FI104179B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen polypeptidin valmistamiseksi - Google Patents

Description

104179

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen polypeptidin valmistamiseksi

Jakamalla erotettu FI-hakemuksesta 905614.

5

Keksinnön kenttä Tämä keksintö koskee menetelmää polypeptidin valmistamiseksi, joka polypeptidi sisältää sekvenssin Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-10 Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp tai sen minkä tahansa muunnoksen, joka on sen kanssa immunologisesti ristireak-tiivinen, mutta joka ei ole koko lämpösokkiproteiini, edellyttäen, että polypeptidi, jolla on seuraava aminohapposekvenssi 15

1 MAKTIAYDEE ARRGLERGLN ALADAVKVTL GPKGRNWLE KKWGAPTITN DGVSIAK2IE 61 LEDPYEKIGA ELVKEVAKKT DDVAGDGTTT ATVLAQALVR EGLRNVAAGA NPLGLKRGIE 121 KAVEKVTETL LKGAKEVETK EQIAATAAIS AGDQSIGDLI AEAMDKVGNE GVITVEESNT 181 FGLQLELTEG MRFDKGYISG YFVTDPERQE AVLEDPYILL VSSKVSTVKD LLPLLEKVIG 241 AGKPLLIIAE DVEGEALSTL WNKIRGTFK SVAVKAPGFG DRRKAMLQDM AILTGGQVIS 2 0 301 EEVGLTLENA DLSLLGKARX VWTKDETTI VEGAGDTDAI AGRVAQIRQE IENSDSDYDR

361 EKLQERLAKL AGGVAVIKAG AATEVELKER KHRIEDAVRN AKAAVEEGIV AGGGVTLLQA 421 APTLDELKLE GDEATGANIV KVALEAPLKQ IAFNSGLEPG WAEKVRNLP AGHGLNAQTG 481 VYEDLLAAGV ADPVKVTRSA LQNAASIAGL FLTTEAWAD KPEKEKASVP GGGDMGGMDF

ja polypeptidit, joilla on aminohapposekvenssit 234 - 540, 25 61 - 540, 109 - 540, 171 - 540, 272 - 540 ja 280 - 540, sekä ihmisen mitokondrioproteiini P1 ovat poissuljettuja. Polypeptidi on käyttökelpoinen insuliinista riippuvan sokeritaudin (IDDM, insulin dependent diabetes mellitus) estämiseen tai IDDM:n hoitamiseen sen alkuvaiheissa.

30 Keksinnön tausta * Insuliinista riippuvan sokeritaudin (IDDM:n) esiin tymistiheys on kasvanut moninkertaiseksi viime vuosikymmenien aikana monissa maissa, ja arvioidaan, että l %:lle tällä hetkellä elävistä ihmisistä on kehittynyt IDDM, en-35 nen kuin he saavuttavat 70 vuoden iän. IDDM:n aiheuttaa 2 104179 autoimmuuniprosessi, joka tuhoaa insuliinia tuottavia bee-tasoluja. Diabetes tulee kliinisesti havaittavaksi vasta 9 hyvin suuren osan (ehkä 90 %) beetasoluista tuhouduttua peruuttamattomasti, ja tämän yksilön elämä tulee riippu-5 vaiseksi ulkoisesta insuliinilähteestä. Toisin sanoen kliinisen diagnoosin tekohetkellä autoimmuuniprosessi on jo aiheuttanut palautumatonta vahinkoa, suurimman osan siitä ilman havaittavia oireita.

Mainitun sairauden syynä olevan autoimmuuniproses-10 sin menestyksellinen hoito tulisi aloittaa, ennen kuin potilaalla on ilmeisiä sokeritaudin oireita ja hän tarvitsee insuliinia korvaamaan menetetty kyky tuottaa insuliinia.

Tämän autoimmuuniprosessin pysäyttäminen johtaisi sairauden paranemiseen ja ulkopuolisen insuliinin tarpeen estä-15 miseen vain silloin, jos sairausprosessi voitaisiin pysäyttää vaiheessa, jossa potilaalla vielä on riittävä määrä beetasoluja endogeenisen insuliinin tuottamiseksi riittävässä määrin. Siksi mikä tahansa hoitomuoto olisi tehokkaampi, jos vaarassa olevat henkilöt voitaisiin identi-20 fioida silloin, kun heillä ei vielä ole näkyviä IDDM-oireita , ja ennen kuin potilaat tarvitsevat eksogeenista insuliinia.

Onneksi on olemassa erilaisia IDDM-eläinmalleja, mukaan luettuina BB-rotat ja NOD-hiiret [katso esimerkiksi 25 Rossini et ai., Ann. Rev. Immunol. 3 (1985) 289 - 320] .

Monilla eläimillä kehittyy spontaanisti autoimmuuni-IDDM, jolla on monia ihmisten IDDM:m piirteitä.

Lämpösokkiproteiinit (hsp:t) ovat ryhmä proteiineja, joita tuottavat korotetuille lämpötiloille tai muille 30 rasituksille altistetut solut. hsp:ihin kuuluu proteiine-ja, joilla on erilainen moolimassa, mukaan luettuina 20 kD, 65 - 68 kD, 70 kD, 90 kD, 110 kD jne. Lämpösokki-proteiineja esiintyy kaikkialla luonnossa; niitä tuottavat bakteerit, hiivat, kasvit, hyönteiset ja ylemmät eläimet, 35 mukaan luettuna ihminen, hsp-proteiinit ovat hyvin evoluu- 3 104179 tiossa säilyneitä ja huomattavan homologisia kaikkien näiden erilaisten eliöiden kesken. Koska lämpösokkiproteiinit ovat säilyneet äärimmäisen hyvin koko evoluution ajan, niiden ajatellaan toteuttavan elintärkeitä tehtäviä. Nii-5 den synteesi tavallisesti lisääntyy solujen jouduttua alttiiksi rasittaville ärsykkeille, mukaan luettuina lämpö, tietyt metallit, lääkkeet tai aminohappoanalogit. Näiden proteiinien erityistehtävät ovat kuitenkin vielä tuntemattomia .

10 Systeemistä punahukkaa (SLE, systemic lupus erythe matosus) sairastavilla potilailla on esimerkiksi havaittu vasta-aineita 90 kD:n lämpösokkiproteiinille [Minota et ai., J. Clin. Invest. 81 (1988) 106 - 109]. Näiden hsp90:n vasta-aineiden toimintaa ei tunneta.

15 hsp65:n on havaittu liittyvän adjuvanttiartriittiin rotilla [katso van Eden et ai., Nature 331 (1988) 171 - 173]. Adjuvanttiartriitti on autoimmuuniartriitti, jonka laukaisee tiettyjen rottakantojen immunisointi Mycobacterium tuberculosis -organismien (MT) suhteen. On havaittu, 20 että T-lymfosyyttiklooni, joka reagoi MT:n hsp65:n erääseen 9 aminohapon pituiseen peptidisekvenssiin (180-188), voi siirtää tämän taudin immunologisesti kehittymättömiin, säteilytettyihin rottiin. Niinpä ilmeni, että adjuvanttiartriitti on anti-hsp65-T-lymfosyyttien aikaansaama auto-* 25 immuunisairaus. Niveliin kohdistuvan autoimmuunihyökkäyk-

sen aiheutti osittainen sekvenssihomologia hsp65-peptidin 180-185 ja ruston proteoglykaanin kytkentäproteiinin erään segmentin välillä [katso Cohen, Scientific American 256 (988) 52 - 60]. On myös havaittu reumatoidista artriittia 30 sairastavien potilaiden nivelnesteiden T-lymfosyyttien * reagoivan MT:n hsp65:een [katso Res et ai., Lancet II

(1988) 478 - 480] .

hsp65:n annon rotille ennen adjuvanttiartriitin indusointia havaittiin estävän artriitin myöhempi kehit-35 tyminen. Niinpä immuunivasteen läsnäolo hsp65:lle liittyi r 4 104179 artriittiin sekä rotissa että ihmisissä, ja hsp65:n anto pystyi johtamaan resistenssiin artriittin suhteen.

EP-hakemusjulkaisussa 262 710 esitetään polypepti-dejä, jotka ovat käyttökelpoisia autoimmuuniartriitin ja 5 vastaavien autoimmuunisairauksien lievittämisessä, hoidossa ja diagnosoinnissa. Ihmisen Pl-proteiinin koko primaa-rirakenne, mukaan luettuina nukleotidisekvenssi ja päätelty aminohapposekvenssi, on julkaistu jokin aika sitten [Jindal, S. et ai., Primary Structure of a Human Mito-10 chondrial Protein Homologous to the Bacterial and Plant Chaperonins and to the 65-Kilodalton Mycobacterial Antigen, Molecular and Cellular Biology 9, 5 (1989) 2 279 - 2 283]. Tämä proteiini, jonka moolimassan ilmoitetaan olevan noin 63 kD, on ihmisen lämpösokkiproteiini, jota kut-15 sutaan tässä hHSP65-proteiiniksi. Tämän julkaisun koko sisältö mainitaan tässä viitteenä. Tämän hakemuksen kuviossa 3 toistetun tämän proteiinin rakenteen on tarkoitus olla identtinen Jindalin julkaisussa esitetyn kanssa.

EP-hakemusjulkaisussa 261 648 esitetään autoimmuu-20 nisairaudelle spesifisten aktivoitujen T-solujen käyttöä tällaisen sairauden hoitoon. T-solut on edullista käsitellä ensin paineella ja sitten kemiallisella silloitusai-neella ja/tai solurunkoa hajottavalla aineella niiden im-munogeenisyyden parantamiseksi. Koko käsiteltyä solua tai 25 osaa siitä voidaan käyttää rokotteena sitä autoimmuunisairautta vastaan, jolle T-solu on spesifinen.

Tunnetussa menettelyssä autoimmuuni-T-solujen sal-paamiseksi kohde immunisoidaan heikennetyillä tai aviru-lenteilla T-soluilla, joilla on kyseinen autoimmuunispesi-30 fisyys, tai niiden fragmenteilla tai osilla. Kohde reagoi aktivoimalla vähintään kahta tyyppiä olevia sääteleviä T-soluja: antiergotyyppi-T-soluja, jotka tunnistavat T-solujen aktivaatiomarkkereita, ja anti-idiotyyppi-T-soluja, jotka näyttävät tunnistavan patogeenisillä endogeenisilla 35 autoimmuuni-T-soluilla esiintyviä oma-antigeenireseptore- 5 104179 ja. T-solurokotus indusoi koe-eläimissä tehokkaasti todetun sairauden pysyvän remission samoin kuin estää sairauden. Howell et ai. [Scence 246 (1989) 668 - 670] ja Van-denbark et ai. [Nature 341 (1989) 541 - 544] esittävät T-5 solureseptorin β-ketjun peptidisekvenssien käyttöä rottien rokottamiseen kokeellista autoimmuunienkefalomyeliittiä vastaan ja tukevat siten päätelmää, että itse autoimmuuni-T-solun reseptori voi olla kohde-epitooppilähteenä sääte-ly-T-soluille.

10 Vaikka tällainen T-solujen tai niiden fragmenttien käyttö autoimmuunisairauksien yhteydessä on tunnettu yleisesti, ei juuri IDDM:lle spesifistä antigeeniä ole aiemmin tunnettu, eikä aktivoituja T-soluja rokotusten tekemiseksi IDDM:ää vastaan ole siten ollut saatavissa.

15 Yhteenveto keksinnöstä Tämä keksintö koskee menetelmää polypeptidin valmistamiseksi, joka polypeptidi sisältää sekvenssin Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp tai sen minkä tahansa 20 muunnoksen, joka on sen kanssa immunologisesti ristireak-tiivinen, mutta joka ei ole koko lämpösokkiproteiini, edellyttäen, että polypeptidi, jolla on seuraava aminohapposekvenssi

1 MAKTIAYDEE ARRGLERGLN ALADAVKVTL GPKGRNWLE KKWGAPTITN DGVSIAKEIE

ώ Sd ·

61 LEDPYEKIGA ELVKEVAKKT DDVAGDGTTT ATVLAQAL VR EGLRNVAAGA NPLGLKRGIE

121 KAVEKVTETL LKGAKEVETK EQIAATAAIS AGDQSIGDLI AEAMDKVGNE GVITVEESNT

181 FGLQLELTEG MRFDKGYISG YFVTDPERQE AVLEDPYILL VSSKVSTVKD LLPLLEKVIG

241 AGKPLLIIAE DVEGEALSTL WNKIRGTFK SVAVKAPGFG DRRXAKLQDM AILTGGQVIS

301 EEVGLTLENA DLSLLGKARK VWTKDETTI VEGAGDTDAI AGRVAQIRQE IENSDSDYDR

30 361 EKLQERLAKL AGGVAVIKAG AATEVELKER KHR1EDAVRN AKAAVEEGIV AGGGVTLLQA

421 APTLDELKLE GDEATGANIV KVALEAPLKQ IAFNSGLEPG WAEKVRNLP AGHGLNAQTG

: 481 VYEDLLAAGV ADPVKVTRSA LQNAASIAGL FLTTEAWAD KPEKEKASVP GGGDMGGMDF

ja polypeptidit, joilla on aminohapposekvenssit 234 - 540, 61 - 540, 109 - 540, 171 - 540, 272 - 540 ja 280 - 540, 35 sekä ihmisen mitokondrioproteiini P1 ovat poissuljettuja, t 6 104179 jolle menetelmälle on tunnusomaista, että polypeptidi syntetisoidaan peptidikemiassa tavanomaisin menetelmin.

Uudet polypeptidit ovat käyttökelpoisia IDDM:n ehkäisemisessä ja hoitamisessa myös alkuvaiheissa.

5 Tämän keksinnön yhteydessä tehtyjen havaintojen mukaan IDDM:n kehittymisen aikana eläimet tuottavat hsp65-molekyylejä tai molekyylejä, jotka ovat sen kanssa risti-reaktiivisia ja jotka kulkeutuvat eläinten vereen ja virtsaan. Ne tuottavat myös vasta-aineita ja T-soluja, jotka 10 ovat spesifisesti tällaisten molekyylien vastaisia. Niinpä hsp65:n tai sen kanssa ristireaktiivisten molekyylien tai sille spesifisten vasta-aineiden tai T-solujen läsnäolo veressä tai virtsassa osoittaa IDDM-prosessin, ennen kuin beetasolut ovat kokonaan tuhoutuneet ja yksilö on tuomittu 15 elinikäiseen sokeritautiin.

Alkamassa olevan diabeteksen detektointi antaa sitten potilaalle mahdollisuuden ryhtyä toimenpiteisiin, joiden päämääränä on pysäyttää autoimmuuniprosessi. hsp65:n tai sen aktiivisen epitoopin tai jonkin muun, sen kanssa 20 immunologisesti ristireaktiivisen molekyylin (antigeenin) anto indusoi esimerkiksi tehokkaasti resistenssin IDDM:ään liittyvälle autoimmuuniprosessille. Tällaisille antigeeneille spesifisten T-solujen antaminen heikennetyssä tai avirulentissa muodossa tai antigeenisyyttä parantavan kä-* ' 25 sittelyn jälkeen tai niiden fragmenttien tai aktiivisten osien antaminen indusoi myös resistenssin IDDM:ään liittyvälle autoimmuuniprosessille.

Keksinnön yhteydessä on myös havaittu, että im-munisoituminen sopivassa adjuvantissa olevalle hsp65:lle 30 tai sen aktiiviselle epitoopille tai muulle molekyylille (antigeenille), joka on immunologisesti ristireaktiivinen sen kanssa, voi indusoida IDDM:n. Rokottaminen tällaisella antigeenillä ilman tehokasta adjuvanttia ja edullisesti yhdessä tolerogeenisen kantajan kanssa voi kuitenkin saada 35 aikaan spesifisen toleranssin tälle antigeenille. Tämä 7 104179 synnyttää tehokkaasti resistenssin IDDM-autoimmuuniproses-sille. Sama pätee rokottamiseen tällaisille antigeeneille spesifisillä T-soluilla heikennetyssä tai virulentissa muodossa tai antigeenisyyttä parantavan käsittelyn jälkeen 5 tai niiden fragmenteilla tai aktiivisilla osilla. Jos potilaan osoitetaan jo olevan IDDM:n esikliinisessä alkuvaiheessa, tällaisen antigeenin tai T-solujen (tai fraktioiden) injektointi voi synnyttää toleranssin tälle antigeenille ja pysäyttää siten autoimmuuniprosessin ennen 10 merkittävien, pysyvien vaurioiden tapahtumista.

Piirustusten lyhyt kuvaus

Keksintö lienee helpommin ymmärrettävissä seuraa-vasta piirustusten lyhyestä kuvauksesta ja sitä seuraavas-ta edullisten suoritusmuotojen yksityiskohtaisesta kuvauk-15 sesta.

Kuvio 1 esittää ihmisen Pl-proteiinin, joka on hHSP65, nukleotidisekvenssiä ja pääteltyä aminohapposekvenssiä. Vasemmalla olevat numerot viittaavat nukleotidi-sekvenssiin suhteessa koordinaattiin 1, joka on otaksutun 20 aloituskodonin alussa. Aminohapposekvenssi on numeroitu samasta pisteestä lähtien aloittaen numerosta 1. Tämän lukukehyksen 5'-pään pidennys esitetään yksikirjaimisin koodein. Sisäisen, lambda22a-sekvenssin alkua osoittavan EcoRI-kohdan (nukleotidi 712) sijainti on osoitettu. Poly- ' 25 adenylaatiosignaali, joka on 15 nukleotidin päässä 3'-pään A-hännästä, on alleviivattu. Oletettu mitokondriokohdis-tussekvenssi N-terminaalisessa päässä ja kerätiinin kaltainen aminohapposekvenssi C-terminaalisessa päässä, joka sisältää toistuvia Gly-Gly-Met-jaksoja, on merkitty laati-30 kolia. Positiivisesti varatut aminohapot C-terminaalisessa ’ alkujaksossa on osoitettu ( + ) .

Kuvio 2 on käyrä, joka esittää NOD/Lt-hiirten T-solujen spontaania reaktiivisuutta ihmisen hsp65:n, MT-hsp65:n ja MT-hsp70:n suhteen iän funktiona.

8 104179

Kuvio 3 on käyrä, joka esittää T-solujen prolife-raatiovastetta p277:ään ja p278:aan peptidipitoisuuden f funktiona.

Kuvio 4 on pylväsdiagrammi, joka esittää T-solu-5 kloonien C7 ja C9, joilla on kyky siirtää akuutti diabetes nuoriin, diabetesta edeltävässä vaiheessa oleviin NOD/Lt-hiiriin, proliferaatiovastetta p277:ään, MThsp65:een ja plasmidivertailunäytteeseen.

Kuvio 5 esittää peptidien p277 ja p278 vastaisen 10 immunisoinnin tuloksia indusoidun diabeteksen vastustamisessa. Täplät osoittavat veren glukoosipitoisuuden kolmen viikon kuluttua testiryhmien kunkin hiiren immunisoinnista .

Edullisten suoritusmuotojen yksityiskohtainen ku- 15 vaus

Seuraavissa esimerkeissä esitetään tämän keksinnön erityissuoritusmuotoja ja tähän keksintöön liittyviä kokeita. Ne on tarkoitettu vain esimerkeiksi ja esitetään keksintöä rajoittamattomina.

20 Esimerkki 1 MThsp65-molekyylin tuotanto

Mycobacterium tuberculosisin hsp-molekyyli trans-fektoitiin E. coliin tavanomaisin menettelyin ja puhdistettiin van Edenin et ai. [Nature 331 (1988) 171 - 173] 25 kuvaamalla tavalla. Tällaiset geeniteknisesti käsitellyt E. coli -solut tuottavat olennaisia määriä MThsp65:ä. Erilaisista lähteistä peräisin olevien hsp.-iden läheisen ho-mologian ansiosta nisäkäs- tai ihmisperäinen hsp65 on tehokas myös tuotettuna geeniteknisesti tai eristämällä so-30 luista.

hHSP65, jota esiintyy veressä tai virtsassa yksilöillä, joissa on kehittymässä IDDM, voisi tulla muutamista lähteistä. Näihin lähteisiin voi kuulua hHSP65, jota tuottavat normaalisti terveet beetasolut ja jota vapautuu 35 immunologisen tuhoutumisen esivaiheena beetasolujen joutu- r s 104179 essa virusinfektion tai myrkkyvaikutuksen kohteiksi, tai sitä voi vapautua beetasoluista immunologisen tuhoutumisen aiheuttaman rasituksen vuoksi. hHSP65:ä voisivat myös erittää immuunijärjestelmän solut pitkittyneen beetasolu-5 jen vastaisen aktiivisuutensa aikana. Vaikka hHSP65:n lähteitä tässä järjestelmässä ei tällä hetkellä tunneta lopullisesti, on määritetty, että kun hHSP65:ä vapautuu, yksilö stimuloituu tuottamaan vasta-aineita hHSP65-mole-kyylille.

10 Vasta-aineita määrittämättömälle molekyylille, jon ka moolimassa on 64 000, on kuvattu esiintyvän joissakin juuri diagnosoiduissa IDDM-potilaissa [Baekeskov et ai., Nature 298 (1982) 167 - 168]. Ei kuitenkaan tiedetä, onko 64 kDm antigeeni hsp. Lisäksi tämän 64 kD:n antigeenin ei 15 tiedetä esiintyvän veressä tai virtsassa ennen IDDM:n puhkeamista. Toisin kuin tämä määrittämätön 64 kD:n beetaso-luantigeeni on hsp65 määritetty proteiini, jonka aminohapposekvenssi tunnetaan [Thole et ai., Infection and Immunity 55 (1987) 1 466 - 1 475]. Samoin hHSP65:n aminohappo- 20 sekvenssi tunnetaan ja esitetään kuviossa 1.

Esimerkki 2 MThsp65:n vastaisten vasta-aineiden tuotanto

Tavanomaisen laboratoriokannan kaniinit (New Zealand White) inokuloitiin injektoimalla ihonalaisesti sel-• 25 kään 100 μg esimerkin 1 mukaisesti tuotettua MThsp65:ä fysiologisessa suolaliuoksessa (0,5 ml) emulgoituna mineraaliöljyyn (0,1 ml) (epätäydellinen adjuvantti). Kuukauden kuluttua kaniineille annettiin tehosteeksi 100 μg MThsp65:ä fysiologisessa suolaliuoksessa (1,0 ml) ja kah-30 den viikon kuluttua kaniineista otettiin verinäytteet ja ' kerättiin seerumi. Kaniineille annettin tehosteannos sa- » maila tavalla kahden kuukauden kuluttua ja otettiin jälleen verinäyte.

104179

Esimerkki 3

Monet hiiren molekyylit ovat ristireaktiivisia my- kobakteeri-hsp65:n kanssa

Mykobakteeri-hsp65:n tunnistamien nisäkäsmolekyy-5 lien identifioimiseksi testattiin kaniinin anti-hsp65-an-tiseerumia samoin kuin monoklonaalista vasta-ainetta, josta käytetään merkintää TB78. Tämän vasta-aineen on kehittänyt ja toimitti tri J. Ivanyi, MCR Tuberculosis Unit, Hammersmith Hospital, Lontoo. Tämä vasta-aine on spesifi-10 nen M. tuberculosisin hsp65-molekyylille. Tutkittiin sitoutuminen näihin vasta-aineisiin viiden tyyppisestä valmisteesta: kloonatusta M. tuberculosishsp65:stä; NOD-hii-rien, joille on kehittymässä IDDM, ja terveiden vertai-lueläinten seerumeista; ja lämpösokilla käsiteltyjen rotan 15 fibroblastien lysaateista ja vertailufibroblastilysaateis- ta.

hsp65 valmistettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Rotan embryofibroblasteja viljeltiin tavanomaisin menettelyin. Lämpösokkiproteiinien indusoimiseksi fibroblas-20 tiviljelmiä inkuboitiin lämpötilassa 42,5 °C kaksi tuntia ja sitten lämpötilassa 37 °C % tuntia. Lämpösokkikäsitel-tyjä fibroblasteja ja vertailufibroblasteja viljeltiin lämpötilassa 37 °C, ja hajotettiin ne sitten (noin 5 *106 solua kumpaakin lajia) käyttämällä hajotuspuskuria, joka .. 25 sisälsi 0,1 % SDS:ää ja 1 % Tritonia, yhdessä proteaasi- inhibiittoreiden kanssa. Proteiinipitoisuus säädettiin Bradford-määrityksen avulla arvoon 2 mg/ml. Materiaalille tehtiin tavanomainen elektroforeettinen käsittely 10-%:i-sessa polyakryyliamidigeelissä pelkistävissä olosuhteissa 30 (2 % 2-merkaptoetanolia) ; näytemäärä oli 100 /xg/kaista.

Terveistä vertailuhiiristä ja IDDM:n kehittävistä NOD-hii-ristä saadut seerumit laimennettiin pitoisuuteen 2 mg/ml. Kullekin näistä seerumivalmisteista tehtiin erotus polyak-ryyliamidigeelielektroforeettisesti edellä kuvatulla ta-35 valla. Erotettuja proteiineja siirrettiin sitten yön yli u 104179 nitroselluloosapaperiin tavanomaisin menettelyin. Papereita inkuboitiin sitten yksi tunti huoneenlämpötilassa hemo-' globiinin kanssa (1 %, suojaamista varten) ja sitten joko normaalin kaniinin seerumin tai anti-hsp65:n kanssa lai-5 mennussuhteen ollessa 1:100 tai TB78:n tai monoklonaalisen vertailuvasta-aineen kanssa laimennussuhteen ollessa 1:100 kaksi tuntia huoneenlämpötilassa. Vasta-aineiden sitoutuminen mihin tahansa erottuneeseen vyöhykkeeseen detek-toitiin inkuboimalla vuohen 125I-leimatun anti-kaniini-Ig:n 10 tai anti-hiiri-Ig:n kanssa, pestiin ja kehitettiin autora-diografisesti. Mukaan sisällytettiin moolimassastandar-dit.

Havaittiin, että anti-hsp65-vasta-aineet tunnistivat muutaman vyöhykkeen. Mykobakteeri-hsp65:n tunnisti 15 sekä kaniinin antiseerumi että monoklonaalinen TB68. Vasta-aineet tunnistivat myös yhden hiiren fibrioblastien 65 kD:n vyöhykkeen, joka syntyi autetusti lämpösokin jälkeen. Kuummenetuissa fibroblastilysaateissa oli myös positiivisia vyöhykkeitä moolimassojen 30 kD ja 47 kD kohdal-20 la. IDDM:n kehittävien NOD-hiirten seerumeissa tuli detek-toiduksi yksi lisävyöhyke suunnilleen kohdalla 25 kD. Niinpä nisäkäsmolekyylit, joiden moolimassa on 65, 47, 30 ja 25 kD, ovat ristireaktiivisia mykobakteeri-hsp65:n kanssa.

, 25 Esimerkki 4 hsp65:ä muodostuu haiman saarekkeissa

Koska IDDM:n kehittymiseen liittyy hsp65:n voimistunut esiintyminen veressä ja virtsassa, ajateltiin, että saarekkeiden beetasolut voisivat olla hsp65:n lähde. Tämän 30 teorian testaamiseksi tutkittiin kaniinin anti-hsp65:ä, v jotta nähtäisiin, sitoutuuko se saarekesoluihin.

Käytettiin tavanomaista menetelmää 6 - 8 μτη:η paksuisten pakastettujen rotan haimaleikkeiden valmistamiseksi. Leikkeet peitettiin normaalilla kaniinin seerumilla 35 tai anti-hsp65-antiseerumilla (absorptiokäsitelty maksa- 12 104179 jauheella epäspesifisten vasta-aineiden poistamiseksi) laimennettuna suhteessa 1:50, inkuboitiin 30 min huoneenlämpötilassa, pestiin perusteellisesti PBS:llä ja inkuboitiin sitten 5 min 5-%:isen normaalin vuohen seerumin kans-5 sa ennen inkubointia vuohen fluoreseiinilla leimatun anti-kaniini-Ig:n kanssa 30 min huoneenlämpötilassa. Saarekkeet värjäytyivät voimakkaasti anti-hsp65-seerumin vaikutuksesta, mutta eivät kaniinin vertailuseerumilla. Siksi saarekkeet tuottavat hsp65:ä.

10 Esimerkki 5

Immunisoituminen hsp:lle indusoi IDDM:n Koska havaittiin, että saarekesolut tuottavat hsp65:ä, oletettiin, että hsp:n vastainen immuunivaste vaurioittaa beetasoluja ja aiheuttaa siksi IDDM:n.

15 C57BL/Ksj-uroshiiret, jotka olivat 8 viikon ikäisiä, tai 4,5 viikon ikäiset NOD-naarashiiret immunisoitiin injektoimalla vatsakalvonsisäisesti 50 μg hsp65:ä, ja testattiin saattaisiko niille kehittyä IDDM, jonka osoituksena on arvon 250 mg/100 ml ylittävä veren glukoosipitoisuus.

20 4,5 viikon ikäisillä NOD-hiirillä spontaanin IDDM:n kehit tyminen kestää vielä ainakin kolme kuukautta. C57BL/Ksj-hiirillä ei kehity spontaania IDDM:ää. hsp65 annettiin emulgoituna öljyyn tai PBS:ään. Öljyyn emulgoitua naudan seerumialbumiinia (BSA) käytettiin vertailunäytteenä. Tu-.. 25 lokset esitetään taulukossa 1. Havaittiin, että hsp65 in dusoi IDDM:n öljyssä mutta ei PBS:ssä annettuna. Siksi immuunivaste hsp65:een voi laukaista IDDM:n, todennäköisesti siitä syystä, että beetasolut tuottavat hsp65:n kanssa ristireaktiivista antigeeniä.

30 13 104179

Taulukko 1 hsp65 adjuvantissa indusoi IDDM:n IDDM:n esiinty- 5 # mistiheys 3 vii- c Antigeeni Adluvantti kon kuluttua NOD hsp65 öljy 7/10 hsp65 PBS 0/10 BSA öljy 0/20 C57BL/ksj hsp65 öljy 6/7 hsp65 PBS 0/9 ei anti- ei adjuvanttia 0/15 geeniä

Lisäkokeessa normaalihiirikannat, joille ei kehity spontaanisti IDDM:ää, kuten NOD-hiirille, eikä edes pienen 15 streptotsotosiiniannoksen jälkeen, kuten C57BL/ksj-hiirille, inokuloitiin intraperitoneaalisesti 50 μg:lla antigeeniä, joko hsp65:ä tai naudan seerumiantigeenia (BSA), emulgoituna epätäydelliseen Freundin adjuvanttiin (öljy). Hiiristä otettiin verinäytteet aamulla 19 päivän kuluttua 20 ja mitattiin veren glukoosi. IDDM-diagnoosina pidettiin veren glukoosipitoisuutta yli 200 mg/100 ml. Tulokset esitetään taulukossa 2. On nähtävissä, että immunisointi hsp65:llä voi indusoida IDDM:n jopa näennäisesti normaaleissa hiirkannoissa, erityisesti sopivana annoksena an-. 25 nettuna. Tämä tukee päätelmää, että hsp65 tai sen kanssa immunologisesti ristireaktiiviset molekyylit ovat kohdean-tigeeneja IDDM:n yhteydessä.

* r 104179 14

Taulukko 2

Immunisointi hsp65:llä indusoi IDDM:n diabetesta sairasta-mattomissa hiirikannoissa 5 IDDM:n esiinty-

Veren glukoosi | mistlheys_

Antigeenit Antigeenit

- Hiirikanta hSP65 BSA | hsp65 BSA

10 I

C3H.eB/Fej 270+41 96+32 I 5/5 0/5 C57BL/6j 298+52 122+26 I 5/5 0/5 DBA/2 14 6+33 126+21 1 0/5 0/5 15 SJL/j 162±27 139+26 | 0/5 0/5

Esimerkki 6 hsp65 voi indusoida resistenssin IDDM:n kehittymiselle 20 On hyvin tunnettua, että antigeeni annettuna ilman tehokasta adjuvanttia tai yhdessä tolerogeenisen antigeenin kanssa voi indusoida immunologisen reagoimattomuuden, ts. spesifisen toleranssin mainitun antigeenin suhteen. Siksi hiiret, joihin oli injektoitu hsp65:ä PBSrssä, tut-25 kittiin sen määrittämiseksi, olivatko hiiret saaneet resistenssin IDDMrlle, jonka indusoi hsp65 öljyssä. Kuukauden kuluttua siitä, kun C57BL/Ksj-hiiret olivat saaneet hsp65:ä PBSrssä, niille annettin hsp65:ä öljyssä, eikä yhdellekään näistä hiiristä kehittynyt IDDMrää, jonka merk-30 kina pidettiin veren suurempaa glukoosipitoisuutta kuin • 260 mg/100 ml kolmen viikon kuluttua. Sitä vastoin 8 ver- tailuhiirelle lOrstä, jotka eivät olleet saaneet hsp65:ä PBSrssä, kehittyi IDDM, kun ne olivat saaneet hsp65:ä öljyssä .

104179 15

Eräässä toisessa kokeessa annettiin hsp65:ä PBS:ssä 30 päivän ikäisille NOD-naarashiirille intraperitoneaali-sesti 15 päivää ennen hsp65:n (50 ^g) antamista öljyssä IDDM:n indusoimiseksi. IDDM:n esiintymisen mittana oli 5 veren glukoosipitoisuus yli 200 mg/100 ml 35 päivän kuluttua indusointiannoksen antamisesta. IDDM:n esiintyminen mitattiin uudelleen hiirten ollessa 5 kuukauden ikäisiä. Tiedetään, että tässä iässä 50 %:lla kaikista käsittelemättömistä NOD-hiiristä on detektoitavissa oleva IDDM.

10 Tulokset esitetään taulukossa 3.

Taulukko 3 hsp65:n käyttö rokotteena XDDM:ää vastaan 25 IDDM:n esiintymistiheys hsp65 PBSrssM 35 päivää immuni- 5 kuukauden _(ua)_ soinnin jälkeen iässä ,_. _ , 0 7/8 1 0/8 0/8 20 5 0/8 0/8 50 0/8 0/8

Niinpä on nähtävissä, että hsp65:ä voidaan käyttää 25 indusoimaan toleranssi diabetekseen johtavan immuunipro-sessin suhteen. Tämä toleranssi ei ole tehokas pelkästään immunogeenisen hsp65-hyökkäyksen suhteen vaan säilyy tehokkaana käsittelynä spontaanin IDDM:n luonnollista kehittymistä vastaan NOD-hiirissä.

30 Esimerkki 7 ·, Alkavan IDDM:n hoito käyttämällä hHSP65:ä

Kuten esimerkissä 6 osoitetaaan, hsp65:ä voidaan käyttää indusoimaan resistenssi IDDM-autoimmuuniprosessil-le. Tämän näyttää aiheuttavan beetasolujen immunologinen 35 toleranssimekanismi niiden jouduttua alttiiksi ulkopuoli- 104179 16 selle hsp65:lle. Niinpä hsp65 voi olla käyttökelpoinen IDDM:n hoidossa ennen sairauden muuttumista kliinisesti havaittavaksi, ja autoimmuuniprosessi voidaan pysäyttää ennen merkittävien pysyvien vaurioiden syntymistä. Tauluk-5 koon 3 kootut koetulokset, se että spontaanin IDDM:n luonnollinen kehittyminen voidaan estää NOD-hiirissä, on merkittävä todiste siitä, että hsp65:ä, erityisesti hHSP65:ä, voidaan käyttää terapeuttisesti. Tämä autoimmuuniprosessi alkaa hyvin varhain NOD-hiirissä. Insuliitti on havaitta-10 vissa jo yhden kuukauden iässä. IDDM tulee kliinisesti havaittavaksi 5 kuukauden iässä 50 %:lla tämän kannan naa-rashiiristä. hsp65:n anto 30 päivän ikäisille hiirille pysäyttää tämän luonnollisen kehityksen. Tämä osoittaa, että hoito voi olla tehokas jopa autoimmuniteetin saarekkeita 15 kohtaan jo synnyttyä.

Esimerkki 8 T-solujen reagointi hHSP65:een liittyy kehittymässä olevaan sokeritautiin

Kuviossa 3 esitetty ihmisen hsp65-geeni kloonattiin 20 ilmentämistä varten tavanomaisella tavalla ja siitä saatiin suurin piirtein puhdasta ihmisen yhdistelmä-hsp65:ä.

Tämä koe osoittaa, että hiirissä, joiden beetasolut tuhoutuvat spontaanisti, T-solut reagoivat ihmisen yhdis-telmä-hsp65:een. Pernasolususpensioista, jotka saatiin 5 -25 7 eri ikäisen NOD/Lt-naarashiiren ryhmistä, tutkittiin T- solujen proliferaatio olennaisilta osiltaan T-solujen ty-roglobuliinivasteiden yhteydessä kuvatulla tavalla [Maron, R. et ai., J. Immunol. 131 (1983) 2 316 - 2 322]. Lyhyesti esitettynä soluja (1*106 solua/ml) inkuboitiin 72 tuntia 30 kolmena rinnakkaisnäytteenä mikromaljan syvennyksissä kas- vualustassa (0,2 ml) seuraavien antigeenien (5 μg/ml) läsnä tai poissa ollessa: ihmisen hsp65, MThsp65 ja MThsp70. Proliferaatio mitattiin sisällyttämällä [3H]tymidiiniä DNA:hän 12 viimeisen inkubointitunnin aikana. Tulokset 35 esitetään Δ cpm-arvona, joka on tutkittavaa antigeeniä si- r 104179 17 sältävien syvennysten keskimääräinen cpm-arvo miinus ilman lisättyä antigeeniä viljeltyjen vertailusyvennysten keskimääräinen cpm-arvo ± standardivirhe (SE). Vertailu-cpm-arvot vaihtelivat alueella 9 000 - 10 500. IDDM:n puhkea-5 minen noin 50 %:ssa hiiristä tapahtui 4-5 kuukauden iässä, kuten osoitetaan merkinnällä "IDDM" kuviossa 4.

Tämän kokeen tulokset, jotka osoittavat NOD/Lt-hiirten T-solujen spontaanin reaktiivisuuden erilaisten antigeenien suhteen iän funktiona, esitetään käyränä kuvi-10 ossa 4. 1 kuukauden iässä, kun NOD/Lt-hiirissä esiintyy vähän tai ei ollenkaan insuliittia, ei ollut havaittavissa T-solujen reaktiivisuutta minkään antigeenin suhteen. 2 ja 3 kuukauden iässä, lisääntyvän insuliitin ohella, havaittiin kuitenkin voimakas ja kasvava reaktiivisuus ihmisen 15 hsp65:n suhteen, suhteellisesti heikompi reaktiivisuus MThsp65:n suhteen eikä ollenkaan reaktiivisuutta MThsp70:n suhteen. Reaktiivisuus ihmisen hsp65:n ja MThsp65:n suhteen aleni IDDM:n puhjetessa 4,5 kuukauden iässä ja laski edelleen 6 kuukauden iässä IDDMrn kliinisen ilmenemisen 20 jälkeen. Niinpä T-solujen reaktio ihmisen hsp65:een näytti liittyvän beetasolujen vaurioitumisen lisääntymiseen ennen näkyvää IDDMrää. T-solujen reaktiivisuuden lasku IDDM:n puhkeamisen yhteydessä voidaan selittää alentuneella im-muunistimulaatiolla, kun beetasolut ja niiden antigeenit .. 25 on menetetty.

Esimerkki 9

Ihmisen hsp65:een reagoivat T-solut aiheuttavat diabeteksen

Pernasolususpensioita tehtiin ryhmistä, jotka si-30 sälsivät viisi 3,5 kuukauden ikäistä kannan NOD/Lt, •5. C57NL/6 tai C57BL/KS naarashiirtä. Yksi NOD/Lt-hiiriryhmä (ryhmä 2) oli pohjustettu 9 päivää aikaisemmin immunisoimalla intraperitoneaalisesti MThsp65:llä (50 μg/ml) öljyssä. Jotkut pernasoluista (ryhmät 4, 6 ja 8) aktivoitiin 35 inkuboimalla niitä 48 tuntia Con A:n kanssa (1,25 μg/ml).

104179 18

Con A -käsitellyt solut siirrettiin kasvaamaan vielä 5 päiväksi elatusalustaan, josta puuttui Con A. Pernasoluista testattiin niiden lisääntymisvasteet ihmisen yhdistel-mä-hsp65:een, yhdistelmä-MThsp65:een tai E. coli -vertai-5 luantigeeniin viikon kuluttua aktivoinnista esimerkissä 12 kuvatulla tavalla. E. coli -vertailusolut transfektoitiin plasmidilla pEX2, joka ei sisältänyt hsp65-geenejä. Antigeenejä käytettiin pitoisuutena 5 ug. Kolmesta rinnakkais-näyttestä saadut lisääntymisvastetulokset esitetään stimu-10 laatioindeksinä (SI), joka on tutkittavan antigeenin kanssa inkuboituihin pernasoluihin sisällytetyksi tulleen [3H] -tymidiinin cpm-arvon suhde lisättyä antigeeniä sisältämättömiin vertailuviljelmiin sisällytetyksi tulleen [3H]tymidiinin cpm-arvoon. Vertailuviljelmien cpm-arvo oli 5 000 -15 7 000 ja standardipoikkeamat cpm-arvon keskiarvosta olivat aina alle 10 % keskiarvosta. Solujen kyky saada aikaan diabetes testattiin aktivoimalla jotkut niistä viljelemällä Con A:n kanssa 48 tuntia. Diabetesta edeltävässä vaiheessa olevista, 1 kuukauden ikäisistä vastaanottajanaa-20 rashiiristä koostuvat ryhmät inokuloitiin intraperitoneaa-lisesti koskemattomilla pernasoluilla tai MThsp65:llä pohjustetuista tai käsittelemättömistä hiiristä saaduilla Con A -aktivoiduilla pernasoluilla. Vastaanottajahiiristä arvioitiin 21 päivän kuluttua akuutin sokeritaudin kehitty-25 minen, josta olivat osoituksena hyperglysemia (veren glu- koosi > 200 mg/100 ml) ja histologiset merkit insuliitis-ta. Veren glukoosi mitattiin ottamalla kunkin hiiren hän-tälaskimosta verinäyte noin klo 9 ja glukoosipitoisuus mitattiin käyttämällä Diascan Glucose Meter -laitetta ja 30 testiliuskoja (Behringwerke, Saksan liittotasavalta). In- ·. suliitti määritettiin histologisesti osoittamalla (hema- toksilineosiini ja vaalean vihreä värjäytyminen, tekijä the Histology Laboratory of The Weizmann Institute). Insu-liitin arvosteli yksilö, joka ei tuntenut testilevyjen 35 identiteettiä.

r 104179 19

Tulokset esitetään taulukossa 4. Erot NOD/Lt-perna-solujen reaktioiden välillä ihmisen hsp65:n ja MThsp65:n suhteen (ryhmät 1 - 4) olivat merkitsevästi suuremmat (P <0,01) kuin NOD-Lt-pernasolujen reaktiot E. coli -ver-5 tailuantigeeniin tai muiden hiirikantojen (ryhmät 5-7) reaktiot hsp65-antigeeneihin käytettäessä Studentin T-testiä; ND = ei määritetty.

t 20 1 04 1 79

CO

>> 0)

O rC

U «H

iJ m O O O · · · ·

in ” H H H σ\ QQ QO

«n s v. \ 'v v. · · · >ioeoocozzzz

C *J

a> e

CO -H

A! -H

<u tn u h e»

X

Λ

•H

Ό

C -H

•H 4J

4J C

3 -H MJ MJ

3 O H H

t-l «H····

<3 ·< -H -H -H >> QQ QQ

•y « <0 JJ . . .

COM SS Z 2 2

01 U I

Q> m vo e a -h o)

CO X -M

J3 -H >> E-* 0) ;c0 · « · ·

2 S Hon HO Q Q QQ

M <U i-ti-l ·- Λ · * ' '

t-j 00ιΗ·ΗγΠγΗ γΗγΗ 2h Z Z

-H O CO

C JJ ϋ

0) C M

0) CO *0) ·· ω > in /-s

vo M

O. CO

co w m K m IL in r- in r- cmh o σ> X to ~ r- - - ~ ^ •u jj .c ro v n «a· hh i-io

0 Tl H

01 " S

4J (0 10 > M o

5 I S s ^ ^ Q . OH

JJ 4-1 2 -H vo ·" λ «Λ·-. OH O H

3 m Ssarviio o co * '

Ή M hi JO -W H (N H (N HH H H

3 μ ® M 2 CO 0) ^ H m -h u

•H Ή c C :aJ C

iHO 4J AJ -H 4-1 -H S ·Μ

OM :cd :M C :M C :0 C

M CU g SC SC WC

• e :o :o -h :o -h 4j -h

4J 4-io 4-io :co O

C +J 4J>4J>B>

0) :c0 :c0 4J :c0 -H :c0 H 4) -H

n 4J B r-t 3 S uj E -M H ·υ 3 3 <U Γ-t 4J <u -*i 0) <U A!

t—1 i—I i-“t ·· 41 i—t CO i—t CO 4-1 CO

0 o ai iou oi i e 4i i e 4J i e CO CO 4-1 vO CO 4J4I 4-1 41 -H 41 1 CO 4J 0.3 4J <3 4) 4J <3 41 CO <3 0)

H C -H C01-| -i-l ,ώ -H -Ui MJ

M tö JOJO CO CH to CiH JJ CH

e :c0 H O :c0 0:ctJ :co Otrt O mj (M J<! 2 P. -ϋ O-n JJ Oi-ι w O-i-i O « V -P > >

* J »J

-H CO > > ® ® m 4J Q Q f" £ •h e o O m in

•h m ; g 2 O U

SS JJ ** :c0

S

£ . . · · ^ h n n -<r m vo r»eo 2i 104179

Tulokset, jotka esitetään taulukossa 4, osoittavat, että 3,5 kuukauden ikäisten NOD/Lt-hiirten T-solujen reaktioita ihmisen hsp65:een voitiin voimistaa immunisoimalla hiiret MThsp65:llä (ryhmä 2) tai aktivoimalla T-solupopu-5 laatio T-solumitogeenilla konkanavaliini A (Con A; ryhmä 4) . Con A:n on osoitettu in vitro stimuloivan ensisijaisesti eläimissä in vivo esiintyviä aktivoituja autoimmuu-ni-T-soluja. Niinpä NOD/Lt-T-solut, jotka on herätetty in vivo immunisoimalla MThsp65:llä tai aktivoitu in vitro Con 10 A:11a, reagoivat luonnostaan ihmisen hsp65:een.

Itse ihmisen hsp65 ei ole mitogeeni; täysikasvuisilla hiirillä, jotka kuuluvat kantoihin, joille ei spontaanisti kehity IDDM:ää, kuten kantaan C57BL/6 (ryhmät 5 ja 6) tai C57BL/KS (ryhmät 7 ja 8), ei esiinny T-solujen 15 reaktiivisuutta Con A -stimuloinnin jälkeen.

Lopuksi mainittakoon, että taulukko 4 valaisee sitä, että ihmisen hsp65:n vastaisen T-solupopulaation aktivointi in vitro Con A:11a teki T-solut kykeneviksi siirtämään akuutin diabeteksen 1 kuukauden ikäisiin diabetesta 20 edeltävässä vaiheessa oleviin NOD/Lt-hiiriin (ryhmät 2 ja 4) .

T-solujen reagoivuuden ihmis-hsp65:een ja diabeteksen välinen yhteys vahvistetaan taulukossa 5. Kokeessa, jossa saatiin taulukon 5 tulokset, T-solulinjat saatiin : 25 stimuloimalla toistuvasti pernasoluja MThsp65:llä (5 ^g/ml) Maronin (supra) kuvaamalla tavalla. Kloonit eristettiin solulinjoista rajalaimennusmenetelmällä. T-so-luklooneista testattiin niiden kyky siirtää akuutti diabetes olennaisilta osiltaan taulukon 4 yhteydessä kuvatulla 30 tavalla, paitsi että siirrettiin intraperitoneaalisesti ' ' 5 -106 Con A -aktivoitua solua. Kloonien lisääntymisvasteet antigeeneihin mitattiin SI:nä taulukon 4 yhteydessä kuvatulla tavalla. Vertailuviljemien cpm-arvo oli 4 500 -6 500 ja standardipoikkeamat cpm-keskiarvosta olivat aina 35 alle 10 %.

104179 22

Taulukko 5

Diabetogeeniset T-solukloonit tunnistavat ihmisen hsp65:n T—solu- Akuutin diabe- Proliferaatiovasteet (SI) anti-klooni teksen siirto geeneihin__ _ (Esiintymis- Ihmisen E. coli ____ tiheys) _hsp65 MT-hsn65_vertailunäyte 27 9/11 16,9 7,1 0,9 C7 10/12 23,8 6,7 1,1 10 1 C9 10/15 38,5 5,8 1,2 21 0/13 6,3 2,8 1,0 15 Kloonien havaittiin reagoivan voimakkaammin ihmisen hsp65:een kuin MThsp65:een tai E. coli -vertailuantigee-niin. Lisäksi kloonit 27, C7 ja C9, jota reagoivat voimakkaasti ihmisen hsp65:een, olivat diabetogeenisiä, kun taas klooni 21, joka reagoi suhteellisen heikosti ihmisen 20 hsp65:een, ei pystynyt siirtämään diabetesta. Koska kloonatuilla T-soluilla esiintyy spesifisyydeltään vain yhdenlaisia antigeenireseptoreja, voidaan päätellä, että akuutin diabeteksen voivat siirtää diabetesta edeltävässä vaiheessa oleviin NOD/Lt-hiiriin T-solut, jotka tunnistavat .. 25 ihmisen hsp65:llä epitoopin, joka on jossakin määrin ris- tireaktiivinen MThsp65:n epitoopin kanssa.

Esimerkki 10

Virulentit T-solut toimivat rokotteena spontaania IDDM:ää vastaan 30 Ryhmät, jotka koostuivat 5-7 diabetesta edeltä vässä vaiheessa olevasta kahden kuukauden ikäisestä NOD/Lt-naarashiirestä, pohjustettiin immunisoimalla antigeenillä (50 μg) öljyssä tai jätettiin pohjustamatta. Hiirten pernasolut aktivoitiin inkuboimalla niitä antigee-35 nien (5 μg/ml) tai Con A:n (1,25 ^g/ml) kanssa esimerkissä 23 1 04 1 79 9 taulukon 5 yhteydessä kuvatulla tavalla tai jätettiin aktivoimatta. Soluja (25 -106) siirrettiin sitten intraperi-toneaalisesti kuukauden ikäisistä, diabetesta edeltävässä vaiheessa olevista hiiristä koostuviin ryhmiin. Hiiristä 5 tutkittiin akuutti diabetes (hyperglysemia; veren glukoosi >200 mg/100 ml) 3 viikon kuluttua esimerkissä 9 kuvatulla tavalla. Spontaani IDDM määritettiin 8 kuukauden iässä tutkimalla hyperglysemia ja insuliitti. Erot vertailuryhmään (ryhmä 1) nähden olivat merkitseviä osoitetuissa talo pauksissa (* p < 0,01). Luvut edustavat 2-3 kokeen kumulatiivisia tuloksia.

«· % t 24 104179

U J~S

C *« Η τ-τ C -rl •rl M O) e Ο >, *

te « rl in * o ι-l -K

rt C -C 00 1-1 OJ Γ^ Γ" o 4J ·· -rl e a <->

O O M

rt P* Q *rl

« M H B

rt | X 1

01 II

4-> ^>ä *rl 0) 0) 4-1 XI U 10 m e οι ti •h rt x> a o rt rt

4-1 1-1 4J

e to -ö e JCÖ CÖ Ή /—s >> e -H N! « « *

0) Ή t» ^ O O O

J ä J3 § o

SS Q < 03 SS

o a

M

e

•H rt I

4-1 -rl 1-4

rt C -H

rt rt s: M rt :rt

rt 4J c M

C rt :rt

U O l-ι KO

rt o. rt S

f» to to 4-1 rt to in rt τι Λ

Slrt S HH N O If» O 1-1 O

o aa ·ηο η-<νηη<νγν

Ji Ό 6 E Si P ! M C rt rH O rt .

3 i-i ss rt e -h ;

1—l :o > M M

3 4J >> I

rt rt E C

H rH “Hl

O CO «U “H

CO p CO u H rt ” -h m o m j_) so vo r- vo u u si > Q, Dj Cl·

rt O O-Hrt -H tnC WW

tn c 4J c <u ϊί ^ rs n m ^ rtCrtf . 5ir,c_.

4-i rH E·· O w H H

tou O S U Λ £ X.

rt rt tn , > > l to rt E H 2 O in .. -h to Γ" vo

m o D ·Η »H *H 04 CU

vO«U t-jOJ -ΦΟ) WW

(O* rt ’oi * $ * t* m s s :rt

E

x! H m n TT in vo * >y cd 104179 25

Kuten odotettiin, käsittelemättömät vertailuhiiret (ryhmä 1) eivät olleet hyperglyseemisiä 7 viikon ikäisinä, ja spontaani IDDM havaittiin 81 %:lla 8 kuukauden iässä. Akuutti diabetes (veren glukoosi yli 200 mg/100 ml) siir-5 tyi sitävastoin käytettäessä diabetesta edeltävässä vaiheessa olevien hiirten pernasoluja sillä edellytyksellä, että pernasolut oli aktivoitu in vitro MThsp65:llä (ryhmä 2) tai Con A:11a (ryhmä 3).

Pernasoluja, jotka oli saatu hiiriltä, jotka oli 10 pohjustettu in vivo MThsp65:llä, BSA:lla tai MThsp70:llä, annettiin aktivoituina in vitro vastaavalla antigeenillä. Anti-MThsp65-solut (ryhmä 6) indusoivat akuutin diabeteksen, mutta anti-BSA- tai anti-MThsp70-solut (ryhmät 4 ja 5) eivät. Toisin kuin Con A:lla ja MThsp65:llä aktivoitu-15 jen solujen kohdalla, jotka reagoivat voimakkaasti ihmisen hsp65:een (taulukot 3 ja 4), BSA:n tai MThsp70:n kanssa reagoivien solujen proliferaatiomäärityksissä ei havaittu reaktiivisuutta MThsp65:een tai ihmisen hsp65:een (tuloksia ei esitetä). Niinpä akuutin diabeteksen siirto oli 20 spesifinen solupopulaatioille, jotka sisälsivät ihmisen hsp65:een reagoivia T-soluja.

Taulukko 6 osoittaa myös, että akuuttia diabetes-kohtausta seurasi merkittävä alentuminen 8 kuukauden iässä kehittyvän spontaanin IDDM:n esiintymistiheydessä. Hiirten ·. 25 inokulointi BSA:n tai MThsp70:n vastaisilla pernasoluilla ei indusoinut akuuttia diabetesta eikä estänyt spontaania IDDM:ää (ryhmät 4 ja 5).

Akuutin, ulkoa siirretyn diabeteksen kyky keskeyttää spontaani IDDM-prosessi havaittiin myös kokeissa, joi-30 ta tehtiin edellä kuvatuilla hsp65:n vastaisilla T-solu-klooneilla (taulukko 4) . 31 hiireen injektoitiin virulent-tia kloonia 27, C7 tai C9, ja kaikille syntyi akuutti diabetes 1-2 viikon kuluessa. Kaikki toipuivat spontaanisti hyperglysemiasta 2 viikon aikana, ja vain 2:lie 31:stä 35 kehittyi spontaani IDDM 8 kuukauden iässä. 13 hiirelle, « 104179 2 6 joihin injektoitiin avirulenttia kloonia 21, ei sen sijaan kehittynyt akuuttia diabetesta, ja 6:lie näistä hiiristä kehittyi spontaani diabetes 6 kuukauden iässä (P <0,01).

Niinpä diabetes, joka aiheutetaan siirtämällä ul-5 koapäin ihmisen hsp65:n vastaisia T-soluja, on ohimenevä. Hiiret eivät kuitenkaan pelkästään toipuneet akuutista diabeteksesta vaan saivat resistenssin myöhemmän spontaanin IDDM:n kehittymistä vastaan. Niinpä luonnollisen IDDM:n puhkeamisen nopeuttamisen tai vakavuuden lisäämisen 10 sijasta diabetesta edeltävässä vaiheessa olevien hiirten saattaminen alttiiksi virulenteille T-soluille itse asiassa johti resistenssin saamiseen diabetesprosessia vastaan.

Esimerkki 11

Heikennetyt T-solut toimivat rokotteena hsp65:een 15 kohdistuvaa autoimmuniteettia vastaan ja estävät IDDM:n

Muodostettiin T-solurokotteita 3 kuukauden ikäisten diabetesta edeltävässä vaiheessa olevien NOD/Lt-hiirten pernasoluista aktivoimalla solut inkuboimalla niitä Con 20 A:n tai MThsp65:n kanssa esimerkissä 8 taulukon 3 yhteydessä kuvatulla tavalla ja heikentämällä sitten aktivoidut solut gammasäteilytyksellä (1500 R) tai glutaarialdehydil-lä (0,3 %, 15 min) Liderin et ai. kuvaamalla tavalla [Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84 (1987) 4 577] . Ryhmät, ·. 25 jotka koostuivat 15 tai 25 viiden viikon ikäisestä diabe testa edeltävässä vaiheessa olevasta NOD-Lt-naarashiires-tä, jätettiin sitten rokottamatta tai rokotettiin inoku-loimalla intraperitoneaalisesti 107 käsitellyllä pernasolulla. Kuuden kuukauden iässä kunkin ryhmän 5 hiirestä 30 tutkittiin pernan T-solujen proliferaatiovasteet ihmis-\ hsp65:een, jotka esitetään stimulaatioindeksinä (SI). Il man lisättyä antigeeniä saadut vertailu-cpm-arvot olivat 2 465 ± 235 ja 2 246 ± 185 rokottamattomilla ja vastaavasti rokotetuilla hiirillä. Lopuista hiiristä otettiin veri-35 näytteet ihmisen hsp65:n vastaisten vasta-aineiden määrit- f 104179 27 tämiseksi tavanomaisella kiinteäfaasiradioimmuunimäärityk-sellä [Schechter et ai., J. Biol. Chem. 259 (1984) 6 411 -6 419] . Seerumin vasta-aineiden detektoimiseksi mikromal-jat päällystettiin inkuboimalla niitä hsp65:n (anti-5 hsp65:n määrittämiseksi), insuliinin (anti-insuliinin määrittämiseksi) tai marsun DM-idiotyypille positiivisen anti-insuliinin (anti-idiotyyppivasta-aineen määrittämiseksi) kanssa (50 μg/ml kutakin). Näiden antigeenien vasta-aineiden läsnäolo detektoitiin inkuboimalla päällystettyjä 10 syvennyksiä tutkittavien hiiren seerumien kanssa (laimennettuina suhteessa 1:50) ja kehittämällä vuohen 125I-leima-tulla anti-hiiri-Ig:llä (Amersham, Englanti; 105 cpm/syven-nys). hsp65-antigeenin (tai sen kanssa ristireagoivan antigeenin) detektoimiseksi syvennyksiä inkuboitiin 1,5 μ1:η 15 kanssa tutkittavaa seerumia, joka oli laimennettu suhteessa 1:5, ja peitettiin sitten kaniinin anti-hsp65-Ig:llä (laimennettuna suhteessa 1:100). Sitoutuminen mitattiin käyttämällä vuohen 125I- leimattua anti-kaniini - Ig: tä (Amersham) . Suhteellinen tiitteri merkitsee suhteessa 1:100 20 laimennetun seerumin sitoutumista ihmisen hsp65:een cpm-arvona. Diabetesta sairastamattomilta 1 kuukauden ikäisiltä NOD/Lt-hiiriltä saadun ihmisen hsp65:n vastaisen seeru-mivasta-aineen keskimääräinen cpm-arvo oli 1 450 ± 194.

Hiirten seerumeista määritettiin hsp65:n tai ristireaktii-.. 25 visen antigeenin läsnäolo käyttämällä edellä kuvattua kiinteäfaasiradioimmuunimääritystä. Tulokset esitetään taulukossa 7. Rokotetut hiiret erosivat merkitsevästi rokottamattomista vertailuhiiristä (1p <0,01).

( 28 104179

/—N

:ce w to s*. * « « “ Ϊ o o o o

ci ^ ^ C

G 10 VO H O ΓΜ

·· 'jj rH

m e * ph

4J

3 rt f" G

0) Ή iH

M B S -H

•HO) O CO

ε 4) PO) JZ 60 m ^

•rt "H

4-1

Iti C

4J π) I

4-* Ή Ή VO r-v

DB -U Q

3D to -H to 03 M «rl C+l •h tu tn turn

> <u <u I

rt to rl MO

*H Ifl "H H

4-1 Ct) 4-14-·· .*4-1 C B * 3 to m et) Q. CO o CU *H vO O « r- U > C tee) CX C ^ ~ •H ai to to tu “» e *rl C CO D C ICO +1 +1 tu 4-i -h :<o i-i to ot · O ·

-2-3 5 > « n a n O

•H cd 4-1 Ή tI ,d B . (Tl · dl tU to e B -H -rl ® 2 cu «·· D4J n a 4-1¾

H rl > .* U ^ C

td 4J ,* oi rt ·· i to e tu oi ,* cd iH ..VO CO J-ι Ai u u m to VO -rl rt rt ex 4J /—> - > tn to 4j Ω m tn X. <u \n cd e dl i o i-ι cd e 4J <u -H j.

.* .* tu -rt q m ψ .* e tn e -h C i P* "0· D <UC iH D cd O 1 <h

•H !-)·· B g I ,, o O

D Dm jz S rt fr · i - , .+| cd rito ΗΉ « n Ϊ

H OCX en -H q. IT) Q Q O

en w cö ·η υ ** * · *·.

ij= > -m w n Z S r>j

H

:co

•ri :co O 4J

rH e AJ

rH <U 3 p £ ^ n * * *

Xc .rt O r-v irv r-, rv 4-1 > tn H TT UI Γ~ ΓΊ e | to H o- n

o» {—i '—- «—1 IN (N

·: .* q dl to tu

D 4-1 4-1 XI O D

Z4 tn o u e D ·· C -H -rl i—t m ·· Ό -n 0 X> S Ph Ph

CO ex Q JZ XI

1 tn o di cu H Xl M TJ T3

tn r-t rH

to η rt

• fr, 4-1 -H "H

• e 1-t Ph 1-1 M

C dl rH rt Cd tu iH rt rt

M dl 4J 4J

•H 4-1 D D

<D ICÖ rH r—| ' X en bo öö •H m

’ 4-1 VO

e a o < < j2

3 ® O O H

m uus < 29 104 179

Taulukossa 7 esitetyt tulokset osoittavat, että muuten virulentit Con A:11a tai MThsp65:llä aktivoidut T-solut voidaan heikentää käsittelemällä ne gammasäteilyllä (1 500 R) tai glutaarialdehydillä (0,3 %) ja niitä voidaan 5 käyttää rokottamiseen spontaania IDDM:ää vastan. Samoin kuin on osoitettu muiden kokeellisten sairauksien yhteydessä, säteilytetyt tai glutaarialdehydillä käsitellyt autoimmuuni-T-solut eivät olleet virulentteja eivätkä aiheuttaneet akuuttia diabetesta (tuloksia ei esitetä). 10 IDDM:n ehkäisyyn liittyi rokotettujen hiirten spontaanin T-solu- ja vasta-aineaktiivisuuden merkittävä heikkeneminen ihmisen hsp65:n suhteen.

Kuten aiemmissa esimerkeissä on kuvattu, NOD/Lt-hiirten saarekkeiden vaurioituminen on merkittävää siihen 15 mennessä, kun seerumiin ilmaantuu proteiini, jonka hsp65:n vastaisen vasta-aineet tunnistavat. Koska tämä seerumian-tigeeni on mahdollisesti peräisin vahingoittuneista beeta-soluista, oli kiinnostavaa nähdä, oliko T-solurokotuksella mitään vaikutusta sen määrään. On nähtävissä (taulukko 7), 20 että T-solurokotteen anto vähensi merkittävästi 6 kuukauden iässä seerumiin ilmaantuvan hsp65:n tai ristireaktii-visen antigeenin määrää. Tämä väheneminen liittyi detek-toitavissa olevan insuliitin puuttumiseen histologisessa tutkimuksessa (tuloksia ei esitetä).

.. 25 Niinpä MThsp65:llä tai Con A:11a aktivoituja viru lentteja ihmisen hsp65:n vastaisia T-soluja voitiin heikentää ja käyttää NOD/Lt-hiirten rokottamisen spontaanin IDDM:n kehittymistä vastaan. Rokotetun tilan merkkinä oli IDDM-prosessin immunologisten merkkien, ihmisen hsp65:n 30 vastaisten T-solujen ja vasta-aineiden, väheneminen. Sa-maila hsp65:n tai hsp65:n kanssa ristireagoivan seerumian-tigeenin määrä väheni, mikä on selitettävissä insuliitin . pysähtymisellä.

30 104179

Esimerkki 12 T-solurokotus antaa resistenssin akuuttia indusoitua diabetesta vastaan

Esimerkissä 5 osoitettiin, että akuutti diabetes, 5 jonka merkkeinä on insuliitti ja hyperglysemia, voitiin indusoida diabetesta edeltävässä vaiheessa olevissa NOD/Lt-hiirissä immunisoimalla ne MThsp65:llä öljyssä. Havaittin myös, että tämä akuutin diabeteksen muoto oli ohimenevä ja johti itse asiassa resistenssiin myöhempää 10 spontaania IDDM:ää vastaan. Tässä kokeessa tutkitaan ihmisen hsp65:llä tehdyn immunisoinnin vaikutuksia ja T-solu-rokotuksen vaikutusta akuuttiin indusoituun diabetekseen.

Ryhmät, jotka koostuivat 4 viikon ikäisistä NOD/Lt-naarashiiristä, rokotettiin 107 Con A:11a aktivoidulla, 15 glutaarialdehydillä käsitelyllä pernasolulla esimerkissä 15 taulukon 12 yhteydessä kuvatulla tavalla tai jätettiin rokottamatta. Kahden viikon kuluttua hiirille annettiin MThsp65:ä tai ihmisen hsp65:ä (50 μg öljyssä) akuutin diabeteksen indusoimiseksi. Hiiristä tutkittiin sitten spon-20 taanin IDDM:n kehittyminen 8 kuukauden iässä mittaamalla hyperglysemia ja insuliitti esimerkissä 9 kuvatulla tavalla. Tulokset esitetään taulukossa 8. Erot olivat merkitseviä, kun *p <0,01.

Taulukko 8 25 T-solurokotus akuuttia hsp65:n indusoimaa diabetesta ja spontaania diabetesta vastaan

Indusoitu diabetes Spontaanin IDDM:n veren esiintymis- 3Q T-rSoluanti- Esiintymis- glukoosi tiheys

geeni rokotus Indusoitu:i Hhpyg. (niq/dl) IDDM

ei ei 0/10 151+19 8/10 ei Ihmisen hsp65 12/15 258±22* 2/15* ei MT hsp65 8/10 339+116* 0/10* kyllä MT hsp65 0/20 14 0±20 1/20* 35 104179 31

On nähtävissä, että rokottamattomat hiiret reagoivat ihmisen hsp65:een tai MThsp65:een, ja niissä kehittyi akuutti, ohimenevä diabetes. Tätä seurasi resistenssi spontaanille IDDM:lle. T-soluilla käsitellyt hiiret olivat ’ 5 sitä vastoin resistenttejä antigeenillä indusoidulle akuu tille diabetekselle. Ne olivat suojassa myös spontaanilta IDDM:Itä. Niinpä T-solurokotus antaa tehokkaasti resistenssin sekä keinotekoisella immunisoinilla aiheutetulle akuutille diabetekselle että myöhemmälle spontaanille 10 IDDM:lie.

Esimerkki 13

Peptidisynteesi

Otaksuttiin, että ihmisen hsp65-molekyylin avainepitooppi oli aminohapposekvenssi, joka on osittain, 15 mutta ei täydellisesti, homologinen MThsp65-sekvenssin kanssa. Koska viimeksi mainittu toimii vähemmän hyvin, on vastaavan epitoopin sekvenssi otaksuttavasti hieman erilainen .

Syntetisoitiin sarja peptidejä aloittaen ihmisen 20 hsp65-sekvenssin karboksyylipäästä ja valiten sekvenssejä, joissa oli pieniä eroja mykobakteerin ja ihmisen sekvenssien välillä. Eräässä tällaisessa peptidissä on kuviossa 1 esitetyn ihmisen hsp65-molekyylin aminohapposekvenssi 437-460, ts. H-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-25 Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp-OH.

Tälle peptidille on annettu nimeksi p277.

Vertailupeptidi p278 menee päällekkäin p277:n kar-boksyylipään kanssa 3 aminohapon verran, ja sillä on seu-raava sekvenssi: H-Asn-Glu-Asp-Gln-Lys-Ile-Gly-Ile-Glu- 30 Ile-Ile-Lys-Arg-Thr-Leu-Lys-Ile-OH. Tämä vastaa kuvion 1 aminohapposekvenssiä 458-474.

t 32 1 04 1 79

Esimerkki 14

Immuunivaste p277:ään IDDM:n kehittymisen diagnosoinnissa

Diabetesta edeltävässä vaiheessa olevien 3 kuukau-5 den ikäisten NOD/Lt-naarashiirten pernasolususpensioista testattiin niiden proliferaatiovasteet p277:ään esimerkissä 8 kuvatulla tavalla, ja tulokset esitetään kuviossa 3. Vaikka näillä hiirillä ei kehity näkyvää IDDM:ää vielä 1 -3 kuukauteen, niiden pernan T-solut reagoivat voimakkaasti 10 p277:ään mutta eivät p278:aan. Optimaalinen peptidipitoi- suus tässä ja muissa in vitro -kokeissa on 5 ug/ml.

Esimerkki 15

Patogeeniset T-solukloonit reagoivat p277:ään ja hsp65-variantteihin 15 Kuvio 4 osoittaa, että T-solukloonit C7 ja C9, joilla on kyky siirtää akuutti diabetes nuoriin, diabetesta edeltävässä vaiheessa oleviin NOD/Lt-hiiriin (katso edellä oleva taulukko 5), reagoivat p277:ään. Kloonien havaitaan reagoivan p277:ään samoin kuin koko mykobaktee-20 ri-hsp65:een mutta ei vertailuplasmidivalmisteeseen, joka ei sisällä hsp65-geeniä. Niinpä on päätelty, että peptidi p277 sisältää patogeenisen epitoopin, koska patogeeniset T-solut tunnistavat sen.

p277-epitooppi esiintyy myös mykobakteerin hsp65-25 molekyylissä, koska C7 ja C9 reagoivat myös siihen molekyyliin. Niinpä sekvenssille p277 homologinen mykobakteerin hsp65-sekvenssi on immunologisesti toimiva. Seuraavana esitetään mykobakteerisekvenssi, jossa on alleviivattu ihmisen p277-sekvenssin korvatut ryhmät: H-Asp-Ala-Glv- 30 Gly-Gly-Val-Thr-Leu-Leu-Gln-Ala-Ala- Pro-Thr-Leu-Asp-Glu- : Leu-Lvs-----Leu-Glu-Glv-Asp-OH. On nähtävissä, että 13 aminohappoa 24:stä on korvautunut. Siksi voimme päätellä, että peptidin p277 immunologiset ominaisuudet pystyvät sietämään sekvenssin noin 60-%:isen muuttumisen. Vaikka 35 pienin mahdollinen epitooppi olisi 10 aminohappoa 24:n si- 104179 33 jasta, ei ole olemassa p277:n 10 aminohapon sekvenssiä, joka ei eroa vähintään 4-6 aminohapon kohdalla mykobak-teerisekvenssistä.

Esimerkki 16 5 Peptidiä p277 voidaan käyttää diabeteksen hoitoon

Esimerkissä 6 on osoitettu, että ei-immunogeenises-sa muodossa oleva koko hsp65-molekyyli voi indusoida NOD/Lt-hiirissä resistenssin akuuttia diabetesta vastaan, joka indusoidaan immunisoimalla immunogeenisella hsp65:llä 10 adjuvantissa. Kuvio 5 osoittaa, että myös peptidiä p277, mutta ei peptidiä p278, voitaisiin käyttää resistenssin aikaansaamiseksi indusoitua diabetesta vastaan. Ryhmiä, jotka koostuivat 7 viiden viikon ikäisestä diabetesta edeltävässä vaiheessa olevasta NOD/Lt-naarashiirestä, kä-15 siteltiin p277:llä tai p278:lla (50 μg) epätäydellisessä Freundin adjuvantissa. Kahden viikon kuluttua hiiret immunisoitiin immunogeenisella hsp65:llä (50 μ%) epätäydellisessä Freundin adjuvantissa akuutin diabeteksen indusoi-miseksi. Kolmen viikon kuluttua mitattiin veren glukoosi. 20 On nähtävissä, että yksikään p277:llä käsitellyistä hiiristä ei tullut hyperglyseemiseksi (vereen glukoosipitoi-suus vähintään 200 mg/100 ml). Sen sijaan 5 peptidillä p278 käsitellyistä 7 hiirestä sai diabeteksen.

Hoito p277:llä esti myös spontaanin diabeteksen 25 kehittymisen kaikilla näillä 7 hiirellä, kun taas 80 %:lle vertailuhiiristä, joita oli hoidettu erilaisilla antigeeneillä, kuten naudan seerumialbumiinilla tai hsp70:llä, kehittyi diabetes 7 kuukauden ikään mennessä. Niinpä p277-käsittely johti resistenssiin sekä indusoitua että spon-30 taania diabetesta vastaan. Niinpä jokin tietty peptidi voi *: saada aikaan ei-immunogeenisessa muodossa annettavan koko hsp65-molekyylin terapeuttisen tehon.

Vaikka edellä esitetyt p277:llä saadut tulokset koskevat NOD-hiirten diabetesta, on ilmeistä, että tätä 35 peptidiä, samoin kuin koko hsp65-molekyyliä tai mitä ta- 34 104179 hansa muuta sen kanssa immunologisesti ristireaktiivista molekyyliä, voidaan käyttää hoitoon ihmisillä. Tämä johtuu siitä, että NOD-hiirten diabetes tunnustetaan ihmisen IDDM:n luotettavaksi malliksi. Lisäksi Toddin et ai. mu-5 kaan [Nature 329 (1987) 599] NOD-hiirillä on eräs päähis-tokompatibiliteettikompleksiryhmän (MHC-ryhmän) II molekyyli (Ia) , joka on samanlainen kuin ihmisen IDDM:ään liittyvä ihmis-DQ6. Siten voidaan odottaa, että sekä ihmisen että NOD-hiiren diabetogeenisten T-solujen pitäisi 10 tunnistaa sama peptidisekvenssi, joka esiintyy MHC-ryhmän II molekyylissä, josta puuttuu asparagiinihappo DQs-ketjun asemasta 57. Jos ihmiset ja NOD-hiiret, joille kehittyy diabetes, tunnistavat samanlaisen peptidiantigeenin, kuten p277:n, voidaan tällaista peptidiä käyttää ihmisillä sa-15 moin kuin NOD-hiirillä IDDM:n hoitoon.

Se nimenomainen proteiini, jota ihmiselimistö tuottaa IDDM:n kehittymisen aikana, on ihmisen lämpösokki-proteiini, jonka koko on noin 65 kD (tai sen kanssa risti-reagoiva antigeeni). Ihmisen 65 kD:n lämpösokkiproteiinin 20 nukleotidisekvenssi ja päätelty aminohapposekvenssi esitetään kuviossa 1. Tätä proteiinia kutsutaan tästedes hHSP65:ksi. In vivo voi syntyä myös muita proteiineja, jotka ristireagoivat 65 kD:n proteiiniin sitoutuvien vasta-aineiden kanssa. Esimerkiksi hiiristä ja rotista on , 25 löydetty 47, 30 ja 25 kD:n molekyylit, jotka myös risti- reagoivat M. tuberculosisin hsp65-molekyylille spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa. Rotan fibroblasteista on löydetty myös 47 kD:n molekyyli, joka on ristireagoiva tällaisen vasta-aineen kanssa. Kun otetaan huomioon läm-30 pösokkiproteiinin säilyminen lajien kesken, on täysin odo-tettavaa, että niitä esiintyy myös ihmisessä. Lisäksi IDDM:n aikana vereen ja virtsaan vapautuva proteiini voi olla muu molekyyli kuin hHSP65, joka on kuitenkin risti-reagoiva sen kanssa. Se voi olla beetasoluilla esiintyvä 104179 35 pintaproteiini tai jopa proteiinifragmentti, jossa on säilynyt hHSP65:llä esiintyvä epitooppi.

Niinpä molekyyli, joka toimii diagnostisena markke-rina alkavan IDDM:n läsnäololle, on molekyyli, joka reagoi 5 immunologisesti hHSP65:ä vastaan syntyneiden polyklonaa-listen vasta-aineiden kanssa ja edullisesti hHSP65:n p277-sekvenssiä vastaan syntyneiden monoklonaalisten tai poly-klonaalisten vasta-aineiden kanssa. Tämän selityksen ja patenttivaatimusten yhteydessä termi "hHSP65" on tarkoi-10 tettu lyhenteeksi ihmisen 65 kD:n lämpösokkiproteiinin lisäksi myös mille tahansa muulle ihmisen seerumissa esiintyvälle sukulaismolekyylille, joka reagoi ristiin minkä tahansa lajin 65 kD:N lämpösokkiproteiinia vastaan syntyneiden polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa. Tämän 15 määritelmään piiriin on erityisesti tarkoitettu kuuluviksi, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, 65, 30, 25 ja 47 kD:n proteiinit, jotka on jo löydetty ja joita käsitellään tässä.

Vaikka edellä yksityiskohtaisesti kuvatuissa ko-20 keissa sekvenssin p277 on osoitettu vastaavan patogeenistä epitooppia NOD/Lt-hiirissä, T-solut eivät reagoi p277:ään eräässä toisessa hiirikannassa, C57BL/6:ssa, jossa diabetes voidaan indusoida ihmisen hsp65:llä ja jonka T-solut reagoivat ihmisen hsp65:een. Siten on ilmeistä, että tämä 25 ei ole hHSP65:n ainoa patogeeninen epitooppi. Itse asiassa on määritetty, etä diabetesta edeltävässä vaiheessa olevien ihmispotilaiden veressä ja virtsassa esiintyvän mark-keriproteiinin moolimassa on noin 62 kD. Niinpä olisi odotettavissa, että päähistokompatibiliteettikompleksissa 30 (MHC) kulloinkin esiintyvä epitooppi (ihmisen leukosyytti-• :* antigeeni, HLA) voi vaihdella yksilöstä toiseen. Niinpä, vaikka sekvenssi p277 on tällä hetkellä edullinen, ammattimiehet ymmärtänevät, että hHSP65-proteiinista löydettä-neen myös muita antigeenisekvensseja, joilla on sama tai 35 samantapainen vaikutus kuin p277:llä. Tämän keksinnön tar- 36 1 04 1 79 koituksena on sulkea piiriinsä kaikki tällaiset sekvenssit .

On merkittävää, että spontaani IDDM väistyy, kun on toivuttu akuutista diabeteskohtauksesta, jonka joko siir-5 tävät virulentit hsp65:n vastaiset T-solut tai indusoi aktiivinen immunisoituminen hsp65:lle. Tämä viittaa siihen, että autoimmuunivasteen kinetiikka ja voimakkuus voivat johtaa itsesäätelyyn. Ilmeisesti salakavala, krooninen prosessi voi "luikerrella läpi" luonnollisesta puolustuk-10 sesta autoimmuunisairautta vastaan, kun taas avoin autoim-muuniärsyke saattaa voimistaa säätelyä. Resistenssin saaminen autoimmuunisairaudelle itse sairauden akuutin kohtauksen jälkeen havaitaan säännöllisesti kokeellisessa autoimmuunienkefalomyeliitti(EAE-)rottamallissa. Kun rotat 15 ovat spontaanisti toipuneet akuutista EAE:sta, jonka on indusoinut joko aktiivinen immunisoituminen myeliinin emäksiselle proteiinille tai aktivoitujen T-solujen passiivinen siirto, ne ovat resistenttejä lisäyrityksille indusoida EAE. On havaittu, että EAE-kohtaus aktivoi me-20 kanismeja, mahdollisesti anti-idiotyyppisuppression, joilla on kyky kontrolloida myeliinin emäksiseen proteiiniin reagoivia virulentteja T-soluja.

T-solurokotus, jossa käytetään heikennettyjä auto-immuuni-T-soluja, näyttää olevan eräs tapa aktivoida sää-25 telymekanismeja, ilman että hintana on akuutti sairaus. Anti-isotyyppi- ja antiergotyyppi-T-solut, jotka ovat EAE: n vastaisen T-solurokotuksen yhteydessä esitettyjen kaltaisia, tukahduttavat hsp65:n vastaisia autoimmuuni-T-soluja ja estävät siten IDDM:n kliinisen ilmaantumisen.

30 Nämä perustelut auttavat selittämään, miten tole- ranssin indusointi tai hHSP65:n vastaisen immuunivasteen suppressio estää tai parantaa diabetesprosesin jopa sen alkamisen jälkeen. Niinpä hsp65:ä, hsp65:n kanssa risti-reagoivia moolimassaltaan pieniä molekyylejä (25, 30 tai 35 47 kD) tai fragmentteja, muunnettuja peptidisekvenssejä, f 37 1 04 1 79 synteettisiä peptidejä tai jopa orgaanisia molekyylejä, jotka perustuvat fuusioproteiinin kopioon ja suunnitellaan siten, että ne täyttävät hsp65:lle asetetut fysikokemial-liset vaatimukset, voidaan käyttää estämään tai hoitamaan 5 IDDM-prosessia, kunhan ne ovat ristireaktiivisia hHSP65:ä vastaan muodostuneiden polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa tai saavat aikaan vasta-aineiden syntymisen, jotka on ristireaktiivisia hHSP65:n kanssa. hHSP65:n sekvenssi p277 on eräs edullinen aine tähän tarkoitukseen. Lisäksi 10 hHSP65:lle tai sen sukulaisantigeenille spesifisiä heikennettyjä T-soluja samoin kuin niiden fragmentteja tai aktiivisia osia voidaan käyttää mainitunlaisen immuniteetin indusointiin tai mainitunlaisen immuunivasteen heikentämiseen .

15 hsp65-molekyylin on osoitettu olevan käyttökelpoi nen terapeuttisena koostumuksena, joka on tehokas IDDM:n kehittymisen jatkumista vastaan synnyttämällä toleranssin hHSP65:lle ja pysäyttämällä siten beetasolujen itsetuhou-tumisen. Aktiivinen aineosa käytettäväksi tällaisessa al-20 kavan IDDMm hoidossa voi olla mikä tahansa materiaali, joka on immunologisesti ristireaktiivinen hHSP65:n kanssa, ts. joko reagoi ristiin hHSP65:ä vastaan muodostuneiden polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa tai saa aikaan hHSP65:n kanssa ristiin reagoivien vasta-aineiden muodos-25 tumisen. Tällainen materiaali, olipa se sitten peptidi, proteiini, hiilihydraatti tai jokin muu aine, indusoi to-lerogeenisesti annettuna toleranssin hHSP65:lle ristireak-tiivisuutensa ansiosta. Jos tämä aine on hsp65-proteiini, se voi olla peräisin mistä lajista tahansa. Aineen ei tar-30 vitse olla kokonainen proteiini ollakseen immunologisesti *Ί ristireaktiivinen hHSP65:n kanssa. Se voisi olla proteii- nifragmentti, jossa on jäljellä itse proteiinin antigeeni-aktiivisuus, kuten sekvenssi p277. Se, onko jokin määrätty aine ristireaktiivinen hHSP65:n kanssa, määritetään rutii-35 nikokein. Jos aine reagoi ristiin hHSP65:ä vastaan muodos- 104179 38 tuneen polyklonaalisen vasta-aineen kanssa tai jos se saa aikaan hHSP65:n kanssa ristireaktiivisten vasta-aineiden muodostumisen, se on käyttökelpoinen alkavan IDDMrn hoitoon. Lisätodisteita tällaisen aineen kyvystä toimia ihmi-5 sen hoidossa saataisiin testaamalla toleranssin indusoitumista esimerkissä 10 kuvatussa hiirikokeessa. Tällaisten kokeiden tekeminen olisi rutiinitoimintaa eikä siihen liittyisi tarpeetonta kokeellista työtä.

Edullinen yhdiste ihmisen IDDM:n hoitamiseksi on 10 hHSP65. Ihmisen lämpösokkiproteiinin aminohapposekvenssi esitetään kuviossa 1. Tätä proteiinia voidaan käyttää mainittuun tarkoitukseen. Sen sekvenssi p277 on eräs toinen tähän tarkoitukseen erityisen edullinen molekyyli.

Tässä käsitellyn hsp65-proteiinin lisäksi sen suo-15 loja, funktionaalisia johdannaisia, esiasteita ja aktiivisia fraktioita, joilla on kyky immunologisesti ristirea-goida hHSP65:n kanssa, voidaan myös käyttää. Sellaiset sekvenssit kuin kuvion 1 mukaiset tai Van Edenin et ai. (supra) esittämät sekvenssit, joissa yksi tai useampi ami-20 nohappo on poistettu, lisätty tai korvattu muilla aminohapoilla, on tarkoitettu kuuluviksi tämän keksinnön piiriin, kunhan niillä on kyky immunologisesti ristireagoida hHSP65:n kanssa.

Tässä käytettynä termi "suolat" tarkoittaa sekä 25 karboksyyliryhmien suoloja että proteiinimolekyylin amino- ryhmien happoadditiosuoloja. Karboksyyliryhmän suoloja voidaan muodostaa alalla tunnetuin menetelmin, ja niihin kuuluvat epäorgaaniset suolat, esimerkiksi natrium-, kalsium-, ammonium-, rauta(III)- tai sinkkisuolat tms., ja 30 suolat orgaanisten emästen kanssa, kuten suolat, joita muodostuu esimerkiksi amiinien, kuten trietanoliamiinin, arginiinin tai lysiinin, piperidiinin, prokaiinin tms., kanssa. Happoadditiosuoloihin kuuluvat esimerkiksi mine-raalihappojen, kuten esimerkiksi vetykloridihapon tai rik- 39 104179 kihapon, ja orgaanisten happojen, kuten esimerkiksi etik-kahapon tai oksaalihapon, kanssa muodostuneet suolat.

Termi "funktionaaliset johdannaiset" tässä käytettynä kattaa johdannaiset, joita voidaan valmistaa funktio-5 naalisista ryhmistä, joita esiintyy ryhmien sivuketjuina tai N- tai C-terminaalisina ryhminä, alalla tunnetuin menetelmin, ja ne sisällytetään keksinnön piiriin, kunhan ne säilyvät farmaseuttisesti hyväksyttävinä, ts. ne eivät tuhoa proteiinin aktiivisuutta, tuo toksisia ominaisuuksia 10 niitä sisältäviin koostumuksiin eivätkä vaikuta haitallisesti niiden antigeenisiin ominaisuuksiin.

Näihin johdannaisiin voi esimerkiksi kuulua karbok-syyliryhmien alifaattisia estereitä, karboksyyliryhmien amideja, joita muodostuu reaktiossa ammoniakin tai primaa-15 risten tai sekundaaristen amiinien kanssa, aminohapporyh-mien vapaiden aminoryhmien N-asyylijohdannaisia, joita muodostuu asyyliryhmittymien (esimerkiksi alkanoyyli- tai karboksyklisten aroyyliryhmien) kanssa, tai vapaan hydrok-syyliryhmän (esimerkiksi seryyli- tai treonyyliryhmien 20 hydroksyyliryhmän) O-asyylijohdannaisia, joita muodostuu asyyliryhmittymien kanssa.

"Esiasteet" ovat yhdisteitä, joita syntyy ennen hsp65:ä ja jotka muuttuvat hsp65:ksi eläin- tai ihmiselimistössä .

25 Suurin piirtein puhdistetun proteiinin "aktiivisiin • · fraktioihin" kuuluvat hsp65-proteiinimolekyylin polypepti-diketjun mitkä tahansa fragmentit tai esiasteet yksinään tai yhdessä niihin liittyvien molekyylien tai kytkeytyneiden ryhmien, esimerkiksi sokeri- tai fosfaattiryhmien, 30 kanssa tai proteiinimolekyyliaggregaatit tai itse sokeri-• ryhmät sillä edellytyksellä, että fraktiolla on kyky ris- tireagoida immunologisesti hHSP65:n kanssa. Eräs esimerkki tällaisesta aktiivisesta fraktiosta on hHSP65:n sekvenssi p277.

104179 40

On ratkaisevaa, että edellä kuvattu aktiivinen aineosa annetaan tavalla, joka indusoi toleranssin immuno-geenisen vasteen herättämisen sijasta. Niinpä sitä ei tulisi antaa öljyssä eikä missään muussakaan immunogeenises-5 sa adjuvantissa. Eräs edullinen tapa antaa aktiivista aineosaa siten, että se indusoi toleranssin, on antaa se yhdessä kantajan kanssa, joka suosii antigeenitoleranssin indusoitumista annettaessa antigeeni-kantajakonjugaattia. Tällaiset kantajat tunnetaan tolerogeenisina kantajina. 10 Esimerkkejä tunnetuista tolerogeenisista kantajista ovat D-aminohappojen polymeerit, polyetyleeniglykoli, sokerimo-lekyylien polymeerit, omat IgG-molekyylit, omat pernasolut ja rasvahappomolekyylit. Antigeeniä voidaan antaa myös monomeerisessa hyvin liukenevassa muodossa toleranssin 15 indusoimiseksi. Eräs tunnettu menetelmä toleranssin indu-soimiseksi antigeenille on sen antaminen suun kautta, jopa ilman tolerogeenisten ominaisuuksiensa vuoksi erityisesti valittua kantajaa. Ammattimiehet tuntevat tapoja antigeenin antamiseksi toleranssin indusoivalla tavalla, ja mitä 20 tahansa mainitunlaista tapaa voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisesti. Tällaiset menetelmät eivät itsessään ole tämän keksinnön osana.

Mainitunlaista tolerogeenista koostumusta voidaan antaa rokotteena IDDM:n kehittymisen estämiseksi esimer-25 kiksi IDDM-potilaiden perheenjäsenille, joilla voi olla perinnöllinen IDDM:n kehittymisvaara. Koostumusta käytetään kuitenkin edullisesti pysäyttämään IDDM:n kehittymisen jatkuminen henkilöillä, joiden veressä tai virtsassa on detektoivaissa olevaa hHSP65:ä, mutta edullisesti ennen 30 kuin heissä on kehittynyt immuunivaste hHSP65:een. Toleranssin indusointi estää mainitun immuunivasteen ja siten kontrolloimattoman hHSP65:n vastaisen reaktion aiheuttaman vaurion (IDDM:n). Ei kuitenkaan ole myöhäistä käyttää koostumusta edes hHSP65:n vastaisten vasta-aineiden il-35 maantumisen jälkeen. Kokeet, joiden tulokset esitetään „ 104179 41 taulukoissa 8 ja 13, osoittavat, että tämä keksintö voi pysäyttää immuunireaktion jopa autoimmuniteetin saarekkeita kohtaan jo alettua. Koska autoimmuuniprosessi voi viedä vuosia ihmisellä, olisi jopa vastetta heikentävä säätely 5 suotuisaa.

hsp65:ä tai sen sukulaismolekyyliä (joita on käsitelty edellä) voidaan käyttää immunogeenina farmaseuttisissa koostumuksissa, erityisesti rokotteissa, IDDM:n lievittämiseksi tai hoitamiseksi.

10 Eräs tapa parantaa hsp65:n tehoa rokotteena tai terapeuttisena aineena on muodostaa, tunnetuin geeniteknisin menetelmin, mikro-organismeja, jotka tuottavat hsp65:ä joko sellaisenaan tai osana fuusioproteiinia tai multimee-rinään. Itse näitä mikro-organismeja voidaan käyttää elä-15 vän rokotteena valmistamiseen, joka ei pelkästään laukaise kyseisen mikro-organismin vastaisten vasta-aineiden tuotantoa, vaan on myös käyttökelpoinen IDDM:n lievittämisessä ja hoidossa. Esimerkkejä soveltuvista geeniteknisesti käsitellyistä mikro-organismeista ovat Vaccinia- ja Salmo-20 nella-kannat.

Tämän keksinnön mukaisesti saatua yhdistettä voidaan antaa oraalisesti tai parenteraalisesti, kuten ihonalaisesti, lihaksensisäisesti, laskimonsisäisesti, nenänsisäisesti tai rektaalisesti. Farmaseuttiset tolero-.. 25 geeniset koostumukset voidaan valmistaa alalla tunnetulla tavalla.

Edellä oleva erityissuoritusmuotojen kuvaus valaisee niin täydellisesti keksinnön yleisluonnetta, että muut pystyvät yleisesti tunnettuja tietoja soveltamalla helpos-30 ti muuntamaan tällaisia erityissuoritusmuotoja ja/tai so veltamaan niitä erilaisiin käyttötarkoituksiin poikkeamatta keksinnön yleisajatuksesta, ja siksi tällaiset sovellutukset ja muunnokset on tarkoitettu kuuluviksi esitettyjen suoritusmuotojen ajatuksen ja ekvivalenttien piiriin. On 35 ymmärrettävä, että tässä käytetyn fraseologian tai terminologian tarkoituksena on kuvaaminen eikä rajoittaminen.

r

Claims (3)

104179

1 MAKTIAYDEE ARRGLERGLN ALADAVKVTL GPKGRNWLE KKWGAPTITN DGVSIAKEIE 61 LEDPYEKIGA ELVKEVAKKT DDVAGDGTTT ATVLAQÄLVR EGLRNVAAGA NPLGLKRGIE 121 KAVEKVTETL LKGAKEVETK EQIAATAAIS AGDQSIGDLI AEAMDKVGNE GVITVEESNT 181 FGLQLELTEG MRFDKGYISG YFVTDPERQE AVLEDPYILL VSSKVSTVKD LLPLLEKVIG 241 AGKPLLIIAE DVEGEALSTL WNKIRGTFK SVAVKAPGFG DRRKAMLQDH AILTGGQVIS 15 301 EEVGLTLENA DLSLLGKARK VWTKDETTI VEGAGDTDAI AG RV AQ IRQ E IENSDSDYDR

361 EKLQERLAKL AGGVAVIKAG AATEVELKER KHRIEDAVRN AKAAVEEGIV AGGGVTLLQA 421 APTLDELKLE GDEATGANIV KVALEAPLKQ IAFNSGLEPG WAEKVRNLP AGHGLNAQTG 481 VYEDLLAAGV ADPVKVTRSA LQNAASIAGL FLTTEAWAD KPEKEKASVP GGGDMGGMDF ja polypeptidit, joilla on aminohapposekvenssit 234 - 540, 20 61 - 540, 109 - 540, 171 - 540, 272 - 540 ja 280 - 540, sekä ihmisen mitokondrioproteiini P1 ovat poissuljettuja, tunnettu siitä, että polypeptidi syntetisoidaan peptidikemiassa tavanomaisin menetelmin.

1. Menetelmä polypeptidin valmistamiseksi, joka polypeptidi sisältää sekvenssin Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-

5 Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp tai sen minkä tahansa muunnoksen, joka on sen kanssa immunologisesti ristireaktiivinen, mutta joka ei ole koko lämpösokkiproteiini, edellyttäen, että polypeptidi, jolla on seuraava aminohapposekvenssi 10

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että valmistetaan polypeptidi, joka sisältää sekvenssin Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp tai sen minkä tahansa muunnoksen, jonka sekvenssi on vähintään 40-%:isesti homologinen sen kanssa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, ’ tunnettu siitä, että valmistetaan polypeptidi, jossa on 24 aminohappoa. 104179