GR20190100075A

GR20190100075A - Μεθοδος παραλαβης σεκοϊριδοειδων τυπου ελαιασινης και ελαιομισσιοναλης και παραγωγης των αντιστοιχων φαρμακευτικων παρασκευασματων τους

Info

Publication number: GR20190100075A
Application number: GR20190100075A
Authority: GR
Inventors: Προκοπιος Παναγιωτη Μαγιατης; Ελενη Ιωαννη Μελλιου; Παναγιωτης Γεωργιου Διαμαντακος; Αιμιλια Πετρου Ρηγακου
Original assignee: Προκοπιος Παναγιωτη Μαγιατης; Ελενη Ιωαννη Μελλιου; Παναγιωτης Γεωργιου Διαμαντακος; Αιμιλια Πετρου Ρηγακου
Priority date: 2019-02-13
Filing date: 2019-02-13
Publication date: 2020-09-16
Also published as: AU2020221684A1; JP2022521065A; ES2951983T3; AU2020221684B2; JP7641904B2; US12466779B2; EP3924326B1; EP3924326C0; WO2020165613A1; US20220119335A1; EP3924326A1

Abstract

Η παρούσα εφεύρεση αφορά τη μέθοδο παραλαβής σε καθαρή μορφή ή σε μίγμα των ουσιών ελαιασίνη και ελαιομισσιονάλη από καρπούς και φύλλα ελιάς και ορισμένων παραγώγων τους, των βιοδραστικών διολικών μορφών, μέσω εκλεκτικής εκχύλισης ειδικά επιλεγμένων φύλλων ή καρπών με νερό ή οργανικούς διαλύτες. Επίσης αφορά τα φαρμακευτικά παρασκευάσματα που περιέχουν τις παραπάνω ουσίες σε διάφορους συνδυασμούς και τις θεραπευτικές ιδιότητες των παρασκευασμάτων αυτών για την θεραπεία του καρκίνου, των εκφυλιστικών παθήσεων του κεντρικού νευρικού συστήματος, του διαβήτη, της υπερλυτιδαιμίας, των φλεγμονωδώνπαθήσεων και για την πρόληψη δημιουργίας αθηρωματικών πλακών και θρόμβων.

Description

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ

«Μέθοδος παραλαβής σεκοϊριδοειδών τύπου ελαιασίνης και ελαιομισσιονάλης και παραγωγής των αντίστοιχων φαρμακευτικών παρασκευασμάτων τους»

ΤΟ ΠΕΔΙΟ ΤΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗΣ

Η αίτηση αφορά την κατοχύρωση της μεθόδου παραλαβής σε καθαρή μορφή των ουσιών ελαιασίνη και ελαιομισσιονάλη από καρπούς και φύλλα ελιάς και ορισμένων παραγώγων τους, τα φαρμακευτικά παρασκευάσματα που περιέχουν ορισμένες από αυτές και τις θεραπευτικές ιδιότητες των παρασκευασμάτων αυτών. Η αίτηση αφορά το γνωστικό πεδίο της ιατρικής, φαρμακευτικής και επιστήμης τροφίμων.

ΣΤΑΘΜΗ ΤΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ

Τα σεκο ριδοειδή του παρακάτω γενικού τύπου

και R1 = Η ή COOCH3, R2 = CHO

αποτελούν σημαντικά συστατικά του ελαιολάδου. Ειδικότερα, η 5-(Ε)-ελαιασίνη (1) και η S-(Ε)-ελαιομισσιονάλη (2) αποτελούν φαινολικές ενώσεις που συναντώνται στις περισσότερες ποικιλίες ελαιολάδων σε συγκεντρώσεις που ποικίλουν από 0 ως 1000 mg/Kg ( Journal of Agricultural and Food Chemistry 2014, 62(3), 600-607, OLIVAE 2015, 122, 22-35). Η ουσία (2) βρίσκεται σε ισορροπία με τις αντίστοιχες διαλδεϋδικές μορφές (2a, b). Για όλα τα συστατικά αυτά υπάρχουν δημοσιευμένες διάφορες μέθοδοι απομόνωσης από φυσικές πηγές ή μέθοδοι χημικής σύνθεσης και επίσης για όλες υπάρχει πλήθος δημοσιευμένων βιολογικών και φαρμακευτικών ιδιοτήτων (αντιφλεγμονώδεις, αντικαρκινικές, αντιδιαβητικές, νευροπροστατευτικές, αντιοξειδωτικές).

Οι εφευρέτες όμως γνωρίζουν από πειράματα που έχουν εκπονήσει ότι οι ουσίες αυτές δεν αποτελούν την πραγματική βιοδιαθέσιμη μορφή με την οποία επιτυγχάνεται η δράση τους. Στην πραγματικότητα, οι ουσίες (1), (2) κατά την επαφή τους με τα ανθρώπινα βιολογικά υγρά αντιδρούν χημικά με το νερό με σχετικά αργό ρυθμό, διαφορετικό ανάλογα με την ουσία και σταδιακά μετατρέπονται στις δραστικές μορφές της 5-(Ε)-ελαιασινοδιόλης (3), 5S-(E)-ελαιομισσιοναδιόλης (4) οι οποίες εμφανίζουν αυξημένη δραστικότητα και πολύ αυξημένη υδατοδιαλυτότητα σε σχέση με τις ουσίες (1), (2).

Επομένως είναι πολύ σημαντικό να αναπτυχθούν μέθοδοι που θα επιτρέπουν την παραγωγή των ουσιών (3), (4) σε καθαρή μορφή και φαρμακευτικών παρασκευασμάτων ή συμπληρωμάτων διατροφής ή καλλυντικών στα οποία θα υπάρχουν οι βιοδιαθέσιμες μορφές (3), (4) μεμονωμένες ή σε μίγμα και δεν θα χρειάζεται να γίνει η ενεργοποίηση τους κατά την είσοδο στον ανθρώπινο οργανισμό. Παράλληλα είναι πολύ σημαντικό να βρεθούν και νέες μέθοδοι που θα οδηγούν στην παραγωγή των προϊόντων (1), (2) με υψηλότερη απόδοση σε σχέση με τις υπάρχουσες μεθόδους και χωρίς τη χρήση μεθόδων υγρής χρωματογραφίας για τον καθαρισμό τους.

Μέχρι σήμερα η δομή της ουσίας (3) δεν είχε ποτέ πλήρως χαρακτηριστεί σωστά ενώ δεν έχει περιγράφει μέθοδος είτε εκλεκτικής παραγωγής είτε σε μορφή μίγματος των ουσιών (3) και (4) με δυνατότητα βιομηχανικής αξιοποίησης. Τα φασματοσκοπικά στοιχεία της ουσίας (4) έχουν περιγράφει (J. Chem. Soc., Perkin trans. 1995, 1, 1519-1523) μετά από ενζυματική υδρόλυση καθαρής ελευρωπαϊνης ενώ η ουσία (9) έχει παραχθεί με πολύ μικρές αποδόσεις, σε μίγματα με άλλες ουσίες που δεν μπορούν να αξιοποιηθούν από εκχυλίσματα καρπών ελιάς (Food Res. Inti. 2000, 33: 475-485)

Πρέπει να αναφερθεί ότι υπάρχουν στη βιβλιογραφία αναφορές σχετικά με τη χρήση φυτών από είδη Phillyrea, τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή της ισομερούς S -(Ζ) -ελαιασινοδιόλης με πολύ μικρές αποδόσεις, σε μίγματα με άλλες ουσίες που δεν μπορούν να αξιοποιηθούν (Phytochemistry Letters 8 (2014) 163-170). Επίσης οι ισομερείς ουσίες 5-(Ζ)-ελαιασινοδιόλη και 5S-(Z)-ελαιομισσιοναδιόλη, εμφανίζονται να παράγονται με πολύ μικρές αποδόσεις, σε μίγματα με άλλες ουσίες που δεν μπορούν να αξιοποιηθούν, κατά τη εκχύλιση ελαιολάδου με μίγμα μεθανόλης νερού. (J. Agric. Food Chem.2018, 66, 6053-6063.)

Είναι πολύ σημαντικό να σημειωθεί ότι οι ουσίες (1), (2) διαθέτουν διάφορες χαρακτηριστικές ομάδες και ιδίως δυο αλδεϋδικές ομάδες που η κάθε μια από τις αλδεϋδικές ομάδες μπορεί να αντιδράσει με το νερό με διαφορετικό τρόπο και υπό διαφορετικές συνθήκες (pH, θερμοκρασία, χρόνος) και επομένως η συσχέτιση των συγκεκριμένων δομών (3), (4) με συγκεκριμένες θεραπευτικές δράσεις δεν είναι προφανής και έχει στοιχεία εφευρετικότητας.

Στην παρούσα εφεύρεση σημαντικό στοιχείο καινοτομίας είναι η χρήση πολυμερών υδρόφιλων αλκοολών ως μέσο διαλυτοποίησης. Οι προτεινόμενες αλκοόλες είναι βιοσυμβατές και έχουν την ικανότητα να διαλυτοποιούν πλήρως τις ουσίες (1), (2) ενώ παράλληλα όταν έρθουν σε επαφή με νερό μπορούν να απελευθερώσουν τις δραστικές μορφές (3), (4).

Πρέπει να αναφερθεί ότι υπάρχουν στη βιβλιογραφία αναφορές σχετικά με τη χρήση φυτών από είδη Ligustrum τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή ελαιασίνης (1) με πολύ μικρές αποδόσεις, σε μίγματα με άλλες ουσίες και με περίπλοκες διαδικασίες καθαρισμού (Journal of Ethnopharmacology 120 (2008) 220-225).

Παρατίθενται οι χημικοί τύποι των ουσιών που περιγράφονται στην παρούσα εφεύρεση:

ΛΕΠΤΟΜΕΡΗΣ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΠΡΟΤΙΜΩΜΕΝΩΝ ΕΦΑΡΜΟΓΏΝ

1. Αρχή μεθόδου παραγωγής Ελαιασινοδιόλης (3) και ελαιασίνης (1):

Η ουσία ελαιασινοδίόλη (3) παράγεται από την αντίδραση της ουσίας ελαιασίνη (1) με το νερό. Η ουσία ελαιασίνη παράγεται βιοσυνθετικά από την πρόδρομη ουσία ελευρωπαΐνη με τη δράση της β-γλυκοσιδάσης επακολούθου μενη από μια αντίδραση απομεθυλίωσης και αποκαρβοξυλίωσης. Οι εφευρέτες γνωρίζουν ότι η πω άφθονη πηγή ελευρωπαΐνης είναι τα νωπά φύλλα ελιάς ( Olea europaea L. και όλων των υποειδών και καλλιεργητικών ποικιλιών) ή φύλλα μερικώς αποξηραμένα στα οποία όμως διατηρείται ενεργή η δράση της γλυκοσιδάσης και της απομεθυλάσης. Τα ένζυμα διατηρούνται σε ξεχωριστά κυτταρικά διαμερίσματα σε σχέση με την πρόδρομη ουσία ώστε να μην γίνεται αντίδραση όταν το φύλλο είναι σε ακέραιη μορφή. Αν τα φυτικά ένζυμα έρθουν σε επαφή με την πρόδρομη ουσία παρουσία νερού κατά τον τεμαχισμό των φύλλων τότε επιτυγχάνεται η μετατροπή της ελευρωπαΐνης σε ελαιασινοδίόλη με απόδοση που μπορεί να φτάσει το 1% ως προς το βάρος νωπού φύλλου. Είναι εξαιρετικά κρίσιμο ότι αν ο τεμαχισμός των φύλλων γίνει απουσία νερού τότε η αντίδραση αυτή γίνεται με πολύ μικρή απόδοση (<0,1%) χωρίς δυνατότητα πρακτικής αξιοποίησης. Επίσης η αντίδραση δεν γίνεται σε ικανοποιητικό βαθμό ή και καθόλου αν το νερό είναι σε θερμοκρασία διαφορετική από 15-40°C.

Επίσης οι εφευρέτες από πειράματα που έχουν εκπονήσει έχουν διαπιστώσει ότι η ουσία ελαιασινοδίόλη όταν έρθει σε επαφή με άπολο οργανικό διαλύτη όπως διχλωρομεθάνιο ή οξικό αιθυλεστέρα εκχυλίζεται ποσοτικά και εκλεκτικά στην οργανική φάση αποβάλλοντας ένα μόρω νερού και επανέρχεται στην αλδεϋδική λιπόφιλη μορφή. Οι εφευρέτες αξιοποιώντας όλη την παραπάνω γνώση που προέκυφε από πειράματα τους, ανέπτυξαν την παρακάτω μέθοδο παραγωγής διαλύματος καθαρής ελαιασινοδιόλης:

1αi. Νωπά φύλλα ελιάς από το είδος Olea europaea L, συμπεριλαμβανομένων όλων των υποειδών και καλλιεργητικών ποικιλιών, (ή φύλλα με υγρασία 0,1-10%) τεμαχίζονται παρουσία νερού με αναλογία (φύλλα:νερό β/β) από 1:1 ως 1:20 σε θερμοκρασία 15-40°C και αφήνονται σε επαφή για χρονικό διάστημα από 30 λεπτά ως 12 ώρες (μίγμα Α).

1αii. Εναλλακτικά, άθικτοι νωποί καρποί ελιάς από το είδος Olea europaea L, συμπεριλαμβανομένων όλων των υποειδών και καλλιεργητικών ποικιλιών, ή καρποί που έχουν καταψυχθεί έρχονται σε επαφή με νερό με αναλογία από 1:1 ως 1:20 σε θερμοκρασία 15-40°C για χρονικό διάστημα από 30 λεπτά ως 12 ώρες. Η απόδοση είναι υψηλότερη εάν ο καρπός είναι κατεψυγμένο καθώς κατά τη διαδικασία της απόψυξης γίνεται ρήξη των κυττάρων και επιτυγχάνεται στιγμιαία επαφή του υποστρώματος (ελευρωπαινη) με τα ένζυμα απογλυκοζυλίωσης και απομεθυλίωσης.

1β. Το υδατικό μίγμα Α που προκύπτει από το 1αi ή 1αii διηθείται και παραλαμβάνεται η υδατική φάση. Το διάλυμα αυτό περιέχει ελαιασινοδιόλη σε μίγμα με σάκχαρα και άλλες υδατοδιαλυτές φαινόλες.

1γ. Το υδατικό διάλυμα από το στάδιο 1β εκχυλίζεται με οργανικό διαλύτη μη αναμίξιμο με το νερό σε αναλογία από 1:10 ως 10:1 (πχ διχλωρομεθάνιο ή οξικό αιθελεστέρα ή υπερκρίσιμο διοξείδιο του άνθρακα) και παραλαμβάνεται η οργανική φάση.

1δ. Η οργανική φάση από το στάδιο 1γ εξατμίζεται και παραλαμβάνεται το προϊόν Β το οποίο περιέχει ελαιασίνη καθαρότητας 95% χωρίς να χρειάζεται καμία διαδικασία περαιτέρω χρωματογραφικού καθαρισμού, σε αντίθεση με όλες τις ως τώρα γνωστές μεθόδους παραγωγής ελαιασίνης.

1ε. Το προϊόν Β (ελαιασίνη) αναμιγνύεται με απιονισμένο και απεσταγμένο νερό, υπό έντονη ανάδευση, σε θερμοκρασία 15-40°C για χρόνο από 5 λεπτά ως 24 ώρες και κατά τη χημική αντίδραση με το νερό μετατρέπεται σε διάλυμα ελαιασινοδιόλης με συγκέντρωση μέχρι 2% (διάλυμα Γ). Ιδιαίτερη προσοχή χρειάζεται στο pH του νερού το οποίο πρέπει να είναι ουδέτερο (6,9-7, 1)

1στ. Εναλλακτικά το προϊόν Β (ελαιασίνη από το στάδιο 1δ) μπορεί να αναμιχθεί με πολυαιθυλενογλυκόλη με μέγεθος από PEG200 ως 400 (διάλυμα ΣΤ) και να μετατραπεί σε σταθερή πολυαιθυλενογλυκολική ημιακετάλη (5) όπου στον παρατιθέμενο τύπο το μέγεθος της αλυσίδας πρέπει υποχρεωτικά να είναι μεταξύ n=4-9.

1ζ. Το διάλυμα ΣΤ μπορεί να αραιωθεί με νερό σε αναλογία PEG200 (ή 400): νερό = 1:10 ή 1:20 ή 1:100 κτλ αποδίδοντας το διάλυμα I και να μετατραπεί η πολυαιθυλενογλυκολική ημιακετάλη της ελαιασίνης (5) σε ελαιασινοδιόλη (3). Το διάλυμα I μπορεί να χρησιμοποιηθεί για απευθείας χορήγηση στο άνθρωπο per os (σιρόπια, διαλύματα, εναιωρήματα), ενέσιμο ή διαδερμικά (ενσωμάτωση σε κρέμες ή γέλες)

1η. Το διάλυμα Γ ή ΣΤ ή I μπορεί σε κατάλληλη συγκέντρωση να χρησιμοποιηθεί για να παρασκευασθούν υπόθετα μετά από ανάμιξη με κατάλληλη βάση (υποθετόμαζα) ή για παρασκευή δισκίων μετά από ανάμιξη με έκδοχα (πχ λακτόζη), ξήρανση με fluid bed (ρευστή κλίνη) και συμπίεση. Πρέπει να σημειωθεί ότι κατά την παρασκευή των δισκίων η χρήση κατάλληλου εκδόχου και η ρύθμιση των επιπέδων υγρασίας κατά την ξήρανση επιτρέπει στην ουσία να παραμένει στη διολική μορφή. Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνεται από τη στιγμιαία διάλυση του δισκίου σε νερό που δεν θα συνέβαινε αν η ουσία ήταν στη λιπόφιλη αλδεϋδική μορφή.

Όπως προκύπτει από τη φασματοσκοπική εξέταση του διαλύματος Γ με τη χρήση φασματοσκοπίας NMR εντός δευτεριωμένου ύδατος (D2O) (Σχήμα 1) πρόκειται για αληθές διάλυμα της διολικής μορφής και όχι για γαλάκτωμα της διαλδεϋδικής μορφής εντός της υδατικής φάσης, η οποία υπάρχει σε πολύ μικρό ποσοστό.

φαρμακευτικές ιδιότητες Ελαιασινοδιόλης:

1θ. Το διάλυμα Γ ή ΣΤ ή I έδειξε ισχυρή αντιοξειδωτική δράση παρεμποδίζοντας την λιπιδική υπεροξείδωση σε συγκέντρωση 1μΜ.

1ι. Μελέτη της κυτταροτοξικής δράσης του διαλύματος Γ ή ΣΤ ή I έδειξε ότι η ελαιασινοδιόλη σε συγκέντρωση 5 μΜ μπορούσε να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο το 50% των καρκινικών κυττάρων HeLa και MCF-7 και επομένως το διάλυμα Γ ή ΣΤ ή I και όσα φαρμακευτικά παρασκευάσματα προκόψουν από αυτά μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία του καρκίνου.

1ια. Το διάλυμα Γ ή ΣΤ ή I σε συγκέντρωση ελαιασινοδιόλης 50 μΜ έδειξε αναστολή του ενζύμου COX-2 σε ποσοστό 65% και επομένως το διάλυμα Γ ή ΣΤ ή I και όσα φαρμακευτικά παρασκευάσματα προκόψουν από αυτά μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία φλεγμονωδών παθήσεων.

1ϊβ. Κατ' επέκταση με τις περιπτώσεις 1θ-1ια, τα διαλύματα Γ ή ΣΤ ή I έχουν τις ίδιες θεραπευτικές ιδιότητες (νευροπροστατευτικές, αντιδιαβητικές, αντιθρομβωτικές) οι οποίες είναι γνωστές για την ελαιασίνη καθώς σε όλες τις περιπτώσεις η ελαιασίνη τουλάχιστον εν μέρει μετατρέπεται σε ελαιασινοδιόλη στο υδατικό περιβάλλον στο οποίο πραγματοποιούνται τα πειράματα μέτρησης των βιολογικών της δράσεων.

Παράδειγμα 1

Αποξηραμένα φύλλα ελιάς ποικιλίας Καλαμών (10 Kg) με υγρασία 1% τεμαχίζονται παρουσία νερού (100 L) σε θερμοκρασία 25°C και αφήνονται σε επαφή για 30 min. Το μίγμα διηθείται και παραλαμβάνεται η υδατική φάση. Το υδατικό διάλυμα εκχυλίζεται με διχλωρομεθάνιο (80 L) και παραλαμβάνεται η στιβάδα του διχλωρομεθανίου η οποία εξατμίζεται υπό κενό σε θερμοκρασία 30°C. Το υπόλειμμα που παραμένει αποτελείται από ελαιασίνη με καθαρότητα 95% με βάρος 100 g. Η ελαιασίνη αναμιγνύεται με νερό (10 L) υπό έντονη ανάδευση για 30 min και μετατρέπεται σε διάλυμα καθαρής ελαιασινοδιόλης. Εναλλακτικά η ελαιασίνη (1 g) αναμιγνύεται με PEG200 ή PEG 400 (5 ml) και μετατρέπεται σε σταθερή πολυαιθυλενογλυκολική ημιακετάλη της ελαιασίνης. Το διάλυμα αυτό είναι σταθερό σε συνθήκες δωματίου για 12 μήνες. Το διάλυμα αυτό μπορεί να αραιωθεί μέχρι τα 100 ml με κορεσμένο διάλυμα σάκχαρης και να προκύψει σιρόπι περιεκτικότητας 1% σε ελαιασινοδιόλη σταθερό για 15-30 ημέρες με αντιφλεγμονώδη χρήση.

Παράδειγμα 2

Άθικτοι καρποί ελιάς (200 g) τοποθετούνται στην κατάψυξη (-20 °C) για 24 ώρες και στη συνέχεια αφήνονται σε επαφή για 24 ώρες με νερό (500 ml) σε θερμοκρασία 25°C. Το μίγμα διηθείται και παραλαμβάνεται η υδατική φάση. Το υδατικό διάλυμα εκχυλίζεται με διχλωρομεθάνιο (250 ml) και παραλαμβάνεται η στιβάδα του διχλωρομεθανίου η οποία εξατμίζεται υπό κενό. Το υπόλειμμα που παραμένει αποτελείται από ελαιασίνη με καθαρότητα 95% με βάρος 1 g. Η ελαιασίνη αναμιγνύεται με νερό (100 ml) υπό ανάδευση για 30 min και μετατρέπεται σε διάλυμα καθαρής ελαιασινοδιόλης. Εναλλακτικά η ελαιασίνη (1 g) αναμιγνύεται με PEG200 ή PEG 400 (5 ml) και μετατρέπεται σε σταθερή πολυαιθυλενογλυκολική ημιακετάλη της ελαιασίνης. 100 μι. του πολυαιθυλενογλυ κολικού διαλύματος αναμιγνύονται με τηγμένη υποθετόμαζα (2g) και αφήνονται να ψυχθούν αποδίδοντας υπόθετα περιεκτικότητας 100 mg.

2. Αρχή μεθόδου παραγωγής Ελαιομισσιοναδιόλης (4) και ελαιομισσιονάλης (2)

Οι εφευρέτες με πειράματα που πραγματοποίησαν ανακάλυψαν ότι αν τα φύλλα της ελιάς ή OL άθικτοι άγουροι πράσινοι καρποί της ελιάς έρθουν σε επαφή με οργανικό λιπόφιλο διαλύτη χωρίς η φυτική ύλη να είναι τεμαχισμένη τότε πραγματοποιείται μόνο το πρώτο στάδιο της απογλυκοζυλίωσης και δεν γίνεται το δεύτερο στάδιο της απομεθυλίωσης. Με αυτό τον τρόπο η πρόδρομη ουσία ελευρωπάΐνη μετατρέπεται εκλεκηκά σε ελαιομισσιονάλη.

Η ουσία αυτή, μετά την απομάκρυνση του οργανικού διαλύτη, μπορεί να έρθει σε επαφή με υδατικό διάλυμα και πολύ αργά να αντιδράσει με το νερό και να μετατραπεί σε Ελαιομισσιοναδιόλη (4) η οποία είναι υδατοδιαλυτή. Με αυτό τον τρόπο μπορεί να διαχωριστεί από τα αδιάλυτα στο νερό τερπένια που εκχυλίζονται στο πρώτο στάδιο με τον οργανικό διαλύτη. Με διήθηση παραλαμβάνεται το καθαρό διάλυμα της ελαιομισσιοναδιάλης.

Με εξάτμιση του υδατικού διαλύματος μπορεί να παραληφθεί καθαρή ελαιομισσιονάλη (2) καθώς γίνεται αντίδραση αφυδάτωσης και σταδιακή επαναφορά της αλδεϋδικής/ενολικής μορφής. Στο στάδιο αυτό συνυπάρχει η ελαιομισσιονάλη με τις δυο στερεοϊσομερείς ελευρωπαΐνοδιάλες (2a, b).

Οι εφευρέτες ενοποιώντας όλη την παραπάνω γνώση, που προέκυφε από πειράματα τους, ανέπτυξαν την παρακάτω μέθοδο παραγωγής διαλύματος καθαρής ελαιομισσιοναδιόλης:

2α. Νωπά φύλλα ελιάς ή νωποί άθικτοι καρποί ελιάς χωρίς να τεμαχίζονται έρχονται σε επαφή με οργανικό διαλύτη μη αναμίξιμο με το νερό (πχ διχλωρομεθάνιο ή οξικό αιθυλεστέρα ή υπερκρίσιμο διοξείδιο του άνθρακα) με αναλογία από 1:1 ως 1:20 σε θερμοκρασία 15-40°C και αφήνονται σε επαφή για χρονικό διάστημα από 30 λεπτά ως 12 ώρες (μίγμα Α).

2β. Το μίγμα διηθείται και παραλαμβάνεται η οργανική φάση. Το διάλυμα αυτό περιέχει ελαιομισσιονάλη σε μίγμα με τερπένια (κυρίως ολεανολικό και μασλινικό οξύ).

2γ. Το διάλυμα εξατμίζεται υπό ελαττωμένη πίεση και θερμοκρασία 30°C και παραλαμβάνεται το υπόλειμμα.

2δ. Το υπόλειμμα διαλύεται σε νερό (με pH που δεν πρέπει να είναι μεγαλύτερο από 7) με ανάδευση για διάστημα από 1 ως 24 ώρες σε θερμοκρασία 15-35°C και κατά τη χημική αντίδραση με το νερό η ελαιομισσιονάλη (και τα ισομερή της) μετατρέπεται σε διάλυμα ελαιομισσιοναδιόλης ενώ όλα τα υπόλοιπα συστατικά παραμένουν αδιάλυτα. Τα αδιάλυτα απομακρύνονται με διήθηση και παραλαμβάνεται το υδατικό διάλυμα Δ που περιέχει καθαρή ελαιομισσιοναδιόλη (4).

2ε. Το διάλυμα εξατμίζεται και παραλαμβάνεται το προϊόν Ε που περιέχει ελαιομισσιονάλη (σε ισορροπία με τα ισομερή της) με ολική καθαρότητας >95% υπό τη μορφή παχύρευστου υγρού.

2στ. Το προϊόν Ε διαλύεται σε PEG200 ή 400 και μετατρέπεται σε διάλυμα 0 που περιέχει την σταθερή πολυαιθυλενογλυκολικής ημιακετάλης της ελαιομισσιονάλης (6).

2ζ. Το διάλυμα Θ μπορεί να αραιωθεί με νερό σε αναλογία PEG200 (ή 400):νερό = 1:10 ή 1:20 ή 1:100 κτλ αποδίδοντας διάλυμα ΙΑ στο οποίο έχει μετατραπεί η πολυαιθυλενογλυκολική ημιακετάλη της ελαιομισσιονάλης (6) σε ελαιομισσιοναδιόλη (4). Το διάλυμα ΙΑ μπορεί να χρησιμοποιηθεί για απευθείας χορήγηση στον άνθρωπο per os (σιρόπια, διαλύματα, εναιωρήματα), ενέσιμο ή διαδερμικά (ενσωμάτωση σε κρέμες ή γέλες)

2η. Το διάλυμα Δ ή Θ ή ΙΑ μπορεί σε κατάλληλη συγκέντρωση να χρησιμοποιηθεί για να παρασκευασθούν υπόθετα μετά από ανάμιξη με κατάλληλη βάση (υποθετόμαζα) ή για παρασκευή δισκίων μετά από ανάμιξη με έκδοχα (πχ λακτόζη), ξήρανση με fluid bed και συμπίεση. Πρέπει να σημειωθεί ότι κατά την παρασκευή των δισκίων η χρήση κατάλληλου εκδόχου και η ρύθμιση των επιπέδων υγρασίας κατά την ξήρανση επιτρέπει στην ουσία να παραμένει στη διολική μορφή.

Όπως προκύπτει από τη φασματοσκοπική εξέταση του διαλύματος Δ με τη χρήση φασματοσκοπίας NMR (Σχήμα 2) πρόκειται για αληθές διάλυμα της διολικής μορφής η οποία υπάρχει σε δυο διαστερεομερείς μορφές και όχι για γαλάκτωμα της διαλδεΰδικής μορφής.

Φαρμακευτικές ιδιότητες Ελαιασινοδιόλης:

2Θ. Το διάλυμα Δ ή Θ ή ΙΑ έδειξε ισχυρή αντιοξειδωτική δράση παρεμποδίζοντας την λιπιδική υπεροξείδωση σε συγκέντρωση ΙμΜ.

2ι. Μελέτη της κυτταροτοξικής δράσης του διαλύματος Δ ή Θ ή ΙΑ έδειξε ότι η ελαιομισσιοναδιόλη σε συγκέντρωση 50 μΜ μπορούσε να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο το 50% των καρκινικών κυττάρων HeLa και MCF-7 και επομένως το διάλυμα Δ ή Θ ή ΙΑ και όσα φαρμακευτικά παρασκευάσματα προκόψουν από αυτά μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία του καρκίνου.

2ια. Το διάλυμα Δ ή 0 ή ΙΑ σε συγκέντρωση ελαιασινοδιόλης 40μΜ έδειξε αναστολή του ενζύμου COX-2 σε ποσοστό 62% και επομένως το διάλυμα Δ ή Θ ή ΙΑ και όσα φαρμακευτικά παρασκευάσματα προκύψουν από αυτά μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία φλεγμονωδών παθήσεων.

Παράδειγμα 3

Νωπά φύλλα ελιάς ποικιλίας Κορωνέικη (100 g) αφήνονται σε επαφή με διχλωρομεθάνιο (500 g) σε θερμοκρασία 25°C για 30 min. Το μίγμα διηθείται και παραλαμβάνεται η οργανική φάση η οποία εξατμίζεται υπό κενό. Το υπόλειμμα που παραμένει διαλύεται σε απιονισμένο και απεσταγμένο νερό με pH = 6 (100 ml) υπό ανάδευση για 24 ώρες, διηθείται και παραλαμβάνεται διάλυμα καθαρής ελαιομισσιοναδιόλης. Το διάλυμα εξατμίζεται ή λυοφιλοποιείται και παραλαμβάνεται ελαιομισσιονάλη (160 mg) με καθαρότητα >95%. Εναλλακτικά η ελαιομισσιονάλη (160 mg) αναμιγνύεται με PEG200 ή PEG 400 (5 ml) και μετατρέπεται σε σταθερή πολυαιθυλενογλυκολική ημιακετάλη της ελαιομισσιονάλης. Το διάλυμα που προκύπτει μπορεί να αραιωθεί μέχρι τα 100 ml με κορεσμένο διάλυμα σάκχαρης και να προκόψει σιρόπι περιεκτικότητας 0,16% σε ελαιομισσιοναδιόλη σταθερό για 15-30 ημέρες με αντιφλεγμονώδη δράση.

Παράδειγμα 4

Νωπά άθικτοι καρποί ελιάς ποικιλίας Κορωνέικη (200 g) αφήνονται σε επαφή με διχλωρομεθάνιο (500 g) σε θερμοκρασία δωματίου για 30 min. Το μίγμα διηθείται και παραλαμβάνεται η οργανική φάση η οποία εξατμίζεται υπό κενό. Το υπόλειμμα που παραμένει διαλύεται σε απιονισμένο και απεσταγμένο νερό διηθείται και παραλαμβάνεται διάλυμα καθαρή ή λυοφιλοποιείται και παραλαμβάνεται ελαιο Εναλλακτικά η ελαιομισσιονάλη (1 g) αναμι μετατρέπεται σε σταθερή πολυαιθυλενογλυκολι με pH = 6 (100 ml) υπό ανάδευση για 24 ώρες, ς ελαιομισσιοναδιόλης. Το διάλυμα εξατμίζεται μισσιονάλη (200 mg) με καθαρότητα >95%. γνύεται με PEG200 ή PEG 400 (5 ml) και ική ημιακετάλη της ελαιομισσιονάλης.

Claims

Αξιώσεις: 1. Μέθοδος παραλαβής σεκοΐριδοειδών του τύπου
Κατά την οποία : Φυτικό υλικό προερχόμενο από το είδος Olea europaea L, συμπεριλαμβανομένων όλων των υποειδών και καλλιεργητικών ποικιλιών, φέρεται σε επαφή με διαλυτικό μέσο με αναλογία από 1:1 ως 1:20 σε θερμοκρασία 15-40°C, αφήνεται σε επαφή για χρονικό διάστημα από 30 λεπτά ως 12 ώρες και παράγεται μίγμα (Α). 2. Μέθοδος παραλαβής σεκοΐριδοειδών σύμφωνα με την αξίωση 1, όπου σαν φυτικό υλικό χρησιμοποιούνται νωπά ή αποξηραμένα φύλλα με υγρασία από 0,1% μέχρι 10% που προηγουμένως έχουν τεμαχιστεί εμβαπτισμένα σε υδατικό διάλυμα ή άθικτοι νωποί καρποί ή καρποί που έχουν ψυχθεί (στους 2-8 °C) ή καταψυχθεί (στους -18 ως -24°C) για τουλάχιστον 24 ώρες, σαν διαλυτικό μέσο χρησιμοποιείται νερό και επιπλέον περιλαμβάνει: Διήθηση του μίγματος (Α), παραλαβή της υδατικής φάσης, εκχύλιση αυτής με οργανικό διαλύτη μη αναμίξιμο με το νερό (πχ διχλωρομεθάνιο ή οξικό αιθυλεστέρα ή υπερκρίσιμο διοξείδιο του άνθρακα) σε αναλογία από 10:1 ως 1:10, παραλαβή της οργανικής φάσης και εξάτμιση αυτής, η οποία αποδίδει προϊόν (Β), το οποίο εμπεριέχει την ουσία με:
Και Rl = Η και R2 = CHO 3. Μέθοδος παραλαβής σεκοΐριδοειδών σύμφωνα μιε την αξίωση 2, η οποία επιπλέον περιλαμβάνει ανάμιξη του προϊόντος (Β) μιε απιονισμιένο και απεσταγμένο νερό με pH =<7 σε αναλογία ως 2% β/β και θερμοκρασία 15-40°C για χρόνο από 5 λεπτά ως 24 ώρες, η οποία αποδίδει διάλυμα (Γ), το οποίο εμπεριέχει την ουσία με:
Και R1 = Η και R2 = CH(ΟΗ)2 4. Μέθοδος παραλαβής σεκόϊριδοειδών σύμφωνα με την αξίωση 1, όπου σαν φυτικό υλικό χρησιμοποιούνται άθικτα νωπά φύλλα ή καρποί, σαν διαλυτικό μέσο χρησιμοποιείται οργανικός διαλύτης μη αναμίξιμος με το νερό (όπως διχλωρομεθάνιο ή οξικός αιθυλεστέρας ή υπερκρίσιμο διοξείδιο του άνθρακα) και επιπλέον περιλαμβάνει: Διήθηση του μίγματος (Α), παραλαβή της οργανικής φάσης, εξάτμιση αυτής, παραλαβή του υπολείμματος, διάλυση αυτού σε απιονισμένο και απεσταγμένο νερό με pH =<7 με ανάδευση σε αναλογία ως 2% β/β και θερμοκρασία 15-35°C για χρόνο από 1 ως 24 ώρες, απομάκρυνση των αδιάλυτων συστατικών με διήθηση και παραλαβή διαλύματος (Δ), το οποίο εμπεριέχει την ουσία με:
Και Rl = COOCH3και R2 = CH(OH)z, 5. Μέθοδος παραλαβής σεκοΐριδοειδών σύμφωνα με την αξίωση 4, η οποία επιπλέον περιλαμβάνει εξάτμιση του διαλύματος (Δ) υπό ελαττωμιένη πίεση και θερμοκρασία <40 °C, η οποία αποδίδει προϊόν (Ε), στο οποίο εμπεριέχονται ουσίες με:
6. Μέθοδος παραλαβής σεκοΐριδοειδών σύμφωνα με την αξίωση 2, η οποία επιπλέον περιλαμβάνει ανάμιξη του προϊόντος (Β) με πολυαιθυλενογλυκόλη με μέσο μοριακό βάρος από 200 ως 400 (PEG200 ως 400), η οποία αποδίδει διάλυμα (ΣΤ), το οποίο εμπεριέχει την ουσία με:
7. Μέθοδος παραλαβής σεκοΐριδοειδών σύμφωνα με την αξίωση 5, η οποία επιπλέον περιλαμβάνει ανάμιξη του προϊόντος (Ε) με πολυαιθυλενογλυκόλη με μέσο μοριακό βάρος από 200 ως 400 (PEG200 ως 400), η οποία αποδίδει διάλυμα (Θ), το οποίο εμπεριέχει την ουσία με:
8. Μέθοδος παραλαβής σεκοΐριδοειδών σύμφωνα με την αξίωση 6, η οποία επιπλέον περιλαμβάνει αραίωση του διαλύματος (ΣΤ) με νερό σε αναλογία πολυαιθυλενογλυκόλη: νερό = 1:10 ή 1:20 ή 1:100, η οποία αποδίδει διάλυμα (I) το οποίο εμπεριέχει την ουσία με:

R1 = Η και R2 = CH(OH)2,
9. Μέθοδος παραλαβής σεκοΐριδοειδών σύμφωνα με την αξίωση 7, η οποία επιπλέον περιλαμβάνει αραίωση του διαλύματος (Θ) με νερό σε αναλογία πολυαιθυλενογλυκόλη: νερό = 1:10 ή 1:20 ή 1:100, η οποία αποδίδει διάλυμα (ΙΑ) το οποίο εμπεριέχει την ουσία με:

R1 = COOCH3και R2 = CH(OH)2,
10. Σεκοϊριδοειδή του τύπου

Όπου

Και R1 = Η ή COOCH3,
11. Σεκοϊριδοειδή του τύπου

Και Rl = Η, R2 = CH(OH)2
12. Χρήση των σεκοΐριδοειδών του τύπου

Όπου /<Rl> Χ = — C"<R>2 Η Και R1 = Η ή COOCH3,

αναμεμιγμένα με κατάλληλα έκδοχα για τ συμπληρωμάτων διατροφής για χορήγηση ην παραγωγή φαρμακευτικών προϊόντων ή είτε από το στόμα (σιρόπια, εναιωρήματα,διαλύματα) είτε διαδερμικά (κρέμες ή γέλες) ή ενέσιμα διαλύματα ή υπόθετα ή δισκία που παράγονται μετά από ξήρανση και συμπίεση.
13.Χρήση των σεκοϊριδοειδών του τύπου

Όπου

αναμεμιγμένα με κατάλληλα έκδοχα για την παραγωγή μη υδατικών φαρμακευτικών προϊόντων ή συμπληρωμάτων διατροφής για χορήγηση είτε από το στόμα (ελαιώδη διαλύματα) είτε διαδερμικά (αλοιφές) ή υπόθετα ή δισκία.
14. Τα φαρμακευτικά παρασκευάσματα των αξιώσεων 12 ή 13 για χρήση στην θεραπεία του καρκίνου, των εκφυλιστικών παθήσεων του κεντρικού νευρικού συστήματος, του διαβήτη, της υπερλιπιδαιμίας, των φλεγμονωδών παθήσεων και για την πρόληψη δημιουργίας αθηρωματικών πλακών και θρόμβων.