HUT65941A - Backbone modified oligonucleotide analogues and pharmaceutical preparations containing them - Google Patents

Backbone modified oligonucleotide analogues and pharmaceutical preparations containing them Download PDF

Info

Publication number
HUT65941A
HUT65941A HU9303290A HU9303290A HUT65941A HU T65941 A HUT65941 A HU T65941A HU 9303290 A HU9303290 A HU 9303290A HU 9303290 A HU9303290 A HU 9303290A HU T65941 A HUT65941 A HU T65941A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
oligonucleotide
group
alkyl
oligonucleotide analog
heterocyclic
Prior art date
Application number
HU9303290A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9303290D0 (en
Inventor
Yogesh S Sanghvi
Jean-Jacques Vasseur
Francoise Debart
Phillip Dan Cook
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24826111&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HUT65941(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc
Publication of HU9303290D0 publication Critical patent/HU9303290D0/hu
Publication of HUT65941A publication Critical patent/HUT65941A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/04—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F7/00—Compounds containing elements of Groups 4 or 14 of the Periodic Table
    • C07F7/02—Silicon compounds
    • C07F7/08—Compounds having one or more C—Si linkages
    • C07F7/18—Compounds having one or more C—Si linkages as well as one or more C—O—Si linkages
    • C07F7/1804—Compounds having Si-O-C linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H11/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by inorganic acids; Metal salts thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány vázon módosított oligonukleotid analógokra, ezek előállítási eljárására, valamint az oligonukleotidokat tartalmazó gyógyszerkészítményekre vonatkozik.
A találmány közelebbről nukleázoknak ellenálló oligonukleotid analógokra vonatkozik, amelyek felhasználhatók gyógyszerként, diagnosztikumként és kutatási reagensként. A találmány szerinti oligonukleotid analógok módosított kötéseket tartalmaznak, amelyek helyettesítik a foszfor-diészter kötéseket, amelyek normál esetben a természetes nukleinsavaknál cukrok közötti kötésként szolgálnak. Az ilyen analógok ellenállók a nukleázok általi degradációnak és képesek a DNS és RNS aktivitásának módosítására. A találmány oltalmi körébe tartozik ezen nukleotid analógok előállítása, a proteinek termelésének módosítása, valamint a találmány szerinti oligonukleotid analógok intermedierként való alkalmazása.
Ismert, hogy az emlősök legtöbb szervezeti állapotát, beleértve a legtöbb betegségi állapotot is, a proteinek nagymértékben befolyásolják. Az ilyen proteinek vagy közvetlenül hatnak vagy enzimatikus funkciójukon keresztül és nagymértékben hozzájárulnak számos betegség kialakulásához állatoknál és embereknél egyaránt.
A klasszikus gyógyszerhatóanyagok általában az ilyen proteinek közötti egymásra hatásokra hatnak annak érdekében, hogy csökkentsék a betegséget kiváltó vagy a betegségeket fokozó szerepüket. Az utóbbi időben azonban kísérleteket végeztek annak érdekében is, hogy csökkentsék az ilyen proteinek tényleges termelődését a molekulákkal, így például intracelluláris RNS-sel való kölcsönhatás révén, amely
-3közvetlenül irányítja ezek szintézisét. Ezek a kölcsönhatások részt vesznek a komplementer antiszenz oligonukleotidok vagy ezek bizonyos analógjainak RNS-hez való hibridizációjában. A hibridizáció az oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok szekvencia-specifikus hidrogén-kötése az RNS-hez vagy az egyszálú DNS-hez. Ezen proteinek termelődési folyamatába való beavatkozásától terápiás eredményt lehet várni maximális hatással és minimális mellékhatásokkal. Hasonlóképpen az oligonukleotid analógok befolyásolhatják ezen proteinek termelődését valamely szervnél.
Az antiszenz oligonukleotidok és oligonukleotid analógok gyógyászati aktivitása hasonlóan más gyógyszerekhez, számos faktortól függ, amelyek befolyásolják ezen szerek hatásos koncentrációját egy specifikus intracelluláris cél helynél. Az egyik igen fontos faktor az oligonukleotidok esetében ezek stabilitása nukleázok jelenlétében. Nem valószínű, hogy a nem-módosított oligonukleotidok hatásos terápiás szerek, mivel ezeket a nukleázok igen gyorsan degradálják. Az oligonukleotidok módosításaival ezeket ellenállóvá tesszük a nukleázokkal szemben, így ezen módosított vegyületek igen szükségesek.
A nukleázokkal szembeni ellenállás érdekében végzett oligonukleotid módosítások általában a foszforatomnál vagy a cukor-foszfát vázon történnek. Különböző foszforo-tioátokat, metil-foszfonátokat, foszfor-amidátokat és foszfo-triésztereket ismertettek már, amelyek bizonyos nukleáz-rezisztenciát biztosítanak, azonban a foszfát-módosított oligonukleotidok általában nem kielégítő hibridizációs tulajdonságokkal rendelkeznek (Cohen J.S., kiadó, Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of
-4gene Expression,· CRC Press, Inc., Boca Raton FL, 1989).
Egy másik kulcs faktor az antiszenz vegyületek azon képessége, hogy gátolják a specifikus sejtek plazma membránját, amely részt vesz a betegségi folyamatban. A celluláris membránok lipid-protein kettős rétegeket tartalmaznak, amelyek szabadon átjárhatók a kicsi, nemionos, lipofil vegyűleteknek és nem átjárható a legtöbb természetes metabolitnak és terápiás szernek (Wilson, D.B. Ann. Rév. Biochem. 47:933-965 (1978). A természetes és módosított oligonukleotidok biológiai és antivirális hatását a tenyésztett emlős sejtekben igen jól dokumentálták, így úgy tűnik, hogy ezek a szerek képesek behatolni a membránokba hogy elérjék az intracelluláris céljukat. Vizsgálták ezen antiszenz vegyületek felvételét a különböző emlős sejtek, így például HL-60 szíriai aranyhörcsög (Syrian Hamster) fibroblaszt, U937, L929, CV-1 és ATH8 sejtek esetén természetes oligonukleotidok és bizonyos nukleázoknak rezisztens analógok, így például alkil-triészterek esetén (Miller, P.S. Braiterman, L.T. és Ts'O, P.O.P., Biochemistry 16:1988-1996 (1977)), metil-foszfonátok esetén (Marcus-Sekura, C.H., Woerner A.M., Shinozuka K., Zon G., és Quinman G.V., Nuc. Acids Rés. 15:5749-5763 (1987) és Miller P.S., McParland K.B., Hayerman K. és Ts'O, P.O.P., Biochemistry 16:1988-1996 (1977) és Loke S.K., Stein C. Zhang X.H. Avigan M., Cohen J. és Neckers L.M., Top Microbiol. Immunoi. 141:282:289 (1988)).
A módosított oligonukleotidok és oligonukleotid analógok gyakran kevésbé könnyen internálizáltak mint a természetes megfelelőjük. Ennek eredményeképpen sok korábban ismert antiszenz oligonukleotid nem rendelkezik elegendő aktivitással a gyakorlati gyógyítás, kutatás vagy diagnosztika céljára. Két másik, igen komoly hátránya az ismert oligo'nukleotidoknak, amelyeket antiszenz hatóanyagként való felhasználásra terveztek az intracelluláris RNS-hez való csekély hibiridizáció és meghatározott kémiai vagy enzim-közvetített folyamat, ami a lényeges RNS funkciókat lezárja.
Az antiszenz oligonukleotidok hatásosságának növelésére irányuló módosítások, valamint ezen problémák leküzdésére irányuló kísérletek igen különböző formájúak. Ezek a módosítások magukban foglalják az alapgyűru módosításait a cukor-rész módosításait, valamint a cukor-foszfát váz módosításait. A korábbi cukor-foszfát vázmódosítások, különösen a foszforatomon végzett módosítások különböző szintű nukleázokkal szembeni rezisztenciát eredményeztek. Azonban, bár az antiszenz oligonukleotidok azon képessége, hogy specifikus DNS-hez vagy RNS-hez rendszeresen kötődnek, alapvető az antiszenz metodika szempontjából, a módosított foszfor-oligonukleotidokra jellemző általában a csökkent képességű hibridizációs tulajdonság.
A foszforatom helyettesítése volt egy alternatív lehetőség a pro-királis foszfát-molekularész módosításával kapcsolatos problémák elkerülésére. Néhány módosítást, amelyeknél a foszforatom helyettesítését érték el, ismertet például Matteucci, M. (Matteucci M. Tetrahedron Letters 31:2385-2388 (1990), ahol a foszforatom helyettesítése a metiléncsoporttal az ismert technikákra korlátozódott és nem biztosította a formacetál-kötés egyenletes inszertációját az egész vázon, továbbá az instabilitás ezt a módszert alkalmatlanná tette a felhasználásra; Cormier és mtársai (Cormier és mtársai, Nucleic Acids Research 16:4583-4594 (1988) módszere szerint a foszforcsoport helyettesítését diizopropil-szilil-csoporttal végezték és a módszer korlátozott a metodológia, a homopolimerek oldhatósága, valamint a hibridizációs tulajdonságok miatt; Stirchak és mtársai szerint (Stirchak és mtársai, Journal of Organic Chemistry 52:4202-4206 (1987) a foszfor-kőtést rövid, karbamát- vagy morfolino-csoportot tartalmazó homopolimerrel végzik, ez is korlátozott a módszertan, a kapott molekula oldhatósága, valamint a hibridizációs tulajdonságok miatt; Mazur és mtársai (Mazur és mtársai, Tetrahedron 40:3949-3956 (1984)) a foszfor-kötés helyettesítését foszfon-kötéssel végezték és ez nem jelentett fejlődést a homotrimer molekulák szintéziséhez képest; Goodchild, J. (Goodchild J., Bioconjugate Chemistry 1:165-187 (1990) az észter-kötést enzimatikusan bontotta észterázzal és ezért a módszer nem volt alkalmas a foszfát-kötés helyettesítésére antiszenz felhasználás esetén.
Az ismert módszerek - amelyek a foszfor-váz módosítását célozták - korlátái egy folyamatos és régóta fennálló szükségletre mutatták rá, hogy más módosítási módszerek szükségesek, amelyek biztosítani képesek a nukleázokkal szembeni rezisztenciát és kielégítő hibridizációs tulajdonságokat biztosítanak a diagnosztikai, terápiás és kutatási célokra szánt antiszenz oligonukleotidoknak.
A fentiek alapján találmányunk a következőkre vonatkozik:
- oligonukleotid analógok antiszenz oligonukleotidként való felhasználásra a diagnosztikában, kutatási reagensként,
-Ίvalamint gyógyszerként,
- oligonukleotid analógok, amelyek fokozott celluláris felvétellel rendelkeznek,
- oligonukleotid analógok, amelyek nagyobb hatásosságúak, mint a nem-módosított antiszenz oligonukleotid analógok,
- eljárás az említett oligonukleotid analógok előállítására .
A fentieket részletesen a következő, szakember számára érthető leírásban és az igénypontokban ismertetjük.
A találmány szerinti készítmények, amelyek felhasználhatók az RNS vagy DNS molekulák aktivitásának módosítására, általában oligonukleotid analógokat tartalmaznak, amelyeknek a váz-kötései legalább részben módosítottak. Ezen módosításoknál a természetes nukleinsavak cukor-foszfát-vázában lévő foszfor-diészter kötések különböző négyatomos-kapcsolócsoporttal vannak helyettesítve. Ezek a négyatomos-kötőcsoportok megtartják a kívánt négyatomos távolságot az egyik cukor vagy cukor analóg 3'-szénatomja és a szomszédos cukor vagy cukor analóg 4'-szénatomja között. A találmány szerinti oligonukleotid analógok egy megválasztott szekvenciával épülnek fel, amelyek specifikusan hibridizálhatók egy egyszálú vagy kétszálú DNS vagy RNS előre meghatározott nukleotid szekvenciájával. Ezek az oligonukleotidok alkalmas módon szintetizálhatok, ismert szilárdfázisú szintetikus eljárással úgy, hogy komplementerek legyenek vagy legalább specifikusan hibridizálhatók legyenek egy RNS vagy DNS előre megválasztott nukleotid szekvenciájával. A nukleinsav szintetizátorok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők és alkalmazásuk szakember számára nyilvánvaló,
-8mint amelyeket hatásosan lehet alkalmazni ésszerű, kívánt hosszúságú közel bármely oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg előállítsához.
A találmány értelmében a nukleozid kifejezés egy heterociklikus bázisból és cukor komponenséből álló egységre utal. A nukleotid kifejezés olyan nukleozidra utal, amely 3' vagy 5'cukor-hidroxil-csoporton foszfátcsoportot tartalmaz. így a nukleozidok, nem úgy mint a nukleotidok, foszfátcsoportot nem tartalmaznak. Az oligonukleotid kifejezés több összekapcsolt nukleotid egységre utal, amelyekben specifikus szekvenciában vannak a természetben előforduló bázisok és pentofuranozil-csoportok és ezeket cukorcsoportok, natív foszfo-diészter kötésekkel kapcsolják össze. Ezek a nukleotid egységek lehetnek nukleinsav bázisok, így például guanin, adenin, citozin, timin vagy uracil. A cukorcsoport lehet dezoxiribóz vagy ribóz. A kifejezés mind természetben előforduló, mind szintetikus egységekre utal, amelyek természetben előforduló alegységekből képződnek.
Az oligonukleotid analóg kifejezés a találmány értelmében olyan csoportokra, olyan részekre utal, amelyek az oligonukleotidokhoz hasonlóan viselkednek, de amelyek tartalmaznak nem-természetben előforduló részeket is. Az oligonukleotid analógok tartalmazhatnak módosított cukor-részeket, módosított bázis-részeket vagy módosított interjúkor kötéseket is. Ebből a szempontból egy találmány szerinti oligonukleotid analóg, amely nem-foszfodiészter kötéseket, azaz egy módosított inter-cukor-kötést tartalmaz, tekinthető oligonukleozidnak is. Az ilyen oligonukleozidok ily módon ♦ * ♦ <* ♦ · * · · · · • · · · · · · ··· ·· ·· ···· ··
-9olyan termékre utalnak, amelyek több nukleozid egységet tartalmaznak a natív foszfo-diészter kötőcsoporttól eltérő csoporttal összekötve. Továbbá, a találmány értelmében az oligomerek megnevezést úgy is tekinthetjük, mint ami magában foglal oligonukleotidokat, oligonukleotid analógokat vagy oligonukleozidokat. így az oligomerek kifejezés utal különböző nukleotidokra vagy nukleozid analógokra, amelyek egymással vagy természetes foszfo-diészter kötésekkel vagy más kötéssel, beleértve a találmány szerinti négyatomos kötéseket is, vannak összekapcsolva. Általában, bár a kötés az egyik nukleozid 3' szénatomja a másik nukleozid 5' szénatomja között van, az oligomer kifejezés magában foglalhat más kötéseket is, igy például a 2'-5' kötést is.
Az oligonukleotid analógok tartalmazhatnak más egyéb módosításokat is, amelyek a találmány lényegével összhangban vannak, és különösen olyan módosításokat, amelyek növelhetik az oligonukleotid készítmények nukleázokkal szembeni rezisztenciáját, hogy bizotsítsák az adott oligonukleotidok antiszenz terápiás, diagnosztikai vagy kutatási célú alkalmazását. így például, ha a nukleozid nukleotid cukorrészét egy karbociklusos vagy egy más résszel helyettesítjük, az többé nem cukor. Továbbá, ha más szubsztitúciót, így például az inter-cukor foszfor-diészter kötés szubsztitúcióját végezzük el, a kapott anyag többé nem igazi nukleinsav. Mindezeket azonban analógoknak nevezzük. A leírásban végig, a nukleinsav-fajták cukorrészére való utalást úgy kell érteni, mint ami vagy egy igazi cukorra vagy egy olyan fajtára utal, amely a cukor szokott helyét foglalja el a természetes nukleinsavakban.
-10Továbbá az inter-cukor kötésekre való utalást úgy kell érteni, hogy az magába foglal olyan részeket, amelyek a cukor vagy cukor analóg részek összekötésére szolgál a' természetes nukleinsavaknál meglévő módon.
A találmány tehát új típusú antiszenz oligonukleotid analógokra és oligonukleozidokra vonatkozik, amelyek úgy vannak módosítva, hogy növekszik a celluláris felvétel, a nukleázokkal szembeni ellenállóképesség, valamint javulnak a hibridizációs tulajdonságok, valamint meghatározott kémiai vagy enzimatikus úton közvetített folyamatok mennek végbe, amelyek befejeznek lényeges RNS funkciókat.
Azt tapasztaltuk, hogy bizonyos oligonukleotid analóg kompozíciók hasznosak lehetnek a gyógyászatban és megfelelnek más egyéb találmány szerinti célnak. Az ilyen oligonukleotid analógok alegységekből állnak, amelyek legalább némelyike az (I) általános képlettel írható le - a képletben Bx jelentése változtatható báziscsoport, Q jelentése 0, CH2, CHF vagy CF2 csoport és
X jelentése H, OH, 1-10 szénatomos rövid szénláncu alkil-, szubsztituált rövid szénláncu alkil-, alkaril- vagy aralkil-csoport, F, Cl, Br, CN, CF3, OCN-csoport, 0-, Svagy N-alkilcsoport, 0-, S- vagy N-alkenilcsoport, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2 csoport, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkaril-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino- vagy szubsztituált szililcsoport, továbbá X jelentése lehet egy RNS-t hasító csoport, egy az oligonukleotid farmakokinetikai tulajdonságait javító csoport vagy egy az oligonukleotid farmakodinamikus « ttM «««4 ·« · · • · * « · » · • · · · k · Λ ·♦· ·· ·« ««·· · ·
-11tulajdonságait javító csoport,
Li és L4 jelentése egymástól függetlenül CH2, C=0, C=S, C-NH2» C-NHR3, C-OH, C-SH, C-O-Ri vagy C-S-R2-csoport,
L12 és L3 jelentése egymástól függetlenül CR1R2, C=CRiR2, ONR3, P(0)R4, P(S)R4, C=O, C=S, O, S, SO, SO2, NR3 vagy SiRsRg-csoport, vagy együttesen egy alkén- vagy alkincsoport, egy aromás, karbociklusos vagy heterociklusos gyűrű részét képezik,
Li, L2, L3 és L4 jelentése a fenti, azzal a megkötéssel, hogy ha Li jelentése C=0 vagy C=S csoport, akkor L2 NR3 csoporttól eltérő vagy ha L4 jelentése C=0 vagy C=S, akkor L3 NR3 csoporttól eltérő, továbbá
Li, L2, L3 és L4 együttesen jelenthet -CH2=N-NH-CH2- vagy -CH2-0-N=CH-csoportot is,
R1 és R2 jelentése H, OH, SH, NH2, 1-10 szénatomos alkil-, szubsztituált alkil-, alkenil-, alkaril- vagy aralkilcsoport, alkoxi-, tio-alkoxi-, alkil-amino-, aralkil-amino-, szubsztituált alkil-amino-, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkil-amino-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino-, halogén-, formil-, keto-, benzoxi-, karboxamido-, tio-karboxamido-, észter-, tio-észter-, karboxamidin-, karbamil-, karbamid- vagy guanidino-csoport, jelenthetnek továbbá egymástól függetlenül egy RNS-t hasító csoportot, továbbá egy az oligonukleotidok farmakokinetikai vagy farmakodinamikai tulajdoinságait javító csoportot,
R3 jelentése H, OH, NH2, rövid szénláncu alkil-, szubsztituált rövid szénláncu alkil-, alkoxi-, rövid szénláncu alkenil-, aralkil-, alkil-amino-, aralkil-amino-, szubsz-12*·♦· ♦·♦<· «« «V
Λ 4 · · « • · · · ·« tituált alkil-amino-, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkil-amino-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino-csoport, vagy egy RNS-t hasító csoport, egy az oligonukleotid farmakokinetikai vagy farmakodinamikai tulajdonságait javító csoport,
R4 jelentése OH, SH, NH2, Ο-alkil-, S-alkil-, NH-alkil-, 0alkil-heterociklusos-, S-alkil-heterociklusos-, N-alkil-heterociklusos- vagy egy nitrogéntartalmú heterociklusos csoport,
R5 és Rg jelentése egymástól függetlenül 1-6 szénatomos alkilvagy alkoxicsoport, azzal a feltétellel, hogy ha L2 jelentése P(0)R4 csoport és R4 jelentése OH csoport, és X jelentése OH csoport és Bx jelentése uracil- vagy adenin-, akkor L3 jelentése 0 atomtól eltérő, továbbá, ha Lj, L2 és L4 jelentése CH2 csoport és X jelentése H vagy OH csoport és Q jelentése 0, akkor L3 jelentése S, SO vagy S02 csoporttól eltérő csoport.
A találmány egy előnyös kiviteli formájánál az oligonukleotid analógok magukban foglalnak cukor-részeket, így ezeknél Q jelentése 0. Egy másik kiviteli formánál és L4 mindegyikének jelentése CRiR2 képletű csoport. Előnyös továbbá, ha L2 és Ü3 jelentése egymástól függetlenül CRiR2, 0, P(0)R4, P(S)R4 vagy NR3 csoport és különösen előnyös, ha L2 és L3 jelentése CRiR2 csoport és a többi L2 és L3 csoport jelentése P(0)R4 vagy P(S)R4 általános képletű csoport. Előnyösek továbbá azok a kombinációk, ahol L2 jelentése 0 és L3 jelentése P(0)R4 vagy P(S)R4.
A találmány egy további előnyös kiviteli formájánál az * * · « ti · ♦ »···» · « * » * ·« ·« *· « « 4| oligonukleotid analógok képéletében L2 és L3 jelentése NR3 csoport, ahol R3 jelentése előnyösen H. A találmány szerinti analógok lehetnek olyanok is, amelyek képletében L2 és L3 együttesen egy ciklopropil-, ciklobutil-, metilén-oxi-, etil-aziridin- vagy egy szubsztituált etil-aziridingyűrű részét képezik. L2 és L3 együttesen lehet továbbá része egy 3-6 szénatomos karbociklusos vagy 4-, 5- vagy 6-tagú nitrogéntartalmú heterociklusos gyűrűnek is.
Előnyösek továbbá azok az olegonukleotid analógok, amelyek képletében X jelentése H vagy OH vagy F, O-alkil- vagy 0-alkenil-csoport, különösen előnyösek azok, ahol Q jelentése 0. A Bx csoport jelentése előnyösen adenin-, guanin-, uracil-, timin-, citozin-, 2-amino-adenozin-, 5-metil-citozin-csoport, bár más egyéb, nem természetben előforduló csoportok is alkalmazhatók.
Egy másik előnyös kiviteli formánál L]_ és L4 mindegyikének jelentése CH2-csoport, különösen előnyösek azok, ahol L2 és L3 mindegyikének jelentése NH-csoport. L2 és L3 egyikének jelenétse, különösen az L3~é lehet 0 és az L2 és L3 közül a másiké pedig NH csoport.
Előnyös továbbá, ha a találmány szerinti oligonukleotid analógok 5-50, fentiek szerinti szerkezetű alegységet tartalmaznak. Bár lényegében a találmány szerinti oligonukleotid analógok mindegyik alegysége lehet a fenti szerkezetű, kívánatos lehet lényegesen változó alegységek esetén is, hogy legyenek említett szerkezetűek.
A találmány szerinti oligonukleotid analógokat gyógyászati adagolás céljára előnyösen gyógyszerészetileg elfogadható
-14• · · · w · · ·· · * ···· ·· hordozóanyagban állítjuk elő. Az analógok fokozott nukleáz rezisztenciával rendelkeznek a megfelelő természetes oligonukleotidokhoz viszonyítva.
A találmány vonatkozik továbbá valamely szervezetben a proteinek termelődésének vagy aktivitásának módosítására is, amelynél a szervezetet egy olyan oligonukleotid analóggal érintkeztetjük, amely specifikusan hibridizálódni képes az említett proteint kódoló nukleinsav szekvencia legalább egy részével és amely oligonukleotidban legalább néhány alegység a fenti szerkezetnek felel meg.
A találmány vonatkozik továbbá valamely szerv kezelésére, amely valamely protein nem kívánatos termelődésével jellemezhető betegségben szenved, amelynél a szervet egy oligonukleotid analóggal érintkeztetjük, amely az említett proteint kódoló nukleinsav szekvencia legalább egy részével hibridizálódni képes, vagy önmagában vagy valamely gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal együtt és az oligonukleotid legalább néhány alegysége a fenti szerkezetű.
A találmány vonatkozik továbbá oligonukleotid analógok előállítására, amelyek alkalmazahatók a találmány szerinti gyógyászati eljárásnál, amely előállítást úgy végzünk, hogy egy (II) általános képletü vegyületet egy (II) általános képletü vegyülettel - a képletekben Bx jelentése változtatható fázis, Q jelentése 0, CH2, CHF vagy CF2 csoport és E]_ és E2 jelentése azonos vagy különböző és bármelyik lehet elektrofilreakcióképes csoport - kapcsolunk össze egy kapcsolócsoporttal az elektrofil-reakcióképes csoporton keresztül.
Egy előnyös előállítási eljárásnál az elektrofil-reak• ···< *· • · · * J • ♦ · «·· ’ · * · · * · ··· »» ·· 4··· ··
-15cióképes csoport a (II) képletű első vegyűletben lehet például halogén-metil-, trifluor-metil-, szulfonil-metil-, p-metil-benzol-, szulfonil-metil- vagy 3'-C-formil-csoport és a második, (III) általános képletű vegyűletben pedig halogénatom, szulfonil-metil-, p-metil-benzol-szulfonil-metilvagy aldehidcsoport. A kapcsolócsoport előnyösen például hidrazin- vagy hidroxil-amin-csoport.
A találmány oltalmi körébe tartozik továbbá a fentiekben ismertetett oligonukleotid analógokban lévő L2 vagy L3 nitrogéncsoport védése azon vegyületekné1, ahol L2 vagy L3 jelentése NR3 általános képletű csoport és L3 jelentése H. Ezen eljárásnál a nitrogéncsoportot fenoxi-acetil-kloriddal blokkoljuk, majd ezután reagáltatjuk az oligonukleotid analógot az oligonukleotid módosítására, majd a nitrogéncsoportot deblokkoljuk ammónium-hidroxiddal.
A találmány oltalmi körébe tartozik továbbá egy módszer a találmány szerinti bifunkcionális nukleozidok vagy oligonukleotid analógok védésére, amelyeknél a bifunkcionális csoportok egyike aldehidcsoport. Ennél az eljárásnál az aldehidet metoxi-aminnal reagáltatjuk, így az aldehid oxim-származékát nyerjük, majd a nukleozidot vagy az oligonukleozid analógot tovább reagáltatjuk a nukleozid vagy oligonukleotid analóg módosítására, majd az oximot egy acetaldehiddel reagáltatjuk az aldehidcsoport regenerálására.
A találmány oltalmi körébe tartozik továbbá eljárás egy oligonukleotid analóg előállítására, amelynél úgy járunk el, hogy a pentofuranozil-nukleozid 3' szénatomjánál gyököt képzünk, a kapott gyököt egy oximmal reagáltatjuk, amely a
-16következő pentofuranozil-nukleozid 5'-helyzetében helyezkedik el.
Előnyös olyan gyógyszerkompozíciót kialakítani, ahol az említett oligonukleotid analóg legalább egy része egy további oligonukleotid fajtába van beépítve, így az oligonukleotid analóg természetes foszfo-diészter kötéseket tartalmaz, amelyek lényegében ily módon kapcsolt területekkel váltakoznak. A beépítést előnyösen a dinukleotidok kivánt szekvenciájának foszfo-diészter kötésével végezzük, amely dinukleotidokat előzőleg ily módon kapcsoltunk.
A találmány oltalmi körébe tartoznak továbbá a (IV) általános képletű prekurzor nukleozidok is - a képletben Bx jelentése változtatható báziscsoport,
Q jelentése 0, CH2, CHF vagy CF2,
X jelentése H, OH, 1-10 szénatomos alkil-, szubsztituált rövid szénláncu alkil-, alkaril-, aralkil-, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCN-csoport, 0-, S- vagy N-alkil-, 0-, S- vagy N-alkenil-csoport, SOCH3, SO2CH3, ONO2, Νθ2» N3, NH2, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkaril-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino-, szubsztituált szilil-, egy RNS-t hasító csoport vagy egy az oligonukleotid farmakokinetikai vagy farmakodinamikai tulajdonságait javító csoport,
Y jelentése hidroxil-, amino-metil-, hidrazino-metil-, hidroxi-metil-, C-formil-, ftálimido-hidroxi-metil-, aril-szubsztituált imidazilidino-, amino-hidroxil-metil-, orto-metil-amino-benzol-tio-, metil-foszfonát- vagy metil-alkil-foszfonát-csoport,
-17Z jelentése Η, hidroxil-, amino-metil-, hidrazino-metil-, hidroxi-metil-, C-formil-, ftálimido-hidroxi-metil-, aril-szubsztituált imidazilidino-, amino-hidroxil-metil-, orto-metil-amino-benzol-tio-, metil-foszfonát- vagy metil-alkil-főszfonát-csoport, azzal a megkötéssel, hogy ha Q jelentése 0 és Y jelentése hidroxi-metil-csoport és X jelentése H vagy OH, akkor Z jelentése H-tól vagy C-formil-csoporttól eltérő, és ha Q jelentése 0 és X jelentése H vagy OH és Z jelentése hidroxilcsoport, akkor Y jelentése amino-hidroxil-metil-, hidrazino-metil- vagy aril-szubsztituált imidazolidino-csoporttól eltérő csoport.
Előnyösek azok a vegyületek, ha X jelentése H vagy OH és Q jelentése 0.
A módosított cukorkőtéseket tartalmazó oligonukleotid analógokról azt találtuk, hogy hatásosan képesek a kitűzött célokat kielégíteni. Az oligonukleotid analógok előnyösen 5-50 nukleinsav bázis alegységet tartalmaznak a hosszban. A találmány szerinti oligonukleotid analógok hibridizálhatók egyszálú vagy kettősszálú DNS és RNS előre megválasztott nukleotid szekvenciáival. A találmány szerint a nukleinsav bázisok lehetnek pirimidinek, így például timin, uracil vagy citozin, vagy purinok, így például guanin vagy adenin vagy ezek módosításai, így például az 5-metil-citozin, választott sorrendben elrendezve. A cukorrész lehet ribóz vagy dezoxiribóz típusú vagy egy cukrot utánzó csoport, így például egy karbociklusos gyűrű. A találmány egy előnyös kiviteli formájának megfelelően az oligonukleotid analógok vagy oligonukleozidok
-18hibridizálódnak a tat proteint kódoló HÍV mRNS-hez vagy a HÍV mRNS TAR szakaszához. Egy másik kiviteli formánál az oligonukleotid analógok vagy oligonukleozid'ok utánozzák a HÍV mRNS TAR szakaszának szerkezetét és ezek megkötik a tat proteint. Egy másik előnyös antiszenz oligonukleotid analóg vagy oligonukleozid szekvencia tartalmaz komplementer szekvenciákat a herpesz papilloma és más vírusok számára.
A találmány szerinti módosított kötések négyatomos kötőcsoportot tartalmaznak a természetben előforduló foszfo-diészter-5'-metilén-kötőcsoport helyett. A természetben előforduló kötések találmány szerinti négyatomos kötőcsoportokkal való helyettesítése a kapott oligonukleotid analógoknak nukleáz rezisztenciát és megnövekedett celluláris felvételt biztosít. A négyatomos kötésen belül előnyös a 3'-dezoxicsoport valamely egyik kapcsolt cukron. A négyatomos kötőcsoport -L1-L2-L3-L4- képletnek megfelelő szerkezetében és L4 jelentése metiléncsoport vagy szubsztituált szénatom és L2 és L3 jelentése metiléncsoport, szubsztituált szénatom, oxigénatom, nitrogénatom vagy szubsztituált nitrogénatom, szubsztituált foszforatom, kénatom vagy szubsztituált kénatom, vagy szubsztituált sziliciumatom. Előnyös, ha módosított kötés lényegében mindegyik kötéshelyen jelen van. Más megoldásnál a módosítás előfordulhat kevesebb helyen is, így például váltakozó kötéshelyeken. A kötések lehetnek semlegesek vagy pozitív vagy negatív töltésüek.
A találmány oltalmi körébe tartozik továbbá ezen oligonukleozidok előállítási eljárása is. A találmány szerinti eljárásnál a 3'-dezoxi-3'-szubsztituált, különösen
-19metilcsoporttal szubsztituált nukleozidot egy 5'-dezoxi-5'-szubsztituált nukleoziddal kapcsolunk egy kétatomos fragmens vagy szubsztituált kétatomos fragmens addíciójával. Az addíciós reakciót végezhetjük lépésenként is, amikor aktiváljuk a 3' és 5' helyzeteket a megfelelő nukleozidokon különböző alkalmas elektrofil csoportokkal, majd az alkalmas kötőcsoportokat reagáltatjuk az elektrofilekkel. Egy másik módszernél az eljárást együttes módon is végezhetjük. Ilyen eljárásoknál használhatunk szilárd hordozóanyagot a DNS szintetizátornál a hordozóanyagot manuálisan manipulálva vagy másképpen is eljárhatunk.
A találmány oltalmi körébe tartozik továbbá egy eljárás a szerveknél a proteinek termelődésének módosítására, amely eljárásnál a szervet egy az előzőek alapján leírtak szerint kialakított kompozícióval érintkeztetjük. Előnyös ha az RNS vagy DNS szakasz, amelyet módosítani kívánunk előre megválasztjuk, hogy olyan DNS vagy RNS szakaszt tartalmazzon, amely azt a proteint kódolja, amelynek a képződését vagy aktivitását módosítani kívánjuk. A felhasználandó készítmény kiválasztott szakasza így olyan, hogy komplementer legyen a DNS vagy RNS előre megválasztott szakaszával, azaz erre a szakaszra egy antiszenz oligonukleotid legyen.
A találmány oltalmi körébe tartozik továbbá egy eljárás olyan organizmusok kezelésére, amelyek betegsége egy protein nem kívánatos termelődésével kapcsolatos. Ennél az eljárásnál a szervet egy előzőek szerinti kompozícióval érintkeztetjük. Ez a kompozíció előnyösen olyan, amely specifikusan kötődik egy messenger RNS-hez, amely kódolja azt a proteint, amelynek
-20termelődését vagy aktivitását módosítani kívánjuk. A találmány vonatkozik továbbá egy diagnosztikai eljárásra, amely alkalmas abnormális RNS molekulák jelenlétének vagy 'távollétének kimutatására vagy alkalmas olyan normál RNS molekulák detektálására, amelyek expressziója a szervben vagy a sejtekben abnormális vagy nem megfelelő.
A találmány oltalmi körébe tartozik továbbá eljárás RNS szelektív megkötésére kutatási vagy diagnosztikai célból. Az ilyen szelektív, erős kötést olyan RNS vagy DNS és valamely találmány szerinti kompozíció egymásra hatásával végezzük, amely készítmények rezisztensek nukleázok degradációs hatásával szemben és amelyek erősebben és nagyobb biztonsággal hibridizálódnak mint az ismert oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok.
Az 1. ábrán bemutatjuk a találmány szerinti egyik kiviteli mód szerinti előállítási eljárást sematikusan, a 2. ábrán egy másik, találmány szerinti előállítási eljárást mutatunk be sematikusan.
A korábban ismert antiszenz oligonukleotidok biológiai aktivitása általában nem volt elegendő a gyakorlatban a gyógyszerek kutatásához vagy diagnosztikai felhasználáshoz. A találmány maga módosított oligonukleotidokra, azaz oligonukleotid analógokra vagy oligonukleozidokra, valamint ezen módosítások megvalósítására szolgáló eljárásokra vonatkozik. Ezek a módosított oligonukleotidok és oligonukleotid analógok megnövelt stabilitással rendelkeznek a természetben előforduló megfelelőjükhöz viszonyítva. Az extracelluláris és intracelluláris nukleázok általában nem ismerik fel őket, és ily módon nem kötődnek a találmány szerinti vázon módosított oligonukleotid analógokhoz vagy oligonukleozidokhoz. A nukleázoknak bármilyen kötődése a vázhoz nem eredményezi a nukleozid-kötések hasítását a megfelelő érzékeny foszfor-oxigén kötések hiánya révén. Továbbá, a kapott új, természetes vagy pozitív töltésű vázak bejutnak a sejtekbe egyszerű passzív transzport útján és nem igényelnek komplikált, proteinek által közvetített folyamatokat. A találmány egy másik előnye, hogy a negatív töltésű váz hiánya megkönnyíti az oligonukleotid analógok vagy oligonukleozidok szekvencia-specifikus kötődését a kiválasztott RNS-hez, amelynek negatív töltése van és amelynek megfelelően visszautasítja a hasonló töltésű oligonukleotidok bejutását. Egy további előnye a találmány szerinti megoldásnak, hogy ezen szerkezeti típusokban helyek vannak azon funkcionális csoportok kötődésére, amelyek a célzott RNS katalitikus hasítását iniciálják.
Egy előnyös kiviteli formánál a találmány az inter-cukor foszfátcsoportok helyettesítésére vonatkozik, amikoris az (I) általános képletnek megfelelő analógokat nyerjük - a képletben Bx jelentése változtatható báziscsoport,
Q jelentése 0, CH2, CHF vagy CF2,
X jelentése H, OH, 1-10 szénatomos alkil-, szubsztituált alkil-, alkaril-, vagy aralkilcsoport, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCN, 0-, S- vagy N-alkil-, 0-, S- vagy N-alkenil-, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkaril-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino-, szubsztituált szilil-, egy RNS-t hasító csoport, egy, az oligonukleotid farmakokinetikai vagy farmako-22dinamikai tulajdonságait javító csoport,
Li és L4 jelentése egymástól függetlenül CH2, C=0, C=S, C-NH2, C-NHR3, C-OH, C-SH, C-O-Rj vagy C-S-Ri'-csoport, és
L2 és L3 jelentése egymástól függetlenül CR1R2, C=CRiR2, C=NR3, P(O)R4, P(S)R4, C=0, C=S, 0, S, SO, SO2, NR3 vagy S1R5R6-csoport, vagy együttesen egy alkén-, alkin-csoport, egy aromás, karbociklusos vagy heterociklusos gyűrű részét képezik, Li, L2, L3 és L4 együttesen -CH=N-NH-CH2- vagy
-CH2-0-N=CH csoportot alkotnak, Ri és R2 jelentése egymástól függetlenül H, OH, SH, NH2, 1-10 szénatomos alkil-, szubsztituált alkil-, alkenil-, alkaril- vagy aralkilcsoport, alkoxi-, tio-alkoxi-, alkil-amino-, aralkil-amino-, szubsztituált alkil-amino-, heterociuklusos alkil-, heterociklusos alkil-amino-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino-, halogén-, formil-, keto-, benzoxi-, karboxamido-, tio-karboxamido-, észter-, tio-észter-, karboxamidin-, karbamil-, karbamido-, gaunidino-csoport, egy RNS-t hasító csoport vagy egy az oligonukleotid farmakokinetikai vagy farmakodinamikai tulajdonságait javító csoport,
R3 jelentése H, OH, NH2, rövid szénláncu alkil-, szubsztituált rövid szénláncu alkil-, alkoxi-, rövid szénláncu alkenil-, aralkil-, alkil-amino-, aralkil-amino-, szubsztituált alkil-amino-, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkil-amino-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino-csoport, egy RNS-t hasító csoport vagy egy az oligonukleotid farmakokinetikai vagy farmakodinamikai
-23tulajdonságait javító csoport,
R4 jelentése OH, SH, NH2, O-alkil-, S-alkil-, Ν-alkil-, O-alkil-heterociklusos, N-alkil-heterociklusos, N-alkil-heterociklusos vagy egy nitrogéntartalmú heterociklusos csoport, és
R5 és Rg jelentése egymástól függetlenül 1-6 szénatomos alkilvagy alkoxicsoport, azzal a feltétellel, hogy ha jelentése C=0 vagy C=S csoport, akkor L2 jelentése NR3 csoporttól eltérő csoport, vagy ha L4 jelentése C=0 vagy C=S, akkor L3 jelentése NR3~tól eltérő csoport, és ha L2 vagy L3 közül az egyik jelentése C=0 vagy C=S, a másik jelentése NR3 csoporttól eltérő csoport, és ha L2 jelentése P(O)R4 és R4 jelentése OH és X jelentése OH és Bx jelentése uracil vagy adenin, akkor L3 jelentése 0 atomtól eltérő, és ha Lj, L2 és L4 jelentése CH2 és X jelentése H vagy OH, Q jelentése O, akkor L3 jelentése S, SO vagy S02-től eltérő csoport.
Egy előnyös kiviteli mód szerint és L4 jelentése metiléncsoport. Az ilyen előnyös kiviteli módnál L2 vagy L3 közül az egyik tartalmazhat aminocsoportot és a másik lehet aminocsoport vagy oxigénatom. így bizonyos előnyös kiviteli módoknál L2 és L3 együttesen hidrazino-, amino-hidroxi- vagy hidroxi-amino-csoportot alkotnak. Egy másik előnyös kiviteli módnál vagy L4 közül az egyik az L2 vagy L3 csoport valamelyikével együtt CH=N csoportot alkotnak és az L2 vagy L3 csoport közül a másik oxigén- vagy nitrogénatom és így a kötőcsoport oxim-, illetve hidrazon-csoportokat tartalmaz. Az ilyen oxim- vagy hidrazim-kötőcsoportok redukálhatok a
-24fentiekben említett amino-hidroxi- vagy hidrazin-csoportokká.
Egy másik előnyős kiviteli módnál L2 és L3 jelentése szubsztituált szénatom, amino-, szubsztituált amin-, oxigén-, kén-, kén-oxidjai, foszfor- vagy szilícium. A szénatom szubsztituensei lehetnek például a következők: hidrogénatom, hidroxi-, tio-, amino-, rövid szénláncu alkil-, szubsztituált rövid szénláncu alkil-, alkoxi-, tio-alkoxi-, rövid szénláncu alkenil-, aralkil-, alkil-amino-, aralkil-amino-, szubsztituált alkil-amino-, heterociklusos alkil-, heterocilusos alkil-amino-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino-, halogén-, formil-, keto-, benzoxi-, észter-, tioészter-, karboxamidin-, guanidino-csoport, egy RNS-t hasítócsoport vagy egy az oligonukleotid farmakokinetikai vagy farmakodinamikai tulajdonságait javító csoport. Egy további előnyös kiviteli módnál L2 és L3 jelentése együttesen C=C. Egy további előnyös kiviteli módnál L2 és L3 együttesen C-C, C=C, C-N vagy N-C atompárt alkotnak egy gyuruszerkezetben, amely lehet például karbociklusos, aromás, heterociklusos, heteroaromás vagy hetrociklusos gyűrű. Egy még további kiviteli módnál Ώχ és L4 jelentése egymástól függetlenül karboxi-, tiokarboxi-, metil-amino-, metil-hidroxi-, metil-tio-, éter- vagy tio-éter-csoport.
A találmány vonatkozik továbbá a módosított inter-cukor kötéseket tartalmazó oligonukleozidok előállítására is. Ezek a módosítások kivitelezhetők például szilárd hordozóanyagok alkalmazásával, amelyek manuálisan manipulálhatók vagy amelyek a DNS szintetizátorokkal kapcsolatban felhasználhatók az előállításnál a DNS szintéziseknél általánosan alkalmazott módszerekkel. Általában ennél az eljárásnál két nukleozid
-25cukorrészét funkcionalizáljuk, amelyek egy megválasztott szekvenciában egymással szomszédosak lesznek. Az 5'->3' módnál az upsteram nukleozidot általában a 3' cukorhelynél módosítjuk és a továbbiakban synthon l-ként említjük. A találmány szerinti egyik eljárásnál az adenin, guanin, citozin, uracil, timin, valamint ezek analógjainak ribo- és 21-dezoxi-ribonukleozidjait módosítjuk és így nyerjük a 3'-dezoxi-3-hidroxi-metil-analógokat. Ezeket a 3'-hidroxi-metil-csoportokat alakítjuk át ezután különböző típusú elektrofil centrumokká. Ezt számos különböző módon végezhetjük, így például a következő előnyös módon.
A kiindulási anyagok egyik csoportját a 3'-dezoxi-3'-hidroxi-metil-ribonukleozidokat például Townsend és mtársai (Towsend és mtársai, Tetrahedron Letters, 31:3101-3104 (1990, Samano, V. és M.J. Morris, Journal of Organic Chemistry, 55:5186-5188 (1990)), és Bergstrom D.E. (Bergstorm D.E., Nucleosides and Nucleotides 8(8):1529-1535 (1989)) módszere szerint állítjuk elő. Ezen nukleozidoknál megfelelő módon szelektíve védjük a cukor hidroxilcsoportjait, majd a standard 2'-dezoxidáló eljárást végezzük és így nyerjük a 2',3'-didezoxi-3'-hidroxi-metil-ribonukleozidokat. Az ilyen típusú nukleozidokat szelektíve védhetjük és a 3'-hidroxi-metilcsoportot különböző alkalmas elektrofil-csoportokkal funkcionálhatjuk. A találmány előnyös kiviteli módjának megfelelően az ilyen elektrofil csoportok közé tartoznak például a következők: halogén-metil-, trifluor-metil-, szulfonil-metil-, p-metil-benzol-szulfonil-metil-, hidrazino-metil- vagy 3'-C-formil-csoport.
• ·
-26A downstream nukleozidokat általában az 5' cukorhelynél módosítjuk és ezeket a továbbiakban synthon 2 névvel jelöljük. Az adenin, guanin, citozin, uracü,' timin, valamint analógiainak ribo- és 2'-dezoxi-ribonukleozidjainak előállításához a módosítást - amelynél az 5'-hidroxi-metilén-csoportot különböző típusú elektrofil centrumokká alakítjuk különböző, kereskedelmi forgalomban beszerezhető nukelozidok felhasználsával végezhetjük. így például az 5'-dezoxi-5'-halogén-nukleozidot, az 5'-dezoxi-5'-tozil-nukleozidokat és az 5'-aldehid-nukleozidokat Jones G.H. és J.G. Moffatt eljárása szerint állíthatjuk elő (Jones G.H. és J. G. Moffatt, Journal of the American Chemical Society 90:5337-5338 (1968)).
A synthon 1 vegyületet a (II), míg a synthon 2 vegyületet a (III) általános képlettel Írhatjuk le, amely képletekben Bx jelentése különböző báziscsoport, Q jelentése 0, CH2, CHF vagy CF2 és Ej és E2 jelentése azonos vagy különböző elektrofil reakcióképes csoport.
A fentiek szerinti két synthon vegyületet egy kötőcsoporttal kapcsoljuk, amely reakcióba képes lépni az elektrofil csoporttal. A synthon 1 és synthon 2 közötti kapcsolást vagy lépésenként végezzük vagy egyszerre visszük végbe a reakciót és ennek eredményeképpen dinukleozidokat nyerünk, amelyek egy találmány szerinti módosított kötéssel kapcsolódnak egymáshoz vagy pedig egy nukleozidőkből álló láncot nyerünk, amelyek mindegyike a találmány szerinti említett, módosított kötőcsoporttal kapcsolódik a következő nukleozidhoz.
Az egyszerre véhezvitt kapcsolási reakciót a synthon 1 és synthon 2 vegyületek elektrofil centrumai között például
-27ammónia vagy ammónia-származék jelenlétében végezzük, így nyerjük a dinukleozidot. A találmány egy előnyös kiviteli módjánál az ismert bróm-metil-típusú syntho'nokat kapcsoljuk hidrazin addícióval, amikoris olyan kötést nyerünk, amelyben az -L1-L2-L3-L4-csoport a -CH2NHNHCH2-csoportnak felel meg. Egy másik előnyös kiviteli módnál a bróm-metil-típusú synthonok kapcsolását hidroxil-amin addíciójával végezzük, amikoris az -L1-L2-L3-L4-kötésnek a -CH2NHOCH2- vagy -CH2ONHCH2 csoport felel meg.
Egy másik élj árásná, amelynél az inter-cukor kötések módosításával a fentiekben leírt szerkezetű dinukleozidokat nyerjük, Witting reakciót végzünk. Előnyösen az ilyen reakcióknál a kiindulási vegyúlet egy 3'-keto-nukleozid (Townsend és mtársai, Tetrahedron Letters 31:3101-3104 (1990); Samano V. és M.J. Morris, Journal of Organic Chemistry 55:5186-5188 (1990); Bergstrom D.E. és mtársai, Nucleosides and Nucleotides 8(8):1529-1535 (1989)) vagy egy 51-aldehid-nukleozid (Jones G.H. és J.G. Moffatt, Journal of the American Chemical SOciety 90:5337-5338 (1968)). A kiindulási anyagot előnyösen egy foszfor-ilid-vegyúlettel reagáltatjuk, amely benzil- vagy más védőcsoportot tartalmaz. Az egyik előnyös ilidvegyület, amelyet alkalmazhatunk, a trifenil-foszforán-benzil-oximetilidin. Egy másik alkalmas ilidvegyület a trifenilfoszforán-benzil-oxi-etilidin. A vinilcsoport redukciójával és a benzil védőcsoport hidrogenolízisével nyerjük a hidroxi-metil-, illetve hidroxi-etil-csoportokat a guanin, adenin, citozin, timin, uracil kívánt nukleozidjainak vagy ezen nukleozidok analógjainak 5'- vagy 3'-helyzetében. Továbbá a
-28Witting reakciót alkalmazhatjuk az 5' és 3'-hidroxi-alkilcsoportok kialakításához a karbociklusos nukleozidoknál.
A hidroxilcsoportok konverziójával nyerjük az elektrofil centrumokat, majd a 3' elektrofil centrumot kapcsoljuk az 5' elektrofil centrummal és így nyerjük a találmány szerinti dinukleozidokat. A találmány egyik kiviteli módjánál a hidroxilcsoportokat például bromid, triflát és tozilát elektrofil centrumokká alakítjuk. A kapcsolás révén olyan dinukleozidokat nyerünk, amelyeknél a szénlánc egy vagy több heteroatommal kapcsolódik. Az ilyen heteroatomok előnyös jelentése például 0, NH, NR3, S, SO, P(0)R4 vagy SiRsRg, mint amelyeket az előzőekben az általános képlet leírásánál megadtunk.
További hasznos dinukleozidok, amelyeket valószínűleg Witting reakcióval lehet előállítani a 3' vagy 5'-karbonilnukleozidok és trifenil-foszforin-metilidin-difenil-foszfonát alkalmazásával, a foszfonát-dinukleozidok. Ennél a reakciónál metil- vagy etil-foszfonátokat nyerünk, amelyek kondenzálhatok a megfelelő 5'- vagy 3'-hidroxicsoporttal, így nyerjük a 3'- vagy 5'-foszfonát-kapcsolású oligonukleozidokat. Az ilyen típusú vegyületek kémiájában ismertetik a dinukleozidok foszfonátjainak előállítását, amelyet biokémiai folyamatok tanulmányozásához alkalmaznak (Moffatt J.G. és mtársai, Journal of American Chemical Society 92:5510-5513 (1970)). Az ilyen típusú kapcsolás alkalmazása egy előnyös módszer, amelynél egy 3'-ketonukleozidot kapcsolunk egy 51-nukleozidhoz szimmetrikus bisz(metil-trifenil-foszfán)-fenil-foszfonát alkalmazásával és így 3', 5'-dimetil-foszfonát-kapcsolású oligonukleotidokat nyerünk.
-29A Witting reakción kívül a 31-hidroxi-metil-nukleozidokat előállíthatjuk az α-karbociklusos nukleozidok inverziójával is. Ennél a kívánt 3'-hidroxi-metil-csoportot a down vagy a-helyen nyerjük. Ezt a csoportot védeni lehet és a 3-hidroxil-csoportot (azonosítja az exo-ciklusos metil-csoportot, amely a cukor 3' helyzetében kapcsolódik mint 3 metil) hidroxi-metilcsoporttá vagy egy hosszabb alkilcsoporttá alakíthatjuk. Az egyik módszer a 3' csoport átalakítására a ketocsoporttá való oxidáció, amelyet egy Witting reakció követ trifenil-foszforin-metilidin-difenil-foszfonáttal, majd egy redukciós lépés. Hosszabb hidroxi-alkil-csoportokat a 3-helyzetbe hasonlóképpen tudunk bevinni. Ennél a kiviteli módnál 4'-dezmetil-3'-hidroxi-metil nukleozin synthont is előállíthatunk. A 4'-dezmetil és a normál 3'-hidroxi-nukleozid közötti kapcsolás egy kétatomos kapcsolócsoporttal dinukleozid synthonokat eredményez, amelyet az előző, függő bejelentésünkben ismertettünk (alapszám 566836, benyújtva 1990. augusztus 13.). A 4 '-dezmetil-hidroxil-csoport kapcsolása a megfelelő 3'-synthonokkal mint azt a fentiekben már említettük, számos más típusú dinukleozid synthont eredményez.
Egy további lehetőség a 3'-dezoxi-3'-metil-nukleozidok metilcsoportjának funkcionalizálására elvégezhető a 3'-dezoxi-3'-ciano-nukleozidok alkalmazásával. K.E.B. Parkes és K. Taylor (Parkes K.E.B. és K. Taylor, Tetrahedron Letters 29:2995-2996 (1988)) egy általános eljárást ismertetnek a 3'-ciano-nukleozidok előállításához. Ennél az eljárásnál 5'-tritil-védett 2'-dezoxi-nukleozidokat 3'-jódoznak metil-trifenil-foszfonium-jodid alkalmazásával. Ezeket az anyagokat
-30•·Λ« »··> ·· «· • · * <t · ezután hexametildiónnal1, terc-butil-izonitrillel és 2,2'-azo-bisz(izobutrilo-nitrillel) (AIBN) kezelnek, amikoris a cianocsoport gyökös addícióját hozzák létre' a 3'-helyzetben. Ezen cianocsoport aldehicsoporttá való átalakítását magas kihozatallal lehet elvégezni. Ezután a kapott intermedier anyagot hidroxi-metil-csoporttá alakítják, amely egy igen értékes prekurzor az elektrofil synthon 1 előállításához.
Egy további módszer, amellyel az inter-cukorkötések módosíthatók a dinukleozidok előállításához, amelynél 3'-C-formil-derivatizált nukleozidokat alkalmaznak synthon 1-ként és 1' -amino-hidroxi-derivatizált nukleozidokat synthon 2 vegyületként. A synthon 1 és 2 vegyületek közvetlen kapcsolásával nyerjük a dinulkeozidokat, amelyek oximkötéssel kapcsolódnak. Ebben az esteben az oxim mint E/Z izomer van jelen. Az izomervegyületeket ezután HPLC-vel elválasztjuk. Továbbá ennél a módszernél az oxim nitrogénatomja szomszédos az upstream nukleozid 3'-végén lévő szénatommal. Az olyan dinukleozidokat, amelyek oxim-nitrogénatomja szomszédos a downstream nukleozid 5'-szénatomjával úgy állítjuk elő, hogy 5'-C-formil-deraivatizált nukleozidot mint synthon 2-t reagáltatunk egy -3'-dezoxi-3'-amino-hidroxi-metil-derivatizált nukleoziddal mint synthon 1 vegyülettel. Ebben az esetben szintén oxim E/Z izomereket is nyerünk. Mindkét esetben az oxim-kapcsolású dimerek alkalmasak az oligomerekbe való közvetlen beépítésre vagy redukáhatók a megfelelő hidroxi-amino-kapcsolású dinukleozidokká. Az oxim-kapcsolású dinukleozidok reakcióját dinukleozid formában vagy mint egy oligomer dinukleozid részeként nátrium-ciano-bórhidriddel
-31végezzük és így nyerjük a megfelelő amino-hidroxil-kapcsolású vegyületeket. A hidroxi-amino-kapcsolású dinukleozidok vagy a nagy oligomer alkilezhető az amino-hidroxil'-kötés aminocsoportjánál és így nyerjük a megfelelő N-alkil-amino-kötőcsoportot.
A 3'-C-formil-derivatizált synthon vegyületet számos szintetikus úton előállíthatjuk. Az egyik előnyös módszernél a megfelelő 3 ' -dezoxi-3'-jód-nukleozid gyökös karbonilezését alkalmazzuk. A jódvegyületet CO-val, AIBN-nel, azaz 2,2'-azobisz(izobutril-nitrillel) és TTMS-sel, azaz trisz(trimetil-szilil)-szilánnal kezeljük. Eljárhatunk úgy is, hogy 3'-dezoxi-3'-ciano-cukrot vagy nukleozidot alkalmazunk. Mind az 5 ' -C-formil-csoport (5 '-aldehido-csoportként is említjük), mind a 3'-C-formil-csoportot alkalmas módon blokkolhatunk O-metilamino-benzoil-tiol-védőcsoport alkalmazásával. Mind az 5', mind a 3'-C-formil-csoportok deblokkolását ezüst-nitrátos oxidációval lehet elvégezni.
Egy másik módszernél a 3'-C-formil-nukleozidok előállításához l-0-metil-3'-dezoxi-3'-0-metil-amino-benzol-tiol-5 ' -0-tritil-E-D-eritro-pentofuranozidot alkalmazunk. Ez a vegyület szolgál bármely 3'-dezoxi-3'-C-formil-nukleozid prekurzorjaként. Az l-0-metil-3'-dezoxi-3'-0-metil-amino-benzol-tiol-5'-0-tritil-S-D-eritro-pentofuranozidot reagáltatjuk egy megfelelő bázissal standard glükozilálási körülmények alkalmazásával, majd a kapott vegyületet deblokkolva nyerjük a kívánt nukleozidot. Még egy további másik módszernél a 3'-dezoxi-3'-ciano-nukleozidot vagy a megfelelő 3 '-dezoxi-3 '-jód-nukleozidból nyerjük vagy egy glükozilálási reakció segítségével 1-0-
-32-metil-3 1 -dezoxi-3 ' -O-ciano-5 ' -O-tritil-S-D-eritro-pentofuranoziddal.
A 3-0-amino-3-hidroxi-metil-nukleozidot és a megfelelő
51-O-amino-nukleozidot alkalmas módon állíthatjuk elő védett ftálimido intermedieren keresztül a Mitsunobu alkalmazási körülmények között N-hidroxi-ftálimid, trifenil-foszfin és diizopropil-azodikarboxilát alkalmazásával. Ezt viszont a Mitsunobu reakcióval állítjuk elő a nukleozid nem védett hidroxilcsoportján. A 3-0-amino-3-hidroxi-metil-nukleozid előállításánál tritilt alkalmazunk védőcsoportként nukleozid 5 '-hidroxilcsoport jához. Mind a purin-, mind a pirimidin-nukleozidokat a reakció előtt N-hidroxi-ftálimiddel védjük, a 3'-hidroxicsoportot pedig TBDPS-sel. A pirimidinbázisok esetén 5'-O-amino-nukleozidok kialakításánál a 3'-hidroxil-csoportot TBDPS védőcsoporttal védhetjük a ftálimidocsoportnak az 5'-helyzetbe való bevitele után.
Egy másik eljárás, amelynél az inter-cukorkötéseket módosíthatjuk hogy foszfonát-kötésü dinukleotidokat nyerjünk, a Michaelis-Arbuzov eljárás (Mazur és mtársai, Tetrahedron, 20:3949 (1984)), amelynél 31-C-foszfonát-dimereket nyerünk. Ez az eljárás alkalmazná a 3'-hidroxi-metil-nukleozidokat mint synthon 1 vegyületet. Ezt kezeljük N-bróm-szukcinimiddel, ekkor nyerjük a megfelelő 3-bróm-metil-származékot. A synthon 2 vegyületként 5'-foszfitot alkalmazunk. A synthon 1 és 2 vegyületek kapcsolásakor nyerjük a dinukleozidot, amely 3'-Cfoszfonát-kötést tartalmaz. A megfelelő 5'-C-foszfonát dimereket úgy állíthatjuk elő, hogy először a megfelelően blokkolt foszfitot reagáltatjuk a synthon 1 vegyülettel, majd *»·
-33ezután végezzük a deblokkolást és így nyerjük a 31-CH2-foszfit intermediert. A synthon 2 vegyületként 5'-bróm-nukleozidot választunk. A 3'-CH2-foszfit intermediert ezután reagáltatjuk a synthon 2 vegyülettel és így nyerjük az 5'-C-foszfát dimert. Ha blokkolt foszfitként tribenzil-foszfitot választunk, a synthon 1 vegyülettel való kapcsolás után a benzilcsoportot hidrogenolízissel távolíthatjuk el. Eljárhatunk úgy is, hogy az 5'-dezoxi-5'-bróm-nukleozidot reagáltatjuk a foszfit-észterrel és így 51-foszfonátot nyerünk. Ezt azután a 31-hidroxi-metilnukleoziddal reagáltatva nyerjük az 5'-C-foszfonát kötésű dimert.
A fentiek szerinti bármelyik dinukleozidot, amelyek hidrazinokkal, hidroxil-aminokkal vagy más találmány szerinti kötőcsoporttal kapcsolódnak, dimetoxi-tritil-csoporttal védhetjük az 5'-hidroxilcsoportnál és aktiválhatjuk a 3'-hidroxil-csoportnál történő ciano-etil-diizopropil-foszfit-csoporttal való kapcsoláshoz. Ezeket a dimereket bármelyik kívánt szekvenciába beépíthetjük standard, szilárdfázisú automatizált DNS szintézises eljárással, amelynél foszforamidát kapcsoló reagenseket alkalmazunk. Ekkor a védett dinuklezidok egy specifikált DNS szekvencia egységeivel kapcsolódnak normál foszfodiészter kötések alkalmazásával. A kapott oligonukleotid analóg vagy oligomer kevert vázú, részben normál foszfodiészter kötéseket és részben új négyatomos, találmány szerinti kötéseket tartalmaz. Ennél a módszernél egy 15-tagú szekvencia-specifikus oligonukleotidot könnyen előállíthatunk, amely 7 hidroxil-amin, hidrazin vagy más típusú kötéssel kötött dinukleozidot tartalmaz. Az ilyen szerkezet megnövekedett vízt·*·· «4 • ·
-34oldhatóságú, összehasonlítva a natív foszfodiészter kapcsolású oligonukleotidokkal.
Az egyforma vázkötésü oligonukleotidokat például a CPG-szilárdhordozós eljárás, valamint standard nukleinsav szintetizáló berendezések alkalmazásával lehet előállítani (lásd például Applied Biosystems Inc. 380B és 394 és Milligen/Biosearch 7500 és 8800s). A kezdő nukleozidot (No. 1 a 3'-terminusznál) a szilárd hordozóhoz (így például szabályozott pórusméretú üveghez) kapcsoljuk, majd a szekvencia specifikus sorrendben mindegyik további új nukleozidot hozzákapcsoljuk vagy manuális manipulációval vagy automatizált szintetizáló rendszerrel. A metilén-hidrazinkötés esetében az ismétlődő nukleozid egység lehet két általános típusú, így egy nukleozid 5'-védett aldehid funkcióval és egy 3'-dezoxi-3'-C-hidrazino-metil-csoporttal vagy egy nukleozid, amely 5 ' -dezoxi-5'-hidrazino-csoport, amelyet egy savra labilis csoporttal, így például egy 3'-dezoxi-3'-C-formil-csoporttal védünk. Mindegyik esetben a körülmények, amelyeket mindegyik ciklusban a szekvencia által megkövetelt egység beépítését végezzük, a következő: savas mosás az 5'-aldehid-védőcsoport eltávolítására; a következő, a 31-metilén-hidrazino-csoportot tartalmazó nukleozid adagolása a megfelelő hidrazon-kapcsolat kialakítására; redukció bármely változtatható szerrel a kívánt metilén-hidrazin-kötésü CPG-között oligonukleozidok kialakítására. Egy ilyen alkalmas redukálószer például a nátrium-ciano-bórhidrid.
Egy előnyös módszert mutatunk be az 1. ábrán. Ennél a módszernél szilárd hordozót alkalmzunk, amelyre rávisszük a
-35synthon 2 vegyületet 5'-védett formában. Előnyösen az 5'-hely védését DMT-vel végezzük. Ezután a synthon 2 vegyület 5' helyét felszabadítjuk, enyhe savval mossuk, majd oxidáljuk és így nyerjük az intermedier terméket. Egy előnyös módszernél az aldehidszármazékot N,N-difenil-etilén-diaminnal reagáltatjuk, így egy intermedier terméket nyerünk, ez az 5'-difenil-imidazolidino-védett synthon 2. Egy még előnyösebb kiviteli formánál az 5'-difenil-imidazolidino-védett synthon 2 vegyületet közvetlenül visszük a hordozóra. Egy másik módszernél az intermedier terméket ezt követően deblokkolhatjuk, így nyerjük a synthon
2-t, amely nukleofil csoportot tartalmaz az 5'-helyzetben. A következő lépésben a synthon 2 vegyületet adagoljuk 5'-aldehidcsoporton védett formában, így például 5'-difenil-imidazolidino-védett 3'-dezoxi-3'-C-hidrazinbázist adagolunk, ezt ezután például nátrium-ciano-bórhidrid adagolásával reagáltatjuk a már felvitt synthon 2-vel. Ezután mosás következik, a kialakult dinukleozid hidrazino-csoporton keresztül kapcsolódik. Ezután a ciklust megismételhetjük, kívánt esetben egy synthon 1 vegyület adagolásával, majd egy sav/bázis védőcsoport eltávolítás következik, így képződik a polysynthon vegyület, ez a kívánt oligomer a kívánt szekvenciában, amely módosított inter-cukor kötéseken keresztül kapcsolódik. Néhány előnyös kiviteli formánál a synthon 1 vegyület lehet egy 5'-DMT-védett 3'-C-hidrazinbázis.
Ezen lépésenként! eljárás egyik előnyös kiviteli formájánál difenil-etil-diamin adduktumot (1,3-diszubsztituált imidazolidino) alkalmazunk a synthon 2 vegyület elektrofil centrumának védésére a szilárd hordozóhoz való kötés során
-36• « 4 « · • · * r·· (Moffatt J.G. és mtársai, Journal of American Chemical Society 90:5337-5338 (1968)). A synthon 2 vegyület kapcsolását előnyösen a szilárd hordozóhoz, így például a szabályozott pórusméretü üvegszemcséhez vagy más alkalmas hordozóhoz a szakember számára ismert módon standard eljárással végezhetjük (Gait M.J., kiadó, Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach (IRL Press 1984)). Eljárhatunk úgy is, hogy az előállítást a védett, felvitt nukleozid közvetlen oxidálásával végezzük, amelyhez különböző standard oxidációs eljárásokat alkalmazunk. A synthon 2 felvitt vegyületet előnyösen egy hidrazinnal reagáltatjuk, így egy Schiff bázist nyerünk, amelyet ezt követően redukálunk. Ennél az eljárásnál a hidroxiamin szintén egy előnyös reagens.
A 2. ábrán egy további módszert mutatunk be az egyforma vázkötésű oligonukleotidok előállítására. Ennél a módszernél szintén szilárd hordozót alkalmazunk, amelyhez kötjük az 51-helyen védett synthon 2 vegyületet. Ebben az esetben a synthon 5'-helyét ftalimido-csoporttal védjük. Ezután a synthon 2 5' helyét felszabadítjuk DCM-ben oldott metil-hidrazinnal, majd DCM/metanol eleggyel mossuk. A synthon 1 vegyület 5' helyén lévő amino-hidroxin-csoportot szintén védjük ftalimido-csoporttal . Ilyen synthon 1 vegyület például az 5'-ftalimido-védett 3'-dezoxi-3'-C-formil nukleozid. A synthon 1 vegyületet a synthon 2 vegyűlettel reagáltatjuk ezután, majd eltávolítjuk az 5' helyen a védőcsoportot és a terméket mossuk, hogy felszabadítsuk a következő 5'-amino-hidroxi reakcióhelyet. A ciklust ismételjük további synthon 1 vegyület adagolásával addig, amíg a kívánt szekvenciát kialakítjuk. Ebben a
-37·*·· »··ν «4·· • · 4* · »*·♦*· ·* ♦· 4« 444·«4 szekvenciában mindegyik nukleozid oxim-kötéssel kapcsolódik egymáshoz. A kívánt oligonukleozid terminális nukleozidját a szekvenciához 5'-DMT-blokkolt 3'-dezoxi-3' -Ό-formil nukleozidként adagoljuk. Az oxim-kötésű oligonukleozidokat eltávolíthatjuk a hordozóról. Ha amino-hidroxil-kötésű oligonukleozidot akarunk előállítani, az oxim-kötéseket nátrium-ciano-bórhidriddel redukáljuk. A redukciót váltakozva is végezhetjük, mivel az oxim-kötésű oligonukleozid még a hordozóhoz van kapcsolva.
A találmány oltalmi körébe tartoznak továbbá a (IV) általános képletnek megfelelő nukleozidok - a képletben Bx jelentése változtatható báziscsoport,
Q jelentése 0, CH2, CHF vagy CF2,
X jelentése H, OH, 1-10 szénatomos alkil-, szubsztituált rövid szénláncu alkil-, alkaril-, aralkil-, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCN-csoport, 0-, S- vagy N-alkil-, 0-, S- vagy N-alkenil-csoport, SOCH3, SO2CH3, 0N02, N02, N3, NH2, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkaril-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino-, szubsztituált szilil-, egy RNS-t hasító csoport vagy egy az oligonukleotid farmakokinetikai vagy farmakodinamikai tulajdonságait javító csoport,
Y jelentése hidroxil-, amino-metil- , hidrazino-metil-, hidroxi-metil-, C-formil-, ftálimido-hidroxi-metil-, aril-szubsztituált imidazilidino-, amino-hidroxil-metil-, orto-metil-amino-benzol-tio-, metil-foszfonát- vagy metil-alkil-foszfonát-csoport,
Z jelentése H, hidroxil-, amino-metil-, hidrazino-metil-, • ···« ···· ·· ·· · · · ν · • · · β ···
-38hidroxi-metil-, C-formil-, ftálimido-hidroxi-metil-, aril-szubsztituált imidazilidino-, amino-hidroxil-metil-, orto-metil-amino-benzol-tio-, metil-foszfonát- vagy metil-alkil-foszfonát-csoport, azzal a megkötéssel, hogy ha Q jelentése 0 és Y jelentése hidroxi-metil-csoport és X jelentése H vagy OH, akkor Z jelentése H-tól vagy C-formil-csoporttól eltérő, és ha Q jelentése 0 és X jelentése H vagy OH és Z jelentése hidroxilcsoport, akkor Y jelentése amino-hidroxil-metil-, hidrazino-metil- vagy aril-szubsztituált imidazolidino-csoporttól eltérő csoport.
Előnyösek azok a vegyületek, ha X jelentése H vagy OH és Q jelentése 0.
A találmány szerinti oligonukleotid analógok felhasználhatók diagnosztikumként, terápiás szerként, kutatási reagensként és készletként. Terápiás alkalmazásnál az oligonukleotid analógokokat olyan élőlényeknek adagoljuk, amelyek bizonyos proteinek által kiváltott betegségben szenvednek. A betegeknek, amelyekről feltételezzük, hogy ilyen betegségben szenvednek, az oligonukleotid analógokat olyan mennyiségben adagoljuk, amely képes a betegség szimptómáit hatásosan csökkenteni. A szakterületen jártas szakember meg tudja határozni az optimlis dózist és a kezelések sorrendjét.
A találmány szerinti terápiás szereket előnyösen orálisan, intavénásan vagy intramuszkulárisan adagoljuk, de más egyéb adagolási módszerek, így például a transzdermális, topikális, vagy intralezionális adagolás szintén hatásos lehet. Az adagolást végezhetjük kúpok formájában is. Bizonyos kiviteli
-39• ···· ···· ·« « ·« · · · · * • · · · *·· ···»·· ·· ··· ·· ·· ···· ·· formánál a gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagok is felhasználhatók.
A következő példákban a találmány szerinti megoldást csupán illusztrálni kívánjuk a korlátozás szándéka nélkül. Ezekben a példákban az NMR adatoknál a dimerek és más magasabb oligonukleozidok monomer egységeit számoztuk, azaz Tj, T2~ként jelöljük ezeket az 5' terminusztól a 3' terminusz felé, így az 5' nukleozid T-T dimerjét Tj-ként és a 3' nukleozidét T2~ként jelöljük.
1. példa
CPG-kötött nukleozidok előállítása metilén-hidrazin kötéssel, azaz (3'-CH2-NH-NH-CH2-5') kötésű oligonukleozidok Difenil-imidazolidino-védett 5'-aldehid-timidin CPG-kötött timidint (30 /zmól timidin 1 g CPG hordozón, ABI, Foster City CA) kezelünk környezeti hőmérsékleten DMSO, benzol, DCC, piridin és trifluor-ecetsav keverékével (15 ml/15 ml/2,48 g/0,4 ml/0,2 ml) Pfitzer K.E. és J.G. Moffatt oxidációs eljárásához (Pfitzer K.E. és J. G. Moffatt, Journal of American Chemical Society 85:3027 (1963)) hasonló eljárással és így 5'aldehid-nukleozidot nyerünk. A keveréket szűrjük miután 1 éjszakán át állni hagytuk, majd a hordozót oxálsawal átmossuk (1,3 g, 5 ml benzol/DMS, 1:1 elegyben), majd 1,2-dianilinoetilénnel (3 g) kezeljük 1 órán át, majd szűrjük, acetonitrillel mossuk és így nyerjük az 5'-difenil-imidazolidino-védett 5'-aldehid timidint.
*-Dezoxi-5'-hidrazino-timidin
A hordozóhoz között 5'-aldehido-timidint hidrazin-40-hidrát/nátrium-cianobórhidrid acetonitriles oldatával kezeljük, így nyerjük a CPG-3'-kötött 5'-dezoxi-5'-hidrazino-timidint, amelyet sósavas sója formájában tárolunk.
51 -Difenil-imidazolidino-védett 31-dezoxi-3*-C-hidrazino-metil-timidin
Kereskedelmi forgalomban beszerezhető 3'-O-acetil-timidint oxidálunk, majd ezt követően védőcsoportot viszünk be és N,N-difenil-etilén-diamin-származékká alakítjuk (1,3-difenilimidazolidino). így kapjuk az ismert 5'-dezoxi-5'-difenil-imidazolidino-3'-O-acetil-timidint (Pfitzer K.E. és J.G. Moffatt, Journal of American Chemical Society 85:3027 (1963)). Ezt az anyagot hidrolizáljuk metanolos ammóniával környezeti hőmérsékleten 15 órán át. 4,5 g 51-dezoxi-5'-difenil-imidazolidino-timidint feloldunk 100 ml DMF-ben és környezeti hőmérsékleten 15 órán át trifenil-metil-foszfonium-jodiddal kezeljük, majd az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk és a visszamaradó anyagot metanolból átkristályosítjuk, így nyerjük a 3'-dezoxi-3'-jód-származékot. A 3'-dezoxi-3'-jód-5'difenil-imidazolino-timidint ezután toluolban oldjuk és hexametildiónnal, terc-butil-izonitrillel és AIBN-nek kezeljük. Ezzel a gyökös reakcióval 3'-dezoxi-3'-cianoszármazékot nyerünk, amelyet diizobutil-ammónium-hidriddel (DIBAL-H) redukálunk toluol/THF elegyben 0°-on és így nyerjük a 3 ' -dezoxi-3'-C-formil-5'-difenil-imidazolidino-timidint. Ezt az anyagot ezután hidrazin-hidráttal és nátrium-ciano-bórhidriddel kezeljük acetonitrilben és így nyerjük a 5'-difenil-imidazolidino-védett 3 ' -dezoxi-3 ' -C-hidrazino-metil-timidin-t. Ezt az anyagot előnyösen acetátsója formájában tároljuk.
2. példa
Egyforma (3'-CH2-NH-NH-CH2-51), azaz metilén-hidrazin-kötésű oligonukleozidok előállítása DNS szintetizátorral
CPG-kötött timidint az 1. példa szerinti difenil
-imidazolidino-védett 5'-aldehiddel, amelyet a 3'-terminális nukleoziddá alakítunk, Applied Biosystems Inc. (ABI) oszlopra viszünk (250 mg, 10 μπιόΐ kötött nukleozid) és egy ABI 380B automata DNS szintetizátorhoz kapcsoljuk. Az automatizált (kompjuter szabályozott) lépések, amelyek szükségesek a dezmetil-nukleozid egységeknek a növekvő lánchoz való kapcsolásához, a következők:
Lépés
Reagens vagy oldószerkeverék
Idő (perc:mp)
3% DCA diklór-etánban
3:00 diklór-etános mosás
1:30
5'-dezoxi-5'-(1,3-difenil-imidazolidino)-3'-dezoxi-3'-C-metilén-hidrazin-nukleozid (a második nukleozid), 20 μπιόΐ, 30 ml acetonitrilben
2:50 nátrium-bórhidrid (50 μτηόΐ 1:1 THF/EtOH elegyben, 50 ml)
3:00 diklór-etános mosás
2:00 recirkulációs indulás az 1. lépésnél (savas mosás)
3:00
Ezzel az eljárással nyerjük az 5'-dimetoxi-tritil-szubsztituált nukleozid egységet.
A szintézis befejezésénél a bázis védőcsoportjának eltávolítását és az oligomernek a hordozóról való eltávolítását
-42ismert eljárással végezzük (Oligonucleotide Synthesis: a practical approach, szerk.: M.J. Gait, IRL Press, 1984). A tritil-on HPLC tisztítása, majd az ezt követő ecetsavas védőcsoport eltávolítással nyerjük az oligonukleotidok acetát sóit.
3. példa
5'-Dezoxi-5'-hidrazino-nukleozidok előállítása 1 -Dezoxi-5' -hidrazino-timidin-hidroklorid
Az 5'-benzil-karbazil-5'-dezoxi-timidin előállítsásához
1,98 g, 5 mmól 51-O-tozil-timidint (Nucleosides & Nucleosides 9:89 (1990)), 4,15 g (25 mmól) benzil-karbazidot, 2 g 3 A aktivált molekulaszitát és 100 ml vízmentes dimetil-acetamidot keverünk 110°C fürdőhőmérsékleten a nedvesség kizárásával 16 órán át. A kapott terméket lehűtjük, csökkentett nyomáson betöményítjük (fűtőhőmérséklet kisebb mint 50°C), a maradékot szilikagél oszlopon tisztítjuk (5,45 cm, CH2C12/MeOH=9/l, tf/tf). A homogén frakciókat egyesítjük, szárazra pároljuk és a visszamaradó habanyagot etanolból átkristályosítjuk, így 0,7 g (36%) 5'-benzil-karbazil-5'-dezoxi-timidint nyerünk, op. 201°C.
TH NMR (Me2SO-dg) ő 1,79 (s, 3, CH3) , 2,00-2,18 (m, 2, C2CH2), 2,95 (t, 2, C5, CH2), 3,75 (m, 1, C4, H), 4,18 (m, 1, C3, H), 4,7 (brs, 1, 0'2NH), 5,03 (s, 2 PhCH2, 5,2 (d, 1, C3,H), 6,16 (t, 1, Ci, H), 7,2-7,4 (m, 5, C6H5), 7,6 (s, 1, C6H), 8,7 (brs, 1, CH2NH), 11,2 (brs, 1, C3NH). Az 5'-dezoxi-5'-hidrazino-timidin sósavas sójának higroszkópos poranyag formájában való előállításához 0,78 g (7 mmól) fenti karbazátot kezelünk szénhordozós palládium jelenlétében (150 mg, 10%) MeOH/HCl vízmentes elegyében (30 ml,
-432t% sósav) atmoszférikus hidrogénnyomáson szobahőmérsékleten 1,5 órán át. A metanolos oldatot ezután celliten leszűrjük a s katalizátor eltávolítására, a szűrőlepényt kétszer 25-25 ml etanollal átmossuk, a szűrletet vákuumban betöményítjük és a visszamaradó anyagot 1 éjszakán át szárítjuk a sósavnyomok eltávolítására. A kapott sárga anyagot 3 ml metanolban oldjuk és cseppenként 150 ml etil-acetáthoz adagoljuk gyors keverés közben. A kiváló csapadékot leszűrjük, háromszor 100-100 ml etil-acetáttal átmossuk és a halványsárga, szilárd anyagot vákuumban szárítjuk, így 0,51 g, 88% 5'-dezoxi-5'-hidrazino-timidin-hidrokloridot nyerünk (higroszkópos poranyag).
XH NMR (Me2SO-d6) δ 1,81 (s, 3, CH3) , 2,02-2,22 (m, 2, C2, CH2), 3,2 (m, 2, C5, CH2), 3,8 (m, 1, C4H), 4,2 (m, 1, C3H), 6,17 (t, 1, CX,H), 7,54 (s, 1, C6H), 1,,18 (brs, 1, C3NH).
4. példa
5'-tritil-1-[2,3-didezoxi-3-C-(forrni1)-E-D-eritro-pentofuranozil]-timin- és -uracil előállítása A módszer
3*-C-Ciano-3'-dezoxi-5*-0-tritil-timidin
A következő műveleteket védősisakban kell végezni és minden elővigyázatosságot meg kell tenni a reagens gőzök belélegzésének elkerülésére.
g 0,01 mól 3'-dezoxi-3'-jód-5'-O-tritil-timidin-t (Verheyden, J.P.H., Moffatt J.G., J. Org. Chem. 35:2868 (1970)), 36 g (22,7 ml) 0,11 mól hexametilditónt, 166 g (225 ml, 2 mól) terc-butil-izocianid és 1,6 g (10 mmól) AIBN
-44keverékét 2 1 frissen, Na/benzofenon jelenlétében desztillált toluolban erőteljesen oxigénmentesítünk úgy, hogy a reakciókeveréken 30 percen át argont buborékoltatunk keresztül, majd a keveréket 38°-on 13 órán át melegítjük. A keverékhez ezután 60°C hőmérsékleten 1,6 g (10 mmól) AIBN-t adunk és a melegítést még 24 órán át folytatjuk. Ezen idő alatt az AIBN adagolást hasonló módon még háromszor megismételjük. A reakciókeveréket ezután szobahőmérsékletre hűtjük és egy szilikagéllel töltött oszlop tetejére (1,5 kg, hexánban) adagoljuk és a következő oldószerrel eluáljuk: hexán:Et2O (100% hexán -> 100% etanol 10 % gradienssel, minden cserénél 1 1 eluenst alkalmazva). A szennyeződések legtöbbjét a gradiens eluálás során mint nem-poláros vegyületeket eltávolítjuk. A végső eluálást 2 1 Et20-val végezzük, a megfelelő frakciókat egyesítjük, betöményítjük és így két vegyületet nyerünk olyan sorrendben, ahogy levettük őket, i) 12,93 g (25%) 3'-C-ciano
-3'-dezoxi-5'-O-tritil-timidin-t, fehér por formájában (átkristályosítva toluol/Et20 elegyből, op. 153-157°C.
1H-NMR (CDCI3) δ 8,83 (s, 1, NH) , 7,04-7,4 (m, 18,5, TrH,
CgH és 0,5 ArH toluolból), 6,10 (dd, 1, H, Hp, Jpi1
Hz, Jit,2,=7»l Hz), 4,20 (m, 1, H4 1 , 131,41=8,4 Hz,
J41,405'=2,8Hz), 3,33-3,60 (m, 3, Hji( 5, 3) > 2,68 (m,
1, H2' , J2, /2,'=í3'® Hz) , 2,52 (m, 1, H2), 2,28 (s, 1,5,
0,5 CH3 toluolból) , 1,50 (s, 3, CH3),
Elemanalízis a C3qH27N3Ö4 összegképletű vegyületre:
(toluolból krist.) számított: C 74,56, H 5,79, N 7,78 mért: C 74,27, H 5,78, N 7,66
-45a reakciókeverék még tartalmaz továbbá 4,82 g (10%) 1-(3’-Cciano-2',3'-didezoxi-51-O-tritil-S-D-treo-pentofuranozil)timint l-H-NMR (CDCI3) δ 8,72 (s, 1, NH) , 7,03-7,44 (m, 18,5, TrH,
CgH és 0,5 ArH toluolból), 6,13 (pszeudo t, 1, HT1,
J1',2'=6 < 7 Hz, J1',2=5'7 Hz) / 4,09 (m, 1, H4 ' , J3' /4.=6,7
Hz, J4',5 1; =4,9 Hz), 3,56 (m, 2, h5',5' 3,28 (m, 1, H3. ,
J31,2'=8,2 Hz, J31,2=5,2 Hz) / 2,70 (m, 1, h2 ' , J2' ,2=14
Hz), 2,28 (s, 1,5, CH3 toluolból) és 1,60 (s, 3, CH3)
Elemanalízis a C3QH27N3O4O,5 ΟγΗθ (toluolból krist.) összegképletű vegyületre:
számított: C 74,56, H 5,79, N 7,78 mért: C 74,10, H 5,74, N 7,52
Epimerizáció
0,3 g (0,61 mmól) 1-(3'-C-ciano-2,3'-didezoxi-5'-0-tritilβ-D-treo-pentofuranozil)-timin-t 20 ml metanolban szuszpendálunk, majd cseppenként hozzáadunk 1 n NaOMe-t addig, amíg az oldat pH-ja kb. 9 lesz. A kapott keveréket ezután visszafolyatás közben 20 órán át melegítjük, majd az oldatot 0°-ra lehűtjük, 1 n HCl/MeOH eleggyel semlegesítjük és csökkentett nyomáson betöményítjük. A visszamaradó anyagot a fentiek szerint tisztítjuk, így 0,186 g (62%) 3'-C-ciano-3'-dezoxi-51-O-tritil-timidin-t nyerünk. A 3'-dezoxi-3'-C-ciano-5'-0-tritil-timin vegyület előállítását a következő irodalmi helyen ismertetik: (Tetrahedron Letters 29:2995 (1988)). E leírásnál megemlítik, hogy a 31-dezoxi-3'-C-ciano-5'-0-tritil-timin-t egyetlen termékként kapják, azonban mi azt tapasztaltuk, hogy keverék képződik. A fenti epimerizációnál ezen keverék xylo komponensét
-46a kívánt vegyületté (3'-dezoxi-3'-C-ciano-5'-O-tritil-timin) konvertáljuk.
3'-Dezoxi-3'-C-formil-5'-O-tritil-timin mólos toluolos DIBAL-H oldatot (50 ml) adagolunk öt részletben 5 óra alatt 10 ml vízmentes THF-ben oldott 9,92 g (20 mmól) 3'-C-ciano-3'-dezoxi-5'-O-tritil-timidinhez keverés közben argonatmoszférában 0°-on. A keverést szobahőmérsékleten 1 órán át még folytatjuk, majd visszahűtjük 0°-ra. Ekkor 25 ml MeOH-t adagolunk cseppenként a hideg oldathoz keverés közben, majd az adagolás befejezése után az oldatot szobahőmérsékletre melegítjük. Ekkor 11 ml vizes Na2SÜ4 oldatot adagolunk a keverékhez, 12 órán át keverjük, majd 30 g porított, vízmentes Na2SC>4-et adagolunk és a szuszpenziót 30 percig keverjük. Ezután a szuszpenziót szűrjük, a visszamaradó anyagot jól átmossuk MeOH/CH2C12=l/9 (tf/tf) eleggyel, amíg a terméket teljesen kimostuk. A szűrleteket ezután egyesítjük, vákuumban betöményítjük, amikoris gumiszerű anyagot kapunk, ezt szilikagélen kromatografáljuk (CH2C12/MeOH, 100% CH2C12~>9:1, tf/tf), amikoris 5,45 g (50%) 3 ' dezoxi-3'-C-formil-5'-0-tritiltimin-t nyerünk fehér hab formájában.
l-H-NMR (CDC13) 6 9,61 (d, 1, CHO, J3. ,3..=1,5 Hz), 8,44 (s,
1, NH) , 7,46 (s, 1, C6H), 7,17-7,45 (m, 15, TrH) , 6,04 (pszeudo t, 1, Hí 1, Ji.,2,=5<3 Hz, Ji.,2=6,6 Hz), 4,31 (m, 1, H411, J4 1 5 1 =3,3 Hz, J3 1,4 1 =7 Hz), 3,28-3,55 (m, 3, 1^5.,5..,3.), 2,69 (m, 1, H2 ') , 2,28 (m, 1, H2), 1,48 (s, 3, CH3),
Elemanalízis a C3oH28N2°5 H2° ősszegképletű vegyületre: számított: C 70,03, H 5,88, N 5,44
-47mért: C 70,40, H 6,00, N 5,33
1-[3-Dezoxi-3-C-(formil)-5-O-tritil-B-D-eritro-
-pentofuranozil]-uracil
0,96 g (2 mmól) 3'-ciano-2',3'-didezoxi-5'-0-tritiluridint (hasonlóképpen előállítva, mint a fenti timidin analógot) 20 ml THF-ben argonatmoszférában 4 ml 1 mólos, toluolos DIABL-H oldathoz (Aldrich) adagolunk keverés közben -10°-on 10 perc alatt. 30 perc elteltével a reakciókeverékhez 5 ml metanolt adagolunk -10°-on, majd a keveréket tovább keverjük szobahőmérsékleten 30 percig, majd 25 ml CH2C12~vel hígítjuk, végül vákuumban betöményítjük. Ezt a műveletet CH2C12-vel megismételjük (3x25 ml) a maradék THF eltávolítására. A maradékot ezután flash kromatográfiával szilikagélen tisztítjuk (25 g, CH2C12/MeOH=9/l) (átkristályosítás ugyanezzel), így nyerjük a 5'-O-tritil-3'-Cformil-2',3'-didezoxi-uridint, 0,53 g, 53%, op. 100°C.
l-H-NMR (CDCI3) ö 2,25-2,8 (m, 2, CH2), 3,4 (m, 1, C31H), 3,45-3,6 (m, 2, C5CH2), 4,37 (m, 1, C4H), 5,4 (d, 1, C5H), 6,1 (m, 1, CrH), 7,2-7,4 (m, 15, C6H5), 7,81 (d, 1, C6H), 7,95 (br s, 1, NH), 9,61 (s, 1, HC=O).
B eljárás
1-[3-Dezoxi-3-C-(formil)-5-0-tritil-B-D-eritro-pentofuranozil]-uracil l-Metil-5-Ο-(terc-butil-fenil-szilil)-2,3-didezoxi-3-C(formil)-D-eritro-pentofuranozilt állítunk elő olaj formájában 90%-os kihozatallal l-metil-5-(terc-butil-fenil-szilil)-2,3-didezoxí-3-C-ciano-D-eritro-pentofuranozíl DIBAL-H-val végzett redukciójával (Tetrahedron, 44:625 (1988). A 3-C-formil-
-csoportot oximmá alakítjuk metoxi-aminnal. Az oximmal blokkolt intermediert ezután glükoziláljuk szililezett timinnel, így nyerjük a cim szerinti vegyületet a- és β-kfeverékét. A védőcsoport eltávolítása után a β anomer megegyezik az A eljárással nyert vegyülettel.
C eljárás
1-[3-Dezoxi-3-C-(forrni1)-5-0-tritil-S-D-eritro-pentofuranozil]-uracil és -timin
0,59 g (4 mmól) 3'-dezoxi-3'-jód-5'-tritil-timidin-t elkeverünk 2,87 g (1,2 mmól) tirsz(trimetil-szilil)-szilánnal, 12 mg (0,072 mmól) AIBN-nel és 20 ml toluollal egy üvegedényben és argonnal telítjük úgy, hogy szobahőmérsékleten argont buborékoltatunk keresztül rajta. Az üvegedényt ezután egy rozsdamentes acélból készült autoklávba merítjük, szén-monoxiddal nyomás alá helyezzük (80 psi), bezárjuk és 90°C fürdőhőmérsékleten 26 órán át melegítjük. A keveréket ezután 0°-ra lehűtjük, a CO gázt óvatosan kiengedjük (védősisakban), a terméket flash kromatográfiával tisztítjuk (szilikagélen, EtOAc/hexán=2/l), majd a megfelelő frakciókat egyesítjük, így 0,3 g (61%) cim szerinti vegyületet nyerünk hab formájában.
A 2',3'-didezoxi-3'-jód-5'-tritil-uridin gyökös karbonilezését hasonlóképpen elvégezve nyerjük a 3'-C-formil-uridin-származékot.
5. példa
Metilén-hidrazzonnal (3'-CH=NH-NH-CH2-5'), metilén-hidrazinnal (3'-CH2-NH-NH-CH2-5') és metilén(dimetil-hidrazonnal) (3·-CH2-N(CH3)-N-(CH3)-CH2-5') kapcsolt dinukleozidok előállítása
3'-Dez(oxi-foszfiniko)-3'- [metilén-(hidrazon) ] -5 * -0tritil-timidilil-(31->51) - 5 ·-dezoxi-timidin
0,645 g (1,3 mmól) 3'-dezoxi-31-C-formil-5'-O-tritiltimidin-t elkeverünk 0,397 g (1,36 mmól) 5'-dezoxi-5'-hidrazino-timidin-hidrokloriddal vízmentes CH2/MeOH/AcOH eleggyel (20 ml/10 ml/0,5 ml) és a kapott keveréket 30 percen át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután az oldószert vákuumban
eltávolítjuk és a kapott hidrazon intermediert analizáljuk.
!h NMR (DMSO-dg) ö 1, 1 (br s , 2, NH) , 8,3 (s, 1, C=N-NH),
7,5-7,74 (m, 17, TrH, 2C6H), 6,8 (ld, lt, 1, HC=N, két
izomer), 6,0-6,1 (2m, 2, Hx 1 ), 5,30 (br t, 1, OH), 3,8-4,2
(3m, 3, H3!, 2 H4 • ) , 3,0-3,3 (m, 5, 2H5',5 π, H31), 2,0-2,4
(m, 4, 2H2' t 2)· 1,5 és 1,7 (2s, 6, 2 CH3)
31-dez(oxi-foszfiniko)-3'-[metilén-(dimetil-hidrazo) ] - 5 * -O-tritil-timidilil-(3'->5')-5'-dezoxi-timidin
A fenti hidrazon dimert feloldjuk 10 ml AcOH-ban és hozzáadunk kis részletekben NaBHjCN-t (4x0,12 g, 7,74 mmól) keverés közben szobahőmérsékleten 30 perc alatt. A kapott oldatot további 15 percig keverjük, majd hozzáadunk 3,9 ml (26 mmól) vizes HCHO-t, 3,9 mmól NaBH3CN-t és 10 ml AcOH-t. A kapott szuszpenziót még 15 percig keverjük, majd az oldatot vákuumban betöményítjük, a visszamaradó anyagot 3x25-25 ml metanollal együtt bepároljuk, így nyerjük a metilén-hidrazo dimert.
1H- NMR (CDCI3) δ 6,8-7,8 (m, 15, TrH, 2 C6H), 6,12 (m, 2,
2HX ' ) , 4,20 (m, 1, T2, H31), 4,05 (m, 1, T2, H41 ) , 3,89
(m, 1, TI H41), 3,80 (2, 6, 2 OCH3), 3,21-3,53 (m, 2, TI,
H51 /5.i) , 2,11-2,75 (m, 10, T2 H5i/5i.H, TI H3.1, TI H3 · , TI
-50Τ2 Η2',2)» 2,26 <8, 6, 2N-CH3), 1,88 és 1,49 (2s, 6, 2 CH3), és más protonok.
' -dez (oxi-foszf iniko) -31 - [metilén- (dinietil-hidrazo) ] -
-timidilil-(3'->5')-5'-dezoxi-timidin
A fenti hidrazin dimert ezután 1 ml 37%-os sósavval keverjük 25 ml etanolban szobahőmérsékleten 24 órán át, majd a kapott keveréket NH40H-val kb. pH=8-ig semlegesítjük, majd szárazra pároljuk. A visszamaradó anyagot fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk (supelcosil LC18, 5 m, H2O:CH3CN gradiens) , így 0,61 g cim szerinti metilén(dimetil-hidrazin)-kapcsolású dimert nyerünk (89%).
XH NMR (90°C, DMSO-dg + 1 csepp D2O), δ 7,66 és 7,43 (2s,
2, 2 C6H) , 6,02 (pszeudo t, 1, T2 Hí i , Jji>2i=7,2 Hz, Jl',2=7»7 Hz)/ 5,96 (pszeudo t, 1, TI Ηχ, Jj>/2i=5,6 Hz, □ 1!>2ιι=6,2 Hz), 4,12 (m, 1, T2 H3i) , 3,90 (m, 1, T2 H4 > ) , 3,71 (m, 1, TI H4. ) , 3,61 (m, 2 TI, H5. , 5 ·>) , 2,4-2,8 (m,
5, T2 H5>/5„, TI H3 π, TI H31) , 2,29 (2s, 6, 2 N-CH3), 2,12 (m, 4, 2H2./2)» 1/76 és !>74 (2s, 2 CH3>
Elemanalízis a C23H34Ng0g H2O összegképletű vegyületre: számított: C 51,10, H 6,71, N 15,54 mért: C 51,05, H 6,68, N 15,54
MS FAB m/z 523 (M+H)+.
6. példa
Metilén(dimetil-hidrazin) (3 1 -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-5') kapcsolású 5'-dimetoxi-tritil-3'-S-ciano-etoxi-diizopropil-foszforamidit dinukleozidok előállítása * -dez (oxi-foszf iniko) -3 * - [metilén- (dimetíl-hidrazo) ] -
-timidilil-5' -0- (dimetoxi-trifenil-metil) - (3' ->5') -3 ' -0.: *♦*: ···: .··. .·· • « « · «· · *····· «a ··· · · ·« ·«·« ··
-51(β-ciano-etil-N-diizopropil-amino-foszfiril)-timidin
Az 5. példa szerinti metilén(dimetil-hidrazin) dimert dimetoxi-tritilezzük ismert eljárás szerint (Oligonucleotide Synthesis: a practical approach, szerk.: M.J. Gait, IRL Press, 1984), amikoris homogén habanyagot kapunk.
XH-NMR (CDC13) δ 6,8-7,8 (m, 20, DMTr, 2H6), 6,12 (m, 2, 2H.), 4,20 (m, 1, T2H31), 4,05 (m, 1, T2 H4.), 3,89 (m, 1, Ί1Η41), 3,80 (s, 6, 2 DMTr OCH3), 3,21-3,53, (m, 2, Tx
H5',5), 2,11-2,75 (m, 9, Tx Ηβΐ^η, Η3», Tx H3 1 , 2H2i/2«), 2,26 (2s, 6, 2 N-CH3), 1,88 és 1,49 (2s, 2, C5 CH3) .
A fenti anyagot ismert módon foszfitilezzük (Oligonucleotide Synthesis: a practical approach, szerk.: M.J. Gait, IRL Press, 1984), amikor 65%-os kihozatallal nyerjük a cim szerinti vegyületet.
XH-NMR (CDCI3) δ 6,14 (m, 1, T2 Hx.), 6,01 (m, 1, TI Hx.), 3,80 (s, 6, 2 0 CH3), 2,23 (m, 6, 2 N-CH3), 1,78 és 1,45 (2s, 6, 2 CH3) és más protonok.
31P NMR (CDCI3) δ 149,43 és 148,85 ppm.
7. példa
Közbenső metilén(dimetil-hidrazin) (3'-CH2-NCH3-NCH3-CH2-5')kötésű oligonukleozidok előállítása
CPG-kötött timidint (vagy bármely más nukleozidot, amely
31-terminális bázissá alakítható) Applied Biosystems Inc. ABI oszlopra viszünk (250 mg, 10 μπιόΐ, kötött nukleozid) és az oszlopot IBA 380B automata DNS szintetizátorhoz kapcsoljuk. A standard automatizált (kompjuter szabályozott) lépésekkel foszforamidát reagensek alkalmazásával visszük fel a metilén* ·
-hidrazin-timidin dimert a kívánt szekvenciában és a kívánt helyeken.
8. példa (3'-CH2-NH-S-CH2-5') kötés előállítása
31-dez(oxi-foszfiniko)-3'-[metilén-(dimetil-szulfenil) ] -timidilil-(3'->5')-5'-dezoxi-timidin
A cím szerinti vegyületet két kiindulási nukleozidból állítjuk elő. Az első nukleozidot a 3'-0-benzil-5'-dezoxi-5'-merkapto-timidint három lépésben nyerjük a 3'-O-benzoil-timidinből kiindulva J.H. Marriott és mtársai szerint (J.H. Marritott és mtársai, Tét. Letts., 31:7385 (1990)) az 5'-S- [9-(4-metoxi-fenil)-xantin-9-il]-csoport kialakításával, majd az ezt követő deblokkolással, amikoris az 5'-SH-csoportot nyerjük. A második nukleozidot a 3'-C-metil-amino-5'-O-tritil-timidint három lépésben állítjuk elő a 3'-C-formil-5'-0-tritil-timidinből kiindulva a 4. példában leírtak szerint. A három lépéses eljárás magában foglalja az NaBH4~gyel végzett formilcsoport redukciót, majd ezt követően az azidocsoporttá való alakítást L1N3/DMF elegyben, majd következő lépésként TBTH/toluolos redukcióval nyerjük a 3'-C-CH2NH2 csoportot. 1 mmól 3'-C-metil-amino-51-O-tritil-timidin nukleozidot adagolunk 4 mmól vizes nátrium-hipoklorid oldathoz, így nyerjük a klóramid intermediert, amelyet 0°-ra lehűtünk, majd 0,9 mmól 3'-O-benzil-5'-dezoxi-5'-merkapto-timidin nukleoziddal reagáltatjuk 15 percen át, majd ezután a szokásos feldolgozással a kromatográfiás tisztítással nyerjük a cim szerinti vegyületet.
9. példa
5-0-ftálimido-nukleozidok előállítása
51-O-Ftalimido-timidin
24,22 g (0,1 mól) timidint 21,75 g (0,13 mól) N-hidroxi-ftálimidet, 34 g (0,13 mól) trifenil-foszfint és 400 ml vízmentes DMF-et tartalmazó oldathoz 30 ml (0,15 mól) diizopropil-azodikarboxilátot adagolunk 3 óra leforgása alatt 0°-on. Az adagolás befejezése után a reakciókeveréket szobahőmérsékletre melegítjük és a keverést még 12 órán át folytatjuk. Az oldatot ezután vákuumban betöményítjük (0,1 mm, kisebb mint 40°), így egy narancsvörös színű, gumiszerű anyagot nyerünk, ezt többször Et20-val átmossuk, majd a mosófolyadékot eldobjuk. A félig szilárd anyagot 500 ml etanolban szuszpendáljuk és 90°-ra melegítve a terméket feloldjuk. Hűtésre 30,98 g (80%) 5'-0-ftálimido-timidin válik ki három részletben fehér, kristályos anyag formájában, op. 233-235°C (bomlik).
1H-NMR (DMSO-dg) δ 11,29 (s, 1, NH) , 7,85 (m, 4, ArH),
7,58 (s, 1, C6H), 6,20 (t, 1, Ejj, J1>/2>=7,8 Hz, Jli,2=6/5 Hz), 5,48 (d, 1, OH31), 4,36 (m, 3, ^41515»), 4,08 (m, 1, H31), 2,09-2,13 (m, 2, H2./2..), 1/79 (s, 3, CH3)
Elemanalízis a C13H17O7N3 0,7 H20 összegképletű vegyületre:
számított: C 54,04, H 4,46, N 10,51 mért: C 53,81, H 4,25, N 10,39
2'-Dezoxi-5'-O-ftalimido-uridin
Analóg reakcióval 21-dezoxi-uridinből kiindulva nyerjük a megfelelő 2'-dezoxi-5'-O-ftalimido-uridint, op. 241-242°C.
10. példa
5' -O-Ftalimido-3·-O-(terc-butil-difenil-szilil)-timidin és 2 · -dezoxi-5'-O-ftalimido-3'-O-(terc-butil-fenil-szilil) -uridin előállítása ' -O-(terc-butil-difenil-szilil)-5'-O-ftalimido-timidin
8,54 g (22 mmól) 5'-O-ftalimido-timidint elkeverünk 6,9 ml (26,5 mmól) t-butil-difenil-szilil-kloriddal és 3,9 g (57,3 mmól) imidazollal 130 ml vízmentes DMF-ben és szobahőmérsékleten 16 órán át argonatmoszférában keverjük. A keveréket ezután 600 ml jeges vízbe öntjük, az oldatot kétszer 400-400 ml CH2C12-vel extraháljuk, a szerves fázist kétszer 250-250 ml vízzel mossuk, majd MgSÖ4-en szárítjuk. A CH2CI2 réteget betöményítjük, a gumiszeru anyagot szilikagélen kromatografáljuk (EtOAc/hexán=l/l tf/tf), így 12,65 g (92%) 3'-0-(terc-butil-difenil-szilil)-5'-O-ftalimido-timidint nyerünk kristályos anyag formájában, op. 172-173,5°C.
1H NMR (DMSO-dg) δ 11,31 (s, 1, NH), 7,83 (m, 4, ArH),
7,59 (m, 4, TNDPhH) , 7,51 (S, 1, CgH), 7,37-7,45 (m, 6,
TBDPhH), 6,30 (dd, 1, Ηχι, Ji ' , 2 '=8,8 Hz, J}i(2=5|6) f
4,55 (m, 1, H41), 4,15 (m, 1, H3 .), 3,94-4,04 (m, 2,
H5 «,5), 2,06-2,13 (m, 2, H2' >2 ), 1,97 (s, 3, CH3), 1,03
(s, 9, C(CH3)3)
Elemanalízis a C33H35O7N3Si összegképletű vegyületre: számított: C 65,26 H 5,64, N 6,71 mért: C 65,00, H 5,60, N 6,42 ' -0-(Terc-butil-difenil-szilil)-2'-dezoxi-5'-O-ftalimido-uridin
Analóg módon eljárva 2'-dezoxi-5'-O-ftalimido-uridinból
-55kiindulva nyerjük a cim szerinti 3'-0-(terc-butil-difenil-szilil)-2 ' -dezoxi-5'-0-ftalimido-uridint.
11. példa
5·-O-amino-nukleozidok előállítása
51-0-Amino-3*-0-(terc-butil-difenil-szilil)-timidin g (16 mmól) 3'-0-(terc-butil-difenil-szilil)-5'-0-ftalimido-timidin-t 100 ml vízmentes CH2C12-ben feloldunk és keverés közben argonatmoszférában hozzáadunk 1,3 ml (24 mmól) metil-hidrazint és a kapott oldatot 12 órán át keverjük. Az oldatot ezután 0°-ra hűtjük, szűrjük, a fehér maradékot kétszer 25-25 ml CH2Cl2-vel átmossuk, a szűrleteket egyesítjük és betöményítjük. A visszamaradó gumiszerű anyagot szilikagélen kromatografáljuk (CH2Cl2/MeOH=98/2 tf/tf), amikoris 7,03 g (89%) 5'-0-amino-3'-0-(terc-butil-difenilszilil) -timidint nyerünk, amelyet CH2Cl2/MeOH-ból átkristályosítunk, op. 141-143°C.
1H NMR (DMSO-dg) δ 11,29 (s, 1, NH), 7,42-7,62 (m, 11,
TBDPhH, Cg H) , 6,25 (dd, 1, Ηχ > , ΰχ>,2 ,=8'4 Hz, Jl',2=6/3 Hz), 6,02 (s, 2, NH2), 4,35 (m, 1, H4.), 4,04 (m, 1, H3.), 3,34-3,51 (m, 2, H51511), 2,04 (m, 2, H2'/2), 1,73 (s, 3, CH3), 1,03 (s, 9, C(CH3)3)
Elemanalízis a C2gH33O5N3Si összegképletű vegyületre: számított: C 63,00, H 6,71, N 8,48 mért: C 62,85, H 6,67, N 8,32
12. példa (3 '-CH=N-0-CH2-5 ')-kötésű oligonukleozidok előállítása (oxim-kötésű dimer)
3'-Dez(oxi-foszfiniko)-3 * -(metilidinén-nitrilo)-timidilil-56*··· ··*<»
«· *· • » · • ··« • · * ···· ·· (3'->5')-timidin
0,99 g (2 mmól) 3'-dezoxi-3'-C-formil-5'-0-tritil-timint elkeverünk 0,99 g (2 mmól) 5'-amino-3'-0-(terc-butil-difneilszilil) -timidinnel és 0,3 ml ACOH-val 20 ml vízmentes CH2CI2ben, majd 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Az oldószert vákuumban ezután eltávolítjuk, a nyers blokkolt 3'-dez(oxi-foszfiniko)-3'-(metilidinén-nitrilo)-timidilil-(3'->5')-3'-(terc-butil-difenil-szilil)-timidin terméket ezután 20 ml THFben feloldjuk, hozzáadunk egy 5 ml 1 mólos tetrahidrofurános nBu4NF-et és a keveréket szobahőmérsékleten keverjük. 1 óra elteltével az oldatot szilikagélen kromatografáljuk (CH2C12/MeOH=99/4, tf/tf), így nyerjük a 3'-deblokkolt dimert. Ezt 50 ml vízmentes MeOH-ban feloldjuk és hozzáadunk 2,5 ml (0,14 mólos) MeOH/HCl oldatot. A reakciókeveréket szobahőmérsékleten 15 órán át keverjük, majd 10 ml vízmentes piridint adagolunk hozzá és az oldószert elpárologtatjuk. Az így nyert nyers terméket, ami a oxim dimer, szilikagélen kromatografáljuk (CH2C12/MeOH=92/8), így 0,87 g (89%) cim szerinti 3'-dez(oxi-foszfiniko)-3'-(metilidinén-nitrilo)-timidilil-(3'->5,)-3l-timidint nyerünk E/Z izomerek keverékének formájában. A két geometriai izomert fordított fázisú HPLC-vel választjuk el (Supelcosil LC18, 5μ, H2/CH3CN gradiens). (A cim szerinti vegyület Z-izomerje).
1H NMR (DMSO-dg) δ 11,28 (br s, 2, 2NH), 7,39 és 7,78 (2s,
2, 2C6H) , 6,92 (d, 1, TI H311, J3 1 # 3» =6,7 Hz) , 6,15 (pszeudo t, 1, T2 Hí·, Ji'f2'=7,8 Hz, J1',2=6'3 Hz), 6,04 (dd, 1, TI Η1Ι( J1I/2'=7,1 Hz, J11/2=6/3 Hz), 5,34 (d, 1, T2 OH), 5,12 (t, 1, TI OH), 4,11-4,25 (m, 3, T2 H5.,5n, T2
-57Τ2
TI
H41), 3,90 (m, 1, TI H4>), 3,49-3,69
H3), 2,06-2,31 (m, 4, TI H2',2» T2 H2 ',2)» 1,73 (s,
6,
2CH3),
Elemanalízis a C21H27N5O9.H2O összegképletű vegyületre:
számított: C
49,31
H 5,72, N
13,69 mért:
49,32,
H 5,57, N
13,59 (a cim szerinti vegyület
E-izomere) !h NMR (DMSO-dg) δ 11,3 (2 br s,
2, 2NH), 7,81 (S, 1,
c6H), 7,52 (d, 1, TI H311, J3 1 , 3 11 =6,7 Hz), 7,45 (S, 1,
c6H), 6,10 (pszeudo t, 1, T2 Hí., Ji ',2'=7» 6 Hz,
Jl',2' 1 =6,4 Hz), 6,04 (dd, 1, TI Hí·, J1',2'=7'3 Hz,
Jl',2' i=3,4 Hz), 5,36 (d, 1, T2 OH), 5,16 (t, 1, TI OH) ,
(m,
4,07-4,22 , TI T2 H4 . ) , (m, 3, T2 H3 1 t 5 t t 5 ··) , 3,91
3,50-3,73 (m, 2, TI H51511), 3,12 (m,
1,
TI H3.), 2,05-2,44 (m,
4, TI
6,
2CH3).
MS FAB: M/Z 494 (M+H)+
13. példa
Foszforamidátot tartalmazó (3'-CH=N-O-CH2-5')-kötésű oligonukelozid előállítása
3'-Dez(oxi-foszfiniko)-3'-(metilidinén-nitrilo)-5'-O-(dimetoxi-trifenil-metil)-timidilil-(3'->5')-3'-O-(ficiano-etil-diizopropi1-amino-foszfiril)-timidin
A 12. példa szerinti izomer dimert a nukleozid 5'-végénél lévő hidroxilcsoporton dimetoxi-tritilezzük, majd a nukleozid 3'-végénél lévő hidroxilcsoporton a 3'-Ο-β-ciano-etil-diizopropil-foszforamidit-származékévá alakítjuk a következő irodalmi helyen leírtak szerint eljárva: Oligonucleotid Synthesis: a practical approach, szerk.: M.J. Gait, IRL Press,
-581984, így nyerjük a cim szerinti vegyületet.
l-H NMR (CDCI3) δ 8,77 (br S, 2, 2NH, 7,68 (s, 0,77, TI C6H E-izomer), 7,59 (s, 0,23, TI CgH E-izomer), 6,3 (ps t, 1, T2 CHi1), 6,14 (m, 0,77, TI CHj1, E-izomer), 6,08 (m, 0,23, Tj CHi1 Z-zimoer), 1,80 és 1,50 (2S , 6, 2 CH3) és más protonok.
31P NMR (CDCI3) 150,77 és 150,38 (Z-izomer), 150,57 és 150,38 (E-izomer).
A védett dimert megfelelően lehet tárolni és felhasználni egy automata DNS szintetizátorban (ABI 380B) akkor és amikor szükséges a terápiás értékű oligomerekbe való specifikus beépítésre. Továbbá, példaképpen az oxim-kötésű dimert megfelelő hidroxi-amin-kötést tartalmazó dimerré redukáljuk, amely viszont alkilezhető a megfelelő hidroxil-metil-amin vagy más hidroxil-alkil-amin-kötések kialakításához.
14. példa (3'-CH2-NH-O-CH2-5') kötésű oligonukleozidok előállítása · -Dez (oxi-foszf iniko) -3 1 - (metilén-imino) -tixnidilil- (3 ' ->5')-timidin
0,49 g (1 mmól) (3'-CH2-NH-0-CH2-5') kötésű oligonukleozidok előállítása 3'-dez(oxi-foszfiniko)-3'(metilidinén-nitrilo)-timidilil-(31->51)-3'-0-(terc-butildifenil-szilil)-timidin blokkolt dimert feloldunk 5 ml jégecetben és hozzáadunk három részletben 0,19 g (3 mmól) NaBH3CN-t argonatmoszférában szobahőmérsékleten. A kapott szuszpenziót 1 órán át keverjük, amíg a gázképződés megszűnik. Ezután további 0,19 g (3 mmól) NaBH3CN-t adagolunk hasonló módon és a keverést 1 órán át folytatjuk. A jégecetet ezután
-59csökkentett nyomáson eltávolítjuk, így nyerjük a 3'-dez(oxi-foszfiniko)-3'-(metilén-imino)-timidilil-(3'->5')-3'-0-(terc-butil-difenil-szilil)-timidint. Ezen dimert ezután az előzőekben leírtak szerint nBu4NF/THF és HCl/MeOH alkalmazásával deblokkoljuk, amikoris a kívánt a 3'-dez(oxi-foszfiniko)-3'-(metilén-imino)-timidilil-(3'->5')-timidint nyerjük fehér por formájában, mennyisége 0,44 g (90%) . Ezt a vegyületet ezután HPLC-vel tisztítjuk (a 12. példában a 3'-dez(oxi-foszfiniko)-3'- (metilidinén-nitrilo)-timidilil-(3'->5')-timidin dimernél leírtak szerint), amikoris az analitikailag tiszta mintát nyerjük.
XH NMR (DMSO-dg) δ 11,23 (br s, 2, 2NH), 7,83 és 7,49 (2s,
2, 2C6H), 6,82 (t, 1, NHO) , 6, 14 (pszeudo t, 1, T2 Hl- 1 ,
Ji ',2'=7/ 6 HZ, Jj ·t 2=θ >54 Hz) , 5,96 (dd, 1, TI Hj 1 /
Ji ',2'=6' 9 Hz, J1',2=4» 3 Hz) , 5,28 (s, 1, T2 OH) , 5,08
(s , 1, TI OH) , 4,18 (m, 1, T2 H3.), 3,89 ( m, 1, TI H41 ') ,
3,1 54-3,78 (m, 5, TI T2 H5. /5» T2 H4 1 ) , 2 , 76- 2,94 (m, 2,
TI H31.) , 2,42 (m, 1, TI H3 ' ) / 2,0-2,17 (m, 4, TI, ' Γ2
«2 ' , 2 ) > 1,77 és 1,74 (2s, 6, 2 CH3).
MS FAB: M/z 496 (M+H)+
Elemanalízis a C21H29N5O9.H2O összegképletű vegyületre:
számított: C 49,12, H 6,09, N 13,46 mért: C 48,99, H 5,96, N 13,49
15. példa
Metilezett [3'-CH2-N(CH3)-O-CH25']-kötésű oligonukleozid előállítása ' -Dez (oxi-foszf iniko) -3 ' - [metilén- (metil-imino) ] ) -timidilil-(3'->5')-timidin • ·
-600,99 g (1 mmól) 3'-dez(oxi-foszfiniko)-3'-(metil-imino)])timidilil-(31->5')-3'-0-(terc-butil-difenil-szilil)-timidindimert feloldunk 10 ml jégecetben és hozzáadunk 3 ml 20%-os vizes HCHO-t. A kapott oldatot 5 percig szobahőmérsékleten keverjük, majd hozzáadunk 0,19 g (3 mmól) NaBH3CN-t három részletben argonatmoszférában szobahőmérsékleten. A 0,19 g mennyiségű NaBH3CN adagolását még egyszer megismételjük és az oldatot további 1 órán át keverjük. A keveréket ezután betöményítjük, így nyerjük a nyers 3'-dez{oxi-foszfiniko) -3'-[metilén-(metil-imino)])-timidilil-(3'->5')3 ' -0-(terc-butil-fenil-szilil)-timidin-dimert, amelyet ezután deblokkolunk (nBu4NF/THF, HCl/MeOH), amikoris a cim szerinti 3'-dez(oxi-foszfiniko)-3'-[metilén-(metil-imino)])-timidilil-(3'->5')-timidint nyerjük, fehér, szilárd anyag formájában, mennyisége 0,44 g (87%). Az így kapott dimert ezután preparatív HPLC-vel tisztítva nyerjük az analitikailag tiszta anyagot.
1 NMR (DMSO-dg) δ 11,30 és 11,24 (2s, 2, 2NH), 7,82 és
7,50 (2s, 2, 2CgH) , 6,15 (pszeudo t, 1, T2 Ηχi, Jii(2,=6'3 Hz, Jii(2=6'3 Hz, j1',2=7»3 Hz), 6,00 (pszeudo t, 1, TI Hl'i Jl',2'=4'2 Hz, Jl',21*6'1 Hz), 5,31 <m< 1 T2 OH), 5,08 (m, 1, TI, OH), 4,17 (m, 1, T2, H3.) , 3,88 (m, 1, T2 H4>), 3,57-3,83 (m, 5, ti T2 H5lf5i., TI H4> ) , 2,69 (m, 2, TI H3..), 2,57 (s, 3, N-CH3), 2,50 (m, 1, TI H3 > ) , 2,052,14 (m, 4, TlT2H2ir2), 1,79 és 1,76 (2s, 6, 2 CH3), MS FAB: M/z 510 (M+H) +
Elemanalízis a C23H3iN50g . H2O összegképletű vegyületre: számított: C 50,09, H 6,31, N 13,28
C 50,05, H 6,21, N 13,08 mért:
16. példa
Foszforamidát-tartalmú, [3·-CH2-N (CH3)-O-CH2-5·]-kötésű oligonukleozid előállítása 3'-Dez(oxi-foszfiniko)-3'-[metilén-(metil-imino) ]) -5' -0-(dimetoxi-trifenil-metil)-timidilil-(3'->5·)-3’-0- (£-ciano-etil-diizopropil-amino-foszfiril)-timidin
A 15. példa szerint előállított 3'-dez(oxi-foszfiniko)-3'- [metilén-(metil-imino)])-timidilil-(3'->5')-timidin dimert tritilezzűk és foszfitilezzük a következő irodalmi helyen leírtak szerint: Oligonucleotide Synthesis: a practical approach, M.J. Gait, IRL Press, 1984, a kihozatal 82%. A védett dimert ezután szilikagélen tisztítjuk (CH2Cl2/MeOH/Et3N=9/l/0,1, tf/tf), a homogén frakciókat egyesítjük és betöményítjük, így nyerjük a tiszta 3'-dez(oxifoszfiniko)-3'-[metilén-(metil-imino)])-timidilil-5'-0(dimetoxi-trifenil-metil)-(3'->5')-3'-O-(β-ciano-etildiizopropil-amino-foszfiril)-timidint fehér hab formájában (ezt közvetlenül alkalmazzuk a DNS szintézishez). A terméket a diasztereoizomerek keverékének formájában nyerjük.
31P NMR (CDC13) δ 149,62 és 149,11 ppm XH-NMR (CDCI3) δ 6,22 (pszeudo t, 1, T2 Hpi,
J11,2 ' =31' , 2 = ® Hz), 6,16 (pszeudo t, 1, TI Hj > , J=l',2'=J1',2=5,8 Hz, 2,58, 2,56 (2s, 3, N-CH3), 1,82, 1,49 (2s, 6, 2, CH3), és más protonok.
A fenti védett foszforamidátot tartalmazó dimert megfelelő módon lehet tárolni és felhasználni a kapcsoláshoz automata DNS szintetizátorban (AJ3I 380B) akkor és amikor szükséges a terápiás értékű oligomerekbe való specifikus beépítéshez. A
-62találmány szerinti más dimerek, így például a fenti metilidin-nitrilo, azaz oxim és a metilén-imino, azaz amino-hidroxi dimerek a megfelelő foszforamidát-származékokká alakíthatók hasonlóképpen és ismert módon oligonukleotidokba beépíthetők. Egy az oxim-kötésű nukleozid dimert tartalmazó oligomert ezután olyan oligomerré redukálható, amely a megfelelő hidroxil-amin-kötésű nukleozid dimert tartalmazza. Mint azt már más példákban említettük, a redukciót végezhetjük CPG-kötött oligomerként vagy pedig a CPG eltávolítása után.
17. példa
Közbülső (3'-CH=N-O-CH2-5'), azaz oxim; (3·-CH2-NH-O-CH2-5'), azaz amino-hidroxi, (3 ' -CH2-IKCH3) -O-CH2-5'), azaz N-metil-amino-hidroxi, (3 ' -CH2-O-N(CH3) -CH2-5 ') , azaz Nmetil-hidroxi-amino, vagy (3'-CH2-N(CH3)-CH2-51), azaz N,N'-dimetil-hidrazino-kötésű oligonukleozidok előállítása Egy megfelelő 2'-dezoxi-nukleozidot, amely egy oligonukleozid 3'-terminális nukleozidja lesz, CPG oszlophoz kötünk ABI 380B automata DNS szintetizátorhoz való alkalmazás céljából. Standard foszforamidit eljárás lépéseit alkalmazzuk a következő kötéseket tartalmazó dimerek megfelelő helyzetbe vagy helyzetekbe a kívánt szekvenciában való megfelelő elhelyezésére: (3'-CH=N-O-CH2-5'), azaz oxim; (3'-CH2-NH-O-CH2-5), azaz amino-hidroxi, (3'-CH2-N(CH3)-O-CH2-5') , azaz N-metil-aminohidroxi, (3'-CH2-0-N(CH3)-CH2-5'), azaz N-metil-hidroxi-amino, vagy (3'-CH2-N(CH3)-CH2-5'), azaz N,Ν'-dimetil-hidrazino.
18. példa
Egyforma 3 ' -CH=N-O-CH2-5' vagy 3’-CH2-NH-O-CH2-5' kötésű oligonukleozidok előállítása ABI 380B NDS szintetizátorral
-633 nukleozid alegység alkalmazásával alegység: CPG kötött 5'-0-ftálimido-timidin (előállítása: Nucleic Acids Research, 18:3813 (1990), ezt az oligonukleozid szintézisnél 3'-terminális egységként alkalmazzuk.
alegység: bifunkcionális 3'-C-formil és 5'-O-ftálimido-dezoxiribonukleozid, amelyet standard glükozilálással nyerünk metil-3-dezoxi-3-C-ciano-5-0-(ftalimido)-β-D-eritro-pentofuranozid-ból, egy megfelelő bázisból, majd a nukleozid termék DIBAL-H redukciójával.
alegység: 51-O-DMT-3'-C-formil-timidin, amelyet az utolsó nukleozid beépítéséhez alkalmazunk, az oligonukleozid 5'-vége.
Az egyforma kötések kialakításához szükséges ciklus automata lépései (10 gmólos méretben: az 1. egység bevitele a
CPG-re) a következő:
Lépés Reagens/oldószer Idő/perc
1 5%-os metil-hidrazin DCM-ben 10
2 DCM:MeOH 9:1 tf/tf 5
3 DCM mosás 2
4 3'-C-formil-5'-0-ftalimido-dezoxi-
-ribonukleozid (2 egység, 20 /zmól
20 ml DCM-ben) 3
5 DCM:Aceton 9:1 tf/tf: zárás 2
6 DCM mosás 3
A fenti 1-6. lépéseket ismételjük minden nukleozid egység beadagolásakor, függően a kívánt szekvenciától és hosszúságtól. Ezután adagoljuk az utolsó egységet:
-648 végső nukleozid (20 μπιόΐ, 20 ml DCM-ben) vagy 3 egység 5
19. példa
Általános és specifikus ΝβΒΗβΟΝ redukció a
3'-CH=N-O-CH2-5' kötés 3’-CH2-NH-0-CH2-5' kötéssé való átlalkításához
Diner redukciója
0,49 g (1 mmól) dimert feloldunk 5 ml jégecetben, majd hozzáadunk 1 ml ecetsavban oldott 0,19 g (3 mmól) nátrium-ciano-bórhidridet. A szuszpenziót 1 órán át keverjük, majd további 1 ml ecetsavas NaBH3CN-t adagolunk és a keverést még 1 órán át folytatjuk. A feleslegben lévő AcOH-t eltávolítjuk csökkentett nyomáson és szobahőmérsékleten, a visszamaradó anyagot toluollal (2x50 ml) együttesen bepároljuk, majd 25 g szilikagélen tisztítjuk (CH2C12:MeOH=9:1 tf/tf), a megfelelő frakciókat egyesítjük, majd ismételten bepároljuk, így 0,36 g (55%) szilárd dimert nyerünk.
Oligonukleozid redukciója μιηόΐ mennyiségű CPG-kötött oligonukleozidot veszünk le a szintetizátorról az előállítási ciklusok befejezése után, amely egy vagy több vázon módosított kötést tartalmaz. 1 mól NaBH3CN oldatot (THF/AcOH=l/l, 10 ml) a CPG-kötött anyagon keresztülszivattyúzunk ismert módon injekcióstűs technika alkalmazásával 30 percen át. Az oszlopot 50 ml THF-el átmossuk, majd a redukált oligonukleozidot felszabadítjuk az oszlopról ismert módon.
Oligonukleozid redukciója más módon
-65A fentitől eltérő módon a redukciót a CPG hordozóról való eltávolítás után is elvégezhetjük. Ha az előállítást befejezetük, az oligonukleozidot eltávolítjuk a CPG-hordozóról ismert eljárással. Az 5'-O-tritil-on-oligonukleozidot HPLC-vel tisztítjuk, majd a fentiekben leírtak szerint NaBH3CN/AcOH/THF eljárással redukáljuk.
20. példa '-0¾-N(CH3)-O-CH2-5' kötésű oligonukleozid előállítása, amely 5' terminális nukleozdiként 2 *,31-didehidro nukleozidot tartalmaz
3'-Dez(oxi-foszfiniko)-21,3'-didehidro-3’- [metilén- (metil-imino)])-5·-0-timidilil-(3’->5’)-timidin
0,13 mmól 1-(5'-0-(MMTr)-B-D-glicero-pentofurán-3'ulozil]-timidint (előállítása: T.-C. Wu és mtársai, Tetrahedron, 45:855 (1989)), 0,13 mmól 5'-0-(metil-amino)-3'-0(terc-butil-difenil-szilil)-timidint, (előállítása: F. Debart és mtársai, Tét. Letters, 33., (1992)), 0,5 mmól etilénglikolt és 0,5 ml HMPA-t elkeverünk 0,1 mól, 3 ml, 3 mmól Sml2~vel THFben szobahőmérsékleten. A színes Sml2 a reakció lefutása során elszintelenedik a kívánt adduktum kialakulásával. A kiindulási anyagok teljes eltűnése után a reakciókeveréket a szokásos módon feldolgozzuk. (A terméket szilikagél oszlopon kromatografálhatjuk a jellemzéshez). A nyers 3'-epimer adduktum keveréket ezután alkilezzük (HCH0/NaCNBH3/AC0H) a fentiek szerint ismertetett módon. A metilezett terméket ezután metil-szulfonil-kloriddal kezeljük piridinben, így nyerjük a 3'-epimer mezilátot, amelyből bázikus kezelés tuán nyerjük a cim szerinti vegyületet.
21. példa
3'-CH2-CH2-NH-CH2-5' kötésű oligonukleozid előállítása 3'-Dez(oxi-foszfiniko)-3'-(1,2-etán-diilimino)-timidilil-51-0-(terc-butil-dimetil-szilil)-(3' ->5 1) -3 *-0-(terc-butil-difenil-szilil)-51-dezoxi-timidin
2,5 g (6,5 mmól) aldehidet (frissen előállítva Fiandor J.
9 és Tam, S.Y. módszere szerint: (Fiandor, J. és Tam S.Y.,
Tetrahedron Letts., 33:597 (1990)), 3,13 g (6,5 mmól) 5'-amino3 ' -O-(terc-butil-difenil-szilil)-5'-dezoxi-timidin-t [két lépésben előállítva az 5'-azido-5'-dezoxi-timidin-3'-O-szililezésével Hata és mtársai módszere szerint (Hata és mtársai, J. Chem. Soc. Perkin I, 306 (1980)), majd a kapott terméket Poopeiko és mtársai szerint redukálva: (Poopeiko és mtársai, Syn. Lett., 342 (1991)] és 0,39 g (6,5 mmól) ecetsavat elkeverünk 65 ml diklór-etánnal, majd hozzáadunk 2,759 g (13,08 mmól) NaBH(0Ac)3 vegyületet argonatmoszférában. A szuszpenziót ezután 3 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd a kapott keveréket 250 ml CH2C12-vel felhígítjuk és kétszer 100-100 ml vízzel mossuk. A szerves fázist szárítjuk (MgSC>4), majd betöményítjük, így nyerjük a nyers terméket szirup formájában, ezt szilikagélen kromatografáljuk, amikoris 3,5 g (64%) cim szerinti vegyületet nyerünk fehér hab formájában.
XH-NMR (CDCI3) δ 0,1 (S, 6, SÍ(CH3)2), 0,9 és 1,1 (2s, 18, 2 SÍ(CH3)3), 1,85 és 1,95 (2s, 6, 2 CH3), 2,5 (m, 2, 3CH2), 3,7 (m, 2, 5'CH2), 4,0 (m, 2, 3',4’ CH), 4,2 (m, 1, 3'CH), 6,05 (m, 1, 1Ή), 6,28 (t, 1, l'H), 7,1 és 7,57 (2s, 2, C6H), 7,35-7,7 (2m, 12, Si(ArH)2) és más cukor « ·
-67protonok.
3'-Dez(oxi-foszfiniko)-3'-(1,2-etán-diil-imino)-timidilil- (3'->5·)-5'-dezoxi-timidin
A védett dimert 81%-os kihozatallal deblokkoljuk ismert eljárással (Bu)4NF/THF alkalmazásával. A deblokkolt dimert HPLC-vel tisztítjuk analízis céljára.
XH NMR (DMSO-dg) δ 1,76 és 1,78 (2s, 6, CH3), 2,0-2,2 (3m,
4, 2'CH2), 3,15 (m, 2, NCH2), 3,56 (m, 2, 4Ή, 5'CH2),
4,18 (br s, 1, 3Ή), 5,17 és 5,22 (2 br s, 2, 2 OH), 5,95 (t, 1, 1Ή), 6,1 (t, 1, 1Ή), 7,6 és 7,85 (2s, 2, 2 (CgH) ) , 11,25 (br s, 2 2NH) és más protonok.
22. példa
Bifunkcionálois nukleozid előállítása (eltérő módszer a
18. példa 2 alegységtől) * -Dezoxi-3 1 -C- [ (metoxi-imino) -metil] - timidin
0,59, 1 mmól 3'-dezoxi-3'-C-formil-5'-O-tritil-timidint (előállítás a 4. példa szerint CH2Cl2/MeOH=2/l elegyben) elkeverünk 0,1 ml AcOH-val és hozzáadunk 0,189 g (2,2 ml) metoxi-amin hidrokloridot. A kapott keveréket 30 percen át keverjük, majd vákuumban betöményítjük és a maradékot 20 ml MeOH-ban oldjuk. Az oldathoz ezután 0,1 ml koncentrált sósavat adunk és 1 órán át keverjük, majd kb. 2 ml NH40H-val semlegesítjük és vákuumban betöményítjük, így nyerjük a cim szerinti vegyületet.
ÍH-NMR (CDC13) δ 9,67 (s, 1, NH), 7,67 (s, 1, H-6), 7,33 (d, 0,70, H-3 E izomer), 6,65 (d, 0,30, H-3' Z izomer),
6,15 (m, 1, H-l'), 3,60-4,12 (m, 3,3, H-4', H-5'-5, H-3' Z-izomer), 3,91 (s, 0,9, OCH3 Z izomer), 3,82 (s, 2,1,
-68OCH3 oxim E izomer), 3,26 (m, 0,7, H-3' E izomer), 2,272,60 (m, 2, H-2',2), 1,91 (2s, 3, C6CH3).
3'-Dezoxi-3'-C-[(metoxi-imino) -metil]-5-metil-citidin
Az 5-metil-citidin analógot a fentiekben ismertetett módon a timidinhez hasonlóan állítjuk elő.
iH-NMR (CDCI3) ö 7,82 (s, 0,34, H-6 Z izomer), 7,75 (s, 0,66, H-6 E izomer), 7,32 (d, 0,66, H-3 E izomer,
J31 3=6,63 Hz), 6,64 (d, 0,34, H-3 Z izomer, ^1,311 = 6,8 Hz), 6,12 (m, 1, H-l), 3,50-4,15 (m, 3,34, H-4', H-5'5, H-3' Z izomer), 3,91 (s, 1,02, OCH3, oxim Z izomer), 3,83 (s, 1,98 OCH3 oxim E izomer), 3,20 (m, 0,66, H-3' E izomer), 2,3-2,6 (m, 2, H-2',2), 1,92 és 1,94 (2s, 3, C5CH3 E és Z izomerek).
3'-Dezoxi-3'-C-[(metoxi-imino)-metil]-5'-O-ftálimido-timidin
A 3 ' -dezoxi-3 '-C- [ (metoxi-imino) -metil]-timidint Ph3P, N-hidroxi-ftálimiddel és DEAD-vel kezeljük (Mitsunobu körülmények), így nyerjük az 5'-O-ftálimido-timidin-származékot.
XH-NMR (CDCI3) δ 8,45 (br s, 1, NH), 7,4-8 (m, «5,64, aromás H, H-6, C3nH=N E izomer), 6,72 (d, 0,36, H-3 Z izomer), 6,15 (m, 1, H-l'), 4,4-4,65 (m, 3, H-4', H5',5), 4,25 (m, 0,36, H-3' Z izomer), 3,92 (s, 1,08, OCH3 oxim Z izomer), 3,85 (s, 1,92, OCH3 oxim E izomer), 3,46 (m, 0,64, H-3' E izomer), 2,30-2,60 (m, 2, H-2',2), 1,97 (2s, 3, C5CH3).
3'-Dezoxi-3'-C-(forrni1-metil-oxim)-5’-metil-citidin
Az 5-metil-citidin analógot a timidinvegyülethez hasonlóan
-69állítjuk elő.
XH-NMR (CDCI3) δ 7,7-7,95 (m, 5, aromás Η, H-6), 7,40 (d,
0,65, H-3 E izomer, σ3ι>3..=5,87 Hz), Έ,69 (d, 0,35, H-3
Z izomer, 031,311=6,3 Hz), 6,16 (m, 1, H-l'), 4,35-4,70 (m, 3, H-4', H5',5), 4,30 (m, 0,35, H-3' Z izomer), 3,88 (s, 1,05, OCH3 Z izomer), 3,81 (s, 1,95, OCH3 E izomer), 3,26 (m, 0,65, H-3' E izomer), 2,30-2,65 (m, 2, H-2',2), 2 és
1,98 (2s, C5H3 Z és E izomerek).
3'-Dezoxi-3·-C-formil-5·-O-ftalimido-timidin
31-Dezoxi-3’-C-[(metoxi-imino)-metil]-5' -O-ftálimido-timidin
Az 3'-Dezoxi-3'-C-[(metoxi-imino)-metil] -5'-O-ftálimido-timidint C^CHO-val metanolban kezelve regeneráljuk a3'-C-formil-csoportot. A kapott terméket szilikagélen kromatografálva nyerjük a cim szerinti vegyületet homogén anyag keverékében, összesen a három lépésre 85%-os kihozatallal.
!h-NMR (CDCI3) δ 9,95 (s, 1, CH=O), 8,62 (br s, 1, NH) , 7,71-7,90 (m, 5, aromás Η, H-6), 6,06 (t, 1, H-l', J1I/2i=6,61 Hz, J112>=6,6 Hz), 4,36-4,73 (m, 3, H-4', H-5',5), 3,78 (m, 1, H-3'), 2,20-2,90 (m, 2, H-2',2),
1,98 (S, 3, C5CH3).
23. példa
Egyenletes 3'-CH=N-O-CH2-5' vagy 3'-CH2-NH-O-CH2-5· vagy
3’-CH2N(CH3)-O-CH2-5'-kötésű tetramer előállítása oldat fázisban
3'-5' lánc
Az 3'-dezoxi-3'-C-formil-5'-O-ftalimido-timidint 5'-0-amino-3'-0-(terc-butil-difenil-szilil)-timidinnel kapcsolva a
12. példában leírtak szerint nyerjük a 3'-dez(oxi-foszfiniko)-3'-(metilidén-nitrilo)-timidilil-5'-0-ftálimido- (3'->5')-3'-O-(terc-butil-difenil-szilil)-timidint. Ez utóbbi terméket metil-hidrazinnal kezelve a 14. példában leírtak szerint nyerjük a 5'-O-NH2-T-3'-CH=N-O-CH2-5'-T-3'-O-TBDOSi-t, amelyet ezután egy ismételt lépésben a 5'-O-Phth-T-3'-CHO-vel * kapcsolva kapjuk a 5'-O-Phth-T-3'-CH=N-O-CH2-5'-T-3'-CH=N-OCH2-5'-T-3'-O-TBDPSi trimert, összesen 83%-os kihozatallal. A tetramert a 14. példában leírtak szerint NaBH3CN/AcOH-val redukálva nyerjük a 5'-O-Tr-T-3'-CH2NH-O-CH2-5'-T-3'-CH2-NH-O-CH2-5'-T-3'-CH2-NH-O-CH25'-T-O-3'-TBDOPSit. A redukált tetramer egy további reduktív alkilezéssel (HCHO/NaBH3CN/AcOH) nyerjük a 5 ' -O-Tr-T-3'-CH2N(CH3)-O-CH2-5'-T-3'-CH2-N(CH3)-O-CH2-5'-T-3'-CH2-N(CH3)-O-CH2-5'-T-3'-O-TBDPSit. A metilezett tetramert ezután sósavval deblokkoljuk és n(Bu)4NF-el kezeljük és így kapjuk a szabad tetramert (5'-OK-T-3'-CH2-N(CH3) -O-CH2-5'-T-3'CH2-N(CH3) -O-CH2-5' -T-3 ' -CH2-N(CH3) -0-CH2-5 ' -T-3 ' -OH) 79%-os ossz kihozatallal. A tetramert HPLC-vel tisztítjuk reverz fázisú oszlopon (Supelcosil LC18, 5μ, 15 cm x 4,5 cm, eluálás H2O -> CH3CN gradiens, (H2O:CH3CN, 95:5, 1 perc, 8:2, 20 perc, 7:3, 30 perc, 2:8, 40 perc/ml). A tetramert 26,96 perc után egyetlen csúcsként eluáljuk, ez megfelel 86%-os kihozatalnak. A 26-27,5 perc közötti frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk, így fehér port nyerünk. A tetramer pontos molekulatömege MS FAB módszerrel meghatározva: m/z 1045 (M+H) + . Mint már a fentiekben említettük, az NMR adatokhoz a gyűrűket az 5' végtől a 3' vég felé jelöltük.
* ··«# ··«« «V ·· • · * · «* w • · · ♦ «·· • · · 4 · ·4 ··· 4 4 Μ · ·♦ ··· XH NMR (D20, 40°C) TOSEY
T4 egység T3 egység
T2 egység
Ti egység (30, 100 mól/mp Mix)
H-l' 6,36
H-2',2 2,53
H-3 ' 4,55
H-4' 4,22
H-5',5 4,04, 4,18
H-6 7,05
H-l' 6,22
H-2 ' 2,52
H-2 2,71
H-3 ' 2,90
H-3 2,91, 2,97
H-4 ' 4,12
H-5',5 4,04, 4,23
H-6 7,18
C5CH3 1,88
H-l' 6,23
H-2 ' 2,52
H-2 ' 2,71
H-3 ' 2,91
H-3 2,91, 2,97
H-4 ' 4,12
H-5',5 4,04, 4,23
H-6 7,14
C5CH3 1,88
H-l' 6,26
H-2 ' 2,54
H-2 2,73
-72Η-3' 3,03
Η-3 3,03, 2,93
Η-4' 4', 06
N-CH3 váz széles
2,83
A fenti oldatfázisú reakciókat könnyen átvihetjűk ABI 380B DNS szintetizátorra, 3-nukleozid alegységeket alkalmazva.
24. példa
Monomer egység előállítása (3 ' -CH2-O-N=CH-5') , (3'-CH2-O-NH-CH2-5·) és (3 *-CH2-O-N(CH3)-CH2-5') kötésekhez
1-[3’-Dezoxi-3'-C-(hidroxi-metil)-5'-O-(tritil)-B-D-eritro-pentofuranozil]-timin
1,36 g (9,6 mmól) NaBH4 szuszpenziót cseppenként keverés közben 31-C-formil-5'-O-tritil-timidin EtOH/H2O-val készült oldatához (22 ml, 3/1 tf/tf) adagoljuk szobahőmérsékleten. 3 óra elteltével 300 ml EtOAc-t adagolunk és a szerves fázist kétszer 150-150 ml vízzel mossuk, majd az EtOAc extraktumot MgSC>4-en szárítjuk, majd betöményítjük csökkentett nyomáson és a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (CH2Cl2/MeOH=9/l tf/tf), majd a megfelelő frakciókat egyesítjük és betöményítjük, így nyerjük a cim szerinti vegyületet, mennyisége 1,13 g, 83%.
iH-NMR (CDC13) δ 8,29 (br s, 1, NH), 7,59 (s, 1, CgH), 7,47-7,22 (m, 15, TrH) , 6,13 (dd, 1, Ηχ 1 , Ji',2'=6,5 Hz),
3,98 (m, 1, H41) , 3,62 (m, 2, H3.1) , 3,56-3,33 (m, 2, Ηςι,Ηβ»), 2,60 (m, 1, H3 > ) , 2,33-2,20, (m, 2, H2 Ή2') , 1,91 (br s, 1, OH), 1,53 (S, 3, CH3)
1-[3' -Dezoxi-3'-C-[0-(ftálimido-hidroxi-metil) ] -5'-0-73- • ··*· V· ·· • · · · « · · • · · · ··« »«·«·· 0« ··· ·· ·· ···* ··
-tritil-S-D-eritro-pentofuranozil] -timin
0,47 ml (2,41 mmól) diizopropil-azodikarboxilátot elkeverünk 10 ml vízmentes tetrahidrofuránb'an oldott 0,8 g (1,62 mmól) 3'-dezoxi-3'-C-)hidroxi-metil)-5 ' -O-tritil-tidimidnnel, 0,35 g (2,15 mmól) N-hidroxi-ftálimiddel és 0,56 g (2,15 mmól) trifenil-foszfinnal. 48 óra után a terméket betöményítjük, a visszamaradó anyagot kétszer 100-100 ml CH2C12_vel extraháljuk, az extraktumokat 5%-os 100 ml NaHC03-mal és 100 ml vízzel mossuk, MgS04~en szárítjuk és csökkentett nyomáson betöményítjük. A visszamaradó anyagot rövid szilikagél oszlopon kromatografáljuk (EtOAc/hexán=l/l), majd a megfelelő frakciókat egyesítjük és betöményítjük, így nyerjük a cim szerinti vegyületet fehér hab formájában (0,82 g, 79%).
XH-NMR (CDC13) ö 8,24 (s, 1, NH), 7,85-7,20 (m, 20, TrH, ArH, CgH) , 6,20 (m, 1, Ηχ. ) , 4,22-4,16 (m, 3, H4>, H3n), 3,63-3,40 (m, 2, H5. , H5.<), 3,02 (m, 1, H3. ) , 2,50-2,43 (m, 2, H2', H2), 1,51 (s, 3, CH3),
Elemanalízis a C38H33N3O7.0,5 EtOAc: összegképletű vegyületre:
számított: C 69,86, H 5,42, N 6,11 mért: C 70,19, H 5,27, N 5,75 l-{3'-Dezoxi-31-C- [O-amino-hidroxi-metil)]-5'-O-tritil-fi-D-eritro-pentofuranozil}-timin ml vízmentes CH2C12-ben feloldunk 0,77 g (1,2 mmól) 3'dezoxi-3 1 -C-[0-(ftálimido-hidroxi-metil)]-5'-O-tritil-timidint és keverés közben hozzáadunk 0,12 ml (2,25 mmól) metil-hidrazint. 1 óra elteltével a kiváló csapadékot szűrjük, a visszamaradó anyagot kétszer 10-10 ml CH2C12~vel mossuk, a
-74<··«<· ···· «« ·· • · « * * * · · ··« * · · · · · · • ·· ·· ··♦· ·♦ szűrleteket egyesítjük, majd betöményítjük és a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (CH2Cl2/MeOH=97/3), majd a megfelelő frakciókat egyesítjük és betöményítjük, így 0,43 g 70% cim szerinti vegyületet nyerünk fehér poranyag formájában.
1H-NMR (CDCI3) δ 8,59 (br s, 1, NH), 7,66 (m, 1, C6H),
7,40-7,15 (m, 15, s, 2, NH2), 3,89 H3 π), 2,81 (m, 1, (s, 3, CH3)
25. példa (3 ' -CH2-O-N=CH-5 ') ,
TrH), 6,06 (pszeudo t, (m, 1, H41), 3,65-3,20
H31), 2,21-2,13 (m, 2, (3·-CH2-O-NH-CH2-5')
1, ΗΣ1), 5,22 (br (rn, 4 , H5 I , H5II ,
H2i, H2h), 1,37 és (3'-CH2-O-N(CH3>-CH2-5') kötésű oligonukleozidok előállítása
3'-Dez(oxi-foszfiniko)-3'-[metilén-oxi- (metil-imino)]-timidilil-(3·->5')-5'-dezoxi-timidin mmól 1-[4-C-fomril-3-0-(terc-butil-difenil-szilil)-β-D-eritro-pentofuranozil)-timin (előállítás: Nucleosides and Nucleotides, 9:533 (199)), 1 mmól 3'-dezoxi-3'-C-[(0-(amino-hidroxi-metil)]-51-O-tritil-timidin, 0,1 ml AcOH és 25 ml vízmentes CH2C12 keverékét szobahőmérsékleten 1 órán át keverjük, az oldószert elpárologtatjuk, a visszamaradó anyagot 5 ml jégecetben feloldjuk. 1 óra elteltével továbbá 3 mmól NaBH3CN-t adagolunk és a keverést 1 órán át még folytatjuk. A keveréket ezután vákuumban betöményítjük, a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk, így nyerjük az 5'-0-TrT-3'-CH2-O-NH-CH2-5'-T-3'-O-TBDPSi dimert.
1H-NMR (CDCI3) Ö 8,73 (br s, 2, 2NH), 7,76 (s, 1 CgH), 7,674-7,23 (m, 20, TrH, TBDPh), 6,965 (s, 1, CgH), 6,23 (pszeudo t, 1, T2 Hp), 6,11 (pszeudo t, 1, Tlt, Hp),
(br s, 1, NH) , 4,16 (m, 1, T2H31 ), 4,02 (m, 1, T2
3, 87 (m, 1, Τχ, H4i 1), 3,52, (m, 3, Ti CH23η, Τχ
3, 23 (m, 1, Τχ H5') 1, 2,55-2,76 (m, 3, TI, H31, T2
H5H511) , 2,33-2,27 (m, 1, T2 H2i), 2,3-2,12 (m, 2, TI
H2H2n), 1,95-1,85 (m, 1, T2 H2«), 1,38 (S, 3, CH3) 1,45
(s, 3, CH3), 1,06 (s, 9, (CH3)3CSi).
Ez utóbbi dimert HCHO/NaBH3CN/AcOH felhasználásával metilezzük, majd deblokkoljuk (nBu4NF/THF és HF/CH3CN) két lépésben, így nyerjük a cim szerinti vegyületet 65%-os kihozatallal.
XH NMR (DMSO-dg) δ 11,27 (br S, 2, NH), 7,85 (s, 1, TI
CgH), 7,51 (S, Íz T2 CgH) , 6, 15 (pszeudo t, 1, T2 Ηχ. ,
J1'_2'=7,8 Hz, J1'-2 = 6,3 Hz) / 6,00 (pszeudo t, 1, Ti Ηχ.,
Jl'k2,=8'9 Hz' J1'-2 =4,5 Hz) f 5,32 (br s, 1, oh3 < ), 5,09
(br s, 1, OH51 ), 4,17 (m, 1, T2 H3.) , 3,90 (m, 1, T2 H4) ,
3,76-3,66 (m, 4, ΤχΗ4., Τχ H5 . , CH2 3»), 3,60-3,52 (m, 1,
Τχ H5„), 2,82 (m, 2, T2 H5f,H5n), 2,57 (s, 3, N-CH3), 2,47 (m, 1, Τχ H3tÚ, 2,23-2,02 (m, 4, Η2·Η2··), 1,81 (s, 3, C5CH3) , 1,78 (S, 3, C5 CH3)
Elemanalízis a Ο22Η3χΝ5θ9.H20 összegképletű vegyületre: számított: C 50,96, H 6,22, N 13,50 mért: C 51,01, H 6,22, N 13,19
MS (FAB+, glicerin) M+H+ m/z=510.
26. példa
Foszfor-amidét tartalmú (3'-CH2-O-N(CH3)-CH2-5* kötésű oligonukleozid előállítása
31-Dez(oxi-foszfiniko)-3'-[metilén-oxi-(metil-imino)]-timidilil-5 *-0-(dimetoxi-trifenil-metil)-(31->5')-3'-(0-76β-ciano-etil-diizopropil-amino-foszfiril)-timidin
Az 5'-OH-T-3'-CH2-O-NCH3-CH2-5'-T-3'-0H dimert dimetoxitritilezve (Oligonucleotide Synthesis: a practical approach, szerk.: M.J. Gait, IRL Press, 1984) nyerjük az 5'-O-DMTr-védett dimert fehér hab formájában.
l-H-NMR (CDC13) δ 7,67 (s, 1, Hg), 7,44-6,82 (m, 14, Hg, DMTrH), 6,20 (pszeudo t, 2, Hx), 4,3 (m, 1, T2H31), 4,15 (m, 1, T2, H41), 4,00 (m, 1, Tx H41), 3,80 (s, 6, OCH3), 3,77-3,23 (m, 4, Tx, H5 > , H5.., CH2 3..), 2,89-2,50 (m, 3, Τ2Η5.Η5π, TI H3.), 2,62 (s, 3, N-CH3), 2,48-2,08 (m, 4, H2.H2π), 1,9 (s, 3, C5CH3), 1,48 (S, 3 C5CH3)
A fenti vegyületet foszfitilezzük (Oligonucleotide Synthesis: a practical approach, szerk.: M.J. Gait, IRL Press, 1984), így nyerjük a cim szerinti vegyületet 70%-os kihozatallal két lépésben fehér por formájában.
1H-NMR (CDCI3) δ 8,25 (br s, 2, NH), 7,66 (s, 1, CgH), 7,15-7,45 (m, 10, ArH, CgH), 6,8-6,9 (m, 4, ArH), 6,12 (m, 2, 2C!iH), 3,79 (s, 6, ArOCH3), 2,56 (S, 3, N-CH3), 1,88, 1,44 (2s, 6, 2 C5 CH3) és más protonok.
31P NMR (CDCI3) 149,42 és 148,75 ppm.
27. példa
A kötéseken farmakokinetikai és farmakodinamikai tulajdonságokat mődosítő csoportokat tartalmazó oligonukleozidok előállítása
31-Dez(oxi-foszfiniko)-31 -[metilén-(benzil-imino)]-timidilil-51-0-(dimetoxi-trifenil-metil)-(31->5')-31 -(0β-ciano-etil-diizopropil-amino-foszfiril)-timidin
1,5 mmól 3'-dezoxi-3'-C-formil-5'-O-tritil-timidint
-ΊΊ reduktíve kapcsolunk 1,5 ml 5'-0-amino-3'-0-(terc-butil-difenil-szilil)-timidinnl a 12. példában leírtak szerint, így nyerjük az 5'-O-Tr-T-3'-CH2-NH-0-CH2-T-3'-0-TBDPSi dimert. A kapott dimert benzilezzük CgHsCHO/NaBHgCN/AcOH-val a fentiekben leírt metilezéshez hasonlóan, így nyerjük az Nbenzilezett dimer 5'-0-Tr-T-3'-CH2-NBz-O-CH2-5'-T-3'-0-TBDPSi-t. Ez utóbbi dimert deblokkoljuk nBU4NF/THF és HCl/MaOH alkalmazásával a fentiekben leírtak szerint, így kapjuk a deblokkolt 5'-0H-T-3'-CH2-NBn-0-CH2-5'-T-3'-OH dimert, amelyet dimetoxi-tritilezve, majd ezt követően foszfitilezve (Oligonucleotide Synthesis: a practical approach, szerk.: M.J. Gait, IRL Press, 1984) nyerjük a cim szerinti vegyületet 45%-os kihozatallal.
XH-NMR (CDCI3) δ 6,15 (pszeudo t, 1, T2 CpH), 6,09 (m, 1, TI Οχ<Η), 3,76 (s, 6, 2OCH3), 1,7 és 1,48 (2S, 6, 2-CH3) és más protonok.
31P NMR (CDCI3) 149,59 és 149,23 ppm.
A foszfitilezett dimert sikeresen építjük be egy oligomerbe automatizált DNS szintetizátor alkalmazásával a 8. példában leírtak szerint, így illusztráljuk, hogy különböző, a farmakokinetikai és farmakodinamikai tulajdonságokat módosító csoportok építhetők a vázon lévő kötésekbe az oligonukleotid DNS szintézisét megelőzően.
28. példa (3'-CH2-NH-CH2-CH2-5 1) és (3'-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-5’) foszforamidát-származék * -Dez (oxi-foszfiniko) -3 ' - [ (metilén-imino) -metilén] -51 -0- (dimetoxi-tritil) -timidilil) - (3 ' ->5') - timidin
-781 mmól 31-dezoxi-3'-C-formil-5'-O-tritil-timidint 1,2 mmól
1-[6'-amino-2',5',6'-tridezoxi-3'-0-(terc-btuil-difenilszilil)-β-D-eritro-hexofuranozil]-timinnel (előállítása: G. Et
Zöld és mtársai, J.C.S. Chem. Comms. 422 (1968)) reduktíve aminálunk (A.F. Abdel-Magid és mtársai, Tetrahedron Letts.
31:5595 (1990) AcOH jelenlétében, így nyerjük a 5'-O-Tr-T-3'CH2NH-CH2-CH2-5'-T-3'-O-TBDPSi blokkolt dimert, amelyről ezután a védőcsoportokat eltávolitva nyerjük a 5'-0H-T-3'-CH2-NH-CH2CH2-5'-T-3'-OH dimert fehér por formájában 70%-os kihozatallal XH NMR (D2O, pH 5,6, 20°C) δ TI timidin egység: 7,78 (s,
1, C6H), 6,17 (t, 1, CjH), 4,45 (m, 1, C3tH), 4,08 (m, 1, C41H), 4,00, 3,72 (m, 2, Csi^nH), 2,9 (m, 2, Οθι,θπΗ),
2,34 (m, 2, C2-,2H), 1,77
7,47 (s, 1, C6H), 6,07 (t,
3,79 (m, 1, C41H), 2,89 (m
2,32 (m, 1, C3iH), 1,72 (S
Pka meghatározás
Vizsgáltuk az N-Me csoport s, 3, CH3), T2 timidin egyseg:
1, CjiH), 3,89 (m, 2, C5.5..H),
1, C3nH), 2,38 (m, 1, C2 Ή) ,
3, CH3), 2,68 (s, N-CH3) .
proton kémiai eltolódásának érzékenységét a fenti dimerrel kapcsolatban, amely a pH változás hatására következik be, NMR segítségével, ami jelzi a váz amin Pka értékét. A kémiai eltolás downfield irányba megy végbe, amikor az aminocsoportot protonáljuk. 4 mg 5'-OH-T-3'CH2-NCH3-CH2-CH2-5'-T-3 '-OH dimer feloldunk 0,6 ml 30 mmólos hidrogén-karbonát pufferban. A pH értékét 5,1 és 10 közötti értékekre állítjuk be 0,1 n nátrium-hidroxiddal 6 lépésben. A N-metil proton kémiai eltolása 2,26 és 2,93 ppm között változik, a Pka érték 7,8±0,l-re növekszik. Bár nem akarjuk magunkat elméletekhez kötni, úgy tűnik, hogy a fiziológiai pH
-79értéknél ez a váz protonálódik.
3'-Dez(oxi-foszfiniko)-3'-[metilén- (metilén-imino)-metilén]-5'-0-(dimetoxi-tritil)-timidilil)-(3'->5')-31-0-(β-ciano-etil-diizopropil-amino-foszfiril)-timidin
Az előzőek szerinti dimert HCHO/NaB^CN alkalmazásával
AcOH-ban metilezzük, így nyerjük a 5'-0H-T-3'-CH2-N(CH3)-CH2CH2-51-T-3'-OH dimert, amelyet dimetoxi-tritilezünk és foszfitilezünk (Oligonucleotide Synthesis: a practical approach, szerk.: M.J. Gait, IRL Press, 1984) szerinti eljárással) , így nyerjük a cim szerinti vegyületet hab formájában 68%-os kihozatallal.
1H-NMR (CDCI3) 06,12 (m, 2, 20].., H) , 2,15, 2,14 (2s, 3, N-CH3), 1,88, 1,45 (2s, 6, 2 C5CH3) és más ptoronok. 31P NMR (CDCI3) 149,49 és 148,96 ppm.
29. példa
3'-CH2-N(labilis védőcsoport)-0-0¾-5') dimer és foszforamidát származék egy 3'-dez(oxifoszfiniko)-3'-(metilén-imino) (3 -> 5') kötés, amely labilis N-védőcsoportot tartalmaz beépítése (3 ' -CH2-NH-O-CH2-5) kötés regenerálására
3' -Dez (oxi-foszfiniko) - 3 ' - [metilén- (fenoxi-acetil-imino) -timidilil)-(3'->5’)-timidin mmól 51-O-Tr-T-3'-CH2-NH-0-CH2-5'-T-31-O-TBDPSi- dimert (előállítása: F. Debart és mtársai, Tetrahedron Letts., 33: 1992) feoldunk 10 ml piridinben és keverés közben hozzáadunk 1,2 mmól fenoxi-acetil-kloridot. 12 óra elteltével a terméket felhígítjuk 200 ml CH2C12-vel, majd kétszer 50-50 ml telített NaHC03 oldattal és kétszer 50-50 ml vízzel mossuk, majd MgSO4
-80en szárítjuk. A CH2CI2 extraktumot betöményítjük és a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (CH2Cl2/MeOH=9/l tf/tf), a megfelelő frakciókat egyesítjük és betöményítjük, így nyerjük fehér hab formájában a 5'-O-Tr-T-3'-CH2-N(C0CH20Ph)-O-CH2-5'-T-3'-O-TBDPSi dimert.
XH NMR (DMSO-dg) δ 11,35 (br s, 2, NH), 7,6-6,65 (m, 32, Tr, TBDPS, fenoxi-acetil, CgH), 6,3 (pszeudo t, 1, Ηχ<), 6,03 (pszeudo t, 1, Ηχι), 4,5 (m, 1, CH2), 4,3 (m, 1, T2 H3), 3,9-3,3 (m, 6, Τχ H4 > , T2 H41 , T2H51 , H51, CH2 3n) , 3,10 (m, 2, T, H5< H5.>), 2,65 (m, 1, Τχ H3. ) , 2,2-2,05 (m, 4, H2., H2„), 1,58 (S, 3, CH3), 1,4 (s, 3, CH3), 1,02 (s, 9, (CH3)3CSi).
Az előzőek szerinti dimert ezután HF (48%)/CH3CN=5/95 tf/tf eleggyel kezeljük a tritilcsoport eltávolítására, majd a terméket nBu4NF/THF eleggyel kezelve eltávolítjuk a szililcsoportot, így nyerjük a cim szerinti vegyületet fehér por formájában (70% a három lépés).
XH NMR (DMSO-dg) δ 11,35 (br s, 1, NH), 11,25 (br s, 1,
NH), 7,92 (s, 1, CgH) , 7,5 (s, 1, CgH) , 7,2-6,8 (m, 5,
ArH), 6,23 (pszeudo t, 1, Ηχι), 5,98 (dd, 1, Ηχι), 5,45 (d, 1, 0H3i), 5,15 (t, 1, 0H5i), 4,9 (m, 2, CH2), 4,3-3,5 (m, 9, T2 H3i, H41, Η51Η5Π, CH23), 2,6 (m, 1, Tj H31), 2,25-2,00 (m, 4, H2iH2), 1,75 (s, 3, CH3), 1,65 (s, 3,
CH2) .
Ez utóbbi dimert ezután dimetoxi-tritilezzük (a következőkben leírt eljárás szerint: (Oligonucleotide
Synthesis: a practical approach, szerk.: M.J. Gait, IRL Press,
1984)), így nyerjük a 5'-O-DMT-T-3'-CH2-N-(COCH2OPh)-0-CH2-5'
-81-Τ-3'-OH dimert halványsárga hab formájában.
XH NMR (DMSO-dg) δ 11,3 (br S, 2, NH) , 7,55 (s, 1, CgH) ,
7,54 (s, 1, CgH), 7,45 (s, 1, CgH), 7,38-6,75 (m, 18, DMTrH, fenoxi-acetil-H), 6,22 (pszeudo t, 1, Τ2Ηχ<), 6,05 (pszeudo t, 1, ΤχΗχi), 4,75-4,60 (m, 2, CH2), 4,25 (m, 1, T2 H51) , 4,18 (m, 1, T2 H31 ) , 4,05 (m, 1, T2 H511), 3,9 (m, 2, H41) , 3,8-3,6 (m, 2, CH2 311 ), 3,65 (s, 6, 2OCH3) , 3,2 (m, 2, Τχ, H51H511), 2,82 (m, 1, Τχ H31 ) , 2,3-2,05 (m, 4,k
H2.H2..), 1,6 (s, 3, T2 CHCH3), 1,38 (s, 3, TI CH3) .
A fenti dimert ezután foszfitilezzük (Oligonucleotide Synthesis: a practical approach, szerk.: M.J. Gait, IRL Press, 1984) ) , így nyerjük a foszforamidát-származék dimert (megfelelő a DNS szintetizátorhoz való alkalmazáshoz) hab formájában (75% a két lépsére).
XH-NMR (CDCI3) δ 7,62 (s, 1, CgH), 7,2-7,45 (2m, 12, ArH) , 6,77-7,05 (3m, 7, ArH, CgH), 6,15 (pszeudo t, 1, Οχ.Η), 6,05 (t, 1, Cx.H), 4,7 (m, 2, 2C4iH), 3,74 (2s, 6, 2ArOCH3) , 2,95 (m, 1, C311H) , 1,78, 1,77 (2s, 3, C5CH3), 1,41 (s, 3, C5CH3), és más protonok.
3XP NMR (CDCI3) 149,76 és 149, 56 ppm.
30. példa
A (3'-CH2-NH-0-CH2-5') kötés regenerálása a (3’-CH2-N(labilis védőcsoport)-CH2-CH2-5 ') kötésből ο1igonukleo t idban
A 29. példa szerinti foszfitilezett dimert beépítjük egy oligonukleotidba a 8. példa szerint. Miután az oligonukleotidot befejeztük a hordozón, az oligonukleotidot a hordozóról lehasítjuk standrad ammónium-hidroxid körülmények között. A
-82hasítással egyidejűleg az ammónium-hidroxidos kezelés lehasítja a fenoxi-acetil-védőcsoportot is a beépített 3'-CH2-N(COCH2OPh)-O-CH2-5' oligonukleozid dimer imino-nitrogénatomjáról és így nyerjük a 3'-CH2-NH-O-CH2-5' kötésű oligonukleozid dimert az oligonukleoitd szerkezeten belül.
31. példa
A (3'-CH2-P(O)2-O-CH2-5') és (3·-CH2-O(P)O2-CH2-5') kötésű oligonukleozidok előállítása
3'-C-foszfonát dimer előállítása
A 3'-hidroxi-metil-5'-O-(terc-butil-difenil-szilil)-timidint bromid származékává alakítjuk NBS-sel végzett kezeléssel. A bromidot Arbuzov reakciónak vetjük alá, így nyerjük a foszfonát-diésztert, ezt trimetil-bróm-szilánnal hasítjuk, amikoris a szabad savat nyerjük és ezt kezeljük 3'-0(terc-butil-difenil-szilil)-timidinnel és DCC-vel pridinben, így nyerjük a dimert.
*-C-foszfonát kötésű oligonukleozidok előállítása
A fenti dimert egy oligonukleozidba építjük alkalmas módon védve és aktiválva a dimert 5'-0-DMT és 3'-0-foszfor-amid-származékként az oligonukleozid kívánt helyére való beépítéshez, ezt standard DNS szintetizáló eljárással végezzük.
5'-C-foszfonát kötésű oligonukleozidok előállítása
A megfelelő 5'-C-foszfonát dimereket úgy nyerjük, hogy az
5'-dezoxi-5'-bróm-nukleozidot egy foszfit-észterrel reagáltatunk, így nyerjük az 5'-foszfonátot, ezt reagáltatjuk tovább a 3'-hidroxi-metil-nukleoziddal és így nyerjük az 5'-C-foszfonát kötésű dimert.
-83Kiértékelés
1. eljárás - Az oligonukleotidok szerkezete és integritása
A. Oligonukleotidok emésztése Oligonukleotidok enzimatikus emésztése
A különböző antiszenz oligonukleotidokban végbevitt váz módosításokat enzimatikus hidrolízissel igazoltuk a következő módszer szerint. Az eljárásnál a szekvencia felsorolásban a jelzést a találmány szerinti kötés elhelyezkedésének jelölésére, míg a p jelzést a normál foszfo-diészter kötés elhelyezkedésére alkalmaztuk. A módosított oligonukleotidot 5'-GpCpGpTpTpTpTpT*TpTpTpTpTpGpCpG-3' (0,2 OD A26onm-nél) feloldjuk 0,1 ml trisz-HCl pufferben (pH=8,3, 200 μΐ) és kígyóméreg foszfo-diészterázzal (0,4 μg) alkálikus foszfatázzal (0,4 μg) és borjúlép foszfodiészterázzal (0,4 μg) kezeljük 24-60 órán át 37°C hőmérsékleten. A kapott keveréket hígítjuk és HPLC-vel analizáljuk: oszlop: C-18 nukleozid (5 μ), áramlási sebesség 1 ml/perc, oldószer A: 10 mmól trietil-ammonium-acetát, oldószer B: acetonitril/víz=l/l, 20 perces lineáris gradiens 0% B -> 50% B. Az anyag mennyiségi meghatározását a csúcs alatti területek alapján végeztük, amelyek a nukleozid alkotók extinkciós koefficiensére irányultak. Mindegyik módosított vázat tartalmazó dimer azonosságát egyidejűleg bejuttatott szintetikus mintával végeztük teljesen elemésztett oligonukleotiddal. Minden esetben a HPLC analízisek csúcsainak integrálása demonstrálta az emésztett oligonukleotid helyes összetételét.
B. A váz kötés integritása
Ezen túlmenően a módosított váz beépítésének integritását
-84a CpT*TpG tetramer XH és 31p NMR analízisével igazoltuk, amelyet ugyanazon ABI 380B DNS szintetizátorral állítottunk elő. Ily módon közvetve megerősítettük a szintetizátoron a kompjuter programot.
2. eljárás - Hibridizációs analízis
Egy találmány szerinti oligonukleotid, egy oligonukleotid analóg vagy egy oligonukleozid relatív képességét, hogy egy komplementer nukleinsavhoz kötődni képes, jellemezhetjük az adott hibridizációs komplex olvadási értékének meghatározásához . Az olvadási hőmérsékleten (Tm) egy jellemző fizikai tulajdonsága a komplementer nukleinsavakkal, jelzi °C-ban azt a hőmérsékletet, amelynél 50% kettős hélix per lánc forma (nem hibridizált) van jelen. A Tm értékét UV spektrum segítségével határozzuk meg, amelynél megállapítható a hibridizáció kialakulása és összeomlása (olvadás). Az alap felhalmozódást, amely a hibridizáció alatt bekövetkezik, az UV abszorpció csökkenése kiséri (hipokromicitás). Következésképpen az UV abszorpcióban bekövetkező csökkenés nagyobb Tm értéket jelez. Minél nagyobb a Tm érték, annál nagyobb az alak kötődési szilárdsága. A nem-Watson-Crick bázispárok erős destabilizáló hatásúak a Tm-re. Következésképpen a bázispárosodás abszolút pontossága szükséges egy antiszenz oligonukleotid vagy oligonukleozid optimális kötődéséhez a cél RNS-jéhez.
A. Az oligonukleotid analógok hibridizációs termodinamikájának kiértékelése
A találmány szerinti kiválasztott oligonukleotid analógok azon képességét, hogy a komplementer RNS vagy DMS szekvenciákhoz hibridizálódni képesek, termikus olvadási analízissel • · · · ·
-85határoztuk meg. Az RNS komplementert T7 RNS polimerázból és a DNS templát-promóterből nyertük, amelyet Applied Biosystems Inc. 380B nukleinsav szintetizátorral szintetizáltunk. Az RNS-t ioncserével tisztítottuk FPLC (LKB Pharmacia Inc.) alkalamzásával. Az antiszenz oligonukleotid analógokat vagy az RNS-hez vagy a DNS komplementhez adagoltuk sztöchiometrikus koncentrációban és vizsgáltuk az abszorpciós hiperkromicitást (260 nm) a duplexnek rendezetlen láncba való átalakulás hatására Gilford Response II spektrofotométer alkalamzásával. Ezeket a méréseket 10 mmólos Na-foszfátban végzetük pH=7,4, 0,4 mmól EDTA és NaCl jelenlétében úgy, hogy az ionerősség vagy 0,1 mól vagy 1 mól volt. A kapott adatokat grafikusan ábrázoltuk 1/Tm vs ln[Ct] összefüggés szerint, ahol a [Ct] jelentése az ossz oligonukleotid koncentráció.
A következő 1. táblázatban összefoglaljuk a találmány szerinti oligonukleotid analógok hibridizációjának termodinamikai analízisénél kapott eredményeket. A szekvenciáknál a jelölést alkalmazzuk a találmány szerinti kötések jelölésére a szekvencián belül, míg a p jelölést a normál foszfo-diészter kötések jelölésére használjuk. Továbbá, e táblázatban, valamint a további táblázatokban is a különböző találmány szerinti váz kötéseknél hivatkozunk az általános kémiai nevekre, valamint a rövid szerkezetekre is a következőképpen: (3'-CH=N-O-CH2-5') oximot jelöl; (3'-CH2-NH-O-CH2-5') amino-hidroxidot jelöl; (3'CH2-N(CH3)-O-CH2-5') N-metil-amino-hidroxidot jelöl; (3'-CH2-ON(CH3)-CH2-5' N-metil-hidroxi-amino-t jelöl és az (3'-CH2N(CH3)-N-(CH3)-CH2-5') N,N'-dimetil-hidrazinot jelöl.
1. táblázat
Duplex stabilitás (NDA-RNA)
Szekvencia = 5'-GpCpGpTpTpTpTpT*TpTpTpTpTpGpCpG-3'
* Váz Tm°C Tm°C
Természetes 50,2
N-met i1-hidroxi-amino 48,9 -1,3
N-metil-amino-hidroxi 49,4 -0,8
N,N'-dimetil-hidrazino 48,3 -1,9
Amino-hidroxi 47,8 -2,4
Szekvencia=5'-GpCpGpTpTpTpT*TpT*TpTpTpTpGpCpG-3'
* Váz Tm eC Tm eC
Természetes 50,2
N-metil-hidroxi-amino 47,5 -2,7
N-metil-amino-hidroxi 49,7, -0,5
N,N'-dimetil-hidrazino 48,6 -1,6
Amino-hidroxi 43,7 -6,4
Szekvencia=5'-GpCpGpTpTpT*TpT*TpT*TpTpTpGpCpG-3'
* Váz Tm°c Tm°C
Természetes 50,2
N-metil-hidroxi-amino 44,2 -6,0
N-metil-amino-hidroxi 48,2 -1,9
N,N'-dimetil-hidrazino 49,0 -1,9
Amino-hidroxi 45,3 -4,9
-87Szekvencia=5' -GpCpGpT*TpTpTpT*TpTpTpT*TpGpCpG-3'
* Váz Tm°c Tm°c
Természetes ' 50,2
N-metil-amino-hidroxi 47,8 -2,4
Szekvencia=5'-GpCpGpTpT*TpT* TpT*TpT*TpTpGpCpG- 3 '
* Váz Tm°c Tm°C
Természetes 50,2
N-metil-hidroxi-amino 42,3 -7,9
Amino-hidroxi 45,5 -4,7
Szekvencia=5'-GpCpGpT*TpTpTp *TpT*TpTpT*TpGpCpG i-3 '
* Váz Tm eC Tm°C
Természetes 50,2
N-metil-amino-hidroxi 47,9 -2,3
N,N'-dimetil-hidrazino 47,3 -2,8
Amino-hidroxi 43,9 -6,3
Szekvencia=5'GpCpGpT*TpT*TpT *TpT*TpT*TpGpCpg-3 1
* Váz Tm°c Tm°c
Természetes 50,2
N-metil-hidroxi-amino 40,0 -10,2
N-metil-amino-hidroxi 50,8 + 0,64
N,N'-dimetil-hidrazino 51,3 + 1,1
Amino-hidroxi 44,2 - 6,0
Szekvencia=5' -CpTpCpGpTpApCpCpT*TpTpCpCpGpGpTpCpC-3 '
Tm ec Tm°C * Váz
-88··· ···« ·· * · · ·
Természetes 63,4
Oxim 60,2 -3,2
N-metil-amino-hidroxi '64,9 + 1,5
N, Ν'-dimetil-hidrazino 64,9 + 1,5
Amino-hidroxi 62,9 -0,5
Szekvencia=5' -CpTpCpGpTpApCpT*TpT*IpCpCpGpGpTpCpC-3'
* Váz Tm ec Tm°C
Természetes 56,7
N-metil-hidroxi-amino 54,3 -2,4
N-metil-amino-hidroxi 57,4 + 0,7
N,N' -dimetil-hidrazino 57,0 + 0,3
Amino-hidroxi 56,0 -0,7
Szekvencia=5'-CpGpApCpTpApTpGpCpApApTpT*TpC-3'
* Váz Tm ec Tm°C
Természetes 44,1
Oxim 41,6 -2,5
N-metil-hidroxi-amino 43,8 -0,3
N-metil-amino-hidroxi 43,6 -0,5
N,N'-dimetil-hidrazino 42,8 -1,3
Amino-hidroxi 43,4 -0,7
Egy következő vizsgálatnál a találmány szerinti módosított kötéseket tartalmazó oligonukleotidok bázispár specificitását vizsgáltuk. Ennél a vizsgálatnál meghatároztuk a T*T dimer 5'-T kötését az 1 -CpTpCpGpTpApCpCpT*TpTpCpCpGpGpTpCpC-3
-89szekvenciában az RNS komplementben lévő A-val való összepasszítással (T:rA pár) és a C, G vagy U-val való nem-egyezéssel. A bázispárok átlagos nem-egyezését a következő 2. táblázatban foglaljuk össze. A 2. táblázatból látható, hogy a találmány szerinti vázkötések alapvető Watson-Crick bázispár specificitása a komplementer szálakhoz nincs veszélyeztetve.
2. táblázat
Bázispár specificitás
5'-CpTpCpGpTpApCpCpT*TpTpCpCpGpGpTpCpC-3
*Váz Tm/nem egyezés
Természetes -5,5
Oxim -4,95
N-metil-amino-hidroxi -7,32
N,Ν'-dimetil-hidrazino -7,41
Amino-hidroxi -6,89
B. Az oligonukleotid analógok hibridizációjának pontossága
A találmány szerinti antiszenz oligonukleotid analógok azon képességét, hogy abszolút specificitással képesek a cél mRNS-hez hibridizálódni, a tisztított cél mRNS Northern biot analízisével mutatjuk ki a totális celluláris RNS jelenlétében. A cél mRNS-t a cél mRNS-hez szükséges cDNS-t tartalmazó vektorból szintetizáljuk, amely a T7 RNS polimeráz promótortól downstream helyezkedik el. A szintetizált mRNS-t elektroforetizáljuk agaróz gélen és egy alkalmas hordozó membránra (nitrocellulóz) átvisszük. A hordozó membránt blokkoljuk és (32P)-jelzett oligonukleotid analógokkal vizsgáljuk. A pontosságot ismételt foltokkal határozzuk meg és
-90vagy emelt hőmérsékleten, vagy csökkent ionerősségu mosópuffer alkalmazásával mossuk. Autoradiográfiát végzünk a heteroduplex formációk jelenlétének megállapítására és az autoradiogrammokat lézer denzitométerrel (LKB Phramacia Inc.) értékeljük. A hibridképződés specificitását a totális celluláris RNS ismert technikával való izolálásával és analízisével végezzük, amelyhez agaróz elektroforézist, membrán transzfert és jelzett oligonukleotid analógokkal való vizsgálatot alkalmazunk. A pontosságot előre meghatározzuk egy nem-módosított antiszenz oligonukleotidra és olyan körülményeket alkalmazunk, amelyeknél csak a specifikusan kiválasztott cél mRNS képes az oligonukleotid analóggal heteroduplex képzésére.
3. Eljárás - Nukleáz rezisztencia
A. Az oligonukleotid analógok szérummal és citoplazmikus nukleázokkal szembeni rezisztenciájának vizsgálata
A találmány szerinti oligonukleotid analógokat a szérum nukleázokkal szembeni rezisztenciájuk megállapítására úgy vizsgálhatjuk, hogy az oligonukleotid analógokat különböző koncentrációban magzati borjúszérumot tartalmazó közegben inkubáljuk. A jelzett oligonukleotid analógokat különböző ideig inkubáljuk, proteáz K-val kezeljük, majd gél elektroforézissel analizáljuk (20% poliakrilamin-karbamid denaturáló gél), majd ezt követően autoradiográfiát végzünk. Az autoraiogrammokat lézer denzitometriával értékeljük ki. A módosított kötések elhelyezkedése, az oligonukleotid ismert hosszúsága alapján meghatározható az adott kodifikáció hatása a nukleáz degradációra. Citoplazmikus nukleázokhoz HL 60 sejtvonalat lehet alkalmazni. Egy poszt-mitokondriális felülúszót készítünk
-91differenciális centrifugálissal és a jelzett oligonukleotid analógokat ezen felülúszóban inkubáljuk különböző ideig. Az inkubálást követően vizsgáljuk az oligonukleotid analógokat a degradáció mértékére, hasonlóan mint ahogy azt a fentiekben a szérum nukleotikus degradációknál ismertettük. Az autoradiográfiás eredményeket kiértékeltük nem módosított és a találmány szerinti oligonukleotid analógok összehasonlítására.
A következő 3. táblázatban néhány találmány szerinti kötés nukleáz rezisztenciáját mutatjuk be 10%-os magzati borjúszérummal szemben. Mint az a 3. táblázatból kitűnik, az összes vizsgált kötés nagyobb stabilitást mutat a magzati borjúszérum nukleázával szemben, mint a természetes nukleotidok. A 3. táblázatban látható a t^ érték mind az N-N-l->, mind az N-l->N-2 átmenetekre. A táblázatnál a szekvenciában a jelölés a találmány szerinti kötés elhelyezkedésére utal, míg a p jelölést a normál foszfo-diészter kötés elhelyezkedésére alkalmazzuk.
3. táblázat
Nukleáz rezisztencia (10% magzati borjúszérum)
Szekvencia=5 1 -CpGpApCpTpApTpGpCpApApTpT*TpC-3'
*Váz
N -> N-l -> N-2
Természetes 0,5 óra 1,0 óra
N-metil-hidroxi-amino 2,0 óra 4,0 óra
N-metil-amino-hidroxi 5,5 óra 12,5 óra
N,N'-dimetil-hidrazino 20,5 óra 36,5 óra
Amino-hidroxi 2,5 óra
. ···* 4 · «· _ * · · · · * ···♦♦· « « *· * · »· · · · « ««
4. eljárás - 51-lipoxigenáz analízis, gyógyszerek és vizsgálatok
A. gyógyszerek
Terápiás felhasználásra állatokat kezeltünk - amelyek feltehetően 5-lipxogenáz abnormális feleslegben való felhalmozódásával jellemezhető betegségben szenvednek - kezeltünk a találmány szerinti oligonukleotid analógok adagolásával. A szakterületen jártas szakember könnyen meghatározhatja az optimális dózist, az adagolás módszerét és az ismétlődés gyakoriságát. A kezelést általában vagy addig végezzük, amíg a kívánt kúrát befejezzük, vagy addig, amíg a betegség tünetei csökkennek. Bizonyos betegségeknél valószínűleg hosszú kezelés szükséges.
B. Kutatási reagensek
A találmány szerinti oligonukleotid analógok hasznosak lehetnek mint kutatási reagensek, amelyek használhatók az 5lipoxigenáz mRNS hasítására, vagy más módosítására nyers sejt lizátumokban vagy pedig részlegesen vagy teljesen tisztított RNS készítményekben. Ezt a találmány szerinti alkalmazást például úgy végezzük, hogy standard módszerekkel sejteket lizálunk, optimálisan extraháljuk az RNS-t, majd kezeljük egy olyan kompozícióval, amelynek a kompozíciója például 100-500 ng/10 Mg ossz RNS, pufferban, amely például 50 mmól foszfát, a pH értéke 4-10 közötti érték és a hőmérséklete 30-50°C közötti érték. A hasított 5-lipoxigenáz RNS-t agaróz gélen elektroforézissel lehet analizálni és a hibridizációját pedig radiojelzett DNS mintával vagy más ismert módszerrel.
C. Diagnosztikumok
A találmány szerinti oligonukleotid analógok alkalmazhatók diagnosztikai célra is, különösen egy specifikus mRNS expressziójának meghatározásához különböző szövetekben vagy abnormális vagy mutáns RNS fajták expressziójának meghatározásához. E példában az oligonukleotid analóg egy hipotetikus abnormális mRNS-t céloz meg, amely úgy van megtervezve, hogy komplementer az abnormális szekvenciával, de nem hibridizálódna vagy nem hasítaná a normál mRNS-t.
A szövetmintákat homogenizáljuk és az RNS-t ismert módon extraháljuk. A nyers homogenizátumot vagy extraktumot például úgy kezeljük, hogy a cél RNS-t hasítjuk. A terméket ezután szilárd hordozóhoz hibridizáljuk, amely a megkötött oligonukleotidot tartalmazza, amely komplementer a hasítási hely 51-végén lévő szakasszal. Az mRNS-nek mind a normál, mind az abnormál 5' szakasza kötődne a szilárd hordozóhoz. Az abnomrál RNS 3' szakasza, amelyet a találmány szerinti vegyület hasít, nem kötődne a hordozóhoz és ily módon a normál mRNS-tői elválasztódna.
A kiválasztott mRNS fajták az 5-lipoxigenázra vonatkoznak, azonban a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány nem korlátozódik erre és az általánosságban is alkalmazható. Az 5'-lipoxigenáz enzim termelődésének gátlása vagy módosítása várhatóan jelentős terápiás hatású a betegségek kezelésénél. A készítmények hatásosságának megállapítására további vizsgálatokat végeztünk.
D. In vitro vizsgálatok
Az 5-lipoxigenáz celluláris vizsgálataihoz előnyösen humán promyelocitikus leukémia HL-60 sejtvonalat alkalmazunk. Ezek a «4
-94sejtek képesek akár monocita-szerű, akár neutrofil-szeru sejtekké differenciálódni különböző szerek hatására. A sejteket 1,3% dimetil-szulfoxiddal DMSO-ban kezelve ismert, hogy a sejtek neutrofilekké való differenciálódását segítjük elő. Most azt találtuk, hogy az alap HL-60 sejtek nem szintetizálnak mérhető mértékben 5-lipoxigenáz proteint vagy szekréciós leukotriéneket (ez az 5-lipoxigenáz downstream terméke). A sejtek DMSO-ban való differenciálódása az 5-lipoxigenáz protein és a leukotrién bioszintézisének megjelenését okozza 48 órával a DMSO adagolása után. így az 5-lipoxigenáz protein szintézisének akiváltása felhasználható vizsgáló rendszerként az antiszenz oligonukleotid analógok analíziséhez, amelyek az 5-lipoxigenáz szintézist gátolják ezen sejtekben.
Antiszenz oligonukleotidokhoz alkalmas egy másik vizsgáló rendszernél azt a tényt hasznosítjuk, hogy az 5-lipoxigenáz egy suicide enzim annyiban, hogy inaktiválja magát a szubsztrátummal való reagáláskor. A differenciált HL-60 vagy más 5lipoxigenázt expresszáló sejteket 10 μ mól A23187-tel, egy kalcium-ionoforral, kezelve elősegítjük az 5-lipoxigenáz transzlokációját a citozoltól a membránhoz és az enzim aktivációja is bekövetkezik. Az aktivációt és több menet katalízist követően az enzim katalitikusán inaktívvá válik. így a sejtet kalcium-ionoforral kezelve az endogén 5-lipoxigenáz inaktiválódik. A sejteknek kb. 24 órába telik, hogy az A23187-kezelésbŐl regenerálódjanak, mint azt a leukotrién B4 szintetizálására való képesség alapján meghatároztuk. Az 5-lipoxigenáz elleni oligonukleotid analógok vizsgálhatók két HL-60 modell rendszerben aktivitásra a következő kvantitaítv • ·· ·! *··« ··*· · · · · ♦* ··► ·· ·.
-95vizsgálat szerint. A vizsgálatokat az intakt sejtekben való 5lipoxigenáz gáltás legközvetlenebb mérésétől az intakt sejtekben végbemenő több downstream eseményig, így az 5-lipoxigenáz aktivitás méréséig írjuk le.
A legközvetlenebb hatás, amit az oligonukleotid analógok az intakt sejtekre kifejthetnek és amely könnyen meghatározható, az 5-lipoxigenáz protein szintézis specifikus gátlása. Ennek kivitelezéséhez a sejteket 35S-metioninnal (50 ^Ci/mL) jelezzük 2 órán át 37°C hőmérsékleten az újonnan szintetizált proteinek jelzésére. A sejteket extraháljuk, az összes celluláris protein szolubilizálására és az 5-lipoxigenázt immunoprecipitáljuk 5-lipoxigenáz antitesttel, majd eluáljuk a protein A Sepharose gyöngyöktől. Az immunporecipitált proteineket ezután SDS-poliakrilamid gél elektroforézissel újra feloldjuk és autoradiográfiát végzünk. Az immunoprecipitált 5-lipoxigenáz mennyiségét scanning denzitometriával határozzuk meg.
Ezen kísérletek alapján a várható eredmények a következők. A kontroll sejtekből immunoprecipitált 5-lipoxigenáz protein mennyiségét 100%-ra normalizáljuk. A sejteket 48 órán át 1 μιηόΐ, 10 μτηΐ és 30 μτηόΐ hatásos oligonukleotid analóggal kezelve az immunoprecipitált 5-lipoxigenáz mennyisége a kontrolihoz viszonyítva 5, 25, illetve 75%-kal csökken.
Az 5-lipoxigenáz enzim aktivitásának mérése a celluláris homogenizátumban szintén alkalmazható a jelenlévő enzim mennyiségének meghatározására, amely leukotriének szintetizálására képes. Kifejlesztettünk egy radiometrikus vizsgálatot az 5-lipoxigenáz enzim aktivitásának mérésére a sejt
-96homogenizátumban fordított fázisú HPLC felhasználásával. A sejteket ultrahangosán összetörjük egy pufferban, amely proteáz inhibitorokat és EDTA-t tartalmaz. A sejt h'omogenizátumot 10000 G mellett 30 percen át centrifugáljuk, majd a felülúszót analizáljuk 5-lipoxigenáz aktivitásra. A cytosolicus proteineket 10 μπιόΐ 14C-arachidonsav, 2 mmól ATP, 50 μτηόΐ szabad kalcium, 100 μg/ml foszfatidilkolin és 50 mmól bisz-trisz puffer jelenlétében (pH=7) 5 percen át 37°-on inkubáljuk. A reakciót azonos térfogatú aceton adagolásával lezárjuk, a zsírsavakat etil-acetáttal extraháljuk. A szubsztrátumot és a reakciótérmékét egymástól fordított fázisú HPLC-vel Novopak C18 oszlop (Watres Inc., Millford MA) alkalmazásával elválasztjuk. A radioaktív csúcsot Beckman típusú 171 radiokromatográfiás detektorral detektáljuk. A di-HETE és mono-HETE formába átalakult arachidonsav mennyiségét használjuk az 5-lipoxigenáz aktivitás mértékének megállapítására.
A várt eredmény a DMSO-val differenciált HL-60 sejteknél, amelyeket 72 órán át 1 μτηόΐ, ΙΟμτηόΙ és 30 μπιόΐ hatásos oligonukleotid analóggal kezelünk, a következők. A kontroll sejtek 200 pmól arachidonsav/5 perc/106 sejtet oxidálnak. Az 1 μπιόΐ, 10 μιηόΐ és 30 μιηόΐ hatásos oligonukleozid analóggal kezelt sejtek 195 pmól, 140 pmól és 60 pmól arachidonsav/5 perc/10^ sejt mennyiséget oxidálnak.
Kifejlesztettünk egy kvantitatív, kompetitív enzimkapcsolásos immunoszorbens vizsgálatot (ELISA) az 5-lipoxigenáz protein mennyiség sejtekben való meghatározásához. E. coli-ben expresszált és extrakcióval tisztított humán 5-lipoxigenázt, Q-Sepharost, hidroxi-apatitot és fordított fázisú HPLC-t
-97♦··· «··· .. t.
* · · * · ’·.· .ίλ alkalmaztunk standardként és primer antigénként a mikrotiter lemezek borításához. 25 ng tisztított 5-lipoxigenázt kötöttünk a mikrotiter lemezekhez 1 éjszakán át 4°C hőmérsékleten. A lyukakat 90 percen át 5%-os kecskeszérummal blokkoltuk, amelyet 20 mmól trisz.HCL pufferral, pH=7,4, blokkoltunk 150 mmól NaCL (TBS) jelenlétében. A sejt extraktumokat (0,2% Triton X-100, 12000 G, 30 perc) vagy a tisztított 5-lipoxigenázt 1:4000 higítású 5-lipoxigenáz poliklón antitesttel inkubáltuk, 90 percig az össz térfogat a mikrotiter lyukakban 100 μΐ volt. Az antitesteket immunizált nyulakból tisztított humán rekombináns 5-lipoxigenázzal nyertük. A lyukakat TBS-sel mostuk, amely 0,05% Tween 20 (TBST) tartalmú volt, majd az inkubálást 100 μΐ 1:1000 higítású peroxidázzal konjugált kecske anti-nyúl IgG-vel (Cappel Laboratories, Melvern, PA) végeztük 60 percen át 25°C hőmérsékleten. A lyukakat TBST-vei mostuk és a peroxidázzal jelzett második antitest mennyiséget meghatároztuk tetrametil-benzidinnel végzett kifejlesztéssel.
A vizsgálatból várható eredmény 30 mer oligonukleotid analóg 1 gmól, 10 μτπόΐ és 3 0 μτηόΐ mennyiségével végzett kezelés után 30 ng, 18 ng, illetve 5 ng 5-lipoxigenáz/106 sejt, míg a kezeletlen sejtek esetében az 5-lipoxigenáz tartalom 34 ng.
Az 5-lipoxigenáz bioszintézisének gátlása azzal a hatással jár, hogy csökken a stimulált sejtekből felszabaduló leukotriének mennyisége. A DMSO-differenciált HL-60 sejtekből leukotrién B4 szabadul fel kalcium ionofor A23187-tel végzett stimulálás hatására. A sejtközegbe felszabaduló leukotrién B4 mennyiségét radioimmuno vizsgálattal lehet meghatározni kereskedelmi forgalomban beszerezhető diagnosztikai kitek (New
-98···: ·*·ί »· ·.
• · · * · ·. · · · ·· !·’.
·· ·· ·♦»· ·«
England Nuclear, Boston, MA) felhasználásával. A leukotrién B4 termelődése kimutatható a HL-60 sejtekben 48 órával a DMSO adagolását követően, amely a sejteket neutrofil-szerű sejtté differenciálja. A sejteket (2xl05 sejt/ml) növekvő koncentrációjú oligonukleotid analógokkal kezeljük 48-72 órán át 1,3% DMSO jelenlétében. A sejteket mossuk és 2x10^ sejt/ml koncentrációban reszuszpendáljuk Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt sóoldatban, amely 1% dezlipidezett szarvasmarha szérum albumint tartalmaz. A sejteket 10 μπιόΐ kalcium ionofor A23187-tel stimuláljuk 15 percig, majd meghatározzuk az LTB4 mennyiségét az 5xl05 sejt mennyiségben radioimmuno vizsgálattal a gyártó előírásai szerint eljárva.
A vizsgálat alkalmazásával várhatóan a következő eredményt kapjuk a 15-mer módosított kötésű, 5-LO mRNS-re irányított antiszenz oligonukleotid (GCAAGGTCACTGAAG) alkalmazásával. A sejteket 72 órán át 1 μιτιόΐ, 10 μιηόΐ vagy 30 μπιόΐ oligonukleotid analóggal kezeljük 1,3% DMSO jelenlétében. Az 5xl05 sejtben termelődött LTB4 mennyisége várhatóan 75 pg, 50 pg, illetve 35 pg, míg a kezeletlen differenciálódott sejtek esetében ez a mennyiség 75 pg LTB4.
E. In vivő vizsgálat
Egerek esetében az 5-lipoxigenáz termelődésének gátlását a következőképpen mutatjuk ki. Az arachidonsav topikális alkalmazása a bőrben a leukotrién B4, leukotrién C4 és prosztaglandin E2 gyors termelődését eredményezi, amelyet ödéma és celluláris infiltráció követ. Bizonyos 5-lipoxigenáz inhibitorokról ismert, hogy aktivitással rendelkeznek ezen vizsgálatnál. A vizsgálathoz 2 mg arachidonsavat alkalmazunk az
-99.: ···: ···· .·* .· : ··· ..... ·· ·..· egerek fülére, kontrollként a másik fül szolgál. A polimorfonukleáris sejt infiltrátumot vizsgáljuk myeloperoxidáz aktivitás mérésével a homogenizátumban, amelyet biopszissal veszünk 1 órával az arachidonsav adagolása után. Az ödémás választ a fül vastagságának mérésével és a biopszis tömegének mérésével határozzuk meg. A biopszis mintában termelődött leukotrién B4 mennyiségének mérését a szövetben az 5-lipoxiogenáz aktivitás közvetlen mérésével végezzük. Az oligonukleotid analógokat topikálisan alkalmazzuk mindkét fülre 12-24 órával az arachidonsav adagolása előtt a vegyületek optimális akivításának kifejtése érdekében. Mindkét fület 24 órán át előkezeljük 0,1 μτηόΐ, 0,3 μιηόΐ vagy 1 μπιόΐ oligonukleotid analóggal az arachidonsawal végzett kezelés után. Az értékeket átlagojuk koncentrációnként három állatra vonatkozóan. A polimorfonukleáris sejt infiltráció gátlásának értéke 0,1 μιηόΐ, 0,3 μπιόΐ és 1 μπιόΐ esetében várhatóan 10%, 75% és 82% a kontroll aktivitásra vonatkozóan. Az ödéma gátlása várhatóan 3%, 50% és 90%, míg a leukotrién B4 termelődsésnek gátlása várhatóan 15%, 79%, illetve 99%.

Claims (96)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Oligonukleotid analóg, amelyben legalább néhány alegység az (I) általános képletnek felel meg - a képletben Bx jelentése változtatható báziscsoport, Q jelentése 0, CH2, CHF vagy CF2 csoport és
    X jelentése H, OH, 1-10 szénatomos rövid szénláncu alkil-, szubsztituált rövid szénláncu alkil-, alkaril- vagy aralkil-csoport, F, Cl, Br, CN, CF3, OCN-csoport, 0-, Svagy N-alkilcsoport, 0-, S- vagy N-alkenilcsoport, SOCH3, SO2CH3, 0N02, N02, N3, NH2 csoport, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkaril-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino- vagy szubsztituált szililcsoport, továbbá X jelentése lehet egy RNS-t hasító csoport, egy az oligonukleotid farmakokinetikai tulajdonságait javító csoport vagy egy az oligonukleotid farmakodinamikus tulajdonságait javító csoport,
    Lj és L4 jelentése egymástól függetlenül CH2, C=0, C=S, C-NH2, C-NHR3, C-OH, C-SH, C-O-Rx vagy C-S-R2-csoport,
    L2 és L3 jelentése egymástól függetlenül CRiR2, C=CRiR2, C=NR3, P(0)R4, P(S)R4, C=0, C=S, 0, S, S0, S02, NR3 vagy SiRgRg-csoport, vagy együttesen egy alkén- vagy alkincsoport, egy aromás, karbociklusos vagy heterociklusos gyűrű részét képezik, vagy
    Li, L2, L3 és L4 jelentése a fenti, azzal a megkötéssel,
    Lj, L2, L3 és L4 együttesen jelenthet -CH2=N-NH-CH2- vagy -CH2-0-N=CH-csoportot is,
    -101R1 és R2 jelentése H, OH, SH, NH2, 1-10 szénatomos alkil-, szubsztituált alkil-, alkenil-, alkaril- vagy aralkilcsoport, alkoxi-, tio-alkoxi-, alkil-amino-, aralkil-amino-, szubsztituált alkil-amino-, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkil-amino-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino-, halogén-, formil-, keto-, benzoxi-, karboxamido-, tio-karboxamido-, észter-, tio-észter-, karboxamidin-, karbamil-, karbamido- vagy guanidino-csoport, jelenthetnek továbbá egymástól függetlenül egy RNS-t hasító csoportot, továbbá egy az oligonukleotidok farmakokinetikai vagy farmakodinamikai tulajdoinságait javító csoportot,
    R3 jelentése H, OH, NH2, rövid szénláncu alkil-, szubsztituált rövid szénláncu alkil-, alkoxi-, rövid szénláncu alkenil-, aralkil-, alkil-amino-, aralkil-amino-, szubsztituált alkil-amino-, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkil-amino-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino-csoport, vagy egy RNS-t hasító csoport, egy az oligonukleotid farmakokinetikai vagy farmakodinamikai tulajdonságait javító csoport,
    R4 jelentése OH, SH, NH2, Ο-alkil-, S-alkil-, NH-alkil-, 0alkil-heterociklusos-, S-alkil-heterociklusos-, N-alkil-heterociklusos- vagy egy nitrogéntartalmú heterociklusos csoport,
    R5 és Rg jelentése egymástól függetlenül 1-6 szénatomos alkilvagy alkoxicsoport, azzal a feltétellel, hogy ha Lj jelentése C=0 vagy C=S csoport, akkor L2 NR3 csoporttól eltérő vagy ha L4 jelentése C=0 vagy C=S, akkor L3 NR3 csoporttól eltérő, továbbá ha L2 vagy L3
    -102közül az egyik C=O vagy C=S akkor a másik NR3-tól eltérő, továbbá hogy ha L2 jelentése P(O)R4 csoport és R4 jelentése OH csoport, és X jelentése OH csoport és Bx jelentése uracil- vagy adenin-, akkor L3 jelentése 0 atomtól eltérő, továbbá, ha Ιιχ, L2 és L4 jelentése CH2 csoport és X jelentése H vagy OH csoport és Q jelentése 0, akkor L3 jelentése S, SO vagy SO2 csoporttól eltérő csoport.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében Q jelentése O.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében L]_ és L4 jelentése CR]_R2 általános képletü csoport.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében Rí és R2 jelentése egyaránt H.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében Q jelentése 0.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében L2 és L3 jelentése egymástól függetlenül CRiR2, 0, P(0)R4, P(S)R4 vagy NR3.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében L2 és L3 közül az egyik jelentése CRiR2 és a másik P(0)R4 vagy P(S)R4-
  8. 8. A 6. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében L2 jelentése O és L3 jelentése P(0)R4 vagy P(S)R4·
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében L2 és L3 jelentése egyaránt NR3.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében R3 jelentése H.
    -103-
  11. 11. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében Lj és L4 jelentése CH2 és L2 és L3 jelentése NR3.
  12. 12. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében L2 és L3 jelentése együttesen egy ciklopropil-, ciklobutil-, etilén-oxi-, etil-aziridin-, szubsztituált etil-aziridin-gyurű részét képezi.
  13. 13. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében L2 és L3 jelentése együttesen egy 3-6 szénatomos karbociklusos vagy 4-, 5- vagy 6-tagú nitrogéntartalmú heterociklusos csoport részét képezi.
  14. 14. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében X jelentése H.
  15. 15. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében X jelentése OH.
  16. 16. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében X jelnetése H, OH, F, O-alkil vagy 0-alkenil, Q jelentése 0.
  17. 17. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében Bx jelentése adenin, guanin, uracil, timin, citozil,
    2-amino-adenozin vagy 5-metil-citozin.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében Q jelentése .
  19. 19. A 18. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében Li és L4 mindegyikének jelenétse CH2.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében L2 és L3 jelentése egyaránt NH.
  21. 21. A 19. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében L2 és L3 közül az egyik jelentése 0 és a másik
    -104jelentése NH.
  22. 22. A 19. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében L2 jelentése NH és ύβ jelentése 0.
  23. 23. A 21. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, amelynek képletében L2 jelentése 0 és L3 jelentése NH.
  24. 24. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy 5-50 említett szerkezetű alegységet tartalmaz.
  25. 25. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy lényegében az összes alegység az említett szerkezetű.
  26. 26. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy lényegében a váltakozó alegységek az említett szerkezetűek.
  27. 27. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal van elkeverve.
  28. 28. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy fokozott nukleáz rezisztenciával rendelkezik a megfelelő természetes oligonukleotidokhoz viszonyítva.
  29. 29. Eljárás egy protein termelődésének vagy aktivitásának módosítására valamely szervben, azzal jellemezve, hogy a szervet egy oligonukleotid analóggal érintkeztetjük, amely specifikusan hibridizálódni képes az említett protein nukleinsav szekvenciájának legalább egy részéhez és amely analógban legalább néhány alegység az (I) általános képletnek megfelelő szerkezetű - a képletben
    Bx jelentése változtatható báziscsoport,
    Q jelentése O, CH2, CHF vagy CF2 csoport és
    -105X jelentése H, OH, 1-10 szénatomos rövid szénláncu alkil-, szubsztituált rövid szénláncu alkil-, alkaril- vagy aralkil-csoport, F, Cl, Br, CN, CF3, OCN-csoport, 0-, Svagy N-alkilcsoport, 0-, S- vagy N-alkenilcsoport, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2 csoport, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkaril-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino- vagy szubsztituált szililcsoport, továbbá X jelentése lehet egy RNS-t hasító csoport, egy az oligonukleotid farmakokinetikai tulajdonságait javító csoport vagy egy az oligonukleotid farmakodinamikus tulajdonságait javító csoport,
    Lp és L4 jelentése egymástól függetlenül CH2, C=0, C=S, C-NH2, C-NHR3, C-OH, C-SH, C-O-Ri vagy C-S-R2-csoport,
    L2 és L3 jelentése egymástól függetlenül CR1R2, C=CRiR2, C=NR3, P(O)R4, P(S)R4, C=0, C=S, 0, S, S0, SO2, NR3 vagy SiRsRg-csoport, vagy együttesen egy alkén- vagy alkincsoport, egy aromás, karbociklusos vagy heterociklusos gyűrű részét képezik, vagy
    Li, L2, L3 és L4 jelentése a fenti, azzal a megkötéssel,
    Llz L2, L3 és L4 együttesen jelenthet -CH2=N-NH-CH2- vagy -CH2-0-N=CH-csoportot is,
    R1 és R2 jelentése H, OH, SH, NH2, 1-10 szénatomos alkil-, szubsztituált alkil-, alkenil-, alkaril- vagy aralkilcsoport, alkoxi-, tio-alkoxi-, alkil-amino-, aralkil-amino-, szubsztituált alkil-amino-, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkil-amino-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino-, halogén-, formil-, keto-, benzoxi-, karboxamido-,
    -106tio-karboxamido-, észter-, tio-észter-, karboxamidin-, karbamil-, karbamido- vagy guanidino-csoport, jelenthetnek továbbá egymástól függetlenül egy RNS-t hasító csoportot, továbbá egy az oligonukleotidok farmakokinetikai vagy farmakodinamikai tulajdoinságait javító csoportot,
    R3 jelentése H, OH, ΝΗ2, rövid szénláncu alkil-, szubsztituált rövid szénláncu alkil-, alkoxi-, rövid szénláncu alkenil-, aralkil-, alkil-amino-, aralkil-amino-, szubsztituált alkil-amino-, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkil-amino-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino-csoport, vagy egy RNS-t hasító csoport, egy az oligonukleotid farmakokinetikai vagy farmakodinamikai tulajdonságait javító csoport,
    R4 jelentése OH, SH, ΝΗ2, Ο-alkil-, S-alkil-, NH-alkil-, 0alkil-heterociklusos-, S-alkil-heterociklusos-, N-alkil-heterociklusos- vagy egy nitrogéntartalmú heterociklusos csoport,
    R5 és Rg jelentése egymástól függetlenül 1-6 szénatomos alkilvagy alkoxicsoport, azzal a feltétellel, hogy ha Lj jelentése C=0 vagy C=S csoport, akkor L2 NR3 csoporttól eltérő vagy ha L4 jelentése C=0 vagy C=S, akkor L3 NR3 csoporttól eltérő, továbbá ha L2 vagy L3 közül az egyik C=O vagy C=S akkor a másik NR3-tól eltérő, továbbá hogy ha L2 jelentése P(0)R4 csoport és R4 jelentése OH csoport, és X jelentése OH csoport és Bx jelentése uracil- vagy adenin-, akkor L3 jelentése 0 atomtól eltérő, továbbá, ha L1# L2 és L4 jelentése CH2 csoport és X jelentése H vagy OH csoport és Q jelentése 0, akkor L3 jelentése S, S0 vagy
    -107-
    SO2 csoporttól eltérő csoport.
  30. 30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében Q jelentése 0.
  31. 31. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében Li és L4 jelentése CR3R2.
  32. 32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében R]_ és R2 mindegyikének jelentése jelentése H.
  33. 33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében Q jelentése 0.
  34. 34. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 és L3 jelentése egymástól függetlenül CRiR2, 0, P(O)R4, P(S)R4 vagy NR3.
  35. 35. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 és L3 közül az egyik jelentése CRiR2 és a másik jelentése P(0)R4 vagy P(S)R4.
  36. 36. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 jelentése 0 és L3 jelentése P(O)R4 vagy P(S)R4.
  37. 37. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 és L3 jelentése egyaránt NR3.
  38. 38. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, • ·
    -108- hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében R3 jelentése H.
  39. 39. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében Li és L4 jelentése egyaránt CH2 és L2 és L3 jelentése egyaránt NR3.
  40. 40. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 és L3 jelentése együttesen egy ciklopropil-, ciklobutil-, etilén-oxi-, etil-aziridin- vagy szubsztituált etil-aziridin-gyűrű részét képezi.
  41. 41. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 és L3 jelentése együttesen egy 3-6 szénatomos karbociklusos vagy 4-, 5- vagy 6-tagú nitrogénatartalmú heterociklusos gyűrű részét képezi.
  42. 42. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében X jelentése H.
  43. 43. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében X jelentése OH.
  44. 44. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében X jelentése H, OH, F, O-alkil- vagy 0-alkenil-csoport és Q jelentése 0.
  45. 45. A 29 igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek
    -109- képletében Bx jelentése adenin-, guanin-, uracil-, timin-, citozin-, 2-amino-adenozin- vagy 5-metil-citozin-csoport.
  46. 46. A 45. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében Q jelentése 0.
  47. 47. A 46. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében Li és L4 mindegyikének jelentése CH2.
  48. 48. A 47. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 és L3 mindegyikének jelentése NH.
  49. 49. A 47. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 és L3 közül az egyik jelentése 0 és a másik jelentése NH.
  50. 50. A 47. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 jelentése NH és L3 jelentése 0.
  51. 51. A 47. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 jelentése 0 és L3 jelentése NH.
  52. 52. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amely 5-50 említett szerkezetű alegységet tartalmaz.
  53. 53. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lényegében az oligonukleotid analógban mindegyik alegység az említett szerkezetű.
  54. 54. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,
    -110- • ···· ···* ·· • · « · · hogy lényegében a váltakozó alegységek az említett szerkezetűek.
  55. 55. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid analógot gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal együtt alkalmazzuk.
  56. 56. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid megnövekedett nukleáz rezisztenciával rendelkezik a megfelelő természetes oligonukleotidokhoz viszonyítva.
  57. 57. Eljárás valamely szerv betegségének kezelésére, amely betegség egy protein nem kívánatos termelődésével jellemezhető, azzal jellemezve, hogy a szervet egy oligonukleotid analóggal érintkeztetjük, amely az említett proteint kódoló nukleinsav szekvencia legalább egy részével hibridizálható, az oligonukleotidot vagy önmagában vagy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal elkeverve alkalmazzuk és amely analógban legalább néhány alegység az (I) általános képletnek felel meg, amely képletben -
    Bx jelentése változtatható báziscsoport, Q jelentése 0, CH2, CHF vagy CF2 csoport és
    X jelentése H, OH, 1-10 szénatomos rövid szénláncu alkil-, szubsztituált rövid szénláncu alkil-, alkaril- vagy aralkil-csoport, F, Cl, Br, CN, CF3, OCN-csoport, 0-, Svagy N-alkilcsoport, 0-, S- vagy N-alkenilcsoport, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2 csoport, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkaril-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino- vagy szubsztituált szililcsoport, továbbá X jelentése lehet egy RNS-t hasító csoport, egy az
    I • · · · ··· ······ · · ♦ · · ·· · · ···· ··
    -Illői igonukleotid farmakokinetikai tulajdonságait javító csoport vagy egy az oligonukleotid farmakodinamikus tulajdonságait javító csoport,
    L3 és L4 jelentése egymástól függetlenül CH2, C=0, C=S, C-NH2, C-NHR3, C-OH, C-SH, C-O-Ri vagy C-S-R2-csoport,
    L2 és L3 jelentése egymástól függetlenül CR1R2, C=CRiR2, C=NR3, P(0)R4, P(S)R4, C=0, C=S, O, S, SO, SC»2, NR3 vagy SÍR5R6-csoport, vagy együttesen egy alkén- vagy alkincsoport, egy aromás, karbociklusos vagy heterociklusos gyűrű részét képezik, vagy
    L3, L2, L3 és L4 jelentése a fenti, azzal a megkötéssel,
    Lj, L2, L3 és L4 együttesen jelenthet -CH2=N-NH-CH2~ vagy -CH2-0-N=CH-csoportot is,
    R1 és R2 jelentése H, OH, SH, NH2, 1-10 szénatomos alkil-, szubsztituált alkil-, alkenil-, alkaril- vagy aralkilcsoport, alkoxi-, tio-alkoxi-, alkil-amino-, aralkil-amino-, szubsztituált alkil-amino-, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkil-amino-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino-, halogén-, formil-, keto-, benzoxi-, karboxamido-, tio-karboxamido-, észter-, tio-észter-, karboxamidin-, karbamil-, karbamido- vagy guanidino-csoport, jelenthetnek továbbá egymástól függetlenül egy RNS-t hasító csoportot, továbbá egy az oligonukleotidok farmakokinetikai vagy farmakodinamikai tulajdoinságait javító csoportot,
    R3 jelentése H, OH, NH2, rövid szénláncu alkil-, szubsztituált rövid szénláncu alkil-, alkoxi-, rövid szénláncu alkenil-, aralkil-, alkil-amino-, aralkil-amino-, szubsz-112tituált alkil-amino-, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkil-amino-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino-csoport, vagy egy RNS-t hasító csoport, egy az oligonukleotid farmakokinetikai vagy farmakodinamikai tulajdonságait javító csoport,
    R4 jelentése OH, SH, NH2, Ο-alkil-, S-alkil-, ΝΗ-alkil-, Oalkil-heterociklusos-, S-alkil-heterociklusos-, N-alkil-heterociklusos- vagy egy nitrogéntartalmú heterociklusos csoport,
    R5 és Rg jelentése egymástól függetlenül 1-6 szénatomos alkilvagy alkoxicsoport, azzal a feltétellel, hogy ha Li jelentése C=0 vagy C=S csoport, akkor L2 NR3 csoporttól eltérő vagy ha L4 jelentése C=0 vagy C=S, akkor L3 NR3 csoporttól eltérő, továbbá ha L2 vagy L3 közül az egyik C=0 vagy C=S akkor a másik NR3-tól eltérő, továbbá hogy ha L2 jelentése P(O)R4 csoport és R4 jelentése OH csoport, és X jelentése OH csoport és Bx jelentése uracil- vagy adenin-, akkor L3 jelentése 0 atomtól eltérő, továbbá, ha Ιιχ, I>2 és L4 jelentése CH2 csoport és X jelentése H vagy OH csoport és Q jelentése 0, akkor L3 jelentése S, SO vagy SO2 csoporttól eltérő csoport.
  58. 58. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében Q jelentése 0.
  59. 59. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L]_ és L4 jelentése CR1R2·
  60. 60. Az 59. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,
    -113- ···♦·«·»· ·* ·· * · · · · • « · ··· ·· ·· ·«·· ·· hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében R]_ és R2 mindegyikének jelentése jelentése H.
  61. 61. A 60. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében Q jelentése 0.
  62. 62. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 és ββ jelentése egymástól függetlenül CRiR2, 0, P(0)R4, P(S)R4 vagy NR3.
  63. 63. A 62. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 és ββ közül az egyik jelentése CRiR2 és a másik jelentése P(O)R4 vagy P(S)R4·
  64. 64. A 62. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 jelentése 0 és ββ jelentése P(0)R4 vagy P(S)R4-
  65. 65. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 és Ιιβ jelentése egyaránt NR3.
  66. 66. A 65. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében R3 jelentése H.
  67. 67. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében Li és L4 jelentése egyaránt CH2 és L2 és Σβ jelentése egyaránt NR3.
  68. 68. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek
    -114-
    4 · » · « · ·«« képletében L2 és L3 jelentése együttesen egy ciklopropil-, ciklobutil-, etilén-oxi-, etil-aziridin- vagy szubsztituált etil-aziridin-gyűrű részét képezi.
  69. 69. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 és L3 jelentése együttesen egy 3-6 szénatomos karbociklusos vagy 4-, 5- vagy 6-tagú nitrogénatartalmú heterociklusos gyűrű részét képezi.
  70. 70. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében X jelentése H.
  71. 71. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében X jelentése OH.
  72. 72. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében X jelentése H, OH, F, 0-alkil- vagy 0-alkenil-csoport és Q jelentése 0.
  73. 73. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében Bx jelentése adenin-, guanin-, uracil-, timin-, citozin-, 2-amino-adenozin- vagy 5-metil-citozin-csoport.
  74. 74. A 73. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében Q jelentése 0.
  75. 75. A 74. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében Lx és L4 mindegyikének jelentése CH2.
    -115-
  76. 76. A 75. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 és L3 mindegyikének jelentése' NH.
  77. 77. A 75. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 és L3 közül az egyik jelentése 0 és a másik jelentése NH.
  78. 78. A 75. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 jelentése NH és L3 jelentése 0.
  79. 79. A 75. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amelynek képletében L2 jelentése 0 és L3 jelentése NH.
  80. 80. A 75. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotid analógot alkalmazunk, amely 5-50 említett szerkezetű alegységet tartalmaz.
  81. 81. A 75. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lényegében az oligonukleotid analógban mindegyik alegység az említett szerkezetű.
  82. 82. A 75. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lényegében a váltakozó alegységek az említett szerkezetűek .
  83. 83. A 75. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid analógot gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal együtt alkalmazzuk.
  84. 84. A 75. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid megnövekedett nukleáz rezisztenciával rendelkezik a megfelelő természetes oligonukleotidokhoz
    -116- —t ···:.·»..· í . · ·. ’· viszonyítva.
  85. 85. Eljárás az 1. igénypont szerinti oligonukleotid analógok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (II) általános képletű vegyületet egy (III) általános képletű vegyűletet - a képletekben Bx jelentése változó bázisos-csoport, Q jelentése 0, CH2, CHF vagy CF2 csoport és Ej és E2 jelentése azonos vagy különböző elektrofil reakcióképes csoport - egymással kapcsolunk egy kötőcsoport segítségével az említett elektrofil reakcióképes csoportokon keresztül.
  86. 86. A 85. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elektrofil reakcióképes csoport (II) általános képletű vegyületben halogén-metil-, trifluor-metil-, szulfonil-metil-, p-metil-benzol-szulfonil-metil- vagy 3'-C-formil-csoport.
  87. 87. A 85.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (III) általános képletű csoportban az elektrofil reakcióképes csoport jelentése halogénatom, szulfonil-metil-, p-metil-benzol-szulfonil-metil- vagy aldehidcsoport.
  88. 88. A 85. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kötőcsoport hidrazin vagy hidroxi1-amin.
  89. 89. A 85. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az emített oligonukleotid analóg legalább egy részét beépítjük egy további oligonukleotid fajtába és így ezen további oligonukleotid analógban a természetes foszfo-diészter kötések lényegében váltakoznak a beépített területekkel.
  90. 90. A 89. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett beépítést egy dinukleotid kívánt szekvenciájának foszfo-diészter kötésével biztosítjuk, amely dinukleotidokat előzőleg kapcsoltunk.
    -117- ·· · « *··ϊ ··<· w „ • · ti I V _ · · · «·· • · · · · · ·’ ·· ···· ··
  91. 91. Egy (IV) általános képletnek megfelelő nukleozid - a képletben
    Bx jelentése változtatható báziscsoport,
    Q jelentése 0, CH2, CHF vagy CF2,
    X jelentése H, OH, 1-10 szénatomos alkil-, szubsztituált rövid szénláncu alkil-, alkaril-, aralkil-, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCN-csoport, 0-, S- vagy N-alkil-, 0-, S- vagy N-alkenil-csoport, SOCH3, S02CH3, 0N02, N02, N3, NH2, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkaril-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino-, szubsztituált szilil-, egy RNS-t hasító csoport vagy egy az oligonukleotid farmakokinetikai vagy farmakodinamikai tulajdonságait javító csoport,
    Y jelentése hidroxil-, amino-metil-, hidrazino-metil-, hidroxi-metil-, C-formil-, ftálimido-hidroxi-metil-, aril-szubsztituált imidazilidino-, amino-hidroxil-metil-, orto-metil-amino-benzol-tio-, metil-foszfonát- vagy metil-alkil-foszfonát-csoport,
    Z jelentése H, hidroxil-, amino-metil-, hidrazino-metil-, hidroxi-metil-, C-formil-, ftálimido-hidroxi-metil-, aril-szubsztituált imidazilidino-, amino-hidroxil-metil-, orto-metil-amino-benzol-tio-, metil-foszfonát- vagy metil-alkil-foszfonát-csoport, azzal a megkötéssel, hogy ha Q jelentése 0 és Y jelentése hidroxi-metil-csoport és X jelentése H vagy OH, akkor Z jelentése H-tól vagy C-formil-csoporttól eltérő, és ha Q jelentése 0 és X jelentése H vagy OH és Z jelentése hidroxilcsoport, akkor Y jelentése amino-hidroxil-metil-, hidrazino-
    -118-metil- vagy aril-szubsztituált imidazolidino-csoporttól eltérő csoport.
  92. 92. A 91. igénypont szerinti nukleozid, amelynek képletében X jelentése H vagy OH.
  93. 93. A 91. igénypont szerinti nukleozid, amelynek képletében Q jelentése 0.
  94. 94. Eljárás egy 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg előállítására, azzal jellemezve, hogy a pentofuranozil nukleozid 3' szénatomján gyököt képzünk, a kapott gyököt egy oximmal reagáltatjuk, amely egy másik pentofuranozil nukleozid 5'-helyzetében van.
  95. 95. Eljárás egy 1. igénypont szerinti oligonukleotid analóg - amelynek képletében L2 vagy L3 közül az egyik NR3 és R3 jelentése H - L2 vagy L3 nitrogéncsoportjának védésére, azzal jellemezve, hogy a nitrogéncsoportot fenoxi-acetil-klorid-csoporttal blokkoljuk, majd az így kapott oligonukleotid analógot tovább reagáltatjuk annak módosítására, majd a nitrogéncsoportot ammónium-hidroxiddal deblokkoljuk.
  96. 96. Eljárás egy bifunkcionális nukleozid vagy oligonukleotid analóg védésére, amelyben a bifunkciós csoportok közül az egyik aldehidcsoport, azzal jellemezve, hogy az aldehidcsoportot egy metoxi-amin-sav sójával reagáltatjuk, így az aldehidet oxim-származékká alakítjuk, majd a kapott nukleozid vagy oligonukleozid analógot tovább reagáltatjuk annak módosítására, majd az említett oximot acetaldehiddel reagáltatjuk az aldehidcsoport regenerálására.
HU9303290A 1991-05-21 1992-05-21 Backbone modified oligonucleotide analogues and pharmaceutical preparations containing them HUT65941A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/703,619 US5378825A (en) 1990-07-27 1991-05-21 Backbone modified oligonucleotide analogs

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9303290D0 HU9303290D0 (en) 1994-03-28
HUT65941A true HUT65941A (en) 1994-08-29

Family

ID=24826111

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9303289A HU221806B1 (hu) 1991-05-21 1992-05-21 Vázon módosított oligonukleotid analógok
HU9303290A HUT65941A (en) 1991-05-21 1992-05-21 Backbone modified oligonucleotide analogues and pharmaceutical preparations containing them

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9303289A HU221806B1 (hu) 1991-05-21 1992-05-21 Vázon módosított oligonukleotid analógok

Country Status (14)

Country Link
US (1) US5378825A (hu)
EP (3) EP1004593A3 (hu)
JP (2) JP2625257B2 (hu)
KR (2) KR0156945B1 (hu)
AT (2) ATE196321T1 (hu)
AU (2) AU662538B2 (hu)
BR (2) BR9206027A (hu)
CA (2) CA2103378A1 (hu)
DE (2) DE69231441T2 (hu)
FI (2) FI935114A7 (hu)
HU (2) HU221806B1 (hu)
IE (2) IE921849A1 (hu)
NO (2) NO934180L (hu)
WO (2) WO1992020823A1 (hu)

Families Citing this family (630)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6444798B1 (en) * 1988-06-06 2002-09-03 Steven Albert Benner Chimeras of sulfur-linked oligonucleotide analogs and DNA and RNA
US5681941A (en) * 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US6339066B1 (en) 1990-01-11 2002-01-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides which have phosphorothioate linkages of high chiral purity and which modulate βI, βII, γ, δ, Ε, ζ and η isoforms of human protein kinase C
US20040142899A1 (en) * 1990-01-11 2004-07-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced biostability and altered biodistribution of oligonucleotides in mammals
US6358931B1 (en) 1990-01-11 2002-03-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating RNA
US5859221A (en) * 1990-01-11 1999-01-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US6753423B1 (en) 1990-01-11 2004-06-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced biostability and altered biodistribution of oligonucleotides in mammals
US6005087A (en) 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6399754B1 (en) 1991-12-24 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides
US5872232A (en) * 1990-01-11 1999-02-16 Isis Pharmaceuticals Inc. 2'-O-modified oligonucleotides
US5623070A (en) * 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5378825A (en) * 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5541307A (en) * 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5998603A (en) * 1994-09-29 1999-12-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analogs, and oligomers thereof
US5386023A (en) * 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5610289A (en) * 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5602240A (en) * 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US6121433A (en) * 1990-07-27 2000-09-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having nitrogen-containing linkages
US5618704A (en) * 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
ES2083593T3 (es) * 1990-08-03 1996-04-16 Sterling Winthrop Inc Compuestos y metodos para inhibir la expresion de genes.
US5789573A (en) * 1990-08-14 1998-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ICAM-1, E-selectin, and CMV IE1/IE2
CA2092002A1 (en) * 1990-09-20 1992-03-21 Mark Matteucci Modified internucleoside linkages
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5965722A (en) * 1991-05-21 1999-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ras gene with chimeric and alternating oligonucleotides
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US8153602B1 (en) 1991-11-19 2012-04-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Composition and methods for the pulmonary delivery of nucleic acids
US5359044A (en) * 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5543507A (en) * 1992-03-05 1996-08-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Covalently cross-linked oligonucleotides
WO1993018052A1 (en) * 1992-03-05 1993-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Covalently cross-linked oligonucleotides
US6117847A (en) * 1992-03-16 2000-09-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for enhanced modulation of protein kinase C expression
US6537973B1 (en) 1992-03-16 2003-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide inhibition of protein kinase C
GB9207380D0 (en) * 1992-04-03 1992-05-13 Ici Plc Compounds
US5434257A (en) * 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5817781A (en) * 1992-06-01 1998-10-06 Gilead Sciences, Inc. Modified internucleoside linkages (II)
JP2879973B2 (ja) * 1992-06-24 1999-04-05 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド ヘテロ原子によるオリゴヌクレオシド連結
US5872242A (en) * 1992-10-05 1999-02-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of ras
EP0670897A4 (en) * 1992-10-05 1997-08-06 Isis Pharmaceuticals Inc INHIBITION OF THE ras GENE USING NON-CODING OLIGONUCLEOTIDES.
US20030013670A1 (en) * 1992-10-05 2003-01-16 Monia Brett P. Antisense oligonucleotide inhibition of ras
US5985558A (en) 1997-04-14 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the inibition of c-Jun and c-Fos
US6784290B1 (en) 1992-10-05 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of ras
CA2159629A1 (en) * 1993-03-31 1994-10-13 Sanofi Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
JPH08508489A (ja) * 1993-03-31 1996-09-10 スターリング ウィンスロップ インコーポレイティド 二官能価ヌクレオシド、それらのオリゴマーならびにそれらの製造方法及び使用方法
GB9311682D0 (en) * 1993-06-05 1993-07-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
US6605708B1 (en) 1993-07-28 2003-08-12 Hybridon, Inc. Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom
US6653458B1 (en) 1993-09-03 2003-11-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides
AU679566B2 (en) 1993-09-03 1997-07-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
ATE222921T1 (de) * 1994-01-26 2002-09-15 Novartis Erfind Verwalt Gmbh Modifizierte oligonukleotide
US5625050A (en) * 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5981731A (en) * 1994-05-31 1999-11-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of B-raf gene expression
US6391636B1 (en) 1994-05-31 2002-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of raf gene expression
EP0775204A1 (en) * 1994-08-09 1997-05-28 Novartis AG Antitumor antisense oligonucleotides
GB9417746D0 (en) * 1994-09-03 1994-10-19 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
GB9417938D0 (en) * 1994-09-06 1994-10-26 Ciba Geigy Ag Compounds
US5681940A (en) * 1994-11-02 1997-10-28 Icn Pharmaceuticals Sugar modified nucleosides and oligonucleotides
EP0714907A1 (en) * 1994-11-30 1996-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligoribonucleotides with amide backbone
US5807718A (en) 1994-12-02 1998-09-15 The Scripps Research Institute Enzymatic DNA molecules
US6207826B1 (en) 1995-03-27 2001-03-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Macrocyclic compounds having nitrogen-containing linkages
WO1996030377A1 (en) 1995-03-27 1996-10-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nitrogenous macrocyclic compounds
US6420549B1 (en) * 1995-06-06 2002-07-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide analogs having modified dimers
EP0830368A1 (en) 1995-06-07 1998-03-25 Genta Incorporated Novel carbamate-based cationic lipids
US5665721A (en) * 1995-06-07 1997-09-09 Abbott Laboratories Heterocyclic substituted cyclopentane compounds
US6143749A (en) * 1995-06-07 2000-11-07 Abbott Laboratories Heterocyclic substituted cyclopentane compounds
US5855911A (en) * 1995-08-29 1999-01-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides
GB9604669D0 (en) 1996-03-05 1996-05-01 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
US5856099A (en) * 1996-05-21 1999-01-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compositions and methods for modulating type I interleukin-1 receptor expression
US20070275921A1 (en) * 1996-06-06 2007-11-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric Compounds That Facilitate Risc Loading
US7812149B2 (en) * 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US9096636B2 (en) * 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US20050042647A1 (en) * 1996-06-06 2005-02-24 Baker Brenda F. Phosphorous-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20040266706A1 (en) * 2002-11-05 2004-12-30 Muthiah Manoharan Cross-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20040161777A1 (en) * 1996-06-06 2004-08-19 Baker Brenda F. Modified oligonucleotides for use in RNA interference
US20040147022A1 (en) * 1996-06-06 2004-07-29 Baker Brenda F. 2'-methoxy substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US20050119470A1 (en) * 1996-06-06 2005-06-02 Muthiah Manoharan Conjugated oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20040203024A1 (en) * 1996-06-06 2004-10-14 Baker Brenda F. Modified oligonucleotides for use in RNA interference
US20050053976A1 (en) * 1996-06-06 2005-03-10 Baker Brenda F. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
GB9612600D0 (en) 1996-06-13 1996-08-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
WO1998000434A1 (en) * 1996-06-28 1998-01-08 Novartis Ag Modified oligonucleotides
US7309692B1 (en) * 1996-07-08 2007-12-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of chronic myelogenous leukemic cell growth by liposomal-antisense oligodeoxy-nucleotides targeting to GRB2 or CRK1
US6077954A (en) * 1996-08-01 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted heterocyclic compounds
US6537783B1 (en) 1996-08-02 2003-03-25 Bio Merieux Prefunctionalized nucleotide and process for amplifying a sequence using a prefunctionalized nucleotide
US6111085A (en) * 1996-09-13 2000-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbamate-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6977244B2 (en) * 1996-10-04 2005-12-20 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US5780241A (en) * 1996-11-05 1998-07-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Complex chemical libraries
US7235653B2 (en) 1996-12-31 2007-06-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US6319906B1 (en) 1996-12-31 2001-11-20 Isis Pharmaceuticals Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US6077833A (en) * 1996-12-31 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US6576752B1 (en) * 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6172209B1 (en) * 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6127533A (en) 1997-02-14 2000-10-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-aminooxy-modified oligonucleotides
US6639062B2 (en) * 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
JP4203126B2 (ja) 1997-04-29 2008-12-24 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート 酵素ｄｎａ分子
DE69834038D1 (de) 1997-07-01 2006-05-18 Isis Pharmaceutical Inc Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von oligonukleotiden über die speiseröhre
US20070149472A1 (en) * 1997-08-13 2007-06-28 Mckay Robert Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of jnk proteins
US6809193B2 (en) 1997-08-13 2004-10-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins
US6133246A (en) * 1997-08-13 2000-10-17 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins
US5877309A (en) * 1997-08-13 1999-03-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides against JNK
US20030165888A1 (en) * 2001-07-18 2003-09-04 Brown Bob D. Oligonucleotide probes and primers comprising universal bases for diagnostic purposes
US6518017B1 (en) * 1997-10-02 2003-02-11 Oasis Biosciences Incorporated Combinatorial antisense library
US7285288B1 (en) 1997-10-03 2007-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US7704962B1 (en) 1997-10-03 2010-04-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Small oligonucleotides with anti-tumor activity
US6232463B1 (en) 1997-10-09 2001-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5948902A (en) 1997-11-20 1999-09-07 South Alabama Medical Science Foundation Antisense oligonucleotides to human serine/threonine protein phosphatase genes
US5968748A (en) * 1998-03-26 1999-10-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of human HER-2 expression
US20040186071A1 (en) * 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US7321828B2 (en) * 1998-04-13 2008-01-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. System of components for preparing oligonucleotides
EP1080103A4 (en) * 1998-05-21 2003-07-02 Isis Pharmaceuticals Inc PREPARATIONS AND METHOD FOR THE NON-PARENTERAL ADMINISTRATION OF OLIGONUCLEOTIDES
JP2002515514A (ja) * 1998-05-21 2002-05-28 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド オリゴヌクレオチドの局所送逹のための組成物及び方法
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US20040009938A1 (en) * 1998-08-07 2004-01-15 Muthiah Manoharan Methods of enhancing renal uptake of oligonucleotides
US6673912B1 (en) 1998-08-07 2004-01-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-O-aminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US6175004B1 (en) 1998-09-01 2001-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligonucleotides incorporating 2-aminoadenosine
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
US6069243A (en) * 1998-10-06 2000-05-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for oligonucleotide synthesis
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US6492111B1 (en) * 1998-11-25 2002-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. In situ binary synthesis of biologically effective molecules
US20030180789A1 (en) * 1998-12-30 2003-09-25 Dale Roderic M.K. Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions
US6087112A (en) * 1998-12-30 2000-07-11 Oligos Etc. Inc. Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions
US6403779B1 (en) 1999-01-08 2002-06-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Regioselective synthesis of 2′-O-modified nucleosides
US6399765B1 (en) 1999-03-17 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for removing dimethoxytrityl groups from oligonucleotides
EP1163333B1 (en) 1999-03-18 2007-11-07 Queen Mary And Westfield College Inhibitors of endothelin-1 synthesis
US6235891B1 (en) 1999-03-31 2001-05-22 South Alabama Medical Science Foundation Glucocorticoid receptor agonist and decreased PP5
US7098192B2 (en) 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
CA2365984A1 (en) * 1999-04-08 2000-10-19 Oasis Biosciences, Inc. Antisense oligonucleotides comprising universal and/or degenerate bases
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
US6147200A (en) * 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
US6277982B1 (en) 1999-08-20 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Alkylation of alcohols, amines, thiols and their derivatives by cyclic sulfate intermediates
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
AU2001276691A1 (en) * 2000-08-03 2002-02-18 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Brushless motor and method of manufacturing the brushless motor
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
CA2790034A1 (en) 2001-06-21 2003-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US6964950B2 (en) 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7227014B2 (en) 2001-08-07 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression
US6750019B2 (en) 2001-10-09 2004-06-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
CA2457565A1 (en) 2001-10-09 2003-04-17 Genentech, Inc. Novel acidic mammalian proteins and polynucleotides encoding the same
NZ585001A (en) 2001-10-09 2011-08-26 Isis Pharmaceuticals Inc Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
DE10159904A1 (de) * 2001-12-06 2003-07-03 Adnagen Ag Oligonukleotidanordnung, Verfahren zum Nukleotidnachweis sowie Vorrichtung hierfür
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
CA2471967A1 (en) * 2002-01-03 2003-07-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Wt1 antisense oligos for the inhibition of breast cancer
US20060009409A1 (en) * 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
EP2213737B1 (en) * 2002-02-01 2012-11-07 Life Technologies Corporation Double-stranded oligonucleotides
US20030166282A1 (en) * 2002-02-01 2003-09-04 David Brown High potency siRNAS for reducing the expression of target genes
US20030191075A1 (en) * 2002-02-22 2003-10-09 Cook Phillip Dan Method of using modified oligonucleotides for hepatic delivery
US7169916B2 (en) * 2002-04-01 2007-01-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chloral-free DCA in oligonucleotide synthesis
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US20100075423A1 (en) * 2002-06-12 2010-03-25 Life Technologies Corporation Methods and compositions relating to polypeptides with rnase iii domains that mediate rna interference
US20040248094A1 (en) * 2002-06-12 2004-12-09 Ford Lance P. Methods and compositions relating to labeled RNA molecules that reduce gene expression
US20040106785A1 (en) * 2002-07-25 2004-06-03 Micrologix Biotech Inc. Inhibitors of RNA dependent RNA polymerase and uses thereof
AU2003260370B2 (en) 2002-08-05 2008-05-22 Silence Therapeutics Gmbh Further novel forms of interfering RNA molecules
US20040029275A1 (en) * 2002-08-10 2004-02-12 David Brown Methods and compositions for reducing target gene expression using cocktails of siRNAs or constructs expressing siRNAs
EP2330194A3 (en) * 2002-09-13 2011-10-12 Replicor, Inc. Non-sequence complementary antiviral oligonucleotides
US20050196382A1 (en) * 2002-09-13 2005-09-08 Replicor, Inc. Antiviral oligonucleotides targeting viral families
AU2003273336A1 (en) * 2002-09-18 2004-04-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Efficient reduction of target rna's by single- and double-stranded oligomeric compounds
US7229976B2 (en) 2002-09-26 2007-06-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of forkhead box O1A expression
AU2003287505A1 (en) 2002-11-05 2004-06-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US8604183B2 (en) * 2002-11-05 2013-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation
EP2336318B1 (en) 2002-11-13 2013-04-24 Genzyme Corporation Antisense modulation of apolipoprotein b expression
SI1569695T1 (sl) 2002-11-13 2013-08-30 Genzyme Corporation Protismiselna modulacija ekspresije apolipoproteina B
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
WO2004072284A1 (en) 2003-02-11 2004-08-26 Antisense Therapeutics Ltd Modulation of insulin like growth factor i receptor expression
US7002006B2 (en) * 2003-02-12 2006-02-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Protection of nucleosides
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
WO2004080406A2 (en) 2003-03-07 2004-09-23 Alnylam Pharmaceuticals Therapeutic compositions
US20040185559A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 1 expression
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
DK1620544T3 (en) 2003-04-17 2019-01-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc MODIFIED iRNA AGENTS
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
US20040219533A1 (en) * 2003-04-29 2004-11-04 Jim Davis Biological bar code
AU2004235747B2 (en) * 2003-05-01 2009-05-28 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides comprising a molecular switch
US7897582B2 (en) 2003-05-23 2011-03-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US7960355B2 (en) 2003-05-23 2011-06-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
EP1660512A4 (en) * 2003-06-02 2009-12-23 Isis Pharmaceuticals Inc SYNTHESIS OF OLIGONUCLEOTIDES USING ALTERNATIVE SOLVENTS
BRPI0410886A (pt) 2003-06-03 2006-07-04 Isis Pharmaceuticals Inc composto de filamento duplo, composição farmacêutica, sal farmaceuticamente aceitável, métodos de modificação do ácido nucleico que codifica a survivina humana, de inibição da expressão da suvivina em células ou tecidos, e de tratamento de uma condição associada com a expressão ou superexpressão da suvivina, e, oligonucleotìdeo de rnai de filamento único
AU2004263830B2 (en) 2003-06-13 2008-12-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded ribonucleic acid with increased effectiveness in an organism
US20060241072A1 (en) * 2003-06-20 2006-10-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds for use in gene modulation
WO2005017108A2 (en) * 2003-06-30 2005-02-24 United Soybean Board Soybean selection system based on aec-resistance
US7683036B2 (en) 2003-07-31 2010-03-23 Regulus Therapeutics Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding RNAs
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
US20070123480A1 (en) * 2003-09-11 2007-05-31 Replicor Inc. Oligonucleotides targeting prion diseases
KR100750788B1 (ko) 2003-09-18 2007-08-20 아이시스 파마수티컬즈 인코포레이티드 ｅＩＦ4Ｅ 발현의 조정
WO2005027962A1 (en) * 2003-09-18 2005-03-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4’-thionucleosides and oligomeric compounds
US7125945B2 (en) * 2003-09-19 2006-10-24 Varian, Inc. Functionalized polymer for oligonucleotide purification
US20050191653A1 (en) 2003-11-03 2005-09-01 Freier Susan M. Modulation of SGLT2 expression
US20050164271A1 (en) 2004-01-20 2005-07-28 Sanjay Bhanot Modulation of glucocorticoid receptor expression
US8569474B2 (en) * 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
US20050244869A1 (en) * 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
US7674778B2 (en) 2004-04-30 2010-03-09 Alnylam Pharmaceuticals Oligonucleotides comprising a conjugate group linked through a C5-modified pyrimidine
EP1758937B1 (en) 2004-05-24 2009-09-02 Genvault Corporation Stable protein storage and stable nucleic acid storage in recoverable form
EP2290071B1 (en) 2004-05-28 2014-12-31 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving microRNA
EP1766052A4 (en) * 2004-06-03 2009-12-16 Isis Pharmaceuticals Inc OLIGOMERIC CHIMERIC COMPOSITIONS WITH BRECH
US20090048192A1 (en) * 2004-06-03 2009-02-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double Strand Compositions Comprising Differentially Modified Strands for Use in Gene Modulation
US8394947B2 (en) * 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
AU2005252663B2 (en) * 2004-06-03 2011-07-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
US7968762B2 (en) * 2004-07-13 2011-06-28 Van Andel Research Institute Immune-compromised transgenic mice expressing human hepatocyte growth factor (hHGF)
EP1791567B1 (en) 2004-08-10 2015-07-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Chemically modified oligonucleotides
JP4468989B2 (ja) 2004-08-16 2010-05-26 クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド Ｒｔｐ８０１阻害剤の治療への使用
WO2006023880A2 (en) 2004-08-23 2006-03-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for the characterization of oligonucleotides
JP2008511678A (ja) * 2004-09-02 2008-04-17 イェール ユニバーシティ マイクロｒｎａによるオンコジーンの調節
US7884086B2 (en) * 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
EP2397563A3 (en) 2004-09-17 2012-07-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced antisense oligonucleotides
CA2857881A1 (en) 2004-11-12 2006-12-28 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving mirna and mirna inhibitor molecules
CN101193905B (zh) 2005-02-11 2014-06-25 纪念斯隆-凯特林癌症中心 用于检测抗药egfr突变体的方法和组合物
EP1871913A2 (en) * 2005-03-25 2008-01-02 Ambion, Inc. Methods and compositions for depleting abundant rna transcripts
WO2006121773A2 (en) 2005-05-06 2006-11-16 Gen-Probe Incorporated Compositions and assays to detect influenza virus a and b nucleic acids
US8354384B2 (en) * 2005-06-23 2013-01-15 Yale University Anti-aging micrornas
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
US20090291431A1 (en) 2005-10-17 2009-11-26 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect legionella pneumophila nucleic acid
WO2007051045A2 (en) 2005-10-28 2007-05-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of huntingtin gene
CA2626690A1 (en) 2005-11-09 2007-05-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of factor v leiden mutant gene
NL2000439C2 (nl) 2006-01-20 2009-03-16 Quark Biotech Therapeutische toepassingen van inhibitoren van RTP801.
JP5342881B2 (ja) 2006-01-27 2013-11-13 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド ６−修飾された二環式核酸類似体
WO2008054834A2 (en) 2006-02-03 2008-05-08 Columbia University Binary deoxyribozyme probes for nucleic acid analysis
EP2511383B1 (en) 2006-03-31 2013-12-25 Columbia University Binary probes for fluorescent analysis of nucleic acids
EP2023940B1 (en) * 2006-05-05 2011-06-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating expression of sglt2
US7666854B2 (en) * 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
ES2874149T3 (es) 2006-05-11 2021-11-04 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para inhibir la expresión del gen PCSK9
AU2007249349B2 (en) * 2006-05-11 2012-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Modified bicyclic nucleic acid analogs
AU2007249286B2 (en) * 2006-05-12 2013-06-13 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect enterococci nucleic acid
WO2007137301A2 (en) * 2006-05-23 2007-11-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of chrebp expression
US8198253B2 (en) 2006-07-19 2012-06-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to HBXIP
AU2007276388A1 (en) 2006-07-21 2008-01-24 Silence Therapeutics Ag Means for inhibiting the expression of protein kinase 3
US9051601B2 (en) 2006-08-01 2015-06-09 Gen-Probe Incorporated Methods of nonspecific target capture of nucleic acids
WO2008036765A2 (en) 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in pancreatic diseases and uses thereof
JP2010510964A (ja) 2006-09-19 2010-04-08 アシュラジェン インコーポレイテッド 治療的介入の標的としての、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４７、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１６、ｍｉＲ−３３１、ｍｍｕ−ｍｉＲ−２９２−３ｐによって調節される遺伝子および経路
AU2007299629C1 (en) 2006-09-21 2012-05-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the HAMP gene
EP3192788A1 (en) 2006-10-03 2017-07-19 Arbutus Biopharma Corporation Lipid containing formulations
JP2010507387A (ja) 2006-10-25 2010-03-11 クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド 新規のｓｉＲＮＡおよびその使用方法
WO2008052774A2 (en) 2006-10-31 2008-05-08 Noxxon Pharma Ag Methods for detection of a single- or double-stranded nucleic acid molecule
DK2104737T3 (da) 2006-12-08 2013-05-27 Asuragen Inc Funktioner og formål for let-7 mikro-RNAer
EP3121286B1 (en) 2006-12-21 2019-11-20 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
EP2114981B1 (en) 2007-01-29 2013-05-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating protein expression
PE20090064A1 (es) 2007-03-26 2009-03-02 Novartis Ag Acido ribonucleico de doble cadena para inhibir la expresion del gen e6ap humano y composicion farmaceutica que lo comprende
CN101986785A (zh) 2007-05-11 2011-03-16 托马斯杰弗逊大学 治疗和预防神经退行性疾病和紊乱的方法
AU2008251467B2 (en) 2007-05-11 2014-07-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treatment of skin ulcers
EP2170917B1 (en) 2007-05-30 2012-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
ES2959127T3 (es) 2007-06-19 2024-02-20 Hoffmann La Roche Secuenciación de ácidos nucleicos de alto rendimiento por expansión
ES2428009T3 (es) 2007-07-05 2013-11-05 Novartis Ag ARNds para tratar infecciones virales
CA2692579C (en) * 2007-07-05 2016-05-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
WO2009023855A2 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tetrahydropyran nucleic acid analogs
AU2008307482B2 (en) 2007-10-02 2012-07-12 Amgen Inc. Increasing erythropoietin using nucleic acids hybridizable to micro-RNA and precursors thereof
AU2008306455C1 (en) 2007-10-03 2014-04-17 Quark Pharmaceuticals, Inc. Novel siRNA structures
US8916531B2 (en) * 2007-11-20 2014-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of CD40 expression
WO2009082607A2 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Targeting lipids
AU2008343380B2 (en) * 2007-12-26 2012-07-12 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect Candida albicans nucleic acid
CA2711499C (en) 2008-01-10 2018-09-25 Research Development Foundation Vaccines and diagnostics for the ehrlichioses
WO2009100320A2 (en) * 2008-02-07 2009-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs
WO2009111375A2 (en) * 2008-03-01 2009-09-11 Abraxis Bioscience, Llc Treatment, diagnostic, and method for discovering antagonist using sparc specific mirnas
WO2009117589A1 (en) 2008-03-21 2009-09-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising tricyclic nucleosides and methods for their use
US8846639B2 (en) * 2008-04-04 2014-09-30 Isis Pharmaceutical, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleosides and having reduced toxicity
DK2285819T3 (da) * 2008-04-04 2013-12-02 Isis Pharmaceuticals Inc Oligomere forbindelser omfattende neutralt bundne, terminale bicykliske nukleosider
WO2009126933A2 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
JP2011519951A (ja) * 2008-05-07 2011-07-14 アブラクシス バイオサイエンス リミテッド ライアビリティー カンパニー ｍｉＲＮＡによる薬物治療の増強
US8258111B2 (en) 2008-05-08 2012-09-04 The Johns Hopkins University Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis
US20100209957A1 (en) * 2008-06-20 2010-08-19 Genvault Corporation Biosample storage devices and methods of use thereof
WO2010017509A1 (en) * 2008-08-07 2010-02-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of transthyretin expression for the treatment of cns related disorders
EP2334792B1 (en) 2008-09-12 2020-09-09 GenTegra LLC Matrices and media for storage and stabilization of biomolecules
EP2342616A2 (en) 2008-09-23 2011-07-13 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with cycloaddition
US8604192B2 (en) * 2008-09-24 2013-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cyclohexenyl nucleic acids analogs
WO2010036698A1 (en) * 2008-09-24 2010-04-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
MX2011004097A (es) 2008-10-15 2011-07-28 Isis Pharmaceuticals Inc Modulacion de la expresion del factor 11.
EP2358398A2 (en) 2008-10-24 2011-08-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and methods
WO2010048549A2 (en) 2008-10-24 2010-04-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5' and 2' bis-substituted nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US20100135904A1 (en) 2008-11-07 2010-06-03 Research Development Foundation Compositions and methods for the inhibition of cripto / grp78 complex formation and signaling
HUE037082T2 (hu) 2008-11-10 2018-08-28 Arbutus Biopharma Corp Új lipidek és készítmények terápiás hatóanyagok szállítására
BRPI0920985A2 (pt) 2008-11-21 2015-08-18 Univ Columbia Enzima de dna dividida para tipificação visual de polimorfismo de nucleotídeo único
RU2572826C2 (ru) 2008-12-02 2016-01-20 Чиралджен, Лтд. Способ синтеза модифицированных по атому фосфора нуклеиновых кислот
WO2010080452A2 (en) 2008-12-18 2010-07-15 Quark Pharmaceuticals, Inc. siRNA COMPOUNDS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2010088404A1 (en) 2009-01-28 2010-08-05 Columbia University Microarrays of binary nucleic acid probes for detecting nucleic acid analytes
US20120021515A1 (en) 2009-02-06 2012-01-26 Swayze Eric E Oligomeric compounds and methods
US8536320B2 (en) 2009-02-06 2013-09-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tetrahydropyran nucleic acid analogs
WO2010091878A2 (en) 2009-02-13 2010-08-19 Silence Therapeutics Ag Means for inhibiting the expression of opa1
WO2010094491A1 (en) 2009-02-18 2010-08-26 Silence Therapeutics Ag Means for inhibiting the expression of ang2
EP2669290A1 (en) 2009-03-02 2013-12-04 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Nucleic Acid Chemical Modifications
AU2010226466A1 (en) * 2009-03-20 2011-10-20 Alios Biopharma, Inc. Substituted nucleoside and nucleotide analogs
US20110045080A1 (en) * 2009-03-24 2011-02-24 William Marsh Rice University Single-Walled Carbon Nanotube/Bioactive Substance Complexes and Methods Related Thereto
EP2258858A1 (en) 2009-06-05 2010-12-08 Universitätsklinikum Freiburg Transgenic LSD1 animal model for cancer
MX342785B (es) 2009-06-10 2016-10-12 Alnylam Pharmaceuticals Inc Formulacion mejorada de lipido.
EP2449132B1 (en) 2009-07-01 2015-05-13 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
CA2767253A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Ontorii, Inc. Novel nucleic acid prodrugs and methods of use thereof
US8927513B2 (en) 2009-07-07 2015-01-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5′ phosphate mimics
WO2011005861A1 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
EP2462153B1 (en) 2009-08-06 2015-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
US9029338B2 (en) 2009-08-14 2015-05-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus
DK2504435T3 (da) 2009-11-26 2019-12-09 Quark Pharmaceuticals Inc Sirna-forbindelser omfattende terminale substitutioner
WO2011071860A2 (en) 2009-12-07 2011-06-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions for nucleic acid delivery
EP2510098B1 (en) 2009-12-09 2015-02-11 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the cns
KR101718534B1 (ko) 2009-12-09 2017-03-22 닛토덴코 가부시키가이샤 Ｈｓｐ４７ 발현의 조절
CA2784568A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 The University Of British Columbia Lipid particles for delivery of nucleic acids
WO2011084193A1 (en) 2010-01-07 2011-07-14 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compounds comprising non-nucleotide overhangs
WO2011085102A1 (en) 2010-01-11 2011-07-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Base modified bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US9198972B2 (en) 2010-01-28 2015-12-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Monomers and oligonucleotides comprising cycloaddition adduct(s)
WO2011094580A2 (en) 2010-01-28 2011-08-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chelated copper for use in the preparation of conjugated oligonucleotides
EP3604558B1 (en) 2010-02-17 2022-10-12 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect atopobium vaginae nucleic acid
ES2631458T3 (es) 2010-03-04 2017-08-31 Interna Technologies B.V. Molécula de ARNmi definida por su fuente y sus usos terapéuticos en el cáncer asociado a la EMT
WO2011115818A1 (en) 2010-03-17 2011-09-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-substituted bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2011123621A2 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc. 2' and 5' modified monomers and oligonucleotides
EP2561094B1 (en) 2010-04-21 2017-03-29 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits to detect herpes simplex virus nucleic acid
WO2011133868A2 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conformationally restricted dinucleotide monomers and oligonucleotides
US10913767B2 (en) 2010-04-22 2021-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
WO2011133871A2 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5'-end derivatives
US9156873B2 (en) 2010-04-28 2015-10-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified 5′ diphosphate nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
KR101869570B1 (ko) 2010-04-28 2018-06-20 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 변형된 뉴클레오사이드 및 그로부터 제조된 올리고머 화합물
WO2011139699A2 (en) 2010-04-28 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5' modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
RS56011B1 (sr) 2010-04-29 2017-09-29 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulacija ekspresije transtiretina
WO2011139911A2 (en) 2010-04-29 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated single stranded rna
KR20200133284A (ko) 2010-05-28 2020-11-26 사렙타 쎄러퓨틱스, 인코퍼레이티드 변형된 서브유니트간 결합 및/또는 말단 그룹을 갖는 올리고뉴클레오타이드 유사체
US8957200B2 (en) 2010-06-07 2015-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP2580228B1 (en) 2010-06-08 2016-03-23 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2'-amino and 2'-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
KR101553753B1 (ko) 2010-06-24 2015-09-16 쿠아크 파마수티칼스 인코퍼레이티드 Ｒｈｏａ에 대한 이중 가닥 ｒｎａ 및 그의 용도
AU2011272868B2 (en) 2010-06-30 2015-09-17 Gen-Probe Incorporated Method and apparatus for identifying analyte-containing samples using single-read determination of analyte and process control signals
NZ704322A (en) 2010-07-06 2016-07-29 Interna Technologies Bv Mirna and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with melanoma, or in diseases or conditions associated with activated braf pathway
US9234249B2 (en) 2010-07-12 2016-01-12 Gen-Probe Incorporated Compositions and assays to detect swine H1N1 influenza A virus, seasonal H1 influenza A virus and seasonal H3 influenza A virus nucleic acids
WO2012016184A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
WO2012016188A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
EP2601212A1 (en) 2010-08-04 2013-06-12 Cizzle Biotechnology Limited Methods and compounds for the diagnosis and treatment of
EP2611932A2 (en) 2010-08-30 2013-07-10 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and reaction mixtures for the detection of xenotropic murine leukemia virus-related virus
WO2012031243A2 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Avi Biopharma, Inc. dsRNA MOLECULES COMPRISING OLIGONUCLEOTIDE ANALOGS HAVING MODIFIED INTERSUBUNIT LINKAGES AND/OR TERMINAL GROUPS
CA2811333C (en) 2010-09-16 2020-05-12 Gen-Probe Incorporated Capture probes immobilizable via l-nucleotide tail
BR112013005872A2 (pt) 2010-09-22 2019-09-24 Alios Biopharma Inc compostos, composição farmacêutica e respectivos usos
JP5868324B2 (ja) 2010-09-24 2016-02-24 株式会社Wave Life Sciences Japan 不斉補助基
EP3438289A1 (en) 2010-10-04 2019-02-06 Gen-Probe Prodesse, Inc. Compositions, methods and kits to detect adenovirus nucleic acids
US20140134231A1 (en) 2010-10-11 2014-05-15 Sanford-Burnham Medical Research Institute Mir-211 expression and related pathways in human melanoma
AU2011323478B2 (en) 2010-11-01 2015-09-10 Gen-Probe Incorporated Integrated capture and amplification of target nucleic acid for sequencing
US8569220B2 (en) 2010-11-12 2013-10-29 Jelmar, Llc Hard surface cleaning composition
CA3077910A1 (en) 2010-11-17 2012-05-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of alpha synuclein expression
AU2011338682B2 (en) 2010-12-06 2017-04-27 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double stranded oligonucleotide compounds comprising threose modifications
EP2474617A1 (en) 2011-01-11 2012-07-11 InteRNA Technologies BV Mir for treating neo-angiogenesis
CA2824526C (en) 2011-01-11 2020-07-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Pegylated lipids and their use for drug delivery
CN103562387A (zh) 2011-03-03 2014-02-05 夸克医药公司 Toll样受体途径的寡核苷酸调剂
CN103492572A (zh) 2011-03-03 2014-01-01 夸克医药公司 用于治疗肺疾病和损伤的组合物和方法
EP2683833B1 (en) 2011-03-10 2018-09-26 Gen-Probe Incorporated Methods for the selection and optimization of oligonucleotide tag sequences
AU2012249751B2 (en) 2011-04-25 2016-11-03 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting BV-associated bacterial nucleic acid
US10196637B2 (en) 2011-06-08 2019-02-05 Nitto Denko Corporation Retinoid-lipid drug carrier
TWI658830B (zh) 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體
WO2012170347A1 (en) 2011-06-09 2012-12-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US20140227293A1 (en) 2011-06-30 2014-08-14 Trustees Of Boston University Method for controlling tumor growth, angiogenesis and metastasis using immunoglobulin containing and proline rich receptor-1 (igpr-1)
JP6150795B2 (ja) 2011-07-15 2017-06-28 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド シングルプレックス又はマルチプレックスアッセイにおいてヒトパルボウイルス核酸を検出及びａ型肝炎ウイルス核酸を検出するための組成物及び方法
AU2012284265B2 (en) 2011-07-19 2017-08-17 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
ES2651514T3 (es) 2011-08-11 2018-01-26 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compuestos oligoméricos gapados que comprenden deoxirribonucleósidos modificados en 5 ' -en la brecha y usos de ellos
EP3453761A1 (en) 2011-08-29 2019-03-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
EP2753714B1 (en) 2011-09-06 2017-04-12 Gen-Probe Incorporated Circularized templates for sequencing
EP3620533B1 (en) 2011-09-06 2023-01-18 Gen-Probe Incorporated Closed nucleic acid structures
AU2012304327B2 (en) 2011-09-08 2015-07-09 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting BV-associated bacterial nucleic acid
WO2013040251A2 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Asurgen, Inc. Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
EP2760477B1 (en) 2011-09-27 2018-08-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Di-aliphatic substituted pegylated lipids
WO2013063519A1 (en) 2011-10-26 2013-05-02 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving mirna expression levels for distinguishing pancreatic cysts
JP6118331B2 (ja) 2011-11-03 2017-04-19 クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドＱｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 神経保護のための方法および組成物
EP3848474A1 (en) 2011-11-04 2021-07-14 Gen-Probe Incorporated Molecular assay reagents and methods
US20140323549A1 (en) 2011-11-08 2014-10-30 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the nervous system
EA202090338A1 (ru) 2011-11-18 2021-04-30 Сарепта Терапьютикс, Инк. Функционально-модифицированные олигонуклеотиды и их субъединицы
DE102011120550B4 (de) 2011-12-05 2013-11-07 Gen-Probe Prodesse, Inc. Zusammensetzungen, Verfahren und Kits zur Detektion von Adenovirusnukleinsäuren
EP2794630A4 (en) 2011-12-22 2015-04-01 Alios Biopharma Inc SUBSTITUTED PHOSPHORTHIOAT NUCLEOTIDE ANALOGUE
UA117095C2 (uk) 2011-12-22 2018-06-25 Аліос Біофарма, Інк. Нуклеозидна сполука або її фармацевтично прийнятна сіль
ES2886147T3 (es) 2011-12-22 2021-12-16 Interna Tech B V MiARN para el tratamiento del cáncer de cabeza y de cuello
JP2015509085A (ja) 2012-01-01 2015-03-26 キュービーアイ エンタープライゼズ リミテッドＱｂｉ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ Ｌｔｄ． 治療剤および診断剤の選択的送達のためのｅｎｄｏ１８０を標的とする粒子
EP2802657B1 (en) 2012-01-12 2018-05-02 Quark Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treating hearing and balance disorders
CA2863084C (en) 2012-02-01 2020-07-07 Gen-Probe Incorporated Asymmetric hairpin target capture oligomers
WO2013123996A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Astrazeneca Uk Limited Novel sirna inhibitors of human icam-1
KR20220047395A (ko) 2012-03-09 2022-04-15 베스타론 코포레이션 독성 펩타이드 제조, 식물에서의 펩타이드 발현 및 시스테인 농후 펩타이드의 조합
EP2639238A1 (en) 2012-03-15 2013-09-18 Universität Bern Tricyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
USRE48171E1 (en) 2012-03-21 2020-08-25 Janssen Biopharma, Inc. Substituted nucleosides, nucleotides and analogs thereof
WO2013142124A1 (en) 2012-03-21 2013-09-26 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Solid forms of a thiophosphoramidate nucleotide prodrug
US9441007B2 (en) 2012-03-21 2016-09-13 Alios Biopharma, Inc. Substituted nucleosides, nucleotides and analogs thereof
US9012427B2 (en) 2012-03-22 2015-04-21 Alios Biopharma, Inc. Pharmaceutical combinations comprising a thionucleotide analog
WO2013154799A1 (en) 2012-04-09 2013-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP2850092B1 (en) 2012-04-09 2017-03-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
AU2013205110B2 (en) 2012-04-24 2016-10-13 Gen-Probe Incorporated Compositions, Methods and Kits to Detect Herpes Simplex Virus Nucleic Acids
EP2854813B1 (en) 2012-05-31 2018-07-25 Bio-lab Ltd. Pyrazolotriazolyl nucleoside analogues and oligonucleotides comprising them
AU2013205064B2 (en) 2012-06-04 2015-07-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Amplifying and Characterizing HCV Nucleic Acid
AU2013205087B2 (en) 2012-07-13 2016-03-03 Gen-Probe Incorporated Method for detecting a minority genotype
SG11201500239VA (en) 2012-07-13 2015-03-30 Wave Life Sciences Japan Asymmetric auxiliary group
AU2013202793B2 (en) 2012-07-31 2014-09-18 Gen-Probe Incorporated System, method and apparatus for automated incubation
DK2890814T3 (da) 2012-08-30 2019-12-16 Gen Probe Inc Flerfaset nukleinsyreamplificering
US9932578B2 (en) 2012-09-12 2018-04-03 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded oligonucleotide molecules to P53 and methods of use thereof
DK2895608T3 (en) 2012-09-12 2019-01-21 Quark Pharmaceuticals Inc DOUBLE-STRENGTHED OIGONUCLEOTIDE MOLECULES FOR P53 AND PROCEDURES FOR USING IT
US9611473B2 (en) 2012-09-12 2017-04-04 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded nucleic acid compounds
WO2014045126A2 (en) 2012-09-18 2014-03-27 Uti Limited Partnership Treatment of pain by inhibition of usp5 de-ubiquitinase
WO2014055117A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Asuragen, Inc. Diagnostic mirnas for differential diagnosis of incidental pancreatic cystic lesions
AU2013205122B2 (en) 2012-10-11 2016-11-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Human Papillomavirus Nucleic Acid
US9029335B2 (en) 2012-10-16 2015-05-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2′-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US10201556B2 (en) 2012-11-06 2019-02-12 Interna Technologies B.V. Combination for use in treating diseases or conditions associated with melanoma, or treating diseases or conditions associated with activated B-raf pathway
AU2013205090B2 (en) 2012-12-07 2016-07-28 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Gastrointestinal Pathogen Nucleic Acid
CN105143470B (zh) 2013-02-28 2020-06-09 德克萨斯大学系统董事会 用于将癌症分类为易感于tmepai定向疗法以及治疗所述癌症的方法
WO2014153260A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Arnold Lyle J Methods for amplification of nucleic acids on solid support
WO2014144666A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The University Of Chicago Methods and compositions related to t-cell activity
EP2971134B1 (en) 2013-03-15 2023-10-25 Aegea Biotechnologies, Inc. Methods for amplifying fragmented target nucleic acids utilizing an assembler sequence
CA2905527C (en) 2013-03-15 2023-10-03 Lyle J. Arnold Methods for amplification of nucleic acids utilizing clamp oligonucleotides
EP2978446B1 (en) 2013-03-27 2020-03-04 The General Hospital Corporation Anti-cd33 antibody for use in treating alzheimer's disease
DK2991656T3 (da) 2013-05-01 2020-03-23 Ionis Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til modulering af apolipoprotein c-iii-ekspression
EP3027223A1 (en) 2013-07-31 2016-06-08 QBI Enterprises Ltd. Methods of use of sphingolipid polyalkylamine oligonucleotide compounds
US9889200B2 (en) 2013-07-31 2018-02-13 Qbi Enterprises Ltd. Sphingolipid-polyalkylamine-oligonucleotide compounds
US10053742B2 (en) 2013-08-14 2018-08-21 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting HEV nucleic acid
EP2853595A1 (en) 2013-09-30 2015-04-01 Soluventis GmbH NOTCH 1 specific siRNA molecules
US11162096B2 (en) 2013-10-14 2021-11-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc Methods for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
EP3065706A4 (en) 2013-11-08 2017-11-29 Baylor Research Institute Nuclear localization of glp-1 stimulates myocardial regeneration and reverses heart failure
ES2797679T3 (es) 2013-12-02 2020-12-03 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos antisentido y usos de los mismos
ES2917473T3 (es) 2014-01-16 2022-07-08 Wave Life Sciences Ltd Diseño quiral
US10087444B2 (en) 2014-02-13 2018-10-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System MicroRNA composition for the treatment of neuroblastoma
EP3119789B1 (en) 2014-03-17 2020-04-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic carbocyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2015143245A1 (en) 2014-03-19 2015-09-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating ataxin 2 expression
CN106103717A (zh) 2014-03-19 2016-11-09 Ionis制药公司 用于调节共济失调蛋白2表达的组合物
RS60707B1 (sr) 2014-04-01 2020-09-30 Biogen Ma Inc Kompozicije za modulaciju ekspresije sod-1
WO2015164693A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising alpha-beta-constrained nucleic acid
DK3137476T3 (da) 2014-04-28 2019-11-18 Ionis Pharmaceuticals Inc Linker-modificerede oligomerforbindelser
PT3137605T (pt) 2014-05-01 2020-12-18 Ionis Pharmaceuticals Inc Composições e métodos para modulação da expressão de angiopoietina de tipo 3
SG11201608502TA (en) 2014-05-01 2016-11-29 Ionis Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for modulating complement factor b expression
EP4039807A1 (en) 2014-06-10 2022-08-10 Erasmus University Rotterdam Medical Center Antisense oligonucleotides useful in treatment of pompe disease
WO2016033424A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Genzyme Corporation Methods for the prevention and treatment of major adverse cardiovascular events using compounds that modulate apolipoprotein b
BR112017004056A2 (pt) 2014-09-12 2017-12-05 Biogen Ma Inc composições e métodos para detecção da proteína smn em um indivíduo e tratamento de um indivíduo
WO2016044271A2 (en) 2014-09-15 2016-03-24 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions to increase somatic cell nuclear transfer (scnt) efficiency by removing histone h3-lysine trimethylation
US20170304459A1 (en) 2014-10-10 2017-10-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inhalation delivery of conjugated oligonucleotide
DE102015220401B4 (de) 2014-10-20 2022-12-29 Gen-Probe Incorporated Erythrozyten-Lyselösung
WO2016083624A1 (en) 2014-11-28 2016-06-02 Silence Therapeutics Gmbh Means for inhibiting the expression of edn1
EP4372091A3 (en) 2014-12-12 2024-07-31 Tod M. Woolf Compositions and methods for editing nucleic acids in cells utilizing oligonucleotides
CA2970795A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Reversir compounds
US9688707B2 (en) 2014-12-30 2017-06-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic morpholino compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2016112132A1 (en) 2015-01-06 2016-07-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating expression of c9orf72 antisense transcript
JP6944873B2 (ja) 2015-01-09 2021-10-06 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 細菌性膣症を診断するための方法および組成物
US10538763B2 (en) 2015-01-16 2020-01-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulation of DUX4
EP3259346B1 (en) 2015-02-20 2024-08-07 Baylor College of Medicine P63 inactivation for the treatment of heart failure
US11129844B2 (en) 2015-03-03 2021-09-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating MECP2 expression
AU2016233298B2 (en) 2015-03-16 2021-09-02 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for detecting bacterial nucleic acid and diagnosing bacterial vaginosis
WO2016167780A1 (en) 2015-04-16 2016-10-20 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating expression of c9orf72 antisense transcript
EP3302489A4 (en) 2015-06-04 2019-02-06 Sarepta Therapeutics, Inc. METHOD AND COMPOUNDS FOR THE TREATMENT OF DISEASES AND SUFFERING IN CONNECTION WITH LYMPHOCYTES
EP3919619A1 (en) 2015-07-17 2021-12-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multi-targeted single entity conjugates
US10533175B2 (en) 2015-09-25 2020-01-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating Ataxin 3 expression
CN108291227A (zh) 2015-10-14 2018-07-17 拜奥-帕斯控股股份有限公司 用于脂质体制剂的对乙氧基核酸
AU2016349625B2 (en) 2015-11-06 2022-07-07 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulating apolipoprotein (a) expression
US11058709B1 (en) 2015-12-04 2021-07-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating breast cancer
CA3007152A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Erasmus University Medical Center Rotterdam Enzymatic replacement therapy and antisense therapy for pompe disease
US20190002887A1 (en) 2015-12-31 2019-01-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing ataxin-2 expression
US11111549B2 (en) 2016-01-04 2021-09-07 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for detecting Candida species
CA3006599A1 (en) 2016-01-05 2017-07-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing lrrk2 expression
WO2017161168A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of dyrk1b expression
AU2017234678A1 (en) 2016-03-16 2018-08-16 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods of modulating KEAP1
WO2017168348A1 (en) 2016-03-31 2017-10-05 Baylor Research Institute Angiopoietin-like protein 8 (angptl8)
EP3228326A1 (en) 2016-04-05 2017-10-11 Silence Therapeutics GmbH Nucleic acid linked to a trivalent glycoconjugate
WO2017181088A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Use of mir-223-3p as a cancer therapeutic and method for treating cancer using the same
EP3471781A4 (en) 2016-06-17 2020-05-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. MODULATION OF GYS1 EXPRESSION
NL2017295B1 (en) 2016-08-05 2018-02-14 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam Antisense oligomeric compound for Pompe disease
NL2017294B1 (en) 2016-08-05 2018-02-14 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam Natural cryptic exon removal by pairs of antisense oligonucleotides.
AU2017325971A1 (en) 2016-09-16 2019-04-11 Bio-Path Holdings, Inc. Combination therapy with liposomal antisense oligonucleotides
EP3522898A4 (en) 2016-10-06 2020-05-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. METHOD FOR CONJUGATING OLIGOMERIC COMPOUNDS
JP7167013B2 (ja) 2016-10-19 2022-11-08 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド Ｃ型肝炎ウイルスを検出または定量するための組成物および方法
JOP20190104A1 (ar) 2016-11-10 2019-05-07 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير عن atxn3
CN110088302B (zh) 2016-11-21 2025-02-25 简·探针公司 用于检测或定量乙型肝炎病毒的组合物和方法
WO2018102745A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 Cold Spring Harbor Laboratory Modulation of lnc05 expression
AU2017379073B2 (en) 2016-12-22 2023-12-14 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiency
US11197928B2 (en) 2017-01-13 2021-12-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Sustained production of high affinity antigen specific antibody by high dose BAFF receptor-targeting mAb-siRNA conjugate
US11180756B2 (en) 2017-03-09 2021-11-23 Ionis Pharmaceuticals Morpholino modified oligomeric compounds
CA3057154C (en) 2017-03-24 2024-11-12 Gen-Probe Incorporated COMPOSITIONS AND METHODS OF DETECTION OR QUANTIFICATION OF THE PARAINFLUENZA VIRUS
EP4219769A3 (en) 2017-03-25 2023-10-11 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits to detect rhinovirus nucleic acid
WO2018185252A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Silence Therapeutics Gmbh Nucleic acid conjugates
EP3385272A1 (en) 2017-04-05 2018-10-10 Silence Therapeutics GmbH Further novel oligonucleotide-ligand conjugates
WO2018185253A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Silence Therapeutics Gmbh Ligand modified double-stranded nucleic acids
CA3062075C (en) 2017-05-11 2024-04-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for isolating target nucleic acids
US11667978B2 (en) 2017-06-07 2023-06-06 Gen-Probe Incorporated Detecting Babesia species nucleic acid in a sample
US20210155978A1 (en) 2017-07-10 2021-05-27 Gen-Probe Incorporated Analytical systems and methods for nucleic acid amplification using sample assigning parameters
US11859257B2 (en) 2017-08-11 2024-01-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting Staphylococcus aureus
US11197884B2 (en) 2017-08-18 2021-12-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of the notch signaling pathway for treatment of respiratory disorders
US10517889B2 (en) 2017-09-08 2019-12-31 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of SMAD7 expression
AR113154A1 (es) 2017-09-29 2020-01-29 Intellia Therapeutics Inc Polinucleótidos, composiciones y métodos para edición del genoma
EP3688161A1 (en) 2017-09-29 2020-08-05 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for ttr gene editing and treating attr amyloidosis
MX2020004600A (es) 2017-11-02 2020-10-05 Janssen Biopharma Inc Constructos de oligonucleotidos y usos de estos.
US11497762B2 (en) 2017-11-03 2022-11-15 Interna Technologies B.V. MiRNA molecule, equivalent, antagomir, or source thereof for treating and/or diagnosing a condition and/or a disease associated with neuronal deficiency or for neuronal (re)generation
TWI809004B (zh) 2017-11-09 2023-07-21 美商Ionis製藥公司 用於降低snca表現之化合物及方法
US11377688B2 (en) 2017-11-17 2022-07-05 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting C1orf43 nucleic acid
US11662281B2 (en) 2017-12-13 2023-05-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for biological sample processing
EP3724354A1 (en) 2017-12-15 2020-10-21 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting toxigenic clostridium difficile
US11459564B2 (en) 2017-12-21 2022-10-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of frataxin expression
BR112020014425A2 (pt) 2018-01-15 2020-12-29 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Moduladores de expressão de dnm2
WO2019147743A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications
US20210071242A1 (en) 2018-01-29 2021-03-11 Gen-Probe Incorporated Analytical systems and methods
FI3749781T3 (fi) 2018-02-06 2024-12-27 Gen Probe Inc Kaukopunaväriaineen koetinformulaatioita
CA3088321A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 Interna Technologies B.V. Anticancer microrna and lipid formulations thereof
EP3759127A4 (en) 2018-03-02 2022-03-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. COMPOUNDS AND METHODS FOR MODULATING AMYLOID BETA PRECURSOR PROTEIN
TWI840345B (zh) 2018-03-02 2024-05-01 美商Ionis製藥公司 Irf4表現之調節劑
US11661601B2 (en) 2018-03-22 2023-05-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating FMR1 expression
EP3549610A1 (en) 2018-04-05 2019-10-09 Silence Therapeutics GmbH Nucleic acid conjugates
CA3094020A1 (en) 2018-04-11 2019-10-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of ezh2 expression
JP7438135B2 (ja) 2018-05-09 2024-02-26 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｆｘｉの発現を低下させるための化合物及び方法
SG11202010215TA (en) 2018-05-09 2020-11-27 Ionis Pharmaceuticals Inc Compounds and methods for reducing atxn3 expression
CA3268712A1 (en) 2018-06-13 2025-10-14 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Group B Streptococcus Nucleic Acid
CA3103429A1 (en) 2018-06-14 2019-12-19 Don W. Cleveland Compounds and methods for increasing stmn2 expression
TWI833770B (zh) 2018-06-27 2024-03-01 美商Ionis製藥公司 用於減少 lrrk2 表現之化合物及方法
WO2020014400A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Gen-Probe Incorporated Methods and systems for detecting and quantifying nucleic acids
EP3823725A4 (en) 2018-07-17 2023-05-10 Aronora, Inc. METHODS FOR SAFELY REDUCING THROMBOPOIETIN
BR112021000308A2 (pt) 2018-07-25 2021-04-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compostos e métodos para redução da expressão de atxn2
BR112021001546A2 (pt) 2018-07-31 2021-05-04 Intellia Therapeutics, Inc. composições e métodos para a edição de gene do hidroxiácido oxidase 1 (hao1) para o tratamento da hiperoxalúria primária tipo 1 (ph1)
EP3830302B1 (en) 2018-08-01 2022-10-05 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acids of epstein-barr virus
US12460254B2 (en) 2018-08-08 2025-11-04 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting Mycoplasma genitalium
EP3833762A4 (en) 2018-08-09 2022-09-28 Verseau Therapeutics, Inc. Oligonucleotide compositions for targeting ccr2 and csf1r and uses thereof
WO2020041414A1 (en) 2018-08-21 2020-02-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human cytomegalovirus
KR20260040117A (ko) 2018-08-24 2026-03-23 젠-프로브 인코포레이티드 세균성 핵산을 검출하고 세균성 질염을 진단하기 위한 조성물 및 방법
CA3112651A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bordetella pertussis and bordetella parapertussis nucleic acid
BR112021005718A2 (pt) 2018-09-28 2021-06-22 Intellia Therapeutics, Inc. composições e métodos para edição de genes de lactato desidrogenase (ldha)
JP2022512703A (ja) 2018-10-16 2022-02-07 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 免疫療法のための組成物および方法
JP7578590B2 (ja) 2018-10-18 2024-11-06 インテリア セラピューティクス，インコーポレーテッド 第ｉｘ因子を発現するための組成物及び方法
US20200268906A1 (en) 2018-10-18 2020-08-27 Intellia Therapeutics, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
AU2019361203B2 (en) 2018-10-18 2026-03-26 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for transgene expression from an albumin locus
AU2019361204A1 (en) 2018-10-18 2021-05-27 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiencey
WO2020086546A1 (en) 2018-10-22 2020-04-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human polyomavirus bk virus
TW202028222A (zh) 2018-11-14 2020-08-01 美商Ionis製藥公司 Foxp3表現之調節劑
BR112021008967A2 (pt) 2018-11-15 2021-08-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. moduladores da expressão de irf5
SG11202103794QA (en) 2018-11-21 2021-05-28 Ionis Pharmaceuticals Inc Compounds and methods for reducing prion expression
TW202030333A (zh) 2018-12-20 2020-08-16 美商簡 探針公司 用於檢測瘧原蟲物種核酸之組成物及方法
US12357959B2 (en) 2018-12-26 2025-07-15 Twist Bioscience Corporation Highly accurate de novo polynucleotide synthesis
SG11202107399WA (en) 2019-01-31 2021-08-30 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulators of yap1 expression
TW202540426A (zh) 2019-02-27 2025-10-16 美商Ionis製藥公司 Malat1表現之調節劑
EP4389916A3 (en) 2019-03-22 2024-10-16 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group a streptococcus
BR112021019224A2 (pt) 2019-03-28 2021-11-30 Intellia Therapeutics Inc Polinucleotídeos, composições e métodos para expressão de polipeptídeo
EP3946598A1 (en) 2019-03-28 2022-02-09 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods comprising a ttr guide rna and a polynucleotide encoding an rna-guided dna binding agent
AU2020248337A1 (en) 2019-03-28 2021-11-04 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for ttr gene editing and treating ATTR amyloidosis comprising a corticosteroid or use thereof
FI3947684T3 (fi) 2019-03-29 2025-05-27 Ionis Pharmaceuticals Inc Yhdisteitä ja menetelmiä ube3a-ats:n moduloimiseksi
EP4371667A3 (en) 2019-05-03 2024-07-31 Gen-Probe Incorporated Receptacle transport system for an analytical system
US20220307093A1 (en) 2019-07-03 2022-09-29 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides for use in determining the presence of trichomonas vaginalis in a sample
EP3956450B1 (en) 2019-07-26 2025-08-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating gfap
EP4013767A4 (en) 2019-08-15 2023-10-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Linkage modified oligomeric compounds and uses thereof
US20220298548A1 (en) 2019-08-23 2022-09-22 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting treponema pallidum
BR112022003505A2 (pt) 2019-08-27 2022-05-24 Vertex Pharma Composições e métodos para tratamento de distúrbios associados a dna repetitivo
JP7556945B2 (ja) 2019-09-05 2024-09-26 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ変異体の核酸の検出
CA3159392A1 (en) 2019-11-14 2021-05-20 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for capturing target nucleic acids
SG10201914033YA (en) 2019-12-31 2021-07-29 Wilmar International Ltd Polypeptides with Lipase Activity and Uses Thereof
CN121344163A (zh) 2020-01-16 2026-01-16 Dnae诊断有限公司 用于分离靶多核苷酸的组合物、试剂盒和方法
MX2022009416A (es) 2020-01-31 2022-10-21 Regeneron Pharma Uso de cromatografía líquida y espectrometría de masas para caracterizar oligonucleótidos.
JP2023512758A (ja) 2020-02-07 2023-03-29 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド カリクレイン（ｋｌｋｂ１）遺伝子編集のための組成物および方法
CR20220485A (es) 2020-02-28 2022-11-10 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y métodos para modular smn2
KR20230017783A (ko) 2020-04-28 2023-02-06 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 시험관내 세포 전달 방법
MX2022013707A (es) 2020-05-01 2022-12-07 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y metodos para modular atxn1.
CN115698325A (zh) 2020-05-07 2023-02-03 盖立复诊断解决方案公司 用于检测SARS-CoV-2核酸的方法和组合物
EP3922720A1 (en) 2020-06-09 2021-12-15 Universidad de Murcia Therapy to prevent adverse cardiac remodeling following an acute myocardial infarction
BR112022024206A2 (pt) 2020-06-29 2023-01-03 Ionis Pharmaceuticals Inc Compostos e métodos para modular plp1
AU2021308095A1 (en) 2020-07-17 2023-03-09 Gen-Probe Incorporated Detection of macrolide-resistant mycoplasma genitalium
AU2021315992A1 (en) 2020-07-28 2023-02-09 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing app expression
IL300258A (en) 2020-08-07 2023-03-01 Ionis Pharmaceuticals Inc Compounds and methods for modulating SCN2A
WO2022034555A1 (en) 2020-08-13 2022-02-17 Janssen Biopharma, Inc. Polynucleotide constructs and uses thereof
US20220096606A1 (en) 2020-09-09 2022-03-31 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and Methods for Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy
CA3297045A1 (en) 2020-10-21 2026-03-02 Gen-Probe Incorporated Fluid container management system
EP4240854A1 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of dm1 with slucas9 and sacas9
EP4136092B1 (en) 2020-11-18 2024-07-31 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating angiotensinogen expression
CA3204997A1 (en) 2020-12-11 2022-06-16 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing mhc class ii in a cell
CR20230305A (es) 2020-12-11 2023-11-10 Intellia Therapeutics Inc Polinucleótidos, composiciones y métodos para la edición del genoma que implican desaminación
JP2023554346A (ja) 2020-12-18 2023-12-27 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド 第ｘｉｉ因子を調節するための化合物及び方法
TW202242101A (zh) 2020-12-23 2022-11-01 美商英特利亞醫療公司 用於細胞中基因修飾ciita之組合物及方法
AU2021409732A1 (en) 2020-12-23 2023-07-20 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing hla-a in a cell
AU2021411521A1 (en) 2020-12-30 2023-08-03 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
EP4277658A4 (en) 2021-01-15 2025-06-04 Board of Regents, The University of Texas System TRANS-COMPLEMENTATION SYSTEM FOR SARS-CoV-2
JP2024506016A (ja) 2021-02-08 2024-02-08 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 免疫療法のためのｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ｔｉｍ３）組成物及び方法
WO2022170194A2 (en) 2021-02-08 2022-08-11 Intellia Therapeutics, Inc. Lymphocyte activation gene 3 (lag3) compositions and methods for immunotherapy
JP2024505672A (ja) 2021-02-08 2024-02-07 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 免疫療法のためのナチュラルキラー細胞受容体２ｂ４組成物及び方法
TW202302848A (zh) 2021-02-26 2023-01-16 美商維泰克斯製藥公司 以crispr/sacas9治療第1型肌強直性營養不良之組合物及方法
EP4298221A1 (en) 2021-02-26 2024-01-03 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 with crispr/slucas9
JP2024510996A (ja) 2021-03-15 2024-03-12 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド 生物学的サンプル処理のための組成物および方法
EP4314295A1 (en) 2021-03-26 2024-02-07 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Nucleotide editing to reframe dmd transcripts by base editing and prime editing
WO2022229851A1 (en) 2021-04-26 2022-11-03 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using slucas9 scaffold sequences
WO2022234519A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using sacas9 scaffold sequences
KR20240023602A (ko) 2021-06-18 2024-02-22 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 Ifnar1 발현을 감소시키기 위한 화합물 및 방법
KR20240038705A (ko) 2021-06-22 2024-03-25 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 간 유전자의 생체 내 편집 방법
US20250269368A1 (en) 2021-07-21 2025-08-28 Dnae Group Holdings Limited Method and system comprising a cartridge for sequencing target polynucleotides
GB202110485D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
GB202110479D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
CA3226812A1 (en) 2021-07-27 2023-02-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting gastrointestinal pathogens
WO2023018637A1 (en) 2021-08-09 2023-02-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Gene editing of regulatory elements
EP4392060A1 (en) 2021-08-24 2024-07-03 Intellia Therapeutics, Inc. Programmed cell death protein 1 (pd1) compositions and methods for cell-based therapy
EP4399302A2 (en) 2021-09-08 2024-07-17 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exon 51 for treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2023049708A1 (en) 2021-09-22 2023-03-30 Herbalife International Of America, Inc. Methods and compositions for identifying botanical material using arms-pcr
EP4426822A2 (en) 2021-11-03 2024-09-11 Intellia Therapeutics, Inc. Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing
EP4426338A2 (en) 2021-11-03 2024-09-11 Intellia Therapeutics, Inc. Cd38 compositions and methods for immunotherapy
EP4490291A1 (en) 2022-03-08 2025-01-15 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exons for treatment of duchenne muscular dystrophy
TW202345911A (zh) 2022-03-08 2023-12-01 美商維泰克斯製藥公司 用於治療杜興氏肌肉失養症(duchenne muscular dystrophy)之部分外顯子44、50及53之精確切除
WO2023185697A2 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treatment of transthyretin amyloidosis
CA3249261A1 (en) 2022-04-18 2023-10-26 Vertex Pharmaceuticals Incorporated COMPOSITIONS AND PROCESSES TO IMPROVE ADENE-ASSOCIATED VIRUS (AAV) THERAPY AND REDUCE AAV TROPISM TO THE LIVER
US20250268940A1 (en) 2022-04-19 2025-08-28 Intellia Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor compositions and uses
EP4540389A2 (en) 2022-06-16 2025-04-23 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing mhc class i in a cell
CN119384498A (zh) 2022-06-16 2025-01-28 因特利亚治疗公司 用于对细胞进行遗传修饰的方法和组合物
EP4540388A2 (en) 2022-06-16 2025-04-23 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genomic editing
CN119585419A (zh) 2022-06-29 2025-03-07 因特利亚治疗公司 工程化t细胞
EP4558634A1 (en) 2022-07-18 2025-05-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tandem guide rnas (tg-rnas) and their use in genome editing
EP4311579A1 (en) 2022-07-29 2024-01-31 Association Française contre les Myopathies B cell-specific mab-sirna conjugates improve myasthenia
IL318625A (en) 2022-07-29 2025-03-01 Regeneron Pharma Compositions and methods for transferrin receptor (TFR)-mediated delivery to brain and muscle
EP4569112A1 (en) 2022-08-12 2025-06-18 Remix Therapeutics Inc. Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites
WO2024054924A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Gen-Probe Incorporated Method of detecting nucleic acid analytes using dual-specificity primers
EP4590820A2 (en) 2022-09-22 2025-07-30 Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treatment of hypercholesterolemia and/or cardiovascular disease
JP2025532127A (ja) 2022-09-23 2025-09-29 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｍｅｃｐ２発現を低減する化合物及び方法
IL320016A (en) 2022-11-04 2025-06-01 Regeneron Pharma Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
CN120390656A (zh) 2022-11-08 2025-07-29 欧纳医疗公司 环状rna组合物
AU2023379457A1 (en) 2022-11-14 2025-05-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes
CN120225676A (zh) 2022-12-02 2025-06-27 上海舶望制药有限公司 双环脱碱基核酸类似物以及由它们制备的寡聚化合物
WO2024137766A2 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for proprotein convertase subtilisin kexin 9 (pcsk9) editing
WO2024138189A2 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Intellia Therapeutics, Inc. Methods for analyzing nucleic acid cargos of lipid nucleic acid assemblies
WO2024138115A1 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Intellia Theraperutics, Inc. Systems and methods for genomic editing
WO2024161179A1 (en) 2023-01-31 2024-08-08 Mobidiag Oy Compositions and methods for detecting stx nucleic acids
EP4662311A2 (en) 2023-02-09 2025-12-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Reversir molecules and methods of use thereof
WO2024186890A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for hepatitis b virus (hbv) genome editing
EP4677067A1 (en) 2023-03-07 2026-01-14 Intellia Therapeutics, Inc. Cish compositions and methods for immunotherapy
CN121194983A (zh) 2023-04-06 2025-12-23 上海舶望制药有限公司 5'-膦酸酯修饰的核苷类似物及其制备的寡核苷酸
EP4455303A1 (en) 2023-04-28 2024-10-30 Mobidiag Oy Nucleic acid amplification process controls
EP4454758A1 (en) 2023-04-28 2024-10-30 Mobidiag Oy Nucleic acid amplification process controls
EP4455304A1 (en) 2023-04-28 2024-10-30 Mobidiag Oy Nucleic acid amplification process controls
WO2024233308A2 (en) 2023-05-05 2024-11-14 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods
US20250051771A1 (en) 2023-07-24 2025-02-13 Astrazeneca Ab Multivalent cargo-carrying complexes and uses thereof
GB202311324D0 (en) 2023-07-24 2023-09-06 Astrazeneca Ab Multivalent cargo-carrying complexes and uses thereof
GB202311334D0 (en) 2023-07-24 2023-09-06 Astrazeneca Ab Multivalent cargo-carrying complexes and uses thereof
TW202521564A (zh) 2023-08-14 2025-06-01 美商英特利亞醫療公司 用於基於細胞之療法的ｃｄ７０ ｃａｒ－ｔ組合物及方法
AU2024324870A1 (en) 2023-08-14 2026-02-12 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genetically modifying transforming growth factor beta receptor type 2 (tgfβr2)
TW202515994A (zh) 2023-08-14 2025-04-16 美商英特利亞醫療公司 用於對ｃｄ７０進行基因修飾之組合物及方法
WO2025038637A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genetically modifying transforming growth factor beta receptor type 2 (tgfβr2)
WO2025049432A1 (en) 2023-08-28 2025-03-06 Intellia Therapeutics, Inc. Methods for editing hla-a in cells pre-screened for the absence of one or both alleles of hla-h*01
WO2025049481A1 (en) 2023-08-28 2025-03-06 Intellia Therapeutics, Inc. Methods of editing an hla-a gene in vitro
WO2025101501A1 (en) 2023-11-07 2025-05-15 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
TW202540417A (zh) 2023-11-10 2025-10-16 美商英特利亞醫療公司 用於基因體編輯之組合物、方法及系統
WO2025137301A1 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Intellia Therapeutics, Inc. Methods for rapid engineering of cells
WO2025137439A2 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
WO2025177174A1 (en) 2024-02-20 2025-08-28 Diagenode S.A. Single-cell rna profiling
WO2025184520A1 (en) 2024-02-29 2025-09-04 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for angiopoietin like 3 (angptl3) editing
TW202603166A (zh) 2024-03-20 2026-01-16 美商維泰克斯製藥公司 黏蛋白５Ｂ（ＭＵＣ５Ｂ）靶向ｓｉＲＮＡ及反義寡核苷酸及其使用方法
WO2025250751A1 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods
WO2025255308A1 (en) 2024-06-07 2025-12-11 Intellia Therapeutics, Inc. Cd8 co-receptor chimeric polypeptides in tcr cell therapy
WO2026006593A1 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Orna Therapeutics, Inc. Synthetic internal ribosome entry sites
WO2026050125A1 (en) 2024-08-28 2026-03-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating an angiotensinogen- (agt-) associated disorder
WO2026072709A1 (en) 2024-09-25 2026-04-02 Orna Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors targeting bcma

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1340645C (en) * 1987-04-17 1999-07-13 Victor E. Marquez Acid stable dideoxynucleosides active against the cytopathic effects of human immunodeficiency virus
IL90359A0 (en) * 1988-05-26 1989-12-15 University Patents Inc Nucleoside and polynucleotide thiophosphoramidite and phosphorodithioate compounds and their production
US5216141A (en) * 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
JPH0231686A (ja) * 1988-07-22 1990-02-01 Yuki Gosei Kogyo Co Ltd トリフルオロチミジンの製造方法
JPH0725785B2 (ja) * 1989-01-11 1995-03-22 日本臓器製薬株式会社 アデノシン誘導体及び該化合物を有効成分として含有する医薬組成物
FR2642074B1 (fr) * 1989-01-20 1994-04-29 Oris Ind Derives de molecules polyhydroxylees permettant l'introduction d'au moins une ramification dans un oligonucleotide
GB8920534D0 (en) * 1989-09-11 1989-10-25 Wellcome Found Antiviral compounds
US5378825A (en) * 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
ES2083593T3 (es) * 1990-08-03 1996-04-16 Sterling Winthrop Inc Compuestos y metodos para inhibir la expresion de genes.
CA2092002A1 (en) * 1990-09-20 1992-03-21 Mark Matteucci Modified internucleoside linkages
AU3250093A (en) * 1991-12-12 1993-07-19 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
FI115214B (fi) * 1992-01-22 2005-03-31 Hoechst Ag Menetelmä oligonukleotidianalogien valmistamiseksi ja niiden käyttö
AU678968B2 (en) * 1992-05-29 1997-06-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
DE69231441T2 (de) 2001-03-22
FI935114L (fi) 1993-12-30
EP0586570A1 (en) 1994-03-16
FI935114A7 (fi) 1993-12-30
NO934180L (no) 1994-01-11
JPH06504067A (ja) 1994-05-12
WO1992020823A1 (en) 1992-11-26
JP2711180B2 (ja) 1998-02-10
FI935113L (fi) 1994-01-03
HU221806B1 (hu) 2003-01-28
NO308703B1 (no) 2000-10-16
EP0586520A1 (en) 1994-03-16
EP1004593A3 (en) 2000-07-19
EP0586520B1 (en) 2000-04-19
AU1998692A (en) 1992-12-30
DE69231441D1 (de) 2000-10-19
HU9303289D0 (en) 1994-03-28
BR9206027A (pt) 1994-12-27
DE69230935T2 (de) 2000-10-19
WO1992020822A1 (en) 1992-11-26
BR9206026A (pt) 1994-12-27
NO934180D0 (no) 1993-11-18
CA2103378A1 (en) 1992-11-22
HU9303290D0 (en) 1994-03-28
AU662538B2 (en) 1995-09-07
JPH06503838A (ja) 1994-04-28
NO934179L (no) 1994-01-12
EP0586570B1 (en) 2000-09-13
HUT66378A (en) 1994-11-28
CA2103464A1 (en) 1992-11-22
FI113870B (fi) 2004-06-30
AU666121B2 (en) 1996-02-01
JP2625257B2 (ja) 1997-07-02
KR0156945B1 (ko) 1998-10-15
IE921849A1 (en) 1992-12-02
DE69230935D1 (de) 2000-05-25
AU2150292A (en) 1992-12-30
FI935114A0 (fi) 1993-11-18
EP0586520A4 (en) 1996-01-10
EP0586570A4 (en) 1996-01-24
US5378825A (en) 1995-01-03
NO934179D0 (no) 1993-11-18
ATE196321T1 (de) 2000-09-15
FI935113A0 (fi) 1993-11-18
KR0155574B1 (ko) 1998-10-15
ATE191933T1 (de) 2000-05-15
IE921850A1 (en) 1992-12-02
EP1004593A2 (en) 2000-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT65941A (en) Backbone modified oligonucleotide analogues and pharmaceutical preparations containing them
US5610289A (en) Backbone modified oligonucleotide analogues
US6025482A (en) Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5489677A (en) Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5792844A (en) Oligonucleoside linkages containing adjacent nitrogen atoms
US5777092A (en) Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5602240A (en) Backbone modified oligonucleotide analogs
US5618704A (en) Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US6087482A (en) Heteroatomic oligonucleoside linkages
IE83315B1 (en) Backbone modified oligonucleotide analogs
EP0649429B1 (en) Heteroatomic oligonucleoside linkages
WO1994022893A1 (en) Oligonucleoside linkages containing adjacent nitrogen atoms
WO1994022894A1 (en) Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling

Legal Events

Date Code Title Description
DFC4 Cancellation of temporary protection due to refusal