FR2854902A1 - Microorganisme a activite cysteine synthase modifiee et procede de preparation de la cysteine - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une souche de microorganismes modifiés en particulier des bactéries, notamment E. coli et les corynébactéries, produisant de l'acide 2-amino-4-(alkylmercapto)propionique de formule générale (I)R-S-CH2-CHNH2-COOH (I)dans laquelle R représente un radical alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 18 atomes de carbones, éventuellement substitué par un ou groupe hydroxy, ou un radical aryle ou hétéroaryle comprenant un ou plusieurs atomes d'azote ou de souffre dans le cycle hétéroaromatique, sélectionné parmi les groupes phényle, pyridyle, pyrolyle, pyrazolyle, triazolyle, tetrazolyle, thiazolyle, ou thienyle,par métabolisme d'une source de carbone simple et d'une source de soufre comprenant un composé de formule générale (II) :R'-SH (II)dans laquelle R' représente un atome d'hydrogène ou R, R étant défini précédemment, et ses sels physiologiquement acceptables,lesdites souches présentant au moins une un gène codant pour une enzyme mutée à activité « cystéine synthase modifiée ».L'invention concerne également un procédé de préparation d'acides aminés de formule générale (I).
Description
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Microorganisme à activité cystéine synthase modifiée et procédé de préparation de la cystéine
La présente invention se rapporte au domaine de la bioconversion et d'obtention d'acides aminés par fermentation de microorganismes. Elle se rapporte à une méthode de criblage et d'évolution dirigée permettant d'identifier une souche de microorganisme, éventuellement génétiquement modifié, possédant une enzyme à activité cystéine synthase modifiée , en particulier une O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase modifiée, ladite souche produisant de la L-cystéine ou un acide aminé dérivé par métabolisme d'une source de carbone simple. L'invention concerne également la souche de microorganisme et un procédé de préparation de la Lcystéine, ou acide aminé dérivé, par culture de ladite souche de microorganisme.
La présente invention se rapporte au domaine de la bioconversion et d'obtention d'acides aminés par fermentation de microorganismes. Elle se rapporte à une méthode de criblage et d'évolution dirigée permettant d'identifier une souche de microorganisme, éventuellement génétiquement modifié, possédant une enzyme à activité cystéine synthase modifiée , en particulier une O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase modifiée, ladite souche produisant de la L-cystéine ou un acide aminé dérivé par métabolisme d'une source de carbone simple. L'invention concerne également la souche de microorganisme et un procédé de préparation de la Lcystéine, ou acide aminé dérivé, par culture de ladite souche de microorganisme.
La cystéine peut-être produite en utilisant des moyens très variés et des sources différentes. Ainsi Sun-Orient Chemical Co., Ltd., extrait la L-cystine à partir des cheveux hydrolysés en présence d'HCl. La L-cystine est alors convertie en Lcysteine monohydrochloride en utilisant un procédé d'électrolyse.
La DL-cystéine monohydrochloride peut être produite par le procédé de Strecker (réaction de la L-cystine en présence d'ammonium, d'HCN et de mercaptaldehyde).
La réaction de Bucherer-Berg, dans laquelle sont mis en présence du chloroacetaldehyde, de l'HCN, du bicarbonate d'ammonium et du sulfide de sodium, permet aussi de produire de la L-cystéine. La L-cystéine étant alors cristallisée sous sa forme monohydrochloride par réaction dans une solution d'acide chlorhydrique.
La production de la cystéine par voie enzymatique ou par bioconversion en utilisant la tryptophane synthase pour catalyser la réaction entre une alanine substituée en position bêta et un sulfide a été décrite dans les demandes de brevet GB 2 174 390 et EP 0 272 365. De même, la production de cystéine par fermentation de microorganismes a été décrite dans les demandes de brevet EP 0 885 962, WO 01/27 307 et WO 97/15 673 qui décrivent respectivement une optimisation de l'excrétion de la cysteine synthétisée par les microorganismes, la surexpression du gène CysB pour optimiser la production d'H2S, et une serine acétyl transferase insensible à la rétro-inhibition par la cystéine.
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La présente invention se rapporte à des souches de microorganismes modifiés en particulier des bactéries, notamment E. coli et les corynébactéries, produisant de l'acide 2-amino-4-(alkylmercapto)propionique de formule générale (I) R-S-CH2-CHNH2-COOH (I) dans laquelle R représente un radical alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 18 atomes de carbones, éventuellement substitué par un ou des groupse hydroxy, ou un radical aryle ou hétéroaryle comprenant un ou plusieurs atomes d'azote ou de soufre dans le cycle hétéroaromatique, sélectionné parmi les groupes phényle, pyridyle, pyrolyle, pyrazolyle, triazolyle, tetrazolyle, thiazolyle, ou thienyle, par métabolisme d'une source de carbone simple et d'une source de soufre comprenant un composé de formule générale (II) :
R'-SH (II) dans laquelle R' représente un atome d'hydrogène ou R, R étant défini précédemment, et ses sels physiologiquement acceptables, lesdites souches présentant au moins un gène codant pour une enzyme mutée à activité cystéine synthase modifiée .
R'-SH (II) dans laquelle R' représente un atome d'hydrogène ou R, R étant défini précédemment, et ses sels physiologiquement acceptables, lesdites souches présentant au moins un gène codant pour une enzyme mutée à activité cystéine synthase modifiée .
Par sel physiologiquement acceptable, on entend selon l'invention les sels du composé de formule générale (I) qui n'affectent pas le métabolisme et la capacité de croissance de la souche de microorganisme selon l'invention, notamment les sels de métaux alcalins comme le sodium.
Par source de carbone simple, selon la présente invention, on entend des sources de carbone utilisables par l'homme du métier pour la croissance normale d'un microorganisme, d'une bactérie en particulier. On entend désigner notamment les différents sucres assimilables, tels le glucose, le galactose, le saccharose, le lactose ou les mélasses, ou les sous-produits de ces sucres. Une source de carbone simple tout particulièrement préférée est le glucose. Une autre source de carbone simple préférée est le saccharose.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, R représente un radical alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 4 atomes de carbone, en particulier choisi parmi les radicaux méthyle, éthyle, n-propyle, i-propyle, n-butyle, i-butyle ou t-butyle. De manière plus préférentielle, R représente le radical méthyle.
L'acide 2-amino-4-(alkylmercapto)propionique de formule générale (I) obtenu est de préférence la L-cystéine.
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Par enzyme à activité cystéine synthase modifiée , on entend selon l'invention toute enzyme mutée impliquée dans la biosynthèse de l'acide aminé de formule générale (I), en particulier de la L-cystéine dont l'activité essentielle consiste à effectuer la conversion directe d'une acétylsérine, de préférence de la O-actéyl-Lsérine en acide aminé de formule générale (I) en présence de composé soufré de formule générale (II), l'activité essentielle de l'enzyme initiale non mutée n'étant pas une activité cystéine synthase . Les enzymes naturellement impliquées dans la biosynthèse de la cystéine par conversion directe de la O-actéyl-L-sérine (acétylsérine) en L-cystéine en présence de sulfure d'hydrogène (H2S), comme les cystéine synthases A ou B, codées par les gènes cysK ou CysM, respectivement, sont exclues de cette définition.
De manière préférentielle, l'enzyme initiale non mutée est une enzyme catalysant une réaction de sulfhydrylation en présence d'H2S, de préférence une enzyme à activité O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase.
De manière avantageuse, les enzymes initiales à activité O-acyl-L- homosérine sulfhydrylases sont choisies parmi les O-acyl-L-homosérine sulfhydrylases correspondant au PFAM référence PF01053 et au COG référence COG2873.
Les PFAM (Protein families database of alignments and Hidden Markov Models ; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) représentent une large collection d'alignements de séquences protéiques. Chaque PFAM permet de visualiser des alignements multiples, de voir des domaines protéiques, d'évaluer la répartition entre les organismes, d'avoir accès à d'autres bases de données, de visualiser des structures connues de protéines.
Les COGs (Clusters of Orthologous Groups of proteins ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) sont obtenus en comparant les séquences protéiques issus de 43 génomes complètement séquences représentant 30 lignées phylogénétiques majeurs. Chaque COG est défini à partir d'au moins trois lignées ce qui permet ainsi d'identifier des domaines conservés anciens.
Elles sont de préférence choisies parmi les acylhomosérine sulfhydrylases suivantes : NP~785969 O-acetylhomoserine (thiol) -lyase, Lactobacillus plantarum WCFS1 AAN68137 O-acetylhomoserine sulfhydrylase, Pseudomonas putida KT2440
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NP~599886 O-acetylhomoserine sulfhydrylase, Corynebacterium glutamicum
ATCC 13032 NP~712243 acetylhomoserine sulfhydrylase, Leptospira interrogans serovar lai str.
ATCC 13032 NP~712243 acetylhomoserine sulfhydrylase, Leptospira interrogans serovar lai str.
56601 BAC46370 O-succinylhomoserine sulfhydrylase, Bradyrhizobium japonicum
USDA110 AA057279 O-succinylhomoserine sulfhydrylase, Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000 NP-284520 O-succinylhomoserine sulfhydrolase [Neisseria meningitidis Z2491 AAA83435 O-succinylhomoserine sulfhydrylase (P. aeruginosa)
L'O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase est plus préférentiellement choisie parmi les O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase codées par le gène metY de Corynebacterium, en particulier le gène metY de C. glutamicum (Genbank AF220150), et les enzymes homologues présentant la même activité O-acyl-Lhomosérine sulfhydrolase, et au moins 80% d'homologie de séquence avec l'O-acylL-homosérine sulfhydrolase codée par le gène metY de C. glutamicum (Genbank AF220150), préférentiellement au moins 85 % d'homologie, plus préférentiellement au moins 90 % d'homologie.
USDA110 AA057279 O-succinylhomoserine sulfhydrylase, Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000 NP-284520 O-succinylhomoserine sulfhydrolase [Neisseria meningitidis Z2491 AAA83435 O-succinylhomoserine sulfhydrylase (P. aeruginosa)
L'O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase est plus préférentiellement choisie parmi les O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase codées par le gène metY de Corynebacterium, en particulier le gène metY de C. glutamicum (Genbank AF220150), et les enzymes homologues présentant la même activité O-acyl-Lhomosérine sulfhydrolase, et au moins 80% d'homologie de séquence avec l'O-acylL-homosérine sulfhydrolase codée par le gène metY de C. glutamicum (Genbank AF220150), préférentiellement au moins 85 % d'homologie, plus préférentiellement au moins 90 % d'homologie.
Les moyens d'identification des séquences homologues et de leur pourcentages d'homologie sont bien connus de l'homme du métier, comprenant notamment le programme BLAST, et notamment le programme BLASTP, qui peut être utilisé à partir du site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ avec les paramètres indiqués par défaut sur ce site.
L'invention est basée notamment sur le fait que l'on peut obtenir, de façon dirigée, une modification de la spécificité de substrat de l'enzyme acyl-homosérine sulfhydrylase afin qu'elle utilise préférentiellement l'acetylsérine. En conséquence l'invention est basée sur le fait que l'on peut modifier de façon dirigée la spécificité de substrat de l'enzyme non modifiée afin d'évoluer d'une activité acylhomoserine sulfhydrolase à une activité cystéine synthase.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, les souches de microorganismes non modifiés ne possèdent pas naturellement d'activité O-acyl-L- homosérine sulfhydrolase ou ne possédant pas de gène homologue au gène metY codant pour cette enzyme.
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On introduit alors dans les bactéries à modifier un gène codant pour une enzyme catalysant une réaction de sulfhydrylation en présence d'H2S, telle que définie précédemment, à l'exclusion des enzymes dont l'activité principale est une activité cystéine synthase (aussi dénommée O-acetylsérine sulfhydrolase), en particulier un gène codant pour une O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase, comme le gène metY de Corynebacterium, en particulier le gène metY de C. glutamicum (Genbank AF220150).
Le gène codant pour une enzyme catalysant une réaction de sulfhydrylation en présence d'H2S peut-être introduit dans la bactérie à modifier selon les techniques usuelles à la disposition de l'homme du métier, soit par intégration directe dans le génome, soit porté par un plasmide réplicatif.
La transformation de l'activité acyl-homosérine sulfhydrylase en activité cystéine synthase modifiée sera réputée acquise lorsque la souche bactérienne génétiquement modifiée puis évoluée par sélection dirigée (A) aura une vitesse de croissance au moins similaire à celle de la souche sauvage (I) initiale lorsque cultivée dans un milieu minimum en présence de glucose pour seule source de carbone. Dans un mode particulier on considérera la transformation de l'activité acyl-homosérine sulfhydrylase en activité cystéine synthase modifiée sera réputée acquise lorsque l'activité cystéine synthase portée par la protéine O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase modifiée sera améliorée de 10% par rapport à son activité initiale. Enfin cette transformation de l'activité acyl-homosérine sulfhydrylase en activité cystéine synthase modifiée sera réputée acquise lorsque la souche (A) produira au moins autant de cystéine que la souche (I) dans des condition de culture équivalentes, ne contenant pas de cystéine initialement.
La souche ainsi construite est de préférence sélectionnée et améliorée par un procédé de criblage et d'évolution, qui est aussi un objet de l'invention.
Les souches selon l'invention peuvent également être génétiquement modifiées par inactivation, mutation et/ou suractivation d'au moins un gène endogène, la modification étant effectuée préalablement ou non à la mise en #uvre avant la modification de leur activité cystéine synthase. En particulier, les souches de microorganismes selon l'invention sont génétiquement modifiées afin de supprimer les gènes cysK et/ou cysM et/ou metB, codant les protéines portant respectivement
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les activités enzymatiques cystéine synthase A, cystéine synthase B et cystathionine gamma synthase. De manière préférentielle, les gènes cysK et cysM sont supprimés.
On peut le cas échéant supprimer le gène codant l'activité cystathionine gamma-lyase.
Le gène cysK code la cysteine synthaseA (GenBank NP 416909) et le gènes cysM code la cysteine synthase B (GenBank NP~416916). L'inactivation de ces gènes revient à supprimer les voies de biosynthèse de la cystéine et donc à rendre la souche auxotrophe pour la cystéine. Ceci permet de sélectionner les souches qui ont modifié l'activité acyl-homoserine sylfhydrylase en activité cystéine synthase afin de restaurer la production de cystéine.
En utilisant les références données sur GenBank pour ces gènes qui sont bien connues, l'homme du métier est capable de déterminer les gènes équivalents dans d'autres souches bactériennes qu'E. coli. Ce travail de routine est avantageusement effectué en utilisant les séquences consensus pouvant être déterminées du fait de la synthèse de ces gènes pour d'autres microorganismes, et en dessinant des sondes dégénérées permettant de cloner le gène correspondant dans un autre organisme. Ces techniques de routine de biologie moléculaire sont bien connues dans l'art et sont décrites par exemple dans Sambrook et al. (1989 Molecular cloning : laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.).
Dans un mode de réalisation, ladite souche bactérienne peut comprendre également une modification de l'activité sérine O-acyltransférase porté par le gène sysE afin de lui conférer une insensibilité à la rétro-inhibition par la cystéine.
Dans un autre mode de réalisation, ladite souche bactérienne peut comprendre également une surexpression du gène cysB afin de déréguler la voie d'assimilation du soufre en H2S.
Il peut-être également avantageux pour la production d'acides aminés de formule (I), de préférence de la L-cysteine, de surexprimer le gène codant l'acetylCoA synthetase, comme le gène acs (EC 6. 2.1.1), ayant le numéro d'accession AE000480, en même temps que le gène codant pour une enzyme à activité cystéine synthase modifiée défini précédemment.
Il peut également être avantageux d'atténuer, voire de supprimer les gènes codant pour une acétate kinase et/ou pour une phosphotransacetylase , notamment les gènes ack et pta ayant respectivement les numéros d'accession AE000318 et
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AE000319, et codant respectivement une acétate kinase (EC 2.7.2.1) et une phosphotransacetylase (EC 2. 3.1.8). Cette atténuation/suppression est de préférence combinée à une surexpression du gène codant l'acetyl-CoA synthetase.
Toutes les modifications mentionnées ci-dessus peuvent être effectuées directement sur la souche initiale. Alternativement, il peut être préférable de préparer une souche à activité cystéine synthase modifiée selon l'invention ne présentant qu'un nombre restreint de modifications, notamment en mettant en #uvre le procédé de criblage selon l'invention, avant d'effectuer d'autres modifications telles que mentionnées, afin d'augmenter la synthèse de l'acide aminé de formule (I) en particulier la L-cystéine.
L'homme du métier connaît les protocoles permettant de modifier le caractère génétique de microorganismes. La surexpression d'un gène peut être effectuée par changement du promoteur de ce gène in situ, par un promoteur fort ou inductible. De façon alternative, on introduit, dans la cellule, un plasmide réplicatif (simple ou multicopies) dans lequel le gène que l'on désire surexprimer est sous le contrôle du promoteur adéquat.
L'inactivation d'un gène se fait préférentiellement par recombinaison homologue. Le principe d'un protocole en est rappelé brièvement : on introduit dans la cellule un fragment linéaire, obtenu in vitro, comprenant les deux régions flanquant le gène, et au moins un gène de sélection entre ces deux régions (généralement un gène de résistance à un antibiotique), ledit fragment linéaire présentant donc un gène inactivé. On sélectionne les cellules ayant subi un événement de recombinaison et ayant intégré le fragment introduit par étalement sur milieu sélectif. On sélectionne ensuite les cellules ayant subi un événement de double recombinaison, dans lesquelles le gène natif a été remplacé par le gène inactivé. Ce protocole peut être amélioré en utilisant des systèmes de sélections positive et négative, afin d'accélérer la détection des événements de double recombinaison.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite souche bactérienne est une souche d'E. coli.
Dans un autre mode de réalisation, ladite souche bactérienne est une souche de Corynebacterium, en particulier C. glutamicum.
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L'invention concerne donc également un procédé de préparation d'une souche bactérienne à activité cystéine synthase modifiée telle que définie précédemment, ledit procédé comprenant une étape consistant cultiver sous pression de sélection dans un milieu de culture approprié comprenant une source de carbone simple et une souche bactérienne comprenant une enzyme catalysant une réaction de sulfhydrylation en présence d'H2S dont l'activité essentielle n'est pas une activité cystéine synthase telle que définie précédemment, afin de diriger une évolution du gène codant pour ladite enzyme dans ladite souche bactérienne, vers un gène codant pour une activité cystéine synthase modifiée .
Selon l'invention, les termes culture et fermentation sont employés indifféremment pour désigner la croissance de la bactérie sur un milieu de culture approprié comprenant une source de carbone simple.
De manière préférentielle et afin d'accélérer la sélection et l'évolution dirigée du gène codant pour l'enzyme catalysant une réaction de sulfhydrylation en présence d'H2S, on peut effectuer les opérations suivantes : a. Coupler la biosynthèse de la cystéine à la croissance du microorganisme de telle sorte que la production de cystéine soit nécessaire à une bonne croissance du microorganisme
Pour cette raison on peut faire le choix de déléter les gènes cysK, cysM et éventuellement metB et éventuellement le gène codant une activité cystationine gamma lyase (e.g. gène yrhB chez B. subtilis), afin de supprimer toutes voies de synthèse naturelle de cystéine. Ce faisant la souche devient auxotrophe pour la cystéine.
Pour cette raison on peut faire le choix de déléter les gènes cysK, cysM et éventuellement metB et éventuellement le gène codant une activité cystationine gamma lyase (e.g. gène yrhB chez B. subtilis), afin de supprimer toutes voies de synthèse naturelle de cystéine. Ce faisant la souche devient auxotrophe pour la cystéine.
Le microorganisme, pour vivre en milieu minimum contenant une source de carbone simple, doit donc optimiser l'activité cystéine synthase de l'O-acyl-Lhomoserine sulfhydrylase, afin de rétablir la voie de synthèse de la cystéine à partir de d'acetylserine et d'H2S. Lorsque la délétion metB est réalisée il peut être nécessaire de supplémenter le milieu en méthionine. b. Supprimer les régulations, notamment les rétro-inhibitions soit au niveau des enzymes, soit au niveau des gènes afin que la voie de biosynthèse principale soit potentialisée
On peut ainsi surexprimer le gène cysB codant une protéine activatrice de la voie d'assimilation du soufre (W00127307), permettant ainsi l'optimisation de la
On peut ainsi surexprimer le gène cysB codant une protéine activatrice de la voie d'assimilation du soufre (W00127307), permettant ainsi l'optimisation de la
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production en H2S. Par ailleurs, il a été montré que la serine acetyl-transferase, codée par le gène cysE, était rétro-inhibée par la cysteine. Il est donc souhaitable de remplacer cette enzyme par une enzyme insensible à la rétro-inhibition (W09715673 ; W002061106 ) ou bien de surexprimer l'enzyme ( W00229029 ).
Les techniques permettant l'expression ou la surexpression de gènes d'intérêt dans les bactéries sont bien connues de l'homme du métier. Les promoteurs, notamment les promoteurs forts, constitutifs chez les microorganismes sont également bien connus, de préférence choisi parmi pTAC-O, pLAC-O, pTRC-0 et pTHLA, promoteurs forts pour lesquels l'opérateur a été délété pour les rendre constitutifs.
L'invention se rapporte également à un procédé de préparation de cystéine, dans lequel on cultive un microorganisme à activité cystéine synthase modifiée tel que défini précédemment dans un milieu de culture approprié, ledit milieu approprié comprenant une source de carbone simple telle que définie précédemment.
La définition des conditions de fermentation est du ressort de l'homme du métier. On fermente notamment les bactéries à une température comprise entre 20 C et 55 C, de préférence entre 25 C et 40 C, plus particulièrement d'environ 30 C pour C. glutamicum et d'environ 37 C pour E. coli.
La fermentation est conduite en fermenteurs avec un milieu minéral de culture de composition connu défini et adapté en fonction des bactéries utilisées, contenant au moins une source de carbone simple.
En particulier, le milieu minéral de culture pour E. coli pourra ainsi être de composition identique ou similaire à un milieu M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32 :120-128), un milieu M63 (Miller, 1992 ; A Short Course in Bacterial Genetics : Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ou un milieu tel que défini par Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270 : 88- 96).
De manière analogue, le milieu minéral de culture pour C. glutamicum pourra ainsi être de composition identique ou similaire au milieu BMCG (Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32 : à un milieu tel que défini par Riedel et al.
(2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3 : 573-583).
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Les milieux peuvent être supplémentés pour compenser les auxotrophies ; contiennent une concentration en carbone simple adaptée en fonction du mode de culture et de production, ainsi que du composé soufré de formule (II) en concentration adaptée en fonction de l'évolution de la souche et du mode de production retenu.
Après fermentation, la cystéine est récupérée selon les méthodes usuelles, et le cas échéant, purifiée.
Les techniques de récupération puis de purification de la cystéine dans les milieux de culture sont bien connues de l'homme du métier.
La présente invention concerne aussi un procédé de préparation d'un acide aminé de formule générale (I) tel que défini prédcédemment, caractérisé en ce que l'on fait réagir de l'acétylsérine avec une enzyme à activité cystéine synthase modifiée telle que définie précédemment, dans un milieu réactionnel approprié comprenant un composé soufré de formule générale (II) défini précédemment.
Le milieu réactionnel approprié est un milieu usuel de réaction enzymatique, bien connu de l'homme du métier, en particulier un milieu aqueux dans lequel les substrats et l'enzyme sont en solution ou en suspension. Les conditions de mise en #uvre de la réaction sont bien connues de l'homme du métier, afin notamment d'éviter une dénaturation substantielle de l'enzyme.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'enzyme à activité cystéine synthase modifiée est présente dans une bactérie inactivée ou dans un extrait cellulaire.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : synthèse de la cysteine à partir de la sérine, chez les bactéries.
Figure 1 : synthèse de la cysteine à partir de la sérine, chez les bactéries.
Figure 2 : stratégie pour obtenir une synthèse de cysteine à partir d' O-acetyl-
L-sérine. La flèche rouge correspond à l'activité cysteine synthase portée par l'enzyme codée par le gène metY évolué selon l'invention (metY*).
L-sérine. La flèche rouge correspond à l'activité cysteine synthase portée par l'enzyme codée par le gène metY évolué selon l'invention (metY*).
EXEMPLES
Exemple 1 : construction de la souche E. coli Kl2 A(cysK, cysM)
Exemple 1 : construction de la souche E. coli Kl2 A(cysK, cysM)
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L'inactivation des gènes cysK et cysM est réalisée en insérant une cassette de résistance à un antibiotique (chloramphénicol et kanamycine respectivement) tout en délétant la majeure partie des gènes concernés. La technique utilisée est décrite par Datsenko, K.A. ; Wanner, B. L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 : 6640- 6645. Pour chaque construction un couple d'oligonucléotide a été synthétisé :
Pour cysK:
DcysKR de 100 bases (SEQ ID NO 1) : TgttgcaattctttctcagtgaagagatcggcaaacaatgcggtgcttaaataacgctcacccgatgatggtagaataacC ATATGAATATCCTCCTTAG avec une région (caractères minuscules) homologue à la séquence (2531396 à
2531317) du gène cysK (séquence de référence sur le site http ://genolist.pasteur.fr/Colibri/) une région (caractères majuscules) pour l'amplification de la cassette de résistance au chloramphénicol (séquence de référence dans la publication
Datsenko, K. A. et Wanner, B. L., 2000, PNAS, 97 : 6640-6645)
DcysKF de 100 bases (SEQ ID NO 2) : agtaagatttttgaagataactcgctgactatcggtcacacgccgctggttcgcctgaatcgcatcggtaacggacgcatT GTAGGCTGGAGCTGCTTCG avec : une région (caractères minuscules) homologue à la séquence (2530432 à
2530511) du gène cysK une région (caractères majuscules) pour l'amplification de la cassette de résistance au chloramphénicol.
Pour cysK:
DcysKR de 100 bases (SEQ ID NO 1) : TgttgcaattctttctcagtgaagagatcggcaaacaatgcggtgcttaaataacgctcacccgatgatggtagaataacC ATATGAATATCCTCCTTAG avec une région (caractères minuscules) homologue à la séquence (2531396 à
2531317) du gène cysK (séquence de référence sur le site http ://genolist.pasteur.fr/Colibri/) une région (caractères majuscules) pour l'amplification de la cassette de résistance au chloramphénicol (séquence de référence dans la publication
Datsenko, K. A. et Wanner, B. L., 2000, PNAS, 97 : 6640-6645)
DcysKF de 100 bases (SEQ ID NO 2) : agtaagatttttgaagataactcgctgactatcggtcacacgccgctggttcgcctgaatcgcatcggtaacggacgcatT GTAGGCTGGAGCTGCTTCG avec : une région (caractères minuscules) homologue à la séquence (2530432 à
2530511) du gène cysK une région (caractères majuscules) pour l'amplification de la cassette de résistance au chloramphénicol.
Pour cysM :
DcysMR de 100 bases (SEQ ID NO 3): cccgccccctggctaaaatgctcttccccaaacaccccggtagaaaggtagcgatcgccacgatcgcagatgatcgcca cCATATGAATATCCTCCTTAG avec : une région (caractères minuscules) homologue à la séquence (2536699 à
2536778) du gène cysM (séquence de référence sur le site http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)
DcysMR de 100 bases (SEQ ID NO 3): cccgccccctggctaaaatgctcttccccaaacaccccggtagaaaggtagcgatcgccacgatcgcagatgatcgcca cCATATGAATATCCTCCTTAG avec : une région (caractères minuscules) homologue à la séquence (2536699 à
2536778) du gène cysM (séquence de référence sur le site http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)
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une région (caractères majuscules) pour l'amplification de la cassette de résistance à la kanamycine
DcysMF de 100 bases (SEQ ID NO 4): Agtacattagaacaaacaataggcaatacgcctctggtgaagttgcagcgaatggggccggataacggcagtgaagtgt gTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG avec : une région (caractères minuscules) homologue à la séquence (2537600 à
2537521) du gène cysM une région (caractères majuscules) pour l'amplification de la cassette de résistance à la kanamycine
Les oligonucléotides DcysKR et DcysKF d'une part et DcysMR et DcysMF d'autre part, sont utilisés pour amplifier respectivement la cassette de résistance au chloramphénicol et à la kanamycine à partir des plasmides pKD3 et pKD4. Le produit PCR obtenu est alors introduit par électroporation dans la souche MG1655 (pKD46) dans laquelle l'enzyme Red recombinase exprimée permet la recombinaison homologue. Les transformants résistants à chacun des antibiotiques sont alors sélectionnés et l'insertion de la cassette de résistance est vérifiée par une analyse PCR avec les oligonucléotides cysKR et cysKF d'une part et cysMR et cysMF d'autre part. cyKR (SEQ ID NO 5) : tttttaacagacgcgacgcacgaagagcgc (homologue à la séquence de 2531698 à 2531669) cysKF (SEQ ID NO 6) : ggcgcgacggcgatgtgggtcgattgctat (homologue à la séquence de 2530188 à 2530217) cysMR (SEQ ID NO 7) : ggggtgacggtcaggactcaccaatacttc (homologue à la séquence de 2536430 à 2536459) cysMF (SEQ ID N08) : gcgcgcatcgctggccgctgggctacacac (homologue à la séquence de 2538071 à 2538042)
Les cassettes de résistance au chloramphénicol et à la kanamycine peuvent ensuite être éliminées. Pour cela, Le plasmide pCP20 porteur de la recombinase FLP agissant au niveau des sites FRT de la cassette de résistance au chloramphénicol ou à la kanamycine, est introduit dans les souches recombinantes par électroporation.
DcysMF de 100 bases (SEQ ID NO 4): Agtacattagaacaaacaataggcaatacgcctctggtgaagttgcagcgaatggggccggataacggcagtgaagtgt gTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG avec : une région (caractères minuscules) homologue à la séquence (2537600 à
2537521) du gène cysM une région (caractères majuscules) pour l'amplification de la cassette de résistance à la kanamycine
Les oligonucléotides DcysKR et DcysKF d'une part et DcysMR et DcysMF d'autre part, sont utilisés pour amplifier respectivement la cassette de résistance au chloramphénicol et à la kanamycine à partir des plasmides pKD3 et pKD4. Le produit PCR obtenu est alors introduit par électroporation dans la souche MG1655 (pKD46) dans laquelle l'enzyme Red recombinase exprimée permet la recombinaison homologue. Les transformants résistants à chacun des antibiotiques sont alors sélectionnés et l'insertion de la cassette de résistance est vérifiée par une analyse PCR avec les oligonucléotides cysKR et cysKF d'une part et cysMR et cysMF d'autre part. cyKR (SEQ ID NO 5) : tttttaacagacgcgacgcacgaagagcgc (homologue à la séquence de 2531698 à 2531669) cysKF (SEQ ID NO 6) : ggcgcgacggcgatgtgggtcgattgctat (homologue à la séquence de 2530188 à 2530217) cysMR (SEQ ID NO 7) : ggggtgacggtcaggactcaccaatacttc (homologue à la séquence de 2536430 à 2536459) cysMF (SEQ ID N08) : gcgcgcatcgctggccgctgggctacacac (homologue à la séquence de 2538071 à 2538042)
Les cassettes de résistance au chloramphénicol et à la kanamycine peuvent ensuite être éliminées. Pour cela, Le plasmide pCP20 porteur de la recombinase FLP agissant au niveau des sites FRT de la cassette de résistance au chloramphénicol ou à la kanamycine, est introduit dans les souches recombinantes par électroporation.
Après une série de cultures à 42 C, la perte de la cassette de résistance à
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l'antibiotique est vérifiée par une analyse PCR avec les mêmes oligonucléotides que ceux utilisés précédemment.
Exemple 2 : du séné metY dans la souche précédente
Le plasmide pTopometY a été construit par insertion du gène metY dans le vecteur Zero Blunt TOPO PCR cloning kit for sequencing (PCR4 TOPO vector, Invitrogen). Pour cela, le gène metY a été amplifié par PCR avec la polymérase Pwo à partir de l'ADN chromosomique de la souche Corynebacterium glutamicum ATCC13032 en utilisant les oligonucléotides suivants :
MetYR (SEQ ID NO 9) : ttagagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaataaaaactcttaaggacctccaaatgcc
Promoteur de type TRC (pTRC-O) en gras et noir, RBS du gène metY en gras et souligné, codon d'initiation du gène metY en gras et italiques.
Le plasmide pTopometY a été construit par insertion du gène metY dans le vecteur Zero Blunt TOPO PCR cloning kit for sequencing (PCR4 TOPO vector, Invitrogen). Pour cela, le gène metY a été amplifié par PCR avec la polymérase Pwo à partir de l'ADN chromosomique de la souche Corynebacterium glutamicum ATCC13032 en utilisant les oligonucléotides suivants :
MetYR (SEQ ID NO 9) : ttagagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaataaaaactcttaaggacctccaaatgcc
Promoteur de type TRC (pTRC-O) en gras et noir, RBS du gène metY en gras et souligné, codon d'initiation du gène metY en gras et italiques.
MetYF (SEQ ID NO 10): gctctgtctagtctagtttgcattctcacg
Séquence choisie en aval du terminateur de transcription du gène metY.
Séquence choisie en aval du terminateur de transcription du gène metY.
Le produit PCR obtenu est ensuite directement cloné dans le vecteur Topo pour donner le plasmide pTopometY. Le vecteur Topo porte une origine de réplication pour E. coli, un gène de résistance à l'ampicilline et un gène de résistance à la kanamycine.
Le plasmide pTopometY est alors introduit dans la souche E. coli DH5a pour vérification de la construction. Le séquençage du gène metY du plasmide pTopometY avec les oligonucléotides universels M13 reverse et M13 forward sera ensuite réalisé pour confirmer la construction.
Le plasmide est introduit dans la souche E. coli A(cysK, cysM) (exemple 1) par électroporation.
Exemple 3 : sélection dirigée de la souche afin de faire évoluer le gène metY codant l'activité acetyl-homoserine sulfhydrylase vers une activité cysteine synthase.
La sélection dirigée de la souche précédente contenant le gène metY peut-être réalisée en flacons ou en Erlen-Meyer. La mise en #uvre de cette technique permet la sélection d'une souche de Escherichia coli dont l'enzyme acetyl-homosérine
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sulfhydrolase a évolué en une activité cystéine synthase . La sélection dirigée est conduite en Erlen-Meyer contenant 50 mL de milieu minéral (Schaefer et al., 1999, Anal. Biochem. 270 : 88-96) en présence de 33 mM glucose, de chloramphénicol à une concentration finale de 25 mg/1 et de kanamycine à une concentration de 25 mg/ml
Les milieux de culture sont ensemencés avec la souche E. coli K12 [# (cysK, cysM) pTopometY] à DO600nm définie. On ensemence avec une population de bactéries suffisamment importante pour que certaines bactéries possèdent potentiellement des mutations spontanées intéressantes dans le gène metY, permettant d'assimiler l'O-acetyl serine. Cette population a été obtenue par culture de la souche auxotrophe en cystéine sur milieu minimum supplémenté en cystéine.
Les milieux de culture sont ensemencés avec la souche E. coli K12 [# (cysK, cysM) pTopometY] à DO600nm définie. On ensemence avec une population de bactéries suffisamment importante pour que certaines bactéries possèdent potentiellement des mutations spontanées intéressantes dans le gène metY, permettant d'assimiler l'O-acetyl serine. Cette population a été obtenue par culture de la souche auxotrophe en cystéine sur milieu minimum supplémenté en cystéine.
Une culture témoin est ensemencée avec la souche E. coli K12 (# cysK, cysM).
Les cultures sont réalisées sous agitation, à 37 C, pendant 6 jours, puis la DO600nm est mesurée. La culture témoin ne présente pratiquement pas d'évolution de DO alors que quelques autres cultures ont vu leur DO évoluer de manière significative. Il est probable que l'activité cystéine synthase modifiée se soit développée dans les populations contenues dans ces Erlen-Meyer . La ou les mutations sont vraisemblablement intervenue dans le gène metY puisque c'est la seule différence entre ces souches et la souche témoin.
La population bactérienne de ces cultures positives peut alors être utilisée pour améliorer davantage l'activité cystéine synthase, soit en utilisant un procédé de criblage et amélioration par fermentation en étage (exemple 4) ou en recommençant le procédé en flacon tel qu'il vient d'être décrit.
Exemple 4 : sélection dirigée de la souche afin de faire évoluer le gène metY codant l'activité acetyl-homoserine sulfhydrylase vers une activité cystéine synthase.
La population précédente E. coliKl2 est introduite dans un système en continu en étage afin de poursuivre la sélection dirigée
Le premier fermenteur produit les bactéries à une vitesse proche du taux de croissance maximum (milieu minimum avec environ 10 M de cystéine). Les bactéries passent en continu de ce fermenteur dans un second fermenteur caractérisé
Le premier fermenteur produit les bactéries à une vitesse proche du taux de croissance maximum (milieu minimum avec environ 10 M de cystéine). Les bactéries passent en continu de ce fermenteur dans un second fermenteur caractérisé
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par un taux de dilution plus faible et un milieu avec le crible de sélection (ici, milieu minimal avec glucose pour seule source de carbone).
La pression de sélection, imposée à la bactérie dans le second fermenteur, est établie par l'absence de cystéine. Des cycles successifs de sélection permettent d'appliquer aux bactéries des cribles de plus en plus fort par des concentrations décroissantes en cystéine dans le fermenteur initial.
Pour chaque concentration, la souche sélectionnée dans le second fermenteur est celle qui présente le meilleur taux de croissance en utilisant du glucose pour seule source de carbone.
On effectue différents cycles de sélection pour obtenir une souche fermentant le glucose dans un milieu minimum avec une vitesse élevée. L'analyse de cette souche permet de définir les mutations dans le gène metY.
Exemple 5 : sélection des clones
La population optimisée est étalée alors sur milieu minimum gélosé contenant du glucose pour seule source de carbone. Les boites inoculées sont placées en condition aérobie dans un incubateur à 37 C. Après 36 heures, les clones apparaissent sur les boites ; ils correspondent aux bactéries capables de produire de la cystéine à partir du glucose pour seule source de carbone. Trois clones sont isolés et le plasmide portant le gène metY isolé et ce gène séquence.
La population optimisée est étalée alors sur milieu minimum gélosé contenant du glucose pour seule source de carbone. Les boites inoculées sont placées en condition aérobie dans un incubateur à 37 C. Après 36 heures, les clones apparaissent sur les boites ; ils correspondent aux bactéries capables de produire de la cystéine à partir du glucose pour seule source de carbone. Trois clones sont isolés et le plasmide portant le gène metY isolé et ce gène séquence.
Exemple 6 : contrôle de la voie de synthèse
La population d'E. coli K12 [# (cysK, cysM) pTopometY] optimisée est mise en culture dans un milieu minimum (Schaefer et al., 1999, Anal. Biochem. 270 : 88- 96) contenant 2,5 g.l-1 de glucose entièrement marqué au carbone 13. Après la culture, les cellules sont récupérées, lavées puis hydrolysées par HC1 6N pendant 24 heures à 107 C. Une analyse par RMN bidimensionnelle est alors réalisée (HSQC). Cette analyse permet d'étudier le flux des carbones 13 du glucose et confirmer que la synthèse de la cystéine se fait bien via la sérine et l'acetyl-sérine suggérant ainsi que l'enzyme codée par le gène metY a effectivement évoluée en une cystéine synthase.
La population d'E. coli K12 [# (cysK, cysM) pTopometY] optimisée est mise en culture dans un milieu minimum (Schaefer et al., 1999, Anal. Biochem. 270 : 88- 96) contenant 2,5 g.l-1 de glucose entièrement marqué au carbone 13. Après la culture, les cellules sont récupérées, lavées puis hydrolysées par HC1 6N pendant 24 heures à 107 C. Une analyse par RMN bidimensionnelle est alors réalisée (HSQC). Cette analyse permet d'étudier le flux des carbones 13 du glucose et confirmer que la synthèse de la cystéine se fait bien via la sérine et l'acetyl-sérine suggérant ainsi que l'enzyme codée par le gène metY a effectivement évoluée en une cystéine synthase.
Claims (18)
1. Souche de microorganismes modifiés en particulier des bactéries, notamment E. coli et les corynébactéries, produisant de l'acide 2-amino-4- (alkylmercapto) propionique de formule générale (I) R-S-CH2-CHNH2-COOH (I) dans laquelle R représente un radical alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 18 atomes de carbones, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes hydroxy, ou un radical aryle ou hétéroaryle comprenant un ou plusieurs atomes d'azote ou de souffre dans le cycle hétéroaromatique, sélectionné parmi les groupes phényle, pyridyle, pyrolyle, pyrazolyle, triazolyle, tetrazolyle, thiazolyle, ou thienyle, par métabolisme d'une source de carbone simple et d'une source de soufre comprenant un composé de formule générale (II) :
R'-SH (II) dans laquelle R' représente un atome d'hydrogène ou R, R étant défini précédemment, et ses sels physiologiquement acceptables, lesdites souches présentant au moins une un gène codant pour une enzyme mutée à activité cystéine synthase modifiée .
2. Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce que R représente un radical alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 4 atomes de carbone.
3. Souche selon la revendication 2, caractérisée en ce que R représente le radical méthyle.
4. Souche selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'acide 2amino-4- (alkylmercapto)propionique de formule générale (I) obtenu est la Lcystéine.
5. Souche selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'enzyme initiale non mutée est une enzyme catalysant une réaction de sulfhydrylation en présence d'H2S.
6. Souche selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'enzyme initiale non mutée est une enzyme à activité O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase.
7. Souche selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'enzyme initiale à activité O-acyl-L-homosérine sulfhydrylases est choisies parmi les 0acyl-L-homosérine sulfhydrylases correspondant au PFAM référence PF01053 et au COG référence COG2873.
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8. Souche selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'nezyme initiale est choisie parmi les acylhomosérine sulfhydrylases suivantes : NP~785969 O-acetylhomoserine (thiol) -lyase, Lactobacillus plantarum WCFS1 AAN68137 O-acetylhomoserine sulfhydrylase, Pseudomonas putida KT2440 NP~599886 O-acetylhomoserine sulfhydrylase, Corynebacterium glutamicum
ATCC 13032 NP~712243 acetylhomoserine sulfhydrylase, Leptospira interrogans serovar lai str.
56601 BAC46370 O-succinylhomoserine sulfhydrylase, Bradyrhizobium japonicum USDA110 AA057279 O-succinylhomoserine sulfhydrylase, Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000 NP~284520 O-succinylhomoserine sulfhydrolase [Neisseria meningitidis Z2491 AAA83435 O-succinylhomoserine sulfhydrylase (P. aeruginosa)
9. Souche selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'enzyme initiale est l'O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase codée par le gène metY de Corynebacterium.
10. Souche selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'O-acyl-Lhomosérine sulfhydrolase est codée par le gène metY de C. glutamicum (Genbank AF220150).
11. Souche selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle est génétiquement modifiée afin de supprimer les gènes cysK et/ou cysM et/ou metB, codant les protéines portant respectivement les activités enzymatiques cystéine synthase A, cystéine synthase B et cystathionine gamma synthase.
12. Souche selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que le gène codant l'activité cystathionine gamma-lyase est atténué ou supprimé.
13. Souche selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que le gène codant l'acetyl-CoA synthetase est surexprimé.
14. Souche selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que les gènes codant pour une acétate kinase et/ou une phosphotransacétylase sont atténués ou supprimés.
15. Procédé de préparation d'une souche bactérienne à activité cystéine synthase modifiée telle que définie dans les revendications 1 à 14, ledit procédé
<Desc/Clms Page number 18>
comprenant une étape consistant cultiver sous pression de sélection dans un milieu de culture approprié comprenant une source de carbone simple une souche bactérienne comprenant une enzyme catalysant une réaction de sulfhydrylation en présence d'H2S dont l'activité essentielle n'est pas une activité cystéine synthase , afin de diriger une évolution du gène codant pour ladite enzyme dans ladite souche bactérienne, vers un gène codant pour une activité cystéine synthase modifiée .
16. Procédé de préparation d'un acide aminé de formule générale (I) tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4, dans lequel on cultive un microorganisme à activité cystéine synthase modifiée tel que défini dans les revendications 1 à 14 dans un milieu de culture approprié comprenant une source de carbone simple et un dérivé soufré de formule générale (II) tel que défini dans l'une des revendications 1 à 3, l'acide aminé de formule (I) étant récupéré et, le cas échéant, purifié.
17. Procédé de préparation d'un acide aminé de formule générale (I) tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on fait réagir de l'acétylsérine avec une enzyme à activité cystéine synthase modifiée telle que définie dans l'une des revendications 1 à 10, dans un milieu réactionnel approprié comprenant un composé soufré de formule générale (II) défini dans l'une des revendications 1 à 3.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'enzyme à activité cystéine synthase modifiée est présente dans une bactérie inactivée ou dans un extrait cellulaire.
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| FR0305769A FR2854902B1 (fr) | 2003-05-14 | 2003-05-14 | Microorganisme a activite cysteine synthase modifiee et procede de preparation de la cysteine |
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| EP10183261A EP2348107A3 (fr) | 2003-02-18 | 2004-02-17 | Procédé de préparation de microorganismes évolués permettant la création ou la modification de voies métaboliques |
| BRPI0407600-1A BRPI0407600A (pt) | 2003-02-18 | 2004-02-17 | processos de preparação de microorganismos evoluìdos e de uma proteìna evoluìda e de biotransformação, gene evoluìdo, proteìna evoluìda, e utilização de um microorganismo evoluìdo ou de uma proteìna evoluìda |
| PCT/FR2004/000354 WO2004076659A2 (fr) | 2003-02-18 | 2004-02-17 | Procede de preparation de microorganismes evolues permettant la creation ou la modification de voies metaboliques |
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- 2003-05-14 FR FR0305769A patent/FR2854902B1/fr not_active Expired - Fee Related
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2854902B1 (fr) | 2006-06-09 |
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