FR2749320A1 - Support d'immobilisation d'enzyme et lipase immobilisee - Google Patents
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Abstract
L'invention fournit des supports inorganiques pour immobiliser une enzyme, présentant une activité élevée, et on peut les utiliser de manière répétée avec une faible baisse de leur activité. On les produit en combinant un support inorganique à l'agent de couplage présentant une liaison ester d'acide carboxylique. Les supports inorganiques sont choisis parmi les supports de type kaolinite destinés à immobiliser une enzyme, ou n'importe quels supports tels que du verre poreux, présentant le groupe fonctionnel capable de se combiner à l'agent de couplage de type silane. De plus, la présente invention fournit une lipase immobilisée dans laquelle il s'est formé une liaison entre les groupes fonctionnels contenus dans la protéine de type lipase et un ester d'acide carboxylique en combinant un support inorganique avec l'agent de couplage présentant une liaison ester d'acide carboxylique, en mélangeant et en agitant le support inorganique avec une solution de lipase présentant une concentration prédéterminée, en filtrant le mélange, et en séchant le matériau filtré.
Description
l
SUPPORT D'IMMOBILISATION D'ENZYME ET LIPASE IMMO-
BILISEE
La présente invention concerne généralement des supports d'immobilisation d'enzymes et une lipase immobilisée qui sont utilisés
comme bioréacteur, biocapteur, etc., pour faciliter diverses réactions bio-
chimiques dans un contexte industriel, dans lequel diverses enzymes sont employées comme catalyseur biologique. Afin de réaliser diverses réactions biochimiques dans un contexte industriel en utilisant un catalyseur organique, par exemple, un catalyseur enzymatique, de nombreuses recherches et études portant sur un bioréacteur à enzyme immobilisée et un biocapteur, ont été menées
activement au cours de ces dernières années. En même temps, on a égale-
ment développé des études portant sur un support pour immobiliser une
enzyme, c'est-à-dire un support d'immobilisation d'enzyme, qui est appli-
qué à ces bioréacteur et biocapteur. Ce bioréacteur à enzyme immobilisée comprend une colonne remplie avec un matériau catalytique organique produit à partir d'un support d'enzyme immobilisée. Pour le support, on peut utiliser divers matériaux, par exemple des matériaux organiques de masse moléculaire élevée et des matériaux inorganiques tels que du verre
poreux, des céramiques, etc., utilisés couramment.
Bien que ces matériaux inorganiques présentent certains avan-
tages, tels qu'une résistance mécanique élevée, et une excellente stabilité
chimique et thermique au cours d'un traitement de stérilisation, ils présen-
tent l'inconvénient de ne pas pouvoir être utilisés de manière répétée, en raison d'une force d'adsorption médiocre pour les enzymes. Quelques
techniques classiques ont été proposées pour surmonter cet inconvénient.
Par exemple, la publication de brevet japonais numéro 55-32357 et numéro 56-15231 divulgue un procédé typique dans lequel une quantité d'agent de couplage de type silane introduite avec des radicaux organiques réactifs est combinée avec un support inorganique tel que du verre poreux, de l'alumine, de la silice, etc., et on fait réagir les groupes fonctionnels des enzymes avec les radicaux organiques réactifs de l'agent de couplage de type silane pour former une liaison entre le support inorganique et l'enzyme. Comme exemple typique d'une telle enzyme immobilisée dans le support inorganique (appelé dans la suite du présent document "enzyme immobilisée") comprenant l'agent de couplage de type silane, on connaît
les enzymes de décomposition d'hydrate de carbone telles que l'oc-amy-
lase, la glucoamylase, etc. Cependant, puisque ces enzymes présentent une faible activité, c'est-à-dire une réactivité médiocre avec l'amidon ou d'autres substrats, par comparaison à l'enzyme qui n'est pas immobilisée
dans le support, une quantité importante d'enzyme immobilisée est néces-
saire pour obtenir le même degré de réactivité d'une enzyme non-immobi-
lisée. Par conséquent, l'enzyme immobilisée n'est pas adaptée à un pro-
cédé de production à l'échelle industrielle. Afin de surmonter ce pro-
blème, la publication du brevet japonais numéro 5-219952 et 4-51894 divulgue de nouveaux support et procédé pour immobiliser une enzyme
dans un support.
D'autre part, l'une des enzymes typiques de coupure de graisses, la lipase, a été rapidement et largement utilisée pour différents processus
dans le domaine de la chimie de synthèse organique telle que la décompo-
sition de monoesters, la synthèse d'esters, la résolution optique d'une forme racémique par une réaction d'échange d'ester, etc., ce qui ressemble à une fonction de coupure exercée sur une huile et une graisse. Néanmoins, il a été seulement étudié et mis au point un procédé d'immobilisation industrielle pour faire adsorber physiquement une solution de lipase très ) concentrée dans de la terre d'infusoires. Afin de produire de la terre d'infusoires à lipase adsorbée, il est nécessaire de mélanger la solution
très concentrée de lipase enzymatique grossière avec de la terre d'infusoi-
res, puis de sécher le mélange. Cependant, la capacité d'adsorption physi-
que de la terre d'infusoires est limitée et sa force d'adsorption est relative-
ment faible en raison de l'adsorption physique. Par conséquent, l'activité de la terre d'infusoires à lipase adsorbée diminuera progressivement lors
de répétitions.
Tout d'abord, un objet principal d'utilisation de l'enzyme immo-
bilisée est que, bien que l'enzyme soit d'un coût élevé, on peut l'utiliser de manière répétée sans avoir à la mettre au rebut après seulement un usage, ce qui permet donc de diminuer le coût de production et le produit ayant
réagi est exempt de toute enzyme restante. En d'autres termes, il est sou-
haitable de préparer une enzyme immobilisée spécifique qui peut être uti-
lisée de manière répétée pendant une longue période avec la quantité la
1) plus petite possible. Quand on augmente l'activité de l'enzyme immobili-
sée, la gamme d'appareil réactionnel devient plus petite, ce qui fournit
donc la valeur de réduction de son coût initial et de son coût de fonctionne-
ment.
Par conséquent, un objet de la présente invention fournit un sup-
port inorganique amélioré pour immobiliser une enzyme, qui surmonte les
problèmes classiques précédemment décrits.
Un autre objet de la présente invention est de fournir un support
inorganique amélioré pour immobiliser une enzyme, qui facilite l'immo-
bilisation de la lipase.
Un objet supplémentaire de la présente invention est de fournir
une lipase immobilisée qui présente une activité élevée.
Un autre objet de la présente invention est de fournir une enzyme immobilisée inorganique et une lipase immobilisée que l'on peut utiliser
d'une manière répétée et dont l'activité diminue peu en même temps.
Pour atteindre les objets décrits ci-dessus, on produit un support inorganique amélioré en combinant un support inorganique avec l'agent
de couplage présentant une liaison ester d'acide carboxylique, et on pro-
duit un support inorganique amélioré destiné à porter la lipase en combi-
nant un support inorganique avec l'agent de couplage qui présente une liaison ester d'acide carboxylique. L'agent de couplage présentant une
liaison ester d'acide carboxylique est un agent de couplage de type silane.
Le support inorganique est choisi parmi les supports de type kaolinite pour immobiliser l'enzyme ou n'importe quels supports, présentant un groupe fonctionnel capable de former une liaison avec l'agent de couplage
de type silane, tels que le verre poreux, la bentonite, le gel de silice, l'alu-
mine, la silice alumine, l'hydroxyapatite, le gel de phosphate de calcium, etc. L'agent de couplage de type silane présentant une liaison ester d'acide carboxylique est choisi parmi les agents de couplage comportant une liaison ester d'acide carboxylique qui répondent à la formule générale RCOO(CH2)nSiR'3 (dans laquelle R représente un groupe fonctionnel organique, R représente un radical choisi dans l'ensemble comprenant les groupes alcoxy inférieur, phénoxy et halogéno, et n représente un nombre
entier). Par exemple, on peut utiliser le y-méthacryloxypropyltriméthoxy-
silane, le y-acétoxypropyltriméthoxysilane, le y-acryloxypropyltrimé-
thoxysilane, etc. De plus, la présente invention fournit une protéine de type lipase immobilisée dans laquelle il y a formation d'une liaison entre les groupes fonctionnels contenus dans la protéine de type lipase et un ester d'acide
carboxylique au moyen des étapes suivantes: la première étape sert à com-
biner un support inorganique avec l'agent de couplage comportant une liaison ester d'acide carboxylique, la seconde étape sert à mélanger et à agiter le support inorganique provenant de la première étape avec une solution de lipase ayant une concentration prédéterminée, la troisième
étape sert à filtrer le mélange, et la quatrième étape sert à sécher le maté-
riau filtré.
Ces supports inorganiques améliorés destinés à immobiliser une
enzyme et la lipase immobilisée apportent des avantages extraordinaires.
En détail, le support et la lipase immobilisée produits selon la présente
invention, présentent une activité très élevée même si la quantité de pro-
téine adsorbée sur le support n'est pas aussi importante que celle obtenue d'une manière classique lorsque la lipase est portée par d'autres supports combinés à des agents de couplage de type silane ne comportant aucune liaison ester d'acide carboxylique ou par des supports non traités. En
d'autres termes, le support et la lipase immobilisée produits selon la pré-
sente invention, ont une activité relativement très élevée pour ce qui
concerne la quantité de protéine adsorbée sur le support et une détériora-
tion extrêmement faible au cours de l'activité. De plus, le procédé fourni
par la présente invention pour former une liaison entre les groupes fonc-
tionnels contenus dans la protéine de type lipase et l'ester d'acide carboxy-
lique n'a pas besoin d'un traitement d'immobilisation compliqué, mais seulement d'étapes d'immobilisation ordinaires dans lesquelles on
mélange et on agite la solution de lipase ayant une concentration prédéter-
minée avec le support, puis le mélange est soumis à une filtration et à un séchage. Le support et la lipase immobilisée produits peuvent être utilisés
d'une manière répétée avec une diminution faible de leur activité. En par-
ticulier, dans des procédés réactionnels en cycles répétés, le support et la
lipase immobilisée produits selon la présente invention peuvent être avan-
tageusement utilisés, ces derniers ne présentant pas de diminution de leur
activité.
La figure 1 est une représentation graphique qui montre la rela-
tion entre l'activité initiale et la quantité de protéine adsorbée sur le sup-
port du mode de réalisation de la présente invention, et celles de l'exemple
comparatif et du support non-traité.
La figure 2 est une représentation graphique qui montre la rela-
tion entre le changement d'activité et le nombre de réactions en cycles répétées en utilisant le support du mode de réalisation de la présente
invention, et celui de l'exemple comparatif ainsi que le support nontraité.
La présente invention sera mieux comprise en présentant un mode de réalisation préféré de support pour immobiliser une enzyme et de lipase immobilisée produite en utilisant le support. Selon la présente invention, une caractéristique est qu'un support inorganique est combiné à
l'agent de couplage ayant une liaison ester d'acide carboxylique, et on pro-
duit le support destiné à porter une lipase en combinant l'agent de cou-
plage ayant la liaison ester d'acide carboxylique avec un support inorgani-
que. Le tableau 1 montre différents agents de couplage à utiliser dans
la présente invention et leurs formules chimiques.
Tableau 1
Formules chimiques d'agents de couplage N Nom de l'agent de couplage Groupe fonctionnel (X-)
1 y-méthacryloxypropyltriméthoxysilane CH2=C-C-O-
2 y-acétoxypropyltriméthoxysilane CH3-C-O-
o
3 y-acryloxypropyltriméthoxysilane CH2----
CH3-C-C-O-
4 allyltriméthoxysilane CH2-CH-
phényltriméthoxysilane
6 y-glucydoxypropyltriméthoxysilane CH-CHCH2O-
7 y-chloropropyltriméthoxysilane C1-
8 'y-aminopropyltriméthoxysilane NH2-
9 phénéthyltriméthoxysilane NH2-
Formule chimique générale: X-(CH2)n-Si(OCH3)3 (n = 0-3) Dans le tableau 1, les numéros 1 à 3 représentent les agents de couplage de type silane ayant une liaison ester d'acide carboxylique que
l'on utilise dans la présente invention, tandis que les numéros 4 à 9 repré-
sentent les autres agents de couplage de type silane comme exemples com-
paratifs. En détail, la présente invention emploie les agents de couplage
ayant une liaison ester d'acide carboxylique, qui sont de préférence choi-
sis parmi les agents de couplage de type silane répondant à une formule générale RCOO(CH2)nSiR'3. Dans cette formule, R représente un groupe
fonctionnel organique qui peut englober un groupe fonctionnel inorgani-
que terminal. R' représente un radical choisi dans l'ensemble comprenant
des groupes alcoxy inférieur, phénoxy et halogéno. n représente un nom-
bre entier.
Le support inorganique à utiliser dans la présente invention est choisi parmi les supports de type kaolinite pour immobiliser une enzyme ou n'importe quels supports comportant un groupe fonctionnel capable de former une liaison avec l'agent de couplage de type silane, tels que le verre poreux, la bentonite, le gel de silice, l'alumine, la silice, la silice-alumine, l'hydroxyapatite, le gel de phosphate de calcium, etc. Dans les modes de réalisation suivants de la présente invention, on a utilisé le support de type kaolinite destiné à immobiliser une enzyme,
formé de particules présentant un diamètre moyen de 200 grm, pour combi-
ner différents agents de couplage de type silane sur la surface du support, puis pour faire en sorte que le support porte la lipase. Des exemples de supports ainsi produits sont soumis à différents essais pour comparer leurs activités réactionnelles. Le résultat de ces essais indique clairement que les échantillons à base des composés correspondant aux numéros 1 à 3, présentent une activité supérieure à celle des échantillons classiques à base des composés correspondant aux numéros 4 à 9, même si la quantité de protéine adsorbée sur les supports produits par la présente invention n'est pas spécialement importante. En détail, le support combiné à l'agent
de couplage de type silane présentant la liaison ester d'acide carboxyli-
que, qui est choisi parmi le le y-méthacryloxypropyltriméthoxysilane, le y-acétoxypropyltriméthoxysilane, le y-acryloxypropyltriméthoxysilane a été utilisé pour porter la lipase (dans la suite du présent document, ceci est appelé "lipase immobilisée et combinée à un ester"). D'autre part, le support combiné à l'autre agent de couplage de type silane ne présentant aucune liaison ester d'acide carboxylique a été utilisé pour porter la lipase (appelé dans la suite du document "lipase immobilisée par couplage à un
autre silane").
Le support de type kaolinite décrit ci-dessus pour immobiliser une enzyme a été produit par un procédé dans lequel un kaolin est soumis à
un traitement hydrothermique avec un acide fort, à un traitement de rin-
çage avec de l'eau pour former une suspension épaisse ou un matériau en poudre, et à un traitement de cuisson à une température de 350 C à 1000 C. On obtient ainsi un support de type kaolinite qui présente une
distribution poreuse uniforme et fine, et un taux de porosité élevé.
Le procédé de production du support de type kaolinite précédem-
ment décrit présente quelques avantages. Le traitement hydrothermique avec un acide fort rend alcalin les composants contenus dans le kaolin comme les impuretés sont éliminées par dissolution, de manière à ce que la
suspension épaisse ou le matériau en poudre par l'intermédiaire du traite-
ment hydrothermique ne comprenne presque pas les composants alcalins solubles. Par conséquent, la stabilité chimique concernant d'une manière
inhérente le kaolin est remarquablement améliorée.
On note que dans le cas du support combiné au y-aminopropyltri-
méthoxysilane (numéro 8 dans le tableau 1), qui est connu pour être très efficace pour les autres enzymes sauf la lipase, ce support immobilise une petite quantité de lipase et le support à lipase immobilisée présente une
faible activité.
Généralement, puisque la lipase disponible dans le commerce englobe une poudre d'enzyme plus grossière qui comprend également divers matériaux de protéine en plus de la protéine de type lipase pure, le fait de porter sélectivement un tel composant de protéine de type lipase pure n'est pas possible sur le support. Par conséquent, afin d'augmenter
l'activité, il est nécessaire de préparer une grande quantité de lipase enzy-
matique très concentrée et grossière pour adsorber une grande quantité de
protéine sur le support. Ceci donnera une opération d'immobilisation dif-
ficile et requiert également que le support présente une capacité d'adsorp-
tion très élevée. En revanche, quand le support combiné à l'agent de cou-
plage de type silane présentant une liaison ester d'acide carboxylique est utilisé, il est possible de produire une lipase immobilisée présentant une activité remarquablement élevée même si une grande quantité de protéine
n'est pas adsorbée sur le support.
Le présente invention ne requiert donc pas le procédé d'immobi-
lisation classique et difficile décrit ci-dessus pour produire une terre d'infusoires à lipase adsorbée, dans lequel il est nécessaire de mélanger la solution très concentrée de lipase enzymatique grossière avec de la terre d'infusoires, puis de sécher le mélange, mais il nécessite seulement un procédé d'immobilisation couramment utilisé, c'est-à-dire que l'on mélange le support et on le agite avec une solution de lipase présentant une concentration prédéterminée, et on filtre le mélange et on le sèche. Bien que la raison de ce phénomène ne soit pas complètement compris, il peut
être anticipé comme suit. On sait bien que l'enzyme est une protéine spéci-
fique agissant comme un catalyseur biologique et ses 20 sortes de résidus d'acides aminés présentent différents groupes fonctionnels tels qu'un groupe amino, un groupe carboxyle, etc. Dans le cas de la protéine de type lipase, il se forme facilement une liaison entre l'un quelconque de ces groupes fonctionnels et un ester d'acide carboxylique de sorte qu'il peut se former sélectivement une liaison entre la protéine de type lipase et l'ester
d'acide carboxylique du support plutôt qu'avec d'autres protéines.
Les essais comparatifs pour comparer la détérioration de l'acti-
vité au cours de la répétition indiquent que la lipase immobilisée à liaison ester selon la présente invention présente une forte force d'adsorption qui entraîne une activité élevée avec une détérioration extrêmement faible en comparaison avec les autres échantillons de lipases immobilisées qui sont produits en utilisant les autres agents de couplage de type silane ou sans
agent de couplage de type silane.
Pour comprendre facilement la présente invention, un mode de
réalisation typique sera décrit comme suit.
Comme exemple de réaction pour effectuer une résolution opti-
que d'une forme racémique, on a mélangé l'alcool DL-l-phénéthylique avec de l'acétate de vinyle comme donneur de groupe acyle pour réaliser
l'estérification de la forme racémique avec une lipase comme catalyseur.
La lipase utilisée est une lipase PS (Pseudomonas Cepacia fournie par Amano Seiyaku Co., Ltd), dont on a déjà confirmé que cette lipase PS peut permettre une réaction sélective du point de vue catalytique de la forme racémique, et en particulier pour la réaction décrite ci- dessus, la lipase PS
indique une sélectivité extrêmement élevée. On a utilisé le support immo-
bilisé par la lipase PS.
EXEMPLES 1 A 3
) On a dilué 0,2 g de chacun des agents de couplage de type silane,
numéros 1 à 3 dans le tableau 1, présentant une liaison ester d'acide car-
boxylique dans 1,8 g de toluène. On a ajouté 1,5 g de support de type kaoli-
nite pour immobiliser l'enzyme, dans la solution d'agent de couplage de type silane dilué dans le toluène, puis on a mélangé le tout pendant une
heure. On a séparé la solution en une partie liquide et en une partie solide.
On a séché la partie solide à 110 C pendant 30 minutes. On a ainsi produit
le matériau de support.
On a ensuite dissous 2,5 g de lipase enzymatique grossière (lipase PS fabriquée par Amano Seiyaku Co., Ltd) dans 25 ml de tampon d'acide phosphorique (pH 7,0). On a filtré cette solution pour éliminer des matériaux insolubles. On a ajouté 0,5 g de support préparé ci-dessus dans cette solution d'enzyme, et on a remué en secouant ce mélange pendant un jour pour obtenir l'immobilisation. Finalement, on a filtré ce mélange
pour récupérer la lipase immobilisée.
EXEMPLES COMPARATIFS 4 A 9
On a dilué dans 1,8 g de toluène, 1,02 g de chacun des agents de couplage de type silane, numéros 4 à 9 présentés dans le tableau 1. On a ajouté 1,5 g de support de type kaolinite pour immobiliser une enzyme, dans la solution d'agent de couplage de type silane diluée dans le toluène, et on a mélangé pendant une heure. On a séparé la solution en une partie solide et en une partie liquide. On a séché la partie solide à 110 C pendant
minutes. On ainsi produit le matériau de support.
On a ensuite dissous 2,5 g de lipase enzymatique grossière (lipase PS fabriquée par Amano Seiyaku Co., Ltd) dans 25 ml de tampon d'acide phosphorique (pH = 7,0). On a filtré cette solution pour éliminer
les matériaux insolubles. On a ajouté 0,5 g de support ainsi préparé cides-
sus dans cette solution d'enzyme, puis on a remué en secouant ce mélange pendant un jour pour obtenir l'immobilisation. Finalement, on a filtré ce
mélange pour récupérer la lipase immobilisée.
Essai sur l'activité
On a ajouté 120 ml de chacune de ces lipases immobilisées pré-
parées dans les exemples 1 à 3 et exemples comparatifs 4 à 9, à une solu-
tion mixte de 1,2 ml d'alcool DL-l-phénéthylique et de 4,6 ml d'acétate de vinyle pour réaliser la réaction d'estérification. La relation entre l'activité initiale (U/g) et la quantité de protéine adsorbée sur les supports (mg/g de support) 20 minutes après le début de l'estérification est présentée dans la figure 1. L'activité, 1 Unité (U), correspond à la quantité d'enzyme qui
produit 1 [tmol d'ester de phénéthyle pendant une minute.
Il
Dans la figure 1, les activités initiales des trois matériaux entou-
rés et annotés A correspondent aux trois exemples selon la présente inven-
tion en utilisant la lipase immobilisée et combinée à l'ester, dans lesquels la lipase est portée par le support combiné à l'agent de couplage de type silane présentant une liaison ester d'acide carboxylique, numéros 1 à 3, le
y-méthacryloxypropyltriméthoxysilane, le y-acétoxypropyltriméthoxy-
silane, ley-acryloxypropyltriméthoxysilane. Ces trois exemples fournis-
sent une activité initiale extrêmement élevée par comparaison avec les six exemples comparatifs qui sont préparés en utilisant les autres agents de couplage de type silane, numéros 4 à 9, et l'exemple non- traité sans agent de couplage de type silane, sans tenir compte de la quantité de protéine
adsorbée sur le support. Par exemple, quand les exemples 1 à 3 sont com-
parés avec l'exemple comparatif 9 qui a pratiquement la même quantité de protéine adsorbée que ces exemples, les valeurs d'activité de ces trois exemples 1 à 3 entourés et annotés A, sont nettement supérieures à celle de l'exemple comparatif 9 traité avec le phénétyltriméthoxysilane. Par ailleurs, quand on compare les exemples 1 à 3 avec l'exemple comparatif 4 qui présente une quantité plus grande de protéine adsorbée par rapport aux
exemples 1 à 3, l'activité de ces trois exemples 1 à 3 est extrêmement supé-
2() rieure à celle de l'exemple 4 traité avec l'allyltriméthoxysilane.
Essai de réaction en cycles Une réaction en cycles utilisant le support (exemple 1) traité avec le y-méthacryloxypropyltriméthoxysilane, numéro 1, est répétée 30 fois. Comme référence, on a répété 30 fois deux réactions discontinues en utilisant respectivement un support traité avec de l'allyltriméthoxysilane, numéro 4, et un support non-traité. Le résultat de cet essai de réaction en cycles est indiqué sur la figure 2 pour montrer clairement la relation entre
le changement d'activité (U/g) et le nombre de réactions en cycles (nom-
bre de répétitions) en utilisant le support de l'exemple conforme à la pré-
sente invention et celui de l'exemple comparatif et le support nontraité.
Dans la figure 2, l'exemple conforme à la présente invention représenté par "A" montre que l'activité diminue légèrement au bout de 10
fois et elle se maintient pratiquement à la même valeur pendant 30 répéti-
tions après cela. Au contraire, l'exemple comparatif 4 et l'exemple non-
traité montrent que leurs activités sont remarquablement faibles au début,
et ont diminué progressivement lorsqu'on a répété la réaction en cycles.
Puis, on a respectivement traité le support de type kaolinite pour immobiliser l'enzyme utilisé pour les exemples précédemment décrits 1 à 3, et d'autres supports inorganiques tels que des billes de verre disponibles dans le commerce (diamètre de particules moyen: 500 jim), avec deux traitements, l'un utilisant le y- méthacryloxypropyltriméthoxysilane, numéro 1, et l'autre utilisant l'allyltriméthoxysilane, numéro 4, comme exemples comparatifs. On a soumis ces échantillons au traitement d'immobilisation pour une lipase et à un traitement d'estérification de la même manière que dans les exemples décrits ci-dessus 1 à 3. Le tableau 2 montre les données obtenues, qui comprennent la quantité de protéine
adsorbée (mg/g), l'activité initiale (U/g) et l'activité relative (U/mg) cor-
respondant au rapport entre l'activité initiale et la quantité de protéine
adsorbée, pour le support non-traité, l'exemple selon la présente inven-
tion, et l'exemple comparatif.
Tableau 2
Comparaison entre le support de type kaolinite pour immobiliser
l'enzyme et les billes de verre.
Agent de Quantité de Activité Activité couplage de type protéine initiale relative Echantillon silane adsorbée (U/g) (U/mg) (mg/g) Support de Non-traité 39,5 254 6,4
type Allyltriméthoxy-
kaolinite silane39,1 348 8,9
y-méthacryloxy-
propyltriméthoxy- 33,2 873 26,3 silane Billes de Non-traitées 7,6 48 6,3
verre Allyltriméthoxy-
silane 7,2 64 8,9
y-méthacryloxy-
propyltriméthoxy- 5,7 150 26,3 __ ___ ___silane D'après les données obtenues dans le tableau 2, l'échantillon du mode de réalisation conforme à la présente invention présente une activité initiale très élevée même si la quantité de protéine adsorbée sur le support
n'est pas aussi importante que pour l'échantillon comparatif et l'échan-
tillon non-traité. En détail, dans le cas du support de type kaolinite destiné à immobiliser l'enzyme, la quantité de protéine adsorbée sur le support non-traité vaut 39,5 mg/g, tandis que pour l'échantillon comparatif (traité avec l'allyltriméthoxysilane), elle vaut 39,1 mg/g et pour l'échantillon du
mode de réalisation (traité avec le y-méthacryloxypropyltriméthoxysi-
lane), elle vaut 33,2 mg/g. L'échantillon non-traité et l'échantillon compa-
ratif présentent des valeurs supérieures à celles de la présente invention. En revanche, l'activité initiale de l'échantillon du mode de réalisation
vaut
873 U/g, celle de l'échantillon non-traité vaut 254 U/g et celle de l'échan-
tillon comparatif vaut 348 U/g. L'échantillon du mode de réalisation pré-
sente une valeur extrêmement élevée. Egalement, l'activité relative de l'échantillon non-traité vaut 6,4 U/mg, celle de l'échantillon comparatif vaut 8,9 U/mg et celle de l'échantillon du mode de réalisation vaut 26,3 U/mg. L'échantillon du mode de réalisation montre alors une valeur
beaucoup plus élevée.
Dans le cas o on utilise des billes de verre disponibles dans le
commerce comme support inorganique, l'échantillon du mode de réalisa-
tion présente une activité initiale extrêmement élevée, de 150 U/g, même si la quantité de protéine adsorbée sur le support est inférieure à celles de l'échantillon comparatif et de l'échantillon non-traité. De plus, l'activité relative de l'échantillon du mode de réalisation vaut 26,3 U/mg qui est très
supérieure à celles des autres échantillons. Cette valeur élevée est équiva-
lente à celle obtenue avec le support de type kaolinite. Sans tenir compte
du type de matériau de support, on confirme que l'agent de couplage pré-
sentant une liaison ester d'acide carboxylique permet au support d'avoir une activité élevée même si la quantité de protéine adsorbée sur le support n'est pas aussi importante que celle des échantillons classiques. En d'autres termes, un support sous forme de billes de verre disponibles dans le commerce présente une faible activité par rapport au support de type
kaolinite, mais leurs valeurs d'activité relatives sont équivalentes et supé-
rieures à celles des échantillons de supports comparatifs et non traités.
Ceci signifie que l'effet lié à l'agent de couplage de type silane présentant une liaison ester d'acide carboxylique n'est pas seulement limité à un type
spécifique de matériau de support inorganique.
Comme explication donnée pour ci-dessus, le support et la lipase immobilisée produits selon la présente invention ont une activité extrêmement élevée (activité relative) même si la quantité de protéine adsorbée sur le support n'est pas aussi importante que celle classique, lorsque la lipase est portée par d'autres supports combinés à des agents de couplage de type silane ne présentant aucune liaison ester d'acide carboxylique ou 1() par des supports non-traités. De plus, les supports et la lipase immobilisée produits peuvent être utilisés de manière répétée avec une légère baisse de son activité. En particulier, dans un procédé de réaction en cycles répétée, les supports et la lipase immobilisée produits selon la présente invention
peuvent être avantageusement utilisés pendant un certain temps.
Il est bien entendu que la description qui précède n'a été donnée
qu'à titre purement illustratif et non limitatif et que des variantes ou des
modifications peuvent y être apportées dans le cadre de la présente inven-
tion.
Claims (7)
1. Support d'immobilisation d'enzyme destiné à immobiliser une enzyme, caractérisé en ce qu'il comprend un support inorganique combiné
à un agent de couplage présentant une liaison ester d'acide carboxylique.
2. Support d'immobilisation d'enzyme destiné à immobiliser une enzyme, caractérisé en ce qu'il comprend un support inorganique pour
porter une lipase, ledit support étant combiné à un agent de couplage pré-
sentant une liaison ester d'acide carboxylique.
3. Support d'immobilisation d'enzyme conforme à la revendica-
tion i ou 2, caractérisé en ce l'agent de couplage précité et présentant une
liaison ester d'acide carboxylique est un agent de couplage de type silane.
4. Support d'immobilisation d'enzyme conforme à la revendica-
tion 3, caractérisé en ce que l'agent de couplage de type silane précité et
présentant une liaison ester d'acide carboxylique répond à la formule chi-
mique générale: RCOO(CH2)nSiR'3 (dans laquelle R représente un groupe fonctionnel organique, R' représente un radical choisi dans l'ensemble
comprenant les groupes alcoxy inférieur, phénoxy et halogéno, et n repré-
) sente un nombre entier).
5. Support d'immobilisation d'enzyme conforme à la revendica-
tion 3 ou 4, caractérisé en ce que l'agent de couplage de type silane précité et présentant une liaison ester d'acide carboxylique est choisi parmi l'un
quelconque des y-méthacryloxypropyltriméthoxysilane, y-acétoxypro-
pyltriméthoxysilane et y-acryloxypropyltriméthoxysilane.
6. Support d'immobilisation d'enzyme conforme à l'une quelcon-
que des précédentes revendications, caractérisé en ce que le support inor-
) ganique précité est choisi parmi n'importe lesquels des supports présen-
tant un groupe fonctionnel capable de se combiner avec un agent de cou-
plage de type silane, tels que les supports de type kaolinite pour immobili-
ser une enzyme, du verre poreux, de la bentonite, du gel de silice, de l'alu-
mine, de la silice, de la silice-alumine, de l'hydroxyapatite et du gel de
phosphate de calcium.
7. Lipase immobilisée produite au moyen d'une première étape servant à combiner le support inorganique à l'agent de couplage présen- tant une liaison ester d'acide carboxylique, une seconde étape servant à
mélanger et agiter le support inorganique avec une solution de lipase pré-
sentant une concentration prédéterminée, une troisième étape servant à
filtrer le mélange, et une quatrième étape servant à sécher le matériau fil-
1() tré, ce qui permet la formation d'une liaison entre les groupes fonctionnels
contenus dans la protéine de type lipase et un ester d'acide carboxylique.
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