CH684594A5 - Agent viral. - Google Patents

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 684 594 A5

Description

La présente invention a trait à l'isolement et à la caractérisation de l'agent viral responsable de l'hépatite non-A non-B post-transfusionnelle (PT-NANBH) et en particulier aux polypeptides viraux PT-NANBH, aux séquences d'ADN codant ces polypeptides viraux, aux vecteurs d'expression contenant ces séquences d'ADN, et aux cellules hôtes transformées par ces vecteurs d'expression. La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une séquence d'ADN dans un essai d'hybridation d'acide nucléique pour le diagnostic de la PT-NANBH. La présente invention a trait, en outre, à l'utilisation de polypeptides viraux PT-NANBH ou d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux contre ces polypeptides dans une immunoanalyse pour le diagnostic de PT-NANBH ou dans un vaccin pour sa prévention.

L'hépatite non-A, non-B (NANBH) est, par définition, un diagnostic d'exclusion et a généralement été utilisée pour décrire des cas d'infection hépatique virale chez l'être humain qui ne sont pas dus à des virus d'hépatite A ou B. Dans la majorité de ces cas, la cause de l'infection n'a pas été identifiée bien que, pour des raisons cliniques et épidémiologiques, on ait pensé à un certain nombre d'agents qui pourraient être responsables, comme revu par Shih et al., (Prog. Liver Dis., 1986, 8, 433-452). Rien qu'aux Etats-Unis d'Amérique, jusqu'à 10% des transfusions sanguines peuvent avoir une NANBH comme conséquence, ce qui en fait un problème d'importance. Même pour la PT-NANBH, il peut y avoir au moins plusieurs agents viraux responsables de l'infection et au fil des années, les revendications quant à l'identification de l'agent n'ont pas manqué, mais aucune n'a été établie.

La demande de brevet européen 88 310 922.5 tend à décrire l'isolement et la caractérisation de l'agent étiologique responsable de la PT-NANBH que l'on appelle également, dans la demande, virus de l'hépatite C (HCV). Une bibliothèque d'ADNc a été préparée à partir d'acide nucléique viral obtenu d'un chimpanzé atteint de PT-NANBH et a été sélectionnée au moyen d'antisérums humains. Une série de clones positifs ont été isolés et séquencés. Les données de séquence d'acide nucléique et d'acide aminé en résultant et qui sont décrites dans la demande, représentent approximativement 70% du génome viral de 10kb et sont entièrement dérivées de son extrémité 3' correspondant à la région codante non structurée.

La Demanderesse a à présent isolé et caractérisé les polypeptides viraux de la PT-NANBH par le clonage et l'expression de séquences d'ADN codant ces polypeptides viraux. D'une manière surprenante, les données de séquence d'acide nucléique et d'acide aminé présentent des différences considérables avec les données correspondantes rapportées dans la demande de brevet européen 88 310 922.5. Dans l'ensemble, ces différences sont d'environ 20% au niveau de l'acide nucléique et d'environ 15% au niveau de l'acide aminé, mais certaines régions des séquences présentent même des différences plus importantes. Le niveau global de différence est plus important que ce que l'on attendrait pour deux isolats du même virus, même en tenant compte de facteurs géographiques, et peut s'expliquer par l'une des deux raisons possibles.

Tout d'abord, la Demanderesse de la présente invention et celle de la demande de brevet européen susmentionnée ont utilisé des sources différentes pour l'acide nucléique utilisé dans le clonage de l'ADNc. En particulier, la demande de brevet européen décrit l'utilisation de plasma de chimpanzé comme source du matériel de départ de l'acide nucléique viral, le virus ayant été transmis à un chimpanzé à deux occasions. La PT-NANBH est, bien sûr, une maladie humaine et le passage du virus dans un hôte étranger, même s'il est proche parent de l'homme, se traduira vraisemblablement par une mutation ample de l'acide nucléique viral. De ce fait, les données de séquence que contient la demande de brevet européen 88 310 922.5 peuvent ne pas être exactement représentatives de l'agent viral réel responsable de la PT-NANBH chez l'homme. Par contraste, la Demanderesse de la présente invention a utilisé l'acide nucléique viral d'une source de plasma humain comme matériel de départ pour le clonage de l'ADNc. Les données de séquence ainsi obtenues sont plus susceptibles de correspondre aux séquences natives d'acide nucléique et d'acide aminé de la PT-NANBH.

Deuxièmement, il peut se faire que l'agent viral existe sous la forme de plus d'un sous-type et que les données de séquence décrites dans la demande de brevet européen et celles élucidées par la Demanderesse de la présente correspondent à des sous-types séparés et distincts du même agent viral. Alternativement, il peut se faire que le niveau de différence entre les deux groupes de données de séquences soit dû à une combinaison de ces deux facteurs.

La présente invention donne un polypeptide viral PT-NANBH comprenant un antigène ayant une séquence d'acide aminé qui est pour au moins 90% homologue à la séquence d'acide aminé indiquée dans les SEQ ID n°: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 ou 22, ou en est un fragment antigénique.

Les SEQ ID n° 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 ou 22 indiquent la séquence d'acide aminé telle qu'on la déduit de la séquence d'acide nucléique. La séquence d'acide aminé sera de préférence homologue à au moins 95% ou même 98% avec la séquence d'acide aminé indiquée en SEQ ID n° 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 ou 22. Facultativement, l'antigène peut être fusionné avec un polypeptide héterologue.

Deux antigènes ou plus peuvent facultativement être utilisés soit en combinaison, soit fusionnés en un seul polypeptide. L'utilisation de deux antigènes ou plus de cette manière dans un essai de diagnostic donne des résultats plus fiables que l'utilisation de l'essai de criblage du sang pour le virus PT-NANBH. On obtiendra de préférence un antigène dans la région codante structurée (l'extrémité 5') et un autre dans la région codante non structurée (l'extrémité 3'). La préférence est donnée en particulier

2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 684 594 A5

à la fusion des antigènes entre eux pour donner un polypeptide recombiné. Cette dernière approche présente une série d'avantages en ce sens que les antigènes individuels peuvent être combinés dans un rapport fixe, déterminé à l'avance (habituellement équimolaire) et qu'il ne faut produire, purifier et caractériser qu'un seul polypeptide.

Un fragment antigénique d'un antigène ayant une séquence d'acide aminé homologue à au moins 90% avec ce qui est indiqué dans les SEQ ID n° 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 ou 22 contiendra de préférence un minimum de cinq, six, sept, huit, neuf ou dix, quinze, vingt, trente, quarante ou cinquante acides aminés. Les emplacements antigéniques de ces antigènes peuvent être identifiés au moyen de procédures types. Celles-ci peuvent impliquer la fragmentation du polypeptide lui-même au moyen d'enzymes protéolytiques ou d'agents chimiques et la détermination subséquente de l'aptitude de chaque fragment à se lier aux anticorps ou à provoquer une réponse immune en cas d'inoculation à un animal ou dans un système de modèle in vitro approprié (Strohmaier et al., J. Gen. Virol., 1982, 59, 205-306). Alternativement, l'ADN codant le polypeptide peut être fragmenté par digestion par des enzymes de restriction ou d'autres techniques réputées et ensuite introduit dans un système d'expression pour produire des fragments (facultativement fusionnés en un polypeptide généralement d'origine bactérienne). Les fragments qui en résultent sont 30 évalués comme décrit précédemment (Spence et al., J. Gen. Virol., 1989, 70, 2843-51; Smith et al., Gene, 1984, 29, 263-9). Une autre approche consiste à synthétiser chimiquement de courts fragments de peptides (longueur de 3-20 acides aminés; conventionnellement longueur de 6 acides aminés) qui couvrent la totalité de la séquence du polypeptide long avec chaque peptide chevauchant le peptide adjacent. (Ce chevauchement peut être à partir de 1-10 acides aminés, mais l'idéal est n-1 acides aminés, où n est la longueur du peptide; Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 1984, 81, 3998-4002). Chaque peptide est alors évalué comme décrit précédemment, si ce n'est que le peptide est généralement d'abord couplé à une molécule porteuse pour faciliter l'induction d'une réponse immune. Enfin, il y a des méthodes de prédiction qui comportent l'analyse de la séquence du point de vue de caractéristiques particulières, par exempie, l'hydrophilie, dont on pense qu'elles ont un rapport avec des emplacements importants immunologiquement parlant (Hopp et Woods, Proc. Nati. Acad. Sci., 1981, 78, 3824-8; Berzofsky, Science, 1985, 229, 932-40). Ces prédictions peuvent alors être testées par les approches du polypeptide ou du peptide recombiné décrites précédemment.

Le polypeptide viral sera, de préférence, fourni sous une forme pure, c'est-à-dire avec une pureté supérieure à 90%, voire 95%.

Le polypeptide viral PT-NANBH de la présente invention peut être obtenu au moyen d'un synthétiseur à acides aminés, s'il s'agit d'un antigène n'ayant pas plus d'environ trente résidus ou par la technologie de l'ADN recombiné.

La présente invention fournit également une séquence d'ADN codant un polypeptide viral PT-NANBH tel que défini ici.

La séquence d'ADN de la présente invention peut être synthétique ou clonée. La séquence d'ADN sera, de préférence, telle qu'indiquée dans la SEQ ID n° 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 ou 22.

Pour obtenir un polypeptide viral PT-NANBH comprenant de multiples antigènes, il est préférable de fusionner les séquences codantes individuelles en un seul cadre de lecture ouvert. La fusion devra, bien sûr, se faire de manière à ce que l'activité antigénique de chaque antigène ne soit pas compromise de manière importante par sa position par rapport à un autre antigène. On accordera, bien entendu, une attention particulière à la nature des séquences à l'endroit de la jonction entre les antigènes. Les méthodes d'obtention de tels polypeptides simples sont bien connues dans ce domaine.

La présente invention fournit également un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN telle que définie ici, et capable, dans un hôte approprié, d'exprimer la séquence d'ADN pour produire un polypeptide viral PT-NANBH.

Le vecteur d'expression contient normalement des éléments de contrôle de l'ADN qui réalisent l'expression de la séquence d'ADN dans un hôte approprié. Ces éléments peuvent varier en fonction de l'hôte, mais comprennent généralement un promoteur, un site de liaison aux ribosomes, des sites d'initiation et d'arrêt traductionnels et un site d'arrêt de la transcription. Des exemples de tels vecteurs sont les Plasmides et les virus. Les vecteurs d'expression de la présente invention comprennent à la fois des vecteurs extrachromosomiques et des vecteurs qui sont intégrés dans le chromosome de la cellule hôte. Pour utilisation dans des £. coli, le vecteur d'expression peut contenir la séquence d'ADN de la présente invention facultativement sous forme de fusion liée soit à l'extrémité 5' ou 3' de la séquence d'ADN codante, par exemple, la ß-galactosidase, soit à l'extrémité 3' de la séquence d'ADN codante, par exemple, le gène trp E. Pour utilisation dans le système de bacillovirus de l'insecte (AcNPV), la séquence d'ADN est facultativement fondue avec la séquence de programmation de la polyhédrine.

La présente invention fournit également une cellule hôte transformée avec un vecteur d'expression tel que défini ici.

Des exemples de cellules hôte utilisées avec la présente invention comprennent les cellules proca-ryotes et eucaryotes telles que cellules bactériennes, de levure, de mammifère et d'insecte. Des exemples particuliers de telles cellules sont les £. coli, les S- cerevisiae. les P. pastoris. des cellules d'ovaire de hamster chinois et de souris, et la Spodoptera fruqiperda et la Tricoplusia ni. Le choix de la cellule hôte peut dépendre d'une série de facteurs, mais si la modification post-traductionnelle du polypeptide viral PT-NANBH est importante, on choisira de préférence un hôte eucaryote.

3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 684 594 A5

La présente invention fournit également un procédé pour préparer le polypeptide viral PT-NANBH qui comprend le clonage ou la synthèse d'une séquence d'ADN codant le polypeptide viral PT-NANBH, tel que défini ici, insérant la séquence d'ADN dans un vecteur d'expression capable, dans un hôte approprié, d'être exprimé, de transformer une cellule hôte avec le vecteur d'expression, de faire une culture de la cellule hôte transformée et d'isoler le polypeptide viral.

Le clonage de la séquence d'ADN peut être effectué au moyen de procédures types bien connues dans ce domaine. Par ailleurs, il est particulièrement avantageux dans ces procédures d'utiliser les données de séquence révélées ici de manière à faciliter l'identification et l'isolement des séquences d'ADN clonées souhaitées. L'ARN sera isolé, de préférence, en rassemblant en culot le virus à partir de plasma d'humains contaminés identifiés par implication dans la transmission de PT-NANBH. L'ARN isolé fait l'objet d'une transcriptase inverse dans l'ADNc par amorçage sélectif ou par oligo-dT. Facultativement, l'ARN peut être soumis à une étape de prétraitement pour en retirer toute structure secondaire qui pourrait interférer avec la synthèse de l'ADNc, par exemple, par chauffage ou par réaction avec de l'hy-droxyde mercurique de méthyle. L'ADNc est habituellement modifié par addition de lieurs suivie d'une digestion avec une enzyme de restriction. Il est alors inséré dans un vecteur de clonage tei que le pBR322 ou un dérivé de celui-ci ou les vecteurs lambda gt10 et gt11 (Huynh et al., DNA Cloning, 1985, volume 1: A Practical Approach, Oxford, IRC Press), conditionné en virions le cas échéant, et les molécules d'ADN résultant de la recombinaison utilisées pour transformer les £. eoli et donc générer la bibliothèque souhaitée.

La bibliothèque peut être examinée de manière sélective en utilisant une stratégie de sélection type. S'il s'agit d'une bibliothèque d'expression, elle peut être examinée sélectivement au moyen d'une méthode immunologique avec des antisérums obtenus à partir de la même source de plasma que le matériel de départ de l'ARN et également avec des antisérums provenant de sources humaines supplémentaires supposées positives pour des anticorps contre la PT-NANBH. Etant donné que les antisérums humains contiennent généralement des anticorps contre les E. coli qui peuvent donner lieu à un important mouvement propre pendant la sélection, il est préférable de les traiter d'abord avec un lysat d'E- eoli non transformé de manière à retirer ces anticorps. Il est avantageux d'avoir recours à un contrôle négatif au moyen d'antisérums provenant de donneurs humains accrédités, c'est-à-dire des donneurs humains ayant été soumis à des tests répétés et ne présentant pas d'anticorps contre l'hépatite virale. Une stratégie de sélection alternative serait d'utiliser un ou plusieurs oligonucléotides marqués comme sondes d'hybridation. L'utilisation d'oligonucléotides dans l'examen sélectif d'une bibliothèque d'ADNc est généralement plus simple et plus fiable que la sélection avec des antisérums. Les oligonucléotides sont synthétisés de préférence en utilisant les informations de la séquence d'ADN contenues ici. Un ou plusieurs tours de criblage supplémentaires d'une sorte ou de l'autre peuvent être effectués pour caractériser et identifier les clones positifs.

Après avoir identifié un premier clone positif, la bibliothèque peut être réexaminée sélectivement pour détecter des clones positifs supplémentaires en utilisant le premier clone comme sonde d'hybridation. Alternativement ou en sus, d'autres bibliothèques peuvent être préparées et celles-ci peuvent être sélectionnées au moyen d'immunosélecteurs ou de sondes d'hybridation. De cette manière, on peut obtenir d'autres séquences d'ADN.

Alternativement, la séquence d'ADN codant le polypeptide viral PT-NANBH peut être synthétisée au moyen de procédures types et cette solution peut être préférée au clonage de l'ADN dans certaines circonstances (Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, 1984, Oxford, IRL Press).

Donc, clonée ou synthétisée, la séquence d'ADN souhaitée peut être insérée dans un vecteur d'expression utilisant des techniques types connues. Le vecteur d'expression est normalement coupé au moyen d'enzymes de restriction et la séquence d'ADN insérée au moyen d'une ligature à extrémités franches ou collantes. La coupure est généralement réalisée en un site de restriction dans une position adéquate dans le vecteur d'expression de manière à ce qu'une fois insérée, la séquence d'ADN soit sous le contrôle des éléments fonctionnels de l'ADN qui réalisent son expression.

La transformation d'une cellule hôte peut être effectuée par des techniques types. Un marqueur phé-notypique est habituellement utilisé pour faire la distinction entre les transformants qui ont repris avec succès le vecteur d'expression et les autres. La mise en culture de la cellule hôte transformée et l'isolement du polypeptide viral PT-NANBH peut également se faire par des techniques types.

L'anticorps spécifique d'un polypeptide viral PT-NANBH de la présente invention peut être obtenu au moyen du polypeptide. L'anticorps peut être polyclonal ou monoclonal. L'anticorps peut être utilisé pour les essais de contrôle de qualité de lots de polypeptides viraux PT-NANBH; la purification d'un polypeptide viral PT-NANBH ou du lysat viral; la topographie des épitopes; lorsqu'il est marqué, comme élément conjugué dans un essai type compétitif, pour la détection des anticorps; et dans les essais de détection des antigènes.

L'anticorps polyclonal contre un polypeptide viral PT-NANBH de la présente invention peut être obtenu en injectant un polypeptide viral PT-NANBH, facultativement couplé à un support pour promouvoir une réponse immune, dans une cellule de mammifère: souris, rat, mouton ou lapin, et en récupérant l'anticorps ainsi produit. Le polypeptide viral PT-NANBH est généralement administré sous forme d'une formulation injectable dans laquelle le polypeptide est mélangé à un diluant physiologiquement acceptable. Des adjuvants tels que l'adjuvant complet de Freund (FCA) ou l'adjuvant incomplet de Freund (FIA)

4

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 684 594 A5

peuvent être inclus dans la formulation. La formulation est normalement injectée à l'hôte sur une période de temps appropriée, des échantillons de plasma étant prélevés à intervalles réguliers pour essai relatif aux anticorps viraux anti-PT-NANBH. Lorsqu'un niveau d'activité approprié est obtenu, l'hôte fuit. L'anticorps est alors extrait du plasma sanguin et purifié par des procédures types, par exemple, par protéine A ou par Chromatographie en résine échangeuse d'ions.

L'anticorps monoclonal contre un polypeptide viral PT-NANBH de la présente invention peut être obtenu en fusionnant des cellules d'une lignée cellulaire immortalisante avec des cellules produisant des anticorps contre le polypeptide viral et en faisant une culture de la lignée cellulaire fusionnée rendue immortelle. De manière typique, on inocule à un hôte mammifère non humain tel que souris ou rat, le polypeptide viral. Après un temps suffisant pour que l'hôte ait pu élaborer une réponse anticorps, des cellules produisant des anticorps telles que les splénocytes, sont retirées. Les cellules d'une lignée cellulaire immortalisante telle qu'une lignée cellulaire de myélome de souris ou de rat, sont fusionnées avec les cellules produisant des anticorps et les fusions en résultant examinées de manière sélective pour identifier une lignée cellulaire telle qu'un hybridome, sécrétant l'anticorps monoclonal souhaité. La lignée cellulaire fusionnée peut être mise en culture et l'anticorps monoclonal purifié du milieu de culture de manière similaire à la purification de l'anticorps polyclonal.

Les essais de diagnostic basés sur la présente invention peuvent être utilisés pour déterminer la présence ou l'absence d'infection PT-NANBH. Ils peuvent également être utilisés pour contrôler le traitement de cette infection, par exemple dans une thérapie d'interféron.

Dans un essai pour le diagnostic d'une infection virale, il y a fondamentalement trois approches distinctes qui peuvent être adoptées impliquant la détection de l'acide nucléique viral, l'antigène viral ou l'anticorps viral. L'acide nucléique viral est généralement considéré comme le meilleur indicateur de la présence du virus lui-même et identifierait des substances susceptibles d'être infectieuses. Par ailleurs, la détection de l'acide nucléique n'est généralement pas aussi directe que la détection d'antigènes ou d'anticorps puisque le niveau cible peut être très bas. L'antigène viral est utilisé comme marqueur pour la présence du virus et comme indicateur de l'infectivité. En fonction du virus, la quantité d'antigènes présente dans un échantillon peut être très faible et difficile à détecter. La détection d'anticorps est relativement directe car, en effet, le système immun de l'hôte amplifie la réponse à une infection en produisant d'importantes quantités d'anticorps qui circulent. La nature de la réponse des anticorps peut souvent être cliniquement utile, par exemple des anticorps de catégorie IgM plutôt qu'IgG indiquent une infection récente, ou la réponse à un antigène viral particulier associé à la clairance du virus. Donc, l'approche exacte adoptée pour le diagnostic d'une infection virale dépend des circonstances particulières et de l'information recherchée. Dans le cas de la PT-NANBH, une analyse de diagnostic peut incorporer n'importe laquelle de ces trois approches.

Dans un essai pour le diagnostic de PT-NANBH impliquant la détection d'acide nucléique viral, la méthode peut comprendre l'hybridation de l'ARN viral présent dans un échantillon ou de l'ADNc synthétisé à partir de cet ARN viral, avec une séquence d'ADN correspondant à la séquence de nucléotide de la SEQ ID n° 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 ou 22 et la sélection des hybrides d'acide nucléique en résultant pour identifier tout acide nucléique viral PT-NANBH. L'application de cette méthode est habituellement limitée à un échantillon d'un tissu approprié tel que biopsie du foie, où l'ARN viral est susceptible d'être présent dans de fortes proportions. La séquence d'ADN correspondant à la séquence de nucléotide de la SEQ ID n° 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 ou 22 peut prendre la forme d'un oligonucléotide ou d'une séquence ADNc contenue facultativement dans un plasmide. La sélection des hybrides d'acide nucléique sera, de préférence, effectuée au moyen d'une séquence d'ADN marquée. Un ou plusieurs tours de sélection supplémentaires d'un type ou de l'autre peuvent être effectués pour mieux caractériser l'hybride et donc identifier tout acide nucléique viral PT-NANBH. Les étapes de l'hybridation et de la sélection sont effectuées suivant des procédures connues.

Par suite de l'application limitée de cette méthode dans l'essai de l'acide nucléique viral, une méthode privilégiée et plus pratique implique la synthèse d'ADNc à partir de l'ARN viral présent dans un échantillon, l'amplification d'une séquence d'ADN présélectionnée correspondant à une sous-séquence de la séquence de nucléotide de la SEQ ID n° 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 ou 22, et l'identification de la séquence d'ADN présélectionnée. L'échantillon pour essai peut être prélevé dans tout tissu approprié ou fluide physiologique et sera de préférence concentré pour tout ARN viral présent. Un exemple de tissu approprié est une biopsie du foie. Des exemples de fluide physiologique approprié sont: l'urine, le plasma, le sang, le sérum, le sperme, les larmes, la salive ou le fluide cérébro-spinal. Les exemples de premier choix sont le sérum et le plasma.

La synthèse de l'ADNc s'effectue normalement par transcription réverse amorcée au moyen d'amorces aléatoires, définies ou oligo-dT. L'amorce la plus avantageuse est un oligonucléotide correspondant à la séquence nucléotide de SEQ ID n° 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 ou 22 et conçu pour enrichir en ADNc contenant la séquence présélectionnée.

L'amplification de la séquence d'ADN présélectionnée est de préférence effectuée au moyen d'une technique de réaction en chaîne de polymérase (PCR) (Saiki et al., Science, 1985, 230, 1350-4). Dans cette technique, on utilise une paire d'amorces oligonucléotides dont l'une correspond à une portion de la séquence de nucléotide de SEQ ID n° 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 ou 22 et dont l'autre se trouve du côté 3' de la première et correspond à une portion de la séquence complémentaire, la paire définissant en-

5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

CH 684 594 A5

tre elles la séquence d'ADN présélectionnée. Les oligonucléotides ont généralement une longueur d'au moins 15, de manière optimale de 20 à 26 bases et bien que quelques erreurs puissent être tolérées en variant les conditions de la réaction, l'extrémité 3' des oligonucléotides devrait être parfaitement complémentaire pour pouvoir amorcer de manière efficace. La distance entre les extrémités 3' des oligonucléotides peut être d'environ 100 à environ 2000 bases. Pratiquement l'un des oligonucléotides de la paire utilisée dans cette technique sert également pour amorcer la synthèse d'ADNc. La technique PCR elle-même est effectuée sur l'ADNc sous forme d'une seule chaîne utilisant une enzyme telle que la polymérase Taq, et un surplus d'amorceurs oligonucléotides de plus de 20-40 cycles conformément aux protocoles publiés (Saiki et al., Science, 1988, 239, 487-491).

Pour raffiner la technique, il peut y avoir plusieurs tours d'amplification, chaque tour étant amorcé par une autre paire d'oligonucléotides. Donc, après le premier tour d'amplification, une paire interne d'oligo-nucléotides définissant une séquence d'ADN plus courte (disons, de 50 à 500 bases) peut être utilisée pour un deuxième tour d'amplification. Dans ce raffinement quelque peu plus fiable, auquel on se réfère sous le nom de «Nested PCR», c'est bien entendu, la séquence d'ADN amplifiée finale qui constitue la séquence présélectionnée. [Kemp et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 1989, 86(7), 2423-7 et Mullis et al., Methods in Enzymology, 1987, 155, 335-350].

L'identification de la séquence d'ADN présélectionnée peut se faire par analyse des produits PCR sur un gel agarose. La présence d'une bande au poids moléculaire calculé pour la séquence présélectionnée est une indication positive de la présence d'acide nucléique viral dans l'échantillon. Des méthodes alternatives d'identification comprennent celles basées sur le transfert Southern, le transfert de points, la restriction oligomère et le séquençage de l'ADN.

La présente invention fournit également un kit d'essai pour la détection de l'acide nucléique viral PT-NANBH, qui comprend:

i) une paire d'amorces oligonucléotides dont l'une correspond à une portion de la séquence de nu-cléotides de SEQ ID n° 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 ou 22 et dont l'autre se trouve du côté 3' de la première et correspond à une portion de la séquence complémentaire, la paire définissant entre elles une séquence d'ADN présélectionnée;

ii) une enzyme de transcriptase réverse pour la synthèse de l'ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon en amont de l'amorce correspondant à la séquence de nucléotides complémentaire de SEQ ID n° 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 ou 22;

iii) une enzyme capable d'amplifier la séquence d'ADN présélectionnée; et facultativement iv) des solutions de lavage et tampons de réaction.

Avantageusement le kit d'essai contient également un échantillon de contrôle positif pour faciliter l'identification de l'acide nucléique viral.

Les caractéristiques des amorces et des enzymes seront de préférence celles indiquées ci-dessus en rapport avec la technique PCR.

Dans un essai pour le diagnostic de la PT-NANBH impliquant la détection d'antigènes viraux ou d'anticorps viraux, la méthode peut comprendre la mise en contact d'un échantillon avec un polypeptide viral PT-NANBH de la présente invention ou un anticorps polyclonal ou monoclonal contre ce polypeptide, et la détermination de l'existence ou non d'une liaison antigène-anticorps contenue dans l'échantillon. Pour cela, un kit d'essai comprend un polypeptide viral PT-NANBH, comme défini ici, ou un anticorps monoclonal ou polyclonal de celui-ci, et des moyens pour déterminer l'existence ou non d'une liaison avec un anticorps ou un antigène, respectivement contenu dans l'échantillon. L'échantillon peut être prélevé dans tout tissu ou fluide physiologique approprié mentionné ci-dessus pour la détection de l'acide nucléique viral. Si on obtient un fluide physiologique, il pourra être concentré de manière optimale pour détecter tout antigène ou anticorps viral présent.

Une série de formats d'analyse peuvent être utilisés. Le polypeptide viral PT-NANBH peut être utilisé pour capturer les anticorps de manière sélective par rapport à la PT-NANBH dans la solution, pour marquer de manière sélective l'anticorps déjà capturé ou à la fois pour capturer et pour marquer l'anticorps. De plus, le polypeptide viral peut être utilisé dans une variété de formats d'analyse homogènes dans lesquels l'anticorps réagissant avec l'antigène est détecté dans la solution sans séparation de phases.

Les types d'essais dans lesquels on utilise le polypeptide viral PT-NANBH pour capturer les anticorps dans la solution impliquent l'immobilisation du polypeptide sur une surface solide. Cette surface devrait pouvoir être lavée d'une manière ou d'une autre. Des exemples de surfaces adéquates sont des polymères de différents types (moulées dans des cupules de microtitrage; des perles; des tigettes de différents types; des bandes d'aspiration; des électrodes; et des appareils optiques), des particules (par exemple, latex; érythrocytes stabilisés; cellules bactériennes ou fongiques; spores; sols contenant de l'or ou d'autres métaux; et colloïdes protéiques), la dimension habituelle de la particule étant de 0,02 à 5 microns, des membranes (par exemple, de nitrocellulose; papier; acétocellulose; et des membranes haute porosité/haute surface d'un matériau organique ou inorganique).

La fixation du polypeptide viral PT-NANBH à la surface peut se faire par adsorption passive d'une solution de composition optimale, qui peut contenir des tensioactifs, des solvants, des sels et/ou des chaotropes; ou par liaison chimique active. La liaison active peut être effectuée au moyen d'une variété

6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 684 594 A5

de groupes fonctionnels réactifs ou activabies qui peuvent être exposés à la surface (par exemple agents de condensation; esters acides actifs, halogénures et anhydrides; groupes aminés, hydroxyle ou carboxyle; groupes sulfhydrile; groupes carbonyle; groupes diazo; ou groupes insaturés). Facultativement la liaison active peut se faire via une protéine (elle-même attachée à la surface passivement ou par liaison active) telle l'albumine ou la caséine, à laquelle le polypeptide viral peut être lié chimiquement par toute une série de méthodes. L'utilisation d'une protéine de cette manière peut conférer des avantages par suite d'un point isoélectrique, d'une charge, de l'hydrophilie ou de toute autre propriété physico-chimique. Le polypeptide viral peut également être attaché à la surface (généralement, mais pas nécessairement, une membrane) suite à la séparation électrophorétique d'un mélange réactionnel tel que la précipitation immune.

Après avoir mis en contact (avoir fait réagir) la surface supportant le polypeptide viral PT-NANBH avec un échantillon, en laissant le temps nécessaire pour qu'il y ait réaction, et le cas échéant, en retirant le surplus d'échantillon par l'un des nombreux moyens disponibles (comme lavage, centrifugation, filtration, magnétisme ou action capillaire), l'anticorps capturé est détecté par n'importe quel moyen qui donnera un signal détectable. On peut, par exemple, y arriver en utilisant une molécule ou une particule marquée comme indiqué ci-dessus qui réagira avec l'anticorps capturé (par exemple, protéine A ou protéine G, et analogues; antiespèce ou sous-type d'anti-immoglobuline; facteur rhumatoïde; ou anticorps de l'antigène utilisé de manière compétitive ou bloquante), ou toute molécule contenant un épito-pe contenu dans le polypeptide.

Le signal détectable peut être optique, radioactif ou physico-chimique et peut être fourni directement en marquant la molécule ou la particule avec, par exemple, un colorant, un marqueur radioactif, une espèce électroactive, une espèce magnétiquement résonante ou fluorogène, ou indirectement en marquant la molécule ou la particule au moyen d'une enzyme capable elle-même de donner lieu à un changement mesurable de n'importe quel type. Alternativement le signal détectable peut être obtenu, par exemple, par agglutination ou par un effet de diffraction ou de biréfringence si la surface est sous forme de particules.

Des essais dans lesquels un polypeptide viral PT-NANBH est utilisé lui-même pour marquer un anticorps déjà capturé demandent une certaine forme de marquage de l'antigène qui permettra sa détection. Le marquage peut être direct en attachant chimiquement ou passivement, par exemple, un marqueur radioactif, une espèce magnétiquement résonante, un marqueur sous forme de particule ou d'enzyme au polypeptide; ou indirect en attachant toute forme de marque à une molécule qui réagira elle-même avec le polypeptide. La chimie de liaison d'un marqueur au polypeptide viral PT-NANBH peut se faire directement via une moitié déjà présente dans le polypeptide telle qu'un groupe aminé, ou par le biais d'une moitié intermédiaire telle qu'un groupe maléimide. La capture de l'anticorps peut se faire sur n'importe laquelle des surfaces déjà mentionnées par n'importe quel réactif y compris l'adsorption passive ou activée qui se traduira par la liaison de complexes spécifiques d'anticorps ou immuns. En particulier, la capture de l'anticorps pourrait se faire par une antiespèce ou un sous-type d'anti-immoglobuline, par facteur rhumatoïde, protéines A, G, et analogues ou par toute molécule contenant un épitope contenu dans le polypeptide.

Le polypeptide PT-NANBH marqué peut être utilisé dans une liaison compétitive où la liaison à toute molécule spécifique sur n'importe laquelle des surfaces données comme exemple ci-dessus est bloquée par l'antigène dans l'échantillon. Alternativement, il peut être utilisé d'une manière non compétitive dans laquelle l'antigène dans l'échantillon est lié spécifiquement ou non spécifiquement à l'une des surfaces ci-dessus et est également lié à une molécule spécifique bi- ou polyvalente (par exemple, un anticorps), ces autres valences étant utilisées pour capturer le polypeptide marqué.

Souvent, dans des analyses homogènes, le polypeptide viral PT-NANBH et un anticorps sont marqués séparément de manière à ce que lorsque l'anticorps réagit avec le polypeptide viral en solution libre, les deux marqueurs interagissent pour permettre, par exemple, le transfert non rayonnant d'énergie capturée par un marqueur vers l'autre marqueur avec détection appropriée du deuxième marqueur excité ou du premier marqueur éteint (par exemple, par fluorimétrie, résonance magnétique ou mesure des enzymes). L'addition de polypeptide viral ou d'anticorps dans un échantillon se traduit par une restriction de l'interaction de la paire marquée et donc par un niveau différent du signal dans le détecteur.

Un format d'essai convenant pour la détection de l'anticorps PT-NANBH est le format de Pimmunodo-sage avec enzyme en sandwich direct (EIA). Un polypeptide viral PT-NANBH est appliqué sur des cupules de microtitrage. Un échantillon et un polypeptide viral PT-NANBH auxquels est couplée une enzyme, sont ajoutés simultanément. Tout anticorps PT-NANBH présent dans l'échantillon se lie à la fois avec le polypeptide viral recouvrant la cupule et avec le polypeptide viral couplé à l'enzyme. De manière typique le même polypeptide viral est utilisé des deux cotés du sandwich. Après lavage, l'enzyme liée est détectée au moyen d'un substrat spécifique impliquant un changement de couleur. Un kit d'essai pour utilisation dans un tel EIA comprend:

(1) un polypeptide viral PT-NANBH marqué par une enzyme;

(2) un substrat pour l'enzyme;

(3) un moyen procurant une surface sur laquelle un polypeptide viral PT-NANBH est immobilisé, et

(4) facultativement, des solutions de lavage et/ou tampons.

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

CH 684 594 A5

Les polypeptides viraux de la présente invention peuvent être incorporés dans une formulation de vaccin pour induire l'immunité contre la PT-NANBH chez l'homme. A cette fin, le polypeptide viral peut être présenté en association avec un support acceptable du point de vue pharmaceutique.

Pour son utilisation dans une formulation de vaccin, le polypeptide viral peut facultativement être présenté comme un élément d'une particule née de la fusion du noyau de l'hépatite B telle que décrite dans Clarke et al., (Nature, 1987, 330, 381-384), ou un polymère à base de polylysine tel que décrit dans Tarn (PNAS, 1988, 85, 5409-5413). Alternativement, le polypeptide viral peut facultativement être attaché à une structure particulaire telle que liposomes ou ISCOMS.

Les supports acceptables du point de vue pharmaceutique sont, entre autres, des milieux liquides pouvant être utilisés comme véhicules pour introduire le polypeptide viral dans l'organisme d'un patient. Un exemple de tels milieux liquides est la solution saline. Le polypeptide viral lui-même peut être dissous ou mis en suspension sous forme de solide dans le support.

La formulation de vaccin peut également contenir un adjuvant pour stimuler la réponse immune et ainsi, accentuer l'effet du vaccin. Des exemples d'adjuvants sont, entre autres l'hydroxyde d'aluminium et le phosphate d'aluminium.

La formulation de vaccin peut contenir une concentration finale du polypeptide viral allant de 0,01 à 5 mg/ml, de préférence de 0,03 à 2 mg/ml. La formulation de vaccin peut être incorporée dans un conteneur stérile qui est alors scellé et stocké à basse température, par exemple, à 4°C, ou peut être lyophilisée.

Pour introduire l'immunité contre la PT-NANBH chez l'homme, on peut administrer une ou plusieurs doses de la formulation du vaccin. Chaque dose peut être de 0,1 à 2 ml, de préférence de 0,2 à 1 ml. Une méthode pour induire l'immunité contre la PT-NANBH chez I 'homme consiste à administrer une quantité efficace de formulation du vaccin comme il a été dit précédemment.

La présente invention fournit également l'utilisation d'un polypeptide viral PT-NANBH dans la préparation d'un vaccin pour utilisation dans l'induction de l'immunité contre la PT-NANBH chez l'homme.

Les vaccins de la présente invention peuvent être administrés par toute méthode appropriée pour l'administration de vaccins, y compris l'injection orale et parentérale (par exemple, intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire). Le traitement peut consister en une seule dose de vaccin ou en plusieurs doses réparties dans le temps.

Les souches de £. eoli transformées suivantes ont été déposées auprès de la National Collection of Type Cultures (NCTC), Central Public Health Laboratory, 61, Colindale Avenue, Londres, NW9 5HT aux dates indiquées:

i) E. soli TG1 transformés par pDX113 (WD001); Dépôt n° NCTC 12369; 7 décembre 1989.

ii) £. sM TG1 transformés par pDX128 (WD002); Dépôt n° NCTC 12382; 23 février 1990.

iii) £. co!iTG1 transformés par p136/155 (WD003); Dépôt n° NCTC 12428; 28 novembre 1990.

(iv) E. efili TG1 transformés par p156/92 (WD004): Dépôt n° NCTC 12429; 28 novembre 1990.

(v) £. coli TG1 transformés par p129/164 (WD005); Dépôt n° NCTC 12430; 28 novembre 1990.

(vi) £. coli TG1 transformés par pDX136 (WD006); Dépôt n° NCTC 12431; 28 novembre 1990.

Dans les figures, la fig. 1 représente la production de pDX122 décrite à l'exemple 7, la fig. 2 représente deux séquences fusionnées alternatives décrites à l'exemple 17, et la fig. 3 représente des cartes de restriction, de SEQ ID n° 21 et 22.

Dans la liste de séquences, il y a des listes SEQ ID n° 1 à 25 auxquelles référence est faite dans la description et dans les revendications.

Les exemples suivants servent à illustrer l'invention.

EXEMPLE 1.-Svnthèse de l'ADNc.

Le plasma regroupé (160 ml) de deux personnes (appelées A et L) connues pour avoir transmis la NANBH via des transfusions a été dilué (1:2,5) avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ensuite centrifugé à 190 000 g (par exemple, 30 000 tours par minute dans un rotor MSE 8 x 50) pendant 5 heures à 4°C. Ce qui surnageait a été retenu comme source des anticorps spécifiques pour la sélection ultérieure des bibliothèques d'ADNc. La pastille a été remise en suspension dans 2 ml de 20 mM Tris-chlorhydrate, 2 mM EDTA 3% SDS, 0,2 M NaCI (2 x PK) extrait 3 fois avec un volume égal de phénol, 3 fois avec du chloroforme, une fois avec de l'éther, et ensuite précipité avec 2,5 volumes d'éthanol à -20°C. Le précipité a été remis en suspension dans 10 (il de 10 mM Tris-chlorhydrate, 1 mM EDTA à pH 8,0 (TE).

L'acide nucléique a été utilisé comme modèle dans un kit de synthèse d'ADNc (Amersham International pic, Amersham, R.-U.) avec amorçage oligo-dT et hexanucléotide aléatoire. Les conditions de la réaction étaient telles que recommandées par le fournisseur du kit. Spécifiquement 1 ni d'acide nucléique a été utilisé pour une première réaction de synthèse de brin qui a été marqué [a-32p]dCTP (Amersham; activité spécifique 3000 Ci/mmol) dans un volume final de 20 (il et incubé à 42°C pendant 1 heure. La totalité de première réaction de brin a ensuite été utilisée pour la deuxième réaction de

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 684 594 A5

synthèse du brin, contenant E. £oä RNaseH (0,8 U) et de la polymérase ADN I (23 U) dans un volume final de 100 ni, incubé à 12°C pendant 60 minutes, ensuite à 22"C pendant 60 minutes. L'ensemble de la réaction a ensuite été incubé à 70°C pendant 10 minutes, placé sur glace, 1 U de polymérase d'ADN T4 y a été ajoutée et ensuite il a été incubé à 37°C pendant 10 minutes. La réaction a été arrêtée en ajoutant 5 jj.I de 0,2 M EDTA pH 8.

Les nucléotides non incorporés ont été enlevés en passant la réaction sur une colonne NICK (Pharmacia Ltd, Milton Keynes, R.-U.). L'ADNc a ensuite été extrait deux fois avec du phénol, trois fois avec du chloroforme, une fois avec de l'éther et ensuite 20 ng de dextrane ont été ajoutés avant précipitation avec 2,5 volumes d'éthanol 100%.

EXEMPLE 2.-

Production de bibliothèques d'expression.

Le culot d'ADNc séché a été remis en suspension dans 5 ni de TE stérile et ensuite incubé avec 500 ng de lieurs EcoRI (Pharmacia, GGAATTCC phosphorylé) et 0,5 U de ligase d'ADN T4 (New England BioLabs, Beverley, MA, E.U.) dans un volume final de 10 ni contenant 20 mM de Tris-HCI pH 7,5, 10 mM MgCh, 10 mM DTT, 1 mM ATP pendant 3 heures à 15°C. La ligase a été neutralisée en chauffant à 65°C pendant 10 minutes et l'ADNc a été digéré avec 180 U d'EcoRI (BCL, Lewes, R.-U.) dans un volume final de 100 n' à 37°C pendant 1 heure. De l'EDTA a été ajouté à une concentration finale de 10 mM et l'ensemble de la réaction chargé sur une colonne AcA34 (LKB). Des fractions (50 nO ont été collectées et comptées. Le pic d'ADNc dans le volume exclu (980 cpm) a été regroupé, extrait deux fois avec du phénol, trois fois avec du chloroforme, une fois avec de l'éther et ensuite précipité à l'éthanol.

L'ADNc ds a été remis en suspension dans 5 ja! de TE et ligaturé sur des bras lambda gt11 EcoRI (Gibco, Paisley, Ecosse) dans une réaction de 10 ni contenant 0,5 U de ligase d'ADN T4, 66 mM de Tris-hydrochlorate, 10 mM de MgCb, 15 mM de DTT pH 7,6 à 15°C pendant la nuit. Après neutralisation de la ligase par chauffage à 65°C pendant 10 minutes, 5 ni de la réaction ont été ajoutés à une réaction de repliage d'Amersham et incubés à 22°C pendant 2 heures. Le matériel replié a été titré sur le brin Y1090 £. coli (Huynh et al., 1985) et contenait un total de 2,6 x 104 recombiné.

Des cellules pour monocouches (Y1090) ont été préparées en inoculant 10 ml de bouillon-L avec une seule colonie d'une plaque d'agar et en agitant pendant la nuit à 37°C. Le jour suivant, 0,5 ml de la culture de la nuit ont été dilués avec 10 ml de bouillon-L frais et 0,1 ml 1 M MgSCU et 0,1 ml 20% (p/v) de maltose ont été ajoutés. La culture est agitée pendant 2 heures à 37°C, les bactéries récoltées par centrifugation à 5000 g pendant 10 minutes et remises en suspension dans 5 ml de 10 mM MgSÛ4 pour produire le stock de cellules pour monocouches. Une portion (1 ni) du matériel replié a été mélangée avec 0,2 ml de cellules pour monocouches, incubée à 37°C pendant 20 minutes avant d'ajouter 3 ml de gélose de couverture et l'ensemble du mélange versé sur une plaque L-agar de 90 mm. Après incubation pendant la nuit à 37°C, les plaques ont été comptées et le nombre total de phages recombinés a été déterminé. Le matériel replié restant (500 ni) a été stocké à 4°C.

Des bibliothèques supplémentaires ont été préparées de manière substantiellement similaire.

EXEMPLE 3.-

Sélection des bibliothèques d'expression.

La bibliothèque initiale décrite à l'exemple 2 a été plaquée sur le brin Y1090 £. coli à une densité d'environ 5 x 103 pfu par plaque de 140 mm et incubée à 37°C pendant 2 heures jusqu'à ce que les plaques soient visibles. Des filtres de nitrocellulose stériles ayant été imprégnés d'IPTG (isopropylthio-galactoside) ont été laissés en contact avec la plaque pendant 3 heures et ensuite retirés. Les filtres ont d'abord été bloqués par incubation avec une solution de blocage [3%(p/v BSA/TBS-Tween(10 mM Tris-HCI pH 8, 150 mM NaCI, 0,05%(v/v) Tween 20) contenant 0,05% bronidox] (20 ml/filtre) et ensuite transférés vers la solution tampon de liaison [1%(p/v)BSA/TBS/Tween contenant 0,05% bronidox] contenant des anticorps purifiés (par Chromatographie échangeuse d'ions) provenant du plasma regroupé de A & L (20 ng/ml). Après incubation à température ambiante pendant 2 heures, les filtres sont lavés trois fois avec TBS-Tween et ensuite incubés dans la solution tampon de liaison contenant un sérum antihumain de mouton biotinylé (1:250). Après 1 heure à température ambiante, les filtres sont lavés 3 fois avec TBS/Tween et ensuite incubés dans la solution tampon de liaison contenant un complexe de streptavidine/peroxydase (1:100). Le signal s'est développé avec DAB. Les signaux positifs sont apparus sous forme de plaques (colorées).

Sur un total de 2,6 x 104 plaques sélectionnées, 8 signaux positifs ont été obtenus lors du premier tour de sélection. En utilisant les filtres comme calibre, les régions des plaques originales correspondant à ces signaux positifs ont été cueillies au moyen d'une pipette de Pasteur stérile. Les bouchons agar ont été mis en suspension dans 0,1 ml de tampon SM et les phages ont pu se diffuser. Le titre de phages de chaque bouchon a été déterminé sur le brin Y1090 £. coli. Le stock de phages de chaque bouchon est ensuite réexaminé de manière sélective comme auparavant sur des plaques séparées de 90 mm à une densité d'environ 1 x 103 pfu par plaque. Sur les 8 signaux positifs du premier tour, 1

9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

CH 684 594 A5

était clairement positif au second tour, c'est-à-dire > 1% de plaques positives, il a été appelé JG2. Cela correspond à un taux positif de 40/106 dans la bibliothèque.

Ceci et d'autres phages positifs identifiés de façon similaire dans d'autres bibliothèques d'ADNc décrites à l'exemple 2 ont ensuite été purifiés par des tours répétés d'examen sélectif de plaques à faible densité (1-200 pfu/plaque de 90 mm) jusqu'à ce que 100% des plaques soient positives avec la sélection d'anticorps A & L. Trois phages recombinés sont JG1, JG2 et JG3.

EXEMPLE 4.-

Sélection secondaire de JG1. JG2 et JG3 avec un échantillonnage de sérum.

Chacun des phages recombinés, JG1, JG2 et JG3, ont été purifiés sur plaque et stockés sous forme de stocks titrés dans un tampon SM à 4°C. Ces phages ont été mélangés (1:1) avec un stock de phages identifiés comme étant négatifs dans l'exemple 3 et le mélange utilisé pour contaminer le brin Y1090 £. eoli à 1000 pfu par plaque. Des décollements de plaque ont été effectués et traités comme décrit à l'exemple 3, si ce n'est que les filtres ont été divisés en quadrants et que chaque quadrant a été incubé avec un anticorps différent; il s'agissait des anticorps A & L (20 p.g/ml); du plasma de A (1:500); du plasma de L (1:500) et d'IgG de H (20 nQ/ml)- H est un patient probablement positif pour les anticorps PT-NANBH, car il s'agissait d'un hémophile qui avait reçu un Facteur VIII n'ayant pas subi de traitement thermique. A la fin de la réaction, chaque filtre a été jugé à l'insu comme étant positif (lorsqu'il y avait manifestement deux types de signal) ou négatif (lorsque toutes les plaques donnaient le même signal). Ce pouvait être un jugement subjectif et les résultats ont donc été comparés et seuls les filtres pour lesquels un accord était atteint à la majorité ont été considérés comme positifs. Les résultats sont présentés au tableau I.

TABLEAU I

A & L

A

L

H

JG1

+

+

-

-

JG2

+

+

+

+

JG3

+

+

+

+

JG1 est apparu comme réagissant uniquement avec des anticorps du patient A et non de L ou H; ce n'est pas ce qu'on attendrait d'un véritable polypeptide résultant de la recombinaison lié à PT-NANBH et donc JG1 a été écarté de l'analyse. Par ailleurs, JG2 et JG3 ont montré des réactions positives nettes avec les trois sérums PT-NANBH A, L et H; on a poursuivi leur analyse.

Le type d'analyse décrit ci-dessus a été répété pour JG2 et JG3, si ce n'est que les filtres ont été divisés en portions plus petites et que celles-ci ont été incubées avec des panneaux de sérums positifs et négatifs. L'échantillonnage de sérums positifs comprenait les sérums de 10 hémophiles et de 9 drogués utilisant la voie intraveineuse (IVDA). Ceux-ci représentaient la meilleure source de sérums positifs même si le taux positif réel était inconnu. L'échantillonnage de sérums négatifs a été obtenu de donneurs accrédités étroitement contrôlés pendant de nombreuses années par le North London Blood Transfusion Centre, Deansbrook Road, Edgware, Middlesex, R.-U. et n'ont jamais présenté aucun signe d'infection pour toute une série d'agents y compris PT-NANBH. Les résultats sont présentés aux tableaux II et III.

10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 684 594 A5

TABLEAU II

I.D.

JG2

JG3

IVDA

V19146

4/4

0/5

V27083

2/4

0/5

V29779

0/4

0/5

V12561

0/5

4/5

V15444

m

515.

V18342

4/4

0/5

V8403

2/4

0/5

V20001

4/4

0/5

V21213

2/4

0/5

Hémophiles

M1582

AIA

4/5

M1581

5/5

515.

M1575

215.

0/5

M1579

515.

515.

M1585

215.

0/5

M1576

1/5

1/5

M1580

1/5

0/5

M1578

1/5

0/5

M1587

1/5

2/5

M1577

2/5

1/5

Les positifs sont soulignés.

TABLEAU III

IVDA

Hémophile

Donneur accrédité

JG2 6/9 (66%)

5/10 (50%)

0/10 (0%)

JG3 2/9 (22%)

4/10 (40%)

0/10 (0%)

JG2 + JG3 1/9(11%)

3/10 (30%)

0/10 (0%)

JG2 ou JG3 7/9 (77%)

6/10 (60%)

0/10 (0%)

Ces données sont compatibles avec l'hypothèse selon laquelle les deux recombinés expriment des polypeptides associés avec un agent responsable du PT-NANBH et que ces polypeptides ne sont pas identiques, mais peuvent partager certains sites antigéniques.

EXEMPLE 5-

Cartographie de la restriction et séquençaae de l'ADN de JG2 et JG3.

Une portion (10 ni) des stocks de phages de JG2 et JG3 a été bouillie pour dénaturer les phages et exposer l'ADN. Cet ADN a alors été utilisé comme modèle dans une amplification PCR en utilisant la polymérase Taq; chaque réaction contenait ce qui suit dans un volume final de 50 ni: 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCb, 0,01% de gélatine, pH 8,3 à 25°C plus des amorces oligonucléotides d19 et d20 (SEQ ID n° 1 et 2 respectivement; 200 ng chacun); ces amorces sont situées dans les séquences lambda flanquant le site de clonage EcoRI et amorcent donc l'amplification de tout ce qui est cloné dans cette région.

Une portion de la réaction a été analysée sur un gel agarose à 1,0% et comparée aux marqueurs. L'amplification de JG2 a produit un fragment d'environ 2 kb; JG3 1 d'environ 1 kb. Le reste du mélange de la réaction a été extrait avec du phénol/chloroforme en présence de 10 mM EDTA et de SDS à 1% et l'ADN récupéré par précipitation par Péthanol. Le matériel amplifié a alors été digéré avec 20 U d'EcoRI pendant 60 minutes à 37°C et séparé sur un gel agarose à 1,0% LGT dans TAE. Les frag11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 684 594 A5

ments ont diminué de taille comme prévu et sont élués et purifiés au moyen d'Elutips (S&S). Les in-serts JG2 et JG3 ont été ligaturés avec pUC13 digéré par EcoRI et transformés dans le brin TG1 £. coli. Les recombinés sont identifiés comme colonies blanches sur des plaques X-gal/L-Amp (plaques L-agar complétées par 100 ng/ml d'ampicilline, 0,5 mg/ml X-gal) et sont vérifiés par des préparations de Plasmide à petite échelle et digestion par l'enzyme de restriction EcoRI pour déterminer la taille de l'in-sert d'ADN. Le plasmide recombiné contenant l'insert JG2 a été appelé DM415 et celui contenant JG3, DM416.

La séquence de l'insert JG2 a été déterminée par séquençage bicaténaire direct de l'ADN du plasmide et par sous-clonage de M13, séquençage de vecteurs tels que mp18 et mp19 suivi d'un séquençage monobrin. La séquence de l'insert JG3 a été déterminée de la même manière, L'ADN résultant et les séquences d'acides aminés déduites sont indiqués dans SEQ ID n° 3 et 4.

EXEMPLE 6.-

Expression du polypeptide PT-NANBH dans les E. coli.

Le plasmide pDM416 (5 ng) a été digéré avec EcoRI (20 U) dans un volume final de 20 ni et l'insert 1 kb récupéré par élution dans un gel d'agarose LGT à 1%. Ce matériel a alors été «poli» en utilisant un fragment de Klenow et un mélange dNTP pour remplir les extrémités en surplomb de l'EcoRI. L'ADN a été récupéré par précipitation à l'éthanol après extraction avec du phénolchloroforme. Le fragment à extrémités franches a été ligaturé en pDEV107 clivé/traité par la phosphatase Smal (un vecteur qui permet le clonage à l'extrémité 3' de lacZ) et ensuite transformé dans des cellules TG1 £. coli. Il y a eu une augmentation de l'ordre de 30 fois des colonies pendant un contrôle vecteur seul. Les transformants contenant le plasmide requis recombiné ont été identifiés par hybridation au moyen d'une sonde radioactive produite par amplification PCR du produit de recombinaison JG3. Douze colonies ont été analysées par digestion avec des enzymes de restriction (Sali) des minipréparations de plasmide pour déterminer l'orientation de l'insert. Un quart de ces produits de recombinaison étaient correctement orientés pour exprimer la séquence PT-NANBH sous forme d'une fusion avec la ß-galactosidase. L'un de ceux-ci (pDX113) a été pris pour continuer l'analyse.

Une colonie de pDX113 a été utilisée pour inoculer 50 ml de bouillon-L, incubé à 37°C et agité jusqu'à la phase «mid-log» et poussée à s'exprimer par addition de 20 mM IPTG. Après 3 heures, les cellules sont récoltées par centrifugation à 5000 g pendant 20 minutes, remises en suspension dans 50 ml de PBS et remises en culot. Les cellules en culot sont remises en suspension dans 5 ml de solution tampon [25 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, 1 mg/ml lysozyme, 0,2%(v/v) Nonidet-P40, pH 8,0] par gramme de pastille et incubées à 0°C pendant 2 heures. L'ADN bactérien émis est digéré par addition de DNase I et de MgSÛ4 pour atteindre des concentrations finales de 40 ng/ml et 2 mM respectivement pour réduire la viscosité.

Ce lysat brut est analysé par PAGE et le modèle des protéines coloré au bleu Coomassie. Une protéine d'environ 150 kd a été induite dans pDX113 contenant des bactéries et on a estimé que cette protéine représentait 10-15% de la protéine totale. Des gels similaires ont été transférés sur membrane PVDF (GRI, Dunmow, Essex, R.-U.) et les membranes incubées avec des sérums PT-NANBH positifs et négatifs; la protéine 150 kd a réagi avec les sérums A et L, mais pas avec le sérum humain normal. Des traces de contrôle contenant du lysat des £. sali exprimant la ß-galactosidase n'ont pas réagi avec les sérums A, L ou avec le sérum humain normal.

On ajoute de l'urée au lysat brut pour avoir une concentration finale de 6 M et le matériel insoluble est récupéré par centrifugation. L'extrait d'urée 6 M est utilisé pour recouvrir directement les cupules de microtitrage pendant 1 heure à 37°C. Les cupules sont lavées trois fois avec de l'eau bidistillée et ensuite bloquées par addition de 0,25 ml de BSA à 0,2% par cupule contenant 0,02% de NaN3 pendant 20 minutes à 37°C. La plaque est alors aspirée. Des plaques de contrôle recouvertes d'un lysat brut d'une souche £. soli produisant de la ß-galactosidase (pXY461 ) sont produites de la même façon. Ces plaques sont utilisées dans des analyses ELISA comme décrit à l'exemple 10.

EXEMPLE 7.-

Expression du Polypeptide PT-NANBH dans des cellules d'insectes.

L'insert PT-NANBH de JG3, isolé comme décrit à l'exemple 5, a été cloné en cadre avec les 34 premiers nucléotides de la polyhédrine dans le vecteur pAc360 (Luckow et Summers, Biotechnology, 1988, 6, 47-55), en utilisant notre connaissance du cadre de lecture du gène lacZ dans le vecteur gt11. Des oligonucléotides sont synthétisés qui sont en mesure de s'hybrider aux séquences gt11 flanquant le site de clonage EcoRI et qui permettent l'amplification de l'insert par PCR. Ces oligonucléotides comprennent des sites de restriction BamHI convenablement placés pour permettre le clonage direct dans le site BamHI de pAc360, en plaçant le gène inséré en cadre avec les séquences terminales aminées de la polyhédrine.

Une petite quantité de produit de recombinaison gt11 JG3 a été bouillie pour exposer l'ADN et ensuite utilisée dans une amplification PCR contenant les amorces oligonucléotides d75 et d76 (SEQ ID n° 6 et 7; 200 mg) et 0,5 U de polymérase Taq.

12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 684 594 A5

Après amplification, la réaction a été extraite avec un volume égal de phénol/chloroforme, précipitée avec de l'éthanol et digérée avec 10 U de BamHI dans un volume final de 30 ni. Le fragment amplifié a été résolu dans un gel agarose à 1%, élué et ligaturé dans le pAc360 digéré avec le BamHI pour produire le construct de transfert pDX119. Le plasmide recombiné (2 ng) et l'ADN de type sauvage AcNPV (1 ng) ont été cotransfectés dans des cellules d'insectes par précipitation du phosphate de calcium. Le virus négatif d'inclusion recombiné a été choisi par sélection visuelle. Après trois tours de purification de plaque, le virus résultant de la recombinaison (BHC-5) a foisonné et l'expression de la protéine recombinée dans les cellules d'insectes a été évaluée par SDS-PAGE, transfert Western et ELISA. Une protéine abondamment exprimée d'environ 70 kd est produite dans les cellules contaminées. Cette protéine réagit avec les sérums PT-NANBH par transfert Western et ELISA.

Un autre produit de recombinaison du bacillovirus (BHC-7) a été construit pour inclure des séquences JG2 en sus des séquences JG3 présentes en BHC-5, comme décrit à la fig. 1. Les séquences PT-NANBH présentes dans JG2 ont été amplifiées et clonées dans le vecteur pAc360 comme dit ci-dessus pour produire pDX118 et les fragments appropriés de BamHI/Sall de pDX119 et pDX118 sont liés ensemble dans cet ordre dans pAc360 pour produire le construct de transfert pDX122.

Les Plasmides recombinés sont identifiés par hybridation et l'orientation de l'ADN inséré déterminée par analyse par enzymes de restriction. Le virus résultant de la recombinaison a été produit comme décrit ci-dessus et la protéine exprimée analysée par SDS-PAGE, transfert Western et ELISA. Un polypeptide très abondant (40% du total de la protéine de la cellule) 95 kd réagissant avec les sérums PT-NANBH a été trouvé dans les cellules infectées.

EXEMPLE 8.-

Purification du polypeptide DX113.

La souche TG1 E. soli contenant le plasmide pDX113 (appelée souche WDL001) est incubée et induite dans un fermenteur de 1,5 litre (modèle SET002, SGI, Newhaven, East Sussex, R.-U.) à 37°C pendant 5 heures. Les cellules sont récoltées par centrifugation à 5000 g pendant 20 minutes et traitées comme suit.

a) Extraction.

Les cellules humides sont remises en suspension (1:20, p/v) dans la solution tampon A [50 mM Tris-HCI, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 10%(v/v) glycérol, pH 8,0]. Un lysozyme est ajouté à 5 mg solide par ml de suspension et le mélange est laissé à 4°C. Après 15 minutes, le mélange est soniqué (6 nm amplitude crête à crête) sur de la glace pendant 3 minutes au total (poussées de 6 x 30 secondes). De la DNase I est ajoutée à raison de 4 ng/ml de suspension et le mélange abandonné pendant 30 minutes. La suspension est centrifugée pendant 20 minutes à 18 000 g (max) et le surnageant écarté.

Le culot est remis en suspension dans la solution tampon B (25 mM Hepes, 4 mM urée, 5 mM DTT, pH 8,0) dans un rapport de 1:6 (p/v) pour obtenir une suspension fine. Celle-ci a été centrifugée à 18 000 g(max) pendant 20 minutes et le surnageant écarté. Le culot est remis en suspension dans la solution tampon C (25 mM Hepes, 8 M urée, 2 mM DTT, pH 8,0) dans un rapport de 1: 6 (p/v); avant la mise en suspension, on a ajouté: de la leupeptine (1 ng/ml), de la pepstatine (1 ng/ml) et E64 (1 ng/ ml). La suspension est centrifugée à 18 000 g(max) pendant 30 minutes et le surnageant décanté et conservé. Le culot est remis en suspension dans 25 mM Hepes, SDS à 1 % pH 8,0.

b) Chromatographie.

Le surnageant de la fraction de 8 M d'urée est dilué 1:5 (v/v) dans 25 mM Hepes, 8 M urée, 2 mM DTT, pH 8,0 et fractionné sur une colonne de 7 ml de Q-Sépharose. Les protéines sont éluées via un gradient de sel de 0-1 M NaCI. La Chromatographie et la manipulation des données sont contrôlées par un FPLC (Pharmacia). Le DX113 élue à environ 500 mM NaCI et est virtuellement homogène suivant analyse SDS PAGE et transfert Western.

EXEMPLE 9.-

Purification du polypeptide BHC-5.

Des cellules Sf9 (2 x 109) sont contaminées par un stock de virus BHC-5 résultant de la recombinaison (moi 5). Après incubation à 28°C pendant 2 jours, les cellules sont récoltées par centrifugation et ensuite traitées comme suit.

a) Extraction.

La masse de cellules humides (1,2 g) est remise en suspension dans 6 ml de solution tampon A (25 mM Hepes, 5 mM DTT, 1 ng/ml de leupeptine, 1 ng/ml de pepstatine, 1 ng/ml d'E64 pH 8,0). Les cellu13

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

CH 684 594 A5

les remises en suspension sont placées sur de la glace et soniquées par 3 secousses de 15 secondes (amplitude crête à crête 6 |im) séparées par des périodes de repos de 30 secondes. La suspension so-niquée est centrifugée à 18 000 g(max) pendant 20 minutes et le surnageant écarté. Le culot est remis en suspension dans la solution tampon A plus 4 M d'urée (6 mi) et centrifugé à 18 000 g(max) pendant 20 minutes. Le surnageant est écarté et le culot réextrait avec la solution tampon A plus 8 M d'urée (6 ml). Après centrifugation à 18 000 g(max) pendant 30 minutes, le surnageant est retenu et dilué 1:6 dans la solution tampon plus 8 M urée. Cet: extrait est chromatographié sur une colonne mono-Q équilibrée par la même solution tampon. La colonne est éluée au moyen d'un gradient de sel (0-1,0 M NaCI) sur 12 volumes de colonne. Le BHC-5 élue à environ 0,45-0,55 M NaCI et a une pureté supérieure à 90% suivant l'estimation de SDS-PAGE. Le rendement est d'environ 70%.

EXEMPLE 10--

Performanoe de DX113 et des polypeptides BHC-5 et -7 dans une ELISA.

Les plaques microelisa (96 cupules, Nunc) sont directement recouvertes de 50 mm de solution tampon de bicarbonate (50 mM bicarbonate de sodium et 50 mM carbonate de sodium, titrés à un pH de 9,5) avec soit un lysat brut de BHC-5 de 6 M urée ou avec du pDX113 purifié. Les plaques sont bloquées avec BSA à 0,2% et ensuite incubées pendant 30 minutes à 37°C avec des sérums dilués dans un rapport de 1:20 (bacille) ou 1:100 (E. coli). Après lavage dans du sérum physioloque-Tween (0,85% sérum physiologique, 0,05% Tween 20, 0,01% Bronidox), les plaques sont incubées avec de Pimmuno-globuline antihumaine de chèvre en conjonction avec la Peroxydase (1:2000) pendant 30 minutes à 37°C. Les plaques sont alors lavées dans une solution de sérum physiologique-Tween et colorées en ajoutant le substrat chromogénique TMB (tétraméthylbenzidine-HCI) (100 (J/cupule) et en incubant pendant 20 minutes à température ambiante. La réaction est arrêtée avec 50 jil d'acide suifurique 2 M et la DO450 déterminée (tableau IV).

TABLEAU IV

Format ELISA IG antihumain indirect pour la détection des anticorps NANB.

Bacille BHC-5 (phase solide)

E. coli DX113 (phase solide)

Sérums de patients à haut risque

>2

1,670

positifs dans l'essai

1,855

1,531

1,081

1,015

1,842

1,558

0,526

0,638

>2

1,516

1,823

1,602

1,779

1,318

1,122

0,616

1,686

1,441

Sérums de patients à haut risque

0,259

0,205

négatifs dans l'essai

0,158

0,120

0,298

0,209

0,194

0,111

0,282

0,181

0,263

0,165

0,184

0,163

0,121

0,099

0,243

0,104

Donneur accrédité

0,224

0,119

Les sérums de patients à haut risque d'infection PT-NANBH (IVDA, hémophiles) ont été essayés comme décrit; toutes les données sont exprimées sous forme de lectures DO450, le donneur accrédité sert de contrôle négatif.

Dans ce groupe particulier de sérums, 10/19 sont positifs dans les deux phases solides.

En outre, le DX113 purifié a été conjugué à une phosphatase alcaline au moyen d'une réduction SATA/maléimide et une analyse immunométrique est réalisée. Les sérums NANB positifs et négatifs connus sont dilués comme indiqué dans le sérum du donneur accrédité et ajoutés à une phase solide recouverte de BHC-7. Simultanément ou après incubation (30 minutes à 37°C), on ajoute le conjugué DX113 (50 ni. 1:2000). Après incubation à 37°C pendant 30 minutes, les plaques sont lavées avec une solution tampon bicarbonate 50 mM et colorées au moyen d'un système d'amplification IQ Bio et la DO492 déterminé (tableau V).

14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 684 594 A5

TABLEAU V

ELISA immunométrique (polypeptide marqué) pour la détection d'anticorps NANB.

Positifs dans

Négatifs dans

Donneur l'essai l'essai accrédité

>2

0,217

0,234

0,821

0,252

>2

0,214

0,542

0,257

0,876

0,308

1,583

0,278

>2

0,296

>2

0,273

1,830

0,262

> 2

0,251

Ainsi, par l'analyse de format antiglobuline ou immunométrique, tous les échantillons à risques élevés donnent des résultats concordants.

EXEMPLE 11.-Formulation de vaccin.

Une formulation de vaccin peut être préparée par des techniques habituelles au moyen des constituants suivants dans les quantités indiquées:

Polypeptide viral PT-NANBH > 0,36 mg

Thiomersal 0,04-0,2 mg

Chlorure de sodium < 8,5 mg

Eau pour faire 1 ml

EXEMPLE 12.-

Production d'anticorps monoclonaux contre les polypeptides PT-NANBH.

L'insert ADN du DM415 est sous-cloné dans le vecteur p36C de transfert du bacillovirus et le virus résultant de la recombinaison produit par une méthode essentiellement similaire à celle décrite à l'exemple 7. Le virus recombiné est appelé BHC-1 et présente de très faibles niveaux de protéine spécifique à PT-NANBH. Des cellules Sf-9 (5 x 107 cellules/ml) contaminées avec BHC-1 sont lysées dans du PBS contenant 1% (v/v) NP40 et centrifugées à 13 000 g pendant 2 minutes. Le surnageant est passé sur Extractigel-D (Pierce Chemicals) pour retirer le détergent et ensuite mélangé sous forme d'émulsion 1:1 avec un adjuvant complet de Freund. On effectue une injection sous-cutanée de 0,1 ml d'émulsion (équivalent à 5 x 106 cellules) à des souris. On fait aux souris une injection intrapéritonéale de 0,1 ml (équivalant à 5 x 106 cellules) d'un extrait exempt de détergent de cellules Sf-9 contaminées par BHC-5, 14 et 28 jours après l'injection; le BHC-5 contient l'insert d'ADN de DM416. Du sang est prélevé à la queue et est analysé pour l'activité anti-PT-NANBH (exemple 10). Deux souris de réponse PT-NANBH spécifique sont ensuite injectées par intraveineuse par un extrait exempt de détergent de cellules Sf-9 infectées par BHC-7; le BHC-7 contient un insert ADN produit en ligaturant ensemble les régions de chevauchement de DM415 et DM416 (exemple 7). Elles ont subi une ablation de la rate trois jours plus tard.

Les cellules de rate sont fusionnées avec des cellules de myélome NSo en présence de PEG1500 en utilisant des techniques types. Les cellules d'hybridome résultantes sont choisies par croissance dans un milieu HAT (hypoxanthine, aminoptérine, thymidine). Le surnageant est examiné de manière sélective par ELISA pour constater l'activité anti-PT-NANBH, 10-14 jours après la fusion. Les cupules qui montrent une réactivité à la fois aux antigènes DX113 et BHC-7 (exemple 10) sont identifiées et les colonies individuelles sont transférées dans d'autres cupules, incubées et retestées. Les cupules présentant une réactivité spécifique à ce stade sont reclonées à une dilution limitée pour assurer la monoclonale.

15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

CH 684 594 A5

EXEMPLE 13.-

Détection de l'acide nucléique viral PT-NANBH chez des patients.

Sérums: les échantillons de 1400 donneurs enrôlés dans une étude prospective sur l'hépatite post-transfusionnelle sont congelés à -20°C. Des échantillons avant transfusion et après transfusion sériels des 260 récipients sont stockés de la même manière. Les échantillons d'après la transfusion sont prélevés tous les 15 jours pendant 3 mois, une fois par mois pendant 6 mois et 6 mois plus tard, jusqu'à 18 mois. Les sérums gelés du donneur et du récipient relatifs à trois incidents de PT-NANBH survenus en 1981 sont également disponibles pour étude. Le diagnostic de la PT-NANBH se base sur une augmentation de la transférase de i'acide aminé alanine du sérum (ALT), dépassant 2,5 fois la limite supérieure à la normale dans au moins deux échantillons séparés après transfusion. D'autres virus hépatotropes sont exclus par des essais sérologiques et les causes non virales de lésion hépatocellulaire sont exclues par des études conventionnelles cliniques et en laboratoire.

Immunodosage: des échantillons de sérum sont testés rétrospectivement afin de détecter la présence d'anticorps contre l'HCV (antigène C100) au moyen du kit Ortho Diagnostics ELISA utilisé d'après tes instructions du fabricant. Des sérums réactifs à plusieurs reprises sont titrés jusqu'au point final dans un sérum humain négatif pour Panti-C100.

Détection des séquences virales PT-NANBH: l'ARN du sérum ou du plasma est extrait, soumis à transcriptase réverse et amplifié comme dit ci-dessous. Les amorces oligonucléotides de la transcripta-se réverse/PCR sont dérivées de la séquence de nucléotide du clone JG2 isolé dans l'exemple 3, et synthétisées sur un synthétiseur Applied Biosystems 381 A. Les séquences des quatre amorces oligonucléotides sont les suivantes.

Désignation

SEQ ID n°

Dimension du produit d94 sens

8

729 pb d95 antisens

9

N1 sens

9

402 pb

N2 antisens

11

(i) Extraction ARN.

On porte à 200 ni, 5-50 ni de sérum (ou de plasma) en ajoutant de l'eau distillée stérile. L'échantillon de 200 ni est ajouté à un volume égal de solution tampon 2 x PK (2 x PK = 0,2 M Tris-CI, pH 7,5, 25 mM EDTA, 0,3 M NaCI, 2% p/v SDS, protéinase K 200 ng/ml), mélangé et incubé à 37°C pendant 40 minutes. Les protéines ont été enlevées en extrayant deux fois avec du phénol/chloroforme et une fois avec du chloroforme seulement. On ajoute 20 ng de glycogène à la phase aqueuse et l'ARN est alors précipité en ajoutant 3 volumes d'éthanol absolu glacé. Après stockage à -70°C pendant 1 heure, l'ARN est mis en culot dans une centrifugeuse Eppendorf (15 minutes, 14 000 tours/minute, 4°C). Le culot est lavé une fois dans de l'éthanol à 95%, séché sous vide et dissous dans 10 ni d'eau distillée stérile. Les solutions d'ARN sont stockées à -70°C.

(ii) Synthèse ADNc.

Un mélange de 10 ni contenant 2 ni de solution d'ARN, 50 ng d'oligonucléotide synthétique d95, 10 mM Hepes-HCI pH 6,9 et 0,2 mM EDTA pH 8,0 est préparé. Ce mélange de 10 ni est recouvert de 2 gouttes d'huile minérale, chauffé pendant 2 minutes dans un bain d'eau à 90°C et rapidement refroidi sur de la glace. La synthèse de l'ADNc est effectuée après ajustement de la réaction de manière à ce qu'elle contienne 50 mM Tris-HCI pH 7,5, 75 mM KCl, 3 mM MgCb, 10 mM DTT, 0,5 mM de dATP, dCTP, dGTP et dTTP, 20 unités d'inhibiteur RNase (Pharmacia) et 15 unités de transcriptase réverse MLV clonée (Pharmacia) dans un volume final de 20 ni- Le mélange de 20 n' est incubé à 37°C pendant 90 minutes. Après synthèse, l'ADNc est stocké à -20°C.

(iii) «Nested» PCR.

Tout au long de cette étude, des résultats de PCR positifs erronés sont évités en appliquant strictement les mesures de prévention de la contamination de Kwok et Higuchi (Nature, 1989, 339, 237-238).

a) Tour 1.

La réaction en chaîne de polymérase est effectuée dans un mélange de 50 ni contenant 10 mM Tris-HCI pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCb, de la gélatine à 0,1% p/v, 1 unité de polymérase ADN Taq

16

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 684 594 A5

résultant de la recombinaison (Perkin Elmer Cetus), 200 nM de dNTP, 30 ng de chaque amorce «externe» (d94 et d95; SEQ ID n° 8 et 9 respectivement) et 5 ßl de la solution d'ADNc. Après une première dénaturation de 5 minutes à 94°C, 35 cycles de 95°C pendant 1,2 minute, 56°C pendant 1 minute, 72°C pendant 1 minute sont effectués, suivis d'une extension finale de 7 minutes à 72°C (Techne PHC-1 Automated Thermal Cycler).

b) Tour 2.

Le mélange réactionnel est comme décrit ci-dessus pour le Tour 1, mais 125 ng de chaque amorce «interne», N1 et N2 (SEQ ID n° 10 et 11 respectivement) ont été utilisés au lieu des amorces «externes» d94 et d95. Un petit échantillon d'1 ni des produits PCR du Tour 1 est transféré dans le mélange réactionnel de 50 ni du Tour 2. On effectue 25 cycles de 95°C pendant 1,2 minute, 46°C pendant 1 minute, 72°C pendant 1 minute, suivis d'une extension à 72°C pendant 7 minutes.

c) Analyse.

On analyse 20 ni des produits PCR du Tour 1 et du Tour 2 par électrophorèse sur un gel agarose à 2%. Les bandes ont été visualisées par coloration au bromure d'éthidium et photographiées à 302 nm.

Valeur de prédiction de la sérologie anti-C100 et PCR dans l'étude prospective: 6 des 1400 donneurs (0,43%) enrôlés dans l'étude prospective ont présenté des anticorps contre le C100 dans leur sérum. Parmi ces 6 donneurs aux anticorps positifs, 1 seulement (le donneur D6) s'est avéré être contaminé comme on a pu l'apprécier par le développement de la séroconversion PT-NANBH et HCV dans un récipient (récipient R6) voir tableau VI ci-dessous.

Les séquences virales sont détectées par PCR dans le sérum du donneur D6, mais pas dans l'un quelconque des sérums des 5 autres donneurs séropositifs. Le récipient R6 où s'est développée la pT-NANBH avait également reçu du sang de 7 autres donneurs (D7 à D13). Les sérums de ces donneurs ont été testés et se sont avérés négatifs à la fois pour les anticorps et pour le PCR.

TABLEAU VI

Résumé des données donneur/recipient: étude prospective.

Donneurs Donneur anti-HCV

PCR

Récipients Récipient

PT-NANBH

Séroconversion anti-HCV

D1

+

-

R1

Non

Non

D2

+

-

R2

Non

Non

D3

+

-

R3

Non

Non

D4

+

-

R4

Non

Non

D5

+

-

R5

Non

Non

D6

+

+

D7

-

-

D8

-

-

D9

-

-

R6

Oui*

Oui+

D10

-

-

D11

-

-

D12

-

-

D13

-

-

'Période d'incubation 1 mois. +Séroconversion 5 mois après la transfusion.

EXEMPLE 14.-

Isolement et expression de séquences d'ADN PT-NANBH supplémentaires.

Les bibliothèques lambda gt11 préparées à l'exemple 2 sont également sélectionnées avec les sérums de patients a haut risque pour le PT-NANBH, mais qui n'ont pas réagi aux antigènes viraux, DX113, BHC-5 et BHC-7, le raisonnement étant qu'ils pourraient bien contenir des anticorps qui reconnaissent différents antigènes. Les sérums PJ-5 (The Newcastle Royal Infirmary, Newcastle), Birm-64

17

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 684 594 A5

(Queen Elizabeth Medicai Centre, Birmingham), PG et Le (University College and Middlesex School of Medicine, Londres) satisfont à ce critère et sont utilisés pour sélectionner les bibliothèques suivant une procédure identique à celle décrite dans les exemples 3 et 4. Une série d'éléments résultant de ia recombinaison sont donc identifiés, dont aucun ne s'est croisé avec des sondes de JG2 et JG3. L'un des produits de recombinaison, BR11, identifié par réaction avec PJ-5, est choisi pour poursuivre l'analyse.

Le clone, BR11, contient un insert d'environ 900 pb qui a été amplifié par PCR au moyen des amorces d75 et d76 (SEQ ID n° 6 et 7) comme décrit à l'exemple 7. La séquence amplifiée est directement clonée dans le vecteur bacillovirus pAc360 pour former du pDX128 contenant un cadre de lecture ouvert en phase avec les 11 premiers acides aminés de la polyhédrine. Les stocks de bacillovirus recombinés (appelés BHC-9) sont produits suivant la procédure décrite à l'exemple 7. Des cellules d'insectes sont contaminées avec un virus recombiné purifié et un polypeptide d'environ 22 kd a été obtenu dans des extraits de cellule marqués radioactivement.

L'insert amplifié de BR11 est également cloné dans le vecteur phage pUC13 et M13 pour séquençage; l'ADN et les données de séquence des acides aminés sont présentés en SEQ ID n° 5. L'insert contient 834 pb plus les lieurs EcoRI ajoutés pendant le clonage.

EXEMPLE 1S--

Activité du polypeptide BHC-9 dans une ELISA.

Une ELISA est établie au moyen de cupules de microtitrage revêtues d'un extrait de cellule infectée BHC-9 et d'un système de détection de conjugué Ig antihumain suivant la procédure décrite à l'exemple 10. Une panoplie de sérums à haut risque a été testée en parallèle avec BHC-7 et BHC-9 et à également été examinée par PCR au moyen du procédé décrit à l'exemple 13. Les résultats sont indiqués au Tableau VII dans lequel les échantillons positifs sont soulignés.

TABLEAU VII

Numéro

PCR

BHC-7

BHC-9

1

+

2.09

2.00

2

+

2.09

2.00

3

+

1.89

1,37

4

+

1.57

0,27

5

+

1.26

2.00

6

+

0.91

2.00

7

-

0.90

£L51

8

+

0.84

1.19

9

-

0.53

0.43

10

-

0.45

2.00

11

+

0,37

1.07

12

-

0,32

2.00

13

-

0,23

0,30

14

-

0,15

0.43

15

+

0,16

0.76

16

-

0,09

hZâ

17

-

0,27

2.00

18

-

0,15

2.00

19

-

0,12

2.00

20

-

0,08

0,05

coupure

0,27

0,29

De ces 20 échantillons, 50% sont manifestement positifs avec le BHC-7 alors que 85% sont positifs avec le BHC-9. Deux échantillons (11 et 12) qui sont à la limite du positif avec le BHC-7 sont clairement positifs avec le BHC-9 et certains échantillons qui sont au niveau de la coupure ou en dessous avec le BHC-7 sont positifs avec le BHC-9. De plus, deux échantillons (11 et 15) qui sont à la limite ou

18

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 684 594 A5

négatifs avec le BHC-7, mais positifs avec le BHC-s, sont PCR positifs. Dans l'ensemble, il n'y a que deux échantillons (13 et 20) qui sont négatifs avec les deux polypeptides et le PCR.

EXEMPLE 16.-

Isolement des séquences d'ADN PT-NANBH chevauchant des clones existants.

La sélection immunologique des bibliothèques d'expression ADNc décrites aux exemples 3, 4 et 14 ne peut identifier que les clones qui contiennent une région immunoréactive du virus. Une autre approche de la production de clones spécifiques à la PT-NANBH est d'utiliser le PCR pour amplifier les molécules d'ADNc qui chevauchent les clones existants. Des jeux d'amorces peuvent être préparés lorsqu'un membre de la paire se trouve dans des séquences clonées existantes et l'autre en-dehors; cette approche peut être étendue aux paires d'amorces «nichées» également.

L'ADNc préparé comme à l'exemple 1 a été amplifié par PCR, avec des paires d'amorces simples ou «nichées», au moyen des conditions de réaction décrites à l'exemple 13. L'approche est illustrée par l'utilisation des paires d'amorces suivantes: d164 (SEQ ID n° 12) et d137 (SEQ ID n° 13); d136 (SEQ ID n° 14) et d155 (SEQ ID n° 15); d156 (SEQ ID n° 16) et d92 (SEQ n° 17). Un membre de chaque paire est conçu pour amorcer dans les séquences clonées existantes (d137 et d136 amorcent respectivement dans les extrémités 5' et 3' de BR11, d92 amorce l'extrémité 5' de JG3). Les autres amorces sont basées sur des séquences disponibles pour d'autres agents PT-NANBH. L'amorce d164 correspond aux bases 10 à 31 de la fig. 2 dans Okamoto et ai., Japan, J. Exp. Med., 1990, 60, 167-177. Les amorces d155 et d156 correspondent aux positions 462 à 489 et 3315 à 3337 respectivement de la fig. 47 de la demande de brevet européen 88 310 922.5. Une ou plusieurs substitutions de nucléotides peuvent se faire pour introduire un site de reconnaissance EcoRI près de l'extrémité 5' des amorces, sauf pour d164 où un site de reconnaissance Bg12 a été introduit; ces changements facilitent ie clonage ultérieur du produit amplifié.

Les produits PCR sont digérés par la ou/les enzymes de restriction appropriées, décomposées par électrophorèse sur gel agarose et des bandes de la dimension attendue ont été excisées et clonées en vecteurs de plasmides et de bactériophages tels que décrits à l'exemple 5. Les séquences des ADN amplifiés 164/137 (SEQ ID n° 18), 136/155 (SEQ ID n° 19) et 156/92 (SEQ ID n° 20) sont présentées dans la liste des séquences. Ces nouvelles séquences étendent la couverture du génome PT-NANBH au-delà de celle obtenue par immunosélection (SEQ ID n° 3, 4 et 5). Ces séquences, ainsi que d'autres qui se trouvent dans les régions déjà décrites, peuvent être combinées en une séquence continue à l'extrémité 5' (SEQ ID n° 21) et à l'extrémité 3' (SEQ ID n° 22) du génome PT-NANBH.

EXEMPLE 17.-

Fusion de différents antigènes PT-NANBH en un seul Polypeptide recombiné.

Les données présentées au Tableau VII indiquent qu'alors qu'on détecte plus d'échantillons de sérum anticorps positifs en utilisant BHC-9 comme antigène cible (17/20) plutôt que BHC-7 (10/20), il y a certains échantillons (par exemple, #4) qui ne sont positifs qu'avec BHC-7. Cette image est confirmée par la poursuite des essais. De même, un construct de fusion a été induit au moyen de la séquence à partir de BHC-7 et BHC-9.

Les séquences de BHC-7 et BHC-9 peuvent être combinées de toute une série de manières: chaque séquence peut être positionnée à l'extrémité amino de la fusion résultante et la nature de la séquence de liaison peut également varier. La fig. 2 illustre deux manières possibles de combiner ces séquences.

Les fragments de restriction appropriés portant des sites d'enzymes de restriction appropriés et des séquences lieur ont été générés soit par PCR au moyen d'amorces spécifiques ou par digestion des plasmides existants par les enzymes de restriction. Le vecteur de transfert DX143 consiste en un fragment BamHI/Pst1 de DX122 (fig. 1; le site Pst est à la position 1504 JG2, SEQ ID n° 3) lié à l'extrémité 5' de l'ensemble de la région codante de BR11 (SEQ ID n° 7) qui a été amplifiée en tant que fragment de Pst1/BamHI utilisant des amorces d24 (SEQ ID n° 23) et d126 (SEQ ID n° 24); la région de liaison consiste en six dérivés acides aminés de l'amorce d126 et en séquences du bactériophage lambda résiduelles. Le vecteur de transfert DX136 diffère de DX143 en ce que le fragment BR11 a été généré au moyen de d24 (SEQ ID n° 23) et d132 (SEQ ID n° 25) et ainsi la région de liaison contient cinq lysines. Ces vecteurs de transfert sont: utilisés pour cotransfecter des cellules Sf-9 d'insectes en culture avec l'ADN AcNPV et des stocks purifiés de plaques de bacillovirus résultant de la recombinaison ont été produits comme décrit à l'exemple 7. BHC-10 a été produit comme résultat de la transfec-tion avec DX143; BHC-11 comme résultat de la transfection avec DX136.

Les polypeptides résultants de la recombinaison exprimés par ces deux virus sont analysés par SDS-PAGE et transfert Western. Le BHC-10 produit un polypeptide avec un poids moléculaire apparent de 118 kd. Le BHC-11 a produit un polypeptide avec un poids moléculaire apparent de 96 kd. Les deux polypeptides réagissent avec des sérums connus pour réagir dans ELISA uniquement avec BHC-7 (par exemple, sérum A) ou uniquement avec BHC-9 (sérum B64, exemple 14). Les deux polypeptides ne diffèrent que dans la séquence lieur et ceci peut affecter soit leur mobilité sur SDS-PAGE, soit la manière par laquelle ils sont traités dans les cellules infectées.

19

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 684 594 A5

EXEMPLE 18--

Activité des antigènes de fusion PT-NANBH dans une ELISA.

Une ELISA est établie au moyen de cupules de microtitrage recouvertes d'extraits de cellules infectées au BHC-9 et d'un conjugué Ig antihumain suivant la procédure décrite à l'exemple 10. Le tableau VIII présente les données à partir d'une comparaison des deux fusions avec les autres antigènes PT-NANBH recombinés BHC-7 et BHC-9 ainsi que la protéine recombinée HCV, C-100-3 (Ortho Diagnostic Systems, Raritan, New Jersey). Les sérums sont groupés par modèle de réaction avec BHC-7, BHC-9 et C-100-3. Les sérums du Groupe I réagissent violemment avec les trois antigènes; le Groupe II réagit violemment avec BHC-7 uniquement; le Groupe III réagit violemment avec BHC-9 uniquement et le Groupe IV réagit violemment avec seulement deux des trois antigènes.

TABLEAU VIII

SERUM

BHC-7

BHC-9

C-100-3

BHC-10

BHC-11

Groupe I

AH

>2,0

>2,0

>2,0

>2,0

>2,0

AC

> 2,0

>2,0

>2,0

>2,0

>2,0

57

>2,0

>2,0

>2,0

>2,0

>2,0

77

>2,0

> 2,0

>2,0

>2,0

>2,0

84

1.4

>2,0

>2,0

>2,0

>2,0

Groupe II

805-6

>2,0

0,261

0,1

1,78

+*

805-17

>2,0

0,181

0,12

1,37

+*

805-149

>2,0

0,651

0,084

1,57

++*

Groupe III

JS

0,32

>2,0

0,17

>2,0

>2,0

805-57

0,069

1,403

0,25

1,9

+*

805-82

0,116

1,272

0,4

1,85

++*

805-94

0,353

1,675

0,2

>2,0

+*

PJ1

0,27

> 2,0

0,2

>2,0

1,85

Groupe IV

A

>2,0

0,14

>2,0

>2,0

>2,0

KT

1,57

0,27

>2,0

>2,0

>2,0

Le

0,152

>2,0

>2,0

>2,0

>2,0

PJ5

0,123

>2,0

>2,0

>2,0

>2,0

303-923

>2,0

0,9

0,37

1,9

+*

303-939

>2,0

1,55

0,268

2,0

+*

*Ces échantillons n'ont été testés que par transfert Western sur BHC-11.

Ces données montrent qu'à la fois BHC-10 et BHC-11 ont une réactivité similaire avec ces sérums et, ce qui est plus important, que les deux activités antigéniques semblent avoir été retenues par les fusions. Tous les sérums des Groupes II et III qui ne réagissent respectivement qu'avec BHC-7 ou BHC-9, donnent une réaction claire avec les fusions. En outre, il semblerait qu'avoir les deux antigènes ensemble donne un essai plus sensible. Par exemple, l'échantillon KT donne des DO de 1,57 et 0,27 avec BHC-7 et 10 BHC-9 respectivement, alors qu'avec les fusions, la DO est > 2,0.

20

a>

o en ai

CJl o

4^ CJl

■t*. O

CO

CJl co o

Ol ro o

SEQ ID n° : 1

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide

LONGUEUR DE SEQUENCE : 21 BASES

ETAT EN BRIN : monobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADN synthétique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : bactériophage lambda gtll

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide; oligo dl9 CARACTERISTIQUES :

de 1 à 21 bases homologues à la partie amont du gène lacZ flanquant le site EcoRI dans le bactériophage lambda gtll

PROPRIETES : amorce la synthèse d'ADN à partir du vecteur phage dans l'ADNc inséré au site

EcoRI

GGTGGCGACG ACTCCTGGAG C

21

Ol en en o

•t*

en

O

CO

en co o

ro en ro o

SEQ ID n° : 2

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide LONGUEUR DE SEQUENCE : 21 BASES

ETAT EN BRIN : monobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADN synthétique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : bactériophage lambda gtll

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide; oligo d20 CARACTERISTIQUES :

de 1 à 21 bases homologues à la partie amont du gene lacZ flanquant le site EcoRI dans le bactériophage lambda gtll

PROPRIETES : amorce la synthèse d'ADN à partir du vecteur phage dans l'ADNc inséré au site d1EcoRI

TTGACACCAG AÇCAACTGGT A

21

o co o

ro o

SEQ ID n° : 3

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR DE SEQUENCE : 177 0 PAIRES DE BASES

ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADNc à ARN génomique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B 0

post-transfusionnelle ^

00

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : clone JG2 de bibliothèque ADNc dans lambda gtll £

>

Ol

CARACTERISTIQUES :

de partie 1 à 1770 pb de la polyprotéine PT-NANBH

PROPRIETES : code probablement des protéines virales non structurelles

CAA AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC AAC CTC CTG TGG Gin Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp

5 10 15

48

CGG CAT GAG ATG GGC GGG GAC ATT ACC CGC GTG GAG TCA GAG AAC AAG Arg His Glu Met Gly Gly Asp Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys 20 25 30

96

en en

Ol en

Ol o

4*.

Ul

4^ O

CO cn co o

ro tn ro o

GTA GTA ATC CTG GAC TCT TTC GAC CCG CTC CGA GCG GAG GAG GAT GAG 144 Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala Glu Glu Asp Glu 35 40 45

CGG GAA GTG TCC GTC CCG GCG GAG ATC CTG CGG AAA TCC AAG AAA TTC 192

Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe 50 55 60

CCA CCA GCG ATG CCC GCA TGG GCA CGC CCG GAT TAC AAC CCT CCG CTG 240 Pro Pro Ala Met Pro Ala Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu

65 70 75 80

O

CTG GAG TCC TGG AAG GCC CCG GAC TAC GTC CCT CCA GTG GTA CAT GGG 288 *

Leu Glu Ser Trp Lys Ala Pro Asp Tyr Val Pro Pro Val Val His Gly g m 85 90 95 f s

TGC CCA CTG CCA CCT ACT ÄAG ACC CCT CCT ATA CCA CCT CCA CGG AGA 33 6 £

Cys Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg o* 100 105 110

AAG AGG ACA GTT GTT CTG ACA GAA TCC ACC GTG TCT TCT GCC CTG GCG 3 84

Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Val Ser Ser Ala Leu Ala 115 120 125

GAG CTT GCC ACA AAG GCT TTT GGT AGC TCC GGA CCG TCG GCC GTC GAC 432

G lu Leu Ala Thr Lys Ala Phe Gly Ser Ser Gly Pro Ser Ala Val Asp 130 135 140

AGC GGC ACG GCA ACC GCC CCT CCT GAC CAA TCC TCC GAC GAC GGC GGA Ser Gly Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp Gin Ser Ser Asp Asp Gly Gly 145 150 155 160

480

O)

en

05

o

Ol o

o co

Ol co o

l\D

en

N> O

GCA GGA TCT GAC GTT GAG TCG TAT TCC TCC ATG CCC CCC CTT GAG GGG 528

Ala Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly

165 170 175

GAG CCG GGG GAC CCC GAT CTC AGC GAC GGG TCT TGG TCT ACC GTG AGT 57 6

Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser 180 185 190

GAG GAG GCC GGT GAG GAC GTC GTC TGC TGC TCG ATG TCC TAC ACA TGG 624

Glu Glu Ala Gly Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp 195 200 205

ACA GGC GCT CTG ATC ACG CCA TGC GCT GCG GAG GAA AGC AAG CTG CCC 672 i

Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu Ser Lys Leu Pro o>

n, 210 215 220 S

01 Ol

ATC AAC GCG TTG AGC AAC ÏCT TTG CTG CGT CAC CAC AAC ATG GTC TAC 72 0 *

Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His Asn Met Val Tyr

225 230 235 240

GCT ACC ACA TCC CGC AGC GCA AGC CAG CGG CAG AAG AAG GTC ACC TTT 768

Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Gin Arg Gin Lys Lys Val Thr Phe

245 250 255

GAC AGA CTG CAA ATC CTG GAC GAT CAC TAC CAG GAC GTG CTC AAG GAG 816

Asp Arg Leu Gin Ile Leu Asp Asp His Tyr Gin Asp Val Leu Lys Glu 260 265 270

ATG AAG GCG AAG GCG TCC ACA GTT AAG GCT AAG CTT CTA TCA GTA GAG Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala Lys Leu Leu Ser Val Glu 275 280 285

864

Ol

Ol

Ol o

Ol o

03

Ol

03

o

N> Ol

1*0 O

GAA GCC

Giù Ala

290

TAT GGG Tyr Gly 305

ATC CGC Ile Arg

GAC ACC Asp Thr

AGA GGA Arg Gly

GTC CGT Val Arg 370

CCT CAG Pro Gin 385

CAG CGG Gin Arg

TGC AAG

Cys Lys

GCA AAG Ala Lys

TCC GTG Ser Val

ACC ATC Thr Ile 340

GGC CGC Gly Arg 355

GTG TGC Val Cys

GCT GTG Ala Val

GTC GAG Val Glu

CTG ACG

Leu Thr

GAC GTC Asp Val 310

TGG GAG Trp Glu 325

ATG GCA Met Ala

AAG CCA Lys Pro

GAG AAA Glu Lys

ATG GGC Met Gly 390

TTC CTG Phe Leu 405

CCC CCA

Pro Pro

295

CGG AAC Arg Asn

GAC TTG Asp Leu

AAA AAT Lys Asn

GCT CGC Ala Arg 360

ATG GCC Met Ala 375

TCC TCG Ser Ser

GTG AAC Val Asn

CAT TCG His Ser

CTA TCC Leu Ser

TTG GAA Leu Glu 330

GAG GTT Glu Val 345

CTT ATC Leu Ile

CTC TAT Leu Tyr

TAC GGA Tyr Gly

GCC TGG Ala Trp 410

GCC AAA Ala Lys 300

AGC AAG Ser Lys 315

GAC ACT Asp Thr

TTC TGC Phe Cys

GTG TTC Val Phe

GAC GTG Asp Val 380

TTC CAG Phe Gin 395

AAA TCA Lys Ser

TCT AAA Ser Lys

GCC ATT Ala Ile

GAA ACA Glu Thr

GTC CAA Val Gin 350

CCA GAC Pro Asp 365

GTC TCC Val Ser

TAT TCT Tyr Ser

AAG AAG Lys Lys

TTT GGC Phe Gly

AAC CAC Asn His 320

CCA ATT Pro Ile 335

CCA GAG Pro Glu

TTG GGG Leu Gly

ACC CTC Thr Leu

CCT GGA Pro Gly 400

ACC CCT Thr Pro 415

01

Ol

Ol o

Ol

CO

o ro

Ol ro o

l\D -vi

ATG GGC TTT GCA TAT GAC ACC CGC TGT TTT GAC TCA ACA GTC ACT GAG 129 6

Met Gly Phe Ala Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu 420 425 430

AAT GAC ATC CGT GTA GAG GAG TCA ATT TAT CAA TGT TGT GAC TTG GCC 13 44

Asn Asp Ile Arg Val Glu Glu Ser Ile Tyr Gin Cys Cys Asp Leu Ala 435 440 445

CCC GAA GCC AGA CAG GCC ATA AGG TCG CTC ACA GAG CGG CTT TAT ATC 139 2

Pro Giù Ala Arg Gin Ala Ile Arg Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Ile 450 455 460

GGG GGT CCC CTG ACT AAT TCA AAA GGG CAG AAC TGC GGC TAT CGC CGG 1440 i

Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gin Asn Cys Gly Tyr Arg Arg o>

465 470 475 480 S

Ol

TGC CGC GCG AGC GGC GTG CTG ACG ACT AGC TGC GGT AAT ACC CTC ACA 14 88 52

Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr

485 490 495

TGT TAC TTG AAG GCC TCT GCA GCC TGT CGA GCT GCA AAG CTC CAG GAC 153 6

Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg Ala Ala Lys Leu Gin Asp 500 505 510

TGC ACG ATG CTC GTG TGC GGA GAC GGC CTT GTC GTT ATC TGT GAG AGC 1584

Cys Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val Ile Cys Glu Ser 515 520 525

GCG GGA ACC CAG GAG GAC GCG GCG AGC CTA CGA GTC TTC ACG GAG GCT Ala Gly Thr Gin Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Val Phe Thr Glu Ala 530 535 540

1632

en o

Ol

Ol

Ol o

01

o co

Ol co o

N> Ol ro o

ATG ACT AGG TAC TCT GCC CCC CCC GGG GAC CCG CCC CAA CCA GAA TAC Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro Gin Pro Glu Tyr 545 550 555 560

GAC CTG GAG TTG ATA ACA TCA TGC TCC TCC AAT GTG TCG GTC GCG CAC Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val Ala His

565 570 575

GAT GCA TCT GGC AAA AGG GTA TAC TAC CTC ACC CGT GAC CCG Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro 580 585 590

-È* CTI

O

CO

o

SEQ ID n° : 4

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR DE SEQUENCE : 103 5 PAIRES DE BASES

ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADNc à ARN génomique

O

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B ^

o post-transfusionnelle $2

03 Ol

CO Jä.

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : clone JG3 de bibliothèque ADNc dans lambda gtll >

CARACTERISTIQUES :

partie de 1 à 1035 pb de la polyprotéine PT-NANBH

PROPRIETES : code probablement des protéines virales non structurelles

ACA GAA GTG GAT GGG GTG CGG CTG CAC AGG TAC GCT CCG GCG TGC AAA Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr Ala Pro Ala Cys Lys

5 10 15

48

CI

Ol

Ol o

•s*

Ol

41. O

CO

Ol co o

IV)

Ol

IO

o

CCT CTC CTA CGG GAG GAG GTC ACA TTC CAG GTC GGG CTC AAC CAA TAC Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr Phe Gin Val Gly Leu Asn Gin Tyr 20 25 30

CTG GTT GGG TCG CAG CTC CCA TGC GAG CCC GAA CCG GAT GTA GCA GTG Leu Val Gly Ser Gin Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro Asp Val Ala Val 35 40 45

CTC ACT TCC ATG CTC ACC GAC CCC TCC CAC ATC ACA GCA GAG ACG GCT Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Thr Ala 50 55 60

AAG CGC AGG CTG GCC AGG GGG TCT CCC CCC TCC TTG GCC AGC TCT TCA Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser Ser 65 70 75 80

GCT AGC CAG TTG TCT GGC CCT TCC TCG AAG GCG ACA TAC ATT ACC CAA Ala Ser Gin Leu Ser Gly Pro Ser Ser Lys Ala Thr Tyr Ile Thr Gin

85 90 95

AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC AAC CTC CTG TGG CGG Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg 100 105 110

CAT GAG ATG GGC GGG GAC ATT ACC CGC GTG GAG TCA GAG AAC AAG GTA His Glu Met Gly Gly Asp Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val 115 120 125

GTA ATC CTG GAC TCT TTC GAC CCG CTC CGA GCG GAG GAG GAT GAG CGG Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala Glu Glu Asp Glu Arg 130 135 140

O)

o

Ol

Ol

Ol

O

CO

Ol

CO

o ro

Ol ro o

GAA GTG TCC GTC CCG GCG GAG ATC CTG CGG AAA TCC AAG AAA TTC CCA 480

Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe Pro 145 150 155 160

CCA GCG ATG CCC GCA TGG GCA CGC CCG GAT TAC AAC CCT CCG CTG CTG 528

Pro Ala Met Pro Ala Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Leu

165 170 175

GAG TCC TGG AAG GCC CCG GAC TAC GTC CCT CCA GTG GTA CAT GGG TGC 57 6

Glu Ser Trp Lys Ala Pro Asp Tyr Val Pro Pro Val Val His Gly Cys

180 185 190

CCA CTG CCA CCT ACT AAG ACC CCT CCT ATA CCA CCT CCA CGG AGA AAG 624

Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg Lys O

195 200 205

I

o>

00

AGG ACA GTT GTT CTG ACA GAA TCC ACC GTG TCT TCT GCC CTG GCG GAG 672 £

Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Val Ser Ser Ala Leu Ala Glu g

210 215 220 >

Cl

CTT GCC ACA AAG GCT TTT GGT AGC TCC GGA CCG TCG GCC GTC GAC AGC 720

Leu Ala Thr Lys Ala Phe Gly Ser Ser Gly Pro Ser Ala Val Asp Ser

225 230 235 240

GGC ACG GCA ACC GCC CCT CCT GAC CAA TCC TCC GAC GAC GGC GGA GCA 768

Gly Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp Gin Ser Ser Asp Asp Gly Gly Ala

245 250 255

GGA TCT GAC GTT GAG TCG TAT TCC TCC ATG CCC CCC CTT GAG GGG GAG 816

Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu 260 265 270

CCG GGG GAC CCC GAT CTC AGC GAC GGG TCT TGG TCT ACC GTG AGT GAG Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser Glu

864

Ol

Ol

Ol o

•b.

Ol o

CO

Ol

CO

o ro

Ol

N> o

GAG GCC Giù Ala 290

GGC GCT Gly Ala 305

AAC GCG Asn Ala

275

GGT GAG Gly Glu

CTG ATC Leu Ile

TTG AGC Leu Ser

GAC GTC Asp Val

ACG CCA Thr Pro 310

AAC TCT Asn Ser 325

280

GTC TGC Val Cys 295

TGC GCT Cys Ala

TTG CTG Leu Leu

TGC TCG Cys Ser

GCG GAG Ala Glu

CGT CAC Arg His 330

ATG TCC Met Ser 300

GAA AGC Glu Ser 315

CAC AAC His Asn

285

TAC ACA Tyr Thr

AAG CTG Lys Leu

ATG GTC Met Val

TGG ACA Trp Thr

CCC ATC Pro Ile 320

TAC GCT Tyr Ala 335

ACC ACA TCC CGC AGC GCA AGC CAG CGG Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Gin Arg 340 345

Ol o

4^

en

■e*, o i\3 en ro o

SEQ ID n° : 5

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR DE SEQUENCE : 834 PAIRES DE BASES

ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADNc à ARN génomique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain; sérum infecté par hépatite non-A, post-transfusionnelle

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : clone BRU de bibliothèque ADNc dans lambda gtll CARACTERISTIQUES :

partie de 1 à 834 pb de la polyprotéine PT-NANBH

PROPRIETES : code probablement des protéines virales structurelles

AGA AAA ACC AAA CGT AAC ACC AAC CTC CGC CCA CAG GAC GTC AGG TTC Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Leu Arg Pro Gin Asp Val Arg Phe

5 10 15

CCG GGC GGT GGT CAG ATC GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG Pro Gly Gly Gly Gin Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg 20 25 30

o>

o

Ol

Ol

Ol o

Ol o

03

01

03

o l\3 Ol

N> O

GGC CCC AGG TTG GGT GTG CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser 35 40 45

CAA CCT CGT GGA AGG CGA CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CAG CCC GAG Gin Pro Arg Gly Arg Arg Gin Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gin Pro Glu 50 55 60

GGC AGG GCC TGG GCT CAG CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAC Gly Arg Ala Trp Ala Gin Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn 65 70 75 80

GAG GGC ATG GGG TGG GCA GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGT GGC TCC CGG Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg

85 90 95

CCT AGT TGG GGC CCC ACT GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly 100 105 110

AAA GTC ATC GAT ACC CTC ACA TGC GGC TTC GCC GAC TCT CAT GGG GTA Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Ser His Gly Val 115 120 125

CAT TCC GCT CGT CGG CGC TCC CTT AGG GGC GCT GCC AGG GCC CTG GCG His Ser Ala Arg Arg Arg Ser Leu Arg Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala 130 135 140

CAT GGC GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn 145 150 155 160

en

CJl

01

Ol

■N Ol o

CO

o

N> Ol ro o

w

Ol

TTA CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTG CTG TCC TGT 52 8

Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys

165 170 175

TTG ACC ATT CCA GCT TCC GCT TAT GAA GTG CGC AAC GTG TCC GGG ATC 57 6

Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile 180 185 190

TAC CAT GTC ACG AAC GAT TGC TCC AAC TCA AGC ATC GTG TAC GAG ACA 62 4

Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Thr 195 200 205

0

GCG GAC ATG ATC ATG CAC ACC CCC GGG TGT GTG CCC TGT GTC CGG GAG 672 1

Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu g

210 215 220

01 CO

GGT AAT TCC TCC CGC TGC T'GG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC 72 0 £

Gly Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala oi

225 230 235 240

AAG GAC GCC AGC ATC CCC ACT GCG ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG 768

Lys Asp Ala Ser Ile Pro Thr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu

245 250 255

CTC GTT GGG GCG GCT GCC TTC TCG TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC 816

Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Ser Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu

260 265 270

TGC GGA TCT GTT TTC CCG Cys Gly Ser Val Phe Pro 275

834

Ol

Ol

Ol o

■fc. Ol o

u

Ol

05

o ro

Ol

N> O

SEQ ID n° : 6

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide

LONGUEUR DE SEQUENCE : 31 BASES

ETAT EN BRIN : monobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADN synthétique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : bactériophage lambda gtll

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide; oligo d75

CARACTERISTIQUES :

de 4 à 9 bases du site BamHI

de 10 à 31 bases homologues à la portion amont du gène lacZ flanquant le site EcoRI dans le bactériophage lambda gtll de 2 6 à 31 bases du site EcoRI

PROPRIETES : amorce la synthèse à partir du vecteur phage dans l'ADNc inséré au site d'EcoRI et introduit un site BamHI approprié pour le clonage ultérieur dans les vecteurs d'expression ,

TAAGGATCCC CCGTCAGTAT CGGCGGAATT C

31

O)

o

Ol en

4^ Oi o

co

Ol ro en ro o

SEQ ID n° : 7

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide

LONGUEUR DE SEQUENCE : 3 0 BASES

ETAT EN BRIN : monobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADN synthétique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : bactériophage lambda gtll

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide; oligo d76

CARACTERISTIQUES :

de 4 à 9 bases du site BamHI

de 10 à 31 bases homologues à la portion aval du gène lacZ flanquant le site EcoRI dans le bactériophage lambda gtll

PROPRIETES : amorce la synthèse de l'ADN à partir du vecteur phage dans l'ADNc inséré au site EcoRI et introduit un site BamHI approprié pour le clonage ultérieur dans les vecteurs d'expression

TATGGATCCG TAGCGACCGG CGCTCAGCTG

30

O)

o

Ol

Ol

Ol o

-U Ol

4*. O

co Ol co o

fO Ol ro o

SEQ ID n° : 8

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide LONGUEUR DE SEQUENCE : 19 BASES

ETAT EN BRIN : monobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADN synthétique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionnelle

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide; oligo d94 CARACTERISTIQUES :

de 1 à 19 bases homologues aux bases 914 à 932 du brin de sens de JG2 (SEQ ID N°3)

PROPRIETES : amorce la synthèse de l'ADN sur le brin négatif de l'ARN/ADN génomique de la

PT-NANBH

ATGGGGCAAA GGACGTCCG

19

Ol

Ol

Ol o

Ol o

N> Ol ro o

SEQ ID n°: 9

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide

LONGUEUR DE SEQUENCE : 24 BASES

ETAT EN BRIN : monobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADN synthétique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionnelle

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide; oligo d95

CARACTERISTIQUES :

de 1 a 24 bases homologues aux bases 1620 à 1643 du brin antisens de JG2 (SEQ ID N°3)

PROPRIETES : amorce la synthèse de l'ADN sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la

PT-NANBH

TACCTAGTCA TAGCCTCCGT GAAG

24

ai en en o

en en en o

en o

co en

Cû

o ro en ro o

SEQ ID n° : 10

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide LONGUEUR DE SEQUENCE : 17 BASES

ETAT EN BRIN : monobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADN synthétique

O

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B ^

00

post-transfusionnelle o c Ol

CD

4* >

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucleotide; oligo NI m

CARACTERISTIQUES :

de 1 à 17 bases homologues aux bases 1033 à 1049 du brin du sens de JG2 (SEQ ID n° 3)

PROPRIETES : amorce la synthèse de l'ADN sur le brin négatif de l'ARN/ADN génomique de la

PT-NANBH

GAGGTTTTCT GCGTCCA

17

Ol o»

o» o

4* O

ro oi

10 o

SEQ ID n° : 11

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide

LONGUEUR DE SEQUENCE : 17 BASES

ETAT EN BRIN : monobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADN synthétique

O

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B jjj

00

post-transfusionnelle

01

<o

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide; oligo N2 oî

CARACTERISTIQUES :

de 1 à 17 bases homologues aux bases 1421 à 1437 du brin antisens de JG2 (SEQ ID n° 3)

PROPRIETES : amorce la synthèse de l'ADN sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la

PT-NANBH

GCGATAGCCG CAGTTCT

17

O)

o

Ol en en o

4^

Ol

O

CO

Ol

03 O

ro en ro o

SEQ ID n° : 12

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide

LONGUEUR DE SEQUENCE ï 22 BASES

ETAT EN BRIN : monobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADN synthétique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionnelle

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE: synthétiseur oligonucléotide; oligo dl64 CARACTERISTIQUES :

de 1 à 22 bases homologues aux bases 10 à 31 de la séquence à la Fig. 2 d'Okamoto et al., Japan, J. Exp. Med., 1990, 60, 167-177, base 22 changée de A en T pour introduire un site de reconnaissance du Bgl2 de 8 à 13 bases du site de reconnaissance Bgl2

PROPRIETES : amorce la synthèse de l'ADN sur le brin négatif de l'ARN/ADN génomique de la

PT-NANBH et introduit un site Bgl2

CCACCATAGA TCTCTCCCCT GT

30

Ol en

Ol o

•u en

.b. o co en ro en

N> O

SEQ ID n° : 13

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide

LONGUEUR DE SEQUENCE : 3 0 BASES

ETAT EN BRIN : monobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADN synthétique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionnelle

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide; oligo dl37

CARACTERISTIQUES :

de 1 à 30 bases homologues aux bases 154 à 183 du brin négatif de BRU (SEQ ID n°5) ; bases 174, 177 et 178 modifiées pour introduire un site de reconnaissance d'EcoRI de 5 à 10 bases du site de reconnaissance d'EcoRI

PROPRIETES : amorce la synthèse de l'ADN sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la

PT-NANBH et introduit un site EcoRI pour clonage

GCGAGAATTC GGGATAGGTT GTCGCCTTCC

30

O) Ol

O)

o

Ol

U1

en o

en o

co en co o

l\3

en ro o

SEQ ID n° : 14

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide

LONGUEUR DE SEQUENCE : 27 BASES

ETAT EN BRIN : monobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADN synthétique

4^

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B 0

T

post-transfusionnelle co 4a.

•Ol

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide; oligo dl3 6 ^

>

ci

CARACTERISTIQUES :

de 1 a 27 bases homologues aux bases 672 à 698 du brin positif de BRÌI (SEQ ID n° 5) ; base 675 changée en G pour introduire un site de reconnaissance d'EcoRI de 4 à 9 bases du site de reconnaissance d'EcoRI

PROPRIETES : amorce la synthèse de l'ADN sur le brin négatif de l'ARN/ADN génomique de la

PT-NANBH et introduit un site EcoRI pour clonage

GGGGAATTCC TCCCGCTGCT GGGTAGC

27

Ol

Ol

Ol o

■b. Ol

CO

Ol co o

N> o

SEQ ID n° : 15

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide

LONGUEUR DE SEQUENCE : 28 BASES

ETAT EN BRIN : monobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADN synthétique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : chimpanzé; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionnelle

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide; oligo dl55

CARACTERISTIQUES :

de 1 à 28 bases homologues aux bases 462 à 489 du brin négatif de la Fig. 47, demande de brevet europeen 88310922.5; bases 483 et 485 modifiées pour introduire un site de reconnaissance EcoRI

de 5 à 10 bases du site de reconnaissance d'EcoRI

PROPRIETES : amorce la synthèse de l'ADN sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la

PT-NANBH et introduit un site EcoRI pour clonage

ACGGGAATTC GACCAGGCAC CTGGGTGT

28

Oî

o

Ol ül

Ol o

Ül

O

CO

ül

CO

o

IO ül fO o

SEQ ID n° : 16

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide

LONGUEUR DE SEQUENCE : 23 BASES

ETAT EN BRIN : monobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADN synthétique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : chimpanzé; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionnelle

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide; oligo dl56

CARACTERISTIQUES :

de 1 à 23 bases homologues aux bases 3315 à 3337 du brin positif de la Fig. 47, demande de brevet europeen 88310922.5; base 3323 changée en C pour introduire un site de reconnaissance EcoRI

de 4 à 9 bases site de reconnaissance d'EcoRI

PROPRIETES amorce la synthèse de l'ADN sur le brin négatif de l'ARN/ADN génomique de la

PT-NANBH et introduit un site EcoRI pour clonage

CTTGAATTCT GGGAGGGCGT CTT

23

o>

o

Ol

Ol

Ol o

■È». Ol o

CO

Ol

CO

o ro

Ol ro o

SEQ ID n° : 17

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide

LONGUEUR DE SEQUENCE : 29 BASES

ETAT EN BRIN : monobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADN synthétique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionnelle

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide; oligo d92

CARACTERISTIQUES : de 1 à 29 bases homologues aux bases 36 à 64 du brin négatif de JG2 (SEQ ID n° 3); bases 57, 58 et 60 changées pour introduire un site de reconnaissance EcoRI de 5 à 10 bases du site de reconnaissance d'EcoRI

PROPRIETES : amorce la synthèse de l'ADN sur le brin positif de l'ARN/ADN génomique de la

PT-NANBH et introduit un site EcoRI pour clonage

CGCCGAATTC ATGCCGCCAC AGGAGGTTG

29

o>

Ol

O)

o

Ol en

Ci o

4* Ol

-U

o co en co o

ro en ro o

SEQ ID n° : 18

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR DE SEQUENCE : 504 PAIRES DE BASES

ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADNc à ARN génomique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B o post-transfusionnelle g>

-fc*.

00 Ol

CD

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : clone 164/137 *

>

Ol

CARACTERISTIQUES :

à partir de 308 à 504 pb, début de la polyoprotéine PT-NANBH

PROPRIETES : code probablement des protéines virales structurelles

en

Ol

O)

o

Ul Ol

U1

o o

00 m u o

10 01

ro o

GATCACTCCC CTGTGAGGAA CTACTGTCTT CACGCAGAAA TATGAGTGTC GTGCAGCCTC CAGGACCCCC CCTCCCGGGA ACCGGTGAGT ACACCGGAAT TGCCAGGACG ACCGGGTCCT ATGCCTGGAG ATTTGGGCGT GCCCCCGCAA GACTGCTAGC AAGGCCTTGT GGTACTGCCT GATAGGGTGC TTGCGAGTGC GTGCACC ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gin Arg

5

GCGTCTAGCC ATGGCGTTAG 60

GAGCCATAGT GGTCTGCGGA 12 0

TTCTTGGATT AACCCGCTCA 180

CGAGTAGTGT TGGGTCGCGA 240

CCCGGGAGGT CTCGTAGACC 3 00

AAA ACC AAA CGT AAC 349 Lys Thr Lys Arg Asn 10

ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC 3 97

Thr Asn Pro Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin Ile

15 20 25 30 O

X

GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG 4 45 g ê Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val

35 40 45 S

CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAA CCT CGT GGA AGG CGA 493 «

Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg 50 55 60

CAA CCT ATC CC Gin Pro Ile Pro 65

504

O)

en

O)

o

Ü1 ül

Ül o

4^ Ül

O

CO Ül

CO

O

ro

Ül ro o

SEQ ID n° : 19

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR DE SEQUENCE : 1107 PAIRES DE BASES

ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADNc à ARN génomique

Ol o

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B 0

X

post-transfusionnelle

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : clone 13 6/155 *

Ol «o

CARACTERISTIQUES : o!

partie de 1 à 1107 pb de la polyprotéine PT-NANBH

PROPRIETES : code probablement des protéines virales structurelles

TCC TCC CGC TGC TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC AAG GAC 48

Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Lys Asp

5 10 15

GCC AGC ATC CCC ACT GCG ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG CTC GTT Ala Ser Ile Pro Thr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val 20 25 30

96

en o

co en co o

f\3 en

N> O

GGG GCG

Gly Ala

TCT GTT Ser Val 50

CAG ACG Gin Thr 65

GGT CAC Gly His

GCC CTA Ala Leu

ATG GTG Met Val

TCC ATG Ser Met 130

GCC GGC Ala Gly 145

GCT GCC

Ala Ala

35

TTC CTC Phe Leu

GTA CAG Val Gin

CGC ATG Arg Met

GTG GTA Val Val 100

GCG GGG Ala Gly 115

GTG GGG Val Gly

GTT GAC Val Àsp

TTC TGC

Phe Cys

GTC TCT Val Ser

GAC TGC Asp Cys 70

GCT TGG Ala Trp 85

TCG CAG Ser Gin

GCC CAC Ala His

AAC TGG Asn Trp

GGG GAA Gly Glu 150

TCC GCT

Ser Ala

40

CAG CTG Gin Leu 55

AAT TGT Asn Cys

GAT ATG Asp Met

CTA CTC Leu Leu

TGG GGA Trp Gly 120

GCT AAG Ala Lys 135

CCT TAC Pro Tyr

ATG TAC Met Tyr

TTC ACC Phe Thr

TCA ATC Ser Ile

ATG ATG Met Met 90

CGG ATC Arg Ile 105

GTC CTG Val Leu

GTC TTG Val Leu

ACG ACA Thr Thr

GTG GGG Val Gly

TTC TCG Phe Ser 60

TAT CCC Tyr Pro 75

AAC TGG Asn Trp

CCA CAA Pro Gin

GCG GGC Ala Gly

GTT GTG Val Val 140

GGG GGG Gly Gly 155

GAT CTC Asp Leu 45

CCT CGC Pro Arg

GGC CAC Gly His

TCA CCT Ser Pro

GCT GTC Ala Val 110

CTT GCC Leu Ala 125

ATG CTA Met Leu

ACA CAC Thr His

TGC GGA Cys Gly

CGA CAT Arg His

GTA TCA Val Ser 80

ACA GCA Thr Ala 95

GTG GAC Val Asp

TAC TAT Tyr Tyr

CTC TTT Leu Phe

GGC CGC Gly Arg 160

O)

o

Ol Ol

Ül o

4^ Ül

4^ O

CO Ül

CO

o ro

Ol ro o

GCC GCC CAC GGG CTT ACA TCC CTC TTC ACA CCT GGG CCG GCT CAG AAA 528

Ala Ala His Gly Leu Thr Ser Leu Phe Thr Pro Gly Pro Ala Gin Lys

165 170 175

ATC CAG CTT GTA AAC ACC AAC GGC AGC TGG CAC ATC AAC AGA ACT GCC 576

Ile Gin Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala 180 185 190

TTG AAC TGC AAT GAC TCC CTC CAA ACT GGG TTC CTT GCC GCG CTG TTC 624

Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gin Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe 195 200 205

TAC ACG CAC AGG TTC AAT GCG TCC GGA TGC TCA GAG CGC ATG GCC AGC 672 x

Tyr Thr His Arg Phe Asn Ala Ser Gly Cys Ser Glu Arg Met Ala Ser o>

oi 210 215 220 S

M S

TGC CGC CCC ATT GAC CAG TTC GAT CAG GGG TGG GGT CCC ATC ACT TAT 720

Cys Arg Pro Ile Asp Gin Phe Asp Gin Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr 225 230 235 240

AAT GAG TCC CAC GGC TTG GAC CAG AGG CCC TAT TGC TGG CAC TAC GCA 768

Asn Glu Ser His Gly Leu Asp Gin Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala

245 250 255

CCT CAA CCG TGT GGT ATC GTG CCC GCG TTG CAG GTG TGT GGC CCA GTG 816

Pro Gin Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Leu Gin Val Cys Gly Pro Val 260 265 270

TAC TGT TTC ACT CCA AGC CCT GTT GTG GTG GGG ACG ACC GAT CGT TTC Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe 275 280 285

864

AN en oi 4^ co co ro ro oSocnooiooio

GGC GCC CCT ACG TAC AGA TGG GGT GAG AAT GAG ACG GAC GTG CTG CTT Gly Ala Pro Thr Tyr Arg Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu 290 295 300

CTC AAC AAC ACG CGG CCG CCA CGG GGC AAC TGG TTC GGC TGT ACA TGG Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp 305 310 315 320

ATG AAT AGC ACC GGG TTC ACC AAG ACG TGT GGG GGC CCC CCG TGC AAC Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn

325 330 335

ATC GGG GGG GTC GGC AAC AAC ACT TTG ATC TGC CCC ACG GAC TGC TTC Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu Ile Cys Pro Thr Asp Cys Phe 340 345 350

CGG AAG CAT CCC GAG GCC ACT TAC ACC AAA TGC GGT TCG GGG CCT TGG Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp 355 360 365

TTG Leu

O)

en en en en o

en

4^ O

CO

en co o

ro en

10 o

SEQ ID n° : 20

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR DE SEQUENCE : 2043 PAIRES DE BASES

ETAT EN BRIN : monobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADNc à ARN génomique

2

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionnelle i

O)

00 j*

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : clone 156/92 g

■p. >

Cl

CARACTERISTIQUES :

partie de 1 à 2043 pb de la polyprotéine PT-NANBH

PROPRIETES : code probablement des protéines virales non structurelles

TGG GAG GGC GTC TTC ACA GGC CTC ACC CAC GTG GAT GCC CAC TTC CTG 48

Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Val Asp Ala His Phe Leu

5 10 15

TCC CAA ACA AAG CAG GCA GGA GAC AAC TTC CCC TAC CTG GTG GCG TAC Ser Gin Thr Lys Gin Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr 20 25 30

96

Cn o

4^

en co en ro en ro o

CAG GCT ACT GTG TGC GCT AGG GCC CAG GCC CCA CCT CCA TCA TGG GAT Gin Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gin Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp 35 40 45

CAA ATG TGG AAG TGT CTC ATA CGG CTA AAG CCT ACT CTG CGC GGG CCA Gin Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu Arg Gly Pro 50 55 60

ACA CCC TTG CTG TAT AGG CTG GGA GCC GTC CAA AAC GAG GTC ACC CTC Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gin Asn Glu Val Thr Leu 65 70 75 80

ACA CAC CCC ATA ACC AAA TTC ATC ATG GCA TGC ATG TCA GCC GAC CTG Thr His Pro Ile Thr Lys Phe Ile Met Ala Cys Met Ser Ala Asp Leu

85 90 95

GAG GTC GTC ACG AGC ACC TGG GTG CTG GTG GGC GGG GTC CTT GCA GCT Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala 100 105 110

CTG GCT GCG TAT TGC TTG ACA ACA GGC AGC GTG GTC ATT GTG GGT AGG Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr Thr Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg 115 120 125

ATC ATC TTG TCC GGG CGG CCG GCT ATT GTT CCC GAC AGG GAA GTC CTC Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Ile Val Pro Asp Arg Glu Val Leu 130 135 140

TAC CAG GAG TTC GAT GAG ATG GAA GAG TGC GCG TCG CAC CTC CCT TAC Tyr Gin Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr 145 150 155 160

O)

o

Ol

Ol

Ol o

ül o

w

Ol

CO

o ro

Ol ro o

ATC GAG CAG GGA ATG CAG CTC GCC GAG CAG TTC AAG CAA AAA GCG CTC Ile Glu Gin Gly Met Gin Leu Ala Glu Gin Phe Lys Gin Lys Ala Leu

165 170 175

GGG TTG CTG CAG ACA GCC ACC AAG CAA GCG GAG GCC GCT GCT CCC GTG Gly Leu Leu Gin Thr Ala Thr Lys Gin Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val 180 185 190

GTG GAG TCC AAG TGG CGA GCC CTT GAG ACC TTC TGG GCG AAA CAC ATG Val Glu Ser Lys Trp Arg Ala Leu Glu Thr Phe Trp Ala Lys His Met 195 200 205

TGG AAC TTC ATC AGC GGG ATA CAG TAC TTA GCA GGC TTG TCC ACT CTG Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gin Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu 210 215 220

CCT GGG AAT CCC GCG ATT G'CA TCA CTG ATG GCG TTC ACA GCC TCT GTC Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met Ala Phe Thr Ala Ser Val 225 230 235 240

ACT AGC CCG CTC ACC ACC CAA TCT ACC CTC CTG CTT AAC ATC CTG GGG Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gin Ser Thr Leu Leu Leu Asn Ile Leu Gly

245 250 255

GGA TGG GTA GCC GCC CAA CTC GCT CCC CCC AGT GCT GCT TCA GCT TTC Gly Trp Val Ala Ala Gin Leu Ala Pro Pro Ser Ala Ala Ser Ala Phe 260 265 270

GTA GGC GCC GGC ATT GCT GGT GCG GCT GTT GGC AGC ATA GGC CTT GGG Val Gly Ala Gly Ile Ala Gly Ala Ala Val Gly Ser Ile Gly Leu Gly 275 280 285

Ul en

Ol o

•t». Ul

CJ

o ro

01

10

o en

AAG GTG CTT GTG GAC ATC TTG GCG GGC TAT GGA GCA GGA GTG GCA GGC 912

Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Val Ala Gly 290 295 300

GCG CTC GTG GCC TTT AAG GTC ATG AGC GGC GAA ATG CCC TCC ACC GAG 9 60

Ala Leu Val Ala Phe Lys Val Met Ser Gly Glu Met Pro Ser Thr Glu 305 310 315 320

GAC CTG GTT AAC TTA CTC CCT GCC ATC CTC TCT CCT GGT GCC CTG GTC 1008

Asp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro Gly Ala Leu Val

325 330 335

GTC GGG GTC GTG TGC GCA GCG ATA CTG CGT CGG CAC GTG GGT CCA GGG 1056 2

Val Gly Val Val Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His Val Gly Pro Gly o,

340 345 350 £

Ol

GAG GGG GCT GTG CAG TGG ATG AAC CGG CTG ATA GCG TTC GCC TCG CGG 1104 2

Glu Gly Ala Val Gin Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala Ser Arg >

355 360 365

GGT AAC CAT GTT TCC CCC ACG CAC TAT GTG CCA GAG AGC GAC GCC GCA 1152

Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Ser Asp Ala Ala 370 375 380

GCA CGT GTC ACT CAG ATC CTC TCC GAC CTT ACT ATC ACC CAA CTG TTG 12 00

Ala Arg Val Thr Gin Ile Leu Ser Asp Leu Thr Ile Thr Gin Leu Leu 385 390 395 400

AAG AGG CTC CAC CAG TGG ATT AAC GAG GAC TGC TCC ACG CCC TGC TCC Lys Arg Leu His Gin Trp Ile Asn Glu Asp Cys Ser Thr Pro Cys Ser

405 410 415

1248

0)0)uiül4^^w03r0l\3 U10010Ü10010010

GGC TCG TGG CTA AGG GAT GTT TGG GAC TGG ATA TGC ACA GTT TTG GCT 129 6

Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Asp Trp Ile Cys Thr Val Leu Ala 420 425 430

GAC TTC AAG ACC TGG CTC CAG TCC AAG CTC CTG CCG CG A TTA CCG GGA 1344

Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gin Ser Lys Leu Leu Pro Arg Leu Pro Gly 435 440 445

GTC CCC TTT TTC TCA TGC CAA CGT GGG TAC AAG GGG GTC TGG CGG GGA 13 92

Val Pro Phe Phe Ser Cys Gin Arg Gly Tyr Lys Gly Val Trp Arg Gly 450 455 460

GAC GGC ATC ATG CAG ACC ACC TGC TCA TGT GGA GCA CAG ATC ACC GGA 144 0 g

Asp Gly Ile Met Gin Thr Thr Cys Ser Cys Gly Ala Gin Ile Thr Gly o,

çn 465 470 475 480 g

Ol

CAT GTC AAA AAC GGT TCC ÄTG AGG ATC GTT GGG CCT AAG ACC TGT AGT 1488 S

His Val Lys Asn Gly Ser Met Arg Ile Val Gly Pro Lys Thr Cys Ser >

485 490 495

AAC ATG TGG CAT GGA ACA TTC CCC ATC AAC GCA TAC ACC ACG GGC CCC 153 6

Asn Met Trp His Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro 500 505 510

TGC ACG CCC TCC CCA GCG CCA AAC TAT TCC AGG GCG CTG TGG CGG GTG 1584

Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser Arg Ala Leu Trp Arg Val 515 520 525

00

GCT GCT GAG GAG TAC GTG GAG GTT A CG CGG GTG GGG GAT TTC CAC TAC Ala Ala Glu Glu Tyr Val Glu Val Thr Arg Val Gly Asp Phe His Tyr 530 535 540

1632

O)

o

01

Ol

O

CD

O

ro

Ol

N> O

GTG ACG

Val Thr

545

GCC CCC Ala Pro

GCT CCG Ala Pro

GGG CTC Gly Leu

CCG GAT Pro Asp 610

ACA GCA Thr Ala 625

TTG GCC Leu Ala

ACA TAC Thr Tyr

AGC ATG

Ser Met

GAA TTC Glu Phe

GCG TGC Ala Cys 580

AAC CAA Asn Gin 595

GTA GCA Val Ala

GAG ACG Glu Thr

AGC TCT Ser Ser

ATT ACC Ile Thr 660

ACC ACT

Thr Thr

550

TTC ACA Phe Thr 565

AAA CCT Lys Pro

TAC CTG Tyr Leu

GTG CTC Val Leu

GCT AAG Ala Lys 630

TCA GCT Ser Ala 645

CAA AAT Gin Asn

GAC AAC

Asp Asn

GAA GTG Glu Val

CTC CTA Leu Leu

GTT GGG Val Gly 600

ACT TCC Thr Ser 615

CGC AGG Arg Arg

AGC CAG Ser Gin

GAC TTC Asp Phe

GTA AAA Val Lys

GAT GGG Asp Gly 570

CGG GAG Arg Glu 585

TCG CAG Ser Gin

ATG CTC Met Leu

CTG GCC Leu Ala

TTG TCT Leu Ser 650

CCA GAC Pro Asp 665

TGC CCG Cys Pro

555

GTG CGG Val Arg

GAG GTC Glu Val

CTC CCA Leu Pro

ACC GAC Thr Asp 620

AGG GGG Arg Gly 635

GCG CCT Ala Pro

GCT GAC Ala Asp

TGC CAG Cys Gin

CTG CAC Leu His

ACA TTC Thr Phe 590

TGC GAG Cys Glu 605

CCC TCC Pro Ser

TCT CCC Ser Pro

TCC TCG Ser Ser

CTC ATC Leu Ile 670

GTT CCA Val Pro 560

AGG TAC Arg Tyr 575

CAG GTC Gin Val

CCC GAA Pro Glu

CAC ATC His Ile

CCC TCC Pro Ser 640

AAG GCG Lys Ala 655

GAG GCC Glu Ala

O)

o

Ol

ül

ül o

-u

Ol o

AAC CTC CTG TGG CGG CAT GAG ATG GGC Asn Leu Leu Trp Arg His Glu Met Gly 675 680

cd çd ro ro oi o ÜI o

20<33

O X

O)

00 ■Pt

01

CO -p»

> Ol

en o

en

CTI

J*. en

O

eo en ro en ro o

SEQ ID n° : 21

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR DE SEQUENCE : 2116 PAIRES DE BASES

ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADNc à ARN génomique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post-transfusionnelle

Ci

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE 1'extrémité 5' du génome contig formé par des clones d'ADNc à partir de

0 :r

CD 03

01 (O

■P* >

en

CARACTERISTIQUES :

de 3 08 à 2116 pb début de la polyprotéine PT-NANBH

PROPRIETES : protéines virales structurelles et non structurelles

O)

Ül

O)

o

Ol Ül

Ül o

Ül o

CO Ül

CO

o ro

Ül ro o

GATCÄCTCCC CTGTGAGGAA CTACTGTCTT CACGCAGAAA GCGTCTAGCC ATGGCGTTAG 60

TATGAGTGTC GTGCAGCCTC CAGGACCCCC CCTCCCGGGA GAGCCATAGT GGTCTGCGGA 12 0

ACCGGTGAGT ACACCGGAAT TGCCAGGACG ACCGGGTCCT TTCTTGGATT AACCCGCTCA 18 0

ATGCCTGGAG ATTTGGGCGT GCCCCCGCAA GACTGCTAGC CGAGTAGTGT TGGGTCGCGA 2 40

AAGGCCTTGT GGTACTGCCT GATAGGGTGC TTGCGAGTGC CCCGGGAGGT CTCGTAGACC 3 00

GTGCACC ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC 349 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gin Arg Lys Thr Lys Arg Asn

5 10

O)

ro

ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC 3 97

Thr Asn Pro Arg Pro Gin Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gin Ile 15 20 25 30

o

GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG 4 45 ^

Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val g

35 40 45

en

CO

CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TGG CAA CCT CGT GGA AGG CGA 493 £

Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gin Pro Arg Gly Arg Arg tn

50 55 60

CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CAG CCC GAG GGC AGG GCC TGG GCT CAG 541

Gin Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gin Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gin 65 70 75

CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAC GAG GGC ATG GGG TGG GCA 589

Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala 80 85 90

GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGT GGC TCC CGG CCT AGT TGG GGC CCC ACT Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr 95 100 105 110

637

Ol o

en

4*.

o co en co o

ro

Ol ro o

GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT AAA GTC ATC GAT ACC CTC Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu

115 120 125

ACA TGC GGC TTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCT Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala 130 135 140

CCC TTA GGG GGC GCT GCC AGG GCC CTG GCG CAT GGC GTC CGG GTT CTG Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu 145 150 155

GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT TTA CCC GGT TGC TCT TTC Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe 160 165 170

TCT ATC TTC CTC TTG GCT TlDG CTG TCC TGT TTG ACC ATT CCA GCT TCC Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser 175 180 185 190

GCT TAT GAA GTG CGC AAC GTG TCC GGG ATC TAC CAT GTC ACG AAC GAT Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp

195 200 205

TGC TCC AAC TCA AGC ATC GTG TAC GAG ACA GCG GAC ATG ATC ATG CAC Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Thr Ala Asp Met Ile Met His 210 215 220

ACC CCC GGG TGT GTG CCC TGT GTC CGG GAG GGT AAT TCC TCC CGC TGC Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ser Ser Arg Cys 225 230 235

CD

O

Ol Üt

Ol O

A Ül o

co

Ül ro

Ol ro o

TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC AAG GAC GCC AGC ATC CCC Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Lys Asp Ala Ser Ile Pro 240 245 250

ACT GCG ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG CTC GTT GGG GCG GCT GCC Thr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala 255 260 265 270

TTC TGC TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC TGC GGA TCT GTT TTC CTC Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu

275 280 285

GTC TCT CAG CTG TTC ACC TTC TCG CCT CGC CGA CAT CAG ACG GTA CAG Val Ser Gin Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Gin Thr Val Gin 290 295 300

GAC TGC AAT TGT TCA ATC TAT CCC GGC CAC GTA TCA GGT CAC CGC ATG Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His Arg Met 305 310 315

GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA CCT ACA GCA GCC CTA GTG GTA Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val 320 325 330

TCG CAG CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCT GTC GTG GAC ATG GTG GCG GGG Ser Gin Leu Leu Arg Ile Pro Gin Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly 335 340 345 350

GCC CAC TGG GGA GTC CTG GCG GGC CTT GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly

355 360 365

•b. o co o

ro en

îo o

AAC TGG GCT AAG GTC TTG GTT GTG ATG CTA CTC TTT GCC GGC GTT GAC

Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp 370 375 380

GGG GAA CCT TAC ACG ACA GGG GGG ACA CAC GGC CGC GCC GCC CAC GGG

Gly Glu Pro Tyr Thr Thr Gly Gly Thr His Gly Arg Ala Ala His Gly 385 390 395

CTT ACA TCC CTC TTC ACA CCT GGG CCG GCT CAG AAA ATC CAG CTT GTA

Leu Thr Ser Leu Phe Thr Pro Gly Pro Ala Gin Lys Ile Gin Leu Val 400 405 410

AAC ACC AAC GGC AGC TGG CAC ATC AAC AGA ACT GCC TTG AAC TGC AAT

Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn

415 420 425 430

GAC TCC CTC CAA ACT GGG TTC CTT GCC GCG CTG TTC TAC ACG CAC AGG

Asp Ser Leu Gin Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr His Arg

435 440 445

TTC AAT GCG TCC GGA TGC TCA GAG CGC ATG GCC AGC TGC CGC CCC ATT

Phe Asn Ala Ser Gly Cys Ser Glu Arg Met Ala Ser Cys Arg Pro Ile 450 455 460

GAC CAG TTC GAT CAG GGG TGG GGT CCC ATC ACT TAT AAT GAG TCC CAC

Asp Gin Phe Asp Gin Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Asn Glu Ser His 465 470 475

GGC TTG GAC CAG AGG CCC TAT TGC TGG CAC TAC GCA CCT CAA CCG TGT Gly Leu Asp Gin Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Gin Pro Cys 480 485 490

a>

o

Ol

01

Ol o

•fc. Ol o

CO

Ol

CO

o

IO Ol ro o

GGT ATC GTG CCC GCG TTG CAG GTG TGT GGC CCA GTG TAC TGT TTC ACT Gly Ile Val Pro Ala Leu Gin Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr 495 500 505 510

CCA AGC CCT GTT GTG GTG GGG ACG ACC GAT CGT TTC GGC GCC CCT ACG Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Ala Pro Thr

515 520 525

TAC AGA TGG GGT GAG AAT GAG ACG GAC GTG CTG CTT CTC AAC AAC ACG Tyr Arg Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr 530 535 540

CGG CCG CCA CGG GGC AAC TGG TTC GGC TGT ACA TGG ATG AAT AGC ACC Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr 545 550 555

GGG TTC ACC AAG ACG TGT GGG GGC CCC CCG TGC AAC ATC GGG GGG GTC Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Val 560 565 570

GGC AAC AAC ACT TTG ATC TGC CCC ACG GAC TGC TTC CGG AAG CAT CCC Gly Asn Asn Thr Leu Ile Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro 575 580 585 590

GAG GCC ACT TAC ACC AAA TGC GGT TCG GGG CCT TGG TTG

Glu Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu

595 600

G)

O

en en en co en co o

ro en

N> o

SEQ ID n° : 22

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide avec protéine correspondante LONGUEUR DE SEQUENCE : 3750 PAIRES DE BASES

O) -J

ETAT EN BRIN : monobrin TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADNc à ARN génomique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : humain; sérum infecté par hépatite non-A, non-B post- x transfusionnelle oo en (O 4^

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : contig formé par des clones d'ADNc à partir de >

en

1'extrémite 3' du génome

CARACTERISTIQUES :

partie de 1 à 3 7 50 pb de la polyprotéine PT-NANBH PROPRIETES : protéines virales non structurelles

TGG GAG GGC GTC TTC ACA GGC CTC ACC CAC GTG GAT GCC CAC TTC CTG Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Val Asp Ala His Phe Leu

5 10 15

48

03 O

Ol

Ol

Ol o

Ol o

CO

Ol co o

ro

Ol

M O

TCC CAA ACA AAG CAG GCA GGA GAC AAC TTC CCC TAC CTG GTG GCG TAC Ser Gin Thr Lys Gin Ala Gly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr 20 25 30

CAG GCT ACT GTG TGC GCT AGG GCC CAG GCC CCA CCT CCA TCA TGG GAT Gin Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gin Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp 35 40 45

CAA ATG TGG AAG TGT CTC ATA CGG CTA AAG CCT ACT CTG CGC GGG CCA Gin Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu Arg Gly Pro 50 55 60

ACA CCC TTG CTG TAT AGG CTG GGA GCC GTC CAA AAC GAG GTC ACC CTC Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gin Asn Glu Val Thr Leu 65 70 75 80

ACA CAC CCC ATA ACC AAA T^C ATC ATG GCA TGC ATG TCA GCC GAC CTG Thr His Pro Ile Thr Lys Phe Ile Met Ala Cys Met Ser Ala Asp Leu

85 90 95

GAG GTC GTC ACG AGC ACC TGG GTG CTG GTG GGC GGG GTC CTT GCA GCT Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala Ala 100 105 110

CTG GCT GCG TAT TGC TTG ACA ACA GGC AGC GTG GTC ATT GTG GGT AGG Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr Thr Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg 115 120 125

ATC ATC TTG TCC GGG CGG CCG GCT ATT GTT CCC GAC AGG GAA GTC CTC Ile lie Leu Ser Gly Arg Pro Ala Ile Val Pro Asp Arg Glu Val Leu 130 135 140

Ol

Ol

4^ Ol

•S» O

co o

IV) Ol

IV)

o

TAC CAG GAG TTC GAT GAG ATG GAA GAG TGC GCG TCG CAC CTC CCT TAC Tyr Gin Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr 145 150 155 160

ATC GAG CAG GGA ATG CAG CTC GCC GAG CAG TTC AAG CAA AAA GCG CTC Ile Glu Gin Gly Met Gin Leu Ala Glu Gin Phe Lys Gin Lys Ala Leu

165 170 175

GGG TTG CTG CAG ACA GCC ACC AAG CAA GCG GAG GCC GCT GCT CCC GTG Gly Leu Leu Gin Thr Ala Thr Lys Gin Ala Glu Ala Ala Ala Pro Val 180 185 190

GTG GAG TCC AAG TGG CGA GCC CTT GAG ACC TTC TGG GCG AAA CAC ATG Val Glu Ser Lys Trp Arg Ala Leu Glu Thr Phe Trp Ala Lys His Met 195 200 205

TGG AAC TTC ATC AGC GGG ATA CAG TAC TTA GCA GGC TTG TCC ACT CTG Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gin Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu 210 215 220

CCT GGG AAT CCC GCG ATT GCA TCA CTG ATG GCG TTC ACA GCC TCT GTC Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met Ala Phe Thr Ala Ser Val 225 230 235 240

ACT AGC CCG CTC ACC ACC CAA TCT ACC CTC CTG CTT AAC ATC CTG GGG Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gin Ser Thr Leu Leu Leu Asn Ile Leu Gly

245 250 255

GGA TGG GTA GCC GCC CAA CTC GCT CCC CCC AGT GCT GCT TCA GCT TTC Gly Trp Val Ala Ala Gin Leu Ala Pro Pro Ser Ala Ala Ser Ala Phe 260 265 270

en o

Ol

Ol

Ol o

•s».

Ol o

Cü

ül

Cù

o

K)

Ol

N> O

GTA GGC GCC GGC ATT GCT GGT GCG GCT GTT GGC AGC ATA GGC CTT GGG Val Gly Ala Gly Ile Ala Gly Ala Ala Val Gly Ser Ile Gly Leu Gly 275 280 285

AAG GTG CTT GTG GAC ATC TTG GCG GGC TAT GGA GCA GGA GTG GCA GGC Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Val Ala Gly 290 295 300

GCG CTC GTG GCC TTT AAG GTC ATG AGC GGC GAA ATG CCC TCC ACC GAG Ala Leu Val Ala Phe Lys Val Met Ser Gly Glu Met Pro Ser Thr Glu 305 310 315 320

GAC CTG GTT AAC TTA CTC CCT GCC ATC CTC TCT CCT GGT GCC CTG GTC Asp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro Gly Ala Leu Val

325 330 335

GTC GGG GTC GTG TGC GCA G'CG ATA CTG CGT CGG CAC GTG GGT CCA GGG Val Gly Val Val Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His Val Gly Pro Gly 340 345 350

GAG GGG GCT GTG CAG TGG ATG AAC CGG CTG ATA GCG TTC GCC TCG CGG Glu Gly Ala Val Gin Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala Ser Arg 355 360 365

GGT AAC CAT GTT TCC CCC ACG CAC TAT GTG CCA GAG AGC GAC GCC GCA Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Ser Asp Ala Ala 370 375 380

GCA CGT GTC ACT CAG ATC CTC TCC GAC CTT ACT ATC ACC CAA CTG TTG Ala Arg Val Thr Gin Ile Leu Ser Asp Leu Thr Ile Thr Gin Leu Leu 385 390 395 400

O) Ol

O)

o en en en o

en

CD

en ro en ro o

AAG AGG CTC CAC CAG TGG ATT AAC GAG GAC TGC TCC ACG CCC TGC TCC 1248

Lys Arg Leu His Gin Trp Ile Asn Glu Asp Cys Ser Thr Pro Cys Ser

405 410 415

GGC TCG TGG CTA AGG GAT GTT TGG GAC TGG ATA TGC ACA GTT TTG GCT 1296

Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Asp Trp Ile Cys Thr Val Leu Ala

420 425 430

GAC TTC AAG ACC TGG CTC CAG TCC AAG CTC CTG CCG CGA TTA CCG GGA 13 4 4

Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gin Ser Lys Leu Leu Pro Arg Leu Pro Gly 435 440 445

GTC CCC TTT TTC TCA TGC CAA CGT GGG TAC AAG GGG GTC TGG CGG GGA 1392 2

Val Pro Phe Phe Ser Cys Gin Arg Gly Tyr Lys Gly Val Trp Arg Gly o>

450 455 460 2

S

GAC GGC ATC ATG CAG ACC ACC TGC TCA TGT GGA GCA CAG ATC ACC GGA 144 0

Asp Gly Ile Met Gin Thr Thr Cys Ser Cys Gly Ala Gin Ile Thr Gly oî

465 470 475 480

CAT GTC AAA AAC GGT TCC ATG AGG ATC GTT GGG CCT AAG ACC TGT AGT 148 8

His Val Lys Asn Gly Ser Met Arg Ile Val Gly Pro Lys Thr Cys Ser

485 490 495

AAC ATG TGG CAT GGA ACA TTC CCC ATC AAC GCA TAC ACC ACG GGC CCC 153 6

Asn Met Trp His Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro

500 505 510

TGC ACG CCC TCC CCA GCG CCA AAC TAT TCC AGG GCG CTG TGG CGG GTG Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser Arg Ala Leu Trp Arg Val 515 520 525

1584

CT)

O

Ol

Ol

Ol o

■t». Ol

■fe. o

CO

Ol

CO

o

N>

Ol

IO

o

GCT GCT GAG GAG TAC GTG GAG GTT ACG CGG GTG GGG GAT TTC CAC TAC Ala Ala Glu Glu Tyr Val Glu Val Thr Arg Val Gly Asp Phe His Tyr 530 535 540

GTG ACG AGC ATG ACC ACT GAC AAC GTA AAA TGC CCG TGC CAG GTT CCA Val Thr Ser Met Thr Thr Asp Asn Val Lys Cys Pro Cys Gin Val Pro 545 550 555 560

GCC CCC GAA TTC TTC ACA GAA GTG GAT GGG GTG CGG CTG CAC AGG TAC Ala Pro Glu Phe Phe Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr

565 570 575

GCT CCG GCG TGC AAA CCT CTC CTA CGG GAG GAG GTC ACA TTC CAG GTC Ala Pro Ala Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr Phe Gin Val 580 585 590

GGG CTC AAC CAA TAC CTG GÏ"T GGG TCG CAG CTC CCA TGC GAG CCC GAA Gly Leu Asn Gin Tyr Leu Val Gly Ser Gin Leu Pro Cys Glu Pro Glu 595 600 605

CCG GAT GTA GCA GTG CTC ACT TCC ATG CTC ACC GAC CCC TCC CAC ATC Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile 610 615 620

ACA GCA GAG ACG GCT AAG CGC AGG CTG GCC AGG GGG TCT CCC CCC TCC Thr Ala Glu Thr Ala Lys Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser 625 630 635 640

TTG GCC AGC TCT TCA GCT AGC CAG TTG TCT GCG CCT TCC TCG AAG GCG Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gin Leu Ser Ala Pro Ser Ser Lys Ala

645 650 655

ül

ül

Ol o

Ji. Ol

CO

Ol

CO

o l\3 Ol

ACA TAC ATT ACC CAA AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC Thr Tyr Ile Thr Gin Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala 660 665 670

AAC CTC CTG TGG CGG CAT GAG ATG GGC GGG GAC ATT ACC CGC GTG GAG Asn Leu Leu Trp Arg His Glu Met Gly Gly Asp Ile Thr Arg Val Glu 675 680 685

TCA GAG AAC AAG GTA GTA ATC CTG GAC TCT TTC GAC CCG CTC CGA GCG Ser Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala 690 695 700

GAG GAG GAT GAG CGG GAA GTG TCC GTC CCG GCG GAG ATC CTG CGG AAA Glu Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys 705 710 715 720

TCC AAG AAA TTC CCA CCA GCG ATG CCC GCA TGG GCA CGC CCG GAT TAC Ser Lys Lys Phe Pro Pro Ala Met Pro Ala Trp Ala Arg Pro Asp Tyr

725 730 735

AAC CCT CCG CTG CTG GAG TCC TGG AAG GCC CCG GAC TAC GTC CCT CCA Asn Pro Pro Leu Leu Glu Ser Trp Lys Ala Pro Asp Tyr Val Pro Pro 740 745 750

GTG GTA CAT GGG TGC CCA CTG CCA CCT ACT AAG ACC CCT CCT ATA CCA Val Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr Pro Pro Ile Pro 755 760 765

CCT CCA CGG AGG AAG AGG ACA GTT GTT CTG ACA GAA TCC ACC GTG TCT Pro Pro Arg Arg Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Val Ser 770 775 780

en o

01

Ol

Ol o

Ol o

w

Ol

03

O

ro

01

ro o

TCT GCC CTG GCG GAG CTT GCC ACA AAG GCT TTC GGT AGC TCC GAA CCG Ser Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ala Phe Gly Ser Ser Glu Pro 785 790 795 800

TCG GCC GTC GAC AGC GGC ACG GCA ACC GCC CCT CCT GAC CAA CCC TCC Ser Ala Val Asp Ser Gly Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp Gin Pro Ser

805 810 815

GAC GAC GGC GGA GCA GGA TCT GAC GTT GAG TCG TAT TCC TCC ATG CCC Asp Asp Gly Gly Ala Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro 820 825 830

CCC CTT GAG GGG GAG CCG GGG GAC CCC GAT CTC AGC GAC GGG TCT TGG Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp 835 840 845

TCT ACC GTG AGT GAG GAG G'CC GGT GAG GAC GTC GTC TGC TGC TCG ATG Ser Thr Val Ser Glu Glu Ala Gly Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met 850 855 860

TCC TAC ACA TGG ACA GGC GCT CTG ATC ACG CCA TGC GCT GCG GAG GAA Ser Tyr Thr Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu 865 870 875 880

AGC AAG CTG CCC ATC AAC GCG TTG AGC AAC TCT TTG CTG CGT CAC CAC Ser Lys Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His

885 890 895

AAC ATG GTC TAC GCT ACC ACA TCC CGC AGC GCA AGC CAG CGG CAG AAG Asn Met Val Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Gin Arg Gin Lys 900 905 910

Ül Ol

Ol o

cn

4^ O

CO

üi ro

Ül ro o

AAG GTC ACC TTT GAC AGA CTG CAA ATC CTG GAC GAT CAC TAC CAG GAC Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gin Ile Leu Asp Asp His Tyr Gin Asp 915 920 925

2784

GTG CTC AAG GAG ATG AAG GCG AAG GCG TCC ACA GTT AAG GCT AAG CTT Val Leu Lys Glu Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala Lys Leu 930 935 940

2832

•Vi

Ül

CTA TCA GTA GAG GAA GCC TGC AAG CTG ACG CCC CCA CAT TCG GCC AAA Leu Ser Val Glu Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys 945 950 955 960

TCT AAA TTT GGC TAT GGG GCA AAG GAC GTC CGG AAC CTA TCC AGC AAG Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser Ser Lys

965 970 975

GCC ATT AAC CAC ATC CGC T'CC GTG TGG GAG GAC TTG TTG GAA GAC ACT Ala Ile Asn His Ile Arg Ser Val Trp Glu Asp Leu Leu Glu Asp Thr 980 985 990

2880

2928

2976

0

1

en co ju ci

CD >

Cl

GAA ACA CCA ATT GAC ACC ACC ATC ATG GCA AAA AAT GAG GTT TTC TGC Glu Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys 995 1000 1005

3024

GTC CAA CCA GAG AGA GGA GGC CGC AAG CCA GCT CGC CTT ATC GTG TTC Val Gin Pro Glu Arg Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe 1010 1015 1020

3072

CCA GAC TTG GGG GTC CGT GTG TGC GAG AAA ATG GCC CTC TAT GAC GTG Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Val 1025 1030 1035 1040

1120

CT)

en o> o en

üi

Ül o

-fck. Ül o

CO ül

CO

o ro

Ül

10 o

GTC TCC ACC CTC CCT CAG GCT GTG ATG GGC TCC TCG TAC GGA TTC CAG Val Ser Thr Leu Pro Gin Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Gin 1045 1050 1055

3168

TAT TCT CCT GGA CAG CGG GTC GAG TTC CTG GTG AAC GCC TGG AAA TCA Tyr Ser Pro Gly Gin Arg Val Glu Phe Leu Val Asn Ala Trp Lys Ser 1060 1065 1070

3216

•vi CD

AAG AAG ACC CCT ATG GGC TTT GCA TAT GAC ACC CGC TGT TTT GAC TCA Lys Lys Thr Pro Met Gly Phe Ala Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser 1075 1080 1085

ACA GTC ACT GAG AAT GAC ATC CGT GTA GAG GAG TCA ATT TAT CAA TGT Thr Val Thr Glu Asn Asp Ile Arg Val Glu Glu Ser Ile Tyr Gin Cys 1090 1095 1100

TGT GAC TTG GCC CCC GAA GCC AGA CAG GCC ATA AGG TCG CTC ACA GAG Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg Gin Ala Ile Arg Ser Leu Thr Glu 1105 1110 1115 1120

3264

3312

3360

0 X

a>

co ■n.

01 co

-£> >

Ol

CGG CTT TAT ATC GGG GGT CCC CTG ACT AAT TCA AAA GGG CAG AAC TGC Arg Leu Tyr Ile Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gin Asn Cys 1125 1130 1135

3408

GGC TAT CGC CGG TGC CGC GCG AGC GGC GTG CTG ACG ACT AGC TGC GGT Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly 1140 1145 1150

3456

AAT Asn

ACC CTC ACA TGT TAC TTG Thr Leu Thr Cys Tyr Leu 1155

AAG GCC TCT GCA GCC TGT CGA GCT GCA Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg Ala Ala 1160 1165

3504

CT) ül

CT) O

Ol ct?

Ül O

Ol

O

CO Ül co o

JO Ül ro o

AAG CTC CAG GAC TGC ACG ATG CTC GTG TGC GGA GAC GGC CTT GTC GTT Lys Leu Gin Asp Cys Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val 1170 1175 1180

3552

ATC TGT GAG AGC GCG GGA ACC CAG GAG GAC GCG GCG AGC CTA CGA GTC Ile Cys Glu Ser Ala Gly Thr Gin Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Val 1185 1190 1195 1200

3600

TTC ACG GAG GCT ATG ACT AGG TAC TCT GCC CCC CCC GGG GAC CCG CCC Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro 1205 1210 1215

CAA CCA GAA TAC GAC CTG GAG TTG ATA ACA TCA TGC TCC TCC AAT GTG Gin Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val 1220 1225 1230

TCG GTC GCG CAC GAT GCA TCT GGC AAA AGG GTA TAC TAC CTC ACC CGT Ser Val Ala His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg 1235 1240 1245

3648

3696

3744

O X

O)

00 ■C»

01

CD >

Ol

GAC CCG Asp Pro 1250

3750

Ol ül

Ol o

■I*. Ol

■fc. O

CO

o ro

Ol ro o

SEQ ID n° : 23

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide

LONGUEUR DE SEQUENCE : 2 3 BASES

ETAT EN BRIN : monobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADN synthétique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : baculovirus Autographa californica Nuclear Polydedrosis virus (AcNPV)

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide; oligo d24 CARACTERISTIQUES :

de 1 à 23 bases homologues à la portion de gène polyhédrine AcNPV en aval du site de clonage BamHI dans les vecteurs pAc3 6 0 et similaires

PROPRIETES: amorce la synthèse de l'ADN à partir des séquences du vecteur de transfert du baculovirus qui flanquent l'ADN inséré au niveau du site BamHI

CGGGTTTAAC ATTACGGATT TCC 23

Ol

Ol co

Ol

CO

o

M Ol ro o

SEQ ID n° : 24

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide

LONGUEUR DE SEQUENCE : 31 BASES

ETAT EN BRIN : moriobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADN synthétique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : baculovirus Autographa californica Nuclear Polydedrosis virus (AcNPV)

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oligonucléotide : oligo dl26 CARACTERISTIQUES :

de 1 à 31 bases homologues aux séquences de jonction en amont produite lorsque l'ADNc amplifie par d75 (SEQ ID n° 5) est cloné dans le site de clonage BamHI dans des vecteurs pAc360 et similaires; des déséquilibres au niveau des bases 13 et 14 introduisent un site Pstl de 1 à 10 bases homologues à la région du site BamHI dans des vecteurs pAc3 60 et similaires de 4 à 9 bases site BamHI

de 12 à 17 bases site Pstl

O)

o

Ül Ül

Ül o

Ül

O

CO Ül co o

tu

Ül ro o

PROPRIETES : amorce la synthèse de l'ADN a la jonction des séquences du vecteur de transfert du baculovirus et des séquences amplifiées précédemment par l'oligo d75; introduit un site de reconnaissance Pstl pour le travail de clonage ultérieur

TAAGGATCCC CCT GCA GTA TCG GCG Ser Ala Val Ser Ala

5

GAA TTC Glu Phe

31

Ol

Ol

Ol

CO

o

PO Ol fo o

SEQ ID n° : 25

TYPE DE SEQUENCE : Nucléotide

LONGUEUR DE SEQUENCE : 4 5 BASES

ETAT EN BRIN : monobrin

TOPOLOGIE : linéaire

TYPE MOLECULE : ADN synthétique

ORGANISME SOURCE D'ORIGINE : N/A

SOURCE EXPERIMENTATION IMMEDIATE : synthétiseur oliqonucléotide; oligo dl3 2 CARACTERISTIQUES :

de 5 à 10 bases site de reconnaissance Pstl de 13 à 21 bases codage de liaison pour cinq résidus Lys de 28 à 45 bases homologues aux bases 4 à 21 de BRÌI (SEQ ID 7)

PROPRIETES : amorce la synthèse de l'ADN à l'extrémité 5' de BRÌI et introduit une séquence synthétique qui code 5 lysines ainsi qu'un site de reconnaissance Pstl pour le travail de clonage ultérieur

O)

o en en en o

en

O

CO en co o

ro en ro o

CTGCCTGCA GTA AAG AAG AAG AAG AAG AAA ACC AAA CGT AAC ACC A 45

Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Lys Arg Asn Leu

5 10

O X

o>

00 4*

01

(O >

en

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 684 594 A5

Claims (19)

Revendications

1. Un polypeptide viral PT-NANBH comprenant un antigène ayant une séquence d'acides aminés qui est au moins homologue à 90% avec la séquence d'acides aminés telle que représentée sur la SEQ ID n° 3, 4, 19, 20, 21 ou 22 ou en est un fragment antigénique.

2. Un polypeptide viral PT-NANBH selon la revendication 1, dans lequel la séquence d'acides aminés est au moins homologue à 90% avec la séquence d'acides aminés telle que représentée sur la SEQ ID n° 3 ou 4 ou en est un fragment antigénique.

3. Un polypeptide viral PT-NANBH selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la séquence d'acides aminés est au moins homologue à 95% avec la séquence d'acides aminés telle que représentée sur la SEQ ID desdites revendications ou en est un fragment antigénique.

4. Un polypeptide viral PT-NANBH selon la revendication 3, dans lequel la séquence d'acides aminés est au moins homologue à 98% avec la séquence d'acides aminés telle que représentée sur la SEQ ID de ladite revendication ou en est un fragment antigénique.

5. Un polypeptide viral PT-NANBH comprenant: un antigène provenant de la région codante structurale du génome viral et un antigène provenant de la zone codante non structurale du génome viral.

6. Un polypeptide viral PT-NANBH selon la revendication 5, dans lequel l'antigène de la région codante structurale a une séquence d'acides aminés qui est au moins homologue à 90% avec la séquence d'acides aminés telle que représentée sur la SEQ ID n° 5, ou en est un fragment antigénique, et l'antigène de la région codante non structurale a une séquence d'acides aminés qui est au moins homologue à 90% avec la séquence d'acides aminés correspondant à la SEQ ID n° 3 ou 4, ou en est un fragment antigénique.

7. Une séquence d'ADN codant pour un polypeptide viral PT-NANBH selon l'une des revendications 1 à 6.

8. Une séquence d'ADN selon la revendication 7 telle que représentée sur la SEQ ID n° 3, 4, 19, 20, 21 ou 22.

9. Un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN selon la revendication 7 ou 8, et capable dans un hôte approprié d'exprimer ladite séquence d'ADN pour produire un polypeptide viral PT-NANBH.

10. Une cellule hôte transformée avec un vecteur d'expression selon la revendication 9.

11. Un procédé pour la préparation d'un polypeptide viral PT-NANBH comprenant le clonage ou la synthétisation d'une séquence d'ADN codant pour un polypeptide viral PT-NANBH selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, l'insertion de la séquence d'ADN dans un vecteur d'expression tel qu'il puisse s'exprimer dans un hôte approprié et la transformation d'une cellule hôte au moyen du vecteur d'expression, la mise en culture de la cellule hôte transformée et l'isolement du polypeptide viral.

12. Un anticorps polyclonal ou monoclonal contre un polypeptide viral PT-NANBH, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.

13. Procédé pour la détection d'acide nucléique viral PT-NANBH comprenant:

i) l'hybridation de l'ARN viral présent dans un échantillon, ou de l'ADNc synthétisé à partir de cet ARN, avec une séquence d'ADN correspondant à la SEQ ID n° 3, 4, 19, 20, 21 ou 22, et le criblage des hybrides d'acide nucléique en résultant pour identifier tout acide nucléique viral PT-NANBH; ou ii) la synthétisation d'ADNc à partir de l'ARN viral présent dans un échantillon, l'amplification d'une séquence d'ADN présélectionnée correspondant à une sous-séquence de la SEQ ID n° 3, 4, 19, 20, 21 ou 22 et l'identification de la séquence d'ADN présélectionnée.

14. Un kit d'essai pour la détection d'acide nucléique viral PT-NANBH comprenant:

i) une paire d'amorces oligonucléotides dont l'une correspond à une portion de la séquence de nucléotide de SEQ ID n° 3, 4, 19, 20, 21 ou 22 et dont l'autre se trouve de côté 3' de la première et correspond à une portion de la séquence complémentaire, la paire définissant entre elles une séquence d'ADN présélectionnée;

ii) un enzyme de transcriptase inverse pour la synthèse de l'ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon en amont de l'amorce correspondant à la séquence de nucléotide complémentaire de la SEQ ID n° 3, 4, 19, 20, 21 ou 22;

iii) un enzyme capable d'amplifier la séquence d'ADN présélectionnée; et éventuellement iv) des solutions de lavage et tampons de réaction.

15. Une méthode pour la détection de l'antigène viral PT-NANBH ou de l'anticorps viral, comprenant la mise en contact d'un échantillon avec un polypeptide viral PT-NANBH selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou un anticorps polyclonal ou monoclonal selon la revendication 12, et la détermination de la présence ou non d'une liaison antigène-anticorps au sein de l'échantillon.

16. Un kit d'essai pour la détection d'antigène viral PT-NANBH ou d'anticorps viral comprenant un polypeptide viral PT-NANBH selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou un anticorps polyclonal ou monoclonal suivant la revendication 12, et des moyens pour déterminer l'existence ou non d'une liaison antigène-anticorps au sein de l'échantillon.

17. Une formulation de vaccin comprenant un polypeptide viral PT-NANBH selon l'une des revendications 1 à 6, en association avec un support acceptable du point de vue pharmaceutique.

18. Une méthode pour la détection d'anticorps viral PT-NANBH, comprenant la mise en contact d'un

83

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

CH 684 594 A5

échantillon avec un ou plusieurs polypeptides viral PT-NANBH, le(s)dit(s) polypeptide(s) viral comprenant deux ou plusieurs antigènes viral PT-NANBH en combinaison ou désagrégé en polypeptide indépendant, au moins un desdits antigènes étant dérivé de la région codante structurale du virus et au moins un autre desdits antigènes étant dérivé de la région codante non structurale du virus, et la détermination de la présence ou non d'une liaison antigène-anticorps au sein de l'échantillon.

19. Un kit d'essai pour la détection d'anticorps viral PT-NANBH comprenant un ou plusieurs polypeptides viral PT-NANBH, le(s)dit(s) polypeptide(s) viral comprenant deux ou plusieurs antigènes viral PT-NANBH en combinaison ou désagrégé en polypeptide indépendant, au moins un desdits antigènes étant dérivé de la région codante structurale du virus et au moins un autre desdits antigènes étant dérivé de la région codante non structurale du virus, et des moyens pour déterminer l'existence ou non d'une liaison antigène-anticorps au sein de l'échantillon.

84