HUT73453A - A truncated keratinocyte growth factor /kgf/ having increased biological activity - Google Patents

A truncated keratinocyte growth factor /kgf/ having increased biological activity Download PDF

Info

Publication number
HUT73453A
HUT73453A HU9503857A HU9503857A HUT73453A HU T73453 A HUT73453 A HU T73453A HU 9503857 A HU9503857 A HU 9503857A HU 9503857 A HU9503857 A HU 9503857A HU T73453 A HUT73453 A HU T73453A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
fragment
kgf
growth factor
keratinocyte growth
sequence
Prior art date
Application number
HU9503857A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9503857D0 (en
Inventor
Denis J Gospodarowicz
Frank Masiarz
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of HU9503857D0 publication Critical patent/HU9503857D0/hu
Publication of HUT73453A publication Critical patent/HUT73453A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

A jelen találmány tárgya általában a keratinocita növekedési faktor (KGF). Pontosabban, a jelen találmány tárgyát képezik a csonkított KGF fragmens és annak analógjai, amelyek egy rekombináns, teljes hosszúságú, rovar sejtrendszerben expresszált KGF-hez viszonyítva fokozott biológiai aktivitással és csökkent citotoxicitással rendelkeznek. Erről a KGF fragmensről, amelyet a továbbiakban KGFjqs-i-23 néven említünk, hiányzik az érett, teljes hosszúságú KGF Nterminálisának első 23 aminosav csoportja: ez az N-terminális tartalmaz egy glikozilezési helyet az N-terminálistól számított 14-16. aminosav csoportokon [Finch,
P.W. és mtsai.: Science 245, 752-755 (1989)], amelyről korábban azt gondolták, hogy ez biztosítja a KGF-nek az epiteliális sejtspecifitást.
A KGF a fibroblaszt növekedési faktorok (FGF-ek) közé tartozik, amelyeknek a prototípusa a bázikus FGF (bFGF). A KGF ismert még FGF-6-ként is. Más FGFekhez hasonlóan a KGF is egy heparinkötő fehérje, de a többi FGF-től eltérően egyedi célsejt-specifitással rendelkezik. Pontosabban, az FGF-ek általában képesek serkenteni a szaporodást és differenciálódást számos különböző, a primer és szekunder mezodermából valamint a neuroektodermából származó sejttípusoknál. A KGF annyiban hasonlít a többi FGF-re, hogy képes az epiteliális sejtszaporodás serkentésére, de annyiban eltér a többi FGF-től, hogy nem képes serkenteni az endoteliális sejtek vagy a fibriblaszt szaporodását [Finch, P.W. és mtsai.: Science 245, 752-755 (1989)].
Az FGF-ekről, beleértve a savas fibroblaszt növekedési faktort (aFGF) és a bázikus fibroblaszt növekedési faktort (bFGF), ismert, hogy heparinkötő tulajdonságokkal rendelkeznek, és képesek a ventrális valamint a dorzális mezoderma differenciálódásának és szaporodásának serkentésére a korai blasztulákban [Gospodarowicz és mtsai.: Cell. Bioi. Rév. 25, 307-314 (1991); Basilico és mtsai.: Adv. Cancer Rés. 59, 1 15-165 (1992)]. A sejteknek az FGF-re adott válaszát az anyagnak a sejtfelszín receptoraihoz (FGFR-ek) való kötődése közvetíti, amelyek közé három, egymással kapcsolatban álló típus tartozik [Hou és mtsai.: Science 251, 665-668 (1991)]. A nagyaffinitású FGFR-ek tirozin-kinázok, ide tartozik az fig receptor (FGFR-1), a bek receptor (FGFR-2) es a K Sam receptor (FGFR-3) [Lee és mtsai.: Science 245, 57-60 (1989): Dionne és mtsai.: EMBO 9, 2685-2692 (1990); Miki és mtsai.: Science 251, 72-75 (1991); Miki és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 89, 246-250 (1992); Deli és mtsai.: Journal of Biological Chemistry 267, 21225-21229 (1992)].
Mind az FGFR-1, mind az FGFR-2 bőven expresszálódik a mezodermális és neuroendodermális szövetekben, és mindkettő hasonló affinitással képes megtalálni az aFGF-et és a bFGF-et. Az FGFR-3 az epiteliális sejtekre specifikus receptor. Ez egy alternatív átirata az FGFR-2-nek. Az FGFR-2-vel ellentétben, amely nagy affinitást mutat mind az aFGF-fel mind a bFGF-fel szemben, de nem mutat affinitást a KGF-fel szemben, az FGFR-3 a KGF-hez és az aFGF-hez körülbelül 20-1000-szer nagyobb affinitással kötődik mint a bFGF-hez [Miki és mtsai.: Science 251, 72-75 (1991); Miki és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 89, 246-250 (1992); Deli és mtsai.: Journal of Biological Chemistry 267, 21225-21229 (1992)].
A KGF-nek az epiteliális sejtekkel szemben tanúsított szigorúan korlátozott profilja kívánatos, például számos típusú sebgyógyítási alkalmazásban, valamint az epidermisz hiperproliferatív megbetegedéseiben, azaz például a pszoriázisban és a bazális sejt karcinómában. Jelenleg a KGF kivételével nincs nagyon alkalmas mitogén faktor ezekhez az alkalmazásokhoz. Az lenne azonban kívánatos, ha a KGF módosítható lenne, hogy fokozzuk a hatékonyságát és csökkentsük a citotoxicitását a gyógyászati alkalmazásokban.
Jelenleg az derült ki [Ron és mtsai.: Journal of Biological Chemistry 268, 2984-2988 (1993)], hogy ha a KGFigg-at expresszáljuk egy T7 prokarióta expressziós rendszerben, akkor egy rekombináns KGF (rKGF) állítható elő, amely mitogén aktivitással rendelkezik. Ha az rKGF molekulát csonkítjuk, az érett KGF153 polipeptid N-terminálisáról 3, 8, 27, 38 és 48 aminosavat eltávolítva, akkor a kapott molekulák biológiai aktivitása változik. 3 és 8 aminosav csoport deléciójával a kapott molekula mitogén aktivitását láthatóan nem érintjük, a teljes hosszúságú rKGF (rKGF-|g3) aktivitásával összehasonlítva. Ha azonban 27 aminosavat vágunk le, akkor a mitogén aktivitás tizedére-huszadára csökken. 38 és 48 aminosav eltávolítása viszont a mitogén aktivitás és heparinkötö képesség teljes elvesztését eredményezi. így Ronnak és munkatársainak nem sikerült olyan csonkított KGF fragmenseket előállítani, amelyek az rKGFig3 molekulához viszonyítva fokozott mitogén aktivitással rendelkeznek.
A jelen találmány tárgya egy olyan KGF fragmens, amely az érett, teljes hosszúságú KGF, a KGF-|g3 aminosav szekvenciájának egy részét tartalmazza, és mitogén aktivitása legalább kétszerese a teljes hosszúságú, rekombináns KGF, az rKGF-|g3 aktivitásának. A találmány tárgya egy olyan KGF fragmens előállítása, amelyről hiányzik az rKGF első 23 N-terminális aminosav csoportját tartalmazó szekvencia, a C-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-N-V-N-C-S-S-P-E-R-H-T-R.
A jelen találmány tárgya továbbá olyan KGF fragmens előállítása, amelynek az rKGF-|g3-hoz viszonyítva kisebb a citotoxicitása. A találmány tárgya tovább egy olyan konjugátum előállítása, amely az előzőkben leírt KGF fragmenst és egy toxin molekulát tartalmaz. A toxin molekula lehet legalább egy ricin A, diftéria toxin és saporin.
A találmány tárgya továbbá egy gyógyászati készítmény, amely egy előzőkben leírt KGF fragmenst és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót, például humán bőrön való topikális alkalmazáshoz megfelelő hordozót tartalmaz.
A jelen találmány tárgya továbbá egy olyan DNS molekula előállítása, amely az előzőkben leírt KGF fragmenst kódoló nukleotid szekvenciát tartalmaz.
• · · · « · · · ··· ·
A találmány tárgya továbbá egy olyan expressziós vektor előállítása, amely az előzőkben leírt KGF fragmenst kódoló DNS molekulát tartalmazza, valamint tartalmaz egy szabályozó szekvenciát, amely lehetővé teszi a DNS molekula expresszióját. Az expressziós vektor lehet például egy bakulovírus.
A jelen találmány tárgya továbbá az előzőkben leírt expressziós vektorral transzformált gazdasejt előállítása. A gazdasejt lehet például egy baktériumsejt, élesztősejt, emlőssejt vagy rovarsejt.
A jelen találmány tárgya továbbá eljárás a KGF fragmens előállítására, az előzőkben leírt transzformált gazdasejt tenyésztésével, a KGF fragmenst a tenyészetből előállítva.
A jelen találmány tárgya továbbá eljárás az epiteliális sejtnövekedés serkentésére, a KGF fragmenst egy olyan területre alkalmazva, amelyen az epiteliális növekedésre szükség van, a sejteket szaporodni hagyva.
A jelen találmány tárgya továbbá eljárás sebek gyógyítására, azzal jellemezve, hogy az előzőkben leírt gyógyászati készítményt egy kezelendő sebes területen alkalmazzuk, majd hagyjuk a sebet gyógyulni.
A jelen találmány tárgya továbbá eljárás az epidermisz egy hiperproliferatív betegségének kezelésére, az előzőkben ismertetett konjugátumot alkalmazva a kezelendő területre.
A jelen találmány további tárgyai, tulajdonságai és előnyei nyilvánvalóak egy, a szakterületen jártas szakember számára, és nem szükséges itt felsorolni őket. A jelen találmány magában foglalja a fentiek variánsait és módosításait, amelyek nyilvánvalóak a szakterületen jártas szakember számára, és nem változtatja meg a fragmens, konjugátum, gyógyászati készítmény, vektor, gazdaszervezet és használt módszer természetét és aktivitását.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.
Az 1. ábrán látható az erett, teljes hosszúságú humán KGF polipeptid aminosav szekvenciája, amely az N-terminálissal kezdődik, 163 aminosavat tartalmaz, valamint egyetlen N-kapcsolt glikozilezési jelet a 14-16-os aminosavakon.
A 2. ábrán a pAcC13 expressziós vektor látható, amelybe beépítjük a KGF 163 aminosavat kódoló szekvenciáját.
A 3. ábrán láthatjuk a jelen találmány szerinti, az SF9-es sejtek kondicionált közegéből származó KGF fragmens további tisztítását, Heparin Sepharose (HS) oszlopon 1 mol/l nátrium-kloriddal való eluálás után. A HS oszlopról származó biológiailag aktív frakciókat egyesítjük, ötszörösre hígítjuk 10 mmol/l TRIS (pH=7,3) pufferrel, majd Mono S HR5/5 kationcserélö FPLC-re visszük.
A 4. ábrán a hosszú, azaz az rKGF-jgg és a rövid, azaz a KGF(jes1-23 KGF forma biológiai aktivitását hasonlítjuk Össze aFGF-fel szemben a Balb/MK sejtvonal sejtjein.
Meglepő felfedezés volt, hogy egy csonkított, glikozilezetlen KGF, amelyet a továbbiakban KGF fragmensnek vagy KGFjqsi .23-nak nevezünk, és amelynek az rKGF-|63 első 23 N-terminális aminosavára terjedő deléciója van, nagyobb biológiai aktivitással és kisebb citotoxicitással rendelkezik az epiteliális sejtekkel szemben mint az rKGF-|g3. Általában a jelen találmány szerinti KGF fragmens megtartja a KGF-|g3-nak az epiteliális sejtszaporodással szembeni specifitását.
Ennek megfelelően, a jelen találmány szerinti előnyös megvalósítási mód egy új, csonkított, glikozilezetlen KGF fragmens, a KGFgggi_23> amelyet nem kísérnek olyan szennyeződések, amelyek normális körülmények között az in vivő előállított természetes molekulát kísérik. Ennek a fragmensnek a látszólagos molekulasúlya körülbelül 18 kDa, amit a NaDodSO4/PAGE-n egyetlen csúcsban való vándorlása alapján határoztunk meg. A tisztított KGFcjes-|_23 specifikus aktivitása Balb/MK • · sejteken körülbelül 2,5x1egység/mg (ED5Q 40 pg/ml), azaz körülbelül 7-10-szer nagyobb mint az rKGF fehérjéé, vagy az aFGF-é, ha sejtszaporodási vizsgálatban hasonlítjuk össze, és 100-szor nagyobb, ha az rKGF-jgg-at biológiailag vizsgáljuk, vizsgálva a DNS szintézis iniciációját Balb/Mk sejtekben egy kémiailag meghatározott tápközegben, lásd a WO 90/08771 számú PCT szabadalmi bejelentést.
A jelen találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a KGFdggi23-at rekombináns DNS technológiával állítjuk elő, főleg ipari méretekben előállítva. Egy további előnyös megvalósítási mód szerint a rekombináns DNS molekulát, az expressziós vektort, amelyik mind tartalmazza a jelen találmány szerinti KGFcjgg-j. 23-at vagy annak analógjait, standard génexpressziós technológiával alkalmazzuk, a szakterületen jól ismert módszereket használva.
Egy további megvalósítási mód szerint a KGFjgg-j -23-at kódoló DNS-t tartalmazó DNS-t vagy vektort bakteriális-, emlős-, élesztő- vagy rovar expressziós rendszerben expresszálhatjuk. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a bakteriális vagy élesztő sejtexpressziós rendszer ideális a KGF(jeS'|_23 fragmens előállítására. Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint a DNS-t vagy a vektort egy rovar expressziós rendszerben expresszáljuk.
A jelen találmány szerinti KGF fragmens használható receptor felismerési helyek felismerésére valamint peptid agonisták vagy antagonisták tervezésére. Emellett, a KGF-nek a keratinocitákkal szemben tanúsított egyedi specifitásának fényében, mivel nem képes indukálni a vaszkuláris endoteliális sejtek vagy fibroblasztok szaporodását, a jelen találmány egy másik megvalósítási módja szerint a KGFdgg-i-23 előnyösen használható sebgyógyításra, különösen akkor, ha a bőr reepítelizációjára van szükség. A KGFcjes^23 egyéb alkalmazásai is elképzeíhetők, az emésztőrendszerben talált epiteliális sejtekkel szembeni specifitása alapján.
• ·
A KGF fragmensnek egyéb növekedési faktorokkal, mint például az epidermális növekedési faktorral (EGF), vérlemezke eredetű növekedési faktorral (PDGF) és egyéb FGF-ekkel szembeni választása a bőr helyreállítására, a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló. A többi növekedési faktor például fibropláziát és angiogenezist indukál, amellett, hogy vagy közvetlenül vagy közvetve serkentik a keratinocita szaporodást. A bor helyreállítása során az ilyen addicionális aktivitások nemkívánt mellékhatásokat okozhatnak, mint például varképzödést. A szaruhártya helyreállítása során, ami akar sérülés, akár sebészeti beavatkozás következménye, ezeknek és egyéb faktoroknak az alkalmazása a vérereknek a szaruhártyába való behatolását okozhatja, aminek eredménye nemkívánatos szaruhártya zavarosság vagy ödéma. A KGF-nek egyébként egyedi specifitása van a keratinocitákkal szemben, és nem indukálja a vaszkuláris endoteliális sejtek vagy fibroblasztok szaporodását, ennek következtében ezeknek a sebgyógyító alkalmazásoknak lehet a választott hatóanyaga.
Emellett, a jelen találmány szerinti KGF fragmens használható a jelen találmány egyéb alkalmazásaiban, KGF fragmens/toxin konjugátum formájában. Egy ilyen konjugátum lelassíthatja vagy megállíthatja az olyan betegség előrehaladását, mint például a pszoriázis, ami az epidermisz keratinocitái bazális rétege hiperproliterációjának eredménye. Ez a konjugátum nem érinti a másik két fő sejttípust, azaz a vaszkuláris endoteliális sejteket és a fibroblasztokat, amelyek megtalálhatók ezekben a szövetekben.
A jelen találmány egy másik megvalósítási módja szerint egy KGF fragmens/toxin konjugátum használható a tumorsejtek, mint például a bazális sejtkarcinóma szaporodásának leállítására.
A jelen találmány végrehajtása során, hacsak külön nem jelezzük, a molekuláris biológia, a mikrobiológia, rekombináns DNS és immunológia szokványos technikáit alkalmazzuk, amelyek a szakterületen jártas szakember számára jól ismertek. Ezeket a technikákat teljes részletességgel ismertetik a szakirodalomban [[Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989); DNA Cloning, I. és II. kötet, szerk:D.N. Glover, IRL Press (1985); Oligonucleotide Synthesis, szerk: M.J. Gait, IRL Press (1984); Nucleic Acid Hybridization, szerk; B.D. Hames & S.J. Higgins, IRL Press (1984); Transcription and Translation, szerk: B.D. Hames & S.J. Higgins, IRL Press (1984); Animál Cell Culture, szerk: R.l. Freshney, IRL Press (1986); B. Perbal: A Practical Guide to Molecular Cloning (kiadó)(1984); a Methods in Enzymology sorozat, Academic Press, Inc.; Gene Transfer Vectors fór Mammalian Cells, szerk: J.H. Miller és M.P. Calos, Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods in Enzymology, 154 és 155, szerk: Wu és Grossman, valamint Wu [Mayer and Walker, szerk: ?????(kiadó)]; (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology Academic Press, London, Scopes (szerzö??](1987), Protein Purification: Principles and Practice, 2. kiadás (Springer-Verlag, N.Y. év?) és Handbook of Experimental Immunology, 1-4., szerk: D.M. Weir és C.C Blackwell (kiadó?)( 1986); Kitts és mtsai.: Biotechniques 14, 810-817 (1993); Munemitsu es mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 10, 59775982 (1990); (EGYEBEK)].
Az aminosavak standard rövidítését használjuk az 1. ábrán, és a leírás más részeiben is. Minden publikációt, szabadalmat és szabadalmi bejelentést referenciának tekintünk. Az érthetőség kedvéért az alkalmazott szakkifejezéseket az alábbiakban részletesebben meghatározzuk.
A továbbiakban a keratinocita növekedési faktor szakkifejezés vagy KGF egy olyan polipeptidre vonatkozik, amely szerkezetileg különböző fehérjék, a fibroblaszt növekedési faktorok, az FGF-ek családjába tartozik, amelyek különböző mértékű szekvencia homológiát mutatnak, jelezve, hogy egy rokon géncsalád kódolja őket. A KGF-nek jellemzője, amit a leírás más részén ismertetünk, például az, hogy kötődik az FGFR-3-hoz, és képes serkenteni az epiteliális sejtek, különösen a keratinociták növekedését. A teljes hosszúságú KGF 163 aminosavból áll.
A továbbiakban a jelen találmány szerinti KGF fragmens jelentése egy olyan polipeptid, amely az érett, teljes hosszúságú KGF aminosav szekvenciájának egy részét tartalmazza. A KGF fragmens egy analógja szakkifejezés jelentése a KGF fragmens kisebb inszercióit, delécióit vagy szubsztitúcióit jelenti, amelyek nem érintik lényegesen a tulajdonságait. Ide tartoznak például a konzervatív aminosav helyettesítések. Ezek olyan helyettesítések, amelyek az oldalláncúkban rokon szerkezetű aminosavak között játszódnak le. Ezek az aminosav családok a következők: (1) savas: aszparaginsav. glutaminsav; (2) bázikus: lizin, arginin, hisztidin; (3) apoláros: alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofán; és (4) töltetlen poláros aminosavak: glicin, aszparagin, glutamin, cisztein, szerin, treonin, tirozin. A fenilalanint, triptofánt és tirozint néha közösen aromás aminosavnak nevezik. Pontosabban, az egy általánosan elfogadott tény, hogy a konzervatív aminosav helyettesítesek, amilyen például egy leucin izolált helyettesítése egy izoleucinnal vagy valinnal, vagy egy aszparaginsav izolált helyettesítése glutaminsavval, vagy egy treonin helyettesítése szerinnel, vagy egy aminosav hasonló konzervatív helyettesítése egy szerkezetileg hasonló aminosavval, a polipeptid aktív pontján kívül, nincsenek jelentős hatással a polipeptid tulajdonságaira.
A KGF fragmens tulajdonságai közé tartozik (i) a biológiai aktivitása, azaz 2-
10-szeres, előnyösen kétszeres, legelőnyösebben 7-10-szeres növekedés az epiteliális sejtszaporodás serkentésében, az érett, teljes hosszúságú természetes KGF molekulával összehasonlítva, és (ii) az FGFR-3-at megkötő képessége.
A rekombináns polinukleotid szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy félszintetikus vagy szintetikus eredetű polinukleotid, vagy cDNS vagy genomiális DNS (gDNS'j által kódolt polinukleotid, amely (1) nem kapcsolódik olyan polinukleotidhoz, vagy annak egy részéhez, amelyhez a természetben kapcsolódik, (2) egy másik polinukleotidhoz kapcsolódik, nem ahhoz, amelyhez a természetben kapcsolódik, vagy (3) nem fordul elő a természetben.
A replikon szakkifejezés jelentese bármely genetikai elem, azaz például plazmid, kromoszóma, vírus, kozmid. stb.. amely a polinukleotid replikáció autonóm egységeként viselkedik egy sejtben; azaz képes a replikációra, saját szabályozással. Egy replikon tartalmazhat például szelektálható markereket.
A rekombináns vektor egy olyan replikon, amelyben egy másik polinukleotid szegment is kapcsolódik, hogy biztosítsa a replikációt és/vagy a hozzákapcsolt polinukleotid szegment expresszióját.
A szabályozó szekvencia szakkifejezés egy olyan polinukleotid szekvenciára vonatkozik, amely ahhoz szükséges, hogy szabályozzuk egy kódoló szekvencia expresszióját, amelyhez a polinukleotid szekvencia funkcionálisan hozzá van kötve. Az ilyen szabályozó szekvenciák természete eltérő, attól függően, hogy milyen gazdasejtben akarjuk a kódoló szekvenciát expresszálni. A prokariótákban az ilyen szabályozó szekvenciák közé tartozik például a promoter, a riboszómális kötőhely és/vagy a transzkripciós terminációs szekvencia. Az eukariótákban általában az ilyen szabályozó szekvenciák közé tartoznak további komponensek, amelyeknek a jelenléte előnyös lehet, ilyen például egy szekréciós vagy vezérszekvencia, amely az expresszálandó polipeptid szekrécióját kódolja.
A funkcionálisan hozzákapcsolt szakkifejezés egy olyan kapcsolódási pontra utal, amelyben az így kapcsolt komponensek olyan helyzetben vannak, amely lehetővé teszi, hogy a tőlük elvárt módon működjenek. Például, egy szabályozó • · · · ··· , | ·> · · · ♦
- *·*····»« szekvencia funkcionálisan kapcsolódik egy kódoló szekvenciához, ha úgy kapcsolódik hozzá, hogy a kódoló szekvencia expresszióját olyan körülmények között érjük el, amelyek kompatibilisek a szabályozó szekvenciával.
A kódoló szekvencia szakkifejezés egy olyan polinukleotid szekvenciát jelent, amely polipeptiddé fordítódik le. ha egy megfelelő szabályozó szekvencia kontrollja alá helyezzük. A kódoló szekvencia határait általában egy transzlációs startkodon határozza meg az 5'-végen és egy transzlációs stopkodon a 3'-végen. Egy kódoló szekvencia tartalmazhat például cDNS-t valamint rekombináns polinukleotid szekvenciákat.
A PCR szakkifejezés a polimeráz láncreakció technikát jelenti [Saiki és mtsai.: Natúré 324, 163 (1986); Scharf és mtsai.: Science 233, 1076-1078 (1986); 4,683,195 számú USA szabadalom; 4,683,202 USA szabadalom],
A továbbiakban a polipeptid szakkifejezés aminosavak polimerére vonatkozik, és nem határozza meg a termék specifikus hosszát, igy ez a szakkifejezés vonatkozik a peptidekre, oligopeptidekre és fehérjékre is. Ez a szakkifejezés vonatkozik a polipeptid transzlációs módosításaira is, azaz például a glikozilezésre, acetilezésre, foszforilezésre és hasonlókra. A meghatározás vonatkozik továbbá a helyettesített kötéseket tartalmazó polipeptidekre, valamint a szakterületen ismert egyéb módosításokra is, amelyek lehetnek természetesek illetve olyanok, amelyek nem fordulnak elő a természetben.
A továbbiakban a terminátor szakkifejezés jelentése szabályozó szekvenciák, mint például poliadenilezési és transzkripciós terminációs szekvenciák, amelyek a kódoló szekvenciák stopkodonjától 3' irányban találhatók.
A rekombináns gazdasejtek, gazdasejtek, sejttenyészetek és más ilyen szakkifejezések olyan mikroorganizmusokat, rovarsejteket és emlős sejteket jelölnek, amelyeket lehet használni, vagy már használtak befogadóként rekombináns vektor vagy egyéb transzfer DNS bejuttatására, és ide tartoznak a transzformált sejt utódai is. Ezek közé az utódok közé tartoznak azok is, amelyek nem szükségszerűen azonosak morfológiailag, vagy genomiális. vagy össz-DNS-ükben az eredeti, kiindulási sejttel, és amelyeket természetes, véletlenszerű vagy szándékos mutációval lehet előállítani. Az ilyen emlős gazdasejtek közé tartozik az aranyhörcsög petefészeksejt (CHO) es a majomvese sejt (COS).
A továbbiakban a mikroorganizmus szakkifejezés jelentése prokarióta és eukarióta mikroorganizmus faj, úgymint baktériumok és gombák, ez utóbbiak közé tartozik az élesztő és a fonalas gomba.
A transzformáció szakkifejezés jelentése a továbbiakban exogén polinukleotidoknak a gazdasejtbe való jutására utal, függetlenül a bevitel módjától, ami lehet például fertőzés, közvetlen felvétel, transzdukció, F-keresztezés, mikroinjekciózás vagy elektroporáció. Az exogén polinukleotid egy nem-integrálódott vektor formájában formájában tartható fenn, azaz lehet például plazmid, vagy integrálódhat a gazdaszervezet genomjába.
A tisztított és izolált szakkifejezes egy polipeptidre vagy egy nukleotid szekvenciára vonatkoztatva azt jelenti, hogy a jelzett molekula lényegében nem tartalmaz azonos fajta vagy típusú egyéb biológiai makromolekulákat. A tisztított szakkifejezés a továbbiakban azt jelenti, hogy súlyra számítva legalább 75%, előnyösen 85%, vagy legelőnyösebben legalább 95% azonos típusú biológiai makromolekula van jelen, de víz, puffer és egyéb kismolekulák, főleg az 1000-es molekulasúlynál kisebb molekulák jelen lehetnek.
A gyógyászatilag elfogadható hordozó szakkifejezés bármely olyan hordozót jelent, amelyet a szakterületen emberek emberekbe való beadásra használnak, amely önmagában nem indukál nemkívánatos mellékhatásokat, azaz például ellenanyag képződést, lázat, stb. A megfelelő hordozók általában nagy, lassan • · 9 « • · · · ··« ff > * · · · » ·«·-······ metabolizálódó makromolekulák, ilyen lehet egy fehérje, egy poliszacharid, egy politejsav, egy poliglikolsav, egy polimer aminosav, aminosav kopolimerek, vagy egy inaktív vírusrészecske. Más hordozók is jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára. A hordozó előnyösen tiroglobulint tartalmaz.
Egy gyógyászati készítmény általában gyógyászatilag elfogadható hordozókat tartalmaz, azaz például vizet, sóoldatot, glicerint, etanolt. stb. Emellett egyéb anyagok, úgymint nedvesítő vagy emulgeáló anyagok, pH-pufferelő anyagok és hasonlók lehetnek jelen a készítményekben.
A gyógyászatilag hatásos mennyiség szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy olyan mennyiséget jelent, amely a kívánt eredmény előidézésében hatékony. Ez a mennyiség változik, függően a kezelendő egyén egészségi állapotától és fizikai kondíciójától, az egyed immunrendszerének ellenanyag szintetizáló képességétől, a védelem kívánt mértékétől, a formulázástól, a kezelőorvosnak a beteg állapotáról kialakult véleményétől, és egyéb releváns faktoroktól. Az várható, hogy a mennyiség széles határok között változik, amit rutinszerű meghatározásokkal megállapíthatunk.
Váratlanul azt találtuk, hogy ha KGF-et expresszálunk rovarsejtekben, azaz Spodoptera frugiperda-ban (SF9), egy rekombináns bakulovírus, Autographa californica segítségével, amely a KGF-|g3-at kódoló cDNS-t tartalmazza, akkor a KGF163 nneíiett egy olyan KGF fragmenst kapunk, amelyről hiányzik a KGF^g3 Nterminális doménje első 23 aminosava, amely egy glikozilezési helyet tartalmaz. A csonkított és nem glikozilezett KGF fragmens, a KGFcjes-|_23, vagy KGF^g, a természetes hosszúságú, KGF-|g3~ként azonosított formával szemben7-10-szeresre fokozódott hatékonyságot mutat a célsejteken. A KGFcjes-)_23 célsejt specifitása nem változik. Emellett, a KGF fragmens nagy koncentrációja mellett nem figyelhető meg toxikus hatás a keratinocitákon, ellentétben azzal, ami a KGFjgg-nál • « megfigyelhető. Ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy azzal szemben, amit korábban a WO 90/08771 számú PCT bejelentésben leírtak, a KGF célsejt specifitása nem az N-terminális doménjeben található. Továbbá, a jelen találmány azt mutatja, hogy a KGF-nek egy N-terminalison csonkított verziója valójában egy javított KGF verzió, amelynek a gyógyászati alkalmazásokban magasabb a biológiai aktivitása, és kisebb a citotoxicitása.
Nagy mennyiségű KGF fragmens állítható elő rekombináns DNS technikákkal, ami előnyös az alternatív eljárásokkal, azaz a KGF természetes forrásokból tisztításával és izolálásával, az első 23 aminosavnak az N-terminálisról való lehasításával szemben. A rekombináns technikákkal előállított KGF lehetővé teszi, hogy a KGF úgy legyen izolálható, hogy nem tartalmaz olyan szennyező molekulákat, amelyek egyébként jelen vannak a sejtekben. Valójában könnyen előállíthatók olyan KGF készítmények, amelyekben nyoma sincs a humán fehérje szennyeződésnek, például baktérium-sejtekben, élesztősejtekben és rovarsejtekben. A rekombináns DNS technika alkalmazásával olyan KGF fragmensek is előállíthatók, amelyek nem találhatók meg a természetben, azaz olyan variánsok például, amelyeket helyspecifikus mutagenezissel készítettünk.
Bármely promoter használható a jelen találmányban, amely lehetővé teszi, hogy a KGF fragmens expresszálódjon a kiválasztott gazdaszervezetben, például Escherichia coli-ban a lac operon szabályozó promoter szekvenciája használható. Egy másik példa az éíesztő alkohol dehidrogenáz (ADH) promoter, amelynek egy upstream aktivátor szekvenciája (UAS) van, amely modulálja az ADH promoter aktivitását. Emellett bizonyos virális fokozó szekvenciák is használhatók. Ezek a fokozó szekvenciák nemcsak fokozzák, de emellett szabályozzák is az expressziót az emlős sejtekben. Ezek a fokozó szekvenciák beépíthetők emlős promoter szekvenciákba, amelyek csak egy inducer, azaz például egy hormon vagy egy enzim • · · · • ··· ·«· · I1’' · ·····*·*·<·* szubsztrát jelenlétében aktiválódnak [Sassone-Corsi és Borelli: Trends Génét. 2, 215 (1986); Maniatis és mtsai.: Science 236, 1237 (1987)]. A jelen találmányban használható promoterek közé tartozik a bakulovírus polihedron hibrid promoter és a p 10 promoter is.
A jelen találmányban használható terminációs szekvenciák közé tartozik a Saccharomyces cerevisiae aipha-faktor terminátor és a bakulovírus terminátor. Emellett olyan virális terminátorok is használhatók, amelyek bizonyos gazdasejtekben működnek. Például az SVJO terminátor működik az aranyhörcsög petefészek (CHO) sejtekben is.
Amikor csonkított fehérjéket tervezünk, akkor a jelen találmány gyakorlatában számos KGF-et részesíthetünk előnyben. Az egyik ilyen például a nem-glikozilezett KGF, amelyről a természetes KGF első 23 aminosava hiányzik. Egy előnyös, csonkított KGF-et kódoló cDNS-t az 1. ábrán mutatunk be. Más KGF fragmensek is léteznek, vagy rutinszerű módszerekkel előállíthatok. A bemutatott szekvenciában egy csonkított fehérje hasítási helye a nyíllal jelzett pontban (a) fordulhat elő, ezzel egy olyan fehérje keletkezik,amelynek molekulasúlya körülbelül 18,000 Da. Az 1. ábrán bemutatott szekvenciát, valamint a csonkított KGF jelzett jellemzőit alkalmazva, a szakterületen jártas szakember számára egyszerű, hogy más olyan DNS szekvenciákat kapjunk, amelyek csonkított KGF-et kódolnak. A struktúrgén például úgy manipulálható, hogy egyes nukleotidokat megváltoztatunk, miközben megtartjuk a megfelelő aminosav(ak)at, vagy változtatjuk a nukleotidokat, de oly módon, hogy ezáltal megváltoztatjuk az aminosavakat, a biológiai aktivitás megtartása mellett. A nukleotidokat ismert technikákkal szubsztituálhatjuk, inszertálhatjuk vagy deletálhatjuk, beleértve például az in vitro mutagenezist és primer repairt. A struktúrgén csonkítható a 3' végén és/vagy az 5' végén, úgy, hogy közben magtartja a biológiai aktivitását.
• · 4 Ζ • ··· ·«» * · ♦ · « - η - · ··♦ ·.» ··
A KGF fragmenst kódoló szekvenciát úgy állíthatjuk elő, hogy megszintetizáljuk a KGF fragmenst kódoló DNS szekvenciát, vagy megváltoztatunk egy létező vagy természetes KGF-et kódoló szekvenciát, a kívánt szekvencia előállítása céljából. A természetes KGF-et kodolo szekvencia vagy polipeptid az, amelyik előfordul a természetben. A természetes KGF aminosav szekvenciáját a X. ábrán mutatjuk be. A szintetikus KGF fragmenst a KGF ismert aminosav szekvenciája alapján állíthatjuk elő, a kiválasztott gazdasejt által előnyben részesített KGF kodonokat használva [Urdea és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 80, 7461 (1983)]. Egy másik módszer szerint a kívánt KGF fragmenst kódoló szekvenciát nukleinsav könyvtárakból klónozhatjuk, a X. ábrán bemutatott nukleinsav szekvencia alapján készített próbákat használva. A nukleinsav könyvtárak készítésének és átvizsgálásának technikáját a szakirodalom ismerteti [Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)]. Más rekombináns technikák, azaz például a helyspecifikus mutagenezis, PCPx. enzimes emésztés és ligálás szintén használható a KGF fragmens kódoló szekvenciája analógjainak és származékainak előállítására. A természetes KGF polipeptidet kódoló szekvencia könnyen módosítható más osztályba tartozó KGF polipeptidek előállítására.
A KGF fragmens analógjai előállíthatok olyan konzervatív aminosav helyettesítéssel, amely nem zavarja meg a KGF fragmens aktivitását. A jelen találmány tárgya továbbá a KGF fragmens analógjainak (muteinjeinek) egy csoportja, amelyekben a KGF fragmensben azokat a ciszteineket, amelyek nem vesznek részt diszulfid kötésekben, általában szerinnel helyettesítjük. Ezek a muteinek szélesebb hőmérséklettertományban lehetnek stabilak mint a módosítatlan KGF fragmens. A muteinek emellett tartalmazhatnak aminosav deléciókat, a természetes KGF fragmenshez viszonyítva. A muteinek a természetes KGF fragmens aktivitásának • · · * * ··· ·«· # _ ι Κ . · ···* ···* %legalább 20%-át, előnyösen 50%-at. és legelőnyösebben legalább 80%-át megtartják. A muteinek kódoló szekvenciáját a természetes KGF fragmens kódoló szekvenciájának in vitro mutagenezisével állíthatjuk elő.
A fragmens a természetes KGF molekulától az N-terminális és/vagy Cterminális aminosav deléciókban különböznek. A levágott aminosavak száma nem kritikus, mindaddig, ameddig a KGF fragmens nem tartalmazza az N-terminális glikozilezési helyet, és a természetes KGF molekula aktivitásának legalább 20%-át megtartja. Ezeknek a fragmenseknek a kódoló szekvenciája könnyen előállítható, ha a fölöslegesnek ítélt nukleotidokat levágjuk a természetes KGF kódoló szekvenciáról vagy annak variánsáról.
Egy, a jelen találmány szerinti expressziós vektor tartalmaz egy promotert, amely a gazdasejtben működik, és működés szempontjából a KGF fragmens vagy analóg kódoló szekvenciájához van kötve. Egy expressziós vektor adott esetben tartalmazhat egy szignálszekvenciát a szekrécióhoz, egy terminátort, egy szelekciós markert, egy replikációs origót, és a gazdasejt szekvenciáival homológ szekvenciákat. Ezeket az addicionális elemeket is bevihetjük, hogy optimalizáljuk az expressziót.
A funkcionális, nem-természetes promoterek is használhatók, például a szintetikus promoterek, amelyek a különböző promoterek konszenzus szekvenciáján alapulnak. Emellett a hatékony promoterek lehetnek hibrid promoterek, amelyek a heterológ expressziós iniciációs régióhoz kapcsolt szabályozó régiót tartalmaznak. A hibrid promoterekre példa lehet az Escherichia coli lac operátora, az Escherichia coli tac transzkripciós aktivációs régióhoz kapcsolva; az élesztő aikohol-dehidrogenáz (ADH) szabályozó szekvenciája az élesztő gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) transzkripciós aktivációs szekvenciájához kapcsolva [4,876,197 és 4,880,734 számú USA szabadalmak, amelyeket a továbbiakban referenciaként • · kezelünk]; és a citomegalovírus fokozó szekvenciája a majomvírus SV40 promoteréhez kapcsolva.
A jelen találmány szerinti KGF fragmens vagy analóg kódoló szekvenciája leolvasási fázisban hozzákapcsolható egy szignálszekvenciához. A szignálszekvencia tipikus esetben tartalmaz egy hidrofób aminosavakból álló aminosav szekvenciát a szekrécióhoz, amely a KGF fragmenst vagy analógot a sejtmembránba irányítja. Egy előnyős megvalósítási mód szerint egy processzáló hely található a szignálszekvencia és a KGF fragmens között, amely lehetővé teszi a hasítást a szignálszekvencia és a KGF fragmens között, mind in vivő, mind in vitro. Azok a megfelelő szignálszekvenciák, amelyek olyan génekből származnak, amelyek szekretált endogén endogén gazdasejt fehérjéket kódolnak, amilyen például az élesztő invertáz gén [12873 számú európai szabadalom, 62,096,086 számú japán szabadalom], az A-faktor génje [4,588.684 számú USA szabadalom], és az interferon szignálszekvencia [EP 60057],
A jelen találmányban az élesztő expresszióhoz használható, előnyben részesített szekréciós vezérszekvencia osztályába tartozik a csonkított alfa-faktor vezérszekvencia, amely legalább egy részét tartalmazza a pre szignálszekvenciának és a pro régiónak. A használható alfa-faktor vezérszekvenciák közé tartozik a teljes hosszúságú pre-pro-alfa-faktor vezérszekvenciája, amely körülbelül 83 aminosavból áll, valamint a csonkított alfafaktor vezérszekvenciák, amelyek tipikusan 25-50 aminosav csoportot tartalmaznak [4,546,083 és 4,870,008 számú USA szabadalom, a XXXXXX számú USA szabadalmi bejelentés, valamint az EP 324274 számú európai szabadalom, amelyekre a továbbiakban referenciaként hivatkozunk]. A további, alfa-faktor fragmenst alkalmazó vezérszekvenciak, amelyek a jelen szabadalomban alkalmazhatók, tartozhatnak a hibrid alfa-faktor vezérszekvenciák, amelyeket egy
- 2’' első élesztő szignálszekvencia preszekvenciájával készítünk, de egy második élesztő alfa-faktorból származó pro-régiót tartalmaznak [PCT WO 89/02463],
A KGF fragmensek és analógjai rekombináns technikákkal expresszálhatók, ha egy, a KGF fragmenst vagy analógját kodolo DNS szekvenciát működés szempontjából helyes leolvasási fázisban es orientációban beépítünk egy vektorba, amint az természetesen jól ismert a szakterületen jártás szakember számára. Ha egy KGF fragmenst tartalmazó genetikai konstrukciót állítunk elő, akkor az előnyös kiindulási anyag a KGF fragmenst kódoló cDNS. Tipikus esetben a csonkított KGF gént a promoter mögé építjük be, utána pedig egy terminátor szekvenciát építünk be, jóllehet a KGF fragmens előállítható hibrid fehérje formájában is, amelyet ha szükséges, akkor el lehet hasítani. Általában csonkított KGF-et és csonkított KGF polipeptid származékok termelési szintjét fokozó gazdasejt-specifikus szekvenciákat használunk, és megfelelő kontroll szekvenciákat adunk az expressziós vektorhoz, azaz például fokozó szekvenciákat, poliadenilezési szekvenciákat és riboszómális kötőhelyeket. Ha egyszer a megfelelő kódoló szekvenciát izoláltuk, akkor az expresszálható számos különböző expressziós rendszerben; például az emlős sejtekben, bakulovírusokban, baktériumokban és élesztőben használt rendszerben. Ezeket az alábbiakban tárgyaljuk.
Az emlős expressziós rendszerek ismertek a szakterületen. Emlős promoter lehet bármely DNS szekvencia, amely képes megkötni az emlős RNS polimerázt és iniciálni a kódoló szekvencia (azaz a struktúrgén) 3' transzkripcióját mRNS-sé. Egy promoternek van transzkripciós iniciációs régiója, amely általában a kódoló szekvencia 5' vége mellett található, és egy TATA boxa, amely általában 25-30 bázispár távolságban található a transzkripciós iniciációs hely előtt. A TATA boxról azt gondolják, hogy az RNS polimeráz II szintézisét irányítja, hogy az RNS szintézis a helyes pozícióban kezdődjön. Egy emlős promoter tartalmaz emellett egy • · * upstream promoter elemet, amely általában a TATA box előtt 100-200 bázispár távolságban található. Egy upstream promoter elem meghatározza azt a sebességet, amellyel a transzkripció iniciálódik, és mindkét irányban képes működni [Sambrook és mtsai.: Moiecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)].
Az emlős vírusgének gyakran erősen expresszálódnak, és széles a gazdaspecifitásuk; ennélfogva az emlős virális géneket kódoló szekvenciák különösen hasznos promoter szekvenciákat szolgáltatnak, lyen például az SV40 promoter, az egér emlötumor vírus LTR promotere, az adenovírus fő késői promotere (Ad MLP), és a herpesz szimplex vírus promotere. Emellett a nem-virális génekből származó szekvenciák, azaz például a rágcsáló metallotionein gén is hasznos promoter szekvenciákat szolgáltatnak. Az expresszió lehet konstitutív vagy szabályozott (indukálható), attól függően, hogy a promoter indukálható-e glükokortikoiddal, hormonra reagáló sejtekben.
Egy fokozó elem jelenléte, az előzőkben ismertetett promoter szekvenciákkal kombinálva, általában fokozza az expressziós szintet. A fokozó egy olyan szabályozó DNS szekvencia, amely képes 1000-szeresre is serkenteni a transzkripciót, ha homológ vagy heterológ promoterhez van kapcsolva, és a szintézis a normális RNS startpontban kezdődik. A fokozok aktívak akkor is, ha a transzkripciós iniciációs pont elé, de akkor is ha a transzkripciós iniciációs pont mögé helyezzük el őket, normális vagy felcserélt orientációban, vagy több mint 1000 nukleotid távolságban a promotertől [Maniatis és mtsai.: Science 236, 1237 (1987); Alberts és mtsai.; Moiecular Biology of the Cell, 2. kiadás (1989)]. A vírusokból származó fokozó elemek különösen hasznosak lehetnek, mivel általában szélesebb a gazdaspecifitásuk. Ilyen például az SV40 korai gén fokozója [Dijkema és mtsai.: EMBO J. 4, 761 (1985)], valamint a Rous szarkóma vírus hosszú terminális • · · ismétlődő szakaszából (LTR) [Gorman es mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 79, 6777 (1982b)] és a humán citomegalovírusból [Boshart és mtsai.: Cell 41, 521 (1985)] származó fokozó/promoter kombinációk. Emellett néhány fokozó szabályozható, es csak inducer, azaz például egy hormon vagy fémion, jelenlétében válik aktívvá [Sassone-Corsi és Borelli: Trends Génét. 2, 215 (1986); Maniatis és mtsai.: Science 236. 1237 (1987)].
Egy DNS molekulát expresszálhatunk intracellulárisan emlős sejtekben. Egy promoter szekvencia közvetlenül kapcsolódhat egy DNS molekulához, amely esetben a rekombináns fehérje N-terminalisának első aminosava mindig metionin lesz, amit az ATG startkodon kódol. Ha szükséges, akkor az N-terminális lehasítható a fehérjével, in vitro brómciánnal inkubálva.
Egy másik módszer szerint idegen fehérjék is szekretálódhatnak a sejtből a szaporító táptalajba, olyan kiméra DNS molekulákat hozva létre, amelyek olyan fúziós fehérjét kódolnak, amely tartalmaz egy, az idegen fehérjének az emlős sejtből való szekrécióját biztosító vezérszekvencia fragmenst. A vezérfragmens és az idegen gén között processzálási pontok találhatók kódolva, amelyek vagy in vivő vagy in vitro elhasíthatók. A vezérszekvencia fragmens általában egy hidrofob aminosavakat tartalmazó szignálpeptidet kodol, amely a fehérjének a sejtből való szekrécióját irányítja. Az adenovirus háromrészes vezérszekvenciája egy olyan vezérszekvenciára példa, amely egy idegen fehérjének emlős sejtek által való szekrécióját biztosítja.
Tipikus esetben az emlős sejtek által felismert transzkripciós terminációs és poliadenilezési szekvenciák olyan szabályozó régiók, amelyek a transzlációs stopkodon után 3' irányban találhatók, és így, a promoter elemekkel együtt, határolják a kódoló szekvenciát. Az érett mRNS 3' terminálisa helyspecifikus poszttranszkripciós hasítással és poliadenilezéssel alakul ki [Birnstiel és mtsai.: Cell 41,
349 (1985); Proudfoot és Whitelaw: Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA; Transcription and splicing (szerk. B.D. Hames és D.M. Glover)(1989); Proudfoot: Trends Biochem. Sci. 14. 105 (1989)]. Ezek a szekvenciák irányítják egy mRNS átírását, ami azután lefordítható a DNS által kódolt polipeptiddé. A transzkripciós terminátor/poliadenilezesi szignál kombinációkra például szolgálhatnak azok, amelyek az SV40-böl származnak [Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 2. Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)].
Néhány gén hatékonyabban expresszálható, ha intronok (azaz megszakító szekvenciák) vannak jelen. Néhány cDNS azonban hatékonyan expresszálódik olyan vektorokról, amelyekben nincsenek meg az illesztő szignálok (ezeket illesztési donor és akceptor helyeknek is hívják [Gothing and Sambrook: Natúré 293, 620 (1981)]. Az intronok nem-kódoló megszakító szekvenciák egy kódoló szekvencián belül, amely illesztési donor és akceptor helyeket tartalmaz. Ezeket egy illesztésnek nevezett eljárás távolítja el. amit a primer átirat poliadenilezése követ [Nevins: Annu. Rév. Biochem. 52, 441 (1983); Green: Annu. Rév. Génét. 20, 671 (1986); Padgett és mtsai.; Annu. Rév. Biochem. 55, 1 1 19 (1986); Krainer és Maniatis: RNA splicing, Transcription and splicing (szerk: B.D. Hames és D.M.GIover)(1988)].
Tipikus esetben az előzőkben ismertetett komponenseket, amelyek tartalmaznak egy promotert, egy poliadenilezési szignált és egy transzkripciós terminációs szekvenciát, expressziós konstrukciókba rakjuk össze. Ha szükséges, akkor az expressziós konstrukció tartalmazhat fokozó szekvenciákat, intronokat, működő illesztési donor és akceptor helyekkel, valamint vezérszekvenciákat. Az expressziós konstrukciókat gyakran egy replikonon tartjuk fenn, azaz egy extrakromoszómális elemen (például plazmidon), amely képes stabilan fennmaradni egy • · · * • · · · ·«« ·
-> I · · · * gazdaszervezetben, azaz emlős sejtekben vagy baktériumokban. Az emlős replikációs rendszerek közé tartoznak az állati vírusokból származók, amelyek a replikációhoz transz-ható faktorokat igényelnek. Például a papovavírusok replikációs rendszereit tartalmazó plazmidok, azaz például az SV40 [Gluzman: Cell 23, 175 (1981)] vagy poliómavírus, rendkívül nagy kópiaszámban replikálódnak a megfelelő virális T antigén jelenlétében. Az emlős replikonokra további példa lehet a szarvasmarha papillómavírusból és az Epstein-Barr vírusból származó replikon. Emellett a replikon tartalmazhat két replikációs rendszert, és így lehetővé teszi, hogy emlős sejtekben tarthassuk fenn az expresszióhoz, és prokarióta gazdaszervezetben a klónozáshoz és amplifikáláshoz. Ilyen emlős-baktérium ingázó vektor lehet például a pMT2 [Kaufman és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 9, 946 (1989)] és a pHEBO [Shimizu és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 6, 1074 (1986)].
A transzformációs eljárás függ attól, hogy milyen gazdaszervezetet akarunk transzformálni. A heterológ polinukleotidoknak az emlős sejtekbe való bejuttatására szolgáló módszerek ismertek a szakterületen, és ide tartozik a dextránnal közvetített transzfekció, a kalcium-foszfátos kicsapás, a protoplaszt fúzió, az elektroporáció, a polinukleotid(ok) liposzómákba való zárása, és a DNS közvetlen mikroinjekciózása a sejtmagba.
Az expresszióhoz gazdaszervezetként hozzáférhető emlős sejtvonalak ismertek a szakterületen, és ide tartozik az American Type Culture Collection-töl (ATCC) beszerezhető számos immortalizált sejtvonal, beleértve, anélkül hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az alábbiak: aranyhörcsög petefészek (CHO) sejtek, HeLa sejtek, bébihörcsög vesesejtek (BHK). majomvese (COS) sejtek, humán hepatocelluláris karcinóma sejtek (azaz például Hep G2), valamint számos egyéb sejtvonal.
« · · · ··· * * · · « • ··· ··· ··
- > Az alábbiakban ismertetjük a bakulovírus rendszereket.
A KGF-et kódoló polinukleotidot beépíthetjük egy megfelelő expressziós vektorba, például egy rovarsejt expressziós vektorba, és működés szempontjából a vektorban található kontroll elemekhez kapcsoljuk. A vektorkonstrukció olyan technikákat alkalmaz, amelyek ismertek a szakterületen. Pontosabban, a jelen találmány céljaira egy bakulovírus expressziós vektort készítünk, lényegében Kitts és munkatársai leírása szerint [Kitts és mtsai.: BioTechniques 14. 810-817 (1993)].
Röviden, először egy KGF expressziós kazettát készítünk, oly módon, hogy a KGF53 kódoló szekvenciát egy transzfer vektorba építjük be, amely a bakulovírus genom egy részével homológ polinukleotid szekvenciát tartalmaz (ezt a továbbiakban mint bakulovírus szekvenciát említjük), és amely képes a genommal homológ rekombinációra. A bakulovírus szekvencia legalább egy esszenciális polinukleotid szekvenciát tartalmaz, amint azt az alábbiakban részletesen ismertetjük. A KGF-et kódoló szekvenciát úgy építjük be a transzfer vektorba, hogy mindkét végén bakulovírus szekvenciák határolják.
A KGF-et kódoló szekvenciát tartalmazó transzfer vektort a gazdasejtekbe transzfektáljuk, a vad típusú bakulovírus egy mutánsával együtt, amelyből hiányzik egy lényeges polinukleotid szekvencia, amely a működőképes vírus előállításához szükséges. Ebből a szempontból egy működőképes vírus előállítható transzfekcióval a gazdasejtekben, ha a mutáns bakulovírus rekombinálódik a KGF expressziós kazettával.
Az ilymódon előállított működőképes bakulovírus ennélfogva tartalmazza a KGF expressziós kazettát, és alkalmas az új gazdasejtekbe való transzfekcióra, a rekombináns KGF és rekombináns KGF(jes^_23 előállításához. Egy másik módszer szerint ezt az eljárást a KGF^gg-at kódoló szekvencia helyett egy KGFcjes-j_23 kódoló szekvenciával hajthatjuk végre.
• · ·
A működő bakulovírus expressziós rendszer általában tartalmaz egy transzfer vektort, általában egy bakteriális plazmidot. amely tartalmazza mind a bakulovírus genomnak egy fragmensét, mind egy kényelmes restrikciós hasítási helyet, az expresszálandó heterológ gén vagy gének beépítéséhez; egy vad típusú bakulovírus, egy olyan szekvenciával, amely homológ a bakulovírus-specifikus fragmenssel a transzfer vektorban (ez lehetővé teszi a heterológ gén rekombinációját a bakulovírus genomjába); és a megfelelő rovar gazdasejtek valamint szaporító táptalajok.
Miután beépítettük a csonkított KGF DNS szekvenciát a transzfer vektorba, a vektort és a vad típusú virális genomot transzferáljuk egy rovar gazdasejtbe, ahol hagyjuk, hogy a vektor és a virális genom rekombinálódjon. A pakolt rekombináns vírust expresszáljuk és a rekombináns tarfoltokat azonosítjuk, majd tisztítjuk. A bakulovírus/rovarsejt expressziós rendszerek anyagai és módszerei kereskedelmi forgalomban beszerezhetők kit formájában, többek között az Invitrogen-töl (San Diego CA)(MaxBac kit). Ezek a technikák általában ismertek a szakterületen jártas szakember számára, részletes leírásuk megtalálható a szakirodalomban [Summers és Smith: Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (a továbbiakban Summers és Smith), amelyre a továbbiakban referenciaként hivatkozunk.
Mielőtt beépítjük a csonkított KGF DNS szekvenciát a bakulovírus genomba, az előzőkben említett komponenseket, amelyek közé tartozik a promoter, a vezérszekvencía (ha szükséges), a számunkra érdekes szekvencia és a transzkripciós terminációs szekvencia, általában egy intermedier átvivő konstrukcióba (transzfer vektor) visszük at. Ez a konstrukció tartalmazhat egyetlen gént, valamint működés szempontjából hozzákapcsolt szabályozó elemeket; tartalmazhat több gént, amelyek mindegyike rendelkezik a saját, működés szempontjából • · hozzákapcsolt szabályozó elemmel; tartalmazhat több gént, úgy, hogy a géneket ugyanaz a szabályozó elem készlet szabályozza. Az intermedier átvivő konstrukciókat gyakran egy replikonban, azaz egy extrakromoszómális elemben (például plazmid) tartjuk fenn, amelyek kepesek stabilan fennmaradni egy gazdaszervezetben, azaz például baktériumban. A replikonnak saját replikációs rendszere van, és ezzel lehetővé teszi, hogy egy megfelelő gazdaszervezetben fennmaradjon, klónozási és amplifikálási céllal.
Jelenleg az idegen géneknek az AnNPV-be való bevitelére leggyakrabban alkalmazott transzfer vektor a pAc373. Szamos egyéb vektort is terveztek, amelyek ismertek a szakterületen jártas szakember szamára. Ezek közé tartozik például a pVL985 (amely a polihedrin startkodont ATG-ről ATT-re változtatja, és amely egy BamHI klónozó helyet visz be az ATT után 32 bázispárral)[Luckow és Summers: Virology 17, 31 (1989)].
A plazmid általában tartalmazza a polihedrin poliadenilezési szignálját [Miller és mtsai.: Ann. Rév. Microbiol. 42, 177 (1988)] és egy prokarióta ampicillinrezisztencia (amp) gént valamint replikációs origót Escherichia co/f-ban való szelekció és szaporítás céljából.
A bakulovírus transzfer vektorok általában tartalmaznak egy bakulovírus promotert. A bakulovírus promoter lehet bármely olyan DNS szekvencia, amely képes iniciálni egy bakulovírus RNS polimerázt és képes iniciálni a kódoló szekvencia (azaz például struktúrgén) 5’-3' irányú transzkripcióját mRNS-sé. Egy promoternek van egy transzkripciós iniciációs régiója, amely általában a kódoló szekvencia 5' végének közelében található. Ez a transzkripciós iniciációs régió tartalmaz általában egy RNS polimeráz kötőhelyet és egy transzkripciós iniciációs helyet. Egy bakulovírus transzfer vektor tartalmazhat egy második domént, amit fokozó szekvenciának neveznek, amely, ha jelen van. akkor a strukturgéntöl távolabb van. Az expresszió lehet szabályozott vagy konstitutív.
Azok a struktúrgének, amelyek a vírus fertőzési ciklusban később, bőven átíródnak, különösen jól hasznaiható promoter szekvenciákat szolgaitatnak. Ezek közé a példák közé tartoznak a virális polihedrin fehérjét kódoló génből származó szekvenciák [Friesen és mtsai.: The Regulation of Baculovirus Gene Expression; The Molecular Biology of Baculoviruses (szerk: Walter Doerfler)(1986); a 127,839 és 155,476 számú EPO publikációk], valamint a p10 fehérjét kódoló gén [Vlak és mtsai.: J. Gén. Virol. 69, 765 (1988)].
A megfelelő szignálszekvenciákat kódoló DNS származhat szekretált rovar vagy bakulovírus fehérjék génjeiből, azaz például a bakulovírus polihedrin génjéből [Carbonell és mtsai.: Gene 73, 409 (1988)]. Egy másik módszer szerint, mivel az emlős sejteknek a poszttranszlációs módosításokhoz (azaz például szignálpeptid hasítás, proteolítikus hasítás és foszforilezés) szükséges szignálszekvenciáit láthatóan felismerik a rovarsejtek, és a szekrécióhoz valamint a nukleáris akkumulációhoz szükséges szignálok is megőrződnek a gerinctelen és gerinces sejtek között, a nem-rovar eredetű vezérszekvenciák, azaz például a humán interferont kódoló génekből származó [Maeda és mtsai.: Natúré 315, 592 (1985)], a humán gasztrin-felszabadító peptidböl származó [Lebacq-Verheyden és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 8, 3129 (1988)], a humán IL-2-böl származó [Smith és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 82, 8404 (1985)], az egér IL-3-ból származó [Miyama és mtsai.: Gene 58. 273 (1987) és a humán glukocerebrozidázból származó [Martin és mtsai.: DNA 7, 99 (1988)], szintén használható arra, hogy rovarokban szekréciót biztosítson.
Egy rekombináns polipeptid vagy poliprotein expresszálható intracellulárisan, vagy ha a megfelelő szabályozó szekvenciákká! expresszáljuk. akkor szekretáiható.
• 4
A nem fúzionált idegen fehérjék intracelluláris expressziójához általában olyan heterológ génekre van szükség, amelyeknek ideális esetben van egy rövid vezérszekvenciájuk, amely megfelelő transzlációs iniciációs szignálokat tartalmaz, az ATG startjel előtt. Ha szükséges, akkor az N-terminálison levő metionin lehasitható az érett fehérjéről, brómciánnal folytatott in vitro inkubálással.
Egy másik módszer szerint azok a rekombináns poliproteinek vagy fehérjék, amelyek a természetben nem szekretálódnak. rovarsejtekből szekretálhatók, ha olyan kiméra DNS molekulákat készítünk, amelyek olyan fúziós fehérjét kódolnak, amely az idegen fehérje rovarokban való szekréciójához szükséges vezérszekvencia fragmenst tartalmaz. A vezérszekvencia fragmens tipikus esetben egy szignálpeptidet kódol, amely hidrofób aminosavakból áll, és ez irányítja a fehérjének az endoplazmatikus retikulumba való transzlokációját.
A csonkított KGF DNS szekvencia és/vagy az expressziós termék prekurzort kódoló gén beillesztése után egy rovarsejtet ko-transzformálunk a transzfer vektor heterológ DNS-ével és a vad típusú bakulovírus genomiális DNS-ével - általában kotranszfekcióval. A konstrukció promoter és transzkripciós terminációs szekvenciája általában a bakulovírus genomnak egy 2-5 kb méretű szekcióját tartalmazza. A heterológ DNS-nek a bakulovírus kívánt pontjába való beillesztésére szolgáló módszerek ismertek a szakterületen [Summers és Smith: Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987); Ju és mtsai. (1987); Smith és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 3, 2156 (1983); Luckow és Summers: Virology 17, 31 (1989)]. Inszertálhatunk egy génbe, például a polihedrin génbe, homológ kettős crossover rekombinációval; az inszerció történhet egy restrikciós enzim hasítási helyre, amelyet a keresett bakulovírus génbe építettünk be [Miller és mtsai.: Bioessays 4, 91 (1989)]. A DNS szekvenciát, ha a polihedrin génbe klónozzuk, akkor mind 5' mind 3’ • · · • · · • · · · * • «·* ··· ··
- Ήι polihedrin-specifikus szekvenciák határolják, és a polihedrin promoter mögött helyezkedik el.
Az újonnan létrejött bakulovírus expressziós vektort azután egy fertőzőképes rekombináns bakulovírusba pakoljuk. A homológ rekombináció alacsony frekvencián jön létre (körülbelül 1% és 5% között), tahat a ko-transzfekció után keletkező vírusok többsége még vad típusú vírus. Tehát szükség van egy módszerre, amellyel a rekombináns vírusokat azonosítani lehet. Az expressziós rendszer előnye egy vizuális szűrővizsgálati módszer, amely lehetővé teszi, hogy megkülönböztessük a rekombináns vírusokat. A polihedrin fehérjét, amelyet a természetes vírus termel, a fertőzött sejtek sejtmagjában nagy mennyiségben keletkezik, a vírusfertőzés késői fázisában. Az akkumulálódott polihedrin fehérje zárványtesteket képez, amelyek maguk is tartalmaznak bezárt részecskéket. Ezek a zárványtestek, amelyek mérete maximum 15 Lim, erősen fénytörőek, ami miatt erősen fénylenek, és ezért könnyen láthatóvá tehetők a fénymikroszkóp alatt. A rekombináns vírusokkal fertőzött sejtekben nincsenek zárványtestek. Ahhoz, hogy megkülönböztessük a rekombináns vírust a vad típusú vírustól, a transzfekciós felülúszót rovarsejtek egysejtrétegére szélesztjük, a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel. Nevezetesen, a tarfoltokat vizsgáljuk a fénymikroszkópban, hogy van-e bennük zárványtest ( ez jelzi a vad típusú vírust) vagy nincs bennük zárványtest (ez jelzi a rekombináns vírust) [Current Protocols in Microbiology, 2, (szerk: Ausubel és mtsai.), a 16.8 pontban (Supp. 10, 1990); Summers és Smith: Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987); Miller és mtsai. (1989)].
Rekombináns bakulovírus expressziós vektorokat számos rovarsejt megfertőzésére kifejlesztettek. Rekombináns bakulovírusokat fejlesztettek ki többek között például az alábbiakhoz; Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx móri, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda és Tríchoplusia ni (WO89/046699 • · · · • · · · ··· · • · · · · . ... ... ..
számú PCT publikáció; Carbonell és mtsai.: J. Virol. 56, 153 (1985); Wright: Natúré 321, 718 (1986); Smith és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 3, 2156 (1983); és általánosságban lásd Fraser és mtsai.: In Vitro Cell. Dev. Bioi. 25, 225 (1989)].
A sejtek és a sejttenyésztő táptalajok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők a heterológ polipeptideknek mind a közvetlen, mind a fúziós fehérjén keresztül való expressziójához egy bakulovírus expressziós rendszerben; a sejttenyésztési technológia általában ismert a szakterületen jártas szakember számára [Summers és Smith: Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)].
A módosított rovarsejteket azután egy megfelelő tápközegben szaporíthatjuk, ami lehetővé teszi a módosított rovar gazdaszervezetben jelenlevő plazmid(ok) fennmaradását. Ahol az expressziós termék indukálható kontroll alatt áll, ott a gazdaszervezetet nagy sűrűségig szaporíthatjuk, majd az expressziót indukálhatjuk. Egy másik eljárás szerint, ahol az expresszió konstitutív, ott a termék folyamatosan expresszálódik a tápközegbe, és a tápközeget folyamatosan keringtetni kell, ezáltal eltávolítjuk a számunkra fontos terméket és pótoljuk az elfogyott tápanyagokat. A terméket tisztíthatjuk például kromatográfiás technikákkal, azaz például HPLC-vel, affinitáskromatográfiával, ioncserélő kromatográfiával, stb; tisztíthatjuk elektroforézissel, sűrűség-gradiens centrifugálással, oldószeres extrakcióval vagy hasonlókkal. Ha szükséges, akkor a terméket tovább tisztíthatjuk, hogy eltávolítsunk minden olyan rovarfehérjét, amely szintén expresszálódik a közegbe, vagy a rovarsejtek lízisének következtében kerül oda, és így olyan terméket állítsunk elő, amely lényegében mentes a gazdaszervezet törmelékeitől, azaz fehérjéitől, lipidjeitől és poliszacharidjaitól.
Ahhoz, hogy a csonkított KGF expresszióját elérjük, a transzformánsokból származó rekombináns gazdasejteket olyan körülmények között inkubáljuk, amelyek • · • ··· ··· · , . · · · · · ···«····· lehetővé teszik a rekombináns, csonkított KGF-et kódoló szekvencia expresszióját. Ezek a körülmények a választott gazdasejttől függően változnak. A körülményeket azonban a szakterületen jártas szakemberek könnyen kidolgozzák, a szakterületen szerzett korábbi tapasztalatok alapján.
A következőkben ismertetjük a bakteriális rendszereket.
A bakteriális expressziós rendszerek ismertek a szakterületen. Baktérium promoter lehet bármely olyan DNS szekvencia, amely képes megkötni a bakteriális RNS polimerázt, és képes iniciálni a kódoló szekvencia (azaz struktúrgén) mRNS-sé való 3' irányú átírását. Egy promoternek van egy transzkripciós iniciációs régiója, amely általában a kódoló szekvencia előtt, 5' irányban található. Ez a transzkripciós iniciációs régió általában tartalmaz egy RNS polimeráz kötőhelyet és egy transzkripciós iniciációs pontot. Egy bakteriális promoternek lehet egy második doménje is, ennek neve operátor, amely átfed azzal a szomszédos RNS polimeráz kötőhellyel, amelynél az RNS szintézis kezdődik. Az operátor lehetővé teszi a negatívan szabályozott (indukálható) transzkripciót, mivel egy génrepresszor fehérje kötődhet az operátorhoz és ezáltal gátolja egy specifikus gén transzkripcióját. A konstitutív expresszió előfordulhat a negatív szabályozó elemek, azaz például az operátor távollétében is. Emellett pozitív szabályozást érhetünk el egy génaktivátor fehérjét kötő szekvenciával, amely, ha jelen van, általában 5' irányban szomszédos az RNS polimerázt kötő szekvenciával. Egy génaktivátor fehérjére példa lehet a katabolit aktivátor fehérje (CAP),amely segíti iniciálni az Escherichia coli-n levő lac operon transzkripcióját [Raibaud és mtsai.: Annu. Rév. Génét. 18, 173 (1984)]. A szabályozott expresszió ennélfogva lehet vagy pozitív vagy negatív, és így vagy erősíti vagy gyengíti a transzkripciót.
A metabolikus bioszintézis útban levő enzimeket kódoló szekvenciák különösen jól használható promoter szekvenciákat szolgáltatnak, ilyenek lehetnek • * « · • ··· «·· · • · · · « ·; *··«···»· például a cukormetabolizáló enzimek [a cukor lehet galaktóz, laktóz [lac, Chang és mtsai.: Natúré 198, 1056 (1977)] és a maltóz. További példa a bioszintetikus enzimekből származó promoter szekvenciákra a triptofán (trp) [Goeddel és mtsai.: Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980); Yelverton és mtsai.: Nucleic Acids Research 9, 731 (1981): 4,738,921 számú USA beielentés, 036 776 és 121 775 számú EPO publikáció], A béta-laktamáz (bla) promoter rendszer [Weissmann: The cloning of interferon and other mistakes, Interferon 3 (szerk: I. Gresser)], a lambda PL bakteriofág [Shimatake és mtsai.: Natúré 292, 128 (1981) és T5 [4,689,406 számú USA bejelentés] promoter rendszerek szintén hasznos promoter szekvenciákkal szolgálnak.
Emellett a természetben elő nem forduló szintetikus promóterek szintén működnek bakteriális promoterekként. Például egy bakteriális vagy bakteriofág promoter transzkripciós aktivációs szekvenciája összekapcsolható egy másik bakteriális vagy bakteriofág promoterrel, ezáltal szintetikus hibrid promóterek jönnek létre [4,551,433 számú USA bejelentés]. Például a tac promoter egy hibrid trp-lac promoter, amely mind trp promoter mind tac promoter szekvenciákat tartalmaz,amelyeket a lac represszor szabályoz [Amann és mtsai.: Gene 25, 167 (1983); de Boer és mtsai..· Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 80, 21 (1983)]. Emellett egy bakteriális promoter tartalmazhat nem-bakteriális eredetű, természetben előforduló promotereket. amelyeknek megvan az a képességük, hogy megkössék a bakteriális RNS polimerázt és iniciálják a transzkripciót. Egy nembakteriális eredetű, természetes promoter szintén összekapcsolható egy kompatibilis RNS polimerázzai, hogy így néhány gén magasszintű expresszióját kapjuk prokariótákban. A bakteriofág T7 RNS polimeráz/promoter rendszer jó példa a kapcsolt promoter rendszerre [Studier és mtsai.: Journal of Molecular Biology 189, 113 (1986); Tábor és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA • · · · · ·
-,'U 82, 1074 (1985)]. Emellett egy hibrid promoter tartalmazhat egy bakteriofág promótert és egy Escherichia co//operator regiót [267 851 számú EPO publikáció].
Egy működő promoter szekvencia mellett egy hatékony riboszómális kötőhely is nagyon hasznos idegen géneknek prokariótákban való expressziójához. Escherichia coli-ban a riboszómális kötőhelyet Shine-Dalgarno (SD) szekvenciának hívják, és ez tartalmaz egy iniciációs kodont (ATG) valamint egy 3-9 nukleotid hosszúságú szekvenciát, amely 3-11 nukleotiddal az iniciációs kodon előtt helyezkedik el [Shine és mtsai.: Natúré 254, 34 (1975)]. Az SD szekvenciáról azt gondoljuk, hogy elősegíti az mRNS-nek a nboszómához való kötődését, oly módon, hogy az SD szekvencia és az Escherichia coli 16S rRNS 3' vége között bázispárosodás jön létre [Steitz és mtsai.: Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA, Biological Regulation and Development: Gene Expression (szerk: R.F. Goldberger)]. A gyenge riboszómális kötőhellyel rendelkező eukarióta és prokarióta genek expressziójának leírása megtalálható a szakirodalomban [Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA (1989)].
Egy DNS molekula expresszálható intracellulárisan. Egy promoter szekvencia kapcsolódhat közvetlenül a DNS molekulához, amely esetben az N-terminálison levő első aminosav mindig metionin lesz, amit az ATG startkodon kódol. Ha szükséges, akkor az N-terminálison levő metionin lehasítható a fehérjéről brómciánnal való in vitro inkubálással, vagy bakteriális N-terminális peptidázzal végzett in vivő vagy in vitro inkubálással [219 237 számú EPO publikáció],
A fúziós fehérjék alternatívát kínálnak a közvetlen expresszióval szemben. Tipikus esetben egy endogén bakteriális feherje, vagy más stabil fehérje N-terminális részét kódoló DNS szekvenciát fúzionáltatunk heterológ kódoló szekvenciák 5' végéhez. Az expresszió következtében ez a konstrukció két aminosav szekvencia • ··» ··· ··· ··· fúzióját szolgáltatja. Például a lambda bakteriofág génje kapcsolható egy idegen gén 5' végéhez és baktériumban expresszálhato. A kapott fúziós fehérje előnyösen tartalmaz egy processzáló enzim (például Xa faktor) által felismert pontot, amely révén a bakteriofág gén lehasítható az idegen génről [Nagai és mtsai.: Natúré 309, 810 (1984)]. A fúziós fehérjéket előállíthatjuk a lacZ-ből származó szekvenciákkal is [Jia és mtsai.: Gene 60, 197 (1987·)], a trpE-ből származó szekvenciákkal is [Allén és mtsai.: J. Biotechnoi. 5, 93 (1987); Makoff es mtsai.: J. Gén. Microbioi. 135, 11 (1989)] és a Chey génből származó szekvenciákkal is [324 647 számú EPO publikáció]. A két aminosav kapcsolódási pontjánál levő DNS szekvencia vagy tartalmaz hasítási helyet vagy nem. Egy másik példa egy ubiquitin fúziós fehérje. Egy ilyen fúziós fehérjét azzal az ubiquitin régióval készítjük, amely előnyösen megtartja a processzáló enzim (azaz ubiquitin-specifikus processzáló proteáz) által felismert helyet, hogy ezen keresztül lehasíthassuk az ubiquitint az idegen fehérjéről. Ezen a módszeren keresztül a természetes idegen fehérje izolálható [Miller és mtsai.: Bio/Technology 7, 698 (1989)].
Egy másik módszer szerint az idegen gének úgy is szekretálhatók a sejtből, hogy az idegen génnek a baktériumból való szekrécióját biztosító szignálpeptid szekvencia fragmenst tartalmazó fúziós fehérjét kódoló kiméra DNS molekulát hozunk létre [4,336,336 számú USA bejelentés], A szignálszekvencia fragmens általában egy szignálpeptidet kódol, amely hidrofób aminosavakból áll, és a fehérjének a sejtből való szekrécióját vezérli. A fehérjét vagy a növesztő táptalajba szekretáljuk (Gram pozitív baktériumok), vagy a a periplazmatikus térbe, amely a sejt külső és belső membránja között helyezkedik el (Gram-negatív baktériumok). Előnyösen vannak processzálási helyek, amelyek mind in vivő mind in vitro lehasíthatók, és a szignálpeptid fragmens valamint az idegen gén között helyezkednek el.
• ··· *·4 t • « · Λ « _ ;η . · ··· ·»· ··
A megfelelő szignálszekvenciákat kódoló DNS származhat szekretált bakteriális fehérjékből, azaz például Escherichia coli külső membrán fehérjéből (ompA) [Masui és mtsai.: Experimental Manipulation of Gene Expression (1983); Ghrayeb és mtsai.: EMBO J. 3, 2437 (1984)] és az Escherichia coli alkalikus foszfatáz szignálszekvenciából (phoA) [Oka es mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 82, 7212 (1985)]. További példa, hogy a különböző Bacíllus törzsekből származó alfa-amiláz gén használható heterológ fehérjék Bacillus subtilis-bö\ való szekretálására [Palva és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 79, 5582 (1982); 244 042 számú EPO publikáció].
A baktériumok által felismert transzkripciós terminációs szekvenciák általában a transzlációs stopkodontól 3' irányban található szabályozó régiók, és így a promoterrel együtt a kódoló szekvenciát határolják. Ezek a szekvenciák vezérlik egy mRNS transzkripcióját, ami azután a DNS által kódolt polipeptiddé fordítódik le. A transzkripciós terminációs szekvenciák gyakran tartalmaznak körülbelül 50 nukleotid hosszúságú DNS szekvenciákat, amelyek képesek a transzkripció lezárását elősegítő hajtűstruktürákat létrehozni. Ilyen terminációs szekvenciák lehetnek például az erős promoterekkel rendelkező génekből, azaz például az Escherichia coli trp génjéből és egyéb bioszintetikus génekből származó transzkripciós terminációs szekvenciák.
Az előzőkben ismertetett komponenseket, azaz a promotert, szignálszekvenciát (ha szükséges), a számunkra lényeges kódoló szekvenciát és a transzkripciós terminációs szekvenciát általában expressziós konstrukciókká rakjuk össze. Az expressziós konstrukciókat általában egy replikonban tartjuk fenn, azaz például egy extrakromoszómális elemben (például plazmid),amely képes stabilan fennmaradni egy gazdaszervezetben, azaz például a baktériumban. A replikonnak van egy replikációs rendszere, amely lehetővé teszi, hogy fennmaradjon egy prokarióta gazdaszervezetben, klónozási vagy amplifikálási célból. A replikon emellett lehet például egy magas vagy alacsony kópiaszámú plazmid. Egy nagy kópiaszámú plazmid kópiaszama általában 5-200, tipikus esetben 10-150. Egy nagy kópiaszámú plazmidot tartalmazó gazdaszervezet előnyösen legalább 10, még előnyösebben legalább 20 plazmidot tartalmaz. Mind magas kópiaszámú, mind alacsony kópiaszámú vektor választható, a vektornak és az idegen fehérjének a gazdaszervezetre gyakorolt hatásától függően.
Egy másik módszer szerint az expressziós konstrukció egy integráló vektorral integrálódhat a bakteriális genomba. Az integrálódó vektorok általában legalább egy olyan szekvenciát tartalmaznak, amely homológ a baktérium kromoszómájával, és ez lehetővé teszi, hogy a vektor integrálódjon a genomba. Az integrációs a vektorban és a bakteriális kromoszómán levő homológ DNS rekombinációja teszi lehetővé az integrációt. Például a különböző Bacillus törzsekből származó DNS-sel készített integrálódó vektorok integrálódnak a Bacillus kromoszómájába [127 328 számú EPO publikáció]. Az integrálódó vektorok tartalmazhatnak bakteriofág vagy transzpozon szekvenciákat is.
Adott esetben az extrakromoszómális és integrálódó expressziós konstrukciók tartalmazhatnak szelekciós markereket, amelyek lehetővé teszik, hogy a transzformált baktérium törzseket szelektáljuk. A szelektálható markerek expresszálhatók a baktérium gazdaszervezetben, és olyan gének lehetnek, amelyek a baktériumokat rezisztenssé teszik például ampicillinnel, kloramfenikollal, eritromicinnel, kanamicinnel (neomicin) és tetraciklinnel szemben [Davies és mtsai.: Annu. Rév. Microbiol. 32, 469 (1978)]. A szelektálható markerek lehetneb bioszintetikus gének is, azaz például a hisztidin, triptofán és leucin bioszintézis útban levő gének.
• · ·
Egy másik módszer szerint az előzőkben ismertetett komponensek közül néhány transzformációs vektorrá rakható össze. A transzformációs vektorok tipikus esetben tartalmaznak szelektálható markért is, ami azután vagy fennmarad a replikonban, vagy egy integrálódó vektorrá fejlődik, az előzőkben ismertetett módon.
Számos baktérium transzformálására kifejlesztettek expressziós és transzformációs vektorokat, legyenek azok extrakromoszómális replikonok vagy integrálódó vektorok. Expressziós vektorokat fejlesztettek ki többek között az alábbi baktériumokra Bacillus subtilis [Palva es mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 79, 5582 (1982); 036 259 és 063 953 számú EPO publikáció]; Escherichla coli [Shimatake és mtsai.: Natúré 292, 128 (1981); Amman és mtsai.: Gene 40, 183 (1985); Studier és mtsai.: Journal of Moiecular Biology 189, 113 (1986); 036776, 136 829 és 136 907 számú EPO publikáció]; Streptococcus cremoris [Powell és mtsai.: Appl. Environ. Microbiol. 54, 655 (1988)]; Streptococcus lividans [Powell és mtsai.: Appl. Environ. Microbiol. 54, 655 (1988)]; Streptomyces lividans [4,745,056 számú USA bejelentés].
Az exogén DNS-nek a bakteriális gazdaszervezetekbe való bejuttatására szolgáló módszerek ismertek a szakterületen. Általában ide tartozik a CaCl2-vel vagy más ágenssel, azaz például kétértékű kationokkal és DMSO-val kezelt baktériumok transzformációja. A DNS elektroporácioval is bejuttatható a baktériumsejtekbe. A transzformációs eljárások a transzformálandó baktériumfajtól függően változnak [Masson és mtsai.: FEMS Microbiol. Lett. 60, 273 (1989); Palva és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 79, 5582 (1982); 036 259 és 063 953 számú EPO publikáció; WO84/04541 számú PCT publikáció, Bacillus], Miller és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 85, 856 (1988); Wang és mtsai.: Journal of Bacteriology 172, 949 (1990); Campylobacter], [Cohen és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 69, 2110 (1973); Dower és mtsai.: Nucleic Acids Research 16, 6127 (1988): Kushner: An improved method fór transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids, Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (szerk: H.W. Boyer és S. Nicosia): Mandel és mtsai.: Journal of Molecular Biology 53, 159 (1970); Taketo: Biochem. Biophys. Acta 948, 318 (1988), Escherichia], [Chassy és mtsai.: FEMS Microbiol Lett. 44, 173 (1987), Lactobacillus]', Fiedler és mtsai.: Anal. Biochem. 170, 38 (1988): Pseudomonas]', [Augustin és mtsai,: FEMS Microbiol Lett. 66, 203 (1990): Staphylococcus]', [Bárány és mtsai.: Journal of Bacteriology, 144, 698 (1980); Harlander: Transformation of
Streptococcus lactis by electroporation, Streptococcal Genetics (szerk.: J. Ferretti és R. Curtiss lll)(1987); Perry és mtsai.: Infec. Immun. 32, 1295 (1981); Powell és mtsai.: Appl. Environ. Microbiol. 54, 655 (1988); Somkuti és mtsai.: Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1_, 412 (1987); Streptococcus],
Az alábbiakban ismertetjük az élesztő expressziós rendszereket.
Az élesztő expressziós rendszerek is ismertek a szakterületen jártas szakember számára. Élesztő promoter lehet minden olyan DNS szekvencia, amely képes megkötni az élesztő RNS polimerázt és képes iniciálni a kódoló szekvencia (azaz például struktúrgén) 3' irányú transzkripcióját mRNS-sé. A promoter transzkripciós iniciációs régiója általában a kódoló szekvencia 5' vége előtt található. Ez a transzkripciós iniciációs régió általában tartalmaz egy RNS polimeráz kötőhelyet (azaz a TATA Box-ot) és egy transzkripciós iniciációs pontot. Az élesztő promotemek lehet lehet egy második doménje is, amit upstream aktivátor szekvenciának (UAS) neveznek, ami, ha jelen van, akkor általában távol van a struktúrgéntől. Az UAS lehetővé teszi a szabályozott (indukálható) expressziót. A konstitutív expresszió az UAS távollétében is lejátszódik. A szabályozott expresszió lehet pozitív vagy negatív, és ez vagy fokozza vagy gyengíti a transzkripciót.
• ·
Az élesztő egy erjesztő mikroorganizmus, aktív metabolikus bioszintézis úttal, és így a metabolikus bioszintézis útban levő enzimeket kódoló szekvenciák különösen jó promoter szekvenciákat szolgáltatnak. Ilyen gén például az alkoholdehidrogenáz (ADH)[284 044 számú EPO publikáció], enoláz. glükokináz, glükóz-6foszfát-izomeráz, gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAP vagy GAPDH), hexokináz, foszfofruktokináz, 3-foszfoglicerat mutáz és piruvát kináz (PyK) [329 203 számú EPO publikáció]. Az élesztő PHO5 gén, amely savas foszfatázt kódol, hasznos promoter szekvenciákat is kódol [Myanohara és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 80, 1 (1983)].
Emellett a természetben elő nem forduló szintetikus promoterek is működnek élesztő promoterként. Például egy élesztő promoter UAS szekvenciái egy másik élesztő promoter transzkripciós aktivációs régiójával kapcsolhatók össze, és így egy szintetikus hibrid promoter állítható elő. Ilyen hibrid promoter lehet az ADH szabályozó szekvencia a GAP transzkripciós aktivációs régiójához kapcsolva [4,876,197 és 4,880,734 számú USA bejelentés]. Egyéb hibrid promoter lehet például az olyan promoter, amely az ADH2, GAL4, GAL10 vagy PHO5 gének szabályozó szekvenciáit tartalmazza, egy glikolitikus enzim, azaz például a GAP vagy PyK transzkripciós aktivációs régiójával [164 556 számú EPO publikáció]. Emellett egy élesztő promoter tartalmazhat természetes, nem-élesztő eredetű promotereket, amelyeknek negvan az a képességük, hogy megkössék az élesztő RNS polimerázt és transzkripciót iniciáljanak. Ilyen promoter több is lehet [Cohen és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 77, 1078 (1980); Henikoff és mtsai.; Natúré 283, 835 (1981); Holienberg és mtsai.: Curr. Topics Microbiol. Immunoi. 96, 119 (1981); Holienberg és mtsai.: The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (szerk.: K.N.
Timmis és A. Puhler) (1979); Mererau-Puigalon és mtsai.: Gene 11, 163 (1980); Panthier és mtsai.: Curr. Génét. 2, 109 (1980)].
Egy DNS molekula expresszálható intracellulárisan élesztőben. Egy promoter szekvencia kapcsolódhat közvetlenül a DNS molekulához, amely esetben a rekombináns fehérje N-terminálisán levő első aminosav mindig metionin, amit az ATG startkodon kódol. Ha szükséges, akkor az N-terminálison levő metionin lehasítható a fehérjéről brómciánnal végzett in vitro inkubálással.
A fúziós fehérjék alternatívát jelentenek az élesztő expresszió rendszer, de az emlős, bakulovírus és bakteriális expressziós rendszerek számára is. Egy DNS szekvenciát, amely egy endogén élesztő fehérje, vagy más stabil fehérje Nterminális részét kódolja, a heterológ kódolo szekvencia 5' végéhez fúzíonáltatjuk. Az expresszió során ez a konstrukció a két aminosav szekvencia fúzióját szolgáltatja. Például az élesztő vagy humán szuperoxid-diszmutáz (SÓD) gén hozzákapcsolható egy idegen gén 5' végéhez, és élesztőben expresszálható. A két aminosav szekvencia kapcsolódásánál levő DNS szekvencia vagy kódol hasítási helyet vagy nem [196 056 számú EPO bejelentés]. Egy másik példa az ubiquitin fúziós fehérje. Ezt a fúziós fehérjét az ubiquitin régióval állítjuk elő, amely előnyösen megtart egy helyet a processzáló enzim (azaz az ubiquitin-specifikus processzáló proteáz) számára, hogy az ubiquitint le lehessen hasítani az idegen fehérjéről. Ezzel a módszerrel tehát természetes idegen fehérje izolálható [WO88/024066 számú PCT publikáció].
Egy másik módszer szerint az idegen fehérjék úgy is szekretálhatók a sejtből a növesztő táptalajba, hogy olyan kiméra DNS molekulákat hozunk létre, amelyek egy olyan fúziós fehérjét kódolnak, amely az idegen fehérjének élesztősejtekből való szekrécióját biztosító vezérszekvencia fragmenst tartalmaznak. Előnyösen vannak processzálási helyek a vezérszekvencia fragmens és az idegen gén közé kódolva,
--12 és az idegen gén akár in vivő akár in vitro elhasítható. A vezérszekvencia fragmens általában egy hidrofób aminosavakból álló szignálpeptidet tartalmaz, amely a fehérjének a sejtből való szekrécióját irányítja.
A megfelelő szignálszekvenciákat kódoló DNS származhat szekretált élesztőfehérjék génjeiből, azaz például az élesztő invertáz génjéből [012 873 számú EPO publikáció; 62,096,086 számú JPO publikáció] és az A-faktor génje [4,588,684 számú USA szabadalmi bejelentés]. Egy másik módszer szerint a nem-élesztő eredetű vezérszekvenciák, azaz például egy interferon vezérszekvencia is alkalmas lehet élesztőben szekréció biztosítására [060 057 számú EPO publikáció],
A szekréciós vezérszekvenciák egy előnyös osztálya az, amely az élesztő alfa-faktor génjének egy fragmensét alkalmazza, amely mind a pre szignálszekvenciát mind egy pro régiót tartalmaz. A használható aifa-fragmensek típusai közé tartozik a teljes hosszúságú pre-pro alfa-faktor vezérszekvencia (körülbelül 83 aminosavból áll), valamint a csonkított alfa-faktor vezérszekvenciák (általában körülbelül 25-50 aminosavból állnak) [4,546,083 és 4,870,008 számú USA szabadalmi bejelentések; 324 274 számú EPO publikáció]. A további, szekréciót biztosító, alfa-faktor vezérszekvencia fragmensek közé tartoznak a hibrid alfa-faktor vezérszekvenciák, amelyeket egy első élesztő pre-szekvenciával állítunk elő, de egy második élesztő aéfa-faktorból származó pro-régióval [WO89/02463 számú PCT publikáció].
Az élesztő által felismert transzkripciós terminációs szekvenciák általában a transzlációs stopkodon után 3' irányban található szabályozó régiók, és így a promoterrel együtt határolják a kódoló szekvenciát. Ezek a szekvenciák vezérlik az mRNS transzkripcióját, ami azután a DNS által kódolt polipeptiddé fordítható le. A transzkripciós terminációs szekvenciák és az egyéb, élesztő által felismert terminációs szekvenciák származhatnak például a glikolitikus enzimekből.
Az előzőkben ismertetett komponenseket, azaz a promotert, szignálszekvenciát (ha szükséges), a számunkra lényeges kódoló szekvenciát és a transzkripciós terminációs szekvenciát általában expressziós konstrukciókká rakjuk össze. Az expressziós konstrukciókat általában egy replikonban tartjuk fenn, azaz például egy extrakromoszómális elemben (például plazmid), amely képes stabilan fennmaradni egy gazdaszervezetben, azaz például élesztőben vagy baktériumban. A replikonnak lehet két replikációs rendszere, amely lehetővé teszi, hogy fennmaradjon élesztőben expresszáiás céljából és egy prokarióta gazdaszervezetben, klónozási vagy amplifikálási célból. Ilyen élesztő-baktérium ingázó vektorokat leírtak a szakirodalomban, ilyen például az YEp24 [Botstein és mtsai.: Gene 8, 17-24 (1979)], a pC1/1 [Brake és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 81, 4642-4646 (1984)]; és az YRp17 [Stinchcomb és mtsai.: Journal of Molecular Biology 158, 157 (1982)]. A replikon emellett lehet például egy magas vagy alacsony kópiaszámú plazmid. Egy nagy kópiaszámú plazmid kópiaszáma általában 5-200, tipikus esetben 10-150. Egy nagy kópiaszámú plazmidot tartalmazó gazdaszervezet előnyösen legalább 10, még előnyösebben legalább 20 plazmidot tartalmaz. Mind magas kópiaszámú, mind alacsony kópiaszámú vektor választható, a vektornak és az idegen fehérjének a gazdaszervezetre gyakorolt hatásától függően [Brake és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 81, 4642-4646 (1984)].
Egy másik módszer szerint az expressziós konstrukciók integrálódhatnak az élesztő genomjába, egy integrálódó vektor segítségével. Az integrálódó vektorok általában legalább egy, az élesztő kromoszómájával homológ szekvenciát tartalmaznak, amelyek lehetővé teszik, hogy a vektor integrálódjon, és előnyösen két homológ szekvenciát tartalmaznak, amelyek közrefogják az expressziós konstrukciót. Az integráció a vektorban és az élesztő kromoszómájában levő . l-i .
homológ DNS közötti rekombináció eredménye [Orr-Weaver és mtsai.: Methods in Enzymology 101, 228-245 (1983)]. Egy integrálódó vektort irányíthatunk egy, az élesztőben levő specifikus lókuszba, a megfelelő homológ szekvenciát beépítve a vektorba [Orr-Weaver és mtsai.: Methods in Enzymology 101, 228-245 (1983)]. EGy vagy több expressziós konstrukció integrálódhat, ezzel valószínűleg érintve a keletkező rekombináns fehérje szintjét [Rine és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 80, 6750 (1983)]. A vektorba beépített kromoszómális szekvenciák lehetnek a vektorban egyetlen szegmentként beépítve, ami az egész vektor integrációját eredményezheti, vagy két, a kromoszómán szomszédos szegment közrefoghatja a vektorban levő expressziós konstrukciót, aminek az lehet az eredménye, hogy csak az expressziós konstrukció integrálódik stabilan a kromoszómába.
Az extrakromoszómális és integrálódó expressziós konstrukciók tartalmazhatnak szelekciós markereket is, amelyek lehetővé teszik a transzformált élesztősejtek szelekcióját. A szelektálható markerek lehetnek bioszintetikus gének, amelyek expresszálhatók az élesztő gazdaszervezetben, azaz például ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 és ALG7, valamint a G418 rezisztencia gén, amely az élesztőben tunikamicin és G418 elleni rezisztenciát biztosít. Emellett, egy megfelelő szelekciós marker képessé teheti az élesztőt arra is, hogy toxikus anyagok, azaz például fémek jelenlétében növekedjen. Például a CUP1 gén lehetővé teszi, hogy az élesztő rézionok jelenlétében növekedjen [Buti és mtsai.: Microbiol. Rév. 51, 351 (1987)].
Egy másik módszer szerint az előzőkben említett komponensek közül néhány transzformációs vektorrá rakható össze. A transzformációs vektorok általában egy szelekciós markért tartalmaznak, amely vagy fennmarad replikon formájában, vagy integrálódó vektorként beépül, amint azt az előzőkben ismertettünk.
Az expressziós és transzformációs vektorokat, legyenek azok akár extrakromoszómális replikonok, akár integrálódó vektorok, számos élesztőfajra kifejlesztették. A szakirodalomban szereplő leírások szerint többek között az alábbi élesztőkre fejlesztettek ki expressziós vektorokat: Candida albicans [Kurtz és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 6, 142 (1986)]; Candida maltosa [Kunze és mtsai.: J. Basic. Microbiol. 25, 141 (1985)]; Hansenula polymorpha [Gleeson és mtsai.: J. Gén. Microbiol. 132, 3459 (1986); Roggenkamp és mtsai.: Molecular and Generál Genetics 202, 302 (1986)]; Kluyveromyces fragilis [Das és mtsai.: Journal of Bacteriology 154, 737 (1983); Van den Berg és mtsai..' Bio/Technology 8, 135 (1990)]; Pichia guillermondii [Kunze és mtsai.: J. Basic Microbiol. 25, 141 (1985)]; Pichia pastoris [Cregg és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 5, 3376 (1985); 4,837,148 és 4,929,555 számú USA bejelentés]; Saccharomyces cerevisiae [Hinnen és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 75, 1929 (1978); lto és mtsai.: Journal of Bacteriology 153, 163 (1983)]; Schizosaccharomyces pombe [Beach és Nurse: Natúré 300, 706 (1981)] és Yarrowia lipolitica [Davidow és mtsai.: Curr. Génét. 1_0, 380-471 (1985); Gaillardin és mtsai.: Curr. Génét. 10, 49 (1985)].
Az exogén DNS élesztő gazdaszervezetbe való bejuttatás! módszerei jól ismertek a szakterületen, ide tartozik a szferoplasztok vagy alkáli kationokkal kezelt ép élesztősejtek transzformációja. A transzformálási eljárások általában a transzformálandó élesztőfajtól függően változnak [Kurtz és mtsai.: Mól. Cell. Bioi.: 6, 142 (1986); Kunze és mtsai.: J. Basic Microbiol. 25, (1985); Candida], [Gleeson és mtsai.: J. Gén. Microbiol. 132, 3459 (1986); Roggenkamp és mtsai.: Molecular and Generál Genetics 202, 302 (1986); Hansenula]; [Das és mtsai.: Journal of Bacteriology 158, 1165 (1984); De Louvencourt és mtsai.: Journal of Bacteriology 154, 1165 (1983); Van den Berg és mtsai.: Bio/Technology 8, 135 (1990); Kluyveromyces],' [Cregg és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 5, 3376 (1985); Kunze és mtsai.: J.
• ·
-46 - .........
Basic. Microbioi. 25, 141 (1985); 4,837,148 és 4,929,555 számú USA bejelentés; Pichia]; [Hinnen és mtsai.; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 75, 1929 (1978); lto és mtsai.: Journal of Bacteriology 153, 163 (1983); Saccharomyces]; [Beach and Nurse: Natúré 300 706 (1981); Schizosaccharomyces]; [Davidow és mtsai.: Curr. Génét. 10, 39 (1985); Gaillardin és mtsai.: Curr. Génét. 10, 49 (1985); Yarrowia],
A jelen találmány szerint egy expressziós vektor szelekciós markereket, egy replikációs origót és a gazdasejt szekvenciáival homológ szekvenciákat tartalmazhat. Egy szelekciós marker arra használható, hogy olyan gazdasejteket keressünk vele, amelyek potenciálisan tartalmazzák az expressziós vektort. Az ilyen markerek közé tartoznak azok, amelyek a gazdasejtet rezisztenssé teszik mondjuk antibiotikumokkal, azaz például ampicillinnel, kloramfenikollal, eritromicinnel, neomicinnel és tetraciklinnel szemben. A markerek lehetnek emellett bioszintézis gének, azaz amelyek a hisztidin, triptofán és leucin bioszintézis-útban szerepelnek, és ennélfogva szükségesek a gazdasejt növekedéséhez. Tehát ha például egy leu(-) gazdasejtet használunk befogadóként egy expressziós vektorral vaió transzformációban, és a táptalajban nincs jelen leucin, akkor csak azok a sejtek élik túl az eljárást, amelyek egy leu(+) gént tartalmazó plazmidot tartalmaznak.
A jelen találmány szerinti egy replikációs origót építhetünk be egy expressziós vektorba, hogy lehetővé tegyük a gazdasejtben való autonóm replikációját. Az ilyen replikációs origó lehet olyan, amely lehetővé teszi, hogy egy expressziós vektor nagy kópiaszámban szaporodjon a sejtben a megfelelő fehérjék jelenlétében, azaz ilyenek például a 2 μ-os és az autonóm replikációs szekvenciák, amelyek élesztőben működnek; valamint a virális T-antigén, amely COS-7 sejtekben működőképes.
A jelen találmány céljára az expressziós vektorok vagy integrálódnak a gazdasejt genomjába, vagy autonóm nődön fennmaradnak a sejtben. A •·« ··· · • · · * • *· ·« · · · gazdaszervezet genomjába való integrációhoz az expressziós vektor olyan polinukleotid szekvenciákat tartalmaz, amelyek homológok a gazdasejt genomjában levő szekvenciákkal. A homológ szekvenciáknak nem kell kapcsolódniuk az expressziós vektorhoz. [MEG KELL KÉRDEZNI, HOGY EZ IGAZ-E. Például az expressziós vektorok integrálódhatnak a CHO genomba, egy nem kapcsolt dihidrofolát reduktáz gén útján.] Az élesztőben előnyös, ha a homológ szekvenciák közrefogják az expressziós kazettát. A jelen találmány szempontjából különösen azok a szekvenciák hasznosak, amelyeket a W090/01800 számú PCT bejelentésben írnak le, valamint a HIS4 gén szekvenciái, amelyet a Genbank-ban írnak le, letéti száma J01331].
A promoter, a terminátor és egy expressziós vektor egyéb opcionális elemeinek megválasztása függ a választott gazdasejttől, ami ismert dolog a szakterületen jártas szakember számára. Ez a találmány nem függ a választott gazdasejttől. Az optimális gazdasejtet a kényelem és a keresett fehérje expressziójának szintje határozza meg. Az expresszióhoz számos gazdaszervezet ismert a szakterületen, és beszerezhető az American Type Culture Collection-től (ATCC).
A KGF fragmens expressziójához jól használható bakteriális gazdaszervezetek közé tartoznak például az alábbiak: Campylobacter, Bacillus, Escherichia, Lactobacillus, Pseudomonas, Staphylococcus és Streptococcus. Az alábbi nemekbe tartozó élesztő gazdaszervezetek használhatók: Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces és Yarrowia. A gazdaszervezetként használható immortalizált emlős sejtek közé tartoznak például a CHO sejtek, a HeLa sejtek, a bébihörcsög vesesejtek (BHK), a majom vesesejtek (COS) és a humán hepatocelluláris karcinóma sejtek, azaz például a Hep G2. Számos rovasejt is alkalmas a KGF fragmens vagy analógjai » ·
- IS • · · » · ·· ··· •·*· expresszálására, beleértve a következőket: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx móri, Drosophila melanogaster és Spodoptera frugiperda [WO 89/046699 számú PCT bejelentés; Carbonell és mtsai.: J. Virol. 56, 153 (1985); Wright: Natúré 321, 718 (1986); Smith és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 3, 2156 (1983); és általánosságban Fraser és mtsai.; in vitro Cell Dev. Bioi. 25. 225 (1989)].
A KGF fragmenst vagy analógot tartalmazó expressziós vektort beépítjük a gazdasejtbe. Expressziós vektoroknak a gazdasejtekbe való juttatására bármely, a szakterületen ismert transzformációs technika használható. A bakteriális gazdaszervezet transzformálása során például először CaCl2-vel vagy más ágenssel, azaz például kétértékű kationokkal és DMSO-val kezeljük a baktériumokat, és bejuttatjuk az exogén DNS-t a kezelt baktériumsejtekbe. A DNS elektroporációval vagy vírusfertőzéssel is bejuttatható a baktériumsejtekbe. A bakteriális gazdaszervezetekhez használható transzformációs eljárásokat ismertették a szakirodalomban [MAsson és mtsai.: FEMS Microbiol. Lett. 60, 273 (1989); Palva és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 79, 5582 (1982); 036 259 és 063 953 számú EP publikáció; WO 84/04541 számú PCT bejelentés (Bacillus); Miller és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 85, 856 (1988); Wang és mtsai.: Journal of Bacterioiogy, 172, 949 (1990) (Campylobacter); Cohen és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 69, 2110 (1973); Dower és mtsai.: Nucleic Acids Research 16, 6127 (1988); Kushner: An improved method fór transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids, Genetic Enfineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (szerk.: H.W. Boyer és S. Nicosia)(1978); Mandel és mtsai.: Journal of Molecular Biology 53, 159 (1970); Taketo: Biochem. Biophys. Acta 949, 318 (1988) (Escherichia)·, Chassy és mtsai.: FEMS Microbiol Lett. 44, 173 (1987) (Lactobacillus)', Fíedler és mtsai.: Anal. Biochem. 170, 38
- _L') (1988)(Pseucfomo/7as); Augustin és mtsai.: FEMS Microbiol Lett. 66, 203 (1990) (Staphylococcus); Bárány és mtsai..· Journal of Bacteriology 144, 698 (1980); Harlender: Transformation of Streptococcus lactís by electroporation, Streptococcal Genetics (szerk.: J. Ferretti és R. Curtiss 111)(1987); Perry és mtsai.: Infec. Immun. 32, 1295 (1981); Powell és mtsai.: Appl. Environ. Microbiol. 54, 655 (1988); Somkuti és mtsai.: Proc. 4th Cong. Biotechnology j_, 412 (1987) (Streptococcus)].
Az. élesztő transzformálási eljárásai jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára, és általában szferoplasztok vagy alkáli-katioríokkal kezelt ép élesztő sejtek transzformálását jelentik. Az élesztő gazdaszervezetek is transzformálhatok elektroporációval [Methods in Enzymology, 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (1991)]. A jelen találmány szerint az alkalmazandó transzformációs eljárás a transzformálandó élesztöfajtól függően változik, és ide tartoznak a szakirodalomban ismertetett eljárások [Kurtz és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 6, 142 (1986); Kunza és mtsai.: J. Basic Microbiol. 25, 141 (1985) (Candida)] Gleeson és mtsai.: J. Gén. Microbiol. 132, 3459 (1986); Roggenkamp és mtsai.: Molecular and Generál Genetics 202, 302 (1986) (Hansenula)', Das és mtsai.: Journal of Bacteriology 158, 1165 (1984); De Louvencourt és mtsai.: Journal of Bacteriology 154, 1165 (1983); Van den Berg és mtsai.: Bio/Technology 8, 135 (1990) (Kluyveromyces)] Cregg és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 5, 3376 (1985); Kunze és mtsai.: J. Basic. Microbiol. 25, 141 (1985); 4,837,148 és 4,929,555 számú USA bejelentések (Pichia)] Hinnen és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 75, 1929 (1978); lto és mtsai.: Journal of Bacteriology 153, 163 ('\983)(Saccharomyces)] Beach és Nurse: Natúré 300, 706 (1981 )(Schizosaccharomyces)] Davidow és mtsai.: Curr. Génét. 10, 39 (1985); Gaillardin és mtsai.: Curr. Génét. 10, 49 (1985)(Yarrow/a)].
···
- 5() Heterológ polinukleotidoknak emlős sejtekbe való bejuttatására szolgáló módszerek ismertek a szakterületen, ide tartozik például a vírusfertőzés, dextrán által közvetített transzfekció, kalcium-foszfátos kicsapás, polibrennel közvetített transzfekció, protoplaszt fúzió, elektroporáció, a polinukleotidok liposzómákba zárása, valamint a DNS közvetlen mikroinjekciózása a sejtmagokba.
Heterológ DNS bakulovírusokba való bejuttatásának módszerei, azzal a céllal, hogy rovar gazdasejt transzformálására alkalmas expressziós vektort hozzunk létre, szintén jól ismertek a szakterületen [Smith és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 3, 2156 (1983); Lucklow és Summers: Virology 17, 31 (1989)]. Például a KGF fragmens DNS homológ kettős crossover rekombinációval építhető be a polihedron génbe. Az inszerciót elvégezhetjük a kiválasztott bakulovírus génbe bevitt restrikciós enzimes hasítási helynél is [Miller és mtsai.: Bioessays 4, 91 (1989)]. A KGF fragmens DNS szekvenciáját, ha az expressziós vektorban a polihedron gén helyére klónozzuk, akkor mind 5' mind 3' polihedron-specifikus szekvenciák határolják, és a polihedron promoter után építjük be.
A jelen találmány megvalósítási módja szerint az újonnan létrehozott bakulovírus expressziós vektort ezután egy fertőzőképes rekombináns bakulovírusba pakolhatjuk. A bakulovírus expressziós rendszerben a homológ rekombináció alacsony gyakorisággal játszódik le, körülbelül 1 és 15% között. Tehát a transzfekció után keletkező vírusok zöme még vad típusú vírus. A rekombináns vírusokat azonban ismert módszerekkel azonosíthatjuk. A natív vírus például magas szinten termel polihedron fehérjét a fertőzött sejtek sejtmagjában, a vírusfertőzés késői fázisában. Az akkumulálódott polihedron fehérje zárványtesteket hoz létre, amelyek vírusrészecskéket is tartalmaznak. Ezek a zárványtestek, méretük maximum 15 pm, erősen fénytörőek, ami csillogó fényes megjelenésüket okozza, és így könnyen azonosíthatók a fénymikroszkóp alatt. A rekombináns vírusokkal fertőzött sejtek nem tartalmaznak zárványtesteket. A rekombináns vírus és a vad típusú vírus szélesztéssel különböztethető meg, ha a transzfekciós felülúszót vagy annak hígításait standard technikákkal rovarsejtek egysejtrétegére szélesztjük. A tarfoltokat fénymikroszkóp alatt átvizsgálhatjuk, hogy tartalmaznak-e zárványtesteket, ami a vad típusú vírus jellemzője, vagy nem, ami a rekombináns vírus jellemzője [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY (1989)].
A szakterületen ismert immunesszék és aktivitásvizsgálatok használhatók annak meghatározására, hogy a transzformált gazdasejtek expresszálják-e a kívánt KGF fragmenst. Például immunfluoreszcencia vizsgálatot végezhetünk a transzformált gazdasejteken, anélkül, hogy a KGF fragmenseket elválasztanánk a sejtmembrántól. Ebben a vizsgálatban a gazdasejteket először egy szilárd hordozóra, azaz például egy mikroszkóp tárgylemezre vagy egy mikrotiter lukba rögzítjük. A rögzített sejteket azután egy anti-KGF ellenanyaggal hozzuk érintkezésbe. A vizsgálat érzékenységének növeléséhez előnyösen a rögzített sejteket egy második ellenanyaggal hozzuk érintkezésbe, amelyet megjelöltünk, és amely kötődik az anti-KGF ellenanyaghoz. A másod ellenanyagot például egy fluoreszcencia markerrel jelezhetjük. A KGF fragmenseket expresszáló gazdasejtek fluoreszcenciásan jelezve lesznek, és így láthatók a fénymikroszkóp alatt.
1. Példa
Egy humán KGF cDNS inszertet építettünk be egy bakulovírus expressziós rendszerbe, a cDNS-t az 1. ábrán látható pAcC13Pst/Notl expressziós vektorba klónozva. Ez a plazmid a pAcC12-böl szármázik [Munemitsu és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 10, 5977-5982 (1990)].
• «
PCR oligonukleotid indító molekulákat terveztünk a csonkított, 18 kDa méretű KGF-hez, a KGF hozzáférhető N-terminális aminosav szekvenciája alapján [Finch és mtsai.: Science 2, 752-755 (1989)]. A szubklónozás megkönnyítésére határoló restrikciós hasítási helyeket építettünk a pAcC13 expressziós vektorba,a mely a pVL941 transzfer vektor származéka [Luckow és mtsai.: Virology 170, 31-39 (1989); Quilliam és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 10. 2901-2908 (1990)]. Ezt az expressziós vektort úgy állítottuk elő, hogy a KGF-et kódoló fragmenst a pAcC13 Pstl/Notl polilinker helyre építjük be. A KGF cDNS a KGF érett, processzált formáját kódolja, amely 163 aminosavból áll, egy potenciális n-glikozilezési hellyel a 14-es és 16-os csoportoknál.
Kondicionált táptalaj készítése
Spodoptera frugiperda Sf9 rovarsejteket fertőzünk Autographa californica bakulovírussal, amely a KGF-μι 53 cDNS-t tartalmazza. Miután [X x 10x] sejt/ml sűrűségre hígítottuk, a sejteket 48-72 óra hosszat Excell-400-ban tenyésztjük, szérumkiegészítők, antibiotikumok, vagy fungicidek távollétében. A tenyészfolyadékot összegyűjtjük, majd 10,000 x g-vel 30 percig centrifugáljuk, hogy eltávolitsuk a lebegő sejteket és a többi sejttörmeléket. A kondicionált táptalajt egy 0,8 μ-os szűrőn (Miilipore) szűrjük at, és ebből a táptalajból körülbelül 5 litert 200 mire töményítünk, egy filtron kazetta rendszert alkalmazva (Omega membrán), amelynek a vágási értéke 3 kDa.
Töményítés után az Sf9 sejtekből származó kondicionált táptalajt összegyűjtjük (20 perc 10,000 x g centrifugálás), majd a közeget szekvenciális heparin Sepharose (HS) affinitáskromatográfiával tisztítjuk. A jelen találmány egy megvalósítási módja szerint körülbelül 1 liter Sf9 sejt kondicionált táptalajt ultraszűrünk, így kapunk 200 ml ultraszűrési maradékot, egy 3 kDa vágási értékkel rendelkező Omega membránt használva.
• · ··«
HSAC és MonoS kationcserélő kromatoqráfia
A felülúszó pH-ját 7,2-re állítjuk. Egy 30 ml-es mintát viszünk fel egy heparin Sepharose gyantára, amelyet 10 mmol/l TRIS-HCI (pH=7,3), 150 mmol/l NaCI összetételű pufferrel hoztunk egyensúlyba. A gyantát alaposan mossuk egyensúlyozó pufferrel, addig, amíg az abszobancia visszatér az alapvonalra, majd lépésekben eluáljuk, 0,45 mol/l, 1 mol/l és 2 mol/l NaCI koncentrációt alkalmazva. Alikvot részeket veszünk ki a frakciókból a sejt proliferációs vizsgálatban való felhasználás céljából, majd a legmagasabb biológiai aktivitást mutató 1 mol/l koncentrációjú frakciókat egyesítjük. Az egyesített frakciókat ötszörösre hígítjuk 10 mmol/l TRIS pH=7,2 pufferrel (végső sókoncentráció 0,2 mol/l NaCI),majd a mintát egy Super loop-pal egy FPLC rendszerhez kapcsolt MonoS oszlopra visszük (Pharmacia, Piscataway, NJ). Az eluálást lineáris gradienssel végezzük (10 mmol/l TRIS, pH=7,3, 0,2 mol/l NaCI => 10 mmol/l TRIS, pH=7,3, 1 mol/l NaCI). Miután az alikvot részeknek megvizsgáltuk a biológiai aktivitását, az aktív frakciókat egyesítjük.
A retentát pH-ját 7,3-ra állítjuk, majd egy körülbelül 30 ml ágytérfogatú HS oszlopra visszük. Hagyjuk, hogy az oszlop körülbelül 2 óra hosszat menjen 4 °C-on. Az oszlopot 150 ml egyensúlyozó pufferrel mossuk, amelynek összetétele 10 mmol/l TRIS-HCI és 0,15 mol/l NaCI, pH=7,3). A visszatartott fehérjét 0,45 mol/l NaCI-lel és 1 mol/l NaCI-lel eluáljuk. Az elúció során az oszlop áramlási sebességét körülbelül 90 ml/óra értékre állítjuk, és 3 ml-es frakciókat szedünk.
A HS affinitáskromatográfiai lépések biológiailag aktív 1 mol/l NaCI-es frakcióit egyesítjük, majd ötszörösre hígítjuk 10 mmol/l TRIS-szel (pH=7,3), majd közvetlenül egy MonoS HR 5/5 oszlopra visszük (Pharmacia). A visszatartott fehérjéket 0,2 mol/l => 1 mol/l NaCI gradienssel eluáljuk. Az aktív frakció biológiai vizsgálatát Balb-Mk sejtvonallal határozzuk meg. Elvégezzük a Mono S kationcserélö kromatográfiával izolált biológiailag aktív fehérje SDS PAGE elemzését. A 37-39 és 41-42 frakciókat ··«
- S_l . .........
egyesítjük, majd 10 μΙ-es alikvot részeket adunk SDS-hez és 10 mmol/l DTT-hez. Ezeket a mintákat hővel denaturáljuk és 12%-os poliakrilamid gélen elektroforetizáljuk, majd ezüsttel megfestjük. Hasonló mintázat figyelhető meg, függetlenül attól, hogy a mintákat redukáló környezetben vagy nem-redukáló környezetben futtatjuk. A 37-39-es frakciókban levő fehérje látszólagos molekulasúlya 25 kDa, a 41-42-es frakciókban levő fehérje látszólagos molekulasúlya 18 kDa.
A HS biológiailag aktív frakciók kromatogrammja a Balb/MK biológiai aktivitást mutatja, a 31-47-es frakciókban, igazolva két molekulatípus jelenlétét, amelyek közül az egyik 0,55 mol/l NaCI-nél eluálódik, a másik pedig 0,6 mol/l NaCI-nél eluálódik.
A KGF aktivitásának meghatározása
A kapott frakciókban levő KGF aktivitás jelenlétét azon képesség alapján határozzuk meg, hogy a frakciók mennyire képesek fokozni a BALB/C-Mk sejtek növekedését. Ehhez bizonyos frakciókból 10 μΙ-es alikvot részeket hígítunk 1 ml 0,2%-os foszfáttal puffereit sóoldatban (PBS) készült zselatinnal, majd a hígított frakciókból 10 μΙ-t vizsgálunk meg abból a szempontból, hogy fokozza-e a BALB/CMk sejtek növekedését (a sejteket 12-lukas lemezekre visszük, mindegyik 22 mm-es lukakat tartalmaz, a sejtek sűrűsége 5 x 10^ sejt/ml). Kiderült, hogy minden KGF aktivitás fennmarad az oszlopon, majd 1 mol/l NaCI-lel eluáljuk.
A KGF biológiailag aktív frakcióit a HS oszlopról 1 mol/l NaCI-lel eluáljuk, majd kationcserélő FPLC oszlopkromatográfiával tisztítjuk tovább. Ezeket a frakciókat egyesítjük, ötszörösre hígítjuk 10 mmol/l TRIS, pH=7,3 összetételű pufferrel, majd közvetlenül felvisszük egy Mono S HR 5/5 oszlopra (Pharmacia).
A mono S HR 5/5 oszlopon fennmaradt fehérjét 0,2 mol/l => 1 mol/l NaCI gradienssel eluáljuk. Az eluált frakciók biológiai aktivitását az előzőkben leírt módon • ··· ·♦♦ « • · < · < *···«··*· -Ν''vizsgáljuk, BALB/C-Mk sejteket alkalmazva. A 3. ábrán látjuk a 31-47-es frakciók aktivitásprofilját.
A mitogén vizsgálatban 10^ ABAE és 1(Ρ ACE sejteket viszünk 12 lukas lemezekre, a sejtek sűrűsége 5 x 103 sejt per luk, 1 ml, 10%-os borjúszérummal valamint antibiotikumokkal kiegészített DMEM oldatban [Bohlen és mtsai.: EMBO 4, 1951-1956 (1985): Gospodarowicz és mtsai.: J. Cell Physiol. 127, 121-136 (1986); Bellosta és mtsai.: J.Cell Bioi. 121, 705-713 (1993)]. Hatórás inkubálást követően három-három párhuzamos sejtet tripszinezünk. majd a sejteket megszámláljuk, hogy meghatározzuk a szélesztés hatékonyságát. Az egyes minták megfelelő hígításából 10 μΙ-es alikvot részeket adunk három párhuzamosban a lukakhoz a 0., 2. és 4. napon. A tenyésztés 5. napja után a lemezeket tripszinezzük és a sejtek sűrűségét Coulter Counter-rel határozzuk meg (Coulter Electronics, Hialeah, FL).
A KGF vagy a bázikus FGF hozzáadását a 0. napon végezzük, utána pedig minden másnap, a jelzett koncentrációban. Ötnapos tenyésztés után a sejteket tripszinezzük, majd a végső sejtsürüséget egy Coulter Counter-rel határozzuk meg.
Elektroforézis (NaDoDSOd/PAGE
Poliakrilamid géleket készítünk NaDodSOq-gyel, Laemmli és munkatársai eljárását követve (Laemmli és mtsai.: Natúré 227, 680-685 (1970)]. A mintákat 3 percig forraljuk 10 mmol/l DTT-ben, majd 12%-os poliakrilamid gélben elektroforetizáljuk. A géleket fixáljuk majd ezüsttel festjük, a BioRad reagenseit és protokollját alkalmazva, valamint Merril és munkatársai leírását követve [Merrill és mtsai.: Science 211, 1437-1438], A megfelelő molekuiasúlyú markereket a BioRad tól szerezzük be.
• ·
- Sejtszaporodási vizsgálat
Az oszlopfrakciók és a tisztított minták mitogén aktivitását BALB/Mk sejtek, mint célsejtek alkalmazásával határozzuk meg. A törzstenyészeteket alacsony kalcium-tartalmú, 10% FCS-sel, 50 pg/ml gentamicinnel, 0,25 ug/ml fungizonnal és 10 ng/ml aFGF-kel kiegészített, módosított Eagle féle tápközegben növesztjük és tartjuk fenn [Gospodarowicz és mtsai.: J. Cell. Physiol. 142, 325-333]. A mitogén vizsgálathoz használt sejteket 12 lukas lemezekre visszük, a sejtek sűrűsége 5 x 10^ - 1 x 104 sejt per luk, 1 ml alacsony kalciumtartalmú MÉM táptalajban, amelyet 10% FCS-sel egészítettünk ki [Gospodarowicz és mtsai.: J. Cell. Physiol. 142, 325-333], A minták hozzáadását és a sejtsűrűségek végső meghatározását 5 nap elteltével végezzük [Gospodarowicz és mtsai.: J. Cell. Physiol. 142, 325-333].
A végső tisztított anyag mitogén aktivitását felnőtt szarvasmarha aorta endoteliális sejteken (ABAE) és adrenális kortex-eredetű kapilláris endoteliális sejteken (ACE) vizsgáljuk [Gospodarowicz és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 73, 4120-4124 (1976)]. A törzstenyészeteket 10% CSsel, 50 Lig/ml gentamicinnel és 0,25 iig/ml fungizonnal kiegészített DMEM-ben tartjuk fenn, hetente passzálva zselatinizált szövettenyésztö lemezeken, 1:10 megosztási arányban.
A szakterületen jól ismert standard módszerek alkalmazásával egyértelmű aminosav szekvenciát határozunk meg a KGF(jesi_23 N-terminálisának 1-20-as pozícióira. Ez a szekvencia az alábbi:
Sí YDM5 EGGD I RVRRLFXRTQ.
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a KGFdes-|.23-t és a KGF rövidebb formáit, amelyekről hiányzik a KGF 153 N-terminális nem-konzervált jellemzője, kódoló DNS szekvenciák, az FGF család egyéb tagjaival összehasonlítva.
·«·
Fehérje mikroszekvenálás
A KGF-|g3 és a KGF(jes-|_23 nominálisan 10 pikomólos mintáit Edman degradációval és AA elemzéssel vizsgáljuk, polivinilidén difluoridhoz való centrifugális adszorpció után (PVDF, Applied Biosystems Biospin). A mintákat egy Applied Biosystems 477A gázfázisú fehérjeszekvenátorra visszük fel. Húsz lépés Edman degradációt hajtunk végre standard szoftver és vegyszerek alkalmazásával (Applied Biosystems), a PTH aminosavak azonosítását automatizált on-line HPLC oszlopokon végezzük (120A modell, Applied Biosystems).

Claims (20)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Érett, teljes hosszúságú keratinocita növekedési faktor aminosav szekvenciájának egy részét tartalmazó keratinocita növekedési faktor fragmens, amely résznek a mitogén aktivitása az érett, rekombináns, teljes hosszúságú keratinocita növekedési faktorral összehasonlítva legalább kétszeresre nőtt, és hiányzik belőle az érett, teljes hosszúságú keratinocita növekedési faktor első 23 Nterminális aminosav csoportját tartalmazó szekvencia.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti keratinocita növekedési faktor fragmens, amely fragmensnek a mitogén aktivitása az érett, rekombináns, teljes hosszúságú növekedési faktorral összehasonlítva hétszeresre nőtt.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti keratinocita növekedési faktor fragmens, amely fragmensnek a mitogén aktivitása az érett, rekombináns, teljes hosszúságú növekedési faktorral összehasonlítva tízszeresre nőtt.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti keratinocita növekedési faktor, amely fragmens az érett, rekombináns, teljes hosszúságú keratinocita növekedési faktorral összehasonlítva csökkent citotoxicitást mutat.
  5. 5. Konjugátum, amely a következőket tartalmazza:
    (a) érett, teljes hosszúságú keratinocita növekedési faktor aminosav szekvenciájának egy részét tartalmazó keratinocita növekedési faktor fragmens, amely résznek a mitogén aktivitása az érett, rekombináns, teljes hosszúságú keratinocita növekedési faktorral összehasonlítva legalább kétszeresre nőtt, és hiányzik belőle az érett, teljes hosszúságú keratinocita növekedési faktor első 23 N-terminális aminosav csoportját tartalmazó szekvencia, és
    - SQ (b) egy toxin molekula.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti konjugátum, amelyben a toxint az alábbi csoportból választjuk ki: ricin A, diftéria toxin és saporin.
  7. 7. Az 5. igénypont szerinti konjugátum, amelyben a fragmens mitogén aktivitása az érett, rekombináns, teljes hosszúságú keratinocita növekedési faktorral összehasonlítva hétszeresre nőtt.
  8. 8. Az 5. igénypont szerinti konjugátum, amelyben a fragmens mitogén aktivitása az érett, rekombináns, teljes hosszúságú keratinocita növekedési faktorral összehasonlítva tízszeresre nőtt.
  9. 9. Gyógyászati készítmény, amely a következőket tartalmazza:
    (a) érett, teljes hosszúságú keratinocita növekedési faktor aminosav szekvenciájának egy részét tartalmazó keratinocita növekedési faktor fragmens, amely résznek a mitogén aktivitása az érett, rekombináns, teljes hosszúságú keratinocita növekedési faktorral összehasonlítva legalább kétszeresre nőtt, és hiányzik belőle az érett, teljes hosszúságú keratinocita növekedési faktor első 23 N-terminális aminosav csoportját tartalmazó szekvencia, és (b) egy gyógyászatilag elfogadható hordozó.
  10. 10. DNS molekula, amely az 1. igénypont szerinti keratinocita növekedési fragmenst kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazza.
  11. 11. DNS molekula, amely a 2. igénypont szerinti keratinocita növekedési fragmenst kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazza.
  12. 12. DNS molekula, amely a 3. igénypont szerinti keratinocita növekedési fragmenst kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazza.
  13. 13. Expressziós vektor, amely a 10. igénypont szerinti DNS molekulát, valamint egy szabályozó szekvenciát tartalmaz a DNS molekula expresszálásához.
    -60 • * · ·
    9 ··· ♦ ♦·« * · 9 9· • ··· ····»
  14. 14. A 13. igénypont szerinti expressziós vektor, aholis a vektor egy bakulovírus.
  15. 15. A 13. igénypont szerinti expressziós vektorral transzformált gazdasejt.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti gazdasejt, aholis a sejtet az alábbi csoportból választjuk ki: baktériumsejt, élesztősejt, emlőssejt és rovarsejt.
  17. 17. Eljárás keratinocita növekedési faktor fragmens előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket tartalmazza: a 15. igénypont szerinti gazdasejt tenyésztése, és a keratinocita növekedési faktor fragmens izolálása a tenyészetből.
  18. 18. Eljárás sebgyógyításra, azzal jellemezve, hogy a 9. igénypont szerinti gyógyászati készítményt a kezelendő sebterületre visszük, és hagyjuk a sebet gyógyulni.
  19. 19. Eljárás az epidermisz hiperproliferatív betegségének kezelésére, azzal jellemezve, hogy az 5. igénypont szerinti konjugátumot a kezelendő területre visszük.
  20. 20. A 20. igénypont szerinti kezelési módszer, azzal jellemezve, hogy a betegség az alábbi csoportba tartozó betegségek egyike: pszoriázis, bazális sejtka rcinóma.
HU9503857A 1993-06-29 1994-04-28 A truncated keratinocyte growth factor /kgf/ having increased biological activity HUT73453A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8642793A 1993-06-29 1993-06-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9503857D0 HU9503857D0 (en) 1996-02-28
HUT73453A true HUT73453A (en) 1996-08-28

Family

ID=22198501

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9503857A HUT73453A (en) 1993-06-29 1994-04-28 A truncated keratinocyte growth factor /kgf/ having increased biological activity

Country Status (25)

Country Link
US (7) US5677278A (hu)
EP (2) EP0706563B1 (hu)
JP (4) JP3570516B2 (hu)
KR (1) KR960703433A (hu)
CN (1) CN1129955A (hu)
AT (1) ATE278777T1 (hu)
AU (1) AU681405B2 (hu)
BG (1) BG100236A (hu)
BR (1) BR9407035A (hu)
CA (1) CA2166278A1 (hu)
CZ (1) CZ343795A3 (hu)
DE (2) DE69434053T2 (hu)
DK (1) DK0706563T3 (hu)
ES (1) ES2227527T3 (hu)
FI (1) FI956203A7 (hu)
FR (1) FR06C0004I2 (hu)
HU (1) HUT73453A (hu)
LU (1) LU91215I2 (hu)
NL (1) NL300217I2 (hu)
NO (1) NO955189D0 (hu)
NZ (1) NZ266622A (hu)
PL (1) PL312257A1 (hu)
PT (1) PT706563E (hu)
SK (1) SK153295A3 (hu)
WO (1) WO1995001434A1 (hu)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2250213C2 (ru) * 1989-01-31 2005-04-20 Джеффри С. РУБИН Выделенный белок фактора роста кератиноцита (kgf), рекомбинантная молекула днк, вектор, способ конструирования клетки-хозяина, способ получения белка, фармацевтическая композиция
US7026291B1 (en) 1989-01-31 2006-04-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Epithelial cell specific growth factor, keratinocyte growth factor (KGF)
US5814605A (en) * 1993-03-26 1998-09-29 Amgen Inc. Therapeutic uses of keratinocyte growth factor
US7084119B2 (en) * 1993-06-29 2006-08-01 Chiron Corporation Truncated keratinocyte growth factor (KGF) having increased biological activity
CA2166278A1 (en) * 1993-06-29 1995-01-12 Denis J. Gospodarowicz A truncated keratinocyte growth factor (kgf) having increased biological activity
US6008328A (en) * 1994-10-13 1999-12-28 Amgen Inc. Method for purifying keratinocyte growth factors
WO1996011949A2 (en) * 1994-10-13 1996-04-25 Amgen Inc. Analogs of keratinocyte growth factor
AU745815B2 (en) * 1994-10-13 2002-04-11 Biovitrum Ab (Publ) Analogs of keratinocyte growth factor, nucleic acids encoding such analogs, processes of making and methods of using
SI0785949T1 (en) * 1994-10-13 2003-08-31 Amgen Inc. Method for purifying keratinocyte growth factors
US7232667B2 (en) 1995-02-14 2007-06-19 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 polynucleotides
US6077692A (en) 1995-02-14 2000-06-20 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
US6693077B1 (en) 1995-02-14 2004-02-17 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
PT871730E (pt) 1995-10-11 2004-11-30 Chiron Corp Combinacao de pdgf, kgf, igf e igfbp para cicatrizacao de ferimentos
US6692961B1 (en) 1996-10-11 2004-02-17 Invitrogen Corporation Defined systems for epithelial cell culture and use thereof
ES2218666T3 (es) * 1996-10-15 2004-11-16 Amgen Inc., Producto a base del factor de crecimiento de queratinocitos-2 (kggf-2).
US6743422B1 (en) 1996-10-15 2004-06-01 Amgen, Inc. Keratinocyte growth factor-2 products
SI0935652T1 (en) * 1996-10-15 2004-06-30 Amgen Inc. Keratinocyte growth factor-2 products
US20030144202A1 (en) * 1996-10-15 2003-07-31 Amgen Inc. Uses of keratinocyte growth factor-2
JP2002513294A (ja) * 1997-06-19 2002-05-08 ジェネティックス・インスチチュート・インコーポレーテッド 分泌蛋白およびそれらをコードするポリヌクレオチド
US20080233086A1 (en) * 1997-09-05 2008-09-25 Canbiocin Inc. Expression Vectors for Treating Bacterial Infections
WO1999032135A1 (en) * 1997-12-22 1999-07-01 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 formulations
US6869927B1 (en) 1997-12-22 2005-03-22 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 formulations
US6599879B1 (en) * 1998-02-13 2003-07-29 Human Genome Sciences, Inc. Therapeutic uses of keratinocyte growth factor-2
DE19934510B4 (de) * 1999-07-22 2009-04-16 Vermicon Ag Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen
AU2039501A (en) 1999-10-15 2001-04-23 Rockefeller University, The System for rapid generation of recombinant baculovirus-based expression vectors for silkworm larvae
DE10024334B4 (de) * 2000-05-17 2006-06-01 Medigene Ag Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäure in eine Zelle (Transfektion) mittels Calciumphosphat
US6812221B2 (en) 2000-11-21 2004-11-02 The Texas A&M University System FGF-affinity chromatography
AU2002309473A1 (en) * 2001-01-08 2002-10-08 Human Genome Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2
WO2002069232A2 (en) 2001-02-19 2002-09-06 Merck Patent Gmbh Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity
AU2002326742B2 (en) * 2001-08-21 2007-05-31 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. KGF polypeptide compositions
US7202066B2 (en) * 2002-01-29 2007-04-10 Carrington Laboratories, Inc. Combination of a growth factor and a protease enzyme
GB0426394D0 (en) 2004-12-01 2005-01-05 Health Prot Agency Fusion proteins
AU2005317166B2 (en) * 2004-12-15 2009-09-10 Biovitrum Ab (Publ) Therapeutic formulations of keratinocyte growth factor
US20060183712A1 (en) * 2005-02-17 2006-08-17 The Texas A&M University System Affinity purified heparin/heparan sulfate for controlling the biological activity of the FGF receptor
ES2514316T3 (es) * 2005-11-22 2014-10-28 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Partículas similares a virus (VLPs) de Norovirus y Sapovirus
GB0611405D0 (en) 2006-06-09 2006-07-19 Univ Belfast FKBP-L: A novel inhibitor of angiogenesis
WO2008005533A2 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 Aaron Thomas Tabor Compositions and methods for genetic modification of cells having cosmetic function to enhance cosmetic appearance
KR101021197B1 (ko) * 2008-04-11 2011-03-11 (주)케어젠 성장인자―미미킹 펩타이드 및 그의 용도
WO2011008904A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Tabor Aaron T Compositions and methods for genetic modification of cells having cosmetic function to enhance cosmetic appearance
RU2016117275A (ru) 2013-11-01 2017-12-04 Сфериум Биомед С.Л. Тельца включения для трансдермальной доставки терапевтических и косметических средств
EP4395806B1 (en) 2021-08-30 2025-10-22 Unichem Laboratories Ltd Protein compositions for the treatment of oral mucositis
KR102691028B1 (ko) * 2021-11-15 2024-08-05 (주)피앤피바이오팜 안정성이 증가된 인간 각질세포 성장인자1 변이체 및 이의 용도

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2250213C2 (ru) 1989-01-31 2005-04-20 Джеффри С. РУБИН Выделенный белок фактора роста кератиноцита (kgf), рекомбинантная молекула днк, вектор, способ конструирования клетки-хозяина, способ получения белка, фармацевтическая композиция
US5194596A (en) * 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
US5350836A (en) * 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
US5814605A (en) 1993-03-26 1998-09-29 Amgen Inc. Therapeutic uses of keratinocyte growth factor
CA2166278A1 (en) 1993-06-29 1995-01-12 Denis J. Gospodarowicz A truncated keratinocyte growth factor (kgf) having increased biological activity
SI0785950T1 (en) 1994-10-13 2003-08-31 Amgen Inc. Keratinocyte growth factor analogs
WO1996011949A2 (en) 1994-10-13 1996-04-25 Amgen Inc. Analogs of keratinocyte growth factor

Also Published As

Publication number Publication date
FI956203A0 (fi) 1995-12-22
JP2004166709A (ja) 2004-06-17
NO955189L (no) 1995-12-20
NO955189D0 (no) 1995-12-20
CA2166278A1 (en) 1995-01-12
JPH09500267A (ja) 1997-01-14
ES2227527T3 (es) 2005-04-01
HU9503857D0 (en) 1996-02-28
FR06C0004I1 (hu) 2006-03-10
US5773586A (en) 1998-06-30
DE69434053D1 (de) 2005-01-20
FI956203A7 (fi) 1996-02-07
AU6820894A (en) 1995-01-24
BG100236A (en) 1996-07-31
CN1129955A (zh) 1996-08-28
EP1493812A3 (en) 2006-02-08
US6677301B1 (en) 2004-01-13
DE69434053T2 (de) 2006-02-23
DE122006000005I2 (de) 2006-11-23
NZ266622A (en) 1997-10-24
EP0706563B1 (en) 2004-10-06
BR9407035A (pt) 1996-03-12
US6074848A (en) 2000-06-13
ATE278777T1 (de) 2004-10-15
WO1995001434A1 (en) 1995-01-12
PL312257A1 (en) 1996-04-01
JP2009062396A (ja) 2009-03-26
NL300217I2 (nl) 2006-05-01
KR960703433A (ko) 1996-08-17
JP3570516B2 (ja) 2004-09-29
FR06C0004I2 (fr) 2006-12-29
CZ343795A3 (en) 1996-07-17
US5843883A (en) 1998-12-01
AU681405B2 (en) 1997-08-28
US5677278A (en) 1997-10-14
NL300217I1 (nl) 2006-04-03
JP2006075173A (ja) 2006-03-23
SK153295A3 (en) 1996-11-06
DE122006000005I1 (de) 2006-08-10
PT706563E (pt) 2005-01-31
DK0706563T3 (da) 2005-01-31
EP0706563A1 (en) 1996-04-17
LU91215I2 (en) 2006-03-27
US5863767A (en) 1999-01-26
US20090093400A1 (en) 2009-04-09
JP4662569B2 (ja) 2011-03-30
EP1493812A2 (en) 2005-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT73453A (en) A truncated keratinocyte growth factor /kgf/ having increased biological activity
US9925243B2 (en) Chimeric fibroblast growth factor (FGF) 2/FGF1 peptides and methods of use
JPWO1996026217A1 (ja) 新規蛋白質及びその製造方法
CA2422033A1 (en) Method for treating inflammation
CA2312000A1 (en) Mammalian cytokine-like polypeptide-10
US20170291931A1 (en) Fgf2 truncations and mutants and uses thereof
JPH10500300A (ja) 単球走化性蛋白質−４
US20180319857A1 (en) Fgf2 truncations and mutants and uses thereof
CA2237543A1 (en) New form of amphiregulin, methods for producing and using the same and compositions comprising the same
IE920044A1 (en) New insulin-like growth factor protein (igfbp-6)
KR20010052345A (ko) 인간 항트롬빈 3 및 그에 관련된 방법
US7247452B2 (en) Truncated keratinocyte growth factor (KGF) having increased biological activity
WO1999053056A1 (fr) Nouvelle proteine et ses procedes de production
CA2321176A1 (en) Connective tissue growth factor homologs
DE19649233A1 (de) Prozessierte Polypeptide mit IL-16 Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung
HU217102B (hu) Tisztított neurotróf faktor és eljárás előállítására
DE19648715A1 (de) Prozessierte Polypeptide mit IL-16 Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung
MXPA97008493A (en) Factor 15 of fibroblas growth

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee