FR2851575A1 - Nouveau gene de la lysine decarboxylase et procede de production de la l-lysine - Google Patents
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Abstract
Une bactérie Methylophilus dans laquelle un gène ayant une séquence de nucléotides identique à un ADN codant pour une protéine définie dans les paragraphes (A) et (B) suivant ou un gène ayant une homologie avec l'ADN à un degré tel qu'une recombinaison homologue avec l'ADN intervient, est interrompu, l'expression du gène étant ainsi réduite ou éliminée, est cultivée dans un milieu contenant du méthanol comme source principale de carbone afin de produire et d'accumuler de la L-lysine dans la culture et la L-lysine est recueillie à partir de la culture :(A) une protéine qui présente la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4 ;(B) une protéine qui présente la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4 comprenant la substitution, la délétion, l'insertion ou l'addition d'un ou de plusieurs résidus d'acides aminés et présente une activité de lysine décarboxylase.
Description
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La présente invention concerne un nouveau gène de la lysine décarboxylase de la bactérie Methylophilus qui est impliqué dans la décomposition de la L-lysine. La présente invention concerne également une bactérie Methylophilus dans laquelle l'expression du gène décrit ci-dessus est supprimée et un procédé de production de Llysine utilisant cette bactérie.
La lysine décarboxylase est une enzyme qui catalyse la réaction produisant de la cadavérine par décarboxylation de la L-lysine. Par exemple, dans Escherichia coli (E. coli), il existe deux enzymes appelées CadA et Ldc (W096 17930). De plus, d'après les informations sur les séquences génétiques des génomes ou des résultats d'expériences, il a été suggéré que la lysine décarboxylase était présente dans différentes bactéries, notamment le Bacillus halodulans, le Bacillus subtilis, le Vibrio cholerae, le Salmonella typhimurium, le Selenomonas ruminantium, le Nicotiana glutinosa etc.
(base de données KEGG (version 25. 0, janvier 2003), Y.
Yakatsuka et al., Journal of Bacteriology, vol. 182, pp.
6732-6741 (2000), Y.-S. Lee et Y. -D. Cho, The Biochemical Journal, vol. 360, pp. 657-665 (2001) ). Cependant, l'existence de l'enzyme s'est révélée incertaine dans les bactéries utilisant du méthanol.
Cependant, on connaît un procédé de production de Llysine utilisant une bactérie Methylophilus et comprenant la culture d'une souche mutante résistante à un analogue de lysine, tel que AEC (S-(2-aminoéthyl)-L-cystéine) ou une souche recombinante abritant un vecteur ayant de l'ADN portant des informations génétiques impliquées dans la biosynthèse de L-lysine (WOOO 61723). Toutefois, on ne connaît pas de gène codant pour la lysine décarboxylase
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dérivée des bactéries Methyldphilus et il n'a été signalé aucune production de L-lysine utilisant une bactérie Methylophilus dans laquelle l'expression d'un tel gène est supprimée ou éliminée.
Un objet de la présente invention est d'obtenir un gène de la lysine décarboxylase de Methylophilus methylotrophus, qui est une bactérie utilisant du méthanol et d'utiliser un tel gène afin de créer une bactérie produisant de la L-lysine appartenant au genre Methylophilus dans laquelle l'expression du gène de la lysine décarboxylase dans la cellule est supprimée. Un autre objet est de proposer un procédé de production de L-lysine en cultivant cette bactérie Methylophilus.
Un objet de la présente invention est de proposer une protéine sélectionnée parmi le groupe constitué de : (A) une protéine qui présente la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4 ; (B) une protéine qui présente la séquence d'acides aminés SEQ ID NO . 4 comprenant la substitution, la délétion, l'insertion ou l'addition d'un ou de plusieurs résidus d'acides aminés et présente une activité de lysine décarboxylase.
Un autre objet de la présente invention est de proposer un ADN codant pour la protéine décrite ci-dessus.
Un autre objet de la présente invention est de proposer l'ADN décrit ci-dessus, lequel ADN est sélectionné parmi le groupe constitué de : (a) un ADN qui présente la séquence de nucléotides des nucléotides 684 à 2930 dans la SEQ ID NO : 3 ; (b) un ADN qui peut être hybridé avec un ADN présentant la séquence de nucléotides des nucléotides 684 à 2930 dans la SEQ ID NO . 3 sous des conditions
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rigoureuses, et code pour une protéine ayant une activité de lysine décarboxylase.
Il est encore un autre objet de la présente invention de proposer l'ADN décrit ci-dessus qui est dérivé d'un chromosome d'une bactérie Methylophilus.
Il est encore un autre objet de la présente invention de proposer une bactérie Methylophilus qui soit capable de produire de la L-lysine et soit modifiée de telle sorte que l'activité de la lysine décarboxylase intracellulaire soit réduite ou éliminée.
Un autre objet de la présente invention est de proposer la bactérie Methylophilus décrite ci-dessus, dans laquelle un gène sur un chromosome ayant une séquence de nucléotides identique à l'ADN décrit est interrompu ou un gène sur un chromosome ayant une homologie avec l'ADN décrit ci-dessus à un degré tel qu'une recombinaison homologue avec l'ADN intervient est interrompu, l'expression du gène est ainsi supprimée et l'activité de la lysine décarboxylase intracellulaire est réduite ou éliminée.
Un autre objet de la présente invention est de proposer un procédé de production de L-lysine comprenant les étapes consistant à cultiver la bactérie Methylophilus décrite ci-dessus dans un milieu contenant du méthanol en tant que source principale de carbone afin de produire et d'accumuler de la L-lysine dans la culture et à recueillir la L-lysine à partir de la culture.
Selon la présente invention, il devient possible de proposer une nouvelle lysine décarboxylase et un gène codant pour cette enzyme. De plus, en cultivant une bactérie Methylophilus qui a la capacité de produire de
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la L-lysine et dans laquelle l'expression du gène est supprimée, la L-lysine peut être produite efficacement.
Les inventeurs de la présente invention menèrent des recherches afin de déterminer si la lysine décarboxylase existait dans les bactéries Methylophilus et, en conséquence, ils découvrirent un cadre ouvert de lecture (ci-après abrégé en orf ) ayant une homologie avec un gène connu de la lysine décarboxylase dérivé d'une séquence d'ADN du génome de Methylophilus methylotrophus.
Concernant l'homologie de la séquence d'acides aminés codée par le gène, une homologie (proportion d'acides aminés identiques) de 38,18 % par rapport au produit cadA de Escherichia coli (E. coli K12, NCBI : AAC77092) et une homologie de 37,85 % par rapport au produit 1dcC de cette même bactérie (E. coli K12, NBCI : AAC733297) furent découvertes. De plus, la séquence d'acides aminés codée par l'orf présentait également une homologie d'environ 38,11 % par rapport à l'arginine décarboxylase qui est le produit génétique de adiA de Escherichia coli (E. coli K12, NCBI : AAC77078), et le nouveau gène ldc fut donc identifié.
Par conséquent, les présents inventeurs tentèrent d'interrompre l'orf du Methylophilus methylotrophus afin d'analyser sa fonction. De ce fait, la souche obtenue ne se développa plus dans le milieu SEII, dans lequel une souche de type sauvage de Methylophilus methylotrophus peut généralement se développer. Il s'agit d'un résultat inattendu, car Escherichia coli et d'autres bactéries ne présentent pas d'auxotrophie particulière, même si cadA et 1dcC sont délétés.
Du fait qu'il fut considéré qu'il existait un nutriment qui était devenu essentiel au Methylophilus
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methylotrophus en raison de la déficience de l'orf et n'était pas contenu dans les composants du milieu SEII, de la cadavérine, qui est un produit de dégradation de la L-lysine, ou de l'agmatine, qui est un produit de dégradation de la L-arginine, furent ajoutés au milieu de la manière appropriée. En conséquence, la souche ne présentant pas d'orf fut capable de se développer dans le milieu.
Par conséquent, il fut découvert que dans le Methylophilus methylotrophus la protéine codée par cet orf était essentielle à la croissance dans un milieu minimal typique et que de la cadavérine ou de l'agmatine étaient nécessaires à la croissance d'une souche ne présentant pas cet orf. Sur la base de ce qui précède, le gène contenant cet orf fut appelé un gène ldc.
De plus, lorsque l'expression du gène 1dc fut supprimée dans une souche produisant de la L-lysine qui fut cultivée à partir de Methylophilus methylotrophus, la production de L-lysine fut améliorée et la présente invention fut ainsi réalisée.
Ci-après, la présente invention sera expliquée en détails.
Lysine décarboxylase de la présente invention et ADN codant pour celle-ci
La lysine décarboxylase de la présente invention est une protéine définie dans les paragraphes (A) ou (B) suivants : (A) une protéine qui présente la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 4 ; (B) une protéine qui présente la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 4 comprenant la substitution, la
La lysine décarboxylase de la présente invention est une protéine définie dans les paragraphes (A) ou (B) suivants : (A) une protéine qui présente la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 4 ; (B) une protéine qui présente la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 4 comprenant la substitution, la
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délétion, l'insertion ou l'addition d'un ou de plusieurs résidus d'acides aminés et présente une activité de lysine décarboxylase.
L'ADN de la présente invention code pour la protéine définie aux paragraphes (A) et (B) ci-dessus.
L'ADN de la présente invention (ci-après également appelé le gène ldc ) peut être isolé et obtenu à partir d'un ADN chromosomique d'une bactérie Methylophilus, par exemple Methylophilus methylotrophus.
Une souche de type sauvage de Methylophilus methylotrophus, la souche AS1 (NCIMB No. 10515), est disponible auprès du National Collections of Industrial and Marine Bacteria (adresse : NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Royaume-Uni).
Bien qu'un procédé de culture typique pour cette souche soit décrit dans le catalogue du NCIMB, elle peut également être cultivée dans le milieu SEII décrit dans les sections d'exemples.
L'ADN génomique de la souche AS1 peut être préparé par un procédé connu et un kit disponible dans le commerce afin de préparer le génome peut être utilisé.
L'ADN de la présente invention peut être obtenu en synthétisant des amorces sur la base de la séquence de nucléotides des nucléotides 684 à 2930 dans la SEQ ID NO : 3, puis en amplifiant l'ADN par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) en utilisant un ADN chromosomique d'une bactérie, telle qu'une bactérie Methylophilus methylotrophus, comme matrice. De plus, l'ADN de la présente invention peut également être obtenu par hybridation sur colonie en utilisant une sonde préparée sur la base de la séquence nucléotidique
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mentionnée précédemment ou un fragment partiel amplifié par PCR en tant que sonde.
Les techniques de préparation de la banque d'ADN génomique, l'hybridation, la PCR, la préparation d'ADN plasmique, la digestion et la ligature d'ADN, la transformation etc. utilisées afin de cloner l'ADN de la présente invention sont décrites dans Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, troisième édition (2001).
Des exemples des amorces utilisées pour la PCR mentionnée précédemment comprennent, de manière non exhaustive, des oligonucléotides de SEQ ID NOS : 1 et 2.
La séquence d'oligonucléotides du gène ldc isolé du génome de Methylophilus methylotrophus, qui fut obtenu ainsi que décrit ci-dessus, est représentée par le SEQ ID NO : 3. De plus, la séquence d'acides aminés de la lysine décarboxylase ainsi codée est représentée par la SEQ ID NO : 4.
De même que pour la séquence d'acides aminés mentionnée ci-dessus, on rechercha dans une banque de données connue les séquences d'acides aminés ayant une homologie avec celle-ci. En conséquence, deux types de lysine décarboxylases (codées par cadA et ldcC) et d'arginine décarboxylase (codée par adiA) de Escherichia coli présentaient des homologies de 38,18 %, 37,85 % et 38,11 %, respectivement, avec la séquence d'acides aminés mentionnée précédemment. Les homologies furent calculées comme les proportions des résidus d'acides aminés identiques par rapport au nombre total de résidus d'acides aminés des régions utilisées pour la comparaison.
L'ADN de la présente invention peut coder pour une séquence d'acides aminés comprenant la substitution, la
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délétion, l'insertion ou l'addition d'un ou de plusieurs résidus d'acides aminés à une ou plusieurs positions, dans la mesure où l'activité de la lysine décarboxylase codée n'est pas substantiellement dégradée. Le terme plusieurs tel qu'utilisé ici varie en fonction des positions des résidus d'acides aminés dans les structures tridimensionnelles de la protéine et des types d'acide aminé. Cependant, la séquence d'acides aminés peut être une séquence démontrant 70 % ou plus, de préférence 80 % ou plus, de préférence encore 90 % ou plus d'homologie avec la séquence entière d'acides aminés constituant la lysine décarboxylase et ayant l'activité de lysine décarboxylase. Précisément, plusieurs représente de préférence une valeur située entre 2 et 20, de préférence encore entre 2 et 10. L'activité de lysine décarboxylase mentionnée précédemment correspond à une activité de catalyse de la réaction produisant de la cadavérine par décarboxylation de la L-lysine.
Un ADN codant pour une protéine substantiellement identique à la lysine décarboxylase mentionnée précédemment peut être obtenu en modifiant la séquence de nucléotides représentée par SEQ ID NO : 3. Par exemple, une mutagenèse dirigée peut être utilisée de sorte qu'une substitution, une délétion, une insertion ou une addition d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés intervienne au niveau d'un site spécifique. De plus, un ADN modifié ainsi que décrit ci-dessus peut également être obtenu par des traitements de mutation conventionnels connus. Des exemples de ces traitements de mutation comprennent un procédé de traitement du gène ldc in vitro avec de l'hydroxylamine ou l'équivalent, un procédé de traitement d'un microorganisme, par exemple une bactérie Escherichia,
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contenant le gène ldc avec un rayonnement ultraviolet ou un agent de mutagenèse utilisé dans un traitement de mutation courant, tel que la N-méthyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidine (NTG) ou l'EMS.
La substitution, la délétion, l'insertion, l'addition, l'inversion ou l'équivalent de nucléotides décrite ci-dessus comprend également une mutation naturelle sur la base, par exemple, d'une différence individuelle ou d'une différence chez des espèces de microorganismes qui contiennent le gène ldc.
Un ADN codant pour substantiellement la même protéine que la lysine décarboxylase peut être obtenu en exprimant un ADN présentant une mutation tel que décrit ci-dessus dans une cellule appropriée et en examinant l'activité de la lysine décarboxylase exprimée. Un ADN codant pour substantiellement la même protéine que la lysine décarboxylase peut également être obtenu en isolant un ADN pouvant être hybridé avec un ADN présentant la séquence de nucléotides correspondant aux nucléotides 684 à 2930 de la séquence de nucléotides représentée par le SEQ ID NO : 3 ou une sonde qui peut être préparée à partir de la séquence de nucléotides sous des conditions rigoureuses et en codant une protéine ayant l'activité de la lysine décarboxylase à partir d'une cellule abritant le gène ldc ayant une mutation.
Les conditions rigoureuses comprennent des conditions sous lesquelles un hybride dit spécifique est formé et un hybride non spécifique n'est pas formé. Il est difficile d'exprimer clairement cette condition en utilisant une valeur numérique. Cependant, par exemple, les conditions rigoureuses comprennent une condition sous laquelle des ADN présentant une homologie élevée, par
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exemple des ADN présentant une homologie de 70 % ou plus, de préférence, de 80 % ou plus, de préférence encore de 90 % ou plus, de manière préférée entre toutes de 95 % ou plus, s'hybrident les uns avec les autres, et des ADN ayant une homologie inférieure à ce qui précède ne s'hybrident pas les uns avec les autres. En variante, les conditions rigoureuses comprennent une condition selon laquelle les ADN s'hybrident les uns avec les autres à une concentration en sel correspondant aux conditions de lavage typiques d'une hybridation de Southern, c'est-àdire 1 x SSC, 0,1 % de SDS, de préférence 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS, à 60 C.
Une séquence partielle du gène ldc peut également être utilisée comme sonde. Une telle sonde peut être produite par PCR en utilisant des oligonucléotides préparés sur la base de la séquence de nucléotides du gène comme des amorces et un fragment d'ADN contenant le gène comme une matrice en utilisant des procédés bien connus de l'homme du métier. Lorsqu'un fragment d'ADN d'une longueur d'environ 300 bp est utilisé comme sonde, les conditions de lavage de l'hybridation peuvent par exemple être de 50 C, 2 x SSC et 0,1 % de SDS.
L'activité de la lysine décarboxylase peut être mesurée par le procédé décrit dans Y.-S. Lee et Y. -D. Cho, The Biochemical Journal, vol. 360, pp. 656-665 (2001).
Outre pour la construction d'une souche interrompue par le gène ldc ainsi que décrit plus bas, le gène ldc de la présente invention peut être utilisé, par exemple, pour la production de la lysine décarboxylase de la présente invention. C'est-à-dire que la lysine décarboxylase peut être produite en introduisant le gène ldc chez un microorganisme hôte approprié afin de
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permettre l'expression du gène. Cela peut être réalisé de la même manière qu'avec un procédé courant de production d'une protéine utile par des techniques de recombinaison génétique. Cela signifie qu'un ADN codant pour la lysine décarboxylase peut être inséré dans un vecteur comprenant un promoteur approprié, un hôte tel que Escherichia coli peut être transformé avec le vecteur recombinant obtenu, et le transformant peut être cultivé afin de permettre l'expression du gène mentionné précédemment. Des exemples d'hôte comprennent, de manière non exhaustive, Escherichia coli, Bacillus subtilis, une levure, etc. Le promoteur peut être un promoteur quelconque qui fonctionne dans l'hôte utilisé et des exemples comprennent lac, trp, tac, trc, recA, T7 (Lecture of Biochemical Experiments, nouvelle édition, vol. 1, Protein, VI Synthesis and Expression, publié par la Japanese Biochemical Society, p. 166, Yasueda, Matsui, 1992, publié par Tokyo Kagaku Dojin), PGK, ADH1, GPD, MFâl, SUC2, PH05, GAL1, GAL4 (Lecture of Biochemical Experiments, nouvelle édition, vol. 1, Protein, VI Synthesis and Expression, publié par la Japanese Biochemical Society, p. 215, Sakai et al., 1992, publié par Tokyo Kagaku Dojin), etc.
La lysine décarboxylase peut être recueillie chez un microorganisme hôte de la même manière que celle utilisée pour la production d'une protéine recombinante ordinaire.
Bactérie Methylophilus de la présente invention
La bactérie de la présente invention est une bactérie Methylophilus ayant la capacité de produire de la L-lysine et étant modifiée de telle sorte que
La bactérie de la présente invention est une bactérie Methylophilus ayant la capacité de produire de la L-lysine et étant modifiée de telle sorte que
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l'activité de la lysine décarboxylase intracellulaire soit réduite ou éliminée.
Un exemple de bactérie Methylophilus est le Methylophilus methylotrophus. La capacité à produire de la L-lysine mentionnée dans la présente invention correspond à une capacité de la bactérie de la présente invention à provoquer l'accumulation d'une quantité significative de L-lysine dans un milieu lorsque la bactérie est cultivée dans ce milieu.
La réduction ou l'élimination de l'activité de la lysine décarboxylase intracellulaire est obtenue, par exemple, en supprimant l'expression du gène ldc. La réduction ou l'élimination de l'activité de la lysine décarboxylase intracellulaire peut également être obtenue en modifiant la structure de l'enzyme lysine décarboxylase codée par le gène afin de réduire ou d'éliminer l'activité spécifique de la lysine décarboxylase. Des exemples du procédé permettant d'obtenir une bactérie Methylophilus dans laquelle l'activité de la lysine décarboxylase intracellulaire soit réduite ou éliminée comprennent un procédé consistant à traiter une bactérie Methylophilus avec un rayonnement ultraviolet ou un agent de mutagenèse utilisé dans un traitement de mutagenèse ordinaire, tel que de la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) ou de l'EMS et à sélectionner une souche mutante présentant une activité de lysine décarboxylase réduite.
Un mode de réalisation préféré de la bactérie de la présente invention est une bactérie Methylophilus dans laquelle le gène ldc sur un chromosome est interrompu, l'expression du gène est donc supprimée et l'activité de la lysine décarboxylase intracellulaire est réduite ou
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éliminée. Le gène ldc mentionné dans ce mode de réalisation comprend un gène codant pour la lysine décarboxylase ayant la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 4 et un gène ayant une homologie avec ce gène à un tel degré qu'une recombinaison homologue intervient avec le gène ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4.
L'homologie mentionnée ci-dessus à un tel degré qu'une recombinaison homologue intervient est de préférence une homologie de 90 % ou plus, de préférence encore de 95 % ou plus, de manière particulièrement préférée de 99 % ou plus.
Le gène ldc sur un chromosome peut être interrompu par un procédé fondé sur la substitution génétique utilisant la recombinaison homologue (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972) ; Matsuyama, S. & Mizushima, S., J. Bacteriol., 162,1196 (1985)) ainsi que décrit dans les sections d'exemples. La capacité à provoquer une recombinaison homologue est une propriété que possèdent généralement les bactéries et les inventeurs de la présente invention découvrirent que la substitution génétique utilisant la recombinaison homologue était possible chez les bactéries Methylophilus. Précisément, une bactérie Methylophilus est transformée avec un ADN contenant le gène ldc modifié de manière à ne pas produire la lysine décarboxylase qui fonctionne normalement (gène 1dc de type délétion) et une recombinaison est provoquée entre le gène ldc de type délétion et le gène ldc sur un chromosome. Ensuite, si la recombinaison intervient à nouveau au niveau d'un site sur le chromosome auquel le plasmide est incorporé, le plasmide est éliminé du chromosome. Suivant le site au niveau duquel la recombinaison intervient, le gène de
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type délétion peut alors être fixé sur le chromosome, et le gène natif peut être éliminé du chromosome ainsi que le plasmide, ou le gène natif peut être fixé sur le chromosome, et le gène de type délétion peut être éliminé du chromosome ainsi que le plasmide. En sélectionnant une souche dans laquelle ce qui précède intervient, une souche dans laquelle le gène de type délétion est substitué au gène natif sur le chromosome peut être obtenu.
De plus, les inventeurs de la présente invention découvrirent également que, dans le Methylophilus methylotrophus, l'introduction d'un gène homologue à un gène souhaité sur un chromosome sous la forme d'un fragment d'ADN linéaire provoquait une recombinaison homologue sur le fragment d'ADN linéaire introduit dans la cellule, que la substitution génétique pouvait ainsi être obtenue, et qu'une telle technique pouvait également être appliquée. Un exemple de substitution génétique réalisée en utilisant cette technique est décrit dans les sections d'exemples.
Des exemples du gène ldc de type délétion mentionné plus haut comprennent des gènes dans lesquels une substitution, une délétion, une insertion, une addition ou une inversion d'un ou de plusieurs nucléotides sont provoquées dans la séquence de nucléotides de la région codante et l'activité spécifique de la protéine codée est ainsi réduite ou éliminée, ainsi que les gènes dont la portion interne ou la portion finale de la région codante est délétée, les gènes dans lesquels une autre séquence est insérée dans la région codante, etc. Des exemples d'autres séquences comprennent des gènes marqueurs, tels que le gène de résistance à la kanamycine.
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L'expression du gène ldc sur un chromosome peut également être réduite ou éliminée en introduisant une substitution, une délétion, une insertion, une addition ou une inversion d'un ou plusieurs nucléotides dans une séquence d'amorce du gène afin de réduire l'activité de l'amorce, supprimant ainsi l'expression du gène au niveau de la transcription (voir Rosenberg, M. & Court, D., Ann. Rev. Genetics, 13, p. 319 (1979) ; Youderian, P., Bouvier, S. & Sussking, M., Cell, 30, pp. 843-853 (1982)).
De plus, l'expression du gène ldc peut également être supprimée au niveau de la traduction en introduisant une substitution, une délétion, une insertion, une addition ou une inversion d'un ou de plusieurs nucléotides dans une région située entre la séquence SD et le codon de départ du gène (voir Dunn, J. J., BuzashPollert, E. & Studier, F. W., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 75, p. 2743 (1978)).
La modification d'un promoteur ou d'une région entre la séquence SD et le codon de départ décrite ci-dessus peut être réalisée de la même manière que pour la substitution génétique mentionnée plus haut. Une mutagenèse dirigée (Kramer, W. & Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154,350 (1987) ) et un traitement avec un agent chimique, tel que l'hyposulfite de sodium ou l'hydroxylamine (Shortle, D. et Nathans, D., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 75,270 (1978) ) peuvent être utilisés spécifiquement afin d'introduire une substitution, une délétion, une insertion, une addition ou une inversion de nucléotides dans un gène.
La mutagenèse dirigée est un procédé utilisant des oligonucléotides synthétiques qui peuvent introduire une substitution, une délétion, une insertion, une addition
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ou une inversion arbitraires dans des paires de bases spécifiques. Afin d'utiliser ce procédé, un plasmide abritant un gène souhaité qui est cloné et présente une séquence nucléotidique d'ADN connue est tout d'abord dénaturé afin de préparer un brin simple. Puis, un oligonucléotide synthétique complémentaire d'une région où on souhaite introduire une mutation est synthétisé.
Dans cette synthèse, la séquence de l'oligonucléotide synthétique n'est pas préparée comme une séquence totalement complémentaire, mais est préparée de manière à comprendre la substitution, la délétion, l'insertion, l'addition ou l'inversion d'un nucléotide ou de plusieurs nucléotides arbitraires. Ensuite, l'ADN simple brin et l'oligonucléotide synthétique comprenant la substitution, la délétion, l'insertion, l'addition ou l'inversion d'un nucléotide ou de plusieurs nucléotides arbitraires sont liés, et un plasmide double brin complet est synthétisé en utilisant un fragment de Klenow de l'ADN polymérase I et de la ligase T4 et est introduit dans des cellules compétentes de Escherichia coli. Certains des transformants obtenus ainsi que décrit ci-dessus auraient un plasmide contenant le gène dans lequel la substitution, la délétion, l'insertion, l'addition ou l'inversion d'un nucléotide ou de plusieurs nucléotides arbitraires est fixée. Un procédé semblable qui permet l'introduction d'une mutation dans un gène souhaité et permet donc la modification ou l'interruption du gène comprend le procédé de PCR recombinant (PCR Technology, Stockton Press (1989) ) .
En remplaçant le gène natif sur un chromosome d'une bactérie Methylophilus par le gène introduit avec une mutation et ainsi modifié ou interrompu tel que décrit
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ci-dessus, l'expression du gène ldc dans la cellule peut être supprimée.
La bactérie Methylophilus ayant une activité de lysine décarboxylase réduite ou éliminée est une bactérie Methylophilus ayant la capacité de produire de la Llysine. Une bactérie Methylophilus ayant la capacité de produire de la L-lysine, par exemple une souche de Methylophilus methylotrophus, peut être obtenue en soumettant une souche qui ne présente pas la capacité de produire de la L-lysine ou présente une faible capacité à produire de la L-lysine à un traitement de mutagenèse afin de lui conférer une résistance à un analogue de la L-lysine, tel que la S-(2-aminoéthyl)-L-cystéine (ciaprès désigné par AEC ). Des exemples du procédé pour le traitement de mutagenèse comprennent, de manière non exhaustive, des procédés de traitements de cellules de Escherichia coli avec un agent de mutagenèse chimique, tel que le NTG ou l'EMS ou avec une exposition à un rayonnement ultraviolet ou l'équivalent. Des exemples spécifiques de cette souche comprennent le Methylophilus methylotrophus AJ13608. Cette souche fut cultivée en conférant la résistance à l'AEC à la souche de Methylophilus methylotrophus AS1. Le Methylophilus methylotrophus AJ13608 fut déposé au National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (actuellement, l'agence administrative indépendante, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japon) le 10 juin 1999 et reçut le numéro d'accès FERM P- 17416. Puis, le dépôt fut transformé en un dépôt
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international selon les dispositions du traité de Budapest du 31 mars 2000 et reçut le numéro d'accès FERM BP-7112.
Un Methylophilus methylotrophus ayant la capacité de produire de la L-lysine peut également être cultivé en introduisant un ADN portant des informations génétiques impliquées dans la biosynthèse de L-lysine ou en améliorant l'expression de l'ADN avec une technique de recombinaison génétique. Le gène ou les gènes à introduire codent pour une enzyme de la voie biosynthétique de la L-lysine telle que la dihydrodipicolinate synthase et la succinyle diaminopimélate transaminase. Dans le cas d'un gène d'enzyme souffrant d'une rétro-inhibition par la L-lysine, telle que la dihydrodipicolinate synthase, il est préférable d'utiliser un gène mutant codant pour l'enzyme pour laquelle l'inhibition est désensibilisée.
De plus, une capacité à produire de la L-lysine peut également être améliorée en augmentant l'activité d'une protéine impliquée dans la sécrétion de L-lysine. Par exemple, comme protéine impliquée dans la sécrétion de Llysine, la protéine LysE codée par le gène lysE est connue (M. Viljic, H. Sahm et L. Eggeling, Molecular Microbiology 22, pp. 815-826 (1996) ; publication de brevet international W097 23597). Les inventeurs de la présente invention confirmèrent que même si un lysE de type sauvage dérivé des bactéries Brevibacterium ne fonctionnait pas du tout dans les bactéries Methylophilus, il pouvait être modifié afin de fonctionner dans les bactéries Methylophilus. Des exemples de ces variantes de la protéine LysE comprennent LysE24 décrite dans les sections d'exemples (voir US 2003 0124687-A1).
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La protéine LysE qui est codée par le gène lysE présente six régions hélicoïdales hydrophobes. On pense que certaines de ces régions hydrophobes sont des domaines transmembranaires. On pense également qu'une région située entre les troisième et quatrième régions par rapport à l'extrémité N-terminale est hydrophile et présente une structure en boucle. La séquence de nucléotides du lysE de type sauvage et la séquence d'acides aminés de la protéine LysE de Brevibacterium lactofermentum sont représentées par les SEQ ID NOS : 21 et 22. Dans cette séquence d'acides aminés, les régions hélicoïdales hydrophobes correspondent aux acides aminés 5-20,37-58, 67-93,146-168, 181-203 et 211-232. La région en boucle correspond aux acides aminés 94 à 145.
Les inventeurs de la présente invention découvrirent que le gène lysE était létal dans les bactéries Methylophilus, mais qu'un ADN codant pour une variante de la protéine LysE qui ne présentait pas la région en boucle ou n'était substantiellement constituée que des hélices hydrophobes augmentait la sécrétion de L-lysine à l'extérieur des cellules de bactérie utilisant du méthanol (US 2003 0124687 Al). Le lysE24 code pour cette protéine LysE mutante ne présentant pas la région en boucle mentionnée plus haut qui est contenue dans une protéine LysE de type sauvage ou qui n'est constituée substantiellement que des hélices hydrophobes.
La LysE mutante mentionnée ci-dessus n'est pas particulièrement limitée dans la mesure où elle présente une ou plusieurs hélices hydrophobes et, lorsqu'elle est exprimée dans une bactérie utilisant du méthanol, provoque une sécrétion accrue de L-lysine. Précisément, un ADN codant pour une LysE mutante qui possède toutes
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les hélices hydrophobes, de la première à la sixième, par rapport à l'extrémité N-terminale est englobée. Plus précisément, un ADN codant pour un peptide contenant les trois premières hélices hydrophobes par rapport à l'extrémité N-terminale et codant pour un peptide contenant les trois dernières hélices par rapport à l'extrémité N-terminale est englobé. Le lysE24 mentionné plus haut est un exemple du lysE mutant qui code pour un peptide contenant les trois premières hélices hydrophobes et pour un peptide contenant les trois dernières hélices hydrophobes. Le gène lysE24 est introduit par une mutation avec un codon stop en aval de la région codant pour la troisième hélice hydrophobe. Les inventeurs de la présente invention confirmèrent que si une région en aval de ce codon stop était délétée, le gène lysE24 mutant ne provoquait pas l'accumulation de L-lysine dans le milieu lorsqu'il était exprimé dans la souche de Methylophilus methylotrophus AS1. Par conséquent, on pense qu'un peptide contenant les trois premières hélices hydrophobes et un peptide contenant les trois dernières hélices hydrophobes sont traduits séparément et fonctionnent dans une bactérie Methylophilus. Les résultats indiquent que l'introduction du gène lysE24 dans une bactérie Methylophilus entraînera l'amélioration de la production de L-lysine.
Un microorganisme quelconque peut être utilisé afin de générer un ADN codant pour une protéine impliquée dans la sécrétion de L-lysine à l'extérieur d'une cellule, c'est-à-dire le gène lysE ou son gène homologue, dans la mesure où il possède une variante du gène qui peut exprimer l'activité de la L-lysine dans une bactérie utilisant du méthanol.
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Précisément, des exemples de ces microorganismes comprennent, de manière non exhaustive, une bactérie de type corynebactérie, telle que Corynebacterium glutamicum et Brevibacterium lactofermentum, des bactéries Escherichia telles que Escherichia coli, des bactéries Pseudomonas telles que Pseudomonas aerugina, des bactéries Mycobacterium telles que Mycobacterium tuberculosis, etc.
Afin d'augmenter l'expression du gène de sécrétion de L-lysine dans une bactérie utilisant du méthanol, le fragment de gène est ligaturé à un vecteur qui est capable de fonctionner dans une bactérie Methylophilus, de préférence un vecteur de type multicopie afin de préparer un ADN recombinant qui est ensuite utilisé afin de transformer la bactérie hôte utilisant du méthanol. En variante, le gène peut être incorporé dans un transposon et introduit dans un chromosome. De plus, un promoteur qui induit une transcription puissante dans une bactérie utilisant du méthanol peut être ligaturé en amont du gène.
Afin d'introduire un gène souhaité, tel qu'un gène de biosynthèse de L-lysine ou un gène de sécrétion de Llysine dans les bactéries Methylophilus et d'augmenter son expression, le gène peut être ligaturé à un vecteur pouvant se répliquer de manière autonome dans une cellule de bactéries Methylophilus afin de préparer un ADN recombinant qui est ensuite utilisé afin de transformer le Methylophilus methylotrophus, par exemple par électroporation. De plus, il est également possible d'incorporer un gène souhaité dans un chromosome hôte par un procédé utilisant une transduction, un transposon (D.E.
Berg, et C.M. Berg, Bio/Technol., 1, p. 417 (1983)), un phage Mu (brevet japonais mis à l'inspection publique
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(Kokai) No. 2 109985) ou une recombinaison homologue (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972) ) .
Les vecteurs pouvant se répliquer de manière autonome dans les bactéries Methylophilus comprennent, de manière non exhaustive, RSF1010, qui est un vecteur à large gamme d'hôtes et les dérivés de celui-ci, par exemple pAYC32 (Chistorardov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 16, pp. 161-167 (1986) ) et pMFY42 (Gène, 44, p.
53 (1990)), pBBRl et ceux dérivés des dérivés de celui-ci (Kovach, M.E., et al., Gène, 166, pp. 175-176 (1995)), pRK310 et ceux dérivés des dérivés de celui-ci (Edts, Murrell, J. C., et Dalton, H., Methane and methanol utilizers, Plenum Press, pp. 183-206 (1992) ), etc.
Une bactérie Methylophilus qui a la capacité de produire de la L-lysine et dans laquelle l'activité de lysine décarboxylase est réduite ou éliminée peut être obtenue en conférant la capacité de produire de la Llysine à une bactérie Methylophilus dans laquelle l'activité de lysine décarboxylase est réduite ou éliminée. De plus, une bactérie telle que mentionnée cidessus peut également être obtenue en modifiant une bactérie Methylophilus ayant la capacité de produire de la L-lysine de sorte que l'activité de lysine décarboxylase soit réduite ou éliminée.
Production de L-lysine
La culture de la bactérie Methylophilus dans laquelle l'activité de la lysine décarboxylase est réduite ou éliminée obtenue ainsi que décrit ci-dessus dans le milieu contenant du méthanol comme source principale de carbone entraîne la production d'une
La culture de la bactérie Methylophilus dans laquelle l'activité de la lysine décarboxylase est réduite ou éliminée obtenue ainsi que décrit ci-dessus dans le milieu contenant du méthanol comme source principale de carbone entraîne la production d'une
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quantité significative de L-lysine et l'accumulation de la L-lysine produite dans le milieu. Par conséquent, l'utilisation de la bactérie Methylophilus de la présente invention ayant la capacité de produire de la L-lysine dans laquelle l'activité de la lysine décarboxylase est réduite ou éliminée est efficace quant à l'amélioration de l'accumulation de L-lysine.
Le milieu utilisé pour la production de L-lysine est un milieu typique qui contient une source de carbone, une source d'azote, des ions inorganiques et d'autres nutriments organiques à l'état de traces selon les besoins. La principale source de carbone est le méthanol.
Cependant, des sucres, tels que le glucose, le lactose, le galactose, le fructose et de l'hydrolysat d'amidon, des alcools, tels que le glycérol et le sorbitol, et des acides organiques, tels que l'acide fumarique, l'acide citrique, l'acide succinique et l'acide pyruvique peuvent être utilisés ensemble. L'expression le méthanol est utilisé comme source principale de carbone signifie que la teneur en méthanol dans la source de carbone totale est de 50 % (M/M) ou plus, de préférence de 80 % (M/M) ou plus, de la source de carbone totale. Si le méthanol est utilisé comme source de carbone, la concentration de celui-ci est généralement située entre 0,001 % et 4 % (M/V) , de préférence entre 0,1 % et 2 % (M/V) . De plus, lorsque du glucose, etc. est ajouté, la concentration de celui-ci est généralement située entre 0,1 % et 3 % (M/M), de préférence entre 0,1 % et 1 % (M/V).
Comme source d'azote, des sels d'ammonium inorganiques, tels que du sulfate d'ammonium, du chlorure d'ammonium et du phosphate d'ammonium, une source d'azote
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organique, telle que de l'hydrolysat de soja, de l'ammoniac, de l'ammoniaque, etc. peuvent être utilisés.
Comme ions inorganiques (ou sources de ceux-ci), une faible quantité de phosphate de potassium, de sulfate de magnésium, d'ions fer, d'ions manganèse, etc. est ajoutée au milieu. Comme nutriments organiques à l'état de traces, de la vitamine B1, de l'extrait de levure, etc. peuvent être ajoutés au milieu dans des quantités appropriées.
La culture est de préférence mise en #uvre pendant environ 16 à 72 heures sous des conditions aérobies. La température de la culture est contrôlée de manière à se situer entre 25 C et 45 C et le pH est contrôlé de manière à se situer entre 5 et 8 au cours de la culture.
Des substances acides ou alcalines inorganiques ou organiques, de l'ammoniac, etc. peuvent être utilisés afin d'ajuster le pH.
Après la fin de la culture, la L-lysine peut être recueillie à partir d'un bouillon de fermentation, par exemple par des procédés typiques utilisant des résines échangeuses d'ions, un procédé de précipitation, etc. en combinaison.
Exemples
Ci-après, la présente invention sera expliquée plus en détails en faisant référence aux exemples non limitatifs suivants.
Ci-après, la présente invention sera expliquée plus en détails en faisant référence aux exemples non limitatifs suivants.
Exemple 1 : clonage du gène de la lysine décarboxylase (ldc) de Methylophilus methylotrophus
Afin d'obtenir un ADN chromosomique à partir de la souche sauvage de Methylophilus methylotrophus AS1, la souche AS1 fut inoculée dans 50 mL du milieu SEII
Afin d'obtenir un ADN chromosomique à partir de la souche sauvage de Methylophilus methylotrophus AS1, la souche AS1 fut inoculée dans 50 mL du milieu SEII
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(composition : 5, 0 g/L de (NH4)2SO4, 1, 9 g/L de K2HP04, 1,56 g/L de NaH2P04.2H20, 200 mg/L de MgS04.7H20, 72 mg/L de CaC12.6H20, 5 g/L de CuS04.5H20, 25 ug/L de MnS04.5H20, 23 ug/L de ZnS04.7H20, 9,7 mg/L de FeCl3.6H20, 0,5 % (V/V) de méthanol) et cultivée pendant la nuit à 37 C avec agitation. Puis, le bouillon de culture fut centrifugé afin de recueillir les cellules. Un ADN chromosomique fut préparé à partir des cellules obtenues en utilisant un kit disponible dans le commerce (Genomic DNA Purification Kit (produit par Edge Biosystems)) suivant le manuel d'utilisation joint.
L'ADN chromosomique fut utilisé comme une matrice avec les amorces d'ADN de SEQ ID NOS : 1 et 2 afin de mettre en #uvre une PCR (un cycle consistant en une dénaturation à 98 C pendant 10 secondes, un recuit à 55 C pendant 30 secondes, une extension à 72 C pendant 3 minutes fut répété pendant 25 cycles) . De la pyrobest polymérase (Takara Shuzo) fut utilisée. En conséquence, un fragment d'ADN ayant une taille d'environ 3,0 kilobases (ci-après abrégé par kbp ) fut obtenu.
Puis, le fragment obtenu fut séquence par le procédé décrit dans Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, troisième édition (2001). Il devint évident que la région du site de l'enzyme de restriction EcoRV au site de l'enzyme de restriction DdeI sur le fragment d'ADN présentait la séquence de nucléotides représentée par le SEQ ID NO : 3. Dans cette séquence d'ADN, un cadre ouvert de lecture (ci-après abrégé par orf ) codant la séquence d'acides aminés représentée par le SEQ ID NO : 4 était contenu. Cet orf fut appelé orf#3098. Le gène
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codant pour la séquence d'acides aminés représentée par le SEQ ID NO : 4 fut appelé le gène ldc.
Exemple 2 : Préparation de la souche de Methylophilus methylotrophus à gène 1dc interrompu (1) Préparation du fragment pour l'interruption du gène 1dc
L'ADN chromosomique obtenu dans l'exemple 1 fut utilisé comme une matrice ainsi que les amorces d'ADN représentées par les SEQ ID NOS : 5 et 6 afin de mettre en #uvre une PCR (conditions de réaction : du TaKaRa Ex Taq fut utilisé, un cycle constitué d'une dénaturation à 94 C pendant 30 secondes, d'un recuit à 60 C pendant 30 secondes et d'une réaction d'extension de brin d'ADN à 72 C pendant 2 minutes fut répété pendant 25 cycles), donnant ainsi un fragment d'environ 1,3 kb. Une PCR fut également mise en #uvre en utilisant les amorces représentées pas les SEQ ID NOS : 7 et 8 sous les mêmes conditions afin d'obtenir un fragment d'ADN ayant une taille d'environ 2,0 kb.
L'ADN chromosomique obtenu dans l'exemple 1 fut utilisé comme une matrice ainsi que les amorces d'ADN représentées par les SEQ ID NOS : 5 et 6 afin de mettre en #uvre une PCR (conditions de réaction : du TaKaRa Ex Taq fut utilisé, un cycle constitué d'une dénaturation à 94 C pendant 30 secondes, d'un recuit à 60 C pendant 30 secondes et d'une réaction d'extension de brin d'ADN à 72 C pendant 2 minutes fut répété pendant 25 cycles), donnant ainsi un fragment d'environ 1,3 kb. Une PCR fut également mise en #uvre en utilisant les amorces représentées pas les SEQ ID NOS : 7 et 8 sous les mêmes conditions afin d'obtenir un fragment d'ADN ayant une taille d'environ 2,0 kb.
Une PCR fut également mise en #uvre en utilisant le plasmide pKD4 (No. d'accès GenBank AY048743, Datsenko, K.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97 (12), 6640-6645 (2000)) comme une matrice et les amorces représentées par les SEQ ID NOS : 9 et 10 sous les mêmes conditions que mentionnées ci-dessus afin d'obtenir un fragment d'ADN contenant un gène de résistance à la kanamycine (Km') (environ 1,5 kb).
Les trois types de fragments d'ADN décrits ci-dessus furent mélangés et utilisés comme matrice ainsi que les amorces représentées par les SEQ ID NOS : 11 et 12 afin
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de mettre en #uvre une PCR (conditions de réaction : du TaKaRa Ex Taq fut utilisé, un cycle constitué d'une dénaturation à 94 C pendant 30 secondes, d'un recuit à 60 C pendant 30 secondes et d'une réaction d'extension de brin d'ADN à 72 C pendant 4 minutes et 30 secondes fut répété pendant 25 cycles), donnant ainsi un fragment d'environ 4,7 kb. Ce fragment contenait le gène ldc interrompu avec le gène de résistance à la kanamycine. Ce fragment fut purifié en utilisant un kit disponible dans le commerce (Wizard PCR Preps DNA Purification System produit par Promega), puis soumis à une précipitation à l'éthanol et les précipités furent dissous dans une solution de TE (10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM d'une solution d'EDTA). Cette solution d'ADN fut utilisée dans l'opération suivante comme un fragment pour l'interruption génétique.
(2) Acquisition de la souche de Methylophilus methylotrophus à gène ldc déficient
Puis, le fragment de gène pour l'interruption génétique décrite ci-dessus fut introduit dans la souche de Methylophilus methylotrophus AS1. Le procédé d'électroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)) fut utilisé pour la transformation. La procédure spécifique fut la suivante.
Puis, le fragment de gène pour l'interruption génétique décrite ci-dessus fut introduit dans la souche de Methylophilus methylotrophus AS1. Le procédé d'électroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)) fut utilisé pour la transformation. La procédure spécifique fut la suivante.
La souche de Methylophilus methylotrophus AS1 fut cultivée dans le milieu liquide SEII (concentration en méthanol : 0,5 % (V/V)) à 37 C pendant 16 heures avec agitation et 20 ml du bouillon de culture furent centrifugés à 10000 tr/mn pendant 10 minutes afin de recueillir les cellules. Les cellules furent ajoutées à 1 mM de tampon HEPES (pH 7,2, 20 ml), suspendues dans
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celui-ci et centrifugées, et cette opération fut réalisée deux fois. Finalement, 1 ml du même tampon fut ajouté aux cellules afin de préparer une suspension de cellules et celles-ci furent utilisées comme cellules à modifier pour l'électroporation. Puis, environ 1 pg du fragment d'ADN mentionné ci-dessus contenant le gène ldc interrompu avec le gène de résistance à la kanamycine (1dc ; KmR) fut ajouté à 100 pl des cellules à modifier et des impulsions électriques furent appliquées avec des conditions de 18,5 kV/cm, 25 pF et 200 U afin de procéder à une électroporation et ainsi introduire le fragment d'ADN dans les cellules. Le milieu liquide SEII fut immédiatement ajouté à cette suspension de cellules et les cellules furent cultivées à 37 C pendant 3 heures.
Ensuite, ce bouillon de culture fut appliqué au milieu d'agar SEII contenant 20 pg/ml de kanamycine et incubé à 37 C. Après une culture de 48 heures, plusieurs dizaines de colonies apparurent sur la plaque. Parmi celles-ci, 20 souches furent sélectionnées au hasard et l'interruption du gène souhaité dans ces souches fut confirmée par un procédé de détection fondé sur le procédé de PCR. C'est-à-dire que les colonies mentionnées ci-dessus qui apparurent furent chacune suspendues dans 20 l d'eau stérilisée, à laquelle on ajouta 5 pl de Protéinase K à 1 mg/ml et 25 pm d'une solution P (solution contenant 40mM de Tris, 0,5 % de Tween 20,1 % de Nonidet P-40, 1 mM d'EDTA (ajusté à un pH de 8,0 avec du HC1)), agitées et incubées à 60 C pendant 20 minutes et à 95 C pendant 5 minutes. Ce mélange de réaction fut utilisé comme une matrice ainsi que les amorces représentées par les SEQ ID NOS : 11 et 12 afin de réaliser une PCR (conditions de réactions : du TaKaRa Ex
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Taq fut utilisé, un cycle constitué d'une dénaturation à 94 C pendant 30 secondes, d'un recuit à 60 C pendant 30 secondes et d'une réaction d'extension de brin d'ADN à 72 C pendant 4 minutes et 30 secondes fut répété pendant 25 cycles), confirmant ainsi l'interruption du gène souhaité. En conséquence, il fut découvert que 10 souches étaient les souches avec le gène interrompu souhaité. Une souche parmi celles-ci fut donc appelée la souche DLC10 (souche MLDC) et utilisée dans les expériences suivantes.
(3) Phénotype de la souche à gène 1dc déficient
La souche DLC10 préparée dans le paragraphe (2) cidessus était une souche sélectionnée comme une souche qui pouvait se développer sur le milieu d'agar SEII contenant de la kanamycine. Cependant, il fut découvert qu'elle ne pouvait pas continuer à se développer lorsqu'elle était soumise à une sous-culture sur le même milieu d'agar. Par conséquent, on chercha à savoir si l'inhibition de la croissance pouvait être complémentée par l'addition de cadavérine (CAD) et d'agmatine (AGM), qui sont des produits de réaction de la lysine décarboxylase (LDC) et de l'arginine décarboxylase (ADC), respectivement, au milieu.
La souche DLC10 préparée dans le paragraphe (2) cidessus était une souche sélectionnée comme une souche qui pouvait se développer sur le milieu d'agar SEII contenant de la kanamycine. Cependant, il fut découvert qu'elle ne pouvait pas continuer à se développer lorsqu'elle était soumise à une sous-culture sur le même milieu d'agar. Par conséquent, on chercha à savoir si l'inhibition de la croissance pouvait être complémentée par l'addition de cadavérine (CAD) et d'agmatine (AGM), qui sont des produits de réaction de la lysine décarboxylase (LDC) et de l'arginine décarboxylase (ADC), respectivement, au milieu.
Un milieu constitué de 4 ml de milieu SEII liquide contenant 20 pg/ml de kanamycine et auquel on ajouta de la cadavérine ou de l'agmatine à une concentration de 1 g/1 fut préparé. Puis, la souche DLC10 mentionnée plus haut fut inoculée au milieu et cultivée à 37 C avec agitation à 116 tr/mn, et la croissance fut examinée. En conséquence, il fut découvert que la souche DLC10 ne pouvait pas se développer sur le milieu qui ne présentait pas de cadavérine ni d'agmatine, tandis que la souche
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pouvait se développer sur le milieu contenant l'une de ces substances. De plus, l'addition de cadavérine montra un meilleur effet de restauration de la croissance comparée à l'addition d'agmatine.
(4) Confirmation de la complémentation de la souche à ldc déficient par l'introduction de l'orf#3098
On vérifia que l'auxotrophie de la cadavérine pour la croissance de la souche à ldc déficient mentionnée cidessus pouvait être complémentée par l'introduction de l'orf #3098 obtenu dans l'exemple 1. Tout d'abord, un plasmide destiné à introduire de l'ADN ne contenant que l'orf #3098 dans la souche à ldc déficient fut préparé.
On vérifia que l'auxotrophie de la cadavérine pour la croissance de la souche à ldc déficient mentionnée cidessus pouvait être complémentée par l'introduction de l'orf #3098 obtenu dans l'exemple 1. Tout d'abord, un plasmide destiné à introduire de l'ADN ne contenant que l'orf #3098 dans la souche à ldc déficient fut préparé.
L'ADN chromosomique décrit dans l'exemple 1 fut utilisé comme matrice, ainsi que les amorces d'ADN ayant la séquence représentée par les SEQ ID NOS : 13 et 14 (le site Sse8371 fut ligaturé à l'extrémité 5') afin de réaliser une PCR (conditions de la réaction d'amplification : une Pyrobest ADN polymérase produite par Takara Shuzo fut utilisé, un cycle constitué d'une dénaturation à 98 C pendant 10 secondes, d'un recuit à 55 C pendant 30 secondes et d'une réaction d'extension de brin d'ADN à 72 C pendant 3 minutes fut répété pendant 25 cycles). Le fragment d'ADN obtenu ayant un site d'environ 3 kb fut digéré par l'enzyme de restriction Sse83871 (Takara Shuzo). Ce fragment d'ADN fut ligaturé avec le vecteur pRStac digéré de la même manière avec Sse8371, puis soumis à un traitement de déphosphorylation (un kit de ligature Ver. 2 produit par Takara Shuzo fut utilisé). Le plasmide portant l'orf #3098 (dans la direction avant par rapport au promoteur
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tac) préparé ainsi que décrit ci-dessus fut appelé pRSorf#3098.
Le pRStac fut construit en introduisant le promoteur tac dans un plasmide pRS connu (voir la publication de brevet international en japonais (Kohyo) No. 3 501682). pRS est un plasmide ayant le segment de vecteur du plasmide pVIC40 (publication de brevet international W090 04636, publication de brevet international en japonais No. 3 501682) et obtenu à partir de pVIC40 en délétant une région d'ADN codant pour l'opéron de thréonine contenu dans le plasmide. Le plasmide pVIC40 est dérivé d'un vecteur plasmidique à large gamme d'hôtes pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y. D., Plasmid, 1986,16, 161-167), qui est un dérivé de RSF1010.
Tout d'abord, le plasmide pRStac possédant le promoteur tac fut construit à partir de pRS. Le vecteur pRS fut digéré avec les enzymes de restriction EcoRi et PstI et ajouté à une solution de phénol/chloroforme, puis mélangé afin de terminer la réaction. Après que le mélange de réaction fut centrifugé, la couche supérieure fut recueillie et les ADN furent recueillis par précipitation à l'éthanol et séparés sur du gel d'agarose à 0,8 %. Un fragment d'ADN de 8 kilopaires de bases fut recueilli en utilisant un EASY TRAP Ver. 2 (kit de collection d'ADN, Takara Shuzo). Par ailleurs, la région du promoteur tac fut amplifiée par PCR en utilisant le plasmide pKK223-3 (vecteur d'expression, Pharmacia) comme matrice et les amorces représentées par les SEQ ID NOS : 17 et 18 (un cycle constitué d'une dénaturation à 94 C pendant 20 secondes, d'un recuit à 55 C pendant 30 secondes et d'une réaction d'extension à 72 C pendant 60 secondes fut répété pendant 30 cycles). De la Pyrobest
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DNA polymérase (Takara Shuzo) fut utilisée pour la PCR. Le fragment d'ADN contenant le promoteur tac amplifié fut purifié en utilisant une PCR prép. (Promega), puis digéré au niveau des sites de l'enzyme de restriction préparés au préalable dans les amorces, c'est-à-dire au niveau des sites EcoRI et EcoT221. Ensuite, le mélange de réaction fut ajouté à une solution de phénol/chloroforme et mélangé afin de terminer la réaction. Après que le mélange de réaction fut centrifugé, la couche supérieure fut recueillie et les ADN furent recueillis par précipitation à l'éthanol et séparés sur un gel d'agarose à 0,8 %. Un fragment d'ADN d'environ 0,15 kbp fut recueilli en utilisant un EASY TRAP Ver. 2.
Le produit de digestion du vecteur pRS préparé ainsi que décrit ci-dessus et la région du promoteur tac furent ligaturés en utilisant un kit de ligature d'ADN Ver. 2 (Takara Shuzo). Cette solution de réaction de ligature fut utilisée afin de transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E. coli JM109, Takara Shuzo).
Les cellules furent déposées sur un milieu d'agar LB contenant 20 mg/L de streptomycine et incubées pendant la nuit à 37 C. Les colonies qui apparurent sur le milieu d'agar furent chacune incubées dans un milieu liquide de LB contenant 20 mg/L de streptomycine et cultivées à 37 C pendant 8 heures avec agitation. L'ADN plasmidique fut extrait de chaque bouillon de culture par le procédé à l'alkali-SDS et la structure de chaque plasmide fut confirmée par digestion avec des enzymes de restriction afin d'obtenir pRStac. Un plasmide dans lequel les directions de transcription du gène de résistance à la streptomycine sur le vecteur pRS et du promoteur tac
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furent identiques l'une à l'autre fut sélectionné comme pRStac.
En utilisant le plasmide pRS-orf#3098 préparé ainsi que décrit ci-dessus ou pRStac comme plasmide de contrôle, la souche DLC10 fut transformée par électroporation et sélectionnée sur le milieu d'agar SEII (contenant 20 ug/ml de kanamycine, 50 ug/ml de streptomycine et 1 g/1 de cadavérine).
Lorsque la souche DLC10/pRS-orf#3098 sélectionnée fut inoculée dans le milieu d'agar SEII ne contenant pas de cadavérine (contenant 20 ug/ml de kanamycine et 50 ug/ml de streptomycine), la croissance de la souche introduite de pRStac-orf#3098 fut possible, tandis que la souche DLC10/pRStac comme souche de contrôle ne put pas se développer. De plus, les plasmides furent extraits de la souche DLC10/pRS-orf#3098 en utilisant un Wizard Minipreps produit par Promega et confirmés par électrophorèse. En conséquence, il fut confirmé que la souche abritait le plasmide souhaité et il fut ainsi découvert que la protéine codée par orf#3098 sur le plasmide agissait en trans et que la complémentation était donc atteinte. On peut considérer que les résultats ci-dessus indiquaient que la déficience d'orf#3098 ellemême conférait à la cadavérine une auxotrophie pour la croissance de la souche.
Exemple 3 : Complémentation de la déficience d'orf#3098 dans la bactérie Methylophilus methylotrophus par l'introduction du gène ldcC dérivé de E. coli
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(1) Préparation du plasmide portant le gène ldcC dérivé de E.coli
Afin de déterminer si un gène ldcC dérivé de E. coli pouvait complémenter l'auxotrophie de la cadavérine de la souche DLC10 pour la croissance, un plasmide portant ldcC dérivé de E.coli fut tout d'abord préparé. La souche E. coli W3110 fut cultivée pendant la nuit à 37 C dans le milieu LB (10 g/1 de trypton, 5 g/1 d'extrait de levure, 10 g/1 de NaCl) et un ADN chromosomique fut préparé à partir des cellules obtenues en utilisant un kit de purification d'ADN génomique produit par Edge BioSystems.
Afin de déterminer si un gène ldcC dérivé de E. coli pouvait complémenter l'auxotrophie de la cadavérine de la souche DLC10 pour la croissance, un plasmide portant ldcC dérivé de E.coli fut tout d'abord préparé. La souche E. coli W3110 fut cultivée pendant la nuit à 37 C dans le milieu LB (10 g/1 de trypton, 5 g/1 d'extrait de levure, 10 g/1 de NaCl) et un ADN chromosomique fut préparé à partir des cellules obtenues en utilisant un kit de purification d'ADN génomique produit par Edge BioSystems.
Cet ADN chromosomique fut utilisé comme une matrice avec les amorces d'ADN (le site Pstl fut ligaturé au côté Nterminal) ayant les séquences représentées pas les SEQ ID NOS : 15 et 16 (J. Bacteriol., 179 (14), 4486-4492 (1997)) afin de réaliser une PCR (conditions de réaction d'amplification : de la Pyrobest ADN polymérase produite par Takara Shuzo fut utilisée, un cycle constitué d'une dénaturation à 98 C pendant 10 secondes, d'un recuit à 60 C pendant 30 secondes et d'une réaction d'extension de brin d'ADN à 72 C pendant 2 minutes fut répété pendant 25 cycles). Le fragment d'ADN obtenu ayant une taille d'environ 2,3 kb fut digéré avec l'enzyme de restriction Pstl (Takara Shuzo). De manière séparée, le vecteur pRStac fut digéré avec la Sse83871, puis soumis à un traitement de déphosphorylation et ligaturé avec le fragment de PCR mentionné plus haut (un kit de ligature Ver. 2 produit par Takara Shuzo fut utilisé). Le plasmide portant ldcC de E.coli préparé ainsi que décrit plus haut fut appelé pRS-ldcC-F (portant ldcC dans la direction avant par rapport au promoteur tac) ou pRS-ldcC-R
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(portant ldcC dans la direction inverse par rapport au promoteur tac).
(2) Confirmation de la complémentation de la déficience d'orf#3098 de la souche DLC10 par LDC dérivé de E.coli
La souche DLC10 fut transformée avec chacun des deux plasmides préparés ainsi que décrit ci-dessus par électroporation, et les transformants furent sélectionnés sur le milieu d'agar SEII (contenant 20 ug/ml de kanamycine, 50 g/ml de streptomycine et 1 g/1 de cadavérine). En conséquence, aucun transformant ne put être obtenu avec pRStac-ldcC-F, et un transformant ne put être obtenu qu'avec pRStac-ldcC-R.
La souche DLC10 fut transformée avec chacun des deux plasmides préparés ainsi que décrit ci-dessus par électroporation, et les transformants furent sélectionnés sur le milieu d'agar SEII (contenant 20 ug/ml de kanamycine, 50 g/ml de streptomycine et 1 g/1 de cadavérine). En conséquence, aucun transformant ne put être obtenu avec pRStac-ldcC-F, et un transformant ne put être obtenu qu'avec pRStac-ldcC-R.
Cette souche DLC10/pRStac-ldcC-R fut appliquée au milieu d'agar SEII ne contenant pas de cadavérine (contenant 20 ug/ml de kanamycine et 50 ug/ml de streptomycine), et il fut confirmé que la souche DLC10/pRStac-ldcC-R pouvait se développer, tandis que la souche DLC10/pRS-tac comme souche de contrôle ne pouvait pas se développer. Ce résultat indique que la LDC (lysine décarboxylase) de E. coli pouvait complémenter l'auxotrophie de la cadavérine de la souche à orf#3098 déficient de Methylophilus methylotrophus.
Exemple 4 : Production de L-lysine par la souche de Methylophilus methylotrophus à orf#3098 (gène ldc) interrompu (1) Construction du plasmide pRSlysE24 pour la production de L-lysine
Afin d'introduire le gène lysE qui code pour une protéine montrant une activité excrétant de la lysine
Afin d'introduire le gène lysE qui code pour une protéine montrant une activité excrétant de la lysine
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dans une Corynebacterium glutamicum dans une bactérie Methylophilus, un plasmide pRSlysE24 pour l'expression de lysE fut construit en utilisant le pRStac mentionné cidessus.
Le pRStac préparé dans l'exemple 2, (4) fut digéré avec la Sse83871 (Takara Shuzo) et SapI (New England Biolabs) et ajouté à une solution de phénol/chloroforme et mélangé afin de terminer la réaction. Après que le mélange de réaction fut centrifugé, la couche supérieure fut recueillie et les ADN furent recueillis par précipitation à l'éthanol et séparés sur un gel d'agarose à 0,8 % afin d'obtenir un fragment d'ADN d'environ 9,0 kbp.
Le fragment de gène lysE fut également amplifié par PCR en utilisant un chromosome extrait de la souche Brevibacterium lactofermentum 2556 (ATCC 13869) comme matrice et les amorces représentées par les SEQ ID NOS : 19 et 20 (dénaturation à 94 C pendant 20 secondes, recuit à 55 C pendant 30 secondes et réaction d'extension à 72 C pendant 90 secondes). De la Pyrobest ADN polymérase (Takara Shuzo) fut utilisée pour la PCR.
Le fragment obtenu fut purifié en utilisant une PCR prép.
(Promega), puis digéré avec les enzymes de restriction Sse83871 et SapI. Le mélange de réaction fut ajouté à une solution de phénol/chloroforme et mélangé afin de terminer la réaction. Après que le mélange de réaction fut centrifugé, la couche supérieure fut recueillie et les ADN furent recueillis par précipitation à l'éthanol, purifiés sur un gel d'agarose à 0,8 % et recueillis.
Le produit de digestion du vecteur pRStac et le fragment de la région du gène lyse préparé ainsi que décrit plus haut furent ligaturés en utilisant un kit de
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ligature d'ADN Ver. 2 (Takara Shuzo). Cette solution de réaction de ligature fut utilisée afin de transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E. coli JM109, Takara Shuzo). Les cellules furent déposées sur un milieu d'agar LB contenant 20 mg/L de streptomycine et incubées pendant la nuit à 37 C. Les colonies qui apparurent sur le milieu d'agar furent chacune inoculées dans le milieu liquide LB contenant 20 mg/L de streptomycine et cultivées à 37 C pendant 8 heures avec agitation. Un ADN plasmique fut extrait de chaque bouillon de culture par le procédé à l'alkali-SDS et la structure du plasmide fut confirmée par digestion avec des enzymes de restriction et détermination de la séquence de nucléotides afin d'obtenir la pRSlysE. Dans la pRSlysE, le gène lysE fut positionné de telle sorte que sa direction de transcription soit la même que celle du promoteur tac.
La pRSlysE obtenu ainsi que décrit ci-dessus fut introduite dans une souche de Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB10515) par électroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43,197 (1997)). En conséquence, un transformant put à peine être obtenu. De plus, lorsque des séquences de nucléotides de plasmides extraits de plusieurs souches qui pourraient former des colonies furent examinées, une mutation fut introduite dans le gène lysE. Et lorsque les colonies furent cultivées, la L-lysine ne s'accumula pas dans les surnageants de culture. Cependant, lorsque de nombreuses colonies furent encore examinées, un gène lysE de type mutant qui pouvait conférer une capacité à produire de la L-lysine à des bactéries Methylophilus, c'est-à-dire qui pouvait fonctionner, put être obtenu par l'analyse de la pRSlysE introduite avec une mutation.
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Ce gène lyse mutant fut appelé gène lysE24. La séquence de nucléotides du gène lysE24 fut analysée et il fut découvert que la mutation n'entraînait pas une substitution d'acides aminés, mais une mutation non-sens introduisant un codon stop autour du centre de la région de traduction du lysE. La séquence de nucléotides du gène lysE de type sauvage et la séquence d'acides aminés codés par celle-ci sont représentées par les SEQ ID NOS : 21 et 22. Dans lysE24, une T (thymine) fut insérée après une G (guanine) à la position 355 du gène lysE de type sauvage représenté par le SEQ ID NO . 21. La séquence de nucléotides de lysE24 et la séquence d'acides aminés codée par celle-ci sont représentées par les SEQ ID NOS : 23 et 24. Le plasmide portant lysE24 fut appelé pRSlysE24.
(2) Préparation du plasmide pRSdapA possédant le gène dapA
On prépara un plasmide possédant un gène codant pour la dihydrodipicolinate synthase qui ne fut pas soumis à une rétro-inhibition par la L-lysine (dapA+) en tant que gène pour l'enzyme du système de biosynthèse de L-lysine.
On prépara un plasmide possédant un gène codant pour la dihydrodipicolinate synthase qui ne fut pas soumis à une rétro-inhibition par la L-lysine (dapA+) en tant que gène pour l'enzyme du système de biosynthèse de L-lysine.
La pRStac préparée dans l'exemple 2, (4) fut digérée avec Sse83871 et Xbal, ajoutée à une solution de phénol/chloroforme et mélangée à celle-ci afin de terminer la réaction. Après que le mélange de réaction fut centrifugé, la couche supérieure fut recueillie et les ADN furent recueillis par précipitation à l'éthanol et séparés sur un gel d'agarose à 0,8 % afin de recueillir un fragment d'ADN d'environ 9 kbp.
Le plasmide RSFD80 connu (voir W090 16042) contenant ce gène fut utilisé comme une matrice afin d'amplifier dapA* par PCR en utilisant les amorces représentées par
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les SEQ ID NOS : 25 et 26 (dénaturation à 94 C pendant 20 secondes, recuit à 55 C pendant 30 secondes et réaction d'extension à 72 C pendant 60 secondes). De la Pyrobest ADN polymérase (Takara Shuzo) fut utilisée pour la PCR. Le fragment dapA* obtenu fut purifié en utilisant une PCR prép. (Promega), puis digéré avec les enzymes de restriction Sse83871 et XbaI. Le mélange de réaction fut ajouté à une solution de phénol/chloroforme et mélangé afin de terminer la réaction. Après que le mélange de réaction fut centrifugé, la couche supérieure fut recueillie et les ADN furent recueillis par précipitation à l'éthanol et séparés sur un gel d'agarose à 0,8 % afin de recueillir un fragment d'ADN d'environ 0,1 kbp.
Le produit de digestion du vecteur pRStac et le fragment de la région génétique dapA* préparé ainsi que décrit plus haut furent ligaturés en utilisant un kit de ligature d'ADN Ver. 2 (Takara Shuzo). Cette solution de réaction de ligature fut utilisée afin de transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E. coli JM109, Takara Shuzo). Les cellules furent déposées sur un milieu d'agar LB contenant 20 mg/L de streptomycine et incubées pendant la nuit à 37 C. Les colonies qui apparurent sur le milieu d'agar furent chacune inoculées dans le milieu liquide LB contenant 20mg/L de streptomycine et cultivées à 37 C pendant 8 heures avec agitation. Un ADN plasmique fut extrait du bouillon de culture par le procédé à l'alkali-SDS et la structure du plasmide fut confirmée par digestion avec des enzymes de restriction et détermination de la séquence de nucléotides afin d'obtenir un plasmide pRSdapA. Dans le plasmide pRSdapA, le gène dapA* fut positionné de telle sorte que sa
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direction de transcription soit la même que celle du promoteur tac.
(3) Construction du plasmide pRSlysEdapA possédant le gène lysE24 et le gène dapA*
Un plasmide constitué du plasmide pRSlysE24 dans lequel on inséra le gène dapA* fut construit afin d'évaluer l'effet de la combinaison de lysE24 et de dapA*.
Un plasmide constitué du plasmide pRSlysE24 dans lequel on inséra le gène dapA* fut construit afin d'évaluer l'effet de la combinaison de lysE24 et de dapA*.
Le pRSlysE24 préparé dans l'exemple 4, (1) fut digéré avec une enzyme de restriction SapI et coupé franchement aux extrémités en utilisant un DNA Blunting Kit (Takara Shuzo). De plus, le plasmide pRSdapA préparé dans l'exemple 4, (2) fut digéré avec les enzymes de restriction EcoRI et SapI, et un fragment d'environ 1 kbp contenant le promoteur tac et la région dapA* fut séparé sur un gel d'agarose de 0,8 %. Ce fragment fut recueilli en utilisant un EASY TRAP Ver. 2 (Takara Shuzo). Ce fragment fut coupé franchement aux extrémités ainsi que décrit précédemment et ligaturé au produit de digestion de pRSlysE24 mentionné plus haut en utilisant un kit de ligature d'ADN Ver. 2 (Taraka Shuzo).
La solution de réaction de ligature mentionnée cidessus fut utilisée afin de transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E. coli JM109, Taraka Shuzo).
Les cellules furent déposées sur un milieu d'agar LB contenant 20 mg/L de streptomycine et incubées pendant la nuit à 37 C. Les colonies qui apparurent sur le milieu d'agar furent chacune inoculées dans un milieu liquide de LB contenant 20 mg/L de streptomycine et cultivées à 37 C pendant 8 heures avec agitation. L'ADN plasmique fut extrait de ce bouillon de culture par le procédé à l'alkali-SDS, et la structure du plasmide fut confirmée
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par digestion avec des enzymes de restriction et détermination de la séquence des nucléotides afin d'obtenir un plasmide pRSlysEdapA. Dans ce plasmide, le gène lysE24 et le gène dapA* furent placés de sorte que leur direction de transcription soit la même.
La souche E. coli JM109 transformée avec le plasmide pRSlysEdapA fut appelée AJ13832, et cette souche fut déposée auprès de l'agence administrative indépendant, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary le 4 juin 2001 et reçut le numéro d'accès FERM P-18371. Puis, le dépôt fut transformé en un dépôt international sous les dispositions du traité de Budapest le 13 mai 2002 et reçut le numéro d'accès FERM BP-8042.
(4) Introduction du plasmide produisant la L-lysine dans la souche à orf#3098 (ldc) déficient de Methylophilus methylotrophus et production de L-lysine
L'influence de la déficience du gène ldc sur la production de L-lysine du Methylophilus methylotrophus fut étudiée. Tout d'abord, du fait que la souche DLC10 préparée dans l'exemple 2 fut préparée à partir d'une souche de type sauvage, la capacité de production de Llysine ne fut pas modifiée. Par conséquent, afin de vérifier effectivement l'influence de la déficience du ldc sur la production de L-lysine, une souche à ldc interrompu fut produite à partir de la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 introduite avec pRSlysEdapA de la même manière que celle de l'exemple 2, (2). La souche obtenue fut appelée une souche DLC12/pRSlysEdapA.
L'influence de la déficience du gène ldc sur la production de L-lysine du Methylophilus methylotrophus fut étudiée. Tout d'abord, du fait que la souche DLC10 préparée dans l'exemple 2 fut préparée à partir d'une souche de type sauvage, la capacité de production de Llysine ne fut pas modifiée. Par conséquent, afin de vérifier effectivement l'influence de la déficience du ldc sur la production de L-lysine, une souche à ldc interrompu fut produite à partir de la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 introduite avec pRSlysEdapA de la même manière que celle de l'exemple 2, (2). La souche obtenue fut appelée une souche DLC12/pRSlysEdapA.
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La souche AS1/pRSlysEdapA comme souche de contrôle et la souche DLC12/pRSlysEdapA furent appliquées au milieu d'agar SEII contenant 50 ug/ml de streptomycine et le milieu d'agar SEII contenant 50 g/ml de streptomycine et 1 g/1 de cadavérine, respectivement, et furent cultivées pendant la nuit à 37 C. Puis, les cellules sur environ 3 cm2 (centimètres carrés) de chaque surface de milieu furent grattées, incubées dans 20 ml du milieu de production SEII contenant 1 g/1 de cadavérine (contenant 50 g/ml de streptomycine) et cultivée à 37 C pendant 67 heures avec agitation. Après la fin de la culture, les cellules furent retirées par centrifugation, et la concentration en L-lysine dans le surnageant de culture fut déterminée en utilisant un analyseur d'acides aminés (Nihon Bunko, chromatographie liquide à haute performance). En conséquence, la souche AS1/pRSlysEdapA accumula 1,26 g/L de L-lysine dans le milieu, et la souche DLC12/pRSlysEdapA accumula 1,79 g/L de L-lysine dans le milieu. Par conséquent, il put être confirmé que la déficience de ldc pouvait améliorer la production de L-lysine.
Si l'invention a été décrite en détails en faisant référence à des modes de réalisation préférés de celle-ci, il apparaîtra évident à l'homme du métier que différents changements peuvent être apportés et que des équivalents peuvent être utilisés sans s'éloigner de la portée de l'invention.
Claims (9)
1. Protéine sélectionnée dans le groupe constitué de : (A) une protéine qui présente la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 4 ; (B) une protéine qui présente la séquence d'acides aminés de SEQ ID NO : 4 comprenant la substitution, la délétion, l'insertion ou l'addition d'un ou de plusieurs résidus d'acides aminés et présente une activité de lysine décarboxylase.
2. Protéine sélectionnée dans le groupe constitué de : (A) une protéine qui présente la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4 ; (B) une protéine qui présente la séquence d'acides aminés SEQ ID NO . 4 comprenant la substitution, la délétion, l'insertion ou l'addition d'un ou de plusieurs résidus d'acides aminés, moyennant quoi ladite protéine présente une activité de lysine décarboxylase et a une homologie d'au moins 90 % avec le SEQ ID NO : 4.
3. ADN codant pour une protéine sélectionnée dans le groupe constitué de : (A) une protéine qui présente la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4 ; (B) une protéine qui présente la séquence d'acides aminés SEQ ID NO . 4 comprenant la substitution, la délétion, l'insertion ou l'addition d'un ou de plusieurs résidus d'acides aminés et présente une activité de lysine décarboxylase.
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4. ADN codant pour une protéine sélectionnée dans le groupe constitué de : (A) une protéine qui présente la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4 ; (B) une protéine qui présente la séquence d'acides aminés SEQ ID NO . 4 comprenant la substitution, la délétion, l'insertion ou l'addition d'un ou de plusieurs acides aminés, moyennant quoi ladite protéine présente une activité de lysine décarboxylase et a une homologie d'au moins 90 % avec le SEQ ID NO : 4.
5. ADN selon la revendication 3, sélectionné dans le groupe constitué de : (a) un ADN qui présente la séquence de nucléotides des nucléotides 684 à 2930 dans la SEQ ID NO : 3 ; (b) un ADN qui peut être hybridé avec un ADN présentant la séquence de nucléotides des nucléotides 684 à 2930 dans la SEQ ID NO . 3 sous des conditions stringentes, et code pour une protéine ayant une activité de lysine décarboxylase.
6. ADN selon la revendication 3, qui est dérivé d'un chromosome d'une bactérie Methylophilus.
7. Bactérie Methylophilus qui produit de la L-lysine et est modifiée de telle sorte que l'activité de la lysine décarboxylase intracellulaire de la protéine selon la revendication 1 ou 2 est réduite ou éliminée.
8. Bactérie Methylophilus qui produit de la L-lysine, dans laquelle un gène sur un chromosome ayant une séquence de nucléotides identique à l'ADN selon la revendication 3 est interrompu, ou un gène sur un chromosome ayant une homologie avec l'ADN selon la revendication 3 à un degré tel qu'une recombinaison
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homologue avec l'ADN intervient, est interrompu, l'expression dudit gène est ainsi supprimée et l'activité de lysine décarboxylase intracellulaire est réduite ou éliminée.
9. Procédé de production de L-lysine, comprenant les étapes consistant à cultiver la bactérie Methylophilus selon la revendication 8 dans un milieu contenant du méthanol comme source principale de carbone entraînant l'accumulation de L-lysine dans la culture, et à recueillir la L-lysine de la culture.
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