JPH03209165A - 生物学的プローブを使用する免疫酵素的アツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物学的ブローブの発見の分野に関する．より
詳細に述べるならば、生物学的ブローフを使用する免疫
酵素的アツセイの一つに関する。

本発明に関する分野、すなわち或る巨大分子（“標的゜
゜と呼ぶことにする）の発見に関するこの分野は、選択
的に標的に結合し、ブローブー槽的、コンプレクス（そ
れは表現されて単一義的に検出される）を与えることが
できる巨大分子（゜“ブローブ゜と呼ぶことにする）の
使用に関係する。

その表現のためには、ビオチン及びアビジン又はそれら
の誘導体、及びストレプトアビジン、アビジンの間の最
大の親和性が利用される．こうしてブローブはビオチニ
ル化され、アビジン物質一ビオチニル化マーカーのよう
な、コンプレクスがラベルとして用いられる．そのラベ
ルは標的−ビオチニル化ブローブーコンプレクスと結合
することによって、酵素の特徴に応じて、検出標的の強
い発色を生成する。

標的の検出、又はむしろラベルの製造操作は使用時に、
アビジンなどの濃溶液とビオチニル化マーカーの濃溶液
との混合物の生成と、その後の生成物の希釈である．さ
ちなければ、すでにつくられているアビシン物質一ビオ
チニル化マーカフンプレクスのａ溶液を使用時に希釈す
る。

上記の方法は両方共、種々の欠点をもつ。

希溶液に関しては、不正確な希釈が避けられないという
問題がある．これは結果の再現性を低下させるから知れ
ない．その上、希溶液は経時的安定性が限られる。後者
の欠点は、濃溶液を用いることによって部分的には解決
されるが、ａ　’ｔ８　Ｍ　ｂ容器の蓋を開けておけば
蒸発する可能性があり、したがって試薬濃度は変化する
。その他に上記溶液は、普通は添加剤によって保護され
ているとはいえ、細菌又はカビによって汚染され得るこ
とも考慮しなければならない． 上記の欠点は、主として、高純度で使用しなければなら
ない出発原料、たとえば過酸化酵素、アルカリホスファ
ターゼ及びストレプトアビジン、アビジン及びアビジン
誘導体のようなマーカーに関して、不可避の廃棄及び高
コストを生じる．米国特許第４，６８４，６０９号は組
織学的サンプルにおけるブローブを標識化できる、溶液
の形の強力、コンプレクスを開示している。その試薬は
アビジン、及びビオチニル化巨大分子溶液から成り、こ
れら溶液は使用前にあらかじめ定められた比で混合され
、種々のシグナル分子を標的の方に近づけるのに十分に
大きいが被験組織サンプルへの侵入を妨げる程には大き
くない巨大分子、コンプレクスを得る．上記のことから
、そのフンプレクスのこのような組成の欠点は明らかで
ある　先づ第一に安定性、そして反応体の用量を、経時
的に正確にかつ安定に保つことかむづかしいことである
． 本発明の系は、アビジン物質一ビオチニル化マーカー−
、コンプレクスの安定性及び用量に関する上記の問題を
すべて克服し、したがって使用のコスト及び時間の著し
い減少を６たらし、使用を容易にする。

ここで用いる゛゜アビジン物質゜゜とは、特異的アビジ
ン蛋白質並びにその化学的に変形した形をーストレプト
アビジン、アビジンも一意味する。後者はｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ　ａｖｉｄｉｎｉｉの発酵ブロス（肉汁）
から抽出され、アビジンとは異なる構造的特徴を示すが
、ビオチンとの結合に関するその挙動はその種の蛋白質
のそれと完全に重ね合わせられる。

ここで用いる゛ビオチニル化マーカー゜゛という語は、
バイオアツセイにおいてディテクターとして一般に用い
られる酵素、たとえば過酸化酵素、アルカリホスファタ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼなど、そ
してたとえば蛍光のようなシグナルを６たらすその他の
非蛋白質物質、たとえばフルオレツセイン及びロータミ
ンを意味する。このようなマーカーはビ才チン　酵素〉
ｌのモル比でビ才チンに共有結合する。

本発明の系は経済的に有利で使い易く、これまでに公知
の方法と比較して著しい改良を示す．このような系は、
アビジン物質−ビオチニル化マーカーのようなあらかじ
め形成されたコンプレクスの較正Ｎ　ｆｃａｌｉｂｒａ
ｔｅｄ　ａｍｏｕｎｔ）に適切に関係づけられた、分析
的に不活性な水溶性又は水分数性支持物質によってつく
られる多数一用量（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ）組成物から
成り、このような組成物は分析１こために用いられる水
又は水性溶媒に容易に溶ける錠剤の形になっており、頂
度使用濃度に希釈された溶液を得ることができる．その
錠剤は、支持物質の種類及び組成からみて、製造後最低
１年までは変化しない． 本発明に好ましく用いられる賦形剤はラクトースのよう
な二糖類である。但し単糖及び多糖ら用いられる．ちし
も水溶性であるか、とにかく容易に水に分散し、不活性
で、活性成分を形成する巨大分子と相容れるならば、た
とえばポリアルコル、アミドなどの、違う種類の物質も
用いられる。゛相容れること゜゛は、１年より長い期間
、、コンプレクスの活性を維持するための決定的要因で
ある． アビジン物質−ビオチニル化マーカー活性、コンプレク
スは、２００．０００〜１．０００，０００ダルトン間
の分子量をもつ凝集物の混合物によってつくられる。活
性、コンプレクスにおいて、ビオチニル化酵素の各分子
は，アビジン物質の最低２分子に結合し，“クラスター
゜゛構造を形成する．それはまだ開いている（ｆｒｅｅ
ｌアビジン部位によって逐次的にビオチニル化ブローブ
ー標的系と相互作用する．本発明の錠剤中のアビジン：
ビオチニル化酵素のモル比は１：ｌＯ〜２：１の間であ
り、約ｌ＝１がより好ましい．アビジン物質一ビオチニ
ル化マーカーの比は２・ｌが限度であることを強調しな
ければならない、なぜならばこのような値を超えると、
、コンプレクスの、ビオチニル化ブローブに対する特異
性が最低になり、検出結果が変る。

鍬形剤に挿入すべきアビジン物質一ビオチニル化マーカ
ー・フンプレクスの量は、後に記すエライサ系（ＥＬＩ
ＳＡ）への投与によって得られる発色反応に基づいて計
算される．このような量は最低１　ｕ　ｇ／２０ｍｇ錠
剤、より好ましくはｌｕｇ／２ｍｇ錠剤である．最終的
組成物では、最低の検出量に比べてわづか過剰の、コン
プレクスが、偏見なく容認される．しかしそれは重要で
はない。

本発明の主な点の一つは記載の組成物における製剤の著
しい安定性に関係し、このような安定性は今の温度に大
きく依存するから、包装段階及びその前の段階ではいく
つかの操作上の規則を正確に守らなければならない。あ
らかじめ活性シリカゲルを半分詰めたスクイブ（ｓｑｕ
ｉｂｓ）に入れる前に，錠剤を無水燐酸真空乾燥器中で
最低２４時間、よく乾燥しなければならない。分配は除
湿した環境で行われなければならず、スクイブ（ｓｑｕ
ｉｂ）は密封しなければならない。その上、直射光はで
きるだけ避けなければならない。

本発明の実施態様をよりよく説明するために、以下に実
施例を示す。これらの実施例は発明を制限するものでは
ない． ４　好ましい実施例 実」Ｌ例」２ ′゛肝アビジンの製法 高純度の天然アビジン１　ｇ　（０．０１５ｍｍｏｌｅ
ｌを０．０５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン緩衝ｉａ　（　Ｔ　Ｒ　Ｉ　Ｓ　）　．　ＰＨ８．０
．１００ｍＩ２に溶かす。この撹拌溶液に無水酢酸０．
１８ｍｌ２（１．９ｍｍｏｌｅｌを加える。

２０％ソジウムハイドレート（ｓｏｄｉｕｍ　ｈｙｄｒ
ａｔｅ）溶液によってＰＨを８．０に調節する．溶液を
さらに２０分間撹拌し、それからそれを４×２ε２回蒸
溜水に対して透析する（温度４℃）。

こうして得られた、アセチルアビジンを含む溶液を凍結
乾燥し、厳密に無水の環境下でそのまま保存した。

同様にして，無水スクシン酸及び無水フタール酸をそれ
ぞれ、無水酢酸の代りに、適当な比で用いることによっ
て、スクシニルアビジン及びフタリルアビジンのような
その他の変形アビジンがつくられる。

セイヨウワサビ過酸化酵素ｘｏｏｍｇ（約２５，　００
０旧を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液　［ＰＨ８．０
）　８　ｍβに溶解する．ＤＭＦ２ｍｆｆにカブ口イル
アミドービオチンーＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル１１０ｍｇを溶かした溶液を加える．反応混合物を
室温で１時間撹拌し，それから６０時間、４−５×８０
０ｍβのＰＢＳ緩衝液（燐ｒＭ緩衝食塩組成物、ｌＣ中
：　Ｎａ２ＨＰＯ４＝（１．９１６ｇ；　ＫＣ１＝０．
２ｇ：　ＮａＣｌｓ　ｇ　；　ＫＨ２ＰＯ４＝　ｏ２ｇ
）に対しで透析する。

Ａ｝｛−ビオチニル化過酸化酵素１［１［ＩＢが、０．
　１５Ｍ　　ＰＢＳ緩衝溶液、ＰＨ７．　５．約１６ｍ
ｊｌ！中に得られる．ビオチンの酵素活性と蛋白質含量
を確認するアッセイを行い、それから任意に希釈した後
、上記溶液をそのまま用いて、凍結乾燥アビジンとの、
コンプレクスをつくる． 髪立 ａ冫溶液Ａは、比活性１２．１μ／ｍｇをもつアセチル
・アビジン６０ｍｇを、フェノール］ＯｍｇとＢＳＡウ
シ血清アルブミン）　１５０ｍｇとを含む二回蒸溜水１
０ｍ２に溶かしたちのである． ｉｇＦｆｉＢは、Ｑ．１５Ｍ　　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（Ｐ｝！
７．５）に、最初の濃度５　ｍｇ／ｍｌ２　（約１，２
０００／＋＋＋ｊ？　）の過酸化酵素を含むＡＨビオチ
ニル化過酸化酵素であり、酵素は０．　０２％塩化ペン
ゼトニウムで安定させてある。溶７ａ　Ａに、温度を約
４℃に保ちながら、おだやがな撹拌下で溶液Ｂ　　ＩＤ
ｍβをゆっくり加える。添加が終了し、それからさらに
少し撹拌した後、生成したＡＢ、コンプレクス溶液を無
菌条件下で０．２ａｍフィルターを通して濾過し、それ
がら強く撹拌し、凍結乾燥する６凍結乾燥したものは真
空下で保存しなければならない． ｂ）活性１５．２Ｕ／ｍｇをもったストレプトアビジン
２３．　９ｍｇを０．１５Ｍ　　Ｐ　Ｈ　Ｓ　　ｆＰ｝
１７．５）　５　ｍ　ｇに正確に溶解することによって
溶液Ａを調製する。

ｆ容液Ｂとして０．１５Ｍ　Ｂ　Ｓ　．　ＰＨ７．５中
のＡＨ　　ビオチニル化過酸化酵素溶液を用いる。これ
は過酸化酵素の最初の濃度が５　ｍｇ／＋＋ｌ　（約１
．２００Ｕ／ｍ９　）で、０．０２％塩化ペンゼトニウ
ムで安定化してある。ＡＢ、コンプレクス溶液をａ）に
記載のようにつくる、但し溶液Ｂ５ｍｆ２を用いる．Ｃ
）溶液Ａは、２％Ｐ／ＶのＢＳＡ．ｌｌ％のＮａＣｌ．
　０．９２５％のスクシニルアビジン（活性＝７．　８
５０／ｎａｇ）を二回蒸留水１０ｍ　１２に溶かすこと
によって調整する．二塩基性燐酸ナトリウムを添加する
ことによってＰＨを７５に調節する。

ｌ＠液Ｂをａ）に記載のようにつくり、この操作後、溶
液Ａ　　１０ｍ！２、溶液Ｂ　　１０ｍｊ２用いてＡＢ
フンプレクスをつくる。

ｄ）溶液Ａは、０１％塩化ペンゼトニウムを含む０．１
５Ｍ　　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（Ｐ｝１７．５１１０ｍｊ２にフ
タリルーアビジン９５．　５ｍｇ＋：溶かすことによっ
てつくる．そして溶液Ｂ調製のために注意深く撹拌して
、過酸化酵素５０ｍｇに相当するあらかじめ凍結乾燥し
たＡＨビオチニル化過酸化酵素１５５ｍｇを０．１５Ｍ
　　Ｐ　Ｂ　Ｓ１０　ｍ２中に溶かす（　ＰＨ７．　５
＋　．溶液Ｂを非常に速かに溶液Ａに加え、その混合物
を１５秒間以内、撹拌する。それからａ）のように凍結
乾燥する． ｅ　）　１５．２Ｕ／ｍｇの活性をちつストレプトアビ
ジン、アビジン３０ｍｇを、フェノール１０　ｍ（ｌと
Ｂ　Ｓ　Ａ　　１５０ｍｇを含む二回蒸留水１０ｍｆｆ
に溶かす（溶液Ａ）。

漬液Ｂは、０．４ｍｇ／　ｍｆ２アジ化ナトリウム、０
．　１＋ｎＭ塩化亜鉛、３Ｍ塩化ナトリウム、３０＋ｎ
Ｍトリエタノールアミン、１ｍＭ塩化マグネシウムを含
む緩衝冫容冫夜１０ｍｆｆにビ才チニノレ化アノレカリ
ホスファターゼ３０ｍｇを溶解してつくる． ＡＢ、コンプレクス溶液をつくるためには、溶液８　　
１０ｍｇ．溶液Ａ　　１０ｍｆ２とをおだやかに撹拌し
ながら温度４℃で混合する。ＡＢ、コンプレクス溶液を
一般的方ｌ去によって凍結乾燥する。

実施例３で得られた凍結乾燥ＡＢ、コンプレクスを秤量
し、原溶液０．５ｍＩ２に相当する部分をとる。この部
分を、おだやかな撹拌下で二回蒸留水０．　５ｍｎに溶
解する．ミクロビベットでこの溶液の段階的量ｆ２０．
２３．２６．２９．３２．３５．３８及び４１ｇ＋を　
１０ｍ　（ｌバイアル８本に加える．この各バイアルに
は乾燥ラクトース９５ｇと均質にブレンドしたＬロイシ
ン塩基５ｇから成る賦形剤１５０ｍｇが入れてある（こ
の賦形剤混合物はあらかじめ無水燐酸乾燥器中で真空下
で乾燥される）、そしてこの溶液をこの混合物と１０−
１５分間接触させる．その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含む０．１５Ｍ　　ＰＨ３６ｎ＋１２を各バイアルに
加え、短時間振とうし、その後１０−１５分間放置し、
それから再び短時間振とうする．こうして得られた溶液
がＥＬ　Ｉ　ＳＡ系に与えられる．この方法で得られる
発色反応に基づいて、賦形剤に挿入される最小量が定め
られる。

この試験には、９６ウエル（凹み）微量滴定プレートを
用いる． ａ）固体層の生成 各ウエルに、５０ｍＭ炭酸塩一重炭酸緩衝液ＰＨ９．５
で１μＲ／ｍｆ２濃度にまで希釈したビオチニル化ＢＳ
Ａ溶液１００ｕ　９．を塗付する．塗付しないウェルを
分光光度測定をリセットするための゛ブランク゛として
用いる．プレートを室温で○／Ｎインキユベートし、そ
れから洗浄緩衝液（ＰＢＳ十０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
）で３回洗った。

ミクロプレートの各ウェルに、ｏ５％Ｔｗｅｅｎ２０及
びｌＯ％ウシ血清を含むＰＢＳ３ｏｏＬＬ！２をさらに
塗付する．プレートを室温でさらに４時間インキユベー
トし、それから上記洗浄緩衝液で３回洗った． ｂ）試験の実施 サンプル及びＩＩキットをＰＢＳ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ
２０で使用濃度にまで希釈する．各溶液１００μＣづつ
を四通り、ミクロプレートのウェルに置き、それから３
０分間室温でインキユベートし、ａ）に記載のように洗
浄緩衝液で５回正確に洗った． 各ウエルには、下記のものを含む過酸化酵素用クロモゲ
ン基質溶液１００ｕ９を入れる二回蒸留水中４０ｍＭ　
２．２’−アジノービス（３一エチルベンズチアゾリン
６−スルフォン酸）（ＡＢＴＳ）１　ｍ９　； −０．１Ｍ酢酸ナトリウム及び００５Ｍ＝塩基性燐酸ナ
トリウム緩衝液　２０ｍβ： 二回蒸留水中０．２５ＭＨ２０２０．２ｎｌ　．分光光
度計を、４０５ｎｍで、゛ブランク゛゜基質溶液に対し
てリセットする．一つのウエルの吸光値を約５−１０分
後に読む．サンプルをその発色反応に基づいて、ＰＡＩ
ｌｌＩ！と比較して評価する．及五旦玉 実施例５の方法により上記実施例の投与を行った、但し
下記のものから成る基質クロモゲン溶液１００μ２を用
いた・ 二回蒸留水中４０ｍＭ　２．２゜−アジノービス（３ー
エチルベンズチアゾリンー６−スルファン酸）（ＡＢＴ
Ｓ）０．５ｍｆ２． −０．１Ｍ酢酸ナトリウム及び０．　０５Ｍ−塩基性燐
酸ナトリウム緩衝液　Ｉｏｍ氾： 二回蒸留水中０．２５Ｍ１１２０２０．ｌｎｌ。

丈』り生ユ 主三」足！臼Ｌ魔 ａ）実施例３−ａ）で得られた凍結乾燥ＡＥ、コンプレ
クスを，無水環境中で、Ｌ一ロイシン塩基５ｇと乾燥ラ
クトース９５ｇとから成る賦形剤と、１：１１００（賦
形剤）の重量比で混合する．これは４５μｇ７５０ｍｇ
錠剤に相当する．ミニ錠は当業者に公知の技術により、
又当業者に公知の装置を用いてつくられる。

ｂ）Ｌ一ロイシン５０ｇをＴＡＢ−　ＦＩＮＥ０９７　
（ＨＳ）　Ｒ　（エドワードマンデル（　Ｅｄｗａｒｄ
Ｍａｎｄｅｌｌ）製９６−９８％デキストロース］　　
９５０ｇと混合する．錠剤の作成はａ）に記載の方法で
行われ、実施例３−ｂ）で得られたＡＢ活性成分を、量
４５μｇ７５０ｍｇ錠挿入する． Ｃ）ａ）に記載の方法にしたがい、ｂ）の賦形剤を用い
て、実施例３−ｃ）でつくられたＡＢ、コンプレクスー
量５７μｇ７５０ｍｇ賦形剤一が用いられる。

ｄ）ａ）の方法にしたがい、ａ）の同じ賦形剤を用いて
、実施例３−ｄ）によりつくられた活性成分を量５０μ
ｇ７５０ｍｇ賦形剤だけ挿入する．ｅ）塩基Ｌ一ロイシ
ン５ｇを無水ラクトース（タブレットースＲ）［メダル
ミルクインダストノー（　Ｍｅｇｇｌｅ　Ｍｉｌｋｉｎ
ｄｕｓｔｒｉｅｌ　］　９５　ｇと混ぜる。

錠剤をａ）に記載の方法でつくり、実施例３一ｅ）で得
られた活性成分を、４８μｇ／５０ｍｇｌ武形剤量だけ
賦形剤に挿入する． ｆ）実施例３−ａ）で調整されたＡＢ、コンプレクス溶
液１０μＣをミクロデイスベンサーにより、５％Ｌ一ロ
イシンを含む無水ラクトースから成る５０ｍｇ錠の表面
に置く．このように処理した錠剤を無水燐酸乾燥器中に
置き、真空下で２４時間乾燥する。

叉』０硼溢 アセチルアビジン（　１２０／ｎ＋ｇｌ　３２０ｍｇを
無水ラクトース１（Ｉｇとホモジナイズする．別個に、
ＡＨ−ビオチニル化過酸化酵素７８０ｍｇ　（過酸化酵
素２７０ｍｇに相当する）を無水ラクトース１０ｇとホ
モジナイズする． あらかじめ細かい篩を通したこれら二つの粉末の等量部
分を、適当なミキサーで混合する．それからこのような
混合物２０ｇを、無水ラクトース４５５ｇとＬ一ロイシ
ン塩基２５ｇとから成る賦形剤によく混ぜ入れる．再び
篩過した後、生成物を無水燐酸乾燥器中で真空下、室温
で２４時間乾かす．その後一般的方法により圧縮を行い
、５０ｍｇ錠剤を得る． ５０ｍｇミニ錠を、０．１５Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ緩衝液　（
ＰＨ７．　５１　２ｍｆ２を含む小瓶（ｓｍａｌｌ　ｖ
ｉａｌｌ又は試験管に入れ、０１％Ｔｗｅｅｎ２０を加
える。混合物を短時間振とうし、それから１０−１５分
間放置する．再び振とうする．得られた溶液をビオチニ
ル化ブローブのための標識化系として直接用いる．

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アトレプトアビジン、アビジン及びそれらの半合成
   誘導体から成から群から選択される物質と、不活性水溶
   性又は水分散性固体担体に支持されたビオチニル化化マ
   ーカーとからつくられるコンプレクスを含んで成る、固
   体、経時的に安定な組成物から成るバイオアツセイ用組
   成物。 ２、コンプレクスが固体担体の最低１μｇ／２０ｍｇ量
   である請求項１記載の組成物。 ３、コンプレクスが固体担体の１μｇ／２ｍｇ量存在す
   る請求項２記載の組成物。 ４、固体組成物中のアビジン物質：ビオチニル化マーカ
   ーの比が１：１０と２：１との間にある先行請求項記載
   の組成物。 ５、固体組成物中のアビジン物質：ビオチニル化マーカ
   ーの比が約１：１である請求項４記載の組成物。 ６、マーカーがクロモゲン基質において色を形成し得る
   物質である先行請求項記載の組成物。 ７、マーカーが目で見えるシグナル又は機器的に検出可
   能の放射線を与え得る物質である先行請求項記載の組成
   物。 ８、ｉ）ビオチニル化マーカー溶液を、ストレプトアビ
   ジン、アビジン及びそれらの半合成誘導体から成る群か
   ら選択されるアビジン物質の溶液と１０：１乃至１：２
   の比で混合し、生成混合物を温度０°〜１０℃に維持し
   ながら撹拌し、コンプレクスを得、それを凍結乾燥し、
   最低一つの分析的に不活性の水液性又は水分散性固体担
   体と、１μｇ／２０ｍｇ固体担体乃至１μｇ／２ｍｇ固
   体担体の比で混合し、或いは ｉｉ）アビジン物質溶液及びビオチニル化マーカー溶液
   を別々に分析的に不活性の水溶性又は水分散性固体担体
   と混合し、二つの粉末をそれから混合し、上記固体担体
   の最低一つの付加的量を加え、こうして得られた粉末を
   保存し、無水条件下で圧縮することを特徴とする先行請
   求項記載の組成物の製法。