HUP0200444A2 - Polymer conjugates of interferon betha-1a and uses - Google Patents

Polymer conjugates of interferon betha-1a and uses

Info

Publication number
HUP0200444A2
HUP0200444A2 HU0200444A HUP0200444A HUP0200444A2 HU P0200444 A2 HUP0200444 A2 HU P0200444A2 HU 0200444 A HU0200444 A HU 0200444A HU P0200444 A HUP0200444 A HU P0200444A HU P0200444 A2 HUP0200444 A2 HU P0200444A2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
interferon
beta
polymer
mutant
composition
Prior art date
Application number
HU0200444A
Other languages
English (en)
Inventor
Margot Brickelmaier
Paula Hochman
Blake Pepinsky
Laura Runkel
Adrian Whitty
Original Assignee
Biogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Inc filed Critical Biogen Inc
Publication of HUP0200444A2 publication Critical patent/HUP0200444A2/hu
Publication of HU229888B1 publication Critical patent/HU229888B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/142—Interferon

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

KIVONAT β-lnterferon-IA polimerkonjugátumai és alkalmazásai
A találmány tárgya polialkilén-csoportot tartalmazó polimerhez (PEG) szelektíven, kovalensen kapcsolt, fiziológiailag aktív béta-interferon-la és ilyeneket tartalmazó gyógyszerkészítmény. A béta-interferon-la előnyösen immunoglobulint tartalmazó fúziós fehérje része. A találmány egy másik, előnyös megvalósítási módja szerint a béta-interferon-la-rész mutáns, amely szelektíven fokozott antivirális és/vagy antiproliferatív aktivitással rendelkezik vad típusú formákhoz viszonyítva. A pegilált béta-interferon-la vízoldékonyabb, megtartja minden biológiai aktivitá- Maa χ Ca.
sát, megváltozott farmakokinetikával és farmakodin^uníával rendelkezik, amely megnövekedett fél-életidőhöz és változásokhoz vezet a szöveti eloszlásban, fokozottan stabilabb oldatban, csökkent mértékben immunogén, védettebb proteolitikus emésztés és azt követő aktivitásvesztés ellen és hőstabilabb a szabad formájú béta-interferon-la-hoz képest. Alkalmazásuk: diagnosztikai reagensként immunológiai vagy más vizsgálati eljárásokban, valamint terápiás célokra angiogenezis és neovaszkularizáció gátlására.
. 4 KÖZZÉTÉTELI .....72.278/BE
PÉLDÁNY £ 2. 2 / p0 2 0 0 4 4 4 y β-lnterferon-IA polimerkonjugátumai és alkalmazásai
Polipeptidek és fehérjék alkalmazása speciális betegségek szisztémás kezelésében ma már jól elfogadott az orvosi gyakorlatban. Ilyen anyagok terápiás szerepe olyan jelentős, hogy sok kutatás nagy mennyiségű, rekombináns DNS-technológiával történő szintézisükre irányult. Sok ilyen polipeptid endogén molekula, amely nagyon hatékony és specifikus biológiai hatásaikra nézve.
A legjelentősebb limitáló faktor ilyen fehérjeszerű anyagok tervezett alkalmazhatóságára nézve parenterális beadásuk esetén az, hogy rövid idő alatt kiürülnek a testből. Ez megtörténhet proteázok metabolizmusának eredményeként, vagy a fehérje kiürítését célzó, normál folyamatokon keresztül, például szűréssel a vesében. Ilyen anyagok orális beadása még problematikusabb, mivel a gyomorban lejátszódó proteolízisen kívül, a gyomorban lévő nagymértékben savas közeg tönkreteszi azokat, mielőtt elérnék tervezett célszövetüket. A fehérjék említett beadási módjaival asszociált problémák jól ismertek a gyógyszeriparban, és különböző stratégiákat alkalmaznak, hogy megkíséreljék azokat megoldani.
Sok munkát közöltek, amelyben fehérjestabilizálással foglalkoznak. Különböző fehérjekonjugálási módszerek ismeretesek polimer anyagokkal, például dextránokkal, poli(vinil-pirrolidon) okkal, glikoproteinekkel, polietilén-glikollal vagy poliaminosavakkal. Az eredményül kapott, konjugált polipeptidekről leírták, hogy megtartották biológiai aktivitásaikat és vízoldhatóságukat parenterális alkalmazások esetén.
Az „interferonok néven ismert peptidcsaládra több klinikai munka összpontosított, valamint erőfeszítések történtek beadásuk és biológiai felszívódásuk javítására. Interferonokat különféle klinikai betegségekben teszteltek. A család egyik tagja, humán béta-interferon alkalmazása a legalaposabban ismert szklerózis multiplex kezelésében. A közelmúltban szabadalmaztatták Európában és az Egyesült Államokban rekombináns béta-interferon két formáját a betegség kezelésére. Az egyik forma a béta-interferon-la (védjegy és terméknév: AVONEX®, gyártó Biogen, Inc., Cambridge, MA), melyet a továbbiakban „béta-interferon-la-nak vagy „béta-IFN-la-nak vagy „β-IFN-la-nak vagy „β-IFN-la-nak jelölünk, amelyek egymással felcserélhető megnevezések. A másik forma béta-interferon-lb (védjegy és terméknév: BETASERON®, gyártó Berlex, Richmond, CA) , melyet a továbbiakban „béta-interferon-lb-nak jelölünk. Az béta-interferon-la-t emlős sejtekben termeltetik, természetes humán gén szekvenciájának alkalmazásával, és glikozilálva van, míg a béta-interferon-lb-t E. coli baktériumban termeltetik, humán gén módosított szekvenciájának alkalmazásával, amely géntechnológiai módosítással létrehozott szubsztitúciót tartalmaz ciszteinről szerinre a 17. aminosav-helyzetben, és nem glikozilált.
Régebben néhányan közvetlenül összehasonlítottuk bétainterferon-la és béta-interferon-lb relatív in vitro hatékonyságát funkcionális vizsgálati eljárásokban, és kimutattuk, hogy a béta-interferon-la specifikus aktivitása körülbelül 10-szer nagyobb, mint béta-interferon-lb specifikus aktivitása [ Runkel et al. , Pharm. Rés. .15, 641-649 (1998)] . Ezeket a kísérleteket arra terveztük, hogy azonosítsuk az aktivitások különbségeinek struk72.278/BE turális alapját, ebben a glikozilálást tartottuk az egyetlen, ismert, termékek között fennálló strukturális különbségként, amely befolyásolja a specifikus aktivitást. A szénhidrát hatása nagyjából a szerkezetre kifejtett stabilizáló szerepében nyilvánul meg. A szénhidrát stabilizáló hatása nyilvánvalóvá vált hődenaturációs kísérletekből és SEC-analizisből. A glikozilálás hiánya továbbá összhangban van az aggregáció mértékének növekedésével és hődenaturációra való fokozott érzékenységgel. A szénhidrát enzimes eltávolítása béta-interferon-la-ról PNGáz-F-el a gikozilált termék jelentős mértékű kicsapódását okozta.
Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy a béta-interferon-la és béta—interferon—lb szekvenciájában lévő konzervatív jelleg ellenére eltérő biokémiai tulajdonságokkal rendelkeznek, és ennélfogva béta-interferon-lb-ről szerzett sok ismeret nem alkalmazható béta-interferon-la-ra, és fordítva.
Kihasználtuk a glikozilált béta-interferon nem-glikozilált formákhoz viszonyított előnyeit. Konkrétan úgy, hogy kifejlesztettünk egy olyan béta-interferon-la-készítményt, amely fokozott aktivitással rendelkezett béta-interferon-lb-hez képest, és amely a pegilált fehérjék hasznos tulajdonságaival is rendelkezett, amely általában, hatását tekintve nem vesztett aktivitásából, konjugálatlan béta-interferon-la-formákhoz képest. Tehát, ha így végezzük a módosítást, hogy a termékek (polimer-bétainterferon-la-konjugátumok) megtartják minden biológiai aktivitásukat, vagy biológiai aktivitásaik többségét, az alábbi tulajdonságokat eredményezve: megváltozott farmakokinetika és farmakodinámia, amely megnövekedett fél-életidőhöz és változásokhoz
72.278/BE vezet a szöveti eloszlásban (például hosszabb ideig képes az érrendszerben maradni), fokozott stabilitás oldatban, csökkent mértékű immunogenitás, védelem proteolitikus emésztés és azt követő aktivitásvesztés ellen. Ilyen formák lényegi előrehaladást jelentenek a gyógyszerészeti és orvostudományban, és szignifikánsan hozzájárulnak különböző olyan betegségek kezeléséhez, amelyben interferont hasznosan lehet alkalmazni, például szklerózis multiplexben, fibrózisban és más gyulladást okozó vagy autoimmun betegségben, rákbetegségekben, hepatitiszben és más vírusos betegségben. Különösen amiatt, hogy a béta-interferon-la hosszabb ideig képes az érrendszerben maradni, lehetővé teszi, hogy angiogenezis gátlására alkalmazzuk, és potenciálisan képes átlépni a vér-agy-gátat. Továbbá polimer-béta-interferon-la-konjugátumok előállításával nyert hőstabilitás előnyös béta-interferon-la porként való kiszerelésekor, ha azt követően úgy kerül alkalmazásra, hogy inhalálással adjuk be.
Felhasználtuk a béta-interferon-la krisztallográfiás szerkezetéről szerzett ismereteinket, és kifejlesztettünk egy olyan beta-interferon-la-polimer-konjugátumot, amelyben a polimert úgy kapcsoltuk béta-interferon-la-n lévő helyhez (helyekhez), hogy lehetővé váljon, hogy a konjugátum megtartsa a béta-interferonla teljes aktivitását, nem-konjugált béta-interferon-la-hoz hasonlítva .
A találmány tárgya egyik vonatkozásában konjugált bétainterferon-la-komplex, amelyben a béta-interferon-la kovalensen van kötve egy polimerhez, amely lényegi alkotórészként polialkilén-csoportot tartalmaz.
72.278/BE
A találmány tárgya egy konkrét vonatkozásában fiziológiailag aktív béta-interferon-la-készítmény, amely fiziológiailag aktív béta-interferon-la-t tartalmaz polialkilén-glikol-csoportot tartalmazó polimerhez kapcsolva, amelyben a béta-interferon-la és a polialkilén-glikol-csoport úgy van elrendezve, hogy a készítményben lévő, fiziológiailag aktív béta-interferon-la fél-életideje megnövekszik az önálló béta-interferon-la-hoz (azaz kapcsolt polimert nem tartalmazó, nem-konjugált formához) képest.
A találmány tárgya egy másik vonatkozásában, polimerhez kapcsolt, fiziológiailag aktív béta-interferon-la-t tartalmazó, béta-ínterferon-la-készítmény, amelyben a béta-interferon-la fúziós fehérje, előnyösen immunoglobulint tartalmazó fúziós fehérje része. Ilyen komplexben az N-terminális (konjugálás helye a polimerrel) és a C-terminális (fúzió helye az Ig-résszel) szoros közelsége alapján feltételezzük, hogy a polimer-konjugálás valószínűleg csökkenti a fúziós fehérje immunogenitását.
A találmány tárgya egy másik vonatkozásában fiziológiailag aktív béta-interferon-la-készítmény, amely fiziológiailag aktív béta-interferon-la-t tartalmaz polialkilén-glikol-csoportot tartalmazó polimerhez kapcsolva, amelyben a béta-interferon-la és a polialkilén-glikol-csoport úgy van elrendezve, hogy a készítményben lévő, fiziológiailag aktív béta-interferon-la aktivitása fokozottabb az önálló béta-interferon-la-hez (azaz kapcsolt polimert nem tartalmazó, nem-konjugált formához) képest.
A találmány tárgya egy másik vonatkozásában konjugált bétainterferon-la-fehérje, amely mutáns béta-interferon-la-t tartalmaz olyan muteinek előállítása céljából, amelyek szelektíven fo
72.278/BE kozott antivirális és/vagy antiproliferatív aktivitással rendelkeznek nem-mutáns béta-interferon-la-formákhoz viszonyítva.
A találmány tárgya egy további vonatkozásában stabil, vízben oldható, konjugált béta-interferon-la-komplex, amely fiziológiailag kompatibilis polietilén-glikol-csoporthoz kovalensen kapcsolt, fiziológiailag aktív béta-interferon-la-t tartalmaz. Az ilyen komplexben a béta-interferon-la olyan kovalens kötéssel lehet a fiziológiailag kompatibilis polietilén-glikol-csoporthoz kapcsolva, amely labilis kovalens kötés a béta-interferon-la szabad aminosav-csoportjánál kialakítva, és amely labilis kovalens kötés in vivo biokémiai hidrolízissel és/vagy proteolízissel hasítható.
A találmány tárgya egy másik vonatkozásában dózisforma, amely gyógyászatilag elfogadható hordozót és stabil, vízben oldható béta-interferon-la-komplexet tartalmaz, amelyben a béta-interferon fiziológiailag kompatibilis polietilén-glikolhoz van kapcsolva.
A találmány tárgyát képezik egy másik vonatkozásában kovalensen kapcsolt béta-interferon-la-készítmények, például olyanok, amelyekben a fentebb leírtak szerint béta-interferon-la-t tartalmaznak diagnosztikai vagy in vivo alkalmazásokra, amelyben a beta-interferon-la például diagnosztikai reagens immunológiai vizsgalati eljárásban történő felhasználásra, vagy más diagnosztikai vagy nem in vivo alkalmazásokban történő felhasználásra. Ilyen nem-terápiás alkalmazásokban a találmány szerinti komplexek nagyon hasznosan alkalmazhatók stabilizált készítményként, amely például kiszerelhető kompatibilis oldószerekben vagy más, oldat-alapú formákban, stabil készítményformák előállítása cél
72.278/BE jából, amelyek fokozottan rezisztensek lebontással szemben.
Béta interferon—la módosítása nem—toxikus polimerrel bizonyos előnyökkel járhat. Ha így végezzük a módosítást, a termékek (polimer-béta-interferon-la-konjugátumok) megtartják minden biológiai aktivitásukat, vagy biológiai aktivitásaik többségét, az alábbi tulajdonságokat eredményezve: megváltozott farmakokineti— ka és farmakodinámia, amely megnövekedett fél-életidőhöz és változásokhoz vezet a szöveti eloszlásban (például hosszabb ideig képes az érrendszerben maradni), fokozott stabilitás oldatban, csökkent mértékű immunogenitás, védelem proteolitikus emésztés és azt követő aktivitásvesztés ellen; a fokozott hőstabilitás következtében hatékonyabb béta-interferon-la-t tartalmazó porformához jutunk orális vagy inhalálással történő alkalmazásra.
A fentebb leírt, javított tulajdonságokkal rendelkező béta— interferon-la hatékony lehet orális, aeroszolos vagy parenterális beadást alkalmazó terápiaként. Más beadási módszerrel, például nazálisán és transzdermálisan is be lehet adni módosított béta-interferon-la-t.
A találmány tárgyát képezi egy másik vonatkozásában eljárás angiogenezis és neovaszkularizáció gátlására, amelyben beadjuk a találmány szerinti készítmény hatásos mennyiségét. Az interferon érhálózatban való megnövekedett mennyiségének eredményeként, a találmány szerinti pegilált terméknek különösen hatékonynak kell lennie angiogenezis-inhibitorként.
Nem-terápiás (például diagnosztikai) alkalmazásokban bétainterferont tartalmazó, diagnosztikai és/vagy reagensfajták konjugálása is a találmány tárgyát képezik. Az eredményül kapott,
72.278/BE konjugált ágens rezisztens környezeti lebontó faktorokkal, például oldószer- vagy oldat-közvetített lebontási folyamatokkal szemben. A béta-interferon ilyen fokozott rezisztenciájának és fokozott stabilitásának eredményeként, a hatóanyag stabilitását is jelentősen meg lehet növelni, amely a béta-interferon-la-t tartalmazó készítmény megbízhatóságával jár együtt ugyanolyan speciális végfelhasználásban, amelyben béta-interferon-la-t is alkalmazunk.
A találmány szerinti megoldás más vonatkozásai, tulajdonságai és módosításai nyilvánvalóbbak lesznek az alábbi leírás és a csatolt szabadalmi igénypontok alapján.
Az ábrák rövid leírása:
1. ábra: Alanin-szubsztituált béta-interferon-la-mutánsok kötődése IFNAR2/lg-jelű, dimer fúziós fehérjéhez, amely I. típusú interférőn—receptorlanc extracelluláris doménjét tartalmazza (IFNAR2-ektodomén humán IgGl konstans doménjéhez fuzionálva)
Az alanin-szubsztitúciós IFN-mutánsok (Al-E) kötési affinitásait IFNAR2-receptorláncra az 1. példában (D-alrészben) leírtak szerint határoztuk meg. A hisztogram bemutatja a kötési affinitásokat ebben a vizsgálati eljárásban, a vad típusú his-bétaIFN-hez viszonyítva (% w.t.). A számított %w.t.-értékeket az alábbiak szerint fejeztük ki: (vad típusú his-béta-IFN affinitása)/ mutáns béta-IFN affinitása x 100. Bemutatjuk az egyedi kísérletekben (n=3) kapott %w.t.-értékeket (0) és több kísérletből származó %w.t.-átlagokat (x) . Az A2-, AB1-, AB2- és E-mutánsok nem kötik az IFNAR2/Fc-t 500-szor nagyobb koncentrációban, mint a vad típusú his-béta-IFN EC50 (*) .
72.278/BE
2. ábra: Alanin szubsztituált béta-interferon-la-mutánsok kötődése I. típusú, sejtfelszíni interferon-receptorkomplexekhez, amelyek Daudi-Burkitt—féle limfóma-sejteken expresszálódnak.
Az alanin-szubsztitúciós mutánsok (Al-E) receptorkötő tulajdonságait FACS-alapú, sejtfelszíni receptorkötő vizsgálati eljárás alkalmazásával határoztuk meg, az 1. példában (D—alrészben) leírtak szerint. A hisztogram bemutatja a receptorkötő affinitásokat ebben a vizsgálati eljárásban, a vad típusú his—béta—IFN— hez viszonyítva (% w.t.). Az egyes mutánsokra számított %w.t.~ értékeket az alábbiak szerint fejeztük ki: (vad típusú his-béta— IFN affinitása)/ mutáns béta—IFN affinitása x 100. Bemutatjuk az egyedi kísérletekben kapott %w.t.-értékeket (0) és több kísérletből származó %w.t.-átlagokat (x).
3. ábra: Alanin-szubsztituált béta-interferon-la-mutánsok antivirális aktivitásai.
Az alanin-szubsztitúciós mutánsok (Al-E) antivirális aktivitásait humán A549-sejtek EMC-vírussal való fertőzésével határoztuk meg, az 1. példában (E-alrészben) leírtak szerint. A hisztogram bemutatja az aktivitásokat ebben a vizsgálati eljárásban, a vad típusú his-béta-IFN-hez viszonyítva (% w.t.). A kiszámított -őw . t. -értékeket az alábbiak szerint fejeztük ki: (vad típusú his-béta-IFN koncentrációja [50% epe])/ mutáns bétaIFN koncentrációja [ 50% epe] x 100. Bemutatjuk több, egyedi vizsgálati eljárásban kapott %w.t.-értékeket (0) és több kísérletből származó %w.t.-átlagokat (x).
4. ábra. Alanin-szubsztituált béta—interferon-la-mutánsok antiproliferatív aktivitásai.
72.278/BE
Az alanin-szubsztitúciós mutánsok (Al-E) antiproliferációs aktivitásait Daudi-Birkitt-féle limfóma-sejteken határoztuk meg, az 1. példában (E-alrészben) leírtak szerint. A hisztogram bemutatja az aktivitásokat ebben a vizsgálati eljárásban, a vad típusú his-béta-IFN-hez viszonyítva (% w.t.). A kiszámított %w.t.~ értékeket az alábbiak szerint fejeztük ki: (vad típusú his-bétaIFN koncentrációja [ 50% növekedési gátlás] )/ mutáns béta-IFN koncentrációja [ 50% növekedési gátlás] x 100. Bemutatjuk több, egyedi vizsgálati eljárásban kapott %w.t.-értékeket (O) és több kísérletből származó %w.t.-átlagokat (x) .
5. ábra: Alanin-szubsztituált béta-interferon-la-mutánsok relatív antivirális és antiproliferatív aktivitásai.
Összehasonlítottuk alanin-szubsztitúciós mutánsok (Al-E) relatív aktivitásait az antivirtális (x-tengely) és antiproliferációs (y-tengely) vizsgálati eljárásokban. Az összehasonlításban a vad típusú his-béta-IFN-ra vonatkoztatott, átlagos százalékos aktivitásokat alkalmaztuk (% w.t., x) , melyeket bemutatunk a 3. és 4. ábrán. Azok a mutánsok, amelyek esetén azonos mértékben, koordináltan változik mindkét aktivitás, a ferde, átlós vonalra esnek. Azok a mutánsok (DEI, D, Cl), amelyek esetén az antivirális aktivitás változása aránytalanul nagyobb az antiproli— ferációs aktivitás változásánál, szignifikánsan eltérnek a ferde vonaltól. A szignifikanciát az alkalmazott átlagos %w.t.-értékekhez tartozó standard deviációk alapján határoztuk meg.
6. ábra: Pegilálás helyének lokalizálása peptid-térképezéssel.
Pegilált és módosítatlan β-interferon-la-t peptid-térképezési
72.278/BE analízisnek vetettünk alá. A mintákat endoproteináz-Lys-C-vel emésztettük, és fordított fázisú HPLC-n vizsgáltuk C4-oszlop alkalmazásával. Az oszlopon előállítottunk 0—70% acetonitril— -gradienst 0,1% trifluor-ecetsavban. Az oszlopról elfolyó anyagot 214 nm-en detektáltuk. A-panel: módosítatlan β-interferon-la. B-panel: pegilált β-interferon-la. A nyilak a β-interferon-la Nterminális endoproteináz-Lys-peptidjének (1-19. aminosavakat tartalmazzák) elúciós helyzetét mutatják.
7. ábra: Konjugált és nem-konjugált béta-interferon-la antivírális aktivitása.
Az X-tengelyen feltüntetett koncentrációkhoz tartozó, bétainterferon—la vagy PEGilált béta-interferon—la aktivitását anti— vitális vizsgálati eljárásban határoztuk meg, humán tüdőkarci— nóma sejtek (A549) alkalmazásával, amelyeket enkefalomiokar— ditisz vírussal fertőztünk. A vírussal való két napos inkubálás után az életképes sejteket MTT-vel megfestettük, a tálcákat 450 nm-en leolvastuk, és a sejtek életképességére utaló abszorbanciát az Y-tengelyen vettük fel. A standard deviációkat, hibajelként ábrázoljuk. Az a béta-interferon-la-koncentráció, amely 50%-os víruspusztulást eredményezett („50%-os citopatikus hatás ) (50% maximum OD45Q) , körülbelül 11 pg/ml volt, és a PEGmódosított béta-interferon-la-ra az 50%-os citopatikus hatás körülbelül 11 pg/ml volt.
8. ábra: Konjugátumok stabilitásának meghatározása hődenaturálással
PEGilált béta-interferon-la-t és kezeletlen béta-interferon-la-kontrollt 20 mM HEPES-t és 20 mM NaCl-t tartalmazó, pH 7,5
72.278/BE pufferben melegítettünk 1 fok/perc sebességgel. Ά denaturációt a 280 nm-en mért abszorbancia változásával követtük, (a) módosítatlan béta-interferon-la, (b) PEGilált béta-interferon-la.
9- ábra: Béta-interferon antivirális aktivitásának meghatározása béta-interferon-la-val vagy PEGilált béta-interferon-la—val kezelt egerek plazmájában.
Egereket i.v. injektáltunk farki vénájukon keresztül 50.000 egység béta-interferon-la-val vagy 50.000 egység (20K méretű PEG-et tartalmazó) PEGilált béta-interferon-la-val. Vért vettünk az egerekből retroorbitális (szemüreg mögötti) véreztetéssel, az injektálás után különböző időpontokban, melyeket feltüntetünk az X-tengelyen. Legalább 3 egeret véreztettünk az egyes időpontokban, plazmát preparáltunk és lefagyasztottuk azokat addig, amíg béta-interferon-aktivitást antivirális vizsgálati eljárásban teszteltünk, enkefalomiokardítisz-vírussal fertőzött, A549-jelű, humán tüdőkarcinoma—sejtek alkalmazásával. Az életképes sejteket megfestettük MTT-oldattal, a tálcákat 450 nm-en leolvastuk az abszorbancia meghatározása céljából, amely a sejtek életképességére és a béta-interferőn—aktivitásra utalt. Felvettünk standard görbéket minden egyes tálcára béta-interferon-la felhasználásával, és az egyes mintákban lévő béta-interferon-la-aktivitásmennyiség meghatározására alkalmaztuk azokat. Bemutatjuk az egyedi állatokból származó adatokat.
10. ábra: Hisztidin-toldalékkal ellátott béta-interferon-gén teljes DNS-szekvenciája és fehérjetermékének szekvenciája.
Bemutatjuk a hisztidin-toldalékkal ellátott béta-IFN-la teljes DNS-szekvenciáját (1. számú szekvencia, SEQ ID NO: 1) és fe
72.278/BE hérjeszekvenciáját (2. számú szekvencia, SEQ ID NO: 2). A VCAM-l-szignálszekvencia lehasitása után 3 amino-terminális aminosav (SerGlyGly) marad a hisztidin-toldaléktól (His6, 4-9. helyzet) szintézisiránnyal szemben. Az enterokináz-linkerszekvenciát (AspAspAspAspLys) egy távtartó (10-12. helyzet, SerSerGly) választja el a hisztidin-toldaléktól. A természetes béta-IFN-la fehérjeszekvencia elhelyezkedése Metl8-Asnl83-poziciók.
11. ábra: A klónozó stratégia és IFN-β expressziós plazmidok vázlatos ábrázolása.
Definíciók
A leírásban a „kovalensen kapcsolt kifejezés azt jelenti, hogy a specifikált csoportok direkt, kovalensen vannak egymáshoz kötve, vagy más esetben indirekt módon, kovalensen vannak egymáshoz kapcsolva egy közbenső részen vagy csoporton, például hídon, távtartón vagy kapcsoló részen vagy csoporton keresztül.
Interferon: Az „interferon („IFN—nek is hívják) kisméretű, faj specifikus, egyláncú polipeptid, amelyet emlős sejtek termelnek különféle indukálószerekre, például vírusokra, polipeptidekre, mitogénekre és hasonlókra adott válaszként. A találmány szerinti megoldásban legelőnyösebben alkalmazott interferon glikozilált, humán béta-interferon, amely a 80. (Asn80) pozícióban van glikozilálva, és előnyösen rekombináns DNS-technológiákkal származtatjuk. Ezeket az előnyös glikoziált béta-interferonokat „béta-interferon-la-nak vagy „béta-IFN-la-nak vagy „béta interferon la-nak vagy „β-interferon-la-nak jelöljük, egymással felcserélhető módon. A „béta-interferon-la kifejezésen értjük annak mutánsait is (például az 1. példában leírtakat), feltéve, ha
72.278/BE az ilyen mutánsok szintén glikoziláltak a 80. (Asn80) pozícióban. Ismeretesek fehérjék, beleértve interferonok termeltetésére szolgáló, rekombináns DNS-módszerek. Lásd például USP 4,399,216, 5,149,636, 5,179,017 (Axel et al.) és 4,470,461 (Kaufman) számú szabadalmi iratokat.
A találmány szerinti eljárásokban előnyösen alkalmazható béta-interferon-la-polinukleotidok különböző gerincesek vad típusú béta-interferon-génszekvenciáiból származnak, előnyösen emlősökből, és szakember által jól ismert módszerek alkalmazásával állítjuk elő azokat, amelyek leírását lásd például az alábbi szabadalmi iratokban: USP 5,641,656. (közzétéve 1997. jún. 24., madárból származó, I. típusú interferon-profehérjét kódoló DNS, és érett, madárból származó, I. típusú interferon); 5,605,688. (1997. febr. 25., kutyából és lóból származó, rekombináns, I. típusú interferonok); 5,554,513. (1996. szept. 10., humán bétainterferon-2A-t kódoló DNS-szekvencia); 5,541,312. (1996. júl. 30., humán fibroblasztból származó, béta-2-interferon-polipeptidet kódoló DNS-szekvencia); 5.231.176. (1993. júl. 27., humán leukocita interferont kódoló DNS-molekula) ; 5,071,761. (1991. dec. 10., humán limfoblasztoid LyIFN-alfa-2 és LyIFN-alfa-3 interferonok alszekvenciáit kódoló DNS-szekvencia); 4,970,161. (1990. nov. 13., humán gamma-interferont kódoló DNS-szekvencia); 4,738,931. (1988. ápr. 19., humán béta-interferon-gént tartalmazó DNS); 4,695,543. (1987. szept. 22., humán alfa-interferon Gx-l-gén) ; és 4,456,748. (1984. jún. 26., különböző, természetesen előforduló leukocita-interferonok alszekvenciáit kódoló DNS).
Béta—interferon-la mutánsait lehet alkalmazni a találmány
72.278/BE szerinti megoldásban. Mutációkat szokásos, szakember által ismert, irányított mutagenezis alkalmazásával hozunk létre. A találmány tárgyát képezik továbbá funkcionálisan ekvivalens bétaínterferon-la-polinukleotidok, amelyek funkcionálisan ekvivalens béta-interferőn-la-polipeptideket kódolnak.
Béta-interferon-la-t kódoló, első polinukleotid „funkcionálisan ekvivalens egy második, béta-interferon-la-t kódoló polinukleotiddal, ha az alábbi feltételek közül legalább egyet kielégít :
(a) a „funkcionálisán ekvivalens egy első polinukleotid, amely képes hibridizálódni standard hibridizációs körülmények között a második polinukleotidhoz és/vagy az első polinukleotidszekvencia degenerált változata. Legelőnyösebben olyan mutáns interferont kódol, amely béta-interferon-la aktivitásával rendelkezik;
(b) a „funkcionálisan ekvivalens egy első polinukleotid, amely expresszióra ugyanolyan aminosav-szekvenciát kódol, mint amelyet a második polinukleotid kódol.
Összegezve, az „interferon kifejezésen értjük például a fentebb felsorolt ágenseket, valamint azok funkcionális ekvivalenseit. A „funkcionális ekvivalens kifejezés tehát olyan bétaínterferon-la-fehérjére vagy béta-interferon-la-fehérjét kódoló polinukleotidra utal, amely ugyanolyan vagy javított jótékony hatást képes kifejteni az emlős recipiensre, mint olyan interferon, amelynek vélhetően funkcionális ekvivalense. Szakember számára nyilvánvaló, hogy funkcionálisan ekvivalens fehérjét elő lehet állítani rekombináns technikákkal, például „funkcionálisan
72.278/BE ekvivalens DNS expresszálásával. Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képezik olyan béta-interferon-la-fehérjék, amelyeket természetesen előforduló DNS-ek kódolnak, valamint nem természetesen előforduló DNS-ek kódolnak, amelyek ugyanazt a fehérjét kódolják, mint a természetesen előforduló DNS. A kódoló nukleotid-szekvenciák degeneráltsága következtében más polinukleotidokat is lehet alkalmazni béta-interferon-la kódolására. Ezek lehetnek például a fentebb leírt, olyan teljes vagy részleges szekvenciák, amelyek különböző kódonok szubsztitúciójával meg vannak változtatva, és ugyanazokat az aminosavakat kódolják a szekvenciában, így „csendes változásokat hoznak létre. Ilyen megváltoztatott szekvenciákat ezen szekvenciák ekvivalenseinek tekintjük. Például a Phe-t (F) két kódon kódolja, TTC vagy TTT, a Tyr-t (Y) TAC vagy TAT és a His-t (H) CAC vagy CAT. Másrészt, a Trp-t (W) egyetlen kódon kódolja, TGG. Ennek megfelelően nyilvánvaló, hogy egy konkrét interferont kódoló, adott DNS-szekvenciára sok degenerált DNS-szekvencia létezik, amely azt kódolja. Ezeket a degenerált DNS-szekvenciákat is az igényelt oltalmi körbe tartozónak tekintjük.
A „fúzió kifejezésen két vagy több fehérje vagy fragmentumaik kolineáris kapcsolatát értjük egyedi peptidvázakon keresztül, melyekhez ilyen fehérjéket kódoló polinukleotid-molekulák génexpressziójával jutunk. A fehérjék vagy fragmentumaik előnyösen különböző forrásokból származnak. Tehát előnyös fúziós fehérjék béta-interferon-la-fehérjét vagy fragmentumot tartalmaznak kovalensen kapcsolva egy másik csoporthoz vagy molekulához, amely nem interferon. Konkrétan, a „béta-interferon-la/lg fúziós
72.273/BE fehérje olyan fehérje, amely találmány szerinti béta-interferon-la-molekulát vagy fragmentumát tartalmazza olyan immunglobulin-lánc N-terminálisához kapcsolva, amelyben az immunglobulin N-terminális része helyettesítve van béta-interferon-laval.
A „rekombináns kifejezés a leírásban rekombináns, emlős expressziós rendszerekből származó fehérjét jelent. A legtöbb bakteriális tenyészetben, például E. coliban a fehérjék glikán nélkül expresszálódnak, így ezek az expressziós rendszerek nem előnyösek. Élesztőben expresszált fehérje olyan oligoszacharidstruktúrával rendelkezhet, amely eltér az emlős sejtekben expresszált struktúrától.
A „biológiailag aktív kifejezés a leírásban béta-interferonla tulajdonságaként azt jelenti, hogy egy adott molekula elegendő aminosav-szekvenciahomológiát mutat a találmány előnyös megvalósítási módja szerint alkalmazott molekulával ahhoz, hogy képes legyen antivirális aktivitást kifejteni, az 1. példában (lásd lentebb) leírt típusú, in vitro antivirális vizsgálati eljárással mérve.
A „terápiás készítmény kifejezésen a leírásban olyan készítményt értünk, amely találmány szerinti fehérjéket és más, fiziológiailag kompatibilis alkotórészeket tartalmaz. A terápiás készítmény tartalmazhat segédanyagot, például vizet, ásványi sókat, hordozókat, például fehérjét.
A találmány szerinti molekula akkor van hatásos mennyiségben jelen, ha ez akkora mennyiség, amely képes eredményt elérni vagy az adott kezelendő állapotra hatásokat kifejteni.
72.278/BE
Az „aminosav kifejezés a leírásban peptid, polipeptid vagy fehérje monomer-egysége. Természetesen előforduló peptidekben, polipeptidekben és fehérjékben húsz aminosavat találtak, amelyek mindegyike L-izomer. A kifejezésen értjük az aminosav-analógokat és a fehérje-aminosavak D-izomerjeit és analógjait.
Egy „származtatott aminosav olyan természetes vagy nemtermészetes aminosav, amelyben a normálisan előforduló oldallánc vagy végcsoport kémiai reakcióval módosítva van. Ilyen módosítás lehet például gamma-karboxilálás, béta-karboxilálás, szulfatálás, szulfonálás, foszforilálás, amidálás, észteresítés, Nacetilálás, karbobenzilálás, tozilálás, és más, szakember által ismert módosítás. Egy „származtatott polipeptid olyan polipeptid, amely egy vagy több, származtatott aminosavat tartalmaz.
A „fehérje kifejezésen értünk bármilyen olyan polimert, amely lényegében a 20 aminosav bármelyikéből áll. Bár a „polipeptid kifejezést gyakran viszonylag nagyméretű polipeptidekre használjuk, és a „peptid kifejezést gyakran viszonylag kisméretű polipeptidekre használjuk, ezen kifejezések szakmai használatában átfedések és variációk vannak. A „fehérje kifejezést a leírásban peptidekre, fehérjékre és polipeptidekre használjuk, hacsak másképpen nem definiáljuk.
A „mutáns kifejezésen bármilyen változtatást értünk egy organizmus genetikai anyagán, különösen vad típusú polinukleotidszekvenciában létrehozott bármilyen változtatást (azaz deléciót, szubsztitúciót, addíciót vagy cserét) vagy vad típusú fehérjében bármilyen változtatást. A „mutein kifejezést felcserélhető módon használjuk a „mutáns kifejezéssel.
72.278/BE
A „vad típus kifejezés egy fehérjének vagy részletének, vagy fehérjeszekvenciának vagy részletének megfelelő exon természetesen előforduló polinukleotid-szekvenciáját jelent, ahogyan normálisan, in vivo létezik.
A „standard hibridizációs körülmények olyan só és hőmérsékleti körülmények, amelyek lényegében ekvivalensek 0,5 X SSC és körülbelül 5 X SSC közötti sókoncentrációval és 65°C hőmérséklettel, hibridizációban és mosásban egyaránt. A „standard hibridizációs körülmények kifejezés a leírásban tehát eljárásra utaló definíció, és hibridizációs körülmények tartományát jelenti. Nagymértékben sztringens körülmények lehetnek például plakkszűrő puffer [0,2% polivinil-pirrolidon, 0,2% Ficoll 400; 0,2% marhaszérum-albumin, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5)]; 1 M NaCl; 0,1% nátrium-pirofoszfát; 1% SDS; 10% dextrán-szulfát és 100 pg/ml denaturált, szonikált lazacsperma-DNS alkalmazásával végzett hibridizációban 65°C-on, 12-20 óra hosszáig, és mosás 75 mM NaCl/7,5 mM nátrium-cifrát (0,5 x SSC)/1% SDS jelenlétében 65°Con. Kismértékben sztringens körülmények lehetnek például plakkszűrő puffer, 10% dextrán-szulfát és 110 pg/ml denaturált, szonikált lazacsperma-DNS alkalmazásával végzett hibridizációban 55°C-on, 12-20 óra hosszáig, és mosás 300 mM NaCl/30 mM nátriumcitrát (2, x SSC)/1% SDS jelenlétében 55°C-on. Lásd még „Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 6.3.1.-6.3.6. részek (1989).
Az „expressziós szabályzó szekvencia kifejezésen olyan polinukleotid-szekvenciát értünk, amely gének expresszióját vezérli és szabályozza, ha működőképesen van kapcsolva azokhoz a génekhez.
72.278/BE
A „működőképesen kapcsolt kifejezésen jelentése: egy polinukleotid-szekvencia (DNS, RNS) akkor van működőképesen kapcsolva egy expressziós szabályzó szekvenciához, ha az expresz-sziós szabályzó szekvencia vezérli és szabályozza a polinukleotid-szekvencia transzkripcióját és transzlációját. A „működőképesen kapcsolt kifejezésen értjük azt is, hogy megfelelő start-szignál (például ATG) van az expresszálandó polinukleotid-szekvencia előtt, és megtartja a pontos leolvasási fázist, amely lehetővé teszi a polinukleotid-szekvencia expresszióját az expressziós szabályzó szekvencia vezérlete alatt, és a polinukloetid-szekvencia által kódolt, kívánt polipeptid termelését.
Az „expressziós vektor kifejezésen polinukleotidot, például DNS-plazmidot vagy fágot (sok más, általánosan előforduló példák közül) értünk, amely lehetővé tesz legalább egy gén expreszszióját, ha az expressziós vektort bevisszük egy gazdasejtbe. A vektor képes lehet, vagy nem lehet képes replikációra a sejtben.
Az „izolált kifejezésen (a „lényegében tiszta kifejezéssel felcserélhető), ha nukleinsavra, azaz fehérjét kódoló polinukleotid-szekvenciára alkalmazzuk, olyan RNS- vagy DNS-polinukleotidot, genomi polinukleotid részét, cDNS-t vagy szintetikus polinukleotidot értünk, amely származása vagy kezelése következtében: (i) nem asszociált valamennyi polinukleotiddal, amellyel természetes körülmények között asszociált (például egy gazdasejtben expressziós vektorként vagy részeként van jelen); vagy (ii) olyan nukleinsavhoz vagy más kémiai csoporthoz van kapcsolva, amelyhez természetes körülmények között nem kapcsolódik; vagy (iii) természetes körülmények között nem fordul elő. Az
72.278/BE
..........
η · * · • · · * «k 4» , I « Ml * izolált kifejezésen értünk továbbá olyan polinukleotid-szekvenciát, amely (i) in vitro amplifikálva van, például polimeráz láncreakció (PCR) alkalmazásával; (ii) kémiailag szintetizált; (iii) rekombinánsan lett előállítva klónozással; vagy (ív) tisztított, hasítással és gélen való elválasztással.
Tehát a lényegében tiszta nukleinsav olyan nukleinsavat jelent, amely nincs folyamatos összefüggésben az egyik vagy mindkét nukleinsavval, amellyel normálisan folyamatos összefüggésben van, olyan organizmus természetes körülmények között előforduló genomjában, ahonnan a nukleinsav származik. Lényegében tiszta DNS-en értünk olyan rekombináns DNS-t, amely hozzáadott szekvenciákat kódoló hidridgén része.
Az izolált kifejezésen (a „lényegében tiszta kifejezéssel felcserélhető), ha polipeptidekre alkalmazzuk, olyan polipeptidet vagy részletét értünk, amely származása vagy kezelése következtében: (i) egy gazdasejtben expressziós vektor termékeként vagy részeként van jelen; vagy (ii) olyan fehérjéhez vagy más kémiai csoporthoz van kapcsolva, amelyhez természetes körülmények között nem kapcsolódik; vagy (iii) természetes körülmények között nem fordul elő. Az izolált kifejezésen értünk továbbá olyan fehérjét, amely (i) kémiailag szintetizált; vagy (ii) egy gazdasejtben lett expresszálva és tisztítva lett asszociált fehérjéktől. A kifejezésen értünk általában olyan polipeptidet, amely el van választva olyan más fehérjéktől és nukleinsavaktól, amelyekkel természetes körülmények között előfordul. A polipeptidet előnyösen elválasztjuk olyan anyagoktól, például antitestektől vagy gélmátrixoktól (poliakrilamidtól) , amelyeket tisztí
72.278/BE tására alkalmaztunk.
A heterológ promoter kifejezésen olyan promótert értünk a leírásban, amely természetes körülmények között nem társult génnel vagy tisztított nukleinsavval.
A homológ kifejezés a leírásban az azonosság kifejezés szinonimája, és szekvencia-hasonlóságra utal két polipeptid, molekula között vagy két nukleinsav között. Ha egy pozíciónál, a két összehasonlított szekvencia közül mindkettőben ugyanaz a bázis vagy aminosav-monomer van (például, ha az egyik pozícióban, a két DNS-molekula mindegyikében adenin van, vagy ha az egyik pozícióban, a két polipeptid mindegyikében lizin van), akkor a vizsgált molekulák ebben a pozícióban homológok. Két szekvencia közötti százalékos homológia mindkét szekvenciában előforduló, egyező vagy homológ helyzetek számának függvénye, elosztva az összehasonlított pozíciók számával x 100. Például, ha a két szekvenciában 10 pozíció közül 6 egyezik vagy homológ, akkor a két szekvencia 60%-ban homológ. Például, a CTGACT és CAGGTT DNSszekvenciák 50%-ban homológok (az összes 6 helyzet közül 3 egyezik) . Általában akkor végzünk összehasonlítást, ha két szekvencia úgy van egymás alá rendezve, hogy az maximális homológiát ad. Ilyen egymás alá rendezést Needleman [ J. Mól. Bioi. 48, 443453 (1970)] által leírt módszer szerint lehet végezni, kényelmesen számítógépes programok, például Align-program (DNAstar, Inc.) alkalmazásával. Homológ szekvenciák azonos vagy hasonló aminosavakat tartalmaznak, amelyben a hasonló aminosavak konzervatív szubsztitúciók, vagy az alárendezett referencia szekvenciában lévő, megfelelő aminosavak megengedett pontmutációi. Eb
72.278/BE ben a vonatkozásban, egy referencia szekvenciában lévő aminosav konzervatív szubsztitúciója olyan szubsztitúció, amely fizikailag vagy funkcionálisan hasonló a megfelelő referencia aminosavhoz, például hasonló mérettel, alakkal, elektromos töltéssel, kémiai tulajdonságokkal rendelkezik, beleértve kovalens vagy hidrogénhíd-kötés kialakításának képességét, vagy hasonlókat. Különösen előnyös konzervatív szubsztitúciók teljesítik azokat a követelményeket, melyeket Dayhoff és munkatársai [ Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, Suppl.3., 22. rész, 354-352. old., Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D. C. (1978)] leírtak elfogadott pontmutációra.
A polinukleotid szekvencia és nukleotidszekvencia kifejezéseket szintén egymással felcserélhető módon alkalmazzuk.
Az „angiogenezis és „neovaszkularizáció kifejezések jelentése tágan vett értelemben új véredények képződése. Az angiogenezis különösen tumor helyén képződő, új véredényekre is vonatkozik.
Az „IFNAR2, „IFNAR1, „IFNAR1/2 olyan fehérjék jelölései, amelyekről ismeretes, hogy I. típusú, sejtfelszíni interferonreceptor alkotórészei. Az IFNAR2-lánc extracelluláris része (ektodoménje) önállóan képes alfa- vagy béta-interferont kötni.
A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában, hacsak másképpen nem jelöljük, szokásos, szakember által ismert sejtbiológiai, sejttenyésztési, molekuláris biológiai, mikrobiológiai, rekombináns DNS, fehérjekémiai és immunológiai technikákat alkalmazunk. Ilyen technikák leírását megtalálhatjuk a szakirodalomban. Lásd például, Molecular Cloning: A Laboratory
72.278/BE
Manual, 2. kiadás, (szerk. Sambrook, Fritsch és Maniatis), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); DNA Cloning I. és II. kötet, (szerk. D. N. Glover) (1985); Oligonucleotid Synthesis, (szerk. M. J. Gait) (1984); Mullis és munkatársai, USP 4.683.195. számú szabadalmi irat; Nucleic Acid Hybridization (szerk. B. D. Hames és S. J. Higgins) (1984); Transcription and Translation (szerk. B. D. Hames és S. J. Higgins) (1984); Culture of Animal Cells (szerk. R. I. Freshney) , Alan R. Liss Inc. (1987); Immobilized Cells and Enzymes IRL Press (1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods in Enzymology 154. és 155. kötet (szerk. Wu et al.), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (szerk. J. H. Miller és Μ. P. Calos), Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (szerk. Mayer és Walker), Academic Press, London (1987); Handbook of Experiment Immunology, I-IV. kötet (szerk. D. M. Weir és C. C. Blackwell) (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Sping Harbor Laboratory Press (1986).
A béta-interferon
Béta-interferon-la ágensként alkalmazható beteg állapot, fiziológiai állapotának, szimptómáinak, vagy etiológiai faktorainak kezelésére, csillapítására vagy gyengítésére, vagy annak elemzésére vagy diagnózisára. A kifejezésen értünk olyan bétainterferon-la-t is, amely fúziós fehérje, például immunglobulin-béta-interferon-la fúziós fehérje része, melyet leírtunk az általunk benyújtott, 60/104,572. és 60/120,161. számú szabadalmi bejelentésekben. Fúziós fehérjék előállítása szakember számára
72.273/BE általában jól ismert.
Egyedi helye(ke)t találtunk polimer-kapcsolásra, amelynek alkalmazása nem szünteti meg a béta-interferon-la funkcióját. Továbbá helyspecifikus mutagenezis eljárásokat is alkalmaztunk polimer-kapcsolási hely(ek) független vizsgálatára (lásd az 1. példát). Röviden összefoglalva, humán béta-interferon-la-t mutációs analízisnek vetettünk alá abból a célból, hogy feltérképezzük az aktivitáshoz és receptorkötéshez szükséges csoportokat. Rendelkezésre állt a humán béta-interferon-la 3-dimenziós kristályszerkezete (lásd a fentebb valamint az 1. példában leírtakat) , amely lehetővé tett béta-interferon-receptor-kölcsönhatáshoz rendelkezésre álló, oldószer-hatásnak kitett csoportok azonosítását alanin- (vagy szerin-) szubsztitúciókhoz, és az intramolekuláris kötésekben szerepet játszó aminosavak megtartását. Tizenöt, szkennelő alanin-mutációból álló panelt terveztünk, amelyben 2-8 közötti aminosavat cseréltünk a béta-interferon-la-ban lévő egyes hélixek (A, B, C, D, E) és hurkok (AB1, AB2, AB3, CDI, CD2, DEI, DE2) jól elhatárolható régióiban. Lásd az 1. példát.
Amino-terminális hisztidin-toldalékot („his-toldalékot) alkalmaztunk emlős sejtek által expresszált mutánsok affinitástisztítására (10. ábra, valamint 1. és 2. számú szekvencia a cDNS- és levezetett aminosav-szekvenciákra, sorrendben) . Ezen mutációk funkcionális következményeit antivirális és antiproliferatív vizsgálati eljárásokban határoztuk meg. Kifejlesztettünk egy nem-radioaktív kötési vizsgálati eljárást ezen mutánsok analizálására arra vonatkozóan, hogy milyen mértékben képesek béta
72.278/BE interferon sejtfelszíni receptorhoz (IFNAR1/2 sejtfelszíni receptorhoz) kötődni. Továbbá, interferont kötni képes, IFNAR2ektodomén/Ig fúziós fehérjét alkalmazó ELISA-ra alapuló vizsgálati eljárást alkalmaztunk béta-interferon-la illetve IFNAR2 közötti felszíni kölcsönhatások feltérképezésére (lásd az 1. példában leírtakat). Ezek a mutációs analízisek azt mutatták, hogy a béta-interferon-molekula N- és C-terminálisánál elhelyezkedő részletek nem fontosak receptorkötéshez vagy biológiai funkcióhoz.
A mutánsok további variánsai a találmány szerinti bétainterferon-la-csoportnak, amelyek különösen hasznosak, amennyiben olyan új tulajdonságokat mutatnak, amelyeket nem találhatunk meg vad típusú béta-interferon-la-ban (lásd az 1. példában leírtakat) . Három hatástípust azonosítottunk, amelyeket célzott mutagenezis okozott. Ezek a hatások előnyösek lehetnek interferon-drog fejlesztésében bizonyos körülmények között. A három hatástípus az alábbi: (a) a mutánsok magasabb antivirális aktivitással rendelkeznek, mint vad típusú béta-interferon-la (például Cl-mutáns); (b) a mutánsok aktívak antivirális és antiproliferatív vizsgálati eljárásokban egyaránt, de amelyek esetén az antiproliferatív aktivitás aránytalanul alacsonyabb az antivirális aktivitáshoz képest, vad típusú béta-interferon-la-hoz viszonyítva (például Cl-, D- és DEl-mutánsok) ; és (c) funkcionális antagonisták (például Al, B2, CD2 és DE1), amelyek olyan antivirális és antiproliferatív aktivitásokat mutatnak, amelyek aránytalanul alacsonyabbak a receptorkötéshez képest, vad típusú béta-interferon-la-hoz viszonyítva.
72.278/BE
A polimer-csoport
A találmány tágan igényelt oltalmi köre szerint, egyetlen polimermolekulát alkalmazunk béta-interferon-la-val való konjugálásra, bár eljárhatunk úgy is, hogy egynél több polimermolekulát alkalmazunk. Azt találtuk, hogy a találmány szerinti, konjugált béta-interferon-la-készitmények hasznosak in vivo, valamint nem in vivo alkalmazásokban. Továbbá, felismertük, hogy a konjugált polimerben más csoportokat, részeket vagy más konjugátumfajtákat lehet alkalmazni a végfelhasználásnak megfelelően. Például néhány alkalmazásban hasznos lehet a polimerhez kovalensen kapcsolni olyan funkciós csoportokat, amelyek UV-lebontás vagy antioxidánsok ellen rezisztenciát, vagy más tulajdonságokat vagy jellemzőket biztosítanak a polimernek. Továbbá például néhány alkalmazásban előnyös lehet a polimert funkcionalizálni, hogy reaktív vagy keresztköthető legyen, a konjugált anyag egészére nézve különböző tulajdonságok vagy jellemzők fokozása céljából. Ennek megfelelően, a polimer tartalmazhat bármilyen olyan funkciót, ismétlődő csoportokat, láncokat vagy más alkotóelemeket, amelyek nem akadályozzák a konjugált béta-interferon-la-készítmény hatékonyságát a tervezett alkalmazásban. A találmány szerinti megoldás más céljai és előnyei nyilvánvalóbbá válnak a leírás és a csatolt szabadalmi igénypontok alapján.
Ezen kívánt tulajdonságok eléréséhez hasznosan alkalmazható polimereket lentebb leírunk a példaként bemutatott reakcióvázlatokban. Kovalensen kötött peptideket alkalmazva, a polimert funkcionalizálhatjuk, és azután kapcsoljuk a peptid(ek) szabad aminosavához (aminosavaihoz), labilis kötések kialakítása céljából.
72.278/BE
A béta-interferon-la-t legelőnyösebben a polimeren lévő terminális reaktív csoporton keresztül konjugáljuk, bár konjugálásokat lehet indítani a nem-terminális, reaktív csoportokról is. Reaktív csoporto(ka)t tartalmazó polimert a leírásban „aktivált polimernek hívunk. A reaktív csoport szelektíven képes reagálni a fehérjén lévő, szabad amino- vagy más reaktív csoporttal. Az aktivált polimer(ek)et úgy reagálnak, hogy a kapcsolódás a bétainterferon-la bármelyik rendelkezésre álló aminocsoportjánál megtörténhet, például -amino-csoportoknál vagy a lizinek -aminocsoport j ainál . A béta-interferon-la-n lévő szabad karboxilcsoportok, alkalmasan aktivált karbonilcsoportok, oxidált szénhidrát-csoportok és merkaptocsoportok (ha rendelkezésre állnak) is felhasználhatók kapcsolódási helyként.
Bár a polimert a béta-interferon-la-molekula bármely részéhez lehet kapcsolni, polimerkapcsolásra a legelőnyösebb hely a bétainterferon-la N-terminálisa. Másodlagos hely(ek) vannak a C-terminális közelében és a cukor-csoportokon. Tehát a találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a következőképpen játhatunk el: (i) béta-interferon-la N-terminálisan kapcsolt polimerkonjugátumai; (ii) béta-interferon-la C-terminálisan kapcsolt polimerkon jugátumai; (iii) cukor-részen keresztül kapcsolt polimerkonjugátumok; (iv) valamint béta-interferon-la fúziós fehérjék N-, C-terminálison és cukorrészen keresztül kapcsolt polimerkonj ugátumai.
Általában körülbelül 1,0 és körülbelül 10 mól aktivált polimert alkalmazunk egy mól fehérjére, a fehérjekoncentrációtól· függően. A végső mennyiséget az határozza meg, hogy egyensúlyban
72.278/BE legyenek az alábbi folyamatok: a reakció maximális mértékben lejátszódjon, miközben minimalizálva legyen a termék nem-specifikus módosítása, és ugyanakkor olyan reakciókörülményeket határozunk meg, amelyek optimális aktivitást biztosítanak, miközben optimalizálva legyen a fehérje fél-életideje, ha lehetséges. A biológiai aktivitásának előnyösen legalább körülbelül 50%-a, és legelőnyösebben 100%-a megmarad.
A reakciókat végrehajthatjuk biológiailag aktív anyagok inert polimerekkel való reagáltatására szolgáló, bármilyen alkalmas módszerrel, előnyösen körülbelül pH 5-7-n, ha a reaktív csoportok az N-terminális alfa-aminocsoportján vannak. A eljárásban általában aktivált polimert (amely legalább egy terminális hidroxilcsoporttal rendelkezhet) , és azután a fehérjét reagáltatjuk az aktivált polimerrel a kiszerelésre alkalmas, szolubilis fehérje előállítása céljából. A fentebb leírt módosítási reakciót számos módszerrel végrehajthatjuk, amely egy vagy több lépést tartalmazhat.
A fentebb említettek szerint, a találmány legelőnyösebb megvalósítási módja szerint a béta-interferon-la N-terminális végét használjuk fel a polimer kapcsolására. Rendelkezésre állnak alkalmas módszerek N-terminálisan módosított béta-interferon-la előállítására. Az egyik ilyen eljárásban például reduktív alkilálást végzünk, amelyben olyan különböző típusú primer aminocsoportok (a lizinen lévő epszilon-aminocsoportok, az N-terminális metioninon lévő aminocsoportokkal szemben) eltérő aktivitásait használjuk ki, amelyek rendelkezésre állnak béta-interferon-la származékképzésére. Megfelelő szelekciós körülmények között, béta-interferon-la
72.278/BE lényegileg szelektív származékait lehet elérni az N-terminálisnál, karbonilcsoportot tartalmazó polimerrel. A reakciót olyan pH-η végezzük, amelyben kihasználjuk a béta-interferon-la lizinjének epszilon-aminocsoportjai és az N-terminális alfa-aminocsoportja közötti pKa-különbség előnyét. Az ilyen típusú kémiai reakció szakember számára jól ismert.
Olyan reakciót alkalmazunk, amelyben a szelektivitást alacsony pH-η (általában 5-6) végzett reakcióval tartjuk fent olyan körülmények között, ahol a PEG-aldehid-polimert béta-interferonla-val nátrium-cianoborohidrid jelenlétében reagáltatjuk. Ez PEG-béta-interferon-la tisztítása és SDS-PAGE, MALDI tömegspektrometria és peptidszekvenálás/térképezés alkalmazásával végzett analízis után olyan béta-interferon-la-t eredményez, amelynek N-termínálisa van specifikusan megcélozva a PEG-csoporttal.
A béta-interferon-la kristályszerkezetén látható, hogy az Nés C-terminális egymáshoz közel van [lásd Karpusas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 11813-11818 (1997)] . Tehát a bétainterferon-la C-terminálisának módosításainak minimális hatással kell lenniük az aktivitásra. Mivel nincsen egyszerű kémiai stratégia polialkilén-glikol-polimer, például PEG célba juttatására a C-terminálishoz, a legegyszerűbb géntechnológiai módosítással, például helyspecifikus mutagenezis alkalmazásával létrehozni egy helyet, amelyet célpontot jelenthet a polimer számára. Például Cys beépítése egy olyan helyre, amely a C-terminálisnál vagy ahhoz közel van, lehetővé tesz specifikus módosítást maleimid, vinilszulfon- vagy haloacetát-aktivált polialkilén-glikol (például PEG) alkalmazásával. Ezeket a származékokat a beépített
72.278/BE cisztein specifikus módosításaira lehet alkalmazni, mivel ezek a reagensek nagymértékben szelektívek Cys-re. Más stratégiákat is lehet alkalmazni, például megcélozható hisztidin-toldalék beépítését [ Fancy et al., Chem. & Bioi. 3, 551 (1996)] , vagy további glikozilációs helyek beépítését, amelyek más alternatívákat jelentenek béta-interferon-la C-terminálisának módosítására.
A béta-interferon-la glikánja olyan helyzetben is előfordul, amely lehetővé tenne további módosításokat az aktivitás változása nélkül. Kémiai módosítás célhelyeiként, cukrok megcélzására szolgáló módszerek jól ismertek, és ezért valószínű, hogy polialkilén-glikol-polimert közvetlenül és specifikusan lehet béta-interferon-la-n lévő, előzőleg oxidációval aktivált cukrokhoz kapcsolni. Például elő lehet állítani polietilén-glikolhidrazidot, amely viszonylag stabil hidrazonkötést képes kialakítani aldehidekkel és ketonokkal való kondenzációval. Ezt a tulajdonságát használjuk fel fehérjék módosítására, oxidált oligoszacharid-kötéseken keresztül [lásd Andresz, H. et al., Makromol. Chem. 179, 301 (1978)] . Elsősorban PEG-karboximetilhidrazid nitrites kezelésével PEG-karboximetil-azidot lehet előállítani, amely elektrofil aktív csoportként viselkedik aminocsoportok irányában. Ezt a reakciót lehet alkalmazni polialkilén-glikollal módosított fehérjék előállítására is [ lásd USP 4,101,380. és 4,179,337. számú szabadalmi iratokat] .
Korábban már felismertük, hogy továbbá tiol-linkerrel médiáit kémia elősegítheti fehérjék keresztkötését. Elsősorban LFA-3 és CD4 homotipikus multimerjeit állítottuk elő egy olyan eljárás alkalmazásával, amelyben például elállítottunk reaktív aldehide
72.278/BE két szénhidrát-csoportokon nátrium-perjodáttal, ciszteamin-konjugátumokat kialakítva az aldehideken keresztül, és keresztkötéssel a ciszteaminokon lévő tiolcsoportokon keresztül [ lásd Pepinsky, B. et al., J. Bioi. Chem. 266, 18244-18249 (1991); és Chen, L. L. et al., J. Bioi. Chem. 266, 18237-18243 (1991)] . Ezért úgy láttuk, hogy ez a típusú kémia megfelelő lehet polialkilén-glikol-polimerekkel való módosításra is, ahol a linkért beépítjük a cukorba, és a polialkilén-glikol-polimert a linkerhez kapcsoljuk. Míg aminotiol- vagy hidrazin-tartalmú linkerek lehetővé tesznek egyetlen polimercsoport hozzákapcsolását, a linker struktúráját meg lehet úgy változtatni, hogy több polimert kapcsoljunk és/vagy megváltoztassuk a polimer térbeli orientációját a béta-interferon-la-hoz képest.
A találmány gyakorlati megvalósításában 1-4 szénatomos alkilpolialkilén-glikolok, előnyösen polietilén-glikol (PEG) polialkilén-glikol-csoportjai, vagy ilyen glikolok poli-(oxi)-alkilénglikol-csoportjai előnyösen beépíthetők a kérdéses polimerrendszerbe. Tehát a polimer, amelyhez a fehérjét kapcsoljuk, lehet polietilén-glikol (PEG) vagy poli-oxi-etilált poliol homopolimerje, feltéve, ha a polimer valamennyi esetben vízben oldható szobahőmérsékleten. Ilyen polimerek például polialkilénoxid-homopolimerek, például PEG, vagy polipropilén-glikolok, polioxietilénnel ellátott poliolok, ezek kopolimerjei valamint ezek blokk-kopolimerjei, feltéve, hogy a blokk-kopolimerek vízoldhatósága fenntartható. Polioxietilált poliol lehet például polioxietilált glicerin, polioxietilált szorbit, polioxietilált glükóz és hasonlók. A polioxietilált glicerinben lévő glicerin
72.278/BE váz ugyanolyan, mint ami természetes körülmények között előfordul, például állatokban és emberekben lévő mono-, di- és trigliceridekben. Tehát a vonal nem szükségszerűen idegen ágens a testben.
Ezzel párhuzamosan, polialkilén-oxidok, dextrán, polivinilpirrolidonok, poliakrilamidok, polivinil-alkoholok, szénhidrátalapú polimerek, és hasonlók is alkalmazhatók. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a fentebb felsorolt lista csupán csak szemléltetés célját szolgálja, és minden olyan polimer-anyag szóba jöhet a találmány szerinti megoldásban, amely az itt leírt minőséggel rendelkezik.
A polimerrel szemben nincsen semmilyen konkrét igény molekulatömeg tekintetében, de előnyösen körülbelül 300 és 100.000 közötti molekulatömegű, előnyösebben körülbelül 10.000 és 40.000 közötti molekulatömegű polimert alkalmazunk. A legjobban különösen 20.000 molekulatömegű vagy nagyobb polimer előzi meg legjobban a vese kiszűrése következtében bekövetkező fehérjeveszteséget.
Polialkilén-glikol—származékoknak számos előnyös tulajdonsága van a találmány szerinti megoldásban alkalmazott polimerinterferon-béta-la-konjugátumformákban, amelyek polialkilénglikol-származékok alábbi tulajdonságaival társultak: vízoldhatóság javulása, míg ugyanekkor nem váltanak ki antigenikus vagy immunogén választ; nagymértékű biológiai kompatibilitás; polialkilén-származékok in vivo biológiai lebontásának hiánya; és könnyű kiválasztás élő szervezetekből.
Továbbá, a találmány tárgyának másik vonatkozásában, olyan, polimer-komponenshez kovalensen kötött béta-interferon-la-t al
72.278/BE kalmazunk, amelyben a konjugáció hasítható kovalens kémiai kötéseket tartalmaz. Ez lehetővé teszi annak időbeli szabályzását, amelyben a polimer lehasítható a béta-interferon-la-ról. Ez a béta-interferon-la-drog és polimer közötti kovalens kötés kémiai vagy enzimes reakcióval hasítható. A polimer-béta-interferon-latermék elfogadható aktivitásmennyiséget megtart. Ezzel egyidejűleg, a polimerben jelenlévő polietilén-glikol lehetővé teszi, hogy a polimer-béta-interferon-la-konjugátum vízben nagyon jól oldódik és élettartama meghosszabbodik a vérkeringésben. Ezen javított tulajdonságok eredményeként, a találmány tárgyát képezik mind az aktív polimer-béta-interferon-la-fajták parenterális, aeroszolos és orális célba juttatása, valamint hidrolitikus hasítást követően, önmagában a béta-interferon-la biológiai hozzáférhetősége, in vivo alkalmazásokban.
Nyilvánvaló, hogy a leírt reakcióvázlatok csak szemléltetés célját szolgálják, és nem korlátozzák azokat a reakciókat és struktúrákat, amelyeket a béta-interferon-la módosításában alkalmazunk, például oldhatóság, stabilitás és a sejtmembrán parenterális és orális beadásra mutatott affinitásának elérésére. A polimer és a béta-interferon-la közötti reakciót, a legelőnyösebb, N-terminálisnál konjugált termékek előállítása céljából, sokféle reakcióvázlat szerint, könnyen végrehajthatjuk. A béta-interferon-la-konjugátumok aktivitását és stabilitását számos módon lehet változtatni, különböző molekulaméretű polimer alkalmazásával. A konjugátumok oldhatóságát a polimer-alkotórészbe épített polietilén-glikol-fragmentum arányának és méretének változtatásával lehet módosítani.
72.278/BE
Alkalmazások
Polialkilén-glikollal származtatott polimerek egyedi tulajdonságának értékét a találmány szerinti terápiás alkalmazásokban általános biológiai kompatibilitásuk jelenti. A polimerek vízben különböző mértékben képesek oldódni, és nem toxikusak. Feltételezzük, hogy nem immunogének és nem antigenikusak, és nem zavarják a béta-interferon-la-csoport biológiai aktivitásait, ha a leírás szerinti körülmények között vannak konjugálva. A vérben hosszú keringési idővel rendelkeznek, és könnyen kiválasztódnak élő szervezetekből.
Azt találtuk, hogy a találmány szerinti termékek alkalmasak béta-interferon-la terápiás fél-életidejének fenntartására, és például vízben vagy elfogadható folyékony közegben való feloldással lehet azokat előállítani. A beadás módja parenterális, aeroszolos vagy orális. Finom kolloid szuszpenziókat lehet előállítani parenterális beadásra depó-hatás kialakítása céljából, vagy orális beadásra, míg az aeroszolos forma lehet folyékony vagy száraz por természetű. A száraz, liofilezett állapotban vagy oldat-formákban a találmány szerinti béta-interferon-lapolimerkonjugátumoknak jó tárolási stabilitásuknak kell lennie. A konjugált béta-interferon-la hőstabilitása előnyös por-formát kialakító eljárásokban, amelyekben dehidratációs lépés van. Lásd például PCT/US/95/06008. számú szabadalmi iratban („Methods and Compositions for Dry Powder of Interferons) leírtakat.
A találmány szerinti, terápiás hatású polimerkonjugátumokat bármilyen állapot vagy betegség profilaxisára vagy kezelésére lehet alkalmazni, amelyre a béta-interferon-la-alkotórész hatásos.
72.278/BE
Továbbá a találmány szerinti, polimer alapú konjugátumokat alkotórészek, állapotok vagy betegségek diagnózisára lehet alkalmazni biológiai rendszerekben vagy mintákban, valamint diagnosztikai célokra lehet alkalmazni nem-fiziológiás rendszerekben.
Terápiás alkalmazásra, a találmány tárgyát képezi eljárás ilyen állapot (ok)ban vagy betegség (ek)ben szenvedő vagy ilyen állapot(ok)ra vagy betegség(ek)re látensen érzékeny állat-alany kezelésére, és ilyen kezelésre szoruló állat-alany kezelésére, amelyben ilyen állatnak beadjuk a találmány szerinti polimerkonjugátum hatásos mennyiségét, amely terápiásán hatásos az állapotra vagy betegségre. A találmány szerinti polimerkonjugátumokkal kezelt alanyok lehetnek emlős alanyok, és legelőnyösebben emberek. A leküzdendő konkrét állapottól vagy betegségtől függően, az állat-alanyoknak a találmány szerinti polimerkonjugátumokból beadhatunk bármilyen terápiásán hatásos és biztonságos dózist, melyet szakember képes könnyen meghatározni szükségtelen kísérletezés nélkül. Az I. típusú interferonok faj specifikus jellege („faj-gát) miatt szükség lehet olyan interferon-polimer-konjugátumok előállítására, amelyek megfelelő fajból származó interferonokat tartalmaznak.
A béta-interferon-la anti-sejtproliferatív aktivitása jól ismert. Különösen bizonyos leírás szerinti béta-interferon-la-polimerkonjugátumok alkalmasak tumorok és rákbetegségek, például oszteogén szarkóma, limfóma, akut limfómás leukémia, mellkarcinóma, melanoma és nasopharyngealis karcinóma, valamint autoimmun állapotok, például fibrózis, lupusz és szklerózis multiplex kezelésére. Továbbá várható, hogy a konjugált fehérjék,
72.278/BE különösen bizonyos találmány szerinti béta-interferon-la muteinkonjugátumok által kifejtett antivirális aktivitást lehet alkalmazni vírusbetegségek, például ECM-fertőzés, influenza és más légzőszervi traktust érintő fertőzések, veszettség és hepatitisz kezelésére. Szintén várható, hogy a béta-interferon-la, különösen a leírás szerinti konjugált fehérjék által kifejtett immunmodulátor aktivitásokat autoimmun és gyulladásos betegségek, például fibrózis és szklerózis multiplex kezelésére lehet alkalmazni. Az, hogy az interferonok új véredények képződését képesek gátolni (azaz angiogenezist és neovaszkularizációt képesek gátolni) , lehetővé teszi, hogy a találmány szerinti konjugátumokat angiogén betegségek, például diabetikus retinopátia, koraszülöttek retinopátiája, makuláris degeneráció, szaruhártyagraft-kilökődés, neovaszkuláris glaukóma, retrolentális fibroplázia, rubeózis és Osler-Webber-szindróma kezelésére alkalmazzuk.
Továbbá, az interferon antiendotél-aktivitása már jó ideje ismert, és az interferon-hatás egy lehetséges mechanizmusa az, hogy valószínűleg zavarja az endotél-sejtaktivitást úgy, hogy gátolja angiogén faktorok tumorsejtek általi termelését vagy hatékonyságukat. Néhány vaszkuláris tumor, például hemangiómák különösen érzékenyek interferon-kezelésre. Alfa-interferon-kezelés az egyetlen dokumentált kezelés erre a betegségre. Várható, hogy a találmány szerinti béta-interferon-la-konjugátumokkal való kezelés lényegi gyógyhatásokat nyújt farmakokinetikai és farmakodinámiás szempontból, mivel a konjugátum várhatóan hosszabb ideig marad az érrendszerben, mint a nem-konjugált interferonok, így eredményesebb és hatékonyabb terápiához vezet anti-angiogén 72.278/BE a · Λ ** M · *»** ?
* · . . ♦ · · < · - ·«'« · ágensként alkalmazva. Lásd a 8. példát.
A találmány szerinti polimer-béta-interferon-la-konjugátumokat beadhatjuk úgy, ahogyan vannak, valamint gyógyászatilag elfogadható észterek, sók, és más, fiziológiailag működőképes származékuk formájában. Ilyen gyógyszerformákban a béta-interferon-la-t előnyösen egy vagy több, gyógyászatilag elfogadható hordozóval és adott esetben bármilyen más, terápiás hatóanyaggal alkalmazzuk együtt. A hordozóknak gyógyászatilag elfogadhatónak hell lenni abban az értelemben, hogy kompatibilisek legyenek a gyógyszerformában lévő többi hatóanyaggal, és ne legyenek túlzottan károsak recipiensükre. A béta-interferon-la-t akkora mennyiségben alkalmazzuk, hogy elérjük a fentebb leírt, kívánt farmakológiai hatást, és megfelelő mennyiségben ahhoz, hogy elérjük a kívánt napi dózist.
A formák alkalmasak lehetnek parenterális valamint nemparenterális beadásra, és speciális körülmények közötti, például orális, rektális, buccalis, topikális, nazális, ophthalmiás, szubkután, intramuszkuláris, intravénás, transzdermális, intratekális, intraartikuláris, intraartériális, szuarachnoidális, bronchiális, limfatikus, vaginális és intrauterinális beadásra. Előnyösen orális, nazális vagy parenterális beadásra alkalmas formákat alkalmazunk.
Ha a béta-interferon-la-t folyékony oldatot tartalmazó formában alkalmazzuk, akkor a formát előnyösen orálisan vagy parenterálisan adjuk be. Ha a béta-interferon-la—t folyékony szuszpenziós formában vagy porként, biológiailag kompatibilis hordozóformában alkalmazzuk, a formát előnyösen orálisan, rektálisan
72.278/BE
,. .. ., > « - · 9 4 » ·’ . * • ♦ · - 9 9 · «· 9 * vagy bronchiálisan adjuk be.
Ha a béta-interferon-la-t közvetlenül szilárd por formájában alkalmazzuk, a béta-interferon-la-t előnyösen orálisan lehet beadni. Más módszer szerint nazálisán vagy bronchiálisan lehet beadni, a por hordozógázban való porlasztásán keresztül, alkalmas porlasztókészülék alkalmazásával a por gázdiszperzióját kialakítva, amelyet a páciens légáramlatból lélegez be.
A találmány szerinti polimerkonjugátumokat tartalmazó formákat alkalmas módon, dózisegységek formájára hozzuk, és elkészíthetjük azokat gyógyszerész-szakmában ismert, bármilyen eljárással. Ilyen eljárásokban általában a hatóanyagot (hatóanyagokat) összekeverjük hordozóval, amely egy vagy több, járulékos alkotórészből áll. A formákat tipikusan egységesen, úgy készítjük el, hogy a hatóanyagot (hatóanyagokat) közvetlenül összekeverjük folyékony hordozóval, finoman eloszlatott szilárd hordozóval, vagy mindkettővel, és azután, ha szükséges, a terméket a kívánt kiszerelési forma dózisegységeibe formázzuk.
A találmány szerinti, orális beadásra alkalmas gyógyszerformákat előállíthatjuk diszkrét egységek formájában, például kapszulaként, ostyaként, tablettaként vagy szögletes tablettaként; amelyek mindegyike előre meghatározott mennyiségű hatóanyagot tartalmaz porként vagy granulátumként; vagy szuszpenzióként vizes folyadékban vagy nem-vizes folyadékban, például szirupként, elixírként, emulzióként vagy kanalas orvosságként.
Tablettát előállíthatunk sajtolással vagy bevonással, adott esetben egy vagy több járulékos alkotórésszel. Sajtolt tablettákat nyomással lehet előállítani, alkalmas berendezéssel, amely
72.278/BE esetben a hatóanyag szabadon folyó, például por vagy granulátumformában van, amelyet adott esetben kötőanyaggal, mállasztószerrel, síkosítószerrel, inert hígítószerrel, felületaktív ágenssel vagy maratószerrel keverünk össze. Bevont tabletták porított polimerkonjugátumokat tartalmaznak alkalmas hordozóval összekeverve, amelyeket alkalmas berendezésben vonnak be.
Szirupot úgy lehet előállítani, hogy a hatóanyagot cukor, például szacharóz töményített oldatához adjuk, amelyhez bármilyen kiegészítő alkotórész(eke)t is hozzáadhatunk. Ilyen kiegészítő alkotórész(eke)t lehetnek ízesítőszerek, alkalmas tartósítószer, a cukrok kristályosodását késleltető ágensek és bármilyen más alkotórész oldhatóságát növelő ágens, például polihidroxi-alkohol, például glicerin vagy szorbit.
Parenterális beadásra szánt formák alkalmas módon a hatóanyag steril vizes preparátumát tartalmazzák, amely előnyösen a recipiens vérével izotóniás (például fiziológiás sóoldat). Ilyen formák szuszpendáló ágenseket és töltőágenseket, vagy más, mikrorészecskékből álló rendszereket tartalmazhatnak, amelyeket úgy terveztek, hogy képesek legyenek a vegyületet a vér komponenseihez, vagy egy vagy több más szervhez célba juttatni. A formákat egy dózist tartalmazó vagy több dózist tartalmazó formákban lehet előállítani.
Orrspray-formák az aktív konjugátum tisztított vizes oldatait tartalmazzák tartósító ágensekkel és izotóniás ágensekkel. Ilyen formákat olyan pH-ra és izotóniás állapotba állítjuk, amely kompatibilis a nazális nyálkahártya-membránokkal.
Rektális beadásra szánt formákat kúpként lehet előállítani
72.278/BE alkalmas hordozóval, például kakaóvajjal, hidrogénezett zsírokkal vagy hidrogénezett zsír-karbonsavval.
Ophthalmiás (szembe) beadásra szánt formákat, például szemcseppeket az orrsprayhez hasonló eljárással állítjuk elő, kivéve azt, hogy a pH-t és az izotóniás faktorokat előnyösen a szemben fennálló körülményekhez igazítjuk.
Topikális formák a találmány szerinti konjugátumokat tartalmazzál feloldva vagy szuszpendálva egy vagy több közegben, például ásványi olajban, petróleumban, polihidroxi-alkoholokban vagy olyan más bázisban, amelyet topikális gyógyszerformákban alkalmaznak.
A fentebb említett alkotórészeken kívül, a találmány szerinti készítmények tartalmazhatnak továbbá egy vagy több járulékos alkotórészt (alkotórészeket) , például hígítószereket, puffereket, ízesítő ágenseket, roncsolószereket, felületaktív ágenseket, töltőanyagokat, síkosítószereket, tartósítószereket (például antioxidánsokat) és hasonlókat.
Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képezi alkalmas polimerek biztosítása béta-interferon-la-oldat in vitro stabilizálására, amely előnyös, szemléltető példaként szolgál nem-terápiás alkalmazásra. A polimereket például a béta-interferon-la hőstabilitásának és enzimes lebontással szembeni rezisztenciájának fokozására lehet alkalmazni. A béta-interferon-la hőstabilitásának fokozása a találmány szerinti konjugációs módszer alkalmazásával lehetőséget biztosít a fél-életidő, a szobahőmérsékleten vett stabilitás és a kutatási célú reagensek és reagenskészletek hatékonyságának javítására.
72.278/BE
Az alábbi példákkal a találmány szerinti megoldást szemléltetjük, amelyekkel nem kívánjuk azt korlátozni. Nyilvánvaló, hogy különösen a leírt in vivo állatkísérleteken változtatni lehet, így az alapvető módszerekben más módosítások és variációk is lehetségesek. Például az 5. példában szakember alkalmazhat más neopterin vizsgálati eljárásokat vagy megváltoztathatja az alkalmazott főemlősök számát vagy fajtáját. A példákban végzett ilyen módosításokat és változtatásokat a igényelt oltalmi körbe és találmányi gondolatba tartozónak tekintjük.
1. példa
Béta-interferon-la szerkezet/aktivitás-vizsgálatai alanin/szerin-szubsztitúciós mutánsok alkalmazásával: receptorkötő helyek és funkcionális domének analízise
A. Áttekintés
Alapos mutációs analízist végeztünk humán béta-interferon-lan (béta-IFN-la) abból a célból, hogy feltérképezzük az aktivitáshoz és receptorkötéshez szükséges csoportokat. Rendelkezésre állt a humán béta-interferon-la 3-dimenziós kristályszerkezete [Karpusas, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 11813-11818 (1997)], amely lehetővé tett béta-interferon-receptorkölcsönhatáshoz rendelkezésre álló, oldószer-hatásnak kitett csoportok azonosítását alanin- (vagy szerin-) szubsztitúciókhoz, és az intramolekuláris kötésekben szerepet játszó aminosavak megtartását. Tizenöt alanin-mutációból álló panelt terveztünk, amelyben 2-8 közötti aminosavat cseréltünk a béta-interferon-la-ban lévő egyes hélixek (A, B, C, D, E) és hurkok (ABI, AB2, AB3, CDI,
72.278/BE
CD2, DEI, DE2) jól elhatárolható régióiban. Hat hisztidinből· álló, amino-terminális hisztidin-toldalékot alkalmaztunk emlős sejtek által expresszált mutánsok affinitástisztítására, valamint enterokináz-hasítóhelyet az amino-terminális meghosszabbítás eltávolítására. Az eredményül kapott interferonokat „his-toldalékkal rendelkező béta-interferon(IFN)-ként vagy „His-béta-interferőn-ként vagy „His6-béta-interférőn-ként vagy hasonló módon jelöljük.
Előállítottunk különböző mutáns, his-toldalékkal rendelkező béta-lFN expressziós plazmidokat, mutaganezis-templátként vad típusú béta-IFN-génkonstrukció alkalmazásával. A mutagenezisstratégiában először bevittünk egyedi restrikciós enzimes hasítóhelyeket elszórtan, a vad típusú, his-toldalékkal rendelkező béta-IFN-génbe, azután kicseréltük a kiválasztott restrikciós helyek által elhatárolt DNS-szekvenciákat olyan szintetikus oligonukleotid-duplexekkel, amelyek az alanin- (vagy szerin-) szubsztitúciós mutánsokat kódolták. Végül, a mutáns IFN-géneket olyan plazmádba szubklónoztuk, amely emlős sejtexpressziót képes vezérelni, humán 293-vese-sejtvonalban.
Ezen mutációk funkcionális következményeit antivirális és antiproliferatív vizsgálati eljárásokban határoztuk meg. Kifejlesztettünk egy nem-radioaktív IFN-kötési vizsgálati eljárást ezen mutánsok analizálására arra vonatkozóan, hogy milyen mértékben képesek Daudi-Burkitt-féle limfómasejteken lévő, bétainterferon sejtfelszíni receptorhoz (IFNARl/2-komplex) kötődni. Továbbá kifejlesztettünk his-béta-IFN-mutánsok és IFNAR2 közötti kölcsönhatási felszínek feltérképezésére szolgáló vizsgálati el
72.278/BE járást, amelyben IFNAR2/Ig fúziós fehérjét alkalmaztunk, amely IFN-receptorfehérjét, IFNAR2 extracelluláris dóménjét tartalmazta humán IgGl-ből származó kapocsrégióhoz, CH2- és CH3-doménekhez fuzionálva.
1. Béta-intérférőn-gén előállítása, amely templátként szolgál mutagenezishez
Béta-IFN alanin- (vagy szerin-) szubsztituált mutánsok előállítását célzó stratégiánkban először előállítottunk olyan módosított béta-IFN-gént, amely vad típusú fehérjét kódolt, de egyedi restrikciós enzimes hasítóhelyeket hordozott, elszórtan elhelyezve a génben. Az egyedi restrikciós helyeket használtuk fel vad típusú szekvenciák olyan szintetikus oligonukleotid-duplexek cseréjére, amelyek a mutáns kódonokat kódolják. Mutáns gének előállítására alkalmas, humán béta-IFN-la-expressziós kazetta létrehozása céljából, a béta-IFN-cDNS-t (GenBank nyilvántartási száma #E00029) PCR-el amplifikáltuk. A béta-IFN-gént először pMJB107-plazmidba klónoztuk [ pACYC184 származéka, lásd Rose et al. , Nucleic Acids Res. 16, 355 (1988)] , amelyre azért volt szükség, hogy elvégezzük a gén helyspecifikus mutagenezisét egy olyan plazmidban, amelyben nem voltak specifikus restrikciós hasítóhelyek, amelyeket mutagenezissel lehetne létrehozni.
A humán béta-IFN-gén kódoló szekvenciájának szubklónozására alkalmazott PCR-primerek azt is lehetővé tették, hogy bevigyünk enterokináz-hasítóhelyet a béta—IFN-géntől szintézisiránnyal szemben és azzal egy leolvasási fázisban (5' -végi PCR-primer: 5' -TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAACTT
GCTTGGATTCCTACAAAGAAGC-3' , 3. számú szekvencia (SEQ ID N3: 3) : „BET-021;
72.278/BE és 3' -végi PCR-primer: 5' -GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCTGTAAGTC-3' , 4. számú szekvencia (SEQ ID NO: 4: „BET-022) és szegélyező restrikciós enzimes hasítóhelyeket (BspEI és Xhol), amelyek pMJB107-plazmid helyeibe való klónozáshoz hasznosak. Az eredményül kapott DNS-t PCR-fragmentum-A-nak jelöltük.
Hatékony szignálszekvenciaként a végső konstrukcióba beépítettünk humán, vaszkuláris, 1. számú sejtadhéziós molekulából (VCAM-1) származó szignálszekvenciát, és bevittünk hat hisztidinből álló toldalékot pDSW247-ből előállított, második DNSfragmentumból (B-fragmentum). A pDSW247-plazmid a pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) származéka, amelyből az EBNA-l-gént deletáltuk, és amely a VCAM-l-szignálszekvenciát (VCAMss) hordozza hat hisztidinből álló toldalékhoz szintézisiránnyal szemben és azzal egy fázisban fuzionálva. A VCAMss-l/hisztidintoldalék-kazettarészlet előállítására alkalmazott PCR-primerek: 5' -végi PCR-primer (KID-369) : 5' -AGCTTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT-3' , 5. számú szekvencia, (SEQ ID NO: 5); és 3'-végi PCR-primer (KID-421) : 5' -CCGGAGCTATGATGATGATGATGATGGCCCCCGGA-3' , 6. számú szekvencia, (SEQ ID NO: 6), amelyekbe szegélyező restrikciós enzimes hasítóhelyek (NotI és BspEI) vannak beépítve, amely lehetővé teszi a fragmentum-B-DNS kivágását.
A VCAM-l-szignálszekvenciát, his-toldalékot és béta-interferon-gént hordozó plazmidvektor előállítása céljából, hármas ligálást végeztük, gélen tisztított DNS-fragmentumok alkalmazásával, amelyek pMJB107-plazmidvektorból (Notl/XhoI-enzimekkel
72.278/BE hasítva), PCR-fragmentum-A-ból (BspEI/XhoI-enzimekkel hasítva) és fragmentum-B-ből (Notl/BspEI-enzimekkel hasítva) származtak. A ligáit plazmáddal JA221 vagy XLl-Blue E. coli-sejteket transzformáltunk, az ampicillin-rezisztens kolóniákat kivettük és inszertekre teszteltük azokat restrikciós térképezési analízissel. Maxiprep-DNS-t készítettünk, és az inszertek szekvenciáját DNS-szekvenálással igazoltuk. Az eredményül kapott konstrukciót pCMG260-nak neveztük.
2. Humán béta-interferon alanin-szubsztitúciós mutánsainak előállítása pCMG26-ban
A pCMG260-plazmidot alkalmaztuk templátként több ciklus mutagenezisben (U.S.E. Site Directed Mutagenesis Kit, Boehringer Mannheim), amellyel egyedi restrikciós hasítóhelyeket vittünk be a béta-IFN-fehérjét kódoló szekvencia helyzeteibe, de amely nem változtatta meg az eredményül kapott fehérje szekvenciáját. A mutagenizált plazmidokkal JA221 vagy XLl-Blue törzshöz tartozó E. coli-sejteket transzformáltunk, és rekombináns kolóniákat ampicillin-rezisztenciára szelektáltunk. Az ampicillin-rezisztens kolóniákat tovább teszteltük a kívánt, egyedi restrikciós enzimes hasítóhelyek jelenlétére, DNS-restrikciós térképezési analízissel. Az eredményül kapott pCMG275.8-jelű, béta-IFN-plazmid a teljes készlet restrikciós enzimes hasítóhelyet tartalmazta, és igazoltuk a gén DNS-szekvenciáját. A módosított, his-toldalékkal ellátott, béta-interferon-gén teljes DNS-szekvenciáját (1. számú szekvencia), a kódolt fehérje szekvenciájával (2. számú szekvencia) együtt megadjuk a 10. ábrán.
A teljes készlet alanin-szubsztitúciós mutánst bemutatjuk az
72.278/BE
1. táblázatban (lentebb). A mutánsok nevei azokat a strukturális régiókat (hélixek és hurkok) határozzák meg, amelyekbe a mutációkat bevittük. A teljes alanin- (szerin-) szubsztitúciós panel a humán béta-IFN 165 aminosavja közül 65 mutációját eredményezte.
A mutációk panelját pCMG275.8-ból hoztuk létre úgy, hogy kicseréltük a kiválasztott restrikciós helyek által elhatárolt DNS-szegmenseket olyan szintetikus oligonukleotid-duplexekkel, amelyek a 2. táblázatban (lásd lentebb) bemutatott genetikai kódoló információkat hordozták. Különböző alanin-szubsztitúciót tartalmazó, mutáns plazmidok előállítása céljából, gélen tisztított pCMG275.8-vektort (megfelelő restrikciós enzimekkel hasítva, melyeket lentebb feltüntetünk az egyes béta-IFN strukturális régiók esetén) és oligonukleotid-duplexeket (a kódoló szál szekvenciáját bemutatjuk a 2. táblázatban) egymáshoz ligáltunk. A ligációs reakciókeverékkel JA221 törzshöz tartozó E. coli-sejteket transzformáltunk, és rekombináns kolóniákat ampicillinrezisztenciára szelektáltunk. Az ampicillin-rezisztens kolóniákat teszteltük a mutáns inszertek jelenlétére, megfelelő restrikciós enzimes hasítóhelyekre való szűréssel. Két mutáns esetén (A2 és CD2) a klónozó stratégiában két, szintetikus oligonukleotid-duplexet alkalmaztunk (a 2. táblázatban bemutatjuk), amelyek komplementer túlnyúló végeket hordoztak egymáshoz illetve a béta-IFN-vektor-vázhoz való ligálásuk lehetővé tétele céljából, hármas ligálásban. Az alábbi listában feltüntetjük azokat a hasítóhelyeket, amelyeket a 2. táblázatban lévő, mutáns oligonukleotidok klónozására alkalmaztunk. A klónozás vázlatán (Balszekció) bemutatjuk a béta-interferon-génen lévő, említett egyedi hasítóhelyek pozícióit.
72.278/BE
1. táblázat κυβ-ΙΓΝ alanin-szubsztitúciós mutánsainak helyzetei
I I I I I β-IFNMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKE
A1 -A-AA—A--A-----------------------------------------A2 --------------AA-AA—AA-----------------------------AB1 ---------------------------AAA-AA-------------------AB2 -----------------------------------AA-A—A----------AB 3 --------------------------------------------AAAAA-AAA |-------A hélix------------1 |-----------AB hurok-----------β-IFN DAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKE
B1 ----------A—AS----------------------------------------B2 -----------------AAA-----------------------------------Cl ---------------------------AS—AA—S-------------------C2 --------------------------------------A A—AA--------CDI -------------------------------------------------AA—AAA |---B hélix -------1 |--------------------------------1 |-CD hurok—
110 120 130 140 150 160
I I I I I I β-IFN DFTRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYRINRLTGYLRN
CD2 AA-A—A—A----------------------------------------------D ------------------A-AA—A-------------------------------DE1 --------------------------AA----------------------------DE 2 -----------------------------AA-------------------------E --------------------------------------A---A—A—A-------CD hurok-| |----D hélix-----1 |----------E hélix-----------1
Az β-IFN-val jelölt sorban bemutatjuk a vad típusú β-IFN szekvenciáját. A β-IFN-ban lévő aminosavak alanin- vagy szerin-szubsztitúciós mutációit bemutatjuk az egyes mutánsokra, az oda vonatkozó régiók alatt húzott vonalak megfelelnek a vad típusú szekvenciának. A hélix- és hurok-struktúrákat a mutánsok alatt, folyamatos vonallal jelöljük. A DE-hurok átíveli a D- és E-hélixek közötti rést. Előállítottunk két további alanin-szubsztitúciós
72.278/BE mutánst (H93A, H97A és H121A), és antivirális vizsgálati eljárásokban analizáltuk ezen hisztidinek mutációjának hatásait, amelyek cinket képesek komplexálni dimer „kéreg-struktúrában. Mindkét mutáns teljesen megtartotta a vad típusú aktivitást antivirális vizsgálati eljárásokban mérve, ami alapján feltételezzük, hogy a cink-mediált dimerképződés nem fontos a β-IFNaktivitáshoz.
2. táblázat
A1 SEQ ID NO: 7 BET-053 CCGGAGACGATGATGACAAGATGGCTTACGCCGCTCTTGGAGCCCTAC AAGCTTCTAGCAATTTTCAGTGTCAGAAGCTCCTGTGGC
A2 SEQ ID NO : 8 BET-039 GATCTAGCAATGCTGCCTGTGCTGCCCTCCTGGCTGCCTTGAATGGGA GGCTTGAATACT
SEQ ID NO : 9 BET-O41 GCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCA GCTGCA
AB1 SEQ ID NO: 10 BET-O80 AATTGAATGGGAGGGCTGCAGCTTGCGCTGCAGACAGGATGAACTTTGA CATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCA
AB 2 SEQ ID NO: 11 BET-082 AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGGCTGCATTTGC TATCCCTGCAGAGATTAAGCAGCTGCA
AB 3 SEQ ID NO : 12 BET-084 AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGATGAAC TTTGACA
SEQ ID NO: 13 BET-086 TCCCTGAGGAGATTGCTGCAGCTGCAGCTTTCGCTGCAGCTGA
B1 SEQ ID NO: 14 BET-110 CGCCGCGTTGACCATCTATGAGATGCTCGCTAACATCGCTAGCATTTTC AGACAAGATTCATCTAGCACTGGCTGGAA
B2 SEQ ID NO: 15 BET-112 CGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTC GCTGCAGCTTCATCTAGCACTGGCTGGAA
72.278/BE
Cl SEQ ID NO : 16 BET-114 GGAATGCTTCAATTGTTGCTGCACTCCTGAGCAATGTCTATCATCAGAT AAACCATCTGAAGACAGTTCTAG
C2 SEQ ID NO: 17 BET-092 GGAATGAGACCATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCGCTCATCAGA TAGCACATCTGGCTGCAGTTCTAG
CDI SEQ ID NO: 18 BET-094 CTAGCTGCAAAACTGGCTGCAGCTGATTTCACCAGGGGAAAACT
CD2 SEQ ID NO: 19 BET-096 CTAGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGCAGCTACCGCTGGAAAAGCAATGA GCGCGCTGCACCTGAAAAGA
SEQ ID NO: 20 BET-106 TATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACTC ACACTGT
Dl SEQ ID NO: 21 BET-108 CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGGCAATTGCTGCATA CCTGGCAGCCAAGGAGTACTCACACTGT
DE1 SEQ ID NO: 22 BET-116 CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTA CCTGAAGGCCGCTGCATACTCACACTGTGCCTGGACGAT
DE 2 SEQ ID NO: 23 BET-118 CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTA CCTGAAGGCAAAGGAGTACGCTGCATGTGCCTGGACGAT
El SEQ ID NO: 24 BET-104 CGTCAGAGCTGAAATCCTAGCAAACTTTGCATTCATTGCAAGA CTTACAG
B. EBNA-293 expressziós plazmidok előállítása
A vad típusú és mutáns IFN-béta-géneket, VCAM-l-szignálszekvenciához, his-toldalékhoz és enterokináz-hasítóhelyhez fuzionálva, gélen 761 bázispár méretű, Notl/BamHI restrikciós fragmentumként tisztítottuk. A tisztított géneket Notl/BamHI-enzimekkel hasított, pDSW247-plazmidvektorba szubklónoztuk, melyet vázlatosan bemutatunk a 11. ábrán. A pDSW247-plazmidvektor fehérjék humán, EBNA293-jelű vesesejtekben való, tranziens expresszálására szolgáló expressziós vektor (Invitrogen,
72.278/BE .:...:...:.. .·
Carlsbad, CA) . Citomegalovírusból származó korai gén promóterét és EBV szabályzóelemeket tartalmaz, amely nagymértékű expreszszióhoz szükséges ebben a rendszerben, valamint szelektálható markereket E. colihoz (ampicillinrezisztenciát) és EBNA293-sejtekhez (higromicinrezisztenciát) , a 11. ábrán vázlatosan bemutatott, klónozó stratégia szerint. JA221- vagy XLl-Blue E. colisejtek transzformálására alkalmazott, ligáit plazmidokat és ampicillinrezisztens kolóniákat kivettük, és restrikciós térképezési analízissel teszteltük inszertekre. Előállítottunk Maxiprep-DNS-t, és az inszertek szekvenciáját DNS-szekvenálással igazoltuk. A kívánt, mutagenizált szekvenciákat tartalmazó, pozitív kiónokat alkalmaztuk humán EBNA293-vesesejtek transzfektálására, a lentebb leírtak szerint.
C. Béta-IFN-la alanin-szubsztitúciós mutánsok expresszálása és mennyiségi meghatározása
Humán EBNA293-sejteket [ Invitrogen, Carlsbad, CA; Chittenden, T., J. Virol. 63, 3016-3025 (1989)] szubkonf luens tenyészetként tartottunk fent 10% magzati borjúszérummal, 2 mM glutaminnal és 250 pm/ml geneticinnel (Life Technologies, Gaithersburg, MD) kiegészített Dulbecco-féle módosított Eagle-féle tápközegben. A pDSW247-jelű expressziós plazmidokat tranziensen transzfektáltuk EBNA293-sejtekbe, lipofektamin-eljárás (Gibco/BRL, Life Technologies) alkalmazásával. A kondicionált tápközeget elkülönítettük transzfekció után 3-4 nappal, a sejttörmeléket lecentrifugáltuk és meghatároztuk a his-béta-IFN-koncentrációkat ELISA alkalmazásával .
72.278/BE r
Az ELISA vizsgálati eljárást úgy végeztük, hogy poliklonális, nyúlban termeltetett antitestekkel (protein-A-n tisztított IgG, tisztított humán béta-IFN-la ellen termeltetett antitestek) burkoltunk 96 mérőhelyet tartalmazó ELISA-tálcákat, és ugyanezen poliklonális, nyúlban termeltetett IgG biotinilált formáját alkalmaztuk szekunder reagensként, amely lehetővé tette az interferon detektálását sztreptavidinnel-kapcsolt, tormából származó peroxidázzal (HRP: Jackson ImmunoResaearch, W. Grove, PA) . Bétainterf eron-la-ból készült hígítási sorozatokat alkalmaztunk standard koncentráció-görbék előállítására. Az EBNA-transzfektánsokból származó, his-béta-IFN-t tartalmazó, kondicionált tápközegeket meghígítottuk olyan minták előállítása céljából, amelyekben a koncentráció 10 ng/ml és 0,3 ng/ml közötti tartományban van az ELISA vizsgálati eljárásban. Az ELISA-val meghatározott, tápközegekben lévő béta-IFN-koncentrációkat western-blot analízissel igazoltuk. Redukált tenyészet-felülúszókat és bétaIFN-la-standardeket SDS-PAGE-nak vetettünk alá, 10-20%-os gradiens gélben (Novex, San Diego, CA) , és PDVF-membránokra blottoltuk. Immunreaktív csíkokat nyúlban termeltetett, poliklonális anti-béta-IFN-la-antiszérummal (#447, Biogén, Inc., egy második antiszérumot béta-IFN-la ellen termeltettünk) detektáltunk, ezt követően tormából származó peroxidázzal (HRP) konjugált, szamárban termeltetett anti-nyúl-IgG-vel (Jackson Immuno Research) kezeltük.
D. Béta-interferon-mutánsok receptorkötő képességének meghatározása
A C-részben leírt béta-interferon-mutánsok receptorkötő tu72.278/BE • ♦ * * «f · · ·♦·· ···» · lajdonságait két különböző kötési vizsgálati eljárásban határoztuk meg. Az egyik vizsgálati eljárásban a béta-interferon-mutánsok kötődését mértük egy fúziós fehérjéhez, IFNAR2/Ig-hez, amely a humán IFNAR2-receptorlánc extracelluláris doménjét tartalmazta humán IgG konstans régiójából származó részhez fuzionálva. Az IFNAR2-Fc-t kínai hörcsög petefészkéből származó sejtekben (CHO) expresszáltuk és protein-A-Sepharose affinitáskromatográfiával tisztítottuk a gyártó (Pierce Chern. Co., Rockford, IL, kát.# 20334) utasításai szerint. A béta-interferon-mutánsok IFNAR2-Fchez való kötődését ELISA-formájú vizsgálati eljárásban mértük. 96, lapos aljú mérőhelyet tartalmazó ELISA-tálcákat burkoltunk egy éjszakán át 4°C-on egérben termeltetett, anti-humán IgGl monoklonális antitesttel (CDG5-AA9, Biogen, Inc.) 10 μg/ml koncentrációban alkalmazva burkoló pufferben, amely 50 mM nátriumhidrogén-karbonátot, 0,2 mM magnézium-kloridot és 0,2 mM kalcium-kloridot tartalmazott (pH 9,6). A tálcákat kétszer mostuk 0,05% Tween-20-at tartalmazó PBS-el, és 0,5% zsírmentes tejport tartalmazó PBS-el blokkoltuk 1 óra hosszáig, szobahőmérsékleten. Két további mosás után az egyes mérőhelyekbe adtunk 50 μΐ, 1 μ g/ml IFAR2-Fc-t, 0,5% tejport és 0,05% Tween-20-at tartalmazó PBS-ben, és 1 óra hosszáig szobahőmérsékleten inkubáltuk, és azután a tálcákat még kétszer mostuk. A béta-interferon-mutánsok IFNAR2-Fc-hez való kötődését úgy mértük, hogy hozzáadtunk 50 μ 1/tenyésztőhely mutáns béta-interferont kondicionált tápközegben, hígítási sort készítve 10% magzati borjúszérummal kiegészített Dulbecco-féle módosított Eagle-féle tápközegben (DMEM), és 2 óra hosszáig inkubáltuk 4°C-on. A béta-interferon-mutáns hígi72.278/BE
X..:.. :
tásai tipikusan körülbelül 1 μΜ-tól 10 pM-ig terjedő tartományban voltak. Mosás után a tálcákhoz kötődött béta-interferont 50 μ 1/mérőhely koktél hozzáadásával detektáltuk, amely koktél nyúlban termeltetett, poliklonális anti-interferon antitestet (#447) és tormából származó peroxidázzal (HRP) jelölt, szamárban termeltetett anti-nyúl-antitesttet (Jackson Immuno Research) tartalmazott, és 15 percig inkubáltuk 4°C-on. Két mosás után hozzáadtunk HRP-szubsztrátot, és a tálcát 4°C-on inkubáltuk, majd ELISA-tálcaleolvasóban leolvastuk a 450 nm-en mért abszorbanciát. A adatokat abszorbanciaként ábrázoltuk a mutáns bétainterferon koncentrációjának függvényében, és a mutáns béta-interferon IFNAR2-Fc-hez való kötődésének affinitását úgy határoztuk meg, hogy az adatokat egyszerű hiperbolikus kötési egyenlethez illesztettük. Az analízis eredményeit bemutatjuk az 1. ábrán, amelyen az egyes mutánsokhoz tartozó kötési affinitást legalább három független kísérletből határoztuk meg, és azt a His6al kapcsolt, vad típusú béta-interferon-la-ra mért érték százalékaként fejeztük ki.
Egy második receptorkötési vizsgálati eljárást alkalmaztunk a béta-interferon-mutánsok mindkét receptorláncot (IFNAR1 és IFNAR2, amelyek együtt alkotják a béta-interferon-receptort) expresszáló Daudi-sejtekhez való affinitásának meghatározására. Ebben a FACS-alapú vizsgálati eljárásban IFNAR1 ellen termeltetett, EA12-jelű, blokkoló monoklonális antitestet (Biogen, Inc.) alkalmaztunk a nem-foglalt (szabad) receptor és béta-interferonhoz kötődött receptor megkülönböztetésére. Daudi-sejteket (20 μΐ, 2,5 x 107 sejt/ml) 96 mérőhelyet tartalmazó, V-aljú ELISA72.278/BE ♦J*··*»···** ·
-tálcákba helyeztünk, és 1 óráig inkubáltuk 4°C-on, különböző koncentrációjú béta-interferon-mutánsokkal (20 μΐ FACS-pufferben; 5% FBS, 0,1% NaN3 PBS-ben). Béta-interferon-mutánsok kívánt hígítás! sorát 0,5 μΜ-tól lefelé 0,5 pM-ig készítettük el. Az egyes mérőhelyekre 100 ng biotinilált, EA12-jelű, rágcsálóból származó anti-IFNARl monoklonális antitestet (10 μΐ) , és a tálcákat további 2 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten, majd kétszer mostuk FACS-pufferrel (4°C). Azután a sejteket 30 percig inkubáltuk 4°C-on 50 μΐ/mérőhely, 1:200-hígítású R-Phycoerytrinnel konjugált sztreptavidinnel (Jackson ImmunoResearch), kétszer mostuk FACSpufferrel, újra felszuszpendáltuk 300 μΐ, 0,5% paraformaldehidet tartalmazó FACS-pufferben, és átvittük 12x75 mm-es polisztirolcsövekbe (Falcon 2052). A mintákat azután áramlási citometriával, FACScan berendezésen (Becton Dickinson) analizáltuk. Az adatokat átlagos fluoreszcencia-intenzitásként (MFCI) ábrázoltuk a béta-interferon-mutáns koncentrációjának függvényében; a kötési affinitásokat az antitest-festődés 50%-os gátlását előidéző, mutáns béta-interferon-koncentrációjaként határoztuk meg. Minden egyes mutánst többször teszteltünk. A 2. ábrán bemutatjuk az egyes béta-interferon-mutánsokra ezzel a módszerrel meghatározott kötési affinitásokat, melyeket a His6-al kapcsolt, vad típusú béta-interferon-la-ra mért érték százalékaként fejeztünk ki.
E. Béta-interferon-mutánsok funkcionális aktivitásának meghatározása
A béta-interferon-mutánsokat funkcionális aktivitásra is teszteltük, in vitro vizsgálati eljárások alkalmazásával, amelyekben antivirális aktivitást és a béta-interferon sejtpro
72.278/BE liferációt gátló képességét vizsgáltuk. Az egyes mutánsok esetén minimum három antivirális vizsgálati eljárást végeztünk, egyenként három párhuzamossal. Referenciaként His6-al kapcsolt, vad típusú béta-interferon-la-t alkalmaztunk minden egyes kísérletben. Az antivirális vizsgálati eljárásokat úgy végeztük, hogy A549-jelű, humán tüdőkarcinóma-sejteket (ATCC CCL 185) kezeltünk egy éjszakán át, felező hígítási sorban, mutáns béta-interferonnal olyan koncentrációtartományban, amely a teljes antivirális védelemtől terjedt a vírusos sejtpusztulás ellen védelmet nem biztosító koncentrációig. A következő napon a sejteket két napig enkefalomiokardítisz (ECMV) vírussal kezeltük olyan hígításban, amely teljes sejtpusztulást eredményezett interferon hiányában. Azután a tálcákat MTT (2,3-bisz[ 2-metoxi-4-nitro-5-szulfo-fenil] -2H-tetrazólium-5-karboxanilid, M5655, Sigma, St. Louis, MO) metabolit-festékkel előhívtuk. MTT-törzsoldatot preparáltunk 5 mg/ml PBS-ben, sterilre szűrtük, és ezt az oldatot 50 μΐ sejttenyészetekbe hígítottuk (100 μΐ/tenyésztőhely) . Szobahőmérsékleten 30-60 percig inkubáltuk, azután az MTT/tápközegoldatot kidobtuk, a sejteket 100 μΐ PBS-el mostuk, és végül a metabolizált festéket 100 μΐ, 90%-os izopropanolban lévő, 1,2 N hidrogén-kloriddal szolubilizáltuk. Életképes sejtek (a festék jelenlétével azonosítottuk) számát meghatároztuk 450 nm-es abszorbancia felhasználásával. Az adatokat úgy analizáltuk, hogy az abszorbancia-értékeket a béta-interferon-mutáns koncentrációjának függvényében ábrázoltuk, és az egyes mutánsok aktivitását az a koncentráció határozta meg, amelynél a sejtek 50%-a elpusztul. A 3. ábrán bemutatjuk az egyes mutánsok aktivitását, a his72 .278/BE ·* · * toldalékkal ellátott, vad típusú béta-interferon-la-ra, az egyes kísérletekben mért aktivitás százalékában kifejezve.
A béta-interferon-la-mutánsok funkcióját értékeltük antiproliferációs vizsgálati eljárásban is. Humán, Daudi-Burkitt-féle limfómasejteket (ATCC#CCL213) szélesztettünk 2 x 105 sejt/ml sűrűségben, 10% definiált magzati borjúszérummal (Hyclone, Logan, UH) és 2 mM L-glutaminnal kiegészített RPMI-1620-tápközegben. Az egyes mérőhelyek adott koncentrációban béta-interferon-mutánst is tartalmaztak, mérőhelyenként összesen 100 μΐ végtérfogatú tápközegben; az alkalmazott béta-interferon koncentrációtartományt úgy választottuk, hogy az a Daudi-sejtek proliferációjának maximális gátlásától terjedt a gátlást nem biztosító koncentrációig (azaz a maximális proliferációig). Kísérleti pontokként két párhuzamost alkalmaztunk a tesztelt béta-interferon-mutánsok egyes koncentrációi esetén, és valamennyi kísérlet tartalmazott kezeletlen sejteket, két párhuzamosból álló készlettel. A sejteket két napig inkubáltuk 37°C-on, 5% szén-dioxidot tartalmazó inkubátorban, azután az egyes tenyésztőhelyekhez hozzáadtunk 50 μΐ tápközegben 1 μCi/tenyésztőhely tritiált timidint (metil-3Htimidin, Amersham TRK758), és további 4 óra hosszáig inkubáltuk. A sejteket elkülönítettük LKB „plate harvester alkalmazásával, és a beépült tritiált timidin mennyiségét megmértük LKB bétatálcaleolvasó alkalmazásával. A párhuzamos kísérleti eredményeket átlagoltuk, és meghatároztuk a standard deviációkat. Az adatokat átlagos beütésszám/percként ábrázoltuk a béta-interferonmutáns koncentrációjának függvényében, és az egyes mutánsok aktivitását az a koncentráció határozta meg, amely szükséges a 72.278/BE
J. . ' megfigyelt maximális növekedési gátlás 50%-ához. Az egyes mutánsokra több vizsgálati eljárást végeztünk. A 4. ábrán bemutatjuk az eredményeket a his-toldalékkal ellátott, vad típusú bétainterferon-la-ra, az egyes kísérletekben mért aktivitás százalékában kifejezve.
F. Béta-interferon mutánsok tulajdonságainak meghatározása
Azt találtuk, hogy a hisztidin-toldalékkal ellátott, vad típusú béta-interferon-la aktivitása antivirális és antiproliferatív vizsgálati eljárásokban körülbelül 3-szor alacsonyabb volt, mint a toldalékot nem tartalmazó, vad típusú béta-interferon-la megfelelő aktivitásai. Mivel valamennyi Al-E béta-interf eron-mutáns azonos his-toldalékszekvenciát tartalmazott Nterminálisánál, a mutációknak a molekula tulajdonságaira kifejtett hatásait úgy határoztuk meg, hogy ezen mutánsok antivirális, antiproliferációs és kötési vizsgálati eljárásokkal meghatározott aktivitásait összehasonlítottuk a his-toldalékkal ellátott, vad típusú béta-interferon-la-ra megfigyelt aktivitással. így eljárva feltételezzük, hogy az Al-E-mutánsok aktivitásainak variációi, a his-toldalékkal ellátott, vad típusú bétainterferon-la-ra megfigyelt aktivitáshoz viszonyítva, kvalitatíve és kvantitatíve körülbelül ugyanolyan mértékűek, mint ugyanezen mutánsok hatásai lennének N-terminális his-toldalék nélkül. Az ekvivalencia feltételezése toldalékkal ellátott vagy fúziós konstrukciókra más szolubilis citokinek esetén is általánosan elfogadott tény alanin-szkennelő mutagenezist végző szakember számára, különösen akkor, ha a toldalékkal ellátott vagy fúziós konstrukció in vitro funkcionális aktivitása közel van a
72.278/BE vad típusú citokin aktivitásához, ahogyan a jelen esetben is. [Lásd például Pearce K. H. Jr. et al·., J. Bioi. Chem. 272, 20595-20602 (1997) és Jones J. T. et al., J. Bioi. Chem. 273, 11667-11674 (1998)] .
Az 1-4. ábrán bemutatott adatok alapján három hatástípust feltételezünk, amelyeket a célzott mutagenezis okozott. Ezeket a hatások előnyösek lehetnek interferon-drog kifejlesztésében, bizonyos körülmények között. Ez a három hatástípus az alábbi: (a) a mutánsok magasabb antivirális aktivitással rendelkeznek, mint vad típusú béta-interferon-la (például C1-mutáns); (b) a mutánsok aktívak antivirális és antiproliferatív vizsgálati eljárásokban egyaránt, de amelyek esetén az antiproliferatív aktivitás aránytalanul alacsonyabb az antivirális aktivitáshoz képest, vad típusú béta-interferon-la-hoz viszonyítva (például Cl-, D- és DEl-mutánsok); és (c) funkcionális antagonisták (például Al, B2, CD2 és DE1), amelyek olyan antivirális és antiproliferatív aktivitásokat mutatnak, amelyek aránytalanul alacsonyabbak a receptorkötéshez képest, vad típusú béta-interferon-la-hoz viszonyítva. Látható, hogy bizonyos mutánsok több osztályba is tartozhatnak. Ezeket az osztályokat lentebb áttekintjük. Míg ezeket a mutáns-osztályokat a felsorolt példák vonatkozásában jellemeztük, nyilvánvaló, hogy ezekben a régiókban létrehozott más mutációk is eredményezhetnek hasonló, sőt fokozottabb, aktivitásra kifejtett hatásokat.
a) A Cl-mutáns antivirális aktivitása 6-szor nagyobb, mint his-toldalékkal ellátott, vad típusú béta-interferon-la aktivitása. Előre jelezhető, hogy ez és más, ilyen típusú mutáns hasz
72.278/BE nosan alkalmazható adott mértékű antivirális aktivitás eléréséhez szükséges béta-interferon mennyiségének csökkentésére. A beadott fehérje mennyiségének csökkentésétől azt várjuk, hogy csökken a fehérje immunogenitása, és csökkenhetnek a nemmechanizmus-alapú toxicitásokból származó mellékhatások is. Előre jelezhető, hogy ehhez az osztályhoz tartozó mutánsok olyan szituációkban alkalmazhatók előnyösen, ahol a béta—interferon beadásának jótékony terápiás hatásait antivirális hatása eredményezi, és ahol antiproliferativ hatások hozzájárulnak toxicitáshoz vagy nem-kívánt mellékhatásokhoz.
b) Az alanin-szubsztituált mutánsok antivirális és antiproliferativ vizsgálati eljárásban mért relatív aktivitásait (vad típus %-a) összahasonlítottuk az 5. ábrán. A legtöbb mutánsban (azokban, amelyek a ferde vonalon fekszenek) azonos mértékben változtak az aktivitások (azaz az antivirális és antiproliferativ aktivitások ugyanolyan faktorral térnek el a vad típusú, his-toldalékkal ellátott béta-interferon-la aktivitásától) . Azonban számos mutáns az egyik vizsgálati eljárásban nagyobb mértékben változik, mint a másikban, vad típusú, histoldalékkal ellátott béta-interferon-la-hoz viszonyítva, amit az mutat, hogy lekerülnek a ferde vonalról. Ezt a három mutánst bemutatjuk lentebb, a 3. táblázatban. A Cl-mutáns antivirális aktivitása kb. 6-szor magasabb, mint a vad típusú, his-toldalékkal ellátott béta—interferon—la aktivitása, de antiproliferációs vizsgálati eljárásban mutatott aktivitása hasonló a vad típuséhoz. A Cl—mutáns antivirális aktivitása tehát 5,2—es faktorral nagyobb, mint antiproliferációs aktivitása, vad típusú, his—
72.278/BE toldalékkal ellátott béta-interferon-la-hoz viszonyítva. Ehhez hasonlóan, a D-mutáns antivirális vizsgálati eljárásban a vad típus aktivitásának 65%-át mutatja, de antiproliferációs vizsgálati eljárásban a vad típus aktivitásának csak 20%-át, tehát antivirális aktivitása 3,4-szer fokozottabb antiproliferatív aktivitásánál, vad típushoz viszonyítva. A DEl-mutáns antivirális vizsgálati eljárásban a vad típus aktivitásának 26%-át mutatja, de antiproliferációs vizsgálati eljárásban a vad típus aktivitásának csak 8,5%-át, tehát antivirális aktivitása 3,0-szor fokozottabb antiproliferatív aktivitásánál, vad típushoz viszonyítva. Ha ezeket a mutáns fehérjéket kívánt mértékű antivirális aktivitás eléréséhez elegendő koncentrációban adjuk be, lényegesen alacsonyabb antiproliferatív aktivitást fognak mutatni, mint a vad típusú fehérje. Előre jelezhető, hogy ehhez az osztályhoz tartozó mutánsok olyan szituációkban alkalmazhatók előnyösen, ahol a béta-interferon beadásának jótékony terápiás hatásait antivirális hatása eredményezi, és ahol antiproliferatív hatások hozzájárulnak toxicitáshoz vagy nem-kívánt mellékhatásokhoz.
3. táblázat
Mutáns Antivirális aktivitás (AV) (vad típus %-a) Antiproliferatív aktivitás (AP) (vad típus %-a) AV/AP
Cl 571 109 5,2
D 65 19 3,4
DE1 26 8,5 3, 0
c) A receptorkötés mértékéhez viszonyítva alacsony antivirális és antiproliferatív aktivitásokkal rendelkező mután
72.278/BE sok, his-toldalékkal ellátott, vad típusú béta-interferon-la-hoz viszonyítva (lásd a 4. táblázatot, lentebb). Az Al-mutáns 2,0szer nagyobb antivirális aktivitást és 1,8-szor magasabb antiproliferatív aktivitást mutat, mint amit megfigyeltünk histoldalékkal ellátott, vad típusú béta-interferon-la-ra, de Daudi-sejteken lévő, megfelelő receptorához 29-szer nagyobb mértékben kötődik, mint a vad típus. Tehát a mutáns kötődése bétaIFN-receptorhoz körülbelül 15-ször fokozottabb a fehérje antivirális és antiproliferatív aktivitásaihoz képest. Ehhez hasonlóan, B2-, CD2- és DEl-mutánsok kötődése is fokozottabb az antivirális aktivitáshoz képest 4,6-, 4,6- illetve 18-szor nagyobb mértékben, sorrendben, és az antiproliferatív aktivitáshoz képest 3,5-, 15- illetve 54-szer nagyobb mértékben, sorrendben. Előre látható, hogy ezek a fehérjék hasznosan alkalmazhatók endogén béta-IFN-aktivitás és valószínűleg más endogén, I. típusú interferon funkcionális antagonistáiként, mivel képesek kötődni és lefoglalni a receptort, továbbá vad típusú béta-IFN esetén látható funkcionális aktivitásnak csak kis részét generálják a célsejtekben.
4. táblázat
Mutáns AV aktivitás (% wt) AP aktivitás (% wt) Sejtkötő aktivitás (% wt) Kötés/ AV Kötés/ AP
A1 200 180 2900 15 16
B2 7, 1 9,2 33 4, 6 3,5
CD2 150 46 690 4, 6 15
DE1 26 8,5 460 18 54
72.278/BE
G. Muteinek és az interferon háromdimenziós struktúrájának kapcsolata
Míg rágcsálóból származó béta-interferon nem-glikozilált formájának [ T. Senda et al., J. Mól. Bioi. 253, 187-207 (1995)] és humán alfa-interferon-2b [ R. Radhakrishnan et al. , Structure 4, 1453-1463 (1996)] közölt kristályszerkezete modellt biztosított humán béta-interferon polipeptid-vázára, a közelmúltban kiderítettük béta-interferon-la glikozilált állapotában lévő szerkezetét [ M. Karpusas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9_4, 1181311818 (1997)] .
Mutációs analíziseink eredményeit összegezni lehet a bétainterferon-la háromdimenziós szerkezetének (itt nem mutatjuk be) vonatkozásában. Bizonyos mutációk az aktivitás csökkenését okozták (2-szerestől >5-szörös csökkenést). A mutációkat tartalmazó régiók megfeleltek az 1. és 2. táblázatban megadott szubsztitúcióknak. Antivirális és antiproliferációs aktivitáshoz fontos csoportokat lokalizáltunk a béta-IFN-la-molekula alsó felében (a- és b-panel) . A molekula felső felében, ahol az amino- és karboxi-terminális van, a mutációknak nem volt hatása a biológiai aktivitásra és a receptorkötésre.
Az A2-hélixben, AB-, AB2-hurokban és E-hélixben lévő mutációknak a legszignifikánsabbak az aktivitásban és a sejtfelszíni receptorkötésben egyaránt. Ez a régió (A2-hélix, AB-, AB2-hurok és E-hélix) megfelel az IFNAR2-kötőhelynek, mivel ezen mutánsok közül egyik sem köt IFNAR/Fc-t vizsgálati eljárásunkban.
Míg az IFNAR2-kötéshez fontos mutációk a sejtkötésre is hatással voltak, a sejtfelszín-kötési tulajdonságokat befolyásolni
72.278/BE lehet a molekula más régióiban lévő (Bl-hélix, C2-hélix) aminosavakkal is. Az alanin-szubsztitúciós mutánsok hatásait bemutató, háromdimenziós modellekben (itt nem mutatjuk be) látható, hogy a béta-IFN-la-molekula N-terminális, C-terminális és glikozilált Chélix-régiója nem esik a receptorkötő-helyre. Ezekben a régiókban a mutációk nem csökkentének biológiai aktivitást illetve nem csökkentik a sejtfelszíni receptorkötés mértékét.
2. példa
Konjugált béta-interferon-la előállítása és jellemzése
A. PEGilált interferon előállítása
Nem-kiszerelt, nagy mennyiségben (bulk, AVONEX® néven) árult béta-interferon-la-intermediert (250 pg/ml 100 mM nátriumfoszfátot és 200 mM NaCl-t tartalmazó, pH 7,2 pufferben) meghígítottunk azonos térfogatú 100 mM MES pH 5,0 pufferrel, és a pH-t 5,0-re állítottuk HCl-el. A mintát felvittük SP-Sepharose® FF-oszlopra (Pharmacia, Piscataway, NJ) , 6 mg béta-interferonla/ml gyanta mennyiségben. Az oszlopot 5 mM nátrium-foszfátot és 75 mM NaCl-t tartalmazó pufferrel (pH 5,5) mostuk, és a terméket 30 mM nátrium-foszfátot és 600 mM NaCl-t tartalmazó pufferrel (pH 6,0) eluáltuk. Az eluált frakciókat 280 nm-en mért abszorbanciára analizáltuk, és a mintákban lévő interferon-koncentrációkat megbecsültük az abszorbanciából, extinkciós együtthatóként 1,51-et vettünk 1 mg/ml-es oldatra.
Az SP-eluátumból származó, 1 mg/ml béta-interferon-la-oldathoz hozzáadtunk 0,5 M nátrium-foszfátot (pH 6,0) 50 mM végkoncentrációig, nátrium-cianoborohidridet (Aldrich, Milwaukee, WI) 5 mM-ig és 20K méretű PEG-aldehidet (Shearwater Polymers,
72.278/BE
Huntsville, AL) 5 mg/ml-ig. A mintát szobahőmérsékleten inkubáltuk 20 óra hosszáig. A pegilált interferont egymás után végzett kromatográfiás lépésekkel tisztítottuk a reakciótermékek közül, Superose®6 FPLC méret szerint elválasztó oszlopon (Pharmacia), mozgó fázisként 5 mM nátrium-foszfátot és 150 mM NaClt tartalmazó puffért (pH 5,5) alkalmazva, és SP-Sepharose®FF-en. A méret szerinti elválasztás eredményeként alapvonalig elválasztottuk a módosított és a módosítatlan béta-interferont (a kromatogrammokat itt nem mutatjuk be) . A gélszűrésből származó, PEG-béta-interferont tartalmazó, egyesített eluátumot 1:1arányban hígítottuk vízzel, és felvittük SP-Sepharose®-oszlopra 2 mg béta-interferon/ml gyanta mennyiségben. Az oszlopot 5 mM nátrium-foszfátot és 75 mM NaCl-t tartalmazó pufferrel (pH 5,5) mostuk, és a pegilált béta-interferont 5 mM nátrium-foszfátot és 800 mM NaCl-t tartalmazó pufferrel (pH 5,5) eluáltuk. Az eluált frakciókat fehérjetartalomra analizáltuk 280 nm-en mért abszorbancia felhasználásával. A pegilált interferon-koncentrációt interferon-ekvivalensekben ábrázoljuk, mivel a PEG-rész nem járult hozzá a 280 nm-en mért abszorbanciához.
B. PEGilált interferon biokémiai jellemzése
A mintákat SDS-PAGE alkalmazásával vizsgáltuk a módosítás mértékére (a gélt itt nem mutatjuk be) nézve. Egyetlen PEG hozzáadása 20 kDa-ról 55 kDa-ra tolja el az interferon látszólagos tömegét, amely könnyen észlelhető ebben az analízisben. A pegilált mintában nem láttunk módosítatlan béta-interferon-la-t, sem nagyobb molekulatömegű formákat, amelyet további PEG-csoportok jelenléte eredményezhet. Egyetlen PEG jelenlétét MALDI
72.278/BE tömegspektrometriával igazoltuk. A pegilálási reakció specifitását peptid-térképezéssel elemeztük. 20 μg alikvot pegilált és kontrollként módosítatlan béta-interferon-la-t, 240 μΐ, 200 mM Tris-HCl-t, 1 mM EDTA-t tartalmazó pufferben (pH 9,0) emésztettünk 1,5 pg Achromobacterből származó lizil-endoproteinázzal (Wako Bioproducts, Richmond, VA) , 3-4 óra hosszáig, 27°C-on. Az egyes mintákhoz hozzáadtunk 200 mg guanidin-HCl-t, és a hasítási termékeket Vydac C4-oszlopon (0,46 X 25 cm) frakcionáltuk, 30 perces, 0,1% TFA-ban 0-70% acetonitril-gradiens, 1,4 ml/perc áramlási sebesség alkalmazásával. Az oszlopról lefolyó anyagot 214 nm-es abszorbanciára teszteltük.
Az analízis eredményeit bemutatjuk a 6. ábrán. A bétainterferon-la endoproteináz-Lys-C-emésztéséből előre várható valamennyi pepiidet azonosítottuk N-terminális szekvenálással és tömegspektrometriával, és ezek közül csak az interferon Nterminálisát tartalmazó peptid (AP8) volt módosítva, amit az bizonyított, hogy eltűnt a térképről. A térképezési adatok tehát azt mutatják, hogy a PEG-rész specifikusan kapcsolódott ehhez a pepiidhez. Az adatok továbbá azt mutatják, hogy a PEG-módositás a fehérje N-terminálisát célozta, mivel csak az N-terminális módosítás eredményezheti a peptid specifikus eltűnését.
Ezt a következtetést továbbá alátámasztják azok a tapasztalatok is, amelyekhez az endoproteináz Lys-C-emésztésből származó, PEGilált N-terminális peptid izolálásával jutottunk úgy, hogy a pepiidet tovább emésztettük brómciánnal (CNBr), és a mintát mátrix-támogatott lézer-deszorpciós ionizációs, energiaforrás után késleltetett (azaz „matrix—assisted laser desorption ionization .278/BE post source decay, azaz MALDI PSD) szekvenciaanalízisnek vetettük alá. A brómciános emésztés az N-terminális pepiidet tovább hasította két fragmentumra, a PEG-részt tartalmazó, terminális metioninra (Ml) és SYNLLGFLQR-re (az érett béta-interferonszekvenciában a 2-11. aminosavak). A szekvenciánál!zisben azonosítottuk a módosítatlan SYNLLGFLQR-peptidet, amely várhatóan megfelelt ezen eljárás eredményének.
A béta-interferon-la-minták antivirális aktivitását humán tüdőkarcinóma-sejteken (A549-sejteken) teszteltük, amelyeket enkefalomiokardítisz (EMC) vírus hatásának tettünk ki, a fentebb leírt MTT-festést tartalmazó eljárások alkalmazásával. Röviden összefoglalva, A549-sejteket 24 óra hosszáig előkezeltünk bétainterferon-la-val vagy PEG-módosított béta-interferon-la-val (4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 75, 62,5, 31,25, 50, 33,3, 22,2, 14, 8, 9,9, 6, 6, 4,39 pg/ml) a vírussal való fertőzés előtt. A vizsgálati eljárást minden egyes béta-interferon-la-koncentrációpontnál két párhuzamossal végeztük. A standard deviációkat, hibajelként feltüntetjük a 7. ábrán. Az a béta-interferon-la-koncentráció (formázott vagy nagy mennyiségű), amely 50%-os víruspusztulást eredményez („50%-os citopatikus hatás) (50% maximum OD450) , körülbelül 11 pg/ml volt, és a PEG-módosított béta-interferon-la-ra az 50%-os citopatikus hatás körülbelül 11 pg/ml volt. Tehát a PEG-konjugálás nem változtatta meg a bétainterferon-la antivirális aktivitását. Ebben a vizsgálati eljárásban rutinszerűen azt találtuk, hogy a béta-interferon-la specifikus aktivitása körülbelül 10-szer nagyobb, mint a bétainterferon-lb specifikus aktivitása, és így tehát a PEGilált bé
72.278/BE ta-interferon-la szignifikánsan aktívabb, mint bármelyik bétainterf erőn- lb- termék .
A béta-interferon-la-t 5K méretű PEG-aldehiddel is PEGiláltuk, melyet a Fluka, Inc. (Kat.sz. 75936, Ronkonkoma, NY) cégtől szereztünk be, ugyanolyan eljárást követve, melyet a 20K méretű PEG-aldehiddel való módosításra leírtunk, kivéve azt, hogy a reakcióelegy 2 mg/ml 5K méretű PEG-et tartalmazott. Az 5K méretű PEG-el való módosítás szintén nagymértékben specifikus az Nterminálisra, és nem változtatta meg a béta-interferon-la antivirális aktivitását. A 20K-adduktumhoz hasonlóan, az 5K PEG-et tartalmazó béta-interferon-la az antivirális vizsgálati eljárásban nem volt megkülönböztethető a módosítatlan béta-interferon-la-tól.
3. példa
A PEGilálás megvédi a béta-interferon-la-t stressz-indukált aggregációtól
Béta-interferon aggregációja káros hatással van az aktivitásra. Korábban már kimutatták, hogy a glikozilálás drámai hatással van a béta-interferon-la stabilitására, a béta-interferon nemglikozilált formáival szemben, és arra a következtetésre jutottak, hogy a glikozilálás hozzájárul a béta-interferon-la magasabb specifikus aktivitásához [Runkel, L. et al. , Pharm. Rés. 15, 641-649] . Annak vizsgálata céljából, hogy polialkilénglikol-polimerrel való konjugálás tovább stabilizálhatja-e a béta-interferont, PEGílált béta-interferon-la-t hőstressznek vetettünk alá az alábbiak szerint:
Hődenaturálást CARY 3 UV-látható spektrofotométer alkalmazá
72,278/BE sával végeztünk, amelyhez számítógéppel szabályzott, termoelektromosan melegített küvettatartó volt illesztve. Béta-interferon-la-oldatokat 20 mM HEPES, 20 mM NaCl, pH 7,5 pufferben ekvilibráltunk 25°C-on, 1 ml-es küvettában. Azután a küvettatartó hőmérsékletét 25°C-ról 80°C-ra emeltük, 2°C/perc sebességgel, és a fehérje denaturációját a 280 nm-en mért abszorbancia folyamatos rögzítésével követtük. A kooperatív konformációvesztéssel járó folyamat középpontját (Tm) az olvadási görbékből úgy kaptuk, hogy meghatároztuk azt a hőmérsékletet, ahol a mért abszorbancia pontosan azon két érték között volt, amelyeket a kooperatív konformációvesztéssel járó folyamat két szélső állapotának megfelelő oldalakon, a lineáris szakaszokból extrapolált vonalak meghatároztak.
Az analízissel kapott eredményeket bemutatjuk a 8. ábrán. Míg a nem-PEGilált béta-interferon-la 50%-ban denaturálódott és í aggregálódott 60°C-os átmeneti pontnál, nem tapasztaltunk aggregálódást PEGilált interferon esetén, még 80°C-nál sem. Egy független analízisben a hőstressz-kezelést kiterjesztettük 95°C-ra, sőt, még magasabb hőmérsékletre, de így sem tapasztaltunk aggregálódást. Tehát, polietilén-glikol-polimerrel történő ilyen konjugálásnak alapvető és jótékony hatása van a fehérje stabilitására. Hasonló mértékű stabilizálást tapasztaltunk 20K és 5K méretű PEG-et tartalmazó, módosított béta-interferon-la esetén.
4. példa
Béta-interferon-la antivirális aktivitásának mérése béta-interferon-la-val és PEGilált interferon-béta-la-val kezelt egerekből származó plazmában
72.278/BE
Egereket (C57B1/6) i.v. injektálunk farki vénájukon keresztül 50.000 egység béta-interferon-la-val vagy 50.000 egység, 20K méretű PEG-et tartalmazó, PEGilált béta-interferon-la-val, vagy kontrollként egyező térfogatú foszfát-pufferrel. Vért veszünk az egerekből retroorbitális (szemüreg mögötti) véreztetéssel, az injektálás után különböző időpontokban (közvetlenül utána, 0,25, 1, 4, 24 és 48 órával utána) . Legalább 3 egeret véreztetünk az egyes időpontokban. Teljes vért gyűjtünk antikoagulánst tartalmazó csövekbe, a sejteket eltávolítjuk és az eredményül kapott plazmát lefagyasztjuk a vizsgálati eljárás idejéig. Ezeket a plazmamintákat azután antivirális vizsgálati eljárásokban teszteljük.
A plazmamintákat 1:10 arányban hígítjuk szérummentes tápközegben, és átnyomtuk fecskendőhöz csatlakoztatott, 0,2 pm-es szűrőn. A hígított mintákat antivirális vizsgálati eljárásokban teszteljük. A mintákat A549-sejteket tartalmazó, 96 helyet tartalmazó szövettenyésztő tálcák kijelölt helyeibe titráljuk. Béta-interf eron-la-ból standard hígításokat (10, 6,7, 4,4, 2,9 1,3, 0,9 és 0,6 U/ml) és négy plazmamintát vizsgálunk minden tálcán. Az A549-sejteket 24 óra hosszáig előkezeljük hígított plazmamintákkal EMC-virussal való fertőzés előtt. A vírussal két napig inkubálunk, az életképes sejteket megfestetjük MTT-oldattal (5 mg/ml foszfát-pufferben) 1 óra hosszáig, foszfát-pufferre! mossuk, és izopropanolban lévő, 1,2 M HCl-el szolubilizáljuk. A tálcákat 450 nm-en leolvassuk. Felveszünk standard görbéket az egyes tálcákra, és az egyes tesztelendő mintákban lévő béta-interferon-la-aktivitásmennyiség meghatározására alkalmazzuk azokat. A különböző egerekből származó mintákban lévő,
72.278/BE egyes időpontokhoz tartozó aktivitásokat a 9. ábrán bemutatjuk.
A PEGilált béta-interferon-la lassabban távozik a keringésből, ami azt mutatja, hogy a PEGilált minták fél-életideje sokkal hosszabb, mint a kezeletlen béta-interferon-la kontrolié. Mig a kontroll nagyjából 4 óra múlva kiürül, a PEGilált termék jelentős részét detektáltuk 48 óra elteltével. A szérumban az aktivitás kezdeti mennyiségére és a 48 óra elteltével maradt aktivitás alapján azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a PEGilált interferon fél-életideje meghosszabbodott, a módosítatlan béta-interferon-la fél-életidejéhez viszonyítva. Ebből a kísérletből származó, másik nagyon jelentős eredmény az, hogy nagyon kevés PEGilált forma veszett el az eloszlási fázisban, amit az bizonyított, hogy hasonlóan magas aktivitás volt a 0. és a 60. perc után is. Ez az adat azt mutatja, hogy a kontroll bétainterferon-la-tól eltérően, a PEGilált termék eloszlása nagymértékben az érrendszerre korlátozódott.
5. példa
Összehasonlító farmakokinetika és farmakodinámia főemlősökben (általános eljárások)
Összehasonlító kísérleteket végzünk polimer-béta-interferonla-konjugátumokkal és natív béta-interferon-la-val (nem formázott, nagy mennyiségű béta-interferon-la-intermedier nátrium-foszfátot és NaCl-t tartalmazó pufferben, pH 7,2) főemlősökben való relatív stabilitásuk és aktivitásuk meghatározása céljából. Ezekben a kísérletekben polimer-béta-interferon-la-konjugátumok farmakokinetikáját és farmakodinámiáját összehasonlítjuk a natív béta-interferon-la ugyanilyen tulajdonságaival, és elfogadható
72.278/BE következtetések kiterjeszthetők emberekre.
Állatok és módszerek
A kísérlet megtervezése
A kísérletben párhuzamos csoportokat és ismételt dózist alkalmazunk, konjugált és nem-konjugált béta-interferon-la összehasonlító farmakokinetikájának és farmakodinámiájának elemzésére.
Egészséges főemlősöket (előnyösen Rhesus-majmokat) alkalmazunk a kísérletben. A dózisok beadása előtt a laboratórium állatorvosa az összes állatot megvizsgálja 14 napon belül két alkalommal a teszt-termék beadása előtt betegség/egészség tüneteire; egy vizsgálatot 24 órával az a teszt-termék első beadása előtt kell végezni. Csak egészséges állatok kapják ezt a tesztterméket. A kiértékelés általános orvosi vizsgálatot és a dózis beadása előtti vérvételt foglal magában a klinikai patológia alapszintjének és béta-interferon-la-ra specifikus antitestek alapszintjének meghatározása céljából. Valamennyi állatot lemérünk és feljegyezzük a testhőmérsékleteket a teszt-termék beadása előtt 24 órán belül.
Tizenkét alanyt veszünk be abba a csoportba, amely 1 mU/kg béta-interferon-la-t kap PEG-béta-interferon-la-konjugátumként vagy nem-konjugált állapotban, de egyébként azonos béta-interferon-la-mennyiséget. A beadás szubkután (SC) vagy intravénásán (IV) történhet. Valamennyi állat naív béta-interferon kezelésre. Az egyes állatok két alkalommal kapnak dózist; a dózisok beadása között négy hét van. A dózisok térfogata 1,0 ml/kg.
Farmakokinetikai teszteléshez különböző időpontokban vért veszünk az injekciót követően. Vérmintákat veszünk interferon-in
72.278/BE dukált biológiai válaszmarker, szérum-neopterin mérésére is a kísérleti drog beadását követően.
A kísérlet ideje alatt a kiértékeléshez klinikai megfigyeléseket végzünk 30 perccel és 1 órával a toxicitás jeleinek kialakulása után. Naponta megfigyeléseket végzünk a tartás helyén, és feljegyezzük a viselkedésbeli változásokat. Követjük a testtömegeket és a testhőmérsékleteket, a dózis beadás követő 21 napon át, szabályos időközönként.
Vizsgálati eljárások
A béta-interferon szérumban lévő mennyiségét citopatikus hatást vizsgáló (CPE), biológiai vizsgálati eljárással mérjük. A CPE vizsgálati eljárásban az interferon-mediált antivirális aktivitást mérjük. A mintában lévő antivirális aktivitás mértéke utal a minta által tartalmazott, aktív interferon-molekulák számára a vérvétel idején. Ezt a megközelítést alkalmazzuk standard módszerként a béta-interferon farmakokinetikájának meghatározására. A jelen kísérletben végzett CPE-eljárásban azt vizsgáljuk, hogy az interferon milyen mértékben képes humán tüdőkarcinómasejteket (A549, #CCL-185, ATCC, Rockville, MD) megvédeni enkefalomiokardítisz- (EMC) vírus által okozott citotoxicitástól. A sejteket 15-20 óra hosszáig előinkubáljuk szérummintákkal, hogy lehetővé tegyük az interferon-indukált, antivirális választ biztosító fehérjék indukcióját és szintézisét. Ezután hozzáadunk EMC-vírust, és további 30 óra hosszáig inkubáljuk, majd meghatározzuk a citotoxicitást kristályibolya-festéssel. Egyidejűleg béta-interferon belső standardét valamint PEG-konjugált standardét tesztelünk a mintákkal, minden egyes vizsgálati
72.278/BE tálcán. Ezt a standardét természetes, humán, fibroblasztból származó interferon referencia-standarddel (WHO Second International Standard for Interferon, Human Fibroblast, Gb-23-90253) szemben kalibráltuk. Az egyes vizsgálati tálcák sejtnövekedési kontroll mérőhelyeket is tartalmaznak, amelyekbe sem béta-interferont, sem EMC-t nem adunk, és vírus-kontroli mérőhelyek sejteket és EMC-t tartalmaznak, de béta-interferont nem. Olyan kontroll tálcákat is készítünk, amelyek standardét és mintákat tartalmaznak, a minták sejtnövekedésre kifejtett hatásának (ha van) meghatározása céljából. Ezeket a tálcákat vírus hozzáadása nélkül festettük meg.
A mintákat és a standardeket két párhuzamossal teszteljük minden egyes tálcán, továbbá két párhuzamos tálcát is összeállítunk, így mintánként négy ponthoz jutunk. A négy párhuzamos mértani középértékét mutatjuk be. A detekciós limit ebben a vizsgálati eljárásban 10 egység/ml (U/ml).
Neopterin szérumban mért koncentrációit a klinikai farmakológiái részlegben határozzuk meg, kereskedelemben rendelkezésre álló vizsgálati eljárások alkalmazásával.
Farmakokinetiai és statisztikai módszerek
RstripTM-szoftvert (MicroMath, Inc., Salt Lake City, UT) alkalmazunk az adatok illesztésére a farmakokinetikai modellekhez. A mértani középérték-koncentrációkat az idő függvényében ábrázoljuk az egyes csoportokban. Mivel a vizsgálati eljárás eredményei hígításban vannak kifejezve, a mértani középértékeket megfelelőbbnek találjuk, mint a számtani középértékeket. A szérumban lévő interferon-mennyiségeket az alapszint értékéhez igazít
72.278/BE juk, és a szérumban nem-detektálható koncentrációt 5 U/ml-re, amely megfelel az alsó detekciós limit felének.
Az IV-infúziós adatokat tekintve, két kompartmentes IV-infúziós modellt illesztünk a szérumban detektálható koncentrációkhoz az egyes alanyok esetén, és az SC-adatokat két kompartmentes injekciós modellhez illesztjük.
Kiszámítjuk az alábbi farmakokinetikaí paramétereket:
(i) megfigyelt legmagasabb koncentráció, Cmax (U/ml) ;
(ii) görbe alatti terület 0-48 óra között, AUC, trapézszabály alkalmazásával;
(iii) elimináció fél-életideje;
és az IV-infúziós adatokból (ha IV-t alkalmazunk):
(iv) eloszlás fél-életideje (óra) ;
(v) kiürülés (ml/óra);
(vi) az eloszlás látszólagos térfogata, Vd (liter) .
WinNonlin-szoftvert (Scientific Consulting Inc., Apex, NC) alkalmazunk az elimináció fél-életidejének számítására SC- és IM-injekció után.
Neopterin esetén a számtani középértékeket mutatjuk az egyes csoportokra, az idő függvényében. Kiszámítjuk az alapvonaltól számított maximális változást (Emax) . Cmax, AUC és Emax értékeket egytényezős variancia-analízisnek vetjük alá a dózist kapott csoportok összehasonlítása céljából. Cmax és AUC értékeket az analízis előtt logaritmikusán transzformáljuk; a mértani középértékeket ábrázoljuk.
72.278/BE
6. példa
PEGilált béta-interferon-la és béta-interferon-la farmakokinetikájának összehasonlító elemzése Rhesus-majmokban
Anyagok és módszerek
Beadtunk béta-interferon-la-t vagy PEGilált béta-IFN-la-t rhesus-majmoknak az 1. napon, és újra a 29. napon, intravénásán (IV) vagy szubkután (SC), az 5. példában leírt általános eljárás szerint. Az 1. napon hat majom kapott béta-IFN-la-t (3-3 beadási módonként) és másik hat majom kapott PEGilált béta-IFN-la-t (3-3 beadási módonként). A 29. napon a dózisokat megismételtük. Az IV-dózist lassan felszabaduló bólusz-injekcióként adtuk be a fej vivőérbe vagy a „vena saphena-ba.
A SC-dózist a háton, bőr alá adtuk, miután leborotváltuk a injektálási helyet. Vért vettünk a combcsonti vénából meghatározott időpontokban, és hagytuk azt megalvadni szérum előállítása céljából. A szérumot funkcionális droganyagok mennyiségeire teszteltük validált antivirális CPE-eljárás alkalmazásával, valamint szérum-neopterinre és béta-2-mikroglobulin-mennyiségekre, az aktivitás farmakodinámiás paramétereiként. A farmakológiai paramétereket WinNonlin-szoftver (2.0-verzió) alkalmazásával számítottuk (Scientific Consulting Inc., Apex, NC).
A koncentráció-adatokat standard, modelltől független módszerekkel (nem-kompartmentes analízissel) analizáltuk, farmakokinetikai paraméterek meghatározása céljából. A görbe alatti területet (AUC) trapézszabály alkalmazásával számítottuk. A statisztikai analíziseket, beleértve számtani középértéket és standard deviációt, Microsoft Excel szoftver alkalmazásával (5.0-verzió)
72.278/BE végeztük (Microsoft Corp., Redmont, VA) . A mérési határ alá (BLQ) eső koncentráció-értékeket nem vettük figyelembe a farmakokinetikai analízisben. Amiatt, hogy különböző számítógépek és számítógépes programok különféleképpen kerekítik és rövidítik a számokat, néhány táblázatban az értékek (például átlagok, standard deviációk vagy egyedi értékek) kissé eltérhetnek más táblázatokban feltüntetett értékektől, egyedileg számított adatoktól vagy a statisztikai analízis adataitól. Sem az adatok integritását, sem azok interpretálását nem befolyásolták ezek a különbségek.
Eredmények és diszkusszió
Mindkét beadási módszerrel a pegilált béta-IFN-la biológiai hozzáférhetősége nagyobb volt (a szérum-koncentráció/idő-görbe alatti területként mérve). A pegilált béta-IFN-la továbbá magasabb abszolút biológiai hozzáférhetőséggel rendelkezett, mint a béta-IFN-la, ha SC módon adtuk be. A farmakokinetikai paramétereket az 5. táblázatban összegezzük. Pegilált béta-IFN-la IV és SC beadás esetén egyaránt a béta-IFN-la fél-életidejének valamint AUC-értékének növekedését eredményezte.
72,278/BE
5. táblázat
BG9418 farmakokinetikai paraméterei 1 MU/kg b-IFN-la vagy pegilált b-IFN-la Rhesus-majmoknakd való IV-vagy SC-beadását (I. dózis) követően
Forma (beadás módja) c max Tmax AUC U* óra/ml CL (mL/kg) Vss (mL/kg) T 1/2
B-IFN-la 6400 0, 083 4453 229 543 3,2
(IV) ( + 0) ( + 0) ( + 799) (+38) (+147) (+1,4)
Pegilált 10800 0,083 34373 29 250 9,5
B-IFN-la (IV) (+3811) (+0) (+3601) ( + 3) ( + 30) (+2,1)
B-IFN-la (SC) 277 (+75) 5, 3 (+1,2) 4753 (+3170) N/A N/A 10,0 ( + 2,9)
Pegilált B-IFN-la (SC) 1080 (+381) 3,3 (+1,2) 42283 (+5934) N/A N/A 22,0 (+3,4)
an=3
Az első dózis IV-beadását követően, a béta-IFN-la- és pegilált béta-IFN-la-koncentrációk (Cmax) szérumban mért átlagának ( + std. dev.) csúcsa 6400 (+0) illetve 10800 (+0) U/ml volt, sorrendben. Az AUC-értékek átlaga 4453 (+799) illetve 34373 (+3601) U*óra/ml volt, sorrendben. Az első SC-beadását követően, a béta-IFN-la-ra és pegilált béta-IFN-la-ra vonatkozó Cmax átlaga ( + std. dev.) 277 (+75) illetve 1080 ( + 381) U/ml volt, sorrendben. Az AUC-értékek átlaga 4753 (+3170) illetve 44952 (+1443) U*óra/ml volt, sorrendben.
A szérumban mért neopterin és béta-2-mikroglobulin-mennyiségei egyaránt megemelkedtek béta-IFN- és pegilált béta-IFN-kezelés után, ami a termékek farmakológiai aktivitását mutatja. Nagy dózisban alkalmazva a tesztvegyületeket, nem volt különbség béta-IFN-la és pegilált béta-IFN-la farmakológiai aktivitása kö
72.278/BE zott, egyik beadási mód esetén sem (az adatokat nem mutatjuk be) .
7. példa
PEGilált béta-interferon-la és béta-interferon-la farmakokinetikájának összehasonlító elemzése patkányokban különböző beadási módszereket követően
A kísérlet célja béta-interferon-la és pegilált béta-interferon-la biológiai hozzáférhetőségének összehasonlítása, néhány beadási módot alkalmazva.
Anyagok és módszerek
Nőstény, Lewis-féle patkányokat (körülbelül 190 g tömegűek) alkalmaztunk farmakokinetikai analízisekre, amelyben két-két patkányt alkalmaztunk beadási módonként és formánként. A patkány torkolati (vena jugularis) vénájába csövet szúrtunk, és beadtunk humán béta-interferon-la-t vagy 5K méretű PEG-el pegilált, humán béta-interferon-la-t vagy 20K méretű PEG-el pegilált, humán béta-interferon-la-t (vivőanyagként 14 mg/ml HAS-val kiegészített, 50 mM nátrium-foszfátot és 100 mM NaCl-t tartalmazó, pH 7,2 puffért alkalmaztunk) intravénásán, intraperitoneálisan, orálisan, szubkután vagy intratracheálisan. Vért néhányszor feldolgoztunk 72 órás időtartam alatt, 0., 5., 15., 30., 75. percben, 3., 24., 48. és 72. órában. Az eljárást bemutatjuk a 6. táblázatban. Citopatikus hatást (CPE) biológiai vizsgálati eljárás alkalmazásával mértük a szérummintákon, béta-interferon szérumban való detektálása céljából. A módosítatlan béta-interferon-la-val és 20K méretű PEG-el pegilált, humán béta-interferon-la-val kapott eredményeket bemutatjuk a 7. táblázatban. A pegilálás valamennyi esetben szignifikáns növekedést eredményezett t^-ben és AUC-ban.
72.278/BE
6. táblázat
20K PEG-el pegilált hIFN-P12 PEGilálatlan hIFN-pi2
Intravénás 0,5,15,30,75 perc, 3,24,48,72 óra 0,5,15,30,75 perc, 3,5 óra
Intraperitoneális 0,5,15,30,75 perc, 3,24,48,72 óra 0,5,15,30,75 perc, 3,5 óra
Orális 0,15, 30,60, 90 perc, 4,7,24,48,72 óra 0, 15,30, 60, 90 perc, 3,5,7 óra
Szubkután 0,30, 60, 90 perc, 4,7,24,48,72 óra 0,30,60,90 perc, 3,5,7,24 óra
Intratracheáiis 0,30,60,90 perc, 4,7,24,48,72 óra 0,30, 60, 90 perc, 3,5,7,24 óra
72.278/BE
7. táblázat
Farmakokinetikai paraméterek béta-interferon-la (IFN) és pegilált béta-IFN-la (IFN-PEG) patkányoknak való IV-, SC-, IP- vagy IT-beadását követően
Forma (beadás módja) c tax (U/ml) T max (óra) AUC/dózis (U.óra/ml.pg) 11/2 (óra)
IFN (IV, 20 pg dózis) 64000 0,25 3035 1,25
IFN-PEG (IV, 3 pg dózis) 23970 0, 08 47728 8, 44
IFN (SC, 20 pg dózis) 2400 1, 00 464,4 0, 96
IFN-PEG (SC, 3 pg dózis) 2400 7,00 14688 11, 9
IFN (IP, 20 pg dózis) 26000 1,25 4159 1,53
IFN-PEG (IP, 3 pg dózis) 9700 1,25 52148 16,2
IFN (IT, 15 pg dózis) 240 1,5 70,7 1,29
IFN-PEG (IT, 15 pg dózis) 270 7,0 233,5 6,21
8. példa
Polimerhez konjugált béta-interferon-la anti-angiogén hatásai: annak meghatározása, hogy PEGilált béta-interferon-la milyen mértékben képes gátolni endotél sejtproliferációt in vitro
Humán vénából származó, endotél sejteket (Cell Systems, Cat# 2V0-P75) és humán dermális mikrovaszkuláris endotél sejteket
72.278/BE (Cell Systems, Cat# 2MI-C25) CS-C tápközeg-készletben (CS-C Medium Kit, Cell Systems, Cat# 4Z0-500), tenyészetben fenntartunk. A kísérlet előtt 24 órával a sejteket tripszinnel kezeljük, és felszuszpendáljuk a vizsgálati eljáráshoz alkalmazott tápközegben, azaz 90% M199-ben és 10% magzati borjúszérumban (FBS), és beállítjuk a kívánt sejtsűrűséget. A sejteket azután zselatinnal burkolt, 24 vagy 96 tenyésztőhelyet tartalmazó tálcákra szélesztjük, 12.500 sejt/mérőhely illetve 2.000 sejt/mérőhely sűrűségben.
Egy éjszakán át inkubáljuk, majd a vizsgálati eljáráshoz alkalmazott tápközeget kicseréljük friss tápközegre, amely 20 ng/ml humán, rekombináns, bázikus fibroblaszt növekedési faktort (Becton Dickinson, Cat.# 40060) és különböző koncentrációjú, konjugált és nem-konjugált béta-interferon-la-fehérjét vagy pozitív kontrollt (pozitív kontrollként endosztatint lehet alkalmazni, lehet bFGF-re specifikus antitest) tartalmazott. A végtérfogatot beállítjuk 0,5 ml-re a 24 tenyésztőhelyet tartalmazó tálcákban vagy 0,2 ml-re a 96 mérőhelyet tartalmazó tálcákban.
óra elteltével a sejteket tripszinnel kezeljük Coulterszámláláshoz, lefagyasztjuk CyQuant fluoreszcencia-leolvasásra, vagy [ 3H]-timidinnel jelöljük. Az endotél sejtproliferáció in vitro gátlása konjugált és nem-konjugált béta-interferon-la-val összehasonlítható mértékű volt, ami azt mutatta, hogy a PEGilálás nem befolyásolta az interferon működőképességét ebben a felállásban.
Ez az in vitro vizsgálat teszteli a találmány szerinti, humán béta-interferon-molekulák endotél sejtproliferációra kifejtett
72.278/BE hatásait, amely in vivo anti-angiogén hatásokra utalhat [ lásd O'Reilly, M.S. et al., Cell 88, 277-285 (1997)] .
9. példa
Konjugált béta-interferon-la anti-angiogén és neovaszkularizációs hatásainak in vivo modellje
Sokféle modellt kifejlesztettek, amelyek a találmány szerinti molekulák anti-angiogén és anti-neovaszkularizációs hatásainak tesztelésére szolgálhatnak. Ezen modellek közül néhányat leírnak az USP 5,733,876. (1998. március 31.) és 5,135,919. (1992. augusztus 4.) számú szabadalmi iratokban. Más vizsgálati eljárás lehet például burokmentes korioallantois membránt (CAM) alkalmazó vizsgálati eljárás [S. Taylor és J. Folkman, Nature 297, 307 (1982) és R. Crum et al. , Science 230, 1375 (1985)]; egér háti (dorzális) léghólyagot alkalmazó anti-angiogenezis modell [ Folkman, J. et al., J. Exp. Med. 133, 275 (1971)] és patkányszaruhártyát alkalmazó, „mikrozseb vizsgálati eljárás [ Gimbrone, M. A. Jr. et al., J. Natl. Cancer Inst. 52, 413 (1974)], amelyben szaruhártya-vaszkularizációt indukálnak úgy, hogy kifejlett, hím, Sprague-Dawley törzshöz (Charles River, Japan) tartozó patkányokba 500 ng, EVA-ban (etilén-vinil-acetátkopolimerben) impregnált bázikus FGF-szemcséket (marhaeredetű, R&D Systems, Inc.) implantálnak az egyes szaruhártyákba.
PEGigált, rágcsálóból származó béta-interferon anti-angiogén hatásainak állatmodellben való tesztelésére szolgáló, más módszerek lehetnek a „Cancer Chemotherapy Reports-ban (3. rész, 3. kötet, 2. szám, 1972. szeptember leírt, új, potenciális rákellenes ágensek szűrésére szolgáló eljárások (a szóba jöhető eljárá
72.278/BE sok nem korlátozódnak csak erre), melyeket kiegészítettek az „In Vivo Cancer Models, 1976-1982 közleményben (NIH Publication No. 84-2635., 1984. február).
Az I. típusú interferonok faj specifikus jellege („faj-gát) miatt, polimerhez konjugált béta-interferon anti-angiogén aktivitásának rágcsáló-modellekben való meghatározása céljából előállítottunk polimerhez konjugált, rágcsálóból származó bétainterferont tartalmazó preparátumokat. A szűrési módszert olyan eljárással szemléltetjük, amelyben pegilált, rágcsálóból származó béta-interferont szubkután implantált, Lewis-féle tüdőkarcinómára kifejtett, anti-angiogén hatásai alapján tesztelünk.
Tumorvonal eredete:
Spontán nőtt 1951-ben tüdőkarcinómaként egy C57Bl/6-egérben.
A teszteljárás összefoglalása: Tumorfragmentumot szubkután implantálunk 6D2Fl-egerek hónaij-régiójába. A tesztágenst (azaz a találmány szerinti PEGilált interferont) különböző dózisokban adjuk be szubkután (SC) vagy intraperitoneálisan (IP), több nappal a tumor-implantációt követően. A mért paraméter az átlagos túlélési idő. Az eredményeket a kontroll túlélési idő százalékaként fejezzük ki.
Állatok:
Szaporítás: C57BL/6-egerek.
Tesztelés: B6D2Fl-egerek.
Tömeg: Az egerek tömege minimum 18 g hímek esetén és 17 g nőstények esetén, + 3 g.
Nem: Egy kísérletben egyféle nemű állatokat alkalmazunk az összes tesztelésre és kontrollra.
72,278/BE
Forrás: Egy kísérletben az állatok egy forrásból származnak, ha van rá lehetőség.
A kísérlet mérete:
Tíz állat tesztcsoportonként.
Tumortranszfer:
SZAPORÍTÁS:
Fragmentum: 2-4 mm-es fragmentumot preparálunk s.c. donor tumorból .
Idő: 13-15. nap
Hely: A fragmentumot s.c. implantáljuk a hónaij-régióba, a lágyéki régióba irányított szúrással.
TESZTELÉS:
Fragmentum: 2-4 mm-es fragmentumot preparálunk s.c. donor tumorból .
Idő: 13-15. nap
Hely: A fragmentumot s.c. implantáljuk a hónaij-régióba, a lágyéki régióba irányított szúrással.
A tesztelés menete:
0. nap: Tumor implantálása. Bakteriális tenyészetek fenntartása. Pozitív kontroll-vegyületet tesztelünk minden páratlan számú kísérletben. Anyagok preparálása. A pusztulásokat naponta feljegyezzük.
1. nap: Tenyészetek ellenőrzése. Szennyeződés esetén a kísérletet félbeszakítjuk. Az állatokat véletlenszerűen rendezzük el. Utasírások szerint kezelünk (az 1. napon és a következő napokon).
2. nap: A tenyészeteket újra ellenőrizzük. Szennyeződés esetén kísérletet félbeszakítjuk.
72.278/BE
5. nap: 2. tömegmérés, és kezdődik a tesztágens toxicitásának elemzése.
14. nap: Korai pusztulások ellenőrzése.
48. nap: Ellenőrzés mintavétel nélkül.
60. nap: Befejezzük és kiértékeljük a kísérletet. A tüdőket szabad szemmel vizsgáljuk tumorra.
Minőség ellenőrzés:
Pozitív kontroll-vegyületet (NSC 26271, Cytoxan, 100 mg/kg/injekció dózisban) alkalmaztunk minden páratlan számú kísérletben, melyet intraperitoneálisan adunk be csak az 1. napon. Az alsó teszt/kontroll-határ 140% a pozitív kontrollra. Az elfogadható, kezeletlen kontroll átlagos túlélési ideje 19-35,6 nap.
Értékelés:
A mért paraméter az átlagos túlélési idő. Kiszámítjuk az állatok 1. napi és 5. napi átlagos testtömegeit, kiszámítjuk a teszt/kontroll-arányt valamennyi tesztcsoportra. Kiszámítjuk az állatok átlagos testtömegeit a mérési napon és az utolsó értékelési napon. Kiszámítjuk a teszt/kontroll-arányt valamennyi tesztcsoportra, amely az 5. napon 65%-nál nagyobb túlélést mutatott. 86%-nál kisebb értékű teszt/kontroll-arány toxicitásra utal. Túlzott mértékű testtömeg-változás különbségét (teszt mínusz kontroll) is alkalmazhatjuk toxicitás értékelésére.
Az aktivitással szemben támasztott követelmények:
140%-nál nagyobb vagy egyenlő, kezdeti teszt/kontroll-arányt tekintünk szükségesnek a mérsékelt aktivitáshoz. 150%-nál nagyobb vagy egyenlő, reprodukálható teszt/kontroll-arányt tekintünk szignifikáns aktivitásnak.
72.278/BE (SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE)
SEQUENCE LISTING <110> BIOGEN, INC.
Pepinsky, Blake
Runkel, Laura
Brickelmaier, Margot
Whitty, Adrian Hochman, Paula <120> Polymer Conjugates of Interferon Beta-la and Uses <130> A065PCT <140> PCT/US99/24201 <141> 1999-10-15 <150> 60/104,572 <151> 1998-10-16 <150> 60/120,161 <151> 1999-02-16 <160> 29 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 549 <212> DNA <213> murine <400> 1 tccgggggcc atcatcatca tcatcatagc tccggagacg atgatgacaa gatgagctac60 aacttgcttg gattcctaca aagaagcagc aattttcagt gtcagaagct cctgtggcaa120 ttgaatggga ggcttgaata ctgcctcaag gacaggatga actttgacat ccctgaggag180 attaagcagc tgcagcagtt ccagaaggag gacgccgcat tgaccatcta tgagatgctc240 cagaacatct ttgctatttt cagacaagat tcatctagca ctggctggaa tgagactatt300 gttgagaacc tcctggctaa tgtctatcat cagataaacc atctgaagac agtcctggaa360 gaaaaactgg agaaagaaga tttcaccagg ggaaaactca tgagcagtct gcacctgaaa420 agatattatg ggaggattct gcattacctg aaggccaagg agtacagtca ctgtgcctgg480 accatagtca gagtggaaat cctaaggaac ttttacttca ttaacagact tacaggttac540 ctccgaaac549 <210> 2 <211> 183 <212> PRT <213> murine <400> 2
Ser Gly Gly His His His His His His Ser Ser Gly Asp Asp Asp Asp .278/BE
Lys Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe 20 2530
Gin Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys 35 4045
Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp lie Pro Glu Glu lie Lys Gin Leu 50 5560
Gin Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr lie Tyr Glu MetLeu
70 7580
Gin Asn lie Phe Ala lie Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr GlyTrp
9095
Asn Glu Thr lie Vai Glu Asn Leu Leu Ala Asn Vai Tyr His Gin Tie 100 105110
Asn His Leu Lys Thr Vai Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe 115 120125
Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly 130 135140
Arg He Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys AlaTrp
145 150 155160
Thr He Vai Arg Vai Glu He Leu Arg Asn Phe Tyr Phe lie AsnArg
165 170175
Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
180 <211>
<212>
DNA human <400> 3 ttctccggag acgatgatga caagatgagc tacaacttgc ttggattcct acaaagaagc 60 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> human <400> 4 gccgctcgag ttatcagttt cggaggtaac ctgtaagtc <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> human <400> 5 agcttccggg ggccatcatc atcatcatca tagct <210>
<211>
<212>
<213> :
72.278/BE
DNA human <400> 6 ccggagctat gatgatgatg atgatggccc ccgga < 210> 7 < 211> 87 < 212> DNA < 213> human <400> 7 ccggagacga tgatgacaag atggcttacg ccgctcttgg agccctacaa gcttctagca 60 attttcagtg tcagaagctc ctgtggc 87 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> human <400> 8 gatctagcaa tgctgcctgt gctgccctcc tggctgcctt gaatgggagg cttgaatact <210> 9 <211> 52 <212> DNA <213> human <400> 9 gcctcaagga caggatgaac tttgacatcc ctgaggagat taagcagctg ca 52 <210> 10 <211> 76 <212> DNA <213> human <400> 10 aattgaatgg gagggctgca gcttgcgctg cagacaggat gaactttgac atccctgagg agattaagca gctgca < 210> 11 < 211> 76 < 212> DNA < 213> human < 400> 11 aattgaatgg gaggcttgaa tactgcctca aggacagggc tgcatttgct atccctgcag 60 agattaagca gctgca 7 6
72.278/ΒΞ <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> human <400> 12 aattgaatgg gaggcttgaa tactgcctca aggacaggat gaactttgac a 51 <210> 13 <211> 43 <212> DNA <213> human <400> 13 tccctgagga gattgctgca gctgcagctt tcgctgcagc tga <210> 14 <211> 78 <212> DNA <213> human <400> 14 cgccgcgttg accatctatg agatgctcgc taacatcgct agcattttca gacaagattc 60 atctagcact ggctggaa 78 <210> 15 <211> 78 <212> DNA <213> human <400> 15 cgccgcattg accatctatg agatgctcca gaacatcttt gctattttcg ctgcagcttc atctagcact ggctggaa <210> 16 <211> 72 <212> DNA <213> human <400> 16 ggaatgcttc aattgttgct gcactcctga gcaatgtcta tcatcagata aaccatctga 60 agacagttct ag 72 <210> 17 <211> 72 <212> DNA <213> human
72.278/BE <400> 17 ggaatgagac cattgttgag aacctcctgg ctaatgtcgc tcatcagata gcacatctgg ctgcagttct ag <210> 18 <211> 44 <212> DNA <213> human <400> 18 ctagctgcaa aactggctgc agctgatttc accaggggaa aact <210> 19 <211> 69 <212> DNA <213> human <400> 19 ctagaagaaa aactggagaa agaagcagct accgctggaa aagcaatgag cgcgctgcac ctgaaaaga <210> 20 <211> 51 <212> DNA <213> human <400> 20 tattatggga ggattctgca ttacctgaag gccaaggagt actcacactg t <210> 21 <211> 163 <212> DNA <213> human <400> 21 catgagcagt ggagtactca attacctgaa ctgcacctga cactgtcatg ggccgctgca aaagatatta agcagtctgc tactcacact tggggcaatt acctgaaaag gtgcctggac gctgcatacc atattatggg gat tggcagccaa aggattctgc
120
163 <210> 22 <211> 87 <212> DNA <213> human <400> 22 catgagcagt ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggcaaa ggagtacgct gcatgtgcct ggacgat
72.278/BE <210>
<211>
<212>
<213>
DNA human
400> 23 cgtcagagct gaaatcctag caaactttgc attcattgca agacttacag <210> 24 <211> 166 <212> PRT <213> human <400> 24
Met Ser Tyr Asn 1
Cys Gin Lys Leu 20
Lys Asp Arg Met 35
Gin Phe Gin Lys 50
Asn lie Phe Ala 65
Glu Thr He Vai
His Leu Lys Thr 100
Arg Gly Ala Leu 115
He Leu His Tyr 130
He Vai Arg Vai 145
Thr Gly Tyr Leu
Leu Leu Gly Phe 5
Leu Trp Gin Leu
Asn Phe Asp He 40
Glu Asp Ala Ala 55 lie Phe Arg Gin 70
Glu Asn Leu Leu 85
Vai Leu Glu Glu
Met Ser Ser Leu
120
Leu Lys Ala Lys 135
Glu He Leu Arg 150
Arg Asn
165
Leu Gin Arg Ser 10
Asn Gly Arg Leu 25
Pro Glu Glu lie
Leu Thr lie Tyr 60
Asp Ser Ser Ser 75
Ala Asn Vai Tyr 90
Lys Leu Glu Lys 105
His Leu Lys Arg
Glu Tyr Ser His
140
Asn Phe Tyr Arg 155
Ser Asn Phe Gin 15
Glu Tyr Cys Leu 30
Lys Gin Leu Gin 45
Glu Met Leu Gin
Thr Gly Trp Asn 80
His Gin lie Asn 95
Glu Asp Phe Thr 110
Tyr Tyr Gly Arg 125
Cys Ala Trp Thr
He Asn Arg Leu
160 <210> 25 <2H> 166 <212> PRT <213> human <400> 25
Met Ala Tyr Ala 1
Cys Gin Lys Leu 20
Lys Asp Arg Met 35
Gin Phe Gin Lys 50
Asn lie Ala Ser 65
72.278/BE
Ala Leu Gly Ala 5
Leu Trp Gin Leu
Asn Phe Asp lie 40
Glu Asp Ala Ala 55 lie Phe Arg Gin 70
Leu Gin Ala Ser 10
Asn Gly Arg Leu 25
Pro Glu Glu He
Leu Thr lie Tyr 60
Asp Ser Ser Ser 75
Ser Asn Phe Gin 15
Glu Tyr Cys Leu 30
Lys Gin Leu Gin 45
Glu Met Leu Ala
Thr Gly Trp Asn 80
Glu Thr He Vai Glu 85 Asn Leu Leu Ala Asn 90 Vai Tyr His Gin He 95 Asn
His Leu Lys Thr 100 Vai Leu Glu Glu Lys 105 Leu Glu Lys Glu Ala HO Ala Thr
Ala Gly Ala 115 Ala Met Ser Ala Leu 120 His Leu Lys Arg Tyr 125 Tyr Gly Arg
lie Leu 130 His Tyr Leu Lys Ala 135 Lys Glu Tyr Ser His 140 Cys Ala Trp Thr
lie Vai Arg 145 Thr Gly Tyr <210> 26 <211> 166 <212> PRT <213> human <400> 26 Vai Leu Glu Arg 165 He 150 Asn Leu Arg Asn Phe Tyr 155 Arg He Asn Arg Leu 160
Met 1 Ser Tyr Asn Leu 5 Leu Gly Phe Leu Gin 10 Arg Ser Ser Asn Ala 15 Ala
Cys Ala Ala Leu 20 Leu Ala Ala Leu Asn 25 Gly Arg Leu Glu Tyr 30 Cys Leu
Lys Asp Arg 35 Met Asn Phe Asp He 40 Pro Glu Glu He Lys 45 Gin Leu Gin
Gin Phe 50 Gin Lys Glu Asp Ala 55 Ala Leu Thr He Tyr 60 Glu Met Leu Gin
Asn 65 He Phe Ala He Phe 70 Ala Ala Ala Ser Ser 75 Ser Thr Gly Trp Asn 80
Glu Thr He Vai Glu 85 Asn Leu Leu Ala Asn 90 Vai Tyr His Gin He 95 Asn
His Leu Lys Thr 100 Vai Leu Glu Glu Lys 105 Leu Glu Lys Glu Asp 110 Phe Thr
Arg Gly Ala 115 Leu Met Ser Ser Leu 120 His Leu Lys Arg Tyr 125 Tyr Gly Ala
He Ala 130 Ala Tyr Leu Ala Ala 135 Lys Glu Tyr Ser His 140 Cys Ala Trp Thr
He Vai Arg 145 Thr Gly Tyr <210> 27 <211> 166 <212> PRT <213> human <400> 27 Vai Leu Glu Arg 165 He 150 Asn Leu Arg Asn Phe Tyr 155 Arg He Asn Arg Leu 160
Met 1 Ser Tyr Asn Leu 5 Leu Gly Phe Leu Gin 10 Arg Ser Ser Asn Phe 15 Gin
Cys Gin Lys Leu 20 Leu Trp Gin Leu Asn 25 Gly Arg Ala Ala Ala 30 Cys Ala
72.278/BE
Ala Asp Arg 35 Met Asn Phe Asp He 40 Pro Glu Glu He Lys 45 Gin Leu Gin
Gin Phe 50 Gin Lys Glu Asp Ala 55 Ala Leu Thr He Tyr 60 Glu Met Leu Gin
Asn 65 He Phe Ala He Phe 70 Arg Gin Asp Ser Ser 75 Ser Thr Gly Trp Asn 80
Ala Ser He Vai Ala 85 Ala Leu Leu Ser Asn 90 Vai Tyr His Gin He 95 Asn
His Leu Lys Thr 100 Vai Leu Glu Glu Lys 105 Leu Glu Lys Glu Asp 110 Phe Thr
Arg Gly Ala 115 Leu Met Ser Ser Leu 120 His Leu Lys Arg Tyr 125 Tyr Gly Arg
lie Leu 130 His Tyr Leu Lys Ala 135 Ala Ala Tyr Ser His 140 Cys Ala Trp Thr
lie 145 Thr Vai Gly Arg Tyr Vai Leu Glu Arg 165 He 150 Asn Leu Arg Asn Phe Tyr 155 Arg He Asn Arg Leu 160
<210> 28 <2H> 166 <212> PRT <213> human
<400> 28
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin
1 5 10 15
Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Ala Ala Phe Ala He Pro Ala Glu He Lys Gin Leu Gin
35 40 45
Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr He Tyr Glu Met Leu Gin
50 55 60
Asn He Phe Ala He Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr He Vai Glu Asn Leu Leu Ala Asn Vai Ala His Gin He Ala
85 90 95
His Leu Ala Ala Vai Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Ala Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
He Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ala Ala Cys Ala Trp Thr
130 135 140
He Vai Arg Vai Glu He Leu Arg Asn Phe Tyr Arg He Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
<210>
<211>
<212>
167 PRT human
72.278/BE <400> 29
Met Ser Tyr Asn 1
Cys Gin Lys Leu 20
Lys Asp Arg Met 35
Ala Phe Ala Ala 50
Asn He Phe Ala 65
Glu Thr He Vai
Asn His Ala Lys
100
Thr Arg Gly Ala 115
Arg lie Leu His 130
Thr lie Vai Arg 145
Leu Thr Gly Tyr
Leu Leu Gly Phe 5
Leu Trp Gin Leu
Asn Phe Asp He 40
Ala Asp Ala Ala 55 lie Phe Arg Gin 70
Glu Asn Leu Leu 85
Thr Ala Leu Ala
Leu Met Ser Ser
120
Tyr Leu Lys Ala 135
Ala Glu He Leu 150
Leu Arg Asn 165
Leu Gin Arg Ser 10
Asn Gly Arg Leu 25
Pro Glu Glu He
Leu Thr lie Tyr 60
Asp Ser Ser Ser 75
Ala Asn Vai Ala 90
Ala Lys Leu Ala 105
Leu His Leu Lys
Lys Glu Tyr Ser
140
Ala Asn Phe Ala
155
Ser Asn Phe Gin 15
Glu Tyr Cys Leu 30
Ala Ala Ala Ala 45
Glu Met Leu Gin
Thr Gly Trp Asn 80
Tyr His Gin Ala 95
Ala Ala Asp Phe 110
Arg Tyr Tyr Gly 125
His Cys Ala Trp
Arg lie Ala Arg
160
72.278/BE

Claims (40)

1. Készítmény, amely glikozilált béta-interferont tartalmaz természetesen elő nem forduló, polialkilén-glikol-csoportot tartalmazó polimerhez kapcsolva.
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amely például aldehidcsoporton, maleimidcsoporton, vinilszulfon-csoporton, halogén-acetát-csoporton, több hisztidincsoporton, hidrazincsoporton vagy aminotiol-csoporton keresztül kapcsolt polialkilén-csoportot tartalmaz.
3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amely glikozilált béta-interferonként béta-interferon-lb-nél aktívabb béta-interferon-la-t tartalmaz, antivirális vizsgálati eljárással meghatározva .
4. A 3. igénypont szerinti készítmény, amelyben a bétainterferon-la megtartotta polimerhez nem kapcsolt béta-interferon-la hatékonyságának 0,5-1-szeresét, antivirális vizsgálati eljárással meghatározva.
5. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amely béta-interferonként béta-interferon-la-t tartalmazó fúziós fehérjét tartalmaz .
6. Az 5. igénypont szerinti készítmény, amelyben a béta-interferon-la-t tartalmazó fúziós fehérje immunoglobulin-molekula egy részletét tartalmazza.
7. Az 1. vagy 5. igénypont szerinti készítmény, amely béta-interferonként az alábbi tulajdonságok közül legalább egyikkel rendelkező, mutáns béta-interferont tartalmaz: (a) a mutáns ma
72.278/BE gasabb antivirális aktivitással rendelkezik, mint vad típusú béta-interferon-la, amely antivirális aktivitást sejtek vírusindukált lízisével mérjük; (b) a mutáns magasabb antivirális aktivitással rendelkezik, mint antiproliferatív aktivitással, vad típusú béta-interferon-la-hoz viszonyítva; (c) a mutáns képes interferon-receptort kötni, de csökkentett antivirális aktivitással és csökkentett antiproliferatív aktivitással rendelkezik, vad típusú béta-interferon-la-hoz viszonyítva.
8. Fiziológiailag aktív béta-interferon-készítmény, amely fiziológiailag aktív béta-interferon-la-t tartalmaz polialkilénglikol-csoportot tartalmazó polimerhez kapcsolva, amelyben fiziológiailag aktív béta-interferon-la és a polialkilén-glikolcsoport úgy van elrendezve, hogy a fiziológiailag aktív bétainterf eron-kés zítményben a fiziológiailag aktív béta-interferonla fokozott aktivitással rendelkezik fiziológiailag aktív bétainterf eron-lb-hez viszonyítva, antivirális vizsgálati eljárással meghatározva.
9. A 8. igénypont szerinti készítmény, amelyben a béta-interferon-la N-terminális végénél van kapcsolva a polimerhez.
10. A 8. igénypont szerinti készítmény, amelyben a béta-interferon-la C-terminális végénél vagy a C-terminális végéhez közeli helyen van kapcsolva a polimerhez.
11. A 8. igénypont szerinti készítmény, amelyben a béta-interferon-la glikáncsoportján keresztül van kapcsolva a polimerhez .
12. A 8. igénypont szerinti készítmény, amely béta-interferonként béta-interferon-la-t tartalmazó fúziós fehérjét tartalmaz .
72.278/BE
13. A 12. igénypont szerinti készítmény, amelyben a béta-interferon-la-t tartalmazó fúziós fehérje immunoglobulin-molekula egy részletét tartalmazza.
14. A 8. vagy 12. igénypont szerinti készítmény, amely béta-interferőnként az alábbi tulajdonságok közül legalább egyikkel rendelkező, mutáns béta-interferont tartalmaz: (a) a mutáns magasabb antivirális aktivitással rendelkezik, mint vad típusú béta-interferon-la, amely antivirális aktivitást sejtek vírusindukált lízisével mérjük; (b) a mutáns magasabb antivirális aktivitással rendelkezik, mint antiproliferatív aktivitással, vad típusú béta-interferon-la-hoz viszonyítva; (c) a mutáns képes interferon-receptort kötni, de csökkentett antivirális aktivitással és csökkentett antiproliferatív aktivitással rendelkezik, vad típusú béta-interferon-la-hoz viszonyítva.
15. Fiziológiailag aktív béta-interferon-készítmény, amely fiziológiailag aktív, glikozilált béta-interferont tartalmaz polialkilén-glikol-csoportot tartalmazó polimerhez N-terminálisan kapcsolva, amelyben a fiziológiailag aktív béta-interferon és a polialkilén-glikol-csoport úgy van elrendezve, hogy a fiziológiailag aktív béta-interferon-készítményben a fiziológiailag aktív béta-interferon ilyen csoportot nem tartalmazó, fiziológiailag aktív béta-interferonéval lényegében hasonló aktivitással rendelkezik, antivirális vizsgálati eljárással meghatározva.
16. A 15. igénypont szerinti készítmény, amelyben a béta-interferon-la N-terminális végénél van kapcsolva a polimerhez.
17. A 15. igénypont szerinti készítmény, amelyben a béta-interferon-la C-terminális végénél vagy a C-terminális végéhez közeli helyen van kapcsolva a polimerhez.
72 .278/BE
18. A 15. igénypont szerinti készítmény, amelyben a béta-interferon-la glikáncsoportján keresztül van kapcsolva a polimerhez .
19. A 15. igénypont szerinti készítmény, amely béta-interferonként béta-interferon-la-t tartalmazó fúziós fehérjét tartalmaz .
20. A 19. igénypont szerinti készítmény, amelyben a béta-interf eron-la-t tartalmazó fúziós fehérje immunoglobulin-molekula egy részletét tartalmazza.
21. A 15. vagy 19. igénypont szerinti készítmény, amely glikozilált béta-interferonként az alábbi tulajdonságok közül legalább egyikkel rendelkező, mutáns béta-interferont tartalmaz: (a) a mutáns magasabb antivirális aktivitással rendelkezik, mint vad típusú béta-interferon-la, amely antivirális aktivitást sejtek vírus-indukált lízisével mérjük; (b) a mutáns magasabb antivirális aktivitással rendelkezik, mint antiproliferatív aktivitással, vad típusú béta-interferon-la-hoz viszonyítva; (c) a mutáns képes interferon-receptort kötni, de csökkentett antivirális aktivitással és csökkentett antiproliferatív aktivitással rendelkezik, vad típusú béta-interferon-la-hoz viszonyítva.
22. Stabil, vízben oldható, konjugált béta-interferon-la-komplex, amely polietilén-glikol-csoporthoz kapcsolt béta-interferon-la-t tartalmaz, amelyben a béta-interferon-la labilis kötéssel van a polietilén-glikol-csoporthoz kapcsolva, amely labilis kötés biokémiai hidrolízissel és/vagy proteolízissel hasítható .
23. Az 1., 15. vagy 22. igénypont szerinti béta-interferon
72.278/BE
100
készítmény, amely körülbelül 5 és körülbelül 40 kilodalton közötti molekulatömegű polimert tartalmaz.
24. Gyógyszerkészítmény, amely 23. igénypont szerinti bétainterferon-készitményt tartalmaz.
25. Eljárás lappangó vagy kifejlődött állapotban lévő vagy betegségben szenvedő emlős alany kezelésére erre hatásos béta-interferon-la alkalmazásával, azzal jellemezve, hogy az alanynak beadunk polietilén-glikol-csoporthoz kapcsolt béta-interferon-la-t tartalmazó béta-interferon-la-készitmény hatásos mennyiségét.
26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polimerhez N-terminális végénél kapcsolt béta-interferon-la-t alkalmazunk.
27. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polimerhez C-terminális végénél vagy a C-terminális végéhez közeli helyen kapcsolt béta-interferon-la-t alkalmazunk.
28. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polimerhez glikáncsoportján keresztül kapcsolt béta-interferon-la-t alkalmazunk.
29. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy béta-interferonként béta-interferon-la-t tartalmazó fúziós fehérjét alkalmazunk.
30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy immunoglobulin-molekula egy részletét tartalmazó, béta-interferon-la fúziós fehérjét alkalmazunk.
31. A 25. és 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy béta-interferon-la-ként az alábbi tulajdonságok közül
72.278/BE 101 \ 'l· '.' legalább egyikkel rendelkező, mutáns béta-interferon-la-t alkalmazunk: (a) a mutáns magasabb antivirális aktivitással rendelkezik, mint vad típusú béta-interferon-la, amely antivirális aktivitást sejtek vírus-indukált lízisével mérjük; (b) a mutáns magasabb antivirális aktivitással rendelkezik, mint antiproliferatív aktivitással, vad típusú béta-interferon-la-hoz viszonyítva; (c) a mutáns képes interferon-receptort kötni, de csökkentett antivirális aktivitással és csökkentett antiproliferatív aktivitással rendelkezik, vad típusú béta-interferon-la-hoz viszonyítva .
32. Eljárás béta-interferon-la aktivitásának meghosszabbítására in vivo vagy in vitro rendszerben, azzal jellemezve, hogy béta-interferon-la-t természetesen elő nem forduló polimercsoporthoz kapcsolunk előállítva kapcsolt polimer-béta-interferon-la-készítményt, és a kapcsolt polimer-béta-interferon-készítményt bevisszük az in vivo vagy in vitro rendszerbe.
33. Az 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a béta-interferon-la-t a béta-interferon-la N-terminális végén lévő helyzetnél kapcsoljuk a polimerhez.
34. Az 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a béta-interferon-la-t a béta-interferon-la C-terminális végén lévő vagy C-terminális végéhez közeli helyzetnél kapcsoljuk a polimerhez.
35. Az 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a béta-interferon-la-t a béta-interferon-la-n lévő glikáncsoporton keresztül kapcsoljuk a polimerhez.
36. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy
72.278/BE
béta-interferonként béta-interferon-la-t tartalmazó fúziós fehérjét alkalmazunk.
37. A 36. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy immunoglobulin-molekula egy részletét tartalmazó, béta-interferon-la fúziós fehérjét alkalmazunk.
38. A 32. és 36. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy béta-interferon-la-ként az alábbi tulajdonságok közül legalább az egyikkel rendelkező, mutáns béta-interferon-la-t alkalmazunk: (a) a mutáns magasabb antivirális aktivitással rendelkezik, mint vad típusú béta-interferon-la, amely antivirális aktivitást sejtek vírus-indukált lízisével mérjük; (b) a mutáns magasabb antivirális aktivitással rendelkezik, mint antiproliferatív aktivitással, vad típusú béta-interferon-la-hoz viszonyítva; (c) a mutáns képes interferon-receptort kötni, de csökkentett antivirális aktivitással és csökkentett antiproliferatív aktivitással rendelkezik, vad típusú béta-interferon-la-hoz viszonyítva .
39. Az 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polialkilén-glikolt tartalmazó polimert kapcsolunk.
40. Eljárás angiogenezis gátlására egy alanyban, azzal jellemezve, hogy az alanynak beadjuk a 23. igénypont szerinti készítmény hatásos mennyiségét.
HU0200444A 1998-10-16 1999-10-15 Polymer conjugates of interferon betha-1a and uses HU229888B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10457298P 1998-10-16 1998-10-16
US12016199P 1999-02-16 1999-02-16
PCT/US1999/024201 WO2000023114A2 (en) 1998-10-16 1999-10-15 Polymer conjugates of interferon beta- 1a and their uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP0200444A2 true HUP0200444A2 (en) 2002-06-29
HU229888B1 HU229888B1 (en) 2014-11-28

Family

ID=26801696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0200444A HU229888B1 (en) 1998-10-16 1999-10-15 Polymer conjugates of interferon betha-1a and uses

Country Status (30)

Country Link
US (5) US6962978B2 (hu)
EP (4) EP1656952B1 (hu)
JP (5) JP4616478B2 (hu)
KR (1) KR100630849B1 (hu)
CN (2) CN101062419B (hu)
AT (1) ATE318149T1 (hu)
AU (1) AU762616B2 (hu)
BR (1) BRPI9915542C1 (hu)
CA (1) CA2345138C (hu)
CY (2) CY1105022T1 (hu)
CZ (1) CZ299164B6 (hu)
DE (1) DE69930015T2 (hu)
DK (2) DK1656952T3 (hu)
EA (1) EA004789B9 (hu)
EE (2) EE04967B1 (hu)
ES (4) ES2630278T3 (hu)
HK (1) HK1042434B (hu)
HU (1) HU229888B1 (hu)
IL (2) IL142282A0 (hu)
IS (1) IS2926B (hu)
LT (2) LT2599503T (hu)
NO (1) NO20011860L (hu)
NZ (1) NZ510689A (hu)
PL (1) PL206536B1 (hu)
PT (2) PT1656952E (hu)
SG (2) SG110047A1 (hu)
SI (2) SI1121156T1 (hu)
SK (1) SK287918B6 (hu)
TR (1) TR200101086T2 (hu)
WO (1) WO2000023114A2 (hu)

Families Citing this family (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1656952T3 (da) * 1998-10-16 2014-01-20 Biogen Idec Inc Polyalkylenglycolkonjugater af interferon beta-1A og anvendelser deraf
AU766190B2 (en) * 1998-10-16 2003-10-09 Biogen Idec Ma Inc. Interferon-beta fusion proteins and uses
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
KR20020034181A (ko) * 1999-08-27 2002-05-08 맥시겐 에이피에스 새로운 인터페론 베타-유사 분자
US7431921B2 (en) 1999-08-27 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
WO2002036628A2 (en) * 2000-11-02 2002-05-10 Maxygen Aps New multimeric interferon beta polypeptides
EP1366075B1 (en) 2001-02-27 2009-05-27 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
US6887462B2 (en) * 2001-04-09 2005-05-03 Chiron Corporation HSA-free formulations of interferon-beta
EP2292273A3 (en) 2001-10-10 2011-11-23 BioGeneriX AG Remodeling and glycoconjugation of peptides
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
PT3025726T (pt) * 2002-01-18 2020-01-09 Biogen Ma Inc Compostos do polímero polialquileno e utilizações dos mesmos
WO2004020468A2 (en) * 2002-08-28 2004-03-11 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
WO2004022593A2 (en) * 2002-09-09 2004-03-18 Nautilus Biotech Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
DK1575531T3 (da) * 2002-09-27 2011-11-21 Biogen Idec Inc Terapier for kronisk inflammatorisk demyeliniserende polyneuropati under anvendelse af interferon-beta
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
GEP20084486B (en) 2002-12-26 2008-09-25 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
RS20050501A (sr) * 2002-12-26 2007-08-03 Mountain View Pharmaceuticals Inc., Polimerni konjugati citokina,hemokina,faktora rasta, polipeptidnih hormona i njihovih antagonista sa očuvanom aktivnošću vezivanja receptora
AU2004221824B2 (en) 2003-03-14 2009-08-27 Ratiopharm Gmbh Branched water-soluble polymers and their conjugates
US20050079155A1 (en) * 2003-03-20 2005-04-14 Xencor, Inc. Generating protein pro-drugs using reversible PPG linkages
AU2004224466B2 (en) * 2003-03-28 2008-01-03 Biopolymed Inc. Biologically active material conjugated with biocompatible polymer with 1:1 complex, preparation method thereof and pharmaceutical composition comprising the same
WO2004091499A2 (en) 2003-04-09 2004-10-28 Neose Technologies, Inc. Intracellular formation of peptide conjugates
CA2522345A1 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
US20070072303A1 (en) * 2003-05-21 2007-03-29 Ares Trading S.A. Method of chromatographic analysis of a protein solution
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
WO2005019260A1 (ja) * 2003-08-25 2005-03-03 Toray Industries, Inc. インターフェロンβ複合体
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
NZ548123A (en) 2004-01-08 2010-05-28 Novo Nordisk As O-linked glycosylation of peptides
BRPI0507169A (pt) 2004-02-02 2007-06-26 Ambrx Inc polipeptìdeos do hormÈnio de crescimento humano modificados e seu usos
US20090214472A1 (en) * 2004-03-01 2009-08-27 Enzon Pharmaceuticals Inc. Interferon-beta polymer conjugates
WO2005112911A2 (en) * 2004-05-21 2005-12-01 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating myelin deficiency disorders
WO2006004959A2 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Egen Corporation Pegylated interferon alpha-1b
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
WO2006031811A2 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
EP1814573B1 (en) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
CA2593682C (en) 2005-01-10 2016-03-22 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US9187546B2 (en) 2005-04-08 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US20080255026A1 (en) 2005-05-25 2008-10-16 Glycopegylated Factor 1X Glycopegylated Factor Ix
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
CN101291684A (zh) * 2005-10-21 2008-10-22 阿维季尼克斯股份有限公司 甘醇化和糖基化的禽类来源的治疗性蛋白
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
CA2626056A1 (en) * 2005-11-18 2007-05-24 Ares Trading S.A. Interferon in influenza
EP1971355B1 (en) 2005-12-20 2020-03-11 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
CN100475270C (zh) * 2006-01-20 2009-04-08 清华大学 一种治疗肿瘤的药物及其应用
US20080038224A1 (en) * 2006-03-28 2008-02-14 Thierry Guyon Modified interferon-beta (IFN-beta) polypeptides
WO2007126808A1 (en) 2006-03-31 2007-11-08 Baxter International Inc Pegylated factor viii
US7982010B2 (en) 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US7985839B2 (en) 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
WO2012024613A1 (en) * 2010-08-19 2012-02-23 Wintrance Corporation Synergistic biomolecule-polymer conjugates
US8637325B2 (en) * 2009-02-16 2014-01-28 University Of Wyoming Method and apparatus for pyrolysis-induced cleavage in peptides and proteins
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
US20100056428A1 (en) 2006-09-01 2010-03-04 Novo Nordisk Health Care Ag Modified proteins
JP2010503630A (ja) * 2006-09-15 2010-02-04 クレアビリス・セラピューティクス・エスピーエー ＨＭＧＢ１のＢｏｘ−ＡおよびＨＭＧＢ１のＢｏｘ−Ａ変異体のポリマー複合体
US8969532B2 (en) 2006-10-03 2015-03-03 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography
DK2101821T3 (da) 2006-12-15 2014-10-06 Baxter Healthcare Sa Faktor VIIA-(poly)sialinsyre-konjugat med forlænget halveringstid in vivo
AU2007338771A1 (en) * 2006-12-19 2008-07-03 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Coadministration of alpha-fetoprotein and an immunomodulatory agent to treat multiple sclerosis
EP2144923B1 (en) 2007-04-03 2013-02-13 BioGeneriX AG Methods of treatment using glycopegylated g-csf
CN101675071B (zh) 2007-05-02 2014-06-18 Ambrx公司 经修饰干扰素β多肽和其用途
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
US20100239517A1 (en) * 2007-10-09 2010-09-23 Stephen Brocchini Novel conjugated proteins and peptides
RS52417B (sr) 2007-12-20 2013-02-28 Merck Serono S.A. Formulacije peg-interferona-beta
SG188143A1 (en) 2008-02-08 2013-03-28 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
US20130189239A1 (en) 2008-02-27 2013-07-25 Novo Nordisk A/S Conjugated Factor VIII Molecules
JP5639039B2 (ja) 2008-04-11 2014-12-10 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド ヒト血清アルブミンリンカーおよびそのコンジュゲート
WO2009129616A1 (en) 2008-04-21 2009-10-29 Tissue Regeneration Therapeutics, Inc. Genetically modified human umbilical cord perivascular cells for prophylaxis against or treatment of biological or chemical agents
EP2318029B1 (en) 2008-07-23 2017-11-01 Ambrx, Inc. Modified bovine g-csf polypeptides and their uses
CN102282168A (zh) 2008-11-18 2011-12-14 梅里麦克制药股份有限公司 人血清白蛋白接头以及其结合物
GB0912485D0 (en) * 2009-07-17 2009-08-26 Polytherics Ltd Improved conjugation method
US9266942B2 (en) * 2009-04-30 2016-02-23 Children's Hospital & Research Center Oakland Chimeric factor H binding proteins (fHbp) and methods of use
EP2440251A4 (en) 2009-06-09 2013-01-16 Defyrus Inc INTERFERON ADMINISTRATION FOR PROPHYLAXIS AGAINST PATHOGEN INFECTION OR TREATMENT OF PATHOGEN INFECTION
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
EP3081233B1 (en) 2009-07-27 2020-12-23 Baxalta GmbH Glycopolysialylation of proteins other than blood coagulation proteins
RU2744370C2 (ru) 2009-07-27 2021-03-05 Баксалта Инкорпорейтед Конъюгаты белков свертывания крови
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
BR112012001814A8 (pt) 2009-07-27 2018-02-06 Baxalta GmbH Conjugados de proteína de coagulação sanguínea
JP2013515081A (ja) 2009-12-21 2013-05-02 アンブルックス，インコーポレイテッド 修飾されているブタのソマトトロピンポリペプチドおよびそれらの使用
EA201290541A1 (ru) 2009-12-21 2013-05-30 Амбркс, Инк. Модифицированные бычьи соматотропиновые полипептиды и их применение
CN101906213B (zh) * 2010-07-23 2012-12-05 华南理工大学 一种新型的蛋白质糖基化接枝的方法
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
US20120082647A1 (en) * 2010-10-01 2012-04-05 Baker Darren P Interferon-beta for use as monotherapy or in combination with other cancer therapies
ES2800983T3 (es) 2010-12-22 2021-01-07 Baxalta GmbH Materiales y métodos para conjugar un derivado de ácido graso soluble en agua con una proteína
IN2014CN02982A (hu) 2011-10-01 2015-07-03 Glytech Inc
US20150030564A1 (en) 2012-02-29 2015-01-29 Toray Industries, Inc. Inhibitory agent for body cavity fluid accumulation
US9345766B2 (en) 2012-08-30 2016-05-24 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies comprising anti-ERBB3 agents
AU2014245917B2 (en) 2013-03-29 2017-09-28 Glytech, Inc. Polypeptide having sialylated sugar chains attached thereto
US11759500B2 (en) 2014-07-24 2023-09-19 Abion Inc. PEGylated interferon-beta variant
WO2017194783A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Orionis Biosciences Nv Targeted mutant interferon-beta and uses thereof
KR102642385B1 (ko) 2017-02-06 2024-03-04 오리오니스 바이오사이언시스 엔브이 표적화된 키메라 단백질 및 이의 용도
RU2661088C1 (ru) * 2017-05-24 2018-07-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) Способ очистки лекарственного средства пролонгированного действия на основе рекомбинантного аналога интерферона бета 1b для лечения рассеянного склероза
CA3090406A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 Orionis Biosciences, Inc. Fibroblast binding agents and use thereof
WO2020198665A1 (en) 2019-03-28 2020-10-01 Orionis Biosciences, Inc. Fibroblast activation protein binding agents and use thereof
RU2739261C1 (ru) * 2019-12-31 2020-12-22 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Способ количественного определения антипролиферативной активности интерферона-бета человека
CN117321087A (zh) 2021-03-26 2023-12-29 先天制药公司 包含与细胞因子融合用于nk细胞衔接的nkp46结合位点、癌抗原结合位点的多特异性蛋白质
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
CN117616050A (zh) 2021-06-09 2024-02-27 先天制药公司 与nkp46、细胞因子受体、肿瘤抗原和cd16a结合的多特异性蛋白质
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
CN116440284A (zh) * 2023-03-02 2023-07-18 北京大学 一种蛋白质-含葡萄糖聚合物的偶联物及其制备方法及应用
CN118027176B (zh) * 2024-03-27 2024-12-24 郑春杨 人β2-微球蛋白突变体

Family Cites Families (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE2360794C2 (de) * 1973-12-06 1984-12-06 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur Herstellung von Peptiden
CH596313A5 (hu) * 1975-05-30 1978-03-15 Battelle Memorial Institute
IL47468A (en) 1975-06-12 1979-05-31 Rehovot Res Prod Process for the cross-linking of proteins using water soluble cross-linking agents
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4456748A (en) 1981-02-23 1984-06-26 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
WO1982002715A1 (fr) 1981-02-04 1982-08-19 Sugano Haruo Gene d'interferon (beta)humain
US4414147A (en) 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
WO1983002461A1 (en) 1982-01-19 1983-07-21 Cetus Corp Multiclass hybrid interferons
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US4695543A (en) 1982-03-23 1987-09-22 Bristol-Myers Company Alpha Interferon GX-1
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4470461A (en) 1982-09-30 1984-09-11 Phillips Petroleum Company Organic nitro compounds as cosurfactants in enhanced oil recovery processes
US4588585A (en) * 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
GB8334102D0 (en) 1983-12-21 1984-02-01 Searle & Co Interferons with cysteine pattern
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8412564D0 (en) 1984-05-17 1984-06-20 Searle & Co Structure and properties
CA1302320C (en) 1984-06-11 1992-06-02 Hideo Niwa Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells
US5231176A (en) 1984-08-27 1993-07-27 Genentech, Inc. Distinct family DNA encoding of human leukocyte interferons
FI90990C (fi) 1984-12-18 1994-04-25 Boehringer Ingelheim Int Rekombinantti-DNA-molekyyli, transformoitu isäntäorganismi ja menetelmä interferonin valmistamiseksi
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
ATE78262T1 (de) 1985-06-11 1992-08-15 Ciba Geigy Ag Hybrid-interferone.
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
EP0229108B1 (en) * 1985-06-26 1990-12-27 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
JP2514950B2 (ja) 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
JPS63152393A (ja) 1986-07-03 1988-06-24 Takeda Chem Ind Ltd グリコシル誘導体
US5183746A (en) 1986-10-27 1993-02-02 Schering Aktiengesellschaft Formulation processes for pharmaceutical compositions of recombinant β-
US4894226A (en) 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US5004605A (en) 1987-12-10 1991-04-02 Cetus Corporation Low pH pharmaceutical compositions of recombinant β-interferon
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5135919A (en) 1988-01-19 1992-08-04 Children's Medical Center Corporation Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US4847625A (en) * 1988-02-16 1989-07-11 Ford Aerospace Corporation Wideband, aperture-coupled microstrip antenna
CA1340810C (en) 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
AU4660789A (en) 1988-11-23 1990-06-12 Genentech Inc. Polypeptide derivatives
EP0401384B1 (en) 1988-12-22 1996-03-13 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5286637A (en) 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
JPH04218000A (ja) 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
AU1674292A (en) 1991-03-15 1992-10-21 Synergen, Inc. Pegylation of polypeptides
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
WO1993000109A1 (en) 1991-06-28 1993-01-07 Genentech, Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
WO1993012145A1 (en) 1991-12-19 1993-06-24 Baylor College Of Medicine Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
WO1994005332A2 (en) 1992-09-01 1994-03-17 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
US5306344A (en) * 1992-12-02 1994-04-26 Edward C. Levy Company Mixture of portland cement concrete materials for freeze/thaw resistance
US5298410A (en) 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5874075A (en) 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
US5641656A (en) 1993-10-22 1997-06-24 University Of Connecticut Nucleic acids encoding avian interferon (IFN) proteins and recombinant methods using them
US5605976A (en) 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
HUT75533A (en) * 1993-11-10 1997-05-28 Schering Corp Improved interferon polymer conjugates
DE69521880T2 (de) 1994-02-08 2002-01-03 Amgen Inc., Thousand Oaks Orales verabreichungssystem von chemischmodifizierten proteinen g-csf
US5545723A (en) 1994-03-15 1996-08-13 Biogen Inc. Muteins of IFN-β
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
GB9415379D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
JPH10510516A (ja) 1994-12-07 1998-10-13 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ アレルゲン性を減らしたポリペプチド
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5702717A (en) 1995-10-25 1997-12-30 Macromed, Inc. Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
AU5773798A (en) 1997-01-29 1998-08-18 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylation process
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
ATE375363T1 (de) 1997-07-14 2007-10-15 Bolder Biotechnology Inc Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine
US6180095B1 (en) 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5965119A (en) 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
CA2323048C (en) 1998-03-12 2006-10-10 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
DE69936409T2 (de) * 1998-04-28 2008-04-17 Laboratoires Serono S.A., Coinsins Verfahren zur schrittweise Bindung von Polyethylenglykol (PEG) an Polypeptide
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
AU766190B2 (en) * 1998-10-16 2003-10-09 Biogen Idec Ma Inc. Interferon-beta fusion proteins and uses
DK1656952T3 (da) * 1998-10-16 2014-01-20 Biogen Idec Inc Polyalkylenglycolkonjugater af interferon beta-1A og anvendelser deraf
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
KR20020034181A (ko) * 1999-08-27 2002-05-08 맥시겐 에이피에스 새로운 인터페론 베타-유사 분자
CA2394980C (en) 1999-12-22 2008-05-13 Shearwater Corporation Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
US9506008B2 (en) 2013-12-23 2016-11-29 Exxonmobil Research And Engineering Company Method for improving engine fuel efficiency

Also Published As

Publication number Publication date
AU1446500A (en) 2000-05-08
DK1121156T3 (da) 2006-06-06
EP1121156A2 (en) 2001-08-08
PL206536B1 (pl) 2010-08-31
TR200101086T2 (tr) 2001-08-21
PL347968A1 (en) 2002-04-22
US9314534B2 (en) 2016-04-19
CA2345138A1 (en) 2000-04-27
SI1656952T1 (sl) 2014-04-30
KR20010103605A (ko) 2001-11-23
EP1656952A2 (en) 2006-05-17
EE200700058A (et) 2008-02-15
WO2000023114A3 (en) 2000-09-28
ATE318149T1 (de) 2006-03-15
BR9915542B1 (pt) 2016-06-07
NZ510689A (en) 2003-07-25
US20090104150A1 (en) 2009-04-23
JP5396358B2 (ja) 2014-01-22
SI1121156T1 (sl) 2006-08-31
HK1089393A1 (en) 2006-12-01
JP4616478B2 (ja) 2011-01-19
IL142282A0 (en) 2002-03-10
JP2007063283A (ja) 2007-03-15
SG2008070138A (en) 2017-08-30
SG110047A1 (en) 2005-04-28
WO2000023114A9 (en) 2001-07-05
EA004789B1 (ru) 2004-08-26
WO2000023114A2 (en) 2000-04-27
DE69930015T2 (de) 2006-10-12
EA004789B9 (ru) 2017-05-31
CN1323225A (zh) 2001-11-21
JP2014129420A (ja) 2014-07-10
EA200100446A1 (ru) 2001-10-22
US20030021765A1 (en) 2003-01-30
CZ299164B6 (cs) 2008-05-07
LTC2599503I2 (lt) 2019-06-25
EP2260872A2 (en) 2010-12-15
LTPA2017030I1 (lt) 2017-10-25
CN101062419B (zh) 2016-06-29
NO20011860L (no) 2001-06-15
BR9915542B8 (pt) 2017-10-31
US20070098688A1 (en) 2007-05-03
US7446173B2 (en) 2008-11-04
EE200100220A (et) 2002-06-17
BRPI9915542C1 (pt) 2021-05-25
NO20011860D0 (no) 2001-04-11
KR100630849B1 (ko) 2006-10-04
CN1329082C (zh) 2007-08-01
HK1042434A1 (en) 2002-08-16
DE69930015D1 (de) 2006-04-27
EP1656952A3 (en) 2006-11-29
PT1656952E (pt) 2014-02-21
ES2630278T3 (es) 2017-08-21
EP1121156B1 (en) 2006-02-22
ES2257884T3 (es) 2006-08-01
US6962978B2 (en) 2005-11-08
EE05201B1 (et) 2009-08-17
EP2599503B1 (en) 2017-05-17
ES2653589T3 (es) 2018-02-07
DK1656952T3 (da) 2014-01-20
US20160250340A1 (en) 2016-09-01
IS5913A (is) 2001-03-30
EP2260872A3 (en) 2011-04-27
EP2599503A2 (en) 2013-06-05
IL142282A (en) 2007-03-08
CY1115125T1 (el) 2016-12-14
SK5062001A3 (en) 2002-01-07
AU762616B2 (en) 2003-07-03
HU229888B1 (en) 2014-11-28
JP5863865B2 (ja) 2016-02-17
US20150011732A1 (en) 2015-01-08
JP2002527491A (ja) 2002-08-27
CN101062419A (zh) 2007-10-31
CZ20011329A3 (cs) 2001-09-12
ES2447772T3 (es) 2014-03-12
EP1656952B1 (en) 2013-12-18
SK287918B6 (sk) 2012-03-02
EP2599503A3 (en) 2013-07-24
IS2926B (is) 2015-09-15
LT2599503T (lt) 2017-06-26
HK1042434B (zh) 2008-01-25
BR9915542A (pt) 2001-08-14
PT1121156E (pt) 2006-05-31
CY1105022T1 (el) 2010-03-03
JP2011026329A (ja) 2011-02-10
CA2345138C (en) 2009-12-15
JP2011093937A (ja) 2011-05-12
EP2260872B1 (en) 2017-08-30
EE04967B1 (et) 2008-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ZA9811590B (en) Interferon polymer conjugates
EG22873A (en) Novel copolymers and films thereof
GB0004544D0 (en) Polymers their preparation and uses
EG24292A (en) Interferon conjugates
IL183948A0 (en) Conjugates of peg-urate oxidase and use thereof
AP2002002505A0 (en) Novel compostition and use
IL128869A0 (en) Pyrozolopyrimidines and pyrazolotriazines
IL146842A0 (en) Polymer conjugates of hedgehog proteins and uses
AU7687298A (en) Dihydropyrimidines and uses thereof
AU1540001A (en) Fluorene-perylene copolymers and uses thereof
AU8967998A (en) Antibiotic-ligand conjugates and methods of use thereof
GB9709045D0 (en) Polymers and their preparation
GB9806806D0 (en) Peptides and uses thereof
AUPQ342599A0 (en) Conjugates and uses thereof
GB0026240D0 (en) Polymers and their uses
SG71754A1 (en) Copolymer and copolymer composition
PL346758A1 (en) Phosphorylated polymers and conjugates thereof
EP1179545A4 (en) POLYMERS AND CROSSLINKABLE COMPOSITIONS
IL130752A0 (en) Polymer composition its preparation and use thereof
GB9810372D0 (en) Polymers and their uses
AU8108998A (en) Aprotinin variants with improved properties and bikunins of aprotinin variants
AU6084598A (en) Antibiotic-ligand conjugates and methods of use thereof
GB0000046D0 (en) Vortex begetter and its applications
GB9927205D0 (en) Novel copolymers and films thereof
NZ513920A (en) Novel proteins and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
HC9A Change of name, address

Owner name: BIOGEN IDEC MA INC., US

Free format text: FORMER OWNER(S): BIOGEN INC., US