HK3396A - Cloning and expression of bordetella pertussis toxin-encoding dna - Google Patents

Claims (20)

1. Fragment EcoRI d'ADN chromosomique de Bordetella pertussis avec 4696 paires de bases contenant les gènes qui codent pour les cinq sous-unités de la toxine de pertussis ou un autre de ses fragments, où l'autre fragment contient au moins un gène qui code pour au moins une sous-unité de la toxine de pertussis.
2. Fragment d'ADN ou autre fragment selon la revendication 1 ayant la séquence donnée dans la figure 3.
3. Fragment d'ADN ou autre fragment selon la revendication 1 ou 2 contenant les gènes codant pour les sous-unités S1, S2, S3, S4 et S5 de la toxine de pertussis et au moins un des cadres ouverts de lecture (ORF) A, B, C et D.
4. Plasmide hybride contenant le fragment d'ADN ou autre de ses fragments tel que défini dans le revendication 1 ou 2 capable d'exprimer le fragment d'ADN ou autre fragment lorsqu'il est porté par un microorganisme, pour synthétiser la toxine de pertussis ou une ou plusieurs sous-unités de toxine de pertussis.
5. Plasmide hybride selon la revendication 4, dans lequel le fragment d'ADN ou autre de ses fragments est placé sous la commande d'une région qui régule l'expression.
6. Plasmide hybride pT101 selon la revendication 4 ou 5, dans lequel le fragment EcoRI a 4696 paires de bases est inséré dans le site de restriction EcoRI de pEMBL8.
7. Plasmide hybride PTE255 selon la revendication 4 ou 5 dans lequel le fragment Sau3A-Xba I qui code pour la sous-unité S1 est inséré dans le site BamHI-XbaI du plasmide 31B.
8. Plasmide hybride PTE211 selon la revendication 4 ou 5, dans lequel le fragment Sau96-Smal qui code pour la sous-unité S2 est inséré dans le site BamHI dans le plasmide 31A.
9. Plasmide hybride PTE221 selon la revendication 4 ou 5, dans lequel le fragment SpH1-DDE1 qui code pour la sous-unité S3 est inséré dans le site BamHI dans le plasmide 31C.
10. Plasmide hybride PTE240 selon la revendication 4 ou 5, dans lequel le fragment BstN1-BstN1 qui code pour la sous-unité S4 est inséré dans le site BamHI du plasmide 31B.
11. Plasmide hybride PTE230 selon la revendication 4 ou 5, dans lequel le fragment Aat2-SnaBI qui code pour la sous-unité S5 est inséré dans le site BamHI du plasmide 31A.
12. Micro-organisme transformé par un plasmide hybride tel que défini dans l'une quelconque des revendications 4 à 11.
13. Micro-organisme Escherichia coli transformé avec un plasmide hybride selon la revendication 7.
14. Le micro-organisme transformé Escherichia coli ATCC 53212.
15. Procédé de préparation de la toxine de pertussis ou d'une ou plusieurs des sous-unités de la toxine de pertussis qui comprend l'étape de mise en culture d'un micro-organisme transformé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 12 à 14 dans un milieu de culture approprié.
16. Procédé de clonage et de séquençage du fragment d'ADN selon la revendication 1 ou 2, dans lequel:

    a) on isole et on clone, dans un phage lambda EMBL4 d'E. coli, des fragments d'ADN chromosomique à 15 000 - 20 000 paires de bases, obtenus par digestion de l'ADN chromosomique de Bordetella pertussis BP 356, une souche mutante qui ne produit pas la toxine de pertussis, qui contient un transposon Tn5 dans son propre ADN chromosomique;

    b) on isole un fragment d'ADN de phage recombinant qui s'hybride avec une sonde marquée pour l'ADN de Tn5 provenant des phages recombinants positifs obtenus;

    c) on découpe le fragment d'ADN de phage recombinant avec l'enzyme de restriction HincII et on isole un fragment avec 1900 pb contenant une séquence de nucléotide qui code pour la sous-unité S3 par hybridation avec une sonde pour l'ADN de Tn5;

    d) on isole et on clone dans un phage lambda EMBL4 d'E. coli des fragments d'ADN chromosomique à 15 000 - 20 000 paires de bases obtenus par digestion de l'ADN chromosomique de Bordetella pertussis BP165;

    e) on isole un fragment d'ADN de phage recombinant qui s'hybride avec une sonde pour S3 telle qu'obtenue au point c) à partir des phages recombinants positifs ainsi obtenus;

    f) on découpe le fragment d'ADN de phage recombinant avec l'enzyme de restriction EcoRI et on isole un fragment EcoRI d'ADN chromosomique à 4696 paires de bases par hybridation avec une sonde pour l'ADN de S3;

    g) on insère le fragment obtenu dans le vecteur plasmidique pPEML8 dans le site de restriction EcoRI, on détermine la séquence nucléotidique du fragment d'ADN et on identifie les gènes qui codent pour les cinq sous-unités de la toxine de pertussis.
17. Application de la toxine de pertussis ou d'une ou plusieurs sous-unités de la toxine de pertussis obtenue comme dans la revendication 15, à la préparation d'un vaccin anti-pertussis dans lequel la toxine de pertussis est dépourvue d'autre matière de B. pertussis.
18. Composition pour la stimulation simultanée de la protection contre les infections par Bordetella pertussis et Vibrio colerae incluant au moins une quantité efficace du peptide S1 obtenu par synthèse chimique ou à partir de micro-organismes transformés avec des molécules d'ADN recombinant contenant le gène qui code pour S1.
19. Application du fragment d'ADN chromosomique selon la revendication 1 à la préparation de trousses de diagnostic pour la détermination d'infection à pertussis.
20. Application du fragment d'ADN chromosomique selon la revendication l pour distinguer B. pertussis de B. parapertussis et bronchiseptica.