IT8448492A1 - Derivati di gangliosidi - Google Patents

Description

Descrizione di una invenzione industriale del titolo DERIVATI DI GANGLIOSIDI " della F.I.D.I.A. Farmaceutici Italiani Derivati Industriali ed Affini societ? per azioni con sede in via Ponte della Fabbrica 3a Abano Terme Padova Italia, nella persona del suo Consigliere Delegato e legale rappresentante dr. Francesco della Valle.

Inventori: Dr. Francesco della Valle

* Prof. Aurelio Romeo

Depositata il . con N.

RIASSUNTO

La presente invenzione si riferisce a nuovi derivati funzionali di gangliosidi e pi? precisamente a nuovi esteri e amidi e ai procedimenti per la loro preparazione, nonch? a preparazioni farmaceutiche contenenti esteri e amidi di gangliosidi, fra cui in particolare quelli nuovi sopra detti, e all'uso terapeutico di esteri e amidi di gangliosidi o delle relative preparazioni farmaceutiche.

T? I gangliosidi sono prodotti naturali contenuti in diversi tessuti o organi animali, soprattutto nei tessuti del sistema nervoso centrale e periferico di vertebrati, ma anche nel midollo surrenale, negli eritrociti, nella milza, e altrove, dai quali possono essere isolati in forma purificata. Della maggior parte dei gangliosidi cos? ottenuti si ? potuto stabilire la struttura base che ? quella di glicosfingolipidi e cio? composti risultanti dall'unione di un oligosaccaride con una sfingosina e un certo numero di acidi sialici legati fra di loro mediante legami glucosidici o chetosidici. I gangliosidi finora descritti in letteratura ed ottenuti in forma purificata non rappresentano composti chimici unitari, se non eventualmente per la parte saccaridica (oligosaccaride), essendo invece assai variabile, entro certi limiti, la componente ceramidica e quella sialica, cosicch? anche quando ci si riferisce a gangliosidi "puri", questo termine va inteso in senso lato e sta ad indicare piuttosto una specie di ganglioside in cui ? unitaria e caratteristica dal punto di vista chimico almeno una parte, per esempio quella saccaridica.

Ci? premesso, prima di definire pi? precisamente l'ambito della presente invenzione, ? utile riportare la seguente formula generale che include tutte le strutture dei gangliosidi finora ottenuti in forma purificata e in cui vengono messe in risalto le funzioni che secondo l'invenzione, vengono ad essere funzionalmente modificate (formula I).

HOOC l l M II addi i ii inOH imOH

alalid

ili mOH

caramida HOOC I I I H I o o I

QH OH

^ ! - - -- - " " - - I - * OH OLIGO SACCA RIDE ?H

In questa formula un residuo di oligosaccaride, formato da un massimo di 5 monosaccaridi, ? connesso mediante un legame glucosidico ad un residuo di ceramide e ad uno o pi? residui di acidi sialici, sia mediante altrettanti legami glucosidici diretti, sia mediante uno solo od alcuni di tali legami, essendo i rimanenti residui di acidi sialici uniti fra di loro mediante legami chetosidici. Nella formula sono riportati in modo schematico i gruppi idrossilici della parte saccaridica, degli acidi sialici e del ceramide, come pure i suddetti legami glucosidici con gli acidi sialici e con il ceramide e i gruppi carbossilici degli acidi sialici.

Gli acidi sialici che fanno parte dei gangliosidi di formula I hanno la struttura generale II

H

CHjCC

COOH

II

OH

in cui uno o pi? dei gruppi idrossilici primari e secondari possono anche essere acilati e in cui i gruppi acilici derivano dall'acido acetico o glicolico. Il numero di acidi sialici presenti nei gangliosidi varia di solito da 1 a 5.

I residui sialici sono legati all'oligosaccaride mediante un legame chetosidico formato dall'idrossile in posizione 2 con un idrossile dell1oligosaccaride.

Quando pi? acidi sialici sono legati fra di loro, l'unione delle loro molecole avviene mediante legami chetosidici formati tra gli idrossili delle posizioni 2 e 8 di due molecole di acidi sialici. Gli acidi sialici dei gangliosidi, anche di quelli purificati nel senso sopra esposto, sono miscele di diversi acidi chimicamente unitari, per esempio di acido N-acetilneuraminico e N-glicolilneuraminico, in cui predomina il primo, ed eventualmente di uno 0 pi? dei loro 0-acilderivati, per esempio degli 8-0-acilder ivati.

1 gangliosidi si trovano in natura allo stato di sali metallici, per esempio di sali sodici, e sono quindi la o le funzioni carbossiliche degli acidi sialici ad essere salificate. Le forme libere dei gangliosidi si possono ottenere vantaggiosamente per trattamento dei sali, per esempio di quelli

* sodici, con degli scambiatori ionici di tipo acido, per esempio con resine del tipo Dowex AG 50x8 forma H+.

Il residuo del ceramide nei gangliosidi di formula I rappresenta in generale un insieme di diversi radicali di sfingosine N-acilate aventi una delle formule

CHj-O- CHa-0-CH-NH-adU CH-NK-acM?

<pH?OH <pH-OH

CHa

CHa

(???-??, (oy?-CH,

in cui n = 10 - 16 e l'acile deriva da un acido grasso saturo o insaturo avente da 16 a 22 atomi di carbonio o da un corrispondente idrossiacido.

L'oligosaccar ide si compone di un massimo di 5 monosaccaridi o derivati di essi con un gruppo acilaminico, soprattutto di esosi e dei loro derivati del suddetto tipo. E* per? sempre presente nell?oligosaccar ide almeno una molecola di glucosio o di galattosio; il residuo pi? frequente come derivato

acilaminico dei suddetti zuccheri e la N-acetilgalattosamina o la N-acetilglucosamina.

Per meglio illustrare la struttura dei gangliosidi

compresi dalla formula I e in particolare il carattere dei legami fra la parte saccaridica, gli acidi

sialici e il ceramide riproduciamo per intera la

formula di un ganglioside "pur GM1 contenente

un solo acido sialico (rappresentato dall'acido

N-acetilneuraminico o N-glicolilneuraminico).

CHj?CO?N COOH

HO H

HJDH HJDH

Hi

OH H/H .ctramMt

H\OH M/H H H/ H X\|H H/H

N-CO-CH, H OH

Y-H OH E' noto che i gangliosidi svolgono una funzione importante nel sistema nervoso ed ? stato recentemente dimostrato che i gangliosidi sono utili nella

terapia delle patologie del sistema nervoso perife-

*

rico e nelle patologie del sistema nervoso centrale [Acta Psychiat.Scand., 5j5, 102, (1977); Eur.Medicophys.,13, 1, (1977); Rie.Sei.Educ.Perm.Suppl.9, 115, (1978); Adv.Exp.Med.Biol. 71, 275, (1976).; Electromyogr .Clin. Neurophysiol., 19^, 353, (1979); Minerva Medica, 6_9, 3277, (1978); Minerva Stomat., 27, 177, (1978); Med.del Lavoro, 68, 296 (1977); Brain Res. 197, 236, (1980)].

L'azione terapeutica dei gangliosidi sembra consistere soprattutto nello stimolare i fenomeni di sprouting della cellula nervosa e nell'attivare gli enzimi di membrana implicati nella conduzione degli stimoli nervosi, come ad esempio l'enzima (Na+,K+) ATPasi [Brain Res., 197, 236 (1980), J. of Neurochem. 3_7, 350 (1981)]. Lo sprouting neuronaie stimolato dai gangliosidi promuove il ripristino funzionale del tessuto nervoso compromesso.

Sono stati compiuti ulteriori studi per trovare composti che si sarebbero potuti rivelare pi? efficaci dei gangliosidi nella terapia delle patologie del sistema nervoso. Tali studi hanno portato per esempio alla scoperta che esteri interni dei gangliosidi, nei quali uno o pi? idrossili della parte saccaridica sono esterificati con uno o pi? gruppi carbossilici degli acidi sialici (reazione intramolecolare) con formazione di altrettanti anelli lattonici sono pi? attivi dei gangliosidi stessi nel promuovere lo sprouting neuronaie e nell1attivare gli enzimi di membrana implicati nella conduzione dello stimolo nervoso, come ad esempio l'enzima (Na+,K+)ATPasi (cfr. per esempio brevetto Belga 894,024 del 3.2.1983). Secondo il trovato della presente invenzione si ? ora scoperto un altro gruppo di derivati dei gangliosidi che presentano vantaggi sopra i gangliosidi stessi per il fatto d'avere un'attivit? prolungata nel tempo (effetto "retard") si tratta di derivati in cui i gruppi carbossilici degli acidi sialici sono funzionalmente modificati per esterificazione o per conversione in amidi e derivati di tali esteri o amidi in cui anche i gruppi idrossilici della parte saccaridica, degli acidi sialici e del ceramide sono esterificati con acidi organici, ossia derivati acilati (che saranno eventualmente in questo testo detti semplicemente "acilati" ed in modo specifico "acetilati, propionilati , ecc.") oppure derivati dei gangliosidi in cui solo questi ultimi gruppi idrossilici sono esterificati con acidi organici.

Due esteri metilici del carbossile di un acido sialico di gangliosidi furono descritti nell'articolo "Notes on improved procedures for th? Chemical modification and degradation of glycosphyngolipids" in Journal of Lipid Research 21, 642-645 (1980) da MacDonald et al.: si tratta degli esteri metilici dei gangliosidi e Ule abbreviazioni usate in questo testo per l'identificazione dei gangliosidi sono quelle proposte da Svennerholm in J. Neurochem. 1?, 613 (1963)], e per? nessuna attivit? biologica venne riportata. L'estere metilico del ganglioside GM3 venne usato pure nella preparazione di un suo derivato peracilato da usarsi in diverse reazioni di degradazione e di copulazione [Methods of Enzymology, i>?, 137-140 (1978)]. Anche nell'articolo menzionato sopra in Journal of Lipid Research viene effettuata una acetilazione degli esteri metilici dei gangliosidi GM1 e GM3, senza l'isolamento dei composti acilati.

L' acetilazione con anidride acetica-piridina di lipidi estratti dalla milza, dal fegato e dai reni di ratti del ceppo Buffalo, da epatomi di Morris e da cellule di fibroblasti ? stata descritta da Terunobo Saito e Sen-Itiroh Hakomori in Journal of Lipid Research, 12, 257-259, (1971). Dal prodotto acilato gli autori hanno isolato per cromatografia la miscela acetilata dei gangliosidi contenuti in quei lipidi assieme ad altri glicolipidi senza per? identificare alcun ganglioside specifico. Delle amidi ? stata descritta 11amide non sostituita del ganglioside [Adv.Exp.Med.Biol. IJi, 95 (1972)] , ma pure in tal caso nessuna propriet? biologica ? stata menzionata.

Un primo oggetto della presente invenzione ? quindi dato dai nuovi derivati funzionali di gangliosidi sopra menzionati, e cio? dagli esteri e dalle amidi dei gruppi carbossilici dei gangliosidi definiti dalla formula I o delle loro miscele, dai derivati di questi esteri e di queste amidi peracilati nei gruppi idrossilici dell1oligosaccaride, degli acidi sialici e del ceramide, e dai derivati peracilati nei gruppi idrossilici dell1oligosaccaride, degli acidi sialici e del ceramide di gangliosidi di formula I o delle loro miscele con le funzioni carbossiliche libere, ad eccezione degli esteri metilici dei gangliosidi G^ e G^ e dei loro peracetilati e dell'amide del ganglioside G^ , nonch? dei peracetilati di gangliosidi ottenuti secondo il

?? procedimento descritto nell'articolo "Quantitative isolation of total glycosphingolipids from animai cells" in Journal of Lipid Research, 12, 257-259 (1971), ed eventualmente dei loro sali.

Un secondo oggetto dell'invenzione ? invece costituito da nuove preparazioni farmaceutiche contenenti sia i nuovi derivati funzionali test? definiti, sia quelli noti pure sopra descritti e un terzo oggetto ? dato dall'uso terapeutico di tutti questi derivati di gangliosidi.

Gli esteri e le amidi sopra definiti sono monoesteri e monoamidi rispettivamente nel caso di monosialogangliosidi e poliesteri e poliamidi nel caso di polisialogangliosidi , con tanti gruppi esteri o amidici quanti sono i gruppi carbossilici presenti e quindi tanti quanto sono i gruppi sialici presenti .

Nelle miscele usate per l'esterificazione o la conversione in amidi per la preparazione di composti attivi secondo l'invenzione, come per esempio la miscela descritta nell'Esempio 3, in cui sono contenuti sia monosialogangliosidi, sia polisialogangliosidi, tutti i gruppi carbossilici vengono modificati in tal senso e si ottengono quindi derivati

> totalmente esterificati o convertiti in amidi. La definizione "esteri e amidi" data in questa descrizione e nelle rivendicazioni va quindi interpretata i tal senso, e ci? vale pure, in modo speciale per i derivati degli Esempi illustrativi che vengono semplicemente riferiti come "esteri" o "amidi" anche quando si tratta di miscele che contengono polisialogangliosidi totalmente esterificati o convertiti nelle amidi in tutti i gruppi carbossilici. I gangliosidi che fanno da base ai derivati funzionali dei vari oggetti dell'invenzione possono essere tutti quelli estratti dai diversi tessuti e organi animali, come in modo speciale dai tessuti del sistema nervoso centrale e periferico, per esempio dal cervello, dal fluido cerebrospinale, dai muscoli, dal plasma e dal siero del sangue, dai reni, dai surreni, dal fegato, dalla milza, dall'intestino, da eritrociti o leucociti, e sono per esempio quelli purificati e descritti nella letteratura, per esempio quelli estratti da tessuti e organi di vertebrati, in modo speciale di mammiferi, per esempio dell'uomo, di bovini, di vitello, di ratto, ?s di topo o da microrganismi.

Dal punto di vista della loro struttura i gangliosidi possono essere monosialo-, disialo-, trisialo-, tetrasialo-, o pentasialogangliosidi, essendo gli acidi sialici soprattutto l'acido N-acetilneuraminico e N-glicolilneuraminico. Gli acidi sialici possono anche essere acilati ad uno degli idrossili della loro catena laterale, per esempio all'idrossile in posizione 8, se questo non ? gi? occupato da un legame chetosidico che lo lega ad un altro residuo sialico. La parte del ceramide pu? variare, come detto sopra, e per la lunghezza della catena di atomi di carbonio delle sfingosine che vi entrano a far parte, che pu? variare da 16 a 22 di tali atomi, e per la lunghezza del residuo acilico, che pu? pure essere compresa in questi limiti, contenendo di solito il residuo ceramidico, anche nei gangliosidi purificati, un miscuglio di acilsfingosine aventi queste diverse grandezze molecolari. Oltre a ci?, il residuo di ceramide pu? variare per la presenza o meno del doppio legame nella sfingosina ed in generale tale residuo si compone in larga misura della sfingosina N-acilata non satura e di una bassa percentuale (che pu? per? anche arrivare sino a circa il 10%) del corrispondente composto saturo. Il gruppo acilico pu? anche essere de-

*

rivato da idrossiacidi alitatici col suddetto numero di atomi di carbonio variante da 16 a 22. Un gruppo di gangliosidi particolarmente importante contiene nel residuo ceramidico sfingosine acilate con 18 o 20 atomi di carbonio nella loro catena e corrispondenti composti saturi, mentre il loro gruppo acilico saturo o insaturo, non sostituito o sostituito da idrossili, ha pure tale numero di 18 o 20 atomi di carbonio.

L'invenzione presente si riferisce da un lato ai derivati funzionali sopraddetti di gangliosidi di formula I "puri", cio? con composizione unitaria nel senso sopra definito, e d'altro canto ai derivati funzionali sopra definiti di miscele di gangliosidi, come si ottengono per esempio per estrazione dai vari tessuti animali. Nel primo caso i gangliosidi base sono soprattutto quelli in cui 1'oligosaccar ide ? formato da un massimo di 4 residui di esosi o N-acetilesosamine, essendo presente per? almeno un residuo di esoso, e in cui questa parte saccaridica ? chimicamente unitaria. Gli esosi sono preferibilmente scelti dal gruppo costituito da glucosio e galattosio e le N-acetilesosamine dal gruppo formato da N-acetilglucosamina e N-acetilgalattosamina (gruppo di gangliosidi A). I gangliosidi di tale gruppo sono per esempio quelli estratti dal cervello di vertebrati, come quelli descritti nell'articolo "Gangliosides of th? Nervous System" in Glycolipid Methodology, Lloyd A. Witting Fd., American Oil Chemists' Society, Champaign, 111. 187-214 (1976) (vedi in modo speciale la tavola 1), per esempio i gangliosidi GM4, GM3, GM2' GM1-G1CNAC, GD2? GDla-GalNAc, GTlc, GQ, GT1 e, in modo particolare, quelli in cui 11oligosaccaride contiene almeno un residuo di glucosio o di galattosio e uno di N-acetilglucosamina o di N-acetilgalattosamina e soprattutto i seguenti (gruppo di gangliosidi B)

Mi

Gal (1? 3)GalNAC(1? 4)Gal(1? 4)Glc(1?1) Ceramide

(!)

NANA

Dia

Gal (1? 3)GalNAC(1?4)Gal(1?4)Glc (1? 1) Ceramide

(!) (!)

NANA NANA

Dlb

Gal {1?*3)GalNAC(1? 4)Gal(1??4)Glc(1? 1) Ceramide

(!)

NANA

(!)

NANA

GTlb

Gal(l? 3)GalNAC(l? 4)Gal(l? 4)Glc(l?1) Ceramide

(!)

NANA NANA

NANA

dove Glc sta per glucosio, GalNAC sta per N-acetil-

galattosamina , Gal sta per galattosio, NANA sta per

acido N-acetilneuraminico.

Se si prendono come base per le conversioni funzio-

nali secondo la presente invenzione miscele di gan-

gliosidi, queste possono essere costituite da quel-

le ottenute direttamente per estrazione dei gan-

gliosidi dai vari tessuti animali come estratti

"totali" di gangliosidi o come frazioni diverse di

questi, per esempio come descritto nella letteratu-

ra, per esempio negli articoli sopra riportati o anche negli articoli "Extraction and analysis of materials containing lipidbound sialic acids" in Glycolipid Methodology, Lloyd A.Witting Fd., American Oil Chemists' Society, Champaign, 111. 159-186 (1976) e "Gangliosides of th? Nervous System" stesso libro, pgg.187-214.

Fra le miscele pi? importanti da usarsi secondo la presente invenzione sono estratti di gangliosidi ottenuti da tessuti del sistema nervoso, in particolare dal cervello e contenenti i gangliosidi GMi ? Goia ' Golb e GTlb gi? soPra ricordati.

Miscele di questo tipo sono per esempio quelle descritte nell'Esempio n. 3.

In seguito vengono specificate le funzioni alcooliche , amidiche e aciliche che si prestano in modo speciale per ottenere nuovi composti particolarmente interessanti secondo l'invenzione e tali gruppi funzionali sono da prendere in considerazione sia per i gangliosidi unitari "puri", sia per le miscele, in modo speciale quelle ora elencate.

In ognuno dei gruppi di gangliosidi sopra elencati i gruppi carbossilici dei residui sialici sono presenti secondo un oggetto dell'invenzione in forma esterificata o in forma di amidi.

I gruppi di estere nei nuovi derivati gangliosidici derivano in modo particolare da alcoli della serie alifatica e specialmente da quelli aventi un massimo di 12 e specialmente di 6 atomi di carbonio, o della serie aralifatica aventi di preferenza un solo anello benzenico eventualmente sostituito da 1-3 gruppi alchilici, inferiori per esempio gruppi metilici e un massimo di 4 atomi di carbonio nella catena alifatica, o di alcoli della serie aliciclica o alifaticoaliciclica aventi un solo anello cicloalifatico e un massimo di 14 atomi di carbonio o della serie eterociclica aventi un massimo di 12 e specialmente di 6 atomi di carbonio e un solo anello eterociclico contenente un eteroatomo scelto dal gruppo formato da N, 0 e S. I gruppi amidici delle funzioni carbossiliche nei derivati gangliosidici della presente invenzione derivano dall'ammoniaca o da amine di qualsiasi classe aventi di preferenza un massimo di 12 atomi di carbonio. Gli alcoli e le amine sopra citati possono poi essere non sostituiti o sostituiti, in modo speciale da funzioni scelte dal gruppo formato di gruppi idrossilici, aminici, alcossilici con un massimo di 4 atomi di carbonio nell'alchile, carbossilici o carbalcossilici con un massimo di 4 atomi nel residuo alchilico, alchilaminici o dialchilaminici con un massimo di 4 atomi di carbonio negli alchili, e possono essere saturi o insaturi, in modo speciale a un solo doppio legame.

Gli alcoli esterificanti le funzioni carbossiliche dei gangliosidi secondo la presente invenzione possono essere monovalenti o polivalenti, in particolare bivalenti. Fra gli alcoli della serie alifatica vanno menzionati in modo speciale gli alcoli inferiori aventi un massimo di 6 atomi di carbonio, come l'alcool metilico, l'alcool etilico, l'alcool propilico e isopropilico, l'alcool butilico normale, l'alcool isobutilico, l'alcool butilico terziario, e fra gli alcoli bivalenti, 1'etilenglicolo e il propilenglicolo. Fra gli alcoli della serie aralifatica vanno menzionati in modo particolare quelli aventi un solo residuo benzenico, come l'alcool benzilico e l'alcool fenetilico; fra gli alcoli della serie aliciclica vengono preferiti quelli aventi un solo anello cicloalifatico, come l'alcool cicloesilico (cicloesanolo), o alcoli terpenici, come il mentanolo, il carvomentolo, o uno dei terpineoli o terpinenoli o il piperitolo.

Fra gli alcoli della serie eterociclica vanno menzionati in modo speciale il tetraidrofuranolo o il tetraidropiranolo .

Per l'esterificazione dei gruppi carbossilici dei gangliosidi possono essere usati anche alcoli alitatici sostituiti, per esempio, da funzioni aminiche, come gli aminoalcoli, per esempio quelli con un massimo di 4 atomi di carbonio e in modo speciale aminoalcoli con un gruppo dialchil -(C^ ^) -aminico come ad esempio il dietilaminoetanolo.

Le funzioni carbossilamidiche secondo la presente invenzione o derivano dall'ammoniaca (e l'amide ? in tal caso l'amide non sostituita -CONH^) o da amine primarie o secondarie, in modo speciale da quelle contenenti un massimo?di l?2 atomi di'carbonio. Tali amine possono essere di natura aromatica, eterociclica, aliciclica, ma soprattutto alifatica. Come oggetto preferito della presente invenzione sono da annoverarsi i derivati carbossilamidici di amine alifatiche con un massimo di 12 atomi di carbonio, le quali amine possono essere a catena aperta, diritta o ramificata o possono essere cicliche, come per esempio le alchilamine derivate da alchile con da 1 a 6 atomi di carbonio, come la metilamina, la etilamina, la propilamina, la esilamina, la dimetilamina, la dietilamina, la diisopropi- t lamina, la diesilamina, oppure le alchilenamine derivate da gruppi alchilenici a catena diritta con da 3 a 6 atomi di carbonio o corrispondenti catene sostituite da 1 a 3 gruppi metilici, come la pirrolidina, la piperidina, l'azepina. I gruppi alchile o alchilene di queste amine possono anche essere interrotti nella catena di atomi di carbonio o sostituiti da altri eteroatomi, in particolare da atomi di azoto, e le amidi dell'invenzione sono derivate in tal caso da diamine, come per esempio la etilendiamina , la trimetilendiamina, la piperazina; o nel caso che i gruppi alchili o alchileni sono interrotti o sostituiti da atomi di ossigeno o di zolfo le amidi rappresentano dei derivati di aminoalcoli, come 1'aminoetanolo o 11aminopropanolo o sono derivati della morfolina o della tiomorfolina. Sono specialmente di interesse nell'ambito della presente invenzione gli esteri e le amidi sopra specificati dei gangliosidi dei gruppi A e B sopra menzionati, e delle loro miscele.

L'invenzione comprende pure i derivati peracilati negli idrossili della parte saccaridica, degli acidi sialici e del ceramide degli esteri e delle amidi ora descritti. In tali derivati i gruppi acilici possono essere derivati da acidi della serie alifatica, aromatica, aralifatica, aliciclica o eterociclica; essi derivano di preferenza da acidi della serie alifatica con un massimo di 10 atomi di carbonio e, in special modo 6 atomi di carbonio, come per esempio l'acido formico, acetico, propionico, gli acidi butirrici, valerianici, l'acido capronico o caprinico. Essi possono inoltre essere anche derivati da acidi per esempio con tale numero di atomi di carbonio ma sostituiti, in modo particolare da idrossiacidi, come l'acido lattico, da aminoacidi, come la glieina o da acidi bibasici, come gli acidi succinico, maionico o maleico.

Fra gli acidi aromatici sono da annoverarsi quelli con un solo nucleo benzenico, in modo particolare l'acido benzoico e i suoi derivati con gruppi metilici, idrossilici, aminici o carbossilici, come l'acido p-aminobenzoico, l'acido salicilico o l'acido ftalico.

L'invenzione comprende inoltre i derivati peracilati dei gangliosidi e delle loro miscele sopra descritte, aventi per? le funzioni carbossiliche libere. Anche per questi derivati sono di particolare

'?? importanza quei derivati acilati derivanti dagli acidi test? specificati.

Anche nel caso dei derivati peracilati con funzione carbossilica libera o esterificata o in forma di amide sono di particolar rilievo i derivati dei gangliosidi dei gruppi A e B e delle loro miscele e fra questi di nuovo quelli con i gruppi acilici ed eventualmente quelli degli esteri o delle amidi messi in risalto sopra.

Cos? per esempio un gruppo di nuovi derivati gangliosidici da mettere in risalto particolare ? quello costituito da esteri e amidi di gangliosidi. e dei loro derivati peracilati nei gruppi idrossilici nonch? da tali derivati peracilati con le funzioni carbossiliche dei detti gangliosidi in forma libera, in cui i gruppi estere sono derivati da alcoli formati dal gruppo consistente di alcoli alitatici con un massimo di 6 atomi di carbonio saturi non sostituiti, o sostituiti da gruppi idrossilici, alcossilici con un massimo di 4 atomi di carbonio, aminici, alchilaminici o dialchilaminici con un massimo di 4 atomi di carbonio nei gruppi alchilici, gruppi carbossilici, gruppi carbalcossilici con un massimo di 4 atomi di carbonio nel residuo alchilico, e dai corrispondenti alcoli aventi al massimo un doppio legame, da alcoli aralifatici con un solo anello benzenico non sostituito o sostituito da 1 a 3 gruppi metilici, da alcoli cicloalifatici o alifatico - cicloalifatici aventi un anello di cicloesano non sostituito o sostituito da 1 a 3 gruppi metilici e un massimo di 4 atomi di carbonio nella parte alifatica, da tetraidrofuranolo o da tetraidropiranolo , in cui i gruppi amidici sono derivati da ammoniaca o da alchilamine, dialchilamine o alchilenaraine con un massimo di 6 atomi di carbonio nei gruppi alchilici e da 4 a 8 atomi di carbonio nei gruppi alchilenici e in cui i gruppi alchilici o alchilenici possono essere'interrotti nella catena di atomi di carbonio da eteroatomi scelti dal gruppo formato da azoto, ossigeno e zolfo, potendo essere il gruppo iminico -NH- nel caso della presenza di un atomo di azoto sostituito da un alchile con un massimo di 4 atomi di carbonio e/o possono essere sostituiti da gruppi scelti dal gruppo formato da gruppi aminici, alchilaminici o dialchilaminici con un massimo di 4 atomi di carbonio nei gruppi alchilici, o da gruppi idrossilici o alcossilici con un massimo di 4 atomi di carbonio nei gruppi alchilici, o da amine aralifatiche aventi un solo anello benzenico eventualmente sostituito da un massimo di 3 gruppi metilici e avente un massimo di 4 atomi di carbonio nella parte alifatica , e in cui i gruppi acilici esterificanti gli idrossili derivano da acidi alifatici saturi o insaturi con un massimo di 6 atomi di carbonio, che possono anche essere sostituiti da una funzione scelta fra il gruppo costituito da gruppi idrossilici, aminici e carbossilici, e dai loro sali.

Tale gruppo di derivati ed in modo speciale quelli di gangliosidi dei gruppi A e B sopraddetti e anche i derivati delle*miscele di gangliosidi, per esempio dei gruppi A e B (con cio? i gruppi funzionali ora specificati) sono particolarmente d'interesse come ingredienti per le preparazioni farmaceutiche secondo la presente invenzione.

Fra i nuovi composti specifici della presente invenzione e di particolare importante per le relative preparazioni farmaceutiche sono di rilievo i seguenti derivati:

l'estere etilico del ganglioside G^

l'estere propilico del ganglioside MI

l'estere isopropilico del ganglioside G^

l'estere butilico normale del ganglioside l'estere isobutilico del ganglioside

l'estere terziar-butilico del ganglioside G^ l'estere cicloesilico del ganglioside GM^

gli esteri corrispondenti a quelli ora elencati contenenti il ganglioside GQlb al posto del ganglioside GM1

gli esteri sopra elencati contenenti il ganglioside ^Dla Posto del ganglioside G^

gli esteri ora elencati contenenti il ganglioside GTlb P?sto de^ ganglioside GM1

i peracetilati degli esteri sopra riportati

i perpropionilati degli esteri sopra riportati i perbutirrilati normali degli esteri sopra riportati

i permaleinilati degli esteri sopra riportati i permalonilati degli esteri sopra riportati i persuccinilati degli esteri sopra riportati

i peracetilati dei gangliosidi GMl, GDib,

GDla' GTlb

e i perpropionilati, i perbutirrilati normali, i permalonilati, i persuccinilati e i permaleinilati degli stessi gangliosidi

l'amide del ganglioside GM?^

l'amide del ganglioside GD^a

l'amide del ganglioside GD^b

l'amide del ganglioside GT^b

la metilamide, l'etilamide, la propilamide dei gangliosidi GM1, GDlb, GDla# GTlb e anche le

amidi di questi gangliosidi derivanti dalla dimetilamina, dietilamina, pirrolidina, piperidina, piperazina, morfplina e tiomorfolina, i peracetilati, i perpropionilati , i perbutirrilati normali, i permalonilati, i permaleinilati e i persuccinilati delle amidi test? elencate

gli esteri metilico, etilico, propilico, isopropilico, terziarbutilico, benzilico, allilico, etossicarbonilmetilico delle miscele di gangliosidi contenenti come principali gangliosidi GM1, GDla, GDlb, GTlbf e *n mot^? speciale della miscela ottenuta secondo l'Esempio illustrativo 3, l'amide non sostituita, la metilamide, l'etilamide, la benzilamide , 1'isopropilamide, la dimetilamide, la dietilamide, la dimetilaminopropilamide , dimetilaminoetilamide, la etanolamide di gangliosidi contenenti come principali gangliosidi GM1, GDla, GDlb, GTlb, e in modo speciale della miscela ottenuta secondo l'Esempio illustrativo 3

i derivati peracetilati, perbutirrilati normali, perpropionilati , permaleinilati, permalonilati, persuccinilati di una miscela di gangliosidi contenenti come principali gangliosidi G^ , Gola' GDlb7 GTlb e mo<^? speciale della miscela ottenuta secondo l'Esempio illustrativo 3.

Dei nuovi composti secondo la presente invenzione aventi le funzioni carbossiliche libere, per esempio dei peracilati dei gangliosidi, per esempio dei gruppi A e B, si possono preparare i sali metallici che pure fanno parte dell'invenzione.

Anche degli altri derivati dell'invenzione che posseggono una funzione acida libera, come per esempio esteri o amidi peracilati con acidi bibasici, si possono preparare i sali metallici. Inoltre fanno parte dell'invenzione anche i sali d'addizione acida di derivati dei gangliosidi che contengono una funzione aminica libera, per esempio esteri con aminoalcoli. Fra i sali metallici sono da annoverarsi in particolare quelli che sono utilizzabili terapeuticamente, come i sali dei metalli alcalini e alcalino-terrosi, per esempio i sali di potassio,

*

di sodio, di ammonio, di calcio, di magnesio, o dei metalli terrosi come l'alluminio, ma anche i sali di basi organiche, per esempio di amine primarie, secondarie o terziarie alifatiche o aromatiche o eterocicliche, come la metilamina, l'etilamina, la propilamina, la piperidina, la morfolina, l'efedrina, la furfurilammina, la colina, 1'etilendiamina, 1'aminoetanolo.

Fra gli acidi che possono dare sali d'addizione acida dei derivati gangliosidici secondo l'invenzione sono da citare in particolare gli idracidi, come l'acido cloridrico, l'acido bromidrico, gli acidi fosforici, l'acido solforico, gli acidi alitatici inferiori con un massimo di 7 atomi di carbonio, come l'acido formico, acetico o propionico, succinico o maleico. Acidi o basi terapeuticamente non utilizzabili, come l'acido picrico, possono venire usati per la purificazione dei nuovi derivati gangliosidici e fanno pure parte dell'invenzione. Per la stretta parentela tra i nuovi derivati in forma libera e in forma dei loro sali, ci si vuole riferire nella presente descrizione dell'invenzione indistintamente all'una o all'altra forma, se non viene esplicitamente detto il contrario.

I nuovi esteri e le nuove amidi di gangliosidi di questa invenzione rappresentano in generale delle polveri amorfe incolori o leggermente grige che si sciolgono abbastanza bene in acqua e in solventi polari, come per esempio negli alcoli alifatici inferiori, come l'alcool metilico, etilico o propilico, o anche in chetoni, come l'acetone o in amidi, come la dimetilformamide o in solfossidi, come il dimetilsolfossido , o eteri, come il diossano o il tetraidrofurano. La solubilit? in acqua ? per? fortemente ridotta nei derivati acilati ai gruppi idrossilici, mentre ne risulta aumentata quella nei solventi organici sopra menzionati. Per la confezione delle preparazioni farmaceutiche in forma di soluzioni per l'uso parenterale si sceglieranno di volta in volta i solventi idonei secondo il carattere pi? o meno idrofilo o lipofilo dei nuovi derivati .

Tutti i nuovi derivati gangliosidici sopra enumerati e, in modo particolare, quelli dei gangliosidi dei gruppi A e B e quelli dell'elenco dei composti specifici, costituiscono gli ingredienti delle preparazioni farmaceutiche della presente invenzione. In pi?, tali preparazioni farmaceutiche possono

4

contenere anche dei derivati gangliosidici del tipo sopra descritto gi? conosciuti in letteratura# come per esempio l'estere metilico del ganglioside o il suo derivato peracetilato. L'invenzione comprende pure l'applicazione di tutti questi derivati gangliosidici, sia nuovi, sia conosciuti, per usi terapeutici .

Come ? stato gi? detto sopra l'azione terapeutica dei gangliosidi e di alcuni derivati, come quelli della presente invenzione ? dovuta ad una stimolazione dei fenomeni di sprouting della cellula nervosa, per cui ? possibile ottenere soprattutto un ripristino della conduzione nervosa. Per esempio, la somministrazione in vivo della miscela di gangliosidi ottenuta dal cervello bovino come descritto nell'Esempio 3 (miscela GA) provoca lo sprouting del nervo sciatico del ratto previamente schiacciato (Gorio A., Carmignoto G., Facci L. e Finesso M. (1980) "Motor nerve sprouting induced by gangliosides treatment. Possible implications for gangliosides on neuronal growth" Brain Res. 197, 236-241) e pu? quindi aiutare il ripristino dell?attivit? V elettrica del nervo a livello delle giunzioni neuromuscolari .

Poich? lo sprouting di neuriti pu? essere considerato come una differenziazione neuronaie localizzata, i meccanismi biochimici per cui le molecole di gangliosidi producono il suddetto effetto [Gorio A., Carmignoto G. e Ferrari G. (1981) "Axon sprouting stimulated by gangliosides. A new model for elongation and sprouting" in "Gangliosides in neurological and neuromuscular function, development and repair" Ed. by M.M. Rapport, A. Gorio, Raven Press, New York, 177-195)] furono studiati sulla base dell'effetto sulla differenziazione cellulare, utilizzando le colture,cellulari in vitro di feocromocitoma PC^ ? L'aggiunta di gangliosidi assieme al fattore di crescita nervosa (Nerve growth factor) (NGF), che ? un induttore della differenziazione delle cellule PC^ / nel mezzo di coltura delle PC^ stimola lo sprouting neuronaie. Tale effetto pu? essere attribuito all'incorporazione di gangliosidi nella membrana neuronaie che induce una modifica delle propriet? funzionali, vale a dire delle attivit? enzimatiche.

Infatti l'incorporazione di gangliosidi nella membrana neuronaie ? capace di stimolare l'attivit? della (Na+, K+)-ATPasi [Leon A., Facci L., Toffano G., Sonnino S. and Tettamanti G. (1981) Activation of (Na+,K+)ATPase by nanomolar concentrations of G^ ganglioside J.Neurochem. 37,

350-357.

Per dar risalto all'importanza dell?attivazione di questo enzima collegato alla membrana, c'? da ricordare che alcuni autori fanno risalire la sopravvivenza e conseguentemente la differenziazione di cellule neuronali in coltura ad una attivazione di questo enzima da parte del NGF Varon S., Skaper S.D., (1983) The Na+,K+ pump may mediate th? control of nerve cells by NGF. TIBS f), 22-25 .

D'altra parte il ruolo chiave di questo enzima nell'attivit? elettrica ? ben noto, essendo coinvolto nel meccanismo ionico soggiacente alla propagazione degli impulsi nervosi lungo le membrane assonali. Sulla base dei metodi suesposti sono state determinate le attivit? farmacologiche espresse in sprouting di neuriti nelle cellule PC^ ? dei nuovi derivati gangliosidici secondo la presente invenzione Sono pure riportati risultati sulla (Na+, K+) ATPasi in vitro di alcuni derivati.

Effetti di derivati gangliosidici sullo sprouting di neuriti in cellule PC12.

Materiali e metodi

La linea cellulare PC^ (derivata da un subclone 1A) ? stata fornita dal Dr. P. Calissano (C.N.R. Laboratorio di Biologia Cellulare - Roma).

Le cellule (100,000/piastra) vengono mantenute a 37?C in un'incubatrice Heraeus (5% CC^ e 95% aria umidificata) e riseminate in piastre Falcon Integrid da 60 mm su supporto di collagene in presenza del seguente mezzo di coltura: 85%RPM 164Q(Gibco), 10% di siero equino inattivato a caldo, 5% di siero fetale di vitello (Gibco), 50 U/ml di penicillina e 25 mg/ml di streptomicina. Le cellule vengono quindi lavate per tre volte con un mezzo privo di siero. Dopo i tre lavaggi le cellule vengono incubate in un mezzo privo di siero con 50 ng/ml di NGF e con il derivato gangliosidico secondo l'invenzione o con la miscela di gangliosidi usata come termine di paragone a concentrazioni di 10 ^M. L'addizione del mezzo privo di siero con 1'NGF (50 ng/ml) ha per effetto di interrompere la proliferazione delle cellule, di formare neuriti e di ottenere la differenziazione gi? dal terzo giorno. Tale effetto viene valutato contando il numero di cellule con neuriti al terzo giorno.

Risultati

I risultati sono riportati nella seguente tabella 1 servendo come valori di paragone quelli ottenuti con la miscela di gangliosidi ottenuta secondo il procedimento dell'Esempio 3 e la frazione singola di monosialoganglioside G^ .

TABELLA 1

Effetti di gangliosidi e loro derivati secondo la

presente invenzione sullo sprouting di neuriti in

cellule PC^ ?

Composti Concentrazione t del numero di cellule con neuri^ ti al 3* giorno

Controlli 21.5

Miscela di gangliosidi GA

(vedi Esempio 3) 10?6M 39.5

Monosialogangl ioside GMl 34. B Estere metilico di GA 32. B Estere metilico di GM1 35.7 Estere etilico di GA 34.9 EBtere etilico di G^ 37.1 Estere isopropilico di GA 37.3 Estere isopropilico di G^ 37.0 Estere terziarbutilico di GA 29.5 Estere terziarbutilico di GH^ 32.3 Estere benzilico di GA 31.4 Estere benzilico di GMl 2B .3 Estere allilico di GA 34.1 Estere allilico di GH^ 31.5 Estere etossicarbonilmetilico di G^ 27.3 Amide di GA 36. 3 Amide di GJQ 33.3 Hetilamide di GA 40. 0 Etilamide di GA 35.0 Etilanide di G^ 32.2 Benzilamide di GA 26.7 Benzilamide di G^ 30.8 isopropilamide di G^ 31.4 Dimetilamide di GA 29.3 Dimetilamide di G^ 34.3 Dietilamide di GA 25.0 Dietilamide di G^ 26 . 5 Etilmetilamide di G^ 35.3 3-dimetilaminopropil-l-amide di GA 32.9 3-dimetilaminopropil-1-amide di G^ 37.3 Dimetilaminoetilamide di G?1 34.8 Etanolamide di GA 3B .3 Etanolamide di G^j 41.2 6-idrossiesil-l-amide di G^ 36.4 Miscela GA peracetilata 26.5 GMuI. peracetilato 30.2 Estere metilico di GA per acetilato 33.6 Estere metilico di G^ peracetilato 29.4 Amide di GA peracetilata 25.3 Amide di GHl peracetilata 31.4 Effetti di derivati gangliosidici sulla (Na+, K+) ATPasi della membrana neuronaie

Materiali e metodi

a. Preparazione della frazione mitocondriale grezza di cervello di ratto (Frazione P2)

Il procedimento usato nella preparazione della frazione P2 ? stato tratto da Morgan e coll., Biochem.Biophys .Acta 241, 37 (1971). (Le diverse operazioni sono state compiute da 0? a 4?C; i valori xg sono le forze centrifughe medie).

Sono stati decapitati dei ratti adulti maschi del ceppo Sprague Dawley (ottenuti dalla Ditta Charles River) (peso corporeo 150-175g) e i loro cervelli rapidamente rimossi e lavati in una soluzione isotonica ghiacciata. In seguito a recisione del cervelletto, i cervelli sono stati omogeneizzati effettuando 12 movimenti in su e in gi? di un omogeneizzatore in vetro e Teflon azionato a motore (clearance radiale dichiarato 0.25 mm; 800 r.p.m.) usando 4 voi. della soluzione di omogeneizzazione (0.32M saccarosio contenente tampone ImM di fosfato di potassio e 0.1 nM di disodio EDTA, pH 7.27).

L'omogeneizzato, filtrato attraverso quattro strati

4

di garza fine, ? stato centrifugato a 1000 x g per 15 minuti.

Il pellet risultante ? stato lavato con il medesimo volume iniziale della soluzione di omogeneizzazione e centrifugato come sopra. I supernatanti riuniti sono stati centrifugati a 17,500 x g per 25 minuti (queste condizioni di forza centrifuga gravitazionali sono state impiegate per ottenere il massimo arricchimento di terminazioni nervose nella frazione) e il pellet ? stato lavato quattro volte con 9 volumi (ogni volta) di soluzione di omogeneizzazione e centrifugato (17,500 x g per 25 minuti).

Il pellet finale, definito come "frazione P2" contiene, come componenti principali, mitocondri integri e terminazioni nervose. Il pellet terminale ? stato risospeso in modo omogeneo con un volume appropriato di soluzione di omogeneizzazione con l'omogeneizzatore in vetro e Teflon, e usato immediatamente per la prova.

Per evitare incongruenze dovute a conservazione del materiale sono state sempre preparate prima dell'uso, delle frazioni P2 fresche. Le preparazioni della frazione P2 avevano un contenuto di gangliosidi di 33.9? 2.8 (S.D.) n moli di acido sialico legate per mg di proteina.

b. Attivazione dell'enzima ATPasi

L'attivit? ATPasica ? stata misurata per spettrofo-\ tometria secondo Wallick e coll. [j. Pharm. Exptl.

Therap. 189, 434, (19.74)]. La miscela di reazione,

a meno che non venga indicato diversamente, si compone di: 50mM di saccarosio, 0.2 mM di disodio EDTA

(portato a pH 7.4), lOOmM NaCl, 5mM MgC^ ? 10mM

KCL, 2mM di sale monopotassico di fosfo(enol)piruvato (PEP) (portato a pH 7.4), 3mM ATP, 50 mM

TRIS-HC1 pH 7.4, 0,33mM NADH, piruvato-chinasi (PK)

(30 ?-g/ml) e lattato deidrogenasi (LDH) (10 /zg/ml)

in un volume finale di 3ml e di un pH finale di 7.2

La reazione iniziava con l'aggiunta di 50-75 ?-g

(come proteina) della frazione P2? L'attivit?

(Na+, K+)ATPasica ? stata determinata dalla

differenza tra l'attivit? ATPasica totale e l'attivit? ATPasica Mg2+ dipendente misurata in presenza di 3 x 10-5M di Ouabaina. Il tempo richiesto

per ogni prova singola era di 3-5 minuti. L'attivit? ATPasica ? stata espressa come Unit? Internazionale (U.I.) (^Limoli ATP idrolizzato/mg proteine/min), L'attivit? dei derivati gangliosidici (50nM) ? sta

ta dosata eseguendo l'incubazione con le membrane

neuronali a 37?C per due ore.

Risultati

I risultati degli studi comparativi sulla attivit?

dell'ATPasi sono riportati nella Tabella 2.

Tabella 2

Effetti di gangliosidi e loro derivati sulla

(Na , K JATPasi della membrana neuronaie

Prodotto Concentra Aumento in zione attivit? di (Na+, K+) ATPasi in %

Controlli 50 100 Miscela di gangliosidi

GA (vedi Esempio 3) 50 142

GM1 50 133 Estere metilico di GA 50 128 Amide di GA 50 139 Estere metilico di GMI 50 132 Amide di G^ 50 128 ?' da osservare che i derivati gangliosidici della presente invenzione posseggono rispetto ai gangliosidi un'azione prolungata nel tempo e sono utili quindi come medicamenti "retard". Tale fenomeno viene illustrato per esempio dai seguenti esperimenti sulla cinetica dell'assorbimento degli esteri gangliosidici .

1. Preparazine dei prodotti marcati

Il ganglioside marcato viene preparato come descritto da Suzuki et al. fj. Lipid Res. 13, 687-690 (1972)] e modificato da Ghidoni et al. [ital.J. Biochem. 2_3, 320-328 (1974)]. Gli esteri etilico ed isopropilico vengono preparati per esterificazione di tale ganglioside marcato. Si misura la radioattivit? specifica sia del ganglioside, sia degli esteri.

2. Trattamento degli animali

Topi Svizzeri provenienti da Charles River (Calco) del peso di circa 20-25 g vengono trattati per via endovenosa con 10 /xC dei prodotti. 2-4-8-12-16 ore dopo somministrazione gli animali vengono uccisi per decapitazione e il sangue ne viene raccolto in beute eparinizzate. La radioattivit? non volatile viene determinata in campioni di sangue per mezzo di uno scintillatore Packard TRICARB e in seguito identificata come 3

riferibile a H ganglioside e agli esteri per TLC.

3. Risultati

Dopo somministrazione intravenosa del ganglioside tritiato la cinetica presenta una curva bifasica declinante con un t/2 di circa tre ore e quindi una lenta fase di eliminazione che rimane costante fino alla sedicesima ora.

Con l'estere etilico ed isopropilico del ganglioside GM^ i livelli di prodotto identificati in un primo tempo non raggiungono il massimo osservato con il prodotto naturale, e per? con il tempo raggiungono massimi pi? elevati e rimangono a questi livelli pi? a lungo. In tal guisa il volume di distribuzione e il tempo di mantenimento della dose terapeutica sono aumentati.

o GMI ?*t?r? etilico 6000

GMI ?etere ieoprepilico

fi 4000-

o

E ?

2000

12 16

Tempo(ore)

In virt? delle propriet? farmacologiche sopra descritte i derivati gangliosidici della presente invenzione possono venire utilizzati come farmaci in

terapie diverse per il trattamento di patologie del

sistema nervoso, in particolare quelle del nervo

periferico e'quelle del sistema nervoso centrale, e

l'applicazione sia dei nuovi derivati gangliosidici

sia di quelli gi? conosciuti sopra citati e delle

relative preparazioni farmaceutiche ad uso terapeutico, in particolare per le indicazini qui elencate, costituiscono un ulteriore oggetto dell'invenzione.

In particolare l'invenzione riguarda l'uso terapeutico dei derivati gangliosidici particolarmente

messi in risalto, come i gruppi di derivati dei

?

gangliosidi A e B e quelli specificati in dettaglio e la somministrazione di tutti'questi derivati nelle dosi riportate in seguito.

Pi? particolarmente tali derivati gangliosidici possono essere usati nella terapia delle patologie del sistema nervoso periferico di origine traumatica, compressiva, generativa o tossico-infettiva, in cui ? necessario stimolare la rigenerazione nervosa e il ripristino della funzione neuromuscolare e nelle patologie del sistema nervoso centrale di origine traumatica, anossica, degenerativa o tossico-infettiva in cui ? necessario stimolare i fenomeni di sprouting neuronale per il recupero funzionale. In virt? del loro effetto retard i derivati gangliosidici della presente invenzione hanno un evidente vantaggio sui gangliosidi stessi che sono i farmaci fino ad ora utilizzati per le indicazioni sopra riportate. Il dosaggio da somministrarsi dipender? dall'effetto desiderato e dalla via di somministrazione prescelta.

La somministrazione avviene di regola per via iniettiva, intramuscolare, subcutanea, endovenosa, intradermica o polmonare di preferenza in mezzo acquoso opportunamente tamponato. La forma farmaceutica di conservazine pu? in tal caso essere quella di fiale contenenti la soluzione del derivato, eventualmente assieme ad altri ingredienti ausiliari, come detto a proposito delle preparazioni .farmaceutiche della presente invenzione. Per l'applicazione terapeutica o eventualmente anche profilattica per la suddetta via parenterale il dosaggio varia di preferenza da 0.05 mg a 5 mg di sostanza attiva per Kg di peso corporeo/die e in modo speciale fra 0.05 mg e 2 mg per Kg di peso corporeo/ die.

Bench? le nuove applicazioni terapeutiche secondo l'invenzione siano adatte in generale in tutte le patologie connesse con disturbi della conduzione dello stimolo nervoso, nel sistema nervoso centrale e periferico, si possono citare le seguenti specifiche; neuriti ottiche retrobulbari, paralisi dei nervi oculomotori, nevralgie del trigemino, paralisi del nervo facciale e di Bell, sindrome di Garcin, radicoliti, lesioni traumatiche dei nervi periferici, polinevriti diabetiche ed alcoliche, paralisi ostetriche, sciatica paralitica, malattia dei motoneuroni, sclerosi laterale amiotrofica-atrofia muscolare mielopatica, paralisi bulbare pr?gressiva, miastenia grave e sindrome di Lambert Eaton, distrofia muscolare, alterazioni della trasmissione nervosa sinaptica a livello del SNC e del SNP, disturbi della coscienza come stato confusionale, commozione cerebrale, trombosi, embolie.

La presente invenzione comprende pure i metodi di preparazione dei nuovi derivati gangliosidici sopra descritti o di quelli gi? conosciuti. Tali metodi sono da un lato per esempio quelli convenzionali e di per s? conosciuti per la preparazione dei nuovi esteri e delle nuove amidi di acidi carbossilici e di acilazione di gruppi idrossilici per la preparazione dei nuovi derivati acilici, escludendo quei metodi che avrebbero per effetto di alterare il ganglioside base, come quelli che facessero uso di agenti di alta acidit? o che comunque si svolgessero in ambiente idrolizzante alcalino o acido, o anche quei metodi che porterebbero ad una indesiderata alchilazione dei gruppi idrossilici della parte saccaridica. D'altro canto l'invenzione comprende pure un nuovo metodo di preparazione degli esteri sia nuovi sia conosciuti, partendo dagli esteri interni dei gangliosidi come descritto in seguito.

Dato che l'invenzione comprende la preparazione dei derivati gangliosidici a funzione carbossilica esterificata o in forma di amide e anche i derivati acilati nei gruppi idrossilici di questi deriv-ati, si pu? da un lato modificare le funzioni carbossiliche nel detto modo sia nei gangliosidi liberi, cio? con le funzioni idrossiliche libere, sia nei gangliosidi aventi le funzioni idrossiliche gi? acilate. D'altro canto ? possibile acilare le funzioni idrossiliche nei derivati gi? esterificati o nelle amidi. In pi? ? possibile, secondo l'invenzione, acilare solo le funzioni idrossiliche, mantenendo libere le funzioni carbossiliche. Per quanto concerne quindi il complesso di procedimenti convenzionali per la preparazione dei nuovi composti e delle miscele, secondo la presente invenzione, in esso un ganglioside o un suo derivato peracilato viene esterificato ai gruppi carbossilici o questi vengono convertiti nelle amidi o i gruppi idrossilici di questi derivati gangliosidici o i gangliosidi a funzione carbossilica libera vengono acilati seguendo metodi di per s? conosciuti, e volendo, composti salificabili ottenuti vengono convertiti nei loro sali.

Fra i metodi di per s? conosciuti per la preparazione dei nuovi esteri carbossilici sono da citare per esempio quelli usati per la preparazione degli esteri metilici gi? noti dei gangliosidi e descritti nel succitato articolo in Journal of Lipid Research, ZI, 642-645 (1980): si possono ottenere gli esteri dei gruppi carbossilici dei gangliosidi facendo reagire quest'ultimi con l'alcool di cui si vuol ottenere l'estere in presenza di uno scambiatore ionico, p.e. di una resina del tipo Dowex 50, la resa essendo limitata per la formazione contemporanea di esteri interni e i tempi di reazione essendo assai lunghi (2-3 giorni). Lo stesso metodo ? usato per esempio anche nel succitato articolo in Methods of Enzymology 137-140 (1978) per la preparazione dell'estere metilico del ganglioside G^ ?

Una tale esterificazione parziale pu? ben inteso anche essere ottenuta, sebbene con rese ancora inferiori, anche in assenza di resine. Oltre alla resina Dowex 50 si possono usare anche altri scambiatori ionici acidi, i quali hanno la funzione di convertire i gangliosidi, che, come detto sopra, sono presenti in generale, e in maniera speciale

*

negli estratti, sotto forma di sali, in modo speciale dei sali sodici, nei gangliosidi liberi. Questa operazione di conversione dei sali gangliosidici nei gangliosidi liberi conviene anche per tutti gli altri metodi convenzionali qui descritti, in cui si vuole modificare funzionalmente la funzione carbossilica , per esempio per quelli delle preparazioni delle amidi.

Il metodo migliore per? descritto nel succitato articolo consiste nell1esterificare il carbossile o i carbossili presenti nei gangliosidi facendone passare una soluzione alcoolica dell'alcool voluto su una resina del tipo Dowex -50Wx8 (100-200 mesh forma H) e trattando l'eluato disciolto nello stesso alcool con il diazoalcano corrispondente.

Nel caso specifico descritto furono preparati gli esteri dei gangliosidi GM^ e per trattamento in tale maniera con metanolo e diazometano ottenendo un'ottima resa.

Un altro buon metodo di preparazione degli esteri ai carbossili dei gangliosidi consiste nel trattare un sale metallico di un ganglioside con un agente eterificante. Si usano i sali dei metalli alcalini, alcalino-terrosi , ma anche qualsiasi altro sale metallico. Come agenti eterificanti si possono usare quelli conosciuti in letteratura, come in modo speciale gli esteri di diversi acidi inorganici, o di acidi solfonici organici, come gli idracidi, cio? in altri termini gli alogenuri idrocarbilici, come lo ioduro di metile, di etile, ecc., o i solfati neutrali o acidi di idrocarbile, i solfiti, i carbonati, i silicati, i fosfiti o i solfonati idrocarbilici, come per esempio il benzo o il p-toluolsolfonato di metile o il clorosolfonato di metile o di etile. La reazione pu? venire eseguita in un solvente opportuno, per esempio un alcool, di preferenza quello corrispondente al gruppo alchilico che si vuol introdurre nel gruppo carbossilico, ma anche in solventi non polari, come i chetoni, gli eteri, come il diossano oppure il dimetilsolfossido Un nuovo metodo caratteristico della presente invenzione per la preparazione di esteri di gangliosidi, e che pu? essere usato sia per la preparazione dei nuovi gangliosidi secondo l'invenzione, ma anche per la preparazione degli esteri gi? noti e quindi serve per la preparazione degli ingredienti attivi delle relative preparazioni farmaceutiche della presente invenzione, consiste nel trattare un estere interno di un ganglioside con una miscela dell'alcool voluto e di un suo alcoolato corrispondente. La reazione pu? essere condotta a temperature corrispondenti al punto di ebollizione dell'alcool e per? si possono usare anche temperature inferiori, essendo allora i tempi di reazione pi? lunghi. Si pu? pure, volendo prescindere da una resa molto buona e da tempi di reazione brevi, trattare l'estere interno solo con l'alcool che interessa, preferibilmente a temperatura d'ebollizione dello stesso. Gli esteri interni sono descritti per esempio nel succitato brevetto Belga N. 894024. Come alcoolati si usano di preferenza gli alcoolati dei metalli alcalini, soprattutto l'alcoolato di sodio .

Le nuove amidi dei gangliosidi secondo la presente invenzione si possono preparare con metodi di per se stessi conosciuti, e in modo speciale con i seguenti metodi.

a) reazione degli esteri interni dei gangliosidi con ammoniaca o con le amine

t b) reazione degli esteri carbossilici dei gangliosidi con ammoniaca o con le amine

c) reazione degli acidi gangliosidici con i gruppi carbossilici attivati con ammoniaca o con le amine

La reazione a), che ? stata descritta nel caso della preparazione dell'amide del ganglioside

(vedi sopra), pu? venire effettuata per trattamento diretto, con o senza solvente, del ganglioside estere interno con l'ammoniaca o con 1'amina di cui si intende preparare l'amide. La reazione pu? essere effettuata anche a temperature assai basse, come per esempio da -5 a 10? ma preferibilmente a temperatura ambiente o a temperature superiori, per esempio tra 30 e 120?. Come solventi si possono usare chetoni, idrocarburi aromatici, dimetilformamide, dimetilsolfossido, diossano o tetraidrofurano. Anche la reazione b) viene effettuata di preferenza nelle condizioni descritte per a). Oltre agli esteri descritti per la presente invenzione si possono usare anche altri esteri, per esempio esteri con fenoli .

Per l'attivazione del gruppo carbossilico nella reazione secondo c) si usano metodi conosciuti nella chimica dei peptidi evitando quelli che fanno uso di condizioni troppo acide o basiche che porterebbero ad una disgregazione della molecola del ganglioside. Se i gangliosidi di partenza sono in forma per esempio di sali sodici conviene trattare prima il sale con una resina scambiatrice di ioni del tipo Dowex o altro scambiatore ionico acido. Si usa per esempio il metodo della condensazione in presenza di carbodiimidi, per esempio dicicloesilcarbodiimide , benzilisopropilcarbodiimide o benziletilcarbodiimide , in presenza di 1-idrossibenzotriazolo o la condenzazione in presenza di ?,?' -carboni Idiimidazolo.

L'acilazione dei gruppi idrossilici della parte saccaridica, sialica e del ceramide avviene pure in modo di per se stesso conosciuto, per esempio per acilazione con un alogenuro o un'anidride dell'acido con cui si vuole acilare, di preferenza in presenza di una base terziaria, come la piridina o la collidina. La reazione pu? avvenire a temperatura bassa, per esempio a temperatura ambiente, lasciando reagire il derivato acido, come per esempio l'anidride, per molte ore, per esempio da 12 a 24 ore, o a temperatura lievemente pi? elevata, per esempio a 50-100?, per qualche ora.

L'invenzione comprende anche le modificazioni dei procedimenti di preparazione dei nuovi derivati, in cui un procedimento viene interrotto ad una fase qualsiasi oppure nelle quali si parte da un composto intermedio e vengono eseguite le rimanenti tappe, o nelle quali i prodotti di partenza vengono formati in situ.

Oggetto della presente invenzione sono pure, come gi? detto le preparazioni farmaceutiche comprendenti come sostanze attive uno o pi? dei nuovi derivati gangliosidici sopra definiti e, in particolare, quelli messi in rilievo, come quelli derivati dai gruppi A e B di gangliosidi e quelli specifici sopra elencati. In pi? le preparazioni farmaceutiche della presente invenzione comprendono anche i derivati esterificati o le amidi e i loro derivati acilati noti e sopra descritti, in particolare gli esteri metilici dei gangliosidi e e i loro derivati peracilati, nonch? l'amide del ganglioside G^ ?

Le preparazioni farmaceutiche ora menzionate possono essere preparazioni per l'uso orale, rettale, parenterale, locale o intradermico. Esse sono quindi in forma solida o semisolida, per esempio confetti, compresse, opercoli gelatinosi, capsule, supposte, capsule di gelatina molle. Per l'uso parenterale si possono usare forme predestinate alla somministrazione intramuscolare, sottocutanea o intradermica, o atte alle infusioni o iniezioni endovenose e si possono quindi presentare come soluzioni dei composti attivi o come polveri liofilizzate dei composti attivi da unire ad uno o pi? eccipienti o diluenti accettabili dal punto di vista farmaceutico, e convenienti per gli usi suddetti e di osmolarit? compatibile con i liquidi fisiologici. Per l'uso locale entrano in considerazione preparazioni in forma di sprays, per esempio sprays nasali, creme o unguenti per l'uso topico o cerotti opportunamente preparati per somministrazione intradermica .

Le preparazioni dell'invenzione possono essere destinate alla somministrazione all'uomo o all'animale. Esse contengono di preferenza da 0.01% al 10% di componente attivo per le soluzioni, gli sprays, gli unguenti e le creme e dall'1% al 100% e preferibilmente da 5% al 50% del composto attivo per i preparati in forma solida. Il dosaggio da somministrarsi dipender? dall'indicazione, dall'effetto desiderato e dalla via di somministrazione prescelta.

I seguenti Esempi 1-45 illustrano la preparazione di nuovi derivati funzionali secondo l'invenzione e anche di derivati funzionali noti da usare per le preparazioni farmaceutiche. Gli Esempi 46-47 illustrano le preparazioni farmaceutiche secondo l'invenzione .

Esempio 1 Estere metilico del ganglioside

5 g dell'estere interno del ganglioside G^ (3.27 mM) vengono sciolti in 200 mi di una miscela anidra di cloruro di metilene e metanolo 4:1. Si aggiungono 176 mg (3.27 mM) di metilato di sodio sciolto in 50 mi di metanolo anidro e la miscela viene fatta bollire a riflusso per 2 ore.

Al termine della reazione il miscuglio viene neutralizzato con resina Dowex AG 50x8 anidra forma H+, la resina separata per filtrazione e lavata con metanolo e la soluzione evaporata a secco. Si riprende il residuo in 50 mi di cloruro di metilene/ metanolo 1:1 e si precipita il prodotto della reazione versando in 250 mi di acetone.

II prodotto grezzo (4.9g) viene purificato mediante cromatografia preparativa ad alta pressione con gel di silice 60 H Merck, usando come solvente una miscela di cloroformio/metanolo/isopropanolo/carbonato d'ammonio al 2% 1140:820:180:140. Le frazioni pure vengono riunite, evaporate a secco, ridisciolte in 15 mi di cloroformio/metanolo 1:1 e il prodotto viene precipitato con 75ml di acetone. Esso rappresenta l'estere metilico del ganglioside GMI? Resa 4.2g.

La spettroscopia IR fatta su pellets di KBr mostra il legame tipico dell'estere a 1750 cm

Il prodotto si rivela essere un composto unitario alla cromatografia su piastre di gel di silice con cloroformio/metanolo/CaCl2 allo 0.2% 55:45:10 e determinato con reagente di Ehrlich (Rf 0.72) ed ? esente dall'estere interno usato come prodotto di partenza (Rf 0.75) e dal ganglioside GM2 (Rf 0.65). Per trattamento con una soluzione 0.1N di Na^O^ a 60? per un'ora il legame estereo viene scisso ottenendosi il prodotto originario G^ .

Esempio 2 Miscela di esteri metilici di una miscela di gangliosidi

5 g di una miscela di esteri interni di una miscela di gangliosidi ottenuta per estrazione di tessuto di cervello bovino come descritto nell'Esempio 3 vengono sciolti in 200ml di una miscela anidra di cloruro di metilene e metanolo 4:1. Si aggiungono 318 mg (5.86 mM) di metilato di sodio sciolto in 50 mi di metanolo anidro e la miscela viene fatta bollire a riflusso per 2 ore.

Il prodotto grezzo della reazione viene indi isolato come descritto nell'Esempio 1 (4.9g).

Il prodotto grezzo viene quindi purificato per mezzo di cromatografia su Sephadex-DEAE forma acetato A-25, usando come solvente la miscela cloroformio/ metanolo/acqua 30:60:8. Le frazioni neutrali riunite vengono evaporate, dializzate in acqua, evaporate di nuovo a secco, i residui sciolti in 15 mi di cloroformio/metanolo 1:1 e il prodotto precipitato con 75 mi di acetone. Resa: 4.3 g.

La spettroscopia IR, fatta su pellets di KBr, mostra il legame tipico dell'estere a 1750 cm \ Alla cromatografia eseguita come descritto nell'E-sempio 1 il prodotto che rappresenta la miscela di esteri metilici dei gangliosidi, mostra un Rf di 0.72-0.85 (Rf della miscela di gangliosidi 0.2-0.70 La completa transesterificazione pu? essere confermata determinando la proporzione molecolare fra i

* gruppi alcossilici e sialici che si ottiene con ' gas-cromatografia "head space" quantitativa dell'alcool metilico liberato in seguito a trattamento con soluzione 0.1N di ^ 200^ a 60? per un'ora, che provoca la scissione di tutti i legami esterei, e con il metodo di Svennerholm per la determinazione dell'acido N-acetilneuraminico.

Esempio 3 Preparazione di una miscela di gangliosidi (miscela GA) per estrazione di tessuto di cervello bovino e della corrispondente miscela di esteri interni da usarsi nei vari Esempi precedenti o susseguenti.

Della corteccia cerebrale bovina, prelevata dall'animale, viene omogeneizzata in tampone fosfato a pH 6,8; vengono quindi aggiunti 6 volumi di tetraidrofurano e la miscela risultante viene centrifugata. Il supernatante viene riestratto per due volte con tetraidrof urano. Dopo centrifugazione i materiali non polari vengono rimossi per partizionamento con etere etilico e la fase acquosa - tetraidrofuranica viene introdotta in colonna a scambio ionico equi-\

librato con etanolo al 50%. All'affluente dalla colonna viene aggiunto idrossido di bario e quattro volumi di etanolo ghiacciato. Dopo 18 ore al freddo viene raccolto un precipitato che viene poi acidificato leggermente con acido cloridrico dopo dissoluzione in acqua. La soluzione cosi ottenuta viene dializzata e liofilizzata. La resa a questo punto ? di circa 0.6 mg di miscela di gangliosidi grezzi per grammo di tessuto nervoso utilizzato. La polvere liofilizzata viene dispersa in 20 volumi di cloroformio-metanolo 2:1, filtrata la soluzione ottenuta fino a renderla perfettamente limpida, questa viene partizionata aggiungendo 0.2 volumi di soluzione di cloruro di potassio in acqua allo 0.88%. La fase superiore viene separata, dializzata e liofilizzata. La resa finale ? di circa 0.3 mg di miscela purificata di sali di gangliosidi per grammo di tessuto cerebrale.

5 grammi di una miscela ottenuta secondo il metodo test? descritto vengono sciolti in 50 mi di DMSO. Si aggiungono quindi 4 grammi di resina del tipo stirene, anidra (acido solfonico) (50-100 mesh, forma H+) alla miscela e il sistema risultante viene agitato per 30 minuti a temperatura ambiente. Questo trattamento con una resina a scambio ionico

* trasforma tutti i gruppi carbossilici salificati dei gangliosidi in gruppi carbossilici liberi. La trasformazione completa viene confermata da un idoneo metodo fisico di analisi, come ad esempio.11assorbimento atomico. La resina viene quindi filtrata sotto aspirazione e la soluzione viene trattata con 1.5 g di dicicloesilcarbodiimide e lasciata riposare per un'ora. La dicicloesilurea che precipita viene rimossa mediante filtrazione e la soluzione risultante viene trattata con 100 mi di acetone che provoca la precipitazione degli esteri interni gangliosidici prodotti. La resa ? di 4.6 g di miscela di esteri interni (circa 9095% del valore teorico). La presenza dei derivati esteri interni viene confermata mediante spettroscopia nell'infrarosso e mediante cromatografia su strato sottile.

Spettroscopia IR eseguita su pellet di KBr, il legame lattonico esterificato produce una banda a 1750 cm"^.

Cromatografia su strato sottile: su piastra di gel di silice, solventi di sviluppo:

CHCl3/MeOH/CaCl20.3% (55:45:10, v/v/v), l'Rf della miscela degli esteri interni si trova tra 0.7 e 0.85. L'RF dei prodotti finali ? maggiore dell'Rf della miscela di sostanze di partenza; di conseguenza la cromatografia mostra l'assenza di materiali di partenza. Per mezzo di un trattamento con una soluzione 0,1 N di ^ 200^ a 60? per un'ora vengono scissi i legami esterei ed ? possibile ottenere la miscela originale dei gangliosidi di partenza .

La miscela di gangliosidi ottenuta pu? essere frazionata in varie porzioni rappresentanti sostanzialmente gangliosidi puri (nel senso gi? usato nella descrizione generale), adoperando colonne di acido silicico ed eluendo con miscele di metanolocloroformio. Si trov? cos? in media una composizione di circa il 40% di ganglioside GD^a, del 21% del ganglioside G^ , del 19% del ganglioside

GmTl.,b e del 16% del ganglioside G^Dl,,b.

Esempio 4 Estere etilico del ganglioside GM^ Viene preparato e isolato nella stessa maniera come l'estere metilico nell'Esempio 1, usando per? l'alcool etilico e etilato di sodio al posto di alcool metilico e metilato di sodio, ed usando le stesse quantit? molari di estere interno e di etilato come

*

nel detto Esempio. Il lavaggio della resina Dowex viene effettuato con alcool etilico e il residuo ottenuto per evaporazione del filtrato vien sciolto in 50 mi di cloruro di metilene/etanolo 1:1. La resa in prodotto grezzo ? di 4.9 g. La purificazione viene pure eseguita?come nell'Esempio 1. Resa in estere etilico del ganglioside purificato:

4.3 g. L'analisi cromatografica del prodotto eseguita nella stessa maniera come nell'Esempio 1 dimostra la presenza di un composto unitario con un Rf di 0.80, e l'assenza del ganglioside GM1 e del suo estere interno (Rf 0,65 e 0,75 risp.). Per idrolisi con ^ 2003 come descritto nell'Esempio 1 si ottiene il ganglioside G^ . All'esame spettroscopico IR su pellets di KBr si nota la banda tipica dell'estere a 1750 cnT^.

Esempio 5 Miscela di esteri etilici di una miscela di gangliosidi.

Viene preparata e isolata nella stessa maniera come la miscela degli esteri metilici dell'Esempio 2, usando per? alcool etilico e etilato di sodio al posto di alcool metilico e metilato di sodio, ed usando 5 g di miscela di esteri interni e 318 mg (5.86mM) di etilato di sodio.

Il lavaggio della resina Dowex viene effettuato con alcool etilico ed il residuo ottenuto per evaporazione del filtrato viene sciolto in 50 mi di cloroformio/etanolo 1:1. La resa in prodotto grezzo ? di 4.9 g. La purificazione viene pure eseguita come nell'Esempio 2. Resa in miscela di esteri etilici purificata: 4.5 g.

La spettroscopia IR, fatta su pellets di KBr, mostra il legame tipico dell'estere a 1750 cm-^.

Cromatogr afato su piastre di gel di silice con una soluzione preparato di fresco di cloroformio/metanolo/idrossido di tetrametilammonio 1M 55:45:10 e determinato con reagente di Ehrlich il prodotto mostra un Rf di 0.50-0.75 (miscela di gangliosidi 0.20-0.60) .

La dimostrazione dell'avvenuta completa transesterificazione si fa in maniera analoga a quella descritta nell'Esempio 2.

Esempio 6 Estere isopropilico del ganglioside Viene preparato e isolato nella stessa maniera come l'estere metilico dell'Esempio 1, usando per? alcool isopropilico e isopropilato di sodio al posto

*

di alcool metilico e metilato di sodio, ed usando le stesse quantit? molari di estere interno e di isopropilato come nel detto Esempio. Il lavaggio della resina Dowex viene effettuato con alcool isopropilico ed il residuo ottenuto per evaporazione del filtrato viene sciolto in 50 mi di cloruro di met ilene/isopropanolo 1:1. La resa in prodotto grezzo ? di 4.9 g. La purificazione viene pure eseguita come nell'Esempio 1. Resa in estere isopropilico del ganglioside purificato: 4.2 g.

L'analisi cromatografica del prodotto, eseguita nella stessa maniera come nell'Esempio 1, dimostra la presenza di un composto unitario con un Rf di 0.85 e l'assenza di ganglioside o del suo estere interno. Per idrolisi con Na2CO^ come descritto nell'esempio 1 si ottiene il ganglioside G All'esame spettroscopico IR su pellets di KBr si nota'la banda tipica dell'estere a 1750 cm \

Esempio 7 Miscela di esteri isopropilici di una miscela di gangliosidi

Viene preparata e isolata nella stessa maniera come la miscela degli esteri metilici dell'Esempio 2, usando per? alcool isopropilico e isopropilato di sodio al posto di alcool metilico e metilato di sodio, ed usando 5 g di miscela di esteri interni e 537 mg (6.52mM) di isopropilato di sodio.

Il lavaggio della resina Dowex viene effettuato con alcool isopropilico ed il residuo ottenuto per evaporazione del filtrato viene sciolto in 50 mi di cloroformio/isopr opanolo 1:1. La resa in prodotto grezzo ? di 4.9 g. La purificazione viene pure eseguita come nell'Esempio 2 usando per? come eluente nella cromatografia una miscela di cloroformio/alcool isopropilico/acqua 20:60:8. Resa in miscela di esteri isopropilici purificata: 4.3 g.

Croma tografato col metodo descritto nell'Esempio 5 il prodotto mostra un Rf di 0.40-0.78 (miscela di gangliosidi 0.20-0.60).

La spettroscopia IR fatta su pellets di KBr mostra il legame tipico dell'estere a 1750 cm

La dimostrazione dell'avvenuta completa transesterificazione si fa come descritto nell'Esempio 2.

Esempio 8 Estere terziarbutilico del ganglioside Viene preparato e isolato nella stessa maniera come l'estere metilico dell'Esempio 1, usando per? al-

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cool terziarbutilico e terziarbutilato di sodio al posto dell'alcool metilico e del metilato di sodio, ed usando le stesse quantit? molari di estere interno e di terziarbutilato come nel detto Esempio. Il lavaggio della resina Dowex viene effettuato con alcool terziarbutilico ed il residuo ottenuto per evaporazione del filtrato viene sciolto in 50 mi di cloruro di metilene/terziarbutanolo 1:1. La resa in prodotto grezzo ? di 4.9 g. La purificazione viene pure eseguita come nell'Esempio 1. Resa in estere terziarbutilico del ganglioside purificato:

4.1 g.

L'analisi cromatografica del prodotto, eseguita nella stessa maniera come nell'Esempio 1, dimostra la presenza di un composto unitario con un Rf di 0.71 e l?assenza di ganglioside e del suo estere interno. Per idrolisi con Na2CO^ come descritto nell'Esempio 1 si ottiene il ganglioside GM^. All'esame spettroscopico IR su pellets di KBr si nota la banda tipica dell'estere a 1750 cm

Esempio 9 Miscela di esteri terziarbutilici di una miscela di gangliosidi

Viene preparata e isolata nella stessa maniera come la miscela degli esteri metilici dell'Esempio 2, usando per? alcool terziarbutilico e .terziarbutilato di sodio al posto di alcool metilico e metilato di sodio, ed usando 5 g di miscela di esteri interni e 628,6 mg (6.52 mM) di terziarbutilato di sodio. Il lavaggio della resina Dowex viene effettuato con alcool terziarbutilico ed il residuo ottenuto per evaporazione del filtrato viene sciolto in 50 mi di cloroformio/terziarbutanolo 1:1. La resa in prodotto grezzo ? di 4.9 g. La purificazione viene pure eseguita come nell'Esempio 2, usando per? come eluente nella cromatografia una miscela di cloroformio/alcool terziarbutilico 1:1. Resa in miscela di esteri terziarbutilici purificata: 4.1 g. La spettroscopia IR fatta su pellets di KBr mostra il legame tipico dell'estere a 1750 cm

Cromatografato col metodo descritto nell'Esempio 5 il prodotto mostra un Rf di 0.25-0.70.

La dimostrazione dell'avvenuta completa reazione si fa come descritto nell'Esempio 2.

Esempio 10 Estere benzilico del ganglioside

5 g del sale di potassio del ganglioside

*

(3.14 mM) vengono sciolti in 50 mi di DMSO e alla soluzione si aggiungono 1.58 g (12.5 mM) di cloruro di benzile e 2.08 g (12.5 mM) di KI. Si lascia reagire in atmosfera di azoto per 24 ore a 25?. .

Al termine della reazione la soluzione viene ripartita con n-butanolo/acqua 2:1 per eliminare il DMSO e i sali. La soluzione butanolica viene evaporata a secco ed il residuo ripreso in 50 mi di cloroformio/alcool benzilico 1:1 e il prodotto della reazione precipitato con 250 mi di acetone.

Il prodotto grezzo cos? ottentuo (5.3 g) viene poi purificato mediante cromatografia preparativa su gel di silice usando come solvente una miscela di cloroformio/metanolo/acqua 65:32:7.

La frazioni pure vengono riunite, evaporate, ridisciolte in 15 mi di cloroformio/isopropanolo 1:1 e il prodotto precipitato con 75 mi di acetone. Resa di estere benzilico puro: 4.8 g.

Alla spettroscopia IR, eseguita su pellets di KBr, si nota la banda tipica dell'estere a 1750 cm ^ e all'esame spettroscopico UV, eseguito in alcool etilico assoluto, si osservano tre massimi a 250, 255 e 261 nM.

Cromatogr afato su piastre di gel di silice con cloroformio/metanolo/CaC^ al 0.3% 60:35:8 e con cloroformio/metanolo/ammoniaca 2.5N 55:45:12 e determinato con reagente di Ehrlich il prodotto si dimostra essere unitario con un Rf di 0.65 e 0.53 rispettivamente ed essere esente da prodotto di partenza GM^ (Rf 0,40 e 0.45 rispettivamente).

Per trattamento con soluzione 0.1N di NajCO^ a 60? per un'ora il legame estereo viene scisso ottenendosi i prodotti di partenza (G^ e alcool benzilico) .

Esempio 11 Miscela di esteri benzilici di una miscela di gangliosidi

5 g di una miscela di gangliosidi salificati (sali di potassio) ottenuta per estrazione di tessuto di cervello bovino come descritto nell'Esempio 3 e quindi sostituzione del sodio con il potassio (scambio ionico) vengono sciolti in 100 mi di DMSO e alla soluzione vengono aggiunti 3.3 g (26.0 mM) di cloruro di benzile e 216 g (13.0 mM) di KI. Si lascia reagire il miscuglio sotto azoto per 48 ore a 25?.

Al termine della reazione la soluzione viene ripartita con n-butanolo/I^O 2:1 per eliminare il DMSO e i sali. La soluzione butanolica viene evaporata a secco e il residuo ripreso in 50 mi di cloroformio/ alcool benzilico 1:1 e il prodotto precipitato con 250 mi di acetone.

Il prodotto grezzo cosi ottenuto (5.6 g) viene quindi purificato mediante cromatografia con Sephadex -DEAE, forma acetato, usando come solvente una miscela di cloroformio/metanolo/acqua 30:60:8.

Le frazioni eluite neutrali vengono riunite, liberate dal solvente per evaporazione, il residuo ripreso con 15 mi di cloroformio/isopropanolo 1:1 e la miscela di esteri benzilici purificata precipitata con 75 mi di acetone. Resa 4,9 g.

Alla spettroscopia IR, eseguita su pellets di KBr, si nota la banda tipica dell'estere a 1750 cm ^ e all?esame spettroscopico UV eseguito in alcool etilico assoluto, si osservano tre massimi a 250, 255 e 261 nM.

Cromatogr afato su piastre di gel di silice con cloroformio/metanolo/CaCl2 al 0.3% 60:25:8 e con cloroformio/metanolo/ammoniaca 2.5N 55:45:10 e determinato con reagente di Ehrlich il prodotto possiede un Rf variante tra 0.40 e 0.70 e tra 0.29 e 0.53 rispettivamente (per la miscela originaria di gangliosidi 0.05-0.40 e 0.12-0.46 rispettivamente). La dimostrazione dell1avvenuta completa reazione si fa come descritto nell'Esempio 2.

Esempio 12 Estere allilico del ganglioside

5 g del sale di potassio (3.14 mM) del ganglioside GM^ vengono sciolti in 50 mi di DMSO e alla soluzione vengono aggiunti 453.7 mg (3.75 mM) di bromuro di allile e 625 mg (3.75 mM) di KI. Si lascia reagire per 48 ore a 25?.

Al termine della reazione la soluzione viene ripartita con n-butanolo/?^O 2:1 per eliminare il DMSO e i sali. La soluzione butanolica viene evaporata a secco e il residuo ripreso in 50 mi di cloroformio/ metanolo 1:1 e il prodotto precipitato con 250 mi di acetone.

Il prodotto grezzo cos? ottenuto (5.1 g) viene quindi purificato mediante cromatografia preparativa in colonna su gel di silice usando come solvente una miscela di cloroformio/metanolo/acqua 60:35:8. Le frazioni pure vengono riunite, evaporate, risciolte in 15 mi di cloroformio/isopropanolo 1:1 e il prodotto precipitato con 75 mi di acetone. Resa in estere allilico puro: 4.5 g.

Nello spettro IR, preso su pellets di KBr, il prodotto mostra la banda tipica dell'estere a 1750 cm ^.

Cromatografato su piastre di gel di silice con cloroformio/metanolo/CaCl2 al 0.3% 60:40:9 e con cloroformio/metanolo/ ammoniaca 2.5N 55:45:10 e determinato con reagente di Ehrlich il prodotto si dimostra un composto unitario con Rf di 0.56 e 0.39 rispettivamente ed essere esente dal ganglioside di partenza GM1 (Rf 0.40 e 0.42 rispettivamente).

Per trattamento con una soluzione di Na^O^

0.1N a 60? per un'ora il legame estereo viene scisso ottenendosi il ganglioside originale GM^ e l'alcool allilicoi.

Esempio 13 Estere etossicarbonilmetilico del ganglioside GM1

5 g del sale di potassio (3.14 mM) del ganglioside GM^ vengono sciolti in 50 mi di DMSO e alla soluzione vengono aggiunti 2.12 g (12.5 mM) di etilmonobromoacetato e 2.08 g (12.5 mM) di KI. Si lascia reagire sotto azoto per 24 ore a 25?. Quindi si procede ad una ripartizione della soluzione con n-butanolo/acqua 2:1 per eliminare il DMSO e i sali. La soluzione butanolica viene evaporata a secco ed il residuo ripreso con 50 mi di cloroformio/metanolo 1:1 e il prodotto precipitato con 250 mi di acetone. Resa 4.8 g

Il prodotto grezzo viene purificato mediante cromatografia preparativa in colonna su gel di silice usando come solvente una miscela di cloroformio/metanolo/acqua 60:32:7.

Le frazioni pure vengono riunite, evaporate a secco, il residuo sciolto in 15 mi di cloroformio/metanolo 1:1 e l'estere etossicarbonilmetilico precipitato con 75 mi di acetone. Resa: 2.4 g.

Lo spettro IR, eseguito su pellets di KBr, mostra la banda tipica dell'estere a 1750 cm

Cromatografato su piastre di gel di silice con cloroformio/metanolo/CaCl2 al 0.3% 60:35:8 e determinato con reagente di Ehrlich il prodotto si rivela essere un composto unitario con Rf di 0.64 ed essere esente da composto di partenza (Rf 0.40).

Per trattamento con soluzione 0.IN di ?32??^ a 60? per un'ora il legame estereo viene scisso ottenendosi il ganglioside originale GM^.

Esempio 14 Amide del ganglioside

5 g dell'estere interno del ganglioside GMl (3.27 mM) vengono sospesi in 100 mi di alcool isopropilico anidro. La sospensione viene mantenuta in agitazione a bassa temperatura (-5?) e vi si fa poi gorgogliare dell'ammoniaca secca in condizioni anidre per 3 ore.

Al termine della reazione il solvente viene eliminato per evaporazione ed il residuo ripreso in 50 mi di cloroformio/metanolo 1:1 ed il prodotto precipitato con 250 mi di acetone.

Il prodotto grezzo (4.9 g) viene trattato con 100 mi di Na2CO^ all'1% per 30 minuti a 25? per idrolizzare gruppi estere residui, dializzato in acqua, evaporato a secco sotto vuoto e quindi purificato mediante una cromatografia preparativa su colonna su gel di silice, usando come primo solvente una miscela di cloroformio/metanolo/i^O 60:40:9 e come secondo solvente una miscela di cloroformio/ metanolo/f^O 55:45:10. Le frazioni pure eluite e riunite vengono evaporate a secco, il residuo sciolto in 15 mi di cloroformio/metanolo 1:1 e l'amide precipitata con 75 mi di acetone. Resa: 4.8 9?

Cromatografato su piastre di gel di silice con cloroformio/me tanolo/ammoniaca 4N 55:45:10 e cloroformio/metanolo/CaCl^ allo 0.3% 55:45:10 e determinato con reagente alla resorcina il prodotto si dimostra essere un composto unitario (Rf 0.10 e 0.32 rispettivamente) ed essere esente da (Rf 0.35 e 0.65 rispettivamente).

Esempio 15 Miscela delle amidi di una miscela di gangliosidi

5 g della miscela di esteri interni di gangliosidi descritta nell'Esempio 3 vengono fatti reagire con ammoniaca come nell'Esempio 14 e precipitati con acetone come pure descritto in quell1Esempio. Dopo un trattamento idrolitico con Na2CO^ come descritto nell'Esempio precedente, il prodotto grezzo viene sottoposto alla purificazione come segue: il prodotto ottenuto dall'idrolisi viene dializzato in acqua, la soluzione evaporata sotto vuoto, il residuo ripreso con 50 mi di cloroformio/metanolo/ H2O 30:60:8 e quindi purificato mediante una cromatografia preparativa con Sephadex DEAE A - 25, forma acetato, usando come solvente una miscela di cloroformio/metanolo/acqua 30:60:8.

- li ?

ba frazioni neutrali eluite vengono evaporate a secco, dializzate, evaporate a secco di nuovo, sciolte in 15 mi di cloroformio/metanolo 1:1 e la miscela, di amidi precipitata con 75 mi di acetone. Resa: 4.8 g.

Lo spettro IR non presenta pi? la banda tipica dell'estere a 1750 cm-^.

Cromatogr afato su piastre di gel di silice con cloroformio/metanolo/ammoniaca 4N 55:45:10 e cloroformio/metanolo/CaC^ al 0.3% 55:45:10 e determinato con reagente alla resorcina il prodotto possiede un Rf variante tra 0.01 e 0.10 e tra 0.55 e 0.45 rispettivamente (miscela di gangliosidi originale Rf 0.15-0.70 e 0.20-0.70 rispettivamente).

Esempio 16 Metilamide del ganglioside

5 g di estere interno del ganglioside (3.27 mM) vengono sospesi in 25 mi di metilamina anidra in recipiente munito di refrigerante a ricadere a -25? in condizioni anidre. La sospensione viene mantenuta in agitazione a temperatura ambiente per 3 ore.

Al termine della reazione il solvente viene eliminato per evaporazione ed il residuo viene ripreso r

con 50 mi di cloroformio/metanolo 1:1 e precipitato con 250 mi di acetone.

Il prodotto grezzo cos? ottenuto (4.9 g) viene trattato con 100 mi di ^ 2(30^ all'1% per 30 minuti a 25? per idrolizzare gruppi estere residui, poi dializzato in acqua, la soluzione evaporata a secco sotto vuoto e il residuo purificato mediante cromatografia preparativa con Sephadex DEAE A - 25, forma acetato, usando come solvente una miscela di cloroformio/me tanolo/acqua 30:60:8.

Le frazioni neutrali riunite vengono evaporate a secco, dializzate, evaporate di nuovo, sciolte in 15 mi di cloroformio/metanolo 1:1 e la metilamide precipitata con 75 mi di acetone. Resa: 4.8 g.

Lo spettro IR non presenta pi? la banda tipica dell'estere a 1750 cm \

Cromatogr afato su piastre di gel di silice con cloroformio/metanolo/ammoniaca 4N 55:45:10 e con cloroformio/me tanolo/CaCl2 al 0.3% 55:45:10 e determinato con reagente alla resorcina il prodotto si rivela essere un composto unitario con Rf di 0.13 e 0.72 ris ivamente ed essere esente da G

rispettivamente)

m92?8J*

Esempio 17 Miscela di metilamidi di una miscela di gangliosidi

5 g della miscela,di esteri interni usata nell'E-sempio 15 vi?ne trattata con metilamina come nell'Esempio precedente e il prodotto di reazione trattato e isolato nella stessa maniera come in tale EsemprbT^La resa di prodotto puro (miscela di metilamidi della miscela,di gangliosidi usata) ? di 4 .8 g.

I valori Rf determinati come nell'Esempio precedente sono 0.01-0.10 e 0.20-0.45 rispettivamente (miscela di gangliosidi originaria: Rf 0.15-0.70 e 0.20-0.70 rispettivamente). I dati spettroscopici sono come quelli dell'Esempio precedente.

Esempio 18 Etilamide del ganglioside GMl

La si prepara da 5 g di estere interno del ganglioside GM1 (3.27 mM) e da 25 mi di etilamina in maniera identica a quella dell'Esempio 16 e si segue pure lo stesso metodo di purificazione. Si ottiene una resa di 4.8 g di etilamide pura del ganglioside GM1?

I dati spettroscopici IR sono gli,stessi come quelli della metilamide dell'esempio 16 e all'esame

4 cromatografico nelle stesse condizioni come in quell 1Esempio il prodotto si rivela essere unitario ed esente da con un Rf di 0.19 e 0.75 rispettivamente (Rf del 0.35 e 0.65 rispettivamente) .

Esempio 19 Miscela di etilamidi di una miscela di gangliosidi

La si prepara da 5 g della miscela di esteri interni di gangliosidi usata nell'Esempio 17 e da 25 mi di etilamina in maniera identica a quella dell'E-sempio 17 e si segue pure lo stesso metodo di purificazione. Si ottiene una resa di 4.8 g del miscuglio di etilamidi della miscela di gangliosidi.

I valori Rf determinati tramite cromatografia su piastre di gel di silice con cloroformio/metanolo/ ammoniaca 4N 55:45:10 e clproformio/metanolo/CaC^ ? al 0.3% 60:35:8 e determinato con reagente alla resorcina il prodotto possiede Rf di 0.11-0.24 e 0.35-0.55 rispettivamente (Rf della miscela originaria di gangliosidi 0.15-0.70 e 0.05-0.40 rispettivamente) .

Esempio 20 Butil-2-amide del ganglioside G^

V

5 g dell'estere interno del ganglioside (3.27 mM) vengono sciolti in 25 mi di piridina anidra. Si aggiungono alla soluzione 12.5 mi di 2-butilamina ed il miscuglio viene mantenuto in agitazione -in condizioni anidre per 24 ore a 25?.

Al termine della reazione il solvente viene evaporato ed il residuo viene ripreso con 50 mi di cloroformio/metanolo 1:1 ed il prodotto della reazione precipitato con 250 mi di acetone.

Il prodotto grezzo cosi ottenuto (5.2 g) viene quindi trattato con 100 mi di Na2CO^ all'1% per 30 minuti a 25? allo scopo di idrolizzare gruppi di estere residui, dializzato in acqua, la soluzione dializzata evaporata a secco sotto vuoto e il residuo purificato mediante cromatografia preparativa su gel di silice, usando come solvente cloroformio/metanolo/acqua 110:40:6. Le frazioni pure eluite vengono riunite, la soluzione evaporata a secco, il residuo sciolto in 15 mi di cloroformio/isopropanolo 1:1 e la butilamide precipitata con 75 mi di acetone. La resa ? di 4.7 g.

La spettroscopia IR non mostra pi? la banda tipica dell'estere a 1750 cm \

Alla cromatografia su piastre di gel di silice con cloroformio/metanolo/ammoniaca 4N 60:40:9 e cloroformio/metanolo/CaC^ al 0.3% 60:35:8 e determinato con reagente alla resorcina il prodotto si dimostra essere unitario ed esente dal ganglioside Gulcon un Rf di 0.30 e 0.50 rispettivamente (Rf del GM^ 0.42 e 0.40 rispettivamente).

Esempio 21 Benzilamide del ganglioside G^

5 g dell'estere interno (3.27 mM) del ganglioside G?^ vengono sciolti in 20 mi di piridina anidra e alla soluzione vengono aggiunti 396 mg (3.27 mM) di benzilamina e la soluzione viene mantenuta in agitazione in condizioni anidre per 24 ore a temperatura ordinaria.

Al termine della reazione il solvente viene eliminato per evaporazione ed il residuo ripreso con 50 mi di cloroformio/metanolo 1:1 ed il prodotto precipitato con 250 mi di acetone.

Il prodotto grezzo cosi ottenuto (5.1 g) viene purificato secondo le indicazioni fatte all'Esempio 16, ottenendosi una resa di 4.6 g di benzilamide pura .

Lo spettro IR non presenta pi? la banda tipica dell'estere a 1750 cm \

La cromatografia su piastre di gel di silice con cloroformio/metanolo/ammoniaca 4N 55:45:10 e cloroformio/metanolo/CaC^ al 0.3% 60:35:8 mostra che il prodotto ? unitario ed esente da e presenta un Rf di 0.32 e 0.69 (Rf del Gw1 = 0.35 e 0.40).

Esempio 22 Miscela di benzilamidi di un miscuglio di gangliosidi

Viene preparata partendo da 5 g del miscuglio di gangliosidi usato nell'Esempio 3 e da 792 mg (7.4 mM) di benzilamina secondo il procedimento usato nell'Esempio precedente per la preparazione della benzilamide del ganglioside G?1. Anche la purificazione del prodotto grezzo ottenuto viene eseguita come nell'Esempio precedente. La resa ? di 4.8 g.

Esame spettroscopico IR e cromatografia su piastre di gel di silice vengono eseguite come nell'Esempio precedente. I valori Rf sono 0.10-0.42 e 0.55-0.71 rispettivamente (miscela origianaria di gangliosidi 0.01-0.15 e 0.05 e 0.40 rispettivamente).

Lo spettro IR non presenta pi? la banda tipica dell'estere a 1750 cm

?? Esempio 23 Isopropilamide del ganglioside 5 g dell?estere interno del ganglioside (3.27 mM) vengono sciolti in 25 mi di isopropilamina anidra e il miscuglio viene mantenuto in agitazione in condizioni anidre per 24 ore.

Al termine della reazione si evapora il solvente e si riprende il residuo in 50 mi di cloroformio/metanolo 1:1 e si precipita il prodotto con 250 mi di acetone .

Il prodotto grezzo (4.8 g) viene trattato con 100 mi di soluzione di ^ 200^ all'1% per 30 minuti a 25? per idrolizzare residui legami di estere, poi dializzato in acqua, la soluzione dializzata evaporata a secco e purificata mediante cromatografia preparativa su gel di silice usando come solvente una miscela di cloroformio/metanolo/ammoniaca 2.5N 60:40:9. Le frazioni pure eluite vengono riunite, sciolte in 15 mi di cloroformio/metanolo 1:1 e il prodotto precipitato con 75 mi di acetone. L'isopropilamide (4.2 g) si dimostra essere unitaria alla cromatografia su piastre di gel di silice usando come solvente cloroformio/metanolo/ammoniaca 2.5N 60:40:9 e cloroformio/metanolo/CaCl2 al 0.3% 60:35:8 e determinato con reagente di resorcina, ed essere esente da GM^ ed avere un Rf di 0.25 e 0.66 rispettivamente (Rf del 0.42 e 0.40 rispettivamente) .

Nello spettro IR non si osserva pi? la banda tipica dell'estere a 1750 cm

Esempio 24 Dimetilamide del ganglioside G?^

5 g dell'estere interno del ganglioside G^ (3.27 mM) vengono sciolti in 25 mi di dimetilamina. Il miscuglio viene mantenuto in agitazione in condizioni anidre a bassa temperatura (-5?) per 24 ore. Al termine della reazione si tratta il miscuglio con Na2CC>2 e si purifica come nell'Esempio precedente, usando per? per la cromatografia come primo solvente cloroformio/metanolo/ammoniaca 2.5N 60:40:9 e come secondo solvente cloroformio/metanolo/acqua 60:40:9. La dimetilamide pesa 4.6 g.

Gli esami spettroscopici e cromatografici vengono eseguiti come nel precedente Esempio. Il prodotto si rivela essere unitario con Rf di 0.20 e 0.46 rispettivamente ed essere esente da G^ (Rf 0.42 e 0.40 rispettivamente). Lo spettro IR non rivela nessuna banda di estere a 1750 cm

Esempio 25 Miscela delle dimetilamidi di un miscuglio di gangliosidi

Si prepara partendo da 5 g della miscela di esteri interni di gangliosidi descritta nell'Esempio 3 e da 20 mi di dimetilamina anidra secondo il metodo dell'Esempio precedente. Il trattamento successivo avviene pure come nell'Esempio precedente, senonch? la cromatografia preparativa viene eseguita su Sephadex A-25, forma acetato, usando come solvente una miscela di cloroformio/metanolo/acqua 30:60:8. Il prodotto puro pesa 4.9 g.

Gli esami IR e cromatografici sono fatti come nell'Esempio precedente.

I valori Rf sono 0.15-0.50 e 0.40-0.56 rispettivamente (miscela originaria di gangliosidi 0.15-0.60 e 0.05-0.40 rispettivamente).

Esempio 26 Dietilamide del ganglioside

Si prepara in modo analogo alla dimetilammide dell'Esempio 24 partendo da 5 g di estere interno del ganglioside GM^ e da 25 mi di dietilamina anidra. La purificazione viene fatta in modo analogo a quella dell'Esempio 23. Resa: 4.7 g. All'esame cromatografico eseguito come nell'esempio 23 il pr?- .

dotto si rivela essere unitario con un Rf di 0.29 e 0.50 rispettivamente ed essere esente da G^ . Lo spettro IR non mostra alcuna banda di estere a 1750 cm

Esempio 27 Miscela di dietilamidi di una miscela di gangliosidi

Si prepara partendo da 5 g di una miscela di gangliosidi degli esteri interni usata nell'Esempio 3 e 20 mi di dietilamina anidra secondo il metodo dell'Esempio precedente. La purificazione viene fatta come per la dimetilamide della miscela dell'Esempio 25. Resa: 5.0 g.

I valori Rf (determinati come nell'Esempio precedente) sono 0.18-0.55 e 0.43-0.60 rispettivamente). Lo spettro IR non mostra alcuna banda di estere a 1750 cm"1.

Esempio 28 Etilmetilamide del ganglioside GMl

Si prepara in maniera analoga a quella dell'Esempio 24 partendo da 5 g di ganglioside e 25 mi di etilmetilamina. La purificazione viene pure eseguita come nel suddetto Esempio. Resa: 4.7 g.

La cromatografia su piastre di gel di silice viene fatta come all'Esempio 24 e il prodotto si rivela essere unitario ed esente da GMI* Rf 0.25 e 0.48 rispettivamente.

Lo spettro IR non mostra alcuna banda tipica degli esteri a 1750 cm 1

Esempio 29 3-dimetilaminopropil-l-amide del ganglioside GM1

5 g dell'estere interno del ganglioside G^ (3.27 mM) vengono sciolti in 20 mi di piridina anidra e alla soluzione si aggiungono 675 mg (6.6 mM) di 3-dimetilaminopropil-l-amina . Il miscuglio viene mantenuto in agitazione a temperatura ambiente per 24 ore .

Il prodotto viene isolato come nell'Esempio precedente e purificato come nell'Esempio 28. Resa in 3-dime tilaminopropill-amide: 4.9 g.

Nella cromatografia su piastre di gel di silice usando come solvente cloroformio/metanolo/ammoniaca 2.5N 55:45:10 e cloroformio/metanolo/CaCl2 al 0.3% 55:45:10 e determinato con reagente alla resorcina il prodotto si rivela essere unitario ed esente da GM^ ed avere un Rf di 0.02 e 0.06 rispettivamente (Rf del GMI 0.45 e 0.65 rispettivamente) ..

Esempio 30 Maleato della 3-dimetilaminopropil-l-amide del ganglioside

5 g della 3-dimetilaminopropil-l-amide del ganglioside ottenuta per esempio come nel precedente Esempio vengono sciolti in 100 mi di cloroformio/ metanolo 1:1 e alla soluzione vengono aggiunti 400 mg (3.44 mM) di acido maleico.

Dopo un'ora di agitazione a temperatura ambiente, la soluzione viene evaporata sotto vuoto e il residuo viene ripreso in 25 mi di cloroformio/metanolo 1:1 e il prodotto precipitato in 200 mi di acetone. Resa in maleato della 3-dimetilaminopropil-l-amide 5.2 g.

Esempio 31 Miscela delle 3-dimetilaminopropil-l-amidi di una miscela di gangliosidi

5 g di una miscela degli esteri interni di gangliosidi come descritta nell'Esempio 3 vengono sciolti in 20 mi di piridina anidra e alla soluzione vengono aggiunti 1.51 g (14.8 mM) di 3-dimetilaminopropil-l-amina e il miscuglio viene mantenuto in agitazione in condizioni anidre per 24 ore a tempera-

*

tura ambiente.

Il trattamento successivo avviene come nell'Esempio 29. Resa di 3-dimetilaminopropil-l-amide della miscela di gangliosidi purificata 5.1 g.

Il cromatogramma su piastre di gel di silice effettuato come nell'esempio 29 da i seguenti valori Rf: 0.01-0.05 e 0.01-0.10 rispettivamente (miscela originaria in gangliosidi Rf 0.15-0.70 e 0.20-0.70 rispettivamente)

Esempio 32 Maleato della miscela delle 3-dimetilaminopropil-l-amidi della miscela di gangliosidi

5 g della miscela delle 3-dimetilaminopropil-l-amidi della miscela di gangliosidi, preparata come nell'Esempio precedente, vengono sciolti in 100 mi di cloroformio/metanolo 1:1 e alla soluzione aggiunti 697 mg (6 mM) di acido maleico.

?

Al termine di un'ora di reazione sotto agitazione a temperatura ambiente, la soluzione viene evaporata a secco sotto vuoto e il residuo ripreso con 25 mi di cloroformio/metanolo 1:1 e il prodotto precipitato in 200 mi di acetone. Resa in sale maleico 5.3 g.

* Esempio 33 Dime tilaminoetilamide del ganglioside

GM1

5 g dell'estere interno del ganglioside GMl (3.27 mM) vengono sciolti in 50 mi di una soluzione anidra di cloroformio/isopropanolo 1:1 e poi vengono aggiunti 537 mg (6.5 mM) di dimetilaminoetilamina. La soluzione viene mantenuta in agitazione in condizioni anidre per 24 ore a temperatura ambiente. L'isolamento e la purificazione del prodotto grezzo cosi ottenuto vengono effettuati come all'Esempio 31, ottenendosi una resa di 4.9 g.

Il prodotto cromatografato nelle condizioni descritte nell'Esempio precedente risulta essere unitario e con Rf di 0.11 e 0.14 rispettivamente. Nello spettro IR non si registra nessuna banda a 1750 cm-1

Esempio 34 Maleato della dimetilaminoetilamide del ganglioside

5 g della dimetilaminoetilamide del ganglioside GMI, ottenuti come descritto nell'Esempio precedente, vengono sciolti in 100 mi di cloroformio/metanolo 1:1 e alla soluzione vengono aggiunti 400 mg (3.44 mM) di acido maleico. Al termine di un'ora a temperatura ambiente sotto agitazione la soluzione viene evaporata nel vuoto e il residuo viene ripreso con 25 mi di cloroformio/metanolo 1:1 e il prodotto precipitato in 200 mi di acetone. Resa: 5.2 g.

Esempio 35 Miscela delle dimetilaminoetilamidi di una miscela di gangliosidi

5 g di una miscela di esteri interni di una miscela di gangliosidi come descritti nell'Esempio 3 vengono sciolti in 50 mi di una soluzione anidra di cloroformio/isopropanolo 1:1 e alla soluzione vengono aggiunti 955 mg (0.8 mM) di dimetilaminoetilamina e la soluzione viene mantenuta a temperatura ambiente sotto agitazione in condizioni anidre per 24 ore. L'ulteriore isolamento del prodotto grezzo e la sua purificazione vengono eseguiti come descritto nell'Esempio 33.

La cromatografia su piastre di gel di silice ese- . guita come nell'Esempio 33 d? dei valori Rf di 0.01-0.14 e 0.01-0.16 rispettivamente (miscela di gangliosidi originaria 0.15-0.70 e 0.20-0.70 rispettivamente) .

Nello spettro IR non si registra alcuna banda nella regione degli esteri a 1750 cm

Esempio 36 Maleato della miscela di dimetilaminoetilamidi della miscela di gangliosidi dell'Esempio precedente

5 g della miscela di dimetilaminoetilamidi di .gangliosidi descritti nell'Esempio precedente vengono sciolti in 100 mi di cloroformio/metanolo 1:1 e alla soluzione vengono aggiunti 697 mg (6 mM) di acido maleico.

Al termine di un'ora in cui si mantiene la soluzione sotto agitazione a temperatura ambiente essa viene evaporata sotto vuoto a secco e il residuo viene ripreso in 25 mi di cloroformio/metanolo 1:1 e il prodotto precipitato con 200 mi di acetone. Resa: 5.3 g del maleato.

Esempio 37 Etanolamide del ganglioside GM^

5 g dell'estere interno del ganglioside (3.27 mM) vengono sciolti in 50 mi di una soluzione anidra di cloroformio/isopropanolo 1:1 e alla soluzione vengono aggiunti 397.2 mg (6.5 mM) di etanolamina e il miscuglio viene mantenuto in condizioni anidre sotto agitazione a temperatura ambiente.

L'isolamento e la purificazione del prodotto di reazione vengono fatti come nell'Esempio 33, ottenendosi 4.9 g. di prodotto puro.

Nella cromatografia su piastre di gel di silice con cloroformio/metanolo/ ammoniaca 4N 55:45:10 e cloro- \ formio/metanolo/CaCl2 0.3% 60:35:8 e determinato

con reagente alla resorcina il prodotto si dimostra

essere unitario ed esente da con un Rf di

0.12 e 0.49 rispettivamente.

Esempio 38 Miscela delle etanolamidi di una miscela di gangliosidi

Viene preparata da 5 g della miscela di esteri interni della miscela di gangliosidi descritti nell'Esempio 3 sciolti in 20 mi di piridina anidra e

da 671 mg {10.8 mM) di etanolamina. La miscela

viene mantenuta sotto agitazione per 24 ore a temperatura ambiente.

L?isolamento del prodotto grezzo della reazione e

la sua purificazione vengono fatti come nell'Esempio precedente, ottenendosi una resa di 5.2 g.

Nella cromatografia su piastre di gel di silice

eseguita come nell'Esempio 33 si ottengono Rf di

0.09-0.56 e 0.25-0.55 rispettivamente. Nello spettro IR non si nota pi? alcuna banda tipica per gli

esteri.

Esempio 39 6-idrossiesil-l-amide del ganglioside

5 g dell'estere interno del ganglioside (3.27 mM) vengono disciolti in 20 mi di piridina anidra, alla soluzione vengono aggiunti 762 mg (6.5 mM) di 6-idrossiesil-l-amina. Si lascia reagire sotto agitazione per 24 ore a temperatura ambiente in condizioni anidre.

L'isolamento del prodotto grezzo della reazione avviene come nell'Esempio 28. L'idrolisi di gruppi estere residui e la dialisi vengono pure fatte come nell'Esempio 12 e si precipita il prodotto purificato con acetone come negli Esempi precedenti. Resa: 4.3 g.

Nella cromatografia su piastre di gel di silice usando come solventi cloroformio/metanolo/ammoniaca 2.5N 60:40:9 e cloroformio/metanolo/CaC^ al 0.3% 60:35:8 e determinato con reagente alla resorcina il prodotto si dimostra essere unitario ed esente da GM1 ed avere un Rf di 0.40 e 0.80 rispettivamente (Rf del GM1 0.42 e 0.40 rispettivamente).

v Esempio 40 Derivato peracetilato del ganglioside

GM1

5 g del sale di sodio (3.19 mM) del ganglioside vengono sciolti in 50 mi di piridina anidra e alla soluzione vengono aggiunti a 25? 25 mi di anidride acetica distillata di fresco a 25?.

La soluzione viene poi mantenuta sotto agitazione per 72 ore a temperatura ambiente. Al termine della reazione la soluzione viene evaporata a secco sotto vuoto ed il residuo viene ripartito fra 100 mi di acqua ghiacciata e 200 mi di acetato di etile. L'acetato di etile viene poi lavato con HC1 freddo 1.0 M, con acqua e con soluzioni di NaHCO^ 1.0 M. Le fasi organiche vengono quindi anidrificate con solfato di sodio, evaporate sotto vuoto e il residuo viene purificato mediante cromatografia preparativa in colonna di gel di silice usando una miscela di diclorometano/acetato d'etile/isopropanolo 70:30:7 come solvente eluente.

Le frazioni pure vengono riunite, evaporate a secco, ridisciolte in 20 mi di etere etilico e il prodotto precipitato in 100 mi di esano normale. Resa: 4.2 g.

Nella cromatografia su piastre di gel di silice usando diclorometano/acetato d'etile/metanolo 70:30:10 e acetato d1etile/isopropanolo 95:5 e determinato con reagente di Ehrlich il prodotto si dimostra essere unitario con un Rf di 0.47 e di. 0.28 rispettivamente.

Esempio 41 Derivato peracetilato di una miscela di gangliosidi

5 g della miscela di gangliosidi descritta nell'E-sempio 3 in forma dei loro sali di sodio vengono sciolti in 25 mi di piridina anidra e alla soluzione si aggiungono 25 mi di anidride acetica. Il miscuglio viene tenuto sotto agitazione per 72 ore a temperatura ambiente. Al termine della reazione la soluzione viene evaporata a secco nel vuoto e il residuo vien ripartito tra 100 mi di acqua ghiacciata e 200 mi di acetato d'etile, l'acetato di etile viene lavato con HCl freddo 1.0N, con acqua e con soluzione di NaHCO^ 1.0 M.

Le fasi organiche vengono quindi anidrificate con solfato di sodio, evaporate nel vuoto e il residuo viene ripreso in 20 mi di acetato di etile e il prodotto precipitato in 100 mi di esano normale. Resa: 4.4 g.

Nella cromatografia eseguita come nell'Esempio precedente si ottiene per la miscela un Rf di 0.01-0.46

e 0.01-0.36 rispettivamente. k

Esempio 42 Derivato peracetilato dell'estere metilico del ganglioside GM^

5 g (3.17 mM) dell'estere metilico del ganglioside

GM1 ven9ono sciolti in 50 mi di piridina anidra e

alla soluzione vengono aggiunti a 25? 25 mi di anidride acetica distillata di fresco e il miscuglio

viene mantenuto in agitazione per 72 ore a temperatura ambiente.

Al termine della reazione la soluzione viene evaporata nel vuoto e il residuo ripartito fra 100 mi di

acqua ghiacciata e 200 mi di acetato d'etile, l'acetato di etile lavato con HC1 freddo 1.0 M, con

acqua e con soluzione di NaHCO^ 1M.

Le fasi organiche vengono anidrificate con solfato

di sodio, evaporate nel vuoto e il residuo purificato mediante cromatografia preparativa su colonna

di gel di silice, usando come solvente una miscela

di diclorometano/acetato di etile/isopropanolo

70:30:45.

Le frazioni pure vengono riunite, evaporate, ridi-

*

sciolte in 20 mi di etere etilico e precipitate in 100 mi di esano normale. Resa 4.5 g del derivato peracetilato dell'estere metilico del ganglioside

Cromatogr afato su piastre di gel di silice con diclorometano/acetato d'etile/metanolo 70:30:10 e acetato d'etile/isopropanolo 95:5 e determinato con reagente di Ehrlich il prodotto si rivela essere unitario con un Rf di 0.47 e 0.28 rispettivamente.

Esempio 43 Derivato peracetilato della miscela di esteri metilici di una miscela di gangliosidi

5 g della miscela di esteri metilici della miscela di gangliosidi dell'Esempio 3 (vedi anche Esempio 2) vengono acetilati come descritto nell'Esempio 40. Anche la purificazione del prodotto di acetilazione viene eseguita come nell'esempio 40, ottenendosi una resa di 5.4 g del derivato peracetilato della miscela di esteri metilici dell'Esempio 2. Nella cromatografia eseguita come nell'Esempio precedente risulta un Rf nell'ambito di 0.23-0.54 e 0.01-0.52.

Esempio 44 Derivato peracetilato dell'amide del ganglioside

Partendo da 5 g (3.20 mM) dell'amide del ganglioside in 50 mi di piridina anidra si prepara il derivato acetilato come nell'Esempio 42. La purificazione viene fatta come nell'Esempio 41, usando per? nella cromatografia diclorometano/isopropanolo 95:5 come solvente. Resa: 4.4 g di derivato puro peracetilato dell'amide del ganglioside GMl?

Il prodotto si dimostra essere unitario se cromatografato come nell'Esempio precedente con un Rf di 0.43 e di 0.48 rispettivamente.

Esempio 45 Derivato peracetilato della miscela di amidi di una miscela di gangliosidi 5 g della miscela di amidi di gangliosidi descritta nell'Esempio 15 sciolti in 50 mi di piridina anidra vengono acetilati con 25 mi di anidride acetica come nell'Esempio precedente. La purificazione viene fatta come nell'Esempio 42, ottenendosi 4.9 g del derivato peracetilato della miscela di gangliosidamidi dell'Esempio 15.

Cromatografato nelle stesse condizioni come nell'E-sempio precedente il composto possiede degli Rf di 0.11-0.45 e 0.01 e 0,50 rispettivamente.

Esempio 46 Preparati farmaceutici in soluzione per iniezione

Preparato No.l - una fiala da 2 mi contiene:

- sostanza attiva mg 5 - cloruro di sodio mg 16 - tampone citrato pH 6 in acqua distillata apirogena q.b.a. mi 2 La sostanza attiva viene scelta dal gruppo costituito dai derivati gangliosidici descritti in uno qualsiasi degli Esempi 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24.

Preparato No.2 - una fiala da 2 mi contiene:

- sostanza attiva mg 50 - cloruro di sodio mg 16 - tampone citrato pH 6 in acqua distillata apirogena q.b.a. mi 2 La sostanza attiva viene scelta dal gruppo costituito dai derivati gangliosidici descritti in uno qualsiasi degli Esempi 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39.

* Preparato No.3 - un flaconcino da 4 mi contiene:

- sostanza attiva mg 100

- cloruro di sodio mg 32 b - tampone citrato pH 6 in acqua

distillata apirogena q.b.a. mi 4

La sostanza attiva viene scelta dal gruppo costituito dai derivati gangliosidici descritti in uno

qualsiasi degli Esempi 20-39.

I preparati No. 1, 2 e 3 possono venire somministrati direttamente ad animali o persone per una

delle vie su descritte. In aggiunta i composti possono contenere sostanza attiva.

Esempio 47 Composizioni farmaceutiche preparate con

doppio flaconcino

Le preparazioni illustrate in questo Esempio vengono ottenute con doppio flaconcino. Il primo flaconcino contiene la sostanza attiva in forma di polvere liofilizzata in quantit? che possono variare dal

10% al 90% in peso assieme ad un eccipiente accettabile dal punto di vista farmaceutico,con glieina

o mannitolo. Il secondo flaconcino contiene il solvente, come una soluzione di cloruro di sodio e un

tampone citrato.

*

Solamente prima della somministrazione i contenuti dei due flaconcini vengono uniti e la polvere della sostanza attiva liofilizzata si discioglie rapidamente dando luogo ad una soluzione iniettabile. La forma farmaceutica che prevede un flaconcino contenente la polvere liofilizzata della sostanza attiva, ? quella preferita dalla presente invenzione.

Sistema No.l

a. un flaconcino liofilizzato da 2 mi contiene:

- sostanza attiva mg 5 - glieina mg 30

b. una fiala di solvente da 2 mi contiene:

- cloruro di sodio mg 16 - tampone citrato in acqua apirogena q.b.a. mi 2 La sostanza attiva viene scelta dal gruppo costituito dai derivati gangliosidici descritti in uno qualsiasi degli Esempi 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24.

Sistema No.2

a. una fiala liofilizzata da 3 mi contiene:

- sostanza attiva mg 5 - mannitolo mg 40

'?4

b. una fiala di solvente da 2 mi contiene: cloruro di sodio mg 16 - tampone citrato in acqua apirogena q.b.a. mi 2 La sostanza attiva viene scelta dal gruppo costituito dai derivati gangliosidici descritti in uno qualsiasi degli Esempi 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13.

Sistema No.3

a. una fiala liofilizzata da 3 mi contiene:

- sostanza attiva mg 50 - glieina mg 25

b. una fiala di solvente da 3 mi contiene:

- cloruro di sodio mg 24 - tampone citrato in acqua apirogena q.b.a. mi 3 La sostanza attiva viene scelta dal gruppo costituito dai derivati gangliosidici descritti in uno qualsiasi degli Esempi 14, 15, 16, 17, 21, 37, 38, 39.

Sistema No.4

a. una fiala liofilizzata da 3 mi contiene sostanza attiva mg 50 mannitolo mg 20

b. una fiala di solvente da 3 mi contiene

cloruro di sodio mg 24 - tampone citrato in acqua apirogena q.b.a. mi 3 La sostanza attiva viene scelta dal gruppo costituito dai derivati gangliosidici descritti in uno qualsiasi degli Esempi 10-13.

Sistema No.5

a. un flaconcino liofilizzato da 5 mi contiene:

- sostanza attiva mg 150 - glieina mg 50

b. una fiala di solvente da 4 mi contiene:

- cloruro di sodio mg 32 - tampone citrato in acqua apirogena q.b.a.mi 4 La sostanza attiva viene scelta dal gruppo costituito dai derivati gangliosidici descritti in uno qualsiasi degli Esempi 14-39.

Sistema No.6

a. un flaconcino liofilizzato da 5 mi contiene: sostanza attiva mglOO mannitolo mg 40

b. una fiala di solvente da 4 mi contiene:

cloruro di sodio mg 32 - tampone citrato in acqua apirogena q.b.a.ml 4 La sostanza attiva viene scelta dal gruppo costituito dai derivati gangliosidici descritti in uno qualsiasi degli Esempi 5-13.

Sistema No.7

a. un flaconcino da 3 mi contiene:

- sostanza attiva micronizzata sterile mg 40

b. una fiala di solvente da 3 mi contiene:

- Tween 80 mg 10 - cloruro di sodio mg 24 - tampone fosfato in acqua apirogena q.b.a.ml 3 La sostanza attiva viene scelta dal gruppo costituito dai derivati gangliosidici descritti in uno qualsiasi degli Esempi 40-45.

Sistema No.8

a. un flaconcino da 5 mi contiene:

- sostanza attiva micronizzata sterile mglOO

b. una fiala di solvente da 4 mi contiene:

- Tween 80 mg 15 - lecitina di soja mg 5 - cloruro di sodio mg 36 - tampone citrato in acqua apirogena q.b.a.ml 4 La sostanza attiva viene scelta dal gruppo costituito dai derivati gangliosidici descritti in uno qualsiasi degli Esempi 40-45.

Si rivendica:

1. Derivati di gangliosidi scelti dal gruppo costituito dagli esteri e dalle amidi dei gruppi carbossilici di gangliosidi della formula generale:

HOOC . j | acidi ,? l ? 1 1 1 1 OH I I OH

s?a I i c

l i i l i I OH

HOOC 1 1 1 1 1 1 OH OH f I I

ceramide

J

OH OL1GOSACCARIDE ?H

in cui un residuo di oligosaccaride formato da un massimo di 5 monosaccaridi ? connesso mediante un legame glucosidico ad un residuo di ceramide e a uno o pi? residui di acidi sialici sia mediante altrettanti legami glucosidici diretti sia mediante uno solo od alcuni di tali legami, essendo i rimanenti residui di acidi sialici uniti fra di loro mediante legami chetosidici, o delle loro miscele, dai loro derivati peracilati nei gruppi idrossilici dell'oligosaccaride , degli acidi sialici e del ceramide, e dai derivati peracilati nei gruppi idrossilici dell'oligosaccaride, degli acidi sialici e del ceramide di gangliosidi di formula I o delle loro miscele aventi le funzioni carbossiliche libere, ad eccezione degli esteri metilici dei gangliosidi GMl e G^ e dei loro peracetilati e dell'amide del ganglioside GM3 t nonch? dei peracetilati di gangliosidi ottenuti secondo il procedimento descritto nell'articolo "Quantitative isolation of total glycosphingolipids from animai cells" in Journal of Lipid Research, _12, 257-259 (1971), ed eventualmente dai loro sali.

2. Derivati gangliosidici secondo la rivendicazione 1, in cui i gangliosidi di base sono quelli estratti da tessuti o organi animali e descritti in letteratura.

3. Derivati di gangliosidi secondo una delle rivendicazioni 1 e 2, in cui i gangliosidi di base sono quelli estratti da tessuti e organi del sistema nervoso di mammiferi.

4. Derivati di gangliosidi secodo la rivendicazione 1, in cui nei gangliosidi di base l'oligosaccaride ? formato da un massimo di 4 esosi o N-acetilesosamine , essendovi presente almeno un residuo di esoso e in cui 11oligosaccaride ha struttura chimicamente unitaria, il residuo di ceramide deriva da un insieme di acilsfingosine aventi un doppio legame o sature e aventi una catena da 16 a 22 atomi di carbonio, e in cui i residui degli acidi sialici derivano dal gruppo costituito dall'acido N-acetilneuraminico e dall'acido N-glicolilneuraminico ed eventualmente da corrispondenti acidi acilati ad uno dei gruppi idrossilici.

5. Derivati di gangliosidi secondo la rivendicazione 4, in,cui il residuo di esoso ? quello del glucosio o del galattosio e quello della N-acetilesosamina ? quello della N-acetilglucosamina o della N-acetilgalattosamina.

6. Derivati di gangliosidi secondo la rivendicazione 5, in cui il residuo di ceramide ha catene di sfingosine di 18 o 20 atomi di carbonio e gruppi acilici pure di tale grandezza molecolare.

7. Derivati di gangliosidi secondo una delle rivendicazioni precedenti in cui i gangliosidi di base sono scelti dal gruppo costituito da GM1' GDla' GDlb e GTlb*

8. Derivati di gangliosidi secondo una delle rivendicazioni precedenti in cui gruppi carbossi-?

lici esterificati derivano da alcoli alifatici con un massimo di 12 atomi di carbonio, o da alcoli aralifatici con un solo anello benzenico eventualmente sostituito da 1 a 3 gruppi alchilici inferiori (C^_4) e un massimo di 4 atomi di carbonio nella catena alifatica o da alcoli eterociclici con un massimo di 12 atomi di carbonio e un solo anello eterociclico contenente un eteroatomo scelto dal gruppo formato da N, S, e 0 o da alcoli della serie aliciclica o alifatico-aliciclica aventi un massimo di 14 atomi di carbonio.

9. Derivati di gangliosidi secondo una delle rivendicazioni 1-7 in cui i gruppi carbamici derivano da amine alifatiche con un massimo di 12 atomi di carbonio a catene aperte o cicliche, da amine aralifatiche con un solo anello benzenico eventualmente sostituito da 1-3 gruppi alchilici inferiori (C-^_4) e un massimo di 4 atomi di carbonio nella parte alifatica, o dal-11ammoniaca .

10. Derivati di gangliosidi secondo una delle rivendicazioni precedenti, in cui i gruppi idrossilici di gangliosidi a funzioni carbossiliche libere o esterificate o convertite nelle amidi sono peracilati con acidi alifatici aventi un massimo di 10 atomi di carbonio o da acidi aromatici scelti dal gruppo costituito dall'acido benzoico e i suoi derivati con gruppi metilici, idrossilici, aminici o carbossilici.

11. Derivati di gangliosidi secondo una delle rivendicazioni precedenti, in cui i gruppi di estere sono derivati da alcoli formati dal gruppo consistente di alcoli alifatici con un massimo di 6 atomi di carbonio, saturo aventi al massimo un doppio legame, non sostituiti o sostituiti da gruppi idrossilici, alcossilici con un massimo di 4 atomi di carbonio, aminici, alchilaminici o dialchilaminici con un massimo di 4 atomi di carbonio nei gruppi alchilici, gruppi carbossilici, gruppi carbalcossilici con un massimo di 4 atomi di carbonio nel residuo alchilico, da alcoli aralifatici con un solo anello benzenico non sostituito o sostituito da 1 a 3 gruppi metilici e un massimo di 4 atomi di carbonio nella parte alifatica, da tetraidrofuranolo da tetraidropiranolo, in cui i gruppi amidici sono derivati da ammoniaca o da alchilamine, dialchilamine o alchilenamine con un massimo di 6 atomi di carbonio nei gruppi alchilici e da 4 a 8 atomi di carbonio nei gruppi alchilenici e in cui i gruppi alchilici o alchilenici possono essere interrotti nella catena di atomi di carbonio da eteroatomi scelti dal gruppo formato di azoto, ossigeno e zolfo, potendo essere il gruppo iminico -NH- nel caso della presenza di un atomo di azoto sostituito da alchile con un massimo di 4 atomi di carbonio, e/o possono essere sostituiti da gruppi scelti dal gruppo formato da gruppi aminici, alchilaminici o dialchilaminici con un massimo di 4 atomi di carbonio nei gruppi alchilici, o da gruppi idrossilici o alcossilici con un massimo di 4 atomi di carbonio nei gruppi alchilici, o da amine aralifatiche aventi un solo anello benzenico eventualmente sostituito da un massimo di 3 gruppi metilici e avente un massimo di 4 atomi di carbonio nella parte alifatica, e in cui i gruppi acilici esterificanti gli idrossili derivano da acidi alifatici saturi o insaturi con un massimo di 6 atomi di carbonio, che possono anche essere sostituiti da una funzione scelta dal gruppo costituito da gruppi idrossilici, aminici e carbossilici, e i loro sali.

12. Derivati di gangliosidi secondo la rivendicazione 11, in cui i gangliosidi base sono scelti dal gruppo definito nella rivendicazione 4.

13. Derivati di gangliosidi secondo la rivendicazione 11, in cui i gangliosidi base sono scelti dal gruppo definito nella rivendicazione 5.

14. Derivati di gangliosidi secondo la rivendicazione 11, in cui i gangliosidi base sono scelti dal gruppo definito nella rivendicazione 7.

15. Derivati gangliosidici secondo la rivendicazione 1 scelti dal gruppo formato dagli esteri metilici, etilici, propilici, isopropilici, butilici normali, isobutilici, terziarbutilici, cicloesilici dei gangliosidi GMl, GDlb,

GTlb?

I

16. Derivati gangliosidici secondo la rivendicazione 1 scelti dal gruppo formato dall'amide non sostituita, dalla metilamide, dalla etilamide, dalla propilamide, dalla dimetilamide, dalla dietilamide, d?lia pirrolidinilamide, dalla piperidinamide , dalla piperazinilamide, dalla morfolinamide e dalla tiomorfolinamide dei gangliosidi GM1> GDlb, GDla, GTlb.

17. Derivati gangliosidici secondo la rivendicazione 1 scelti dal gruppo formato dai peracetilati, dai perpropionilati, dai perbutirrilati, dai maleinilati, dai succinilati degli esteri riferiti nella rivendicazione 15.

18. Derivati gangliosidici secondo la rivendicazione 1 scelti dal gruppo formato dai peracetilati, dai perpropionilati, dai perbutirrilati, dai maleinilati, dai succinilati delle amidi elencate nella rivendicazione 16.

19. Derivati gangliosidici secondo la rivendicazione 1 scelti dal gruppo formato dai peracetilati, dai perpropionilati, dai perbutirrilati, dai maleinilati, dai succinilati dei gangliosi-

dl GM1' GDlb' GDla' GTlb*

20. Derivati gangliosidici secondo la rivendicazione 1 scelti dal gruppo formato dagli esteri metilici, etilici, propilici, isopropilici, terziarbutilici , benzilici, allilici, etossicarbonilmetilici di miscele di gangliosidi G^ ,

GDlb' GDla' GTlb*

21. Derivati gangliosidici secondo la rivendicazione 1 scelti dal gruppo formato dall'amide non sostituita, dalla metilamide, dalla etilamide, dalla propilamide, dalla dimetilamide, dalla dietilamide, dalla pirrolidinilamide, dalla piperidinamide , dalla piperazinilamide, dalla morfolinamide e dalla tiomorfolinamide di miscele di gangliosidi contenenti come principali gangliosidi GM1, GDlb, G^ , G^ .

22. Derivati gangliosidici secondo la rivendicazione 1 scelti dal gruppo formato dai peracetilati, dai perbutirrilati normali, dai perpropionilati, dai permaleinilati, dai permalonilati e dai persuccinilati di miscele di gangliosidi contenenti come principali gangliosidi GM1 ' GDlb' GDla' GTlb*

23. Derivati gangliosidici secondo la rivendicazione 1 scelti dal gruppo formato dagli esteri metilico, etilico, isopropilico, terziarbutilico, benzilico, allilico, etossicarbonilmetilico del ganglioside GM^.

24. Derivati gangliosidici secondo la rivendicazione 1 scelti dal gruppo formato dall'amide non sostituita, dalla metilamide, dalla etilamide, dalla butilamide, dalla benzilamide, dalla isopropilamide , dalla dimetilamide, dalla dietilamide, dalla etilmetilamide, dalla dimetilaminopropilamide, dalla dimetilaminoetilamide, dalla etanolamide, dalla esanolamide del ganglioside

25. Preparazioni farmaceutiche contenenti come ingredienti attivi derivati di gangliosidi scelti dal gruppo costituito dagli esteri o dalle amidi dei gruppi carbossilici di gangliosidi della formula generale:

HOOC u n i i [ acidi I n i n i OH p l l lOH

J sialid 1

n i m OH

< ceramide i HOOC n i n i O O OH OH

vr r J ?

J

- -

OH OLIGOSACCARIDE OH

in cui un residuo di oligosaccaride formato da un massimo di 5 monosaccaridi ? connesso mediante un legame glucosidico ad un residuo di ceramide e ad uno o pi? residui di acidi sialici sia mediante altrettanti legami glucosidici diretti sia mediante uno solo od alcuni di tali legami, essendo i rimanenti residui di acidi sialici uniti fra di loro mediante legami chetosidici o delle loro miscele, dai loro derivati peracilati nei gruppi idrossilici dell'oligosaccaride, degli acidi sialici e del ceramide, e dai derivati peracilati nei gruppi idrossilici dell'oligosaccaride, degli acidi sialici e del ceramide di gangliosidi di formula I o delle loro miscele aventi le funzioni carbossiliche libere, o/e dai sali di tali derivati gangliosidici , insieme ad un opportuno eccipiente.

26. Preparazioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 25 contenenti come ingrediente attivo uno qualsiasi dei derivati gangliosidici definiti in una delle rivendicazioni 2-10.

iV

27. Preparazioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 25 contenenti come ingrediente attivo

uno qualsiasi dei derivati gangliosidici definiti nella rivendicazione 11.

28. Preparazioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 25 contenenti come ingrediente attivo

uno qualsiasi dei derivati gangliosidici definiti in una delle rivendicazioni 12-14.

29. Preparazioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 25 contenenti come ingrediente attivo

uno qualsiasi dei derivati gangliosidici definiti in una delle rivendicazioni 15-24.

30. Preparazioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 25 contenenti come ingrediente attivo

un derivato gangliosidico scelto dal gruppo

formato dall'estere metilico, del ganglioside

G^ , dall'estere metilico del ganglioside

r dall'amide non sostituita del ganglioside GM3, dai derivati peracetilati degli esteri metilici dei gangliosidi G^ e G^ t dagli esteri metilici e dalle amidi non sostitui

te di una delle miscele di gangliosidi formata dai gangliosidi G^ , GDla, GDlb, GTlb, dai loro peracetilati e dai peracetilati di una miscela dei gangliosidi GMl, GDla, GDlb, GTlk).

31. Preparazioni farmaceutiche secondo una delle rivendicazioni 25-30 per la somministrazione parenterale .

32. Preparazioni farmaceutiche secondo una delle rivendicazioni 25-30 per la somministrazione locale o topica.

33. Preparazioni farmaceutiche secondo una delle rivendicazioni 25-30 per la somministrazione a mezzo di opportuno sistema terapeutico transdermico.

34. Preparazioni farmaceutiche secondo una delle rivendicazioni 25-31 per la somministrazione parenterale in forma di soluzioni delle sostanze attive.

35. Preparazioni farmaceutiche secondo una delle rivendicazioni 25-31 per la somministrazione parenterale in forma di polveri liofilizzate da unire ad uno o pi? eccipienti o diluenti accettabili dal punto di vista farmaceutico.

36. Preparazioni farmaceutiche secondo una delle rivendicazioni 25-35 in forma di fiale contenenti l'ingrediente attivo in quantit? variante dai 5 mg ai 100 mg unitamente a quantit? fisiologiche di cloruro di sodio ? un opportuno tampone .

37. Preparazioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 36 e descritte nell'Esempio 46.

38. Preparazioni farmaceutiche secondo una delle rivendicazioni 25-35 in doppio flaconcino contenenti l'uno la sostanza attiva in forma di polvere liofilizzata in quantit? varianti dal 10% al 90% in peso assieme ad un eccipiente accettabile dal punto di vista farmaceutico, e l'altro un solvente consistente in una soluzione fisiologica di cloruro di sodio e in un opportuno tampone.

39. Preparazioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 38 e descritte nell'Esempio 47.

40. Preparazioni farmaceutiche secondo una delle rivendicazioni 25-39 contenente come sostanza attiva un derivato gangliosidico descritto in uno degli Esempi 1-45.

41. Un metodo terapeutico per il trattamento delle patologie del sistema nervoso consistente nella somministrazione di una quantit? efficace di un derivato gangliosidico come rivendicato in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-24 o un derivato gangliosidico secondo la rivendicazione 30.

42. Un metodo terapeutico secondo la rivendicazione 40 utile nella terapie delle patologie del sistema nervoso periferico di origine traumatica, compressiva, degenerativa o tossico-infettiva, in cui ? necessario stimolare la rigenerazione nervosa ed il ripristino della funzione neuromuscolare .

|r\ 43. Un metodo terapeutico secondo la rivendicazione

41, in cui si somministrano per via parenterale

quantit? varianti da 0.05 mg a 5 mg di sostanza

attiva per Kg di peso corporeo al giorno.

44. Un metodo terapeutico secondo la rivendicazione

41, in cui si somministrano quantit? varianti

da 0.05 mg a 5 mg di sostanza attiva per Kg di

peso corporeo al giorno.

45. I nuovi derivati gangliosidici descritti negli

Esempi illustrativi 1-45.

46. Procedimento per la preparazione di un derivato gangliosidico definito nella rivendicazione 1,

in cui un ganglioside o una miscela di gangliosidi o derivati peracilati di questi composti

vengono esterificati ai gruppi carbossilici o

questi vengono convertiti nelle amidi o i gruppi idrossilici di questi derivati gangliosidici

o i gangliosidi a funzione carbossilica libera

o le loro miscele vengono acilati seguendo metodi di per s? conosciuti, e, volendo, i composti salificabili ottenuti vengono convertiti

nei loro sali.

47. Procedimento secondo la rivendicazione 46, in cui l'esterificazione viene eseguita per trattamento con diazoalcani negli alcoli corrispondenti previo trattamento con scambiatori ionici di tipo acido.

48. Procedimento secondo la rivendicazione 46, in cui si tratta i sali metallici dei composti di partenza menzionati con un agente eterificante contenente il gruppo idrocarbilico che si vuole introdurre nelle funzioni carbossiliche.

49. Procedimento per la preparazione di esteri carbossilici di gangliosidi definiti nella rivendicazione 1 e anche degli esteri eccettuati in quella rivendicazione, in cui si tratta un estere interno di un ganglioside o di una miscela di gangliosidi con l'alcool di cui si vuole preparare l'estere.

50. Procedimento per la preparazione di esteri secondo la rivendicazione 49, in cui il trattamento viene effettuato in presenza di un alcoolato metallico corrispondente.

51. Procedimento per la preparazione di esteri secondo la rivendicazione 50, in cui si usa l'alcoolato di un metallo alcalino.

52. Procedimento per la preparazione delle amidi secondo la rivendicazione 46, in cui

a. un estere interno di un ganglioside o di una miscela di gangliosidi viene trattato con ammoniaca o con un'amina, o

b. un estere carbossilico di un ganglioside o di una miscela di gangliosidi viene trattato con ammoniaca o con un'amina, o

c. un ganglioside o una miscela di gangliosidi con i gruppi carbossilici attivati vengono trattati con ammoniaca o con un'amina.

53. Procedimento per la preparazione delle amidi secondo la rivendicazione 52 in cui si usano metodi della chimica dei peptidi che lasciano intatta la compagine molecolare del ganglioside.

Claims (1)

1. 54. Procedimento per la preparazione dei peracilati dei gangliosidi, dei loro esteri o delle loro amidi o di miscele di questi composti, in cui essi vengono acilati con un agente acilante in presenza di una base.

   55. Procedimento secondo la rivendicazione 54, in cui si usa un'anidride come agente acilante e un'amina terziaria come base.

   p.a egato ala Ue)