HRP970525A2

HRP970525A2 - Method for puryfying gbs toxin/cm101

Info

Publication number: HRP970525A2
Application number: HR08/744,770A
Authority: HR
Inventors: Carl G Hellerqvist
Original assignee: Carl G. Hellerqvist
Priority date: 1996-09-30
Filing date: 1997-09-29
Publication date: 1998-08-31
Also published as: ES2235228T3; US6407069B1; IL129162A0; CN1235642A; BR9712167A; JP2009173945A; WO1998014603A1; AR011238A1; CA2265696A1; ATE284449T1; CA2265696C; JP2001504144A; ZA978754B; CN1192115C; DE69731891T2; DK0932696T3; US5811403A; US6136789A; AU4802697A; DE69731891D1

Description

Tehničko polje

Ovaj izum se odnosi na poboljšane postupke pročišćavanja polisaharida.

Pozadina izuma

CM101, GBS toksin, je patogena molekula izolirana iz grupe B β-hemolitičke Streptococcus (GBS) bakterije. Novorođena djeca mogu se zaraziti s GBS, stanje poznato kao GBS upala pluća ili "early-onset disease", te patiti od sepse, granulositopenije, i respiratornih smetnji, tj. plućne hipertenzije i proteinaznog plućnog edema (Hellerqvist, C.G. et al., Studies on group B β-hemolytic Streptococcus i. Isolation and partial characterization of an extra-cellular toxin., Pediatr. Res., 12:892-898 (1981)).

Unatoč štetnim utjecajima na novorođenčad izloženu djelovanju GBS, nije poznato da CM101 uzrokuje toksičnost kod starijih ljudi. U stvari, istraživanje ovog toksina je otkrilo značajne mogućnosti terapeutske primjene. Vidi U.S. Patent 5,010,062 i Hellerqvist, C.G. et al., Early Results of a Phase I Trial of CM 101 in Cancer Patients., Proceedings of the American Association of Cancer Research Annual Meeting (1995), gdje je CM101 korišten za sprečavanje vaskularizacije tumora. Stoga je dobivanje pročišćenog CM101 kritično kako za istraživanje, tako i za terapeutske primjene.

CM101 je kompleksni polisaharidni toksin s molekularnom težinom od približno 300,000 Daltona koji sadrži N-acetil-galaktozamin, N-acetil-glukozamin, glukozu, galaktozu, te ostatke manoze. Rezultati Nmr (nuklearne magnetne rezonance) pokazuju da i ostaci alditola također mogu biti prisutni. Vjeruje se da su i funkcionalne grupe karboksilne kiseline, vjerojatno galakturozna kiselina, također integralni dio ove molekule. Ponavljanje aktivnih epitopa najvjerojatnije igra važnu ulogu u patofiziološkoj reakciji na CM101 putem križno vezanih receptora na ciljanom endotelimu (Hellerqvist, C.G. et al, Early Results of a Phase I Trial of CM 101 in Cancer Patients., Proceedings of the American Association of Cancer Research Annual Meeting (1995); DeVore, R.F., et aL, A Phase I Study of the Antineovascularization Drug CM101, J. Clin. Can. Res., 3:365-372 (1997)).

U.S. Patent br. 5,010,062 omogućava postupak za pročišćavanje GBS toksina. Predloženi postupak zahtijeva intenzivan rad, te u svakom slučaju brojne korake uz učestale nivoe gubitka biološke aktivnosti.

Pročišćavanje CM101 prema današnjim spoznajama znanosti daje krajnji materijal koji je samo 40% čist prema mjerenjima kemijskim analizama i biološkim pokusima. Ostalih 60% sadrži biljne i kvasne polisaharide i endogene bakterijske polisaharide. Biljni i kvasni zagađivači nastaju u većini iz aditiva komercijalnim kulturama korištenim za optimalan rast GBS bakterija. Endogeni zagađivači uključuju GBS polisaharide uključujući grupu i tip specifičnih antigena (Paoletti, L.C. et aL, Neonatal mouse protection against infection with multiple group B streptococcal (GBS) serotypes by maternal immunization with a tetravalent GBS polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine, Infect. Immun. 62(8);3236-43 (1994); Michon, R, Multiantennary group-specific polysaccharide of Group B Streptococcus, Biocheiru 27;5341-51 (1988)), Stoga postoji potreba za postupkom pročišćavanja CM101 koji rezultira krajnjim proizvodom s povećanom ukupnom čistoćom, po mogućnosti uz uklanjanje stranih biljnih i kvasnih polisaharida i GBS antigenih polisaharida.

Dodatno, shema pročišćavanja poznata u znanosti uključuje faze nezdrave (štetne) po okolinu, kao što je korištenje velike količine fenola u fenol:voda ekstrakciji. Fenol je dobro poznati bazični (kaustičan) materija.

Iz tog razloga, ciljevi predmetnog izuma su osiguravanje postupka pročišćavanja koji rezultira (i) materijalom visoke čistoće, (ii) korištenjem minimalnog broja koraka, (iii) svoženjem na minimum korištenje kaustičnih ili toksičnih materijala poput fenola, te (iv) povećanjem prinosa materijala.

Sažetak izuma

Ovdje opisanim izumom postignuti su gore navedem ciljevi. Posebno, shema pročišćavanja koja uključuje hidrofobnu interakcijsku kromatografsku (HIC) smolu za pročišćavanje CM101 iz GBS bakterijske kulture rezultira proizvodom čistoće veće od 95%.

Jedan aspekt ovog izuma je postupak za pročišćavanje polisaharidnog toksina iz GBS bakterije, postupak koji uključuje primjenu HIC smole. Predmetni izum također uključuje uglavnom čisti polisaharid toksin iz GBS bakterije proizveden ovdje otkrivenim postupkom, te farmaceutski sastav koji sadrži uglavnom čisti toksin i farmaceutski prihvatljiv nositelj. Farmaceutski sastav se može koristiti za tretman pacijenta s medicinskim uvjetima. Na primjer, sastavom prema predmetnom izumu može se liječiti pacijent s tumorom.

Kratki opis crteža

Slika 1 prikazuje shemu pročišćavanja CM 101 prema ovom izumu.

Slika 2 prikazuje poznatu shemu pročišćavanja CM101.

Slika 3 je standardna krivulja kvantitativne analize koja prikazuje reakciju PAD detektora na dozu od 5, 20 i 50 µ g dekstrana (glukozni polimer) s 6-deoksi glukozom kao stalnim unutrašnjim standardom,

Slika 4 prikazuje separaciju standardnih uzoraka šećera.

Slika 5a-b su profili elucije (izdvajanja) koncentrata medija na butil-sefaroza HIC koloni.

Slika 5a je mjerenje kod ekstinkcije (prigušenja) UV 206. Slika 5b je mjerenje kod ekstinkcije UV 280.

Slika 6a je HPLC profil HIC-pročišćavanjem i eluiranjem vodom dobivene frakcije koja sadrži CM101 (16 min. vršno opterećenje) praćene kod ekstinkcije UV 203 na Millenium 2000 Diodo-Ray detektoru (Waters, Millford, MA).

Slika 6b je Diodo-Ray spektar koji odgovara slici 6a i prikazuje minimalno prisustvo ekstinkcije 260 (RNA i DNA) i ekstinkcije 280 (protein sa sadržajem tirozina) za CM101 uključujući (16 min.) maksimum.

Slika 7a je profil elucije praćen kod 203 nm koji prikazuje čistoću HIC vodom izdvojen maksimum sa sl. 6a dalje podvrgnut fenol/slanoj ekstrakciji i daljnjoj DEAE kromatografiji.

Slika 7b je Diodo-Ray spektar koji ilistrira čistoću CM101 sa maksimumom (šiljkom) sa slike 7a što potvrđuje uski simetrični šiljak i manjak ekstinkcije kod 260nm (RNA/DNA) i 280nm (protein).

Slika 8 je profil IL-6 aktivnosti pomoću ANA-1 analize frakcija dobivenih iz HIC kolone.

Slika 9 ilustrira analizu šećera kod CM101 pročišćenog postupkom prema predmetnom izumu.

Slika 10 je HPLC profil sadašnjeg kliničkog stupnja CM101 dalje podvrgnutog HIC kromatografiji.

Slika 11 ilustrira analizu šećera uzorka sadašnjeg kliničkog stupnja CM101 koji je bio dodatno pročišćen pomoću HIC i HPLC.

Slika 12a je HPLC profil CM101 pročišćenog pomoću poznatog postupka uz korištenje 10nM fosfatnog pufera (tampona), pH 8.4.

Slika 12b je HPLC profil CM101 pročišćenog postupkom u skladu s ovim izumom, uz korištenje istih radnih uvjeta kao HPLC profil sa slike 12a.

Opis posebnih izvedbi

GBS toksin kako se ovdje koristi je definiran kao bilo koja frakcija ili komponenta izolirana iz prirodne ili razložene (lizirane) GBS bakterije, ili izvedena iz medija koji je iznad lizirane i/ili u autoklavu tretirane bakterije, a koja ima biološku aktivnost dokazanu indukcijom respiratornih smetnji u pokusima s ovcama (Hellerqvist, C.G. et al, Studies on group B β-hemolytic streptococcus I, Isolation and partial characterization of an extra-cellular toxin, Pediat. Res.. 12:892-898 (1981) ili aktiviranjem komplementa i vezivanja na neovaskulaturu kako je prikazano analizom peroksidaze-antiperoksidaze uzorka tkiva tumora (Hellerqvist, C.G. et al, Anti-tumor effects of GBS toxin; a polysaccharide cxotoxin from group B p-hemolytic streptococcus, J. Canc Res. Clin. Oncol., 120:63-70 (1993); i Hellerqvist, C.G. et al, Early Results o f a Phase I Trial of CM101 in Cancer Patiens., Proceedings of the American Association of Cancer Research Annual Meeting (1995)).

Uglavnom čist GBS toksin znači preparat u kojem je GBS toksin više od 40% čist (npr. prisutan u koncentraciji od najmanje oko 40% težinskih), po mogućnosti najmanje približno 60% čist, još bolje najmanje oko 90% čist, a najbolje najmanje oko 95% čist.

Izvor za GBS početni materijal za korištenje u postupku prema ovom izumu može se dobiti kultiviranjem soja grupe B β-hemolitičke streptokok bakterije koja je inficirala ili može inficirati novorođenu djecu. Takvi sojevi se mogu izolirati iz krvi zaražene djece.

Visoka proizvodnja CM101 uglavnom zahtijeva fermentaciju s kompleksnim medijem THB koji sadrži materijal visoke molekularne težine u obliku polisaharida i proteina za optimalan rast GBS i proizvodnju CM101. Za vrijeme fermentacijskog postupka, bakterije proizvode iz hranjive podloge i druge proteine, nukleinske kiseline i polisaharide osim CM101. Procijenjena koncentracija CM101 u fermentacijskoj smjesi je manja od 0.1% težinskih.

Postupak pročišćavanja prema predmetnom izumu uključuje hidrofobnu interakcijsku kromatografiju (HIC) koja eliminira masu endogenih i egzogenih kontaminirajući proteina, nukleinskih kiselina i polisaharida efikasnije od poznatih postupaka, te rezultira krajnjim proizvodom koji sadrži 10-50% čistog CM101. U samo jednom koraku dovođenja u kontakt GBS početnog materijala i HIC smole, što predstavlja 100-500 puta više pročišćavanje od početnog materijala.

Primjena HIC smole za pročišćavanje polisaharida je iznenađujuća i nova jer su za HIC kolone projektirane za pročišćavanje hidrofobnih proteina i nije se vjerovalo da mogu biti korisne za polisaharide bez . proteina i lipida. Polisaharidi su uglavnom karakterizirani kao hidrofilni zbog njihovih brojnih hidroksilnih grupa. Stoga bi dovođenje početnog materijala u HIC kolonu pod uvjetima preporučenim od strane proizvođača i korištenim od stručnjaka bilo s namjerom zadržavanja proteina i omogućavanja polisaharidima da prođu kroz kolonu nevezani.

Iznenađujuće otkriće je da CM101 ima hidrofobna svojstva koja omogućavaju primjenu sadašnjih shema pročišćavanja za postizanje visokog nivoa čistoće. Posebno iznenađujuće je da CM101 ima znatno više hidrofobnim svojstava od većine proteina i polisaharida prisutnih u gornjem sloju iz kojeg se CM101 izolira. Više od 98% tih onečišćujućih proteina i polisaharida prolazi kroz HIC kolonu. Iako se HIC smola uglavnom koristi u HIC koloni, taj korak postupka se alternativno može izvesti kontaktiranjem smole i početnog materijala na neki drugi način. Na primjer, izvor GBS-a i smola se mogu staviti u posudu zajedno u diskontinuiranom postupku, te se dio sa sadržajem toksina zatim separira iz smole na primjer centrifugiranjem.

Dodatne faze pročišćavanja mogu uključivati fenol/slanu ekstrakciju u malom volumenu u odnosu na prvobitnu metodu (približno 1000 puta smanjeno) i kolonu za ionsku izmjenu. Te dodatne faze pročišćavanja doprinose dobivanju krajnjeg proizvoda čistoće veće od 95%.

HIC je postupak korišten za separaciju proteina, poput membranskih proteina, baziran na njihovom hidrofobnom karakteru. HIC smola je definirana kao smola koja ima interaktivne hidrofobne grupe koje su uglavnom kovalentno vezane na podlogu tako da hidrofobne grupe mogu slobodno doći u interakciju s tvarima u kontaktu sa smolom. Primjeri hidrofobnih grupa uključuju alkil, alkoksil i aril grupe. Preferirana HIC smola za korištenje u skladu s ovim izumom ima podlogu s dodanim alifatskim grupama od dva ili više ugljika, po mogućnosti alkilne grupe u rasponu od 2 do 12 ugljika, još bolje normalne ili razgranate butil grupe. Fenil grupe ili alkoksil grupe sa do 20 ugljika su također preporučene interaktivne hidrofobne grupe. Interaktivne hidrofobne grupe imaju po mogućnosti kao podlogu sefarozu (Pharmacija), akrilamid (Toso Haas, Montgomeryville, PA), ili siliku. U skladu sa standardnim postupkom za korištenje HIC kolone, početni materijal sa sadržajem određenog proteina se stavlja u kolonu u do 2M vodenoj slanoj otopini, te se vezani proteini zatim eluiraju i separiraju kroz smanjivanje u hidrofobnim interakcijama snižavanjem ionske napetosti u puferu koji se razvija. Promjene u pH vrijednosti i/ili temperaturi se također mogu koristiti za promjenu hidrofobnih interakcija.

Pročišćavanje CM101 iz grupe B Sireptococcus zahtijeva GBS bakterijsku kulturu. Bakterijske inokule se inkubiraju do kasne log faze u Todd Hewitt smjesi (THB) modificiranoj dodavanjem 2g/l ili više glukoze i Na2HPO4. Kako je naznačeno na slici 1, kultura se zatim tretira u autoklavu. CM101 je nakon autoklava prisutan u gornjem sloju GBS fermentacijskih kultura u koncentraciji od 2-15 mg/l. Mediji sadrže približno 15 g/l ostalih bakterijskih komponenti i medija. Dakle, CM101 čini približno 0.01-0.1% komponenti u gornjem sloju. Nakon obrade u autoklavu, mediji se filtriraju. Filtrat se po mogućnosti koncentrira preko filtera granice propuštanja 10,000 Dalton (10kD), iako se može koristiti i filter s granicom propuštanja od 50,000 Daltona (50kD) ili manje.

CM101 se zatim pročišćava u skladu s predmetnim izumom, kako je prikazano na Slici 1, dovođenjem koncentrata gornjeg sloja ili rekonstituiranog alkoholnog taloga od kojeg je dobiveno 0.75-2M u kalijevom fosfatu ili drugoj soli, poput natrijevog fosfata, natrijevog ili kalijevog sulfata, klorida ili acetata, u HIC kolonu po mogućnosti uravnoteženu u istoj soli istog molariteta. Postupak u kojem se koncentrat medija ili 10kD-50kD početni materijal primjenjuje bez taloženja i rekonstituiranja alkohola se preferira zbog toga, što koncentrat medija kao početni materijal daje proizvodi više CM101 od rekonstituiranog alkoholnog taloga.

Početni materijal koji sadrži CM101 se dovodi u HIC kolonu i ispire s vodenim fosfatom kod 0.75-2M. Nakon 0.75-2M

ispiranja, kolona se dalje razvija s 0.5-1M i zatim s 0.25M soli, po mogućnosti fosfatnom. U preporučenoj izvedbi, CM101 se eluira iz kolone s vodom kao jednostruki vrh sa sadržajem 10-50% CM101. Alternativno, voda se zamjenjuje za eluiranje CM101 iz HIC kolone sa 10mM fosfatom, pH 6.8 u 10% etanolu u vodi (Pufer A), a zatim s 20% etanolom u vodi, Aktivnost CM101 se uspostavlja kako u puferu A tako i u 20% etanol frakciji. Primjena pufera A uglavnom nije dovoljna za potpuno uklanjanje CM101 iz HIC kolone, tako da nakon ispiranja puferom A slijedi dodatno ispiranje 20% etanolom. Ipak, u određenom omjeru, fenol predstavlja opasnost po okoliš, a kasnija fenol/sol ekstrakcija vodenog šiljka ili pufer A i 20% etanol vršne frakcije daju CM101 približno iste čistoće. HIC postupak uklanja više od 98% proteina i polisaharida u mediju koji preostaju u 10k koncentratu ili rekonstituiranom alkoholnom talogu.

Obogaćeni CM101 iz HIC kolone se može dalje pročišćavati ekstrakcijom u fenolu i vodenoj otopini soli, po mogućnosti 0.05M fiziološkoj otopini. Taj dodatni korak daje CM101 frakciju približno 95% čistoće.

Vodene ili kombinirane Pufer A i 20% etanol frakcije eluirane iz HIC kolone se bilo dijaliziraju s vodom i liofiliziraju i rekonstituiraju u 0.05 fiziološkoj otopini ili dijaliziraju slanom otopinom nakon koncentriranja. Uobičajeno, fenol se dodaje materijalu i otopina se naglo zagrijava do 70-80°C Kada se oformi jedna faza, otopina se hladi na 4°C Dobivena slana faza fenol/saline ekstrakcije sadrži CM101 i tada se mode uvesti u kolonu za kationsku izmjenu, poput DEAE.

Za postupak sa DEAE kolonom, DEAE kolona se dovodi u ravnotežu u vodi i zatim ispire s 0.1M fiziološkom otopinom, 0.05 NaOAc, pH 7.4 i razvija stupnjevito do 0.34M NaCl Eluiranje CM101 se prati i kvantificira pomoću ANA-1 analize. Kao kod postupka s HIC smolom, može se smola za ionsku izmjenu dovesti u kontakt s materijalom koji sadrži toksin i pomoću druge opreme osim kolone. Frakcija koja sadrži CM101 se zatim dijalizira vodom i liofilizira.

Nakon fenol/saline ekstrakcije i koraka ionske izmjene, CM101 je više od 95% čist.

Proizvodi elucije kolone, ili materijal dobiven u fazi kontakta sa smolom, se analiziraju obzirom na biološku aktivnost pomoću ANA-1 i/ili Dot Blot analize. Biološka aktivnost se zatim potvrđuje pokusom s ovcom. Tabela 1 prikazuje nekoliko separacija AP i 10k materijala dobivenih iz različitih šarži početnih materijala i tretiranih u HIC koloni. Uklanjanje denaturiranog proteina i medijskih polisaharida i drugog materijala je slično.

Iako je preferirani redoslijed pročišćavanja izvođenje HIC koraka, nakon toga fenol/saline ekstrakcije, a zatim korak ionske izmjene, pročišćavanje se može također provesti i drugim redoslijedom.

Slika 2 prikazuje primjer poznatog postupka pročišćavanja CM10L Naročito, koristi se korak sa 70% etanol precipitatom, nakon čega ubrzo slijedi fenol/voda ekstrakcija. Velike količine etanola i fenola koji su potrebni u tim početnim stupnjevima poznatog postupka pročišćavanja predstavljaju po okolinu štetnu praksu. Postupak prikazan na Sl 2 također zahtijeva kolonu za ionsku izmjenu, kolonu za gel filtraciju, te lentil lektin kolonu.

Prijašnji postupak sadrži brojne korake, uključujući i one opasne po okolinu. S druge strane, postupak u skladu s predmetnim izumom je efikasan, daje veću čistoću i 2 do 25 puta veći prinos, te na minimum svodi korištenje materijala štetnih po okolinu.

Po okolinu opasna faza ekstrakcije fenol-voda se smanjuje 1000 puta u usporedbi s prethodno korištenim postupcima. Osim toga, dodatno pročišćavanje gel filtracijom se eliminira. Korak lentil-lektin kromatografije se također uklanja. Krajnji proizvod HIC kolone, fenol/saline ekstrakcija, te koraci u koloni za ionsku izmjenu daju čistoću 95%, tako da ostale obrade nisu potrebne.

CM101 pročišćen postupkom prema ovom izumu se može koristiti za ispitivanja ili terapeutsku namjenu. CM101 je posebno koristan kada se kombinira s farmaceutski prihvatljivim nositeljem, npr. rekonstituiran u fiziološkoj otopini i intravenozno administriran pacijentu. Također se mogu koristiti i ostali oblici doziranja za administriranje pročišćenog CM101. Farmaceutski sastav prema ovom izumu sadrži u osnovi čisti GBS toksin prema ovom izumu u kombinaciji s farmaceutski prihvatljivim nositeljem. Uglavnom, nositelj će biti onaj koji se dobro miješa s toksinom za oblikovanje sastava koji se može administrirati intravenoznim (IV) putem. Dakle, kao nositelj se preferira voda, koja može imati druge farmaceutski prihvatljive ekscipijente radi osiguravanja prikladnosti za intravenozno administriranje. Dobiveni sastav će biti sterilan i imati će prihvatljiva osmotska svojstva. Općenito, prikladna IV formulacija se u skladu s ovim izumom priprema standardnim tehnikama poznatim u znanosti. Na primjer, Poglavlje 85 pod nazivom "Intravenous Admixtures" (Intravenozne smjese") autora Salvatore J. Turco u osamnaestom izdanju Remington's Pharmaceutical Sciences, Mach Publishing Co. (1990), na koje se ovdje poziva, daje standardne tehnike za pripremu farmaceutski prihvatljivog IV sastava koji se može koristiti u skladu s ovim izumom.

Dodatno, pacijent s medicinskim stanjem za koje je ustanovljeno da dobro reagira na CM101 može se liječiti s farmaceutskim sastavom prema predmetnom izumu. Na primjer, pacijent s tumorom može biti prikladno liječen intravenoznim administriranjem ovdje prikazanim sastavom. U.S. Patent br. 5,010,062 obrađuje liječenje određenih tumora kod ljudi i uključen je ovdje kao referenca.

Kvantitativna i kvalitativna analiza

HPLC analiza

Čistoća i količina CM101 dobivenog iz uzorka nakon HIC kromatografije se ustanovljuje analizom gel filtracije pomoću visokotlačnog tekućeg kromatografa (HPLC). Kolona za gel filtraciju se obično uravnotežuje s 10% acetonitrilom u vodi, a biološki aktivan CM101 eluira kao uključeni homogeni uski šiljak (maksimum). Alternativno, kolona se može razviti u 10mM fosfatnom puferu, pH 8.4, što daje više uključeni šiljak. Amonij acetat (NH4OAc) pufer, pH 8.4, se može koristiti kao daljnja alternativa za 10mM fosfatni pufer.

Tipični odziv detektora (ekstinkcija UV 203) uz korištenje 30, 50 i 100 µg čistog CM101 standardno ubrizganog u 100 µl razvijajućeg pufera na Hydragel 1000 koloni (Waters, Millford, MA) je 26 x 106, 48 x 106 odnosno 97 x 106 područnih jedinica, što daje krivulju reakcije na dozu za kvantificiranje nepoznatih uzoraka.

Molekularna težina CM101 se također može mjeriti gel filtracijskom kromatografijom. Ne-denaturirani pufer, kao što su prije opisani acetonitril, fosfat ili amonij acetat puferi, se koristi za rad kolone. Elucija CM101 se uspoređuje s elucijom standardnih dekstran polisaharidnih markera različite molekularne težine. CM101 ima molekularnu težinu od približno 300,000 Daltona pod ovim uvjetima.

Analiza amino kiselinom

Kvantitativna i kvalitativna automatska analiza amino kiseline može se izvesti primjenom standardne komercijalno raspoložive opreme, na pr. Pico Tag, može se nabaviti kod Watres, Millford, MA.

ANA-1 analiza

Za praćenje biološke aktivnosti različitih faza fermentacije i pročišćavanja može se primijeniti in vitro pokus korištenjem transformirane makrofag stanične linije miša. Pokus mjeri IL-6 proizvodnju makrofag ANA-1 kod miša kao reakciju izlaganju CM101.

Točnije, CM101 inducira kod raf/myc transformirane makrofag stanične linije ANA-1 mišje koštane moždine da reagira in vitro proizvodnjom IL-6. Takožer se mogu upotrijebiti ostale makrofag stanične linije i leukociti svježe periferne krvi.

Za provođenje ANA-1 pokusa, uzorci se prvo razrjeđuju do odgovarajućeg nivoa (ovisno o očekivanoj aktivnosti CM101) i četiri do osam koncentracija se ispituje kod razrjeđenja 1:4. Korištenjem kliničkog stupnja CM101 rekonstruiranog u PBS dobiva se standardna krivulja CM101. Napravljena je otopina 4000 ng/ml u PBSu, koja je dala 2000 ng/ml konačne koncentracije nakon dodavanja stanica, zajedno sa šest serijskih otopina 1:2. Mogu se, na primjer, koristiti stanice kod koncentracije od 2 x 106/ml. Osjetljivost pokusa je bila povećana dodavanjem 200 U/ml mišjeg IFN-γ u ANA-1 stanice. Konačne kulture su bile 100 U/ml IFN- γ.

Mikrolit ploču s kulturama treba staviti preko noći u vlažni inkubator na 37°, 5% CO2u zraku (16-18 sati), a zatim provesti pokus ELISA IL-6 (R.D. Systems, Minneapolis, MN). Detaljnije, gornji slojevi kultura se prenose na ploču za pokus IL-6 i ploča se drži na 4°C sve dok IL-6 pokus ne završi.

Pokus točkastom mrljom (Dot Blot)

Alternativni brzi postupak za kvantitativno otkrivanje CM101 u otopinama ili biološkim tekućinama je nanošenje mrlje uzorka na polivinilidin difluorid (PVDF) membrane u serijskim otopinama. Količina CM101 se kvantificira primjenom bilo fluorescentno označenog (markiranog) mišjeg monoklonalnog antitijela na CM101 ili mišjeg monoklonalnog antitijela na CM101 i nakon toga fluorescentno označenog anti-mišjeg IgG. U tu je svrhu korisno antitijelo 7A3 usmjereno na CM101 antigen. Količine CM101 u različitim frakcijama se ustanovljavaju usporedbom sa standardnom krivuljom serijski razrijeđenog CM101.

Pokus s plućnim arterijskim tlakom kod ovce

Toksin djeluje na pluća ovce tako da povećava plućnu hipertenziju, što se manifestira povećanim plućnim arterijskim tlakom i povećanjem plućne vaskularne propusnosti.

Uzorci CM101 u fosfatnoj puferiranoj fiziološkoj otopini (PBS) se mogu administrirati janjcima infuzijom, a promjene u plućnom arterijskom tlaku se bilježe u intervalima od 15 minuta. Te promjene su u vezi s aktivnošću CM101. (Hellerqvist, C.G. et al., Studies on group B β-hemolytic streptococcus L Isolation and partial characterizatfon of and extra-cellular toxin., Pediatr. Res., 15:892-898 (1981)).

Analiza šećera

Količina od 100 µg uzorka se hidrolizira tokom dva sata kod 100°C u smjesi trifluoroctene kiseline (TFA), octene kiseline (HOAc) i vode u omjeru 5:70:25. Otopina se isparava i uzorak se dalje hidrolizira tokom dva sata kod 100°C u smjesi TFA i vode u omjeru 2:8. Taj postupak u potpunosti hidrolizira sve glikosidne veze u uzorku. Također se uklanjaju N-acetil grupe početno prisutne na amino šećerima.

Uzorci se zatim analiziraju na Dionex sistemu za analizu šećera primjenom PAD (Pulsed Amperometric Detection) detektora. Rezolucija je prikazana na Sl. 4.

Čistoća uzorka se ustanovljuje kvantitativnom i kvalitativnom analizom šećera. Princip je prikazan na slikama 3 i 4. Uzorak polisaharida kvantitativno određen pomoću HPLC i dopunjen standardnom 6-deoksil-D-glukozom hidrolizira se i analizira. Postupak opisan u ovom odlomku daje linearnu reakciju na dozu u ispitanom opsegu, a kvalitativna analiza se dovršava uspoređivanjem vremena zadržavanja nepoznatih uzoraka sa standardima.

Primjeri

Primjer 1

Povećana shema pročišćavanja za CM101

Izolat Grupe B Streptococcus serotipa III korišten je kao radni materijal u fermentatoru zapremnine 3,000 galona. 25 ml sjemena bakterijske kulture je korišteno za 80 litarsku posudu sa 65 litara radnog volumena (Irv) koja je zatim korištena za inokulaciju posude od 750 Irv, što nakon toga ide konačno u fermentator od 7500 Irv (3,000 galona). Alternativno, 65 Irv se može koristiti direktno za inokulaciju fermentatora od 7500 Irv.

Kulture završavaju u kasnoj log fazi tretmanom u autoklavu. Bakterije se zatim uklanjaju kontinuiranim centrifugiranjem kod 10,000 x g, nakon čega slijedi filtracija kasetom 0.45 mikrona (Millipore Corporation, Bedford, MA).

Rezultirajući gornji sloj se zatim koncentrira 15 puta filtriranjem kroz kasetu primjenom kaseta propusne moći 10kD do 50kD (Millipore) u 500 litara. Koncentrirani materijal se zatim dovodi do 2M u soli, po mogućnosti natrijevom fosfatu, pH 7.4 (pufer za punjenje) putem dialize.

Koncentrirani gornji sloj se zatim podvrgava hidrofobnoj interakcijskoj kromatografiji, korištenjem 60 litarske n-butil sefaroza kolone (Pharmacia, Uppsala, Švedska) primjenom BioPilot sistema (Pharmacia), Kapacitet n-butil sefaroza smole za biološku CM101 aktivnost u koncentratu medija bez protoka aktivnostije približno 80 litara medija na jednu litru smole. Nakon punjenja koncentriranog gornjeg sloja u kolonu, kolona se ispire puferom za punjenje nakon čega slijedi 0.5-1M i zatim 0.25 fosfatni pufer, pH l A. Frakcija koja sadrži CM101 se eluira s vodom u približno 120 litara ili dva volumena kolone i koncentrira na 2 litre u kaseti propusne moći u rasponu od 10kD do 50 kD. Eluiranje kolone se regulira prethodno određenim programom u BioPilot sistemu, a elucija se prati prema UV ekstinkciji kod 260 i 280 nm, provodljivosti i pH vrijednosti.

Frakcija od 2 litre koja sadrži CM101 se dializira sa 0.05M fiziološkom otopinom, pH 7.0 i zatim zagrijava do temperature od 75-80°C i dodaje se 0.2-2 litre fenola. Smjesa se zatim zagrijava na 80°C i održava kod te temperature 5 minuta. Nakon toga, smjesa se hladi na 4°C. Vodena faza dobivena u tom koraku se po mogućnosti ekstrahira dva puta sa 0.2 volumena kloroforma prije dovođenja u DEAE Sephacel FF kolonu (Pharmacia, Uppsala, Švedska) uravnoteženu u vodi. Kolona se ispire sa 10mM fiziološke otopine, 0.05M NaOAc, pH 7.4, a biološki aktivan materijal, CM101, se zatim eluira iz DEAE kolone sa NaCl gradijentom. Biološki aktivitet se ustanovljuje pokusom IL-6 i HPLC analizom. Kvaliteta CM101 pročišćenog kroz ovaj postupak se ustanovljava HPLC i analizom šećera, kao i biološka aktivnost pomoću IL-6 i pokusima s ovcama.

Ova povećana shema pročišćavanja omogućava prednost izbjegavanja velikog volumena, ranije fenol-voda ekstrakcije alkoholnog taloga koja se koristila u prijašnjem postupku.

Rezultati

Slike 5a-b prikazuju profile elucije koncentrata medija na butil-sefaroza HIC koloni u 2M K2HPO4, pH 7.2. Različiti šiljci (maksimumi) su rezultati vremenski stupnjevitih promjena u gradijentu eluiranja. Slika 5 a predstavlja profil mjeren kod UV 206 ekstinkcije, koja kvantificira vršne frakcije za ukupni organski materijal, i pokazuje CM101 u zadnjem uskom šiljku (približno 383 minute). Slika 5b predstavlja profil mjeren kod ekstinkcije UV 280, koja kvantificira količinu proteina u različitim frakcijama.

Provođenjem faze HIC kolone, CM101 je prisiljen da se veže na kolonu pri čemu do 99.7% proteina i do 98.5% neutralni i nabijenih polisaharida prolazi kroz kolonu, kako je naznačeno u Tabeli 1.

Tabela 1. Pročišćavanje CM101 aktivnosti pomoću HIC kromatografije

Kvantificiranje integracijom UV 280 i 206 profila

[image]

U Tabeli 1, različite fermentacijske mase kao alkoholni taloži (AP), AP1, AP2 i AP6, te 10k koncentrati su bili podvrgnuti HIC kromatografiji i eluirani bilo s vodom ili puferom A. Oba postupka su dala približno jednako efikasno uklanjanje egzogenih i endogenih proteina (UV280) i polisaharida i općih organskih tvari (UV206).

Slike 6a-b predstavljaju HPLC profil, kao i Diodo-Ray spektar, HIC postupkom pročišćene i vodom eluirane frakcije koja sadrži CM101, praćene kod ekstinkcije UV 203. Navedene brojke ilustriraju minimalno prisustvo ekstinkcije 260 e (RNA i DNA) i ekstinkcije 280 (protein) za vrh koji sadrži CM101.

Nakon što je HIC frakcija dalje podvrgnuta ekstrakciji fenol/fiziološka otopina i ionskoj izmjeni, čistoća HIC vodom eluiranog šiljka se još povećala, kako se može vidjeti na slikama 7a-b. Obratiti pažnju na uski simetrični šiljak kod približno 16 minuta od vremena nula i pomanjkanje ekstinkcije kod 260 (RNA/DNA) i 280 (protein). Za profile elucije prikazane na slikama 6a-b i 7a-b, HPLC je bio izveden sa 10% acetonitrilom u vodi, a protok je bio približno 0.3 ml/min.

Ovi profili elucije kao i biološka aktivnost su slični onima dobivenim kada je korišten alkoholni talog kao početni materijal za HIC kolonu.

Sposobnost HIC frakcija iz 10k početnog materijala da induciraju IL-6 sintezu u ANA-1 stanicama je prikazana na Slici 8. HIC kromatografija je dala približno iskorištenje od 50% ukupne biološke aktivnosti u gornjem sloju medija, mjereno ANA-1 pokusom. Pokusi s točkastom mrljom (Dot blot) istog materijala koji pokazuje imunoreaktivitet u prisustvu CM101 antigena su bili korišteni za potvrđivanje rezultata pokusa ANA-1.

Različite frakcije dobivene iz 10k koncentrata nakon HIC kromatografije su također bili ispitani na biološku aktivnost na modelu ovce. Količina CM101 aktivnosti je određena na bazi krivulje odziva na dozu primjenom sadašnjeg kliničkog CM101 (l jedinica aktivnosti odgovara 7.5 µg/kg). Rezultati su prikazani u Tabeli 2 u kojoj su uspoređene HIC frakcije alkoholnog taloga (AP) i koncentrata medija (10k).

Tabela 2: Količina CM101 dobivena iz HIC kromatografije AP i 10K materijala bazirano na kvantifikaciji biološke aktivnosti kod modela ovce

Kvantificiranje integracijom UV 280 i 206 profila

[image]

Biološka aktivnost CM101 pročišćenog postupkom u skladu s predmetnim izumom je također mjerena pokusom plućnog arterijskog tlaka kod ovce, te zatim uspoređena s aktivnošću CM101 pročišćenog starim postupkom, na primjer onim navedenim u U.S. Patentnu br. 5,010,062. Materijal pročišćen u skladu s ovim izumom pokazao je specifičnu aktivnost dva do tri puta veću od materijala pročišćenog starim postupkom, što znači od onoga koji nije bio u kontaktu s HIC smolom.

Prinos proizvoda u postupku prema ovom izumu također dokazan prije navedeni, obzirom da poznati postupci daju približno 300 µg CM101 po litri fermentacijskog volumena, u usporedbi sa gore navedenom vrijednošću od 7520 µg/l.

Pročišćeni CM101 prikazan na slikama 7a-b dobiven postupkom prema ovom izumu je također bio podvrgnut analizi šećera. Rezultati šećera su prikazani na si. 9.

Kvantitativno, CM101 dobiven postupkom u skladu s predmetnim izumom je više od 95% čisti ugljikohidrat i sadrži manje od 5% proteina ustanovljenih kvantitativno i kvalitativno kako je prije prikazano, te automatskom analizom amino kiseline (PicoTag, Waters, Millford, MA).

Primjer 2

Usporedba sadašnjeg kliničkog stupnja i novog sastava

CM101 dobiven postupkom u skladu s predmetnim izumom je poboljšan iznad sadašnjeg kliničkog stupnja CM101. Točnije, HPLC profil elucije sa sL 10 u usporedbi sa slikom 7a pokazuje veću čistoću u uzorku proizvedenom u skladu s predmetnim izumom. Slika 7a prikazuje jedan uski i simetrični glavni šiljak (amplitudu), umjesto nekoliko šiljaka.

U svrhu daljnjeg demonstriranja prednosti upotrebe HIC kolone, te osiguravanja dodatnih dokaza o pročišćavanju toksina poznatog kao CM101, CM101 sadašnjeg kliničkog stupnja je bio podvrgnut pročišćavanju HIC kolonom i HPLC pročišćavanju, te je izvršena analiza šećera. Rezultati, na slici 11, se mogu usporediti sa slikom 9. Analiza šećera pokazuje kvantitativno i kvalitativno slične krajnje proizvode, te dokazuje da postupak HIC kromatografije uklanja šećere neovisno o biološki aktivnom CM10L Taj rezultat je također naveden u Tabeli 3.

Tabela 3: Sastav ugljikohidrata u CM101

(prikazano kao integralni omjer ugljikohidrata)

[image]

Gore prikazana tabela ostataka šećera daje približne molarne udjele. Stvarne zaostale količine u CM101 pročišćenom u skladu s predmetnim izumom (prva kolona) su u opsegu od (0.2-1 manoza):(2.5-3.5 galaktoza):(0.5-1 glukoza):(1N-acetil glukozamin) :(0.5-1 N-acetil galaktozamin). Brojevi su svedeni na N-acetil glukozamin; dakle N-acetil glukozamin je odrežen kao 1.

Za daljnju komparaciju, slike 12a-b prikazuju HPLC profile CM101 proizvedenog starim postupkom (Sl 12a) i u skladu s postupkom prema ovom izumu (Sl 12b). Kolona za gel filtraciju (Ultragel 100, Waters, Milford, MA) je bila razvijena u 10mM fosfatnom puferu, pH 8.4, Kako se vidi na slici 12b, CM101 pročišćen postupkom prema ovom izumu eluira u relativno uskom šiljku u rasponu od približno 5 minuta. Vrijeme eluiranja je približno 24 minute od vremena nula uz količinu protoka 0.3 ml/min. Materijal pročišćen starim postupkom, nasuprot tome, eluira u širokom šiljku tokom približno 12 minuta.

Primjer 3

Analiza CM101 pomoću SDS-PAGE / Western Blot

Natrij dodecil sulfat-poliakrilamid gel elektroforeza je bila izvedena korištenjem gela s gradijentom 4-20%. Uzorci CM101 u puferu od 2% SDS, 0.5M Tris-HCl, 5% glicerin, 0.05% bromofenil plavi, i 5% β-merkaptoetanol pH 0.8 su inkubirani kod 55° tokom 10 minuta i u 4% gel omotaču stavljeni u 4-20% SDS-PAGE radni gel. Gel je bio pod naponom od 200 volti tokom 90 minuta.

Gel je bio razvijen u "western blotting" puferu (25 mM Tris, 192 mM glicin i 20% metanol) i sušen kod 100 volti tokom 2 sata. Gel je bio blokiran 5%-tnim nemasnim mlijekom u PBS kod sobne temperature u trajanju 1 sat i dva puta ispran veznim puferom (fosfat puferirana fiziološka otopina, 2% fetalni goveđi serum, i 0.5% TWIN-20 deterđent (BBT)), zatim inkubiran 1 sat sa 10 µg/ml 7A3 (monoklonalno antitijelo na CM101).

Gel je bio inkubiran 4 puta po 10 minuta sa BBT i inkubiran s alkalin fosfataza konjugiranim antitijelom anti-miša tokom 45 minuta, ispran 4 puta sa BBT i razvijen s Pierce jednostepenim AP razvijačem tokom 50 minuta.

Iz SDS-PAGEA Vestern Blot analize proizlazi da CM101 ima komponentu od 26,000 Daltona ili više puta toliko kada se analizira pod tim uvjetima.

Dakle, postupak prema ovom izumu daje poboljšani postupak pročišćavanja koji na minimum svodi poteškoću opasnih koraka i osigurava izvrsnu čistoću. Dodatno tome, proizvod dobiven ovdje navedenim postupkom je poboljšan u odnosu na trenutno raspoloživi CM101.

Sve publikacije i patentne prijave navedene u ovoj specifikaciji su ovdje uključene kao referenca u istom opsegu kao da je svaka pojedina publikacija ili patentna prijava određeno i pojedinačno navedena da je uključena kao referenca.

Nakon što je izum u potpunosti opisan, svakom stručnjaku će biti vidljivo da se mogu izvršiti mnoge njegove izmjene i modifikacije bez udaljavanja od duha ili opsega pripadajućih patentnih zahtjeva.

Claims

1. Postupak pročišćavanja polisaharid toksina iz GBS bakterije, naznačen time, da uključuje kontaktiranje vodene smjese sa sadržajem toksina sa HIC smolom.

2. Postupak prema patentnom zahtjevu 1, naznačen time, da faza kontaktiranja HIC smole nadalje uključuje separaciju toksina iz HIC smole.

3. Postupak prema patentnom zahtjevu 1, naznačen time, da toksin znači CM101.

4. Postupak prema patentnom zahtjevu 1, naznačen time, da je čistoća toksina dobivenog iz koraka kontaktiranja HIC smole povećana 100-500 puta.

5. Postupak prema patentnom zahtjevu 1, naznačen time, da je toksin dobiven korakom kontaktiranja HIC smole više od 40% čist.

6. Postupak prema patentnom zahtjevu 5, naznačen time, da je toksin dobiven korakom kontaktiranja HIC smole najmanje približno 60% čist.

7. Postupak prema patentnom zahtjevu 6, naznačen time, da je toksin dobiven korakom kontaktiranja HIC smole najmanje približno 90% čist.

8. Postupak prema patentnom zahtjevu 1, naznačen time, da toksin dobiven korakom kontaktiranja HIC smole najmanje približno 95% čist.

9. Postupak prema patentnom zahtjevu 1, naznačen time, da HIC smola nadalje sadrži smolu koja ima interaktivne grupe odabrane iz grupe koja uključuje alkilne, alkoksilne i arilne grupe.

10. Postupak prema patentnom zahtjevu 9, naznačen time, da su interaktivne grupe alkilne grupe s rasponom od 2 do 12 ugljika.

11. Postupak prema patentnom zahtjevu 10, naznačen time, da su interaktivne grupe butil grupe.

12. Postupak prema patentnom zahtjevu 11, naznačen time, da su interaktivne grupe normalne butil grupe.

13. Postupak prema patentnom zahtjevu 9, naznačen time, da je interaktivna grupa fenil grupa.

14. Postupak prema patentnom zahtjevu 1, naznačen time, da nadalje uključuje ekstrakciju toksina s vodenom fenolnom smjesom.

15. Postupak prema patentnom zahtjevu 1, naznačen time, da nadalje uključuje kontaktiranje toksina sa smolom za ionsku izmjenu.

16. Postupak prema patentnom zahtjevu 1, naznačen time, da nakon koraka kontaktiranja HIC smole, sadrži ekstrakciju toksina s vodenom fenolnom smjesom, i kontaktiranje toksina sa smolom za ionsku izmjenu.

17. Toksin iz GBS bakterije, naznačen time, da je pročišćen postupkom u skladu s patentnim zahtjevom 1.

18. Toksin iz patentnog zahtjeva 17, naznačen time, da je toksin CM101.

19. Toksin iz patentnog zahtjeva 18, naznačen time, da je toksin najmanje oko 90% čist.

20. Toksin iz patentnog zahtjeva 19, naznačen time, da je toksin najmanje oko 90% čist.

21. Toksin iz patentnog zahtjeva 20, naznačen time, da je toksin najmanje oko 95% čist.

22. Toksin iz patentnog zahtjeva 18, naznačen time, da nadalje sadrži zaostatke šećera manoze, galaktoze, glukoze, N- acetil glukozamina, te N-acetil galaktozamina u molarnom udjelu od (0.2-1 manoza):(2.5-3.5 galaktoza):(0.5-1 glukoza):(1 N-acetil glukozamin):(0.5-1 N-acetil galaktozamin).

23. Toksin prema patentnom zahtjevu 22, naznačen time, da su zaostaci šećera manoze, galaktoze, glukoze, N-acetil glukozamina, te N-acetil galaktozamina prisutni u molarnom udjelu od (1 manoza):(3 galaktoza):(1 glukoza):(1 N- acetil glukozamin):(1 N-acetil galaktozamin).

24. Toksin prema patentnom zahtjevu 18, naznačen time, da služi za korištenje u postupku terapije.

25. Toksin prema patentnom zahtjevu 18, naznačen time, da ima molekularnu težinu od približno 300,000 Daltona mjereno gel filtracijskom kromatografijom u ne-denaturiranim uvjetima.

26. Toksin prema patentnom zahtjevu 18, naznačen time, da toksin eluira u uskom simetričnom šiljku mjereno kod ekstinkcije 203 nm kod približno 16 minuta od vremena nula. kada se analizira pomoću HPLC u 10%-tnom acetonitril puferu uz količinu protoka od približno 0.3 ml/min.

27. Toksin prema patentnom zahtjevu 18, naznačen time, da toksin eluira u uskom simetričnom šiljku mjereno kod ekstinkcije 203 nm kod približno 24 minute od vremena nula, kada se analizira pomoću HPLC u 10 mM fosfatnom puferu, pH 8.4.

28. Toksin prema patentnom zahtjevu 18, naznačen time, da ima specifičnu aktivnost približno dva do tri puta veću od specifične aktivnosti GBS toksina koji nije imao kontakt sa HIC smolom, mjereno pokusom za povećani plućni arterijski tlak kod ovce.

29. Postupak za pročišćavanje polisaharidnog toksina iz GBS bakterije, koji uključuje: (30) uvođenje izvora GBS bakterijskog toksina u HIC kolonu, (31) eluciju HIC kolone za dobivanje HIC eluata uključujući toksin, (32) ekstrakciju HIC eluata kombinacijom fenola i vodene otopine kako bi se oformila vodena faza uključujući toksin, (33) uvođenje vodene faze u kolonu za ionsku izmjenu, te (34) eluiranje kolone za ionsku izmjenu kako bi se dobio eluat ionske izmjene, naznačen time, da eluat ionske izmjene sadrži uglavnom čisti toksin.

30. Postupak prema patentnom zahtjevu 29, naznačen time, da uglavnom čisti toksin je CM101.

31. Postupak prema patentnom zahtjevu 30, naznačen time, da je uglavnom čisti toksin najmanje oko 60% čist.

32. Postupak prema patentnom zahtjevu 31, naznačen time, da je uglavnom čisti toksin najmanje oko 95% čist.

33. Sastav, naznačen time, da se u osnovi sastoji od uglavnom čistog GBS toksina.

34. Sastav prema patentnom zahtjevu 33, naznačen time, da je uglavnom čisti toksin CM101.

35. Postupak prema patentnom zahtjevu 34, naznačen time, da je toksin najmanje oko 60% čist.

36. Postupak prema patentnom zahtjevu 35, naznačen time, da je toksin najmanje oko 90% čist.

37. Postupak prema patentnom zahtjevu 36, naznačen time, da je toksin najmanje oko 95% čist.

38. Sastav prema patentnom zahtjevu 34, naznačen time, da toksin nadalje sadrži zaostatke šećera manoze, galaktoze, glukoze, N-acetil glukozamina, te N-acetil galaktozamina u molarnom udjelu od (0.2-1 manoza):(2.5-3.5 galaktoza): (0.5-1 glukoza):(l N-acetil glukozamin):(0.5-1 N-acetil galaktozamin).

39. Toksin prema patentnom zahtjevu 38, naznačen time, da su zaostaci šećera manoze, galaktoze, glukoze, N-acetil glukozamina, te N-acetil galaktozamina prisutni u molarnom udjelu od (1 manoza):(3 galaktoza):(1 glukoza):(1 N- acetil glukozamin): (1 N-acetil galaktozamin).

40. Sastav prema patentnom zahtjevu 34, naznačen time, da toksin ima molekularnu težinu od približno 300,000 Daltona mjereno gel filtracijskom kromatografijom u ne-denaturiranim uvjetima.

41. Sastav prema patentnom zahtjevu 34, naznačen time, da toksin eluira u uskom simetričnom šiljku mjereno kod ekstinkcije 203 nm kod približno 16 minuta od vremena nula, kada se analizira pomoću HPLC u 10%-tnom acetonitril puferu uz količinu protoka od približno 0.3 ml/min.

42. Sastav prema patentnom zahtjevu 34, naznačen time, da toksin eluira u uskom simetričnom šiljku mjereno kod ekstinkcije 203 nm kod približno 24 minute od vremena nula, kada se analizira pomoću HPLC u 10 mM fosfatnom puferu, pH 8.4.

43. Farmaceutski sastav, naznačen time, da sadrži uglavnom čisti CM101 i farmaceutski prihvatljiv nositelj.

44. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtjevu 43, naznačen time, da je sastav najmanje oko 60% čist.

45. Postupak za liječenje pacijenta s medicinskim uvjetima, naznačen time, da uključuje administriranje pacijentu sastava iz patentnog zahtjeva 43.

46. Postupak liječenja pacijenta s tumorom, naznačen time, da uključuje administriranje pacijentu farmaceutskog sastava prema patentnom zahtjevu 43.