HUT77875A - Mesterséges biológiai szervbe bezárt sejtek szaporodásának szabályozására szolgáló módszerek és készítmények - Google Patents

Mesterséges biológiai szervbe bezárt sejtek szaporodásának szabályozására szolgáló módszerek és készítmények Download PDF

Info

Publication number
HUT77875A
HUT77875A HU9700181A HU9700181A HUT77875A HU T77875 A HUT77875 A HU T77875A HU 9700181 A HU9700181 A HU 9700181A HU 9700181 A HU9700181 A HU 9700181A HU T77875 A HUT77875 A HU T77875A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
cell
proliferation
gene
differentiation
Prior art date
Application number
HU9700181A
Other languages
English (en)
Inventor
Patrick Aebischer
Brian M. Cain
Edward J. Doherty
Frank T. Gentile
Joseph P. Hammang
Laura M. Holland
Malcolm Schinstine
Molly S. Shoichet
Shelley R. Winn
Original Assignee
Cytotherapeutics, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/279,773 external-priority patent/US5935849A/en
Application filed by Cytotherapeutics, Inc. filed Critical Cytotherapeutics, Inc.
Publication of HUT77875A publication Critical patent/HUT77875A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/18—Macromolecular materials obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/383—Nerve cells, e.g. dendritic cells, Schwann cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/74—Alginate

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

A TALÁLMÁNY LEÍRÁSA
Mesterséges biológiai szervekbe zárt sejtek szaporításának módszere
A találmány területe
A jelen találmány mesterséges biológiai szervbe bezárt sejtek szaporodásának szabályozására szolgáló módszerekkel és készítményekkel kapcsolatos.
A találmány háttere
A mesterséges biológiai szervek (BAO-k) olyan eszközök, melyek élő sejteket tartalmaznak és egy gazda számára egy olyan metabolikus funkciót biztosítanak, melyre a gazdának szüksége van.
A mesterséges biológiai szervekbe bezárt sejtek egy vagy több biológiailag aktív molekulával látják el a gazdát, így felhasználhatók számos klinikai körülmény, hiányállapot és betegség megelőzésére vagy kezelésére.
Például az inzulint szekretáló sejteket tartalmazó BAO-k a diabetes kezelésére használhatók. Hasonlóképpen, más betegségek, mint a hipoparatiroidizmus és az amémia is
kezelhető olyan sejtekkel, melyek sorrendben paratiroid hormont és erithropoietint szekretálnak.
A mesterséges biológiai szervek felhasználhatók olyan biológiailag aktív molekulák biztosítására is, melyekkel neurodegeneratív állapotok, például a Huntington-féle betegség, a Parkinson-kór, az Alzheimer-kór és a Szerzett Immunhiány Betegséggel kapcsolatos dementiák, kezelhetők vagy megelőzhetők. Továbbá, limfokinek és citokinek is biztosíthatók BAO-kkal a gazda immunrendszerének módosítása céljából. A mesterséges biológiai szervekkel biztosítható biológiailag aktív molekulák közé tartoznak a katekolaminok, az endorfinok, az enkefalinok és más opioid vagy nem-opioid peptidek, melyek a fájdalom kezelésében hasznosak. Az enzimatikus hiányok is kezelhetők BAO-kkal. Másik lehetőségként a biológiailag aktív molekula eltávolíthat vagy kiiktathat káros molekulákat a gazdaszervezetből. Például a BAO tartalmazhat olyan sejteket, melyek olyan biológiailag aktív molekulákat termelnek, melyek felhasználhatók a koleszterin gazdából való kisöprésére.
Különböző makrokapszula BAO-k ismertek. Lásd például Aebischer (5,158,881 számú US szabadalom) Dionne et al. , (WO 92/03327), Mandel et al. , (WO 91/00119), Aebischer (WO 93/00128). A BAO-k tartalmaznak extravaszkuláris diffúziós kamrákat, intravaszkuláris diffúziós kamrákat, intravaszkuláris ultrafiltrációs kamrákat és mikrokapszulákat. Lásd például Lim et al. , Science 210:908-910 (1980); Sun, A.M. Methods in Enzymology 137:575-579 (1988); Dunleavy et al., (WO 93/03901) és Chick et al., (5,002,661 számú US szabadalom).
Mivel a BAO-kba bezárt sejtek a kívánt metabolikus funkciókat biztosítják kívánatos, hogy ezek a sejtek a funkciót • · • ♦ · · · · · • · · · · · · t ·········· ·· befolyásoló biológiailag aktív molekulákat optimálisan biztosítsák. Tipikusan a differenciálódott, nem osztódó sejteket részesítjük előnyben az osztódó sejtekkel szemben a BAO-k esetében való alkalmazáskor, mivel ezek lehetővé teszik a kívánt biológiailag aktív molekulák optimális termelését. Például, számos differenciálódott, nem osztódó sejt nagyobb mennyiségben termeli a kívánt terápiás proteint, mint az osztódó sejtek, mivel a differenciálódás specifikus gének expresszióját és a sejt osztódást antagonista folyamatoknak tartják. Wollheim, Establishment and Culture of InsulineSecreting béta Cell Lines, Methods in Enzymology, 192, p. 223235, 1990. A celluláris replikálódási kapacitás csökken a sejtek differenciálódásával. Számos esetben a szaporodás és a differenciálódás kölcsönösen kizárólagos. Gonos Oncogenes in Cellular Immortalisation and Differentiation, 13, Anticancer
Research, p. 1117, 1993.
A differenciálódótt szövet használata előnyös, mert a BAOba való beépítéshez szükséges szövet funkcionális tulajdonságait leginkább az in vivő differenciált szövet tulajdonságai határozzák meg. A differenciált, nem osztódó sejtek alkalmazásának másik előnye az, hogy a BAO-n belüli sejtszám viszonylag állandó marad. Ez, viszont sokkal kiszámíthatóbb eredményekhez, valamint a recipiens gazda stabil dózisaihoz vezet. Továbbá, a differenciált sejtek jobban illenek az olyan BAO-kban való felhasználáshoz, ahol egynél több, biológiailag aktív molekulát szekretáló sejttípust zártunk be. Az ilyen BAO-kban, ha osztódó sejteket használunk, a különböző sejt típusok különböző sebességgel szaporodhatnak, ami az egyik sejt típus túlzott szaporodásához vezethet. A ···· ···· differenciált, nem osztódó sejtek felhasználásával a két vagy több szinergista sejt típus relatív arányát sokkal könnyebb ellenőrizni.
Bár számos esetben a differenciált sejtek alkalmazása előnyős, számos probléma merült fel a közvetlenül emlősökből izolált differenciált sejtek felhasználásával.
Először, ott van az izolált szövet potenciális fertőzése, ami azt teszi szükségessé, hogy az egyes állatokból izolált szöveteket költséges és időigényes tesztelésnek vessük alá, annak biztosítása céljából, hogy ezek patogénmentesek.
Másodszor, a szövet megsérülhet az izolálás során a mechanikai vagy enzimatikus izolálási eljárások következtében az izolálási folyamat során. A mechanikai manipulálás nem mindig standardizálható könnyen, ami az izolátumok közötti variabilitáshoz vezethet.
Harmadszor, ischemia következhet be az izolálás során, ami szövet károsodást eredményezhet.
Negyedszer, a reprodukálható hozamok különbözők lehetnek a szövet donorokban való eltérések következtében. Például, a kor, a nem, az egészségi állapot, a forrás állat hormonális státusza hatással lehet a kérdéses szövet hozamára és minőségére.
Ötödször, néha nincs elegendő forrás szövet a BAO tervezett követelményeinek kielégítésére. Ez például akkor fordul elő, ha a forrás szövet egy kis méretű szervből származik, vagy ha a szövet mennyiség iránti végső igény magas. Ha az izolált szövet forrása az ember, gyakran komoly hiány lép fel a donor szövet esetében.
Hatodszor, néhány esetben kívánatos lehet a BAO-ban használt szövet genetikai módosítása. A nem osztódó szövetet ···· »··· patogénekre ezideig nehéz volt genetikailag módosítani in vitro és a módosított sejtek hozama és tulajdonságai bizonytalanok, fgy az előzőekben szereplő problémák miatt míg a differenciált, nem osztódó sejtek kívánatosak, szükség van a BAO-kba bezárandó differenciált, nem osztódó sejtek termelésére és fenntartására szolgáló módszerekre.
Ezen problémák miatt, az osztódó sejtek és sejtvonalak részesültek előnyben a BAO-kban való alkalmazáskor a szükséges biológiai funkció biztosítása céljából. Az osztódó sejtek használatában egy fontos előny az, hogy az ilyen sejtek nagy létszámúakká szaporodhatnak in vitro és tesztelhetók és bankokba tehetők. Ez egy majdnem korlátlan szövet utánpótlást tesz lehetővé alacsonyabb termelési költséggel. A szelekciós sémák, mint a sejt válogatás vagy klónozás alkalmazható a sejtek esetében olyan szubpopulációk kifejlesztéséhez, melyek javított tulajdonságokkal rendelkeznek. Továbbá, az osztódó sejtek és sejtvonalak sokkal jobban manipulálhatók genetikailag, mint a differenciált, nem osztódó sejtek. A heterológ rekombináns DNS bejuttatása számos új lehetőséget nyit meg a BAO-ba bezárandó sejtek funkciójának vagy fenotapusának megváltoztatásához. Ez viszont a BAO-k terápiás alkalmazásának nagyobb diverzitását biztosítja.
Azonban, a fentiekben megtárgyaltak szerint, a folyamatosan osztódó sejtek BAO-ba való bezárásának hátrányai közé tartoznak az eszközben levő sejtszám gyenge szabályozása, ami a kívánt biológiailag aktív molekula termelését kevésbé kiszámíthatóvá teszi.
Míg a legtöbb esetben kívánatos lehet korlátozni vagy minimalizálni
BAO-ban levő sejtek szaporodását, más • •4 · esetekben, például ahol a BAO-t ellenséges környezetbe implantáljuk, kívánatos lehet ha a sejteket hagyjuk lassan szaporodni a BAO-ban levő sejtszám fenntartása céljából.
Van egy másik a sejtek bezárásával kapcsolatos általános probléma is. Számos sejt típus adherens tulajdonságokkal rendelkezik, mint például, az hogy a sejtek hajlamosak az egymáshoz tapadásra és sűrű agglomerációk vagy aggregátumok létrehozására, különösen ha nincs megfelelő a sejtek számára rendelkezésre álló szubsztrát. Az ilyen sejt csoportok központi nekrotikus régiókat hozhatnak létre a tápanyagok és az oxigén magba beágyazott sej tekhez való relatív hozzáférhetetlenségének, vagy a magban bekövetkező toxikus termékek létrejöttének következtében, felszabadíthat többlet celluláris szükségtelenül árasztják el a gazdát xeno-proteinekkel, vagy más olyan faktorokkal, melyek károsak a túlélő sejtek számára, péládul olyan faktorok, melyek makrofág vagy más immunválaszt váltanak ki. Ez a probléma súlyosbodhat, ha a sejteket a BAO-ba egy szemipermeábilis membrán burokba zárjuk, a membránon keresztüli diffúziós kötöttségeknek köszönhetően. Gyakran kevesebb oxigén és kevesebb gazda által biztosított tápanyag áll rendelkezésre a BAO-n belül. Továbbá, a BAO-ban hulladék termékek is akkumulálódhatnak.
Ezek a sűrű celluláris tömegek lassan, vagy gyorsan sűrű telepeket alakíthatnak ki, a frissen diszpergált sejtek, vagy szövetek sejt-felszíni adhéziós proteinek által közvetített új rákapcsolódása révén. A nagy anyagcsere aktivitással rendelkező sejtek vagy szövetek különösen fogékonyak az oxigén vagy tápanyag hiány hatásával szemben, és egy nagy sejt csomóba
A nekrotikus proteineket, szövet melyek w * ·« « , · · * *- » • · · · · · · t ·#·*·····«·’ való beágyazódás után rövidesen el is pusztulnak. Számos endokrin szövet, melyek normálisan sűrű kapilláris közegben találhatók, ilyen tulajdonságot mutat; a Langerhans szigetek különösen érzékenynek tűnnek a beágyazódással szemben.
Szükség van a bezárt sejtek szaporodásának szebályozására szolgáló módszerre és készítményekre, melyek a szaporodó sejtek és a differenciálódott, nem osztódó sejtek különböző előnyeit egyesítik. A jelen találmány olyan módszereket és készítményeket biztosít, melyek révén a sejtek szaporíthatok és korlátlan ideig terjeszthetők in vitro és ahol a szaporodás és differenciálódás egyensúlya szabályozható ha a sejteket BAO-ba ágyazzuk be oly módon, hogy a készülék a megfelelő, kívánt módon működjön. Ily módon a jelen találmány lehetővé teszi a BAO-ban levő sejtszám szabályozását és ezen keresztül a kapszula megnyilvánulásának javított szabályozását biztosítja. A jelen találmány olyan módszereket is biztosít, melyek révén a sejtek szaporodása a BAO-n belüli elhelyezkedés révén szabályozható, ily módon a BAO-ban a nem kívánatos nekrotikus sejt magok kialakulását csökkenti. A sejtszám és a BAO-n belüli sejt elhelyezkedés szabályozása biztosítja azt az előnyt, hogy megkönnyíti a BAO membrán, valamint az adott beágyazott sejt típus más eszköz paramétereinek optimalizálását. Ez azért lehetséges, mert a kívánt készülék jellemzők könnyebben meghatározhatók egy rögzített sejt populáció esetén, mint osztódó sejt populációk esetében a BAO-ban. Továbbá, a biológiailag aktív molekulák hosszútávú biztosítása ily módon megoldható.
A találmány összefoglalása ·· ··· · • ·
A jelen találmány ezen problémákra irányul, oly módon, hogy módszereket és készítményeket biztosít a sejtek eloszlásának szabályozására (azaz a mesterséges biológiai szerven belül a sejtszám vagy a sejt elhelyezkedés, vagy mindkettő szabályozására) a mesterséges biológiai szerven belül. A jelen találmány módszerei és készítményei a következőket foglalják magukba: (1) a mesterséges biológiai szervbe beágyazott sejtek módosítására szolgáló módszereket és készítményeket és (2) a mesterséges biológiai szerven belüli szaporodási felszín módosítására szolgáló módszereket és készítményeket.
A celluláris manipulációra szolgáló módszerek és készítmények közé tartoznak a sejtek genetikai megválatoztatása olyan gén segítségével, mely egy a sejt szaporodást vagy differenciálódást befolyásoló terméket kódol. A kezelés magába foglalhatja egy olyan kémiai vegyület vagy növekedési faktor biztosítását, mely a proliierációt gátolja, vagy a differenciálódást indukálja. Másik lehetőségként a kezelés állhat egy olyan kémiai vegyület, vagy növekedési faktor a szaporító tápközegból való eltávolításából, melyek stimulálják a proliferációt, vagy melyek gátolják a differenciálódást. A kezelés történhet a mesterséges biológiai szervbe való beágyazás előtt vagy után, előnyösen a beágyazás után. Továbbá, a sejt szaporodás szabályozható besugárzással is.
A szaporodási felszín módosítására szolgáló módszerek és készítmények magukba foglalják a mesterséges biológiai szerven belüli legalább egy szaporító felszín egy vagy több extracelluláris mátrix molekulával (ECM) való burkolását. Az • ·
ECM-ek burkolhatok közvetlenül a luminális felszínre vagy a mesterséges biológiai szerven belüli belső támasztékra, vagy a mikroszféra hordozókra (mikrohordozók). A sejtek vagy a sejtekkel-beoltott mikrohordozók továbbá szuszpendálhatók egy olyan mátrix anyagban, mely fizikailag gátolja a sejt szaporodást. Továbbá, a mátrix anyag származhat kémiai vagy peptid származékokból is.
Továbbá, a mesterséges biológiai szerv szaporodási felszíne módosítható kémiai kezeléssel, oly módon, hogy gátolja a sejt kapcsolódást vagy fokozza a sejtek mesterséges biológiai szervek luminális felszínéhez való kapcsolódását. Azonkívül, a szaporodási felszín módosítható egy inért állványrendszer hozzáadásával a sejt bejuttatást megelőzően. Az állványzat fizikailag akadályozza meg a sejtek szaporodását és további helyeket biztosít a sejtkapcsolódás számára. El kell fogadni, hogy a sejt módosításra és a szaporító felszín módosítására szolgáló különböző módszerek és készítmények nem kölcsönösen kizárólagosak és ezek kombinációkban is alkalmazhatók.
Az ábrák rövid leírása
Az 1. ábra egy olyan szerkezet plazmid térképét mutatja, mely magába foglalja a patkány Mx-1 promóter 2,3 kb fragmentjét az SV4 0 korai régióhoz fuzionálva, melyet egy egér béta globin 3' nem transziáit régióból származó BamHI-Xbal fragment követ.
A 2. ábra az NGF szekréciót (ng/ml/24 óra) mutatja 4, 11 és 25 nap után olyan BHK sejtek esetében, melyeket kontroll, nem származtatott membránokba ágyazunk (0%-ként mutatjuk a • · függelékben) vagy 1% vagy 5% PEO-PDMS származtatott membránokba ágyazunk (sorrendben 1%, vagy 5%-ként mutatjuk be a függelékben). A sejteket beágyazzuk mátrix nélkül, (no matDként szerepel a függelékben), egy Vitrogen mátrixba (vit-ként mutatjuk be a függelékben) vagy egy agaróz mátrixba (agseként mutatjuk be a függelékben).
A 3 . ábra a CultiSphers-en agaróz mátrix hiányában szaporított BHK sejtekből származó NGF felszabadulást mutatja (függelék: n-mat-008, 0709-n-m) vagy egy agaróz mátrix jelenlétében (függelék: agaro-008, agaro-0709).
A 4. ábra a katekolamin felszabadulást mutatja a PC12A sejtekből az inért PHEMA álványzattal rendelkező BAO-ba való beágyazás után 1, 14 és 28 nap elteltével. Az A panel az alap katekolamin felszabadulást mutatja; a B panel a K+-kiváltott katekolamin felszabadulást. Az L-dopa, a NÉPI, az epi, a DOPAC,
a DA és a HVA rövidítések sorrendben az L-dopa, a norepinefrin,
az epinefrin , a dopac, a dopamin és a homovanillinsav
megfelelői.
Az 5 . ábra a katekolaminok PC12A sejtekből való
felszabadítását mutatja az inért PHEMA/MMA állványzattal rendelkező BAO-kba való beágyazás után 1, 14 és 28 nap elteltével. Az A panel az alap katekolamin termelést mutatja; a B panel a K+-által kiváltott katekolamin felszabadulást. Az Ldopa, a NÉPI, az epi, a DOPAC, a DA és a HVA rövidítések sorrendben az L-dopa, a norepinefrin, az epinefrin, a dopac, a dopamin és a homovanillinsav megfelelői.
A 6. ábra a Cultispherákon egy alginát mátrix jelenlétében (függelék:CS/AL), vagy egy agaróz mátrix jelenlétében (függelék:CS/AG) szaporított SV40/Dbeta4-NGF sejtekből történő • ·
L-dopa felszabadulást mutatja a BAO-kba való beágyazás után 2, 20, 40, és 80 nappal.
A találmány részletes leírása
A következőkben megadjuk a találmányban használt definíciókat:
A találmány szerinti alkalmazásban a mesterséges biológiai szerv vagy BAO egy olyan készüléket takar, melyet egy gazdába való implantációhoz tervezünk, vagy mely úgy készíthető el, hogy a testen kívül funkcionáljon és vagy állandóan vagy eltávolíthatóan kapcsolódjon a gazdához. Egy BAO sejteket vagy élő szöveteket tartalmaz, melyek egy biológiailag aktív molekulát termelnek, mely terápiás hatású a gazdára nézve. A BAO a gazda recipiensben való inplantáció során biokompatibilis kell legyen. Ennek megfelelően, a BAO nem szabad, hogy káros gazda választ váltson ki olyann mértékben, mely működésképtelenné vagy terápiás szempontból használhatatlanná teszi a BAO-t. Az ilyen működésképtelenség előfordulhat, például a kapszula körüli fibrotikus szerkezet kialakulása révén, ami az abban levő sejtek számára a tápanyagok diffúzióját korlátozza. A káros hatások közé tartozhatnak a kapszula kilökése, vagy toxikus vagy pirogén vegyületek (például szintetikus polimer melléktermékek) kiválasztása a BAO-ból a környező gazda szövetbe.
A beágyazott sejteket tartalmazó BAO-k megszerkeszthetök immunoizolációs tulajdonságokkal, melyek megakadályozzák a gazda immunrendszer elemeinek a szervbe való bejutását, így védelmet biztosítanak a mesterséges biológiai szervben található sejtek számára a káros immun pusztítástól. A BAO ···· · · · · alkalmazása növeli a terápiában alkalmazható sejt típusok diverzitását. Az implantált BAO-kban a készülékek, melyek immunoizolációsak lehetnek vagy lehetnek nem immunoizolációsak, általában egy szelektált terméket termelő sejteket vagy szöveteket tartalmaznak egy szemi-permeábilis fizikai korláton belül, mely lehetővé teszi a tápanyagok, a hulladék anyagok diffúzióját és a szekretált termékek környező gazda szövetbe való diffúzióját és visszatartják a bennük található sejteket, de minimalizálják az immunológiai kilökődés effektorainak celluláris és molekuláris káros hatásait. Az immunoizolációs tulajdonságok, azonban nem szükségszernek minden esetben (például ha a sejtek autológok vagy szingenikusak a gazdával szemben).
Egy biológiailag aktív molekula olyan molekula, mely (a) funkcionálhat az olyan sejten belül, melyben termelődik, vagy (b) expresszálható a sejt felszínén és hatással lehet a sejt más sejtekkel, vagy biológiailag aktív molekulákkal való kölcsönhatására (például egy neurotranszmitter receptor, vagy sejt adhéziós molekula), vagy (c) felszabadítható vagy szekretálható azokból a sejtekből, melyekben termelődnek és hatásukat egy külön célsejtre, vagy cél molekulára fejtik ki a gazdában (például egy neurotranszmitter, hormon, növekedési faktor, vagy citokin).
A találmány szerinti használatban hacsak másként nem specifikáljuk, a sejtek fogalma bármilyen formájú sejteket jelent, ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a szövetben visszamaradó sejteket, a sejt csoportokat és az egyedileg izolált sejteket. A jelen találmányban használt sejtek legalább egy biológiailag aktív molekulát termelnek.
• ·
A BAO-n belüli sejt eloszlás (disztribúció) szabályozása a BAO-n belüli sejtszám szabályozását, a BAO-n belül a sejtek térbeli elhelyezkedésének szabályozását vagy mindkettőt jelenti.
Sejtek széles köre alkalmazható a jelen találmányban. Ezek közé taroznak a jól ismert, nyilvánosan beszerezhető halhatatlanná tett sejtvonalak, valamint az osztódó primer sejt tenyésztek. A nyilvánosan beszerezhető és a jelen találmányban megfelelően alkalmazható sejtvonalakra példák az L-6 sejtek, az MDCK sejtek, az LLC-PK sejtek, a beta-CH3 sejtek, a C2 sejtek, a hörcsög vese (BHK), a kínai hörcsög ovárium (CHO), az egér fibroblaszt (L-M), a NIH Swiss egér embrió (NIH/3T3) esetében, az afrikai zöld majom sejtvonalak (ideértve a COS-a, COS-1, COS-6, COS-7, BSC-1, BSC-40, BMT-10 és Verő sejtvonalakat), a patkány mellékvese feokromocitoma (PC12) sejtek, a patkány gliás tumor sejtek (C6), a RAJI (humán limfóma) sejtek, a MOPC31C egér plazmacitoma sejtek, az MN9D sejtek, a ripTAg transzgenikus egér eredetű sejtek, az SCT-1, beta-TC sejtek, a Hep-G2 sejtek, az AT-T20 sejtek, a béta sejtvonalak, mint a NIT sejtek vagy a RIN sejtek, az Ntera-2 sejtek (Pleasure et. al., Journ. Neuroscience, 12, pp. 1802-15, 1992) és a humán asztrocita sejtvonalak, mint az U-373 és az U-937.
A felhasználható primer sejtek közé tartoznak a bFGFérzékeny neurális törzs/utód sejtek, melyek emlősök CNS-éból származik (Richards et al. , PNAS 89, pp. 8591-8595, 1992; Ray et al., PNAS, 90, pp. 3602-3606, 1993) a primer fibroblasztok, Schwann sejtek (WO 92/03536) asztrociták, oligodendrociták és ezek prekurzorai, mioblasztjai és mellékvese kromaffin sejtjei. Például egy ilyen mioblaszt sejtvonal a C2C12 sejtvonal.
• ·
A sejtek választhatók a használni kívánt növekedés szabályozás és differenciálódás adott módszerétől függően is. Például, a törzs sejtek könnyen használhatók olyan módszerekkel, melyek a differenciálódást egy kémiai anyag alkalmazásával indukálják. Általában, a törzs sejtek nem differenciált sejtek, melyek in vivő normálisan nyugalomban vannak, de melyek szaporodára képesek és még több olyan törzs sejt létrehozására képesek, melyek nagy számú utód sejtek létrehozására képesek, ami viszont differenciált vagy differenciálható leánysejtek létrehozását teszik lehetővé. A törzs sejtek a sejtek egy olyan osztályát képviselik, melyek könnyen kibővíthetők tenyészetben és melyek utódsejtjei terminálisán differenciálhatok egy specifikus növekedési faktor hozzáadásával. Lásd például Weiss et al., (PCT/CA 92/00283) .
A mioblasztok egy olyan sejt típust jelentenek, melyek a találmány szerint egy BAO-ba ágyazhatok. A mioblasztok izom prekurzor sejtek, melyek eredetileg mezodermális törzs sejt populációkból származnak. Számos mioblaszt sejtvonal szerezhető be, melyek tenyészetben differenciálódáson mennek keresztül, például az L-6 és a beta-CH3 sejtek. A primer mioblasztok könnyen izolálhatok egy autopsziából vagy biopsziából származó szövetből és tisztíthatok és kibővíthetők. A mioblasztok szaporodnak és egymással fúzionálnak, hogy egy differenciált, sokmagvú miotubulust hozzanak létre. A mitubulusok nem osztódnak tovább, de tovább folytatják az izom proteinek termelését. A szaporodás alatt a mioblasztok könnyen manipulálhatók génsebészeti eljárásokkal terápiás molekulák termeltetése céljából. A mioblasztokba egy kívánt biológiailag aktív molekulák termeltetése céljából való egy vagy több gén • · bejuttatásának módszerei ismertek. A mioblasztok képesek migrálni, korábban létező rostokhoz fúzionálni, valamint hordozókként szolgálni a bejuttatott gén(ek) számára. Verma et al., (WO 94/01129); Blau et al. , TIG 9, pp. 269-74, 1993; WO 93/03768; WO 90/15863. Ezután a genetikailag manipulált sejtek beágyazhatok és a BAO-ban differenciálódni hagyhatók vagy maguk a differenciálódott sejtek kapszulázhatok be.
A sejtek kiválasztása függ a tervezett alkalmazástól is. A BAO-n belüli sejtek egy neurotranszmitter szekréciójára is választhatók. Az ilyen neurotranszmitterek közé tartoznak a dopamin, a gamma aminovajsav (GABA), a szerotonin, az acetilkolin, a noradrenalin, az epinefrin, a glutaminsav és más peptid neurotranszmitterek. Olyan sejtek is alkalmazhatók, melyek neurotranszmitterek fragmentjeinek agonistáit, analógjait, számrazékait szintetizálják vagy szekretálják, melyek aktívak, ideértve például a bromokriptint, egy dopamin agonistát szekretáló sejteket, és az L-dopát, egy dopamin prekurzort szekretáló sejteket.
A sejtek választhatók hormon, citokin, növekedési faktor, tropikus faktor, angiogenezises faktor, antitest, vér koagulációs faktor, limfokin, enzim és más terápiás anyag vagy agonista, prekurzor, aktív analóg vagy ezek aktív fragmentjeinek szekréciójára. Ezek közé tartoznak az enkefalinok, a katekolaminok, az endorfinok, a dinorfinok, az inzulin, a VlII-as faktor, az eritropoietin, a P szubsztancia, az ideg növekedési faktor (NGF), a gliás sejvonal eredetű neurotróp faktor (GDNF), a vérlemezke eredetű növeledési faktor (PDGF), az epidermális növekedési faktor (EGF), az agy eredetű neurotróp faktor (BDNF), a neurotrofin-3 (NT-3), a neurotrofin··· · ·· ·· ·· ·· • · · · · · · ♦ · · · ·· • · · · · .
• ··········*
4/5, a CDF/LIF, a bFGF, az aFGF, egy sor más fibriblaszt növekedési faktor, ciliáris neurotróf faktor (CNTF) és az interleukinek.
Az előzőek alapján el kell fogadni, hogy a jelen találmány módszereiben hasznos sejtek nem transzformált sejteket is magukba foglalnak, melyek a kívánt biológiailag aktív molekulá(ka)t szekretálják, vagy azokat a sejteket is, melyek ilyenné transzformálhatok.
A számos biológiailag aktív molekulát kódoló géneket már klónozták és nukleotid szekvenciáikat publikálták. Ezen gének közül sok nyilvánosan is beszerezhető olyan deponálóktól, mitn az American Type Culture Collection (ATCC) vagy számos kereskedelemi forrásból is. A jelen találmányban hasznos és a nyilvánosan nem beszerezhető biológiailag aktív molekulákat kódoló gének standard rekombináns DNS módszerekkel - mint például PCR amplifikációval, genom és cDNS könyvtár bármilyen közzétett szekvenciából származó oligonukleotid próbákkal való szkrínelésével is kinyerhetők. A biológiailag aktív molekulákat kódoló bármely ismert gén felhasználható a jelen találmányban. Lásd például az 5,04 9,4 93 számú US szabadalmat; Gage et al. , 5,082,670 számú US szabadalmat; és az 5,167,762 számú US szabadalmat.
Egy kérdéses gén (azaz egy a megfelelő biológiailag aktív molekulát kódoló gén) egy megfelelő expressziós vektor klónozási helyére inzertálható standard technikák segítségével. Ezek a technikák jól ismertek a tudomány e területén képzett szakemberek számára.
A kérdéses gént tartalmazó expressziós vektor ezután a jelen találmány módszerében használandó sejtvonal transzfektálására használható. A standard transzfektálási módszerek, mint a kálcium foszfát ko-precipitáció, a DEAEdextrán transzfekció, a lipid által közvetített módszerek vagy az elektroporáció is felhasználhatók.
A jelen találmányban az osztódó sejtek szaporodásának szabályozására szolgáló módszereket biztosítunk, ahol a szaporodás és a differenciálódás közötti egyensúly úgy szabályozható, hogy differenciált, nem osztódó beágyazott sejteket biztosítson a BAO-n belül. Olyan módszert is biztosítunk, mely az osztódó és a nem opsztódó sejtek szaporodásának szabályozását is biztosítja, ahol a BAO-n belüli sejt eloszlás és sejtszám kerül szabályozásra, ami a nekrotikus sejt magok képződését és a celluláris hulladékot csökkenti.
A proliferáció és a differenciálódás génsebészeti szabályozása
A jelen találmányban módszereket és készítményeket biztosítunk a sejt szaporodás szabályozására a sejtek genetikai megváltoztatása révén egy olyan terméket kódoló gén segítségével, mely a sejtproliferációt vagy differenciálódást befolyásolj a.
A jelen találmány egy aspektusa szerint a feltételesen immortalizált (halhatatlanná tett) (feltételtől sej tvonalak függő) kerülnek felhasználásra
BAO-ban történő szaporodás szabályozásának elérése céljából. A primer sejteket egy proliierációt elősegítő terméket kódoló génnek transzformáljuk. A proliierációt elősegítő gén működőképesen kapcsolódik egy szabályozható promóterhez. Az immortalizált sejtek előállítására szolgáló Land et al., által (Natúré, 304, ··· · ···· · · · · · · csökkentett expressziójával Az onkogén csökkentett pp. 596-602, 1983), vagy Cepko által (Neuron, 11, pp. 345-53,
1988) leírt technikák rutinszerűen módosíthatók a feltételesen immortalizált sejtek létrehozása céljából.
Ezen módszer szerint, a sejt proliferáció (például a mitózis) a proliierációt elősegítő gén, mint például egy onkogén (péládul a c-myc, v-mos, v-Ha-ras, SV40 T antigén, az adenovirusból származó El-A) gátolható vagy korlátozható, expressziója az onkogén expresszióját irányító promóter lefelé ható szabályozásával, repressziójával vagy inaktiválásával érhető el, ha a BAO-t in vivő egy gazdába implantáljuk. A felfelé ható szabályozás, a szabályozható promóter in vitro aktiválása vagy derepresszálása a proliierációt elősegítő gén expresszióját eredményezi, így lehetővé teszi a sejt in vitro proliferációját. A megfelelő promóterek azok, melyek in vivő lefelé hatóan szabályozhatók, ideértve például a glükokortikoidra reagáló promótereket, mint a PNMT (Hammang et al. , Neuroprotocolsa, 3, pp. 176-83, 1993) és az interferonra reagáló (INF) promótereket, mint az Mxl (Húg et al. , Mól. Cell. Bioi. 8. pp. 3065-79, 1988; Arnheiter et al. , Cell, 52, pp. 51-61, 1990), a retrovirális hosszú terminális ismétlési promótereket, a tetraciklinre reagáló promótereket, péládul a lac promótert és az inzulinra reagáló promótereket. Lásd McDonnell et al., WO 93/23431. El kell fogadni, hogy a promóter kiválasztása a tervezett implantációs helytől függ. így például a glükokortikoid vagy IFN-re reagáló promóterek hasznosak, ha a találmány szerinti implantációt az agyban végezzük, mivel a glükokortikoid és/vagy az IFN mennyisége nagyon alacsony az agyban. így ezektói a promóterektől nem várható, hogy az • « ··· · onkogének jelentős szintű expresszióját fogják irányítani a BAO agyba való implantációjakor.
Egy megvalósulásban a feltételesen immortalizált sejtek úgy hozhatók létre, hogy egy onkogént egy szabályozható promóterhez kapcsolunk működőképesen. A promótert aktiváljuk vagy egy kötő protein jelenlétében felfelé hatóan szabályozzuk. A kötő protein termelése úgy szabályozható, ha a kötő proteint kódoló gént működőképesen egy tetraciklinre reagáló promóterhez kapcsoljuk.
Például egy megvalósulásban egy a tét represszor expressziót irányító konstitutív promótert tartalmazó transzformált sejtet tervezünk. A sejt továbbá tartalmaz egy a CMV-IE promóterhez működőképesen kapcsolódó heterológ gént is. Ha a CMV-IE promótert egy tét operátor szekvencia határolja az ezen promóterből történő expresszió kikapcsolható a tét represszorral. A tét jelenlétében transzkripció fog bekövetkezni, mivel a tét a tét represszorral kapcsolódik lehetővé téve, hogy más transzkripciós faktorok is a CMV-IE promóterhez kapcsolódjanak. Az ezen megvalósulás szerint az onkogén csupán csak akkor expresszálódik, ha tetraciklin van jelen. így a sejtek in vitro szaporíthatok tetraciklin jelenlétében.
Az implantáció előtt néhány nappal a tetraciklin eltávolítható a transzgén expressziójának csökkentése céljából és így ennek megfelelően a BAO-ban a sejt proliferáció csökkentése vagy leállítása céljából.
Egy specifikus, a feltételesen immortalizált sejteket alkalmazó megvalósulásban a szaporodás ellenőrzése úgy érhető el, ha az Mxl promótert alkalmazzuk. Az Mxl gén egy olyan .· ···» proteint kódol, mely az influenza A-val és B-vel szemben biztosít rezisztenciát. Az Mxl gént szorosan szabályozza ennek promótere. Interferon (IFN) hiányában a gén nem expresszálódik és a gén IFN-alfa és IFN-beta jelenlétében indukálható. Arnheiter et al. , (Cell 52, pp. 51-61, 1990) az Mxl transzgenikus egér létrehozásáról számolnak be, mely számos szövetben a tarnszgén interferonnal indukálható expresszióját mutatja. Az SV40 nagy T-antigén számos szövetből származó sejt transzformálására és immortalizálására képes.
Egy megvalósulásban az egér Mxl promóter az SV4 0 korai régióval fúzionáltatható és a kiméra gén transzgenikus egerek létrehozására használható. Az Mxl promóter elemek által biztosított szigorú szabályozás lehetővé teszi az onkogén szövetekben vagy a transzgenikus állatokból származó sejt tenyészetekben való expressziójának szabályozását, így lehetővé téve feltételesen immortalizált sejtvonalal létrehozását.
Az IFN-alfa vagy IFN-beta jelenlétében az ily módon termelt sejtvonalak aritmetikusan bővíthetők, mint a legtöbb sejtvonal esetében. A sejtosztódás az IFN-alfa vagy az IFN-beta eltávolításával megállítható akár a bekapszulázás előtt, akár a bekapszulázás után. Egy előnyben részesített megvalósulásban a neurális törzs sejtek (neurosférák) az Mxl-SV40 T-antigén szerkezetet tartalmazó transzgenikus egerekből állíthatók elő Weiss (PCT/CA 92/00283) módszerét használva. Az így nyert feltételezetten immortalizált neurális törzs sejtvonal ezután bekapszulázható és egy gazdába implantálható in vivő.
Továbbá, tetszés szerint a feltételezetten immortalizált neurális törzs sejt vonal további genetikai módosításnak vethető alá bármilyen számú növekedési faktor vagy ··« * • * · * · ···· ♦«·· ** neurotranszmitter molekulák standard technikákkal való felszabadítása céljából. Ebben a megvalósulásban más IFN-re reagáló promóter molekulák is felhasználhatók. Ezek a promóterek magukba foglalják a metallotioneint, a H-2K^-t, a H2D^-t, a H-2L^-t, a HLA-A3-at, a HLA-DRalfát, egy HLA I-es osztályú gént, a 202-ót, az 56K-t, a 6-16-ot, az ΙΡ-10-et, az ISG15-öt, az ISG54-et és a 2',5'-oligo(A) szintetázt. Lásd Húg et al., Mól. Cell. Bioi. 8. pp. 3065-79, 1988).
Ez a megvalósulás különösen jól illik a BAO-ba bekapszulázandó sejtekhez az agyba való implantáció esetére. Az IFN-alfa és az IFN-beta agyban keringő szintjei elegendően alacsony szintűek ahhoz, hogy az Mxl promóter által irányított transzkripciós aktivitás ne legyen elegendő a sejt proliferáció eredményezéséhez. Az alapító transzgenikus állatokban, a Tantigén expressziója számos szövetben indukálható, azonban az onkogének természetes expresszióját csak a timuszban figyeltük meg. Azonban, az onkogén timuszos expressziója egy viszonylag gyakori jelenség az SV40 korai régiót expresszáló transzgenikus állatokban. így a szignifikáns onkogén expresszió hiányában a sejtek in vivő közel nyugalmi állapotban tarthatók.
Egy másik megvalósulás azt a megfigyelést hasznosítja, mely szerint a sejt génsebészethez in vivő alkalmazott, felhasznált hagyományos retrovirális fertőzési technikákban retrovirális, például a hosszú terminális ismétlési (LTR) promóter kerül felhasználásra. Lásd például Gage et al., 5,082,670 számú US szabadalom). Az ezen promóterek által irányított gének expresszióját in vivő tipikusan lefelé hatóan szabályozzuk. Az az elképzelés, hogy ezt a lefelé ható szabályozást a keringő citokinek közvetítik. A jelen találmány «··· ···· · kihasználja a retrovirális gének ezen normálisan káros lefelé ható szabályozását a sejtek proliferációjának csökkentésére vagy megállítására, ha a sejtek a BAO-ba vannak bekapszulázva és in vivő implantált állapotban vannak. Ebben az esetben egy immortalizáló gént (onkogén) irányítunk az LTR-ből. Ez a gén fogja immortalizálni a sejteket, míg ezeket in vitro fenntartjuk és bővítjük. Az implantáció után a citokinek jelenlétében az immortalizáló onkogén lefelé szabályozódik a proliferáció csökken vagy leáll és a sejtek nyugalmi állapotba kerülhetnek a készüléken belül.
Az ezen megvalósulás szerint a feltételezetten immortalizált sejtek retrovirális fertőzéssel vagy egy retrovirális promóterhez, péládul az LTR promóterhez működőképesen kapcsolódó onkogént (például c-myc, v-mos, v-Haras, SV40 T-antigén, adenovírusokból származó El-A) tartalmazó cDNS-sel történő DNS transzfekcióval állíthatók elő. A jelen találmányban a Moloney patkány leukémia vírus (MLV), a Rous szarkoma vírus (RSV) és az egér emlő tumor vírus (MMTV) promóter szekvenciákat részesítjük előnyben.
Ezek a transzformált sejtek normálisan expresszálják az onkogént in vitro. A sikeresen transzformált sejtek szaporodnak a tenyészetben megalapozott tenyésztési technikákat alkalmazva. Az LTR-transzgén expresszió stimulálható a dexametazon vagy epidermális növekedési faktor hozzáadásával a transzformált sejtek tenyésztéséhez szükséges idő lerövidítése céljából. A sejtek citokineknek például gamma interferonnak (IFN-gamma), TNF-alfa és transzformáló növekedési faktor-bétának (TGFbeta) a előnyösen napokkal a bekapszulázás és implantáció előtt történő kitevése révén a mitózis csökkenthető az LTR által irányított • · transzgén expresszió gátlásával. Schinstein and Gage Moleccular and Cellular Approaches to the Treatment of Neurological Diseases, 71, ed. Waxman, S.G. 1993; Seliger et al., J. Immunoi. 141, pp. 2138-44, 1988; Seliger et al. , J. Virology, 61, pp. 2567-72, 1987; Seliger et al. , J. Virology, 62, pp. 619-21, 1988.
A fenti módszerrel bármely megfelelő sejt feltételezetten halhatatlanná tehető. A tudomány e területén átlagosan képzett szakember meghatározhatja egy adott sejttípus alkalmasságát a feltételezett immortalizációhoz, a tudomány e területén ismert szkrínelési módszereket használva, ideértve a jelen találmányban biztosított módszereket.
Módszereket biztosítunk az immortalizált sejtvonalak vagy más folyamatosan szaporodó sejtek szaporodásának szabályozására oly módon, hogy ezeket a sejteket úgy transzformáljuk, hogy tumor szupresszor géneket, péládul a p53 gént, vagy az RB gént tartalmazzák, a proliferáció megállítása vagy csökkentése céljából. A tumor szupresszor génekről vagy az antionkogénekról úgy vélik, hogy szaporodást kényszerítő gének. Lásd például Weinberg, Neuron, 11, pp. 191-96, 1993. Például egy vad típusú p53-aktivált l-es fragment (WAF1) szupresszálni képes a tumor sejtek szaporodását tenyészetben. Az az elmélet, hogy a p53 protein által indukált gének közvetíthetik ennek tumor szupresszorkénti biológiai szerepét. El-Deiry et al. , WAF1, a Potential Mediator of p53 Tumor Suppression, Cell, 75 pp. 817-825, 1993. A WAF1 génre CIP1 génként is szoktak hivatkozni. Más p53 álatl közvetített szaporodást gátló gének közé tartoznak a GADD45 és a GADD153 (vagy CHOP) . Lásd Ron, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, pp. 1985-86, 1994) . A fent ···· ···· ·· ·· ···· • · · · · • · · · · • · · · · • · · · megtárgyalt heterológ DNS-sel történő sejt transzformálási standard technikák a találmányban is felhasználhatók.
Egy megvalósulás szerint az immortalizált sejteket vagy a folyamatosan szaporodó sejteket egy szabályozható promóterhez működőképesen kapcsolódó tumor szupresszor génnel transzformáljuk. Egy megfelelő szabályozható vagy indukálható promóter alkalmazása lehetővé teszi a lefelé szabályozandó vagy kikapcsolandó transzgén expresszióját, ha a transzformált sejteket in vitro tenyésztjük, lehetővé téve így az expanziót. A bekapszulázás és az implantáció során a promóter indukálódik vagy felfelé szabályozódik és a tumor szuppresszor gén expressziója bekövetkezik, csökkentett vagy gátolt sejt proliferációt eredményezve.
A tirozin hidroxiláz és az eritropoietin promóterek hasznosak lehetnek a jelen találmány ezen aspektusában. Ezek a promóterek tipikusan lefelé szabályozódnak magas O2 körülmények között, mint amelyek in vitro körülmények között fordulnak elő, de alacsony O2 körülmények között, mint amilyenekkel a sejtek egy BAO-ba való bekapszulázáskor és egy gazdába való implantáció során találkoznak, felfelé szabályozódnak.
Ezenkívül, a megfelelő kapcsolt vagy depresszálható promóter rendszerek alkalmazhatók a proliferáció-szuppresszáló gének kívánt szabályozásának elérése céljából. Egy ilyen megfelelő rendszer péládul magába foglalja az API promóter és a lac operátor/PGKl promóter rendszer (Hannan et al. , Gene 13 0, pp. 233-39, 1993, írták le) alkalmazását. Az API promóter működőképesen kapcsolódik a lac represszor génhez. A lacO (lac operátor) és a 3-foszfoglicerát kináz (PGK1) promóter
........
• · · · · · · ········ · · · · működőképesen kapcsolódik a proliferáció-szuppresszáló génhez. Az exogén fórból észter in vitro hozzáadása indukálja az API promótert, ami a lac represszor protein expresszióját eredményezi. A represszor protein jelenlétében a lacO-PGKl promóter szerkezet represszálódik és nem következik be a proliferáció-szuppresszáló gén expressziója. In vivő a fórból észter hiányában a represszor protein nem expresszálódik, a lacO-PGKl promóter depresszálódik és a proliferációszuppresszáló gén expreszálódik.
Egy módszernek megfelelően egy megfelelő sejtet egy a differenciálódást indukáló terméket kódoló génnel transzformálunk. Ez a differenciálódás indukáló gén működőképesen kapcsolódik egy szabályozható promóterhez. Ezen módszer szerint a differenciálódást indukáló gén a bekapszulázás és az in vivő gazádba törénő implantáció során expresszálódna. Azonban, az expresszió in vitro lefékezhető vagy gátolható a szabályozható promóter megfelelő lefelé ható regulációjával, repressziójával vagy inaktiválásával, így lehetővé téve egy kívánt sejt vagy sejtvonal in vitro expanzióját. Ez a módszer alkalmazható osztódó sjetekkel, vagy immortalizált primer sejtekkel is. A nagy mobilitású csoport kromoszómális 14-es protein, a HMG, egy olyan génre példa, mely részt vesz a sejtek differenciálódásának szabályozásában. Bármilyen in vivő felfelé szabályozott megfelelő promóter, mely azonban in vitro kikapcsolható vagy lefelé szabályozható felhasználható ebben a megvalósulásban, amint azt korábban említettük proliferációt lefékező génekkel kapcsolatos alkalmazás során. Ezenkívül, bármely megfelelő depresszálható • · promóter rendszer alkalmazható, a fent megtárgyaltak szerint, a tumor szuppresszor gén expresszió szabályozásában.
A szaporodás szabályozásának egy másik módszerében antisense RNS-t vagy DNS-t vagy ezek származékát használjuk. Az antisense RNS vagy DNS egy egyszálú nukleinsav, mely komplementer egy gén kódoló szálával vagy az ezen gén transzkripciójából származó kódoló mRNS-sel. Ha az antisense RNS ugyanabban az időben van jelen a sejtben, mint az mRNS, az antisense RNS az mRNS-hez hibridizálódik egy kettős szálat létrehozva, melyet azután a riboszómák nem transzlálhatnak protein előállítás céljából. Antisense RNS adható a sejteknek vagy mikroinjektáláson vagy a tápközeghez való ömlesztett formában való hozzáadáson keresztül. A jelen találmány előnyben részesített módszere a célsejtek eukarióta expressziós vektorral való transzfektálására irányul. Neckers et al. , Antisense Technology: Biological Utility and Practical Considerations, Am. J. Physiol., 265 (Lung Cell. Mól. Physiol., 9) pp. L1-L12, 1993.
Ezen megvalósulás szerint egy proliferáció-t indukáló génhez vagy egy tumor szuppresszor génhez való antisense RNS-t kódoló antisense gén működőképesen kapcsolható egy indukálható promóterhez. Ha a promóter indukálódik antisense RNS termelődik. Ha a transzformált sejtek egy proliierációt indukáló gént tartalmaznak, az ezen megvalósulás szerint, az antisense RNS termelés megállna, vagy in vitro lefelé szabályozódna, lehetővé téve a sejt expanziót és in vivő felfelé szabályozódna a proliferáció megszüntetésének vagy csökkentésének elérése céljából.
• · ···· ····
Másik lehetőségként, ha a transzformált sejtek egy tumor szuppresszor gént tartalmaznak, az antisense RNS termelése felfelé szabályozódna in vitro és lefelé szabályozódna in vivő a kívánt szaporodási kontroll elérése céljából.
Ezenkívül, antisense technológia alkalmazható bármilyen a proliferációhoz vagy a differenciálódáshoz alapvető fontosságó terméket kódoló génhez való antisense gén megszerkesztéséhez. Az antisense gén expressziójának megfelelő indukciója lehetővé tenné a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára, hogy megvalósíthassa a találmány szerinti bekapszulázott sejtek kívánt szaporodási szabályozását.
Előnyben részesül egy szabályozható promóter/gén szerkezet alkalmazása, mely in vivő manipulálható abban az esetben, ha ez szükségessé válik vagy további in vivő sejt proliferációt szándékozunk indukálni. Például a korábbiakban megtárgyalt Mxl/SV40 szerkezetben IFN adható lokálisan vagy szisztémásán az onkogén expresszió indukálása céljából. Az in vivő BAO-ban levő sejt osztódás növekedése kívánatos lehet a sejtszám növeléséhez a BAO-n belüli elhalt sejtek pótlása céljából, vagy a BAO-ból származó kívánt biológiailag aktív molekula mennyiségének növelése elérése céljából.
A szaporodás és a differenciálódás szabályozásának megvalósítása kémiai vegyületekkel
A jelen találmány módszereinek megfelelően a sejtek olyan kezelésnek vethetők alá, mely gátolja a proliferációt vagy indukálja a differenciálódást. Néhány módszerben a kezelés egy kémiai vegyület vagy növekedési faktor biztosítását foglalja • · magába. Más módszerekben a kezelés egy kémiai vegyület vagy növekedési tápközegból.
faktor eltávolítását jelenti
A kezelés bekövetkezhet a bekapszulázás előtt vagy után, előnyösen a bekapszulázás előtt.
A használt protein, vagy kémiai vegyület a sejttípustól és a tervezett hatástól függ. A tudomány e területén átlagosan képzett szakember egy adott sejttípust rutin technikákkal szkrínelhet annak érzékenységére, egy vegyület, vagy protein szelektálása céljából.
Egy módszer szerint a sejt eloszlást egy olyan kezeléssel lehet szabályozni, mely magába foglalja egy proliferáció-t indukáló kémiai vegyület vagy növekedési faktor sejt szaporító tápközegböl való eltávolítását. Egy megvalósulásban a növekedési faktorok, mint péládul az epidermális növekedési faktor (EGF), a transzformáló növekedési faktor alfa (TGFalfa), az amfiregulin vagy bármely más megfelelő anyag felhasználható a törzs sejtek vagy utód sejtek - ideértve az embrionális szimpatikus ganglionok és immortalizált útód sejtekből származó sejteket, előnyösen a neurális törzs sejteket (Weiss, PCT/CA 92/00283) - proliferációjának indukálására. Ez lehetővé teszi a neuronális prekurzor sejtek in vitro biztosításának fenntartását és expanzióját. Ha ezen proliierációt indukáló növekedési faktorok hiányában végezzük a bekapszulázást, a neuránális prekurzor sejtek osztódása és differenciálódása csökken.
A neuronális prekurzor sejtek további differenciálódásra indukálhatok kezeléssel, például fórból észteres, vagy egy rögzített szubsztáron való növekedéssel, ideértve az ionosán töltéssel rendelkező felszíneket, mint például a poli-L-lizint a szaporító
BAO-ba való ·· ··· · és a poli-L-ornitint és más hasonló vegyületeket. A differenciálódás indukálható az FGF család egyik tagjával való kezeléssel is, az Ip et al (WO 94/03199) által leírt faktor családokba tartozó ciliáris neutrotóf faktor (CNTF) vagy ideg növekedési faktor (NGF) család legalább egy tagjával kombinációban.
Egy másik megvalósulásban a sztrómában termelt sokvonalú növekedési faktor, melyet hízósejt növekedési faktornak, törzs sejt faktornak, c-kit-ligandumnak vagy acél faktornak is hívnak, felhasználható a hematopoietikus törzs sejtek proliierációjának indukálására. Az osztódó sejtek biztosításának fenntartásához a hematopoietikus törzs sejteket a hízósejt növekedési faktor jelenlétében tenyésztjük. A proliferáció lefékezéséhez vagy csökkentéséhez a hízósejt növekedési faktort eltávolítjuk a tenyész tápközegből. Ezt megtehetjük a bekapszulázás előtt és után, előnyösen a bekapszulázás előtt.
Más sokvonalú növekedési faktorokra - melyek a proliierációt indukálják - szolgáló példák közé tartoznak az interleukin-3 és a granulocita-makrofág telep stimuláló faktor. A hízósejt növekedési faktor hatással lehet a sejt szaporodásra más sokvonalú növekedési faktorral kombinációban, vagy vonal specifikus növekedési faktorokkal kombinációban, péládul az eritropoietinnel. Például a hízósejt növekedési faktorról úgy vélik szinergikusan hat az IL-3-mal az erősen dúsított patkány hematopoietikus törzs sejtek proliferációjának és differenciálódásának indukálásában. Galli et al. , The Biology os Stem Cell Factor, a New Hematopoietic Growth Factor Involved in Stem Cell Regulation, Int. J. Clin. Láb. Rés. 23, pp. 7077, 1993.
A jelen találmány egy másik módszerében a BAO-n belüli sejt eloszlás szabályozását úgy lehet elérni, hogy olyan kémiai vegyületet vagy növekedési faktort biztosítunk, melyek gátolják a sejt proliierációt vagy indukálják a differenciálódást. Bármilyen proliierációt gátló vagy differenciálódást indukáló vegyület felhasználható ezen módszer szerint. A tudomány területén átlagosan képzett szakember rutinszerűen szkrínelheti az adott vegyületet, hogy meghatározza egy adott sejt típus esetében a proliierációra vagy a differenciálódásra kifejtett hatásának hatékonyságát.
Egy másik megvalósulásban a citokinek, ideértve például a transzformáló növekedési faktor betal-et (TGFbetal), felhasználhatók a sejt proliferáció gátlására vagy lefékezésére vagy a sejt differenciálódás indukálására. Például, a BHK sejtek csökkentett proliferációja és fokozott differenciálódása elérhető a TGFbetal-nek és aszkorbátnak való kitevéssel. Hasonlóképpen, a TGFbetal felhasználható a fibroblaszt sejtek a differenciálódás indukálására valamint a keratinociták és endoteliális sejtek szaporodásának inhibitoraként. Phillips et al. , Ascorbic Acid and Transforming Growth Factor-betal Increase Collagen Biosynthesis via Different Mechanisms: Coordinate Regulation of Proalfal(I) and proalfal(III) Collagens Archives of Biochemistry and Biophysics, 195, pp.
397-403, 1992.
Egy másik megvalósulásban a TGFbetal, szerotonin vagy az FGF használható a neuroendokrin sejtek szaporodásának szabályozására. A neuroendokrin sejtek szaporodása neuroendokrin • »· · szabályozható saját termékeikéi is autokrin módon. A TGFbetal egy autokrin szaporodás-gátló faktor a humán hasnyálmirigy karcinoid sejtjei (BON) számára, míg az FGF és a szerotonin autokrin szaporodás stimuláló faktorok. A TGFbetal BON sejtek szaporodására kifejtett gátló hatása megfordítható szerotonin hozzáadásával. Townsend Jr. et al. , Studies of Growth Regulation in a Neuroendocrine Cell Line Acta Oncologica, 32.
pp. 125-130, 1993.
Számos más kémiai anyag is felhasználható a jelen találmány módszerei szerint a sejtek proliierációjának lefékezésére vagy gátlására vagy a differenciálódás indukálására. Ezek közé a kémiai anyagok közé tartoznak a mitomycin C, az 5-bromo-dezoxiuridin (BrdU) , a prosztaglandin E]_ (PGE]J , a dibutiril cAMP, az 1-beta-D-arabinofuranozil citozin (Ara-C) a nikotinamid, és a heparin. A mitomycin különösen alkalmas lehet a bekapszulázott betaHC sejtvonalak proliierációjának szabályozására. Lásd például Radvanyi et al., Mól. Cell. Bioi., 13, pp. 4223-27, 1993.
Néha kémiai anyagok kombinációját alkalmazzuk. Az IMR-32 humán neuroblasztoma sejtek in vitro differenciálódásra indukálhatok, ha mitomycin C-vel és BrdU-val vagy PGE^-gyel és dibutiril cAAMP-vel (dbcAMP) kezeljük. Gash et al. , Amitotic Neuroblastoma Cells Used fór Neural Implants in Monkeys Science, 233, pp. 1420-22, 1986. A humán embrionális rhabdomyoszarkoma sejtvonal Ara-C-vel való előkezelése jelentős in vitro szaporodás gátlást, in vivő, pedig a tumorigenicitás elvesztését, és egy még differenciáltabb fenotípust eredményez még a vegyület eltávolítása után is. Crouch et al. , Ara-C
Treatment Leads to Differentiation and Reverses the Transformed ν· * «.< ·»·· • · V ·· ’· · * • « · · ·« * · « · · # ·»·#»····*·*
Phenotype in a Humán Rhabdomyosarcoma Cell Line, Experimental Cell Research, 204, pp. 210-16, 1993. A nikotinamidról (NIC) úgy vélik indukálja a humán magzati hasnyálmirigy sziget sejtek differenciálódását és érését. Otonkoski et al. , Nicotinamide
Is a Potent Inducer of Endocrine Differentiation in Cultured Humán Featl Pancreatic Cells J. Clin. Invest. 92. pp. 1459-66,
1993 .
A dbcAMP hozzáadása esetében arról számoltak be, hogy a fejlődő szövetek differenciálódását befolyásolja. Például a dbcAMP-röl úgy vélik módosítja az asztrocita prekurzorok differenciálódását, a PC12 sejtekben indukálja a neurit képződését és stimulálja a Schwann sejt proliierációt. BaronVan Evercooren et al., Schwann Cell Differentiation in vitro: Extracellural Mátrix Deposition and Interaction, Dev. Neurosci. 8, pp. 182-96, 1986. Hasonlóképpen a Schwann sejtek differenciálódása indukálható az aszkorbátnak való expozícióval is. Ibid.
Továbbá, szialoglikopeptid (SGP) molekulák használhatók a sejt proliferáció gátlására vagy lefékezésére. Például egy intakt szarvasmarha cerebrális kortex sejtekből izolált 18 kDa méretű sejt felszíni szialoglikopeptid lefékezi az exponenciálisan szaporodó Swiss 3T3 sejtek proliferációját. Lásd például Toole-Simms et al., Jour. Cell. Physiol., 147, pp. 292-97, 1991; Fattaey et al., Exp. Cell. Rés., 194, pp. 62-68,
1991. Számos transzformált és nem transzformált sejt típusról kimutatták, hogy fogékonyak néhány SGP-vel szemben. Ezek közé a sejtek közé tartoznak a gerinces és gerinctelen fajok széles kóréból származó epiteliális-szerű és fibroblaszt sejtek. Lásd ·*· · •r t például Fattaey et al. , Jour. Cell. Physiol. 139, pp. 269-74,
1989., mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak.
Méltányolni fogják, hogy a korábbiakban bemutatott néhány kezelés csupán átmeneti hatással van a proliferációra és differenciálódásra. Ezekben az esetekben kívánatos lehet egy folyamatosan újrafeltöltött vegyület vagy növekedési faktor forrást biztosítani a bekapszulázott sejtek számára ha egy gazdába in vivő implantálásra kerülnek. Ez együtt járhat egy növekedési faktor vagy vegyület biológiailag lebontható polimer nem celluláris forrásának használatával, vagy a növekedési celluláris forrásának együttes bármely más megfelelő eszköz alkalmazásával. Lásd például az 5,106,627 és 5,156,844 számú
US szabadalmakat.
faktor, vagy vegyület bekapszulázásával, vagy
A szaporodás szabályozása besugárzással
A sejt proliferáció szabályozható a sejtek egy megfelelő dózisú besugárzásnak - például röntgen sugárzás, ultraibolya (UV) sugárzás és más hasonló sugárzások - való kitevésével. Amikor a sejteket besugárzásnak vetjük alá, ezek sejtcikluson keresztüli átesésük gátolható. A kritikus dózis arány, vagy a minimum dózis arány a tudomány számára ismert módszerekkel meghatározható egy adott sejt típusra. Lásd például Stanley and Lee, Radiat Rés. 133, pp. 163-9, 1993; Mitchell et al., Radiat. Rés., 79, pp. 537-51, 1979, Péládul a normál humán epidermális keratinociták 5 és 10 mJ/cm^ UVB-vel való besugárzása jelentős (78%-ig terjedő) proliferációbeli csökkenést eredményez a besugárzás után 3-5 nappal. Prystowsky et al. , J. Invest.
• · «····· * ···········
Dermatol., 101, pp. 54-58, 1993. Yi és munkatársai (Radiation
Research, 133, pp. 163-69, 1993) a röntgen sugárzásnak való kitettséggel történő sejt proliferáció megállításához szükséges legalacsonyabb dózis kiszámítására biztosít módszert.
A szaporodás és differenciálódás szabályozása extracelluláris mátrix molekulák felhasználásával
A jelen találmányban módszert biztosítunk a BAO-n belüli sejt eloszlás szabályozására egy szaporodási felszín szaporodás szabályozó extracelluáris mátrixszal (ECM), vagy ezek alkotórészeivel való módosítása révén, magában vagy egy szaporodást szabályozó fizikai mátrixszal vagy más szaporodást szabályozó anyagokkal kombinációban.
Élő szövetben az ECM számos proteinből és poliszacharidból jön létre, melyeket a sejtek szekretálnak és az ezeket szekretáló sejtek közelében egy hálózattá állnak össze. Az ECM molekulák közé tartoznak a glükózaminoglükánok és a proteoglükánok, mint a kondroitin szulfát, a fibronektin, a heparin szulfát, a hialuron, a dermatán szulfát, a keratin szulfát, a laminin, a kollagén, a heparán szulfát proteoglükán (HSPG) és az elasztin. Különösen a kollagén az ECM in vivő fő összetevője. Az ECM molekulákról ismert, hogy sejt proliferáció csökkenést és sejt differenciálódás növekedést okoznak. Azonkívül, az acelluláris ECM, ha a találmány módszereiben kerülnek alkalmazásra, befolyásolhatják a BAO-ban bekapszulázott sejtek térbeli elhelyezkedését is.
Az ECM kinyerhető az ECM-et deponáló sejtek - ideértve a mezenhima vagy asztrocita eredetű sejteket - tenyésztésével. A • · »· ·· ·· • · · · · · • · · · · · »······ · · ·
Schwann sejtek az ECM szintetizálására indukálhatok, ha aszkorbáttal és cAMP-vel kezelik ezeket. Ezek az ECM alkotórészek hasonlítanak a Schwann sejt proliferációt elősegítő alap membrán egy prekurzorára. Továbbá, az endoteliális sejtekből természetesen termelt ECM és egy az Engelbreth Holm-Swarm tumor sejtekből (EHS) újra megszerkesztett alap membrán gél elősegíti a különböző epiteliális és endoteliális sejtek szaporodását és differenciálódását. Baron-Van Evercooren et al. , Schwann Cell Differentiation in vitro: Extracellular Mátrix Deposition and Interaction, Dev. Neurosci., 8, pp. 182-96, 1986.
Egy megvalósulásban a szaporodás szabályozás a BAO-ban levő szaporodási felszín ECM-mel (vagy ennek szaporodást szabályozó alkotórészeivel) való burkolásával érhető el. Azt részesítjük előnyben ha a BAO-ban a szaporodási felszínt olyan sejtekkel oltjuk be, melyek ECM-et termelnek és a sejteket összeérésig szaporítjuk. Ezután a sejteket detergenssel és Nt^OH-val kezeljük. A kapott BAO-t - a szaporodási felszínen az acelluláris ECM borítással - a kívánt biológiailag aktív molekulát termelő sejtekkel való bekapszulázáshoz használjuk.
Egy másik megvalósulásban az ECM-et in vitro alapjában véve azonos módon állítjuk elő, liofilezzük, fragmentáijuk és szuszpenzióként a sejtekkel keverjük. A sejt/ECM fragmenteket ezután együttesen visszük be a BAO-ba.
A néhány ECM molekula jelenlétében szaporított sejtek csökkent proliferációt és megnövekedett differenciálódást mutatnak a hagyományos monoréteges tenyészetben szaporított sejtekhez képest. Például, az adrenokortikális sejtek melyekről ismert, hogy bizonyos szteroid hormonokat, mint például aldoszteront, szintetizálnak - csökkent proliterációt mutatnak ha in vitro kollagén gél jelenlétében szaporítjuk. Fujiyama et al. , Influence of Extracelluar Mátrix on the
Proliieration and Differentiation of Adrenocortical Cells in
Culture, Path. Rés. Prect. 189, pp. 12051-14, 1993.
A Schwann sejtek is mutathatnak csökkent proliferációt és megnövekedett differenciálódást ha kollagén jelenlétében szaporítjuk ezeket.
Az endokrin sejtekről ismert, hogy in vitro akkor differenciálódnak ha a szaporodási felszínt a IV-es típusú kollagén és HSPG kombinációjával burkoljuk. A IV-es típusú kollagénre a sejt adhézióban van szükség és a HSPG a differenciálódást indukálja, de Bruine et al. , Extracellular Mátrix Components Induce Endocrine Differentiation In Vitro in NCI-H716 Cells American Journal of Pathology, 142, pp. 773782, 1993.
A fentieket beleértve számos növekedési faktor vagy kémiai anyag adható az ECM komponensekhez a sejtek proliferációjának és differenciálódásának további szabályozása céljából. A növekedési faktorok in vitro a sejtekhez adhatók az implantáció előtt vagy in vivő a sejtekhez adhatók, vagy mind a két eset alkalmazható. Lásd péládul az 5,156,844 és az 5,106,627 számú US szabadalmakat, melyek olyan módszerekre utalnak, melyekkel növekedési faktorokat szállítunk növekedési faktorok közösen bekapszulázott celluláris vagy nem celluláris forrásaként. Ezenkívül, az ECM molekulák származtathatók szaporodást szabályozó peptidekkel is ismert technikák segítségével.
Például a transzformáló növekedési faktor-beta - mely magában modulálja a sejt szaporodást és mely reverzibilisen kötődik bizonyos ECM molekulákhoz (például dekorin) hozzáadható az ECM-hez az ECM moelkulák szaporodás gátló hatásának erősítése céljából.
Hasonlóképpen a heparinról szintén kimutatták, hogy megakadályozhatja a nem transzformált és a transzformált sejtvonalak szaporodását. Matuoka et al. , Cell Structure and Function, 9. p. 357, 1984.
Az alap fibroblaszt növekedési faktorról is kimutatták, hogy fokozza az endokrin sejt differenciálódást ha ECM komponensekkel együtt alkalmazzák. Lásd, de Bruine et al. , Extracellular Mátrix Components Induce Endocrine Differentiátion In Vitro in NCI-H716 Cells, American Journal of Pathology, 142, pp. 773-782, 1993.
A növekedési faktorok a sejtekre különböző hatásokat fejthetnek ki ha különböző ECM komponensekkel együtt alkalmazzák ezeket. Péládul, a fibroblaszt növekedési faktorról (FGF) kimutatták, hogy hatékony differenciálódást elősegítő faktor és gyenge mitogén a lamininen szaporodó kromaffin sejtekre nézve. Azonban, ha FGF-et adunk hozzá a kollagénen szaporodó kromaffin sejtekhez az FGF gyenge differenciálódást elősegítő faktor és erős mitogén. Ezt a tulajdonságot mutatták ki a ciklikus AMP analóg (8-(4-klorofeniltio) ciklikus AMP) esetében. Chu et al., Neuroscience, 95, pp. 43-54, 1994.
Az 1. táblázat az olyan ECM molekulák, növekedési faktorok és kémiai vegyületek egy részleges listája, melyekről ismert, hogy hatással vannak a proliierációra és a differenciálódásra bizonyos sejttípusok esetében.
• · • · • · · · · · · • · · · • · · · · ···· ···· · ·
1. táblázat: A
ECM molekulák,
Sejt típus
Schwann proliferációt és a differenciálódást befolyásoló növekedési faktorok és kémiai vegyületek differenciálódás indukáló/szaporodás gátló aszkorbát; kollagén (Vitrogen); kultiszférák/agaróz proliferáció elősegítő
TGF-beta;
dbcAMP • · ·· ··· · • · · · · • · · · · • · · · ·
PC12 NGF; dbcAMP; SGP
fibroblasztok TGF-beta-1; kulti- Vitrogen
mioblasztok szférák/agaróz; aszkorbát; SGP kollagén; aszkorbát
neurális törzs laminin; peptid 2000 EGF; bFGF; TGF
kultiszférák/peptid alfa; amfiregu
2000; fórból észter; lin
humán embrionális heparin; FGF és (CNTF vagy NGF) Ara-C
rabdomyoszarkoma sejtvonal humán magzati nikotinamid (NIC)
hasnyálmirigy sziget sejtek asztroblasztok dbcAMP
Swiss 3T3 SGP
adrenokortikális kollagén
1. táblázat (folytatás) endokrin IV-es típusú kollagén + HSPG; bFGF + ECM kromaffin komponensek
FGF + laminin; 8-(4kloro-feniltio)ciklikus
AMP + laminin
FGF + kollagén;
8-(4-klorofeniltio)ciklikus AMP + kollagén • · ···· ···· hematopoietikus emlő sejt növekedési faktor
BHK keratinociták endoteliális sej neuroendokrin (humán hasnyálmirigy karanoid sej tek (BON)) humán neuroblasztoma
IMR-32 sejtvonal
SCT-1
TGFbeta-1 + aszkorbát; az E15 patkány meningeális sejtekből származó ECM
TGFbeta-1 tek TGFbeta-1
TGFbeta-1 mitomycin C +
BrdU; ΡΟΕτ + dbcAMP
SGP kollagén; aszkorbát
TGFbeta-1 aszkorbát;
szerotonin
FGF
A BAO-n belüli szaporodási felszín magába foglalja a BAO luminális felszíneit, azonkívül más szaporodási felszíneket is, mint péládul egy belső támasztékot, mely a BAO-n belülre ágyazható.
A mikrohordozók felszínt biztosíthatnak a sejt szaporodáshoz. A mikrohordozók használata nagyobb bekapszulázandó sejtszámot tesz lehetővé és egyenletesebb eloszlást a BAO-n belül, különösen azon sejtek számára, melyek szaporodással kapcsolatban gátoltak lesznek. A mikrohordozók számos típusa szerezhető be a kereskedelemben, ideértve a Cytodex (Sigma, St. Louis, MO) dextrán mikrohordozókat és a CultiSpher (HyClone Labs, Logan, UT) makropórusos zselatin ···· ···· mikrohordozókat és az üveg mikrohordozókat. Ezeket a mikrohordozókat gyakran használják a rögzítés függő sejtek tenyésztésére. Azon sejtvonalak közé, melyekről kimutatták, hogy makroporózusos zselatin mikrohordozókon szaporodnak, tartoznak az OBHK, a BHK-21, az L-929, a CHO-K1, az rCHO, az MDCK, a V79, az F9, a HeLa és az MDBK. A míkrohordozók készíthetők ECM molekulákból vagy burkolhatok ECM molekulákkal (mint például FACT kollagén burkolt mikrohordozók (Solo Hill labs, Ann Arbor, MI)), vagy acelluláris ECM molekulákkal, alapjában véve a fent leírtak szerint.
Egy előnyben részesített megvalósulásban a kívánt biológiailag aktív molekulákat termelő sej etek az ECM-mel burkolt mikrohordozó felületekre olthatok és a mikrohordozókon szaporíthatok in vitro, a bekapszulázást és az implantációt megelőzően. Cherksey (WO 93/14790) a sejtek üveg vagy műanyag gyöngyökön való szaporítására utal, majd a mikrogyöngyök ezt követő recipiens agyba való implantációjára.
Egy másik megvalósulásban a jelen találmány szerint, a mikrohordozókra oltott sejtek egy megfelelő szaporodást gátló mátrix jelenlétében szuszpendálhatók, majd a BAO-ba kapszulázhatok. Az ilyen mátrix anyag (például agaróz, vagy agar a fibroblasztok esetében; kollagén az adrenokortikális sejtek esetében) fizikailag gátolja a sejtek további szaporodását. Ilyen hidrogél mátrixokról ír például Dionne WO 92/19195, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak.
A jelen találmány egy másik aspektusa szerint az agaróz az ECM helyettesítöjeként alkalmazható peptid szekvenciákkal való származtatással a sejtek mátrixhoz való kapcsolódásának befolyásolása céljából. Például agaróz hidrogélek agaróz
Például származtathatók a laminin vagy fibronektin peptid szekvenciáival.
Ebben a módszerben a sejteket a sejt adhézióban résztvevő sejt felszíni receptort felismerő peptid szekvenciával származtatott agarózból álló 3-D mátrixokban szuszpendáljuk. Számos peptid szekvenciáról kimutatták (a 2-D-ben), hogy elősegítik a sejt adhéziót. Lásd péládul Pierschbacher et al. , Science, 309, pp. 30-33, 1984 ; Gráf et al. , Biochemistry, 26, pp. 6896-900, 1987; Smallheiser et al., Dev. Brain Rés. 12, pp. 136-40, 1984; Jucker et al., J. Neurosci. Rés., 28, pp. 507-17, 1991. A jelen találmány származtatott agaróz mátrixai a megfelelő molekuláris utasításokat prezentálhatják a sejt adhézióhoz a 3-D-ben. Az agaróz koncentráció előnyösen 1,25 % w/v, vagy kevesebb, legelőnyösebben körülbelül 1,0 %. Az RGD tartalmú szekvenciákat (azaz az AraGlyAsp; a 2. számú szekvencia AA2AA4-e), az YIGSR tartalmú szekvenciákat (TyrlleGlySerArg; az 1. számú szekvencia AAg-AAg-e), az IKVAV tartalmú szekvenciákat (IleLysValAlaVal; a 3. számú szekvencia AA]j-AAi5-e) és más hasonló szekvenciákat részesítünk előnyben. A származtatás egy bifunkcionális párosító anyag használatával valósítható meg, mint például az l'l karbonil-diimidazollal vagy bármely más megfelelő módszerrel.
Az ECM alkotórészek helyett történő agaróz használatának egy kifejezett előnye az, hogy a természetesen előforduló ECM komponensek enzimatikusan lebonthatók az idő múlásával in vivő, míg az agaróz nem bomlik le könnyen. Az agaróz alkalmazása azért is előnyős, mert ez egy határozott összetételű anyag, a Matrigélhez hasonló anyagoktól eltérően, mely egy tumor sejtvonalból származik és ezért egy nem határozott összetételű anyag. Specifikusan, kimutatták, hogy a Matrigel bFGF-et - egy számos sejt típus számára hatásos mitogén anyagot - tartalmaz. Az agaróz egy tiszta, termoreverzibilis, poliszacharidokból készített hidrogél. Azon kívül, hogy fizikailag korlátozza a sejt kinövést, maga az agaróz gátolja a proliierációt és differenciálódást indukál. Lásd, péládul Aulthouse, in Expression of the Humán Chondrocyte Phenotype In Vitro In Vitro Cellular & Developmental Biology, 25, pp. 659-668, 1989.
Az agaróz kémiailag módosítható származékokkal, péládul PEO-PDMS-sel, hogy tovább gátolja a sejt kinövést, előnyösen a sejtekre kifejtett toxikus hatás nélkül.
Értékelendő, hogy a különböző sejt típusok különböző érzékenységet mutatnak egy adott ECM molekulával szemben, vagy egy adott forrás acelluláris ECM-jével szemben. Lásd péládul End and Engel, Múltidomain Proteins of the Extracellular Mátrix and Cellular Growth, pp. 79-129, in Receptors Fór Extracellular Mátrix [Eds] McDonald and Mecham, Academic Pree, New York, 1991, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak. A tudomány e területén átlagosan képzett szakember könnyen szkrínel egy sejt típust, egy ECM molekulával, vagy egy specifikus forrásból származó acelluláris ECM molekulával szembeni érzékenységének meghatározása céljából, a sejt eloszlás szabályozásában tapasztalható hatékonyságának meghatározása céljából.
Szaporodás szabályozás a BAO-ban levő szaporodási felszín módosításával • · • ·· ···· ···· ··
Módszereket biztosítunk a sejt szaporodás szabályozására a BAO-ban oly módon, hogy kémiailag módosítjuk a szaporodási felszínt a BAO-ban található sejtszám és sejt elhelyezkedés szabályozása céljából. A mesterséges biológiai szerven belüli szaporodási felszínek oly módon módosíthatók, hogy szabályozzák a sejtek szaporodási felszínhez való kapcsolódását. A BAO-n belüli szaporodási felszín lehet a BAO luminális felszíne, vagy egy belső membrán, mikrohordozó vagy egy a BAO-ba helyezett belső támaszték. A mikrohordozókkal és a belső támaszték megvalósulásokkal a sejtek ezeken a szerkezeteken in vitro tenyészthetők, majd a BAO-ba kapszulázhatok az implantáció céljából.
A BAO membrán különböző ismert módszerekkel módosítható, ideértve a kémiai módosítást, a karboxilsav, amin vagy hidroxil csoportok vagy más reakcióképes funkciós csoport létrehozása céljából, vagy módosítható abszorpcióval. Ezek a reakcióképes funkciós csoportok melyek máskülönben nincsenek jelen a polimer gerincen, ezután a további származtatás helyeiként használhatók.
Egy megvalósulásban a BAO luminális felszíne úgy módosítható, hogy elősegítse az ehhez való celluáris kapcsolódást. A luminális felszínhez történő szabályozott sejt kapcsolódás hasznos lehet a sejtek túlélésének fokozása céljából. A sejtek előnyösen a membránhoz való kapcsolásával a kapszulán belüli egyenletes sejt eloszlást eredményezhet kevesebb sejttel, mint amit az immobilizálási technikák során használunk egy hidrogél szuszpenziót használva. A kisebb sejtszám felhasználása kisebb mennyiségű sejt hulladékot eredményez. Másik előny a tápanyagok sejtekhez való fokozott • · diffúziója, mivel a sejtek szoros közelségben vannak a membránnal. Ha membrán módosítást mátrix anyag nélkül használjuk a kapszulában a gélen keresztüli transzporttal kapcsolatos, valamint a proteinek vagy sejt termékek mátrix anyaghoz való adszorpciójával kapcsolatos komplikációk is elkerülhetők. A celluláris kapcsolódás elősegíthető a BAO luminális felszín különböző molekulasúlyú poli(d-lizin)-nel való kezelésével. A poli(d-lizin) a BAO luminális felszínre adszorbeálódhat egy 11-es pH értékű puffereit oldatból. A körülbelül 67000 g/mol poli(d-lizin)-t részesítjük előnyben.
Ezenkívül azt találtuk, hogy a peptid származékok, péládul az RGD tartalmú szekvenciák (ArgGlyAsp; a 2. számú szekvencia AA2~AA4-e), az YIGSR tartalmú szekvenciák (TyrlleGlySerArg; az 1. számú szekvencia AAg-AAg-e), ideértve a CDPGYIGSR (CysAspProGlyTyrlleGlySerArg; 1. számú szekvencia), valamint az IKVAV tartalmú szekvenciák (IleLysValAlaVal, a 3. számú szekvencia AA]_]_-AA.]_5-e) (előnyösen CysSerArgAlaArgLysGlnAlaAla SerlleLysValAlaVAlSerAlaAspArg 3. számú szekvencia), különösen hasznosak a celluláris kapcsolódás elősegítésében. Péládul az RGD (ArgGlyAsp; a 2. számú szekvencia AA2~AA4~e) ezen peptidek leggyakoribbika kémiailag kapcsolható a BAO membránhoz ismert technikákat használva. Néhány RGD (ArgGlyAsp; a 2. számú szekvencia AA2~AA4-e) tartalmú molekula beszerezhető a kereskedelemben -- péládul PepTite (Telios).
Egy másik megvalósulásban a BAO mebrán módosítható, hogy gátolja a sejtkapcsolódást például a PEO-PDMS vagy poli(dlizin)-alginát adszorpción keresztül. A PEO-PDMS módosítást részesítjük előnyben, kükönösen, ha a szaporodási felszín porózus. Ez azért van így, mert a PEO-PDMS a pórusokon it II ·* ·*»· • β · · · * • · · ♦ · • · · · · · «· · · · * · keresztük diffundál és a felszínhez adszorbeálódik ahogy keresztül halad a pórusokon a hidrofób-hidrofób kötődések révén. Különösen az alacsony molekulasúlyú (600-3000 g/mol) PEO-PDMS részesül előnyben.
Ez a megvalósulás különösen akkor hasznos, ha a sej étkét mikrohordozókon szaporítjuk és BAO-ba kapszulázzuk. Ily módon egyenletes sejt eloszlás érhető el, a sejtszám szabályozható és a sejt adhézió a mikrohordozóra korlátozható.
Eznekívül a sejt kapcsolódást elősegítő és gátló anyagok kombinációban is alkalmazhatók. Például a BAO luminális felszíne a sejt kapcsolódást gátló vegyületekkel kezelhető és a sejteket hordozó mikroszférák, vagy a sejteket körülvevő mátrix (ha használunk ilyet) kezelhető a sejt kapcsolódást elősegítő vegyületekkel.
Egy másik megvalósulásban a BAO belső része megváltoztatható egy inért állványzat BAO-ban való biztosításával a sejtek bejuttatása előtt. Ez az állványzat egy olyan szerkezetet biztosít, mely a sejtek adhézióját és a kapszulán belüli egyenletes sejt eloszlást segíti elő. Egy inért állványzat előállításában hasznos vegyületek közé tartoznak a poli(hidroxietil metakrilát)(PHEMA) és a poli(hidroxietil metakrilát-ko-metil metakrilát) (PHEMA/MMA). Továbbá, az állványzat származhat különböző kémiai anyagokból vagy proteinekből, ideértve a korábban tárgyal vegyületeket, a szaporodás és differenciálódás további szabályozása céljából. Ezen módszer szerint egy megfelelő állvány anyag oldata kicsapatásra kerül a BAO-ban a kívánt állvány létrehozása céljából.
» ··+ · • i - · * V » k « · » · ·, · • · · · · · · ··»«···« ·· * ·
Egy másik megvalósulás a sejtek egy olyan membránon való tenyésztését jelenti, mely belső támasztékként szolgál. A belső támszték bármilyen alapjában véve biokompatibilis anyagból készülhet, mint péládul titánból, vagy egy megfelelő polimerből. A támaszték lehet egy gerenda (támasztórúd) formájú, vagy tervezhető úgy, hogy egy állványzatként funkcionáljon, nagy méretű felületi területet biztosítva a sejtszaporodáshoz. Egy ilyen állványzati anyagra példa a nemfonott poliészter szövet (NWPF)(Reemay, Tennessee). Számos NWPF típus létezik, a szőtt lap szövés szorosságának és vastagságának változásával. Az ilyen technikák lehetővé teszik a BAO-ban levő sejtszám pontos szabályozását valamint a sejt/állványzat BAO-ba való inzertációja előtti kvalifikálását. Ezenkívül az ilyen anyagon szaporított sejtek differenciálódása (a készülékhez képest külső) bekövetkezhet az anyag készülékbe történő inzertálása előtt. Egy ilyen állványzat is módosítható péládul sejt adhéziós peptidekkel, a celluláris differenciálódás indukálása céljából. Ezenkívül az anyag fokozza a BAO szilárdságát. A belső támasztékot tartalmazó BAOk összeállítása a függő SN 08/105,728 számú szabadalomban került leírásra.
Az ezen találmányban hasznos BAO-k tipikusan legalább egy szemipermeábilis külső felszín membránnal vagy burokkal rendelkeznek a sejtet tartalmazó nag körül. A burok lehetővé teszi a tápanyagok, biológiailag aktív molekulák és más kiválasztott termékek BAO-n keresztüli diffúzióját. A BAO biokompatibilis és előnyösen immunoizolációs. A mag izolált sejteket tartalmaz vagy egy folyadék tápközegben szuszpendálva vagy egy hidrogél mátrixban immobilizált formában.
• J « · ·” · ··»· ····
El kell fogadni, hogy a korábbiakban leírt, a BAO-n belüli sejt eloszlás szabályozására szolgáló módszerek és készítmények nem kizárólagosak. Kívánatos lehet különböző módszerek és készítmények kombinációban történő alkalmazása a kívánt szaporodási kontroll elérése céljából.
Például kívánatos lehet olyan sejteket előállítani, melyeket genetikusán módosítottunk oly módon, hogy egy szaporodást szabályozó gént tartalmazzanak a jelen találmány szerint, ezeket a sejteket ECM mikrohordozókon sszaporítjuk és a sejt/mikrohordozó csoportokat egy olyan BAO-ba ágyazzuk, melyben legalább egy szaporító felszínt a sejt eloszlás szabályozására módosítottunk.
A BAO beágyazó membránja olyan anyagból készíthető, mely azonos a mag anyagáéval, vagy készülhet különböző anyagból. Bármelyik esetben egy a BAO-t körbevevő vagy perifériás membrán régió - mely permszelektív és biokompatibilis - jön létre. A membrán megszerkeszthető úgy is, hogy tetszés szerint immunoizolációs legyen.
A felhasznált anyagok kiválasztását a BAO megszerkesztéséhez számos tényező befolyásolja és részletesen Dionne írja le (WO 92/19195). Röviden, különböző polimerek és polimer keverékek használhatók a kapszula burok előállítására. A polimer membránok, melyek a BAO-t képezik és az azokban levő szaporodási felszínek közé tartoznak a poliakrilátok (ideértve az akril kopolimereket) , a polivinilidének, a polivinil klorid kopolimerek, a poliuretánok, a polisztirének, a poliamidok, a cellulóz acetátok, a cellulóz nitrátok, a poliszulfonok, a polifoszfazének, a poliakrilonitrilek, a ·· · · ·· ·· · · · · • · · ·· ·· · · • · · · · · · • · · · · · · ···········« poli(akrilonitril/kovinil klorid), valamint ezek származékai, kopolimerei és keverékei.
A BAO-kat a tudomány e területén ismert bármely módszerrel előállíthatjuk. Egy ilyen módszer magába foglalja egy polimer kiöntő oldat és egy koaguláns - biológiai szövet fragmenteket, szerveket, vagy sejtek és/vagy terápiás anyagok szuszpenzióját is magába foglalhatja - koextrúzióját, amint azt Dionne (WO 92/19195) valamint az 5,158,881, 5,283,187, és 5,284,761 számú
US szabadalmak (melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak ) leírják.
A burkolat lehet egyrétegű (1-es, vagy 2-es típusú) vagy lehet kétrétegű (4-es típus). Egy egyrétegű üreges rost létrehozható úgy, hogy a koextrudáció során csökkentjük a a polimer oldat egyik felszínét. A kétrétegű üreges rost úgy hozható létre, hogy a koextrudáció során a polimer oldat mindkét felszínét csökkentjük. Tipikusan az 1-es típusú üreges rost külső felszínének nagyobb százalékát borítják makropórusok a 4-es típusú üreges rosthoz képest. A 2-es típusú üreges rost egy köztes termék.
Számos kapszula konfiguráció ismert, mint péládul a hengeres, a korong alakú vagy a kerek.
A BAO burokja olyan pórus mérettel rendelkezik, mely a permszelektív membrán nominális molakulasúly határait (nMWCO) határozza meg. Az nMWCO-nál nagyobb molekulák fizikailag akadályozottak a membránon való áthaladásban. A nominális molekulasúly határokat a konvektív körülmények közötti 90%-os visszatartásként határozzuk meg. Az olyan esetekben, amikor a BAO immunoizolációs kell legyen a membrán pórus méretét úgy választjuk meg, hogy lehetővé tegye a sejtek által termelt ·· ·· · · ·· ··· • · · ·· · · · • · · · · · · • · · · · · · ········ · · · · adott faktorok hordozóhoz való diffúzióját, azonban kizárja a gazda immun válasz faktorainak BAO-ba való bejutását. Tipikusan az nMWCO 50-200 kD közötti, előnyösen 90-150 kD közötti. A legmegfelelőbb membrán összetétel minimalizálja a gazda immun effektor molekuláinak (melyekről ismert, hogy az implantációs helyen jelen vannak) és a BAO kölső membrán komponenseinek kölcsönhatását.
A BAO magját úgy szerkesztjük meg, hogy egy megfelelő helyi környezetet biztosítson az abban izolált adott sejtek számára. A mag tartalmazhat egy folyadék tápközeget a sejtszaporodás fenntartásához. A folyadék magok különösen alkalmasak a transzformált sejtvonalak, mint péládul a PC12 sejtek fenntartásához. Másik lehetőségként a mag állhat egy gél mátrixból. A gél mátrix állhat egy hidrogélből (alginát, Vitrogen, stb) vagy extracelluláris mátrix komponensekből. Lásd például Dionne WO 92/19195.
A hidrogéleket létrehozó készítmények három általános osztályba sorolhatók. Az első osztály egy nettó negatív töltést (péládul az alginát) hordoz. A második osztály egy nettó pozitív töltést hordoz (péládul kollagén és laminin). A kereskedelemben beszerezhető extracelluláris mátrix komponensekre szolgáló példák közé tartoznak a Matrigel és a Vitrogen. A harmadik osztály egy nettó semleges töltést hordoz (erősen keresztközött polietilén oxid, vagy polivinil alkohol).
A BAO zárásának bármely megfelelő módszere alkalmazható ideértve a polimer adhéziós és/vagy zsugorításos, csomózásos vagy hőzárásos módszereket. Ezek a zárási technikák ismertek a tudomány e területén. Ezenkívül bármely megfelelő száraz zárási módszer felhasználható. Az ilyen módszerekben egy alapjában véve nem porózusos illesztést biztosítunk, melyen keresztül a sejteket tartalmazó oldatot bejuttatjuk. A töltés után a BAO-t zárjuk. Ilyen módszer került leírásra a 08/082407 számú US szabadalomban, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak.
Egy vagy több in vitro vizsgálatot előnyösen felhasználunk a BAO funkcionalitásának létrehozására a in vivő implantáció előtt. A tudomány számára jól ismert vizsgálatok vagy diagnosztikai tesztek felhasználhatók ebből a célból. Lásd például Methods in Enzymology, Abelson [ed] Academic Press, 1993. Péládul az ELISA (enzim kötött immunoszorbens vizsgálat), kromatográfiás vagy enzimatikus vizsgálatok vagy a szekretált termékre specifikus biovizsgálatok is alkalmazhatók. Tetszés szerint egy implantum szekréciós funkciója nyomon követhető oly módon, hogy a megfelelő mintákat összegyűjtjük (péládul szérumot) a recipiensből és vizsgáljuk. Ha a recipiens főemlős mikrodialízis alkalmazható.
A BAO-k száma és a BAO-k mérete megfelelő kell legyen a terápiás hatás létrehozásához az implantáció során, ezt az adott alkalmazáshoz szükséges biológiailag aktív molekulák mennyisége révén határozzuk meg. terápiás anyagokat felszabadító szekréciós sejtek esetében standard dózis szempontok és a tudomány számára ismert kritériumok veendők figyelembe a kívánt szekréciós anyag mennyiségének meghatározása céljából. A figyelembe veendő faktorokat Dionne (WO 92/19195) írta le.
A BAO implantációját steril körülmények között végzik.
Általában a BAO-t a gazdában olyan helyen helyezik el, ami megfelelő a szekretált termék vagy funkció gazdának való • · · • · · · · · · • · · · · · · ········ ·· · t biztosításához, valamint a tápanyagok bekapszulázott sejtekhez vagy szövetekhez való eljuttatásához, ezenkívül lehetővé teszi a BAO visszanyerését és/vagy visszahelyezését. Az előnyben részesített gazda egy főemlős, legelőnyösebben egy ember.
Számos implantációs hely figyelembe vehető. Ezen implantációs helyek közé tartozik a központi ideg rendszer, ideértve az agyat, a gerincvelőt és a szem vizes és üvegszerű részeit. Az agyban előnyben részesített helyek közé tartozik a striatum, a cerebrális cortex, a szubthalmikus magok és a Meynert basális magjai. Az egyéb előnyben részesített helyek közé tartoznak a cerebrospinális folyadék, leginkább a szubarachnoidális tér és a laterális ventrikulumok. A jelen találmány fontolóra veszi a vese szubkapszuláris helyre való implantációt is, valamint az intraperitoneális és szubkután helyeket, vagy bármely más terápiásán hasznos helyet.
A jelen találmány jobb megértése céljából a következőkben példákkal szemléltetjük a találmányt. A példák csupán illusztratív célúak és semmilyen módon nem szándékozzuk ezekkel a találmány körét korlátozni.
1. példa
Szaporodási szabályozás Mxl promóter alkalmazásával
Az egér Mxl promótert az SV40 korai régióval
fűzionáltatjuk és a kiméra gént transzgenikus egerek
létrehozására használjuk. Mivel az Mxl promóter elemek IFN-alfa
vagy IFN-beta jelenlétében indukálódnak, a transzgenikus állatokból előállított szövetekben vagy sejttenyészetekben az ···· ···· onkogén expresszió szabályozható. Ily módon, feltételesen immortalizált sejtvonalak hozhatók létre.
Transzgenikus egerek létrehozása
Az általunk használt Mxl-Tag szerkezet körülbelül 2 kb hosszúságú Mxl prmótert (azaz Xbal-EcoRl fgragment) tartalmaz egy intakt SV40 korai régió cDNS-éhez fúzionálva, mely mind a nagy T és kis T antigéneket kódolja és az egér béta globin 3' nemtranszlált régiótól és a poli-A szignáltól (BamHl-Xbal fragment) upstream fúzionálódik. A béta globin szekvenciákat azért vettük be, hogy hasítási helyeket biztosítsanak és fokozzák a cDNS trangenikus állatokban való expresszióját. Az
1. ábra az Mxl szerkezet plazmid térképét mutatja.
Az Mxl-tag szerkezetet magukba foglaló transzgenikus egereket az egysejtű megtermékenyített egér petesejtbe való pro-nukleáris mikroinjektálás standard technikájával állítjuk elő (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, pp. 44384442, 1985) . Az alapító állatokból származó szövetek Southern lenyomat analízise megerősíti, hogy a transzgén intakt kópiái beépültek a genomba.
Az ezen egerek utódairól az SV40 korai régiót felismerő PCR amplimerekkel megállapítjuk, hogy DNS pozotívak.
Feltételezetten immortalizált törzs sejtek
Striatumot távolítunk el E15 tarnszgenikus egér embriókból és DNS negatív alom tagjaiból, és primer (individuális) sejt tenyészetbe szélesztjük EGF tartalmú neuroszféra tápközegben ·· · · • · ·· · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · * < ·····«······ (100 ml-enként 50 ml DDH2O-t, 10 ml 10 x DMEM/F12-öt, 2,0 ml 30%-os glükózt, 1,5 ml NaHCC^-at, 0,5 ml ΙΜ-os HEPES-yt, 1,0 Lglutamint, 10 ml 10 x hormon keveréket, 25 ml DDH2O-t (a szűrő mosásához) tartalmaz). A neuroszférákat Weiss módszerének (PCT CA 92/00283) és Reynolds and Weiss módszerének (J. Neuroscience, 12, pp. 4565-74, 1992) megfelelően készítjük el.
A sejteket hetente hét alkalommal oltjuk át, majd két csoportra osztjuk: exogén interferon (IFN) nélkül és IFN-nel. A sejteket T25 lombikokba helyezzük a szélesztési sűrűség 500000 sejt/5 ml EGF tartalmú neuroszféra tápközeg. 1000 egység/ml IFN-t adunk a sejtek feléhez. A kontroll neuroszférák nem kapnak IFN-t. A sejteket 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk 5% CO2 alatt és hetente átoltjuk.
átoltás után (23 IFN-nel) a sejteket szérum tartalmú tápközegbe helyezzük (DMEM, 5% magzati borjú szérum, és 1 x Lglutamin 1000 egység IFN-nel 1,25 millió sejt/15 ml) . A friss IFN-t minden másnap adjuk a tápközeghez.
Néhány nappal később a tápközeget eltávolítjuk a sejteket Hank-féle egyensúlyi sóoldattal mossuk (HBSS) és a lombikokat enyhén tripszinizáljuk. A sejteket 10 ml szérum tartalmú tápközegben reszuszpendáljuk, 1000 rpm fordulatszámon 2 perciűg centrifugáljuk és a tápközeget levegőztetéssel eltávolítjuk. Ekkor a sejteket 2 ml szérumos tápközegben reszuszpendáljuk triturálással egy tűzön fényesített (fire-polished) pipettával.
Megközelítően 25000 sejtet szélesztünk poli-ornitin kezelt fedölemezekre DMEM-ben 5% FBS-sel. A fedőlemezek feléhez IFN-t adunk (1000 egység/ml) minden másnap. A sejteket SV40 T antigénre (Tag) és gliás fibrillás savas proteinre (GFAP) egy köztes szálas fehérje, mely specifikusan asztrocitákban • · expresszálódik kölkönbözö intervallumokban - festjük az alábbi eljárást alkalmazva.
A fedölemezet 0,1 M-os foszfát puffereit sóoldatban (PBS) levő 4% paraformaldehidbe merítjük 20 percre szobahőmérsékleten, majd kétszer 5 percig mossuk PBS-ben. A sejteket permeabilizáljuk 100% EtOH-ban 2 percig, majd ismét kétszer öt percig mossuk 0,1 M PBS-ben. A sejteket 0,1 M PBSben hígított 5% NGS-sel (normál kecske szérum) blokkoljuk legalább 30 percen keresztül szobahőmérsékleten. A primer antitesteket összegyűjtjük és 2 órán keresztül 1% NGS-sel hígítjuk, majd a fedölemezekre adjuk szobahőmérsékleten az alábbiak szerint: anti-Tag-ot (egér monoklonális) 1:10 arányban hígítjuk, az anti-GFAP-t (nyúl poliklonális) 1:500 arányban hígítjuk. A primer antitesteket eltávolítjuk és a fedőlemezeket kétszer 5 percig PBS-sel mossuk.
A másodlagos antitesteket összegyűjtjük és 1% NGS-ben hígítjuk, majd 30 perig a fedőlemezekre helyezzük szobahőmérsékleten és sötétben a következők szerint: GAM-FITC (1:128); GAR-Texas Red (1:100 hígítás). A másodlagos antitesteket eltávolítjuk és a fedőlemezeket kétszer 5 percig PBS-sel mossuk sötétben.
A fedólemezeket Citifluorral (vagy valami más tartós (anti-fadent) preparáló közeggel) tárgylemezekre helyezzük és 4 C° hőmérsékleten tároljuk egy fluoreszcensz mikroszkóppal való vizsgálatig (a mikroszkóp rodamin és fuoreszcein optikákkal van felszerelve).
Ezekben a kísérlet sorozatokban azt akarjuk meghatározni, hogy milyen gyorsan esik a T-antigén szintje az interferon eltávolítása mellett. Ezenkívül az is érdekelt bennünket, hogy • · • · meghatározzuk a T-antigén szintjének hatását a sejt proliierációra és differenciálódásra.
A differenciálódást a GFAP szint nyomonkövetésével vizsgáljuk. A GFAP egy olyan köztes szálas protein, mely sepcifikusan az érett asztrocitákban expresszálódik. A következő fluoreszcensz erdményeket figyeltük meg.
Nap IFN (1000 egység/ml) Tag GFAP Kontrol Tag (IFN nélkül) GFAP
1 ++ + + + + -
4 + + + + + /-
7 + + + + /- + /-
10 + + + - +
így, amint azt a Tag és GFAP immunofestéssel kimutattuk, a
szérumos tápközegben eltöltött idő után az IFN-nel kezelt
sej tek azt mutatják, hogy folytatják a T-antigén
expresszálását, folytatják a proliierációt, nincs bizonyíték a GFAP expresszióra, míg a kontrollok (IFN nélkül) elkezdik a differenciálódást (a GFAP expresszió felfelé szabályozása) és csökken az osztódásuk. Ezt a fedőlemezek vizuális megfigyelése is alátámasztja -- egyértelmű különbség látható a 4. napon a sejtszámban. A 10. napra az IFN-kezelt sejtek sokkal nagyobb számban vannak, mint a kontroll sejtek.
Az SV40 T-antigén expressziója ebben a szerkezetben dózisfüggő módon szabályozódik. A létrehozott sejtvonalakban maximális T-antigén expressziót (immunofluoreszcenciával mértük) figyelünk meg 500-1000 egység/ml IFN dózisnál. 100 egység/ml dózisnál minimális expressziót figyelünk meg. Amint • · arra számítani lehet a proliferáció sebessége korrelációban van az IFN dózissal; 100 egység/ml IFN dózisnál vagy kicsi a sejt osztódás vagy nincs is.
A korábban leírt Mxl Tag EGF-re reagáló neurális törzs sejtekkel leírt további vizsgálatokban kimutattuk, hogy a proliferáció és a differenciálódás szabályozható. Ezen törzs sejtek populációját differenciálódásra kényszerítjük az EGF eltávolításával és FBS hozzáadásával. 1000 egység/ml alfa/beta IFN hozzáadásával lapos, asztrocita-szerü sejtek csoportjai kezdenek proliferálni és végül megtöltik a tenyész edényt. 70 átoltáson keresztül ezeket a sejteket IFN-ben tartjuk fenn és 24-36 órás megkettóződési sebességet tartottunk fenn ebben az időszakban. Neurális és glia-specifikus antitestek paneljével végzett próbáztatás után ezek az IF-kezelt sejtek láthatóan mind nesztin- és T-antígén pozitívak, azonban gyengeén immunoreaktívak glutaminszintetázra és GFAP negatívak.
Az IFN eltávolítása után ezen lapos sejtek osztódási sebessége gyorsan csökken, elveszítik T-antigén immunoreaktivitásukat és általában megnövekedik a glutamin szintetáz és GFAP immunoreaktivitásuk. Ezek a sejtek in vitro több hónapig életképesek maradnak és nincs nyilvánvaló proliferáció az IFN folyamatos hiánya mellett. Érdekes, hogy a T-antigén immunoreaktivitás és a sejt proliferáció újra indukálható IFN hozzáadásával. Ez egy olyan sejtvonalat biztosít, melynek proliferációja vagy differenciálódása szabályozott módon valósítható meg.
2. példa • * ···· ····
Az 1. példa szerint eloálított sejteket bekapszulázzuk és egy humán gazdába implantáljuk.
A PAN/PVC rostok előállítása
A permszelektív üreges rostokat egy száraz jet-nedves pörgetéses technikával (Cabasso, Hollow Fiber Membranes, vol. 12, Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Wiley, New York, 3rd Ed., pp. 492-517, 1980; Dionne, WO 92/19195;
5,158,881 számú US szabadalom). Az aszimmetrikus üreges rostot kiöntjük a 12,5 % poliakrilonitril polivinil klorid (PAN/PVC) kopolimer dimetil szulfoxidban (w/w) levő oldatából. Egyrétegű vagy kétrétegű rostokat állítunk elő. A rostokat egy nem oldószeres víz-fürdőben gyűjtjük össze, glicerináljuk és megszárítjuk. A sejteket 25000 sejt/μΙ sűrűségben töltjük a PAN/PVC egyrétegű üreges rostokba és hevítés mellett zárjuk.
A gazdába való implantáció
A bekapszulázott sejteket egy humán gazdába implantáljuk. Az implantációs helyek közé tartoznak a laterális ventrikulumok és az agy striátuma. A BAO-k agyba való implantációs eljárásai t Aebischer et al. , (WO 93/00127) írták le, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak.
3. példa
Neunatális asztrociták feltételezett immortalizációja ·* ··· ·
Egy egér emlő tumor vírus (MMTV) promóter elemeit tartalmazó fragmentet fuzionálunk az SV40 korai régió cDNS-hez. Az E15 patkány agyból származó neonatális asztrocitákat elektroporációval transzfektáljuk és a transzformánsokat proliferációra való vizsgálattal szelektáljuk. Az osztódó sejteket eltávolítjuk, expandáljuk és a nagy T-antigén expressziójára vizsgáljuk, anti-nagy T antitesteket használva. A transzformált sejteket BAO-kba ágyazzuk és egy gazdába implantáljuk, alapjában véve a 2. példában leírtak szerint. A BAO-kat egy hónapon keresztül in vivő tartjuk. Ezután a BAO-kat kivesszük és a BAO-n belüli sejt eloszlást az in vitro ugyanilyen ideig fenntartott kontrollokhoz hasonlítjuk.
4. példa
Az SCT-1 sejtek kollagénnel csökkentett proliferációja és aszkorbáttal indukált differenciálódása
Az SCT-1 sejteket csípő ideg tumorból klónozzuk egy PoSV40 transzgenikus egérből (Messing et al., j: Neuroscience, 14, pp. 3533-39, 1994). Ezek az SCT-1 sejtek immunoreaktívak az S100 és Po Schwann sejt markerekre, valamint az SV40 Tantigénre.
Az SCT-1 sejteket három körülmény alatt szaporítjuk: (1) szövettenyésztő műanyagon aszkorbát nélkül, (2) szövettenyésztő műanyagon 50 ^g/ml aszkorbát jelenlétében a differenciálódás indukálása céljából, és (3) I-es típusú kollagénben szuszpendáljuk.
Egy műanyag szubsztráton aszkorbát hiányában a legtöbb sejt fibroblaszt-szerü morfológiával rendelkezik. Azonban • · ·* néhány bipoláris sejt is jelen van. A sejtek 18-20 óra alatt duplázódnak meg és nem mutatnak érintkezési gátlást.
Az aszkorbát jelenlétében szaporodó SCT-1 sejtek lassabb szaporodást és egy sokkal robosztusabb festódést mutatnak a fibrinektinre és a IV-es típusú kollagénre. A laminin immunoreaktiviás másrészt viszont hasonló a kontroll és az aszkorbáttal indukált differenciálódótt tenyészetekben.
Az I-es típusú kollagénben szuszpendált SCT-1 sejtek bipoláros morfológiájúak és a mitotikus aktivitásban drámai csökkenést (azaz a megdúplázódási idő több mint 30 nap) mutatnak.
5. példa
A BHK sejt proliferáció gátlása aszkorbáttal és TGF-betával
A CNTF-et szekretáló BHK sejteket DMEM-ben (magas glükóz tartalmú) szaporítjuk. A szubkonfluens BHK tenyészetek kezelése TGF-betal-gyei (2,5 ng/ml) és aszkorbáttal (100 μΜ) csökkenti a mitózist. Ezenkívül a sejtek megnyúlnak és néhány sejt csoportosul. Ezek az adatok azt jelzik, hogy a TGF-beta és az aszkorbát gátolják a proliierációt és indukálják a BHK sejtek differenciálódását.
További kísérletekben a hNGF-et szekretáló BHK sejteket 2,5 ng/ml TGFbetával és 100 μΜ aszkorbinsavval kezeljük a BAOkba való beágyazás és az implantáció előtt. A nem kezelt sejtek szolgálnak kontrollként. A specifikus változók közé tartoznak a) a TGFbeta, Vitrogen nélkül; b) TGFbeta/aszkorbát, Vitrogen; c) TGFbeta/aszkorbát nélkül, Vitrogén és d) TGFbeta/aszkorbát és Vitrogén nélkül. Ezenkívül számos különböző polimert • · ··· · • · « » · · • * · ·· «V · • · · · · · « · · · · · · « ·«··«·····*· használunk. A kapszulákat felnőtt patkányok striatumába implantáljuk. A patkányokat 3 hónap után elpusztítjuk.
6. példa
EGF jelenlétében proliferáló és EGF hiányában differenciálódó neurális törzs sejtek
A neuroszférákat a Weiss et al PCT/CA 92/00283 által leírt módszerekkel állítjuk eló. A 68-as átoltású neuroszférákat összegyűjtjük és szétosztjuk. A neuroszférák felét egysejtű szuszpenzióvá dörzsöljük szét a másik felét csomókban hagyjuk. Az egysejt számot egysejt szuszpenziót használva állapítjuk meg, azt feltételezzük, hogy a csomókban álló sejtek koncentrációja ugyanolyan. Az egyedüli sejteket és a sejtcsomókat külön szuszpendáljuk azonos mennyiségű Vitrogenben és vagy neuroszféra tápközegben 20 ng/ml EGF-fel kontrollként vagy PC-1 tápközegben.
A sejteket 25000 sejt/μΙ sűrűségben egyrétegű burkolattal ellátott üreges PAN/PVC BAO rostokba töltjük, melyeket alapjában véve a 2. példában leírtak szerint állítottunk eló. A BAO-kat vagy neuroszféra + EGF tápközegben vagy PC-1 tápközegben (EGF nélkül) tartjuk.
A BAO-kat 3 nap és 7 nap után felnyitjuk és a gliás fibrillás savas protein (GFAP) vizsgálatára megfestjük immunocitokémiával. A GFAP egy köztes filamentumos protein, mely specifikusan expresszálódik az asztrocitákban. A GFAP reaktivitás azt jelzi, hogy a neurális törzs sejtek asztrocitákká differenciálódtak. A következőket figyeltük meg:
Idó (nap)
GFAP reaktivitás ···· ·· ·» *· »· ·«»··>*« · • · · · · * · « · · · · · · ··«·«·· ·· * «
Egysejt, EGF né'. Lkül 3 kis % + GFAP
Egysejt, EGF 3 negatív
Sejt csoportok, EGF nélkül 3 kis % + GFAP
Sejt csoportok, EGF 3 negatív
Egysejt, EGF nélkül 7 intenzív + GFAP
Egysejt, EGF 7 negatív
Sejt csoportok, EGF nélkül 7 intenzív + GFAP
Sejt csoportok, EGF 7 negatív
A 7. napra a bekapszulázott neurális törzs sejtek asztrocitákká differenciálódtak az EGF hiányában.
7. példa
Az ECM hatása a BHK sejtekre
Az acelluláris ECM előállítása napos embrionális patkányokból nyert E15 patkány meningeális sejteket szélesztünk soküregű lemezekre és konfluenciáig hagyjuk szaporodni. A sejteket két hét múlva egyrétegűvé tesszük majd hagyjuk újra szaporodni.
Az acelluáris ECM-et 0,1% Triton X-100 detergenssel 30 percig tartó kezeléssel extraháljuk, majd 5 mM NH40H-val kezeljük 3 percig.
BHK-hNGF sejtek
Egy NGF-et szekretáló BHK sejtvonalat állítunk elő az alábbiak szerint. Egy első intron 3' végének körülbelül 37 • .« » „ «·*· « / w · » · · · » • ··«·. · « · · · · « · ··«*·«·« Λ» 9 * bázispár hosszúságú részletét tartalmazó 2,51 kb fragmentet, egy a pre-pro-NGF protein transzlációs startjának vélt kettős ATG szekvenciát és a teljes kódoló szekvenciát, valamint a a humán NGF gén teljes 3' nem transziáit régióját (Hoyle et al., Neuron, 10, pp. 1019-34, 1993) a DHFR alapú pNUT expressziós vektorba szubklónozzuk közvetlenül az egér metallotionein 1 promótertől (-650 - +7) és a patkány inzulin ΙΙ-es géntől (Beatge et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, pp. 5454-58,
1986) downstream irányban.
Baby hörcsög vese (BHK) sejteket transzfektálunk pNUTbetaNGF szerkezettel a kálcium foszfátos módszert alkalmazva. A
BHK sejtek 10% magzati borjú szérumot, 1 x penicillin/sztreptomycin/ampicillin B keveréket (0,8 g/l) és Lglutamint (GIBCO) tartalmazó DMEM-ben szaporítjuk 5 % CC>2 alatt 37 C° hőmérsékleten. A transzfektált BHK sejteket 200 μΜ metotrexátot (Sigma) tartalmazó tápközegen szelektáljuk 3-4 héten keresztül és a rezisztens sejteket poliklonális populációként tartjuk fenn 200 μΜ metotrexáttal vagy metotrexát nélkül.
A transzformált BHK-hNGF sejteket 1,0 x 104 sűrűségben meningeális sejtekből kivont ECM-et lemezekre szélesztjük. A BHK-hNGF sejteket sűrűségben ECM-et nem tartalmazó kontroll szélesztjük. A sejteket hemacitométert használva 6 megszámoljuk.
A kontroll üregek sejtszáma átlagosan 4,5 x 10θ sej t/üreg tartalmazó ugyanilyen lemezekre
DIV után +/- 4,5 x
105 sejt. Az extrahált ECM-et tartalmazó lemezek esetében az átlagos sejtszám 9,9 x 105 +/- 4,9 x 105 sejt. Ezek az ··*· eredmények azt mutatják, hogy a kezelt lemezeken a sejtszaporodás 4,5 - szőrösére csökken.
8. példa
A sejtek egy belső támasztékon levő acelluláris ECM-hez való adhéziój a
További kísérletekben primer meningeális sejteket oltunk egy TECO poliuretán rostra. Az ilyen rostok BAO-k belső támasztékaiként kerülnek felhasználásra. 10% FBS-sel kiegészített DMEM tápközeget használunk tenyésztápközegként. Két hét elteltével a rostokat 0,1% Triton Χ-100-zal extraháljuk 30 percig, melyet 25 mM NH^OH-val történő 3 perces extrahálás követ. Néhány rostot immunofestésnek vetünk alá antifibronektin antitesttel a rostban levő acelluláris ECM jelenlétének megerősítése céljából. Más rostokat a BHK sejtekkel végzett sejt adhéziós vizsgálatban alkalmazunk.
9. példa
A PEO-PDMS-sel módosított BAO-kba beágyazott mikrohordozókon történő BHK sejt szaporodás
A PEO-PDMS származtatott BAO-k előállítása • · • · · · • · · · · · • · · · · • · · · ·· · • · · · · · · ········ · · · ·
Az egyrétegű PAN/PVC üreges rostos BAO-kat a 2. példában leírtak szerint állítjuk elő. Ezek a BAO-k 642,6 +36,7 μπι ID értékkel, 787,8 + 32,2 μπι OD értékkel 67,8 + 16,2 μπι falvastagsággal és 100%-os BSA kilöködési koefficienssel és körülbelül 21,8 ml/perc/m2/mmHg hidraulikus permeabilitási értékkel rendelkeznek.
A PAN/PVC BAO-kat PEO-PDMS-sel származtatjuk steril körülmények között. A PEO-PDMS 1%-os vagy 5%-os (v/v)(Huls, PS073, MW=3126 g/mol; 82% PEO/súly) oldatát 1 ml vagy 5 ml PEOPDSM 100 ml deionizált vízzel való hígításával állítjuk elő. Az oldatot sterilre szűrjük (0,2 μιη) egy nedves PAN/PVC membránba való injektálás előtt. A membránt hevítéssel zárjuk és vizes oldatba merítjük. A rostokat Hank-féle puffereit sóoldattal leöblítjük 72 óra elteltével és a sejtekkel való használat előtt.
A 7. példában leírtak szerinti NGF-szekretáló BHK sejteket PEO-PDMS származtatott rostokba töltjük az alábbiak szerint.
Töltési és zárási eljárás
A 90%-os konfluenciáig szaporított NGF-termelö BHK sejtek egysejt szuszpenzióját PBS-sel mossuk (ebből hiányzik a kalcium és a magnézium), körülbelül 1 percig tripszinizáljuk, majd centrifugálással (1000 rpm, 3 perc) pelletizáljuk. A sejteket a tápközegben reszuszpendáljuk így a végső sejt koncentráció 2 x 107 selt/ml.
A sejteket vagy közvetlenül a PEO-PDMS származtatott rostokba töltjük, vagy 0,15% Vitrogen mátrix oldattal vagy 0,5% agaróz oldattal keverjük és ezután töltjük be. Megközelítően • · · · ····
2,5 μΐ sejtet vagy sejt/mátrix keveréket (10000 sejt/μΐ) töltünk az egyes rostokba egy 24-es méretű ferde katéter hegyet és egy Hamilton fecskendőt használva.
A kapszulákat úgy zárjuk le, hogy egy 1-1,1 cm hosszú száraz üreges rostot emelünk egy agyra egy szeptális rögzítéssel a proximális végen, mely töltési lehetőséget biztosít a beinjektálandó sejtek számára a készülék belsejébe. A 2,5 μΐ celluláris szuszpenzió bejuttatása után a szeptumot lepattintjuk és a bejutási nyílást zárjuk egy fény-vulkanizáló akriláttal (Luxtrak LCM 24, ICI Resins US, Wilmington, MA)(agy zárás) A kapszulákat ezután kipányvázzuk egy 1,5 cm-es 0,020 szilasztikus csőbe való helyezéssel az akril agy fölött.
Ily módon a kővetkező BAO-kat állítjuk elő:
1. kontroll nem származtatott burok, mátrix nélkül;
2 . kontroll nem származtatott burok, Vitrogen mátrixszal;
3 . kontroll nem származtatott burok, agaróz mátrixszal;
4 . 1% PEO-PDMS származtatott burok, mátrix nélkül;
5 . 1% PEO-PDMS származtatott burok, Vitrogen mátrixszal;
6 . 1% PEO-PDMS származtatott burok, agaróz mátrixszal;
7 . 5% PEO-PDMS származtatott burok, mátrix nélkül;
8 . 5% PEO-PDMS származtatott burok, Vitrogen mátrixszal;
9 . 5% PEO-PDMS származtatott burok, agaróz mátrixszal;
A BAO-kat környezeti O2 értéken tartjuk 4 napig
bekapszulázás után, majd alacsony O2 értéken tartjuk (50 mmHg) a vizsgálat hátralévő ideje alatt. A 2. ábra a 2., 11. és 25 napos NGF szekréciókat mutatja (ELISA módszerrel mértük).
Az NGF felszabadulási adatok azt jelzik, hogy maga a mátrix kis hatással van a sejtek termelésére. Azonban a PEO68 • · · · · · · • · · « · · • · · · « • · · ···· ··
PDMS jelenlétében az NGF felszabadulás lényegesen alacsonyabb ha agarózt használunk mátrix nélkül, de ha Vitrogent használunk nem befolyásolódik. Ezenkívül a módosításban használt PEO-PDMS százalék nyilvánvalóan kis hatással van az NGF felszabadulásra. A hisztológiai adatok alapján az agarózba beágyazott BHK sejtek megnyúlt morfológiával rendelkeznek és a készülék falát borítják, azonban nagyon kevés sejt életképes magában az agarózban. A PEO-PDMS-sel módosított rostokba agarózzal töltött BHK sejtek szintén kibélelik a kapszula belső luminális felszínét, de kerek morfológiájúak. A PEO-PDMS-PAN/PVC módosított rostokban kevesebb sejt található, mint a nem módosított rostokban agarózzal, ami azt jelzi, hogy a sejt szaporodást sikerült szabályozni. A Vitrogénnel töltött készülékben levő sejteket nem módosította a rost módosítás, sem azokat a sejteket, melyeket mátrix nélkül kapszuláztunk be.
A nem módosított, Vitrogen mátrixot tartalmazó rostokban levő BHK sejtek jó eloszlást mutatnak, megközelítően 75%-os életképességgel. Volt egy csekély nekrózis a készülék belsejében. A PEO-PDMS módosítás nincs hatással a sejt megoszlásra, életképességre vagy morfológiára. Mátrixként agarózt használva a sejt eloszlás kiváló, a sejtek életképessége körülbelül 90%-os. A BHK sejtek morfológiáját a PEO-PDMS származtatott membrán (1% és 5%) agaróz mátrix használata mellett befolyásolja. A sejtek megnyúlnak a nem módosított P(AN/VC)-bán és sokkal kerekebbek a módosított P(AN/VC)-ben. A sejtek nem az agaróz mátrixban helyezkednek el, hanem a rostok és agaróz szálak közötti térben. Mátrix nélkül a sejt eloszlás sokkal kevésbé kielégítő, mivel a sejtek nagy • · csoportokat képeznek és az életképesség is alacsonyabb (megközelítően 60%-os).
10. példa
A BHK sejt szaporodás CultiSpherákon
A 7. példa szerint leírt NGF szekretáló BHK sejteket kollagén borítású CultiSpherákon szaporítjuk. A CultiSpherákat (1 g) 50 ml PBS-ben (CMF) rehidratáljuk. 15 x 106 sejtet szuszpendálunk 1 ml rehidratált CultiSpherában. A sejt/CultiSphera szuszpenziót közvetlenül egyrétegű PAN/PVC üreges rostokba töltjük vagy 1:1 arányban 1%-os agarózzal keverjüök és ezután töltjük egyrétegű PAN/PVC üreges rostokba. A rostokat alapjában véve a 2. példában leírtak szerint állítjuk elő és alapjában véve a 9. példában leírtak szerint töltjük és zárjuk.
A bekapszulázott sejteket NGF termelésre teszteljük ELISA módszert használva 2., 15. és 56. napon. A tápközeget hetenként három alkalommal kiegészítjük. A 3. ábra mutatja az eredményeket. Az NGF felszabadulási adatok azt mutatják, hogy a BHK sejtek nőhetnek CultiSphera mikrohordozókon ha BAO-kba ágyazzuk ezeket (3. ábra, jelölés: n-mat-008, 0709-n-m). Ezenkívül, az NGF felszabadítási adatok azt is jelzik, hogy a BHK sejt/CultiSphera tovább szuszpendálható egy agaróz mátrixban az NGF szekrécióra kifejtett kis hatás mellett, vagy hatás nélkül (3. ábra; jelölés: agaro-008, agaro-0709).
11. példa • · • · • ·· ·· ·· · · • · · · · · ·
Egy peptid származék alkalmazása a sejtszám és sejt eloszlás szabályozására
Ebben a példában a BAO luminális felszínét PEO-PDMS-sel, poli(d-lizinnel) vagy PepTite 2000-rel módosítjuk, mely egy a kereskedelkemeben beszerezhető adhéziós protein.
Ebben a vizsgálatban baby hörcsög vese (BHK) sejteket használunk, mivel ezek rögzítés függő sejtek és korábban kimutattuk, hogy üreges rostos membránhoz kötődnek.
Rostok
Egyrétegű PAN/PVS BAO-kat állítunk elő alapjában véve a 2. példában leírtak szerint. A rost dimenziói a következők: 625 μιη fal vastagság. A rostokat 70%-os alkoholba való egy éjszakán át tartó merítéssel sterilezzük, majd ismételten HBSS-sel mossuk.
Származtatás
1. PDMS-PEO: A BAO-kat PDMS-PEO-val a következők szerint származtatjuk. Egy 1%-os PEO-PDMS oldatot (Huls-tól vásároltuk, PSO73, MW=3126 g/mol; 82% PEO/súly) állítunk elő 1 ml PEO-PDMS 100 ml deionizált vízzel való elegyítésével. Az oldatot szűréssel (0,2 μτα) sterilezzük egy steril membránba való injektálás előtt. A membránt 1% PEO-PDMS vizes oldatba merítjük 24 órára szobahőmérsékleten. A rostokat vízzel mossuk (háromszor), majd HBSS-sel a sejtek injektálása előtt.
• ·
2. PdL:BAO-kat származtatunk poli(d-lizinnel) az alábbiak szerint. A rostokat 67000 molekulasúlyú poli(d-lizin) vizes oldatába merítjük 2 mg/ml koncentrációban 24 óráig szobahőmérsékleten. A rostokat háromszor mossuk vízzel, majd háromszor HBSS-sel a sejtek injektálása előtt.
3. PepTite 2000: A BAO-kat PepTite 2000-rel az alábbiak szerint származtatjuk. A rostokat 100 mg/ml korábban etanolban feloldott PepTite 2000 PBS oldatába merítjük. A rostokat ebben az oldatban tartjuk 24 órán keresztül szobahőmérsékleten, majd háromszor mossuk PBS-ben a sejtek injektálása előtt.
4. PAN/PVC: A kontroll rostokat HBSS-be merítjük 24 órán keresztül szobahőmérsékleten a sejtek injektálása előtt.
Sej tek
A BHK sejteket 5000 sejt/μΙ koncentrációban töltjük a származtatott rostokba. A rostokat zárjuk és egy csavaros kupakkal záródó kémcsőbe helyezzük, mely szérummentes tápközeget (PCI tápközeg) tartalmaz, majd forgó dobra helyezzük két hétig terjedő időtartamra egy inkubációs készülékben 37 C° hőmérsékleten. A forgó dob forgási sebessége 2 rpm. A megfelelő időpontban a rosotkat 4%-os paraformaldehidben rögzítjük (fixáljuk), etanol grádiensben dehidráljuk és hematoxilinnel és eozinnal (H&E) festjük a sejt eloszlás ozmium tetraoxidos hisztológiai analíziséhez.
A PAN/PVC származtatott membránok jó sejt eloszlást mutatnak ha poli(d-lizin)-nel származtatunk és egy sokkal
egyenletesebb eloszlást mutatnak ha PepTite 2000-rel
származtatunk, ahogy azt az ozmium tetraoxidos festés
kimutatja.
A PAN/PVC membránok, a PepTite 2000 módosításokat
kétféleképpen kíséreltük meg elvégezni. Először a membránok belső luminális felszínét módosítjuk csak, és másodszor mind a belső luminális felszínt és a külső felszínt kezeljük. Az üres BAO-kat (azaz sejtmentes BAO-k) teljes aminosavra analizáljuk a poli(d-lizin), vagy a PepTite 2000 kötődésének meghatározása céljából. A kontrol nem módosított membránokhoz való teljes aminosav kötődés megközelítően 0,2 jug/BAO. A poli (d-lizin)-nel módosított membránokhoz kötődő teljes aminosav megközelítően 0,8 jxg/BAO a módosított belső luminális membránok esetében és megközelítően 2,6 ^g/BAO ha mind a belső luminális felszínt és a külső felszínt módosítottuk. BHK sejtekkel töltött hasonló BAO-kat tartunk fenn 14 napig, majd hisztológiailag vizsgáljuk. A kontrol, nem módosított BAO-kban a sejtek egyenetlenül nagy csoportokban helyezkednek el a rost teljes hosszában. Ezzel szemben mind a két típusú módosított rostban a sejtek egyenletesen oszlanak meg a membrán luminális felszíne mentén.
Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a poli(d-lizin) és a PepTite 2000 hatékonyak a sejtek BAO luminális felszínéhez való kapcsolódásának elősegítésében és így hatékonyab szabályozzák a sejtek eloszlását a BAO-n belül.
12. példa
ECM molekulák használata a neuroszférák szaporodásának szabályozásában
A 71-es átoltású neuroszférákat alapjában az 1. példa szerint állítjuk elő. Többüregű edényeket elöburkolunk 0,5% agarózzal (Sea-Prep), hogy megakadályozzuk a neuroszférák műanyeg edényekhez való kapcsolódását. A sejteket körülbelül 50000 sejt/üreg sűrűségben szélesztjük a tervezett mátrixokra a kísérletben. Az egyes mátrix körülmények esetében három üreget használunk; az üregek közül kettő PC-1 tápközeget (kontroll) és egy pedig neuroszférát + EGF tápközeget (EGF) tartalmaz.
Egy dermális eredetű 1-es típusú kollagént (Zydast, Collagen Biomedical, Palo Alto), egy tendon-eredetű 1-es típusú kollagént (Organogenesis), egy 1-es típusú kollagént (Vitrogen, Celtrix, Santa Clara) és agarózt használunk a sejt szaporodás szabályozásában elért hatékonyságuk meghatározására magukban, vagy lamininnel vagy PepTite 2000-rel vagy mindkettővel való kombinációban.
A 4. és 14. napon a sejteket fluoreszcein diacetát/propidium jodiddal (FDA/PI) való festéssel vizsgáljuk és a sejt életképességet, szaporodást és differenciálódást vizsgáljuk. Az Organogenesis kollagén PepTite 2000 és a laminin kombinációjának kitett sejtek mutatják a legnagyobb mértékű differenciálódást, körülbelül a sejtek 90%-a esett át Az agaróz peptid differenciálódáson kombinációj ának differenciálódott.
kitett sej tek
2000 es körülbelül laminin
80%-a . példa
Egy inért állványzat alkalmazása a BAO-n belüli BHK sejtszám és sejt eloszlás szabályozására
Két PAN/PVC rost típust (alapjában véve a 2. példában leírtak szerinti) használunk: egy egyréteggel borított rostot, mely a külső felszínén permszelektív membránnal rendelkezik és egy egyréteggel borított rostot, mely a belső felszínén egy permszelektív membránnal rendelkezik.
Először PAN/PVC rostokat deglicerinizálunk és sterilezünk 70%-os sterilre szűrt etanolban egy éjszakán keresztül. Ezután a rostokat steril vízzel öblítjük háromszor 1-2 órás időtartam alatt.
Ezután, 15%-os koncentrációjú poli(hidroxietil metakrilát)(PHEMA) állványzat mátrixot készítünk oly módon, hogy 10 ml 95%-os etanolban (190 fokos, Quantum) feloldunk 1,5 g PHEMA-t. Ezenkívül egy 10% koncentrációjú poli(hidroxietil metakrilát-ko-metil metakrilát)(PHEMA/MMA) állványzat mátrixot állítunk elő 1,0 g PHEMA/MMA 10 ml 95%-os etanolban való feloldásával. A polimerek még könnyebb feloldása céljából az oldatot keverjük és melegítjük.
A PHEMA vagy PHEMA/MMA oldatokat injekcióstűvel a PAN/PVC rostokba juttatjuk, melyeket ezután steril vízbe helyezünk. A megtöltött rostokat további 1 órán keresztül a vízben hagyjuk az állványzat precipitációjának biztosítása céljából, valamint az etanol magból való kidiffundálásának céljából. A rostok végeit levágjuk, mert ezek gyakran eltömödnek vagy PHEMA-val vagy PHEMA/MMA-val. A rostokat steril HBSS-t tartalmazó Petri csészékbe helyezzük. PHEMA-val, PHEMA/MMA-val töltött BAO-kat és a kontroll BAO-kat ily módon készítjük el.
NGF-et szekretáló BHK sejteket (a 7. példában kerülnek leírásra) hozzáadott glutamint és antibiotikumot tartalmazó 10% DMEM-ben szaporítjuk. A sejteket óvatosan eltávolítjuk a • · · · · * β · · · » · • · · ·· ·· · · • · · · ·· · • ♦ · · · · · ········ ·· · · lombikokból 0,25% tripszin segítségével, mossuk és PCI tápközegben reszuszpendáljuk az 1 x ίο7 sejt/ml sűrűség elérése céljából.
A BHK-NGF sejteket 10000 sejt/μΐ mennyiségben töltjük a rostokba egy 22-es méretű Teflon katéter segítségével. A BAOkat hevítéses lecsippentéssel zárjuk.
Az egyes típusokból öt BAO-t készítünk. Négyet egy 1 ml PC-1 tápközeg tartalmú 24 üregű lemezre helyezünk. Az ötödiket körülbelül 3-4 ml PC-l-et tartalmazó vertikális kémcsőbe helyezzük. 24 óra elteltével a vertikális kémcsőbe helyezett BAO-kat kinyitjuk a lumen mentén (longitudinális kereszt szekció) és 24 óra múlva fluoreszcensz diacetát/propidium jodiddal (FDA/PI) való festéssel analizáljuk a roston belüli sejt eloszlásra. Egy fluoreszcensz mikroszkóp alatti megfigyelés során az FDA az élő sejteket zöldre és a Pl a nem élő sejteket pirosra festi.
A maradék BAO-kat két héten keresztül tenyésztjük. A BAOkat környezeti O2 értéken tartjuk 4 napig a bekapszulázás után, majd alacsony O2 szinteken (50 mmHg) a vizsgálat hátralevő ideje alatt.
A BHK-NGF sejtek működőképességét úgy teszteljük, hogy mérjük az NGF szekréciót (ELISA módszerrel) 4, 7 és 14 nap után. A sejt PHEMA vagy PHEMA/MMA állványzatot tartalmazó BAO-k a vizsgálat ideje alatt tovább folytatták az NGF szekréciót. A hisztológiai és az NGF adatok is azt jelzik, hogy a PHEMA és PHEMA/MMA állványzat lehetővé teszi a BAO-kban eloszlatott, funkcionálisan aktív életképes sejtek fenntartását. A 10% PHEMA-MMA állványzatok a legjobbak.
·· ·· ·· ·« * ·· · · ·· · · • · · · ·· · • · · · · « · *·«··«·· ·· » · »»* »
14. példa
Egy inért állványzat alkalmazása a BAO-ban levő PC12 sejtszám és sejt eloszlás szabályozása céljából
A PHEMA és PHEMA/MMA inért állványzatok hatékonyságát felmérjük a PC12 BAO-ban való eloszlásának szabályozásában mutatott hatékonyságukra is.
Az egyrétegű borítású rostokat alapjában véve a 2. példában leírtak szerint állítjuk elő. Ezek a rostok tipikusan az alábbi tulajdonságokkal rendelkeznek: 642 μτη ID, 787 pmOD, 68 pm falvastagság, 100%-os kilökődési koefficiens (BSA), 22 ml/perc/m2/mmHg hidraulikus permeabilitás.
A PHEMA és PHEMA/MMA inért állványzatokat ezekben a rostokban állítjuk eló alapjában véve a 13. példában leírtak szerint.
HL-1 tápközegben levő PC12 sejteket (1 x 107 sejt/ml) injektálunk a rostok lumenébe és a rostokat hóvei zárjuk körülbelül 1 cm hosszúságú BAO-k létrehozása céljából. Az eszközöket 37 C° hőmérsékleten tartjuk környezeti nyomáson HL-1 tápközegben. A beágyazott sejtek működésének felméréséhez a BAO-kat az alap és a K+-által kiváltott katekolamin felszabadításra vizsgáljuk 1, 14 és 28 nappal a beágyazás után. Az eredményeket a 4Ά és 5A (alap felszabadulás) és a 4B és 5B (k+-által kiváltott felszabadulás) ábrák mutatják. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az inért PHEMA és PHEMA/MMA állványzatot tartalmazó BAO-kba beágyazott PC12 sejtek megtartják működőképességüket, amint azt a katekolamin felszabaduláson keresztül mértük.
• ·» » *» ·· · * · · « ·· ·· ·· * · • · · · ·« · * · · · · · · * ·*»··♦···· r·
A sejtek BAO-n belüli eloszlását 5 óra és 4 nap elteltével mérjük a rostok vertikális félbevágásával és a sejtek FDA/PI festésével. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a PHEMA és PHEMA/MMA állványzatok nem toxikusak és segítik a PC12 sejtek életképességét és működőképességét.
15. példa
Egy NWPF alkalmazása a sejt adhézió és differenciálódás elősegítése céljából a BAO-ban
Hat típusú NWPF-et (Reemay, Tennessee) próbálunk ki: #2470, #2295, #2024, #2055, #2033, #2250 (Reemay #-ok). A kapott szövet lemez formában van; korongokat vágunk ki, hogy illeszkedjen a 24 üregű lemezekhez. Az NWPF korongokat 1% nátrium dódecil szulfátba (SDS)(w/v) merítjük 6 órán keresztül, majd 3-szor vízzel mossuk. Ezután a korongokat 1% kénsavba mártjuk (v/v ^O-banj 13 órán keresztül (egy éjszakán át), majd háromszor mossuk vízzel. A papír törülközőn megszárított korongokat ezután autoklávozással sterilezzük.
A korongokat 3 sejttípussal oltjuk be a sejt adhézió tesztelése céljából: BHK, AT-3 és TSA sejtekkel. Körülbelül 100000 sejtet adunk egy a fenti 6 NWPF korongok egyikét PCI tápközegben tartalmazó 24 üregű lemezhez. Egy szérum mentes tápközeget használunk a sejtek adhéziójának tesztelése céljából a szérum következményei nélkül (a TSA sejteket kivéve). Négy nap után a BHK és az AT-3 sejtek adhézióját PDA/PI-vel vizsgáljuk. A sejtek megnyúlt morfológiával rendelkeznek és úgy tűnik, hogy a Reemay #2250 és 2055 NWPF-hez kapcsolódnak. 10 nap után a BHK sejtek szaporodnak legjobban a #2250 NWPF-en. Az • ·
AT-3 sejtek legjobban a 2024-hez és a 2295-höz kapcsolódnak. Az AT-3 sejtek legjobban a 2024-en nőnek 10 nap után. A TSA sejtek (10% FCS-ben) 1 nap után megnyúlt morfológiával rendelkeznek amikor a #2250, #2055 NWPF-en nőnek és legjobban a #2024-en szaporodnak 7 nap után a TSA sejtek legjobban a #2055-ön szaporodnak.
16. példa
Mátrix anyagban szuszpendált mikrohordozókon levő SV40/DbetaHNGF sejtek
A dopamin beta-hidroxiláz (DbetaH) gén (Hoyle et al. , J. NeuroSci., 14, pp. 2455-63, 1994) szabályzó elemeit használjuk az SV40 T antigén (tsa58)(DbetaH-SV) és a humán növekedési faktor (DbetaH-hNGF) transzgenikus egerekben való koexpressziójának irányítására. A kiméra gén koexpressziója neoplazmákat eredményez a mellékvese velőállományban és a noradrenerg szimpatikus ganglionokban. Egy az ezen egerek egyikének ciliáris régiójából származó tumort felboncolunk és a tumor szövetet mechanikailag disszociáljuk és sejt tenyészetbe (DMEM, 10% FBS, 37 C° , 5% CO2) helyezzük. Két eltérő sejt típus - nagy lapos fibroblaszt-szerű sejtek és kis fázis-fényes sejtek extenzív neurit nyúlványokkal - van jelen a kezdeti tenyész periódusban. A kis sejtek katekolaminerg neuron tulajdonságokat mutatnak ideértve a neurofilament-L-lel és -Mmel és a tirozin hidroxilázzal szembeni immunoreaktivitást. Ezekben a sejtekben az SV40 T-antigénnel szembeni immunoreaktivitás is jelen van szemben a fibroblaszt-szerű *
sejtekkel, melyek negatívak ezekre a markerekre. A sejteket hetente átoltjuk.
A sejteket egy CultiSpers-en szaporítjuk a 10. példában leírtak szerint és vagy alginátban (1,5%) vagy agaróz (1%) mátrixban szuszpendáljuk. Az alginát mátrix esetében az alginátot kereszt kötésekkel látjuk el oly módon, hogy a készüléket 1%-os vizes kálcium klorid oldatba merítjük 5 percig a bekapszulázás után. A sejt/CultiSphers/mátrix elegyet PAN/PVC üreges rostokba töltjük a 10. példaában leírtak szerint.
A sejttel töltött BAO-kat egy szérum mentes tápközegben tartjuk fenn. Meghatározott időintervallumokban a készülékeket mossuk a HBSS-ben történő 30 perces inkubáljást megelőzően. Az alap tápközeget összegyűjtjük és HPLC-ED-vel L-dopára vizsgáljuk. A készülékek folytatják az L-dopa szekretálását 80, napon is in vitro.
17. példa
Genetikailag módosított mioblasztok NGF szekréciója differenciálódás után
Az egér C2C12 mioblaszt sejteknek megvan az az előnye, hogy gyorsan osztódó sejtek, i vitro nagy mennyiségben szaporíthatok, proteinek expresszálása céljából transzferálhatok, és a szelektált kiónok izolálhatok. Az egér C2C12 sejtek post-mitotikus állapotba differenciálhatok alacsony szérum tartalmú tápközegnek való kitevésen keresztül. Ezek a sejtek így kedvezően ágyazhatok be azokhoz a sejtekhez képest, melyek proliferációja nem szabályozható -- ez utóbbi • · • « · · • · · · ···· sejtek addig folytatják osztódásukat, míg megtöltik a kapszulát és hulladék akkumuláció figyelhető meg több hónap elteltével.
A transzfektált C2C12 mioblaszt vonal azon képességét teszteljük, hogy folytatják-e a hNGF szekréciót miután a miotubulusokba való fúzió bekövetkezett.
C2C12 mioblaszt sejteket (ATCC) transzfektálunk egy hNGF génnel Lipofektamin reagenst használva a gyártók utasításának (Gibco) megfelelően. A sejteket 1 mg G418-cal szelektáljuk 2 héten keresztül, majd NGF termelésre teszteljük. A sejteket körülbelül 260 sejt/cm2 sűrűségben oltjuk T75 lombikokba és fedővel ellátott vagy fedő nélküli 24 üregű lemezekre.A sejteket hetente kétszer DMEM-mel és 10% FBS-sel tápláljuk. A sejteket az 1., 5., 8., és a 13. napon gyűjtjük össze és ekkor az NGF szekréciót megmérjük. Az eredményeket a 2. táblázat mutatja.
. táblázat
Az NGF szekréció C2C12 szkrínelésének időbeli lefolyása • · • · · · • · · · · · • · · · · · • · · · · · · ♦♦·»··!· ·· · ·
Sejtvonal Tenyészetben % konfluencia % fúzió NGF
szekréció eltölt. idő
szülői 1 nap 25 0 nt
3/23/95
+NGF 1 nap 25 0 nt
3/23/95
szülői 5 nap 40 0 nt
+NGF 5 nap 30 0 nt
szülői 8 nap 98 5 * * *
+NGF 8 nap 90 1 0,0018
szülői 13 nap 1000 80 nd
+NGF 13 nap 100 50 0,014
% fúzió = miotubulusokká alakuló mioblaszt sejtek
+NGF = a hNGF génnel transzfektált ^2^12 sejbeket jelzi
szülői - nem transzfektált C2C12 sejteket jelent
az NGF szekréciót pg/ml/sejt/24 óra értékben fejezzük ki
nt = nem teszteltük
nd = nem detektáltuk
* 8 nap = a sejtek mérete nö, négy fúziót hoznak létre * 8 nap - több a fúzió a tenyész edényekben mint a T lombikokban (áramlás citometriát végeztünk a lombikokkal)
Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a transzfektált mioblasztok tovább folytatják a kívánt heterológ termék szekretálását, azaz az NGF szekretálását a miotubulusokká való terminális differenciálódás után.
• · · ·
18. példa
A genetikailag módosított mioblasztok differenciálódás után
CNTF-t szekretálnak
Az egér C2C12 mioblasztokat a humán CNTF gént tartalmazó pNUT expressziós vektorral transzfektáljuk (Baetge et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, pp. 5454-58, 1986). A hCNTF gén expressziójának szintjét és a faktor bioaktivitását Northern lenyomat technikával, ELISA vizsgálattal és embrionális gerincvelő motoneuron tenyészeteken végzett ChAT aktivitással analizáljuk. Azt találtuk, hogy egy C2CI2 klón megközelítő szekréciója 0,2 g CNTF/10 sejt/nap. A hCNTF szekréció sebessége nem változik a C2C12 mioblasztok differenciálódásával. Végül a C2C12-hCNTF képes volt megmenteni a motoneuronokat az axotomia által indukált sejt pusztulástól. Az újszülöttek arc nukleuszainak morfológiai vizsgálata, az axtomia után egy héttel, azt jelzi, hogy az arc motoneuronok csupán 13,4 %-a maradt meg a kontroll állatokban, míg a hCNTF folyamatos felszabadulása a motoneuronok 22,7 %-ának túlélését eredményezte.
SZEKVENCIA LISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:
• · (i) FELTALÁLÓ:CytoTherapeutics, Inc.
(ii) A TALÁLMÁNY CÍME: A MESTERSÉGES BIOLÓGIAI SZERVEKBE BEZÁRT SEJTEK SZAPORODÁSÁNAK SZABÁLYOZÁSÁRA SZOLGÁLÓ MÓDSZEREK ÉS KÉSZÍTMÉNYEK (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 4 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:
(A) CÍMZETT:James F. Haley, Jr., FISH & NEAVE
(B) UTCA: 1251 Ave of Americas
(C) VÁROS: New York
(D) ÁLLAM: New York
(E) ORSZÁG : USA
(F) IRÁNYÍTÓSZÁM: 10020-1104
(iv) SZÁMÍTÓGÉPES LEOLVASÁSI FORMA:
(A) HORDOZÓ TÍPUSA: Floppy lemez (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, #1.25 verz.
(vi) A JELEN TALÁLMÁNY ADATAI:
(A) ALKALMAZÁSI SZÁM:
(B) IKTATÁSI DÁTUM:
(C) OSZTÁLYOZÁS:
(vii) ELSŐBBSÉGI ADATOK:
(A) ALKALMAZÁSI SZÁM : US 08/279,773
(B) IKTATÁSI DÁTUM: 1994 július 20.
(C) ALKALMAZÁSI SZÁM : US 08/432,698
(D) IKTATÁSI DÁTUM: 1995 május 9.
(viii) ÜGYVÉDI/IRODA ADATOK:
(A) NÉV: Haley Jr. James F.
• · · • · · · · · • · · β · • · · · · « · < ····*·*····· (Β) REGISZTRÁCIÓS SZÁM: 27,794 (C) REFERENCIA/DOKUMENTUM SZÁM: CTI-22 CIP PCT (ix) TELEKOMMUNIKÁCIÓS ADATOK:
(A) TELEFON: (212) 596-9000 (B) TELEFAX: (212) 596-9090 (2) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMEZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav
(B) TÍPUS: aminosav
(C) SZÁLTÍPUS: egyszálú
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTI-SENSE: nincs (xi) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Cys Asp Pro Gly Tyr Ile Gly Ser Arg
5 (2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMEZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 6 aminosav
(B) TÍPUS: aminosav
(C) SZÁLTÍPUS: egyszálú
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid • · • · (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTI-SENSE: nincs (xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Arg Gly Asp Ser Pro
5 (2) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMEZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 19 aminosav
(B) TÍPUS: aminosav
(C) SZÁLTÍPUS: egyszálú
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTI-SENSE: nincs (xi) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Cys Ser Arg Alá Arg Lys Gin Alá Alá Ser He Lys Val Alá Val Ser
10 15
Alá Asp Arg (2) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMEZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 5 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú • · • · · · · · · • · · · · · * · · · · · ······ ·· · · (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nincs (iv) ANTI-SENSE: nincs (xi) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Gly Gly Gly Gly

Claims (31)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Egy mesterséges biológiai szerven belül a sejtek eloszlásának szabályozására szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy a sejteket egy olyan kezelésnek vetjük alá, mely gátolja a sejtek szaporodását, vagy elősegíti a sejt differenciálódást, a kezelés a gazdába való in vivő implantációkor hatékonynak bizonyul.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a kezelés során a sejteket egy szabályozható promóterhez működőképesen kapcsolódó szaporodást elősegítő génnel transzformáljuk oly módon, hogy a proliferációt elősegítő gén expressziója a gazdába való in vivő implantáció során gátolható.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a szaporodást elősegítő gén egy onkogént jelent.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a kezelés során a sejteket egy szabályozható promóterhez működőképesen kapcsolódó szaporodást szuppresszáló génnel transzformáljuk oly módon, hogy a proliferációt szuppresszáló gén expressziója a gazdába való in vivő implantáció során következik be de in vitro gátolni lehet.
    • ·
  5. 5. A 4. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a proliterációt gátló gén egy a p53 gént és az RB gént magába foglaló csoportból szelektált tumor gátló gének közül szelektáljuk.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a kezelés során a sejteket egy szabályozható promóterhez működőképesen kapcsolódó differenciálódást indukáló génnel transzformáljuk oly módon, hogy a differenciálódást indukáló gén expressziója bekövetkezhet egy gazdába való in vivő implantáció során, azonban in vitro gátolható.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a differenciálódást indukáló gént a nagy mobilitású csoport kromoszóma 14-es protein képviseli.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a kezelés során a sejteket egy proliierációt gátló vegyület hatásának, vagy egy differenciálódást indukáló vegyület hatásának kitesszük.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a proliierációt gátló vegyületet, vagy a differenciálódást indukáló vegyületet a fórból észtert, a heparint, a TGF-betát, az aszkorbátot, a mitomycint, a BrdU-t, a PGE^-et, a dbcAMP-t, az Ara-C-t, a nikotinamidot és az SPG-t magába foglaló csoportból szelektáljuk.
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a kezelés során a sejteket a proliierációt stimuláló vegyület vagy a differenciálódást gátló vegyület hatása alól kivesszük.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a proliierációt stimuláló vegyületet, vagy a differenciálódást gátló vegyületet az EGF-t, a TGF-alfát, és az amfiregulint magába foglaló csoportból szelektáljuk és a sejteket a neurális törzs sejtek képviselik.
  12. 12. Módszer a mesterséges biológiai szerven belüli sejtek eloszlásának szabályozására azzal jellemezve, hogy a mesterséges biológiai szerv legalább egy szaporodási felszínét egy olyan kezelésnek vetjük alá, mely a sejt szaporodást gátolja vagy a sejt differenciálódást elősegíti, a kezelés egy gazdába való in vivő implantáció során hatékonynak bizonyul.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a kezelés során a szaporító felületet legalább egy extracelluáris mátrix molekula hatékony mennyiségével burkoljuk.
  14. 14. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a kezelés során a sejteket egy hidrogél mátrixban szuszpendáljuk a mesterséges biológiai szerven belül a mátrix egy proliierációt-gátló vagy egy differenciálódást indukáló peptidböl vagy peptid szekvenciából származik.
    • · · · ·· ·· · · ·» • ·* ·· ·· · · • · · · ·· · ·*····· ’ ···*······ Ρ·
  15. 15. A 14. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a hidrogél mátrix egy RGD-tartalmú szekvenciát, (ArgGlyAsp; a 2. számú szekvencia AA2-AA4~e), egy YIGSRtartalmú szekvenciát (TyrlleGlySerArg; az 1. számú szekvencia AAg-AAg-e) és egy IKVAV-tartalmú szekvenciát (IleLysValAlaVal; a 3 . számú szekvencia AA^-AA^-e) magába foglaló csoportból szelektált peptiddel származtatott agarózt tartalmaz.
  16. 16. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a kezelés során egy mikrohordozót a mesterséges biológiai szerven belül szuszpendálunk.
  17. 17. Módszer a mesterséges biológiai szerven belüli sejtek eloszlásának szabályozására azzal jellemezve, hogy a mesterséges biológiai szerv legalább egyik szaporító felszínét kitesszük egy olyan kezelés hatásának, mely a sejtek ezen felszínhez való kapcsolódását elősegíti.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a kezelés az alábbiakból áll: egy vegyületet a szaporodási felülethez származtatjuk vagy adszorbeáltatjuk és a vegyületet a poli(d-lizin)-t, egy RGD-tartalmú szekvenciát, (ArgGlyAsp; a 2. számú szekvencia AAg-T^gye), egy YIGSR-tartalmú szekvenciát (TyrlleGlySerArg; az 1. számú szekvencia AAg-AAg-e) és egy IKVAV-tartalmú szekvenciát (IleLysValAlaVal; a 3. számú szekvencia AA^-AA^-e) magába foglaló csoportból szelektáljuk.
    ··♦ · • · · » * » • · · · u • · · · · ··«·«·· ·« *
  19. 19. A 17. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a kezelés a mesterséges biológiai szerven belül egy inért állványrendszer létrejöttét magába foglalja.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az inért állványrendszert a poli(hidroxi-etil-metakrilát)ot, és a poli(hidroxi-etil metakrilát-ko-metil metakrilát)-ot magába foglaló csoportból szelektált vegyületböl létrehozzuk.
  21. 21. Módszer a mesterséges biológiai szerven belüli sejtek eloszlásának szabályozására azzal jellemezve, hogy a mesterséges biológiai szerv legalább egyik szaporító felszínét kitesszük egy olyan kezelés hatásának, mely a sejtek ezen felszínhez való kapcsolódását gátolja.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a kezelés a PEO-PDMS szaporító felszínre való származtatását vagy adszorbeálását magába foglalja.
  23. 23. Az 1. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a kezelés során a sejteket egy proliferációt gátló UV sugárzási dózis hatásának vetjük alá.
  24. 24. Egy mesterséges biológiai szerv azzal jellemezve, hogy (a) egy biokompatibilis, preszelektiv burkot, és (b) éló sejtek egy magját foglalja magába, ahol a sejteket egy olyan kezelés hatásának tesszük ki, az 1. - 23. igénypont bármelyike szerint, hogy a mesterséges biológiai szerven belül ♦ ·*· * • * > « w .
    * * · · . .
    • * · · · · · ··«·♦··· »f / a a sejtek eloszlása a gazdába való implantáció során szabályozhatóvá válik.
  25. 25. Egy rekombináns DNS molekulával transzformált sejt azzal jellemezve, hogy magába foglal (a) egy az expresszió során sejt osztódást indukálni képes proliferációt elősegítő gént, (b) egy a proliferációt elősegítő génhez működőképesen kapcsolódó Mx-1 promótert, ahol az említett sejt a szaporodásra indukálható ha interferon proliferációt elősegítő gén expressziójának eléréséhez elegendő mennyiségének hatása alá vetjük.
  26. 26. A 25. igénypont szerinti sejt azzal jellemezve, hogy a proliferációt elősegítő gént az SV40 nagy T antigénje képviseli.
  27. 27. Egy rekombináns DNS molekulával transzformált transzgenikus emlős azzal jellemezve, hogy (a) egy az expresszió során a sejt osztódást indukálni képes preoliferációt elősegítő gént, (b) és a proliferációt elősegítő génhez működőképesen kapcsolódó Mx-1 promótert magába foglal.
  28. 28. A 27. igénypont szerinti transzgenikus emlős azzal jellemezve, hogy a proliferációt elősegítő gént az SV40 nagy T antigén képviseli.
    w* ····
  29. 29. Utódok azzal jellemezve, hogy a 27. igénypont szerinti transzgenikus emlős leszármazottait jelentik.
  30. 30. Egy izolált sejt azzal jellemezve, hogy a 27. vagy a 29. igénypont szerinti transzgenikus emlősből izolált sejtet j elent.
  31. 31. Egy feltételesen halhatatlanná tett sejt létrehozására szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy a következő lépéseket foglalja magába:
    (a) egy sejtet egy olyan DNS molekulával transzformálunk, mely egy az expresszálódáskor a sejt osztódást indukálni képes proliierációt elősegítő gént és egy a proliferációs génhez működőképesen kapcsolódó Mx-1 promótert tartalmaz oly módon, hogy az említett transzformált sejt szaporodásra indukálható ha egy interferon olyan mennyiségének hatása alá vetjük, mely elegendő ahhoz, hogy a proliferációt elősegítő gén expreszióját eredményezze, (b) az említett transzformált sejteket tenyésztjük.
HU9700181A 1994-07-20 1995-07-20 Mesterséges biológiai szervbe bezárt sejtek szaporodásának szabályozására szolgáló módszerek és készítmények HUT77875A (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/279,773 US5935849A (en) 1994-07-20 1994-07-20 Methods and compositions of growth control for cells encapsulated within bioartificial organs
US08/432,698 US5843431A (en) 1994-07-20 1995-05-09 Controlling proliferation of cells before and after encapsulation in a bioartificial organ by gene transformation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT77875A true HUT77875A (hu) 1998-09-28

Family

ID=26959885

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9700181A HUT77875A (hu) 1994-07-20 1995-07-20 Mesterséges biológiai szervbe bezárt sejtek szaporodásának szabályozására szolgáló módszerek és készítmények

Country Status (20)

Country Link
US (7) US5795790A (hu)
EP (1) EP0771350A1 (hu)
JP (3) JPH10506266A (hu)
CN (1) CN1152938A (hu)
AU (1) AU698624B2 (hu)
BR (1) BR9508312A (hu)
CA (1) CA2195446C (hu)
CZ (1) CZ16397A3 (hu)
EE (1) EE9700018A (hu)
FI (1) FI970217A0 (hu)
HU (1) HUT77875A (hu)
IL (1) IL114671A0 (hu)
IS (1) IS4417A (hu)
MX (1) MX9700527A (hu)
NO (1) NO970156L (hu)
NZ (1) NZ290629A (hu)
PL (1) PL318288A1 (hu)
SK (1) SK7797A3 (hu)
TR (1) TR199500882A2 (hu)
WO (1) WO1996002646A2 (hu)

Families Citing this family (199)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0822834A4 (en) * 1995-04-07 2002-09-18 Einstein Coll Med RECOMBINANT (BETA) CELL AND ITS USE
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
CA2220226C (en) * 1995-05-04 2008-10-21 Carl H. June Improved methods for transfecting t cells
US5837234A (en) * 1995-06-07 1998-11-17 Cytotherapeutics, Inc. Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane
US5855613A (en) 1995-10-13 1999-01-05 Islet Sheet Medical, Inc. Retrievable bioartificial implants having dimensions allowing rapid diffusion of oxygen and rapid biological response to physiological change
US6054142A (en) * 1996-08-01 2000-04-25 Cyto Therapeutics, Inc. Biocompatible devices with foam scaffolds
US6150164A (en) * 1996-09-30 2000-11-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions of a bioartificial kidney suitable for use in vivo or ex vivo
US20050033132A1 (en) 1997-03-04 2005-02-10 Shults Mark C. Analyte measuring device
JP2002515932A (ja) * 1997-04-18 2002-05-28 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 多機能性ポリマー性組織コーティング
US6117643A (en) 1997-11-25 2000-09-12 Ut Battelle, Llc Bioluminescent bioreporter integrated circuit
US6872387B1 (en) 1998-02-24 2005-03-29 The Regents Of The University Of Michigan Three-dimensional hydrogel/cell system
DE19811574A1 (de) 1998-03-17 1999-09-23 Siemens Ag Verfahren und Vorrichtung zum Überwachen der Funktionsfähigkeit eines Katalysators einer Brennkraftmaschine
US6378527B1 (en) * 1998-04-08 2002-04-30 Chondros, Inc. Cell-culture and polymer constructs
US6303136B1 (en) 1998-04-13 2001-10-16 Neurotech S.A. Cells or tissue attached to a non-degradable filamentous matrix encapsulated by a semi-permeable membrane
US6171610B1 (en) * 1998-04-24 2001-01-09 University Of Massachusetts Guided development and support of hydrogel-cell compositions
US6027744A (en) * 1998-04-24 2000-02-22 University Of Massachusetts Medical Center Guided development and support of hydrogel-cell compositions
EP1117778A2 (en) * 1998-10-02 2001-07-25 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Methods and compositions for inducing differentiation and apoptosis in cells that overexpress the notch protein
US6197294B1 (en) 1998-10-26 2001-03-06 Neurotech S.A. Cell surface molecule-induced macrophage activation
US6713293B1 (en) 1999-02-08 2004-03-30 Friedrich Grummt Encapsulated cells containing an amplified expression vector as a drug delivery device
US6903244B1 (en) 1999-02-26 2005-06-07 University Of Utah Research Foundation Mice which are +/− or −/− for the elastin gene as models for vascular disease
US6365385B1 (en) 1999-03-22 2002-04-02 Duke University Methods of culturing and encapsulating pancreatic islet cells
US6303355B1 (en) 1999-03-22 2001-10-16 Duke University Method of culturing, cryopreserving and encapsulating pancreatic islet cells
DE60041255D1 (de) * 1999-04-28 2009-02-12 Eidgenoess Tech Hochschule Polyionische beschichtungen für analytische und sensor-vorrichtungen
EP1283904A2 (en) * 1999-11-03 2003-02-19 Oncotech, Inc. Cancer diagnosis using cell-sorting and gene-expression-profiles
US7560275B2 (en) * 1999-12-30 2009-07-14 Vbi Technologies, L.L.C. Compositions and methods for generating skin
US7575921B2 (en) * 1999-12-30 2009-08-18 Vbi Technologies, L.L.C. Spore-like cells and uses thereof
AU3499801A (en) * 2000-02-11 2001-08-20 Schepens Eye Res Inst Isolation and transplantation of retinal stem cells
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
US6719970B1 (en) 2000-07-10 2004-04-13 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Method of generating cartilage
AU2002213143A1 (en) * 2000-10-12 2002-04-22 Institute Of Materials Research And Engineering Non-disruptive three-dimensional culture and harvest system for anchorage-dependent cells
US20020151050A1 (en) * 2000-10-30 2002-10-17 Vacanti Charles A. Isolation of spore-like cells from tissues exposed to extreme conditions
US6998234B2 (en) * 2000-11-03 2006-02-14 Oncotech, Inc. Methods for cancer prognosis and diagnosis relating to tumor vascular endothelial cells
US6538010B1 (en) * 2000-11-08 2003-03-25 Research Triangle Institute Compounds and methods for promoting smoking cessation
JP3603103B2 (ja) * 2000-11-15 2004-12-22 独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構 動物（但し、ヒトを除く。）の受精卵の共培養担体及びこの担体を用いる動物（但し、ヒトを除く。）の受精卵の培養方法
US20020142304A1 (en) * 2001-03-09 2002-10-03 Anderson Daniel G. Uses and methods of making microarrays of polymeric biomaterials
US7858679B2 (en) * 2001-07-20 2010-12-28 Northwestern University Polymeric compositions and related methods of use
US7618937B2 (en) * 2001-07-20 2009-11-17 Northwestern University Peptidomimetic polymers for antifouling surfaces
US8815793B2 (en) * 2001-07-20 2014-08-26 Northwestern University Polymeric compositions and related methods of use
EP1281767A3 (en) 2001-07-31 2003-05-28 Aladar A. Szalay Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of tumors
AR036400A1 (es) * 2001-08-30 2004-09-08 Stem Cell Therapeutics Inc Regulacion combinada de la produccion de celulas nerviosas.
US7332330B2 (en) 2001-09-11 2008-02-19 Renamed Biologics, Inc. Device for maintaining vascularization near an implant
ATE541921T1 (de) * 2001-09-14 2012-02-15 Stem Cell Therapeutics Inc Prolaktin-induzierte zunahme an neuronalen stammzellen und dessen therapeutische anwendung
US20030054551A1 (en) * 2001-09-18 2003-03-20 Stem Cell Therapeutics Inc. Effect of growth hormone and IGF-1 on neural stem cells
WO2003054171A1 (en) * 2001-12-06 2003-07-03 The Regents Of The University Of California Method for differentiating islet precursor cells into beta cells
US7442546B2 (en) * 2002-03-15 2008-10-28 The Regents Of The University Of Michigan Method of modulating inflammatory response
WO2003080649A2 (en) * 2002-03-20 2003-10-02 Regents Of The University Of Minnesota Induction of hepatocyte proliferation in vitro by inhibition of cell cycle inhibitors
GB2387599B (en) 2002-04-17 2005-08-10 Jason Peter Brown Methods for producing antibodies
US8187326B2 (en) * 2002-05-22 2012-05-29 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc. Attachment of absorbable tissue scaffolds to fixation devices
US20030228261A1 (en) * 2002-06-05 2003-12-11 Aladar Szalay Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of diseases associated with wounded or inflamed tissue
EP1369491A1 (en) 2002-06-05 2003-12-10 Aladar A. Szalay Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of diseases associated with wounded or inflamed tissue
US7299805B2 (en) 2002-06-07 2007-11-27 Marctec, Llc Scaffold and method for implanting cells
US20030228287A1 (en) * 2002-06-07 2003-12-11 Regents Of The University Of California Maintenance of islet cells
US8911831B2 (en) * 2002-07-19 2014-12-16 Northwestern University Surface independent, surface-modifying, multifunctional coatings and applications thereof
US20080171012A1 (en) * 2007-01-11 2008-07-17 Phillip Messersmith Fouling Resistant Coatings and Methods of Making Same
DE10234742A1 (de) * 2002-07-30 2004-02-19 Bionethos Holding Verfahren und Vorrichtung zum Züchten von Zellen
CA2492442A1 (en) * 2002-07-31 2004-02-05 Stem Cell Therapeutics Inc. Method of enhancing neural stem cell proliferation, differentiation, and survival using pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (pacap)
US7744651B2 (en) * 2002-09-18 2010-06-29 Warsaw Orthopedic, Inc Compositions and methods for treating intervertebral discs with collagen-based materials
US20040054414A1 (en) * 2002-09-18 2004-03-18 Trieu Hai H. Collagen-based materials and methods for augmenting intervertebral discs
CN100394989C (zh) * 2002-11-15 2008-06-18 华沙整形外科股份有限公司 包含微粒状基于胶原材料的组合物的制药应用和包含所述组合物的滑膜关节
AU2003291093A1 (en) * 2002-11-19 2004-06-15 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Multilayered microcultures
AU2002952993A0 (en) 2002-11-29 2002-12-12 The Corporation Of The Trustees Of The Order Of The Sisters Of Mercy In Queensland Therapeutic and diagnostic agents
US20040186471A1 (en) * 2002-12-07 2004-09-23 Sdgi Holdings, Inc. Method and apparatus for intervertebral disc expansion
AU2003294541A1 (en) * 2002-12-24 2004-07-22 An-Go-Gen Inc. Encapsulated cell for therapy
WO2004094602A2 (en) * 2003-04-16 2004-11-04 Emory University Combinatorial surface chip compositions for selection, differentiation and propagation of cells
ATE420160T1 (de) 2003-06-18 2009-01-15 Genelux Corp Modifizierte rekombinante vacciniaviren, verwendungen davon
US7651596B2 (en) 2005-04-08 2010-01-26 Dexcom, Inc. Cellulosic-based interference domain for an analyte sensor
US9135402B2 (en) 2007-12-17 2015-09-15 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
US7591801B2 (en) 2004-02-26 2009-09-22 Dexcom, Inc. Integrated delivery device for continuous glucose sensor
US7920906B2 (en) 2005-03-10 2011-04-05 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data for sensor calibration
EP1667516A4 (en) 2003-08-29 2009-11-11 Inst Medical W & E Hall METHOD FOR SELECTION OF ANIMAL MODELS FROM ANIMALS MUTAGENICALLY SUBJECTED AND THE USE OF MYB TRANSCRIPTION FACTORS FOR SCREENING
US9247900B2 (en) 2004-07-13 2016-02-02 Dexcom, Inc. Analyte sensor
EP1701736A4 (en) 2003-12-24 2008-05-07 Inst Medical W & E Hall THERAPEUTIC AGENTS AND USES
CA2556266A1 (en) 2004-02-13 2005-08-25 Stem Cell Therapeutics Corp. Use of luteinizing hormone (lh), and chorionic gonadotropin (hcg) for proliferation of neural stem cells and neurogenesis
WO2009048462A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Dexcom, Inc. Integrated insulin delivery system with continuous glucose sensor
US8808228B2 (en) 2004-02-26 2014-08-19 Dexcom, Inc. Integrated medicament delivery device for use with continuous analyte sensor
US20050202096A1 (en) * 2004-03-09 2005-09-15 Jun Li Microcapsules for encapsulation of bioactive substances
WO2005099758A2 (en) * 2004-04-17 2005-10-27 The Board Of Trustees The Leland Standford Junior University Injectable bioartificial tissue matrix
WO2005108981A1 (en) 2004-05-12 2005-11-17 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research A method of cell isolation
US20070045902A1 (en) 2004-07-13 2007-03-01 Brauker James H Analyte sensor
US8989833B2 (en) 2004-07-13 2015-03-24 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
US20080095822A1 (en) * 2004-11-16 2008-04-24 Universite De Liege Active Substance Delivery System Comprising A Hydrogel Atrix And Microcarriers
US8133178B2 (en) 2006-02-22 2012-03-13 Dexcom, Inc. Analyte sensor
JP2008533995A (ja) * 2005-04-01 2008-08-28 エヌエスジーン・アクティーゼルスカブ ヒト不死化神経前駆細胞系
US8744546B2 (en) * 2005-05-05 2014-06-03 Dexcom, Inc. Cellulosic-based resistance domain for an analyte sensor
WO2006121661A2 (en) * 2005-05-05 2006-11-16 Dexcom, Inc. Cellulosic-based resistance domain for an analyte sensor
EP1883446B8 (en) * 2005-05-17 2017-11-15 Gloria Therapeutics Sarl An implantable therapy system for treating a living being with an active factor
WO2006138380A2 (en) * 2005-06-15 2006-12-28 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipids and uses thereof
AU2006261599B2 (en) 2005-06-24 2011-10-06 The Walter & Eliza Hall Institute Of Medical Research Therapeutic pro-apoptotic BH3-like molecules and methods for generating and/or selecting the same
WO2007036033A1 (en) 2005-09-27 2007-04-05 Stem Cell Therapeutics Corp. Oligodendrocyte precursor cell proliferation regulated by prolactin
US9388382B2 (en) * 2005-10-05 2016-07-12 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Isolation of CD14 negative, CD45 positive and CD117 positive embryonic-like stem cells free of monocytes from human umbilical cord blood mononuclear cells
EP2004796B1 (en) * 2006-01-18 2015-04-08 DexCom, Inc. Membranes for an analyte sensor
US7732539B2 (en) * 2006-02-16 2010-06-08 National Science Foundation Modified acrylic block copolymers for hydrogels and pressure sensitive wet adhesives
WO2007106987A1 (en) * 2006-03-17 2007-09-27 Stem Cell Therapeutics Corp. Continuous dosing regimens for neural stem cell proliferating agents and neural stem cell differentiating agents
US20080004703A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-03 Warsaw Orthopedic, Inc. Method of treating a patient using a collagen material
US20080004431A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-03 Warsaw Orthopedic Inc Method of manufacturing an injectable collagen material
US8399619B2 (en) * 2006-06-30 2013-03-19 Warsaw Orthopedic, Inc. Injectable collagen material
US8118779B2 (en) * 2006-06-30 2012-02-21 Warsaw Orthopedic, Inc. Collagen delivery device
AU2007275764B2 (en) 2006-07-18 2013-11-14 University Of Utah Research Foundation Methods for treating pain and screening analgesic compounds
US8563117B2 (en) * 2006-08-04 2013-10-22 Phillip B. Messersmith Biomimetic modular adhesive complex: materials, methods and applications therefore
US7622533B2 (en) 2006-08-04 2009-11-24 Nerites Corporation Biomimetic compounds and synthetic methods therefor
KR100770440B1 (ko) * 2006-08-29 2007-10-26 삼성전기주식회사 질화물 반도체 발광소자
EP1895012A1 (en) 2006-08-30 2008-03-05 Universitätsklinikum Freiburg Method for inducing tumor apoptosis by increasing nitric oxide levels
CA2666789C (en) * 2006-10-18 2016-11-22 Yong Zhao Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
US8673286B2 (en) 2007-04-09 2014-03-18 Northwestern University DOPA-functionalized, branched, poly(aklylene oxide) adhesives
US8383092B2 (en) * 2007-02-16 2013-02-26 Knc Ner Acquisition Sub, Inc. Bioadhesive constructs
JP5645657B2 (ja) 2007-06-07 2014-12-24 ウェイク・フォレスト・ユニヴァーシティ・ヘルス・サイエンシズ インクジェット遺伝子印刷法
US20080306444A1 (en) 2007-06-08 2008-12-11 Dexcom, Inc. Integrated medicament delivery device for use with continuous analyte sensor
WO2009005769A2 (en) * 2007-06-29 2009-01-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Soft gel systems in modulating stem cell development
US8417312B2 (en) 2007-10-25 2013-04-09 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
US8290559B2 (en) * 2007-12-17 2012-10-16 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
WO2009105709A1 (en) 2008-02-21 2009-08-27 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing, transmitting and displaying sensor data
JP2011514169A (ja) 2008-03-17 2011-05-06 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 幹細胞培養のためのマイクロキャリア
US20110143433A1 (en) * 2008-03-17 2011-06-16 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for Stem Cell Culture
US8691569B2 (en) * 2008-03-17 2014-04-08 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
US9458431B2 (en) 2008-03-17 2016-10-04 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
US8828720B2 (en) * 2008-03-17 2014-09-09 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
WO2009125332A1 (en) * 2008-04-07 2009-10-15 Peter Bromley New and safe procedure for immunization against infectious diseases agents
EP3269395A1 (en) 2008-11-07 2018-01-17 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
US20100125265A1 (en) * 2008-11-20 2010-05-20 Medtronic Vascular, Inc. Cell Delivery System to Induce Cell Growth and Angiogenesis
AU2010206374B2 (en) 2009-01-23 2013-01-17 Gloriana Therapeutics Sarl Improved cell lines and their use in encapsulated cell biodelivery
JP2012520672A (ja) 2009-03-20 2012-09-10 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ マイクロキャリアー上の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）および多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞の培養
PL2470228T3 (pl) 2009-08-28 2018-03-30 Sernova Corporation Sposoby i urządzenia do przeszczepiania komórek
KR20120100962A (ko) 2009-10-02 2012-09-12 박스터 헬쓰케어 에스.에이. 신장 손상을 치료하는데 사용하기 위한 조혈 줄기 세포
EP2499240A1 (en) 2009-11-12 2012-09-19 Vbi Technologies, LLC Subpopulations of spore-like cells and uses thereof
EP3318248B1 (en) 2009-12-01 2019-04-10 Translate Bio, Inc. Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
US20110130465A1 (en) * 2009-12-01 2011-06-02 Nerites Corporation Coatings for prevention of biofilms
US9193827B2 (en) 2010-08-26 2015-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Poly(beta-amino alcohols), their preparation, and uses thereof
WO2012048276A2 (en) 2010-10-08 2012-04-12 Caridianbct, Inc. Customizable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system
WO2012064821A2 (en) 2010-11-09 2012-05-18 Knc Ner Acquisition Sub, Inc. Adhesive compounds and methods use for hernia repair
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
EP2646468B1 (en) 2010-12-01 2018-07-25 AlderBio Holdings LLC Anti-ngf compositions and use thereof
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
JP2014506119A (ja) 2010-12-02 2014-03-13 ニューロテック ユーエスエー， インコーポレイテッド 抗血管新生抗体足場および可溶性受容体を分泌する細胞株およびその使用
EP2691443B1 (en) 2011-03-28 2021-02-17 Massachusetts Institute of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
RU2013154295A (ru) 2011-06-08 2015-07-20 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. КОМПОЗИЦИИ ЛИПИДНЫХ НАНОЧАСТИЦ И СПОСОБЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ мРНК
CN102350008A (zh) 2011-10-25 2012-02-15 微创医疗器械(上海)有限公司 一种处理动物源性胶原纤维材料的方法
ES2700980T3 (es) 2012-02-17 2019-02-20 Schepens Eye Res Inst Perfil fenotípico de células progenitoras de retina humana
JP2015508101A (ja) 2012-02-21 2015-03-16 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ Ｃｄ３４＋細胞を含む薬学的組成物
CN104640579A (zh) 2012-05-30 2015-05-20 神经技术美国有限公司 冷冻保存的可植入细胞培养装置及其用途
WO2013185067A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
WO2014028487A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipidoids and uses thereof
CN105229144A (zh) 2013-02-22 2016-01-06 细胞动力学国际有限公司 通过组合的遗传工程和化学工程经由正向编程产生肝细胞
RS57739B1 (sr) 2013-03-14 2018-12-31 Translate Bio Inc Kompozicije cftr irnk i postupci i upotrebe u vezi sa njima
JP6586075B2 (ja) 2013-03-14 2019-10-02 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａの精製方法
US10081609B2 (en) 2013-03-15 2018-09-25 The Broad Institute, Inc. Compounds for inducing proliferation and differentiation of cells, and methods of use thereof
US9888680B2 (en) 2013-04-04 2018-02-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Functional recovery of human lungs for transplantation
WO2014179562A1 (en) 2013-05-01 2014-11-06 Massachusetts Institute Of Technology 1,3,5-triazinane-2,4,6-trione derivatives and uses thereof
US11229789B2 (en) 2013-05-30 2022-01-25 Neurostim Oab, Inc. Neuro activator with controller
EP3441109A1 (en) 2013-05-30 2019-02-13 Graham H. Creasey Flexible dermal patch for a topical nerve stimulator system
JP6681826B2 (ja) 2013-05-31 2020-04-15 ザ ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデイション コノトキシンペプチド、医薬組成物およびそれらの使用
US20150044259A1 (en) * 2013-08-08 2015-02-12 Mauris N. DeSilva Scaffold for enhanced neural tissue regeneration
CA2922483A1 (en) 2013-09-11 2015-03-19 Neurotech Usa, Inc. Encapsulated cell therapy cartridge
CN106413811A (zh) 2013-10-22 2017-02-15 夏尔人类遗传性治疗公司 精氨基琥珀酸合成酶缺乏症的mrna疗法
ES3032935T3 (en) 2013-10-22 2025-07-29 Translate Bio Inc Lipid formulations for delivery of messenger rna
JP6506749B2 (ja) 2013-10-22 2019-04-24 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド フェニルケトン尿症のためのｍＲＮＡ療法
WO2015073913A1 (en) 2013-11-16 2015-05-21 Terumo Bct, Inc. Expanding cells in a bioreactor
WO2015148704A1 (en) 2014-03-25 2015-10-01 Terumo Bct, Inc. Passive replacement of media
US20170107486A1 (en) 2014-04-21 2017-04-20 Cellular Dynamics International, Inc. Hepatocyte production via forward programming by combined genetic and chemical engineering
US9850269B2 (en) 2014-04-25 2017-12-26 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger RNA
JP6557722B2 (ja) 2014-05-30 2019-08-07 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド 核酸の送達のための生分解性脂質
KR102559979B1 (ko) 2014-06-24 2023-07-25 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 핵산의 전달용 입체화학적으로 풍부한 조성물
US9840479B2 (en) 2014-07-02 2017-12-12 Massachusetts Institute Of Technology Polyamine-fatty acid derived lipidoids and uses thereof
EP3198006B1 (en) 2014-09-26 2021-03-24 Terumo BCT, Inc. Scheduled feed
US11077301B2 (en) 2015-02-21 2021-08-03 NeurostimOAB, Inc. Topical nerve stimulator and sensor for bladder control
CA2986769A1 (en) 2015-05-27 2016-12-01 Neurotech Usa, Inc. Use of encapsulated cell therapy for treatment of ophthalmic disorders
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
CA2998991A1 (en) 2015-09-25 2017-04-20 Maxivax Sa Vaccination with immuno-isolated cells producing an immunomodulator
EP3365429B1 (en) 2015-10-19 2020-03-11 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Production of virus-receptive pluripotent stem cell (psc)-derived hepatocytes
JP6877419B2 (ja) 2015-10-27 2021-05-26 ザ ユニバーシティー オブ クイーンズランド 治療の方法およびそのために有用な剤
EP3397753B1 (en) 2015-12-30 2021-10-27 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Microtissue formation using stem cell-derived human hepatocytes
US11965175B2 (en) 2016-05-25 2024-04-23 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
CN106497877A (zh) * 2016-11-01 2017-03-15 南方医科大学 一种促进骨髓间充质干细胞向神经诱导分化的基质材料
CA3042495A1 (en) 2016-11-10 2018-05-17 Viacyte, Inc. Pdx1 pancreatic endoderm cells in cell delivery devices and methods thereof
EA201991747A1 (ru) 2017-02-27 2020-06-04 Транслейт Био, Инк. НОВАЯ КОДОН-ОПТИМИЗИРОВАННАЯ мРНК CFTR
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US12234441B2 (en) 2017-03-31 2025-02-25 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
CN117247899A (zh) 2017-03-31 2023-12-19 泰尔茂比司特公司 细胞扩增
MX2019013752A (es) 2017-05-16 2020-07-20 Translate Bio Inc Tratamiento de la fibrosis quística mediante el suministro de arnm que codifica cftr optimizado en codones.
US11331022B2 (en) 2017-10-24 2022-05-17 Dexcom, Inc. Pre-connected analyte sensors
US11382540B2 (en) 2017-10-24 2022-07-12 Dexcom, Inc. Pre-connected analyte sensors
WO2019094365A1 (en) 2017-11-07 2019-05-16 Neurostim Oab, Inc. Non-invasive nerve activator with adaptive circuit
KR102950141B1 (ko) 2018-08-24 2026-04-07 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 전령 rna의 정제 방법
WO2020106946A1 (en) 2018-11-21 2020-05-28 Translate Bio, Inc. TREATMENT OF CYSTIC FIBROSIS BY DELIVERY OF NEBULIZED mRNA ENCODING CFTR
CN113748200A (zh) * 2019-04-03 2021-12-03 赛康特集团有限责任公司 用于纺织品和纤维的人细胞沉积的细胞外基质涂层
JP7556502B2 (ja) 2019-05-09 2024-09-26 フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド ヘパトサイトの作製方法
CA3144957A1 (en) 2019-06-26 2020-12-30 Neurostim Technologies Llc Non-invasive nerve activator with adaptive circuit
EP4031662A1 (en) 2019-09-20 2022-07-27 Translate Bio, Inc. Mrna encoding engineered cftr
WO2021126921A1 (en) 2019-12-16 2021-06-24 Neurostim Solutions, Llc Non-invasive nerve activator with boosted charge delivery
US20230383261A1 (en) 2020-10-14 2023-11-30 Sana Biotechnology, Inc. Hepatocyte-like cells
EP4314244B1 (en) 2021-03-23 2025-07-23 Terumo BCT, Inc. Cell capture and expansion
WO2022235869A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Astellas Institute For Regenerative Medicine Methods of generating mature hepatocytes
US12209689B2 (en) 2022-02-28 2025-01-28 Terumo Kabushiki Kaisha Multiple-tube pinch valve assembly
USD1099116S1 (en) 2022-09-01 2025-10-21 Terumo Bct, Inc. Display screen or portion thereof with a graphical user interface for displaying cell culture process steps and measurements of an associated bioreactor device

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4391909A (en) 1979-03-28 1983-07-05 Damon Corporation Microcapsules containing viable tissue cells
US4495288A (en) 1981-03-13 1985-01-22 Damon Biotech, Inc. Method of culturing anchorage dependent cells
US4402694A (en) * 1981-07-16 1983-09-06 Biotek, Inc. Body cavity access device containing a hormone source
US4485096A (en) * 1982-02-26 1984-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Tissue-equivalent and method for preparation thereof
US4479796A (en) * 1982-11-15 1984-10-30 Medtronic, Inc. Self-regenerating drug administration device
US4489796A (en) * 1983-05-25 1984-12-25 Gte Laboratories Incorporated Insert for a mine tool roof bit and a method of drilling therewith
IL75554A (en) * 1985-06-18 1993-01-14 Yeda Res & Dev Matrix for cell cultivation in vitro
US4829000A (en) * 1985-08-30 1989-05-09 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Reconstituted basement membrane complex with biological activity
US5049493A (en) * 1987-10-23 1991-09-17 California Institute Of Technology Enhancement of cell growth by expression of a cloned hemoglobin gene
US5158881A (en) * 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US5106627A (en) * 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US5182111A (en) * 1987-11-17 1993-01-26 Boston University Research Foundation In vivo delivery of active factors by co-cultured cell implants
US5156844A (en) * 1987-11-17 1992-10-20 Brown University Research Foundation Neurological therapy system
US5283187A (en) * 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
US5270191A (en) * 1988-04-12 1993-12-14 Massachusetts Institute Of Technology Method for manipulation of the cell types of eukaryotes
ATE90724T1 (de) * 1988-04-12 1993-07-15 Massachusetts Inst Technology Verfahren zur manipulation des zelltyps von eukaryonten.
US5250414A (en) * 1988-11-04 1993-10-05 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Diagnostic methods using neurite growth regulatory factors
US5082670A (en) * 1988-12-15 1992-01-21 The Regents Of The University Of California Method of grafting genetically modified cells to treat defects, disease or damage or the central nervous system
JP3244696B2 (ja) * 1989-06-13 2002-01-07 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー ヒト筋肉細胞の単離、増殖および分化
US5538722A (en) * 1989-06-13 1996-07-23 Stanford University Isolation, growth, differentiation and genetic engineering of human muscle cells
WO1991000119A1 (en) 1989-06-30 1991-01-10 Baxter International Inc. Implantable device
US5053332A (en) * 1989-07-24 1991-10-01 Cook Richard B Agarose beads, preferably incorporating biological materials
US5354736A (en) * 1989-08-14 1994-10-11 Regents Of The University Of California Synthetic compounds and compositions with enhanced cell binding
US5002661A (en) 1989-08-25 1991-03-26 W. R. Grace & Co.-Conn. Artificial pancreatic perfusion device
GB8928884D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Feldmann Marc Transformed cell lines
GB9003791D0 (en) * 1990-02-20 1990-04-18 Ludwig Inst Cancer Res Transgenic animals,cell lines therefrom,and their use
US5101319A (en) * 1990-04-03 1992-03-31 Vistatech Corporation Pre-engineered electrode/dielectric composite film and related manufacturing process for multilayer ceramic chip capacitors
DE4123629A1 (de) * 1990-08-06 1992-02-20 Jakob Dr Bodziony Ein implantierbares und biologisch aktive substanzen sezernierendes bio-artifizielles organ, das auf dem prinzip des druckgradients funktioniert
CA2089582A1 (en) * 1990-08-15 1992-02-16 Richard P. Bunge Autotransplantation of schwann cells to promote nervous system repair
ATE156344T1 (de) * 1991-04-25 1997-08-15 Univ Brown Res Found Implantierbare, biokompatible immunisolator- trägersubstanz zum abgeben ausgesuchter, therapeutischer produkte
SG47451A1 (en) * 1991-06-28 1998-04-17 Univ Brown Res Found Implantable therapy system
CA2111978A1 (en) * 1991-06-28 1993-01-07 Patrick Aebischer Renewable neural implant device and method
DK0594669T4 (da) * 1991-07-08 2008-04-21 Neurospheres Holdings Ltd Neurale progenitorceller, som reagerer på vækstfaktorer og kan formeres in vitro
WO1993003901A1 (en) * 1991-08-23 1993-03-04 W.R. Grace & Co. - Conn. Implantable immunoisolated therapeutic devices
AU3586993A (en) * 1992-01-23 1993-09-01 New York University A method for transplanting cells into the brain and therapeutic uses therefor
WO1993021902A1 (en) * 1992-04-24 1993-11-11 Somatix Therapy Corporation Biocompatible, therapeutic, implantable device
AU4114493A (en) * 1992-04-24 1993-11-29 Polymer Technology Group, Inc., The Method of culturing viable cells and method of regulating the level of a compound in a body fluid
EP0745121B1 (en) * 1992-05-14 2007-06-20 Baylor College Of Medicine Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy
CA2137456A1 (en) * 1992-07-02 1994-01-20 Inder Verma Use of myoblasts for sustained delivery of gene products
AU4995193A (en) * 1992-08-04 1994-03-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of enhancing differentiation and survival of neuronal precursor cells
US5489743A (en) * 1993-01-19 1996-02-06 Amgen Inc. Transgenic animal models for thrombocytopenia
JPH09500526A (ja) * 1993-06-14 1997-01-21 ベーアーエスエフ アクツィエンゲゼルシャフト テトラサイクリン反応性プロモーターによる真核細胞の遺伝子発現の厳密な制御
SG48813A1 (en) * 1993-08-12 1998-05-18 Cytotherapeutics Inc Improved composition and methods for the delivery of biologically active molecules using genetically altered cells contained in biocompatible immunoisolatory capsules
US5453368A (en) * 1993-08-27 1995-09-26 Brown University Research Foundation Method of encapsulating biological substances in microspheres
US5550050A (en) * 1994-04-15 1996-08-27 Cytotherapeutics, Inc. Method for implanting encapsulated cells in a host

Also Published As

Publication number Publication date
IS4417A (is) 1997-01-17
US5795790A (en) 1998-08-18
BR9508312A (pt) 1999-06-01
CA2195446C (en) 2010-05-25
US6392118B1 (en) 2002-05-21
CZ16397A3 (cs) 1998-03-18
SK7797A3 (en) 1997-08-06
WO1996002646A2 (en) 1996-02-01
US5853717A (en) 1998-12-29
TR199500882A2 (tr) 1996-06-21
AU3142295A (en) 1996-02-16
CA2195446A1 (en) 1996-02-01
US5858747A (en) 1999-01-12
IL114671A0 (en) 1995-11-27
FI970217A7 (fi) 1997-01-17
EP0771350A1 (en) 1997-05-07
EE9700018A (et) 1997-06-16
JP2006198414A (ja) 2006-08-03
JPH10506266A (ja) 1998-06-23
CN1152938A (zh) 1997-06-25
US5776747A (en) 1998-07-07
JP2005224614A (ja) 2005-08-25
NO970156L (no) 1997-03-20
US5840576A (en) 1998-11-24
FI970217A0 (fi) 1997-01-17
PL318288A1 (en) 1997-06-09
NZ290629A (en) 1998-10-28
NO970156D0 (no) 1997-01-14
MX9700527A (es) 1997-04-30
WO1996002646A3 (en) 1996-05-17
AU698624B2 (en) 1998-11-05
US5833979A (en) 1998-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU698624B2 (en) Growth control for cells encapsulated within bioartificial organs
US5935849A (en) Methods and compositions of growth control for cells encapsulated within bioartificial organs
Hosseinkhani et al. DNA nanoparticles encapsulated in 3D tissue‐engineered scaffolds enhance osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells
US6054142A (en) Biocompatible devices with foam scaffolds
Loh et al. The regrowth of axons within tissue defects in the CNS is promoted by implanted hydrogel matrices that contain BDNF and CNTF producing fibroblasts
US6495364B2 (en) Mx-1 conditionally immortalized cells
US20060153815A1 (en) Tissue engineering devices for the repair and regeneration of tissue
AU2005319401A1 (en) Tissue engineering devices for the repair and regeneration of tissue
Yang et al. Hollow fibers for hepatocyte encapsulation and transplantation: studies of survival and function in rats
KR100864648B1 (ko) 단백질 대사 기능을 갖는 인공 신장 및 그 제작 방법
CN115770324B (zh) 一种促进神经再生的活体静电纺丝支架的制备方法
JPH11243948A (ja) 動物細胞増殖用の細胞培養床基材及びその調製方法
JPWO2002012451A1 (ja) ヒト軟骨細胞培養方法
AU708186B2 (en) Growth control for cells encapsulated within bioartificial organs
Li et al. Encapsulation matrices for neurotrophic factor-secreting myoblast cells
WO2000006204A2 (en) Genetically engineered cells and tissues
CN101189327A (zh) 人无限增殖神经前体细胞系
RU2464987C1 (ru) Способ получения резорбируемой полилактидной матрицы для культивирования и имплантации клеток, предназначенных для заживления ран
AU701860B2 (en) Glucose responsive insulin secreting beta-cell lines and method for producing same
WO2014110389A1 (en) Hybrid matrix
MacDonald The Effect of Growth Facotrs and Extracellular Matrix Materials on the Growth and Differentiation of Microencapsulated Myoblasts
Schurig Tissue engineering for reconstructing the central dopaminergic nigro-striatal pathway in Parkinson’s disease: Cutting edge cell culture studies
Rodríguez-cabello et al. Elastin-like recombinamers as substrates for retinal pigment epithelial cell growth

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee