JPH03184995A - 抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、抗腫瘍剤に関するものである。

また、本発明は、特に、ピシバニールを併用して効果的
に抗腫瘍活性を高めてなる抗腫瘍剤に関するものである
。

（従来技術及び問題点） 従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）の生菌体
を弱毒化して製剤化したものは、すでに制癌剤″ピシバ
ニール″として使用されている。

また、本発明者らは、先に、溶連菌（ストレプトコッカ
ス属菌）の培養濾液又はその限外濾過濃縮液に有機溶剤
を添加して得られる沈澱物から分離したＳＰＦ−ＰＣＯ
−２０，ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０に抗腫瘍活性を認めて特
許出願をした。（特開昭６３−１０１４００、特開昭６
３−１０１３９２） このように、従来、溶連菌に関する抗腫瘍剤については
、単品についてかなりの抗腫瘍効果をあげているのであ
るが、更によりすぐれた抗腫瘍剤の出現が望まれるので
ある。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、溶連菌に関する各種抗腫瘍剤の抗腫瘍効
果を高める研究を行った結果、溶連菌菌体製剤であるピ
シバニールと溶連菌培養濾液沈澱物との併用がすぐれた
抗腫瘍効果を発揮することを見出したのである。

本発明は、ストレプトコッカス属菌の培養濾液２ もしくはその限外濾過濃縮液に有機溶剤を添加して得ら
れる沈澱物又はこの沈澱物から分離されたＳＰＦ−ＰＣ
Ｏ−２０もしくはＳＰＦ−ＰＣＯ−３０、と、ビシバー
ルとを併用して効果的に抗腫瘍活性を高めてなる抗腫瘍
剤に関する。

又、本発明は、ストレプトコッカス属菌の培養濾液もし
くはその限外濾過濃縮液に有機溶剤を添加して得られる
沈澱物で抗腫瘍活性を有するＳＰＦ−ｐｃｏに関するも
のである。

本発明に使用する沈澱物は、ストレプトコッカス属菌の
培養濾過もしくはその限外濾過濃縮液に有機溶剤を添加
することによって生じる沈澱物である。

使用するストレプトコッカス属菌は次に例示される。

ストレプトコッカス・ピオゲネス　ＡＴＣＣ２１０６０
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ス
トレプトコッカス・エスピー　　ＡＴＣＣ２１５９７（
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ、）ストレプトコッ
カス・ピオゲネス　ＡＴＣＣ２１５４６３− （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ス
トレプトコッカス・ピオゲネス　ＡＴＣＣ２１５４７（
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）スト
レプトコッカス・ピオゲネス　ＡＴＣＣ２１５４８（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）培養液
は、肉エキス培地、酵母エキス培地、プレイン・ハート
・インフュージョン培地（ＢＨＩ培地）等の天然培地が
よく用いられるが、ストレプトコツカス属細菌の生育に
適した培地であれば任意の培地を使用できる。

培養ｐＨは、５．０〜８，０、好ましくは、６．１〜７
．２であり、温度は３０〜４０℃、好ましくは３５℃〜
３７℃であり、嫌気的に静置培養または攪拌培養を行う
ことができる。

培養時間は、対数増殖期にかかって後↓〜３０時間、好
ましくは２〜２０時間である。

培養液は遠心分離によって菌体を除去し、濾液を得る。

濾液は、硫安を添加し５０〜９０％飽和度の画分とし濃
縮するか、もしくは、限外濾過膜を用いて濃縮すること
もできる。

４− 沈澱物は、培養濾液もしくはその限外濾過濃縮液に、メ
タノール、エタノール等のアルコール類、アセトン等の
有機溶媒を添加することにより、沈澱物として得られる
。

メタノール、エタノール等のアルコール類又はアセトン
等の有機溶媒は、培養濾液又は濃縮液１部に対して０．
６５〜３部、好ましくは０，６５〜１．５部攪拌しなが
ら添加する。

得られた溶連菌培養濾液沈澱物は、濾取して。

凍結乾燥等によって乾燥物とし、このまま抗腫瘍剤とし
て使用することもできる。この溶連菌培養濾液沈澱物を
ＳＰＦ−ＰＣＯと名付けた。

この溶連菌培養濾液沈澱物ＳＰＦ−ＰＣＯは各種成分の
混合物であるが、次に示す一定の理化学的性質を示す。

溶連菌培養濾液沈澱物の理化学的性質 Ｊ、塩基性、酸性、中性の区別 本物質の０．１％の水溶液のＰＨは５．３〜５．８であ
る。

２、物質の色 白ないし微黄色 ３、本物質は２１０℃で褐変し、 ３００℃で全体が褐色となる。

４、　元素分析 Ｃ：　　４３．７９％ Ｈ’：　　　６．８６％ ０　　：　　４５．’６４％ Ｎ　　：　　　２．４１％ ５、紫外線吸収スペク ある。

６゜赤外線吸収スペク ある。

７、比旋光度 〔α〕′Ｄ。＝＋１０５．３°（Ｃ＝　１．Ｈ２Ｏ）８
、呈色反応 ローリ−反応　　　　　十 ビューレット反応　　　十 ニンヒドリン反応　　　十 アンスロン硫酸反応　　十 システィン硫酸反応　　十 オルシン反応　　　　　士 トルは第２図に示す通りで トルは第１図に示す通りで ２５８℃で一部融解し、 ９、分子量 ゲル濾過法による測定では、分子量１０，０００以上で
ある。

】０．蛋白質吸着体に対する挙動 ハイドロキシアパタイトにほとんどが吸着される。

１１、溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノール、エタノール、ｎ−プロ
パツール、アセトン、エチルエーテル、ｎ−ヘキサン、
クロロホルム、酢酸エチル等の有機溶剤には、難溶又は
不溶である。

溶連菌培養濾液沈澱物は、水もしくは緩衝液に溶解し、
ハイドロキシアパタイトに吸着させ、０．０１１ン酸緩
衝液で充分洗浄後０．１ＭＩＪン酸緩衝液で溶出させる
とき、抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−２０を得ることが
できる。溶出成分は脱イオン水に対して透析し、凍結乾
燥することによってＳＰＦ−ＰＣＯ−２０乾燥標品を得
ることができる。

０．１Ｍリン酸緩衝液でＳＰＦ−ＰＣＯ−２０を溶出さ
せた後は、０．２５Ｍリン酸緩衝液で溶出させるとき、
抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０を得ることができる
。溶出成分は脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥する
ことによってＳＰＦ−ＰＣＯ−３０乾燥標品を得ること
ができる。

次に、実施例２で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦＰＣ：０
−２０の凍結乾燥標品は次の理化学的性質を示す。

抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−２０の理化学的性質。

１、元素分析 ０　　３８．２〜４０．５ Ｈ５，５〜６，６ Ｎ　　２．３〜３．２ ０　５０．９〜４６．３ Ａｓｈ　　　３．１〜３．４ ２、分解点 本物質は１８５℃で褐変し、２６７℃になると黒色とな
り分解する。

３、比旋光度 〔α］２１′＝　８０°　〜１５０°　（Ｃ＝　１．０
０）８− ４、紫外線吸収スペクトル 本物質の水溶液の紫外線吸収スペクトルは第３図に示さ
れる。

５、赤外線吸収スペクトル 第４図に示される。

６、塩基性、酸性、中性の区別 本物質の０．１％の水溶液のｐＨは５．３〜５．７であ
る。

７、物質の色 白ないし微黄色 ８、呈色反応 ローリ−反応　　　　　十 ビューレット反応　　　十 ニンヒドリン反応　　　十 アンスロン硫酸反応　　十 システィン硫酸反応　　十 オルシン反応 ９、分子量 ゲル濾過法による測定では、分子量ｉｏ、ｏｏｏ以」二
である。

一 １０、蛋白質吸着体に対する挙動 ハイドロキシアパタイトに吸着され、０．１Ｍリン酸緩
衝液により溶出される。

１１、溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノール、エタノール、ｎ−プロ
パツール、アセトン、エチルエーテル。

ｎ−ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル等の溶剤には
、難溶又は不溶である。

１２、温度に対する安定性 本物質の水溶液は、４５℃３０分の加熱後もインビトロ
で測定される抗腫瘍性活性の多くを保持する。

１３、蛋白質分解酵素に対する安定性 本物質は、トリプシン又はプロナーゼによる処理後もイ
ンビトロで測定される抗腫瘍性活性の多くを保持する。

１４．８ＤＳアクリルアミドゲル電気泳動で糖と蛋白に
分離するのが確認される。

また、実施例３で得られた抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ
−３０の凍結乾燥標品は次の理化学的性質を示す。

１０ 抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣ：０−３０の理化学的性質１
１元素分析 Ｃ３７，１〜３９．３ Ｈ５，４〜６．４ Ｎ　　３．５〜４．８ ０　５０．５〜４５．７ Ａｓｈ　　　３．５−３．８ ２、分解点 本物質は１８５℃で褐変し、２５５℃になると黒色とな
り分解する。

３、比旋光度 〔α〕２０＝３０°　〜８０″’　　（Ｃ＝　１．００
）４、紫外線吸収スペクトル 本物質の水溶液の紫外線吸収スペク ５図に示される。

５、赤外線吸収スペクトル 第６図に示される。

６、塩基性、酸性、中性の区別 トルは第 １１− 本物質の０゜１％の水溶液のＰＨは５．５〜５．８であ
る。

７、物質の色 白ないし微黄色 ８、呈色反応 ローリ−反応　　　　　十 ビューレット反応　　　十 ニンヒドリン反応　　　十 アンスロン硫酸反応　　十 システィン硫酸反応　　十 オルシン反応 ９、分子量 ゲル濾過法による測定では、分子量１０，０００以上で
ある。

ＩＯ９蛋白質吸着体に対する挙動 ハイドロキシアパタイトに吸着され、０．２５Ｍリン酸
緩衝液により溶出される。

１１、溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノール、エタノール、ｎ−プロ
パツール、アセトン、エチルエーテル、ｎ−ヘキサン、
クロロホルム、酢酸エチル等の溶１２ 剤には、難溶又は不溶である。

１２、温度に対する安定性 本物質の水溶液は、４５℃、３０分の加熱によりインビ
トロで測定される抗腫瘍性活性を保持する。

１３、蛋白質分解酵素に対する安定性 本物質は、トリプシンによる処理後もインビトロで測定
される抗腫瘍性活性において活性保持する。しかし、プ
ロナーゼによる処理後は抗腫瘍活性がやや低下する。

１４．８ＤＳアクリルアミドゲル電気泳動で糖と蛋白に
分離するのが確認される。

本発明においては、溶連菌の培養濾液もしくはその限外
濾過濃縮液に有機溶剤を添加して得られる沈澱物そのも
のを抗腫瘍剤とするものであり、そして沈澱物又はこの
沈澱物から分離されたＳＰＦ−ＰＣＯ−２０もしくはＳ
ＰＦ−ＰＣＯ−３０，と、ビシバニールとを併用して抗
腫瘍剤とするものである。

本発明に使用するビシバニールは溶連菌の生菌体を弱毒
化して製剤化したものであるが、すでに３− 市販されているものであるから、容易に入手し得るもの
である。

投与に際しては、溶連菌培養濾液沈澱物を筋肉注射によ
って投与し、また、溶連菌培養濾液沈澱物、ＳＰＦ−Ｐ
ＣＯ−２０及びＳＰＦ−ＰＣＯ−３０から選んだ１種以
上をビシバニールと混合溶解して筋肉注射によって投与
するのがよい。投与量としては、溶連菌培養濾液沈澱物
、　ＳＰＦ−ＰＣＯ−２０及びＳＰＦ−ＰＣＯ−３０か
ら選んだ１種以上が０．１〜１００■／ｋｇ体重７日程
度がピシバニールの投与適量とともに投与するのがよい
。

次に、本発明の実施例を示す。

実施例１ ストレプトコッカス・ピオゲネス （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）　
ＡＴＣＣ２１０６０をＢＨＩ培地１００ｍ１２に接種し
て３７℃、８時間静置培養をおこなって得た種培養液を
第１表に示す培地Ａ１Ｍに接種し、種培養と同一条件で
嫌気的に前培養を行った。

第１表　培地Ａ マルトース　　　　　　　０．２５％ １４ 肉エキス　　　　　　　　１．０％ ポリペプトン　　　　　　１．０％ 酵母エキス　　　　　　　０．２５％ に８２ＰＯ４０，１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％ ＮａＣＱ０．１％ ＰＨ６，５ １１１ジャーファーメンタ−に培地Ａ８Ｑを投入して１
２０℃、１０分間加熱殺菌後、３７℃まで冷却して、前
培養液ＩＩｌを接種し、３７℃、１５．５時間、ｐＨ６
，５，５０ｒ、ｐ、ｍ、で攪拌しながら嫌気的に培養す
る。

得られた培養液を遠心分離にかけて菌体を除去し、培養
濾液を得た。培養濾液の濃縮方法は次の通り行った。

培養濾液は、分画分子量１０，０００の限外濾過膜（米
国、ロミコン社）を用いて、　ｉ、ｓＱに濃縮した。

この濃縮液を用いて下記の通り精製した。

濃縮液は、充分冷却しつつ、あらかじめ冷却しておいた
メチルアルコール１．０Ｑを少量づつ攪拌下に加え、４
時間放置した。この場合、１０℃を超え５ ないように処理した。生じた沈澱物は、冷却下遠心分離
機を用いて集め、凍結乾燥した。

得られた溶連菌培養濾液沈澱物は４５０■であった。

実施例２ 実施例１で得られた溶連菌培養濾液沈澱物４５０■を水
に溶解後、０．０１Ｍリン酸緩衝液で平衡化したハイド
ロキシアパタイトカラムに吸着させ、０．０１Ｍリン酸
緩衝液で充分洗浄後０．１Ｍリン酸緩衝液で溶出してく
るフラクションをプール後、脱イオン水に対して透析し
、凍結乾燥した。この凍結乾燥標品は抗腫瘍性成分ＳＰ
Ｆ−ＰＣＯ−２０であり、１１５■を得た。

実施例３ 実施例２で０．１Ｍリン酸緩衝液でＳＰＦ−ＰＣＯ−２
０を溶離させた後のハイドロキシアパタイトカラムを。

０．１Ｍリン酸緩衝液で充分洗浄後０．２５Ｍリン酸緩
衝液で溶出してくるフラクションをプール後、脱イオン
水に対して透析し、凍結乾燥した。この凍結乾燥標品は
抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０であり、８６■６ を得た。

実施例４ 実施例１〜３で得た溶連菌培養濾液沈澱物（以下、ＳＰ
Ｆ−ＰＣＯという）、ＳＰＦ−ＰＣＯ−２０及びＳＰＦ
−ＰＣＯ−３０のそれぞれをピシバニールと併用してマ
ウスにおける抗腫瘍活性をみた。

ピシバニール（以下、ＰＣＢという）（中外製薬（株）
製）については市販品を用い、その０．１ＫＥを投与直
前に上記併用剤溶液と混合して投与した。

インビボにおける抗腫瘍性活性試験は、Ｃｒｊ　；ＣＤ
、１　（ＩＣＲ系、雄性５週齢）マウスを使用した。腫
瘍細胞としては、Ｓａｒｃｏｍａ−１８０腹水癌細胞を
用い、これを生理食塩水に浮遊させ、マウスの腹腔内に
１×１０″’ｃｅｌｌｓ／マウス接種した。

癌細胞接種２４時間後から、１日１回５日間連続して検
体を腹腔内に投与してその生存数を観察しその結果を第
１表に示す。

なお、延命率ＩＬＳ　（％）は、６０日間飼育後、それ
ぞれの条件下における平均生存日数を計算し、コントロ
ールにおける日数で割った値で示している。

１７ ８−

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＳＰＦ−ＰＣＯの紫外線吸収スペクトルを示
し、第２図は同じ＜　ＫＢｒ法による赤外線吸収スペク
トルを示し、第３図は抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−２
０の紫外線吸収スペクトルを示し、第４図は同じ＜　Ｋ
Ｂｒ法による赤外線吸収スペクトルを示し、第５図は、
抗腫瘍性成分ＳＰＦ−ＰＣＯ−３０の紫外吸収スペクト
ルを示し、第６図は同じ＜　ＫＢｒ法による赤外線吸収
スペクトルを示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ストレプトコッカス属菌の培養濾液もしくはその
   限外濾過濃縮液に有機溶剤を添加して得られる沈澱物又
   はこの沈澱物から分離されたＳＰＦ−ＰＣＯ−２０もし
   くはＳＰＦ−ＰＣＯ−３０、と、ピシバニールとを併用
   して効果的に抗腫瘍活性を高めてなる抗腫瘍剤。
2. （２）ストレプトコッカス属菌の培養濾液もしくはその
   限外濾過濃縮液に有機溶剤を添加して得られる沈澱物で
   抗腫瘍活性を有するＳＰＦ−ＰＣＯ。