, Fc deo ili region prvog i drugog fuzionog polipeptida je isti. U nekim realizacijama, Fc deo ili region prvog i drugog fuzionog polipeptida je različit. U nekim realizacijama, molekul višedomenskog steka sadrži prvi fuzioni Fc polipeptid koji sadrži 1, 2, 3, 4 ili više varijanti ICOSL polipeptida i/ili 1, 2, 3, 4 ili više dodatnih IgSF domena, pri čemu je ukupan broj IgSF domena u prvom steku Fc fuzionog polipeptida veći od 2, 3, 4, 5, 6 ili više. U jednom primeru takve realizacije, drugi stek Fc fuzionog polipeptida sadrži 1, 2, 3, 4 ili više varijanti ICOSL polipeptida i/ili 1, 2, 3, 4 ili više drugih IgSF domena, pri čemu je ukupan broj IgSF domena u drugom steku Fc fuzionog polipeptida veći od 2, 3, 4, 5, 6 ili više. U drugom primeru takve realizacije, drugi Fc fuzionog polipeptida nije vezan ni sa varijantom ICOSL polipeptida ni sa dodatnim IgSF domenom.
[0889] [0343] U nekim realizacijama, heterodimerni molekul steka sadrži prvi imunomodulatorni Fc fuzioni polipeptid steka i drugi imunomodulatorni Fc fuzioni polipeptid steka u kome su prvi i drugi polipeptid različiti. U nekim realizacijama, heterodimerni molekul steka sadrži prvu fuziju Fc polipeptida koja sadrži Fc region i prvi varijantni ICOSL polipeptid i/ili drugi IgSF domen (npr. drugi varijantni IgSF domen) i drugu fuziju Fc polipeptida koja sadrži Fc region i drugi od prvog varijantnog ICOSL polipeptida ili drugog IgSF domena. U nekim realizacijama, heterodimerni molekul steka sadrži prvu fuziju Fc polipeptida koja sadrži Fc region i prvi varijantni ICOSL polipeptid i/ili drugi IgSF domen (npr. drugi varijantni IgSF domen) i drugu fuziju Fc polipeptida koja sadrži i prvi varijantni ICOSL polipeptid i drugi IgSF domen (npr. drugi varijantni IgSF domen), ali u drugačijoj orijentaciji ili konfiguraciji od prvog Fc regiona. U nekim realizacijama, prvi i/ili drugi Fc fuzioni polipeptid, takođe, sadrži treći IgSF domen (npr. treći varijantni IgSF domen).
[0891] U nekim realizacijama, Fc domen jednog ili oba od prvog i drugog stek imunomodulatornog Fc fuzionog polipeptida sadrži modifikaciju (npr. supstituciju) tako da je interfejs Fc molekula modifikovan da bi se olakšala i/ili promovisala heterodimerizacija. U nekim realizacijama, modifikacije uključuju uvođenje izbočine (knob) u prvi Fc polipeptid i šupljine (hole) u drugi Fc polipeptid tako da se izbočina može pozicionirati u šupljini da bi se pospešilo kompleksiranje prvog i drugog polipeptida koji sadrže Fc. Amino-kiseline koje su ciljane za zamenu i/ili modifikaciju da bi se stvorile izbočine ili šupljine u polipeptidu su obično aminokiseline u interfejsu koje interaguju ili kontaktiraju sa jednom ili više amino-kiselina u interfejsu drugog polipeptida.
[0893] U nekim realizacijama, sekvenca amino-kiselina se dodaje pre Fc sekvence za konstrukte u kojima je Fc sekvenca N-terminalni deo sekvence. U nekim slučajevima, sekvenca aminokiselina HMSSVSAQ (SEQ ID NO:475) se dodaje neposredno pre Fc sekvence za konstrukte u kojima je Fc sekvenca N-terminalni deo sekvence. U nekim realizacijama, heterodimerni molekul steka sadrži prvu fuziju Fc polipeptida koja sadrži Fc region (knob) i prvu varijantu ICOSL polipeptida i/ili drugi IgSF domen (npr. druga varijanta IgSF domena) i drugu fuziju Fc polipeptida koja sadrži Fc region (hole) i sekvencu za popunjavanje HMSSVSAQ (SEQ ID NO:475) dodatu neposredno pre oba Fc regiona prve i druge fuzije Fc polipeptida.
[0895] [0346] U nekim realizacijama, prvi polipeptid koji je modifikovan da sadrži amino-kiseline sa protuberancijom (šupljinom) uključuje zamenu nativne ili originalne amino-kiseline aminokiselinom koja ima najmanje jedan bočni lanac koji viri iz interfejsa prvog polipeptida i stoga se može pozicionirati u kompenzacionoj šupljini (hole) u susednom interfejsu drugog polipeptida. Najčešće, zamenska amino-kiselina je ona koja ima veću zapreminu bočnog lanca od originalnog ostatka amino-kiseline. Stručnjak u tehnici zna kako da odredi i/ili proceni svojstva ostataka amino-kiselina kako bi identifikovao one koje su idealne zamenske amino-kiseline za stvaranje protuberance. U nekim realizacijama, zamenski ostaci za formiranje protuberance su prirodni ostaci amino-kiselina i uključuju, na primer, arginin (R), fenilalanin (F), tirozin (Y) ili triptofan (W). U nekim primerima, originalni ostatak identifikovan za zamenu je ostatak amino-kiseline koji ima mali bočni lanac kao što je, na primer, alanin, asparagin, asparaginska kiselina, glicin, serin, treonin ili valin.
[0897] U nekim realizacijama, drugi polipeptid koji je modifikovan da sadrži šupljinu (hole) je onaj koji uključuje zamenu nativne ili originalne amino-kiseline amino-kiselinom koja ima najmanje jedan bočni lanac koji je uvučen iz interfejsa drugog polipeptida i stoga je u stanju da primi odgovarajuću izbočinu iz interfejsa prvog polipeptida. Najčešće, zamenska amino-kiselina je ona koja ima manju zapreminu bočnog lanca od originalnog ostatka amino-kiseline. Stručnjak u tehnici zna kako da odredi i/ili proceni svojstva ostataka amino-kiselina kako bi identifikovao one koji su idealni zamenski ostaci za formiranje šupljine. Generalno, zamenski ostaci za formiranje šupljine su prirodne amino-kiseline i uključuju, na primer, alanin (A), serin (S), treonin (T) i valin (V). U nekim primerima, originalna amino-kiselina identifikovana za zamenu je aminokiselina koja ima veliki bočni lanac kao što je, na primer, tirozin, arginin, fenilalanin ili triptofan.
[0899] Na primer, CH3 interfejs humanog IgG1 uključuje šesnaest ostataka na svakom domenu koji se nalaze na četiri antiparalelna β-lanca koja zakopavaju 1090 Å2 sa svake površine (videti npr. Deisenhofer et al. (1981) Biochemistry, 20:2361‑2370; Miller et al., (1990) J Mol. Biol., 216, 965‑973; Ridgway et al., (1996) Prot. Engin., 9: 617‑621; U.S. Pat. br.5,731,168). Modifikacije CH3 domena radi stvaranja izbočina ili šupljina opisane su, na primer, u U.S. Pat. br.5,731,168; međunarodnim prijavama patentna WO98/50431 i WO 2005/063816; i Ridgway et al., (1996) Prot. Engin., 9: 617‑621. U nekim primerima, modifikacije CH3 domena radi stvaranja izbočina ili šupljina su obično usmerene na ostatke koji se nalaze na dva centralna antiparalelna β-lanca. Cilj je da se minimizira rizik da se stvorene izbočine mogu smestiti prodiranjem u okolni rastvarač, umesto da budu smeštene kompenzacionom šupljinom u partnerskom CH3 domenu.
[0901] [0349] U nekim realizacijama, heterodimerni molekul sadrži T366W mutaciju u CH3 domenu „lanca izbočina (knob)“ i T366S, L368A, Y407V mutacije u CH3 domenu „lanca šupljina (hole)“. U nekim slučajevima, može se koristiti i dodatni međulančani disulfidni most između CH3 domena (Merchant, A. M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677‑681) npr. uvođenjem Y349C mutacije u CH3 domen „izbočine“ ili „šupljine“ lanca i E356C mutacije ili S354C mutacije u CH3 domen drugog lanca. U nekim realizacijama, heterodimerni molekul sadrži S354C, T366W mutacije u jednom od dva CH3 domena i Y349C, T366S, L368A, Y407V mutacije u drugom od dva CH3 domena. U nekim realizacijama, heterodimerni molekul sadrži E356C, T366W mutacije u jednom od dva CH3 domena i Y349C, T366S, L368A, Y407V mutacije u drugom od dva CH3 domena. U nekim realizacijama, heterodimerni molekul sadrži mutacije Y349C, T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije E356C, T366S, L368A, Y407V u drugom od dva CH3 domena. U nekim realizacijama, heterodimerni molekul sadrži mutacije Y349C, T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije S354C, T366S, L368A, Y407V u drugom od dva CH3 domena. Primeri drugih tehnologija „dužbi u rupama“ su poznati u tehnici, npr. kao što je opisano od strane EP 1870 459 A1.
[0903] U nekim realizacijama, Fc regioni heterodimernog molekula mogu dodatno sadržati jednu ili više drugih Fc mutacija, kao što je bilo koja opisana gore. U nekim realizacijama, heterodimerni molekul sadrži Fc region sa mutacijom koja smanjuje efektorsku funkciju.
[0905] U nekim realizacijama, Fc varijanta koja sadrži modifikacije CH3 izbočina (knob) ili šupljina (hole) može se spojiti sa stek imunomodulatornim polipeptidom bilo gde, ali obično preko svog N- ili C-terminusa, sa N- ili C-terminusom prvog i/ili drugog stek imunomodulatornog polipeptida, tako da se formira fuzioni polipeptid. Veza može biti direktna ili indirektna preko linkera. Obično, molekul izbočine i šupljine se generiše koekspresijom prvog stek imunomodulatornog polipeptida vezanog sa Fc varijantom koja sadrži modifikaciju(e) CH3 izbočina sa drugim stek imunomodulatornim polipeptidom vezanim sa Fc varijantom koja sadrži modifikaciju(e) CH3 šupljine.
[0907] Takođe su obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijantni ICOSL-Fc fuzioni protein. U nekim realizacijama, za proizvodnju Fc fuzionog proteina, molekul nukleinske kiseline koji kodira varijantni ICOSL-Fc fuzioni protein se ubacuje u odgovarajući ekspresioni vektor. Dobijeni varijantni ICOSL-Fc fuzioni protein može se eksprimovati u ćelijama domaćinima transformisanim ekspresijom gde se sklapanje između Fc domena odvija međulančanim disulfidnim vezama formiranim između Fc delova da bi se dobili dimerni, kao što su dvovalentni, varijantni ICOSL-Fc fuzioni proteini.
[0909] [0353] Dobijeni Fc fuzioni proteini mogu se lako prečistiti afinitetnom hromatografijom preko kolona sa proteinom A ili proteinom G. Za generisanje heterodimera mogu biti neophodni dodatni koraci za prečišćavanje. Na primer, tamo gde se dve nukleinske kiseline koje kodiraju različite varijante ICOSL polipeptida transformišu u ćelije, formiranje heterodimera mora se biohemijski postići, jer će varijantni ICOSL molekuli koji nose Fc-domen biti eksprimovani i kao disulfidno vezani homodimeri. Dakle, homodimeri se mogu redukovati pod uslovima koji favorizuju prekid međulančanih disulfida, ali ne utiču na intralančane disulfide. U nekim slučajevima, različiti varijantni-ICOSL Fc monomeri se mešaju u ekvimolarnim količinama i oksiduju da bi se formirala smeša homo- i heterodimera. Komponente ove smeše se razdvajaju hromatografskim tehnikama. Alternativno, formiranje ove vrste heterodimera može biti pristrasno genetskim inženjeringom i ekspresijom Fc fuzionih molekula koji sadrže varijantni ICOSL polipeptid korišćenjem metoda „knob in hole“ opisanih u daljem tekstu.
[0911] B. KONJUGATI I FUZIJE VARIJANTNIH POLIPEPTIDA I IMUNOMODULATORNIH PROTEINA
[0913] U nekim realizacijama, varijantni polipeptidi dati ovde, koji su imunomodulatorni proteini koji sadrže varijante Ig domena IgSF porodice (vIgD), mogu biti konjugovani sa, kao što je direktno ili indirektno spojeni, sa delom, kao što je efektorski deo, kao što je drugi protein, direktno ili indirektno, da bi se formirao konjugat („IgSF konjugat“). U nekim realizacijama, varijantni ICOSL imunomodulatorni protein je dat kao konjugat u kome je sadržan vIgD ICOSL vezan, direktno ili indirektno, sa ciljajućim sredstvom ili delom, npr. sa antitelom ili drugim molekulima za vezivanje koji se specifično vezuju za ligand, npr. antigen, na primer, za ciljanje ili lokalizaciju vIgD u specifično okruženje ili ćeliju, kao kada se daje subjektu. U nekim realizacijama, sredstvo za ciljanje, npr. Antitelo ili drugi vezujući molekul vezuje se za tumorski antigen, čime lokalizuje varijantu ICOSL koja sadrži vIgD u tumorskom mikrookruženju, na primer, da bi modulirala aktivnost tumorski infiltrirajućih limfocita (TIL) specifičnih za tumorsko mikrookruženje. U nekim realizacijama, vezivanje može biti kovalentno ili nekovalentno, npr. putem nekovalentne interakcije biotin-streptavidin. U nekim realizacijama, konjugat je fuzioni protein varijante ICOSL polipeptida vezanog, direktno ili preko linkera, sa drugim proteinom ili polipeptidnim delom.
[0915] U nekim realizacijama, fuzioni protein je varijantna fuzija ICOSL-Fc, u kojoj bilo koja dva ili više gore navedenih varijantnih polipeptida mogu biti vezana za Fc.
[0917] [0356] U nekim realizacijama, IgSF konjugat, kao što je fuzioni protein, sadrži ECD divljeg tipa (pune dužine ili skraćen) ili varijante ICOSL polipeptida. U nekim realizacijama, IgSF konjugat, kao što je fuzioni protein, sadrži IgV domen ili IgC (npr. IgC2) domen ili domene, ili specifični vezujući fragment IgV domena ili specifični vezujući fragment IgC (npr. IgC2) domena ili domena. U nekim realizacijama, IgSF konjugat, kao što je fuzioni protein, sadrži IgV domen ICOSL kao što je navedeno u SEQ ID NO: 196 ili 545.
[0919] U nekim realizacijama, deo može biti ciljajući deo, lek male molekulske veličine (nepolipeptidni lek molarne mase manje od 500 daltona), toksin, citostatički agens, citotoksični agens, imunosupresivni agens, radioaktivni agens pogodan za dijagnostičke svrhe, radioaktivni metalni jon za terapeutske svrhe, enzim koji aktivira prolek, agens koji povećava biološki poluživot ili dijagnostički ili detektabilni agens.
[0921] U nekim realizacijama, efektorski deo je terapeutsko sredstvo, kao što je terapeutsko sredstvo za rak, koje je ili citotoksično, citostatsko ili na drugi način obezbeđuje neku terapeutsku korist. U nekim realizacijama, efektorski deo je ciljajući deo ili sredstvo, kao što je sredstvo koje cilja antigen na površini ćelije, npr. antigen na površini tumorske ćelije. U nekim realizacijama, efektorski deo je oznaka, koja može generisati detektabilan signal, direktno ili indirektno. U nekim realizacijama, efektorski deo je toksin. U nekim realizacijama, efektorski deo je protein, peptid, nukleinska kiselina, mali molekul ili nanočestica.
[0923] U nekim realizacijama, 1, 2, 3, 4, 5 ili više efektorskih jedinica, koje mogu biti iste ili različite, su konjugovane, vezane ili fuzovane sa varijantom polipeptida ili proteina da bi se formirao IgSF konjugat. U nekim realizacijama, takve efektorske jedinice mogu biti vezane za varijantu polipeptida ili imunomodulatornog proteina korišćenjem različitih molekularnobioloških ili hemijskih metoda konjugacije i povezivanja poznatih u tehnici i opisanih u daljem tekstu. U nekim realizacijama, linkeri kao što su peptidni linkeri, cepivi linkeri, necepivi linkeri ili linkeri koji pomažu u reakciji konjugacije, mogu se koristiti za povezivanje ili konjugovanje efektorskih jedinica sa varijantom polipeptida ili imunomodulatornog proteina.
[0925] U nekim realizacijama, IgSF konjugat sadrži sledeće komponente:
[0926] (protein ili polipeptid), (L)<q>i (efektorski deo)<m>, pri čemu je protein ili polipeptid bilo koji od opisanih varijantnih polipeptida ili imunomodulatornih proteina sposobnih da se vežu za jedan ili više srodnih liganda kontrastrukture kao što je opisano; L je linker za povezivanje proteina ili polipeptida sa delom; m je najmanje 1; q je 0 ili više; i dobijeni IgSF konjugat se vezuje za jedan ili više liganda kontrastrukture. U određenim realizacijama, m je od 1 do 4, a q je od 0 do 8. U nekim realizacijama, linker je peptid. U nekim realizacijama, efektorski deo je protein ili polipeptid.
[0928] U nekim realizacijama, obezbeđen je IgSF konjugat koji sadrži varijantni polipeptid ili imunomodulatorni protein dat ovde, konjugovan sa sredstvom za ciljanje koje se vezuje za molekul na površini ćelije, na primer, za ciljanu isporuku varijantnog polipeptida ili imunomodulatornog proteina u određenu ćeliju. U nekim realizacijama, sredstvo za ciljanje je molekul(i) koji ima sposobnost da se lokalizuje i veže za molekul prisutan na normalnoj ćeliji/tkivu i/ili tumorskoj ćeliji/tumoru kod subjekta. Drugim rečima, IgSF konjugati koji sadrže sredstvo za ciljanje mogu se vezati za ligand (direktno ili indirektno), koji je prisutan na ćeliji, kao što je tumorska ćelija. Sredstva za ciljanje pronalaska koja se predviđaju za upotrebu uključuju antitela, polipeptide, peptide, aptamere, druge ligande ili bilo koju njihovu kombinaciju, koja se može vezati za komponentu ciljne ćelije ili molekula.
[0930] U nekim realizacijama, sredstvo za ciljanje vezuje se za ćeliju(e) tumora ili se može vezati u blizini ćelije(a) tumora (npr. vaskulatura tumora ili mikrookruženje tumora) nakon primene na subjekta. Sredstvo za ciljanje može se vezati za receptor ili ligand na površini ćelije raka. U drugom aspektu pronalaska, bira se sredstvo za ciljanje koje je specifično za nekancerozne ćelije ili tkivo. Na primer, sredstvo za ciljanje može biti specifično za molekul koji je normalno prisutan na određenoj ćeliji ili tkivu. Štaviše, u nekim realizacijama, isti molekul može biti prisutan na normalnim i ćelijama raka. Poznate su različite ćelijske komponente i molekuli. Na primer, ako je sredstvo za ciljanje specifično za EGFR, rezultujući IgSF konjugat može ciljati ćelije raka koje eksprimuju EGFR, kao i normalne ćelije epidermisa kože koje eksprimuju EGFR. Stoga, u nekim realizacijama, IgSF konjugat pronalaska može delovati pomoću dva odvojena mehanizma (ciljanje ćelija raka i nekanceroznih ćelija).
[0932] [0363] U različitim aspektima pronalaska koji su ovde stavljeni na uvid, IgSF konjugat pronalaska sadrži sredstvo za ciljanje koje može da se veže/cilja ćelijsku komponentu, kao što je tumorski antigen, bakterijski antigen, virusni antigen, antigen mikoplazme, gljivični antigen, prionski antigen, antigen parazita. U nekim aspektima, ćelijska komponenta, antigen ili molekul mogu se koristiti da označe željenu metu za sredstvo za ciljanje. Na primer, u različitim realizacijama, sredstvo za ciljanje je specifično za ili se vezuje za komponentu, što uključuje, ali nije ograničeno na, receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR, ErbB-1, HER1), ErbB-2 (HER2/neu), ErbB3/HER3, ErbB-4/HER4, porodicu EGFR liganda; porodicu receptora insulinu sličnog faktora rasta (IGFR), IGF-vezujuće proteine (IGFBP), porodicu IGFR liganda; porodicu receptora faktora rasta izvedenog iz trombocita (PDGFR), porodicu PDGFR liganda; porodicu receptora faktora rasta fibroblasta (FGFR), porodicu FGFR liganda, porodicu receptora vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGFR), VEGF porodicu; Porodica HGF receptora; porodica TRK receptora; porodica efrinskog (EPH) receptora; porodica AXL receptora; porodica receptora leukocitne tirozin kinaze (LTK); porodica TIE receptora, angiopoetin 1,2; porodica receptora tirozin kinazi sličnih siromašnih receptora (ROR), npr. ROR1; CD171 (L1CAM); B7-H6 (NCR3LG1); PD-L1, antigen glikozilacije tumora, npr. sTn ili Tn, kao što je sTn Ag od MUC1; LHR (LHCGR); porodica receptora fosfatidilserina, porodica receptora diskoidinskog domena (DDR); porodica RET receptora; porodica KLG receptora; porodica RYK receptora; porodica MuSK receptora; receptori transformujućeg faktora rasta-α (TGF-α), TGF-β; receptori citokina, receptori klase I (porodica hematopoetina) i klase II (porodica interferona/IL-10), superporodica receptora faktora nekroze tumora (TNF) (TNFRSF), porodica receptora smrti; antigeni raka testisa (CT), antigeni specifični za lozu, antigeni diferencijacije, alfa-aktinin-4, ARTCl, fuzioni proizvodi regiona klastera preloma-Abelson (Bcr-abl), B-RAF, kaspaza-5 (CASP-5), kaspaza-8 (CASP-8), β-katenin (CTNNBl), ciklus deobe ćelija 27 (CDC27), ciklin-zavisna kinaza 4 (CDK4), CDKN2A, COA-I, fuzioni protein dek-can, EFTUD-2, faktor elongacije 2 (ELF2), fuzioni protein Ets varijante gena 6/gena akutne mijeloidne leukemije 1 ETS (ETC6-AML1), fibronektin (FN), npr. ekstradomen A (EDA) fibronektina, GPNMB, fuzioni protein lipida niske gustine/GDP-L fukoza: β-D-galaktoza 2-α-L-fukoziltransferaze (LDLR/FUT), HLA-A2. zamena arginina za izoleucin na ostatku 170 αheliksa α2-domena u HLA-A2 genu (HLA-A*201-R170I), HLA-Al 1, protein toplotnog šoka 70-2 mutiran (HSP70-2M), K1AA0205, MART2, melanom sveprisutan mutiran 1, 2, 3 (MUM-I, 2, 3), prostatična kisela fosfataza (PAP), neo-PAP, miozin klase I, NFYC, OGT, OS-9, pml-RARα fuzioni protein, PRDX5, PTPRK, K-ras (KRAS2), N-ras (NRAS), HRAS, RBAF600, SIRT2, SNRPDl, SYT-SSXl ili -SSX2 fuzioni protein, triozefosfat izomeraza, BAGE, BAGK-1, BAGE-2,3,4,5, GAGE-1,2,3,4,5,6,7,8, GnT-V (aberantna N-acetil glukozaminil transferaza V, MGAT5), HERV-K-MEL, KK-LC, KM-HN-I, LAGE, LAGE-I, CTL-prepoznati antigen na melanomu (CAMEL), MAGE-Al (MAGE-I), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGEAlO, MAGE-AI l, MAGE-A12, MAGE‑3, MAGE-Bl, MAGE-B2, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE- Cl, MAGE-C2, mucin 1 (MUCl), MART‑1/Melan-A (MLANA), gp100, gpl00/Pmell7 (SILV), tirozinaza (TYR), TRP-I, HAGE, NA-88, NY-ESO-I, NY-ESO-l/LAGE-2, SAGE, Spl7, SSX-1,2,3,4, TRP2-INT2, karcino-embrionalni antigen (CEA), kalikrein 4, mamaglobin-A, OAl, prostatno specifični antigen (PSA), TRP-1/gp75, TRP-2, adipofilin, interferon inducibilni protein odsutan kod melanoma 2 (AIM-2), BING-4, CPSF, ciklin D1, molekul adhezije epitelnih ćelija (Ep-CAM), EphA3, faktor rasta fibroblasta-5 (FGF-5), glikoprotein 250 (gp250), EGFR (ERBBl), HER-2/neu (ERBB2), lanac α2 receptora interleukina 13 (IL13Rα2), receptor IL-6, crevna karboksil esteraza (iCE), alfa-feto protein (AFP), M-CSF, mdm-2, MUCl, p53 (TP53), PBF, PRAME, PSMA, RAGE-I, RNF43, RU2AS, SOXIO, STEAPI, survivin (BIRC5), reverzna transkriptaza humane telomeraze (hTERT), telomeraza, gen Vilmsovog tumora (WTl), SYCPl, BRDT, SPANX, XAGE, ADAM2, PAGE‑5, LIPl, CTAGEI, CSAGE, MMAl, CAGE, BORIS, HOM-TES‑85, AF15ql4, HCA661, LDHC, MORC, SGY-I, SPOl 1, TPXl, NY-SAR‑35, FTHL17, NXF2, TDRDl, TEX15, FATE, TPTE, imunoglobulinski idiotipovi, Bens-Džounsov protein, estrogenski receptori (ER), androgeni receptori (AR), CD40, CD30, CD20, CD19, CD33, antigen raka 72-4 (CA 72-4), antigen raka 15-3 (CA 15-3), antigen raka 27-29 (CA 27-29), antigen raka 125 (CA 125), antigen raka 19-9 (CA 19-9), β-humani horionski gonadotropin, β-2 mikroglobulin, antigen skvamoznog ćelijskog karcinoma, neuronspecifična enolaza, protein toplotnog šoka gp96, GM2, sargramostim, CTLA-4, 707 alanin prolin (707-AP), antigen adenokarcinoma koji prepoznaju T ćelije 4 (ART-4), karcinoembriogeni antigen peptid-1 (CAP-I), kalcijum-aktivirani hloridni kanal-2 (CLCA2), ciklofilin B (Cyp-B), humani signet-ring tumor 2 (HST-2), proteini humanog papiloma virusa (HPV) (HPV-E6, HPV-E7, glavni ili sporedni kapsidni antigeni, drugi), proteini Epštajn-Barovog virusa (EBV) (proteini latentne membrane EBV - LMPl, LMP2; drugi), proteini virusa hepatitisa B ili C i HIV proteini.
[0934] [0364] U nekim realizacijama, sredstvo za ciljanje je specifično za ili se vezuje za komponentu, koja uključuje, ali nije ograničena na, HER1/EGFR, HER2/ERBB2, CD20, CD25 (IL-2Rα receptor), CD33, CD52, CD133, CD206, CEA, CEACAM1, CEACAM3, CEACAM5, CEACAM6, antigen raka 125 (CA125), alfa-fetoprotein (AFP), Lewis Y, TAG72, Caprin-1, mezotelin, PDGF receptor (PDGFR; kao što je PDGF-Rα), PD-1, PD-L1, CTLA-4, IL-2 receptor, faktor rasta vaskularnog endotela (VEGF), CD30, EpCAM, EphA2, Glypican-3, gpA33, mucine, CAIX, PSMA, protein koji vezuje folat, gangliozide (kao što su GD2, GD3, GM1 i GM2), VEGF receptor (VEGFR),VEGFR2, VEGF-A, integrin αVβ3, integrin α5β1, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, tenascin, AFP, BCR kompleks, CD3, CD18, CD44, CTLA-4, gp72, HLA-DR 10 β, HLA-DR antigen, IgE, MUC-1, nuC242, PEM antigen, metaloproteinaze, efrinski receptor, efrinski ligandi, HGF receptor, CXCR4, CXCR4, bombezin receptor, SK-1 antigen, Bcr-abl, RET, MET, TRKB, TIE2, ALK, ROS, EML4-ALK, ROS1, BRAFV600E, SRC, c-KIT, mTOR, TSC1, TSC2, BTK, KIT, BRCA, CDK 4/6, JAK1, JAK2, BRAF, FLT-3, MEK1, MEK2, SMO ili B7-H6 (NCR3LG1).
[0936] U nekim realizacijama, IgSF konjugat, preko svog ciljnog sredstva, vezaće se za ćelijsku komponentu tumorske ćelije, vaskulaturu tumora ili mikrookruženje tumora, čime će podstaći ubijanje ciljanih ćelija putem modulacije imunog odgovora (npr. aktivacijom kostimulativnih molekula ili inhibicijom negativnih regulatornih molekula aktivacije imunskih ćelija), inhibicijom signala preživljavanja (npr. faktora rasta ili citokina ili antagonista hormonskih receptora), aktivacijom signala smrti i/ili imunološki posredovane citotoksičnosti, kao što je ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela. Takvi IgSF konjugati mogu funkcionisati putem nekoliko mehanizama za sprečavanje, smanjenje ili eliminisanje tumorskih ćelija, kao što je olakšavanje isporuke konjugovanih efektorskih jedinica ciljnom tumoru, kao što je endocitoza IgSF konjugata posredovana receptorom; ili takvi konjugati mogu regrutovati, vezati se i/ili aktivirati imune ćelije (npr. NK ćelije, monocite/makrofage, dendritske ćelije, T ćelije, B ćelije). Štaviše, u nekim slučajevima jedan ili više gore navedenih puteva mogu delovati nakon primene jednog ili više IgSF konjugata pronalaska.
[0938] U nekim realizacijama, konjugovani IgSF, preko svog ciljnog sredstva, biće lokalizovan, na primer, vezan za, ćelijsku komponentu tumorske ćelije, vaskulaturu tumora ili mikrookruženje tumora, čime modulira ćelije imunog odgovora u blizini tumora. U nekim realizacijama, ciljno sredstvo olakšava isporuku konjugovanog IgSF (npr. vIgD) do ciljnog tumora, na primer, da bi interagovao sa svojim srodnim partnerom za vezivanje kako bi promenio signalizaciju imunih ćelija (npr. NK ćelije, monociti/makrofagi, dendritske ćelije, T ćelije, B ćelije) koje nose srodnog partnera za vezivanje. U nekim realizacijama, lokalizovana isporuka agonizuje ili stimuliše kostimulativni receptor.
[0940] [0367] U nekim realizacijama, ciljno sredstvo je imunoglobulin. Kako se ovde koristi, izraz „imunoglobulin“ obuhvata prirodna ili veštačka mono- ili polivalentna antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na, poliklonalna, monoklonalna, multispecifična, ljudska, humanizovana ili himerna antitela, jednolančana antitela, Fab fragmente, F(ab’) fragmente, fragmente proizvedene Fab ekspresionom bibliotekom, jednolančani Fv (scFv); anti-idiotipska (anti-Id) antitela (uključujući, npr. anti-Id antitela na antitela pronalaska) i fragmente koji vezuju epitope bilo kog od gore navedenih. Izraz „antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina, npr. molekule koji sadrže mesto vezivanja antigena koje imunospecifično vezuje antigen. Molekuli imunoglobulina prema pedmetnom pronalasku mogu biti bilo kog tipa (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili podklase molekula imunoglobulina.
[0942] U nekim realizacijama, IgSF konjugat, preko svog antitela usmerenog na ćelijsku komponentu tumorske ćelije, vaskulature tumora ili tumorskog mikrookruženja, čime podstiče apoptozu ciljanih ćelija putem modulacije imunog odgovora (npr. aktivacijom kostimulativnih molekula ili inhibicijom negativnih regulatornih molekula aktivacije imunskih ćelija), inhibicijom signala preživljavanja (npr. antagonista faktora rasta ili citokina ili hormonskih receptora), aktivacijom signala smrti i/ili imunološki posredovane citotoksičnosti, kao što je ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela. Takvi IgSF konjugati mogu funkcionisati putem nekoliko mehanizama za sprečavanje, smanjenje ili eliminisanje tumorskih ćelija, kao što je olakšavanje isporuke konjugovanih efektorskih jedinica ciljnom tumoru, kao što je endocitoza IgSF konjugata posredovana receptorom; ili takvi konjugati mogu regrutovati, vezati se i/ili aktivirati imune ćelije (npr. NK ćelije, monocite/makrofage, dendritske ćelije, T ćelije, B ćelije).
[0944] U nekim realizacijama, IgSF konjugat, preko svog dela usmerenog na antitela, vezaće se za ćelijsku komponentu tumorske ćelije, vaskulaturu tumora ili mikrookruženje tumora, čime modulira imuni odgovor (npr. aktivacijom kostimulativnih molekula ili inhibicijom negativnih regulatornih molekula aktivacije imunskih ćelija). U nekim realizacijama, takvi konjugati mogu prepoznati, vezati se i/ili modulirati (npr. inhibirati ili aktivirati) imune ćelije (npr. NK ćelije, monocite/makrofage, dendritske ćelije, T ćelije, B ćelije).
[0946] [0370] Delovi antitela usmereni na antitela prema pedmetnom pronalasku uključuju fragmente antitela koji uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab’ i F(ab’)2, Fd, jednolančane Fv (scFv), jednolančana antitela, disulfidno vezane Fv (sdFv) i fragmente koji sadrže ili VL ili VH domen. Fragmenti antitela koji vezuju antigen, uključujući jednolančana antitela, mogu da sadrže varijabilni region(e) sam(i) ili u kombinaciji sa celinom ili delom sledećeg: zglobni region, CH1, CH2 i CH3 domeni. Takođe su u pronalazak uključeni fragmenti koji vezuju antigen i koji takođe sadrže bilo koju kombinaciju varijabilnog regiona(a) sa zglobnim regionom, CH1, CH2 i CH3 domenima. Takođe su u pronalazak uključeni Fc fragmenti, fuzioni proteini antigen-Fc i konjugati ili fuzioni proizvodi delova usmerenih na Fc (Fc-peptid, Fc-aptamer). Ciljajući delovi usmereni na antitela prema pedmetnom pronalasku mogu biti bilo kog životinjskog porekla, uključujući ptice i sisare. U jednom aspektu, ciljajući delovi usmereni na antitela su poreklom od čoveka, miša (npr. miš i pacov), magarca, ovce, zeca, koze, zamorca, kamile, konja ili kokoši. Dalje, takva antitela mogu biti humanizovane verzije životinjskih antitela. Ciljajući delovi usmereni na antitela predmetnog pronalaska mogu biti monospecifična, bispecifična, trispecifična ili veće multispecifičnosti.
[0948] U različitim realizacijama, antitelo/ciljajući deo regrutuje, vezuje se i/ili aktivira imune ćelije (npr. NK ćelije, monocite/makrofage, dendritske ćelije) putem interakcija između Fc (u antitelima) i Fc receptora (na imunim ćelijama) i putem konjugovanih varijantnih polipeptida ili imunomodulatornih proteina koji su ovde dati. U nekim realizacijama, antitelo/ ciljajući deo prepoznaje ili se vezuje za tumorski agens i lokalizuje tumorske ćelije putem konjugovane varijantne polipeptida ili imunomodulatorne proteina koji su ovde dati kako bi se olakšala modulacija imunih ćelija u blizini tumora.
[0950] [0372] Primeri antitela koja se mogu ugraditi u IgSF konjugate uključuju, ali nisu ograničena na antitela kao što je Cetuksimab (IMC-C225; Erbitux®), Trastuzumab (Herceptin®), Rituksimab (Rituxan®; MabThera®), Bevacizumab (Avastin®), Alemtuzumab (Campath®; Campath‑1H®; Mabcampath®), Pertuzumab (Perjeta®), Panitumumab (ABXEGF; Vectibix®), Ranibizumab (Lucentis®), Ibritumomab, Ibritumomab tiuksetan, (Zevalin®), Tositumomab, Iodine I 131 Tositumomab (BEXXAR®), Katumaksomab (Removab®), Dinutuksimab (Unituxin™), Gemtuzumab, Gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®), Abatacept (CTLA4-Ig; Orencia®), Belatacept (L104EA29YIg; LEA29Y; LEA), Ipilimumab (MDX‑010; MDX‑101), Tremelimumab (ticilimumab; CP‑675,206), PRS‑010, PRS‑050, Aflibercept (VEGF Trap AVE005), Volociximab (M200), F200, MORAb‑009, SS1P (CAT‑5001), Cixutumumab (IMC-A12), Matuzumab (EMD72000), Nimotuzumab (h-R3), Zalutumumab (HuMax-EGFR), Necitumumab IMC‑11F8, mAb806/ch806, Sym004, mAb‑425, Panorex @ (17‑1A) (mišje monoklonsko antitelo); Panoreks @ (17-1A) (himerno mišje monoklonsko antitelo); IDEC-Y2B8 (mišji, anti-CD2O MAb); BEC2 (anti-idiotipski MAb, imitira GD epitop) (sa BCG); Olaratumab (Lartruvo<™>); Onkolim (monoklonsko antitelo Lym-1); SMART MI95 Ab, humanizovano 13’ I LYM-I (Onkolim), Ovareks (B43.13, anti-idiotipsko mišje MAb); Ramucirumab (Cyramza<®>); MDX-210 (humanizovano anti-HER-2 bispecifično antitelo); 3622W94 MAb koje se vezuje za EGP40 (17-1A) pankarcinomski antigen na adenokarcinomima; Anti-VEGF, Zenapaks (SMART Anti-Tac (IL-2 receptor); SMART MI95 Ab, humanizovano Ab, humanizovano); MDX-210 (humanizovano anti-HER-2 bispecifično antitelo); MDX-447 (humanizovano anti-EGF receptor bispecifično antitelo); NovoMAb-G2 (pankarcinom specifično Ab); TNT (himerno MAb za histonske antigene); TNT (himerno MAb za histonske antigene); Gliomab-H (Monoclon s -Humanizovana Abs); GNI-250 Mab; EMD-72000 (himerni-EGF antagonist); LymphoCide (humanizovano LL2 antitelo); i MDX-260 bispecifični, cilja GD-2, ANA antitela, SMART ID10 antitela, SMART ABL 364 antitela ili ImmuRAIT-CEA. Kao što je ilustrovano prethodnom listom, uobičajeno je da se prave antitela na određeni ciljni epitop.
[0952] U nekim realizacijama, antitelo ili fragment koji vezuje antigen datih konjugata, uključujući fuzione molekule, je cetuksimab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, trastuzumab, Ado-trastuzumab emtanzin, Tozitumomab (Bexxar<®>), Rituksimab (Rituxan, Mabthera), Ibritumomab tiuksetan (Zevalin), Daclizumab (Zenapax), Gemtuzumab (Mylotarg), Alemtuzumab, CEA-scan Fab fragment, OC125 monoklonsko antitelo, ab75705, B72.3, Bevacizumab (Avastin®), Afatinib, Aksitinib, Bosutinib, Kabozantinib, Ceritinib, Krizotinib, Dabrafenib, Dasatinib, Dinutuksimab (Unituksin<™>), Erlotinib, Everolimus, Ibrutinib, Imatinib, Lapatinib, Lenvatinib, Nilotinib, Olaparib, Olaratumab (Lartruvo<™>), Palbociklib, Pazopanib, Pertuzumab (Perjeta<®>), Ramucirumab (Cyramza<®>), Regorafenib, Ruksolitinib, Sorafenib, Sunitinib, Temsirolimus, Trametinib, Vandetanib, Vemurafenib, Vismodegib, Basiliximab, Ipilimumab, Nivolumab, pembrolizumab, MPDL3280A, Pidilizumab (CT‑011), AMP‑224, MSB001078C, ili MEDI4736, BMS‑935559, LY3300054, atezolizumab, avelumab ili durvalumab ili je njihov fragment koji se vezuje za antigen.
[0954] [0374] U nekim realizacijama, PD-L1 antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu biti ugrađeni u IgSF konjugate. Primeri PD-L1 antitela koja mogu biti ugrađena u IgSF konjugate uključuju, ali nisu ograničena na antitela kao što su BMS‑936559, 12A4, LY3300054, Atezolizumab (Tecentriq®), Avelumab (Bavencio®), Durvalumab (Imfinzi®). Videti, npr. WO2007/005874, WO2017/034916, WO2010/077634, WO2013/079174, WO2011/066389. U nekim realizacijama, vIgD je vezan, direktno ili indirektno, sa N- ili C-terminusom lakog i/ili teškog lanca anti-PD-L1 antitela. U nekim realizacijama, anti-PD-L1 antitelo je BMS-936559, LY3300054, atezolizumab, avelumab ili durvalumab. Primeri lakog i teškog lanca anti-PD-L1 antitela atezolizumab navedeni su u SEQ ID NO: 866 i 867, redom. Primeri IgSF konjugata koji uključuju anti-PD-L1 antitelo Atezolizumab navedeni su u SEQ ID NO: 868-895.
[0956] U nekim realizacijama, deo koji cilja antitelo je antitelo pune dužine, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrži Fc domen. U nekim realizacijama, varijantni polipeptid ili imunomodulatorni protein je konjugovan sa Fc delom dela koji cilja antitelo, kao što je konjugacija sa N-terminusom Fc dela antitela.
[0958] U nekim realizacijama, vIgD je vezan, direktno ili indirektno, sa N- ili C-terminusom lakog i/ili teškog lanca antitela. U nekim realizacijama, povezivanje može biti preko peptidnog linkera, kao što je bilo koji gore opisan. U nekim realizacijama, linker može dalje da sadrži amino-kiseline uvedene kloniranjem i/ili sa mesta restrikcije. U nekim realizacijama, linker može da sadrži dodatne amino-kiseline na bilo kom kraju uvedene putem mesta restrikcije. Na primer, linker može da sadrži dodatne amino-kiseline kao što je SA (u jednoslovnom kodu amino-kiseline) uvedene korišćenjem mesta restrikcije AFEI. Mogu se konstruisati različite konfiguracije. Sl. 10A-10C prikazuju primerne konfiguracije. U nekim realizacijama, konjugat antitela može se proizvesti koekspresijom teškog i lakog lanca antitela u ćeliji.
[0960] U jednom aspektu pronalaska, sredstvo za ciljanje je molekul aptamera. Na primer, u nekim realizacijama, aptamer se sastoji od nukleinskih kiselina koje funkcionišu kao sredstvo za ciljanje. U različitim realizacijama, IgSF konjugat pronalaska sadrži aptamer koji je specifičan za molekul na tumorskoj ćeliji, vaskulaturi tumora i/ili mikrookruženju tumora. U nekim realizacijama, sam aptamer može da sadrži biološki aktivnu sekvencu, pored modula (sekvence) za ciljanje, pri čemu biološki aktivna sekvenca može da indukuje imuni odgovor na ciljnu ćeliju. Drugim rečima, takav molekul aptamera je sredstvo dvostruke upotrebe. U nekim realizacijama, IgSF konjugat pronalaska sadrži konjugaciju aptamera sa antitelom, pri čemu su aptamer i antitelo specifični za vezivanje za odvojene molekule na tumorskoj ćeliji, vaskulaturi tumora, mikrookruženju tumora i/ili imunim ćelijama.
[0962] [0378] Izraz „aptamer“ obuhvata DNK, RNK ili peptide koji su odabrani na osnovu specifičnih svojstava vezivanja za određeni molekul. Na primer, aptamer(i) mogu biti odabrani za vezivanje određenog gena ili genskog proizvoda u tumorskoj ćeliji, vaskulaturi tumora, mikrookruženju tumora i/ili imunoj ćeliji, kao što je ovde opisano, gde se selekcija vrši metodama poznatim u tehnici i poznatim stručnjaku u tehnici.
[0964] U nekim aspektima pronalaska, sredstvo za ciljanje je peptid. Na primer, varijantni polipeptidi ili imunomodulatorni proteini koji su ovde dati mogu biti konjugovani sa peptidom koji se može vezati za komponentu ćelija raka ili tumora. Stoga, takvi IgSF konjugati pronalaska sadrže sredstva za ciljanje peptida koja se vezuju za ćelijsku komponentu ćelije tumora, vaskulaturu tumora i/ili komponentu mikrookruženja tumora. U nekim realizacijama, peptidi sredstva za ciljanje mogu biti antagonist ili agonist integrina. Integrini, koji sadrže alfa i beta podjedinicu, uključuju brojne tipove dobro poznate stručnjaku.
[0966] U jednoj realizaciji, sredstvo za ciljanje je Vvβ3. Integrin Vvβ3 se eksprimuje na različitim ćelijama i pokazano je da posreduje u nekoliko biološki relevantnih procesa, uključujući adheziju osteoklasta na koštani matriks, migraciju ćelija vaskularnih glatkih mišića i angiogenezu. Pogodni ciljajući molekuli za integrine uključuju RGD peptide ili peptidomimetike, kao i ne-RGD peptide ili peptidomimetike (videti, npr. U.S. Pat. br.5,767,071 i 5,780,426) za druge integrine kao što su V4.βi (VLA-4), V4-P7 (videti, npr. U.S. Pat. br.6,365,619; Chang et al, Bioorganic & Medicinal Chem Lett, 12:159‑163 (2002); Lin et al., Bioorganic & Medicinal Chem Lett, 12:133‑136 (2002)), i slično.
[0968] U nekim realizacijama, obezbeđen je IgSF konjugat koji sadrži varijantni polipeptid ili imunomodulatorni protein koji je ovde dat, konjugovan sa terapeutskim sredstvom. U nekim realizacijama, terapeutsko sredstvo uključuje, na primer, daunomicin, doksorubicin, metotreksat i vindezin (Rowland et al., Cancer Immunol. Immunother. 21:183‑187, 1986). U nekim realizacijama, terapeutsko sredstvo ima intracelularnu aktivnost. U nekim realizacijama, IgSF konjugat je internalizovan i terapeutsko sredstvo je citotoksin koji blokira sintezu proteina ćelije, što dovodi do ćelijske smrti. U nekim realizacijama, terapeutsko sredstvo je citotoksin koji sadrži polipeptid koji ima aktivnost inaktivacije ribozoma, uključujući, na primer, gelonin, buganin, saporin, ricin, lanac ricina A, briodin, toksin difterije, restriktocin, Pseudomonas egzotoksin A i njihove varijante. U nekim realizacijama, pri čemu je terapeutsko sredstvo citotoksin koji sadrži polipeptid koji ima aktivnost inaktivacije ribozoma, IgSF konjugat mora biti internalizovan nakon vezivanja za ciljnu ćeliju da bi protein bio citotoksičan za ćelije.
[0969] U nekim realizacijama, obezbeđen je IgSF konjugat koji sadrži varijantni polipeptid ili imunomodulatorni protein koji je ovde dat, konjugovan sa toksinom. U nekim realizacijama, toksin uključuje, na primer, bakterijske toksine kao što je difterijski toksin, biljne toksine kao što je ricin, toksine malih molekula kao što je geldanamicin (Mandler et al., J.Nat. Cancer Inst.
[0970] 92(19):1573‑1581 (2000); Mandler et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025‑ 1028 (2000); Mandler et al., Bioconjugate Chem. 13:786‑791 (2002)) majtanzinoidi (EP 1391213; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618‑8623 (1996)), i kaliheamicin (Lode et al., Cancer Res.
[0971] 58:2928 (1998); Hinman et al., Cancer Res. 53:3336‑3342 (1993)). Toksini mogu ispoljiti svoje citotoksične i citostatske efekte mehanizmima koji uključuju vezivanje za tubulin, vezivanje za DNK ili inhibiciju topoizomeraze.
[0973] U nekim realizacijama, obezbeđen je IgSF konjugat koji sadrži varijantni polipeptid ili imunomodulatorni protein ovde dat, konjugovan sa oznakom, koja može generisati detektabilni signal, indirektno ili direktno. Ovi IgSF konjugati mogu se koristiti za istraživačke ili dijagnostičke primene, kao što je za in vivo detekciju raka. Oznaka je poželjno sposobna da proizvede, direktno ili indirektno, detektabilni signal. Na primer, oznaka može biti radio-neprozirna ili radioizotop, kao što su 3H, 14C, 32P, 35S, 123I, 125I, 131I; fluorescentno (fluorofor) ili hemiluminiscentno (hromofor) jedinjenje, kao što su fluorescein izotiocijanat, rodamin ili luciferin; enzim, kao što su alkalna fosfataza, β-galaktozidaza ili peroksidaza rena; sredstvo za snimanje; ili metalni jon. U nekim realizacijama, oznaka je radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer 99Tc ili 123I, ili spinska oznaka za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznato kao magnetna rezonanca, MRI), kao što su cirkonijum-89, jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe. Cirkonijum-89 može biti kompleksiran sa različitim helatnim sredstvima metala i konjugovan sa antitelima, npr. za PET snimanje (WO 2011/056983). U nekim realizacijama, IgSF konjugat se može indirektno detektovati. Na primer, sekundarno antitelo koje je specifično za IgSF konjugat i sadrži detektabilnu oznaku može se koristiti za detekciju IgSF konjugata.
[0975] IgSF konjugati mogu se pripremiti korišćenjem bilo koje metode poznate u tehnici. Videti, npr. WO 2009/067800, WO 2011/133886 i U.S. objavu patenta br.2014322129.
[0977] [0385] Varijantni polipeptidi ili imunomodulatorni proteini IgSF konjugata mogu biti „pričvršćeni“ za efektorski deo na bilo koji način kojim se varijantni polipeptidi ili imunomodulatorni proteini mogu povezati sa, ili vezati za, efektorski deo. Na primer, varijantni polipeptidi ili imunomodulatorni proteini IgSF konjugata mogu biti pričvršćeni za efektorski deo hemijskim ili rekombinantnim sredstvima. Hemijska sredstva za pripremu fuzija ili konjugata su poznata u tehnici i mogu se koristiti za pripremu IgSF konjugata. Postupak koji se koristi za konjugaciju varijantni polipeptida ili imunomodulatornih proteina i efektorskog dela mora biti sposoban da spoji varijantne polipeptide ili imunomodulatorne proteine sa efektorskim delom bez ometanja sposobnosti varijantni polipeptida ili imunomodulatornih proteina da se vežu za svoj jedan ili više liganda kontrastrukture.
[0979] Varijantni polipeptidi ili imunomodulatorni proteini IgSF konjugata mogu biti indirektno vezani sa efektorskim delom. Na primer, varijantni polipeptidi ili imunomodulatorni proteini IgSF konjugata mogu biti direktno vezani sa lipozomom koji sadrži efektorski deo jednog od nekoliko tipova. Efektorski deo(ovi) i/ili varijantni polipeptidi ili imunomodulatorni proteini takođe mogu biti vezani za čvrstu površinu.
[0981] U nekim realizacijama, varijantni polipeptidi ili imunomodulatorni proteini IgSF konjugata i efektorskog dela su oba proteina i mogu se konjugovati korišćenjem tehnika dobro poznatih u tehnici. Postoji nekoliko stotina dostupnih umreživača koji mogu konjugovati dva proteina. (Videti, na primer „Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking,“ 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor). Sredstvo za umrežavanje se generalno bira na osnovu reaktivnih funkcionalnih grupa dostupnih ili umetnutih na varijante polipeptida ili imunomodulatornih proteina i/ili efektorskog dela. Pored toga, ako nema reaktivnih grupa, može se koristiti fotoaktivabilno sredstvo za umrežavanje. U određenim slučajevima, može biti poželjno uključiti spejser između varijanti polipeptida ili imunomodulatornih proteina i efektorskog dela. Sredstva za umrežavanje poznata u tehnici uključuju homobifunkcionalna sredstva: glutaraldehid, dimetiladipimidat i bis(diazobenzidin) i heterobifunkcionalna sredstva: m maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid i sulfo-m maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid.
[0983] U nekim realizacijama, varijantni polipeptidi ili imunomodulatorni proteini IgSF konjugata mogu biti konstruisani sa specifičnim ostacima za hemijsko vezivanje efektorskog dela. Specifični ostaci koji se koriste za hemijsko vezivanje molekula poznatih u tehnici uključuju lizin i cistein. Unakrsno sredstvo se bira na osnovu reaktivnih funkcionalnih grupa umetnutih na varijante polipeptida ili imunomodulatornih proteina, a dostupnih na efektorskom delu.
[0984] IgSF konjugat se, takođe, može pripremiti korišćenjem tehnika rekombinantne DNK. U takvom slučaju, DNK sekvenca koja kodira varijante polipeptida ili imunomodulatornih proteina se fuzira sa DNK sekvencom koja kodira efektorski deo, što rezultira himernim molekulom DNK. Himerna DNK sekvenca se transfektuje u ćeliju domaćina koja eksprimuje fuzioni protein. Fuzioni protein se može izolovati iz ćelijske kulture i prečistiti korišćenjem tehnika poznatih u tehnici.
[0986] Primeri vezivanja efektorskog dela, koji je oznaka, za varijante polipeptida ili imunomodulatornih proteina uključuju metode opisane u Hunter, et al., Nature 144:945 (1962); David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol. Meth.40:219 (1981); Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982); Wensel and Meares, Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y. (1983); i Colcher et al., "Use Of Monoclonal Antibodies as Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice", Meth. Enzymol., 121:802‑16 (1986).
[0988] Radio- ili druge oznake mogu se ugraditi u konjugat na poznate načine. Na primer, peptid se može biosintetizovati ili se može sintetizovati hemijskom sintezom amino-kiselina korišćenjem odgovarajućih prekursora amino-kiselina koji uključuju, na primer, fluor-19 umesto vodonika. Oznake kao što su 99Tc ili 123I, 186Re, 188Re i 111In mogu se vezati preko ostatka cisteina u peptidu. Itrijum-90 se može vezati preko ostatka lizina. JODOGEN metoda (Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49‑57 (1978)) može se koristiti za ugradnju joda-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) detaljno opisuje druge metode.
[0990] [0392] Konjugati varijantnih polipeptida ili imunomodulatornih proteina i citotoksičnog sredstva mogu se napraviti korišćenjem različitih bifunkcionalnih agenasa za spajanje proteina kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis(p-azidobenzoil)heksandiamin), derivati bisdiazonijuma (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin može se pripremiti kao što je opisano u Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). 1-p-izotiocijanatobenzil-3-metildietilentriaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) obeležena ugljenikom-14 je primer helatnog sredstva za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. Videti, npr. WO94/11026. Linker može biti „cepljivi linker“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, kiselo-labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetilni linker ili linker koji sadrži disulfid Chari et al., Cancer Research 52:127‑131 (1992); U.S. Patent br.5,208,020) mogu se koristiti.
[0992] IgSF konjugati predmetnog pronalaska izričito predviđaju, ali nisu ograničeni na, konjugate lekova pripremljene sa reagensima za unakrsnu vezu: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, i sulfo-SMPB, i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. od Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ilinois, SAD). Videti strane 467-498, 2003‑2004 Applications Handbook and Catalog.
[0994] C. TRANSMEMBRANSKI I SEKRETUJUĆI IMUNOMODULATORNI PROTEINI I KONSTRUISANE ĆELIJE
[0996] Ovde su date konstruisane ćelije koje eksprimuju imunomodulatorne varijante ICOSL polipeptida (alternativno, „konstruisane ćelije“). U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida se eksprimuje na ćeliji, kao što je imuna ćelija (npr. T ćelija ili ćelija koja prezentuje antigen), u membranski vezanom obliku, čime se obezbeđuje transmembranski imunomodulatorni protein (u daljem tekstu takođe nazvan „TIP“). U nekim aspektima, varijanta ICOSL polipeptida se eksprimuje u ćeliji, kao što je imuna ćelija (npr. T ćelija ili ćelija koja prezentuje antigen), u sekretibilnom obliku da bi se time proizveo sekretovani ili rastvorljivi oblik varijante ICOSL polipeptida (u daljem tekstu takođe nazvan „SIP“), kao kada se ćelije administriraju subjektu. U nekim aspektima, SIP može antagonizovati srodnog partnera za vezivanje u okruženju (npr. mikrookruženju tumora) u kojem se sekretuje.
[0998] 1. Transmembranski imunomodulatorni proteini
[1000] [0395] U nekim realizacijama, imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL može biti membranski vezan protein. Kao što je detaljnije opisano u daljem tekstu, imunomodulatorni polipeptid može biti transmembranski imunomodulatorni polipeptid koji sadrži varijantu ICOSL u kojoj se nalazi: ektodomen koji sadrži najmanje jedan afinitetno modifikovani IgSF domen (IgV ili IgC), transmembranski domen i, opciono, citoplazmatski domen. U nekim realizacijama, transmembranski imunomodulatorni protein može se eksprimovati na površini imune ćelije, kao što je ćelija sisara, uključujući i površinu limfocita (npr. T ćelije ili NK ćelije) ili ćelije koja prezentuje antigen. U nekim realizacijama, transmembranski imunomodulatorni protein se eksprimuje na površini T-ćelije sisara, uključujući T-ćelije kao što su: T ćelija pomagač, citotoksična T-ćelija (alternativno, citotoksični T limfocit ili CTL), prirodna T-ćelija ubica, regulatorna T-ćelija, memorijska T-ćelija ili gama delta T-ćelija. U nekim realizacijama, ćelija sisara je ćelija koja prezentuje antigen (APC). Tipično, ali ne isključivo, ektodomen (alternativno, „ekstracelularni domen“) obuhvata jednu ili više varijacija amino-kiselina (npr. supstitucije amino-kiselina) varijante ICOSL prema pronalasku. Tako, na primer, u nekim realizacijama transmembranski protein će obuhvatati ektodomen koji obuhvata jednu ili više supstitucija aminokiselina varijante ICOSL izuma.
[1002] U nekim realizacijama, konstruisane ćelije eksprimuju varijante ICOSL polipeptida koji su transmembranski imunomodulatorni polipeptidi (TIP) koji mogu biti membranski proteini kao što je transmembranski protein. U uobičajenim realizacijama, ektodomen membranskog proteina obuhvata ekstracelularni domen ili njegov IgSF domen varijante ICOSL date ovde, u kojem je sadržana jedna ili više amino-kiselinskih supstitucija u najmanje jednom IgSF domenu kao što je opisano. Transmembranski imunomodulatorni proteini dati ovde dalje sadrže transmembranski domen vezan sa ektodomenom. U nekim realizacijama, transmembranski domen rezultira kodiranim proteinom za ekspresiju na površini ćelije na ćeliji. U nekim realizacijama, transmembranski domen je direktno vezan sa ektodomenom. U nekim realizacijama, transmembranski domen je indirektno vezan sa ektodomenom preko jednog ili više linkera ili spejser. U nekim realizacijama, transmembranski domen sadrži pretežno hidrofobne aminokiselinske ostatke, kao što su leucin i valin.
[1004] [0397] U nekim realizacijama, transmembranski sidreni domen pune dužine može se koristiti da bi se osiguralo da će TIP biti eksprimovani na površini konstruisane ćelije, kao što je konstruisana T ćelija. Pogodno je da ovo može biti iz određenog nativnog proteina koji se afinitetno modifikuje (npr. ICOSL ili drugi nativni IgSF protein), i jednostavno fuzionisan sa sekvencom prvog membranskog proksimalnog domena na sličan način kao nativni IgSF protein (npr. ICOSL). U nekim realizacijama, transmembranski imunomodulatorni protein sadrži transmembranski domen odgovarajućeg referentnog (npr. nemodifikovanog) ili divljeg tipa IgSF člana, kao što je transmembranski domen sadržan u sekvenci amino-kiselina navedenih u SEQ ID NO:5 (Tabela 2). U nekim realizacijama, membranski vezani oblik sadrži transmembranski domen odgovarajućeg referentnog (npr. nemodifikovanog) ili divljeg tipa polipeptida, kao što je onaj koji odgovara ostacima 257-277 SEQ ID NO:5.
[1006] U nekim realizacijama, transmembranski domen je ne-nativni transmembranski domen koji nije transmembranski domen nativnog ICOSL. U nekim realizacijama, transmembranski domen je izveden iz transmembranskog domena iz drugog polipeptida koji nije član porodice ICOSL, a koji je vezan za membranu ili je transmembranski protein. U nekim realizacijama, može se koristiti transmembranski sidreni domen iz drugog proteina na T ćelijama. U nekim realizacijama, transmembranski domen je izveden iz CD8. U nekim realizacijama, transmembranski domen može dalje da sadrži ekstracelularni deo CD8 koji služi kao razmakni domen. Primer transmembranskog domena izvedenog iz CD8 je naveden u SEQ ID NO: 246 ili 483 ili njegov deo koji sadrži transmembranski domen CD8. U nekim realizacijama, transmembranski domen je sintetički transmembranski domen.
[1008] U nekim realizacijama, transmembranski imunomodulatorni protein dodatno sadrži endodomen, kao što je citoplazmatski signalni domen, vezan sa transmembranskim domenom. U nekim realizacijama, citoplazmatski signalni domen indukuje ćelijsku signalizaciju. U nekim realizacijama, endodomen transmembranskog imunomodulatornog proteina obuhvata citoplazmatski domen odgovarajućeg referentnog (npr. nemodifikovanog) ili polipeptida divljeg tipa, kao što je citoplazmatski domen koji je u sekvenci amino-kiselina navedenoj u SEQ ID NO:5 (videti Tabelu 2).
[1010] [0400] U nekim realizacijama, obezbeđeni transmembranski imunomodulatorni protein koji jeste ili sadrži varijantu ICOSL sadrži sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 257 i sadrži ektodomen koji obuhvata najmanje jedan afinitetno modifikovani ICOSL IgSF domen kao što je opisano i transmembranski domen. U nekim realizacijama, transmembranski imunomodulatorni protein sadrži bilo koju jednu ili više supstitucija aminokiselina u IgSF domenu (npr. IgV domen) kao što je opisano, uključujući bilo koju navedenu u Tabeli 1. U nekim realizacijama, transmembranski imunomodulatorni protein može dalje da sadrži citoplazmatski domen kao što je opisano. U nekim realizacijama, transmembranski imunomodulatorni protein može dalje da sadrži signalni peptid. U nekim realizacijama, signalni peptid je nativni signalni peptid divljeg tipa IgSF člana, kao što je sadržan u sekvenci aminokiselina navedenoj u SEQ ID NO: 5 (videti npr. Tabelu 2).
[1012] U nekim realizacijama, obezbeđeni su transmembranski imunomodulatorni proteini koji sadrže amino-kiselinske supstitucije E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, N52H/N57Y/Q100R, ili N52H/N57Y/Q100P. U nekim realizacijama, obezbeđeni transmembranski imunomodulatorni protein jeste ili sadrži varijantu ICOSL koja sadrži sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO:257, ali koja sadrži amino supstitucije E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, N52H/N57Y/Q100R ili N52H/N57Y/Q100P na odgovarajućim pozicijama u SEQ ID NO:257, ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 257 i sadrži amino-kiselinske supstitucije E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R, N52H/N57Y/Q100R ili N52H/N57Y/Q100P.
[1014] U nekim realizacijama, obezbeđeni su transmembranski imunomodulatorni proteini koji sadrže sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO: 496 ili 497 (svaka sadrži supstituciju amino-kiselina N52D), SEQ ID NO: 498 ili 499 (svaka sadrži supstitucije amino-kiselina N52H/N57Y/Q100P), SEQ ID NO: 500 ili 501 (svaka sadrži supstitucije amino-kiselina E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R) ili SEQ ID NO: 502 ili 503 (svaki sadrži supstitucije amino-kiselina N52H/N57Y/Q100R), ili sekvencu amino-kiselina koja sadrži najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO: 495-503 i koji sadrži naznačene supstitucije amino-kiselina. U nekim realizacijama, kada se eksprimuju u genetski modifikovanoj ćeliji, takvi transmembranski imunomodulatorni proteini se eksprimuju na površini ćelije.
[1016] [0403] Takođe je obezbeđen molekul nukleinske kiseline koji kodira takve transmembranske imunomodulatorne proteine. U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline koji kodira transmembranski imunomodulatorni protein sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 257 i sadrži ektodomen koji obuhvata najmanje jedan afinitetno modifikovani IgSF domen kao što je opisano, transmembranski domen i, opciono, citoplazmatski domen. U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline može dalje da sadrži sekvencu nukleotida koji kodiraju signalni peptid. U nekim realizacijama, signalni peptid je nativni signalni peptid odgovarajućeg člana IgSF divljeg tipa (videti npr. Tabelu 2).
[1018] Primer transmembranskog imunomodulatornog proteina je ICOSL TIP koji sadrži i) sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO:383 ili ii) sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 243 i koja sadrži afinitetno modifikovani domen sadržan u SEQ ID NO: 243 ili supstitucije amino-kiselina u njoj. Takođe je obezbeđen i) niz nukleotida naveden u SEQ ID NO: 244, ii) niz koji ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti niza sa SEQ ID NO: 244 i koji kodira TIP koji sadrži afinitetno modifikovani domen SEQ ID NO: 243, ili iii) sekvencu iz i) ili ii) koji ima degenerisane kodone.
[1020] [0405] U nekim realizacijama, obezbeđeni su transmembranski imunomodulatorni proteini vezani sa CAR-om u kojima endodomen transmembranskog imunomodulatornog proteina obuhvata citoplazmatski signalni domen koji obuhvata najmanje jedan signalni domen koji sadrži ITAM (imunoreceptorski tirozin-bazirani aktivacioni motiv). ITAM je konzervirani motiv koji se nalazi u brojnim domenima proteinske signalizacije uključenim u transdukciju signala imunih ćelija, uključujući CD3-zeta lanac („CD3-z“) koji je uključen u transdukciju signala T-ćelijskog receptora. U nekim realizacijama, endodomen obuhvata CD3-zeta signalni domen. U nekim realizacijama, CD3-zeta signalni domen obuhvata sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO: 243 ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% u odnosu na SEQ ID NO:247 i zadržava aktivnost T ćelijske signalizacije. U nekim realizacijama, endodomen transmembranskog imunomodulatornog proteina povezanog sa CAR može dalje da sadrži kostimulativni signalni domen za dodatnu modulaciju imunomodulatornih odgovora T-ćelije. U nekim realizacijama, kostimulativni signalni domen je CD28, ICOS, 41BB ili OX40. U nekim realizacijama, kostimulativni signalni domen je izveden iz CD28 ili 4-1BB i obuhvata sekvencu amino-kiselina navedenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 484-487 ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% u odnosu na SEQ ID NO: 484-487 i zadržava aktivnost kostimulativne signalizacije T ćelija. U nekim realizacijama, obezbeđeni transmembranski imunomodulatorni proteini vezani sa CAR imaju karakteristike CAR da stimulišu signalizaciju T ćelija nakon vezivanja afinitetno modifikovanog IgSF domena za srodnog partnera za vezivanje ili kontrastrukturu. U nekim realizacijama, specifično vezivanje afinitetno modifikovanog IgSF domena za njegovu kontrastrukturu može dovesti do promena u imunološkoj aktivnosti T-ćelija, što se ogleda u promenama u citotoksičnosti, proliferaciji ili proizvodnji citokina.
[1022] U nekim realizacijama, transmembranski imunomodulatorni protein ne sadrži endodomen sposoban da posreduje u citoplazmatskoj signalizaciji. U nekim realizacijama, transmembranskom imunomodulatornom proteinu nedostaje mehanizam prenosa signala divljeg tipa ili nemodifikovanog polipeptida i stoga sam ne indukuje ćelijsku signalizaciju. U nekim realizacijama, transmembranskom imunomodulatornom proteinu nedostaje intracelularni (citoplazmatski) domen ili deo intracelularnog domena odgovarajućeg referentnog (npr. nemodifikovanog) ili polipeptida divljeg tipa, kao što je citoplazmatski signalni domen sadržan u sekvenci amino-kiselina navedenoj u SEQ ID NO:5 (videti Tabelu 2). U nekim realizacijama, transmembranski imunomodulatorni protein ne sadrži ITIM (motiv inhibicije zasnovan na tirozinu imunoreceptora), kao što je sadržan u određenim inhibitornim receptorima, uključujući inhibitorne receptore porodice IgSF (npr. PD-1 ili TIGIT). Dakle, u nekim realizacijama, transmembranski imunomodulatorni protein sadrži samo ektodomen i transmembranski domen, kao što je bilo koji opisan.
[1024] 2. Sekretovani imunomodulatorni proteini i konstruisane ćelije
[1026] [0407] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL imunomodulatornog polipeptida koja sadrži jednu ili više amino-kiselinskih mutacija kako je ovde opisano, može se sekretovati, kao na primer kada se eksprimuje iz ćelije. Takav varijanta ICOSL imunomodulatornog proteina ne sadrži transmembranski domen. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL imunomodulatornog proteina nije konjugovana sa delom koji produžava poluživot (kao što je Fc domen ili domen multimerizacije). U nekim realizacijama, varijanta ICOSL imunomodulatornog proteina sadrži signalni peptid, npr. signalni peptid antitela ili drugu efikasnu signalnu sekvencu za izlazak domena van ćelije. Kada imunomodulatorni protein sadrži signalni peptid i eksprimuje ga konstruisana ćelija, signalni peptid uzrokuje da konstruisana ćelija luči imunomodulatorni protein. Generalno, signalni peptid, ili deo signalnog peptida, se odvaja od imunomodulatornog proteina sekrecijom. Imunomodulatorni protein može biti kodiran nukleinskom kiselinom (koja može biti deo ekspresionog vektora). U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein se eksprimuje i sekretuje od strane ćelije (kao što je imunska ćelija, na primer, primarna imunska ćelija).
[1028] Dakle, u nekim realizacijama, obezbeđeni su varijantni ICOSL imunomodulatorni proteini koji dodatno sadrže signalni peptid. U nekim realizacijama, ovde je obezbeđen molekul nukleinske kiseline koji kodira varijantni ICOSL imunomodulatorni protein operativno vezan sa sekvencom sekrecije koja kodira signalni peptid.
[1030] Signalni peptid je sekvenca na N-terminusu imunomodulatornog proteina koja signalizira sekreciju imunomodulatornog proteina iz ćelije. U nekim realizacijama, signalni peptid je dugačak od oko 5 do oko 40 amino-kiselina (kao što je oko 5 do oko 7, oko 7 do oko 10, oko 10 do oko 15, oko 15 do oko 20, oko 20 do oko 25, ili oko 25 do oko 30, oko 30 do oko 35, ili oko 35 do oko 40 amino-kiselina).
[1032] U nekim realizacijama, signalni peptid je nativni signalni peptid iz odgovarajućeg ICOSL divljeg tipa (videti Tabelu 6). U nekim realizacijama, signalni peptid je ne-nativni signalni peptid. Na primer, u nekim realizacijama, ne-nativni signalni peptid je mutantni nativni signalni peptid iz odgovarajućeg ICOSL divljeg tipa i može da uključuje jednu ili više (kao što su 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više) supstitucija, insercija ili delecija. U nekim realizacijama, ne-nativni signalni peptid je signalni peptid ili njegov mutant člana porodice iz iste IgSF porodice kao i član porodice IgSF divljeg tipa. U nekim realizacijama, ne-nativni signalni peptid je signalni peptid ili njegov mutant iz člana IgSF porodice iz različite IgSF porodice od člana porodice IgSF divljeg tipa. U nekim realizacijama, signalni peptid je signalni peptid ili njegov mutant iz porodice proteina koji nisu IgSF, kao što je signalni peptid iz imunoglobulina (kao što je teški lanac IgG ili laki lanac IgG-kapa), citokina (kao što je interleukin-2 (IL-2) ili CD33), proteina serumskog albumina (npr. HSA ili albumin), signalne sekvence preproteina humanog azurocidina, luciferaze, tripsinogena (npr. himotripsinogen ili tripsinogen) ili drugog signalnog peptida sposobnog da efikasno luči protein iz ćelije. Primeri signalnih peptida uključuju bilo koji opisan u Tabeli 6
[1033]
[1034]
[1037] U nekim realizacijama imunomodulatornog proteina ICOSL koji se može sekretovati, imunomodulatorni protein sadrži signalni peptid kada se eksprimuje, a signalni peptid (ili njegov deo) se odvaja od imunomodulatornog proteina nakon sekrecije.
[1039] U nekim realizacijama, konstruisane ćelije eksprimuju varijantu ICOSL polipeptida koja se sekretuje iz ćelije. U nekim realizacijama, takva varijanta ICOSL polipeptida je kodirana molekulom nukleinske kiseline koji kodira imunomodulatorni protein pod operativnom kontrolom signalne sekvence za sekreciju. U nekim realizacijama, kodirani imunomodulatorni protein se sekretuje kada se eksprimuje iz ćelije. U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein koji kodira molekul nukleinske kiseline ne sadrži transmembranski domen. U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein koji kodira molekul nukleinske kiseline ne sadrži deo koji produžava poluživot (kao što je Fc domen ili multimerizacioni domen). U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein koji kodira molekul nukleinske kiseline sadrži signalni peptid. U nekim realizacijama, nukleinska kiselina pronalaska dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira sekretorni ili signalni peptid operativno vezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira imunomodulatorni protein, čime se omogućava sekrecija imunomodulatornog proteina.
[1041] 3. Ćelije i konstruisane ćelije
[1043] [0413] Ovde su date konstruisane (genetski modifikovane) ćelije koje eksprimuju bilo koji od obezbeđenih imunomodulatornih polipeptida. U nekim realizacijama, konstruisane ćelije eksprimuju na svojoj površini bilo koji od obezbeđenih transmembranskih imunomodulatornih polipeptida. U nekim realizacijama, konstruisane ćelije eksprimuju i sposobne su ili su u stanju da luče imunomodulatorni protein iz ćelija pod uslovima pogodnim za sekreciju proteina. U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein se eksprimuje na ili u limfocitu kao što je tumor infiltrirajući limfocit (TIL), T-ćelija ili NK ćelija, ili na mijeloidnoj ćeliji. U nekim realizacijama, konstruisane ćelije su ćelije koje prezentuju antigen (APC). U nekim realizacijama, konstruisane ćelije su konstruisane T-ćelije sisara ili konstruisane ćelije koje prezentuju antigen sisara (APC). U nekim realizacijama, konstruisane T-ćelije ili APC su humane ili mišje ćelije.
[1045] U nekim realizacijama, konstruisane T-ćelije uključuju, ali nisu ograničene na, T pomoćne T-ćelije, citotoksične T-ćelije (alternativno, citotoksične T-limfocite ili CTL), prirodne T-ćelije ubice, regulatorne T-ćelije, memorijske T-ćelije ili gama delta T-ćelije. U nekim realizacijama, genetski modifikovane T-ćelije su CD4+ ili CD8+. Pored signala MHC, genetski modifikovanim T-ćelijama je, takođe, potreban kostimulativni signal koji u nekim realizacijama obezbeđuje varijanta ICOSL transmembranskog imunomodulatornog polipeptida eksprimovana u membranski vezanom obliku, kao što je prethodno diskutovano.
[1047] U nekim realizacijama, konstruisane APC uključuju, na primer, APC koje eksprimuju MHC II kao što su makrofagi, B ćelije i dendritske ćelije, kao i veštačke APC (aAPC), uključujući i ćelijske i acelularne (npr. biorazgradive polimerne mikročestice) aAPC. Veštački APC (aAPC) su sintetičke verzije APC koje mogu delovati na sličan način kao APC po tome što prezentuju antigene T-ćelijama, kao i da ih aktiviraju. Prezentaciju antigena vrši MHC (klasa I ili klasa II). U nekim realizacijama, kod konstruisane APC kao što su aAPC, antigen koji je učitan na MHC je, u nekim realizacijama, tumorski specifičan antigen ili tumorski vezan antigen. Antigen učitan na MHC prepoznaje T-ćelijski receptor (TCR) T ćelije, koji, u nekim slučajevima, može da eksprimuje ICOS, CD28 ili drugi molekul koji prepoznaju varijante ICOSL polipeptida date ovde. Materijali koji se mogu koristiti za izradu aAPC uključuju: poli(glikolnu kiselinu), poli(mlečnuko-glikolnu kiselinu), gvožđe-oksid, lipozome, lipidne dvoslojeve, sefarozu i polistiren.
[1049] U nekim realizacijama, ćelijska aAPC može biti konstruisana tako da sadrži TIP i TCR agonist koji se koristi u adoptivnoj ćelijskoj terapiji. U nekim realizacijama, ćelijska aAPC može biti konstruisana tako da sadrži TIP i TCR agonist koji se koristi u ex vivo ekspanziji humanih T ćelija, kao što je pre primene, npr. za ponovno uvođenje u pacijenta. U nekim aspektima, aAPC može uključivati ekspresiju najmanje jednog klona anti-CD3 antitela, npr. kao što su, na primer, OKT3 i/ili UCHT1. U nekim aspektima, aAPC mogu biti inaktivirane (npr. ozračene). U nekim realizacijama, TIP može uključivati bilo koji varijantni IgSF domen koji ispoljava afinitet vezivanja za srodnog partnera za vezivanje na T ćeliji.
[1051] [0417] U nekim realizacijama, imunomodulatorni protein koji je ovde dat, kao što je transmembranski imunomodulatorni protein ili sekretibilni imunomodulatorni protein, koeksprimuje se ili modifikuje u ćeliju koja eksprimuje receptor koji vezuje antigen, kao što je rekombinantni receptor, kao što je himerni antigenski receptor (CAR) ili T ćelijski receptor (TCR). U nekim realizacijama, konstruisana ćelija, kao što je konstruisana T ćelija, prepoznaje željeni antigen vezan sa rakom, inflamatornim i autoimunim poremećajima ili virusnom infekcijom. U specifičnim realizacijama, receptor koji vezuje antigen sadrži deo koji vezuje antigen i koji se specifično vezuje za tumorski specifičan antigen ili antigen vezan sa tumorom. U nekim realizacijama, konstruisana T-ćelija je CAR (himerni antigenski receptor) T-ćelija koja sadrži domen koji vezuje antigen (npr. scFv) koji se specifično vezuje za antigen, kao što je tumorski specifičan antigen ili antigen vezan sa tumorom. U nekim realizacijama, domen koji vezuje antigen (npr. scFv) je specifičan za određeni antigen, npr. CD19. Primer CAR je anti-CD19 CAR, kao što je CAR koji sadrži anti-CD19 scFv naveden u SEQ ID NO:482 ili SEQ ID NO:245. U nekim realizacijama, TIP protein se eksprimuje u konstruisanoj ćeliji T-ćelijskog receptora ili konstruisanoj himernoj ćeliji antigenskog receptora. U takvim realizacijama, konstruisana ćelija koeksprimuje TIP i CAR ili TCR. U nekim realizacijama, SIP protein se eksprimuje u konstruisanoj ćeliji T-ćelijskog receptora ili konstruisanoj himernoj ćeliji antigenskog receptora. U takvim realizacijama, konstruisana ćelija koeksprimuje SIP i CAR ili TCR.
[1053] [0418] Himerni antigenski receptori (CAR) su rekombinantni receptori koji uključuju domen koji vezuje antigen (ektodomen), transmembranski domen i intracelularni signalni region (endodomen) koji je sposoban da indukuje ili posreduje u aktivacionom signalu T ćeliji nakon što je antigen vezan. U nekim primerima, ćelije koje eksprimuju CAR su konstruisane da eksprimuju ekstracelularni varijabilni fragment jednog lanca (scFv) sa specifičnošću za određeni tumorski antigen vezan sa intracelularnim signalnim delom koji sadrži aktivacioni domen i, u nekim slučajevima, kostimulativni domen. Kostimulativni domen može biti izveden iz, npr. CD28, OX-40, 4-1BB/CD137 ili inducibilnog kostimulatora T ćelija (ICOS). Aktivacioni domen može biti izveden iz, npr. CD3, kao što su CD3 zeta, epsilon, delta, gama ili slično. U određenim realizacijama, CAR je dizajniran da ima dva, tri, četiri ili više kostimulativnih domena. CAR scFv može biti dizajniran da cilja antigen eksprimovan na ćeliji vezanoj sa bolešću ili stanjem, npr. tumorski antigen, kao što je, na primer, CD19, koji je transmembranski protein koji eksprimuju ćelije u B ćelijskoj liniji, uključujući sve normalne B ćelije i maligne B ćelije, uključujući, ali ne ograničavajući se na NHL, CLL i ALL koje nisu T ćelije. Primeri CAR+ T ćelijskih terapija i konstrukt su opisani u U.S. objave patenta br. 2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309, i 2014/0050708.
[1055] U nekim aspektima, domen koji vezuje antigen je antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, kao što je jednolančani fragment (scFv). U nekim realizacijama, antigen se eksprimuje na tumoru ili ćeliji raka. Primer antigena je CD19. Primer CAR je anti-CD19 CAR, kao što je CAR koji sadrži anti-CD19 scFv naveden u SEQ ID NO: 245. U nekim realizacijama, CAR dalje sadrži spejser, transmembranski domen i intracelularni signalni domen ili region koji obuhvata ITAM signalni domen, kao što je CD3zeta signalni domen. U nekim realizacijama, CAR dalje uključuje kostimulativni signalni domen.
[1057] U nekim realizacijama, CAR dalje sadrži spejser ili šarku, transmembranski domen i intracelularni signalni domen (endodomen) koji obuhvata ITAM signalni domen, kao što je CD3zeta signalni domen. U nekim realizacijama, CAR dalje uključuje kostimulativni signalni domen. Kostimulativni domen može biti izveden iz, npr. CD28, OX-40, 4-1BB/CD137 ili inducibilnog T ćelijskog kostimulatora (ICOS). U određenim realizacijama, CAR je dizajniran da ima dva, tri, četiri ili više kostimulativnih domena. CAR scFv može biti dizajniran da cilja antigen eksprimovan na ćeliji povezanoj sa bolešću ili stanjem, npr. tumorski antigen, kao što je, na primer, CD19, koji je transmembranski protein koji eksprimuju ćelije u B ćelijskoj lozi, uključujući sve normalne B ćelije i B ćelijske malignitete, uključujući, ali ne ograničavajući se na NHL, CLL i ALL koje nisu T ćelije. Primeri CAR+ T ćelijskih terapija i konstrukt su opisani u U.S. Objavama patenta br.. 2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309, i 2014/0050708. U nekim realizacijama, spejser ili šarka je prisutna između domena koji vezuje antigen i transmembranskog domena, kao što je između domena koji vezuje antigen i plazma membrane kada se eksprimuje na ćeliji. U nekim realizacijama, spejser ili šarka je izvedena iz IgG podklase (kao što su IgG1 i IgG4, IgD ili CD8 (videti npr. Qin et al. (2017) J. Hematol. Oncol., 10:68). U nekim realizacijama, spejser ili šarka je izvedena iz IgG1.
[1059] [0421] U nekim realizacijama, razmakni deo i transmembranski domen su zglobni i transmembranski domen izveden iz CD8, kao što je primer sekvence navedene u SEQ ID NO: 246, 483 ili 897 ili sekvenca amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 246, 483 ili 897. U nekim realizacijama, endodomen obuhvata CD3-zeta signalni domen. U nekim realizacijama, CD3-zeta signalni domen obuhvata sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO: 243 ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% ili više identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 247 i zadržava aktivnost T ćelijske signalizacije. U nekim realizacijama, endodomen CAR može dalje da obuhvati kostimulativni signalni domen ili region za dalje moduliranje imunomodulatornih odgovora T-ćelije. U nekim realizacijama, kostimulativni signalni domen jeste ili sadrži kostimulativni region, ili je izveden iz kostimulativnog regiona CD28, ICOS, 41BB ili OX40. U nekim realizacijama, kostimulativni signalni domen je izveden iz CD28 ili 4-1BB i obuhvata sekvencu amino-kiselina navedenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 484-487 ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% ili više identiteta sekvence sa SEQ ID NO:484-487 i zadržava aktivnost kostimulativne signalizacije T ćelija.
[1061] Ovde je dat polinukleotid koji kodira ICOSL polipeptid i kodira jedan ili više proteina, kao što je rekombinantni antigenski receptor (npr. himerni antigenski receptor (CAR) ili konstruisani T ćelijski receptor (TCR)), marker i jedan ili više samocepajućih peptida. U nekim realizacijama, konstrukt koji kodira CAR dalje kodira drugi protein, kao što je marker, npr. detektabilni protein, odvojen od CAR samocepajućom peptidnom sekvencom. U nekim primerima, nukleinska kiselina koja kodira varijantu ICOSL polipeptida je odvojena od jedne ili više sekvenci koje su nukleinska kiselina koja kodira protein, pri čemu protein kodira rekombinantni antigenski receptor (npr. CAR ili TCR), marker, citokin ili hemokin. Bilo koja od nukleotidnih sekvenci može biti u vektoru, kao što je virusni vektor. U nekim primerima, virusni vektor je lentivirusni vektor ili retrovirusni vektor.
[1063] [0423] U nekim realizacijama, sekvenca samorazdvajajućeg peptida je F2A, T2A, E2A ili P2A samorazdvajajući peptid. Primerne sekvence T2A samorazdvajajućeg peptida su postavljene za bilo koju od SEQ ID NO: 250, 488, 860-862 ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% ili više identiteta sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 250, 488, 860-862. U nekim realizacijama, T2A je kodiran sekvencom nukleotida navedenom u SEQ ID NO:249 ili sekvencom koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% ili više identiteta sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 249. Primer sekvence samocepajućeg P2A peptida je naveden u SEQ ID NO: 863 ili sekvencom amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% ili više identiteta sekvence sa SEQ ID. NOS: 863. U nekim slučajevima, nukleinska kiselinska konstrukt koja kodira više od jednog samocepajućeg P2A peptida (kao što su P2A1 i P2A2), u kojoj nukleotidna sekvenca P2A1 i P2A2 svaka kodira P2A naveden u SEQ ID NO:863, nukleotidna sekvenca može biti različita kako bi se izbegla rekombinacija između sekvenci.
[1065] U nekim realizacijama, marker je detektabilni protein, kao što je fluorescentni protein, npr. zeleni fluorescentni protein (GFP) ili plavi fluorescentni protein (BFP). Primeri sekvenci fluorescentnog proteinskog markera navedeni su u SEQ ID NO:489, 858, 859, 903 ili sekvenca amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% ili više identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 489, 858, 859, 903.
[1067] U nekim realizacijama, CAR je anti-CD19 CAR koji ima sekvencu amino-kiselina navedenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 479, 490, 491, 492, 898, 899, 901 ili 902 ili sekvencu amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% ili više identiteta sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 479, 490, 491, 492, 898, 899, 901 ili 902. U nekim realizacijama, CAR je kodiran sekvencom nukleotida navedenom u SEQ ID NO: 248 ili 900 ili sekvenca amino-kiselina koja ispoljava najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% ili više identiteta sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO: 248 ili 900.
[1069] U drugoj realizaciji, genetski modifikovana T-ćelija poseduje TCR, uključujući rekombinantni ili genetski modifikovani TCR. U nekim realizacijama, TCR može biti nativni TCR. Stručnjaci u tehnici će prepoznati da generalno nativni receptori T-ćelija sisara sadrže alfa i beta lanac (ili gama i delta lanac) koji su uključeni u prepoznavanje i vezivanje specifično za antigen. U nekim realizacijama, TCR je genetski modifikovani TCR. U nekim realizacijama, TCR genetski modifikovane T-ćelije se specifično vezuje za antigen vezan sa tumorom ili specifičan za tumor koga prezentuje APC.
[1071] [0427] U nekim realizacijama, imunomodulatorni polipeptidi, kao što su transmembranski imunomodulatorni polipeptidi ili sekretibilni imunomodulatorni polipeptidi, mogu se ugraditi u konstruisane ćelije, kao što su konstruisane T ćelije ili konstruisane APC, različitim strategijama, kao što su one koje se koriste za rekombinantne ćelije domaćina. U tehnici je poznat niz metoda za uvođenje DNK konstrukcije u primarne T ćelije. U nekim realizacijama, koristi se virusna transdukcija ili plazmidna elektroporacija. U uobičajenim realizacijama, molekul nukleinske kiseline koji kodira imunomodulatorni protein, ili ekspresioni vektor, sadrži signalni peptid koji lokalizuje eksprimovane transmembranske imunomodulatorne proteine na ćelijsku membranu ili za sekreciju. U nekim realizacijama, nukleinska kiselina koja kodira transmembranske imunomodulatorne proteine pronalaska je subklonirana u virusni vektor, kao što je retrovirusni vektor, koji omogućava ekspresiju u ćeliji sisara domaćina. Ekspresioni vektor može se uvesti u ćeliju domaćina sisara i, pod uslovima kulture ćelija domaćina, imunomodulatorni protein se eksprimuje na površini ili se sekretuje.
[1073] U jednom primernom primeru, primarne T-ćelije mogu biti prečišćene ex vivo (CD4 ćelije ili CD8 ćelije ili obe) i stimulisane protokolom aktivacije koji se sastoji od različitih TCR/CD28 agonista, kao što su perle obložene anti-CD3/anti-CD28. Nakon procesa aktivacije od 2 ili 3 dana, rekombinantni vektor ekspresije koji sadrži imunomodulatorni polipeptid može biti stabilno uveden u primarne T-ćelije putem standardnih protokola lentivirusne ili retrovirusne transdukcije ili strategija elektroporacije plazmida. Ćelije se mogu pratiti na ekspresiju imunomodulatornog polipeptida, na primer, protočnom citometrijom koristeći anti-epitopsku oznaku ili antitela koja unakrsno reaguju sa nativnim roditeljskim molekulom i polipeptidima koji sadrže varijantu ICOSL. T-ćelije koje eksprimuju imunomodulatorni polipeptid mogu biti obogaćene sortiranjem sa anti-epitopskom oznakom ili obogaćene za visoku ili nisku ekspresiju u zavisnosti od primene.
[1075] [0429] Nakon ekspresije imunomodulatornog polipeptida, genetski modifikovana T-ćelija može biti testirana na odgovarajuću funkciju na različite načine. Genetski modifikovana koekspresija CAR ili TCR može biti validirana kako bi se pokazalo da ovaj deo genetski modifikovane T ćelije nije bio značajno pogođen ekspresijom imunomodulatornog proteina. Nakon validacije, standardni in vitro testovi citotoksičnosti, proliferacije ili citokina (npr. ekspresija IFN-γ) mogu se koristiti za procenu funkcije genetski modifikovanih T-ćelija. Primeri standardnih krajnjih tačaka su procenat lize tumorske linije, proliferacija genetski modifikovanih T-ćelija ili ekspresija IFN-γ proteina u supernatantima kulture. Može se odabrati genetski modifikovana konstrukt koja rezultira statistički značajnim povećanjem lize tumorske linije, povećanom proliferacijom genetski modifikovanih T-ćelija ili povećanom ekspresijom IFN-γ u odnosu na kontrolnu konstrukciju. Pored toga, nemodifikovane, kao što su prirodne primarne ili endogene T-ćelije, takođe bi mogle biti uključene u isti in vitro test kako bi se izmerila sposobnost imunomodulatorne polipeptidne konstrukcije eksprimovane na konstruisanim ćelijama, kao što su konstruisane T-ćelije, da modulira aktivnost, uključujući, u nekim slučajevima, aktiviranje i generisanje efektorske funkcije kod posmatrača, prirodne T-ćelije. Povećana ekspresija aktivacionih markera kao što su CD69, CD44 ili CD62L mogla bi se pratiti na endogenim T ćelijama, a povećana proliferacija i/ili proizvodnja citokina mogla bi ukazivati na željenu aktivnost imunomodulatornog proteina eksprimovanog na konstruisanim T ćelijama.
[1077] U nekim realizacijama, slični testovi mogu se koristiti za poređenje funkcije konstruisanih T ćelija koje sadrže samo CAR ili TCR sa onima koje sadrže CAR ili TCR i TIP konstrukciju. Obično, ovi in vitro testovi se izvode zajedničkim zasejavanjem različitih odnosa konstruisanih T ćelija i „tumorske“ ćelijske linije koja sadrži srodni CAR ili TCR antigen u kulturi. Standardni krajnji pokazatelji su procenat liza tumorske linije, proliferacija konstruisanih T ćelija ili proizvodnja IFN-γ u supernatantima kulture. Može se odabrati konstruisani imunomodulatorni protein koji je rezultirao statistički značajnim povećanjem liza tumorske linije, povećanom proliferacijom konstruisanih T ćelija ili povećanom proizvodnjom IFN-γ u odnosu na samo isti TCR ili CAR konstrukt.
[1079] Konstruisane humane T ćelije mogu se analizirati kod imunokompromitovanih miševa, poput soja NSG, kome nedostaju mišje T, NK i B ćelije. Konstruisane humane T ćelije u kojima se CAR ili TCR vezuju za ciljnu kontrastrukturu na ksenograftu i koeksprimuju se sa TIP afinitetno modifikovanim IgSF domenom mogu se adoptivno preneti in vivo sa različitim brojevima i odnosima ćelija u poređenju sa ksenograftom. Na primer, kalemljenje CD19+ linija tumora leukemije koje sadrže luciferazni/GFP vektor može se pratiti putem bioluminiscencije ili ex vivo protočnom citometrijom. U uobičajenoj realizaciji, ksenograft se unosi u mišji model, a zatim se nekoliko dana kasnije ubacuju konstruisane T ćelije. Konstruisane T ćelije koje sadrže imunomodulatorni protein mogu se testirati na povećano preživljavanje, klirens tumora ili povećani broj konstruisanih T ćelija u odnosu na konstruisane T ćelije koje sadrže samo CAR ili TCR. Kao i u in vitro testu, endogene, prirodne (tj. nemodifikovane) humane T ćelije mogu se koadoptivno transferovati kako bi se potražilo uspešno širenje epitopa u toj populaciji, što bi rezultiralo boljim preživljavanjem ili uklanjanjem tumora.
[1080] D. INFEKTIVNI AGENSI KOJI EKSPRIMUJU VARIJANTNE POLIPEPTIDE I IMUNOMODULATORNE PROTEINE
[1082] Takođe su obezbeđeni infektivni agensi koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koji od varijantnih polipeptida, kao što su ICOSL vIgD polipeptidi, uključujući sekretibilne ili transmembranske imunomodulatorne proteine opisane ovde. U nekim realizacijama, takvi infektivni agensi mogu isporučiti nukleinske kiseline koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida opisane ovde, kao što su ICOSL vIgD polipeptidi, ciljnoj ćeliji kod subjekta, npr. imunoj ćeliji i/ili ćeliji koja prezentuje antigen (APC) ili tumorskoj ćeliji kod subjekta. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline sadržane u takvim infektivnim agensima i/ili nukleinske kiseline za generisanje ili modifikaciju takvih infektivnih agensa, kao što su vektori i/ili plazmidi, i kompozicije koje sadrže takve infektivne agense. U nekim realizacijama, varijantni ICOSL polipeptid se eksprimuje u infektivnom agensu (npr. virusnom ili bakterijskom agensu) koji je, nakon primene kod subjekta, u stanju da inficira ćeliju in vivo, kao što je imuna ćelija (npr. T ćelija ili ćelija koja prezentuje antigen) ili tumor, za isporuku ili ekspresiju varijantnog polipeptida kao TIP ili SIP u ćeliji.
[1084] U nekim realizacijama, infektivni agens je mikroorganizam ili mikrob. U nekim realizacijama, infektivni agens je virus ili bakterija. U nekim realizacijama, infektivni agens je virus. U nekim realizacijama, infektivni agens je bakterija. U nekim realizacijama, takvi infektivni agensi mogu da isporuče sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju bilo koji od varijantnih polipeptida, kao što su ICOSL vIgD polipeptidi, uključujući sekretibilne ili transmembranske imunomodulatorne proteine, opisane ovde. Stoga, u nekim realizacijama, ćelija kod subjekta koja je inficirana ili je u kontaktu sa infektivnim agensima može biti učinjena da eksprimuje na površini ćelije ili da luči varijantne imunomodulatorne polipeptide. U nekim realizacijama, infektivni agens, takođe, može da isporuči jedan ili više drugih terapeutskih sredstava ili nukleinskih kiselina koje kodiraju druga terapeutska sredstva ćeliji i/ili u okruženje unutar subjekta. U nekim realizacijama, druga terapeutska sredstva koja mogu biti isporučena infektivnim agensima uključuju citokine ili druge imunomodulatorne molekule.
[1086] [0434] U nekim realizacijama, infektivni agens, npr. virus ili bakterija, sadrži sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju bilo koji od varijantnih polipeptida, kao što su ICOSL vIgD polipeptidi, uključujući sekretabilne ili transmembranske imunomodulatorne proteine, opisane ovde, i zahvaljujući kontaktu i/ili infekciji ćelije kod subjekta, ćelija eksprimuje varijante polipeptida, kao što su ICOSL vIgD polipeptidi, uključujući sekretabilne ili transmembranske imunomodulatorne proteine, kodirane sekvencama nukleinskih kiselina sadržanim u infektivnom agensu. U nekim realizacijama, infektivni agens se može administrirati subjektu. U nekim realizacijama, infektivni agens se može uvesti u ćelije od subjekta ex vivo.
[1088] U nekim realizacijama, varijantni polipeptidi, kao što su ICOSL vIgD polipeptidi, uključujući transmembranske imunomodulatorne proteine, koje eksprimuje ćelija inficirana infektivnim agensom, jesu transmembranski proteini i eksprimuju se na površini. U nekim realizacijama, varijantni polipeptidi, kao što su ICOSL vIgD polipeptidi, uključujući sekretibilne imunomodulatorne proteine, koje eksprimuje ćelija inficirana infektivnim agensom, eksprimuju se i sekretuju iz ćelije. Transmembranski imunomodulatorni protein ili sekretovani imunomodulatorni protein može biti bilo koji od ovde opisanih.
[1090] U nekim realizacijama, ćelije kod subjekta koje su ciljane infektivnim agensom uključuju tumorsku ćeliju, imunsku ćeliju i/ili ćeliju koja prezentuje antigen (APC). U nekim realizacijama, infektivni agens cilja ćeliju u tumorskom mikrookruženju (TME). U nekim realizacijama, infektivni agens isporučuje nukleinske kiseline koje kodiraju varijante polipeptida, kao što su ICOSL vIgD polipeptidi, uključujući sekretibilne ili transmembranske imunomodulatorne proteine, odgovarajućoj ćeliji (na primer, APC, kao što je ćelija koja prikazuje peptid/MHC kompleks na svojoj ćelijskoj površini, kao što je dendritska ćelija) ili tkivu (npr. limfoidno tkivo) koje modulira imuni odgovor i/ili specifičan ćelijski medikiran imuni odgovor, npr. CD4 i/ili CD8 T ćelijski odgovor, koji CD8 T ćelijski odgovor može uključivati citotoksični T ćelijski (CTL) odgovor. U nekim realizacijama, infektivni agens cilja APC, kao što je dendritska ćelija (DC). U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline koji dostavljaju infektivni agensi opisani ovde uključuje odgovarajuće sekvence nukleinskih kiselina neophodne za ekspresiju operativno vezanih kodirajućih sekvenci koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida, u određenoj ciljnoj ćeliji, npr. regulatorne elemente kao što su promotori.
[1092] [0437] U nekim realizacijama, infektivni agens koji sadrži sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju imunomodulatorne polipeptide može takođe da sadrži sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju jedan ili više dodatnih genskih proizvoda, npr. citokine, enzime za konverziju prolekova, citotoksine i/ili detektabilne genske proizvode. Na primer, u nekim realizacijama, infektivni agens je onkolitički virus i virus može da sadrži sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju dodatne terapeutske genske proizvode (videti, npr. Kirn et al., (2009) Nat Rev Cancer 9:64‑71; Garcia-Aragoncillo et al., (2010) Curr Opin Mol Ther 12:403‑411; videti U.S. Pat. br. 7,588,767, 7,588,771, 7,662,398 i 7,754,221 and U.S. Pat. objave br. 2007/0202572, 2007/0212727, 2010/0062016, 2009/0098529, 2009/0053244, 2009/0155287, 2009/0117034, 2010/0233078, 2009/0162288, 2010/0196325, 2009/0136917 i 2011/0064650. U nekim realizacijama, dodatni genski proizvod može biti terapeutski genski proizvod koji može dovesti do smrti ciljne ćelije (npr. tumorske ćelije) ili genski proizvodi koji mogu povećati, pojačati ili regulisati imuni odgovor (npr. citokin). Primeri genskih proizvoda takođe uključuju, između ostalog, antikancerogeno sredstvo, antimetastatsko sredstvo, antiangiogeno sredstvo, imunomodulatorni molekul, inhibitor imunološke kontrolne tačke, antitelo, citokin, faktor rasta, antigen, citotoksični genski proizvod, pro-apoptotski genski proizvod, anti-apoptotski genski proizvod, gen za degradaciju ćelijskog matriksa, gene za regeneraciju tkiva i reprogramiranje humanih somatskih ćelija u pluripotentnost i druge gene opisane ovde ili poznate stručnjaku u tehnici. U nekim realizacijama, dodatni genski proizvod je faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (GM-CSF).
[1094] 1. Virusi
[1096] U nekim realizacijama, infektivni agens je virus. U nekim realizacijama, infektivni agens je onkolitički virus ili virus koji cilja određene ćelije, npr. imune ćelije. U nekim realizacijama, infektivni agens cilja ćeliju tumora i/ili ćeliju raka kod subjekta. U nekim realizacijama, infektivni agens cilja imunu ćeliju ili ćeliju koja prezentuje antigen (APC).
[1098] U nekim realizacijama, infektivni agens je onkolitički virus. Onkolitički virusi su virusi koji se akumuliraju u tumorskim ćelijama i repliciraju u tumorskim ćelijama. Zahvaljujući replikaciji u tumorskim ćelijama i opcionoj isporuci nukleinskih kiselina koje kodiraju varijante ICOSL polipeptida ili imunomodulatornih polipeptida opisanih ovde, tumorske ćelije se liziraju, a tumor se smanjuje i može biti eliminisan. Onkolitički virusi, takođe, mogu imati širok raspon domaćina i tipova ćelija. Na primer, onkolitički virusi se mogu akumulirati u imunoprivilegovanim ćelijama ili imunoprivilegovanim tkivima, uključujući tumore i/ili metastaze, a takođe uključujući i ranjena tkiva i ćelije, što omogućava isporuku i ekspresiju nukleinskih kiselina koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida opisanih ovde u širokom rasponu tipova ćelija.
[1099] Onkolitički virusi se, takođe, mogu replicirati na način specifičan za tumorske ćelije, što rezultira lizom tumorskih ćelija i efikasnom regresijom tumora.
[1101] Primeri onkolitičkih virusa uključuju adenoviruse, adeno-asocirane viruse, viruse herpesa, virus herpes simpleksa, vezikularni stomatski virus, reovirus, virus Njukaslske bolesti, parvovirus, virus malih boginja, virus vezikularnog stomatitisa (VSV), koksaki virus i virus vakcinije. U nekim realizacijama, onkolitički virusi mogu specifično kolonizovati solidne tumore, a da pritom ne inficiraju druge organe, i mogu se koristiti kao infektivni agens za isporuku nukleinskih kiselina koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida opisanih ovde takvim solidnim tumorima.
[1103] Onkolitički virusi za upotrebu u isporuci nukleinskih kiselina koje kodiraju varijantne ICOSL polipeptide ili imunomodulatorne polipeptide opisane ovde, mogu biti bilo koji od onih poznatih stručnjaku u tehnici i uključuju, na primer, virus vezikularnog stomatitisa, videti, npr. U.S. Pat. br. 7,731,974, 7,153,510, 6,653,103 i U.S. Pat. obj. br. 2010/0178684, 2010/0172877, 2010/0113567, 2007/0098743, 20050260601, 20050220818 i EP Pat. br. 1385466, 1606411 i 1520175; herpes simpleksa, videti, npr. U.S. Pat. br.7,897,146, 7,731,952, 7,550,296, 7,537,924, 6,723,316, 6,428,968 i U.S. Pat. Obj. br. 2014/0154216, 2011/0177032, 2011/0158948, 2010/0092515, 2009/0274728, 2009/0285860, 2009/0215147, 2009/0010889, 2007/0110720, 2006/0039894, 2004/0009604, 2004/0063094, međunarodne objave patenata WO 2007/052029, WO 1999/038955; retrovirusi, videti, npr. U.S. Pat. br. 6,689,871, 6,635,472, 5,851,529, 5,716,826, 5,716,613 i U.S. Pat. obj. br.20110212530; virusi vakcinije, videti, npr.2016/0339066, i adeno-asocirani virusi, videti, npr. U.S. Pat. br. 8,007,780, 7,968,340, 7,943,374, 7,906,111, 7,927,585, 7,811,814, 7,662,627, 7,241,447, 7,238,526, 7,172,893, 7,033,826, 7,001,765, 6,897,045, i 6,632,670.
[1105] [0442] Onkolitički virusi, takođe, uključuju viruse koji su genetski izmenjeni da bi se smanjila njihova virulencija, poboljšao njihov bezbednosni profil, povećala njihova specifičnost za tumor, a takođe su opremljeni dodatnim genima, na primer citotoksinima, citokinima, enzimima za konverziju prolekova kako bi se poboljšala ukupna efikasnost virusa (videti, npr. Kirn et al., (2009) Nat Rev Cancer 9:64‑71; Garcia-Aragoncillo et al., (2010) Curr Opin Mol Ther 12:403‑411; videti U.S. Pat. br. 7,588,767, 7,588,771, 7,662,398 i 7,754,221 i U.S. Pat. obj. br. 2007/0202572, 2007/0212727, 2010/0062016, 2009/0098529, 2009/0053244, 2009/0155287, 2009/0117034, 2010/0233078, 2009/0162288, 2010/0196325, 2009/0136917 i 2011/0064650). U nekim realizacijama, onkolitički virusi mogu biti oni koji su modifikovani tako da se selektivno repliciraju u ćelijama raka i stoga su onkolitički. Na primer, onkolitički virus je adenovirus koji je konstruisan da ima modifikovani tropizam za terapiju tumora, a takođe i kao vektori genske terapije. Primeri za to su ONYX-015, H101 i Ad5ΔCR (Hallden and Portella (2012) Expert Opin Ther Targets, 16:945‑58) i TNFerade (McLoughlin et al. (2005) Ann. Surg. Oncol., 12:825‑30), ili uslovno replikativni adenovirus Oncorine<®>.
[1107] U nekim realizacijama, infektivni agens je modifikovani virus herpesa simpleksa. U nekim realizacijama, infektivni agens je modifikovana verzija Talimogen laherparepvek-a (takođe poznatog kao T-Vec, Imlygic ili OncoVex GM-CSF), koja je modifikovana da sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koji od varijantnih ICOSL polipeptida ili imunomodulatornih polipeptida opisanih ovde. U nekim realizacijama, infektivni agens je modifikovani virus herpes simpleksa koji je opisan, npr. u WO 2007/052029, WO 1999/038955, US 2004/0063094, US 2014/0154216, ili, njihove varijante.
[1109] [0444] U nekim realizacijama, infektivni agens je virus koji cilja određenu vrstu ćelija kod subjekta kome je virus primenjen, npr. virus koji cilja imune ćelije ili ćelije koje prezentuju antigen (APC). Dendritske ćelije (DC) su esencijalne APC za pokretanje i kontrolu imunih odgovora. DC mogu da hvataju i obrađuju antigene, migriraju sa periferije u limfoidni organ i prezentuju antigene T ćelijama u mirovanju na način ograničen glavnim kompleksom histokompatibilnosti (MHC). U nekim realizacijama, infektivni agens je virus koji može specifično da cilja DC da bi isporučio nukleinske kiseline koje kodiraju varijantu ICOSL polipeptida ili imunomodulatorne polipeptide za ekspresiju u DC. U nekim realizacijama, virus je lentivirus ili njegova varijanta ili derivat, kao što je lentivirusni vektor sa nedostatkom integracije. U nekim realizacijama, virus je lentivirus koji je pseudotipizovan da bi se efikasno vezao i produktivno inficirao ćelije koje eksprimuju neintegrin (DC-SIGN), marker ćelijske površine, specifičan za dendritske ćelije i intercelularni adhezijski molekul-3 koji hvata neintegrin (DC-SIGN), kao što su DC. U nekim realizacijama, virus je lentivirus pseudotipizovan sa glikoproteinom E2 virusa Sindbis ili njegovim modifikovanim oblikom, kao što su oni opisani u WO 2013/149167. U nekim realizacijama, virus omogućava isporuku i ekspresiju sekvence od interesa (npr. nukleinske kiseline koja kodira bilo koji od varijantnih ICOSL polipeptida ili imunomodulatornih polipeptida opisanih ovde) u dendritsku ćelijsku ćeliju (DC). U nekim realizacijama, virus uključuje one opisane u WO 2008/011636, US 2011/0064763, Tareen et al. (2014) Mol. Ther., 22:575-587, ili njihove varijante. Primer dendritske ćelijsko-tropske vektorske platforme je ZVex<™>.
[1111] 2. Bakterije
[1113] U nekim realizacijama, infektivni agens je bakterija. Na primer, u nekim realizacijama, bakterije mogu da isporuče nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koji od ovde opisanih varijantnih imunomodulatornih polipeptida, npr. varijantni ICOSL polipeptid ili imunomodulatorni polipeptid, ciljnoj ćeliji kod subjekta, kao što je tumorska ćelija, imunska ćelija, ćelija koja prezentuje antigen i/ili fagocitna ćelija. U nekim realizacijama, bakterija može biti preferencijalno usmerena na specifično okruženje unutar subjekta, kao što je tumorsko mikrookruženje (TME), radi ekspresije i/ili sekrecije varijantnih imunomodulatornih polipeptida i/ili da cilja specifične ćelije u okruženju radi ekspresije varijantnih imunomodulatornih polipeptida.
[1115] U nekim realizacijama, bakterija isporučuje nukleinske kiseline ćelijama putem bakterijski posredovanog transfera plazmidne DNK u ćelije sisara (takođe, poznato kao „baktofekcija“). Na primer, u nekim realizacijama, isporuka genetskog materijala se postiže ulaskom cele bakterije u ciljne ćelije. U nekim realizacijama, spontana ili indukovana bakterijska liza može dovesti do oslobađanja plazmida za naknadnu ekspresiju eukariotskih ćelija. U nekim realizacijama, bakterija može isporučiti nukleinske kiseline nefagocitnim ćelijama sisara (npr. tumorskim ćelijama) i/ili fagocitnim ćelijama, npr. određenim imunim ćelijama i/ili APC. U nekim realizacijama, nukleinske kiseline koje isporučuje bakterija mogu se preneti u jedro ćelije kod subjekta radi ekspresije. U nekim realizacijama, nukleinske kiseline, takođe, uključuju odgovarajuće sekvence nukleinskih kiselina neophodne za ekspresiju operativno vezanih sekvenci koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida u određenoj ćeliji domaćinu, npr. regulatorne elemente kao što su promoteri ili pojačivači. U nekim realizacijama, infektivni agens koji je bakterija može da isporuči nukleinske kiseline koje kodiraju imunomodulatorne proteine u obliku RNK, kao što je unapred napravljena RNK kompetentna za translaciju isporučena u citoplazmu ciljne ćelije radi translacije pomoću mehanizma ciljne ćelije.
[1117] [0447] U nekim realizacijama, bakterija može da replicira i lizira ciljne ćelije, npr. tumorske ćelije. U nekim realizacijama, bakterija može da sadrži i/ili oslobađa sekvence nukleinskih kiselina i/ili genske proizvode u citoplazmi ciljnih ćelija, čime ubija ciljnu ćeliju, npr. tumorsku ćeliju. U nekim realizacijama, infektivni agens je bakterija koja se može specifično replicirati u određenom okruženju kod subjekta, npr. tumorskom mikrookruženju (TME). Na primer, u nekim realizacijama, bakterija se može specifično replicirati u anaerobnim ili hipoksičnim mikrookruženjima. U nekim realizacijama, uslovi ili faktori prisutni u određenim okruženjima, npr. aspartat, serin, citrat, riboza ili galaktoza koje proizvode ćelije u TME, mogu delovati kao hemoatraktanti da bi privukli bakteriju u okruženje. U nekim realizacijama, bakterija može da eksprimuje i/ili luči imunomodulatorne proteine opisane ovde u okruženju, npr. TME.
[1119] U nekim realizacijama, infektivni agens je bakterija koja je listeria sp., bifidobacterium sp., escherichia sp., clostridium sp., salmonella sp., shigella sp., vibrio sp. ili yersinia sp.. U nekim realizacijama, bakterija je izabrana iz jedne ili više od listeria monocytogenes, salmonella typhimurium, salmonella choleraesuis, escherichia coli, vibrio cholera, clostridium perfringens, clostridium butyricum, clostridium novyi, clostridium acetobutylicum, bifidobacterium infantis, bifidobacterium longum i bifidobacterium adolescentis. U nekim realizacijama, bakterija je veštački modifikovana bakterija. U nekim realizacijama, bakterija je veštački modifikovana bakterija kao što su one opisane u, npr. Seow and Wood (2009) Molecular Therapy 17(5):767‑777; Baban et al. (2010) Bioengineered Bugs 1:6, 385‑394; Patyar et al. (2010) J Biomed Sci 17:21; Tangney et al. (2010) Bioengineered Bugs 1:4, 284‑287; van Pijkeren et al. (2010) Hum Gene Ther. 21(4):405‑416; WO 2012/149364; WO 2014/198002; US 9103831; US 9453227; US 2014/0186401; US 2004/0146488; US 2011/0293705; US 2015/0359909 i EP 3020816. Bakterija može biti modifikovana da bi isporučila sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju bilo koji od varijantnih imunomodulatornih polipeptida, konjugata i/ili fuzija ovde datih, i/ili da bi ekspresovala takve varijante imunomodulatornih polipeptida kod subjekta.
[1121] IV. NUKLEINSKE KISELINE, VEKTORI I POSTUPCI ZA PROIZVODNJU POLIPEPTIDA ILI ĆELIJA
[1123] [0449] Ovde su date izolovane ili rekombinantne nukleinske kiseline, zajednički nazvane „nukleinske kiseline“, koje kodiraju bilo koje od različitih datih realizacija varijantnih ICOSL polipeptida ili imunomodulatornih polipeptida datih ovde. U nekim realizacijama, nukleinske kiseline date ovde, uključujući sve opisane u daljem tekstu, korisne su u rekombinantnoj proizvodnji (npr. ekspresiji) varijantnih ICOSL polipeptida ili imunomodulatornih polipeptida datih ovde. U nekim realizacijama, nukleinske kiseline date ovde, uključujući sve opisane u daljem tekstu, korisne su u ekspresiji varijanti ICOSL polipeptida ili imunomodulatornih polipeptida datih ovde u ćelijama, kao što su konstruisane ćelije, npr. imune ćelije ili ćelije infektivnog agensa. Nukleinske kiseline date ovde mogu biti u obliku RNK ili u obliku DNK, i uključuju mRNK, cRNK, rekombinantnu ili sintetičku RNK i DNK, i cDNK. Nukleinske kiseline date ovde su obično molekuli DNK, i obično dvolančani molekuli DNK. Međutim, takođe su date jednolančana DNK, jednolančana RNK, dvolančana RNK i hibridne DNK/RNK nukleinske kiseline ili njihove kombinacije koje sadrže bilo koju od nukleotidnih sekvenci pronalaska.
[1125] Takođe su ovde dati rekombinantni ekspresioni vektori i rekombinantne ćelije domaćina korisne u proizvodnji varijantnih ICOSL polipeptida ili imunomodulatornih polipeptida datih ovde.
[1127] Ovde su, takođe, date konstruisane ćelije, kao što su konstruisane imune ćelije, koje sadrže bilo koji od obezbeđenih molekula nukleinske kiseline ili bilo koji od varijantnih ICOSL polipeptida ili imunomodulatornih polipeptida, kao što je bilo koji od transmembranskih imunomodulatornih polipeptida ili sekretibilnih imunomodulatornih polipeptida.
[1129] Ovde su, takođe, dati infektivni agensi, kao što su bakterijske ili virusne ćelije, koje sadrže bilo koji od datih molekula nukleinske kiseline ili bilo koji od varijantnih ICOSL polipeptida ili imunomodulatornih polipeptida, kao što je bilo koji od transmembranskih imunomodulatornih polipeptida ili sekretibilnih imunomodulatornih polipeptida.
[1131] [0453] U bilo kojoj od gore datih realizacija, nukleinske kiseline koje kodiraju varijante polipeptida ili imunomodulatornih polipeptida datih ovde mogu se uvesti u ćelije korišćenjem rekombinantne DNK i tehnika kloniranja. Da bi se to uradilo, priprema se molekul rekombinantne DNK koji kodira imunomodulatorni polipeptid. Metode pripreme takvih molekula DNK su dobro poznate u tehnici. Na primer, sekvence koje kodiraju peptide mogu se iseći iz DNK korišćenjem odgovarajućih restrikcionih enzima. Alternativno, molekul DNK može se sintetizovati korišćenjem tehnika hemijske sinteze, kao što je fosforamiditna metoda. Takođe, može se koristiti kombinacija ovih tehnika. U nekim slučajevima, rekombinantna ili sintetička nukleinska kiselina može se generisati putem polimerazne lančane reakcije (PCR). U nekim realizacijama, može se generisati DNK umetak koji kodira jedan ili više varijanti ICOSL polipeptida koji sadrže najmanje jedan afinitetno modifikovani IgSF domen i, u nekim realizacijama, signalni peptid, transmembranski domen i/ili endodomen u skladu sa datim opisom. Ovaj DNK umetak može se klonirati u odgovarajući vektor transdukcije/transfekcije, kao što je poznato stručnjacima u tehnici. Takođe su dati ekspresioni vektori koji sadrže molekule nukleinskih kiselina.
[1133] U nekim realizacijama, ekspresioni vektori su sposobni da eksprimuju imunomodulatorne proteine u odgovarajućoj ćeliji pod uslovima pogodnim za ekspresiju proteina. U nekim aspektima, molekul nukleinske kiseline ili vektor ekspresije sadrži molekul DNK koji kodira imunomodulatorni protein operativno vezan sa odgovarajućim sekvencama za kontrolu ekspresije. Metode za sprovođenje ovog operativnog povezivanja, bilo pre ili nakon umetanja molekula DNK u vektor, dobro su poznate. Sekvence za kontrolu ekspresije uključuju promotere, aktivatore, pojačivače, operatore, mesta vezivanja ribozoma, start signale, stop signale, kep signale, signale poliadenilacije i druge signale uključene u kontrolu transkripcije ili translacije.
[1135] U nekim realizacijama, ekspresiju imunomodulatornog proteina kontroliše promotor ili pojačivač radi kontrole ili regulacije ekspresije. Promotor je operativno vezan sa delom molekula nukleinske kiseline koji kodira varijantni polipeptid ili imunomodulatorni protein. U nekim realizacijama, promotor je konstitutivno aktivni promotor (kao što je tkivno specifičan konstitutivno aktivni promotor ili drugi konstitutivni promotor). U nekim realizacijama, promotor je inducibilni promotor, koji može biti osetljiv na indukujući agens (kao što je signal aktivacije T ćelija).
[1137] U nekim realizacijama, konstitutivni promotor je operativno vezan sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira varijantni polipeptid ili imunomodulatorni protein. Primeri konstitutivnih promotora uključuju promotor virusa vakuolacije majmuna 40 (SV40), promotor citomegalovirusa (CMV), promotor ubikvitina C (UbC) i promotor EF-1 alfa (EF1a). U nekim realizacijama, konstitutivni promotor je specifičan za tkivo. Na primer, u nekim realizacijama, promotor omogućava konstitutivnu ekspresiju imunomodulatornog proteina u specifičnim tkivima, kao što su imune ćelije, limfociti ili T ćelije. Primeri promotora specifičnih za tkivo su opisani u U.S. Patentu br. 5,998,205, uključujući, na primer, fetoprotein, DF3, tirozinazu, CEA, surfaktantski protein i ErbB2 promotere.
[1139] [0457] U nekim realizacijama, inducibilni promotor je operativno vezan sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira varijantni polipeptid ili imunomodulatorni protein tako da je ekspresija nukleinske kiseline kontrolisana kontrolom prisustva ili odsustva odgovarajućeg induktora transkripcije. Na primer, promotor može biti regulisani sistem ekspresije promotora i transkripcionog faktora, kao što su objavljeni sistemi regulisani tetraciklinom ili drugi regulabilni sistemi (videti, npr. objavljeni Međunarodnu PCT prijavu br. WO 01/30843), kako bi se omogućila regulisana ekspresija kodiranog polipeptida. Primer regulisanog promoterskog sistema je Tet-On (i Tet-Off) sistem dostupan, na primer, od kompanije Clontech (Palo Alto, Kalifornija). Ovaj promoterski sistem omogućava regulisanu ekspresiju transgena kontrolisanu tetraciklinom ili derivatima tetraciklina, kao što je doksiciklin. Poznati su i drugi regulisani promoterski sistemi (videti npr. objavljeno U.S. prijavi br. 2002-0168714, pod nazivom „Regulation of Gene Expression Using Single-Chain, Monomeric, Ligand Dependent Polypeptide Switches“, koji opisuje genske prekidače koji sadrže domene za vezivanje liganda i domene za regulaciju transkripcije, kao što su oni iz hormonskih receptora).
[1141] U nekim realizacijama, promotor reaguje na element koji reaguje na signalizaciju aktivacije T-ćelija. Samo kao primer, u nekim realizacijama, genetski modifikovana T ćelija sadrži ekspresioni vektor koji kodira imunomodulatorni protein i promotor operativno vezan sa kontrolom ekspresije imunomodulatornog proteina. Genetski modifikovana T ćelija može biti aktivirana, na primer, signalizacijom putem genetski modifikovanog T ćelijskog receptora (TCR) ili himernog antigenskog rektora (CAR), i time pokreće ekspresiju i sekreciju imunomodulatornog proteina putem genetski modifikovanog promotora.
[1143] [0459] U nekim realizacijama, inducibilni promotor je operativno vezan sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira imunomodulatorni protein tako da se imunomodulatorni protein eksprimuje kao odgovor na nuklearni faktor aktiviranih T-ćelija (NFAT) ili pojačivač kapa-lakog lanca nuklearnog faktora aktiviranih B ćelija (NF-κB). Na primer, u nekim realizacijama, inducibilni promotor sadrži mesto vezivanja za NFAT ili NF-κB. Na primer, u nekim realizacijama, promotor je NFAT ili NF-κB promotor ili njegova funkcionalna varijanta. Dakle, u nekim realizacijama, nukleinske kiseline omogućavaju kontrolu ekspresije imunomodulatornog proteina, a istovremeno smanjuju ili eliminišu toksičnost imunomodulatornog proteina. Konkretno, konstruisane imune ćelije koje sadrže nukleinske kiseline pronalaska eksprimuju i luče imunomodulatorni protein samo kada je ćelija (npr. T-ćelijski receptor (TCR) ili himerni antigenski receptor (CAR) koji eksprimuje ćelija) specifično stimulisana antigenom i/ili je ćelija (npr. kalcijumski signalni put ćelije) nespecifično stimulisana, npr. forbol miristat acetatom (PMA)/jonomicinom. Shodno tome, ekspresija i, u nekim slučajevima, sekrecija imunomodulatornog proteina mogu se kontrolisati tako da se dešavaju samo kada i gde je to potrebno (npr. u prisustvu agensa koji izaziva infektivnu bolest, raka ili na mestu tumora), što može smanjiti ili izbeći neželjene interakcije imunomodulatornih proteina.
[1145] U nekim realizacijama, nukleinska kiselina koja kodira imunomodulatorni protein opisan ovde sadrži odgovarajuću nukleotidnu sekvencu koja kodira NFAT promotor, NF-κB promotor ili njegovu funkcionalnu varijantu. „NFAT promotor“, kako se ovde koristi, označava jedan ili više NFAT elemenata koji reaguju povezane sa minimalnim promotorom. „NF-κB promotor“ se odnosi na jedan ili više NF-κB elemenata koji reaguju povezane sa minimalnim promotorom. U nekim realizacijama, minimalni promotor gena je minimalni humani IL-2 promotor ili CMV promotor. NFAT elementi koji reaguju mogu da sadrže, npr. NFAT1, NFAT2, NFAT3 i/ili NFAT4 elemente. NFAT promotor, NF-κB promotor ili njegova funkcionalna varijanta mogu da sadrže bilo koji broj motiva vezivanja, npr. najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet ili najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet, najmanje deset, najmanje jedanaest ili do dvanaest motiva vezivanja.
[1147] Dobijeni rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži molekul DNK koristi se za transformaciju odgovarajućeg domaćina. Ova transformacija se može izvršiti korišćenjem metoda dobro poznatih u tehnici. U nekim realizacijama, nukleinska kiselina koja je ovde data dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira sekretorni ili signalni peptid operativno vezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira imunomodulatorni polipeptid tako da se rezultujući rastvorljivi imunomodulatorni polipeptid izoluje iz podloge za kultivaciju, ćelije domaćina ili periplazme ćelije domaćina. U drugim realizacijama, odgovarajući signali za kontrolu ekspresije su odabrani da bi se omogućila membranska ekspresija imunomodulatornog polipeptida. Štaviše, komercijalno dostupni kompleti, kao i kompanije za ugovornu proizvodnju, takođe se mogu koristiti za pravljenje konstruisanih ćelija ili rekombinantnih ćelija domaćina koje su ovde date.
[1149] [0462] U nekim realizacijama, rezultujući vektor ekspresije koji sadrži molekul DNK koristi se za transformaciju, kao što je transdukcija, odgovarajuće ćelije. Unošenje se može izvršiti korišćenjem metoda dobro poznatih u tehnici. Primeri metoda uključuju one za prenos nukleinskih kiselina koje kodiraju receptore, uključujući putem virusne, npr. retrovirusne ili lentivirusne, transdukcije, transpozona i elektroporacije. U nekim realizacijama, vektor ekspresije je virusni vektor. U nekim realizacijama, nukleinska kiselina se prenosi u ćelije lentivirusnim ili retrovirusnim metodama transdukcije.
[1151] Bilo koja od velikog broja javno dostupnih i dobro poznatih ćelija domaćina sisara, uključujući T-ćelije sisara ili APC, može se koristiti u pripremi polipeptida ili genetski modifikovanih ćelija. Izbor ćelije zavisi od brojnih faktora koje stručnjaci prepoznaju. To uključuje, na primer, kompatibilnost sa izabranim vektorom ekspresije, toksičnost peptida koje kodira molekul DNK, brzinu transformacije, lakoću oporavka peptida, karakteristike ekspresije, biološku bezbednost i troškove. Ravnoteža ovih faktora mora se postići uz razumevanje da nisu sve ćelije podjednako efikasne za ekspresiju određene sekvence DNK.
[1153] U nekim realizacijama, ćelije domaćini mogu biti razne eukariotske ćelije, kao što su ćelije kvasca, ili sa ćelijama sisara kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili HEK293 ćelije. U nekim realizacijama, ćelija domaćin je suspenziona ćelija, a polipeptid je konstruisan ili proizveden u kultivisanoj suspenziji, kao što su kultivisane suspenzione CHO ćelije, npr. CHO-S ćelije. U nekim primerima, ćelijska linija je CHO ćelijska linija koja je deficijentna u DHFR (DHFR-), kao što su DG44 i DUXB11. U nekim realizacijama, ćelija je deficijentna u glutamin sintazi (GS), npr. CHO-S ćelije, CHOK1 SV ćelije i CHOZN((R)) GS-/- ćelije. U nekim realizacijama, CHO ćelije, kao što su suspenzione CHO ćelije, mogu biti CHO-S-2H2 ćelije, CHO-S-klon 14 ćelije ili ExpiCHO-S ćelije.
[1155] U nekim realizacijama, ekspresija obezbeđenih ICOSL polipeptida iz CHO ćelija rezultira homogenijim sastavom proizvedenih proteina. U nekim realizacijama, obezbeđeni ICOSL polipeptidi rezultiraju homogenijim proizvodom kada se proteini eksprimuju iz CHO ćelija u poređenju sa ICOSL polipeptidima koji sadrže punu ECD referentnu sekvencu i/ili sadrže mesto cepanja proteaze (npr. LQQN/LT). U nekim realizacijama, najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sastava proizvedenih proteina koji sadrže ICOSL varijantni polipeptid proizveden ovde, imaju istu dužinu amino-kiselina ili su iste veličine. Tehnike za procenu homogenosti veličine uključuju visokoefikasnu tečnu hromatografiju (HPLC), hromatografiju isključivanja veličine, SDS pagiranje ili sekvenciranje.
[1157] [0466] U nekim realizacijama, ćelije domaćina mogu biti i prokariotske ćelije, kao što su e. koli. Transformisani rekombinantni domaćin se kultiviše pod uslovima ekspresije polipeptida, a zatim prečišćava da bi se dobio rastvorljivi protein. Rekombinantne ćelije domaćina mogu se kultivisati pod konvencionalnim uslovima fermentacije tako da se željeni polipeptidi eksprimuju. Takvi uslovi fermentacije su dobro poznati u tehnici. Konačno, polipeptidi koji su ovde dati mogu se regenerisati i prečistiti iz rekombinantnih ćelijskih kultura bilo kojom od brojnih metoda dobro poznatih u tehnici, uključujući taloženje amonijum sulfatom ili etanolom, ekstrakciju kiselinom, anjonsku ili katjonsku izmenjivačku hromatografiju, fosfoceluloznu hromatografiju, hidrofobnu interakcionu hromatografiju i afinitetnu hromatografiju. Koraci ponovnog savijanja proteina mogu se koristiti, po želji, za završetak konfiguracije zrelog proteina. Konačno, visokoefikasna tečna hromatografija (HPLC) može se koristiti u završnim koracima prečišćavanja.
[1159] U nekim realizacijama, ćelija je imuna ćelija, kao što je bilo koja gore opisana u vezi sa pripremom konstruisanih ćelija. U nekim realizacijama, takve konstruisane ćelije su primarne ćelije. U nekim realizacijama, konstruisane ćelije su autologne za subjekta. U nekim realizacijama, konstruisane ćelije su alogene za subjekta. U nekim realizacijama, konstruisane ćelije se dobijaju od subjekta, kao što je leukafereza, i transformišu se ex vivo za ekspresiju imunomodulatornog polipeptida, npr. transmembranskog imunomodulatornog polipeptida ili sekretibilnog imunomodulatornog polipeptida.
[1161] Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koji od varijantnih imunomodulatornih polipeptida sadržanih u infektivnim agensima opisanim ovde. U nekim realizacijama, infektivni agensi isporučuju nukleinske kiseline do ćelije kod subjekta i/ili omogućavaju ekspresiju kodiranih varijantnih polipeptida u ćeliji. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje se koriste za generisanje, proizvodnju ili modifikaciju takvih infektivnih agenasa. Na primer, u nekim realizacijama, obezbeđeni su vektori i/ili plazmidi koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida, za generisanje infektivnih agenasa, isporuku do ćelija kod subjekta i/ili ekspresiju varijanti imunomodulatornih polipeptida u ćelijama kod subjekta.
[1163] [0469] U nekim realizacijama, obezbeđene nukleinske kiseline su rekombinantni virusni ili bakterijski vektori koji sadrže sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida. U nekim realizacijama, rekombinantni vektori se mogu koristiti za proizvodnju infektivnog agensa koji sadrži sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida i/ili za isporuku ciljnoj ćeliji kod subjekta radi ekspresije od strane ciljne ćelije. U nekim realizacijama, rekombinantni vektor je ekspresioni vektor. U nekim realizacijama, rekombinantni vektor uključuje odgovarajuće sekvence neophodne za generisanje i/ili proizvodnju infektivnog agensa i ekspresiju u ciljnoj ćeliji.
[1165] U nekim realizacijama, rekombinantni vektor je plazmid ili kozmid. Plazmid ili kozmid koji sadrži sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju varijante imunomodulatornih polipeptida, kao što je ovde opisano, lako se konstruiše korišćenjem standardnih tehnika dobro poznatih u tehnici. Za generisanje infektivnog agensa, vektor ili genom može biti konstruisan u plazmidnom obliku koji se zatim može transfektovati u ćelijsku liniju za pakovanje ili proizvođača ili u bakteriju domaćina. Rekombinantni vektori mogu biti generisani korišćenjem bilo koje od rekombinantnih tehnika poznatih u tehnici. U nekim realizacijama, vektori mogu da uključuju prokariotski početak replikacije i/ili gen čija ekspresija daje detektabilan ili selektivan marker, kao što je otpornost na lekove za razmnožavanje i/ili selekciju u prokariotskim sistemima.
[1167] U nekim realizacijama, rekombinantni vektor je virusni vektor. Primeri rekombinantnih virusnih vektora uključuju genom lentivirusnog vektora, genom vektora poksvirusa, genom vektora virusa vakcinije, genom vektora adenovirusa, genom vektora virusa vezanog sa adenovirusom, genom vektora virusa herpesa i genom vektora alfa virusa. Virusni vektori mogu biti živi, atenuirani, replikacijski uslovni ili replikacijski deficijentni, nepatogeni (defektni), replikacijski kompetentni virusni vektori i/ili su modifikovani da eksprimuju heterologni genski proizvod, npr. varijante imunomodulatornih polipeptida date ovde. Vektori za generisanje virusa, takođe, mogu biti modifikovani da bi se promenilo atenuiranje virusa, što uključuje bilo koju metodu povećanja ili smanjenja transkripcionog ili translacionog opterećenja.
[1169] [0472] Primeri virusnih vektora koji se mogu koristiti uključuju modifikovane vektore virusa vakcinije (videti, npr. Guerra et al., J. Virol. 80:985‑98 (2006); Tartaglia et al., AIDS Research and Human Retroviruses 8: 1445‑47 (1992); Gheradi et al., J. Gen. Virol.86:2925‑36 (2005); Mayr et al., Infection 3:6‑14 (1975); Hu et al., J. Virol.75: 10300‑308 (2001); U.S. Patent br.5,698,530, 6,998,252, 5,443,964, 7,247,615 i 7,368,116); adenovirusne vektore ili vektore virusa povezanih sa adenovirusom (videti, npr. Molin et al., J. Virol.72:8358‑61 (1998); Narumi et al., Am J. Respir. Cell Mol. Biol.19:936‑41 (1998); Mercier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6188‑93 (2004); U.S. Patent br. 6,143,290; 6,596,535; 6,855,317; 6,936,257; 7,125,717; 7,378,087; 7,550,296); retrovirusne vektore, uključujući one zasnovane na virusu mišje leukemije (MuLV), virusu leukemije gibonskih majmuna (GaLV), ekotropnim retrovirusima, virusu imunodeficijencije majmuna (SIV), virusu humane imunodeficijencije (HIV) i kombinacijama (videti, npr. Buchscher et al., J. Virol.66:2731‑39 (1992); Johann et al., J. Virol.66: 1635‑40 (1992); Sommerfelt et al., Virology 176:58‑59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374‑78 (1989) ; Miller et al., J. Virol.
[1170] 65:2220‑24 (1991); Miller et al., Mol. Cell Biol. 10:4239 (1990); Kolberg, NIH Res. 4:43 1992; Cornetta et al., Hum. Gene Ther. 2:215 (1991)); lentivirusne vektore, uključujući one zasnovane na virusu humane imunodeficijencije (HIV-1), HIV-2, virusu mačje imunodeficijencije (FIV), virusu infektivne anemije konja, virusu majmunske imunodeficijencije (SIV) i virusu maedi/visna (videti, npr. Pfeifer et al., Annu. Rev. Genomics Hum. Genet.2: 177‑211 (2001); Zufferey et al., J. Virol. 72: 9873, 1998; Miyoshi et al., J. Virol. 72:8150, 1998; Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Engelman et al., J. Virol. 69: 2729, 1995; Nightingale et al., Mol. Therapy, 13: 1121, 2006; Brown et al., J. Virol. 73:9011 (1999); WO 2009/076524; WO 2012/141984; WO 2016/011083; McWilliams et al., J. Virol. 77: 11150, 2003; Powell et al., J. Virol. 70:5288, 1996) ili bilo koje njihove varijante, i/ili vektore koji se mogu koristiti za generisanje bilo kog od gore opisanih virusa. U nekim realizacijama, rekombinantni vektor može da uključuje regulatorne sekvence, kao što su promotorske ili enhanser sekvence, koje mogu da regulišu ekspresiju virusnog genoma, kao što je slučaj sa RNK virusima, u ćelijskoj liniji za pakovanje (videti, npr. U.S. Patent br.5,385,839 i 5,168,062).
[1172] U nekim realizacijama, rekombinantni vektor je ekspresioni vektor, npr. ekspresioni vektor koji omogućava ekspresiju kodiranog genskog proizvoda kada se isporuči u ciljnu ćeliju, npr. ćeliju kod subjekta, npr. tumorsku ćeliju, imunsku ćeliju i/ili aktivnu parenteritnu ćeliju (APC). U nekim realizacijama, rekombinantni ekspresioni vektori koji su u infektivnom agensu sposobni su da eksprimuju imunomodulatorne proteine u ciljnoj ćeliji kod subjekta, pod uslovima pogodnim za ekspresiju proteina.
[1174] [0474] U nekim aspektima, nukleinske kiseline ili vektor ekspresije sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira imunomodulatorni protein operativno povezan sa odgovarajućim sekvencama za kontrolu ekspresije. Metode koje utiču na ovo operativno povezivanje, bilo pre ili nakon što se sekvenca nukleinske kiseline koja kodira imunomodulatorni protein ubaci u vektor, dobro su poznate. Sekvence za kontrolu ekspresije uključuju promotere, aktivatore, pojačivače, operatore, mesta vezivanja ribozoma, start signale, stop signale, kap signale, signale poliadenilacije i druge signale koji su uključeni u kontrolu transkripcije ili translacije. Promotor može biti operativno vezan sa delom sekvence nukleinske kiseline koji kodira imunomodulatorni protein. U nekim realizacijama, promotor je konstitutivno aktivni promotor u ciljnoj ćeliji (kao što je konstitutivno aktivni promotor specifičan za tkivo ili drugi konstitutivni promotor). Na primer, rekombinantni vektor ekspresije može, takođe, da uključuje transkripcione regulatorne elemente specifične za limfoidno tkivo (TRE) kao što su B limfocit, T limfocit ili TRE specifičan za dendritske ćelije. TRE specifični za limfoidno tkivo su poznati u tehnici (videti, npr. Thompson et al., Mol. Cell. Biol. 12:1043‑53 (1992); Todd et al., J. Exp. Med.177:1663‑74 (1993); Penix et al., J. Exp. Med.
[1175] 178:1483‑96 (1993)). U nekim realizacijama, promotor je inducibilni promotor, koji može biti osetljiv na indukujući agens (kao što je signal aktivacije T ćelija). U nekim realizacijama, nukleinske kiseline dostavljene ciljnoj ćeliji kod subjekta, npr. tumorskoj ćeliji, imunskoj ćeliji i/ili APC, mogu biti operativno povezane sa bilo kojim od gore opisanih regulatornih elemenata.
[1177] U nekim realizacijama, vektor je bakterijski vektor, npr. bakterijski plazmid ili kozmid. U nekim realizacijama, bakterijski vektor se isporučuje ciljnoj ćeliji, npr. tumorskim ćelijama, imunim ćelijama i/ili APC, putem bakterijski posredovanog transfera plazmidne DNK u ćelije sisara (takođe poznato kao „baktofekcija“). U nekim realizacijama, isporučeni bakterijski vektor, takođe, sadrži odgovarajuće sekvence za kontrolu ekspresije u ciljnim ćelijama, kao što su promoterska sekvenca i/ili enhanserske sekvence, ili bilo koje regulatorne ili kontrolne sekvence opisane gore. U nekim realizacijama, bakterijski vektor sadrži odgovarajuće sekvence za kontrolu ekspresije za ekspresiju i/ili sekreciju kodiranih varijantnih polipeptida u infektivnom agensu, npr. bakteriji.
[1179] U nekim realizacijama, polipeptidi koji su ovde dati mogu se, takođe, napraviti sintetičkim metodama. Sinteza u čvrstoj fazi je poželjna tehnika za pravljenje pojedinačnih peptida, jer je to najisplativiji metod za pravljenje malih peptida. Na primer, dobro poznate tehnike sinteze u čvrstoj fazi uključuju upotrebu zaštitnih grupa, linkera i nosača u čvrstoj fazi, kao i specifične uslove reakcije zaštite i deprotekcije, uslove cepanja linkera, upotrebu hvatača i druge aspekte sinteze peptida u čvrstoj fazi. Peptidi se zatim mogu sastaviti u polipeptide kao što je ovde dato.
[1181] V. POSTUPCI PROCENE AKTIVNOSTI IMUNOMODULACIJE VARIJANTNIH ICOSL POLIPEPTIDA I IMUNOMODULATORNIH PROTEINA
[1183] [0477] U nekim realizacijama, varijante ICOSL polipeptida date ovde (npr. fragmenti ili konjugati pune dužine i/ili specifičnog vezivanja, njihove konstrukcije ili fuzija) pokazuju imunomodulatornu aktivnost za modulaciju aktivacije T ćelija. U nekim realizacijama, ICOSL polipeptidi moduliraju ekspresiju IFN-γ u primarnom testu T ćelija u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili kontrolni ICOSL divljeg tipa. U nekim slučajevima, modulacija ekspresije IFN-γ može povećati ili smanjiti ekspresiju IFN-γ u odnosu na kontrolu. Testovi za određivanje specifičnog vezivanja i ekspresije IFN-γ su dobro poznati u tehnici i uključuju MLR (mešana limfocitna reakcija) testove koji mere nivoe citokina interferon-γ u supernatantima kulture (Wang et al., Cancer Immunol Res. 2014 Sep: 2(9):846‑56), test stimulacije T ćelija SEB (stafilokokni enterotoksin B) (Wang et al., Cancer Immunol Res.2014 Sep: 2(9):846‑56), i testovi stimulacije T ćelija protiv CD3 (Li and Kurlander, J Transl Med.2010: 8: 104).
[1185] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida može u nekim realizacijama povećati ili, u alternativnim realizacijama, smanjiti ekspresiju IFN-γ (interferon-γ) u primarnom T-ćelijskom testu u odnosu na kontrolu divljeg tipa ICOSL. U nekim realizacijama obezbeđenih polipeptida koji sadrže rastvorljivu varijantnu ICOSL sekvencu, polipeptid može povećati ekspresiju IFN-γ i, u alternativnim realizacijama, smanjiti ekspresiju IFN-γ u primarnom T-ćelijskom testu u odnosu na kontrolu divljeg tipa ICOSL. U nekim realizacijama obezbeđenih polipeptida koji sadrže više varijantnih ICOSL sekvenci, polipeptid može povećati ekspresiju IFN-γ i, u alternativnim realizacijama, smanjiti ekspresiju IFN-γ u primarnom T-ćelijskom testu u odnosu na kontrolu divljeg tipa ICOSL.
[1187] Stručnjaci će prepoznati da se format primarnog T-ćelijskog testa koji se koristi za određivanje povećanja ekspresije IFN-γ može razlikovati od onog koji se koristi za ispitivanje smanjenja ekspresije IFN-γ. Prilikom ispitivanja sposobnosti varijante ICOSL da smanji ekspresiju IFN-γ u primarnom T-ćelijskom testu, može se koristiti test reakcije mešovitih limfocita (MLR) kao što je opisano u Primeru 6. U nekim slučajevima, rastvorljivi oblik varijante ICOSL može se koristiti za određivanje sposobnosti varijante ICOSL da antagonizuje i time smanji ekspresiju IFN-γ u MLR kao što je, takođe, opisano u Primeru 6.
[1189] [0480] Alternativno, u ispitivanju sposobnosti varijante ICOSL da poveća ekspresiju IFN-γ u primarnom testu T-ćelija, može se koristiti test koimobilizacije kao što je opisano u Primeru 6. U testu koimobilizacije, TCR signal, koji u nekim realizacijama obezbeđuje anti-CD3 antitelo, koristi se zajedno sa koimobilizovanom varijantom ICOSL da bi se odredila sposobnost povećanja ekspresije IFN-γ u odnosu na kontrolu ICOSL. U nekim slučajevima, rastvorljivi oblik varijante ICOSL koji je multimerizovan do stepena da obezbedi multivalentno vezivanje može se koristiti za određivanje sposobnosti varijante ICOSL da agonizuje i time poveća ekspresiju IFN-γ u MLR kao što je, takođe, opisano u Primeru 6.
[1191] U nekim realizacijama, prilikom ispitivanja sposobnosti varijante ICOSL da modulira povećanje ili smanjenje ekspresije IFN-γ, može se koristiti test reportera T ćelija. U nekim realizacijama, T ćelija je Jurkat T ćelijska linija ili je izvedena iz Jurkat T ćelijskih linija. U testovima reportera, linija reportera (npr. Jurkat reporterska ćelija) se, takođe, generiše da prekomerno eksprimuje inhibitorni receptor koji je srodni partner za vezivanje domena polipeptida varijante IgSF. U nekim realizacijama, reporter T ćelije takođe sadrže reportersku konstrukciju koja sadrži inducibilni promotor koji reaguje na aktivaciju T ćelija operativno vezanu sa reporterom. U nekim realizacijama, reporter je fluorescentni ili luminescentni reporter. U nekim realizacijama, reporter je luciferaza. U nekim realizacijama, promotor reaguje na CD3 signalizaciju. U nekim realizacijama, promotor je NFAT promotor. U nekim realizacijama, promotor reaguje na kostimulativnu signalizaciju, npr. CD28 kostimulativnu signalizaciju. U nekim realizacijama, promotor je IL-2 promotor.
[1193] U aspektima reporterskog testa, reporterska ćelijska linija se stimuliše, kao što je koinkubacija sa ćelijama koje prezentuju antigen (APC) i koje eksprimuju ligand divljeg tipa inhibitornog receptora, npr. ICOSL. U nekim realizacijama, APC su veštačke APC. Veštačke APC su dobro poznate stručnjaku. U nekim realizacijama, veštačke APC su izvedene iz jedne ili više ćelijskih linija sisara, kao što su ćelije K562, CHO ili 293.
[1195] [0483] U nekim realizacijama, Jurkat reporter ćelije se koinkubiraju sa veštačkim APC koje prekomerno eksprimuju inhibitorni ligand u prisustvu molekula domena varijante IgSF ili imunomodulatornog proteina, npr. varijante ICOSL polipeptida ili imunomodulatornog proteina. U nekim realizacijama, ekspresija reportera se prati, kao što je određivanje luminescencije ili fluorescencije ćelija. U nekim realizacijama, normalne interakcije između njegovog inhibitornog receptora i liganda rezultiraju represijom ili smanjenjem reporterskog signala, kao u poređenju sa kontrolom, npr. ekspresija reportera koinkubacijom kontrolnih T ćelija i APC kod kojih interakcija inhibitornog receptora i liganda nije prisutna, npr. APC koje ne prekomerno eksprimuju ICOSL. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida ili imunomodulatornog proteina data ovde antagonizuje interakciju, npr. kada je data u rastvorljivom obliku kao varijanta ICOSL-Fc ili kada je eksprimovana iz APC kao sekretibilni imunomodulatorni protein, što rezultira povećanjem reporterskog signala u poređenju sa odsustvom varijante ICOSL polipeptida ili imunomodulatornog proteina. U nekim slučajevima, određeni formati varijante ICOSL polipeptida ili imunomodulatornog proteina kao što je ovde dato mogu pružiti agonističku aktivnost, čime se smanjuje ekspresija reportera u poređenju sa odsustvom varijante ICOSL polipeptida ili imunomodulatornog proteina.
[1197] Upotreba odgovarajućih kontrola je poznata stručnjacima u tehnici, međutim, u gore navedenim realizacijama, kontrola obično uključuje upotrebu referentnog ICOSL, kao što je divlji tip nativne ICOSL izoforme od iste vrste sisara iz koje je izvedena ili razvijena varijanta ICOSL. Bez obzira na to da li je afinitet vezivanja za jedan ili oba, ICOS i CD28, povećan ili smanjen, varijanta ICOSL u nekim realizacijama će povećati ekspresiju IFN-γ, a u alternativnim realizacijama će smanjiti ekspresiju IFN-γ u primarnom T-ćelijskom testu u odnosu na kontrolu divljeg tipa ICOSL.
[1199] U nekim realizacijama, varijanta ICOSL povećava ekspresiju IFN-gama (tj. ekspresiju proteina) u odnosu na referentni (npr. nemodifikovani) ili kontrolni ICOSL divljeg tipa za najmanje: 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više. U drugim realizacijama, varijanta ICOSL smanjuje ekspresiju IFN-gama (tj. ekspresiju proteina) u odnosu na kontrolni ICOSL divljeg tipa ili nemodifikovani za najmanje: 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više. U nekim realizacijama, kontrolni ICOSL divljeg tipa je mišji ICOSL, kakav bi se obično koristio za varijantu ICOSL izmenjene sekvence u odnosu na sekvencu mišjeg ICOSL divljeg tipa. U nekim realizacijama, kontrola divljeg tipa ICOSL je humani ICOSL, kao što bi se obično koristilo za varijantu ICOSL izmenjenu u sekvenci u odnosu na sekvencu divljeg tipa humanog ICOSL, kao što je ICOSL sekvenca koja sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO:32 ili SEQ ID NO:196 ili 545.
[1201] VI. FARMACEUTSKE FORMULACIJE
[1203] [0486] Ovde su date kompozicije koje sadrže bilo koji od varijantnih ICOSL polipeptida, imunomodulatornih proteina, konjugata, konstruisanih ćelija ili infektivnih agenasa opisanih ovde. Farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. Na primer, farmaceutska kompozicija može da sadrži jedan ili više ekscipijenata za modifikovanje, održavanje ili očuvanje, na primer, pH vrednosti, osmolarnosti, viskoznosti, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, adsorpcije ili penetracije kompozicije. U nekim aspektima, stručnjak razume da se farmaceutska kompozicija koja sadrži ćelije može razlikovati od farmaceutske kompozicije koja sadrži protein.
[1205] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija je čvrsta supstanca, kao što je prah, kapsula ili tableta. Na primer, komponente farmaceutske kompozicije mogu biti liofilizovane. U nekim realizacijama, čvrsta farmaceutska kompozicija se rekonstituiše ili rastvara u tečnosti pre primene.
[1207] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija je tečnost, na primer, varijanta ICOSL polipeptida rastvorena u vodenom rastvoru (kao što je fiziološki rastvor ili Ringerov rastvor). U nekim realizacijama, pH farmaceutske kompozicije je između oko 4.0 i oko 8.5 (kao što je između oko 4.0 i oko 5.0, između oko 4.5 i oko 5.5, između oko 5.0 i oko 6.0, između oko 5.5 i oko 6.5, između oko 6.0 i oko 7.0, između oko 6.5 i oko 7.5, između oko 7.0 i oko 8.0 ili između oko 7.5 i oko 8.5).
[1209] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, na primer punilo, vezivo, premaz, konzervans, lubrikant, sredstvo za poboljšanje ukusa, zaslađivač, sredstvo za bojenje, rastvarač, pufer, helat ili stabilizator. Primeri farmaceutski prihvatljivih punila uključuju celulozu, dibazni kalcijum fosfat, kalcijum karbonat, mikrokristalnu celulozu, saharozu, laktozu, glukozu, manitol, sorbitol, maltol, preželatinizovani skrob, kukuruzni skrob ili skrob od krompira. Primeri farmaceutski prihvatljivih veziva uključuju polivinilpirolidon, skrob, laktozu, ksilitol, sorbitol, maltitol, želatin, saharozu, polietilen glikol, metil celulozu ili celulozu. Primeri farmaceutski prihvatljivih premaza uključuju hidroksipropil metilcelulozu (HPMC), šelak, zein kukuruznog proteina ili želatin. Primeri farmaceutski prihvatljivih dezintegranata uključuju polivinilpirolidon, karboksimetil celulozu ili natrijum skrob glikolat. Primeri farmaceutski prihvatljivih lubrikanata uključuju polietilen glikol, magnezijum stearat ili stearinsku kiselinu. Primeri farmaceutski prihvatljivih konzervansa uključuju metil parabene, etil parabene, propil paraben, benzojevu kiselinu ili sorbinsku kiselinu. Primeri farmaceutski prihvatljivih zaslađivača uključuju saharozu, saharin, aspartam ili sorbitol. Primeri farmaceutski prihvatljivih puferskih sredstava uključuju karbonate, citrate, glukonate, acetate, fosfate ili tartrate.
[1210] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija dalje sadrži sredstvo za kontrolisano ili produženo oslobađanje proizvoda, kao što su injekcione mikrosfere, bio-erodibilne čestice, polimerna jedinjenja (polimlečna kiselina, poliglikolna kiselina), perle ili lipozomi.
[1212] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija je sterilna. Sterilizacija se može postići filtracijom kroz sterilne filtracione membrane ili zračenjem. Kada je kompozicija liofilizovana, sterilizacija korišćenjem ove metode može se sprovesti pre ili nakon liofilizacije i rekonstitucije. Kompozicija za parenteralnu primenu može se čuvati u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Pored toga, parenteralne kompozicije se generalno stavljaju u posudu koja ima sterilni pristupni otvor, na primer, kesu ili bočicu za intravenski rastvor sa čepom koji se može probušiti iglom za hipodermičku injekciju.
[1214] U nekim realizacijama, obezbeđene su farmaceutske kompozicije koje sadrže transmembranske imunomodulatorne proteine, uključujući konstruisane ćelije koje eksprimuju takve transmembranske imunomodulatorne proteine. U nekim realizacijama, farmaceutske kompozicije i formulacije uključuju jedan ili više opcionih farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenata. Takve kompozicije mogu da sadrže pufere kao što su neutralni puferovani fiziološki rastvor, fosfatno puferovani fiziološki rastvor i slično; ugljene hidrate kao što su glukoza, manoza, saharoza ili dekstran, manitol; proteine; polipeptide ili amino-kiseline kao što je glicin; antioksidante; helatna sredstva kao što su EDTA ili glutation; adjuvanse (npr. aluminijum hidroksid); i konzervanse. Kompozicije predmetnog pronalaska su poželjno formulisane za intravensku primenu.
[1216] [0493] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija sadrži infektivne agense koji sadrže sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju imunomodulatorne varijantne polipeptide. U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija sadrži dozu infektivnih agenasa pogodnu za davanje subjektu koji je pogodan za lečenje. U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija sadrži infektivni agens koji je virus, u jednokratnoj ili višestrukoj količini doze, između, između oko ili oko 1×10<5>i oko 1×10<12>jedinice koje formiraju plak (pfu), 1×10<6>i 1×10<10>pfu, ili 1×10<7>i 1×10<10>pfu, uključujući svaku, kao što je najmanje ili najmanje oko ili oko 1×10<6>, 1×10<7>, 1×10<8>, 1×10<9>, 2×10<9>, 3×10<9>, 4×10<9>, 5×10<9>pfu ili oko 1×10<10>pfu. U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija može da sadrži koncentraciju virusa od ili od oko 10<5>do oko 10<10>pfu/ml, na primer, 5×10<6>do 5×10<9>ili 1×10<7>do 1×10<9>pfu/mL, kao što je najmanje ili najmanje oko ili oko 10<6>pfu/ml, 10<7>pfu/ml, 10<8>pfu/ml ili 10<9>pfu/mL. U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija sadrži infektivni agens koji je bakterija, u jednokratnoj ili višestrukoj doznoj količini, između, između oko ili oko 1×10<3>i oko 1×10<9>jedinice koje formiraju kolonije (cfu), 1×10<4>i 1×10<9>cfu, ili 1×10<5>i 1×10<7>cfu, svaka inkluzivno, kao što je najmanje ili najmanje oko ili oko 1×10<4>, 1×10<5>, 1×10<6>, 1×10<7>, 1×10<8>ili 1×10<9>cfu. U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija može da sadrži koncentraciju bakterija od ili od oko 10<3>do oko 10<8>cfu/ml, na primer, 5×10<5>do 5×10<7>ili 1×10<6>do 1×10<7>cfu/mL, kao što je najmanje ili najmanje oko ili oko 10<5>cfu/ml, 10<6>cfu/ml, 10<7>cfu/ml ili 10<8>cfu/ml.
[1218] Takva formulacija može, na primer, biti u obliku pogodnom za intravenoznu infuziju. Farmaceutski prihvatljiv nosač može biti farmaceutski prihvatljiv materijal, kompozicija ili sredstvo koje je uključeno u prenošenje ili transport ćelija od interesa iz jednog tkiva, organa ili dela tela u drugo tkivo, organ ili deo tela. Na primer, nosač može biti tečni ili čvrsto punilo, razblaživač, ekscipijens, rastvarač ili materijal za kapsuliranje ili neka njihova kombinacija. Svaka komponenta nosača mora biti „farmaceutski prihvatljiva“ u smislu da mora biti kompatibilna sa ostalim sastojcima formulacije. Takođe, mora biti pogodna za kontakt sa bilo kojim tkivom, organom ili delom tela sa kojim može doći u kontakt, što znači da ne sme nositi rizik od toksičnosti, iritacije, alergijske reakcije, imunogenosti ili bilo koje druge komplikacije koja prekomerno nadmašuje njegove terapeutske koristi.
[1220] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija se daje subjektu. Generalno, doze i načini administriranja farmaceutske kompozicije određuju se prema veličini i stanju subjekta, u skladu sa standardnom farmaceutskom praksom. Na primer, terapeutski efikasna doza može se u početku proceniti ili u testovima ćelijske kulture ili na životinjskim modelima kao što su miševi, pacovi, zečevi, psi, svinje ili majmuni. Životinjski model se, takođe, može koristiti za određivanje odgovarajućeg raspona koncentracije i načina primene. Takve informacije se zatim mogu koristiti za određivanje korisnih doza i načina primene kod ljudi. Tačna doza će biti određena u svetlu faktora vezanih za subjekta kome je potrebno lečenje. Doziranje i primena se prilagođavaju kako bi se obezbedili dovoljni nivoi aktivnog jedinjenja ili kako bi se održao željeni efekat. Faktori koji se mogu uzeti u obzir uključuju težinu bolesnog stanja, opšte zdravstveno stanje subjekta, starost, težinu i pol subjekta, vreme i učestalost primene, kombinaciju(e) lekova, osetljivost reakcije i odgovor na terapiju.
[1221] Farmaceutske kompozicije dugog dejstva mogu se primenjivati svaka 3 do 4 dana, svake nedelje ili dvonedeljno, u zavisnosti od poluživota i brzine klirensa određene formulacije. Učestalost doziranja zavisiće od farmakokinetičkih parametara molekula u korišćenoj formulaciji. Obično, kompozicija se primenjuje dok se ne dostigne doza koja postiže željeni efekat. Kompozicija se stoga može primenjivati kao jedna doza ili kao višestruke doze (u istim ili različitim koncentracijama/dozama) tokom vremena, ili kao kontinuirana infuzija. Dalje preciziranje odgovarajuće doze se rutinski vrši. Odgovarajuće doze mogu se utvrditi korišćenjem odgovarajućih podataka o odgovoru na dozu. Može se pratiti niz biomarkera ili fizioloških markera za terapeutski efekat, uključujući aktivaciju ili proliferaciju T ćelija, sintezu ili proizvodnju citokina (npr. proizvodnja TNF-α, IFN-γ, IL-2), indukciju različitih markera aktivacije (npr. CD25, IL-2 receptor), upalu, otok ili osetljivost zglobova, nivo C-reaktivnog proteina u serumu, proizvodnju antitela protiv kolagena i/ili odgovor(e) antitela zavisnih od T ćelija.
[1223] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija se daje subjektu bilo kojim putem, uključujući oralno, transdermalno, inhalacijom, intravenski, intraarterijski, intramuskularno, direktnom primenom na mesto rane, primenom na mesto hirurške intervencije, intraperitonealno, supozitorijumom, supkutano, intradermalno, transkutano, nebulizacijom, intrapleuralno, intraventrikularno, intraartikularno, intraokularno ili intraspinalno.
[1225] U nekim realizacijama, doza farmaceutske kompozicije je jednokratna doza ili ponovljena doza. U nekim realizacijama, doze se daju subjektu jednom dnevno, dva puta dnevno, tri puta dnevno ili četiri ili više puta dnevno. U nekim realizacijama, oko 1 ili više (kao što je oko 2 ili više, oko 3 ili više, oko 4 ili više, oko 5 ili više, oko 6 ili više ili oko 7 ili više) doza se daje nedeljno. U nekim realizacijama, višestruke doze se daju tokom dana, nedelja, meseci ili godina. U nekim realizacijama, kurs lečenja je oko 1 ili više doza (kao što je oko 2 ili više doza, oko 3 ili više doza, oko 4 ili više doza, oko 5 ili više doza, oko 7 ili više doza, oko 10 ili više doza, oko 15 ili više doza, oko 25 ili više doza, oko 40 ili više doza, oko 50 ili više doza ili oko 100 ili više doza).
[1227] [0499] U nekim realizacijama, primenjena doza farmaceutske kompozicije je oko 1 µg proteina po kg telesne mase subjekta ili više (kao što je oko 2 µg proteina po kg telesne mase subjekta ili više, oko 5 µg proteina po kg telesne mase subjekta ili više, oko 10 µg proteina po kg telesne mase subjekta ili više, oko 25 µg proteina po kg telesne mase subjekta ili više, oko 50 µg proteina po kg telesne mase subjekta ili više, oko 100 µg proteina po kg telesne mase subjekta ili više, oko 250 µg proteina po kg telesne mase subjekta ili više, oko 500 µg proteina po kg telesne mase subjekta ili više, oko 1 mg proteina po kg telesne mase subjekta ili više, oko 2 mg proteina po kg telesne mase subjekta ili više, ili oko 5 mg proteina po kg telesne mase subjekta ili više).
[1229] U nekim realizacijama, primenjuje se terapeutska količina ćelijske kompozicije. Obično, preciznu količinu kompozicije predmetnog pronalaska koja se primenjuje može odrediti lekar, uzimajući u obzir individualne razlike u starosti, težini, veličini tumora, obimu infekcije ili metastaza i stanju pacijenta (subjekta). Generalno se može reći da se farmaceutska kompozicija koji sadrži konstruisane ćelije, npr. T ćelije, kao što je ovde opisano, može primenjivati u dozi od 10<4>do 10<9>ćelija/kg telesne težine, kao što je 10<5>do 10<6>ćelija/kg telesne težine, uključujući sve celobrojne vrednosti unutar tih raspona. Kompozicije konstruisanih ćelija, kao što su kompozicije T ćelija, takođe se mogu primenjivati više puta u ovim dozama. Ćelije se mogu primenjivati korišćenjem infuzionih tehnika koje su opšte poznate u imunoterapiji (videti, npr. Rosenberg et al, New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988). Optimalnu dozu i režim lečenja za određenog pacijenta može lako odrediti stručnjak u medicinskoj oblasti praćenjem pacijenta na znake bolesti i prilagođavanjem lečenja u skladu sa tim.
[1231] [0501] Poznat je niz načina za određivanje da li primena terapeutske kompozicije pronalaska dovoljno modulira imunološku aktivnost eliminisanjem, sekvestracijom ili inaktivacijom imunih ćelija koje posreduju ili su sposobne da posreduju u neželjenom imunom odgovoru; indukovanjem, generisanjem ili uključivanjem imunih ćelija koje posreduju ili su sposobne da posreduju u zaštitnom imunom odgovoru; promenom fizičkih ili funkcionalnih svojstava imunih ćelija; ili kombinacijom ovih efekata. Primeri merenja modulacije imunološke aktivnosti uključuju, ali nisu ograničeni na, ispitivanje prisustva ili odsustva populacija imunih ćelija (korišćenjem protočne citometrije, imunohistohemije, histologije, elektronske mikroskopije, polimerazne lančane reakcije (PCR)); merenje funkcionalnog kapaciteta imunih ćelija, uključujući sposobnost ili otpornost na proliferaciju ili deobu kao odgovor na signal (kao što je korišćenje testova proliferacije T-ćelija i pepskan analize zasnovane na ugradnji 3H-timidina nakon stimulacije anti-CD3 antitelom, antitelom protiv T-ćelijskog receptora, anti-CD28 antitelom, kalcijum jonoforima, PMA (forbol 12-miristat 13-acetat) ćelijama koje prezentuju antigen napunjenim peptidnim ili proteinskim antigenom; testovi proliferacije B ćelija); merenje sposobnosti ubijanja ili liziranja drugih ćelija (kao što su testovi citotoksičnih T ćelija); merenja citokina, hemokina, molekula na ćelijskoj površini, antitela i drugih proizvoda ćelija (npr. protočnom citometrijom, enzimski vezanim imunosorbentnim testovima, Western blot analizom, analizom proteinskog mikročipa, imunoprecipitacijskom analizom); merenje biohemijskih markera aktivacije imunih ćelija ili signalnih puteva unutar imunih ćelija (npr. Western blot i imunoprecipitaciona analiza fosforilacije tirozina, serina ili treonina, cepanja polipeptida i formiranja ili disocijacije proteinskih kompleksa; analiza proteinskih nizova; transkripcija DNK, profilisanje korišćenjem DNK nizova ili subtraktivne hibridizacije); merenja ćelijske smrti apoptozom, nekrozom ili drugim mehanizmima (npr. bojenje aneksinom V, TUNEL testovi, gel elektroforeza za merenje DNK lestvičastog raspoređivanja, histologija; fluorogenski testovi kaspaze, Western blot analiza kaspaznih supstrata); merenje gena, proteina i drugih molekula koje proizvode imune ćelije (npr. Northern blot analiza, lančana reakcija polimeraze, DNK mikronizovi, proteinski mikronizovi, dvodimenzionalna gel elektroforeza, Western blot analiza, enzimski vezani imunosorbentni testovi, protočna citometrija); i merenje kliničkih simptoma ili ishoda kao što je poboljšanje autoimunih, neurodegenerativnih i drugih bolesti koje uključuju sopstvene proteine ili sopstvene polipeptide (klinički rezultati, zahtevi za upotrebu dodatnih terapija, funkcionalni status, studije snimanja) na primer, merenjem stope recidiva ili težine bolesti (korišćenjem kliničkih rezultata poznatih prosečno veštom stručnjaku) u slučaju multiple skleroze, merenjem glukoze u krvi u slučaju dijabetesa tipa I ili upale zglobova u slučaju reumatoidnog artritisa.
[1233] VII. PROIZVODI I KOMPLET
[1235] Ovde su, takođe, dati proizvodi koji sadrže farmaceutske kompozicije opisane ovde u odgovarajućem pakovanju. Pogodna pakovanja za kompozicije (kao što su oftalmološke kompozicije) opisane ovde su poznata u tehnici i uključuju, na primer, bočice (kao što su zapečaćene bočice), posude, ampule, bočice, tegle, fleksibilna pakovanja (npr. zapečaćene milar ili plastične kese) i slično. Ovi proizvodi mogu se dodatno sterilisati i/ili zapečatiti.
[1237] Dalje su obezbeđeni kompleti koji sadrže farmaceutske kompozicije (ili proizvodne artikle) opisane ovde, koji mogu dalje da sadrže uputstva o metodama korišćenja kompozicije, kao što su upotrebe opisane ovde. Kompleti opisani ovde mogu, takođe, da sadrže druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle, špriceve i uputstva za upotrebu sa uputstvima za izvođenje bilo kojih ovde opisanih metoda.
[1238] VIII. TERAPEUTSKA PRIMENA
[1240] Farmaceutske kompozicije opisane ovde (uključujući farmaceutsku kompoziciju koja sadrži varijante ICOSL polipeptida, imunomodulatorne proteine, konjugate, konstruisane ćelije i infektivne agense opisane ovde) mogu se koristiti u različitim terapijskim primenama, kao što je lečenje bolesti. Na primer, u nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija se koristi za lečenje inflamatornih ili autoimunih poremećaja, raka, transplantacije organa, virusnih infekcija i/ili bakterijskih infekcija kod sisara. Farmaceutska kompozicija može modulirati (npr. povećati ili smanjiti) imuni odgovor radi lečenja bolesti.
[1242] Takve upotrebe uključuju terapeutske upotrebe, na primer, koje uključuju primenu molekula ili konstruisanih ćelija, ili kompozicija koje ih sadrže, subjektu koji ima bolest, stanje ili poremećaj. U nekim slučajevima, kao što je opisano, bolest ili poremećaj je autoimuna ili inflamatorna bolest ili poremećaj. U nekim slučajevima, kao što je opisano, bolest ili poremećaj je tumor ili rak. U nekim realizacijama, molekul ili konstruisana ćelija se administrira u efikasnoj količini da bi se sprovelo lečenje bolesti ili poremećaja. Upotrebe uključuju upotrebu molekula koji sadrže varijantu ICOSL polipeptida, imunomodulatorni protein, konjugat, konstruisanu ćeliju i infektivne agense u takvim tretmanima i u pripremi leka kako bi se sproveli takvi tretmani. U nekim realizacijama, varijanta ICOSL polipeptida, imunomodulatorni protein, konjugat, konstruisana ćelija i infektivni agens, ili kompozicije koje ih sadrže, za terapeutsku upotrebu se daju subjektu koji ima ili se sumnja da ima bolest ili stanje, čime se leči bolest ili stanje ili poremećaj kod subjekta.
[1244] U nekim realizacijama, obezbeđeni postupci su primenljivi za terapijsku primenu varijantnih ICOSL polipeptida, imunomodulatornih proteina, konjugata, konstruisanih ćelija i infektivnih agenasa opisanih ovde. U okviru je znaja veštog stručnjaka, s obzirom na predmetni pronalazak, da izabere format za indikaciju u zavisnosti od vrste modulacije imunog odgovora, npr. povećanje ili smanjenje koje se želi.
[1246] U nekim realizacijama, primenjuje se farmaceutska kompozicija koja je ovde dataa i koja stimuliše imuni odgovor, što može biti korisno, na primer, u lečenju raka, virusnih infekcija ili bakterijskih infekcija. U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija sadrži varijantu ICOSL polipeptida u formatu koji ispoljava agonističku aktivnost svog srodnog partnera za vezivanje CD28 ili ICOS i/ili koji stimuliše ili inicira kostimulativnu signalizaciju putem CD28 ili ICOS.
[1247] Primerni formati ICOSL polipeptida za upotrebu u vezi sa takvim terapijskim primenama uključuju, na primer, imunomodulatorni protein ili „stek“ varijante ICOSL polipeptida i IgSF domena ili njegove varijante koja se vezuje za tumorski antigen (npr. Nkp30 ili afinitetno modifikovana varijanta) (takođe nazvan „tumor-lokalizujući IgSF domen), konjugat koji sadrži varijantu ICOSL polipeptida vezanu sa delom usmerenim na tumor (takođe nazvan deo usmeren na tumor), konstruisanu ćeliju koja eksprimuje transmembranski imunomodulatorni protein ili infektivni agens koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira transmembranski imunomodulatorni protein, kao što je za ekspresiju transmembranskog imunomodulatornog proteina u inficiranoj ćeliji (npr. tumorskoj ćeliji ili APC, npr. dendritskoj ćeliji).
[1249] Farmaceutske kompozicije koje sadrže konstruisane ćelije i metode opisane ovde mogu se koristiti u aplikacijama za adoptivni transfer ćelija. U nekim realizacijama, ćelijske kompozicije koje sadrže konstruisane ćelije mogu se koristiti u srodnim metodama za, na primer, modulaciju imunološke aktivnosti u imunoterapijskom pristupu lečenju, na primer, raka kod sisara ili, u drugim realizacijama, lečenju autoimunih poremećaja. Korišćene metode generalno obuhvataju metod kontaktiranja TIP-a predmetnog pronalaska sa ćelijom sisara pod uslovima koji su dozvoljeni za specifično vezivanje afinitetno modifikovanog IgSF domena i modulaciju imunološke aktivnosti ćelije sisara. U nekim realizacijama, imune ćelije (kao što su tumorski infiltrirajući limfociti (TIL), T-ćelije (uključujući CD8+ ili CD4+ T-ćelije) ili APC) su konstruisane da se eksprimuju kao membranski protein i/ili kao rastvorljiva varijanta ICOSL polipeptida, imunomodulatorni protein ili konjugat kao što je ovde opisano. Konstruisane ćelije zatim mogu da kontaktiraju ćeliju sisara, kao što je APC, drugi limfocit ili tumorska ćelija u kojoj je željena modulacija imunološke aktivnosti pod uslovima koji dozvoljavaju specifično vezivanje afinitetno modifikovanog IgSF domena za kontrastrukturu na ćeliji sisara tako da se imunološka aktivnost može modulirati u ćeliji sisara. Ćelije se mogu kontaktirati in vivo ili ex vivo.
[1251] [0509] U nekim realizacijama, konstruisane ćelije su autologne ćelije. U drugim realizacijama, ćelije su alogene. U nekim realizacijama, ćelije su autologne konstruisane ćelije reinfuzirane u sisara iz koga su izolovane. U nekim realizacijama, ćelije su alogene konstruisane ćelije infuzirane u sisara. U nekim realizacijama, ćelije se uzimaju iz krvi ili tumora pacijenta, modifikuju se da eksprimuju polipeptid (kao što je varijanta ICOSL polipeptida, imunomodulatorni protein ili konjugat kao što je ovde opisano), ekspanduju se u in vitro sistemu uzgoja (na primer, stimulisanjem ćelija) i ponovo infuziraju u pacijenta da bi se posredovalo uništavanje tumora. U nekim realizacijama, postupci se sprovode adoptivnim ćelijskim transferom, gde se ćelije koje eksprimuju TIP (npr. T-ćelije) infuziraju nazad u pacijenta. U nekim realizacijama, terapeutske kompozicije i postupci pronalaska se koriste u lečenju sisara obolelih od raka kao što su limfom, limfoidna leukemija, mijeloidna leukemija, rak grlića materice, neuroblastom ili multipli mijelom.
[1253] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija može se koristiti za inhibiciju rasta ćelija raka sisara (kao što su ćelije raka kod ljudi). Metod lečenja raka može uključivati davanje efikasne količine bilo koje od farmaceutskih kompozicija opisanih ovde subjektu sa rakom. Efikasna količina farmaceutske kompozicije može se primeniti da inhibira, zaustavi ili obrne progresiju raka.
[1255] Tipovi raka koji se mogu lečiti farmaceutskim kompozicijama i metodama lečenja opisanim ovde uključuju, ali nisu ograničeni na, melanom, rak bešike, hematološke malignitete (leukemija, limfom, mijelom), rak jetre, rak mozga, rak bubrega, rak dojke, rak pankreasa (adenokarcinom), kolorektalni karcinom, rak pluća (mikrocelularni i nemikrocelularni), rak slezine, rak timusa ili krvnih zrnaca (tj. leukemija), rak prostate, rak testisa, rak jajnika, rak materice, karcinom želuca, rak mišićno-skeletnog sistema, rak glave i vrata, gastrointestinalni rak, rak germinativnih ćelija ili endokrini i neuroendokrini rak. U nekim realizacijama, rak je Juingov sarkom. U nekim realizacijama, rak je izabran iz melanoma, raka pluća, raka bešike i hematološkog maligniteta. U nekim realizacijama, rak je limfom, limfoidna leukemija, mijeloidna leukemija, rak grlića materice, neuroblastom ili multipli mijelom.
[1257] Humane ćelije raka mogu se lečiti in vivo ili ex vivo. Kod ex vivo lečenja humanog pacijenta, tkivo ili tečnosti koje sadrže ćelije raka se tretiraju van tela, a zatim se tkivo ili tečnosti ponovo unose u pacijenta. U nekim realizacijama, rak se kod humanog pacijenta leči in vivo administriranjem terapeutske kompozicije u pacijenta.
[1259] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija se primenjuje kao monoterapija (tj. kao jedno sredstvo) ili kao kombinovana terapija (tj. u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih antikancerogenih sredstava, kao što su hemoterapeutski lek, vakcina protiv raka ili inhibitor imunološke kontrolne tačke). U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija se, takođe, može primenjivati sa radioterapijom.
[1260] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija se primenjuje kao monoterapija (tj. kao jedno sredstvo) ili kao kombinovana terapija (tj. u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih antikancerogenih sredstava, kao što su hemoterapeutski lek, vakcina protiv raka ili inhibitor imunološke kontrolne tačke). U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija se, takođe, može primenjivati sa radioterapijom. U nekim aspektima, inhibitor imunološke kontrolne tačke blokira interakcije PD-1 sa PD-L1 i/ili PD-L2. U nekim slučajevima, inhibitor imunološke kontrolne tačke je antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen i specifično se vezuje za PD-1, PD-L1 ili PD-L2. U nekim slučajevima, inhibitor imunološke kontrolne tačke je anti-PD-1 antitelo, kao što su nivolumab ili pembrolizumab ili njihov fragment koji se vezuje za antigen. U nekim slučajevima, inhibitor imunološke kontrolne tačke blokira ili je antagonist CTLA-4, kao što je anti-CTLA-4 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen. U nekim aspektima predmetnog pronalaska, inhibitor imunološke kontrolne tačke je tremelimumab ili ipilimumab.
[1262] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija suzbija imuni odgovor, što može biti korisno u lečenju inflamatornih ili autoimunih poremećaja ili transplantacije organa. U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija sadrži varijantu ICOSL polipeptida u formatu koji ispoljava antagonističku aktivnost svog srodnog partnera za vezivanje CD28 ili ICOS i/ili koji blokira ili inhibira kostimulativnu signalizaciju putem CD28 ili ICOS. Primeri formata ICOSL polipeptida za upotrebu u vezi sa takvim terapijskim primenama uključuju, na primer, varijantu ICOSL polipeptida koja je rastvorljiva (npr. varijanta ICOSL-Fc fuzionog proteina), imunomodulatorni protein ili „stek“ varijante ICOSL polipeptida i drugog IgSF domena, uključujući njegove rastvorljive oblike koji su Fc fuzije, konstruisanu ćeliju koja eksprimuje sekretujući imunomodulatorni protein ili infektivni agens koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira sekretujući imunomodulatorni protein, kao što je za ekspresiju i sekreciju sekretujućeg imunomodulatornog proteina u inficiranoj ćeliji (npr. tumorska ćelija ili APC, npr. dendritska ćelija).
[1264] U nekim realizacijama, inflamatorni ili autoimuni poremećaj je vaskulitisi udruženi sa antineutrofilnim citoplazmatskim antitelima (ANCA), vaskulitis, autoimuna kožna bolest, transplantacija, reumatska bolest, inflamatorna gastrointestinalna bolest, inflamatorna bolest oka, inflamatorna neurološka bolest, inflamatorna plućna bolest, inflamatorna endokrina bolest ili autoimuna hematološka bolest.
[1265] [0517] U nekim realizacijama, inflamatorni i autoimuni poremećaji koji se mogu lečiti farmaceutskim sastavom opisanim ovde su Adisonova bolest, alergije, alopecija areata, Alchajmerova bolest, vaskulitisi udruženi sa antineutrofilnim citoplazmatskim antitelima (ANCA), ankilozirajući spondilitis, antifosfolipidni sindrom (Hjuzov sindrom), astma, ateroskleroza, reumatoidni artritis, autoimuna hemolitička anemija, autoimuni hepatitis, autoimuno oboljenje unutrašnjeg uha, autoimuni limfoproliferativni sindrom, autoimuni miokarditis, autoimuni oforitis, autoimuni orhitis, azoospermija, Behčetova bolest, Bergerova bolest, bulozni pemfigoid, kardiomiopatija, kardiovaskularne bolesti, celijačna bolest ili celijakija, sindrom hroničnog umora i imunodisfunkcije (CFIDS), hronični idiopatski polineuritis, hronična inflamatorna demijelinizirajuća poliradikuloneuropatija (CIDP), hronična recidivirajuća polineuropatija (Guillain-Barréov sindrom), Čarg-Štrausov (Churg Strauss) sindrom, cikatricijalni pemfigoid, bolest hladnih aglutinina (CAD), HOBP (hronična opstruktivna plućna bolest), CREST sindrom, Kronova bolest, dermatitis, herpetiformus, dermatomiozitis, dijabetes, diskoidni lupus, ekcem, epidermolysis bullosa acquisita (stečena bulozna epidemoliza), esencijalna mešovita krioglobulinemija, Evanov sindrom, egzoftalmos, fibromijalgija, Gudpasturov sindrom, Grejvsova bolest, Hašimotov tireoiditis, idiopatska plućna fibroza, idiopatska trombocitopenija purpura (ITP), IgA nefropatija, imunoproliferativna bolest ili poremećaj, inflamatorna bolest creva (IBD), intersticijalna bolest pluća, juvenilni artritis, juvenilni idiopatski artritis (JIA), Kavasakijeva bolest, Lambert–Itonov mijastenični sindrom, lihen planus, lupus nefritis, limfocitni hipofizitis, Menijerova bolest, Miler Fišerov sindrom / akutna diseminovana encefalo mijeloradikulopatija, mešovita bolest vezivnog tkiva, multipla skleroza (MS), mišićni reumatizam, mijalgični encefalomijelitis (ME), mijastenija gravis, upala oka, pemphigus foliaceus, pemphigus vulgaris, perniciozna anemija, nodozni poliarteritis, polihondritis, poliglandularni sindromi (Vitakerov sindrom), reumatska polimijalgija, polimiozitis, primarna agamaglobulinemija, primarna bilijarna ciroza / autoimuna holangiopatija, psorijaza, psorijazni artritis, Rejnoov fenomen, Rajterov sindrom / reaktivni artritis, restenoza, reumatska groznica, reumatska bolest, sarkoidoza, Šmitov sindrom, skleroderma, Sjogrenov sindrom, sindrom ukočene osobe, sistemski eritemski lupus (SLE), sistemska skleroderma, Takajasuov arteritis, temporalni arteritis / gigantocelularni arteritis, tireoiditis, dijabetes tipa 1, ulcerozni kolitis, uveitis, vaskulitis, vitiligo, intersticijalna bolest creva ili Vegenerova granulomatoza. U nekim realizacijama, inflamatorni ili autoimuni poremećaj je izabran iz intersticijalne bolesti creva, transplantacije, Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa, multiple skleroze, astme, reumatoidnog artritisa i psorijaze.
[1267] U nekim realizacijama, inflamatorni ili autoimuni poremećaj je hronična autoimuna bolest. U nekim realizacijama, inflamatorni ili autoimuni poremećaj je Sjogrenov sindrom (pSS) ili sistemski eritemski lupus (SLE). U nekim realizacijama, inflamatorni ili autoimuni poremećaj je inflamatorna bolest creva (IBC). U nekim primerima, inflamatorni ili autoimuni poremećaj je Kronova bolest. U nekim realizacijama, inflamatorni ili autoimuni poremećaj je bolest ili poremećaj vezan sa IBC, npr. intersticijalna bolest pluća (ILD). U nekim realizacijama, inflamatorni ili autoimuni poremećaj je psorijazni artritis ili reumatoidni artritis. U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija se primenjuje da modulira autoimuno stanje. Na primer, suzbijanje imunog odgovora može biti korisno u metodama za inhibiranje odbacivanja transplantacije tkiva, ćelija ili organa od donora od strane primaoca. Shodno tome, u nekim realizacijama, farmaceutske kompozicije opisane ovde se koriste za ograničavanje ili sprečavanje bolesti ili poremećaja vezanih sa kalemom ili transplantacijom, kao što je bolest kalema protiv domaćina (GvHD). U nekim realizacijama, farmaceutske kompozicije se koriste za suzbijanje autoimunog odbacivanja transplantirane ili kalemljene koštane srži, organa, kože, mišića, neurona, ostrvaca ili parenhimalnih ćelija.
[1269] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija koja je ovde data, kao što je varijanta ICOSL IgSF (npr. IgV) Fc fuzionog proteina koji je ovde dat, koristi se za lečenje psorijaznog artritisa (PsA). U nekim slučajevima, PsA pogađa jedan ili više zglobova, kao što su prsti na rukama, prsti na nogama, ruke ili noge, uključujući laktove, zglobove, šake i stopala, ili sakroilijačni zglob. U nekim slučajevima, PsA je blag i/ili pogađa četiri ili manje zglobova. U nekim slučajevima, PsA je umeren i/ili pogađa četiri ili više zglobova. U nekim slučajevima, osoba sa PsA može ispoljavati bol, ukočenost ili upalu u kičmi ili vratu, ili u još jednom zglobu.
[1271] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija koja je ovde data, kao što je varijanta ICOSL IgSF (npr. IgV) Fc fuzionog proteina koji je ovde dat, koristi se za lečenje reumatoidnog artritisa (RA). U nekim slučajevima, RA pogađa zglobove, sluzokožu zglobova i/ili strukture u telu koje nisu zglobovi (npr. koža, oči, pluća, srce, bubrezi, pljuvačne žlezde, nervno tkivo, koštana srž ili krvni sudovi). U nekim realizacijama, RA ili simptomi RA su hronični.
[1272] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija koja je ovde data, kao što je varijanta ICOSL IgSF (npr. IgV) Fc fuzionog proteina koji je ovde dat, koristi se za lečenje GVHD-a. U nekim realizacijama, GVHD je akutni GVHD (aGVHD). U nekim slučajevima, aGVHD se javlja nakon alogene transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT) i/ili reakcije imunih ćelija donora na tkiva domaćina. U nekim slučajevima, aGVHD se manifestuje na koži, jetri ili gastrointestinalnom traktu.
[1274] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija koja je ovde data, kao što je varijanta ICOSL IgSF (npr. IgV) Fc fuzionog proteina koji je ovde dat, koristi se za lečenje autoimunog stanja vezanog sa transplantacijom organa. U nekim slučajevima, lečenje autoimunog stanja vezanog sa transplantacijom organa može produžiti preživljavanje domaćina i transplantiranog organa. U nekim realizacijama, lečenje autoimunog stanja povezanog sa transplantacijom organa uključuje profilaksu ili inhibiranje ili sprečavanje odbacivanja transplantata od strane subjekta koji je primalac transplantiranog organa.
[1276] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija ovde dataa, kao što je varijanta ICOSL IgSF (npr. IgV) Fc fuzionog proteina ovde data, koristi se za lečenje inflamatorne bolesti creva (IBD). U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija ovde dataa, kao što je varijanta ICOSL IgSF (npr. IgV) Fc fuzionog proteina ovde dataa, koristi se za lečenje Kronove bolesti. U nekim realizacijama, Kronova bolest može da uključuje podtip Kronovog kolitisa, Kronovog enteritisa, Kronovog iletisa ili Kronovog enterokolitisa.
[1278] U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija ovde dataa, kao što je varijanta ICOSL IgSF (npr. IgV) Fc fuzionog proteina ovde data, koristi se za lečenje sistemskog eritematoznog lupusa (SLE). U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija ovde data, kao što je varijanta ICOSL IgSF (npr. IgV) Fc fuzionog proteina ovde data, koristi se za lečenje Šegrenovog sindroma.
[1280] IX. PRIMERI
[1282] Sledeći primeri su uključeni samo u ilustrativne svrhe i nisu namenjeni da ograniče obim pronalaska. Svi primeri koji ne spadaju u doslovni obim zahteva uključeni su samo radi objašnjenja stanja tehnike ili u uporednu svrhu.
[1283] PRIMER 1
[1285] Primer 1 Generisanje mutantnih DNK konstrukata IgSF domena
[1287] Primer 1 opisuje generisanje mutantnih DNK konstrukata humanih ICOSL IgSF domena za translaciju i ekspresiju na površini kvasca kao kvasnih biblioteka za prikaz.
[1289] A. Degenerisane biblioteka
[1291] Generisani su mutantni DNK konstrukti koji kodiraju varijantu ECD domena ICOSL. Konstrukti su generisani na osnovu sekvence divljeg tipa humanog ICOSL navedene u SEQ ID NO:32 koja sadrži ECD domen na sledeći način:
[1293]
[1296] Za biblioteke koje ciljaju specifične ostatke za potpunu ili delimičnu randomizaciju sa degenerisanim kodonima, DNK koja kodira SEQ ID NO:32 je naručena od Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) kao skup preklapajućih oligonukleotida dužine do 80 baznih parova (bp). Da bi se generisala biblioteka različitih varijanti ECD, oligonukleotidi su sadržali željene degenerisane kodone, kao što su specifični mešoviti bazni skupovi za kodiranje različitih supstitucija amino-kiselina, na željenim pozicijama amino-kiselina. Degenerisani kodoni su generisani korišćenjem algoritma na URL adresi: rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/
[1298] Generalno, pozicije za mutaciju i degeneraciju kodona su izabrane iz modela homologije (ICOSL) parova cilj-ligand od interesa kako bi se identifikovali ostaci kontakta liganda, kao što su ostaci bočnog lanca cilja koji interaguju sa ligandom, kao i ostaci koji se nalaze na granici interakcije proteina. Ova analiza je izvršena korišćenjem pregledača struktura dostupnog na URL adresi: spdbv.vital-it.ch).
[1300] [0530] Sledeći korak u dizajnu biblioteke bio je poravnanje humanih, mišjih, pacovskih i majmunskih ICOSL sekvenci kako bi se identifikovali konzervirani ostaci. Na osnovu ove analize, konzervirani ciljni ostaci su mutirani degenerisanim kodonima koji su specificirali samo konzervativne promene amino-kiselina plus ostatak divljeg tipa. Ostaci koji nisu bili konzervirani, mutirani su agresivnije, ali su takođe uključivali ostatak divljeg tipa. Degenerisani kodoni koji su, takođe, kodirali ostatak divljeg tipa su primenjeni kako bi se izbegla prekomerna mutageneza ciljnog proteina. Iz istog razloga, samo do 20 pozicija je ciljano za mutagenezu istovremeno. Ovi ostaci su bili kombinacija kontaktnih ostataka i ostataka bez kontaktnog interfejsa.
[1302] Oligonukleotidi su rastvoreni u sterilnoj vodi, pomešani u ekvimolarnim odnosima, zagrejani na 95°C tokom pet minuta i polako ohlađeni na sobnu temperaturu radi žarenja. Za generisanje PCR proizvoda korišćeni su ECD-specifični oligonukleotidni prajmeri koji se žare na početak i kraj ECD, redom. ECD-specifični oligonukleotidi koji se preklapaju za 40-50 bp sa modifikovanom verzijom pBYDS03 vektora za kloniranje (Life Technologies USA), izvan i uključujući mesta za kloniranje BamH1 i Kpn1, zatim su korišćeni za amplifikaciju 100 ng PCR proizvoda iz prethodnog koraka da bi se generisalo ukupno 5 µg DNK. Obe PCR su urađene polimeraznom lančanom reakcijom (PCR) korišćenjem OneTaq 2x PCR master mix-a (New England Biolabs, SAD). Drugi PCR proizvodi su prečišćeni korišćenjem PCR kompleta za prečišćavanje (Qiagen, Nemačka) i resuspendovani u sterilnoj dejonizovanoj vodi.
[1304] Da bi se pripremila za umetanje u biblioteku, modifikovana verzija vektora pBYDS03 za prikazivanje kvasca je digestirana restrikcionim enzimima BamHI i KpnI (New England Biolabs, SAD), a veliki fragment vektora je prečišćen gelom i rastvoren u sterilnoj, dejonizovanoj vodi. DNK spremna za elektroporaciju za sledeći korak je generisana mešanjem 12 µg DNK biblioteke za svaku elektroporaciju sa 4 µg linearizovanog vektora u ukupnoj zapremini od 50 µl dejonizovane i sterilne vode. Alternativni način za generisanje ciljanih biblioteka bio je sprovođenje usmerene mutageneze (Multisite kit, Agilent, SAD) ciljnog ECD sa oligonukleotidima koji sadrže degenerisane kodone. Ovaj pristup je korišćen za generisanje podbiblioteka koje ciljaju samo specifične delove ciljnog proteina za mutagenezu. U ovim slučajevima, podbiblioteke su pomešane pre nego što se pređe na korake selekcije. Generalno, veličine biblioteka su bile u rasponu od 10E7 do 10E8 klonova, osim što su podbiblioteke bile samo u rasponu od 10E4 do 10E5. Velike biblioteke i podbiblioteke se generišu za ICOSL.
[1306] B. Slučajne biblioteke
[1308] [0533] Takođe su konstruisane slučajne (nasumične) biblioteke da bi se identifikovale varijante ECD kod ICOSL navedene u SEQ ID NO:32 koje sadrže ECD domen. DNK koja kodira ECD divljeg tipa klonirana je između restrikcionih mesta BamHI i KpnI modifikovanog vektora za prikazivanje kvasca pBYDS03. DNK je zatim mutagenizovana pomoću Genemorph II kompleta (Agilent, SAD) da bi se generisalo prosečno tri do pet promena amino-kiselina po varijanti biblioteke. Mutagenizovana DNK je zatim amplifikovana dvostepenom PCR i dalje obrađena kao što je gore opisano za ciljane biblioteke.
[1310] PRIMER 2
[1312] Uvođenje DNK biblioteka u kvasac
[1314] Primer 2 opisuje uvođenje ICOSL DNK biblioteka u kvasac.
[1316] Da bi se u kvasac uvela degenerisana i slučajna bibliotečka DNK, ćelije kvasca soja BJ5464 (ATCC.org; ATCC broj 208288) kompetentne za elektroporaciju su pripremljene i elektroporirane na Gene Pulser-u II (Biorad, SAD) sa DNK spremnom za elektroporaciju iz gornjeg koraka u suštini kao što je opisano (Colby, D.W. et al. 2004 Methods Enzymology 388, 348-358). Jedini izuzetak je to što su transformisane ćelije gajene u neindukujućoj minimalno selektivnoj SCD-Leu podlozi kako bi se smestio selektivni marker LEU2 koji nosi modifikovani plazmid pBYDS03. Jedan litar SCD-Leu podloge sadrži 14,7 grama natrijum citrata, 4,29 grama monohidrata limunske kiseline, 20 grama dekstroze, 6,7 grama azotne baze kvasca i 1,6 grama dodatka sintetičke podloge za odvajanje kvasca bez leucina. Podloga je sterilisana filtracijom pre upotrebe pomoću vakuumskog filtera od 0,22 µm.
[1318] Veličina biblioteke je određena presađivanjem serijskih razblaženja sveže oporavljenih ćelija na SCD-Leu agar ploče, a zatim ekstrapolacijom veličine biblioteke iz broja pojedinačnih kolonija iz presađivanja koje su generisale najmanje 50 kolonija po ploči. Generalno, veličine biblioteka su se kretale od 10E8 do 10E9 transformanata na osnovu ovog testa razblaživanja. Preostali deo elektroporirane kulture je rastao do zasićenja u SCD-Leu, a ćelije iz ove kulture su ponovo subkultivisane (npr. 1/100) u svež SCD-Leu kako bi se minimizirao udeo netransformisanih ćelija. Da bi se održala raznolikost biblioteke, ovaj korak subkultivacije je sproveden korišćenjem inokuluma koji je sadržao najmanje 10 puta više ćelija od izračunate veličine biblioteke. Ćelije iz druge zasićene kulture su resuspendovane u svežem medijumu koji sadrži sterilnih 25% (težina/zapremina) glicerola do gustine od 10E10/mL, zamrznute i čuvane na -80°C (zamrznuti bibliotečki materijal).
[1319] Veličina biblioteke je određena presađivanjem razblaženih rastvora sveže dobijenih ćelija na SCD-Leu agar ploče, a zatim ekstrapolacijom veličine biblioteke iz broja pojedinačnih kolonija sa presađivanja koje generišu najmanje 50 kolonija po ploči.
[1321] Da bi se plazmid odvojio od ćelija koje sadrže dva ili više različitih bibliotečkih klonova, broj ćelija koji odgovara 10 puta većoj veličini biblioteke uzet je iz SCD-Leu kulture uzgajane preko noći i subkultivisan u odnosu 1/100 u svež SCD-Leu medijum i uzgajan preko noći. Ćelije iz ove kulture uzgajane preko noći resuspendovane su u sterilnom 25% (težina/zapremina) glicerolu do gustine od 10E10/mL, zamrznute i čuvane na -80°C (zamrznuti bibliotečki materijal).
[1323] PRIMER 3
[1325] Izbor kvasca
[1327] Primer 3 opisuje selekciju kvasca koji eksprimuje afinitetno modifikovane varijante ICOSL.
[1329] Broj ćelija jednak najmanje 10 puta veličine biblioteke odmrznut je iz pojedinačnih bibliotečkih zaliha, suspendovan na 0,1 x 10E6 ćelija/ml u neindukujućem SCD-Leu medijumu i uzgajan preko noći. Sledećeg dana, broj ćelija jednak 10 puta veličine biblioteke centrifugiran je na 2000 rpm tokom dva minuta i resuspendovan na 0,5 x 10E6 ćelija/ml u indukujućem SCDG-Leu medijumu. Jedan litar indukcionog SCDG-Leu medijuma sadrži 5,4 grama Na<2>HPO<4>. 8,56 grama NaH<2>PO<4>•H<2>O, 20 grama galaktoze, 2,0 grama dekstroze, 6,7 grama azotne baze kvasca Difco i 1,6 grama sintetičkog dodatka za selektivni medijum kvasca bez leucina rastvorenog u vodi i sterilizovanog kroz membranski filter od 0,22 µm. Kultura je gajena dva dana na 20°C da bi se indukovala ekspresija proteina biblioteke na površini ćelija kvasca.
[1331] Ćelije su obrađene magnetnim perlama kako bi se smanjile supstance koje se ne vezuju i obogatile sve ICOSL varijante sposobnošću vezivanja za njihove egzogene rekombinantne proteine kontrastrukture. Nakon toga su usledila dva do tri kruga sortiranja protočnom citometrijom korišćenjem bojenja egzogenim proteinima kontrastrukture kako bi se obogatila frakcija ćelija kvasca koja ispoljava poboljšane supstance za vezivanje. Obogaćivanje magnetnim perlama i selekcija protočnom citometrijom su u suštini onakvi kakvi su opisani u Miller, K.D. Current Protocols in Cytometry 4.7.1‑4.7.30, jul 2008.
[1332] Sa ICOSL bibliotekama, ciljni ligandni proteini su nabavljeni od R&D Systems (SAD) na sledeći način: humani rCD28.Fc (tj. rekombinantni CD28-Fc fuzioni protein), rCTLA4.Fc i rICOS.Fc. Magnetne streptavidin perle su nabavljene od New England Biolabs, SAD. Za biotinilaciju proteina kontrastrukture, korišćen je komplet za biotinilaciju kat. br. 21955, Life Technologies, SAD. Za dvobojno, protočno citometrijsko sortiranje, korišćen je Becton Dickinson FACS Aria II sorter. Nivoi ispoljavanja ICOSL su praćeni antitelom protiv hemaglutinina obeleženim sa Alexafluor 488 (Life Technologies, SAD). Fc fuzioni proteini koji vezuju ligand rCD28.Fc, rCTLA4.Fc ili rICOS.Fc su detektovani pomoću PE konjugovanog humanog Ig specifičnog kozjeg Fab (Jackson ImmunoResearch, SAD). Dubletni kvasac je izdvojen korišćenjem parametara rasejanja unapred (FSC) / bočnog rasejanja (SSC), a sortiranje je zasnovano na većem vezivanju liganda otkrivenom u FL4 koji je imao ograničenije vezivanje ekspresije oznake u FL1.
[1334] Izlazi kvasca dobijeni protočnom citometrijom testirani su na viši specifični afinitet vezivanja. Izlazni sortirani kvasac je proširen i ponovo indukovan da eksprimuje određene varijante modifikovanog domena afiniteta IgSF koje kodiraju. Ova populacija se zatim može uporediti sa roditeljskim, divljim tipom soja kvasca ili bilo kojim drugim odabranim izlazima, kao što je populacija kvasca dobijena protočnom citometrijom.
[1336] Za ICOSL, izlazi druge sorte (F2) su upoređeni sa roditeljskim ICOSL kvascem za vezivanje svakog rICOS.Fc, rCD28.Fc i rCTLA4.Fc dvostrukim bojenjem svake populacije sa ekspresijom anti-HA (hemaglutinin) oznake i sekundarnim anti-humanim Fc za detekciju vezivanja liganda.
[1338] U slučaju ICOSL varijanti kvasca odabranih za vezivanje za ICOS, rezultati F2 sortiranja dali su vrednosti srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) od 997, kada su obojeni sa 5,6 nM rICOS.Fc, dok je roditeljski ICOSL soj MFI izmeren na 397 kada je obojen istom koncentracijom rICOS.Fc. Ovo predstavlja otprilike trostruko poboljšanje prosečnog vezivanja u ovom F2 odabranom skupu klonova, i predviđa se da će pojedinačni klonovi iz tog skupa imati mnogo više poboljšan MFI/afinitet kada se pojedinačno testiraju.
[1340] [0546] U slučaju ICOSL varijanti kvasca odabranih za vezivanje za CD28, izlazi F2 sortiranja dali su MFI vrednosti od 640 kada su obojeni sa 100nM rCD28.Fc, dok je roditeljski ICOSL soj MFI izmeren na 29 kada je obojen istom koncentracijom rCD28.Fc (poboljšanje od 22 puta). U slučaju ICOSL varijanti kvasca odabranih za vezivanje za CTLA4, izlazi F2 sortiranja dali su MFI vrednosti od 949 kada su obojeni sa 100nM rCTLA4.Fc, dok je roditeljski ICOSL soj MFI izmeren na 29 kada je obojen istom koncentracijom rCTLA4.Fc (poboljšanje od 32 puta).
[1342] Važno je napomenuti da se MFI svih gore opisanih F2 izlaza, merenih sa anti-HA tag antitelom na FL1, nisu povećavali, a ponekad su se i smanjivali u poređenju sa sojevima divljeg tipa, što ukazuje da povećano vezivanje nije bila funkcija povećane ekspresije odabranih varijanti na površini kvasca i da su validirane strategije gejtinga samo za odabir srednjih do niskih ekspresora sa visokim vezivanjem liganda.
[1344] Odabrane varijante ICOSL ECD domena su dalje formatirane kao fuzioni proteini i testirane na vezivanje i funkcionalnu aktivnost kao što je opisano u daljem tekstu.
[1346] PRIMER 4
[1348] Reformatiranje izlaza selekcije kao Fc-fuzije i u različitim tipovima imunomodulatornih proteina
[1350] Primer 4 opisuje reformatiranje izlaza selekcije identifikovanih u Primeru 3 kao imunomodulatornih proteina koji sadrže afinitetno modifikovani (varijantni) ekstracelularni domen (ECD) ICOSL fuzionisan sa Fc molekulom (varijantni ECD-Fc fuzioni molekuli).
[1352] Izlazne ćelije iz finalnih ICOSL sorti protočnog citometra uzgajane su do terminalne gustine u SCD-Leu medijumu. Plazmidna DNK iz svakog izlaza izolovana je korišćenjem kompleta za izolaciju plazmidne DNK kvasca (Zymo Research, SAD). Za Fc fuzije, PCR prajmeri sa dodatim restrikcionim mestima pogodnim za kloniranje u izabrani Fc fuzioni vektor korišćeni su za serijsko amplifikaciju kodirajućih DNK za mutantne ciljne ECD iz pripremljenih plazmidnih DNK. Nakon restrikcione digestije, PCR proizvodi su ligirani u odgovarajući Fc fuzioni vektor, nakon čega je usledila hemijska transformacija u soj e. coli XL1 Blue (Agilent, SAD) ili NEB5alpha (New England Biolabs, SAD) prema uputstvima dobavljača. Primer Fc fuzionog vektora je pFUSE-hIgG1-Fc2 (InvivoGen, SAD).
[1354] Razblaženja reakcija transformacije su zasejana na LB-agar koji sadrži 100 µg/ml karbenicilina (Teknova, SAD) da bi se generisale pojedinačne kolonije. Do 96 kolonija iz svake transformacije je zatim uzgajano u pločama sa 96 ležišta do zasićenja preko noći na 37°C u LBbujonu (Teknova kat. br. L8112) i mali alikvot iz svakog ležišta je poslat na sekvenciranje DNK ECD umetka kako bi se identifikovale mutacije u svim klonovima. Priprema uzoraka za sekvenciranje DNK je sprovedena korišćenjem protokola koje je obezbedio dobavljač usluga (Genewiz; South Plainfield, NJ). Nakon uklanjanja uzorka za sekvenciranje DNK, glicerol je zatim dodat preostalim kulturama do konačnog sadržaja glicerola od 25% i ploče su čuvane na -20°C za buduću upotrebu kao glavne ploče (videti dole). Alternativno, uzorci za sekvenciranje DNK su generisani repliciranjem iz uzgajanih tečnih kultura na ploče sa čvrstim agarom korišćenjem replikatora za jednokratnu upotrebu sa 96 ležišta (VWR, SAD). Ove ploče su inkubirane preko noći da bi se generisali delovi rasta, a ploče su poslate kompaniji Genewiz na sekvenciranje DNK prema njihovim specifikacijama. U nekim slučajevima, izvršeno je ponovno sekvenciranje radi verifikacije mutacija.
[1356] Nakon analize podataka sekvenciranja DNK generisanih pomoću Genewiz-a, klonovi od interesa su izolovani sa master ploča i pojedinačno uzgajani do zasićenja u 5 mL tečnog LB-bujona koji sadrži 100 µg/mL karbenicilina (Teknova, SAD), a 2 mL svake kulture je zatim korišćeno za pripremu približno 10 µg miniprep plazmidne DNK svakog klona korišćenjem standardnog kompleta kao što je Pureyield komplet (Promega, SAD). Identifikacija klonova od interesa generalno je uključivala sledeće korake. Prvo, datoteke sa podacima o sekvenci DNK su preuzete sa Genewiz internet stranice. Sve sekvence su zatim ručno kurirane tako da počinju na početku ECD kodirajućeg regiona. Kurirane sekvence su zatim serijski translirane korišćenjem odgovarajućeg programa dostupnog na URL adresi: www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/. Translirane sekvence su zatim poravnate korišćenjem odgovarajućeg programa dostupnog na URL adresi: multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html. Alternativno, Genewiz sekvence su obrađene da bi se generisala poravnanja korišćenjem Ugene softvera (http://ugene.net).
[1358] Klonovi od interesa su zatim identifikovani korišćenjem sledećih kriterijuma: 1) identičan klon se javlja najmanje dva puta u poravnanju i 2) mutacija se javlja najmanje dva puta u poravnanju i poželjno u različitim klonovima. Klonovi koji ispunjavaju najmanje jedan od ovih kriterijuma bili su klonovi koji su obogaćeni procesom sortiranja, najverovatnije zbog poboljšanog vezivanja.
[1360] [0554] Da bi se generisali rekombinantni imunomodulatorni proteini koji su Fc fuzioni proteini koji sadrže ECD ICOSL sa najmanje jednim domenom modifikovanog afiniteta (npr. varijanta ICOSL ECD-Fc), generisan je kodirajući molekul nukleinske kiseline da kodira protein dizajniran na sledeći način: signalni peptid praćen varijantom (mutantnim) ICOSL ECD praćen linkerom od tri alanina (AAA) praćen humanim IgG1 Fc koji sadrži mutaciju N82G u odnosu na divlji tip humanog IgG1 Fc navedenog u SEQ ID NO: 226 (što odgovara N297G prema EU numeraciji). Ovaj primerni Fc je takođe sadržao stabilizujuće mutacije cisteina R77C i V87C i zamenu ostatka cisteina serinskim ostatkom na poziciji 220 (C220S) prema EU numeraciji (što odgovara poziciji 5 (C5S) sa referencom na Fc divljeg tipa humanog IgG1 navedenog u SEQ ID NO:226 (što odgovara R292C, V302C i C220S, redom, prema EU numeraciji). U nekim slučajevima, mesto za kloniranje NotI koje doprinosi AAA linkerskoj sekvenci je obrisano da bi se generisala direktna fuzija ICOSL ECD i početka Fc. Pošto konstrukt ne uključuje lake lance antitela koji mogu da formiraju kovalentnu vezu sa cisteinom, Fc humanog IgG1 takođe sadrži zamenu ostataka cisteina serinskim ostatkom na poziciji 5 (C5S) u poređenju sa Fc divljeg tipa ili nemodifikovanim Fc navedenim u SEQ ID NO: 226.
[1362] PRIMER 5
[1364] Ekspresija i prečišćavanje Fc-fuzija
[1366] Primer 5 opisuje ekspresiju i prečišćavanje Fc-fuzionih proteina sa visokim protokom koji sadrže varijantu ECD ICOSL kao što je opisano u gornjim primerima.
[1368] Rekombinantne varijante Fc fuzionih proteina su proizvedene iz suspenzijom adaptiranih ćelija humanog embrionalnog bubrega (HEK) 293 korišćenjem sistema ekspresije Expi293 (Invitrogen, SAD). 4 µg svake plazmidne DNK iz prethodnog koraka je dodato u 200 µLOpti MEM (Invitrogen, SAD) istovremeno kada je 10,8 µL ExpiFectamine odvojeno dodato u još 200 µL Opti-MEM. Nakon 5 minuta, 200 µL plazmidne DNK je pomešano sa 200 µL ExpiFectamine i dalje je inkubirano dodatnih 20 minuta pre dodavanja ove smeše ćelijama. Deset miliona Expi293 ćelija je raspoređeno u odvojena ležišta sterilne duboke ploče za rast sa 24 ležišta, konusnim od 10 ml (Thomson Instrument Company, SAD) u Expi293 medijumu zapremine 3,4 ml (Invitrogen, SAD). Ploče su mućkane 5 dana na 120 rpm u inkubatoru za ćelijske kulture sisara podešenom na 95% vlažnosti i 8% CO<2>. Nakon 5 dana inkubacije, ćelije su peletirane, a supernatanti kulture su zadržani.
[1369] Proteini su prečišćeni iz supernatanata korišćenjem kompleta za prečišćavanje proteina A sa 96 ležišta visokog protoka, prema protokolu proizvođača (kataloški broj 45202, Life Technologies, SAD). Dobijene frakcije eluiranja su puferski zamenjene u PBS korišćenjem Zeba ploče za odsoljavanje sa 96 ležišta (kataloški broj 89807, Life Technologies, SAD) prema protokolu proizvođača. Prečišćeni protein je kvantifikovan korišćenjem apsorbancije na 280 nm merene Nanodrop instrumentom (Thermo Fisher Scientific, SAD), a čistoća proteina je procenjena nanošenjem 5 µg proteina na NUPAGE pre-cast, poliakrilamidne gelove (Life Technologies, SAD) pod uslovima denaturacije i redukcije, a zatim i gel elektroforezom. Proteini su vizuelizovani u gelu korišćenjem standardnog Kumasi (Coomassie) bojenja.
[1371] PRIMER 6
[1373] Procena vezivanja i aktivnosti molekula koji sadrže domen IgSF sa afinitetnim zrenjem
[1374] A. Vezivanje za ćelijski eksprimovane kontrastrukture
[1376] Ovaj primer opisuje studije vezivanja Fc-fuzije prečišćenih proteina iz gore navedenih primera radi procene specifičnosti i afiniteta imunomodulatornih proteina varijante ICOSL domena za srodne partnere za vezivanje.
[1378] Da bi se proizvele ćelije koje eksprimuju srodne partnere za vezivanje, dizajnirane su konstrukcije za ekspresiju površine sisara pune dužine za svaki od humanih CD28 i ICOS u ekspresionom vektoru pcDNA3.1 (Life Technologies) i nabavljene od Genscript, SAD. Studije vezivanja su sprovedene na transfektovanim HEK293 ćelijama generisanim da eksprimuju ligande površine sisara pune dužine korišćenjem sistema za prolaznu transfekciju (Life Technologies, SAD) opisanog gore. Kao kontrola, takođe je procenjeno vezivanje za lažne (netransfektovane) ćelije. Određen je broj ćelija potrebnih za eksperiment, a odgovarajuća skala transfekcije od 30 mL je izvršena korišćenjem protokola koji je predložio proizvođač. Za svaku CD28, ICOS ili lažnu transfekciju od 30 mL, 75 miliona Expi293F ćelija je inkubirano sa 30 µg ekspresionog DNK konstrukta i 1,5 mL razblaženog ExpiFectamine 293 reagensa tokom 48 sati, nakon čega su ćelije sakupljene za bojenje.
[1380] [0560] Za bojenje protočnom citometrijom, 200.000 ćelija odgovarajuće prolazne transfekcije ili negativne kontrole (mock) je zasejano na ploče sa okruglim dnom sa 96 ležišta. Ćelije su centrifugirane i resuspendovane u puferu za bojenje (PBS (fosfatno puferovani fiziološki rastvor), 1% BSA (goveđi serumski albumin) i 0,1% natrijum azida) tokom 20 minuta da bi se blokiralo nespecifično vezivanje. Nakon toga, ćelije su ponovo centrifugirane i resuspendovane u puferu za bojenje koji sadrži 100nM do 1nM varijante imunomodulatornog proteina, u zavisnosti od eksperimenta svakog kandidata CD80 varijante Fc, ICOSL varijante Fc ili naslaganog IgSF varijante Fc fuzionog proteina u 50 µL. Primarno bojenje je izvršeno na ledu tokom 45 minuta, pre nego što su ćelije dva puta isprane u puferu za bojenje. PE-konjugovani anti-humani Fc (Jackson ImmunoResearch, SAD) je razblažen 1:150 u 50 µL pufera za bojenje i dodat ćelijama i inkubiran još 30 minuta na ledu. Sekundarno antitelo je isprano dva puta, ćelije su fiksirane u 4% formaldehidu/PBS, a uzorci su analizirani na FACScan protočnom citometru (Becton Dickinson, SAD) ili Hypercyt protočnom citometru (Intellicyte, SAD).
[1382] Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) je izračunat za svaki transfektant i negativnu roditeljsku liniju pomoću softvera Cell Quest Pro (Becton Dickinson, SAD) ili protočnog citometra Hypercyt (Intellicyte, SAD).
[1384] B. Karakterizacija biološke aktivnosti
[1386] Ovaj primer dalje opisuje karakterizaciju biološke aktivnosti proteina varijante Fc-fuzije u humanim primarnim T ćelijama in vitro analize.
[1388] 1. Reakcija mešovitih limfocita (MLR)
[1390] [0563] Bioaktivnost rastvorljivog rICOSL.Fc testirana je u reakciji humanih mešovitih limfocita (MLR). Humane primarne dendritske ćelije (DC) generisane su kultivacijom monocita izolovanih iz PBMC (BenTech Bio, SAD) in vitro tokom 7 dana sa 500 U/mL rIL-4 (R&D Systems, SAD) i 250 U/mL rGM-CSF (R&D Systems, SAD) u Ex-Vivo 15 medijumu (Lonza, Švajcarska).10.000 zrelih DC i 100.000 prečišćenih alogenih CD4+ T ćelija (BenTech Bio, SAD) su kokultivisane sa ICOSL varijantom Fc fuzionih proteina i kontrolama u pločama sa okruglim dnom sa 96 ležišta u konačnoj zapremini od 200 µl Ex-Vivo 15 medijuma. 5. dana, sekrecija IFN-γ u supernatantima kulture analizirana je korišćenjem Human IFN-γ Duoset ELISA kompleta (R&D Systems, SAD). Optička gustina je merena pomoću VMax ELISA mikroplate čitača (Molecular Devices, SAD) i kvantifikovana u odnosu na titrirani rIFN-γ standard koji je uključen u IFN-γ Duo-set komplet (R&D Systems, SAD). Drugi MLR protokol se sastojao od humanih primarnih dendritskih ćelija (DC) generisanih kultivisanjem monocita izolovanih iz PBMC (BenTech Bio, SAD) in vitro tokom 7 dana sa 50 ng/ml rIL-4 (R&D Systems, SAD) i 80 ng/ml rGM-CSF (R&D Systems, SAD) u Ex-Vivo 15 medijumu (Lonza, Švajcarska). Trećeg i petog dana, polovina medijuma je uklonjena i zamenjena svežim medijumom koji sadrži 50 ng/ml rIL-4 i 80 ng/ml rGM-CSF. Da bi se potpuno indukovalo sazrevanje dendritskih ćelija (DC), lipopolisaharid (LPS) (InvivoGen Corp., SAD) je dodat u koncentraciji od 100 ng/ml u DC kulture 6. dana i ćelije su inkubirane dodatnih 24 sata. Približno 10.000 zrelih DC i 100.000 prečišćenih alogenih CD3+ T ćelija (BenTech Bio, SAD) su kokultivisane sa ICOSL varijantom Fc fuzionih proteina i kontrolama u pločama sa okruglim dnom sa 96 ležišta u konačnoj zapremini od 200 µl Ex-Vivo 15 medijuma. 4. i 5. dana, sekrecija IFN-γ u supernatantima kulture je analizirana korišćenjem Human IFN-γ Duoset ELISA kompleta (R&D Systems, SAD). Optička gustina je merena na BioTek Cytation Multimode Microplate Reader-u (BioTek Corp., SAD) i kvantifikovana u odnosu na titrirani rIFN-γ standard koji je uključen u IFN-γ Duo-set komplet (R&D Systems, SAD).
[1392] 2. Test koimobilizacije anti-CD3
[1394] Kostimulativna bioaktivnost ICOSL fuzionih varijanti određena je u testovima koimobilizacije anti-CD3. 1nM ili 10 nM mišjeg anti-humanog CD3 (OKT3, Biolegends, SAD) razblaženo je u PBS-u sa 1nM do 80nM rICOSL.Fc varijantnih proteina. Ova smeša je dodata u ploče sa 96 ležišta ravnog dna tretirane kulturom tkiva (Corning, SAD) preko noći kako bi se olakšalo prijanjanje stimulatornih proteina na ležišta ploče. Sledećeg dana, nevezani protein je ispran sa ploča i 100.000 prečišćenih humanih pan T ćelija (BenTech Bio, SAD) ili klona BC3 humanih T ćelija (Astarte Biologics, SAD) dodato je u svako ležište u konačnoj zapremini od 200µl Ex-Vivo 15 medijuma (Lonza, Švajcarska). U nekim slučajevima, humane pan T ćelije su obeležene sa 0,25 μM karboksifluorescein sukcinimidil estra (CFSE, ThermoFisher Scientific, SAD). Ćelije su kultivisane 3 dana pre sakupljanja supernatanata kulture i merenja nivoa humanog IFN-γ pomoću Duoset ELISA kompleta (R&D Systems, SAD) kao što je gore pomenuto. Ćelijska proliferacija je određena procentom ulaznih ćelija koje su ušle u deobu, mereno CFSE razblaživanjem na ćelijama obojenim fluorescentno konjugovanim anti-CD4, anti-CD8 antitelima (BD, SAD) ili ukupnim T ćelijama putem protočne citometrijske analize na LSR II (BD, SAD).
[1396] C. Rezultati
[1398] [0565] Rezultati studija vezivanja i aktivnosti za primerne testirane varijante prikazani su u Tabeli 7 koja navodi primerne supstitucije (zamene) amino-kiselina IgSF domena u ECD-u ICOSL odabranom u skriningu za afinitetno sazrevanje u odnosu na odgovarajuće srodne strukture ICOS i CD28. U Tabelama, primerne supstitucije amino-kiselina označene su brojem pozicije aminokiseline koji odgovara odgovarajućoj referentnoj (npr. nemodifikovanoj) ECD sekvenci na sledeći način. Na primer, referentna (npr. nemodifikovana) ECD sekvenca u Tabeli 7 (WT ICOSL) je (npr. nemodifikovana) ICOSL ECD sekvenca navedena u SEQ ID NO: 32. Pozicija amino-kiseline je naznačena u sredini, sa odgovarajućom referentnom (npr. nemodifikovanom ili divljeg tipa) amino-kiselinom navedenom pre broja i identifikovanom varijantom supstitucije amino-kiseline navedenom posle broja. Kolona 2 navodi identifikator SEQ ID NO za varijantni ECD za svaki varijantni ECD-Fc fuzioni molekul.
[1400] Takođe je prikazana aktivnost vezivanja merena vrednošću srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) za vezivanje svake varijante Fc-fuzionog molekula za ćelije transfektovane da eksprimuju srodni ligand i odnos MFI u poređenju sa vezivanjem odgovarajućeg referentnog (npr. nemodifikovanog) ECD-Fc fuzionog molekula koji ne sadrži supstituciju(e) amino-kiselina za isti ligand kontrastrukture eksprimovan u ćelijama. Funkcionalna aktivnost varijanti Fcfuzionih molekula za modulaciju aktivnosti T ćelija takođe je prikazana na osnovu izračunatih nivoa IFN-γ u supernatantima kulture (pg/mL) generisanih ili i) sa naznačenim varijantom ECD-Fc fuzionog molekula koimobilizovanim sa anti-CD3 ili ii) sa naznačenim varijantom ECD-Fc fuzionog molekula u MLR testu. Tabela, takođe, prikazuje odnos IFN-γ koji proizvodi svaka varijanta ECD-Fc u poređenju sa odgovarajućim referentnim (npr. nemodifikovanim ili divljeg tipa) ECD-Fc u oba funkcionalna testa.
[1402] [0567] Kao što je prikazano, selekcije su rezultirale identifikacijom brojnih varijanti ICOSL IgSF domena koje su afinitetno modifikovane da bi pokazale povećano vezivanje za najmanje jedan, a u nekim slučajevima i više od jednog, srodnog liganda kontrastrukture. Pored toga, rezultati su pokazali da je afinitetna modifikacija varijantnih molekula, takođe, pokazala poboljšane aktivnosti i za povećanje i/ili smanjenje imunološke aktivnosti u zavisnosti od formata molekula. Na primer, koimobilizacija liganda verovatno obezbeđuje multivalentnu interakciju sa ćelijom da bi se grupisala ili povećala avidnost u korist agonističke aktivnosti i povećala aktivacija T ćelija u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim ili divljeg tipa) ECD-Fc molekulom koji ne sadrži zamenu(e) amino-kiseline. Međutim, kada je molekul obezbeđen kao dvovalentni Fc molekul u rastvoru, iste varijante IgSF domena pokazale su antagonističku aktivnost da smanje aktivaciju T ćelija u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim ili divljeg tipa) ECD-Fv molekulom koji ne sadrži zamenu(e) amino-kiseline.
[1403]
[1404]
[1407] Testovi vezivanja su ponovljeni uglavnom kao što je gore opisano, osim što je vezivanje, takođe, procenjeno u odnosu na ćelije koje eksprimuju humani CTLA4 pune dužine. ICOSL varijantni Fc fuzioni proteini su, takođe, dalje procenjeni u testu koimobilizacije anti-CD3 uglavnom kao što je gore opisano. Rezultati su potvrdili identifikaciju brojnih varijanti ICOSL IgSF domena koje su pokazale povećan afinitet vezivanja za najmanje jedan, a u nekim slučajevima i za više od jednog, srodnog liganda. Pored toga, rezultati su pokazali da je modifikacija afiniteta varijantnih molekula takođe pokazala poboljšane aktivnosti u testu koimobilizacije.
[1409] PRIMER 7
[1411] Dodatni afinitetno modifikovani IgSF domeni
[1412] Ovi primeri opisuju dizajn, kreiranje i skrining dodatnih afinitetno modifikovanih imunomodulatornih proteina CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) i NKp30, koji su druge komponente imune sinapse (IS) koje imaju dokazanu dvostruku ulogu i u imunološkoj aktivaciji i u inhibiciji. Ovi primeri pokazuju da afinitetna modifikacija IgSF domena daje proteine koji mogu delovati i na povećanje i na smanjenje imunološke aktivnosti. Ovaj rad, takođe, opisuje različite kombinacije tih domena spojenih u parovima (tj. naslaganih) sa varijantom afinitetno modifikovanog ICOSL da bi se formirao imunomodulatorni protein tipa II radi postizanja imunomodulatorne aktivnosti.
[1414] Mutantne DNK konstrukcije humanih CD80, CD86 i NKp30 IgSF domena za translaciju i ekspresiju kao biblioteke za prikazivanje kvasca generisane su uglavnom kao što je opisano u Primeru 1. Za biblioteke koje ciljaju specifične ostatke ciljnog proteina za potpunu ili delimičnu randomizaciju sa degenerisanim kodonima, kodirajuće DNK za ekstracelularne domene (ECD) humanog CD80 (SEQ ID NO:28) i NKp30 (SEQ ID NO:54) su naručene od Integrated DNA Technologies (Koralvil, Ajova) kao skup preklapajućih oligonukleotida dužine do 80 baznih parova (bp). Alternativno, ostaci su mutirani ciljanom mutagenezom usmerenom na mesto uglavnom kao što je opisano u Primeru 1. Alternativno, konstruisane su slučajne biblioteke da bi se identifikovale varijante ECD CD80 (SEQ ID NO:28), CD86 (SEQ ID NO:29) i NKp30 (SEQ ID NO:54) uglavnom kao što je opisano u Primeru 1.
[1416] DNK ciljane i nasumične biblioteke je uvedena u kvasac uglavnom kao što je opisano u Primeru 2 da bi se generisale biblioteke kvasca. Biblioteke su korišćene za selekciju kvasca koji eksprimuje afinitetno modifikovane varijante CD80, CD86 i NKp30 uglavnom kao što je opisano u Primeru 3. Ćelije su obrađene da bi se smanjile nevezujuće supstance i da bi se obogatile varijante CD80, CD86 ili NKp30 sa sposobnošću da se vežu za svoje egzogene rekombinantne proteine kontrastrukture uglavnom kao što je opisano u Primeru 3. Na primer, kvasac koji je prikazivao ciljane ili nasumične CD80 biblioteke je odabrao za svaki od CD28, CTL-4 i PD-L1, odvojeno. Nakon toga su usledila dva do tri kruga sortiranja protočnom citometrijom korišćenjem bojenja egzogenih proteina kontrastrukture da bi se obogatila frakcija ćelija kvasca koja ispoljava poboljšane vezujuće supstance. Obogaćivanje magnetnim perlama i selekcije protočnom citometrijom su u suštini kao što je opisano u Keith D. Miller,1 Noah B. Pefaur,2 and Cheryl L. Baird1 Current Protocols in Cytometry 4.7.1‑4.7.30, jul 2008.
[1417] Sa bibliotekama CD80, CD86 i NKp30, ciljni ligandni proteini su nabavljeni od R&D Systems (SAD) na sledeći način: humani rCD28.Fc (tj. rekombinantni fuzioni protein CD28-Fc), rPDL1.Fc, rCTLA4.Fc i rB7H6.Fc. Dvobojna protočna citometrija je izvršena uglavnom kao što je opisano u Primeru 3. Izlazi kvasca iz sorti protočne citometrije su testirani na viši specifični afinitet vezivanja. Izlazni kvasac sorte je proširen i ponovo indukovan da eksprimuje određene varijante domena modifikovanog afiniteta IgSF koje kodiraju. Ova populacija se zatim može uporediti sa roditeljskim, divljim tipom soja kvasca ili bilo kojim drugim odabranim izlazima, kao što je populacija kvasca dobijena iz perli, pomoću protočne citometrije.
[1419] U slučaju varijanti kvasca NKp30 odabranih za vezivanje za B7-H6, izlazi sortiranja F2 dali su vrednosti MFI od 533 kada su obojeni sa 16,6 nM rB7H6.Fc, dok je MFI roditeljskog soja NKp30 izmeren na 90 kada je obojen istom koncentracijom rB7H6.Fc (6-struko poboljšanje).
[1421] Među identifikovanim varijantama NKp30, bila je varijanta koja je sadržala mutacije L30V/A60V/S64P/S86G u odnosu na pozicije u ekstracelularnom domenu NKp30 koje odgovaraju pozicijama navedenim u SEQ ID NO:54. Među identifikovanim varijantama CD86, bila je varijanta koja je sadržala mutacije Q35H/H90L/Q102H u odnosu na pozicije u ekstracelularnom domenu CD86 koje odgovaraju pozicijama navedenim u SEQ ID NO: 29. Među identifikovanim varijantama CD80, bile su varijante navedene u Tabeli 8 i detaljnije opisane u daljem tekstu.
[1423] Kao i kod ICOSL, MFI svih gore opisanih F2 izlaza, merenih sa anti-HA tag antitelom na FL1, nisu se povećavali, a ponekad su se smanjivali u poređenju sa sojevima divljeg tipa, što ukazuje da povećano vezivanje nije bila funkcija povećane ekspresije odabranih varijanti na površini kvasca i da su validirane strategije gejtinga samo za odabir srednjih do niskih ekspresora sa visokim vezivanjem liganda.
[1425] Primerni izlazi selekcije su reformatirani kao imunomodulatorni proteini koji sadrže afinitetno modifikovani (varijantni) ekstracelularni domen (ECD) CD80 spojen sa Fc molekulom (varijantni ECD-Fc fuzioni molekuli) uglavnom kao što je opisano u Primeru 4, a Fc-fuzioni protein je eksprimovan i prečišćen uglavnom kao što je opisano u Primeru 5.
[1427] [0577] Vezivanje primernih CD80 Fc-fuzionih varijanti za ćelijski eksprimovane kontrastrukture je zatim procenjeno uglavnom kao što je opisano u Primeru 6. Da bi se proizvele ćelije koje eksprimuju srodne partnere za vezivanje, proizvedene su konstrukcije za površinsku ekspresiju sisara pune dužine za svaki od humanih CD28, CTLA4 i PD-L1 uglavnom kao što je opisano u Primeru 6. Studije vezivanja i protočna citometrija su sprovedene uglavnom kao što je opisano u Primeru 6. Pored toga, bioaktivnost Fc-fuzionog varijantnog proteina je okarakterisana ili reakcijom mešovitih limfocita (MLR) ili testom koimobilizacije anti-CD3 uglavnom kao što je opisano u Primeru 6.
[1429] Rezultati studija vezivanja i aktivnosti za primerne testirane varijante prikazani su u tabelama 8 i 9. Konkretno, Tabela 8 navodi primerne supstitucije (zamene) amino-kiselina IgSF domena u ECD CD80 odabranom u skriningu za afinitetno sazrevanje u odnosu na odgovarajuću srodnu strukturu CD28. Tabela 9 navodi primerne supstitucije (zamene) amino-kiselina IgSF domena u ECD CD80 odabranom u skriningu za afinitetno sazrevanje u odnosu na odgovarajuću srodnu strukturu PD-L1. Kao i gore, za svaku Tabelu, primerne supstitucije amino-kiselina su označene brojem pozicije amino-kiseline koji odgovara odgovarajućoj referentnoj (npr. nemodifikovanoj) ECD sekvenci na sledeći način. Na primer, referentna (npr. nemodifikovana) ECD sekvenca u Tabelama 8 i 9 je nemodifikovana CD80 ECD sekvenca navedena u SEQ ID NO:28. Pozicija amino-kiseline je naznačena u sredini, sa odgovarajućom referentnom (npr. nemodifikovanom) amino-kiselinom navedenom pre broja i identifikovanom varijantom supstitucije amino-kiseline navedenom posle broja. Kolona 2 navodi SEQ ID NO identifikator za varijantu ECD za svaku varijantu ECD-Fc fuzionog molekula.
[1431] Takođe je prikazana aktivnost vezivanja merena vrednošću srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) za vezivanje svake varijante Fc-fuzionog molekula za ćelije konstruisane da eksprimuju srodni ligand kontrastrukture i odnos MFI u poređenju sa vezivanjem odgovarajućeg referentnog (npr. nemodifikovanog) ECD-Fc fuzionog molekula koji ne sadrži supstituciju(e) amino-kiselina za isti ligand kontrastrukture eksprimovan u ćelijama. Funkcionalna aktivnost varijanti Fc-fuzionih molekula za modulaciju aktivnosti T ćelija takođe je prikazana na osnovu izračunatih nivoa IFN-γ u supernatantima kulture (pg/mL) generisanih ili i) sa naznačenim varijantom ECD-Fc fuzionog molekula koimobilizovanim sa anti-CD3 ili ii) sa naznačenim varijantom ECD-Fc fuzionog molekula u MLR testu. Tabele, takođe, prikazuju odnos IFN-γ koji proizvodi svaka varijanta ECD-Fc u poređenju sa odgovarajućim referentnim (npr. nemodifikovanim) ECD-Fc u oba funkcionalna testa.
[1432] Kao što je prikazano, selekcije su rezultirale identifikacijom brojnih varijanti CD80 IgSF domena koje su afinitetno modifikovane da bi pokazale povećano vezivanje za najmanje jedan, a u nekim slučajevima i više od jednog, srodnog liganda kontrastrukture. Pored toga, rezultati su pokazali da je afinitetna modifikacija varijantnih molekula, takođe, pokazala poboljšane aktivnosti i za povećanje i za smanjenje imunološke aktivnosti u zavisnosti od formata molekula. Na primer, koimobilizacija liganda verovatno obezbeđuje multivalentnu interakciju sa ćelijom da bi se grupisala ili povećala avidnost u korist agonističke aktivnosti i povećala aktivacija T ćelija u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim ili divljeg tipa) ECD-Fc molekulom koji ne sadrži zamenu(e) amino-kiseline. Međutim, kada je molekul obezbeđen kao dvovalentni Fc molekul u rastvoru, iste varijante IgSF domena pokazale su antagonističku aktivnost da smanje aktivaciju T ćelija u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim ili divljeg tipa) ECD-Fc molekulom koji ne sadrži zamenu(e) amino-kiseline.
[1434]
[1435]
[1436]
[1437]
[1438]
[1439]
[1440]
[1441]
[1444] PRIMER 8
[1446] Generisanje i procena stek molekula koji sadrže različite domene modifikovanog afiniteta
[1447] Ovaj primer opisuje dodatne imunomodulatorne proteine koji su generisani kao stek konstrukti koji sadrže najmanje dva različita afinitetno modifikovana domena iz identifikovanih varijantnih ICOSL polipeptida i još jedan dodatni varijantni CD80, CD86, ICOSL i NKp30 molekul vezanih zajedno i fuzionisanih sa Fc.
[1448] Odabrane varijante molekula opisane gore, koje su afinitetno modifikovane za jedan ili više liganda kontrastrukture, korišćene su za generisanje „stek“ molekula (tj. imunomodulatornog proteina tipa II) koji sadrži dva ili više afinitetno modifikovanih IgSF domena. Stek konstrukti su dobijeni kao genski blokovi (Integrated DNA Technologies, Koralvil, Ajova) koji kodiraju stek u formatu koji omogućava njegovo spajanje sa Fc standardnim Gibson sklapanjem korišćenjem Gibson kompleta za sklapanje (New England Biolabs, SAD).
[1450] Molekul nukleinske kiseline koji kodira sve stekove je generisan da kodira protein dizajniran na sledeći način: Signalni peptid, nakon čega sledi prva varijanta IgV od interesa, zatim linker od 15 amino-kiselina koji se sastoji od tri GGGGS(G4S) motiva (SEQ ID NO:228), zatim drugi IgV od interesa, zatim dva GGGGS linkera (SEQ ID NO:229), pa tri alanina (AAA), a zatim humani IgG1 Fc kao što je gore opisano. Da bi se maksimizirala šansa za pravilno savijanje IgV domena u svakom steku, prvom IgV su prethodili svi ostaci koji se normalno javljaju u proteinu divljeg tipa između ovog IgV i signalnog peptida (vodeća sekvenca). Slično tome, prvom IgV su prethodili svi ostaci koji ga normalno povezuju u proteinu divljeg tipa sa sledećim Ig domenom (obično IgC domenom) ili, ako takav drugi IgV domen nije prisutan, ostaci koji ga povezuju sa transmembranskim domenom (završna sekvenca). Isti princip dizajna je primenjen na drugi IgV domen, osim što kada su oba IgV domena izvedena iz istog roditeljskog proteina (npr. ICOSL IgV naslagan sa drugim ICOSL IgV), linker između oba nije dupliran.
[1452] Tabela 10 prikazuje dizajn za primerne naslagane konstrukcije. Primerni molekuli naslaga prikazani u Tabeli 10 sadrže Ig domene (npr. IgV domen) kao što je naznačeno i dodatne prateće sekvence kao što je gore opisano. U Tabeli su sledeće komponente prisutne redom: signalni peptid (SP; SEQ ID NO:225), Ig domen 1 (npr. Ig1), prateća sekvenca 1 (TS1), linker 1 (LR1; SEQ ID NO:228), Ig domen 2 (Ig2), prateća sekvenca 2 (TS2), linker 2 (LR2; SEQ ID NO:230) i Fc domen (SEQ ID NO:226 koji sadrži supstituciju amino-kiselina C5S/R77C/N82G/V87C). U nekim slučajevima, vodeća sekvenca 1 (LS1) je prisutna između signalnog peptida i IgV1, a u nekim slučajevima vodeća sekvenca 2 (LS2) je prisutna između linkera i IgV2.
[1453]
[1454]
[1455]
[1456]
[1459] Visokopropusna ekspresija i prečišćavanje varijantinih IgV-složenih-Fc fuzionih molekula koji sadrže različite kombinacije varijanti IgV domena iz CD80, CD86, ICOSL ili Nkp30, koji sadrže najmanje jedan afinitetno modifikovani IgV domen, generisani su uglavnom kao što je opisano u Primeru 5. Vezivanje varijanti IgV-složenih-Fc fuzionih molekula za odgovarajuće kontrastrukture i funkcionalna aktivnost pomoću testa koimobilizacije anti-CD3 takođe su procenjeni uglavnom kao što je opisano u Primeru 6. Na primer, kostimulativna bioaktivnost složenih IgSF Fc fuzionih proteina određena je sličnim testom imobilizovanog anti-CD3 kao gore. U ovom slučaju, 4nM anti-CD3 (OKT3, Biolegend, SAD) je koimobilizovano sa 4 nM do 120 nM humanog rB7-H6.Fc (R&D Systems, SAD) ili humanog rPD-L1.Fc (R&D Systems, SAD) preko noći na pločama sa 96 ležišta tretiranim kulturom tkiva (Corning, SAD). Sledećeg dana, nevezani protein je ispran sa PBS i 100.000 prečišćenih pan T ćelija je dodato u svako ležište u 100 µl Ex-Vivo 15 medijuma (Lonza, Švajcarska). Naslagani IgSF domeni su potom dodati u koncentracijama u rasponu od 8 nM do 40 nM u zapremini od 100 µl za ukupnu zapreminu od 200 µl. Ćelije su kultivisane 3 dana pre sakupljanja supernatanata kulture i merenja nivoa humanog IFN-γ pomoću Duoset ELISA kompleta (R&D Systems, SAD) kao što je gore pomenuto.
[1460] Rezultati su prikazani u Tabelama 11-13. Konkretno, Tabela 11 prikazuje rezultate vezivanja i funkcionalne aktivnosti za varijante IgV-stek-Fc fuzione molekule koji sadrže NKp30 IgV domen i ICOSL IgV domen. Tabele 12 i 13 prikazuju rezultate vezivanja i funkcionalne aktivnosti za varijante IgV-stek-Fc fuzione molekule koje sadrže varijantni ICOSL IgV domen i varijantni CD80 IgV ili CD86 IgV domen.
[1462] Za svaku od Tabela 11-13, Kolona 1 označava strukturnu organizaciju i orijentaciju stek, afinitetno modifikovanih ili divljeg tipa (WT) domena počevši od amino terminalnog (N terminalnog) domena, nakon čega sledi srednji WT ili afinitetno modifikovani domen koji se nalazi pre C terminalnih Fc domena humanog IgG1. Kolona 2 navodi SEQ ID NO identifikator za sekvencu svakog IgV domena sadržanog u odgovarajućem „stek“ molekulu. Kolona 3 prikazuje partnere za vezivanje u odnosu na koje su naznačeni afinitetno modifikovani naslagani domeni iz kolone 1 odabrani.
[1464] Takođe je prikazana aktivnost vezivanja merena vrednošću srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) za vezivanje svakog stek molekula za ćelije transfektovane da eksprimuju različite ligande kontrastrukture i odnos MFI u poređenju sa vezivanjem odgovarajućeg stek molekula koji sadrži referentne (npr. nemodifikovane) IgV domene koji ne sadrže supstituciju(e) amino-kiselina za isti ligand kontrastrukture eksprimovan u ćelijama. Funkcionalna aktivnost varijantnih stek molekula za modulaciju aktivnosti T ćelija takođe je prikazana na osnovu izračunatih nivoa IFN-γ u supernatantima kulture (pg/mL) generisanih sa naznačenim varijantnim molekulom steka u rastvoru i odgovarajućim ligandom koimobilizovanim sa anti-CD3 kao što je opisano u Primeru 6. Tabela, takođe, prikazuje odnos IFN-γ koji proizvodi svaki varijantni molekul steka u poređenju sa odgovarajućim referentnim (npr. nemodifikovanim) molekulom steka u testu koimobilizacije.
[1466] [0589] Kao što je prikazano, rezultati su pokazali da je moguće generisati stek molekule koji sadrže najmanje jedan varijantni IgSF domen koji je ispoljavao afinitetno modifikovanu aktivnost povećanog vezivanja za najmanje jedan srodni ligand kontrastrukture u poređenju sa odgovarajućim molekulom naslaga koji sadrži odgovarajući referentni (npr. divljeg tipa ili nemodifikovani) IgV domen. U nekim slučajevima, stek molekul, bilo iz jednog ili kombinacije oba varijantna IgSF domena u molekulu, pokazao je povećano vezivanje za više od jednog srodnog liganda kontrastrukture. Rezultati su, takođe, pokazali da redosled IgV domena u naslaganim molekulima može, u nekim slučajevima, promeniti stepen poboljšane aktivnosti vezivanja. U nekim slučajevima, funkcionalna aktivnost T ćelija je takođe bila promenjena kada je procenjena u testu ciljane koimobilizacije.
[1468]
[1469]
[1470]
[1471]
[1472]
[1473]
[1474]
[1475]
[1476]
[1477]
[1480] PRIMER 9
[1482] Generisanje i procena konstruisanih ćelija koje eksprimuju transmembranski imunomodulatorni protein
[1484] Generisane su konstruisane T ćelije u kojima je transmembranski imunomodulatorni protein (TIP) koji sadrži ekstracelularni domen (ECD) koji sadrži ili varijantu CD80 kao što je gore opisano ili ICOSL afinitetno modifikovani IgSF domen koeksprimovan sa himernim antigenskim receptorom (CAR). TIP je, takođe, sadržao transmembranski domen i citoplazmatski domen odgovarajuće sekvence transmembranskog proteina CD80 divljeg tipa ili ICOSL. Imunomodulatorna aktivnost konstruisanih ćelija upoređena je sa ćelijama koje su eksprimovale samo CAR ili ćelijama koje su koeksprimovale odgovarajući transmembranski protein CD80 divljeg tipa ili ICOSL sa CAR.
[1486] Primerni CD80-TIP bio je varijanta CD80 koja ima afinitetno modifikovani IgSF domen koji sadrži amino-kiselinske mutacije u IgV i IgC domenima koje odgovaraju I67T/L70Q/A91G/T120S u odnosu na pozicije u ekstracelularnom domenu CD80 navedene u SEQ ID NO:28 i transmembranski i citoplazmatski domen koji odgovara ostacima 243-288 SEQ ID NO: 1. Amino-kiselinska sekvenca primernog CD80-TIP je navedena u SEQ ID NO: 241 i kodirana je sekvencom nukleotida navedenom u SEQ ID NO:242. Odgovarajući transmembranski protein CD80 divljeg tipa imao je sekvencu amino-kiselina navedenu kao amino-kiselinske ostatke 35-288 SEQ ID NO:1 i kodiran je sekvencom amino-kiselina navedenom u SEQ ID NO:251.
[1487] Primerni ICOSL-TIP bio je varijanta ICOSL sa afinitetno modifikovanim IgSF domenom koji sadrži mutacije amino-kiselina u IgV domenu koje odgovaraju N52H/I143T u odnosu na pozicije u ekstracelularnom domenu ICOSL navedene u SEQ ID NO:32 i transmembranski i citoplazmatski domen koji odgovaraju ostacima 257-302 SEQ ID NO:5. Amino-kiselinska sekvenca primernog ICOSL-TIP je navedena u SEQ ID NO:243 i kodirana je sekvencom nukleotida navedenom u SEQ ID NO:244. Odgovarajući transmembranski protein ICOSL divljeg tipa imao je sekvencu amino-kiselina navedenu kao amino-kiselinske ostatke 19-302 SEQ ID NO:5 i kodiran je sekvencom amino-kiselina navedenom u SEQ ID NO:252.
[1489] TIP koji sadrži afinitetno modifikovani domen ili transmembranski protein divljeg tipa koji sadrži odgovarajući neafinitetno modifikovani IgSF domen koeksprimovani su u T ćelijama sa 1. generacijom himernog antigenskog receptora (CAR) koji sadrži intracelularni signalni domen CD3zeta. Prva generacija CAR je uključivala scFv specifičan za CD19 (SEQ ID NO:245), zglobni i transmembranski domen izveden iz CD8 (SEQ ID NO:246) i intracelularni signalni domen izveden iz CD3zeta (naveden u SEQ ID NO:47). Nukleotidna sekvenca koja kodira CD19 scFv -CD3zeta CAR je navedena u SEQ ID NO: 248, a amino-kiselinska sekvenca CD19 scFv - CD3zeta CAR je navedena u SEQ ID NO: 479.
[1491] Generisani su molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju samostalno CAR ili takođe kodiraju jedan od primernih TIP ili transmembranskih proteina divljeg tipa odvojenih od CAR samorazdvajajućom T2A sekvencom (SEQ ID NO:250 i kodirana sekvencom nukleotida navedenom u SEQ ID NO:249). Primerni konstrukti su sadržali sekvence nukleinskih kiselina navedene u Tabeli 14. Kao kontrola,takođe je generisan i konstrukt nukleinske kiseline koji kodira 2. generaciju CAR dodatno sadrži CD28 kostimulativni domen (CD19 scFv - CD28 - CD3zeta).
[1492]
[1495] Molekuli nukleinskih kiselina su pojedinačno klonirani u lentivirusni vektor, koji je korišćen za transdukciju T ćelija izolovanih iz uzoraka humanih PBMC dobijenih od tri različita zdrava donora. Čestice lentivirusa koje sadrže sekvence nukleinskih kiselina su proizvedene nakon ko-transfekcije ćelija HEK293 sa vektorima i konstruktima za pakovanje lentivirusa. Čestice lentivirusa su sakupljene iz podloge za kultivaciju ultracentrifugiranjem i titrirane pomoću qRT-PCR. Mononuklearne ćelije periferne krvi čoveka (PBMC) su izolovane od tri normalna donora krvi korišćenjem sedimentacije gustine. PBMC su kultivisane preko noći sa anti-CD3 i anti-CD28 antitelima i IL-2, a zatim transdukovane preparatima lentivirusa pri multiplicitetu infekcije od 5:1. Lentivirusni vektori koji kodiraju kontrolnu 2. generaciju CAR je korišćen samo za transdukciju ćelija od jednog donora.
[1497] [0596] Nakon dve nedelje (14 dana) uzgoja, ćelije su analizirane na citotoksičnost nakon kokultivacije sa ćelijama koje eksprimuju ciljni antigen korišćenjem Acea Real-Time Cell Analyzer-a (RTCA), koji meri varijacije impedanse u medijumu za kultivaciju mikroelektronske ploče sa 96 ležišta (E-ploča) i prikazuje promene u broju i morfologiji ćelija u realnom vremenu. Ciljne HeLa ćelije koje eksprimuju CD19 (HeLa-CD19) su zasejane u E-ploču sa 96 ležišta i impedansa svakog monosloja je praćena 24 sata korišćenjem RTCA sistema. Konstruisane T ćelije su dodate u ležišta u odnosu efektor:cilj od 10:1, a ležišta su praćena još 48 sati. Rezultati su prikazani i zabeleženi kao vrednost ćelijskog indeksa (CI) izvedena iz promene izmerene električne impedanse, a zatim su transformisani odnosom deljenjem očitavanja CI svih ležišta u svim vremenskim tačkama sa vrednošću CI pojedinačnih ležišta u istom vremenu (bazno vreme) da bi se dobila normalizovana vrednost ćelijskog indeksa koja predstavlja procenat vrednosti u baznom vremenu (videti Zhang et al. „Introduction to the Data Analysis of the Roche xCELLigence® System with RTCA Package.“ Bioconductor. 3. maj 2016, bioconductor.org/packages/devel/bioc/ vignettes/RTCA/inst/doc/aboutRTCA.pdf. pristupljeno 9. septembra 2016). U ovom testu, smanjenje impedanse monosloja odražava ubijanje ciljnih ćelija od strane transdukovanih ćelija.
[1499] Rezultati su pokazali da je smanjena impedansa primećena u ćelijama koje eksprimuju 1. generaciju CAR u poređenju sa netransdukovanim T ćelijama, iako je stepen smanjene impedanse za ćelije koje eksprimuju 1. generaciju CAR je bila manja nego u ćelijama koje eksprimuju 2. generaciju CAR. Smanjena impedansa u ćelijama koje eksprimuju 1. generaciju CAR se generalno nastavila do prvih 8 sati testa, dok su samo ćelije koje eksprimuju CAR 2. generacije nastavile su da smanjuju impedansu nakon toga.
[1501] Kao što je prikazano u Sl. 1, kod jednog donora, svaka od ćelija koeksprimuje TIP ili odgovarajući transmembranski protein divljeg tipa sa 1. generacijom CAR pokazala je veći pad impedanse, što ukazuje na veću citotoksičnu aktivnost, u poređenju sa ćelijama koje eksprimuju samo 1. generaciju CAR. Dalje, rezultati su pokazali da je citotoksična aktivnost bila veća u ćelijama koje eksprimuju CAR i koje su koeksprimovale CD80-TIP ili ICOSL-TIP u odnosu na ćelije koje eksprimuju CAR i koje su koeksprimovale odgovarajuće transmembranske proteine divljeg tipa CD80 ili ICOSL koji sadrže IgSF domen modifikovan bez afiniteta. Posmatrani rezultati ovih ćelija modifikovanih TIP pokazali su da citotoksična aktivnost u ćelijama koje koeksprimuju CD80-TIP ili ICOSL-TIP sa CAR pokazuju povećanu aktivnost u modulaciji citotoksičnog imunog odgovora antigen-specifičnih T ćelija, kao što su T ćelije koje eksprimuju CAR.
[1503] [0599] Kod druga dva donora, ćelije koje eksprimuju CD80-TIP nisu dovele do većeg smanjenja impedanse u poređenju sa ćelijama koje eksprimuju odgovarajući transmembranski protein CD80 divljeg tipa. Kod jednog donora, nije bilo dovoljno ćelija za transdukciju sa konstrukcijom transmembranskog proteina divljeg tipa, iako je kod ovog donora ICOS-L TIP pokazao najbolju citotoksičnost u poređenju sa drugim testiranim konstrukcijama. Kod drugog donora, ćelije koje eksprimuju ICOS-L-TIP nisu dovele do većeg smanjenja impedanse u poređenju sa ćelijama koje eksprimuju odgovarajući transmembranski protein ICOS-L divljeg tipa. U testiranim ćelijama, sve ćelije koje koeksprimuju ili CD80-TIP, ICOSL-TIP ili odgovarajući transmembranski protein divljeg tipa sa CAR pokazale su veću citotoksičnu aktivnost nego ćelije koje eksprimuju samo CAR prve generacije. Razlike u rezultatima primećenim među donorima mogu biti vezane sa razlikama u T ćelijama među donorima, razlikama u nivoima ekspresije različitih genetski modifikovanih proteina na površini ćelija, posebnim uslovima koji se koriste u ovom primernom testu za procenu ubijanja ćelija (npr. procena transdukovanih ćelija 14. dana, procena odnosa jednog efektora i ciljne ćelije) ili drugim faktorima.
[1505] PRIMER 10
[1507] Procena vezivanja i aktivnosti varijanti ICOSL IgSF domena
[1509] Dodatne ECD ICOSL varijante su identifikovane postupkom selekcije kvasca uglavnom kao što je gore opisano i korišćene su za proizvodnju ECD-Fc fuzionih proteina kao što je opisano u Primeru 5. Studije vezivanja su sprovedene da bi se procenila specifičnost i afinitet imunomodulatornih proteina varijante ICOSL domena za srodne partnere za vezivanje uglavnom kao što je opisano u Primeru 6.
[1511] A. Vezivanje i funkcionalna karakterizacija
[1513] Vezivanje je procenjeno za ćelije koje eksprimuju srodne partnere za vezivanje CD28, ICOS i CTLA-4 pune dužine, uglavnom kao što je opisano u Primeru 6. Bioaktivnost ECD ICOSL varijanti je, takođe, procenjena u testu koimobilizacije anti-CD3 ili reakciji humanih mešovitih limfocita (MLR) uglavnom kao što je opisano u Primeru 6, osim što je za test koimobilizacije kostimulativna aktivnost određena kulturom humanih T ćelija sa smešom 10 nM proteina varijante ICOSL Fc vezanih za ploču.
[1515] [0602] Tabela 15 prikazuje primerne rezultate za dodatne varijante ICOSL IgSF domena za vezivanje za kontrastrukture koje se eksprimuju u ćelijama i bioaktivnost u testu koimobilizacije anti-CD3 ili MLR testu. Primerne supstitucije amino-kiselina prikazane u Tabeli 15 označene su brojem pozicije amino-kiseline koji odgovara odgovarajućoj referentnoj (npr. nemodifikovanoj) ICOSL ECD sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:32. Pozicija amino-kiseline je naznačena u sredini, sa odgovarajućom nemodifikovanom (npr. divljeg tipa) amino-kiselinom navedenom pre broja i identifikovanom varijantom supstitucije amino-kiseline navedenom posle broja. Kolona 2 navodi SEQ ID NO identifikator za varijantu ECD za svaku varijantu ECD-Fc fuzionog molekula.
[1517] Rezultati u Tabeli 15 prikazuju aktivnost vezivanja merenu vrednošću srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) za vezivanje svake varijante Fc-fuzionog molekula za ćelije konstruisane da eksprimuju srodni ligand kontrastrukture i odnos MFI u poređenju sa vezivanjem odgovarajućeg referentnog (npr. nemodifikovanog) ECD-Fc fuzionog molekula koji ne sadrži supstituciju(e) amino-kiselina za isti ligand kontrastrukture koji se eksprimuje u ćelijama. Funkcionalna aktivnost varijanti Fc-fuzionih molekula za modulaciju aktivnosti T ćelija takođe je prikazana na osnovu izračunatih nivoa IFN-γ u supernatantima kulture (pg/mL) generisanih ili i) sa naznačenim varijantom ECD-Fc fuzionog molekula koimobilizovanim sa anti-CD3 ili ii) sa naznačenim varijantom ECD-Fc fuzionog molekula u MLR testu. Tabela, takođe, prikazuje odnos IFN-γ koji proizvodi svaka varijanta ECD-Fc u poređenju sa odgovarajućim nemodifikovanim (parentalnim) ECD-Fc u oba funkcionalna testa.
[1519] Rezultati pokazuju izmenjen, uključujući povećan, afinitet vezivanja varijanti ICOSL IgSF domena sa modifikovanim afinitetom za najmanje jedan srodni ligand kontrastrukture i/ili poboljšanu imunološku aktivnost. Konkretno, slično početnim pogocima identifikovanim u Primeru 6, selekcije su rezultirale identifikacijom brojnih dodatnih varijanti ICOSL IgSF domena koje su afinitetno modifikovane da bi pokazale povećano vezivanje za najmanje jedan, a u nekim slučajevima i više od jednog, srodnog liganda kontrastrukture. Pored toga, rezultati su pokazali da je modifikacija afiniteta varijanti molekula, takođe, pokazala poboljšane aktivnosti i za povećanje i/ili smanjenje imunološke aktivnosti u zavisnosti od formata molekula kao što je opisano u Primeru 6.
[1520]
[1521]
[1522]
[1523]
[1524]
[1526] B. Proizvodnja citokina u testovima kostimulacije anti-CD3
[1527] [0605] Primeri varijanti ECD ICOSL Fc-fuzionih molekula opisanih gore su dalje procenjeni na stimulaciju citokina IL-17 u testu biološke aktivnosti anti-CD3 kostimulativne (koimobilizacije) opisanom gore. Smeša 10 nM anti-CD3 vezanih za ploču i 40 nM ICOSL Fc varijanti proteina je kultivisana sa humanim T ćelijama. Supernatanti su sakupljeni i nivoi IL-17 su određeni ELISA testom. Izmerena je količina IL-17 u supernatantima kulture (pg/mL) generisana sa naznačenim varijantom ECD-Fc fuzionog molekula i odgovarajućim nemodifikovanim (parentalnim) ECD-Fc koimobilizovanim sa anti-CD3. Radi poređenja, u ovoj tabeli su, takođe, prikazani rezultati za proizvodnju IFN-γ u istom testu kao što je prikazano u Tabeli 15 za primerne varijante.
[1529] Rezultati su prikazani u Tabeli 16, koja prikazuje pg/mL IL-17 izmeren u supernatantu, kao i odnos (povećanje u broju puta) IL-17 proizvedenog od strane svake varijante ECD-Fc u poređenju sa odgovarajućim nemodifikovanim (divljim tipom) ECD-Fc. Slični rezultati su prikazani za IFN-γ. Takođe je prikazan procenat ukupnog IL-17 ili IFN-γ citokina proizvedenog od strane ćelija. Rezultati su pokazali da je afinitetna modifikacija varijanti molekula pokazala izmenjenu funkcionalnu aktivnost T ćelija da poveća IL-17 pored IFN-γ u testu kostimulacije.
[1531]
[1532]
[1535] PRIMER 11
[1537] Generisanje dodatnih konstruisanih T ćelija koje eksprimuju transmembranski imunomodulatorni protein i procena proliferacije
[1539] [0607] Ovaj primer opisuje generisanje dodatnih konstruisanih T ćelija u kojima je transmembranski imunomodulatorni protein (TIP) koji sadrži ekstracelularni domen (ECD) koji sadrži ICOSL afinitetno modifikovani IgSF domen koeksprimovan sa himernim antigenskim receptorom (CAR). Konkretno, TIP je generisan da bi uključio ECD primerne varijante ICOSL koja sadrži amino-kiselinske mutacije N52D, N52H/N57Y/Q100P, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R ili N52H/N57Y/Q100R uz upućivanje na pozicije u ekstracelularnom domenu ICOSL navedene u SEQ ID NO:32. TIP je takođe sadržao transmembranski domen i citoplazmatski domen odgovarajuće sekvence transmembranskog proteina ICOSL divljeg tipa koja odgovara ostacima 257-302 SEQ ID NO:5. Sekvenca TIP-a sa i bez njegovog signalnog peptida je sledeća: N52D (SEQ ID NO: 496 i 497); N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 498 i 499); E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R (SEQ ID NO: 500 i 501) i N52H/N57Y/Q100R (SEQ ID NO: 502 i 503). Poređenja radi, transmembranski ICOSL divljeg tipa pune dužine (amino-kiselinski ostaci 19-302 SEQ ID NO:5) je takođe eksprimovan u ćelijama. Sekvenca divljeg tipa TIP sa i bez njegovog signalnog peptida je navedena u SEQ ID NO: 494 i 495. Nukleinska kiselina koja kodira TIP takođe je uključivala sekvencu koja kodira zeleni fluorescentni protein (GFP) odvojen od TIP samocepajućom T2A sekvencom.
[1541] TIP koji sadrži afinitetno modifikovani domen ili transmembranski protein divljeg tipa koji sadrži odgovarajući neafinitetno modifikovani IgSF domen koeksprimovani su u T ćelijama sa himernim antigenskim receptorom (CAR). Nukleotidna sekvenca koja kodira CAR kodira, redom: CD8 signalnu sekvencu (SEQ ID NO: 481), anti-CD19 scFv (SEQ ID NO: 482), zglobni/transmembranski region izveden iz CD8 (SEQ ID NO: 483), kostimulativni signalni domen izveden iz 4-1BB (SEQ ID NO: 484) i CD3zeta signalni domen (SEQ ID NO: 247). Dobijeni anti-CD19 CAR ima sekvencu amino-kiselina navedenu u SEQ ID NO: 490. Nukleinska kiselina koja kodira CAR takođe je uključivala sekvencu koja kodira plavi fluorescentni protein (BFP; SEQ ID NO: 489) odvojen od CAR samocepajućom T2A sekvencom (navedenom u SEQ ID NO: 488).
[1543] [0609] Konstrukti virusnih vektora su odvojeno generisani, i u njih je kloniran ili molekul nukleinske kiseline koji kodira samo CAR ili molekul nukleinske kiseline koji kodira jedan od primernih TIP ili divljeg tipa ICOSL. Virusni vektor koji kodira CAR i virusni vektor koji kodira TIP ili divlji tip ICOSL su kotransdukovani u T ćelije. Za transdukciju, primarne T ćelije su aktivirane sa anti-CD3 i anti-CD28 perlama (Dynal) u odnosu perla:ćelija 1:1 i inkubirane u prisustvu 100 IU/mL IL-2 na 37°C tokom 2 dana. T ćelije su zatim sakupljene i transdukovane sa 400 µL CAR virusnog supernatanta i 400 µL TIP virusnog supernatanta u prisustvu 8 µg/mL polibrena. Ćelije su spinokulirane na 1000g tokom 30 minuta na 30°C. Ćelije su zatim prebačene i inkubirane preko noći na 37°C. Nakon inkubacije, ćelije su sakupljene i virusni supernatant je uklonjen. Ćelije su resuspendovane sa kompletnim medijumom i 50 IU/mL IL-2. Ćelije su ekspandirane, dopunjavane sa IL-2 i medijumom svaka dva dana tokom ukupno 6 dana. Kuglice su uklonjene iz ćelija pomoću magneta i prebrojane pre nego što su procenjene u testu proliferacije. Primeran profil ekspresije TIP i CAR u primernim transdukovanim T ćelijama je prikazan na Sl.
[1544] 2A.
[1546] Da bi se procenila proliferacija CAR T ćelija i CAR-TIP T ćelija kao odgovor na antigen, ćelije su obeležene tragovima ćelija u crvenoj boji. Ciljne ćelije Nalm6 koje eksprimuju CD19 titrirane su počevši od odnosa cilj:T ćelija 1,5:1 i razblaživanjima od 1:2 sa 8-tačkastim razblaživanjem. Obeležene CAR T ćelije ili CAR-TIP T ćelije su dodate u Nalm6 ćelije i kultura je inkubirana 4 dana pre nego što su ćelije analizirane protočnom citometrijom. Supernatant je sakupljen i dalje procenjen u testu oslobađanja citokina.
[1548] Kao što je prikazano na Sl.2B, CAR+ primarne T ćelije proliferiraju na način zavisan od doze u CD19+ NALM6 ćelije. U poređenju sa T ćelijama koje eksprimuju samo CAR, T ćelije koje koeksprimuju CAR i ili divlji tip ICOSL ili jedan od primernih ICOSL TIP pokazale su poboljšanu proliferaciju u poređenju sa T ćelijama koje eksprimuju samo CAR. Koekspresija CAR i TIP koji sadrži ili N52H/N57Y/Q100P, E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R ili N52H/N57Y/Q100R varijantu ICOSLECD pokazala je veću proliferaciju od T ćelija koje koeksprimuju CAR i divlji tip ICOSL, što ukazuje da TIP eksprimovani na primarnim T ćelijama obezbeđuju poboljšani kostimulativni signal za poboljšanje proliferacije T ćelija.
[1550] PRIMER 12
[1552] Prečišćavanje i procena prečišćenih varijanti ICOSL IgSF domena
[1554] [0612] Strategija prečišćavanja je korišćena za primerne kandidatske pogodke opisane u Primerima 6 i 10. Humane ćelije izvedene iz ćelijske linije 293 (Expi293) su prolazno transfektovane ekspresionim konstruktom i ECD ICOSL Fc fuzioni molekul je eksprimovan u ćelijama. Fc fuzioni proteini su zatim prečišćeni iz supernatanata sa Proteinom A afinitetnom hromatografijom (MabSelect SuRe). Nakon ovog početnog koraka prečišćavanja usledio je korak preparativne hromatografije isključivanja po veličini (SEC) radi daljeg prečišćavanja proteina (Superdex200 16x60). Uzorci iz oba koraka prečišćavanja su zadržani i upoređeni analitičkom SEC. Koncentracija proteina je određena nakon prečišćavanja Proteinom A. Dobijeni prečišćeni proteini su, takođe, analizirani analitičkom SEC na tečnoj hromatografiji visokih performansi (HPLC) radi procene čistoće.
[1556] Procenat glavnog pika u prečišćenim uzorcima je određen i upoređen sa proteinom prečišćenim u početnom koraku Proteina A (% Glavnog pika Prot A pula) u odnosu na protein prečišćen sa Proteinom A, nakon čega je usledila preparativna SEC (% Glavnog pika SEC pula T=D0). Kao što je prikazano u Tabeli 17, dodatni korak SEC je značajno povećao čistoću proteina prečišćenih proteina. Da bi se dalje procenila stabilnost proteina, proteini prečišćeni preparativnom SEC su ostavljeni na sobnoj temperaturi 24 sata, a zatim je procenjen % Glavnog pika pomoću HPLC (% Glavnog pika SEC pula T=D24) i upoređen sa uzorkom D0. Određena je promena u % Glavnog pika na D0 u odnosu na D24 (▲% Glavnog pika SEC pula). Kao što je prikazano u Tabeli 17, većina testiranih primernih varijanti ECD ICOSL Fc fuzionih molekula pokazala je malu promenu u % Glavnog pika u ovom trenutku, što ukazuje na minimalnu agregaciju proteinskih varijanti.
[1558]
[1559]
[1562] PRIMER 13
[1564] Procena kostimulativne bioaktivnosti prečišćenih pogodaka varijante ICOSL IgSF domena
[1565] Primerni ECD ICOSL Fc fuzioni molekuli prečišćeni kao što je opisano u Primeru 12 procenjeni su na biološku aktivnost pomoću MLR u suštini kao što je opisano u Primeru 6. Smeša 10 nM ili 40 nM ICOSL Fc varijantnih proteina je vezana preko noći za ploče sa 96 ležišta u prisustvu 10 nM anti-CD3. Ploče su isprane i dodato je 100.000 CFSE obeleženih pan T ćelija tokom 96 sati. Supernatanti su sakupljeni, a nivoi IFN-γ i IL-17 su mereni pomoću ELISA.
[1567] [0615] Rezultati za sekreciju citokina indukovanu kostimulacijom anti-CD3 sa primernim testiranim varijantama (10nM i 40nM ICOSL Fc) su prikazani na Sl. 3A i 3B, što ukazuje na primerne supstitucije (zamene) amino-kiselina IgSF domena u ECD ICOSL. Stubičasti grafikoni na Sl. 3A i 3B prikazuju količinu sekretovanog IFN-γ i IL-17, redom, pomoću ELISA testa u supernatantima (pg/mL). Nivo oslobađanja citokina indukovan anti-CD3 kostimulacijom sa testiranim varijantama u poređenju sa nivoom indukovanim anti-CD3 kostimulacijom sa WT ICOSL je naznačen horizontalnom linijom. Rezultati su pokazali da je afinitetna modifikacija varijanti molekula pokazala aktivnost u modulaciji funkcionalne aktivnosti T ćelija, uključujući značajno povećanje sekrecije IFN-γ i IL-17 u testu kostimulacije. Povećana imunološka aktivnost je primećena kod nekih varijanti.
[1569] PRIMER 14
[1571] Procena proliferacije prečišćenih pogodaka varijante ICOSL IgSF domena
[1573] Primeri varijanti ECD ICOSL Fc fuzionih molekula, prečišćenih kao što je opisano u Primeru 12, procenjeni su na sposobnost kostimulacije proliferacije T ćelija indukovane anti-CD3. Primarne T ćelije su obeležene karboksifluorescein sukcinmidil estrom (CFSE). Smeša 10 nM ili 40 nM varijante ECD ICOSL Fc ili proteina divljeg tipa ECD ICOSL vezana je preko noći za ploče sa 96 ležišta u prisustvu 10 nM anti-CD3, a zatim su dodate obeležene T ćelije i inkubirane 3 dana. Kao kontrola, proliferacija je, takođe, procenjena u prisustvu vezanog anti-CD3 i IgG ili samo IgG. Ćelije su obojene za površinske markere CD4 ili CD8, a proliferacija ukupnih T ćelija, CD4+ T ćelija ili CD8+ T ćelija određena je procenom razblaženja CFSE protočnom citometrijom.
[1575] Rezultati su prikazani na Sl. 4A i Sl. 4B za primerne varijante testirane na 40nM i 10nM ICOSL, redom. Kao što je prikazano na Sl. 4A, skoro svi testirani varijantni ECD ICOSL Fc fuzioni molekuli indukovali su proliferaciju veću od WT kontrole. Kao što je prikazano na Sl.
[1576] 4B, razlike u proliferaciji bile su očiglednije na 10 nM, pri čemu su određene varijante obezbeđivale maksimalnu proliferaciju čak i pri ovoj nižoj koncentraciji.
[1578] PRIMER 15
[1580] Procena vezivanja i aktivnosti prečišćenih pogodaka varijante ICOSL IgSF domena
[1581] Primeri varijanti ECD ICOSL Fc fuzionih molekula prečišćenih kao što je opisano u Primeru 12, procenjeni su na aktivnosti vezivanja i funkcionalne aktivnosti korišćenjem metoda u suštini onakvih kakve su opisane u Primeru 6 ili Primeru 10.
[1583] A. Testovi vezivanja protočnom citometrijom
[1584] Humane ćelije izvedene iz ćelijske linije 293 (Expi293) su transfektovane sa CD28, CTLA-4, ICOS ili su podvrgnute lažnoj transfektaciji. Ćelije su zatim inkubirane sa ECD ICOSL Fc fuzionim molekulima ili divljim tipom ECD ICOSL-Fc koji su titrirani od 100.000 pM do 46 pM, a vezivanje je posmatrano korišćenjem PE-konjugovanog anti-humanog Fc kao što je opisano u Primeru 6. Vezivanje je procenjeno protočnom citometrijom, a srednji intenzitet fluorescencije (MFI) i procenat (%) ćelija pozitivnih na signal su određeni korišćenjem Cell Quest Pro softvera (Becton Dickinson, SAD). Određena je koncentracija ICOSL-Fc koja je dala polumaksimalni MFI odgovor (MFI EC50) ili % pozitivnih ćelija (% (+) EC50).
[1586] Tabela 18 prikazuje rezultate. ICOSL amino-kiselinske supstitucije prikazane u Tabeli 18 označene su brojem pozicije amino-kiseline koji odgovara odgovarajućoj referentnoj (npr. nemodifikovanoj) ICOSL ECD sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:32. Za neke vrednosti (npr. WT vezivanje za CD28) nije bilo moguće dobiti EC50, stoga je 1000000 pM proizvoljno izabrano u svrhu formatiranja podataka. Slično rezultatima dobijenim iz prethodnih testova vezivanja kao što je opisano u Primeru 10 iznad, primećen je izmenjeni afinitet vezivanja varijante ICOSL ECD-Fc fuzionog molekula za najmanje jedan srodni ligand kontrastrukture.
[1588]
[1589]
[1592] B. Test vezivanja ForteBio
[1594] [0621] Interakcije protein-protein između receptora i imunomodulatornih proteina varijante ICOSL domena dalje su procenjene korišćenjem Fortebio testova vezivanja. ICOS, CD28 i CTLA-4 receptori su pojedinačno učitani na senzore za hvatanje anti-humanih antitela (ForteBio Octet AHC) i nemodifikovani ICOSL ECD-Fc fuzioni molekul divljeg tipa, PD-L2 ED-Fc fuzioni molekul divljeg tipa ili varijantni ICOSL Fc-fuzioni molekuli su vezani za receptore u 4-tačkastim titracijama. Svaka titracija je bila globalno prilagođena za izračunavanje asocijata (ko<on>) i disocijacija (K<dis>) svakog proteina. Određen je odgovor opterećenja senzora za hvatanje hvatanje anti-humanih antitela svakog receptora koji je testiran varijantom ICOSL ECD-Fc fuzionog molekula. Konstanta disocijacije (KD) je izračunata i upoređena sa divljim tipom da bi se odredila vrednost višestrukog poboljšanja (fold imp.).
[1596] Rezultati vezivanja za ICOS su prikazani u Tabeli 19, za CD28 su prikazani u Tabeli 20 i za CTLA-4 su prikazani u Tabeli 21. Primerne supstitucije amino-kiselina prikazane u Tabelama 19-21 su označene brojem pozicije amino-kiselina koji odgovara odgovarajućoj referentnoj nemodifikovanoj ICOSL ECD sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:32.
[1598]
[1599]
[1600]
[1601]
[1602]
[1603]
[1606] C. Test koimobilizacije
[1608] Kostimulativna bioaktivnost ICOSL fuzionih varijanti određena je u testovima koimobilizacije anti-CD3, uglavnom onako kako je opisano u Primeru 6. Približno 0,37 nM, 1,3 nM ili 10 nM mišjeg anti-humanog CD3 (OKT3, Biolegends, SAD) razblaženo je u PBS sa 10 nM ili 40 nM varijante ICOSL ECD Fc ili divljeg tipa ICOSL ECD-Fc. Ova smeša je dodata preko noći u ploče sa 96 ležišta ravnog dna tretirane kulturom tkiva kako bi se olakšalo prijanjanje stimulatornih proteina na ležišta ploče. Sledećeg dana, nevezani protein je ispran sa ploča i u svako ležište je dodato 100.000 prečišćenih humanih pan T ćelija. Ćelije su kultivisane 3 dana pre sakupljanja supernatanata kulture i merenja nivoa humanog IFN-gama pomoću ELISA kompleta.
[1610] Tabela 22 prikazuje količinu IFN-γ (pg/mL) koju proizvode ćelije pod različitim uslovima u testu koimobilizacije anti-CD3. U tabeli, supstitucije amino-kiselina primernih varijanti ECD ICOSL-Fc fuzija označene su brojem pozicije amino-kiselina koji odgovara nemodifikovanoj ICOSL ECD sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 32 i odgovarajućim identifikatorom SEQ ID NO za varijantu ECD za svaki varijantni ICOSL ECD-Fc fuzioni molekul je naveden. Prikazan je odnos IFN-gama proizvedenog u prisustvu svake varijante ICOSL ECD-Fc u funkcionalnom testu u poređenju sa prisustvom odgovarajućeg nemodifikovanog (divljeg tipa) ECD-Fc (Fold ↑WT). Kao što je prikazano, kostimulativna signalizacija varijanti ICOSL-ECD-Fc molekula bila je znatno veća u poređenju sa divljim tipom ICOSL.
[1611]
[1612] D. Reakcija mešovitih limfocita za procenu supresije bioreaktivnosti
[1614] Modulacija aktivnosti T ćelija fuzionim varijantama određena je u reakciji mešovitih limfocita (MLR) uglavnom kao što je opisano u Primeru 6. Humani monociti su inkubirani 6 dana u prisustvu IL-4 i GM-CSF i sazreli su u dendritske ćelije uz dodatak LPS tokom poslednjih 24 sata. 1x10<4>dendritske ćelije i 1x10<5>Humane T ćelije obeležene CFSE su zasejane po ležištu i inkubirane 4 dana u prisustvu tri različite koncentracije (40 nM, 13,3 nM ili 4,4 nM) molekula divljeg tipa ili rekombinantne varijante ICOSL ECD-Fc razblaženih u PBS. Iste koncentracije humanog IgG, PD-L2-Fc ili Belatacepta (CTLA4-Fc koji sadrži L104E i A29Y mutacije) su korišćene kao kontrole. Supernatanti su sakupljeni, a IFN-gama odgovori su okarakterisani ELISA testom.
[1616] Sl. 5 prikazuje proizvodnju IFN-gama pod različitim uslovima. Nivoi IFN-gama koje proizvode ćelije u prisustvu divljeg tipa ICOSL su prikazani horizontalnom linijom. Nije primećena supresija proizvodnje IFN-gama u prisustvu negativnog kontrolnog proteina PD-L2-Fc. Nasuprot tome, većina testiranih varijanti ICOSL pokazala je određeni stepen inhibicije proizvodnje IFN-gama u MLR. Određene varijante su pokazale značajnu inhibiciju IFN-γ sa veoma niskim ili nikakvim detektovanim IFN-gama proizvedenim u kulturama, čak i pri najnižoj testiranoj koncentraciji od 4,4 nM. Procenat supresije MLR u prisustvu 4,4 nM varijante varijante ECD ICOSL-Fc je naveden u Tabeli 23. U Tabeli, negativne vrednosti ukazuju na inflamatorni efekat u testu.
[1618]
[1619]
[1622] E. Procena proliferacije i intracelularnih citokinskih markera protočnom citometrijom
[1623] T ćelije obeležene karboksifluorescein sukcinmidil estrom (CFSE) iz MLR studija, kao što je gore opisano, koje su inkubirane 4 dana u prisustvu molekula divljeg tipa ili rekombinantne varijante ICOSL ECD-Fc, dalje su testirane na nivoe citokina restimulacijom sa forbol miristat acetatom (PMA)/jonomicinom tokom 6 sati u prisustvu inhibitora Goldžijevog aparata (Goldži/Blok/Čep). T ćelije iz MLR studije koje su inkubirane sa humanim IgG, anti-CD28, anti-ICOSL, PD-L2-Fc ili Belataceptom (CTLA4-Fc koji sadrži L104E i A29Y mutacije) takođe su restimulisane. T ćelije su obojene za površinske markere CD4 ili CD8, fiksirane, permeabilizovane i intracelularno obojene za različite citokine, kao što je navedeno u Tabelama 24 i 25.
[1625] [0628] Procenat (%) CD4+ i CD8+ T ćelija koje su bile pozitivne na specifične intracelularne citokine prikazan je u Tabeli 24, redom. Rezultati su pokazali da je određeni broj varijantnih ICOSL ECD-Fc molekula bio u stanju da suzbije jedan ili više citokina, uključujući, u nekim slučajevima, većinu citokina. Ukupan rezultat i srednji rezultat su izračunati da bi se procenili zbirni efekti pojedinačnih molekula testiranih u odnosu na parametre ispitivane u ovom testu. Takođe je procenjena proliferacija, a procenat ćelija koje su se podelile, određen CFSE razblaživanjem, takođe je prikazan u Tabelama 24 i 25. Među datim rezultatima, rezultati pokazuju da određene varijante pokazuju uporedivu ili bolju aktivnost od Belatacepta, posebno iz CD8+ ćelija.
[1626]
[1627]
[1628]
[1629]
[1631] PRIMER 16 Procena proizvodnje citokina u kokulturi B-T ćelija
[1633] B ćelije i CD4+ T ćelije su prečišćene od istog donora i obeležene sa CSFE i zasejane na ploče sa 96 ležišta u ćelijskim odnosima 1:1 pri 5 x 10<4>ćelije svakog po ležištu. Varijantni ICOSL ECD-Fc fuzioni molekuli ili Belatacept su dodati u konačnoj koncentraciji od 40nM po ležištu. Ćelije su ili nestimulirane ili inkubirane sa 100 ng/mL Staphylococcus enterotoxin B (SEB), 1 µg/mL Pokeweed Mitogena (PWM) ili oba tokom 7 dana na 37°C u konačnoj zapremini od 200 µl/ležištu.
[1635] Ćelije su sakupljene i površinski obojene za sledeće markere B i T ćelijske loze (IgM, IgD, CD38, CD138, CD27, CD19, CD4, CD3). Proliferacija je procenjena protočnom citometrijom, a supernatanti kulture su analizirani na citokine IL-5, IL-13 ili IL-21 korišćenjem LEGENDplex kompleta za detekciju humanih Th citokina (Biolegend, SAD).
[1637] Kao što je prikazano na Sl. 6A, broj B ćelija koje se dele je smanjen u kokulturama B/T ćelija kada su inkubirane u prisustvu varijanti ICOSL ECD Fc-fuzionih molekula u poređenju sa kontrolama bez proteina. Stepen antagonističkog efekta za testirane primerne varijante bio je sličan CTLA-4-Ig Belataceptu (L104E, A29Y). Slično tome, kao što je prikazano na Sl. 6B-6D, varijantni ICOSL ECD Fc-fuzioni molekuli inhibirali su proizvodnju citokina u primarnoj kokulturi humanih B ćelija/T ćelija in vitro u poređenju sa kontrolama bez proteina, kao i sa kulturama koje sadrže kontrolu divljeg tipa ICOSL. U poređenju sa Belataceptom, primereno testirani varijantni ICOSL ECD Fc-fuzioni molekuli bili su efikasniji u blokiranju proizvodnje citokina u nekim slučajevima.
[1639] PRIMER 17
[1641] Procena preživljavanja i aktivnosti bolesti u modelu reakcije kalem protiv domaćina (GvHD)
[1643] [0632] Primerni ICOSL varijantni ECD-Fc protein, procenjen je na aktivnost u modelu bolesti kalem protiv domaćina (GvHD). Ženke NSG miševa (n = 10 po grupi) su ozračene (100 rad) i supkutano im je administrirano 10 mg gama globulina na Dan -1. Na Dan 0, miševi su primili 10 miliona mononuklearnih ćelija humane periferne krvi (PBMC) i intraperitonealnu injekciju od 100µg WT-ICOSL ECD Fc, varijante ICOSL ECD Fc molekula N52H/I143T (ECD naveden u SEQ ID NO: 135), varijante ICOSL ECD Fc molekula N52H/N57Y/Q100P (ECD naveden u SEQ ID NO: 113), 75µg Belatacepta (CTLA-4-Ig L104E/A29Y; US20160271218) ili fiziološki rastvor kao kontrola. 15. dana, kalemljene humane CD45+ ćelije su fenotipizovane protočnom citometrijom. Nakon što je studija završena 35. dana, procenjena su završna merenja preživljavanja, gubitka telesne težine i aktivnosti bolesti.
[1645] Sl. 7A prikazuje preživljavanje GVHD miševa tretiranih fiziološkim rastvorom, WT ICOSL-ECD Fc, varijantnim ICOSL ECD-Fc molekulima ili Belataceptom. Primećena je značajna razlika u preživljavanju miševa kojima je davana varijanta ICOSL ECD-Fc N52H/N57Y/Q100P (ECD naveden u SEQ ID NO: 113) u poređenju sa miševima kojima je davan fiziološki rastvor ili WT ICSOL ECD-Fc (p <0,0001 pomoću Mantel-Cox i Gehan-Breslow-Wilcoxon testova). Sl.
[1646] 7B prikazuje slične razlike između gubitka telesne težine miševa tretiranih fiziološkim rastvorom, WT ICOSL ECD-Fc, varijantnim ICOSL ECD-Fc molekulima ili Belataceptom tokom studije.
[1648] Indeks aktivnosti bolesti (DAI) je određvian tri puta nedeljno tokom studije i procenjivao je gubitak težine, držanje tela, aktivnost, izgled dlake i kože miševa. Stepen bolesti tokom trajanja studije je prikazan na Sl. 7C. Grupe za tretman koje su primale ICOSL Fc varijantu N52H/N57Y/Q100P (ECD naveden kao SEQ ID NO: 113) ili Belatacept pokazale su značajno poboljšane DAI rezultate. Procenat humanih T ćelija u perifernoj krvi 14. dana studije takođe je procenjen protočnom citometrijom. Merenja su usrednjena po grupama za tretman, a grafikoni grešaka predstavljaju standardnu grešku srednje vrednosti (SEM). Sl.7D prikazuje procenat živih CD3+/CD4+ ili CD3+/CD8+ ćelija u krvi. Grupe za lečenje koje su primale varijantu ICOSL ECD Fc sa N52H1N57Y/Q100P (ECD naveden SEQ ID NO: 113) ili Belatacept pokazale su značajno različite nivoe CD4+ T ćelija u poređenju sa grupom tretiranom fiziološkim rastvorom (p = 0,008 i 0,006, redom, neuparenim t-testom). Ova studija pokazuje terapeutski efekat varijante ICOSL Fc proteina na humane primarne T ćelije i GVHD tokom in vivo modeliranje.
[1650] [0635] Slična studija sa dodatnim varijantnim ICOSL ECD-Fc fuzionim molekulima je sprovedena, uključujući varijantu ICOSL ECD-Fc N52H/N57Y/Q100R/C198R (ECD naveden u SEQ ID NO: 365), N52H/N57Y/Q100R/F172S (ECD naveden u SEQ ID NO: 291) i N52H/N57Y/Q100P (ECD naveden u SEQ ID NO: 288). N52H/Q100R (ECD naveden u SEQ ID NO: 285), koji je imao smanjenu aktivnost u in vitro MLR studijama kao što je gore prikazano, takođe je testiran. NSG miševi (n=9/grupa) su tretirani kao što je gore opisano. U ovoj studiji, doziranje ICOSL-Fc ili Belatacepta je nastavljeno 3 puta nedeljno od dana 0 do dana 37, a preživeli miševi su uništeni 49. dana. Da bi se utvrdile statističke razlike u proporcijama preživljavanja među grupama, podaci su analizirani korišćenjem Mantel-Koksovog (log-rank) testa. Dobijene krive preživljavanja su prikazane na Sl. 7E. Varijante belatacepta i ICOSL-Fc N52H/N57Y/Q100R/C198R (ECD naveden u SEQ ID NO: 365), N52H/N57Y/Q100R/F172S (ECD naveden u SEQ ID NO: 291) i N52H/N57Y/Q100P (ECD naveden u SEQ ID NO: 288) značajno su produžile preživljavanje u poređenju sa fiziološkim rastvorom i WT ICOSL-Fc (p<0,001). Prosečni DAI rezultati su prikazani za vremenski tok eksperimenta, pri čemu je poslednje posmatranje (tj. prosečni rezultati prikupljeni na dane završetka) preneto na grafikon za one grupe koje su završene pre poslednjeg planiranog dana studije (Dan 49). Značajne razlike među grupama za podatke tokom vremena (tj. DAI rezultati) određene su korišćenjem dvofaktorske ANOVA ponovljenih merenja za efekte „tretmana“. Dobijeni DAI rezultati su prikazani na Sl.7F. Varijante belatacepta i ICOSL-Fc N52H/N57Y/Q100R/C198R (ECD naveden u SEQ ID NO: 365), N52H/N57Y/Q100R/F172S (ECD naveden u SEQ ID NO: 291) i N52H/N57Y/Q100P (ECD naveden u SEQ ID NO: 288) značajno su smanjile DAI rezultate u poređenju sa fiziološkim rastvorom i WT ICOSL-Fc (p<0,001), i između belatacepta i ICOSL-Fc varijante sa N52H/N57Y/Q100R/C198R pomoću dvofaktorske ANOVA za DAI rezultate (p = 0,035).
[1652] Aktivnost varijante ICOSL-Fc, u nekim slučajevima, bila je poboljšana u poređenju sa tretmanom belataceptom. Primena varijanti ICOSL-Fc štitila je od efekata GVHD-a, što je dokazano poboljšanim preživljavanjem i usporenim razvojem bolesti, na nivoima uporedivim ili boljim od belatacepta. Aktivnost u ovom modelu je bila u korelaciji sa in vitro aktivnošću, pošto WT ICOSL-Fc i varijanta ICOSL-Fc sa mutacijama N52H/Q100R (ECD naveden u SEQ ID NO: 285) nisu bile toliko efikasne u ovom modelu.
[1654] PRIMER 18
[1656] Procena aktivacije pomoću stek molekula
[1658] [0637] Stek varijantni IgV Fc fuzioni proteini koji sadrže NKp30 IgV domen kao lokalizacioni domen (označen kao „L“) i ICOSL IgV domen kao kostimulativni domen (označen kao „C“) su generisani i procenjeni uglavnom kao što je opisano u Primeru 8. Konkretno, konstrukti testirani u ovom eksperimentu uključuju: (1) stek konstrukt sa varijantom IgV Fc fuzionog proteina (vIgD C-L) koji sadrži NKp30 sastavljen od Ig konsenzusne NKp30 varijante (SEQ ID NO:143) sa IgV domenom ICOSL varijante N52H/N57Y/Q100P (ECD naveden u SEQ ID NO:113 i IgV naveden u SEQ ID NO:201); (2) naslagani konstrukt sa NKp30 domenom divljeg tipa Ig (SEQ ID NO:214) i V domenom divljeg tipa ICOSL (WT C-L) (SEQ ID NO:196); (3) konstrukt sa divljim tipom ICOSL IgV domenom (WT C domen; SEQ ID NO: 196), i (3) konstrukt sa divljim tipom NKp30 domenom (WT L domen; SEQ ID NO: 214).
[1660] Ćelije CD32+ K562 su dizajnirane da stabilno eksprimuju B7-H6 na površini ćelije. Ćelije su zatim tretirane mitomicinom i zasejane sa pan T-ćelijama u prisustvu odsustva 10nM anti-CD3 i naslaganih varijanti ili kontrolnih domena na 100, 33, 11 ili 3,7 nM. Ćelije su kultivisane 3 dana pre sakupljanja supernatanata kulture i merenja nivoa humanog IFN-γ pomoću ELISA testa.
[1662] Kao što je prikazano u Sl.8A, i varijantni i divlji tip kostimulativno-lokalizujućih domena bili su u stanju da se lokalizuju na konstruisanim K562 ćelijama i da isporuče kostimulativni signal pan-T-ćelijama kako bi indukovali sekreciju IFN-γ. Naslagana konstrukt sa varijantnim IgV Fc fuzionim proteinom (vIgD C-L) pokazala je povećane rezultate funkcionalne aktivnosti pri svim testiranim koncentracijama, dok pojedinačne komponente domena nisu imale efekat kada nisu kombinovane jedna sa drugom.
[1664] PRIMER 19
[1666] Procena preosetljivosti odloženog tipa in vivo
[1668] Varijantni ICOSL ECD-Fc fuzioni molekuli su procenjeni na antiinflamatornu aktivnost in vivo u modelu preosetljivosti odloženog tipa (DTH) kod miševa. Imunološke reakcije preosetljivosti odloženog tipa su izazvane kod miševa senzibilizovanih ovalbuminom (OVA) i procenjen je odgovor nakon izazivanja. Testirani varijantni ICOSL ECD-Fc fuzioni molekuli su sadržali varijantu ECD sa sledećim supstitucijama amino-kiselina: N52H/N57Y/Q100P (ECD naveden u SEQ ID NO: 113), N52H/Q100R (ECD naveden u SEQ ID NO: 285) ili N52H/N57Y/Q100R/F172S (ECD naveden u SEQ ID NO: 291). Varijante su fuzionisane ili sa Fc osnovom koja sadrži mutacije C220S/L234A/L235E/G237A prema EU numeraciji (označene kao Fc#1) navedene u SEQ ID NO: 477) ili sa Fc osnovom (kičmom) koja sadrži mutacije C220S/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K prema EU numeraciji (označene kao Fc#2) navedene u SEQ ID NO: 478) sa ili bez G4S (GGGGS; SEQ ID NO: 636) linkera. Tabela 26 prikazuje testirane konstrukte:
[1669]
[1672] Radi senzibilizacije, 8 nedelja starim ženkama BALB/c miševa je potkožno ubrizgano 100 µg OVA emulgovanog u Sigma adjuvantu (100 µL; kataloški broj S6322-1VL) u koren repa 0. dana. 1. i 4. dana, miševima su davani varijantni ICOSL ECD-Fc fuzioni proteini, 75 µg CTLA-4 Fc (abatacept) ili PBS kao negativna kontrola intraperitonealnom injekcijom. 7. dana, dva do tri sata pre OVA izazova, miševima je dodatno dat PBS kao kontrola, 75 µg CTLA-4 Fc (abatacept od Orencia) ili naznačeni varijantni ICOSL polipeptid intraperitonealnom injekcijom. Abatacept i varijantni ICOSL-Fc fuzioni molekuli su dozirani u molarnim ekvivalentima.
[1674] Za OVA izazov, intradermalna injekcija od 10 µg OVA u školjke levog uha u zapremini od 10 µL PBS-a je data pod anestezijom gasom izofluranom 2-3 sata nakon terapijskog tretmana. Početna debljina uha je merena pre OVA izazova.
[1676] Osmog dana, debljina uha je merena pod izofluranskom anestezijom pomoću Mitutoyo kalipera i određena je promena debljine uha pre i posle OVA izazova. Kao što je prikazano na Sl.
[1677] 9, Miševi tretirani naznačenim varijantama ICOSL ECD-Fc fuzionih molekula pokazali su značajno manje OVA-indukovano oticanje uha u poređenju sa PBS kontrolom (< 0,0001 jednosmernom ANOVA). Nije bilo značajnih razlika između debljine uha kod miševa tretiranih abataceptom u poređenju sa bilo kojim od naznačenih testiranih varijanta ICOSL ECD-Fc fuzionih molekula ili između tretmana varijantom ICOSL. Ovi rezultati pokazuju da varijante ICOSL molekula mogu smanjiti imuni odgovor in vivo.
[1678] PRIMER 20
[1680] Generisanje i procena vezivanja i aktivnosti varijanti ICOSL IgSF domena koji sadrže molekule
[1682] Dodatni molekuli koji sadrže varijantni ICOSL IgSF (npr. ECD) domen su generisani, kao što je opisano u daljem tekstu. U svakoj od tabela u daljem tekstu, tabela prikazuje supstitucije amino-kiselina u ECD varijante ICOSL, označene brojem pozicije amino-kiselina koji odgovara pozicijama amino-kiselina u odgovarajućoj referentnoj (npr. nemodifikovanoj) sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) ICOSL navedenoj u SEQ ID NO:32. U nekim slučajevima, uklanjanje AAA linkerske sekvence varijante ICOSL ECD-Fc je označeno sa "ΔAAA". Kolona 2 navodi identifikator SEQ ID NO za svaki varijantni ECD domen sadržan u varijantnom ECD-Fc fuzionom molekulu.
[1684] A. Generisanje dodatnih varijanti
[1686] 1. Varijante rastvorljivosti
[1688] Iz kolekcije mutanata koji sadrže sledeće mutacije, uključujući E16V, N30D, K42E, N52H, N52Y, N52S, N57Y, E90A, Q100R, Q100P, L102R, V110D, H115R, F120S, V122A, F138L, 1143V, 1143T, H152C, K156M, F172S, N194D, C198R, L203P, R221I, 1224V, mutacije H115R, F172S i C198R su identifikovane kao mutacije koje potencijalno mogu poboljšati rastvorljivost proteina ili poboljšati ekspresiju proteina („mutacije rastvorljivosti“). Ove tri mutacije (H115R, F172S i C198R) su nasumično uvedene mutagenezom usmerenom na mesto u isti skup klonova da bi se generisala kolekcija derivata koji sadrže jednu ili više ovih mutacija rastvorljivosti. Pošto je reakcija mutageneze usmerene na mesto sprovedena sa objedinjenim mutagenim oligonukleotidima koji su reagovali sa objedinjenim roditeljskim klonovima u jednoj reakciji, neki od klonova, takođe, sadrže neke mutacije iz drugih roditeljskih klonova. Generisane varijante su sadržale između 3 i 10 različitih mutacija amino-kiselina u različitim kombinacijama, kao što je sumirano u Tabeli 27A.
[1689]
[1690]
[1693] 2. Dodatne varijante
[1695] Posebne primerne mutacije, uključujući N52H, N52Y, N57Y, Q100R, Q100P, F138L, C198R, L203P identifikovane u odabranim varijantama opisanim u Primeru 6, dalje su kombinovane u ECD referentnog (npr. divljeg tipa) ICOSL uz upućivanje na pozicije navedene u SEQ ID NO:32 da bi se generisale dodatne kombinovane varijante. Generisane varijante su sadržale između 1 i 3 različite mutacije amino-kiselina u različitim kombinacijama kao što je navedeno u Tabeli 27B.
[1697]
[1698] 3. Varijante glikozilacije
[1700] Primerne mutacije glikozilacije izabrane iz N52H, N52Q, N84Q, N119Q, N155H, N155Q, N168Q, N207Q kombinovane su u različitim permutacijama u ECD referentnog (npr. divljeg tipa) ICOSL uz upućivanje na pozicije navedene u SEQ ID NO:32 da bi se generisale dodatne varijante kombinacija. Generisane varijante su sadržale između 1 i 5 različitih mutacija amino-kiselina u različitim kombinacijama kao što je navedeno u Tabeli 27C. Mutacije označene sa „X“ označavaju ili N ili Q na naznačenoj poziciji.
[1702]
[1703]
[1706] B. Vezivanje za ćelijski eksprimovane kontrastrukture
[1708] Dodatne varijante su formatirane kao Fc-fuzioni proteini kao što je opisano u Primeru 4. Varijantni Fc-fuzioni molekuli su procenjeni u studijama vezivanja kako bi se procenila specifičnost i afinitet imunomodulatornih proteina varijante ICOSL domena za srodne partnere za vezivanje. Ćelije Expi293 transfektovane srodnim partnerima za vezivanje, humanim CD28, ICOS i CTLA4, korišćene su u studijama vezivanja kao što je opisano u Primeru 6. MFI je određen za svaki transfektant i upoređen sa odgovarajućim nemodifikovanim (roditeljskim) ECD-Fc.
[1710] Rezultati vezivanja za primerne varijante ICOSL ECD-Fc fuzionih molekula prikazani su u tabelama 28A-C. Kao što je prikazano u Tabeli 28A-C, varijante ICOSL IgSF (npr. ECD) domena generisane različitim kombinacijama specifičnih mutacija pokazale su povećano vezivanje za najmanje jedan, a u nekim slučajevima i za više od jednog, srodnog liganda kontrastrukture.
[1711] C. Karakterizacija biološke aktivnosti pomoću testa koimobilizacije anti-CD3
[1713] Kostimulativna bioaktivnost generisanih varijanti Fc-fuzionih molekula je, takođe, procenjena u testovima koimobilizacije anti-CD3 kao što je opisano u Primeru 6. Tabela 28A-C prikazuje odnos IFN-γ koji proizvodi svaka varijanta ECD-Fc u poređenju sa odgovarajućim nemodifikovanim (divljim tipom) ICOSL ECD-Fc u testu. Mutacije označene sa „X“ označavaju Q ili ostatak divljeg tipa koji odgovara naznačenoj poziciji SEQ ID NO: 32 na naznačenoj poziciji. Kao što je prikazano, generisani varijanti Fc-fuzionih molekula pokazali su poboljšane aktivnosti u povećanju imunološke aktivnosti.
[1715]
[1716]
[1717]
[1718]
[1719]
[1720]
[1721]
[1723] PRIMER 21
[1724] Generisanje i procena fuzionih molekula sa antitelom usmerenim na HER2
[1725] Ovaj primer opisuje generisanje i procenu varijantnih ICOSL ECD-Fc fuzionih molekula konjugovanih sa sredstvom za ciljanje tumora da bi se formirao konjugat („vIgD konjugat“).
[1726] Samo V-domen ICOSL vIgD (N52H/N57Y/Q100P; naveden u SEQ ID NO: 201) je spojen sa amino i karboksilnim krajevima lakog lanca. (Sl. 10A) i teški lanac (Sl. 10B) antitela usmerenog na HER2 sa interventnim GGGSGGGS linkerima. Primerne konfiguracije vIgD konjugata su prikazane na Sl.10C.
[1728] Da bi se procenilo vezivanje za HER2, transfektanti HER2 DNK ili lažni Expi293 su obojeni titriranim količinama antitela usmerenog ka HER2 koje sadrži varijantni ICOSL konjugat (vIgD N52H/N57Y/Q100P konjugat) u koncentraciji od 100pM do 100nM. Takođe su testirani kontrolni proteini, uključujući fuziju divljeg tipa ICOSL ECD-Fc, fuziju divljeg tipa PD-L2 IgV-Fc i fuzioni molekul varijante ICOSL ECD-Fc sa mutacijama na N52H/N57Y/Q100P. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) ili procenat pozitivnih ćelija je određen za svaki transfektant kao što je opisano u Primeru 6. Svi IgSF konjugati su generisani kao što je prikazano na Sl. 11A-11B zadržao je vezivanje za HER2 u poređenju sa endogenim nivoom ekspresije HER2 primećenim u ćelijama Expi293. Slično tome, vIgD konjugati su, takođe, pokazali vezivanje za srodne partnere za vezivanje ICOSL, uključujući CD28, CTLA-4 i ICOS.
[1730] Bioaktivnost proteina i proliferacija humanih primarnih T ćelija in vitro su, takođe, okarakterisani kao što je opisano u Primeru 6. vIgD konjugati su vezani preko noći za ploče sa 96 ležišta pri 30-0,1 nM u prisustvu 10 nM anti-CD3. Ploče su isprane i 100.000 CFSE-obeleženih pan T ćelija je dodato na ploče i inkubirano 72 sata. Nivoi IFN gama u supernatantu su testirani ELISA metodom. Kao što je prikazano na Sl.12, vIgD konjugati sa naznačenim konfiguracijama pokazali su veću sekreciju i proliferaciju IFN gama u poređenju sa parenteralnim konjugatom fuzionog molekula ICOSL ECD-Fc divljeg tipa.
[1732] PRIMER 22
[1734] Nanostring transkripcioni potpis primarnih humanih T ćelija
[1736] [0655] Ploče za kulturu tkiva su obložene sa 10 nM anti-CD3 sa 40 nM Fc-kontrolnog proteina, divljeg tipa ICOSL-Fc, divljeg tipa CD80-Fc, oba ova proteina ili varijantnih ICOSL Fc-fuzionih proteina sa mutacijama kao što je naznačeno. Prečišćene humane T ćelije su zatim zasejane na ploče obložene proteinima i inkubirane na 37°C. Kulture iz svake gore opisane grupe za tretman su sakupljene nakon 24, 48 i 72 sata i ukupna RNK je pripremljena iz svakog uzorka ćelija. RNK je preneta u Nanostring i čip Cancer Immune je korišćen za kvantifikaciju transkripata gena 750 u svakom uzorku. Vrednosti transkripata su normalizovane korišćenjem Nanostring-ovog vlasničkog softvera koji omogućava poređenje nivoa transkripata između grupa tretmana i tokom različitih vremenskih tačaka. Kao što je prikazano na Sl. 18 i Sl. 19, testirani varijantni ICOSL ECD-Fc polipeptidi pokazuju izmenjenu inflamatornu aktivnost u poređenju sa divljim tipom CD80 ECD-Fc, divljim tipom ICOSL ECD-Fc ili kombinacijom oba.
[1738] PRIMER 23
[1740] Generisanje i procena fuzionih molekula sa antitelom usmerenim na HER2
[1742] Takođe je okarakterisana proliferacija humanih T-ćelija kokultivisanih sa VmAbs i ciljnim ćelijama koje eksprimuju HER2. CFSE-obeležene pan T-ćelije su stimulisane 72 sata sa veštačkim ciljnim ćelijama izvedenim iz K562 koje prikazuju površinski anti-CD3 jednolančani Fv (OKT3) i HER2 u prisustvu VmAbs ili kontrolnih proteina. Proliferacija je merena protočnom citometrijskom analizom CFSE-razblaženja na CD4<+>ili CD8<+>obojene T-ćelije. VmAb su testirani varirajući ili broj ciljnih ćelija ili koncentraciju korišćenog VmAb. U prvom testu, K562 ciljne ćelije su titrirane od 2500 do 78 ćelija/ležištu i dodate u 100.000 T-ćelija za raspon efektor:cilj (E:T) od 40 do 1280:1. VmAb, roditeljski IgSF domen ili WT ICOSL su dodati u koncentraciji od 1000 pM. U drugom testu, K562 ciljne ćelije su dodate u koncentraciji od 625 ćelija/bunarčiću u 100.000 T-ćelija za odnos efektor:cilj od 160:1. VmAb ili kontrolni proteini su titrirani i dodati u koncentraciji od 3000 do 37 pM. Kao što je prikazano na Sl. 20A i 20B, obe konfiguracije testa pokazuju da VmAb koji sadrže vIgD-konjugat pružaju superiornu proliferaciju u poređenju sa roditeljskim antitelom, roditeljskim IgSF domenom ili WT ICOSL. Pored toga, vIgD-konjugati su posredovali u proliferaciji pri niskim odnosima E:T (1280:1) ili pri niskim koncentracijama proteina (37pM).
[1744] PRIMER 24
[1746] Generisanje i procena konstruisanih ćelija koje eksprimuju transmembranski imunomodulatorni protein i T ćelijski receptor
[1748] Ovaj primer opisuje ekspresiju različitih varijanti transmembranskih imunomodulatornih proteina (TIP) koji sadrže ICOSL IgSF domen sa primernim rekombinantnim E6-specifičnim T ćelijskim receptorom (TCR) u humanim T ćelijama i procenu proliferacije T ćelija.
[1749] Humane HLA-A2+ T ćelije su aktivirane 0. dana sa anti-CD3/anti-CD28 aktivacionim perlama (ThermoFisher Scientific, SAD) i transdukovane, 1. dana, sa TCR specifičnim za HPV E6 (opisanim u WO 2015/009606) i raznim transmembranskim imunomodulatornim proteinima (TIP) koji sadrže varijantni ICOSL IgSF domen. Primerni ICOSL-TIP-ovi su imali afinitetno modifikovani IgSF domen koji sadrži amino-kiselinskih mutacija koje odgovaraju ili E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R ili N52H/N57Y/Q100R u odnosu na pozicije u ekstracelularnom domenu ICOSL navedene u SEQ ID NO: 32. ICOSL TIP su takođe uključivali transmembranski i citoplazmatski domen koji odgovara ostacima 257-302 SEQ ID NO: 5. Radi poređenja, T ćelije su takođe kotransdukovane sa HPV E6 TCR i ili WT CD80-TIP (navedenim kao amino-kiseline 35-288 SEQ ID NO: 1 i kodiranim sekvencom nukleotida navedenih u SEQ ID NO:251) ili WT ICOSL-TIP (navedenim kao amino-kiseline 19-302 od SEQ ID NO:5 i kodiranim sekvencom nukleotida navedenom u SEQ ID NO:252). Za transdukciju, ćelije su transdukovane konstrukcijom virusnog vektora u koju je umetnut polinukleotid koji kodira TIP i sekvence lanaca TCRα i TCRβ, svaka odvojena jedna od druge sekvencom koja kodira sekvencu preskakanja ribozoma P2A (SEQ ID NO: 863), za koekspresiju TIP i TCR koji sadrži TCRα i TCRβ lanac u inženjerisanim ćelijama. Konkretno, konstrukt nukleinske kiseline imala je sledeću strukturu: ICOSL - P2A1 - TCRβ - P2A2 - TCRα, u kojoj su nukleotidne sekvence P2A1 i P2A2 svaka kodirale P2A naveden u SEQ ID NO: 863, ali su se razlikovale u nukleotidnoj sekvenci kako bi se izbegla rekombinacija između sekvenci.
[1751] Kao kontrola, T ćelije su lažno transdukovane ili transdukovane samo sa primernim E6 TCR.
[1753] Perle za aktivaciju T ćelija su uklonjene 3. dana, a citokini IL-2, IL-7 i IL-15 su dodati u kulturu. 6. dana nakon transdukcije, ekspresija TIP i TCR na površini ćelija je procenjena protočnom citometrijom, pri čemu je 35-65% konstruisanih ćelija bilo dvostruko pozitivno na TCR i TIP. Ćelije koje eksprimuju TCR su ekspandovane u prisustvu HPV E6 peptida, što je rezultiralo populacijom ćelija koje su bile >90% dvostruko pozitivne na TCR/TIP, kako je procenjeno 14. dana. 14. dana, konstruisane ćelije su inkubirane sa HPV-inficiranim ćelijama, bilo ćelijskom linijom skvamoznog ćelijskog karcinoma UPCI:SCC152 (ATCC® CRL‑3240™; HPV+, HLA-A2+), ćelijama epidermoidnog karcinoma CaSki (ATCC® No. CRL‑1550™; HPV+, HLA-A2+), ili ćelijama SiHa skvamoznog ćelijskog karcinoma (ATCC® HTB‑35™; HPV+, HLA-A2‑).
[1754] Proliferacija genetski modifikovanih ćelija je procenjena 3. dana nakon početka ko-kultivacije sa ciljnim ćelijama. Kao što je prikazano na Sl. 21, povećana proliferacija T ćelija genetski modifikovanih sa E6 TCR primećena je u dve HPV+ ćelijske linije, ali ne značajno u HPV-SiHa liniji. Genetski modifikovane ćelije koje su koeksprimovale varijantu ICOSL TIPS imale su povećanu proliferaciju kao odgovor na HLA-A2+HPV+ ciljne ćelijske linije SCC152 i Caski.
[1755] PRIMER 25
[1757] Generisanje i procena imunomodulatornih proteina Fc-fuzije
[1759] Molekuli koji sadrže varijantni ICOSL IgSF (npr. ECD) domen su formatirani kao Fcfuzioni proteini uglavnom kao što je opisano u Primeru 4, osim korišćenja različitih linkera i Fc molekula. Da bi se generisali imunomodulatorni proteini koji su Fc fuzioni proteini koji sadrže ECD ICOSL sa najmanje jednim afinitetno modifikovanim domenom (npr. varijanta ICOSL ECD-Fc), generisan je kodirajući molekul nukleinske kiseline da kodira protein dizajniran na sledeći način: varijanta (mutantni) ECD vezana direktno ili indirektno preko linkera sa inertnim humanim IgG1 Fc. Konkretno, generisani imunomodulatorni proteini ili nisu sadržali linker (nijedan) ili su sadržali AAA ili G4S (SEQ ID NO: 636) linker. Inertni humani IgG1 Fc sadržao je mutacije, prema EU numeraciji, kao što sledi: C220S/R292C/N297G/V302C (SEQ ID NO: 476), C220S/E233P/L234V/-L235A/G236del/S267K (SEQ ID NO: 478), C220S/L234A/L235E/G237A (SEQ ID NO: 477), ili njihove alotipove. Zamena C220S je uključena jer rezultujući proteini ne uključuju laki lanac antitela koji može da formira kovalentnu vezu sa cisteinom. Rekombinantni varijantni Fc fuzioni proteini su proizvedeni u ćelijama 293 i prečišćeni sa proteinom A uglavnom kao što je opisano u Primeru 5.
[1761] Varijantni ICOSL Fc-fuzioni imunomodulatorni proteini su procenjeni u studijama vezivanja kako bi se procenilo vezivanje za srodne partnere za vezivanje. Ćelije Expi293 transfektovane sa srodnim partnerima za vezivanje, humanim CD28, ICOS i CTLA4, korišćene su kao ciljne ćelije u studijama vezivanja kao što je opisano u Primeru 6. MFI vezivanja varijanti ICOSL Fc fuzionih imunomodulatornih proteina za ciljne ćelije koje eksprimuju svaki partner za vezivanje je određen i upoređen sa vezivanjem odgovarajućeg nemodifikovanog (divljeg tipa) ICOSL ECD-Fc za iste ciljne ćelije. Modulacija aktivnosti T ćelija varijantom ICOSL Fc-fuzionih imunomodulatornih proteina je takođe određena korišćenjem reakcije mešovitih limfocita (MLR) uglavnom kao što je opisano u Primeru 6.
[1762] Rezultati vezivanja primernih imunomodulatornih proteina varijante ICOSL ECD-Fc koji sadrže različite linkere i Fc regione prikazani su u Tabeli 29. Tabela prikazuje supstitucije aminokiselina u ECD varijante ICOSL, označene brojem pozicije amino-kiselina koji odgovara pozicijama amino-kiselina u odgovarajućoj referentnoj (npr. nemodifikovanoj) sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) ICOSL navedenoj u SEQ ID NO:32. Kolona 1, takođe, navodi SEQ ID NO identifikator za svaki ECD domen varijante sadržan u Fc fuziji varijante ICOSL. Kolona 2 označava linker koji se koristi u Fc fuzijskom proteinu i SEQ ID NO identifikator za linker. Kolona 3 navodi mutacije u Fc prema EU numeraciji i SEQ ID NO identifikator za Fc sadržan u Fc fuzijskom proteinu varijante ICOSL.
[1764] Kao što je prikazano u Tabeli 29, slični rezultati su primećeni za vezivanje za srodne partnere za vezivanje među testiranim varijantama ICOSL Fc fuzionih proteina. Ovi rezultati ukazuju da format Fc fuzije sa različitim Fc molekulima ili različitim linkerima nije uticao na vezivanje varijanti ICOSL IgSF domena za njihovog srodnog partnera za vezivanje. Pored toga, svi Fc fuzioni formati, kada su dati kao dvovalentni Fc molekuli u rastvoru u MLR reakciji, pokazali su antagonističku aktivnost u smanjenju aktivacije T ćelija u poređenju sa referentnim (npr. nemodifikovanim ili divljeg tipa) ECD-Fc molekulom koji nije sadržao supstituciju aminokiseline. U nekim slučajevima, nije izmeren detektabilan IFN-γ u supernatantu, što je u skladu sa potpunim blokiranjem interakcija kognatnih partnera za vezivanje kostimulativnih liganda sa njihovim ligandima radi indukovanja sekrecije IFN-γ.
[1765]
[1766]
[1767]
[1770] PRIMER 26
[1772] Ekspresija varijantnih ICOSL molekula u CHO ćelijama
[1774] Kao alternativa ekspresiji varijanti ICOSL Fc fuzionih proteina u Expi293 ćelijama, kao što je opisano u Primeru 5, korišćene su suspenzione ćelije jajnika kineskog hrčka (ExpiCHO-S) za proizvodnju različitih ICOSL molekula. DNK konstrukt koji kodira primerne varijante ICOSL IgSF (npr. ECD) Fc fuzionih proteina koji sadrže varijantu (mutant) ECD N52H/N57Y/Q100R/F172S (SEQ ID NO:291) vezanu sa inertnim Fc koji sadrži mutacije C220S/L234A/L235E/G237A prema EU numeraciji navedene u SEQ ID NO: 477 ili njegovog alotipa navedenog u SEQ ID NO: 637, sa GSGGGGS linkerom (SEQ ID NO: 635) korišćena je za transfekciju ćelija.
[1776] [0666] ExpiCHO-S ćelije i reagensi za transfekciju korišćenjem ExpiCHO<™>ekspresioni sistem kupljeni su od kompanije ThermoFisher Scientific (kat. br. A29133). Ćelije su odmrznute i ekspandovane prema protokolu koji preporučuje proizvođač. Nakon najmanje 2 pasaža, ćelije su podeljene 24 sata pre transfekcije i ostavljene su da se ekspanduju do visoke gustine. Ćelije su zatim razblažene na broj ćelija za transfekciju, DNK kompleks je formiran sa ExpiFectamine.<™>CHO reagens i dodat ćelijama. Dan nakon dodavanja DNK kompleksa, u kulturu su dodati ExpiCHO<™>prehrana i EkspiFektamin<™>CHO pojačivači, koja je zatim smeštena u inkubator na 32 stepena Celzijusa. Praćena je vijabilnost ćelija i ćelijska masa, a kultura je sakupljena kada je vijabilnost pala ispod 80%. Kultura je zatim centrifugirana malom brzinom da bi se uklonio ćelijski talog, a prečišćeni supernatant je sterilno filtriran kroz 0,2 μm. Protein je prečišćen kao što je opisano u Primeru 5.
[1778] A. Analiza proteina
[1780] Prečišćena varijanta ICOSL Fc fuzionog proteina je analizirana na SDS-PAGE i bojenjem proteina. Višestruke trake su primećene u ćelijama proizvedenim iz CHO ćelija, ali ne i iz 293 ćelija, što je u skladu sa zapažanjem da se proteolizno odsecanje ICOSL dešava kada se eksprimuje u CHO ćelijama. Tabela 30A prikazuje molekulsku težinu intaktnih, jednostruko odsečenih i dvostruko odsečenih proteina izračunatu na osnovu amino-kiselinskih sekvenci i potencijalnih ugljenih hidrata, kako je primećeno SDS-PAGE. Primećena je proteoliza ICOSL Fc-fuzionih proteina eksprimovanih u ćelijama izvedenim iz ExpiCHO-S, što je naznačeno prisustvom i redukovanih/neredukovano odsečenih vrsta sa manjom molekulskom težinom (jednostruko i dvostruko odsecanje). Na osnovu veličine posmatranih traka i analize masene spektrometrije, ovi rezultati su u skladu sa potencijalnim mestom cepanja u ICOSL ECD koje odgovara sekvenci LQQN/LT („/“ označava potencijalno mesto cepanja), što rezultira cepanjem pre regiona stabljike ECD i uklanjanjem Fc dela sekvence u jednom ili oba lanca Fc fuzionog proteina. Uočeno razlaganje proteaze može rezultirati heterogenim proteinskim proizvodom kada se proizvodi u CHO ćelijama. Takođe, za formate eksprimovane kao transmembranski imunomodulatorni proteini, razlaganje proteaze, koje se javlja u određenim ćelijama, može dovesti do oslobađanja rastvorljivog proteina iz ćelija, čime se smanjuju oblici varijante proteina eksprimovani na površini ćelija na konstruisanim ćelijama.
[1781]
[1784] PRIMER 27
[1786] Generisanje varijanti otpornih na proteolizu molekula koji sadrže ICOSL IgSF domen
[1787] Da bi se varijante ICOSL polipeptida učinile otpornim na proteolizu nakon ekspresije u ćelijama, kao što su CHO ćelije, generisani su različiti dodatni oblici varijanti ICOSL polipeptida. Generisane su sledeće dodatne modifikovane referentne sekvence ICOSL ECD: (1) različita skraćenja ECD kojima nedostaje celokupno ili deo mesta cepanja LQQN/LT proteaze (označeno kao Trunc #4, #5, #6, #7 ili #8); (2) referentne sekvence varijante ICOSL koje sadrže mutacije na mestu cepanja N207 i/ili L208 uz upućivanje na pozicije navedene u SEQ ID NO:32; ili samo ICOSL IgV referentna sekvenca koja sadrži IgV domen kao jedini IgSF domen molekula (navedeno u SEQ ID NO: 545, što odgovara amino-kiselinama 1-122 SEQ ID NO:32). U nekim slučajevima, kombinacije gore navedenih strategija su korišćene u referentnoj sekvenci ICOSL ECD. Tabela 30B ispod prikazuje različite generisane referentne sekvence.
[1788] Primerne mutacije N52H/N57Y/Q100R/F172S, uz upućivanje na numeraciju navedenu u SEQ ID NO: 32, uvedene su u različite referentne sekvence. Pošto referentni ICOSL IgV naveden u SEQ ID NO: 545 ne sadrži poziciju koja odgovara F172S, varijanta ICOSL IgV nije sadržala mutaciju F172S. Generisani varijantni ICOSL polipeptidi su formatirani kao Fc fuzioni protein koji sadrži generisani referentni ICOSL IgSF domen vezan preko (G<4>S)2 linker (SEQ ID NO:229) sa inertnim Fc koji sadrži mutacije C220S/L234A/L235E/G237A/K447del prema EU numeraciji navedene u SEQ ID NO: 633, ili njihov alotip naveden u SEQ ID NO:637.
[1790]
[1793] A. Procena proteolize
[1794] DNK konstrukti koji kodiraju varijante ICOSL Fc-fuzionih molekula opisanih gore transfektovani su u ćelije jajnika kineskog hrčka (ExpiCHO-S). ICOSL Fc-fuzioni proteini su zatim prečišćeni iz supernatanata sa proteinom A afinitetnom hromatografijom kao što je opisano u Primeru 5. Prečišćeni protein je analiziran analitičkom SEC.
[1796] SEC analizom, intaktni protein se prikazivao kao jedan vrh, dok se odsečeni protein prikazivao kao višestruki vrhovi (pikovi), uključujući vrste niže molekulske težine. U skladu sa rezultatima SDS-PAGE opisanim u Primeru 26, proteoliza procenjena SEK analizom je primećena kada je varijanta ICOSL ECD Fc-fuzionog proteina eksprimovana u ćelijama izvedenim iz ExpiCHO-S, što je naznačeno višestrukim vrhovima prikazanim na Sl.22A. Kao što je prikazano na Sl. 22B-22G, pojedinačni pikovi su primećeni SEC analizom varijante ICOSL Fc fuzionih proteina generisanih korišćenjem modifikovanih referentnih ICOSL polipeptida kod kojih je pretpostavljeno mesto cepanja ECD proteaze uklonjeno ili mutirano, što ukazuje na smanjeno cepanje proteina. Međutim, u jednoj seriji za prečišćavanje, vrste niže molekulske težine su primećene SEC analizom varijante ICOSL Fc fuzionog proteina generisanog korišćenjem referentnog ICOSL polipeptida navedenog u SEQ ID NO: 604 (Trunc. #5), iako nije bio jasan razlog za prisustvo ovih vrsta u ovoj seriji. Kao što je prikazano na Sl.22G, generisanje vrsta niže molekulske težine, a samim tim i proteoliza, takođe nije primećeno SEC analizom varijantnih ICOSL Fc-fuzionih proteina generisanih korišćenjem same ICOSL IgV referentne sekvence.
[1797] B. Vezivanje i aktivnost
[1799] Upoređeno je vezivanje i aktivnost proteina proizvedenog i prečišćenog nakon transfekcije DNK konstrukata koji kodiraju varijante ICOSL Fc-fuzionih imunomodulatornih proteina u različitim referentnim sekvencama opisanim gore u CHO ćelijama. U nekim slučajevima, prečišćeni klonovi, kako je procenjeno u daljem tekstu, kasnije su utvrdili da sadrže dodatne mutacije pored onih opisanih gore, za koje se ne veruje da utiču na imunomodulatornu aktivnost testiranih proteina.
[1801] Dobijeni prečišćeni varijantni ICOSL Fc-fuzioni imunomodulatorni proteini su procenjeni na vezivanje za srodne partnere za vezivanje i na modulaciju aktivnosti T ćelija korišćenjem reakcije mešovitih limfocita (MLR) u suštini kao što je gore opisano. Tabela 30C prikazuje supstitucije amino-kiselina u ICOSL referentnoj sekvenci, označene brojem pozicije aminokiselina koji odgovara pozicijama amino-kiselina u odgovarajućoj referentnoj (npr.
[1802] nemodifikovanoj) sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) ICOSL navedenoj u SEQ ID NO: 32, i navodi identifikator SEQ ID NO za svaku ICOSL referentnu sekvencu. Kao što je prikazano, vezivanje i MLR antagonistička aktivnost su generalno bile slične za sve testirane formate.
[1804]
[1805]
[1808] C. Vezivanje i aktivnost proteina eksprimovanih u ćelijama 293 (Expi293) ili CHO
[1809] Varijantni ICOSL Fc fuzioni proteini, generisani na osnovu gore opisanih ICOSL referentnih sekvenci, procenjeni su na vezivanje i aktivnost nakon ekspresije u 293 (Expi293) ili CHO ćelijama. Pored toga, DNK konstrukt koji kodira primerne ICOSL varijante IgSF domena N52H/N57Y/Q100R/C198R ili N52H/Q100R, u primernim ICOSL referentnim sekvencama kao što je navedeno u Tabeli 30D, takođe je vezan sa inertnim Fc koji sadrži mutacije C220S/L234A/L235E/G237A prema EU numeraciji navedene u SEQ ID NO: 477, i proizvedeni su i prečišćeni nakon transfekcije 293 ili CHO ćelija sa DNK konstruktima. Pored toga, primerni varijantni imunomodulatorni protein je generisan kao monomer u kome su ćelije transfektovane DNK konstruktom koji kodira varijantu u referentnoj sekvenci varijante ICOSL ECD, ali bez fuzije sa Fc sekvencom.
[1811] [0675] Dobijeni prečišćeni varijantni ICOSL Fc-fuzioni proteini ili varijantni ICOSL monomer su procenjeni na vezivanje za srodne partnere za vezivanje i na modulaciju aktivnosti T ćelija korišćenjem reakcije mešovitih limfocita (MLR) u suštini kao što je gore opisano. Tabela 30D prikazuje supstitucije amino-kiselina u referentnoj sekvenci varijante ICOSL, označene brojem pozicije amino-kiselina koji odgovara pozicijama amino-kiselina u odgovarajućoj referentnoj (npr. nemodifikovanoj) sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) ICOSL navedenoj u SEQ ID NO:32, i navodi SEQ ID NO identifikator za svaku referentnu ICOSL sekvencu. Kolona 3 prikazuje tip ćelije (ExpiCHO-S ili Expi293) koji se koristi za proizvodnju ICOSL proteina. Kao što je prikazano u Tabeli 30D, rezultati ukazuju na suštinski slično vezivanje i aktivnost, bez obzira da li je imunomodulatorni protein varijante ICOSL proizveden u CHO ili 293 ćelijama.
[1813]
[1814]
[1817] PRIMER 28
[1819] Generisanje NNK biblioteke varijanti ICOSL IgSF domena i procena vezivanja i aktivnosti
[1820] Dodatni molekuli koji sadrže varijante ICOSL IgSF domena generisani su sa mutacijama na pozicijama 52, 57 i 100 u odnosu na pozicije navedene u SEQ ID NO:32. Varijante su generisane iz NNK biblioteke, pri čemu je K=T ili G, tako da kodirajući kodoni kodiraju sve potencijalne amino-kiseline, ali sprečavaju kodiranje dva stop ostatka TAA i TGA. DNK iz NNK biblioteke je uvedena u kvasac uglavnom kao što je opisano u Primeru 2 da bi se generisale biblioteke kvasca. Biblioteke su korišćene za selekciju kvasca koji eksprimuje afinitetno modifikovane varijante ICOSL uglavnom kao što je opisano u Primeru 3.
[1822] Odabrani molekuli koji sadrže varijantu ICOSL IgSF domena dalje su formatirani kao Fcfuzioni protein u suštini kao što je opisano u Primeru 4, osim što sadrže generisani ICOSL IgSF domen vezan preko GSGGGGS linkera (SEQ ID NO:635) sa inertnim Fc koji sadrži mutacije C220S/L234A/L235E/G237A/K447del prema EU numeraciji navedene u SEQ ID NO: 633, ili njegovog alotipa navedenog u SEQ ID NO:637.
[1823] Varijantni ICOSL Fc-fuzioni imunomodulatorni proteini su procenjeni u studijama vezivanja kako bi se procenilo vezivanje za srodne partnere za vezivanje. Ćelije Expi293 transfektovane sa srodnim partnerima za vezivanje, humanim CD28, ICOS i CTLA4, korišćene su kao ciljne ćelije u studijama vezivanja kao što je opisano u Primeru 6. MFI vezivanja 100 nM varijanti ICOSL Fc fuzionih imunomodulatornih proteina za ciljne ćelije koje eksprimuju svakog partnera za vezivanje je određen i upoređen za vezivanje odgovarajućeg referentnog (npr. nemodifikovanog ili divljeg tipa) ICOSL IgV-Fc za istu ciljnu ćeliju. Kostimulativna bioaktivnost generisanih ICOSL varijanti Fc-fuzionih molekula je, takođe, procenjena u testovima koimobilizacije anti-CD3 (10 mM) kao što je opisano u Primeru 6. Modulacija aktivnosti T ćelija pomoću varijante ICOSL Fc fuzionih imunomodulatornih proteina je, takođe, određena korišćenjem reakcije mešovitih limfocita (MLR) sa 1 nM ICOSL-Fc, uglavnom kao što je opisano u Primeru 6. Određena je sekrecija IFN-gama iz trostrukih bunara.
[1825] [0679] Rezultati vezivanja i funkcionalne aktivnosti, zasnovani na kostimulativnoj bioaktivnosti ili aktivnosti u MLR testu, za primerne varijante ICOSL IgV-Fc fuzionih molekula prikazani su u Tabeli 31. Tabela ispod prikazuje supstitucije amino-kiselina u varijanti ICOSL, označene brojem pozicije amino-kiselina koji odgovara pozicijama amino-kiselina u odgovarajućoj referentnoj (npr. nemodifikovanoj) sekvenci ekstracelularnog domena (ECD) ICOSL navedenoj u SEQ ID NO:32. Kolona 2 prikazuje identifikator SEQ ID NO za svaki varijantni IgV domen sadržan u varijantnom IgV-Fc fuzionom molekulu. Kao što je prikazano, varijante ICOSL IgSF (npr. IgV) domena generisane različitim kombinacijama specifičnih mutacija na pozicijama 52, 57 i 100, pokazale su izmenjeno vezivanje za najmanje jednog, a u nekim slučajevima i za više od jednog, srodnog partnera za vezivanje. Poslednje dve kolone Tabele, takođe, prikazuju funkcionalnu aktivnost varijanti Fc-fuzionih molekula u modulaciji aktivnosti T ćelija na osnovu izračunatih nivoa IFN-γ u supernatantima kulture (pg/mL) generisanih ili i) sa naznačenim varijantom IgV-Fc fuzionog rastvorljivog molekula koimobilizovanog sa anti-CD3 ili ii) sa naznačenim varijantom IgV-Fc fuzionog molekula u MLR testu. Tabela takođe prikazuje odnos IFN-γ proizvedenog od strane svake varijante ECD-Fc u poređenju sa odgovarajućim referentnim (npr. nemodifikovanim ili divljeg tipa) ECD-Fc u oba funkcionalna testa. Varijantni Fc-fuzioni proteini takođe su pokazali izmenjenu imunološku aktivnost. Kostimulativna signalizacija nekih varijanti molekula bila je znatno veća u poređenju sa divljim tipom ICOSL. Određene varijante su pokazale značajnu inhibiciju IFN-γ sa veoma niskim ili nikakvim detektovanim IFN-γ proizvedenim u kulturama u MLR testu.
[1826]
[1827]
[1828]
[1829]
[1832] PRIMER 29
[1834] Procena ćelija K562 koje eksprimuju transmembranski imunomodulatorni protein (TIP)
[1836] K562 ćelije su konstruisane da eksprimuju transmembranski imunomodulatorni protein (TIP) koji je sadržao ECD vIgD ICOSL domena spojenih sa nativnim transmembranskim i intracelularnim domenom WT humanog ICOSL navedenim u SEQ ID NO: 5. Primerna varijanta ICOSL-TIP imala je afinitetno modifikovani IgSF domen koji sadrži amino-kiselinske mutacije koje odgovaraju N52H/N57Y/Q100P (SEQ ID NO: 288), N52H/N57Y/Q100R (SEQ ID NO: 283) ili E16V/N52H/N57Y/Q100R/V110D/H115R/Y152C/K156M/C198R (SEQ ID NO: 300) u odnosu na pozicije u ekstracelularnom domenu ICOSL navedenim u SEQ ID NO:32.
[1837] K562 ćelije (ATCC) su obeležene sa CFSE kako bi se bolje razlikovale od T ćelija u testovima ko-kultivacije. Prečišćene primarne humane T ćelije su obeležene sa Cell Trace Far Red (oba od Thermo-Fisher-a) i ko-zasejane na ploče za tkivnu kulturu sa okruglim dnom sa 96 ležišta sa anti-CD3 antitelom. Da bi se obezbedio TCR signal za T ćelije, anti-CD3 antitelo je uključeno u rastvorljivom formatu u rasponu koncentracija koje su omogućile K562 prezentaciju ovog stimulativnog antitela preko Fc-receptora CD32 koji ćelije eksprimuju. Ćelije su inkubirane 72 sata i došlo je do proliferacije CD4+. (Sl.23A) i CD8+ (Sl.23B) praćen je i prikazan kao procenat podeljenih ćelija u odnosu na koncentraciju anti-CD3. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost trostrukih ležišta sa trakama greške koje prikazuju standardnu devijaciju.
[1839] Ćelije divljeg tipa K562 stimulisale su proliferaciju T ćelija kada su koinkubirane sa rastvorljivim anti-CD3 antitelom na način zavisan od doze, dok K562 ćelije u odsustvu anti-CD3 nisu. Kao što je prikazano na Sl. 23A i 23B, ekspresija WT ICOSL TIP na površini je pojačala odgovore, ali su efekti bili veći kada su K562 ćelije eksprimovale varijante ICOSL TIP, što ukazuje da ovi molekuli eksprimovani na površini ćelija obezbeđuju superiornu kostimulaciju za T ćelije.
[1841] PRIMER 30
[1843] Procena vezivanja i kostimulativne funkcije fuzionih molekula sa antitelom usmerenim na HER2
[1845] [0683] Primerna varijanta ICOSL ECD, koja sadrži mutacije N52H/N57Y/Q100R, spojena je sa N- ili C-terminalnim krajevima teškog ili lakog lanca primernog anti-HER2 antitela, trastuzumaba, kao što je prikazano u različitim konfiguracijama prikazanim na Sl.24A-24F. DNK VmAbs koja kodira svaki od konstrukata prikazanih na dijagramu Sl. 24A-24F je transfektovan u HEK-293 ćelije, a sekretovani proteini su prečišćeni pomoću proteina A i hromatografije isključivanja po veličini. Dobijeni V-mAb proteini su zatim procenjeni na zadržavanje odgovarajućih svojstava vezivanja. HEK-293 ćelije su prolazno transfektovane sa HER2, CD28 ili ICOS ekspresionim vektorima, a svaki transfektant je zatim inkubiran sa pojedinačnim V-mAb proteinima plus sekundarnim antitelom za detekciju vezanih reagensa. Kao što je prikazano na Sl.24A, vezivanje za HER2 je zadržano od strane svih V-mAb, iako je intenzitet vezivanja donekle smanjen. Štaviše, vezivanje V-mAb za CD28 transfektovane ćelije je uglavnom bilo netaknuto, iako je nekoliko oblika pokazalo izvesno smanjenje vezivanja (Sl.24A). Ovi podaci ukazuju da su ICOSL varijante spojene sa teškim i/ili lakim lancima antitela da bi formirale fuzione proteine u velikoj meri zadržale kontrastrukturu i aktivnost vezivanja antitela.
[1847] Da bi se testiralo da li VmAbs mogu da pokrenu ciljno specifičnu kostimulaciju T ćelija, korišćen je transfektovani ćelijski sistem koji uključuje T ćelijsku reportersku liniju za merenje kostimulacije. Jurkat ćelije sa luciferaznim reporterom promotera IL-2 korišćene su za procenu kostimulativne funkcije. Da bi se stimulisale ćelije, K562 ćelije su konstruisane za upotrebu kao veštačke ćelije koje prezentuju antigen. Konkretno, K562 ćelije su transdukovane lentivirusom koji kodira jednolančanu Fv verziju anti-CD3 antitela OKT3 sa ili bez transdukcije sa odvojenim lentivirusom koji usmerava ekspresiju HER2. K562 ćelije koje prikazuju jednolančani Fv anti-CD3 na površini ćelije (OKT3) sa ili bez površinske ekspresije HER2 su zasejane u Jurkat pufer za ispitivanje (RPMI1640 5%FBS) u koncentraciji od 2x10<4>ćelija/ležište. Ciljne ćelije su inkubirane sa V-mAb titriranim od 20.000 pM do 6 pM ili kontrolnim proteinima tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Jurkat efektorske ćelije koje eksprimuju IL-2-luciferazni reporterski gen (Promega) su dodate u količini od 1x10<5>ćelija/ležište da bi se konačna zapremina/ležište dovela do 100 µl. Ciljne i Jurkat ćelije su inkubirane 5 sati na 37°C. Ploče su izvađene iz inkubatora i aklimatizovane na sobnu temperaturu tokom 15 minuta. U svaki bunarčić je dodato 100 µL ćelijske lize i rastvora luciferaznog supstrata (BioGlo luciferazni reagens, Promega) i ploče su inkubirane na orbitalnom šejkeru tokom 10 minuta. Luminescencija je merena sa vremenom integracije od 1 sekunde po ležištu korišćenjem Cytation 3 imaging čitača (BioTek Instruments). Relativne vrednosti luminescencije (RLU) su određene za svaki testirani uzorak i zabeležene.
[1849] Kao što je prikazano na Sl.24B, uključivanje nativnog trastuzumaba nije imalo uticaja na indukciju luciferaze. Slično tome, uključivanje varijante ICOSL-Fc proteina N52H/N57Y/Q100R (nije spojen sa trastuzumabom) nije uticalo na odgovore (Sl. 24B). Međutim, uključivanje višestrukih V-mAb je obezbedilo značajan kostimulativni signal u prisustvu HER2+ K562/OKT3 ćelija koji je bio mnogo robusniji nego kod K562/OKT3 kojima je nedostajala HER2 ekspresija (Sl. 24C-24F). U nekim slučajevima, signal je indukovan u ćelijama K562/OKT3 kojima nedostaje HER2, ali to je najverovatnije bilo zbog Fc domena V-mAb koji omogućava CD32-posredovanu prezentaciju V-mAb. Rezultati ukazuju da se fuzija varijante ICOSL polipeptida sa antitelom može koristiti za isporuku lokalizovanog kostimulativnog signala T ćelija.
[1851] PRIMER 31
[1852] Generisanje stek molekula koji sadrže ICOSL i NKp30 afinitetno modifikovane domene
[1853] Ovaj primer opisuje imunomodulatorne proteine koji su generisani kao višedomenski stek konstrukti koji sadrže afinitetno modifikovani IgV domen iz identifikovanih varijantnih ICOSL polipeptida i identifikovanih varijantnih NKp30 polipeptida opisanih gore. Konkretno, primerna varijanta ICOSL IgV (N52D kao što je navedeno u SEQ ID NO:548; N52H/Q100R kao što je navedeno u SEQ ID NO:567; N52H/N57Y/Q100R kao što je navedeno u SEQ ID NO:565; N52L/N57H/Q100R kao što je navedeno u SEQ ID NO:761), i primerna varijanta NKp30 IgV molekula L30V/A60V/S64P/S86G (SEQ ID NO: 504) su vezani zajedno i fuzionisani sa inertnim Fc (koji sadrži mutacije L234A, L235E i L235E u humanom IgG1 Fc, npr. navedenom u SEQ ID NO:637) u različitim konfiguracijama. Generisani su homodimerni stek konstrukti koji sadrže identične Fc podjedinice u kojima su varijanta ICOSL IgV i varijanta NKp30 IgV različito vezane sa N- ili C-terminusom Fc regiona preko peptidnog linkera GSGGGS (SEQ ID NO: 635) i/ili 3x GGGGS (SEQ ID NO: 228). Drugi linkeri i Fc regioni su, takođe, pogodni za generisanje stek molekula. Primeri generisanih stekova navedeni su u daljem tekstu.
[1855] Molekul nukleinske kiseline koji kodira imunomodulatorne proteine takođe je sadržao ostatke koji kodiraju primerni signalni peptid MGSTAILALLLAVLQGVSA (naveden u SEQ ID NO: 225). Ekspresioni konstrukti koji kodiraju Fc fuzione proteine od interesa su prolazno eksprimovani u ćelijama Expi293 HEK293 od Invitrogen-a koristeći komercijalne Expifectamine reagense i podloge proizvođača. Supernatanti su sakupljeni, a protein je zarobljen i eluiran iz kolone sa proteinom A korišćenjem AKTA sistema za prečišćavanje proteina.
[1857] Kodirajući molekul nukleinske kiseline je dizajniran da proizvodi homodimerne stekove u različitim konfiguracijama sekvenci redosledom prikazanim u Tabeli 32.
[1858]
[1860] PRIMER 32
[1861] Procena vezivanja za ćelijski eksprimovane kontrastrukture i biološke aktivnosti stek molekula koji sadrže ICOSL i NKp30 domen
[1862] Ovaj primer opisuje studije vezivanja kako bi se pokazala specifičnost i afinitet primernih stek ICOSL/NKp30 imunomodulatornih proteina generisanih u Primeru 31 za srodne partnere za vezivanje. Primerni stek ICOSL/NKp30 imunomodulatorni proteini generisani u Primeru 31 takođe su procenjeni na karakterizaciju biološke aktivnosti u in vitro testu u humanoj primarnoj T ćeliji.
[1864] A. Vezivanje za ćelijski eksprimovanu kontrastrukturu
[1866] Studije vezivanja ICOSL/NKp30 steka sprovedene su na ćelijama sa stabilnom ili prolaznom ekspresijom na površini ćelija srodnih partnera za vezivanje specifičnih za imunomodulatorne proteine varijante ICOSL domena ili NKp30-Fc.
[1868] Za procenu vezivanja za partnera za vezivanje varijantnih ICOSL domena, korišćene su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) koje su transdukovane lentivirusom za površinsku ekspresiju humanog CD28, CTLA-4 ili ICOS pune dužine.
[1870] Da bi se proizvele ćelije koje eksprimuju srodni partner za vezivanje NKp30, kloniran je površinski ekspresioni konstrukt sisara pune dužine koji sadrži humani B7-H6 u ekspresioni vektor pcDNA3.1 (Life Technologies). Studije vezivanja su sprovedene korišćenjem sistema za prolaznu transfekciju Expi293F (Life Technologies, SAD). Ukratko, za transfekciju od 30 mL, približno 75 miliona Expi293F ćelija je inkubirano sa 30 µg DNK ekspresione konstrukcije i 1,5 mL razblaženog reagensa ExpiFectamine 293 tokom 48 sati, nakon čega su ćelije sakupljene za bojenje.
[1872] [0693] Za analizu protočnom citometrijom, 200.000 ćelija date stabilne ćelijske linije, prolazne transfekcije ili odgovarajuće negativne kontrole, zasejane su na ploče sa okruglim dnom sa 96 ležišta. Ćelije su centrifugirane i suspendovane u puferu za bojenje (PBS (fosfatno puferovani fiziološki rastvor), 1% BSA (goveđi serumski albumin) i 0,1% natrijum azida) tokom 20 minuta da bi se blokiralo nespecifično vezivanje. Nakon toga, ćelije su ponovo centrifugirane i suspendovane u puferu za bojenje koji sadrži 100nM do 32 pM ICOSL/NKp30 steka ili kontrolnog proteina u 50 µL. Primarno bojenje je izvršeno 45 minuta, pre nego što su ćelije dva puta isprane u puferu za bojenje. Vezani protein je detektovan pomoću PE-konjugovanog anti-humanog IgG (Jackson ImmunoResearch, SAD) razblaženog 1:150 u 50 µL pufera za bojenje i inkubiran 30 minuta. Nakon završne inkubacije, ćelije su isprane dva puta da bi se uklonila nevezana konjugovana antitela, fiksirane u 2% formaldehidu/PBS i analizirane na protočnom citometru LSRII (Becton Dickinson, SAD). Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) je izračunat za svaki uzorak pomoću softvera FlowJo verzije 10 (FlowJo LLC, SAD).
[1874] Aktivnost vezivanja, merena MFI metodom, procenjena je za sve ICOSL-NKp30 Fc fuzione proteine ili kontrole. Kao što je prikazano na Sl. 25A-25D, primerni stek proteini vezuju srodne proteine i ICOSL i NKp30 sa visokim afinitetom.
[1876] B. Procena biološke aktivnosti afinitetno zrelih molekula koji sadrže domen IgSF
[1877] Bioaktivnost rastvorljivih ICOSL/NKp30 stek proteina testirana je u ko-kulturi sa B7-H6+ ćelijama radi indukcije proizvodnje citokina u primarnim humanim T ćelijama. K562 ćelije koje endogeno eksprimuju B7-H6 transdukovane su lentivirusom da bi eksprimovale površinski antihumani CD3 jednolančani Fv (OKT3), što je dalo K562/OTK3 ciljeve. Humane primarne T ćelije su ko-kultivisane u odnosu efektora i cilja (E:T) od 2,5 ili 10:1 sa ICOSL/Nkp30 stekom ili kontrolnim proteinima titriranim od 100 nM do 49pM u 200 µL konačne zapremine Ex-Vivo 15 medijuma. 3-5. dana, test je završen i supernatanti kulture su testirani korišćenjem IL-2 i TNF-alfa ELISA MAX kompleta (Biolegend, SAD). Optička gustina je merena na BioTek Cytation Multimode Microplate Reader-u (BioTek Corp., SAD) i kvantifikovana u odnosu na titrirane rIL-2 i rTNF-alfa standarde uključene u ELISA komplete.
[1879] Rezultati studija biološke aktivnosti za primerne testirane ICOSL/NKp30 stek proteine prikazani su na Sl. 26A i 26B, koje prikazuju izračunate nivoe IL-2 ili IFN-γ u supernatantima kulture (pg/mL). Identifikator sekvence (SEQ ID NO) za svaki protein steka je naveden na Sl.
[1880] 26A i 26B. Inkubacija u prisustvu primernih ICOSL/NKp30 stek proteina u ovom testu rezultirala je povećanim nivoima indukcije citokina zavisnih od B7-H6 u primarnim humanim T ćelijama, što je pokazano povećanjem proizvodnje citokina sa ICOSL/NKp30 stekovima u poređenju sa parenteralnim ICOSL ili samo NKp30 proteinima.
[1882] C. Procena proliferacije
[1884] [0697] Takođe je okarakterisana proliferacija humanih T-ćelija ko-kultivisanih sa ICOSL/NKp30 stek proteinima i B7-H6+ ćelijama. Humane primarne T-ćelije obeležene CFSE su stimulisane 3-5 dana sa K562/OKT3 u odnosu E:T od 2,5 do 10:1 u prisustvu ICOSL/NKp30 stek proteina ili kontrolnih proteina. Primerni ICOSL/NKp30 stek proteini su titrirani od 100 nM do 49 pM u 200 µL konačne zapremine Ex-Vivo 15 medijuma. Proliferacija je merena protočnom citometrijskom analizom CFSE-razblaženja na CD4+ ili CD8+ obojenim T-ćelijama korišćenjem LSRII protočnog citometra i Flowjo softvera kao što je gore opisano.
[1886] Kao što je prikazano na Sl. 27, Primerno testirani ICOSL/NKp30 stek proteini kostimulisali su proliferaciju primarnih humanih CD4+ T ćelija na B7H6-zavisan način, što je pokazano povećanjem proliferacije ICOSL/NKp30 steka u poređenju sa parenteralnim ICOSL ili samo NKp30 proteinima.
[1888] PRIMER 33
[1890] Procena stek molekula koji sadrže ICOSL i NKp30 domen u kombinaciji i anti-PD-1 antitela u modelu tumora
[1892] Ovaj primer opisuje procenu antitumorske aktivnosti primernih ICOSL/NKp30 stek proteina, generisanih kao što je opisano u Primeru 31, procenjenih samostalno ili u kombinaciji sa monoklonskim antitelom protiv mišjeg PD-1 (mPD-1 mAb) kod miševa koji nose ćelije karcinoma debelog creva B7-H6+ CT26.
[1894] Miševima je supkutano implantirano približno 0,3 x 10<5>tumorske ćelije B7-H6+ CT26. Tumori su uzgajani do 13. dana, a miševima je određen stadijum i merena im je srednja zapremina tumora (80 do 120 mm<3>). Tumori su mereni elektronskim kaliperima dvodimenzionalno počevši od 6. dana nakon implantacije ćelija tumora. Izmerena je zapremina tumora i određena je srednja zapremina tumora. Tri miša/grupa sa najmanjim početnim tumorima (~75 mm<3>) su isključeni iz analize.
[1896] Kao što je prikazano na Sl.28, kombinacija testiranog ICOSL/NKp30 stek proteina i mPD-1 mAb značajno je smanjila rast tumora (medijanske zapremine tumora) tokom vremena u poređenju sa grupama tretiranim Fc kontrolom, bilo samo ICOSL ili NKp30, samo ICOSL/NKp30 stekom ili anti- samo mišjim PD-1 mAb. Nisu primećene razlike u rastu bilo koje grupe za tretman sa roditeljskim CT26 (B7-H6-negativnim) tumorima. Antitumorska aktivnost kombinacije, kao što je prikazano na Sl.28 je u skladu sa nalazom da je kombinacija testiranog ICOSL/NKp30 stek proteina i anti-PD-1 antitela bolja od pojedinačnih reagensa.
[1898] PRIMER 34
[1899] Procena doziranja i in vivo efekti ICOSL IgV-Fc fuzionih molekula u CIA modelu
[1900] Varijantni ICOSL IgV-Fc fuzioni molekuli su procenjeni na antiinflamatornu aktivnost u modelu artritisa indukovanog kolagenom (CIA) sa profilaktičkom ili terapijskom dozom. Varijantni ICOSL IgV-Fc fuzioni molekul je doziran najviše 4 puta pre ili neposredno nakon početka bolesti. Testirani varijantni ICOSL IgV-Fc fuzioni molekul je sadržao varijantu ICOSL IgV sa N52H/N57Y/Q100P kao što je navedeno u SEQ ID NO: 570 ili N52H/N57Y/Q100R kao što je navedeno u SEQ ID NO: 565, fuzionisanu sa inertnim Fc (koji sadrži mutacije L234A, L235E i L235E u humanom IgG1 Fc, npr. navedeno u SEQ ID NO:637).
[1902] Za indukovanje upale zglobova, miševima je ubrizgana emulzija pilećeg ili goveđeg kolagena II/CFA u rep 18. ili 21. dana, a emulzija pilećeg ili goveđeg kolagena II/IFA („bust“) 0. dana. Za profilaktičko doziranje, miševima je data varijanta ICOSL IgV-Fc fuzionog molekula (N52H/N57Y/Q100P) sa četiri doze počev od dana busta, pre početka bolesti. Za terapeutski/odloženi tretman, miševima je data varijanta ICOSL IgV-Fc fuzionog molekula (N52H/N57Y/Q100R) počev od dana kada je primećeni rezultat šape bio veći od jedan, a doziranje se vršilo svaka dva dana, ukupno četiri doze. Kao kontrola, testirani su i samo Fc molekuli i molekul CTLA-4-Fc (abatacept). Određen je rezultat šape na osnovu crvenila ili otoka. Takođe je prikupljen serum za merenje antitela protiv kolagena (CII IgG) i proinflamatornih citokina IL-6 i TNFα. Ćelije iz drenirajućih limfnih čvorova su sakupljene, obojene za CD4, CD8, CD44 ili markere T folikularnih pomoćnih (T<FH>) ćelija (CD25-CD4+PD-1+CXCR5+). Sl. 29A-29D prikazuju rezultate za profilaktičko doziranje. Miševi tretirani varijantom ICOSL IgV-Fc fuzionog molekula tokom profilaktičkog doziranja pokazali su suzbijanje bolesti u CIA mišjem modelu reumatoidnog artritisa, što je pokazano nižim prosečnim zbirnim rezultatom šapa (Sl.
[1903] 29A), i smanjen detektovani CII IgG (Sl.29B). *p<0,05 za ICOSL IgV-Fc u odnosu na abatacept **p<0,001 za ICOSL IgV-Fc u odnosu na PBS (ponovljenim merenjima dvosmernom ANOVA). Niži nivoi serumskih citokina (Sl.29C) i CD44+ aktivirane T ćelije ili T<FH>ćelije (Sl.29D) takođe su primećeni kod miševa tretiranih varijantom ICOSL IgV-Fc fuzionog molekula u poređenju sa Fc kontrolom; *p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001, ****p< 0,0001 (jednosmernom ANOVA). Frakcija B ćelija u drenirajućem limfnom čvoru je, takođe, značajno smanjena u grupi tretiranoj ICOSL IgV-Fc u odnosu na Fc kontrolnu grupu (p<0,05) (Sl.29E).
[1904] Sl. 30A-30D prikazuju rezultate za odloženo doziranje. Varijanta ICOSL-IgV Fc je rezultirala najnižim srednjim zbirnim rezultatom šape (Sl. 30A) i najvećom procentualnom promenom telesne težine (Sl.30B) u poređenju sa drugim grupama, uključujući kontrolnu grupu sa abataceptom. Kao što je prikazano na Sl. 30C i Sl. 30D, serumski citokini su, takođe, bili suzbijeni u terapeutskom CIA modelu kod miševa tretiranih varijantom ICOS IgV-Fc. Statistička značajnost između grupa: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 pomoću Studentovog neuparenog ttesta. Na Sl.30C i Sl.30D, isprekidane horizontalne linije označavaju donju granicu kvantifikacije (LLOQ) za svaki citokin.
[1906] Zajedno, ovi podaci dokazuju da CD28 i ICOS putevi igraju važnu ulogu u inflamatornom artritisu. Posebno, superiorna aktivnost varijante ICOSL dualnog CD28/ICOS antagonista je u skladu sa zapažanjem da je blokada oba puta neophodna i da se samo delimična korist postiže blokadom jednog puta.
[1908] PRIMER 35
[1910] Procena in vivo efekata ICOSL IgV-Fc fuzionih molekula u EAE modelu
[1912] Varijantni ICOSL IgV-Fc fuzioni molekul je procenjen na antiinflamatornu aktivnost u eksperimentalnom modelu autoimunog encefalomijelitisa (EAE) sa adoptivnim transferom. Testirani varijantni ICOSL IgV-Fc fuzioni molekul sadrži varijantu ICOSL IgV (N52H/N57Y/Q100R; SEQ ID NO: 565) fuzionisanu sa inertnim Fc (koji sadrži mutacije L234A, L235E i L235E u humanom IgG1 Fc).
[1914] Ženkama miševa C57BL/6 je supkutano ubrizgana emulzija MOG<35-55>/CFA. Nakon 11 dana, ćelije slezine su dobijene i kultivisane sa MOG<35-55>peptidom, IL-12 i anti-IFNγ. Tri dana nakon kulture, encefalitogene T ćelije su isporučene putem intraperitonealne injekcije (Dan 0). Miševima je dat varijantni ICOSL IgV-Fc fuzioni molekul svakog drugog dana počev od Dana 0, ukupno pet doza. Kao kontrola, testirani su i samo Fc molekuli i CTLA-4-Fc molekul (abatacept). Tokom 20 dana nakon injekcije T ćelija, miševi su mereni, praćeni i procenjivani na EAE skor kao što je opisano u Tabeli 33. Na kraju studije, serum je sakupljen za analizu proinflamatornih citokina, a ćelije iz drenirajućih limfnih čvorova su sakupljene za analizu protočnom citometrijom.
[1915]
[1918] Kao što je prikazano na Sl. 31A, miševi tretirani varijantom ICOSL IgV-Fc fuzionog molekula suzbili su bolest u EAE modelu miša, što je pokazano nižim EAE rezultatom, *p<0,0001 pomoću površine ispod krive (AUC) jednosmerne ANOVA; varijanta ICOSL IgV-Fc fuzionog molekula u poređenju sa kontrolama.
[1920] Za protočnu citometrijsku analizu T ćelija ingvinalnih limfnih čvorova, ćelije su obojene bojom za procenu vijabilnosti i analizirane sa anti-CD44, anti-CD62L, anti-CD4, anti-CD8 i procenjene na procenat vijabilnih naivnih (CD62L+CD44-) i T<efektor>memorijskih (Tem) CD62L‑ CD44+) CD4+ and CD8+ T ćelija. Kao što je prikazano na Sl.31C, CD4+ i CD8+ Tem ćelije su smanjene tretmanom sa varijantom ICOSL IgV-Fc fuzionog molekula (****p<0,0001; ***p<0,001 pomoću jednosmerne ANOVA).
[1922] Serumski citokini su procenjeni na dan 0 (2 sata nakon 1. doze) i 6. dana (1 sat pre 4. doze). Kao što je prikazano na Sl.31D, testirana varijanta ICOSL IgV-Fc fuzionog molekula je rezultirala smanjenjem proinflamatornih citokina u serumu 0. dana, uključujući IL-5, IL-10, IL-12p70 i TNFα. 6. dana, nivoi IFN-γ i IL-6 u serumu su smanjeni tretmanom varijantom ICOSL IgV-Fc fuzionog molekula u poređenju sa Fc kontrolom.
[1924] PRIMER 36
[1926] Studija raspona doza varijante ICOSL-IgV Fc u modelu bolesti kalem protiv domaćina (GvHD)
[1927] Studija raspona doza sprovedena je sa 20, 100 ili 500 µg varijante ICOSL IgV-Fc molekula, koja sadrži varijantu ICOSL IgV (N52H/N57Y/Q100R; SEQ ID NO: 565) fuzionisanu sa inertnim Fc (koji sadrži mutacije L234A, L235E i L235E u humanom IgG1 Fc, npr. navedeno u SEQ ID NO:637), u mišjem modelu bolesti kalem protiv domaćina (GVHD). Aktivnost varijante ICOSL IgV-Fc molekula upoređena je sa belataceptom (CTLA-4-FcL104E/A29Y; US2016/0271218).
[1929] Ženke NSG miševa (n = 5 po grupi za Grupu 1, bez tretmana; n = 10 po grupi za grupe za tretman 2-7) primile su 10 mg gama globulina supkutano, a zatim su ozračene (100 cGy/rad) na Dan -1. Na Dan 0 (u roku od 24 sata nakon zračenja), miševi u Grupama 2-7 su primili doze testnih proizvoda kao što je navedeno u Tabeli 34, a zatim su svi miševi primili 1x10<7>humanih PBMC ubrizganih intravenski preko repne vene nakon doziranja.
[1931] Indeks aktivnosti bolesti (DAI) je određen procenom miševa tri puta nedeljno tokom studije i bodovanjem bolesti na osnovu gubitka telesne težine, držanja, aktivnosti, izgleda krzna i kože miševa. Nakon što je studija završena 42. dana, procenjena su merenja preživljavanja na krajnjim tačkama, gubitka telesne težine i aktivnosti bolesti. Generisani su Kaplan-Majerovi grafikoni preživljavanja koji predstavljaju procenat životinja koje su preživele do krajnje tačke studije, a poređenja krivih preživljavanja analizirana su Mantel-Koksovim i Gehan-Breslou-Vilkoksovim testovima (95% CI). Uzorci krvi/seruma su prikupljeni od preživelih miševa na kraju studije (42. dan), a ćelije su procenjene protočnom citometrijom na markere T ćelija, uključujući mišje ili humane markere, CD4, CD8, CD28, ICOS, markere aktivacije ili iscrpljenosti (PD-1, Ki67) i FoxP3 (marker Tregs). Takođe su procenjeni nivoi proinflamatornih citokina u serumu (npr. IFN-γ, IL-10, IL-12(p70), IL-17A, IL-4, IL-5 i TNFα).
[1932]
[1935] Sl.32A-32B prikazuju preživljavanje i DAI rezultate GVHD miševa tretiranih u skladu sa svakim rasporedom doziranja. Kao što je prikazano, testirana varijanta ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) na svim testiranim nivoima doza značajno je poboljšala preživljavanje (Sl.
[1936] 32A) i smanjene rezultate bolesti (Sl.32B) u poređenju sa miševima tretiranim belataceptom (tj.
[1937] 100% naspram 40% preživljavanja na 42. dan, redom; p<0,01 pomoću Mantel-Koksovog log rank testa). Primetno je da je jednokratna primena (100 µg) varijante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) rezultirala sličnom zaštitom od bolesti kao i ponovljena doza od 100 µg belatacepta.
[1939] [0715] Analiza krvi prikupljene protočnom citometrijom na kraju studije pokazala je da testirana varijanta ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) efikasno suzbija širenje transferovanih humanih T ćelija, što je primećeno smanjenim odnosom humanih ćelija i mišjih ćelija (Sl. 33A) i znatno smanjenim ukupnim brojem T ćelija (Sl.33B). Kao što je prikazano na Sl.33C-33F, bojenje krvi prikupljene na kraju studije protočnom citometrijom CD4+ i CD8+ T ćelija, zajedno obojenih za ICOS (Sl. 33C-33D) i CD28 (Sl. 33E-33F) nije pokazao u suštini nikakvo bojenje u grupama tretiranim varijantom ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R), iako su CD4+ i CD8+ T ćelije koje eksprimuju ICOS bile lako detektujuće kod miševa tretiranih belataceptom. Ovi rezultati su u skladu sa nedostatkom T ćelija koje su preostale kod miševa tretiranih ICOSL IgV-Fc, a takođe i sa sposobnošću varijante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) da se veže za svoje ciljne molekule CD28 i ICOS i blokira njihovu detekciju pomoću antitela protočne citometrije. Vezivanje varijante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) na nekoliko preostalih humanih T ćelija potvrđeno je detekcijom pomoću anti-humanog IgG Fc. Primetno je da, dok je većina transferovanih humanih T ćelija u početku eksprimovala CD28 i samo 10-20% bilo ICOS+, aktivirane T ćelije koje su preostale kod miševa tretiranih fiziološkim rastvorom ili belataceptom na prekidu/kraju studije bile su >80% ICOS+.
[1941] Prisustvo markera aktivacije ili iscrpljenosti T ćelija je, takođe, bilo suzbijeno u grupama tretiranim varijantom ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R), što je dokazano nižom ekspresijom PD1 u CD4+ i CD8+ T ćelijama i smanjenom ekspresijom Ki67 u CD4+ T ćelijama (Sl.34A-3B). Odnos efektorskih T ćelija i Treg ćelija je ostao stabilan u grupama tretiranim varijantom ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) u poređenju sa belataceptom (Sl.34C). Serumski proinflamatorni citokini su, takođe, bili suzbijeni u grupama tretiranim varijantom ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) u poređenju sa belataceptom (Sl.35A-35D).
[1943] Farmakokinetička (PK) analiza je, takođe, sprovedena radi praćenja serumske izloženosti varijante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R). Koncentracije testiranog jedinjenja merene su u uzorcima mišjeg seruma korišćenjem kvantitativne PK ELISA analize sa anti-humanim ICOSL mAb antitelom za hvatanje i Fc-specifičnim mišjim anti-humanim IgG kao reagensom za detekciju.
[1945] Uočena serumska izloženost varijante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) u GVHD modelu bila je 45% niža nego kod normalnih miševa, utvrđeno u posebnoj studiji (Sl.35E). Duži terminalni poluživot varijante ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) u GvHD modelu može biti posledica smanjene mete (CD28, ICOS) u kasnijim vremenskim tačkama u GvHD (kako humane T ćelije nestaju) i/ili formiranja antitela protiv leka (ADA) kod normalnih miševa, što može ometati izloženost leku. Zapažanje da je varijanta ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) imala nižu serumsku izloženost u poređenju sa normalnim miševima može biti posledica raspodele leka posredovane ciljem (TMDD) u GvHD modelu (tj. njenog većeg afiniteta za humani CD28 i ICOS u poređenju sa mišjim ortolozima) i/ili nedostatka FcRn kod NOD/SCID (NSG) miševa korišćenih u ovom modelu.
[1946] Zajedno, ovi rezultati su u skladu sa zapažanjem da varijanta ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) ispoljava snažnu antagonističku aktivnost, čak i sa samo jednom dozom, i superiornu aktivnost u odnosu na belatacept. Ovo zapažanje može se pripisati varijanti ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) koja ispoljava superiornu kontrolu ICOS+ T ćelija, koje inače izbegavaju blokadu pojedinačnih ICOS ili CD28 puteva, kao što je ona postignuta sa antagonistom CD28 puta belataceptom.
[1948] PRIMER 37
[1950] Procena varijante ICOSL-IgV Fc u modelu kolitisa izazvanog CD4+CD45RBhigh
[1952] Procenjen je efekat primerne varijante ICOSL IgV-Fc koja sadrži varijantu ICOSL IgV (N52H/N57Y/Q100R; SEQ ID NO: 565) fuzionisane sa inertnim Fc (koji sadrži mutacije L234A, L235E i L235E u humanom IgG1 Fc, npr. navedene u SEQ ID NO:637) na razvoj bolesti u modelu kolitisa indukovanog CD4+CD45RBhigh.
[1954] Donorske ćelije CD4+CD45RBhigh su obogaćene negativnom selekcijom iz suspenzija ćelija slezine dobijenih od 15 mužjaka BALB/C donorskih miševa. Na dan 0, 0,3 miliona CD4+CD25-CD45RBhigh (Treg osiromašenih) donorskih ćelija je intravenski ubrizgano imunodeficijentnim C.B17 (SCID) miševima (n=12 ili 21 po grupi) da bi se indukovao kolitis. Kao kontrola, 0,3 miliona CD4+ ćelija (koje sadrže Treg ćelije), koje ne indukuju razvoj kolitisa u ovom modelu, ubrizgano je u SCID miševe primaoce (n=12). Na dan prenosa ćelija, miševima u svakoj grupi je data varijanta ICOSL-IgV Fc ili samo Fc ili kontrole sa nosačem. Tabela 35 sumira režim lečenja za testirane grupe.
[1956]
[1957] Telesna težina (merena počev od Dana 0) i rezultat konzistencije stolice (meren počev od Dana 10) procenjivani su tri puta nedeljno. Dnevni indeks aktivnosti bolesti (DAI) izračunat je iz telesne težine i rezultata stolice. Nakon što je studija završena 42. dana, debelo crevo je sakupljeno radi određivanja dužine i težine i histološke analize. Statistička analiza konačne telesne težine i konačne težine debelog creva i dužine grupe tretirane varijantom ICOSL-IgV Fc u odnosu na grupu tretiranu nosačem procenjena je korišćenjem Studentovog t-testa sa dva uzorka. Rezultati stolice i DAI rezultati upoređeni su korišćenjem Vilkoksonovog neparametarskog T-testa.
[1959] Rezultati DAI su prikazani u Tabelama 36 (DAI) i na Sl. 36A, merenja debelog creva su prikazana u Tabeli 37, a rezultati histologije debelog creva su prikazani u Tabeli 38 i na Sl.
[1960] 36B. Kao što je prikazano, testirana varijanta ICOSL IgV-Fc (N52H/N57Y/Q100R) pokazala je značajno smanjen razvoj kolitisa u ovom modelu, što je u skladu sa korisnošću ovog dvostrukog CD28/ICOS antagonista za efikasno lečenje inflamatorne bolesti creva (IBD).
[1962]
[1963]
[1964]
[1965]
[1966]
[1967]
[1969] Nije namera da predmetni pronalazak bude ograničen po obimu na pojedinačne realizacije stavljene na uvid javnosti, koje su date, na primer, da ilustruju različite aspekte pronalaska. Različite modifikacije opisanih kompozicija i postupaka postaće očigledne iz opisa i učenja u ovom dokumentu. Predmetni pronalazak je definisan u patentnim zahtevima. Bilo koji predmet koji je ovde opisan, ali čija se zaštita ne traži, ne čini deo pronalaska.

Claims (16)

1. Patentni zahtevi
1. Imunomodulatorni fuzioni protein, koji sadrži varijantu ICOSL polipeptida i Fc region imunoglobulina, pri čemu imunomodulatorni fuzioni protein sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:928.
2. Imunomodulatorni fuzioni protein prema zahtevu 1, koji je homodimer.
3. Molekul(i) nukleinske kiseline, koji kodiraju imunomodulatorni fuzioni protein prema zahtevu 1 ili zahtevu 2.
4. Vektor, koji sadrži molekul(e) nukleinske kiseline prema zahtevu 3.
5. Ćelija, koja sadrži molekul(e) nukleinske kiseline prema zahtevu 3 ili vektor prema zahtevu 4.
6. Postupak proizvodnje imunomodulatornog fuzionog proteina koji sadrži varijantu ICOSL polipeptida i Fc region imunoglobulina, koji obuhvata uvođenje molekula nukleinske kiseline prema zahtevu 3 ili vektora prema zahtevu 4 u ćeliju domaćina pod uslovima za eksprimovanje proteina u ćeliji, pri čemu opciono ćelija je ćelija sisara.
7. Postupak prema zahtevu 6, pri čemu ćelija je ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili njen derivat, opciono CHO DG44.
8. Postupak prema zahtevu 6 ili zahtevu 7, koji dalje obuhvata izolovanje ili prečišćavanje proteina iz ćelije.
9. Protein proizveden postupkom prema bilo kom od zahteva 6-8.
10. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži imunomodulatorni fuzioni protein prema zahtevu 1 ili zahtevu 2 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
11. Imunomodulatorni fuzioni protein prema zahtevu 1 ili zahtevu 2 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 10 za upotrebu kao lek.
12. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 11, za modulaciju imunog odgovora, pri čemu je imuni odgovor smanjen.
13. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 10 za upotrebu u lečenju bolesti ili stanja kod subjekta, pri čemu je bolest ili stanje inflamatorna ili autoimuna bolest ili stanje.
14. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 13, pri čemu je bolest ili stanje Adisonova bolest, alergije, alopecija areata, Alchajmerova bolest, vaskulitisi udruženi sa antineutrofilnim citoplazmatskim antitelima (ANCA), ankilozirajući spondilitis, antifosfolipidni sindrom (Hjuzov sindrom), astma, ateroskleroza, reumatoidni artritis, autoimuna hemolitička anemija, autoimuni hepatitis, autoimuno oboljenje unutrašnjeg uha, autoimuni limfoproliferativni sindrom, autoimuni miokarditis, autoimuni oforitis, autoimuni orhitis, azoospermija, Behčetova bolest, Bergerova bolest, bulozni pemfigoid, kardiomiopatija, kardiovaskularne bolesti, celijačna bolest ili celijakija, sindrom hroničnog umora i imunodisfunkcije (CFIDS), hronični idiopatski polineuritis, hronična inflamatorna demijelinizirajuća poliradikuloneuropatija (CIDP), hronična recidivirajuća polineuropatija (Guillain-Barréov sindrom), Čarg-Štrausov (Churg Strauss) sindrom, cikatricijalni pemfigoid, bolest hladnih aglutinina (CAD), HOBP (hronična opstruktivna plućna bolest), CREST sindrom, Kronova bolest, dermatitis, herpetiformus, dermatomiozitis, dijabetes, diskoidni lupus, ekcem, epidermolysis bullosa acquisita (stečena bulozna epidemoliza), esencijalna mešovita krioglobulinemija, Evanov sindrom, egzoftalmos, fibromijalgija, Gudpasturov sindrom, Grejvsova bolest, Hašimotov tireoiditis, idiopatska plućna fibroza, idiopatska trombocitopenija purpura (ITP), IgA nefropatija, imunoproliferativna bolest ili poremećaj, inflamatorna bolest creva (IBD), intersticijalna bolest pluća, juvenilni artritis, juvenilni idiopatski artritis (JIA), Kavasakijeva bolest, Lambert–Itonov mijastenični sindrom, lihen planus, lupus nefritis, limfocitni hipofizitis, Menijerova bolest, Miler Fišerov sindrom / akutna diseminovana encefalo mijeloradikulopatija, mešovita bolest vezivnog tkiva, multipla skleroza (MS), mišićni reumatizam, mijalgični encefalomijelitis (ME), mijastenija gravis, upala oka, pemphigus foliaceus, pemphigus vulgaris, perniciozna anemija, nodozni poliarteritis,
polihondritis, poliglandularni sindromi (Vitakerov sindrom), reumatska polimijalgija, polimiozitis, primarna agamaglobulinemija, primarna bilijarna ciroza / autoimuna holangiopatija, psorijaza, psorijazni artritis, Rejnoov fenomen, Rajterov sindrom / reaktivni artritis, restenoza, reumatska groznica, reumatska bolest, sarkoidoza, Šmitov sindrom, skleroderma, Sjogrenov sindrom, sindrom ukočene osobe, sistemski eritemski lupus (SLE), sistemska skleroderma, Takajasuov arteritis, temporalni arteritis / gigantocelularni arteritis, tireoiditis, dijabetes tipa 1, ulcerozni kolitis, uveitis, vaskulitis, vitiligo, intersticijalna bolest creva ili Vegenerova granulomatoza.
15. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 13 ili zahtevu 14, pri čemu je bolest ili stanje sistemski eritematozni lupus (SLE).
16. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 13, pri čemu je bolest ili stanje inflamatorna bolest creva (IBD); bolest ili poremećaj povezan sa IBD, opciono intersticijalna bolest pluća; bolest kalema protiv domaćina (GVHD), opciono akutni GVHD (aGVHD); psorijazni artritis (PsA); reumatoidni artritis; autoimuno stanje povezano sa transplantacijom organa; ili Sjogrenov sindrom.
RS20260125A 2017-10-18 2018-10-17 Imunomodulatorni proteini varijanti icos liganda i povezane kompozicije i postupci RS67712B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762574161P 2017-10-18 2017-10-18
EP18803814.5A EP3697810B1 (en) 2017-10-18 2018-10-17 Variant icos ligand immunomodulatory proteins and related compositions and methods
PCT/US2018/056381 WO2019079520A2 (en) 2017-10-18 2018-10-17 ICOS VARIANT LIGAND IMMUNOMODULATORY IMMUNOMODULATORY PROTEINS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67712B1 true RS67712B1 (sr) 2026-02-27

Family

ID=64316982

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20260125A RS67712B1 (sr) 2017-10-18 2018-10-17 Imunomodulatorni proteini varijanti icos liganda i povezane kompozicije i postupci

Country Status (31)

Country Link
US (3) US20200283500A1 (sr)
EP (2) EP3697810B1 (sr)
JP (3) JP7282760B2 (sr)
KR (2) KR102776394B1 (sr)
CN (1) CN111712515A (sr)
AR (1) AR113455A1 (sr)
AU (2) AU2018351000B2 (sr)
BR (1) BR112020007542A2 (sr)
CA (1) CA3078517A1 (sr)
DK (1) DK3697810T3 (sr)
EA (1) EA202090974A1 (sr)
ES (1) ES3061962T3 (sr)
FI (1) FI3697810T3 (sr)
HR (1) HRP20260069T1 (sr)
IL (2) IL320945A (sr)
LT (1) LT3697810T (sr)
MA (1) MA50404B1 (sr)
MD (1) MD3697810T2 (sr)
MX (1) MX2020004540A (sr)
MY (1) MY203416A (sr)
PH (1) PH12020550449A1 (sr)
PL (1) PL3697810T3 (sr)
PT (1) PT3697810T (sr)
RS (1) RS67712B1 (sr)
SA (1) SA520411779B1 (sr)
SG (1) SG11202003078VA (sr)
SI (1) SI3697810T1 (sr)
SM (1) SMT202600062T1 (sr)
TW (2) TW202500579A (sr)
UA (1) UA129833C2 (sr)
WO (1) WO2019079520A2 (sr)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN121159719A (zh) 2015-04-17 2025-12-19 高山免疫科学股份有限公司 具有可调的亲和力的免疫调节蛋白
MX2018012472A (es) 2016-04-15 2019-08-12 Alpine Immune Sciences Inc Proteinas inmunomoduladoras variantes de ligando icos y sus usos.
JP7749319B2 (ja) 2017-10-10 2025-10-06 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Ｃｔｌａ－４変異型免疫調節タンパク質およびそれらの使用
BR112020007542A2 (pt) 2017-10-18 2020-12-01 Alpine Immune Sciences, Inc. proteínas imunomoduladoras ligantes de icos variantes e composições e métodos relacionados
AU2019205273B2 (en) 2018-01-03 2024-04-04 Alpine Immune Sciences, Inc. Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
WO2019241758A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
MX2021012607A (es) * 2019-04-17 2022-03-11 Alpine Immune Sciences Inc Metodos y usos de proteinas de fusion de ligando icos (icosl) variante.
BR112022002028A2 (pt) * 2019-08-02 2022-04-12 Cttq Akeso Shanghai Biomed Tech Co Ltd Anticorpo anti-pd-1 e uso farmacêutico do mesmo
US12528856B2 (en) 2019-08-30 2026-01-20 Allogene Therapeutics, Inc. Chimeric cytokine receptors comprising TGF β binding domains
AU2020389422B2 (en) * 2019-11-20 2024-08-08 Gi Cell, Inc. Medium composition for culturing T cells and method for culturing T cells using same
EP4118105A2 (en) * 2020-03-09 2023-01-18 Pfizer Inc. Cd80-fc fusion protein and uses thereof
EP4146684A2 (en) 2020-05-08 2023-03-15 Alpine Immune Sciences, Inc. April and baff inhibitory immunomodulatory proteins with and without a t cell inhibitory protein and methods of use thereof
CA3191448A1 (en) * 2020-08-12 2022-02-17 Migal Galilee Research Institute Ltd. Alloreactive immune cell-distancing device and uses thereof for protecting donor-derived cells from allorejection
WO2023214705A1 (ko) * 2022-05-03 2023-11-09 고려대학교 산학협력단 Icos와의 결합력이 향상된 icos-l 변이체

Family Cites Families (193)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7045313B1 (en) 1982-11-30 2006-05-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant vaccinia virus containing a chimeric gene having foreign DNA flanked by vaccinia regulatory DNA
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5443964A (en) 1987-08-10 1995-08-22 Duke University Poxvirus insertion/expression vector
US6218525B1 (en) 1988-02-25 2001-04-17 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding CD28
US5716826A (en) 1988-03-21 1998-02-10 Chiron Viagene, Inc. Recombinant retroviruses
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US6410010B1 (en) 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
EP0584266B1 (en) 1991-05-06 2003-09-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Recombinant virus expressing carcinoembryonic antigen and methods of use thereof
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US6887471B1 (en) 1991-06-27 2005-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Method to inhibit T cell interactions with soluble B7
US5262522A (en) 1991-11-22 1993-11-16 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M and leukemia inhibitory factor
DK0752248T3 (da) 1992-11-13 2000-11-13 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimæriske og radioaktivt mærkede antistoffer mod humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantig
US5773253A (en) 1993-01-22 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company MYPPPY variants of CTL A4 and uses thereof
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5457035A (en) 1993-07-23 1995-10-10 Immunex Corporation Cytokine which is a ligand for OX40
US20020159979A1 (en) 1994-06-06 2002-10-31 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
WO1996009380A1 (en) 1994-09-23 1996-03-28 The University Of British Columbia Method of enhancing expression of mhc class i molecules bearing endogenous peptides
DE69519521T2 (de) 1994-10-03 2001-06-28 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary National Institute Of Health Zusammensetzung enthaltend ein antigen exprimierendes rekombinantes virus und ein immunstimulierendes molekül exprimierendes rekombinantes virus
US5998205A (en) 1994-11-28 1999-12-07 Genetic Therapy, Inc. Vectors for tissue-specific replication
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
US5767071A (en) 1995-06-07 1998-06-16 Ixsys Incorporated Sevenmer cyclic peptide inhibitors of diseases involving αv β3
US5780426A (en) 1995-06-07 1998-07-14 Ixsys, Incorporated Fivemer cyclic peptide inhibitors of diseases involving αv β3
FR2735789B1 (fr) 1995-06-23 1997-07-25 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants, leur utilisation pour preparer des aav, lignee cellulaire complementaire et compositions pharmaceutiques les contenant
US6632670B1 (en) 1995-09-08 2003-10-14 Genzyme Corporation AAV vectors for gene therapy
US7001765B2 (en) 1996-03-06 2006-02-21 Medigene Ag Adeno-associated virus vector for boosting immunogenicity of cells
US6294170B1 (en) 1997-08-08 2001-09-25 Amgen Inc. Composition and method for treating inflammatory diseases
ATE299938T1 (de) 1997-05-02 2005-08-15 Genentech Inc Ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US5891432A (en) 1997-07-29 1999-04-06 The Immune Response Corporation Membrane-bound cytokine compositions comprising GM=CSF and methods of modulating an immune response using same
EP1012236A1 (en) 1997-08-15 2000-06-28 Rubicon Laboratory Inc. Retrovirus and viral vectors
EP1015619A1 (en) 1997-09-19 2000-07-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
GB9801930D0 (en) 1998-01-29 1998-03-25 Univ London Mutant herpes simplex viruses and uses thereof
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US20040063094A1 (en) 1998-05-20 2004-04-01 Biovex Limited Mutant herpes simplex viruses and uses thereof
US6436392B1 (en) 1998-05-20 2002-08-20 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors
GB2337755B (en) 1998-05-29 2003-10-29 Secr Defence Virus vaccine
US6375952B1 (en) 1998-08-07 2002-04-23 University Of Washington Immunological herpes simplex virus antigens and methods for use thereof
AU780231B2 (en) 1998-11-10 2005-03-10 University Of North Carolina At Chapel Hill, The Virus vectors and methods of making and administering the same
PL209392B1 (pl) 1999-01-15 2011-08-31 Genentech Inc Przeciwciało, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciała oraz zastosowanie przeciwciała
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US8624010B1 (en) 1999-02-03 2014-01-07 Steven K. Yoshinaga Nucleic acids encoding B7RP1
GB9904582D0 (en) 1999-02-26 1999-04-21 Nycomed Imaging As Process
US6428968B1 (en) 1999-03-15 2002-08-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Combined therapy with a chemotherapeutic agent and an oncolytic virus for killing tumor cells in a subject
DE19933288A1 (de) 1999-07-15 2001-01-18 Medigene Ag Strukturprotein von Adeno-assoziiertem Virus mit veränderter Antigenität, seine Herstellung und Verwendung
US6365619B1 (en) 1999-07-22 2002-04-02 Novartis Ag Treatment of arteriosclerosis
CA2379166C (en) 1999-08-09 2013-03-26 Targeted Genetics Corporation Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms instrastrand base pairs
DK1218504T3 (da) 1999-09-21 2007-11-12 Genetics Inst Llc GL50 molekyler og anvendelser deraf
US7241447B1 (en) 1999-10-07 2007-07-10 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors and uses thereof
US7329728B1 (en) 1999-10-25 2008-02-12 The Scripps Research Institute Ligand activated transcriptional regulator proteins
AU2584901A (en) 1999-12-22 2001-07-03 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Herpes simplex virus-1 glycoprotein c mutants for treating unwanted hyperproliferative cell growth
GB2375113B (en) 2000-01-21 2004-10-20 Biovex Ltd A modified, oncolytic, non-laboratory HSV strain and its use in treating cancer
US7306902B2 (en) 2002-06-28 2007-12-11 Oncolyties Biotech Inc. Oncolytic viruses as phenotyping agents for neoplasms
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
EP1360290A2 (en) 2000-06-23 2003-11-12 Maxygen, Inc. Co-stimulatory molecules
US7183376B2 (en) 2000-06-23 2007-02-27 Maxygen, Inc. Variant B7 co-stimulatory molecules
US20040022787A1 (en) 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
EP1935427B1 (en) 2000-07-03 2018-03-07 Bristol-Myers Squibb Company Uses of soluble CTLA4 mutant molecules
US7011972B2 (en) 2000-07-18 2006-03-14 The Scripps Research Institute Fusion polypeptide comprising two ligand binding domains
US6635750B1 (en) 2000-07-20 2003-10-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. B7-H2 nucleic acids, members of the B7 family
US6653103B2 (en) 2001-03-30 2003-11-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Inhibition of nucleocytoplasmic transport by vesicular stomatitis virus M protein-like polypeptides
HUP0400882A3 (en) 2001-05-11 2011-01-28 Wellstat Biologics Corp Oncolytic virus therapy
AU2002368044A1 (en) 2001-06-22 2004-04-19 Maxygen, Inc. Co-stimulatory molecules
CA2452517A1 (en) 2001-07-11 2003-01-23 University Of Miami Recombinant vsv for the treatment of tumor cells
CN1304559C (zh) 2001-10-09 2007-03-14 杭州康科生物技术有限公司 表达热休克蛋白的溶瘤微生物及其应用
DE60235041D1 (de) 2001-11-30 2010-02-25 Us Gov Health & Human Serv Und ihre verwendung
US7235631B2 (en) 2002-02-07 2007-06-26 Mayo Foundation For Medical Education And Research ICOS mutants
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
AU2003258060B2 (en) 2002-03-27 2007-07-12 Baylor College Of Medicine Potent oncolytic herpes simplex virus for cancer therapy
US20030225260A1 (en) 2002-04-30 2003-12-04 Snyder Richard O. Production of recombinant AAV virions
US20050220818A1 (en) 2002-06-21 2005-10-06 Wellstat Biologics Corporation Administration of therapeutic viruses
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
AU2003268505A1 (en) 2002-09-09 2004-03-29 University Of Tennessee Research Foundation Recombinatant mutants of rhabdovirus and methods of use thereof
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
TWI335821B (en) 2002-12-16 2011-01-11 Genentech Inc Immunoglobulin variants and uses thereof
US7731974B2 (en) 2003-03-27 2010-06-08 Ottawa Hospital Research Institute Mutant vesicular stomatitis viruses and uses thereof
JP2007524363A (ja) 2003-03-27 2007-08-30 オタワ ヘルス リサーチ インスティチュート 変異体水疱性口内炎ウイルスおよびそれらの使用
ATE420160T1 (de) 2003-06-18 2009-01-15 Genelux Corp Modifizierte rekombinante vacciniaviren, verwendungen davon
EP2345731B1 (en) 2003-09-30 2015-10-21 The Trustees of the University of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clades, sequences, vectors containing same, and uses thereof
US20070003520A1 (en) 2003-11-17 2007-01-04 Brown Susanne M Mutant viruses
GB0326798D0 (en) 2003-11-17 2003-12-24 Crusade Lab Ltd Methods for generating mutant virus
US7897146B2 (en) 2003-11-17 2011-03-01 Crusade Laboratories Limited Treatment using herpes simplex virus
PT1718677E (pt) 2003-12-19 2012-07-18 Genentech Inc Fragmentos de anticorpo monovalentes úteis como agentes terapêuticos
PT1737891E (pt) 2004-04-13 2013-04-16 Hoffmann La Roche Anticorpos anti p-selectina
WO2005116224A2 (en) 2004-05-18 2005-12-08 Children's Memorial Hospital Tetracycline-regulated adeno-associated viral (aav) vectors for gene delivery to the nervous system
US7427396B2 (en) 2004-06-03 2008-09-23 Genzyme Corporation AAV vectors for gene delivery to the lung
WO2006002394A2 (en) 2004-06-24 2006-01-05 New York University Avirulent oncolytic herpes simplex virus strains engineered to counter the innate host response
EP2471813B1 (en) 2004-07-15 2014-12-31 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
EP1810979B1 (en) 2004-09-22 2012-06-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. STABILIZED HUMAN IgG4 ANTIBODIES
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
US20090208924A1 (en) 2004-12-01 2009-08-20 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Generation of Replication Competent Viruses for Therapeutic Use
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
EP1885186B1 (en) 2005-06-01 2015-09-02 California Institute Of Technology Method of targeted gene delivery using viral vectors
AU2006262021C1 (en) 2005-06-23 2012-05-10 The University Of Houston Use of mutant Herpes Simplex Virus-2 for cancer therapy
PT1907424E (pt) 2005-07-01 2015-10-09 Squibb & Sons Llc Anticorpos monoclonais humanos para o ligando 1 de morte programada (pd-l1)
US7943374B2 (en) 2005-08-21 2011-05-17 Markus Hildinger Super-size adeno-associated viral vector harboring a recombinant genome larger than 5.7 kb
GB0522476D0 (en) 2005-11-03 2005-12-14 Biovex Ltd Oncolytic herpes virus vectors
DK1969007T3 (da) 2005-12-20 2013-11-25 Bristol Myers Squibb Co Sammensætninger og fremgangsmåder til fremstilling af en sammensætning
US8329162B2 (en) 2006-07-21 2012-12-11 California Institute Of Technology Targeted gene delivery for dendritic cell vaccination
EP2097517B1 (en) 2006-10-16 2014-06-04 Genelux Corporation Recombinant Lister strain vaccinia virus encoding an anti-VEGF single chain antibody
US20100178684A1 (en) 2006-12-21 2010-07-15 Woo Savio L C Transgenic oncolytic viruses and uses thereof
WO2008092117A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Xencor, Inc. Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region
GB2446721B (en) 2007-02-16 2009-03-25 Crusade Lab Ltd Herpes simplex viruses and methods of viral replication
SI2856876T1 (en) 2007-03-30 2018-04-30 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Constitutive expression of costimulatory ligands on adoptively transferred T lymphocytes
CA2690627C (en) 2007-06-15 2014-12-02 Genelux Corporation Microorganisms for imaging and/or treatment of tumors
SI2173890T1 (sl) 2007-06-21 2011-06-30 Univ Muenchen Tech Biološko aktivni proteini, ki imajo povečano in vivo in/ali in vitro stabilnost
CN101784564B (zh) 2007-07-13 2014-07-02 约翰霍普金斯大学 B7-dc变体
JP2010533718A (ja) 2007-07-18 2010-10-28 ジェネラックス・コーポレイション 腫瘍溶解性ウイルス治療に付随する副作用の処置もしくは改善用医薬の製造における化学治療剤の使用
KR101680906B1 (ko) * 2007-09-26 2016-11-30 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체 정상영역 개변체
WO2009054996A2 (en) 2007-10-25 2009-04-30 Genelux Corporation Systems and methods for viral therapy
EP2612867A1 (en) 2007-11-01 2013-07-10 Perseid Therapeutics LLC Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
EP2225277A4 (en) 2007-11-27 2012-03-14 Viventia Biotech Inc ANTIBODIES TO A CANCER-ASSOCIATED EPITOPE OF THE VARIANT NFKBIB AND APPLICATIONS THEREOF
PL2222861T3 (pl) 2007-12-11 2018-04-30 The University Of North Carolina At Chapel Hill Wektory retrowirusowe ze zmodyfikowanym odcinkiem polipurynowym
US8313896B2 (en) 2008-04-04 2012-11-20 The General Hospital Corporation Oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in the treatment of brain cancer
US20120052003A9 (en) 2008-05-16 2012-03-01 Szalay Aladar A Microorganisms for preventing and treating neoplasms accompanying cellular therapy
WO2009148488A2 (en) 2008-05-29 2009-12-10 The General Hospital Corporation Use of oncolytic herpes viruses for killing cancer stem cells
US9283184B2 (en) 2008-11-24 2016-03-15 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for localized agent delivery
EP3255060A1 (en) 2008-12-09 2017-12-13 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function
US8481297B2 (en) 2009-01-08 2013-07-09 Yale University Compositions and methods of use of an oncolytic vesicular stomatitis virus
EP2283810A1 (en) 2009-07-16 2011-02-16 University College Cork-National University of Ireland, Cork Orally administered bacteria as vehicles for systemic delivery of agents
US20150359909A1 (en) 2009-07-16 2015-12-17 University College Cork-National University Of Ireland, Cork Orally administered bacteria as vehicles for systemic delivery of agents
RS53257B2 (sr) 2009-07-24 2018-06-29 Immune Design Corp Lentiviralni vektori pseudotipizirani sa omotačem od glikobelančevine iz sindbis-virusa
CA2769822C (en) * 2009-08-13 2019-02-19 The Johns Hopkins University Methods of modulating immune function
EP2482849B1 (en) 2009-09-30 2018-06-06 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Combination immunotherapy for the treatment of cancer
PL2504364T3 (pl) 2009-11-24 2017-12-29 Medimmune Limited Ukierunkowane środki wiążące przeciwko B7-H1
ES2724451T3 (es) 2010-02-04 2019-09-11 Univ Pennsylvania ICOS regula fundamentalmente la expansión y la función de linfocitos Th17 humanos inflamatorios
HUE030100T2 (en) 2010-02-19 2017-04-28 Xencor Inc New CTLA4-IG immunoadhesins
CN106432474A (zh) 2010-03-12 2017-02-22 艾伯维生物医疗股份有限公司 Ctla4蛋白和其用途
KR101860963B1 (ko) 2010-04-23 2018-05-24 제넨테크, 인크. 이종다량체 단백질의 생산
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
KR20140004174A (ko) 2011-01-18 2014-01-10 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암 치료를 위한 조성물 및 방법
EP2686345B1 (en) 2011-03-16 2018-04-25 Amgen Inc. Fc variants
EA027236B1 (ru) 2011-04-08 2017-07-31 Иммьюн Дизайн Корп. Иммуногенные композиции и способы применения таких композиций для индукции гуморального и клеточного иммунного ответа
WO2012149364A1 (en) 2011-04-28 2012-11-01 Diamond Don J Tumor associated vaccines and compositions for disrupting tumor-derived immunosuppression for use in combination cancer immunotherapy
CN102836441B (zh) 2011-06-24 2019-06-11 台北荣民总医院 于感染性与恶性疾病的治疗中提升免疫反应的方法
CN103796681B (zh) 2011-06-30 2018-07-20 建新公司 T细胞活化的抑制剂
US9428574B2 (en) 2011-06-30 2016-08-30 Compugen Ltd. Polypeptides and uses thereof for treatment of autoimmune disorders and infection
CN103946952A (zh) 2011-09-16 2014-07-23 宾夕法尼亚大学董事会 用于治疗癌症的rna改造的t细胞
US8956619B2 (en) 2011-10-25 2015-02-17 University Of Maryland, Baltimore County Soluble CD80 as a therapeutic to reverse immune supression in cancer patients
KR101764096B1 (ko) 2011-11-28 2017-08-02 메르크 파텐트 게엠베하 항-ｐｄ-ｌ1 항체 및 그의 용도
JP6355563B2 (ja) 2012-02-27 2018-07-11 アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド Ｘｔｅｎ共役組成物およびそれを製造する方法
WO2013149167A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Immune Design Corp. Lentiviral vector particles having improved transduction efficiency for cells expressing dc- sign
WO2013156054A1 (en) * 2012-04-16 2013-10-24 Universität Stuttgart The igm and ige heavy chain domain 2 as covalently linked homodimerization modules for the generation of fusion proteins with dual specificity
WO2013169338A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Medimmune, Llc Ctla-4 variants
KR20150033703A (ko) 2012-06-27 2015-04-01 오르반 바이오테크 엘엘씨 당뇨병 치료를 위한 ctla4 융합 단백질
WO2014055657A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
EP3508215A3 (en) 2012-12-03 2019-10-02 Bristol-Myers Squibb Company Enhancing anti-cancer activity of immunomodulatory fc fusion proteins
HK1210964A1 (en) 2012-12-04 2016-05-13 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Immunotherapy with binding agents
US9944689B2 (en) 2013-03-07 2018-04-17 The General Hospital Corporation Human CTLA4 mutants and use thereof
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
JP2016515120A (ja) 2013-03-15 2016-05-26 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 抗アルファｖベータ５抗体を用いた急性腎損傷の治療及び予防
WO2014198002A1 (en) 2013-06-14 2014-12-18 Ottawa Hospital Research Institute A bacterium producing an interferon binding protein and uses thereof
GB201311475D0 (en) 2013-06-27 2013-08-14 Alligator Bioscience Ab Polypeptides
US20160271218A1 (en) 2013-06-27 2016-09-22 Mor Research Applications Ltd. Soluble ctla-4 molecules and derivatives thereof for treatment of minimal change disease
ES2745472T3 (es) 2013-07-15 2020-03-02 The U S A As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Office Of Tech Tra Receptores de células T anti-virus del papiloma humano 16 E6
AU2014319921A1 (en) * 2013-09-11 2016-03-17 Compugen Ltd. Anti-VSTM5 antibodies and the use thereof in therapy and diagnosis
US10238700B2 (en) 2014-01-02 2019-03-26 Genelux Corporation Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity
RU2727639C2 (ru) 2014-01-15 2020-07-22 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Варианты fc-области с модифицированной способностью связываться с fcrn и с сохраненной способностью связываться с белком а
WO2015113494A1 (zh) 2014-01-28 2015-08-06 北京韩美药品有限公司 双功能融合蛋白及其制备方法和用途
ES2792849T3 (es) 2014-02-10 2020-11-12 Univ Emory Expresión de polipéptido químico con receptores de linfocitos variables en células inmunes y usos para tratar el cáncer
EP3699195A3 (en) * 2014-03-28 2020-11-04 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to cd38 and cd3
US20170042972A1 (en) 2014-04-25 2017-02-16 Chetan KARYEKAR Use of ctla4 compound for achieving drug-free remission in subjects with early ra
KR20170032373A (ko) 2014-07-15 2017-03-22 이뮨 디자인 코포레이션 Tlr4 작용제 보조제 및 렌티바이러스 벡터를 이용한 프라임-부스트 요법
RU2696312C2 (ru) 2014-07-16 2019-08-01 Трансген Са Онколитический вирус для экспрессии модуляторов иммунологических контрольных точек
AU2015301338C1 (en) * 2014-08-04 2021-07-22 Baylor Research Institute Antagonistic anti-OX40L antibodies and methods of their use
PT3177640T (pt) 2014-08-08 2020-08-31 Univ Leland Stanford Junior Agentes pd-1 de alta afinidade e métodos de utilização
EP3188752A2 (en) 2014-09-03 2017-07-12 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) filovirus vaccine
US20160145344A1 (en) 2014-10-20 2016-05-26 University Of Southern California Murine and human innate lymphoid cells and lung inflammation
US20190119353A1 (en) 2014-11-06 2019-04-25 Children's Research Institute, Children's National Medical Center Immunotherapeutics for cancer and autoimmune diseases
EP3020816A1 (en) 2014-11-11 2016-05-18 University College Cork Bacterial mediated gene therapy
WO2016118577A1 (en) 2015-01-22 2016-07-28 Medimmune, Llc Thymosin-beta-four fusion proteins
HK1250637A1 (zh) 2015-04-02 2019-01-11 Cancure Limited 用於引发免疫应答的剂和组合物
WO2016164428A1 (en) 2015-04-06 2016-10-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Receptor-based antagonists of the programmed cell death 1 (pd-1) pathway
CN121159719A (zh) * 2015-04-17 2025-12-19 高山免疫科学股份有限公司 具有可调的亲和力的免疫调节蛋白
TWI715587B (zh) 2015-05-28 2021-01-11 美商安可美德藥物股份有限公司 Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途
HUE068868T2 (hu) 2015-07-30 2025-02-28 Macrogenics Inc PD-1-hez kötõdõ molekulák és alkalmazásukra szolgáló eljárások
CA2993429A1 (en) 2015-07-31 2017-02-09 Tarveda Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immuno-oncology therapies
AR105654A1 (es) 2015-08-24 2017-10-25 Lilly Co Eli Anticuerpos pd-l1 (ligando 1 de muerte celular programada)
CN108513576A (zh) 2015-09-14 2018-09-07 高山免疫科学股份有限公司 可调变体免疫球蛋白超家族结构域和工程改造的细胞治疗
ES2924402T3 (es) 2015-10-02 2022-10-06 Symphogen As Anticuerpos anti-PD-1 y composiciones
MX2018012472A (es) * 2016-04-15 2019-08-12 Alpine Immune Sciences Inc Proteinas inmunomoduladoras variantes de ligando icos y sus usos.
WO2017181152A2 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN109689096A (zh) 2016-05-18 2019-04-26 阿尔伯特爱因斯坦医学院公司 变体pd-l1多肽、t细胞调节性多聚体多肽及其使用方法
WO2018022946A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2018022945A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2018075978A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Alpine Immune Sciences, Inc. Secretable variant immunomodulatory proteins and engineered cell therapy
BR112020007542A2 (pt) 2017-10-18 2020-12-01 Alpine Immune Sciences, Inc. proteínas imunomoduladoras ligantes de icos variantes e composições e métodos relacionados
AU2019205273B2 (en) * 2018-01-03 2024-04-04 Alpine Immune Sciences, Inc. Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
WO2019241758A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
MX2021012607A (es) 2019-04-17 2022-03-11 Alpine Immune Sciences Inc Metodos y usos de proteinas de fusion de ligando icos (icosl) variante.

Also Published As

Publication number Publication date
IL273726A (en) 2020-05-31
JP2023055821A (ja) 2023-04-18
PL3697810T3 (pl) 2026-04-27
KR102776394B1 (ko) 2025-03-10
SI3697810T1 (sl) 2026-03-31
US20220112265A1 (en) 2022-04-14
IL273726B1 (en) 2025-06-01
JP2024103596A (ja) 2024-08-01
WO2019079520A3 (en) 2019-05-23
IL320945A (en) 2025-07-01
DK3697810T3 (da) 2026-02-02
BR112020007542A2 (pt) 2020-12-01
SMT202600062T1 (it) 2026-03-09
MD3697810T2 (ro) 2026-04-30
AU2024201301A1 (en) 2024-03-21
EP3697810B1 (en) 2025-12-03
US11613566B2 (en) 2023-03-28
WO2019079520A2 (en) 2019-04-25
JP7530457B2 (ja) 2024-08-07
HRP20260069T1 (hr) 2026-02-27
KR20250034197A (ko) 2025-03-10
US20230235012A1 (en) 2023-07-27
FI3697810T3 (fi) 2026-02-05
TWI899046B (zh) 2025-10-01
PT3697810T (pt) 2026-02-19
PH12020550449A1 (en) 2021-05-17
LT3697810T (lt) 2026-02-25
CA3078517A1 (en) 2019-04-25
EP3697810A2 (en) 2020-08-26
JP7282760B2 (ja) 2023-05-29
SA520411779B1 (ar) 2024-03-17
JP2021500024A (ja) 2021-01-07
EA202090974A1 (ru) 2020-08-05
US20200283500A1 (en) 2020-09-10
IL273726B2 (en) 2025-10-01
AU2018351000B2 (en) 2023-11-30
UA129833C2 (uk) 2025-08-20
MX2020004540A (es) 2020-08-03
KR20200085777A (ko) 2020-07-15
MY203416A (en) 2024-06-27
SG11202003078VA (en) 2020-05-28
AU2018351000A1 (en) 2020-04-30
CN111712515A (zh) 2020-09-25
TW202500579A (zh) 2025-01-01
MA50404A (fr) 2020-08-26
ES3061962T3 (en) 2026-04-08
MA50404B1 (fr) 2026-02-27
TW201925223A (zh) 2019-07-01
AR113455A1 (es) 2020-05-06
EP4717707A2 (en) 2026-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7623967B2 (ja) Ｉｃｏｓリガンドバリアント免疫調節タンパク質およびその使用
US11479609B2 (en) CD80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11613566B2 (en) Variant ICOS ligand immunomodulatory proteins and related compositions and methods
JP7664022B2 (ja) Ｐｄ－ｌ１バリアント免疫調節タンパク質及びその使用
JP7713886B2 (ja) Ｃｄ８６バリアント免疫調節タンパク質およびその使用
EA044356B1 (ru) Вариантные иммуномодулирующие белки лиганда icos и их применение