IT9048588A1 - Polipeptidi del virus dell'epatite non-a e non-b, post-trasfusionali procedimento di produzione e corredo per il saggio dei relativi acidi nucleici virali. - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di Brevetto di Invenzione

dal titolo Polipeptidi del virus dell epatite non-A e non-3, post-trasfusionali procedimento di produzione e corredo per il saggio dei relativi acidi nuc leici virali

La presente invenzione si riferisce all ìsolamento e la caratterizzazione dell'agente virale responsabile dell'epatite non-A e non-B post-trasfus10-nale (PT-NANBH) ed in particolare ai polipeptidi virali PT-NANBH, alle sequenze di DNA che codificano tal i pol ipeptidi viral i , a i ve ttor i d i espress ione ch e contengono tali sequenze di DNA, ed alle cellule ospi_ ti trasformate da tali vettori di espressione La presente invenzione inoltre di riferisce all impiego di una sequenza di DNA in un saggio di ibridazione con acido nucleicoperl a diagnosi di PT-NANBH La presente invenzione inoltre si riferisce all impiego di polipeptidi virali PT-NANBH o anticorpi poiìclonali o monocIonali contro tali polipeptidi in un saggio ìmmunologico per la diagnosi di PT-NANBH ovvero in un vaccino per la prevenzione di questa

L epatite non-A e non-B (NANBH) è per definizione una diagnosi di esclusione ed in generale questa è stata impiegata per descrivere casi di infezione da epatite virale in esseri umani che non sono dovuti ai virus dell epatite A ovvero della epatite B Nella maggioranza di tali casi, la causa della infezione non è stata identificata sebbene su basì cliniche ed epidemiologiche un certo numero di agenti siano stati ritenuti responsabili, come viene passato in rassegna da (Prog Liyer Dis . 1986. vol 8, 433-452) Nei soli Stati Uniti fino al 10 % delle trasfusi oni di sangue può dar luogo a NANBH cosa che rende tale malattia un problema significativo. Anche per PT-NANBH vi possono essere almeno parecchi agenti virali responsabili dell'infezione e negli anni sono

state fattemolte affermazioni riguardanti la possibilità di identificazione dell agente, ma nessuna di queste è stata sostanziata

La domanda di brevetto europeo No 88310922 5 si riferisce alla descrizione dell isolamento e della caratterizzazione dell'agente eziologico responsabile della PT-NANBH che è anche indicato nella descrizione come virus C dell epatite HCV) Veniva preparata una biblioteca di cDNA dall acido nucleico virale ottenuto da uno scimpanzè infettato con PT-NANBH e questo veniva sottoposto a discriminazione usando antisieri umani Un certo numero di cloni positivi era isolato e sottoposto a determinazione di sequenza I risultanti dati di sequenza degli acidi nucleici e degli amminoacidi che sono descritti nella domanda rappresentano al' incirca il 70 % del genoma virale di 10 kb e sono derivati interamente dal suo terminale3' corrispondente alla regione dicodificazione non strutturale.

Ipresenti inventorihanno ora isolato ecaratterizzato i polipeptidivirali PT-NANBH mediante la clonaziane e l espressione delle sequenze di DNAchecodificano per tali polipeptidi virali Sorprendentemente, 1 dati di sequenze di acido nucleico ed amminnoacidoentrambi mostrano considerevoli differenze rispetto ai dati corrispondenti riportati nella domanda di brevetto europeo No 883109225 Globalmente queste differenze ammontano a circa 20 % al livello di acido nucleico e circa 15 % al livello di amminoacido ma alcune regioni delle sequenze mostrano differenze anche maggiori II livello globale di differenza è molto maggiore di quello che ci si potrebbe attendere per due materiali isolati del medesimo virus anche tenendo coto dei fattori geografici e tale livello è ritenuta dovuto ad una di due possibili ragioni

In primo luogo i presenti inventori e quelli della domanda di brevetto europeo sopra menzionata usavano differenti fonti per l'acido nucleico impiegato nella clonazione di cDNA In particolare, la domanda di brevetto europeo descrive l'impiego di plasma di scimpanzè come fonte per il materiale di partenza di acido nucleico virale con il virus che era stato fatto passare attraverso uno scimpanzè in due occasioni II PT-NANBH è naturalmente una malattia umana e i.l passaggio del virus attraverso un ospite estraneo, anche se esso è un parente pr.os.simo per gli esseri umam dà probabilmente come risultato una mutazione estesad ell'acido nucleico virale..Pertanto, i dati di sequenza contenuti nell domanda brevetto europ.eo No 883109225 possono non„essere veramente rappresentativi dell'agente virale reale che è responsabile della PT-NANBH negli esseri umani In contrasto, 1 presenti inventori hanno utilizzato acido nucleico virale da una fonte di plasma umano come materiale di partenza per la clonazione di cDNA I dati della sequenza cosi ottenuti hanno più probabilità di corrispondere alle sequenze di amminoacido e di acido nucleico nativi della PT-NANBH

In secondo luogo, può essere che 1 agente virale esista come più di un sottotipo e i dati della sequenza descritti nella domanda di brevetto europeo e quelli resi chiari dai presenti inventori corrispondano a sottotipi distinti e separati del mesimo agente virale Come alternativa, può essere che il livello di differenza tra i due gruppi di dati di sequenze sia dovuto ad unacombinazione di questi due fattori

La presente invenzione fornisce un polipeptide viralel PJT-NANBH che comprende un antigene avente una sequenza di amminoacidi che è omologa per almeno il 90 % a sequenza d 'amm.inoacidi stabi1ita_in_SEQ lD NO 3,4,5,18,19,20,21 o.22 oppure è un frammento antigenico della stessa.

SEQ D NO 3.4,5,18,19,20,21 o 22 stabiliscono la sequenza di amminoacidi quale viene dedotta dalla sequenza di acidi nucleici Di preferenza, la sequenza di amminoacidi è di almeno 95 % o addirittura 98 % omologa con la sequenza di amminoacidi stabilita in SEQ ID NO 3,4,5,18,19,20,21 o 22 Facoltativamente 1 antigene può essere fuso così da dare un polipeptide eterologo

Due o più antigeni possono essere facoltativamente impiegati insieme in combinazione o fusi come polipeptide singolo L'impiego di due o più antigem in questo modo in un saggio diagnostico fornisce risultati affidabili nell impiego del saggio nella discriminazione di sangue per il virus PT-NANBH Di preferenza, un antigene viene ottenuto dalla regione di codificazione strutturale (1 estremità 5') ed un altro antigene viene ottenuto dalla regione di codificazione non strutturale (1 estremità 3 ) In partìco-Jare si preferisce che gli antigeni siano fusi insieme come polipeptide ncombinante Quest ultima impostazione offre un certo numero di vantaggi per il fatto che gli antigeni individuali possono essere combinati in un rapporto fissato predeterminato (di solito Iequimolare) e soltanto un polipeptide sing"o"lo ha ne-i

di essere prodotto purificato e caratterìzzi ato

Un frammento antigenico di un antigene avente una sequenza di amminoacidi che è omologa per almeno il 90 % con quella stabilita in SEQ ID NO 3,4,5,18, 19 20 21 o 22 di preferenza contiene un minimo di 5, 6, 7, 8, 9 o 10, 15 20, 30, 40 o 50 amminoacidi I siti antigenici di tali antigeni possono essere identificati impiegando^tecniche standard Questi possono comprendere la frammentazione del polipeptide stesso impiegando enzimi proteolitici o agenti chimici e poi determinando la capacità di ciascun frammento di legarsi agli anticorpi o di provocare una risposta immune nell inoculazione in un animale o m un adatto sistema modello in vito (Strohmaier et al J Gen Virol , 1982 voi 59 pg 205 306) In alternativa il DNA che codifica il polipeptide può essere frammen tato a mezzo della digestione con Qnzina di restrizione oaltreben note tecniche e poi introdotto in unsistema di espressione per produrre frammenti (facoltativamente fusi cosi da formare un polipeptide di solito di origine batterica) I risultanti frammenti sono stabiliti come in precedenza descritto (Spence _ et al., J. Gen Vlrol J989 voi 70.-2843-5U SmLttl et al Gene 1984 voi 29 263 9) Un altra impo stazione è quella che sintetizza chimicamente corti frammenti peptidici (lunghezza da 3 a 20 amminoacidi convenzionalmente lunghezza di 6 amminoacidi) che coprono 1 intera sequenza del polipeptide di completa lunghezza con ciascun peptide che si sovrappone al peptide adiacente (questa sovrapposizione può essere di 1-10 amminoacidi ma idealmente è di n 1 amminoacidi dove n è la lunghezza del peptide Geysen et al Proc Nati Acad Sci 1984 volume 81 3998-4002) Ciascun peptide viene quindi determinato come in precedenza descritto ad eccezione del fatto che il pepti de è di solito dapprima copulato con alcune molecole di veicolo per facilitare 1 induzione di una risposta immune. Infine, vi sono dei metodi di previsione che comprendono l'analisi della sequenza per particolari caratteristiche, per esempio il carattere idrofilo, , che è ritenuto associato con i siti immunologicamente .importanti .(.Hopp e. Woods,_Proc. Nati Acad. Sci.., 198L,..volume 78 3824.r8 B.e.rzofsky. Sci.ence 19.85., voi. 229. 932-40). Queste preyisioni„possono essere provate impiegando l'impostazione del polipeptide o del peptide ricombinant igià In precedenza descritta.

Di preférenza, il polipeptide virale viene fornito in forma pura, e cioè con purezza maggiore del 90 % o anche del 95 %.

Il polipeptide virale di PT-NANBH della presente invenzlone può essere ottenuto impiegando un s intetizzatore diamminoacidi, se esso è.un antigene. avente non più di circa .30 residui, ovvero mediant e la tecnologia del DNA ricombinante.

La presente invenzione,inoltre fornisce una sequenza di DNA che codifica per un polipeptide virale di PTrNANBH come qui definito.

La sequenza di.DNA della presente invenzione può essere sintetica.o clonata. Di.preferenza la sequenza di DNA è come viene stabilito in SEQ ID NO:

3,4,5,13,19,20,21 p 22.

Per ottenere un polipeptide virale di PT-NANBH comprendente antigem multipli si preferisce fondere le sequenze di codificazione individuali in un singolo riferimento di lettura aperto La fusione dovrebbe essere natuuralmente realizzata in modo tale che l'attività antigemca di ciscun antigene non sia compromessa in maniera significativa dalla sua posiziope relativa rispetto ad un altro antigene Si dovreb-|be avere uun particolare riguardo naturalmente per la natura delle sequenze alla giunzione reale tra gli antigeni I metodi, con quali tali polipeptidd sin-, goli possono essere ottenuti sono ben noti nel ramo , relativo

La presente invenzione inoltre fornisce un vettore di espressione che contiene„una sequenza di DNA, come qui definito, e che è capace in un ospite appropriato di esprimere la sequenza di DNA cosi da produrre uun polipeptide virale PT-NANBH

Il vettore di espressione normalmente contiene elementi di controllo del DNA che effettuano 1 espressione della sequenza di DNA in un ospite appropriato Questi elementi possono variare in accordo all ospite ma di solito includono un promotore, un sito legante dei ribosomi, siti di inizio e di arresto della traduzione, e uun sito di terminazione della trascrizione Esempi di tali vettori includono i plasmidi e i virus. I vettori di espressione della presente invenzione comprendono sia i .vettori extra-.cromosomici che i. vettori ,i quali sono integrati nel. cromosoma della.cellula ospite. Per l'impiega in E. coli, il vettore di espressione.può contenere la se-, quuenza di DNA facoltativamente come fusione legata alla estremità 5'. oppure 3' della sequenza.di DNA che codifica per esempio la beta-galattosidasi ovvero all'estremità 31 della sequenza di DNA che codifica per esempio per il gene trp E . Per l'impiego nel sistema di baculovirus di insetto (AcNPV), la sequenza del DNA è facoltativamente fusa con la sequenza che codifica per la poliedrina .

La presente invenzione inoltre for nisce una cellula ,ospite trasformata con un vettore di espressione come qui definito .

Esempi di cellule ospiti di utilità nell'ambito della presente invenzione incluudono le celluule procariotiche ed eucariotiche, come pure le cellule batteriche lievito, cellule di insetti e di mammiferi. Esempi particolari di tali cellule sono E. coli, S. cerevisiae, P. pastoris, cellule di topo ed ovaie di criceto cinese, e Spodoptera frugiperda e Tricoplusia ni. La scelta della cellula ospite può dipendere da un certo numero di fattori ma se la modificazione post-traduzione del polipeptide virale di PT-NANBH è importante, allora uun ospite eucariotico sarebbe preferito.

La presente invenzione inoltre fornisce un procedimento per la produzione di polipeptide virale di PT-NANBH che comprende la clonazione o la sintesi di una sequenza di DNA.che codifica per un polipeptide virale di PT-NANBH, come qui definito, inserendo Ia sequenza del DNA in unvettore di espressione in maniera tale che esso sia capace in un ospite appropriato di essere espresso trasformando una cellula ospite con il vettore di espressione, ponendo in coltura.la cellula ospite trasformata ed isolando il poilipeptide virale .La clonazione della.sequenza di DNA può esse-, .re realizzata impiegando tecniche standard già ben note nel ramo relativo. Tuttavia è particolarmente vantaggioso in.tal tecniche fare impiego dei dati di. sequenze qui descritte cosi da facilitare l'identificazione e l'isolamento delle desiderate sequenze di DNA clonato. Di preferenza, l'RNA viene isolato riducendo in pezzetti il virus da plasma di esseri umani infettati identificati mediante implicazione nella trasmissione di PT-NANBH. L'RNA isolato è sottoposto a trascrizione inversa il cDNA usando l'innesco casuale ovvero oligo dT Facoltativamente 1 R A può essere soggetto ad uuno stadio di trattamento preventivo al lo scopo di rimuovere ogni possibile struuttura secon daria la quale possa interferire con la sintesi di cDNA per esempio mediante riscaldamento o reazione con idrossido metilmercurico II cDNA è di solito mo dificato mediante aggiunta di agenti leganti operazione seguita dalla dìgestione con un enzima di restrizione Esso viene poi inserito in un vettore di clona zione come ad esempio pBR322 ovvero un suo derivato ovvero i vettori lambda gt10 e g t1 1[Huynh et al , DNA Cloning 1985 Vol 1 A practical Approach Oxford IRC Press) impaccato a formare virioni come appropriato, e le risultanti molecole di DNA ricombi nante usate per trasformare E coli e cosi generare la biblioteca desiderata

La biblioteca può essere sottoposta a discri minazione impiegando uuna strategia di discriminazione standard Se la biblioteca è una biblioteca di e spressione essa può essere sottoposta a discrimina zione impiegando un metodo immunologico con antisieri ottenuti dalla medesima fonte di plasma del materiale di partenza di RiiA ed inoltre con antisieri da fonti umane aggiuntive che ci si aspettava essere positive per gli anticorpi contro PT-NANBH .Poichè gli antisie ri umani di solito contengono anticorpi contro E. coli i quali possono dare luogo ad un fondo di valore elevato durante la discriminazione, è preferibile dapprima trattare gli antisieri con materiale di scissione non trasformata di E. coli cosi da rimuovere tali anticorpi. E' vantaggioso impiegare un controllo negativo usando antisieri ottenuti da donatori umani accreditati, cioè donatori umani che sono stati ripetutamente analizzati e constatati non avere anticorpi contro l'epatite virale. Una strategia di discriminazione alternativa sarebbe quella di impiegare come sonde di ibridazione uno o più oligonucleotidi marcati L'impiego degli oligonucleotidi nella discriminazione di una biblioteca di cDNA è generalmente più semplice e più sicuro della discriminazione con antisieri. Gli oligonucleotidi sono di preferenza sintetizzati impiega do l i nf ormaz ione delle sequenze di DNA qui descritta.. Uno o più passaggi aggiuntivi di discriminazione di un tipo o di un altro possono essere realizzati per caratterizzare ed identificare i cloni positivi.

Avendo identificato un primo clone positivo, la biblioteca può essere nuovamente sottoposta a discriminazione per cloni positivi aggiuntivi impiegando il primo clone come sonda di ibridazione. In alternativa o in aggiunta, ulteriori biblioteche possono essere preparate e queste possono essere sottoposte a discriminazione impiegando sonde di ibridazione o di immunodiscriminazione. In questo modo si possono ottenere ulteriori sequenze di DNA.

Come alternativa la sequenza di DNA che codi-, fica per un polipeptide virale di PT-NAN3H può essere sintetizzata impiegando tecniche standard e questo può..essere preferito in alcune..circostanze alla clolezione del.DNA.(Gait 01igonucleotide Synthesis: A .. Prac.tical-Approach, 1984,. Oxford, IRL.Press).

Così clonata o sintetizzata, la desiderata se quenza di DNA può essere inserita in un vettore di espressione usando tecniche note e standardizzate. il vettore di .espressione,viene normalmente tagliato usando enzimi di restrizione e la sequenza di DNA inserita usando una legatura con.terminale spuntatolo terminale sfalsato. Il taglio è di solito effettuato in un sito di restrizione in una posizione conveniente nel vettore di espressione in maniera tale che, una volta inserita, la sequenza di DNA sia sotto il controllo degli elementi funzionali del DNA che effettuano la sua espressione.

La trasformazione di una cellula ospite può essere realizzata usando tecniche standard. Qualche marcatore fenotipico è di solito impiegato allo scopo di distinguere tra i trasformanti che hanno con successo catturato il vettore di espressione e quelli che non lo hanno catturato II trattamento di coltura della cellula ospite trasfornata e 1 isolamento del polipeptide virale di PT-NANBH possono anche essere realizzati impiegando tecniche standard Anticorpo specifico per un polipeptide virale tdi. PTNANBH della presente invenzione può essere ot tenuto usando il polipeptide L'anticorpo può essere monoclonale o policlonale L anticorpo può essere ìm piegato in prove di control lo della qualità di poli peptide viraie di PT-NANBH nella purificazione di un poiipeptide virale di PT-NANBH o di un materiale di scissione virale la mappatura con epitopo quando è marcato, come coniugato in un saggio di tipo compe tititvo, per la rivelazione di un anticorpo, e nei saggi di rivelazione di un antigene

L antìcorpo policlonale contro un pol peptide virale di PT-NANBH della presente invenzione può essere ottenuto iniettando un polipeptide virale di PT-NANBH facoltativamente copulato con un veicolo per promuovere una risposta immune in un ospite costituito da un mammifero come ad esempio un topo un ratto pecora o coniglio e recuperando l anticorpo così prodotto II polipeptide virale di PT-NANBH viene ge ruralmente somministrato nella forma di una formula zione iniettabile nella quale il polipeptide viene miscelato con un diluente fisiologicamente accettabi le Gli agenti ausiliari come l'agente ausiliare con pleto dì Freund (FCA) ovvero l' ausiliare incompleto di Freund (FIA) possono essere inclusi nella formulazione La formulazione viene normalmente iniettata nell ospite per un adatto periodo di tempo campioni di plasma essendo prelevati ad intervalli appropriati per il saggio per l' anticorpo virale anti-PT-NANBH Quando si ottiene un livello appropriato di attività l' ospite viene sottoposto a salasso L anticorpo viene poi estratto epurificato dal plasma sanguigno usando tecniche standard per esempio mediante proteina A ovvero cromatografia di scambio ionico

L anticorpo monoclonale contro un polipeptide virale di PT-NANBH della presente invenzione può essere ottenuto fondendo cellule di una linea cellulare immorta lizzante con cellule che producono anticorpo contro il polipeptide virale e ponendo in coltura la linea cellulare immortalizzata fusa Tipicamente un ospite mammifero non umano come un topo o un ratto viene inoculato con il polipeptide virale Dopo che è trascorso un tempo sufficiente perchè l' ospite dia una risposta di anticorpi le cellule che producono anticorpo come gli splenociti sono rimosse Cellule di una linea cellulare immortaiizzante come ad esem pio la linea cellulare di mieloma di ratto o di topo sono fuse con le cellule che producono anticorpo e le risultanti fusioni sono discriminate per identificare una linea cellulare come ad esemplo un ibridoma, che secerne il desiderato anticorpo mono clonale La linea cellulare fusa può essere posta in coltura e l'anticorpo monoclonale purificato dai mezzidi coltura in maniera analoga alla purificazione di anticorpo policlonale

I saggi diagnostici basati sullapresente invenzione pos sono essere usati per determinare la presenza o assenza di infezione da PT-NANBH Essi possono essere usati anche per monitorare il trattamento di tale infezione, per esempio nella terapia con interferoni.

In un saggio per la diagnosi delle infezioni virali vi sono fondamentalmente tre impostazioni distinte che possono essere adottate che comprendono la rivelazione di acido nucleico virale antigene virale o anticorpo virale L acido nucleico virale è generalmente riguardato come miglior indicatore della presenza del virus stesso e può identificare materiali che hanno probabilità di essere infettivi Tuttavia la rivelazione di acido nucleico non è di solito tanto diretta ed insediata quanto la rivelazione di antigeni o anticorpi poiché il livello di bersaglio può essere molto basso L antigene virale viene usa to come marcatore per la presenza di virus e come in dicatore di infettività In dipendenza dal virus la quantità di antigene presente in un campione può es sere molto bassa e difficile da rivelare La rivelazione di anticorpo è relativamente lineare perchè in effetti,, il sistema immune dell ospite amplifica la risposta ad una infezione producendo grandi quantità di anticorpo in circolazione La natura della risposta dell anticorpo può essere spesso clinicamente utile per esempio anticorpi della classe di Igll anzichè della classe di IgG sono indicativi di una infezione recente o la risposta ad un particolare antigene virale può essere associata con l'eliminazione del virus Così I esatta impostazione adottata per la diagnosi di una Infezione virale dipende dalle parti colari circostanze e dalle informazioni desiderate Nel caso della PT-NANBH un saggio diagnostico può com prendere una qualunque di queste tre impostazioni In un saggio per la diagnosi della PT NANBH che comprende la rivelazione di acido nucleico virale il procedimento può comprendere l' ibridazione dell' RNA virale presente in un campione di prova o del cDNA sintetizzato da tale RNA virale con una sequenza di DNA corrispondente alla sequenza nucleotidica di SEQ ID NO 345 18 1920 21 o 22 e la discrimina zione degli ibridi di acido nucleico risultanti per caratterizzare ulteriormente un acido nucleico virale PT NANBH L applicazione di questo procedimento di solito è limi tata ad un campione di prova di un tessuto appropria to cone ad esempio una biopsia del fegato in cui l' R\A virale è probabile che sia presente ad un livel lo elevato La sequenza di DNA corrispondente alla sequenza nucleotidica di SE ID NO 3 4 5 18 19 20 21 o 22 può assumere la forma di un oligonucleotide o dj. una sequenza di cDNA facoltativamente contenuti in un plasmide La discriminazione degli ibridi di acido nucleico preferibilmente è effettuala usando una sequenza di DNA marcat .Uno più giri aggiuntivi di discriminazione di un tipo o di un altro tipo posso no essere realizzati per caratterizzare gli ibridi e così identificare un acido nud elco virale di PT NANBH Gli stadi di ibridazione e di discriminazione sono effettuati in accordo.con le tecniche note nel ramo relativo

A causa della limitata applicazione di questo procedimento nel saggio per l' acido nucleico virale un procedimento più conveniente e preferito comprende la sintesi di cDNA dall RIA virale presente in un cam pione di prova l' amplificazione di una sequenza di DNA prescelta corrispondente ad una subsequenza della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO 3 4 5 18 19 20 21 o 22 e l' identificazione della sequenza prescel ta di DNA II campione di prova può essere di un qua lunque tessuto appropriato o fluido biologico e di preferenza è concentrato per un RNA virale presente Esempi di un tessuto appropriato includono una biopsia del fegato Esempi di un appropriato fluido fisiolo gico includono urina plasma sangue siero sperma lacrime, .saliva o fluido cerebrospinale Esempi pre feriti sono il siero ed il plasma

La sintesi del cDNA normalmente viene effettua ta mediante trascrizione inversa con primer usando primer casuali, definiti o oligo-dT Con vantaggio il prijner è un oligonucleotide corrispondente alla sequenza nucleotidica di SE ID NO 3,4,5,18 20 21 o 22 e progettato per arricchire con il cDNA contener te la sequenza prescelta

L amplificazione della sequenza di DNA prescel ta viene effettuata preferibilmente usando la tecnica di reazione a catena con polimerasi (PCR) (Saiki et al Science 1985 230 1350 4) In questa tecnica una coppia di primer o11gonuc1eotidici viene im piegata uno dei quali primer corrisponde ad una por zione della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO

3 4 5 18 1920 2 1 o 22 e l' altro dei quali primer è collocato sul lato 3 del primo e corrisponde ad una porzione della sequenza complementare la coppia de finendo tra loro la sequenza prescelta di DNA li oligonucleotìdì di solito sono almeno 15 in modo ot tinaie da 20 a 26 basi di lunghezza a sebbene possa no essere tollerati alcuni disaccordi variando le con dizioni di reazione l' estremo 3 degli oligonucleo tidi dovrebbe essere perfettamente complementare in modo da agire efficientemente da primer La distanza tra gli estremi 3 degli oligonucleotidi può essere da circa 100 a circa 200 basi Convenientemente uno della coppia di oligonucleotidi che viene usata in questa tecnica viene anche usato per agire come primer nella sintesi di cDNA La tecnica PCR stessa viene realizzata sul cDNA in forma di filamento sin -golo usando un enzima come la Taq polimerasi ed un eccesso dei primer oligonucleotidici in 2040 cicli in accordo con i protocolli pubblicatί (Saìki et al. Science 1988» 239 487491 )

Come raffinazione della tecnica,vi possono essere parecchi cicli di amplificazione ciascun ci ciò essendo effettuato con primer mediante una diver sa coppia di oligonucleotidi Cosi dopo il primo ciclo di amplificazione una coppia interna di oligonu cleotidi che definisce una sequenza più corta di DNA (cioè di lunghezza da 50 a 500 basi) può essere usa ta per un secondo ciclo di amplificazione In questa raffinazione alquanto più affidabile riportata come Nested PCR naturalmente è la sequenza finale am plificata di DNA che costituisce la sequenza prescel ta (Kemp et al Proc Nati Acad Sci 1989 80 (7) 2423 7 e Mullis et al Methods in Enzymology 1987 voi 155 335 350)

L identificazione della sequenza prescelta di DNA può essere effettuata mediante 1 analisi dei prodotti di PCR su gel di agarosio La presenza di una banda al peso molecolare calcolato per la sequenza prescelta è un indicatore positivo dell acido nuclei co virale nel campione di prova. Procedimenti alternativi di identificazione includono quelli basati su procedimento di prova Southern blotting o sul dot blotting sulla restrizione con oligomeri e determinazione di sequenza del DNA .

La presente invenzione inoltre fornisce un corredo di prova per la rivelazione dell acido nuclei co virale di PT-NAN3H che comprende

I) una coppia di primer oligonucleotidici uno dei quali corrisponde ad una porzione della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO 345 18 19 20 21 o 22 e 1 altro dei quali è collocato al lato o della prima e corrisponde ad una porzione della sequenza compie mentare la coppia definendo tra essi una sequenza di DNA preselezionata

II) un enzima di trascriptasi inversa per la sintesi di cDiA dall RIA canpione di prova a monte del primer corrispondente alla sequenza nucleotidica complementare di SEQ ID NO 3 4 5 18 19 20 21 o 22 III) un enzima capace di amplificare la sequen za di DNA preselezionata, e facoltativamente IV) soluzione di lavaggio e tamponi di reazione Con vantaggio, 14 corredo di prova contiene. anche un campione di controlio positivo per facilita-. re l'identificazione dell acido nucleico virale -Le caratteristiche dei primer e gli enzimi sono di preferenza quali sono stati sopra descritti in connessione con la recnica PCR In un saggio per la diagnosi di PT N.ANBH che comprende la rivelazione di antigene virale o di anticorpo virale il metodo può comprendere l'operazione di porre a contatto un campione di prova con un polipeptide virale di PT NANBH della presente invenzione ovvero un anticorpo policlonale o monoclonale contro il polipeptide e terminando se vi è un qualunque an tigene anticorpo legante contenuto entro il campione di prova Per questo proposito un corredo di prova può essere fornito comprendere un polipeptide virale di PT 1AN3H come qui definito ovvero un anticorpo monoclonale o policlonale per lo stesso e mezzi per determinare se vi sia una qualunque formazione di legame con anticorpo o antigene rispettivamente rontanu ti nel campione di prova II campione di prova può es sere prelevato da uno qualunque del tessuti appropria ti e fluidi fisiologici appropriati sopra menzionati per la rivelazione di acido nucleico virale Se si ot tiene un fluido fisiologico esso può essere facoltativamente concentrato per .un qualunque antìgene virale o anticorpo che sia presente

Si può fare impiego di una varietà di forme di saggio Il polipeptide virale di PT-NANBH può essere impiegato per catturare selettivamente 1 anticorpo contro PT NANBH daIla soluzione per mareare selettivamente l anticorpo già catturato ovvero sia per cat turare che per marcare l anticorpo stesso In aggiunta il polipeptide virale può essere impiegato in un ampia, varietà di forme di saggio omogenee in cui 1 anticorpo reattivo con l antigene viene rivelato in soluzione senza alcuna separazione di fasi

I tipi di saggio in cui il polipeptide virale di PT-NANBH viene impiegato per catturare l anticorpo dalla soluzione comprendono l immobilizzazione del polipeptide su di una superficie solida Questa super fiele dovrebbe essere allontanabile per lavaggio in qualche modo Esempi di adatti superfici includono polimeri di svariati tipi (stampati in forma di poz zetti da microtitolazione perlina bacchette di sva riati tipi estremità da aspirazione elettrodi e dispositivi ottici) particelle (per esempio lattici globuli rossi stabilizzati cellule batteriche o fun gali spore soli contenenti metalli oppure di oro o altri metalli e colloidi proteici) con le usuali dimensioni delle particelle che sono da 002 a 5 micron membrane tper esempio di nitrocellulosa carta acetato di cellulosa e membrane di elevata porosità/elevata area superficiale, di un materiale organico ^ inorganico)

Il collegamento del polipeptide virale di PT NANBH alla superficie può essere effettuato mediante adsorbimento passivo da una soluzione di composizione ottimale che può includere tensioattivi solventi sali e/ovvero caotropici ovvero mediante formazione di legame chimico attivo II legame attivo può essere effettuato per il tramite di una varietà di gruppi funzionali reattivi o attivabili che possono essere esposti sulla superficie (per esempio agenti di con densazione esteri acidi attivi alogenuri ed anidridi gruppi amminici ossidrilici o carbossilici grup pi solfidriIìci gruppi carbonilici gruppi diazoici ovvero gruppi insaturi) Facoltativamente la forma zione di legame attivo può essere effettuata per il tramite di una proteina (essa stessa attaccata alla superficie passivamente o per il tramite di un legame attivo) come ad esempio albumina o caseina alla qua le il polipeptide virale può essere chimicamente le gato mediante una qualunque di una ampia varietà di metodi .L'impiego di una proteina in questo modo può conferìre„vantaggi a causa del punto isoelettrico della carica del carattere idrofilo o di altre prò prietà fisico chimiche II polipeptide virale può an che essere attaccato alla superficie (di solito ma non necessariamente una membrana) in seguito alla se_ parazione elettroforetica di una miscela di reazione, come ad esempio la precipitazione immune .

Dopo il contatto (la re azione) della superficie che reca il polipeptide virale di ΡΤ- ΝΑΝΒΗ con un campione di prova concedendo il tempo necessario per la reazione e ove fosse necessario rimuovendo l ec cesso del campione mediante una qualunque di un ampia varietà di sistematiche (come ad esempio lavaggio centrifugazione fiItrazione azioni magnetiche o di capillarità) l anticorpo catturato viene rivelato me dìante un,qualunque mezzo che possa dare un segnale rivelabile Per esempio questo può essere ottenuto me diante l uso di una molecola marcata o di una parti cella marcata come sopra è stato descritto che possa reagire con l anticorpo catturato (per esempio la prò teina A o la proteina G e simili anti specie o sot totipi di anti immunoglobulina fattore reumatoide ovvero anticorpo per l antigene impiegato in maniera competitiva o bloccante) ovvero una qualunque molecola che contenga un epitopo contenuto nel polipeptide Il segnale rivelabile può essere ottico o ra dioattivo o fisicochimico e può essere fornito diret tamente mediante marcatura della molecola o della par ticella per esempio con un colorante „con un radiomarcante una specie elettroattiva una specie che dia risonanza magnetica oppure un fluoroforo ovvero ìndìrettamente mediante marcatura della molecola o della particella con un enzima che sia esso stesso capace di dar luogo ad una variazione misurabile di un qualunque tipo In alternativa il segnale rivelabile può essere ottenuto impiegando per esempio 1 aggluti nazione ovvero per il tramite di un effetto di diffrazione o di birifrangenza se la superficie è nella forma di particelle

I saggi in cui un polipeptide virale stesso di PT NANBH viene impiegato per marcare un anticorpo già catturato richiedono una certa forma di marcatura dell antigene che ne permetta la rivelazione La mar catura può essere diretta mediante attacco in maniera chimica o in maniera passiva per esempio di un radio marcante ovvero di una specie che dia risonanza ma gnetica ovvero di una particella o di un enzima di marcatura per il polipeptide ovvero può essere indi retta mediante attacco di una qualunque forma di mar catura ad una molecola che di per se potrà reagir e con il polipeptide.La chimica di effettuazione del legame di una marcatura con il polipeptide virale di PT-NANBH può essere effettuata direttamente per il tramite di una parte che è già pjresente nel polipe pti· de, come ad esempio un ammino gruppo, ovvero per il tramile di una parte intermedia come ad esempio un gruppo di maleimmide La cattura dell anticorpo può essere effettuata su una qualunque delle superfici già menzionate mediante unqual unque reagente che in elude 1 adsorbimento passivo o attivo che darà come risultato un anticorpo specifico o complessi immuni che sono legati In particolare la cattura dell anti corpo potrebbe essere effettuata mediante anti specie o sottotipi di anti immunoglobulina mediante il fat tore reumatoide le proteine A G e simili ovvero me diante una qualunque molecola contenente un epitopo_ contenuto nel polipeptide

Il polipeptide di PT NANBH marcato può essere impiegato in maniera competitiva nella formazione di legame in cui la sua formazione di legame con una qua lunque molecola specifica su una qualunque delle su perfici sopra esemplificate è bloccata dall antigene presente nel campione stesso Come alternativa esso può essere impiegato in maniera non competitiva in cui l antigene presente nel campione è legato in maniera specifica o in maniera non specifica ad una qua lunque delle superfici di cui sopra ed è anche legato ad una molecola specifica, bivalente o polivalente Cper esempio un anticorpo) le valenze restanti essendo impiegate per catturare il polipeptide marcato Spesso nei saggi omogenei il polipeptide virale di PT-NANBH ed un anticorpo sono separatamente marcati cosi che quando l anticorpo reagisce con li polipeptide virale nella soluzione libera, le due marcature interagiscono cosi da permettere per esempio un trasferimento non irraggiente di energia catturata da una marcatura verso l altra marcatura con appro pn ata rivelazione della seconda marcatura eccitata o della prima marcatura smorzata (per esempio medainte fluorimetria risonanza magnetica o misurazione enzi matica) L aggiunta di un polipeptide virale o di un anticorpo in un campione dà come risultato la restri zione dell interazione della coppia marcata e cosi un differente livello di segnale nel rivelatore

Una adatta forma di saggio per rivelare l'anticorpo di PT NANBH è la forma di saggio immunologico enzimatico (EIA) diretto con sandwich Un poiipepti de virale di PT-NANBH viene depositato come rivesti mento su pozzetti da microtitolazione Un campione di prova ed un polipeptide virale di PT-NANBH cui un enzima è accoppiato sono aggiunti simultaneamente.Un qualunque anticorpo di PT NANBH presente nel campione di prova si lega sia al rivestimento di polipeptide virale nel pozzetto che al polipeptide virale copula to con l' enzima Tipicamente il medesimo poli peptide virale viene us.ato su entrambi i lati del sandwich

Dopo lavaggio l' enzima legato viene rivelato usando un substrato specifico che comprende una variazione di colorazione Un corredo di prova per l'uso in taIe EIA comprende

1) un polipeptide virale di PT NANBH marcato con un enzima

2) un substrato per 1 enzima 3) mezzi che forniscono una superficie sulla quale un polipeptide virale di PT-NANBH è immobiliz zato e

4) facoltativamente soluzioni di lavaggio e/ ovvero agenti tamponanti

I polipeptidi virali della presente invenzione possono essere incorporati in una formulazione di vac cino per indurre immunità a PT M iBH nell uomo Per questo proposito il polipeptide virale può essere pre sentato in associazione con un veicolo farmaceutica mente accettabile

Per l impiego in una formulazione di vaccino il polipeptide virale può essere facoltativamente presentato come parte di una particella di fusione del nucleo dell epatite B come viene descritto in Clarke et al (Nature 1987, voi 330, 381-384) ovve ro un polimero basato su polilisina come descritto in Tarn (PNAS 1988 Voi 85 5409 5413) Come alterna tiva, il polipeptide virale può essere facoltativamente attaccato ad una struttura particellare, come ad esempio liposomi ovvero ISCOMS

Veicoli farmaceuticamente accettabili includono mezzi liquidi adatti per l uso come veicoli per introdurre il polipeptide virale in un paziente Un esempio di tali mezzi liquidi è costituito da una soluzione salina II polipeptide virale stesso può essere disciolto o sospeso nella forma di un solido nel veicolo stesso

La formulazione di vaccino può anche contenere un agente ausiliario per stimolare la risposta immune e così potenziare 1 effetto del vaccino stesso Esem pi ai agenti ausiliari includono idrossido di alluni nio e fosfato di alluminio La formulazione di vaccino può contenere una concentrazione finale di polipeptide virale nell intervallo da 0,01 a 5 mg/ml, preferibilmente da 0 03 2 mg/ml La formulazione di vaccino può essere incorporata in un contenitore sterile il quale viene poi sigillato e conservato a bassa temperatura per e sempio 4°C ovvero può essere liofilizzato Allo scopo di indurre immunità nell uomo a PT-NANBH, si può effettuare la somministrazione di una o più dosi delIa formulazione di vaccino Ciascuna do se può essere variabile da 0 1 a 2 ml, di preferenza da 0, 2 ml a 1 ml. Un procedimento per indurre immunità a PT-NANBH nell uomo, comprende la somministrazione di una quantità efficiente di una formulazione di vaccino come qui in precedenza è stata definita La presente invenzione inoltre fornisce 1 im piego di un polipeptìde virale di T-NANBH nella prepa razione di un vaccino per l uso nella induzione di immunità a PT NANBH nell uomo

I vaccini della presente invenzione possono es sere somministrati mediante un qualunque conveniente procedimento per la somministrazione di vaccini con 1 inclusione della introduzione orale e l iniezione per via parenterale (per esempio iniezione enaovenosa sottocutanea ed intramuscolare) Il trattamento può essere costituito dalla somministrazione di una dose singola di vaccino o di una pluralità di dosi entro un periodo di tempo predeterminato

I seguenti ceppi trasformati di E coli erano depositati presso la National Collection of Type Cuitures (NCTC) Central Publìc Health Laboratory 61 Colindale Avenue London NW95.HT alle date indicate

i)

ii)

iii)

iv)

v)

vi )

Nelle figure allegate la figura 1 nostra una rappresentazione della produzione di pDX122 descritto nell esempio 7 la figura 2 mostra una rappresentazio ne della produzione di due sequenze fuse alternative descritte nell esempio 17 e la figura 3 mostra mappe

di restrizione di SEQ ID 10 21 e 22

Nella lista di sequenze sono introdotte SEQ ID NO da 1 a 25 cui si fa riferimento nella de scrizione e nelle rivendicazioni

I seguenti esempi servono ad illustrare la presente invenzione

Esempio 1

Sintesi di cDNA

Plasma raccolto (160 mi) da due individui (indicati come A e L) noti per avere NANBH trasmessa per trasfusioni veniva diluito nel rapporto di 1/2,5con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e poi centrifugato a 190000 g (per esempio 30000 giri per minuto in un rotore MSE 8 x 50) per 5 ore a 4°C II sovranatante veniva trattenuto come fonte di anticor pi specifici per la susseguente discriminazione delle biblioteche di cDNA La pallina di entrifugazione veniva risospesa in un volume di 2 mi di Tris d ori drato 20 mfl EDTA 2 mM 3 % SDS NaCl 02 M (2 x PK) estraendo quindi tre volte con un volume eguale di fenolo tre volte con cloroformio una volta con etere e poi precipitando con 25 volumi di etanolo alla temperatura di 20°C II precipitato veniva quindi risospeso in 10 microlitri di Tris cloridrato 10 mi EDTA 1 m 1 a pH di 80 (TE)

L acido nucleico veniva impiegato come stampo in un corredo di sintesi di cDJA (Amersham Internatio nal pie Amersham Regno Unito) con trattamento a mezzo di prmer sia con oligo dt con esanuc1eot1de casuale Le condizioni di reazione erano come viene raccomandato dal fornitore del corredo di sintesi In maniera specifica, si impiegava 1 microlitro de11 a cido nucleico per una prima reazione di sintesi del filamento che eramarcato con [alfa-32P]dCTP (jAmersham attività speci-fica di3000 Ci/mmole in un vo _ lume finale di 20 microlitri ed incubazione a 42°C I per un ora. L intera reazione di primo filamento era_ poi usata per una reazione di sintesi del_ secondo filamento contenente E coll RNasiH (0,8 U) e DNA-polimerasi I (23 U) in un volume finale di 100 microlitri quindj incubazione a 12°C per 60 minuti e quindi a 22°C per 60 minuti La intera miscela di reazione era poi tenuta in incubazione a 70°C per 10 minuti quin di collocata su ghiaccio si aggiungeva 1 unità di T4 DilA polimerasi tenendo quindi in incubazione a 37°C per 10 minuti La reazione era quindi interrotta me diante aggiunta di 5 mirolitri di EDTA 02 11 a pH 8

I nucleotidi non incorporati venivano rimossi facendo passare la miscela di reazione su di una co lonna NICK (Pharmacia Ltd Milton Keynes Regno Uni to) Il cDJA veniva quindi estritto per due volte con fenolo per tre volte con cloroformio una volta con etere e poi si aggiungevano 20 microgrammi di destra no prima della precipitazione con 25 volumi di età nolo al 100 %

Esempio 2

Produzione di biblioteche diespressione La pallina di cDNA essiccata veniva nuovamente sospesa in 5 microlitri di TE sterile e poi sottoposta ad incubazione con 500 ng di leganti EcoRI (Pharmacia GGAATTCC fosforilato) e 5,0 U dì T4 DNA_Jigasi. (New England BioLabs Beverley MA, USA) in un volume finale di 10 microlitri contenente Tris-HCl 20 mM a pH 7,5, MgCl2.10 mM DTT 10 mM, ATP1 mM per 3 ore a 15°C La ligasi veniva resa inattiva riscaldando a 65°C per 10 minuti e il cDNA veniva digerito con 180 U di EcoRI (BCL Leves U K ) in un volume finale di 100 microlitri a 37°C per un ora EDTA veniva aggiunto ad una concentrazione finale di 10 mi e 1 intera miscela di reazione era caricata su di una colonna AcA34 (LKB) Frazioni (50 microlitri) venivano raccolte e sottoposte a conteggio II picco di cDNA nel vo lume escluso (980 cpm) veniva raccolto estratto due volte con fenolo tre volte con cloroformio una voi ta con etere e poi precipitato con etanolo

Il ds CD JM veniva risospeso in o nicrolitr di TE e legato su bracci di lambda gt11 eCoRI (Gibco Paisley Scotland) in 10 microlitri di miscela di rea zioone contenenti 0 5 U di T4 DNA ligasi Tris clori drato 66 ml M9cl2 10 mM DTT 15 mM a pH 7 6 a 15°C per una notte Dopo aver disattivato la ligasi riscal dando a 65°C per 10 minuti si aggiungevano 5 micro litri della miscela di reazione ad un riempimento di neazione Amersbam e si teneva in incubatrice a 22°C per 2 oore Il materiale con riempimento era titola lo sul ceppo Y1090 di E coli (Huynh et a1 1985) e conteneva un totale di 2,6 x 10 ricombinanti Cellule su lastra (Y1090) venivano preparate inoculando 10 ml di brodo L con una colonia singola da una lastra di agar ed agitando per una notte a 37°C II giorno dopo 0 5 ml della coltura della notte venivano diluiti con 10 mi di brodo L fresco e 0 1 mi di IgSO4 1 M e 0 1 mi di ma1tosio al 20 % (peso/ volume) venivano aggiunti La coltura veniva agitata per due ore a 37°C ibatteri venivano raccolti me diante centrifugazione a 5 000 g per 10 minuti e ri sospesi in 5 mi di IgSO4 10 mi per produrre II quanti tativoo di cellule su lastra Una porzione (1 microlitro) del materiale riempito veniva miscelata con 0 2 mi di cellule su lastra si poneva in ìncubatri ce a 37°C per 20 minuti prima che 3 mi della parte superiore dell agar venissero aggiunti e 1 intera mi scela veniva versata su una lastra di agar L da 80 nn Dopo incubazione per una notte a 37°C le piastre venivano conteggiate e si determinava il numero totale di fagi ricombinanti II materiale restante con riempimento (500 microlitri) era conservato a 4°C Si preparavano biblioteche aggiuntive in manie ra sostanzialmente analoga

Esempio 3

Discriminazione di biblioteche di espressione La biblioteca iniziale descritta nell esempio 2 veniva posta su lastra sul ceppo Y1090 di E coli ad una densità di circa 5 x 103 pfu per140 mm di lastra e fatta crescere a 37°C per 2 ore finché le piastre erano visibili Filtri di nitrocellulosa ste rili che erano stati impregnati con IPTG (isopropiltioga lattosìde) venivano lasciati in contatto la lastra per 3 ore e poi rimossi I filtri venivano prima bloccati mediante incubazione con la soluzione bloccante [3 % (peso/volume) di BSA/TBS Tween (Tris HC1 10 mi a pH 8 NaCl 150 mM 005 % (vo1urne/vo1urne Tween 20) contenente 005 % bromao ] (20 ml/filtro) e poi trasferiti al tampone legante [1 % (peso/volu me) BSA/TBS/Tween contenente 005 % bronidox] conte nente anticerpi purificati (m°diante rcmtografia GÌ scambio ionico) ottenuti da plasma A&L raccolto (20 microgrammi/ml) Dopo incubazione alla temperatura ambiente per 2 ore 1 filtri erano lavati tre volte ContLBS Tween e quindi tenuti in incubazione in tamn pone legante contenente anti umano pecora biotinila to (1//25Q) Dopo un ora alla temperatura ambiente 1 filtri venivano lavati tre volte con T3S/Tween e quindi tenutì in incubazione in tampone legante contenen_ te streptavidina/perossidasi complesso (1/100) Il segnale si sviluppava con DAB I segnali positivi apparivano come piastre (colorate).

Diun totale di 2 6 x 10 piastre discrimina te, si ottenevano positivi nella prima operazione di diseriminazione Impiegando ifiltri come stampo le regioni delle piastre originali corrispondenti a que sti segnali positivi erano prelevate impiegando una pipetta sterile di Pasteur I tamponi di agar veniva no sospesi in un volume di 0 1 ml di tampone SI ed il fago veniva fatto diffondere II titolo del fago da ciascun tampone veniva determinato sul ceppo Y1090 di E coli II materiale costituito dal fago da ciascun tampone era poi nuovamente sottoposto alla disonni nazione come prima su lastre individuali da 90 mm ad una densità di circa 1 x 10 pfu peryjastra Di otto positivi nel primo gruppo di prove uno era chiaranen te positivo al secondo gruppo e cioè più di 1 % di piastre positive e questo era indicato come JG2 Questo corrisponde ad un rapporto positivo di 40/106 nella biblioteca

Questo ed un altro fago positivo identificato in modo analogo da altre biblioteche dicDNA descrit te nell esempio 2 erano poi purificati mediante serie ripetute di discriminazione di piastre a densità mi nore (1 200 pfu/lastra di 90 mm) finché il 100 % delle piastre erano positive con la discriminazione con anticorpo A&L Tre di tali fagi ricombinanti erano JG 1 JG2 ed JG3

Esempio 4

Discriminazione secondaria di JG1 JG2 ed JG3 con gruppi di siero

Ciascuno dei fagi ricombinanti JG1 JG2 ed JG3 venivano purificati su piastra e conservati come ma teriali titolati in tampone SM alla temperatura di 4°C Questi fagi erano miscelati (11) con un gruppo di fagi identificati come negativi nell esempio 3 e la miscela veniva impiegata per infettare il ceppo Y1090 di E coli a 1000 pfu per lastra Prelievi di piastre venivano effettuati e trattati come descrit to nell esempio 3 eccetto che i filtri erano tagliati in quadranti e ciascun quadrante era tenuto in ineu bazione con un differente anticorpo questi erano gli anticorpi A&L (20 microg/ml) plasma A (1/500) plasma L (1/500) e H IgG (20 microg/ml) H è un paziente che ci si attende esserepositivo per gli anticorpi di PT NANBH poiché egliera un emofiliaco che ave va ricevuto il fattorI VIII non trattato termicamente Alla fine della reazione ciascun fiItro veniva sottoposto a stima cieca così da risultare positivo (quando vi fosseroch iaramente due classi di segnali) oppure negativo (quando tutte le piastre davano i l medesimo segnale) Questo poteva essere un giudizio soggettivo e cosi le stime erano paragonaie e soltan to quei filtri dove vi era un accordo maggioritario erano presi come positivi i risultati sono presentati in tabella 1

JG1 appariva tale da reagire soltanto con an ticorpi ottenuti dal paziente A e non L ovvero H questo non è ciò che ci si sarebbe potuto attendere da un vero polipeptide ricombinante in relazione con PT-NANBH e cosi JG1 veniva eliminato dalle analisi Tuttavia sia JG2 che JG3 davano reazioni positive e videnti con tre sieri A L ed H di PT-NANBH questi venivano analizzati ulteriormente

Il tipo di analisi sopra descritto veniva ri petuto per JG2 ed JG3 eccetto che i filtri venivano tagliati in porzioni minori e queste erano tenute in ìncubazione con gruppi di sieri positivi e negativi I gruppi di sieri positivi comprendevano un gruppo di 10 sieri emofiliaci ed un gruppo di 9 sieri di tossicodipendenti per via endovenosa (IVDA) Questi rappresentavano la miglior fonte di sieri positivi anche se il rapporto di positività reale era ignoto II gruppo di sieri negativi veniva ottenuto da donatori accreditati che sono stati accuratamente controllati in un periodo di molti anni dal North London Blood Transfusion Centre Deansbrook Road Edgware Middle sex Regno Unito e non hanno mai mostrato alcun se gno di infezione con una varietà di agenti con l in clusione di PT-iANBH I risultati sono presentati nel le tabelle 2 e 3

l positivi sono sottolineati.

Questi dati sono in accordo con l ipotesi secondo la quale entrambi i ricombinanti esprimono po lipeptidi associati con un agente che è responsabile di PT-NANBH e secondo la quale questi polipeptidi non sono identici ma possono avere in comune alcuni siti antigenici

Esempio 5

Formazione di mappe di restrizione e de

terminazione delle sequenze di DJM di JG2 e di JG3

Una porzione (10 microlitri) dei materiali di fagi sia per 0G2 che per JG3 veniva fatta bollire per denaturare il fago e per esporre il DNA Questo DNA era poi impiegato come stampo in una amplificazione di PCR usando la Taq polimerasi ciascuna reazione c onteneva quanto segue in un volume finale di 50 mi crolitri Tris HC1 10 mM KCl 50 mM MgCl21 ,5 mM 0,01 % di gelatina, pH di 8,3 a 25°C più primer oligonucleotidici d19 e d20 (SEQ ID NO 1 e 2 rispettivamente 200 ng ciascuno) questi primer sono collocati

nelle sequenze lambda che fiancheggia no il sito di

clonazione ECoRI e perciò innescanol'a lificazion di qualunque cosa clonata in questo sito .

Una porzione della miscela di reazione veniva

analizzata su di un gel di agarosio 1,0 % e paragona

ta con i marcatori L amplificazione di JG2 produceva

un frammento di circa 2 kb JG3 ne produceva uno di

circa 1 kb La rimanente miscela di reazione veniva

estratta con fenolo/cloroformio in presenza di EDTA

10 mM ed 1 % SDS ed il DNA veniva recuperato median

te precipitazione con etanolo II materiale ampliti

cato veniva poi fatto digerire con 20 U di EcoRI per

60 minuti a 37°C e quindi separato su di un gel di

agarosio LGT all 10 % in TAc I frammenti erano ri

dotti di dimensione come ci si aspettava ed erano e luiti e purificati usando Elutips (S&S) Gli elementi inseriti di JG2 ed JG3 erano legati con pUC13 digerì to con EcoRI e trasformati in ceppi TG1 di E coli I ricombinanti erano identificati nella forma di colo pie bianche su lastre X gal/L Amp (le piastre di L-agar supplementate con 100 microg/ml di ampicillina 0 5 mg/mi diJXgal) ed erano controllati mediante pre parazioni plasmidiche su piccola scala e digestione con enzima di restrizione di EcoRI allo scopo di determinare le dimensioni del DNA inserito II plasmi de ricomòinante contenente lo JG2 inserito era indicato col termine di DM415 e quello contenente 1 ele-i mento inserito JG3 era indicato col termine di DM416)

La sequenza dell IG2 inserito era determinata mediante diretta determinazione della sequenza con doppio filamento del DNA plasmidico e mediante subclo nazione a vettori di determinazione di sequenza M13 come ad esempio mp18 e mp19 seguiti dalla determina zione di sequenza a filamento singolo La sequenza del materiale inserito JG3 era determinata in maniera analoga II risultante DNA e le sequenze di amminoacidi detratte sono stabiliti in SEQ IO NO 3 e 4

Esempio 6

espressione di polipeptide di PT A BH in E coli Il plasmide pDM416 (5 microgrammi) era posto a digerire con EcoRI (20 U) in un volume finale di 20 microlitri e l'elemento inserito da 1 kb venivarecu perato mediante eluizione da un gel di agarosio LGT all 1 % Questo materiale veniva poi lucidato usando il frammenta di Klenow ed una miscela di dNTP per riempire le estremità pendenti di EcoRI II DNA„veni va recuperato mediante precipitazione con etanolo in seguito all'estrazione confenolo /cloroformio .Il frammento con terminale smussato era legato a formare pDEV107 scisso /sottoposto a fosfatasi con Smal (un vettore che permette la clonazione alla estremità 3 dì lac Z) e poi trasformato in celluIe TG1 di E coli Vi era un aumento pari a 30 volte in colonie in un controllo con solo vettore Gli agenti trasformanti contenenti il richiesto plasmide ricombinante venivano identificati mediante ibridazione con una sonda radioattiva prodotta mediante amplificazione PCR del JGo rìcombìnante 12 colonie venivano analizzate me diante digestione con enzima di restrizione (SalI) dì mini preparazioni plasmidiche per determinare 1 orien tamento del materiale inserito Un quarto di questi ncombinanti si trovava nella corretta orientazione per esprimere la sequenza di PT A1DH come fusione con beta-ga l attosidasi Uno di questi (pDX113) era preso per 1 ulteriore analisi

Si usava una colonia di pXD113 per inoculare 50 mi di brodo L questa veniva fatta crescere alla temperatura di 37°C con agitazione fino a metà fase logaritmica e 1 espressione veniva indotta mediante aggiunta di IPTG 20 mM Dopo tre ore le cellule venivano raccolte mediante centrifugazione a 5000 g per_ 20 minuti risospese in 50 mi di PBS e quindi di nuo vo ridotte in pezzetti Le cellule ridotte in pezzetti venivano risospese in 5 mi di tampone (Tris HC125 nM EDTA 1 mM lisozima 1 mg/ml, Nom det-P400 2 % in volume /volume,pH 8,0) per g di pezzetto e quindi si teneva in incubazione a 0°C per due ore II DNA bat terico ceduto era posto a digerire mediante aggiunta di DNA-asi I ed MgSO4 fino a concentrazioni finali di 40 microg/ml e 2 mM rispettivamente per ridurre la vi scosità

Questo materiale di scissione greggio veniva analizzato mediante PAGE e la disposizione di protei ne veniva colorata con blu Coomassie Una proteina di circa 150 kD veniva indotta in batteri contenenti pDX113 e questa proteina veniva stimata tale da ren dere ragione del 10-15 % della proteina totale Analoghi geli venivano trasferiti su membrana PVDF (GRI Dunmow Essex Regno Unito) e le membrane venivano tenute in incubazione con sieri positivi a PT NANBH e con sieri negativi la proteina da 150 kD reagiva con ì sieri A e L ma non con siero umano normale Tracce di controllo contenenti materiale di scissione proveniente da E coli che esprimevano beta-galattosidasi non reagivano con i sieri umani A,L o normali

L urea era aggìunta al materiale di scissione gregg io fino ad una concentrazione finale di 6 H ed il materiale insolubile veniva rimosso mediante centrifug azione L estratto di urea 6M veniva usat per rivestire direttamente i pozzetti da microtitola zione per un ora a 37°C. I pozzetti erano lavati tre volte con acquadoppiamente distillata e poi bloccati, mediante aggiunta di 025 mi di BSA allo 02 % per pozzetto contenente NaN3 allo 002 % per 20 minuti alla temperatura di 37°C. La lastra era poi posta sot to aspirazione Lastre di controllo rivestite con un materiale di scissione greggio di un ceppo (pXY461) di E coli produttore di beta galattosidasi erano prò dotte nello stesso modo Queste lastre erano usate in saggi ELISA come descritto nell esempio 10

Esempio 7

Espressione di polipeptide di PT NANBH in

cellule di insetti

Il materiale inserito da JG3 di PT NA13H iso lato come descritto nell esempio 5 veniva clonato in frame o in riferimento con i primi 34 nucleotidi di poliedrina nel vettore pAc360 (Luckov e Summers B ìotechno1ogy 1988 voi 6 47 55) utilizzando la nostra conoscenza del riferimento di letturadel gene di lacZ nel vettore gt11 Gli oligonucleotidi venivano sintetizzati che erano capaci di ibridare a sequenze gt11 a fianco del sito di clonazione di EcoRI e cherendevano possibile l'ampiificazione del' inserto con PCR Questi oligonucleotidi includevano siti di restrizione BamHI collocati in maniera adatta in modo da permettere la clonazione diretta nel sitoBamHI di pAC360 collocando il gene inserito inframe o riferimento con le sequenze terminali amminiche della poliedrina

Una piccola quantità dell JG3 ricombinante di gt11 era fatta bollire allo scopo di esporre il DIA e quindi impiegata in una tecnica di amplificazione con PCR contenente ì prìmer oligonucleotidici d75 e d76 (SEQ ID NO 6 e 7 200 mg) e 05 U di Taq polimerasi Dopo l amplificazione la miscela di reazione veniva estratta con un volume eguale di fenolo/cloro formio precipitata con etanolo e digerita con 10 U di BanHI in un volume finale di 30 microlitri II frammento amplificato veniva separato su di un gel di agarosio all 1 % eluito e legato a formare pAc360 digerito con BamHI per produrre il costruito di trasferimento pDX1J9 II plasmide ricombinante (2 microg) e iIDNA di AcNPV di tipo selvatico (1 microq) venivano co-transfettati in cel lule di insetto medi an te preci pitazione con fosfato di cal cio Il vi rus ri combinante negati vo di inclus ione veniva selezionato mediante discriminazione visiva Dopo tre turn i d i puriflcazi one supias tra.Ilvirus ricombinante (BHC-5) veniva espanso e l espressione di proteina ricombi nante nelle cellule di insetto era stabilita mediante i saggi SDS-PAGE. Western blot ed ELISA Una proteina espressa inmanieraabbondante di circa 70 kD era prodotta in cellule infettate Questa proteina è reattiva con sieri di PTfJJANBH mediante il saggio Western blot ed ilsaggio ELISA .

Un ulteriorericombinante di baculovirus (BHC 7) veniva costruito cosi da includere sequenze JG2 aggiuntive alle sequenza JG3 presenti in BHC 5 come viene illustrato in figura 1 Le sequenze di PT NANBH presenti in JG2 venivano amplificate e clonate a for mare il vettore pAc360 come sopra descritto per prò durre pDX118 e gli appropriati frammenti BamHI/SalI di pDX119 e pDX118 erano legati insieme in quest or dine in pAc360 per produrre il costruito di trasferì mento pDX122

I plasmidi ricombinanti erano identificati mediante ibridazione ed orientazione del DNA inserito determinate mediante analisi enzimatica di restrizio ne II vìrus ricombinante era prodotto come sopra de scritto e la proteina espressa veniva analizzata mediante i saggi SDS-PAGE Western blot ed ELISA . Un polipeptide molto abbondante (40 % di proteina cellu lare totale) di 95 kD che reagiva con sieri di PT-NANBH veniva osservato nelle cellule infettate Esempio 8 Purificazionedi polipeptide DX113 Il ceppo TG1 di E coli contenente il plasmide pDX 113 (il ceppo designato WDL001) veniva fatto crescere ed indotto in un fermentatore di 15 litri (modello SET0Q2 SGI New Haven East Sussex Regno Uni to) alla temperatura di 37°C per 5 ore Le cellule venivano raccolte mediante centrifugazione a 5000 x g per 20 minuti e trattate come segue

(a) estrazione

Le cellule umide venivano risospese (1/20 in peso/volune) in tampone A (Tris HCl 50 ml NaCl 50 mM EDTA 1 m.M DTT 5 mM glicerolo al 10 % in volume / volume pH 8 0) Lisozima veniva aggiunto a 5 mg di solido per mi di sospensione e la miscela veniva la sciata a riposo a 40C Dopo 15 minuti la miscela ve niva trattata con ultrasuoni (6 micrometri di ampiez za da picco a picco) su ghiaccio per un totale di 3 minuti (impulsi di 6 x 30 secondi) Si aggiungeva poi DNA asi 1 a 4 microg per ml in sospensione e la miscela veniva lasciata per altri 30 minuti La sospensione veniva centrifugata per 20 minuti a 18000 x g (mas simo) ed il sovranatante veniva scartato .

La pallina di centrifugazione veniva risospe sa in tampone B (Hepes 25 mM urea 4 M DTT 5 ml a pH 8 0) ad un rapporto di 1/6 in peso/volume cosi da ottenere una sospensione fine Questa veniva centrifugata a 18 000 x g (massimo) per 20 minuti ed ilsovranatante veniva scartato La pallina era risospesa in tampone C (Hepes 2.5 mM urea 8 M , DTT 2 mM pH 8 0) ad un rapporto di 1/6 (in peso/volume) prima della sospensione si aggiungono iseguenti leupeptina (1 microg/ml) pepstatina (1 microg/ml) ed E64 (1 microg/ mi) La sospensione veniva centrifugata a 18 000 x g (massimo) per 30 minuti ed il sovranatante veniva separato per decantazione e tenuto da parte La palli na era risospesa in Hepes 25 ml1 % SDS a pH di o 0 b) Cromatografia

Il sovranaiante proveniente dalla frazione di urea 8M era diluito nel rapporto di 1/5 (volume /volu me) in Hepes 25 mM urea 8 M DTT 2 mM pH di 80 e frazionato su di una colonna di Q Sepharose di 7 ml Le proteine venivano eluite con un gradiente salino di NaCl 01 M La cromatografia e la manipolazione dei dati erano controllate mediante un FPLC (Pharmacia) Il DX113 viene eluito a circa 500 mM NaCl e risulta virtualmente omogeneo all analisi effettuata con i saggi SDS PAGE e Western blot

Esempio 9

Purificazione di polipeptide BHC 5 Cellule Sf9 (2 x 109) venivano infettate con un quantitativo del virus ricombinante BHC 5 (mol 5) Dopo incubazione a 28°C per due giorni le cellule venivano raccolte mediante centrigugazione e quindi sottoposte a trattamento nel modo seguente

a) Estrazione

La massa di cellule umide (12 g) veniva riso spesa in 6 mi di tampone A (Hepes 25 mil DTT 5 mfl leupeptìna 1 microg/ml pepstatina 1 microg/ml E64 1 microg/ml pH 80) Le cellule risospese erano collocate su ghiaccio e sottoposte a trattamento ultra sonico per mezzo di mpulsi di 3 x 15 secondi (ampiez za di 6 micrometri da picco a picco) interdispersi con periodi di riposo della durata di 30 secondi La sospensione sottoposta a trattamento ultrasonico veniva centrifugata a 18000 x g (massimo) per 20 minuti ed il sovranatante era scartato La pallina era riso spesa in tampone A più 6 mi di urea 4M e centrifugata a 18 000 x g (massimo) per 20 minuti II sovranatan tee/a scartato e la pallina venivariestratta con tampone A più 6 ml diurea 8M. Dopo centrifugazione a 18000 x g (massimo) per 30 minuti il sovranatante era trattentuo e diluito nel rapporto 1/6 in tampone A più urea 8M Questo estratto veniva sottoposto a cromatografìa su di una colonna mono Q in equilibrio nel medesimo tampone La colonna veniva eluita con un gradiente salino (NaCl..0-1,CLM) su 12 volumi di colonna BHC-5 veniva eluito a concentrazione di NaCl di circa 045-0 55 M ed era di purezza maggiore del 90 % come si poteva giudicare mediante il saggio SDS PAGE La resa era di circa 70 %

Esempio 10

Funzionante di polipeptidi di DX113 e BHC 5 e BHC-7 in un saggio ELISA

Piastre per microelisa (96 pozzetti Nunc) erano direttamente rivestite in un tampone di bicarbonato 50 ml (bicarbonato sodico 50 mi e carbonato sodico 50 m titolato fino a pH di 95) con un mate riale di scissione di urea 6 greggio di BHC 5 ovve ro con pDX113 purificato Le piastre erano bloccate con BSA allo 02 % e poi tenute in incubatrice per 30 minuti a 37°C con sieri diluiti nel rapporto di 1/20 (baculo) ovvero di 1/100 (Escherichia coli) Dopo la vaggio in Tween soluzione salina (soluzione salina allo 085 % Tween 20 allo 005 %, Bronidox allo 001 %) le lastre venivano tenute in incubazione con immunoglobulina anti umana capra coniugati con perossida si ( 1/2000.) per 30 minu ti alla temperatura di 37°C Le piastre erano poi lavate in Tween-soluzione salinae sviluppate per colorazione medìante aggiunta del substrato croniogeno TMB (tetrametiIbenzidina-HC1) (100 mierolitri/pozzetto) e tenendo in incubazione per 20 minuti alla temperatura ambiente La reazione era interrotta con 50 microlitri di acido solforico 2M e si determinava il valore di0D45Q (tabella 4) Tabella 4

ELISA con Ig anti umana indiretta per la rivelazione di anticorpo NANB

(segue tabella)

I sieri dai pazienti ad alto rischio di infe zione di PT NANBH (IVDA emofiliaci) venivano sottoposti a saggio come descritto tutti i dati sono e spressi come letture di OD450 con 11 donatore accreditato come controllo negativo

Di questo gruppo particolare di sieri 10/ 19 sono positivi su entrambe le fasi solide

In aggiunta DX113 purificato veniva coniuga to a fosfatasi alcalina usando la riduzione SATA/maleimmide e si stabiliva un saggio immunometrico Sieri noti positivi e negativi per NANB venivano diluiti come indicato in siero di donatore accreditato e venivano aggiunti quindi ad una fase solida rivestita con BHC-7 0 simultaneamente o dopo Incubazione (30 minuti a 37°C) soggiungeva il coniugato DX113 (50 microlitri, rapoorto 1/2000). Dopo incubazione a 37 per 30 minuti, le lastre erano.Lavate con soluzione tampone di bicarbonato 50 mM e il colore venlca sviluppato usando il sistema di ampliflcazione IQ Bio e si determinava 0D492 (tabella 5)

TABELLA 5 Saggio ELISA immunometrico (pollpeptide marcato) per la rivelazione di antlcorpo di NANB

Perciò con il formato da saggio - immunoglobulinico o immunometrico - tutti i campioni ad alto rischio fornirono risultati concordanti

ESEMPIO 11

Formulazione di vaccino

Una formulazione di vaccino può essere prepa rata mediante tecniche convenzionali impiegando i se guenti costituenti nelle quantità indicate

Esempio 12

Produzione di anticorpì monoclonali per polipeptidi PT NANBH

L elemento inserito di DNA proveniente da DM415 veniva sub-clonato cosi da ottenere il vettore p36C di trasferimento di baculoviruse virus ricombinante prodotto mediante un procedimento che è essenzialmente analogo a quello descritto nell esempio 7 Il virus ricombinante era indicato col termine di BHC 1 ed esprimeva livelli molto bassi dì proteina specifica di PT NANBH Cellule Sf-9 (5 x 107 cellule/ mi) infettate con BHC 1 erano sottoposte a scissione in PBS contenente 1 % in volume/volume di NP40 e sot toposte a centrifugazione a 13000 x g per 2 minuti Il sovranatante era fatto passare su Extractigel D (Pierce Chemicals) per rimuovere il detergente e poi miscelato come emulsione nel rapporto di 1/1 con mezzo ausiliario di Preund completo Topi vanivano sot toposti ad iniezione per via sottocutanea con 01 ni di emulsione (equivalenti a 5 x 10 cellule) A 14 giorni e 28 giorni dopo 1 iniezione i topi venivano sottoposti a richiamo con iniezione.per via intrape ritoneale di 01ml( equivalenti a 5 x 10 cellule) d ì un estratto privo di.detergente di cellule Sf 9 infettate con 3HC-5 II BHC 5 contiene l elemento in sento di DNA di DM416 Si effettuavano prellevi di sangue per il saggio dalla coda e il saggio veniva effettuato nei riguardi dell'attiviità anti PT NANBH in un saggio con ELISA (esempio 10) Due topi conrisposta specifica a PT NANBH erano ulteriormente sot toposti a richiamo mediante inizione per via endovenosa.con.un estratto privo di detergente di cellule Sf-9 infettate con BHC7 BHC 7 contiene un elemento inserito di DNA prodotto legando insieme le regioni di sovrapposizione di DM415 e di DM416 (esempio 7) Le milze venivano rimosse tre giorni più tardi

Le cellule dì milza venivano fuse con cellule di mieloma NSo in presenza di PEG1500 mediante l in piego di tecniche standard Le risultanti cellule di ibridoma venivano selezionai·3 mediante crescita in ΗΛΤ {ipoxantina amminopterina timidina) A 1014 giorni dopo la fusione i sovranatanti veniva sottopo stì a discriminazione mediante LLISM per l attività anti-PT JAJ3H I pozzetti che mostravano reattività sia con antigeni DX113 che BHC 7 (esempio 10) veniva no identificati e colonie individuali °rano trasferite a pozzetti separati fatte crescere e nuovamente sottoposte al saggio I pozzetti che mostravano reattività specifica in questo stadio erano ulteriormente sottoposti a clonazione a diluizione limitata al lo scopo di assicurare la monoclonalità

Esempio 13

Rivelazione di acido nucleico virale di PT NANBH in pazienti siero positivi

Sieri campioni di donazione provenienti da 1400 donatori,coinvolti in uno studio in prospettiva di epatite post-trasfusionale erano congelati a temperatura di 20°C Campioni di pre-trasfusione e campioni in serie post-trasfusionali provenienti dai 260 recettori erano analogamente conservati I campioni post trasfusionali venivano raccolti ogni 15 giorni fino a 3 mesi mensilmente fino a 6 nesi e ogni o me si più tardi fino a 18 mesi Sieri congelati di dona tore e recettore da tre casi di PT-NANBH che si veri ficavano nel 1981 erano anche disponibili per lo studio La diagnosi di PT NANBH era basata sulla salita della amminotransferasi di alanina nel siero (ALT) fino a superare ai 25 volte il limite superiore del normale in almeno due campioni separati post trasfu sionali Altri virus epatotropici erano esclusi me diante saggio sierologico e veniva escluse la cause non virali di danno epatocellulare mediante studi convenzionali clinici e di laboratorio.

Saggio immunologico Campioni di siero veniva provatiretrospetti vanente per la presenza di anti corpi per HCV (C100 antigene)con il corredo Ortho Diagnostics ELISA im iegato in..accordo con le istruz ioni del fabbricante Sieri ripetutanente reattivi venivano titolati ai punti finali in un siero umano negativo per anti C100

Rivelazione di sequenza virali di PT-NANBH RNA di siero o di plasma veniva estratto sottoposto a trascrizione inversa ed amplificato come più sotto verrà descritto I primer 011gonucleotidici di tra scrizione inversa/PCR erano derivati dalla sequenza nucleotidica del clone JG2 isolato nell esempio 3 e sintetizzato in un sintetizzatore Applied Biosystems 381 A Le sequenze dei 4 primer olìgonucleotidici erano come segue

1) Estrazione dell RNA

5 50 microlitri di siero (o plasma) venivano portati a 200 microlitri aggiungendo acqua distillarla sterile II campione da 200 microlitri veniva ag giunto ad un volume eguale di tampone 2 x PK (2 x PK Tr isCL 02 M a pH 75 EDTA 25 mM NaCl 0 3 il é u ìn peso/volume di SDS 200 microg/ml di proteinasi K ) miscelati e posti in incubazione a 37°C per 40 minuti Le proteine veniva rimosse estraendo due vol te con fenolo/cloroformio ed una volta con clorofor mio da solo 20 microg di glicogeno veniva aggiunti alla fase acquosa e poi l RNA precipitava per aggiunta di 3 volumi di etanolo assoluto raffreddato con ghiaccio Dopo conservazione a 70°C per l ora l RNA era ridotto in una pallina in una centrifuga Eppendorf (15 minuti 1400 giri per minuto 4°C) La pallina veniva lavata una volta in etanolo al 95 % essiccata sotto vuoto e disciolta in 10 microlitri di acqua di stillata sterile Le soluzioni di RNA venivano conser vate a 70°C

ii) Sintesi del cD NA

Una miscela di 10 microlitri veniva preparata contenente 2 microlitri della soluzione di RNA 50 ng di oligonucleo ide sintetico d95 Hepes 10 m a p o 9 e EDTA 02 m a pH 30 Questi 10 m crolitri di miscela venivano ricoperti con 2 gocce di olio mine rale riscaldati per 2 minuti in un bagno d acqua a 90°C e raffreddati rapidamente su ghiaccio. Lasinte si del cDNA era effettuata dopo aver regolato la m i s ce I a di reazione in modo da contenere Tri s H C l 50 mM a pH 75,K Cl 75 mM,MgCl2 3 ml DTT10 mM 05 mM di ognuno di dATP dCTP dGTP e dTTP, 20 unità di inibitore di RNasi (Pharmacia) in un volume finale di 20 microlitri La miscela di 20 microlitri veniva posta in incuibazione a 37°C per 90 minuti Dopo l a sin tesi il cDNA veniva conservato a -20°C

iii) PCR Nested I Mediante questo studio veni vano evitati i ri sultati PCR falsamente positivi a mezzo di una stret ta applicazione delle misure per evitare la contami nazione di Kwok e Higuchi (Nature 1989 vol 339 237 238)

a) Serie 1

La reazione a catena con polimerasi veniva ef fettuata in una miscela di 50 microlitri contenente Tris HC110 m a pH 8 a KC150 m NgC l2 15 mM 0 1 % in peso/volume di gelatina 1 unità di Taq DNA po imerasi ricombinante (Perkin E1mer Cetus) dNTP 200 m icro 30 ng di ciascun primer esterno (d94 e d95 SEQ ID No 8 e 9 rispettivamente) e 5 microlitri del la soluzione di cDNA Dopo una denaturazione inizia le di 5 minuti a 94°C si effettuavano 35 cicli a 95 °C per 1 ,2minuti a 56°C per 1 minuto, a 72°C per 1 minuto, seguiti da un prolungamento finale di 7mi nut ì a 72°C (Techne PHC 1 Automated Thermal Cycler) b) Serie 2

La miscela di reazione era come è stata descrit ta sopra per la Serie 1 ma si usavano 125 ng di cia scun primer interno N1 e N2 ( SEQ ID No 10 ed 1 1 rispett ivamente) al posto dei primer esterni d94 e d95 .Una quantità aliquota di 1 microlìtro deipro_ dotti PCR della Serie 1 veniva trasferita nella miscela di reazione di 50 mierolitri della Serie 2 Si ef_ fettuavano 25 cicli di 95°C per 1,2 minuti 46°C per 1 minuto 72°C per 1 minuto seguiti da un prolungamen to di 7 mìnuti a 72 °C

c ) Analisi

20 microlitri dei prodotti PCR della Serie 1 e della Serie 2 venivano analizzati mediante elettrofo resi su di un gel di agarosio al 2 % Le bande veniva no visualizzate mediante colorazione con bromuro di etidio e fotografate a 302 nm

Valore previsto della sierologia anti HCV e di PCR nello studio riguardante il fuiuro Sei dei 1400 donatori (043 %) arruolati nello studio per il futuro venivano trovati possedere anticorpi per C 100 nel loro siero Di questi sei donatori con anticorpi positivi si provava che solamente un donatore (il donatore D6) era infettivo come veniva giudicato dallo sviluppo della sieroconversione di PT-NANBH e C 100 in un ricevente (ricevente R6) si veda la tabella 6 qui sotto

Le sequenze virali erano rivelate mediante PCR nel siero del donatore D6 ma in nessun altro degli altri 5 sieri di donatori sieropositivi II ricevente R6 che sviluppava la PT-NANBH aveva anche ricevuto sangue da altre sette donatori (da D7 a D13) Isieri provenienti da questi donatori venivano provati e si trovava che erano negativi sia agli anticorpi che a PCR

Esempio 14 Isolamento ed espressionee di sequenze aggiuntive di DNA di PT NANBH.

Le biblioteche lamda gt11 preparate nell esem pio 2 venivano anche discriminate con sieri provenien ti da pazienti con elevato raschio per la PT NANBH ma che non reagivano con gli antigeni virali DX113 BHC 5 e BHC 7 il ragionamento essendo quello per cui es si potevano ben contenere anticorpi che riconoscevano antigeni diversi .Isieri, PJ 5 (The Newcastle Royal Infirmary Newcastle), Birm 64 (Queen Elizabeth ledical Centre Birmingham) PG e Le (University College and Middlesex School of edicine Londra) erano in ac cordo con questo criterio e venivano usati per discri minare le biblioteche seguendo la medesima tecnica de scritta negli esempi 3 e 4 Un certo numero di ricom binanti veniva così identificato nessuno dei quali si ibridava incrociatamente con le sonde preparate da JG2 e JG3 Uno dei ricombmanti BR11 identificato mediante reazione con PJ 5 veniva scelto per una ulteriore analisi .

Il clone, BR11 conteneva un inserto di circa iSOO coppie di basi che veniva amplificato mediante PCR usando i primer d75 e d76 [SEQ ID NO e 7] co_ me descr itto nel l esempio 7 La sequenza amplificata veniva clonata direttamente nel vettore di baculovi rus pAc360 per formare pDX128 contenente un riferimen to di Iettura aperto in fase con i primi 11 amminoacidi della poliedrina I ceppi di baculovirus ricombinanti (indicati come BHC-9) venivano prodotti seguendo la tecnica descritta nell esempio 7 Cellule di insetto venivano infettate con virus ncombinante purificato ed un polipeptide di circa 22 kD veniva ottenuto in estratti cellulari radiomarcati

L inserto amplificato di BR11 era anche clona to in vettore pUC13 e di fago M13 per formare la sequenza ì dati di DNA e della sequenza di amminoacidi sono presentati in SEQ ID NO 5 L inserto contiene 834 coppie di basiu piu i leganti EcoRU aggiunti du rante Ia clonazione

Esempio 15

Funzionalità del polipeptide BHC 5 in un sag gio ELISA

Un saggio ELISA veniva stabilito usando poz zetti da microtitolazione rivestiti con estratto cel lulare infetto con BHC 9 ed un sisterna di rivelazione di conìugato I ganti-umano seguendo la tescnica de_ scritta nell esempio 10.Un gruppo di sieri a rischio elevato veniva sottoposto a saggio in parallelo contro BHC 7 e BHC 9 ed inoltre veniva esaminato me dìante PCR impiegando la tecnica descritta nell esempio 13 I risultati sono mostrati in tabella 7 in cui i campioni positivi sono sottolineati

Di questi 20 campioni, il 50 % è chiaramente positivo con BHC 7 mentre 185 % è positivo con BHC-9 Due campioni (11 e 12) che sono al limite della posiitivi tà con BHC 7 sono chiaramente positivi con BHC 9 ed alcuni dei campioni al taglio o al di. sotto del taglio con BHC 7 soono positivi con BHC 9 Inoltre 2 campioni (11 e 15) che sono al confine o negativi con BHC-7 ma positivi con BHC 9 sono positivi con PCR In tutto vi sono solo due campioni (13 e 20) che sono I negativi con sia i polipeptidì che PCR

Esempio 16

Isolamento di sequenze di DNA di PT-NANBH che si sovrappongono a cloni esìstenti La discriminazione immunologica di biblioteche di espressione di cDNA descritte negli esempi 3 4 e 14 può identificare solamente quei cloni che conten gono una regione immunoreattiva del virus Un altro approccio alla produzione di cloni specifici per la PT NAN8H è quello di usare PCR per amplificare le molecole di cDNA che si sovrappongono ai cloni esister ti Gruppi di primer possono essere preparati in cu un membro della coppia si trova in sequenze clonate esistenti e l altro si trova al di fuori questo approccio può essere esteso pure alle coppie nested di primer

cDNA preparato come descritto nell esempio 1 veniva amplificato mediante PCR con coppie o singole o nested di primer usando le condizioni di rea zione descritte nell esempio 13 L approccio è ìllu strato mediante l'impiego delle seguenti coppie di primer d 164 (SEQ ID No 12) e d137 (SEQ ID NO 13), d136 (SEQ ID NO 14) e d155 (SEQ ID NO 15) d156 (SEQ ID NO 16) e d92 (SEQ ID NO 17) Un membro di calscuna doppia è progettato inmodo da agire come primer entro le sequenze clonate esistenti (d137 e d136 agiscono come primer entro le estremità 5 e 3 di 3R11 rispettivamente d92 agisce come primer all estremo 5 di JG3) Gli altri primer sono basati su sequenze disponibili per altri agenti PT-JANBH II primer d164 corrisponde alle basi da 10 a 31 della figura 2 in Okamoto et al Japan J Exp Ied

1990 voi 60 167 177 I primer d155 e d156 corri spondono alle posizioni da 462 a 489 e da 3315 a 3o37 rispettivamente nella figura 47 della domanda di bre veto europeo 883109225 Una o più sostituzioni di nu cleotidi erano effettuate per introdurre un sito di riconoscimento di EcoRI vicino all estremità 5 dei primer eccetto per il d164 dove veniva introdotto un sito di riconoscimento di Bg12 queste variazioni fa cilitano La successivarelonazione delprodotto amplificato

I prodotti di PCR venivano fatti digerire con l appropriato enzima o gli appropriati enzimi di restrrzione, risolti mediante elettroforesi su gel di agarosio e le bandedelle dimensioni aspettate veni vano tagliate e clonate in vettorisiadi plasmidi che dibatteriof agi come descritto nell esempio 5 Le sequenze dei DNA 164/137 (SEQ ID NO 18), 136/155 (SEQ ID N0 19) e 156/92 (SEQ ID NO 20) amplificati sono presentate nell elenco di sequenze. Queste nuove sequenze si estongo a ricoprire il genoma di PT NANBH oltre quello ottenuto mediante immunodiscri minazione (SEQ ID NO 3 4 e 5) Queste sequenze in sieme con altre che si trovano nelle regioni già de scritte possono essere combinate in una sequenza con tigua all estremità 5 (SEQ ID NO 21) e all estre m i tà 3 ( SEQ I D NO 22 ) de l genoma PT-NANBH Esempio 17

Fusione di diversi antigeni BT NANBH inun singolo polipeptide ricombinante

I dati presentati in taoella 7 moicano che mentre piu campioni di siero sono rivelati come anti corpo positivi usando 3HC 9 come antigene bersaglio (17/20) anziché BHC 7 (10/20) vi sono alcuni campio ni (per esempio il numero 4) che sono positivi sola mente con BHC 7 Questo quadro nasce da una più ampia prova dei campioni Pertanto vem va derivato un co struito di fusione usando la sequenza da BHC-7 e BHC 9

Le sequenzeda BHC 7 e BHC-9 possono essere combinate in una varietà di modi una sequenza può essere posizionata al terminale amminico della fusio ne risultante e la natura della sequenza legante può anche essere variata. La figura2 illustra due possibili modi in cui le sequenze possono essere combinate Appropriati frammenti di restrizione che reca no adatti siti enzimatici di restrizione e sequenze leganti venivano generati o mediante PCR usando primer specifici o mediante digestione con enzima di re Strizione di plasmidi esistenti II vettore di trasfe rimento DX143 consiste di un frammento BamHI/Pstl da DX122 (figura 1 il sito Pst è in posizione 1504 JG2 SEQ IO NO a) legato all estremo 5 dell intera re gione codificatrice di BR11 (SEQ ID NO 7) che è stato amplificato come frammento Pst1/BamH1 usando 1 primer d24 (SLQ ID C 2O) e d126 (ScQ ID 0 24) la regione di legame consiste di o amminoacidi derivati dal primer d126 e le sequenze residue di batteriofago lanbda II vettore di asferimento DX136 dif ferisce dal DX143 per il fatto che il frammento veniva generato impiegando d24 (SEQ ID NO 23) e d132 (SEQ ID NO 25) e così la regione di legame contiene 5 lisine. Questi vettori di trasferimento erano impeegati per co-transfettare cellule di ins etto Sf9 in coltura con DNA di AcNPV e materiali purificati su piastra di baculoviru s ricombinanti venivano prodotti, come descritto nell esempio 7 II BHC 10 veniva.prodotto come risltato della transfezione con DX143 il PHC 11 come risultato della transfezione con DX136

I polipeptidi ricombinanti espressi da questi due virus erano analizzati mediante SDS PAGE e Western blotting II 3HC 10 produceva un polipeptide con un peso molecolare apparente di 118 kD .Il BHC 11 produ ceva un polipeptide con peso molecolare apparente di 96 kD Entrambi i polipeptidi reagivano con sieri no ti per reagìre nel saggio ELISA soltanto con BHC 7 (per esempio il siero A) ovvero soltanto con BHC 9 (siero B64 esempio 14) I due polipeptidi differisco no soltanto nella sequenza legante e questo può in fluenzare la loro mobilità su SDS PAGE ovvero come essi sono sottoposti a trattamento nelle cellule in f ettate

Esempio 18

Funzionalità di antigeni di fusione di PT NANBH in un saggio ELISA

Un saggio ELISA veniva stabilito impiegando pozzetti da microtito1az1one rivestiti con estratti di cellule infettate con BHC 9 ed un coniugato Ig anti umano seguendo la tecnica che è descritta nell esempio U) La tabella 8 presenta i dati ottenuti da un paragone delle due fusioni con qli altri antiqeni' ricompinantiPT-NANBH e cioè BHC 7 e BHC 9 come pure la proteina ricombinante C 1003 di HCV (Ortho Dia gnostic Systemsm Raritan New Jersey) I sieri sono raggruppati mediante il modello di reazione con BHC 7 BHC-9 e C 1003 I sieri del gruppo I reagisco no fortemente con tutti e tre gli antigeni 1 grup po II reagisce fortemente con il solo BHC 7 il gruppo III reagisce fortemente con il solo BHC 9 mentre il gruppo IV reagisce fortemente con soltanto due dei tre antigeni

Tabella 8

(segue tabella)

* Questi campioni sono stati provati soltanto mediante il saggio di Western blotting su BHC 11

Questi dati mostrano che sia BHC 10 che BHC-11 hanno una analoga reattività con questi sieri e cosa assai importante che entrambe le attività anti geniche sembrano essere state trattenute dalle fusio ni Tutti i sieri nei gruppi II e III che reagiscono soltanto con BHC 7 o con BHC 9 rispettivamente dan no una chiara reazione con le fusioni Inoltre vi è una indicazione secondo la quale il fatto di avere ì due antigeni insieme fornisce un saggio piu sensi bi le Peresempio il campione KT fornisce valori di OD di i 57 e 027 con BHC 7 e BHC 9 rispettivamente mentre con le fusioni il valore di OD è maggiore di 20 SEQ ID NO. 1

Tipo di sequenza nucleotidica

Lunghezza di sequenza 21 basi

filamento singolo

topologia lineare

tipo di molecola DNA sintetico

Organismo come fonte originaria batteriofago landa gt11

Sorgente sperimentale immediata sintetizzatore oli gonucleotìdìco oligo d19

Caratteristiche

da 1 a 21 basi omologhe alla porzione a monte del gene lacZ a fianco del sito EcoRI nel batteriofago lambda gt11

Proprietà innesca la sintesi del DNA dal fago vettore cosi da formare cDNA inserito nel sito di EcoRI

SEQ ID NO 2

Tipo di sequenza nucleotidica

Lunghezza di sequenza 21 basi

Filamento singolo

Topologia lineare

Tipo di mol ecola DNA sintet ico Organismo come sorgente originari a batteriofago lambda gt11

Sorgente sperimentale immediata sintetizzatore oligonucleotidico oligo d20

Caratteristiche da 1 a 21 basi omologhe fino alla porzione a valle de1 gene lacZ a fianco del sito EcoRI nel batteriofago lambda gt1 1

Proprietà innesca la sintesi del DNA dal fago vettore così da formare cDNA inserito nel sito di EcoRI

SEQ ID NO 3

Tipo di sequenza nucleotidica con Ia proteina cor rispondente

Lunghezza di sequenza 1770 coppie di base

F ilamento singolo

Topologia lineare

Tipo di molecola cDiA per RIA genomico

Organismo sorgente originaria umano siero infetti vo per l epatite non A non B,post trasfusionale Sorgente sperimentale immediata clone JG2 da una bi blioteca cDNA in lambda gt11

Caratteristiche porzione da 1 a 1770 coppie di base della poliproteina di PT NΑΝΒΗ Proprietà, probabilmente codifica le proteine non strutturali virali

SE Q ID NO 4

Tipo di sequenza nucleotidica con la proteina corri spondente

Lunghezza di sequenza 1035 coppie di base Filamento singolo

Topologia lineare

Tipo di molecola cDAN per RNA genomico

Organismo sorgente originaria umano siero infetti vo per l epatite non A non B post-trasfusionale Sorgente sperimentale immediata clone JG3 dallabiblioteca di cNDA nel lambda gt11

Caratteristiche porzione da 1 a 1035 coppie di base della poliproteina PT-NANBH

Proprìetà probabilmente codifica le proteine non strutturali virali

SEQ ID NO 5

Tipo di sequenza nucleotidica con la proteina cor rispondente

Lunghezza di sequenza 834 coppie di base

Filamento singolo

Tipologìa lineare

Tipo di molecola cDNA per RNA genomico Organismo fonte originaria umano siero infettivo per epatite non A non 3 post trasfusionale Sorgente sperimentale immediata clone BR11 dalla bi blioteca cDNA in lambda gt11

Caratteristiche Porzione da 1 a 834 coppie di base della poliproteina di PT NANBH

Proprietà probabilmente codifica le proteine strut_ turali virali

-

SEQ ID NO 6

Tipo di sequenza nucleotidica

Lunghezza di sequenza 31 basi

Filamento singolo

Topologia lineare

Tipo di molecola DNA sintetico

Organsimo fonte originaria il batteriofago lambda gt11

Fonte sperimentale immediata sintetizzatore oligo nucleotidico oligo d75

Caratteristiche

sito da 4 a 9 basi BAmHI

basi da 10 a 31 omologhe alla porzione a monte del gene lacZ a fianco del sito EcoRl nel batteriofago lambda gt11

sito da 26 a 31 basi EcoRl

Proprietà innesca la sintesi del DNA dal fago vet

tore cosi da formare cDJA inserito nel sito EcoRI ed introduce un sito BamHI adatto per la susseguente ciò nazione a formare vettori di espressione

SEQ ID NO 7

Tipo di sequenza nucleotidica Lunghezza di sequenza 30 basi Fìlamento singolo Topologia lineare Tipo di molecola DNA sintetico Organismo fonte originaria il batteriofago lambda gt11

Fonte sperimentale immediata sintetizzatore oligonu cleotidico oligo d76 Caratteristiche

sito da 4 a 9 basi BamHI da 10 a 30 basi omologhe alla porzione a valle del gene lacZ a fianco del sito EcoRI nel batteriofago lambda gt11 Proprietà innesca la sintesi del DNA dal fago vetto re così da formare cDNA inserito nel sito EcoRI ed introduce un sito BamHI adatto per la susseguente ciò nazione a formare vettori di espressione

SEQ ID NO 8

Tipo di sequenza nucleotidica

Lunghezza di sequenza 19 basi

Filamento singolo

Topologia lineare

Tipo di molecola DNA sintetico

Organismo fonte originaria umano siero infettivo, per epatite non A, non B post trasfusionale Fonte sperimentale immediata sintetizzatore oligonu cleotidico oligo d94

Caratterìstìche

da 1 a 19 basi omologhe alle basi da 914 a 932 del filamento di senso di JG2 (SEQ ID NO 3) Proprietà innesca la sintesi del DNA sul filamento negativo di RNA/DNA genomico diPT-NANBH_

SEQ ID NO 9

Tipo di sequenza nucleotidica

Lunghezza di sequenza 24 basi

Filamento singolo

Topologia lineare

Tipo di molecola DNA sintetico

Organismo fonte originaria umano siero infettivo per 1 epatite non A non 3 post trasfusionale Fonte sperimentale immediata sintetizzatore oligonu cleotidico oligod95

Caratteristiche

da 1 a 24 basi omologhe alle basi da 1620 a 164o del filamento antìsenso di JG2 (SEQ ID 10 3) Proprietà innesca la sintesi del DNA sul filamento positivo di RNA/DNA genomico di PT NA 1BH

SEQ ID NO . 10 .

Tipo di sequenza nucleotidica

Lunghezza di sequenza 17 basi

Filamento sìngolo

Topologia lineare

Tipo di molecola DNA sintetico

Organismo fonte originaria umano siero infettivo per epatite non A non B, post trasfusionale Fonte sperimentale immediata sintetizzatore oligonu cleotidico oligo N1

Caratteri stiche

da 1 a 17 basi omologhe alle basi da 1033 a 1049 del filamento di senso di JG2 (SEQ ID NO 3) Proprietà innesca la sintesi del DNA sul filamento negativo di RNA/DNA genomico di PT NANBH

SEQ ID NO 11

Tipo di sequenza nucleotidica

Lunghezza di sequenza 17 basi

Filamento singolo Topologia lineare Tipo di molecola DNA sintetico Organismo fonte origina n umano siero infettivo per epatite non A non B e post trasfusionale Sorgente sperimentale immediata sintetizzatore oligonucleotidico, oligo N2

Caratteristiche

da 1 a 17 basi omologhe alle basi da 1421 e 1437 del filamento anti -sens di JG2 (SEQ ID N0 3) Proprietà innesca la sintesi del DNA sul filamento positivo di RNA/DNA genomico di PT NAN8H

SEQ ID NO 12

Tipo di seguenza nucleotidica

Lunghezza di sequenza 22 basi

Filamento singolo

Topologia lineare

Tipo di molecola DNA sintetico

Organismo fonte originaria umano siero infettivo per epatite non A non B post trasfusionale

Fonte sperimentale immediata sintetizzatore oligonu cleotidico oligo d104

Caratteristiche

da 1 a 22 basi omologhe alle basi da 10 a 31 della sequenza in figura 2 di Okamoto et al Japan o Exp Med 1990 vol 60 167-177 la base 22 variata da A in T allo scopo di introdurre il sito di ricono scimento Bg12

sito di riconoscimento di Bg12 da 8 a 13 basi Proprietà innesca la sintesi del DNA sul filamento negativo di RNA/DNA genomico di PT NANBH ed introduce un sito Bg12

SEQ ID NO 13

Tipo di sequenza nucleotidica.

Lunghezza di sequenza 30 basi

Filamento singolo

Topologia lineare

Tipo di molecola DNA sintetico

Organismo fonte originaria umano siero infettivo per epatite non A non B post-trasfusionale

Fonte sperimentale immediata sintetizzatore oligonu cleotidico oligo d137

Caratterist iche

da 1 a 30 basi omologhe alle basi da 154 a 183 del filamento negativo di BR11 (SEQ ID NO 5) basi 174 177 e 178 modificate per introdurre un sito di ricono scimento EcoRI

sito di riconoscimento EcoRI da 5 a 10 basi

Proprietà innesca la sintesi del DNAsul filamento positivo dell RNA /DNA genom co di PT A BH ed intro duce un sito EcoRI per la clonazione

SEQ ID NO 14

Tipo di sequenza nucleotidica

Lunghezza di sequenza 27 basi.

Filamento singolo

Ippologia lineare

Tipo di molecola DNA sintetico

Organismo fonte originaria umano siero infettivo per epatite non A non B post trasfusionale Sorgente sperimentale immediata sintetizzatore oli.gonucleotidico oligo d136

Caratteristiche

da 1 a 27 basi omologhe alle basi da 672 a 698 del filamento positivo di BR11 (SEQ ID NO 5) base 675 cambiata in G per introdurre un sito di riconoscimento EcoRI

sito di riconoscimento EcoRI da 4 a 9 basi Proprietà innesca la sintesi del DIA sul filamento negativo dell RNA/DNA genomico di PT NANBH ed intro duce un sito EcoRI per la clonazione

SEQ ID NO 15

Tipo di sequenza nucleotidica

Lunghezza di sequenza 28 basi

Filamento singolo

Topologia lineare

Tipo di molecola DNA sintetico

Ojrganismo sorgente originaria scimpanzè siero in fettivo per l epatite non A non B post trasfusionale So rgente sperimentale immediata intetizzatore oli gonuc 1eotidico oligo d155

da1 a 28 basiamologhe alle basi da 462 a 489 del filamento negativo di figura 47, domanda di brevetto europeo No 88310922 5 le basi 483 e 485 erano variate per introdurre un sito di riconoscimento EcoRI Sito di riconoscimento EcoRI da 5 a 10 basi Proprietà innesca la sintesi del DNA sul filamento positivo dell RNA/DNA genomico di PT NANBH ed introduce un sito EcoRI per la clonazione

SEQ ID NO 16

Tipo di sequenza nucleotidica

Lunghezza di sequenza 23 basi

Filamento singolo

Topologia lineare

Tipo di molecola DNA sintetico

Organismo sorgente originaria scimpanzè siero infet tivo per l epatite non A non B post-trasfusionale Sorgente sperimentale immediata sintetizzatore oli gnucleotidico oligo d156

Caratteristiche

da 1 a 23 basi omologhe alle basi da 3315 a 3337 del filamento positivo della figura 47,domanda di brevet to europeo No 833109225 la base 3323 variva in C per i ntrodurre un sito di riconoscimento EcoRI sito di riconoscimento EcoRI da 4 a 9 basi Proprietà innesca la sintesi delDNA sul filamento negativo dell'RNA/DNA genomico di PT NANBH ed intro duce un sito EcoRI per la clonazione.

SEQ ID NO 17

Tipo di sequenza nucleotidica

Lunghezza di sequenza 29 basi Filamento singolo Topologia lineare Tipo dimolecola DNA sintetico Organismo fonte originaria umano siero infettivo per epatite non A non B post trasfusionale Sorgente sperimentale immediata sintetizzatore oli gonucleotìdìco oligod92

Caratteristiche

da 1 a 29 basi onologhe alle basi da 36 a 64 del fila mento negativo di JG2 (SEQ ID NO 3) basi 57 58 e 60 variate per introdurre un sito di riconoscimento EcoRI

sito di riconoscimento EcoRI da 5 a 10 basi Proprietà innesca la sintesi del DNA sul filamento positivo dell RNA/DNA genomico di PT-NANBH ed introduce un sito EcoRI per la clonazione

SEQ ID NO 18

Tipo di sequenza nucleotidica con proteina corrispondente

Lughezza di sequenza 504 coppie di base

Filamento singolo

Tipo di molecola cDNA per RNA genonico

Organismo fonte originaria umano siero infettivo per epatite non A non B post trasfusionale Sorgente sperimentale immediata clone 164/137 Caratteristiche

da 300 a 504 coppie di base l inizio della poliprotei na di PT MN3H

Proprietà probabilmente codifica le proteine strut turali virali

(segue sequenza)

SEQ ID NO 19

Tipo di sequenza nucleotidica con proteina corri. spondente

Lunghezza di sequenza 1107 coppie di base Filamento singolo

Topologia lineare

Tipo di molecola cDNA per RiiA genomico

Organismossorgente originaria umano siero infetti vo per epatiti non A non B post-trasfusionale

Sorgente sperimentale immediata clone 18/165 Caratteristiche

da 1 a 1107 coppie di base porzione della poliprotei na PT NΑNBH

Proprietà probabilmente codifica le proteine strut turali virali

SEQ ID NO 20

Tipo di sequenza nucleotidica con proteina corri spondente

Lunghezza di sequenza 2043 coppie di base

Filamento singolo

Topologia lineare

Tipo di nolecola cD A per R M genomico

Organismo sorgente originaria umano siero infettivo per l epatite non A non B post trasfusionale Sorgente sperimentale immediata clone 156/92 Caratteristiche

da 1 a 2043 coppie di base porzione della poliproteina di PT NANBH

Proprietà probabilmente codifica le proteine virali non strutturali

SEQ ID NO 21

Tipo di sequenza nucleotidica con proteina corri spondente

Lunghezza di sequenza 2116 coppie di base Filamento singolo

Topologia lineare

Tipo di molecola cDNA per RNA genomico

Organismo sorgente originaria umano sieroinfettivo per epatite non A non B post trasfusionale Sorgente sperimentale immediata contig formato da cloni cDNA dall estremità 5 del genoma Caratteristiche da 308 a 2116 coppie di base dipartenza della poliproteina di PT NANBH

Proprietà proteine virali strutturali e non struttu rali

SEQ ID NO 22

Tipo di sequenza nucleotidico con proteina corrispon dente

Lunghezza di sequenza 3750 coppie di base

Filamento singolo

Topologia lineare

Tipo di molecola cDNA per RNA genomico

Organismo sorgente originaria umano siero infettivo per epatite non A non B post trasfusionale

Sorgente sperimentale immediata contig formato da cloni cDNA dall estremità 3 del genoma

Caratteristiche

porzione da 1 a 3750 coppie di base della poliprotei na di PT NANBH

Proprietà proteine virali non strutturali

SEQ ID NO 23

Tipo di sequenza nucleotidico

Lunghezza della sequenza 23 basi

Filamento singolo

Topologia lineare

Tipo di molecola DNA sintetico

Organismo sorgente originaria baculovirus virus Auto grapha californica Nuclear Polyedrosis (AcNPV)

Sorgente sperimentale immediata sintetizzatore oli gonucleotidico oligo d24

Caratteristiche

da 1 a 23 basi omologhe alla porzione di gene poliedrinico AcNPV a valle del sito di clonazione BamH1 in pAc360 e simili vettori

Proprietà funziona da primer per la sintesi di DNA da sequenze di vettore di trasferimento di baculovi rus che affiancano il DNA inserito nel sito BamH1

SEQ ID NO 24

Tipo di sequenza nucleotidica

Lunghezza della sequenza 31 basi

Filamento singolo

Topologia lineare

Tipo di molecola DNA sintetico

Organismo sorgente originaria baculovirus Autographa Californica uclear Polyhedrosis virus (Ac PV) Sorgente sperimentale immediata sintetizzatore oli gonu cleotidico oligo d126

Caratter ìstiche

da 1 a 32 basi omologhe alle sequenze di giunzione a monte prodotte quando cDNA amplificato da d75 (SEQ ID 5) viene clonato nel sito clonante BamH1 in pAc360 e simili vettori disaccordi alle basi 13 e 14 introdu cono un sito Pst1

da 1 a 10 basi omologhe alla regione del sito BamH1 in pAc360 e simili vettori

da 4 a 9 basi sito BamHI

da 12 a 17 basisito Pst1

Proprietà agisce da primer nella sintesi diDNA alla giunzione di sequenze di vettore di trasferimento di baculov irus e sequenze precedentemente amplificate da oligo d75 introduce un sito diriconoscimento Pst1 per il successivo lavoro di clonazione

SEQ ID NO 25

Tipo di sequenza nucleotidica

Lunghezza della sequenza 45 basi

Filamento singolo

Topologia lineare

Tipo di molecola DNA sintetico

Organismo sorgente originaria n a

Sorgente sperimentale immediata sintetizzatore oli gonucleotidico oligo d132

Caratterìstìche

da 5 a 10 basi sito di riconoscimento Pst1

da 13 a 27 basi legante che codifica per 5 residui Lys

da 28 a 45 basi omologhe alle basi da 4 a 21 di BR11 (SEQ ID 7)

Proprietà agisce da primer per la sintesi di DNA all estremità 5 di BR11 ed introduce una sequenza sintetica che codifica per 5 lisine come pure un sito di riconooscimento Pst1 per il successivo lavoro di clonazione

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1. Polipept ide virale di PT NANBH che compren de un antigene avente una sequenza di amminoacidi che è almeno per il 90 % omologa con la sequenza di ammi noacidi stabilita in SEQ ID 10 o 45 13 1920 21 ovvero 22 ovvero un suo frammento antigemco 2 .Polipeptide virale di PT NANBH secondo la rivendicazione 1 in cui la sequenza di amminoacidi e almeno per il 90 % omologa con la sequenza di amminoacidi stabilita in SEQ ID NO a 4 ovvero 5 ovvero in un suo frammento antigenico 3. Polipeptide virale di PT NANBH secondo la rivendicazione 2 in cui la sequenza di amminoacidi è almeno per il 90 % omologa con la sequenza di ammino acidi stabilita in SEQ ID NO 3 ovvero 4 ovvero è un suo frammento antigeinico . 4. Polipeptide virale di PT NANBH secondo la rivendicazione 2 in cui la sequenza di amminoacidi è almeno per il 90 % omologa con la sequenza di ammino acidi stab ilta in SEQ ID NO 5 ovvero è un suo frani mento antigenico 5 .Polipeptide virale di PT NANBH secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti in cui la sequenza di amminoacidi è almeno per il 95 % omologa con la sequenza di amminoacidi stabilita nella SEQ ID NO ovvero è un suo frammento antigenico 6. Polipeptide virale di PT NA NBH secondo la rivendicazione 5 in cui la sequenza di amminoacidi è almeno per il 98 % omologa con la sequenza di annino acidi stabilita nella SEQ ID 10 ovvero è un suo frammento antigenico 7. olipeptide v ral° di PT NANBH comprendente un antigene proveniente dalla regione di codificazio ne strutturale del genoma virale ed un antigene prò veniente dalla regione di codificazione non struttu rale del genoma virale 8. Polipeptide virale di PT NANBH secondo la rivendicazione 7, in cui 1 antigene proveniente dal la regione di codificazione strutturale possiede una sequenza di amminoacidi che è almeno per il 90 % omo loga con la sequenza di amminoacidistabilita in SEQ. ID NO 5 oppure un suo frammento antigenico e l an _ tigene proveniente dalla regione di codificazione non strutturale possiede una sequenza di amminoacidi che è almeno per il 90 % omologa con la sequenza con la sequenza di amminoacidi stabilita in SEQ ID NO 3 ovvero 4 ovvero un suo frammento antigenico 9.Sequenza di DNA che codifica per un poli peptide virale di PT NANBH secondo una qualunque del le rivendicazioni da 1 ad 8 10. Sequenza di DNA secondo la rivendicazione 9 come stabilito in SEQ ID NO 3 4 o 131920 21 ov vero 22 11. Vettore di espressione contenente una se quenza di DNA secondo le rivendicazioni 9 e 10 e che è capace in un ospite appropriato di esprimere la sequenza di DNA per procurre un polipeptide virale di PT NANBH 12. Cellula ospite trasformata con un vettore di espressione secondo la rivendicazione 11 13. Procedimento per la produzione diun polipeptide virale di PT NANBH che comprende la clonazio ne o la sintesi diuna sequenza di DNA che codifica per un polipeptide virale di PT NANBH secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 ad 8 l inserimen to della sequenza di DNA in un vettore di espressio ne tale da essere capace di essere espresso in un ospite appropriato la trasformazione di una cellula ospite con il vettore di espressione, 1 operazione di porre in coltura la cellula ospite trasformata e l ' isolamento del polipeptide virale 14. Antìcorpo policlonale o monoclonale contro un polipeptide virale di PT ΝANBH secondo una qualun que delle rivendicaziοni da 1 a 6 15. Procedimento per la rivelazione di un aci do nucleico virale di PT NANBH il quale procedimento comprende i) l ibridazione dell RNA virale presente in un campione di prova ovvero cDNA sintetizzato a parti re da tale RNA con una sequenza di DNA che corrispon de alla SEQ ID NO 3 4 5 18 1920 21 ovvero 22 e la discriminazione dei risultanti ibridi di acido nucleico per identificare un qualunque acido nucleico virale di PT-NANBH ovvero ii) la sintesi di CDNA dall RNA virale presen te in un campione di prova l amplificazione di una sequenza di DNA preselezionato corrispondente ad una subsequenza dell SEQ ID NO 34 5 18 19 20 21 ovvero 22 e l'identificazione della sequenza di DNA presele zionata 16. Corredo di prova per la rivelazione di acido nucleico virale diPTNANBH che comprende i) una coppia di primer oligonucleotidici uno dei quali corrisponde ad una porzione della sequenza nucleotidica di SEQ IO NO 345 18,19 20 21 ovvero 22 e l altro dei quali è collocato sul lato 3 della prima e corrisponde ad una porzione della sequenza complementare la coppia definendo tra questi una se quenza di DNA preselezionata ii) un enzima di transcrittasi inversa per la sintesi di cDNA dall RNA campione di prova a monte del primer che corrisponde alla sequenza nucleotidica complementare di SEQ ID NO 345 18 1920 21 o 22 iii) un enzima capace di amplificare la sequen za di DNA preselezionata e facoltativamente iv) soluzioni di lavaggio ed agenti tamponanti dì reazione 17. Procedimento per la rivelazione di antige ne virale di PT NANBH o di anticorpo virale il quale procedimento comprende l operazione di porre a contatto un campione di prova con un polipeptide virale di PT-NANBH secondo una qualunque delle rivendicazio ni da 1 ad 8 ovvero un anticorpo policlonale o mono clonale secondo la rivendicazione 14 e l operazione di determìnare se vi sia una qualunque formazione di legame antigene anticorpo contenuti entro il campio ne sottoposto al saggio . 18. Corredo di prova per la rivelazione di un antigene virale di PT NANBH o di un anticorpo virale il quale corredo comprende un polipeptide virale di PT NANΒΗ secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 ad 3 ovvero un anticorpo policlonale o un anti corpo monoclonale secondo la rivendicazione 14 e mezzi per determinare se vi sia un legame antigene anticorpo contenuto entro il campione sottoposto al saggio 19. Formulazione di vaccino che comprende un polipeptide virale di PT NANBH secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 ad 8 in associazione con un veicolo farmaceuticamente accettabile 20. Procedimento per indurre immunità nell uomo a PT-NANBH, il quale procedimento comprende la somministrazione di una quantità efficiente di una formulazione di vaccino secondo la rivendicazione 19.