IT8922206A1 - Formulazioni solide di sistemi complessi tipo sostanza avidinica-marcatore biotinilato utili in analisi biologiche. - Google Patents

Description

Descrizione di un'invenzione avente titolo:

FORMULAZIONI SOLIDE DI SISTEMI COMPLESSI TIPO SOSTANZA AVIDINICA-MARCATORE BIOTINILATQ UTILI IN ANALISI BIOLOGICHE.

RIASSUNTO

Un sistema utile per analisi immuno-biologiche consistente in una formulazione solida e stabile nel tempo che comprende un complesso formato da avidina, streptavidina o da un loro derivato semi-sintetico e da un marcatore biotilinato, insieme ad un adatto veicolo solido idrosolubile o idrodispersibile.

DESCRIZIONE

La presente invenzione ? relativa al settore della rilevazione di sonde biologiche, e pi? particolarmente a quello delle analisi immuno-enzimatiche attraverso l'uso di sonde biologiche.

Nel settore interessato dall'invenzione, la rilevazione di date macromolecole (definite "bersaglio") implica l'uso di macromolecole (definite "sonde") in grado di combinarsi selettivamente con il bersaglio e dare origine ad un complesso sonda-bersaglio che per la sua univoca determinazione deve venire evidenziato.

Per 1'evidenziazione si sfrutta l'altissima affinit? esistente tra la biotina e l'avidina, i suoi derivati, e la streptavidina. Dunque la sonda viene biotinilata e, come marcatori, si usano complessi del tipo sostanza avidinica-marcatore biotinilato, che legandosi al complesso bersaglio-sonda biotinilata, danno luogo, grazie alle caratteristiche dell'enzima, ad una evidenziazione cromatica intensa del bersaglio ricercato.

La rilevazione del bersaglio, o meglio le procedure di preparazione del marcatore, prevedono la miscelazione, al momento dell'uso, di una soluzione concentrata di avidina, o simile, con una soluzione concentrata di marcatore biotinilato, e, successivamente, la diluizione della miscela risultante. In alternativa, una soluzione concentrata di complesso sostanza avidinica-marcatore biotinilato gi? preformato viene diluita al momento dell'uso.

Entrambe le metodiche sopra descritte presentano diversi inconvenienti. Per quanto riguarda le soluzioni diluite, esiste il problema dell'inevitabile imprecisione della diluizione che pu? inficiare la riproducibilit? dei risultati, ed inoltre la loro stabilit? ? limitata nel tempo. Quest'ultimo svantaggio -viene solo parzialmente risolto dall'uso di soluzioni concentrate che comunque, una volta aperti i contenitori in cui vengono vendute, possono andare incontro ad evaporazione con conseguenti variazioni della concentrazione dei vari reagenti, senza contare che dette soluzioni, pur generalmente protette da additivi all'origine, possono comunque venir contaminate da batteri o muffe.

Detti inconvenienti sono fonte di inevitabili sprechi e di costi elevati,che riguardano soprattutto prodotti di partenza quali i marcatori come la perossidasi, la fosfatasi alcalina, e i derivati dell'avidina e la streptavidina che devono venire impiegati ad elevato grado di purezza.

Il brevetto U.S. n.4.684.609 illustra un complesso potenziato in forma di soluzione che permette la localizzazione di sonde su sezioni istologiche. Il reattivo ? costituito da soluzioni di avidina e da macromolecole biotini1ate da miscelare prima dell'uso, in rapporti prestabiliti, per ottenere un complesso macromolecolare sufficientemente grande da convogliare sul bersaglio diverse molecole segnale,ma non tanto da impedirne la penetrazione nelle sezioni del tessuto in esame. Sono ovvii, da quanto sopra detto, gli inconvenienti di una tale formulazione del complesso, primo fra tutti la stabilit? e la difficolt? di avere un dosaggio dei reattivi preciso e costante nel tempo.

Il sistema oggetto della presente invenzione va a superare tutti i problemi sopra esposti riguardanti la stabilit? e il dosaggio del complesso sostanza avidinica-marcatore biotinilato, e di conseguenza porta ad una notevole diminuizione dei costi e dei tempi di utilizzo, nonch? ad un facilitazione dello stesso.

11 termine "sostanza avidinica" ? qui inteso significare la proteina specifica avidina nonch? le sue forme chimicamente modificate, come pure la streptavidina.Quest1ultima, estratta dal brodo di fermentazione dello Streptomyces avidinii, presenta alcune caratteristiche strutturali diverse da quelle dell'avidina, ma il suo comportamento per quanto riguarda il legame con la biotina ? perfettamente sovrapponibile a quello di tale proteina.

Il termine "marcatore biotinilato" va qui ad intendere un qualsiasi enzima normalmente impiegato come rilevatore in analisi biologiche, quale la perossidasi, la fosfatasi alcalina, la -galattosidasi, la glucosio-ossidasi, ecc., come pure altre sostanze non-proteiche che danno luogo a segnali, ad esempio di tipo fluorescente, come la fluoresceina e la rodamina; tali marcatori sono covalentemente legati alla biotina in un rapporto molare biotina:enzima maggiore di 1.

Il sistema oggetto della presente invenzione ? economicamente vantaggioso e pratico e rappresenta un notevole miglioramento rispetto ai metodi sinora conosciuti. Tale sistema consiste in una formulazione multidose costituita da un supporto idrosolubile o idrodispersibile, inerte dal punto di vista analitico, opportunamente associato ad una quantit? calibrata di complesso preformato di tipo sostanza avidinicamarcatore biotinilato, che si presenta in forma di compresse facilmente solubili in acqua o nel mezzo acquoso impiegato per l'analisi, tale da consentire l'ottenimento di una soluzione gi? diluita alla concentrazione d'uso, concentrazione che,data la natura del supporto e del tipo di formulazione, rimane inalterata fino ad almeno un anno dalla preparazione del prodotto.

L'eccipiente di preferenza usato nella presente invenzione ? un disaccaride, ad esempio lattosio, sebbene possano essere usati mono- e polisaccaridi, cos? come sostanze di diversa natura quali polialcoli, amidi, ecc. purch? idrosolubili o comunque facilmente idrodispersibi1i, inerti e compatibili con le macromolecole costituenti il principio attivo. Come compatibilit? si intende il fattore determinante ai fini della conservazione dell'attivit? del complesso per un tempo non inferiore all'anno.

Il complesso attivo sostanza avidinica-marcatore biotinilato ? costituito da una miscela di aggregati aventi peso molecolare compreso tra 200.000 fino ad oltre 1.000.000 di daltons. Nel complesso attivo ogni molecola di enzima biotinilato lega due molecole di sostanza avidinica in modo da costituire una struttura "a grappolo" che andr? poi ad interagire, tramite i siti del1'avidina ancora liberi, con iil sistema sonda biotinilata-bersaglio. Il rapporto tra avidina ed enzima biotini1ato all'interno di una compressa della presente invenzione ? compreso tra valori di 1:10 e 2:1, preferibilmente di circa 1:1. Si deve sottolineare che il rapporto sostanza avidinica-marcatore b?otini1ato trova un suo limite massimo nel valore 2:1 perch? oltre tale valore viene a perdersi la specificit? del complesso nei confronti della sonda biotinilata, falsandosi cos? la risposta di rilevazione.

La quantit? di complesso sostanza avidinica-marcatore biotinilato da incorporare nell'eccipiente viene determinata in base alle risposte cromatiche ottenute tramite un dosaggio ABC in sistema ELISA, che verr? descritto pi? avanti. Tale quantit? ? di almeno 1 /^g/ 20 mg di compressa, preferibilmente di 1^g/2 mg di compressa. Nella formulazione finale, un lieve eccesso di complesso rispetto alla quantit? minima trovata ? accettabile senza alcun pregiudizio, ma non ? indispensabile.

Poich? uno degli aspetti principali della presente invenzione riguarda la notevole stabilit? del preparato nella formulazione descritta, ed essendo tale stabilit? significativamente dipendente dal grado di umidit? presente, si devono osservare scrupolosamente alcune norme operative nella fase precedente e durante il confezionamento. Prima della distribuzione nei tubetti, che saranno precedentemente riempiti per met? con gel di silice attivato, le compresse devono essere essiccate a fondo in essiccatore ad anidride fosforica sotto vuoto per almeno 24 ore. La distribuzione deve avvenire in ambiente deumidificato e i tubetti devono essere a tenuta ermetica. Inoltre la luce diretta deve, per quanto possibile, essere evitata.

Qui di seguito verrano forniti esempi per chiarire meglio gli aspetti dell'invenzione, esempi che comunque non dovranno in alcun caso essere intesi come limitativi dell'invenzione stessa.

ESEMPIO 1

Preparazione deH ' avidina modificata

1 g (0,015 mmoli) di avidina nativa ad elevato grado di purezza viene sciolto in 100 mi di tampone tris(idrossimetil)aminometano (TRIS) 0,05 M a pH 8,0. A questa soluzione, mantenuta sotto agitazione, vengono aggiunti 0,18 mi (1,9 mmoli) di anidride acetica. Il pH viene corretto ad un valore costante di 8,0 con ad una soluzione di sodio idrato al 20%,e la soluzione viene mantenuta sotto agitazione per altri 20 minuti, quindi si dializza contro 4 cambi di acqua bidistillata da 21 ciascuno, alla temperatura di 4?C.

La sol?zione cos? ottenuta, in cui sono presenti circa 0,9 g di aceti1-avidina, viene liofilizzata a bassa temperatura e conservata come tale in ambiente rigorosamente anidro.

In maniera simile si preparano altre avidine modificate, quali la succini1-avidina e la ftali1-avidina impiegando rispettivamente anidride succinica e ftalica al posto dell'anidride acetica, in opportuni rapporti.

ESEMPIO 2

Preparazione di un enzima biotinilato

100 mg (circa 25.000 U) di perossidasi di radice di rafano vengono sciolti in 8 mi di una soluzione 0,1 M di bicarbonato di sodio a pH 8; si aggiunge poi una soluzione di 80 mg di?-caproilamido-biotina-N-idrossisuccinimide in 2 mi di dimeti1formamide. La miscela di reazione viene posta sotto agitazione per 1 ora a temperatura ambiente e viene poi dializzata per 60 ore contro 4-5 cambi da 800 mi ciascuno di tampone PBS (tampone fosfato salino composizione per 11: Na2HP04 = 0,916 g; KC1 = 0,2 g; NaCl - 8 g; KH2P04 = 0,2 g).

Si ottengono 100 mg di perossidasi-AH-biotinilata in circa 16 mi di soluzione tampone PBS 0,15 M a pH 7,5. Tale soluzione, previa analisi per la verifica dell'attivit? enzimatica,del contenuto in biotina e proteine, e successiva eventuale diluizione, viene utilizzata tal quale per la preparazione?dei complessi con avidina liofilizzata.

ESEMPIO 3

Preparazioni di complessi avidina-enzima biotinilato

a) La soluzione A consta di 60 mg di aceti1-avidina ad attivit? specifica di 12,1 U/mg, sciolti in 10 mi di acqua bidistillata contenente 10 mg di fenolo e 150 mg di ^BSA (siero-albumina bovina).

La soluzione B ? composta da perossidasi-AH-biotiniTata alla concentrazione originale equivalente a 5 mg/ml (circa 1200 U/ml) di perossidasi in tampone PBS 0,15 M a pH 7,5, stabilizzata con lo 0,02% di benzetonio cloruro.

10 mi di soluzione B vengono addizionati lentamente alla soluzione A sotto moderata agitazione e mantenendo la temperatura a circa 4?C. Al termine dell'aggiunta e dopo qualche minuto addizionale di agitazione, la soluzione del complesso AB ottenuta viene filtrata sterilmente con un filtro da 0,2 m e quindi sottoposta ad energica agitazione e liofilizzata. Il liofilizzato deve venire conservato fuori dal contatto con l'aria.

b) La soluzione A viene preparata sciogliendo accuratamente 23,9 mg di streptavidina ad attivit? di 15,2 U/mg, in 5 mi di PBS 0,15 M a pH 7,5.

Come soluzione B si utilizza una soluzione di perossidasi-AH-biotinilata in PBS 0,15 M a pH 7,5, stabilizzata con lo 0,02% di benzetonio cloruro, alla concentrazione originale di perossidasi equivalente a 5 mg/ml (circa 1200 U/ml).

La soluzione-complesso AB viene preparata come descritto nel punto a) utilizzando per? 5 mi di soluzione B.

c) La soluzione A viene preparata sciogliendo in 10 mi di acqua bidistillata il 2% p/v di BSA, l'l% p/v di NaC?, lo 0,925% di succini1-avidina (attivit? = 7,85 U/mg). Il pH viene portato a 7,5 per aggiunta di sodio fosfato bibasico.

La soluzione B viene preparata come descritto nel punto a), e, sempre seguendo il procedimento spiegato in tale punto, si prepara la soluzione-complesso AB utilizzando 10 mi di soluzione A e IO mi di soluzione B.

d) La soluzione A consta di 95,5 mg di ftali1-avidina sciolti in 10 mi di tampone PBS 0,15 M a pH 7,5 contenente lo 0,1% di benzetonio cloruro, ed accuratamente agitati.

Per la preparazione della soluzione B si sciolgono 155 mg di perossidasi-AH-biotinilata, precedentemente liofilizzata e tamponata, corrispondenti a 50 mg di perossidasi, in 10 mi di PBS 0,15 M a pH 7,5.

La soluzione B viene aggiunta molto rapidamente alla soluzione A, e la miscela sottoposta ad agitazione per non pi? di 15 secondi. Si procede quindi alla liofilizzazione come nel punto a).

e) 30 mg di streptavidina ad attivit? di 15,2 U/mg vengono disciolti il 10 mi di acqua bidistillata contenenti 10 mg di fenolo e 150 mg di BSA (soluzione A).

La soluzione B consta di 30 mg di fosfatasi alcalina biotinilata sciolti in 10 mi di una soluzione tampone contenente 0,4 mg/ml di sodio azide, 0,1 mM di zinco cloruro, 3M di cloruro di sodio, 30mM di trietanolamina, 1 mM di magnesio cloruro.

Per ottenere la soluzione-complesso AB si utilizzano 10 mi di soluzione B e 10 mi di soluzione A, miscelati ad una temperatura di 4?C sotto moderata agitazione. La soluzione-complesso AB viene liofilizzata secondo le tecniche tradizionali.

ESEMPIO 4

Determinazione della quantit? di principio attivo da incorporarsi nell'eccipiente

Si pesa il complesso AB liofilizzato, ottenuto come nell'esempio 3,e se ne preleva una aliquota corrispondente a 0,5 mi della soluzione originale. Questa aliquota viene sciolta in 0,5 mi di acqua bidistillata sotto moderata agitazione. Tramite una micro-pipetta, si aggiungono volumi scalari di questa soluzione (20, 23, 26, 29, 32, 35, 38 e 41 /?) ad una serie di 8 flaconi da 10 mi contenenti ciascuno 150 mg dell'eccipiente che consta in 5 g di L-leucina base miscelati omogeneamente con 95 g lattosio anidro (la miscela eccipiente ? stata precedentemente essiccata sotto vuoto in essiccatore ad anidride fosforica), e si lascia a contatto per 10-15 minuti. Si aggiungono poi a ciascun flacone 6 mi di PBS 0,15 M contenente lo 0,1% di Tween 20, si agita brevemente, si lascia a riposo per altri 10-15 minuti e quindi si agita nuovamente per breve tempo.

Le soluzioni cos? ottenute vengono sottoposte al dosaggio ABC in sistema ELISA: in tal modo si stabilisce la quantit? minima da incorporare nell'eccipiente in base alle risposte cromatiche ottenute.

ESEMPIO 5

Dosaggio ABC in sistema ELISA

Per il saggio vengono utilizzate piastre da microtitolazione a 96 pozzetti,

a) Preparazione della fase solida

Ciascun pozzetto della micropiastra viene stratificato con 100 J? di una soluzione di BSA biotini1ata, diluita alla concentrazione di ly*g/ml in tampone carbonato-bicarbonato 50 mM; pH 9,5. Da questa stratificazione vengono esclusi i pozzetti che saranno utilizzati come "bianco" per l'azzeramento spettrofotometrico.La piastra viene incubata 0/N a temperatura ambiente, quindi lavata 3 volte con il tampone di lavaggio (PBS Tween 20 allo 0,05%).

In ciascun pozzetto della micropiastra vengono poi distribuiti 300^1 di PBS contenente Tween 20 allo 0,5% e siero di vitello al 10%. La piastra viene incubata per 4 ore a temperatura ambiente, poi lavata 3 volte con il tampone di lavaggio di cui sopra e asciugata,

b) Esecuzione del saggio

I campioni in esame e gli standard di riferimento vengono diluiti alla concentrazione d'uso in PBS Tween 20 allo 0,5%.100 /A di ciascuna soluzione, in quadruplicato, vengono distribuiti nei pozzetti della micropiastra, poi incubata per 30 minuti a temperatura ambiente ed accuratamente lavata 5 volte con il tampone di lavaggio del punto a).

In ciascun pozzetto vengono distribuiti 100 /? di soluzione di substrato croniogeno per la perossidasi, cosi composto:

- 1 mi di 2,2'-azino-bis{3-etilbenzotiazolin-6-solfonato) (ABTS) 40 mM in acqua bidistillata;

- 20 mi di tampone acetato di sodio 0,1 M e fosfato di sodio monobasico 0,05 M;

- 0,2 mi di H^O^, soluzione al 30% da diluire prima dell'uso a 0,25 M in acqua bidistillata.

Lo spettrofotometro viene azzerato a 405 nm contro un "bianco" di soluzione substrato. I valori di assorbimento dei singoli pozzetti vengono letti dopo circa 5-10 minuti. I campioni vengono valutati in base alla loro risposta cromatica in confronto agli standard di riferimento.

ESEMPIO 6

Preparazione delle compresse

a) Il complesso AB liofilizzato, come ottenuto nell'esempio 3, punto a), viene miscelato in ambiente anidro con l'eccipiente formato da 5 g di L-leucina base e 95 g di lattosio anidro, in un rapporto in peso di 1:1100 di eccipiente, equivalente a 45y^g per una compressa da 50 mg. Le compresse vengono preparate secondo tecniche ed apparecchiature note nell'arte.

b) Si miscelano 50 g di L-leucina con 950 g di TABFINE 097 (HS)R (destrosio al 96-98% della Edward Mendell). La preparazione delle compresse segue lo stesso procedimento descritto nel punto a), incorporando il principio attivo AB come ottenuto nell'esempio 3, punto b), in quantit? di 45 y*g per una compressa di 50 mg.

c) Seguendo lo stesso procedimento descritto nel punto a) ed utilizzando l'eccipiente di cui al punto b), si ? utilizzato il complesso AB come preparato nell'esmpio 3, punto c) in quantit? di 57ytg su 50 mg di eccipiente.

d) Seguendo il procedimento ed utilizzando lo stesso eccipiente del punto a), si ? incorporato il principio attivo preparato secondo l'esempio 3, punto d) in quantit? di 50 yte-q su 50 mg di eccipiente.

e) Si miscelano 5 g di L-leucina base con 95 g di lattosio anidro (TablettoseR) (Megg?e Milkindustrie). Le compresse vengono preparate seguendo lo stesso procedimento descritto nel punto a), incorporando nell'eccipiente il principio attivo come ottenuto nell'esempio 3, punto e), in quantit? di 48y?g su 50 mg di eccipiente,

f) 10 /j,1 di soluzione-complesso AB come preparata nell'esempio 3, punto a), vengono deposti,tramite un micro--dispensatore sulla superficie di una compressa da 50 mg costituita da lattosio anidro contenete il 5% di L-leucina. Le compresse cos? trattate vengono poste in essiccatore ad anidride fosforica ed ivi essiccate per 24 ore sotto vuoto.

ESEMPIO 7

320 mg di aceti1-avidina (12 U/mg) vengono omogeneizzati con 10 g di lattosio anidro. Separatamente, 780 mg di perossidasi-AH-biotinilata (pari a 270 mg di perossidasi) vengono omogeneizzati con 10 g di lattosio anidro.

Le due polveri, fatte previamente passare attraverso un setaccio fine, sono miscelate in parti uguali in opportuno miscelatore.20 g di detta miscela vengono quindi intimamente incorporati nell'eccipiente costituito da 455 g di lattosio anidro e 25 g di L-leucina base. Dopo un'ulteriore setacciatura, il prodotto viene posto in essiccatore ad anidride fosforica, sotto vuoto per 24 ore a temperatura ambiente.

Si procede poi alla comprimitura secondo le consuete modalit?,per ottenere compresse da 50 mg.

ESEMPIO .8

Modalit? d*Liti1izzo delle compresse

Una micro-compressa da 50 mg viene posta in un piccolo recipiente contenente 2 mi di tampone PBS 0,15 M a pH 7,5, addizionato con lo 0,1% di Tween 20. Si agita brevemente e quindi si lascia riposare per 10-15 minuti.Agitare nuovamente. Si procede all'utilizzo diretto della soluzione ottenuta come sistema rilevatore per sonde biotinilate.

Claims (8)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un sistema utile nel campo immuno-biologico che consiste in una formulazione solida, stabile nel tempo, comprendente un complesso formato da una sostanza scelta dal gruppo composto da avidina, streptavidina, e i loro derivati semi-sintetici, e da un marcatore biotinilato, supportato da un veicolo solido idrosolubile o idrodispersibile inerte dal punto di vista analitico.
2. 2. Un sistema secondo la rivendicazione 1, in cui il complesso ? presente in una quantit? di almeno 1 yug per 20 mg di veicolo solido.
3. 3. Un sistema secondo la rivendicazione 2, in cui il complesso ? presente in una quantit? di 1 /cg per 2 mg di veicolo solido.
4. 4. Un sistema secondo le rivendicazioni precedenti, in cui i l rapporto sostanza avidinica:marcatore biotini l ato ? compreso tra 1:10 e 2:1 nella formulazione solida.
5. 5. Un sistema secondo la rivendicazione 4, in cui il rapporto sostanza avidinica:marcatore biotinilato ? di circa 1:1 nella formulazione solida.
6. 6. Unsisternasecondo le rivendicazioni precedenti, in cui il marcatore ? un agente in grado di indurre la formazione di colore in un substrato croniogeno.
7. 7. Un sistema secondo le rivendicazioni precedenti in cui il marcatore ? un agente atto a fornire radiazioni rilevabili visivamente o strumentalmente.
8. 8. Un metodo per analisi immuno-biologiche consistente in formulazioni solide come rivendicate nella rivendicazione 1.